JP2023531822A - タウ結合分子 - Google Patents

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Abstract

本発明は、ヒトタウ２Ｎ４Ｒからのエピトープを含む単離組み換えペプチドに関する。本発明はまた、ヒトタウ２Ｎ４Ｒからのエピトープを含む単離組み換えペプチドに特異的な抗体、及びアルツハイマー病などのタウオパチーの調査、診断及び治療に使用するためのこのような抗体に関する。

Description

発明の分野
本発明は、新規なタウエピトープに特異的に結合することが可能な、結合分子、例えば抗体に関する。本発明は、タウオパチーの治療又は診断に使用するための、抗タウ結合分子、例えば抗体、及びその組成物に関する。本発明はさらに、抗タウ結合分子、例えば、抗体を投与することを含む、タウオパチーを治療する方法に関する。
発明の背景
微小管結合タンパク質（ＭＡＰ）タウは、アルツハイマー病（ＡＤ）及び関連するタウオパチーの発症において重大な役割を果たす。タウ病変の発生は、進行するニューロンの損失及び認知低下に関連する。アルツハイマー病（ＡＤ）を含む、タウに関わる認知症の患者において、タウ病変は、予測可能な空間的順序で脳に広がり、これは、疾病負荷と相関する。最近のエビデンスは、神経原線維病変のニューロン間の伝播及び異なる脳領域にわたるタウ毒性の広がりにおける細胞外タウ種の関与を示唆している。タウ伝播の根底にある機構は、十分に特徴付けられていないが、シナプス性及び非シナプス性機構を介した、認知低下及びタウ病変の広がりの両方における細胞外タウの役割を示唆している。
タウタンパク質は、単一遺伝子、ＭＡＰＴ（微小管結合タンパク質タウ）から選択的スプライシングによって産生され；ヒトにおいて、ＭＡＰＴ遺伝子は、染色体１７ｑ２１上に位置する。タウタンパク質は、中枢神経系のニューロン中に多くあり、ＣＮＳ星状膠細胞及び乏突起膠細胞中でも、非常に低いレベルで発現される。ニューロン内で、タウは、主に、高溶解性リンタンパク質として軸索中に見られる。タウは、翻訳後に修飾され、生理学的及び病態生理学的結果の両方を有する。タウのアセチル化、ユビキチン化、Ｏ－結合Ｎ－アセチルグルコサミン修飾、メチル化及びリン酸化は全て、タウの機能を調節することが記載されている（Morris et al (2015) Nature Neuroscience 18:1183-1189）。さらに、タウは、凝集体を形成する強化された能力及び／又は神経毒性を有するペプチドを形成するように切断され得る。
微小管結合タンパク質タウ及びその過リン酸化形態は、ＡＤ及び前頭側頭認知症を含むいくつかの認知症の特徴である、細胞内の神経原線維変化の主成分を形成する。このエビデンスは、ＡＤについての仮説の基礎となり、ここで、タウの細胞内蓄積は、微小管分解、樹状脊椎の崩壊、及び軸索の変性；ニューロンと細胞死との間の伝達の機能障害をもたらす。したがって、特にリン酸化形態のタウは、ＡＤ及び他のタウオパチーのための受動及び能動免疫療法の開発のための標的であった。
タウの様々なエピトープを標的とする臨床開発における免疫療法が、Pedersen et al. (2015) Trends Mol Med 21(6):394-402によって要約された。
Figure 2023531822000001
Figure 2023531822000002
表１に列挙される療法に加えて、Janssenは、ｐＴ２１７（ＪＮＪ６３７３３６５７）を特異的に標的とする抗体を進行中であり、UCBは、中間領域タウ配列を標的とする抗体（２Ｎ４Ｒタウのアミノ酸２３５～２４６；ＵＣＢ０１０７）を用いて臨床試験中である（Sandusky-Beltran et al., 2020, Neuropharmacol. 175:108104に概説されている）。Eisaiもまた、微小管結合領域中の配列を標的とする抗体を用いた臨床試験に向けて準備している（アミノ酸２９９～３０３及び３６２～３６６；Ｅ２８１４；Roberts et al., 2020, Acta Neuropathologica Comms 8:13）。
米国特許第９１３９６４３Ｂ２号には、正常なタウタンパク質に結合せず、完全長ヒト２Ｎ４Ｒ（アミノ酸１～４４１）タウ（配列番号２）のアミノ酸残基３７９～４０８内のエピトープに結合する、ミスフォールドされた及び／又は凝集されたタウタンパク質に特異的な抗体が記載されており、タウタンパク質が完全にリン酸化されることが好ましい。
米国特許第９７７７０５６Ｂ２号には、タウ位３９６及びタウ位４０４にホスホセリン残基を有するアミノ酸残基３７９～４０８内のタウエピトープに対して産生された、タウタンパク質のミスフォールドされた及び／又は凝集体形態に特異的に結合することが可能な抗体が記載されている。
国際公開第２０１０１４４７１１号には、タウ３７９～４０８、その明細書の配列番号５７、及びタウ３７９～３９１、その明細書の配列番号１０２を含む様々な単離タウペプチドによる免疫化によって引き起こされる、正常なタウタンパク質と比べて、病理学的タウタンパク質に優先的に結合することが可能な、組み換えにより産生された抗体が記載されている。
米国特許出願公開第２０１７／０２６０２６３ Ａ１号には、「治療用エピトープ」タウ３６１－ＴＨＶＰＧＧＧ－３６７（その明細書の配列番号１０１）を含むタウペプチドが記載されている。
米国特許出願公開第２００４／０１１０２５０ Ａ１号には、タウ凝集及びＰＨＦタウのアセンブリに重要な領域が記載されている。それは、タウの取り込み、又は治療用抗体に言及していない。タウ１８６～３９１構築物は、細胞内で発現され、細胞内でタンパク質分解的に処理され、得られた切断されたペプチドが、細胞内で検出される。タウの細胞外形態の説明はない。
国際公開第２０１１／０３２１５５ Ａ２号には、タウがカルパインによって切断されるときに生成されるエピトープを標的とし、完全長ヒトタウ４４１タンパク質に結合しないフラグメント特異的抗体が開示されている。
国際公開第２０１８／１７８０７７ Ａ１号には、ヒトタウ４４１タンパク質のアミノ酸残基２９９～３１８を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体が開示されている。
国際公開第２０１４／１５９２４４号には、セリン４００においてＯ－ＧｌｃＮＡｃ化タウアイソフォーム２Ｎ４Ｒに結合するのに特異的な抗体が開示されている。
最近の研究は、脳の細胞外空間に位置する疾患特異的タウ種についての有毒な役割を示唆している。
タウ媒介性シナプス機能障害及びタウ病変の伝播のプロセスを早期に妨げることを意図した新規な治療手法を特定することが必要とされており；したがって、タウタンパク質の細胞外病理学的種において特異的に存在するタウのエピトープを同定し、タウタンパク質の細胞外病理学的種に特異的に結合することによって疾患進行を食い止めようとする治療用抗体を生成することが必要とされている。このようなエピトープ及びそれに結合する分子はまた、タウオパチーの診断に有用であり得る。
発明の記述
本発明は、以下を提供する。
１．ヒト２Ｎ４Ｒ（アミノ酸１～４４１）タウ（配列番号２）のアミノ酸配列３６９～３８１（配列番号１）の残基によって形成されるエピトープに特異的に結合することが可能な、ヒト化抗体又はその抗原結合フラグメント。
２．ヒト２Ｎ４Ｒ（アミノ酸１～４４１）タウ（配列番号２）のアミノ酸配列３７３～３７９（ＴＨＫＬＴＦＲ、配列番号１５０）の残基によって形成されるエピトープに特異的に結合することが可能な、ヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントであって、好ましくは、エピトープが、残基：Ｋ３７５、Ｔ３７７及びＲ３７９を含み、より好ましくは、エピトープが、残基Ｔ３７３、Ｋ３７５、Ｔ３７７及びＲ３７９を含む、項１に記載のヒト化抗体又はその抗原結合フラグメント。
３．ヒトフレームワーク配列（ＦＷ１～ＦＷ４）及びＣＤＲ（それぞれ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＲＤ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）を含む抗原結合部位を含む、ヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントであって、ＨＣＤＲ１が、配列番号２０であり；ＨＣＤＲ２が、配列番号２１又は変異体であり、ここで：アミノ酸５１が、Ｃ、Ｖ及びＡから選択され；アミノ酸５４が、Ｒ、Ａ及びＳから選択され；アミノ酸５５が、Ｒ、Ａ及びＶから選択され；アミノ酸５７が、Ｇ、Ｈ、Ｎ、Ｒ、Ａ及びＳから選択され；ＨＣＤＲ３が、配列番号２２又は変異体であり、ここで：アミノ酸９６が、Ｓ、Ｖ、Ｒ及びＡから選択され；アミノ酸９８が、Ａ、Ｓ、Ｄ、Ｈ及びＴから選択され；アミノ酸１０２が、Ｐ、Ｖ及びＹから選択され；ＬＣＤＲ１が、配列番号２３であり、ＬＣＤＲ２が、配列番号２４であり、ＬＣＤＲ３が、配列番号２５又は配列番号２０７から選択される、項１又は項２に記載のヒト化抗体又はその抗原結合フラグメント。
４．
（ａ）配列番号２０、配列番号２１、配列番号１６４、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５（ＶＨ４＿Ｈ０４）；
（ｂ）配列番号２０、配列番号２１、配列番号１６２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５（ＶＨ４＿Ｈ０２）；
（ｃ）配列番号２０、配列番号１６７、配列番号１６６、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５（ＶＨ４＿Ｈ０６）；
（ｄ）配列番号２０、配列番号２１、配列番号１６１、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５（ＶＨ４＿Ｈ０１）；
（ｅ）配列番号２０、配列番号１６７、配列番号１６４、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５（ＶＨ４＿Ｈ０６＿Ｈ０４）；
（ｆ）配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５（ＶＨ４ＶＫ４）；
（ｇ）配列番号２０、配列番号２１、配列番号１６３、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５（ＶＨ４＿Ｈ０３）
（ｈ）配列番号２０、配列番号２１、配列番号１６５、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５（ＶＨ４＿Ｈ０５）；
（ｉ）配列番号２０、配列番号１６８、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５（ＶＨ４＿Ｈ０７）；
（ｊ）配列番号２０、配列番号１６９、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５（ＶＨ４＿Ｈ０８）；
（ｋ）配列番号２０、配列番号１７０、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５（ＶＨ４＿Ｈ０９）；
（ｌ）配列番号２０、配列番号１７１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５（ＶＨ４＿Ｈ１０）；
（ｍ）配列番号２０、配列番号１７２、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５（ＶＨ４＿Ｈ１１）；
（ｎ）配列番号２０、配列番号１７３、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５（ＶＨ４＿Ｈ１２）；
（ｏ）配列番号２０、配列番号１７４、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５（ＶＨ４＿Ｈ１３）；
（ｐ）配列番号２０、配列番号１７５、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５（ＶＨ４＿Ｈ１４）；
（ｑ）配列番号２０、配列番号１７６、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５（ＶＨ４＿Ｈ１５）；
（ｒ）配列番号２０、配列番号１７７、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５（ＶＨ４＿Ｈ１６）；
（ｓ）配列番号２０、配列番号１７８、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５（ＶＨ４＿Ｈ１７）；
（ｔ）配列番号２０、配列番号１７９、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５（ＶＨ４＿Ｈ１８）；
（ｕ）配列番号２０、配列番号１８０、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５（ＶＨ４＿Ｈ１９）；
（ｖ）配列番号２０、配列番号１８１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５（ＶＨ４＿Ｈ２０）；
（ｗ）配列番号２０、配列番号１６７、配列番号１６１、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５（ＶＨ４Ｈ＿０６＿Ｈ０１）；
（ｘ）配列番号２０、配列番号１６７、配列番号１６２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５（ＶＨ４＿Ｈ０６＿Ｈ０２）；
（ｙ）配列番号２０、配列番号１７７、配列番号１６４、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５（ＶＨ４＿Ｈ１６＿Ｈ０４）；
（ｚ）配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号１８２（ＶＫ４＿Ｌ２）；
（ａａ）配列番号２０、配列番号１６７、配列番号１６６、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号１８２（ＶＨ４＿Ｈ０６／Ｌ２）；
（ｂｂ）配列番号２０、配列番号１６８、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号１８２（ＶＨ４＿Ｈ０７／Ｌ２）；
（ｃｃ）配列番号２０、配列番号１７０、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号１８２（ＶＨ４＿Ｈ０９／Ｌ２）
（ｄｄ）配列番号２０、配列番号１７４、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号１８２（ＶＨ４＿Ｈ１３／Ｌ２）；並びに
（ｅｅ）配列番号２０、配列番号１５、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号１８２（ＶＨ４＿Ｈ１４／Ｌ２）
から選択される、ヒトフレームワーク配列（ＦＷ１～ＦＷ４）及びＣＤＲ（それぞれ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＲＤ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）を含む抗原結合部位を含む、ヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントであって；
配列が、Kabat命名法に従って定義される、いずれかの先行する項に記載のヒト化抗体又はその抗原結合フラグメント。
５．抗原結合部位が、
（ａ）それぞれ、ＶＨ配列番号１８６及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ０４；
（ｂ）それぞれ、ＶＨ配列番号１８４及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ０２；
（ｃ）それぞれ、ＶＨ配列番号１８８及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ０６；
（ｄ）それぞれ、ＶＨ配列番号１８３及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ０１；
（ｅ）それぞれ、ＶＨ配列番号２０５及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ０６＿Ｈ０４；
（ｆ）それぞれ、ＶＨ配列番号１５４及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４ＶＫ４（Ｅ）；
（ｇ）それぞれ、ＶＨ配列番号１８５及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ０３；
（ｈ）それぞれ、ＶＨ配列番号１８７及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ０５；
（ｉ）それぞれ、ＶＨ配列番号１８９及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ０７；
（ｊ）それぞれ、ＶＨ配列番号１９０及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ０８；
（ｋ）それぞれ、ＶＨ配列番号１９１及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ０９；
（ｌ）それぞれ、ＶＨ配列番号１９２及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ１０；
（ｍ）それぞれ、ＶＨ配列番号１９３及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ１１；
（ｎ）それぞれ、ＶＨ配列番号１９４及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ１２；
（ｏ）それぞれ、ＶＨ配列番号１９５及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ１３；
（ｐ）それぞれ、ＶＨ配列番号１９６及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ１４；
（ｑ）それぞれ、ＶＨ配列番号１９７及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ１５；
（ｒ）それぞれ、ＶＨ配列番号１９８及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ１６；
（ｓ）それぞれ、ＶＨ配列番号１９９及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ１７；
（ｔ）それぞれ、ＶＨ配列番号２００及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ１８；
（ｕ）それぞれ、ＶＨ配列番号２０１及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ１９；
（ｖ）それぞれ、ＶＨ配列番号２０２及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ２０；
（ｗ）それぞれ、ＶＨ配列番号２０３及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４Ｈ＿０６＿Ｈ０１；
（ｘ）それぞれ、ＶＨ配列番号２０４及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ０６＿Ｈ０２；
（ｙ）それぞれ、ＶＨ配列番号２０６及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ１６＿Ｈ０４；
（ｚ）それぞれ、ＶＨ配列番号１５４及びＶＬ配列番号２０７のクローンＶＫ４＿Ｌ２；
（ａａ）それぞれ、ＶＨ配列番号１８８及びＶＬ配列番号２０７のクローンＶＨ４＿Ｈ０６／Ｌ２；
（ｂｂ）それぞれ、ＶＨ配列番号１８９及びＶＬ配列番号２０７のクローンＶＨ４＿Ｈ０７／Ｌ２；
（ｃｃ）それぞれ、ＶＨ配列番号１９１及びＶＬ配列番号２０７のクローンＶＨ４＿Ｈ０９／Ｌ２
（ｄｄ）それぞれ、ＶＨ配列番号１９５及びＶＬ配列番号２０７のクローンＶＨ４＿Ｈ１３／Ｌ２；
（ｅｅ）それぞれ、ＶＨ配列番号１９６及びＶＬ配列番号２０７のクローンＶＨ４＿Ｈ１４／Ｌ２；
（ｆｆ）それぞれ、配列番号１５３及び配列番号１５９のクローンＶＨ３ＶＫ３（Ａ）；
（ｇｇ）それぞれ、配列番号１５３及び配列番号１６０のクローンＶＨ３ＶＫ４（Ｂ）；
（ｈｈ）それぞれ、配列番号１５４及び配列番号１５８のクローンＶＨ４ＶＫ２（Ｃ）；並びに
（ｉｉ）それぞれ、配列番号１５４及び配列番号１５９のクローンＶＨ４ＶＫ３（Ｄ）
から選択されるクローンのＶＨ及び／又はＶＬドメイン配列、又はそのようなクローンに対して少なくとも７０、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％の同一性を有するＶＨ及び／又はＶＬドメイン配列を含み；
配列が、Kabat命名法に従って定義される、いずれかの先行する項に記載のヒト化抗体又はその抗原結合フラグメント。
６．抗体が、
（ａ）それぞれ、ＶＨ配列番号１８６及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ０４；
（ｂ）それぞれ、ＶＨ配列番号１８４及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ０２；
（ｃ）それぞれ、ＶＨ配列番号１８８及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ０６；
（ｄ）それぞれ、ＶＨ配列番号１８３及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ０１；
（ｅ）それぞれ、ＶＨ配列番号２０５及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ０６＿Ｈ０４；
（ｆ）それぞれ、ＶＨ配列番号１５４及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４ＶＫ４（Ｅ）；
（ｇ）それぞれ、ＶＨ配列番号１８５及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ０３；
（ｈ）それぞれ、ＶＨ配列番号１８７及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ０５；
（ｉ）それぞれ、ＶＨ配列番号１８９及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ０７；
（ｊ）それぞれ、ＶＨ配列番号１９０及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ０８；
（ｋ）それぞれ、ＶＨ配列番号１９１及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ０９；
（ｌ）それぞれ、ＶＨ配列番号１９２及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ１０；
（ｍ）それぞれ、ＶＨ配列番号１９３及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ１１；
（ｎ）それぞれ、ＶＨ配列番号１９４及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ１２；
（ｏ）それぞれ、ＶＨ配列番号１９５及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ１３；
（ｐ）それぞれ、ＶＨ配列番号１９６及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ１４；
（ｑ）それぞれ、ＶＨ配列番号１９７及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ１５；
（ｒ）それぞれ、ＶＨ配列番号１９８及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ１６；
（ｓ）それぞれ、ＶＨ配列番号１９９及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ１７；
（ｔ）それぞれ、ＶＨ配列番号２００及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ１８；
（ｕ）それぞれ、ＶＨ配列番号２０１及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ１９；
（ｖ）それぞれ、ＶＨ配列番号２０２及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ２０；
（ｗ）それぞれ、ＶＨ配列番号２０３及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４Ｈ＿０６＿Ｈ０１；
（ｘ）それぞれ、ＶＨ配列番号２０４及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ０６＿Ｈ０２；
（ｙ）それぞれ、ＶＨ配列番号２０６及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ１６＿Ｈ０４；
（ｚ）それぞれ、ＶＨ配列番号１５４及びＶＬ配列番号２０７のクローンＶＫ４＿Ｌ２；
（ａａ）それぞれ、ＶＨ配列番号１８８及びＶＬ配列番号２０７のクローンＶＨ４＿Ｈ０６／Ｌ２；
（ｂｂ）それぞれ、ＶＨ配列番号１８９及びＶＬ配列番号２０７のクローンＶＨ４＿Ｈ０７／Ｌ２；
（ｃｃ）それぞれ、ＶＨ配列番号１９１及びＶＬ配列番号２０７のクローンＶＨ４＿Ｈ０９／Ｌ２
（ｄｄ）それぞれ、ＶＨ配列番号１９５及びＶＬ配列番号２０７のクローンＶＨ４＿Ｈ１３／Ｌ２；
（ｅｅ）それぞれ、ＶＨ配列番号１９６及びＶＬ配列番号２０７のクローンＶＨ４＿Ｈ１４／Ｌ２；
（ｆｆ）それぞれ、配列番号１５３及び配列番号１５９のクローンＶＨ３ＶＫ３（Ａ）；
（ｇｇ）それぞれ、配列番号１５３及び配列番号１６０のクローンＶＨ３ＶＫ４（Ｂ）；
（ｈｈ）それぞれ、配列番号１５４及び配列番号１５８のクローンＶＨ４ＶＫ２（Ｃ）；並びに
（ｉｉ）それぞれ、配列番号１５４及び配列番号１５９のクローンＶＨ４ＶＫ３（Ｄ）
のＶＨ及び／又はＶＬドメインを含み；
配列が、Kabat命名法に従って定義される、いずれかの先行する項に記載のヒト化抗体又はその抗原結合フラグメント。
７．競合アッセイにおいて評価されるとき、ヒト２Ｎ４Ｒ（アミノ酸１～４４１）タウ（配列番号２）のアミノ酸配列３７３～３７９（ＴＨＫＬＴＦＲ、配列番号１５０）の残基によって形成されるエピトープへの結合について、項１～６のいずれか１つに記載の抗体と競合することが可能な、ヒト化若しくはヒト抗体又はその抗原結合フラグメント。
８．組み換えＤＮＡ又はＲＮＡ配列の発現の産物である、いずれかの先行する項に記載の単離抗体又はその抗原結合フラグメント。
９．項１～８のいずれか１つに記載の単離抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする配列を含む単離組み換えＤＮＡ又はＲＮＡ配列。
１０．ベクターである、項９に記載の単離組み換えＤＮＡ配列。
１１．発現ベクターである、項１０に記載の単離組み換えＤＮＡ配列。
１２．プロモーターの制御下で、項１～８のいずれか１つに記載の抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする、項１０又は１１に記載の単離組み換えＤＮＡ配列。
１３．項８～１２のいずれか１つに記載のＤＮＡ又はＲＮＡ配列を含む宿主細胞。
１４．項１～８のいずれか１つに記載の単離抗体又はその抗原結合フラグメントを発現することが可能な、項１３に記載の宿主細胞。
１５．項１～８のいずれか１つに記載の単離抗体又はその抗原結合フラグメントを作製する方法であって、単離抗体又はその抗原結合フラグメントの発現に好適な条件で、項１３又は１４に記載の宿主細胞を培養することを含む方法。
１６．項１～８のいずれか１つに記載の単離抗体又はその抗原結合フラグメント及び希釈剤、好ましくは、薬学的に許容される希釈剤を含む組成物。
１７．薬剤として使用するための又は診断に使用するための、項１～８のいずれか１つに記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は項１６に記載の組成物。
１８．タウオパチーの予防的若しくは治療的処置に使用するための、又はタウオパチーの予防的若しくは治療的処置のための薬剤の製造のための、項１～８のいずれか１つに記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は項１６に記載の組成物であって、好ましくは、タウオパチーが、アルツハイマー病（散発性及び一遺伝子性家族性形態）、筋萎縮性側索硬化症／／パーキンソン認知症複合、嗜銀顆粒病、β－プロペラタンパク質関連神経変性（ＢＰＡＮ）、英国型アミロイド血管症、脳アミロイド血管症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ボクサー認知症、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化、ダウン症、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、前頭側頭認知症（ＦＴＤ）、１７番染色体に連鎖しパーキンソン症を伴う前頭側頭認知症（ＦＴＤＰ－１７）、前頭側頭葉変性症、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、ハレルフォルデン・スパッツ病、封入体筋炎、多系統萎縮症、筋強直性ジストロフィー、Ｃ型ニーマン・ピック病、神経原線維変化を伴う非グアム島人型運動ニューロン病、パーキンソン病（散発性及び一遺伝子性家族性形態）、ピック病、脳炎後パーキンソン症、原発性年齢関連タウオパチー（ＰＡＲＴ）、プリオンタンパク質脳アミロイド血管症、進行性皮質下グリオーシス、進行性核上まひ（ＰＳＰ）、亜急性硬化性全脳炎、神経原線維変化優位型認知症、球状グリア細胞タウオパチー、グアムのパーキンソン認知症複合、進行性非流暢性失語、多発梗塞性認知症、虚血性脳卒中、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）及び脳卒中から選択される、項１～８のいずれか１つに記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は項１６に記載の組成物。
１９．ヒトミクログリア中のタウ種の食作用を増加させ、及び／又はヒトニューロンによるモノマータウ及び凝集されたタウ種の取り込みを減少させ、及び／又はヒト星状膠細胞によるタウ種の取り込みを促進し、及び／又はヒト星状膠細胞によるタウ種の取り込みを防止し、及び／又はげっ歯類モデルにおける長期増強のタウ媒介性阻害を防止することが可能である、項１～８のいずれか１つに記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は項１６に記載の組成物。
２０．ヒト２Ｎ４Ｒタウ（配列番号２）の残基３６９～３８１（配列番号１）によって形成されるエピトープを含む、好ましくは、ヒト２Ｎ４Ｒ（アミノ酸１～４４１）タウ（配列番号２）のアミノ酸配列３７３～３７９（ＴＨＫＬＴＦＲ、配列番号１５０）の残基によって形成されるエピトープを含むヒトタウタンパク質を同定するのに使用するための、項１～８のいずれか１つに記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は項１６に記載の組成物。
２１．タウオパチーの診断検査に使用するための、項１～８のいずれか１つに記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は項１６に記載の組成物。
２２．項１～８のいずれか１つに記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は項１６に記載の組成物及び前記単離組み換えペプチド結合分子、抗原結合タンパク質又はそのフラグメントを含有する免疫学的（抗原－抗体）複合体を検出することが可能な試薬を含む診断キットであって、任意に、前記単離組み換えペプチド及び／又は結合分子、抗原結合タンパク質若しくはそのフラグメントが、固体担体（例えば、マイクロプレートウェル）上で免疫化され、及び／又は任意に、前記単離組み換えペプチド、結合分子、抗原結合タンパク質又はそのフラグメントを含有する前記免疫学的複合体が、ＥＬＩＳＡ若しくは代替的な免疫測定法によって、又は側方流動によって検出可能である、診断キット。
２３．１つ以上の対照標準及び／又は検体希釈液及び／又は洗浄緩衝液をさらに含む、項２２に記載の診断キット。
詳細な説明
本発明は、ヒトタウ（タウ１～４４１配列番号２）の残基３６９～３８１（ＫＫＩＥＴＨＫＬＴＦＲＥＮ、配列番号１）内で形成されるエピトープを含む単離組み換えペプチドに特異的に結合することが可能な、ヒト化抗体及びその抗原結合フラグメントに関する。本発明はさらに、ヒトタウ（タウ１～４４１配列番号２）の残基３６９～３８１（ＫＫＩＥＴＨＫＬＴＦＲＥＮ、配列番号１）内に含まれるエピトープに特異的なＣＤＲベースの抗原結合部位を含む、ヒト化抗体及び抗原結合フラグメントに関する。
本発明のヒト化抗体及びその抗原結合フラグメントは、ヒトタウ（タウ１～４４１配列番号２）の残基３６９～３８１（ＫＫＩＥＴＨＫＬＴＦＲＥＮ、配列番号１）によって形成されるエピトープを含む細胞外タウ種に特異的に結合する。
本発明のヒト化抗体及びその抗原結合フラグメントは、キャリアタンパク質又は検出可能な標識のコンジュゲーションのためのＮ末端システイン（ＣＫＫＩＥＴＨＫＬＴＦＲＥＮ、配列番号１３）又はＣ末端システインをさらに含む単離組み換えペプチドに特異的に結合することが可能である。Ｎ末端システインを介してコンジュゲートされ得るキャリアタンパク質は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ロコガイ（Concholepas concholepas）ヘモシアニン（「Blue Carrier」）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カチオン化ＢＳＡ（ｃＢＳＡ）及びオボアルブミン（ＯＶＡ）から選択され得る。本発明のヒト化抗体及びその抗原結合フラグメントは、ＫＫＩＥＴＨＫＬＴＦＲＥＮ、配列番号１を含むコンジュゲートに特異的に結合することが可能である。
