CN103619878A - 结合血清白蛋白的蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及能够结合血清白蛋白的氨基酸序列；涉及包含该氨基酸序列的蛋白和多肽，或基本上由该氨基酸序列组成的蛋白和多肽；涉及编码该氨基酸序列、蛋白或多肽的核酸；涉及包含该氨基酸序列、蛋白和多肽的组合物，特别是药物组合物；并且涉及该氨基酸序列、蛋白和多肽的应用。

Description

结合血清白蛋白的蛋白
本发明涉及能够结合血清白蛋白的氨基酸序列；涉及包含该氨基酸序列的蛋白和多肽，或基本上由该氨基酸序列组成的蛋白和多肽；涉及编码该氨基酸序列、蛋白或多肽的核酸；涉及包含该氨基酸序列、蛋白和多肽的组合物，特别是药物组合物；并且涉及该氨基酸序列、蛋白和多肽的应用。
本发明的其他方面，实施方案，优势和应用将通过本文进一步描述变得清晰。
如果任何术语在本文没有具体定义，这些术语具有在WO2009/068627或WO06/122787中给出的关于它们的定义。如果在本文中所用的任何术语在本文或在WO2009/068627/WO06/122787中没有具体定义，那么它们具有在本领域的一般含义，对于此例如参考标准书籍。
能够结合人血清白蛋白的氨基酸序列及其在多肽构建体中增加治疗相关蛋白和多肽的半衰期的应用是本领域中已知的。
例如，申请人的WO04/041865描述了针对血清白蛋白（和具体地针对人血清白蛋白）的纳米抗体，所述纳米抗体可以连接于其他蛋白(如针对需要的靶标的一个或多个其他纳米抗体)从而增加所述蛋白的半衰期。
国际申请WO06/122787描述了许多针对(人)血清白蛋白的纳米抗体。这些纳米抗体包括称为Alb-1(在WO06/122787中的SEQ ID NO:52)的纳米抗体及其人源化变体，如Alb-8(在WO06/122787中的SEQ ID NO:62)。[纳米抗体
Figure BDA0000442823710000011
和纳米抗体
Figure BDA0000442823710000012
是Ablynx N.V.的商标]。此外，这些可以用于延长治疗用蛋白和多肽和其他治疗用实体或结构部分的半衰期。
到第一次提交本申请之日时，针对（人）血清白蛋白的纳米抗体用于延长治疗用结构部分如纳米抗体的半衰期的应用已经通过临床试验的方式得到证实。例如，已经在I期临床试验中证实了ALX-0141的安全性，耐受性，免疫原性和药物代谢动力学(PK)，所述ALX-0141是一种包括两个针对RANK-L的纳米抗体和一个针对人血清白蛋白的纳米抗体的蛋白构建体(在伦敦的欧洲风湿病学年度代表大会(Annual European Congress ofRheumatology(EULAR)上由Ablynx N.V.在2011年5月27日提交的数据))。此外，许多Ablynx N.V.的公开的专利申请提供了具有增加的半衰期的构建体的实例，所述构建体包括一个或多个针对治疗靶标的纳米抗体和一个或多个针对血清白蛋白的纳米抗体(如Alb-8)。例如，参考WO04/041862,WO2006/122786,WO2008/020079,WO2008/142164,WO2009/068627和WO2009/147248。
尽管已经确定使用针对(人)血清白蛋白的纳米抗体(如在WO04/041865和WO06/122787中所述的那些和具体地在WO06/122787中所述的Alb-1的人源化变体)对于延长纳米抗体和其他治疗用结构部分和实体的半衰期提供了良好的和可广泛使用的方法，但是这并不意味着技术人员不会得益于针对人血清白蛋白的进一步改善的纳米抗体的获得，技术人员为此目的对所述纳米抗体进行处理。
本发明提供针对人血清白蛋白的这样的改善的纳米抗体(称为“Alb-23”;见SEQ ID NO:1)，以及该纳米抗体的许多变体(在本文也称为“Alb-23样序列”或“Alb-23变体”，关于一些非限制性实例参见SEQ IDNO’s3-11)，以及包含其的化合物，多肽和其他(蛋白)构建体(如本文进一步所述)。
改善的SEQ ID NO:1的纳米抗体及其变体可以提供的超过在WO04/041865和WO06/122787中所述的纳米抗体的优势通过本文进一步描述变得清晰。例如，但不限于，这些优势可以包括
-提高的稳定性(如通过测量Tm所确定的提高的热稳定性);和/或
-和/或提高的贮存稳定性，如例如在实施例5所述的SEC实验中所测量的);和/或
-在一些配制条件下降低的形成二聚体的倾向(例如，在一些水性制剂缓冲液中高浓度下-也见例如实施例5)。
此外，已经发现改善的SEQ ID NO:1的纳米抗体及其变体特别适合用于延长免疫球蛋白单可变结构域的半衰期，所述免疫球蛋白单可变结构域包含超过一个二硫键，如属于“VHH-1类”的VHH’s和纳米抗体(其如本文进一步所述可以包括两个或甚至三个二硫键)。例如，但不限于，已经发现与包含根据WO06/122787的结合血清白蛋白的纳米抗体如“Alb-8”(在WO06/122787中的SEQ ID NO:62)而不是SEQ ID NO:1的氨基酸序列的相应多肽相比，包括一个或多个VHH-1类的治疗用VHH’s/纳米抗体和纳米抗体Alb-23(或Alb-23变体)的多肽在某些宿主或宿主细胞中可以具有更好的表达水平(和/或通常当其表达、纯化和/或制备/生产时其他的优势性质)。此外，这将通过本文进一步的描述和实验部分变得清晰。
本发明的这些和其他优势，以及各个方面，实施方案，用途和应用，将通过本文进一步描述变得清晰。
已知免疫球蛋白单可变结构域如纳米抗体，VHH’s，(单)结构域抗体，dAbs，IgNAR结构域和微体(如例如在WO00/29004中所述)可以在许多宿主细胞和宿主生物中表达，所述宿主细胞和宿主生物如细菌细胞如大肠杆菌(E.coli)，酵母菌株如毕赤酵母(Pichia)和酿酒酵母(Saccharomyces)，和各种哺乳动物细胞或细胞系。例如，参考EP0656946和EP0698097，以及各种Ablynx N.V.的公开的专利申请，如例如WO04/041862,WO2006/122786,WO2008/020079,WO2008/142164,WO2009/068627或WO2009/147248。
类似地，已知当一个或多个针对治疗靶标的免疫球蛋白单可变结构域与针对(人)血清白蛋白的纳米抗体（如在WO04/041865和WO06/122787中描述的那些）连接从而提供具有增加的半衰期（即，与单独的治疗用结构域比较）的构建体时，得到的多肽和构建体也可以在许多宿主细胞和宿主生物如细菌细胞如大肠杆菌(E.coli)，酵母菌株如毕赤酵母和酿酒酵母，和各种哺乳动物细胞或细胞系中表达。再次参考WO04/041865，WO06/122787，WO2010/056550和本文提及的来自Ablynx N.V.的各种公开的专利申请。
通常也已知所有的VHH’s和纳米抗体包含在位置22的半胱氨酸残基和在位置92的半胱氨酸残基之间的至少一个二硫键（根据Kabat的编号方式，见Ablynx N.V.的专利申请）。
尽管大多数VHH’s仅包含这样的单个二硫键，但是还已知一些VHH’s包含共两个（或在例外的情形中，三个）二硫键。例如，被称为“VHH-1型”或“VHH-1类”的一类VHH’s和纳米抗体通常在位置50的半胱氨酸残基（CDR2的第一个氨基酸残基）和CDR3中存在的半胱氨酸残基之间具有第二个二硫键(所述VHH’s和纳米抗体也通常在位置44-47具有序列基序EREG)。此外，来自骆驼的一些VHH’s有时在CDR1中存在的半胱氨酸残基和CDR3存在的半胱氨酸残基之间具有二硫键。
