CN116075521A - tau结合分子 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含来自人tau 2N4R的表位的分离的重组肽。本发明还涉及对包含来自人tau 2N4R的表位的分离的重组肽具有特异性的抗体，以及涉及此类抗体用于研究、诊断和治疗tau蛋白病诸如阿尔茨海默病。

Description

tau结合分子
技术领域
本发明涉及能够特异性结合新型tau表位的结合分子，诸如抗体。本发明涉及用于治疗或诊断tau蛋白病的抗tau结合分子诸如抗体及其组合物。本发明还涉及治疗tau蛋白病的方法，这些方法涉及施用抗tau结合分子，例如抗体。
背景技术
微管相关蛋白(MAP)tau在阿尔茨海默病(AD)和相关tau蛋白病的发病机理中起关键作用。tau病理的发展与进行性神经元损失和认知衰退有关。在患有涉及tau的痴呆(包括阿尔茨海默病(AD))的患者中，tau病理以可预测的空间顺序通过脑扩散，这与疾病负担相关。最近的证据提示细胞外tau物质参与神经原纤维损伤的神经元之间的传播以及tau毒性在不同脑区域中的扩散。tau传播的潜在机制尚未完全表征，但提示细胞外tau在认知衰退和tau病理的扩散中通过突触和非突触机制起作用。
通过从单个基因MAPT(微管相关蛋白tau)选择性剪接产生tau蛋白；在人类中，MAPT基因位于染色体17q21上。tau蛋白在中枢神经系统的神经元中富集，并且在CNS星形胶质细胞和少突胶质细胞中也以非常低的水平表达。在神经元内，tau主要作为高度可溶的磷蛋白存在于轴突中。tau被翻译后修饰，产生生理和病理生理后果。tau的乙酰化、泛素化、O-连接的N-乙酰葡糖胺修饰、甲基化和磷酸化均已被描述为调节tau的功能(Morris等人(2015)Nature Neuroscience[自然神经科学]18:1183-1189)。此外，tau可被切割以形成具有增强的形成聚集体的能力和/或具有神经毒性特性的肽。
微管相关蛋白tau及其过度磷酸化形式形成细胞内神经原纤维缠结的主要成分，这是包括AD和额颞叶痴呆在内的几种痴呆的标志。该证据形成AD假说的基础，其中tau的细胞内积累导致微管分解、树突状脊柱塌陷和轴突变性；神经元之间通讯故障和细胞死亡。因此，tau，特别是磷酸化形式的tau，已成为AD和其他tau蛋白病的被动和主动免疫疗法开发的靶标。
Pedersen等人(2015)Trends Mol Med[分子医学趋势]21(6):394-402总结了靶向tau的各种表位的处于临床开发中的免疫疗法：
Figure BDA0004094741790000021
Figure BDA0004094741790000031
Figure BDA0004094741790000041
表1：临床开发中的免疫疗法
除了表1中列出的疗法之外，杨森公司正在推进特异性靶向pT217的抗体(JNJ63733657)，并且UCB正在临床研究靶向中间区tau序列(2N4R tau的氨基酸235-246；UCB0107)的抗体(综述于Sandusky-Beltran等人,2020,Neuropharmacol.[神经药理学]175:108104)。卫材公司(Eisai)还准备用靶向微管结合区中的序列(氨基酸299-303和362-366；E2814；Roberts等人,2020,Acta Neuropathologica Comms[神经病理学通讯]8:13)的抗体进行临床试验。
US 9139643 B2描述了一种对错误折叠和/或聚集的tau蛋白具有特异性的抗体，该抗体不结合正常tau蛋白而是结合全长人2N4R(氨基酸1-441)tau(SEQ ID NO:2)的氨基酸残基379-408内的表位，优选的是，tau蛋白被完全磷酸化。
US 9777056 B2描述了一种能够特异性结合错误折叠和/或聚集形式的tau蛋白的抗体，该抗体针对氨基酸残基379-408内的tau表位产生，该tau表位在tau位置396和tau位置404处具有磷酸丝氨酸残基。
WO 2010144711描述了能够相对于正常tau蛋白优先结合病理性tau蛋白的重组产生的抗体，这些抗体通过用各种分离的tau肽免疫而引发，这些分离的tau肽包括该说明书的SEQ ID NO:57的tau 379-408和该说明书的SEQ ID NO:102的tau 379-391。
US 2017/0260263 A1描述了包含“治疗性表位”Tau 361-THVPGGG-367(该说明书的SEQ ID NO:101)的tau肽。
US 2004/0110250 A1描述了tau聚集和对于PHF tau的组装重要的区域。其并未提及tau摄取或治疗性抗体。Tau 186-391构建体在细胞内表达，在细胞内经蛋白水解处理，并在细胞内检测得到的截短肽。没有讨论tau的细胞外形式。
WO 2011/032155 A2披露了靶向当tau被钙蛋白酶切割时生成的表位并且不结合全长人Tau441蛋白的片段特异性抗体。
WO 2018/178077 A1披露了一种结合包含人Tau441蛋白的氨基酸残基299-318的表位的单克隆抗体。
WO 2014/159244披露了一种对在丝氨酸400处结合O-GlcNAc酰化tau同种型2N4R具有特异性的抗体。
最近的研究提示位于脑细胞外空间的疾病特异性tau物质的毒性作用。
需要鉴定旨在早期干扰tau介导的突触功能障碍的过程和tau病理传播的新型治疗方法；因此，需要鉴定在tau蛋白的细胞外病理种类上特异性存在的tau表位，并生成治疗性抗体，这些治疗性抗体寻求通过与tau蛋白的细胞外病理种类特异性结合来阻止疾病进展。此类表位和与其结合的分子也可用于诊断tau蛋白病。
发明内容
本发明提供：
1.一种人源化抗体或其抗原结合片段，其能够特异性结合由人2N4R(氨基酸1-441)tau(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列369-381(SEQ ID NO:1)的残基形成的表位。
2.根据条款1所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其能够特异性结合由人2N4R(氨基酸1-441)tau(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列373至379(THKLTFR，SEQ ID NO:150)的残基形成的表位，优选地其中该表位包含以下残基：K375、T377和R379，更优选地其中该表位包含残基T373、K375、T377和R379。
3.根据条款1或条款2所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其包含含有人框架序列(FW1至FW4)和CDR(分别为HCDR1、HCRD2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3)的抗原结合位点，其中HCDR1为SEQ ID NO:20；HCDR2为SEQ ID NO:21或如下的变体，其中：氨基酸51选自C、V和A；氨基酸54选自R、A和S；氨基酸55选自R、A和V；并且氨基酸57选自G、H、N、R、A和S；HCDR3为SEQ ID NO:22或如下的变体，其中：氨基酸96选自S、V、R和A；氨基酸98选自A、S、D、H和T；氨基酸102选自P、V和Y；LCDR1为SEQ ID NO:23，LCDR2为SEQ ID NO:24并且LCDR3选自SEQID NO:25或SEQ ID NO 207。
4.根据任一项前述条款所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其包含含有人框架序列(FW1至FW4)和选自以下的CDR(分别为HCDR1、HCRD2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3)的抗原结合位点：
(a)SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25(VH4_H04)；
(b)SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25(VH4_H02)；
(c)SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25(VH4_H06)；
(d)SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25(VH4_H01)；
(e)SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25(VH4_H06_H04)；
(f)SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25(VH4VK4)；
(g)SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25(VH4_H03)
(h)SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25(VH4_H05)；
(i)SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25(VH4_H07)；
(j)SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25(VH4_H08)；
(k)SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25(VH4_H09)；
(l)SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25(VH4_H10)；
(m)SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25(VH4_H11)；
(n)SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25(VH4_H12)；
(o)SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25(VH4_H13)；
(p)SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25(VH4_H14)；
(q)SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25(VH4_H15)；
(r)SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25(VH4_H16)；
(s)SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25(VH4_H17)；
(t)SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25(VH4_H18)；
(u)SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25(VH4_H19)；
(v)SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25(VH4_H20)；
(w)SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25(VH4H_06_H01)；
(x)SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25(VH4_H06_H02)；
(y)SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25(VH4_H16_H04)；
(z)SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:182(VK4_L2)；
(aa)SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:182(VH4_H06/L2)；
(bb)SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:182(VH4_H07/L2)；
(cc)SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:182(VH4_H09/L2)
(dd)SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:182(VH4_H13/L2)；以及
(ee)SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:182(VH4_H14/L2)；
其中这些序列根据Kabat命名法定义。
5.根据任一项前述条款所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其中该抗原结合位点包含选自以下的克隆的VH和/或VL结构域序列，或者与选自以下的克隆具有至少70％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH和/或VL结构域序列：
(a)分别为VH SEQ ID NO:186和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H04；
(b)分别为VH SEQ ID NO:184和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H02；
(c)分别为VH SEQ ID NO:188和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H06；
(d)分别为VH SEQ ID NO:183和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H01；
(e)分别为VH SEQ ID NO:205和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H06_H04；
(f)分别为VH SEQ ID NO:154和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4VK4(E)；
(g)分别为VH SEQ ID NO:185和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H03；
(h)分别为VH SEQ ID NO:187和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H05；
(i)分别为VH SEQ ID NO:189和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H07；
(j)分别为VH SEQ ID NO:190和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H08；
(k)分别为VH SEQ ID NO:191和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H09；
(l)分别为VH SEQ ID NO:192和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H10；
(m)分别为VH SEQ ID NO:193和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H11；
(n)分别为VH SEQ ID NO:194和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H12；
(o)分别为VH SEQ ID NO:195和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H13；
(p)分别为VH SEQ ID NO:196和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H14；
(q)分别为VH SEQ ID NO:197和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H15；
(r)分别为VH SEQ ID NO:198和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H16；
(s)分别为VH SEQ ID NO:199和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H17；
(t)分别为VH SEQ ID NO:200和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H18；
(u)分别为VH SEQ ID NO:201和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H19；
(v)分别为VH SEQ ID NO:202和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H20；
(w)分别为VH SEQ ID NO:203和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4H_06_H01；
(x)分别为VH SEQ ID NO:204和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H06_H02；
(y)分别为VH SEQ ID NO:206和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H16_H04；
(z)分别为VH SEQ ID NO:154和VL SEQ ID NO:207的克隆VK4_L2；
(aa)分别为VH SEQ ID NO:188和VL SEQ ID NO:207的克隆VH4_H06/L2；
(bb)分别为VH SEQ ID NO:189和VL SEQ ID NO:207的克隆VH4_H07/L2；
(cc)分别为VH SEQ ID NO:191和VL SEQ ID NO:207的克隆VH4_H09/L2
(dd)分别为VH SEQ ID NO:195和VL SEQ ID NO:207的克隆VH4_H13/L2；
(ee)分别为VH SEQ ID NO:196和VL SEQ ID NO:207的克隆VH4_H14/L2；
(ff)分别为SEQ ID NO:153和SEQ ID NO:159的克隆VH3VK3(A)；
(gg)分别为SEQ ID NO:153和SEQ ID NO:160的克隆VH3VK4(B)；
(hh)分别为SEQ ID NO:154和SEQ ID NO:158的克隆VH4VK2(C)；以及
(ii)分别为SEQ ID NO:154和SEQ ID NO:159的克隆VH4VK3(D)；
其中这些序列根据Kabat命名法定义。
6.根据任一项前述条款所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其中该抗体包含以下的VH和/或VL结构域：
(a)分别为VH SEQ ID NO:186和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H04；
(b)分别为VH SEQ ID NO:184和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H02；
(c)分别为VH SEQ ID NO:188和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H06；
(d)分别为VH SEQ ID NO:183和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H01；
(e)分别为VH SEQ ID NO:205和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H06_H04；
(f)分别为VH SEQ ID NO:154和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4VK4(E)；
(g)分别为VH SEQ ID NO:185和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H03；
(h)分别为VH SEQ ID NO:187和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H05；
(i)分别为VH SEQ ID NO:189和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H07；
(j)分别为VH SEQ ID NO:190和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H08；
(k)分别为VH SEQ ID NO:191和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H09；
(l)分别为VH SEQ ID NO:192和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H10；
(m)分别为VH SEQ ID NO:193和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H11；
(n)分别为VH SEQ ID NO:194和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H12；
(o)分别为VH SEQ ID NO:195和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H13；
(p)分别为VH SEQ ID NO:196和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H14；
(q)分别为VH SEQ ID NO:197和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H15；
(r)分别为VH SEQ ID NO:198和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H16；
(s)分别为VH SEQ ID NO:199和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H17；
(t)分别为VH SEQ ID NO:200和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H18；
(u)分别为VH SEQ ID NO:201和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H19；
(v)分别为VH SEQ ID NO:202和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H20；
(w)分别为VH SEQ ID NO:203和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4H_06_H01；
(x)分别为VH SEQ ID NO:204和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H06_H02；
(y)分别为VH SEQ ID NO:206和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H16_H04；
(z)分别为VH SEQ ID NO:154和VL SEQ ID NO:207的克隆VK4_L2；
(aa)分别为VH SEQ ID NO:188和VL SEQ ID NO:207的克隆VH4_H06/L2；
(bb)分别为VH SEQ ID NO:189和VL SEQ ID NO:207的克隆VH4_H07/L2；
(cc)分别为VH SEQ ID NO:191和VL SEQ ID NO:207的克隆VH4_H09/L2
(dd)分别为VH SEQ ID NO:195和VL SEQ ID NO:207的克隆VH4_H13/L2；
(ee)分别为VH SEQ ID NO:196和VL SEQ ID NO:207的克隆VH4_H14/L2；
(ff)分别为SEQ ID NO:153和SEQ ID NO:159的克隆VH3VK3(A)；
(gg)分别为SEQ ID NO:153和SEQ ID NO:160的克隆VH3VK4(B)；
(hh)分别为SEQ ID NO:154和SEQ ID NO:158的克隆VH4VK2(C)；以及
(ii)分别为SEQ ID NO:154和SEQ ID NO:159的克隆VH4VK3(D)；
其中这些序列根据Kabat命名法定义。
7.一种人源化或人抗体或其抗原结合片段，当在竞争测定中评估时其能够与根据条款1至6中任一项所述的抗体竞争结合由人2N4R(氨基酸1-441)tau(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列373至379(THKLTFR，SEQ ID NO:150)的残基形成的表位。
8.根据任一项前述条款所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其为重组DNA或RNA序列的表达产物。
9.一种分离的重组DNA或RNA序列，其包含编码根据条款1至8中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段的序列。
10.根据条款9所述的分离的重组DNA序列，其为载体。
11.根据条款10所述的分离的重组DNA序列，其为表达载体。
12.根据条款10或11所述的分离的重组DNA序列，其在启动子控制下编码根据条款1至8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
13.一种宿主细胞，其包含根据条款8至12中任一项所述的DNA或RNA序列。
14.根据条款13所述的宿主细胞，其能够表达根据条款1至8任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段。
