KR20130010114A - 바이파라토픽 ａ-베타 결합 폴리펩타이드 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 바이파라토픽 A-베타 결합 폴리펩타이드, 및 보다 특히 A-베타의 상이한 에피토프에 결합하는 2개 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 바이파라토픽 A-베타 결합 폴리펩타이드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 특정 서열의 상기 폴리펩타이드, 이들의 제조 방법, 및 알츠하이머 질환과 같은 질환 치료 방버을 포함하는, 이들을 사용하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 신규한 베타-아밀로이드 펩타이드(이하에서 "A-베타") 결합 폴리펩타이드에 관한 것이고, 상기 폴리펩타이드는 특이적 면역글로불린 도메인을 포함한다. 본 발명은 또한 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산; 상기 폴리펩타이드를 제조하는 방법; 상기 폴리펩타이드를 발현하거나 발현할 수 있는 숙주 세포; 상기 폴리펩타이드를 포함하는 조성물; 및 상기 폴리펩타이드 또는 상기 조성물의 용도, 특히 예방학적, 치료학적 및 진단학적 목적을 위한 용도에 관한 것이다.
여러 퇴행성 신경 질환은 단백질의 부적절한 폴딩 또는 프로세싱, 또는 프리온에 의해 유발되고, 이들 모두는 아밀로이드 플라크로서 공지된 침입성 신경 침착을 유발한다. 가장 광범위하게 공지된 퇴행성 신경 질환은 아마도 알츠하이머 질환(AD)이다.
AD의 발병률은 긴급하고 충족되지 않은 의학적 필요성을 필요로 하고 65세 내지 85세 연령의 모든 사람들의 10 내지 40%가 AD를 나타낸다. 또한, 상기 부분의 집단은 대수적으로 계속 증가한다. 따라서, 사회적 및 경제적 관점에서뿐만 아니라 인도주의적 관점에서 상기 파괴적인 장애를 효율적으로 진단하고 치료하기 위한 방법을 모색하는 것은 필수적이다. 치료와 관련하여, 질환 진행을 느리게 하거나 정지시키는 것뿐만 아니라 AD의 초기 단계 동안(진단 전)에 이미 발생된 뇌 손상을 회복시키기 위한 약물이 요구된다. 현재, 조기-진단 또는 치료가 효율적이지 못하다.
AD는 주로 아밀로이드 펩타이드로 구성된 세포외 아밀로이드 플라크가 뇌에 존재하고 주로 단백질 타우(tau)로 구성된 세포내 신경섬유 얽힘(NFT)과 일치하는 치매로서 정의된다.
AD의 특징인 아밀로이드 플라크의 주요 성분은 높은 불용성의 베타 아밀로이드 펩타이드(A-베타)이고, 이는 길이가 39 내지 43개 아미노산(aa)이고, 베타 시트 구조를 취하고 올리고머화하여 단백질 응집체를 형성하는 경향이 강하다. A-베타는 2개의 단백질가수분해 사건에 의해 A-베타 전구체 단백질(APP)로부터 제조된다. A 베타-세크레타제 활성은 아미노산 Met-671과 Asp-672(APP의 770개 aa 이소형에 대한 넘버링을 사용하여) 사이의 A-베타("베타-부위")의 N-말단에서 APP를 절단한다. 상기 베타-부위에서의 절단은 99개 aa(C99)의 막-연합 APP 단편을 생성시킨다. 이어서, C99의 막관통 도메인 내의 제2 부위("감마 부위")는 감마-세크레타제에 의해 절단되어 A-베타를 방출시킬 수 있다. APP는 또한 이의 A-베타 영역 내에서, 주로 APP의 알파-세크레타제 절단 부위에서 절단되어 83개 aa의 C-말단 APP 단편(C83)을 생성시킬 수 있고, 또한 이는 감마-세크레타제에 의해 추가로 절단되어 소형 가용성 분비된 펩타이드, p3을 생성시킬 수 있다. 상기 경로는 A-베타의 잠재적인 축적을 감소시킨다.
세포내 및 세포외 A-베타는 베타-시트 입체구조를 취하고 ADDL로 호칭되는 중간체(아밀로이드 유도된 확산성 리간드) 및 원시섬유를 형성하여 최종적으로 아밀로이드 플라크로 조립되는 아밀로이드 섬유의 형태로 침착된다. 이들 과정에서, 보다 소수성인 A-베타(1-42) 펩타이드(하기 참조)는 이의 주변에서 플라크를 계속적으로 성장시키는 핵제로서 작용하는 것으로 추정된다.
APP내 다수의 미스센스(missense) 돌연변이가 조기-발병 가족력 AD 형태에 연루되어 있다. 이들 돌연변이 모두는 APP의 정상적인 절단 부위 중 하나에 또는 이의 근처에 존재한다. 따라서, 스웨덴 이중 돌연변이(K670N/M671L)는 베타-세크레타제 절단 부위에 바로 인접해 있고 베타-세크레타제의 활성 효율을 증가시켜 A-베타의 총 생성량을 보다 증가시킨다. 감마-세크레타제 절단 부위 근처의 APP 잔기 717번에서의 3개의 임의의 돌연변이는 또한 보다 통상적인 40개 aa 형태, A-베타(1-40)에 비해 A-베타(1-42)로 호칭되는 보다 아밀로이드성인 42개 aa 형태의 비율을 증가시킨다. APP의 2개의 추가적인 돌연변이는 알파-부위와 인접한(adjacent) 것은 아니지만 근접한(close) 것으로 보고되었다. 플랑드르(Flemish)계 가족에서의 돌연변이(A692G, A-베타 잔기 21) 및 네덜란드계 가족에서의 돌연변이(E693Q, A-베타 잔기 22)는 독특한 형태의 가족력 AD에 연루되어 있다. 플랑드르계 돌연변이는 특히 반복적인 대뇌내 출혈 증후군으로서 또는 AD형 치매로서 나타난다. 상기 신경병리학적 발견은 피질 및 해마에서 노인성 플라크 및 일반적으로 대뇌 미세혈관 벽에서의 다중 아밀로이드 침착을 포함한다.
수해 전에, 막-연합 아스파르틸 프로테아제인 BACE(또한, 메마프신 또는 Asp2로 호칭됨)는 베타-세크레타제로 예상되는 성질을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 상기 효소는 APP의 베타-부위, 및 A-베타 영역의 Tyr-10과 Glu-11 사이에서 비교할 만한 효율로 APP를 절단한다. 상기 후자의 부위에서 절단된 A-베타 단편은 AD내 아밀로이드 플라크 및 APP-형질감염된 HEK293 사람 배아 신장 세포의 매질(media)에서 관찰되었다. 몇몇의 연구 그룹은 BACE와 유사한 동족체(현재 BACE1로서도 언급됨)인 추가의 아스파르틸 프로테아제, BACE2(또한 Asp1로 호칭됨)의 데이터베이스에서의 존재를 관찰했다. BACE2는 APP의 베타-부위에서 및 보다 효율적으로는 A-베타의 Phe-19 및 Phe-20 이후의 APP의 A-베타 영역 내의 부위에서 APP를 절단한다. 이들 내부 A-베타-부위는 잔기 21번에서 플랑드르계 APP 돌연변이에 인접해 있고, 이러한 돌연변이는 BACE2에 의해 생성되는 베타-부위 절단 생성물의 비율을 현저히 증가시킨다. (스웨덴 돌연변이)를 증가시키거나 (M671V) 베타-세크레타제 활성을 억제하는 APP의 보존적 베타-부위 돌연변이는 BACE1 및 BACE2 활성에 유사한 영향을 미친다. BACE1과 같이 BACE2는 산성 pH에서 최대로 APP를 단백질가수분해시킨다.
AAP 유전자내 또는 프레세닐린 1(PS1) 유전자("감마-세크레타제" 활성을 지니고 있음)내 돌연변이는 조기-발병 가족력 AD를 유발한다. APP 돌연변이의 예는 상기 언급된 '스웨덴' 및 '런던'(717) 돌연변이이고 상기 돌연변이는 각각 베타- 및 감마-세크레타제 절단 부위 근처에 위치한다. 이들 돌연변이는 A-베타 펩타이드 및 특히 A-베타(1-42)의 형성을 증가시킴에 의해 아밀로이드 응집체 및 플라크의 형성을 증가시킨다. 초기에 플라크는 AD 발병에 대한 주요 촉발제인 것으로 사료되지만 현재 연구는 주요 독성 성분으로서 원시섬유 및 ADDL의 역할을 강조한다. 더욱이 플라크는 신경독성 펩타이드가 실제로 생물학적 불활성이 되도록 하는 기작임을 감지할 수 있다.
신경퇴행성 질환 및 여기서 A-베타의 역할에 대한 추가의 정보는 문헌[참조: Wisniewski & Konietzko (2008), Lancet Neurol. 7(9), 805-811 , Spires-Jones et al. (2009), Neurobiology of Disease, 213-220, 및 Lichlen & Mohajeri (2008), Journal of Neurochem. 104, 859-874]으로부터 취할 수 있다.
AD에 대한 현재 대부분의 치료는 아세틸콜린에스테라제 억제제, 예를 들어, 경미하거나 중간 정도의 AD에 대한 치료를 위해 등록된 도네페질(Aricept?), 갈란타민(Reminyl?), 및 리바스티그민(Exelon?)을 사용한 아세틸콜린 결핍을 표적으로 한다. 도네페질은 또한 미국 및 캐나다에서 중증 치매 알츠하이머 유형(DAT)에 대해 승인되어 있다. 아세틸콜린 결핍은 기저 전뇌의 콜린성 뉴런의 퇴행을 반영하고 상기 질환의 신경 정신병학적 증상과 매우 상호관련이 있는 것으로 나타난다. 아세틸콜린에스테라제 억제제를 사용한 치료는 몇몇 이로운 효과(인지력 및 전반적 기능의 임상적 측정시 일관되고 상당하지만 미온적 효능)를 갖지만 질환의 진행을 치료하거나 중지시킬 수 없고 신경 퇴행의 병인은 치료되지 않은 채로 유지된다.
메만틴(Axura?, Namenda?, Ebixa?; Merz Pharmaceuticals)은 NMDA 수용체 길항제이고 이는 중간 정도 내지 중증의 알츠하이머 질환을 갖는 AD 환자에서 임상적 영역의 인지력, 일상 생활 활동 및 총체적 임상적 반응에서 위약과 비교하여 보다 우수한 결과는 보여주었다. 메만틴은 중간정도 내지 중증의 알츠하이머 질환용으로만 승인된 증상적 치료요법이다. 이것은 질환의 진행을 치료하거나 중지시키지 못한다. 메만틴 및 아세틸콜린에스테라제 억제제의 배합은 중간 정도의 중증 내지 중증의 DAT에서 보다 우수한 효능을 갖는 것으로 나타났지만 경미하거나 중간 정도의 질환 단계에서는 그렇지 않은 것으로 나타났다.
몇몇의 현재 실험적 치료학적 전략은 표적으로서의 A-베타에 집중되어 있다. 3가지 주요 연구 계획이 있다:
a) 아밀로이드 펩타이드 응집체의 베타-시트 구조물을 방해하도록 디자인된 베타-시트 브레이커로 호칭되는 소분자(흔히 펩티도-모사체)의 개발. 안정한 "베타-시트 브레이커"가 AD의 형질전환 마우스 모델에게 투여되는 경우, 혈뇌 장벽에 침투하여 다수의 플라크를 감소시킬 수 있는 것으로 입증되었다(문헌 참조: Permanne et al. (2002), FASEB J. 16, 860-862). 상기 접근법이 인지력 보호 및/또는 회복을 유도하는지의 여부는 입증되어야 한다.
b) APP의 아밀로이드 펩타이드로의 단백질가수분해 프로세싱을 억제하는 소분자의 개발. 베타- 또는 감마-세크레타제의 억제제는 A-베타의 형성을 효율적으로 차단하고, 따라서 아밀로이드의 신경독성 효과로부터 뇌를 보호한다. 수년에 걸쳐 축적된 아밀로이드 플라크와 같은 기존의 뇌 A-베타 부과물에 대한 효과는 기대되지 않는다.
c) A-베타에 대한 수동 및 능동 백신접종. 이러한 연구 계열은 A-베타(1-42)를 사용한 형질전환 AD 마우스의 백신접종이 아밀로이드 플라크의 형성을 차단한다는 문헌[참조: Schenk et al. (1999), Nature 400, 173-177]에 의한 관찰과 함께 시작되었다. 첫번째 실험에서, 어린 성체 마우스(6주령)의 1개월 간격의 백신접종은 필수적으로 플라크 형성 및 수반되는 뇌에서의 염증 반응을 차단하였고, 즉, 아밀로이드 플라크, 별아교세포증 및 미세신경교증이 발생하지 않았다. 후반 연령에 개시되는 백신접종은, 아밀로이드 플라크가 이미 확립된 경우, 부분적으로 제거하였다. 후속적으로, A-베타를 사용한 백신접종이 수중 미로 기억 시험에서 측정시 행동 및 기억 결핍을 개선시키는 것으로 입증되었다. 전체 A-베타를 사용한 백신접종의 부작용이 발생하는 경우, 보다 짧은 대안의 펩타이드를 디자인하여 형질전환 마우스를 백신접종하는데 사용하였다. 임상적 시험은 A-베타를 사용한 활성 면역화가 플라크 제거를 유발하고, 플라크-관련 병리학을 약화시키고, 타우 수준을 감소시키고 환자의 인지 감퇴를 느리게 함에 의해 입증되는 바와 같이 치료학적으로 활성임을 시사하였다. 그러나, 상당수의 환자들은 활성 면역화에 응답하여 자가반응성 T 림프구의 뇌로의 침입에 의해 주로 유발되는 자가면역 수막뇌염을 나타내었다(문헌 참조: Ferrer et al. (2004), Brain Pathol. 14, 11 -20; Nicoll et al. (2003), Nat. Med. 9, 448-452; Masliah et al. (2005), Neurology 64, 1553-1562).
활성 면역화 접근법에 대한 대안으로서, A-베타에 대해 지시된 항체가 환자에게 투여될 수 있다. 상기 수동 면역화 접근법은 형질전환 AD 마우스에서 뇌 A-베타 부하를 감소시키는데 성공적인 것으로 밝혀졌다(문헌 참조: DeMattos et al.(2001), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 8850-8855). 이것은 항체가 혈뇌 장벽을 통과하여 뇌에 존재하는 플라크를 표적화할 가능성이 없는 것으로 생각되기 때문에 상기 근본적인 기작을 추측할 필요가 있다. 따라서, 상기 저자는 항체가 뇌로부터 A-베타를 적정하는, 혈장에서의 'A-베타 싱크(sink)'를 생성시킴을 시사하였다. 후속적으로, 겔솔린 및 강글리오시드 1을 사용하여, 임의의 A-베타-결합 리간드가 혈뇌 장벽을 통과하지 않고 형질전환 AD 마우스에서 아밀로이드 부하를 감소시키는 잠재력을 갖는다는 것이 입증되었다(문헌 참조: Matsuoka et al. (2003) J. Neuroscience 23, 29-33). 단기(24시간) 수동 면역화는 총 뇌 아밀로이드 부하량에 영향을 주지 않으면서도 형질전환 AD 마우스의 인지 결핍을 회복시키는 것으로 나타났다(문헌 참조: Dodart et al. (2002) Nature Neuroscience 5, 452-457). 상기 결과는 여전히 가용성인 A-베타의 보다 작은 응집체가 먼저 일부 항체에 의해 표적화되고, 또한 이들이 가장 독성 형태의 A-베타임을 시사한다. 따라서, 원시섬유성 A-베타의 제거는 적어도 형질전환 APP-마우스에서 기억력을 회복시킬 수 있다.
한편, 사람화된 항-A-베타 모노클로날 항체 바피네우주마브(bapineuzumab)("3D6"으로서 공지된 항-A-베타 마우스 항체의 유사체)는 임상적 시험에 진입했다. 그러나, II기 시험으로부터 보고된 제1 데이터는 혼합된 결과를 보여주었다: 몇몇의 효능 종점에 대한 통계학적으로 유의적인 효과가 ApoE4 비보유자에게서만 관찰되었다. 또한, 바피네우주마브는 ApoE4 비보유자에서 매우 내성이고 안전한 반면, ApoE4 보유자에서는 위약 아암(arm)에서 보다 바피네우주마브-치료된 환자에서 심각한 부작용이 보다 흔하게 관찰되었다. 또한, 혈관성 부종 사건들이 관찰되었다. 또한, 뇌 미세출혈의 유도가 형질전환 APP 마우스에서 임상 전에 보고되었다.
항-A-베타 수동 면역화에서 사용되는 통상적인 항체(Fc 부분을 함유함)는 사람 및 동물 모델에서 관찰된 혈관성 부종 또는 미세출혈을 유도하는 것으로 의심되고, 이는 ADCC 및/또는 CDC를 통해 미세출혈을 유도하는 뇌 혈관 A-베타 침착(뇌 아밀로이드 혈관병증)의 표적화와 관련된다(문헌 참조: Wilcock, DM, Colton, CA, CNS Neurol. Disord. Drug Targets (2009) Vol. 8(1):50-64). 최종적으로, 바이어코어(Biacore)에 의한 측정시 상기 항체의 약 2.5nM의 결합 친화성은 효과적인 "말초 싱크 효과"를 유도하기에는 너무 낮은 것으로 추정된다.
다른 항-A-베타 항체인, 솔라네주마브(사람화된 항체 m266; LY-2062430)는 또한 임상 시험에 진입하였다. 성취될 수 있는 최대 플라크 부하량 감소는 약 60%인 것으로 공개되었다. 또한, 상기 항체의 특이성은 가용성 A-베타로 제한되어 응집체 또는 플라크의 결합이 예상될 수 없다.
제3 항-A-베타 항체인 포네주마브(ponezumab) (PF4360365)는 단지 A-베타(x-40) 분자에 결합하지만 A-베타(x-42) 분자에는 결합하지 않고, 후자는 (보다) 병원성인 A-베타 종인 것으로 추정된다. 이의 친화성은 바피네우주마브의 친화성 보다도 낮고, 뇌 미세출혈의 위험성은 이의 Fc 부분의 잔류 ADCC/CDC 활성과 조합되는, 혈관에서 A-베타 플라크에 결합하는 이의 능력 때문에 여전히 배제될 수 없다.
요약컨대, 상기 사실은 (전형적인) 항체에 의한 A-베타 결합 및 제거가 예를 들어, AD 치료용 치료제의 개발을 위해 매력적인 작용 방식인 것으로 나타난다고 해도 특정 형태의 A-베타와 결합하는 이들의 성질의 약리학적 관련성과 같은, 아직 완전히 밝혀지지 않은 상기 면역글로불린의 다른 특징 및 효과가, 처음에 안전하고 효율적인 치료학적 항체를 모색하고 개발하기 위해 당업자가 짐작했던 것 보다 훨씬 어렵게 함을 입증한다.
면역글로불린 단일 가변 도메인 항체 또는 VHH 도메인(하기 정의된 바와 같음)과 같은, A-베타에 대한 특이성을 갖는 항체 단편은 또한 문헌[참조: WO2004/44204; WO2006/40153; WO2007/35092; WO2008/122441; 및 WO2009/04494]에 기재되어 있다. 상기 WO 공개공보에 따라 본 발명자에 의해 합성된 VHH의 결합 특성은 만족스럽지 못하였고, 이러한 이유로 이들은 임상적 개발에 진입하지 못하였다.
WO09/149185는 소위 DVD 작제물, 및 특히 A-베타 결합 특이성을 갖는 DVD 작제물을 기재하고 있다. 상기 DVD 작제물에서 2개의 상이한 항-A-베타 가변 도메인의 조합시, 모 항체의 결합은 유지되었지만, 상기 조합에 의한 친화성의 증가는 관찰되지 않았다. 또한, 상기된 DVD 작제물은 "전형적인" 항체에 존재하는 Fc 부분을 함유하므로 Fc 이펙터 기능, 예를 들어, 보체-의존성 세포독성(CDC) 또는 항체-의존성 세포 독성(ADCC)에 의해 유발되는 부작용은 회피될 수 없다(상기 참조).
AD의 명확한 진단은 아밀로이드 플라크, 신경섬유성 얽힘, 시냅스 상실 및 신경 퇴행의 존재를 입증하기 위한 뇌의 사후 병리학적 조사를 여전히 필요로 한다. 이것은 필수적으로 1906년에 알로이스 알츠하이머(Alois Alzheimer)에 의해 정의된 바와 동일한 과정이다. 1984년에 국립기관(the National Institute of Neurological and Communicative Disorders and Stroke and the Alzheimer's Disease and Related Disorders Association(NINCDS-ADRDA))은 AD의 진단을 위한 공식적인 기준을 확립하였다[문헌(참조: Petrella et al. (2003), Radiology 226, 315-336)에서 검토됨]. 하기의 기준 모두를 충족하는 환자는 AD일 가능성이 있는 것으로 진단된다: 검사 및 시험 (예를 들어, 소형-정신적 시험(Mini-Mental Test), 블레스드 치매 스케일(Blessed Dementia Scale), 또는 유사 시험)에 의해 입증된 치매, 기억 및 적어도 하나의 다른 인지 기능, 정상적인 의식 손상, 40 내지 90세 연령 사이에서의 발병, 치매를 유발하는 다른 질환 징후의 부재(제외 기준). 확인가능한 원인 없이 점진적인 진행성 인지 손상은 AD일 가능성이 있는 것으로 진단될 것이다. 가능성 있는 AD는 경미한(조기), 중간 정도(중기) 또는 심각한(후기) 치매로서 추가로 정의된다. 실험실 분석은 치매의 또 다른 원인을 객관적으로 정의하거나 배제하기 위해 사용된다. ApoE4(예비배치된 유전학적 인자)에 대한 유전자형 분석(genotyping)과 조합된, 뇌척수액(CSF)에서 A-베타(1-42) 및 포스포-타우의 ELISA 분석은 민감하고 특이적인 것으로 나타난다. 그러나, 상기 방법은 공격적인 CSF 천공 때문에 범용성이 아니고, 이것이 통상적인 스크리닝이 되는 것을 방해한다. 신경사 단백질(neural thread protein)(AD7C-NTP)(니목스(Nymox)에 의해 개발됨)에 대한 ELISA는 비-AD 치매 환자 또는 건강한 대조군 유래의 것 보다 AD 환자 유래의 뇨에서 높은 수준임을 입증하였다. 그러나, 상기 평균 수준은 조기 AD 경우에 상당히 낮았고, 이는 시험이 AD의 조기 발병에 대한 시험을 위해서는 신뢰할 수 없는 것임을 시사한다.
어떠한 생물학적 방법도 조기 단계의 AD를 확고히 진단하기 위해 아직은 적합하지 않고, 차라리 이들은 진행된 사례의 임상적 진단을 확인하는데 일조할 뿐이다. 명백하게, 비가역적 뇌 손상을 신호전달하는 임상적 증상의 개시 전 조기 진단을 가능하게 하기 위해서는 보다 진보된 기술이 요구된다.
최종적으로, 진단 목적을 위한 것뿐만 아니라 예를 들어, 임상전 연구 및 개발에서도 A-베타 결합 분자는 연구 도구로서 유용하다. 이미 상기 언급된 항체, 즉, 항체 3D6 및 항체 m266이 광범위하게 사용된다. 항체 3D6은 비교적 낮은 친화성으로 A-베타에 결합하고, 따라서 모든 목적에 적합할 수는 없다. 항체 m266은 p3과 같은 A-베타의 N-말단 절단된 버젼과 교차 반응하고, 이는 질환-관련 A-베타 종(예를 들어, A-베타(1-40) 및 A-베타(1-42))과 다른 분자(예를 들어, p3)를 구분할 수 없다.
상기 관점에서, 본 발명의 목적은 A-베타와 관련되고/되거나 A-베타에 의해 매개되는 질환, 장애 또는 병태, 예를 들어, AD의 예방, 치료, 완화 및/또는 진단에 사용될 수 있는, 약리학적 활성 제제 및 상기 활성 제제를 포함하는 조성물을 제공하고, 상기 활성 제제 및 조성물의 사용 및/또는 투여에 관여하는, 상기 질환, 장애 또는 병태의 예방, 치료, 완화 및/또는 진단을 위한 방법을 제공하는 것이다. 상기 제제는 또한 일반적인 AD 분야 및 구체적으로 AD 질환 기작 및 잠재적인 치료학적 및/또는 예방학적 기작에 대한 연구를 수행하기 위해 유용할 수 있다.
특히, 본 발명의 목적은 당업계에서 현재 사용되고/되거나 공지된 제제, 조성물 및/또는 방법에 비해 특정 이점을 제공하는 상기 약리학적 활성 제제, 조성물 및/또는 방법을 제공하는 것이다. 이들 이점은 특히 상기 섹션에서 기재된 것들과 같은 A-베타에 대한 통상적인 항체 또는 이의 단편에 비해 개선된 치료학적 및/또는 약리학적 성질 및/또는 다른 유리한 성질(예를 들어, 개선된 제조의 용이함 및/또는 감소된 제품 비용)을 포함한다. 추가의 이점은 하기의 추가 기재로부터 명백해질 것이다.
보다 특히, 본 발명의 목적은 신규한 A-베타 결합 분자, 및 구체적으로 포유동물 및 특히 사람 A-베타에 결합하는 폴리펩타이드를 제공하는 것이고, 여기서, 상기 분자 또는 폴리펩타이드는 상기 진단학적, 치료학적 및 연구 목적에 적합하다.
본 발명의 제1 양상에 따라, A-베타의 제1 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 A-베타의 제2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩타이드가 제공되고, 여기서, A-베타의 상기 제1 에피토프 및 제2 에피토프는 동일한 에피토프들이 아니며, 즉 상이한 에피토프이고, 예를 들어, 한편으로는 N-말단 에피토프(서열번호 3) 및 다른 한편으로는 중앙 에피토프(서열번호 4)이다.
바람직하게, 상기 제1 및 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인들 각각이 필수적으로 4개의 골격 영역(각각 FR1 내지 FR4) 및 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1 내지 CDR3)으로 이루어지고, 여기서, 상기 제1 및 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인들은 링커 펩타이드에 의해 공유결합으로 연결되고, 여기서 상기 링커 펩타이드는 임의로 제3 면역글로불린 도메인, 예를 들어, 제3 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하거나 제3 면역글로불린 도메인으로 이루어진다.
또한, 상기 제1 및 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인들이 바람직하게는 항체 도메인들, 보다 바람직하게는 VHH 도메인들, 보다 더 바람직하게는 사람화된 VHH 도메인들이다.
본 발명의 상기 폴리펩타이드에 포함된 면역글로불린 단일 가변 도메인들은 통상적으로 각각
FR(1)1 - CDR(1)1 - FR(1)2 - CDR(1)2 - FR(1)3 - CDR(1)3 - FR(1)4, 및
FR(2)1 - CDR(2)1 - FR(2)2 - CDR(2)2 - FR(2)3 - CDR(2)3 - FR(2)4의 구조를 갖는다. 바람직하게, CDR(1)3은,
- 서열번호 13 및 서열번호 16에 따른 아미노산 서열들; 및
- 서열번호 13 또는 서열번호 16에 따른 상기 아미노산 서열들과 비교하여 각각 3개 이하, 바람직하게는 2개 이하, 보다 바람직하게는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열들로 이루어진 그룹으로부터 선택되고,
CDR(2)3은,
- 서열번호 19에 따른 아미노산 서열; 및
- 서열번호 19에 따른 아미노산 서열과 비교하여, 3개 이하, 바람직하게는 2개 이하, 보다 바람직하게는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열들로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
대안으로, CDR(1)3은,
- 서열번호 19에 따른 아미노산 서열; 및
- 서열번호 19에 따른 아미노산 서열과 비교하여, 3개 이하, 바람직하게는 2개 이하, 보다 바람직하게는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열들로 이루어진 그룹으로부터 선택되고,
CDR(2)3은,
- 서열번호 13 및 서열번호 16에 따른 아미노산 서열들; 및
- 서열번호 13 또는 서열번호 16에 따른 상기 아미노산 서열들과 비교하여, 각각 3개 이하, 바람직하게는 2개 이하, 보다 바람직하게는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열들로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
특히, 본 발명의 유용한 폴리펩타이드는 하기의 CDR 서열을 포함할 것이다(상기 문단에서 지적된 바와 같은 넘버링):
- CDR(1)1: 서열번호 11
- CDR(1)2: 서열번호 12
- CDR(1)3: 서열번호 13
- CDR(2)1: 서열번호 17
- CDR(2)2: 서열번호 18
- CDR(2)3: 서열번호 19
또는
- CDR(1)1: 서열번호 14
- CDR(1)2: 서열번호 15
- CDR(1)3: 서열번호 16
- CDR(2)1: 서열번호 17
- CDR(2)2: 서열번호 18
- CDR(2)3: 서열번호 19
또는
- CDR(1)1: 서열번호 17
- CDR(1)2: 서열번호 18
- CDR(1)3: 서열번호 19
- CDR(2)1: 서열번호 11
- CDR(2)2: 서열번호 12
- CDR(2)3: 서열번호 13
또는
- CDR(1)1: 서열번호 17
- CDR(1)2: 서열번호 18
- CDR(1)3: 서열번호 19
- CDR(2)1: 서열번호 14
- CDR(2)2: 서열번호 15
- CDR(2)3: 서열번호 16
본 발명의 특정 실시형태에 따라, 본 발명의 폴리펩타이드는 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인으로서 VHH 도메인 ABII035(서열번호 44), 및 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인으로서 VHH 도메인 ABII059(서열번호 45), 또는 그 반대로 포함한다.
특히 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 상기 폴리펩타이드는 바람직하게는 상기 폴리펩타이드에 공유 결합된 반감기 연장 모이어티, 예를 들어, 알부민 결합 모이어티(예를 들어, 항-알부민 면역글로불린 도메인), 트랜스페린 결합 모이어티(예를 들어, 항-트랜스페린 면역글로불린 도메인), 폴리에틸렌 글리콜 분자, 재조합 폴리에틸렌 글리콜 분자, 사람 혈청 알부민, 사람 혈청 알부민의 단편 및 알부민 결합 펩타이드를 추가로 포함한다.
본 발명의 매우 특이적인 양태는 서열번호 26 내지 31(Fc 융합 폴리펩타이드); 서열번호 32(HSA 융합 폴리펩타이드); 서열번호 34 내지 39 및 145 내지 152(알부민 결합 면역글로불린 단일 가변 도메인 융합 폴리펩타이드); 및 서열번호 40 내지 43, 142 및 143(페길화된 폴리펩타이드)로 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드이다.
본 발명의 폴리펩타이드는 바람직하게 이의 면역글로불린 단일 가변 도메인중 하나를 사용하여 서열번호 3에 의해 정의된 A-베타 에피토프(N-말단 에피토프)에 결합하고, 또 다른 면역글로불린 단일 가변 도메인을 사용하여 서열번호 4에 의해 정의된 A-베타 에피토프(중앙 에피토프)에 결합한다. 보다 더 바람직하게, 본 발의 상기 폴리펩타이드는 사람 A-베타 펩타이드(서열번호 1)의 적어도 아미노산 1번(아스파르테이트), 3번(글루타메이트), 19번(페닐알라닌), 20번(페닐알라닌) 및 23번(아스파르테이트)에 대한 접촉부들을 형성한다. TR-FRET 결합 분석(경쟁자들로서 ABII002 = 서열번호 62 및 ABII050 = 서열번호 100을 사용함; 실시예 9.3 참조)으로 측정시 IC50 값은 바람직하게 10-9 몰/리터 이하의 범위, 보다 바람직하게는 5 x 10-10 몰/리터 내지 10-12 몰/리터의 범위이다.
다른 양상에 따라, 본 발명은 4개의 골격 영역(각각 FR1 내지 FR4) 및 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1 내지 CDR3)으로 필수적으로 이루어진 면역글로불린 단일 가변 도메인들을 포함하거나 이것으로 이루어진 폴리펩타이드(여기서, 상기 CDR 서열들은 하기와 같이 정의된다:
- CDR1: 서열번호 11
- CDR2: 서열번호 12
- CDR3: 서열번호 13
또는
- CDR1: 서열번호 14
- CDR2: 서열번호 15
- CDR3: 서열번호 16
또는
- CDR1: 서열번호 17
- CDR2: 서열번호 18
- CDR3: 서열번호 19)
및 서열번호 47 내지 111로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VHH 도메인을 포함하거나 이들로 이루어진 폴리펩타이드에 관한 것이다. 이들 폴리펩타이드는 본 발명의 제1 양상에 따라 바이파라토픽 A-베타 결합 폴리펩타이드를 작제하는데 유용한 빌딩 블록 또는 중간체이다.
추가의 양상에 따라, 본 발명은 본 발명의 폴리펩타이드 제조에 사용되는, 핵산 분자, 발현 벡터, 숙주 세포 및 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자는 본 발명의 폴리펩타이드의 생물약제학적 제조를 위해 사용되는 숙주 세포로 형질감염될 수 있는 관련 발현 벡터를 작제하기 위해 분리된 형태로 사용될 수 있다. 상기 제조 방법은 전형적으로 폴리펩타이드의 발현을 허용하는 조건 하에 숙주 세포를 배양하는 단계, 상기 폴리펩타이드를 회수하는 단계 및 당업계에 공지된 방법에 따라 상기 폴리페타이드를 정제하는 단계를 포함한다.
본 발명의 폴리펩타이드는 특히, 하기에 상세히 기재된 바와 같은 질환, 장애 및 병태를 진단, 예방, 치료 및/또는 완화시키는 방법에서 유용하고, 특히 알츠하이머 질환(AD)의 치료에 유용하다. 따라서, 상기 양상에 따라, 본 발명의 폴리펩타이드는 약제학적 조성물의 형태로, 즉 질환, 장애 또는 병태, 바람직하게는 신경퇴행성 질환 또는 장애, 알츠하이머 질환, 알츠하이머 유형의 치매, 건성 AMD, 녹내장, 대뇌 아밀로이드 혈관병증(CAA), 삼체성 21(trisomy 21)(다운 증후군), 성인 다운 증후군, 네덜란드형의 아밀로이드증을 갖는 유전성 대뇌 출혈(HCHWA-D), 루이체(Lewy Body)를 갖는 치매, 이마관자엽 변성(frontotemporal lobar degeneration), 녹내장, 근위축성 측색 경화증, 산발성 봉입체 근염(sporadic inclusion body myositis) 및 노인의 불안 장애로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 사람의 질환, 장애 또는 병태의 치료, 완화 또는 예방용 약물로서 사용되거나, 상기 질환, 장애 또는 병태의 진단을 위해 사용될 것이다.
상기에 추가로, 본 발명의 폴리펩타이드는 특히 건성 AMD(노인성 황반 변성) 및 녹내장의 치료를 위해 유용하다. "중앙 지도형 근위축"으로서도 공지된 "건성" 형태의 AMD는 감각신경망막 아래의 망막 색소 상피층에 대한 근위축으로부터 비롯되고, 이는 눈의 중심부내 광수용체(간상체 및 추상체)의 상실을 통한 시력 상실을 유발한다. 현재 어떠한 의학적 또는 수술적 치료도 상기 병태에 대해 이용할 수 없다. 지금까지 이용가능한 치료(예를 들어, 기관(National Eye Institute)에 의해 제안됨)는 고용량의 산화방지제, 루테닌 및 제아크산틴과 함께 비타민 보충물의 사용을 포함하고, 이것은 건성 황반 변성의 진행을 늦출 수 있다. 녹내장은 눈 내부의 유압이 증가하여 시신경에 비가역적 손상을 유발하여 시력을 상실시키는 질환이다. A-베타는 실험적 녹내장에서 아폽토시스성 망막 신경절 세포와 함께 공동으로 위치하고, 용량- 및 시간-의존성 방식으로 상당한 망막 신경절 세포 아폽토시스를 유도한다.
