CN102781962B - 双互补位A-β结合多肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及双互补位A-β结合多肽，更具体地涉及包含至少两个结合于A-β的不同抗原表位的免疫球蛋白单一可变域的双互补位A-β结合多肽。本发明还涉及所述多肽的具体序列、其制备方法及其使用方法，包括治疗例如阿尔茨海默氏病的疾病的方法。

Description

双互补位A-β结合多肽
技术领域
本发明涉及新的β-淀粉样肽(以下为：“A-β”)结合多肽，所述多肽包含特定免疫球蛋白域。本发明还涉及编码所述多肽的核酸；制备所述多肽的方法；表达或能够表达所述多肽的宿主细胞；包含所述多肽的组合物；及所述多肽或所述组合物尤其用于预防性、治疗性及诊断性目的用途。
发明背景
若干种退行性神经疾病由蛋白质的不当折叠或加工引起或由朊病毒引起，两者皆会导致侵入性神经沉积，称为淀粉样斑。最广为人知的退行性神经疾病为阿尔茨海默氏病(AD)。
AD的发病率证明迫切且未满足的医学需求：所有65至85岁的人中10%至40%会出现AD。此外，此部分的人数持续指数增长。因此，从人道以及社会与经济角度出发，急需找到有效诊断及治疗此破坏性病症的方法。关于治疗，药物不仅需要减缓或停止疾病进展，而且亦需要使在AD初期(在诊断之前)已出现的脑损伤恢复。此时，早期诊断与疗法治疗皆无效。
AD定义为与大脑中存在主要由淀粉样肽构成的细胞外淀粉样斑及主要由蛋白τ构成的细胞内神经原纤维缠结(NFT)同时发生的痴呆。
作为AD特征的淀粉样斑的主要组分为β-淀粉样肽(A-β)，其为长39-43个氨基酸(aa)且高度倾向于采用β折叠结构、寡聚并形成蛋白聚集体的高度不溶性肽。A-β由A-β前体蛋白(APP)通过两个溶解蛋白事件产生。A-β分泌酶活性使APP在A-β的氨基酸Met-671与Asp-672(使用APP的770aa同工型的编号)之间的N端(“β位点”)裂解。β位点的裂解产生99aa的膜相关APP片段(C99)。C99的跨膜域中的第二位点(“γ位点”)可接着由γ-分泌酶裂解，释放A-β。或者APP可在其A-β区中，主要在APP的α-分泌酶裂解位点裂解，产生83aa的C端APP片段(C 83)，其亦可进一步由γ-分泌酶裂解，产生小的可溶性分泌肽p3。此路径减少A-β的潜在积累。
细胞内及细胞外A-β采用β折叠构象且形成称为ADDL(淀粉样蛋白衍生的可扩散配体)的中间物及原纤维，最后以淀粉样原纤维的形式沉淀，所述淀粉样原纤维组装成淀粉样斑。在这些过程中，推测疏水性较大的A-β(1-42)肽(参考下文)充当所述斑块不断生长所环绕的成核剂。
APP的许多错义突变与早发型家族性AD的形式有关。所有这些突变均在APP的一个经典裂解位点处或附近。因此，瑞典双突变(Swedish doublemutation)(K670N/M671L)紧邻β-分泌酶裂解位点且提高β-分泌酶活性的效率，从而产生更多的总A-β。在γ-分泌酶裂解位点附近的APP残基717处的三个突变中的任一者可使A-β的更促淀粉样的42aa形式(亦称为A-β(1-42))相对于更常见40aa形式A-β(1-40)的比例增加。
已描述APP的另外两个突变，其靠近但不邻接α位点。佛兰德斯(Flemish)家族突变(A692G，A-β残基21)和荷兰(Dutch)家族突变(E693Q，A-β残基22)各与家族性AD的不同形式有关。具体而言，佛兰德斯突变呈现为重复脑内出血的综合征或AD型痴呆。神经病理学发现包括皮质及海马区中的老年斑，及通常大脑微血管壁中的多个淀粉样沉积物。
若干年前，已显示膜相关天冬氨酰基蛋白酶BACE(亦称为曼普辛(memapsin)或Asp2)呈现对β-分泌酶所期望的性质。此酶以类似效率使APP在其β位点处及A-β区的Tyr-10与Glu-11之间裂解。已在AD的淀粉样斑中及经APP转染的HEK293人胚肾细胞的培养基中观察到在后者的位点处裂解的A-β折叠段。若干小组亦观察到数据库中存在另一天冬氨酰基蛋白酶BACE2(亦称为Asp1)，其为BACE(现亦称为BACE1)的相近同源物。BACE2使APP在其β位点处裂解，及更有效地在APP的A-β区中A-β的Phe-19及Phe-20后的位点处裂解。这些内部A-β位点相邻于残基21的佛兰德斯APP突变，且此突变显著增加由BACE2产生的β位点裂解产物的比例。增加(瑞典突变)或抑制(M671V)β-分泌酶活性的APP保守性β位点突变类似地影响BACE1及BACE2活性。类似于BACE1，BACE2在酸性pH值下最大限度地分解APP。
APP基因或早老素1(presenilin 1，PS1)基因(带有“γ-分泌酶”活性)的突变引起早发型家族性AD。APP突变的实施例为分别位于β及γ分泌酶裂解位点附近的上述“瑞典”及“伦敦(London)”(717)突变。这些突变增加A-β肽及尤其是A-β(1-42)的形成，由此增加淀粉样聚集体及斑块的形成。然而，最初的斑块被认为是发展AD的主要触发物，但当前研究却强调原纤维及ADDL作为主要毒性组分的作用。甚至可想象斑块为实际上使神经毒性肽无生物活性的机理。
关于神经退化性疾病及A-β在其中的作用的其他信息可得自Wisniewski和Konietzko(2008)，Lancet Neurol 7(9)，805-811，Spires-Jones等人(2009)，Neurobiology of Disease，213-220，以及Lichlen和Mohajeri(2008)，Journal ofNeurochem.104.859-874。
当前大部分AD治疗旨在使用例如多奈哌齐(donepezil)加兰他敏(galantamine)及利伐斯的明(rivastigmine)的注册用于治疗轻度至中度AD的乙酰胆碱酯酶抑制剂使乙酰胆碱缺乏。在美国和加拿大，多奈哌齐亦获批准用于重度阿尔茨海默型痴呆(Dementia Alzheimer'stype，DAT)。乙酰胆碱缺乏反映基底前脑的胆碱能神经元退化且似乎与该疾病的神经精神病学表现非常有关。用乙酰胆碱酯酶抑制剂治疗具有一定有益作用(对认知及全面功能的临床测量具有稳定且显著但适中的功效)，但无法治愈或停止疾病进展，因为未治疗到神经退化的病因。
美金刚(Memantine)(Merz Pharmaceuticals)为一种NMDA受体拮抗剂，其在患中度至重度阿尔茨海默氏病的AD患者中在临床领域认知、日常生活活力及整体临床反应方面的结果均优于安慰剂。美金刚仍然仅为批准用于中度至重度阿尔茨海默氏病的对症治疗。其既不治愈亦不停止疾病进展。已显示美金刚与乙酰胆碱酯酶抑制剂的组合在中重度至重度DAT而非轻度至中度疾病阶段中具有优良功效。
一些当前实验性治疗策略集中于A-β上，将其作为靶标。存在三个主要研究路线：
a)开发称为β折叠裂解剂的小分子(常常为肽模拟物)，其经设计以干扰淀粉样肽聚集体的β折叠结构。已证明稳定“β折叠裂解剂”在给予AD的转基因小鼠模型时能够穿透血脑屏障且减少斑块数目(Permanne等人(2002)，FASEB J.16，860-862)。有待证明此方法是否会引起认知保护和/或恢复。
b)开发抑制APP经溶解蛋白加工成淀粉样肽的小分子。β或γ分泌酶的抑制剂应有效地阻断A-β的形成且因此保护大脑免受淀粉样蛋白的神经毒性作用。未预期对已存在的脑A-β负荷(例如已积累多年的淀粉样斑)的作用。
c)针对A-β的被动及主动疫苗接种。此研究路线以如下Schenk等人(1999)，Nature 400，173-177的观察结果开始：用A-β(1-42)对转基因AD小鼠进行疫苗接种可预防淀粉样斑形成。在第一实验中，青壮年小鼠(6周龄)的每月疫苗接种基本上可预防大脑中斑块形成及伴随的发炎反应，亦即不存在淀粉样斑、星状细胞增生及小胶质细胞增生。在已形成淀粉样斑时的较晚年龄开始疫苗接种可部分地清除。随后，证明用A-β进行疫苗接种可改善行为及记忆缺失，如在水迷宫记忆测试中所测量。在用整个A-β进行疫苗接种具有副作用的情况下，已设计替代性较短肽且用于接种转基因小鼠。临床试验表明，用A-β进行主动免疫具有治疗活性，如通过引起斑块清除、减弱斑块相关病状、降低τ含量及减缓患者认知下降所证明。然而，大量患者发展自体免疫脑膜脑炎，主要由自体反应性T淋巴细胞对主动免疫作出反应而浸润至脑中所引起(Ferrer等人(2004)，Brain Pathol.14，11-20；Nicoll等人(2003)，Nat.Med.9，448-452；Masliah等人(2005)，Neurology 64，1553-1562)。
作为主动免疫方法的替代方法，可向患者给予针对A-β的抗体。所述被动免疫方法显示成功地降低转基因AD小鼠的脑A-β负荷(DeMattos等人(2001)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98，8850-8855)。潜在机制仍在推测中，因为认为抗体不太可能会穿过血脑屏障且靶向于脑中存在的斑块。因此，作者提出，抗体在自脑中滴定A-β的血浆中形成“A-β沉陷”。随后，使用凝胶溶素及神经节苷脂1，证明任何A-β结合配体均具有降低转基因AD小鼠中的淀粉样蛋白负荷而不穿过血脑屏障的潜力(Matsuoka等人(2003)J.Neuroscience 23，29-33)。短期(24小时)被动免疫似乎可恢复转基因AD小鼠的认知缺乏，甚至不会影响总脑淀粉样蛋白负荷(Dodart等人(2002)NatureNeuroscience 5，452-457)。此结果表明，一些抗体首先靶向于A-β的较小但仍可溶的聚集体，且亦表明这些聚集体为A-β的最毒形式。因此，清除原纤维A-β可恢复记忆，至少在转基因APP小鼠中。
同时人源化抗A-β单克隆抗体巴匹珠单抗(bapineuzumab)(称为“3D6”的抗A-β小鼠抗体的类似物)已进入临床试验。然而，自II期试验报导的第一数据显示混杂的结果：仅在ApoE4非携带者中观察到对若干功效终点的统计显著作用。此外，巴匹珠单抗在ApoE4非携带者中耐受性良好且安全，而在ApoE4携带者中，相较于安慰剂组，在经巴匹珠单抗处理的患者中更常观察到严重不良事件。此外，已观察到血管性水肿事件。亦已公开了在转基因APP小鼠中临床前诱发大脑微出血。
怀疑用于抗A-β被动免疫中的常规抗体(含有FC部分)为在人及动物模型中所观察到的血管性水肿或微出血的诱因，其与靶向于大脑血管A-β沉积物(大脑淀粉样血管病变)并通过ADCC和/或CDC导致微出血相关(Wilcock，DM，Colton，CA，CNS Neurol.Disord.Drug Targets(2009)第8卷(1)：50-64)。
最后，认为如由Biacore所测量的此抗体约2.5nM的结合亲和力过低而无法诱发有效“外周沉陷作用”。
另一抗A-β抗体索拉珠单抗(solanezumab)(人源化抗体m266：LY-2062430)亦已进入临床测试。可达成的最大斑块负荷降低公布为约60%。另外，此抗体的特异性限于可溶性A-β，以使聚集体或斑块的结合不可预期。
第三种抗A-β抗体普恩珠单抗(ponezumab)(PF4360365)仅结合于A-β(X-40)分子且不结合于A-β(X-42)分子，后者被认为是病原性(更大)的A-β类型。其亲和力甚至低于巴匹珠单抗的亲和力，且由于其能够结合于血管中的A-β斑块以及保留其Fc部分的ADCC/CDC活性，故仍无法消除大脑微出血的风险。
总而言之，上文说明，即使通过(经典)抗体达成的A-β结合及清除似乎是开发供治疗例如AD的治疗剂的吸引人的作用模式，但尚未完全阐明的所述免疫球蛋白的其他特征及作用(例如其结合于A-β的某些形式的性质的药理学关系)亦使得比最初假设的情况更难以发现并开发安全且有效的治疗抗体。
对A-β具有特异性的抗体片段(例如免疫球蛋白单一可变域抗体或VHH域(如下文所定义))亦描述于本领域中：WO 2004/44204；WO 2006/40153；WO 2007/35092；WO 2008/122441；及WO 2009/04494。由本发明者根据以上WO公开案所合成的VHH的结合特征并不令人满意，因此其并不允许进入临床开发。
WO 09/149185公开所谓DVD构建体，及尤其具有A-β结合特异性的DVD构建体。在所述DVD构建体中组合两种不同抗A-β可变域后，维持亲本抗体的结合，但未观察到此组合使亲和力增加。此外，所公开的DVD构建体含有存在于“经典”抗体中的Fc部分，以致无法避免由例如补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的Fc效应子功能所引起的副作用(参考上文)。
AD的明确诊断仍需要对脑进行死后病理学检查以证明存在淀粉样斑、神经原纤维缠结、突触丧失及神经元退化。此为与Alois Alzheimer (1906)所定义基本上相同的程序。1984年，美国国家神经病症、沟通障碍及中风研究所及阿尔茨海默氏病与相关病症协会(National Institute of Neurological andCommunicative Disorders and Stroke and the Alzheimer's Disease and RelatedDisorders Association，NINCDS-ADRDA)建立关于AD诊断的正式标准(综述于Petrella等人(2003)，Radiology 226，315-336中)。符合所有以下标准的患者诊断为可能发生AD：由检查及测试(例如简易心智测试(Mini-Mental Test)、布雷氏痴呆量表(Blessed Dementia Scale)或类似测试)证明痴呆，记忆及至少一种其他认知功能受损，意识正常，在40岁与90岁之间发作，不存在引起痴呆的其他疾病征兆(排除标准)。无可鉴别病因的逐渐进行性认知障碍将诊断为可能发生AD，可能发生的AD进一步定义为轻度(早期)、中度(中期)或重度(晚期)痴呆。使用实验室分析客观地确定或排除痴呆的替代性病因。对脑脊髓液(CSF)中的A-β(1-42)及磷酸化τ的ELISA检测结合对ApoE4(素因性遗传因子)的基因型分析似乎具有敏感性及特异性。然而，由于进行侵入性CSF穿刺，故所述方法并不广泛适用，从而阻碍此成为常规筛检。对神经丝蛋白(AD7C-NTP)的ELISA(由NymoX开发)证明在AD患者的尿中的含量高于非AD痴呆患者或健康对照者。然而，在早期AD病例中，平均含量显著较低，表明该测试对于测试AD的早期发作而言并不可靠。
至今尚无生物化学方法适合于AD早期的可靠诊断，相反，所述方法仅有助于证实晚期病例的临床诊断。显然，需要更先进技术以在指示不可逆脑损伤的临床症状发作前进行早期诊断。
最后，不仅出于诊断性目的，而且在例如临床前研究及开发中，A-β结合分子均适用作研究工具。广泛使用上文已提及的抗体，亦即抗体3D6及抗体m266。抗体3D6以相对低亲和力结合于A-β且因此可能不适于所有目的。抗体m266与A-β的N端截短形式(例如p3)交叉反应，此使得例如A-β(1-40)及A-β(1-42)的疾病相关的A-β类型与例如p3的其他分子无法区分。
鉴于上文，本发明的一个目的在于提供可用于预防、治疗、减轻和/或诊断与A-β相关和/或由A-β介导的疾病、障碍或病症(例如AD)的药理学活性剂，以及包含所述活性剂的组合物，提供预防、治疗、减轻和/或诊断所述疾病、障碍或病症的方法，包括使用和/或给药所述药剂及组合物。所述药剂亦可用于研究一般AD领域及具体而言阐明AD疾病机制及潜在的治疗性和/或预防性机制。
具体而言，本发明的一个目的在于提供所述药理学活性剂、组合物和/或方法，其与当前所用和/或本领域中已知的药剂、组合物和/或方法相比提供某些优点。这些优点包括改良治疗性质和/或药理学性质和/或其他有利性质(例如改良制备容易性和/或降低物品成本)，尤其与以上部分中所述的针对A-β或其片段的常规抗体相比。其他优点将自以下进一步描述而变得清楚。
更具体而言，本发明的一个目的在于提供新的A-β结合分子及具体而言结合于哺乳动物及尤其人A-β的多肽，其中所述分子或多肽适于以上诊断性、治疗性及研究目的。
发明内容
根据本发明的第一方面，提供包含特异性结合于A-β的第一抗原表位的第一免疫球蛋白单一可变域和特异性结合于A-β的第二抗原表位的第二免疫球蛋白单一可变域的多肽，其中A-β的该第一抗原表位及该第二抗原表位不为相同抗原表位，亦即为不同的抗原表位，例如一方面为N端抗原表位(SEQID NO:3)且另一方面为中心抗原表位(SEQ ID NO:4)。
优选地，该第一免疫球蛋白单一可变域和该第二免疫球蛋白单一可变域各基本上由四个框架区(分别为FR1至FR4)和三个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中该第一免疫球蛋白单一可变域和该第二免疫球蛋白单一可变域由接头肽共价连接，其中该接头肽任选包含第三免疫球蛋白域(例如第三免疫球蛋白单一可变域)或由其组成。
此外，该第一免疫球蛋白单一可变域和该第二免疫球蛋白单一可变域优选为抗体域，更优选为VHH域，且甚至更优选为人源化VHH域。
本发明的该多肽中所包含的免疫球蛋白单一可变域通常将分别具有结构FR(1)1-CDR(1)1-FR(1)2-CDR(1)2-FR(1)3-CDR(1)3-FR(1)4和FR(2)1-CDR(2)1-FR(2)2-CDR(2)2-FR(2)3-CDR(2)3-FR(2)4。优选地，CDR(1)3选自：
-SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:16的氨基酸序列；及
-分别与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:16的所述氨基酸序列相比有至多三个、优选至多两个且更优选一个氨基酸不同的氨基酸序列；且
CDR(2)3选自：
-SEQ ID NO:19的氨基酸序列；及
-与SEQ ID NO:19的该氨基酸序列相比有至多三个、优选至多两个且更优选一个氨基酸不同的氨基酸序列。
或者，CDR(1)3选自：
-SEQ ID NO:19的氨基酸序列；及
-与SEQ ID NO:19的该氨基酸序列相比有至多三个、优选至多两个且更优选一个氨基酸不同的氨基酸序列；且
CDR(2)3选自：
-SEQ ID NO:13及SEQ ID NO:16的氨基酸序列；及
-分别与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:16的所述氨基酸序列相比有至多三个、优选至多两个且更优选一个氨基酸不同的氨基酸序列。
本发明尤其适用的多肽将包括以下CDR序列(编号如以上段落中所指示)：
-CDR(1)1：SEQ ID NO:11
-CDR(1)2：SEQ ID NO:12
-CDR(1)3：SEQ ID NO:13
-CDR(2)1：SEQ ID NO:17
-CDR(2)2：SEQ ID NO:18
-CDR(2)3：SEQ ID NO:19
或：
-CDR(1)1：SEQ ID NO:14
-CDR(1)2：SEQ ID NO:15
-CDR(1)3：SEQ ID NO:16
-CDR(2)1：SEQ ID NO:17
-CDR(2)2：SEQ ID NO:18
-CDR(2)3：SEQ ID NO:19
或：
-CDR(1)1：SEQ ID NO:17
-CDR(1)2：SEQ ID NO:18
-CDR(1)3：SEQ ID NO:19
-CDR(2)1：SEQ ID NO:11
-CDR(2)2：SEQ ID NO:12
-CDR(2)3：SEQ ID NO:13
或：
-CDR(1)1：SEQ ID NO:17
-CDR(1)2：SEQ ID NO:18
-CDR(1)3：SEQ ID NO:19
-CDR(2)1：SEQ ID NO:14
-CDR(2)2：SEQ ID NO:15
-CDR(2)3：SEQ ID NO:16。
根据本发明的一个具体实施方案，本发明的多肽包含VHH域ABII035(SEQ ID NO:44)作为第一免疫球蛋白单一可变域及VHH域ABII059(SEQ IDNO:45)作为第二免疫球蛋白单一可变域，或反之亦然。
在一个尤其优选实施方案中，本发明的该多肽还包含半衰期延长部分，其优选共价连接于该多肽，例如白蛋白结合部分(例如抗白蛋白免疫球蛋白域)、转铁蛋白结合部分(例如抗转铁蛋白免疫球蛋白域)、聚乙二醇分子、重组聚乙二醇分子、人血清白蛋白、人血清白蛋白片段和白蛋白结合肽。
本发明的特别具体的实施方案为具有如以下中所示的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO:26至31(Fc融合多肽)；SEQ ID NO:32(HSA融合多肽)：SEQID NO:34至39及145至152(白蛋白结合免疫球蛋白单一可变域融合多肽)；及SEQ ID NO:40至43、142及143(聚乙二醇化多肽)。
本发明的多肽优选以其一个免疫球蛋白单一可变域结合于由SEQ IDNO:3定义的A-β抗原表位(N端抗原表位)，且以另一免疫球蛋白单一可变域结合于由SEQ ID NO:4定义的A-β抗原表位(中心抗原表位)。甚至更优选地，本发明的所述多肽至少与人A-β肽(SEQ ID NO:1)的氨基酸1(天冬氨酸)、3(谷氨酸)、19(苯丙氨酸)、20(苯丙氨酸)和23(天冬氨酸)形成接触。如在TR-FRET结合测试(使用ABII002=SEQ ID NO:62及ABII050=SEQ ID NO:100作为竞争者；参考实施例9.3)中所测量的IC50值优选在10-9摩尔/升或小于10-9摩尔/升的范围内，且更优选在5×10-9摩尔/升至10-12摩尔/升的范围内。
根据另一方面，本发明涉及包含免疫球蛋白单一可变域或由其组成的多肽，该免疫球蛋白单一可变域基本上由四个框架区(分别为FR1至FR4)和三个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成，其中所述CDR序列定义如下：
-CDR1：SEQ ID NO:11
-CDR2：SEQ ID NO:12
-CDR3：SEQ ID NO:13
或：
-CDR1：SEQ ID NO:14
-CDR2：SEQ ID NO:15
-CDR3：SEQ ID NO:16
或
-CDR1：SEQ ID NO:17
-CDR2：SEQ ID NO:18
-CDR3：SEQ ID NO:19，
及涉及包含具有选自SEQ ID NO:47至111的氨基酸序列的VHH域或由其组成的多肽。这些多肽为适用于构建本发明的第一方面的双互补位A-β结合多肽的构建模块或中间物。
根据其他方面，本发明涉及核酸分子、表达载体、宿主细胞及用于制备本发明多肽的制备方法。可使用呈分离形式的编码本发明多肽的核酸分子来构建各别表达载体，接着可将表达载体转染至用于在生物药学上制备本发明多肽的宿主细胞中。该制备方法通常包括以下步骤：在允许表达该多肽的条件下培养该宿主细胞，回收该多肽及根据本领域中已知的方法将其纯化。