所述VHH-1型纳米抗体的一些非限制性实例(在本文仅作举例；可以在来自Ablynx N.V.的一些其他专利申请中发现针对其它靶标的其他VHH-1型序列)是来自WO2009/068627的序列P23ILPMP37D5(SEQ ID NO:2490)和P12ILPMP80F10(SEQ ID NO:1954)，来自WO2008/020079的序列PMP30A2(SEQ ID NO:419)，PMP31C5(SEQ ID NO:413)和PMP30G11(SEQID NO:416)；和来自WO2009/147248的序列RSVPMP5A2(SEQ ID NO:262)，RSVPMP5B2(SEQ ID NO:263)和RSVPMP5C3(SEQ ID NO:264)。
都转让于Ablynx N.V.的未预先公开的美国申请61/388,172(2010年9月30日提交并且标题为“涉及c-Met的生物材料”和US61/451,869(2011年3月11日提交并且标题为“涉及c-Met的生物材料”)描述了针对治疗靶标c-Met的VHH’s和纳米抗体；并且这些VHH’s和纳米抗体中的一些(如US61/451,869中的4E09,SEQ ID NO:26，和这里的SEQ ID NO:12，以及在US61/451,869中描述的4E09的一些变体)也属于VHH-1类。
US61/388,172和US61/451,869也描述了所述VHH-1类纳米抗体可以与针对人血清白蛋白的纳米抗体连接从而增加其半衰期(在US61/388,172和US61/451,869中所用的针对人血清白蛋白的纳米抗体被称为“Alb-11”并且在US61/451,869中在SEQ ID NO:5中给出。Alb-11具有和Alb-8相同的氨基酸序列，其是在WO06/122787中的SEQ ID NO:62)。包含Alb-11和4E09的所述多肽的实例在US61/451,869中的SEQ ID NO:9中给出。
尽管VHH-1型的VHH’s/纳米抗体(或更一般地，包含两个或三个二硫键的VHH’s/纳米抗体)，以及包含其的多肽和其他蛋白构建体(包括还包含至少一个针对血清白蛋白的纳米抗体从而提供增加的半衰期的这样的多肽)，可以在任何适合的宿主或宿主生物中表达，但是已经发现关于所述VHH，纳米抗体，多肽或构建体获得的表达水平可以明显低于关于包含不属于VHH-1类的VHH’s或纳米抗体(或更一般地，包含仅具有一个二硫键的VHH’s/纳米抗体)的类似/相当的VHH’s，纳米抗体，多肽或构建体获得的表达水平。例如，但不限于，尽管关于包含Alb-8和一个或多个非VHH-1型的治疗用纳米抗体的多肽，在毕赤酵母(Pichia)中常规获得了超过0.8g/l以上(如1g/l以上)的表达水平(再次参见Ablynx N.V.的一些公开的专利申请)，但是发现对于包含抗-c-Met VHH-1型的纳米抗体4E09(在US61/451,869中的SEQ ID NO:26和本文的SEQ ID NO:12)或其人源化的变体和Alb-8的多肽，难以获得超过0.5g/l的表达水平(见下面的实验部分)。令人惊奇的是，现在发现当在所述多肽中使用SEQ ID NO:1的纳米抗体(即，替代Alb-8)时，可以获得显著更高的表达水平（见下面的实验部分）。
如所提及，在第一方面中，本发明涉及针对(人)血清白蛋白的氨基酸序列，其基本由下述氨基酸序列组成，或是下述氨基酸序列：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISG
SGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQ
GTLVTVSS[SEQ ID NO：1]
该氨基酸序列在本文中也称为“Alb-23”或“本发明的氨基酸序列”。Alb-23是氨基酸序列“Alb-1”（来自WO06/122787的SEQ ID NO:52，在WO06/122787中也称为“PMP6A6”）的人源化形式。
为方便起见，图1提供了Alb-23与Alb-1和WO06/122787的表III中公开的Alb-1的人源化形式(在WO06/122787中称为“Alb-3”-“Alb-10”，也见WO06/122787中的SEQ ID NO’s:57-64)的比对。Alb-1的氨基酸序列为：
AVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKEPEWVSSIS
GSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLKPEDTAVYYCTIGGSLSRS
SQGTQVTVSS[SEQ ID NO：2]
在上述序列中，已经以粗体和下划线表示了Alb1和Alb-23之间的主要差异。这些是(关于根据Kabat的编号方式，见例如WO2008/020079的表A-5至A-8；并且关于根据标准单字母氨基酸符号给氨基酸残基命名的每个字母，例如参见WO2008/020079的表A-2)：位置5:V-L;位置16:N-G;位置44和45:EP-GP;位置74-76:AKT-SKN;位置83:K-R。
因此，在另一个方面中，本发明涉及作为序列Alb-1(SEQ ID NO:2)的变体的氨基酸序列，所述变体包括：
(i)在位置44和45上的氨基酸基序GP；
(ii)在位置74-76上的氨基酸基序SKN；
(iii)氨基酸序列为SFGMS(SEQ ID NO:29)的CDR1；
(iv)氨基酸序列为SISGSGSDTLYADSVKG(SEQ ID NO:30)的CDR2；
(v)氨基酸序列为GGSLSR(SEQ ID NO:31)的CDR3；
并且其优选地还包括
(vi)在位置16的G；
并且其中优选地(但不限于)：
(vii)位置83是R（但是可以任选地也是K；
并且相对于在SEQ ID NO:2中给出的序列，还包括(即除了在位置16,44和45,74-76和83上的前述氨基酸差异之外，其中在位置16和83的氨基酸差异是任选的但是优选的)1-7个如1-5个其他的“氨基酸差异”(如在WO2008/020079中所定义的)，其可以例如是一个或多个人源化取代（如在WO2008/020079中所定义；也见例如表A-5至A-8）和/或其他取代(其中所述人源化或其他取代的非限制性实例是：位置1：A至E，位置14：P至A，或位置108：Q至L)。
类似地，本发明涉及作为序列Alb-23(SEQ ID NO:1)的变体的氨基酸序列，所述变体包括：
(ii)在位置44和45上的氨基酸基序GP；
(ii)在位置74-76上的氨基酸基序SKN；
(iii)氨基酸序列为SFGMS(SEQ ID NO:29)的CDR1；
(iv)氨基酸序列为SISGSGSDTLYADSVKG(SEQ ID NO:30)的CDR2；
(v)氨基酸序列为GGSLSR(SEQ ID NO:31)的CDR3；
并且其优选地还包括
(vi)在位置16的G；
并且其中优选地(但不限于)：
(vii)位置83是R（但是可以任选地也是K）；
并且相对于在SEQ ID NO:1中给出的序列，还包括1-7个如1-5个其他的“氨基酸差异”(如在WO2008/020079中所定义的)，其可以例如是一个或多个人源化取代（如在WO2008/020079中所定义；也见例如表A-5至A-8）和/或其他取代(其中所述人源化或其他取代的非限制性实例是：位置1：A至E，位置14：P至A，或位置108：Q至L)。
如技术人员所清楚的，并且尽管Alb-23(的应用)在本发明的背景中通常是优选的，但是在前述段落中描述的变体与Alb-23共享一些相同的氨基酸取代(即与Alb-1比较)，这是Alb-23的特征（也与在WO06/122787中所述的Alb-1的人源化变体比较），并且因此预期提供至少一些或甚至全部在本文中关于Alb-23所述的优势。为此原因，这些变体在本文中也称为“Alb-23-样序列”或“Alb-23变体”。