15.一种制备根据条款1至8中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在适于表达该分离的抗体或其抗原结合片段的条件下培养根据条款13或14所述的宿主细胞。
16.一种组合物，其包含根据条款1至8中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段和稀释剂，优选地药学上可接受的稀释剂。
17.根据条款1至8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或根据条款16所述的组合物，其用作药物或用于诊断。
18.根据条款1至8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或根据条款16所述的组合物，其用于预防性或治疗性治疗tau蛋白病，或用于制造用于预防性或治疗性治疗tau蛋白病的药物，优选地该tau蛋白病选自阿尔茨海默病(散发性和单基因家族性形式)、肌萎缩侧索硬化/帕金森综合征-痴呆复合征、嗜银粒病、β-螺旋桨蛋白相关神经变性(BPAN)、英国型淀粉样血管病、脑淀粉样血管病、克雅氏病、拳击员痴呆、弥漫性神经原纤维缠结伴钙化、唐氏综合征、慢性创伤性脑病(CTE)、皮质基底节变性(CBD)、额颞叶痴呆(FTD)、与染色体17相关的额颞叶痴呆和帕金森综合征(FTDP-17)、额颞叶变性、格斯特曼-斯特劳斯勒-申克病、哈勒沃登-施帕茨病、包涵体肌炎、多系统萎缩、强直性肌营养不良、尼曼-皮克病C型、具有神经原纤维缠结的非关岛运动神经元病、帕金森病(散发性和单基因家族性形式)、匹克氏病、脑炎后帕金森综合征、原发性年龄相关性tau蛋白病(PART)、朊病毒蛋白脑淀粉样血管病、进行性皮质下神经胶质增生、进行性核上性麻痹(PSP)、亚急性硬化性全脑炎、缠结显性痴呆、球状胶质tau蛋白病、关岛型帕金森综合征-痴呆复合征、进行性非流畅性失语症、多梗塞性痴呆、缺血性中风、创伤性脑损伤(TBI)和中风。
19.根据条款1至8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或根据条款16所述的组合物，其能够增加人小胶质细胞中tau物质的吞噬作用和/或减少人神经元对单体和聚集的tau物质的摄取和/或促进人星形胶质细胞对tau物质的摄取和/或防止人星形胶质细胞对tau物质的摄取和/或防止啮齿动物模型中tau介导的对长时程增强作用的抑制。
20.根据条款1至8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或根据条款16所述的组合物，其用于鉴定人tau蛋白，这些人tau蛋白包含由人2N4R tau(SEQ ID NO:2)的残基369-381(SEQ ID NO:1)形成的表位，优选地包括由人2N4R(氨基酸1-441)tau(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列373至379(THKLTFR，SEQ ID NO:150)的残基形成的表位。
21.根据条款1至8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或根据条款16所述的组合物，其用于tau蛋白病的诊断测试中。
22.一种诊断试剂盒，其包括根据条款1至8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、或根据条款16所述的组合物和能够检测免疫(抗原-抗体)复合物的试剂，该免疫(抗原-抗体)复合物含有所述分离的重组肽结合分子、抗原结合蛋白或其片段，其中任选地所述分离的重组肽和/或结合分子、抗原结合蛋白或其片段被固定在固体支持物(例如，微板孔)上，和/或其中任选地，含有所述分离的重组肽、结合分子、抗原结合蛋白或其片段的所述免疫复合物能够通过ELISA或替代的免疫测定方法或通过侧向流来检测。
23.根据条款22所述的诊断试剂盒，其还包括一种或多种对照标准物和/或样本稀释剂和/或洗涤缓冲液。
具体实施方式
本发明涉及能够特异性结合分离的重组肽的人源化抗体及其抗原结合片段，该重组肽包含在人tau(tau1-441 SEQ ID NO:2)的残基369-381(KKIETHKLTFREN，SEQ ID NO:1)内形成的表位。本发明还涉及包含对人tau(tau1-441 SEQ ID NO:2)的残基369-381(KKIETHKLTFREN，SEQ ID NO:1)内所含的表位具有特异性的基于CDR的抗原结合位点的人源化抗体和抗原结合片段。
本发明的人源化抗体及其抗原结合片段特异性结合包含由人tau(tau1-441 SEQID NO:2)的残基369-381(KKIETHKLTFREN，SEQ ID NO:1)形成的表位的细胞外tau物质。
本发明的人源化抗体及其抗原结合片段能够特异性结合分离的重组肽，该重组肽还包含用于缀合载剂蛋白或可检测标记的N-末端半胱氨酸(CKKIETHKLTFREN，SEQ ID NO:13)或C-末端半胱氨酸。可通过N-末端半胱氨酸缀合的载剂蛋白可选自匙孔血蓝蛋白(KLH)、似鲍罗螺(Concholepas concholepas)血蓝蛋白(“蓝色载剂”)、牛血清白蛋白(BSA)、阳离子化BSA(cBSA)和卵清蛋白(OVA)。本发明的人源化抗体及其抗原结合片段能够特异性结合包含KKIETHKLTFREN(SEQ ID NO:1)的缀合物。
本发明的抗体或其抗原结合片段可通过重组方法产生。“重组抗体”是由重组工程化宿主细胞产生的抗体。根据本发明的抗体或其抗原结合片段任选地被分离或纯化。
术语“抗体”或“抗体分子”描述天然的或部分或完全合成产生的免疫球蛋白。本发明的抗原结合蛋白可以是抗体，优选地单克隆抗体，并且可以是人或非人的、嵌合的或人源化的。
抗体分子优选地是单克隆抗体分子。抗体的实例是免疫球蛋白同种型，诸如免疫球蛋白G，和它们的同种型亚类，诸如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，以及它们的片段。四个人亚类(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)各自含有不同的重链；但它们是高度同源的，并且主要在铰链区和它们激活宿主免疫系统的程度上不同。IgG1和IgG4在铰链区含有两个链间二硫键，IgG2具有4个链间二硫键，并且IgG3具有11个链间二硫键。
如本文所用，术语“抗体”和“抗体分子”包括抗体片段，诸如Fab和scFv片段，条件是所述片段包含针对包含人tau的残基369-381的表位的基于CDR的抗原结合位点。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scFv)和结构域抗体(sdAb)。除非上下文另有要求，否则如本文所用，术语“抗原结合蛋白”、“抗体”或“抗体分子”因此等同于“抗体或其抗原结合片段”。
抗体是免疫球蛋白，其具有相同的基本结构，由形成两个Fab臂的含有通过柔性铰链区与抗体的茎即Fc结构域连接从而产生经典的“Y”形的相同结构域的两条重链和两条轻链组成。Fab结构域由两个可变结构域和两个恒定结构域组成，重链上具有可变重链(VH)和恒定重链1(CH1)结构域，轻链上具有可变轻链(VL)和恒定轻链(CL)结构域。两个可变结构域(VH和VL)形成可变片段(Fv)，其提供抗体的基于CDR的抗原特异性，其中恒定结构域(CH1和VL)充当结构框架。每个可变结构域含有三个高变环，称为互补决定区(CDR)。在VH和VL的每一者上，三个CDR(CDR1、CDR2和CDR3)的侧翼为四个较少可变的构架(FR)区(FR1、FW2、FW3和FW4)，得到结构FW1-CDR1-FW2-CDR2-FW3-CDR3-FW4。CDR在抗体表面提供了特异性抗原识别位点。
本文可使用Kabat和ImMunoGeneTics(IMGT)编号命名法两者。通常，除非另有说明(明确地或通过上下文)，氨基酸残基在本文中根据Kabat编号方案(Kabat等人,1991,JImmunol[免疫学杂志]147(5):1709-19)进行编号。对于当使用IMGT编号方案时的那些情况，氨基酸残基在本文中根据Lefranc等人,2005,Dev Comp Immunol[发育与比较免疫学]29(3):185-203中描述的ImMunoGeneTics(IMGT)编号方案进行编号。
可采用单克隆抗体和其他抗体，并使用重组DNA技术产生其他抗体或嵌合分子，它们通常保留原始抗体的特异性。此类技术可涉及将CDR导入不同的免疫球蛋白框架，或将可变区移植到不同的免疫球蛋白恒定区。例如在EP-A-184187、GB 2188638A或EP-A-239400中描述了将一种免疫球蛋白的CDR引入另一种免疫球蛋白中。替代性地，产生抗体分子的杂交瘤或其他细胞可进行遗传突变或其他改变，这可改变或不改变所产生抗体的结合特异性。
抗体人源化涉及将关键的非人氨基酸转移或“移植”到人抗体框架上。这主要包括在互补决定区(CDR)中移植氨基酸，但潜在地还包括对VH:VL接口和CDR的取向关键的其他框架氨基酸。人源化试图引入人内容物以降低免疫原性的风险，同时保留非人亲本抗体的原始结合活性。术语“人源化抗体”是指这样的抗体，其中来源于另一种哺乳动物物种的种系的CDR序列已被移植到人框架序列上；任选地，可在人框架序列内进行附加的框架区修饰。术语“人源化抗体”包括这样的抗体，其中来源于另一种哺乳动物物种的种系的CDR序列已被移植到人框架序列上并被优化(例如通过亲和力成熟)，例如通过修饰一个或多个CDR和/或一个或多个框架序列中的一个或多个氨基酸残基以调节或改善人源化抗体的生物学特性，例如以增加亲和力，或调节抗体与其靶表位结合的结合速率和/或解离速率。术语“人源化抗体”包括已被优化(例如通过亲和力成熟)的人源化抗体，因此本发明的人源化抗体可以是人源化的，或人源化且优化的，例如人源化且亲和力成熟的。
由于抗体可以多种方式修饰，术语“抗原结合蛋白”或“抗体”应被解释为涵盖抗体的抗体片段、衍生物、功能等同物和同源物，包括包含免疫球蛋白结合结构域的任何多肽、适体、亲和体或双环肽，无论是天然的或全部或部分合成的。因此包括包含与另一种多肽融合的免疫球蛋白结合结构域或等同物的嵌合分子。嵌合抗体的克隆和表达在EP-A-0120694和EP-A-0125023中有描述。
包含CDR序列和CH3结构域的抗体片段的实例是包含与CH3结构域接合的scFv的微型抗体(Hu等人(1996)Cancer Res[癌症研究]56(13):3055-61)。
结构域(单结构域)抗体是一种肽，通常约110个氨基酸长，包含重链抗体或IgG的一个可变结构域(VH)。单结构域抗体(sdAb)(例如，纳米抗体)是由单个单体可变抗体结构域组成的抗体片段。与完整抗体(包含两条重链和两条轻链)一样，它是能够选择性结合特定抗原的抗原结合蛋白。结构域抗体仅具有12-15kDa的分子量，因此远小于由两条重蛋白链和两条轻链组成的抗体(150-160kDa)，并且结构域抗体甚至小于Fab片段(约50kDa，一条轻链和一半重链)和单链可变片段(约25kDa，两个可变结构域，一个来自轻链，一个来自重链)。已从在骆驼科动物中发现的重链抗体工程化单结构域抗体；这些被称为VHH片段。软骨鱼也具有重链抗体(IgNAR，“免疫球蛋白新抗原受体”)，从中可获得称为VNAR片段的单结构域抗体。结构域(单结构域)抗体可以是VH或VL。结构域抗体可以是人或鼠来源的VH或VL。尽管大多数单结构域抗体是重链可变结构域，但也已显示轻链单结构域抗体(VL)特异性结合靶表位。
蛋白质支架具有相对确定的三维结构，并且通常含有服从于特异性或随机的氨基酸序列变化以在支架内产生能够结合抗原的抗原结合区的一个或多个区。
本发明的人源化抗体或抗原结合片段结合由人tau的残基369-381形成的表位。在此上下文中的结合可指特异性结合。术语“特异性”可指这样的情况，其中抗体分子将不显示与除其特异性结合配偶体(此处为人tau的369-381残基内的表位)以外的分子的任何显著结合。术语“特异性”也适用于抗体对特定表位具有特异性的情况，这些特定表位诸如由许多抗原携带的包含在人tau残基369-381内的表位，在这种情况下抗体分子将能够结合携带该表位的各种抗原。表位可存在于为单体、寡聚或聚集的tau物质中。tau物质可以是全长的或在残基369-381之外的区域被截短。表位可存在于包含人tau1-441(SEQ ID NO:2)的残基369-381(SEQ ID NO:1)的tau片段中。优选地，本发明的人源化抗体及其抗原结合片段结合特征在于以下的细胞外tau物质它们结合的表位由人2N4R(氨基酸1-441)tau(SEQ IDNO:2)的氨基酸序列373至379(THKLTFR，SEQ ID NO:150)的残基形成。
在本发明的特别优选的方面，本发明的人源化抗体及其抗原结合片段结合特征在于以下的细胞外tau物质表位由人2N4R(氨基酸1-441)tau(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列373至379(THKLTFR，SEQ ID NO:150)的残基形成和限定，其中该表位包含残基K375、T377和R379，优选地包含残基T373、K375、T377和R379(由克隆2(#44)及其人源化形式结合的表位)。
在此上下文中的结合可指特异性结合。术语“特异性”可指这样的情况，其中抗体分子将不显示与除其特异性结合配偶体以外的分子的任何显著结合，该特异性结合配偶体在此是由人2N4R(氨基酸1-441)tau(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列373至379(THKLTFR，SEQID NO:150)的残基形成的表位。术语“特异性”也适用于抗体分子对特定表位具有特异性的情况，这些特定表位诸如由许多抗原携带的由如本文所述的人tau的氨基酸序列373至379的残基形成的表位，在这种情况下抗体分子将能够结合携带该表位的各种抗原。本文所述的新型表位可存在于单体、寡聚或聚集的tau物质中。tau物质可以是全长的或在残基373-379之外的区域被截短。表位可存在于包含人tau1-441(SEQ ID NO:2)的残基373-379(SEQID NO:150)的tau片段中。
优选地，本发明的人源化抗体及其抗原结合片段结合特征在于以下的细胞外tau物质它们结合的表位由人2N4R(氨基酸1-441)tau(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列373至379(THKLTFR，SEQ ID NO:150)的残基形成。在本发明特别优选的方面，人源化抗体及其抗原结合片段结合特征在于以下的细胞外tau物质该表位由人2N4R(氨基酸1-441)tau(SEQ IDNO:2)的氨基酸序列373至379(THKLTFR，SEQ ID NO:150)的残基形成，其中该表位包含以下残基：K375、T377和R379，优选地包含残基T373、K375、T377和R379(例如，由克隆2(#44)结合的表位)。
氨基酸可用它们的单字母或三字母代码或用它们的全名来表示。下面列出了二十种标准氨基酸中每一种的一字母和三字母代码以及全名。
Figure BDA0004094741790000171
Figure BDA0004094741790000181
表2.氨基酸，一字母和三字母代码。
在优选的实施例中，本发明的抗体或其抗原结合片段可包含克隆2(#44)的一组六个CDR(HCDR1(SEQ ID NO:20)、HCDR2(SEQ ID NO:21)、HCDR3(SEQ ID NO:22)、LCDR1(SEQID NO:23)、LCDR2(SEQ ID NO:24)和LCDR3(SEQ ID NO:25))(例如，当由Kabat命名法定义时如表5所示)。
本发明的抗体或其抗原结合片段可包含克隆2的VH和VL序列(SEQ ID NO:118和119)的人源化变体。
本发明的抗体或其抗原结合片段可在VH和/或VL序列中包含一个或多个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个另外的氨基酸修饰，条件是保留抗体的功能特性。
修饰可以是氨基酸取代、缺失或插入。优选地，修饰是取代。
在一个或多个氨基酸被另一个氨基酸取代的优选实施例中，取代可以是保守取代，例如根据下表。在一些实施例中，例如，中间列中相同类别的氨基酸彼此取代，即非极性氨基酸被另一种非极性氨基酸取代。在一些实施例中，最右列中相同行中的氨基酸彼此取代。
Figure BDA0004094741790000182
Figure BDA0004094741790000191
表3.氨基酸
在一些实施例中，取代可以是功能保守的。即，在一些实施例中，与等同的未取代的抗体分子相比，取代可不影响(或可基本上不影响)包含该取代的抗体分子的一种或多种功能特性(例如，结合亲和力)。
在优选的实施例中，本发明的抗体或其抗原结合片段可包含与本文所示的本发明的VH和/或VL序列相比具有一个或多个氨基酸序列改变(氨基酸残基的添加、缺失、取代和/或插入)、优选地20个改变或更少、15个改变或更少、10个改变或更少、5个改变或更少、4个改变或更少、3个改变或更少、2个改变或更少、或1个改变的VH和/或VL结构域序列。
在优选的实施例中，本发明的人源化抗体或其抗原结合片段可包含SEQ ID NO:118所示的克隆2的人源化VH结构域序列，例如，具有与SEQ ID NO:118所示的克隆2的序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的人源化VH结构域。
在优选的实施例中，本发明的人源化抗体或其抗原结合片段可包含SEQ ID NO:154的VH4VK4的人源化VH结构域序列，例如，具有与SEQ ID NO:154的克隆VH4VK4的VH序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的人源化VH结构域。
在优选的实施例中，本发明的人源化抗体或其抗原结合片段包含含有一组HCDR的VH结构域氨基酸序列：克隆2的HCDR1(SEQ ID NO:20)、HCDR2(SEQ ID NO:21)和HCDR3(SEQID NO:22)，例如当由Kabat命名法定义时如表5所示，并且该VH结构域具有与SEQ ID NO:118所示的克隆2的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在优选的实施例中，本发明的人源化抗体或其抗原结合片段包含含有一组HCDR的VH结构域氨基酸序列：当由Kabat命名法定义时SEQ ID NO:154的克隆VH4VK4的HCDR1(SEQID NO:20)、HCDR2(SEQ ID NO:21)和HCDR3(SEQ ID NO:22)，并且该VH结构域具有与SEQ IDNO:154的克隆VH4VK4的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在优选的实施例中，本发明的人源化抗体或其抗原结合片段可包含SEQ ID NO:119所示的克隆2的人源化VL结构域氨基酸序列，例如，具有与SEQ ID NO:119所示的克隆2的序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的人源化VL结构域。
在优选的实施例中，本发明的人源化抗体或其抗原结合片段可包含SEQ ID NO:160的克隆VH4VK4的人源化VL结构域氨基酸序列，例如，具有与SEQ ID NO:160的VH4VK4的序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的人源化VL结构域。
在优选的实施例中，本发明的人源化抗体或其抗原结合片段包含含有一组LCDR的VL结构域：分别为克隆2的LCDR1(SEQ ID NO:23)、LCDR2(SEQ ID NO:24)和LCDR3(SEQ IDNO:25)，例如当由Kabat命名法定义时如表5所示，并且该VL结构域具有与SEQ ID NO:119所示的克隆2的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在优选的实施例中，本发明的人源化抗体或其抗原结合片段包含含有一组LCDR的VL结构域：当由Kabat命名法定义时分别为SEQ ID NO:160的克隆VH4VK4的LCDR1(SEQ IDNO:23)、LCDR2(SEQ ID NO:24)和LCDR3(SEQ ID NO:25)，并且该VL结构域具有分别与SEQID NO:160的克隆VH4VK4的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
序列同一性通常参照算法GAP(Wisconsin GCG包，美国圣地亚哥的阿赛乐德公司(Accelerys Inc,San Diego USA))来定义。GAP使用Needleman和Wunsch算法来比对两个完整的序列，最大化匹配的数量并最小化缺口的数量。通常，使用默认参数，其中缺口产生罚分等于12，并且缺口延伸罚分等于4。优选使用GAP，但也可使用其他算法，例如BLAST(其使用Altschul等人(1990)J.MoI.Biol.[分子生物学杂志]215:405-410的方法)、FASTA(其使用Pearson和Lipman(1988)PNAS USA[美国科学院院报]85:2444-2448的方法)、或史密斯-沃特曼算法(Smith和Waterman(1981)J.MoI Biol.[分子生物学杂志]147:195-197)、或Altschul等人(1990)(出处同上)的TBLASTN程序，通常采用默认参数。特别地，可使用psi-Blast算法(Nucl.Acids Res.[核酸研究](1997)25 3389-3402)。可使用Bioedit、ClustalW算法定义序列同一性。
使用Snapgene并基于MUSCLE(通过对数期望进行的多序列比较)算法(Edgar(2004a)Nucleic Acids Res[核酸研究]32:1792-7；Edgar(2004b)BMC Bioinformatics[BMC生物信息学]5:113)进行比对。
抗体可包含CH2结构域。CH2结构域优选地位于CH3结构域的N-末端，如在人IgG分子中的情况。抗体的CH2结构域优选地是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的CH2结构域，更优选地人IgG1的CH2结构域。人IgG结构域的序列是本领域已知的。
抗体可在CH2结构域的N-末端包含免疫球蛋白铰链区或其部分。免疫球蛋白铰链区允许两个CH2-CH3结构域序列缔合并形成二聚体。优选地，铰链区或其部分是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4铰链区或其部分。更优选地，铰链区或其部分是IgG1铰链区或其部分。
CH3结构域的序列没有特别限制。优选地，CH3结构域是人免疫球蛋白G结构域，诸如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 CH3结构域，最优选地人IgG1 CH3结构域。
本发明的抗体可包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定区。人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4CH3结构域的序列是本领域已知的。本发明的抗体可包含人IgG恒定区，例如人IgG1恒定区。
本发明的抗体可包含具有效应子功能的人IgG Fc。
Fc受体(FcR)是将抗体介导的(体液)免疫应答与细胞效应子功能联系起来的关键免疫调节受体。已鉴定了所有免疫球蛋白类别的受体，包括FcγR(IgG)、FcεRI(IgE)、FcαRI(IgA)、FcμR(IgM)和FcδR(IgD)。在白细胞上发现了以下三类人IgG受体：CD64(FcγRI)、CD32(FcγRIIa、FcγRIIb和FcγRIIc)和CD16(FcγRIIIa和FcγRIIIb)。FcγRI被分类为高亲和力受体(纳摩尔范围KD)，而FcγRII和FcγRIII是低至中等亲和力受体(微摩尔范围KD)。
在抗体依赖性细胞毒性(ADCC)中，效应细胞(自然杀伤细胞、巨噬细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞)表面上的FcvR结合IgG的Fc区，IgG自身结合靶细胞。一旦结合，信号传导途径就被触发，这导致分泌多种介导靶细胞破坏的物质，诸如裂解酶、穿孔素、颗粒酶和肿瘤坏死因子。对于IgG亚型而言ADCC效应子功能的水平不同。尽管这取决于同种异型和特异性FcvR，但简单来说，ADCC效应子功能对于人IgG1和IgG3较高，而对于IgG2和IgG4较低。关于IgG亚型在效应子功能上的变化见下文，按效力降低排序。
Figure BDA0004094741790000221
Figure BDA0004094741790000231
FcγR在铰链和上部CH2区上不对称地结合IgG。对结合位点的了解已导致调节IgG效应子功能的工程化努力。
本发明的抗体可具有包括效应子功能、增强的效应子功能或降低的效应子功能的Fc。
抗体的效力可通过增强介导细胞毒性功能的能力来增加，诸如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)。已经鉴定了Fc结构域内的许多突变，其直接或间接增强Fc受体的结合并显著增强细胞的细胞毒性：突变S239D/A330L/I332E(“3M”)、F243L或G236A。替代性地，效应子功能的增强可通过修饰Fc结构域的糖基化来实现，FcγR与CH2结构域上的碳水化合物相互作用，并且聚糖组合物对效应子功能活性具有显著影响。去岩藻糖基化(非岩藻糖基化)抗体通过增加与FcγRIIIa的结合而表现出大大增强的ADCC活性。
ADCC和CDC的激活对于一些治疗性抗体可能是期望的，然而，在一些实施例中，优选不激活效应子功能的抗体。
由于它们缺乏效应子功能，IgG4抗体是用于受体阻断而无细胞耗竭的优选IgG亚类。然而，IgG4分子可在称为Fab-臂交换的动态过程中交换半分子。这种现象可能发生在治疗性抗体和内源性IgG4之间。S228P突变已显示阻止该重组过程，从而允许设计具有降低的Fab-臂交换倾向的IgG4抗体。