本发明的多肽尤其适用于诊断、预防、治疗和/或减轻如下文详细阐述的疾病、病症及病状及尤其是治疗阿尔茨海默氏病(AD)的方法中。因此，根据此方面，本发明的多肽将以药物组合物形式使用，亦即用作治疗、减轻或预防优选人的疾病、障碍或病症的药剂，该疾病、障碍或病症选自：神经变性疾病或病症、阿尔茨海默氏病、阿尔茨海默型痴呆、大脑淀粉样血管病变(CAA)、21-三体(唐氏综合征)、成人唐氏综合征、伴有荷兰型淀粉样变性的遗传性脑出血(HCHWA-D)、路易体痴呆(dementia with Lewy Bodies)、额颞叶退化、青光眼、肌萎缩侧索硬化、偶发性包涵体肌炎(sporadic inclusion bodymyositis)及老年人焦虑症，或将用于诊断该疾病、障碍或病症。
除上述外，本发明的多肽特别适用于治疗干性AMD(年龄相关黄斑变性)及青光眼。“干”性AMD亦称为“中间地图状萎缩”，其是由感觉神经性视网膜下的视网膜色素上皮层萎缩引起，通过眼睛中心部分中的感光器(视杆及视锥)损失而引起视力损失。目前尚无医学或外科治疗可用于此病状。迄今为止可用的疗法(例如由美国国家眼科研究所(National Eye Institute)提出)包括使用含高剂量抗氧化剂、叶黄素及玉米黄素的维生素补充剂，其可减缓干性黄斑变性的进展。青光眼为眼内流体压力增加，从而引起视神经的不可逆损伤及视力损失的疾病。在实验性青光眼中A-β与细胞凋亡视网膜神经节细胞共定位且以剂量及时间依赖性方式诱发显著的视网膜神经节细胞凋亡。
出于治疗性目的，本发明的多肽或包含所述多肽的药物组合物可通过例如非经肠(尤其静脉内或皮下)或玻璃体内(尤其对于治疗干性AMD或青光眼而言)注射来给药至有此需要的人。
本发明的其他方面、实施方案及应用将自以下进一步描述及随附权利要求而变得清楚。
出乎意料地，尽管已深入研究A-β结合单克隆抗体且尽管已可得到对A-β具有高亲和力的高度特异性抗体，但本发明者继续提供一组具有改良特征的A-β结合分子，其与例如抗体3D6及m266相比具有甚至更佳的IC50值(参考例如表XVI)，其人源化对应物目前测试用于人治疗性用途。
另外，尽管可证明本领域中已知的抗A-β抗体实际上能够降低过度产生A-β的转基因小鼠的淀粉样斑负荷(已公布通过给予单克隆抗体m266或其人源化对应物所达成的最大斑块负荷降低为约60%)，但例如抗体m266缺乏淀粉样斑结合。因此，在抗A-β分子直接结合于淀粉样聚集体中存在的A-β产生额外益处的情形下，可预期该常规抗体的潜力较小。相比之下，本发明者能够产生结合于淀粉样斑且因此预期通过促进实体解离来减少或移除血管淀粉样蛋白而不增加风险或诱发微出血的A-β结合分子。因为血管淀粉样蛋白与AD的严重程度相关，所以本发明多肽的此优点可证明尤其适用于治疗晚期或重度AD，亦即可预期其尤其适用于治疗具有积累多年的高脑淀粉样斑负荷的患者。
因此，总而言之，本发明的A-β结合多肽的较高亲和力及其独特的斑块结合能力提供与本领域中所述的常规抗A-β抗体相比出乎意料的优势。
目前临床试验中的另一抗体普恩珠单抗对A-β(X-40)具有特异性且不结合于AD的主要病原性类型A-β(X-42)，因此预期A-β(X-40):A-β(X-42)平衡向有毒的A-β类型(X-42)的方向移动。相比之下，本发明者继续提供通过结合于至少两个不同抗原表位而能够捕捉A-β(X-40)及A-β(X-42)以中和两个类型的毒效应的A-β结合分子。
与一般常规抗体相比，本发明的多肽可更容易、更快且更廉价地制备，具有更高稳定性及低抗原性，且由于其尺寸及结构小而可适于比注射或输注方便的给药途径。更具体而言，与需要昂贵哺乳动物细胞培养设施的常规抗体制备相比，通过在适宜重组宿主有机体(例如大肠杆菌及酵母)中发酵来产生本发明的多肽更节省成本。此外，可达成的表达量高，且本发明多肽的产率在1g/l至10g/l的范围(大肠杆菌)及多达10g/l(酵母)及以上。本发明的多肽的可溶性更大，这意味着其可以比常规抗体高的浓度储存和/或给药。其在室温为稳定的，这意味着其可在不使用冷冻设备下进行制备、储存和/或运输，从而节省成本、时间且环保。本发明的多肽在极端pH值下亦呈现长时间稳定性，这意味着其将适于通过口服给药来递送。
此外，本发明的多肽无需包含存在于“经典”抗体中的Fc部分，从而避免了由例如补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的Fc效应子功能所引起的副作用。当用于抗A-β被动免疫时，怀疑常规抗体(具有Fc部分)为诱发在人及动物模型中所观察到的微出血的原因，其与靶向于大脑血管A-β沉积物(大脑淀粉样血管病变)并通过ADCC和/或CDC导致微出血相关(Wilcock，DM，Colton，CA，CNS Neurol.Disord.Drug Targets(2009)第8卷(1)：50-64)。
因此，总而言之，本发明的多肽组合了常规抗体的有利特征(例如高特异性及高选择性)与如上文所概述的优点，且与常规A-β结合抗体相比，具有令人吃惊的改良的亲和力及特异性特性。
与本领域中已知的结合A-β的VHH域(例如WO 2006/040153、WO2007/35092及WO 2004/44204中所述的VHH)相比，本发明的多肽显示在结合于单体A-β以及结合于聚集A-β方面显著改良的结合特性(参考例如以下实施例3.2及6)。此外，与例如WO 2008/122441或Habicht等人(2007)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA；104(49)：19232-19237中所述的仅结合于聚集淀粉样斑的VHH域相比，本发明的多肽结合于单体A-β以及淀粉样斑。
此外，本发明的A-β结合多肽的VHH域同等有效地结合于人及啮齿动物A-β，如例如实施例7及图2中所示。与单VHH域相比，本发明的双互补位多肽的结合甚至使对人以及啮齿动物A-β的亲和力增加至少103倍。因此，本发明的多肽为用于疾病相关A-β形式(例如A-β(1-40)及A-β(1-42))的理想的跨物种检测工具，从而允许临床前及科学研究使用动物模型，尤其是啮齿动物模型。其优于以显著较低亲和力结合于A-β且仅与啮齿动物A-β微弱交叉反应的抗体3D6。与同样良好地识别啮齿动物及人A-β，但与A-β的N端截短形式(例如p3)交叉反应，以致不适用于依靠对疾病相关A-β类型(例如A-β(1-40)及A-β(1-42))的特异性检测的某些测试或检测的m266抗体相比，亦存在优势。
最后，当组合检测两个不同A-β抗原表位的两个VHH时，本发明的双互补位抗A-βVHH构建体使亲和力增加1000倍以上，此与WO 09/149185中所公开的构建体形成鲜明对比。
当然，与本领域中已知的其他A-β结合分子相比，本发明的多肽基于其亲和力(敏感性)、特异性(关于抗原表位以及类型)及其如上文所概述的其他特征亦适用于诊断性目的。
附图说明
图1显示在APP转基因小鼠(n=3)中在腹膜内给药ABII320、ABII322、3D6-IgG和m266-IgG后血浆中的游离/未结合A-β(1-40)的减少，如注射后2小时所检测。图示：第一柱(未填充框)：载体(PBS)；第二柱：ABII320(132nmol/kg)；第三柱：ABII322(132nmol/kg)；第四柱：IgG3D6(132nmol/kg)；第五柱：IgG m266(66.6nmol/kg)；计算每一结合位点(每一IgG分子2个结合位点)的IgG浓度。
图2显示双互补位抗A-βVHH构建体(包括VHH域ABII035和ABII059)与人及啮齿动物(小鼠)A-β的结合。
发明详述
定义
本发明的以上及其他方面及实施方案将自本文中的进一步描述而变得清楚：
a)除非另有指示或定义，否则所有所用术语均具有本领域中的通常含义，该含义将为本领域技术人员所了解。参考例如标准手册，如Sambrook等人，“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”(第2版)，第1-3卷，Cold SpringHarbor Laboratory Press(1989)；Lewin，“Genes IV”，Oxford University Press，New York，(1990)；及Roitt等人，“Immunology”(第2版)，Gower MedicalPublishing，London，New York(1989)，以及本文中引用的一般现有技术；此外，除非另有说明，否则未具体详述的所有方法、步骤、技术及操作均可以且已经以本身已知的方式进行，该方式将为本领域技术人员所了解。亦参考例如标准手册、上述一般现有技术及其中引用的其他参考文献。
b)除非另有说明，否则术语“免疫球蛋白”及“免疫球蛋白序列”在本文中无论是指重链抗体还是指常规4链抗体，均用作一般术语以包括全长抗体、其单个的链、以及其所有部分、域或片段(包括但不限于抗原结合域或片段，分别例如VHH域或VH/VL域)。此外，本文所用的术语“序列”(例如在“免疫球蛋白序列”、“抗体序列”、“(单一)可变域序列”、“VHH序列”或“蛋白序列”等的术语中)一般应理解为既包括相关氨基酸序列，以及编码所述序列的核酸序列或核苷酸序列，除非上下文需要更限定的解释。
c)如本文所用的术语(多肽或蛋白的)“域”是指折叠蛋白结构，其能够独立于蛋白的其余部分而保持其三级结构。一般而言，域负责蛋白的单个的功能性质，且在许多情况下可添加、移除或转移至其他蛋白而不损失蛋白的其余部分和/或域的功能。
d)如本文所用的术语“免疫球蛋白域”是指抗体链(例如常规4链抗体的链或重链抗体的链)的球形区域，或是指基本上由这类球形区域组成的多肽。免疫球蛋白域的特征在于其维持抗体分子的免疫球蛋白折叠特征，其由排列在两个β折叠中任选由保守二硫键稳定的约7个反平行β折叠股的2层夹层(sandwich)组成。
e)如本文所用的术语“免疫球蛋白可变域”是指基本上由本领域及下文中分别称为“框架区1”或“FR1”、“框架区2”或“FR2”、“框架区3”或“FR3”和“框架区4”或“FR4”的四个“框架区”组成的免疫球蛋白域；所述框架区由本领域及下文中分别称为“互补决定区1”或“CDR1”、“互补决定区2”或“CDR2”和“互补决定区3”或“CDR3”的三个“互补决定区”或“CDR”中断。因此，免疫球蛋白可变域的一般结构或序列可如下表示为：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。免疫球蛋白可变域正是因具有抗原结合位点而赋予抗体对抗原的特异性。
f)如本文所用的术语“免疫球蛋白单一可变域”是指能够在不与其他可变免疫球蛋白域配对的情况下特异性结合抗原的表位的免疫球蛋白可变域。本发明含义中的免疫球蛋白单一可变域的一个实例为“域抗体”，例如免疫球蛋白单一可变域VH及VL(VH域和VL域)。免疫球蛋白单一可变域的另一实例为如下文定义的骆驼科的“VHH域”(或简称为“VHH”)。
鉴于以上定义，常规4链抗体(例如本领域中已知的IgG、IgM、IgA、IgD或IgE分子)或源自所述常规4链抗体的Fab片段、F(ab′)2片段、Fv片段(例如二硫键连接的Fv或scFv片段)、或双特异抗体(均为本领域中已知)的抗原结合域，通常不视为免疫球蛋白单一可变域，这是因为在该情况下，与抗原的各别表位发生结合通常并非通过一个(单一)免疫球蛋白域，而是通过共同结合各别抗原的表位的一对(缔合)免疫球蛋白域(例如轻链和重链可变域)，即通过免疫球蛋白域的VH-VL对。
f1)“VHH域”，亦称为VHHs、VHH域、VHH抗体片段和VHH抗体，已最初描述为“重链抗体”(即“缺乏轻链的抗体”)的抗原结合免疫球蛋白(可变)域(Hamers-Casterman C，Atarhouch T，Muyldermans S，Robinson G，HamersC，Songa EB，Bendahman N，Hamers R.:“Naturally occurring antibodies devoidof light chains”；Nature 363，446-448(1993))。已经选择术语“VHH域”以将这些可变域与存在于常规4链抗体中的重链可变域(其在本文中称为“VH域”或“VH域”)以及存在于常规4链抗体中的轻链可变域(其在本文中称为“VL域”或“VL域”)进行区分。VHH域特异性结合表位而没有无其他抗原结合域(此与常规4链抗体中的VH或VL域相反，在该情况下表位由VL域与VH域一起识别)。VHH域为由单一免疫球蛋白域形成的小型稳定且高效的抗原识别单元。
在本发明的上下文中，术语VHH域、VHH、VHH域、VHH抗体片段、VHH抗体以及及域”(“Nanobody”为Ablynx N.V.公司，Ghent，Belgium的商标)可互换使用且表示免疫球蛋白单一可变域(具有FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4结构且无需第二免疫球蛋白可变域的存在即可特异性结合表位)，且其由例如WO 2009/109635图1中定义的所谓“印记残基(hallmark residue)”与VH域区分。
如例如Riechmann和Muyldermans，J.Immunol.Methods 231，25-38(1999)的图2中所示，对于骆驼科的VHH域所应用的VHH域的氨基酸残基，根据Kabat等人给出的VH域的一般编号法来编号(“Sequence of proteins ofimmunological interest”，US Public Health Services，NIH Bethesda，MD，公开案第91号)。根据该编号法，
-FR1包含在位置1-30处的氨基酸残基，
-CDR1包含在位置31-35处的氨基酸残基，
-FR2包含在位置36-49处的氨基酸，
-CDR2包含在位置50-65处的氨基酸残基，
-FR3包含在位置66-94处的氨基酸残基，
-CDR3包含在位置95-102处的氨基酸残基，且
-FR4包含在位置103-113处的氨基酸残基。
然而应注意，如本领域中对于VH域及VHH域所公知的，各CDR中的氨基酸残基的总数可能不同，且可能不对应于由Kabat编号指示的氨基酸残基的总数(即根据Kabat编号的一个或多个位置可能在实际序列中未被占据，或实际序列可能含有多于Kabat编号所允许数目的氨基酸残基)。这意味着一般而言，根据Kabat的编号可能对应或可能不对应于实际序列中氨基酸残基的实际编号。
对VH域的氨基酸残基进行编号的替代方法(该方法还可以以类似方式应用于VHH域)在本领域中是已知的。然而，除非另有说明，否则在本说明书、权利要求书及附图中，将遵循如上所述根据Kabat且应用于VHH域的编号。
VHH域中的氨基酸残基的总数将通常在110至120范围内，常常介于112与115之间。然而应注意较小及较长序列也可适于本文所述的目的。
VHH域及含有其的多肽的其他结构特征及功能性质可概括如下：
VHH域(其本性上设计成在不存在轻链可变域及与轻链可变域不存在相互作用的情况下在功能上结合于抗原)可充当相对较小的单功能性抗原结合结构单元、域或多肽。此将所述VHH域与常规4链抗体的VH及VL域区别开，所述VH及VL域自身一般不适合作为单抗原结合蛋白或免疫球蛋白单一可变域用于实际应用，而需要以某一形式或另一形式组合来提供功能性抗原结合单元(例如在Fab片段等的常规抗体片段中；由VH域共价连接于VL域组成的scFv中)。
由于具有这些独特性质，所以单独使用或作为较大多肽的一部分而使用的VHH域可提供许多明显优于使用常规VH和VL域、scFv或常规抗体片段(例如Fab或F(ab')2片段)的优点：
-仅需要单域以高亲和力及高选择性结合抗原，因此不需要存在两个各别域，亦不需要确保此两个域以正确的空间构象及构型存在(亦即通过使用特别设计的接头，如同scFV一样)；
-VHH域可由单一基因表达且不需要转译后折叠或修饰：
-VHH域可易于经工程改造为多价及多特异性形式(如本文进一步讨论)；
-VHH域高度可溶且不倾向于聚集(如同Ward等人，Nature 341:544-546(1989)所述的源自小鼠的抗原结合域一样)；
-VHH域对热、pH值、蛋白酶及其他变性剂或条件高度稳定，因此可在不使用冷冻设备下进行制备、储存或运输，从而节省成本、时间且环保；
-VHH域的制备容易且相对廉价，甚至在生产所需规模上也如此。举例而言，VHH域及含有其的多肽可使用微生物发酵(例如如下文进一步所述)来产生且不需要如同例如常规抗体片段一样，使用哺乳动物表达系统：
-与常规4链抗体及其抗原结合片段相比，VHH域相对较小(约15kDa，或为常规IgG的1/10)，因此
-显示对组织的(较)高渗透率，且
-可以以高于所述常规4链抗体及其抗原结合片段的剂量给药；
-VHH域可显示所谓空腔结合性质(尤其是因为其与常规VH域相比，具有伸长的CDR3环)，因此亦可接近常规4链抗体及其抗原结合片段不易接近的靶标及抗原表位。
获得结合具体抗原或表位的VHH域的方法，先前已公开于例如WO2006/040153及WO 2006/122786中。亦如其中所详述，源自骆驼科的VHH域可通过以人常规4链抗体VH域中相应位置处存在的一个或多个氨基酸残基置换原始VHH序列的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基而经“人源化”。人源化VHH域可含有一个或多个完全人框架区序列，且在甚至更具体的实施方案中，可含有源自DP-29、DP-47、DP-51或其部分，任选与JH序列(例如JH5)合并的人框架区序列。
f2)域抗体，亦称为“Dab”、“域抗体”及“dAb”(术语“域抗体(DomainAntibodies)”及“dAb”被GlaxoSmithKline公司集团用作商标)，已公开于例如以下文献中：Ward，E.S.,等人:“Binding activities of a repertoire of singleimmunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli”；Nature 341:544-546(1989)；Holt，L.J.等人:“Domain antibodies:proteins for therapy”；TRENDS in Biotechnology 21(11):484-490(2003)；及WO 2003/002609。
域抗体基本上对应于非骆驼科哺乳动物的抗体(特别是人4链抗体)的VH或VL域。为了以单一抗原结合域的形式(即在不与VL域或VH域分别配对的情况下)结合表位，需要例如通过使用人单一VH或VL域序列的文库对这些抗原结合性质进行具体选择。
类似于VHH，域抗体的分子量为约13kDa至约16kDa，且若源自完全人序列，则不需要进行人源化以供例如人治疗使用。在VHH域的情况下，域抗体在原核表达系统中也很好地得以表达，从而显著降低总制造成本。
可通过将一个或多个变化引入一个或多个CDR的氨基酸序列中，使域抗体以及VHH域进行亲和力成熟，所述变化导致与各别亲本分子相比，所得免疫球蛋白单一可变域对其各别抗原的亲和力获得改良。本发明的亲和力成熟的免疫球蛋白单一可变域分子可通过本领域中已知的方法制备，例如以下文献所述：Marks等人，1992，Biotechnology 10：779-783，或Barbas等人，1994，Proc.Nat.Acad.Sci，USA 91:3809-3813.；Shier等人，1995，Gene 169：147-155；Yelton等人，1995，Immunol.155：1994-2004；Jackson等人，1995，J.Immunol.154(7)：3310-9；及Hawkins等人，1992，J.MoI.Biol.226(3)：889-896；KS Johnson及RE Hawkins，“Affinity maturation of antibodies usingphage display”，Oxford University Press 1996。
f3)此外，本领域技术人员还将了解，有可能将一个或多个上述CDR“移植”于其他“支架”(包括但不限于人支架或非免疫球蛋白支架)上。适于所述CDR移植的支架及技术在本领域中是已知的。
g)可互换使用的术语“抗原表位”及“抗原决定簇”是指大分子(例如多肽)的一部分，其由抗原结合分子(例如常规抗体或本发明的多肽)识别，且更具体地由所述分子的抗原结合位点识别。表位定义免疫球蛋白的最小结合位点，因此表示免疫球蛋白的特异性的靶点。
抗原-结合分子(例如常规抗体或本发明的多肽)识别抗原表位的部分称为互补位。
h)如本文中所使用，术语“双互补位(biparatopic)”(抗原)结合分子或“双互补位”多肽是指包含如本文所定义的第一免疫球蛋白单一可变域和第二免疫球蛋白单一可变域的多肽，其中此两个可变域能够结合于一个抗原的两个不同抗原表位，所述抗原表位通常不会同时结合于一个单特异性免疫球蛋白(例如常规抗体)或一个免疫球蛋白单一可变域。本发明的双互补位多肽由具有不同抗原表位特异性的可变域构成，且不含有结合于同一抗原表位的互补可变域对。因此，其并不彼此竞争结合于A-β。
i)可“结合”或“特异性结合”某一表位、抗原或蛋白(或其至少一部分、片段或表位)、对其“具有亲和性”和/或“具有特异性”的多肽(例如免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单一可变域、本发明的多肽，或一般的抗原结合分子或其片段)是指“对抗”或“针对”该表位、抗原或蛋白，或为关于该表位、抗原或蛋白的“结合”分子。
k)一般而言，术语“特异性”是指具体抗原-结合分子或抗原-结合蛋白(例如免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单一可变域或本发明的多肽)可结合的不同类型抗原或表位的数目。可基于抗原结合蛋白的亲和性和/或亲抗原性(avidity)确定其特异性。由抗原与抗原结合蛋白的解离平衡常数(KD)所表示的亲和性，是表位与抗原-结合蛋白上抗原-结合位点之间结合强度的量度：KD值越小，表位与抗原-结合分子之间的结合强度越强(或者，亲和性也可表示为亲和性常数(KA)，其为1/KD)。如本领域技术人员将了解(例如基于本文其他公开的内容)，取决于具体感兴趣的抗原，可以以以本身已知方式测定亲和性。亲抗原性为抗原结合分子(例如免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单一可变域或本发明的多肽)与相关抗原之间结合强度的量度。亲抗原性与以下两者有关：与其抗原结合分子上的抗原结合位点之间的亲和性，以及存在于抗原结合分子上的相关结合位点的数目。
