KR20230043842A - 타우 결합 분자 - Google Patents

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KR20230043842A
KR20230043842A KR1020237002687A KR20237002687A KR20230043842A KR 20230043842 A KR20230043842 A KR 20230043842A KR 1020237002687 A KR1020237002687 A KR 1020237002687A KR 20237002687 A KR20237002687 A KR 20237002687A KR 20230043842 A KR20230043842 A KR 20230043842A
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프레드릭 라이브시
클레어 존스
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젠2 뉴로사이언스 리미티드
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Abstract

본 발명은 인간 타우 2N4R로부터의 에피토프를 포함하는 단리된 재조합 펩티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 인간 타우 2N4R로부터의 에피토프를 포함하는 단리된 재조합 펩티드에 특이적인 항체, 및 타우병증, 예컨대, 알츠하이머병의 조사, 진단 및 치료에서의 용도를 위한 상기 항체에 관한 것이다.

Description

타우 결합 분자
본 발명은 신규한 타우 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 분자, 예컨대, 항체에 관한 것이다. 본 발명은 타우병증의 치료 또는 진단에서의 용도를 위한 항-타우 결합 분자, 예컨대, 항체, 및 이의 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 항-타우 결합 분자, 예를 들어, 항체를 투여하는 것을 수반하는, 타우병증을 치료하는 방법에 관한 것이다.
미세소관-관련 단백질(microtubule-associated protein; MAP) 타우는 알츠하이머병(AD) 및 관련 타우병증의 발병에 있어 중요한 역할을 한다. 타우 병리의 발달은 진행성 뉴런 손실 및 인지 저하와 관련이 있다. 알츠하이머병(AD)을 포함하는 타우를 수반하는 치매 환자에서, 타우 병리는 예측 가능한 공간 순서로 뇌를 통해 확산되며, 이는 질병 부담과 상관 관계가 있다. 최근의 증거는 신경원섬유 병변의 뉴런 사이의 전파 및 상이한 뇌 영역에 걸친 타우 독성의 확산에 있어서 세포외 타우 종의 관여를 시사한다. 타우 전파의 기초를 이루는 메커니즘은 완전히 특징규명되지 않았지만, 시냅스 및 비-시냅스 메커니즘을 통해 인지 저하와 타우 병리의 확산 둘 모두에서 세포외 타우의 역할을 시사한다.
타우 단백질은 단일 유전자, MAPT(미세소관-관련 단백질 타우)로부터의 대체 스플라이싱에 의해 생산되고; 인간에서 MAPT 유전자는 염색체 17q21에 위치한다. 타우 단백질은 중추 신경계의 뉴런에 풍부하고, 또한 CNS 성상세포 및 희소돌기아교세포에서 매우 낮은 수준으로 발현된다. 뉴런 내에서, 타우는 고용해성 인단백질로서 축삭에서 주로 발견된다. 타우는 생리학적 결과와 병리생리학적 결과 둘 모두로 번역후 변형된다. 타우의 아세틸화, 유비퀴틴화, O-연결 N-아세틸글루코사민 변형, 메틸화 및 인산화는 모두 타우의 기능을 조절하는 것으로 기재되어 있다(Morris et al (2015) Nature Neuroscience 18:1183-1189). 또한, 타우는 절단되어, 응집체를 형성하는 향상된 능력 및/또는 신경독성 성질을 갖는 펩티드를 형성할 수 있다.
미세소관-관련 단백질 타우 및 이의 과인산화된 버전은 AD 및 전두측두 치매를 포함하여 몇몇 치매의 특징인 세포내 신경원섬유 엉킴의 주요 구성요소를 형성한다. 이러한 증거는 타우의 세포내 축적이 미세소관 분해, 수지상 척추 붕괴, 및 축삭의 변성, 뉴런과 세포 사멸 사이의 소통 오작동을 야기한다는 AD에 대한 가설의 기초를 형성한다. 따라서, 특히 인산화된 형태의 타우는 AD 및 다른 타우병증에 대한 수동 및 능동 면역요법의 개발을 위한 표적이 되어 왔다.
타우의 다양한 에피토프를 표적화하는 임상 개발에서의 면역요법은 문헌[Pedersen et al. (2015) Trends Mol Med 21(6): 394-402]에 의해 요약되어 있다:
Figure pct00001
Figure pct00002
표 1: 임상 개발에서의 면역요법
표 1에 열거된 요법 이외에, Janssen은 pT217을 특이적으로 표적화하는 항체(JNJ63733657)를 진행하고 있으며, UCB는 중간-영역 타우 서열(2N4R 타우의 아미노산 235 내지 246; UCB0107)을 표적화하는 항체로 임상 중에 있다(문헌[Sandusky-Beltran et al., 2020, Neuropharmacol.175:108104]에서 검토됨). Eisai는 또한 미세소관 결합 영역에서 항체 표적화 서열을 이용한 임상 시험을 준비하고 있다(아미노산 299 내지 303 및 362 내지 366; E2814; 문헌[Roberts et al., 2020, Acta Neuropathologica Comms 8:13]).
제US9139643B2호에는 정상 타우 단백질에 결합하지 않고 전장 인간 2N4R(아미노산 1 내지 441) 타우(SEQ ID NO: 2)의 아미노산 잔기 379 내지 408 내의 에피토프에 결합하는 미스폴딩된 및/또는 응집된 타우 단백질에 특이적인 항체가 기재되어 있으며, 타우 단백질은 완전히 인산화된 것이 바람직하다.
제US9777056B2호에는 타우 위치 396 및 타우 위치 404에서 포스포세린 잔기를 지니는 아미노산 잔기 379 내지 408 내의 타우 에피토프에 대해 발생된, 미스폴딩된 및/또는 응집 형태의 타우 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 기재되어 있다.
제WO2010144711호에는 타우 379 내지 408, 해당 명세서의 SEQ ID NO: 57, 및 타우 379 내지 391, 해당 명세서의 SEQ ID NO: 102를 포함하는 다양한 단리된 타우 펩티드를 이용한 면역화에 의해 유발된, 정상 타우 단백질에 비해 병리학적 타우 단백질에 우선적으로 결합할 수 있는 재조합적으로-생산된 항체가 기재되어 있다.
제US 2017/0260263 A1호에는 "치료용 에피토프" 타우 361-THVPGGG-367(해당 명세서의 SEQ ID NO: 101)을 포함하는 타우 펩티드가 기재되어 있다.
제US2004/0110250 A1호에는 타우 응집 및 PHF 타우의 어셈블리에 중요한 영역이 기재되어 있다. 여기에는 타우 흡수, 또는 치료용 항체는 언급되어 있지 않다. 타우 186 내지 391 작제물은 세포 내에서 발현되고, 세포내에서 단백질분해적으로 프로세싱되고, 생성된 트렁케이션된 펩티드는 세포 내에서 검출된다. 세포외 형태의 타우에 대한 논의는 없다.
제WO 2011/032155 A2호에는 타우가 칼페인에 의해 절단될 때 생성된 에피토프를 표적화하고 전장 인간 타우441 단백질에 결합하지 않는 단편-특이적 항체가 개시되어 있다.
제WO 2018/178077 A1호에는 인간 타우441 단백질의 아미노산 잔기 299 내지 318을 포함하는 에피토프에 결합하는 단클론성 항체가 개시되어 있다.
제WO 2014/159244호에는 세린 400에서 O-GlcNAc화된 타우 동형 2N4R에 결합하는 데 특이적인 항체가 개시되어 있다.
최근 연구는 뇌 세포외 공간에 위치한 질병-특이적 타우 종에 대한 독성 역할을 시사한다.
타우-매개된 시냅스 기능장애의 과정 및 타우 병리의 전파를 초기에 방해하고자 하는 신규한 치료적 접근법을 확인할 필요가 있으며; 따라서, 타우 단백질의 세포외 병리학적 종에서 특이적으로 발생하는 타우의 에피토프를 확인하고, 타우 단백질의 세포외 병리학적 종에 특이적으로 결합함으로써 질병 진행을 중단시키고자 하는 치료용 항체를 생성할 필요가 있다. 이러한 에피토프 및 이에 결합하는 분자는 또한 타우병증의 진단에 유용할 수 있다.
발명의 진술
본 발명은 하기를 제공한다:
1. 인간 2N4R(아미노산 1 내지 441) 타우(SEQ ID NO: 2)의 아미노산 서열 369 내지 381(SEQ ID NO: 1)의 잔기에 의해 형성된 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는, 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
2. 조항 1에 있어서, 인간 2N4R(아미노산 1 내지 441) 타우(SEQ ID NO: 2)의 아미노산 서열 373 내지 379(THKLTFR, SEQ ID NO: 150)의 잔기에 의해 형성된 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있고, 바람직하게는 에피토프는 잔기 K375, T377 및 R379를 포함하고, 더욱 바람직하게는 에피토프는 잔기 T373, K375, T377 및 R379를 포함하는, 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
3. 조항 1 또는 조항 2에 있어서, 인간 프레임워크 서열(FW1 내지 FW4) 및 CDR(각각 HCDR1, HCRD2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)을 포함하는 항원-결합 부위를 포함하고, HCDR1은 SEQ ID NO: 20이고; HCDR2는 SEQ ID NO: 21 또는 변이형이고, 여기서 아미노산 51은 C, V 및 A로부터 선택되고; 아미노산 54는 R, A 및 S로부터 선택되고; 아미노산 55는 R, A 및 V로부터 선택되고; 아미노산 57은 G, H, N, R, A 및 S로부터 선택되고; HCDR3은 SEQ ID NO: 22 또는 변이형이고, 여기서 아미노산 96은 S, V, R 및 A로부터 선택되고; 아미노산 98은 A, S, D, H 및 T로부터 선택되고; 아미노산 102는 P, V 및 Y로부터 선택되고; LCDR1은 SEQ ID NO: 23이고, LCDR2는 SEQ ID NO: 24이고, LCDR3은 SEQ ID NO: 25 또는 SEQ ID NO: 207로부터 선택되는, 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
4. 조항 1 내지 조항 3 중 어느 한 조항에 있어서,
(a) SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 25(VH4_H04);
(b) SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 25(VH4_H02);
(c) SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 25(VH4_H06);
(d) SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 25(VH4_H01);
(e) SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 25(VH4_H06_H04);
(f) SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 25(VH4VK4);
(g) SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 25(VH4_H03)
(h) SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 25(VH4_H05);
(i) SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 25(VH4_H07);
(j) SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 25(VH4_H08);
(k) SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 25(VH4_H09);
(l) SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 25(VH4_H10);
(m) SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 25(VH4_H11);
(n) SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 25(VH4_H12);
(o) SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 25(VH4_H13);
(p) SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 25(VH4_H14);
(q) SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 25(VH4_H15);
(r) SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 25(VH4_H16);
(s) SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 25(VH4_H17);
(t) SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 25(VH4_H18);
(u) SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 25(VH4_H19);
(v) SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 25(VH4_H20);
(w) SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 25(VH4H_06_H01);
(x) SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 25(VH4_H06_H02);
(y) SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 25(VH4_H16_H04);
(z) SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 182(VK4_L2);
(aa) SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 182(VH4_H06/L2);
(bb) SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 182(VH4_H07/L2);
(cc) SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 182(VH4_H09/L2)
(dd) SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 182(VH4_H13/L2); 및
(ee) SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 182(VH4_H14/L2)
(여기서, 서열은 카바트(Kabat) 명명법에 따라 정의됨)
로부터 선택된 인간 프레임워크 서열(FW1 내지 FW4) 및 CDR(각각 HCDR1, HCRD2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)을 포함하는 항원-결합 부위를 포함하는, 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
5. 조항 1 내지 조항 4 중 어느 한 조항에 있어서, 항원-결합 부위는
(a) 각각 VH SEQ ID NO: 186 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H04;
(b) 각각 VH SEQ ID NO: 184 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H02;
(c) 각각 VH SEQ ID NO: 188 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H06;
(d) 각각 VH SEQ ID NO: 183 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H01;
(e) 각각 VH SEQ ID NO: 205 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H06_H04;
(f) 각각 VH SEQ ID NO: 154 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4VK4(E);
(g) 각각 VH SEQ ID NO: 185 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H03;
(h) 각각 VH SEQ ID NO: 187 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H05;
(i) 각각 VH SEQ ID NO: 189 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H07;
(j) 각각 VH SEQ ID NO: 190 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H08;
(k) 각각 VH SEQ ID NO: 191 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H09;
(l) 각각 VH SEQ ID NO: 192 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H10;
(m) 각각 VH SEQ ID NO: 193 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H11;
(n) 각각 VH SEQ ID NO: 194 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H12;
(o) 각각 VH SEQ ID NO: 195 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H13;
(p) 각각 VH SEQ ID NO: 196 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H14;
(q) 각각 VH SEQ ID NO: 197 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H15;
(r) 각각 VH SEQ ID NO: 198 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H16;
(s) 각각 VH SEQ ID NO: 199 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H17;
(t) 각각 VH SEQ ID NO: 200 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H18;
(u) 각각 VH SEQ ID NO: 201 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H19;
(v) 각각 VH SEQ ID NO: 202 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H20;
(w) 각각 VH SEQ ID NO: 203 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4H_06_H01;
(x) 각각 VH SEQ ID NO: 204 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H06_H02;
(y) 각각 VH SEQ ID NO: 206 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H16_H04;
(z) 각각 VH SEQ ID NO: 154 및 VL SEQ ID NO: 207의 클론 VK4_L2;
(aa) 각각 VH SEQ ID NO: 188 및 VL SEQ ID NO: 207의 클론 VH4_H06/L2;
(bb) 각각 VH SEQ ID NO: 189 및 VL SEQ ID NO: 207의 클론 VH4_H07/L2;
(cc) 각각 VH SEQ ID NO: 191 및 VL SEQ ID NO: 207의 클론 VH4_H09/L2;
(dd) 각각 VH SEQ ID NO: 195 및 VL SEQ ID NO: 207의 클론 VH4_H13/L2;
(ee) 각각 VH SEQ ID NO: 196 및 VL SEQ ID NO: 207의 클론 VH4_H14/L2;
(ff) 각각 SEQ ID NO: 153 및 SEQ ID NO: 159의 클론 VH3VK3(A);
(gg) 각각 SEQ ID NO: 153 및 SEQ ID NO: 160의 클론 VH3VK4(B);
(hh) 각각 SEQ ID NO: 154 및 SEQ ID NO: 158의 클론 VH4VK2(C); 및
(ii) 각각 SEQ ID NO: 154 및 SEQ ID NO: 159의 클론 VH4VK3(D)
(여기서, 서열은 카바트 명명법에 따라 정의됨)
로부터 선택된 클론의 VH 및/또는 VL 도메인 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 가진 VH 및/또는 VL 도메인 서열을 포함하는, 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
6. 조항 1 내지 조항 5 중 어느 한 조항에 있어서, 항체는
(a) 각각 VH SEQ ID NO: 186 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H04;
(b) 각각 VH SEQ ID NO: 184 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H02;
(c) 각각 VH SEQ ID NO: 188 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H06;
(d) 각각 VH SEQ ID NO: 183 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H01;
(e) 각각 VH SEQ ID NO: 205 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H06_H04;
(f) 각각 VH SEQ ID NO: 154 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4VK4(E);
(g) 각각 VH SEQ ID NO: 185 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H03;
(h) 각각 VH SEQ ID NO: 187 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H05;
(i) 각각 VH SEQ ID NO: 189 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H07;
(j) 각각 VH SEQ ID NO: 190 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H08;
(k) 각각 VH SEQ ID NO: 191 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H09;
(l) 각각 VH SEQ ID NO: 192 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H10;
(m) 각각 VH SEQ ID NO: 193 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H11;
(n) 각각 VH SEQ ID NO: 194 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H12;
(o) 각각 VH SEQ ID NO: 195 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H13;
(p) 각각 VH SEQ ID NO: 196 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H14;
(q) 각각 VH SEQ ID NO: 197 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H15;
(r) 각각 VH SEQ ID NO: 198 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H16;
(s) 각각 VH SEQ ID NO: 199 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H17;
(t) 각각 VH SEQ ID NO: 200 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H18;
(u) 각각 VH SEQ ID NO: 201 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H19;
(v) 각각 VH SEQ ID NO: 202 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H20;
(w) 각각 VH SEQ ID NO: 203 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4H_06_H01;
(x) 각각 VH SEQ ID NO: 204 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H06_H02;
(y) 각각 VH SEQ ID NO: 206 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H16_H04;
(z) 각각 VH SEQ ID NO: 154 및 VL SEQ ID NO: 207의 클론 VK4_L2;
(aa) 각각 VH SEQ ID NO: 188 및 VL SEQ ID NO: 207의 클론 VH4_H06/L2;
(bb) 각각 VH SEQ ID NO: 189 및 VL SEQ ID NO: 207의 클론 VH4_H07/L2;
(cc) 각각 VH SEQ ID NO: 191 및 VL SEQ ID NO: 207의 클론 VH4_H09/L2;
(dd) 각각 VH SEQ ID NO: 195 및 VL SEQ ID NO: 207의 클론 VH4_H13/L2;
(ee) 각각 VH SEQ ID NO: 196 및 VL SEQ ID NO: 207의 클론 VH4_H14/L2;
(ff) 각각 SEQ ID NO: 153 및 SEQ ID NO: 159의 클론 VH3VK3(A);
(gg) 각각 SEQ ID NO: 153 및 SEQ ID NO: 160의 클론 VH3VK4(B);
(hh) 각각 SEQ ID NO: 154 및 SEQ ID NO: 158의 클론 VH4VK2(C); 및
(ii) 각각 SEQ ID NO: 154 및 SEQ ID NO: 159의 클론 VH4VK3(D)
(여기서, 서열은 카바트 명명법에 따라 정의됨)
의 VH 및/또는 VL 도메인을 포함하는, 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
7. 경쟁 검정에서 평가될 때 인간 2N4R(아미노산 1 내지 441) 타우(SEQ ID NO: 2)의 아미노산 서열 373 내지 379(THKLTFR, SEQ ID NO: 150)의 잔기에 의해 형성된 에피토프에 대한 결합을 위해 조항 1 내지 조항 6 중 어느 한 조항에 따른 항체와 경쟁할 수 있는, 인간화 또는 인간 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
8. 조항 1 내지 조항 7 중 어느 한 조항에 있어서, 재조합 DNA 또는 RNA 서열의 발현의 산물인, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
9. 조항 1 내지 조항 8 중 어느 한 조항에 따른 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 서열을 포함하는, 단리된 재조합 DNA 또는 RNA 서열.
10. 조항 9에 있어서, 벡터인, 단리된 재조합 DNA 서열.
11. 조항 10에 있어서, 발현 벡터인, 단리된 재조합 DNA 서열.
12. 조항 10 또는 조항 11에 있어서, 프로모터의 제어 하에 조항 1 내지 조항 8 중 어느 한 조항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는, 단리된 재조합 DNA 서열.
13. 조항 8 내지 조항 12 중 어느 한 조항에 따른 DNA 또는 RNA 서열을 포함하는, 숙주 세포.
14. 조항 13에 있어서, 조항 1 내지 조항 8 중 어느 한 조항의 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 발현시킬 수 있는, 숙주 세포.
15. 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 발현에 적합한 조건에서 조항 13 또는 조항 14에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 조항 1 내지 조항 8 중 어느 한 조항의 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제조하는 방법.
16. 조항 1 내지 조항 8 중 어느 한 조항에 따른 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 희석제, 바람직하게는 약학적으로 허용되는 희석제를 포함하는, 조성물.
17. 조항 1 내지 조항 8 중 어느 한 조항, 또는 조항 16에 있어서, 의약으로서의 용도를 위한 또는 진단에서의 용도를 위한, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 조성물.
18. 조항 1 내지 조항 8 중 어느 한 조항, 또는 조항 16에 있어서, 타우병증의 예방적 또는 치료적 치료에서의 용도를 위한, 또는 타우병증의 예방적 또는 치료적 치료를 위한 의약의 제조를 위한 것이며, 바람직하게는 타우병증은 알츠하이머병(산발성 및 단발성 가족성 형태), 근위축성 측삭 경화증/파킨슨병-치매 복합, 은친화 과립성 질환, 베타-프로펠러 단백질 관련 신경변성(BPAN), 영국형 아밀로이드 혈관병증, 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 크로이츠펠트-야콥병, 권투선수 치매, 석회화를 동반한 미만성 신경원섬유 엉킴, 다운 증후군, 만성 외상성 뇌병증(CTE), 피질기저핵 변성(CBD), 전두측두 치매(FTD), 17번 염색체와 연관된 전두측두 치매 및 파킨슨증(FTDP-17), 전두측두엽 변성, 게르스트만-슈트라우슬러-샤인커병, 할러포르덴-스파츠병, 포함체 근육염, 다계통 위축증, 근긴장 이영양증, C형 니만-피크병, 신경원섬유 엉킴을 동반한 비-구아마니안 운동 뉴런 질환, 파킨슨병(산발성 및 단발성 가족성 형태), 피크병, 뇌염 후 파킨슨증, 원발성 연령-관련 타우병증(PART), 프리온 단백질 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 진행성 피질하 신경교증, 진행성 핵상 마비(PSP), 아급성 경화성 범뇌염, 엉킴-우성 치매, 구상 신경교 타우병증, 괌의 파킨슨병 치매 복합, 진행성 비유창성 실어증, 다발성 경색 치매, 허혈성 뇌졸중, 외상성 뇌손상(TBI) 및 뇌졸중으로부터 선택되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 조성물.
19. 조항 1 내지 조항 8 중 어느 한 조항, 또는 조항 16에 있어서, 인간 미세아교세포에서 타우 종의 식세포작용을 증가시키고/시키거나 인간 뉴런에 의한 모노머성 타우 종 및 응집된 타우 종의 흡수를 감소시키고/시키거나 인간 성상세포에 의한 타우 종의 흡수를 촉진시키고/시키거나 인간 성상세포에 의한 타우 종의 흡수를 예방하고/하거나 설치류 모델에서 장기 강화의 타우-매개 억제를 예방할 수 있는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 조성물.
20. 조항 1 내지 조항 8 중 어느 한 조항, 또는 조항 16에 있어서, 인간 2N4R 타우(SEQ ID NO: 2)의 잔기 369 내지 381(SEQ ID NO: 1)에 의해 형성된 에피토프를 포함하는, 바람직하게는 인간 2N4R(아미노산 1 내지 441) 타우(SEQ ID NO: 2)의 아미노산 서열 373 내지 379(THKLTFR, SEQ ID NO: 150)의 잔기에 의해 형성된 에피토프를 포함하는 인간 타우 단백질을 확인하는 용도를 위한, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 조성물.
21. 조항 1 내지 조항 8 중 어느 한 조항, 또는 조항 16에 있어서, 타우병증에 대한 진단 검사에서의 용도를 위한, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 조성물.
22. 조항 1 내지 조항 8 중 어느 한 조항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 조항 16의 조성물 및 상기 단리된 재조합 펩티드 결합 분자, 항원-결합 단백질 또는 이의 단편을 함유하는 면역학적(항원-항체) 복합체를 검출할 수 있는 시약을 포함하는 진단 키트로서, 선택적으로 상기 단리된 재조합 펩티드 및/또는 결합 분자, 항원-결합 단백질 또는 이의 단편은 고체 지지체(예를 들어, 마이크로플레이트 웰) 상에 고정되고/되거나 선택적으로 상기 단리된 재조합 펩티드, 결합 분자, 항원-결합 단백질 또는 이의 단편을 함유하는 상기 면역학적 복합체는 ELISA 또는 대안적인 면역검정 방법에 의해 또는 측방 유동에 의해 검출 가능한, 진단 키트.
23. 조항 22에 있어서, 하나 이상의 대조 표준물 및/또는 시편 희석제 및/또는 세척 완충제를 추가로 포함하는, 진단 키트.
상세한 설명
본 발명은 인간 타우(타우1 내지 441 SEQ ID NO: 2)의 잔기 369 내지 381(KKIETHKLTFREN, SEQ ID NO: 1) 내에 형성된 에피토프를 포함하는 단리된 재조합 펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 인간화 항체 및 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 인간 타우(타우1 내지 441 SEQ ID NO: 2)의 잔기 369 내지 381(KKIETHKLTFREN, SEQ ID NO: 1) 내에 포함된 에피토프에 특이적인 CDR-기반 항원-결합 부위를 포함하는 인간화 항체 및 항원 결합 단편에 관한 것이다.
본 발명의 인간화 항체 및 이의 항원 결합 단편은 인간 타우(타우1 내지 441 SEQ ID NO: 2)의 잔기 369 내지 381(KKIETHKLTFREN, SEQ ID NO: 1)에 의해 형성된 에피토프를 포함하는 세포외 타우 종에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 인간화 항체 및 이의 항원 결합 단편은 담체 단백질 또는 검출 가능한 라벨의 접합을 위한 N-말단 시스테인(CKKIETHKLTFREN, SEQ ID NO: 13) 또는 C-말단 시스테인을 추가로 포함하는 단리된 재조합 펩티드에 특이적으로 결합할 수 있다. N-말단 시스테인을 통해 접합될 수 있는 담체 단백질은 키홀 림펫 헤모시아닌(Keyhole limpet hemocyanin; KLH), 콘콜레파스 콘콜레파스 헤모시아닌(Concholepas concholepas hemocyanin; "블루 캐리어(Blue Carrier)"), 소 혈청 알부민(Bovine serum albumin; BSA), 양이온화된 BSA(Cationized BSA; cBSA) 및 오발부민(Ovalbumin; OVA)으로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 인간화 항체 및 이의 항원 결합 단편은 KKIETHKLTFREN, SEQ ID NO: 1을 포함하는 접합체에 특이적으로 결합할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 재조합 수단에 의해 생산될 수 있다. "재조합 항체"는 재조합적으로 조작된 숙주 세포에 의해 생산된 항체이다. 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 선택적으로 단리되거나 정제된다.
"항체" 또는 "항체 분자"라는 용어는 천연 또는 부분적으로 또는 완전히 합성 생산된 면역글로불린을 나타낸다. 본 발명의 항원-결합 단백질은 항체, 바람직하게는 단클론성 항체일 수 있고, 인간 또는 비-인간, 키메라 또는 인간화일 수 있다.
항체 분자는 바람직하게는 단클론성 항체 분자이다. 항체의 예는 면역글로불린 이소형, 예컨대, 면역글로불린 G, 및 이들의 이소형 서브클래스, 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4, 뿐만 아니라 이의 단편이다. 4 개의 인간 서브클래스(IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4)는 각각 상이한 중쇄를 함유하지만; 이들은 고도로 상동성이고, 주로 힌지 영역 및 이들이 숙주 면역계를 활성화시키는 정도가 상이하다. IgG1 및 IgG4는 힌지 영역에 2 개의 사슬간 디설파이드 결합을 함유하고, IgG2는 4 개의 사슬간 디설파이드 결합을 가지고, IgG3은 11 개의 사슬간 디설파이드 결합을 가진다.
본원에서 사용되는 "항체" 및 "항체 분자"라는 용어는 항체 단편, 예컨대, Fab 및 scFv 단편을 포함하며, 단 상기 단편은 인간 타우의 잔기 369 내지 381을 포함하는 에피토프에 대한 CDR-기반 항원 결합 부위를 포함한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일-사슬 항체 분자(예를 들어, scFv) 및 도메인 항체(sdAb)를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 문맥상 달리 요구하지 않는 한, 본원에서 사용되는 "항원-결합 단백질", "항체" 또는 "항체 분자"라는 용어는 따라서 "항체 또는 이의 항원-결합 단편"과 동등하다.
항체는 면역글로불린이며, 이는 항체의 줄기인 Fc 도메인에 가요성 힌지 영역에 의해 부착된 동일한 도메인을 함유하는 2 개의 Fab 아암을 형성하여 고전적인 'Y' 형상을 제공하는 2 개의 중쇄 및 2 개의 경쇄로 이루어진 동일한 기본 구조를 가진다. Fab 도메인은 중쇄 상에 가변 중쇄(VH) 및 불변 중쇄 1(CH1) 도메인 및 경쇄 상에 가변 경쇄(VL) 및 불변 경쇄(CL) 도메인을 갖는 2 개의 가변 및 2 개의 불변 도메인으로 이루어진다. 2 개의 가변 도메인(VH 및 VL)은 구조적 프레임워크로서 작용하는 불변 도메인(CH1 및 VL)과 함께 항체의 CDR-기반 항원 특이성을 제공하는 가변 단편(Fv)을 형성한다. 각각의 가변 도메인은 상보성 결정 영역(CDR)으로 알려진 3 개의 초가변 루프를 함유한다. VH 및 VL 각각에는 3 개의 CDR(CDR1, CDR2, 및 CDR3)이 4 개의 덜 가변적인 프레임워크(FR) 영역(FR1, FW2, FW3 및 FW4)에 의해 측접되어 구조 FW1-CDR1-FW2-CDR2-FW3-CDR3-FW4를 제공한다. CDR은 항체의 표면 상에 특이적 항원 인식 부위를 제공한다.
카바트 및 ImMunoGeneTics(IMGT) 넘버링 명명법 둘 모두가 본원에서 사용될 수 있다. 일반적으로, (명시적으로 또는 문맥 상) 달리 지시되지 않는 한, 아미노산 잔기는 본원에서 카바트 넘버링 체계에 따라 넘버링된다(Kabat et al., 1991, J Immunol 147(5): 1709-19). IMGT 넘버링 체계가 사용될 때의 예들의 경우, 아미노산 잔기는 본원에서 문헌[Lefranc et al., 2005, Dev Comp Immunol 29(3): 185-203]에 기재된 ImMunoGeneTics(IMGT) 넘버링 체계에 따라 넘버링된다.
단클론성 및 다른 항체를 취하고 재조합 DNA 기술의 기법을 사용하여 일반적으로 원래 항체의 특이성을 보유하는 다른 항체 또는 키메라 분자를 생산할 수 있다. 이러한 기법은 CDR을 상이한 면역글로불린 프레임워크 내로 도입하거나, 가변 영역을 상이한 면역글로불린 불변 영역 상에 그라프팅시키는 것을 수반할 수 있다. 하나의 면역글로불린의 또 다른 면역글로불린으로의 CDR 도입은, 예를 들어, EP-A-184187, GB2188638A 또는 EP-A-239400에 기재되어 있다. 대안적으로, 하이브리도마 또는 항체 분자를 생산하는 다른 세포는 생산된 항체의 결합 특이성을 변경하거나 변경하지 않을 수 있는 유전적 돌연변이 또는 다른 변화를 거칠 수 있다.
항체 인간화는 인간 항체 프레임워크 상에 중요한 비-인간 아미노산의 전달 또는 "그라프팅"을 수반한다. 주로 이는 상보성-결정 영역(CDR)에서의 아미노산의 그라프팅을 포함하지만, 잠재적으로 또한 VH:VL 계면 및 CDR의 배향에 중요한 다른 프레임워크 아미노산을 포함한다. 인간화는 비-인간 모 항체의 원래 결합 활성을 보유하면서 면역원성의 위험을 감소시키기 위해 인간 내용물을 도입하고자 한다. "인간화 항체"라는 용어는 또 다른 포유류 종의 배선으로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 상에 그라프팅된 항체를 지칭하고자 하는 것이며; 선택적으로 추가적인 프레임워크 영역 변형은 인간 프레임워크 서열 내에서 이루어질 수 있다. "인간화 항체"라는 용어는 인간화 항체의 생물학적 성질을 조절하거나 개선하기 위해, 예를 들어, 항체의 이의 표적 에피토프에 대한 결합의 친화성을 증가시키거나, 이에 대한 온 레이트(on rate) 및/또는 오프 레이트(off rate)를 조절하기 위해 또 다른 포유류 종의 배선으로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 상에 그라프팅되고, 예를 들어, CDR 중 하나 이상에서 및/또는 하나 이상의 프레임워크 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 변형에 의해 최적화된(예를 들어, 친화성 성숙에 의해) 항체를 포함한다. "인간화 항체"라는 용어는 최적화된(예를 들어, 친화성 성숙에 의해) 인간화 항체를 포함하며, 따라서 본 발명의 인간화 항체는 인간화될 수 있거나, 인간화와 최적화 둘 모두가 될 수 있는데, 예를 들어, 인간화되고 친화성 성숙될 수 있다.
항체는 여러 방식으로 변형될 수 있으므로, "항원-결합 단백질" 또는 "항체"라는 용어는 천연 또는 전체적으로 또는 부분적으로 합성인 것에 상관없이, 면역글로불린 결합 도메인, 압타머, 아피머 또는 바이사이클릭 펩티드를 포함하는 임의의 폴리펩티드를 포함하여, 항체 단편, 유도체, 기능적 등가물 및 항체의 상동체를 포괄하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 또 다른 폴리펩티드에 융합된 면역글로불린 결합 도메인, 또는 등가물을 포함하는 키메라 분자가 포함된다. 키메라 항체의 클로닝 및 발현은 EP-A-0120694 및 EP-A-0125023에 기재되어 있다.
CDR 서열과 CH3 도메인 둘 모두를 포함하는 항체 단편의 예는 CH3 도메인에 연결된 scFv를 포함하는 미니바디이다(Hu et al. (1996) Cancer Res 56(13): 3055-61).
도메인(단일-도메인) 항체는 중쇄 항체 또는 IgG의 하나의 가변 도메인(VH)을 포함하는, 일반적으로 약 110 개 아미노산 길이의 펩티드이다. 단일-도메인 항체(sdAb)(예를 들어, 나노바디)는 단일 모노머성 가변 항체 도메인으로 이루어진 항체 단편이다. 전체 항체(2 개의 중쇄 및 2 개의 경쇄를 포함함)와 같이, 이는 특정 항원에 선택적으로 결합할 수 있는 항원-결합 단백질이다. 도메인 항체는 단지 12 kDa 내지 15 kDa의 분자량을 가지며, 따라서 2 개의 단백질 중쇄 및 2 개의 경쇄로 구성된 항체(150 kDa 내지 160 kDa)보다 훨씬 작으며, 도메인 항체는 Fab 단편(약 50 kDa, 하나의 경쇄 및 절반의 중쇄) 및 단쇄 가변 단편(약 25 kDa, 하나는 경쇄로부터 및 하나는 중쇄로부터 유래되는 2 개의 가변 도메인) 보다 훨씬 더 작다. 단일-도메인 항체는 낙타과에서 발견되는 중쇄 항체로부터 조작되었고; 이들은 VHH 단편으로 칭해진다. 연골 어류는 또한 중쇄 항체(IgNAR, '면역글로불린 신규 항원 수용체')를 가지며, 이로부터 VNAR 단편으로 불리는 단일-도메인 항체가 수득될 수 있다. 도메인(단일-도메인) 항체는 VH 또는 VL일 수 있다. 도메인 항체는 인간 또는 뮤린 기원의 VH 또는 VL일 수 있다. 대부분의 단일-도메인 항체는 중쇄 가변 도메인이지만, 경쇄 단일-도메인 항체(VL)가 또한 표적 에피토프에 특이적으로 결합하는 것으로 나타났다.