在一个具体，但非限制性的方面中，Alb-23变体是这样的从而使得当其在实施例5中所述的贮存稳定性测定法中使用时(即作为还包含IGE045和9GS接头的构建体的部分)，在25℃贮存1个月后关于包含Alb-23变体的构建体在SE-HPLC上的前锋(在实施例5中给出的其他条件下)少于10%，优选地少于5%；和/或在40℃贮存1个月后，关于包含Alb-23变体的构建体在SE-HPLC上的前锋(在实施例5中给出的其他条件下)少于20%，优选地少于15%。例如，参考在表8中的比较结果。
一些Alb-23样序列的一些非限制性实例在SEQ ID NO’s:3-11中给出。当在多肽或蛋白构建体的C-端末端提供结合白蛋白的纳米抗体时，可以具体地使用SEQ ID NO’s6-11的变体(或在C-端具有1-3个氨基酸残基的其他Alb-23变体，所述氨基酸残基可以分别独立地选自天然存在的氨基酸残基并且可以例如独立地选自A,G,V,L和I)。在图2中提供Alb-23与SEQ IDNO’s:6-11的序列的比对。
Alb-23A：
AVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISG
SGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQ
GTLVTVSS[SEQ ID NO：3]
Alb-23B：
AVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISG
SGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQ
GTQVTVSS[SEQ ID NO：4]
Alb-23C：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISG
SGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQ
GTQRVTVSS[SEQ ID NO：5]
Alb-23D：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISG
SGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQ
GTLVTVSSA[SEQ ID NO：6]
Alb-23E：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISG
SGSDTLYADSVGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQ
GTLVTVSSAA[SEQ ID NO：7]
Alb-23F：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISG
SGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQ
GTLVTVSSAAA[SEQ ID NO：8]
Alb-23G：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISG
SGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQ
GTLVTVSSG[SEQ ID NO：9]
Alb-23H：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISG
SGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQ
GTLVTVSSGG[SEQ ID NO：10]
Alb-23I：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISG
SGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQ
GTLVTVSSGGG[SEQ ID NO：11]
因此，在一个具体但非限制性的方面中，本发明提供这样的蛋白或多肽，其基本由氨基酸序列Alb-23(或本文所述的Alb-23变体之一的氨基酸序列)组成。
如本文进一步所述，氨基酸序列Alb-23和本文所述的其他Alb-23变体可以在作为结构部分，结合单元或融合配偶体使用以增加治疗用结构部分的半衰期上具有优势，所述治疗用结构部分如多肽，蛋白，化合物(包括，但不限于小分子)或其他治疗用实体。
因此，在另一个方面中，本发明提供多肽、蛋白、构建体、化合物或其他化学实体，其包括氨基酸序列Alb-23(或本文所述的Alb-23变体之一的氨基酸序列)和一个或多个其它氨基酸序列、(结合)结构域、结合单元或其他结构部分或化学实体或基本由氨基酸序列Alb-23(或本文所述的Alb-23变体之一的氨基酸序列)和一个或多个其它氨基酸序列、(结合)结构域、结合单元或其他结构部分或化学实体组成。
具体地，本发明提供这样的多肽、蛋白、构建体、化合物或其他化学实体，其包括彼此直接或通过一个或多个适合的接头或间隔臂适当地连接的氨基酸序列Alb-23(或本文所述的Alb-23变体之一)和一个或多个(如一个或两个)治疗用结构部分（其可以是相同的或不同的，并且可以例如针对相同的靶标或不同的靶标，并且当它们针对相同的靶标时，可以针对所述靶标的相同的或不同的表位，部分，结构域或亚基）。所述多肽、蛋白或构建体可以例如但不限于是融合蛋白，如本文所述。
本发明还涉及所述多肽，蛋白，构建体或化合物的治疗应用和包含所述多肽，蛋白，构建体或化合物的药物组合物。
在一个方面中，至少一个治疗用结构部分包括治疗用蛋白，多肽，化合物，因子或其他实体或基本由治疗用蛋白，多肽，化合物，因子或其他实体组成。在一个优选的实施方案中，治疗用结构部分针对需要的抗原或靶标，能够结合需要的抗原(并且具体地能够特异性结合需要的抗原)，和/或能够与需要的靶标相互作用。在另一个实施方案中，至少一个治疗用结构部分包括治疗用蛋白或多肽或基本由治疗用蛋白或多肽组成。在另一个实施方案中，至少一个治疗用结构部分包括结合结构域或结合单元，如免疫球蛋白或免疫球蛋白序列(包括但不限于免疫球蛋白片段)，如抗体或抗体片段(包括但不限于ScFv片段)，或基本由其组成，或基本由另一种适合的蛋白支架组成，所述蛋白支架如蛋白A结构域(如AffibodiesTM)，淀粉酶抑肽(tendamistat)，纤连蛋白，脂笼蛋白，CTLA-4，T-细胞受体，设计的锚蛋白重复序列，avimers和PDZ结构域(Binz等,Nat.Biotech2005,卷23:1257)，和基于DNA或RNA的结合结构部分，包括但不限于DNA或RNA适体(Ulrich等,Comb Chem High Throughput Screen20069(8):619-32)。
在另一个方面中，至少一个治疗用结构部分包括抗体可变结构域，如重链可变结构域或轻链可变结构域或基本由抗体可变结构域，如重链可变结构域或轻链可变结构域组成。
在一个优选的方面中，至少一个治疗用结构部分包括或基本由下述组成：至少一个免疫球蛋白单可变结构域,如结构域抗体，单结构域抗体，“dAb”或纳米抗体(如VHH，人源化VHH或骆驼源化VH)或IgNAR结构域。
在一个具体实施方案中，至少一个治疗用结构部分包括或基本由下述组成：至少一个单价纳米抗体或二价，多价，双特异性或多特异性纳米抗体构建体。
包含Alb-23(或Alb-23)变体和一个或多个治疗用结构部分的多肽，（融合）蛋白，构建体或化合物可以通常如上述引用的现有技术(如WO04/041865和WO06/122787)所述进行(制备和使用)，但是用Alb-23或Alb-23变体取代在所述现有技术中所述的增加半衰期的结构部分。
包含Alb-23(或Alb-23)变体和一个或多个治疗用结构部分的多肽，（融合）蛋白，构建体或化合物通常地和优选地具有与所述一个治疗用结构部分或多个治疗用结构部分本身相比增加的半衰期。