本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、組み換え手段によって産生され得る。「組み換え抗体」は、組み換え操作された宿主細胞によって産生された抗体である。本発明に係る抗体又はその抗原結合フラグメントは、任意に、単離又は精製される。
「抗体」又は「抗体分子」という用語は、天然の又は部分的に若しくは完全に合成により産生された免疫グロブリンを表す。本発明の抗原結合タンパク質は、抗体、好ましくは、モノクローナル抗体であり得、ヒト又は非ヒト、キメラ又はヒト化抗体であり得る。
抗体分子は、好ましくは、モノクローナル抗体分子である。抗体の例は、免疫グロブリンアイソタイプ、例えば、免疫グロブリンＧ、及びそれらの同形サブクラス、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４、並びにそのフラグメントである。４つのヒトサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４）がそれぞれ、異なる重鎖を含むが；それらは、高度の相同性を示し、主に、ヒンジ領域及びそれらが宿主免疫系を活性化する程度が異なる。ＩｇＧ１及びＩｇＧ４は、ヒンジ領域における２つの鎖間ジスルフィド結合を含み、ＩｇＧ２は、４つを有し、ＩｇＧ３は、１１の鎖間ジスルフィド結合を有する。
本明細書において使用される際の「抗体」及び「抗体分子」という用語は、抗体フラグメント、例えば、Ｆａｂ及びｓｃＦｖフラグメントを含み、ただし、前記フラグメントは、ヒトタウの残基３６９～３８１を含むエピトープのためのＣＤＲベースの抗原結合部位を含む。抗体フラグメントの例としては、限定はされないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；線形抗体；一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）及びドメイン抗体（ｓｄＡｂ）が挙げられる。したがって、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、本明細書において使用される際の「抗原結合タンパク質」、「抗体」又は「抗体分子」という用語は、「抗体又はその抗原結合フラグメント」に相当する。
抗体は、古典的な「Ｙ」形状を得るように、フレキシブルヒンジ領域によって抗体のステム、Ｆｃドメインに結合された同一のドメインを含む２つのＦａｂアームを形成する２つの重鎖及び２つの軽鎖からなる同じ基本構造を有する免疫グロブリンである。Ｆａｂドメインは、２つの可変及び２つの定常ドメインからなり、重鎖上の可変重鎖（ＶＨ）及び定常重鎖１（ＣＨ１）ドメイン並びに軽鎖上の可変軽鎖（ＶＬ）及び定常軽鎖（ＣＬ）ドメインを有する。２つの可変ドメイン（ＶＨ及びＶＬ）は、可変フラグメント（Ｆｖ）を形成し、これは、抗体のＣＤＲベースの抗原特異性を提供し、定常ドメイン（ＣＨ１及びＶＬ）は、構造的なフレームワークとして作用する。各可変ドメインは、相補性決定領域（ＣＤＲ）として知られている３つの超可変ループを含有する。ＶＨ及びＶＬのそれぞれにおいて、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）は、４つの低可変フレームワーク（ＦＲ）領域（ＦＲ１、ＦＷ２、ＦＷ３及びＦＷ４）によって隣接されて、構造ＦＷ１－ＣＤＲ１－ＦＷ２－ＣＤＲ２－ＦＷ３－ＣＤＲ３－ＦＷ４が得られる。ＣＤＲは、抗体の表面に特定の抗原認識部位を提供する。
Kabat及びImMunoGeneTics（ＩＭＧＴ）番号付け命名法の両方が、本明細書において使用され得る。一般に、特に示されない限り（明示的に又は文脈上）、アミノ酸残基は、Kabat番号付けスキーム（Kabat et al., 1991, J Immunol 147(5): 1709-19）に従って、本明細書において番号付けされる。ＩＭＧＴ番号付けスキームが使用される場合の例では、アミノ酸残基は、Lefranc et al., 2005, Dev Comp Immunol 29(3): 185-203に記載されるImMunoGeneTics（ＩＭＧＴ）番号付けスキームに従って、本明細書において番号付けされる。
モノクローナル及び他の抗体を取り、組み換えＤＮＡ技術の技術を使用して、元の抗体の特性をほぼ保持する他の抗体又はキメラ分子を産生することが可能である。このような技術は、ＣＤＲを、異なる免疫グロブリンフレームワーク中に導入すること、又は可変領域異なる免疫グロブリン定常領域へとグラフトすることを含み得る。１つの免疫グロブリンのＣＤＲを、別の免疫グロブリン中に導入することは、例えば、ＥＰ－Ａ－１８４１８７号、ＧＢ２１８８６３８Ａ号又はＥＰ－Ａ－２３９４００号に記載されている。或いは、ハイブリドーマ又は抗体分子を産生する他の細胞は、産生される抗体の結合特異性を改変しても又は改変しなくてもよい、遺伝子突然変異又は他の変化に供され得る。
抗体ヒト化は、重要な非ヒトアミノ酸の、ヒト抗体フレームワークへの移動、又は「グラフト」を含む。主に、これは、相補性決定領域（ＣＤＲ）におけるアミノ酸のグラフトを含むが、潜在的に、ＶＨ：ＶＬ界面及びＣＤＲの配向のために重要な他のフレームワークアミノ酸も含む。ヒト化は、非ヒト親抗体の元の結合活性を保持しながら、免疫原性のリスクを低下させるために、ヒト内容物（human content）を導入しようとする。「ヒト化抗体」という用語は、別の哺乳動物種の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列へとグラフトされた抗体を指すことが意図され；任意に、さらなるフレームワーク領域修飾が、ヒトフレームワーク配列内で作製され得る。「ヒト化抗体」という用語は、別の哺乳動物種の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列が、ヒトフレームワーク配列へとグラフトされ、例えば、ＣＤＲの１つ以上及び／又は１つ以上のレームワーク配列における１つ以上のアミノ酸残基の修飾によって、（例えば親和性成熟によって）最適化されて、ヒト化抗体の生物学的特性を調節若しくは改善し、例えば、親和性を増加させ、又はその標的エピトープへの抗体の結合についてオンレート（on rate）及び／又はオフレート（off rate）で調節する、抗体を含む。「ヒト化抗体」という用語は、（例えば親和性成熟によって）最適化されたヒト化抗体を含み、したがって、本発明のヒト化抗体は、ヒト化されるか、又はヒト化及び最適化の両方をされていてもよく、例えばヒト化され、親和性成熟されていてもよい。
抗体が、いくつかの方法で修飾され得る際、「抗原結合タンパク質」又は「抗体」という用語は、天然であるか又は完全若しくは部分的に合成であるかにかかわらず、免疫グロブリン結合ドメイン、アプタマー、アフィマー又は二環式ペプチドを含む任意のポリペプチドを含む、抗体の抗体フラグメント、誘導体、機能的同等物及びホモログを包含するものと解釈されるべきである。したがって、別のポリペプチドに融合された、免疫グロブリン結合ドメイン、又は同等物を含むキメラ分子が含まれる。キメラ抗体のクローニング及び発現は、ＥＰ－Ａ－０１２０６９４号及びＥＰ－Ａ－０１２５０２３号に記載されている。
ＣＤＲ配列及びＣＨ３ドメインの両方を含む抗体フラグメントの例は、ＣＨ３ドメインに結合されたｓｃＦｖを含むミニボディである（Hu et al. (1996) Cancer Res 56(13):3055-61）。
ドメイン（単一ドメイン）抗体は、重鎖抗体の、又はＩｇＧの１つの可変ドメイン（ＶＨ）を含む、通常、約１１０アミノ酸長のペプチドである。単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、（例えば、ナノボディ）は、単一モノマー可変抗体ドメインからなる抗体フラグメントである。全抗体（２つの重鎖及び２つの軽鎖を含む）のように、それは、特定の抗原に選択的に結合することが可能な抗原結合タンパク質である。ドメイン抗体は、わずか１２～１５ｋＤａの分子量を有し、したがって、２つの重鎖タンパク質鎖及び２つの軽鎖（１５０～１６０ｋＤａ）から構成される抗体よりはるかに小さく、ドメイン抗体は、Ｆａｂフラグメント（約５０ｋＤａ、１つの軽鎖及び半分の重鎖）並びに一本鎖可変フラグメント（約２５ｋＤａ、２つの可変ドメイン、軽鎖から１つ及び重鎖から１つ）よりさらに小さい。単一ドメイン抗体は、ラクダ科の動物に見られる重鎖抗体から操作されており；これらは、ＶＨＨフラグメントと呼ばれる。軟骨魚類はまた、重鎖抗体（ＩｇＮＡＲ、「免疫グロブリン新抗原受容体」）を有し、それから、ＶＮＡＲフラグメントと呼ばれる単一ドメイン抗体が得られる。ドメイン（単一ドメイン）抗体は、ＶＨ又はＶＬであり得る。ドメイン抗体は、ヒト又はマウス由来のＶＨ又はＶＬであり得る。ほとんどの単一ドメイン抗体が、重鎖可変ドメインであるが、軽鎖単一ドメイン抗体（ＶＬ）も、エピトープを標的とするために特異的に結合することが示されている。
タンパク質足場は、比較的明確な３次元構造を有し、典型的に、抗原に結合することが可能な抗原結合領域を足場内で生成するために、特定の又はランダムなアミノ酸配列変異を起こしやすい１つ以上の領域を含む。
本発明のヒト化抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒトタウの残基３６９～３８１によって形成されるエピトープに結合する。この文脈における結合は、特異的結合を指し得る。「特異的」という用語は、抗体分子が、その特定の結合パートナー、本明細書において、ヒトタウの残基３６９～３８１内のエピトープ以外の分子への有意な結合を示さない状況を指し得る。「特異的」という用語はまた、いくつかの抗原によって保有される（その場合、抗体分子が、エピトープを保有する様々な抗原に結合することが可能である）、ヒトタウの残基３６９～３８１内に含まれるエピトープなどの特定のエピトープに対して、抗体が特異的である場合に該当する。エピトープは、モノマー、オリゴマー又は凝集体であるタウ種中に存在し得る。タウ種は、完全長であるか、又は残基３６９～３８１の外部の領域において切断され得る。エピトープは、ヒトタウ１～４４１（配列番号２）の残基３６９～３８１（配列番号１）を含むタウのフラグメント中に存在し得る。好ましくは、本発明のヒト化抗体及びその抗原結合フラグメントは、それが結合するエピトープが、ヒト２Ｎ４Ｒ（アミノ酸１～４４１）タウ（配列番号２）のアミノ酸配列３７３～３７９（ＴＨＫＬＴＦＲ、配列番号１５０）の残基によって形成されることを特徴とする細胞外タウ種に結合する。
本発明の特に好ましい態様において、本発明のヒト化抗体及びその抗原結合フラグメントは、エピトープが、ヒト２Ｎ４Ｒ（アミノ酸１～４４１）タウ（配列番号２）のアミノ酸配列３７３～３７９（ＴＨＫＬＴＦＲ、配列番号１５０）の残基によって形成及び定義されることを特徴とする細胞外タウ種に結合し、ここで、エピトープは、残基Ｋ３７５、Ｔ３７７及びＲ３７９を含み、好ましくは、残基Ｔ３７３、Ｋ３７５、Ｔ３７７及びＲ３７９（クローン２によって結合されたエピトープ、＃４４及びそのヒト化形態）を含む。
この文脈における結合は、特異的結合を指し得る。「特異的」という用語は、抗体分子が、その特定の結合パートナー、本明細書において、ヒト２Ｎ４Ｒ（アミノ酸１～４４１）タウ（配列番号２のアミノ酸配列３７３～３７９（ＴＨＫＬＴＦＲ、配列番号１５０）の残基によって形成されるエピトープ以外の分子への有意な結合を示さない状況を指し得る。「特異的」という用語はまた、いくつかの抗原によって保有される（その場合、抗体分子が、エピトープを保有する様々な抗原に結合することが可能である）、本明細書に記載される、ヒトタウのアミノ酸配列３７３～３７９の残基によって形成されるエピトープなどの特定のエピトープに対して、抗体分子が特異的である場合に該当する。本明細書に記載される新規なエピトープは、モノマー、オリゴマー又は凝集体であるタウ種中に存在し得る。タウ種は、完全長であるか、又は残基３７３～３７９の外部の領域において切断され得る。エピトープは、ヒトタウ１～４４１（配列番号２）の残基３７３～３７９（配列番号１５０）を含むタウのフラグメント中に存在し得る。
好ましくは、本発明のヒト化抗体及びその抗原結合フラグメントは、それらが結合するエピトープが、ヒト２Ｎ４Ｒ（アミノ酸１～４４１）タウ（配列番号２）のアミノ酸配列３７３～３７９（ＴＨＫＬＴＦＲ、配列番号１５０）の残基によって形成されることを特徴とする細胞外タウ種に結合する。本発明の特に好ましい態様において、ヒト化抗体及びその抗原結合フラグメントは、エピトープが、ヒト２Ｎ４Ｒ（アミノ酸１～４４１）タウ（配列番号２）のアミノ酸配列３７３～３７９（ＴＨＫＬＴＦＲ、配列番号１５０）の残基によって形成されることを特徴とする細胞外タウ種に結合し、ここで、エピトープは、残基：Ｋ３７５、Ｔ３７７及びＲ３７９を含み、好ましくは、残基Ｔ３７３、Ｋ３７５、Ｔ３７７及びＲ３７９（例えば、クローン２、＃４４によって結合されたエピトープ）を含む。
アミノ酸は、それらの一文字若しくは三文字コードによって、又はそれらの正式名称によって称され得る。２０の標準的なアミノ酸のそれぞれの一文字及び三文字コード、並びに正式名称が、以下に記載される。
Figure 2023531822000003
好ましい実施形態において、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、クローン２（＃４４）の６つのＣＤＲ（ＨＣＤＲ１（配列番号２０）、ＨＣＤＲ２（配列番号２１）、ＨＣＤＲ３（配列番号２２）、ＬＣＤＲ１（配列番号２３）、ＬＣＤＲ２（配列番号２４）、及びＬＣＤＲ３（配列番号２５））の組（例えば、Kabat命名法によって定義されるとき、表５に記載されるように）を含み得る。
本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、クローン２のＶＨ及びＶＬ配列（配列番号１１８及び１１９）のヒト化変異体を含み得る。
本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、抗体の機能特性が保持される限り、ＶＨ及び／又はＶＬ配列における１つ以上、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０のさらなるアミノ酸修飾を含み得る。
修飾は、アミノ酸置換、欠失又は挿入であり得る。好ましくは、修飾は、置換である。
１つ以上のアミノ酸が別のアミノ酸で置換される好ましい実施形態において、置換は、例えば、以下の表に記載される保存的置換であり得る。ある実施形態において、真ん中の列における同じカテゴリーのアミノ酸は、互いに置き換えられ、すなわち、非極性アミノ酸は、例えば、別の非極性アミノ酸で置き換えられる。ある実施形態において、最も右側の列の同じ行におけるアミノ酸は、互いに置き換えられる。
Figure 2023531822000004
ある実施形態において、置換は、機能的保存置換であり得る。すなわち、ある実施形態において、置換は、同等の非置換抗体分子と比較して、置換を含む抗体分子の１つ以上の機能特性（例えば、結合親和性）に影響を与えないことがある（又は実質的に影響を与えないことがある）。
好ましい実施形態において、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、本明細書に記載される本発明のＶＨ及び／又はＶＬ配列と比較して、１つ以上のアミノ酸配列改変（アミノ酸残基の付加、欠失、置換及び／又は挿入）、好ましくは、２０以下の改変、１５以下の改変、１０以下の改変、５つ以下の改変、４つ以下の改変、３つ以下の改変、２つ以下の改変、又は１つの改変を有するＶＨ及び／又はＶＬドメイン配列を含み得る。
好ましい実施形態において、本発明のヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１１８に記載されるクローン２のヒト化ＶＨドメイン配列、例えば、配列番号１１８に記載されるクローン２の配列に対する少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するヒト化ＶＨドメインを含み得る。
好ましい実施形態において、本発明のヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１５４のＶＨ４ＶＫ４のヒト化ＶＨドメイン配列、例えば、配列番号１５４のクローンＶＨ４ＶＫ４のＶＨ配列に対する少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するヒト化ＶＨドメインを含み得る。
好ましい実施形態において、本発明のヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントは、例えば、Kabat命名法によって定義されるとき、表５に記載されるように、クローン２のＨＣＤＲの組：ＨＣＤＲ１（配列番号２０）、ＨＣＤＲ２（配列番号２１）、及びＨＣＤＲ３（配列番号２２）を含むＶＨドメインアミノ酸配列を含み、ＶＨドメインは、配列番号１１８に記載されるクローン２の配列に対する少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
好ましい実施形態において、本発明のヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントは、Kabat命名法によって定義されるとき、配列番号１５４のクローンＶＨ４ＶＫ４の、ＨＣＤＲの組：ＨＣＤＲ１（配列番号２０）、ＨＣＤＲ２（配列番号２１）、及びＨＣＤＲ３（配列番号２２）を含むＶＨドメインアミノ酸配列を含み、ＶＨドメインは、配列番号１５４のクローンＶＨ４ＶＫ４の配列に対する少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
好ましい実施形態において、本発明のヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１１９に記載されるクローン２のヒト化ＶＬドメインアミノ酸配列、例えば、配列番号１１９に記載されるクローン２の配列に対する少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するヒト化ＶＬドメインを含み得る。
好ましい実施形態において、本発明のヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１６０のクローンＶＨ４ＶＫ４のヒト化ＶＬドメインアミノ酸配列、例えば、配列番号１６０のＶＨ４ＶＫ４の配列に対する少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するヒト化ＶＬドメインを含み得る。
好ましい実施形態において、本発明のヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントは、例えば、Kabat命名法によって定義されるとき、表５に記載されるように、それぞれ、クローン２のＬＣＤＲの組：ＬＣＤＲ１（配列番号２３）、ＬＣＤＲ２（配列番号２４）及びＬＣＤＲ３（配列番号２５）を含むＶＬドメインを含み、ＶＬドメインは、配列番号１１９に記載されるクローン２の配列に対する少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
好ましい実施形態において、本発明のヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントは、Kabat命名法によって定義されるとき、それぞれ、配列番号１６０のクローンＶＨ４ＶＫ４のＬＣＤＲの組：ＬＣＤＲ１（配列番号２３）、ＬＣＤＲ２（配列番号２４）及びＬＣＤＲ３（配列番号２５）を含むＶＬドメインを含み、ＶＬドメインは、それぞれ、配列番号１６０のクローンＶＨ４ＶＫ４に対する少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
配列同一性は、アルゴリズムGAP（Wisconsin GCG package, Accelerys Inc, San Diego USA）を参照して一般的に定義される。GAPは、Needleman and Wunschアルゴリズムを用いて、マッチの数を最大にし、ギャップの数を最小限に抑えるように、２つの完全な配列をアラインする。一般に、デフォルトパラメータが使用され、ギャップ生成ペナルティは、１２に相当し、ギャップ伸長ペナルティは、４に相当する。GAPの使用が、好ましいことがあるが、他のアルゴリズム、例えばBLAST（Altschul et al. (1990) J. MoI. Biol. 215: 405-410の方法を使用する）、FASTA（Pearson and Lipman (1988) PNAS USA 85: 2444-2448の方法を使用する）、又はSmith-Watermanアルゴリズム（Smith and Waterman (1981) J. MoI Biol. 147: 195-197）、又は一般にデフォルトパラメータを用いる、上記のAltschul et al. (1990)のTBLASTNプログラムが使用され得る。特に、psi-Blastアルゴリズムが、使用され得る（Nucl. Acids Res. (1997) 25 3389-3402）。配列同一性は、Bioedit、ClustalWアルゴリズムを用いて定義され得る。
アラインメントは、Snapgeneを用いて行われ、ＭＵＳＣＬＥ（ログ予想による複数の配列比較（Multiple Sequence Comparison by Log-Expectation））アルゴリズム（Edgar (2004a) Nucleic Acids Res 32:1792-7；Edgar (2004b) BMC Bioinformatics 5:113.）に基づいていた。
抗体は、ＣＨ２ドメインを含み得る。ＣＨ２ドメインは、好ましくは、ヒトＩｇＧ分子における場合のように、ＣＨ３ドメインのＮ末端に位置する。抗体のＣＨ２ドメインは、好ましくは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のＣＨ２ドメイン、より好ましくは、ヒトＩｇＧ１のＣＨ２ドメインである。ヒトＩｇＧドメインの配列は、当該技術分野において公知である。
抗体は、ＣＨ２ドメインのＮ末端に、免疫グロブリンヒンジ領域、又はその部分を含み得る。免疫グロブリンヒンジ領域は、２つのＣＨ２－ＣＨ３ドメイン配列が結合し、二量体を形成するのを可能にする。好ましくは、ヒンジ領域、又はその部分は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４ヒンジ領域、又はその部分である。より好ましくは、ヒンジ領域、又はその部分は、ＩｇＧ１ヒンジ領域、又はその部分である。
ＣＨ３ドメインの配列は、特に限定されない。好ましくは、ＣＨ３ドメインは、ヒト免疫グロブリンＧドメイン、例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４ ＣＨ３ドメイン、最も好ましくは、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインである。
本発明の抗体は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４定常領域を含み得る。ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４ ＣＨ３ドメインの配列は、当該技術分野において公知である。本発明の抗体は、ヒトＩｇＧ定常領域、例えば、ヒトＩｇＧ１定常領域を含み得る。
本発明の抗体は、エフェクター機能を有するヒトＩｇＧ Ｆｃを含み得る。
Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）は、抗体媒介性（液性）免疫応答を、細胞エフェクター機能に結び付ける重要な免疫調節受容体である。ＦｃγＲ（ＩｇＧ）、ＦｃεＲＩ（ＩｇＥ）、ＦｃαＲＩ（ＩｇＡ）、ＦｃμＲ（ＩｇＭ）及びＦｃδＲ（ＩｇＤ）を含む全てのクラスの免疫グロブリンの受容体が、同定されている。白血球に見られるヒトＩｇＧの３つのクラスの受容体がある：ＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）、ＣＤ３２（ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩｃ）及びＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩａ及びＦｃγＲＩＩＩｂ）。ＦｃγＲＩは、高親和性受容体（ナノモル範囲ＫＤ）として分類される一方、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩは、低いないし中間の親和性（マイクロモル範囲ＫＤ）である。
抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）において、エフェクター細胞（ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、単球及び好酸球）の表面のＦｃｖＲが、それ自体が標的細胞に結合されるＩｇＧのＦｃ領域に結合する。結合すると、シグナル伝達経路が誘発され、それが、標的細胞の破壊を媒介する、溶解酵素、パーフォリン、グランザイム及び腫瘍壊死因子などの様々な物質の分泌をもたらす。ＡＤＣＣエフェクター機能のレベルは、ＩｇＧサブタイプで様々である。これは、アロタイプ及び特定のＦｃｖＲに依存するが、簡単に述べると、ＡＤＣＣエフェクター機能は、ヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ３について高く、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４について低い。効力の降順で順位付けられた、エフェクター機能におけるＩｇＧサブタイプの変化については以下を参照されたい。
Figure 2023531822000005
ＦｃγＲは、ヒンジ及び上側ＣＨ２領域にわたって非対称的にＩｇＧに結合する。結合部位の知識は、ＩｇＧエフェクター機能を調節するための技術的な取り組みをもたらした。
本発明の抗体は、エフェクター機能、向上したエフェクター機能又は低下したエフェクター機能を有するＦｃを有し得る。
抗体の効力は、細胞毒性機能、例えば、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）及び抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）を媒介する能力の強化によって増加され得る。Ｆｃ受容体の結合を直接又は間接的に強化し、細胞毒性を有意に強化する、Ｆｃドメイン内のいくつかの突然変異：突然変異Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ（「３Ｍ」）、Ｆ２４３Ｌ又はＧ２３６Ａが同定されている。或いは、エフェクター機能の強化は、Ｆｃドメインのグリコシル化を修飾することによって達成され得、ＦｃγＲは、ＣＨ２ドメインにおける炭水化物と相互作用し、グリカン組成物は、エフェクター機能活性にかなりの効果を与える。脱フコシル化（非フコシル化）抗体は、ＦｃγＲＩＩＩａへの増加した結合によって非常に強化されたＡＤＣＣ活性を示す。
ＡＤＣＣ及びＣＤＣの活性化は、一部の治療用抗体にとって望ましいことがあるが、ある実施形態において、エフェクター機能を活性化しない抗体が好ましい。
エフェクター機能のそれらの欠如のため、ＩｇＧ４抗体は、細胞枯渇を伴わない受容体ブロッキングのための好ましいＩｇＧサブクラスである。しかしながら、ＩｇＧ４分子は、Ｆａｂ－アーム交換と呼ばれる動的プロセスにおいて半分子を交換し得る。この現象は、治療用抗体と内因性ＩｇＧ４との間で起こり得る。Ｓ２２８Ｐ突然変異は、この組み換えプロセスを防いで、Ｆａｂ－アーム交換の低下した傾向を有するＩｇＧ４抗体の設計を可能にすることが示された。
Ｆｃ操作手法が、Ｆｃγ受容体とのＩｇＧ１ Ｆｃドメインの及びＣ１ｑの重要な相互作用部位を決定し、次に、結合を減少させるか又はなくすように、これらの位置を突然変異させるために使用されている。アラニンスキャニングによって、Ｆｃドメインのヒンジ及び上側ＣＨ２をカバーする領域へのＣ１ｑの結合部位を同定した。本発明の抗体又はフラグメントのＣＨ２ドメインは、１つ以上のＦｃγ受容体、例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲｌｌａ、ＦｃγＲｌｌｂ、ＦｃγＲＩＩＩ及び／又は補体へのＣＨ２ドメインの結合を減少させるか又はなくすための１つ以上の突然変異を含み得る。ヒトｌｇＧドメインのＣＨ２ドメインは、通常、Ｆｃγ受容体及び補体に結合し、Ｆｃγ受容体への結合の減少は、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を減少させることが予想され、補体への結合の減少は、抗体分子の補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）活性を減少させることが予想される。１つ以上のＦｃγ受容体及び／又は補体へのＣＨ２ドメインの結合を減少させるか又はなくすための突然変異は、当該技術分野において公知である。本発明の抗体分子は、修飾Ｋ３２２Ａ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ又はＬ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ（「ＴＭ」）を有するＦｃを含んでいてもよく、これは、ＦｃγＲ及びＣ１ｑ結合をほぼ完全になくす。本発明の抗体分子は、ＣＨ２ドメインを含んでいてもよく、ここで、ＣＨ２ドメインは、ＥＵ位置２３４及び２３５（ＩＭＧＴ番号付けによる位置１．３及び１．２）にアラニン残基（「ＬＡＬＡ突然変異」）を含む。さらに、補体活性化及びＡＤＣＣが、例えば、Ｐ３２９Ａ又はＰ３２９Ｇのいずれかへの、Ｐｒｏ３２９（ＥＵ番号付けに従う位置）の突然変異によって減少され得る。本発明の抗体分子は、ＣＨ２ドメインを含んでいてもよく、ここで、ＣＨ２ドメインは、ＥＵ位置２３４及び２３５（ＩＭＧＴ番号付けによる位置１．３及び１．２）にアラニン残基及びＥＵ位置３２９（ＩＭＧＴ番号付けによる位置１１４）にアラニン（ＬＡＬＡ－ＰＡ）又はグリシン（ＬＡＬＡ－ＰＧ）を含む。さらに又は代わりに、本発明の抗体分子は、ＥＵ位置２９７（ＩＭＧＴ番号付けによる位置８４．４）にアラニン、グルタミン又はグリシンを含み得る。
最適なＦｃＲ相互作用に必要であることが知られている、Ｆｃドメインのアスパラギン２９７におけるグリコシル化の修飾は、ＦｃＲへの結合の低下を与え得；ＦｃＲへの結合の低下は、Ｎ２９７点突然変異において観察された。本発明の抗体分子は、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｇ又はＮ２９７Ｑ突然変異を有するＦｃを含み得る。アグリコシルＦｃドメインを有する本発明の抗体分子は、酵素的脱グリコシル化によって、グリコシル化阻害剤の存在下における組み換え発現によって、又は細菌中のＦｃドメインの発現後に得られ得る。
ＩｇＧは、ＦｃＲｎ媒介性リサイクリングにより血清中で長期間にわたって天然に持続して、それに約２１日間の典型的な半減期をもたらす。半減期は、ｐＨ７．４で最小の結合を保持しながら、ｐＨ６．０で親和性を高めるために、ＦｃＲｎとのＦｃドメインのｐＨ依存性相互作用を操作することによって延長され得る。Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ変異体が、ＩｇＧ半減期の約２倍の増加（アカゲザルにおいて評価される）を与えられた一方、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ変異体（「ＹＴＥ」）は、ＩｇＧ半減期の約４倍の増加（カニクイザルにおいて評価される）を与えられた。半減期の延長は、有効性を維持又は改善しながら、投与頻度の減少の可能性を可能にし得る。
免疫グロブリンは、個別のドメインを含むモジュール構造を有することが知られており、このモジュール構造は、多数の異なる方法で組み合わされて、多重特異性、例えば二重特異性、三重特異性、又は四重特異性抗体フォーマットを生成し得る。例示的な多重特異性抗体フォーマットが、例えば、Spiess et al. (2015) Mol Immunol 67: 95-106及びKontermann (2012) Mabs 4(2):182-97に記載されている。本発明の抗体は、このような多重特異性フォーマットにおいて用いられ得る。
本発明は、エピトープを含む単離組み換えペプチドへの結合について、本明細書に記載される本発明の抗体（例えば、クローン２のＨＣＤＲ及びＬＣＤＲの組（例えば、Kabat命名法によって定義されるとき、表５に列挙されるように）及び／又はクローン２のＶＨ及びＶＬアミノ酸配列のヒト化変異体）と競合することが可能な、ヒト化又はヒト抗体又はその抗原結合フラグメントを提供し、前記ペプチドは、競合アッセイにおいて評価されるとき、ヒト２Ｎ４Ｒタウ（配列番号２）の残基３６９～３８１（配列番号１）を含むか又はそれからなる。好ましくは、前記エピトープは、ヒト２Ｎ４Ｒ（アミノ酸１～４４１）タウ（配列番号２）のアミノ酸配列３７３～３７９（ＴＨＫＬＴＦＲ、配列番号１５０）の残基によって形成及び定義され、好ましくは、エピトープは、残基：Ｋ３７５、Ｔ３７７及びＲ３７９を含み、それによって定義され、より好ましくは、エピトープは、残基Ｔ３７３、Ｋ３７５、Ｔ３７７及びＲ３７９を含み、それによって定義される（例えば、クローン２、＃４４によって結合されたエピトープ）。
競合アッセイは、ＥＬＩＳＡ、ＨＴＲＦ、フローサイトメトリー、蛍光マイクロボリュームアッセイ技術（microvolume assay technology）（ＦＭＡＴ）アッセイ、Mirrorball、ハイコンテントイメージングに基づく蛍光免疫測定、放射性リガンド結合アッセイ、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）及びサーマルシフトアッセイなどの、免疫測定を含む細胞系及び無細胞系結合アッセイを含む。
参照抗体と同じエピトープ又は参照抗体と重複するエピトープに結合する抗体は、競合アッセイにおいて、参照抗体の、その結合パートナー（例えば、抗原又は「標的」）への結合を５０％以上ブロックする抗体を指し、及び／又は逆に、参照抗体は、競合アッセイにおいて、抗体の、その結合パートナーへの結合を５０％以上ブロックする。このような抗体は、対象とするエピトープへの結合について競合すると記載される。
本発明の抗原結合タンパク質、例えば、抗体又はその抗原結合フラグメントは、検出可能な標識（例えば、放射性同位体）；又は生物活性分子にコンジュゲートされ得る。この場合、抗原結合タンパク質、例えば、抗体又はその抗原結合フラグメントは、コンジュゲートと呼ばれ得る。このようなコンジュゲートは、本明細書に記載される疾患の治療及び／又は診断に応用され得る。このようなコンジュゲートは、ヒト２Ｎ４Ｒ（アミノ酸１～４４１）タウ（配列番号２）の残基３６９～３８１（配列番号１）を含むか又はそれからなるエピトープの検出（例えば、インビトロ検出）に応用され得；好ましくは、前記エピトープは、ヒト２Ｎ４Ｒ（アミノ酸１～４４１）タウ（配列番号２）のアミノ酸配列３７３～３７９（ＴＨＫＬＴＦＲ、配列番号１５０）の残基によって形成され、好ましくは、エピトープは、残基：Ｋ３７５、Ｔ３７７及びＲ３７９を含み、より好ましくは、エピトープは、残基Ｔ３７３、Ｋ３７５、Ｔ３７７及びＲ３７９（例えば、クローン２、＃４４によって結合されたエピトープ）を含む。