Fc工程化方法已用于确定IgG1 Fc结构域与Fcγ受体和C1q的关键相互作用位点，然后对这些位置进行突变以降低或消除结合。通过丙氨酸扫描，鉴定了C1q与覆盖Fc结构域的铰链和上部CH2的区域的结合位点。本发明的抗体或片段的CH2结构域可包含一个或多个突变以降低或消除CH2结构域与一种或多种Fcγ受体(诸如FcγRI、FcγRlla、FcγRllb、FcγRIII)的结合和/或与补体的结合。人lgG结构域的CH2结构域通常结合Fcγ受体和补体，预期降低的与Fcγ受体的结合降低抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，并且预期降低的与补体的结合降低抗体分子的补体依赖性细胞毒性(CDC)活性。降低或消除CH2结构域与一种或多种Fcγ受体和/或补体的结合的突变是本领域已知的。本发明的抗体分子可包含具有修饰K322A/L234A/L235A或L234F/L235E/P331S(“TM”)的Fc，其几乎完全消除FcγR和C1q结合。本发明的抗体分子可包含CH2结构域，其中CH2结构域在EU位置234和235(通过IMGT编号的位置1.3和1.2)包含丙氨酸残基(“LALA突变”)。此外，补体激活和ADCC可通过Pro329(根据EU编号的位置)突变为例如P329A或P329G而降低。本发明的抗体分子可包含CH2结构域，其中CH2结构域在EU位置234和235(根据IMGT编号的位置1.3和1.2)包含丙氨酸残基并且在EU位置329(根据IMGT编号的位置114)包含丙氨酸(LALA-PA)或甘氨酸(LALA-PG)。另外地或替代性地，本发明的抗体分子可在EU位置297(通过IMGT编号的位置84.4)包含丙氨酸、谷氨酰胺或甘氨酸。
已知最佳FcR相互作用所需的Fc结构域的天冬酰胺297上的糖基化修饰可导致与FcR结合的丧失；在N297点突变中观察到与FcR结合的丧失。本发明的抗体分子可包含具有N297A、N297G或N297Q突变的Fc。具有无糖基Fc结构域的本发明抗体分子可通过酶促去糖基化、通过在糖基化抑制剂存在下的重组表达或在细菌中表达Fc结构域后获得。
IgG由于FcRn介导的再循环而在血清中天然持续延长的时段，使其典型的半衰期为约21天。通过工程化Fc结构域与FcRn的pH依赖性相互作用以增加在pH 6.0下的亲和力同时保持在pH 7.4下的最小结合，可延长半衰期。T250Q/M428L变体赋予IgG半衰期约2倍的增加(在恒河猴中评估)，而M252Y/S254T/T256E变体(“YTE”)赋予IgG半衰期约4倍的增加(在食蟹猴中评估)。延长半衰期可允许降低施用频率的可能性，同时维持或改善功效。
已知免疫球蛋白具有包含离散结构域的模块结构，其可以多种不同方式组合以产生多特异性，例如双特异性、三特异性或四特异性抗体形式。示例性多特异性抗体形式描述于例如Spiess等人(2015)Mol Immunol[分子免疫学]67:95-106和Kontermann(2012)Mabs4(2):182-97中。本发明的抗体可以此类多特异性形式使用。
本发明提供了人源化或人抗体或其抗原结合片段，当在竞争测定中评估时该人源化或人抗体或其抗原结合片段能够与本文所述的本发明的抗体(例如，包含克隆2的一组HCDR和LCDR(例如，当通过Kabat命名法定义时如表5中所列)和/或克隆2的VH和VL氨基酸序列的人源化变体)竞争结合包含表位的分离的重组肽，所述肽包含人2N4R tau(SEQ ID NO:2)的残基369-381(SEQ ID NO:1)或由其组成。优选地，所述表位由人2N4R(氨基酸1-441)tau(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列373至379(THKLTFR，SEQ ID NO:150)的残基形成和限定，优选地其中该表位包含以下残基并由其限定：K375、T377和R379，更优选地其中该表位包含残基T373、K375、T377和R379(例如，由克隆2(#44)结合的表位)并由其限定。
竞争测定包括基于细胞的和无细胞的结合测定，包括免疫测定诸如ELISA、HTRF、流式细胞术、荧光微容量测定技术(FMAT)测定、Mirrorball、基于高含量成像的荧光免疫测定、放射性配体结合测定、生物层干涉测量法(BLI)、表面等离子体共振(SPR)和热移位测定。
与参考抗体结合相同表位或与参考抗体重叠的表位的抗体是指在竞争测定中阻断参考抗体与其结合配偶体(例如，抗原或“靶标”)结合50％或更多的抗体，和/或相反地，参考抗体在竞争测定中阻断抗体与其结合配偶体结合50％或更多的抗体。据说此类抗体竞争结合感兴趣的表位。
抗原结合蛋白，诸如本发明的抗体或其抗原结合片段可缀合至可检测标记(例如，放射性同位素)；或缀合至生物活性分子。在这种情况下，抗原结合蛋白，诸如抗体或其抗原结合片段可称为缀合物。此类缀合物可用于如本文所述的疾病的治疗和/或诊断中。此类缀合物可用于检测(例如，体外检测)包含人2N4R(氨基酸1-441)tau(SEQ ID NO:2)的残基369-381(SEQ ID NO:1)或由其组成的表位；优选地，所述表位由人2N4R(氨基酸1-441)tau(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列373至379(THKLTFR，SEQ ID NO:150)的残基形成，优选地其中该表位包含以下残基：K375、T377和R379，更优选地其中该表位包含残基T373、K375、T377和R379(例如，由克隆2(#44)结合的表位)。
本发明的抗原结合蛋白(包括缀合物)可用于检测(例如体外检测)本发明的表位(存在于由人2N4R(氨基酸1-441)tau(SEQ ID NO:2)的残基369-381(SEQ ID NO:1)组成的分离的重组肽上的表位)；优选地，所述表位由人2N4R(氨基酸1-441)tau(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列373至379(THKLTFR，SEQ ID NO:150)的残基形成，优选地其中该表位由以下残基限定：K375、T377和R379，更优选地其中该表位由残基T373、K375、T377和R379限定(例如，由克隆2(#44)结合的表位)。因此，本发明涉及本发明的抗原结合蛋白用于检测样品中本发明表位的存在的用途。抗原结合蛋白可与本文别处描述的可检测标记缀合。
在优选的实施例中，本发明涉及检测样品中本发明表位的体外方法，其中该方法包括将本发明的抗原结合蛋白与感兴趣的样品一起孵育，并测定抗原结合蛋白与样品中存在的本发明表位的结合，其中该抗原结合蛋白的结合指示样品中本发明表位的存在。用于检测抗原结合蛋白与其靶抗原结合的方法是本领域已知的，并且包括ELISA、ICC、IHC、免疫荧光、蛋白质印迹、IP、SPR和流式细胞术。
感兴趣的样品可以是从个体获得的样品。该个体可以是人。样品包括但不限于组织(诸如脑组织)、脑脊液(CSF)、原代或培养的细胞或细胞系、细胞上清液、细胞裂解物、血小板、血清、血浆、玻璃体液、淋巴液、滑液、滤泡液、精液、羊水、乳汁、全血、血浆、血清、血液来源的细胞、尿液、唾液、痰、泪液、汗液、粘液、肿瘤裂解物和组织培养基、组织提取物(诸如匀浆组织、肿瘤组织、细胞提取物)以及它们的组合。
孵育后，使用合适的检测系统检测抗原结合蛋白与抗原的结合，例如抗体与抗原的结合。检测方法可以是直接或间接的，并且可生成荧光或显色信号。直接检测涉及使用直接与标记缀合的一抗。间接检测方法使用针对初级抗原结合蛋白(例如抗体)宿主物种产生的标记的二抗。间接方法可包括增加信号强度的放大步骤。用于抗原结合蛋白-抗原(例如，抗体-表位)相互作用的可视化(即，检测)的常用标记包括荧光团和将可溶性底物转化为不溶性显色终产物的酶。
术语“检测”在本文中以最广泛的意义使用，包括靶分子的定性和定量测量。检测包括仅鉴定样品中靶分子的存在以及确定样品中是否存在可检测水平的靶分子。检测可以是直接的或间接的。
可缀合至抗原结合蛋白(诸如抗体)的合适的可检测标记是本领域已知的，并且包括放射性同位素，诸如碘-125、碘-131、钇-90、铟-111和锝-99；荧光染料，诸如荧光素、罗丹明、藻红蛋白、德克萨斯红和花青染料衍生物，例如Cy7、Alexa750和Alexa Fluor 647；显色染料，诸如二氨基联苯胺；胶乳珠；酶标记物诸如辣根过氧化物酶；具有光谱隔离的吸收或发射特性的磷或激光染料；电致化学发光标记，诸如SULFO-TAG，其可通过在适当的化学环境中用电刺激来检测；和化学部分，诸如生物素，其可通过与特定的同源可检测部分(例如标记的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白)结合来检测。
本发明的抗原结合蛋白，诸如抗体或其片段，可通过任何合适的共价或非共价连接，诸如二硫键或肽键，与可检测标记缀合。合适的肽接头是本领域已知的，并且长度可以是5至25、5至20、5至15、10至25、10至20或10至15个氨基酸。
本发明还提供了编码本发明的抗体或抗原结合片段的核酸或核酸组，以及包含此类核酸或核酸组的载体。
当核酸编码本发明抗体分子的VH和VL结构域、或重链和轻链时，两个结构域或链可在相同或分开的核酸分子上编码。
分离的核酸分子可用于表达本发明的抗体分子。核酸通常以用于表达的重组载体的形式提供。因此，本发明的另一方面提供了包含如上所述的核酸的载体。可选择或构建合适的载体，其含有合适的调节序列，包括启动子序列、终止子片段、聚腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因和其他合适的序列。优选地，载体含有适当的调节序列以驱动核酸在宿主细胞中表达。载体可以是质粒、病毒例如噬菌体或噬菌粒，视情况而定。
可将如本文所述的核酸分子或载体引入宿主细胞。将核酸或载体引入宿主细胞的技术是本领域公知的，并且可采用任何合适的技术。适于产生重组抗体分子的宿主细胞范围是本领域已知的，包括细菌、酵母、昆虫或哺乳动物宿主细胞。优选的宿主细胞是哺乳动物细胞，诸如CHO、NS0或HEK细胞，例如HEK293细胞。
还提供了包含本发明的核酸或载体的重组宿主细胞。此类重组宿主细胞可用于产生本发明的抗原结合蛋白(例如，抗体)。因此，还提供了产生本发明的抗原结合蛋白(例如抗体)的方法，该方法包括在适于产生抗原结合蛋白(例如抗体)的条件下培养重组宿主细胞。该方法还可包括分离和/或纯化抗原结合蛋白(例如抗体)的步骤。
因此，本发明提供了产生本发明的抗原结合蛋白(例如抗体)的方法，该方法包括在宿主细胞中表达编码抗原结合蛋白(例如抗体)的核酸，以及任选地分离和/或纯化由此产生的抗原结合蛋白(例如抗体)。培养宿主细胞的方法是本领域公知的。用于纯化重组抗原结合蛋白(例如抗体)的技术是本领域公知的，并且包括例如HPLC、FPLC或亲和色谱法，例如使用蛋白A或蛋白L。在一些实施例中，可使用抗原结合蛋白(例如抗体)上的亲和标签进行纯化。该方法还可包括将抗原结合蛋白(例如抗体)配制成药物组合物，任选地与如下所述的药学上可接受的赋形剂或其他物质一起配制。
预期本发明的抗原结合蛋白(例如抗体)可用于治疗性应用，特别是人的治疗性应用，例如用于治疗tau蛋白病，包括但不限于选自阿尔茨海默病(散发性和单基因家族性形式)、肌萎缩侧索硬化/帕金森综合征-痴呆复合征、嗜银粒病、β-螺旋桨蛋白相关神经变性(BPAN)、英国型淀粉样血管病、脑淀粉样血管病、克雅氏病、拳击员痴呆、弥漫性神经原纤维缠结伴钙化、唐氏综合征、慢性创伤性脑病(CTE)、皮质基底节变性(CBD)、额颞叶痴呆(FTD)、与染色体17相关的额颞叶痴呆和帕金森综合征(FTDP-17)、额颞叶变性、格斯特曼-斯特劳斯勒-申克病(Gerstmann-Straussler-Scheinker disease)、哈勒沃登-施帕茨病(Hallervorden-Spatz disease)、包涵体肌炎、多系统萎缩、强直性肌营养不良、尼曼-皮克病C型、具有神经原纤维缠结的非关岛运动神经元病、帕金森病(散发性和单基因家族性形式)、匹克氏病、脑炎后帕金森综合征、原发性年龄相关性tau蛋白病(PART)、朊病毒蛋白脑淀粉样血管病、进行性皮质下神经胶质增生、进行性核上性麻痹(PSP)、亚急性硬化性全脑炎、缠结显性痴呆、球状胶质tau蛋白病、关岛型帕金森综合征-痴呆复合征、进行性非流畅性失语症、多梗塞性痴呆、缺血性中风、创伤性脑损伤(TBI)和中风的tau蛋白病。
还提供了包含根据本发明的抗原结合蛋白(例如抗体)和赋形剂(诸如药学上可接受的赋形剂)的组合物，诸如药物组合物。
本发明还提供了在治疗方法中使用的本发明的抗原结合蛋白，例如抗体。还提供了治疗患者的方法，其中该方法包括向患者施用治疗有效量的根据本发明的抗原结合蛋白，例如抗体。还提供了根据本发明的抗原结合蛋白(例如抗体)用于制造药物的用途。如本文所指，患者优选地为人类患者。
本发明还提供了在治疗患者的tau蛋白病诸如阿尔茨海默病的方法中使用的本发明的抗原结合蛋白(例如抗体)。还提供了治疗患者的tau蛋白病诸如阿尔茨海默病的方法，其中该方法包括向该患者施用治疗有效量的根据本发明的抗原结合蛋白(例如抗体)。还提供了根据本发明的抗原结合蛋白(例如抗体)在制造用于治疗患者的tau蛋白病诸如阿尔茨海默病的药物中的用途。治疗还可包括向患者施用第二疗法，诸如FDA批准的AD药物，例如乙酰胆碱酯酶抑制剂(例如多奈哌齐)、乙酰胆碱受体正调节剂(例如加兰他敏)、NMDA受体拮抗剂(例如美金刚胺)或帕金森病药物(例如卡比多巴-左旋多巴)、多巴胺受体拮抗剂(例如普拉克索)、单胺氧化酶B抑制剂(例如司来吉兰)、儿茶酚O-甲基转移酶(COMT)抑制剂、金刚烷胺或抗胆碱能药(例如苯扎托品)。第二疗法可与本发明的抗原结合蛋白(例如抗体)同时、分开或依次施用于患者。
在另一方面，本发明涉及本发明的抗原结合蛋白(例如抗体)用于以下方面：a)治疗tau蛋白病，b)延迟tau蛋白病的进展，c)保持患有tau蛋白病患者的认知功能，d)延长tau蛋白病患者的生存期，e)降低CSF和/或血清中游离C-末端tau的水平，f)降低CSF和/或血清中总tau的水平，g)降低游离C-末端tau:CSF和/或血清中总tau的比率，h)降低CSF和/或血清中神经丝轻链蛋白(NfL)的水平，i)降低神经元和/或星形胶质细胞和/或小胶质细胞中的总细胞内tau水平，j)降低全脑容量和/或区域脑容量的下降速率，k)降低脑的功能连接性的下降速率，l)改善脑的功能连接性，或m)基于PET或其他成像方法降低脑tau负荷。
因此，本文所述的抗原结合蛋白(例如抗体)可用于治疗性应用，特别是用于治疗tau蛋白病，诸如阿尔茨海默病。
如本文所述的抗原结合蛋白(例如抗体)可用于治疗人或动物体的方法中。本发明的相关方面提供；
(i)用作药物的本文所述的抗原结合蛋白(例如抗体)，
(ii)在治疗疾病或障碍的方法中使用的本文所述的抗原结合蛋白(例如抗体)，
(iii)本文所述的抗原结合蛋白(例如抗体)在制造用于治疗疾病或障碍的药物中的用途；以及，
(iv)一种治疗个体中的疾病或障碍的方法，其中该方法包括向该个体施用治疗有效量的如本文所述的抗原结合蛋白(例如抗体)。
个体可以是患者，优选地人类患者。
治疗可以是其中实现一些期望的治疗效果的任何治疗或疗法，例如抑制或延迟病症的进展，并且包括进展速率的降低、进展速率的停止、病症的改善、病症的治愈或缓解(无论是部分的还是全部的)，预防、改善、延迟、减轻或阻止病症的一种或多种症状和/或体征，或延长个体或患者的生存期超过在没有治疗的情况下所预期的。
还包括作为预防措施(即预防)的治疗。例如，易患tau蛋白病诸如AD或处于发生tau蛋白病的风险中的个体可如本文所述进行治疗。此类治疗可预防或延迟个体中疾病的发生。
所述治疗方法可包括除了抗原结合蛋白(例如抗体)外还向个体施用至少一种另外的治疗。因此，本文所述的抗原结合蛋白(例如抗体)可单独或与一种或多种其他治疗组合施用于个体。当抗原结合蛋白(例如抗体)与另一种治疗组合施用于个体时，附加的治疗可与抗原结合蛋白(例如抗体)的施用同时、依次或分开施用于个体。当附加的治疗与抗原结合蛋白(例如抗体)同时施用时，抗原结合蛋白(例如抗体)和附加的治疗可作为组合制剂施用于个体。例如，附加的疗法可以是用于待治疗疾病的已知疗法或治疗剂。
虽然抗原结合蛋白(例如抗体)可单独施用，但抗原结合蛋白(例如抗体)通常将以药物组合物的形式施用，该药物组合物除抗原结合蛋白(例如抗体)外还可以包含至少一种组分。因此，本发明的另一方面提供了包含如本文所述的抗原结合蛋白(例如抗体)的药物组合物。还提供了包括将抗原结合蛋白(例如抗体)配制到药物组合物中的方法。
除了抗原结合蛋白(例如抗体)之外，药物组合物还可以包含药学上可接受的赋形剂、载剂、缓冲液、稳定剂或本领域技术人员公知的其他材料。如本文所用，术语“药学上可接受的”涉及在合理的医学判断范围内适用于与受试者(例如人)的组织接触而没有过度毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症的与合理的利益/风险比相称的化合物、材料、组合物和/或剂型。每种载剂、赋形剂等在与制剂的其他成分相容的意义上也必须是“可接受的”。载剂或其他材料的精确性质将取决于施用途径，其可通过输注、注射或任何其他合适的途径，如下文所讨论。
对于肠胃外施用，例如皮下或静脉内施用，例如通过注射，包含抗原结合蛋白(例如抗体)的药物组合物可以是肠胃外可接受的水溶液的形式，其是无热原的并且具有合适的pH、等渗性和稳定性。本领域相关技术人员能够使用例如等渗媒介物诸如氯化钠注射液、林格氏注射液或乳酸林格氏注射液制备合适的溶液。可根据需要使用防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂，包括缓冲剂诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，诸如抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3'-戊醇；和间甲酚)；低分子量多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反离子，诸如钠；金属复合物(例如，Zn-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
在一些实施例中，抗原结合蛋白(例如抗体)可以冻干形式提供，用于在施用前重构。例如，冻干的抗原结合蛋白(例如抗体)可在施用于个体之前在无菌水或盐水中重构。
施用可以是“治疗有效量”，这足以显示对个体的益处。施用的实际量以及施用的速率和时程将取决于所治疗的疾病的性质和严重程度、所治疗的特定个体、个体的临床状况、障碍的原因、组合物的递送部位、抗原结合蛋白(例如抗体)的类型、施用的方法、施用的时间表和执业医师已知的其他因素。治疗的处方，例如剂量决定等，在普通医师和其他医生的责任范围内，并且可取决于所治疗疾病的严重程度和/或进展。抗原结合蛋白(例如抗体)的适当剂量是本领域公知的。抗原结合蛋白(例如抗体)的治疗有效量或合适剂量可通过比较动物模型中的体外活性和体内活性来确定。将小鼠和其他测试动物中的有效剂量外推至人的方法是已知的。精确剂量将取决于许多因素，包括待治疗区域的大小和位置，以及抗原结合蛋白(例如抗体)的精确性质。
典型抗体剂量对于全身施用为100μg至1g，并且对于局部施用为1μg至1mg。可施用初始较高的负荷剂量，随后施用一个或多个较低的剂量。这是用于成人个体的单次治疗的剂量，其可针对儿童和婴儿成比例地调整，并且还可针对其他抗体形式与分子量成比例地调整。
治疗可以每天、每周两次、每周或每月的间隔重复，由医师决定。个体的治疗方案可取决于抗体组合物的药代动力学和药效学特性、施用途径和所治疗病症的性质。
治疗可以是周期性的，并且施用之间的周期可以是约两周或更长，例如约三周或更长、约四周或更长、约一月一次或更长、约五周或更长、或约六周或更长。例如，治疗可以是每两至四周或每四至八周。合适的制剂和施用途径如上所述。
在优选的实施例中，如本文所述的抗体可用于治疗阿尔茨海默病的方法中。
在优选的实施例中，抗原结合蛋白，例如本发明的抗体或其抗原结合片段，不结合包含在人tau 2N4R的残基379-408或379-391中的表位。
附图说明
图1.在对照神经元上清液中没有发现从人家族性阿尔茨海默病神经元中释放的多种tau。使用市售抗体HT7(泳道3、6、9)或Tau-13(泳道2、5、8)，从来自非疾病对照(NDC；泳道1-3)、家族性阿尔茨海默病(fAD)相关突变PSEN1 Y115C(PSEN；泳道4-6)和额颞叶痴呆(FTD；泳道7-9)相关突变MAPT IVS10+16(MAPT)神经元的培养物上清液中免疫沉淀(IP)tau，并与IgG对照(1、4、7)进行比较。蛋白质印迹示出了使用抗tau抗体(K9JA)(A)在每次IP后tau物质的检测。切下突出显示并编号为1-5的条带并通过质谱进行分析。
图2.抗tau IgG克隆#44(克隆2)和#66(克隆1)免疫耗竭来自人iPSC衍生的神经元分泌组的tau物质。用免疫前血清(1)、K9JA多克隆抗体(2)、#44(克隆2)(3)和#66(克隆1)(4)免疫耗竭来自NDC(浅灰色)和2个单独的TS21系(深灰色、黑色)的条件培养基，并通过中间区(MR tau；基于市售抗体BT2和Tau5；A)和微管结合区(MTBR tau；基于可商购获得的抗体，K9JA；B)ELISA进行分析。免疫前血清用作模拟耗竭样品的阴性对照。数值代表三次技术重复的平均值+/-SD。
图3.抗tau IgG克隆#44(克隆2)和#66(克隆1)在体内防止tau介导的对长时程增强作用(LTP)的阻断。在由三体性21(TS21)iPSC衍生的神经元培养物生成的分泌组的存在下在麻醉大鼠中测量海马LTP。LTP在媒介物处理的动物中诱导(黑色条；1)，但在模拟耗竭的TS21分泌组(白色条；2)存在时被抑制。在使用IgG克隆#44(克隆2)(灰色条；3)或#66(克隆1)(检验条；4)免疫耗竭的TS21分泌组存在下观察到LTP诱导，表明负责LTP阻断的tau物质的去除。LTP的量值表示为n＝4(媒介物)或n＝7(分泌组样品)动物的刺激前基线EPSP幅值(±SEM)的百分比。**，p<0.01；*，p<0.05；相对于媒介物对照(1)的单向ANOVA与Bonferroni多次对比检验；####，p<0.0001，##，p<0.01，配对t检验，LTP诱导后与诱导前。
图4.人AD CSF含有C-末端tau。合并来自16名临床证实患有阿尔茨海默病的个体的CSF样品(终体积8.5mL)(A)。将150ng克隆#44(克隆2)IgG结合并交联到蛋白A包被的珠上，并将这些珠用于免疫纯化合并的AD CSF中存在的含有靶表位的tau(B)。用胰蛋白酶消化珠上的蛋白质(C)，并通过质谱解析洗脱的肽(D)。在合并的AD CSF(E，示出为“X”)中鉴定了与Gen2B表位(示出为“Y”)相邻的C-末端tau肽，证实了在AD CSF中存在C-末端tau片段。
图5.抗tau抗体结合免疫原序列内的不同表位。抗体克隆#44(克隆2；A)和#66(克隆1，B)的表位取代扫描分析的字母图表示突出显示了结合tau所需的关键残基。同种型对照兔IgG与肽阵列的低水平结合(C)证明抗tau抗体结合是CDR特异性的。生成的线性肽在天然前导肽序列的每个位置处携带单个氨基酸取代，如下图所示。通过在记录值的高度处绘制的每个替换残基的字母代码来指示针对替换获得的值。箭头指示前导序列的中值。
图6.使用复合人抗体技术(阿布泽纳公司(Abzena))设计基于兔抗体克隆#44的人源化重链(VH)和轻链(VK)序列。示出了与原始兔序列(亲本)比对的6个VH链(A)和4个VK链(B)序列。CDR定义和蛋白质序列根据Kabat编号。相对于兔亲本序列的变化用阴影表示。
图7.一组人源化抗tau IgG以ELISA形式结合全长重组2N4R tau。以1:100测试用每种IgG克隆瞬时转染的HEK细胞的上清液与全长重组2N4R tau的结合(实心条)。对于任何测试的变体，没有观察到与BSA的可检测结合(空条)。使用HRP-缀合的抗人二抗检测抗tauhIgG1的结合，并示出了来自代表性实验的数据(n＝1个重复)。
图8.人源化抗tau IgG以高亲和力结合tau。代表性SPR结合曲线示出了克隆#44变体VH0VK0(A)、VH3VK3(B)、VH3VK4(C)、VH4VK2(D)、VH4VK3(E)和VH4VK4(F)与全长重组2N4Rtau的结合(以2倍稀释施用0.39nM至12.5nM)。使用Biacore T200进行实验，结合时间为60s且解离时间为200s。
图9.克隆#44的人源化抗体变体具有超过65℃的Tm。对于优先化的变体VH3VK3(A)、VH3VK4(B)、VH4VK2(C)、VH4VK3(D)、VH4VK4(E)，示出了来自单个重复的荧光(三角形)和473nm处的静态光散射(SLS；正方形)信号。
图10.人源化单克隆抗tau抗体抑制神经元对单体tau的摄取。将抗体克隆#44的人源化变体VH3VK3(A)、VH3VK4(B)、VH4VK2(C)、VH4VK3(D)、VH4VK4(E)(实心三角形，实线)或同种型对照人IgG1(空心正方形，实线)与全长pHrodo标记的单体(P301S)2N4R tau(25nM)一起孵育，然后在Incucyte S3上成像。每60分钟持续21小时定量的平均橙色(pHrodo)面积/神经元(相)面积在同种型和无抗体(实心圆，虚线)处理中随时间稳定增加，但在用抗tau抗体变体处理的细胞中显著降低。***，p<0.001；相对于无抗体对照的单向ANOVA与Tukey多次对比检验。还示出了不含pHrodo标记的tau的阴性对照孔(空心圆，虚线)。数据显示为来自一个代表性实验的n＝4个孔的平均值+/-SEM。
图11.人源化单克隆抗tau抗体抑制人iPSC衍生的神经元对聚集tau的摄取。将抗体克隆#44的人源化变体VH3VK3(A)、VH3VK4(B)、VH4VK2(C)、VH4VK3(D)、VH4VK4(E)(实心三角形，实线)或同种型对照人IgG1(空心正方形，实线)与全长pHrodo标记的聚集(P301S)2N4R tau(50nM)一起孵育，然后在Incucyte S3上成像。每60分钟持续21小时定量的平均橙色(pHrodo)面积/神经元(相)面积在同种型和无抗体(实心圆，虚线)处理中随时间稳定增加，但在用抗tau抗体变体处理的细胞中显著降低。***，p<0.001；相对于无抗体对照的单向ANOVA与Tukey多次对比检验。还示出了不含pHrodo标记的tau的阴性对照孔(空心圆，虚线)。数据显示为来自一个代表性实验的n＝4个孔的平均值+/-SEM。
图12.人源化单克隆抗tau抗体抑制人iPSC衍生的星形胶质细胞对单体tau的摄取。将抗体克隆#44的人源化变体VH3VK3(A)、VH3VK4(B)、VH4VK2(C)、VH4VK3(D)、VH4VK4(E)(实心三角形，实线)或同种型对照人IgG1(空心正方形，实线)与全长pHrodo标记的单体(P301S)2N4R tau(25nM)一起孵育，然后在Incucyte S3上成像。每60分钟持续20小时定量的平均橙色(pHrodo)面积/星形胶质细胞(相)面积在同种型和无抗体(实心圆，虚线)处理中随时间稳定增加，但在用抗tau抗体变体处理的细胞中显著降低。***，p<0.001；相对于无抗体对照的单向ANOVA与Tukey多次对比检验。还示出了不含pHrodo标记的tau的阴性对照孔(空心圆，虚线)。数据显示为来自一个代表性实验的n＝4个孔的平均值+/-SEM。