치료학적 목적을 위해, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 상기 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물은 예를 들어, 비경구(특히, 정맥내 또는 피하) 또는 초자체내(특히, 건성 AMD 또는 녹내장의 치료를 위해) 주사에 의해 이를 필요로 하는 사람에게 투여할 수 있다.
추가의 양상에서, 본 발명의 실시형태 및 응용은 하기의 추가의 기재 및 첨부된 특허청구범위로부터 명백해질 것이다.
예상치 않게도, A-베타 결합 모노클로날 항체에 대한 집중적인 연구가 이미 수행되었고 A-베타에 고친화성을 갖는 고도로 특이적인 항체가 이미 이용가능하지만, 본 발명자들은 예를 들어, 항체 3D6 및 m266(예를 들어, 표 16 참조)(이의 사람화된 대응체는 현재 사람의 치료학적 용도에 대해 시험되고 있다)보다 개선된 특징을 갖는, 예를 들어, 보다 우수한 IC50 값을 갖는 A-베타 결합 분자 그룹을 제공하는데 성공하였다.
추가로, 당업계에 공지된 항-A-베타 항체가 실제로 A-베타를 과생성하는 형질전환 마우스에서 아밀로이드 플라크 부하를 감소시킬 수 있는 것으로 입증될 수 있지만(모노클로날 항체 m266 또는 이의 사람화된 대응물의 투여에 의해 성취된 최대 플라크 부하 감소가 약 60% 인 것으로 공개되었다), 예를 들어, 항체 m266은 아밀로이드 플라크 결합이 결여되어 있다. 따라서, 상기 통상적인 항체는 아밀로이드 응집체중에 존재하는 A-베타에 대한 항-A-베타 분자의 직접적인 결합이 추가의 이점을 유도하는 상황에서 잠재력이 덜한 것으로 예상될 수 있다. 이와는 대조적으로, 본 발명자들은 아밀로이드 플라크에 결합함에 따라서 미세출혈을 유도하거나 위험을 증가시키지 않고 물리적 분해를 촉진시킴에 의해 혈관 아밀로이드를 감소시키거나 제거할 것으로 예상되는 A-베타 결합 분자를 제조할 수 있었다. 혈관 아밀로이드가 AD의 중증도와 연관되어 있기 때문에, 본 발명의 폴리펩타이드의 상기 이점은 후반-단계 또는 중증 AD의 치료에 특히 유용한 것으로 입증될 있고, 즉 이들은 수년간 축적된 높은 뇌 아밀로이드 플라크 부하를 갖는 환자의 치료에 특히 유용한 것으로 예상될 수 있다.
따라서, 요약컨대, 본 발명의 A-베타 결합 폴리펩타이드의 보다 높은 친화성 및 이들의 독특한 플라크 결합 능력은 당업계에 기재된 통상적인 항-A-베타 항체와 비교하여 예상치 못한 월등함을 제공한다.
현재 임상 시험 중인 다른 항체, 포네주마브는 A-베타(x-40)에 대해 특이성을 갖고, AD에서 주요 병원성 종인 A-베타(x-42)에는 결합하지 않으므로, A-베타(x-40):A-베타(x-42) 균형이 독성 A-베타(x-42) 종쪽으로 전환될 것으로 예상된다. 이와는 반대로, 본 발명자들은 적어도 2개의 상이한 에피토프에 결합함에 의해 A-베타(x-40) 및 A-베타(x-42)를 포획하여 상기 2개의 종의 독성 효과를 중화시킬 수 있는 A-베타 결합 분자를 제공하는데 성공하였다.
일반적으로 통상적인 항체와 비교하는 경우, 본 발명의 폴리펩타이드는 보다 용이하고 신속하고 저렴하게 제조될 수 있고, 보다 높은 안정성 및 낮은 항원성을 가지며, 이들의 작은 크기 및 구조로 인해 주사 또는 주입보다 더 간편한 투여 경로에 적합할 수 있다. 보다 구체적으로, 이. 콜라이 및 효모와 같은 간편한 재조합 숙주 유기체에서의 발효를 통한 본 발명의 폴리펩타이드의 제조는 고가의 포유동물 세포 배양 설비를 요구하는 통상적인 항체의 제조와 비교하여 저렴하다. 또한, 성취가능한 발현 수준은 높고 본 발명의 폴리펩타이드의 수율은 1 내지 10 g/l (이. 콜라이)의 범위 및 10g/l 이상(효모)이다. 본 발명의 폴리펩타이드는 보다 가용성이고, 이는 이들이 통상적인 항체와 비교하여 보다 높은 농도로 저장되고/되거나 투여될 수 있음을 의미한다. 이들은 실온에서 안정하고, 이는 이들이 냉장 설비의 사용, 운송 비용, 시간 및 환경적 비축 없이 제조되고/되거나, 저장되고/되거나 수송될 수 있음을 의미한다. 본 발명의 폴리펩타이드는 또한 극한 pH에서 장기간 안정성을 나타내고, 이것은 이들이 경구 투여에 의한 전달에 적합할 수 있음을 의미한다.
또한, 본 발명의 폴리펩타이드는 "전형적인" 항체에 존재하는 Fc 부분을 포함할 필요가 없어 Fc 이펙터 기능에 의해 유발되는 부작용, 예를 들어, 보체-의존성 세포독성(CDC) 또는 항체-의존성 세포독성(ADCC)이 회피될 수 있다. 항-A-베타 수동 면역화에 사용되는 경우, 통상적인 항체(Fc 부분을 가짐)는 ADCC 및/또는 CDC를 통해 미세출혈을 유발하는 대뇌 혈관 A-베타 침착(대뇌 아밀로이드 맥관형성증)의 표적화와 관련된, 사람 및 동물 모델에서 관찰되는 미세출혈의 유도에 관여하는 것으로 의심된다(Wilcock, DM, Colton, CA, CNS Neurol. Disord. Drug Targets (2009) Vol. 8(1):50-64).
따라서, 요약컨대, 본 발명의 폴리펩타이드는 상기된 이점과, 고특이성 및 고선택성과 같은 통상적인 항체의 유리한 특징을 조합하고 놀랍게도 통상적인 A-베타 결합 항체와 비교하여 친화성 및 특이성과 관련하여 개선된 특성을 갖는다.
WO2006/040153, WO2007/35092 및 WO2004/44204에 기재된 VHH와 같은 당업계에 이미 공지된 A-베타 결합 VHH 도메인과 비교하는 경우, 본 발명의 폴리펩타이드는 응집된 A-베타에 결합하는 것뿐만 아니라 단량체 A-베타에 결합하는 것에 대해 상당히 개선된 결합 특성을 보여준다(예를 들어, 하기 실시예 3.2 및 6 참조). 또한, 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 예를 들어, 문헌[참조: WO2008/122441 또는 Habicht et al. (2007), Proc. Natl. Acad. Sci. USA;104(49):19232-19237]에 기재된 바와 같은, 응집된 아밀로이드 플라크에만 결합하는 VHH 도메인과는 대조적으로 아밀로이드 플라크뿐만 아니라 단량체 A-베타 둘 다에 결합한다.
또한, 본 발명의 A-베타 결합 폴리펩타이드의 VHH 도메인은 예를 들어, 실시예 7 및 도 2에 나타낸 바와 같이 사람 및 설치류 A-베타에 균등하게 강력히 결합한다. 본 발명의 바이파라토픽 폴리펩타이드의 결합은 심지어 단일 VHH 도메인과 비교하여 설치류 A-베타 뿐만 아니라 사람 A-베타에 대한 친화성을 적어도 103 인자로 증가시킨다. 따라서, 본 발명의 폴리펩타이드는 A-베타(1-40) 및 A-베타(1-42)와 같은, 질환 관련 A-베타 형태에 대해 다양한 종에 걸쳐 이상적인 검출 도구이고 특히 임상전 및 과학적 연구를 위한 설치류 동물 모델의 사용을 가능하게 한다. 이들은 상당히 낮은 친화성으로 A-베타에 결합하고 설치류 A-베타에 대해 단지 약한 교차-반응성인 항체 3D6에 비해 월등함을 제공한다. 또한, 설치류 및 사람 A-베타를 균등하게 잘 인지하지만 p3과 같은 A-베타의 N-말단 절단된 버젼과 교차-반응하여, A-베타(1-40) 및 A-베타(1-42)와 같은 질환-관련 A-베타 종의 특이적 검출에 의존하는 특정 시험 또는 분석을 위해 유용하지 않은 항체 m266과 비교하여 월등하다.
최종적으로, 본 발명에 따른 바이파라토픽 항-A-베타 VHH 작제물은 2개의 상이한 A-베타 에피토프를 검출하는 2개의 VHH가 조합되는 경우 1000배 초과의 인자만큼 친화성이 증가되고 이는 명백히 WO09/149185에 기재된 작제물들과는 대조적이다.
물론, 본 발명의 폴리펩타이드는 또한 이들의 친화성(민감성), 특이성(종 뿐만 아니라 에피토프와 관련하여) 및 상기된 바와 같은 다른 특성을 토대로 당업계에 공지된 다른 A-베타 결합 분자와 비교하여 진단 목적을 위해 유용하다.
도 1은 APP 형질전환 마우스(n=3)에서 주사한지 2시간 후 검출된 바 ABII320, ABII322, 3D6-IgG 및 m266-IgG의 복강내 투여 후의 혈장내 유리된/비결합된 A-베타(1-40)의 감소를 보여준다. 제1 컬럼(미충전 박스)은 비히클(PBS)을 나타내고; 제2 컬럼은 ABII320(132 nmol/kg)을 나타내고; 제3 컬럼은 ABII322(132 nmol/kg)를 나타내고; 제4 컬럼은 IgG 3D6(132 nmol/kg)을 나타내고; 제5 컬럼은 IgG m266(66.6 nmol/kg)을 나타내고; IgG의 농도는 결합 부위(IgG 분자 당 2개의 결합 부위)당 계산된다.
도 2는 사람 및 설치류 (마우스) A-베타에 대한 VHH 도메인 ABII035 및 ABII059를 포함하는 바이파라토픽 항-A-베타 VHH 작제물의 결합을 보여준다.
도 2는 사람 및 설치류 (마우스) A-베타에 대한 VHH 도메인 ABII035 및 ABII059를 포함하는 바이파라토픽 항-A-베타 VHH 작제물의 결합을 보여준다.
정의
본 발명의 상기 및 다른 양상 및 실시형태는 하기의 추가의 기재로부터 명백해질 것이고, 여기서,
a) 달리 정의되거나 지적되지 않는 경우, 사용되는 모든 용어는 당업자에게 자명한 통상적인 당업계의 의미를 갖는다. 예를 들어, 본원에 인용된 일반적인 배경 기술뿐만 아니라 문헌[참조: Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2nd Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Lewin, "Genes IV", Oxford University Press, New York, (1990), 및 Roitt et al., "Immunology" (2nd Ed.), Gower Medical Publishing, London, New York (1989)]과 같은 표준 핸드북이 참조로서 인용되고; 또한, 달리 지적되지 않는 한, 구체적으로 상세히 기재되지 않은 모든 방법, 단계, 기술 및 조작은 당업자에게 자명한 공지된 그 자체의 방식으로 수행될 수 있고 수행되었다. 예를 들어, 상기 언급된 일반적인 배경 기술 및 본원에 인용된 추가의 참조문헌이 참조로서 인용된다.
b) 달리 지적되지 않는 한, 용어 "면역글로불린" 및 "면역글로불린 서열"(본원에서 중쇄 항체 또는 통상적인 4개 쇄 항체를 언급하기 위해 사용됨)은 일반적인 용어로서 완전한 크기의 항체, 이의 개별 쇄 및 이의 모든 부분, 도메인 또는 단편(각각 VHH 도메인 또는 VH/VL 도메인과 같은 항원-결합 도메인 또는 단편을 포함하지만 이들에 제한되지 않음) 모두를 포함하는 것으로 사용된다. 추가로, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "서열"(예를 들어, "면역글로불린 서열", "항체 서열", "(단일) 가변 도메인 서열", "VHH 서열" 또는 "단백질 서열"과 같은 용어에서)은 일반적으로 관련 문단이 보다 제한된 해석을 요구하지 않는 경우 관련 아미노산 서열, 및 이를 암호화하는 핵산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열 모두를 포함하는 것으로 이해되어야만 한다.
c) 본원에 사용된 바와 같은 용어 "도메인"(폴리펩타이드 또는 단백질의 도메인)은 단백질의 나머지 부분과 독립적으로 3차원 구조를 보유하는 능력을 갖는 폴딩된 단백질 구조를 나타낸다. 일반적으로, 도메인은 단백질의 별개의 기능적 성질에 관여하고, 다수의 경우에 단백질 및/또는 도메인의 나머지 기능의 손실 없이 다른 단백질에 부가되거나 제거되거나 전달될 수 있다.
d) 본원에 사용된 바와 같은 용어 "면역글로불린 도메인"은 항체 쇄(예를 들어, 통상적인 4개 쇄 항체 또는 중쇄 항체의 쇄 등)의 구형 영역을 나타내거나 필수적으로 상기 구형 영역으로 이루어진 폴리펩타이드를 나타낸다. 면역글로불린 도메인은 이들이 보존된 디설파이드 결합에 의해 임의로 안정화된, 2개의 베타-시트 내에 정렬된 약 7개의 역평행 베타-가닥의 2층 샌드위치로 이루어진 항체 분자를 특징으로 하는 면역글로불린 폴딩을 보유하고 있음을 특징으로 한다.
e) 본원에 사용된 바와 같은 용어 "면역글로불린 가변 도메인"은 당업계 및 하기에서 "골격 영역 1" 또는 "FR1"로서; "골격 영역 2" 또는 "FR2"로서; "골격 영역 3" 또는 "FR3"으로서; 및 "골격 영역 4" 또는 "FR4"로서 각각 언급되는 4개의 "골격 영역"으로 필수적으로 이루어지는 면역글로불린을 의미하고; 상기 골격 영역은 당업계 및 하기에서 "상보성 결정 영역 1" 또는 "CDR1"로서; "상보성 결정 영역 2" 또는 "CDR2"로서; 및 "상보성 결정 영역 3" 또는 "CDR3"으로서 각각 언급되는 3개의 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"에 의해 차단되어 있다. 따라서, 면역글로불린 가변 도메인의 일반적인 구조 또는 서열은 하기와 같이 나타낼 수 있다: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3 -FR4. 이것은 항원-결합 부위를 함유함에 의해 항체에 항원에 대한 특이성을 부여하는 면역글로불린 가변 도메인(들)이다.
f) 본원에 사용된 바와 같은 용어 "면역글로불린 단일 가변 도메인"은 추가의 가변 면역글로불린 도메인과 쌍을 형성하지 않으면서 항원의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 가변 도메인을 의미한다. 본 발명의 측면에서 면역글로불린 단일 가변 도메인의 한 예는 면역글로불린 단일 가변 도메인 VH 및 VL(VH 도메인 및 VL 도메인)과 같은 "도메인 항체"이다. 면역글로불린 단일 가변 도메인의 또 다른 예는 이후에 정의된 바와 같이 카멜리드(camelid) 기원의 "VHH 도메인"(또는 단순히 "VHH")이다.
상기 정의된 관점에서, 통상적인 4개 쇄 항체(예를 들어, IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE 분자; 당업계에 공지됨) 또는 Fab 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 예를 들어, 디설파이드 연결된 Fv 또는 scFv 단편, 또는 상기 통상적인 4개 쇄 항체로부터 유도된 디아바디(모두 당업계에 공지됨)의 항원-결합 도메인은 일반적으로 면역글로불린 단일 가변 도메인으로서 간주되지 않는데, 그 이유는 이들 경우에 항원의 각각의 에피토프로의 결합이 하나의 (단일) 면역글로불린 도메인에 의해 발생하는 것이 아니라 경쇄 및 중쇄 가변 도메인과 같은 한쌍의 (연합된) 면역글로불린 도메인, 즉 각각의 항원의 에피토프에 함께 결합하는 VH-VL 쌍의 면역글로불린 도메인에 의해 발생하기 때문이다.
f1) VHH, VHH 도메인, VHH 항체 단편, 및 VHH 항체로서도 공지된 "VHH 도메인"은 본래에 "중쇄 항체"(즉, "경쇄가 없는 항체"; 문헌참조: Hamers-Casterman C, Atarhouch T, Muyldermans S, Robinson G, Hamers C, Songa EB, Bendahman N, Hamers R.: "Naturally occurring antibodies devoid of light chains"; Nature 363, 446-448 (1993))의 항원 결합 면역글로불린 (가변) 도메인으로서 기재되었다. 용어 "VHH 도메인"은 상기 가변 도메인을, 통상적인 4개 쇄 항체에 존재하는 중쇄 가변 도메인(이는 본원에서 "VH 도메인" 또는 "VH 도메인"으로서 언급됨) 및 통상적인 4개 쇄 항체에 존재하는 경쇄 가변 도메인(이는 본원에서 "VL 도메인" 또는 "VL 도메인"으로서 언급됨)으로부터 구분하기 위해 선택되었다. VHH 도메인은 추가의 항원 결합 도메인 없이 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다(이는 통상적인 4개 쇄 항체에서의 VH 또는 VL 도메인과는 반대이고 이 경우에 에피토프는 VH 도메인과 함께 VL 도메인에 의해 인식된다). VHH 도메인은 단일 면역글로불린 도메인에 의해 형성되는 소형이면서 강력하고 효율적인 항원 인식 단위체이다.
본 발명에서, "Nanobody?" 및 "Nanobody? 도메인"("Nanobody"는 제조원(company Ablynx N.V.; Ghent; Belgium)의 상표명이다)뿐만 아니라 용어 VHH 도메인, VHH, VHH 도메인, VHH 항체 단편, VHH 항체는 상호교환적으로 사용되고 면역글로불린 단일 가변 도메인(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4의 구조를 갖고 제2 면역글로불린 가변 도메인의 존재를 필요로 하지 않고 에피토프에 특이적으로 결합함)을 나타내며, 이는 예를 들어, WO2009/109635, 도 1에 정의된 바와 같은 소위 "홀마크 잔기(hallmark residue)"에 의해 VH 도메인과는 구분된다.
VHH 도메인의 아미노산 잔기는 예를 들어, 문헌(참조: Riechmann and Muyldermans, J. Immunol. Methods 231, 25-38 (1999))의 도 2에 나타낸 카멜리드 기원의 VHH 도메인에 적용되는 바와 같이, 캐뱃(Kabat) 등(문헌 참조: "Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91)에 의해 주어진 VH 도메인에 대한 일반적인 넘버링에 따라 번호가 매겨진다. 상기 넘버링에 따르면,
- FR1은 1번 내지 30번 위치의 아미노산 잔기들을 포함하고,
- CDR1은 31번 내지 35번 위치의 아미노산 잔기들을 포함하고,
- FR2는 36번 내지 49번 위치의 아미노산 잔기들을 포함하고,
- CDR2는 50번 내지 65번 위치의 아미노산 잔기들을 포함하고,
- FR3은 66번 내지 94번 위치의 아미노산 잔기들을 포함하고,
- CDR3은 95번 내지 102번 위치의 아미노산 잔기들을 포함하고,
- FR4는 103번 내지 113번 위치의 아미노산 잔기들을 포함한다.
그러나, VH 도메인 및 VHH 도메인에 대해서 당업계에 널리 공지된 바와 같이 각각의 CDR에서 아미노산 잔기의 총수는 다양할 수 있고 캐뱃 넘버링에 의해 지적된 아미노산 잔기의 총수에 상응하지 않을 수 있다는 것을 주지해야 한다(즉, 캐뱃 넘버링에 따른 하나 이상의 위치는 실제 서열에서 존재할 수 없거나 실제 서열은 캐뱃 넘버링에 의해 허용되는 수보다 많은 아미노산 잔기를 함유할 수 있다). 이것은 일반적으로 캐뱃에 따른 넘버링이 실제 서열에서 아미노산 잔기의 실제 넘버링에 상응하거나 상응하지 않을 수 있음을 의미한다.
VHH 도메인과 유사한 방식으로 적용될 수 있는, VH 도메인의 아미노산 잔기를 넘버링하기 위한 대안의 방법이 당업계에 공지되어 있다. 그러나, 달리 지적되지 않는 경우, 본원 명세서, 청구항 및 도면에서는 상기된 바와 같이 VHH 도메인에 적용되는 캐뱃에 따른 넘버링이 수행될 것이다.
VHH 도메인에서 아미노산 잔기의 총수는 통상적으로 110개 내지 120개, 흔히 112개 내지 115개의 범위일 것이다. 그러나 보다 작고 긴 서열이 본원에 기재된 목적에 적합할 수 있음을 주지해야 한다.
VHH 도메인 및 이를 함유하는 폴리펩타이드의 추가의 구조적 특징 및 기능적 성질은 하기와 같이 요약될 수 있다:
VHH 도메인(경쇄 가변 도메인의 존재 및 이것과의 임의의 상호작용 없이 본래 기능적으로 항원에 결합하도록 "디자인"됨)은 단일의 비교적 작은 기능성 항원 결합 구조 단위, 도메인 또는 폴리펩타이드로서 기능할 수 있다. 이것은 VHH 도메인을, 그 자체가 단일 항원-결합 단백질 또는 면역글로불린 단일 가변 도메인으로서 실제 응용에 적합하지 않아 기능성 항원-결합 단위(예를 들어, 통상적인 항체 단편, 예를 들어, Fab 단편에서; VL 도메인에 공유 결합된 VH 도메인으로 이루어진 scFv에서)를 제공하기 위해서는 몇몇 형태 또는 또 다른 형태로 조합될 필요가 있는 통상적인 4개 쇄 항체의 VH 및 VL 도메인과 구분시켜 준다.
이들 독특한 성질 때문에, 단독으로서 또는 대형 폴리펩타이드의 일부로서 VHH 도메인의 용도는 통상적인 VH 및 VL 도메인, scFv 또는 통상적인 항체 단편(예를 들어, Fab- 또는 F(ab')2-단편)의 용도보다 상당수의 이점을 제공한다:
- 고친화성 및 고선택성으로 항원과 결합하는데 단일 도메인만이 요구되어 2개의 별도의 도메인이 존재할 필요가 없고 이들 2개의 도메인이 올바른 공간 입체구조 및 구성(즉, scFv와 함께 특별히 디자인된 링커의 사용을 통한)로 존재하도록 할 필요가 없고;
- VHH 도메인은 단일 유전자로부터 발현될 수 있고 어떠한 해독 후 폴딩 또는 변형을 필요로 하지 않고;
- VHH 도메인은 다가 및 다특이적 포맷(본원에서 추가로 논의되는 바와 같음)으로 용이하게 조작될 수 있고;
- VHH 도메인은 고도로 가용성이고 응집하는 경향을 갖지 않고(문헌[참조: Ward et al., Nature 341: 544-546 (1989)]에 기재된 마우스 유래 항원-결합 도메인과 같음);
- VHH 도메인은 열, pH, 프로테아제 및 다른 변성제 또는 조건에 대해 고도로 안정하므로, 냉장 설비의 사용, 운송 비용, 시간 및 환경적 비축 없이 제조되거나, 저장되거나 수송될 수 있으며;
- VHH 도메인은 생산을 위해 요구되는 규모로도 제조하기가 용이하고 비교적 저렴하다. 예를 들어, VHH 도메인 및 이를 함유하는 폴리펩타이드는 미생물 발효(예를 들어, 하기에 추가로 기재된 바와 같음)를 사용하여 제조될 수 있고, 예를 들어 통상적인 항체 단편과 같이 포유동물 발현 시스템을 사용할 필요가 없고;
- VHH 도메인은 통상적인 4개 쇄 항체 및 이의 항원 결합 단편과 비교하여 비교적 작고(대략적으로 15 kDa, 또는 통상적인 IgG 보다 10배 작음), 따라서, 상기 통상적인 4개 쇄 항체 및 이의 항원-결합 단편보다
-- 높은 조직으로의 (보다) 높은 침투율을 보여주고
-- 보다 고용량으로 투여될 수 있고;
- VHH 도메인은 소위 중공(cavity)-결합 성질(특히, 통상적인 VH 도메인과 비교하여 이들의 연장된 CDR3 루프로 인함)을 나타낼 수 있고, 따라서 또한 통상적인 4개 쇄 항체 및 이의 항원-결합 단편에 접근 불가능한 표적 및 에피토프에 접근할 수 있다.
특이적 항원 또는 에피토프에 결합하는 VHH 도메인을 수득하는 방법은 예를 들어, WO2006/040153 및 WO2006/122786에서 일찍이 기재되었다. 또한, 본원에 상세히 기재된 바와 같이, 카멜리드로부터 유도된 VHH 도메인은 본래의 VHH 서열의 아미노산 서열 중에 하나 이상의 아미노산 잔기를 사람 기원의 통상적인 4개 쇄 항체의 VH 도메인에서 상응하는 위치(들)에 발생하는 하나 이상의 아미노산 잔기로 대체함에 의해 "사람화"될 수 있다. 사람화된 VHH 도메인은 하나 이상의 완전한 사람 골격 영역 서열을 함유할 수 있고, 보다 더 특이적인 실시형태에서, JH 서열, 예를 들어, JH5와 임의로 조합된, DP-29, DP-47, DP-51 또는 이의 일부로부터 유도된 사람 골격 영역 서열을 함유할 수 있다.
f2) "Dab", "도메인 항체", 및 "dAb"(용어 "도메인 항체" 및 "dAb"는 제조원(GlaxoSmithKline group of companies)에 의해 상표명으로 사용된다)로서도 공지되어 있는 "도메인 항체"는 예를 들어, 문헌[참조: Ward, E.S., et al.: "Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli", Nature 341: 544-546 (1989); Holt, L.J. et al.: "Domain antibodies: proteins for therapy"; TRENDS in Biotechnology 21(11): 484-490 (2003); 및 WO2003/002609]에 기재되어 있다.
도메인 항체는 필수적으로 비-카멜리드 포유동물, 특히 사람 4개 쇄 항체의 VH 또는 VL 도메인에 상응한다. 단일 항원 결합 도메인으로서, 즉 각각 VL 또는 VH 도메인과 쌍을 형성하지 않고 에피토프에 결합하기 위해서는, 예를 들어, 사람 단일 VH 또는 VL 도메인 서열의 라이브러리를 사용하여 상기 항원 결합 성질에 대한 특이적 선택이 요구된다. 도메인 항체는 VHH와 같이 약 13 내지 약 16kDa의 분자량을 갖고, 완전한 사람 서열로부터 유도되는 경우, 예를 들어, 사람에서 치료학적 사용을 위해 사람화될 필요가 없다. VHH 도메인의 경우에서와 같이, 이들은 또한 원핵 발현 시스템에서도 잘 발현되어 총 제조 비용의 현저한 절감을 제공한다.
VHH 도메인뿐만 아니라 도메인 항체는 하나 이상의 CDR의 아미노산 서열 중에 하나 이상의 변경을 도입시켜 친화성 성숙을 행할 수 있고, 상기 변경은 각각의 모 분자와 비교하여 각각의 항원에 대해 수득된 면역글로불린 단일 가변 도메인의 친화성을 개선시킨다. 본 발명의 친화성-성숙된 면역글로불린 단일 가변 도메인 분자는 예를 들어, 문헌[참조: Marks et al., 1992, Biotechnology 10:779-783, 또는 Barbas, et al., 1994, Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91: 3809-3813.; Shier et al., 1995, Gene 169:147-155; Yelton et al., 1995, Immunol. 155: 1994-2004; Jackson et al., 1995, J. Immunol. 154(7):3310-9; 및 Hawkins et al., 1992, J. Mol. Biol. 226(3): 889 896; KS Johnson and RE Hawkins, "Affinity maturation of antibodies using phage display", Oxford University Press 1996]에 기재된 바와 같이 당업계에 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다.
f3) 또한, 상기 언급된 CDR 중 하나 이상을, 사람 스캐폴드(scaffold) 또는 비-면역글로불린 스캐폴드를 포함하지만 이들에 제한되지 않는 다른 "스캐폴드"상으로 "절편이식"시킬 수 있음은 당업자에게 자명할 것이다. 상기 CDR 절편이식을 위해 적합한 스캐폴드 및 기술은 당업계에 공지되어 있다.
g) 상호교환적으로 사용될 수 있는 용어 "에피토프" 및 "항원 결정인자"는 항원-결합 분자, 예를 들어, 본 발명의 통상적인 항체 또는 폴리펩타이드에 의해 인지되는 거대 분자의 일부, 예를 들어 폴리펩타이드를 나타내고, 보다 특히 상기 분자의 항원-결합 부위에 의해 인지되는 거대분자의 일부를 나타낸다. 에피토프는 면역글로불린에 대한 최소 결합 부위를 한정하고, 따라서 면역글로불린의 특이성 표적을 나타낸다.
에피토프를 인지하는 항원-결합 분자(예를 들어, 통상적인 항체 또는 본 발명의 폴리펩타이드)의 일부는 소위 파라토프로 불리운다.
h) 본원에 사용된 바와 같은 용어 "바이파라토픽" (항원-)결합 분자 또는 "바이파라토픽" 폴리펩타이드는 본원에 정의된 바와 같은 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 의미하고, 여기서, 상기 2개의 가변 도메인은 하나의 항원의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있고, 상기 에피토프는 통상적으로 하나의 단일특이적 면역글로불린, 예를 들어, 통상적인 항체 또는 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인에 의해 동시에 결합되지 않는다. 본 발명에 따른 바이파라토픽 폴리펩타이드는 상이한 에피토프 특이성을 갖고, 동일한 에피토프에 결합하는 상호 상보적 가변 도메인 쌍을 함유하지 않는 가변 도메인으로 이루어진다. 이들은 따라서 A-베타에 결합하는 것에 대해 서로 경쟁하지 않는다.
i) "결합할 수 있는" 또는 "특이적으로 결합할 수 있는", 특정 에피토프, 항원 또는 단백질에 대하여(또는 이의 하나 이상의 부분, 단편 또는 에피토프에 대하여) "에 대한 친화성을 갖는" 및/또는 "에 대해 특이성을 갖는" 폴리펩타이드(예를 들어, 면역글로불린, 항체, 면역글로불린 단일 가변 도메인, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 일반적으로 항원 결합 분자 또는 이의 단편)는 상기 에피토프, 항원 또는 단백질에 "대한" 또는 "대해 지시된" 것으로 일컬어지거나 상기 에피토프, 항원 또는 단백질과 관련된 "결합" 분자이다.
k) 일반적으로, 상기 용어 "특이성"은 특정 항원-결합 분자 또는 항원-결합 단백질(예를 들어, 면역글로불린, 항체, 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 본 발명의 폴리펩타이드)이 결합할 수 있는 상이한 유형의 항원 또는 에피토프의 수를 나타낸다. 항원-결합 단백질의 특이성은 이의 친화성 및/또는 결합활성(avidity)을 기준으로 결정할 수 있다. 항원-결합 단백질과 항원의 해리에 대한 평형 상수(KD)로 나타낸 친화성은 항원-결합 단백질 상의 에피토프와 항원-결합 부위간의 결합 강도에 대한 척도이다: KD의 값이 작을수록 에피토프와 항원-결합 분자간의 결합 강도는 강해진다(대안적으로, 상기 친화성은 또한 1/KD인 친화성 상수(KA)로서 표현될 수 있다). 당업자에게 자명한 바와 같이(예를 들어, 본원의 추가의 기재를 기준으로), 친화성은 목적하는 특이적 항원에 따라 공지된 방식 자체로 측정될 수 있다. 결합활성은 항원-결합 분자(예를 들어, 면역글로불린, 항체, 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 본 발명의 폴리펩타이드)와 적합한 항원간의 결합 강도의 척도이다. 결합활성은 항원-결합 분자 상의 에피토프와 이의 항원 결합 부위간의 친화성과, 항원-결합 분자 상에 존재하는 관련 결합 부위의 수 모두와 관련된다.
전형적으로, 항원-결합 단백질(예를 들어, 본 발명의 폴리펩타이드)은 10E-5 내지 10E-14 몰/리터(M) 이하, 및 바람직하게는 10E-7 내지 10E-14 몰/리터(M) 이하, 보다 바람직하게는 10E-8 내지 10E-14 몰/리터, 및 보다 더 바람직하게는 10E-11 내지 10E-13의 해리 상수(KD)(실시예 9.7에 기재된 바와 같은 키넥사 검사(Kinexa assay)으로 측정시), 및/또는 적어도 10E7 ME-1, 바람직하게 적어도 10E8 ME-1, 보다 바람직하게 적어도 10E9 ME-1, 예를 들어, 적어도 10E11 ME-1의 결합 상수(KA)로 결합할 것이다. 10E-4 M 초과의 임의의 KD 값은 일반적으로 비-특이적 결합을 지적하는 것으로 고려된다. 바람직하게, 본 발명의 폴리펩타이드는 500 nM 미만, 바람직하게는 200 nM 미만, 보다 바람직하게는 10 nM 미만, 예를 들어 500 pM 미만의 KD로 목적하는 항원에 결합할 것이다. 항원 또는 에피토프로의 항원-결합 단백질의 특이적 결합은 예를 들어, 본원에 기재된 검사, 스캐차드 분석(Scatchard analysis) 및/또는 경쟁 결합 분석, 예를 들어, 방사선 면역 검사(RIA), 효소 면역 검사(EIA) 및 샌드위치 경쟁 검사를 포함하는 임의의 공지된 적합한 방식 자체 및 당업계에 공지된 자체의 상이한 변법으로 측정할 수 있다.
l) 아미노산 잔기는 당업계에 일반적으로 공지되고 이에 동의된 표준 3개-문자 또는 1개-문자 아미노산 코드에 따라 나타낼 것이다. 2개의 아미노산 서열을 비교하는 경우, 상기 용어 "아미노산 차이"는 제2 서열과 비교하여 참조 서열의 위치에서 지적된 수의 아미노산 잔기의 삽입, 결실 또는 치환을 나타낸다. 치환(들)의 경우에, 상기 치환(들)은 바람직하게 보존성 아미노산 치환(들)이고, 이는 아미노산 잔기가 유사한 화학적 구조의 다른 아미노산 잔기로 대체된 것을 의미하고, 상기 폴리펩타이드의 기능, 활성 또는 다른 생물학적 성질에 대해 필수적으로 거의 어떠한 영향을 미치지 않거나 전혀 영향을 미치지 않는다. 상기 보존성 아미노산 치환은 예를 들어, WO 98/49185에 기재된 바와 같이 당업계에 널리 공지되어 있고, 보존성 아미노산 치환은 바람직하게 하기 그룹 (i) 내지 (v) 내 하나의 아미노산이 동일한 그룹 내에 다른 아미노산 잔기에 의해 치환되는 치환이다: (i) 소형 지방족, 비극성 또는 약간의 극성 잔기: Ala, Ser, Thr, Pro 및 Gly; (ii) 극성의 음으로 하전된 잔기 및 이들의 (비하전된) 아미드: Asp, Asn, Glu 및 Gln; (iii) 극성의 양으로 하전된 잔기: His, Arg 및 Lys; (iv) 대형 지방족의 비극성 잔기: Met, Leu, Ile, Val 및 Cys; 및 (v) 방향족 잔기: Phe, Tyr 및 Trp. 특히 바람직한 보존성 아미노산 치환은 다음과 같다:
Ala의 Gly 또는 Ser로의 치환;
Arg의 Lys로의 치환;
Asn의 Gln 또는 His로의 치환;
Asp의 Glu로의 치환;
Cys의 Ser로의 치환;
Gln의 Asn으로의 치환;
Glu의 Asp로의 치환;
Gly의 Ala 또는 Pro로의 치환;
His의 Asn 또는 Gln으로의 치환;
Ile의 Leu 또는 Val로의 치환;
Leu의 Ile 또는 Val로의 치환;
Lys의 Arg, Gln 또는 Glu로의 치환;
Met의 Leu, Tyr 또는 Ile로의 치환;
Phe의 Met, Leu 또는 Tyr로의 치환;
Ser의 Thr로의 치환;
Thr의 Ser로의 치환;
Trp의 Tyr로의 치환;
Tyr의 Trp 또는 Phe로의 치환;
Val의 Ile 또는 Leu로의 치환.
m) 핵산 또는 폴리펩타이드 분자는 예를 들어, 이의 본래의 생물학적 공급원 및/또는 이것이 수득되는 반응 매질 또는 배양 배지와 비교하는 경우, 이것이 일반적으로 상기 공급원 또는 배지 중에서 연합된 하나 이상의 다른 성분, 예를 들어, 다른 핵산, 다른 단백질/폴리펩타이드, 다른 생물학적 성분 또는 거대분자 또는 하나 이상의 오염물, 불순물 또는 최소 성분으로부터 분리되는 경우, "필수적으로 분리된 (형태)"인 것으로 고려된다. 특히, 핵산 또는 폴리펩타이드 분자는 이것이 적어도 2배, 특히 적어도 10배, 보다 특히 적어도 100배 및 1000배까지 또는 그 이상으로 정제된 경우 "필수적으로 분리된"것으로 고려된다. "필수적으로 분리된 형태"인 핵산 또는 폴리펩타이드 분자는 바람직하게 필수적으로, 적합한 크로마토그래피 기술, 예를 들어, 폴리아크릴아미드-겔 전기영동과 같은 적합한 기술을 사용한 측정시 균일하다.
n) 예를 들어, 2개의 면역글로불린 단일 가변 도메인 서열간의 "서열 동일성"은 이들 2개의 서열간에 동일한 아미노산 백분율(%)을 나타낸다. 이것은 문헌[WO08/020079]의 제49면 및 제50면 상에 문단 f)에 기재된 바와 같이 계산되고 결정될 수 있다. "서열 유사성"은 동일하거나 보존성 아미노산 치환을 나타내는 아미노산의 백분율(%)을 나타낸다.