一般地，本文所述的构建体或融合蛋白优选地具有是相应治疗用结构部分本身的半衰期的至少1.5倍，优选地至少2倍，如至少5倍，例如至少10倍或超过20倍的半衰期(如在人或适合的动物，如小鼠或食蟹猴中所测量的)。
此外，优选地，任何这样的融合蛋白或构建体在人中具有与相应治疗用结构部分本身的半衰期相比增加超过1小时，优选地超过2小时，更优选地超过6小时的半衰期，如增加超过12小时的半衰期。
此外，优选地，任何融合蛋白或构建体在人中具有超过1小时，优选地超过2小时，更优选地超过6小时，如超过12小时的半衰期，例如具有约1天，2天，1周，2周或3周的半衰期，优选地不超过2个月的半衰期，尽管后者可以是较不重要的。
通常，半衰期可以定义为多肽在体内的血清浓度减少50%(例如由于通过天然机制导致配体的降解和/或配体的清除或螯合)所需要的时间。具体地，半衰期可以在WO2009/068627中定义。
药物代谢动力学分析和半衰期确定的方法是本领域技术人员所熟悉的。详情可见于Kenneth,A等:Chemical Stability of Pharmaceuticals:AHandbook for Pharmacists（药物的化学稳定性：药剂师手册）和Peters等，Pharmacokinete analysis:A Practical Approach(药物代谢动力学分析：实践方法)(1996)。还参考"Pharmacokinetics(药物代谢动力学)",M Gibaldi&DPerron,Marcel Dekker出版,第二修订版(1982)。
如所提及，在一个方面中，可以将氨基酸序列Alb-23(或本文所述的Alb-23变体中任一个的氨基酸序列)用于增加(一个或多个)免疫球蛋白单可变结构域，如结构域抗体，单结构域抗体，“dAb’s”，VHH’s或纳米抗体(如VHH’s,人源化VHH’s或骆驼源化的VH’s如骆驼源化的人VH’s)的半衰期。
具体地，如本文所提及，氨基酸序列Alb-23(或本文所述的Alb-23变体中任一个的氨基酸序列)的使用可以有利于增加包含两个以上（如两个或三个）二硫键的免疫球蛋白单可变结构域，如VHH’s/VHH-1类的纳米抗体的半衰期。
因此，本发明的一个实施方案涉及这样的多肽，构建体或融合蛋白，其包含彼此直接或任选地通过一个或多个适合的接头或间隔臂适当连接的氨基酸序列Alb-23(或本文所述的Alb-23变体之一)和一个或多个(如一个或两个)免疫球蛋白单可变结构域序列。如本文所提及，在所述多肽，构建体或融合蛋白中存在的每个这样的免疫球蛋白单可变结构域可以独立地是结构域抗体,单结构域抗体,“dAb’”或纳米抗体(如VHH，人源化VHH或骆驼源化的VH，如骆驼源化的人VH)；并且根据一个具体但非限制的方面，至少一个（并且至多所有的）这些免疫球蛋白单可变结构域包含两个或三个二硫键。
优选地，每个这样的免疫球蛋白单可变结构域是纳米抗体；并且根据一个具体的但非限制性的方面，至少一个（并且至多所有的）这些免疫球蛋白单可变结构域是VHH-1类的纳米抗体。
例如，但不限于，所述构建体，融合蛋白或多肽可以包括：
-一个拷贝的Alb-23(或一个拷贝的本文所述的Alb-23变体之一)和一个这样的免疫球蛋白单可变结构域序列；
-一个拷贝的Alb-23(或一个拷贝的本文所述的Alb-23变体之一)和两个这样的免疫球蛋白单可变结构域序列(其可以是相同或不同的);
或甚至(尽管通常不需要并且较不优选，这是因为得到的蛋白更大)
-两个拷贝的Alb-23(或两个拷贝的本文所述的Alb-23变体，其可以是相同或不同的)和一个这样的免疫球蛋白单可变结构域序列;
-两个拷贝的Alb-23(或两个拷贝的本文所述的Alb-23变体，其可以是相同或不同的)和两个这样的免疫球蛋白单可变结构域序列(其可以是相同或不同的);
-一个拷贝的Alb-23和三个这样的免疫球蛋白单可变结构域序列(其可以是相同或不同的)。
本发明的构建体，融合蛋白或多肽的一些非限制性实例可以如下示意性地表示，其中“[Alb-23]”表示Alb-23(或本文所述的Alb-23变体之一)，“[治疗用结构部分1]”和“[治疗用结构部分2]”表示治疗用结构部分(其如提及可以彼此独立地是免疫球蛋白单可变结构域)，“-“表示适合的接头（其是任选的）并且N-端在左手侧，C-端在右手侧。
[Alb-23]-[治疗用结构部分1]
[治疗用结构部分1]-[Alb-23]
[Alb-23]-[治疗用结构部分1]-[治疗用结构部分1]
[治疗用结构部分1]-[治疗用结构部分1]-[Alb-23]
[治疗用结构部分1]-[Alb-23]-[治疗用结构部分1]
[Alb-23]-[治疗用结构部分1]-[治疗用结构部分2]
[治疗用结构部分1]-[治疗用结构部分2]-[Alb-23]
[治疗用结构部分1]-[Alb-23]-[治疗用结构部分2]
当在本发明的构建体或多肽中存在两个以上不同的治疗用结构部分（如两个以上不同的免疫球蛋白单可变结构域）时，它们可以是相同或不同的，并且当它们是不同时，它们可以针对相同的靶标(例如，针对所述靶标相同或不同的部分，结构域，亚基或表位)或针对不同的靶标。
因此，在另一个方面中，本发明涉及包含Alb-23(或本文所述的Alb-23变体之一)和至少一个其他纳米抗体(如一个或两个其他纳米抗体,其可以是相同或不同的)的多特异性（和具体地双特异性）纳米抗体构建体，其中所述至少一个其他纳米抗体优选地针对需要的靶标（其优选地是治疗靶标）和/或是另一种用于或适合用于治疗，预防和/或诊断目的的纳米抗体。此外，Alb-23和其他纳米抗体可以直接或任选地通过一个或多个适合的接头或间隔臂适当地彼此连接，并且根据一个具体但非限制性的方面，其他纳米抗体的至少一个(并且多至所有)可以是VHH-1类的。
对于包含一个或多个纳米抗体的多价和多特异性多肽和它们的制备的一般描述，也参考Conrath等,J.Biol.Chem.（生物化学杂志）,卷276,10.7346-7350,2001;Muyldermans,Reviews in Molecular Biotechnology(分子生物技术综述)74(2001),277-302;以及例如WO96/34103,WO99/23221,WO04/041862,WO2006/122786,WO2008/020079,WO2008/142164或WO2009/068627。
本发明的一些具体多特异性和/或多价多肽的一些其他实例可以见于本文提及的Ablynx N.V.的申请。具体地，关于包含针对血清蛋白的用于增加半衰期的至少一个纳米抗体的多价和多特异性构建体，编码其的核酸，包含其的组合物，前述的制备和前述的应用的一般描述，参考上述提及的国际申请WO04/041865和WO06/122787(本文所述的Alb-23和Alb-23变体通常可以类似于本文所述的延长半衰期的纳米抗体如Alb-8的方式使用)，以及参考在WO04/041862,WO2006/122786,WO2008/020079,WO2008/142164或WO2009/068627中给出的所述构建体的一般描述和具体实例。
在一个非-限制性实施方案中，在所述多肽或蛋白构建体中存在的一个或多个其他纳米抗体可以针对c-Met，并且可以具体地是针对c-Met的I型纳米抗体。可以在所述多肽或蛋白构建体中存在的针对c-Met的纳米抗体的一些非限制性实例可以例如见于本文提及的未预先公开的美国申请US61/388,172和US61/451,869。
