KR20200130350A - 항-phf-타우 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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콜렌 크리스토프 반
마르크 머르켄
엘린 레이시
루페시 난준다
존 휠러
진취안 루오
마리안느 보거스
린다 바론
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얀센 파마슈티카 엔.브이.
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Abstract

단일클론 항-타우 항체 및 이의 항원-결합 단편이 기재된다. 또한, 상기 항체를 인코딩하는 핵산, 상기 항체를 포함하는 조성물, 상기 항체를 생성하는 방법 및 타우병증과 같은 질환을 치료 또는 예방하기 위하여 상기 항체를 사용하는 방법이 기재된다. 본 발명의 항체는 또한 생물학적 샘플에서 타우를 정량화하기 위해 사용될 수 있다.

Description

항-PHF-타우 항체 및 이의 용도
본 발명은 항-PHF-타우 항체, 및 이들의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다.
임상적으로 알츠하이머병(Alzheimer's Disease, AD)은 기억, 인지, 사고, 판단, 및 감정적 안정성의 점진적인 상실로 인하여 점진적으로 극심한 정신 황폐(mental deterioration) 및 궁극적으로 사망에까지 이르게 하는 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌 장애이다. AD는 노인의 진행성 정신 부전(치매)의 매우 보편적인 원인이며, 미국에서는 네 번째로 가장 보편적인 의학적 사망 원인을 나타내는 것으로 여겨진다. AD는 전세계적으로 인종 집단에서 관찰되었고, 현재 및 미래의 공중 보건상의 주요 문제를 나타낸다.
AD를 가진 개체의 뇌에는 노인성(또는 아밀로이드) 플라크, 아밀로이드 혈관병증(혈관 내 아밀로이드 침착) 및 신경섬유 농축체(neurofibrillary tangle)로 명명되는 특징적인 병변이 나타난다. 다수의 이들 병변, 특히 쌍 나선형 필라멘트의 신경섬유 농축체 및 아밀로이드 플라크가 AD를 가진 환자에서 기억 및 인지 기능에 중요한 인간 뇌의 몇몇 영역에서 일반적으로 발견된다.
AD 및 몇몇 다른 신경퇴행성 질환에서의 신경섬유 변성의 주요 단백질 성분은 미세소관 관련 단백질 타우의 과인산화된 형태이다. 타우 응집을 예방하거나 제거하는 치료제의 개발은 여러 해 동안 관심의 대상이었으나, 항-응집 화합물 및 키나제 억제제를 포함하는 후보 약물이 단지 임상 시험에 진입했을 뿐이다(문헌[Brunden, et al. Nat Rev Drug Discov 8:783-93, 2009]).
최근에, 타우에 대한 능동 및 수동 면역화가 치료 잠재력을 가질 수 있다는 전임상 증거가 유전자도입 타우 마우스 모델에서 생성되었다(문헌[Chai, et al. J Biol Chem 286:34457-67, 2011], 문헌[Boutajangout, et al. J Neurochem 118:658-67, 2011], 문헌[Boutajangout, et al. J Neurosci 30:16559-66, 2010], 문헌[Asuni, et al. J Neurosci 27:9115-29, 2007]). 타우병증 전파 및 확산 가설이 최근에 기재된 바 있으며, 이는 인간 뇌에서 타우병증 진행의 브라크 병기(Braak stage) 및 전임상 타우 모델에서 타우 응집체 주사 후의 타우병증 확산에 기초한다(문헌[Frost, et al. J Biol Chem 284:12845-52, 2009], 문헌[Clavaguera, et al. Nat Cell Biol 11:909-13, 2009]). 따라서, AD 및 다른 신경퇴행성 질환을 치료하기 위한 타우 응집 및 타우병증 진행을 예방하는 치료제에 대한 필요성이 존재한다.
일반적인 일 태양에서 본 발명은, 단리된 항체, 바람직하게는 단리된 단일클론 항체, 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이며, 여기서 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 PHF-타우, 바람직하게는 인간 PHF-타우에 결합한다.
일 실시 형태에서, 본 발명의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호 1 또는 7의 HCDR1; 서열 번호 2, 8, 10, 12, 13, 또는 14의 HCDR2; 및 서열 번호 3의 HCDR3을 포함하는 중쇄를 갖는다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 단일클론 항체는 서열 번호 4, 9, 또는 11의 LCDR1; 서열 번호 5의 LCDR2; 및 서열 번호 6의 LCDR3을 포함하는 경쇄를 갖는다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 단일클론 항체는 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 및 14 중 임의의 것의 CDR과 97% 이상 동일하거나, 98% 이상 동일하거나, 99% 이상 동일한 CDR을 포함한다.
다른 실시 형태에서, 본 발명의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호 15, 17, 19, 21, 23, 및 24 중 임의의 것과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호 16, 18, 20, 22, 및 25 중 임의의 것과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
다른 실시 형태에서, 본 발명의 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 불변 영역, 예컨대 인간 또는 마우스 중쇄 IgG 불변 영역, 및 인간 또는 마우스 항체 경쇄 카파 또는 람다 불변 영역을 추가로 포함한다.
다른 일반적인 태양에서 본 발명은, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 단리된 핵산에 관한 것이다.
다른 일반적인 태양에서 본 발명은, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
다른 일반적인 태양에서 본 발명은, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
다른 일반적인 태양에서 본 발명은, 본 발명의 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
다른 일반적인 태양에서, 본 발명은 병리학적 타우 응집 또는 타우병증의 확산의 감소를 필요로 하는 대상체에서 병리학적 타우 응집 또는 타우병증의 확산을 감소시키는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 본 발명의 약제학적 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 타우병증은 알츠하이머병(가족성 알츠하이머병 및 산발성 알츠하이머병을 포함함), 17번 염색체와 연관된 파킨슨증을 동반하는 전측두엽 치매(FTDP-17), 진행성 핵상 마비, 피질기저핵 변성, 픽병(Pick's disease), 진행성 피질하 신경교증, 농축체 단독 치매(tangle only dementia), 석회화를 동반하는 미만성 신경섬유 농축체, 은친화성 과립성 치매(argyrophilic grain dementia), 근위축성 측삭 경화증 파킨슨증-치매 복합군, 다운 증후군, 게르스트만-슈투로이슬러-샤잉커병(Gerstmann-
Figure pct00001
-Scheinker disease), 할러포르덴-스파츠병(Hallervorden-Spatz disease), 봉입체 근염, 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeld-Jakob disease), 다계통 위축증, C형 니만-픽병(Niemann-Pick disease type C), 프리온 단백질 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 아급성 경화성 범뇌염, 근긴장성 이영양증, 신경섬유 농축체를 동반하는 비-괌(non-Guamanian) 운동 신경세포병, 뇌염후 파킨슨증, 만성 외상성 뇌병증, 및 권투선수 치매(복싱병)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
바람직하게는, 타우병증은 알츠하이머병(가족성 알츠하이머병 및 산발성 알츠하이머병을 포함함), FTDP-17, 또는 진행성 핵상 마비이다.