표적 특이성
본 발명의 폴리펩타이드는 이들이 하나 이상의 A-베타 분자 및 보다 정확하게는 A-베타 분자(들) 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하여 A-베타에 대한 특이성을 갖는다. A-베타는 예를 들어, 상이한 형태, 예를 들어, 단량체성 형태, 올리고- 및 다량체성 형태, 응집된 가용성 및 불용성 형태, 섬유 형태, 원시섬유 형태, 아밀로이드 플라크 형태 및 침착물로 인체에 존재할 수 있고, 이들은 중추신경계, 골근육, 혈소판, 혈관계, 췌장, 신장, 비장, 심장, 간, 고환, 대동맥, 폐, 장, 피부, 부신, 침샘 및 갑상선에 존재한다(문헌참조: Roher et al. Alzheimer's & Dementia 5 (2009) p.18-29). 본 발명의 폴리펩타이드가 A-베타가 발생할 수 있는 임의의 형태 및 특히 생물학적 및/또는 치료학적 관점으로부터 가장 관련이 있는 형태에 결합한다는 것은 본 발명의 범위 내에 있다.
본 발명의 폴리펩타이드는 상이한 길이의 A-펩타이드 분자, 예를 들어, 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 A-베타(1-42), 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열 중 아미노산 1번 내지 40번으로 이루어진 A-베타(1-40), A-베타(1-39)(아미노산 1번 내지 39번), A-베타(1-38)(아미노산 1번 내지 38), A-베타(1-37)(아미노산 1번 내지 37번) 등과 결합할 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드의 결합은 N-말단, C-말단 또는 이 사이의 임의의 곳에서 일어날 수 있다.
또한, 본 발명은 A-베타의 종 형태로 제한되지 않는다. 따라서, 본 발명의 폴리펩타이드는 바람직하게 치료학적 목적으로 의도되는 경우 사람 A-베타(서열번호 1)에 결합할 수 있다. 그러나, 예를 들어, 다른 온혈 동물 또는 바람직하게 포유동물 형태의 A-베타에 결합하는 폴리펩타이드도 본 발명의 범위 내에 있다. A-베타의 하나의 종 형태에 결합하는 본 발명의 폴리펩타이드는 하나 이상의 다른 종 기원의 A-베타와 교차-반응할 수 있다. 예를 들어, 사람 A-베타에 결합하는 본 발명의 폴리펩타이드는 영장류의 하나 이상의 다른 종 기원의 A-베타 및/또는 질환에 대한 동물 모델(예를 들어 마우스 - 참조 서열번호 2, 래트, 토끼, 돼지 또는 개)에서 및 특히 A-베타와 연관된 질환 및 장애에 대한 동물 모델(예를 들어, 본원에 언급된 종 및 동물 모델)에서 흔히 사용되는 하나 이상의 동물 종 기원의 A-베타와의 교차-반응을 나타내거나 나타내지 않을 수 있다. 상기 교차-반응성을 나타내는 본 발명의 폴리펩타이드는 연구 및/또는 약물 개발 관점에서 이점을 가질 수 있는데 그 이유는 이것이 본 발명의 폴리펩타이드가 마우스 또는 래트와 같은 중요한 질환 모델에서 시험될 수 있기 때문이다.
또한, 본 발명은 본 발명의 폴리펩타이드가 지시되는 A-베타의 특이적 항원 결정인자, 에피토프, 부분, 도메인, 서브유니트 또는 입체구조(경우에 따라)로 제한되거나 이에 의해 정의되지 않는다. 본 발명의 폴리펩타이드가 지시될 수 있는 A-베타의 바람직한 에피토프의 일부는 면역치료요법 및 특히 AD의 수동 면역치료요법을 위해 사용되는 에피토프이다. 예를 들어, 문헌[참조: Weksler M., Immunity and Ageing 1, 2 (2004)] 및 본원에 언급된 배경 기술에 언급된 바와 같이, A-베타 상에는 3개의 주요 에피토프, 즉 N-말단 에피토프(A-베타의 아미노산 1번 내지 16번: DAEFRHDSGYEVHHQK; 서열번호 3), 중앙 에피토프(아미노산 16-28: KLVFFAEDVGSNK; 서열번호 4) 및 C-말단 에피토프(아미노산 28-42; KGAIIGLMVGGVVIA; 서열번호 5)가 존재하는 것으로 공지되어 있다. 본 발명의 폴리펩타이드는 이들 에피토프 중 어느 하나에 대해 지시될 수 있다. 2개 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 본 발명의 폴리펩타이드가 특히 바람직하고, 여기서 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 N-말단 에피토프에 결합하고 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인은 중앙 에피토프에 결합한다.
본 발명의
폴리펩타이드
이의 광범위한 의미에서, 본 발명은 A-베타 관련 질환, 장애 또는 병태 및 구체적으로 AD의 예방, 치료, 완화 및/또는 진단을 위한 신규한 약제학적 활성 제제를 제공한다. 본 발명에 따른 제제는 신규한 부류의 A-베타 결합 분자, 즉, 상이한 에피토프에서 항원 A-베타에 결합하는 2개 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 바이파라토픽 폴리펩타이드에 속한다. 보다 구체적으로, 본 발명의 상기 폴리펩타이드는 필수적으로 (i) A-베타의 제1 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 (ii) A-베타의 제2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인으로 이루어지거나 이를 포함하고, 여기서, A-베타의 제1 에피토프 및 A-베타의 제2 에피토프는 동일한 에피토프들이 아니다. 즉, 본 발명의 상기 폴리펩타이드는 A-베타내 존재하는 2개의 이상의 상이한 에피토프에 대해 지시된 2개 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하거나 필수적으로 이들로 이루어지고, 여기서, 상기 면역글로불린 단일 가변 도메인은 이들이 A-베타 동시에 결합할 수 있는 방식으로 서로 결합한다. 이러한 측면에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 또한 전체 폴리펩타이드가 A-베타에 대해 2개 이상의 결합 부위를 포함하는, "다가" 면역글로불린 작제물 및 특히 "다가 면역글로불린 단일 가변 도메인 작제물"로서 간주될 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드는 (적어도) 2개의 항-A-베타 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하고, 여기서, (상기) 2개의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 A-베타 분자내 상이한 에피토프에 대해 지시된다. 따라서, 상기 2개의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 상이한 에피토프 특이성을 갖고, 따라서 상이한 CDR 서열을 갖는다. 이러한 이유 때문에, 본원에서 본 발명의 폴리펩타이드는 각각 "바이파라토픽 폴리펩타이드", 또는 "바이파라토픽 도메인 항체 작제물"(면역글로불린 단일 가변 도메인이 도메인 항체로 이루어지거나 필수적으로 이루어진 경우), 또는 "바이파라토픽 나노바디 작제물" 또는 "바이파라토픽 VHH 도메인 작제물", 또는 "바이파라토픽 VHH 작제물"(면역글로불린 단일 가변 도메인이 나노바디 또는 VHH 도메인으로 이루어지거나 필수적으로 이루어진 경우)로 호칭되고 상기 2개의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 2개의 상이한 파라토프를 포함할 것이다.
본 발명의 특정 실시형태에 따라, 본 발명의 폴리펩타이드가 2개 이상의 항-A-베타 면역글로불린 단일 가변 도메인, 즉 3개, 4개 또는 그 이상의 항-A-베타 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 경우에, 항-A-베타 면역글로불린 단일 가변 도메인 중 2개 이상이 A-베타 분자내 상이한 에피토프에 대해 지시되고, 여기서 임의의 추가의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 상기 2개의 상이한 에피토프 및/또는 A-베타 분자내 존재하는 추가의 에피토프 중 어느 하나에 결합할 수 있다.
본 발명의 또 다른 특정 실시형태에 따라, 본 발명의 폴리펩타이드는 상기된 2개의 항-A-베타 면역글로불린 단일 가변 도메인 뿐만 아니라 A-베타로의 결합이 하기 임의의 추가의 모이어티에 의해 차단되지 않는 한, 임의의 다른 추가의 모이어티, 예를 들어, 링커(하기에 보다 상세하게 기재됨) 및/또는 추가의 단백질 도메인, 예를 들어, 추가의 면역글로불린 단일 가변 도메인(하기에서 보다 상세하게 기재된 바와 같음)을 포함할 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드는 글리코실 잔기, 변형된 아미노산 측쇄 등과 같은 변형을 추가로 포함할 수 있다.
이전에 제시된 바와 같이, 본 발명의 하나의 폴리펩타이드내에 2개의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 A-베타의 상이한 에피토프에 결합할 것이다. 이것은 하기의 방식 중 하나로 성취될 수 있다: 또한 2개의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 하나 및 동일한 A-베타 분자내 2개의 에피토프에 결합할 것이다(분자내 결합). 대안적으로, 이들은 2개의 별도의 A-베타 분자들 내에 위치한 에피토프에 결합할 수 있고, 즉 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 하나의 A-베타 분자 상에 하나의 에피토프에 결합하는 반면, 다른 면역글로불린 단일 가변 도메인은 다른 A-베타 분자 상에 다른 에피토프에 결합하여 2개의 A-베타 분자를 교차-결합시킬 것이다(분자간 결합).
바람직한 실시형태에 따라, 본 발명의 폴리펩타이드는 하나 및 동일한 A-베타 분자 내에 2개의 에피토프에 결합하여 교차-결합이 발생하고 본 발명의 폴리펩타이드-A-베타 복합체가 1:1의 화학양론으로 형성될 것이다. 따라서, (주로) 분자내 결합이 (주로) 분자간 결합에 비해 바람직하고, 그럼에도 불구하고 작은 일부분의 분자간 결합이 발생할 수 있는 것으로 이해된다. 분자내 및 분자간 결합은 바이아코어(Biacore) 또는 크기 배제 크로마토그래피 검사를 사용하여 구별될 수 있다[문헌(Santora et al., Anal. Biochem., 299: 119-129)에 기재된 바와 같음 - 하기 실시예 8.2 참조]. 그러나, 분리된 A-베타 분자들의 분자간 결합을 통해 작동하는 폴리펩타이드도 본 발명의 범위 내에 있는 것임을 주지해야 한다.
본 발명의 다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드에 포함되는 제1 및 제2 항-A-베타 면역글로불린 단일 가변 도메인은 각각 4개 골격 영역(각각 FR1 내지 FR4) 및 3개의 상보적 결정 영역(각각 CDR1 내지 CDR3)으로 필수적으로 이루어진다. 본 발명의 폴리펩타이드 내에서, 상기 제1 및 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인은 임의로 하기에 기재된 링커 펩타이드에 의해 공유 결합되고, 여기서, 상기 링커는 각각의 A-베타 에피토프에 대한 2개 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인의 최적 결합을 입체적으로 가능하게 한다.
사람에서의 약제학적 용도를 위해 본 발명의 폴리펩타이드가 바람직하게 사람 A-베타에 대해 지시되는 반면, 수의학적 목적을 위해서는 본 발명의 폴리펩타이드가 바람직하게 치료될 종 기원의 A-베타에 대해 지시된다는 것은 당업자에게 자명할 것이다.
사람에서 치료제로서 사용되는 경우, 본 발명에 따른 폴리펩타이드 내에 포함되는 면역글로불린 단일 가변 도메인이 바람직하게 사람화된 면역글로불린 단일 가변 도메인임은 당업자에게 또한 자명할 것이다.
본 발명에 따라, 2개 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 서로 독립적으로 도메인 항체, 즉, 상기된 바와 같이 VL 또는 VH 항체 도메인, 및/또는 상기된 바와 같이 VHH 도메인, 및/또는 임의의 다른 부류의 면역글로불린 단일 가변 도메인이고, 단, 이들 면역글로불린 단일 가변 도메인은 동일한 에피토프에 함께 결합하는 상호 상보적 가변 도메인 쌍(예를 들어, 통상적인 항체의 VL-VH 도메인 쌍의 경우에)을 형성함에 의한 것이 아니라 독립적으로 상이한 에피토프에 결합함에 의해(즉, 상기 정의된 바와 같이 "바이파라토픽" 항원 결합 분자로서) 항원, 즉 A-베타에 결합할 것이다.
본 발명의 바람직한 실시형태에 따라, 제1 및 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인은 필수적으로 상기된 바와 같이 도메인 항체 서열 또는 VHH 도메인 서열로 이루어진다. 특히 바람직한 실시형태에 따라, 제1 및 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인은 VHH 도메인 서열로 필수적으로 이루어진다.
따라서, 본 발명은 본원에서 및 특히 실험 부분에서 A-베타의 2개의 상이한 에피토프에 결합하는 2개의 (임의로 사람화된) 항-A-베타 VHH 도메인 서열(VHH)을 포함하는 바이파라토픽 폴리펩타이드, 즉 바이파라토픽 VHH 도메인 작제물에 관하여 보다 상세하게 기재할 걸이다. 그러나, 본원에서의 교시가 다른 항-A-베타 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩타이드, 예를 들어, 도메인 항체에 유사하게 적용될 수 있음은 당업자에게 자명할 것이다.
본 발명의 폴리펩타이드는 낮은 독성 및 고특이성과 같은 통상적인 항체의 유리한 특징을 가질 뿐만 아니라 이들은 또한 추가의 성질을 나타낸다. 이들은 보다 가용성이고, 이는 이들이 통상적인 항체와 비교하여 보다 높은 농도로 저장되고/되거나 투여될 수 있음을 의미한다. 이들은 실온에서 안정하고 이는 이들이 냉장 설비의 사용, 운송 비용, 시간 및 환경적 비축 없이 제조되고/되거나 저장되고/되거나 수송될 수 있음을 의미한다. 본 발명의 폴리펩타이드는 또한 극한 pH에서 연장된 안정성을 나타내고, 이는 이들이 경구 투여에 의한 전달에 적합할 수 있음을 의미한다.
또한, 본 발명의 폴리펩타이드는 "전형적인" 항체에 존재하는 Fc 부분을 포함할 필요가 없어 Fc 이펙터 기능에 의해 유발되는 부작용(예를 들어, 보체-의존성 세포독성(CDC) 또는 항체-의존성 세포독성(ADCC))이 회피될 수 있다. 항-A-베타 수동 면역화에 사용되는 경우, 통상적인 항체(Fc 부분을 가짐)는 ADCC 및/또는 CDC를 통한 미세출혈을 유도하는 대뇌 혈관 A-베타 침착(대뇌 아밀로이드 혈관병증)의 표적화와 관련된, 사람 및 동물 모델에서 관찰된 미세출혈의 유도에 관여할 것으로 의심된다(문헌 참조: Wilcock, DM, Colton, CA, CNS Neurol. Disord. Drug Targets (2009) Vol. 8(1):50-64).
본 발명의 다른 실시형태에 따라, 본 발명의 폴리펩타이드에 존재하는 2개 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 서로 직접(즉, 링커의 사용 없이) 또는 링커를 통해 연결될 수 있다. 상기 링커는 바람직하게 링커 펩타이드이고, 본 발명에 따라 2개 이상의 상이한 면역글로불린 단일 가변 도메인이 하나 및 동일한 A-베타 분자내 또는 2개의 상이한 분자내 A-베타의 2개 이상의 상이한 에피토프 각각에 결합할 수 있도록 선택될 것이다.
적합한 링커는 특히 에피토프 및 구체적으로 면역글로불린 단일 가변 도메인이 결합하는 A-베타 상의 에피토프간의 거리에 따라 다양하고, 본원에 기재된 바를 토대로, 임의로 제한된 정도의 통상적인 실험 후에 당업자에게 자명할 것이다.
또한, A-베타에 결합하는 2개 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인이 도메인 항체 또는 VHH 도메인인 경우, 이들은 또한 제3 도메인 항체 또는 VHH 도메인을 통해 서로 결합될 수 있다(여기서, 2개 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 제3 도메인 항체 또는 VHH 도메인에 직접 결합하거나 적합한 링커를 통해 결합할 수 있다). 상기 제3 도메인 항체 또는 VHH 도메인은 예를 들어, 본원에서 추가로 기재된 바와 같은 증가된 반감기를 위해 제공되는 도메인 항체 또는 VHH 도메인일 수 있다. 예를 들어, 후자 도메인 항체 또는 VHH 도메인은 본원에서 추가로 기재된 바와 같이 (사람) 혈청 알부민 또는 (사람) 트랜스페린과 같은 (사람) 혈청 단백질에 결합할 수 있는 도메인 항체 또는 VHH 도메인일 수 있다.
대안적으로, A-베타에 결합하는 2개 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 연속으로(직접적으로 또는 적합한 링커를 통해) 결합될 수 있고, 제3 (단일) 도메인 항체 또는 VHH 도메인(상기된 바와 같은 증가된 반감기를 제공할 수 있음)이 직접적으로 또는 링커를 통해 상기 2개 이상의 상기 언급된 면역글로불린 서열 중 하나에 연결될 수 있다.
적합한 링커는 본 발명의 특정 폴리펩타이드와 관련하여 기재되고 예를 들어, 제한 없이 9개 이상의 아미노산 길이, 보다 바람직하게는 17개 이상의 아미노산 길이, 예를 들어, 약 20개 내지 40개의 아미노산 길이를 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 그러나, 상한치는 중요하지 않고 예를 들어, 상기 폴리펩타이드의 생물약제학적 제조와 관련된 편의의 이유로 선택된다.
상기 링커 서열은 천연 발생 서열 또는 비-천연 발생 서열일 수 있다. 치료학적 목적을 위해 사용되는 경우, 상기 링커는 바람직하게 본 발명의 항-A-베타 폴리펩타이드가 투여되는 피검체에서 비면역원성이다.
링커 서열의 한가지 유용한 그룹은 WO 96/34103 및 WO 94/04678에 기재된 바와 같은 중쇄 항체의 힌지 영역으로부터 유도된 링커이다.
다른 예는 Ala-Ala-Ala와 같은 폴리-알라닌 링커 서열이다.
링커 서열의 추가의 바람직한 예는 상이한 길이의 Gly/Ser 링커, 예를 들어, (glyxsery)z 링커이고, (gly4ser)3, (gly4ser)4, (gly4ser), (gly3ser), gly3, 및 (gly3ser2)3을 포함한다.
본 발명의 폴리펩타이드가 중합체, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 모이어티의 부착에 의해 변형되는 경우, 상기 링커 서열은 바람직하게 링커 영역에서 상기 변형, 예를 들어, 페길화(PEGylation)를 가능하게 하는 시스테인 또는 라이신과 같은 아미노산 잔기를 포함한다. 상기 링커의 바람직한 예는 다음과 같다:
("GS27,C14", 서열번호 8),
("GS35,C15", 서열번호 9), 및
("GS35,C5", 서열번호 10).
상기 링커를 포함하는 본 발명의 페길화된 폴리펩타이드의 몇몇 비제한적인 예는 서열번호 40 내지 43, 142 및 143에 나타낸다.
또한, 상기 링커는 예를 들어, WO04/081026에 나타낸 바와 같이 폴리(에틸렌 글리콜) 모이어티일 수도 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드의 2개 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인은, 바람직하지만 비제한적인 실시형태에서 이미 상기된 바와 같은 추가의 면역글로불린 단일 가변 도메인일 수 있는 다른 폴리펩타이드와 같은 다른 모이어티를 통해(임의로 1개 또는 2개의 링커를 통해) 서로 결합한다. 상기 모이어티는 필수적으로 불활성이거나 상기 폴리펩타이드의 목적하는 성질을 개선시키는 것과 같은 생물학적 효과를 가질 수 있거나 상기 폴리펩타이드에 하나 이상의 추가의 목적하는 성질을 부여할 수 있다. 예를 들어, 제한없이 상기 모이어티는 단백질 또는 폴리펩타이드의 반감기를 개선시킬 수 있고/있거나 이의 면역원성을 감소시키거나 임의의 다른 목적하는 성질을 개선시킬 수 있다.
상기 작제물의 몇몇 비제한적인 예는 서열번호 34 내지 39의 작제물이다.
바람직한 실시형태에 따라, 본 발명의 폴리펩타이드는 서열번호 3에 의해 정의된 바와 같은 에피토프에 결합하는 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 서열번호 4에 의해 정의된 바와 같은 에피토프에 결합하는 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인, 또는 서열번호 4에 정의된 바와 같은 에피토프에 결합하는 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 서열번호 3에 의해 정의된 바와 같은 에피토프에 결합하는 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함한다.
보다 더 바람직하게는, 실시예 8.2 및 8.3에 기재된 바와 같이 면역글로불린 단일 가변 도메인과 A-베타 분자간의 접촉이 이루어지는데, 즉, 본 발명의 폴리펩타이드는 사람 또는 마우스 A-베타 펩타이드의 적어도 아미노산 1번, 3번, 13번, 20번 및 23번과 접촉한다.
바람직하게, 본 발명의 폴리펩타이드는 실시예 9.7에 기재된 바와 같은 키넥사 검사로 측정시 10- 6몰/리터 이하, 보다 바람직하게는 10- 9몰/리터 이하 및 보다 더 바람직하게는 10-11 내지 10-13 몰/리터 범위의 해리 상수(KD) 값을 갖거나, 실시예 9.3에 제시된 바와 같은 TR-FRET 결합 검사로 측정시 10-9 몰/리터 이하 및 바람직하게는 5 x 10- 10몰/리터 내지 10- 12몰/리터 범위의 IC50 값을 갖는다.
본 발명의 보다 더 바람직한 실시형태에 따라, 본 발명의 폴리펩타이드내 CDR 서열은 하기에 정의된 바와 같고, 또한 본 발명의 폴리펩타이드가 상기 문단에 제시된 바와 같은 해리 상수(KD)로 A-베타에 결합하거나 상기 제시된 바와 같은 IC50 값을 갖는다.
본 발명의 특정 실시형태에 따라, 본 발명의 폴리펩타이드는 하기의 구조를 갖는 2개의 A-베타 결합 면역글로불린 단일 가변 도메인(하기 표 1에 나타낸 바와 같은 서열번호)을 포함한다:
면역글로불린 단일 가변 도메인 1:
FR(1)1-CDR(1)1-FR(1)2-CDR(1)2-FR(1)3-CDR(1)3-FR(1)4,
면역글로불린 단일 가변 도메인 2:
FR(2)1-CDR(2)1-FR(2)2-CDR(2)2-FR(2)3-CDR(2)3-FR(2)4,
여기서
CDR(1)3은,
- 서열번호 13 및 서열번호 16에 따른 아미노산 서열; 및
- 각각 서열번호 13 또는 서열번호 16에 따른 상기 아미노산 서열과 비교하여, 3개 이하, 바람직하게는 2개 이하 및 보다 바람직하게는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열
로 이루어진 그룹으로부터 선택되고,
CDR(2)3은,
- 서열번호 19에 따른 아미노산 서열; 및
- 서열번호 19에 따른 상기 아미노산 서열과 비교하여 3개 이하, 바람직하게는 2개 이하 및 보다 바람직하게는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열
로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
여기서, 다른 CDR 서열 및 골격 영역 서열은 특별히 제한되지 않지만, 특정 요구에 따라 본 발명의 폴리펩타이드의 면역원성을 감소시키기 위해 사람용으로 의도된 폴리펩타이드의 경우에 사람화된 골격 영역과 같이 당업자에 의해 선택될 것이다. 면역글로불린 단일 가변 도메인 1 및 2의 순서는 특히 제한되지 않아 본 발명의 폴리펩타이드 내에 면역글로불린 단일 가변 도메인 1이 N-말단에 위치할 수 있고 면역글로불린 단일 가변 도메인 2는 C 말단에 위치할 수 있거나 그 반대일 수 있다.
바람직하게, CDR(1)3은 서열번호 13 및 서열번호 16에 따른 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, CDR(2)3은 서열번호 19에 따른 아미노산 서열이다.
보다 더 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩타이드는 하기의 구조를 갖는 2개의 A-베타 결합 면역글로불린 단일 가변 도메인(하기 표 1에 나타낸 서열번호)을 포함한다:
면역글로불린 단일 가변 도메인 1:
FR(1)1-CDR(1)1-FR(1)2-CDR(1)2-FR(1)3-CDR(1)3-FR(1)4,
면역글로불린 단일 가변 도메인 2:
FR(2)1-CDR(2)1-FR(2)2-CDR(2)2-FR(2)3-CDR(2)3-FR(2)4,
여기서,
CDR(1)1은 서열번호 11에 따른 아미노산 서열(서열번호 14에 따른 아미노산 서열과 동일함)이고;
CDR(1)2는 서열번호 12 및 서열번호 15에 따른 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
CDR(1)3은 서열번호 13 및 서열번호 16에 따른 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
CDR(2)1은 서열번호 17에 따른 아미노산 서열이고;
CDR(2)2는 서열번호 18에 따른 아미노산 서열이고;
CDR(2)3은 서열번호 19에 따른 아미노산 서열이고;
여기서, 골격 영역 서열은 특별히 제한되지 않지만 특정 필요에 따라 본 발명의 폴리펩타이드의 면역원성을 감소시키기 위해 사람용으로 의도된 폴리펩타이드의 경우에 사람화된 골격 영역과 같이 당업자에 의해 선택될 것이다.
상기된 바와 같은 본 발명의 폴리펩타이드에서, 상기 폴리펩타이드 내에서 상기한 바와 같은 면역글로불린 단일 가변 도메인 1 및 2의 특정 순서는 중요하지 않으므로 상기 언급된 면역글로불린 단일 가변 도메인 1은 상기 폴리펩타이드의 N-말단에 위치하고, 이어서 상기 언급된 면역글로불린 단일 가변 도메인 2가 위치할 수 있거나; 대안적으로, 상기 언급된 면역글로불린 단일 가변 도메인 2는 상기 폴리펩타이드의 N-말단에 위치하고, 이어서 상기 언급된 면역글로불린 단일 가변 도메인 1이 위치할 수 있다. 2개의 경우에, 추가의 서열 및 잔기는 본 발명의 폴리펩타이드 내에 예를 들어, N-말단 또는 C-말단에 존재하거나, 본원에서 보다 상세하게 제시된 바와 같이 2개의 면역글로불린 단일 가변 도메인 사이에 위치할 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드 내에 존재하고 상기된 바와 같은 상기 CDR 서열 및 6개 CDR 서열 세트는 각각 하기 표 1 및 2에 요약되어 있다:
표 1 및 표 2: 2개의 상이한 A-베타 결합 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 본 발명의 폴리펩타이드 내의 바람직한 CDR 조합
상기된 바와 같은 면역글로불린 단일 가변 도메인에 대해 골격 영역 서열로서 또한 사용될 수 있는 사람 면역글로불린 골격 영역 서열(FR)은 당업계에 공지되어 있다. 또한, 사람 이외의 종으로부터 유도된 면역글로불린 단일 가변 도메인의 골격 영역을 사람화시키기 위한 방법이 당업계에 공지되어 있다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 하기의 골격 영역 아미노산 서열 1 내지 4(FR1 내지 FR4: 하기 표 3에 지적된 바와 같은 서열번호)를 포함한다:
FR1은 서열번호 20 및 서열번호 21에 따른 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열이거나 이를 포함하고;
FR2는 서열번호 22에 따른 아미노산 서열이거나 이를 포함하고;
FR3은 서열번호 23 및 서열번호 24에 따른 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열이거나 이를 포함하고; FR4는 서열번호 25에 따른 아미노산 서열이거나 이를 포함한다.
상기된 바와 같은 FR 및 CDR 서열을 갖는 면역글로불린 단일 가변 도메인의 특정 예는 다음과 같다:
면역글로불린 단일 가변 도메인 1(제1 아미노산, 즉, 글루타메이트는 임의로 부재일 수 있다):
(ABII035; 서열번호 44)
면역글로불린 단일 가변 도메인 2(제1 아미노산, 즉, 글루타메이트는 임의로 부재일 수 있다):
하나의 단일 폴리펩타이드 쇄에 상기에 나타낸 2개의 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 임의로 상기 2개의 면역글로불린 단일 가변 도메인을 연결하는 링커를 포함하는 본 발명의 폴리펩타이드의 특정 예는 하기에 추가로 나타낸다.
바람직한 실시형태에 따라, 본 발명의 폴리펩타이드는 특히 치료제로서 사용되는 경우 환자의 혈청 또는 다른 체액에서 본 발명의 폴리펩타이드의 반감기를 연장하는 모이어티를 포함한다. 상기 용어 "반감기"는 예를 들어, 중화 기작에 의한 상기 폴리펩타이드의 분해 및/또는 제거 및/또는 차단으로 인해 (변형된) 폴리펩타이드의 혈청 농도가 생체 내에서 50%까지 감소하는데 소요되는 시간을 의미한다.
보다 구체적으로, 상기 반감기 연장 모이어티는 상기 폴리펩타이드에 공유결합으로 연결되거나 융합될 수 있고, 제한없이 Fc 부분, 알부민 모이어티, 알부민 모이어티의 단편, 알부민 결합 모이어티, 예를 들어, 항-알부민 면역글로불린 단일 가변 도메인, 트랜스페린 결합 모이어티, 예를 들어, 항-트랜스페린 면역글로불린 단일 가변 도메인, 폴리옥시알킬렌 분자, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 분자, 알부민 결합 펩타이드, 또는 하이드록시에틸 전분(HES) 유도체일 수 있다.
하나의 실시형태에 따라, 본 발명의 폴리펩타이드는, 본 발명의 폴리펩타이드에 하나 이상의 이펙터 기능을 부여하고/하거나 하나 이상의 Fc 수용체에 결합하는 능력을 부여할 수 있는 하나 이상의 항체 부분, 단편 또는 도메인에 결합할 수 있다. 예를 들어, 상기 목적을 위해서 및 이에 제한되지 않고, 상기 항체 부분은 예를 들어 중쇄 항체(상기된 바와 같음) 및 보다 바람직하게는 통상적인 사람 4개 쇄 항체로부터 기원하는, 항체의 CH2 및/또는 CH3 도메인이거나 이를 포함할 수 있고; 구체적으로 본 발명의 폴리펩타이드는 예를 들어, 사람 IgG, 사람 IgE 또는 다른 사람 Ig로부터 기원하는 Fc 영역에 결합할 수 있다. 예를 들어, WO 94/04678은 카멜리드 VHH 도메인 또는 이의 사람화된 유도체를 포함하는 중쇄 항체를 기재하고 있고, 여기서, 카멜리대 CH2 및/또는 CH3 도메인은 사람 CH2 및/또는 CH3 도메인으로 대체되어 2개의 중쇄로 이루어진 면역글로불린을 제공할 수 있고 상기 중쇄 각각은 임의로 사람화된 VHH 도메인 및 사람 CH2 및 CH3 도메인(그러나 CH1 도메인은 부재)을 포함하고, 상기 면역글로불린은 CH2 및 CH3 도메인에 의해 제공된 이펙터 기능을 갖고, 임의의 경쇄의 부재 하에 기능할 수 있고, 상기 변형 없이 상응하는 VHH 도메인과 비교하여 증가된 반감기를 갖는다.
Fc 부분(이펙터 기능 부재 또는 존재)을 포함하는 본 발명의 폴리펩타이드의 특정 예는 하기에 지적된 폴리펩타이드이다:
(서열번호 26)
(서열번호 27)
(서열번호 28)
(서열번호 30)
(서열번호 31)
본 발명의 추가의 실시형태에 따라, 2개의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 예를 들어, WO01/79271 및 WO03/59934에 기재된 바와 같이 혈청 알부민 분자에 융합될 수 있다.
사람 혈청 알부민 모이어티를 포함하는 본 발명의 바이파라토픽 A-베타 결합 폴리펩타이드의 예는 표 4에 나타낸다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 혈액 중에서 발견되는 항원, 예를 들어, 혈청 알부민, 혈청 면역글로불린, 티록신-결합 단백질, 피브리노겐 또는 트랜스페린에 결합하는 모이어티를 포함하여 본 발명의 수득된 폴리펩타이드에 증가된 생체내 반감기를 부여한다. 특히 바람직한 실시형태에 따라, 상기 모이어티는 알부민-결합 면역글로불린이고, 특히 바람직하게는 알부민-결합 VHH 도메인과 같은 알부민-결합 면역글로불린 단일 가변 도메인이다.
사람용으로 의도되는 경우, 상기 알부민-결합 면역글로불린 단일 가변 도메인은 바람직하게 사람 혈청 알부민에 결합하고, 바람직하게는 사람화된 알부민-결합 VHH 도메인일 것이다.