단백질 스캐폴드는 비교적 분명한 3차원 구조를 가지며, 전형적으로 항원에 결합할 수 있는 스캐폴드 내의 항원-결합 영역을 생산하기 위해 특이적 또는 무작위 아미노산 서열 변이에 순응하는 하나 이상의 영역을 함유한다.
본 발명의 인간화 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 타우의 잔기 369 내지 381에 의해 형성된 에피토프에 결합한다. 이러한 맥락에서 결합은 특이적 결합을 지칭할 수 있다. "특이적"이라는 용어는 항체 분자가 이의 특이적 결합 파트너(들), 본원에서 인간 타우의 잔기 369 내지 381 내의 에피토프 이외의 분자에 대해 임의의 유의한 결합을 나타내지 않을 상황을 지칭할 수 있다. "특이적"이라는 용어는 또한 항체가, 다수의 항원에 의해 운반되는(이러한 경우에 항체 분자는 에피토프를 운반하는 다양한 항원에 결합할 수 있을 것임) 인간 타우의 잔기 369 내지 381 내에 포함된 에피토프와 같은 특정 에피토프에 특이적인 경우에 적용 가능하다. 에피토프는 모노머성, 올리고머성 또는 응집체인 타우 종에 존재할 수 있다. 타우 종은 전장이거나 잔기 369 내지 381 외부의 영역에서 트렁케이션될 수 있다. 에피토프는 인간 타우1 내지 441(SEQ ID NO: 2)의 잔기 369 내지 381(SEQ ID NO: 1)을 포함하는 타우의 단편에 존재할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 인간화 항체 및 이의 항원-결합 단편은 이들이 결합하는 에피토프가 인간 2N4R(아미노산 1 내지 441) 타우(SEQ ID NO: 2)의 아미노산 서열 373 내지 379(THKLTFR, SEQ ID NO: 150)의 잔기에 의해 형성되는 것을 특징으로 하는 세포외 타우 종에 결합한다.
본 발명의 특히 바람직한 양태에서, 본 발명의 인간화 항체 및 이의 항원-결합 단편은 에피토프가 인간 2N4R(아미노산 1 내지 441) 타우(SEQ ID NO: 2)의 아미노산 서열 373 내지 379(THKLTFR, SEQ ID NO: 150)의 잔기에 의해 형성되고 정의되는 것을 특징으로 하는 세포외 타우 종에 결합하고, 여기서 에피토프는 잔기 K375, T377 및 R379를 포함하고, 바람직하게는 잔기 T373, K375, T377 및 R379를 포함한다(클론 2, #44에 의해 결합된 에피토프 및 이의 인간화 버전).
이러한 맥락에서 결합은 특이적 결합을 지칭할 수 있다. "특이적"이라는 용어는 항체 분자가 이의 특이적 결합 파트너(들), 여기서 인간 2N4R(아미노산 1 내지 441) 타우(SEQ ID NO: 2)의 아미노산 서열 373 내지 379(THKLTFR, SEQ ID NO: 150)의 잔기에 의해 형성된 에피토프 이외의 분자에 대해 임의의 유의한 결합을 나타내지 않을 상황을 지칭할 수 있다. "특이적"이라는 용어는 또한 항체 분자가 다수의 항원에 의해 운반되는(이러한 경우에 항체 분자는 에피토프를 운반하는 다양한 항원에 결합할 수 있을 것임) 본원에 기재된 바와 같은 인간 타우의 아미노산 서열 373 내지 379의 잔기에 의해 형성된 에피토프와 같이 특정 에피토프에 특이적인 경우에 적용 가능하다. 본원에 기재된 신규한 에피토프는 모노머성, 올리고머성 또는 응집체인 타우 종에 존재할 수 있다. 타우 종은 전장이거나 잔기 373 내지 379 외부의 영역에서 트렁케이션될 수 있다. 에피토프는 인간 타우1 내지 441(SEQ ID NO: 2)의 잔기 373 내지 379(SEQ ID NO: 150)를 포함하는 타우의 단편에 존재할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 인간화 항체 및 이의 항원-결합 단편은 이들이 결합하는 에피토프가 인간 2N4R(아미노산 1 내지 441) 타우(SEQ ID NO: 2)의 아미노산 서열 373 내지 379(THKLTFR, SEQ ID NO: 150)의 잔기에 의해 형성되는 것을 특징으로 하는 세포외 타우 종에 결합한다. 본 발명의 특히 바람직한 양태에서, 인간화 항체 및 이의 항원-결합 단편은 에피토프가 인간 2N4R(아미노산 1 내지 441) 타우(SEQ ID NO: 2)의 아미노산 서열 373 내지 379(THKLTFR, SEQ ID NO: 150)의 잔기에 의해 형성되는 것을 특징으로 하는 세포외 타우 종에 결합하고, 여기서 에피토프는 잔기 K375, T377 및 R379를 포함하고, 바람직하게는 잔기 T373, K375, T377 및 R379를 포함한다(예를 들어, 클론 2, #44에 의해 결합된 에피토프).
아미노산은 이의 1 문자 코드 또는 3 문자 코드, 또는 이들의 온전한 명칭으로 지칭될 수 있다. 20 개의 표준 아미노산 각각의 온전한 명칭뿐만 아니라 1 문자 코드 및 3 문자 코드가 하기에 제시되어 있다.
Figure pct00003
표 2. 아미노산, 1 문자 코드 및 3 문자 코드.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 클론 2(#44)의 6 개의 CDR의 세트(HCDR1(SEQ ID NO: 20), HCDR2(SEQ ID NO: 21), HCDR3(SEQ ID NO: 22), LCDR1(SEQ ID NO: 23), LCDR2(SEQ ID NO: 24), 및 LCDR3(SEQ ID NO: 25))를 포함할 수 있다(예를 들어, 카바트 명명법에 의해 정의될 때 표 5에 제시된 바와 같이).
본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 클론 2의 VH 및 VL 서열(SEQ ID NO: 118 및 119)의 인간화 변이형을 포함할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 항체의 기능적 성질이 보유되는 한, VH 및/또는 VL 서열에서 하나 이상, 예를 들어, 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개 또는 10 개의 추가 아미노산 변형을 포함할 수 있다.
변형은 아미노산 치환, 결실 또는 삽입일 수 있다. 바람직하게는, 변형은 치환이다.
하나 이상의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 바람직한 구현예에서, 치환은, 예를 들어, 하기 표에 따른 보존적 치환일 수 있다. 일부 구현예에서, 중간 열에서 동일한 카테고리의 아미노산은 서로 치환되며, 즉, 예를 들어, 비-극성 아미노산은 또 다른 비-극성 아미노산으로 치환된다. 일부 구현예에서, 가장 우측 열에서 같은 행의 아미노산은 서로 치환된다.
Figure pct00004
표 3. 아미노산
일부 구현예에서, 치환(들)은 기능적으로 보존적일 수 있다. 즉, 일부 구현예에서, 치환은 동등한 비치환된 항체 분자와 비교하여 치환을 포함하는 항체 분자의 하나 이상의 기능적 성질(예를 들어, 결합 친화성)에 영향을 미치지 않을 수 있다(또는 실질적으로 영향을 미치지 않을 수 있다).
바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하나 이상의 아미노산 서열 변경(아미노산 잔기의 부가, 결실, 치환 및/또는 삽입), 바람직하게는 본원에 제시된 본 발명의 VH 및/또는 VL 서열과 비교하여 20 개 이하의 변경, 15 개 이하의 변경, 10 개 이하의 변경, 5 개 이하의 변경, 4 개 이하의 변경, 3 개 이하의 변경, 2 개 이하의 변경, 또는 1 개 변경을 갖는 VH 및/또는 VL 도메인 서열을 포함할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 118에 제시된 클론 2의 인간화 VH 도메인 서열, 예를 들어, SEQ ID NO: 118에 제시된 클론 2의 서열과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 갖는 인간화 VH 도메인을 포함할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 154의 VH4VK4의 인간화 VH 도메인 서열, 예를 들어, SEQ ID NO: 154의 클론 VH4VK4의 VH 서열과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 갖는 인간화 VH 도메인을 포함할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 카바트 명명법에 의해 정의될 때, 예를 들어, 표 5에 제시된 바와 같은 클론 2의 HCDR의 세트: HCDR1(SEQ ID NO: 20), HCDR2(SEQ ID NO: 21), 및 HCDR3(SEQ ID NO: 22)을 포함하는 VH 도메인 아미노산 서열을 포함하고, VH 도메인은 SEQ ID NO: 118에 기재된 클론 2의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 가진다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 카바트 명명법에 의해 정의될 때 SEQ ID NO: 154의 클론 VH4VK4의 HCDR의 세트: HCDR1(SEQ ID NO: 20), HCDR2(SEQ ID NO: 21), 및 HCDR3(SEQ ID NO: 22)을 포함하는 VH 도메인 아미노산 서열을 포함하고, VH 도메인은 SEQ ID NO: 154의 클론 VH4VK4의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 가진다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 119에 제시된 클론 2의 인간화 VL 도메인 아미노산 서열, 예를 들어, SEQ ID NO: 119에 제시된 클론 2의 서열과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 갖는 인간화 VL 도메인을 포함할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 160의 클론 VH4VK4의 인간화 VL 도메인 아미노산 서열, 예를 들어, SEQ ID NO: 160의 VH4VK4의 서열과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 갖는 인간화 VL 도메인을 포함할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 카바트 명명법에 의해 정의될 때, 예를 들어, 표 5에 제시된 바와 같은 각각 클론 2의 LCDR의 세트: LCDR1(SEQ ID NO: 23), LCDR2(SEQ ID NO: 24) 및 LCDR3(SEQ ID NO: 25)를 포함하는 VL 도메인을 포함하고, VL 도메인은 SEQ ID NO: 119에 기재된 클론 2의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, %, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, %, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 가진다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 카바트 명명법에 의해 정의될 때 각각 SEQ ID NO: 160의 클론 VH4VK4의 LCDR의 세트: LCDR1(SEQ ID NO: 23), LCDR2(SEQ ID NO: 24) 및 LCDR3(SEQ ID NO: 25)를 포함하는 VL 도메인을 포함하고, VL 도메인은 각각 SEQ ID NO: 160의 클론 VH4VK4의 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, %, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, %, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 가진다.
서열 동일성은 일반적으로 알고리즘 GAP(Wisconsin GCG package, Accelerys Inc, San Diego USA)를 참조하여 정의된다. GAP는 Needleman 및 Wunsch 알고리즘을 사용하여 2 개의 완전한 서열을 정렬함으로써, 매치의 수를 최대화하고 갭 수를 최소화한다. 일반적으로, 12인 갭 생성 패널티 및 4인 갭 확장 패널티와 함께 디폴트 파라미터가 사용된다. GAP의 사용이 바람직할 수 있지만, 일반적으로 디폴트 파라미터를 사용하여, 다른 알고리즘, 예를 들어, BLAST(문헌[Altschul et al. (1990) J. MoI. Biol. 215: 405-410]의 방법을 사용), FASTA(문헌[Pearson and Lipman (1988) PNAS USA 85: 2444-2448]의 방법을 사용), 또는 Smith-Waterman 알고리즘(문헌[Smith and Waterman (1981) J. MoI Biol. 147: 195-197]), 또는 상기 문헌[Altschul et al. (1990)]의 TBLASTN 프로그램이 사용될 수 있다. 특히, psi-Blast 알고리즘이 사용될 수 있다(Nucl. Acids Res. (1997) 25 3389-3402). 서열 동일성은 Bioedit, ClustalW 알고리즘을 사용하여 정의될 수 있다.
정렬은 Snapgene을 사용하여 MUSCLE(로그-기대값에 의한 다중 서열 비교(Multiple Sequence Comparison by Log-Expectation)) 알고리즘을 기반으로 수행되었다(Edgar(2004a) Nucleic Acids Res 32:1792-7; Edgar(2004b) BMC Bioinformatics 5:113).
항체는 CH2 도메인을 포함할 수 있다. CH2 도메인은 바람직하게는 인간 IgG 분자의 경우에서와 같이 CH3 도메인의 N-말단에 위치한다. 항체의 CH2 도메인은 바람직하게는 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4의 CH2 도메인, 더욱 바람직하게는 인간 IgG1의 CH2 도메인이다. 인간 IgG 도메인의 서열은 당 분야에 공지되어 있다.
항체는 CH2 도메인의 N-말단에 면역글로불린 힌지 영역, 또는 이의 일부를 포함할 수 있다. 면역글로불린 힌지 영역은 2 개의 CH2-CH3 도메인 서열이 회합하여 다이머를 형성하는 것을 가능하게 한다. 바람직하게는, 힌지 영역, 또는 이의 일부는 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 힌지 영역, 또는 이의 일부이다. 더욱 바람직하게는, 힌지 영역, 또는 이의 일부는 IgG1 힌지 영역, 또는 이의 일부이다.
CH3 도메인의 서열은 특별히 제한되지 않는다. 바람직하게는, CH3 도메인은 인간 면역글로불린 G 도메인, 예컨대, 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 CH3 도메인, 가장 바람직하게는 인간 IgG1 CH3 도메인이다.
본 발명의 항체는 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 불변 영역을 포함할 수 있다. 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 CH3 도메인의 서열은 당 분야에 공지되어 있다. 본 발명의 항체는 인간 IgG 불변 영역, 예를 들어, 인간 IgG1 불변 영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 항체는 이펙터 기능을 가진 인간 IgG Fc를 포함할 수 있다.
Fc 수용체(FcR)는 항체 매개(체액) 면역 반응을 세포 이펙터 기능에 연결하는 주요 면역 조절 수용체이다. FcγR(IgG), FcεRI(IgE), FcαRI(IgA), FcμR(IgM) 및 FcδR(IgD)를 포함하여 모든 부류의 면역글로불린에 대한 수용체가 확인되었다. 백혈구에서 발견되는 인간 IgG에 대한 세 가지 부류의 수용체가 존재한다: CD64(FcγRI), CD32(FcγRIIa, FcγRIIb 및 FcγRIIc) 및 CD16(FcγRIIIa 및 FcγRIIIb). FcγRI는 고 친화성 수용체(나노몰 범위 KD)로 분류되는 반면, FcγRII 및 FcγRIII는 낮은 친화성 내지 중간 친화성(마이크로몰 범위 KD)이다.
항체의존성세포독해작용(antibody dependent cellular cytotoxicity; ADCC)에서, 이펙터 세포(자연 살해 세포, 대식세포, 단핵구 및 호산구)의 표면 상의 FcvR은 그 자체가 표적 세포에 결합되는 IgG의 Fc 영역에 결합한다. 결합 시, 표적 세포의 파괴를 매개하는 용해 효소, 퍼포린, 그랜자임 및 종양 괴사 인자와 같은 다양한 물질의 분비를 초래하는 신호전달 경로가 촉발된다. ADCC 이펙터 기능의 수준은 IgG 아형에 따라 다양하다. 이는 간단히 말하면 알로타입 및 특이적 FcvR에 의존적이지만, ADCC 이펙터 기능은 인간 IgG1 및 IgG3에 대해 높고 IgG2 및 IgG4에 대해 낮다. 감소하는 역가로 순위가 매겨진 이펙터 기능의 IgG 아형 변이에 대해서는 하기를 참조한다.
Figure pct00005
FcγR은 힌지 및 상부 CH2 영역에 걸쳐 IgG에 비대칭적으로 결합한다. 결합 부위를 인지함에 따라, IgG 이펙터 기능을 조절하기 위한 공학적 노력이 이루어졌다.
본 발명의 항체는 이펙터 기능, 증진된 이펙터 기능 또는 감소된 이펙터 기능을 가진 Fc를 가질 수 있다.
항체의 역가는 항체-의존성 세포-매개된 세포독성(ADCC) 및 항체-의존성 세포-매개된 식세포작용(ADCP)과 같은 세포독성 기능을 매개하는 능력의 향상에 의해 증가될 수 있다. Fc 도메인 내의 다수의 돌연변이는 Fc 수용체의 결합을 직접 또는 간접적으로 향상시키고 세포독성을 유의하게 향상시키는 것으로 확인되었다: 돌연변이 S239D/A330L/I332E("3M"), F243L 또는 G236A. 대안적으로, 이펙터 기능의 향상은 Fc 도메인의 글리코실화를 변형시킴으로써 달성될 수 있고, FcγR은 CH2 도메인 상의 탄수화물과 상호작용하고, 글리칸 조성물은 이펙터 기능 활성에 실질적인 영향을 미친다. 아푸코실화된(비-푸코실화된) 항체는 FcγRIIIa에 대한 증가된 결합을 통해 크게 향상된 ADCC 활성을 나타낸다.
ADCC 및 CDC의 활성화는 일부 치료용 항체에 바람직할 수 있지만, 일부 구현예에서, 이펙터 기능을 활성화하지 않는 항체가 바람직하다.
이들의 이펙터 기능 결여로 인해, IgG4 항체는 세포 고갈 없이 수용체 차단을 위한 바람직한 IgG 서브클래스이다. 그러나, IgG4 분자는 Fab-아암 교환으로 칭해지는 동적 과정에서 반-분자를 교환할 수 있다. 이러한 현상은 치료용 항체와 내인성 IgG4 간에 발생할 수 있다. S228P 돌연변이는 이러한 재조합 과정을 방지하여 Fab-아암 교환에 대한 경향이 감소된 IgG4 항체의 설계를 가능하게 하는 것으로 나타났다.
Fc 공학 접근법은 IgG1 Fc 도메인과 Fcγ 수용체 및 C1q에 대한 주요 상호작용 부위를 결정한 다음 이러한 위치를 돌연변이시켜 결합을 감소시키거나 없애는 데 사용되어 왔다. 알라닌 스캐닝을 통해 Fc 도메인의 힌지 및 상부 CH2를 포괄하는 영역에 대한 C1q의 결합 부위가 확인되었다. 본 발명의 항체 또는 단편의 CH2 도메인은 하나 이상의 Fcγ 수용체, 예컨대, FcγRI, FcγRlla, FcγRllb, FcγRIII 및/또는 보체에 대한 CH2 도메인의 결합을 감소시키거나 없애기 위한 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 인간 IgG 도메인의 CH2 도메인은 일반적으로 Fcγ 수용체 및 보체에 결합하고, Fcγ 수용체에 대한 결합의 감소는 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC)을 감소시키는 것으로 예상되고, 보체에 대한 결합의 감소는 항체 분자의 보체-의존성 세포독성(CDC) 활성을 감소시키는 것으로 예상된다. 하나 이상의 Fcγ 수용체 및/또는 보체에 대한 CH2 도메인의 결합을 감소시키거나 없애기 위한 돌연변이는 당 분야에 공지되어 있다. 본 발명의 항체 분자는 FcγR 및 C1q 결합을 거의 완전히 없애는 변형 K322A/L234A/L235A 또는 L234F/L235E/P331S("TM")를 가진 Fc를 포함할 수 있다. 본 발명의 항체 분자는 CH2 도메인을 포함할 수 있고, 여기서 CH2 도메인은 EU 위치 234 및 235(IMGT 넘버링에 의한 위치 1.3 및 1.2)에 알라닌 잔기를 포함한다("LALA 돌연변이"). 또한, 보체 활성화 및 ADCC는, 예를 들어, P329A 또는 P329G로의 Pro329(EU 넘버링에 따른 위치)의 돌연변이에 의해 감소될 수 있다. 본 발명의 항체 분자는 CH2 도메인을 포함할 수 있고, 여기서 CH2 도메인은 EU 위치 234 및 235(IMGT 넘버링에 의한 위치 1.3 및 1.2)에 알라닌 잔기 및 EU 위치 329(IMGT 넘버링에 의한 위치 114)에 알라닌(LALA-PA) 또는 글리신(LALA-PG)을 포함한다. 추가로 또는 대안적으로, 본 발명의 항체 분자는 EU 위치 297(IMGT 넘버링에 의한 위치 84.4)에 알라닌, 글루타민 또는 글리신을 포함할 수 있다.
최적의 FcR 상호작용에 필요한 것으로 공지된 Fc 도메인의 아스파라긴 297에 대한 글리코실화의 변형은 FcR에 대한 결합의 손실을 제공할 수 있고; FcR에 대한 결합의 손실은 N297 점 돌연변이에서 관찰되었다. 본 발명의 항체 분자는 N297A, N297G 또는 N297Q 돌연변이를 가진 Fc를 포함할 수 있다. 아글리코실 Fc 도메인을 갖는 본 발명의 항체 분자는 효소적 탈당화에 의해, 글리코실화 억제제의 존재 하에서 재조합 발현에 의해, 또는 박테리아에서 Fc 도메인의 발현 후에 수득될 수 있다.
IgG는 FcRn-매개된 재순환으로 인해 혈청에서 자연적으로 장기간 지속되어 대략 21 일의 통상적인 반감기를 제공한다. 반감기는 pH 7.4에서 최소 결합을 보유하면서 pH 6.0에서 친화성을 증가시키기 위해 Fc 도메인과 FcRn의 pH-의존적 상호작용을 조작함으로써 연장될 수 있다. T250Q/M428L 변이형은 IgG 반감기의 대략 2 배 증가를 제공하였고(레서스 원숭이에서 평가됨), 반면에 M252Y/S254T/T256E 변이형("YTE")은 IgG 반감기의 대략 4 배 증가를 제공하였다(사이노몰구스 원숭이에서 평가됨). 반감기를 연장하면, 효능을 유지하거나 개선하면서 투여 빈도를 감소시키는 것이 가능해질 수 있다.
면역글로불린은 다중특이성, 예를 들어, 이중특이성, 삼중특이성, 또는 사중특이성 항체 포맷을 생성하기 위해 다수의 상이한 방식으로 조합될 수 있는 별개의 도메인을 포함하는 모듈식 구조를 갖는 것으로 공지되어 있다. 예시적인 다중특이성 항체 포맷은, 예를 들어, 문헌[Spiess et al. (2015) Mol Immunol 67: 95-106 및 Kontermann(2012) Mabs 4(2): 182-97]에 기재되어 있다. 본 발명의 항체는 이러한 다중특이성 포맷으로 사용될 수 있다.
본 발명은 에피토프를 포함하는 단리된 재조합 펩티드에 대한 결합을 위해 본원에 기재된 본 발명의 항체(예를 들어, 클론 2의 HCDR 및 LCDR의 세트(예를 들어, 카바트 명명법에 의해 정의될 때 표 5에 나열된 바와 같음) 및/또는 클론 2의 VH 및 VL 아미노산 서열의 인간화 변이형을 포함함)와 경쟁할 수 있는 인간화 또는 인간 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하고, 상기 펩티드는 경쟁 검정에서 평가될 때 인간 2N4R 타우(SEQ ID NO: 2)의 잔기 369 내지 381(SEQ ID NO: 1)를 포함하거나 이로 이루어진다. 바람직하게는, 상기 에피토프는 인간 2N4R(아미노산 1 내지 441) 타우(SEQ ID NO: 2)의 아미노산 서열 373 내지 379(THKLTFR, SEQ ID NO: 150)의 잔기에 의해 형성되고 정의되며, 바람직하게는 여기서 에피토프는 잔기: K375, T377 및 R379를 포함하고 이에 의해 정의되고, 더욱 바람직하게는 에피토프는 잔기 T373, K375, T377 및 R379를 포함하고 이에 의해 정의된다(예를 들어, 클론 2, #44에 의해 결합된 에피토프).
경쟁 검정은 면역검정, 예컨대, ELISA, HTRF, 유세포 분석, 형광 미세부피 검정 기술(FMAT) 검정, 미러볼(Mirrorball), 고함량 영상화 기반 형광 면역검정, 방사선리간드 결합 검정, 바이오-층 간섭법(BLI), 표면 플라즈몬 공명(SPR) 및 열 이동 검정을 포함하는 세포-기반 및 무세포 결합 검정을 포함한다.
참조 항체와 동일한 에피토프, 또는 이와 중첩되는 에피토프에 결합하는 항체는 경쟁 검정에서 이의 결합 파트너(예를 들어, 항원 또는 "표적")에 대한 참조 항체의 결합을 50% 이상 차단하는 항체를 지칭하고/하거나, 반대로 참조 항체는 경쟁 검정에서 이의 결합 파트너에 대한 항체의 결합을 50% 이상 차단한다. 이러한 항체는 관심 에피토프에 대한 결합에 대해 경쟁하는 것으로 언급된다.
항원-결합 단백질, 예컨대, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 검출 가능한 표지(예를 들어, 방사성동위원소)에; 또는 생물활성 분자에 접합될 수 있다. 이러한 경우에, 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 같은 항원-결합 단백질은 접합체로 지칭될 수 있다. 이러한 접합체는 본원에 기재된 바와 같은 질병의 치료 및/또는 진단에서의 적용을 찾을 수 있다. 이러한 접합체는 인간 2N4R(아미노산 1 내지 441) 타우(SEQ ID NO: 2)의 잔기 369 내지 381(SEQ ID NO: 1)을 포함하거나 이로 이루어진 에피토프의 검출(예를 들어, 시험관내 검출)을 위한 적용을 찾을 수 있고; 바람직하게는 상기 에피토프는 인간 2N4R(아미노산 1 내지 441) 타우(SEQ ID NO: 2)의 아미노산 서열 373 내지 379(THKLTFR, SEQ ID NO: 150)의 잔기에 의해 형성되고, 바람직하게는 여기서 에피토프는 잔기: K375, T377 및 R379를 포함하고, 더욱 바람직하게는 여기서 에피토프는 잔기 T373, K375, T377 및 R379를 포함한다(예를 들어, 클론 2, #44에 의해 결합된 에피토프).
본 발명의 항원-결합 단백질(접합체 포함)은 본 발명의 에피토프(인간 2N4R(아미노산 1 내지 441) 타우(SEQ ID NO: 2)의 잔기 369 내지 381(SEQ ID NO: 1)로 이루어진 단리된 재조합 펩티드 상에 존재하는 에피토프)의 검출(예를 들어, 시험관내 검출)에 유용할 수 있으며; 바람직하게는 상기 에피토프는 인간 2N4R(아미노산 1 내지 441) 타우(SEQ ID NO: 2)의 아미노산 서열 373 내지 379(THKLTFR, SEQ ID NO: 150)의 잔기에 의해 형성되고, 바람직하게는 여기서 에피토프는 잔기: K375, T377 및 R379에 의해 정의되고, 더욱 바람직하게는 여기서 에피토프는 잔기 T373, K375, T377 및 R379에 의해 정의된다(예를 들어, 클론 2, #44에 의해 결합된 에피토프). 따라서, 본 발명은 샘플에서 본 발명의 에피토프의 존재를 검출하기 위한 본 발명의 항원-결합 단백질의 용도에 관한 것이다. 항원-결합 단백질은 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이 검출 가능한 표지에 접합될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 샘플에서 본 발명의 에피토프를 검출하는 시험관내 방법에 관한 것이고, 여기서 상기 방법은 본 발명의 항원-결합 단백질을 관심 샘플과 인큐베이션하는 단계, 및 샘플에 존재하는 본 발명의 에피토프에 대한 항원-결합 단백질의 결합을 결정하는 단계를 포함하고, 항원-결합 단백질의 결합은 샘플에서 본 발명의 에피토프의 존재를 지시한다. 항원-결합 단백질의 이의 표적 항원에 대한 결합을 검출하기 위한 방법은 당 분야에 공지되어 있으며, ELISA, ICC, IHC, 면역형광, 웨스턴 블롯, IP, SPR 및 유세포 분석을 포함한다.
관심 샘플은 개체로부터 수득된 샘플일 수 있다. 개체는 인간일 수 있다. 샘플은 조직, 예컨대, 뇌 조직, 뇌척수액(CSF), 일차 또는 배양된 세포 또는 세포주, 세포 상청액, 세포 용해물, 혈소판, 혈청, 혈장, 유리체액, 림프액, 활액, 여포액, 정액, 양수, 유즙, 전혈, 혈장, 혈청, 혈액-유래 세포, 소변, 타액, 가래, 눈물, 발한, 점액, 종양 용해물, 및 조직 배양 배지, 조직 추출물, 예컨대, 균질화 조직, 종양 조직, 세포 추출물, 및 이들의 조합을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
인큐베이션 후, 항원에 대한 항원-결합 단백질 결합, 예를 들어, 항원에 대한 항체 결합은 적절한 검출 시스템을 사용하여 검출된다. 검출 방법은 직접적 또는 간접적일 수 있고, 형광 또는 발색 신호를 생성할 수 있다. 직접 검출은 표지에 직접 접합된 일차 항체의 사용을 수반한다. 간접 검출 방법은 일차 항원-결합 단백질, 예를 들어, 항체, 숙주 종에 대해 발생된 표지된 이차 항체를 이용한다. 간접 방법은 신호 강도를 증가시키기 위한 증폭 단계를 포함할 수 있다. 항원-결합 단백질 - 항원(예를 들어, 항체 - 에피토프) 상호작용의 시각화(즉, 검출)를 위해 일반적으로 사용되는 표지는 가용성 기질을 불용성, 발색성 최종 생성물로 전환시키는 형광단 및 효소를 포함한다.
"검출하는"이라는 용어는 표적 분자의 정성적 측정과 정량적 측정 둘 모두를 포함하는 가장 넓은 의미로 본원에서 사용된다. 검출은 샘플에서 표적 분자의 단순한 존재를 확인하는 것뿐만 아니라 표적 분자가 검출 가능한 수준으로 샘플에 존재하는지의 여부를 결정하는 것을 포함한다. 검출은 직접적이거나 간접적일 수 있다.
항원-결합 단백질, 예컨대, 항체에 접합될 수 있는 적합한 검출 가능한 표지는 당 분야에 공지되어 있으며, 요오드-125, 요오드-131, 이트륨-90, 인듐-111 및 테크네튬-99와 같은 방사성동위원소; 플루오레세인, 로다민, 피코에리트린, 텍사스 레드 및 시아닌 염료 유도체, 예를 들어, Cy7, Alexa750 및 Alexa Fluor 647와 같은 형광색소; 디아미노벤지딘과 같은 발색 염료; 라텍스 비드; 양고추냉이 퍼옥시다제와 같은 효소 표지; 스펙트럼 분리된 흡수 또는 방출 특징을 갖는 포스포 또는 레이저 염료; 적절한 화학적 환경에서 전기 자극을 통해 검출될 수 있는 SULFO-TAG와 같은 전기-화학발광 표지; 및 특정 동족 검출 가능한 모이어티, 예를 들어, 표지된 아비딘 또는 스트렙타비딘에 대한 결합을 통해 검출될 수 있는 비오틴과 같은 화학적 모이어티를 포함한다.
본 발명의 항체 또는 이의 단편과 같은 항원-결합 단백질은 디설파이드 또는 펩티드 결합과 같은 임의의 적합한 공유 또는 비공유 결합에 의해 검출 가능한 표지에 접합될 수 있다. 적합한 펩티드 링커는 당 분야에 공지되어 있으며, 5 개 내지 25 개, 5 개 내지 20 개, 5 개 내지 15 개, 10 개 내지 25 개, 10 개 내지 20 개, 또는 10 개 내지 15 개 아미노산 길이일 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편을 인코딩하는 핵산 또는 핵산의 세트, 뿐만 아니라 이러한 핵산 또는 핵산의 세트를 포함하는 벡터를 제공한다.
핵산이 본 발명의 항체 분자의 VH 및 VL 도메인, 또는 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 경우, 2 개의 도메인 또는 사슬은 동일하거나 별도의 핵산 분자 상에 인코딩될 수 있다.
단리된 핵산 분자는 본 발명의 항체 분자를 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 핵산은 일반적으로 발현을 위한 재조합 벡터의 형태로 제공될 것이다. 따라서, 본 발명의 또 다른 양태는 상기 기재된 바와 같은 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 프로모터 서열, 종결자 단편, 폴리아데닐화 서열, 인핸서 서열, 마커 유전자 및 적절한 경우 다른 서열을 포함하는 적절한 조절 서열을 함유하는 적합한 벡터가 선택되거나 작제될 수 있다. 바람직하게는, 벡터는 숙주 세포에서 핵산의 발현을 구동하기에 적절한 조절 서열을 함유한다. 벡터는 플라스미드, 바이러스, 예를 들어, 적절한 경우, 파지, 또는 파지미드일 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자 또는 벡터는 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 핵산 또는 벡터를 숙주 세포로 도입하기 위한 기법은 당 분야에 잘 확립되어 있으며, 임의의 적합한 기법이 사용될 수 있다. 재조합 항체 분자의 생산에 적합한 다양한 숙주 세포는 당 분야에 공지되어 있으며, 박테리아, 효모, 곤충 또는 포유류 숙주 세포를 포함한다. 바람직한 숙주 세포는 포유류 세포, 예컨대, CHO, NS0, 또는 HEK 세포, 예를 들어, HEK293 세포이다.