图13.人源化单克隆抗tau抗体抑制人iPSC衍生的星形胶质细胞对聚集tau的摄取。将抗体克隆#44的人源化变体VH3VK3(A)、VH3VK4(B)、VH4VK2(C)、VH4VK3(D)、VH4VK4(E)(实心三角形，实线)或同种型对照人IgG1(空心正方形，实线)与全长pHrodo标记的聚集(P301S)2N4R tau(50nM)一起孵育，然后在Incucyte S3上成像。每60分钟持续20小时定量的平均橙色(pHrodo)面积/星形胶质细胞(相)面积在同种型和无抗体(实心圆，虚线)处理中随时间稳定增加，但在用抗tau抗体变体处理的细胞中显著降低。***，p<0.001；相对于无抗体对照的单向ANOVA与Tukey多次对比检验。还示出了不含pHrodo标记的tau的阴性对照孔(空心圆，虚线)。数据显示为来自一个代表性实验的n＝4个孔的平均值+/-SEM。
图14.人源化抗tau人IgG1增加人iPSC衍生的小胶质细胞对单体tau的摄取。将抗体克隆#44的人源化变体VH3VK3(A)、VH3VK4(B)、VH4VK2(C)、VH4VK3(D)、VH4VK4(E)(实心圆，实线)或同种型对照hIgG1(空心正方形，实线)与全长pHrodo标记的单体2N4R一起孵育，然后在Incucyte S3上成像。每30分钟持续15小时定量的平均橙色(pHrodo)面积/小胶质细胞(相)面积在同种型和无抗体(实心三角形，虚线)处理中随时间适度增加，但在用抗tau抗体克隆处理的细胞中显著增加。还示出了不含pHrodo标记的tau的阴性对照孔(空心圆，虚线)。数据以来自一个代表性实验的n＝4个孔的平均值+/-SEM给出。***，p<0.001；**，p<0.005；相对于无抗体对照的单向ANOVA与Tukey多次对比检验。
图15.人源化抗tau人IgG1增加人iPSC衍生的小胶质细胞对聚集tau的摄取。将抗体克隆#44的人源化变体VH3VK3(A)、VH3VK4(B)、VH4VK2(C)、VH4VK3(D)、VH4VK4(E)(实心圆，实线)或同种型对照hIgG1(空心正方形，实线)与全长pHrodo标记的单体2N4R一起孵育，然后在Incucyte S3上成像。每30分钟持续15小时定量的平均橙色(pHrodo)面积/小胶质细胞(相)面积在同种型和无抗体(实心三角形，虚线)处理中随时间适度增加，但在用抗tau抗体克隆处理的细胞中显著增加。还示出了不含pHrodo标记的tau的阴性对照孔(空心圆，虚线)。数据以来自一个代表性实验的n＝4个孔的平均值+/-SEM给出。***，p<0.001；**，p<0.005；相对于无抗体对照的单向ANOVA与Tukey多次对比检验。
图16.与非痴呆对照(NDC)死后大脑皮质相比，纯化的人源化单克隆抗tau抗体在家族性阿尔茨海默病(AD；早老素1突变)中检测到tau水平的增加。示出了重组2N4R tau(泳道1)与来自NDC(泳道2)和AD患者(泳道3)的脑裂解物相比的蛋白质印迹。克隆#44变体VH3VK3(A)、VH3VK4(B)、VH4VK2(C)、VH4VK3(D)、VH4VK4(E)和亲本VH0VK0克隆#44(F)抗体检测对应于不同形式的tau的多个种类，其中AD样品中高和低MW种类两者的检测增加。箭头指示在NDC脑中未检测到的疾病特异性tau物质。肌动蛋白(**)和神经元微管蛋白(*)被示出(G)并被包括以分别对照载量和死后蛋白质降解。
图17.与非痴呆对照(NDC)死后大脑皮质相比，抗tau抗体在家族性阿尔茨海默病(AD)、散发性AD和路易体痴呆(DLB)中检测到tau水平的增加。示出了来自NDC(A，泳道1-5；B-C，泳道1-4)、家族性AD患者(A；泳道6-10)、散发性AD患者(B，泳道5-8)和DLB患者(C；泳道5-8)的大脑皮质裂解物的蛋白质印迹。亲本兔IgG克隆#44(i)和人源化变体#44VH4VK4(ii)表现类似，并检测到对应于不同形式的tau的多个种类，其中阿尔茨海默病和DLB样品中高和低MW种类两者的检测增加。图iii-vii示出了使用可商购获得的抗tau抗体重新探测的相同印迹：Tau13(iii.)、HT7(iv.)、Tau5(v.)和Tau46(vi.)，并且与N末端(Tau13)、中间区(HT7，Tau5)和远C末端(Tau46)抗体相比，突出显示了用靶向SEQ ID NO:1的抗体检测的tau物质的明确疾病特异性。箭头表示通过靶向SEQ ID NO:1的抗体而不是通过可商购获得的抗体在疾病样品而不是NDC中检测到的tau物质。肌动蛋白(**)和神经元微管蛋白(*)被示出(vii.)并被包括以分别对照载量和死后蛋白质降解。
图18.通过VH CDR2(H01-H06)和VH CDR3(H06-H20)(阿布泽纳公司)和VL CDR3(L02)的诱变生成基于人源化抗体克隆#44_VH4VK4的新型抗体。示出了与亲本人源化抗体克隆#44_VH4VK4序列(P)比对的前20个VH变体(#44_VH4VK4_H01至_H20)和4个重组变体(#44_VH4VK4_H06-H01、_H06-H02、_H06-H04、H16-H04)(A)和1个代表性VK链变体(#44_VH4VK4_L02)(B)序列的比对。CDR定义和蛋白质序列根据Kabat编号。相对于亲本人源化序列的变化用阴影表示。
图19.一组亲和力成熟的#44_VH4VK4 hIgG1变体以ELISA形式结合全长重组2N4Rtau。以1:100测试用每种IgG克隆瞬时转染的HEK细胞的上清液与全长重组2N4R tau的结合(实心条)。对于任何测试的变体，没有观察到与BSA的可检测结合(空条)。使用HRP-缀合的抗人二抗检测抗tau hIgG1的结合，并示出了来自代表性实验的数据(n＝1个重复)。
图20.亲和力成熟的人源化抗tau IgG以高亲和力结合tau。代表性SPR结合曲线示出了克隆#44_VH4VK4变体_H01(A)(VH SEQ ID No:183，VL SEQ ID NO:160)、_H02(B)(VHSEQ ID No:184，VL SEQ ID NO:160)、_H04(C)(VH SEQ ID No:186，VL SEQ ID NO:160)、_H06(D)(VH SEQ ID No:188，VL SEQ ID NO:160)和亲本#44_VH4VK4(E)(VH SEQ ID N:154，VL SEQ ID NO:160)与全长重组2N4R tau的结合(以2倍稀释施用0.39nM至50nM)。使用Biacore T200进行实验，结合时间为60s且解离时间为200s(剪至100s以改善拟合)。抗体作为hIgG1进行测试。
图21.表达为hIgG1的克隆#44_VH4VK4的亲和力成熟的人源化抗体变体具有超过64℃的Tm。对于与亲本#44_VH4VK4(E)相比的优先化的变体_H01(A)、_H02(B)、_H04(C)、_H06(D)，示出了来自单个重复的荧光(三角形)和473nm处的静态光散射(SLS；正方形)信号。
图22.亲和力成熟的人源化单克隆抗tau抗体抑制人神经元对tau的摄取。将人源化抗体克隆#44_VH4VK4(pVH/pVL)的亲和力成熟变体H01/pVL(A)、H02/pVL(B)、H04/pVL(C)、H06/pVL(D)和亲本pVH/pVL(E)(实心三角形，实线)或同种型对照人IgG1(空心正方形，实线)与全长pHrodo标记的单体2N4R tau 2N4R tau(25nM)一起孵育，然后在Incucyte S3上成像。每60分钟持续18小时定量的平均橙色(pHrodo)面积/神经元(相)面积在同种型和无抗体(实心圆，虚线)处理中随时间稳定增加，但在用抗tau抗体变体处理的细胞中显著降低。***，p<0.001；相对于无抗体对照的单向ANOVA与Dunnett多次对比检验。还示出了不含pHrodo标记的tau的阴性对照孔(空心圆，虚线)。数据显示为来自一个代表性实验的n＝4个孔的平均值+/-SEM。
图23.亲和力成熟的人源化单克隆抗tau抗体抑制人神经元对聚集tau的摄取。将抗体克隆#44_VH4VK4(pVH/pVL)的亲和力成熟的人源化变体H01/pVL(A)、H02/pVL(B)、H04/pVL(C)、H06/pVL(D)和亲本pVH/pVL(E)(实心三角形，实线)或同种型对照人IgG1(空心正方形，实线)与全长pHrodo标记的聚集(P301S)2N4R tau(50nM)一起孵育，然后在Incucyte S3上成像。每60分钟持续18小时定量的平均橙色(pHrodo)面积/神经元(相)面积在同种型和无抗体(实心圆，虚线)处理中随时间稳定增加，但在用抗tau抗体变体处理的细胞中显著降低。***，p<0.001；相对于无抗体对照的单向ANOVA与Tukey多次对比检验。还示出了不含pHrodo标记的tau的阴性对照孔(空心圆，虚线)。数据显示为来自一个代表性实验的n＝4个孔的平均值+/-SEM。
图24.亲和力成熟的人源化单克隆抗tau抗体抑制人星形胶质细胞对单体tau的摄取。将抗体克隆#44_VH4VK4(pVH/pVL)的亲和力成熟的人源化变体H01/pVL(A)、H02/pVL(B)、H04/pVL(C)、H06/pVL(D)和亲本pVH/pVL(E)(实心三角形，实线)或同种型对照人IgG1(空心正方形，实线)与全长pHrodo标记的单体(P301S)2N4R tau(25nM)一起孵育，然后在Incucyte S3上成像。每60分钟持续21小时定量的平均橙色(pHrodo)面积/星形胶质细胞(相)面积在同种型和无抗体(实心圆，虚线)处理中随时间稳定增加，但在用抗tau抗体变体处理的细胞中显著降低。***，p<0.001；相对于无抗体对照的单向ANOVA与Tukey多次对比检验。还示出了不含pHrodo标记的tau的阴性对照孔(空心圆，虚线)。数据显示为来自一个代表性实验的n＝4个孔的平均值+/-SEM。
图25.亲和力成熟的人源化单克隆抗tau抗体抑制人星形胶质细胞对聚集tau的摄取。将抗体克隆#44_VH4VK4(pVH/pVL)的亲和力成熟的人源化变体H01/pVL(A)、H02/pVL(B)、H04/pVL(C)、H06/pVL(D)和亲本pVH/pVL(E)(实心三角形，实线)或同种型对照人IgG1(空心正方形，实线)与全长pHrodo标记的聚集(P301S)2N4R tau(50nM)一起孵育，然后在Incucyte S3上成像。每60分钟持续21小时定量的平均橙色(pHrodo)面积/星形胶质细胞(相)面积在同种型和无抗体(实心圆，虚线)处理中随时间稳定增加，但在用抗tau抗体变体处理的细胞中显著降低。***，p<0.001；相对于无抗体对照的单向ANOVA与Tukey多次对比检验。还示出了不含pHrodo标记的tau的阴性对照孔(空心圆，虚线)。数据显示为来自一个代表性实验的n＝4个孔的平均值+/-SEM。
图26.与非痴呆对照(NDC)死后大脑皮质相比，纯化的亲和力成熟的人源化单克隆抗tau抗体在家族性阿尔茨海默病(AD；早老素1突变)中检测到tau水平的增加。示出了重组2N4R tau(泳道1)与来自NDC(泳道2)和AD患者(泳道3)的脑裂解物相比的蛋白质印迹。克隆#44变体pVH/pVL(亲本)(A)、H01/pVL(B)、H02/pVL(C)、H04/pVL(D)、H06/pVL(E)和H16/pVL(F)抗体检测对应于不同形式的tau的多个种类，其中AD样品中高和低MW种类两者的检测增加。箭头指示在NDC脑中未检测到的疾病特异性tau物质。对于每个死后脑样品，将等量的蛋白质加载到每个凝胶上。
图27.与非痴呆对照(NDC)死后大脑皮质相比，亲和力成熟的抗tau抗体在一组家族性阿尔茨海默病(AD)中检测到tau水平的增加。示出了来自NDC(泳道1-5)、家族性AD患者(泳道6-10)的大脑皮质裂解物的蛋白质印迹。亲和力成熟的人源化变体#44_VH4VK4_H01/pVL(A)、_H02/pVL(B)、_H04/pVL(C)和_H06/pVL(D)检测对应于不同形式的tau的多个种类，其中家族性阿尔茨海默样品中高和低MW种类两者的检测增加。箭头表示通过靶向SEQ IDNO:1的抗体在疾病样品而不是NDC中检测到的tau物质，肌动蛋白(**)和神经元微管蛋白(*)如下示出并被包括以分别对照载量和死后蛋白质降解。
图28.与非痴呆对照(NDC)死后大脑皮质相比，亲和力成熟的抗tau抗体在散发性AD和路易体痴呆(DLB)中检测到tau水平的增加。示出了来自NDC(泳道1-4)、散发性AD患者(A、C；泳道5-8)和DLB患者(B、D；泳道5-8)的大脑皮质裂解物的蛋白质印迹。亲和力成熟的人源化变体#44_VH4VK4_H04/pVL(A、B)和#44_VH4VK4_H06/pVL(C、D)表现类似并且检测对应于不同形式的tau的多个种类，其中阿尔茨海默病和DLB样品中高和低MW种类两者的检测增加。箭头表示通过靶向SEQ ID NO:1的抗体在疾病样品而不是NDC中检测到的tau物质，肌动蛋白(**)和神经元微管蛋白(*)如下示出(E、F)并被包括以分别对照载量和死后蛋白质降解。
图29.人源化抗tau抗体结合免疫原序列内的相同表位。抗体克隆#44_VH4VK4_H04/pVL(克隆VH4VK4_H04；A)和#44_VH4VK4_H06/pVL(克隆VH4VK4_H06，B)的表位取代扫描分析的字母图表示突出显示了结合tau所需的关键残基。同种型对照人IgG1与肽阵列的低水平结合(C)明显不同于抗tau抗体的结合并且证明抗tau抗体结合是CDR特异性的。生成的线性肽在天然前导肽序列的每个位置处携带单个氨基酸取代，如下图所示。通过在记录值的高度处绘制的每个替换残基的字母代码来指示针对替换获得的值。箭头指示前导序列的中值。
实例
实例1：在对照培养物上清液中没有发现从家族性阿尔茨海默病神经元培养物中释放的多种tau(图1)
在非痴呆对照(NDC)神经元培养物上清液中没有发现从家族性阿尔茨海默病(fAD)和额颞叶痴呆(FTD)神经元培养物中释放的多种tau。使用市售抗体HT7(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰生命技术有限公司(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA))或Tau13(美国德克萨斯州达拉斯的圣克鲁斯公司(Santa-Cruz,Dallas,TX,USA))从来自NDC、fAD相关突变、PSEN1 Y115C(PSEN)和FTD相关突变、MAPT IVS10+16(MAPT)的神经元细胞培养物上清液中免疫沉淀(IP)tau，并与小鼠单克隆IgG对照比较。蛋白质印迹(图1)示出了使用抗tau抗体(K9JA；美国加利福尼亚州圣塔克拉拉的安捷伦公司(Agilent,Santa Clara,CA,USA))在每次免疫沉淀后tau物质的检测。切下条带(在图1的框1-5中突出显示)并通过质谱分析以鉴定富含疾病相关分泌组的tau肽。该分析表明，与来自NDC的肽相比，疾病相关分泌组中来自微管结合结构域(对应于2N4R tau的氨基酸260-267(SEQ ID NO:9)、306-317(SEQ IDNO:10)和354-369(SEQ ID NO:11))和C-末端(对应于2N4R tau的氨基酸396-406(SEQ IDNO:12))的肽数量增加(表4)。数据显示，与NDC相比，包括微管结合结构域和邻近的C-末端区域的tau物质以较高水平从疾病相关神经元分泌，并因此可代表tau的病理或毒性形式。
1.1人iPSC衍生的神经元的细胞培养：人多能干细胞(iPSC)向投射神经元培养物的分化如Shi等人,Nature Neurosci.[自然-神经科学]15(3):477-86(2012)所述进行。使用来自不同遗传背景的iPSC系：NDC((Shi等人,Nature Neurosci.[自然-神经科学]15(3):477-86；Shi等人Nature Protocols[自然-实验室指南]7(10):1836-46(2012))；三体性21(TS21；Shi等人Nature Protocols[自然-实验室指南]7(10):1836-46(2012))；PSEN1Y115C突变(PSEN；Moore等人Cell Rep[细胞通讯]11(5):689-96(2015))；APP V717I突变(APP；Moore等人Cell Rep[细胞通讯]11(5):689-96(2015)；MAPT IVS10+16(MAPT；Sposito等人Hum Mol Genet[人类分子遗传学]24(18):5260-5269(2015))。在体外第40天将细胞铺板用于单个实验，并维持至第60+天(D60+)，其中体外的天数是指诱导后的天数(如稍后详述)。
1.2免疫沉淀和蛋白质印迹(图1)：将iPSC衍生的神经元在12孔板(美国纽约的康宁公司(Corning,New York,USA))中培养并成熟至D60，此后，每48小时收集条件培养基。离心培养基以去除细胞碎片并将上清液储存在-20℃。将条件培养基在冰上解冻并使用Vivaspin 20即10kDa MWCO聚醚砜(美国密歇根州圣路易斯的西格玛公司(Sigma,StLouise,MI,USA))浓缩约10倍。
1.2.1抗体缀合：洗涤Dynabeads(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA))，然后用5μg指定抗体孵育10分钟。然后将IgG抗体珠混合物添加到浓缩的条件培养基中并在滚筒上孵育过夜。从条件培养基中取出Dynabeads并用Tau13(英国剑桥的艾博抗公司(Abcam,Cambridge,UK))抗体珠混合物替换并孵育约8小时。从条件培养基中取出Dynabeads并用HT7(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰生命技术有限公司)抗体珠混合物替换并孵育过夜。将所有珠用0.05％ Tween(PBS)洗涤三次。将100μl Laemlli裂解缓冲液添加到所有珠中并煮沸10分钟。将上清液在SDS凝胶上电泳。
1.2.2蛋白质印迹：将20μl样品加载到12％ Mini-Protean TGX预制凝胶(美国加利福尼亚州赫拉克勒斯的伯乐公司(Bio-Rad,Hercules,CA,USA))中并在4℃以200mA转移到0.2μm PVDF膜(美国伊利诺伊州芝加哥的GE医疗集团生命科学事业部(GE HealthcareLife science,Chicago,IL,USA))上保持两小时。将膜在5％脱脂奶粉(Marvel，英国圣奥尔本斯的第一食品公司(Premier Foods,St Albans,UK))、0.1％Tween的PBS溶液中在室温(RT)下封闭1小时。
在RT下用一抗(以指定的浓度)探测蛋白质转移膜过夜。随后将膜与二抗(山羊抗兔HRP)在RT下孵育1小时。
1.3质谱：将20μl样品加载到12％ Mini-Protean TGX预制凝胶(美国加利福尼亚州赫拉克勒斯的伯乐公司)中。然后将凝胶与EZBlueTM凝胶染色试剂(美国密苏里州圣路易斯的西格玛公司)孵育4小时，然后用ddH2O脱色过夜。从胶体蓝SDS-PAGE中切下通过蛋白质印迹分析的对应于tau的条带。使切下的条带在200μl 100mM碳酸氢铵/50％乙腈中经受20℃，随后用5mM三(2-羧乙基)膦还原。然后通过添加碘乙酰胺(25mM终浓度；每步孵育30分钟)进行烷基化，然后去除液体。将凝胶块真空干燥10分钟，并添加25μl含有5μg/mL改性胰蛋白酶(美国威斯康星州麦迪逊的普洛麦格公司(Promega,Madison,WI,USA))的100mM碳酸氢铵(在37℃消化17小时)。回收肽并使用μC18 ZipTip(美国马萨诸塞州伯灵顿的密理博公司(Millipore,Burlington,MA,USA))脱盐，并使用1-2μl在50％乙腈/0.1％三氟乙酸中的α-氰基-4-羟基肉桂酸基质(美国密苏里州圣路易斯的西格玛公司)洗脱至maldi靶板。使用Bruker ultrafleXtreme Maldi质谱仪以反射模式测定肽质量，并以LIFT模式进行ms/ms片段化。用FlexAnalysis(比奥图斯公司(BioTools))和ProteinScape软件(美国马萨诸塞州比尔里卡的布鲁克公司(Bruker,Billerica,MA,USA))进行数据分析。使用Mascot(http:// www.matrixscience.com)进行组合的质量指纹-ms/ms数据的数据库检索。(表4)
Figure BDA0004094741790000421
Figure BDA0004094741790000431
表4.总结了从切下的条带1-5(图1)制备的样品中通过质谱鉴定的肽片段。给出了全长2N4R tau序列(SEQ ID NO:2)内的氨基酸序列和位置，以及鉴定每种肽的次数。
实例2：肽合成
为了进一步研究含有微管结合结构域/C-末端的tau片段在神经变性疾病中的重要性，生成靶向该区域的新型抗体。出于多种原因，选择对应于2N4R tau的氨基酸369-381的肽序列KKIETHKLTFREN(SEQ ID NO:1)作为免疫原以生成兔IgG。首先，该序列邻接微管结合区(MTBR)，但与MTBR本身不同，显示出与tau蛋白内的其他区域和微管结合蛋白家族成员的低同一性。这增加了所生成的抗体与tau中的靶区域特异性和选择性结合的可能性，与其他区域/蛋白质交叉反应的风险低。第二，在tau磷酸化与病理结果相关的区域中，推定磷酸化位点的缺失简化了所得数据的解释(Augustinack等人,Acta Neuropathol[神经病理学通讯]103(1):26-35(2002))。因此，靶向该肽的抗体能够有探索/靶向含有C-末端的tau物质的作用，而没有与多个位点结合和/或与磷酸化/去磷酸化tau的差异结合相关的并发症。在公共领域没有满足这些标准的类似抗体。
与由对应于2N4R tau的氨基酸369-381的肽序列KKIETHKLTFREN(SEQ ID NO:1)形成的表位特异性结合的兔单克隆IgG抗体的生成和表征描述于2020年6月29日提交的国际专利申请号PCT/EP 2020/068314中，其于2020年12月30日公开为WO/2020/260722，本申请要求其优先权。公开为WO/2020/260722的国际专利申请号PCT/EP 2020/068314的内容通过援引以其全文并入，
抗原肽，[C]-KKIETHKLTFREN-酰胺(SEQ ID NO:13)通过坎布里奇研究生物化学公司(英国比林汉姆)(Cambridge Research Biochemicals(Billingham,UK))使用标准技术合成并且通过HPLC显示>95％纯，用于免疫的肽经由马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)接头通过N-末端半胱氨酸上的游离硫醇缀合至钥孔血蓝蛋白(KLH)。使用专有方法(美国加利福尼亚州圣地亚哥的外显子生物公司(Exonbio,San Diego,CA,USA))，使用N-末端半胱氨酸上的游离硫醇将用于单浆细胞询问(SPIN)方案的肽缀合至生物素化聚合物。
实例3：用靶免疫原免疫兔
3.1：用靶免疫原免疫兔：使用一只新西兰白兔生成兔单克隆抗体。在第0天(在弗氏完全佐剂中)，然后每19天至第76天(在弗氏完全佐剂中)，用200μg(以1mg/mL稀释度制备)纯化的KLH-缀合肽([C]-KKIETHKLTFREN(SEQ ID NO:13)，对应于2N4R tau的氨基酸369-381)免疫兔。分别在第94天和第97天给予佐剂和抗原加强(i.p.)，然后在第104天进行最终取血并使用标准方法(Hancock&O'Reilly Methods[汉考克-奥莱利方法]Mol Biol[分子生物学]295:27-40(2005))收集抗血清。
动物饲养和所用的程序符合1966年动物福利法案(美国动植物卫生检验局)。
3.2：肽ELISA(图2)：为了证实强免疫应答的生成，在免疫后的不同时间点测试血清对固定的靶抗原的免疫反应性。免疫后第76天采集的血清在1:1000-1:1000,000的稀释度下显示对线性肽靶标的免疫反应性，这表明IgG滴度足以进行单克隆抗体分离。
将ELISA板用抗原(非缀合抗原肽(抗原肽([C]-KKIETHKLTFREN-酰胺(SEQ ID NO:13)；在1x PBS中2μg/孔)在4℃包被过夜。从孔中去除抗原，并将板在RT下用1x PBS中的5％奶粉封闭1小时。去除封闭溶液，将100μL稀释的血清(在1％BSA/1x PBS中稀释)添加到相关孔中，并将板在RT下温和振荡孵育1小时。然后用PBS/0.1％Tween(PBST)洗涤板四次。将在含1％BSA的PBS中1:10,000稀释的抗兔IgG-HRP抗体(美国密苏里州圣路易斯的西格玛公司)添加到每个孔中，并将板在RT下温和振荡孵育30分钟，然后用PBST洗涤四次。向每个孔中添加50μL 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)ELISA溶液，并将板在RT下孵育15分钟，向每个孔中添加等体积的1M硫酸并在450nm下测量OD。
实例4：对靶表位具有特异性的单克隆IgG的分离
使用专有方法(美国加利福尼亚州圣地亚哥的外显子生物公司)，通过Exonbio使用靶免疫原鉴定和分离96个单个抗原特异性浆细胞。
用Ficoll梯度(1.084)从免疫兔的脾中分离脾细胞，并用浆细胞标记物和生物素缀合的抗原染色。分离抗原特异性浆细胞并以每孔一个细胞分选到96孔板中。通过单细胞聚合酶链式反应(PCR)单独扩增抗体重链和轻链的可变区。然后将扩增的重链和轻链克隆到pRab293质粒中，并使用英杰生命技术有限公司(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)293fectin转染试剂，按照制造商的说明书，在无血清培养基中的HEK293F悬浮细胞中表达。
Figure BDA0004094741790000461
Figure BDA0004094741790000471
实例5：瞬时表达的IgG结合分离的肽免疫原(图3)。
在HEK293F细胞中瞬时表达单个兔IgG克隆以便生成用于体外测试的IgG样品。测试含有单个IgG克隆的上清液结合短肽免疫原([C]-KKIETHKLTFREN-酰胺；SEQ ID NO:13)和全长2N4R重组tau蛋白(SEQ ID NO:2)两者的能力。发现23个克隆结合全长tau，OD>0.3，并将其优先用于测序。鉴定并表达了十七个独特的克隆(表5)。数据证明了短肽免疫原([C]-KKIETHKLTFREN-酰胺)用于生成能够结合全长重组2N4R tau的IgG的效用；并证明了17个优先化克隆结合免疫原和全长2N4R tau两者的能力。
5.1 IgG在HEK细胞中的瞬时表达
在HEK293F细胞中瞬时表达单个兔IgG克隆以便生成用于体外测试的IgG样品。使用293fectin转染试剂(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰生命技术有限公司)，按照制造商的说明书，用pRab293质粒中的构建体瞬时转染悬浮培养的HEK293F细胞。
转染后7天收集上清液。使用AKTA色谱系统(美国伊利诺伊州芝加哥的通用电气医疗公司)上的蛋白A柱(25mL树脂)和标准方法纯化抗体。简而言之，用上清液以5mL/min上样到蛋白A柱上，然后用PBS洗涤(5x总柱体积)。收集蛋白质峰并在PBS中在4℃透析过夜。
为了生成mg量的IgG，将300mL-1升HEK293F细胞瞬时转染，并在转染后7天使用如上所述的蛋白A柱从培养基中纯化IgG。
5.2肽ELISA.