가장 바람직하게는, 타우병증은 알츠하이머병(가족성 알츠하이머병 및 산발성 알츠하이머병을 포함함)이다.
다른 일반적인 태양에서 본 발명은, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생성하는 조건 하에 항체 또는 항원-결합 단편을 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 배양하는 단계, 및 세포 또는 세포 배양물로부터 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생성하는 방법에 관한 것이다.
다른 일반적인 태양에서 본 발명은, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 약제학적으로 허용가능한 담체와 조합하여 약제학적 조성물을 얻는 단계를 포함하는, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 약제학적 조성물을 생성하는 방법에 관한 것이다.
다른 일반적인 태양에서 본 발명은, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 사용하여 대상에서 PHF-타우의 존재를 검출하는 방법, 또는 대상에서 PHF-타우의 존재를 검출함으로써 대상에서 타우병증을 진단하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 태양, 특징 및 이점은 본 발명 및 그의 바람직한 실시 형태의 상세한 설명을 포함한 하기의 개시내용 및 첨부된 청구범위로부터 명백할 것이다.
전술한 발명의 내용뿐만 아니라 하기의 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용도 첨부 도면과 함께 읽을 때 더 잘 이해될 것이다. 본 발명은 도면에 나타낸 정확한 실시 형태로 제한되지 않음이 이해되어야 한다.
도 1a 내지 도 1c는 표면 플라즈몬 공명(SPR: surface plasmon resonance)에 의해 분석된 PHF-타우 및 가용성-타우에 대한 재조합적으로 발현된 PT82 mAb 또는 그의 Fab 단편의 결합을 나타내며, 여기서 항체 또는 Fab의 농도는 각각의 센서그램 다음에 표시된다(75 nM; 15 nM; 3 nM; 0.6 nM). (A) PHF에 대한 mAb (B) PHF에 대한 Fab 및 (C) 2N4R 타우에 대한 Fab의 결합을 나타낸다.
도 2는 10 ng/mL 또는 1 ng/mL에서 2N4R 타우의 2개의 코팅 농도를 사용하여 ELISA에 의해 분석한 재조합 2N4R 타우에 대한 하이브리도마 상층액으로부터의 PT82 및 재조합적으로 발현된 PT82의 결합을 나타낸다.
도 3a 및 도 3b는 FRET 검정에서 타우 응집체 형성을 차단하는 PT82 mAb의 능력을 나타낸다. (A)는 사용된 세포 모델에서의 FRET 검정의 다이어그램을 나타낸다. (B)는 음성 대조군 mAb(CNTO1037/C18A 항체)에 비교하여 FRET 검정에서의 PT82의 효능을 나타낸다.
도 4a 내지 도 4c는 면역고갈 검정에서 타우 응집체 형성을 차단하는 PT82 mAb의 능력을 나타낸다. (A)는 PT82 mAb를 사용하여 인간 AD 뇌 또는 P301S 마우스 척수 추출물로부터의 균질물을 면역고갈시킨 경우에 사용된 면역고갈 검정의 다이어그램을 나타낸다. (B) FRET 검정 및 (C) 타우 응집-선택적 MSD 검정에 의해 검정되는 바와 같이 PT82 mAb는 AD 뇌 및 P301S 척수 추출물 둘 모두에서 타우 시드를 감소시킬 수 있었다.
도 5a 및 도 5b는 (A) 총 균질물 또는 (B) 불용성 분획을 분석했을 경우, 생체 내 ePHF 주사 모델에서 AT180 및 PT3 항체에 비교하여 PT82의 효능을 나타낸다.
도 6a 내지 도 6d는 (B) 항체 및 PHF의 두개내 동시-주사에 비교하여 (A) 항체의 말초 투여(IP 주사) 시의 PT82 및 PT3의 효능을 나타낸다. (C) 총 균질물 및 (D) 불용성 분획에서 효능을 분석하였다.
도 7은 PT82의 선형 펩티드 맵핑을 사용하는 에피토프 맵핑 데이터를 나타낸다.
도 8은 ELISA에 의해 측정된 가용성 타우에 결합하는 인간화 PT82 mAb를 나타낸다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 넓은 의미로 의도되며, 다중클론 항체, 뮤린(murine), 인간, 인간-적응화, 인간화, 및 키메라 단일클론 항체를 포함하는 단일클론 항체 및 항체 단편을 포함하는 면역글로불린 또는 항체 분자를 포함한다.
일반적으로, 항체는 특정 항원에 대하여 결합 특이성을 나타내는 단백질 또는 펩티드 사슬이다. 항체 구조는 잘 알려져 있다. 면역글로불린은 중쇄 불변 도메인 아미노산 서열에 따라, 5개의 주요 분류, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM으로 정해질 수 있다. IgA 및 IgG는 동종형(isotype) IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 추가로 하위-분류된다. 임의의 척추동물 종의 항체 경쇄는 이들의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 명확하게 별개의 2개의 유형, 즉 카파(κ) 및 람다(λ) 중 하나로 정해질 수 있다.
용어 "항체 단편"은 온전한 항체의 일부를 의미한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편, CDR, 항원-결합 부위, 중쇄 또는 경쇄 가변 영역, 다이아바디, 단일쇄 항체 분자 및 2 개 이상의 온전한 항체 또는 이의 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체를 포함한다.
면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 가변 영역은 "항원-결합 부위"가 개재된 "프레임워크" 영역으로 이루어진다. 항원-결합 부위는 하기와 같이 다양한 용어를 사용하여 정의된다: (i)상보성 결정 영역(CDR)은 서열 가변성에 기초한다(문헌[Wu and Kabat J Exp Med 132:211-50, 1970]). 일반적으로, 항원-결합 부위는 각각의 가변 영역 내에 3개의 CDR을 갖는다(중쇄 가변 영역(VH) 내의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 및 경쇄 가변 영역(VL) 내의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3)(문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.; Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991]). (ii) 용어 "초가변 영역", "HVR", 또는 "HV"는 초티아(Chothia) 및 레스크(Lesk)에 의해 정의된 바와 같이 구조에 있어서 초가변성인 항체 가변 도메인의 영역을 지칭한다(문헌[Chothia and Lesk J Mol Biol 196:901-17, 1987]). 일반적으로, 항원-결합 부위는 각각의 VH(H1, H2, H3) 및 VL(L1, L2, L3) 내에 3개의 초가변 영역을 갖는다. 초티아 및 레스크는 구조적으로 보존된 HV를 "정준 구조"로 지칭한다. 넘버링 체계뿐만 아니라 CDR 및 HV의 주석이 아히난단(Abhinandan) 및 마틴(Martin)에 의해 최근에 개정되었다(문헌[Abhinandan and Martin Mol Immunol 45:3832-9, 2008]). (iii) 항원-결합 부위를 형성하는 영역의 다른 정의가 T-세포 수용체 및 면역글로불린으로부터의 V 도메인의 비교에 기초하여 레프란크(Lefranc)(문헌[Lefranc, et al. Dev Comp Immunol 27:55-77, 2003])에 의해 제안되었다. IMGT(International ImMunoGeneTics) 데이터베이스는 이들 영역의 표준화된 넘버링 및 정의를 제공한다. CDR, HV, 및 IMGT 기술 사이의 상응성은 문헌[Lefranc et al., 상기 문헌]에 기재되어 있다. (iv) 항원-결합 부위는 또한 특이성 결정 잔기 용법(SDRU: Specificity Determining Residue Usage)에 기초하여 기술될 수 있으며(문헌[Almagro J Mol Recognit 17:132-43, 2004]), 여기서 특이성 결정 잔기(SDR)는 항원 접촉에 직접 관여하는 면역글로불린의 아미노산 잔기를 지칭한다.