通常，抗原结合蛋白(例如本发明的多肽)将以如例如于实施例9.7所述的KinExA分析中测量的10E-5至10E-14摩尔/升(M)或10E-14摩尔/升以下、且优选10E-7至10E-14摩尔/升(M)或10E-14摩尔/升以下、更优选10E-8至10E-14摩尔/升、且甚至更优选10E-11至10E-13的解离常数(KD)，和/或以至少10E7ME-1、优选至少10E8ME-1、更优选至少10E9ME-1，例如至少10E11ME-1的缔合常数(KA)结合。任何大于10E-4M的KD值一般都视为指示非特异性结合。优选地，本发明的多肽将以小于500nM、优选小于200nM、更优选小于10nM，例如小于500pM的KD结合所需的抗原。抗原-结合蛋白对抗原或表位的特异性结合可以以本身已知的任何适合方式来测定，包括例如本文所述的分析、斯卡查德分析(Scatchard analysis)和/或竞争性结合分析(例如放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA)及夹心式竞争性分析(sandwichcompetition assay))及本领域中本身已知的其不同变化形式。
l)氨基酸残基将根据如本领域中公知且达成一致的标准三字母或一字母氨基酸码加以指示。在比较两个氨基酸序列时，术语“氨基酸差异”是指相比于第二序列，在参考序列某一位置处指定数目氨基酸残基的插入、缺失或取代。在取代的情况下，所述取代将优选为保守氨基酸取代，所述保守氨基酸是指氨基酸残基被化学结构类似的另一氨基酸残基置换，且其对多肽的功能、活性或其他生物性质影响较小或基本上无影响。这些保守氨基酸取代在本领域中是公知的，例如根据WO 98/49185，其中保守氨基酸取代优选是以下群组(i)-(v)内的一个氨基酸被同一群组内的另一氨基酸残基所取代：(i)较小脂族非极性或弱极性残基：Ala、Ser、Thr、Pro及Gly；(ii)极性带负电残基及其(不带电)酰胺：Asp、Asn、Glu及Gln；(iii)极性带正电残基：His、Arg及Lys；(iv)较大脂族非极性残基：Met、Leu、Ile、Val及Cys；及(v)芳族残基：Phe、Tyr及Trp。特别优选的保守氨基酸取代如下：
Ala被Gly或Ser取代；
Arg被Lys取代；
Asn被Gln或His取代；
Asp被Glu取代；
Cys被Ser取代；
Gln被Asn取代；
Glu被Asp取代；
Gly被Ala或Pro取代；
His被Asn或Gln取代；
Ile被Leu或Val取代；
Leu被Ile或Val取代；
Lys被Arg、Gln或Glu取代；
Met被Leu、Tyr或Ile取代；
Phe被Met、Leu或Tyr取代；
Ser被Thr取代；
Thr被Ser取代；
Trp被Tyr取代；
Tyr被Trp或Phe取代；
Val被Ile或Leu取代。
m)例如相比于其天然生物来源和/或获得该核酸或多肽分子的反应介质或培养基，在其已与至少一种在该来源或介质(培养基)中其通常与之相关的其他组分分离时，核酸或多肽分子视为“(呈)基本上分离(的形式)”(所述其他组分例如另一核酸、另一蛋白/多肽、另一生物组分或大分子或至少一种污染物、杂质或微量组分)。特别地，核酸或多肽分子在其已纯化至少2倍、特别是至少10倍、更特别是至少100倍且多达1000倍或1000倍以上时被视为“基本上被分离”。经适合的技术(例如适合色谱技术，如聚丙烯酰胺凝胶电泳)确定，“呈基本上被分离的形式”的核酸或多肽分子优选基本上为均质的。
n)例如两个免疫球蛋白单一可变域序列之间的“序列一致度”指示这两个序列之间相同氨基酸的百分比。其可如WO 08/020079第49及50页段落f)中所述加以计算或测定。“序列相似度”指示相同或表达保守氨基酸取代的氨基酸的百分比。
靶标特异性
本发明的多肽对A-β具有特异性的原因在于其包含特异性结合于一个或多个A-β分子且更确切而言结合于A-β分子中的抗原表位的免疫球蛋白单一可变域。A-β例如在人体内可采用不同形式且以不同形式存在，例如单体形式、寡聚及多聚形式、可溶性及不溶性聚集形式、原纤维形式、初原纤维(proto-fibrillar)形式、存在于中枢神经系统、骨骼肌、血小板、血管系统、胰脏、肾、脾、心脏、肝、睾丸、主动脉、肺、肠道、皮肤、肾上腺、唾液及甲状腺中的淀粉样斑及沉积物形式(Roher等人，Alzheimer's&Dementia 5(2009)第18-29页)。本发明的多肽结合于A-β可存在的任一形式且尤其结合于自生物学和/或治疗性角度来看最相关的形式，这也在本发明的范围内。
本发明的多肽可结合于不同长度的A-β肽分子，例如由如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的A-β(1-42)、由如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的氨基酸1至40组成的A-β(1-40)、A-β(1-39)(氨基酸1至39)、A-β(1-38)(氨基酸1至38)、A-β(1-37)(氨基酸1至37)等。本发明的多肽的结合可在N端、C端或其间某处进行。
而且，本发明在A-β的物种形式方面并无限制。因此，若欲用于治疗性目的，则本发明的多肽可优选结合于人A-β(SEQ ID NO:1)。然而，结合于例如其他温血动物或优选哺乳动物形式的A-β的多肽亦在本发明的范围内。结合于A-β的一个物种形式的本发明多肽可与来自一个或多个其他物种的A-β交叉反应。举例而言，结合于人A-β的本发明多肽可能显示或不显示与来自灵长类动物的一个或多个其他物种的A-β的交叉反应性，和/或与来自常用于动物疾病模型(例如小鼠(参考SEQ ID NO:2)、大鼠、兔、猪或狗)且尤其用于与A-β相关的疾病及病症的动物模型(例如本文所提及的物种及动物模型)中的动物的一个或多个物种的A-β的交叉反应性。自研究和/或药物开发角度来看，显示该交叉反应性的本发明多肽可具有优点，因为其允许本发明的多肽结合于在重要疾病模型(例如小鼠或大鼠)中进行测试的人A-β。
而且，本发明不限于本发明多肽所针对的A-β的特异性抗原决定基、抗原表位、部分、域、亚单元或确证(适当时)。本发明多肽所针对的A-β的一些优选抗原表位为用于免疫疗法及尤其用于AD的被动免疫疗法的抗原表位。举例而言，如Weksler M.，Immunity and Ageing 1，2(2004)及其中所提及的背景技术中所提及，已知A-β上存在三种主要抗原表位，亦即N端抗原表位(A-β的氨基酸1-16：DAEFRHDSGYEVHHQK；SEQ ID NO:3)、中心抗原表位(氨基酸16-28：KLVFFAEDVGSNK；SEQ ID NO:4)及C端抗原表位(氨基酸28-42：KGAIIGLMVGGVVIA；SEQ ID NO:5)。本发明的多肽可针对这些抗原表位中的任一者。包含至少两个免疫球蛋白单一可变域的本发明多肽尤其优选，其中一个免疫球蛋白单一可变域结合于N端抗原表位且第二个免疫球蛋白单一可变域结合于中心抗原表位。
本发明的多肽
在最广泛意义上，本发明提供用于预防、治疗、减轻和/或诊断A-β相关疾病、障碍或病症及尤其AD的新的药学活性剂。本发明的药剂属于一类新的A-β结合分子，亦即包含在不同抗原表位结合于抗原A-β的两个或两个以上免疫球蛋白单一可变域的双互补位多肽。更具体而言，本发明的所述多肽基本上由以下组成或包含以下：(i)特异性结合于A-β的第一抗原表位的第一免疫球蛋白单一可变域和(ii)特异性结合于A-β的第二抗原表位的第二免疫球蛋白单一可变域，其中A-β的第一抗原表位与A-β的第二抗原表位为不相同的抗原表位。换言之，本发明的所述多肽包含针对A-β中存在的至少两个不同抗原表位的两个或两个以上免疫球蛋白单一可变域或基本上由其组成，其中所述免疫球蛋白单一可变域以使其能够同时结合A-β的方式彼此连接。在此意义上，本发明的多肽亦可视为“多价”免疫球蛋白构建体，且尤其视为“多价免疫球蛋白单一可变域构建体”，因为整个多肽包括至少两个A-β结合位点。
本发明的多肽包括(至少)两个抗A-β免疫球蛋白单一可变域，其中(所述)两个免疫球蛋白单一可变域针对A-β分子中的不同抗原表位。因此，此两个免疫球蛋白单一可变域将具有不同抗原表位特异性且因此具有不同CDR序列。为此，本发明的多肽在本文中亦分别称为“双互补位多肽”或“双互补位域抗体构建体”(若免疫球蛋白单一可变域由域抗体组成或基本上由其组成)，或“双互补位纳米抗体构建体”或“双互补位VHH域构建体”，或“双互补位VHH构建体”(若免疫球蛋白单一可变域由纳米抗体或VHH域组成或基本上由其组成)，这是因为两个免疫球蛋白单一可变域将包括两个不同互补位。
根据本发明的一个具体实施方案，在本发明的多肽包括两个以上抗A-β免疫球蛋白单一可变域，亦即三个、四个或甚至四个以上抗A-β免疫球蛋白单一可变域的情况下，至少两个抗A-β免疫球蛋白单一可变域针对A-β分子中的不同抗原表位，其中任何其他免疫球蛋白单一可变域可结合于此两个不同抗原表位的任一者和/或A-β分子中存在的另一抗原表位。
根据本发明的另一个具体实施方案，除上述两个抗A-β免疫球蛋白单一可变域外，本发明的多肽可包括任何其他额外部分，例如接头(如下文更详细描述)和/或额外蛋白质域，例如另一免疫球蛋白单一可变域(如下文更详细描述)，只要其与A-β的结合不会受该额外部分阻碍即可。本发明的多肽可另外含有例如糖基残基、经修饰的氨基酸侧链等的修饰。
如前文所述，一个本发明多肽中的两个免疫球蛋白单一可变域将结合于A-β的不同抗原表位。此可通过以下方式中的一者达成：两个免疫球蛋白单一可变域将结合同一个A-β分子中的两个抗原表位(分子内结合)；或者，其可结合位于两个不同A-β分子中的抗原表位，亦即一个免疫球蛋白单一可变域将结合于一个A-β分子上的一个抗原表位，而另一免疫球蛋白单一可变域将结合于另一A-β分子上的另一抗原表位，由此交联两个A-β分子(分子间结合)。
根据一个优选实施方案，本发明的多肽将结合同一个A-β分子中的两个抗原表位，以便不发生交联，且本发明的多肽与A-β复合物将形成1:1的化学计量。因此，与(主要)分子间结合相比，(主要)分子内结合为优选，应了解，仍可存在少部分的分子间结合。可使用Biacore或尺寸排阻色谱检测(如Santora等人，Anal.Biochem.，299:119-129所述)(参考下文实施例8.2)区别分子内结合与分子间结合。然而，应注意，通过各别A-β分子的分子间结合起作用的多肽亦在本发明的范围内。
在本发明的另一个优选实施方案中，本发明的多肽中所包含的第一和第二抗A-β免疫球蛋白单一可变域各基本上由4个框架区(分别为FR1至FR4)及3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成。在本发明的多肽内，该第一免疫球蛋白单一可变域和该第二免疫球蛋白单一可变域共价连接，任选通过如下文所述的接头肽共价连接，其中该接头在空间上允许至少两个免疫球蛋白单一可变域与各别A-β抗原表位最佳结合。
本领域技术人员应清楚，对于人医药用途，本发明的多肽优选针对人A-β，而对于兽医目的，本发明的多肽优选针对来自待治疗物种的A-β。
本领域技术人员亦应清楚，当用作人治疗剂时，本发明的多肽中所包含的免疫球蛋白单一可变域优选为人源化免疫球蛋白单一可变域。
根据本发明，两个或两个以上免疫球蛋白单一可变域可彼此独立地为：域抗体，亦即如上文所述的VL或VH抗体域，和/或如上文所述的VHH域，和/或任何其他类别的免疫球蛋白单一可变域，其限制条件为这些免疫球蛋白单一可变域与抗原(亦即A-β)的结合并非通过形成共同结合于同一抗原表位的互补可变域对(如在例如常规抗体的VL-VH域对的情况下)，而是通过独立地结合于不同抗原表位(亦即作为如上义所定义的“双互补位”抗原结合分子)。
根据本发明的一个优选实施方案，第一和第二免疫球蛋白单一可变域基本上由如上文所述的域抗体序列或VHH域序列组成。根据一个尤其优选实施方案，第一和第二免疫球蛋白单一可变域基本上由VHH域序列组成。因此，在本文中及尤其在实验部分中，将参考包含结合于A-β的两个不同抗原表位的两个(任选人源化)抗A-βVHH域序列(VHH)的双互补位多肽(亦即双互补位VHH域构建体)，更详细地描述本发明。然而，本领域技术人员应清楚，本文中的教导可类似地应用于包括其他抗A-β免疫球蛋白单一可变域(例如域抗体)的多肽。
本发明的多肽不仅具有常规抗体的有利特征，例如低毒性及高选择性，而且其亦呈现其他性质。其可溶性更大，这意味着其可以以比常规抗体高的浓度储存和/或给药。其在室温为稳定的，这意味着其可在不使用冷冻设备下进行制备、储存和/或运输，从而节省成本、时间且环保。本发明的多肽在极端pH值下亦呈现长时间稳定性，这意味着其将适于通过口服给药来递送。
此外，本发明的多肽无需包含存在于“经典”抗体中的Fc部分，以便避免由例如补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的Fc效应子功能所引起的副作用。当用于抗A-β被动免疫时，怀疑常规抗体(其具有Fc部分)为诱发在人及动物模型中所观察到的微出血的原因，其与靶向于大脑血管A-β沉积物(大脑淀粉样血管病变)并通过ADCC和/或CDC导致微出血相关(Wilcock，DM，Colton，CA，CNS Neurol.Disord.Drug Targets(2009)，第8卷(1):50-64)。
根据本发明的另一个实施方案，本发明的多肽中存在的至少两个免疫球蛋白单一可变域可直接(亦即不使用接头)或通过接头彼此连接。该接头优选为接头肽，且根据本发明将经选择以允许至少两个不同免疫球蛋白单一可变域各结合于A-β(同一个A-β分子中或两个不同分子中)的至少两个不同抗原表位。
适合的接头将尤其取决于抗原表位之间的距离，且具体而言取决于免疫球蛋白单一可变域所结合的A-β上的抗原表位之间的距离，且基于本文的公开内容，任选在进行一定有限程度的常规实验后，应为本领域技术人员所清楚。
而且，当结合于A-β的两个或两个以上免疫球蛋白单一可变域为域抗体或VHH域时，其亦可通过第三域抗体或VHH域彼此连接(其中该两个或两个以上免疫球蛋白单一可变域可直接或通过适合的接头连接于该第三域抗体或VHH域)。此类第三域抗体或VHH域可例如为使半衰期延长的域抗体或VHH域，如本文进一步所述。举例而言，后者的域抗体或VHH域可为能够结合于(人)血清蛋白(例如(人)血清白蛋白或(人)转铁蛋白)的域抗体或VHH域，如本文进一步所述。
或者，结合于A-β的两个或两个以上免疫球蛋白单一可变域可串联连接(直接或通过适合的接头)，且第三(单)域抗体或VHH域(其可使半衰期延长，如上文所述)可直接或通过接头连接于此两个或两个以上上述免疫球蛋白序列。
适合的接头在本文中结合本发明的具体多肽描述且可例如(但不限于)包含氨基酸序列，该氨基酸序列的长度优选为9个或9个以上氨基酸，更优选为至少17个氨基酸，例如约20至40个氨基酸。然而，上限并不重要，而是为方便例如所述多肽的生物医药生产起见进行选择。
接头序列可为天然存在的序列或非天然存在的序列。若用于治疗性目的，则接头优选在给药本发明的抗A-β多肽的受试者体内无免疫原性。
一组适用的接头序列为源自如WO 96/34103和WO 94/04678中所述的重链抗体的铰链区的接头。
其他实施例为聚丙氨酸接头序列，例如Ala-Ala-Ala。
接头序列的其他优选实施例为具有不同长度的Gly/Ser接头，例如(glyxsery)z接头，包括(gly4ser)3、(gly4ser)4、(gly4ser)、(gly3ser)、gly3及(gly3Ser2)3。
若本发明的多肽通过连接聚合物(例如聚乙二醇(PEG)部分)来修饰，则接头序列优选包括例如半胱氨酸或赖氨酸的氨基酸残基，以允许连接区中的该修饰(例如聚乙二醇化)。所述接头的优选实施例为：
GGGGCGGGS(“GS9，C5”，SEQ ID NO：6)
GGGGCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(“GS25，C5，SEQ ID NO：7)
GGGSGGGGSGGGGCGGGGSGGGGSGGG  (″GS27，C14″，SEQ ID NO：8)，
GGGGSGGGGSGGGGCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(″GS35，C15″，SEQID NO：9)，和
GGGGCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(“GS35，C5”，SEQ IDNO：10)。
包括所述接头的本发明的聚乙二醇化多肽的一些非限制性实施例如SEQID NO 40至43、142及143所示。
此外，接头亦可为聚(乙二醇)部分，如例如WO 04/081026中所示。
在另一个实施方案中，本发明多肽的至少两个免疫球蛋白单一可变域通过另一部分(任选通过一或两个接头)彼此连接，该另一部分例如另一多肽，在一优选但非限制性实施方案中，其可为如上文已描述的另一免疫球蛋白单一可变域。该部分可基本上无活性或可具有例如改良多肽的所需性质的生物作用或可赋予多肽一种或多种其他所需性质。举例而言(但不限于)，该部分可改良蛋白质或多肽的半衰期，和/或可降低其免疫原性或改良任何其他所需性质。
所述构建体的一些非限制性实施例为SEQ ID NO:34至39的构建体。
根据一个优选实施方案，本发明的多肽包含结合于如SEQ ID NO:3所定义的抗原表位的第一免疫球蛋白单一可变域，及结合于如SEQ ID NO:4所定义的抗原表位的第二免疫球蛋白单一可变域，或结合于如SEQ ID NO:4所定义的抗原表位的第一免疫球蛋白单一可变域，及结合于如SEQ ID NO:3所定义的抗原表位的第二免疫球蛋白单一可变域。
甚至更优选地，如实施例8.2及8.3中所述，使免疫球蛋白单一可变域与A-β分子接触，亦即本发明的多肽至少与人或小鼠A-β肽的氨基酸1、3、13、20及23形成接触。
优选地，如实施例9.7中所述的KinExA检测中所测量，本发明多肽的解离常数(KD)值在10-6摩尔/升或小于10-6摩尔/升、更优选10-9摩尔/升或小于10-9摩尔/升的范围内，且甚至更优选在10-11至10-13摩尔/升的范围内，或如实施例9.3中所述的TR-FRET结合测试中所测量，IC50值为10-9摩尔/升或10-9摩尔/升以下，且优选在5×10-10摩尔/升至10-12摩尔/升的范围内。
根据本发明的一个甚至更优选实施方案，本发明多肽中的CDR序列如下文所定义且亦使得本发明的多肽以如以上段落中所述的解离常数(KD)结合于A-β或具有如上文所述的IC50值。
根据本发明的一个具体实施方案，本发明的多肽包含具有以下结构的两个A-β结合免疫球蛋白单一可变域(SEQ ID NO在下表I中给出)：
免疫球蛋白单一可变域1：
FR(1)1-CDR(1)1-FR(1)2-CDR(1)2-FR(1)3-CDR(1)3-FR(1)4，
免疫球蛋白单一可变域2：
FR(2)1-CDR(2)1-FR(2)2-CDR(2)2-FR(2)3-CDR(2)3-FR(2)4，
其中：
CDR(1)3选自：
-SEQ ID NO:13及SEQ ID NO:16的氨基酸序列；及
-分别与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:16的所述氨基酸序列相比有至多三个、优选至多两个且更优选一个氨基酸不同的氨基酸序列：
且
CDR(2)3选自；
-SEQ ID NO:19的氨基酸序列；及
-与SEQ ID NO:19的该氨基酸序列相比有至多三个、优选至多两个且更优选一个氨基酸不同的氨基酸序列；
且
其中其他CDR序列及框架区序列不受特别限制，但将由本领域技术人员根据具体需要来选择，例如在多肽欲用于人用途的情况下使用人源化框架区以降低本发明多肽的免疫原性。免疫球蛋白单一可变域1及2的顺序不受特别限制，因此在本发明的多肽中，免疫球蛋白单一可变域1可位于N端且免疫球蛋白单一可变域2可位于C端，或反之亦然。
优选地，CDR(1)3选自SEQ ID NO:13及SEQ ID NO:16的氨基酸序列，且CDR(2)3为SEQ ID NO:19的氨基酸序列。
甚至更优选地，本发明的多肽包含具有以下结构的两个A-β结合免疫球蛋白单一可变域(SEQ ID NO在下表I中给出)：
免疫球蛋白单一可变域1：
FR(1)1-CDR(1)1-FR(1)2-CDR(1)2-FR(1)3-CDR(1)3-FR(1)4，
免疫球蛋白单一可变域2：
FR(2)1-CDR(2)1-FR(2)2-CDR(2)2-FR(2)3-CDR(2)3-FR(2)4，
其中：
CDR(1)1为SEQ ID NO:11的氨基酸序列(其与SEQ ID NO:14的氨基酸序列相同)；
CDR(1)2选自SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:15的氨基酸序列；
CDR(1)3选自SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:16的氨基酸序列；
CDR(2)1为SEQ ID NO:17的氨基酸序列；
CDR(2)2为SEQ ID NO:18的氨基酸序列；且
CDR(2)3为SEQ ID NO:19的氨基酸序列；
且
其中框架区序列不受特别限制，但将由本领域技术人员根据具体需要来选择，例如在多肽欲用于人用途的情况下使用人源化框架区以降低本发明多肽的免疫原性。
在如上文所述的本发明多肽中，多肽中如上文所述的免疫球蛋白单一可变域1及2的具体顺序并不重要，因此上述免疫球蛋白单一可变域1可位于多肽的N端，随后为上述免疫球蛋白单一可变域2；或者，上述免疫球蛋白单一可变域2可位于多肽的N端，随后为上述免疫球蛋白单一可变域1。在两种情况下，其他序列及部分可存在于本发明的多肽中，例如存在于N端、C端或位于两个免疫球蛋白单一可变域之间，如本文更详细陈述。
存在于本发明的多肽中且上文所概述的以上CDR序列及6CDR序列组分别概括于下表I及II中：
表I及表II：包含两个不同A-β结合免疫球蛋白单一可变域的本发明多肽中的优选CDR组合
表I：CDR序列
 SEQ ID NO：   氨基酸序列
 11   TDTMG
 12   AVTWNSGRTNYADSVKG
 13   HRLVVGGTSVGDWRY
 14   TDTMG
 15   AVTWNSGRINYADSVKG
 16   HRFVVGGNRVEDWRY
 17   NYNMG
 18   AVSRSGVSTYYADSVKG
 19   AYRGTAINVRRSYSS
表II：优选CDR序列组/CDR组合(由其SEQ ID NO:定义的序列在上表I中给出)：
  组1   组2   组3   组4
  CDR(1)1   11   14   17   17
  CDR(1)2   12   15   18   18
  CDR(1)3   13   16   19   19