将ELISA板用抗原(非缀合抗原肽([C]-KKIETHKLTFREN-酰胺(SEQ ID NO:13))或全长2N4R tau(SEQ ID NO:2)，100ng/孔，或1x TBS中的1％BSA)在1x碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液中在37℃包被1小时。从孔中去除抗原，然后将板在RT下用在1x TBS中的5％奶粉封闭1小时。去除封闭溶液，将HEK293F细胞上清液(10μg/mL至0.0001μg/mL，在1％BSA/1x TBS中)添加到相关孔中，并将板在RT下温和振荡孵育1小时。然后用TBS/0.1％Tween(TBST)洗涤板四次。将在5％乳/TBS中1:5000稀释的抗兔IgG-HRP抗体(美国密苏里州圣路易斯的西格玛公司)添加到每个孔中，并将板在RT下温和振荡孵育1小时，然后用TBST洗涤四次。将3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)ELISA溶液添加到每个孔中，并将板在RT下孵育15分钟。向每个孔中添加等体积的1M硫酸并在450nm下测量OD。
实例6：单克隆抗体通过ELISA以浓度依赖性方式检测全长重组tau。
抗tau兔IgG克隆#66(克隆1)和#44(克隆2)以浓度依赖性方式结合固定在ELISA板上的全长重组2N4R tau(SEQ ID NO:2)，分别在0.82nM[0.7至0.95nM]和1.05nM[0.96至1.15nM]观察到半数最大ELISA信号(给出单个实验中n＝2个孔的平均值和95％置信区间)。数据证明两个克隆与全长tau的高亲和力结合。
实例7：单克隆抗tau抗体检测人iPSC衍生的神经元培养物中的tau。
蛋白质印迹证明了抗tau IgG检测重组和天然表达的tau的能力。含有兔IgG克隆#12(克隆3)、#44(克隆2)、#45(克隆4)或#66(克隆1)的HEK293F细胞衍生的上清液(根据实例5.1生成)在约60kD检测到全长重组2N4R tau(SEQ ID NO:2)(美国佐治亚州沃特金斯维尔的重组肽公司(rPeptide,Watkinsville,GA,USA))作为主条带。所有测试的克隆均能够检测加载到单个泳道中的22ng tau。所有4个克隆均在人iPSC衍生的神经元裂解物中检测到约50kD的主条带。用λ磷酸酶处理神经元裂解物使蛋白质去磷酸化，降低了在神经元裂解物中检测到的tau物质的表观分子量(与成功的去磷酸化一致)，但不影响抗体检测天然表达的tau的能力。数据证明，所有4个测试的IgG克隆均同等好地结合磷酸化和去磷酸化的tau样品，并且能够通过蛋白质印迹检测重组和天然表达的tau。
纯化的克隆#44(克隆2)和#66(克隆1)IgG检测来自NDC、疾病-AD相关(PSENY115C，三体性21)和FTD相关(MAPT IVS10+16)遗传背景的人iPSC衍生的神经元中的tau(图6)。在每个神经元样品中检测到约50kD的主条带。可商购获得的抗体HT7(针对对应于2N4Rtau的氨基酸159-163的表位产生；美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰生命技术有限公司)也在用于再次探测印迹时检测到约50kD的主条带，与代表全长tau的这种情况一致。数据显示，可通过靶向对应于2N4R tau(SEQ ID NO:2)的氨基酸369-381(SEQ ID NO:1)的表位的抗体来检测培养物中人iPSC衍生的神经元中细胞内存在的tau。
实例8：与非痴呆的对照死后脑相比，单克隆抗tau抗体检测到家族性阿尔茨海默病(fAD)中tau水平的增加。
使用来自NDC和阿尔茨海默病患者的脑裂解物进行蛋白质印迹。含有IgG克隆#12(克隆3)、#44(克隆2)、#45(克隆4)或#66(克隆1)的HEK293F细胞衍生的上清液检测人死后脑样品中的tau。与NDC脑样品相比，所有4个克隆均检测到AD中tau水平的增加，包括所测试的NDC样品中不存在的多个高(>75kD)和低(<40kD)分子量种类。数据证明，靶向对应于2N4Rtau的氨基酸369-381(SEQ ID NO:1)的序列的4个不同的IgG克隆，除了存在于NDC和疾病样品中的约50kD的条带外，均还在AD脑裂解物中检测到类似模式的疾病特异性高分子量和低分子量种类的tau。这提示所做的观察可推广到所有与SEQ ID NO:1结合的抗体。
当评估更广泛选择的死后样品时，纯化的克隆#44(克隆2)和#66(克隆1)IgG再次检测到对应于不同形式的tau的多个种类，其中阿尔茨海默病样品中高分子量和低分子量种类两者的检测增加(图8)。包括肌动蛋白和神经元微管蛋白以分别对照载量和死后蛋白质降解，证明AD样品中tau的检测增加不是蛋白质载量增加或降解减少的结果，而是反映了与NDC相比AD脑中含有C-末端tau的种类的丰度增加。值得注意的是，靶向SEQ ID NO:1的抗体在死后脑样品中检测到tau物质的不同模式，这种模式通过可商购获得的抗中间区tau抗体HT7未检测到。这些包括与NDC脑样品相比在AD中丰度明显增加的低和高MW种类。通过HT7抗体检测到的低分子量种类与非疾病脑相比在疾病中相对不变或减少。这提示通过本文所述的新型抗体检测到疾病特异性tau物质，而通过可商购获得的中间区抗体未检测到。数据证实与对照相比，阿尔茨海默病脑中含有感兴趣表位的tau物质的存在和丰度增加。
8.1人脑样品：人死后脑样品获自英国伦敦神经变性疾病脑库。所有工作都是伦理上批准的，并且在脑捐献之前获得知情同意。阿尔茨海默病脑样品来自患有家族性阿尔茨海默病(PSEN1突变；总结在表6中)的个体的额叶皮质。非痴呆对照脑样品来自没有显示痴呆临床征象的年龄匹配的个体。对照个体的死亡原因为：肺癌(1)、冠状动脉闭塞(2)、肺癌(3)、急性肝衰竭(4)、转移性前列腺癌(5)；预测它们都不会影响死后检测到的tau水平/种类。
Figure BDA0004094741790000501
Figure BDA0004094741790000511
表6：AD脑样品中存在的与家族性阿尔茨海默病相关的已知突变的总结。
实例9：与非痴呆对照死后脑相比，单克隆抗tau抗体在散发性阿尔茨海默病(AD)和路易体痴呆(DLB)中检测到tau水平的增加。
为了将数据集扩展到超过家族形式的AD，通过蛋白质印迹评估来自散发性AD和DLB患者的死后脑样品。当与NDC相比，克隆#66(克隆1)IgG检测到所有疾病相关样品中高分子量和低分子量tau物质的水平均增加。如前所述(实例8)，可商购获得的中间区tau抗体HT7和BT2(马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔公司)在所有样品中均检测到一系列主要较低分子量(<40kD)的tau物质(除了约50kD的全长tau)，没有可检测的疾病相关性增加。肌动蛋白和神经元微管蛋白对照证实tau水平的变化不是由于所示样品中蛋白质和/或神经元水平的变化。数据证明，除了家族性AD以外，在散发性AD和tau蛋白病脑中也存在含有感兴趣表位(SEQ ID NO:1)的tau物质且其丰度增加。这提示这些种类可能是AD和tau蛋白病的一般特征，并且靶向该区域的治疗剂除了治疗散发性和家族性形式的AD外还在一系列tau蛋白病中具有广泛的效用。
9.1人脑样品：关于人死后脑样品的来源参见实例8。所有样品来自患有临床和病理学证实的散发性阿尔茨海默病(Braak 6期)或DLB的个体的额叶皮质。非痴呆对照脑样品来自未显示痴呆的临床征象或AD/tau蛋白病的病理征象(Braak 0期)的年龄匹配的个体。注意到对照个体的死亡原因预测不会影响死后检测到的tau水平/种类。
实例10：抗tau IgG通过免疫细胞化学检测人iPSC衍生的神经元培养物中天然表达的tau。
使用克隆#66(克隆1)通过免疫细胞化学观察在NDC和FTD相关(MAPT IVS10+16)iPSC衍生的神经元中的tau表达(第50+天)。染色模式与tau的主要轴突定位一致，具有低水平的背景。数据证明，克隆#66(克隆1)能够在人神经元中原位检测天然表达的tau，并且是组织学分析的有用工具。
实例11：单克隆抗体在夹心免疫测定中检测全长重组tau
抗tau兔IgG克隆#44(克隆2)和#66(克隆1)在中尺度发现(MSD)测定中检测到重组tau作为抗体对的一部分。使用全长重组2N4R tau(美国佐治亚州沃特金斯维尔的重组肽公司)和克隆#44(克隆2)或#66(克隆1)作为捕获抗体，结合可商购获得的多克隆抗体K9JA(靶向氨基酸244-441；美国加利福尼亚州圣塔克拉拉的安捷伦公司)或可商购获得的单克隆抗体Tau5(靶向氨基酸210-241；美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司)来构建标准曲线。每个测定的检测限约为80pg/mL。数据证明了靶向感兴趣表位(SEQ ID NO:1)的抗体与可商购获得的单克隆或多克隆抗体组合用于使用夹心免疫测定检测tau的效用。
实例12：抗tau IgG抑制单体和聚集的tau摄入人神经元
细胞外单体和聚集的tau通过胞吞作用和巨胞饮作用的组合被人神经元摄取(Evans等人(2018)Cell Rep[细胞通讯]22(13):3612-3624)。该过程在生理学上发生，但也被认为在tau蛋白病(包括阿尔茨海默病)中观察到的毒性形式tau的致病性扩散中起作用。因此，预测抑制毒性tau物质的摄取在限制脑中tau病理的扩散方面是治疗上有益的。tau的神经元摄取可通过测量与用pH敏感性染料pHrodo标记的tau相关的荧光来评估和定量。标记的tau内化进入酸性内体区室后发生荧光增加，从而提供tau摄取/内化的动态测量。抗tau IgG克隆#44(克隆2)和#66(克隆1)抑制pHrodo标记的单体tau(在4小时时分别为65％和71％抑制)和pHrodo标记的聚集tau(在4小时时分别为56％和47％抑制)摄入人iPSC衍生的神经元。同种型对照抗体(单克隆兔IgG；美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司)对该系统中的tau摄取没有显著影响。
数据证明，靶向SEQ ID NO:1的抗体能够减少人神经元对含有该表位的tau物质的摄取。因此，预测此类抗体将限制包含该表位(SEQ ID NO:1)的毒性tau物质在阿尔茨海默病和tau蛋白病中的神经元-神经元传播，从而减少/减缓患者临床症状的进展。
12.1人iPSC衍生的大脑皮质神经元的产生：如实例1.1中所详述
12.2聚集(寡聚)的tau物质的生成：Tau P301S_10xhis-tag_avi-tag在BL21(DE3)细菌中过表达。使用BugBuster(美国马萨诸塞州伯灵顿的密理博公司)裂解细胞，并将澄清的裂解物施加到在2x PBS中的5mL HisTrapHP柱(美国伊利诺伊州芝加哥的通用电气医疗公司)上。使用0-500mM咪唑梯度洗脱tau。合并峰级分并使用Superdex 200 16/60凝胶过滤柱(美国伊利诺伊州芝加哥的通用电气医疗公司)在2x PBS中进一步纯化。然后使用旋转浓缩器(美国马萨诸塞州伯灵顿的密理博公司)将合并的级分浓缩至约8mg/mL。通过Nanodrop分析确定最终蛋白质浓度。
将8mg/mL的1mL tau P301S与4mg/mL肝素(美国密苏里州圣路易斯的西格玛公司)在PBS/30mM 3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)(pH 7.2)中在37℃孵育72小时。将聚集的物质在9mL PBS加1％(v/v)sarkosyl(美国密苏里州圣路易斯的西格玛公司)中稀释并在RT下摇动1小时以完全溶解任何未聚集的物质。通过在4℃超速离心1小时将不溶性tau沉淀。将沉淀物重悬于1mL PBS中并在100W下超声处理3×20s(Hielscher UP200St超声波仪；德国特尔托公司(Teltow,Germany))以分散团块或蛋白质并将大的细丝破碎成较小的种类。
12.3纯化的重组tau的标记：单体重组2N4R tau购自重组肽公司(美国佐治亚州沃特金斯维尔)。如上所述制备聚集tau。将重组单体tau(150μM)或等同的聚集tau浓度(约7μg/mL)与1.5mM pHrodo Red马来酰亚胺(溶解于DMSO中)和1.5mM三(2-羧乙基)膦(分别为1:10:10摩尔比)在黑暗中在RT下孵育2小时。然后将标记的样品在50mM磷酸盐(pH 7.4)和150mM NaCl溶液中在4℃进行尺寸排阻色谱(Superdex 200Increase 10/300GL；美国伊利诺伊州芝加哥的通用电气医疗公司)以去除未反应的染料。评估聚集体的寡聚状态并发现其不受标记的影响。
12.4人iPSC衍生的皮质神经元对tau摄取的定量：在N2B27(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司)中制备单体tau(25nM)和聚集tau(50nM)，并与相对于tau为10倍摩尔过量的抗体(即250和50nM IgG)在37℃下孵育90分钟。将100μL抗体/tau混合物添加到NDC神经元中(第60+天)，并使用Opera Phenix成像系统(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的珀金埃尔默公司(Perkin Elmer,Waltham,MA,USA))在37℃/5％ CO2下从每孔18个视野中每15分钟对荧光成像4小时。使用识别Alexa 568通道中的“强斑点”的算法来定量每孔荧光的强斑点的数量，并且将这些绘制为n＝4个细胞随时间的平均值+/-SEM。相对于无抗体对照进行单向ANOVA和Dunnett多次对比检验以确定显著性。
实例13.来自从人iPSC衍生的神经元获得的条件培养基的单克隆抗tau IgG免疫耗竭tau物质(图2)
在神经元诱导后第70天和第80天之间以48小时间隔从人iPSC衍生的神经元培养物(如实例1.1中所述生成)收集分泌组。在-20℃冷冻之前，通过离心使分泌组澄清。将样品在冰上解冻并对人工脑脊液(aCSF)透析。通过用单克隆抗体和蛋白G琼脂糖珠在4℃下孵育2轮12小时来实现tau的免疫耗竭，来自兔的免疫前血清用作对照以模拟耗竭样品。从两个遗传上不同的三体性21系和一个NDC生成的iPSC衍生的神经元培养物收集分泌组。使用中间区(BT2(马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔公司)/Tau5抗体对)MSD测定和微管结合区(MTBR；K9JA/K9JA抗体对)测定定量tau水平证实与NDC相比在三体性21分泌组中存在升高的tau水平。此外，MTBR tau水平显著(至少4x)低于中间区tau，这表明切割事件导致生成缺少MTBR和/或C-末端结构域的中间区tau片段，或存在其中MTBR和/或C-末端表位不可用的tau物质。克隆#44(克隆2)和#66(克隆1)耗竭来自所有三个分泌组的tau物质(图2)。克隆#44(克隆2)和#66(克隆1)在三体性21分泌组中(B系，深灰色条，分别被#44(克隆2)和#66(克隆1)耗竭58％和47％；以及，C系，黑色条，分别被#44(克隆2)和#66(克隆1)耗竭62％和60％)比在NDC分泌组中(浅灰色条，分别被#44(克隆2)和#66(克隆1)耗竭42％和17％)更大程度地耗竭含有MTBR的tau，表明与NDC分泌组相比，在三体性21中包括MTBR和靶表位(SEQID NO:1)两者的tau物质的相对水平增加。克隆#44(克隆2)和#66(克隆1)仅耗竭来自TS21分泌组(非NDC)的中间区tau，最显著地来自一个批次(C系；分别为16％和34％)，表明含有中间区和靶表位(SEQ ID NO:1)两者的tau物质的疾病特异性存在。这些数据证明，与NDC相比，存在于疾病中的不同tau物质的平衡发生了改变(可能是由于疾病特异性切割事件、改变的翻译后修饰和/或构象变化)，从而导致绝对tau水平以及可通过靶向SEQ ID NO:1的抗体检测的含有MTBR和/或MR的tau的比例两者的增加。
Figure BDA0004094741790000541
Figure BDA0004094741790000551
表8.示出了相对于免疫前血清基于使用中间区和MTBR测定定量的tau水平的测试抗体的免疫耗竭效率(以去除百分比计)。
实例14.通过在给药前用IgG克隆#44(克隆2)或#66(克隆1)免疫耗竭样品来预防由三体性21神经元分泌组引起的tau介导的对体内长时程增强作用(LTP)的阻断(图3)
对尿烷麻醉(105-106g/kg，腹膜内)的雄性Lister Hooded大鼠(250-350g)进行电生理学实验。如前所述(Hu等人(2014)Nature Commun[自然-通讯]5:3374)，通过记录响应于200Hz高频刺激(HFS)前后同侧Schaffer侧枝/连合通路刺激的CA1辐射层的场兴奋性突触后电位(EPSP)来测量海马LTP。在诱导突触可塑性前30分钟，经由套管将分泌组注射到大鼠的侧脑室中。
在v6.07(美国加利福尼亚州拉霍亚的格拉夫派得软件公司(GraphPad Software,La Jolla,CA,USA))中进行LTP的所有统计分析。LTP的量值表示为HFS前基线EPSP幅值的百分比(±SEM)。n是指每组动物的数量。整个过程中随机交错进行对照实验。对于图形表示，EPSP幅值被分组为5分钟时期；为了统计分析，将EPSP幅值分组为10分钟时期。使用单向ANOVA与Sidak多次对比检验(单向ANOVA-Sidak)在三个组或更多个组之间进行比较。当仅有两组时，使用具有Sidak多次对比检验重复测量的双向ANOVA(双向ANOVA RM-Sidak)。进行配对t检验以比较组内HFS前后的值。p<0.05的值被认为是统计学显著的。
测试了从三体性21“C系”(图2所示)分离的分泌组。与媒介物对照处理的动物相比，模拟耗竭样品显著阻断LTP的诱导(p<0.01)，与分泌组中“毒性”或抑制性分子的存在一致，如前所述(Hu等人,2014,Nat Commun[自然-通讯]5:3374)。使用克隆#44(克隆2)或#66(克隆1)去除包含靶表位(SEQ ID NO:1)的tau物质而免疫耗竭的三体性21分泌组当与基线相比时表现出统计学显著的LTP(分别为p<0.01和p<0.001)(图3)。数据证明，通过去除包含靶表位(SEQ ID NO:1)的tau物质可防止由三体性21分泌组诱导的LTP阻断，并因此显示含C末端的tau物质负责LTP阻断的一个组分。因此，预测通过施用特异性抗体在患者中去除这些tau物质将为治疗上有用的。
实例15：具有效应子功能的单克隆抗tau抗体增加小胶质细胞对tau的摄取
小胶质细胞在清除中枢神经系统中的细胞外物质中发挥重要作用，以防止碎片的积累并使修复过程能够发生。在神经变性疾病的情况下，细胞外蛋白(包括聚集、寡聚和单体形式)的吞噬作用有助于降低这些种类的细胞外浓度。与单独tau或tau加同种型对照IgG条件相比，具有效应子功能(即兔IgG Fc)的抗体克隆#44(克隆2)和#66(克隆1)增加人iPSC衍生的小胶质细胞对单体和聚集的tau的摄取。数据提示具有效应子功能的治疗性抗体(例如，格式化为hIgG1)将增加小胶质细胞对毒性形式的tau的清除，并由此降低CNS中毒性形式的tau的细胞外浓度和有害作用。预测这种活性将是治疗上有益的。
实例16.人AD CSF含有C-末端tau。
为了使抗体在体内/患者中有效地靶向tau，相关的tau物质必须存在于细胞外。为了证明含有感兴趣表位(SEQ ID NO:1)的细胞外tau物质的存在，我们使用抗体克隆#44(克隆2)从获自AD患者的合并的脑脊液(CSF)样品中纯化tau。然后用胰蛋白酶消化结合的蛋白质并通过质谱进行解析(图4)。鉴定了多种tau肽，包括位于抗体表位附近的C-末端肽(SPVVSGDTSPR；对应于2N4R tau的氨基酸396-406；SEQ ID NO:12)。这些数据证实了AD CSF中包含抗体表位(SEQ ID NO:1)和其他C-末端区域两者的tau物质的存在，并证明了此类种类在细胞外的存在。因此，这些含C-末端tau的种类可被治疗性抗体靶向并存在于可用于生物标记物检测的流体中。
实例17.抗tau IgG抑制单体和聚集的tau摄入人星形胶质细胞
关于人星形胶质细胞对细胞外tau物质的摄取的有限信息是可用的，尽管已知这在啮齿动物中发生(Martini-Stoica等人J Exp Med[实验医学杂志]215(9):2355-2377(2018))。此外，最近描述的用于神经元tau摄取的受体即脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)，被报道在星形胶质细胞中表达(Rauch等人Nature[自然]580(7803):381-385(2020))，提示摄取机制可能是共同的。作为中枢神经系统中的主要细胞类型，在阿尔茨海默病和tau蛋白病中tau病理的传播中具有推定的作用(综述见
Figure BDA0004094741790000571
&
Figure BDA0004094741790000572
BiochemJ[生物化学杂志]476(22):3493-3504(2019))，我们研究了靶向对应于2N4R tau的氨基酸369-381的序列(SEQ ID NO:1)的抗体是否对星形胶质细胞对tau物质的摄取有任何影响。
人iPSC衍生的星形胶质细胞容易摄取单体和聚集的tau物质。与不存在抗体时的摄取相比，tau与抗tau克隆#44的孵育显著(P<0.001)使单体2N4R tau的摄取抑制98.4％±0.4％并使聚集tau的摄取抑制43.3％±2.9％。数据提供了靶向SEQ ID NO:1的治疗性抗tau抗体将减少星形胶质细胞对毒性形式tau的摄取，并由此减少星形胶质细胞对tau病理传播的影响的证据。预测这种活性是治疗上有益的。
实例18.单克隆抗tau嵌合人IgG1增加人iPSC衍生的小胶质细胞对单体和聚集的tau的摄取
如实例15所述，具有效应子功能的单克隆抗tau兔IgG增加小胶质细胞对单体和聚集的tau的摄取。用抗tau人IgG1也观察到这种tau摄取的增加。与单独摄取tau相比，表达为嵌合人IgG1(即具有效应子功能)的抗体克隆#66(克隆1)显著增加人iPSC衍生的小胶质细胞对单体tau(56％±7％；p<0.001)和聚集tau(59％±9％；p<0.05)两者的摄取。与不存在抗体时的基线tau摄取相比，同种型对照人IgG1对单体tau(6.7％±6％减少)或聚集tau(23％±9％减少)的小胶质细胞摄取没有显著影响。数据提供了进一步的证据，即治疗性hIgG1将增加小胶质细胞对细胞外tau的清除，从而降低CNS中细胞外形式的tau的细胞外浓度和有害作用。预测这种活性是治疗上有益的。
18.1嵌合hIgG1抗体的产生：使用兔VH和VK序列(SEQ ID NO:116和117，克隆1，#66)，使用专有方法(HEXpressTM服务)，通过绝对抗体(英国牛津公司(Oxford,UK))生成嵌合hIgG1。简而言之，抗体在HEK293细胞中瞬时表达后产生，亲和纯化，缓冲液交换到磷酸盐缓冲盐水中，无菌过滤并以>98％的纯度(基于SDS-PAGE)提供<1EU/mg内毒素。
18.2人iPSC衍生的小胶质细胞的生产：人多能干细胞(iPSC)向小胶质细胞培养物的分化如Brownjohn等人Stem Cell Rep[干细胞报告]10(4):1294-1307(2018)所述进行。使用来自NDC背景的iPSC系。收集小胶质细胞祖细胞，铺板于96孔板中，并在使用前在完全的小胶质细胞培养基(如Brownjohn等人，2018中所述)中维持约14天。在使用前一天，将培养物转入无血清培养基(补充有10ng/mL GM-CSF和100ng/mL IL-34(来自美国新泽西州的佩普罗泰克(Peprotech,NJ,US)的生长因子)的RPMI 1640/Glutamax)，并在无血清条件下完成吞噬作用实验。
18.3聚集(寡聚)的tau物质的生成：参见实例12.2
18.4纯化的重组tau的标记：参见实例12.3。
P301S tau用于单体和聚集的tau两者的制备。
18.5人iPSC衍生的小胶质细胞对tau摄取的定量：在无血清小胶质细胞培养基中制备单体tau(25nM)和聚集tau(50nM)，并以1:10比率的抗体:tau(即分别为2.5和5nM IgG)在37℃下孵育90分钟。将抗tau hIgG1与同种型对照(抗荧光素[4-4-20(增强型)]，绝对抗体，英国牛津公司)进行比较。将100μL抗体/tau混合物添加到iPSC衍生的小胶质细胞中，并使用Incucyte S3成像系统(德国哥廷根的赛多利斯公司(Sartorius,
Figure BDA0004094741790000581
Germany))在37℃/5％ CO2下从每孔9个视野中每30分钟拍摄图像(明视野和橙色通道)持续16小时。将定量(每孔)橙色通道中荧光的平均面积的算法(激发：513-568nm)归一化为由细胞占据的平均面积(相面积)，并将其绘制为n＝4个细胞随时间的平均值+/-SEM。相对于无抗体对照进行单向ANOVA和Tukey多次对比检验以确定显著性。
实例19.抗tau IgG以高亲和力结合tau
抗tau IgG以高亲和力结合全长2N4R tau(SEQ ID NO:2)。克隆#66(克隆1)和克隆#44(克隆2)分别以2.39nM和3.83nM的KD结合全长重组2N4R tau(表9)。预测这些抗体的结合亲和力将等同于含有对应于2N4R tau蛋白的氨基酸369-381(SEQ ID NO:1)的表位的任何tau物质，如果该序列是可及的。
19.1嵌合hIgG1抗体的产生：如实例18.1所述生成克隆#66hIgG1。克隆#44hIgG1由阿布泽纳公司(英国剑桥(Cambridge,UK))使用兔VH和VK序列(SEQ ID NO:118和119，克隆2，#44作为亲本VH和VK)并使用专有方法生成。简而言之，抗体在CHO细胞中瞬时表达后产生，亲和纯化，缓冲液交换到磷酸盐缓冲盐水中，无菌过滤并以>98％的纯度提供(在尺寸排阻色谱法后)。
19.2抗体与tau结合的评估：使用运行Biacore T200评价软件V2.0.1的BiacoreT200(美国伊利诺伊州芝加哥的通用电气医疗公司)评估抗tau hIgG1与全长重组2N4R tau(重组肽公司；SEQ ID NO:2)的结合。在25℃下将hIgG1固定在运行缓冲液(HBS-EP+含有1mg/mL BSA的缓冲液)中的蛋白A捕获传感器芯片上，以10μL/min捕获至约50RU。对于多循环动力学实验(克隆#66)，重组2N4R tau以0.39nM至50nM范围内的浓度在运行缓冲液中以40μL/min流动，结合时间为150s且解离时间为250s。将多循环动力学实验的优化条件应用于克隆#44：使重组2N4R tau以0.39nM至12.5nM(2倍稀释)范围内的浓度流动，结合时间为60s且解离时间为200s(剪至65s以提高分析拟合)。将曲线与模拟固定的参考细胞(不存在抗体)进行比较。
使用描述表面处的1:1相互作用的Langmuir(1:1)结合分析来分析数据：
Figure BDA0004094741790000591
其中：ka为结合速率常数(M-1s-1)并且kd为解离速率常数(s-1)
根据描述实验曲线和拟合曲线之间的偏差的卡方值来判断拟合的接近度：
Figure BDA0004094741790000592
其中：rf为在给定点的拟合值，rx为在同一点的实验值，n为数据点的数量，p为拟合参数的数量。拟合算法试图最小化卡方值。
抗体 <![CDATA[K<sub>a</sub>(1/Ms)]]> <![CDATA[K<sub>d</sub>(1/s)]]> <![CDATA[K<sub>D</sub>(M)]]> <![CDATA[R<sub>MAX</sub>]]> <![CDATA[Chi<sup>2</sup>(RU<sup>2</sup>)]]>
#66 2.01E+06 0.004783 2.39E-09 25.98 0.194
#44 2.07E+06 9.68E-03 4.68E-09 30.5 0.041
表9.克隆#66(克隆1)和#44(克隆2)与全长重组2N4R tau结合的MCK结合分析数据的总结。
实例20：抗tau抗体结合区域373THKLTFR379内的不同表位。
进行表位精细作图以鉴定2N4R tau的氨基酸369-381即SEQ ID NO:1内抗体结合所需的关键残基。在置换分析中，将每个残基突变为其他氨基酸以评价该残基对于与抗体结合的重要性。