사람 혈청 알부민에 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, WO2006/122786에 추가로 상세히 기재되어 있다. 특히 유용한 알부민 결합 VHH 도메인은 아미노산 서열로 이루어지거나 이를 포함한다:
(서열번호 33)
알부민 결합 VHH 도메인을 포함하는 본 발명의 폴리펩타이드의 특정 예는 표 5에 나타낸다:
또 다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 혈청 알부민에 결합하는 모이어티를 포함하고, 여기서 상기 모이어티는 예를 들어, 국제 특허 공보 WO2008/068280 및 WO2009/127691에 기재된 바와 같은 알부민 결합 펩타이드이다.
또 다른 실시형태에 따라, 본 발명의 폴리펩타이드의 반감기 연장 변형(상기 변형은 또한 폴리펩타이드의 면역원성을 감소시킴)은 직쇄 또는 측쇄 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG) 또는 이의 유도체(예를 들어, 메톡시폴리(에틸렌 글리콜) 또는 mPEG)와 같은 적합한 약리학적으로 허용되는 중합체의 부착을 포함한다. 일반적으로, 임의의 적합한 형태의 페길화가 사용될 수 있고, 예를 들어, 항체 및 항체 단편(도메인 항체 및 scFv를 포함하지만 이에 제한되지 않음)을 위해 당업계에서 사용되는 페길화가 있고, 예를 들어, 문헌[Chapman, Nat. Biotechnol., 54, 531 -545 (2002); Veronese and Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 453-456 (2003); Harris and Chess, Nat. Rev. Drug. Discov. 2 (2003); WO 04/060965; 및 US6,875,841]을 참조한다.
폴리펩타이드의 페길화를 위한 다양한 시약이 또한 예를 들어, 제조원[Nektar Therapeutics, USA, 또는 NOF Corporation, Japan]으로부터 시판되고 있고, 예를 들어, Sunbright? EA 계열, SH 계열, MA 계열, CA 계열, 및 ME 계열, 예를 들어, Sunbright? ME-100MA, Sunbright? ME-200MA, 및 Sunbright? ME-400MA가 있다.
바람직하게, 부위-지시된 페길화는 특히 시스테인-잔기를 통해 사용된다(문헌 참조: Yang et al., Protein Engineering 16, 761-770 (2003)). 예를 들어, 상기 목적을 위해, PEG는 본 발명의 폴리펩타이드 내에서 천연적으로 발생하는 시스테인 잔기에 부착시킬 수 있거나 본 발명의 폴리펩타이드는 PEG 부착을 위해, 적합하게 하나 이상의 시스테인 잔기가 도입되도록 변형시킬 수 있거나, PEG의 부착을 위해, 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 아미노산 서열은 본 발명의 폴리펩타이드의 2개 이상의 기능성 도메인을 가교하는 링커 영역의 N- 및/또는 C-말단에 융합시킬 수 있고, 모두 당업자에게 공지된 단백질 조작 기술 자체를 사용한다.
바람직하게, 본 발명의 폴리펩타이드를 위해, 분자량이 5kDa 초과, 예를 들어 10kDa 초과 및 200kDa 미만, 예를 들어, 100kDa 미만, 예를 들어, 20kDa 내지 80 kDa의 범위인 PEG가 사용된다.
페길화와 관련하여, 일반적으로 본 발명은 또한 하나 이상의 아미노산 위치에서 페길화된 본 발명의 임의의 폴리펩타이드를 포함하고, 바람직하게 상기 방식의 페길화는 (1) 생체내 반감기를 증가시키고/시키거나, (2) 면역원성을 감소시키고/시키거나, (3) 페길화를 위해 공지된 하나 이상의 추가의 이로운 성질 자체를 제공하고/하거나, (4) A-베타에 대해 상기 폴리펩타이드의 친화성에 근본적으로 영향을 주지 않고/않거나(예를 들어, 하기 실시예에 기재된 것들과 같은 적합한 검사 의한 측정시 상기 친화성을 50% 초과로 감소시키지 않고, 보다 바람직하게는 10% 초과로 감소시키지 않음) (5) 본 발명의 폴리펩타이드의 다른 목적하는 성질 중 어느 하나에 영향을 주지 않음을 주지해야 한다. 적합한 PEG-그룹 및 이들을 특이적으로 또는 비특이적으로 부착시키는 방법은 당업자에게 자명할 것이다.
본 발명의 구체적인 바람직한 실시형태에 따라, 본 발명의 페길화된 폴리펩타이드는 분자량이 40 kDa 또는 60 kDa인 선형 PEG의 하나의 PEG 모이어티를 포함하고, 여기서, 상기 PEG 모이어티는 링커 영역내 폴리펩타이드에 부착되고, 구체적으로 서열번호 6에 나타낸 GS9-링커 펩타이드의 5번 위치, 서열번호 8에 나타낸 GS27-링커 펩타이드의 14번 위치, 또는 서열번호 9에 나타낸 GS35-링커 펩타이드의 15번 위치, 또는 서열번호 10에 나타낸 35GS-링커 펩타이드의 5번 위치의 Cys 잔기에 부착된다.
평균 분자량이 40kDa인 하기 화학식으로 나타낸 "Sunbright? ME-400MA"와 같은 상기 언급된 PEG 시약 중 하나로 바람직하게 페길화된 본 발명의 폴리펩타이드의 바람직한 예는 하기 표 6에 나타낸다.
추가의 실시형태에 따라, 본 발명의 폴리펩타이드는 폴리펩타이드가 혈뇌 장벽을 통과할 수 있게 해주는 모이어티를 추가로 포함한다. 특히, 본 발명의 수득한 폴리펩타이드가 혈뇌 장벽을 통과하도록 하는 상기 모이어티는 하나 이상(예를 들어 2개 및 바람직하게는 1개)의 면역글로불린 단일 가변 도메인, 예를 들어, WO02/057445에 기재된 뇌 표적화 항체 단편(VHH) FC44 및 FC5일 수 있다. 이의 예는 하기 표 19에 나타낸다.
따라서, 본 발명의 폴리펩타이드는 또한 하기의 화학식으로 기재할 수 있다:
A - ISVD1 - B - ISVD2 - C,
여기서,
ISVD1 및 ISVD2는 이전에 기재된 바와 같은 A-베타 결합 면역글로불린 단일 가변 도메인을 나타내고, 이는 A-베타의 상이한 에피토프에 결합하고, 예를 들어, 각각 서열번호 44 및 45에 따른 면역글로불린 단일 가변 도메인이고;
A, B 및 C는 서로 독립적으로,
- 비 부가적 모이어티(즉, A는 ISVD1의 N-말단이고, B는 ISVD1 및 ISVD2를 연결하는 펩타이드 결합이고, C는 ISVD2의 C-말단이다)
- 사람 IgG, IgM, IgD, IgE 등의 CH1, CH2, 및 CH3 도메인 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 도메인(바람직하게는 C는 CH2-CH3를 나타냄);
- 알부민 또는 이의 단편, 및 바람직하게는 사람 혈청 알부민 또는 이의 단편;
- 알부민 결합 모이어티 및 바람직하게는 알부민 결합 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 알부민 결합 펩타이드;
- 임의로 페길화된 링커 펩타이드(바람직하게 B는 바람직하게 PEG40 또는 PEG60 모이어티를 갖는 페길화된 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는, 3 내지 45개 아미노산을 갖는 링커 펩타이드를 나타냄);
- 하나 이상의 A-베타 결합 모이어티, 바람직하게 ISVD1 또는 ISVD2와 동일하거나 동일하지 않은 추가의 항-A-베타 면역글로불린 가변 도메인; 또는
- WO02/057445에 기재된 FC44 및 FC5와 같이 폴리펩타이드에 혈뇌 장벽 통과 성질을 부여하는 폴리펩타이드, 바람직하게 면역글로불린 단일 가변 도메인을 나타내거나,
여기서,
ISVD1, ISVD2, B 및 C는 상기된 의미를 갖고,
- A는 예를 들어, 이종 숙주 유기체에서의 발현 결과로서 N-말단의 임의로 포밀화된 Met 잔기; 및/또는 합성시 숙주 세포로부터 본 발명의 폴리펩타이드의 분비를 지시하는 시그널 또는 리더 서열; 및/또는 적합한 숙주 세포에서 폴리펩타이드의 발현 후 임의로 제거되는 프로-서열을 나타내거나;
여기서,
ISVD1, ISVD2, A 및 B는 상기된 의미를 갖고,
- C는 예를 들어, 상기 서열 또는 잔기에 대해 지시된 친화성 기술을 사용하여, 본 발명의 폴리펩타이드의 정제를 가능하게 하거나 촉진시키는 아미노산 서열 또는 잔기와 같은 "태그"를 나타내고; 상기 태그는 임의로 상기 정제 단계 후, 예를 들어, 화학적 또는 효소적 절단에 의해 제거되어 상기 폴리펩타이드의 성숙한 서열을 제공할 수 있고; 이러한 목적을 위해 상기 태그는 절단 가능한 링커 서열을 통해 폴리펩타이드 서열에 임의로 결합할 수 있거나 절단 가능한 모티프를 함유할 수 있다. 상기 잔기의 몇몇 바람직하지만 비제한적인 예는 다중 히스티딘 잔기, 글루타티온 잔기 및 myc-태그이고, 예를 들어, 
(서열번호 46)이다.
치료학적 용도
중요한 추가의 양상에 따라, 본 발명의 폴리펩타이드는 예를 들어,
- 특히 사람에서 하기 제시된 바와 같이, 알츠하이머 질환(AD), 건식 AMD 또는 녹내장과 같은 장애, 질환 또는 병태의 예방, 치료 및/또는 완화를 위한;
- 본 발명의 약제학적 유효량의 하나 이상의 폴리펩타이드 또는 본 발명의 상기 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물(하기 상세하게 기재된 바와 같음)을 이를 필요로 하는 피검체에게 투여함을 포함하는, 상기 치료요법을 필요로 하는 환자를 치료하는 방법(여기서, 상기 치료요법을 필요로 하는 피검체는 하기에 제시된 바와 같이, AD, 건식 AMD 또는 녹내장과 같은 장애, 질환 또는 병태를 앓는 사람일 수 있다)에서;
- 사람에서 하기 제시된 바와 같이, AD, 건식 AMD 또는 녹내장과 같은 장애, 질환 또는 병태의 예방, 치료 또는 완화용 약제를 제조하기 위한;
- 상기 언급된 목적을 위해 사용되는 약제학적 조성물 또는 약제에서 활성 성분으로서,
치료학적 목적을 위해 사용된다.
상기 언급된 바와 같은 장애, 질환 또는 병태(하기에서: 질환)는 본 발명의 폴리펩타이드를 환자 또는 사람에게 투여함에 의해 예방되고/되거나 치료되고/되거나 완화될 수 있는 질환이고, 보다 특히, A-베타 기능부전에 의해 매개되는 질환, 예를 들어, A-베타 생산의 기능부전, 침착 또는 제거 부재 및/또는 아밀로이드 플라크 형성, A-베타 올리고머의 형성 등에 의해 매개되는 질환 등이다. 보다 더 구체적으로, 상기 질환은 환자에서 A-베타 및/또는 아밀로이드 플라크 및/또는 A-베타 올리고머의 (목적하지 않은) 형성 또는 증강을 조절하고/하거나 감소시키고/시키거나 역전시킴에 의해 예방되고/되거나 치료되고/되거나 완화될 수 있는 질환이고, 상기 질환은 예를 들어, 신경퇴행성 질환, 즉, AD인 가장 중요한 A-베타 관련 신경퇴행성 질환을 포함한다.
따라서, 본 발명의 폴리펩타이드는,
- 또한 "알츠하이머 유형의 치매"로서 공지된, 알츠하이머 질환(AD: 임상전 및 전구증상 단계를 포함하는 모든 유형 및 단계의 질환;
- 건식 형태의 노인성 황반 변성(건식 AMD: 중앙 지도형 근위축)
- 녹내장
- 대뇌 아밀로이드 혈관병증(CAA);
- 성인 다운 증후군을 포함하는 삼체성 21 (다운 증후군);
- 네덜란드형의 아밀로이드증을 갖는 유전성 대뇌 출혈(HCHWA-D);
- 루이체를 갖는 치매;
- 이마관자엽 변성;
- 녹내장;
- 근위축성 축색 경화증,
- 산발성 봉입체 근염; 및
- 강박 장애, 공황 장애, 공황 발작, 광장 공포증, 외상후 스트레스 장애, 사회 공포증, 파괴적 행동 장애 및 만성 피로 증후군으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 노인 피검체(예를 들어, 55세 이상)에서의 불안 장애(여기서, 상기 노인 피검체는 임상 또는 임상전 AD, 만성 아밀로이드 혈관병증 및 다운 증후군으로부터 선택되는, A-베타와 관련된 병태로 진단되거나 진단되지 않을 수 있음)와 같은 질환의 예방, 치료 또는 완화를 위한 방법에 사용될 수 있고,
여기서, 상기 방법은 약제학적 활성량의 본 발명의 폴리펩타이드 및/또는 이를 포함하는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 피검체에게 투여함을 포함한다.
본원에서, 용어 "예방, 치료 및/또는 완화"는 질환의 예방 및/또는 치료 및/또는 경감을 포함할 뿐만 아니라 일반적으로 질환 개시를 차단하거나, 질환 진행을 서행시키거나 역전시키거나, 질환과 관련된 하나 이상의 증상의 개시를 차단하거나 서행시키거나, 질환과 관련된 하나 이상의 증상의 개시를 차단하거나 서행시키거나, 질환과 관련된 하나 이상의 증상을 감소시키고/시키거나 경감시키거나, 질환 및/또는 이와 관련된 임의의 증상의 중증도 및/또는 지속성을 감소시키고/시키거나 질환 및/또는 이와 관련된 임의의 증상의 중중도의 증가를 추가로 차단하거나 질환에 의해 유발되는 임의의 생리학적 손상을 감소시키거나 복구시킴을 포함하고, 일반적으로 치료되는 환자에게 유익한 임의의 약리학적 작용을 포함한다.
구체적으로, AD의 경우에, 본 발명의 폴리펩타이드, 조성물 및 방법은 AD에 대해 동정된 위험 인자 및/또는 입증된 A-베타 침착을 갖는 환자에서 AD의 개시를 차단하거나 지연시키는 것을 도와주기 위해, AD로 전환될 위험이 있는 경미한 인지 손상(MCI)을 갖는 환자를 치료하기 위해 그리고 임상전 또는 전구증상 질환 단계로부터 치매로 진행될 것으로 예상되는 환자에서 AD의 개시를 차단하거나 지연시키기 위해 사용될 수 있다. AD에 대한 유전학적 위험 인자는 APP 유전자내(특히 717번 위치에서 뿐만 아니라 670번 및 671번에서), 프레세닐린 유전자 PS1 및 PS2내 및 ApoE4내 특이적 돌연변이를 포함한다. 다른 위험 인자는 AD, 고콜레스테롤혈증, 죽상동맥경화증, 당뇨병 및/또는 고령의 가족력을 포함한다. AD에 대한 침착은 CSF내 A-베타(1-42) 및 타우 농도를 분석함에 의해 조기 진단될 수 있다. 신경영상화 기술(예를 들어, PET 및 MRI)은 AD로 전환될 위험에 처한 환자를 동정할 수 있다. 일반적으로, 여러 생물마커의 사용은 고민감성 및 특이성으로 매우 조기 단계에서 AD의 진단을 가능하게 한다.
다운 증후군, 네덜란드형의 아밀로이드증과 함께 유전성 대뇌 출혈 및 대뇌 베타-아밀로이드 혈관병증에 대한 소인의 경우, 본 발명의 폴리펩타이드, 조성물 및 방법은 또한 단일 및 재발성 대엽 출혈과 같은 이들의 잠재적인 결과물을 예방하기 위해 유용할 수 있다.
치료될 피검체는 포유동물 및 보다 특히 사람이다. 당업자에게 자명한 바와 같이, 치료될 피검체는 특히 본원에 언급된 질환, 장애 또는 병태를 앓거나 이의 위험에 처한 사람이다.
상기 질환의 치료 방법이 상기 질환을 치료하기 위한 약제의 제조를 포함한다는 것은 당업자에게 자명할 것이다. 또한, 본 발명의 폴리펩타이드는 상기 질환의 치료를 위해 의도된 약제 또는 약제학적 조성물에서 활성 성분으로서 사용될 수 있음은 자명하다. 따라서, 본 발명은 또한 상기 언급된 어느 질환, 장애 또는 병태의 예방, 치료 및/또는 완화용 약제학적 조성물의 제조에서 본 발명의 폴리펩타이드의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 치료학적 또는 예방학적 사용을 위한, 그리고 상기 본원에서 언급된 어느 질환, 장애 또는 병태의 예방, 치료 및/또는 완화를 위한 본 발명의 폴리펩타이드에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 본원에서 상기 언급된 질환, 장애 또는 병태의 예방, 치료 및/또는 완화를 위한 약제학적 조성물에 관한 것이고, 여기서, 상기 조성물은 하나 이상의 본 발명의 폴리펩타이드를 포함한다.
특정 이론에 얽매이지 않고, 상기 치료학적 또는 예방학적 효과는 하기의 기작에 의해 수행될 수 있다: 본 발명의 폴리펩타이드는 A-베타에 결합함으로써 하나 이상의 다른 A-베타 분자와의 상호작용 또는 A-베타와 수용체의 상호작용 또는 A-베타와 가용성 생분자의 상호작용 또는 A-베타와 불용성 생분자의 상호작용을 억제한다. 상기 표적 A-베타는 플라크 또는 현탁액 또는 용액의 일부, 또는 이들 중 하나 이상일 수 있고, 여기서, 다른 A-베타 분자는 또한 현탁액 또는 용액 또는 이들중 하나 이상 중에 플라크의 일부일 수 있다. 뇌, 혈관 또는 체내 다른 부위로부터 기원하는 단량체 형태, 올리고 및 다량체 형태, 응집된 가용성 및 불용성 형태, 섬유 형태, 원시 섬유 형태 및 아밀로이드 플라크와 같은 상이한 A-베타 형태의 제거는 본 발명의 폴리펩타이드가 A-베타에 결합하기 때문일 수 있다. A-베타 분자와, 예를 들어, 다른 A-베타 분자와 같은 다른 분자간의 상호작용 억제에 의한 체액 중 A-베타 수준의 감소, 및 바람직하게 혈액 중 가용성 A-베타 수준의 감소는 퇴행성 신경 질환의 증상을 완화시키고/시키거나 질환 진행을 서행시키거나 정지시키고/시키거나 뇌 손상, 기억 및 인지를 회복시킨다.
추가의 보다 일반적인 양상에 따라, 본 발명은 면역 치료요법 및 특히 수동 면역치료요법에 관한 것이고, 상기 방법은 본원에 언급된 바와 같은 질환을 앓거나 이의 위험에 처한 피검체에게 약제학적 활성량의 본 발명의 폴리펩타이드 및/또는 이를 포함하는 약제학적 조성물을 투여함을 포함한다.
또 다른 양상에 따라, 본 발명은 (i) 인지력 쇠퇴의 예방, 치료 및/또는 완화 및/또는 (ii) 인지 기능의 회복 및/또는 인지 기능의 개선을 위한 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 약제학적 활성량의 본 발명의 폴리펩타이드 및/또는 이를 포함하는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 피검체에게 투여함을 포함한다.
본 발명의 폴리펩타이드 및/또는 이를 포함하는 조성물은 사용될 특정 약제학적 제형 또는 조성물을 임의의 적합한 방식으로 이를 필요로 하는 피검체에게 투여할 수 있다. 따라서, 본 발명의 폴리펩타이드 및/또는 이를 포함하는 조성물은 예를 들어, 정맥내, 피하내, 근육내, 복강내, 피내, 경구로, 설하로(예를 들어, 혀 아래에 부가되고 점막을 통해 혀 아래 모세관 네트워크로 흡수되는 설하 정제, 분무제 또는 소적의 형태), 비강(내)(예를 들어, 비강 분무제 및/또는 에어로졸 형태로), 국소적으로, 좌제에 의해, 흡입에 의해, 유리체내로(특히, 건식 AMD 또는 녹내장의 치료를 위해) 또는 유효량 또는 유효 용량의 임의의 다른 적합한 방식으로 투여될 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드 및/또는 이를 포함하는 조성물은 예방되거나, 치료되거나 완화될 질환, 장애 또는 병태를 예방하고/하거나 치료하고/하거나 완화시키기 위해 적합한 치료 계획에 따라 투여된다. 임상의는 일반적으로 예방되거나, 치료되거나 완화될 질환, 장애 또는 병태, 이의 질환의 중증도, 이의 증상의 중증도, 사용될 본 발명의 특정 폴리펩타이드, 특정 투여 경로 및 사용될 약제학적 제형 또는 조성물, 연령, 성별, 체중, 식이, 환자의 일반적 상태와 같은 인자 및 임상의에게 널리 공지된 유사 인자에 따라 적합한 치료 계획을 결정할 수 있다. 일반적으로, 상기 치료 계획은 치료학적 및/또는 예방학적 유효량 또는 유효 용량으로 본 발명의 하나 이상의 폴리펩타이드 또는 이를 포함하는 하나 이상의 조성물을 투여함을 포함한다.
일반적으로, 본원에 언급된 질환, 장애 및 병태의 예방, 치료 및/또는 완화를 위해 그리고 치료될 특정 질환, 장애 또는 병태, 사용될 본 발명의 특정 폴리펩타이드의 효능, 특정 투여 경로 및 사용될 특정 약제학적 제형 또는 조성물에 따라, 본 발명의 폴리펩타이드는 일반적으로 체중 kg 및 용량 당 0.005 내지 20.0 mg, 바람직하게는 0.05 내지 10.0 mg/kg/용량, 및 보다 바람직하게는 0.5 내지 10 mg/kg/용량의 양으로, 연속적으로(예를 들어, 주입에 의해) 또는 단일 용량(예를 들어, 매일, 주 간격 또는 1개월 간격의 투약: 하기 참조)으로 투여되지만, 특히 이전에 언급된 파라미터에 따라 상당히 다양할 수 있다.
예방학적 적용을 위해, 본 발명의 폴리펩타이드를 함유하는 조성물은 또한 유사하거나 약간 보다 적은 용량으로 투여될 수 있다. 상기 용량은 또한 임의의 합병증의 경우에 개별 의사가 조정할 수 있다.
본 발명의 특정 폴리펩타이드 및 이의 특정 약리역학적 및 다른 성질에 따라, 이것은 매일, 2일마다, 3일마다, 4일마다, 5일마다 또는 6일마다, 1주 간격, 1개월 간격 등으로 투여될 수 있다. 투여 계획은 장기, 주간 치료를 포함할 수 있다. "장기"란 적어도 2주 및 바람직하게는 수개월 또는 수년간 지속됨을 의미한다.
본 발명의 폴리펩타이드 및 이를 포함하는 조성물의 효능은 관련된 특정 질환에 따라 임의의 적합한 시험관내 분석, 세포-기반 분석, 생체내 분석 및/또는 공지된 동물 모델 그 자체 또는 이의 조합을 사용하여 시험될 수 있다. 적합한 검사 및 동물 모델은 당업자에게 자명할 것이고, 예를 들어 하기 실시예에 사용되는 검사 및 동물 모델을 포함한다. 따라서, 적합한 검사는 항-A-베타 폴리펩타이드의 피복된 단량체성 또는 응집된 A-베타 펩타이드 또는 포획된 비오티닐화된 A-베타로의 결합을 측정하는 ELISA 결합 검사, 피복된 단량체성 또는 응집된 A-베타 펩타이드 또는 포획된 비오티닐화된 A-베타로의 결합을 측정하는 SPR(표면 플라스몬 공명) 검사(문헌참조: Malmqvist M.: Surface plasmon resonance for detection and measurement of antibody-antigen affinity and kinetics; Curr. Opin. Immunol. 5(2):282 (1993)), A-베타(1-40) 펩타이드/N-말단 영역 특이적 결합제 상호작용 또는 A-베타(1-40)/중추 영역 특이적 결합제 상호작용과의 경쟁을 측정하는 경쟁 TR-FRET(시간 분석된 형광 공명 에너지 전달) 검사, 응집의 예방 또는 분해를 측정하는 시험관내 A-베타 응집 검사, 알츠하이머 질환 환자 또는 APP 형질전환 동물 기원의 뇌에 대한 면역조직학적 분석을 사용한 분자의 아밀로이드 플라크로의 결합을 측정하는 TAPIR(조직 아밀로이드 플라크 면역반응성) 검사, 및 생체내 기계적 모델이지만, 이들에 제한되지 않는다.
바람직하게, 본 발명의 폴리펩타이드는 상기 검사 또는 모델 중 하나 이상에서 및 바람직하게 생체내 모델 중 하나 이상에서 당업계에 공지된 통상적인 항체(예를 들어, m266 및 3D6 항-A-베타 IgG 항체) 또는 WO2006/40153에 기재된 Nanobodies? 보다 우수한 특징을 갖는다.
약제학적 용도를 위해, 본 발명의 폴리펩타이드는 (i) 본 발명의 하나 이상의 폴리펩타이드 및 (ii) 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제, 보조제 및/또는 안정화제, 및 (iii) 임의로 하나 이상의 추가의 약제학적 활성 폴리펩타이드 및/또는 화합물을 포함하는 약제학적 제제로서 제형화될 수 있다. "약제학적으로 허용되는"이란 각각의 물질이 개체에게 투여되는 경우 임의의 생물학적 또는 다른 바람직하지 않은 효과를 나타내지 않고 이것이 함유된 약제학적 조성물 중에 다른 어느 성분(예를 들어, 약제학적 활성 성분)과 해로운 방식으로 상호작용하지 않음을 의미한다. 구체적인 예는 표준 참고서[문헌 참조: 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Company, USA (1990)]에서 찾을 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩타이드는 통상적인 항체 및 항체 단편 및 다른 약제학적 활성 단백질에 대해 임의의 공지된 방식 그 자체로 제형화되고 투여될 수 있다. 따라서, 추가의 실시형태에 따라, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 폴리펩타이드 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제, 보조제 및/또는 안정화제, 및 임의로 하나 이상의 추가의 약제학적 활성 물질을 함유하는 약제학적 조성물 또는 제제에 관한 것이다.
비제한적인 예로, 상기 제형은 경구 투여, 비경구 투여(예를 들어, 정맥내, 근육내, 피하, 수막강내, 해면체내 또는 복강내 주사 또는 정맥내 주입)를 위해, 국소적 투여를 위해, 설하 투여를 위해, 흡입, 피부 패치, 임플란트, 좌제에 의한 투여를 위해, 경피, 비강, 유리체내, 직장 또는 질내 투여 등을 위해 적합한 형태일 수 있다. 이의 제조에 사용하기 위한 방법 및 담체 뿐만 아니라 투여 방식에 의존하여 고체, 반고체 또는 액체일 수 있는 상기 적합한 투여 형태는 당업자에게 자명할 것이다.
정맥내, 근육내, 피하 주사 또는 정맥내 주입과 같은 비경구 투여를 위한 약제학적 제제는 예를 들어, 활성 성분을 포함하고 임의의 추가의 용해 또는 희석 단계 후에 주입 또는 주사용으로 적합한 멸균 용액, 현탁액, 분산액, 에멀젼 또는 산제일 수 있다. 상기 제제를 위해 적합한 담체 또는 희석제는 예를 들어, 제한없이 멸균수 및 약제학적으로 허용되는 수성 완충제 및 용액, 예를 들어, 생리학적 인산 완충 식염수, 링거 용액, 덱스트로스 용액, 및 행크 용액; 물 오일; 글리세롤; 에탄올; 글리콜, 예를 들어, 프로필렌 글리콜, 및 미네랄 오일, 동물성 오일 및 식물성 오일, 예를 들어, 땅콩 오일, 대두 오일, 및 이들의 적합한 혼합물을 포함할 수 있다.
활성 화합물 또는 이의 염의 용액은 또한 항세균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살(티오메르살) 등과 같은 미생물의 성장을 차단하는 방부제를 함유할 수 있다. 많은 경우에, 등장성 제제, 예를 들어, 당, 완충제 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 적당한 유동성은 예를 들어, 리포좀 형성, 분산제의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지 또는 계면활성제의 사용으로 유지될 수 있다. 흡수를 지연시키는 다른 제제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴이 또한 첨가될 수 있다.
모든 경우에, 최종 용량 형태는 멸균 유체이어야만 하고 제조 및 저장 조건하에서 안정해야만 한다. 멸균된 주사 용액은 필요에 따라 상기 열거된 다른 다양한 성분과 함께 적당한 용매 중에서 요구되는 양으로 활성 화합물을 혼입함에 이어서 여과 멸균함에 의해 제조된다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 산제의 경우에, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조 기술이고, 이는 이전에 멸균 여과된 용액 중에 존재하는 임의의 추가의 목적하는 성분 및 활성 성분의 산제를 생성시킨다.
일반적으로, 수용액 또는 현탁액이 바람직할 것이다. 일반적으로, 본 발명의 폴리펩타이드와 같은 치료학적 단백질을 위해 적합한 제형은 용액의 등장성을 제공하기 위해 적합한 농도(예를 들어, 0.001 내지 400 mg/ml, 바람직하게 0.005 내지 200 mg/ml, 보다 바람직하게 0.01 내지 200 mg/ml, 보다 바람직하게 1.0 내지 100 mg/ml, 예를 들어, 1.0 mg/ml(정맥내 투여) 또는 100 mg/ml(피하 투여) 및 수성 완충제, 예를 들어,
- 포스페이트 완충 식염수, pH 7.4,
- 다른 포스페이트 완충액, pH 6.2 내지 8.2,
- 히스티딘 완충액, pH 5.5 내지 7.0,
- 숙시네이트 완충액, pH 3.2 내지 6.6, 및
- 시트레이트 완충제, pH 2.1 내지 6.2,
및, 임의로, 염(예를 들어, NaCI) 및/또는 당 또는 다가알콜(예를 들어, 트레할로스, 만니톨, 또는 글리세롤)로 단백질을 함유하는 용액과 같은 완충 단백질 용액이다.
바람직한 완충 단백질 용액은 220mM 트레할로스를 첨가함에 의해 등장성으로 조정된 25mM 포스페이트 완충액(pH 6.5) 중에 용해된 약 0.05mg/ml의 본 발명의 폴리펩타이드를 함유하는 용액이다. 추가로, 세제와 같은 다른 제제, 예를 들어, 0.02 % Tween-20 또는 Tween-80이 상기 용액에 함유될 수 있다. 피하 적용을 위한 제형은 100mg/ml 이하 또는 100mg/ml 초과와 같이 상당히 고농도의 본 발명의 폴리펩타이드를 함유할 수 있다. 그러나, 상기 제시된 바와 같은 성분 및 이의 양이 단지 하나의 바람직한 옵션을 나타낸다는 것은 당업자에게 자명할 것이다. 또 다른 방법 및 이의 변법은 즉시 당업자에게 명백하거나 상기로부터 출발하여 용이하게 인지될 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드는 또한 예를 들어, 피부 아래 이식용의 조절된 방출 장치를 사용하고/하거나 약제학적 활성 물질 투여용 또는 기본 제제용 공지된 투약 펌프 또는 다른 장치를 사용하는 주사용으로 적합한 데포(dept), 서방성 또는 지연방출 제형을 사용하여 투여될 수 있다. 추가로, 본 발명의 폴리펩타이드는 피부상에 놓여지는 경우 피부를 통과하는 겔, 크림, 분무, 적가, 패치 또는 필름 형태로 제형화될 수 있다.
또한, 통상적인 항체 또는 항체 단편과 비교하여, 본 발명의 폴리펩타이드를 사용하는 한가지 주요 이점은 이들이 또한 비경구 투여 이외의 경로를 통해 용이하게 투여될 수 있고, 상기 투여용으로 용이하게 제헝화될 수 있다는 것이다. 예를 들어, 국제 출원 WO2004/041867에 기재된 바와 같이, 상기 폴리펩타이드는 경구, 비강내, 폐내 및 경피 투여용으로 제형화될 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태에 따라, 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 하나 이상의 항-A-베타 폴리펩타이드, 및 도네페질, 리바스티그민, 갈란타민 및 타크린과 같은 콜린에스테라제 억제제; 메만틴과 같은 NMDA 길항제; A-베타의 형성에 관여하는 하나 이상의 효소를 억제할 수 있는 제제, 예를 들어, 베타-세크레타제 억제제, 감마-세크레타제 억제제 및 감마-세크레타제 조절제와 같은 A-베타 저하제; A-베타 플라크 축적을 차단하거나 감소시키는 제제; A-베타 응집 억제제; RAGE 길항제; 및 신경퇴행성 질환 및/또는 인지 기능의 쇠퇴를 예방하거나 치료하거나 완화시키기 위한 다른 제제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 다른 치료제를 포함하는 약제학적 조합이 제공된다. 상기 다른 치료제의 특정 예는 ELND-005, 카프로스피놀, NRM-8499, PBT-2, 포시펜, EHT-0202, CTS-21166, 세마가세스트, BMS-708163, BMS-299897, BMS-433796, ELND-006, ELN-475516, ELN-318463, ELN-475513, 베가세스타트, E-2012, CHF-5074, 디메볼린(라트레피리딘), 및 PF-4494700이다. 상기 약제학적 조합물은 임의로 희석제, 부형제, 보조제 및/또는 안정화제를 추가로 포함할 수 있다.
2개 이상의 물질 또는 기본 제제가 조합된 치료 계획의 일부로서 사용되어야만 하는 경우, 이들은 동일한 투여 경로 또는 상이한 투여 경로를 통해 필수적으로 동시에 또는 상이한 시점(예를 들어, 필수적으로 동시에, 연속적으로 또는 또 다른 계획에 따라)에 투여될 수 있다. 상기 물질 또는 기본 제제가 동일한 투여 경로를 통해 동시에 투여되어야만 하는 경우, 이들은 상이한 약제학적 제형 또는 조성물 또는 조합된 약제학적 제형 또는 조성물의 일부로서 투여될 수 있다. 또한, 2개 이상의 활성 물질 또는 기본 제제가 조합된 치료 계획의 일부로서 사용되어야만 하는 경우, 상기 물질 또는 기본 제제 각각은 상기 화합물 또는 기본 제제가 이 자체로 사용되는 경우에서와 동일한 계획에 따라 동일한 양 및 동일한 계획에 따라 투여될 수 있고 상기 조합 용도는 상승작용 효과를 유도하거나 유도하지 않을 수 있다. 그러나, 2개 이상의 활성 물질 또는 기본 제제의 조합된 용도가 상승작용 효과를 유도하는 경우, 또한 투여될 물질 또는 기본 제제 중 하나, 그 이상 또는 전부의 양을 감소시키면서 목적하는 치료학적 작용을 여전히 성취할 수 있다. 이것은 예를 들어, 이들의 이들이 통상적인 양으로 사용되는 경우, 상기 물질 또는 기본 제제의 하나 이상의 사용과 연관된 원치않는 부작용을 회피하거나 제한하거나 감소시키면서 여전히 목적하는 약제학적 또는 치료학적 효과를 성취하는데 유용할 수 있다.