本発明の抗原結合タンパク質（コンジュゲートを含む）は、本発明のエピトープ（ヒト２Ｎ４Ｒ（アミノ酸１～４４１）タウ（配列番号２）の残基３６９～３８１（配列番号１）からなる単離組み換えペプチド上に存在するエピトープ）の検出（例えば、インビトロ検出）に有用であり得；好ましくは、前記エピトープは、ヒト２Ｎ４Ｒ（アミノ酸１～４４１）タウ（配列番号２）のアミノ酸配列３７３～３７９（ＴＨＫＬＴＦＲ、配列番号１５０）の残基によって形成され、好ましくは、エピトープは、残基：Ｋ３７５、Ｔ３７７及びＲ３７９によって定義され、より好ましくは、エピトープは、残基Ｔ３７３、Ｋ３７５、Ｔ３７７及びＲ３７９によって定義される（例えば、クローン２、＃４４によって結合されたエピトープ）。したがって、本発明は、試料における本発明のエピトープの存在を検出するための、本発明の抗原結合タンパク質の使用に関する。抗原結合タンパク質は、本明細書において他の箇所に記載される検出可能な標識にコンジュゲートされ得る。
好ましい実施形態において、本発明は、試料における本発明のエピトープを検出するためのインビトロ方法に関し、ここで、本方法は、本発明の抗原結合タンパク質を、対象とする試料と共にインキュベートすること、及び試料中に存在する本発明のエピトープへの、抗原結合タンパク質の結合を決定することを含み、ここで、抗原結合タンパク質の結合は、試料における本発明のエピトープの存在を示す。その標的抗原への抗原結合タンパク質の結合を検出するための方法が、当該技術分野において公知であり、ＥＬＩＳＡ、ＩＣＣ、ＩＨＣ、免疫蛍光、ウエスタンブロット、ＩＰ、ＳＰＲ及びフローサイトメトリーを含む。
対象とする試料は、個体から得られる試料であり得る。個体は、ヒトであり得る。試料としては、限定はされないが、組織、例えば、脳組織、脳脊髄液（ＣＳＦ）、初代細胞若しくは培養細胞又は細胞株、細胞上清、細胞溶解物、血小板、血清、血漿、硝子体液、リンパ液、滑液、卵胞液、精液、羊水、乳、全血、血漿、血清、血液由来細胞、尿、唾液、痰、涙液、汗、粘液、腫瘍溶解物、及び組織培養培地、組織抽出物、例えば、均質化組織、腫瘍組織、細胞抽出物、並びにそれらの組合せが挙げられる。
インキュベーションの後、抗原結合タンパク質－抗原結合、例えば、抗体－抗原結合が、適切な検出システムを用いて検出される。検出の方法は、直接又は間接的であり得、蛍光又は発色シグナルを生成し得る。直接の検出は、標識に直接コンジュゲートされる一次抗体の使用を含む。間接的な検出方法は、一次抗原結合タンパク質、例えば、抗体、宿主種に対して生成された標識二次抗体を用いる。間接的な方法は、シグナル強度を高めるために増幅工程を含み得る。抗原結合タンパク質－抗原（例えば、抗体－エピトープ）相互作用の視覚化（すなわち、検出）のための一般的に使用される標識は、可溶性基質を不溶性発色最終産物に転化するフルオロフォア及び酵素を含む。
「検出すること」という用語は、最も広い意味で、標的分子の定性的及び定量的測定の両方を含むように、本明細書において使用される。検出することは、試料における標的分子の存在のみを同定すること、並びに標的分子が、検出可能なレベルで試料中に存在するかどうかを決定することを含む。検出することは、直接又は間接的であり得る。
抗原結合タンパク質、例えば、抗体にコンジュゲートされ得る好適な検出可能な標識は、当該技術分野において公知であり、ヨウ素－１２５、ヨウ素－１３１、イットリウム－９０、インジウム－１１１及びテクネチウム－９９などの放射性同位体；フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、テキサスレッド及びシアニン色素誘導体、例えば、Cy7、Alexa750及びAlexa Fluor 647などの蛍光色素；ジアミノベンジジンなどの発色色素；ラテックスビーズ；西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素標識；スペクトル的に分離された吸収又は発光特性を有するホスホ又はレーザー色素；適切な化学環境において電気による刺激によって検出され得るスルホ－ＴＡＧなどの電気化学発光標識；及び特定の同種検出可能部分、例えば、標識されたアビジン又はストレプトアビジンへの結合によって検出され得るビオチンなどの化学部分を含む。
本発明の抗原結合タンパク質、例えば、抗体又はそのフラグメントは、ジスルフィド又はペプチド結合などの任意の好適な共有結合又は非共有結合によって検出可能な標識にコンジュゲートされ得る。好適なペプチドリンカーは、当該技術分野において公知であり、５～２５、５～２０、５～１５、１０～２５、１０～２０、又は１０～１５アミノ酸長であり得る。
本発明はまた、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントをコードする核酸又は核酸の組、並びにこのような核酸又は核酸の組を含むベクターを提供する。
核酸が、本発明の抗体分子のＶＨ及びＶＬドメイン、又は重鎖及び軽鎖をコードする場合、２つのドメイン又は鎖が、同じ核酸分子又は別個の核酸分子においてコードされ得る。
単離核酸分子は、本発明の抗体分子を発現させるのに使用され得る。核酸は、一般に、発現のために組み換えベクターの形態で提供されるであろう。したがって、本発明の別の態様は、上述される核酸を含むベクターを提供する。必要に応じて、プロモーター配列、ターミネーターフラグメント、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子及び他の配列を含む適切な調節配列を含有する好適なベクターが、選択又は構築され得る。好ましくは、ベクターは、宿主細胞内の核酸の発現を駆動するために適切な調節配列を含有する。ベクターは、必要に応じて、プラスミド、ウイルス、例えばファージ、又はファージミドであり得る。
本明細書に記載される核酸分子又はベクターは、宿主細胞中に導入され得る。宿主細胞中への核酸又はベクターの導入のための技術は、当該技術分野において十分に確立されており、任意の好適な技術が用いられ得る。組み換え抗体分子の産生に好適な様々な宿主細胞が、当該技術分野において公知であり、細菌、酵母、昆虫又は哺乳動物宿主細胞を含む。好ましい宿主細胞は、ＣＨＯ、ＮＳ０、又はＨＥＫ細胞、例えばＨＥＫ２９３細胞などの哺乳動物細胞である。
本発明の核酸又はベクターを含む組み換え宿主細胞も提供される。このような組み換え宿主細胞は、本発明の抗原結合タンパク質（例えば、抗体）を産生するのに使用され得る。したがって、本発明の抗原結合タンパク質、例えば、抗体を産生する方法も提供され、本方法は、抗原結合タンパク質、例えば、抗体の産生に好適な条件下で、組み換え宿主細胞を培養することを含む。本方法は、抗原結合タンパク質、例えば、抗体を単離及び／又は精製する工程をさらに含み得る。
したがって、本発明は、本発明の抗原結合タンパク質、例えば、抗体を産生する方法であって、宿主細胞内で、抗原結合タンパク質、例えば、抗体をコードする核酸を発現させること、及び任意に、このように産生された抗原結合タンパク質、例えば、抗体を単離及び／又は精製することを含む方法を提供する。宿主細胞を培養するための方法は、当該技術分野において周知である。組み換え抗原結合タンパク質、例えば、抗体の精製のための技術は、当該技術分野において周知であり、例えば、プロテインＡ又はプロテインＬを用いた、例えばＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ又は親和性クロマトグラフィーを含む。ある実施形態において、精製は、抗原結合タンパク質、例えば、抗体において親和性タグを用いて行われ得る。本方法は、任意に、薬学的に許容される賦形剤又は後述される他の物質を用いて、抗原結合タンパク質、例えば、抗体を、医薬組成物へと製剤化することも含み得る。
本発明の抗原結合タンパク質、例えば、抗体は、治療用途、特に、ヒトにおける治療用途、例えば、限定はされないが、アルツハイマー病（散発性及び一遺伝子性家族性形態）、筋萎縮性側索硬化症／パーキンソン認知症複合、嗜銀顆粒病、β－プロペラタンパク質関連神経変性（ＢＰＡＮ）、英国型アミロイド血管症、脳アミロイド血管症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ボクサー認知症、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化、ダウン症、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、前頭側頭認知症（ＦＴＤ）、１７番染色体に連鎖しパーキンソン症を伴う前頭側頭認知症（ＦＴＤＰ－１７）、前頭側頭葉変性症、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、ハレルフォルデン・スパッツ病、封入体筋炎、多系統萎縮症、筋強直性ジストロフィー、Ｃ型ニーマン・ピック病、神経原線維変化を伴う非グアム島人型運動ニューロン病、パーキンソン病（散発性及び一遺伝子性家族性形態）、ピック病、脳炎後パーキンソン症、原発性年齢関連タウオパチー（ＰＡＲＴ）、プリオンタンパク質脳アミロイド血管症、進行性皮質下グリオーシス、進行性核上まひ（ＰＳＰ）、亜急性硬化性全脳炎、神経原線維変化優位型認知症、球状グリア細胞タウオパチー、グアムのパーキンソン認知症複合、進行性非流暢性失語、多発梗塞性認知症、虚血性脳卒中、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）及び脳卒中から選択されるタウオパチーを含むタウオパチーの治療に応用されることが予想される。
本発明に係る抗原結合タンパク質、例えば、抗体、及び薬学的に許容される賦形剤などの賦形剤を含む医薬組成物などの組成物も提供される。
本発明はさらに、治療の方法に使用するための、本発明の抗原結合タンパク質、例えば、抗体を提供する。患者を治療する方法であって、治療有効量の、本発明に係る抗原結合タンパク質、例えば、抗体を患者に投与することを含む方法も提供される。薬剤の製造に使用するための、本発明に係る抗原結合タンパク質、例えば、抗体の使用がさらに提供される。本明細書において言及される患者は、好ましくは、ヒト患者である。
本発明はまた、患者におけるアルツハイマー病などのタウオパチーを治療する方法に使用するための、本発明の抗原結合タンパク質、例えば、抗体を提供する。患者におけるアルツハイマー病などのタウオパチーを治療する方法であって、治療有効量の、本発明に係る抗原結合タンパク質、例えば、抗体を患者に投与することを含む方法も提供される。患者におけるアルツハイマー病などのタウオパチーの治療のための薬剤の製造に使用するための、本発明に係る抗原結合タンパク質、例えば、抗体の使用がさらに提供される。治療は、ＦＤＡ承認ＡＤ薬剤、例えば、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤（例えばドネペジル）、アセチルコリン受容体陽性調節剤（例えば、ガランタミン）、ＮＭＤＡ受容体拮抗薬（例えば、メマンチン）、又はパーキンソン病薬剤、例えば、カルビドパ－レボドパ、ドーパミン受容体拮抗薬（例えばプラミペキソール）、モノアミンオキシダーゼＢ阻害剤（例えば、セレギリン）、カテコールＯ－メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）阻害剤、アマンタジン、又は抗コリン作用薬（例えば、ベンズトロピン）などの二次療法を患者に投与することをさらに含み得る。二次療法は、本発明の抗原結合タンパク質、例えば、抗体と同時に、別々に、又は連続して、患者に投与され得る。
別の態様において、本発明は、ａ）タウオパチーを治療すること、ｂ）タウオパチーの進行を遅らせること、ｃ）タウオパチーに罹患している患者の認知機能を維持すること、ｄ）タウオパチーに罹患している患者の生存期間を延長すること、ｅ）ＣＳＦ及び／又は血清における遊離Ｃ末端タウのレベルを低下させること、ｆ）ＣＳＦ及び／又は血清における総タウのレベルを低下させること、ｇ）ＣＳＦ及び／又は血清における遊離Ｃ末端タウ：総タウの比率を低下させること、ｈ）ＣＳＦ及び／又は血清におけるニューロフィラメント軽鎖タンパク質（ＮｆＬ）のレベルを低下させること、ｉ）ニューロン及び／又は星状膠細胞及び／又はミクログリアにおける総細胞内タウレベルを低下させること、ｊ）全脳容積及び／又は局所的な脳容積の減少速度を低下させること、ｋ）脳の機能的結合の減少速度を低下させること、ｌ）脳の機能的結合を改善すること、又はｍ）ＰＥＴ又は他のイメージング方法に基づく脳タウ負荷を減少させることに使用するための、本発明の抗原結合タンパク質、例えば、抗体に関する。
したがって、本明細書に記載される抗原結合タンパク質、例えば、抗体は、治療用途に、特に、アルツハイマー病などのタウオパチーの治療に使用するためのものであり得る。
本明細書に記載される抗原結合タンパク質、例えば、抗体は、ヒト又は動物身体の治療の方法に使用され得る。本発明の関連する態様は、
（ｉ）薬剤として使用するための、本明細書に記載される抗原結合タンパク質、例えば、抗体、
（ｉｉ）疾患又は障害の治療の方法に使用するための、本明細書に記載される抗原結合タンパク質、例えば、抗体、
（ｉｉｉ）疾患又は障害の治療に使用するための薬剤の製造における、本明細書に記載される抗原結合タンパク質、例えば、抗体の使用；及び
（ｉｖ）個体における疾患又は障害を治療する方法であって、治療有効量の、本明細書に記載される抗原結合タンパク質、例えば、抗体を個体に投与することを含む方法
を提供する。
個体は、患者、好ましくは、ヒト患者であり得る。
治療は、いくらかの所望の治療効果、例えば、病態の阻害又は病態の進行の遅延が達成される任意の治療又は療法であり得、進行の速度の低下、進行の速度の停止、病態の改善、病態の治癒若しくは寛解（部分的か若しくは完全かにかかわらず）、病態の１つ以上の症状及び／又は兆候の予防、改善、遅延、緩和若しくは停止、又は治療しない場合に予想されるものを超える個体若しくは患者の生存期間の延長を含む。
予防的措置（すなわち、予防）としての治療も含まれる。例えば、ＡＤなどのタウオパチーの発生を起こしやすい又は発生のリスクがある個体が、本明細書に記載されるように治療され得る。このような治療は、個体における疾患の発症を予防するか又は遅らせ得る。
記載される治療の方法は、抗原結合タンパク質、例えば、抗体に加えて、少なくとも１つのさらなる治療を個体に投与することを含み得る。したがって、本明細書に記載される抗原結合タンパク質、例えば、抗体は、単独で又は１つ以上の他の治療と組み合わせて、個体に投与され得る。抗原結合タンパク質、例えば、抗体が、別の治療と組み合わせて、個体に投与される場合、さらなる治療は、抗原結合タンパク質、例えば、抗体の投与と同時に、連続して、又は別々に、個体に投与され得る。さらなる治療が、抗原結合タンパク質、例えば、抗体と同時に投与される場合、抗原結合タンパク質、例えば、抗体、及びさらなる治療は、組み合わされた製剤として、個体に投与され得る。例えば、さらなる療法は、治療される疾患のための公知の療法又は治療剤であり得る。
抗原結合タンパク質、例えば、抗体は、単独で投与されてもよいが、抗原結合タンパク質、例えば、抗体は、通常、抗原結合タンパク質、例えば、抗体に加えて、少なくとも１つの成分を含み得る医薬組成物の形態で投与されるであろう。したがって、本発明の別の態様は、本明細書に記載される抗原結合タンパク質、例えば、抗体を含む医薬組成物を提供する。抗原結合タンパク質、例えば、抗体を、医薬組成物へと製剤化することを含む方法も提供される。
医薬組成物は、抗原結合タンパク質、例えば、抗体に加えて、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝液、安定剤又は当業者に周知の他の材料を含み得る。本明細書において使用される際の「薬学的に許容される」という用語は、妥当なベネフィット／リスク比に見合い、妥当な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、又は他の問題若しくは合併症を伴わずに対象（例えば、ヒト）の組織と接触して使用するのに好適な、化合物、材料、組成物、及び／又は剤形に関する。各担体、賦形剤などはまた、製剤の他の成分と適合するという意味で「許容され」なければならない。担体又は他の材料の正確な性質は、後述されるように、注入、注射又は任意の他の好適な経路によるものであり得る投与経路に依存する。
例えば、注射による、非経口、例えば皮下又は静脈内投与では、抗原結合タンパク質、例えば、抗体を含む医薬組成物は、パイロジェンフリーであり、好適なｐＨ、等張性及び安定性を有する非経口的に許容される水溶液の形態であり得る。当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、又は乳酸リンゲル注射液などの等張ビヒクルを用いて、好適な溶液を調製することができる。防腐剤、安定剤、緩衝液、酸化防止剤及び／又はホスフェート、シトレート及び他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンなどの酸化防止剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３’－ペンタノール；及びｍ－クレゾールなど）；低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、若しくはリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類及びグルコース、マンノース若しくはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース若しくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質複合体）；及び／又はTWEEN（商標）、PLURONICS（商標）若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む他の添加剤が、必要に応じて用いられ得る。
ある実施形態において、抗原結合タンパク質、例えば、抗体は、投与前の再構成のために凍結乾燥形態で提供され得る。例えば、凍結乾燥抗原結合タンパク質、例えば、抗体は、個体への投与前に、滅菌水又は生理食塩水中で再構成され得る。
投与は、「治療有効量」で行われ得、これは、個体に対する利益を示すのに十分である。投与される実際の量、並びに投与の速度及び時間経過は、治療されるものの性質及び重症度、治療される特定の個体、個体の臨床状態、障害の原因、組成物の送達部位、抗原結合タンパク質、例えば、抗体のタイプ、投与の方法、投与のスケジューリング及び医師に公知の他の要因に依存するであろう。治療の処方、例えば、投与量に関する決定などは、一般医師及び他の医師の責任に含まれ、治療される疾患の症状の重症度及び／又は進行に依存し得る。抗原結合タンパク質、例えば、抗体の適切な用量は、当該技術分野において周知である。抗原結合タンパク質、例えば、抗体の治療有効量又は好適な用量は、動物モデルにおけるインビトロ活性及びインビボ活性を比較することによって決定され得る。マウス及び他の試験動物における有効な投与量をヒトに外挿するための方法が公知である。正確な用量は、治療される部位のサイズ及び位置がどうであるか、並びに抗原結合タンパク質、例えば、抗体の正確な性質を含むいくつかの要因に依存するであろう。
典型的な抗体用量は、全身用途では１００μｇ～１ｇ、及び局所用途では１μｇ～１ｍｇの範囲である。初期のより多い負荷用量、その後、１つ以上のより少ない用量が、投与され得る。これは、成人個体の単回治療のための用量であり、これは、小児及び乳幼児のために比例的に調整され得、また、分子量に比例して他の抗体フォーマットのために調整され得る。
治療は、医師の判断により、１日１回、週２回、週１回又は月１回の間隔で、繰り返され得る。個体の治療スケジュールは、抗体組成物の薬物動態及び薬力学的特性、投与経路及び治療される病態の性質に依存し得る。
治療は、定期的であってもよく、投与間の期間は、約２週間以上、例えば、約３週間以上、約４週間以上、約１か月以上で１回、約５週間以上、又は約６週間以上であり得る。例えば、治療は、２～４週間置き又は４～８週間置きであり得る。好適な製剤及び投与の経路は、上述されている。
好ましい実施形態において、本明細書に記載される抗体は、アルツハイマー病を治療する方法に使用するためのものであり得る。
好ましい実施形態において、本発明の抗原結合タンパク質、例えば、抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒトタウ２Ｎ４Ｒの残基３７９～４０８又は３７９～３９１に含まれるエピトープに結合しない。
図面
ヒト家族性アルツハイマー病ニューロンから放出された複数種のタウは、対照ニューロン上清において見られない。タウは、市販の抗体、ＨＴ７（レーン３、６、９）又はタウ－１３（レーン２、５、８）を用いて、非疾患対照（ＮＤＣ；レーン１～３）、家族性アルツハイマー病（ｆＡＤ）関連突然変異、ＰＳＥＮ１ Ｙ１１５Ｃ（ＰＳＥＮ；レーン４～６）及び前頭側頭認知症（ＦＴＤ；レーン７～９）関連突然変異、ＭＡＰＴ ＩＶＳ１０＋１６（ＭＡＰＴ）ニューロンからの培養上清から免疫沈降（ＩＰ）され、ＩｇＧ対照（１、４、７）と比較された。ウエスタンブロットは、抗タウ抗体（Ｋ９ＪＡ）（Ａ）を用いた各ＩＰの後のタウ種の検出を示す。強調され、１～５と付番されたバンドが切除され、質量分析法によって分析された。 抗タウＩｇＧクローン＃４４（クローン２）及び＃６６（クローン１）は、ヒトｉＰＳＣ由来ニューロンセクレトーム（neuronal secretome）からのタウ種を免疫除去させた。ＮＤＣ（薄い灰色）及び２つの別個のＴＳ２１ライン（濃い灰色、黒色）からの馴化培地が、免疫前血清（１）、Ｋ９ＪＡポリクローナル抗体（２）、＃４４（クローン２）（３）及び＃６６（クローン１）（４）により免疫除去され、中間領域によって分析された（ＭＲタウ；市販の抗体ＢＴ２及びタウ５に基づいて；Ａ）及び微小管結合領域（ＭＴＢＲタウ；市販の抗体、Ｋ９ＪＡに基づいて；Ｂ）ＥＬＩＳＡ。免疫前血清は、モック除去試料に対する陰性対照として用いられる。値は、３つの技術的レプリケートの平均＋／－ＳＤを表す。 抗タウＩｇＧクローン＃４４（クローン２）及び＃６６（クローン１）は、インビボで長期増強（ＬＴＰ）のタウ媒介性遮断を防止する。海馬ＬＴＰを、トリソミー２１（ＴＳ２１）ｉＰＳＣ由来ニューロン培養物によって生成されるセクレトームの存在下で、麻酔されたラットにおいて測定した。ＬＴＰが、ビヒクル処理動物（黒色のバー；１）において誘導されたが、モック除去ＴＳ２１セクレトーム（白色のバー；２）の存在下で阻害された。ＬＴＰ誘導が、ＩｇＧクローン＃４４（クローン２）（灰色のバー；３）又は＃６６（クローン１）（チェック柄のバー；４）を用いて免疫除去されたＴＳ２１セクレトームの存在下で観察され、これは、ＬＴＰブロックに関与するタウ種の除去を示す。ＬＴＰの大きさは、ｎ＝４（ビヒクル）又はｎ＝７（セクレトーム試料）動物についての刺激前ベースラインＥＰＳＰ振幅（±ＳＥＭ）のパーセンテージとして表される。＊＊、ｐ＜０．０１；＊、ｐ＜０．０５；ビヒクル対照（１）に対するボンフェローニの多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡ；＃＃＃＃、ｐ＜０．０００１、＃＃、ｐ＜０．０１、対応のあるｔ検定、ＬＴＰ誘導前に対するＬＴＰ誘導後。 ヒトＡＤ ＣＳＦは、Ｃ末端タウを含有する。アルツハイマー病が臨床的に確認された１６の個体からのＣＳＦ試料をプールした（最終体積８．５ｍＬ）（Ａ）。１５０ｎｇのクローン＃４４（クローン２）ＩｇＧが、プロテインＡ被覆ビーズに結合及び架橋され、ビーズを用いて、プールされたＡＤ ＣＳＦ中に存在するタウを免疫精製し、これは、標的エピトープ（Ｂ）を含有していた。タンパク質が、トリプシン（Ｃ）を用いてビーズ上で消化され、溶離されたペプチドが、質量分析法（Ｄ）によって分解された。Ｃ末端タウペプチドが、Ｇｅｎ２Ｂエピトープ（「Ｙ」として示される）に隣接して、プールされたＡＤ ＣＳＦ（Ｅ、「Ｘ」として示される）において同定され、これは、ＡＤ ＣＳＦにおけるＣ末端タウフラグメントの存在を確認する。 抗タウ抗体は、免疫原配列内の個別のエピトープに結合する。抗体クローン＃４４（クローン２；Ａ）及び＃６６（クローン１、Ｂ）についてのエピトープ置換走査分析の文字プロット図が、タウへの結合に必要な主要な残基を強調する。ペプチドアレイ（Ｃ）へのアイソタイプ対照ウサギＩｇＧの低レベルの結合は、抗タウ抗体結合がＣＤＲ特異的であることを実証する。プロットに下に示される天然のリードペプチド配列の各位置において単一のアミノ酸置換を有する線形ペプチドが生成された。置換について得られる値は、記録される値の高さにおいてプロットされた各置換残基についての文字コードによって示される。矢印は、リード配列についての中央値を示す。 ウサギ抗体クローン＃４４に基づくヒト化重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＫ）配列を、Composite Human Antibody Technology（Abzena）を用いて設計した。元のウサギ配列（親）に対してアラインされた、６ＶＨ鎖（Ａ）及び４ＶＫ鎖（Ｂ）配列のアラインメントが示される。ＣＤＲ定義及びタンパク質配列が、Kabatに従って番号付けされる。ウサギ親配列からの変化に、陰影が付けられている。 ヒト化抗タウＩｇＧのパネルが、ＥＬＩＳＡフォーマットにおいて完全長組み換え２Ｎ４Ｒタウに結合する。各ＩｇＧクローンで一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ細胞からの上清を、完全長組み換え２Ｎ４Ｒタウ（黒色のバー）への結合について１：１００で試験した。ＢＳＡへの検出可能な結合が、試験される変異体（白色のバー）のいずれかについて観察された。抗タウｈＩｇＧ１の結合が、ＨＲＰコンジュゲート抗ヒト二次抗体を用いて検出され、データが、代表的な実験（ｎ＝１レプリケート）から示される。 ヒト化抗タウＩｇＧは、高い親和性でタウに結合する。代表的なＳＰＲ結合曲線は、完全長組み換え２Ｎ４Ｒタウ（０．３９ｎＭ～１２．５ｎＭが、２倍希釈で適用される）へのクローン＃４４変異体、ＶＨ０ＶＫ０（Ａ）、ＶＨ３ＶＫ３（Ｂ）、ＶＨ３ＶＫ４（Ｃ）、ＶＨ４ＶＫ２（Ｄ）、ＶＨ４ＶＫ３（Ｅ）及びＶＨ４ＶＫ４（Ｆ）結合を示す。実験を、６０秒の結合時間及び２００秒の解離時間でBiacore T200を用いて実行した。 クローン＃４４のヒト化抗体変異体は、６５℃を超えるＴｍを有する。単一のレプリケートからの蛍光（三角）及び４７３ｎｍにおける静的光散乱（ＳＬＳ；四角）シグナルが、優先順位を付けられた変異体、ＶＨ３ＶＫ３（Ａ）、ＶＨ３ＶＫ４（Ｂ）、ＶＨ４ＶＫ２（Ｃ）、ＶＨ４ＶＫ３（Ｄ）、ＶＨ４ＶＫ４（Ｅ）について示される。 ヒト化モノクローナル抗タウ抗体は、ニューロンによるモノマータウ取り込みを阻害する。抗体クローン＃４４のヒト化変異体、ＶＨ３ＶＫ３（Ａ）、ＶＨ３ＶＫ４（Ｂ）、ＶＨ４ＶＫ２（Ｃ）、ＶＨ４ＶＫ３（Ｄ）、ＶＨ４ＶＫ４（Ｅ）（黒色の三角、実線）又はアイソタイプ対照ヒトＩｇＧ１（白色の四角、実線）を、完全長pHrodo標識モノマー（Ｐ３０１Ｓ）２Ｎ４Ｒタウ（２５ｎＭ）と共にインキュベートしてから、Incucyte S3においてイメージングした。２１時間にわたって６０分置きに定量されたニューロン（ファージ）面積当たりの平均オレンジ色（pHrodo）面積は、アイソタイプ及び抗体なし（黒色の丸、破線）処理において時間と共に着実に増加したが、抗タウ抗体変異体で処理された細胞内で有意に減少した。＊＊＊、ｐ＜０．００１；抗体なし対照に対するテューキーの多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡ。pHrodo標識タウを含まない陰性対照ウェルも示される（白色の丸、破線）。データが、１つの代表的な実験からのｎ＝４ウェルの平均＋／－ＳＥＭとして示される。 ヒト化モノクローナル抗タウ抗体は、ヒトｉＰＳＣ由来ニューロンによる凝集されたタウ取り込みを阻害する。抗体クローン＃４４のヒト化変異体、ＶＨ３ＶＫ３（Ａ）、ＶＨ３ＶＫ４（Ｂ）、ＶＨ４ＶＫ２（Ｃ）、ＶＨ４ＶＫ３（Ｄ）、ＶＨ４ＶＫ４（Ｅ）（黒色の三角、実線）又はアイソタイプ対照ヒトＩｇＧ１（白色の四角、実線）を、完全長pHrodo標識凝集（Ｐ３０１Ｓ）２Ｎ４Ｒタウ（５０ｎＭ）と共にインキュベートしてから、Incucyte S3においてイメージングした。２１時間にわたって６０分置きに定量されたニューロン（ファージ）面積当たりの平均オレンジ色（pHrodo）面積は、アイソタイプ及び抗体なし（黒色の丸、破線）処理において時間と共に着実に増加したが、抗タウ抗体変異体で処理された細胞内で有意に減少した。＊＊＊、ｐ＜０．００１；抗体なし対照に対するテューキーの多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡ。pHrodo標識タウを含まない陰性対照ウェルも示される（白色の丸、破線）。データが、１つの代表的な実験からのｎ＝４ウェルの平均＋／－ＳＥＭとして示される。 ヒト化モノクローナル抗タウ抗体は、ヒトｉＰＳＣ由来星状膠細胞によるモノマータウ取り込みを阻害する。抗体クローン＃４４のヒト化変異体、ＶＨ３ＶＫ３（Ａ）、ＶＨ３ＶＫ４（Ｂ）、ＶＨ４ＶＫ２（Ｃ）、ＶＨ４ＶＫ３（Ｄ）、ＶＨ４ＶＫ４（Ｅ）（黒色の三角、実線）又はアイソタイプ対照ヒトＩｇＧ１（白色の四角、実線）を、完全長pHrodo標識モノマー（Ｐ３０１Ｓ）２Ｎ４Ｒタウ（２５ｎＭ）と共にインキュベートしてから、Incucyte S3においてイメージングした。２０時間にわたって６０分置きに定量された星状膠細胞（ファージ）面積当たりの平均オレンジ色（pHrodo）面積は、アイソタイプ及び抗体なし（黒色の丸、破線）処理において時間と共に着実に増加したが、抗タウ抗体変異体で処理された細胞内で有意に減少した。＊＊＊、ｐ＜０．００１；抗体なし対照に対するテューキーの多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡ。pHrodo標識タウを含まない陰性対照ウェルも示される（白色の丸、破線）。データが、１つの代表的な実験からのｎ＝４ウェルの平均＋／－ＳＥＭとして示される。 ヒト化モノクローナル抗タウ抗体は、ヒトｉＰＳＣ由来星状膠細胞による凝集されたタウ取り込みを阻害する。抗体クローン＃４４のヒト化変異体、ＶＨ３ＶＫ３（Ａ）、ＶＨ３ＶＫ４（Ｂ）、ＶＨ４ＶＫ２（Ｃ）、ＶＨ４ＶＫ３（Ｄ）、ＶＨ４ＶＫ４（Ｅ）（黒色の三角、実線）又はアイソタイプ対照ヒトＩｇＧ１（白色の四角、実線）を、完全長pHrodo標識凝集（Ｐ３０１Ｓ）２Ｎ４Ｒタウ（５０ｎＭ）と共にインキュベートしてから、Incucyte S3においてイメージングした。２０時間にわたって６０分置きに定量された星状膠細胞（ファージ）面積当たりの平均オレンジ色（pHrodo）面積は、アイソタイプ及び抗体なし（黒色の丸、破線）処理において時間と共に着実に増加したが、抗タウ抗体変異体で処理された細胞内で有意に減少した。＊＊＊、ｐ＜０．００１；抗体なし対照に対するテューキーの多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡ。pHrodo標識タウを含まない陰性対照ウェルも示される（白色の丸、破線）。データが、１つの代表的な実験からのｎ＝４ウェルの平均＋／－ＳＥＭとして示される。 ヒト化抗タウヒトＩｇＧ１は、ヒトｉＰＳＣ由来ミクログリアによるモノマータウの取り込みを増加させる。抗体クローン＃４４のヒト化変異体、ＶＨ３ＶＫ３（Ａ）、ＶＨ３ＶＫ４（Ｂ）、ＶＨ４ＶＫ２（Ｃ）、ＶＨ４ＶＫ３（Ｄ）、ＶＨ４ＶＫ４（Ｅ）（黒色の丸、実線）又はアイソタイプ対照ｈＩｇＧ１（白色の四角、実線）を、完全長pHrodo標識モノマー２Ｎ４Ｒと共にインキュベートしてから、Incucyte S3においてイメージングした。１５時間にわたって３０分置きに定量されたミクログリア（ファージ）面積当たりの平均オレンジ色（pHrodo）面積は、アイソタイプ及び抗体なし（黒色の三角、破線）処理において時間と共にわずかに増加したが、抗タウ抗体クローンで処理された細胞内で有意に増加した。pHrodo標識タウを含まない陰性対照ウェルも示される（白色の丸、破線）。データが、１つの代表的な実験からのｎ＝４ウェルの平均＋／－ＳＥＭとして示される。＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊、ｐ＜０．００５；抗体なし対照に対するテューキーの多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡ。 ヒト化抗タウヒトＩｇＧ１は、ヒトｉＰＳＣ由来ミクログリアによる凝集されたタウの取り込みを増加させる。抗体クローン＃４４のヒト化変異体、ＶＨ３ＶＫ３（Ａ）、ＶＨ３ＶＫ４（Ｂ）、ＶＨ４ＶＫ２（Ｃ）、ＶＨ４ＶＫ３（Ｄ）、ＶＨ４ＶＫ４（Ｅ）（黒色の丸、実線）又はアイソタイプ対照ｈＩｇＧ１（白色の四角、実線）を、完全長pHrodo標識モノマー２Ｎ４Ｒと共にインキュベートしてから、Incucyte S3においてイメージングした。１５時間にわたって３０分置きに定量されたミクログリア（ファージ）面積当たりの平均オレンジ色（pHrodo）面積は、アイソタイプ及び抗体なし（黒色の三角、破線）処理において時間と共にわずかに増加したが、抗タウ抗体クローンで処理された細胞内で有意に増加した。pHrodo標識タウを含まない陰性対照ウェルも示される（白色の丸、破線）。データが、１つの代表的な実験からのｎ＝４ウェルの平均＋／－ＳＥＭとして示される。＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊、ｐ＜０．００５；抗体なし対照に対するテューキーの多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡ。 精製されたヒト化モノクローナル抗タウ抗体は、非認知症対照（ＮＤＣ）死後大脳皮質と比較した、家族性アルツハイマー病（ＡＤ；プレセニリン１突然変異）におけるタウの増加したレベルを検出する。ＮＤＣ（レーン２）及びＡＤ患者（レーン３）からの脳溶解物と比較した組み換え２Ｎ４Ｒタウ（レーン１）のウエスタンブロットが示される。クローン＃４４変異体、ＶＨ３ＶＫ３（Ａ）、ＶＨ３ＶＫ４（Ｂ）、ＶＨ４ＶＫ２（Ｃ）、ＶＨ４ＶＫ３（Ｄ）、ＶＨ４ＶＫ４（Ｅ）及び親ＶＨ０ＶＫ０クローン＃４４（Ｆ）抗体は、様々な形態のタウに対応する複数種を検出し、ＡＤ試料における高及び低ＭＷ種の両方の増加した検出を伴う。矢印は、ＮＤＣ脳において検出されない疾患特異的タウ種を示す。