对于抗体克隆#44(克隆2)，置换分析显示区域373THKLTFR379中的氨基酸残基对于结合是重要的(图5A)。具体地，残基T373、K375、T377和R379作为这些残基的取代导致所有取代的强度下降。K375、T377和R379的取代将信号强度降低至背景水平，提示它们对于该克隆的结合是关键的。
对于抗体克隆#66(克隆1)，374HKL376和378FR379对于结合是重要的(图5B)。具体地，L376或F378的取代导致所有取代的抗体结合降低，提示这些残基的关键作用。
在该系统中几乎没有检测到同种型对照兔IgG的结合(图5C)，表明抗tau抗体克隆#44和#66获得的ELISA信号是CDR特异性的。
数据证明，本文所述的抗体(以克隆#44(克隆2)和#66(克隆1)为例)结合肽序列(2N4R tau的氨基酸369-381；SEQ ID NO:1)内的不同特异性表位。所描述的这些抗体具有共同的功能特性，表明正是该序列内的且由该序列形成的表位决定了功能结果。
20.1表位取代扫描分析-肽合成：置换分析由派普斯坎公司(Pepscan Presto BV)(荷兰莱利斯塔德(Lelystad,The Netherlands))使用专有方法进行。简而言之，使用基于Fmoc的固相肽合成来合成肽文库。通过用专有的亲水聚合物制剂接枝，接着使用二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基苯并三唑(HOBt)与叔丁氧基羰基-六亚甲基二胺(BocHMDA)反应，并且随后使用三氟乙酸(TFA)切割Boc-基团，获得氨基官能化聚丙烯支持物。使用标准Fmoc-肽合成法通过定制修改的JANUS液体处理站(珀金埃尔默公司)在氨基官能化的固体支持物上合成肽。
肽基于起始肽(369KKIETHKLTFREN381；SEQ ID NO:1)进行设计，使得每个氨基酸一次一个地突变为每个其他天然氨基酸。将迷你卡上肽的顺序随机化，并将数据与用同种型对照抗体(兔IgG；英国剑桥的艾博抗公司)获得的数据进行比较。
20.2表位取代扫描分析-ELISA筛选：在基于Pepscan的ELISA中测试抗体与每种合成肽的结合。将肽阵列与一抗溶液(5μg/mL；在4℃过夜)一起孵育。洗涤后，将肽阵列与1/1000稀释的猪抗兔IgG过氧化物酶缀合物(德国耶拿的丹科公司(DAKO,Jena,Germany))在25℃下孵育1小时。洗涤后，添加过氧化物酶底物2,2'-联氮双-3-乙基苯并噻唑啉磺酸盐(ABTS)和20μL/mL的3％ H2O2。1小时后，测量显色。用电荷耦合器件(CCD)-相机和图像处理系统定量显色。引用从CCD相机获得的值(范围：0至3000mAU)。
数据以示出每种测试肽获得的ELISA信号的字母图表示。观察到的与最大ELISA信号的偏差指示与测试抗体和靶肽的改变(降低)的结合相关的突变。
实例21：抗体克隆#44的人源化
兔抗体克隆#44使用由安迪拓普公司(Antitope)开发并由阿布泽纳公司商业化的Composite Human Antibody TechnologyTM人源化。人源化过程的目的是降低与使用非人单克隆抗体作为慢性治疗性治疗相关的免疫原性的可能性，同时保留亲本抗体的抗原结合亲和力。
设计了总共六个VH(SEQ ID NO:151-156)和四个VK序列(SEQ ID NO:157-160)(总结在图6中)并以所有可能的组合表达以产生24种新的人源化变体。当在哺乳动物细胞中表达时，含有VH1、VH2、VH3、VH4或VH5的变体形成结合全长重组2N4R tau的抗体(图7)。ELISA信号背景低，证明抗体相关信号是由于与tau的特异性相互作用。人源化变体的表达水平在HEK293细胞中瞬时转染后是可变的(参见表10)，因此从上清液的单一稀释物获得的ELISA信号不提供结合亲和力的指示。
Biacore单循环动力学(SCK)实验能够计算抗体KD。对于人源化变体，KD范围为3.2nM至14.2nM(分别对于VH1VK1和VH5VK3；总结在表10中)。含有VH6的变体不结合2N4Rtau(基于ELISA和Biacore数据)，表明在该序列中突变的残基可能是亲本抗体结合tau所需的。具体地，VH6在可能对于结合tau是必需的VH CDR1(A35S；根据Kabat编号)内包含突变。
数据证明，保留原始亲本CDR序列的克隆#44的人源化变体保留与tau的高亲和力结合(<20nM)。预测这些抗体的结合亲和力将等同于含有对应于2N4R tau蛋白的氨基酸369-381(SEQ ID NO:1)的表位的任何tau物质，如果该序列是可及的。该序列(SEQ ID NO:1)在哺乳动物物种中是100％保守的，因此预测对人tau所述的活性将适用于其他哺乳动物物种的tau。由于人源化变体的CDR序列与亲本抗体相同，并且与2N4R tau的结合是等同的，因此预测新变体的CDR驱动的生物活性将与亲本克隆#44等同。
21.1复合人抗体可变区的设计：使用Swiss PDB(Guex&Peitsch,Electrophoresis[电泳]18,2714-2722,1997)产生抗体V区的结构模型，并进行分析以鉴定V区中可能对抗体的结合特性是必需的重要“限制性”氨基酸。CDR内所含的大多数残基(使用Kabat和Chothia定义)连同许多框架残基被认为是重要的。
当与人抗体比较时，兔重链的第一个氨基酸在克隆#44中不存在(与大多数兔种系VH基因一样)。它还含有在兔种系基因的亚组中发现的VH FW3内的两个氨基酸缺失(图6)。
基于该分析，产生了复合人序列，其中CDR外部的替代残基具有宽范围，但在CDR序列内仅具有可能残基的窄范围。初步分析表明，来自几种人抗体的对应序列片段可组合以产生与兔序列中的CDR类似或相同的CDR。对于CDR外部和侧翼的区域，广泛选择的人序列片段被鉴定为新型人源化V区的可能组分。
21.2 CD4+T细胞表位回避(通过iTopeTM分析)：基于结构分析，鉴定了可用于产生人源化变体的一大组初步序列片段。选择这些片段并使用iTopeTM技术进行分析，用于计算机分析与人MHC II类等位基因结合的肽(Perry等人,Drugs R D[药物研发]9(6):385-96,2008)。iTopeTM软件预测肽的氨基酸侧链与34种人MHC II类等位基因的特异性结合口袋之间的有利相互作用。这些等位基因代表在世界范围内发现的最常见的HLA-DR等位基因，没有权重归因于在任何特定种族群体中最普遍发现的那些。关键结合残基的定位通过计算机生成9mer肽来实现，这些肽与跨越测试蛋白质序列的八个氨基酸重叠。
将鉴定为具有降低的MHC II类结合风险的所选择的序列片段组装成具有降低的T细胞表位的完整V区序列。变体序列示于图6中。
21.3人源化抗体变体的生成：由阿布泽纳公司(英国剑桥)使用专有方法生成新的人源化hIgG1变体。简而言之，合成编码复合人抗体可变区的DNA，将其克隆到具有人恒定区的表达载体(hIgG1)上，并瞬时转染到HEK293细胞中。收集并分析含有hIgG1的上清液。
21.4抗体与tau结合的评估(ELISA)：将ELISA板用全长2N4R tau(SEQ ID NO:2)(100ng/孔，或1x TBS中的1％ BSA)在1x碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液中在37℃包被1小时。从孔中去除抗原，然后将板在RT下用在1x TBS中的5％奶粉封闭1小时。去除封闭溶液，将HEK293细胞上清液(在1％ BSA/1x TBS中1:100)添加到相关孔中，并将板在RT下温和振荡孵育1小时。然后用TBS/0.1％ Tween(TBST)洗涤板四次。将在5％乳/TBS中1:2000稀释的山羊抗人IgG-HRP抗体(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司)添加到每个孔中，并将板在RT下温和振荡孵育1小时，然后用TBST洗涤四次。将3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)ELISA溶液添加到每个孔中，并将板在RT下孵育15分钟。向每个孔中添加等体积的1M硫酸并在450nm下测量OD。
21.5抗体与tau结合的评估(Biacore SCK分析)：使用运行Biacore T200评价软件V2.0.1的Biacore T200(美国伊利诺伊州芝加哥的通用电气医疗公司)评估抗tau hIgG1与全长重组2N4R tau(重组肽公司；SEQ ID NO:2)的结合。在25℃下将hIgG1固定在运行缓冲液(HBS-EP+含有1mg/mL BSA的缓冲液)中的蛋白A捕获传感器芯片上，以10μL/min捕获至约50RU。对于单循环动力学实验，使重组2N4R tau以1.25nM至10nM(2倍稀释)范围内的浓度流动，结合时间为60s且解离时间为200s。将曲线与模拟固定的参考细胞(不存在抗体)进行比较。
使用Langmuir(1:1)结合分析来分析数据，如实例19.2中所述。
Figure BDA0004094741790000631
Figure BDA0004094741790000641
表10.克隆#44的人源化变体与全长重组2N4R tau结合的结合分析数据总结(SCK)。亲本克隆#44被示出为VH0VK0(SEQ ID NO:118和119)，并且相对于该克隆计算“相对KD”值。HEK滴度基于转染后第7天的Octet分析。
实例22.人源化抗tau IgG以高亲和力结合tau
选择前五种人源化变体用于更大规模的表达和进一步表征(基于表10中总结的数据)：VH3VK3(SEQ ID NO:153和159)；VH3VK4(SEQ ID NO:153和160)；VH4VK2(SEQ ID NO:154和158)；VH4VK3(SEQ ID NO:154和159)；VH4VK4(SEQ ID NO:154和160)。从HEK293细胞中转染获得的产量低于预期，因此将CHO细胞用于这种更大规模生产。
抗体结合重组2N4R tau的Biacore多循环动力学(MCK)分析总结在图8和表11中。所有五种变体均显示出在嵌合亲本抗体2倍内的KD(VH0VK0；KD＝3.25nM)。认为RMAX的轻微变化可能是由于配体捕获的差异，而不是反映抗体结合特征的显著变化。
数据证实人源化变体保留亲本(兔)抗体(VH0VK0)克隆#44对全长2N4R tau的结合特性。如实例21所述，预测如果靶序列(SEQ ID NO:1)存在且可接近，则对人tau所述的活性将适用于其他哺乳动物物种的tau。
22.1蛋白A纯化的hIgG1抗体的产生：由阿布泽纳公司(英国剑桥)使用专有方法生成克隆#44VH0VK0和新的人源化hIgG1变体。简而言之，合成编码复合人抗体可变区的DNA，将其克隆到具有人恒定区的表达载体(hIgG1)上，并瞬时转染到CHO细胞中。收集含有hIgG1的上清液并将hIgG1亲和纯化，缓冲液交换到磷酸盐缓冲盐水中，无菌过滤，然后通过尺寸排阻色谱法(SEC)进一步纯化以实现>99％的最终单体纯度。
22.2抗体与tau结合的评估(Biacore MCK分析)：使用运行Biacore T200评价软件V2.0.1的Biacore T200(美国伊利诺伊州芝加哥的通用电气医疗公司)评估抗tau hIgG1与全长重组2N4R tau(重组肽公司；SEQ ID NO:2)的结合。在25℃下将hIgG1固定在运行缓冲液(HBS-EP+含有1mg/mL BSA的缓冲液)中的蛋白A捕获传感器芯片上，以10μL/min捕获至约50RU。对于多循环动力学实验，使重组2N4R tau以0.39nM至12.5nM范围内的浓度在运行缓冲液中以40μL/min流动，结合时间为60s且解离时间为200s。将曲线与模拟固定的参考细胞(不存在抗体)进行比较。
使用Langmuir(1:1)结合分析来分析数据，如实例19.2中所述。
Figure BDA0004094741790000651
表11克隆#44的纯化人源化变体与全长重组2N4R tau结合的Biacore MCK分析总结。亲本克隆#44被示出为VH0VK0，并且相对于该克隆计算“相对KD”值。人源化变体作为SEC纯化的样品进行测试。亲本IgG作为HEK293上清液进行测试。
实例23.人源化IgG变体是热力学稳定的
为了评估人源化变体开发成治疗性抗体的潜力，评估了每种抗体的热稳定性。数据总结在表12和图9中。平均解链温度(Tm)范围为对于VH4VK4的68.7℃至对于VH3VK3的71.9℃，这被认为是治疗性抗体可接受的。
23.1热稳定性分析：使用SYPRO orange(Lo等人,Analytical Biochem[分析生物化学]332(1):153-9,2004)评估热稳定性。如表13所指示制备样品。将9μL的每种样品混合物一式两份加载到Uncle Uni微量比色皿中，并使用“Tm using SYPRO”应用程序运行。使样品经受15℃-95℃的热升温，升温速率为0.3℃/min，并在473nm激发。从250-720nm收集全光谱，并且Uncle软件使用510-680nm之间的曲线下面积计算转变曲线的感染点。监测473nm处的静态光散射(SLS)允许在同一实验中检测蛋白质聚集。从所得SLS曲线计算聚集的起始(Tagg)。
Figure BDA0004094741790000661
表12克隆#44的人源化变体的热稳定性分布数据总结。亲本克隆#44示出为VH0VK0。
Figure BDA0004094741790000671
表13用于热稳定性分析的样品制备的细节(实例23.1)。
实例24.抗tau克隆#44的人源化变体抑制单体和聚集的tau摄入人iPSC衍生的神经元(图10、图11)
认为“毒性”形式的细胞外tau的神经元摄取在tau蛋白病诸如阿尔茨海默病中观察到的tau的致病性扩散中起重要作用。细胞外单体和聚集的tau通过胞吞作用和巨胞饮作用的组合被人神经元摄取(Evans等人(2018)Cell Rep[细胞通讯]22(13):3612-3624)。该过程在生理学上发生，但也被认为在tau蛋白病(包括阿尔茨海默病)中观察到的毒性形式tau的致病性扩散中起作用。因此，预测抑制毒性tau物质的摄取在限制脑中tau病理的扩散方面是治疗上有益的。tau的神经元摄取可通过测量与用pH敏感性染料pHrodo标记的tau相关的荧光来评估和定量。标记的tau内化进入酸性内体区室后发生荧光增加，从而提供tau摄取/内化的动态测量。靶向SEQ ID NO:1的抗tau兔IgG，包括抗体克隆#44(克隆2)，能够减少人神经元对含有该表位的tau物质的摄取(实例12)。预测表现出这种活性的抗体将限制细胞外tau物质在体内的神经元-神经元传播，并且因此是治疗上有用的。
测试的克隆#44的所有人源化变体显著(P<0.001)抑制单体tau摄入人iPSC衍生的神经元(图10)至如下与兔克隆的类似程度：48.4％±2.9％(VH3VK3)、43.1％±3％(VH3VK4)、50％±2.2％(VH4VK2)、41.8％±6.3％(VH4VK3)、62.8％±4.1％(VH4VK4)。测试的所有人源化变体也显著(P<0.001)抑制聚集tau摄入人iPSC衍生的神经元(图11)至如下与兔克隆类似的程度：30.6％±3.2％(VH3VK3)、33.3％±2.9％(VH3VK4)、41.9％±2.8％(VH4VK2)、36.3％±4.7％(VH4VK3)、34.9％±3.2％(VH4VK4)。同种型对照人IgG1抗体对该系统中的tau摄取没有显著影响(对于单体和聚集的tau分别抑制-3.4％±5.2％和-1.2％±5％)。
数据证明，与亲本兔抗体(#44，克隆2)一样，靶向SEQ ID NO:1的氨基酸序列的人源化抗体能够减少人神经元对含有该表位的tau物质的摄取。因此，预测此类抗体将限制包含由(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列形成的该表位的细胞外tau物质(单体和多聚体两者)在阿尔茨海默病和tau蛋白病中的神经元-神经元传播，从而减少/减缓患者临床症状的进展。
24.1人iPSC衍生的大脑皮质神经元的产生：参见实例1.1。
24.2聚集(寡聚)的tau物质的生成：Tau P301S_10xhis-tag_avi-tag在BL21(DE3)细菌中过表达。使用BugBuster(美国马萨诸塞州伯灵顿的密理博公司)裂解细胞，并将澄清的裂解物施加到在2x PBS中的5mL HisTrapHP柱(美国伊利诺伊州芝加哥的通用电气医疗公司)上。使用0-500mM咪唑梯度洗脱tau。合并峰级分并使用Superdex 200 16/60凝胶过滤柱(美国伊利诺伊州芝加哥的通用电气医疗公司)在2x PBS中进一步纯化。然后使用旋转浓缩器(美国马萨诸塞州伯灵顿的密理博公司)将合并的级分浓缩至约8mg/mL。通过Nanodrop分析确定最终蛋白质浓度。
将8mg/mL的1mL tau P301S与4mg/mL肝素(美国密苏里州圣路易斯的西格玛公司)在PBS/30mM 3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)(pH 7.2)中在37℃孵育72小时。将聚集的物质在9mL PBS加1％(v/v)sarkosyl(美国密苏里州圣路易斯的西格玛公司)中稀释并在RT下摇动1小时以完全溶解任何未聚集的物质。通过在4℃超速离心1小时使不溶性tau沉淀。将沉淀物重悬于1mL PBS中并在100W下超声处理3×20s(Hielscher UP200St超声波仪；德国特尔托公司(Teltow,Germany))以分散团块或蛋白质并将大的细丝破碎成较小的种类。
24.3纯化的重组tau的标记：单体重组2N4R tau购自重组肽公司(美国佐治亚州沃特金斯维尔)。如上所述制备聚集tau。将重组单体tau(150μM)或等同的聚集tau浓度(约7μg/mL)与1.5mM pHrodo Red马来酰亚胺(溶解于DMSO中)和1.5mM三(2-羧乙基)膦(分别为1:10:10摩尔比)在黑暗中在RT下孵育2小时。然后将标记的样品在50mM磷酸盐(pH 7.4)和150mM NaCl溶液中在4℃进行尺寸排阻色谱(Superdex 200Increase 10/300GL；美国伊利诺伊州芝加哥的通用电气医疗公司)以去除未反应的染料。评估聚集体的寡聚状态并发现其不受标记的影响。
P301S tau用于单体和聚集的tau两者的制备。
24.4人iPSC衍生的皮质神经元对tau摄取的定量：在N2B27(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司)中制备单体tau(25nM)和聚集tau(50nM)，并与相对于tau为10倍摩尔过量的抗体(即250和500nM IgG)在37℃下孵育90分钟。将克隆#44的人源化变体与同种型对照人IgG1(抗荧光素[4-4-20(增强型)]，绝对抗体，英国牛津公司)进行比较。将200μL抗体/tau混合物添加到NDC神经元中(第60+天)，并使用Incucyte S3成像系统(德国哥廷根的赛多利斯公司)在37℃/5％CO2下从每孔9个视野中每小时拍摄图像(荧光和明视野)持续21小时。将定量(每孔)橙色通道中荧光的平均面积的算法(激发：513-568nm)归一化为由细胞占据的平均面积(相面积)，并将其绘制为4个孔随时间的平均值+/-SEM。相对于无抗体对照进行单向ANOVA和Tukey多次对比检验以确定显著性。
实例25.抗tau IgG克隆#44的人源化变体抑制单体和聚集的tau摄入人星形胶质细胞(图12、图13)
认为细胞外tau的星形细胞摄取在tau蛋白病诸如阿尔茨海默病中观察到的tau的致病性扩散中起作用。
关于人星形胶质细胞对细胞外tau物质的摄取的有限信息是可用的，尽管已知这在啮齿动物中发生(Martini-Stoica等人J Exp Med[实验医学杂志]215(9):2355-2377(2018))。此外，最近描述的用于神经元tau摄取的受体即脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)，被报道在星形胶质细胞中表达(Rauch等人Nature[自然]580(7803):381-385(2020))，提示摄取机制可能是共同的。作为中枢神经系统中的主要细胞类型，在阿尔茨海默病和tau蛋白病中tau病理的传播中具有推定的作用(综述见
Figure BDA0004094741790000691
&
Figure BDA0004094741790000692
BiochemJ[生物化学杂志]476(22):3493-3504(2019))，我们研究了靶向对应于2N4R tau的氨基酸369-381的序列(SEQ ID NO:1)的抗体是否对星形胶质细胞对tau物质的摄取有任何影响。
人iPSC衍生的星形胶质细胞容易摄取单体和聚集的tau物质。靶向SEQ ID NO:1的抗tau兔IgG，包括抗体克隆#44(克隆2)，能够减少人星形胶质细胞对含有该表位的tau物质的摄取。与不存在抗体时的摄取相比，tau与抗tau兔克隆#44的孵育显著(P<0.001)使单体2N4R tau的摄取抑制98.4％±0.4％并使聚集tau的摄取抑制43.3％±2.9％。该数据提供了靶向SEQ ID NO:1的治疗性抗tau抗体将减少星形胶质细胞对毒性形式tau的摄取，并由此减少星形胶质细胞对tau病理传播的影响的证据。预测这种活性是治疗上有益的。
测试的克隆#44的所有人源化变体显著(P<0.001)抑制单体tau摄入人iPSC衍生的星形胶质细胞(图12)至如下与兔克隆类似的程度：85.2％±1.4％(VH3VK3)、87.6％±1.2％(VH3VK4)、84.6％±1.9％(VH4VK2)、87.5％±1.7％(VH4VK3)、94.1％±0.6％(VH4VK4)。测试的所有人源化变体也显著(P<0.001)抑制聚集tau摄入人iPSC衍生的星形胶质细胞(图13)至如下与兔克隆类似的程度：46.4％±3.9％(VH3VK3)、45.0％±2.8％(VH3VK4)、48.0％±2.1％(VH4VK2)、49.9％±2.2％(VH4VK3)、61.9％±2.8％(VH4VK4)。同种型对照人IgG1(抗荧光素[4-4-20(增强型)]，绝对抗体，英国牛津公司)对该系统中的tau摄取没有显著影响(对于单体和聚集的tau分别抑制-1.6％±4.5％和1.8％±3.9％)。
数据证明，与亲本兔抗体(#44，克隆2)一样，靶向由SEQ ID NO:1形成的表位的人源化抗体能够减少人星形胶质细胞对含有该表位的tau物质的摄取。预测这种活性是治疗上有益的。
25.1人iPSC衍生的星形胶质细胞的产生：使用来自NDC背景的iPSC系进行人iPSC向星形胶质细胞的分化。如针对皮质神经元所述生成神经上皮片(Shi等人,NatureProtocols[自然-实验室指南]7(10):1836-46,2012；方案遵循步骤31)。从第16天开始，将细胞用Accutase传代到新的基质胶包被的板(6孔板的1.5×106个细胞/孔)中，并转移到“星形胶质细胞分化培养基1”(Shi等人,Nature Protocols[自然-实验室指南]7(10):1836-46,2012中描述的神经维持培养基；补充有20ng/mL FGF2、20ng/mL EGF)中保持7天，每隔一天更换培养基。然后将细胞用Accutase传代到新的基质胶包被的板(如前)中，并转移到“星形细胞分化培养基2”(补充有10ng/mL BDNF、10ng/mL CNTF、1μM嘌吗啡胺的神经维持培养基)中保持7天，每隔一天更换培养基。然后将星形胶质细胞维持在“成熟培养基”(Neurobasal培养基，1x B27补充物，1％ FBS，50U/mL青霉素和50mg/mL链霉素，1XGlutaMAX)中直至使用(在约第130+天)。
25.2聚集(寡聚)的tau物质的生成：参见实例24.2
25.3纯化的重组tau的标记：参见实例24.3。
P301S tau用于单体和聚集的tau两者的制备。
25.4人iPSC衍生的星形胶质细胞对tau摄取的定量：在无血清Optimem(赛默飞世尔公司)培养基中制备单体tau(25nM)和聚集tau(50nM)，并与10倍摩尔过量浓度的测试抗体(即分别为250和500nM IgG)在37℃下孵育90分钟。将200μL抗体/tau混合物添加到iPSC衍生的星形胶质细胞中，并使用Incucyte S3成像系统在37℃/5％ CO2下从每孔9个视野中每小时拍摄图像(明视野和橙色通道)持续20小时。将定量(每孔)橙色通道中荧光的平均面积的算法(激发：513-568nm)归一化为由细胞占据的平均面积(相面积)，并将其绘制为4个孔随时间的平均值+/-SEM。相对于无抗体对照进行单向ANOVA和Tukey多次对比检验以确定显著性。
在该实验中，使用抗人IgG1同种型对照(抗荧光素[4-4-20(增强型)]，绝对抗体，英国牛津公司)。
实例26.单克隆抗tau克隆#44人IgG1的人源化变体增加人iPSC衍生的小胶质细胞对单体和聚集的tau的摄取(图14、图15)
小胶质细胞在清除中枢神经系统中的细胞外物质中发挥重要作用，以防止碎片的积累并使修复过程能够发生。在神经变性疾病的情况下，细胞外蛋白(包括聚集、寡聚和单体形式)的吞噬作用有助于降低这些种类的细胞外浓度。作为hIgG1测试的克隆#44的所有人源化变体显著地(P<0.005)将单体tau向人iPSC衍生的小胶质细胞中的摄入增加了以下值(图14)：16.1％±1％(VH3VK3)、80.3％±0.8％(VH3VK4)、71.4％±1.6％(VH4VK2)、60.2％±1.1％(VH4VK3)、59.4％±1.4％(VH4VK4)。作为hIgG1测试的所有人源化变体也显著地(P<0.001)将聚集tau向人iPSC衍生的小胶质细胞中的摄入增加了以下值(图15)：77.7％±2.1％(VH3VK3)、83.9％±2.4％(VH3VK4)、97.6％±2.2％(VH4VK2)、90.5％±2.8％(VH4VK3)、114.6％±3.3％(VH4VK4)。同种型对照抗体对该系统中的tau摄取没有显著影响(对于单体和聚集的tau分别降低9.4％±1.5％和增加15.7％±2.2％)。
数据证明，与亲本抗体(#44，克隆2)一样，靶向SEQ ID NO:1的具有效应子功能的治疗性抗体(例如，格式化为hIgG1)将增加小胶质细胞对含有靶向序列(SEQ ID NO:1)的细胞外tau的清除，并且由此降低CNS中细胞外tau的细胞外浓度和有害作用。预测这种活性是治疗上有益的。
26.1 hIgG1抗体的产生：参见实例22.1。
26.2人iPSC衍生的小胶质细胞的生产：人多能干细胞(iPSC)向小胶质细胞培养物的分化如Brownjohn等人(2018)Stem Cell Rep[干细胞报告]10(4):1294-1307所述进行。使用来自NDC背景的iPSC系。收集小胶质细胞祖细胞，铺板于96孔板中，并在使用前在完全的小胶质细胞培养基(如Brownjohn等人，2018中所述)中维持约14天。在使用前一天，将培养物转入无血清培养基(补充有10ng/mL GM-CSF和100ng/mL IL-34(来自美国新泽西州的佩普罗泰克(Peprotech,NJ,US)的生长因子)的RPMI 1640/Glutamax)，并在无血清条件下完成吞噬作用实验。
26.3聚集(寡聚)的tau物质的生成：参见实例24.2
26.4纯化的重组tau的标记：参见实例24.3。注意P301S tau用于单体和聚集的tau两者的制备。
26.5人iPSC衍生的小胶质细胞对tau摄取的定量：在无血清小胶质细胞培养基中制备单体tau(25nM)和聚集tau(50nM)，并以1:10比率的tau:抗体(即分别为2.5和5nM IgG)在37℃下孵育90分钟。将抗tau hIgG1与同种型对照(抗荧光素[4-4-20(增强型)]，绝对抗体，英国牛津公司)进行比较。将100μL抗体/tau混合物添加到iPSC衍生的小胶质细胞中，并使用Incucyte S3成像系统(德国哥廷根的赛多利斯公司(Sartorius,
Figure BDA0004094741790000721
Germany))在37℃/5％ CO2下从每孔9个视野中每30分钟拍摄图像(明视野和橙色通道)持续15小时。将定量(每孔)橙色通道中荧光的平均面积的算法(激发：513-568nm)归一化为由细胞占据的平均面积(相面积)，并将其绘制为n＝4个细胞随时间的平均值+/-SEM。相对于无抗体对照进行单向ANOVA和Tukey多次对比检验以确定显著性。相对于“无tau”对照计算所引用的tau摄取的增加。