그러나, 본 발명의 추가의 실시형태는 개체에게, 동시에, 별도로 또는 연속적으로, 상기된 바와 같은 본 발명의 하나 이상의 항-A-베타 폴리펩타이드, 및 상기 제시된 바와 같은 구체적인 예를 포함하는, 도네페질, 리바스티그민, 갈란타민 및 타크린과 같은 콜린에스테라제 억제제; 메만틴과 같은 NMDA 길항제; A-베타의 형성에 관여하는 하나 이상의 효소를 억제할 수 있는 제제, 예를 들어, 베타-세크레타제 억제제, 감마-세크레타제 억제제 및 감마-세크레타제 조절제와 같은 A-베타 저하제; A-베타 플라크 축적을 차단하거나 감소시키는 제제; A-베타 응집 억제제; RAGE 길항제; 및 신경퇴행성 질환 및/또는 인지 기능의 쇠퇴를 예방하거나 치료하거나 완화시키기 위한 다른 제제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 다른 치료제 유효량을 투여함을 포함하는, 상기 제시된 바와 같은 질환 및 장애를 치료하기 위한 방법이다.
본 발명의 추가의 양상에 따라, 본 발명의 A-베타 결합 폴리펩타이드는 상기 제시된 바와 같은 구체적인 예를 포함하는, 도네페질, 리바스티그민, 갈란타민 및 타크린과 같은 콜린에스테라제 억제제; 메만틴과 같은 NMDA 길항제; A-베타의 형성에 관여하는 하나 이상의 효소를 억제할 수 있는 제제, 예를 들어, 베타-세크레타제 억제제, 감마-세크레타제 억제제 및 감마-세크레타제 조절제와 같은 A-베타 저하제; A-베타 플라크 축적을 차단하거나 감소시키는 제제; A-베타 응집 억제제; RAGE 길항제; 및 신경퇴행성 질환 및/또는 인지 기능의 쇠퇴를 예방하거나 치료하거나 완화시키기 위한 다른 제제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 다른 약물과 같이, 상기 제시된 질환 및 장애의 치료를 위해 사용되는 다른 약물과 조합하여 투여되도록 제조된다.
본 발명의 또 다른 양상에 따라, 도네페질, 리바스티그민, 갈란타민 및 타크린과 같은 콜린에스테라제 억제제; 메만틴과 같은 NMDA 길항제; A-베타의 형성에 관여하는 하나 이상의 효소를 억제할 수 있는 제제, 예를 들어, 베타-세크레타제 억제제, 감마-세크레타제 억제제 및 감마-세크레타제 조절제와 같은 A-베타 저하제; A-베타 플라크 축적을 차단하거나 감소시키는 제제; A-베타 응집 억제제; RAGE 길항제; 및 신경퇴행성 질환 및/또는 인지 기능의 쇠퇴를 예방하거나 치료하거나 완화시키기 위한 다른 제제(상기 제시된 바와 같은 구체적인 예를 포함)로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 상기 제시된 질환 및 장애의 치료를 위해 사용되는 약물은 본 발명의 A-베타 결합 폴리펩타이드와 조합하여 투여되도록 제조된다.
본 발명의 추가의 양상에 따라, 본 발명의 A-베타 결합 폴리펩타이드는 시린지, 주사기 펜 또는 다른 장치와 같은, 폴리펩타이드의 투여를 위해 유용한 장치와 조합하여 사용된다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 따라,
a) 피검체로부터 샘플을 수득하는 단계, 및
b) 상기 정의된 바와 같은 본 발명의 폴리펩타이드와 상기 샘플을 시험관내 접촉시키는 단계, 및
c) 상기 폴리펩타이드의 상기 샘플로의 결합을 검출하는 단계, 및
d) 단계 (c)에서 검출된 결합을 표준물과 비교하는 단계(여기서, 상기 샘플에 상대적인 결합의 차이가 A-베타 기능부전 및/또는 아밀로이드 플라크 형성을 특징으로 하는 질환, 장애 또는 병태를 진단한다)
를 포함하는, A-베타 기능부전 및/또는 아밀로이드 플라크 형성에 의해 매개되는 질환, 장애 또는 병태를 진단하는 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 실시형태에 따라,
a) 피검체로부터 샘플을 수득하는 단계,
b) 상기 정의된 바와 같은 본 발명의 폴리펩타이드와 상기 샘플을 접촉시키는 단계;
c) 샘플 중에 A-베타의 양을 측정하는 단계; 및
d) 단계 (c)에서 측정된 양을 표준물과 비교하는 단계(여기서, 상기 샘플에 상대적인 양의 차이가 A-베타 기능부전 및/또는 아밀로이드 플라크 형성을 특징으로 하는 질환, 장애 또는 병태를 진단한다)
를 포함하는 A-베타 기능부전 및/또는 아밀로이드 플라크 형성에 의해 매개된 질환, 장애 또는 병태를 진단하는 방법이 제공된다.
상기 샘플은 예를 들어, 혈액 또는 뇌척수액(CSF)과 같은, 피검체의 체액일 수 있다. A-베타에 대한 본 발명의 폴리펩타이드의 결합을 검출하는 단계 또는 상기 샘플 중에서 A-베타의 양을 측정하는 단계는 일반적으로 폴리펩타이드와 A-베타간의 복합체 형성을 측정함을 포함한다. 상기 방법의 상이한 실시형태에 따라, 복합체 형성은 용액 중에서 또는 하나의 성분이 기재상에 고정화한 후 발생하고, 이어서 상기 복합체를 검출한다. 상기 목적에 대해, 이것은 예를 들어, 특이적 결합쌍(예를 들어, 비오틴-(스트렙트)아비딘 결합 쌍)의 한 부분인 기능성 그룹을 도입함에 의해, 본 발명의 폴리펩타이드를 추가로 변형시키기 위해 유용할 수 있다. 상기 기능성 그룹은 본 발명의 폴리펩타이드를, 결합쌍의 다른 반쪽에 결합된, 즉 결합쌍의 형성을 통해 결합된 또 다른 단백질, 폴리펩타이드 또는 화학적 화합물에 결합시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩타이드는 비오틴에 접합될 수 있고, 아비딘 또는 스트렙트아비딘에 접합된 다른 단백질, 폴리펩타이드, 화합물 또는 담체에 결합될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 상기 접합된 폴리펩타이드는 예를 들어, 검출가능한 시그널 생성제가 아비딘 또는 스트렙트아비딘에 접합되어 있는 진단 시스템에서 리포터로서 사용될 수 있다.
상기 진단 방법은 또한 피검체의 치료학적 치료 효과를 모니터링하기 위해 사용될 수 있다.
발명의 다른 실시형태에 따라, 상기 정의된 바와 같은 방법에 사용하기 위한, A-베타 기능부전 및 특히 아밀로이드 플라크 형성 및/또는 AD에 의해 매개되는 질환, 장애 또는 병태의 진단 키트가 제공되고, 상기 키트는 본 발명의 하나 이상의 폴리펩타이드 및 임의로 하나 이상의 매질, 검출 수단 및/또는 시험관내 또는 생체내 영상화제 및 추가로 임의의 사용 지침서를 포함한다. 적합한 생체내 이미지화제는 99mTc, 111인듐, 123요오드, 및 자기 공명 영상화를 위한 상자성(paramagnetic) 화합물을 포함한다. 본 발명의 표지된 항-A-베타 폴리펩타이드와 SPECT, PET 또는 MRI의 조합은 각각의 환자에 대한 'A-베타 뇌 스캔' 및 개별 위험 평가를 가능하게 한다.
본 발명의 또 다른 실시형태에 따라, 본 발명의 특정 A-베타 결합 폴리펩타이드는 마우스 A-베타 또는 다른 동물 종 기원의 A-베타 뿐만 아니라 사람 A-베타의 특이적인 검출 및 상기 검출에 따른 시험 및 검사를 위한 연구 도구로서 사용될 수 있다. 이것은 특히 동물 모델을 사용하는 시험 및 검사를 위해 유용할 수 있다.
본 발명은 추가로 본 발명의 하나 이상의 A-베타 결합 폴리펩타이드, 및 추가로 상기된 바와 같은 질환 및 장애의 치료를 위해 사용되는 다른 약물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 다른 성분, 및 상기된 바와 같은 장치를 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명은 추가로 본 발명의 A-베타 결합 폴리펩타이드를 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 일반적으로
- 본 발명의 폴리펩타이드의 발현을 허용하는 조건 하에 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화할 수 있는 핵산(이후부터: "본 발명의 핵산")을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
- 숙주 세포에 의해 발현된 폴리펩타이드를 배양물로부터 회수하거나 분리하는 단계; 및
- 임의로 본 발명의 폴리펩타이드를 추가로 정제하고/하거나 변형시키고/시키거나 제형화하는 단계를 포함한다.
본 발명의 핵산은 게놈 DNA, cDNA 또는 합성 DNA(예를 들어, 의도된 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서 발현적으로 특이적으로 채택된 코돈 용법을 갖는 DNA)일 수 있다. 본 발명의 한 실시형태에 따라, 본 발명의 핵산은 상기 정의된 바와 같은 필수적으로 분리된 형태이다.
본 발명의 핵산은 또한 예를 들어, 필수적으로 분리된 형태일 수 있는 플라스미드, 코스미드 또는 YAC와 같은 벡터 형태일 수 있고/있거나 이에 존재하고/하거나 이의 일부일 수 있다. 상기 벡터는 필수적으로 발현 벡터, 즉, 시험관내 및/또는 생체내(예를 들어, 적합한 숙주 세포, 숙주 유기체 및/또는 발현 시스템내) 폴리펩타이드의 발현을 위해 제공될 수 있는 벡터일 수 있다. 상기 발현 벡터는 일반적으로 하나 이상의 적합한 조절 요소(들), 예를 들어, 프로모터(들), 인핸서(들), 터미네이터(들) 등에 작동적으로 연결되는 본 발명의 하나 이상의 핵산을 포함한다. 본 발명의 폴리펩타이드를 발현하는데 유용하거나 필요한 상기 조절 요소, 및 통합 인자(들), 선별 마커(들), 시그널 또는 리더 서열(들), 리포터 유전자(들) 등과 같은 다른 요소의 특정 예는 WO2006/040153의 제131면 내지 제133면에 기재되어 있다.
본 발명의 핵산은 본원에 기재된 본 발명의 폴리펩타이드의 아미노산 서열에 대한 정보를 기초로 공지된 방법대로(예를 들어, 자동화 DNA 합성 및/또는 재조합 DNA 기술에 의해) 제조되거나 수득될 수 있고/있거나 적합한 천연 공급원으로부터 분리될 수 있다.
다른 실시형태에 따라, 본 발명은 본 발명의 폴리펩타이드를 발현하거나 발현할 수 있고/있거나 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 함유하는 숙주 또는 숙주 세포에 관한 것이다. 특히 바람직한 실시형태에 따라, 상기 숙주 세포는 세균 세포, 효모 세포, 진균류 세포 또는 포유동물 세포이다.
적합한 세균 세포는 그람-음성 세균 균주, 예를 들어, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 프로테우스(Proteus), 및 슈도모나스(Pseudomonas)의 균주 기원의 세포, 및 그람-양성 세균 균주, 예를 들어, 바실러스(Bacillus), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 스태필로코커스(Staphylococcus), 및 락토코커스( Lactococcus) 균주 기원의 세포를 포함한다. 적합한 진균류 세포는 트리코더마(Trichoderma), 뉴로스포라(Neurospora), 및 아스퍼질러스(Aspergillus) 종 기원의 세포를 포함한다. 적합한 효모 세포는 사카로마이세스(Saccharomyces)(예를 들어, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces)(예를 들어, 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)), 피키아(Pichia)(예를 들어, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 및 피키아 메탄올리카(Pichia methanolica)), 및 한세눌라(Hansenula) 종 기원의 세포를 포함한다.
적합한 포유동물 세포는 예를 들어, CHO 세포, BHK 세포, HeLa 세포, COS 세포 등을 포함한다. 그러나, 양서류 세포, 곤충 세포, 식물 세포 및 이종성 단백질발현용의 당업계에서 사용되는 임의의 다른 세포가 또한 사용될 수 있다.
산업적 규모의 생산에 있어서, 면역글로불린 단일 가변 도메인 폴리펩타이드및 이를 함유하는 단백질 치료제의 (산업적) 생산을 위해 바람직한 이종성 숙주는 대규모 발현, 생산 및 발효 및 특히 대규모 (생물)약제학적 발현, 생산 및 발효를 위해 적합한 이. 콜라이(E. coli), 피키아 파스토리스 및 에스. 세레비지애 균주를 포함한다.
특정 발현 시스템의 선택은 부분적으로 특정 해독후 변형, 보다 특히 당화를 위한 요건에 따라 다양하다. 당화가 요망되거나 요구되는 본 발명의 폴리펩타이드의 제조는 발현된 단백질을 당화시키는 능력을 갖는 포유동물 발현 숙주의 사용을 필요로 한다. 이러한 관점에서, 수득된 당화 패턴(즉, 부착된 잔기의 종류, 수 및 위치)이 발현을 위해 사용되는 세포 또는 세포주에 의존한다는 것은 당업자에게 자명하다.
상기 제시된 바와 같은 세포에서 제조되는 본 발명의 폴리펩타이드는 세포내(예를 들어, 세포질내, 주변 세포질(periplasma)내 또는 봉입체로)에서 제조될 수 있고, 이어서 숙주 세포로부터 분리되고 임의로 추가로 정제될 수 있거나; 이들은 세포외(숙주 세포가 배양되는 배지로 분비됨)로 제조될 수 있고, 이어서 배양 배지로부터 분리되고 임의로 추가로 정제될 수 있다.
적합한 발현 벡터, 형질전환 또는 형질감염 방법, 선별 마커, 단백질 발현 유도 방법, 배양 조건 등과 같은, 폴리펩타이드의 재조합 생산을 위해 사용되는 추가의 방법 및 시약은 당업계에 공지되어 있다. 유사하게, 본 발명의 폴리펩타이드의 제조 방법에 유용한 단백질 분리 및 정제 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
이. 콜라이 및 효모와 같은 간편한 재조합 숙주 유기체내에서 발효를 통한 본 발명의 폴리펩타이드의 제조는 고가의 포유동물 세포 배양 설비를 또한 요구하는 통상적인 항체와 비교하여 저렴하다. 추가로, 발현의 성취가능한 수준은 높고 본 발명의 폴리펩타이드의 수율은 1 내지 10 g/l(이. 콜라이) 및 10 g/l 이하(효모) 및 그 이상의 범위이다.
본 발명의 또 다른 양상에 따라, 본 발명의 A-베타 결합 폴리펩타이드를 증강시키거나 작제하기 위해 유용한 하기 표 7에 열거된 바와 같은 면역글로불린 단일 가변 도메인이 제공된다. 따라서, 표 7에 열거된 바와 같은 임의의 면역글로불린 단일 가변 도메인(임의로 사람화된 후)이, A-베타의 상이한 에피토프에 결합하는 하나 이상의 다른 A-베타 결합 면역글로불린 단일 가변 도메인(들)과 조합되는 경우(바람직하게 하나의 연속 폴리펩타이드 쇄 형태로), 이것은 예를 들어, 하기 실시예 9 내지 11에서 상세하게 기재된 바와 같은 유용한 결합 특성을 갖는, 본 발명에 다른 바이파라토픽 A-베타 결합 분자를 생성시킨다.
실시예
실시예
1:
체액성
면역 반응의 유도를 위한, A-베타를 사용한 라마의 면역화
단량체성 A-베타 펩타이드(BAM)의 생성: 단량체성 A-베타 펩타이드(BAM)는 트리플루오로아세트산(TFA; Sigma)/1,1,1,3,3,3-헥사플루오르-2-프로판올(HFIP; Fluka) 치료를 통해 제조한다. 동결건조된 A-베타 펩타이드를 이의 본래의 바이알에서 1mg/ml의 최종 농도로 100% TFA 중에 용해시킨다. 이어서, 상기 용액을 실온에서 스피드백 중에서 증발시킨다. 상기 및 모든 후속적 증발 단계 후, 잔류하는 펠렛을 빙상에 놓는다. 상기 펠렛을 HFIP 중에 재현탁시키고, 다시 실온에서 스피드백 중에서 증발시킴에 이어서 다른 HFIP 가용화시키고 이후 상기 용액을 적당한 용적의 분획으로 나눈다. 상기 분획을 실온에서 스피드백 중에서 증발시키고 상기 펠렛을 -80℃에서 저장한다. 사용 직전에, TFA/HFIP 치료된 A-베타 펩타이드 분획을 반복적인 상하 피펫팅을 통해 100% DMSO 중에 용해시킨다. 상기 A-베타 펩타이드 용액을 10분 동안 14000rpm에서 원심분리하여 가능한 응집물을 제거하고 상청액을 다양한 분석에 사용한다.
라마의 면역화: 시간에 따라 감소하는 용량으로 목 부근에 면역원을 근육내 주사함에 의해 라마를 응집된 A-베타 펩타이드(BAA) 및 올리고머 A-베타 펩타이드(BAO)로 면역화시킨다. BAA는 필수적으로 문헌[참조: Schenk et al., 1999, Nature 400: 173-177]에 기재된 바와 같이 제조된 합성 A-베타(1-40) 및 A-베타(1-42) 펩타이드의 혼합물로 이루어진다. BAO는 필수적으로 문헌[참조: Kayed et al. (2003), Science 300:486-489]에 기재된 바와 같이 제조한다. 제1의 2개의 항원 주사는 각각 라마당 100㎍의 항원으로 이루어지고, 모든 후속 투여를 위해 상기 용량은 라마당 50㎍으로 감소시킨다. 라마 144 및 145는 새롭게 제조된 BAA로 백신접종시킨다. 총, 9개의 BAA 항원 용량을 프로인트 완전 보조제(제1 주사) 또는 스티뮨(모든 후속 면역원 부스트)를 사용한 에멀젼으로서 최대 16일 간격으로 주사한다. 라마 129, 130, 177 및 178은 BAO로 백신접종시킨다. 총 6개 내지 9개 BAO 항원 용량을 프로인트 완전(제1 주사) 및 프로인트 불완전 보조제 또는 스티뮨(모든 후속 항원 부스트)을 사용한 에멀젼으로서 최대 18일 간격으로 주사한다. 라마는 또한 소 혈청 알부민에 접합된 A-베타 펩타이드 단편 1-16(BSA; 라마 181 및 186) 또는 BSA에 접합된 A-베타 펩타이드 단편 1 -30(라마 185 및 187)으로 면역화시킨다. 4개의 항원 주사는 프로인트 완전 또는 프로인트 불완전 보조제를 사용하여 항원 용량을 라마당 100㎍(제1의 2회의 주사)에서 50㎍(2회의 후속 주사)로 감소시키면서 14일 간격으로 투여한다. 각각의 면역화 계획 개시 직전에 예비-면역 혈청 샘플, 및 면역화 실험 동안에 정규적 시점에서 다중 면역 혈청 샘플을 수거하여, 독특한 동물의 A-베타 펩타이드 특이적 체액성 반응을 평가한다.
ELISA를 통한 A-베타 펩타이드 특이적 혈청 역가를 모니터링하기 위해, C-말단에서 비오티닐화된 2㎍/ml의 A-베타(1-40)(Anaspec)를 실온에서 2시간 동안 뉴트라비딘-피복된(웰당 0.2-0.5㎍) 96-웰 Maxisorp 플레이트(Nunc) 상에 고정화시킨다. 웰을 카제인 용액(PBS 중 1%)으로 블로킹한다. 일련의 희석된 예비-면역 및 면역 혈청 샘플을 첨가한 후, 특이적으로 결합된 라마 면역글로불린을, 염소-항-라마 서양고추냉이 퍼옥시다제 접합체(Bethyl Lab. Inc.)를 사용하여 검출하여 통상적인 항체 및 중쇄만 함유하는 항체 둘 다에 의해 매개된 체액성 반응을 검출한다. 특정 경우에, 연속 ELISA를 수행하여 중쇄만을 함유하는 라마 IgG2 및 IgG3 항체를 특이적으로 인식하는 마우스 mAb에 이어서 래빗 항-마우스-HRP 접합체(DAKO)를 사용한 검출을 통해 중쇄 항체 매개된 반응을 특이적으로 평가한다(문헌참조: Daley et al., 2005, Clin. Diagn. Lab. Imm. 12:380-386). ELISA는 발색 기질로서 TMB(Promega)를 사용하여 현상시키고 흡광도는 450nm에서 측정한다. 모든 4개의 면역원 포맷(BAA, BAO, A-베타(1-16)-BSA 및 A-베타(1-30)-BSA)에 대해, (비오티닐화된) 단량체성 A-베타(1-40)에 특이적인 통상적인 항체 및 중쇄 항체 둘 다에 의해 매개된 면역 반응을 검출한다. 단량체성 A-베타(1-40)에 대해 양성인 혈청 샘플은 또한 Maxisorp 플레이트 상으로 직접 피복된 BAA에 대해 시험되는 경우 양성이고, 이는 사용되는 단량체성 A-베타 및 BAA 제제 중에 적어도 부분적으로 공통된 에피토프가 존재함을 시사한다.
실시예
2: 면역화된 라마로부터의 A-베타 결합
VHH
도메인(
VHH
)의 분리
중쇄만을 함유하는 항체 단편 레퍼토리의 클로닝: 최종 면역원 주사 후, 중쇄 항체를 생산하는 B-세포의 공급원으로서의 면역 조직을 면역화된 라마로부터 수거한다. 전형적으로, 2개의 150ml 혈액 샘플을 마지막 항원 주사 후 4일 및 8일째에 수거하고, 마지막 항원 주사 후 4일째 수거된 하나의 림프절 생검을 동물당 수거한다. 혈액 샘플로부터, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 제조업자의 지침(Amersham Biosciences)에 따라 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque)를 사용하여 제조한다. PBMC 및 림프절 생검으로부터 전체 RNA를 추출하고, 이를 RT-PCR에 대한 출발 물질로서 사용하여 VHH 암호화 유전자 절편을 증폭시킨다(이전에, WO2005/044858에 기재됨). 각각의 면역화된 라마에 대해, 라이브러리는 상기 동물의 모든 수거된 면역 조직으로부터 분리된 총 RNA를 풀링(pooling)함에 의해 작제한다. 간략하게, 상기 PCR-증폭된 VHH 레퍼토리는 특이적 제한 부위를 통해 VHH 라이브러리의 파지 디스플레이를 촉진시키도록 디자인된 벡터 내로 클로닝한다. 상기 벡터는 pUC119로부터 유도되고 LacZ 프로모터, M13 파지 gIII 단백질 암호화 서열, 암피실린 또는 카베니실린에 대한 내성 유전자, 다중 클로닝 부위 및 하이브리드 gIII-pelB 리더 서열(pAX050)을 포함한다. VHH 암호화 서열과의 프레임 내에서, 상기 벡터는 C-말단 c-myc 태그 및 (His)6 태그를 암호화한다. 파지는 표준 프로토콜에 따라 제조하고 추후 사용을 위해 여과 멸균 후 4℃에 저장한다.
파지 디스플레이를 통한 A-베타 특이적 VHH 의 선별: 모든 라마로부터 수득되고 파지 라이브러리로서 클로닝된 VHH 레퍼토리는 다수의 선별 조건을 적용하는 상이한 선별 전략에 사용한다. 변수는 다음을 포함한다:
i) A-베타 펩타이드 포맷(C- 또는 N-말단 비오티닐화된 A-베타(1-40), C-말단 비오티닐화된 A-베타(1-16), N-말단 비오티닐화된 A-베타(1-30) 및 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST) 융합체, 예를 들어, A-베타(1-42)-GST, A-베타(1-10)-GST 또는 GST-A-베타(1-42)),
ii) A-베타 펩타이드 응집 상태(단량체성 A-베타, BAO 또는 BAA),
iii) 항원 제시 방법(고체상: 뉴트라비딘-피복된 플레이트 상으로 직접 피복되거나 비오틴-태그를 통함; 용액상: 용액내 항온처리에 이어서 뉴트라비딘-피복된 플레이트 상에 포획),
iv) 항원 농도 및
v) 상이한 용출 방법(트립신 또는 TEA).
선별은 다음과 같이 수행한다: 고체상 및 용액상 선별 포맷에 대한 항원 제제는 다중 농도로 상기된 바와 같이 제시한다. 파지 라이브러리와 2시간 항온처리에 이어서 광범위한 세척 후, 결합된 파지는 15분 동안 트립신(1mg/ml) 또는 TEA로 용출시킨다. 트립신이 파지 용출을 위해 사용되는 경우에, 상기 프로테아제 활성은 즉시 0.8mM 프로테아제 억제제 ABSF를 적용하여 중화시킨다. 대조군으로서, 선별 w/o 항원을 병행하여 수행한다. 백그라운드(비-항원 대조군)에 대한 증식을 보여주는 파지 결과물을 사용하여 이. 콜라이를 감염시킨다. 감염된 이. 콜라이 세포를 사용하여 다음 선별 라운드(파지 구제)용 파지를 제조하거나 개별 VHH 클론의 분석을 위해 한천 플레이트(LB + Amp + 2% 글루코스) 상에 도말한다. 특이적 결합제에 대한 선별 결과물을 스크리닝하기 위해, 단일 콜로니를 한천 플레이트로부터 집어내어 1ml의 96-딥(deep)-웰 플레이트에서 성장시킨다. 상기 placZ 조절된 VHH 발현은 글루코스 부재 하에 IPTG(0.1 내지 1 mM 최종)를 첨가하여 유도한다. 주변세포질 추출물(약 80 ㎕의 용적)을 표준 방법에 따라 제조한다.
A-베타에 결합하는 것에 대한 주변세포질 추출물의 스크리닝: 2㎍/ml의 C-말단에서 비오티닐화된 A-베타(1-40)는 뉴트라비딘-피복된(웰당 0.2 내지 0.5㎍) 96웰 Maxisorp 플레이트(Nunc) 상에서 실온에서 2시간 동안 포획한다. 웰은 카제인 용액(PBS 중 1%)으로 블록킹한다. 전형적으로 주변세포질 추출물의 10배 희석물을 첨가한 후, VHH 결합은 마우스 항-myc 및 항-마우스 HRP 접합체(DAKO)를 사용하여 검출한다. 백그라운드보다 최소 2배 이상의 ELISA 시그널을 나타내는 클론은 서열 분석을 위해 유지시킨다. (비오티닐화된) 단량체성 A-베타(1-40)와 결합할 수 있는 VHH는 16개의 상이한 B-세포 계통에 할당할 수 있다. 동일한 B-세포 계통으로부터 유도된 클론은 고도로 유사한 CDR3 서열을 공유하고, 따라서 동일한 에피토프를 인식할 가능성이 있다. 표 8은 16개의 B-세포 계통 각각의 대표적인 VHH의 동정을 유도하는 선별 파라미터를 요약한다. 표 9에서, 표 8에 열거된 VHH의 아미노산 서열을 나타낸다.
각각의 B-세포 계통에 대해 발견되는 변이체(최소 1개의 아미노산의 차이)의 총 수는 1(ABII5D2), 195(ABII42D4), 1(ABII42G10), 1(ABII60D2), 1(ABII60H5), 23(ABII1E11), 3(ABII14D4), 3(ABII35C7), 6(ABII35G2), 1(ABII35D2), 7(ABII42B10), 2(ABII42F5), 3(ABII42E10), 2(ABII60A10), 2(ABII60G11) 및 15(ABII61F6)이다.
최고의 결합 성질을 갖는 B-세포 계통 변이체를 동정하기 위해, 모든 VHH 변이체의 주변세포질 추출물을 사용하여 해리-속도(off-rate)(Biacore T100, GE Healthcare)를 결정한다. 단량체성 A-베타(1-40)(C-말단에서 비오티닐화됨; Anaspec), 단량체성 A-베타(1-16)(C-말단에서 비오티닐화됨; Bachem) 및 단량체성 A-베타(12-28)(N-말단에서 비오티닐화됨; Bachem)는 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하고, 동일한 SA 센서 칩(GE Healthcare)의 3개의 상이한 채널 상에서 스트렙트아비딘을 통해 비가역적으로 포획된다. 표면은 먼저 표면 세척 완충액(50mM NaOH 중의 1M NaCl)의 3x 1-분 주사에 이어서 100RU의 표적 수준까지 50nM의 비오티닐화된 A-베타를 주사하여 세척하였다. 포획한 후, 표면은 5㎕/분에서 180초 동안 과량(200㎍/ml)의 d-비오틴을 주사함에 의해 블록킹한다. 표준 표면은 d-비오틴으로 세척하고 블록킹한다. HBS-EP+ 완충액은 전개 완충액으로 사용하고 실험은 25℃에서 수행한다. 해리-속도 스크리닝을 위해, VHH의 주변세포질 추출물을 45㎕/분으로 2분 동안 10배 희석액으로 주사하고, 10분 동안 해리하도록 방치한다. 정제된 표준 결합제(100nM의 VHH, 10nM의 3D6 Fab)는 양성 대조군 샘플로서 주사하고 적어도 각각 실험의 개시 및 종점에서 평가한다. 상이한 VHH 샘플간에, 상기 표면은 45㎕/분에서 25초 동안에 재생 완충액(50mM NaOH)으로 재생함에 이어서 재생이 불완전한 경우 45㎕/분으로 10초 동안 6M GuHCl로 재생시킨다. 해리-속도는 포획된 비오티닐화된 A-베타(1-4O)와 함께 채널로부터 수득된 센서그램(sensorgram)으로부터 계산한다. 단지 2개의 VHH B-세포 계통의 변이체, ABII42D4 및 ABII60G11은 단일상 결합 패턴을 나타내고 이로써 각각 1:1 상호작용 모델(6.1E-3s-1 및 2.7E-2s-1)을 통한 해리-속도의 계산을 가능하게 하였다. 모든 다른 VHH B-세포 계통에 대해, 2개의 상이한 해리 곡선 부분을 별도로 피팅하여 kd1 (125 내지 160초 사이에 해리 프레임으로부터 계산됨) 및 kd2 (400초 내지 700초)를 부여한다. 데이터는 표준 채널에 대한 곡선 및 블랭크 전개 완충액 주사의 공제에 의해 2회 표준화시킨다. 센서그램은 Biacore T100 평가 소프트웨어 v1.1.1을 사용하는 1:1 해리 모델을 피팅함에 의해 평가한다. VHH ABII60D2 및 ABII60H5의 A-베타로의 결합이 스크리닝 ELISA에서 관찰되지만 이들 VHH는 센서 칩에 대해 불량한 결합을 나타낸다.
1가의 비-VHH 결합제의 결합 특성을 연구하기 위해, 모노클로날 항체 m266 및 3D6의 Fab 단편을 사용한다. 모노클로날 항체 3D6은 문헌[참조: Johnson-Wood et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. 94:1550-1555; 및 Bard et al., 2000 Nature Medicine 6: 916-919]]에 기재되어 있고, A-베타의 1 내지 5번의 아미노산 잔기(N-말단 에피토프)에 특이적으로 결합한다. 모노클로날 항체 m266은 문헌[참조: Seubert et al., 1992, Nature 359:325-327]에 기재되어 있고 A-베타의 16번 내지 24번의 아미노산 잔기(A-베타의 중앙 에피토프)에 특이적으로 결합한다. 가변 경쇄(VL), 가변 중쇄(VH), 불변 경쇄(CL) 및 각각의 항체의 중쇄(CH1)의 불변 도메인 1(하기에 나타낸 서열), 및 추가로 C-말단 c-myc 태그 및 헥사-히스티딘((His)6 태그)을 포함하는 Fab 단편은 숙주 유기체로서 이. 콜라이 및 정제를 위해 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC) 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 사용하는 통상적인 기술에 따라 클로닝하고 발현하고 정제한다. m266 및 3D6의 정제된 Fab 단편은 상기된 결합 실험에서 각각 4.0E-5s-1 및 4.7E-4s-1의 해리-속도를 나타낸다.
3D6의 Fab 단편의 VL- 및 VH-서열:
VL:
(서열번호 128)
VH:
(서열번호 129)
m266의 Fab 단편의 VL- 및 VH-서열:
VL:
VH:
(서열번호 131)
실시예
3: 정제된
VHH
의 특성 분석
각각의 B-세포 계통에 대해 가장 느린 해리 속도를 갖는 VHH 변이체는 LacZ 프로모터, 암피실린 또는 카나마이신에 대한 내성 유전자, 다중 클로닝 부위 및 하이브리드 gIII-pelB 리더 서열을 함유하는, pUC119로부터 유래된 발현 벡터에 재클로닝한다. VHH 암호화 서열과의 프레임 내에서, 상기 벡터는 C-말단 c-myc 태그 및 (His)6 태그를 암호화한다. VHH는 이. 콜라이 TG1에서 제조하고 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC) 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 통해 정제하여 SDS-PAGE를 통해 평가되는 바와 같이 95%의 순도가 되게 한다.
3.1 고정화된 A-베타에 결합하는 VHH ( ELISA ): 단량체성 A-베타 펩타이드(BAM)에 대한 VHH의 결합을 정량하기 위해, VHH는 실시예 2에 기재된 바와 동일한 셋업을 사용하여 ELISA에 일련의 희석액으로서 적용한다. VHH ABII60D2 및 ABII60H5를 제외하고, EC50 값을 계산하고 표 10에 요약한다. A-베타의 N-말단 에피토프(아미노산 1번 내지 16번) 또는 A-베타의 중앙 에피토프(아미노산 12번 내지 28번)와 상호작용하는 가장 효능있는 VHH는 각각 ABII42D4(14.2 nM의 EC50) 및 ABII60A10(4.9 nM의 EC50)인 것으로 측정되었다.
BAM에 대해 검출가능한 시그널을 부여하는 VHH는 실시예 2에 기재된 바와 유사한 셋업을 적용하여 ELISA에서 A-베타 펩타이드 응집체(BAA)에 결합하는 것에 대해 시험한다. 항원은 문헌[참조: Bohrmann et al., 1999, J Biol Chem 274: 15990-15995]에 기재된 바와 같이 제조하고 고정화시킨다. 요약해서, 2mg/ml 합성 A-베타(1-40)(Bachem)의 DMSO 스톡 용액 기원의 TBS 완충액(50 mM Tris, 150 mM NaCl pH 7.4 및 0.05% Na-아지드) 중에 희석된 lO㎍/ml의 A-베타(1-40) 100㎕를 37℃에서 60시간 동안 응집되도록 방치한다. BAM를 인지하는 모든 VHH는 또한 BAA도 인식하고 각각의 EC50 값은 표 10에 요약한다.
3.2 용액 중의 A-베타에 결합하는 VHH ( TR - FRET ): 용액 중에서 항-A-베타 VHH와 A-베타 펩타이드의 상호작용은 시간 분석된 형광 공명 에너지 전달(TR-FRET) 경쟁 검사를 사용하여 평가한다. 2개의 상이한 셋업에서, A-베타(1-40) 펩타이드-ABII42D4 상호작용(N-말단 영역 특이적) 또는 A-베타(1-40)-ABII60A10 상호작용(중앙 영역 특이적)과의 경쟁을 시험한다. 검사를 위해, 스트렙타아비딘-유로피움 킬레이트로 표지된 단량체성 A-베타(1-40)(C-말단에서 비오티닐화됨; Anaspec) 및 AlexaFluor647로 표지된 VHH ABII42D4 또는 ABII60A10을 상이한 농도의 비표지된 경쟁자(VHH, IgG 또는 Fab)와 1시간 동안 항온처리한다. 상기 표지된 화합물은 각각 0.2 nM(A-베타(1-40)), 50 nM(ABII42D4) 및 10nM(ABII60A10)의 농도로 사용하고, 결합 상호작용에 따라 방출되는 형광 시그널은 665nm에서 검출된다. IC50 값은 ABII42D4 및 ABII60A10 TR-FRET 검사에서 측정하여 시험된 N-말단 영역 특이적 결합제에 대한 하기의 효능 랭킹을 수득한다: 모노클로날 항체 3D6 (2.5nM) > Fab 단편 3D6 (3.4nM) > ABII42D4 (46.8nM) > ABII5D2 = 42G10 (>1000nM). 상기 검사를 통해 동정된 가장 효능있는 중앙-영역 특이적 VHH는 ABII60A10이고, 11.1 nM의 IC50을 나타내고, 벤치마크 항체는 0.50nM(모노클로날 항체 m266) 및 0.52nM(m266의 Fab 단편)의 IC50을 나타내었다.