  CDR(2)1   17   17   11   14
  CDR(2)2   18   18   12   15
  CDR(2)3   19   19   13   16
亦可用作如上文所述的免疫球蛋白单一可变域的框架区序列的人免疫球蛋白框架区序列(FR)为本领域所知。本领域中亦已知使源自非人物种的免疫球蛋白单一可变域的框架区人源化的方法。
在一个优选实施方案中，本发明的多肽包含以下框架区氨基酸序列1至4(FR1至FR4；SEQ ID NO如下表III中所指示)：
FR1为或包含选自SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21的氨基酸序列的氨基酸序列；
FR2为或包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；
FR3为或包含选自SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24的氨基酸序列的氨基酸序列；且
FR4为或包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。
表III：FR氨基酸序列
具有如上文所示的FR及CDR序列的免疫球蛋白单一可变域的具体实施例为：
免疫球蛋白单一可变域1(第一氨基酸，亦即谷氨酸，可任选丢失)：
evqllesggglvqpggslrlscvhsgptfrtdtmgwfrqapgkgrefvaavtwnsgrinyadsvkgrftisrdnskntaylqmnslrpedtavyycaahrfvvggnrvedwrywgqgtlvtvss(ABII035；SEQ ID NO：44)
免疫球蛋白单一可变域2(第一氨基酸，亦即谷氨酸，可任选丢失)：
evqllesggglvqpggslrlscaasgrtfnnynmgwfrqapgkgrefvaavsrsgvstyyadsvkgrftisrdnskntvylqmnslrpedtavyycaaayrgtainvrrsysswgqgtlvtvss(ABII059；SEQ ID NO：45)
下文进一步给出在一个单多肽链中包括两个如上文所示的免疫球蛋白单一可变域及任选存在的连接两个免疫球蛋白单一可变域的接头的本发明多肽的具体实施例。
根据一个优选的实施方案，尤其在用作治疗剂时，本发明多肽包括延长本发明的多肽在患者血清或其他体液中的半衰期的部分。术语“半衰期”指(经修饰)多肽的血清浓度例如由于天然机制所致的多肽降解和/或清除和/或螯合而在体内降低50%所花费的时间。
更具体地，该半衰期延长部分可共价连接至或融合所述多肽且可为(但不限于)Fc部分、白蛋白部分、白蛋白片段部分、白蛋白结合部分(例如抗白蛋白免疫球蛋白单一可变域)、转铁蛋白结合部分(例如抗转铁蛋白免疫球蛋白单一可变域)、聚氧化烯(polyoxyalkylene)分子(例如聚乙二醇分子)、白蛋白结合肽或羟乙基淀粉(HES)衍生物。
根据一个实施方案，本发明的多肽可连接于赋予本发明多肽一种或多种效应子功能和/或可赋予结合于一个或多个Fc受体能力的一个或多个抗体部分、片段或域。为此目的，例如但不限于，所述抗体部分可为或可包含抗体的CH2和/或CH3域，例如重链抗体(如上文所述)且更优选常规人4链抗体的CH2和/或CH3域；具体而言，本发明的多肽可连接于Fc区，例如人IgG、人IgE或另一人Ig的Fc区。举例而言，WO 94/04678描述包含骆驼类VHH域或其人源化衍生物的重链抗体，其中骆驼科CH2和/或CH3域已经被人CH2和/或CH3域置换，以提供由各包含任选人源化的VHH域及人CH2及CH3域(但无CH1域)的2个重链组成的免疫球蛋白，该免疫球蛋白具有由CH2及CH3域提供的效应子功能，可在无任何轻链存在下起作用，且与无该修饰的相应VHH域相比半衰期延长。
包括Fc部分(有或无效应子功能)的本发明多肽的具体实施例为下文所指示的多肽：
evqllesggglvqpggslrlscvhsgptfrtdtmgwfrqapgkgrefvaavtwnsgrinyadsvkgrftisrdnskntaylqmnslrpedtavyycaahrfvvggnrvedwrywgqgtlvtvssggggsgggsevqllesggglvqpggslrlscaasgrtfnnynmgwfrqapgkgrefvaavsrsgvstyyadsvkgrftisrdnskntvylqmnslrpedtavyycaaayrgtainvrrsysswgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(SEQ ID NO：26)
evqllesggglvqpggslrlscaasgrtfnnynmgwfrqapgkgrefvaavsrsgvstyyadsvkgrftisrdnskntvylqmnslrpedtavyycaaayrgtainvrrsysswgqgtlvtvssgggsggggsggggsggggsggggsgggevqllesggglvqpggslrlscvhsgptfrtdtmgwfrqapgkgrefvaavtwnsgrinyadsvkgrftisrdnskntaylqmnslrpedtavyycaahrfvvggnrvedwrywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(SEQ ID NO：27)
evqllesggglvqpggslrlscaasgrtfnnynmgwfrqapgkgrefvaavsrsgvstyyadsvkgrftisrdnskntvylqmnslrpedtavyycaaayrgtainvrrsysswgqgtlvtvssggggsggggsggggcggggsggggsggggsggggsevqllesggglvqpggslrlscvhsgptfrtdtmgwfrqapgkgrefvaavtwnsgrinyadsvkgrftisrdnskntaylqmnslrpedtavyycaahrfvvggnrvedwrywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(SEQ ID NO：28)
evqllesggglvqpggslrlscvhsgptfrtdtmgwfrqapgkgrefvaavtwnsgrinyadsvkgrftisrdnskntaylqmnslrpedtavyycaahrfvvggnrvedwrywgqgtlvtvssggggsgggsevqllesggglvqpggslrlscaasgrtfnnynmgwfrqapgkgrefvaavsrsgvstyyadsvkgrftisrdnskntvylqmnslrpedtavyycaaayrgtainvrrsysswgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(SEQ ID NO：29)
evqllesggglvqpggslrlscaasgrtfnnynmgwfrqapgkgrefvaavsrsgvstyyadsvkgrftisrdnskntvylqmnslrpedtavyycaaayrgtainvrrsysswgqgtlvtvssgggsggggsggggsggggsggggsgggevqllesggglvqpggslrlscvhsgptfrtdtmgwfrqapgkgrefvaavtwnsgrinyadsvkgrftisrdnskntaylqmnslrpedtavyycaahrfvvggnrvedwrywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(SEQ ID NO：30)
evqllesggglvqpggslrlscaasgrtfnnynmgwfrqapgkgrefvaavsrsgvstyyadsvkgrftisrdnskntvylqmnslrpedtavyycaaayrgtainvrrsysswgqgtlvtvssggggsggggsggggcggggsggggsggggsggggsevqllesggglvqpggslrlscvhsgptfrtdtmgwfrqapgkgrefvaavtwnsgrinyadsvkgrftisrdnskntaylqmnslrpedtavyycaahrfvvggnrvedwrywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(SEQ ID NO：31)
根据本发明的另一个实施方案，两个免疫球蛋白单一可变域可与血清白蛋白分子融合，例如WO 01/79271及WO03/59934中所述。
包含人血清白蛋白部分的本发明双互补位A-β结合多肽的一个实施例在表IV中给出。
表IV：HSA-融合蛋白
在另一个实施方案中，本发明的双特异性结合分子包含与存在于血液中的抗原结合的部分，例如血清白蛋白、血清免疫球蛋白、甲状腺素结合蛋白、纤维蛋白原(brinogen)或转铁蛋白，因而使所得本发明的多肽的体内半衰期增加。根据一个特别优选的实施方案，该部分为白蛋白-结合免疫球蛋白且尤其优选为白蛋白-结合免疫球蛋白单一可变域，例如白蛋白-结合VHH域。
若欲在人中使用，则该白蛋白-结合免疫球蛋白单一可变域优选结合人血清白蛋白且优选为人源化白蛋白-结合VHH域。
结合人血清白蛋白的免疫球蛋白单一可变域在本领域中是已知的，且进一步详述于例如WO 2006/122786中。具体适用的白蛋白结合VHH域由以下氨基酸序列组成或含有以下氨基酸序列：
evqlvesggglvqpgnslrlscaasgftfssfgmswvrqapgkglewvssisgsgsdtlyadsvkgrftisrdnakttlylqmnslrpedtavyyctiggslsrssqgtlvtvss(SEQ ID NO：33)
包含白蛋白结合VHH域的本发明多肽的具体实施例见于表V中：
表V：包含两个抗A-βVHH域及一个抗HSAVHH域的本发明双互补位多肽
在另一个优选实施方案中，本发明的多肽包含结合于血清白蛋白的部分，其中该部分为白蛋白结合肽，如例如国际专利公开案WO 2008/068280及WO2009/127691中所述。
根据另一个实施方案，本发明的多肽的半衰期延长修饰(此修饰亦降低多肽的免疫原性)包含连接药理学上可接受的合适的聚合物，例如直链或支链聚(乙二醇)(PEG)或其衍生物(例如甲氧基聚(乙二醇)或mPEG)。一般而言，可使用任何适合形式的聚乙二醇化，例如本领域中用于抗体及抗体片段(包括但不限于域抗体及scFv片段)的聚乙二醇化；参考例如：Chapman，Nat.Biotechnol.，54，531-545(2002)；Veronese及Harris，Adv.Drug Deliv.Rev.54，453-456(2003)；Harris及Chess，Nat.Rev.Drug.Discov.2(2003)；WO04/060965；及US6,875,841。
用于使多肽聚乙二醇化的各种试剂也是市售的，例如可从NektarTherapeutics，USA或NOF Corporation，Japan购得，所述试剂例如EA系列、SH系列、MA系列、CA系列及ME系列，例如ME-100MA、ME-200MA及ME-400MA。
优选使用(特别是通过半胱氨酸残基的)定点聚乙二醇化(参见例如Yang等人，Protein Engineering 16，761-770(2003))。例如，出于此目的，PEG可连接至天然存在于本发明的多肽中的半胱氨酸残基，本发明的多肽可经修饰以便适当引入一个或多个用于连接PEG的半胱氨酸残基，或包含一个或多个用于连接PEG的半胱氨酸残基的氨基酸序列可融合至本发明的多肽的N-末端和/或C-末端和/或桥接两个或多个功能域的接头区域，以上均使用对本领域技术人员而言本身已知的蛋白工程的技术。
优选地，对于本发明的多肽，使用PEG的分子量大于5kDa (例如大于10kDa)且小于200kDa(例如小于100kDa)，例如在20kDa至80kDa范围内。
关于聚乙二醇化应注意，一般而言，本发明也优选涵盖已在一个或多个氨基酸位置处经聚乙二醇化的任何本发明多肽，该聚乙二醇化：(1)增加体内半衰期；(2)降低免疫原性；(3)提供对于聚乙二醇化本身已知的一种或多种其他有益性质；(4)基本上不影响多肽对A-β的亲和性(例如通过下面实施例中所述的适合分析所测定，不使该亲和性降低50%以上、且更优选不使之降低10%以上)；和/或(5)不影响本发明的多肽的任何其他所需性质。适合的PEG群组及用于特异性或非特异性与之连接的方法将为本领域技术人员所了解。
根据本发明的一个尤其优选的实施方案，本发明的聚乙二醇化多肽包括一个具有40kDa或60kDa分子量的线性PEG的PEG部分，其中该PEG部分在连接区域中连接至所述多肽，且特别是在如SEQ ID NO:6中所示的GS9接头肽的位置5处、在如SEQ ID NO:8中所示的GS27接头肽的位置14处、或在如SEQ ID NO:9中所示的GS35接头肽的位置15处、或在如SEQ IDNO:10中所示的35GS接头肽的位置5处的Cys残基处连接至所述多肽。
如以下化学式中所示，本发明的多肽的优选实施例可优选地经如上提及的PEG试剂之一(例如“ME-400MA”)来聚乙二醇化：
其平均分子量为40kDa。
表VI：本发明的聚乙二醇化多肽；C*指示带有PEG部分的Cys残基
根据另一个实施方案，本发明的多肽还包含允许多肽穿过血脑屏障的部分。具体而言，允许所得本发明的多肽穿过血脑屏障的该部分可为一个或多个(例如两个且优选一个)免疫球蛋白单一可变域，例如WO 02/057445中所述的靶向于脑的抗体片段(VHH)FC44及FC5。其实施例见于下表XIX中。
因此，本发明的多肽亦可由以下通式描述：
A-ISVD1-B-ISVD2-C，其中
ISVD1及ISVD2表示结合于A-β的不同抗原表位的如上文所述的A-β结合免疫球蛋白单一可变域，例如分别为SEQ ID NO 44及45的免疫球蛋白单一可变域；且
A、B及C彼此独立地表示：
-无额外部分(亦即A为ISVD1的N端，B为连接ISVD1与ISVD2的肽键，且C为ISVD2的C端)
-一个或多个选自人IgG、IgM、IgD、IgE等的CH1、CH2及CH3域的域，且C优选表示CH2-CH3；
-白蛋白或其片段，且优选为人血清白蛋白或其片段；
-白蛋白结合部分，且优选为白蛋白结合免疫球蛋白单一可变域或白蛋白结合肽；
-接头肽，其任选经聚乙二醇化；且B优选表示具有3至45个氨基酸的接头肽，包括至少一个经聚乙二醇化的半胱氨酸残基，优选具有PEG40或PEG60部分；
-一个或多个A-β结合部分，优选为另一抗A-β免疫球蛋白可变域，其与ISVD1或ISVD2相同或不相同：
-多肽，优选为赋予多肽穿过血脑屏障的性质的免疫球蛋白单一可变域，例如WO 02/057445中所述的FC44及FC5；
或其中
ISVD1、ISVD2、B及C具有如上所述的含义且
-A表示N端的任选经甲酰化的Met残基，其例如由在异源宿主有机体中表达而产生；和/或引导本发明的多肽在合成后自宿主细胞分泌的信号或前导序列；和/或任选在多肽在适合的宿主细胞中表达后移除的前序列；
或其中
ISVD1、ISVD2、A及B具有如上所述的含义且
-C表示“标记”，例如允许或有助于纯化本发明的多肽的氨基酸序列或残基，例如使用针对该序列或残基的亲和力技术；该标记可任选在该纯化步骤后例如通过化学或酶促裂解移除，以提供多肽的成熟序列；出于此目的，标记可任选通过可裂解接头序列连接于多肽序列或含有可裂解模体。所述残基的一些优选但非限制性实施例为多个组氨酸残基、谷胱甘肽残基及myc标记，例如AAAEQKLISEEDLNGAA(SEQ ID NO：46)。
治疗用途
根据另一重要方面，本发明的多肽用于达成治疗性目的，例如
-用于预防、治疗和/或减轻如下文所述的病症、疾病或病状，尤其人的病症、疾病或病状，例如阿尔茨海默氏病(AD)、干性AMD或青光眼；
-用于治疗需要该疗法的患者的方法中，该方法包括向有此需要的受试者给药药学活性量的至少一种本发明多肽或包含本发明该多肽的药物组合物(如下文详细阐述)，其中需要该疗法的该受试者可为罹患如下文所述的任何病症、疾病或病状(例如AD、干性AMD或青光眼)的人；
-用于制备供预防、治疗或减轻人的如下文所述的病症、疾病或病状(例如AD、干性AMD或青光眼)的药剂；
-用作用于达成上述目的药物组合物或药剂中的活性成分。
如上文所提及的病症、疾病或病状(下文为：疾病)为可通过向患者或人给药本发明的多肽来预防和/或治疗和/或减轻的疾病，且更具体而言为由A-β功能障碍介导的疾病，例如A-β产生、沉积或缺乏清除的功能障碍，和/或由淀粉样斑形成、A-β寡聚物形成及其类似情况介导的疾病。甚至更具体而言，该疾病为可通过调节、降低和/或逆转A-β和/或淀粉样斑和/或A-β寡聚物在患者体内(不需要的)形成或积聚来预防和/或治疗和/或减轻的疾病，所述疾病包括例如神经退化性疾病，最突出的A-β相关神经退化性疾病为AD。
因此，本发明的多肽可用于预防、治疗或减轻例如以下的疾病的方法中：
-阿尔茨海默氏病(AD：该疾病的所有类型及阶段，包括临床前及前体阶段)：亦称为“阿尔茨海默型痴呆”；
-干性形式的年龄相关黄斑变性(干性AMD；中心地图状萎缩)；
-青光眼；
-大脑淀粉样血管病变(CAA)；
-21-三体(唐氏综合征)，包括成人唐氏综合征；
-伴有荷兰型淀粉样变性的遗传性脑出血(HCHWA-D)；
-路易体痴呆；
-额颞叶退化；
-青光眼；
-肌萎缩侧索硬化；
-偶发性包涵体肌炎；及
-老年人(例如至少55岁)的焦虑症，其选自：强迫症、恐慌症、恐慌发作、广场恐惧症、创伤后压力症、社交恐惧症、破坏性行为障碍及慢性疲劳综合征(其中该老年人可能经诊断或未诊断患有选自以下的与A-β有关的病状：临床或临床前AD、慢性淀粉样血管病变及唐氏综合征)；
其中该方法包括向有此需要的受试者给药药学活性量的本发明多肽和/或包含其的药物组合物。
在本发明的上下文中，术语“预防、治疗和/或减轻”不仅包括预防和/或治疗和/或减轻疾病，而且一般亦包括预防疾病发作，减缓或逆转疾病进展，预防或减缓一种或多种与该疾病相关的症状发作，减少和/或减轻一种或多种与该疾病相关的症状，降低疾病和/或与其相关的任何症状的严重程度和/或缩短持续时间，和/或预防疾病和/或与其相关的任何症状的严重程度进一步增加，预防、减少或逆转由疾病引起的任何生理损伤，及一般有益于所治疗的患者的任何药理作用。
具体而言，在AD的情况下，本发明的多肽、组合物及方法可用于帮助预防或延缓经鉴别存在AD风险因素和/或经证实具有A-β沉积物的患者的AD发作，用于治疗患轻度认知障碍(MCI)且处于转变成AD风险中的患者，及用于预防或延缓预期将另外自临床前或前体疾病阶段发展至痴呆的患者的AD发作。AD的遗传风险因素包括APP基因(尤其在位置670及671以及位置717)、早老素基因PS1及PS2及ApoE4的具体突变。其他风险因素包括AD家族史、高胆固醇血症、动脉粥样硬化、糖尿病和/或高龄。AD倾向可通过分析CSF中的A-β(1-42)及τ浓度进行早期诊断。神经成像技术(例如PET及MRI)可鉴别处于转变成AD风险中的患者。一般而言，使用若干生物标记物可允许在极早阶段以高敏感性及特异性诊断AD。
在易患唐氏综合征、伴有荷兰型淀粉样变性的遗传性脑出血及大脑β-淀粉样血管病变的情况下，本发明的多肽、组合物及方法亦可适用于预防其潜在后果，例如单一性及复发性脑叶出血。
所治疗的受试者将为哺乳动物，且更尤其为人。如本领域技术人员所清楚，所治疗的受试者尤其将为罹患本文所提及的疾病、障碍或病症或处于所述疾病、障碍或病症风险中的人。
本领域技术人员亦应清楚，以上疾病治疗方法包括制备用于治疗该疾病的药剂。此外，清楚本发明的多肽可用作欲用于治疗以上疾病的药剂或药物组合物中的活性成分。因此，本发明还涉及本发明的多肽用于制备供预防、治疗和/或减轻上文所提及的任何疾病、障碍或病症的药物组合物的用途。本发明还涉及一种用于治疗性或预防性用途且具体而言用于预防、治疗和/或减轻上文所提及的任何疾病、障碍或病症的本发明多肽。本发明还涉及一种用于预防、治疗和/或减轻上文所提及的疾病、障碍或病症的药物组合物，其中该组合物包含至少一种本发明的多肽。
不希望受具体理论束缚，以上治疗性或预防性作用可通过以下机制实现：本发明的多肽结合于A-β，由此抑制A-β与一个或多个其他A-β分子相互作用，或A-β与受体相互作用，或A-β与可溶性生物分子相互作用，或A-β与不溶性生物分子相互作用。靶标A-β可为斑块或悬浮液或溶液的一部分或这些的一或多者，其中所述其他A-β分子亦可为斑块、悬浮液或溶液的一部分或这些的一或多者。脑、血管或体内其他部分中不同A-β形式(例如单体形式、寡聚及多聚形式、聚集可溶性及不溶性形式、原纤维形式、初原纤维形式及淀粉样斑)的清除可归因于本发明的多肽与A-β的结合。通过抑制A-β分子与另一分子(例如另一A-β分子)之间的相互作用来降低体液中的A-β含量且优选降低血液中的可溶性A-β含量将减轻退行性神经疾病的症状，减缓或停止疾病进展和/或恢复脑损伤、记忆及认知。
根据另一更一般方面，本发明涉及一种用于免疫疗法且尤其用于被动免疫疗法的方法，该方法包括向罹患如本文所提及的疾病或处于所述疾病风险中的受试者给药药学活性量的本发明多肽和/或包含其的药物组合物。
根据另一方面，本发明涉及一种(i)用于预防、治疗和/或减轻认知下降，和/或(ii)用于恢复认知功能和/或改良认知功能的方法，该方法包括向有此需要的受试者给药药学活性量的本发明多肽和/或包含其的药物组合物。
本发明的多肽和/或包含其的组合物可以任何适合的方式给药有此需要的患者，视所用的具体医药制剂或组合物而定。因此，本发明的多肽和/或包含其的组合物可例如通过静脉内、皮下、肌内、腹膜内、经皮、口服，舌下(例如以置于舌下且通过黏膜经舌下毛细管网吸收的舌下片剂、喷雾剂或滴剂形式)、经鼻(内)(例如以鼻用喷雾和/或气雾剂的形式)、局部、借助于栓剂、经吸入、玻璃体内(尤其对于治疗干性AMD或青光眼而言)或任何其他适合的方式以有效量或有效剂量给药。
本发明的多肽和/或包含其的组合物根据适于预防、治疗和/或减轻待预防、治疗或减轻的疾病、障碍或病症的治疗方案给药。临床医师一般将能够确定适合的治疗方案，视例如以下的因素而定：待预防、治疗或减轻的疾病、障碍或病症，疾病严重程度，其症状严重程度，所用本发明的具体多肽，所用具体给药途径及医药制剂或组合物，患者的年龄、性别、体重、膳食、一般状况，及临床医师所熟知的类似因素。一般而言，治疗方案将包含以治疗和/或预防有效量或有效剂量给药一种或多种本发明的多肽或一种或多种包含其的组合物。