"프레임워크" 또는 "프레임워크 서열"은 항원-결합 부위 서열인 것으로 정의된 것들 외에 항체의 가변 영역 내의 잔여 서열이다. 항원-결합 부위의 정확한 정의는 상기와 같이 다양한 기술에 의해 결정될 수 있으므로, 정확한 프레임워크 서열은 항원-결합 부위의 정의에 따라 달라진다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "단일클론 항체"(mAb)는 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 얻어진 항체(또는 항체 단편)를 의미한다. 단일클론 항체는 고도로 특이적이며, 전형적으로 단일 항원성 결정기를 지향한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "에피토프"는 항체가 특이적으로 결합하는 항원의 일부를 의미한다. 에피토프는 통상적으로 아미노산, 인산화 아미노산, 또는 다당류 측쇄와 같은 모이어티(moiety)의 화학적으로 활성인(예컨대, 극성, 비극성, 또는 소수성) 표면 그룹화(grouping)로 이루어지며, 특이적인 3-차원 구조 특징뿐만 아니라 특이적인 전하 특징을 가질 수 있다. 에피토프는 사실상 선형일 수 있거나, 불연속 에피토프, 예를 들어, 선형 연쇄 아미노산(linear series of amino acid)보다는 항원의 비-인접 아미노산 사이의 공간적 관계에 의해 형성되는 입체배좌(conformational) 에피토프일 수 있다. 입체배좌 에피토프는 항원의 폴딩(folding)으로부터 생성되는 에피토프를 포함하며, 여기서 항원의 선형 서열의 상이한 부분으로부터의 아미노산은 3-차원 공간에서 매우 근접하게 된다.
타우는 다중의 잘 알려진 아이소형을 갖는 풍부한 중추 및 말초 신경계 단백질이다. 인간 CNS에는, 선택적 스플라이싱으로 인해 크기가 352 내지 441 범위인 6개의 주요 타우 아이소형이 존재한다(문헌[Hanger, et al. Trends Mol Med 15:112-9, 2009]). 이들 아이소형은, 0 내지 2개의 N-말단 삽입체 및 3 또는 4개의 직렬로 배열된 미세소관-결합 반복체의 조절된 포함에 의해 서로 상이하며, 0N3R(서열 번호 26), 1N3R(서열 번호 27), 2N3R(서열 번호 28), 0N4R(서열 번호 29), 1N4R(서열 번호 30), 및 2N4R(서열 번호 31)이라고 지칭된다. 본 명세서에 호환적으로 사용되는 바와 같이, 용어 "대조군 타우" 및 "가용성-타우"는 인산화 및 다른 번역후 변형이 없는 서열 번호 31의 타우 아이소형을 지칭한다.
타우는 미세소관에 결합하며, 타우 인산화에 의해 조절될 수 있는 과정인, 세포를 통한 카고(cargo)의 수송을 조절한다. AD 및 관련 장애에서는, 타우의 비정상적인 인산화가 만연하며, 피브릴로의 타우의 응집(쌍 나선형 필라멘트(PHF)라고 명명됨)에 선행하고/하거나 이를 촉발하는 것으로 생각된다. PHF의 주요 성분은 과인산화된 타우이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "쌍 나선형 필라멘트-타우" 또는 "PHF-타우"는 쌍 나선형 필라멘트 내의 잘 알려진 타우 응집체를 지칭한다. PHF 구조 내의 2개의 주요 영역이 전자 현미경법, 퍼지 코트, 및 코어 필라멘트에서 명백하며; 퍼지 코트는 단백질분해에 민감하고 필라멘트의 외부에 위치되며, 필라멘트의 프로테아제 내성 코어는 PHF의 골격을 형성한다(문헌[Wischik, et al. Proc Natl Acad Sci U S A 85:4884-8, 1988]).
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "PHF-타우에 결합하는 항체"는 웨스턴 블롯 상에서 평가할 때 PHF-타우에 결합하는 항체를 지칭한다. 전형적으로, PHF-타우에 결합하는 항체는 5%(w/v) 무지방 분유(NFDM) TBS-T, 0.05% Tween-20 중에 1 시간 차단한 후, 약 500 ng의 PHF-타우의 쿠마시 염색 후에 평가될 수 있다. PHF-타우 에피토프에 대한 선호도가 없는 타우 항체(예를 들어, 항체 HT7, 미국 일리노이주 록포드 소재의 ThermoScientific)에 의해 대조군 타우 및 PHF-타우 둘 모두가 동일하게 검출되는 항원 로딩 조건 하에 시험할 경우에 웨스턴 블롯에 의해 측정되는 바와 같이, PHF-타우에 결합하는 항체는 임의로 대조군 타우(서열 번호 31)에 결합하지 않는다(문헌[Mercken, et al. J Neurochem 58:548-53, 1992]). 그러한 예시적인 항원 로딩 조건은 500 ng PHF-타우 및 200 ng 대조군 타우이다.
통상적인 잘 알려진 1-문자 및 3-문자 아미노산 코드가 본 명세서에 사용된다.
물질의 조성물
본 발명은 항-PHF-타우 항체 및 그러한 항체의 용도에 관한 것이다. 그러한 항-PHF-타우 항체는 PHF-타우 상의 인산화된 에피토프에 결합하거나 또는 PHF-타우 상의 비-인산화된 에피토프에 결합하는 특성을 가질 수 있다. 항-PHF-타우 항체는 치료제로서, 그리고 생물학적 샘플에서, 예를 들어 조직 또는 세포에서 PHF-타우를 검출하기 위한 연구 시약 또는 진단 시약으로서 유용할 수 있다.