비교 목적을 위해, 이전에 기재된 바와 같은 항-A-베타 VHH("참조 VHH")는 하기에 나타낸 국제 특허 공보로부터 이용가능한 서열 정보를 사용하여 상기된 바와 같이 제조하고 정제한다:
VHH 2D2 및 2G6: WO2006/40153;
VHH 3A, 1B, 11G, 4D, 및 8B: WO2007/35092; 및
VHH 31-1 : WO2004/44204.
이의 아미노산 서열은 표 11에 나타낸다.
표준 VHH 2G6(N-말단 영역 특이적) 및 2D2(중앙-영역 특이적)와 비교하여, VHH 42D4 및 60A10는 각각 21배 이상 및 36배 이상의 개선된 IC50을 나타낸다(표 10 참조).
3.3 A-베타 펩타이드 - VHH 상호작용의 친화성 측정: A-베타 펩타이드-VHH/Fab 상호작용에 대한 친화성은 이전에 기재된 바와 같이(실시예 2) 스트렙트아비딘 센서 칩상에 포획된 C-말단 비오티닐화된 A-베타(1-40)를 사용한 표면 플라스몬 공명(Biacore)을 통해 측정한다. 정제된 VHH 또는 Fab 단편은 2분 동안 5개의 상이한 농도(ABII42D4 및 ABII60A10에 대해 2.5 내지 300nM)로 주사하고, 10분 동안 해리되도록 방치한다. ABII60A10가 아닌 ABII42D4에 대한 결합 및 해리 곡선은 1:1 상호작용 모델(Langmuir 결합)을 사용하여 피팅할 수 있고 정확한 KD 값을 측정할 수 있다. 상기 친화성은 각각 VHH ABII42D4에 대해서는 16nM이고, 3D6의 Fab 단편에 대해서는 5.1 nM이고, m266의 Fab 단편에 대해서는 0.3nM인 것으로 밝혀졌다.
3.4 표면 플라스몬 공명을 통한 에피토프 맵핑: VHH의 결합 특이성은 이전에 기재된 바와 같이 스트렙트아비딘 센서 칩 상에 포획된 A-베타(1-16)(C-말단에서 비오티닐화됨; Bachem) 및 A-베타(12-28)(N-말단에서 비오티닐화됨; Bachem) 펩타이드를 사용한 표면 플라스몬 공명(Biacore)을 통해 측정한다. 상기 표 9에서 열거된 5개의 VHH는 A-베타 펩타이드(ABII5D2, ABII42D4, ABII42G10, ABII60D2 및 ABII60H5)의 N-말단 영역과 상호작용하는 것으로 밝혀졌고, 11개의 VHH(ABII1E11, ABII14D4, ABII35C7, ABII35G2, ABII35D2, ABII42B10, ABII42F5, ABII42E10, ABII60A10, ABII60G11 및 ABII61 F6; 표 10 참조)는 중앙 영역과 상호작용하는 것으로 밝혀졌다.
3.5 시험관내 A-베타 응집 분석: VHH는 시험관내 A-베타 응집 분석에서 시험하여 응집이 억제되거나 감소될 수 있는지의 여부를 평가한다. 시험관내 A-베타 응집은 A-베타 섬유 형성 즉시 전형적 적색 전환을 진행하는 티오플라빈 T (ThT) 형광을 사용하여 측정한다(문헌참조: Levine, H. 1993. Protein Science (2): 404-410). 상기 분석을 위해, 25mM 글라이신-NaOH pH 8.5의 100% DMSO 및 ThT중에서 합성 A-베타(1-40)(Bachem)의 스톡 용액을 제조하고 -20℃에서 저장하였다. 사용 전에 상기 A-베타(1-40) 스톡 용액은 응집 완충액 (50 mM 인산나트륨, 100 mM NaCl pH5, 0.02% NaN3)중에서 56μM로 희석한다. Fab 단편 및 VHH는 56 내지 7 μΜ의 농도를 사용하는 D-PBS중의 일련의 희석액으로서 시험한다. 동일한 용적(20㎕)의 56 μΜ A-베타(1-40) 용액 및 항체/VHH 샘플 또는 적당한 음성 대조군을 혼합하고(3회) 혼합물을 암실 환경에서 37℃에서 48시간 동안 저접착 소형원심분리 튜브중에서 항온처리한다. 30㎕의 항온처리된 샘플을 블랙 96웰 평저 폴리프로필렌 플레이트(Grenier Bio-One)로 이동시킨 후 , 250㎕의 2.5 μΜ ThT (25mM 글라이신-NaOH로 희석된 스톡 용액) 용액을 첨가하고 형광 시그널을 측정한다(Envision, PerkinElmer). 경쟁자의 부재하에 측정된 A-베타(1-40)의 최대 형광 시그널은 100% 응집(또는 0% 억제)로서 설정한다. 시험된 최고 VHH 농도(28 μΜ)에서 최대 억제는 적어도 2개의 독립적인 실험의 평균값으로서 계산한다. 대략 25%의 일관된 기본 억제가 비-관련된(비-A-베타 특이적) VHH에 대해서 검출되지만 1가의 Fab 단편 3D6 및 266은 각각 79 및 85%의 최대 억제로 재현가능한 투여 의존성 억제를 나타낸다. 시험된 VHH의 패널 중에서, 14D4, 35C7, 35G2, 35D2, 42B10, 42F5, 42E10 및 60A10은 각각 78, 82, 76, 73, 77, 79, 75 및 80%의 펩타이드 응집의 일관된 억제(비-특이적 대조군 VHH에 의해 유도된 25% 기본 억제 보다 높음)를 나타낸다.
실시예
4:
VHH
의 친화성
성숙화
VHH ABII42D4는 2 사이클의 친화성 성숙화에 적용한다. 제1 사이클에서, 개별 CDR 잔기는 모든 다른 19개 아미노산으로 돌연변이시킨다. 하기의 잔기를 표적화한다: CDR1: G26-G35; CDR2: V51-N58; 및 CDR3: H95-Y102 (캐뱃에 따라 넘버링함). 돌연변이유발은 돌연변이된 위치에서 NNS 코돈을 함유하는 축퇴성 올리고뉴클레오타이드를 사용한 PCR계 방법으로 수행한다. PCR 생성물을 각각의 CDR에 대해 풀링하고 유일한 제한 부위를 통해 ABII42D4 유전자 주형내로 삽입한다. 개별 돌연변이체는 LacZ 프로모터, 가나마이신에 대한 내성 유전자, 다중 클로닝 부위 및 ompA 리더 서열(pAX100)을 함유하는, pUC119로부터 유래된 발현 벡터를 사용하여 재조합 단백질로서 제조한다. 이. 콜라이 TG1 세포는 발현 벡터 라이브러리를 사용하여 형질전환시키고 한천 플레이트(LB + Amp + 2% 글루코스)상에 분주한다. 단일 콜로니를 한천 플레이트로부터 집어내고 1ml의 96웰 딥 웰 플레이트에서 성장시킨다. VHH 발현은 IPTG(1mM)을 첨가함에 의해 유도한다. 세포막주변공간 추출물(약 80㎕의 용액중에)은 표준 방법에 따라 제조하고 이전에 기재된 바와 같이(실시예 2) ELISA 및 Biacore 해리 속도 분석에서 A-베타(1-40)에 결합하는 것에 대해 스크리닝한다. 6개 위치 (S30, T57, L97, T100b, S100c, G100e)에서의 돌연변이는 약간 (약 2배) 개선된 해리 속도를 유도한다.
제2 사이클에서, 조합 라이브러리는 사이클 1에서 동정된 6개의 민감한 위치를 동시에 무작위함에 의해 제조한다. 이를 위해, 전장 ABII42D4 유전자는 무작위화 위치에서 축퇴성 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 오버랩 PCR(NNS)에 의해 합성하고 구제 PCR을 수행한다. 무작위화된 ABII42D4 유전자는 파지 디스플레이 벡터(pAX50)로 삽입하여 6 x 10E7의 기능성 라이브러리 크기를 수득한다. 파지는 표준 프로토콜에 따라 제조한다. 상기 파지 라이브러리는 포획 단계용 스트렙트아비딘 피복된 자기 비드를 사용하는 (비오티닐화된) 단량체성 A-베타(1-40)에 대한 3 라운드의 용액 상 선별에 적용한다. 상기 항원 농도는 라운드 1에서 50nM의 항원 농도로부터 개시하여 각 라운드에서 10배 감소한다. 결합된 파지는 30분 동안 트립신(1mg/ml)으로 용출시키고 파지 생성물은 개별 VHH 클론의 주변세포질 추출물의 제조를 위해 이. 콜라이 TG1에 감염시킨다. ELISA 및 Biacore 해리 속도 분석(실시예 2)에서 A-베타(1-40)에 결합하는 것에 대한 스크리닝으로 해리속도가 10배까지 개선된 클론을 동정한다. 최상의 ABII42D4 변이체는 C-말단 c-myc 태그 및 (His)6 태그와의 프레임내로 발현 벡터 pAX100내로 클로닝한다. VHH는 His6-태그된 단백질로서 이. 콜라이에서 생산하고 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC) 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 정제한다. 정제된 VHH의 친화성은 표면 플라스몬 공명(Biacore)를 통해 측정하고 IC50 값은 ABII42D4 TR-FRET 경쟁 분석(실시예 3.2)으로 측정한다.
결합 친화성을 추가로 개선시키기 위해, 변이체 ABIIPMP111B5를 주형으로서 사용하고 클론에서 발견되는 분기된 돌연변이, ABIIPMP111E4 및 ABIIPMP111B4를 하나씩 도입한다. 수득한 변이체는 이. 콜라이에서 생산하고 이전에 기재된 바와 같이 특징 분석한다. ABII111 B5_M107R, ABII111B5_M107E 및 ABII111B5_E109Q는 본래의 ABII42D4에 비해 IC50 및 KD 둘다가 10배 초과로 개선된 최상의 변이체로서 동정한다. 상기 언급된 변이체에 대한 서열 정보 및 생물학적 데이터는 상기 표 7에 요약되어 있다(제1 라인: 42D4; 라인 2 내지 9: 첫번째 2개의 사이클의 친화성 성숙화로부터 비롯된 유용한 클론; 라인 10 내지 18: 추가의 표적화된 돌연변이로부터 비롯되는 유용한 클론).
실시예
5:
VHH
의
사람화
항-A-베타 VHH ABII111B5_M107R(= ABII002; 서열번호 62) 및 항-A-베타 VHH ABII60A10 (= ABII050; 서열번호 100)의 아미노산 서열은 사람 생식선 VH 서열 데이터베이스에 대해 블래스팅한다. JH5와 조합된 상기 사람 생식선 VH3-23 서열은(DP47; 서열번호 140)은 VHH 서열 둘다와 최고의 서열 동일성을 나타냈다.
서열 DP-47A/H3-23:
(서열번호 140)
서열 JH5:
ABII002 및 ABII050 각각의 17개 및 10개의 아미노산 잔기는 사람화를 위해 치환하여 각각의 VHH의 다수의 상이한 변이체를 제조한다. 모든 변이체는 PCR 오버랩 연장 방법을 사용하여 올리고뉴클레오타이드로부터 어셈블리하고 발현 벡터(pAX100)내에 클로닝시키고 이. 콜라이에서 생산한다. ABII002의 수득된 변이체, 즉 ABII003 내지 ABII037, 및 ABII0050의 수득된 변이체, 즉 ABII051 내지 ABII061에 대한 서열 정보 및 결합 데이터는 상기 VII에 요약한다(각각 라인 19 내지 53 및 라인 55 내지 마지막 라인 65). 표 12는 추가로 ABII002 내지 ABII036 및 ABII050 내지 ABII060의 사람화 정도를 열거한다.
상기 표 7 및 12에 요약된 생물학적 데이터에 따르면, 본원에 열거된 VHH 변이체 모두는 적어도 하나의 중간체로서 본 발명의 폴리펩타이드의 작제를 위해 사용될 수 있다. 구체적으로, 사람에 사용하기 위해, 사람화된 VHH 변이체 ABII003 내지 ABII037 및 ABII051 내지 ABII061이 바람직하다. 고도의 사람화를 보여주지만 이들의 결합 특성을 보유하는, 특히 유용한 변이체는 본래의 클론 42D4로부터 유래된 ABII035 및 클론 60A10으로부터 유래된 ABII059이다. ABII035는 A-베타의 N 말단 에피토에 결합하고 서열번호 14 내지 16의 CDR 서열을 포함한다. ABII059는 중앙 에피토프에 결합하고 서열번호 17 내지 19의 CDR 서열을 포함한다.
실시예
6:
사람화된
VHH
와 표준
VHH
와의 비교
정제된 항-A-베타 표준 VHH (실시예 3.2, 표 11)는 C 말단 비오티닐화된 단량체 A-베타(1-40)로 피복된 SA 센서 칩에 실시예 3에 기재된 바와 같이 결합하는 것에 대해 시험한다. ABII035 및 ABII059는 각각 주사된 11 및 3nM의 농도에서 50 초과의 수준을 나타냈고 VHH 1B, 11G, 8B, 4D, 3A 및 VHH31-1 어느 것도 시험된 조건하에 1000nM의 농도로 센서 칩에 결합(> 10 RU)에 결합함을 나타내지 않았다. 동일한 실험에서, 표준 VHH 2G6 및 2D2는 각각 1000 및 100nM의 주사된 농도에서 50초과의 RU 수준을 나타냈고 따라서 ABII035 및 ABII059보다 효능이 훨씬 적다. 상기 실험을 사용하여 표면 분해에 대한 어떠한 징후도 검출되지 않았다. 후속적으로, 상기 세트의 표준 VHH의 결합은 또한 포획된 A-베타(1-40) (C- 또는 N-말단 비오티닐화된), 직접적으로 고정화된 A-베타(1-40) 및 A-베타(1-42), GST-A-베타(1-42) 또는 A-베타(1-42)-GST (1mg/ml의 농도에서 포획)과 같은 펩타이드 포맷의 독특한 제공을 사용하는 경우 다중 ELISA 셋업(실시예 3에 기재된 검출)에서 단량체성 A-베타에 결합하는 것으로 입증된다. 표준 VHH 1B, 11G, 8B, 4D, 3A에 대해, 단량체 A-베타에 대한 결합이 검출되지 않는다. BAA ELISA에서, 표준 VHH 8B만이 VHH의 1000nM 이상의 농도에서 응집된 A-베타에 결합함을 보여준다. 2D2 및 2G6 VHH와 비교하여, ABII035 및 ABII059 VHH는 50배 초과의 보다 높은 EC50 값을 보여준다. 상기 결과는 표 12a에 나타낸다.
[표 12a]
실시예
7: 설치류 A-베타로의 항-사람 A-베타
VHH
의 결합(
ELISA
및
Biacore
)
상기 수득된 바와 같은 VHH의 설치류 A 베타로의 결합을 ELISA로 분석한다.
마우스(Bachem) 또는 사람 A-베타(1-40)(Anaspec)은 Maxisorp 플레이트상으로 2㎍/ml로 피복시키고 VHH의 결합 및 비교 목적용 Fab 단편의 결합은 마우스 항-myc 항체 및 항-마우스-HRP 접합체(DAKO)를 통해 검출한다. EC50 값은 3D6, VHH ABII002, 및 VHH ABII035의 Fab 단편에 대해 측정한다. 상기 결과는 하기 표 13에 열거한다(최소 2개의 독립적인 실험의 평균치).
3D6 Fab 단편은 마우스 A-베타에 사람 A-베타 보다 상당히 적게(26배 차이) 결합하지만, ABII002 및 ABII035는 동등하게 둘다(각각 1.8 및 2.2배 차이)에 잘 결합하고 이는 ABII002 및 이의 사람화된 유도체 ABII035가 3D6에 의해 인지되는 에피토프와는 구분되는 에피토프에 결합함을 지적한다.
마우스 및 사람 A-베타로의 VHH의 결합은 칩상으로 직접 피복된 비-비오티닐화된 펩타이드를 사용하여 바이아코어상에서 추가로 평가한다. 사람화 전후 VHH에 대한 사람 및 설치류 A-베타 펩타이드의 친화성에 대해 어떠한 차이도 검출되지 않는다.
실시예
8:
바이파라토픽
항-A-베타
VHH
작제물의
제조 및 특성 분석
VHH ABII42D4 (A-베타 펩타이드의 N 말단 영역을 인지하는) 및 VHH ABII60A10 (중앙 영역을 인지하는)은 유연성 글라이신-세린 링커(예를 들어, 9GS: GGGGSGGGG; 서열번호 141)를 통해 융합하여 2가 VHH 작제물을 제조한다. 링커 길이 및 배향에 있어서 상이한 4개의 바이파라토픽 작제물(상이한 에피토프 특이성을 갖는 2개의 VHH 도메인을 포함하는)을 보다 상세히 분석하여(ABII42D4-25GS-ABII60A10, ABII60A10-25GS-ABII42D4, ABII42D4-35GS-ABII60A10 및 ABII60A10-35GS-ABII42D4_ 각각의 VHH 이량체((2가 ABII42D4-9GS-ABII42D4 작제물과 같은 2개의 동일한 VHH 도메인을 포함하는)와 비교한다. 바이파라토픽 및 이량체/2가 VHH는 이. 콜라이 TG1 세포에서 생산하고 친화성 크로마토그래피(IMAC 또는 단백질 A) 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 정제하여 SDS-PABE로 평가시 95% 이상의 순도를 유도한다.
8.1 TR - FRET 결합 분석: A-베타(1-40)로의 바이파라토픽 VHH 작제물의 결합은 ABII42D4 및 ABII60A10 TR-FRET 분석(실시예 3.2)을 사용하여 평가한다. 2가 ABII42D4-9GS-ABII42D4 작제물은 약간 개선된 IC50(1가 ABII42D4에 비해 3.2배 개선된)을 나타내지만 바이파라토픽 VHH는 놀랍게도 1가 빌딩 블록 및 3D6 및 m266 Fab 단편(표 14) 및 3D6 및 m266 IgG(3D6 및 m266 전장 모노클로날 항체) 보다 A-베타 펩타이드에 상당히 강하게 결합하는 것으로 밝혀졌다. 효능에 있어서 상이한 링커 길이 및 배향을 갖는 작제물간에는 어떠한 차이도 밝혀지지 않았다.
8.2 결합 모드의 측정: 바이파라토픽 작제물의 결합 모드를 연구하기 위해, VHH 결합 블록 둘다가 동일한 펩타이드 분자에 동시에 결합할 수 있는지를 평가한다. 샌드위치 ELISA에서, 태그가 없는 ABII60A10 또는 his-태그된 ABII42D4는 Maxisorp 플레이트상으로 피복하고 A-베타(1-40) 펩타이드로 항온처리한다. 이어서 수득한 VHH-펩타이드 복합체는 N 말단 또는 중앙 A-베타 펩타이드 에피토프를 인지하는 c-myc-태그된 VHH와 항온처리한다. c-myc를 통한 검출은 이전에 기재된 바와 같이(실시예 2) 수행한다. 셋업 둘다에서 결합이 나타나고 이는 N-말단 또는 중앙 에피토프를 인지하는 2개의 VHH가 A-베타 펩타이드에 동시에 결합할 수 있음을 지적한다.
SPR -기본 분석에 의한 결합 모드의 측정: C 말단 비오티닐화된 A-베타(1-40)는 이전에 기재된 바와 같이(실시예 2) 센서칩상에 고정화시킨다. ABII60A10은 500nM의 포화 농도로 주사하고 A-베타(1-40)으로의 결합이 관찰된다. 120초 후, 200 nM의 ABII42D4 및 500 nM의 ABII60A10은 동시 주사하여 추가의 결합을 유도한다. 500nM의 60A10 단독의 대조군 주사는 임의의 추가의 결합을 유도하지 않고 이는 관찰된 추가의 결합이 ABII42D4-A-베타 상호작용으로 인한 것임을 보여준다.
크기 배제 크로마토그래피를 사용한 결합 모드의 측정: 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)는 분자들이 컬럼에 충전된 겔 여과 매질을 통해 통과하면서 크기 차이에 따라 상기 분자들을 분리한다. 바이파라토픽 VHH 작제물의 이들의 표적으로의 결합 모드는 1:2 몰비의 각각의 VHH 작제물과 표적 단백질을 항온처리한 후 단백질 복합체를 분석함에 의해 동정될 수 있다. 따라서, 상기 혼합물은 SEC에 의해 분리되고 수득한 피크의 내용물은 단백질 겔 전기영동으로 분석한다. A-베타(1-28)-p38 융합 단백질은 46kDa의 계산된 분자량을 갖고 단량체로서 SEC중에서 전개한다. 사람 혈청 알부민 (60A10-27GS-42D4-Alb)에 융합된 바이파라토릭 VHH는 95kDa의 계산된 분자량을 갖는다. 바이파라토픽 VHH가 1개(=분자내 결합) 또는 2개(=분자간 결합)의 A-베타(1-28)-p38 융합 단백질에 결합하는지를 동정하기 위해, 1:2 몰비의 VHH 및 표적 단백질을 혼합하고 밤새 4℃에서 항온처리하고 단일 단백질로부터 단백질 복합체를 분리하기 위해 정제용 크기 배제 컬럼 (HiLoad 26/60 Superdex 200 prep grade, GE Healthcare, USA)와 조합된 4KTA탐색기(GE Healthcare, USA)를 사용하여 SEC에 적용한다. 겔 여과는 2개의 피크를 생성하고 이는 자동화 전기영동 스테이션 익스페리온 (Bio-Rad, USA) 및 적당한 칩(Pro260 Chip, Bio-Rad, USA)을 사용하는 SDS-PAGE로 추가로 분석한다. 익스페리온에 대한 분석은 VHH 및 A-베타(1-28)-p38 융합 단백질이 VHH 및 A-베타(1-28)-p38 융합 단백질을 함유하는 반면 보다 작은 피크는 A-베타(1-28)-p38 융합 단백질만을 함유함을 밝힌다. 복합체내 VHH 및 A-베타(1-28)-p38 융합 단백질의 양은 익스페리온 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 측정한다. 익스페리온으로 측정된 단백질의 분자량은 A-베타-p38 융합 단백질에 대해 53kDa이고 60A10-27GS-42D4-Alb 단백질에 대해 101kDa이다. 상기 측정된 농도 및 이어서 계산된 몰농도는 A-베타 (1-28)-p38 융합 단백질 및 60A10-27GS-42D4-Alb 단백질에 대해 각각 0.87 μΜ 및 0.86 μΜ 이다. 따라서, 분석된 단백질 복합체내 A-베타(1-28)-p38 대 60A10-27GS-42D4-Alb의 비는 약 1:1이지만 이는 1:2의 몰비로 혼합된다. 상기 결과로부터, 하나의 바이파라토픽 VHH가 1개 및 동일한 A-베타 분자내에 A-베타 펩타이드 분자의 2개의 에피토프에 결합하고 따라서 2가 VHH 작제물을 통해 A-베타 분자의 교차 결합을 통해 작용하지 않는 (또는 적어도 주요한 것이 아닌) 것으로 결론지을 수 있다.
8.3 결정화 연구: 결정화를 위해, ABII035 및 ABII059 (각각 160 μΜ)은 16시간 동안 3배 몰 과량의 사람 A-베타 펩타이드(잔기 1-24)과 항온처리하고 복합체는 크기 배제 크로마토그래피로 정제한다. 상기 복합체는 정용여과로 4 mg/ml의 농도로 농축시킨다. 결정화 시험은 저장소 용적 100㎕에 대해 200nl의 단백질을 200nl의 저장소 용액과 혼합함에 의해 씨팅 드랍 증기 확산 실험으로서 설정한다. 결정은 수일 후에 다양한 상이한 조건하에서 나타나고 이들 중에서 하기를 사용하여 구조를 결정한다: 100 mM MMT 완충액 pH 5, 25% PEG1500. 결정은 냉도 보호제 (85 mM MMT 완충액 pH 5, 35% PEG1500)로 처리하고 액체 질소로 순간 동결시킨다. 데이터는 기관[ Paul-Scherrer Institute in Villigen, Switzerland]의 스위스 광원의 빔라인(beamline) 6SA에서 수거한다.
결정 구조에서, ABII035, ABII059, 및 사람 A-베타 펩타이드(잔기 1-24)로부터 유래된 펩타이드는 3차원 복합체를 형성한다. 이러한 복합체는 2개 분자의 A-베타 펩타이드의에 의해 형성되는 역평행 베타 시트를 통해 이량체화한다. 상기 결정의 비대칭 단위는 각각 A-베타 펩타이드, ABII035 및 ABII059의 총 4개의 분자인 상기 구조중 2개에 의해 차지된다. A-베타의 잔기 1 내지 9는 알파-나선 형태를 취하고 잔기 10번 내지 20번은 베타 가닥을 형성한다. A-베타의 잔기 1 내지 14는 ABII035에 인접해 있고 이들 중에서 Asp1, Ala2, Glu3, Phe4, Asp7, 및 His14는 ABII035와 직접 접촉한다. A-베타의 잔기 15 내지 24는 ABII059에 인접해 있고 이들 중에서 Gln15, Lys16, Val18, Phe19, Phe20, Glu22, 및 Asp23은 ABII059와 직접 접촉한다.
상기에 추가로, ABII035 및 ABII059가 A-베타의 하나 및 동일한 분자에 동시에 결합할 수 있다는 것은 결정 구조로부터 명백히 알 수 있고 이는 상기 실시에 8.2에서 수득된 결과를 확인시켜준다.
추가로, 상기 결정 구조 데이터에 의해 입증되는 바와 같이 A-베타 유래된 펩타이드와 ABII035의 상호작용 모드는 상기 실시예 7에 기재되 바와 같은 관찰과 일치하고: ABII035는 설치류 A-베타 펩타이드와 관련하여 우수한 종 교차 반응성을 나타낸다. 사람과 설치류 A-베타와의 단지 서열 차이는 R5G, Y10F 및 H13R이다.
상기 데이터에 따라, 이들 잔기중 어느것도 VHH와 접촉하지 않는다. 따라서 설치류 A-베타는 사람 A-베타와 동일한 형태로 ABII035에 결합할 수 있는 것으로 추정되고 이는 특히 마우스 또는 랫트와 같은 설치류 동물 모델(설치류 A-베타 펩타이드를 생산하는)을 포함하는 분석을 위한 도구 시약(연구 도구)으로서 유용하게 한다.
실시예 9: 반감기 연장된 사람화된 바이파라토픽 항-A-베타 VHH 작제물의 제조 및 특성 분석
9.1 작제물 ABII314 내지 ABII323 의 작제: 사람화된 바이파라토픽 VHH 작제물을 사용한 생체내 확인 연구를 위해, 상이한 반감기 연장(HLE) 전략을 탐구하다: 1) 알부민 결합 VHH로의 유전학적 융합(예를 들어, WO2004/041865에 기재된 바와 같이), 2) VHH간에 또는 VHH의 C-말단에서 링커에 위치한 Cys 잔기의 페길화(WO2008/142164) 및 3) 사람 또는 마우스 혈청 알부민으로의 유전학적 융합. 상이한 HLE 전략은 ABII035 및 ABII059 VHH 도메인/빌딩 블록을 포함하는 바이파라토픽 VHH 작제물을 사용하여 탐구한다. 작제물 ABII314 내지 ABII323은 적당한 세트의 오버래핑 올리고뉴클레오타이드를 사용한 유전자 어셈블리를 통해 제조한다. ABII314 내지 ABII323의 서열번호 및 아미노산 서열은 표 15에 열거한다. 작제물ABII314, ABII315, ABII322 및 ABII323에서, 빌딩 블록 ABII059는 PEG와의 접합을 위해 시스테인 잔기(표 15에 지적된 바와 같은 위치에서)를 함유하는 상이한 길이의 Gly-Ser 링커(표 15에 나타낸 바와 같이)를 통해 ABII035에 융합시킨다. 작제물 ABII316 내지 ABII321은 상이한 배향으로 9- 또는 35-GS 링커에 의해 분리되는 유전학적으로 결합된 VHH ABII035, ABII059 및 ALB8 (마우스 교차 반응성을 갖는 사람화된 항-사람 알부민 VHH)으로 이루어진다. 하기 표 15에 나타낸 작제물은 임의로, 헥사-히스티딘 태그 및/또는수득한 폴리펩타이드의 정제를 촉진시키는 다른 태그를 추가로 포함한다.
9.2 사람화된 반감기 연장된 바이파라토픽 VHH 작제물의 제조, 정제 및 페길화: His6-태그된 바이파라토픽 VHH 작제물 ABII314, ABII315, ABII322 및 ABII323은 친화성 크로마토그래피(IMAC 또는 단백질 A), 양이온 교환 크로마토그래피(SP 세파로스, 공급원 30S 또는 POROS 50HS) 및 크기 배제 크로마토그래피(Superdex75 또는 세파크릴 S100)을 통해 정제한다. 최소 90%의 단백질 순도 수준(SDS-PAGE 및 후속 코마시 블리리언트 블루 염색을 통해 결정되는)에서, 페길화를 수행한다. VHH의 분자간 S-S 결합은 먼저 10mM의 최종농도로 DL-디티오트레이톨 용액(DTT)를 첨가하고 이어서 실온 또는 밤새 4℃에서 2 내지 3시간 항온처리함에 의해 환원시킨다. 후속적으로 상기 환원제는 D-PBS 전개 완충액중에서 크기 배제 크로마토그래피(Superdex 75/200)을 통해 제거하고 주요 피크를 수거한다. 환원제를 제거한 직후, 바이파라토픽 폴리펩타이드 작제물은 실온 또는 밤새 4℃에서 1시간 동안 5배 몰과량의 PEG와 항온처리한다. 상기 페길화된 폴리펩타이드는 양이온 교환 크로마토그래피 (MacroCap SP)를 통해 유리된 PEG 및 비-페길화된 폴리펩타이드로부터 분리한다. D-PBS에 대한 최종 세척 단계 및 완충액 교환은 Superdex200 또는 세파크릴 S200상에서 정제용 크기 배제 크로마토그래피를 통해 수행한다. 정제된 페길화된 폴리펩타이드의 품질은 문헌[참조: Natarajan et al (1995) in Bioconjugate chemistry 16:1 13-121]에서 이전에 기재된 바와 같이 SDS-PAGE에 이어서 CBB- 및 PEG-염색을 통해 확인한다.
9.3 TR-FRET에 의한 반감기 연장된 사람화된 바이파라토픽 항-A-베타 VHH 작제물의 특성 분석: 상기된 반감기 연장된 바이파라토픽 VHH 작제물의 결합 성질과 모노클로날 항체(IgG) 3D6 및 m266의 결합 성질을 비교하기 위해, ABII315 내지 ABII320, ABII322 및 ABII323을 ABII002 및 ABII050 경쟁 TR-FRET 분석으로 시험한다(실시예 8.1 및 3.2 참조). 적어도 2개의 독립적인 실험으로부터 유래된 평균 IC50은 표 16에 요약한다.
ABII002 TR-FRET 경쟁 분석에서, 시험된 모든 반감기 연장된 VHH 작제물은 3D6 IgG(1.9nM의 IC50)와 비교하여 6.5배 내지 14.6배(ABII315-PEG20)의 고도로 개선된 효능을 나타낸다. IgG m266과 비교하여, 모든 VHH 작제물은 ABII050 TR-FRET 경쟁 분석에서 상당히 우수한 IC50 값을 나타내고 VHH ABII320은 IgG266에 비해 2.5배 개선된 0.21 nM의 최저 IC50을 갖는다.
1가 VHH ABII035의 효능과 비교하여, 최고 효능을 갖는 상기 개조된 VHH 작제물(ABII315-PEG20)은 ABII002 TR-FRET 경쟁 분석에서 27배 개선된 IC50을 나타낸다. VHH 작제물 ABII320은 ABII050 TR-FRET 경쟁 분석에서 1가 ABII059에 비해 61배 개선된 효능을 나타낸다.
단량체 빌딩 블록 ABII035 및 ABII059에 비해 바이파라토픽 작제물의 증가된 효능은 비-사람화된, 비-성숙화된 작제물로 수득된 결과를 확인시켜주고(실시예 8.1) 하나의 A-베타 펩타이드 분자에 대한 하나의 바이파라토픽 VHH 작제물의 분자내 결합 가설을 지지한다(상기 실시예 8.2 참조). 추가로, 이들 실험은 상기된 바와 같이 VHH 작제물에 적용된 반감기 연장 기술이 A-베타 펩타이드에 대한 상기 작제물의 결합을 방해하지 않음을 입증한다.
A-베타 펩타이드에 대한 ALB8-함유 VHH 작제물의 결합이 HSA(혈류에 존재하는 것과 같은)에 의해 영향받는지를 평가하기 위해, ABII316-ABII320과 동등하지만 비-사람화된 VHH 빌딩 블록을 함유하는 바이파라토픽 작제물은 μΜ몰량의 알부민의 존재 및 부재하의 경쟁 TR-FRET 분석 둘다로 시험한다. 2개의 분석 포맷에서, 6.5 내지 10μΜ 사람, 개 또는 소 알부민(여기서, 후자의 2개의 알부민 변이체는 ALB8과 어떠한 검출가능한 상호작용을 나타내지 않는다)과의 예비 항온처리는 TR-FRET 분석에서 효능에 영향을 주지 않는다.
ALB8이 바이파라토픽 VHH 작제물의 구조에서 여전히 알부민과 결합할 수 있는지를 시험하기 위해, HSA로 피복된 칩에 결합하는 것에 대한 VHH 작제물의 역학적 분석을 수행한다(Biacore). 상응하는 친화성은 시험된 1가 ALB8 및 ALB8 융합 작제물에 대해 결정하고 이는 ALB8 빌딩 블록의 HSA-결합이 영향받지 않음을 지적한다.
9.4 A-베타 섬유 형성의 억제: 추가의 실험에서, 바이파라토픽 VHH 작제물 ABII320의 일련의 희석액은 실시예 3.5하에 기재된 바와 같은 시험관내 A-베타 섬유의 형성을 억제하는 이의 능력에 대해 평가하고 이의 1가 빌딩 블록 ABII035 및 ABII059 및 대조군 항체의 활성과 비교한다. 시험된 최고 농도(26 μΜ)의 VHH 작제물에서 최대 억제는 2개의 독립적인 실험의 평균치로서 계산한다. 대략 17%의 일관된 기본 억제가, 비-관련된(비-A-베타 특이적) VHH를 대조군으로서 사용하는 경우 검출되지만 1가 3D6 및 m266 Fab 단편은 82%의 최대 억제를 갖는 재현가능한 용량 의존성 억제를 나타낸다. (온전한) IgG 3D6 및 m266은 각각 75% 및 83%의 억제를 유도한다. 1가 VHH ABII035 및 ABII059는 각각 54% 및 80%의 최대 억제를 나타내고 반감기 연장된 바이파라토픽 VHH 작제물 ABII320은 26 μΜ에서 84%의 최대 억제 능력을 나타낸다.