可以在所述多价和/或多特异性多肽中存在的针对c-Met的一个特别优选的I型纳米抗体(仅次于Alb-23或Alb-23变体)是4E09(在US61/451,869中的SEQ ID NO:26和本文的SEQ ID NO:12)或其变体。4E09的这样的变体可以通常在US61/451,869中所述(并且通常与4E09具有至少80%，如至少85%，例如至少90%以上如95%以上的序列同一性)并且优选是这样的从而使得(i)其与4E09竞争与c-Met的结合（在适合的结合测定法中，如在实施例7中所述的alphascreen测定法中，但是使用4E09替代如在实施例7中所用的HGF）；和/或(ii)其结合与4E09相同的在c-Met上的表位；和/或(iii)交叉阻断(如在WO2009/068627中定义)4E09与c-Met的结合。4E09的这样的变体可以例如是4E09的人源化和/或序列-优化的变体（如在US61/451,869中进一步所述）。可以在所述蛋白或多肽中存在的4E09的一些优选，但是非限制性实例如下，其也在US61/451,869:04E09(L49S);04E09(C50S/C100bG);04E09(C22A/C92S);A00790067=4E09(Q108L);A00790068=4E09(A74S,K83R,Q108L);A00790069=4E09(A74S,K83R,G88A,Q108L)和A00790105=4E09(E1D,A74S,K83R,G88A,Q108L)中进行描述，其中尤其优选后者。4E09和这些变体的氨基酸序列在SEQ ID NO’s:12-19中给出。
因此，在一个具体但非限制性的方面中，本发明涉及这样的多肽或蛋白构建体，其包括与一种或两种针对c-Met的纳米抗体适当地连接(直接或通过一个或多个适合的接头)的Alb-23(优选的)或Alb-23变体(如本文所述)或基本由其组成。如所提及，根据一个具体的，但非限制性的方面，所述针对c-Met的一种或两种纳米抗体包含两个二硫键(即，是“I类”)。
具体地，本发明涉及这样的多肽或蛋白构建体，其包括与一种或两种（优选地仅一种）针对c-Met的纳米抗体适当地连接(直接或通过一个或多个适合的接头)的Alb-23(优选的)或Alb-23变体(如本文所述)或基本由其组成，所述针对c-Met的纳米抗体是4E09(SEQ ID NO12)或4E09的变体(如本文所述并且在US61/451,869中描述)，并且优选地是4E09的人源化或序列优化的变体并且更优选地是A00790105(SEQ ID NO:19)。
所述蛋白和多肽的一些具体但非限制性的实例是构建体
Alb23-9GS-4E09,4E09-9GS-Alb23,Alb23-9GS-A00790105,
A00790105-9GS-Alb23,Alb23-35GS-4E09,4E09-35GS-Alb23,Alb23-35GS-A00790105,A00790105-35GS-Alb23和
A00790105-35GS-A00790105-35GS-Alb23。这些的序列分别在SEQ ID NO’s:20-28中给出。在这些之中，构建体A00790105-9GS-Alb23(SEQ ID NO:23)是特别优选的，并且因此本发明的一个方面还涉及这样的多肽，其与SEQID NO:23的多肽具有至少80%，如至少85%，例如至少90%，如至少95%以上的序列同一性。
本发明还涉及这样的核苷酸序列或核酸，其编码本文所述的氨基酸序列，融合蛋白和构建体。本发明还包括这样的遗传构建体，其包含前述核苷酸序列或核酸以及用于本身已知的遗传构建体的一个或多个元件。遗传构建体可以是质粒或载体的形式。此外，所述构建体可以通常如在AblynxN.V的公开的专利申请中描述，所述专利申请如例如WO04/041862，WO2006/122786，WO2008/020079，WO2008/142164或WO2009/068627。
本发明还涉及这样的宿主或宿主细胞，其包含所述核苷酸序列或核酸，和/或表达(或能够表达)本文所述的氨基酸序列，融合蛋白和构建体。此外，所述宿主细胞可以通常如在Ablynx N.V的公开的专利申请中所述，所述专利申请如例如WO04/041862,WO2006/122786,WO2008/020079,WO2008/142164或WO2009/068627。
本发明还涉及用于制备本文所述的氨基酸序列，融合蛋白或构建体的方法，所述方法包括在使得宿主细胞产生或表达本文所述的氨基酸序列，融合蛋白或构建体的条件下培养或维持本文所述的宿主细胞，并且任选地还包括分离这样产生的氨基酸序列，融合蛋白或构建体。此外，所述方法可以如通常在Ablynx N.V公开的专利申请中所述进行，所述专利申请如例如WO04/041862,WO2006/122786,WO2008/020079,WO2008/142164或WO2009/068627。
本发明还涉及药物组合物，其包含至少一种本文所述的氨基酸序列，融合蛋白或构建体，和任选地至少一种药用载体，稀释剂或赋形剂。所述制剂，载体，赋形剂和稀释剂可以通常如在Ablynx N.V.的公开的专利申请中所述，所述专利申请如例如WO04/041862,WO2006/122786,WO2008/020079,WO2008/142164或WO2009/068627。
然而，由于本文所述的氨基酸序列，融合蛋白或构建体具有增加的半衰期，所以它们优选地施用于循环。因此，它们可以以允许氨基酸序列，融合蛋白或构建体进入循环的任何适合方式进行施用，如静脉内，通过注射或输注，或以允许氨基酸序列，融合蛋白或构建体进入循环的任何其他适合的方式进行施用(包括口服施用，皮下施用，肌内施用，通过皮肤施用，鼻内施用，通过肺施用等)。适合的施用方法和路径是技术人员清楚的，并且也例如来自Ablynx N.V.的公开的专利申请的教导，所述专利申请如例如WO04/041862,WO2006/122786,WO2008/020079,WO2008/142164或WO2009/068627。
因此，在另一个方面中，本发明涉及用于预防和/或治疗至少一种可以通过使用本文所述的融合蛋白或构建体进行预防或治疗的疾病或病症，所述方法包括向需要其的受试者施用药用活性量的本发明的融合蛋白或构建体，和/或包含其的药物组合物。可以通过使用本文所述的融合蛋白或构建体预防或治疗的疾病和病症通常与可以通过使用本发明的融合蛋白或构建体中存在的治疗用结构部分预防或治疗的疾病和病症相同。
在本发明的上下文中，术语“预防和/或治疗”不仅包括预防和/或治疗疾病，通常还包括预防疾病的发作，减缓或逆转疾病进程，预防或减缓一个或多个与疾病相关症状的发作，减轻和/或缓解一个或多个与疾病相关的症状，减轻疾病和/或其任意相关症状的严重性和/或持续时间，和/或预防疾病和/或其任意相关症状严重性的进一步增加，预防、降低或逆转由疾病导致的任何生理学损伤，和通常任何有益于被治疗的患者的药理学作用。
待治疗的受试者可以是任何温血动物，但是特别是哺乳动物，和更特别地是人。如技术人员应该清楚的，待治疗的受试者应该具体地是患有本文中提及的疾病和病症或处于本文中提及的疾病和病症危险中的人。
在另一个实施方案中，本发明涉及用于免疫治疗，和特别是用于被动免疫治疗的方法，所述方法包括向患有本文中提及疾病和病症或处于本文中提及疾病和病症危险中的受试者施用药物活性量的本发明的融合蛋白或构建体，和/或药物活性量的包括所述本发明的融合蛋白或构建体的药物组合物。
按照适于预防和/或治疗待预防或治疗的疾病或病症的治疗方案，施用融合蛋白或构建体和/或包含其的组合物。临床医生通常应该能够根据各种因素确定合适的治疗方案，所述因素诸如待预防或治疗的疾病或病症，待治疗疾病的严重性和/或其症状的严重性，待使用的具体的本发明的多肽，使用的具体给药途径和药物制剂或组合物，患者的年龄、性别、体重、饮食、总体状态，和临床医生熟知的类似因素。
通常，所述治疗方案包括以一个或多个药物有效量或剂量，施用一个或多个本发明的融合蛋白或构建体，或一个或多个包含其的组合物。临床医生也可以根据以上列出的因素确定具体的待施用量或剂量。