바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 표 1에 나타낸 서열을 갖는다. PT82는 마우스 단일클론 항체이고 PT1B778, PT1B779, PT1B780, PT1B781, 및 PT1B782는 PT82의 인간화 버전이다. CDR은 가변 영역 서열에서 밑줄로 표시된다. 인간화 단일클론 항체의 CDR 내의 굵은 서체로 표시된 아미노산은 PT82 CDR 서열에 비교하여 치환을 표시한다.
[표 1]
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일 실시 형태에서, 본 발명의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호 1 또는 7의 HCDR1; 서열 번호 2, 8, 10, 12, 13, 또는 14의 HCDR2; 및 서열 번호 3의 HCDR3을 포함하는 중쇄를 갖는다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 단일클론 항체는 서열 번호 4, 9, 또는 11의 LCDR1; 서열 번호 5의 LCDR2; 및 서열 번호 6의 LCDR3을 포함하는 경쇄를 갖는다.
바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은,
서열 번호 1의 HCDR1; 서열 번호 2의 HCDR2 및 서열 번호 3의 HCDR3 및 서열 번호 4의 LCDR1; 서열번호 5의 LCDR2; 및 서열번호 6의 LCDR3;
서열 번호 7의 HCDR1; 서열 번호 8의 HCDR2 및 서열 번호 3의 HCDR3 및 서열 번호 9의 LCDR1; 서열번호 5의 LCDR2; 및 서열번호 6의 LCDR3;
서열 번호 7의 HCDR1; 서열 번호 10의 HCDR2 및 서열 번호 3의 HCDR3 및 서열 번호 11의 LCDR1; 서열번호 5의 LCDR2; 및 서열번호 6의 LCDR3;
서열 번호 7의 HCDR1; 서열 번호 12의 HCDR2 및 서열 번호 3의 HCDR3 및 서열 번호 11의 LCDR1; 서열번호 5의 LCDR2; 및 서열번호 6의 LCDR3;
서열 번호 7의 HCDR1; 서열 번호 13의 HCDR2 및 서열 번호 3의 HCDR3 및 서열 번호 11의 LCDR1; 서열번호 5의 LCDR2; 및 서열번호 6의 LCDR3; 또는
서열 번호 7의 HCDR1; 서열 번호 14의 HCDR2 및 서열 번호 3의 HCDR3 및 서열 번호 11의 LCDR1; 서열 번호 5의 LCDR2; 및 서열 번호 6의 LCDR3을 포함한다.
다른 실시 형태에서, PHF-타우에 결합하는 본 발명의 단일클론 항체는 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 및 14 중 임의의 것의 CDR과 97% 이상 동일하거나, 98% 이상 동일하거나, 99% 이상 동일한 하나 이상의 CDR을 포함한다.
다른 실시 형태에서, 본 발명의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호 15, 17, 19, 21, 23, 및 24 중 임의의 것을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 16, 18, 20, 22, 및 25 중 임의의 것을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
다른 실시 형태에서, 본 발명의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은,
서열 번호 15를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 16을 포함하는 경쇄 가변 영역;
서열 번호 17을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 18을 포함하는 경쇄 가변 영역;
서열 번호 19를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 20을 포함하는 경쇄 가변 영역;
서열 번호 21을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 22를 포함하는 경쇄 가변 영역;
서열 번호 23을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 20을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
서열 번호 24를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 25를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
다른 실시 형태에서, PHF-타우에 결합하는 본 발명의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호 15, 17, 19, 21, 23, 및 24 중 임의의 것과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및/또는 서열 번호 16, 18, 20, 22, 및 25 중 임의의 것과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특이적인 실시 형태에서, 아미노산 변화가 가변 영역의 비-CDR 영역 내에 존재하도록 CDR 영역은 표 1에 기재된 바와 같다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 타우 단백질의 119 내지 126을 포함하는 에피토프에 결합하며, 여기서 아미노산의 넘버링은 서열 번호 31에 제시된 아미노산 서열을 참조한다.
실시예에 예시된 실시 형태는 중쇄로부터 하나 및 경쇄로부터 하나의 가변 영역의 쌍을 포함하지만, 당업자는 대안적인 실시 형태가 단일 중쇄 또는 경쇄 가변 영역들을 포함할 수 있음을 인식할 것이다. 단일 가변 영역을 사용하여, 예를 들어 PHF-타우에 결합할 수 있는 2-도메인 특이적 항원-결합 단편을 형성할 수 있는 가변 도메인에 대해 스크리닝할 수 있다. 예를 들어 PCT 특허 출원 공개 제WO92/01047호에 개시된 계층적 이중 조합 접근법(hierarchical dual combinatorial approach)을 사용하여 파지 디스플레이 스크리닝 방법에 의해 스크리닝을 수행할 수 있다. 이 접근법에서는, H 또는 L 사슬 클론을 함유하는 개별적인 콜로니를 사용하여, 다른 사슬(L 또는 H)을 인코딩하는 클론의 완전한 라이브러리를 감염시키고, 생성되는 2-사슬 특이적 항원-결합 도메인을 기재된 바와 같은 파지 디스플레이 기술에 따라 선택한다.
본 발명의 다른 실시 형태는 서열 번호 15, 17, 19, 21, 23, 및 24 중 임의의 것의 중쇄 가변 영역(VH) 및/또는 서열 번호 16, 18, 20, 22, 및 25 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 항원-결합 부위를 포함하는 PHF-타우에 결합하는 단리된 항체이다. 일 실시 형태에서, 본 발명의 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 IGHV6-3*01의 IMGT 생식세포계열 식별자(문헌[Barbie and Lefranc, 1998, Exp. Clin. Immunogenet, 15: 171-183])를 갖는 VH, 및 IGKV6-13*01의 IMGT 생식세포계열 식별자를 갖는 VL을 포함한다.
선행하는 실시 형태 중 어느 하나에서, PHF-타우에 결합하는 단리된 항체는 인간화될 수 있다.
본 발명의 항체는 다양한 기술에 의해, 예를 들어 하이브리도마 방법(문헌[Kohler and Milstein Nature 256:495-7, 1975])에 의해 생성될 수 있다. 수용자 항체(전형적으로 다른 포유동물 종, 예컨대 인간)로부터 유래된 경쇄 및 중쇄 불변 영역과 회합된 공여자 항체(전형적으로 뮤린)로부터 유래된 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 함유하는 키메라 mAb는 미국 특허 제4,816,567호에 개시된 방법에 의해 제조될 수 있다. 비-인간 공여자 면역글로불린(전형적으로 뮤린)으로부터 유래된 CDR을 갖는 CDR-그래프팅된 mAb 및
하나 이상의 인간 면역글로불린으로부터 유래된 분자의 잔여 면역글로불린-유래 부분은, 미국 특허 제5,225,539호에 개시된 것과 같은 당업자에게 알려진 기술에 의해 제조될 수 있다. 임의의 비-인간 서열이 결여된 완전 인간 mAb는 문헌[Lonberg, et al. Nature 368:856-9, 1994], 문헌[Fishwild, et al. Nat Biotechnol 14:845-51, 1996], 문헌[Mendez, et al. Nat Genet 15:146-56, 1997]에 언급된 기술에 의해 인간 면역글로불린 유전자도입 마우스로부터 제조될 수 있다. 인간 mAb는 또한 파지 디스플레이 라이브러리로부터 제조되고 최적화될 수 있다(문헌[Knappik, et al. J Mol Biol 296:57-86, 2000], 문헌[Krebs, et al. J Immunol Methods 254:67-84, 2001], 문헌[Shi, et al. J Mol Biol 397:385-96, 2010]).