实例27.单克隆抗tau克隆#44的人源化变体在家族性阿尔茨海默病中检测到高和低MW tau物质水平的增加，但在非痴呆对照死后脑中未检测到(图16)
抗tau抗体克隆#44的人源化变体在死后家族性阿尔茨海默病(fAD；早老素1突变)大脑皮质样品中检测到疾病相关形式的tau，但非痴呆对照(NDC)样品中未检测到。蛋白质印迹证明了五种变体：与NDC样品相比，VH3VK3、VH3VK4、VH4VK2、VH4VK3和VH4VK4在代表性fAD中检测到增加的tau水平，包括在所测试的NDC样品中不存在的多个高(>75kD)和低(<40kD)分子量种类(图16)。肌动蛋白对照证实脑裂解物样品的载量相等。检测到的tau物质显示出与亲本抗体(#44VH0VK0)类似的模式，证明亲本兔克隆#44的结合特征已被人源化变体保留。
27.1人脑样品：详见实例8.1。
27.2.蛋白质提取：使用补充有蛋白酶抑制剂(cOmplete Mini，无EDTA，瑞士罗特克罗伊茨的罗氏诊断公司(Roche Diagnostics,Rotkreux,Switzerland))的RIPA缓冲液(美国密苏里州圣路易斯的西格玛公司)裂解iPSC衍生的神经元培养物。根据制造商的说明书，用Pierce BCA蛋白测定试剂盒(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司)测量蛋白质浓度，并且在指定的情况下，用λ蛋白磷酸酶(l-PP)(美国马萨诸塞州伊普斯威奇的新英格兰生物实验室公司(New England Biolabs,Ipswich,MA,USA))处理脑裂解物。
27.3蛋白质印迹：将20μL总体积中的40μg蛋白质(除非另有说明)加载到12％Mini-Protean TGX预制凝胶(美国加利福尼亚州赫拉克勒斯的伯乐公司)中并在4℃以200mA转移到0.2μm PVDF膜(美国伊利诺伊州芝加哥的GE医疗集团生命科学事业部)上保持两小时。在RT下将膜在封闭溶液(5％脱脂奶粉、0.1％ Tween的PBS溶液)中孵育1小时。
27.4抗体孵育：在RT下用一抗(以指定的浓度)探测蛋白质转移膜过夜。随后将膜与Tidyblot(美国加利福尼亚州赫拉克勒斯的伯乐公司；1:200)在RT下孵育1小时。用Tidyblot代替标准二抗以使死后脑样品中存在的污染人IgG的影响最小化
27.5膜可视化：使用增强化学发光(ECL)蛋白质印迹检测试剂(美国伊利诺伊州芝加哥的GE医疗集团生命科学事业部)检测每个膜，并使用ImageQuant LAS 4000(美国伊利诺伊州芝加哥的GE医疗集团生命科学事业部)可视化。
27.6β-肌动蛋白归一化：包括β-肌动蛋白作为上样对照。成像后，使用RestorePLUS蛋白质印迹剥离缓冲液(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司)在RT下从PVDF膜上去除第一抗体复合物持续25分钟。将膜与封闭溶液在RT下孵育1小时。将每个膜用小鼠单克隆抗β-肌动蛋白(美国密苏里州圣路易斯的西格玛公司；1:1000)或TuJ1一抗(美国明尼苏达州明尼阿波利斯的安迪生物公司(R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)；1:1000)探测，然后用山羊抗小鼠IgG-过氧化物酶二抗(美国密苏里州圣路易斯的西格玛公司；1:2000)孵育。将两种抗体在RT下连续孵育1小时。
实例28.与非痴呆对照脑相比，人源化变体#44VH4VK4在家族性阿尔茨海默病、散发性阿尔茨海默病和路易体痴呆脑中检测到高和低MW tau物质水平的增加。
为了证实#44的人源化变体保留了亲本兔IgG在一系列tau蛋白病和一组患者样品中检测疾病相关tau物质的能力，更详细地描绘了亲本克隆#44(兔IgG)和人源化变体#44VH4VK4(hIgG1)。如所预期的，人源化变体#44VH4VK4的表现与亲本克隆#44类似，并且在代表家族性阿尔茨海默病(fAD)、散发性阿尔茨海默病(sAD)和路易体痴呆(DLB)的一组患者样品中检测到高和低MW种类两者水平的增加(图17)。肌动蛋白和神经元微管蛋白对照证实tau水平的变化不是由于测试样品中蛋白质和/或神经元水平的变化。数据证实，亲本克隆#44和人源化抗体变体VH4VK4均以与针对抗体克隆#66(克隆1)描述的类似方式检测到疾病相关的tau物质，并提示实例21中所述的人源化变体组以及结合SEQ ID NO:1的任何其他抗体的人源化变体可能表现类似。因此，#44VH4VK4或替代的人源化变体与疾病特异性tau物质的结合具有在治疗AD和tau蛋白病中治疗上有用的潜力。
此外，通过可商购获得的N-末端(Tau13)、中间区(HT7和Tau5)和远C-末端tau(Tau46)抗体对tau物质的检测显示在较高和较低分子量两者范围内对跨fAD、sAD和DLB脑样品的疾病特异性tau物质的有限检测(图17)。数据证明，靶向对应于2N4R tau的氨基酸369-381(SEQ ID NO:1)的序列的抗体结合疾病特异性tau物质，这种结合不能被靶向tau的N-末端、中间区或远C-末端区域的一系列抗体检测到，并且因此显示与靶向序列相关的独特和有益特性。
28.1人脑样品：关于人死后脑样品的来源参见实例8.1。所有样品来自患有临床和病理学证实的散发性阿尔茨海默病(Braak 6期)或DLB的个体的额叶皮质。非痴呆对照脑样品来自未显示痴呆的临床征象或AD/tau蛋白病的病理征象(Braak 0期)的年龄匹配的个体。注意到对照个体的死亡原因预测不会影响死后检测到的tau水平/种类。
28.2蛋白质印迹：详见实例27。
使用的市售抗体为：HT7(靶向氨基酸159-163；美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰生命技术有限公司)、Tau5(靶向氨基酸210-241；美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司)、Tau13(靶向氨基酸2-18；英国剑桥的艾博抗公司)或Tau46(靶向氨基酸404-441；美国马萨诸塞州伊普斯威奇的新英格兰生物实验室公司)。
实例29.人源化抗体克隆#44VH4VK4的亲和力成熟
使用常规诱变方法用简并寡核苷酸(NNK)使人源化抗体克隆#44_VH4VK4亲和力成熟以使VH CDR3(文库1)、VL CDR3(文库2A和2B)和VH CDR2(文库3)中的残基突变。文库表达为scFv，并且完成多轮可溶性选择和被动选择两者以鉴定最高亲和力的scFv。文库2A没有产生值得进一步研究的克隆。在多克隆噬菌体ELISA中没有被动选择显示任何结合。在噬菌体ELISA中筛选总共2486个单个克隆：945个来自文库1，222个来自文库2B并且1319个来自文库3。然后挑取88个克隆用于最终结合ELISA：64个来自文库3，1个来自文库2B并且23个来自文库1。该板包含20个独特的VH序列(15个来自文库3，5个来自文库1)。
将二十个新VH(SEQ ID NO:183-206)和一个新VK序列(SEQ ID NO:207)优先化(序列比对在图18中提供)并与亲本VH(pVH)或VK(pVL)组合表达以产生21个新变体。当在哺乳动物细胞中表达时，所有新IgG变体形成结合全长重组2N4R tau的抗体，如ELISA所证明(图19)。ELISA信号背景低，证明抗体相关信号是由于与tau的特异性相互作用。所有上清液的浓度匹配并在30ng/mL下进行测试。
Biacore单循环动力学(SCK)实验能够计算抗体KD。对于新变体，KD范围为593pM至34.2nM(分别对于H04/pVL和H18/pVL；总结在表15中)。测试了将H06、H07、H09、H13或H14与新型VL变体L2组合的附加变体。没有一个表现好于与pVL组合的相同VH，提示VLCDR3不是抗体结合tau的主要决定因素。
亲和力成熟产生4种新型抗体，其对tau的亲和力高于亲本人源化克隆#44VH4VK4(SEQ ID NO:154/SEQ ID NO:160)、H01/pVL(SEQ ID NO:183/SEQ ID NO:160)、H02/pVL(SEQ ID NO:184/SEQ ID NO:160)、H04/pVL(SEQ ID NO:186/SEQ ID NO:160)、H06/pVL(SEQ ID NO:188/SEQ ID NO:160)。这些克隆都在VH CDR3中含有突变，其中H06也包含VHCDR2突变，暗示VH CDR2和VH CDR3是#44_VH4VK4相关抗体结合tau的关键区域。VL CDR3(文库2A和2B)的突变没有产生抗体亲和力的改善。
与原始H06/pVL克隆相比，H06(VH CDR2)与H01、H02或H04(VH CDR3)重组以形成H06-01/pVL、H06-02/pVL、H06-04/pVL未导致亲和力增加(参见表16)。与原始克隆相比，H16CDR2与H04 CDR3的附加重组也未产生亲和力增加。
数据证明VH CDR3和VH CDR2在确定#44_VH4VK4相关抗体与tau的相互作用的亲和力中的重要性。具体地，如表14所示：
Figure BDA0004094741790000761
表14.
进行阿布泽纳公司的专有iTope分析以评估预测的MHC II类结合肽的存在，目的是使优先化前导序列中高亲和力结合位点的存在最小化。该分析的总结提供于表16中。新型VH克隆含有1-4个预测的高亲和力位点(与亲本#44_VH4的1个相比)和2-5个中等亲和力位点(与亲本#44_VH4的4个相比)。单个新型VK克隆共享亲本#44_VK4克隆的2个中等亲和力位点和2个高亲和力位点。
29.1通过噬菌体展示的亲和力成熟-文库设计和构建：如上所概述设计文库以突变以下项中的区域：VH CDR3(从D95至P102的区域，文库1)；VH CDR2(C50至F58的残基，不包括保持恒定的I51、G55和T57，文库3)，VL CDR3(L89至S93、N96和V97，文库2A；位置C94和C95D中的两个Cys之间的四个残基，保持两个Cys恒定；文库2B)。使用标准方法构建文库。设计寡聚物以在具有NcoI或NotI限制性位点的靶向序列中引入随机化。用NcoI和NotI消化所有三个文库的纯化、扩增的DNA，并连接到经类似切割的噬菌粒载体(pANT65)中。使用RocheHP PCR产物纯化试剂盒(英国布杰斯希尔的罗氏生命科学公司(Roche Life Sciences,Burgess Hill,UK))在无核酸酶的水中清洗和洗脱连接的DNA，并通过电穿孔将其转化到新鲜制备的电感受态TG1细胞中。第二天，计数菌落，刮平板，并且制备甘油储液。将文库电穿孔多次以充分覆盖理论文库多样性。对于每个文库，获得十倍或更大的覆盖度。这给出了覆盖整个文库的99％的统计概率。
29.2亲和力成熟-文库噬菌体拯救：使用至少100x观察到的文库多样性的接种物将来自四个文库的细菌接种到150mL 2TYCG(2％)培养物中。使培养物生长至对数中期(OD600nm≈0.4)，估计细胞总数(基于OD600nm为1≈5x 108个细胞/mL)。以10的感染复数添加辅助噬菌体(M13K07)(英国希钦的新英格兰生物实验室公司(New England BioLabs,Hitchin,UK))并以150rpm孵育1小时，然后离心，重悬于2TYCK培养基中并在30℃下生长过夜。第二天，通过离心回收培养上清液，接着用3/10体积的冷却的20％ PEG/2.5M NaCl沉淀来收获噬菌体。在冰上孵育1小时后，通过离心回收沉淀的噬菌体，并将沉淀物重悬于1xPBS pH 7.4中。将上清液再次离心以去除任何细胞碎片，然后如上所述将上清液再次沉淀。将沉淀的噬菌体重悬于1x PBS pH 7.4中。
29.3亲和力改善的噬菌体选择：对于溶液中的选择，基于亲和力改善，用MPBS(含有3％乳)预封闭每个文库，然后在室温下将噬菌体与浓度递减的可溶性生物素化全长Tau(50nM)孵育1小时。将预封闭的链霉抗生物素顺磁珠添加到每个选择物中并旋转5分钟。使用KingFisher 1mL(美国沃尔瑟姆的赛默飞世尔公司)，将链霉抗生物素蛋白-抗原-噬菌体复合物用PBST洗涤8次，接着用PBS洗涤。通过添加50mM HCl从珠上洗脱噬菌体，然后通过添加1M Tris-HCl pH 9.0中和。然后将噬菌体感染到对数期TG1细胞中并铺在含有羧苄青霉素的LB琼脂板上。对于所有选择，按照如上所述的方案进行“无抗原”对照选择，但省略抗原。比较来自有或没有抗原的选择的输出板上的菌落数提供了关于任何特定选择成功的信息。
对于被动选择，用MPBS(含有5％乳)预封闭每个文库，然后将噬菌体与包被有浓度递减的非生物素化全长人Tau(22.2nM)的免疫管一起孵育，并用MPBS在室温下封闭1小时。将抗原-噬菌体复合物用PBST洗涤3次，接着用PBS洗涤。通过添加50mM HCl从珠上洗脱噬菌体，然后通过添加1M Tris-HCl pH 9.0中和。然后如溶液选择所述将噬菌体感染到对数期TG1细胞中。
29.4scFv的表达和测试：首先表达可溶性scFv，并以单点结合ELISA形式测试其与Tau(一种IPTG诱导后分泌到培养基中的蛋白质)的结合。将来自所选择的选择输出的单个菌落挑取到1mL 2TYCG(0.1％)培养基中，并通过在37℃下振荡5小时来生长。通过添加IPTG至终浓度为1mM诱导培养物，然后在30℃振荡生长过夜。第二天，将培养物离心并通过ELISA(1:20稀释)测试上清液。所有文库的表达到培养基中的来自scFv的菌落用亲本scFv和包含在每个测定板上的不相关scFv作为对照进行筛选。
将Nunc Immuno MaxiSorp 96孔平底微量滴定板过夜在4℃下用1.0μg/mL的50μLTau包被过夜。将板洗涤并在室温下用5％ MPBS封闭1小时。将含有表达的scFv的诱导培养基以1:20稀释，添加到封闭的板中(100μL/孔)，并在室温下在板上孵育1小时。然后将板洗涤，用抗HIS抗体-HRP(英国多塞特郡的西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich,Dorset,UK))检测scFv与靶标的结合，并用TMB底物(英国拉夫堡的英杰生命技术有限公司(Invitrogen,Loughborough,UK))显色。用1M HCl终止反应，在Dynex Technologies MRX TC II读板器上读取450nm处的吸光度并绘制结合数据。
29.5 CD4+T细胞表位回避(通过iTopeTM分析)：参见实例21.2。
29.6新型抗体变体的生成：参见实例21.3
29.7抗体与tau结合的评估(ELISA)：参见实例21.4。此处上清液的浓度与30ng/mL相匹配(使用基于Octet的滴度估计，通过阿布泽纳公司使用标准方法计算)。
29.8抗体与tau结合的评估(Biacore SCK分析)：参见实例21.5。
Figure BDA0004094741790000791
Figure BDA0004094741790000801
Figure BDA0004094741790000811
Figure BDA0004094741790000821
表16.显示亲本克隆#44_VH4VK4(pVH，pVL)以及VH(H01-H20)和VK(L02)的亲和力成熟变体中存在的预测的中等和高亲和力MHC II类结合肽的数量的iTope分析输出总结。
Figure BDA0004094741790000822
Figure BDA0004094741790000831
表17.克隆#44_VH4VK4的亲和力成熟变体与全长重组2N4R tau结合的结合分析(SCK)数据总结。亲本克隆#44_VH4VK4被示出为pVH/pVL(VH SEQ ID NO:154和VL SEQ IDNO:160)，并且相对于该克隆计算“倍数改善”值。所有克隆均表达为hIgG1。HEK滴度基于转染后第7天的Octet分析。
实例30.亲和力成熟的IgG以高亲和力结合tau
选择前四种亲和力成熟的人源化变体用于作为hIgG1的更大规模表达和进一步表征(基于表17中总结的数据)：#44_VH4VK4_H01/pVL(SEQ ID NO:183和SEQ ID NO:160)；#44_VH4VK4_H02/pVL(SEQ ID NO:184和SEQ ID NO:160)；#44_VH4VK4_H04/pVL(SEQ ID NO:186和SEQ ID NO:160)；和#44_VH4VK4_H06/pVL(SEQ ID NO:188和SEQ ID NO:160)。将CHO细胞用于这种更大规模生产以使产量最大化。当称为_H01、_H02等时，应当理解这些克隆衍生自#44_VH4VK4并包含亲本VL(pVL)。所有克隆均表达为人IgG1(hIgG1)。如果克隆以不同的同种型/形式表达，则预期结合特性将不变。
抗体结合重组2N4R tau的Biacore多循环动力学(MCK)分析总结在图20和表18中。所有四种变体显示出比亲本#44_VH4VK4对tau更高的亲和力：0.736nM(_H04)、1.52nM(_H02)、1.53nM(_H06)和4.01nM(_H01)，相比之下，对于平行测试的亲本IgG为7.76nM。认为RMAX的轻微变化可能是由于配体捕获的差异，而不是反映抗体结合特征的显著变化。
如实例21所述，预测如果靶序列(SEQ ID NO:1)存在且可接近，则对人tau所述的活性将适用于其他哺乳动物物种的tau。
30.1蛋白A纯化的hIgG1抗体的产生：参见实例22.1。
30.2抗体与tau结合的评估(Biacore MCK分析)：参见实例22.2。注意在该实验中，将流速增加至100μL/min以使传质限制的影响最小化。
Figure BDA0004094741790000841
Figure BDA0004094741790000851
表18.克隆#44_VH4VK4(H01-H06；hIgG1)的纯化亲和成熟变体与全长重组2N4Rtau结合的Biacore MCK分析总结。亲本克隆#44_VH4VK4被示出为pVH/pVL，并且相对于该克隆计算“相对KD”值。新变体作为SEC纯化的样品进行测试。*在传质限制的边界上。
实例31.亲和力成熟的IgG是热力学稳定的
为了评估亲和力成熟的人源化变体开发成治疗性抗体的潜力，评估了每种抗体的热稳定性。数据总结在表19和图36中。平均解链温度(Tm)范围为对于#44_VH4VK4_H06/pVL的64.2℃至对于#44_VH4VK4_H01/pVL的69.6℃，这被认为是治疗性抗体可接受的。
Figure BDA0004094741790000852
表19.克隆#44_VH4VK4(H01-H06)的新型变体的热稳定性特征数据的总结。亲本克隆#44VH4VK4被示出为pVH/pVL。所有抗体均表达为hIgG1。
31.1热稳定性分析：参见实例23.1。
实例32.抗体#44_VH4VK4的亲和力成熟变体抑制单体和聚集的tau摄入人神经元
如实例12和24所述，认为“毒性”形式的细胞外tau的神经元摄取在tau蛋白病诸如阿尔茨海默病中观察到的tau的致病性扩散中起重要作用。靶向SEQ ID NO:1的抗tau兔IgG，包括抗体克隆#44(克隆2)，能够减少人神经元对含有该表位的tau物质的摄取(实例12)。预测表现出这种活性的抗体将限制包含靶表位的细胞外tau物质在体内的神经元-神经元传播，并且因此是治疗上有用的。
测试的克隆#44_VH4VK4的所有亲和力成熟的人源化变体(作为hIgG1)显著(P<0.001)抑制单体tau摄入人iPSC衍生的神经元(图22)至如下与亲本人源化#44_VH4VK4克隆类似或更大的程度：相比于70.6％±4.3％(#44_VH4VK4)，89.2％±1.5％(H01/pVL)、84.1％±1.9％(H02/pVL)、81.8％±1.7％(VH04/pVL)、71.0％±4.1％(H06/pVL)。测试的所有人源化变体也显著(P<0.001)抑制聚集tau摄入人iPSC衍生的神经元(图23)至如下与亲本人源化克隆#44_VH4VK4类似的程度：相比于58.0％±4.7％(#44_VH4VK4)，61.1％±4.8％(H01/pVL)、59.2％±6.4％(H02/pVL)、65.5％±3.8％(H04/pVL)、55.0％±4.9％(H06/pVL)。同种型对照人IgG1抗体对该系统中的tau摄取没有显著影响(对于单体和聚集的tau分别抑制6.2％±7.0％和14.3％±6.8％)。应当注意，在这些复杂的基于细胞的模型中预期tau摄取的绝对水平和抗体介导的抑制的绝对水平的一些可变性。除了通常的实验可变性之外，这种可变性还可能是由于tau摄取所需的蛋白质表达的可变性所致。本实例中显示的数据代表在多次实验运行中观察到的数据。
数据证明，与亲本人源化抗体(#44_VH4VK4)一样，靶向SEQ ID NO:1的氨基酸序列的亲和力成熟的抗体能够减少人神经元对含有该表位的tau物质的摄取。因此，预测此类抗体将限制包含由(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列形成的表位的细胞外tau物质(单体和多聚体，包括全长和截短形式)在阿尔茨海默病和tau蛋白病中的神经元-神经元传播，从而减少/减缓患者临床症状的进展。使用hIgG1生成所示数据。这种活性是CDR依赖性的(而不是同种型依赖性的)，因此如果这些克隆以不同的同种型/形式表达，则预测该活性不变。
32.1人iPSC衍生的大脑皮质神经元的产生：参见实例1.1。
32.2 tau物质的生成和标记：参见实例24.2、24.3。注意P301S tau用于单体和聚集的tau两者的制备。
32.3人iPSC衍生的皮质神经元对tau摄取的定量：参见实例24.4。
实例33.抗体#44_VH4VK4的亲和力成熟变体抑制单体和聚集的tau摄入人星形胶质细胞
如实例17和25所述，认为细胞外tau的星形细胞摄取在tau蛋白病诸如阿尔茨海默病中观察到的tau的致病性扩散中起作用。靶向SEQ ID NO:1的抗tau兔IgG，包括抗体克隆#44(克隆2)和该克隆的人源化变体(包括抗体#44_VH4VK4)，能够减少人星形胶质细胞对含有该表位的tau物质的摄取(实例17)。预测显示这种活性的抗体是治疗上有用的。
所测试的克隆#44_VH4VK4的所有亲和力成熟的人源化变体显著地(P<0.001)将单体tau向人星形胶质细胞中的摄入抑制了以下值(图24)：相比于52.3％±3.4％(#44_VH4VK4)，为67.5％±2.5％(H01/pVL)、64.7％±3.5％(H02/pVL)、35.6％±4.4％(H04/pVL)、35.1％±4.3％(H06/pVL)。测试的所有人源化变体也显著(P<0.001)抑制聚集tau摄入人星形胶质细胞(图25)至如下与兔克隆类似的程度：相比于41.3％±2.9％(#44_VH4VK4)，38.6％±％3.2％(H01/pVL)、43.3％±3.1％(H02/pVL)、32.6％±3.0％(H04/pVL)、39.1％±2.9％(H06/pVL)。同种型对照人IgG1(抗荧光素[4-4-20(增强型)]，绝对抗体，英国牛津公司)对该系统中的tau摄取没有显著影响(对于单体和聚集的tau分别抑制-1.7％±6.3％和-6.7％±3.5％)。当在给定实验中比较时，通过亲和力成熟的抗体实现的抑制的量值类似于亲本#44_VH4VK4克隆。应当注意，在这些复杂的基于细胞的模型中预期tau摄取的绝对水平和抗体介导的抑制的绝对水平的一些可变性。除了通常的实验可变性之外，这种可变性还可能是由于tau摄取所需的蛋白质表达的可变性所致。本实例中显示的数据代表在多次实验运行中观察到的数据。
数据证明，与亲本兔抗体(#44，克隆2)和克隆#44的人源化变体一样，靶向由SEQID NO:1形成的表位的基于#44_VH4VK4的亲和力成熟的克隆能够减少人星形胶质细胞对含有该表位的tau物质(单体和多聚体，包括全长和截短形式)的摄取。预测这种活性是治疗上有益的。使用hIgG1生成所示数据。这种活性是CDR依赖性的(而不是同种型依赖性的)，因此如果这些克隆以不同的同种型/形式表达，则预期该活性不变。
33.1人iPSC衍生的星形胶质细胞的产生：参见实例17.1。
33.2 tau物质的生成和标记：参见实例12.2、12.3。注意P301S tau用于单体和聚集的tau两者的制备。
33.3人iPSC衍生的星形胶质细胞对tau摄取的定量：参见实例25.4。
实例34.抗体#44_VH4VK4的亲和力成熟变体在家族性阿尔茨海默病中检测到高和低MW tau物质水平的增加，但在非痴呆对照死后脑中未检测到
抗tau抗体克隆#44_VH4VK4的亲和力成熟的人源化变体在死后家族性阿尔茨海默病(fAD；早老素1突变)大脑皮质样品中检测到疾病相关形式的tau，但非痴呆对照(NDC)样品中未检测到。蛋白质印迹表明与NDC样品相比，五种变体(全部表达为hIgG1；作为来自瞬时转染的上清液测试)：H01/pVL、H02/pVL、H04/pVL、H06/pVL和H16/pVL在代表性fAD中检测到增加的tau水平，包括在所测试的NDC样品中不存在的多个高(>75kD)和低(<40kD)分子量种类(图26)。所示印迹用相同条件平行处理。不同的检测水平与这些克隆对tau的不同亲和力一致，其中_H02/pVL、_H04/pVL和_H06/pVL表现出对tau的最高亲和力和通过蛋白质印迹对tau的最大检测。对于NDC和疾病脑裂解物样品加载等量的蛋白质，因此检测中的差异是由于疾病中存在的tau物质与NDC的差异，而不是由于蛋白质载量的差异。检测到的tau物质显示出与亲本人源化抗体(#44_VH4VK4)类似的模式，这继而显示出与原始亲本兔克隆#44(实例27、28)类似的检测模式，证明亲本兔克隆#44的结合特征已被人源化亲和力成熟变体保留。
34.1人脑样品：参见实例8.1。
34.2蛋白质印迹：参见实例27。
实例35.亲和力成熟的变体抗体#44_VH4VK4_H04/pVL和#44_VH4VK4_H06/pVL在家族性阿尔茨海默病、散发性阿尔茨海默病和路易体痴呆中检测到高和低MW tau物质水平的增加，但在非痴呆对照死后脑中未检测到
为了证实#44_VH4VK4的亲和力成熟的人源化变体保留了亲本人源化克隆#44_VH4VK4在一系列tau蛋白病和一组患者样品中检测疾病相关tau物质的能力(参见实例27、28)，更详细地描绘了四种新型亲和力成熟的人源化抗体#44_VH4VK4_H01/pVL、#44_VH4VK4_H02/pVL、#44_VH4VK4_H04/pVL和#44_VH4VK4_H06/pVL(hIgG1)。如所预期的，所有亲和力成熟的克隆的表现与亲本克隆#44_VH4VK4类似，并且在一组家族性阿尔茨海默病(fAD)患者样品中检测到高和低MW种类两者水平的增加(图27)。肌动蛋白对照证明fAD样品中增强的tau检测不是由于与非痴呆对照相比这些样品中增加的蛋白质载量。注意到在许多疾病相关的脑裂解物中肌动蛋白检测是低的。这可能是由于疾病样品中神经元的变性，以及死后采集的脑样品的一定程度的样品降解。尽管如此，预测该样品降解将减少而不是增加这些样品中tau(和其他蛋白质)的可用性，因此这并不减损在疾病与非疾病脑样品中tau检测增加的发现。
进一步研究了代表VH CDR3(#44_VH4VK4_H04/pVL)和与VH CDR3组合的VH CDR2(#44_VH4VK4_H06/pVL)中的突变的两个克隆，并在散发性阿尔茨海默病(sAD)和路易体痴呆(DLB)脑样品中检测到高和低MW tau物质水平的增加(图28)。肌动蛋白和神经元微管蛋白对照证实tau水平的变化不是由于测试样品中蛋白质和/或神经元水平的变化。如上所述，在许多疾病相关样品中肌动蛋白检测是低的，但这并不减损在疾病与非疾病脑中tau检测增加的发现。数据证实基于#44_VH4VK4的亲和力成熟的人源化抗体以与针对亲本#44_VH4VK4抗体和兔IgG克隆#44和#66所述的类似方式检测疾病相关的tau物质(实例8、9、27、28)。数据支持这样的预测，即实例29中描述的亲和力成熟的人源化变体组以及结合SEQ IDNO:1的任何其他抗体的亲和力成熟的人源化变体可能表现类似。#44_VH4VK4_H04(#44_VH4VK4_H04/pVL(SEQ ID NO:186和SEQ ID NO:160))、#44_VH4VK4_VH06(#44_VH4VK4_H06/pVL(SEQ ID NO:188和SEQ ID NO:160))或替代的亲和力成熟的人源化变体与疾病特异性tau物质的结合因此具有在治疗AD和tau蛋白病中治疗上有用的潜力。
35.1人脑样品：参见实例8.1和9.1。