通常，为了预防和/或治疗本文提及的疾病和病症，并根据待治疗的具体疾病或病症，使用的具体融合蛋白或构建体的功效和/或半衰期，使用的具体给药途径和具体药物制剂或组合物，通常应该以这样的量，在一天中连续地(例如通过输注)作为单次日剂量或作为多个分剂量施用本发明的纳米抗体和多肽，所述量是1克-0.01微克/kg体重/天，优选地0.1克-0.1微克/kg体重/天，诸如约1，10，100或1000微克/kg体重/天。临床医生通常也能够根据本文中提到的因素确定合适的日剂量。还应该清楚的是，在具体情形中，例如，基于以上列出的因素和他的专业判断，临床医生可以选择偏离这些量。通常，可以由对基本通过相同途径施用的针对相同靶标的类似常规抗体或抗体片段通常施用的量获得一些关于待施用量的指导，然而考虑亲和性/亲合力、功效、生物分布、半衰期和技术人员熟知的类似因素中的差别。
通常，在以上方法中，使用本发明的单一多肽。然而，组合使用两种或更多种本发明的多肽也属于本发明的范围。
本发明的多肽还可以与一个或多个其他药物活性化合物或成分组合使用，即作为组合的治疗方案使用，其可以引起或可以不引起协同功效。而且，临床医生能够基于以上列出的因素和他的专业判断，选择这些其他化合物或成分，以及合适的组合治疗方案。
特别地，本发明的多肽可以与其他药物活性化合物或成分组合使用，所述药物活性化合物或成分用于或能够用于预防和/或治疗能够用本发明的融合蛋白或构建体预防或治疗的疾病和病症，且作为其结果，可以获得或可以不获得协同功效。
临床医生应该清楚地，可以以关于所涉及的疾病或病症本身已知的任何方式，确定和/或跟踪按照本发明使用的治疗方案的效力。临床医生还能够，在适当时和或在个案基础上，改变或改进具体的治疗方案，从而获得理想的治疗效果，以避免、限制或减少不希望的副作用，和/或在一方面获得理想治疗效果和另一方面避免、限制或减少不希望有的副作用之间获得适当的平衡。
通常，应该遵从治疗方案，直到获得理想的治疗效果和/或尽量长地维持理想治疗效果。而且，这可以由临床医生确定。
待治疗的受试者可以是任何温血动物，特别是哺乳动物，和更特别是人。如技术人员应该清楚的，待治疗的受试者应该特别是患有本文中提及的疾病和病症或处于本文中提及的疾病和病症危险中的人。
本发明的其他方面，实施方案，优势和应用将通过本文进一步的描述变得清晰。
现在将通过非限制性实验部分和附图进一步举例说明，其中：
-图1是Alb-23(SEQ ID NO:1)与在WO06/122787中描述的Alb-1及其各种人源化变体的比对；
-图2是Alb-23(SEQ ID NO:1)与本文描述的Alb-23变体中的一些的比对；
-图3显示在本申请说明书中提及的各种序列；
-图4显示使用SDS-PAGE分析由具有低(L=1)和高(H=超过1)拷贝数(CN)的表达盒的毕赤酵母克隆产生的A007900009的表达模式。
-图5显示使用SDS-PAGE分析由具有低(L=1)和高(H=超过1)拷贝数(CN)的表达盒的毕赤酵母克隆产生的A007900171的表达模式。
-图6显示使用SDS-PAGE分析由具有低(L=1)和高(H=超过1)拷贝数(CN)的表达盒的毕赤酵母克隆产生的A007900057和A007900058的表达模式。
-图7显示使用SDS-PAGE分析由具有低(L=1)和高(H=超过1)拷贝数(CN)的表达盒的毕赤酵母克隆产生的A007901219变体的表达模式。
-图8显示表达A00700171和A00701219的巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)的发酵样品诱导结束时的SDS-Page分析(非还原条件)。将5μL无细胞培养基加载到凝胶上(泳道1-4)。泳道5-7包括以不同的量加载的对照纳米抗体。左边的泳道包括分子量标记物。
实验部分:
实施例1:4E09组合Alb11或Alb23的表达模式
表1提供了基于抗-c-Met4E09VHH1纳米抗体结构单元(SEQ IDNO:12)组合Alb11和Alb23的形式的综述。将不同的纳米抗体克隆到pPiczalpha表达载体中，并转化到巴斯德毕赤酵母X-33菌株中（来自Invitrogen/RCT的商购表达系统）。在包含博莱霉素(zeocin)的平板上选择克隆并且进行qPCR以根据它们的拷贝数对克隆进行分等级。在摇瓶实验中比较低拷贝和高拷贝数克隆之间的表达水平。关于包含Alb11的形式观察到在表达水平和拷贝数之间的逆相关(图4和5)。与此相反，关于包含Alb23纳米抗体的纳米抗体形式观察到在表达水平和拷贝数之间的正相关(图6和7)。
表1:VHH14E09纳米抗体结构单元或序列优化的形式通过9GS或35GS接头与Alb11或Alb23纳米抗体结构单元融合的5种形式的综述。
形式 构建体 SEQ ID NO:
A007900009 4E09-9GS-ALB11-Flag3-His6 39
A007900057 4E09-9GS-ALB23 21
A007900058 4E09-35GS-ALB23 25
A007900171 A00790105-9GS-Alb11 40
A007901219 A00790105--9GS-Alb23 23
实施例2:4E09与Alb11或Alb23组合的发酵产率
使用巴斯德毕赤酵母X33作为宿主生物评估A007900171(4E9序列优化的-9GS-Alb11)和A007901219(4E9序列优化的-9GS-Alb23)纳米抗体
Figure BDA0000442823710000208
的表达。评估AOX启动子(MeOH可诱导的启动子)和GAP启动子(组成型诱导启动子)两者。
将复合的、基于蛋白胨的培养基用于发酵过程。对于用使用AOX启动子的X33克隆进行的发酵，将MeOH用于纳米抗体的表达。简言之，将该过程分成三个阶段：分批阶段，甘油补料分批阶段和MeOH诱导阶段。在分批阶段和甘油补料分批阶段中，生物量增加到约40%(湿重/体积)。接着开始MeOH适应和诱导阶段，在此过程中表达纳米抗体
Figure BDA0000442823710000201
并将其分泌到培养基中。
关于用使用GAP启动子的X33克隆的发酵，将葡萄糖用于诱导纳米抗体
Figure BDA0000442823710000202
的表达。该过程也可以分成3个阶段：关于甘油的分批阶段，使用高进料速率将生物量增加到约40%(湿重/体积)的葡萄糖补料分批阶段和以更低进料速率来进一步诱导纳米抗体的表达/分泌的第二葡萄糖补料分批阶段。
使用Sartorius设备(
Figure BDA0000442823710000204
Aplus,
Figure BDA0000442823710000205
Bplus和
Figure BDA0000442823710000206
Bplus双联控制器,2L
Figure BDA0000442823710000207
反应器，通过MFCSwin软件控制)以2L发酵器规模进行所有的发酵。在发酵过程中，监测/操纵下述参数：DO(溶解氧)，pH，起泡，生物量(关于大肠杆菌的OD600和关于巴斯德毕赤酵母的湿细胞重量(WCW))，产物的表达水平和质量。DO典型的是30%并且通过搅拌级联控制，并且根据需要通过加入纯氧进一步补偿。通过pH电极监测pH并通过以碱泵(base pump)进行的氨气添加进行调节。进行离线pH测量来检查在高压灭菌后的pH电极功能。
表2提供了关于使用巴斯德毕赤酵母作为宿主生物表达A007900171和A007901219进行的发酵批次的综述。
图8显示用巴斯德毕赤酵母进行的不同发酵的诱导样品结束时的SDS-Page分析(非还原条件)。]
在表3中，显示了具有它们各自的参数设置，发酵特征，和基于SDS-Page分析的诱导样品结束时的估计的表达产率的不同巴斯德毕赤酵母发酵的综述。
通过小规模的protA澄清化方法随后进行RP-HPLC分析来确定在发酵结束时产生的纳米抗体的滴度和纯度。简言之，样品制备基于protA亲和层析法，从培养基中纯化纳米抗体
Figure BDA0000442823710000211