一般而言，为预防、治疗和/或减轻本文所提及的疾病、病症及病状且视待治疗的具体疾病、障碍或病症、所用本发明的具体多肽的效能、所用具体给药途径及具体医药制剂或组合物而定，本发明的多肽一般将以每剂每公斤体重0.005mg至20.0mg及优选每剂0.05mg/kg至10.0mg/kg且更优选每剂0.5mg/kg至10mg/kg的量连续(例如通过输注)或以单次剂量形式(例如每天、每周或每月剂量；参考下文)给药，但可显著变化，尤其视上述参数而定。
对于预防性应用，含有本发明多肽的组合物亦可以类似或略低剂量给药。该剂量亦可由个别医师在任何并发症的情况下调整。
视本发明的具体多肽及其具体药物动力学及其他性质而定，其可每天、每两天、每三天、每四天、第五天、第六天、每周、每月及其类似频率给药。给药方案可包括长期每周治疗。“长期”指至少两周且优选数月或数年的持续时间。
本发明的多肽及包含其的组合物的功效可使用任何适合的活体外检测、基于细胞的检测、活体内检测和/或本身已知的动物模型或其任何组合来测试，视所涉及的具体疾病而定。适合的检测及动物模型为本领域技术人员所清楚，且例如包括下文实施例中所用的检测及动物模型。因此，适合的检测为(但不限于)测量抗A-β多肽与经涂布的单体或聚集A-β肽或捕捉的生物素标记A-β的结合的ELISA结合检测、测量与经涂布的单体或聚集A-β肽或捕捉的生物素标记A-β的结合的SPR(表面等离子共振)检测(Malmqvist M.:Surface plasmon resonance for detection and measurement of antibody-antigenaffinity and kinetics；Curr.Opin.Immunol.5(2):282(1993))、测量与A-β(1-40)肽/N端区域特异性结合剂相互作用或与A-β(1-40)/中心区域特异性结合剂相互作用竞争的竞争TR-FRET(时间依赖式荧光共振能量传递)检测、测量聚集的预防或解聚集的活体外A-β聚集检测、使用对阿尔茨海默氏病患者或APP转基因动物的脑的免疫组织化学分析测量分子与淀粉样斑的结合的TAPIR(组织淀粉样斑免疫应答性)检测以及活体内机械模型。
优选地，在这些检测或模型中的至少一者中，且优选在一种或多种活体内模型中，与本领域中已知的常规抗体(例如m266及3D6抗A-βIgG抗体)或WO 2006/40153中所述的Nanobodies相比，本发明的多肽具有更佳的特征。
对于医药用途，本发明的多肽可调配为医药制剂，其包含(i)至少一种本发明的多肽；及(ii)至少一种药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂、佐剂和/或稳定剂；及(iii)任选存在的一种或多种其他药学活性多肽和/或化合物。“药学上可接受”指各别物质在给药受试者时不显示任何生物作用或其他不良作用且不以有害的方式与含有其的药物组合物的任何其他组分(例如药学活性成分)相互作用。具体实施例可见于标准手册中，例如Remington'sPharmaceutical Sciences，第18版，Mack Publishing Company，USA(1990)。举例而言，本发明的多肽可以本身已知用于常规抗体及抗体片段及其他药学活性蛋白质的任何方式来调配及给药。因此，根据另一个实施方案，本发明涉及一种药物组合物或制剂，其含有至少一种本发明的多肽及至少一种药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂、佐剂和/或稳定剂，及任选存在的一种或多种其他药学活性物质。
借助于非限制性实施例，此类制剂可呈适于如下给药的形式：口服给药；非经肠给药(例如通过静脉内、肌内、皮下、鞘内、海绵体内或腹膜内注射或静脉内输注)；局部给药；舌下给药；通过吸入给药；通过皮肤贴片给药；通过植入物给药；通过栓剂给药；经皮、经鼻、玻璃体内、经直肠或经阴道给药及其类似给药形式。本领域技术人员应清楚该适合的给药形式(其可为固体、半固体或液体，视给药方式而定)以及用于制备其的方法及载体。
用于非经肠给药(例如静脉内、肌内、皮下注射或静脉内输注)的医药制剂可例如为无菌溶液、悬浮液、分散液、乳液或散剂，其包含活性成分且适于任选在进一步溶解或稀释步骤后输注或注射。适于所述制剂的载体或稀释剂例如包括(但不限于)无菌水及药学上可接受的水性缓冲液及溶液，例如磷酸盐缓冲生理盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)，右旋糖溶液及汉克氏溶液(Hank's solution)；水油；甘油；乙醇；二醇，例如丙二醇；以及矿物油、动物油及植物油，例如花生油、大豆油；以及其适合的混合物。
活性化合物或其盐的溶液亦可含有防止微生物生长的防腐剂，例如抗细菌剂及抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情况下，优选包括等张剂，例如糖、缓冲剂或氯化钠。可例如通过形成脂质体，通过在分散液情况下维持所需粒径，或通过使用表面活性剂来维持适当流动性。亦可添加延迟吸收的其他药剂，例如单硬脂酸铝及明胶。
在所有情况下，最终剂型必须在制备及储存条件下为无菌、流体且稳定的。通过将所需量的活性化合物并入含多种上文所列举的其他成分的适当溶剂中且按需要随后过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选制备方法为真空干燥及冻干技术，其得到存在于先前无菌过滤溶液中的活性成分加任何其他所需成分的粉末。
通常，水性溶液或悬浮液为优选。一般而言，适于治疗性蛋白质(例如本发明的多肽)的制剂为缓冲蛋白质溶液，例如包括以下的溶液：适合浓度(例如0.001mg/ml至400mg/ml、优选0.005mg/ml至200mg/ml、更优选0.01mg/ml至200mg/ml、更优选1.0-100mg/ml，例如1.0mg/ml(静脉内给药)或100mg/ml(皮下给药)的蛋白质，及水性缓冲液，例如：
-磷酸盐缓冲生理盐水(pH 7.4)、
-其他磷酸盐缓冲液(pH 6.2至8.2)、
-组氨酸缓冲液(pH 5.5至7.0)、
-丁二酸盐缓冲液(pH 3.2至6.6)，及
-柠檬酸盐缓冲液(pH 2.1至6.2)，
及任选存在的用于提供溶液的等张性的盐(例如NaCl)和/或糖或多元醇(例如海藻糖、甘露糖醇或甘油)。
优选缓冲蛋白质溶液为包括约0.05mg/ml的本发明多肽溶解于25mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)中且通过添加220mM海藻糖调整至等张性的溶液。另外，例如清洁剂(例如0.02%Tween-20或Tween-80)的其他药剂可包括于所述溶液中。皮下施用的制剂可包括显著较高浓度的本发明多肽，例如高达100mg/ml或甚至高于100mg/ml。然而，本领域技术人员应清楚，如上文所给出的成分及其量仅代表一个优选选择。其替代物及变化为本领域技术人员直接显而易见，或可容易由以上公开内容开始进行设想。
本发明的多肽亦可使用适合的储槽式缓慢释放或持续释放制剂(例如适于注射)，使用植入皮下的控制释放装置，和/或使用本身已知用于给药药学活性物质或成分的给药泵或其他装置来给药。另外，本发明的多肽可以凝胶、乳膏、喷雾、滴剂、贴片或膜的形式调配，若将其置于皮肤上，则其可穿过皮肤。
而且，与常规抗体或抗体片段相比，使用本发明多肽的一个主要优点在于其亦可通过不为非经肠给药的途径容易地给药且可容易调配用于该给药。举例而言，如国际申请案WO 2004/041867中所述，所述多肽可经调配用于口服、鼻内、肺内及经皮给药。
根据本发明的另一个实施方案，提供一种药物组合，其包含如至少一种本文所公开的本发明的抗A-β多肽及至少一种其他治疗剂，该治疗剂选自：胆碱酯酶抑制剂，例如多奈哌齐、利伐斯的明、加兰他敏及他克林(tacrine)；NMDA拮抗剂，例如美金刚；A-β降低剂，例如能够抑制一种或多种与A-β形成有关的酶的药剂，例如β-分泌酶抑制剂、γ-分泌酶抑制剂及γ-分泌酶调节剂；预防或减少A-β斑块形成的药剂；A-β聚集抑制剂；RAGE拮抗剂；及用于预防、治疗或减轻神经退化性疾病和/或认知功能下降的其他药剂。所述其他治疗剂的具体实施例为：ELND-005、Caprospinol、NRM-8499、PBT-2、Posiphen、EHT-0202、CTS-21166、司马西特(Semagacest)、BMS-708163、BMS-299897、BMS-433796、ELND-006、ELN-475516、ELN-318463、ELN-475513、贝加司他(Begacestat)、E-2012、CHF-5074、Dimebolin(Latrepiridin)和PF-4494700。所述药物组合可任选还包含稀释剂、赋形剂、佐剂和/或稳定剂。
当两种或两种以上物质或成分待用作组合治疗方案的一部分时，其可在基本上相同时间或在不同时间(例如基本上同时、连续或根据交替方案)通过相同给药途径或通过不同给药途径给药。当物质或成分待通过相同给药途径同时给药时，其可以不同医药制剂或组合物形式或以组合医药制剂或组合物的一部分形式给药。而且，当两种或两种以上活性物质或成分待用作组合治疗方案的一部分时，物质或成分各可以相同量且根据与化合物或成分独自使用时所用相同的方案给药，且该组合使用可产生或不产生协同效应。然而，当两种或两种以上活性物质或成分的组合使用产生协同效应时，其亦有可能减少待给药的物质或成分中的一者、多者或全部的量，同时仍达成所需治疗性作用。此可例如适用于避免、限制或减少当一种或多种物质或成分以其常见量使用时与其使用相关的任何不良副作用，同时仍获得所需医药或治疗性作用。
本发明的另一个实施方案为一种治疗如上文所述的疾病及病症的方法，其包含向受试者同时、分别或依次给药有效量的至少一种本发明的抗A-β多肽及至少一种选自以下的药剂：胆碱酯酶抑制剂，例如多奈哌齐、利伐斯的明、加兰他敏及他克林；NMDA拮抗剂，例如美金刚；A-β降低剂，例如能够抑制一种或多种与A-β形成有关的酶的药剂，例如β-分泌酶抑制剂、γ-分泌酶抑制剂及γ-分泌酶调节剂；预防或减少A-β斑块形成的药剂；A-β聚集抑制剂；RAGE拮抗剂；及用于预防、治疗或减轻神经退化性疾病和/或认知功能下降的其他药剂，包括如上文所述的具体实施例。
根据本发明的另一方面，制备本发明的A-β结合多肽以与用于治疗上文所述的疾病及病症的其他药物组合给药，所述其他药物选自：胆碱酯酶抑制剂，例如多奈哌齐、利伐斯的明、加兰他敏及他克林；NMDA拮抗剂，例如美金刚：A-β降低剂，例如能够抑制一种或多种与A-β形成有关的酶的药剂，例如β-分泌酶抑制剂、γ-分泌酶抑制剂及γ-分泌酶调节剂；防止或减少A-β斑块形成的药剂；A-β聚集抑制剂；RAGE拮抗剂；及预防、治疗或减轻神经退化性疾病和/或认知功能下降的其他药剂，包括如上文所述的具体实施例。
根据本发明的另一方面，制备用于治疗上文所述的疾病及病症的药物以与本发明的A-β结合多肽组合给药，所述药物选自：胆碱酯酶抑制剂，例如多奈哌齐、利伐斯的明、加兰他敏及他克林；NMDA拮抗剂，例如美金刚：A-β降低剂，例如能够抑制一种或多种与A-β形成有关的酶的药剂，例如β-分泌酶抑制剂、γ-分泌酶抑制剂及γ-分泌酶调节剂；防止或减少A-β斑块形成的药剂；A-β聚集抑制剂；RAGE拮抗剂；及预防、治疗或减轻神经退化性疾病和/或认知功能下降的其他药剂(包括如上文所述的具体实施例)。
根据本发明的另一方面，本发明的A-β结合多肽与适用于给药多肽的装置(例如注射器、注射笔或其他装置)组合使用。
根据本发明的又一个实施方案，提供一种诊断由A-β功能障碍和/或淀粉样斑形成所介导的疾病、障碍或病症的方法，其包括以下步骤：
a)自受试者获得样品，及
b)在活体外使该样品与如上文所定义的本发明多肽接触，及
c)检测该多肽与该样品的结合，及
d)将步骤(c)中所检测的结合与标准进行比较，其中相对于该样品的结合差异可诊断特征为A-β功能障碍和/或淀粉样斑形成的疾病、障碍或病症。
根据本发明的另一个实施方案，提供一种诊断由A-β功能障碍和/或淀粉样斑形成介导的疾病、障碍或病症的方法，其包括以下步骤：
a)自受试者获得样品，及
b)使该样品与如上文所定义的本发明多肽接触；
c)测定样品中A-β的量；及
d)将步骤(c)中所检测的结合与标准进行比较，其中相对于该样品的量差异可诊断特征为A-β功能障碍和/或淀粉样斑形成的疾病、障碍或病症。
样品可例如为受试者的体液，例如血液或脑脊髓液(CSF)。检测本发明多肽与A-β的结合的步骤或测定样品中A-β的量的步骤一般将包含测量多肽与A-β之间的复合物的形成。根据此方法的不同实施方案，复合物的形成将在溶液状态下或在一种组分固定于底物上后进行，且将随后检测所述复合物。出于此目的，进一步修饰本发明的多肽可能是适用的，所述修饰例如通过引入作为特异性结合对(例如生物素-抗生物素蛋白(链菌素)结合对)的一部分的官能基。此类官能基可用于将本发明的多肽与结合于该结合对的另一半的另一蛋白质、多肽或化合物连接，亦即通过形成结合对连接。举例而言，本发明的多肽可与生物素结合，且连接于与抗生物素蛋白或链亲和素结合的另一蛋白质、多肽、化合物或载体。举例而言，此类结合的本发明多肽可用作报道分子，例如在产生可检测信号的药剂与抗生物素蛋白或链亲和素结合的诊断系统中。
以上诊断方法亦可用于监测治疗性处理受试者的有效性。
根据本发明的另一个实施方案，提供一种诊断由A-β功能障碍及尤其淀粉样斑形成和/或AD介导的疾病、障碍或病症的试剂盒，其用于如上文所定义的方法中，该试剂盒包含至少一种本发明的多肽及任选存在的一种或多种介质、检测手段和/或活体外或活体内成像剂，及进一步任选存在的使用说明书。适合的活体内成像剂包括99mTc、111铟、123碘及用于磁共振成像的顺磁化合物。SPECT、PET或MRI与经标记的本发明的抗A-β多肽的组合将允许对各患者进行“A-β脑扫描”及个别风险评估。
根据本发明的又一个实施方案，某些本发明的A-β结合多肽可用作特异性检测人和小鼠A-β或其他动物物种A-β以及依靠该检测的试验和检测的研究工具。此可尤其适用于使用动物模型的试验和检测。
本发明进一步提供一种试剂盒，其包含至少一种本发明的A-β结合多肽及另外一种或多种选自用于治疗如上文所述的疾病及病症的其他药物的其他组分及如上文所述的装置。
本发明进一步提供制备本发明的A-β结合多肽的方法，所述方法一般包括以下步骤：
-在允许本发明的多肽表达的条件下培养包含能够编码本发明多肽的核酸(下文：“本发明的核酸”)的宿主细胞；及
-自培养物回收或分离所述宿主细胞所表达的多肽；和
-任选进一步纯化和/或修饰和/或调配本发明的多肽。
本发明的核酸可为基因组DNA、cDNA或合成DNA(例如具有具体适用于在目标宿主细胞或宿主有机体中表达的密码子使用的DNA)。根据本发明的一个实施方案，本发明的核酸呈基本上分离形式，如下文所定义。
本发明的核酸亦可呈载体形式，存在于载体中和/或为载体的一部分，该载体例如为质粒、粘端质粒或YAC，其又可呈基本上分离形式。载体可尤其为表达载体，亦即可使得多肽在活体外和/或活体内(例如在适合的宿主细胞、宿主有机体和/或表达系统中)表达的载体。该表达载体一般包含至少一种本发明的核酸，其可操作地连接于一种或多种适合的调控组件，例如启动子、增强子、终止子等。适用于表达本发明的多肽或为该表达所必需的所述调控组件及其他组件的具体实施例(例如整合因子、选择标记物、信号或前导序列、报道基因等)例如公开于WO 2006/040153的第131至133页。
本发明的核酸可基于有关本文所给的本发明多肽的氨基酸序列的信息，以本身已知的方式(例如通过自动化DNA合成和/或重组DNA技术)制备或获得，和/或可自适合的天然来源分离。
根据另一个实施方案，本发明涉及一种宿主或宿主细胞，其表达或能够表达本发明的多肽，和/或含有编码本发明多肽的核酸。根据一个尤其优选实施方案，所述宿主细胞为细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞。
适合的细菌细胞包括来自以下的细胞：革兰氏阴性细菌菌株，例如大肠杆菌(Escherichia coli)、变形杆菌属(Proteus)及假单胞菌属(Pseudomonas)的菌株；及革兰氏阳性细菌菌株，例如芽胞杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)及乳球菌属(Lactococcus)。适合的真菌细胞包括来自木霉属(Trichoderma)、脉孢菌属(Neurospora)及曲霉属(Neurospora)的物种的细胞。适合的酵母细胞包括来自酵母属(Saccharomyces)(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)(例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe))、毕赤酵母属(Pichia)(例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)及甲醇毕赤酵母(Pichiamethanolica))及汉森酵母属(Hansenula)的物种的细胞。
适合的哺乳动物细胞包括例如CHO细胞、BHK细胞、海拉细胞(HeLacell)、COS细胞等。然而，亦可使用两栖动物细胞、昆虫细胞、植物细胞及本领域中用于表达异源蛋白质的任何其他细胞。
对于工业规模生产而言，用于(工业)生产免疫球蛋白单一可变域多肽及含有其的蛋白质治疗剂的优选异源宿主包括适于大规模表达、生产及发酵，尤其是适用于大规模(生物)医药表达、生产及发酵的大肠杆菌、巴斯德毕赤酵母及酿酒酵母菌株。
具体表达系统的选择将部分视某些转译后修饰、更尤其糖基化的需要而定。希望或需要糖基化的本发明多肽的产生将需要使用能够使所表达的蛋白质糖基化的哺乳动物表达宿主。就此而言，本领域技术人员应清楚，所获得的糖基化模式(亦即所连接残基的类型、数目及位置)将视用于表达的细胞或细胞株而定。
在如上文所述的细胞中产生的本发明多肽可在细胞内(例如在胞质溶胶中、在外周胞质中或在包涵体中)产生，接着自宿主细胞分离且任选进一步纯化；或其可在细胞外产生(分泌于培育宿主细胞的培养基中)，接着自该培养基分离且任选进一步纯化。
本领域中已知用于重组产生多肽的其他方法及试剂，例如适合的表达载体、转化或转染方法、选择标记物、诱导蛋白质表达的方法、培养条件等。类似地，适用于制备本发明多肽的方法中的蛋白质分离及纯化技术为本领域技术人员所熟知。
与亦需要昂贵哺乳动物细胞培养设施的常规抗体制备相比，通过在适宜重组宿主有机体(例如大肠杆菌及酵母)中发酵来产生本发明的多肽可节省成本。此外，可达成的表达量高且本发明多肽的产率在1g/l至10g/l(大肠杆菌)及多达10g/l(酵母)及以上的范围内。
根据本发明的另一方面，提供如下表VII中所列的免疫球蛋白单一可变域，其适用于构建或构建本发明的A-β结合多肽。因此，若如表VII中所列的任何免疫球蛋白单一可变域(任选在经人源化后)与一种或多种其他A-β结合免疫球蛋白单一可变域(其中该其他免疫球蛋白单一可变域结合于A-β的不同抗原表位)组合，则此将产生具有适用结合特征的本发明双互补位A-β结合分子，如例如以下实施例9至11中所详细陈述。
表VII：A-β结合免疫球蛋白单一可变域
实施例
实施例1：用A-β使美洲驼(llamas)免疫以诱导体液免疫应答
单体A-β肽(BAM)的产生：通过三氟乙酸(TFA：Sigma)/1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(HFIP；Fluka)处理来制备单体A-β肽(BAM)。将冻干的A-β肽溶解于其初始小瓶中的100%TFA中，最终浓度为1mg/ml。接着在室温在speedvac中蒸发溶液。此蒸发步骤及所有随后蒸发步骤后，将剩余沉淀置于冰上。将该沉淀再悬浮于HFIP中且再次在室温在speedvac中蒸发，随后再用HFIP溶解，而后将溶液分成适当体积的等分试样。在室温在speedvac中蒸发所述等分试样且将沉淀储存于-80℃。在即将使用之前，通过来回重复用吸管吸取将经TFA/HFIP处理的A-β肽等分试样溶解于100%DMSO中。在14000rpm下离心该A-β肽溶液10分钟以移除可能的聚集体且将上清液用于不同检测中。
美洲驼的免疫：用聚集A-β肽(BAA)及寡聚A-β肽(BAO)使美洲驼免疫(通过将所述免疫原经肌内注入颈部区)，随时间施用递减剂量。BAA是由合成A-β(1-40)与A-β(1-42)肽的混合物组成，其基本上如Schenk等人，1999，Nature400：173-177所述制备。BAO基本上如Kayed等人(2003)，Science 300：486-489所述制备。头两次抗原注射由每只美洲驼每次100μg抗原组成，而对于所有后续给药，剂量减少至每只美洲驼50μg。美洲驼144及145接种新鲜制备的BAA。总共注射9次BAA抗原剂量，使用弗氏完全佐剂(第一次注射)或Stimune(所有后续免疫原加强)呈乳液形式注射，间隔最多16天。美洲驼129、130、177及178接种BAO。总共注射6至9次BAO抗原剂量，使用弗氏完全佐剂(第一次注射)及弗氏不完全佐剂或Stimune(所有后续抗原加强)呈乳液形式注射，间隔最多18天。亦用结合牛血清白蛋白(BSA：美洲驼181及186)的A-β肽片段1-16或结合BSA(美洲驼185及187)的A-β肽片段1-30使美洲驼免疫。4次抗原注射以14天间隔使用弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂给药，其中抗原剂量自每只美洲驼100μg(头两次注射)减至50μg(后两次注射)。在即将开始各免疫流程之前收集免疫前血清样品，且在免疫实验期间的规则时间点收集多个免疫血清样品，以评估不同动物的A-β肽特异性体液应答。
为通过ELISA监测A-β肽特异性血清效价，在室温将2μg/ml在C端经生物素标记的A-β(1-40)(Anaspec)固定于涂有中性链亲和素(每孔0.2-0.5μg)的96孔Maxisorp培养板(Nunc)上，持续2小时。用酪蛋白溶液(1%于PBS中)阻断各孔。添加一系列免疫前及免疫血清样品稀释液后，使用山羊抗美洲驼辣根过氧化酶结合物(Bethyl Lab.Inc.)检测特异性结合的美洲驼免疫球蛋白，以检测由常规抗体与单重链抗体两者介导的体液应答。在某些情况下，进行连续ELISA以通过用特异性识别单重链美洲驼IgG2及IgG3抗体的小鼠mAb(Daley等人，2005，Clin.Diagn.Lab.Imm.12：380-386)，随后用兔抗小鼠-HRP结合物(DAKO)检测来具体评估重链抗体介导的反应。使用TMB(Promega)作为发色底物来开展ELISA且在450nm下测量吸光度。对于所有四种免疫原格式(BAA、BAO、A-β(1-16)-BSA及A-β(1-30)-BSA)，检测对(生物素标记)单体A-β(1-40)具有特异性的常规抗体与重链抗体介导的免疫应答。对单体A-β(1-40)呈阳性的血清样品在针对直接涂布于MaXisorp培养板上的BAA测试时亦呈阳性，表明所用的单体A-β及BAA制剂中存在至少部分共同的抗原表位。