본 발명의 핵산 또는 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포가 또한 제공된다. 이러한 재조합 숙주 세포는 본 발명의 항원-결합 단백질(예를 들어, 항체)을 생산하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 또한 본 발명의 항원-결합 단백질, 예를 들어, 항체를 생산하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 항원-결합 단백질, 예를 들어, 항체의 생산에 적합한 조건 하에 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 항원-결합 단백질, 예를 들어, 항체를 단리하고/하거나 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명은 숙주 세포에서 항원-결합 단백질, 예를 들어, 항체를 인코딩하는 핵산을 발현시키는 단계 및 선택적으로 이에 따라 생산된 항원-결합 단백질, 예를 들어, 항체를 단리하고/하거나 정제하는 단계를 포함하는, 본 발명의 항원-결합 단백질, 예를 들어, 항체를 생산하는 방법을 제공한다. 숙주 세포를 배양하기 위한 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있다. 재조합 항원-결합 단백질, 예를 들어, 항체의 정제를 위한 기법은 당 분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, 단백질 A 또는 단백질 L을 사용하는, 예를 들어, HPLC, FPLC 또는 친화성 크로마토그래피를 포함한다. 일부 구현예에서, 정제는 항원-결합 단백질, 예를 들어, 항체 상의 친화성 태그를 사용하여 수행될 수 있다. 상기 방법은 또한 항원-결합 단백질, 예를 들어, 항체를 선택적으로 하기 기재된 바와 같은 약학적으로 허용되는 부형제 또는 다른 물질과 함께 약학적 조성물로 제형화하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 항원-결합 단백질, 예를 들어, 항체는 치료적 적용, 특히 인간에서 치료적 적용에서, 예를 들어, 타우병증, 이로 제한되지는 않지만, 알츠하이머병(산발성 및 단발성 가족성 형태), 근위축성 측삭 경화증/파킨슨병-치매 복합, 은친화 과립성 질환, 베타-프로펠러 단백질 관련 신경변성(BPAN), 영국형 아밀로이드 혈관병증, 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 크로이츠펠트-야콥병, 권투선수 치매, 석회화를 동반한 미만성 신경원섬유 엉킴, 다운 증후군, 만성 외상성 뇌병증(CTE), 피질기저핵 변성(CBD), 전두측두 치매(FTD), 17번 염색체와 연관된 전두측두 치매 및 파킨슨증(FTDP-17), 전두측두엽 변성, 게르스트만-슈트라우슬러-샤인커병, 할러포르덴-스파츠병, 포함체 근육염, 다계통 위축증, 근긴장 이영양증, C형 니만-피크병, 신경원섬유 엉킴을 동반한 비-구아마니안 운동 뉴런 질환, 파킨슨병(산발성 및 단발성 가족성 형태), 피크병, 뇌염 후 파킨슨증, 원발성 연령-관련 타우병증(PART), 프리온 단백질 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 진행성 피질하 신경교증, 진행성 핵상 마비(PSP), 아급성 경화성 범뇌염, 엉킴-우성 치매, 구상 신경교 타우병증, 괌의 파킨슨병 치매 복합, 진행성 비유창성 실어증, 다발성 경색 치매, 허혈성 뇌졸중, 외상성 뇌손상(TBI) 및 뇌졸중으로부터 선택된 타우병증의 치료에서 그 적용이 확인될 것으로 예상된다.
또한, 본 발명에 따른 항원-결합 단백질, 예를 들어, 항체 및 부형제, 예컨대, 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 조성물, 예컨대, 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명은 추가로 치료 방법에 사용하기 위한 본 발명의 항원-결합 단백질, 예를 들어, 항체를 제공한다. 또한, 환자를 치료하는 방법이 제공되며, 여기서 상기 방법은 치료적 유효량의 본 발명에 따른 항원-결합 단백질, 예를 들어, 항체를 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 추가로, 의약의 제조에 사용하기 위한 본 발명에 따른 항원-결합 단백질, 예를 들어, 항체의 용도가 제공된다. 본원에서 언급된 바와 같은 환자는 바람직하게는 인간 환자이다.
본 발명은 또한 환자에서 타우병증, 예컨대, 알츠하이머병을 치료하는 방법에 사용하기 위한 본 발명의 항원-결합 단백질, 예를 들어, 항체를 제공한다. 또한, 환자에서 타우병증, 예컨대, 알츠하이머병을 치료하는 방법이 제공되며, 여기서 상기 방법은 치료적 유효량의 본 발명에 따른 항원-결합 단백질, 예를 들어, 항체를 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 추가로, 환자에서 타우병증, 예컨대, 알츠하이머병의 치료를 위한 의약의 제조에 사용하기 위한 본 발명에 따른 항원-결합 단백질, 예를 들어, 항체의 용도가 제공된다. 치료는 환자에게 제2 요법제, 예컨대, FDA-승인된 AD 약물, 예를 들어, 아세틸콜린에스테라제 억제제(예를 들어, 도네페질), 아세틸콜린 수용체 양성 조절제(예를 들어, 갈란타민), NMDA 수용체 길항제(예를 들어, 메만틴) 또는 파킨슨병 약, 예를 들어, 카르비도파-레보도파, 도파민 수용체 길항제(예를 들어, 프라미펙솔), 모노아민 옥시다제 B 억제제(예를 들어, 셀레길린), 카테콜 O-메틸트렌스페라제(COMT) 억제제, 아만타딘, 또는 항콜린제(예를 들어, 벤즈트로핀)을 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 제2 요법제는 본 발명의 항원-결합 단백질, 예를 들어, 항체에 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 환자에게 투여될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 a) 타우병증을 치료하고, b) 타우병증의 진행을 지연시키고, c) 타우병증을 앓고 있는 환자의 인지 기능을 보존하고, d) 타우병증을 앓고 있는 환자의 생존을 연장시키고, e) CSF 및/또는 혈청 중 유리 C-말단 타우의 수준을 감소시키고, f) CSF 및/또는 혈청 중 총 타우의 수준을 감소시키고, g) CSF 및/또는 혈청 중 유리 C-말단 타우:전체 타우의 비율을 감소시키고, h) CSF 및/또는 혈청 중 신경필라멘트 경쇄 단백질(NfL)의 수준을 감소시키고, i) 뉴런 및/또는 성상세포 및/또는 미세아교세포 중 총 세포내 타우 수준을 감소시키고, j) 전체 뇌 부피 및/또는 국소 뇌 부피의 저하 속도를 감소시키고, k) 뇌의 기능적 연결성 저하 속도를 감소시키고, l) 뇌의 기능적 연결성을 개선하고, 또는 m) PET 또는 다른 영상화 방법에 기초한 뇌 타우 부담을 감소시키는 데 사용하기 위한 본 발명의 항원-결합 단백질, 예를 들어, 항체에 관한 것이다.
따라서, 본원에 기재된 바와 같은 항원-결합 단백질, 예를 들어, 항체는 치료적 적용, 특히 타우병증, 예컨대, 알츠하이머병의 치료에 사용하기 위한 것일 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 항원-결합 단백질, 예를 들어, 항체는 인간 또는 동물 신체의 치료 방법에 사용될 수 있다. 본 발명의 관련 양태는 하기를 제공한다:
(i) 의약으로서 사용하기 위한 본원에 기재된 항원-결합 단백질, 예를 들어, 항체,
(ii) 질병 또는 장애의 치료 방법에 사용하기 위한 본원에 기재된 항원-결합 단백질, 예를 들어, 항체,
(iii) 질병 또는 장애의 치료에 사용하기 위한 의약의 제조에서의 본원에 기재된 항원-결합 단백질, 예를 들어, 항체의 용도; 및
(iv) 개체에서 질병 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 개체에게 치료적 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 항원-결합 단백질, 예를 들어, 항체를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
개체는 환자, 바람직하게는 인간 환자일 수 있다.
치료는 일부 요망되는 치료 효과, 예를 들어, 질환 진행의 억제 또는 지연이 달성되는 임의의 치료 또는 요법일 수 있고, 질환의 진행 속도의 감소, 진행 속도의 정지, 호전, 질환의 치유 또는 관해(부분적 또는 전체적이든), 질환의 하나 이상의 증상 및/또는 징후의 예방, 호전, 지연, 경감 또는 저지 및/또는 치료의 부재 시 예상되는 것 이상으로 개체 또는 환자의 생존의 연장을 포함한다.
예방적 조치(즉, 예방)로서의 치료가 또한 포함된다. 예를 들어, 타우병증, 예컨대, AD에 걸리기 쉽거나 발병할 위험이 있는 개체는 본원에 기재된 바와 같이 치료될 수 있다. 이러한 치료는 개체에서 질환의 발생을 예방하거나 지연시킬 수 있다.
기재된 바와 같은 치료 방법은 개체에게 항원-결합 단백질, 예를 들어, 항체에 이외에 적어도 하나의 추가 치료제를 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 항원-결합 단백질, 예를 들어, 항체는 단독으로 또는 하나 이상의 다른 치료제와 조합하여 개체에게 투여될 수 있다. 항원-결합 단백질, 예를 들어, 항체가 또 다른 치료제와 조합하여 개체에게 투여될 때, 추가 치료제는 항원-결합 단백질, 예를 들어, 항체의 투여와 동시에, 순차적으로, 또는 별도로 개체에게 투여될 수 있다. 추가 치료가 항원-결합 단백질, 예를 들어, 항체와 동시에 투여되는 경우, 항원-결합 단백질, 예를 들어, 항체, 및 추가 치료제는 조합된 제제로서 개체에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 추가 요법은 치료하고자 하는 질환에 대한 공지된 요법 또는 치료제일 수 있다.
항원-결합 단백질, 예를 들어, 항체는 단독으로 투여될 수 있지만, 항원-결합 단백질, 예를 들어, 항체는 일반적으로 항원-결합 단백질, 예를 들어, 항체 이외에 적어도 하나의 성분을 포함할 수 있는 약학적 조성물의 형태로 투여될 것이다. 따라서, 본 발명의 또 다른 양태는 본원에 기재된 바와 같은 항원-결합 단백질, 예를 들어, 항체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 항원-결합 단백질, 예를 들어, 항체를 약학적 조성물로 제형화하는 단계를 포함하는 방법이 또한 제공된다.
약학적 조성물은 항원-결합 단백질, 예를 들어, 항체 이외에, 약학적으로 허용되는 부형제, 담체, 완충제, 안정화제 또는 당업자에게 널리 공지된 다른 물질들을 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 "약학적으로 허용되는"이라는 용어는 합리적인 이익/위험 비율에 상응하는 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 건전한 의학적 판단의 범위 내에서 대상체(예를 들어, 인간)의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물, 및/또는 투여형에 관한 것이다. 각각의 담체, 부형제 등은 또한 제형의 다른 성분과 양립 가능하다는 의미에서 "허용"되어야 한다. 담체 또는 다른 물질의 정확한 성질은 투여 경로에 좌우될 것이며, 이는, 하기 논의되는 바와 같이, 주입, 주사 또는 임의의 다른 적합한 경로일 수 있다.
예를 들어, 주사에 의한 비경구, 예를 들어, 피하 또는 정맥내 투여의 경우, 항원-결합 단백질, 예를 들어, 항체를 포함하는 약학적 조성물은 발열원이 없고 적합한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 비경구적으로 허용되는 수용액의 형태일 수 있다. 당업자는, 예를 들어, 등장성 비히클, 예컨대, 소듐 클로라이드 주사, 링거 주사, 또는 락테이트 링거 주사를 사용하여 적합한 용액을 제조할 수 있다. 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산을 포함하는 완충제; 아스코르브산 및 메티오닌과 같은 항산화제; 보존제(예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로빈과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 폴리머; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신과 같은 아미노산; 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하여 단당류, 이당류, 및 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르베이트와 같은 당; 나트륨과 같은 염-형성 상대-이온; 금속 착체(예를 들어, Zn-단백질 착체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대, TWEENTM, PLURONICSTM, 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함하여, 보존제, 안정화제, 완충제, 항산화제 및/또는 기타 첨가제가 필요에 따라 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 항원-결합 단백질, 예를 들어, 항체는 투여 전 재구성을 위한 동결건조된 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, 동결건조된 항원-결합 단백질, 예를 들어, 항체는 개체에게 투여되기 전에 멸균수 또는 염수에서 재구성될 수 있다.
투여는 "치료적 유효량"일 수 있으며, 이는 개체에게 이익을 나타내기에 충분한 것이다. 투여되는 실제 양, 및 투여 속도 및 시간-경과는 치료되는 것의 성질 및 중증도, 치료되는 특정 개체, 개체의 임상 상태, 장애의 원인, 조성물의 전달 부위, 항원-결합 단백질, 예를 들어, 항체의 유형, 투여 방법, 투여 일정 및 의료 종사자에게 알려진 기타 요인에 좌우될 것이다. 치료의 처방, 예를 들어, 투여량 등에 대한 판단은 일반 개업의 및 다른 의사의 권한 내에 있으며, 증상의 중증도 및/또는 치료되는 질병의 진행에 좌우될 수 있다. 항원-결합 단백질, 예를 들어, 항체의 적절한 용량은 당 분야에 널리 공지되어 있다. 항원-결합 단백질, 예를 들어, 항체의 치료적 유효량 또는 적합한 용량은 동물 모델에서 시험관내 활성 및 생체내 활성을 비교함으로써 결정될 수 있다. 마우스 및 다른 시험 동물에서 인간에 대한 유효 투여량의 외삽법이 공지되어 있다. 정확한 용량은 치료될 영역의 크기 및 위치, 및 항원-결합 단백질, 예를 들어, 항체의 정확한 성질을 포함하는 다수의 인자에 좌우될 것이다.
전형적인 항체 용량은 전신 적용의 경우 100 μg 내지 1 g, 및 국소 적용의 경우 1 μg 내지 1 mg의 범위이다. 초기 더 높은 로딩 용량, 및 이어서 하나 이상의 더 낮은 용량이 투여될 수 있다. 이는 성인 개체의 단일 치료를 위한 용량이며, 이는 어린이 및 유아에 대해 비례적으로 조정될 수 있고, 또한 분자량에 비례하여 다른 항체 포맷에 대해 조정될 수 있다.
치료는 의사의 재량에 따라 매일, 주 2 회, 매주 또는 매월 간격으로 반복될 수 있다. 개체를 위한 치료 스케줄은 항체 조성물의 약동학적 및 약력학적 성질, 투여 경로 및 치료되는 질환의 특성에 좌우될 수 있다.
치료는 주기적일 수 있고, 투여 사이의 기간은 약 2 주 이상, 예를 들어, 약 3 주 이상, 약 4 주 이상, 약 1 개월 이상, 약 5 주 이상, 또는 약 6 주 이상에 한 번일 수 있다. 예를 들어, 치료는 2 주 내지 4 주 마다 또는 4 주 내지 8 주 마다 있을 수 있다. 적합한 제형 및 투여 경로는 상기 기재되어 있다.
바람직한 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체는 알츠하이머병을 치료하는 방법에 사용하기 위한 것일 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 같은 항원-결합 단백질은 인간 타우 2N4R의 잔기 379 내지 408 또는 379 내지 391에 포함된 에피토프에 결합하지 않는다.
도 1. 인간 가족성 알츠하이머병 뉴런으로부터 방출된 다중 종의 타우는 대조 뉴런 상청액에서 발견되지 않는다. 타우는 상용 항체, HT7(레인 3, 6, 9) 또는 타우-13(레인 2, 5, 8)을 사용하고 IgG 대조(1, 4, 7)와 비교하여 비-질병 대조(NDC; 레인 1 내지 3), 가족성 알츠하이머병(fAD)-관련 돌연변이, PSEN1 Y115C(PSEN; 레인 4 내지 6) 및 전두측두 치매(FTD; 레인 7 내지 9) 관련 돌연변이, MAPT IVS10+16(MAPT) 뉴런으로부터의 배양 상청액으로부터 면역침전(IP)되었다. 웨스턴 블롯은 항-타우 항체(K9JA)를 사용한 각 IP 후 타우 종의 검출을 보여준다(A). 강조 표시되고 1 내지 5로 번호가 매겨진 밴드가 절제되고 질량 분광계에 의해 분석되었다.
도 2. 인간 iPSC 유래된 뉴런 분비체로부터의 항-타우 IgG 클론 #44(클론 2) 및 #66(클론 1) 면역고갈된 타우 종. NDC(연회색) 및 2 개의 개별 TS21 라인(진회색, 검은색)으로부터의 컨디셔닝된 배지가 면역전 혈청(1), K9JA 다클론성 항체(2), #44(클론 2)(3) 및 #66(클론 1)(4)으로 면역고갈되고, 중간-영역(MR 타우; 상용 항체 BT2 및 타우5 기반; A) 및 미세소관 결합 영역(MTBR 타우; 상업적으로 이용 가능한 항체 기반, K9JA; B) ELISA에 의해 분석되었다. 면역전 혈청은 고갈 샘플을 모의하기 위한 음성 대조로서 제공되었다. 값은 3 개의 기술 복제물의 평균 +/- SD를 나타낸다.
도 3. 항-타우 IgG 클론 #44(클론 2) 및 #66(클론 1)은 생체내에서 장기 강화(LTP)의 타우-매개 차단을 방지한다. 해마 LTP는 삼염색체성 21(TS21) iPSC-유래 뉴런 배양물에 의해 생성된 분비체의 존재 하에 마취된 래트에서 측정되었다. LTP는 비히클 처리된 동물에서 유도되었지만(검정색 막대; 1), 모의-고갈된 TS21 분비체의 존재 하에서 억제되었다(백색 막대; 2). LTP 유도는 IgG 클론 #44(클론 2)(회색 막대; 3) 또는 #66(클론 1)(체크 막대; 4)를 사용하여 면역고갈된 TS21 분비체의 존재 하에서 관찰되었는데, 이는 LTP 차단의 원인이 되는 타우 종의 제거를 나타낸다. LTP의 크기는 n=4(비히클) 또는 n=7(분비체 샘플) 동물에 대한 자극전 기준선 EPSP 진폭(± SEM)의 백분율로 표현된다. **, p<0.01; *, p<0.05; 본페로니(Bonferroni) 다중 비교 검정 대 비히클 대조를 사용한 일원 ANOVA(1); ####, p<0.0001, ##, p<0.01, 대응표본 t-검정, LTP 유도 후 대 LTP 유도 전.
도 4. 인간 AD CSF는 C-말단 타우를 함유한다. 임상적으로 확인된 알츠하이머병을 갖는 16 명의 개체로부터의 CSF 샘플이 푸울링되었다(최종 부피 8.5 mL)(A). 150 ng의 클론 #44(클론 2) IgG가 단백질 A-코팅된 비드에 결합되고 가교되었으며, 비드는 표적 에피토프를 함유한 푸울링된 AD CSF에 존재하는 타우를 면역정제하는 데 사용되었다(B). 단백질은 트립신으로 비드 상에서 분해되었고(C), 용리된 펩티드는 질량 분광계에 의해 분해되었다(D). Gen2B 에피토프('Y'로 표시됨)에 인접한 푸울링된 AD CSF(E, 'X'로 표시됨)에서 C-말단 타우 펩티드가 확인되어, AD CSF에서 C-말단 타우 단편의 존재를 확인시켜 주었다.
도 5. 항-타우 항체는 면역원 서열 내의 별개의 에피토프에 결합한다. 항체 클론 #44(클론 2; A) 및 #66(클론 1, B)에 대한 에피토프 치환 스캔 분석의 문자 플롯 도식은 타우에 대한 결합에 필요한 주요 잔기를 강조 표시한다. 펩티드 어레이(C)에 대한 이소형 대조 토끼 IgG의 낮은 수준의 결합은 항-타우 항체 결합이 CDR-특이적임을 입증한다. 플롯 아래에 도시된, 네이티브 리드 펩티드 서열의 각 위치에서 단일 아미노산 치환을 지니는 선형 펩티드가 생성되었다. 대체에 대해 수득된 값은 기록된 값의 높이에 플롯팅된 각 대체 잔기에 대한 문자 코드로 나타난다. 화살표는 리드 서열에 대한 중앙값을 나타낸다.
도 6. 토끼 항체 클론 #44에 기반한 인간화 중쇄(VH) 및 경쇄(VK) 서열은 Composite Human Antibody Technology(Abzena)를 사용하여 설계되었다. 6 개의 VH 사슬(A) 및 4 개의 VK 사슬(B) 서열의 정렬이 원래의 토끼 서열(모체)에 정렬된 것으로 도시되어 있다. CDR 정의 및 단백질 서열은 카바트에 따라 넘버링된다. 토끼 모 서열로부터의 변화는 음영 처리되어 있다.
도 7. 인간화 항-타우 IgG의 패널은 ELISA 포맷으로 전장 재조합 2N4R 타우에 결합한다. 각각의 IgG 클론으로 일시적으로 형질감염된 HEK 세포로부터의 상청액은 전장 재조합 2N4R 타우에 대한 결합에 대해 1:100에서 시험되었다(채워진 막대). 시험된 임의의 변이형에 대해 BSA에 대한 검출 가능한 결합이 관찰되지 않았다(빈 막대). 항-타우 hIgG1의 결합은 HRP-접합된 항-인간 이차 항체를 사용하여 검출되었고, 데이터는 대표적인 실험으로부터 제시된 것이다(n=1 복제물).
도 8. 인간화 항-타우 IgG는 높은 친화성으로 타우에 결합한다. 대표적인 SPR 결합 곡선은 전장 재조합 2N4R 타우(0.39 nM 내지 12.5 nM이 2 배 희석으로 적용됨)에 대한 클론 #44 변이형, VH0VK0(A), VH3VK3(B), VH3VK4(C), VH4VK2(D), VH4VK3(E) 및 VH4VK4(F) 결합을 보여준다. 실험은 Biacore T200을 사용하여 수행되었으며, 회합 시간은 60 s였고 해리 시간은 200 s였다.
도 9. 클론 #44의 인간화 항체 변이형은 65℃ 초과의 Tm을 가진다. 우선순위화된 변이형, VH3VK3(A), VH3VK4(B), VH4VK2(C), VH4VK3(D), VH4VK4(E)에 대하여 단일 복제물로부터의 473 nm(SLS; 사각형) 신호에서 형광(삼각형) 및 정적 광 산란이 도시되어 있다.
도 10. 인간화 단클론성 항-타우 항체는 뉴런에 의한 모노머성 타우 흡수를 억제한다. 항체 클론 #44, VH3VK3(A), VH3VK4(B), VH4VK2(C), VH4VK3(D), VH4VK4(E)의 인간화 변이형(채워진 삼각형, 실선) 또는 이소형 대조 인간 IgG1(빈 사각형, 실선)은 Incucyte S3에서 영상화하기 전에 전장 pHrodo-표지된 모노머(P301S) 2N4R 타우(25 nM)와 함께 인큐베이션되었다. 21 h 동안 60 min마다 정량화된 뉴런(상) 면적 당 평균 주황색(pHrodo) 면적은 이소형 및 항체 부재(채워진 원, 점선) 처리에서 시간이 지남에 따라 꾸준히 증가했지만, 항-타우 항체 변이형으로 처리된 세포에서는 유의하게 감소하였다. ***, p<0.001; 항체 부재 대조 대비 터키(Tukey)의 다중 비교 검정을 이용한 일원 ANOVA. pHrodo-표지된 타우를 포함하지 않는 음성 대조 웰이 또한 도시되어 있다(빈 원, 점선). 데이터는 하나의 대표적인 실험으로부터 n=4 웰의 평균 +/- SEM으로 도시되어 있다.
도 11. 인간화 단클론성 항-타우 항체는 인간 iPSC-유래 뉴런에 의한 응집된 타우 흡수를 억제한다. 항체 클론 #44, VH3VK3(A), VH3VK4(B), VH4VK2(C), VH4VK3(D), VH4VK4(E)의 인간화 변이형(채워진 삼각형, 실선) 또는 이소형 대조 인간 IgG1(빈 사각형, 실선)은 Incucyte S3에서 영상화하기 전에 전장 pHrodo-표지된 응집된(P301S) 2N4R 타우(50 nM)와 함께 인큐베이션되었다. 21 h 동안 60 min마다 정량화된 뉴런(상) 면적 당 평균 주황색(pHrodo) 면적은 이소형 및 항체 부재(채워진 원, 점선) 처리에서 시간이 지남에 따라 꾸준히 증가했지만, 항-타우 항체 변이형으로 처리된 세포에서는 유의하게 감소하였다. ***, p<0.001; 항체 부재 대조 대비 터키의 다중 비교 검정을 이용한 일원 ANOVA. pHrodo-표지된 타우를 포함하지 않는 음성 대조 웰이 또한 도시되어 있다(빈 원, 점선). 데이터는 하나의 대표적인 실험으로부터 n=4 웰의 평균 +/- SEM으로 도시되어 있다.
도 12. 인간화 단클론성 항-타우 항체는 인간 iPSC-유래 성상세포에 의한 모노머성 타우 흡수를 억제한다. 항체 클론 #44, VH3VK3(A), VH3VK4(B), VH4VK2(C), VH4VK3(D), VH4VK4(E)의 인간화 변이형(채워진 삼각형, 실선) 또는 이소형 대조 인간 IgG1(빈 사각형, 실선)은 Incucyte S3에서 영상화하기 전에 전장 pHrodo-표지된 모노머(P301S) 2N4R 타우(25 nM)와 함께 인큐베이션되었다. 20 h 동안 60 min마다 정량화된 성상세포(상) 면적 당 평균 주황색(pHrodo) 면적은 이소형 및 항체 부재(채워진 원, 점선) 처리에서 시간이 지남에 따라 꾸준히 증가했지만, 항-타우 항체 변이형으로 처리된 세포에서는 유의하게 감소하였다. ***, p<0.001; 항체 부재 대조 대비 터키의 다중 비교 검정을 이용한 일원 ANOVA. pHrodo-표지된 타우를 포함하지 않는 음성 대조 웰이 또한 도시되어 있다(빈 원, 점선). 데이터는 하나의 대표적인 실험으로부터 n=4 웰의 평균 +/- SEM으로 도시되어 있다.
도 13. 인간화 단클론성 항-타우 항체는 인간 iPSC-유래 성상세포에 의한 응집된 타우 흡수를 억제한다. 항체 클론 #44, VH3VK3(A), VH3VK4(B), VH4VK2(C), VH4VK3(D), VH4VK4(E)의 인간화 변이형(채워진 삼각형, 실선) 또는 이소형 대조 인간 IgG1(빈 사각형, 실선)은 Incucyte S3에서 영상화하기 전에 전장 pHrodo-표지된 응집된(P301S) 2N4R 타우(50 nM)와 함께 인큐베이션되었다. 20 h 동안 60 min마다 정량화된 성상세포(상) 면적 당 평균 주황색(pHrodo) 면적은 이소형 및 항체 부재(채워진 원, 점선) 처리에서 시간이 지남에 따라 꾸준히 증가했지만, 항-타우 항체 변이형으로 처리된 세포에서는 유의하게 감소하였다. ***, p<0.001; 항체 부재 대조 대비 터키의 다중 비교 검정을 이용한 일원 ANOVA. pHrodo-표지된 타우를 포함하지 않는 음성 대조 웰이 또한 도시되어 있다(빈 원, 점선). 데이터는 하나의 대표적인 실험으로부터 n=4 웰의 평균 +/- SEM으로 도시되어 있다.
도 14. 인간화 항-타우 인간 IgG1은 인간 iPSC-유래 미세아교세포에 의한 모노머성 타우의 흡수를 증가시킨다. 항체 클론 #44, VH3VK3(A), VH3VK4(B), VH4VK2(C), VH4VK3(D), VH4VK4(E)의 인간화 변이형(채워진 원, 실선) 또는 이소형 대조 hIgG1(빈 사각형, 실선)은 Incucyte S3에서 영상화하기 전에 전장 pHrodo-표지된 모노머성 2N4R과 함께 인큐베이션되었다. 15 h 동안 30 min마다 정량화된 미세아교세포(상) 면적 당 평균 주황색(pHrodo) 면적은 이소형 및 항체 부재(채워진 삼각형, 점선) 처리에서 시간이 지남에 따라 중간 정도로 증가했지만, 항-타우 항체 클론으로 처리된 세포에서는 유의하게 증가하였다. pHrodo-표지된 타우를 포함하지 않는 음성 대조 웰이 또한 도시되어 있다(빈 원, 점선). 데이터는 하나의 대표적인 실험으로부터 n=4 웰의 평균 +/- SEM으로 주어져 있다. ***, p<0.001; **, p<0.005; 항체 부재 대조 대비 터키의 다중 비교 검정을 이용한 일원 ANOVA.
도 15. 인간화 항-타우 인간 IgG1은 인간 iPSC-유래 미세아교세포에 의한 응집된 타우의 흡수를 증가시킨다. 항체 클론 #44, VH3VK3(A), VH3VK4(B), VH4VK2(C), VH4VK3(D), VH4VK4(E)의 인간화 변이형(채워진 원, 실선) 또는 이소형 대조 hIgG1(빈 사각형, 실선)은 Incucyte S3에서 영상화하기 전에 전장 pHrodo-표지된 모노머성 2N4R과 함께 인큐베이션되었다. 15 h 동안 30 min마다 정량화된 미세아교세포(상) 면적 당 평균 주황색(pHrodo) 면적은 이소형 및 항체 부재(채워진 삼각형, 점선) 처리에서 시간이 지남에 따라 중간 정도로 증가했지만, 항-타우 항체 클론으로 처리된 세포에서는 유의하게 증가하였다. pHrodo-표지된 타우를 포함하지 않는 음성 대조 웰이 또한 도시되어 있다(빈 원, 점선). 데이터는 하나의 대표적인 실험으로부터 n=4 웰의 평균 +/- SEM으로 주어져 있다. ***, p<0.001; **, p<0.005; 항체 부재 대조 대비 터키의 다중 비교 검정을 이용한 일원 ANOVA.
도 16. 정제된 인간화 단클론성 항-타우 항체는 비-치매 대조(NDC) 사후 대뇌 피질과 비교하여 가족성 알츠하이머병(AD; 프레세닐린 1 돌연변이)에서 증가된 수준의 타우를 검출한다. NDC(레인 2) 및 AD 환자(레인 3)로부터의 뇌 용해물과 비교한 재조합 2N4R 타우(레인 1)의 웨스턴 블롯이 도시되어 있다. 클론 #44 변이형, VH3VK3(A), VH3VK4(B), VH4VK2(C), VH4VK3(D), VH4VK4(E), 및 모 VH0VK0 클론 #44(F) 항체는 AD 샘플에서 고 및 저 MW 종 둘 모두의 검출 증가와 함께 상이한 형태의 타우에 상응하는 다중 종을 검출한다. 화살표는 NDC 뇌에서 검출되지 않은 질병-특이적 타우 종을 나타낸다. 액틴(**) 및 뉴런 튜불린(*)이 도시되어 있고(G), 각각 로딩 및 사후 단백질 분해에 대한 대조를 위해 포함되었다.
도 17. 항-타우 항체는 비-치매 대조(NDC) 사후 대뇌 피질과 비교하여 가족성 알츠하이머병(AD), 산발성 AD 및 루이소체를 동반한 치매(DLB)에서 증가된 수준의 타우를 검출한다. NDC로부터의 대뇌 피질 용해물의 웨스턴 블롯(A, 레인 1 내지 5; B 내지 C, 레인 1 내지 4); 가족성 AD 환자(A; 레인 6 내지 10); 산발성 AD 환자(B, 레인 5 내지 8) 및 DLB 환자(C; 레인 5 내지 8)가 도시되어 있다. 모 토끼 IgG 클론 #44(i) 및 인간화 변이형 #44 VH4VK4(ii)는 유사하게 거동하고, 알츠하이머 및 DLB 샘플에서 고 및 저 MW 종 둘 모두의 검출 증가와 함께, 상이한 형태의 타우에 상응하는 다중 종을 검출한다. 패널 iii 내지 vii는 상업적으로 이용 가능한 항-타우 항체: 타우13(iii.), HT7(iv.), 타우5(v.) 및 타우46(vi.)를 사용하여 재프로빙된 동일한 블롯을 나타내고, N-말단(타우13), 중간-영역(HT7, 타우5) 및 원위 C-말단(타우46) 항체와 비교하여, SEQ ID NO: 1을 표적화하는 항체로 검출된 타우 종의 분명한 질병 특이성을 강조 표시한다. 화살표는 상업적으로 이용 가능한 항체에 의해서가 아닌, SEQ ID NO: 1을 표적화하는 항체에 의해, NDC는 아니지만, 질병 샘플에서 검출된 타우 종을 나타낸다. 액틴(**) 및 뉴런 튜불린(*)이 도시되어 있고(vii.), 각각 로딩 및 사후 단백질 분해에 대한 대조를 위해 포함되었다.
도 18. 인간화 항체 클론 #44_VH4VK4에 기반한 신규한 항체는 VH CDR2(H01-H06) 및 VH CDR3(H06-H20)(Abzena) 및 VL CDR3(L02)의 돌연변이유발에 의해 생성되었다. 모 인간화 항체 클론 #44_VH4VK4 서열(P)에 정렬된 20 개의 상위 VH 변이형(#44_VH4VK4_H01 내지 _H20) 및 4 개의 재조합된 변이형(#44_VH4VK4_H06-H01, _H06-H02, _H06-H04, H16-H04)(A) 및 1 개의 대표적인 VK 사슬 변이형(#44_VH4VK4_L02)(B) 서열의 정렬이 도시되어 있다. CDR 정의 및 단백질 서열은 카바트에 따라 넘버링된다. 모 인간화 서열로부터의 변화는 음영 처리되어 있다.
도 19. 친화성 성숙된 #44_VH4VK4 hIgG1 변이형의 패널은 ELISA 포맷으로 전장 재조합 2N4R 타우에 결합한다. 각각의 IgG 클론으로 일시적으로 형질감염된 HEK 세포로부터의 상청액은 전장 재조합 2N4R 타우에 대한 결합에 대해 1:100에서 시험되었다(채워진 막대). 시험된 임의의 변이형에 대해 BSA에 대한 검출 가능한 결합이 관찰되지 않았다(빈 막대). 항-타우 hIgG1의 결합은 HRP-접합된 항-인간 이차 항체를 사용하여 검출되었고, 데이터는 대표적인 실험으로부터 제시된 것이다(n=1 복제물).