使用UV分光光度法来测定洗脱级分的蛋白浓度并且随后进行反相高效液相层析法(RP-HPLC)，允许确定产物滴度和产物纯度/异质性。表4总结了RPC结果。
实施例3:A007900171和A007901219的纯化。
根据在表5中显示的方案纯化A007900171和A007901219分子。
表5:纯化步骤综述
Figure BDA0000442823710000251
*仅对于A007901219
实施例4:比较Alb-1,Alb-8(=Alb-11)和Alb-23的性质
测定并且比较Alb-1,Alb-8和Alb-23的各种性质。结果显示于表6中。
此外，关于Alb-8和Alb-23形成二聚体倾向的并行比较，通过Arrhenius曲线计算在PBS缓冲液中在不同的温度关于单价Alb-8(Ea=73.0kcal/mol)和Alb-23(Ea=50.8kcal/mol)的二聚作用动力学。结果显示在表7中，并且显示关于Alb-11，动力学从室温向上开始增加，特别是当与Alb-23比较时。
Figure BDA0000442823710000261
实施例5:与Alb-11相比，包含Alb-23的构建体的贮存稳定性
为了比较分别包含Alb-8和Alb-23的双特异性构建体的贮存稳定性，制备两种双特异性纳米抗体构建体，其包含与Alb-23(IGE045-9GS-ALB23;SEQ ID NO:41)和Alb-11(IGE045-9GS-ALB11;SEQ ID NO:42)连接的针对IgE的相同纳米抗体(IGE045,SEQ ID NO:43)，将其以50mg/ml的浓度配制在D-PBS缓冲液中，并在塑料PCR管中在不同温度避光贮存1个月。随后，使用SE-HPLC测定并且比较前峰(相应于二聚体形成)的量。使用aBioSepSEC-2000柱(Phenomenex)并以流速0.2ml/min的D-PBS作为运行缓冲液，进行SE-HPLC分析。注射10μg物质并使用Chromeleon软件分析数据。结果显示在表8中。
在类似实验中，比较两种三价双特异性构建体的贮存稳定性(在20mMHis缓冲液，pH6.5，8%蔗糖中，浓度为50mg/ml)。构建体是OX40L079(SEQID NO:44)，其是一种三价双特异性纳米抗体构建体(包含Alb-11和针对OX40L(见2010年12月14日提交的Ablynx N.V.的PCT/EP2010/069606的SEQ ID NO:229)和OX40L089(SEQ ID NO:45)的两个纳米抗体)，包含相同的两个针对OX40L的纳米抗体但是以Alb-23取代Alb-11的相应构建体。结果显示在表8A中。
表8A:Alb-23和Alb-11构建体的比较贮存稳定性（在指定的温度贮存指定的贮存时期后在SE-HPLC上的%前峰）
在另一实验中，比较针对c-Met的四种不同纳米抗体构建体(A007901222/SEQ ID NO:46;A007901256/SEQ ID NO:47;A007901259/SEQ ID NO:48和A007901260/SEQ ID NO:49)的发酵产率贮存稳定性。在这些构建体中，A007901222包含Alb-23结合白蛋白的纳米抗体（发明）以及“VHH-1型”抗-c-Met纳米抗体(4E09-也见上述提及的美国申请61/388,172和US61/451,869)，然而其他的构建体（用作比较参照）包含Alb-11结合白蛋白的纳米抗体和非VHH-1型的抗c-Met纳米抗体。关于所用的构建体的更详细的描述，参照由申请人在2012年3月30日提交的共同待审的美国申请13/435,567(Beste等)。
在巴斯德毕赤酵母中产生不同的纳米抗体构建体（也见US13/435,567,US61/388,172和US61/451,869），并提供广泛可比较的发酵产率(1.03g/L;关于A007901256，1.43g/L；关于A007901259，0.91g/L；关于A007901260，1.45g/L)，证实本发明可以提供这样的构建体，其包含VHH-1型纳米抗体，具有与不包含VHH-1型的纳米抗体的构建体的表达产率相当的表达产率。
接着纯化纳米抗体构建体(在SEC上>99%的纯度和在RPC上>90%的纯度)并将其在D-PBS中，以约15mg/ml的浓度，在-70℃,-20℃,5℃,25℃和40℃温育7.5周。通过浊度测量(OD500)，RP-HLPC和SE-HLPC评估样品。将结果总结在表8B中。当贮存在-70℃,-20℃或5℃达7.5周时，关于所有测试的样品的稳定性是可接受的。
表8B:不同抗c-Met纳米抗体构建体的比较贮存稳定性
Figure BDA0000442823710000291
实施例6:使用表面等离振子共振进行亲和性确定
使用在Biacore T100仪器上的表面等离振子共振，进行抗-c-Met纳米抗体-Alb融合构建体A007900171(SEQ ID NO:40)和A007901219(SEQ IDNO:23)关于人、食蟹猴和小鼠血清白蛋白的动力学分析。将HBS-EP+缓冲液(包含0.15M NaCl，3mM EDTA和0.05%表面活性剂p20的0.01M HEPES缓冲液，pH7.4)用作运行缓冲液并且在25℃进行实验。通过5μl/分钟的流速的手动固定操作将血清白蛋白化学偶联在具有羧甲基化的葡聚糖表面的Series S传感器芯片CM5上。将表面首先用75mg/ml EDC和11.5mg/ml NHS的1:1混合物(Biacore胺偶联试剂盒)注射7分钟活化。将血清白蛋白在10mM乙酸盐，pH4.5中以10μg/ml注射，直到达到关于人，食蟹猴和小鼠血清白蛋白的水平分别为970RU(流动池2)，890RU(流动池3)和1360RU(流动池4)。在固定化后，将表面用1M乙醇胺pH8.5注射7分钟进行失活。活化空白参照表面(流动池1)并且如上所述进行失活。在HBS-EP+中制备一系列的纳米抗体浓缩物(即，0nM,1.9nM,7.8nM,31.25nM,125nM,500nM,0nM,7.8nM,125nM)，将其以45μl/min注射2分钟(流路1,2,3,和4)并使其在运行缓冲液中解离10分钟。在不同的样品之间，将表面用再生缓冲液10mM甘氨酸-HCl pH1.5,100s以45μl/min进行再生。通过扣除在参照通道上的曲线和空白运行缓冲液注射曲线来将数据进行双重参照。通过在Biacore T100评估软件中的结合曲线上拟合1:1结合模型来评估处理的曲线。报告结合速率(ka)，解离速率(kd)和亲和性(KD)，并将其显示在表9中。
Figure BDA0000442823710000311
实施例7:在Alphascreen测定法中MET-配体HGF的结合
在HGF/c-MET竞争AlphaScreen测定法中表征抗-c-MET/抗-血清白蛋白纳米抗体构建体，以评估它们的阻断效力和功效并且将其与基准抗体片段(5D5Fab v2)比较。在15分钟时期内，在室温，将从250nM开始到0.9pM系列稀释的抗-c-MET纳米抗体和基准5D5Fab v2用100pM生物素化的hHGF进行预温育。向该混合物中加入抗-人Fc缀合的受体珠和c-MET/Fc(100pM最终浓度)并将其在室温温育2小时。接下来，加入链霉抗生物素蛋白供体珠，并将混合物再温育1小时。通过使用680nm的激发波长和520nm的发射波长在EnVision多标记平板阅读器上阅读平板来测量荧光。
所述两种构建体以剂量-依赖性方式有效地抑制HGF与c-MET受体的结合。计算的IC50值和相应的95%置信度区间显示在表10中。A007900171和两批次的A007901219具有类似的IC50值；它们的95%CI是重叠的，这说明差异在统计学上是不显著的。与基准5D5Fab v2比较，所述纳米抗体显示>5倍改善的效力。
表10:如通过Alphascreen确定的对HGF与cMET结合的抑制(IC50值和95%置信度区间)