アクチン（＊＊）及びニューロンチューブリン（＊）が示され（Ｇ）、ローディングタンパク質及び死後タンパク質分解のそれぞれの対照として含まれていた。 抗タウ抗体は、非認知症対照（ＮＤＣ）死後大脳皮質と比較した、家族性アルツハイマー病（ＡＤ）、散発性ＡＤ及びレビー小体認知症（ＤＬＢ）におけるタウの増加したレベルを検出する。ＮＤＣ（Ａ、レーン１～５；Ｂ～Ｃ、レーン１～４）；家族性ＡＤ患者（Ａ；レーン６～１０）；散発性ＡＤ患者（Ｂ、レーン５～８）及びＤＬＢ患者（Ｃ；レーン５～８）からの大脳皮質溶解物のウエスタンブロットが示される。親ウサギＩｇＧクローン＃４４（ｉ）及びヒト化変異体＃４４ ＶＨ４ＶＫ４（ｉｉ）は、同様に挙動し、様々な形態のタウに対応する複数種を検出し、アルツハイマー病及びＤＬＢ試料における高及び低ＭＷ種の両方の増加した検出を伴う。パネルｉｉｉ～ｖｉｉは、市販の抗タウ抗体：タウ１３（ｉｉｉ．）、ＨＴ７（ｉｖ．）、タウ５（ｖ．）及びタウ４６（ｖｉ．）を用いて再度調査された同じブロットを示し、Ｎ末端（タウ１３）、中間領域（ＨＴ７、タウ５）及び遠位Ｃ末端（タウ４６）抗体と比較した、配列番号１を標的とする抗体により検出されたタウ種の明らかな疾患特異性を強調する。矢印は、市販の抗体によってではなく、配列番号１を標的とする抗体によって、ＮＤＣではなく疾患試料において検出されたタウ種を示す。アクチン（＊＊）及びニューロンチューブリン（＊）が示され（ｖｉｉ．）、ローディングタンパク質及び死後タンパク質分解のそれぞれの対照として含まれていた。 ヒト化抗体クローン＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４に基づく新規な抗体を、ＶＨ ＣＤＲ２（Ｈ０１－Ｈ０６）及びＶＨ ＣＤＲ３（Ｈ０６－Ｈ２０）（Abzena）及びＶＬ ＣＤＲ３（Ｌ０２）の突然変異誘発によって生成した。親ヒト化抗体クローン＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４配列（Ｐ）に対してアラインされた、上位２０のＶＨ変異体（＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４＿Ｈ０１～＿Ｈ２０）及び４つの組み換え変異体（＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４＿Ｈ０６－Ｈ０１、＿Ｈ０６－Ｈ０２、＿Ｈ０６－Ｈ０４、Ｈ１６－Ｈ０４）（Ａ）及び１つの代表的なＶＫ鎖変異体（＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４＿Ｌ０２）（Ｂ）配列のアラインメントが示される。ＣＤＲ定義及びタンパク質配列が、Kabatに従って番号付けされる。親ヒト化配列からの変化に、陰影が付けられている。 親和性成熟＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４ ｈＩｇＧ１変異体のパネルが、ＥＬＩＳＡフォーマットにおいて完全長組み換え２Ｎ４Ｒタウに結合する。各ＩｇＧクローンで一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ細胞からの上清を、完全長組み換え２Ｎ４Ｒタウ（黒色のバー）への結合について１：１００で試験した。ＢＳＡへの検出可能な結合が、試験される変異体（白色のバー）のいずれかについて観察された。抗タウｈＩｇＧ１の結合が、ＨＲＰコンジュゲート抗ヒト二次抗体を用いて検出され、データが、代表的な実験（ｎ＝１レプリケート）から示される。 親和性成熟ヒト化抗タウＩｇＧは、高い親和性でタウに結合する。代表的なＳＰＲ結合曲線は、完全長組み換え２Ｎ４Ｒタウ（０．３９ｎＭ～５０ｎＭが、２倍希釈で適用される）へのクローン＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４変異体、＿Ｈ０１（Ａ）（ＶＨ配列番号１８３、ＶＬ配列番号１６０）、＿Ｈ０２（Ｂ）（ＶＨ配列番号１８４、ＶＬ配列番号１６０）、＿Ｈ０４（Ｃ）（ＶＨ配列番号１８６、ＶＬ配列番号１６０）、＿Ｈ０６（Ｄ）（ＶＨ配列番号１８８、ＶＬ配列番号１６０）及び親＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４（Ｅ）（ＶＨ配列番号１５４、ＶＬ配列番号１６０）結合を示す。実験を、６０秒の結合時間及び２００秒の解離時間（フィットを改善するために１００秒まで減少される）でBiacore T200を用いて実行した。抗体を、ｈＩｇＧ１として試験した。 ｈＩｇＧ１として表される、クローン＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４の親和性成熟ヒト化抗体変異体は、６４℃を超えるＴｍを有する。単一のレプリケートからの蛍光（三角）及び４７３ｎｍにおける静的光散乱（ＳＬＳ；四角）シグナルが、親＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４（Ｅ）と比較して、優先順位を付けられた変異体、＿Ｈ０１（Ａ）、＿Ｈ０２（Ｂ）、＿Ｈ０４（Ｃ）、＿Ｈ０６（Ｄ）について示される。 親和性成熟ヒト化モノクローナル抗タウ抗体は、ヒトニューロンによるタウ取り込みを阻害する。ヒト化抗体クローン＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４（ｐＶＨ／ｐＶＬ）の親和性成熟変異体、Ｈ０１／ｐＶＬ（Ａ）、Ｈ０２／ｐＶＬ（Ｂ）、Ｈ０４／ｐＶＬ（Ｃ）、Ｈ０６／ｐＶＬ（Ｄ）、及び親ｐＶＨ／ｐＶＬ（Ｅ）（黒色の三角、実線）又はアイソタイプ対照ヒトＩｇＧ１（白色の四角、実線）を、完全長pHrodo標識モノマー２Ｎ４Ｒタウ２Ｎ４Ｒタウ（２５ｎＭ）共にインキュベートしてから、Incucyte S3においてイメージングした。１８時間にわたって６０分置きに定量されたニューロン（ファージ）面積当たりの平均オレンジ色（pHrodo）面積は、アイソタイプ及び抗体なし（黒色の丸、破線）処理において時間と共に着実に増加したが、抗タウ抗体変異体で処理された細胞内で有意に減少した。＊＊＊、ｐ＜０．００１；抗体なし対照に対するダネットの多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡ。pHrodo標識タウを含まない陰性対照ウェルも示される（白色の丸、破線）。データが、１つの代表的な実験からのｎ＝４ウェルの平均＋／－ＳＥＭとして示される。 親和性成熟ヒト化モノクローナル抗タウ抗体は、ヒトニューロンによる凝集されたタウ取り込みを阻害する。抗体クローン＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４（ｐＶＨ／ｐＶＬ）の親和性成熟ヒト化変異体、Ｈ０１／ｐＶＬ（Ａ）、Ｈ０２／ｐＶＬ（Ｂ）、Ｈ０４／ｐＶＬ（Ｃ）、Ｈ０６／ｐＶＬ（Ｄ）、及び親ｐＶＨ／ｐＶＬ（Ｅ）（黒色の三角、実線）又はアイソタイプ対照ヒトＩｇＧ１（白色の四角、実線）を、完全長pHrodo標識凝集（Ｐ３０１Ｓ）２Ｎ４Ｒタウ（５０ｎＭ）と共にインキュベートしてから、Incucyte S3においてイメージングした。１８時間にわたって６０分置きに定量されたニューロン（ファージ）面積当たりの平均オレンジ色（pHrodo）面積は、アイソタイプ及び抗体なし（黒色の丸、破線）処理において時間と共に着実に増加したが、抗タウ抗体変異体で処理された細胞内で有意に減少した。＊＊＊、ｐ＜０．００１；抗体なし対照に対するテューキーの多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡ。pHrodo標識タウを含まない陰性対照ウェルも示される（白色の丸、破線）。データが、１つの代表的な実験からのｎ＝４ウェルの平均＋／－ＳＥＭとして示される。 親和性成熟ヒト化モノクローナル抗タウ抗体は、ヒト星状膠細胞によるモノマータウ取り込みを阻害する。抗体クローン＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４（ｐＶＨ／ｐＶＬ）の親和性成熟ヒト化変異体、Ｈ０１／ｐＶＬ（Ａ）、Ｈ０２／ｐＶＬ（Ｂ）、Ｈ０４／ｐＶＬ（Ｃ）、Ｈ０６／ｐＶＬ（Ｄ）、及び親ｐＶＨ／ｐＶＬ（Ｅ）（黒色の三角、実線）又はアイソタイプ対照ヒトＩｇＧ１（白色の四角、実線）を、完全長pHrodo標識モノマー（Ｐ３０１Ｓ）２Ｎ４Ｒタウ（２５ｎＭ）と共にインキュベートしてから、Incucyte S3においてイメージングした。２１時間にわたって６０分置きに定量された星状膠細胞（ファージ）面積当たりの平均オレンジ色（pHrodo）面積は、アイソタイプ及び抗体なし（黒色の丸、破線）処理において時間と共に着実に増加したが、抗タウ抗体変異体で処理された細胞内で有意に減少した。＊＊＊、ｐ＜０．００１；抗体なし対照に対するテューキーの多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡ。pHrodo標識タウを含まない陰性対照ウェルも示される（白色の丸、破線）。データが、１つの代表的な実験からのｎ＝４ウェルの平均＋／－ＳＥＭとして示される。 親和性成熟ヒト化モノクローナル抗タウ抗体は、ヒト星状膠細胞による凝集されたタウ取り込みを阻害する。抗体クローン＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４（ｐＶＨ／ｐＶＬ）の親和性成熟ヒト化変異体、Ｈ０１／ｐＶＬ（Ａ）、Ｈ０２／ｐＶＬ（Ｂ）、Ｈ０４／ｐＶＬ（Ｃ）、Ｈ０６／ｐＶＬ（Ｄ）、及び親ｐＶＨ／ｐＶＬ（Ｅ）（黒色の三角、実線）又はアイソタイプ対照ヒトＩｇＧ１（白色の四角、実線）を、完全長pHrodo標識凝集（Ｐ３０１Ｓ）２Ｎ４Ｒタウ（５０ｎＭ）と共にインキュベートしてから、Incucyte S3においてイメージングした。２１時間にわたって６０分置きに定量された星状膠細胞（ファージ）面積当たりの平均オレンジ色（pHrodo）面積は、アイソタイプ及び抗体なし（黒色の丸、破線）処理において時間と共に着実に増加したが、抗タウ抗体変異体で処理された細胞内で有意に減少した。＊＊＊、ｐ＜０．００１；抗体なし対照に対するテューキーの多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡ。pHrodo標識タウを含まない陰性対照ウェルも示される（白色の丸、破線）。データが、１つの代表的な実験からのｎ＝４ウェルの平均＋／－ＳＥＭとして示される。 精製された親和性成熟ヒト化モノクローナル抗タウ抗体は、非認知症対照（ＮＤＣ）死後大脳皮質と比較した、家族性アルツハイマー病（ＡＤ；プレセニリン１突然変異）におけるタウの増加したレベルを検出する。ＮＤＣ（レーン２）及びＡＤ患者（レーン３）からの脳溶解物と比較した組み換え２Ｎ４Ｒタウ（レーン１）のウエスタンブロットが示される。クローン＃４４変異体、ｐＶＨ／ｐＶＬ（親）（Ａ）、Ｈ０１／ｐＶＬ（Ｂ）、Ｈ０２／ｐＶＬ（Ｃ）、Ｈ０４／ｐＶＬ（Ｄ）、Ｈ０６／ｐＶＬ（Ｅ）及びＨ１６／ｐＶＬ（Ｆ）抗体は、様々な形態のタウに対応する複数種を検出し、ＡＤ試料における高及び低ＭＷ種の両方の増加した検出を伴う。矢印は、ＮＤＣ脳において検出されない疾患特異的タウ種を示す。等量のタンパク質を、各死後脳試料の各ゲルに充填した。 親和性成熟抗タウ抗体は、非認知症対照（ＮＤＣ）死後大脳皮質と比較した、家族性アルツハイマー病（ＡＤ）のパネルにおけるタウの増加したレベルを検出する。ＮＤＣ（レーン１～５）；家族性ＡＤ患者（レーン６～１０）からの大脳皮質溶解物のウエスタンブロットが示される。親和性成熟ヒト化変異体＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４＿Ｈ０１／ｐＶＬ（Ａ）＿Ｈ０２／ｐＶＬ（Ｂ）、＿Ｈ０４／ｐＶＬ（Ｃ）及び＿Ｈ０６／ｐＶＬ（Ｄ）は、様々な形態のタウに対応する複数種を検出し、家族性アルツハイマー病試料における高及び低ＭＷ種の両方の増加した検出を伴う。矢印は、配列番号１を標的とする抗体によって、ＮＤＣではなく疾患試料において検出されたタウ種を示し、アクチン（＊＊）及びニューロンチューブリン（＊）が、以下に示され、ローディングタンパク質及び死後タンパク質分解のそれぞれの対照として含まれていた。 親和性成熟抗タウ抗体は、非認知症対照（ＮＤＣ）死後大脳皮質と比較した、散発性ＡＤ及びレビー小体認知症（ＤＬＢ）におけるタウの増加したレベルを検出する。ＮＤＣ（レーン１～４）；散発性ＡＤ患者（Ａ、Ｃ；レーン５～８）及びＤＬＢ患者（Ｂ、Ｄ；レーン５～８）からの大脳皮質溶解物のウエスタンブロットが示される。親和性成熟ヒト化変異体＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４＿Ｈ０４／ｐＶＬ（Ａ、Ｂ）及び＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４＿Ｈ０６／ｐＶＬ（Ｃ、Ｄ）は、同様に挙動し、様々な形態のタウに対応する複数種を検出し、アルツハイマー病及びＤＬＢ試料における高及び低ＭＷ種の両方の増加した検出を伴う。矢印は、配列番号１を標的とする抗体によって、ＮＤＣではなく疾患試料において検出されたタウ種を示し、アクチン（＊＊）及びニューロンチューブリン（＊）が、以下に示され（Ｅ、Ｆ）、ローディングタンパク質及び死後タンパク質分解のそれぞれの対照として含まれていた。 ヒト化抗タウ抗体は、免疫原配列内の同じエピトープに結合する。抗体クローン＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４＿Ｈ０４／ｐＶＬ（クローンＶＨ４ＶＫ４＿Ｈ０４；Ａ）及び＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４＿Ｈ０６／ｐＶＬ（クローンＶＨ４ＶＫ４＿Ｈ０６、Ｂ）についてのエピトープ置換走査分析の文字プロット図が、タウへの結合に必要な主要な残基を強調する。ペプチドアレイ（Ｃ）へのアイソタイプ対照ヒトＩｇＧ１の低レベルの結合が、抗タウ抗体の結合とは明らかに異なり、抗タウ抗体結合がＣＤＲ特異的であることを実証する。プロットの下に示される天然のリードペプチド配列の各位置において単一のアミノ酸置換を有する線形ペプチドが生成された。置換について得られる値は、記録される値の高さにおいてプロットされた各置換残基についての文字コードによって示される。矢印は、リード配列についての中央値を示す。
実施例
実施例１：家族性アルツハイマー病ニューロン培養物から放出された複数種のタウは、対照培養上清において見られない（図１）
家族性アルツハイマー病（ｆＡＤ）及び前頭側頭認知症（ＦＴＤ）ニューロン培養物から放出された複数種のタウは、非認知症対照（ＮＤＣ）ニューロン培養上清において見られない。タウは、市販の抗体、ＨＴ７（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）又はタウ１３（Santa-Cruz, Dallas, TX,USA）を用いて、ＮＤＣ、ｆＡＤ関連突然変異、ＰＳＥＮ１ Ｙ１１５Ｃ（ＰＳＥＮ）及びＦＴＤ関連突然変異、ＭＡＰＴ ＩＶＳ１０＋１６（ＭＡＰＴ）からの神経細胞培養上清から免疫沈降（ＩＰ）され、マウスモノクローナルＩｇＧ対照と比較された。ウエスタンブロット（図１）は、抗タウ抗体（Ｋ９ＪＡ；Agilent, Santa Clara, CA,USA）を用いた各免疫沈降の後のタウ種の検出を示す。バンド（ボックス１～５において強調される、図１）が切除され、疾患関連セクレトームが富化されたタウペプチドを同定するために質量分析法によって分析された。この分析は、ＮＤＣ由来のものと比較した、疾患関連セクレトームにおける微小管結合ドメイン（２Ｎ４Ｒタウのアミノ酸２６０～２６７（配列番号９）、３０６～３１７（配列番号１０）及び３５４～３６９（配列番号１１）に対応する）並びにＣ末端（２Ｎ４Ｒタウのアミノ酸３９６～４０６（配列番号１２）に対応する）からのペプチドの数の増加を示す（表４）。データは、微小管結合ドメイン及び隣接するＣ末端領域を含むタウ種が、ＮＤＣと比較して疾患関連ニューロンからより高いレベルで分泌され、したがって、タウの病理学的又は毒性形態を表し得ることを示す。
１．１ ヒトｉＰＳＣ由来ニューロンの細胞培養：投射ニューロン培養物へのヒト多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の分化を、Shi et al., Nature Neurosci. 15(3):477-86 (2012)によって記載されるように行った。様々な遺伝的素因からのｉＰＳＣ系統を使用した：ＮＤＣ（Shi et al., Nature Neurosci. 15(3):477-86；Shi et al. Nature Protocols 7(10): 1836-46 (2012)）；トリソミー２１（ＴＳ２１；Shi et al. Nature Protocols 7(10): 1836-46 (2012)）；ＰＳＥＮ１ Ｙ１１５Ｃ突然変異（ＰＳＥＮ；Moore et al. Cell Rep 11(5): 689-96 (2015)）；ＡＰＰ Ｖ７１７Ｉ突然変異（ＡＰＰ；Moore et al. Cell Rep 11(5): 689-96 (2015）；ＭＡＰＴ ＩＶＳ１０＋１６（ＭＡＰＴ；Sposito et al. Hum Mol Genet 24(18):5260-5269 (2015)）。細胞を、インビトロで４０日目に個々の実験のためにプレートから取り出し、６０＋日（Ｄ６０＋）まで維持し、ここで、インビトロでの日数は、誘導後の日数を指す（以後、詳述される）。
１．２ 免疫沈降及びウエスタンブロット法（図１）：ｉＰＳＣ由来ニューロンを、１２のウェルプレート（Corning, New York, USA）において培養し、Ｄ６０まで成熟させ、この後、馴化培地を、４８時間ごとに収集した。培地を回転させて、細胞残屑を除去し、上清を－２０℃で貯蔵した。馴化培地を氷上で解凍し、Vivaspin 20、１０ｋＤａのＭＷＣＯポリエーテルスルホン（Sigma, St Louise, MI, USA）を用いて約１０倍濃縮した。
１．２．１ 抗体コンジュゲーション：Dynabeads（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）を、１０分間にわたって５μｇの規定の抗体によるインキュベーションの前に洗浄した。次に、ＩｇＧ抗体ビーズミックスを加えて、馴化培地を濃縮し、ローラー上で一晩インキュベートした。Dynabeadsを、馴化培地から除去し、タウ１３（Abcam, Cambridge, UK）抗体ビーズミックスで置き換え、約８時間にわたってインキュベートした。Dynabeadsを、馴化培地から除去し、ＨＴ７（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）抗体ビーズミックスで置き換え、一晩インキュベートした。全てのビーズを、０．０５％のtween（ＰＢＳ）で３回洗浄した。１００μｌのLaemlli溶解緩衝液を、全てのビーズに加え、１０分間にわたって沸騰させた。上清を、ＳＤＳゲルにおける電気泳動のために保存した。
１．２．２ ウエスタンブロット法：２０μｌの試料を、１２％のMini-Protean TGX precast gel（Bio-Rad, Hercules, CA, USA）中に充填し、４℃で２時間にわたって、２００ｍＡで０．２μｍのＰＶＤＦ膜（GE Healthcare Life science, Chicago, IL, USA）に移した。膜を、室温（ＲＴ）で１時間にわたって、５％の乾燥脱脂粉乳（Marvel, Premier Foods, St Albans, UK）、ＰＢＳ中０．１％のTween中でブロックした。
タンパク質移動膜を、一次抗体（規定の濃度で）を用いて、室温で一晩調べた。その後、膜を、室温で１時間にわたって二次抗体（ヤギ抗ウサギＨＲＰ）と共にインキュベートした。
１．３ 質量分析法：２０μｌの試料を、１２％のMini-Protean TGX precast gel（Bio-Rad, Hercules, CA, USA）中に充填した。次に、ゲルを、４時間にわたってEZBlue（商標）ゲル染色試薬（Sigma, St Louis, MO, USA）と共にインキュベートし、次に、一晩ｄｄＨ２Ｏで脱染した。ウエスタンブロット分析によってタウに対応していたバンドを、コロイドブルーＳＤＳ－ＰＡＧＥから切除した。切除されたバンドを、２００μｌの１００ｍＭの重炭酸アンモニウム／５０％のアセトニトリル中２０℃に、続いて、５ｍＭのトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンによる還元に供した。次に、ヨードアセトアミドの添加によるアルキル化（２５ｍＭの最終濃度；工程当たり３０分間にわたる各インキュベーション）を行い、次に、液体を除去した。ゲル片を、１０分間にわたって減圧下で乾燥させ、５μｇ／ｍＬの修飾トリプシンを含有する２５μｌの１００ｍＭの重炭酸アンモニウム（Promega, Madison, WI, USA）を加えた（３７℃で１７時間にわたる消化）。ペプチドを回収し、μC18 ZipTip（Millipore, Burlington, MA, USA）を用いて脱塩し、５０％のアセトニトリル／０．１％のトリフルオロ酢酸中の１～２μｌのα－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸マトリックス（Sigma, St Louis, MO, USA）を用いてmaldiターゲットプレートへと溶離した。ペプチド質量を、リフレクトロンモードでBruker ultrafleXtreme Maldi質量分析計を用いて決定し、ｍｓ／ｍｓ断片化を、ＬＩＦＴモードで行った。データ分析を、FlexAnalysis、BioTools及びProteinScapeソフトウェア（Bruker, Billerica, MA, USA）を用いて行った。組み合わされた質量フィンガープリント－ｍｓ／ｍｓデータのデータベース検索を、Mascot（http://www.matrixscience.com）を用いて行った（表４）。
Figure 2023531822000006
実施例２：ペプチド合成
神経変性疾患におけるタウフラグメントを含有する微小管結合ドメイン／Ｃ末端の重要性をさらに調べるために、この領域を標的とする新規な抗体を生成した。２Ｎ４Ｒタウのアミノ酸３６９～３８１に対応するペプチド配列ＫＫＩＥＴＨＫＬＴＦＲＥＮ（配列番号１）を、いくつかの理由で、ウサギＩｇＧを生成するための免疫原として選択した。まず、配列は、微小管結合領域（ＭＴＢＲ）に隣接するが、ＭＴＢＲ自体と異なり、タウタンパク質内の他の領域及び微小管結合タンパク質ファミリーメンバーとの低い同一性を示す。これは、生成された抗体が、他の領域／タンパク質との交差反応性の低いリスクを伴い、タウにおける標的領域に特異的に及び選択的に結合する可能性を増加させる。第２に、推定リン酸化部位の非存在は、タウリン酸化が病理学的転帰に関連付けられた部位における、得られたデータの解釈を簡素化する（Augustinack et al., Acta Neuropathol 103(1): 26-35 (2002)）。したがって、このペプチドを標的とする抗体は、複数の部位への結合及び／又はリン酸化／脱リン酸化タウへの異なる結合に関連する合併症を伴わずに、タウ種を含むＣ末端の役割が調査／標的化されるのを可能にする。公に入手可能な、これらの基準を満たす同様の抗体はない。
２Ｎ４Ｒタウのアミノ酸３６９～３８１に対応するペプチド配列ＫＫＩＥＴＨＫＬＴＦＲＥＮ（配列番号１）によって形成されたエピトープに特異的に結合するウサギモノクローナルＩｇＧ抗体の生成及び特性評価が、本出願が優先権を主張する、２０２０年１２月３０日に国際公開第２０２０／２６０７２２号として公開された、２０２０年６月２９日に出願された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２０２０／０６８３１４号に記載されている。国際公開第２０２０／２６０７２２号として公開された、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２０２０／０６８３１４号の内容は、全体が本明細書に援用される。抗原ペプチド、［Ｃ］－ＫＫＩＥＴＨＫＬＴＦＲＥＮ－アミド（配列番号１３）を、標準的な技術を用いて、Cambridge Research Biochemicals（Billingham, UK）によって合成し、ＨＰＬＣによって＞９５％純粋であることが示され、免疫化のためのペプチドを、マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）リンカーを介して、Ｎ末端システインにおける遊離チオールによって、キーホールリンペットヘモシアン（ＫＬＨ）にコンジュゲートした。Single Plasma cell Interrogation（SPIN）プロトコルに使用するためのペプチドを、独自の方法（Exonbio, San Diego, CA, USA）を用いて、Ｎ末端システインにおける遊離チオールを用いて、ビオチン化ポリマーにコンジュゲートした。
実施例３：標的免疫原によるウサギの免疫化
３．１：標的免疫原によるウサギの免疫化：１匹のニュージーランド・ホワイトウサギを用いて、ウサギモノクローナル抗体を生成した。ウサギを、０日目に（フロイント完全アジュバント中で）、次に、１９日～７６日目置きに（フロイント完全アジュバント中で）、２００μｇ（１ｍｇ／ｍＬの希釈で調製された）の精製ＫＬＨコンジュゲートペプチド（２Ｎ４Ｒタウのアミノ酸３６９～３８１に対応する［Ｃ］－ＫＫＩＥＴＨＫＬＴＦＲＥＮ（配列番号１３））で免疫化した。アジュバント及び抗原ブーストを、９４日目及び９７日目にそれぞれ投与（腹腔内（ｉ．ｐ．））してから、最終的な出血を、１０４日目に取り、抗血清を、標準的な方法（Hancock & O’Reilly Methods Mol Biol 295:27-40 (2005)）を用いて採取した。
動物飼育及び使用される手順は、Animal Welfare Act, 1966（US Animal and Plant Health Inspection Service）に準拠した。
３．２：ペプチドＥＬＩＳＡ（図２）：堅固な免疫応答の生成を確認するために、血清を、免疫化後の様々な時点で免疫化された標的抗原に対する免疫反応性について試験した。免疫化の７６日後に取られた血清は、１：１０００～１：１０００，０００の希釈で直鎖状ペプチド標的に対して免疫反応性を示し、これは、モノクローナル抗体単離に進めるのに十分なＩｇＧ力価を示す。
ＥＬＩＳＡプレートを、４℃で一晩、抗原（非コンジュゲート抗原ペプチド（抗原ペプチド（［Ｃ］－ＫＫＩＥＴＨＫＬＴＦＲＥＮ－アミド（配列番号１３）；１×ＰＢＳ中の２μｇ／ウェル）で被覆した。抗原を、ウェルから除去し、プレートを、１×ＰＢＳ中５％の粉乳で、室温で１時間にわたってブロックした。ブロッキング溶液を除去し、１００μＬの希釈血清（１％のＢＳＡ／１×ＰＢＳ中で希釈された）を関連するウェルに加え、プレートを、穏やかに振とうしながら室温で１時間にわたってインキュベートした。次に、プレートを、ＰＢＳ／０．１％のTween（ＰＢＳＴ）で４回洗浄した。ＰＢＳ中１％のＢＳＡ中で１：１０，０００に希釈された抗ウサギＩｇＧ－ＨＲＰ抗体（Sigma, St Louis, MO,USA）を、各ウェルに加え、プレートを、穏やかに振とうしながら室温で３０分間インキュベートしてから、ＰＢＳＴで４回洗浄した。５０μＬの３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）ＥＬＩＳＡ溶液を、各ウェルに加え、プレートを、室温で１５分間インキュベートし、等体積の１Ｍの硫酸を、各ウェルに加え、ＯＤを４５０ｎｍで測定した。
実施例４：標的エピトープに特異的なモノクローナルＩｇＧの単離
９６個の個々の抗原特異的形質細胞を同定し、独自の方法（Exonbio, San Diego, CA, USA）を用いてExonbioによって標的免疫原を用いて単離した。
脾細胞を、Ficoll勾配（１．０８４）を用いて、免疫化されたウサギの脾臓から単離し、形質細胞マーカー及びビオチンコンジュゲート抗原で染色した。抗原特異的形質細胞を単離し、ウェル当たり１個の細胞で９６ウェルプレート中に振り分けた。抗体重鎖及び軽鎖の可変領域を、単一細胞ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって個別に増幅した。次に、増幅された重鎖及び軽鎖を、pRab293プラスミドへとクローニングし、製造業者の指示に従って、Invitrogen（Carlsbad, CA, USA）293fectinトランスフェクション試薬を用いて、無血清培地中のＨＥＫ２９３Ｆ懸濁液細胞内で発現させた。
Figure 2023531822000007
Figure 2023531822000008
実施例５：一過性に発現されたＩｇＧは、単離されたペプチド免疫原に結合する（図３）。
個々のウサギＩｇＧクローンを、インビトロ試験のためのＩｇＧ試料を生成するために、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞内で一過性に発現させた。単一のＩｇＧクローンを含有する上清を、短鎖ペプチド免疫原（［Ｃ］－ＫＫＩＥＴＨＫＬＴＦＲＥＮ－アミド；配列番号１３）及び完全長２Ｎ４Ｒ組み換えタウ（配列番号２）の両方に結合する能力について試験した。２３のクローンが、ＯＤ＞０．３で完全長タウに結合することが分かり、シーケンシングのために優先順位を付けられた。１７の固有のクローンを同定し、発現させた（表５）。データは、完全長組み換え２Ｎ４Ｒタウに結合することが可能なＩｇＧの生成のための短鎖ペプチド免疫原（［Ｃ］－ＫＫＩＥＴＨＫＬＴＦＲＥＮ－アミド）の有用性を実証し；免疫原及び完全長２Ｎ４Ｒタウの両方に結合する１７の優先順位を付けられたクローンの能力を実証する。
５．１ ＨＥＫ細胞内のＩｇＧの一過性発現
個々のウサギＩｇＧクローンを、インビトロ試験のためのＩｇＧ試料を生成するために、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞内で一過性に発現させた。懸濁液中で培養されたＨＥＫ２９３Ｆ細胞を、製造業者の指示に従って293fectinトランスフェクション試薬（Invitrogen, Carlsbad, CA,USA）を用いて、pRab293プラスミド中で、構築物で一過性にトランスフェクトした。
上清を、トランスフェクションの７日後に収集した。抗体を、AKTAクロマトグラフィーシステム（GE Healthcare, Chicago, IL, USA）におけるプロテインＡカラム（２５ｍＬの樹脂）及び標準的な方法を用いて精製した。簡潔に述べると、プロテインＡカラムに、５ｍＬ／分で上清を充填し、次に、ＰＢＳ（５×総カラム体積）で洗浄した。タンパク質ピークを収集し、４℃で一晩、ＰＢＳ中で透析した。
ｍｇの量のＩｇＧの生成のために、３００ｍＬ～１リットルのＨＥＫ２９３Ｆ細胞を、一過性にトランスフェクトし、ＩｇＧを、上記のように、プロテインＡカラムを用いて、トランスフェクションの７日後に培養培地から精製した。
５．２ ペプチドＥＬＩＳＡ。
ＥＬＩＳＡプレートを、３７℃で１時間にわたって、１×炭酸塩－重炭酸塩緩衝液中の抗原（非コンジュゲート抗原ペプチド（抗原ペプチド（［Ｃ］－ＫＫＩＥＴＨＫＬＴＦＲＥＮ－アミド（配列番号１３））又は完全長２Ｎ４Ｒタウ（配列番号２）、１００ｎｇ／ウェル；又は１×ＴＢＳ中１％のＢＳＡ）で被覆した。抗原を、ウェルから除去し、次に、プレートを、１×ＴＢＳ中５％の粉乳で、室温で１時間にわたってブロックした。ブロッキング溶液を除去し、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞上清（１０μｇ／ｍＬ、１％のＢＳＡ／１×ＴＢＳ中０．０００１μｇ／ｍＬまで）を関連するウェルに加え、プレートを、穏やかに振とうしながら室温で１時間にわたってインキュベートした。次に、プレートを、ＴＢＳ／０．１％のTween（ＴＢＳＴ）で４回洗浄した。５％の乳／ＴＢＳ中で１：５０００に希釈された抗ウサギＩｇＧ－ＨＲＰ抗体（Sigma, St Louis, MO,USA）を、各ウェルに加え、プレートを、穏やかに振とうしながら室温で１時間にわたってインキュベートしてから、ＴＢＳＴで４回洗浄した。３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）ＥＬＩＳＡ溶液を、各ウェルに加え、プレートを、室温で１５分間インキュベートした。等体積の１Ｍの硫酸を、各ウェルに加え、ＯＤを４５０ｎｍで測定した。
実施例６：モノクローナル抗体は、濃度依存的に、ＥＬＩＳＡによって完全長組み換えタウを検出する。
抗タウウサギＩｇＧクローン＃６６（クローン１）及び＃４４（クローン２）は、ＥＬＩＳＡプレート上に固定化された完全長組み換え２Ｎ４Ｒタウ（配列番号２）に、濃度依存的に結合し、半値最大ＥＬＩＳＡシグナルが、それぞれ０．８２ｎＭ［０．７～０．９５ｎＭ］及び１．０５ｎＭ［０．９６～１．１５ｎＭ］で観察された（単一の実験におけるｎ＝２ウェルからの平均及び９５％信頼区間が示される）。データは、完全長タウへの両方のクローンの高親和性結合を実証する。
実施例７：モノクローナル抗タウ抗体は、ヒトｉＰＳＣ由来ニューロン培養物中のタウを検出する。
ウエスタンブロットは、組み換え及び天然に発現されたタウを検出する抗タウＩｇＧの能力を実証した。ウサギＩｇＧクローン＃１２（クローン３）、＃４４（クローン２）、＃４５（クローン４）又は＃６６（クローン１）を含有するＨＥＫ２９３Ｆ細胞由来上清（実施例５．１のように生成される）は、約６０ｋＤで主要なバンドとして完全長組み換え２Ｎ４Ｒタウ（配列番号２）（rPeptide, Watkinsville, GA, USA）を検出した。試験される全てのクローンは、単一のレーンへと充填された２２ｎｇのタウを検出することができた。全ての４つのクローンは、ヒトｉＰＳＣ由来ニューロン溶解物中で、約５０ｋＤで主要なバンドを検出した。タンパク質を脱リン酸化するためのλホスファターゼによるニューロン溶解物の処理は、ニューロン溶解物中で検出された検出タウ種の見掛けの分子量を減少させたが（成功した脱リン酸化と一致する）、天然に発現されたタウを検出する抗体の能力に影響を与えなかった。データは、試験される全ての４つのＩｇＧクローンが、リン酸化及び脱リン酸化タウ試料に同様に十分に結合し、ウエスタンブロットによって組み換え及び天然に発現されたタウの両方を検出することができることを実証する。
精製されたクローン＃４４（クローン２）及び＃６６（クローン１）ＩｇＧは、ＮＤＣ、疾患－ＡＤ関連（ＰＳＥＮ Ｙ１１５Ｃ、トリソミー２１）及びＦＴＤ関連（ＭＡＰＴ ＩＶＳ１０＋１６）の遺伝的素因から、ヒトｉＰＳＣ由来ニューロン中のタウを検出する（図６）。主要なバンドが、各ニューロン試料中で、約５０ｋＤで検出される。市販の抗体、ＨＴ７（２Ｎ４Ｒタウのアミノ酸１５９～１６３に対応するエピトープに対して生成される；Invitrogen, Carlsbad, CA,USA）も、ブロットを再度調査するのに使用されるとき、約５０ｋＤで主要なバンドを検出し、これは、これが完全長タウを表すことに一致する。データは、培養物中のヒトｉＰＳＣ由来ニューロンにおける細胞内に存在するタウが、２Ｎ４Ｒタウ（配列番号２）のアミノ酸３６９～３８１（配列番号１）に対応するエピトープを標的とする抗体によって検出され得ることを示す。