항체 인간화는 잘 알려진 방법, 예컨대 특이성 결정 잔기 재표면화(SDRR: specificity determining residues resurfacing)(미국 특허 출원 공개 제2010/0261620호), 재표면화(문헌[Padlan et al. Mol. Immunol. 28:489-98, 1991]), 수퍼 인간화(국제 특허 출원 공개 제WO04/006955호) 및 인간 스트링 함량 최적화(human string content optimization)(미국 특허 제7,657,380호)를 사용하여 수행할 수 있다. 그래프팅/인간화에 유용한 인간 프레임워크 서열은 당업자에 의해 관련 데이터베이스로부터 선택될 수 있다. 선택된 프레임워크를 퀸(Queen) 등(문헌[Queen, et al. Proc Natl Acad Sci U S A 86:10029-33, 1989]) 또는 미국 특허 출원 공개 제2011/0092372호에 기재된 것들과 같은 기술에 의해 추가로 변형하여 결합 친화성을 보존하거나 향상시킬 수 있다.
파지 디스플레이 라이브러리로부터 항체를 면역화 또는 단리하기 위한 항원으로서 사용될 PHF-타우의 제조는 임의의 적합한 기술을 사용하여 실행할 수 있다. 예시적인 방법에서, PHF-타우는 그린버그(Greenberg) 및 데이비스(Davies)(문헌[Greenberg and Davies Proc Natl Acad Sci U S A 87:5827-31, 1990])에 기재된 것과 같은 잘 알려진 프로토콜을 사용하여 AD를 갖는 환자의 뇌로부터 단리된다. PHF-타우는 알츠하이머 환자의 사후 피질로부터 단리될 수 있다. PHF-타우와 반응하는 것으로 알려진 항체를 이용하여, 단리된 PHF-타우를 그의 순도 및 과인산화 상태에 대해 특성화한다. 전형적인 PHF-타우 제조에서, 웨스턴 블롯에서 약 60, 64, 68, 및 72 kDa으로 이동하는 과인산화된 밴드(문헌[Spillantini and Goedert Trends Neurosci 21:428-33, 1998])는 과인산화된 PHF-타우에 특이적으로 결합하지만 탈인산화된 PHF-타우에는 결합하지 않는 AT8 항체에 의해 검출된다.
본 발명의 항체는 서열 번호 31의 대조군 타우에 결합하지 않는 특징을 가질 수 있다. 상기 기재된 방법을 사용하고 상기 기재된 바와 같은 웨스턴 블롯 후의 쿠마시 염색에서의 대조군 타우에 대한 그들의 결합의 결여에 대해 항체를 시험하여, 그러한 항체를 생성할 수 있다. 대조군 타우는 표준 방법을 사용하여 재조합적으로 발현되고 정제될 수 있다.
예를 들어 대조군 및 AD 뇌 슬라이스에 대한 면역조직화학을 사용하여, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 그들의 특이성에 대해 추가로 평가할 수 있다.
본 발명의 항체는 약 10-7, 10-8, 10-9, 10-10, 10-11, 또는 10-12 M 이하의 해리 상수(KD)로 PHF-타우에 대한 친화성을 가질 수 있다. PHF-타우에 대한 주어진 분자의 친화성은 임의의 적합한 방법을 사용하여 실험적으로 결정할 수 있다. 그러한 방법은 당업자에게 알려진 Biacore, ProteOn, 또는 KinExA 기기, ELISA 또는 경쟁적 결합 검정을 이용할 수 있다.
본 발명의 다른 태양은 서열 번호 15, 17, 19, 21, 23, 및 24 중 임의의 것의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 16, 18, 20, 22, 및 25 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 항원-결합 부위를 포함하는 단일클론 항체와 PHF-타우 결합에 대해 경쟁하는 단리된 항체 또는 항원 결합 단편이다.
본 발명의 다른 태양은 서열 번호 15의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 서열 번호 17의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 서열 번호 19의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 서열 번호 21의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 서열 번호 23의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는 서열 번호 24의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 항원-결합 부위를 포함하는 단일클론 항체와 PHF-타우 결합에 대해 경쟁하는 단리된 항체 또는 항원 결합 단편이다.
PHF-타우에 대한 결합 사이의 경쟁은 잘 알려진 방법을 사용하여 시험관내에서 검정할 수 있다. 예를 들어, 면역검정에 이어서 전기화학발광 검출을 사용하여, 표지되지 않은 항체의 존재 하에 MSD Sulfo-Tag™ NHS-에스테르-표지 항체의 PHF-타우에 대한 결합을 평가할 수 있다.
경쟁적 결합에 부가하여 몇몇 잘 알려진 방법을 사용하여 본 발명의 항체의 결합 에피토프를 결정할 수 있다. 예를 들어, 개별 성분 둘 모두의 구조가 알려져 있는 경우에, 컴퓨터 모의실험(in silico) 단백질-단백질 도킹(docking)을 실행하여 상용성 상호작용 부위를 확인할 수 있다. 항원 및 항체 복합체로 수소-중수소(H/D) 교환을 실행하여, 항체에 의해 결합될 수 있는 항원 상의 영역을 맵핑할 수 있다. 항원의 세그먼트 및 점 돌연변이생성을 사용하여, 항체 결합에 중요한 아미노산의 위치를 찾을 수 있다. 항체-항원 복합체의 공결정(co-crystal) 구조를 사용하여, 에피토프 및 파라토프에 기여하는 잔기를 확인한다.
본 발명의 항체는 IgG, IgD, IgA, 또는 IgM 동종형의 단일클론 항체일 수 있다. 본 발명의 항체는 이중특이성 또는 다중특이성일 수 있다. 예시적인 이중특이성 항체는 PHF-타우 상의 2개의 별개의 에피토프에 결합할 수 있거나, PHF-타우 및 아밀로이드 베타(Aβ(에 결합할 수 있다. 다른 예시적인 이중특이성 항체는 PHF-타우 및 내인성 혈액-뇌 장벽 세포통과(transcytosis) 수용체, 예컨대 인슐린 수용체, 전달 수용체, 인슐린-유사 성장 인자-1 수용체, 및 리포단백질 수용체에 결합할 수 있다.β(예시적인 항체는 IgG1 유형의 것이다.