도 20. 친화성 성숙된 인간화 항-타우 IgG는 높은 친화성으로 타우에 결합한다. 대표적인 SPR 결합 곡선은 전장 재조합 2N4R 타우에 결합하는 클론 #44_VH4VK4 변이형, _H01(A)(VH SEQ ID No: 183, VL SEQ ID NO: 160), _H02(B)(VH SEQ ID No: 184, VL SEQ ID NO: 160), _H04(C)(VH SEQ ID No: 186, VL SEQ ID NO: 160), _H06(D)(VH SEQ ID No: 188, VL SEQ ID NO: 160) 및 모 #44_VH4VK4(E)(VH SEQ ID No: 154, VL SEQ ID NO: 160)을 보여준다(2 배 희석으로 적용된 0.39 nM 내지 50 nM). 실험은 Biacore T200을 사용하여 수행되었으며, 회합 시간은 60 s였고 해리 시간은 200 s였다(적합성(fit)을 개선하기 위해 100 s로 자름). 항체는 hIgG1로서 시험되었다.
도 21. hIgG1로 발현되는 클론 #44_VH4VK4의 친화성 성숙된 인간화 항체 변이형은 64℃ 초과의 Tm을 가진다. 모 #44_VH4VK4(E)와 비교하여 우선순위화된 변이형, _H01(A), _H02(B), _H04(C), _H06(D)에 대하여 단일 복제물로부터의 473 nm(SLS; 사각형) 신호에서 형광(삼각형) 및 정적 광 산란이 도시되어 있다.
도 22. 친화성 성숙된 인간화 단클론성 항-타우 항체는 인간 뉴런에 의한 모노머성 타우 흡수를 억제한다. 인간화 항체 클론 #44_VH4VK4(pVH/pVL)의 친화성 성숙된 변이형, H01/pVL(A), H02/pVL(B), H04/pVL(C), H06/pVL(D), 및 모 pVH/pVL(E)(채워진 삼각형, 실선) 또는 이소형 대조 인간 IgG1(빈 사각형, 실선)은 Incucyte S3에서 영상화하기 전에 전장 pHrodo-표지된 모노머성 2N4R 타우 2N4R 타우(25 nM)와 함께 인큐베이션되었다. 18 h 동안 60 min마다 정량화된 뉴런(상) 면적 당 평균 주황색(pHrodo) 면적은 이소형 및 항체 부재(채워진 원, 점선) 처리에서 시간이 지남에 따라 꾸준히 증가했지만, 항-타우 항체 변이형으로 처리된 세포에서는 유의하게 감소하였다. ***, p<0.001; 항체 부재 대조 대비 던넷(Dunnett)의 다중 비교 검정을 이용한 일원 ANOVA. pHrodo-표지된 타우를 포함하지 않는 음성 대조 웰이 또한 도시되어 있다(빈 원, 점선). 데이터는 하나의 대표적인 실험으로부터 n=4 웰의 평균 +/- SEM으로 도시되어 있다.
도 23. 친화성 성숙된 인간화 단클론성 항-타우 항체는 인간 뉴런에 의한 응집된 타우 흡수를 억제한다. 항체 클론 #44_VH4VK4(pVH/pVL)의 친화성 성숙된 인간화 변이형, H01/pVL(A), H02/pVL(B), H04/pVL(C), H06/pVL(D), 및 모 pVH/pVL(E)(채워진 삼각형, 실선) 또는 이소형 대조 인간 IgG1(빈 사각형, 실선)은 Incucyte S3에서 영상화하기 전에 전장 pHrodo-표지된 응집된 (P301S) 2N4R 타우(50 nM)와 함께 인큐베이션되었다. 18 h 동안 60 min마다 정량화된 뉴런(상) 면적 당 평균 주황색(pHrodo) 면적은 이소형 및 항체 부재(채워진 원, 점선) 처리에서 시간이 지남에 따라 꾸준히 증가했지만, 항-타우 항체 변이형으로 처리된 세포에서는 유의하게 감소하였다. ***, p<0.001; 항체 부재 대조 대비 터키의 다중 비교 검정을 이용한 일원 ANOVA. pHrodo-표지된 타우를 포함하지 않는 음성 대조 웰이 또한 도시되어 있다(빈 원, 점선). 데이터는 하나의 대표적인 실험으로부터 n=4 웰의 평균 +/- SEM으로 도시되어 있다.
도 24. 친화성 성숙된 인간화 단클론성 항-타우 항체는 인간 성상세포에 의한 모노머성 타우 흡수를 억제한다. 항체 클론 #44_VH4VK4(pVH/pVL)의 친화성 성숙된 인간화 변이형, H01/pVL(A), H02/pVL(B), H04/pVL(C), H06/pVL(D), 및 모 pVH/pVL(E)(채워진 삼각형, 실선) 또는 이소형 대조 인간 IgG1(빈 사각형, 실선)은 Incucyte S3에서 영상화하기 전에 전장 pHrodo-표지된 모노머성 (P301S) 2N4R 타우(25 nM)와 함께 인큐베이션되었다. 21 h 동안 60 min마다 정량화된 성상세포(상) 면적 당 평균 주황색(pHrodo) 면적은 이소형 및 항체 부재(채워진 원, 점선) 처리에서 시간이 지남에 따라 꾸준히 증가했지만, 항-타우 항체 변이형으로 처리된 세포에서는 유의하게 감소하였다. ***, p<0.001; 항체 부재 대조 대비 터키의 다중 비교 검정을 이용한 일원 ANOVA. pHrodo-표지된 타우를 포함하지 않는 음성 대조 웰이 또한 도시되어 있다(빈 원, 점선). 데이터는 하나의 대표적인 실험으로부터 n=4 웰의 평균 +/- SEM으로 도시되어 있다.
도 25. 친화성 성숙된 인간화 단클론성 항-타우 항체는 인간 성상세포에 의한 응집된 타우 흡수를 억제한다. 항체 클론 #44_VH4VK4(pVH/pVL)의 친화성 성숙된 인간화 변이형, H01/pVL(A), H02/pVL(B), H04/pVL(C), H06/pVL(D), 및 모 pVH/pVL(E)(채워진 삼각형, 실선) 또는 이소형 대조 인간 IgG1(빈 사각형, 실선)은 Incucyte S3에서 영상화하기 전에 전장 pHrodo-표지된 응집된 (P301S) 2N4R 타우(50 nM)와 함께 인큐베이션되었다. 21 h 동안 60 min마다 정량화된 성상세포(상) 면적 당 평균 주황색(pHrodo) 면적은 이소형 및 항체 부재(채워진 원, 점선) 처리에서 시간이 지남에 따라 꾸준히 증가했지만, 항-타우 항체 변이형으로 처리된 세포에서는 유의하게 감소하였다. ***, p<0.001; 항체 부재 대조 대비 터키의 다중 비교 검정을 이용한 일원 ANOVA. pHrodo-표지된 타우를 포함하지 않는 음성 대조 웰이 또한 도시되어 있다(빈 원, 점선). 데이터는 하나의 대표적인 실험으로부터 n=4 웰의 평균 +/- SEM으로 도시되어 있다.
도 26. 정제된 친화성 성숙된 인간화 단클론성 항-타우 항체는 비-치매 대조(NDC) 사후 대뇌 피질과 비교하여 가족성 알츠하이머병(AD; 프레세닐린 1 돌연변이)에서 증가된 수준의 타우를 검출한다. NDC(레인 2) 및 AD 환자(레인 3)로부터의 뇌 용해물과 비교한 재조합 2N4R 타우(레인 1)의 웨스턴 블롯이 도시되어 있다. 클론 #44 변이형, pVH/pVL(모)(A), H01/pVL(B), H02/pVL(C), H04/pVL(D), H06/pVL(E) 및 H16/pVL(F) 항체는 AD 샘플에서 고 및 저 MW 종 둘 모두의 검출 증가와 함께 상이한 형태의 타우에 상응하는 다중 종을 검출한다. 화살표는 NDC 뇌에서 검출되지 않은 질병-특이적 타우 종을 나타낸다. 각각의 사후 뇌 샘플에 대해 동일한 양의 단백질이 각 겔 상에 로딩되었다.
도 27. 친화성 성숙된 항-타우 항체는 비-치매 대조(NDC) 사후 대뇌 피질과 비교하여 가족성 알츠하이머병(AD)의 패널에서 증가된 수준의 타우를 검출한다. NDC(레인 1 내지 5); 가족성 AD 환자(레인 6 내지 10)로부터의 대뇌 피질 용해물의 웨스턴 블롯이 도시되어 있다. 친화성 성숙된 인간화 변이형 #44_VH4VK4_H01/pVL(A), _H02/pVL(B), _H04/pVL(C) 및 _H06/pVL(D)은 가족성 알츠하이머병 샘플에서 높은 및 낮은 MW 종 둘 모두의 검출 증가와 함께 상이한 형태의 타우에 상응하는 다중 종을 검출한다. 화살표는 SEQ ID NO: 1을 표적화하는 항체에 의해, NDC는 아니지만, 질병 샘플에서 검출된 타우 종을 나타내고, 액틴(**) 및 뉴런 튜불린(*)이 하기 도시되어 있고, 각각 로딩 및 사후 단백질 분해에 대한 대조를 위해 포함되었다.
도 28. 친화성 성숙된 항-타우 항체는 비-치매 대조(NDC) 사후 대뇌 피질과 비교하여 산발성 AD 및 루이소체를 동반한 치매(DLB)에서 증가된 수준의 타우를 검출한다. NDC(레인 1 내지 4); 산발성 AD 환자(A, C; 레인 5 내지 8) 및 DLB 환자(B, D; 레인 5 내지 8)로부터의 대뇌 피질 용해물의 웨스턴 블롯이 도시되어 있다. 친화성 성숙된 인간화 변이형 #44_VH4VK4_H04/pVL(A, B) 및 #44_VH4VK4_H06/pVL(C, D)은 유사하게 거동하고, 알츠하이머 및 DLB 샘플에서 높은 및 낮은 MW 종 둘 모두의 검출 증가와 함께 상이한 형태의 타우에 상응하는 다중 종을 검출한다. 화살표는 SEQ ID NO: 1을 표적화하는 항체에 의해, NDC는 아니지만, 질병 샘플에서 검출된 타우 종을 나타내고, 액틴(**) 및 뉴런 튜불린(*)이 하기 도시되어 있고(E, F), 각각 로딩 및 사후 단백질 분해에 대한 대조를 위해 포함되었다.
도 29. 인간화 항-타우 항체는 면역원 서열 내의 동일한 에피토프에 결합한다. 항체 클론 #44_VH4VK4_H04/pVL(클론 VH4VK4_H04; A) 및 #44_VH4VK4_H06/pVL(클론 VH4VK4_H06, B)에 대한 에피토프 치환 스캔 분석의 문자 플롯 도식은 타우에 대한 결합에 필요한 주요 잔기를 강조 표시한다. 펩티드 어레이에 대한 이소형 대조 인간 IgG1의 낮은 수준의 결합(C)은 항-타우 항체의 결합과 분명히 다르며, 항-타우 항체 결합이 CDR-특이적임을 입증한다. 플롯 아래에 도시된, 네이티브 리드 펩티드 서열의 각각의 위치에서 단일 아미노산 치환을 지니는 선형 펩티드가 생성되었다. 대체에 대해 수득된 값은 기록된 값의 높이에 플롯팅된 각각의 대체 잔기에 대한 문자 코드로 나타난다. 화살표는 리드 서열에 대한 중앙값을 나타낸다.
실시예
실시예 1: 가족성 알츠하이머병 뉴런 배양물로부터 방출된 다중 종의 타우가 대조 배양 상청액에서 발견되지 않는다(도 1)
가족성 알츠하이머병(fAD) 및 전두측두 치매(FTD) 신경 배양물로부터 방출된 다중 종의 타우는 비-치매 대조(NDC) 신경 배양 상청액에서 발견되지 않는다. 타우를 상용 항체, HT7(Invitrogen, 칼즈배드, CA, USA) 또는 타우13(산타크루즈, 댈러스, TX, USA)을 사용하여 NDC, fAD-관련 돌연변이, PSEN1 Y115C(PSEN) 및 FTD-관련 돌연변이, MAPT IVS10+16(MAPT)으로부터의 뉴런 세포 배양 상청액으로부터 면역침전(IP)시키고, 마우스 단클론성 IgG 대조와 비교하였다. 웨스턴 블롯(도 1)은 항-타우 항체(K9JA; Agilent, 산타클라라, CA, USA)를 사용한 각각의 면역침전 후 타우 종의 검출을 보여준다. 밴드(도 1의 박스 1 내지 5에 강조 표시됨)를 절제하고, 질량 분광계에 의해 분석하여 질병-관련 분비체가 풍부한 타우 펩티드를 확인하였다. 이러한 분석은 NDC로부터의 것들과 비교하여 질병-관련 분비체에서 미세소관 결합 도메인(2N4R 타우의 아미노산 260 내지 267(SEQ ID NO: 9), 306 내지 317(SEQ ID NO: 10) 및 354 내지 369(SEQ ID NO: 11)) 및 C-말단(2N4R 타우의 아미노산 396 내지 406(SEQ ID NO: 12)에 상응함)으로부터의 펩티드 수의 증가를 드러냈다(표 4). 데이터는 미세소관 결합 도메인 및 이웃하는 C-말단 영역을 포함하는 타우 종이 NDC와 비교하여 질병-관련 뉴런으로부터 더 높은 수준으로 분비되고, 따라서 병리학적 또는 독성 형태의 타우를 나타낼 수 있음을 보여준다.
1.1 인간 iPSC-유래 뉴런의 세포 배양: 투사 뉴런 배양에 대한 인간 만능 줄기 세포(iPSC)의 분화를 문헌[Shi et al., Nature Neurosci. 15(3):477-86(2012)]에 기재된 바와 같이 수행하였다. 상이한 유전적 배경으로부터의 iPSC 세포주를 사용하였다: NDC(Shi et al., Nature Neurosci. 15(3):477-86; Shi et al. Nature Protocols 7(10): 1836-46(2012)); 삼염색체 21(TS21; Shi et al. Nature Protocols 7(10): 1836-46(2012)); PSEN1 Y115C 돌연변이(PSEN; Moore et al. Cell Rep 11(5): 689-96(2015)); APP V717I 돌연변이(APP; Moore et al. Cell Rep 11(5): 689-96(2015); MAPT IVS10+16(MAPT; Sposito et al. Hum Mol Genet 24(18):5260-5269(2015)). 개별 실험을 위해 세포를 시험관내에서 40 일차에 플레이팅하고, 60+ 일차(D60+)까지 유지하였고, 여기서 시험관내 일수는 유도 후 일수를 지칭한다(이후에 상세히 설명됨).
1.2 면역침전 및 웨스턴 블롯팅(도 1): iPSC-유래 뉴런을 12 웰 플레이트(Corning, 뉴욕, USA)에서 배양하고 D60까지 성숙시키고, 그 후에, 컨디셔닝된 배지를 48 시간마다 수집하였다. 배지를 회전시켜 세포 잔해를 제거하고, 상청액을 -20℃에 저장하였다. 컨디셔닝된 배지를 얼음 상에서 해동시키고, Vivaspin 20, 10 kDa MWCO 폴리에테르설폰(Sigma, 세인트 루이스, MI, USA)을 사용하여 약 10 배 농축시켰다.
1.2.1 항체 접합: Dynabead(Thermo Fisher Scientific, 월쌈, MA, USA)를 세척한 다음, 10 min 동안 5 μg의 명시된 항체와 함께 인큐베이션하였다. 이어서, IgG 항체 비드 믹스를 농축 컨디셔닝된 배지에 첨가하고, 롤러 상에서 밤새 인큐베이션하였다. Dynabead를 컨디셔닝된 배지로부터 제거하고, 타우13(Abcam, 케임브리지, UK) 항체 비드 믹스로 교체하고, 약 8 시간 동안 인큐베이션하였다. Dynabead를 컨디셔닝된 배지로부터 제거하고, HT7(Invitrogen, 칼즈배드, CA, USA) 항체 비드 믹스로 교체하고, 밤새 인큐베이션하였다. 모든 비드를 0.05% 트윈(PBS)으로 3 회 세척하였다. 100 μl의 Laemlli 용해 완충제를 모든 비드에 첨가하고, 10 min 동안 비등시켰다. 상청액을 SDS 겔 상에서의 러닝을 위해 보관하였다.
1.2.2 웨스턴 블롯팅: 20 μl의 샘플을 12% Mini-Protean TGX 프리캐스트 겔(Bio-Rad, 허큘리스, CA, USA)에 로딩하고, 4℃에서 2 시간 동안 200 mA에서 0.2 μm PVDF 막(GE Healthcare Life science, 시카고, IL, USA) 상으로 옮겼다. 막을 실온(RT)에서 1 시간 동안 PBS 중 0.1% 트윈, 5% 건조 탈지유(Marvel, Premier Foods, 세인트 알반스, UK)에서 차단하였다.
단백질-전달된 막을 일차 항체(명시된 농도에서)로 RT에서 밤새 탐침하였다. 막을 후속하여 RT에서 1 시간 동안 이차 항체(염소 항-토끼 HRP)와 함께 인큐베이션하였다.
1.3 질량 분석: 20 μl의 샘플을 12% Mini-Protean TGX 프리캐스트 겔(Bio-Rad, 허큘리스, CA, USA)에 로딩하였다. 이후, 겔을 EZBlueTM 겔 염색 시약(Sigma, 세인트 루이스, MO, USA)과 함께 4 hr 동안 인큐베이션한 다음, 밤새 ddH2O로 탈색시켰다. 웨스턴 블롯 분석에 의해 타우에 상응하는 밴드를 콜로이드성 청색 SDS-PAGE로부터 절제하였다. 절제된 밴드를 200 μl의 100 mM 암모늄 바이카르보네이트/50% 아세토니트릴에서 20℃에 노출시키고, 이어서, 5 mM 트리스(2-카르복시에틸)포스핀으로 환원시켰다. 이후, 아이오도아세트아미드의 첨가에 의한 알킬화 후(25 mM 최종 농도; 단계 당 30 min 동안 각각의 인큐베이션) 액체를 제거하였다. 겔 조각을 진공에서 10 min 동안 건조시키고, 5 μg/mL의 변형된 트립신(Promega, 매디슨, WI, USA)을 함유하는 25 μl의 100 mM 암모늄 바이카르보네이트를 첨가하였다(37℃에서 17 h 동안 분해). 펩티드를 회수하고, μC18 ZipTip(Millipore, 벌링턴, MA, USA)을 사용하여 탈염시키고, 50% 아세토니트릴/0.1% 트리플루오로아세트산 중 1 μl 내지 2 μl의 알파-시아노-4-하이드록시신남산 매트릭스(Sigma, 세인트 루이스, MO, USA)를 사용하여 maldi 표적 플레이트로 용리시켰다. 리플렉트론 모드에서 Bruker ultrafleXtreme Maldi 질량 분석기를 사용하여 펩티드 질량을 결정하고, LIFT 모드에서 ms/ms 단편화를 수행하였다. 데이터 분석을 FlexAnalysis, BioTools 및 ProteinScape 소프트웨어(Bruker, 빌러리카, MA, USA)로 수행하였다. 조합된 질량 핑거프린트-ms/ms 데이터의 데이터베이스 검색을 Mascot(http:/www.matrixscience.com)를 사용하여 수행하였다. (표 4)
Figure pct00006
표 4. 절제된 밴드 1 내지 5(도 1)로부터 제조된 샘플에서 질량 분광기에 의해 확인된 펩티드 단편이 요약되어 있다. 전장 2N4R 타우 서열(SEQ ID NO: 2) 내의 아미노산 서열 및 위치가 각각의 펩티드가 확인된 횟수와 함께 제공된다.
실시예 2: 펩티드 합성
신경퇴행성 질환에서 미세소관 결합 도메인/C-말단 함유 타우 단편의 중요성을 추가로 조사하기 위해, 이러한 영역을 표적화하는 신규한 항체를 생성하였다. 2N4R 타우의 아미노산 369 내지 381에 상응하는 펩티드 서열 KKIETHKLTFREN(SEQ ID NO: 1)을 여러 가지 이유로 토끼 IgG를 생성하기 위한 면역원으로서 선택하였다. 첫째로, 서열은 미세소관 결합 영역(MTBR)에 인접하지만, MTBR 자체와 달리, 타우 단백질 내의 다른 영역 및 미세소관 결합 단백질 패밀리 구성원과 낮은 동일성을 나타낸다. 이는 생성된 항체가 다른 영역/단백질과의 교차-반응성 위험이 낮으면서 타우 내의 표적 영역에 특이적으로 및 선택적으로 결합하는 확률을 증가시킨다. 둘째로, 추정 인산화 부위의 부재는 타우 인산화가 병리학적 결과와 연관성이 있는 영역에서 수득된 데이터의 해석을 단순화시킨다(Augustinack et al., Acta Neuropathol 103(1): 26-35(2002)). 따라서, 이러한 펩티드를 표적화하는 항체는 다중 부위에 대한 결합 및/또는 인산화된/탈인산화된 타우에 대한 차등적 결합과 관련된 합병증 없이, C-말단 함유 타우 종의 역할을 탐색/표적화할 수 있게 한다. 이러한 기준을 충족하는 유사한 항체는 공개 도메인에서 이용 가능하지 않다.
2N4R 타우의 아미노산 369 내지 381에 상응하는 펩티드 서열 KKIETHKLTFREN(SEQ ID NO: 1)에 의해 형성된 에피토프에 특이적으로 결합하는 토끼 단클론성 IgG 항체의 생성 및 특징규명은 2020년 6월 29일에 출원되어 2020년 12월 30일에 제WO/2020/260722호로 공개된 국제 특허 출원 번호 제PCT/EP2020/068314호에 기재되어 있으며, 본 출원은 이로부터 우선권을 주장한다. 제WO/2020/260722호로 공개된 국제 특허 출원 번호 제PCT/EP2020/068314호의 내용은 그 전체가 본원에 포함된다.
항원성 펩티드, [C]-KKIETHKLTFREN-아미드(SEQ ID NO: 13)를 표준 기법을 사용하여 Cambridge Research Biochemicals(빌링햄, UK)에 의해 합성하였고, HPLC에 의해 95% 초과 순도인 것으로 나타났다. 면역화를 위한 펩티드를 말레이미도벤조일-N-하이드록시석신이미드 에스테르(MBS) 링커를 거쳐 N-말단 시스테인 상의 유리 티올을 통해 키홀 림펫 헤모시아닌(Keyhole Limpet Haemocyanin; KLH)에 접합시켰다. 단일 혈장 세포 인테로게이션(Single Plasma cell Interrogation; SPIN) 프로토콜에 사용하기 위한 펩티드를 전매 방법(Exonbio, 샌디에이고, CA, USA)을 이용하여 N-말단 시스테인 상의 유리 티올을 사용하여 비오티닐화된 폴리머에 접합시켰다.
실시예 3: 표적 면역원을 사용한 토끼의 면역화
3.1: 표적 면역원을 사용한 토끼의 면역화: 1 마리의 뉴질랜드 흰토끼를 사용하여 토끼 단클론성 항체를 생성하였다. 토끼를 0 일차(프로인드 완전 애주번트에서), 이후 19 일마다 76 일차까지(프로인드 완전 애주번트에서) 200 μg(1 mg/mL 희석액으로 제조됨) 정제된 KLH-접합 펩티드([C]-KKIETHKLTFREN(SEQ ID NO: 13), 2N4R 타우의 아미노산 369 내지 381에 상응함)로 면역화시켰다. 애주번트 및 항원 부스트를 각각 94 일차 및 97 일차에 제공하고(i.p.), 이후 104 일차에 최종 채혈을 수행하고, 표준 방법을 이용하여 항혈청을 수집하였다(Hancock & O'Reilly Methods Mol Biol 295:27-40(2005)).
사용된 축산 및 절차는 1966년 동물 복지법(미국 동식물 검역국(US Animal and Plant Health Inspection Service))을 준수하였다.
3.2: 펩티드 ELISA(도 2): 강력한 면역 반응의 생성을 확인하기 위해, 면역화 후 다양한 시점에 고정된 표적 항원에 대한 면역반응성에 대해 혈청을 시험하였다. 면역화 후 76 일차에 취한 혈청은 1:1000 내지 1:1000,000의 희석액에서 선형 펩티드 표적에 대해, 단클론성 항체 단리를 진행하기에 충분한 IgG 역가를 나타내는 면역반응성을 보였다.
ELISA 플레이트를 4℃에서 밤새 항원(비-접합된 항원 펩티드(항원 펩티드([C]-KKIETHKLTFREN-아미드(SEQ ID NO: 13); 1Х PBS 중 2 μg/웰)으로 코팅하였다. 항원을 웰로부터 제거하고, 플레이트를 1Х PBS 중 5% 건조 우유로 RT에서 1 시간 동안 차단하였다. 차단 용액을 제거하고, 100 μL의 희석된 혈청(1% BSA/1Х PBS에서 희석됨)을 관련 웰에 첨가하고, 플레이트를 RT에서 1 시간 동안 약하게 진탕시키면서 인큐베이션하였다. 이후, 플레이트를 PBS/0.1% 트윈(PBST)으로 4 회 세척하였다. PBS 중 1% BSA에서 1:10,000으로 희석된 항-토끼 IgG-HRP 항체(Sigma, 세인트 루이스, MO, USA)를 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 약하게 진탕시키면서 RT에서 30 min 동안 인큐베이션한 후, PBST로 4 회 세척하였다. 50 μL의 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB) ELISA 용액을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 RT에서 15 min 동안 인큐베이션하고, 동일한 부피의 1 M 황산을 각각의 웰에 첨가하고, OD를 450 nm에서 측정하였다.
실시예 4: 표적 에피토프에 특이적인 단클론성 IgG의 단리
96 개의 개별 항원-특이적 형질 세포를 전매 방법(Exonbio, 샌디에이고, CA, USA)을 사용하여 Exonbio에 의해 표적 면역원을 사용하여 확인하고 단리하였다.
비장세포를 면역화된 토끼의 비장으로부터 피콜(Ficoll) 구배(1.084)로 단리하고, 형질 세포 마커 및 비오틴-접합된 항원으로 염색하였다. 항원-특이적 형질 세포를 단리하고, 웰 당 하나의 세포로 96-웰 플레이트에 분류하였다. 항체 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 단일 세포 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 개별적으로 증폭시켰다. 이어서, 증폭된 중쇄 및 경쇄를 pRab293 플라스미드로 클로닝하고, 제조업체의 지침에 따라 Invitrogen(칼즈배드, CA, USA) 293fectin 형질감염 시약을 사용하여 무혈청 배지 중 HEK293F 현탁 세포에서 발현시켰다.
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Figure pct00008
표 5 클론 1 내지 클론 17에 대한 중쇄 및 경쇄 아미노산 CDR 서열
실시예 5: 일시적으로 발현된 IgG는 단리된 펩티드 면역원에 결합한다(도 3).
시험관내 시험을 위한 IgG 샘플을 생성하기 위해 개별 토끼 IgG 클론을 HEK293F 세포에서 일시적으로 발현시켰다. 단일 IgG 클론을 함유하는 상청액을 짧은 펩티드 면역원([C]-KKIETHKLTFREN-아미드; SEQ ID NO: 13)과 전장 2N4R 재조합 타우(SEQ ID NO: 2) 둘 모두에 결합하는 능력에 대해 시험하였다. 23 개의 클론이 0.3 초과의 OD로 전장 타우에 결합한다는 것이 발견되었고, 시퀀싱을 위해 우선순위화되었다. 17 개의 고유한 클론을 확인하고 발현시켰다(표 5). 데이터는 전장 재조합 2N4R 타우에 결합할 수 있는 IgG의 생성을 위한 짧은 펩티드 면역원([C]-KKIETHKLTFREN-아미드)의 유용성을 입증하고; 면역원과 전장 2N4R 타우 둘 모두에 결합하는 17 개의 우선순위화된 클론의 능력을 입증한다.
5.1 HEK 세포에서 IgG의 일시적 발현
시험관내 시험을 위한 IgG 샘플을 생성하기 위해 개별 토끼 IgG 클론을 HEK293F 세포에서 일시적으로 발현시켰다. 현탁액에서 배양된 HEK293F 세포를 제조업체의 지침에 따라 293fectin 형질감염 시약(Invitrogen, 칼즈배드, CA, USA)을 사용하여 pRab293 플라스미드에서 작제물로 일시적으로 형질감염시켰다.
상청액을 형질감염 7 일 후에 수집하였다. 항체를 AKTA 크로마토그래피 시스템(GE Healthcare, 시카고, IL, USA)에서 단백질 A 컬럼(25 mL의 수지) 및 표준 방법을 이용하여 정제하였다. 간략히, 단백질 A 컬럼에 5 mL/min으로 상청액을 로딩한 다음, PBS(5x 총 컬럼 부피)로 세척하였다. 단백질 피크를 수집하고, 4℃에서 PBS 중에 밤새 투석하였다.
mg 양의 IgG의 생성을 위해, 300 mL-1 리터 HEK293F 세포를 일시적으로 형질감염시키고, 상기와 같이 단백질 A 컬럼을 사용하여 형질감염 7 일 후에 IgG를 배양 배지로부터 정제하였다.
5.2 펩티드 ELISA.
ELISA 플레이트를 37℃에서 1 시간 동안 1Х 카르보네이트-바이카르보네이트 완충제 중 항원(비-접합된 항원 펩티드(항원 펩티드([C]-KKIETHKLTFREN-아미드(SEQ ID NO: 13)) 또는 전장 2N4R 타우(SEQ ID NO: 2), 100 ng/웰; 또는 1Х TBS 중 1% BSA)으로 코팅하였다. 항원을 웰로부터 제거하고, 플레이트를 이후 1Х TBS 중 5% 건조 우유로 RT에서 1 시간 동안 차단하였다. 차단 용액을 제거하고, HEK293F 세포 상청액(1% BSA/1Х TBS 중 10 μg/mL, 내지 0.0001 μg/mL)을 관련 웰에 첨가하고, 플레이트를 RT에서 1 시간 동안 약하게 진탕시키면서 인큐베이션하였다. 이후, 플레이트를 TBS/0.1% 트윈(TBST)으로 4 회 세척하였다. 5% 우유/TBS에서 1:5000으로 희석된 항-토끼 IgG-HRP 항체(Sigma, 세인트 루이스, MO, USA)를 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 약하게 진탕시키면서 RT에서 1 시간 동안 인큐베이션한 후, TBST로 4 회 세척하였다. 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB) ELISA 용액을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 RT에서 15 min 동안 인큐베이션하였다. 동일한 부피의 1 M 황산을 각각의 웰에 첨가하고, OD를 450 nm에서 측정하였다.
실시예 6: 단클론성 항체는 농도-의존적 방식으로 ELISA에 의해 전장 재조합 타우를 검출한다.
항-타우 토끼 IgG 클론 #66(클론 1) 및 #44(클론 2)는 ELISA 플레이트에 고정된 전장 재조합 2N4R 타우(SEQ ID NO: 2)에 농도-의존적 방식으로 결합하고, 반치 최대 ELISA 신호는 각각 0.82 nM[0.7 nM 내지 0.95 nM] 및 1.05 nM[0.96 nM 내지 1.15 nM]에서 관찰되었다(단일 실험에서 n=2 웰로부터의 평균 및 95% 신뢰 구간이 제공됨). 데이터는 전장 타우에 대한 두 클론 모두의 높은 친화성 결합을 입증한다.
실시예 7: 단클론성 항-타우 항체는 인간 iPSC-유래 뉴런 배양물에서 타우를 검출한다.
웨스턴 블롯으로 재조합 및 천연적으로 발현된 타우를 검출하는 항-타우 IgG의 능력을 입증하였다. 토끼 IgG 클론 #12(클론 3), #44(클론 2), #45(클론 4) 또는 #66(클론 1)을 함유하는 HEK293F 세포-유래 상청액(실시예 5.1에 따라 생성됨)을 전장 재조합 2N4R 타우(SEQ ID NO: 2)(rPeptide, 왓킨스빌, GA, USA)를 약 60 kD에서 우세한 밴드로서 검출하였다. 시험된 모든 클론은 단일 레인에 로딩된 22 ng의 타우를 검출할 수 있었다. 4 개의 클론 모두는 인간 iPSC-유래 뉴런 용해물에서 약 50 kD에서 우세한 밴드를 검출하였다. 단백질을 탈인산화하기 위한 람다 포스파타제를 이용한 신경 용해물의 처리는 신경 용해물에서 검출되는 검출된 타우 종의 겉보기 분자량을 감소시켰지만(성공적인 탈인산화와 일치함), 천연적으로 발현된 타우를 검출하는 항체의 능력에는 영향을 미치지 않았다. 데이터는 시험된 모든 4 개의 IgG 클론이 인산화된 및 탈인산화된 타우 샘플에 동등하게 잘 결합하고 웨스턴 블롯에 의해 재조합 타우와 천연 발현된 타우 둘 모두를 검출할 수 있음을 입증한다.
정제된 클론 #44(클론 2) 및 #66(클론 1) IgG는 NDC, 질병-AD-관련(PSEN Y115C, 삼염색체 21) 및 FTD-관련(MAPT IVS10+16) 유전적 배경으로부터의 인간 iPSC-유래 뉴런에서 타우를 검출하였다(도 6). 우세한 밴드는 각 뉴런 샘플 중 약 50 kD에서 검출되었다. 상업적으로 이용 가능한 항체, HT7(2N4R 타우의 아미노산 159 내지 163에 상응하는 에피토프에 대해 발생됨; Invitrogen, 칼즈배드, CA, USA)은 또한, 이것이 전장 타우를 나타내는 것과 일치하여, 블롯을 재탐침하는 데 사용될 때 약 50 kD에서 우세한 밴드를 검출하였다. 데이터는 배양물에서 인간 iPSC-유래 뉴런에서 세포내에 존재하는 타우가 2N4R 타우(SEQ ID NO: 2)의 아미노산 369 내지 381(SEQ ID NO: 1)에 상응하는 에피토프를 표적화하는 항체에 의해 검출될 수 있음을 보여준다.
실시예 8: 단클론성 항-타우 항체는 비-치매 대조 사후 뇌와 비교하여 가족성 알츠하이머병(fAD)에서 증가된 수준의 타우를 검출한다.