実施例８：モノクローナル抗タウ抗体は、非認知症対照死後脳と比較して、家族性アルツハイマー病（ｆＡＤ）におけるタウの増加したレベルを検出する。
ウエスタンブロットを、ＮＤＣ及びアルツハイマー病患者からの脳溶解物を用いて実行した。ＩｇＧクローン＃１２（クローン３）、＃４４（クローン２）、＃４５（クローン４）又は＃６６（クローン１）を含有するＨＥＫ２９３Ｆ細胞由来上清は、ヒト死後脳試料におけるタウを検出する。全ての４つのクローンは、試験されるＮＤＣ試料中に存在しない複数の高（＞７５ｋＤ）及び低（＜４０ｋＤ）分子量種を含む、ＮＤＣ脳試料と比較して、ＡＤにおけるタウの増加したレベルを検出する。データは、２Ｎ４Ｒタウ（配列番号１）のアミノ酸３６９～３８１に対応する配列を標的とする４つの異なるＩｇＧクローンが全て、ＮＤＣ及び疾患試料中に存在する約５０ｋＤにおけるバンドに加えて、ＡＤ脳溶解物におけるタウの疾患特異的高及び低分子量種の同様のパターンを検出することを実証する。これは、行われた観察が、配列番号１に結合する全ての抗体に一般化可能であることを示唆する。
死後試料のより広い選択が評価された場合、精製されたクローン＃４４（クローン２）及び＃６６（クローン１）ＩｇＧが同様に、様々な形態のタウに対応する複数種を検出し、アルツハイマー病試料において高及び低分子量種の両方の増加した検出を伴う（図８）。アクチン及びニューロンチューブリンが、負荷及び死後タンパク質分解のそれぞれを制御するために含まれ、ＡＤ試料におけるタウの増加した検出が、増加したタンパク質充填又は減少した分解の結果ではなく、むしろ、ＮＤＣと比較して、ＡＤ脳におけるＣ末端タウ含有種の存在量の増加を反映することを実証する。特に、配列番号１を標的とする抗体は、市販の抗中間領域タウ抗体、ＨＴ７によって検出されなかった、死後脳試料におけるタウ種の異なるパターンを検出した。これらは、ＮＤＣ脳試料と比較して、ＡＤにおいて存在量が明らかに増加する低及び高ＭＷ種の両方を含む。ＨＴ７抗体によって検出される低分子量種は、比較的変化せず、又は非疾患脳と比較して、疾患脳において減少される。これは、疾患特異的タウ種が、本明細書に記載される新規な抗体によって検出され、市販の中間領域抗体によって検出されないことを示唆する。データは、対照と比較して、アルツハイマー病脳において、対象とするエピトープを含有するタウ種の存在及び増加した存在量を確認した。
８．１ ヒト脳試料：ヒト死後脳試料は、Kings College London Neurodegenerative Diseases Brain Bankから入手された。全ての研究は、倫理的に認められ、インフォームドコンセントが、脳提供の前に得られた。アルツハイマー病脳試料は、家族性アルツハイマー病の個体の前頭葉に由来する（ＰＳＥＮ１突然変異；表６に要約される）。非認知症対照脳試料は、認知症の臨床兆候を示さなかった年齢を適合させた個体に由来した。対照個体の死亡の原因は：肺癌（１）、冠動脈閉塞（２）、肺癌（３）、急性肝不全（４）、転移性前立腺癌（５）であり；これらはいずれも、死後検出されるタウレベル／種に影響を与えないことが予測されるであろう。
Figure 2023531822000009
実施例９：モノクローナル抗タウ抗体は、非認知症対照死後脳と比較して、散発性アルツハイマー病（ＡＤ）、及びレビー小体認知症（ＤＬＢ）におけるタウの増加したレベルを検出する。
家族性型のＡＤを越えてデータセットを拡張するために、散発性ＡＤ及びＤＬＢ患者からの死後脳試料を、ウエスタンブロットによって評価した。クローン＃６６（クローン１）ＩｇＧは、ＮＤＣと比較した際の、全ての疾患関連試料における高及び低分子量タウ種の両方の増加したレベルを検出した。上述されるように（実施例８）、市販の中間領域タウ抗体、ＨＴ７及びＢＴ２（ThermoFisher, Waltham, MA）は、全ての試料（約５０ｋＤにおける完全長タウに加えて）中の主により低い分子量（＜４０ｋＤ）タウ種の範囲を検出し、検出可能な疾患関連の増加はなかった。アクチン及びニューロンチューブリン対照は、タウレベルの変化が、示される試料におけるタンパク質及び／又はニューロンレベルの変化に起因しないことを確認する。データは、家族性ＡＤに加えて、散発性ＡＤ及びタウオパチー脳における対象とするエピトープを含有するタウ種（配列番号１）の存在及び増加した存在量を実証する。これは、これらの種が、ＡＤ及びタウオパチーの一般的な特徴であり得、この領域を標的とする治療が、散発性及び家族性型のＡＤの両方に加えて、様々なタウオパチーを治療する際に広い有用性を有し得ることを示唆する。
９．１ ヒト脳試料：ヒト死後脳試料の由来については実施例８を参照。全ての試料は、臨床的に及び病理学的に確認された散発性アルツハイマー病（ブラークステージ６）又はＤＬＢの個体の前頭葉に由来した。非認知症対照脳試料は、認知症の臨床兆候又はＡＤ／タウオパチーの病理学的兆候を示さなかった（ブラークステージ０）年齢を適合させた個体に由来した。対照個体の死亡の原因は、示される場合、死後検出されるタウレベル／種に影響を与えることは予測されないであろう。
実施例１０：抗タウＩｇＧは、免疫細胞化学によってヒトｉＰＳＣ由来ニューロン培養物における天然に発現されたタウを検出する。
クローン＃６６（クローン１）を用いて、免疫細胞化学によってＮＤＣ及びＦＴＤ関連（ＭＡＰＴ ＩＶＳ１０＋１６）ｉＰＳＣ由来ニューロン（５０＋日目）におけるタウ発現を視覚化した。染色パターンは、低いレベルのバックグラウンドで、タウの主に軸索局在化に一致する。データは、クローン＃６６（クローン１）が、ヒトニューロン中インサイチュで、天然に発現されたタウを検出することができ、組織学的分析のための有用な手段であることを実証する。
実施例１１：モノクローナル抗体は、サンドイッチ免疫測定において完全長組み換えタウを検出する
抗タウウサギＩｇＧクローン＃４４（クローン２）及び＃６６（クローン１）は、MesoScale Discovery（ＭＳＤ）アッセイにおいて、抗体対の一部として組み換えタウを検出する。標準曲線を、捕捉抗体として、完全長組み換え２Ｎ４Ｒタウ（rPeptide, Watkinsville, GA, USA）及びクローン＃４４（クローン２）又は＃６６（クローン１）を、市販のポリクローナル抗体、Ｋ９ＪＡ（アミノ酸２４４～４４１を標的とする；Agilent, Santa Clara, CA, USA）、又は市販のモノクローナル抗体、タウ５（アミノ酸２１０～２４１を標的とする；Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）のいずれかを組み合わせて構築した。各アッセイの検出の限度は、約８０ｐｇ／ｍＬであった。データは、サンドイッチ免疫測定を用いたタウの検出のための、市販のモノクローナル又はポリクローナル抗体と組み合わせた、対象とするエピトープを標的とする抗体（配列番号１）の有用性を実証する。
実施例１２：抗タウＩｇＧは、ヒトニューロンへのモノマー及び凝集されたタウの取り込みを阻害する
細胞外モノマー及び凝集されたタウは、エンドサイトーシス及びマクロピノサイトーシスの組合せ（Evans et al. (2018) Cell Rep 22(13): 3612-3624）によって、ヒトニューロンによって取り込まれる。このプロセスは、生理学的に起こるが、また、アルツハイマー病を含むタウオパチーにおいて観察されるタウの毒性形態の病原性の広がりにおいて役割を果たすことも示される。したがって、毒性タウ種の取り込みの阻害は、脳におけるタウ病変の広がりを抑える際に治療的に有益であることが予測される。タウのニューロン取り込みは、ｐＨ感受性色素、pHrodoで標識されたタウに関連する蛍光を測定することによって評価及び定量され得る。増加した蛍光は、酸性エンドソーム区画への標識化されたタウの内在化の後に起こり、それによって、タウ取り込み／内在化の動的測定を提供する。抗タウＩｇＧクローン、＃４４（クローン２）及び＃６６（クローン１）は、ヒトｉＰＳＣ由来ニューロンへのpHrodo標識モノマータウの取り込みを４時間の時点でそれぞれ６５％及び７１％の阻害だけ阻害し、pHrodo標識凝集されたタウの取り込みを４時間の時点でそれぞれ５６％及び４７％の阻害だけ阻害する。アイソタイプ対照抗体（モノクローナルウサギＩｇＧ；Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）は、このシステムにおいてタウ取り込みに有意な効果を与えなかった。
データは、配列番号１を標的とする抗体が、ヒトニューロンによる、このエピトープを含有するタウ種の取り込みを減少させることができることを実証する。したがって、このような抗体は、アルツハイマー病及びタウオパチーにおけるこのエピトープ（配列番号１）を含む毒性タウ種のニューロン間の伝播を抑制し、それによって、患者における臨床症状を軽減し／その進行を遅らせることが予測されるであろう。
１２．１ ヒトｉＰＳＣ由来大脳皮質ニューロンの生成：実施例１．１に詳述されるように。
１２．２ 凝集された（オリゴマー）タウ種の生成：タウＰ３０１Ｓ＿１０ｘｈｉｓ－ｔａｇ＿ａｖｉ－タグを、ＢＬ２１（ＤＥ３）細菌中で過剰発現させた。細胞を、BugBuster（Millipore, Burlington, MA, USA）を用いて溶解させ、精製された溶解物を、２×ＰＢＳ中の５ｍＬのHisTrapHPカラム（GE Healthcare, Chicago, IL, USA）に適用した。タウを、０～５００ｍＭのイミダゾール勾配を用いて溶離させた。ピーク画分をプールし、Superdex 200 16/60ゲルろ過カラム（GE Healthcare, Chicago, IL, USA）を用いて２×ＰＢＳ中でさらに精製した。次に、プールされた画分を、スピン濃縮器（Millipore, Burlington, MA,USA）を用いて約８ｍｇ／ｍＬに濃縮した。最終的なタンパク質濃度を、Nanodrop分析によって決定した。
８ｍｇ／ｍＬで１ｍＬのタウＰ３０１Ｓを、７２時間にわたって３７℃で、ＰＢＳ／３０ｍＭの３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）（ｐＨ７．２）中の４ｍｇ／ｍＬのヘパリン（Sigma, St Louis, MO,USA）と共にインキュベートした。凝集された材料を、９ｍＬのＰＢＳ及び１％（ｖ／ｖ）のサルコシル（Sigma, St Louis, MO,USA）中で希釈し、室温で１時間にわたって揺動させて、非凝集材料を完全に可溶化した。不溶性タウを、４℃で１時間にわたって超遠心分離によってペレット化した。ペレットを、１ｍＬのＰＢＳ中で再度懸濁させ、３×２０秒間にわたって１００Ｗで超音波処理して（Hielscher UP200St超音波照射装置；Teltow, Germany）、塊又はタンパク質を分散させ、大きいフィラメントをより小さい片へと破壊した。
１２．３ 精製された組み換えタウの標識：モノマー組み換え２Ｎ４Ｒタウは、rPeptide（Watkinsville, GA, USA）から購入された。凝集されたタウを、上述されるように調製した。組み換えモノマータウ（１５０μＭ）又は同様の凝集されたタウ濃度（約７μｇ／ｍＬ）を、室温で、暗所で２時間にわたって、１．５ｍＭのpHrodo Redマレイミド（ＤＭＳＯに溶解された）及び１．５ｍＭのトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（それぞれ１：１０：１０のモル比）と共にインキュベートした。次に、標識された試料を、５０ｍＭのホスフェート（ｐＨ７．４）及び１５０ｍＭのＮａＣｌ中で、４℃でサイズ排除クロマトグラフィー（Superdex 200 Increase 10/300 GL；GE Healthcare, Chicago, IL, USA）に供して、未反応色素を除去した。凝集体のオリゴマー状態を評価し、標識によって影響されないことが分かった。
１２．４ ヒトｉＰＳＣ由来皮質ニューロンによるタウ取り込みの定量：モノマータウ（２５ｎＭ）及び凝集されたタウ（５０ｎＭ）を、Ｎ２Ｂ２７（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）中で調製し、３７℃で９０分間にわたってタウより１０倍モル過剰の抗体（すなわち、２５０及び５０ｎＭのＩｇＧ）と共にインキュベートした。１００μＬの抗体／タウ混合物を、ＮＤＣニューロン（６０＋日目）に加え、蛍光を、Opera Phenixイメージングシステム（Perkin Elmer, Waltham, MA, USA）を用いて、ウェル当たり１８の視野から、３７℃／５％のＣＯ２で、４時間にわたって１５分ごとにイメージングした。Alexa 568チャネルにおける「強いスポット」を同定するためのアルゴリズムを用いて、ウェル当たりの蛍光の強いスポットの数を定量し、これらを、時間の経過とともにｎ＝４細胞からの平均＋／－ＳＥＭとしてプロットした。ダネットの多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを、抗体なし対照と比べて実行して、有意差を決定した。
実施例１３．モノクローナル抗タウＩｇＧは、ヒトｉＰＳＣ由来ニューロンから得られた馴化培地からのタウ種を免疫除去する（図２）
セクレトームを、ニューロン誘導の７０～８０日後に４８時間間隔で、ヒトｉＰＳＣ由来ニューロン培養物（実施例１．１に記載されるように生成された）から収集した。セクレトームを、遠心分離によって精製してから、－２０℃で凍結させた。試料を、氷上で解凍し、人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）に対して透析した。タウの免疫除去を、４℃でモノクローナル抗体及びプロテインＧアガロースビースとの２回の１２時間インキュベーションによって達成した。ウサギ由来の免疫前血清を、モック除去試料に対する対照として使用した。セクレトームを、２つの遺伝的に異なるトリソミー２１ライン、及び１つのＮＤＣから生成されたｉＰＳＣ由来ニューロン培養物から収集した。中間領域（ＢＴ２（ThermoFisher, Waltham, MA）／タウ５抗体対）ＭＳＤアッセイ及び微小管結合領域（ＭＴＢＲ；Ｋ９ＪＡ／Ｋ９ＪＡ抗体対）アッセイを用いたタウレベルの定量が、ＮＤＣと比較して、トリソミー２１セクレトームにおける上昇したタウレベルの存在を確認した。さらに、ＭＴＢＲタウレベルは、中間領域タウより大幅に（少なくとも４倍）低く、これは、ＭＴＢＲ及び／又はＣ末端ドメインを欠く中間領域タウフラグメントの生成につながる切断事象、又はＭＴＢＲ及び／又はＣ末端エピトープが利用できないタウ種の存在を示す。クローン＃４４（クローン２）及び＃６６（クローン１）は、全ての３つのセクレトームからのタウ種を除去する（図２）。クローン＃４４（クローン２）及び＃６６（クローン１）は、ＮＤＣセクレトーム（薄い灰色のバー、＃４４（クローン２）及び＃６６（クローン１）のそれぞれによる４２％及び１７％の除去）よりトリソミー２１セクレトーム（ラインＢ、濃い灰色のバー、＃４４（クローン２）及び＃６６（クローン１）のそれぞれによる５８％及び４７％の除去；並びに、ラインＣ、黒色のバー、＃４４（クローン２）及び＃６６（クローン１）のそれぞれによる６２％及び６０％の除去）においてより大きい程度にタウを含有するＭＴＢＲを除去し、これは、ＮＤＣセクレトームと比較して、トリソミー２１において、ＭＴＢＲ及び標的エピトープ（配列番号１）の両方を含むタウ種の相対レベルの増加を示す。クローン＃４４（クローン２）及び＃６６（クローン１）は、ＴＳ２１セクレトーム（ＮＤＣなし）から、最も特に、１つのバッチ（ラインＣ；それぞれ１６％及び３４％）から中間領域タウのみを除去し、これは、中間領域及び標的エピトープ（配列番号１）の両方を含有するタウ種の疾患特異的な存在を示す。これらのデータは、ＮＤＣと比較して疾患に存在する様々なタウ種のバランスの変化（潜在的に、疾患特異的切断事象、改変された翻訳後修飾及び／又は立体構造変化による）を実証し、これは、絶対タウレベル並びに配列番号１を標的とする抗体によって検出され得るタウを含有するＭＴＢＲ及び／又はＭＲの割合の両方の増加につながる。
Figure 2023531822000010
実施例１４．トリソミー２１ニューロンセクレトームによるインビボ長期増強（ＬＴＰ）のタウ媒介性遮断は、投与前にＩｇＧクローン＃４４（クローン２）又は＃６６（クローン１）による試料の免疫除去によって防止される（図３）
電気生理学実験を、ウレタン麻酔（１０５～１０６ｇ／ｋｇ、腹腔内）雄Lister Hoodedラット（２５０～３５０ｇ）において行った。上述されるように（Hu et al. (2014) Nature Commun 5:3374）、海馬ＬＴＰを、２００Ｈｚの高周波刺激（ＨＦＳ）の前及び後に、同側シェファー側枝／交連神経路の刺激に応答して、ＣＡ１の放射状層からの興奮性シナプス後場電位（ＥＰＳＰ）を記録することによって測定した。シナプス可塑性の誘導の３０分前に、セクレトームを、カニューレを介して、ラットの側脳室中に注射した。
ＬＴＰの全ての統計的分析を、v6.07（GraphPad Software, La Jolla, CA, USA）において行った。ＬＴＰの大きさが、プレ－ＨＦＳベースラインＥＰＳＰ振幅のパーセンテージ（±ＳＥＭ）として表される。ｎは、群当たりの動物の数を指す。対照実験が、全体を通してランダムに挟まれていた。グラフ表示では、ＥＰＳＰ振幅が、５分エポックで分けられ；統計的分析では、ＥＰＳＰ振幅が、１０分エポックで分けられた。シダックの多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡ（一元配置ＡＮＯＶＡ－シダック）が、３つ以上の群間の比較に使用された。シダックの多重比較検定による反復測定を用いた二元配置ＡＮＯＶＡ（二元配置ＡＮＯＶＡ ＲＭ－シダック）を、２つのみの群がある場合に使用した。対応のあるｔ検定を行って、群内のプレ－及びポスト－ＨＦＳ値を比較した。ｐ＜０．０５の値は、統計的に有意であると見なされた。
トリソミー２１「ラインＣ」から単離されたセクレトーム（図２に示される）を試験した。モック除去試料は、ビヒクル対照処理動物と比較して、ＬＴＰの誘導を有意にブロックし（ｐ＜０．０１）、これは、上述されるように（Hu et al., 2014, Nat Commun 5: 3374）、セクレトームにおける「毒性」又は阻害性分子の存在と一致していた。標的エピトープ（配列番号１）を含むタウ種を除去するためにクローン＃４４（クローン２）又は＃６６（クローン１）のいずれかを用いて免疫除去されたトリソミー２１セクレトームは、ベースラインと比較した際に、統計的に有意なＬＴＰを示した（それぞれｐ＜０．０１及びｐ＜０．００１）（図３）。データは、トリソミー２１セクレトームによって誘導されるＬＴＰブロックが、標的エピトープ（配列番号１）を含むタウ種の除去によって防止され得し、それによって、タウ種を含有するＣ末端が、ＬＴＰブロックの成分に関与することを示すことを実証する。特定の抗体の投与による患者におけるこれらのタウ種の除去は、治療的に有用であることが予測されるであろう。
実施例１５：エフェクター機能を有するモノクローナル抗タウ抗体は、ミクログリアによるタウ取り込みを増加させる
ミクログリアは、残屑の蓄積を防止し、修復プロセスが起こるのを可能にするために、中枢神経系中の細胞外材料を取り除く際に重要な役割を果たす。神経変性疾患に関連して、凝集体、オリゴマー及びモノマー形態を含む細胞外タンパク質の食作用が、これらの種の細胞外濃度を低下させるのに役立つ。エフェクター機能（すなわち、ウサギＩｇＧ Ｆｃ）を有する抗体クローン＃４４（クローン２）及び＃６６（クローン１）は、タウ単独又はタウ及びアイソタイプ対照ＩｇＧ条件のいずれかと比較して、ヒトｉＰＳＣ由来ミクログリアによるモノマー及び凝集されたタウの両方の取り込みを増加させる。データは、エフェクター機能を有する治療用抗体（例えば、ｈＩｇＧ１としてフォーマットされる）が、ミクログリアによるタウの毒性形態のクリアランスを増加させ、それによって、ＣＮＳにおけるタウの毒性形態の細胞外濃度及び有害な影響を減少させることを示唆する。この活性は、治療的に有益であることが予測されるであろう。
実施例１６．ヒトＡＤ ＣＳＦは、Ｃ末端タウを含有する。
抗体が、インビボ／患者中のタウを有効に標的とするために、関連するタウ種が、細胞外に存在しなければならない。対象とするエピトープ（配列番号１）を含有する細胞外タウ種の存在を実証するために、本発明者らは、抗体クローン＃４４（クローン２）を用いてＡＤ患者から得られたプールされた脳脊髄液（ＣＳＦ）試料からタウを精製した。次に、結合タンパク質を、トリプシンを用いて消化させ、質量分析法によって分解した（図４）。抗体エピトープに隣接して位置するＣ末端ペプチド（ＳＰＶＶＳＧＤＴＳＰＲ；２Ｎ４Ｒタウのアミノ酸３９６～４０６に対応する；配列番号１２）を含む複数のタウペプチドを同定した。これらのデータは、ＡＤ ＣＳＦにおける抗体エピトープ（配列番号１）及び他のＣ末端領域の両方を含むタウ種の存在を確認し、細胞外にこのような種の存在を実証する。したがって、これらのＣ末端タウ含有種は、治療用抗体によって標的化可能であり、バイオマーカー検出に利用され得る流体中に存在する。
実施例１７．抗タウＩｇＧは、ヒト星状膠細胞へのモノマー及び凝集されたタウの取り込みを阻害する
限られた情報が、ヒト星状膠細胞による細胞外タウ種の取り込みについて入手可能であるが、これは、げっ歯類において起こることが知られている（Martini-Stoica et al. J Exp Med 215(9): 2355-2377 (2018)）。さらに、ニューロンタウ取り込みについて最近記載された受容体、リポタンパク質受容体関連タンパク質１（ＬＲＰ１）が、星状膠細胞において発現されることが報告され（Rauch et al. Nature 580(7803):381-385 (2020)）、これは、取り込みの機構が共有され得ることを示唆する。アルツハイマー病及びタウオパチーにおけるタウ病変の伝播における推定的役割を有する、中枢神経系における主要な細胞型として（Sidoryk-Wegrzynowicz & Struzynska Biochem J 476(22):3493-3504 (2019)において概説される）、本発明者らは、２Ｎ４Ｒタウ（配列番号１）のアミノ酸３６９～３８１に対応する配列を標的とする抗体が、星状膠細胞によるタウ種の取り込みに影響を与えるかどうかを調べた。
ヒトｉＰＳＣ由来星状膠細胞は、モノマー及び凝集されたタウ種の両方を容易に取り込む。抗タウクローン＃４４とのタウのインキュベーションは、抗体の非存在下での取り込みと比較して、モノマー２Ｎ４Ｒタウの取り込みを９８．４±０．４％だけ、及び凝集されたタウの取り込みを４３．３±２．９％だけ有意に（Ｐ＜０．００１）阻害する。データは、配列番号１を標的とする治療用抗タウ抗体が、星状膠細胞によるタウの毒性形態の取り込みを減少させ、それによって、タウ病変の伝播における星状膠細胞の影響を減少させるというエビデンスを提供する。この活性は、治療的に有益であることが予測される。
実施例１８．モノクローナル抗タウキメラヒトＩｇＧ１は、ヒトｉＰＳＣ由来ミクログリアによるモノマー及び凝集されたタウの取り込みを増加させる
実施例１５に記載されるように、エフェクター機能を有するモノクローナル抗タウウサギＩｇＧは、ミクログリアによるモノマー及び凝集されたタウの両方の取り込みを増加させた。タウ取り込みのこの増加は、抗タウヒトＩｇＧ１でも観察される。キメラヒトＩｇＧ１として表される（すなわち、エフェクター機能を有する）抗体クローン＃６６（クローン１）は、タウ単独の取り込みと比較して、ヒトｉＰＳＣ由来ミクログリアによるモノマー（５６±７％だけ；Ｐ＜０．００１）及び凝集されたタウ（５９±９％だけ；Ｐ＜０．０５）の両方の取り込みを有意に増加させた。アイソタイプ対照ヒトＩｇＧ１は、抗体の非存在下でのベースラインタウ取り込みと比較して、モノマー（６．７±６％の減少）又は凝集されたタウ（２３±９％の減少）のミクログリア取り込みに有意な効果を与えなかった。データは、治療用ｈＩｇＧ１が、ミクログリアによる細胞外タウのクリアランスを増加させ、それによって、ＣＮＳにおけるタウの細胞外濃度及び細胞外形態の有害な影響を減少させるというさらなるエビデンスを提供した。この活性は、治療的に有益であることが予測される。
１８．１ キメラｈＩｇＧ１抗体の生成：キメラｈＩｇＧ１を、独自の方法（HEXpress（商標）サービス）を用いて、ウサギＶＨ及びＶＫ配列（配列番号１１６及び１１７、クローン１、＃６６）を用いて、Absolute Antibody（Oxford, UK）によって生成した。簡潔に述べると、抗体を、ＨＥＫ２９３細胞内での一過性の発現の後に生成し、親和性精製し、緩衝液をリン酸緩衝生理食塩水に交換し、滅菌ろ過し、＜１ＥＵ／ｍｇのエンドトキシンを含む＞９８％の純度（ＳＤＳ－ＰＡＧＥに基づく）で得た。
１８．２ ヒトｉＰＳＣ由来ミクログリアの生成：ミクログリア培養物へのヒト多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の分化を、Brownjohn et al. Stem Cell Rep10(4):1294-1307 (2018)によって記載されるように行った。ＮＤＣバックグラウンドからのｉＰＳＣ系統を使用した。ミクログリア前駆細胞を収集し、９６ウェルプレートにおいて平板培養し、使用前に約１４日間にわたって完全ミクログリア培地中で維持した（Brownjohn et al., 2018に記載されるように）。使用の前日に、培養物を、無血清培地（１０ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ及び１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３４（Peprotech, NJ, USからの増殖因子）を補充されたRPMI 1640/Glutamax）に入れ替え、食作用実験を、無血清条件において完了させた。
１８．３ 凝集された（オリゴマー）タウ種の生成：実施例１２．２を参照。
１８．４ 精製された組み換えタウの標識：実施例１２．３を参照。
Ｐ３０１Ｓタウを、モノマー及び凝集されたタウ調製の両方に使用した。
１８．５ ヒトｉＰＳＣ由来ミクログリアによるタウ取り込みの定量：モノマータウ（２５ｎＭ）及び凝集されたタウ（５０ｎＭ）を、無血清ミクログリア培地中で調製し、３７℃で９０分間にわたって、１：１０の比率の抗体：タウ（すなわち、それぞれ２．５及び５ｎＭのＩｇＧ）と共にインキュベートした。抗タウｈＩｇＧ１を、アイソタイプ対照（抗フルオレセイン［４－４－２０（強化された）］、Absolute Antibody, Oxford, UK）と比較した。１００μＬの抗体／タウ混合物を、ｉＰＳＣ由来ミクログリアに加え、画像を、Incucyte S3イメージングシステム（Sartorius, Goettingen, Germany）を用いてウェル当たり９つの視野から３７℃／５％のＣＯ２で、１６時間にわたって３０分ごとに撮影した（明視野及びオレンジ色チャネル）。オレンジ色チャネル（励起：５１３～５６８ｎｍ）における蛍光の（ウェル当たりの）平均面積を定量するためのアルゴリズムを、細胞が占める平均面積（ファージ面積）に対して正規化し、これを、時間の経過とともにｎ＝４細胞からの平均＋／－ＳＥＭとしてプロットした。テューキーの多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを、抗体なし対照に対して実行して、有意差を決定した。
実施例１９．抗タウＩｇＧは、高い親和性でタウに結合する
抗タウＩｇＧは、高い親和性で完全長２Ｎ４Ｒタウ（配列番号２）に結合する。クローン＃６６（クローン１）及びクローン＃４４（クローン２）は、それぞれ２．３９ｎＭ及び３．８３ｎＭのＫＤで、完全長組み換え２Ｎ４Ｒタウに結合する（表９）。これらの抗体の結合親和性は、この配列が利用可能である場合、２Ｎ４Ｒタウ（配列番号１）のアミノ酸３６９～３８１に対応するエピトープを含有する任意のタウ種に相当するであろうことが予測される。
１９．１ キメラｈＩｇＧ１抗体の生成：クローン＃６６ ｈＩｇＧ１を、実施例１８．１に記載されるように生成した。クローン＃４４ ｈＩｇＧ１を、ウサギＶＨ及びＶＫ配列（配列番号１１８及び１１９、親ＶＨ及びＶＫとしてクローン２、＃４４）を用いて及び独自の方法を用いて、Abzena（Cambridge, UK）によって生成した。簡潔に述べると、抗体を、ＣＨＯ細胞内での一過性の発現の後に生成し、親和性精製し、緩衝液をリン酸緩衝生理食塩水に交換し、滅菌ろ過し、＞９８％の純度（サイズ排除クロマトグラフィーの後）で得た。
１９．２ タウへの抗体結合の評価：完全長組み換え２Ｎ４Ｒタウ（Rpeptide；配列番号２）への抗タウｈＩｇＧ１の結合を、Biacore T200 Evaluation Software V2.0.1を実行するBiacore T200（GE Healthcare, Chicago, IL, USA）を用いて評価した。ｈＩｇＧ１を、２５℃で、ランニングバッファー（１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含有するＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液）中で、プロテインＡ捕捉センサーチップに固定化し、１０μＬ／分で約５０ＲＵまで捕捉した。マルチサイクル動態実験（クローン＃６６）では、組み換え２Ｎ４Ｒタウを、１５０秒の結合時間及び２５０秒の解離時間で、４０μＬ／分でランニングバッファー中０．３９ｎＭ～５０ｎＭの範囲の濃度で流動させた。マルチサイクル動態実験のための最適化条件を、クローン＃４４に適用し：組み換え２Ｎ４Ｒタウを、６０秒の結合時間及び２００秒の解離時間（分析フィットを改善するために６５秒まで減少される）で、０．３９ｎＭ～１２．５ｎＭ（２倍希釈）の範囲の濃度で流動させた。曲線を、モック固定化された（抗体が存在しない）参照細胞と比較した。
データを、表面における１：１相互作用を表すLangmuir（１：１）結合分析を用いて分析した：
Figure 2023531822000011
式中：ｋａは、結合速度定数（Ｍ－１ｓ－１）であり、ｋｄは、解離速度定数（ｓ－１）である。
フィットの近さは、実験及びフィット曲線の間の逸脱を表すカイ二乗値において判断される：
Figure 2023531822000012
式中：ｒｆは、所与の点においてフィット値であり、ｒｘは、同じ点における実験値であり、ｎは、データ点の数であり、ｐは、フィットパラメータの数である。フィッティングアルゴリズムは、カイ二乗を最小化すべきである。
Figure 2023531822000013
実施例２０：抗タウ抗体は、領域３７３ＴＨＫＬＴＦＲ３７９内で異なるエピトープに結合する。
エピトープ精密マッピングを、抗体結合に必要とされる２Ｎ４Ｒタウ；配列番号１のアミノ酸３６９～３８１内の重要な残基を同定するために行った。置換分析において、抗体への結合についての残基の重要性を評価するために、各残基が、他のアミノ酸へと突然変異される。
抗体クローン＃４４（クローン２）について、置換分析は、領域におけるアミノ酸残基、３７３ＴＨＫＬＴＦＲ３７９が、結合のために重要であることを示す（図５Ａ）。特に、これらの残基の置換としての残基、Ｔ３７３、Ｋ３７５、Ｔ３７７及びＲ３７９は、全ての置換についての強度の低下をもたらす。Ｋ３７５、Ｔ３７７及びＲ３７９の置換は、シグナル強度をバックグラウンドレベルに低下させ、これは、それらが、このクローンの結合のために重要であることを示唆する。
抗体クローン＃６６（クローン１）について、３７４ＨＫＬ３７６及び３７８ＦＲ３７９は、結合のために重要である（図５Ｂ）。特に、Ｌ３７６又はＦ３７８の置換は、全ての置換についての減少した抗体結合をもたらし、これは、これらの残基の重要な役割を示唆する。
アイソタイプ対照ウサギＩｇＧのわずかな結合が、このシステムにおいて検出され（図５Ｃ）、これは、抗タウ抗体クローン＃４４及び＃６６について得られたＥＬＩＳＡシグナルがＣＤＲ特異的であることを示す。
データは、クローン＃４４（クローン２）及び＃６６（クローン１）によって例示される、本明細書に記載される抗体が、ペプチド配列内の異なる特定のエピトープ（２Ｎ４Ｒタウ；配列番号１のアミノ酸３６９～３８１）に結合することを実証する。記載される抗体は、機能特性を共有し、これは、機能転帰を決定するのが、この配列内の及びこの配列によって形成されるエピトープであることを示す。
２０．１ エピトープ置換走査分析－ペプチド合成：置換分析を、独自の方法を用いてPepscan Presto BV（Lelystad, the Netherlands）によって行った。簡潔に述べると、ペプチドのライブラリーを、Ｆｍｏｃベースの固相ペプチド合成を用いて合成した。アミノ官能化ポリプロピレン担体が、独自の親水性ポリマー製剤によるグラフト、続いて、Ｎ－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）と共にジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を用いたｔ－ブチルオキシカルボニル－ヘキサメチレンジアミン（ＢｏｃＨＭＤＡ）との反応、及びトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いたＢｏｃ基のその後の切断によって得られた。標準的なＦｍｏｃ－ペプチド合成を用いて、カスタム修正されたJANUS liquid handling stations（Perkin Elmer）によってアミノ官能化固体担体上でペプチドを合成した。
各アミノ酸が、一度に１つずつ、あらゆる他の天然アミノ酸に突然変異されるように、ペプチドを、出発ペプチド（３６９ＫＫＩＥＴＨＫＬＴＦＲＥＮ３８１；配列番号１）に基づいて設計した。ミニカード（mini-card）におけるペプチドの順序を無作為化し、データを、アイソタイプ対照抗体（ウサギＩｇＧ；Abcam, Cambridge, UK）による得られたものと比較した。
２０．２ エピトープ置換走査分析－ＥＬＩＳＡスクリーニング：合成ペプチドのそれぞれへの抗体の結合を、PepscanベースのＥＬＩＳＡにおいて試験した。ペプチドアレイを、一次抗体溶液（５μｇ／ｍＬ；４℃で一晩）と共にインキュベートした。洗浄した後、ペプチドアレイを、２５℃で１時間にわたってブタ抗ウサギＩｇＧペルオキシダーゼコンジュゲート（DAKO, Jena, Germany）の１／１０００希釈物と共にインキュベートした。洗浄した後、ペルオキシダーゼ基質２，２’－アジノ－ジ－３－エチルベンズチアゾリンスルホネート（ＡＢＴＳ）及び２０μＬ／ｍＬの３％のＨ２Ｏ２を加えた。１時間後、発色を測定した。発色を、電荷結合デバイス（ＣＣＤ）－カメラ及び画像処理システムを用いて定量した。ＣＣＤカメラから得られた値が引用される（範囲：０～３０００ｍＡＵ）。