당업자에게 알려진 기법에 의한 Fc 변형을 통해 본 발명의 항체의 면역 이펙터 특성이 향상되거나 침묵될 수 있다. 예를 들어, Fc 이펙터 기능, 예컨대 C1q 결합, 보체 의존성 세포독성(CDC), 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC), 식세포작용, 세포 표면 수용체(예를 들어, B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절 등이, 이들 활성을 담당하는 Fc 내의 잔기를 변형함으로써 제공 및/또는 제어될 수 있다. 예를 들어, Fc 영역은 이펙터 기능을 제거하는 치환을 갖는 인간 IgG4 Fc 영역을 함유할 수 있다. 따라서, 단리된 항체는 하기 치환 중 하나 이상을 함유하는 변형된 인간 IgG4 Fc 영역을 갖는 Fc 영역을 추가로 포함한다: 잔기 233에서 글루타메이트 대신 프롤린으로의 치환, 잔기 234에서 페닐알라닌 대신 알라닌 또는 발린으로의 치환, 및 잔기 235에서 류신 대신 알라닌 또는 글루타메이트로의 치환(EU 넘버링, 문헌[Kabat, E. A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. U.S. Dept. of Health and Human Services, Bethesda, Md., NIH Publication no. 91-3242]). 잔기 297(EU 넘버링)에서 Asn 대신 Ala로 치환함으로써 IgG4 Fc 영역 내의 N-연결된 글리코실화 부위를 제거하는 것은 잔류 이펙터 활성이 제거됨을 보장하는 다른 방법이다. 항체 반감기를 연장하는 Fc 도메인 내의 잔기를 돌연변이화함으로써 약동학적 특성이 또한 향상될 수 있을 것이다(문헌[Strohl Curr Opin Biotechnol 20:685-91, 2009]).
부가적으로, 본 발명의 항체는 글리코실화, 이성질체화, 탈글리코실화(deglycosylation), 또는 비-천연 발생 공유적 변형, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 모이어티의 첨가(페길화) 및 지질화와 같은 과정에 의해 번역후 변형될 수 있다. 그러한 변형은 생체내에서 또는 시험관내에서 일어날 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 폴리에틸렌 글리콜에 접합되어(PEG화되어), 그의 약동학적 프로파일을 개선할 수 있다. 접합은 당업자에게 알려져 있는 기법에 의해 수행될 수 있다. 치료적 항체와 PEG의 접합은 기능을 방해하지 않으면서 약력학적 특성을 향상시키는 것으로 나타났다(문헌[Knight, et al. Platelets 15:409-18, 2004], 문헌[Leong, et al. Cytokine 16:106-19, 2001], 문헌[Yang, et al. Protein Eng 16:761-70, 2003]).
본 발명의 다른 실시 형태는 본 발명의 항체 또는 그들의 보체 또는 이의 단편을 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드이다. 예시적인 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 1 또는 7의 HCDR1; 서열 번호 2, 8, 10, 12, 13, 또는 14의 HCDR2; 및 서열 번호 3의 HCDR3을 포함하는 면역글로불린 중쇄를 포함하고; 서열 번호 4, 9, 또는 11의 LCDR1; 서열 번호 5의 LCDR2; 및 서열 번호 6의 LCDR3을 포함하는 경쇄를 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드이다. 부가적인 예시적인 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 15, 17, 19, 21, 23, 및 24 중 임의의 것의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 16, 18, 20, 22, 및 25 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드이다.
주어진 발현 시스템에서의 유전자 코드의 축퇴성(degeneracy) 또는 코돈 선호도를 고려하여, 본 발명의 항체를 인코딩하는 다른 폴리뉴클레오티드도 또한 본 발명의 범주 내에 있다. 본 발명의 단리된 핵산은 잘 알려진 재조합 기법 또는 합성 기법을 사용하여 제조할 수 있다. 단일클론 항체를 인코딩하는 DNA는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 용이하게 단리되고 서열분석된다. 하이브리도마가 생성되는 경우, 그러한 세포는 그러한 DNA의 공급원으로서의 역할을 할 수 있다. 대안적으로, 코딩 서열 및 번역 산물이 연결된 디스플레이 기술, 예컨대 파지 또는 리보솜 디스플레이 라이브러리를 사용하여, 결합제 및 핵산의 선택이 단순화된다. 파지 선택 후, 파지로부터의 항체 코딩 영역을 단리하고 사용하여 인간 항체 또는 임의의 다른 원하는 항원 결합 단편을 포함하는 전체 항체를 생성하고, 포유류 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모, 및 박테리아를 포함하는 임의의 원하는 숙주에서 발현시킬 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태는 본 발명의 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터이다. 그러한 벡터는 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 트랜스포손 기반 벡터, 또는 임의의 수단에 의해 주어진 유기체 또는 유전적 백그라운드 내로 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 도입하기에 적합한 임의의 다른 벡터일 수 있다.
본 발명의 다른 실시 형태는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것을 포함하는 숙주 세포이다. 그러한 숙주 세포는 진핵 세포, 박테리아 세포, 식물 세포, 또는 고세균(archeal) 세포일 수 있다. 예시적인 진핵 세포는 포유류, 곤충, 조류 또는 다른 동물 기원의 것일 수 있다. 포유류 진핵 세포는 불멸화 세포주, 예컨대 하이브리도마 또는 골수종 세포주, 예컨대 SP2/0(미국 버지니아주 머내서스 소재의 ATCC (American Type Culture Collection), CRL-1581), NS0 (영국 윌트셔주 솔즈베리 소재의 ECACC (European Collection of Cell Cultures), ECACC No. 85110503), FO (ATCC CRL-1646) 및 Ag653 (ATCC CRL-1580) 뮤린 세포주를 포함한다. 예시적인 인간 골수종 세포주는 U266(ATCC CRL-TIB-196)이다. 다른 유용한 세포주는, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 예컨대 CHO-K1SV(Lonza Biologics), CHO-K1(ATCC CRL-61, Invitrogen), 또는 DG44로부터 유래된 것들을 포함한다.
본 발명의 다른 실시 형태는 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 숙주 세포에 의해 생성된 항체를 회수하는 단계를 포함하는, PHF-타우에 결합하는 항체의 제조 방법이다. 항체의 제조 방법 및 이들의 정제 방법은 본 기술 분야에 잘 알려져 있다.