NDC 및 알츠하이머병 환자로부터의 뇌 용해물을 사용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다. IgG 클론 #12(클론 3), #44(클론 2), #45(클론 4) 또는 #66(클론 1)을 함유하는 HEK293F 세포-유래 상청액은 인간 사후 뇌 샘플에서 타우를 검출하였다. 4 개의 클론 모두는 시험된 NDC 샘플에 존재하지 않는 다중 고(75 kD 초과) 및 저(40 kD 미만) 분자량 종을 포함하여, NDC 뇌 샘플에 비해 AD에서 증가된 수준의 타우를 검출한다. 데이터는 2N4R 타우(SEQ ID NO: 1)의 아미노산 369 내지 381에 상응하는 서열을 표적화하는 4 개의 별개의 IgG 클론이 모두, NDC 및 질병 샘플에 존재하는 약 50 kD의 밴드 이외에, AD 뇌 용해물에서 질병-특이적 고분자량 및 저분자량 종의 타우의 유사한 패턴을 검출한다는 것을 입증한다. 이는 관찰이 SEQ ID NO: 1에 대한 모든 항체 결합에 대해 일반화될 수 있음을 시사한다.
더 넓은 선택의 사후 샘플이 평가될 때, 정제된 클론 #44(클론 2) 및 #66(클론 1) IgG는 알츠하이머 샘플에서 고분자량과 저분자량 종 둘 모두의 검출 증가와 함께 상이한 형태의 타우에 상응하는 다중 종을 다시 검출하였다(도 8). 액틴 및 뉴런 튜불린은 각각 로딩 및 사후 단백질 분해에 대한 대조를 위해 포함되었으며, 이는 AD 샘플에서 타우의 검출 증가가 단백질 로딩 증가 또는 분해 감소의 결과가 아니라 오히려 NDC와 비교하여 AD 뇌에서 C-말단 타우 함유 종의 존재비의 증가를 반영한다는 것을 입증한다. 특히, SEQ ID NO: 1을 표적화하는 항체는 상업적으로 이용 가능한 항-중간-영역 타우 항체, HT7에 의해 검출되지 않은 사후 뇌 샘플에서 별개의 패턴의 타우 종을 검출하였다. 이들은 NDC 뇌 샘플과 비교하여 AD에서 존재비가 분명히 증가된 저 및 고 MW 종 둘 모두를 포함한다. HT7 항체에 의해 검출된 저분자량 종은 비-질병 뇌와 비교하여 질병이 비교적 변하지 않거나 감소한다. 이는 질병-특이적 타우 종이 상업적으로 이용 가능한 중간-영역 항체에 의해 검출되지 않는데 본원에 기재된 신규한 항체에 의해 검출된다는 것을 시사한다. 데이터는 대조와 비교하여 알츠하이머병 뇌에서 관심 에피토프를 함유하는 타우 종의 존재 및 증가된 존재비를 확인시켜 주었다.
8.1 인간 뇌 샘플: 인간 사후 뇌 샘플을 킹스 칼리지 런던 신경퇴행성 질환 브레인 뱅크(Kings College London Neurodegenerative Diseases Brain Bank)로부터 입수하였다. 모든 작업은 윤리적으로 승인되었고, 뇌 기증 전에 사전 동의를 얻었다. 알츠하이머병 뇌 샘플은 가족성 알츠하이머병을 갖는 개체의 전두엽 피질로부터의 샘플이었다(PSEN1 돌연변이; 표 6에 요약됨). 비-치매 대조 뇌 샘플은 치매의 임상 징후를 나타내지 않은 동일 연령 개체로부터의 샘플이었다. 대조 개체의 사망 원인은 다음과 같았다: 폐암종(1), 관상동맥 폐색(2), 폐암(3), 급성 간부전(4), 전이성 전립선암(5); 이들 중 어느 것도 사후에 검출된 타우 수준/종에 영향을 미치지 않을 것으로 예상된다.
Figure pct00009
표 6: AD 뇌 샘플에 존재하는 가족성 알츠하이머병과 관련된 공지된 돌연변이의 요약.
실시예 9: 단클론성 항-타우 항체는 비-치매 대조 사후 뇌와 비교하여 산발성 알츠하이머병(AD), 및 루이소체를 동반한 치매(DLB)에서 증가된 수준의 타우를 검출한다.
데이터세트를 가족성 형태의 AD를 넘어서도록 확장하기 위해, 산발성 AD 및 DLB 환자로부터의 사후 뇌 샘플을 웨스턴 블롯에 의해 평가하였다. 클론 #66(클론 1) IgG는 NDC와 비교할 때 모든 질병 관련 샘플에서 고분자량 타우 종과 저분자량 타우 종 둘 모두의 증가된 수준을 검출하였다. 앞서 기술된 바와 같이(실시예 8), 상업적으로 이용 가능한 중간-영역 타우 항체, HT7 및 BT2(ThermoFisher, 월쌈, MA)는 검출 가능한 질병-관련 증가 없이 모든 샘플에서(약 50 kD에서 전장 타우 이외에) 다양한 주로 더 낮은 분자량(40 kD 미만)의 타우 종을 검출하였다. 액틴 및 뉴런 튜불린 대조는 타우 수준의 변화가 제시된 샘플에서 단백질 및/또는 뉴런 수준의 변동으로 인한 것이 아님을 확인시켜 준다. 데이터는, 가족성 AD 이외에, 산발성 AD 및 타우병증 뇌에서 관심 에피토프(SEQ ID NO: 1)를 함유하는 타우 종의 존재 및 증가된 존재비를 입증한다. 이는 이러한 종들이 AD 및 타우병증의 일반적인 특징일 수 있고 이러한 영역을 표적화하는 치료제가 산발성과 가족성 형태 둘 모두의 AD 이외에 다양한 타우병증을 치료하는 데 광범위한 유용성을 가질 수 있음을 시사한다.
9.1 인간 뇌 샘플: 인간 사후 뇌 샘플의 기원에 대해서는 실시예 8을 참조한다. 모든 샘플은 임상적으로 및 병리학적으로 확인된 산발성 알츠하이머병(Braak 병기 6) 또는 DLB를 가진 개체의 전두 피질로부터의 샘플이었다. 비-치매 대조 뇌 샘플은 치매의 임상 징후 또는 AD/타우병증의 병리학적 징후를 나타내지 않은(Braak 병기 0) 동일 연령 개체로부터의 샘플이었다. 언급된 경우, 대조 개체의 사망 원인은 사후에 검출된 타우 수준/종에 영향을 미치는 것으로 예측되지 않을 것이다.
실시예 10: 항-타우 IgG는 면역세포화학에 의해 인간 iPSC-유래 뉴런 배양물에서 천연적으로 발현된 타우를 검출한다.
클론 #66(클론 1)을 사용하여 면역세포화학에 의해 NDC 및 FTD-관련(MAPT IVS10+16) iPSC-유래 뉴런(50+ 일차)에서 타우 발현을 시각화하였다. 염색 패턴은 낮은 수준의 배경으로, 주로 타우의 축삭 국소화와 일치한다. 데이터는 클론 #66(클론 1)이 인간 뉴런에서 인 시츄(in situ)로 천연 발현된 타우를 검출할 수 있고 조직학적 분석을 위한 유용한 도구임을 입증한다.
실시예 11: 단클론성 항체는 샌드위치 면역검정에서 전장 재조합 타우를 검출한다
항-타우 토끼 IgG 클론 #44(클론 2) 및 #66(클론 1)은 MesoScale Discovery(MSD) 검정에서 항체 쌍의 일부로서 재조합 타우를 검출한다. 표준 곡선은 상업적으로 이용 가능한 다클론성 항체, K9JA(아미노산 244 내지 441을 표적화; Agilent, 산타클라라, CA, USA), 또는 상업적으로 이용 가능한 단클론성 항체, 타우5(아미노산 210 내지 241을 표적화; Thermo Fisher Scientific, 월쌈, MA, USA)과 조합하여 포획 항체로서 전장 재조합 2N4R 타우(rPeptide, 왓킨스빌, GA, USA) 및 클론 #44(클론 2) 또는 #66(클론 1)을 사용하여 구축하였다. 각 검정의 검출 한계는 대략 80 pg/mL였다. 데이터는 샌드위치 면역검정을 사용한 타우의 검출을 위해, 상업적으로 이용 가능한 단클론성 또는 다클론성 항체와 조합하여 관심 에피토프(SEQ ID NO: 1)를 표적화하는 항체의 유용성을 입증한다.
실시예 12: 항-타우 IgG는 인간 뉴런으로의 모노머성 타우 및 응집된 타우의 흡수를 억제한다
세포외 모노머성 타우 및 응집된 타우는 세포내이입과 거대음세포작용의 조합을 통해 인간 뉴런에 의해 흡수된다(Evans et al. (2018) Cell Rep 22(13): 3612-3624). 이러한 과정은 생리학적으로 발생하지만, 또한 알츠하이머병을 포함하여 타우병증에서 관찰되는 독성 형태의 타우의 병원성 확산에 있어 역할을 한다는 것이 제안된다. 따라서, 독성 타우 종의 흡수를 억제하는 것은 뇌에서 타우 병리의 확산을 제한하는 데 치료적으로 유익한 것으로 예측된다. 타우의 뉴런 흡수는 pH-민감성 염료, pHrodo로 표지된 타우와 관련된 형광을 측정함으로써 평가되고 정량화될 수 있다. 증가된 형광은 표지된 타우의 산성 엔도솜 구획으로의 내재화 후에 발생하여, 타우 흡수/내재화의 동적 측정을 제공한다. 항-타우 IgG 클론, #44(클론 2) 및 #66(클론 1)은 인간 iPSC-유래 뉴런으로 4 h째에 pHrodo-표지 모노머성 타우의 흡수를 각각 65% 및 71% 억제율로 억제하고, 4 h째에 pHrodo-표지 응집된 타우의 흡수를 각각 56% 및 47% 억제율로 억제한다. 이소형 대조 항체(단클론성 토끼 IgG; Thermo Fisher Scientific, 월쌈, MA, USA)는 이러한 시스템에서 타우 흡수에 유의한 영향을 미치지 않았다.
데이터는 SEQ ID NO: 1을 표적화하는 항체가 인간 뉴런에 의한 이러한 에피토프를 함유하는 타우 종의 흡수를 감소시킬 수 있음을 입증한다. 따라서, 이러한 항체는 알츠하이머병 및 타우병증에서 이러한 에피토프(SEQ ID NO: 1)를 포함하는 독성 타우 종의 뉴런-대-뉴런 전파를 제한하고, 이에 따라 환자에서 임상 증상의 진행을 감소시킬/늦출 것으로 예측될 것이다.
12.1 인간 iPSC-유래 대뇌 피질 뉴런의 생산: 실시예 1.1에 상세히 기재된 바와 같음
12.2 응집된(올리고머성) 타우 종의 생성: 타우 P301S_10xhis-태그_avi-태그를 BL21(DE3) 박테리아에서 과발현시켰다. 세포를 BugBuster(Millipore, 벌링턴, MA, USA)를 사용하여 용해시키고, 정화된 용해물을 2Х PBS 중 5 mL HisTrapHP 컬럼(GE Healthcare, 시카고, IL, USA)에 적용하였다. 타우를 0-mM 내지 500-mM 이미다졸 구배를 사용하여 용리시켰다. 피크 분획을 푸울링하고, Superdex 200 16/60 겔 여과 컬럼(GE Healthcare, 시카고, IL, USA)을 사용하여 2Х PBS에서 추가로 정제하였다. 이어서, 푸울링된 분획을 스핀 농축기(Millipore, 벌링턴, MA, USA)를 사용하여 약 8 mg/mL로 농축시켰다. 최종 단백질 농도를 Nanodrop 분석에 의해 결정하였다.
8 mg/mL에서 1 mL의 타우 P301S를 37℃에서 72 h 동안 PBS/30 mM 3-(N-모르폴리노)프로판설폰산(MOPS)(pH 7.2)에서 4 mg/mL의 헤파린(Sigma, 세인트 루이스, MO, USA)과 함께 인큐베이션하였다. 응집된 물질을 9 mL의 PBS + 1%(v/v) 사르코실(Sigma, 세인트 루이스, MO, USA)에 희석하고, 임의의 비응집된 물질을 완전히 가용화시키기 위해 RT에서 1 h 동안 흔들어 놓았다. 불용성 타우를 4℃에서 1 h 동안 초원심분리에 의해 펠렛화하였다. 펠렛을 1 mL의 PBS에 재현탁시키고, 100 W에서 3 Х 20 s 동안 초음파처리하여(Hielscher UP200St 초음파발생기; 텔토, 독일), 덩어리 또는 단백질을 분산시키고 큰 필라멘트를 더 작은 종으로 분해하였다.
12.3 정제된 재조합 타우의 표지화: 모노머성 재조합 2N4R 타우를 rPeptide(왓킨스빌, GA, USA)로부터 구입하였다. 응집된 타우를 상기 기재된 바와 같이 제조하였다. 재조합 모노머성 타우(150 μM) 또는 등가의 응집된 타우 농도(약 7 μg/mL)를 RT에서 암소에서 2 h 동안 1.5 mM pHrodo 적색 말레이미드(DMSO에 용해됨) 및 1.5 mM 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(각각 1:10:10 몰비)과 함께 인큐베이션하였다. 이어서, 표지된 샘플이 50 mM 포스페이트(pH 7.4) 및 150 mM NaCl에서 4℃에서 크기 배제 크로마토그래피(Superdex 200 Increase 10/300 GL; GE Healthcare, 시카고, IL, USA)를 거치게 하여 미반응 염료를 제거하였다. 응집체의 올리고머성 상태를 평가하였고, 이는 표지화에 의해 영향을 받지 않는 것으로 밝혀졌다.
12.4 인간 iPSC-유래 피질 뉴런에 의한 타우 흡수의 정량화: 모노머성 타우(25 nM) 및 응집된 타우(50 nM)를 N2B27(Thermo Fisher Scientific, 월쌈, MA, USA)에서 제조하고, 37℃에서 90 min 동안 타우에 대한 10 배 몰 과량의 항체(즉, 250 nM 및 50 nM IgG)와 인큐베이션하였다. 100 μL의 항체/타우 혼합물을 NDC 뉴런에 첨가하고(60+ 일차), 형광을 Opera Phenix 영상화 시스템(Perkin Elmer, 월쌈, MA, USA)을 사용하여 웰 당 18 개 필드로부터 37℃/5% CO2에서 4 h 동안 15 min마다 영상화하였다. Alexa 568 채널에서 '강렬한 스폿(intense spot)'을 확인하기 위한 알고리즘을 사용하여 웰 당 형광의 강렬한 스폿의 수를 정량화하고, 이들을 시간 경과에 따라 n=4 세포로부터 평균 +/- SEM으로 플롯팅하였다. 던넷의 다중 비교 검정을 사용한 일원 ANOVA를 항체 부재 대조에 대해 실행하여 유의성을 결정하였다.
실시예 13. 인간 iPSC-유래 뉴런으로부터 수득된 컨디셔닝된 배지로부터의 단클론성 항-타우 IgG 면역고갈 타우 종(도 2)
뉴런 유도 후 70 일차 내지 80 일차에 48 시간 간격으로 인간 iPSC-유래 뉴런 배양물(실시예 1.1에 기재된 바와 같이 생성됨)로부터 분비체를 수집하였다. 분비체를 원심분리에 의해 정화한 후 -20℃에서 동결시켰다. 샘플을 얼음 위에서 해동시키고, 인공 뇌척수액(aCSF)에 대해 투석하였다. 타우의 면역고갈을 4℃에서 단클론성 항체 및 단백질 G 아가로스 비드와 2 라운드의 12 시간 인큐베이션에 의해 달성하였다. 토끼로부터의 면역전 혈청을 고갈 샘플을 모의하기 위한 대조로서 사용하였다. 분비체를 2 개의 유전적으로 별개의 삼염색체 21 라인으로부터 및 하나의 NDC로부터 생성된 iPSC-유래 뉴런 배양물로부터 수집하였다. 중간-영역(BT2(ThermoFisher, 월쌈, MA)/타우5 항체 쌍) MSD 검정 및 미세소관 결합 영역(MTBR; K9JA/K9JA 항체 쌍) 검정을 이용한 타우 수준의 정량화는 NDC와 비교하여 삼염색체 21 분비체에서 상승된 타우 수준의 존재를 확인시켜 주었다. 또한, MTBR 타우 수준은 중간-영역 타우보다 실질적으로 (적어도 4x) 낮았는데, 이는 MTBR 및/또는 C-말단 도메인이 결여된 중간-영역 타우 단편의 생성, 또는 MTBR 및/또는 C-말단 에피토프를 이용할 수 없는 타우 종의 존재를 야기하는 절단 사건을 나타낸다. 클론 #44(클론 2) 및 #66(클론 1)은 3 개의 분비체 모두로부터 타우 종을 고갈시킨다(도 2). 클론 #44(클론 2) 및 #66(클론 1)은 NDC 분비체(연회색 막대, 각각 #44(클론 2) 및 #66(클론 1)에 의해 42% 및 17% 고갈)에서보다 삼염색체 21 분비체에서 더 큰 정도로 타우를 함유하는 MTBR을 고갈시켰는데(라인 B, 진회색 막대, 각각 #44(클론 2) 및 #66(클론 1)에 의해 58% 및 47% 고갈; 및 라인 C, 검은색 막대, 각각 #44(클론 2) 및 #66(클론 1)에 의해 62% 및 60% 고갈), 이는 NDC 분비체와 비교하여 삼염색체 21에서 MTBR과 표적 에피토프(SEQ ID NO: 1) 둘 모두를 포함하는 타우 종의 상대적 수준의 증가를 나타낸다. 클론 #44(클론 2) 및 #66(클론 1)은 단지 TS21 분비체(NDC 아님)로부터, 가장 특히 하나의 배치(라인 C; 각각 16% 및 34%)로부터 중간-영역 타우를 고갈시켰는데, 이는 중간-영역과 표적 에피토프(SEQ ID NO: 1) 둘 모두를 함유하는 타우 종의 질병-특이적 존재를 나타낸다. 이러한 데이터는 NDC와 비교하여 질병에 존재하는 상이한 타우 종의 균형의 이동(잠재적으로 질병-특이적 절단 사건, 변경된 번역후 변형 및/또는 입체형태 변화로 인해)을 입증하였는데, 이는 절대 타우 수준과 SEQ ID NO: 1을 표적화하는 항체에 의해 검출될 수 있는 타우를 함유하는 MTBR 및/또는 MR의 비율 둘 모두의 증가를 야기한다.
Figure pct00010
표 8. 중간-영역 및 MTBR 검정을 사용하여 정량화된 타우 수준에 기초하여, 면역전 혈청 대비 시험된 항체의 면역고갈 효율(제거 퍼센트 단위)이 나타나 있다.
실시예 14. 삼염색체 21 뉴런 분비체에 의한 생체내 장기 강화(LTP)의 타우-매개 차단은 투여 전 IgG 클론 #44(클론 2) 또는 #66(클론 1)을 갖는 샘플의 면역고갈에 의해 방지된다(도 3)
우레탄-마취된(105 g/kg 내지 106 g/kg, 복강내) 수컷 리스터 후디드(Lister Hooded) 래트(250 g 내지 350 g)에서 전기생리학 실험을 수행하였다. 해마 LTP는 이전에 기재된 바와 같이(Hu et al. (2014) Nature Commun 5:3374) 200 Hz 고주파 자극(HFS) 전 및 후에 동측 Schaffer 측부/교련 경로의 자극에 반응하여 CA1의 방사상층(stratum radiatum)으로부터의 전기장 흥분성 시냅스 후 전위(EPSP)를 기록함으로써 측정하였다. 시냅스 가소성의 유도 30 min 전에 분비체를 캐뉼러를 통해 래트의 측뇌실에 주사하였다.
LTP의 모든 통계적 분석을 v6.07(GraphPad Software, 라 호야, CA, USA)에서 수행하였다. LTP의 크기는 HFS 전 기준선 EPSP 진폭의 백분율(± SEM)로 표현된다. n은 그룹 당 동물의 수를 나타낸다. 대조 실험을 전체에 걸쳐 무작위로 교차배치하였다. 그래프 도식을 위해, EPSP 진폭을 5 min 에포크(epoch)로 그룹화하였고; 통계적 분석을 위해, EPSP 진폭을 10 min 에포크로 그룹화하였다. 시닥(Sidak)의 다중 비교 검정(일원 ANOVA-시닥)을 이용한 일원 ANOVA를 3 개 이상의 그룹 사이의 비교에 사용하였다. 시닥의 다중 비교 검정(이원 ANOVA RM-시닥)에 의한 반복 측정으로 이원 ANOVA를 단지 2 개의 그룹이 있을 때 사용하였다. 그룹 내에서 HFS 전 및 후 값을 비교하기 위해 대응표본 t 검정을 수행하였다. p<0.05의 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
삼염색체 21 '라인 C'로부터 단리된 분비체(도 2에 도시됨)를 시험하였다. 모의-고갈된 샘플은, 이전에 기재된 바와 같이(Hu et al., 2014, Nat Commun 5: 3374) 분비체에서 '독성' 또는 억제 분자의 존재와 일치하여, 비히클 대조 처리된 동물에 비해 LTP의 유도를 유의하게 차단하였다(p<0.01). 표적 에피토프(SEQ ID NO: 1)를 포함하는 타우 종을 제거하기 위해 클론 #44(클론 2) 또는 #66(클론 1)을 사용하여 면역-고갈된 삼염색체 21 분비체는 기준선과 비교할 때 통계적으로 유의한 LTP를 나타냈다(각각 p<0.01 및 p<0.001)(도 3). 데이터는 삼염색체 21 분비체에 의해 유도된 LTP 차단이 표적 에피토프(SEQ ID NO: 1)를 포함하는 타우 종의 제거에 의해 예방될 수 있다는 것을 입증하고, 이에 의해 C-말단 함유 타우 종이 LTP 차단의 성분의 원인임을 보여준다. 따라서, 특이적 항체의 투여에 의한 환자에서 이러한 타우 종을 제거하는 것은 치료적으로 유용한 것으로 예측될 것이다.
실시예 15: 이펙터 기능을 갖는 단클론성 항-타우 항체는 미세아교세포에 의한 타우 흡수를 증가시킨다
미세아교세포는 중추 신경계에서 세포외 물질을 제거하여 잔해의 축적을 방지하고 복구 과정이 일어나도록 하는 데 중요한 역할을 한다. 신경퇴행성 질환의 맥락에서, 응집체, 올리고머 및 모노머성 형태를 포함하는 세포외 단백질의 식세포작용은 이러한 종의 세포외 농도를 감소시키는 데 도움이 된다. 이펙터 기능(즉, 토끼 IgG Fc)을 갖는 항체 클론 #44(클론 2) 및 #66(클론 1)은 타우 단독 또는 타우 + 이소형 대조 IgG 조건과 비교하여 인간 iPSC-유래 미세아교세포에 의한 모노머성 타우와 응집된 타우 둘 모두의 흡수를 증가시킨다. 데이터는 이펙터 기능을 갖는 치료용 항체(예를 들어, hIgG1로서 포맷됨)가 미세아교세포에 의한 독성 형태의 타우의 제거를 증가시키고, 이에 의해 CNS에서 독성 형태의 타우의 세포외 농도 및 유해한 효과를 감소시킬 것임을 시사한다. 이러한 활성은 치료적으로 유익한 것으로 예측될 것이다.
실시예 16. 인간 AD CSF는 C-말단 타우를 함유한다.
항체가 생체내에서/환자에서 타우를 효과적으로 표적화하기 위해서는 관련 타우 종이 세포외에 존재해야 한다. 관심 에피토프(SEQ ID NO: 1)를 함유하는 세포외 타우 종의 존재를 입증하기 위해, 본 발명자들은 항체 클론 #44(클론 2)를 사용하여 AD 환자로부터 수득된 푸울링된 뇌척수액(CSF) 샘플로부터 타우를 정제하였다. 이어서, 결합된 단백질을 트립신을 사용하여 분해하고, 질량 분광계에 의해 분해하였다(도 4). 항체 에피토프에 인접하여 위치된 C-말단 펩티드(SPVVSGDTSPR; 2N4R 타우; SEQ ID NO: 12의 아미노산 396 내지 406에 상응함)를 포함하는 다중 타우 펩티드가 확인되었다. 이러한 데이터는 AD CSF에서 항체 에피토프(SEQ ID NO: 1)와 다른 C-말단 영역 둘 모두를 포함하는 타우 종의 존재를 확인시켜 주고, 세포외로 이러한 종의 존재를 입증한다. 따라서, 이러한 C-말단 타우-함유 종은 치료용 항체에 의해 표적화될 수 있고, 바이오마커 검출을 위해 이용될 수 있는 유체에 존재한다.
실시예 17. 항-타우 IgG는 인간 성상세포로의 모노머성 타우 및 응집된 타우의 흡수를 억제한다
설치류에서 발생하는 것으로 알려져 있기는 하지만(Martini-Stoica et al. J Exp Med 215(9): 2355-2377(2018)), 인간 성상세포에 의한 세포외 타우 종의 흡수에 대한 이용 가능한 정보는 제한적이다. 또한, 뉴런 타우 흡수에 대한 최근에 기술된 수용체인 지단백질 수용체-관련 단백질 1(LRP1)은 성상세포에서 발현되는 것으로 보고되어 있는데(Rauch et al. Nature 580(7803):381-385(2020)), 이는 흡수 메커니즘이 공유될 수 있다는 것을 시사한다. 중추 신경계에서의 주요 세포 유형으로서, 알츠하이머병 및 타우병증에서 타우 병리의 전파에 있어서의 추정적인 역할과 함께(문헌[
Figure pct00011
]에서 검토됨), 본 발명자들은 2N4R 타우(SEQ ID NO: 1)의 아미노산 369 내지 381에 상응하는 서열을 표적화하는 항체가 성상세포에 의한 타우 종의 흡수에 임의의 영향을 미치는지의 여부를 탐색하였다.
인간 iPSC-유래 성상세포는 모노머성 타우 종과 응집된 타우 종 둘 모두를 용이하게 흡수한다. 항-타우 클론 #44와 함께 타우의 인큐베이션은 항체의 부재 하에서의 흡수와 비교하여 모노머성 2N4R 타우의 흡수를 98.4 ± 0.4%만큼 및 응집된 타우의 흡수를 43.3 ± 2.9%만큼 유의하게(P<0.001) 억제한다. 데이터는 SEQ ID NO: 1을 표적화하는 치료용 항-타우 항체가 성상세포에 의한 독성 형태의 타우 흡수를 감소시키고, 이에 의해 타우 병리의 전파에서 성상세포의 영향을 감소시킬 것이라는 증거를 제공한다. 이러한 활성은 치료적으로 유익한 것으로 예측된다.
실시예 18. 단클론성 항-타우 키메라 인간 IgG1은 인간 iPSC-유래 미세아교세포에 의한 모노머성 타우 및 응집된 타우의 흡수를 증가시킨다
실시예 15에 기재된 바와 같이, 이펙터 기능을 갖는 단클론성 항-타우 토끼 IgG는 미세아교세포에 의한 모노머성 타우와 응집된 타우 둘 모두의 흡수를 증가시켰다. 이러한 타우 흡수 증가는 또한 항-타우 인간 IgG1에서도 관찰된다. 키메라 인간 IgG1(즉, 이펙터 기능을 가짐)으로서 발현된 항체 클론 #66(클론 1)은 타우 단독의 흡수와 비교하여 인간 iPSC-유래 미세아교세포에 의해 모노머성 타우(56 ± 7%만큼; P<0.001) 및 응집된 타우(59 ± 9%만큼; P<0.05)의 흡수를 유의하게 증가시켰다. 이소형 대조 인간 IgG1은 항체의 부재 하에서 기준선 타우 흡수와 비교하여 모노머성 타우(6.7 ± 6% 감소) 또는 응집된 타우(23 ± 9% 감소)의 미세아교세포 흡수에 유의한 영향을 미치지 않았다. 데이터는 치료용 hIgG1이 미세아교세포에 의한 세포외 타우의 제거를 증가시키고, 이에 의해 CNS에서 세포외 형태의 타우의 세포외 농도 및 유해한 효과를 감소시킬 것이라는 추가 증거를 제공하였다. 이러한 활성은 치료적으로 유익한 것으로 예측된다.
18.1 키메라 hIgG1 항체의 생산: 키메라 hIgG1을 전매 방법(HEXpressTM 서비스)을 사용하여 토끼 VH 및 VK 서열(SEQ ID NO: 116 및 117, 클론 1, #66)을 사용하여 Absolute Antibody(옥스포드, UK)에 의해 생성하였다. 간략히, HEK293 세포에서 일시적인 발현 후 항체를 생산하고, 친화성 정제하고, 포스페이트 완충된 염수로 완충제 교환하고, 멸균 여과하고, 1 EU/mg 미만의 내독소를 갖는 98% 초과의 순도로(SDS-PAGE 기반) 제공하였다.
18.2 인간 iPSC-유래 미세아교세포의 생산: 미세아교세포 배양물에 대한 인간 만능 줄기 세포(iPSC)의 분화를 문헌[Brownjohn et al. Stem Cell Rep 10(4): 1294-1307(2018)]에 기재된 바와 같이 수행하였다. NDC 배경으로부터의 iPSC 세포주를 사용하였다. 미세아교 전구 세포를 수집하고, 96 웰 플레이트에 플레이팅하고, 사용 전 대략 14 일 동안 완전 미세아교세포 배지(문헌[Brownjohn et al., 2018]에 기재된 바와 같이)에서 유지하였다. 사용 전날, 배양물을 무혈청 배지(10 ng/mL의 GM-CSF 및 100 ng/mL의 IL-34가 보충된 RPMI 1640/Glutamax(Peprotech(NJ, US)로부터의 성장 인자))로 바꾸고, 식세포작용 실험을 무혈청 조건에서 완료하였다.
18.3 응집된(올리고머성) 타우 종의 생성: 실시예 12.2 참조
18.4 정제된 재조합 타우의 표지화: 실시예 12.3 참조.
P301S 타우를 모노머성 타우 제제와 응집된 타우 제제 둘 모두에 사용하였다.
18.5 인간 iPSC-유래 미세아교세포에 의한 타우 흡수의 정량화: 모노머성 타우(25 nM) 및 응집된 타우(50 nM)를 무혈청 미세아교세포 배지에서 제조하고, 1:10 비율의 항체:타우(즉, 각각 2.5 nM 및 5 nM IgG)와 함께 37℃에서 90 min 동안 인큐베이션하였다. 항-타우 hIgG1을 이소형 대조(항-플루오레세인[4-4-20(증진)], Absolute Antibody, 옥스포드, UK)와 비교하였다. 100 μL의 항체/타우 혼합물을 iPSC-유래 미세아교세포에 첨가하고, Incucyte S3 영상화 시스템(Sartorius, 괴팅겐, 독일)을 사용하여 웰 당 9 개 필드로부터 37℃/5% CO2에서 16 h 동안 30 min 마다 영상을 촬영하였다(명시야 및 주황색 채널). 주황색 채널(여기: 513 nm 내지 568 nm)에서 형광의 평균 면적을 정량화하기 위한(웰 당) 알고리즘을 세포가 차지하는 평균 면적(상 면적)으로 정규화하고, 이를 시간 경과에 따라 n=4 세포로부터 평균 +/- SEM으로 플롯팅하였다. 터키의 다중 비교 검정을 사용한 일원 ANOVA를 항체 부재 대조에 대해 실행하여 유의성을 결정하였다.
실시예 19. 항-타우 IgG는 높은 친화성으로 타우에 결합한다
항-타우 IgG는 전장 2N4R 타우(SEQ ID NO: 2)에 높은 친화성으로 결합한다. 클론 #66(클론 1) 및 클론 #44(클론 2)는 각각 2.39 nM 및 3.83 nM의 KD로 전장 재조합 2N4R 타우에 결합한다(표 9). 이러한 항체의 결합 친화성은 2N4R 타우(SEQ ID NO: 1)(이러한 서열이 접근 가능한 경우)의 아미노산 369 내지 381에 상응하는 에피토프를 함유하는 임의의 타우 종과 동등할 것으로 예측된다.
19.1 키메라 hIgG1 항체의 생산: 클론 #66 hIgG1을 실시예 18.1에 기재된 바와 같이 생성하였다. 클론 #44 hIgG1을 토끼 VH 및 VK 서열(SEQ ID NO: 118 및 119, 모 VH 및 VK로서 클론 2, #44)을 사용하고 전매 방법을 이용하여 Abzena(케임브리지, UK)에 의해 생성하였다. 간략히, CHO 세포에서 일시적인 발현 후 항체를 생산하고, 친화성 정제하고, 포스페이트 완충된 염수로 완충제 교환하고, 멸균 여과하고, 98% 초과의 순도(크기 배제 크로마토그래피 후)로 제공하였다.
19.2 타우에 대한 항체 결합의 평가: Biacore T200 평가 소프트웨어 V2.0.1을 실행하는 Biacore T200(GE Healthcare, 시카고, IL, USA)을 사용하여 전장 재조합 2N4R 타우(Rpeptide; SEQ ID NO: 2)에 대한 항-타우 hIgG1의 결합을 평가하였다. hIgG1을 25℃에서 러닝 완충제(1 mg/mL의 BSA를 함유하는 HBS-EP+ 완충제)에서 단백질 A 포획 센서 칩 상에 고정시키고, 10 μL/min으로 약 50 RU까지 포획하였다. 다중-사이클 동역학 실험(클론 #66)을 위해, 재조합 2N4R 타우는 40 μL/min으로 러닝 완충제에서 0.39 nM 내지 50 nM 범위의 농도로 유동시켰으며, 회합 시간은 150 s였고 해리 시간은 250 s였다. 다중-사이클 동역학 실험을 위한 최적화된 조건을 클론 #44에 적용하였다: 재조합 2N4R 타우를 0.39 nM 내지 12.5 nM(2 배 희석) 범위의 농도로 유동시켰으며, 회합 시간은 60 s였고 해리 시간은 200 s였다(분석 적합성을 개선하기 위해 65 s로 자름). 곡선을 모의 고정된 참조 세포(항체가 존재하지 않음)와 비교하였다.
표면에서의 1:1 상호작용을 설명하는 랭뮤어(1:1) 결합 분석을 이용하여 데이터를 분석하였다:
Figure pct00012
여기서, ka는 결합 속도 상수(M-1s-1)이고, kd는 해리 속도 상수(s-1)이다.