实施例2：自经免疫的美洲驼分离结合A-β的VHH域(VHH)
单重链抗体片段谱系的克隆：在最后免疫原注射后，自经免疫的美洲驼收集作为产生该重链抗体的B细胞来源的免疫组织。通常，对于每只动物，在最后抗原注射后的4及8天收集两个150ml血液样品，且在最后抗原注射后的4天收集一个淋巴结活检体。根据制造商的说明书(AmerShamBiosciences)，使用聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)，由血液样品制备外周血液单核细胞(PBMC)。自PBMC及淋巴结活检体提取总RNA，将其用作RT-PCR的起始物质以扩增编码基因区段的VHH(先前描述于WO 2005/044858中)。对于各经免疫的美洲驼而言，通过汇集自所有收集的动物的免疫组织分离的总RNA来构建文库。简而言之，通过特异性限制性位点，将经PCR扩增的VHH谱系克隆至设计成有助于VHH文库的噬菌体展示的载体中。该载体源自pUC 119且含有LacZ启动子、M13噬菌体gIII蛋白质编码序列、氨苄西林(ampicillin)或羧苄西林(carbenicillin)的抗性基因、多个克隆位点及杂交gIII-pelB前导序列(pAX050)。与VHH编码序列同框，载体编码C端c-myC标记及(His)6标记。根据标准方案制备噬菌体且在过滤灭菌后储存于4℃以供进一步使用。
通过噬菌体展示选择A-β特异性VHH：将自所有美洲驼获得且作为噬菌体文库克隆的VHH谱系用于应用许多选择条件的不同选择策略中。变量包括：
i)A-β肽格式(在C或N端经生物素标记的A-β(1-40)、在C端经生物素标记的A-β(1-16)、在N端经生物素标记的A-β(1-30)及谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合体，例如A-β(1-42)-GST、A-β(1-10)-GST或GST-A-β(1-42))，
ii)A-β肽聚集状态(单体A-β、BAO或BAA)，
iii)抗原呈递方法(固相：直接涂布或通过生物素标记涂于涂有中性链亲和素的培养板上；溶液相：在溶液状态下培育，随后捕捉于涂有中性链亲和素的培养板上)，
iv)抗原浓度，及
v)不同洗脱方法(胰蛋白酶或TEA)。
选择如下进行：用于固相及溶液相选择格式的抗原制剂如上文所述以多种浓度提供。与噬菌体文库一起培育2小时，接着彻底洗涤后，用胰蛋白酶(1mg/ml)或TEA洗脱结合的噬菌体15分钟。在使用胰蛋白酶进行噬菌体洗脱的情况下，立刻施用0.8mM蛋白酶抑制剂ABSF来中和蛋白酶活性。作为对照，平行进行使用/不使用抗原的选择。使用显示相对于背景(无抗原对照)富集的噬菌体输出物来感染大肠杆菌。使用受感染的大肠杆菌细胞制备用于下一轮选择的噬菌体(噬菌体援救)，或将其涂于琼脂培养板(LB+Amp+2%葡萄糖)上以分析个别VHH克隆。为筛选用于特异性结合物的选择输出物，自琼脂培养板挑取单一群落且在1ml 96深孔板中生长。通过在葡萄糖不存在下添加IPTG(最终0.1-1mM)来诱导placZ控制的VHH表达。根据标准方法制备外周胞质提取物(体积为约80μl)。
针对结合于A-β来筛选外周胞质提取物：在室温将2μg/ml在C端经生物素标记的A-β(1-40)(Anaspec)捕捉于涂有中性链亲和素(每孔0.2-0.5μg)的96孔Maxisorp培养板(Nunc)上，持续2小时。用酪蛋白溶液(1%于PBS中)阻断各孔。常规地添加外周胞质提取物的10倍稀释液后，使用小鼠抗myc及抗小鼠-HRP结合物(DAKO)检测VHH结合。保留所产生的ELISA信号最小为背景两倍的克隆，以进行序列分析。能够结合(生物素标记)单体A-β(1-40)的VHH可分派给16个不同B细胞谱系。源自同一B细胞谱系的克隆共有高度相似的CDR3序列且因此可能识别相同抗原表位。表VIII概括了鉴别16个B细胞谱系中每一者的代表性VHH的选择参数。在表IX中，显示表VIII中所列的VHH的氨基酸序列。
表VIII：使用选择参数鉴别A-β特异性VHH B细胞谱系
表IX：所得代表性VHH的氨基酸序列：
对各B细胞谱系发现的变异体总数(最少1个氨基酸不同)为1(ABII5D2)、195(ABII42D4)、1(ABII42G10)、1(ABII60D2)、1(ABII60H5)、23(ABII1E11)、3(ABII14D4)、3(ABII35C7)、6(ABII35G2)、1(ABII35D2)、7(ABII42B10)、2(ABII42F5)、3(ABII42E10)、2(ABII60A10)、2(ABII60G11)和15(ABII61F6)。
为鉴别具有最佳结合性质的B细胞谱系变异体，使用所有VHH变异体的外周胞质提取物测定解离速率(Biacore T100，GE Healthcare)。单体A-β(1-40)(在C端经生物素标记；Anaspec)、单体A-β(1-16)(在C端经生物素标记；Bachem)及单体A-β(12-28)(在N端经生物素标记：Bachem)如实施例1中所述制备，其通过链亲和素不可逆地捕捉于同一SA感应芯片(GE Healthcare)的三个不同通道上。首先通过3次1分钟注射表面洗涤缓冲液(含1M NaCl的50mM NaOH)来洗涤表面，随后注射50nM的生物素标记A-β至100RU的目标含量。捕捉后，通过以5微升/分钟注射过量(200μg/ml)的d-生物素180秒来阻断表面。洗涤参考表面且用d-生物素阻断。使用HBS-EP+缓冲液作为操作缓冲液且在25℃进行实验。对于解离速率筛选，以45微升/分钟注射呈10倍稀释液形式的VHH的外周胞质提取物2分钟且使其解离10分钟。注射经纯化的参考结合物(100nM VHH、10nM 3D6Fab)作为阳性对照样品，且至少在各实验开始及结束时进行评估。在不同VHH样品之间，用再生缓冲液(50mM NaOH)以45微升/分钟使表面再生25秒，随后若未完全再生，则用6MGuHCL以45微升/分钟再生10秒。由自捕捉有生物素标记A-β(1-40)的通道获得的传感器图谱计算解离速率。仅两个VHH B细胞谱系ABII42D4与ABII60G11的变异体显示单相结合模式且允许通过1:1相互作用模型计算解离速率：分别为6.1E-3s-1及2.7E-2s-1。对于所有其他VHH B细胞谱系而言，分别拟合解离曲线的2个不同部分，得到kd1(由125秒与160秒之间的解离范围计算)及kd2(由400秒-700秒之间的解离范围计算)。通过减去参考信道的曲线及空白操作缓冲液注射来双重参考数据。通过使用Biacore T100评估软件v1.1.1拟合1:1解离模型来评估传感器图谱。尽管在筛选ELISA中观察到VHH ABII60D2及ABII60H5结合于A-β，但这些VHH显示与感应芯片的结合微弱。
为研究单价非VHH结合物的结合特征，使用单克隆抗体m266及3D6的Fab片段。单克隆抗体3D6描述于Johnson-Wood等人，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.94：1550-1555及Bard等人，2000，Nature Medicine 6:916-919中且特异性结合于A-β的氨基酸残基1至5(N端抗原表位)。单克隆抗体m266描述于Seubert等人，1992，Nature 359：325-327中且特异性结合于A-β的氨基酸残基16至24(A-β的中心抗原表位)。根据常规技术，使用作为宿主有机体的大肠杆菌及用于纯化的固定金属亲和色谱(IMAC)及尺寸排阻色谱(SEC)来克隆、表达及纯化包含各别抗体的可变轻链(VL)、可变重链(VH)、恒定轻链(CL)及重链恒定域1(CH1)(序列如下文所给出)以及C端c-myc标记及六组氨酸((His)6标记)的Fab片段。在上述结合实验中，m266及3D6的经纯化Fab片段显示解离速率分别为4.0E-5s-1及4.7E-4s-1。
3D6的Fab片段的VL及VH序列：
VL：
YVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRIEAEDLGLYYCWQGTHFPRTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO：128)
VH：
EVKLVESGGGLVKPGASLKLSCAASGFTFSNYGMSWVRQNSDKRLEWVASIRSGGGRTYYSDNVKGRFTISRENAKNTLYLQMSSLKSEDTALYYCVRYDHYSGSSDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：129)
m266的Fab片段的VL及VH序列：
VL：
DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLIYSDGNAYLHWFLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDLGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO：130)
VH：
EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCAVSGFTFSRYSMSWVRQTPEKRLELVAQINSVGNSTYYPDTVKGRFTISRDNAEYTLSLQMSGLRSDDTATYYCASGDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO：131)
实施例3：纯化的VHH的表征
将各B细胞谱系中具有最慢解离速率的VHH变异体再克隆至源自pUC119的表达载体中，该表达载体含有LacZ启动子、氨苄西林或卡那霉素(kanamycin)的抗性基因、多克隆位点及杂交gIII-pelB前导序列。与VHH编码序列同框，载体编码C端c-myc标记及(His)6标记。在大肠杆菌TG1中产生VHH且通过固定金属亲和色谱(IMAC)及尺寸排阻色谱(SEC)纯化，产生95%纯度，如通过SDS-PAGE所评估。
3.1VHH结合于固定A-β(ELISA)：为定量VHH与单体A-β肽(BAM)的结合，在ELISA中，使用与实施例2中所述相同的设置，使用系列VHH稀释液。除VHH ABII60D2及ABII60H5外，可计算EC50值且概括于表X中。将最有效地与A-β的N端抗原表位(氨基酸1至16)或A-β的中心抗原表位(氨基酸12至28)相互作用的VHH分别确定为ABII42D4(EC50为14.2nM)及ABII60A10(EC50为4.9nM)。
在ELISA中，应用与实施例2中所述类似的设置，测试针对BAM产生可检测信号的VHH与A-β肽聚集体(BAA)的结合。如Bohrmann等人，1999，J Biol Chem 274：15990-15995中所述制备及固定抗原。简而言之，在37℃让用TBS缓冲液(50mM Tris、150mM NaCl(pH 7.4)及0.05%叠氮化钠)自2mg/ml合成A-β(1-40)的DMSO储备溶液(Bachem)稀释的100μl 10μg/ml A-β(1-40)聚集60小时。所有识别BAM的VHH均亦识别BAA且各别EC50值概括于表X中。
表X：在BAM及BAA ELISA中纯化的VHH的EC50值
  ABII42G10   1-16   87.0   49.5   ＞1000
  ABII60A10   12-28   4.9   0.8   11.1
  ABII60G11   12-28   187   6.0   34.4
  ABII60D2   1-16   ＞1μM   ND   ND
  ABII60H5   1-16   ＞1μM   ND   ND
  ABII61F6   12-28   469   14.5   967＊
  2D2   12-28   15.8   4.7   404＊
  2G6   1-16   98.6   7.2   ＞1000
  Fab266   16-24＊   1.8   1.8   0.52
  Fab3D6   1-5＊   1.8   0.3   3.4
ND：未测出：*：由外推曲线计算IC50
3.2溶液状态下VHH结合于A-β(TR-FRET)：使用时间分辨荧光共振能量传递(TR-FRET)竞争检测评估溶液状态下抗A-βVHH与A-β肽的相互作用。在两个不同设置中，测试与A-β(1-40)肽-ABII42D4相互作用(N端区域特异性)或与A-β(1-40)-ABII60A10相互作用(中心区域特异性)的竞争。对于该检测而言，将经链亲和素-铕螯合物标记的单体A-β(1-40)(在C端经生物素标记；Anaspec)及经AlexaFluor647标记的VHH ABII42D4或ABII60A 10与不同浓度的未标记竞争者(VHH、IgG或Fab)一起培育1小时。使用浓度分别为0.2nM(A-β(1-40))、50nM(ABII42D4)及10nM(ABII60A10)的经标记化合物且在665nm下检测结合相互作用后发射的荧光信号。在ABII42D4及ABII60A 10TR-FRET检测中测得IC50值，从而得到所测试的N端区域特异性结合物的以下效能分级：单克隆抗体3D6(2.5nM)>Fab片段3D6(3.4nM)>ABII42D4(46.8nM)>ABII5D2=42G10(>1000nM)。通过此检测鉴别的最有效中心区域特异性VHH为ABII60A10，其显示11.1nM的IC50，而基准抗体产生0.50nM(单克隆抗体m266)及0.52nM(m266的Fab片段)的IC50。
为进行比较，如上文所述，使用获自下文所指示的国际专利公开案的序列信息，产生及纯化如先前所公开的抗A-βVHH(“参考VHH”)：
VHH 2D2及2G6：WO 2006/40153；
VHH 3A、1B、11G、4D及8B：WO 2007/35092；及
VHH 31-1：WO 2004/44204。
其氨基酸序列见于表XI中。
表XI：参考VHH的氨基酸序列
与参考VHH 2G6(N端区域特异性)及2D2(中心区域特异性)相比，VHH42D4及60A10分别显示IC50改良≥21倍及36倍(参考表X)。
3.3测定A-β肽-VHH相互作用的亲和力：通过表面等离子共振(Biacore)，使用如前文所述(实施例2)捕捉于链亲和素感应芯片上的在C端经生物素标记的A-β(1-40)来测定A-β肽-VHH/Fab相互作用的亲和力。注射5个不同浓度(对于ABII42D4及ABII60A10而言介于2.5nM与300nM之间)的纯化的VHH或Fab片段2分钟，且使其解离10分钟。对于ABII42D4而非ABII60A10，缔合及解离曲线可使用1∶1相互作用模型(朗缪耳结合(Langmuir binding))拟合且可测定精确KD值。发现亲和力分别对于VHHABII42D4为16nM，对于3D6的Fab片段为5.1nM，且对于m266的Fab片段为0.3nM。
3.4通过表面等离子共振进行抗原表位定位：通过表面等离子共振(Biacore)，使用如前文所述捕捉于链亲和素感应芯片上的A-β(1-16)(在C端经生物素标记；Bachem)及A-β(12-28)(在N端经生物素标记；Bachem)肽来测定VHH的结合特异性。发现上表IX中所列的5种VHH与Aβ肽的N端区域相互作用(ABII5D2、ABII42D4、ABII42G 10、ABII60D2及ABII60H5)，且发现11种VHH与中心区域相互作用(ABII1E11、ABII14D4、ABII35C7、ABII35G2、ABII35D2、ABII42B10、ABII42F5、ABII42E10、ABII60A10、ABII60G11及ABII61F6；参考表X)。
3.5活体外A-β聚集检测：在活体外A-β聚集检测中测试VHH以评估是否可抑制或减少聚集。使用硫磺素T(ThT)荧光测量活体外A-β聚集，该荧光在A-β原纤维形成后经历典型红移(Levine，H.1993-Protein Science(2)：404-410)。对于该检测，制备合成A-β(1-40)(Bachem)于100%DMSO中及ThT于25mM甘氨酸-NaOH(pH 8.5)中的储备溶液且储存于-20℃。在使用之前，用聚集缓冲液(50mM磷酸钠、100mM NaCl(pH5)、0.02%NaN3)将A-β(1-40)储备溶液稀释至56μM。使用介于56μM与7μM之间的浓度，测试呈一系列于D-PBS中的稀释液形式的Fab片段及VHH。混合(一式三份)等体积(20μl)的56μM A-β(1-40)溶液与抗体/VHH样品或适当阴性对照，且在37℃在黑暗环境中在低黏着力微量离心管中培育混合物48小时。将30μl培育样品转移至黑色96孔平底聚丙烯培养板(Greiner Bio-One)中后，添加250μl 2.5μm ThT(用25mM甘氨酸-NaOH稀释的储备溶液)溶液且测量荧光信号(Envision，PerkinElmer)。在竞争者不存在下测量的A-β(1-40)的最大荧光信号设定为100%聚集(或0%抑制)。在所测试的最高VHH浓度(28μM)下的最大抑制以至少两个独立实验的平均值来计算。虽然对非相关(非A-β特异性)VHH检测到约25%的一致背景抑制，但单价Fab片段3D6及266显示可再现的剂量依赖性抑制，其中最大抑制分别为79%及85%。在所测试的VHH组中，14D4、35C7、35G2、35D2、42B10、42F5、42E10及60A10分别显示肽聚集的78%、82%、76%、73%、77%、79%、75%及80%的一致抑制(高于由非特异性对照VHH诱导的25%背景抑制)。
实施例4：VHH的亲和力成熟
将VHH ABII42D4进行两轮亲和力成熟。在第一轮中，个别CDR残基突变为所有其他19种氨基酸。靶向以下残基：CDR1：G26-G35；CDR2：V51-N58；和CDR3：H95-Y102(根据Kabat编号)。在基于PCR的方法中，使用在突变位置含有NNS密码子的简并寡核苷酸进行突变诱发。汇集各CDR的PCR产物，且通过独特限制性位点插入至ABII42D4基因模板中。使用源自pUC119的表达载体，产生呈重组蛋白质形式的个别突变体，该载体含有LacZ启动子、卡那霉素抗性基因、多克隆位点和ompA前导序列(pAX100)。用表达载体文库使大肠杆菌TG1细胞转化，并涂覆于琼脂培养板(LB+Amp+2%葡萄糖)上。自该琼脂培养板挑取单一群落，并在1ml 96深孔板中生长。通过添加IPTG(1mM)诱导VHH表达。根据标准方法制备外周胞质提取物(体积为约80μl)，如前文所述(实施例2)在ELISA中和在Biacore解离速率检测中针对与A-β(1-40)的结合进行筛选。6个位置的突变(S30、T57、L97、T100b、S100c、G100e)使解离速率略有(约2倍)改良。
在第二轮中，通过同时随机化第一轮中所鉴别的6个易受影响位置形成组合性文库。为此，通过重叠PCR，在随机化位置使用简并寡核苷酸(NNS)合成全长ABII42D4基因，并进行援救PCR。将随机化的ABII42D4基因插入噬菌体展示载体(pAX50)中，得到6×10E7的功能文库尺寸。根据标准方案制备噬菌体。使噬菌体文库经受使用用于捕捉步骤的涂有链亲和素的磁性珠粒(Dynal)，针对(生物素标记)单体A-β(1-40)的三轮液相选择。以第一轮50nM的抗原浓度开始，抗原浓度在每一轮降低10倍。用胰蛋白酶(1mg/ml)洗脱结合的噬菌体30分钟，并使噬菌体输出物感染于大肠杆菌TG1中以制备个别VHH克隆的外周胞质提取物。在ELISA中和在Biacore解离速率检测(实施例2)中针对与A-β(1-40)的结合的筛选鉴别解离速率改良高达10倍的克隆。将最佳ABII42D4变异体克隆至表达载体pAX100中，与C端C-myc标记及(His)6标记同框。在大肠杆菌中产生呈His6标记的蛋白质形式的VHH且通过固定金属亲和色谱(IMAC)及尺寸排阻色谱(SEC)纯化。通过表面等离子共振(Biacore)测定经纯化VHH的亲和力且在ABII42D4TR-FRET竞争检测(实施例3.2)中测定IC50值。
试图进一步改良结合亲和力，使用变异ABIIPMP111B5作为模板且逐一引入在克隆ABIIPMP111E4和ABIIPMP111B4中所发现的趋异突变(divergentmutation)。在大肠杆菌中产生所得变异体且如前文所述表征。ABII111B5M107R、ABII111B5M107E和ABII111B5E109Q经鉴别为IC50与KD相对于初始ABII42D4皆改良超过10倍的最佳变异体。关于上文所提及的变异体的序列信息及生物学数据概括于上表VII中(第1列：42D4：第2至9列：自最初两轮亲和力成熟产生的适用克隆；第10至18列：自其他靶向突变得到的适用克隆)。
实施例5：VHH的人源化
针对人生殖系VH序列数据库，对于抗A-βVHH ABII111B5M107R(=ABII002；SEQ ID NO:62)和抗A-βVHH ABII60A10(=ABII050；SEQ IDNO:100)的氨基酸序列进行Blast操作。人生殖系VH3-23序列(DP47；SEQ IDNO:140)与JH5的组合显示与两种VHH序列的序列一致性最高。
序列DP-47/VH3-23：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK(SEQ IDNO：140)
序列JH5：
NWFDSWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：153)
出于人源化目的，分别取代ABII002和ABII050的17个及10个氨基酸残基，从而形成各VHH的许多不同变异体。使用PCR重叠延伸方法，由寡核苷酸组装所有变异体，将所述变异体克隆至表达载体(pAX100)中，并在大肠杆菌中产生。关于所得ABII002变异体(亦即ABII003至ABII037)及所得ABII0050变异体(亦即ABII051至ABII061)的序列信息及结合数据概括于上表VII中(分别为第19至53列及第55列至最后的第65列)。另外表XII列出ABII002至ABII036及ABII050至ABII060的人源化程度。
表XII：ABII002和ABII050的人源化变异体