치료 방법
Fab, (Fab')2, scFv 단편, 또는 본 발명의 항체의 항원-결합 부위를 포함하는 항체를 포함하는 본 발명의 항-PHF-타우 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 사용하여 뇌 내 타우의 병리학적 응집을 수반하는 신경퇴행성 질환을 갖는 환자에서 증상을 치료하거나 감소시키거나 예방할 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 치료할 질환(타우병증)은 알츠하이머병(가족성 알츠하이머병 및 산발성 알츠하이머병을 포함함), 17번 염색체와 연관된 파킨슨증을 동반하는 전측두엽 치매(FTDP-17), 진행성 핵상 마비, 피질기저핵 변성, 픽병, 진행성 피질하 신경교증, 농축체 단독 치매, 석회화를 동반하는 미만성 신경섬유 농축체, 은친화성 과립성 치매, 근위축성 측삭 경화증 파킨슨증-치매 복합군, 다운 증후군, 게르스트만-슈투로이슬러-샤잉커병, 할러포르덴-스파츠병, 봉입체 근염, 크로이츠펠트-야콥병, 다계통 위축증, C형 니만-픽병, 프리온 단백질 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 아급성 경화성 범뇌염, 근긴장성 이영양증, 신경섬유 농축체를 동반하는 비-괌 운동 신경세포병, 뇌염후 파킨슨증, 만성 외상성 뇌병증, 및 권투선수 치매(복싱병)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
바람직하게는, 질환(타우병증)은 알츠하이머병(가족성 알츠하이머병 및 산발성 알츠하이머병을 포함함), FTDP-17, 또는 진행성 핵상 마비이다.
가장 바람직하게는, 질환(타우병증)은 알츠하이머병(가족성 알츠하이머병 및 산발성 알츠하이머병을 포함함)이다.
임의의 특정 이론에 의해 구애되고자 하는 것은 아니지만, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 병리학적 타우 응집을 감소시킴으로써(예를 들어, 응집을 방지하고/하거나 이미 발생한 응집을 감소시킴으로써), 따라서 뇌 내의 PHF-타우의 양을 감소시킴으로써 그들의 유익한 효과를 발휘할 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 임의의 분류에 속하는 동물 환자를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 그러한 동물의 예에는 포유동물, 예를 들어 인간, 설치류, 개, 고양이 및 가축이 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 AD의 치료를 위한 의약의 제조에 유용하며, 여기서 의약은 본 명세서에 정의된 투여량으로 투여하기 위해 제조된다.
본 발명의 다른 실시 형태는 타우의 응집을 감소시키기에 충분한 시간 동안 본 발명의 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 타우의 응집을 감소시킬 필요가 있는 환자에서 타우의 응집을 감소시키는 방법이다.
본 발명의 다른 실시 형태는 신경퇴행성 질환의 증상을 치료하거나 감소시키기에 충분한 시간 동안 본 발명의 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 타우의 응집을 수반하는 신경퇴행성 질환의 증상을 치료하거나 감소시키는 방법이다.
상기 실시 형태 중 임의의 것에서, 타우의 응집을 수반하는 신경퇴행성 질환은 타우병증이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "타우병증"은 뇌 내에 타우의 병리학적 응집을 수반하는 임의의 신경퇴행성 질병을 포함한다. 가족성 및 산발성 AD에 부가하여, 다른 예시적인 타우병증은 17번 염색체와 연관된 파킨슨증을 동반하는 전측두엽 치매(FTDP-17), 진행성 핵상 마비, 피질기저핵 변성, 픽병, 진행성 피질하 신경교증, 농축체 단독 치매, 석회화를 동반하는 미만성 신경섬유 농축체, 은친화성 과립성 치매, 근위축성 측삭 경화증 파킨슨증-치매 복합군, 다운 증후군, 게르스트만-슈투로이슬러-샤잉커병, 할러포르덴-스파츠병, 봉입체 근염, 크로이츠펠트-야콥병, 다계통 위축증, C형 니만-픽병, 프리온 단백질 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 아급성 경화성 범뇌염, 근긴장성 이영양증, 신경섬유 농축체를 동반하는 비-괌 운동 신경세포병, 뇌염후 파킨슨증, 및 만성 외상성 뇌병증, 예컨대 권투선수 치매(복싱병)이다. (문헌[Morris, et al. Neuron 70:410-26, 2011]).
타우병증-관련 행동 표현형은 인지 장애, 조기 인격 변조 및 탈억제, 감정둔마(apathy), 의지결여증(abulia), 무언증, 행위상실증, 보속증(perseveration), 상동성 운동/행동, 과잉구강증(hyperorality), 부조화, 순차적 임무의 계획 또는 체계화 불능, 이기심/무감각, 반사회적 특성, 공감 결여, 말더듬기(halting), 빈번한 착어증 오류를 동반하는 비문법적 담화(그러나 상대적으로 보존된 이해력), 손상된 이해력 및 단어 찾기 장애, 서서히 진행하는 보행 불안정성, 후방돌진, 동결, 자주 넘어짐, 비-레보도파 반응성 체간 강직(non-levodopa responsive axial rigidity), 핵상 주시 마비, 사각파 단수축, 느린 수직 단속성 안구운동(slow vertical saccade), 가성 연수 마비, 사지 실행증, 근육 긴장이상, 피질성 감각상실, 및 진전증을 포함한다.
치료에 적합한 환자는 AD 또는 다른 타우병증의 위험이 있는 무증상 개체뿐만 아니라, 현재 증상을 나타내는 환자를 포함한다. 치료에 적합한 환자는 공지된 AD의 유전자적 위험, 예를 들어, AD의 가족력 또는 게놈 내의 유전자적 위험 인자의 존재를 가진 개체를 포함한다. 예시적인 위험 인자는 아밀로이드 전구체 단백질(amyloid precursor protein; APP) 내의, 특히 위치 717 및 위치 670 및 671에서의 돌연변이(각각 하디(Hardy) 및 스웨디시(Swedish) 돌연변이)이다. 다른 위험 인자는 프레세닐린 유전자 PS1 및 PS2, 및 ApoE4 내의 돌연변이, 고콜레스테롤혈증 또는 죽상 동맥경화증의 가족력이다. 상기 위험 인자의 존재에 의해 현재 AD를 앓고 있는 개체를 특징적인 치매로부터 인식할 수 있다. 부가적으로, AD를 갖는 개체를 확인하기 위한 다수의 진단 시험이 이용가능하다. 이들은 뇌척수액 타우 및 Aβ42 수준의 측정을 포함한다. 상승된 타우 및 감소된 Aβ42 수준은 AD의 존재를 의미한다. AD를 앓고 있는 개체는 또한 AD 및 관련 장애 협회(AD and Related Disorders Association) 기준에 의해 진단될 수 있다.