적합성의 근접성을 실험 곡선과 핏팅된 곡선 사이의 편차를 나타내는 카이 제곱(Chi square) 값의 관점에서 판단하였다:
Figure pct00013
여기서, rf는 주어진 점에서의 핏팅된 값이고, rx는 동일한 점에서의 실험 값이고, n은 데이터 점의 수이고, p는 핏팅된 파라미터의 수이다. 핏팅 알고리즘은 카이 제곱을 최소화하고자 하였다.
Figure pct00014
표 9. 전장 재조합 2N4R 타우에 결합하는 클론 #66(클론 1) 및 #44(클론 2)에 대한 MCK 결합 분석 데이터의 요약.
실시예 20: 항-타우 항체는 영역 373 THKLTFR 379 내의 별개의 에피토프에 결합한다.
항체 결합에 필요한 2N4R 타우; SEQ ID NO: 1의 아미노산 369 내지 381 내의 중요한 잔기를 확인하기 위해 에피토프 미세 맵핑을 수행하였다. 대체 분석에서, 각각의 잔기는 항체로의 결합에 대한 잔기의 중요성을 평가하기 위해 다른 아미노산으로 돌연변이된다.
항체 클론 #44(클론 2)의 경우, 대체 분석은 영역 373THKLTFR379 내 아미노산 잔기가 결합에 중요하다는 것을 보여준다(도 5의 A). 구체적으로, 이들 잔기의 치환으로서 잔기, T373, K375, T377 및 R379는 모든 치환체에 대한 강도의 저하를 초래한다. K375, T377 및 R379의 치환은 신호 강도를 배경 수준으로 떨어뜨리는데, 이것은 이들이 이러한 클론의 결합에 중요하다는 것을 시사한다.
항체 클론 #66(클론 1)의 경우, 374HKL376 및 378FR379가 결합에 중요하다(도 5의 B). 구체적으로, L376 또는 F378의 치환은 모든 치환체에 대한 항체 결합의 감소를 초래하는데, 이는 이러한 잔기의 주요 역할을 시사한다.
이러한 시스템에서 이소형 대조 토끼 IgG의 결합은 거의 검출되지 않았는데(도 5의 C), 이는 항-타우 항체 클론 #44 및 #66에 대해 수득된 ELISA 신호가 CDR-특이적임을 나타낸다.
데이터는 클론 #44(클론 2) 및 #66(클론 1)으로 예시되는 본원에 기재된 항체가 펩티드 서열(2N4R 타우; SEQ ID NO: 1의 아미노산 369 내지 381) 내의 상이한 특이적 에피토프에 결합한다는 것을 입증한다. 기재된 항체는 기능적 성질을 공유하는데, 이는 기능적 결과를 결정하는 것이 이러한 서열 내에 있고 이에 의해 형성된 에피토프라는 것을 나타낸다.
20.1 에피토프 치환 스캔 분석 - 펩티드 합성: 대체 분석은 전매 방법을 이용하여 Pepscan Presto BV(렐리스타트, 네덜란드)에 의해 실시하였다. 간략히, Fmoc-기반 고체-상 펩티드 합성을 사용하여 펩티드의 라이브러리를 합성하였다. 아미노 작용성화된 폴리프로필렌 지지체를 전매 친수성 폴리머 제형으로 그라프팅하고, 이어서 디사이클로헥실카르보디이미드(DCC)를 N-하이드록시벤조트리아졸(HOBt)과 함께 사용하여 t-부틸옥시카르보닐-헥사메틸렌디아민(BocHMDA)과 반응시키고, 트리플루오로아세트산(TFA)을 사용하여 Boc-기의 후속 절단에 의해 수득하였다. 표준 Fmoc-펩티드 합성을 사용하여 맞춤 변형된 JANUS 액체 취급 스테이션(Perkin Elmer)에 의해 아미노-작용성화된 고체 지지체 상에서 펩티드를 합성하였다.
각각의 아미노산이 다른 모든 천연 아미노산으로 한 번에 하나씩 돌연변이되도록 출발 펩티드(369KKIETHKLTFREN381; SEQ ID NO: 1)를 기반으로 펩티드를 설계하였다. 미니-카드 상의 펩티드의 순서를 무작위화하고, 데이터를 이소형 대조 항체(토끼 IgG; Abcam, 케임브리지, UK)로 수득된 것과 비교하였다.
20.2 에피토프 치환 스캔 분석 - ELISA 스크리닝: 합성된 펩티드 각각에 대한 항체의 결합을 Pepscan-기반 ELISA에서 시험하였다. 펩티드 어레이를 일차 항체 용액(5 μg/mL; 4℃에서 밤새)과 함께 인큐베이션하였다. 세척 후, 펩티드 어레이를 돼지 항-토끼 IgG 퍼옥시다제 접합체(DAKO, 예나, 독일)의 1/1000 희석액과 함께 25℃에서 1 h 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 퍼옥시다제 기질 2,2'-아지노-디-3-에틸벤즈티아졸린 설포네이트(ABTS) 및 20 μL/mL의 3% H2O2를 첨가하였다. 1 h 후, 발색을 측정하였다. 전하 결합 소자(charge coupled device; CCD) - 카메라 및 영상 처리 시스템으로 발색을 정량화하였다. CCD 카메라로부터 수득된 값이 인용된다(범위: 0 mAU 내지 3000 mAU).
데이터는 시험된 각 펩티드에 대해 수득된 ELISA 신호를 나타내는 문자 플롯으로 제시된다. 최대 ELISA 신호로부터 관찰된 편차는 표적 펩티드에 대한 시험된 항체의 변경된(감소된) 결합과 관련된 돌연변이를 나타낸다.
실시예 21: 항체 클론 #44의 인간화
토끼 항체 클론 #44를, Antitope에 의해 개발되고 Abzena에 의해 상용화된 Composite Human Antibody TechnologyTM를 사용하여 인간화하였다. 인간화 과정의 목적은 모 항체의 항원 결합 친화성을 유지하면서 만성 치료적 치료로서 비-인간 단클론성 항체를 사용하는 것과 관련된 면역원성에 대한 잠재력을 감소시키는 것이다.
총 6 개의 VH(SEQ ID NO: 151 내지 156) 및 4 개의 VK 서열(SEQ ID NO: 157 내지 160)을 설계하고(도 6에 요약됨), 24 개의 새로운 인간화 변이형을 생성하기 위해 모든 가능한 조합으로 발현시켰다. 포유류 세포에서 발현될 때, VH1, VH2, VH3, VH4 또는 VH5를 함유하는 변이형은 전장 재조합 2N4R 타우에 결합하는 항체를 형성한다(도 7). 배경 ELISA 신호는 낮은데, 이는 항체-관련 신호가 타우와의 특이적 상호작용에 기인한다는 것을 입증해 준다. 인간화 변이형의 발현 수준은 HEK293 세포에서 일시적인 형질감염 후 가변적이므로(표 10 참조), 상청액의 단일 희석액으로부터 얻어진 ELISA 신호는 결합 친화성의 징후를 제공하지 않는다.
Biacore 단일 사이클 동역학(SCK) 실험은 항체 KD의 계산을 가능하게 한다. 인간화 변이형의 경우, KD는 3.2 nM 내지 14.2 nM의 범위이다(각각 VH1VK1 및 VH5VK3에 대해 표 10에 요약됨). VH6을 함유하는 변이형은 2N4R 타우에 결합하지 않는데(ELISA 및 Biacore 데이터에 기초함), 이는 이러한 서열에서 돌연변이된 잔기가 타우에 대한 모 항체의 결합에 필요할 수 있다는 것을 나타낸다. 구체적으로, VH6은 타우에 결합하는 데 필요할 수 있는 VH CDR1(A35S; 카바트에 따라 넘버링됨) 내의 돌연변이를 포함한다.
데이터는 원래의 모 CDR 서열을 보유하는 클론 #44의 인간화 변이형이 타우에 대한 높은 친화성 결합을 보유한다는 것을 입증한다(20 nM 미만). 이러한 항체의 결합 친화성은 2N4R 타우(SEQ ID NO: 1)(이러한 서열이 접근 가능한 경우)의 아미노산 369 내지 381에 상응하는 에피토프를 함유하는 임의의 타우 종과 동등할 것으로 예측된다. 이러한 서열(SEQ ID NO: 1)은 포유류 종 내에서 100% 보존되므로, 인간 타우에 대해 기재된 활성은 타우의 다른 포유류 종에 적용 가능할 것으로 예측된다. 인간화 변이형의 CDR 서열은 모 항체와 동일하고 2N4R 타우에 대한 결합은 동등하기 때문에, 새로운 변이형의 CDR-유도 생물학적 활성은 모 클론 #44와 동등할 것으로 예측된다.
21.1 복합 인간 항체 가변 영역의 설계: Swiss PDB(Guex & Peitsch, Electrophoresis 18, 2714-2722, 1997)를 사용하여 항체 V 영역의 구조 모델을 생성하고, 항체의 결합 성질에 필수적일 가능성이 있었던 V 영역에서 중요한 "제약적(constraining)" 아미노산을 확인하기 위해 분석하였다. 다수의 프레임워크 잔기와 함께 CDR 내에 함유된 대부분의 잔기(카바트 정의와 코티아(Chothia) 정의 둘 모두를 사용)가 중요한 것으로 간주되었다.
인간 항체와 비교할 때, 토끼 중쇄의 첫 번째 아미노산은 클론 #44에 존재하지 않는다(대부분의 토끼 배선 VH 유전자와 공통됨). 이는 또한 토끼 배선 유전자의 서브세트에서 발견되는 VH FW3 내에 2 개의 아미노산 결실을 함유한다(도 6).
이러한 분석에 기초하여, CDR 외부의 대안적인 잔기에 대해 넓은 관용도를 갖지만 CDR 서열 내에 가능한 잔기의 좁은 메뉴만을 갖는 복합 인간 서열을 생성하였다. 예비 분석은 몇몇 인간 항체로부터의 상응하는 서열 세그먼트가 조합되어 토끼 서열에서의 CDR과 유사하거나 동일한 CDR을 생성할 수 있음을 나타냈다. CDR의 외부 및 측접 영역의 경우, 갖가지 인간 서열 세그먼트가 신규한 인간화 V 영역의 가능한 성분으로서 확인되었다.
21.2 CD4+ T 세포 에피토프 회피(iTope TM 에 의한 분석): 구조적 분석에 기초하여, 인간화 변이형을 생성하는 데 사용될 수 있는 서열 세그먼트의 큰 예비 세트를 확인하였다. 이러한 세그먼트를 인간 MHC 클래스 II 대립유전자에 결합하는 펩티드의 인실리코 분석을 위해 iTopeTM 기술을 사용하여 선택하고 분석하였다(Perry et al, Drugs R D 9(6):385-96, 2008). iTopeTM 소프트웨어는 펩티드의 아미노산 측쇄와 34 개의 인간 MHC 클래스 II 대립유전자의 특이적 결합 포켓 사이의 유리한 상호작용을 예측한다. 이러한 대립유전자는 임의의 특정 민족 집단에서 가장 널리 발견되는 것에 기인하는 가중치 없이 전 세계적으로 발견되는 가장 흔한 HLA-DR 대립유전자를 나타낸다. 주요 결합 잔기의 위치는 시험 단백질 서열을 포괄하는 8 개의 아미노산에 의해 중첩되는 9량체 펩티드의 인실리코 생성에 의해 달성된다.
MHC 클래스 II 결합의 위험이 감소된 것으로 확인된 선택된 서열 세그먼트를 T 세포 에피토프가 감소된 완전한 V 영역 서열로 조립하였다. 변이형 서열은 도 6에 제시되어 있다.
21.3 인간화 항체 변이형의 생성: 전매 방법을 이용하여 Abzena(케임브리지, UK)에 의해 hIgG1의 새로운 인간화 변이형을 생성하였다. 간략히, 복합 인간 항체에 대한 가변 영역을 인코딩하는 DNA를 합성하고, 인간 불변 영역(hIgG1)을 갖는 발현 벡터 상에 클로닝하고, HEK293 세포에 일시적으로 형질감염시켰다. hIgG1을 함유하는 상청액을 수집하고 분석하였다.
21.4 타우에 대한 항체 결합의 평가(ELISA): ELISA 플레이트를 1Х 카르보네이트-바이카르보네이트 완충제에서 전장 2N4R 타우(SEQ ID NO: 2), 100 ng/웰; 또는 1Х TBS 중 1% BSA로 37℃에서 1 시간 동안 코팅하였다. 항원을 웰로부터 제거하고, 플레이트를 이후 1Х TBS 중 5% 건조 우유로 RT에서 1 시간 동안 차단하였다. 차단 용액을 제거하고, HEK293 세포 상청액(1% BSA/1Х TBS 중 1:100)을 관련 웰에 첨가하고, 플레이트를 RT에서 1 시간 동안 약하게 진탕시키면서 인큐베이션하였다. 이후, 플레이트를 TBS/0.1% 트윈(TBST)으로 4 회 세척하였다. 5% 우유/TBS에서 1:2000으로 희석된 염소 항-인간 IgG-HRP 항체(Thermo Fisher Scientific, 월쌈, MA, USA)를 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 약하게 진탕시키면서 RT에서 1 시간 동안 인큐베이션한 후, TBST로 4 회 세척하였다. 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB) ELISA 용액을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 RT에서 15 min 동안 인큐베이션하였다. 동일한 부피의 1 M 황산을 각각의 웰에 첨가하고, OD를 450 nm에서 측정하였다.
21.5 타우에 대한 항체 결합의 평가(Biacore SCK 분석): Biacore T200 평가 소프트웨어 V2.0.1을 실행하는 Biacore T200(GE Healthcare, 시카고, IL, USA)을 사용하여 전장 재조합 2N4R 타우(Rpeptide; SEQ ID NO: 2)에 대한 항-타우 hIgG1의 결합을 평가하였다. hIgG1을 25℃에서 러닝 완충제(1 mg/mL의 BSA를 함유하는 HBS-EP+ 완충제)에서 단백질 A 포획 센서 칩에 고정시키고, 10 μL/min으로 약 50 RU까지 포획하였다. 단일-사이클 동역학 실험을 위해, 재조합 2N4R 타우를 1.25 nM 내지 10 nM(2 배 희석) 범위의 농도로 유동시켰으며, 회합 시간은 60 s였고 해리 시간은 200 s였다. 곡선을 모의 고정된 참조 세포(항체가 존재하지 않음)와 비교하였다.
실시예 19.2에 기재된 바와 같이, 랭뮤어(1:1) 결합 분석을 이용하여 데이터를 분석하였다.
Figure pct00015
표 10. 전장 재조합 2N4R 타우에 결합하는 클론 #44(SCK)의 인간화 변이형에 대한 결합 분석 데이터의 요약. 모 클론 #44는 VH0VK0(SEQ ID NO: 118 및 119)로 제시되고, '상대 KD' 값은 이러한 클론과 비교하여 계산된다. HEK 역가는 형질감염 후 7 일차의 옥텟(Octet) 분석에 기초한다.
실시예 22. 인간화 항-타우 IgG는 높은 친화성으로 타우에 결합한다
상위 5 개의 인간화 변이형을 더 큰 규모의 발현 및 추가의 특징규명을 위해 선택하였다(표 10에 요약된 데이터에 기초함): VH3VK3(SEQ ID NO: 153 및 159); VH3VK4(SEQ ID NO: 153 및 160); VH4VK2(SEQ ID NO: 154 및 158); VH4VK3(SEQ ID NO: 154 및 159); VH4VK4(SEQ ID NO: 154 및 160). HEK293 세포에서의 형질감염으로부터 얻어진 수율은 예상보다 낮았으므로, CHO 세포를 이러한 더 큰 규모 생산에 사용하였다.
재조합 2N4R 타우에 대한 항체 결합의 Biacore 다중-사이클 동역학(MCK) 분석은 도 8 및 표 11에 요약되어 있다. 5 개의 모든 변이형은 키메라 모 항체의 2 배 이내의 KD를 나타낸다(VH0VK0; KD = 3.25 nM). RMAX의 약간의 변동은 아마도 리간드 포획의 차이에 기인한 것이고, 항체 결합 특성의 유의한 변동을 반영하지 않는 것으로 여겨진다.
데이터는 인간화 변이형이 전장 2N4R 타우에 대한 모(토끼) 항체(VH0VK0), 클론 #44의 결합 특성을 보유한다는 것을 확인시켜 준다. 실시예 21에 기재된 바와 같이, 인간 타우에 대해 기재된 활성은 표적 서열(SEQ ID NO: 1)이 존재하고 접근 가능한 경우, 타우의 다른 포유류 종에 적용 가능할 것으로 예측된다.
22.1 단백질 A 정제된 hIgG1 항체의 생산: 전매 방법을 이용하여 Abzena(케임브리지, UK)에 의해 클론 #44 VH0VK0 및 hIgG1의 새로운 인간화 변이형을 생성하였다. 간략히, 복합 인간 항체에 대한 가변 영역을 인코딩하는 DNA를 합성하고, 인간 불변 영역(hIgG1)을 갖는 발현 벡터 상에 클로닝하고, CHO 세포에 일시적으로 형질감염시켰다. hIgG1을 함유하는 상청액을 수집하고, hIgG1을 친화성 정제하고, 포스페이트 완충된 염수로 완충제 교환하고, 멸균 여과한 다음, 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 추가로 정제하여 99% 초과의 최종 모노머 순도를 달성하였다.
22.2 타우에 대한 항체 결합의 평가(Biacore MCK 분석): Biacore T200 평가 소프트웨어 V2.0.1을 실행하는 Biacore T200(GE Healthcare, 시카고, IL, USA)을 사용하여 전장 재조합 2N4R 타우(Rpeptide; SEQ ID NO: 2)에 대한 항-타우 hIgG1의 결합을 평가하였다. hIgG1을 25℃에서 러닝 완충제(1 mg/mL의 BSA를 함유하는 HBS-EP+ 완충제)에서 단백질 A 포획 센서 칩에 고정시키고, 10 μL/min으로 약 50 RU까지 포획하였다. 다중-사이클 동역학 실험을 위해, 재조합 2N4R 타우는 40 μL/min으로 러닝 완충제에서 0.39 nM 내지 12.5 nM 범위의 농도로 유동시켰으며, 회합 시간은 60 s였고 해리 시간은 200 s였다. 곡선을 모의 고정된 참조 세포(항체가 존재하지 않음)와 비교하였다.
실시예 19.2에 기재된 바와 같이, 랭뮤어(1:1) 결합 분석을 이용하여 데이터를 분석하였다.
Figure pct00016
표 11 전장 재조합 2N4R 타우에 결합하는 클론 #44의 정제된 인간화 변이형에 대한 Biacore MCK 분석의 요약. 모 클론 #44는 VH0VK0으로 제시되고, '상대 KD' 값은 이러한 클론과 비교하여 계산된다. 인간화 변이형을 SEC 정제된 샘플로서 시험하였다. 모 IgG를 HEK293 상청액으로서 시험하였다.
실시예 23. 인간화 IgG 변이형은 열역학적으로 안정하다
치료용 항체로 개발하기 위한 인간화 변이형의 잠재력을 평가하기 위해, 각각의 열 안정성을 평가하였다. 데이터는 표 12 및 도 9에 요약되어 있다. 평균 용융 온도(Tm)는 68.7℃ (VH4VK4의 경우)부터 71.9℃ (VH3VK3의 경우)까지의 범위였는데, 이는 치료용 항체에 허용되는 것으로 여겨진다.
23.1 열 안정성 분석: SYPRO 오렌지(orange)를 사용하여 열 안정성을 평가하였다(Lo et al, Analytical Biochem 332(1): 153-9, 2004). 표 13에 나타낸 바와 같이 샘플을 제조하였다. 9 μL의 각각의 샘플 혼합물을 Uncle Uni 마이크로큐벳에 이중으로 로딩하고, 'SYPRO 사용 Tm' 적용을 이용하기 시작하였다. 샘플은 0.3℃/min의 램프 속도 및 473 nm에서의 여기로 15℃ 내지 95℃의 열 램프를 거치게 하였다. 전체 스펙트럼을 250 nm 내지 720 nm에서 수집하고, Uncle 소프트웨어로 510 nm 내지 680 nm의 곡선 하 면적을 이용하여 전이 곡선의 감염 지점을 계산하였다. 473 nm에서 정적 광 산란(SLS)을 모니터링하는 것은, 동일한 실험에서 단백질 응집의 검출을 가능하게 한다. 생성된 SLS 프로파일로부터 응집 개시(T응집)를 계산하였다.
Figure pct00017
표 12 클론 #44의 인간화 변이형에 대한 열 안정성 프로파일링 데이터의 요약. 모 클론 #44는 VH0VK0으로 제시되어 있다.
Figure pct00018
표 13 열 안정성 분석을 위한 샘플 제조의 세부사항(실시예 23.1).
실시예 24. 항-타우 클론 #44의 인간화 변이형은 인간 iPSC-유래 뉴런으로의 모노머성 타우 및 응집된 타우의 흡수를 억제한다(도 10, 도 11)
세포외 타우의 '독성' 형태의 뉴런 흡수는 타우병증, 예컨대, 알츠하이머병에서 관찰되는 타우의 병원성 확산에 있어 중요한 역할을 한다는 것이 제안된다. 세포외 모노머성 타우 및 응집된 타우는 세포내이입과 거대음세포작용의 조합을 통해 인간 뉴런에 의해 흡수된다(Evans et al. (2018) Cell Rep 22(13): 3612-3624). 이러한 과정은 생리학적으로 발생하지만, 또한 알츠하이머병을 포함하는 타우병증에서 관찰되는 독성 형태의 타우의 병원성 확산에 있어 역할을 한다는 것이 제안된다. 따라서, 독성 타우 종의 흡수를 억제하는 것은 뇌에서 타우 병리의 확산을 제한하는 데 치료적으로 유익한 것으로 예측된다. 타우의 뉴런 흡수는 pH-민감성 염료, pHrodo로 표지된 타우와 관련된 형광을 측정함으로써 평가되고 정량화될 수 있다. 증가된 형광은 표지된 타우의 산성 엔도솜 구획으로의 내재화 후에 발생하여, 타우 흡수/내재화의 동적 측정을 제공한다. 항체 클론 #44(클론 2)를 포함하는 SEQ ID NO: 1을 표적화하는 항-타우 토끼 IgG는 인간 뉴런에 의한 이러한 에피토프를 함유하는 타우 종의 흡수를 감소시킬 수 있다(실시예 12). 이러한 활성을 나타내는 항체는 생체내에서 세포외 타우 종의 뉴런-뉴런 전파를 제한하고, 이에 따라 치료적으로 유용할 것으로 예측될 것이다.
시험된 클론 #44의 모든 인간화 변이형은 토끼 클론과 유사한 정도로 인간 iPSC-유래 뉴런으로의 모노머성 타우의 흡수를 유의하게(P<0.001) 억제한다(도 10): 48.4 ± 2.9%(VH3VK3), 43.1 ± 3%(VH3VK4), 50 ± 2.2%(VH4VK2), 41.8 ± 6.3%(VH4VK3), 62.8 ± 4.1%(VH4VK4)만큼. 시험된 모든 인간화 변이형은 또한 토끼 클론과 유사한 정도로 인간 iPSC-유래 뉴런으로의 응집된 타우의 흡수를 유의하게(P<0.001) 억제한다(도 11): 30.6 ± 3.2%(VH3VK3), 33.3 ± 2.9%(VH3VK4), 41.9 ± 2.8%(VH4VK2), 36.3 ± 4.7%(VH4VK3), 34.9 ± 3.2%(VH4VK4)만큼. 이소형 대조 인간 IgG1 항체는 이러한 시스템에서 타우 흡수에 유의한 영향을 미치지 않았다(모노머성 타우 및 응집된 타우에 대해 각각 -3.4 ± 5.2% 및 -1.2 ± 5%의 억제).
데이터는 모 토끼 항체(#44, 클론 2)와 같이, SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 표적화하는 인간화 항체가 인간 뉴런에 의한 이러한 에피토프를 함유하는 타우 종의 흡수를 감소시킬 수 있었다는 것을 입증하였다. 따라서, 이러한 항체는 알츠하이머병 및 타우병증에서 (SEQ ID NO: 1)의 아미노산 서열에 의해 형성된 이러한 에피토프를 포함하는 세포외 타우 종(모노머성과 멀티머성 둘 모두)의 뉴런-대-뉴런 전파를 제한하고, 이에 의해 환자에서 임상 증상의 진행을 감소시킬/늦출 것으로 예측될 것이다.
24.1 인간 iPSC-유래 대뇌 피질 뉴런의 생산: 실시예 1.1 참조.
24.2 응집된(올리고머성) 타우 종의 생성: 타우 P301S_10xhis-태그_avi-태그를 BL21(DE3) 박테리아에서 과발현시켰다. 세포를 BugBuster(Millipore, 벌링턴, MA, USA)를 사용하여 용해시키고, 정화된 용해물을 2Х PBS 중 5 mL HisTrapHP 컬럼(GE Healthcare, 시카고, IL, USA)에 적용하였다. 타우를 0-mM 내지 500-mM 이미다졸 구배를 사용하여 용리시켰다. 피크 분획을 푸울링하고, Superdex 200 16/60 겔 여과 컬럼(GE Healthcare, 시카고, IL, USA)을 사용하여 2Х PBS에서 추가로 정제하였다. 이어서, 푸울링된 분획을 스핀 농축기(Millipore, 벌링턴, MA, USA)를 사용하여 약 8 mg/mL까지 농축시켰다. 최종 단백질 농도를 Nanodrop 분석에 의해 결정하였다.
8 mg/mL에서 1 mL의 타우 P301S를 PBS/30 mM 3-(N-모르폴리노)프로판설폰산(MOPS)(pH 7.2)에서 4 mg/mL의 헤파린(Sigma, 세인트 루이스, MO, USA)과 함께 37℃에서 72 h 동안 인큐베이션하였다. 응집된 물질을 9 mL의 PBS + 1%(v/v) 사르코실(Sigma, 세인트 루이스, MO, USA)에 희석하고, 임의의 비응집된 물질을 완전히 가용화시키기 위해 RT에서 1 h 동안 흔들어 놓았다. 불용성 타우를 4℃에서 1 h 동안 초원심분리에 의해 펠렛화하였다. 펠렛을 1 mL의 PBS에 재현탁시키고, 100 W에서 3 Х 20 s 동안 초음파처리하여(Hielscher UP200St 초음파발생기; 텔토, 독일), 덩어리 또는 단백질을 분산시키고 큰 필라멘트를 더 작은 종으로 분해하였다.
24.3 정제된 재조합 타우의 표지화: 모노머성 재조합 2N4R 타우를 rPeptide(왓킨스빌, GA, USA)로부터 구입하였다. 응집된 타우를 상기 기재된 바와 같이 제조하였다. 재조합 모노머성 타우(150 μM) 또는 등가의 응집된 타우 농도(약 7 μg/mL)를 RT에서 암소에서 2 h 동안 1.5 mM pHrodo 적색 말레이미드(DMSO에 용해됨) 및 1.5 mM 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(각각 1:10:10 몰비)과 함께 인큐베이션하였다. 이어서, 표지된 샘플이 50 mM 포스페이트(pH 7.4) 및 150 mM NaCl에서 4℃에서 크기 배제 크로마토그래피(Superdex 200 Increase 10/300 GL; GE Healthcare, 시카고, IL, USA)를 거치게 하여 미반응 염료를 제거하였다. 응집체의 올리고머성 상태를 평가하였고, 이는 표지화에 의해 영향을 받지 않는 것으로 밝혀졌다.
P301S 타우를 모노머성 타우 제제와 응집된 타우 제제 둘 모두에 사용하였다.
24.4 인간 iPSC-유래 피질 뉴런에 의한 타우 흡수의 정량화: 모노머성 타우(25 nM) 및 응집된 타우(50 nM)를 N2B27(Thermo Fisher Scientific, 월쌈, MA, USA)에서 제조하고, 37℃에서 90 min 동안 타우에 대한 10 배 몰 과량의 항체(즉, 250 nM 및 500 nM IgG)와 인큐베이션하였다. 클론 #44의 인간화 변이형을 이소형 대조 인간 IgG1(항-플루오레세인[4-4-20(증진)], Absolute Antibody, 옥스포드, UK)과 비교하였다. 200 μL의 항체/타우 혼합물을 NDC 뉴런에 첨가하고(60+ 일차), Incucyte S3 영상화 시스템(Sartorius, 괴팅겐, 독일)을 사용하여 웰 당 9 개 필드로부터 37℃/5% CO2에서 21 h 동안 매시간 영상을 촬영(형광 및 명시야)하였다. 주황색 채널(여기: 513 nm 내지 568 nm)에서 형광의 평균 면적을 정량화하기 위한(웰 당) 알고리즘을 세포가 차지하는 평균 면적(상 면적)으로 정규화하고, 이를 시간 경과에 따라 4 개 웰로부터 평균 +/- SEM으로 플롯팅하였다. 터키의 다중 비교 검정을 사용한 일원 ANOVA를 항체 부재 대조에 대해 실행하여 유의성을 결정하였다.
실시예 25. 항-타우 IgG 클론 #44의 인간화 변이형은 인간 성상세포로의 모노머성 타우 및 응집된 타우의 흡수를 억제한다(도 12, 도 13)
세포외 타우의 성상세포 흡수는 타우병증, 예컨대, 알츠하이머병에서 관찰되는 타우의 병원성 확산에 있어 역할을 한다는 것이 제안된다.
설치류에서 발생하는 것으로 알려져 있기는 하지만(Martini-Stoica et al. J Exp Med 215(9): 2355-2377 (2018)), 인간 성상세포에 의한 세포외 타우 종의 흡수에 대한 이용 가능한 정보는 제한적이다. 또한, 최근에 기술된 뉴런 타우 흡수에 대한 수용체인 지단백질 수용체-관련 단백질 1(LRP1)은 성상세포에서 발현되는 것으로 보고되어 있는데(Rauch et al. Nature 580(7803):381-385(2020)), 이는 흡수 메커니즘이 공유될 수 있다는 것을 시사한다. 중추 신경계에서의 주요 세포 유형으로서, 알츠하이머병 및 타우병증에서 타우 병리의 전파에 있어서의 추정적인 역할과 함께(문헌[
Figure pct00019
Figure pct00020
]에서 검토됨), 본 발명자들은 2N4R 타우(SEQ ID NO: 1)의 아미노산 369 내지 381에 상응하는 서열을 표적화하는 항체가 성상세포에 의한 타우 종의 흡수에 임의의 영향을 미치는지의 여부를 탐색하였다.
인간 iPSC-유래 성상세포는 모노머성 타우 종과 응집된 타우 종 둘 모두를 용이하게 흡수한다. 항체 클론 #44(클론 2)를 포함하는 SEQ ID NO: 1을 표적화하는 항-타우 토끼 IgG는 인간 성상세포에 의한 이러한 에피토프를 함유하는 타우 종의 흡수를 감소시킬 수 있다. 항-타우 토끼 클론 #44와 함께 타우의 인큐베이션은 항체의 부재 하에서의 흡수와 비교하여 모노머성 2N4R 타우의 흡수를 98.4 ± 0.4%만큼, 그리고 응집된 타우의 흡수를 43.3 ± 2.9%만큼 유의하게(P<0.001) 억제하였다. 이러한 데이터는 SEQ ID NO: 1을 표적화하는 치료용 항-타우 항체가 성상세포에 의한 독성 형태의 타우 흡수를 감소시키고, 이에 의해 타우 병리의 전파에서 성상세포의 영향을 감소시킬 것이라는 증거를 제공하였다. 이러한 활성은 치료적으로 유익한 것으로 예측된다.
시험된 클론 #44의 모든 인간화 변이형은 토끼 클론과 유사한 정도로 인간 iPSC-유래 성상세포로의 모노머성 타우의 흡수를 유의하게(P<0.001) 억제하였다(도 12): 85.2 ± 1.4%(VH3VK3), 87.6 ± 1.2%(VH3VK4), 84.6 ± 1.9%(VH4VK2), 87.5 ± 1.7%(VH4VK3), 94.1 ± 0.6%(VH4VK4)만큼. 시험된 모든 인간화 변이형은 또한 토끼 클론과 유사한 정도로 인간 iPSC-유래 성상세포로의 응집된 타우의 흡수를 유의하게(P<0.001) 억제하였다(도 13): 46.4 ± 3.9%(VH3VK3), 45.0 ± 2.8%(VH3VK4), 48.0 ± 2.1%(VH4VK2), 49.9 ± 2.2%(VH4VK3), 61.9 ± 2.8%(VH4VK4)만큼. 이소형 대조 인간 IgG1(항-플루오레세인[4-4-20(증진)], Absolute Antibody, 옥스포드, UK)은 이러한 시스템에서 타우 흡수에 유의한 영향을 미치지 않았다(각각 모노머성 타우 및 응집된 타우에 대해 -1.6 ± 4.5% 및 1.8 ± 3.9%의 억제).
데이터는 모 토끼 항체(#44, 클론 2)와 같이, SEQ ID NO: 1에 의해 형성된 에피토프를 표적화하는 인간화 항체가 인간 성상세포에 의한 이러한 에피토프를 함유하는 타우 종의 흡수를 감소시킬 수 있었다는 것을 입증하였다. 이러한 활성은 치료적으로 유익한 것으로 예측된다.
25.1 인간 iPSC-유래 성상세포의 생산: NDC 배경으로부터의 iPSC 세포주를 사용하여 인간 iPSC의 성상세포로의 분화를 수행하였다. 신경상피 시트를 피질 뉴런에 대해 기재된 바와 같이 생성하였다(문헌[Shi et al., Nature Protocols 7(10): 1836-46, 2012]; 프로토콜은 단계 31에 따랐다). 16 일차로부터, 아큐타제(Accutase)와 함께 새로운 매트리겔-코팅된 플레이트(6 웰 플레이트의 1.5 Х 106 개 세포/웰)로 세포를 계대하고, 7 일 동안 '성상세포 분화 배지 1'(문헌[Shi et al., Nature Protocols 7(10): 1836-46, 2012]에 기재된 신경 유지 배지; 20 ng/mL의 FGF2, 20 ng/mL의 EGF가 보충됨)로 옮겼고, 배지를 격일로 교체하였다. 이후, 새로운 매트리겔-코팅된 플레이트(이전과 같이)에 아큐타제로 세포를 계대하고, '성상세포 분화 배지 2'(10 ng/mL의 BDNF, 10 ng/mL의 CNTF, 1 μM의 푸르모르파민이 보충된 신경 유지 배지)로 7일 동안 옮겼고, 배지를 격일로 교체하였다. 이후, 성상세포를 사용 시까지(약 130+ 일차에) '성숙 배지'(신경기저 배지, 1Х B27 보충물, 1% FBS, 50 U/mL의 페니실린 및 50 mg/mL의 스트렙토마이신, 1Х GlutaMAX)에서 유지하였다.