根据概括于上表VII和XII中的生物学数据，其中所列出的所有VHH变异体均可(至少作为中间物)用于构建本发明的多肽。具体而言，对于人用用途，优选为人源化VHH变异体ABII003至ABII037和ABII051至ABII061。显示高度人源化但保持其结合性质的尤其有用的变异体为源自初始克隆42D4的ABII035及源自初始克隆60A10的ABII059。ABII035结合至A-β的N端抗原表位且包含CDR序列SEQ ID NO:14至16。ABII059结合至中心抗原表位且包含CDR序列SEQ ID NO:17至19。
实施例6：人源化VHH与参考VHH的比较
测试经纯化的抗A-β参考VHH(实施例3.2，表XI)与涂有在C端经生物素化的单体A-β(1-40)的SA感应芯片的结合，如实施例3中所述。虽然ABII035和ABII059分别在11nM及3nM的注射浓度下显示RU含量>50，但VHH 1B、11G、8B、4D、3A和VHH31-1在1000nM的浓度下在所测试条件下均未显示与感应芯片的结合(>10RU)。在相同实验中，参考VHH 2G6和2D2分别在1000nM和100nM注射浓度下显示RU含量>50，因此效能远低于ABII035和ABII059。在实验期间未检测到表面降解的迹象。随后，亦在多个ELISA设置下(实施例3中所述的检测)检验此组参考VHH与单体A-β的结合，其中使用肽格式的不同呈递形式，例如捕捉的A-β(1-40)(在C端或N端经生物素化)、直接固定的A-β(1-40)和A-β(1-42)、GST-A-β(1-42)或A-β(1-42)-GST(在1μg/ml浓度下捕捉)。对于参考VHH 1B、11G、8B、4D、3A，未检测到与单体A-β的结合。在BAA ELISA中，仅参考VHH 8B在高于1000nM的VHH浓度下显示结合至聚集A-β。与2D2和2G6VHH相比，ABII035和ABII059VHH显示EC50值高50倍以上。结果概括于表XIIa中。
表XIIa：源自42D4及60A10的VHH的结合特征与参考抗A-βVHH的结合特征的比较
ND：未测出；*：由外推曲线计算IC50
实施例7：抗人A-βVHH与啮齿动物A-β的结合(ELISA和Biacore)
在ELISA中评估如上文所获得的VHH与啮齿动物A-β的结合。将小鼠(Bachem)或人A-β(1-40)(Anaspec)以2μg/ml涂布于Maxisorp培养板上，且出于比较目的，通过小鼠抗myc抗体及抗小鼠-HRP结合物(DAKO)检测VHH及Fab片段的结合。测定3D6的Fab片段、VHH ABII002及VHH ABII035的EC50值。结果列于下表XIII中(最少两个独立实验的平均值)。
表XIII：结合于人和小鼠A-β的EC50值
虽然3D6Fab片段与小鼠A-β的结合显著小于与人A-β的结合(相差26倍)，但ABII002和ABII035同等良好地结合于两者(分别相差1.8及2.2倍)，此表明ABII002及其人源化衍生物ABII035所识别的抗原表位不同于3D6所识别的抗原表位。
在Biacore上，使用直接涂布于芯片上的非生物素化的肽进一步评估VHH与小鼠及人A-β的结合。对于人源化之前及之后的VHH，未检测到对人及啮齿动物A-β肽的亲和力的差异。
实施例8：双互补位抗A-βVHH构建体的产生及表征
VHH ABII42D4(识别A-β肽的N端区域)与VHH ABII60A10(识别中心区域)通过可挠性甘氨酸-丝氨酸接头(例如9GS：GGGGSGGGG；SEQ IDNO:141)融合，形成二价VHH构建体。更详细地研究接头长度及方向不同的四种双互补位构建体(包含两个具有不同抗原表位特异性的VHH域)：ABII42D4-25GS-ABII60A10、ABII60A10-25GS-ABII42D4、ABII42D4-35GS-ABII60A10和ABII60A10-35GS-ABII42D4，且与各别VHH二聚体(包含两个相同VHH域，例如二价ABII42D4-9GS-ABII42D4构建体)相比。在大肠杆菌TG1细胞中产生双互补位及二聚/二价VHH并使用亲和色谱(IMAC或蛋白A)及尺寸排阻色谱(Superdex75或Sephacryl S100)纯化，使纯度≥95％，如通过SDS-PAGE所评估。
8.1TR-FRET结合测试：使用ABII42D4和ABII60A10TR-FRET检测(实施例3.2)评估双互补位VHH构建体与A-β(1-40)的结合。虽然二价ABII42D4-9GS-ABII42D4构建体仅显示IC50略有改良(相对于单价ABII42D4改良3.2倍)，但出乎意料地发现该双互补位VHH与A-β肽的结合显著强于与单价构建模块及3D6和m266Fab片段(表XIV)以及3D6和m266IgG(3D6及m266全长单克隆抗体)的结合。发现具有不同接头长度及方向的构建体之间无效能差异。
表XIV：在ABII42D4和ABII60A 10TR-FRET检测中双互补位抗A-βVHH构建体及比较实施例的IC50值
8.2结合模式的测定：为了研究该双互补位构建体的结合模式，评估两种VHH构建模块是否可同时结合于同一肽分子。在夹心式ELISA中，将未标记的ABII60A10或his标记的ABII42D4涂布于Maxisorp培养板上，并与A-β(1-40)肽一起培育。接着将所得VHH-肽复合物与识别N端或中心A-β肽抗原表位的c-myc标记的VHH一起培育。如前文所述(实施例2)通过c-myc进行检测。对于两种设置皆可见结合，此表明识别N端抗原表位或中心抗原表位的这两种VHH可同时结合于A-β肽。
通过基于SPR检测的结合模式的测定：如前文所述(实施例2)将在C端经生物素化的A-β(1-40)固定于感应芯片上。ABII60A10以饱和浓度500nM注射，且观察到与A-β(1-40)的结合。120秒后，共注射200nM ABII42D4与500nM ABII60A10，产生额外结合。单独500nM 60A10的对照注射未产生任何额外结合，这表明所观察到的额外结合是由ABII42D4-A-β相互作用引起的。
使用尺寸排阻色谱的结合模式的测定：当分子通过装填于柱中的凝胶过滤介质时，尺寸排阻色谱(SEC)根据尺寸差异分离分子。双互补位VHH构建体与其靶标的结合模式可通过在培育1:2摩尔比的各别VHH构建体与靶标蛋白质之后通过分析蛋白质复合物来鉴定。因此，通过SEC分离混合物，且通过蛋白凝胶电泳分析所得峰的内含物。A-β(1-28)-p38融合蛋白(计算分子量为46kDa)在SEC中以单体形式过柱。与人血清白蛋白融合的双互补位VHH(60A10-27GS-42D4-Alb)的计算分子量为95kDa。为鉴别双互补位VHH是结合一个(=分子内结合)还是两个(=分子间结合)A-β(1-28)-p38融合蛋白，混合1:2摩尔比的VHH与靶标蛋白，在4℃培育过夜且施加至使用(GE Healthcare，USA)与制备型尺寸排阻柱(HiLoad 26/60Superdex 200prepgrade，GE Heaithcare，USA)的组合的SEC上，以使蛋白复合物与单一蛋白分离。凝胶过滤产生两个峰，其进一步通过SDS-PAGE使用自动化电泳工作站Experion(Bio-Rad，USA)及合适的芯片(Pro260芯片，Bio-Rad，USA)分析。在Experion上的分析显示主峰含有VHH及A-β(1-28)-p38融合蛋白，而较小峰仅含A-β(1-28)-p38融合蛋白。使用Experion数据分析软件测定复合物中VHH及A-β(1-28)-p38融合蛋白的量。用Experion测量的蛋白质的分子量，A-β-p38融合蛋白为53kDa，且60A10-27GS-42D4-Alb蛋白质为101kDa。A-β(1-28)-p38融合蛋白及60A10-27GS-42D4-Alb蛋白的所测量浓度及由此所计算摩尔浓度分别为0.87μM及0.86μM。因此，所分析的蛋白质复合物中A-β(1-28)-p38与60A10-27GS-42D4-Alb的比率为约1:1，尽管其以1:2的摩尔比混合。由此结果可推断一个双互补位VHH结合同一个A-β分子中A-β肽分子的两个抗原表位，且因此不(或至少主要不)通过A-β分子通过二价VHH构建体交联起作用。
8.3结晶研究：为了结晶，将ABII035和ABII059(各为160μM)与3倍摩尔浓度过量的人A-β肽(残基1-24)一起培育16小时，且通过尺寸排阻色谱纯化复合物。通过透析过滤法至4mg/ml的浓度来浓缩复合物。结晶试验设置为通过相对于100μl的储集容积混合200nl蛋白质与200nl储集溶液进行的沉滴气相扩散实验。在各种不同条件下若干天出现晶体，其中使用以下测定结构：100mM MMT缓冲液(pH 5)、25%PEG1500。用低温保护剂(85mMMMT缓冲液(pH 5)、35%PEG1500)处理晶体且用液氮快速冷冻。在保罗谢勒研究所(Paul-Scherrer Institute)(Villigen，Switzerland)在瑞士光源(swiss lightsource)的光束线6SA下收集资料。
在晶体结构中，ABII035、ABII059和源自人A-β肽的肽(残基1.24)的一个分子形成三元复合物。此复合物通过两个A-β肽分子所形成的反向平行β折叠发生二聚。晶体的不对称单元由两个这些结构占据，总计为各A-β肽、ABII035及ABII059四个分子。A-β的残基1至9采用α螺旋构象，残基10至20形成β链。A-β的残基1至14接近于ABII035且其中Asp1、Ala2、Glu3、Phe4、Asp7及His14直接接触ABII035。A-β的残基15至24接近于ABII059且其中Gln15、Lys16、Val18、Phe19、Phe20、Glu22及Asp23直接接触ABII059。
除以上外，由晶体结构可清楚ABII035和ABII059可同时结合于同一个A-β分子，此证实如以上实施例8.2中所获得的结果。
此外，如通过以上晶体结构数据所证明，ABII035与源自A-β的肽的相互作用模式与如以上实施例7中所述的观察结果一致：ABII035显示对啮齿动物A-β肽的良好物种交叉反应性。人与啮齿动物A-β之间的唯一序列差异为R5G、Y10F和H13R。根据以上资料，这些残基均不与VHH形成接触。因此，推测啮齿动物A-β可以与人A-β相同的构象结合于ABII035，从而使其尤其适用作用于涉及啮齿动物动物模型(产生啮齿动物A-β肽)(例如小鼠或大鼠)的检测的工具试剂(研究工具)。
实施例9：半衰期延长的人源化双互补位抗A-βVHH构建体的产生及表征
9.1构建体ABII314至ABII323的产生：为了使用人源化双互补位VHH构建体的活体内验证研究，开发不同半衰期延长(HLE)策略：1)与结合VHH的白蛋白的遗传融合(例如WO 2004/041865中所述)；2)位于VHH中间或VHHC端的接头中的Cys残基的聚乙二醇化(WO 2008/142164)；及3)与人或小鼠血清白蛋白的遗传融合。使用包含ABII035和ABII059VHH域/构建模块的双互补位VHH构建体研究不同HLE策略。通过基因组装，使用适当重叠寡核苷酸组产生构建体ABII314至ABII323。ABII314至ABII323的序列ID及氨基酸序列列于表XV中。在构建体ABII314、ABII315、ABII322和ABII323中，构建模块ABII059通过不同长度的Gly-Ser接头与ABII035融合(如表XV中所指示)，该接头含有半胱氨酸残基用于与PEG结合(在如表XV中所指示的位置)。构建体ABII316至ABII321由处于不同方向且由9-GS或35-GS接头隔开的遗传连接的VHH ABII035、ABII059和ALB8(具有小鼠白蛋白交叉反应性的人源化抗人白蛋白VHH)组成。下表XV中所示的构建体可任选另外包括六组氨酸标记和/或其他标记以例如有助于所得多肽的纯化。
表XV：双互补位VHH构建体ABII314至ABII323
9.2半衰期延长的人源化双互补位VHH构建体的产生、纯化及聚乙二醇化：通过亲和色谱(IMAC或蛋白A)、阳离子交换色谱(SP Sepharose、Source30S或POROS 50HS)及尺寸排阻色谱(Superdex75或Sephacryl S100)纯化His6标记的双互补位VHH构建体ABII314、ABII315、ABII322和ABII323。在最小90%的蛋白纯度(先后通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝(Coomassie BrilliantBlue)染色测定)时，进行聚乙二醇化。VHH的分子间S-S键首先通过添加DL-二硫苏糖醇溶液(DTT)至10mM的最终浓度，随后通过在室温培育2至3小时或在4℃培育过夜来还原。随后通过尺寸排阻色谱(Superdex 75/200)以D-PBS操作缓冲液移除还原剂，收集主峰。在移除还原剂后立刻将双互补位多肽构建体与5倍摩尔浓度过量的PEG一起在室温培育1小时或在4℃培育过夜。通过阳离子交换色谱(MacroCap SP)使聚乙二醇化多肽与游离PEG及未聚乙二醇化多肽分离。通过制备型尺寸排阻色谱，在Superdex200或SephacrylS200上进行最后精制(polishing)步骤及将缓冲液更换成D-PBS。如前文由Natarajan等人(1995)Bioconjugate chemistry 16：113-121所述，通过SDS-PAGE，随后通过CBB染色及PEG染色来检验经纯化的聚乙二醇化多肽的品质。
9.3通过TR-FRET表征半衰期延长的人源化双互补位抗A-βVHH构建体：为比较上述半衰期延长的双互补位VHH构建体的结合性质与单克隆抗体(IgG)3D6及m266的结合性质，在ABII002和ABII050竞争TR-FRET检测中测试ABII315至ABII320、ABII322和ABII323(参见实施例8.1及3.2)。来源于至少两个独立实验的平均IC50概括于表XVI中。
表XVI：在白蛋白不存在/存在下半衰期延长的抗A-β双互补位VHH的IC50值
NC：未检测到竞争
MSA：小鼠血清白蛋白
MSA_D3：小鼠血清白蛋白的域III
在ABII002TR-FRET竞争检测中，与3D6IgG(IC50为1.9nM)相比，所有测试的半衰期延长的VHH构建体均显示效能高度改良6.5倍至14.6倍(对于ABII315-PEG20而言)。在ABII050TR-FRET竞争检测中，与IgG m266相比，所有VHH构建体均显示显著更佳的IC50值，其中VHH ABII320具有0.21nM的最低IC50，相对于IgG266改良2.5倍。
在ABII002TR-FRET竞争检测中，与单价VHH ABII035的效能相比，具有最高效能的特制VHH构建体(ABII315-PEG20)显示IC50改良27倍。在ABII050TR-FRET竞争检测中，VHH构建体ABII320显示相对于单价ABII059效能改良61倍。
双互补位构建体相对于单体构建模块ABII035和ABII059的效能增加证实了由非人源化、非成熟构建体(实施例8.1)获得的结果且证明一个双互补位VHH构建体与一个A-β肽分子的分子内结合的假设(参考以上实施例8.2)。此外，这些实验证明应用于如上文所述的VHH构建体的半衰期延长技术不会干扰构建体与A-β肽的结合。
为评估含有ALB8的VHH构建体与A-β肽的结合是否受HAS(如存在于血流中)影响，在存在及不存在微摩尔量的白蛋白的两种竞争TR-FRET检测中测试与ABII316-ABII320等效但含有非人源化VHH构建模块的双互补位构建体。在两种检测模式下，在TR-FRET检测中，与6.5-10μM人、狗或牛白蛋白(后两种白蛋白变异体显示不可检测的与ALB8的相互作用)一起预培育不影响效能。
为测试在双互补位VHH构建体的情形下ALB8是否仍可结合于白蛋白，对结合于涂有HSA的芯片的VHH构建体进行动力学分析(Biacore)。测得所测试的单价ALB8及ALB8融合构建体的亲和力类似，此表明ALB8构建模块的HSA结合不受影响。
9.4A-β原纤维形成的抑制：在另一实验中，评估一系列双互补位VHH构建体ABII320稀释液抑制活体外A-β原纤维形成的能力，如实施例3.5所述，且与其单价构建模块ABII035和ABII059及对照抗体的活性进行比较。在所测试的VHH构建体的最高浓度(26μM)下的最大抑制以两个独立实验的平均值来计算。虽然当使用非相关(非A-β特异性)VHH作为对照时，检测到约17%的一致背景抑制，但单价3D6及m266Fab片段显示可再现的剂量依赖性抑制，其中最大抑制为82%。(完整)IgG 3D6和m266分别导致75%和83%抑制。单价VHH ABII035和ABII059分别显示为54%和80%的最大抑制，而半衰期延长的双互补位VHH构建体ABII320在26μM下显示84%的最大抑制能力。
9.5与可溶性APP-α的结合：可溶性APP-α(sAPPα)通过α-分泌酶活性自其细胞结合前体蛋白APP而释放。虽然sAPPα的氨基酸序列含有A-β肽的头16个氨基酸残基，但不含有正确的3D6抗原表位，因为A-β肽中的游离N端氨基酸残基为完整3D6相互作用所必需的。抗原表位定位表明，与单克隆抗体3D6相比，N端区域特异性VHH ABII001及其衍生物与不同抗原表位相互作用。使用基于TR-FRET的检测设置，测试与A-β相比VHH与sAPPα的结合。将最终浓度为0.82nM的生物素化的sAPPα(Sigma)与相同浓度的标记链亲和素-铕的珠粒及4.4nM标记AlexaFluor 647的ABII320混合。测试以下未经标记的化合物的竞争情况：ABII320、sAPPα、IgG m266、IgG 3D6、ABII035和A-β(1-40)。应用一系列竞争化合物稀释液，进行两个独立实验。未经标记的ABII320、ABII035、A-β(1-40)和sAPP α的平均IC50值分别为0.72nM、25.6nM、0.23nM和14nM。正如所期望的，对于IgG m266和IgG 3D6未观察到竞争。在此检测设置中，ABII320与A-β(1-40)的相互作用为与sAPPα的相互作用的63倍。在使用生物素化的A-β(1-40)而非生物素化的sAPPα的平行设置下，ABII320与A-β(1-40)的相互作用为与sAPPα的相互作用的至少20000倍(基于在较高浓度下外推的数据估计IC50)，此表明相对于sAPPα，ABII320优先结合于A-β(1-40)。
9.6用于双互补位VHH构建体的抗原表位定位：使用以肽微点阵(PepStarTM)形式呈现的源自A-β(1-42)的肽测定VHH的抗原表位。PepStarTM肽微点阵(JPT Peptide Technologies，Germany)为用于快速筛选载玻片上所呈现的抗体/VHH肽相互作用所定制的肽微点阵组。微点阵的肽表示源自通过N端固定的A-β(1-42)的一级结构的12/11扫描。另外，通过其C端固定表示A-β(1-42)的头16个至头7个氨基酸的N端截短肽。与VHH一起培育后，结合事件可通过读取针对VHH的经标记二次抗体的荧光强度来检测。
在4℃用阻断缓冲液(PBS、1%BSA、0.1%Tween20)阻断微点阵过夜后，在4℃将其与200μl浓度为5μg/ml的含双互补位VHH构建体ABII320的洗涤缓冲液(PBS、5mM DTT、0.05%Triton X-100、5%甘油、1%BSA)一起培育2小时。为移除过量VHH，将微点阵与洗涤缓冲液一起在冰上培育三次，每次两分钟。随后，在4℃在浓度为0.5μg/ml的洗涤缓冲液中将微点阵与抗VHHAlexa Fluor 647(Boehringer Ingelheim Pharma GmbH＆Co KG，Germany)一起培育1小时。抗VHH源自用VHH二聚体G6-G6免疫后的山羊血清。通过将微点阵与洗涤缓冲液一起在冰上培育三次(每次两分钟)来移除未结合的二级抗体。最后，在离心机中以800×g干燥载玻片三分钟，并用Perkin Elmer的ProScanArray使用633nm激光扫描。用Perkin Elmer的ScanArray软件分析数据。
结果，获得直径为420μm的肽斑点，分析其荧光强度，由此可以以半定量方式评估VHH与肽的相互作用。因此，将双互补位VHH构建体ABII320与肽微点阵一起培育显示了ABII320与A-β肽的残基1-11和15-24相互作用。丙氨酸扫描表明，A-β肽的残基Asp1、Glu3、Phe19、Phe20和Asp23为双互补位VHH的结合所必需的，此与自晶体结构分析获得的数据一致。使用包括ABII035和ABII059VHH域的两种其他双互补位VHH构建体获得相同结果。
9.7使用动力学排除检测(KinExA)测定结合常数；使用KinExA(动力学排除检测)测定三种双互补位VHH构建体对A-β肽的亲和力。KinExA为能够测量溶液相中未经修饰的分子的技术(Darling，R.J.和Brault，P.-A.：Kineticexclusion assay technology：Characterization of Molecular Interactions；Assay andDrug Development Technologies 2(6)：647(2004))。KinExA方法测量VHH、抗原及VHH-抗原复合物的混合物中未复合VHH分子的浓度。通过将溶液相混合物暴露于固相固定抗原极短时间来测量未复合VHH的浓度。液相混合物与固相固定抗原之间的“接触时间”保持足够短，以使得VHH-抗原复合物不显著解离。当在动力学上排除VHH-抗原复合物的显著解离的可能性时，仅未复合(“游离”)VHH可结合于固相。结合于固相的游离VHH的量(通过来自二级标记的荧光发射测量)与液相样品中游离VHH浓度成正比。
使用A-β(1-28)肽(Anaspec，USA)作为与双互补位VHH一起培育的抗原。使用融合蛋白“HiS.Xa.Aβ1-28.GS.p38”制备用于结合未复合VHH的固相。该融合蛋白的结构如下：His标记、因子Xa裂解位点、A-β(1-28)肽、GS接头、鼠类p38α且具有以下序列：
MHHHHHHIEGRDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGGSGGSQERPTFYRQELNKTIWEVPERYQNLSPVGSGAYGSVCAAFDTKTGHRVAVKKLSRPFQSIIHAKRTYRELRLLKHMKHENVIGLLDVFTPARSLEEFNDVYLVTHLMGADLNNIVKCQKLTDDHVQFLIYQILRGLKYIHSADIIHRDLKPSNLAVNEDCELKILDFGLARHTDDEMTGYVATRWYRAPEIMLNWMHYNQTVDIWSVGCIMAELLTGRTLFPGTDHIDQLKLILRLVGTPGAELLKKISSESARNYIQSLAQMPKMNFANVFIGANPLAVDLLEKMLVLDSDKRITAAQALAHAYFAQYHDPDDEPVADPYDQSFESRDLLIDEWKSLTYDEVISFVPPPLDQEEMES(SEQ ID NO：144).