9.5 가용성 APP -알파로의 결합: 가용성 APP-알파 (sAPP알파)는 알파-세크레타제 활성에 의해 이의 세포 결합된 전구체 APP로부터 방출된다. A-베타 펩타이드에서 유리된 N-말단 아미노산 잔기는 전체 3D6 상호작용을 위해 필수적이기 때문에 sAPP알파의 아미노산 서열은 A-베타 펩타이드의 첫번째 16개의 아미노산 잔기를 함유하지만 올바른 3D6 에피포트를 함유하지 않는다. 에피토프 맵핑은 N 말단 영역 특이적 VHH ABII001 및 이의 유도체가 모노클로날 항체 3D6과 비교하여 다른 에피토프와 상호작용함을 지적한다. A-베타와 비교하여 sAPP알파에 결합하는 VHH는 TR-FRET-기본 분석 셋업을 사용하여 시험한다. 0.82nM의 최종 농도에서 비오티닐화된 sAPP알파 (Sigma)는 동일한 농도의 스트렙트아비딘-유로피움 표지된 비드 및 4.4nM의 AlexaFluor647-표지된 ABII320와 혼합한다. 하기의 비-표지된 화합물은 경쟁에 대해 시험한다: ABII320, sAPP알파, IgG m266, IgG 3D6, ABII035 및 A-베타(1 -40). 2개의 독립적인 실험은 경쟁자 화합물의 일련의 희석액을 적용하여 수행한다. 평균 IC50값은 각각 비표지된 ABII320, ABII035, A-베타(1-40) 및 sAPP알파에 대해 0.72nM, 25.6nM, 0.23nM, 및 14 nM이다. 예상된 바와 같이, IgG m266 및 IgG 3D6에 대해 어떠한 경쟁도 관찰되지 않는다. 상기 분석 셋업에서, ABII320은 sAPP알파보다 A-베타(1-40)와 63배 우수하게 상호작용한다. 비오티닐화된 sAPP알파 대신 비오티닐화된 A-베타(1-40)를 사용하는 병행 셋업에서, ABII320은 sAPP알파 보다(외삽된 데이터를 기준으로 보다 높은 농도의 IC50) A-베타(1-40)와 2000배 이상 우수하게 상호작용하고 이는 ABII320이 sAPP알파 보다는 A-베타(1-40)로의 결합을 선호한다는 것을 지적한다.
9.6 바이파라토픽 VHH 작제물에 대한 에피토프 맵핑: 펩타이드 마이크로어레이 (PepStar™)로서 디스플레이된 A-베타(1-42) 유래된 펩타이드를 사용하여 VHH의 에피토프를 결정한다. PepStar™ 펩타이드 마이크로어레이(JPT Peptide Technologies, Germany)은 유리 슬라이드상에 디스플레이된 항체/VHH 펩타이드 상호작용의 신속한 스크리닝을 위해 맞춤주문되는 펩타이드 마이크로어레이 세트이다. 상기 마이크로어레이의 펩타이드는 이들의 N-말단을 통해 고정화된 A-베타(1-42)의 1차 구조로부터 유래된 12/11 스캔을 나타낸다. 추가로, A-베타(1-42)의 처음 16개 내지 처음 17개 아미노산을 나타내는 N-말단의 절단된 펩타이드는 이들의 C 말단을 통해 고정화된다. VHH와의 항온처리시 결합 반응은 VHH에 대해 지시된, 표지된 2차 항체의 형광 강도를 판독함에 의해 검출할 수 있다.
상기 마이크로어레이를 블록킹 완충액(PBS, 1% BSA, 0.1% Tween20)으로 밤새 4℃에서 블록킹한 후, 5g/ml의 농도로 세척 완충액(PBS, 5 mM DTT, 0,05% Triton X-100, 5% 글리세롤, 1 % BSA)중에서 200㎕의 바이파라토픽 VHH 작제물 ABII320으로 2시간 동안 4℃에서 항온처리한다. 잉여량의 VHH를 제거하기 위해, 마이크로어레이를 세척 완충액으로 2분 동안 빙상에서 3회 항온처리한다. 이후, 상기 마이크로어레이는 0.5g/ml의 농도로 세척 완충액중에서 항-VHH Alexa Fluor 647 (Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co KG, Germany)로 1시간 동안 항온처리한다. 상기 항-VHH는 VHH 이량체 G6-G6로 면역화시킨 후 염소 혈청으로부터 유래한다. 미결합된 2차 항체는 마이크로어레이를 세척 완충액으로 빙상에서 2분 동안 3회 항온처리함에 의해 제거한다. 최종적으로 상기 슬라이드를 3분 동안 800 x g에서 원심분리로 건조시키고 633nm 레이저를 사용하여 프로스캔어레이(ProScanArray) (제조원: Perkin Elmer)로 스캐닝한다. 상기 데이터는 스캔어레이(ScanArray) Express? 소프트웨어(제조원: Perkin Elmer)로 분석한다.
결과로서, 직경이 420㎛인 펩타이드 스팟을 수득하고 이를 형광 강도에 대해 분석하고 이로부터 상기 펩타이드와 VHH의 상호작용이 반-정량적 방식으로 평가될 수 있다. 따라서, 펩타이드 마이크로어레이와 바이파라토픽 VHH 작제물 ABII320의 항온처리는 ABII320이 A-베타 펩타이드의 잔기 1번 내지 11번 및 15번 내지 24번과 상호작용함을 밝힌다. 상기 알라닌 스캔은 A-베타 펩타이드의 잔기 Asp1, Glu3, Phe19, Phe20 및 Asp23가 바이파라토픽 VHH의 결합을 위해 필수적임을 지적하고 이는 결정 구조 분석으로부터 수득된 데이터와 일치한다. 동일한 결과는 ABII035 및 ABII059 VHH 도메인을 포함하는 2개의 다른 바이파라토픽 VHH 작제물을 사용하여 수득한다.
9.7 역학적 배제 분석( KinExA )을 사용한 결합 작제물의 측정: A-베타 펩타이드에 대한 3개의 바이파라토픽 VHH 작제물의 친화성은 KinExA (역학적 배제 분석)을 사용하여 측정한다. KinExA는 용액 상에서 비변형된 분자를 측정하는 능력을 갖는 기술이다(문헌참조: Darling, R.J. and Brault, P. -A.: Kinetic Exclusion assay Technology: Characterization of Molecular Interactions; Assay and Drug Development Technologies 2(6):647 (2004)). KinExA 방법으로 VHH, 항원 및 VHH-항원의 혼합물중에 비복합체화된 VHH 분자의 농도를 측정한다. 비복합체화된 VHH의 농도는 매우 짧은 시간 동안 용액 상 혼합물을 고체상 고정화된 항원에 노출시켜 측정한다. 용액 상 혼합물과 고체상 고정화된 항원간의 "접촉 시간"은 VHH-항원 복합체의 해리가 무시하기에 미미할 정도로 충분히 짧게 지속한다. VHH 항원 복합체의 유의적인 해리 가능성이 역학적으로 배제되는 경우, 단지 비복합체화된("유리된") VHH가 고체상에 결합할 수 있다. 고체상에 결합하는 유리된 VHH의 양(2차 표지로부터의 형광 방출에 의해 측정됨)은 용액 상 샘플중에 유리된 VHH의 농도와 직비례한다.
A-베타(1-28) 펩타이드 (Anaspec, USA)는 바이파라토픽 VHH와의 항온처리를 위한 항원으로서 사용한다. 융합 단백질 "His.Xa.Abeta1-28.GS.p38"을 사용하여 비복합체화된 VHH와 결합하는 고체상을 제조한다. 융합 단백질의 구조는 His-tag, 인자 Xa 절단 부위, A-베타(1-28) 펩타이드, GS-링커, 쥐 p38 알파와 같고 하기의 서열을 갖는다:
(서열번호 144).
상기 융합 단백질은 이. 콜라이에서 발현시키고 Ni-NTA(Qiagen, Germany)를 사용하여 정제하고 로도아세트아미드(Sigma, USA)로 알킬화한다.
폴리메틸메타크릴레이트 비드 (Sapidyne Instruments Inc., USA)는 0.02% NaN3과 함께 PBS중의 융합 단백질로 피복시키고 동일한 완충액중에서 1% BSA로 블록킹하고 고체상으로서 모든 실험을 위해 사용된다. KinExA 실험은 실온에서(예를 들어, 21℃) KinExA 3000 및 KinExA 프로 소프트웨어(Sapidyne Instruments Inc., USA)를 사용하여 수행한다. 0.02% NaN3과 함께 PBS는 전개 완충액으로서 사용한다. 모든 실험을 위해, 항원은 일정한 VHH 농도를 갖는 0.1 % BSA 및 0.02% NaN3를 갖는 PBS내로 연속으로 희석시킨다. 항원 및 VHH의 혼합물은 측정 전에 실온에서 24시간 동안 항온처리한다. 모든 실험용 샘플 및 표지화 항체의 유속은 0,25ml/분이다.
ABII320 VHH 작제물 (제1 VHH 작제물)의 측정을 위한 2차 형광 표지된 항체는 상기 9.6하에 기재된 Alexa 647-접합된 염소 항-G6G6 (항-VHH)이다. 상기 항체는 500㎕의 용적 및 0.1% BSA 및 0.02% NaN3을 갖는 PbS중에서 0.5g/ml의 농도로 사용한다. ABII320은 재조합 사람 알부민(albcult™, novozymes, USA)의 존재하에 기재된 바와 같이 추가로 측정한다. 고체상에 대한 페길화된 ABII322 VHH 작제물(제2 VHH 작제물)의 결합은 동일한 완충액중에 0.25g/ml의 농도에서 250㎕의 Alexa 647 접합된 염소 항-토끼(Molecular Probes Inc., USA)와 조합된 기구의 라인 13상에 0.1% BSA 및 0.02% NaN3을 갖는 PBS중의 0.1pg/ml의 농도에서 500㎕의 래빗 항-PEG(Epitomics Inc., USA)를 사용하여 측정한다. 상기 표 4에 나타낸 HSA-바이파라토픽 VHH 작제물 융합 단백질(서열번호 32; 3번째 VHH 작제물)의 결합은 동일한 완충액중에서 0.5g/ml의 농도에서 500㎕의 Alexa 647 접합된 래빗 항-염소(Molecular Probes Inc., USA)와 조합된 기구의 라인 13상에 0.1% BSA 및 0.02% NaN3을 갖는 PBS중의 0.5pg/ml의 농도에서 500㎕의 염소 항-HSA(Bethyl Laboratories Inc., USA)를 사용하여 측정한다.
평형 적정 데이터는 KinExA 프로 소프트웨어 버젼 1.0.3 (Sapidyne Instruments Inc., USA)을 사용한 1:1 결합 모델에 피팅한다. 제1 VHH 작제물(바이파라토픽 VHH ABII320)은 3, 5 및 10pM의 농도에서 측정한다. 상기 샘플 용적은 각각 5ml이다. 측정된 KD는 1% 재조합 사람 알부민의 존재하에 1, 1 ± 0,3 pM 및 0.4 ± 0,1 pM이다. 제2 VHH 작제물(바이파라토픽 페길화된 VHH ABII322)은 3, 4, 5 및 6 pM의 농도에서 측정한다. 상기 샘플 용적은 각각 11 ml이다. 상기 측정된 KD는 0.6 ± 0.2 pM이다. 제3 VHH 작제물(HSA-VHH 융합 단백질)은 2, 3 및 4pM의 농도에서 측정한다. 상기 샘플 용적은 각각 5ml이다. 상기 측정된 KD는 0.5 ± 0.3 pM이다.
9.8 피로글루타밀 -A베타로의 결합: 피로글루타밀 (pGlu)-A-베타는 알츠하이머 질환에서 신경염 플라크의 주요 성분이다. 이것은 A-베타의 매우 아밀로이드형성 변이체를 유도하는 글루타밀 사이클라제(QC)에 의해 촉매되는 3번위치에서의 N-말단 글루타메이트의 폐환에 의해 형성된다. pGlu-A-베타의 아미노산 서열은 A-베타 펩타이드의 아미노산 잔기 3 내지 42번을 함유한다. 항체 3D6과 완전한 상호작용을 위해 필수적인 첫번째 2개의 N 말단 아미노산이 결실되어 있다. pGlu-A-베타-ABII320/ABII322/m266/3D6 상호작용을 위한 친화성은 이전에 기재된 바와 같이(실시예 2) 스트렙트아비딘 센서 칩상에 포획된 C 말단 비오티닐화된 pGlu-A-베타(1-28)을 사용하여 표면 플라스몬 공명(Biacore)을 통해 측정한다. 정제된 폴리펩타이드 ABII320 또는 ABII322 또는 항체 m266 또는 3D6은 3분 동안 9개의 상이한 농도 (ABII320에 대해 0.195 내지 50 nM , ABII322에 대해 0.39-100 nM 및 3D6 및 m266에 대해 0.782-200 nM)로 주사하고 10분 동안 해리하도록 방치한다. 결합 및 해리 곡선은 1:1 상호작용 모델을 사용하여 피팅할 수 있고 정확한 KD 값을 측정할 수 있다. 상기 친화성은 ABII320에 대해 2nM이고, ABII322에 대해서는 1nM이고 항체 m266에 대해서는 224pM인 것으로 밝혀졌고 항체 3D6에 대해서는 어떠한 결합도 관찰될 수 없었다.
실시예
10: 아밀로이드 플라크에 대한 항-A-베타
VHH
의 결합
VHH는 Tg2576 마우스 뇌 슬라이스중에 아밀로이드 플라크에 결합하는 능력에 따라 조직 아밀로이드 플라크 면역반응성(TAPIR) 분석에서 프로파일링한다. 상기 TAPIR 분석은 VHH의 정량적 평가(최소 유효 용량 MED) 뿐만아니라 정성적 평가(밀집된 코어 및/또는 분산 아밀로이드 플라크)를 가능하게 한다. 상기 분석을 위해, 플라크-양성 마우스의 냉동유지 절단된 코로날(coronal) 절편을 제조하고 76x26 mm 슈퍼프로스트(Superfrost) 슬라이드(Roth)상에 탑재하고 -20℃에서 저장한다. 냉동절편을 20분 동안 해동시키고, 10분 동안 빙상에서 3% 파라포름알데하이드(PFA)중에 고정시킨다. 절편을 이어서 30분 동안 0.3% 과산화수소중에서 항온처리하고 2.5% 소 혈청 알부민(BSA) 및 2% 마우스 혈청을 함유하는 PBS로 1.5시간 동안 블록킹하고 상이한 농도(3.0 mg/ml 내지 4.11 ng/ml)에서 myc-태그된 VHH 또는 Fab와 항온처리하고, 2.5% BSA를 함유하는 PBS중에 용해시킨다. 이어서 상기 슬라이스를, 2.5% BSA를 함유하는 PBS중에 용해된 10mg/ml의 비오티닐화된 마우스 항 c-myc 모노클로날 항체(9E10)(Sigma-Aldrich)로 1.5시간 동안 항온처리한다(비오티닐화된 ABII320으로 항온처리된 슬라이스는 제외시킴). 상기 절편은 제조업자의 지침에 따라 제조된 벡타스타인 ABC ELITE 키트 용액(Vector Laboratories)으로 1.5시간 동안 항온처리하고 다시 제조업자의 지침에 따라 제조된 벡터 VIP SK 4600 용액(Vector Laboratories)을 사용하여 가시화시킨다. 상기 절편을 점진적으로 60-, 80- 및 100% 에탄올 및 100% 이소프로판올중에서 5분 항온처리함에 의해 탈수시키고 크실렌중에서 5분 동안 세정한다. 이어서 상기 절편을 엔텔란 새로운 탑재 매질(Merck)와 함께 탑재하고 24x50 mm 커버슬립(Menzel-Glaeser)으로 덮었다. 상기 결과는 하기의 표에 요약한다.
ABII320 및 상기된 모노클로날 항체 m266의 Fab 단편에 추가로, 여러 다른(myc-태그된) 바이파라토픽 VHH 작제물은 상기 TAPIR 분석으로 분석하였다. VHH 작제물 ABII300 내지 ABII305의 구조물은 하기 표 12에 나타내고 모든 경우에 상이한 순서로 및 알부민 결합 VHH 도메인 (ABII300 내지 ABII304) 또는 PEG40 잔기(ABII305)와 조합된 VHH 도메인 ABII002(서열번호 62) 및 ABII050(서열번호 100)을 포함한다.
상기 결과로부터, ABII305-PEG40 뿐만 아니라 바이파라토픽 VHHs ABII300, ABII301 , ABII302, ABII303 및 ABII304은 TAPIR 분석에서 실제 조직 아밀로이드 플라크(밀집된 코어 및 분산 유형의 플라크)에 동일한 친화성을 나타내는 것으로 보일 수있다. PEG40으로의 링커 또는 접합의 특정 순서는 플라크 친화성에 대해 상당한 효과를 갖는 것으로 나타나지 않는다.
실시예
11: 반감기 연장된
바이파라토픽
항-A-베타
VHH
작제물의
약력학
VHH의 약역학 및 약동력학 성질을 결정하기 위해, 샘플을 APP 유전자 전이 마우스로 정맥 또는 복강내 주사한다. 혈장 샘플은 브이. 사페나를 채혈함에 의해 수득한다. 예비 투여 샘플은 VHH, IgG 또는 비히클 적용 전 및 4시간 및 24시간 후에 취하였다.
VHH 및 IgG의 결합이 ELISA에서의 검출을 방해하기 때문에, A-베타:VHH 또는 A-베타:IgG 복합체는 분석 전에 변성시켜 혈장 A-베타(1-40)의 총양을 검출한다. 간략하게, 샘플은 6M GuHCl(Sigma Aldrich)로 변성시키고 고체상 추출 컬럼상에 정제한다. 60 mg의 오아시스 HLB 96-웰 플레이트(Waters)를 하우스 진공기에 연결된 추출 플레이트 매니폴드(waters)내에 장착한다. 컬럼은 1ml의 메탄올(MeOH)에 이어서 1ml의 H2O로 활성화시킨다. GuHCl-추출된 샘플을 로딩하고 후속적으로 1ml 용적의 5 및 30% MeOH로 세척하고 이어서 A-베타는 90% MeOH 중의 2% NH4OH로 용출시킨다. 용출된 샘플은 수거하고 1400rpm에서 90분 동안 60℃에서 진공 원심분리(Eppendorf Vacufuge)시킨다. 샘플이 완전히 건조되면 이들을 블록킹 완충액으로 재구성하고 분석때까지 -20℃에서 저장한다. A-베타(1-40)의 총 혈장 수준은 제조업자의 지침에 따라 샌드위치 ELISA (4G8/항-A-베타(1-40), 메소스케일 디스커버리)로 측정한다.
APP 유전자 전이 마우스의 예비 용량의 총 A-베타(1-40) 수준은 혈장에서 약 1.25nM이다. 15nmol/kg의 바이파라토픽 VHH 또는 IgG(결합 부위로 표준화된 동일 용량)가 주사된 상기 마우스에서 혈장 중 총 A-베타의 수준은 정맥내 투여 후 약 4시간에 최대에 도달하였다. 데이터는 "예비 용량에 비교되는 배수 증가"로서 나타내고, 여기서, 주사한지 4시간 및 24시간 째에 측정된 혈장 농도는 예비 용량 수준으로 나눈다. 결과는 표 18에 나타낸다.
따라서, 당업계에 공지된 IgG 분자와 비교하여, 바이파라토픽 VHH 작제물은 총 혈장 A-베타에 대해 50% 보다 높은 피크 수준을 나타내고 AUD 값을 2배 초과로 증가시키는 잠재력을 가지며 이는 A-베타를 포획하는데 있어서, IgG 보다 이들 VHH 작제물이 월등함을 지적한다.
유리된/비결합된 혈장 A-베타의 수준이 VHH 작제물의 투여 후 감소함을 확인하기 위해, 경쟁 ELISA를 전개한다. 간략하게, A-베타(1-40)는 ECL-ELISA 플레이트(메소스케일 디스커버리)에 커플링된 A-베타(1-40) 특이적 항체로 포획한다. 수동 면역치료에서 동물을 치료하기 위해 사용되는 VHH 또는 IgG 분자는 제조업자의 매뉴얼에 따라 MSD 설포-태그 NHS-Ester(메소스케일 디스커버리)를 사용하여 태그하고 상기 샌드위치 ELISA 포맷에서 검출 도구로서 사용한다. VHH 또는 IgG에 결합된 A-베타(1-40)는 이들 셋팅에서 검출될 수 없는 반면, 유리된/미결합된 A-베타(1-40)은 검출가능하다. 상이한 분석으로부터 데이터를 비교하기 위해, 모든 값은 비히클 처리된 그룹 기원의 데이터로 표준화시킨다. APP 유전자 전이 마우스는 지적된 바와 같은 VHH 또는 IgG로 처리하고 혈장을 수거하고 유리된/비결합된 A-베타(1-40)에 대해 분석한다. 132nmol/kg의 항-A-베타 VHH(각각 132 nmol/kg anti-A-beta VHHs (ABII320 및 ABII322)의 복강내 주사 후 2시간이 되는 즉시, 유리된/비결합된 A-베타(1-40)는 기준선 수준(대략 2nM)으로부터 2pM의 검출 한계 미만으로 매우 상당히 감소한다. 동등한 용량의 3D6-IgG (10 mg/kg, 132 nmol/kg 결합 부위 = 66 nmol/kg IgG)는 혈장내 비결합된 A-베타(1-40)의 수준을 52pM 수준 미만으로 감소시킬 수 있다(도 1). 이러한 비교에서, 상기 바이파라토픽 VHH 작제물 ABII320 및 ABII322는 예상치 않게 동일한 용량에서 3D6 IgG와 비교하여 혈장 중에 유리된/비결합된 A-베타를 크게 감소시킴을 보여주고 이는 다시 IgG(3D6)과 비교되는 A-베타 포획의 월등함을 지적한다. 이것은 특히 상기 VHH 작제물이 VHH의 치료학적 효능 측면에서 유용하게 한다. 구체적으로, 혈장 중 A-베타의 보다 효율적인 고갈은 혈장으로부터 뇌로의 A-베타의 유입을 차단하므로써 뇌 혈장 A-베타 풀 사이에 가파른 농도 기울기를 생성시키고 이로써 뇌로부터 혈장으로의 A-베타의 유출을 가속화할 것으로 예상된다.
실시예
12:
BBB
통과
VHH
VHH 작제물의 혈뇌 장벽(BBB) 통과 특성을 추가로 개선시키기 위해, 바이파라토픽 VHH 및 BBB 통과 VHH FC44 및 FC5를 포함하는 이특이적 VHH를 작제한다(WO2002/057445에 상세히 기재된 바와 같이). 이들 VHH는 BBB상에 발현된 표적 단백질에 결합함에 의해 BBB 통과를 개선시키고, 이후, 상기 VHH는 내피 세포를 통해 세포질을 통과하고, 뇌 유조직에서 방출된다. 이와 같이, FC44 및 FC5에 유전학적으로 융합된 VHH는 활성 수송체가 뇌로 진입되도록 하여 뇌 수준을 보다 높이고 치료학적 효과를 개선시킬 것으로 예상된다. FC44 또는 FC5 VHH를 포함하는 작제물 ABII400-ABII407은 적당한 세트의 오버래핑 올리고뉴클레오타이드를 사용한 유전자 어셈블리를 통해 제조한다. 서열번호 및 아미노산 서열은 하기 표 19에 열거한다. 간략하게, ABII035와 ABII059 VHH 빌딩 사이에 또는 HSA 결합 VHH와 ABII035 빌딩 블록 사이에 또는 상기 분자의 아미노 또는 카복시 말단에서 FC5 또는 FC44 VHH를 함유하는 VHH를 제조한다(표 19 참조). VHH는 이. 콜라이 또는 피키아 파스토리스에서 발현시키고 실시예 9.2에 기재된 바와 같이 정제한다. 정제된 VHH는 기재된 바와 같은 시험관내 BBB 통과 분석으로 평가한다(WO2002/057445 및 본원에서의 추가의 참조서류). 추가로, FC5 및 FC44 빌딩 블록을 포함하는 방사능표지되거나 비-방사능표지된 VHH는 생체내 투여하고 뇌 수준은 액체 섬광 카운팅 또는 ELISA를 사용하여 측정한다.
실시예 13: 본 발명의 페길화된 바이파라토픽 폴리펩타이드에 대한 산업적 제조 방법
13.1 발효: 임의의 폴리펩타이드 ABII305, ABII306, ABI1314, ABI1315, ABII322, 및 ABII323은 유도가능한 프로모터의 조절하에 W31 10, TG1 , BL21 , BL21 (DE3), HMS174, HMS174(DE3) 및 MM294와 같은 상이한 이. 콜라이 균주의 세포질에서 발현시킬 수 있다. 상기 프로모터는 lacUV5, tac, T7, trp, T5 및 araB로부터 선택될 수 있다. 상기 배양 배지는 바람직하게 문헌[참조: Wilms et al., 2001 (Wilms, B., Hauck, A., Reuss, M., Syldatk, C, Mattes, R., Siemann, M., and Altenbuchner, J. : High-Cell-Density Fermentation for Production of L-N-Carbamoylase Using an Expression System Based on the Escherichia coli rhaBAD Promoter. Biotechnology and Bioengineering, 73: 95-103 (2001 )), DeLisa et al., 1999 (DeLisa, M. P., Li, J. C, Rao, G., Weigand, W. A., and Bentley, W. E.: Monitoring GFP-operon fusion protein expression during high cell density cultivation of Escherichia coli using an on-line optical sensor. Biotechnology and Bioengineering, 65: 54-64.(1999)]에 따라 또는 이의 균등범위로 정의된다. 그러나, 이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트레오닌, 트립토판 및 발린과 같은 아미노산 또는 대두 펩톤 또는 효모 추출물과 같은 복합배지 성분의 보충이 이로울 수 있다. 발효 방법은 유가식 방식으로 수행된다. 조건: 온도 30-40℃, pH 6 - 7.5, 용존 산소는 20% 이상으로 유지된다. 초기 C 공급원의 소비 후 상기 배양물에 상기된 공급 배지 (또는 균등물)를 주입한다. 발효기내 무수 세포 중량이 40 내지 90g/L에 도달한 경우, 상기 배양물을 사용되는 프로모터 시스템(예를 들어, IPTG, 락토스, 아라비노스)에 상등하는 적당한 유도제로 유도한다. 상기 유도는 개별 유도제를 발효기에 장시간 동안 주입함에 의해 펄스된 완전 유도 또는 부분적 유도로서 수행될 수 있다. 상기 제조 단계는 적어도 4시간 지속해야만 한다. 상기 세포는 분리판 원심분리기, 관형 분리판 원심분리기 또는 디스크 스택 원심분리기에서 원심분리하여 회수하고 배양 상청액은 버린다.
13.2 정제: 이. 콜라이 세포 질량은 6 내지 8배 양의 용해 완충액(포스페이트 또는 트리스 완충액 pH 7-8.5)중에 현탁시킨다. 세포 용해는 바람직하게 고압 파쇄에 이어서 분리판, 관형 분리판 또는 디스크 스택 원심분리기로 원심분리하여 세포 파쇄물을 제거함에 의해 수행한다. 표적 단백질을 함유하는 상청액은 임의로 0.22-10㎛ 여과기를 사용하여 여과하고 양이온 교환 크로마토그래피(예를 들어, Toyopearl MegaCap? II SP-550EC, Toyopearl GigaCap S-650M, SP 세파로스 BB, SP 세파로스 FF 또는 S HyperCel™)를 통해 pH 7-8.5에서 분리한다. pH 7-8.5에서 선형으로 증가하는 NaCl 농도 구배에 의해 용출시킨다. 표적 단백질을 함유하는 분획물을 풀링하고 이어서 5-10mM DTT와 항온처리하여 유리된 시스테인 잔기에 의해 매개되는 이량체화 또는 응집을 차단한다. 0.8-1 M 황산암모늄 또는 2-3 M NaCl을 추가로 첨가한 후, 용액을 친수성 상호작용 크로마토그래피(예를 들어, 페닐 세파로스 HP, 페닐 세파로스 FF, 부틸 세파로스 HP, 부틸 세파로스 FF, 부틸 토요펄 650(S.M.C), 페닐 토요펄 650(S.M.C)를 통해 pH 7-8.5에서 수행한다. 5mM DTT의 존재하에 선형으로 감소하는 황산 암모늄 또는 NaCl 농도 구배에 의해 pH 7-8.5에서 용출시킨다.
최소 90%의 순도 수준으로 표적 단백질을 함유하는 분획물을 풀링하고 5mM DTT의 존재하에 정용여과하고 대략 5mg/ml로 농축시켜 탈염시킨다. 후속적 리폴딩은 단백질 용액을 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 4 mM 시스타민, 10 mM CHAPS을 사용하여 pH 8.5에서 0.25 내지 1mg/ml의 최종 단백질 농도로 1:5 내지 1:20으로 희석시킨다. 리폴딩 단백질은 실온에서 12 내지 36시간 동안 교한하에 항온처리하고 이어서 pH 7-8.5에서 양이온 교환 크로마토그래피(예를 들어, SP 세파로스 FF, SP 세파로스 HP, 토요펄 SP-650 (S. M. C))에 의해 분리한다. pH 7-8.5에서 선형으로 증가하는 NaCl 농도 구배에 의해 용출시킨다. 단량체성 표적 단백질을 함유하는 분획물을 풀링하고 DTT, DTE 또는 TCEP와 같은 환원제를 첨가하여 페길화를 위해 활성화시킨다. 상기 용액은 이어서 2시간 동안 실온에서 항온처리한다. Na-포스페이트 완충액 pH 6.5-7.5 또는 20 mM HEPES 완충액 pH 6.5-7.5 또는 Tris 완충액 pH 8.0에 대한 정용여과 및 5-10mg/ml로의 농축 후 40kDa 말레이미드-폴리에틸렌글리콜(PEG)을 첨가한다(단백질 대 PEG의 비는 1:2 내지 1:10). 용액을 실온에서 3 내지 18시간 동안 교한하에 항온처리하고 이어서 0.22㎛ 여과기를 사용하여 여과한다. 페길화된 표적 단백질은 양이온 교환 크로마토그래피(SP 세파로스 HP, 토요펄 SP 650M, MacroCap™SP, Source™30S 또는 Fractogel?EMD (M))를 통해 pH 5 내지 7에서 유리된 PEG 및 비-페길화된 표적 단백질로부터 분리한다. 선형으로 증가하는 NaCl 농도구배에 의해 용출시킨다. 모노-페길화된 표적을 함유하는 분획물을 풀링하고 정용여과를 통해 25mM Na-포스페이트, 220mM 내독소 유리 트레할로스 pH 7.5중에서 제형화한다.
실시예
14: 약제학적 제형 및 용도
14.1 약제학적 제형: 본 발명의 사람화된 임의의 바이파라토픽 폴리펩타이드 작제물, 예를 들어, ABII314 내지 ABII323은 하기와 같은 조성을 갖는 피하 적용용 약제학적 제형의 제조를 위해 선택될 수 있다:
약물: 100 mg/ml (1 내지 3 nmol/ml)
포스페이트 완충액: 25 mM
트레할로스: 220 mM
Tween-20: 0.02 %
약물은 상기 조성을 갖는 용액내에서 제형화하고 멸균시키고 2 내지 8℃에서 저장한다.
14.2 약제학적 용도: 상기 14.1하에 제조된 상기 용액은 AD를 앓는 사람과 같이 이를 필요로 하는 환자에게 2주 내지 4주 마다 1 내지 2ml(100 내지 200mg 투여량)의 용적으로 복부에 피하 주사한다.