25.2 응집된(올리고머성) 타우 종의 생성: 실시예 24.2 참조
25.3 정제된 재조합 타우의 표지화: 실시예 24.3 참조.
P301S 타우를 모노머성 타우 제제와 응집된 타우 제제 둘 모두에 사용하였다.
25.4 인간 iPSC-유래 성상세포에 의한 타우 흡수의 정량화: 모노머성 타우(25 nM) 및 응집된 타우(50 nM)를 무혈청 Optimem(ThermoFisher) 배지에서 제조하고, 10 배 몰 과량 농도의 시험된 항체(즉, 각각 250 nM 및 500 nM IgG)와 함께 37℃에서 90 min 동안 인큐베이션하였다. 200 μL의 항체/타우 혼합물을 iPSC-유래 성상세포에 첨가하고, Incucyte S3 영상화 시스템(Sartorius, 괴팅겐, 독일)을 사용하여 웰 당 9 개 필드로부터 37℃/5% CO2에서 20 h 동안 매시간 영상을 촬영하였다(명시야 및 주황색 채널). 주황색 채널(여기: 513 nm 내지 568 nm)에서 형광의 평균 면적을 정량화하기 위한(웰 당) 알고리즘을 세포가 차지하는 평균 면적(상 면적)으로 정규화하고, 이를 시간 경과에 따라 4 개 웰로부터 평균 +/- SEM으로 플롯팅하였다. 터키의 다중 비교 검정을 사용한 일원 ANOVA를 항체 부재 대조에 대해 실행하여 유의성을 결정하였다.
본 실험에서, 항-인간 IgG1 이소형 대조를 사용하였다(항-플루오레세인[4-4-20(증진)], Absolute Antibody, 옥스포드, UK).
실시예 26. 단클론성 항-타우 클론 #44 인간 IgG1의 인간화 변이형은 인간 iPSC-유래 미세아교세포에 의한 모노머성 타우 및 응집된 타우의 흡수를 증가시킨다(도 14, 도 15)
미세아교세포는 중추 신경계에서 세포외 물질을 제거하여 잔해의 축적을 방지하고 복구 과정이 일어나도록 하는 데 중요한 역할을 한다. 신경퇴행성 질환의 맥락에서, 응집체, 올리고머 및 모노머성 형태를 포함하는 세포외 단백질의 식세포작용은 이러한 종의 세포외 농도를 감소시키는 데 도움이 된다. hIgG1로서 시험된 클론 #44의 모든 인간화 변이형은 인간 iPSC-유래 미세아교세포로의 모노머성 타우의 흡수를 유의하게(P<0.005) 증가시켰다(도 14): 16.1 ± 1%(VH3VK3), 80.3 ± 0.8%(VH3VK4), 71.4 ± 1.6%(VH4VK2), 60.2 ± 1.1%(VH4VK3), 59.4 ± 1.4%(VH4VK4)만큼. hIgG1로서 시험된 모든 인간화 변이형은 또한 인간 iPSC-유래 미세아교세포로의 응집된 타우의 흡수를 유의하게(P<0.001) 증가시켰다(도 15): 77.7 ± 2.1%(VH3VK3), 83.9 ± 2.4%(VH3VK4), 97.6 ± 2.2%(VH4VK2), 90.5 ± 2.8%(VH4VK3), 114.6 ± 3.3%(VH4VK4)만큼. 이소형 대조 항체는 이러한 시스템에서 타우 흡수에 유의한 영향을 미치지 않았다(모노머성 타우 및 응집된 타우에 대해 각각 9.4 ± 1.5%의 감소 및 15.7 ± 2.2%의 증가).
데이터는 모 항체(#44, 클론 2)와 같이, 이펙터 기능(예를 들어, hIgG1으로서 포맷됨)을 갖는 SEQ ID NO: 1을 표적화하는 치료용 항체가 미세아교세포에 의해 표적화된 서열(SEQ ID NO: 1)을 함유하는 세포외 타우의 제거를 증가시키고, 이에 의해 CNS에서 세포외 농도 및 세포외 타우의 유해한 효과를 감소시킬 것임을 입증해 주었다. 이러한 활성은 치료적으로 유익한 것으로 예측된다.
26.1 hIgG1 항체의 생산: 실시예 22.1 참조.
26.2 인간 iPSC-유래 미세아교세포의 생산: 미세아교세포 배양물에 대한 인간 만능 줄기 세포(iPSC)의 분화를 문헌[Brownjohn et al. (2018) Stem Cell Rep 10(4): 1294-1307]에 기재된 바와 같이 수행하였다. NDC 배경으로부터의 iPSC 세포주를 사용하였다. 미세아교 전구 세포를 수집하고, 96 웰 플레이트에 플레이팅하고, 사용 전 대략 14 일 동안 완전 미세아교세포 배지(문헌[Brownjohn et al., 2018]에 기재된 바와 같이)에서 유지하였다. 사용 전날, 배양물을 무혈청 배지(10 ng/mL의 GM-CSF 및 100 ng/mL의 IL-34가 보충된 RPMI 1640/Glutamax(Peprotech(NJ, US)로부터의 성장 인자))로 바꾸고, 식세포작용 실험을 무혈청 조건에서 완료하였다.
26.3 응집된(올리고머성) 타우 종의 생성: 실시예 24.2 참조
26.4 정제된 재조합 타우의 표지화: 실시예 24.3 참조. P301S 타우를 모노머성 타우 제제와 응집된 타우 제제 둘 모두에 사용하였음에 주목한다.
26.5 인간 iPSC-유래 미세아교세포에 의한 타우 흡수의 정량화: 모노머성 타우(25 nM) 및 응집된 타우(50 nM)를 무혈청 미세아교세포 배지에서 제조하고, 1:10 비율의 타우:항체(즉, 각각 2.5 nM 및 5 nM IgG) 와 함께 37℃에서 90 min 동안 인큐베이션하였다. 항-타우 hIgG1을 이소형 대조(항-플루오레세인[4-4-20(증진)], Absolute Antibody, 옥스포드, UK)와 비교하였다. 100 μL의 항체/타우 혼합물을 iPSC-유래 미세아교세포에 첨가하고, Incucyte S3 영상화 시스템(Sartorius, 괴팅겐, 독일)을 사용하여 웰 당 9 개 필드로부터 37℃/5% CO2에서 15 h 동안 30 min 마다 영상을 촬영하였다(명시야 및 주황색 채널). 주황색 채널(여기: 513 nm 내지 568 nm)에서 형광의 평균 면적을 정량화하기 위한(웰 당) 알고리즘을 세포가 차지하는 평균 면적(상 면적)으로 정규화하고, 이를 시간 경과에 따라 n=4 세포로부터 평균 +/- SEM으로 플롯팅하였다. 터키의 다중 비교 검정을 사용한 일원 ANOVA를 항체 부재 대조에 대해 실행하여 유의성을 결정하였다. 인용된 타우 흡수의 증가는 '타우 부재' 대조와 비교하여 계산된다.
실시예 27. 단클론성 항-타우 클론 #44의 인간화 변이형은 비-치매 대조 사후 뇌에서는 아니지만 가족성 알츠하이머병에서 고 및 저 MW 타우 종의 증가된 수준을 검출한다(도 16)
항-타우 항체 클론 #44의 인간화 변이형은 비-치매 대조(NDC) 샘플에서는 아니지만 사후 가족성 알츠하이머병(fAD; 프레세닐린 1 돌연변이) 대뇌 피질 샘플에서 질병-관련 형태의 타우를 검출한다. 웨스턴 블롯은 5 개의 변이형: VH3VK3, VH3VK4, VH4VK2, VH4VK3 및 VH4VK4가 시험된 NDC 샘플에는 존재하지 않았던 다중 고(75 kD 초과) 및 저(40 kD 미만) 분자량 종을 포함하여, NDC 샘플에 비해 대표적인 fAD에서 증가된 수준의 타우를 검출하였음을 입증하였다(도 16). 액틴 대조는 뇌 용해물 샘플의 동일한 로딩을 확인시켜 주었다. 검출된 타우 종은 모 항체(#44 VH0VK0)와 유사한 패턴을 나타냈고, 이는 모 토끼 클론 #44의 결합 특성이 인간화 변이형에 의해 보유되었음을 입증한다.
27.1 인간 뇌 샘플: 세부사항은 실시예 8.1을 참조한다.
27.2. 단백질 추출: iPSC-유래 뉴런 배양물을 프로테아제 억제제(cOomplete Mini, EDTA 비함유, Roche Diagnostics, Rotkreux, 스위스)가 보충된 RIPA 완충제(Sigma, 세인트 루이스, MO, USA)를 사용하여 용해시켰다. 단백질 농도를 Pierce BCA 단백질 검정 키트(Thermo Fisher Scientific, 월쌈, MA, USA)로 측정하고, 명시된 경우, 뇌 용해물을 제조업체의 지침에 따라 람다 단백질 포스파타제(1-PP); (New England Biolabs, 입스위치, MA, USA)로 처리하였다.
27.3 웨스턴 블롯팅: 20 μL의 총 부피 중 40 μg의 단백질(달리 언급되지 않는 한)을 12% Mini-Protean TGX 프리캐스트 겔(Bio-Rad, 허큘리스, CA, USA) 상에 로딩하고, 4℃에서 2 시간 동안 200 mA에서 0.2 μm PVDF 막(GE Healthcare Life science, 시카고, IL, USA) 상으로 옮겼다. 막을 차단 용액(PBS 중, 5% 건조 탈지유, 0.1% 트윈)에서 1 시간 동안 RT에서 인큐베이션하였다.
27.4 항체 인큐베이션: 단백질-전달된 막을 일차 항체(명시된 농도에서)로 RT에서 밤새 탐침하였다. 막을 후속하여 Tidyblot(Bio-Rad, 허큘리스, CA, USA; 1:200)과 함께 RT에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 사후 뇌 샘플에 존재하는 인간 IgG를 오염시키는 영향을 최소화하기 위해 표준 이차 항체 대신에 Tidyblot을 사용하였다.
27.5 막 시각화: 각각의 막을 증진된 화학발광(ECL) 웨스턴 블롯팅 검출 시약(GE Healthcare Life Science, 시카고, IL, USA)을 사용하여 검출하고, ImageQuant LAS 4000(GE Healthcare Life Science, 시카고, IL, USA)을 사용하여 시각화하였다.
27.6 베타-액틴 정규화: 베타-액틴을 로딩 대조로서 포함시켰다. 영상화 후, RT에서 25 분 동안 Restore PLUS 웨스턴 블롯 스트립핑 완충제(Thermo Fisher Scientific, 월쌈, MA, USA)를 사용하여 PVDF 막으로부터 제1 항체 복합체를 제거하였다. 막을 차단 용액과 함께 RT에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 각각의 막을 마우스 단클론성 항-베타-액틴(Sigma, 세인트 루이스, MO, USA; 1:1000), 또는 TuJ1 일차 항체(R&D Systems, 미니애폴리스, MN, USA; 1:1000)로 탐침한 다음, 염소 항 -마우스 IgG-퍼옥시다제 이차 항체(Sigma, 세인트 루이스, MO, USA; 1:2000)와 인큐베이션하였다. 두 항체 모두를 RT에서 1 시간 동안 연속적으로 인큐베이션하였다.
실시예 28. 인간화 변이형 #44 VH4VK4는 비-치매 대조 뇌와 비교하여 가족성 알츠하이머병, 산발성 알츠하이머병 및 루이소체 치매를 동반한 치매에서 고 및 저 MW 타우 종의 증가된 수준을 검출한다.
#44의 인간화 변이형이 다양한 타우병증에 걸쳐 및 환자 샘플의 패널에 걸쳐 질병-관련 타우 종을 검출하는 모 토끼 IgG의 능력을 보유했는지 확인하기 위해, 모 클론 #44(토끼 IgG) 및 인간화 변이형 #44 VH4VK4(hIgG1)를 보다 상세히 프로파일링하였다. 예상된 바와 같이, 인간화 변이형 #44 VH4VK4는 모 클론 #44와 유사하게 수행되었고, 가족성 알츠하이머병(fAD), 산발성 알츠하이머병(sAD) 및 루이소체를 동반한 치매(DLB)를 나타내는 환자 샘플의 패널에 걸쳐 고 및 저 MW 종 둘 모두의 증가된 수준을 검출하였다(도 17). 액틴 및 뉴런 튜불린 대조는 타우 수준의 변화가 시험된 샘플에서 단백질 및/또는 뉴런 수준의 변동으로 인한 것이 아니었음을 확인시켜 주었다. 데이터는 모 클론 #44와 인간화 항체 변이형 VH4VK4 둘 모두가 항체 클론 #66(클론 1)에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 질병-관련 타우 종을 검출하였음을 확인시켜 주었고, 실시예 21에 기재된 인간화 변이형의 패널뿐만 아니라 SEQ ID NO: 1에 결합하는 임의의 다른 항체의 인간화 변이형이 유사하게 거동했을 가능성이 있었음을 시사하였다. 따라서, 질병-특이적 타우 종에 대한 #44 VH4VK4, 또는 대안적인 인간화 변이형의 결합은 AD 및 타우병증의 치료에 치료적으로 유용할 잠재력을 가진다.
또한, 상업적으로 이용 가능한 N-말단(타우13), 중간-영역(HT7 및 타우5) 및 원위 C-말단 타우(타우46) 항체에 의한 타우 종의 검출은 더 높은 및 더 낮은 분자량 범위 둘 모두에서 fAD, sAD 및 DLB 뇌 샘플에 걸쳐 질병-특이적 타우 종의 제한된 검출을 나타냈다(도 17). 데이터는 2N4R 타우(SEQ ID NO: 1)의 아미노산 369 내지 381에 상응하는 서열을 표적화하는 항체가 타우의 N-말단, 중간-영역 또는 원위 C-말단 영역을 표적화하는 다양한 항체에 의해 검출되지 않는 질병-특이적 타우 종에 결합하고, 이에 따라 표적화된 서열과 관련하여 독특하고 유익한 성질을 나타낸다는 것을 입증하였다.
28.1 인간 뇌 샘플: 인간 사후 뇌 샘플의 기원에 대해서는 실시예 8.1을 참조한다. 모든 샘플은 임상적으로 및 병리학적으로 확인된 산발성 알츠하이머병(Braak 병기 6) 또는 DLB를 가진 개체의 전두 피질로부터의 샘플이었다. 비-치매 대조 뇌 샘플은 치매의 임상 징후 또는 AD/타우병증의 병리학적 징후(Braak 병기 0)를 나타내지 않은 동일 연령 개체로부터의 샘플이었다. 언급된 경우, 대조 개체의 사망 원인은 사후에 검출된 타우 수준/종에 영향을 미치는 것으로 예측되지 않을 것이다.
28.2 웨스턴 블롯: 세부사항은 실시예 27을 참조한다.
사용된 상용 항체는 다음과 같았다: HT7(아미노산 159 내지 163을 표적화; Invitrogen, 칼즈배드, CA, USA), 타우5(아미노산 210 내지 241을 표적화; Thermo Fisher Scientific, 월쌈, MA, USA), 타우13(아미노산 2 내지 18을 표적화; Abcam, 케임브리지, UK), 또는 타우46(아미노산 404 내지 441을 표적화; New England Biolabs, 입스위치, MA, USA).
실시예 29. 인간화 항체 클론 #44 VH4VK4의 친화성 성숙
인간화 항체 클론 #44_VH4VK4를 VH CDR3(라이브러리 1), VL CDR3(라이브러리 2A 및 2B) 및 VH CDR2(라이브러리 3)에서 잔기를 돌연변이시키기 위해 축퇴성 올리고(NNK)를 이용한 통상적인 돌연변이유발 접근법을 사용하여 친화성 성숙시켰다. 라이브러리를 scFv로 표현하고, 가용성 선별과 수동 선별 둘 모두의 여러 라운드를 완료하여 가장 높은 친화성 scFv를 확인하였다. 라이브러리 2A는 추가로 연구할 가치가 있는 클론을 산출하지 않았다. 수동 선별 중 어느 것도 다클론성 파지 ELISA에서 임의의 결합을 나타내지 않았다. 총 2486 개의 개별 클론을 파지 ELISA에서 스크리닝하였다: 라이브러리 1로부터 945 개, 라이브러리 2B로부터 222 개, 및 라이브러리 3으로부터 1319 개. 이후 88 개의 클론을 최종 결합 ELISA를 위해 체리 피킹하였다: 라이브러리 3으로부터 64 개, 라이브러리 2B로부터 1 개 및 라이브러리 1로부터 23 개. 이러한 플레이트는 20 개의 독특한 VH 서열(라이브러리 3으로부터 15 개, 라이브러리 1로부터 5 개)을 포함하였다.
20 개의 새로운 VH(SEQ ID NO: 183 내지 206) 및 하나의 새로운 VK 서열(SEQ ID NO: 207)을 우선순위화하고(서열 정렬은 도 18에 제공됨), 21 개의 새로운 변이형을 생성하기에 적절한 모 VH(pVH) 또는 VK(pVL)와 조합하여 발현시켰다. 포유류 세포에서 발현될 때, 모든 새로운 IgG 변이형은 ELISA에 의해 입증된 바와 같이 전장 재조합 2N4R 타우에 결합하는 항체를 형성한다(도 19). 배경 ELISA 신호는 낮은데, 이는 항체-관련 신호가 타우와의 특이적 상호작용에 기인한다는 것을 입증해 준다. 모든 상청액을 농도 매칭시키고, 30 ng/mL에서 시험하였다.
Biacore 단일 사이클 동역학(SCK) 실험은 항체 KD의 계산을 가능하게 한다. 새로운 변이형의 경우, KD는 593 pM 내지 34.2 nM의 범위이다(각각 H04/pVL 및 H18/pVL의 경우; 표 15에 요약됨). H06, H07, H09, H13 또는 H14를 신규한 VL 변이형, L2와 조합하는 추가 변이형을 시험하였다. pVL과 조합된 동일한 VH보다 더 잘 수행된 것은 없었는데, 이는 VL CDR3이 타우에 대한 항체 결합의 주요 결정인자가 아님을 시사한다.
친화성 성숙은 모 인간화 클론 #44 VH4VK4(SEQ ID NO: 154/SEQ ID NO: 160)보다 타우에 대해 더 높은 친화성을 갖는 4 개의 신규한 항체를 생성하였다: H01/pVL(SEQ ID NO: 183 / SEQ ID NO: 160), H02/pVL(SEQ ID NO: 184 / SEQ ID NO: 160), H04/pVL(SEQ ID NO: 186 / SEQ ID NO: 160), H06/pVL(SEQ ID NO: 188 / SEQ ID NO: 160). 이들 클론 모두는 VH CDR2 돌연변이도 포함하는 H06과 함께 VH CDR3에 돌연변이를 함유하는데, 이는 타우로의 #44_VH4VK4-관련 항체 결합에 대한 주요 영역으로서 VH CDR2 및 VH CDR3을 암시하는 것이다. VL CDR3의 돌연변이(라이브러리 2A 및 2B)는 항체 친화성의 개선을 산출하지 않았다.
H06(VH CDR2)과 H01, H02 또는 H04(VH CDR3)의 재조합으로 H06-01/pVL, H06-02/pVL, H06-04/pVL을 형성하는 것은 원래의 H06/pVL 클론과 비교하여 친화성의 증가를 야기하지 않았다(표 16 참조). H16 CDR2와 H04 CDR3의 추가적인 재조합은 또한 원래의 클론과 비교하여 친화성의 증가를 산출하지 않았다.
데이터는 타우와 #44_VH4VK4-관련 항체 상호작용의 친화성을 결정하는 데 있어서 VH CDR3 및 VH CDR2의 중요성을 입증해 주었다. 구체적으로는, 표 14에 나타낸 바와 같았다:
Figure pct00021
표 14.
우선순위화된 리드에서 고 친화성 결합 부위의 존재를 최소화하려는 목적으로, Abzena의 전매 iTope 분석을 수행하여 예측된 MHC 클래스 II 결합 펩티드의 존재를 평가하였다. 이러한 분석의 요약은 표 16에 제공되어 있다. 신규한 VH 클론은 1 개 내지 4 개의 예측된 고 친화성 부위(모 #44_VH4에 대한 1 개와 비교하여) 및 2 개 내지 5 개의 중간 친화성 부위(모체 #44_VH4에 대한 4 개와 비교하여)를 함유한다. 단일 신규 VK 클론은 모 #44_VK4 클론의 2 개의 중간 친화성 및 2 개의 높은 친화성 부위를 공유한다.
29.1 파지 디스플레이에 의한 친화성 성숙 - 라이브러리 설계 및 작제: VH CDR3(D95 내지 P102의 영역, 라이브러리 1); VH CDR2(C50 내지 F58의 잔기, 일정하게 유지된 I51, G55 및 T57 제외, 라이브러리 3), VL CDR3(L89 내지 S93, N96 및 V97, 라이브러리 2A; 위치 C94 및 C95D에서 2 개의 Cys 사이의 4 개 잔기, 두 Cys 모두를 일정하게 유지; 라이브러리 2B)에서의 영역을 돌연변이시키도록 라이브러리를 상기 개략된 바와 같이 설계하였다. 라이브러리를 표준 방법을 이용하여 작제하였다. NcoI 또는 NotI 제한 부위를 갖는 표적화된 서열에 무작위화를 도입하도록 올리고를 설계하였다. 3 개 모두의 라이브러리에 대한 정제되고 증폭된 DNA를 NcoI 및 NotI를 사용하여 분해하고, 유사하게 절단된 파지미드 벡터(pANT65)에 결찰하였다. 결찰된 DNA를 세정하고, Roche HP PCR 산물 정제 키트(Roche Life Sciences, 버지스힐, UK)를 사용하여 뉴클레아제-비함유 물에서 용리시키고, 전기천공에 의해 새로 제조된 전기적격 TG1 세포로 형질전환시켰다. 다음 날, 콜로니를 계수하고, 플레이트를 스크레이핑하고, 글리세롤 스톡을 제조하였다. 이론적 라이브러리 다양성을 충분히 포괄하도록 라이브러리를 여러 번 전기천공하였다. 라이브러리 각각에 대해 10 배 이상의 범위가 수득되었다. 이는 전체 라이브러리의 99%를 포괄하는 통계적 확률을 제공한다.
29.2 친화성 성숙 - 라이브러리 파지 구조: 4 개의 라이브러리로부터의 박테리아를 관찰된 라이브러리 다양성의 적어도 100x로 접종물을 사용하여 150 mL의 2TYCG(2%) 배양물에 접종하였다. 배양물을 중간-대수기로 성장시키고(OD600nm
Figure pct00022
0.4), 총 세포 수를 추정하였다(1
Figure pct00023
5 Х 108 개 세포/mL의 OD600nm를 기준으로 함). 헬퍼 파지(M13K07)(New England BioLabs, 히친, UK)를 10의 감염 다중도로 첨가하고, 150 rpm으로 1 시간 동안 인큐베이션한 다음, 원심분리하고, 2TYCK 배지에 재현탁시키고, 30℃에서 밤새 성장시켰다. 다음 날, 원심분리에 의해 배양 상청액을 회수함으로써 파지를 수확하고, 이어서 3/10 부피의 냉각된 20% PEG/2.5 M NaCl을 사용하여 침전시켰다. 얼음 위에서 1 시간 인큐베이션 후, 침전된 파지를 원심분리에 의해 회수하고, 펠렛을 1Х PBS pH 7.4에 재현탁시켰다. 상청액을 재원심분리하여 임의의 세포 잔해를 제거하고, 그 후에 상청액을 상기 기재된 바와 같이 재침전시켰다. 침전된 파지를 1Х PBS pH 7.4에 재현탁시켰다.
29.3 친화성 개선된 파지 선별: 용액 중 선별을 위해, 친화성 개선에 기초하여, 라이브러리 각각을 MPBS(3% 우유 함유)로 사전-차단한 다음, 파지를 실온에서 1 시간 동안 감소하는 농도의 가용성 비오티닐화된 전장 타우(50 nM)와 함께 인큐베이션하였다. 사전-차단된 스트렙타비딘 상자성 비드를 각 선별에 첨가하고, 5 min 동안 회전시켰다. 스트렙타비딘-항원-파지 복합체를 KingFisher 1 mL(ThermoFisher, 월쌈, USA)를 사용하여 PBST로 8 회 세척 단계로 세척하고, 이어서 PBS로 세척하였다. 50 mM HCl의 첨가에 의해 비드로부터 파지를 용리시킨 다음, 1 M 트리스-HCl pH 9.0의 첨가에 의해 중화시켰다. 이후, 파지를 대수기 TG1 세포에 감염시키고, 카르베니실린을 함유하는 LB Agar 플레이트 상에 플레이팅하였다. 모든 선별에 대해, 항원을 생략하지만 상기 기재된 바와 같은 프로토콜에 따라 "항원 부재" 대조 선별을 수행하였다. 항원의 존재 또는 부재 하의 선별로부터의 산출 플레이트 상의 콜로니 수의 비교는 임의의 특정 선별의 성공에 대한 정보를 제공한다.
수동 선별을 위해, 라이브러리 각각을 MPBS(5% 우유 함유)로 사전-차단한 다음, 파지를 감소하는 농도의 비오티닐화되지 않은 전장 인간 타우(22.2 nM)로 코팅된 면역 튜브와 함께 인큐베이션하고, 실온에서 1 시간 동안 MPBS로 차단하였다. 항원-파지 복합체를 PBST로 3 회 세척하고, 이어서 PBS로 세척하였다. 50 mM HCl의 첨가에 의해 비드로부터 파지를 용리시킨 다음, 1 M 트리스-HCl pH 9.0의 첨가에 의해 중화시켰다. 이어서, 용액 선별에 대해 기재된 바와 같이 파지를 대수기 TG1 세포에 감염시켰다.
29.4 scFv의 발현 및 시험: 가용성 scFv를 초기에 발현시키고, IPTG 유도 후 배지로 분비된 단백질로서 타우에 대한 결합에 대해 단일 점 결합 ELISA 포맷으로 시험하였다. 선별된 선별 산출물로부터의 개별 콜로니를 1 mL의 2TYCG(0.1%) 배지로 피킹하고, 37℃에서 5 h 동안 진탕시킴으로써 성장시켰다. IPTG를 1 mM의 최종 농도로 첨가함으로써 배양을 유도한 다음, 30℃에서 진탕하면서 밤새 성장시켰다. 다음 날, 배양물을 원심분리하고, 상청액을 ELISA(1:20 희석)에 의해 시험하였다. 모든 라이브러리에 대해 배지로 발현된 scFv로부터의 콜로니를 대조로서 각 검정 플레이트 상에 포함된 모 scFv 및 관련 없는 scFv로 스크리닝하였다.
Nunc Immuno MaxiSorp 96 웰 평저 미세역가 플레이트를 4℃에서 밤새 1.0 μg/mL에서 50 μL의 타우로 코팅하였다. 플레이트를 세척하고, 실온에서 5% MPBS로 1 h 동안 차단하였다. 발현된 scFv를 함유하는 유도된 배지를 1:20으로 희석하고, 차단된 플레이트에 첨가하고(웰 당 100 μL), 실온에서 1 h 동안 플레이트 상에서 인큐베이션하였다. 이어서, 플레이트를 세척하고, 표적에 대한 scFv의 결합을 항-HIS 항체-HRP(Sigma-Aldrich, 도셋, UK)로 검출하고, TMB 기질(Invitrogen, 러프버러, UK)로 전개시켰다. 반응을 1 M HCl로 중단시키고, Dynex Technologies MRX TC II 플레이트 리더 상에서 450 nm에서 흡광도를 판독하고, 결합 데이터를 플롯팅하였다.
29.5 CD4+ T 세포 에피토프 회피(iTope TM 에 의한 분석): 실시예 21.2 참조.
29.6 신규한 항체 변이형의 생성: 실시예 21.3 참조
29.7 타우에 대한 항체 결합의 평가(ELISA): 실시예 21.4 참조. 여기서 상청액은 30 ng/mL에 매칭된 농도였다(역가의 옥텟(Octet)-기반 추정을 이용하여, 표준 방법을 이용하여 Abzena에 의해 계산됨).
29.8 타우에 대한 항체 결합의 평가(Biacore SCK 분석): 실시예 21.5 참조.
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
표 15. 친화성 성숙된 항체 패널로부터의 CDR의 서열
Figure pct00027
표 16. 모 클론 #44_VH4VK4(pVH, pVL) 및 VH(H01 내지 H20) 및 VK(L02)의 친화성 성숙된 변이형에 존재하는 예측된 중간 및 고 친화성 MHC 클래스 II 결합 펩티드의 수를 보여주는 iTope 분석 결과의 요약.
Figure pct00028
표 17. 전장 재조합 2N4R 타우에 결합하는 클론 #44_VH4VK4의 친화성 성숙된 변이형에 대한 결합 분석(SCK) 데이터의 요약. 모 클론 #44_VH4VK4는 pVH/pVL(VH SEQ ID NO: 154 및 VL SEQ ID NO: 160)로 제시되고, '배수 개선' 값은 이러한 클론과 비교하여 계산된다. 모든 클론은 hIgG1로서 발현된다. HEK 역가는 형질감염 후 7 일차의 옥텟(Octet) 분석에 기초한다.
실시예 30. 친화성 성숙된 IgG는 높은 친화성으로 타우에 결합한다
상위 4 개의 친화성 성숙된 인간화 변이형을 hIgG1로서 더 큰 규모의 발현 및 추가 특징규명을 위해 선택하였다(표 17에 요약된 데이터에 기초함): #44_VH4VK4_H01/pVL(SEQ ID NO: 183 및 SEQ ID NO: 160); #44_VH4VK4_H02/pVL(SEQ ID NO: 184 및 SEQ ID NO: 160); #44_VH4VK4_H04/pVL(SEQ ID NO: 186 및 SEQ ID NO: 160); 및 #44_VH4VK4_H06/pVL(SEQ ID NO: 188 및 SEQ ID NO: 160). 수율을 최대화하기 위해 CHO 세포를 이러한 더 큰 규모 생산에 사용하였다. _H01, _H02 등으로 언급될 때, 이들 클론은 #44_VH4VK4로부터 유래되고 모 VL(pVL)을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 모든 클론은 인간 IgG1(hIgG1)로서 발현되었다. 클론이 상이한 이소형/포맷으로 발현될 경우, 결합 특성은 변하지 않을 것으로 예상된다.
재조합 2N4R 타우에 대한 항체 결합의 Biacore 다중-사이클 동역학(MCK) 분석은 도 20 및 표 18에 요약되어 있다. 4 개의 변이형 모두는 모 #44_VH4VK4보다 타우에 대해 더 높은 친화성을 나타낸다: 병행하여 시험된 모 IgG에 대해 시험된 7.76 nM과 비교하여 0.736 nM(_H04), 1.52 nM(_H02), 1.53 nM(_H06), 및 4.01 nM(_H01). RMAX의 약간의 변동은 아마도 리간드 포획의 차이에 기인한 것이고, 항체 결합 특성의 유의한 변동을 반영하지 않는 것으로 여겨진다.
실시예 21에 기재된 바와 같이, 인간 타우에 대해 기재된 활성은 표적 서열(SEQ ID NO: 1)이 존재하고 접근 가능한 경우, 타우의 다른 포유류 종에 적용 가능할 것으로 예측된다.
30.1 단백질 A 정제된 hIgG1 항체의 생산: 실시예 22.1 참조.
30.2 타우에 대한 항체 결합의 평가(Biacore MCK 분석): 실시예 22.2 참조. 이러한 실험에서, 질량 수송 한계의 영향을 최소화하기 위해 유량을 100 μL/min으로 증가시켰다는 점에 주목한다.
Figure pct00029
표 18. 전장 재조합 2N4R 타우에 결합하는 클론 #44_VH4VK4(H01 내지 H06; hIgG1)의 정제된 친화성 성숙된 변이형에 대한 Biacore MCK 분석의 요약. 모 클론 #44_VH4VK4는 pVH/pVL으로 제시되고, '상대 KD' 값은 이러한 클론과 비교하여 계산된다. 새로운 변이형은 SEC 정제된 샘플로서 시험되었다. *대량 운송 제한의 경계에 있음.
실시예 31. 친화성 성숙된 IgG는 열역학적으로 안정하다
치료용 항체로 개발하기 위한 친화성 성숙된 인간화 변이형의 잠재력을 평가하기 위해, 각각의 열 안정성을 평가하였다. 데이터는 표 19 및 도 36에 요약되어 있다. 평균 용융 온도(Tm)는 64.2℃ (#44_VH4VK4_H06/pVL의 경우)부터 69.6℃ (#44_VH4VK4_H01/pVL의 경우)까지의 범위였는데, 이는 치료용 항체에 허용되는 것으로 간주된다.
Figure pct00030
표 19. 클론 #44 VH4VK4(H01 내지 H06)의 신규한 변이형에 대한 열 안정성 프로파일링 데이터의 요약. 모 클론 #44 VH4VK4는 pVH/pVL로 제시된다. 모든 항체는 hIgG1로서 발현되었다.
31.1 열 안정성 분석: 실시예 23.1 참조.