融合蛋白在大肠杆菌中表达，使用Ni-NTA(Qiagen，Germany)纯化且用碘乙酰胺(Sigma，USA)烷基化。用含0.02%NaN3的PBS中的融合蛋白涂布聚甲基丙烯酸甲酯珠粒(Sapidyne Instruments Inc.，USA)，用含1%BSA的相同缓冲液阻断且作为固相用于所有实验。用KinExA 3000及KinExA Pro软件(Sapidyne Instruments Inc.，USA)在室温(约21℃)进行KinExA实验。使用含0.02%NaN3的PBS作为操作缓冲液。对于所有实验而言，在恒定VHH浓度下，用含0.1%BSA和0.02%NaN3的PBS连续稀释抗原。在室温培育抗原与VHH的混合物24小时，随后进行测量。用于所有实验的样品及标记抗体的流速为0.25ml/分钟。
用于测量ABII320VHH构建体(第一VHH构建体)的第二荧光标记抗体为以上9.6中所述的结合Alexa 647的山羊抗G6G6(抗VHH)。此抗体以体积为500μl以及在PBS(含0.1%BSA及0.02%NaN3)中浓度为0.5μg/ml使用。ABII320另外如存在重组人白蛋白(albcultTM，novozymes，USA)时所述测量。在仪器第13行，使用500μl于含0.1%BSA及0.02%NaN3的PBS中浓度为0.1μg/ml的兔抗PEG(Epitomics Inc.，USA)与250μl于相同缓冲液中浓度为0.25μg/ml的结合Alexa 647的山羊抗兔(Molecular Probes Inc.，USA)组合，测定聚乙二醇化ABII322VHH构建体(第二VHH构建体)与固相的结合。在仪器第13行，使用500μl于含0.1%BSA及0.02%NaN3的PBS中浓度为0.5μg/ml的山羊抗HSA(Bethyl Laboratories Inc.，USA)与500μl于相同缓冲液中浓度为0.5μg/ml的结合Alexa 647的兔抗山羊(Molecular Probes Inc.，USA)组合，测定上表IV中所示的HSA-双互补位VHH构建体融合蛋白(SEQ IDNO:32；第三VHH构建体)与固相的结合。
使用KinExA Pro软件1.0.3版(Sapidyne Instruments Inc.，USA)使平衡滴定数据拟合至1:1结合模型。在3、5及10pM的浓度下测量第一VHH构建体(双互补位VHH ABII320)。样品体积各为5ml。在1%重组人白蛋白存在下所测量的KD为1.1±0.3pM和0.4±0.1pM。在3、4、5及6pM的浓度下测量第二VHH构建体(双互补位聚乙二醇化VHH ABII322)。样品体积各为11ml。所测量的KD为0.6±0.2pM。在2、3及4pM的浓度下测量第三VHH构建体(HSA-VHH融合蛋白)。样品体积各为5ml。所测量的KD为0.5±0.3pM。
9.8与焦谷氨酰基-Aβ的结合：焦谷氨酰基(pGlu)-A-β为阿尔茨海默氏病的神经炎斑块的主要组分。其是由谷氨酰基环化酶(QC)催化位置3的N端谷氨酸环化，产生A-β的极促淀粉样变异体来形成。pGlu-A-β的氨基酸序列含有A-β肽的氨基酸残基3-42。丢失为与抗体3D6的完整相互作用所必需的N端头两个氨基酸。通过表面等离子共振(Biacore)，使用如前文所述(实施例2)捕捉于链亲和素感应芯片上的在C端经生物素化的pGlu-A-β(1-28)测定对pGlu-A-β-ABII320/ABII322/m266/3D6相互作用的亲和力。注射9种不同浓度(ABII320介于0.195nM与50nM之间，ABII322为0.39-100nM且3D6及m266为0.782-200nM)的经纯化的多肽ABII320或ABII322或抗体m266或3D6，持续3分钟，且使其解离10分钟。可使用1:1相互作用模型拟合缔合及解离曲线且测定精确KD值。发现亲和力对于ABII320为2nM，对于ABII322为1nM，对于抗体m266为224pM且对于抗体3D6未观察到结合。
实施例10：抗A-βVHH与淀粉样斑的结合
在组织淀粉样斑免疫应答性(TAPIR)检测中，根据结合于Tg2576小鼠脑切片中的淀粉样斑的能力，对VHH作概况分析。该TAPIR检测允许VHH的定性(致密中心和/或弥漫性淀粉样斑)以及定量评估(最低有效剂量MED)。为了该检测，制备斑块阳性小鼠的低温切割的冠状切片，封固于76×26mmSuperfrost载片(Roth)上且储存于-20℃。解冻低温切片20分钟，在冰上固定于3%多聚甲醛(PFA)中10分钟。接着将切片于0.3%过氧化氢中培育30分钟，用含有2.5%牛血清白蛋白(BSA)及2%小鼠血清的PBS阻断1.5小时，且与不同浓度(3.0mg/ml至4.11ng/ml)的myc标记的VHH或Fab一起培育，溶解于含有2.5%BSA的PBS中。接着将切片与10mg/ml生物素化的小鼠抗c-myc单克隆抗体(9E10)(Sigma-Aldrich)一起培育1.5小时，溶解于含有2.5%BSA的PBS中(除了与生物素化的ABII320一起培育的切片)。将切片与根据制造商的说明书制备的Vectastain ABC ELITE试剂盒溶液(Vector Laboratories)一起培育1.5小时，且使用根据制造商的说明书制备的Vector VIP SK 4600溶液(Vector Laboratories)目测。通过在60%、80%及100%乙醇及100%异丙醇中培育5分钟使切片逐渐脱水，且用二甲苯清洁5分钟。接着用Entellan新封固介质(Merck)封固切片，并用24×50mm盖玻片(Menzel-Glaeser)覆盖。结果概括于下表中。
除上述ABII320以及单克隆抗体m266的Fab片段外，在以上TAPIR检测中分析若干种其他(myc标记的)双互补位VHH构建体。VHH构建体ABII300至ABII305的结构见于下表XVII中，且在所有情况下均包括呈不同顺序且与结合VHH域(ABII300至ABII304)的白蛋白或PEG40部分(ABII305)组合的VHH域ABII002(SEQ ID NO:62)及ABII050(SEQ ID NO:100)。
由所述结果可见双互补位VHH ABII300、ABII301、ABII302、ABII303及ABII304以及ABII305-PEG40显示在TAPIR检测中显示对真正组织淀粉样斑(致密中心及弥漫型斑块)的亲和力相同。接头或与PEG40结合的具体顺序似乎对斑块亲和力不具有显著作用。
表XVII：双互补位VHH构建体ABII300至305的结构及TAPIR检测中所获得的结果
实施例11：半衰期延长的双互补位抗A-βVHH构建体的药效学
为了测定VHH的药代动力学及药效学性质，将样品经静脉内或腹膜内注入APP转基因小鼠。通过使隐静脉(V.saphena)出血来获得血浆样品。在施用VHH、IgG或载体之前获得给药前样品及在施用后4及24小时获得样品。
因为VHH及IgG的结合干扰ELISA检测，所以使A-β:VHH或A-β:IgG复合物在检测之前变性以检测血浆A-β(1-40)的总量。简言之，用6M GuHCl(Sigma Aldrich)使样品变性且通过固相提取柱纯化。60mg Oasis HLB 96孔板(Waters)设定为连接于室内真空的提取板歧管(Waters)。先后用1mL甲醇(MeOH)和1mL H2O活化柱。装载GuHCl经萃取的样品且依次用1mL体积的5%及30%MeOH洗涤，接着用含2%NH4OH的90%MeOH洗脱A-β。收集洗脱的样品且在1400rpm、60℃真空离心(EppendorfVacufuge)90分钟。一旦样品完全干燥，则用阻断缓冲液复原且储存于-20℃直至分析。根据制造商的说明书，通过夹心式ELISA(4G8/抗A-β(1-40)，mesoscale discoveries)测定A-β(1-40)的总血浆含量。
APP转基因小鼠的血浆中，给药前总A-β(1-40)含量为约1.25nM。在注射15nmol/kg双互补位VHH或IgG(相同剂量，针对结合位点校正)的这些小鼠中，血浆中总A-β含量在静脉内施用后约4小时达到峰值。数据以“相对于给药前的增加倍数”表示，其中用注射后4及24小时所测定的A-β(1-40)血浆浓度除以给药前含量。结果见于表XVIII中。
表XVIII：与抗A-β抗体3D6及m266相比，静脉内注射抗A-βVHH后血浆A-β(1-40)的增加倍数及AUD
*当针对结合位点计算(每一IgG分子2个)时为15nmol/kg
因此，与本领域中已知的IgG分子相比，双互补位VHH构建体有潜力显示总血浆A-β(4小时)峰浓度升高50%且AUD值增加>2倍，这表明这些VHH构建体相对于IgG在捕捉A-β方面的优势。
为证实游离/未结合血浆A-β的含量在给予VHH构建体后降低，进行竞争ELISA。简言之，用A-β(1-40)特异性抗体偶合至ECL-ELISA培养板(mesoscale discoveries)以捕捉A-β(1-40)。根据制造商的手册，使用MSDSulfo-Tag NHS-Ester(mesoscale discoveries)标记用于以被动免疫疗法处理动物的VHH或IgG分子，且所述分子用作此夹心式ELISA格式中的检测工具。在这些设置下无法检测到结合于VHH或IgG的A-β(1-40)，而可检测到游离/未结合A-β(1-40)。为比较来自不同检测的数据，所有值均相对于来自载体处理组的数据进行校正。如所指示，用VHH或IgG处理APP转基因小鼠且收集血浆并分析游离/未结合A-β(1-40)。一旦在腹膜内注射132nmol/kg抗A-βVHH(分别为ABII320及ABII322)后达2小时，则游离/未结合A-β(1-40)的含量自基线含量(约2nM)剧烈且高度显著降至2pM的检测限以下。等剂量的3D6-IgG(10mg/kg，132nmol/kg结合位点=66nmol/kgIgG)能够使血浆中的未结合A-β(1-40)减至52pM的含量(图1)。在此比较中，双互补位VHH构建体ABII320及ABII322在相同剂量下显示使血浆中的游离/未结合A-β降低的程度出乎意料地比3D6IgG大得多，这再次表明相对于IgG(3D6)的A-β捕捉优势。此使得所述VHH构建体就VHH的治疗功效而言尤其适用。具体而言，预期血浆中的A-β的更有效耗竭可完全防止A-β自血浆流入脑中，由此在脑与血浆A-β池之间产生较陡的浓度梯度，从而加速A-β自脑流出并流入血浆中。
实施例12：穿过BBB的VHH
为进一步改良VHH构建体穿过血脑屏障(BBB)的特性，构建包含双互补位VHH及穿过BBB的VHH FC44及FC5的双特异性VHH(如WO2002/057445中详细描述)。这些VHH通过结合于表达于BBB上的靶标蛋白质来改良BBB穿透，随后VHH通过内皮细胞胞转并释放于脑实质中。因此，预期与FC44及FC5VHH遗传融合的VHH经历主动转运至脑中，导致脑含量较高及治疗性作用改良。包含FC44或FC5VHH的构建体ABII400-ABII407通过基因组装，使用适当重叠寡核苷酸组来产生。SEQ ID NO及氨基酸序列列于下表XIX中。总而言之，产生在ABII035与ABII059VHH构建模块之间或在结合VHH的HSA与ABII035或ABII059构建模块之间或在分子的氨基端或羧基端含有FC5或FC44VHH的VHH(参见表XIX)。VHH在大肠杆菌或巴斯德毕赤酵母中表达且如实施例9.2中所述纯化。如所述(WO2002/057445及其中其他参考文献)在活体外BBB穿透检测中评估经纯化的VHH。另外，活体内给药包含FC5及FC44构建模块的经放射性标记或未经放射性标记的VHH且使用液体闪烁计数法或ELISA测定脑含量。
表XIX：还包含FC5及FC44部分的双互补位抗A-βVHH构建体
实施例13：本发明的聚乙二醇化双互补位多肽的工业制备方法
13.1发酵：ABII305、ABII306、ABII314、ABII315、ABII322和ABII323中的任何多肽可在如W3110、TG1、BL21、BL21(DE3)、HMS174、HMS174(DE3)、MM294的不同大肠杆菌菌株的细胞质中在诱导性启动子的控制下表达。此启动子可选自lacUV5、tac、T7、trp、T5、araB。培养基优选完全根据以下文献定义：Wilms等人，2001(Wilms，B.，Hauck，A.，Reuss，M.，Syldatk，C.，Mattes，R.，Siemann，M.，和Altenbuchner，J.:High-Cell-DensityFermentation for Production of L-N-Carbamoylase Using an Expression SystemBased on the Escherichia coli rhaBAD Promoter.Biotechnology andBioengineering，73:95-103(2001))，DeLisa等人，1999(DeLisa，M.P.，Li，J.C.，Rao，G.，Weigand，W.A.，和Bentley，W.E.:Monitoring GFP-operon fusionprotein expression during high cell density cultivation of Escherichia coli using anon-line optical sensor.Biotechnology and Bioengineering，65:54-64.(1999))，或等效物。然而，用如异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸及缬氨酸的氨基酸或例如大豆蛋白胨或酵母提取物的复合培养基组分来补充培养基可为有益的。发酵过程以分批馈料模式进行。条件：温度30-40℃，pH 6-7.5，溶解氧保持在20%以上。消耗初始C源后，向培养物馈入上述馈料培养基(或等效物)。当发酵罐中的干细胞重量达到40g/L至90g/L时，用对应于所用启动子系统的适当诱导剂(例如IPTG、乳糖、阿拉伯糖)诱导培养物。该诱导可通过经长时间将各别诱导剂馈入发酵罐中，以脉冲完全诱导形式或部分诱导形式进行。产生阶段应持续至少4小时。通过在碗式(bowl)离心机、管碗式(tubular bowl)离心机或盘式堆叠(disc stack)离心机中离心来回收细胞，丢弃培养上清液。
13.2纯化：将大肠杆菌细胞块再悬浮于6至8倍量的溶解缓冲液(磷酸盐或Tris缓冲液，pH 7-8.5)中。细胞溶解优选通过高压均质化，随后通过在碗式离心机、管碗式离心机或盘式堆叠离心机中离心来移除细胞碎片而进行。任选使用0.22-10μm过滤器来过滤含有靶标蛋白质的上清液且在pH 7-8.5下通过阳离子交换色谱(例如ToyopearlII SP-550EC，ToyopearlGigaCap S-650M，SP Sepharose BB，SP Sepharose FF或S HyperCelTM)分离。在pH 7-8.5下通过线性递增的NaCl梯度进行洗脱。汇集含有靶标蛋白质的洗脱份，随后与5-10mM DTT一起培育，以防止由游离半胱氨酸残基介导的二聚或聚集。进一步添加0.8-1M硫酸铵或2-3M NaCl后，在pH 7-8.5下通过亲水性相互作用色谱(例如Phenyl Sepharose HP，Phenyl Sepharose FF，ButylSepharose HP，Butyl Sephrose FF，Butyl Toyopearl 650(S,M,C)，PhenylToyopearl 650(S,M,C))分离溶液。在pH 7-8.5下在5mM DTT存在下通过线性递减的硫酸铵或NaCl梯度进行洗脱。汇集纯度最小为90%的含有靶标蛋白质的洗脱份，且通过在5mM DTT存在下透滤来去盐，随后浓缩至约5mg/ml。随后通过用50mM Tris、150mM NaCl、4mM塞斯塔明(Cystamin)、10mMCHAPS(pH 8.5)以1:5-1:20将蛋白质溶液稀释至0.25-1mg/ml的最终蛋白质浓度进行再折叠。在室温在搅拌下培育再折叠溶液12-36小时、接着在pH 7-8.5下通过阳离子交换色谱(例如SP Sepharose FF，SP Sepharose HP，ToyopearlSP-650(S，M，C))分离。在pH 7-8.5下通过线性递增的NaCl梯度进行洗脱。汇集含有单体靶标蛋白质的洗脱份，且通过添加例如DTT、DTE或TCEP的还原剂进行活化以用于聚乙二醇化。随后在室温培育溶液2小时。相对于磷酸钠缓冲液(pH 6.5-7.5)或20mM HEPES缓冲液(pH 6.5-7.5)或Tris缓冲液(pH8.0)透滤及浓缩至5-10mg/ml后，添加40kDa顺丁烯二酰亚胺.聚乙二醇(PEG)(蛋白质与PEG之比为1:2-1:10)。在室温在搅拌下培育溶液3-18小时，随后使用0.22μm过滤器过滤。在pH 5-7下通过阳离子交换色谱(SP Sepharose HP，Toyopearl SP 650M，MacroCapTMSP，SourceTM30S或(M))将聚乙二醇化靶标蛋白质与游离PEG及未聚乙二醇化靶标蛋白质分离。通过线性递增的NaCl梯度进行洗脱。汇集含有单体聚乙二醇化靶标的洗脱份且通过透滤调配于25mM磷酸钠、220mM无内毒素海藻糖(pH 7.5)中。
实施例14：医药制剂和用途
14.1医药制剂：可选择任何本发明的人源化双互补位多肽构建体(例如ABII314至AbII323)用于制备供皮下施用的医药制剂，该医药制剂具有如下组成：
将药物物质配制于具有以上组成的溶液中，灭菌且储存于2℃至8℃。
14.2医药用途：通过每两至四周以1ml至2ml的体积(100mg至200mg的剂量)皮下注入腹部，将如根据以上14.1制备的溶液施用于有此需要的患者，例如罹患AD的人。

Claims (23)

1.一种多肽，其包含特异性结合于A-β的第一抗原表位的第一免疫球蛋白单一可变域和特异性结合于A-β的第二抗原表位的第二免疫球蛋白单一可变域，其中A-β的该第一抗原表位及该第二抗原表位不为相同抗原表位，其中所述第一免疫球蛋白可变域的CDR序列即CDR(1)序列和第二免疫球蛋白可变域的CDR序列即CDR(2)序列定义如下：
-CDR(1)1：SEQ ID NO:11
-CDR(1)2：SEQ ID NO:12
-CDR(1)3：SEQ ID NO:13
-CDR(2)1：SEQ ID NO:17
-CDR(2)2：SEQ ID NO:18
-CDR(2)3：SEQ ID NO:19
或：
-CDR(1)1：SEQ ID NO:14
-CDR(1)2：SEQ ID NO:15
-CDR(1)3：SEQ ID NO:16
-CDR(2)1：SEQ ID NO:17
-CDR(2)2：SEQ ID NO:18
-CDR(2)3：SEQ ID NO:19
或：
-CDR(1)1：SEQ ID NO:17
-CDR(1)2：SEQ ID NO:18
-CDR(1)3：SEQ ID NO:19
-CDR(2)1：SEQ ID NO:11
-CDR(2)2：SEQ ID NO:12
-CDR(2)3：SEQ ID NO:13
或：
-CDR(1)1：SEQ ID NO:17
-CDR(1)2：SEQ ID NO:18
-CDR(1)3：SEQ ID NO:19
-CDR(2)1：SEQ ID NO:14
-CDR(2)2：SEQ ID NO:15
-CDR(2)3：SEQ ID NO:16。
2.一种多肽，其包含第一免疫球蛋白单一可变域和第二免疫球蛋白单一可变域，其中所述第一免疫球蛋白单一可变域为VHH域ABII035(SEQ IDNO:44)，所述第二免疫球蛋白单一可变域为VHH域ABII059(SEQ IDNO:45)，或其中所述第一免疫球蛋白单一可变域为VHH域ABII059(SEQ IDNO:45)，所述第二免疫球蛋白单一可变域为VHH域ABII035(SEQ IDNO:44)。
3.权利要求1或2的多肽，其中所述多肽还包含半衰期延长部分。
4.权利要求3的多肽，其中所述半衰期延长部分选自白蛋白结合部分、转铁蛋白结合部分、聚乙二醇分子、重组聚乙二醇分子、人血清白蛋白、人血清白蛋白片段和白蛋白结合肽。
5.权利要求4的多肽，其中所述所述半衰期延长部分选自抗白蛋白免疫球蛋白域和抗转铁蛋白免疫球蛋白域。
6.一种多肽，其选自具有SEQ ID NO:26至32、34至43、142、143及145至152中任一项的多肽。
7.一种核酸分子，其包含编码权利要求1至6中任一项的多肽的区域。
8.权利要求7的核酸分子，其中所述核酸分子呈分离形式。
9.一种表达载体，其包含权利要求7或8的核酸分子。
10.一种宿主细胞，其带有权利要求9的表达载体，其中所述宿主细胞能够表达权利要求1至6中任一项的多肽，且其中该宿主细胞为原核或真核细胞。
11.药物组合物，其包含(i)一种或多种权利要求1至6中任一项的多肽作为活性成分；和(ii)药学上可接受的载体；和任选地(iii)稀释剂、赋形剂、佐剂和/或稳定剂。
12.一种制备权利要求1至6中任一项的多肽的方法，其包括以下步骤：
-在允许权利要求1至6中任一项的多肽表达的条件下培养权利要求10的宿主细胞；
-回收该多肽；和
-纯化该多肽。
13.权利要求1至6中任一项的多肽或权利要求11的药物组合物在制备用于治疗、预防或减轻人的疾病、障碍或病症的药物中的用途。
14.权利要求1至6中任一项的多肽或权利要求11的药物组合物在制备用于治疗、预防或减轻人的疾病、障碍或病症的药物中的用途，其中所述疾病、障碍或病症选自：神经变性疾病或病症、干性AMD、青光眼、大脑淀粉样血管病变、21-三体(唐氏综合征)、成人唐氏综合征、荷兰型淀粉样变性的遗传性脑出血(HCHWA-D)、路易体痴呆，额颞叶退化、肌萎缩侧索硬化、偶发性包涵体肌炎及老年人焦虑症。
15.权利要求14的用途，其中所述疾病、障碍或病症是阿尔茨海默氏病或阿尔茨海默型痴呆。
16.权利要求1至6中任一项的多肽或权利要求11的药物组合物在制备用于预防和/或治疗与A-β沉积相关的疾病或病症的药物中的用途。
17.权利要求13至16中任一项的用途，其中所述权利要求1至6中任一项的多肽或权利要求11的药物组合物经制备用于通过静脉内或皮下注射来给药至有此需要的人。
18.药物组合物，其包含(i)一种或多种权利要求1至6中任一项的多肽；和(ii)一种或多种其他治疗剂，所述其他治疗剂优选选自：ELND-005、Caprospinol、NRM-8499、PBT-2、Posiphen、EHT-0202、CTS-21166、司马西特、BMS-708163、BMS-299897、BMS-433796、ELND-006、ELN-475516、ELN-318463、ELN-475513、贝加司他、E-2012、CHF-5074、Dimebolin和PF-4494700；和(iii)药学上可接受的载体；以及任选地(iv)稀释剂、赋形剂、佐剂和/或稳定剂。
19.化合物ABII322:
其在接头的位置14的半胱氨酸处聚乙二醇化，该位置以C*表示。
20.化合物ABII323:
其在接头的位置15的半胱氨酸处聚乙二醇化，该位置以C*表示。
21.化合物ABII314:
其在接头的位置5的半胱氨酸处聚乙二醇化，该位置以C*表示。
22.化合物ABII315:
其在接头的位置5的半胱氨酸处聚乙二醇化，该位置以C*表示。
23.权利要求1至6中任一项的多肽或权利要求19至22中任一项的化合物用于在活体外降低体液中的A-β含量的用途。
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