データが、試験される各ペプチドについて得られたＥＬＩＳＡシグナルを示す文字プロットとして示される。最大ＥＬＩＳＡシグナルからの観察された逸脱は、標的ペプチドへの試験抗体の変化した（減少した）結合に関連する突然変異を示す。
実施例２１：抗体クローン＃４４のヒト化
ウサギ抗体クローン＃４４は、Antitopeによって開発され、Abzenaによって商品化されたComposite Human Antibody Technology（商標）を用いてヒト化された。ヒト化プロセスの目的は、親抗体の抗原結合親和性を保持しながら、長期の治療的処置としての非ヒトモノクローナル抗体の使用に関連する免疫原性の可能性を低下させることである。
合計で６つのＶＨ（配列番号１５１～１５６）及び４つのＶＫ配列（配列番号１５７～１６０）を設計し（図６に要約される）、２４の新規なヒト化変異体を生成するために全ての可能な組合せで発現させた。哺乳類細胞内で発現されるとき、ＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ３、ＶＨ４又はＶＨ５を含有する変異体は、完全長組み換え２Ｎ４Ｒタウに結合する抗体を形成する（図７）。バックグラウンドＥＬＩＳＡシグナルは低く、これは、抗体関連シグナルが、タウとの特異的な相互作用に起因することを実証する。ヒト化変異体の発現レベルは、ＨＥＫ２９３細胞における一過性のトランスフェクションの後、可変であるため（表１０を参照）、上清の単一の希釈物から得られたＥＬＩＳＡシグナルは、結合親和性の指標とならない。
Biacore単一サイクル動態（ＳＣＫ）実験は、抗体ＫＤの計算を可能にする。ヒト化変異体について、ＫＤは、３．２ｎＭ～１４．２ｎＭの範囲である（ＶＨ１ＶＫ１及びＶＨ５ＶＫ３のそれぞれについて；表１０に要約される）。ＶＨ６を含有する変異体は、２Ｎ４Ｒタウに結合せず（ＥＬＩＳＡ及びBiacoreデータに基づいて）、これは、この配列中で突然変異された残基が、タウへの親抗体の結合に必要とされ得ることを示す。特に、ＶＨ６は、タウへの結合のために必要であり得る、ＶＨ ＣＤＲ１内の突然変異（Ａ３５Ｓ；Kabatに従って命名される）を含む。
データは、元の親ＣＤＲ配列を保持するクローン＃４４のヒト化変異体が、タウへの高い親和性の結合を保持する（＜２０ｎＭ）ことを実証する。これらの抗体の結合親和性は、この配列が利用可能である場合、２Ｎ４Ｒタウ（配列番号１）のアミノ酸３６９～３８１に対応するエピトープを含有する任意のタウ種に相当するであろうことが予測される。この配列（配列番号１）は、哺乳動物種内で１００％保存されるため、ヒトタウについて記載される活性が、タウの他の哺乳動物種に適用可能であろうことが予測される。ヒト化変異体のＣＤＲ配列が、親抗体と同一であり、２Ｎ４Ｒタウへの結合が同等である際、新規な変異体のＣＤＲに駆動される生物学的活性が、親クローン＃４４と同等であろうことが予測される。
２１．１ 複合ヒト抗体可変領域の設計：抗体Ｖ領域の構造モデルを、Swiss PDB（Guex & Peitsch, Electrophoresis 18, 2714-2722, 1997）を用いて生成し、抗体の結合特性に必須である可能性が高いＶ領域における重要な「制限（constraining）」アミノ酸を同定するために分析した。いくつかのフレームワーク残基と一緒にＣＤＲ内に含まれるほとんどの残基（Kabat及びChothia定義の両方を用いて）は、重要であると見なされた。
ヒト抗体と比較した際、ウサギ重鎖の第１のアミノ酸が、クローン＃４４中に存在しない（ウサギ生殖細胞系列ＶＨ遺伝子の大部分と共通）。それは、ウサギ生殖細胞系列遺伝子のサブセットに見られるＶＨ ＦＷ３内の２つのアミノ酸欠失も含有する（図６）。
この分析に基づいて、ＣＤＲの外部に代替的な残基の広い範囲を有するが、ＣＤＲ配列内の可能な残基の狭い範囲のみを有する複合ヒト配列を生成した。予備分析は、いくつかのヒト抗体からの対応する配列セグメントが、ウサギ配列におけるものと同様又は同一のＣＤＲを生成するために組み合わされ得ることを示した。ＣＤＲの外部の領域、及びＣＤＲに隣接する領域について、ヒト配列セグメントの広い選択が、新規なヒト化Ｖ領域の可能な構成要素として同定された。
２１．２ ＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープ回避（iTope（商標）による分析）：構造分析に基づいて、ヒト化変異体を生成するのに使用され得る、配列セグメントの大きい予備セットを同定した。これらのセグメントを、ヒトＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子に結合するペプチドのインシリコ分析のために選択し、iTope（商標）技術を用いて分析した（Perry et al, Drugs R D 9(6):385-96, 2008）。iTope（商標）ソフトウェアは、ペプチドのアミノ酸側鎖及び３４ヒトＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子の特異的結合ポケットの間の好ましい相互作用を予測する。これらの対立遺伝子は、任意の特定の民族集団において最もよく見られるものによる重み付けなしで、世界的に見られる最も一般的なＨＬＡ－ＤＲ対立遺伝子を表す。主要な結合残基の位置は、試験タンパク質配列にわたる８つのアミノ酸によって重複する９量体ペプチドのインシリコ生成によって達成される。
ＭＨＣクラスＩＩ結合の低下したリスクを有すると同定された選択された配列セグメントを、減少したＴ細胞エピトープを有する完全Ｖ領域配列へと組み立てた。変異体配列が、図６に示される。
２１．３ ヒト化抗体変異体の生成：ｈＩｇＧ１の新規なヒト化変異体を、独自の方法を用いて、Abzena（Cambridge, UK）によって生成した。簡潔に述べると、複合ヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡを合成し、ヒト定常領域（ｈＩｇＧ１）を有する発現ベクターへとクローニングし、ＨＥＫ２９３細胞中に一過性にトランスフェクトした。ｈＩｇＧ１を含有する上清を収集し、分析した。
２１．４ タウ（ＥＬＩＳＡ）への抗体結合の評価：ＥＬＩＳＡプレートを、３７℃で１時間にわたって、１×炭酸塩－重炭酸塩緩衝液中の完全長２Ｎ４Ｒタウ（配列番号２）、１００ｎｇ／ウェル；又は１×ＴＢＳ中１％のＢＳＡ）で被覆した。抗原を、ウェルから除去し、次に、プレートを、１×ＴＢＳ中５％の粉乳で、室温で１時間にわたってブロックした。ブロッキング溶液を除去し、ＨＥＫ２９３細胞上清（１％のＢＳＡ／１×ＴＢＳ中の１：１００）を関連するウェルに加え、プレートを、穏やかに振とうしながら室温で１時間にわたってインキュベートした。次に、プレートを、ＴＢＳ／０．１％のTween（ＴＢＳＴ）で４回洗浄した。５％の乳／ＴＢＳ中で１：２０００に希釈されたヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＨＲＰ抗体（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）を、各ウェルに加え、プレートを、穏やかに振とうしながら室温で１時間にわたってインキュベートしてから、ＴＢＳＴで４回洗浄した。３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）ＥＬＩＳＡ溶液を、各ウェルに加え、プレートを、室温で１５分間インキュベートした。等体積の１Ｍの硫酸を、各ウェルに加え、ＯＤ を４５０ｎｍで測定した。
２１．５ タウへの抗体結合の評価（Biacore SCK分析）：完全長組み換え２Ｎ４Ｒタウ（Rpeptide；配列番号２）への抗タウｈＩｇＧ１の結合を、Biacore T200 Evaluation Software V2.0.1を実行するBiacore T200（GE Healthcare, Chicago, IL, USA）を用いて評価した。ｈＩｇＧ１を、２５℃で、ランニングバッファー（１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含有するＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液）中で、プロテインＡ捕捉センサーチップに固定化し、１０μＬ／分で約５０ＲＵまで捕捉した。単一サイクル動態実験では、組み換え２Ｎ４Ｒタウを、６０秒の結合時間及び２００秒の解離時間で、１．２５ｎＭ～１０ｎＭ（２倍希釈）の範囲の濃度で流動させた。曲線を、モック固定化された（抗体が存在しない）参照細胞と比較した。
データを、実施例１９．２に記載されるように、Langmuir（１：１）結合分析を用いて分析した。
Figure 2023531822000014
実施例２２．ヒト化抗タウＩｇＧは、高い親和性でタウに結合する
上位５つのヒト化変異体を、より大規模の発現及びさらなる特性評価のために選択した（表１０に要約されるデータに基づいて）：ＶＨ３ＶＫ３（配列番号１５３及び１５９）；ＶＨ３ＶＫ４（配列番号１５３及び１６０）；ＶＨ４ＶＫ２（配列番号１５４及び１５８）；ＶＨ４ＶＫ３（配列番号１５４及び１５９）；ＶＨ４ＶＫ４（配列番号１５４及び１６０）。ＨＥＫ２９３細胞内でのトランスフェクションから得られた収率は、予想されるより低かったため、ＣＨＯ細胞を、このより大規模の生成に使用した。
組み換え２Ｎ４Ｒタウへの抗体結合のためのBiacoreマルチサイクル動態（ＭＣＫ）分析が、図８及び表１１に要約される。全ての５つの変異体が、キメラ親抗体（ＶＨ０ＶＫ０；ＫＤ＝３．２５ｎＭ）の２倍以内のＫＤを実証する。ＲＭＡＸのわずかな変化が、リガンド捕捉の差に起因する可能性が高いと考えられ、抗体結合特性の有意な差を反映しない。
データは、ヒト化変異体が、完全長２Ｎ４Ｒタウへの親（ウサギ）抗体（ＶＨ０ＶＫ０）、クローン＃４４の結合特性を保持することを確認する。実施例２１に記載されるように、標的配列（配列番号１）が存在し、利用可能である場合、ヒトタウについて記載される活性が、タウの他の哺乳動物種に適用可能であろうことが予測される。
２２．１ プロテインＡ精製ｈＩｇＧ１抗体の生成：クローン＃４４ ＶＨ０ＶＫ０及びｈＩｇＧ１の新規なヒト化変異体を、独自の方法を用いて、Abzena（Cambridge, UK）によって生成した。簡潔に述べると、複合ヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡを合成し、ヒト定常領域（ｈＩｇＧ１）を有する発現ベクターへとクローニングし、ＣＨＯ細胞中に一過性にトランスフェクトした。ｈＩｇＧ１を含有する上清を収集し、ｈＩｇＧ１を親和性精製し、緩衝液をリン酸緩衝生理食塩水に交換し、滅菌ろ過し、次に、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によってさらに精製して、＞９９％の最終的なモノマー純度を得た。
２２．２ タウへの抗体結合の評価（Biacore MCK分析）：完全長組み換え２Ｎ４Ｒタウ（Rpeptide；配列番号２）への抗タウｈＩｇＧ１の結合を、Biacore T200 Evaluation Software V2.0.1を実行するBiacore T200（GE Healthcare, Chicago, IL, USA）を用いて評価した。ｈＩｇＧ１を、２５℃で、ランニングバッファー（１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含有するＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液）中で、プロテインＡ捕捉センサーチップに固定化し、１０μＬ／分で約５０ＲＵまで捕捉した。マルチサイクル動態実験では、組み換え２Ｎ４Ｒタウを、６０秒の結合時間及び２００秒の解離時間で、４０μＬ／分で、ランニングバッファー中０．３９ｎＭ～１２．５ｎＭの範囲の濃度で流動させた。曲線を、モック固定化された（抗体が存在しない）参照細胞と比較した。
データを、実施例１９．２に記載されるように、Langmuir（１：１）結合分析を用いて分析した。
Figure 2023531822000015
実施例２３．ヒト化ＩｇＧ変異体は、熱力学的に安定している
治療用抗体への発展のためのヒト化変異体の可能性を評価するために、それぞれの熱安定性を評価した。データが、表１２及び図９に要約される。平均溶融温度（Ｔｍ）は、ＶＨ４ＶＫ４についての６８．７℃から、ＶＨ３ＶＫ３についての７１．９℃までの範囲であり、これは、治療用抗体のために許容されると見なされる。
２３．１ 熱安定性分析：熱安定性を、SYPROオレンジを用いて評価した（Lo et al, Analytical Biochem 332(1):153-9, 2004）。試料を、表１３に示されるように調製した。９μＬの各試料混合物を、Uncle Uniマイクロキュベット中にデュプリケートで充填し、「SYPROを用いたＴｍ」適用により実行した。試料を、０．３℃／分の上昇速度及び４７３ｎｍにおける励起を用いて、１５～９５℃の温度上昇に供した。フルスペクトルを、２５０～７２０ｎｍから収集し、Uncleソフトウェアが、５１０～６８０ｎｍの曲線下面積を使用して、遷移曲線の感染点を計算した。４７３ｎｍで静的光散乱（ＳＬＳ）を監視することにより、同じ実験におけるタンパク質凝集の検出を可能にする。凝集（Ｔａｇｇ）の発現を、得られるＳＬＳプロファイルから計算した。
Figure 2023531822000016
Figure 2023531822000017
実施例２４．抗タウクローン＃４４のヒト化変異体は、ヒトｉＰＳＣ由来ニューロンへのモノマー及び凝集されたタウの取り込みを阻害する（図１０、１１）
細胞外タウの「毒性」形態のニューロン取り込みが、アルツハイマー病などのタウオパチーにおいて観察されるタウの病原性の広がりにおいて重要な役割を果たすことが示される。細胞外モノマー及び凝集されたタウは、エンドサイトーシス及びマクロピノサイトーシスの組合せを介して、ヒトニューロンによって取り込まれる（Evans et al. (2018) Cell Rep 22(13): 3612-3624）。このプロセスは、生理学的に起こるが、また、アルツハイマー病を含むタウオパチーにおいて観察されるタウの毒性形態の病原性の広がりにおいて役割を果たすことも示される。したがって、毒性タウ種の取り込みの阻害は、脳におけるタウ病変の広がりを抑える際に治療的に有益であることが予測される。タウのニューロン取り込みは、ｐＨ感受性色素、pHrodoで標識されたタウに関連する蛍光を測定することによって評価及び定量され得る。増加した蛍光は、酸性エンドソーム区画への標識化されたタウの内在化の後に起こり、それによって、タウ取り込み／内在化の動的測定を提供する。抗体クローン＃４４（クローン２）を含む、配列番号１を標的とする抗タウウサギＩｇＧは、ヒトニューロンによるこのエピトープを含有するタウ種の取り込みを減少させることが可能である（実施例１２）。この活性を示す抗体は、インビボで細胞外タウ種のニューロン間の伝播を抑制し、したがって、治療的に有用であることが予測されるであろう。
試験されるクローン＃４４の全てのヒト化変異体は、ウサギクローンと同様の程度に：４８．４±２．９％（ＶＨ３ＶＫ３）、４３．１±３％（ＶＨ３ＶＫ４）、５０±２．２％（ＶＨ４ＶＫ２）、４１．８±６．３％（ＶＨ４ＶＫ３）、６２．８±４．１％（ＶＨ４ＶＫ４）だけ、ヒトｉＰＳＣ由来ニューロンへのモノマータウの取り込みの有意に（Ｐ＜０．００１）阻害する（図１０）。試験される全てのヒト化変異体はまた、ウサギクローンと同様の程度に：３０．６±３．２％（ＶＨ３ＶＫ３）、３３．３±２．９％（ＶＨ３ＶＫ４）、４１．９±２．８％（ＶＨ４ＶＫ２）、３６．３±４．７％（ＶＨ４ＶＫ３）、３４．９±３．２％（ＶＨ４ＶＫ４）だけ、ヒトｉＰＳＣ由来ニューロンへの凝集されたタウの取り込みを有意に（Ｐ＜０．００１）阻害する（図１１）。アイソタイプ対照ヒトＩｇＧ１抗体は、このシステムにおいてタウ取り込みに有意な効果を与えなかった（モノマー及び凝集されたタウのそれぞれについて、－３．４±５．２％及び－１．２±５％の阻害）。
データは、親ウサギ抗体（＃４４、クローン２）と同様に、配列番号１のアミノ酸配列を標的とするヒト化抗体が、ヒトニューロンによるこのエピトープを含有するタウ種の取り込みを減少させることが可能であったことを実証した。したがって、このような抗体は、アルツハイマー病及びタウオパチーにおける（配列番号１）のアミノ酸配列によって形成されたこのエピトープを含む細胞外タウ種（モノマー及び多量体の両方）のニューロン間の伝播を抑制し、それによって、患者における臨床症状を軽減し／その進行を遅らせることが予測されるであろう。
２４．１ ヒトｉＰＳＣ由来大脳皮質ニューロンの生成：実施例１．１を参照。
２４．２ 凝集された（オリゴマー）タウ種の生成：タウＰ３０１Ｓ＿１０ｘｈｉｓ－ｔａｇ＿ａｖｉ－タグを、ＢＬ２１（ＤＥ３）細菌中で過剰発現させた。細胞を、BugBuster（Millipore, Burlington, MA, USA）を用いて溶解させ、精製された溶解物を、２×ＰＢＳ中の５ｍＬのHisTrapHPカラム（GE Healthcare, Chicago, IL, USA）に適用した。タウを、０～５００ｍＭのイミダゾール勾配を用いて溶離させた。ピーク画分をプールし、Superdex 200 16/60ゲルろ過カラム（GE Healthcare, Chicago, IL, USA）を用いて２×ＰＢＳ中でさらに精製した。次に、プールされた画分を、スピン濃縮器（Millipore, Burlington, MA,USA）を用いて約８ｍｇ／ｍＬに濃縮した。最終的なタンパク質濃度を、Nanodrop分析によって決定した。
８ｍｇ／ｍＬで１ｍＬのタウＰ３０１Ｓを、７２時間にわたって３７℃で、ＰＢＳ／３０ｍＭの３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）（ｐＨ７．２）中の４ｍｇ／ｍＬのヘパリン（Sigma, St Louis, MO,USA）と共にインキュベートした。凝集された材料を、９ｍＬのＰＢＳ及び１％（ｖ／ｖ）のサルコシル（Sigma, St Louis, MO,USA）中で希釈し、室温で１時間にわたって揺動させて、非凝集材料を完全に可溶化した。不溶性タウを、４℃で１時間にわたって超遠心分離によってペレット化した。ペレットを、１ｍＬのＰＢＳ中で再度懸濁させ、３×２０秒間にわたって１００Ｗで超音波処理して（Hielscher UP200St超音波照射装置；Teltow, Germany）、塊又はタンパク質を分散させ、大きいフィラメントをより小さい片へと破壊した。
２４．３ 精製された組み換えタウの標識：モノマー組み換え２Ｎ４Ｒタウは、rPeptide（Watkinsville, GA, USA）から購入された。凝集されたタウを、上述されるように調製した。組み換えモノマータウ（１５０μＭ）又は同様の凝集されたタウ濃度（約７μｇ／ｍＬ）を、室温で、暗所で２時間にわたって、１．５ｍＭのpHrodo Redマレイミド（ＤＭＳＯに溶解された）及び１．５ｍＭのトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（それぞれ１：１０：１０のモル比）と共にインキュベートした。次に、標識された試料を、５０ｍＭのホスフェート（ｐＨ７．４）及び１５０ｍＭのＮａＣｌ中で、４℃でサイズ排除クロマトグラフィー（Superdex 200 Increase 10/300 GL；GE Healthcare, Chicago, IL, USA）に供して、未反応色素を除去した。凝集体のオリゴマー状態を評価し、標識によって影響されないことが分かった。
Ｐ３０１Ｓタウを、モノマー及び凝集されたタウ調製の両方に使用した。
２４．４ ヒトｉＰＳＣ由来皮質ニューロンによるタウ取り込みの定量：モノマータウ（２５ｎＭ）及び凝集されたタウ（５０ｎＭ）を、Ｎ２Ｂ２７（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）中で調製し、３７℃で９０分間にわたってタウより１０倍モル過剰の抗体（すなわち、２５０及び５００ｎＭのＩｇＧ）と共にインキュベートした。クローン＃４４のヒト化変異体を、アイソタイプ対照ヒトＩｇＧ１（抗フルオレセイン［４－４－２０（強化された）］、Absolute Antibody, Oxford, UK）と比較した。２００μＬの抗体／タウ混合物を、ＮＤＣニューロン（６０＋日目）に加え、画像を、Incucyte S3イメージングシステム（Sartorius, Goettingen, Germany）を用いてウェル当たり９つの視野から３７℃／５％のＣＯ２で、２１時間にわたって１時間ごとに撮影した（蛍光及び明視野）。オレンジ色チャネル（励起：５１３～５６８ｎｍ）における蛍光の（ウェル当たりの）平均面積を定量するためのアルゴリズムを、細胞が占める平均面積（ファージ面積）に対して正規化し、これを、時間の経過とともに４つのウェルからの平均＋／－ＳＥＭとしてプロットした。テューキーの多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを、抗体なし対照に対して実行して、有意差を決定した。
実施例２５．抗タウＩｇＧクローン＃４４のヒト化変異体は、ヒト星状膠細胞へのモノマー及び凝集されたタウの取り込みを阻害する（図１２、１３）
細胞外タウの星状膠細胞の取り込みが、アルツハイマー病などのタウオパチーにおいて観察されるタウの病原性の広がりにおいて役割を果たすことが示される。
限られた情報が、ヒト星状膠細胞による細胞外タウ種の取り込みについて入手可能であるが、これは、げっ歯類において起こることが知られている（Martini-Stoica et al. J Exp Med 215(9): 2355-2377 (2018)）。さらに、ニューロンタウ取り込みについて最近記載された受容体、リポタンパク質受容体関連タンパク質１（ＬＲＰ１）が、星状膠細胞において発現されることが報告され（Rauch et al. Nature 580(7803):381-385 (2020)）、これは、取り込みの機構が共有され得ることを示唆する。アルツハイマー病及びタウオパチーにおけるタウ病変の伝播における推定的役割を有する、中枢神経系における主要な細胞型として（Sidoryk-Wegrzynowicz & Struzynska Biochem J 476(22):3493-3504 (2019)において概説される）、本発明者らは、２Ｎ４Ｒタウ（配列番号１）のアミノ酸３６９～３８１に対応する配列を標的とする抗体が、星状膠細胞によるタウ種の取り込みに影響を与えるかどうかを調べた。
ヒトｉＰＳＣ由来星状膠細胞は、モノマー及び凝集されたタウ種の両方を容易に取り込む。抗体クローン＃４４（クローン２）を含む、配列番号１を標的とする抗タウウサギＩｇＧは、ヒト星状膠細胞によるこのエピトープを含有するタウ種の取り込みを減少させることができる。抗タウウサギクローン＃４４とのタウのインキュベーションは、抗体の非存在下での取り込みと比較して、モノマー２Ｎ４Ｒタウの取り込みを９８．４±０．４％だけ、及び凝集されたタウの取り込みを４３．３±２．９％だけ有意に（Ｐ＜０．００１）阻害した。このデータは、配列番号１を標的とする治療用抗タウ抗体が、星状膠細胞によるタウの毒性形態の取り込みを減少させ、それによって、タウ病変の伝播における星状膠細胞の影響を減少させるというエビデンスを提供した。この活性は、治療的に有益であることが予測される。
試験されるクローン＃４４の全てのヒト化変異体は、ウサギクローンと同様の程度に：８５．２±１．４％（ＶＨ３ＶＫ３）、８７．６±１．２％（ＶＨ３ＶＫ４）、８４．６±１．９％（ＶＨ４ＶＫ２）、８７．５±１．７％（ＶＨ４ＶＫ３）、９４．１±０．６％（ＶＨ４ＶＫ４）だけ、ヒトｉＰＳＣ由来星状膠細胞へのモノマータウの取り込みを有意に（Ｐ＜０．００１）阻害した（図１２）。試験される全てのヒト化変異体はまた、ウサギクローンと同様の程度に：４６．４±３．９％（ＶＨ３ＶＫ３）、４５．０±２．８％（ＶＨ３ＶＫ４）、４８．０±２．１％（ＶＨ４ＶＫ２）、４９．９±２．２％（ＶＨ４ＶＫ３）、６１．９±２．８％（ＶＨ４ＶＫ４）だけ、ヒトｉＰＳＣ由来星状膠細胞への凝集されたタウの取り込みを有意に（Ｐ＜０．００１）阻害した（図１３）。アイソタイプ対照ヒトＩｇＧ１（抗フルオレセイン［４－４－２０（強化された）］、Absolute Antibody, Oxford, UK）は、このシステムにおいてタウ取り込みに有意な効果を与えなかった（モノマー及び凝集されたタウのそれぞれについて、－１．６±４．５％及び１．８±３．９％の阻害）。
データは、親ウサギ抗体（＃４４、クローン２）と同様に、配列番号１によって形成されたエピトープを標的とするヒト化抗体が、ヒト星状膠細胞によるこのエピトープを含有するタウ種の取り込みを減少させることが可能であったことを実証した。この活性は、治療的に有益であることが予測される。
２５．１ ヒトｉＰＳＣ由来星状膠細胞の生成：星状膠細胞へのヒトｉＰＳＣの分化を、ＮＤＣバックグラウンドからのｉＰＳＣ系統を用いて行った。神経上皮シートを、皮質ニューロンについて記載されるように生成した（Shi et al., Nature Protocols 7(10): 1836-46, 2012；工程３１に従ったプロトコル）。１６日目から、細胞を、新しいMatrigel被覆プレート（１．５×１０６個の細胞／６ウェルプレートのウェル）中でAccutaseを用いて継代し、１日置きに培地を交換しながら、７日間にわたって、「星状膠細胞分化培地１」（２０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２、２０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦが補充された；Shi et al., Nature Protocols 7(10): 1836-46, 2012に記載されるニューロン維持培地）に移した。次に、細胞を、新しいMatrigel被覆プレート中でAccutaseを用いて継代し（上記のように）、１日置きに培地を交換しながら、７日間にわたって、「星状膠細胞分化培地２」（１０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ、１０ｎｇ／ｍＬのＣＮＴＦ、１μＭのパルモルファミンが補充されたニューロン維持培地）に移した。次に、星状膠細胞を、使用まで（約１３０＋日の時点）、「成熟培地」（Neurobasal培地、１×Ｂ２７補給剤、１％のＦＢＳ、５０Ｕ／ｍＬのペニシリン及び５０ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１×GlutaMAX）中で維持した。
２５．２ 凝集された（オリゴマー）タウ種の生成：実施例２４．２を参照。
２５．３ 精製された組み換えタウの標識：実施例２４．３を参照。
Ｐ３０１Ｓタウを、モノマー及び凝集されたタウ調製の両方に使用した。
２５．４ ヒトｉＰＳＣ由来星状膠細胞によるタウ取り込みの定量：モノマータウ（２５ｎＭ）及び凝集されたタウ（５０ｎＭ）を、無血清Optimem（ThermoFisher）培地中で調製し、３７℃で９０分間にわたって、１０倍モル過剰の濃度（すなわち、それぞれ２５０及び５００ｎＭのＩｇＧ）で、試験される抗体と共にインキュベートした。２００μＬの抗体／タウ混合物を、ｉＰＳＣ由来星状膠細胞に加え、画像を、Incucyte S3イメージングシステム（Sartorius, Goettingen, Germany）を用いてウェル当たり９つの視野から３７℃／５％のＣＯ２で、２０時間にわたって１時間ごとに撮影した（明視野及びオレンジ色チャネル）。オレンジ色チャネル（励起：５１３～５６８ｎｍ）における蛍光の（ウェル当たりの）平均面積を定量するためのアルゴリズムを、細胞が占める平均面積（ファージ面積）に対して正規化し、これを、時間の経過とともに４つのウェルからの平均＋／－ＳＥＭとしてプロットした。テューキーの多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを、抗体なし対照に対して実行して、有意差を決定した。
この実験において、抗ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照を使用した（抗フルオレセイン［４－４－２０（強化された）］、Absolute Antibody, Oxford, UK）。
実施例２６．モノクローナル抗タウクローン＃４４ヒトＩｇＧ１のヒト化変異体は、ヒトｉＰＳＣ由来ミクログリアによるモノマー及び凝集されたタウの取り込みを増加させる（図１４、１５）
ミクログリアは、残屑の蓄積を防止し、修復プロセスが起こるのを可能にするために、中枢神経系中の細胞外材料を取り除く際に重要な役割を果たす。神経変性疾患に関連して、凝集体、オリゴマー及びモノマー形態を含む細胞外タンパク質の食作用が、これらの種の細胞外濃度を低下させるのに役立つ。ｈＩｇＧ１としての試験されるクローン＃４４の全てのヒト化変異体は、１６．１±１％（ＶＨ３ＶＫ３）、８０．３±０．８％（ＶＨ３ＶＫ４）、７１．４±１．６％（ＶＨ４ＶＫ２）、６０．２±１．１％（ＶＨ４ＶＫ３）、５９．４±１．４％（ＶＨ４ＶＫ４）だけ、ヒトｉＰＳＣ由来ミクログリアへのモノマータウの取り込みを有意に（Ｐ＜０．００５）増加させた（図１４）。ｈＩｇＧ１としての試験される全てのヒト化変異体はまた、７７．７±２．１％（ＶＨ３ＶＫ３）、８３．９±２．４％（ＶＨ３ＶＫ４）、９７．６±２．２％（ＶＨ４ＶＫ２）、９０．５±２．８％（ＶＨ４ＶＫ３）、１１４．６±３．３％（ＶＨ４ＶＫ４）だけ、ヒトｉＰＳＣ由来ミクログリアへの凝集されたタウの取り込みを有意に（Ｐ＜０．００１）増加させた（図１５）。アイソタイプ対照抗体は、このシステムにおいてタウ取り込みに有意な効果を与えなかった（モノマー及び凝集されたタウのそれぞれについて、９．４±１．５％の減少及び１５．７±２．２％の増加）。
データは、親抗体（＃４４、クローン２）と同様に、エフェクター機能を有する配列番号１を標的とする治療用抗体（例えば、ｈＩｇＧ１としてフォーマットされる）が、ミクログリアによる、標的化配列（配列番号１）を含有する細胞外タウのクリアランスを増加させ、それによって、ＣＮＳにおける細胞外タウの細胞外濃度及び有害な影響を減少させ得ることを実証した。この活性は、治療的に有益であることが予測される。
２６．１ ｈＩｇＧ１抗体の生成：実施例２２．１を参照。
２６．２ ヒトｉＰＳＣ由来ミクログリアの生成：ミクログリア培養物へのヒト多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の分化を、Brownjohn et al. (2018) Stem Cell Rep 10(4):1294-1307によって記載されるように行った。ＮＤＣバックグラウンドからのｉＰＳＣ系統を使用した。ミクログリア前駆細胞を収集し、９６ウェルプレートにおいて平板培養し、使用前に約１４日間にわたって完全ミクログリア培地中で維持した（Brownjohn et al., 2018に記載されるように）。使用の前日に、培養物を、無血清培地（１０ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ及び１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３４（Peprotech, NJ, USからの増殖因子）を補充されたRPMI 1640/Glutamax）に入れ替え、食作用実験を、無血清条件において完了させた。
２６．３ 凝集された（オリゴマー）タウ種の生成：実施例２４．２を参照。
２６．４ 精製された組み換えタウの標識：実施例２４．３を参照。Ｐ３０１Ｓタウを、モノマー及び凝集されたタウ調製の両方に使用したことに留意されたい。
２６．５ ヒトｉＰＳＣ由来ミクログリアによるタウ取り込みの定量：モノマータウ（２５ｎＭ）及び凝集されたタウ（５０ｎＭ）を、無血清ミクログリア培地中で調製し、３７℃で９０分間にわたって、１：１０の比率のタウ：抗体（すなわち、それぞれ２．５及び５ｎＭのＩｇＧ）と共にインキュベートした。抗タウｈＩｇＧ１を、アイソタイプ対照（抗フルオレセイン［４－４－２０（強化された）］、Absolute Antibody, Oxford, UK）と比較した。１００μＬの抗体／タウ混合物を、ｉＰＳＣ由来ミクログリアに加え、画像を、Incucyte S3イメージングシステム（Sartorius, Goettingen, Germany）を用いてウェル当たり９つの視野から３７℃／５％のＣＯ２で、１５時間にわたって３０分ごとに撮影した（明視野及びオレンジ色チャネル）。オレンジ色チャネル（励起：５１３～５６８ｎｍ）における蛍光の（ウェル当たりの）平均面積を定量するためのアルゴリズムを、細胞が占める平均面積（ファージ面積）に対して正規化し、これを、時間の経過とともにｎ＝４細胞からの平均＋／－ＳＥＭとしてプロットした。テューキーの多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを、抗体なし対照に対して実行して、有意差を決定した。引用されるタウ取り込みの増加が、「タウなし」対照に対して計算される。
実施例２７．モノクローナル抗タウクローン＃４４のヒト化変異体は、非認知症対照死後脳ではなく家族性アルツハイマー病における高及び低ＭＷタウ種の増加したレベルを検出する（図１６）
抗タウ抗体クローン＃４４のヒト化変異体は、非認知症対照（ＮＤＣ）試料ではなく、死後家族性アルツハイマー病（ｆＡＤ；プレセニリン１突然変異）大脳皮質試料におけるタウの疾患関連形態を検出する。ウエスタンブロットは、５つの変異体：ＶＨ３ＶＫ３、ＶＨ３ＶＫ４、ＶＨ４ＶＫ２、ＶＨ４ＶＫ３及びＶＨ４ＶＫ４が、試験されるＮＤＣ試料中に存在しない複数の高（＞７５ｋＤ）及び低（＜４０ｋＤ）分子量種を含むＮＤＣ試料と比較して、代表的なｆＡＤにおけるタウの増加したレベルを検出したことを実証した（図１６）。アクチン対照は、脳溶解物試料の等しい負荷を確認した。検出されたタウ種は、親抗体（＃４４ ＶＨ０ＶＫ０）と同様のパターンを示し、これは、親ウサギクローン＃４４の結合特性が、ヒト化変異体によって保持されていたことを実証する。
２７．１ ヒト脳試料：詳細については実施例８．１を参照。
２７．２．タンパク質抽出：ｉＰＳＣ由来ニューロン培養物を、プロテアーゼ阻害剤（cOmplete Mini, EDTA free, Roche Diagnostics, Rotkreux, Switzerland）が補充されたＲＩＰＡ緩衝液（Sigma, St Louis, MO, USA）を用いて溶解させた。タンパク質濃度を、Pierce BCA Protein Assay Kit（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）を用いて測定し、規定される場合、脳溶解物を、製造業者の指示に従って、λタンパク質ホスファターゼ（ｌ－ＰＰ）；（New England Biolabs, Ipswich, MA, USA）で処理した。