SEQUENCE LISTING
<110> BOEHRINGER INGELHEIM INTERNATIONAL GMBH
<120> BIPARATOPIC ABETA BINDING POLYPEPTIDES
<130> P01-2596
<150> EP 10 155 339.4
<151> 2010-03-03
<160> 153
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 42
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1 5 10 15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
20 25 30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
35 40
<210> 2
<211> 40
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 2
Asp Ala Glu Phe Gly His Asp Ser Gly Phe Glu Val Arg His Gln Lys
1 5 10 15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
20 25 30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val
35 40
<210> 3
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1 5 10 15
<210> 4
<211> 13
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys
1 5 10
<210> 5
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
1 5 10 15
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> linker GS9, C5
<400> 6
Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 7
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> linker GS25, C5
<400> 7
Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 8
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> linker GS27, C14
<400> 8
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
20 25
<210> 9
<211> 35
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> linker GS35, C15
<400> 9
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Cys Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser
35
<210> 10
<211> 35
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> linker GS35, C5
<400> 10
Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser
35
<210> 11
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> CDR
<400> 11
Thr Asp Thr Met Gly
1 5
<210> 12
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> CDR
<400> 12
Ala Val Thr Trp Asn Ser Gly Arg Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 13
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> CDR
<400> 13
His Arg Leu Val Val Gly Gly Thr Ser Val Gly Asp Trp Arg Tyr
1 5 10 15
<210> 14
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> CDR
<400> 14
Thr Asp Thr Met Gly
1 5
<210> 15
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> CDR
<400> 15
Ala Val Thr Trp Asn Ser Gly Arg Ile Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 16
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> CDR
<400> 16
His Arg Phe Val Val Gly Gly Asn Arg Val Glu Asp Trp Arg Tyr
1 5 10 15
<210> 17
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> CDR
<400> 17
Asn Tyr Asn Met Gly
1 5
<210> 18
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> CDR
<400> 18
Ala Val Ser Arg Ser Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 19
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> CDR
<400> 19
Ala Tyr Arg Gly Thr Ala Ile Asn Val Arg Arg Ser Tyr Ser Ser
1 5 10 15
<210> 20
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> FR1/1
<400> 20
Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Val His Ser Gly Pro Thr Phe Arg
20 25
<210> 21
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> FR1/2
<400> 21
Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Asn
20 25
<210> 22
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> FR2
<400> 22
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val Ala
1 5 10
<210> 23
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> FR3/1
<400> 23
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
20 25 30
<210> 24
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> FR3/2
<400> 24
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
20 25 30
<210> 25
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> FR4
<400> 25
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 26
<211> 587
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Fc fusion protein
<400> 26
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val His Ser Gly Pro Thr Phe Arg Thr Asp
20 25 30
Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Val Thr Trp Asn Ser Gly Arg Ile Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala His Arg Phe Val Val Gly Gly Asn Arg Val Glu Asp Trp Arg
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu
130 135 140
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg
145 150 155 160
Thr Phe Asn Asn Tyr Asn Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
165 170 175
Gly Arg Glu Phe Val Ala Ala Val Ser Arg Ser Gly Val Ser Thr Tyr
180 185 190
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
195 200 205
Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr
210 215 220
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Tyr Arg Gly Thr Ala Ile Asn Val
225 230 235 240
Arg Arg Ser Tyr Ser Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
245 250 255
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
260 265 270
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
275 280 285
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
290 295 300
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
305 310 315 320
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln
325 330 335
Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
340 345 350
Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
355 360 365
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
370 375 380
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
385 390 395 400
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
405 410 415
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
420 425 430
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
435 440 445
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
450 455 460
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
465 470 475 480
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
485 490 495
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
500 505 510
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
515 520 525
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
530 535 540
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
545 550 555 560
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
565 570 575
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
580 585
<210> 27
<211> 605
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Fc fusion protein
<400> 27
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Asn Asn Tyr
20 25 30
Asn Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Val Ser Arg Ser Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Tyr Arg Gly Thr Ala Ile Asn Val Arg Arg Ser Tyr Ser
100 105 110
Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly
145 150 155 160
Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val His Ser
165 170 175
Gly Pro Thr Phe Arg Thr Asp Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro
180 185 190
Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val Ala Ala Val Thr Trp Asn Ser Gly Arg
195 200 205
Ile Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
210 215 220
Asn Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu
225 230 235 240
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala His Arg Phe Val Val Gly Gly
245 250 255
Asn Arg Val Glu Asp Trp Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
260 265 270
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
275 280 285
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
290 295 300
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
305 310 315 320
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
325 330 335
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
340 345 350
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
355 360 365
Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
370 375 380
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
385 390 395 400
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
405 410 415
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
420 425 430
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
435 440 445
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
450 455 460
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
465 470 475 480
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
485 490 495
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
500 505 510
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
515 520 525
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
530 535 540
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
545 550 555 560
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
565 570 575
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
580 585 590
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
595 600 605
<210> 28
<211> 330
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Fc fusion protein
<400> 28
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 29
<211> 330
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Fc fusion protein
<400> 29
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
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<211> 407
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<220>
<223> ABII319
<400> 37
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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
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Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
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Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Asn Asn Tyr Asn
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Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val Ala
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Ala Val Ser Arg Ser Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
210 215 220
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
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Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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Ala Ala Tyr Arg Gly Thr Ala Ile Asn Val Arg Arg Ser Tyr Ser Ser
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
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<213> Artificial
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Ala Ala Val Thr Trp Asn Ser Gly Arg Ile Asn Tyr Ala Asp Ser Val
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Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Thr Arg Asn Ala Ala Tyr
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<210> 83
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> ABII021
<400> 83
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala His Ser Gly Pro Thr Phe Arg Thr Asp
20 25 30
Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Val Thr Trp Asn Ser Gly Arg Ile Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ala Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala His Arg Phe Val Val Gly Gly Asn Arg Val Glu Asp Trp Arg
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 84
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> ABII022
<400> 84
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Ala Ala His Arg Phe Val Val Gly Gly Asn Arg Val Glu Asp Trp Arg
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 85
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> ABII023
<400> 85
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1 5 10 15
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20 25 30
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Ala Ala His Arg Phe Val Val Gly Gly Asn Arg Val Glu Asp Trp Arg
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115 120
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
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<400> 86
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<213> Artificial
<220>
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<400> 87
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<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
<220>
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<400> 89
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
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<400> 90
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
<220>
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<400> 92
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
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<400> 93
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> ABII032
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
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<400> 95
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<213> Artificial
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<400> 96
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
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<400> 97
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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115 120
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
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<400> 98
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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<213> Artificial
<220>
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<400> 99
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115 120
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<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
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<400> 100
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1 5 10 15
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<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> ABII051
<400> 101
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Asn Asn Tyr
20 25 30
Asn Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val
35 40 45
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<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> ABII052
<400> 102
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1 5 10 15
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<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> ABII053
<400> 103
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> ABII054
<400> 104
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> ABII055
<400> 105
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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<210> 106
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> ABII056
<400> 106
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Asn Asn Tyr
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Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 107
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> ABII057
<400> 107
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Asn Asn Tyr
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<210> 108
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> ABII058
<400> 108
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Asn Asn Tyr
20 25 30
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115 120
<210> 109
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> ABII059
<400> 109
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
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Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 110
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> ABII060
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Asn Asn Tyr
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Asn Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val
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Ala Ala Val Ser Arg Ser Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
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<213> Artificial
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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<213> Artificial
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<223> 4D
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Ala Thr Ile Arg Trp Asn Gly Asp Tyr Ala Asp Ser Val Arg Asp Arg
50 55 60
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr Val Phe Leu Gln Met
65 70 75 80
Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg
85 90 95
Leu Gly Pro Arg Thr Ser Gln Ala Ala Leu Tyr Arg Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<213> Artificial
<220>
<223> 8B
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Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Gly Trp Ser Gly Gly Ser Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Ala Pro Thr Arg Trp Val Pro Arg Asp Ser Arg Phe Tyr Asp
100 105 110
Arg Trp Gly Gln Gly Thr Arg Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<213> Artificial
<220>
<223> 31-1
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1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Gly Trp
20 25 30
Ser Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Ser Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Ala Thr Thr Tyr Thr Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Arg Ala Lys Asn Thr Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr
85 90 95
Cys Asn Ala Asp Val Ser Thr Gly Phe Arg Tyr Gln Arg Lys Asp Tyr
100 105 110
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115 120
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<213> Artificial
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
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1 5
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<213> Artificial
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Asn Asn Tyr
20 25 30
Asn Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Val Ser Arg Ser Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
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<213> Artificial
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Asn Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val
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<213> Artificial
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Val Cys Ala Ala Phe Asp Thr Lys Thr Gly His Arg Val Ala Val Lys
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Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val
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Arg Val Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly
245 250 255
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
260 265 270
Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
275 280 285
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala
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Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser
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Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
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<213> Artificial
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<400> 146
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Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
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Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
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Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
245 250 255
Ser Glu Val Gln Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly
260 265 270
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Val Arg Thr Phe Ser Ile
275 280 285
Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe
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Val Ala Gly Ile Asn Arg Ser Gly Asp Val Thr Lys Tyr Ala Asp Phe
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Val Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Met Val
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Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr
340 345 350
Cys Ala Ala Thr Trp Ala Tyr Asp Thr Val Gly Ala Leu Thr Ser Gly
355 360 365
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370 375 380
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly
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Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
405 410 415
Gly Arg Thr Phe Asn Asn Tyr Asn Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro
420 425 430
Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val Ala Ala Val Ser Arg Ser Gly Val Ser
435 440 445
Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
450 455 460
Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu
465 470 475 480
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<213> Artificial
<220>
<223> ABII402
<400> 147
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
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Ala Ala His Arg Phe Val Val Gly Gly Asn Arg Val Glu Asp Trp Arg
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115 120 125
Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
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Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
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Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu
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Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
195 200 205
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
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Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
260 265 270
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Asn Asn
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Val Ala Ala Val Ser Arg Ser Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
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Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> ABII403
<400> 148
Glu Val Gln Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
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35 40 45
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100 105 110
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Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly
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Arg Val Glu Asp Trp Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
245 250 255
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val
260 265 270
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser
275 280 285
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val
290 295 300
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly
305 310 315 320
Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
325 330 335
Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser
340 345 350
Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser
355 360 365
Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
370 375 380
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly
385 390 395 400
Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
405 410 415
Gly Arg Thr Phe Asn Asn Tyr Asn Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro
420 425 430
Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val Ala Ala Val Ser Arg Ser Gly Val Ser
435 440 445
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450 455 460
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Val Ser Ser
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<213> Artificial
<220>
<223> ABII404
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Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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225 230 235 240
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
245 250 255
Ala Ala Tyr Arg Gly Thr Ala Ile Asn Val Arg Arg Ser Tyr Ser Ser
260 265 270
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
275 280 285
Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
290 295 300
Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr
305 310 315 320
Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
325 330 335
Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr
340 345 350
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys
355 360 365
Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala
370 375 380
Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly
385 390 395 400
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
405 410 415
Glu Val Gln Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
420 425 430
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Val Arg Thr Phe Ser Ile Tyr
435 440 445
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
450 455 460
Ala Gly Ile Asn Arg Ser Gly Asp Val Thr Lys Tyr Ala Asp Phe Val
465 470 475 480
Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Met Val Tyr
485 490 495
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
500 505 510
Ala Ala Thr Trp Ala Tyr Asp Thr Val Gly Ala Leu Thr Ser Gly Tyr
515 520 525
Asn Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
530 535 540
<210> 150
<211> 515
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> ABII405
<400> 150
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val His Ser Gly Pro Thr Phe Arg Thr Asp
20 25 30
Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Val Thr Trp Asn Ser Gly Arg Ile Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala His Arg Phe Val Val Gly Gly Asn Arg Val Glu Asp Trp Arg
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Leu
130 135 140
Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Val Arg
145 150 155 160
Thr Phe Ser Ile Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
165 170 175
Glu Arg Glu Phe Val Ala Gly Ile Asn Arg Ser Gly Asp Val Thr Lys
180 185 190
Tyr Ala Asp Phe Val Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ala
195 200 205
Lys Asn Met Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr
210 215 220
Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Ala Thr Trp Ala Tyr Asp Thr Val Gly Ala
225 230 235 240
Leu Thr Ser Gly Tyr Asn Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
245 250 255
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu
260 265 270
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
275 280 285
Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Asn Asn Tyr Asn Met Gly Trp Phe
290 295 300
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val Ala Ala Val Ser Arg
305 310 315 320
Ser Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
325 330 335
Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser
340 345 350
Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Tyr Arg
355 360 365
Gly Thr Ala Ile Asn Val Arg Arg Ser Tyr Ser Ser Trp Gly Gln Gly
370 375 380
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
385 390 395 400
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
405 410 415
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
420 425 430
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
435 440 445
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
450 455 460
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
465 470 475 480
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
485 490 495
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
500 505 510
Val Ser Ser
515
<210> 151
<211> 512
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> ABII406
<400> 151
Glu Val Gln Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Lys Ile Thr His Tyr
20 25 30
Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ser Arg Ile Thr Trp Gly Gly Asp Asn Thr Phe Tyr Ser Asn Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Asp Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Ser Thr Ser Thr Ala Thr Pro Leu Arg Val Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
130 135 140
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val His Ser Gly Pro Thr Phe
145 150 155 160
Arg Thr Asp Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg
165 170 175
Glu Phe Val Ala Ala Val Thr Trp Asn Ser Gly Arg Ile Asn Tyr Ala
180 185 190
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
195 200 205
Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val
210 215 220
Tyr Tyr Cys Ala Ala His Arg Phe Val Val Gly Gly Asn Arg Val Glu
225 230 235 240
Asp Trp Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly
245 250 255
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly
260 265 270
Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
275 280 285
Ser Gly Arg Thr Phe Asn Asn Tyr Asn Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala
290 295 300
Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val Ala Ala Val Ser Arg Ser Gly Val
305 310 315 320
Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
325 330 335
Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro
340 345 350
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Tyr Arg Gly Thr Ala
355 360 365
Ile Asn Val Arg Arg Ser Tyr Ser Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
370 375 380
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln
385 390 395 400
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg
405 410 415
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser
420 425 430
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile
435 440 445
Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
450 455 460
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met
465 470 475 480
Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly
485 490 495
Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
500 505 510
<210> 152
<211> 538
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> ABII407
<400> 152
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val His Ser Gly Pro Thr Phe Arg Thr Asp
20 25 30
Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Val Thr Trp Asn Ser Gly Arg Ile Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala His Arg Phe Val Val Gly Gly Asn Arg Val Glu Asp Trp Arg
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
145 150 155 160
Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
165 170 175
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Asn Asn Tyr Asn
180 185 190
Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val Ala
195 200 205
Ala Val Ser Arg Ser Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
210 215 220
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
225 230 235 240
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
245 250 255
Ala Ala Tyr Arg Gly Thr Ala Ile Asn Val Arg Arg Ser Tyr Ser Ser
260 265 270
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
275 280 285
Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Leu Val
290 295 300
Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Lys
305 310 315 320
Ile Thr His Tyr Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu
325 330 335
Arg Glu Phe Val Ser Arg Ile Thr Trp Gly Gly Asp Asn Thr Phe Tyr
340 345 350
Ser Asn Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys
355 360 365
Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala
370 375 380
Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Ser Thr Ser Thr Ala Thr Pro Leu Arg
385 390 395 400
Val Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
405 410 415
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly
420 425 430
Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
435 440 445
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro
450 455 460
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp
465 470 475 480
Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
485 490 495
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515 520 525
Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
530 535
<210> 153
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> JH5
<400> 153
Asn Trp Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10 15
Claims (32)
- A-베타의 제1 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 A-베타의 제2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩타이드(여기서, A-베타의 상기 제1 에피토프 및 제2 에피토프는 동일한 에피토프들이 아니다).
- 제1항에 있어서, 상기 제1 및 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인들 각각이 필수적으로 4개의 골격 영역(각각 FR1 내지 FR4) 및 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1 내지 CDR3)으로 이루어지고, 여기서 상기 제1 및 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인들은 링커 펩타이드에 의해 공유결합으로 연결되고(covalently linked), 여기서 상기 링커 펩타이드는 임의로 제3 면역글로불린 도메인을 포함하거나 제3 면역글로불린 도메인으로 이루어진, 폴리펩타이드.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제1 및 상기 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인들이 항체 도메인들, 바람직하게는 VHH 도메인들, 보다 바람직하게는 사람화된 VHH 도메인들인, 폴리펩타이드.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, A-베타의 상기 제1 에피토프가 서열번호 3에 의해 정의된 에피토프이고 A-베타의 상기 제2 에피토프가 서열번호 4에 의해 정의된 에피토프이거나, 여기서 A-베타의 상기 제1 에피토프가 서열번호 4에 의해 정의된 에피토프이고 A-베타의 상기 제2 에피토프가 서열번호 3에 의해 정의된 에피토프인, 폴리펩타이드.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 사람 A-베타 펩타이드(서열번호 1)의 적어도 아미노산 1번(아스파르테이트), 3번(글루타메이트), 19번(페닐알라닌), 20번(페닐알라닌) 및 23번(아스파르테이트)에 대한 접촉부들을 형성하는, 폴리펩타이드.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, TR-FRET 결합 검사(경쟁자들로서 ABII002 = 서열번호 62 및 ABII050 = 서열번호 100을 사용함)로 측정시 IC50값이 10-9몰/리터 이하의 범위, 바람직하게는 5 x 10-10 몰/리터 내지 10-12 몰/리터의 범위인, 폴리펩타이드.
- 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 2개의 A-베타 결합 면역글로불린 단일 가변 도메인들을 포함하고, 상기 면역글로불린 단일 가변 도메인들이 각각
FR(1)1 - CDR(1)1 - FR(1)2 - CDR(1)2 - FR(1)3 - CDR(1)3 - FR(1)4, 및
FR(2)1 - CDR(2)1 - FR(2)2 - CDR(2)2 - FR(2)3 - CDR(2)3 - FR(2)4의 구조를 갖고, 여기서,
CDR(1)3은,
- 서열번호 13 및 서열번호 16에 따른 아미노산 서열들; 및
- 서열번호 13 또는 서열번호 16에 따른 상기 아미노산 서열들과 비교하여, 각각 3개 이하, 바람직하게는 2개 이하, 보다 바람직하게는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열들로 이루어진 그룹으로부터 선택되고,
CDR(2)3은,
- 서열번호 19에 따른 아미노산 서열; 및
- 서열번호 19에 따른 상기 아미노산 서열과 비교하여, 3개 이하, 바람직하게는 2개 이하, 보다 바람직하게는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열들로 이루어진 그룹으로부터 선택되거나,
여기서,
CDR(1)3은,
- 서열번호 19에 따른 아미노산 서열; 및
- 서열번호 19에 따른 아미노산 서열과 비교하여, 3개 이하, 바람직하게는 2개 이하, 보다 바람직하게는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열들로 이루어진 그룹으로부터 선택되고,
여기서,
CDR(2)3은,
- 서열번호 13 및 서열번호 16에 따른 아미노산 서열들; 및
- 서열번호 13 또는 서열번호 16에 따른 상기 아미노산 서열들과 비교하여, 각각 3개 이하, 바람직하게는 2개 이하, 보다 바람직하게는 1개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 폴리펩타이드. - 제2항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 면역글로불린 가변 도메인의 CDR 서열들(CDR(1) 서열들) 및 상기 제2 면역글로불린 가변 도메인의 CDR 서열들(CDR(2) 서열들)이,
- CDR(1)1: 서열번호 11
- CDR(1)2: 서열번호 12
- CDR(1)3: 서열번호 13
- CDR(2)1: 서열번호 17
- CDR(2)2: 서열번호 18
- CDR(2)3: 서열번호 19
또는
- CDR(1)1: 서열번호 14
- CDR(1)2: 서열번호 15
- CDR(1)3: 서열번호 16
- CDR(2)1: 서열번호 17
- CDR(2)2: 서열번호 18
- CDR(2)3: 서열번호 19
또는
- CDR(1)1: 서열번호 17
- CDR(1)2: 서열번호 18
- CDR(1)3: 서열번호 19
- CDR(2)1: 서열번호 11
- CDR(2)2: 서열번호 12
- CDR(2)3: 서열번호 13
또는
- CDR(1)1: 서열번호 17
- CDR(1)2: 서열번호 18
- CDR(1)3: 서열번호 19
- CDR(2)1: 서열번호 14
- CDR(2)2: 서열번호 15
- CDR(2)3: 서열번호 16으로 정의되는, 폴리펩타이드. - 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하고, 여기서, 상기 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인이 VHH 도메인 ABII035(서열번호 44)이고, 상기 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인이 VHH 도메인 ABII059(서열번호 45)이거나, 여기서, 상기 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인이 VHH 도메인 ABII059(서열번호 45)이고, 상기 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인이 VHH 도메인 ABII035(서열번호 44)인, 폴리펩타이드.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 반감기 연장 모이어티(moiety)를 추가로 포함하는, 폴리펩타이드.
- 제10항에 있어서, 상기 반감기 연장 모이어티가 상기 폴리펩타이드에 공유결합으로 연결되고, 상기 반감기 연장 모이어티가, 항-알부민 면역글로불린 도메인과 같은 알부민 결합 모이어티, 항-트랜스페린 면역글로불린 도메인과 같은 트랜스페린 결합 모이어티, 폴리에틸렌 글리콜 분자, 재조합 폴리에틸렌 글리콜 분자, 사람 혈청 알부민, 사람 혈청 알부민의 단편 및 알부민 결합 펩타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 폴리펩타이드.
- 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 서열번호 26 내지 32, 34 내지 43, 142, 143, 및 145 내지 152를 갖는 폴리펩타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 폴리펩타이드.
- 4개의 골격 영역(각각 FR1 내지 FR4) 및 3개의 상보성 결정 영역(각각 CDR1 내지 CDR3)으로 필수적으로 이루어진 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하거나 상기 도메인으로 이루어진 폴리펩타이드로서, 여기서, 상기 CDR 서열들이,
- CDR1: 서열번호 11
- CDR2: 서열번호 12
- CDR3: 서열번호 13
또는
- CDR1: 서열번호 14
- CDR2: 서열번호 15
- CDR3: 서열번호 16
또는
- CDR1: 서열번호 17
- CDR2: 서열번호 18
- CDR3: 서열번호 19로서 정의되는, 폴리펩타이드. - 서열번호 47 내지 111로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VHH 도메인을 포함하거나 상기 도메인으로 이루어진, 폴리펩타이드.
- 제13항 또는 제14항에 있어서, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 바이파라토픽 A-베타 결합 폴리펩타이드의 작제에 사용하기 위한, 폴리펩타이드.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는 영역을 포함하는, 바람직하게는 분리된 형태의, 핵산 분자.
- 제16항에 따른 핵산 분자를 포함하는, 발현 벡터.
- 제17항에 따른 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포로서, 상기 숙주 세포가 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드를 발현할 수 있고, 여기서 상기 숙주 세포가 원핵 세포 또는 진핵 세포인, 숙주 세포.
- (i) 활성 성분으로서, 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 폴리펩타이드 및 (ii) 약제학적으로 허용되는 담체, 및 임의로 (iii) 희석제, 부형제, 보조제 및/또는 안정화제를 포함하는, 약제학적 조성물.
- - 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드의 발현을 허용하는 조건 하에서 제18항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계;
- 상기 폴리펩타이드를 회수하는 단계; 및
- 상기 폴리펩타이드를 정제하는 단계
를 포함하는, 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드를 제조하는 방법. - 사람의 질환, 장애 또는 병태의 치료, 예방 또는 완화용 약물로서 사용하기 위한 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드 또는 제19항에 따른 약제학적 조성물.
- 신경퇴행성 질환 또는 장애, 알츠하이머 질환, 알츠하이머 유형의 치매, 건성 AMD, 녹내장, 대뇌 아밀로이드 혈관병증(CAA), 삼체성 21(trisomy 21)(다운 증후군), 성인 다운 증후군, 네덜란드형의 아밀로이드증을 갖는 유전성 대뇌 출혈(HCHWA-D), 루이체(Lewy Body)를 갖는 치매, 이마관자엽 변성(frontotemporal lobar degeneration), 녹내장, 근위축성 측색 경화증, 산발성 봉입체 근염(sporadic inclusion body myositis) 및 노인의 불안 장애로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 사람의 질환, 장애 또는 병태의 치료학적 치료, 예방 또는 완화용 약물로서 사용하기 위한, 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드 또는 제19항에 따른 약제학적 조성물.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드 또는 제19항에 따른 약제학적 조성물로서,
이를 필요로 하는 사람에 대한 정맥내 또는 피하 주사에 의한 투여용으로 제조된, 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드 또는 제19항에 따른 약제학적 조성물. - A-베타 침착과 관련된 질환 또는 장애를 예방하고/하거나 치료하기 위한 방법으로서,
A-베타 침착과 관련된 질환 또는 장애를 예방하고/하거나 치료하는 것을 필요로 하는 피검체에게 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 폴리펩타이드 또는 제19항에 따른 약제학적 조성물을 약제학적 활성량으로 투여함을 포함하는, A-베타 침착과 관련된 질환 또는 장애를 예방하고/하거나 치료하기 위한 방법. - ELND-005, 카프로스피놀, NRM-8499, PBT-2, 포시펜, EHT-0202, CTS-21166, 세마가세스트, BMS-708163, BMS-299897, BMS-433796, ELND-006, ELN-475516, ELN-318463, ELN-475513, 베가세스타트, E-2012, CHF-5074, 디메볼린, 및 PF-4494700으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 치료제와의 병용 투여용으로 제조된, 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드 또는 제19항에 따른 약제학적 조성물.
- 필요로 하는 환자에 대한 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드 또는 제19항에 따른 약제학적 조성물과의 병용 투여용으로 제조된 ELND-005, 카프로스피놀, NRM-8499, PBT-2, 포시펜, EHT-0202, CTS-21166, 세마가세스트, BMS-708163, BMS-299897, BMS-433796, ELND-006, ELN-475516, ELN-318463, ELN-475513, 베가세스타트, E-2012, CHF-5074, 디메볼린, 및 PF-4494700으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 치료제.
- (i) 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 폴리펩타이드, 및 (ii) ELND-005, 카프로스피놀, NRM-8499, PBT-2, 포시펜, EHT-0202, CTS-21166, 세마가세스트, BMS-708163, BMS-299897, BMS-433796, ELND-006, ELN-475516, ELN-318463, ELN-475513, 베가세스타트, E-2012, CHF-5074, 디메볼린, 및 PF-4494700로 이루어진 그룹으로부터 바람직하게 선택되는 하나 이상의 추가의 치료제, 및 (iii) 약제학적으로 허용되는 담체, 및 임의로 (iv) 희석제, 부형제, 보조제 및/또는 안정화제를 포함하는, 약제학적 조성물.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 체액 중의 A-베타 수준을 감소시키기 위한, 바람직하게는 혈중 가용성 A-베타의 수준을 감소시키기 위한, 폴리펩타이드.
- 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩타이드로서, 여기서, 상기 제1 면역글로불린 가변 도메인의 CDR 서열들(CDR(1) 서열들) 및 상기 제2 면역글로불린 가변 도메인의 CDR 서열들(CDR(2) 서열들)이,
- CDR(1)1: 서열번호 11
- CDR(1)2: 서열번호 12
- CDR(1)3: 서열번호 13
- CDR(2)1: 서열번호 17
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또는
- CDR(1)1: 서열번호 14
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- CDR(2)1: 서열번호 14
- CDR(2)2: 서열번호 15
- CDR(2)3: 서열번호 16으로 정의되는, 폴리펩타이드. - 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩타이드로서, 여기서, 상기 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인이 VHH 도메인 ABII035(서열번호 44)이고, 상기 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인이 VHH 도메인 ABII059(서열번호 45)이거나, 여기서, 상기 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인이 VHH 도메인 ABII059(서열번호 45)이고, 상기 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인이 VHH 도메인 ABII035(서열번호 44)인, 폴리펩타이드.
- 제29항 또는 제30항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 반감기 연장 모이어티를 추가로 포함하고, 상기 반감기 연장 모이어티가 항-알부민 면역글로불린 도메인과 같은 알부민 결합 모이어티, 항-트랜스페린 면역글로불린 도메인과 같은 트랜스페린 결합 모이어티, 폴리에틸렌 글리콜 분자, 재조합 폴리에틸렌 글리콜 분자, 사람 혈청 알부민, 사람 혈청 알부민의 단편 및 알부민 결합 펩타이드로 이루어진 그룹으로부터 바람직하게 선택되는, 폴리펩타이드.
- 서열번호 26 내지 32, 34 내지 43, 142, 143, 및 145 내지 152 중 어느 하나를 갖는 폴리펩타이드들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 폴리펩타이드.
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| BR122018009619B1 (pt) | 2014-05-16 | 2024-01-02 | Ablynx N.V | Domínios variáveis de imunoglobulina aperfeiçoados |
| CA2966397A1 (en) * | 2014-11-03 | 2016-05-12 | Merck Patent Gmbh | Methods for generating bispecific shark variable antibody domains and use thereof |
| US20170335324A1 (en) | 2014-11-12 | 2017-11-23 | The General Hospital Corporation | Methods for treating neurodegenerative diseases |
| CN104558172A (zh) * | 2015-01-04 | 2015-04-29 | 东南大学 | 一种针对β淀粉样蛋白的单域重链纳米抗体及其应用 |
| CA2974720A1 (en) | 2015-02-06 | 2016-08-11 | University Of Maryland, Baltimore | Tetra-specific, octameric binding agents and antibodies against clostridium difficile toxin a and toxin b for treatment of c. difficile infection |
| CN107531750B (zh) * | 2015-04-28 | 2021-03-16 | 深圳翰宇药业股份有限公司 | 多肽混合物高效液相色谱分析方法 |
| SI3383425T1 (sl) | 2015-12-04 | 2020-11-30 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Biparatopični polipeptidi, ki antagonizirajo WNT-signaliziranje v tumorskih celicah |
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| AR114269A1 (es) * | 2018-02-26 | 2020-08-12 | Ablynx Nv | Secuencias nucleotídicas mejoradas que codifican para péptidos de unión |
| US20210190796A1 (en) * | 2018-08-17 | 2021-06-24 | Ab Studio Inc. | Catabodies and methods of use thereof |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK1087013T3 (da) | 1992-08-21 | 2009-05-11 | Univ Bruxelles | Immunoglobuliner uden lette kæder |
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| US6329516B1 (en) | 1997-04-28 | 2001-12-11 | Fmc Corporation | Lepidopteran GABA-gated chloride channels |
| US7964192B1 (en) | 1997-12-02 | 2011-06-21 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Prevention and treatment of amyloidgenic disease |
| TWI239847B (en) | 1997-12-02 | 2005-09-21 | Elan Pharm Inc | N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease |
| CA2405709A1 (en) | 2000-04-12 | 2001-10-25 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| CA2441903C (en) | 2000-05-26 | 2012-07-31 | National Research Council Of Canada | Single-domain brain-targeting antibody fragments derived from llama antibodies |
| PE20020574A1 (es) | 2000-12-06 | 2002-07-02 | Wyeth Corp | Anticuerpos humanizados que reconocen el peptido amiloideo beta |
| EP1399484B1 (en) | 2001-06-28 | 2010-08-11 | Domantis Limited | Dual-specific ligand and its use |
| JP4123856B2 (ja) | 2001-07-31 | 2008-07-23 | 日油株式会社 | 生体関連物質の修飾剤およびポリオキシアルキレン誘導体の製造方法 |
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| AR038568A1 (es) | 2002-02-20 | 2005-01-19 | Hoffmann La Roche | Anticuerpos anti-a beta y su uso |
| MY139983A (en) | 2002-03-12 | 2009-11-30 | Janssen Alzheimer Immunotherap | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide |
| FR2846667B1 (fr) | 2002-11-06 | 2004-12-31 | Pasteur Institut | Fragments variables d'anticorps de camelides a chaine unique diriges contre le peptide beta-amyloide 1-42 et leurs applications pour le diagnostic et le traitement des maladies neuroagregatives |
| EP2267032A3 (en) | 2002-11-08 | 2011-11-09 | Ablynx N.V. | Method of administering therapeutic polypeptides, and polypeptides therefor |
| WO2004041865A2 (en) | 2002-11-08 | 2004-05-21 | Ablynx N.V. | Stabilized single domain antibodies |
| KR101025143B1 (ko) | 2002-12-31 | 2011-04-01 | 넥타르 테라퓨틱스 | 가수분해상으로 안정한 말레이미드－종결 중합체 |
| CN101412759A (zh) * | 2003-01-10 | 2009-04-22 | 埃博灵克斯股份有限公司 | 治疗性多肽,其同源物、其片段及其在调节血小板介导的聚集方面的应用 |
| PE20050627A1 (es) | 2003-05-30 | 2005-08-10 | Wyeth Corp | Anticuerpos humanizados que reconocen el peptido beta amiloideo |
| PL1639011T3 (pl) | 2003-06-30 | 2009-05-29 | Domantis Ltd | Pegilowane przeciwciała jednodomenowe (dAb) |
| DK1687338T3 (da) | 2003-11-07 | 2011-02-07 | Ablynx Nv | Camelidae enkeltdomæne-antistoffer VHH, der er rettet mod epidermal vækstfaktor-receptor og anvendelser deraf |
| PL2336147T3 (pl) | 2003-12-17 | 2015-01-30 | Janssen Alzheimer Immunotherap | Immunogenne koniugaty A beta z nośnikiem peptydowym i sposoby ich otrzymywania |
| AU2005293752A1 (en) * | 2004-10-13 | 2006-04-20 | Ablynx N.V. | Single domain camelide anti-amyloid beta antibodies and polypeptides comprising the same for the treatment and diagnosis of degenarative neural diseases such as Alzheimer's disease |
| CN101076543A (zh) * | 2004-10-13 | 2007-11-21 | 阿布林克斯公司 | 用于治疗和诊断变性神经疾病如阿尔茨海默症的单结构域骆驼抗淀粉样蛋白β的抗体以及包含它的多肽 |
| WO2006066089A1 (en) | 2004-12-15 | 2006-06-22 | Neuralab Limited | Humanized amyloid beta antibodies for use in improving cognition |
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| PE20061401A1 (es) | 2004-12-15 | 2006-12-23 | Neuralab Ltd | ANTICUERPOS Aß PARA MEJORAR LA COGNICION |
| US7906625B2 (en) | 2005-01-24 | 2011-03-15 | Amgen Inc. | Humanized anti-amyloid antibody |
| GT200600031A (es) | 2005-01-28 | 2006-08-29 | Formulacion anticuerpo anti a beta | |
| MY148086A (en) | 2005-04-29 | 2013-02-28 | Rinat Neuroscience Corp | Antibodies directed against amyloid-beta peptide and methods using same |
| EP1888640B1 (en) | 2005-05-18 | 2012-03-14 | Ablynx N.V. | Improved nanobodies against tumor necrosis factor-alpha |
| PL3415535T3 (pl) * | 2005-05-20 | 2021-06-14 | Ablynx N.V. | Ulepszone Nanociała TM do leczenia zaburzeń, w których pośredniczy agregacja |
| AU2006283532B2 (en) * | 2005-08-19 | 2012-04-26 | Abbvie Inc. | Dual variable domain immunoglobin and uses thereof |
| US7612181B2 (en) | 2005-08-19 | 2009-11-03 | Abbott Laboratories | Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof |
| JP2009508521A (ja) | 2005-09-23 | 2009-03-05 | アカデミッシュ ジーケンハイス レイデン | タンパク凝集に関連する疾患の診断予防及び治療のためのｖｈｈ |
| PE20100684A1 (es) | 2005-12-12 | 2010-10-04 | Hoffmann La Roche | Anticuerpo anti b-4-amiloide que contiene asparagina glicosilada en la region variable de vh |
| RU2015111675A (ru) | 2005-12-12 | 2015-08-10 | Ац Иммуне Са | Специфические в отношении амилоида бета (а бета) 1-42 моноклональные антитела, обладающие терапевтическими свойствами |
| CN103539857A (zh) | 2006-03-30 | 2014-01-29 | 葛兰素集团有限公司 | 针对β-淀粉样蛋白肽的抗体 |
| AR062065A1 (es) | 2006-07-14 | 2008-10-15 | Ac Immune Sa | Anticuerpo humanizado |
| WO2008020079A1 (en) | 2006-08-18 | 2008-02-21 | Ablynx N.V. | Amino acid sequences directed against il-6r and polypeptides comprising the same for the treatment of deseases and disorders associated with il-6-mediated signalling |
| JP2010511397A (ja) | 2006-12-05 | 2010-04-15 | アブリンクス エン．ヴェー． | 血清タンパク質と結合可能なペプチド |
| CA2671968A1 (en) | 2006-12-11 | 2008-06-19 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Abeta antibody parenteral formulation |
| WO2008071447A2 (en) * | 2006-12-15 | 2008-06-19 | Ablynx N.V. | Amino acid sequences that modulate the interaction between cells of the immune system |
| LT2842967T (lt) | 2007-01-18 | 2017-02-27 | Eli Lilly And Company | Beta amiloido pegilintas fab |
| EP1978035A1 (en) | 2007-04-05 | 2008-10-08 | Hans-Knöll-Institut Leibniz-Institut für Naturstoff-Forschung | Anti-amyloid antibodies and their use in diagnosis and therapy of amyloid diseases |
| MX2009012650A (es) | 2007-05-24 | 2010-02-18 | Ablynx Nv | Secuencias de aminoacido dirigidas contra rank-l y polipeptidos que comprenden lo mismo para el tratamiento de enfermedades y trastornos de huesos. |
| PE20090329A1 (es) | 2007-05-30 | 2009-03-27 | Abbott Lab | Anticuerpos humanizados contra el globulomero ab(20-42) y sus usos |
| MX2009013505A (es) | 2007-06-12 | 2010-01-27 | Ac Immune Sa | Anticuerpos humanizados para amiloide beta. |
| KR20160017126A (ko) | 2007-06-12 | 2016-02-15 | 에이씨 이뮨 에스.에이. | 모노클로널 항 베타 아밀로이드 항체 |
| EP2008666A1 (en) * | 2007-06-29 | 2008-12-31 | Institut Pasteur | Use of VHH antibodies for the preparation of peptide vectors for delivering a substance of interest and their applications |
| EP2009445A1 (en) | 2007-06-29 | 2008-12-31 | Institut Pasteur | Use of a camelid single-domain antibody for detecting an oligomeric form of an amyloid beta peptide and its applications |
| JO3076B1 (ar) | 2007-10-17 | 2017-03-15 | Janssen Alzheimer Immunotherap | نظم العلاج المناعي المعتمد على حالة apoe |
| EA201070539A1 (ru) | 2007-10-29 | 2010-10-29 | Энсэрм (Энститю Насьональ Де Ля Санте Э Де Ля Решерш Медикаль) | НОВЫЕ АНТИТЕЛА, СПЕЦИФИЧНЫЕ К β-АМИЛОИДНЫМ ПЕПТИДАМ, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В КАЧЕСТВЕ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ИЛИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ |
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