실시예 32. 항체 #44_VH4VK4의 친화성 성숙된 변이형은 인간 뉴런으로의 모노머성 타우 및 응집된 타우의 흡수를 억제한다
실시예 12 및 실시예 24에 기재된 바와 같이, 세포외 타우의 '독성' 형태의 뉴런 흡수는 타우병증, 예컨대, 알츠하이머병에서 관찰되는 타우의 병원성 확산에 있어 중요한 역할을 한다는 것이 제안된다. 항체 클론 #44(클론 2)를 포함하는 SEQ ID NO: 1을 표적화하는 항-타우 토끼 IgG는 인간 뉴런에 의한 이러한 에피토프를 함유하는 타우 종의 흡수를 감소시킬 수 있다(실시예 12). 이러한 활성을 나타내는 항체는 생체내에서 표적 에피토프를 포함하는 세포외 타우 종의 뉴런-뉴런 전파를 제한하고, 이에 따라 치료적으로 유용할 것으로 예측될 것이다.
시험된 클론 #44_VH4VK4(hIgG1로서)의 모든 친화성 성숙 인간화 변이형은 모 인간화 #44_VH4VK4 클론과 유사하거나 더 큰 정도로 인간 iPSC-유래 뉴런으로의 모노머성 타우의 흡수를 유의하게(P<0.001) 억제하였다(도 22): 70.6 ± 4.3%(#44_VH4VK4)와 비교하여 89.2 ± 1.5%(H01/pVL), 84.1 ± 1.9%(H02/pVL), 81.8 ± 1.7%(VH04/pVL), 71.0 ± 4.1%(H06/pVL)만큼. 시험된 모든 인간화 변이형은 또한 모 인간화 클론, #44_VH4VK4와 유사한 정도로 인간 iPSC-유래 뉴런으로의 응집된 타우의 흡수를 유의하게(P<0.001) 억제하였다(도 23): 58.0 ± 4.7%(#44_VH4VK4)와 비교하여 61.1 ± 4.8%(H01/pVL), 59.2 ± 6.4%(H02/pVL), 65.5 ± 3.8%(H04/pVL), 55.0 ± 4.9%(H06/pVL)만큼. 이소형 대조 인간 IgG1 항체는 이러한 시스템에서 타우 흡수에 유의한 영향을 미치지 않았다(모노머성 타우 및 응집된 타우에 대해 각각 6.2 ± 7.0% 및 14.3 ± 6.8%의 억제). 이러한 복합 세포-기반 모델에서 타우 흡수의 절대 수준 및 항체-매개 억제의 절대 수준에서 일부 가변성이 예상된다는 점에 주목해야 한다. 이러한 가변성은 통상적인 실험 가변성 이외에 타우 흡수에 필요한 단백질의 발현의 가변성에 기인했을 가능성이 있다. 이 실시예에 제시된 데이터는 다중 실험 실행에서 관찰된 데이터를 나타낸다.
데이터는 모 인간화 항체(#44_VH4VK4)와 같이, SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 표적화하는 친화성 성숙된 항체가 인간 뉴런에 의한 이러한 에피토프를 함유하는 타우 종의 흡수를 감소시킬 수 있었다는 것을 입증하였다. 따라서, 이러한 항체는 알츠하이머병 및 타우병증에서 (SEQ ID NO: 1)의 아미노산 서열에 의해 형성된 에피토프를 포함하는 세포외 타우 종(전장 및 트렁케이션된 형태를 포함하여, 모노머성 및 멀티머성)의 뉴런-대-뉴런 전파를 제한하고, 이에 의해 환자에서 임상 증상의 진행을 감소시킬/늦출 것으로 예측될 것이다. 제시된 데이터는 hIgG1을 사용하여 생성되었다. 이러한 활성은 CDR-의존적이며(이소형-의존적이라기보다는), 따라서 이들 클론이 상이한 이소형/포맷으로 발현된 경우 변하지 않는 것으로 예측될 것이다.
32.1 인간 iPSC-유래 대뇌 피질 뉴런의 생산: 실시예 1.1 참조.
32.2 타우 종의 생성 및 표지화: 실시예 24.2, 실시예 24.3 참조. P301S 타우를 모노머성 타우 제제와 응집된 타우 제제 둘 모두에 사용하였음에 주목한다.
32.3 인간 iPSC-유래 피질 뉴런에 의한 타우 흡수의 정량화: 실시예 24.4 참조.
실시예 33. 항체 #44_VH4VK4의 친화성 성숙된 변이형은 인간 성상세포로의 모노머성 타우 및 응집된 타우의 흡수를 억제한다
실시예 17 및 실시예 25에 기재된 바와 같이, 세포외 타우의 성상세포 흡수는 타우병증, 예컨대, 알츠하이머병에서 관찰되는 타우의 병원성 확산에 있어 역할을 한다는 것이 제안된다. 항체 클론 #44(클론 2) 및 이러한 클론의 인간화 변이형(항체 #44_VH4VK4 포함)을 포함하여, SEQ ID NO: 1을 표적화하는 항-타우 토끼 IgG는 인간 성상세포에 의한 이러한 에피토프를 함유하는 타우 종의 흡수를 감소시킬 수 있었다(실시예 17). 이러한 활성을 나타내는 항체는 치료적으로 유용한 것으로 예측된다.
시험된 클론 #44_VH4VK4의 모든 친화성 성숙된 인간화 변이형은 인간 성상세포로의 모노머성 타우의 흡수를 유의하게(P<0.001) 억제하였다(도 24): 52.3 ± 3.4%(#44_VH4VK4)와 비교하여 67.5 ± 2.5%(H01/pVL), 64.7 ± 3.5%(H02/pVL), 35.6 ± 4.4%(H04/pVL), 35.1 ± 4.3%(H06/pVL)만큼. 시험된 모든 인간화 변이형은 또한 토끼 클론과 유사한 정도로 응집된 타우의 인간 성상세포로의 흡수를 유의하게(P<0.001) 억제한다(도 25): 41.3 ± 2.9%(#44_VH4VK4)와 비교하여 38.6 ± 3.2%(H01/pVL), 43.3 ± 3.1%(H02/pVL), 32.6 ± 3.0%(H04/pVL), 39.1 ± 2.9%(H06/pVL)만큼. 이소형 대조 인간 IgG1(항-플루오레세인[4-4-20(증진)], Absolute Antibody, 옥스포드, UK)은 이러한 시스템에서 타우 흡수에 유의한 영향을 미치지 않았다(각각 모노머성 타우 및 응집된 타우에 대해 -1.7 ± 6.3% 및 -6.7 ± 3.5%의 억제). 주어진 실험에서 비교할 때, 친화성 성숙된 항체에 의해 달성된 억제의 크기는 모 #44_VH4VK4 클론과 유사하였다. 이러한 복합 세포-기반 모델에서 타우 흡수의 절대 수준 및 항체-매개 억제의 절대 수준에서 일부 가변성이 예상된다는 점에 주목해야 한다. 이러한 가변성은 통상적인 실험 가변성 이외에 타우 흡수에 필요한 단백질의 발현의 가변성에 기인했을 가능성이 있다. 이 실시예에 제시된 데이터는 다중 실험 실행에서 관찰된 데이터를 나타낸다.
데이터는 모 토끼 항체(#44, 클론 2), 및 클론 #44의 인간화 변이형과 같이, SEQ ID NO: 1에 의해 형성된 에피토프를 표적화하는 #44_VH4VK4를 기반으로 한 친화성-성숙된 클론이 인간 성상세포에 의한 이러한 에피토프(전장 및 트렁케이션된 형태를 포함하여 모노머성 및 멀티머성)를 함유하는 타우 종의 흡수를 감소시킬 수 있다는 것을 입증하였다. 이러한 활성은 치료적으로 유익한 것으로 예측된다. 제시된 데이터는 hIgG1을 사용하여 생성되었다. 이러한 활성은 CDR-의존적이며(이소형-의존적이라기보다는), 따라서 이들 클론이 상이한 이소형/포맷으로 발현된 경우 변하지 않는 것으로 예상될 것이다.
33.1 인간 iPSC-유래 성상세포의 생산: 실시예 17.1 참조.
33.2 타우 종의 생성 및 표지화: 실시예 12.2, 실시예 12.3 참조. P301S 타우를 모노머성 타우 제제와 응집된 타우 제제 둘 모두에 사용하였음에 주목한다.
33.3 인간 iPSC-유래 성상세포에 의한 타우 흡수의 정량화: 실시예 25.4 참조.
실시예 34. 항체 #44_VH4VK4의 친화성 성숙된 변이형은 비-치매 대조 사후 뇌에서는 아니지만 가족성 알츠하이머병에서 고 및 저 MW 타우 종의 증가된 수준을 검출한다
항-타우 항체 클론 #44_VH4VK4의 친화성 성숙된 인간화 변이형은 비-치매 대조(NDC) 샘플에서는 아니지만 사후 가족성 알츠하이머병(fAD; 프레세닐린 1 돌연변이) 대뇌 피질 샘플에서 질병-관련 형태의 타우를 검출하였다. 웨스턴 블롯은 5 개의 변이형(모두 hIgG1로서 발현됨; 일시적 형질감염으로부터 상청액으로서 시험됨): H01/pVL, H02/pVL, H04/pVL, H06/pVL 및 H16/pVL이, 시험된 NDC 샘플에 존재하지 않는 다중 고(75 kD 초과) 및 저(40 kD 미만) 분자량 종을 포함하여, NDC 샘플과 비교하여 대표적인 fAD에서 타우의 증가된 수준을 검출하였음을 입증한다(도 26). 도시된 블롯은 동일한 조건으로 병행하여 처리되었다. 상이한 수준의 검출은 타우에 대한 이들 클론의 상이한 친화성과 일치하며, _H02/pVL, _H04/pVL 및 _H06/pVL은 타우에 대한 가장 높은 친화성 및 웨스턴 블롯에 의한 타우의 가장 큰 검출을 나타낸다. NDC 및 질병 뇌 용해물 샘플에 대해 동일한 양의 단백질을 로딩하였고, 이로써 검출의 차이는 단백질 로딩의 차이이기보다는 NDC 대비 질병에 존재하는 타우 종의 차이에 기인하였다. 검출된 타우 종은 모 인간화 항체(#44_VH4VK4)와 유사한 패턴을 나타냈는데, 이는 결과적으로 원래의 모 토끼 클론 #44와 유사한 검출 패턴을 나타냈고(실시예 27, 실시예 28), 이는 모 토끼 클론 #44의 결합 특성이 인간화 친화성 성숙된 변이형에 의해 보유되었음을 입증하였다.
34.1 인간 뇌 샘플: 실시예 8.1 참조.
34.2 웨스턴 블롯: 실시예 27 참조.
실시예 35. 친화성 성숙된 변이형 항체, #44_VH4VK4_H04/pVL 및 #44_VH4VK4_H06/pVL은 비-치매 대조 사후 뇌에서는 아니지만 가족성 알츠하이머병, 산발성 알츠하이머병 및 루이소체를 동반한 치매에서 고 및 저 MW 타우 종의 증가된 수준을 검출한다
#44_VH4VK4의 친화성 성숙된 인간화 변이형이 다양한 타우병증에 걸쳐 및 환자 샘플의 패널에 걸쳐 질병-관련 타우 종을 검출하는 모 인간화 클론 #44_VH4VK4의 능력을 보유하였다는 것을 확인하기 위해(실시예 27, 실시예 28 참조), 4 개의 신규한 친화성 성숙된 인간화 항체, #44_VH4VK4_H01/pVL, #44_VH4VK4_H02/pVL, #44_VH4VK4_H04/pVL 및 #44_VH4VK4_H06/pVL(hIgG1)를 보다 상세하게 프로파일링하였다. 예상된 바와 같이, 모든 친화성 성숙된 클론은 모 클론 #44_VH4VK4와 유사하게 수행되었고, 가족성 알츠하이머병(fAD) 환자 샘플의 패널에 걸쳐 고 및 저 MW 종 둘 모두의 증가된 수준을 검출하였다(도 27). 액틴 대조는 fAD 샘플에서 향상된 타우 검출이 비-치매 대조와 비교하여 이러한 샘플의 증가된 단백질 로딩에 기인한 것이 아님을 입증해 주었다. 액틴 검출은 다수의 질병-관련 뇌 용해물에서 낮다는 것에 주목한다. 이는 질병 샘플에서 뉴런의 변성뿐만 아니라 사후 수확된 뇌 샘플의 어느 정도의 샘플 분해에 기인했을 가능성이 있다. 그럼에도 불구하고, 이러한 샘플 분해는 이들 샘플에서 타우(및 다른 단백질)의 이용 가능성을 증가시키기보다는 감소시킬 것으로 예측될 것이며, 따라서 이는 질병 대 비-질병 뇌 샘플에서 증가된 타우 검출의 발견을 손상시키지 않는다.
VH CDR3(#44_VH4VK4_H04/pVL) 및 VH CDR3(#44_VH4VK4_H06/pVL)과 조합된 VH CDR2에서의 돌연변이를 나타내는 2 개의 클론을 추가로 탐색하였고, 산발성 알츠하이머병(sAD) 및 루이소체를 동반한 치매(DLB) 뇌 샘플에서 고 및 저 MW 타우 종의 증가된 수준을 검출하였다(도 28). 액틴 및 뉴런 튜불린 대조는 타우 수준의 변화가 시험된 샘플에서 단백질 및/또는 뉴런 수준의 변화에 기인한 것이 아니었음을 확인시켜 주었다. 상기 논의된 바와 같이, 액틴 검출은 다수의 질병-관련 샘플에서 낮았지만, 이는 질병 대 비-질병 뇌에서 증가된 타우 검출의 발견을 손상시키지 않는다. 데이터는 #44_VH4VK4에 기반한 친화성 성숙된 인간화 항체가 모 #44_VH4VK4 항체 및 토끼 IgG 클론 #44 및 #66에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 질병-관련 타우 종을 검출한다는 것을 확인시켜주었다(실시예 8, 실시예 9, 실시예 27, 실시예 28). 데이터는 실시예 29에 기재된 친화성 성숙된 인간화 변이형의 패널뿐만 아니라 SEQ ID NO: 1에 결합하는 임의의 다른 항체의 친화성 성숙된 인간화 변이형이 유사하게 거동할 가능성이 있다는 예측을 뒷받침한다. 따라서, 질병-특이적 타우 종에 대한 #44_VH4VK4_H04(#44_VH4VK4_H04/pVL(SEQ ID NO: 186 및 SEQ ID NO: 160)), #44_VH4VK4_VH06(#44_VH4VK4_H06/pVL(SEQ ID NO: 188 및 SEQ ID NO: 160)), 또는 대안적인 친화성 성숙된 인간화 변이형의 결합은 AD 및 타우병증의 치료에 치료적으로 유용할 잠재력을 가진다.
35.1 인간 뇌 샘플: 실시예 8.1 및 9.1 참조.
35.2 웨스턴 블롯: 실시예 27 참조.
실시예 36: 인간화 항-타우 항체는 2N4R 타우의 아미노산 369 내지 381 내에서 373 THKLTFR 379 에 의해 형성된 에피토프에 결합한다.
항체 결합에 필요한 2N4R 타우; SEQ ID NO: 1의 아미노산 369 내지 381 내의 중요한 잔기를 확인하기 위해 에피토프 미세 맵핑을 수행하였다. 대체 분석에서, 각각의 잔기는 항체로의 결합에 대한 잔기의 중요성을 평가하기 위해 다른 아미노산으로 돌연변이된다.
모 토끼 IgG 클론 #44(클론 2; 실시예 20 참조)로 생성된 데이터와 일치하여, 대체 분석은 영역 373THKLTFR379의 아미노산 잔기가 친화성 성숙된 클론 #44_VH4VK4_H04/pVL("_H04") 및 #44_VH4VK4_H06/pVL("_H06")의 결합에 있어서 중요하다는 것을 보여준다(도 29). 특히, 잔기 K375, T377 및 R379는 이들 잔기의 치환으로서 _H04와 _H06 둘 모두에 대한 대부분의 치환체에 대한 강도의 저하를 초래한다. K375, T377 및 R379의 치환은 신호 강도를 배경 수준으로 떨어뜨리는데, 이것은 이들이 이들 클론의 결합에 중요하다는 것을 시사한다. T373, L376 및 F378의 치환은 일부 치환에 대한 강도 감소를 초래하여, 항체 결합에 있어서의 작은 역할을 시사하였다. 클론 _H04 및 _H06은 모 VH CDR3(_H04) 및 VH CDR2 및 CDR3(_H06) 둘 모두에 대한 돌연변이에 기반하여 생성된 친화성 성숙된 클론을 반영하는 예시로서 제공된다.
시험 샘플과 분명히 구별되는 이소형 대조 인간 IgG1의 저 수준 결합이 이러한 시스템에서 검출되었는데(도 29), 이는 항-타우 항체 클론 _H04 및 _H06에 대해 얻어진 ELISA 신호가 CDR-특이적임을 나타낸다.
데이터는 친화성 성숙된 클론 _H04(#44_VH4VK4_H04/pVL(SEQ ID NO: 186 및 SEQ ID NO: 160)) 및 _H06(#44_VH4VK4_H06/pVL(SEQ ID NO: 188 및 SEQ ID NO: 160))에 의해 예시되는 본원에 기재된 항체가 펩티드 서열(2N4R 타우; SEQ ID NO: 1의 아미노산 369 내지 381) 내에서 모 토끼 IgG, 클론 #44(클론 X)와 공통의 특이적 에피토프를 공유하고; 잔기 K375, T377 및 R379가 모 토끼 클론 #44 및 인간화 클론 #44_VH4VK4에 기반하여 생성된 인간화 친화성-성숙 항체의 결합에 중요하다는 것을 입증한다. 클론 사이의 위치 T373, H374, L376 및 F378에서의 치환의 효과의 약간의 차이는 시험된 항체의 친화성의 차이를 반영했을 가능성이 있는데, 이는 작은 상호작용이 더 낮은 농도(또는 더 낮은 친화성 항체)에서 보다 용이하게 입증되기 때문이다.
36.1 에피토프 치환 스캔 분석 - 펩티드 합성: 실시예 20.1 참조
36.2 에피토프 치환 스캔 분석 - ELISA 스크리닝: 실시예 20.2 참조
데이터는 시험된 각 펩티드에 대해 수득된 ELISA 신호를 나타내는 문자 플롯으로 제시된다. 최대 ELISA 신호로부터 관찰된 편차는 표적 펩티드에 대한 시험된 항체의 변경된(감소된) 결합과 관련된 돌연변이를 나타낸다.
참고문헌:
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
서열 목록
본원에 제출된 서열 목록은 출원된 명세서의 일부를 형성한다.
SEQUENCE LISTING <110> Gen2 Neuroscience Limited <120> Tau Binding Molecules <130> GEN2BH001WO1 <150> GB2009930.5 <151> 2020-06-29 <150> PCT/EP2020/068314 <151> 2020-06-29 <150> GB2020754.4 <151> 2020-12-30 <160> 207 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide sequence corresponding to amino acids 369-381 of 2N4R tau 1-441 <400> 1 Lys Lys Glu Ile Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn 1 5 10 <210> 2 <211> 441 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Full length 2N4R recombinant tau 1-441 <400> 2 Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly 1 5 10 15 Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His 20 25 30 Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu 35 40 45 Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser 50 55 60 Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val 65 70 75 80 Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu 85 90 95 Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro 100 105 110 Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val 115 120 125 Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly 130 135 140 Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro 145 150 155 160 Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro 165 170 175 Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly 180 185 190 Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser 195 200 205 Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys 210 215 220 Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys 225 230 235 240 Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val 245 250 255 Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly 260 265 270 Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln 275 280 285 Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly 290 295 300 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Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Glu

Claims (23)

  1. 인간 2N4R(아미노산 1 내지 441) 타우(SEQ ID NO: 2)의 아미노산 서열 369 내지 381(SEQ ID NO: 1)의 잔기에 의해 형성된 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는, 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 인간 2N4R(아미노산 1 내지 441) 타우(SEQ ID NO: 2)의 아미노산 서열 373 내지 379(THKLTFR, SEQ ID NO: 150)의 잔기에 의해 형성된 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있고, 바람직하게는 에피토프는 잔기 K375, T377 및 R379를 포함하고, 더욱 바람직하게는 에피토프는 잔기 T373, K375, T377 및 R379를 포함하는, 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 인간 프레임워크 서열(FW1 내지 FW4) 및 CDR(각각 HCDR1, HCRD2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)을 포함하는 항원-결합 부위를 포함하고, HCDR1은 SEQ ID NO: 20이고; HCDR2는 SEQ ID NO: 21 또는 변이형이고, 여기서 아미노산 51은 C, V 및 A로부터 선택되고; 아미노산 54는 R, A 및 S로부터 선택되고; 아미노산 55는 R, A 및 V로부터 선택되고; 아미노산 57은 G, H, N, R, A 및 S로부터 선택되고; HCDR3은 SEQ ID NO: 22 또는 변이형이고, 여기서 아미노산 96은 S, V, R 및 A로부터 선택되고; 아미노산 98은 A, S, D, H 및 T로부터 선택되고; 아미노산 102는 P, V 및 Y로부터 선택되고; LCDR1은 SEQ ID NO: 23이고, LCDR2는 SEQ ID NO: 24이고, LCDR3은 SEQ ID NO: 25 또는 SEQ ID NO: 207로부터 선택되는, 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 25(VH4_H04);
    (b) SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 25(VH4_H02);
    (c) SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 25(VH4_H06);
    (d) SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 25(VH4_H01);
    (e) SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 25(VH4_H06_H04);
    (f) SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 25(VH4VK4);
    (g) SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 25(VH4_H03);
    (h) SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 25(VH4_H05);
    (i) SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 25(VH4_H07);
    (j) SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 25(VH4_H08);
    (k) SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 25(VH4_H09);
    (l) SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 25(VH4_H10);
    (m) SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 25(VH4_H11);
    (n) SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 25(VH4_H12);
    (o) SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 25(VH4_H13);
    (p) SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 25(VH4_H14);
    (q) SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 25(VH4_H15);
    (r) SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 25(VH4_H16);
    (s) SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 25(VH4_H17);
    (t) SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 25(VH4_H18);
    (u) SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 25(VH4_H19);
    (v) SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 25(VH4_H20);
    (w) SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 25(VH4H_06_H01);
    (x) SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 25(VH4_H06_H02);
    (y) SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 25(VH4_H16_H04);
    (z) SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 182(VK4_L2);
    (aa) SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 182(VH4_H06/L2);
    (bb) SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 182(VH4_H07/L2);
    (cc) SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 182(VH4_H09/L2);
    (dd) SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 182(VH4_H13/L2); 및
    (ee) SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 182(VH4_H14/L2)
    (여기서, 서열은 카바트(Kabat) 명명법에 따라 정의됨)
    로부터 선택된 인간 프레임워크 서열(FW1 내지 FW4) 및 CDR(각각 HCDR1, HCRD2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)을 포함하는 항원-결합 부위를 포함하는, 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항원-결합 부위는
    (a) 각각 VH SEQ ID NO: 186 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H04;
    (b) 각각 VH SEQ ID NO: 184 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H02;
    (c) 각각 VH SEQ ID NO: 188 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H06;
    (d) 각각 VH SEQ ID NO: 183 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H01;
    (e) 각각 VH SEQ ID NO: 205 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H06_H04;
    (f) 각각 VH SEQ ID NO: 154 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4VK4(E);
    (g) 각각 VH SEQ ID NO: 185 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H03;
    (h) 각각 VH SEQ ID NO: 187 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H05;
    (i) 각각 VH SEQ ID NO: 189 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H07;
    (j) 각각 VH SEQ ID NO: 190 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H08;
    (k) 각각 VH SEQ ID NO: 191 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H09;
    (l) 각각 VH SEQ ID NO: 192 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H10;
    (m) 각각 VH SEQ ID NO: 193 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H11;
    (n) 각각 VH SEQ ID NO: 194 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H12;
    (o) 각각 VH SEQ ID NO: 195 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H13;
    (p) 각각 VH SEQ ID NO: 196 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H14;
    (q) 각각 VH SEQ ID NO: 197 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H15;
    (r) 각각 VH SEQ ID NO: 198 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H16;
    (s) 각각 VH SEQ ID NO: 199 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H17;
    (t) 각각 VH SEQ ID NO: 200 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H18;
    (u) 각각 VH SEQ ID NO: 201 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H19;
    (v) 각각 VH SEQ ID NO: 202 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H20;
    (w) 각각 VH SEQ ID NO: 203 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4H_06_H01;
    (x) 각각 VH SEQ ID NO: 204 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H06_H02;
    (y) 각각 VH SEQ ID NO: 206 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H16_H04;
    (z) 각각 VH SEQ ID NO: 154 및 VL SEQ ID NO: 207의 클론 VK4_L2;
    (aa) 각각 VH SEQ ID NO: 188 및 VL SEQ ID NO: 207의 클론 VH4_H06/L2;
    (bb) 각각 VH SEQ ID NO: 189 및 VL SEQ ID NO: 207의 클론 VH4_H07/L2;
    (cc) 각각 VH SEQ ID NO: 191 및 VL SEQ ID NO: 207의 클론 VH4_H09/L2;
    (dd) 각각 VH SEQ ID NO: 195 및 VL SEQ ID NO: 207의 클론 VH4_H13/L2;
    (ee) 각각 VH SEQ ID NO: 196 및 VL SEQ ID NO: 207의 클론 VH4_H14/L2;
    (ff) 각각 SEQ ID NO: 153 및 SEQ ID NO: 159의 클론 VH3VK3(A);
    (gg) 각각 SEQ ID NO: 153 및 SEQ ID NO: 160의 클론 VH3VK4(B);
    (hh) 각각 SEQ ID NO: 154 및 SEQ ID NO: 158의 클론 VH4VK2(C); 및
    (ii) 각각 SEQ ID NO: 154 및 SEQ ID NO: 159의 클론 VH4VK3(D)
    (여기서, 서열은 카바트 명명법에 따라 정의됨)
    로부터 선택된 클론의 VH 및/또는 VL 도메인 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 가진 VH 및/또는 VL 도메인 서열을 포함하는, 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는
    (a) 각각 VH SEQ ID NO: 186 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H04;
    (b) 각각 VH SEQ ID NO: 184 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H02;
    (c) 각각 VH SEQ ID NO: 188 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H06;
    (d) 각각 VH SEQ ID NO: 183 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H01;
    (e) 각각 VH SEQ ID NO: 205 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H06_H04;
    (f) 각각 VH SEQ ID NO: 154 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4VK4(E);
    (g) 각각 VH SEQ ID NO: 185 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H03;
    (h) 각각 VH SEQ ID NO: 187 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H05;
    (i) 각각 VH SEQ ID NO: 189 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H07;
    (j) 각각 VH SEQ ID NO: 190 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H08;
    (k) 각각 VH SEQ ID NO: 191 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H09;
    (l) 각각 VH SEQ ID NO: 192 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H10;
    (m) 각각 VH SEQ ID NO: 193 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H11;
    (n) 각각 VH SEQ ID NO: 194 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H12;
    (o) 각각 VH SEQ ID NO: 195 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H13;
    (p) 각각 VH SEQ ID NO: 196 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H14;
    (q) 각각 VH SEQ ID NO: 197 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H15;
    (r) 각각 VH SEQ ID NO: 198 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H16;
    (s) 각각 VH SEQ ID NO: 199 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H17;
    (t) 각각 VH SEQ ID NO: 200 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H18;
    (u) 각각 VH SEQ ID NO: 201 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H19;
    (v) 각각 VH SEQ ID NO: 202 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H20;
    (w) 각각 VH SEQ ID NO: 203 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4H_06_H01;
    (x) 각각 VH SEQ ID NO: 204 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H06_H02;
    (y) 각각 VH SEQ ID NO: 206 및 VL SEQ ID NO: 160의 클론 VH4_H16_H04;
    (z) 각각 VH SEQ ID NO: 154 및 VL SEQ ID NO: 207의 클론 VK4_L2;
    (aa) 각각 VH SEQ ID NO: 188 및 VL SEQ ID NO: 207의 클론 VH4_H06/L2;
    (bb) 각각 VH SEQ ID NO: 189 및 VL SEQ ID NO: 207의 클론 VH4_H07/L2;
    (cc) 각각 VH SEQ ID NO: 191 및 VL SEQ ID NO: 207의 클론 VH4_H09/L2;
    (dd) 각각 VH SEQ ID NO: 195 및 VL SEQ ID NO: 207의 클론 VH4_H13/L2;
    (ee) 각각 VH SEQ ID NO: 196 및 VL SEQ ID NO: 207의 클론 VH4_H14/L2;
    (ff) 각각 SEQ ID NO: 153 및 SEQ ID NO: 159의 클론 VH3VK3(A);
    (gg) 각각 SEQ ID NO: 153 및 SEQ ID NO: 160의 클론 VH3VK4(B);
    (hh) 각각 SEQ ID NO: 154 및 SEQ ID NO: 158의 클론 VH4VK2(C); 및
    (ii) 각각 SEQ ID NO: 154 및 SEQ ID NO: 159의 클론 VH4VK3(D)
    (여기서, 서열은 카바트 명명법에 따라 정의됨)
    의 VH 및/또는 VL 도메인을 포함하는, 인간화 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  7. 경쟁 검정에서 평가될 때 인간 2N4R(아미노산 1 내지 441) 타우(SEQ ID NO: 2)의 아미노산 서열 373 내지 379(THKLTFR, SEQ ID NO: 150)의 잔기에 의해 형성된 에피토프에 대한 결합을 위해 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항체와 경쟁할 수 있는, 인간화 또는 인간 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 DNA 또는 RNA 서열의 발현의 산물인, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 서열을 포함하는, 단리된 재조합 DNA 또는 RNA 서열.
  10. 제9항에 있어서, 벡터인, 단리된 재조합 DNA 서열.
  11. 제10항에 있어서, 발현 벡터인, 단리된 재조합 DNA 서열.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 프로모터의 제어 하에 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는, 단리된 재조합 DNA 서열.
  13. 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 DNA 또는 RNA 서열을 포함하는, 숙주 세포.
  14. 제13항에 있어서, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 발현시킬 수 있는, 숙주 세포.
  15. 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 발현에 적합한 조건에서 제13항 또는 제14항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제조하는 방법.
  16. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 희석제, 바람직하게는 약학적으로 허용되는 희석제를 포함하는, 조성물.
  17. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항, 또는 제16항에 있어서, 의약으로서의 용도를 위한 또는 진단에서의 용도를 위한, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 조성물.
  18. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항, 또는 제16항에 있어서, 타우병증의 예방적 또는 치료적 치료에서의 용도를 위한, 또는 타우병증의 예방적 또는 치료적 치료를 위한 의약의 제조를 위한 것이며, 바람직하게는 타우병증은 알츠하이머병(산발성 및 단발성 가족성 형태), 근위축성 측삭 경화증/파킨슨병-치매 복합, 은친화 과립성 질환, 베타-프로펠러 단백질 관련 신경변성(BPAN), 영국형 아밀로이드 혈관병증, 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 크로이츠펠트-야콥병, 권투선수 치매, 석회화를 동반한 미만성 신경원섬유 엉킴, 다운 증후군, 만성 외상성 뇌병증(CTE), 피질기저핵 변성(CBD), 전두측두 치매(FTD), 17번 염색체와 연관된 전두측두 치매 및 파킨슨증(FTDP-17), 전두측두엽 변성, 게르스트만-슈트라우슬러-샤인커병, 할러포르덴-스파츠병, 포함체 근육염, 다계통 위축증, 근긴장 이영양증, C형 니만-피크병, 신경원섬유 엉킴을 동반한 비-구아마니안 운동 뉴런 질환, 파킨슨병(산발성 및 단발성 가족성 형태), 피크병, 뇌염 후 파킨슨증, 원발성 연령-관련 타우병증(PART), 프리온 단백질 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 진행성 피질하 신경교증, 진행성 핵상 마비(PSP), 아급성 경화성 범뇌염, 엉킴-우성 치매, 구상 신경교 타우병증, 괌의 파킨슨병 치매 복합, 진행성 비유창성 실어증, 다발성 경색 치매, 허혈성 뇌졸중, 외상성 뇌손상(TBI) 및 뇌졸중으로부터 선택되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 조성물.
  19. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항, 또는 제16항에 있어서, 인간 미세아교세포에서 타우 종의 식세포작용을 증가시키고/시키거나 인간 뉴런에 의한 모노머성 타우 종 및 응집된 타우 종의 흡수를 감소시키고/시키거나 인간 성상세포에 의한 타우 종의 흡수를 촉진시키고/시키거나 인간 성상세포에 의한 타우 종의 흡수를 예방하고/하거나 설치류 모델에서 장기 강화의 타우-매개 억제를 예방할 수 있는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 조성물.
  20. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항, 또는 제16항에 있어서, 인간 2N4R 타우(SEQ ID NO: 2)의 잔기 369 내지 381(SEQ ID NO: 1)에 의해 형성된 에피토프를 포함하는, 바람직하게는 인간 2N4R(아미노산 1 내지 441) 타우(SEQ ID NO: 2)의 아미노산 서열 373 내지 379(THKLTFR, SEQ ID NO: 150)의 잔기에 의해 형성된 에피토프를 포함하는 인간 타우 단백질을 확인하는 용도를 위한, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 조성물.
  21. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항, 또는 제16항에 있어서, 타우병증에 대한 진단 검사에서의 용도를 위한, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 조성물.
  22. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 제16항의 조성물 및 상기 단리된 재조합 펩티드 결합 분자, 항원-결합 단백질 또는 이의 단편을 함유하는 면역학적(항원-항체) 복합체를 검출할 수 있는 시약을 포함하는 진단 키트로서, 선택적으로 상기 단리된 재조합 펩티드 및/또는 결합 분자, 항원-결합 단백질 또는 이의 단편은 고체 지지체(예를 들어, 마이크로플레이트 웰) 상에 고정되고/되거나, 선택적으로 상기 단리된 재조합 펩티드, 결합 분자, 항원-결합 단백질 또는 이의 단편을 함유하는 상기 면역학적 복합체는 ELISA 또는 대안적인 면역검정 방법에 의해 또는 측방 유동에 의해 검출 가능한, 진단 키트.
  23. 제22항에 있어서, 하나 이상의 대조 표준물 및/또는 시편 희석제 및/또는 세척 완충제를 추가로 포함하는, 진단 키트.
KR1020237002687A 2019-06-28 2021-06-29 타우 결합 분자 KR20230043842A (ko)

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