２７．３ ウエスタンブロット法：２０μＬの総体積中４０μｇのタンパク質（特に記載しない限り）を、１２％のMini-Protean TGX precast gel（Bio-Rad, Hercules, CA,USA）に充填し、４℃で２時間にわたって、２００ｍＡで０．２μｍのＰＶＤＦ膜（GE Healthcare Life science, Chicago,IL, USA）に移した。膜を、室温で１時間にわたって、ブロッキング溶液（５％の乾燥脱脂粉乳、ＰＢＳ中０．１％のTween）中でインキュベートした。
２７．４ 抗体インキュベーション：タンパク質移動膜を、一次抗体（規定の濃度で）を用いて室温で一晩調べた。続いて、膜を、室温で１時間にわたって、Tidyblot（Bio-Rad, Hercules, CA, USA；１：２００）と共にインキュベートした。Tidyblotを、標準的な二次抗体の代わりに使用して、死後脳試料中に存在する汚染ヒトＩｇＧの影響を最小限に抑えた。
２７．５ 膜の視覚化：各膜を、強化された化学発光（ＥＣＬ）ウエスタンブロット法検出試薬（GE Healthcare Life Science, Chicago, IL, USA）を用いて検出し、ImageQuant LAS 4000（GE Healthcare Life Science, Chicago, IL, USA）を用いて視覚化した。
２７．６ β－アクチン正規化：β－アクチンが、ローディングコントロールとして含まれていた。第１の抗体をイメージングした後、複合体を、室温で２５分間にわたって、Restore PLUS Western Blot Stripping Buffer（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）を用いてＰＶＤＦ膜から除去した。膜を、室温で１時間にわたって、ブロッキング溶液と共にインキュベートした。各膜を、マウスモノクローナル抗β－アクチン（Sigma, St Louis MO, USA；１：１０００）、又はＴｕＪ１一次抗体（R&D Systems, Minneapolis, MN, USA；１：１０００）により調査し、次に、ヤギ抗マウスＩｇＧ－ペルオキシダーゼ二次抗体（Sigma, St Louis, MO,USA；１：２０００）と共にインキュベートした。両方の抗体を、連続して室温で１時間にわたってインキュベートした。
実施例２８．ヒト化変異体＃４４ ＶＨ４ＶＫ４は、非認知症対照脳と比較して、家族性アルツハイマー病、散発性アルツハイマー病及びレビー小体認知症脳における高及び低ＭＷタウ種の増加したレベルを検出する。
＃４４のヒト化変異体が、タウオパチーの範囲にわたって及び患者試料のパネルにわたって疾患関連タウ種を検出する親ウサギＩｇＧの能力を保持したことを確認するために、親クローン＃４４（ウサギＩｇＧ）及びヒト化変異体＃４４ ＶＨ４ＶＫ４（ｈＩｇＧ１）を、より詳細にプロファイルした。予想どおり、ヒト化変異体＃４４ ＶＨ４ＶＫ４は、親クローン＃４４と同様に機能し、家族性アルツハイマー病（ｆＡＤ）、散発性アルツハイマー病（ｓＡＤ）及びレビー小体認知症（ＤＬＢ）を表す患者試料のパネルにわたって、高及び低ＭＷ種の両方の増加したレベルを検出した（図１７）。アクチン及びニューロンチューブリン対照は、タウレベルの変化が、試験される試料におけるタンパク質及び／又はニューロンレベルの変化に起因しなかったことを確認した。データは、親クローン＃４４及びヒト化抗体変異体ＶＨ４ＶＫ４の両方が、抗体クローン＃６６（クローン１）について記載されるものと同様に疾患関連タウ種を検出したことを確認し、実施例２１について記載されるヒト化変異体のパネル、並びに配列番号１に結合する任意の他の抗体のヒト化変異体が、同様に挙動する可能性が高いことを示唆した。したがって、疾患特異的タウ種への、＃４４ ＶＨ４ＶＫ４、又は代替的なヒト化変異体の結合は、ＡＤ及びタウオパチーの治療において治療的に有用である可能性を有する。
さらに、市販のＮ末端（タウ１３）、中間領域（ＨＴ７及びタウ５）及び遠位Ｃ末端タウ（タウ４６）抗体によるタウ種の検出は、より高い及びより低い分子量範囲の両方で、ｆＡＤ、ｓＡＤ及びＤＬＢ脳試料にわたって疾患特異的タウ種の限られた検出を示した（図１７）。データは、２Ｎ４Ｒタウ（配列番号１）のアミノ酸３６９～３８１に対応する配列を標的とする抗体が、タウのＮ末端、中間領域又は遠位Ｃ末端領域を標的とするある範囲の抗体によって検出されない疾患特異的タウ種に結合し、したがって、標的化配列に関連する固有の及び有益な特性を示すことを実証した。
２８．１ ヒト脳試料：ヒト死後脳試料の由来については実施例８．１を参照。全ての試料は、臨床的に及び病理学的に確認された散発性アルツハイマー病（ブラークステージ６）又はＤＬＢの個体の前頭葉に由来した。非認知症対照脳試料が、認知症の臨床兆候又はＡＤ／タウオパチーの病理学的兆候を示さなかった（ブラークステージ０）年齢を適合させた個体に由来した。対照個体の死亡の原因は、示される場合、死後検出されるタウレベル／種に影響を与えることが予測されないであろう。
２８．２ ウエスタンブロット：詳細については実施例２７を参照。
使用される市販の抗体は、ＨＴ７（アミノ酸１５９～１６３を標的とする；Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）、タウ５（アミノ酸２１０～２４１を標的とする；Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）、タウ１３（アミノ酸２～１８を標的とする；Abcam, Cambridge,UK）、又はタウ４６（アミノ酸４０４～４４１を標的とする；New England Biolabs, Ipswich, MA, USA）であった。
実施例２９．ヒト化抗体クローン＃４４ ＶＨ４ＶＫ４の親和性成熟
ヒト化抗体クローン＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４を、ＶＨ ＣＤＲ３（ライブラリー１）、ＶＬ ＣＤＲ３（ライブラリー２Ａ及び２Ｂ）並びにＶＨ ＣＤＲ２（ライブラリー３）における残基を突然変異させるために、縮重オリゴ（ＮＮＫ）による従来の突然変異誘発手法を用いて親和性成熟した。ライブラリーを、ｓｃＦｖとして表し、複数回の可溶性及び受動的選択の両方を完了させて、最も高い親和性ｓｃＦｖを同定した。ライブラリー２Ａは、さらなる研究に値するクローンを生じなかった。受動的選択のいずれも、ポリクローナルファージＥＬＩＳＡにおける結合を示さなかった。合計で２４８６の個々のクローンを、ファージＥＬＩＳＡにおいてスクリーニングした：ライブラリー１から９４５、ライブラリー２Ｂから２２２、及びライブラリー３から１３１９。次に、８８のクローンを、最終的な結合ＥＬＩＳＡのために取った：ライブラリー３から６４、ライブラリー２Ｂから１及びライブラリー１から２３。このプレートは、２０の固有のＶＨ配列（ライブラリー３から１５、ライブラリー１から５）を含んでいた。
２０の新しいＶＨ（配列番号１８３～２０６）及び１つの新しいＶＫ配列（配列番号２０７）に、優先順位を付け（配列アラインメントが、図１８に示される）、必要に応じて親ＶＨ（ｐＶＨ）又はＶＫ（ｐＶＬ）と組み合わせて発現させて、２１の新しい変異体を生成した。哺乳類細胞内で発現されるとき、全ての新しいＩｇＧ変異体は、ＥＬＩＳＡによって実証されるように、完全長組み換え２Ｎ４Ｒタウに結合する抗体を形成する（図１９）。バックグラウンドＥＬＩＳＡシグナルは低く、これは、抗体関連シグナルが、タウとの特異的な相互作用に起因することを実証する。全ての上清を、濃度一致させ、３０ｎｇ／ｍＬで試験した。
Biacore単一サイクル動態（ＳＣＫ）実験は、抗体ＫＤの計算を可能にする。新しい変異体では、ＫＤは、５９３ｐＭ～３４．２ｎＭの範囲である（それぞれＨ０４／ｐＶＬ及びＨ１８／ｐＶＬについて；表１５に要約される）。Ｈ０６、Ｈ０７、Ｈ０９、Ｈ１３又はＨ１４を、新規なＶＬ変異体、Ｌ２と組み合わせたさらなる変異体を試験した。ｐＶＬと組み合わされた同じＶＨより良好に機能したものはなく、これは、ＶＬ ＣＤＲ３が、タウへの抗体結合の主要な決定因子ではないことを示唆する。
親和性成熟は、親ヒト化クローン＃４４ ＶＨ４ＶＫ４（配列番号１５４／配列番号１６０）よりタウに対するより高い親和性を有する４つの新規な抗体をもたらした：Ｈ０１／ｐＶＬ（配列番号１８３／配列番号１６０）、Ｈ０２／ｐＶＬ（配列番号１８４／配列番号１６０）、Ｈ０４／ｐＶＬ（配列番号１８６／配列番号１６０）、Ｈ０６／ｐＶＬ（配列番号１８８／配列番号１６０）。これらのクローンは全て、ＶＨ ＣＤＲ３における突然変異を含み、Ｈ０６は、ＶＨ ＣＤＲ２突然変異も含み、これは、タウへの＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４関連抗体結合のための主要な領域としてのＶＨ ＣＤＲ２及びＶＨ ＣＤＲ３を暗示している。ＶＬ ＣＤＲ３（ライブラリー２Ａ及び２Ｂ）の突然変異は、抗体親和性の改善を生じなかった。
Ｈ０６－０１／ｐＶＬ、Ｈ０６－０２／ｐＶＬ、Ｈ０６－０４／ｐＶＬを形成するためのＨ０１、Ｈ０２又はＨ０４（ＶＨ ＣＤＲ３）によるＨ０６（ＶＨ ＣＤＲ２）の組み換えは、元のＨ０６／ｐＶＬクローンと比較して、親和性の増加をもたらさなかった（表１６を参照）。Ｈ０４ ＣＤＲ３によるＨ１６ ＣＤＲ２のさらなる組み換えはまた、元のクローンと比較して、親和性の増加を生じなかった。
データは、タウとの＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４関連抗体相互作用の親和性を決定する際のＶＨ ＣＤＲ３及びＶＨ ＣＤＲ２の重要性を実証した。特に、表１４に示されるように。
Figure 2023531822000018
Abzenaの独自のiTope分析を、優先順位を付けられたリードにおける高親和性結合部位の存在を最小限に抑える目的で、予測されるＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドの存在を評価するために実行した。この分析の要約が、表１６に示される。新規なＶＨクローンは、１～４つの予測される高親和性部位（親＃４４＿ＶＨ４について１と比較される）及び２～５つの中程度の親和性の部位（親＃４４＿ＶＨ４について４と比較される）を含有する。単一の新規なＶＫクローンは、親＃４４＿ＶＫ４クローン２つの中程度の親和性及び２つの高親和性部位を共有する。
２９．１ ファージディスプレイによる親和性成熟－ライブラリー設計及び構築：ライブラリーを、ＶＨ ＣＤＲ３（Ｄ９５～Ｐ１０２の領域、ライブラリー１）；ＶＨ ＣＤＲ２（Ｃ５０～Ｆ５８の残基、一定に保たれるＩ５１、Ｇ５５及びＴ５７を除く、ライブラリー３）、ＶＬ ＣＤＲ３（Ｌ８９～Ｓ９３、Ｎ９６及びＶ９７、ライブラリー２Ａ；位置Ｃ９４及びＣ９５Ｄにおける２つのＣｙｓ間の４つの残基、両方のＣｙｓが一定に保たれる；ライブラリー２Ｂ）における領域を突然変異させるために、上記で概説されるように設計した。ライブラリーを、標準的な方法を用いて構築した。オリゴを、ＮｃｏＩ又はＮｏｔＩ制限部位を有する標的化配列に無作為化を導入するように設計した。全ての３つのライブラリーのための、精製され、増幅されたＤＮＡを、ＮｃｏＩ及びＮｏｔＩを用いて消化させ、同様に切断されたファージミドベクター（ｐＡＮＴ６５）へとライゲートした。ライゲートされたＤＮＡを、清浄化し、Roche HP PCR Product Purification Kit（Roche Life Sciences, Burgess Hill, UK）を用いてヌクレアーゼフリー水に溶離させ、エレクトロポレーションによって、新たに調製されたエレクトロコンピテントＴＧ１細胞へと変換した。翌日、コロニーを計数し、プレートを擦り取り、グリセロールストックを調製した。ライブラリーを、理論的なライブラリー多様性を十分にカバーするために、複数回エレクトロポレートした。ライブラリーのそれぞれについて、１０倍以上のカバー率が得られた。これは、全ライブラリーの９９％をカバーする統計的確率を与える。
２９．２ 親和性成熟－ライブラリーファージレスキュー：４つのライブラリーからの細菌を、観察されたライブラリー多様性の少なくとも１００倍での接種材料を用いて１５０ｍＬの２ＴＹＣＧ（２％）培養物に接種した。培養物を、中間対数期（mid-log phase）（ＯＤ６００ｎｍ≒０．４）になるまで増殖させ、細胞の総数を推定した（１≒５×１０８個の細胞／ｍＬのＯＤ６００ｎｍに基づいて）。ヘルパーファージ（Ｍ１３Ｋ０７）（New England BioLabs, Hitchin, UK）を、１０の感染多重度で加え、１５０ｒｐｍで１時間インキュベートし、次に、遠心分離し、２ＴＹＣＫ培地中で再度懸濁させ、３０℃で一晩増殖させた。翌日、ファージを、遠心分離によって培養上清を回収した後、冷却された２０％のＰＥＧ／２．５ＭのＮａＣｌの３／１０ｔｈの体積を用いて沈殿させることによって収集した。氷上での１時間のインキュベーションの後、沈殿されたファージを、遠心分離によって回収し、ペレットを、１×ＰＢＳ ｐＨ７．４中で再度懸濁させた。上清を、再度遠心分離して、細胞残屑を除去し、その後、上清を、上述されるように再度沈殿させた。沈殿されたファージを、１×ＰＢＳ ｐＨ７．４中で再度懸濁させた。
２９．３ 親和性が改善されたファージの選択：親和性改善に基づいた溶液選択のために、ライブラリーのそれぞれを、ＭＰＢＳ（３％の乳を含有する）で予めブロックし、次に、ファージを、室温で１時間にわたって、減少する濃度の可溶性ビオチン化完全長タウ（５０ｎＭ）と共にインキュベートした。予めブロックされたストレプトアビジン常磁性ビーズを、各選択に加え、５分間にわたって回転させた。ストレプトアビジン－抗原－ファージ複合体を、KingFisher １ｍＬ（ThermoFisher, Waltham, USA）を用いて、ＰＢＳＴによる８回の洗浄工程、続いて、ＰＢＳ洗浄で洗浄した。ファージを、５０ｍＭのＨＣｌの添加によってビーズから溶離させ、次に、１Ｍのトリス－ＨＣｌ ｐＨ９．０の添加によって中和した。次に、ファージを、対数期ＴＧ１細胞へと感染させ、カルベニシリンを含有するＬＢ寒天プレートにおいて沈着させた。全ての選択のために、「抗原なし」対照選択を、抗原を省略する以外は上述されるプロトコルに従って行った。抗原を用いた又は用いない選択からの出力プレートにおけるコロニーの数の比較は、任意の特定の選択の成功についての情報を提供する。
受動的な選択のために、ライブラリーのそれぞれを、ＭＰＢＳ（５％の乳を含有する）で予めブロックし、次に、ファージを、減少する濃度の非ビオチン化完全長ヒトタウ（２２．２ｎＭ）で被覆された免疫チューブ（immune tube）を用いてインキュベートし、室温で１時間にわたってＭＰＢＳでブロックした。抗原－ファージ複合体を、ＰＢＳＴで３回、続いてＰＢＳ洗浄で洗浄した。ファージを、５０ｍＭのＨＣｌの添加によってビーズから溶離させ、次に、１Ｍのトリス－ＨＣｌ ｐＨ９．０の添加によって中和した。次に、ファージを、溶液選択について記載されるように、対数期ＴＧ１細胞へと感染させた。
２９．４ ｓｃＦｖの発現及び試験：可溶性ｓｃＦｖを、最初に発現させ、単一点結合ＥＬＩＳＡフォーマットにおいて、ＩＰＴＧ誘導後に培地中に分泌されるタンパク質として、タウへの結合について試験した。選択された選択出力からの個々のコロニーを、１ｍＬの２ＴＹＣＧ（０．１％）培地中に取り、３７℃で５時間にわたって振とうすることによって増殖させた。培養物を、ＩＰＴＧを、１ｍＭの最終濃度になるまで加えることによって誘導し、次に、３０℃で振とうしながら、一晩増殖させた。翌日、培養物を、遠心分離し、上清を、ＥＬＩＳＡ（１：２０希釈）によって試験した。全てのライブラリーのために、培地中で発現された、ｓｃＦｖからのコロニーを、親ｓｃＦｖによりスクリーニングし、非関連ｓｃＦｖが、対照として各アッセイプレートに含まれていた。
Nunc Immuno MaxiSorp ９６ウェル平底マイクロタイタープレートを、４℃で一晩、１．０μｇ／ｍＬで、５０μＬのタウで被覆した。プレートを洗浄し、５％のＭＰＢＳで、室温で１時間ブロックした。発現されたｓｃＦｖを含有する誘導された培地を、１：２０に希釈し、ブロックされたプレート（ウェル当たり１００μＬ）に加え、室温で１時間にわたってプレート上でインキュベートした。次に、プレートを洗浄し、標的へのｓｃＦｖの結合を、抗ＨＩＳ抗体－ＨＲＰ（Sigma-Aldrich, Dorset, UK）を用いて検出し、ＴＭＢ基質（Invitrogen, Loughborough, UK）を用いて発色させた。反応を、１ＭのＨＣｌを用いて停止させ、吸光度を、Dynex Technologies MRX TC IIプレートリーダーにおいて４５０ｎｍで読み取り、結合データをプロットした。
２９．５ ＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープ回避（iTope（商標）による分析）：実施例２１．２を参照。
２９．６ 新規な抗体変異体の生成：実施例２１．３を参照。
２９．７ タウ（ＥＬＩＳＡ）への抗体結合の評価：実施例２１．４を参照。ここで、上清を、３０ｎｇ／ｍＬに濃度一致させた（標準的な方法を用いてAbzenaによって計算される、力価のOctetベースの推定を用いて）。
２９．８ タウへの抗体結合の評価（Biacore SCK分析）：実施例２１．５を参照。
Figure 2023531822000019
Figure 2023531822000020
Figure 2023531822000021
Figure 2023531822000022
Figure 2023531822000023
実施例３０．親和性成熟ＩｇＧは、高い親和性でタウに結合する
上位４つの親和性成熟ヒト化変異体を、ｈＩｇＧ１としてのより大規模の発現及びさらなる特性評価のために選択した（表１７に要約されるデータに基づいて）：＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４＿Ｈ０１／ｐＶＬ（配列番号１８３及び配列番号１６０）；＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４＿Ｈ０２／ｐＶＬ（配列番号１８４及び配列番号１６０）；＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４＿Ｈ０４／ｐＶＬ（配列番号１８６及び配列番号１６０）；及び＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４＿Ｈ０６／ｐＶＬ（配列番号１８８及び配列番号１６０）。ＣＨＯ細胞を、このより大規模の生成に用いて、収率を最大にした。＿Ｈ０１、＿Ｈ０２などとして言及される場合、これらのクローンが、＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４に由来し、親ＶＬ（ｐＶＬ）を含むことが理解されるべきである。全てのクローンを、ヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１）として発現させた。クローンが異なるアイソタイプ／フォーマットとして示される場合、結合特性は変化されないであろうことが予想される。
組み換え２Ｎ４Ｒタウへの抗体結合についてのBiacoreマルチサイクル動態（ＭＣＫ）分析が、図２０及び表１８に要約される。全ての４つの変異体は、親＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４よりタウに対するより高い親和性を実証する：並行して試験される親ＩｇＧについての７．７６ｎＭと比較して、０．７３６ｎＭ（＿Ｈ０４）、１．５２ｎＭ（＿Ｈ０２）、１．５３ｎＭ（＿Ｈ０６）、及び４．０１ｎＭ（＿Ｈ０１）。ＲＭＡＸのわずかな変化は、リガンド捕捉の差に起因する可能性が高いと考えられ、抗体結合特性の有意な変化を反映しない。
実施例２１に記載されるように、標的配列（配列番号１）が存在し、入手可能である場合、ヒトタウについて記載される活性が、タウの他の哺乳動物種に適用可能であろうことが予測される。
３０．１ プロテインＡ精製ｈＩｇＧ１抗体の生成：実施例２２．１を参照。
３０．２ タウへの抗体結合の評価（Biacore MCK分析）：実施例２２．２を参照。この実験において、流量が、１００μＬ／分まで増加されて、質量輸送制限の影響を最小限に抑えることに留意されたい。
Figure 2023531822000024
実施例３１．親和性成熟ＩｇＧは、熱力学的に安定している
治療用抗体への発展のための親和性成熟ヒト化変異体の可能性を評価するために、それぞれの熱安定性を評価した。データが、表１９及び図３６に要約される。平均溶融温度（Ｔｍ）は、＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４＿Ｈ０６／ｐＶＬについての６４．２℃から、＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４＿Ｈ０１／ｐＶＬについての６９．６℃までの範囲であり、これは、治療用抗体のために許容されると見なされる。
Figure 2023531822000025
３１．１ 熱安定性分析：実施例２３．１を参照。
実施例３２．抗体＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４の親和性成熟変異体は、ヒトニューロンへのモノマー及び凝集されたタウの取り込みを阻害する
実施例１２及び２４に記載されるように、細胞外タウの「毒性」形態のニューロン取り込みが、アルツハイマー病などのタウオパチーにおいて観察されるタウの病原性の広がりにおいて重要な役割を果たすことが示される。抗体クローン＃４４（クローン２）を含む、配列番号１を標的とする抗タウウサギＩｇＧは、ヒトニューロンによるこのエピトープを含有するタウ種の取り込みを減少させることが可能である（実施例１２）。この活性を示す抗体は、インビボで標的エピトープを含む細胞外タウ種のニューロン間の伝播を抑制し、したがって、治療的に有用であることが予測されるであろう。
試験されるクローン＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４の全ての親和性成熟ヒト化変異体（ｈＩｇＧ１として）は、親ヒト化＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４クローンと同様又はより大きい程度に：７０．６±４．３％（＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４）と比較して、８９．２±１．５％（Ｈ０１／ｐＶＬ）、８４．１±１．９％（Ｈ０２／ｐＶＬ）、８１．８±１．７％（ＶＨ０４／ｐＶＬ）、７１．０±４．１％（Ｈ０６／ｐＶＬ）だけ、ヒトｉＰＳＣ由来ニューロンへのモノマータウの取り込みを有意に（Ｐ＜０．００１）阻害した（図２２）。試験される全てのヒト化変異体はまた、親ヒト化クローン、＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４と同様の程度に：５８．０±４．７％（＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４）と比較して、６１．１±４．８％（Ｈ０１／ｐＶＬ）、５９．２±６．４％（Ｈ０２／ｐＶＬ）、６５．５±３．８％（Ｈ０４／ｐＶＬ）、５５．０±４．９％（Ｈ０６／ｐＶＬ）だけ、ヒトｉＰＳＣ由来ニューロンへの凝集されたタウの取り込みを有意に（Ｐ＜０．００１）阻害した（図２３）。アイソタイプ対照ヒトＩｇＧ１抗体は、このシステムにおいてタウ取り込みに有意な効果を与えなかった（モノマー及び凝集されたタウのそれぞれについて、６．２±７．０％及び１４．３±６．８％の阻害）。タウ取り込みの絶対レベル及び抗体媒介性阻害の絶対レベルのいくらかの変化が、これらの複合細胞ベースモデルにおいて予想されることが留意されるべきである。この変化は、通常の実験的変動に加えて、タウ取り込みに必要とされるタンパク質の発現の変化に起因する可能性が高い。この実施例に示されるデータは、複数の実験実行において観察されるデータを代表するものである。
データは、親ヒト化抗体（＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４）のように、配列番号１のアミノ酸配列を標的とする親和性成熟抗体が、ヒトニューロンによる、このエピトープを含有するタウ種の取り込みを減少させることが可能であったことを実証した。したがって、このような抗体は、アルツハイマー病及びタウオパチーにおける（配列番号１）のアミノ酸配列によって形成されるエピトープを含む細胞外タウ種（完全長及び切断型を含む、モノマー及び多量体）のニューロン間の伝播を抑制し、それによって、患者における臨床症状を軽減し／その進行を遅らせることが予測されるであろう。示されるデータを、ｈＩｇＧ１を用いて生成した。この活性は、ＣＤＲ依存的であり（アイソタイプ依存的ではなく）、したがって、これらのクローンが、異なるアイソタイプ／フォーマットとして示される場合、変化されないことが予測されるであろう。
３２．１ ヒトｉＰＳＣ由来大脳皮質ニューロンの生成：実施例１．１を参照。
３２．２ タウ種の生成及び標識：実施例２４．２、２４．３を参照。Ｐ３０１Ｓタウを、モノマー及び凝集されたタウ調製の両方に使用したことに留意されたい。
３２．３ ヒトｉＰＳＣ由来皮質ニューロンによるタウ取り込みの定量：実施例２４．４を参照。
実施例３３．抗体＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４の親和性成熟変異体は、ヒト星状膠細胞へのモノマー及び凝集されたタウの取り込みを阻害する
実施例１７及び２５に記載されるように、細胞外タウの星状膠細胞の取り込みが、アルツハイマー病などのタウオパチーにおいて観察されるタウの病原性の広がりにおいて役割を果たすことが示される。抗体クローン＃４４（クローン２）を含む、配列番号１を標的とする抗タウウサギＩｇＧ、及びこのクローン（抗体＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４を含む）のヒト化変異体は、ヒト星状膠細胞による、このエピトープを含有するタウ種の取り込みを減少させることが可能であった（実施例１７）。この活性を示す抗体は、治療的に有用であると予測される。
試験されるクローン＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４の全ての親和性成熟ヒト化変異体は、５２．３±３．４％（＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４）と比較して、６７．５±２．５％（Ｈ０１／ｐＶＬ）、６４．７±３．５％（Ｈ０２／ｐＶＬ）、３５．６±４．４％（Ｈ０４／ｐＶＬ）、３５．１±４．３％（Ｈ０６／ｐＶＬ）だけ、ヒト星状膠細胞へのモノマータウの取り込みを有意に（Ｐ＜０．００１）阻害した（図２４）。試験される全てのヒト化変異体はまた、ウサギクローンと同様の程度に：４１．３±２．９％（＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４）と比較して、３８．６±３．２％（Ｈ０１／ｐＶＬ）、４３．３±３．１％（Ｈ０２／ｐＶＬ）、３２．６±３．０％（Ｈ０４／ｐＶＬ）、３９．１±２．９％（Ｈ０６／ｐＶＬ）だけ、ヒト星状膠細胞への凝集されたタウの取り込みを有意に（Ｐ＜０．００１）阻害する（図２５）。アイソタイプ対照ヒトＩｇＧ１（抗フルオレセイン［４－４－２０（強化された）］、Absolute Antibody, Oxford, UK）は、このシステムにおいてタウ取り込みに有意な効果を与えなかった（モノマー及び凝集されたタウのそれぞれについて、－１．７±６．３％及び－６．７±３．５％の阻害）。親和性成熟抗体によって達成される阻害の大きさは、所与の実験において比較される際、親＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４クローンと同様であった。タウ取り込みの絶対レベル及び抗体媒介性阻害の絶対レベルのいくらかの変化が、これらの複合細胞ベースモデルにおいて予測されることに留意されるべきである。この変化は、通常の実験的変動に加えて、タウ取り込みに必要とされるタンパク質の発現の変化に起因する可能性が高い。この実施例に示されるデータは、複数の実験実行において観察されるデータを代表するものである。
データは、親ウサギ抗体（＃４４、クローン２）、及びクローン＃４４のヒト化変異体のように、配列番号１によって形成されるエピトープを標的とする＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４に基づく親和性成熟クローンが、ヒト星状膠細胞による、このエピトープを含有するタウ種（完全長及び切断型を含む、モノマー及び多量体）の取り込みを減少させることが可能であったことを実証した。この活性は、治療的に有益であることが予測される。示されるデータを、ｈＩｇＧ１を用いて生成した。この活性は、ＣＤＲ依存性であり（アイソタイプ－依存性ではなく）、したがって、これらのクローンが、異なるアイソタイプ／フォーマットとして示される場合、変化されないことが予測されるであろう。
３３．１ ヒトｉＰＳＣ由来星状膠細胞の生成：実施例１７．１を参照。
３３．２ タウ種の生成及び標識：実施例１２．２、１２．３を参照。Ｐ３０１Ｓタウを、モノマー及び凝集されたタウ調製の両方に使用したことに留意されたい。
３３．３ ヒトｉＰＳＣ由来星状膠細胞によるタウ取り込みの定量：実施例２５．４を参照。
実施例３４．抗体＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４の親和性成熟変異体は、非認知症対照死後脳ではなく家族性アルツハイマー病における高及び低ＭＷタウ種の増加したレベルを検出する
抗タウ抗体クローン＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４の親和性成熟ヒト化変異体は、非認知症対照（ＮＤＣ）試料ではなく死後家族性アルツハイマー病（ｆＡＤ；プレセニリン１突然変異）大脳皮質試料におけるタウの疾患関連形態を検出した。ウエスタンブロットは、５つの変異体（全てｈＩｇＧ１として表され；一過性のトランスフェクションからの上清として試験される）：Ｈ０１／ｐＶＬ、Ｈ０２／ｐＶＬ、Ｈ０４／ｐＶＬ、Ｈ０６／ｐＶＬ及びＨ１６／ｐＶＬが、試験されるＮＤＣ試料中に存在しない複数の高（＞７５ｋＤ）及び低（＜４０ｋＤ）分子量種を含むＮＤＣ試料と比較して、代表的なｆＡＤにおけるタウの増加したレベルを検出したことを実証する（図２６）。示されるブロットを、同一の条件を用いて並行して処理した。検出の異なるレベルは、タウに対するこれらのクローンの異なる親和性と一致しており、＿Ｈ０２／ｐＶＬ、＿Ｈ０４／ｐＶＬ及び＿Ｈ０６／ｐＶＬは、タウに対する最も高い親和性及びウエスタンブロットによるタウの最も多い検出を示す。等量のタンパク質を、ＮＤＣ及び疾患脳溶解物試料のために充填するため、検出の差は、タンパク質充填の差ではなく、ＮＤＣと比べて疾患に存在するタウ種の差に起因した。検出されたタウ種は、親ヒト化抗体（＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４）と同様のパターンを示し、これは、ひいては、元の親ウサギクローン＃４４と同様のパターンの検出を示し（実施例２７、２８）、これは、親ウサギクローン＃４４の結合特性が、ヒト化親和性成熟変異体によって保持されていることを実証する。
３４．１ ヒト脳試料：実施例８．１を参照。
３４．２ ウエスタンブロット：実施例２７を参照。
実施例３５．親和性成熟変異体抗体、＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４＿Ｈ０４／ｐＶＬ及び＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４＿Ｈ０６／ｐＶＬは、非認知症対照死後脳ではなく、家族性アルツハイマー病、散発性アルツハイマー病及びレビー小体認知症における高及び低ＭＷタウ種の増加したレベルを検出する
＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４の親和性成熟ヒト化変異体が、タウオパチーの範囲にわたって及び患者試料のパネルにわたって疾患関連タウ種を検出する親ヒト化クローン、＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４の能力を保持したことを確認するために（実施例２７、２８を参照）、４つの新規の親和性成熟ヒト化抗体、＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４＿Ｈ０１／ｐＶＬ、＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４＿Ｈ０２／ｐＶＬ、＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４＿Ｈ０４／ｐＶＬ及び＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４＿Ｈ０６／ｐＶＬ（ｈＩｇＧ１）を、より詳細にプロファイルした。予想どおり、全ての親和性成熟クローンが、親クローン＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４と同様に機能し、家族性アルツハイマー病（ｆＡＤ）患者試料のパネルにわたって高及び低ＭＷ種の両方の増加したレベルを検出した（図２７）。アクチン対照は、ｆＡＤ試料における強化されたタウ検出が、非認知症対照と比較してこれらの試料の増加したタンパク質充填に起因しないことを実証した。アクチン検出が、いくつかの疾患関連脳溶解物において低いことが留意される。これは、疾患試料におけるニューロンの変性、並びに死後採取された脳試料のある程度の試料分解に起因する可能性が高い。それにもかかわらず、この試料分解は、これらの試料におけるタウ（及び他のタンパク質）の利用可能性を増加させずに減少させることが予測され得るため、これは、非疾患脳試料と比べて疾患における増加したタウ検出の知見から逸脱しない。