ID IC50[以pM] 95%CI[以pM]
5D5Fab v2 380 330-440
A007900171(Alb11) 58 50-66
A007901219(Alb23) 66 57-78
实施例8:在A549癌细胞系中阻断HGF-诱导的MET磷酸化
在HGF-依赖性磷酸化测定法中表征纯化的抗-c-MET/抗-血清白蛋白纳米抗体构建体。在15分钟期间，在37℃将从1μM开始直到0.23nM的系列稀释的抗-cMET构建体或抗-cMET基准5D5Fab v2与1nM HGF在A549细胞上进行共同温育。接着，将1/3的溶解的细胞溶液应用到磷酸c-MET MSD测定板上。将细胞培养物水平上的两份重复样在MSD水平上合并。在将未结合的物质洗去后，用磺基(sulfo)-标记的检测cMET抗体检测磷酸化的以及未磷酸化的受体两者。用sector成像仪2400进行读数。
所述两种抗-c-MET/抗-血清白蛋白纳米抗体构建体以剂量依赖性方式有效地抑制HGF-依赖的c-MET受体磷酸化。将计算的IC50值和相应的95%置信度区间显示在11中。A007900171和两批次的A007901219具有类似的IC50值；它们的95%CI重叠，这说明差异在统计学上是不显著的。与基准5D5Fab v2比较，所述纳米抗体显示约2-倍改善的效力。另外，在95%置信度区间内，将人血清白蛋白加入刺激的细胞中并没有改变测试的纳米抗体的IC50值。
表11:如通过cMET磷酸化测定法确定的对HGF与cMET结合的抑制(IC50值和95%置信度区间)
Figure BDA0000442823710000331
将在本申请通篇中引用的所有参考文献（包括文献参考文献，授权的专利，公开的专利申请和共同待审的专利申请）的完整内容特此清楚地通过引用结合在本文中，特别是关于在本文引用的教导。
Figure IDA0000442823750000011
Figure IDA0000442823750000021
Figure IDA0000442823750000031
Figure IDA0000442823750000041
Figure IDA0000442823750000051
Figure IDA0000442823750000061
Figure IDA0000442823750000071
Figure IDA0000442823750000081
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Figure IDA0000442823750000101
Figure IDA0000442823750000121
Figure IDA0000442823750000131
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Figure IDA0000442823750000171
Figure IDA0000442823750000181
Figure IDA0000442823750000191
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Figure IDA0000442823750000361

Claims (13)

1.多肽、蛋白、构建体、化合物或其他化学实体，其包括直接或任选地通过一个或多个适合的接头或间隔臂彼此适当连接的氨基酸序列Alb-23(SEQ ID NO:1)或Alb-23的变体和一个或多个（如一个或两个）其他氨基酸序列、结合结构域、结合单元或其他结构部分或化学实体，或基本由直接或任选地通过一个或多个适合的接头或间隔臂彼此适当连接的氨基酸序列Alb-23(SEQ ID NO:1)或Alb-23的变体和一个或多个（如一个或两个）其他氨基酸序列、结合结构域、结合单元或其他结构部分或化学实体组成。
2.根据权利要求1所述的多肽、蛋白、构建体、化合物或其他化学实体，其中所述Alb-23的变体包括：
(i)在位置44和45上的氨基酸基序GP；
(ii)在位置74-76上的氨基酸基序SKN；
(iii)氨基酸序列为SFGMS(SEQ ID NO:29)的CDR1；
(iv)氨基酸序列为SISGSGSDTLYADSVKG(SEQ ID NO:30)的CDR2；
(v)氨基酸序列为GGSLSR(SEQ ID NO:31)的CDR3；
并且其优选地还包括
(vi)在位置16上的G；和/或(vii)在位置83上的R（优选地在位置16上是G并且在位置83上是R）；
并且相对于在SEQ ID NO:1中给出的序列，还包括1-7个如1-5个其他的氨基酸差异。
3.根据权利要求1所述的多肽、蛋白、构建体、化合物或其他化学实体，其包括直接或任选地通过一个或多个适合的接头或间隔臂彼此适当连接的氨基酸序列Alb-23(SEQ ID NO:1)和一个或多个（如一个或两个）其他氨基酸序列、(结合)结构域、结合单元或其他结构部分或化学实体，或基本由直接或任选地通过一个或多个适合的接头或间隔臂彼此适当连接的氨基酸序列Alb-23(SEQ ID NO:1)和一个或多个（如一个或两个）其他氨基酸序列、(结合)结构域、结合单元或其他结构部分或化学实体组成。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的多肽、蛋白、构建体、化合物或其他化学实体，其中所述一个或多个(如一个或两个)其他氨基酸序列、(结合)结构域、结合单元或其他结构部分或化学实体是一个或多个(如一个或两个)治疗用氨基酸序列、(结合)结构域、结合单元、结构部分或实体。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的多肽、蛋白或构建体，其中所述一个或多个其他氨基酸序列、(结合)结构域、结合单元或其他结构部分或化学实体是一个或多个(如一个或两个)免疫球蛋白单可变结构域。
6.根据权利要求5所述的多肽、蛋白或构建体，其中所述一个或多个其他氨基酸序列、(结合)结构域、结合单元或其他结构部分或化学实体是一个或多个(如一个或两个)纳米抗体。
7.根据权利要求5或6所述的多肽、蛋白或构建体，其中至少一个（和至多全部）的免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体包含至少两个二硫键。
8.根据权利要求6或7所述的多肽、蛋白或构建体，其中至少一个（和至多全部）的纳米抗体是I类VHH纳米抗体。
9.根据权利要求5-8中任一项所述的多肽、蛋白或构建体，其中至少一个（和至多全部）的免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体是针对c-met。
10.根据权利要求9所述的多肽、蛋白或构建体，其中至少一个（和至多全部）针对c-met的免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体包含两个二硫键。
11.根据权利要求9或10所述的多肽、蛋白或构建体，其中针对c-met的所述免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体是4E09(SEQ ID NO12)或4E09的变体。
12.根据权利要求9-11中任一项所述的多肽、蛋白或构建体，其中针对c-met的所述免疫球蛋白单可变结构域或纳米抗体是A00790105(SEQID NO:19)。
13.根据权利要求11任一项所述的多肽、蛋白或构建体，其为A00790105-9GS-Alb23(SEQ ID NO:23)或与SEQ ID NO:23具有至少80%、如至少85%、例如至少90%、如至少95%或更高序列同一性的多肽。
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