35.2蛋白质印迹：参见实例27。
实例36：人源化抗tau抗体结合由2N4R tau的氨基酸369-381内的373THKLTFR379形成的表位。
进行表位精细作图以鉴定2N4R tau的氨基酸369-381即SEQ ID NO:1内抗体结合所需的关键残基。在置换分析中，将每个残基突变为其他氨基酸以评价该残基对于与抗体结合的重要性。
与用亲本兔IgG克隆#44(克隆2；参见实例20)生成的数据一致，置换分析显示区域373THKLTFR379中的氨基酸残基对于亲和力成熟的克隆#44_VH4VK4_H04/pVL(“_H04”)和#44_VH4VK4_H06/pVL(“_H06”)的结合是重要的(图29)。特别地，残基K375、T377和R379，作为这些残基的取代，导致对于_H04和_H06两者的大多数取代的强度下降。K375、T377和R379的取代将信号强度降低至背景水平，提示它们对于这些克隆的结合是关键的。T373、L376和F378的取代导致一些取代的强度降低，提示在抗体结合中的次要作用。提供克隆_H04和_H06作为反映基于对亲本VH CDR3(_H04)以及VH CDR2和CDR3(_H06)两者的突变生成的亲和力成熟的克隆的范例。
在该系统中检测到明显不同于测试样品的同种型对照人IgG1的低水平结合(图29)，表明抗tau抗体克隆_H04和_H06获得的ELISA信号是CDR特异性的。
数据证明，本文所述的抗体，以亲和力成熟的克隆_H04(#44_VH4VK4_H04/pVL(SEQID NO:186和SEQ ID NO:160))和_H06(#44_VH4VK4_H06/pVL(SEQ ID NO:188和SEQ ID NO:160))为例，与亲本兔IgG克隆#44(克隆X)共享在肽序列(2N4R tau的氨基酸369-381；SEQID NO:1)内的共同特异性表位；残基K375、T377和R379对于基于亲本兔克隆#44和人源化克隆#44_VH4VK4生成的人源化、亲和力成熟的抗体的结合是重要的。克隆之间在位置T373、H374、L376和F378处的取代作用的轻微差异可能反映了测试的抗体亲和力的差异，因为在较低浓度下(或使用较低亲和力的抗体)更容易证明微小的相互作用。
36.1表位取代扫描分析-肽合成：参见实例20.1
36.2表位取代扫描分析-ELISA筛选：参见实例20.2
数据以示出每种测试肽获得的ELISA信号的字母图表示。观察到的与最大ELISA信号的偏差指示与测试抗体和靶肽的改变(降低)的结合相关的突变。
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Claims (23)

1.一种人源化抗体或其抗原结合片段，其能够特异性结合由人2N4R(氨基酸1-441)tau(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列369-381(SEQ ID NO:1)的残基形成的表位。
2.根据权利要求1所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其能够特异性结合由人2N4R(氨基酸1-441)tau(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列373至379(THKLTFR，SEQ ID NO:150)的残基形成的表位，优选地其中该表位包含以下残基：K375、T377和R379，更优选地其中该表位包含残基T373、K375、T377和R379。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其包含含有人框架序列(FW1至FW4)和CDR(分别为HCDR1、HCRD2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3)的抗原结合位点，其中HCDR1为SEQ ID NO:20；HCDR2为SEQ ID NO:21或如下的变体，其中：氨基酸51选自C、V和A；氨基酸54选自R、A和S；氨基酸55选自R、A和V；并且氨基酸57选自G、H、N、R、A和S；HCDR3为SEQ ID NO:22或如下的变体，其中：氨基酸96选自S、V、R和A；氨基酸98选自A、S、D、H和T；氨基酸102选自P、V和Y；LCDR1为SEQ ID NO:23，LCDR2为SEQ ID NO:24并且LCDR3选自SEQ ID NO:25或SEQ ID NO 207。
4.根据任一项前述权利要求所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其包含含有人框架序列(FW1至FW4)和选自以下的CDR(分别为HCDR1、HCRD2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3)的抗原结合位点：
(a)SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQID NO:25(VH4_H04)；
(b)SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQID NO:25(VH4_H02)；
(c)SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25(VH4_H06)；
(d)SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQID NO:25(VH4_H01)；
(e)SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25(VH4_H06_H04)；
(f)SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQID NO:25(VH4VK4)；
(g)SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQID NO:25(VH4_H03)；
(h)SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQID NO:25(VH4_H05)；
(i)SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQID NO:25(VH4_H07)；
(j)SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQID NO:25(VH4_H08)；
(k)SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQID NO:25(VH4_H09)；
(l)SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQID NO:25(VH4_H10)；
(m)SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQID NO:25(VH4_H11)；
(n)SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQID NO:25(VH4_H12)；
(o)SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQID NO:25(VH4_H13)；
(p)SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQID NO:25(VH4_H14)；
(q)SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQID NO:25(VH4_H15)；
(r)SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQID NO:25(VH4_H16)；
(s)SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQID NO:25(VH4_H17)；
(t)SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQID NO:25(VH4_H18)；
(u)SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQID NO:25(VH4_H19)；
(v)SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQID NO:25(VH4_H20)；
(w)SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25(VH4H_06_H01)；
(x)SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25(VH4_H06_H02)；
(y)SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25(VH4_H16_H04)；
(z)SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQID NO:182(VK4_L2)；
(aa)SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:182(VH4_H06/L2)；
(bb)SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:182(VH4_H07/L2)；
(cc)SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:182(VH4_H09/L2)；
(dd)SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:182(VH4_H13/L2)；以及
(ee)SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQID NO:182(VH4_H14/L2)；
其中这些序列根据Kabat命名法定义。
5.根据任一项前述权利要求所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其中该抗原结合位点包含选自以下的克隆的VH和/或VL结构域序列，或者与选自以下的克隆具有至少70％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH和/或VL结构域序列：
(a)分别为VH SEQ ID NO:186和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H04；
(b)分别为VH SEQ ID NO:184和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H02；
(c)分别为VH SEQ ID NO:188和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H06；
(d)分别为VH SEQ ID NO:183和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H01；
(e)分别为VH SEQ ID NO:205和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H06_H04；
(f)分别为VH SEQ ID NO:154和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4VK4(E)；
(g)分别为VH SEQ ID NO:185和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H03；
(h)分别为VH SEQ ID NO:187和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H05；
(i)分别为VH SEQ ID NO:189和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H07；
(j)分别为VH SEQ ID NO:190和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H08；
(k)分别为VH SEQ ID NO:191和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H09；
(l)分别为VH SEQ ID NO:192和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H10；
(m)分别为VH SEQ ID NO:193和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H11；
(n)分别为VH SEQ ID NO:194和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H12；
(o)分别为VH SEQ ID NO:195和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H13；
(p)分别为VH SEQ ID NO:196和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H14；
(q)分别为VH SEQ ID NO:197和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H15；
(r)分别为VH SEQ ID NO:198和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H16；
(s)分别为VH SEQ ID NO:199和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H17；
(t)分别为VH SEQ ID NO:200和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H18；
(u)分别为VH SEQ ID NO:201和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H19；
(v)分别为VH SEQ ID NO:202和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H20；
(w)分别为VH SEQ ID NO:203和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4H_06_H01；
(x)分别为VH SEQ ID NO:204和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H06_H02；
(y)分别为VH SEQ ID NO:206和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H16_H04；
(z)分别为VH SEQ ID NO:154和VL SEQ ID NO:207的克隆VK4_L2；
(aa)分别为VH SEQ ID NO:188和VL SEQ ID NO:207的克隆VH4_H06/L2；
(bb)分别为VH SEQ ID NO:189和VL SEQ ID NO:207的克隆VH4_H07/L2；
(cc)分别为VH SEQ ID NO:191和VL SEQ ID NO:207的克隆VH4_H09/L2
(dd)分别为VH SEQ ID NO:195和VL SEQ ID NO:207的克隆VH4_H13/L2；
(ee)分别为VH SEQ ID NO:196和VL SEQ ID NO:207的克隆VH4_H14/L2；
(ff)分别为SEQ ID NO:153和SEQ ID NO:159的克隆VH3VK3(A)；
(gg)分别为SEQ ID NO:153和SEQ ID NO:160的克隆VH3VK4(B)；
(hh)分别为SEQ ID NO:154和SEQ ID NO:158的克隆VH4VK2(C)；以及
(ii)分别为SEQ ID NO:154和SEQ ID NO:159的克隆VH4VK3(D)；
其中这些序列根据Kabat命名法定义。
6.根据任一项前述权利要求所述的人源化抗体或其抗原结合片段，其中该抗体包含以下的VH和/或VL结构域：
(a)分别为VH SEQ ID NO:186和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H04；
(b)分别为VH SEQ ID NO:184和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H02；
(c)分别为VH SEQ ID NO:188和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H06；
(d)分别为VH SEQ ID NO:183和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H01；
(e)分别为VH SEQ ID NO:205和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H06_H04；
(f)分别为VH SEQ ID NO:154和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4VK4(E)；
(g)分别为VH SEQ ID NO:185和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H03；
(h)分别为VH SEQ ID NO:187和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H05；(i)分别为VH SEQID NO:189和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H07；
(j)分别为VH SEQ ID NO:190和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H08；
(k)分别为VH SEQ ID NO:191和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H09；
(l)分别为VH SEQ ID NO:192和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H10；
(m)分别为VH SEQ ID NO:193和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H11；
(n)分别为VH SEQ ID NO:194和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H12；
(o)分别为VH SEQ ID NO:195和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H13；
(p)分别为VH SEQ ID NO:196和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H14；
(q)分别为VH SEQ ID NO:197和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H15；
(r)分别为VH SEQ ID NO:198和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H16；
(s)分别为VH SEQ ID NO:199和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H17；
(t)分别为VH SEQ ID NO:200和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H18；
(u)分别为VH SEQ ID NO:201和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H19；
(v)分别为VH SEQ ID NO:202和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H20；
(w)分别为VH SEQ ID NO:203和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4H_06_H01；
(x)分别为VH SEQ ID NO:204和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H06_H02；
(y)分别为VH SEQ ID NO:206和VL SEQ ID NO:160的克隆VH4_H16_H04；
(z)分别为VH SEQ ID NO:154和VL SEQ ID NO:207的克隆VK4_L2；
(aa)分别为VH SEQ ID NO:188和VL SEQ ID NO:207的克隆VH4_H06/L2；(bb)分别为VHSEQ ID NO:189和VL SEQ ID NO:207的克隆VH4_H07/L2；(cc)分别为VH SEQ ID NO:191和VL SEQ ID NO:207的克隆VH4_H09/L2(dd)分别为VH SEQ ID NO:195和VL SEQ ID NO:207的克隆VH4_H13/L2；(ee)分别为VH SEQ ID NO:196和VL SEQ ID NO:207的克隆VH4_H14/L2：(ff)分别为SEQ ID NO:153和SEQ ID NO:159的克隆VH3VK3(A)；
(gg)分别为SEQ ID NO:153和SEQ ID NO:160的克隆VH3VK4(B)；
(hh)分别为SEQ ID NO:154和SEQ ID NO:158的克隆VH4VK2(C)；以及(ii)分别为SEQID NO:154和SEQ ID NO:159的克隆VH4VK3(D)；
其中这些序列根据Kabat命名法定义。
7.一种人源化或人抗体或其抗原结合片段，当在竞争测定中评估时其能够与根据权利要求1至6中任一项所述的抗体竞争结合由人2N4R(氨基酸1-441)tau(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列373至379(THKLTFR，SEQ ID NO:150)的残基形成的表位。
8.根据任一项前述权利要求所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其为重组DNA或RNA序列的表达产物。
9.一种分离的重组DNA或RNA序列，其包含编码根据权利要求1至8中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段的序列。
10.根据权利要求9所述的分离的重组DNA序列，其为载体。
11.根据权利要求10所述的分离的重组DNA序列，其为表达载体。
12.根据权利要求10或11所述的分离的重组DNA序列，其在启动子控制下编码根据权利要求1至8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
13.一种宿主细胞，其包含根据权利要求8至12中任一项所述的DNA或RNA序列。
14.根据权利要求13所述的宿主细胞，其能够表达根据权利要求1至8任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段。
15.一种制备根据权利要求1至8中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括在适于表达该分离的抗体或其抗原结合片段的条件下培养根据权利要求13或14所述的宿主细胞。
16.一种组合物，其包含根据权利要求1至8中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段和稀释剂，优选地药学上可接受的稀释剂。
17.根据权利要求1至8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或根据权利要求16所述的组合物，其用作药物或用于诊断。
18.根据权利要求1至8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或根据权利要求16所述的组合物，其用于预防性或治疗性治疗tau蛋白病，或用于制造用于预防性或治疗性治疗tau蛋白病的药物，优选地该tau蛋白病选自阿尔茨海默病(散发性和单基因家族性形式)、肌萎缩侧索硬化/帕金森综合征-痴呆复合征、嗜银粒病、β-螺旋桨蛋白相关神经变性(BPAN)、英国型淀粉样血管病、脑淀粉样血管病、克雅氏病、拳击员痴呆、弥漫性神经原纤维缠结伴钙化、唐氏综合征、慢性创伤性脑病(CTE)、皮质基底节变性(CBD)、额颞叶痴呆(FTD)、与染色体17相关的额颞叶痴呆和帕金森综合征(FTDP-17)、额颞叶变性、格斯特曼-斯特劳斯勒-申克病、哈勒沃登-施帕茨病、包涵体肌炎、多系统萎缩、强直性肌营养不良、尼曼-皮克病C型、具有神经原纤维缠结的非关岛运动神经元病、帕金森病(散发性和单基因家族性形式)、匹克氏病、脑炎后帕金森综合征、原发性年龄相关性tau蛋白病(PART)、朊病毒蛋白脑淀粉样血管病、进行性皮质下神经胶质增生、进行性核上性麻痹(PSP)、亚急性硬化性全脑炎、缠结显性痴呆、球状胶质tau蛋白病、关岛型帕金森综合征-痴呆复合征、进行性非流畅性失语症、多梗塞性痴呆、缺血性中风、创伤性脑损伤(TBI)和中风。
19.根据权利要求1至8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或根据权利要求16所述的组合物，其能够增加人小胶质细胞中tau物质的吞噬作用和/或减少人神经元对单体和聚集的tau物质的摄取和/或促进人星形胶质细胞对tau物质的摄取和/或防止人星形胶质细胞对tau物质的摄取和/或防止啮齿动物模型中tau介导的对长时程增强作用的抑制。
20.根据权利要求1至8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或根据权利要求16所述的组合物，其用于鉴定人tau蛋白，这些人tau蛋白包含由人2N4R tau(SEQ ID NO:2)的残基369-381(SEQ ID NO:1)形成的表位，优选地包括由人2N4R(氨基酸1-441)tau(SEQ IDNO:2)的氨基酸序列373至379(THKLTFR，SEQ ID NO:150)的残基形成的表位。
21.根据权利要求1至8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或根据权利要求16所述的组合物，其用于tau蛋白病的诊断测试中。
22.一种诊断试剂盒，其包括根据权利要求1至8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、或根据权利要求16所述的组合物和能够检测免疫(抗原-抗体)复合物的试剂，该免疫(抗原-抗体)复合物含有所述分离的重组肽结合分子、抗原结合蛋白或其片段，其中任选地所述分离的重组肽和/或结合分子、抗原结合蛋白或其片段被固定在固体支持物(例如，微板孔)上，和/或其中任选地，含有所述分离的重组肽、结合分子、抗原结合蛋白或其片段的所述免疫复合物能够通过ELISA或替代的免疫测定方法或通过侧向流来检测。
23.根据权利要求22所述的诊断试剂盒，其还包括一种或多种对照标准物和/或样本稀释剂和/或洗涤缓冲液。
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