ＶＨ ＣＤＲ３（＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４＿Ｈ０６／ｐＶＬ）と組み合わされたＶＨ ＣＤＲ３（＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４＿Ｈ０４／ｐＶＬ）及びＶＨ ＣＤＲ２における突然変異を表す２つのクローンをさらに調べ、散発性アルツハイマー病（ｓＡＤ）及びレビー小体認知症（ＤＬＢ）脳試料における高及び低ＭＷタウ種の増加したレベルを検出した（図２８）。アクチン及びニューロンチューブリン対照は、タウレベルの変化が、試験される試料におけるタンパク質及び／又はニューロンレベルの変化に起因しなかったことを確認した。上述されるように、アクチン検出は、いくつかの疾患関連試料において低かったが、これは、非疾患脳と比べて疾患における増加したタウ検出の知見から逸脱しない。データは、＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４に基づいて親和性成熟ヒト化抗体が、親＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４抗体及びウサギＩｇＧクローン＃４４及び＃６６について記載されるものと同様に疾患関連タウ種を検出することを確認した（実施例８、９、２７、２８）。データは、実施例２９に記載される親和性成熟ヒト化変異体のパネル、並びに配列番号１に結合する任意の他の抗体の親和性成熟ヒト化変異体が、同様に挙動する可能性が高いという予測を裏付ける。したがって、疾患特異的タウ種への、＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４＿Ｈ０４（＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４＿Ｈ０４／ｐＶＬ（配列番号１８６及び配列番号１６０））、＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４＿ＶＨ０６（＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４＿Ｈ０６／ｐＶＬ（配列番号１８８及び配列番号１６０））、又は代替的な親和性成熟ヒト化変異体の結合は、ＡＤ及びタウオパチーの治療において治療的に有用である可能性を有する。
３５．１ ヒト脳試料：実施例８．１及び９．１を参照。
３５．２ ウエスタンブロット：実施例２７を参照。
実施例３６：ヒト化抗タウ抗体は、２Ｎ４Ｒタウのアミノ酸３６９～３８１内の３７３ＴＨＫＬＴＦＲ３７９によって形成されたエピトープに結合する。
エピトープ精密マッピングを、抗体結合に必要とされる２Ｎ４Ｒタウ；配列番号１のアミノ酸３６９～３８１内の重要な残基を同定するために行った。置換分析において、抗体への結合についての残基の重要性を評価するために、各残基が、他のアミノ酸へと突然変異される。
親ウサギＩｇＧクローン＃４４（クローン２；実施例２０を参照）により生成されたデータと一致して、置換分析は、領域、３７３ＴＨＫＬＴＦＲ３７９におけるアミノ酸残基が、親和性成熟クローン、＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４＿Ｈ０４／ｐＶＬ（「＿Ｈ０４」）及び＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４＿Ｈ０６／ｐＶＬ（「＿Ｈ０６」）の結合のために重要であることを示す（図２９）。特に、これらの残基の置換としての、残基、Ｋ３７５、Ｔ３７７及びＲ３７９は、＿Ｈ０４及び＿Ｈ０６の両方のための、ほとんどの置換についての強度の低下をもたらす。Ｋ３７５、Ｔ３７７及びＲ３７９の置換は、シグナル強度をバックグラウンドレベルに低下させ、これは、それらが、これらのクローンの結合に重要であることを示唆する。Ｔ３７３、Ｌ３７６及びＦ３７８の置換は、いくつかの置換についての低下した強度をもたらし、これは、抗体結合における小さい役割を示唆する。クローン＿Ｈ０４及び＿Ｈ０６は、親ＶＨ ＣＤＲ３（＿Ｈ０４）並びにＶＨ ＣＤＲ２及びＣＤＲ３（＿Ｈ０６）の両方に対する突然変異に基づいて生成される親和性成熟クローンを反映する例として提供される。
試験試料と明らかに異なる、アイソタイプ対照ヒトＩｇＧ１の低レベルの結合が、このシステムにおいて検出され（図２９）、これは、抗タウ抗体クローン＿Ｈ０４及び＿Ｈ０６について得られたＥＬＩＳＡシグナルがＣＤＲ特異的であることを示す。
データは、親和性成熟クローン＿Ｈ０４（＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４＿Ｈ０４／ｐＶＬ（配列番号１８６及び配列番号１６０））及び＿Ｈ０６（＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４＿Ｈ０６／ｐＶＬ（配列番号１８８及び配列番号１６０））によって例示される、本明細書に記載される抗体が、ペプチド配列内の親ウサギＩｇＧ、クローン＃４４（クローンＸ）（２Ｎ４Ｒタウ；配列番号１のアミノ酸３６９～３８１）と共通の特定のエピトープを共有し；残基Ｋ３７５、Ｔ３７７及びＲ３７９が、親ウサギクローン＃４４及びヒト化クローン＃４４＿ＶＨ４ＶＫ４に基づいて生成されたヒト化、親和性成熟抗体の結合のために重要であることを実証する。小さい相互作用が、より低い濃度で（又はより低い親和性の抗体で）より容易に明らかであるため、クローン間の位置Ｔ３７３、Ｈ３７４、Ｌ３７６及びＦ３７８における置換の影響のわずかな差は、試験される抗体の親和性の差を反映する可能性が高い。
３６．１ エピトープ置換走査分析－ペプチド合成：実施例２０．１を参照。
３６．２ エピトープ置換走査分析－ＥＬＩＳＡスクリーニング：実施例２０．２を参照。
データが、試験される各ペプチドについて得られたＥＬＩＳＡシグナルを示す文字プロットとして示される。最大ＥＬＩＳＡシグナルからの観察された逸脱は、標的ペプチドへの試験抗体の変化した（減少した）結合に関連する突然変異を示す。
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Ｓｐｏｓｉｔｏ Ｔ，Ｐｒｅｚａ Ｅ，Ｍａｈｏｎｅｙ ＣＪ，Ｓｅｔｏ－Ｓａｌｖｉａ Ｎ，Ｒｙａｎ ＮＳ，Ｍｏｒｒｉｓ ＨＲ，Ａｒｂｅｒ Ｃ，Ｄｅｖｉｎｅ ＭＪ，Ｈｏｕｌｄｅｎ Ｈ，Ｗａｒｎｅｒ ＴＴ，Ｂｕｓｈｅｌｌ ＴＪ，Ｚａｇｎｏｎｉ Ｍ，Ｋｕｎａｔｈ Ｔ，Ｌｉｖｅｓｅｙ ＦＪ，Ｆｏｘ ＮＣ，Ｒｏｓｓｏｒ ＭＮ，Ｈａｒｄｙ Ｊ，Ｗｒａｙ Ｓ（２０１５）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔａｕ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｉｓ ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ ｉｎ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｎｓ ｆｒｏｍ ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ ｄｅｍｅｎｔｉａ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ １０＋１６ ｓｐｌｉｃｅ－ｓｉｔｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ＭＡＰＴ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ２４（１８）：５２６０－５２６９
配列表
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Claims (23)

  1. ヒト２Ｎ４Ｒ（アミノ酸１～４４１）タウ（配列番号２）のアミノ酸配列３６９～３８１（配列番号１）の残基によって形成されるエピトープに特異的に結合することが可能な、ヒト化抗体又はその抗原結合フラグメント。
  2. ヒト２Ｎ４Ｒ（アミノ酸１～４４１）タウ（配列番号２）のアミノ酸配列３７３～３７９（ＴＨＫＬＴＦＲ、配列番号１５０）の残基によって形成されるエピトープに特異的に結合することが可能な、ヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントであって、好ましくは、前記エピトープが、残基：Ｋ３７５、Ｔ３７７及びＲ３７９を含み、より好ましくは、前記エピトープが、残基Ｔ３７３、Ｋ３７５、Ｔ３７７及びＲ３７９を含む、請求項１に記載のヒト化抗体又はその抗原結合フラグメント。
  3. ヒトフレームワーク配列（ＦＷ１～ＦＷ４）及びＣＤＲ（それぞれ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＲＤ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）を含む抗原結合部位を含む、ヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントであって、ＨＣＤＲ１が、配列番号２０であり；ＨＣＤＲ２が、配列番号２１又は変異体であり、ここで：アミノ酸５１が、Ｃ、Ｖ及びＡから選択され；アミノ酸５４が、Ｒ、Ａ及びＳから選択され；アミノ酸５５が、Ｒ、Ａ及びＶから選択され；アミノ酸５７が、Ｇ、Ｈ、Ｎ、Ｒ、Ａ及びＳから選択され；ＨＣＤＲ３が、配列番号２２又は変異体であり、ここで：アミノ酸９６が、Ｓ、Ｖ、Ｒ及びＡから選択され；アミノ酸９８が、Ａ、Ｓ、Ｄ、Ｈ及びＴから選択され；アミノ酸１０２が、Ｐ、Ｖ及びＹから選択され；ＬＣＤＲ１が、配列番号２３であり、ＬＣＤＲ２が、配列番号２４であり、ＬＣＤＲ３が、配列番号２５又は配列番号２０７から選択される、請求項１又は請求項２に記載のヒト化抗体又はその抗原結合フラグメント。
  4. （ａ）配列番号２０、配列番号２１、配列番号１６４、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５（ＶＨ４＿Ｈ０４）；
    （ｂ）配列番号２０、配列番号２１、配列番号１６２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５（ＶＨ４＿Ｈ０２）；
    （ｃ）配列番号２０、配列番号１６７、配列番号１６６、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５（ＶＨ４＿Ｈ０６）；
    （ｄ）配列番号２０、配列番号２１、配列番号１６１、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５（ＶＨ４＿Ｈ０１）；
    （ｅ）配列番号２０、配列番号１６７、配列番号１６４、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５（ＶＨ４＿Ｈ０６＿Ｈ０４）；
    （ｆ）配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５（ＶＨ４ＶＫ４）；
    （ｇ）配列番号２０、配列番号２１、配列番号１６３、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５（ＶＨ４＿Ｈ０３）；
    （ｈ）配列番号２０、配列番号２１、配列番号１６５、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５（ＶＨ４＿Ｈ０５）；
    （ｉ）配列番号２０、配列番号１６８、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５（ＶＨ４＿Ｈ０７）；
    （ｊ）配列番号２０、配列番号１６９、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５（ＶＨ４＿Ｈ０８）；
    （ｋ）配列番号２０、配列番号１７０、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５（ＶＨ４＿Ｈ０９）；
    （ｌ）配列番号２０、配列番号１７１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５（ＶＨ４＿Ｈ１０）；
    （ｍ）配列番号２０、配列番号１７２、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５（ＶＨ４＿Ｈ１１）；
    （ｎ）配列番号２０、配列番号１７３、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５（ＶＨ４＿Ｈ１２）；
    （ｏ）配列番号２０、配列番号１７４、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５（ＶＨ４＿Ｈ１３）；
    （ｐ）配列番号２０、配列番号１７５、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５（ＶＨ４＿Ｈ１４）；
    （ｑ）配列番号２０、配列番号１７６、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５（ＶＨ４＿Ｈ１５）；
    （ｒ）配列番号２０、配列番号１７７、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５（ＶＨ４＿Ｈ１６）；
    （ｓ）配列番号２０、配列番号１７８、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５（ＶＨ４＿Ｈ１７）；
    （ｔ）配列番号２０、配列番号１７９、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５（ＶＨ４＿Ｈ１８）；
    （ｕ）配列番号２０、配列番号１８０、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５（ＶＨ４＿Ｈ１９）；
    （ｖ）配列番号２０、配列番号１８１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５（ＶＨ４＿Ｈ２０）；
    （ｗ）配列番号２０、配列番号１６７、配列番号１６１、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５（ＶＨ４Ｈ＿０６＿Ｈ０１）；
    （ｘ）配列番号２０、配列番号１６７、配列番号１６２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５（ＶＨ４＿Ｈ０６＿Ｈ０２）；
    （ｙ）配列番号２０、配列番号１７７、配列番号１６４、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５（ＶＨ４＿Ｈ１６＿Ｈ０４）；
    （ｚ）配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号１８２（ＶＫ４＿Ｌ２）；
    （ａａ）配列番号２０、配列番号１６７、配列番号１６６、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号１８２（ＶＨ４＿Ｈ０６／Ｌ２）；
    （ｂｂ）配列番号２０、配列番号１６８、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号１８２（ＶＨ４＿Ｈ０７／Ｌ２）；
    （ｃｃ）配列番号２０、配列番号１７０、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号１８２（ＶＨ４＿Ｈ０９／Ｌ２）；
    （ｄｄ）配列番号２０、配列番号１７４、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号１８２（ＶＨ４＿Ｈ１３／Ｌ２）；並びに
    （ｅｅ）配列番号２０、配列番号１５、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４及び配列番号１８２（ＶＨ４＿Ｈ１４／Ｌ２）
    から選択される、ヒトフレームワーク配列（ＦＷ１～ＦＷ４）及びＣＤＲ（それぞれ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＲＤ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）を含む抗原結合部位を含む、ヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントであって；
    前記配列が、Kabat命名法に従って定義される、請求項１～３のいずれか一項に記載のヒト化抗体又はその抗原結合フラグメント。
  5. 前記抗原結合部位が、
    （ａ）それぞれ、ＶＨ配列番号１８６及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ０４；
    （ｂ）それぞれ、ＶＨ配列番号１８４及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ０２；
    （ｃ）それぞれ、ＶＨ配列番号１８８及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ０６；
    （ｄ）それぞれ、ＶＨ配列番号１８３及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ０１；
    （ｅ）それぞれ、ＶＨ配列番号２０５及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ０６＿Ｈ０４；
    （ｆ）それぞれ、ＶＨ配列番号１５４及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４ＶＫ４（Ｅ）；
    （ｇ）それぞれ、ＶＨ配列番号１８５及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ０３；
    （ｈ）それぞれ、ＶＨ配列番号１８７及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ０５；
    （ｉ）それぞれ、ＶＨ配列番号１８９及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ０７；
    （ｊ）それぞれ、ＶＨ配列番号１９０及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ０８；
    （ｋ）それぞれ、ＶＨ配列番号１９１及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ０９；
    （ｌ）それぞれ、ＶＨ配列番号１９２及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ１０；
    （ｍ）それぞれ、ＶＨ配列番号１９３及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ１１；
    （ｎ）それぞれ、ＶＨ配列番号１９４及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ１２；
    （ｏ）それぞれ、ＶＨ配列番号１９５及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ１３；
    （ｐ）それぞれ、ＶＨ配列番号１９６及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ１４；
    （ｑ）それぞれ、ＶＨ配列番号１９７及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ１５；
    （ｒ）それぞれ、ＶＨ配列番号１９８及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ１６；
    （ｓ）それぞれ、ＶＨ配列番号１９９及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ１７；
    （ｔ）それぞれ、ＶＨ配列番号２００及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ１８；
    （ｕ）それぞれ、ＶＨ配列番号２０１及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ１９；
    （ｖ）それぞれ、ＶＨ配列番号２０２及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ２０；
    （ｗ）それぞれ、ＶＨ配列番号２０３及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４Ｈ＿０６＿Ｈ０１；
    （ｘ）それぞれ、ＶＨ配列番号２０４及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ０６＿Ｈ０２；
    （ｙ）それぞれ、ＶＨ配列番号２０６及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ１６＿Ｈ０４；
    （ｚ）それぞれ、ＶＨ配列番号１５４及びＶＬ配列番号２０７のクローンＶＫ４＿Ｌ２；
    （ａａ）それぞれ、ＶＨ配列番号１８８及びＶＬ配列番号２０７のクローンＶＨ４＿Ｈ０６／Ｌ２；
    （ｂｂ）それぞれ、ＶＨ配列番号１８９及びＶＬ配列番号２０７のクローンＶＨ４＿Ｈ０７／Ｌ２；
    （ｃｃ）それぞれ、ＶＨ配列番号１９１及びＶＬ配列番号２０７のクローンＶＨ４＿Ｈ０９／Ｌ２
    （ｄｄ）それぞれ、ＶＨ配列番号１９５及びＶＬ配列番号２０７のクローンＶＨ４＿Ｈ１３／Ｌ２；
    （ｅｅ）それぞれ、ＶＨ配列番号１９６及びＶＬ配列番号２０７のクローンＶＨ４＿Ｈ１４／Ｌ２；
    （ｆｆ）それぞれ、配列番号１５３及び配列番号１５９のクローンＶＨ３ＶＫ３（Ａ）；
    （ｇｇ）それぞれ、配列番号１５３及び配列番号１６０のクローンＶＨ３ＶＫ４（Ｂ）；
    （ｈｈ）それぞれ、配列番号１５４及び配列番号１５８のクローンＶＨ４ＶＫ２（Ｃ）；並びに
    （ｉｉ）それぞれ、配列番号１５４及び配列番号１５９のクローンＶＨ４ＶＫ３（Ｄ）
    から選択されるクローンのＶＨ及び／又はＶＬドメイン配列、又はそのようなクローンに対して少なくとも７０、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％の同一性を有するＶＨ及び／又はＶＬドメイン配列を含み；
    前記配列が、Kabat命名法に従って定義される、請求項１～４のいずれか一項に記載のヒト化抗体又はその抗原結合フラグメント。
  6. 前記抗体が、
    （ａ）それぞれ、ＶＨ配列番号１８６及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ０４；
    （ｂ）それぞれ、ＶＨ配列番号１８４及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ０２；
    （ｃ）それぞれ、ＶＨ配列番号１８８及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ０６；
    （ｄ）それぞれ、ＶＨ配列番号１８３及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ０１；
    （ｅ）それぞれ、ＶＨ配列番号２０５及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ０６＿Ｈ０４；
    （ｆ）それぞれ、ＶＨ配列番号１５４及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４ＶＫ４（Ｅ）；
    （ｇ）それぞれ、ＶＨ配列番号１８５及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ０３；
    （ｈ）それぞれ、ＶＨ配列番号１８７及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ０５；
    （ｉ）それぞれ、ＶＨ配列番号１８９及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ０７；
    （ｊ）それぞれ、ＶＨ配列番号１９０及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ０８；
    （ｋ）それぞれ、ＶＨ配列番号１９１及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ０９；
    （ｌ）それぞれ、ＶＨ配列番号１９２及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ１０；
    （ｍ）それぞれ、ＶＨ配列番号１９３及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ１１；
    （ｎ）それぞれ、ＶＨ配列番号１９４及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ１２；
    （ｏ）それぞれ、ＶＨ配列番号１９５及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ１３；
    （ｐ）それぞれ、ＶＨ配列番号１９６及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ１４；
    （ｑ）それぞれ、ＶＨ配列番号１９７及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ１５；
    （ｒ）それぞれ、ＶＨ配列番号１９８及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ１６；
    （ｓ）それぞれ、ＶＨ配列番号１９９及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ１７；
    （ｔ）それぞれ、ＶＨ配列番号２００及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ１８；
    （ｕ）それぞれ、ＶＨ配列番号２０１及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ１９；
    （ｖ）それぞれ、ＶＨ配列番号２０２及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ２０；
    （ｗ）それぞれ、ＶＨ配列番号２０３及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４Ｈ＿０６＿Ｈ０１；
    （ｘ）それぞれ、ＶＨ配列番号２０４及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ０６＿Ｈ０２；
    （ｙ）それぞれ、ＶＨ配列番号２０６及びＶＬ配列番号１６０のクローンＶＨ４＿Ｈ１６＿Ｈ０４；
    （ｚ）それぞれ、ＶＨ配列番号１５４及びＶＬ配列番号２０７のクローンＶＫ４＿Ｌ２；
    （ａａ）それぞれ、ＶＨ配列番号１８８及びＶＬ配列番号２０７のクローンＶＨ４＿Ｈ０６／Ｌ２；
    （ｂｂ）それぞれ、ＶＨ配列番号１８９及びＶＬ配列番号２０７のクローンＶＨ４＿Ｈ０７／Ｌ２；
    （ｃｃ）それぞれ、ＶＨ配列番号１９１及びＶＬ配列番号２０７のクローンＶＨ４＿Ｈ０９／Ｌ２
    （ｄｄ）それぞれ、ＶＨ配列番号１９５及びＶＬ配列番号２０７のクローンＶＨ４＿Ｈ１３／Ｌ２；
    （ｅｅ）それぞれ、ＶＨ配列番号１９６及びＶＬ配列番号２０７のクローンＶＨ４＿Ｈ１４／Ｌ２：
    （ｆｆ）それぞれ、配列番号１５３及び配列番号１５９のクローンＶＨ３ＶＫ３（Ａ）；
    （ｇｇ）それぞれ、配列番号１５３及び配列番号１６０のクローンＶＨ３ＶＫ４（Ｂ）；
    （ｈｈ）それぞれ、配列番号１５４及び配列番号１５８のクローンＶＨ４ＶＫ２（Ｃ）；並びに
    （ｉｉ）それぞれ、配列番号１５４及び配列番号１５９のクローンＶＨ４ＶＫ３（Ｄ）
    のＶＨ及び／又はＶＬドメインを含み；
    前記配列が、Kabat命名法に従って定義される、請求項１～５のいずれか一項に記載のヒト化抗体又はその抗原結合フラグメント。
  7. 競合アッセイにおいて評価されるとき、ヒト２Ｎ４Ｒ（アミノ酸１～４４１）タウ（配列番号２）のアミノ酸配列３７３～３７９（ＴＨＫＬＴＦＲ、配列番号１５０）の残基によって形成されるエピトープへの結合について、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体と競合することが可能な、ヒト化若しくはヒト抗体又はその抗原結合フラグメント。
  8. 組み換えＤＮＡ又はＲＮＡ配列の発現の産物である、請求項１～７のいずれか一項に記載の単離抗体又はその抗原結合フラグメント。
  9. 請求項１～８のいずれか一項に記載の単離抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする配列を含む単離組み換えＤＮＡ又はＲＮＡ配列。
  10. ベクターである、請求項９に記載の単離組み換えＤＮＡ配列。
  11. 発現ベクターである、請求項１０に記載の単離組み換えＤＮＡ配列。
  12. プロモーターの制御下で、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする、請求項１０又は１１に記載の単離組み換えＤＮＡ配列。
  13. 請求項８～１２のいずれか一項に記載のＤＮＡ又はＲＮＡ配列を含む宿主細胞。
  14. 請求項１～８のいずれか一項に記載の単離抗体又はその抗原結合フラグメントを発現することが可能な、請求項１３に記載の宿主細胞。
  15. 請求項１～８のいずれか一項に記載の単離抗体又はその抗原結合フラグメントを作製する方法であって、前記単離抗体又はその抗原結合フラグメントの発現に好適な条件で、請求項１３又は１４に記載の宿主細胞を培養することを含む方法。
  16. 請求項１～８のいずれか一項に記載の単離抗体又はその抗原結合フラグメント及び希釈剤、好ましくは、薬学的に許容される希釈剤を含む組成物。
  17. 薬剤として使用するための又は診断に使用するための、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は請求項１６に記載の組成物。
  18. タウオパチーの予防的若しくは治療的処置に使用するための、又はタウオパチーの予防的若しくは治療的処置のための薬剤の製造のための、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は請求項１６に記載の組成物であって、好ましくは、前記タウオパチーが、アルツハイマー病（散発性及び一遺伝子性家族性形態）、筋萎縮性側索硬化症／パーキンソン認知症複合、嗜銀顆粒病、β－プロペラタンパク質関連神経変性（ＢＰＡＮ）、英国型アミロイド血管症、脳アミロイド血管症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ボクサー認知症、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化、ダウン症、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、前頭側頭認知症（ＦＴＤ）、１７番染色体に連鎖しパーキンソン症を伴う前頭側頭認知症（ＦＴＤＰ－１７）、前頭側頭葉変性症、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、ハレルフォルデン・スパッツ病、封入体筋炎、多系統萎縮症、筋強直性ジストロフィー、Ｃ型ニーマン・ピック病、神経原線維変化を伴う非グアム島人型運動ニューロン病、パーキンソン病（散発性及び一遺伝子性家族性形態）、ピック病、脳炎後パーキンソン症、原発性年齢関連タウオパチー（ＰＡＲＴ）、プリオンタンパク質脳アミロイド血管症、進行性皮質下グリオーシス、進行性核上まひ（ＰＳＰ）、亜急性硬化性全脳炎、神経原線維変化優位型認知症、球状グリア細胞タウオパチー、グアムのパーキンソン認知症複合、進行性非流暢性失語、多発梗塞性認知症、虚血性脳卒中、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）及び脳卒中から選択される、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は請求項１６に記載の組成物。
  19. ヒトミクログリア中のタウ種の食作用を増加させ、及び／又はヒトニューロンによるモノマータウ及び凝集されたタウ種の取り込みを減少させ、及び／又はヒト星状膠細胞によるタウ種の取り込みを促進し、及び／又はヒト星状膠細胞によるタウ種の取り込みを防止し、及び／又はげっ歯類モデルにおける長期増強のタウ媒介性阻害を防止することが可能である、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は請求項１６に記載の組成物。
  20. ヒト２Ｎ４Ｒタウ（配列番号２）の残基３６９～３８１（配列番号１）によって形成されるエピトープを含む、好ましくは、ヒト２Ｎ４Ｒ（アミノ酸１～４４１）タウ（配列番号２）のアミノ酸配列３７３～３７９（ＴＨＫＬＴＦＲ、配列番号１５０）の残基によって形成されるエピトープを含むヒトタウタンパク質を同定するのに使用するための、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は請求項１６に記載の組成物。
  21. タウオパチーの診断検査に使用するための、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は請求項１６に記載の組成物。
  22. 請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は請求項１６に記載の組成物及び前記単離組み換えペプチド結合分子、抗原結合タンパク質又はそのフラグメントを含有する免疫学的（抗原－抗体）複合体を検出することが可能な試薬を含む診断キットであって、任意に、前記単離組み換えペプチド及び／又は結合分子、抗原結合タンパク質若しくはそのフラグメントが、固体担体（例えば、マイクロプレートウェル）上で免疫化され、及び／又は任意に、前記単離組み換えペプチド、結合分子、抗原結合タンパク質又はそのフラグメントを含有する前記免疫学的複合体が、ＥＬＩＳＡ若しくは代替的な免疫測定法によって、又は側方流動によって検出可能である、診断キット。
  23. １つ以上の対照標準及び／又は検体希釈液及び／又は洗浄緩衝液をさらに含む、請求項２２に記載の診断キット。
JP2022581556A 2019-06-28 2021-06-29 タウ結合分子 Pending JP2023531822A (ja)

Applications Claiming Priority (8)

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GBGB1909393.9A GB201909393D0 (en) 2019-06-28 2019-06-28 Tau epitope and binding molecules
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GBGB2009930.5A GB202009930D0 (en) 2019-06-28 2020-06-29 Tau epitodes and binding molecules
GB2009930.5 2020-06-29
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