투여/약제학적 조성물
본 발명의 항-PHF-타우 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 타우의 병리학적 응집을 수반하는 신경퇴행성 질환, 예컨대 AD 또는 다른 타우병증의 치료 또는 예방을 위한 치료제 및 예방제 둘 모두로서 적합하다. 무증상 환자에서는, 임의의 연령(예를 들어, 약 10, 15, 20, 25, 30세)에서 치료를 시작할 수 있다. 그러나 통상적으로는, 환자가 약 40, 50, 60, 또는 70세에 도달할 때까지 치료를 시작하는 것이 필요하지 않다. 치료는 전형적으로 소정 기간에 걸쳐 다회 투여를 수반한다. 시간 경과에 따라 항체, 또는 치료제에 대한 활성화된 T-세포 또는 B-세포 반응을 검정함으로써 치료를 모니터링할 수 있다. 반응이 하락할 경우, 추가 투여(booster dosage)가 지시된다.
예방적 응용에서는, 질환의 생화학적, 조직학적, 및/또는 행동 증상, 질환의 전개 중에 나타나는 그의 합병증 및 중간 병리학적 표현형을 포함하여, 질환의 위험을 제거 또는 감소시키거나, 중증도를 경감하거나, 발병을 지연시키기에 충분한 양으로 약제학적 조성물 또는 의약을 AD 또는 다른 타우병증에 걸리기 쉽거나 달리 AD 또는 다른 타우병증의 위험이 있는 환자에게 투여한다. 치료적 응용에서는, 질병의 증상 중 임의의 것(생화학적, 조직학적, 및/또는 행동)을 감소시키거나, 정지시키거나, 지연시키기에 충분한 양으로 조성물 또는 의약을 이러한 질병이 의심되거나 이러한 질병을 이미 앓고 있는 환자에게 투여한다. 치료제의 투여는 장애의 특징적인 병리가 아직 전개되지 않은 환자에서 경도 인지 장애를 감소시키거나 제거할 수 있다. 치료적 또는 예방적 치료를 수행하기에 적당한 양은 치료적으로 또는 예방적으로 유효한 용량으로서 정의된다. 예방 계획 및 치료 계획 둘 모두에서, 조성물 또는 의약은 통상적으로 충분한 면역 반응이 달성되었을 때까지 몇몇 투여량으로 투여된다.
본 발명의 항-PHF-타우 항체 또는 이의 단편은 관련된 신경퇴행성 질환의 치료에 효과적인 다른 제제와 조합하여 투여될 수 있다.
본 발명의 방법에서, 타우병증의 치료 또는 증상의 개선에 있어서 항체의 "치료적 유효량"은 표준 연구 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 항체의 투여량은 당업계에 잘 알려진 관련 동물 모델에 제제를 투여함으로써 결정될 수 있다.
부가적으로, 최적의 투여량 범위를 확인하는 데 도움을 주기 위해 시험관내 검정이 임의로 사용될 수 있다. 특정 유효 용량의 선택은 몇몇 인자의 고려에 기초하여 당업자에 의해 결정될 수 있다(예를 들어, 임상 시험을 통해). 그러한 인자는 치료 또는 예방하고자 하는 질병, 관련된 증상, 환자의 체중, 환자의 면역 상태 및 당업자가 알고 있는 다른 인자를 포함한다. 제형에 사용되는 정확한 용량은 또한 투여 경로, 및 질병의 중증도에 좌우될 것이며, 전문의의 판단 및 각각의 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다. 유효 용량은 시험관내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유래하는 용량-반응 곡선으로부터 외삽될 수 있다.
본 발명의 항체의 치료적 용도를 위한 투여 방식은 작용제를 숙주에게 전달하는 임의의 적합한 경로일 수 있다. 이들 항체의 약제학적 조성물은 비경구 투여, 예를 들어, 피내, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하, 비강내, 또는 두개내 투여에 유용하거나, 그들은 뇌 또는 척추의 뇌척수액 내로 투여될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 약제학적으로 허용가능한 담체 중에 활성 성분으로서 항체 또는 단편의 유효량을 함유하는 약제학적 조성물로서 제조될 수 있다. 용어 "담체"는 항체와 함께 투여되는 희석제, 애쥬번트(adjuvant), 부형제, 또는 비히클을 지칭한다. 그러한 약제학적 비히클은 석유, 동물, 식물, 또는 합성 기원의 것들, 예컨대 낙화생유, 대두유, 광유, 참기름 등을 포함하는, 물 및 오일과 같은 액체일 수 있다. 예를 들어, 0.4% 식염수 및 0.3% 글리신이 사용될 수 있다. 이들 용액은 멸균되어 있으며, 일반적으로 입자상 물질이 없다. 이들은 통상적인 잘 알려진 멸균 기술(예를 들어, 여과)에 의해 멸균될 수 있다. 조성물은 pH 조정제 및 완충제, 안정화제, 증점제, 윤활제, 및 착색제 등과 같은, 생리적 조건에 근접시키기 위해 필요한 약제학적으로 허용가능한 보조 물질을 함유할 수 있다. 그러한 약제학적 제형에서 본 발명의 항체의 농도는 광범위하게, 즉, 약 0.5 중량% 미만, 통상적으로는 약 1 중량% 이상으로부터 15 또는 20 중량%에 달하기까지 변동될 수 있으며, 선택된 특정 투여 방식에 따라, 필요한 용량, 유체 부피, 점도 등에 기초하여 주로 선택될 것이다.
치료는 단회 용량 스케줄로, 또는 다회 용량 스케줄로 주어질 수 있으며, 다회 용량 스케줄에서는 치료의 1차 과정이 1 내지 10회의 개별 용량을 사용한 후, 반응을 유지하고/하거나 강화하기 위해 필요한 후속 시간 간격에, 예를 들어, 제2 용량을 위해 1 내지 4개월에 다른 용량이 주어지며, 필요한 경우에는, 몇 개월 후에 후속 용량(들)이 주어질 수 있다. 적합한 치료 스케줄의 예는 (i) 0, 1개월 및 6개월, (ii) 0, 7일 및 1개월, (iii) 0 및 1개월, (iv) 0 및 6개월, 또는 질병 증상을 감소시키거나 질병의 심각성을 감소시킬 것으로 예상되는 바람직한 반응을 유도하는 데 충분한 다른 스케줄을 포함한다.
따라서, 근육내 주사를 위한 본 발명의 약제학적 조성물은 1 ml의 멸균 완충수 및 약 1 ng 내지 약 100 mg, 약 50 ng 내지 약 30 mg, 또는 약 5 mg 내지 약 25 mg의 본 발명의 항체를 함유하도록 제조될 수 있을 것이다. 유사하게, 정맥내 주입을 위한 본 발명의 약제학적 조성물은 약 250 ml의 멸균 링거 용액 및 약 1 mg 내지 약 30 mg 또는 약 5 mg 내지 약 25 mg의 본 발명의 항체를 함유하도록 구성될 수 있을 것이다. 비경구로 투여가능한 조성물을 제조하기 위한 실제의 방법은 잘 알려져 있고, 예를 들어 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Science", 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA]에 더욱 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 항체 및 이의 단편은 저장을 위해 동결건조되고 사용 전에 적합한 담체 중에 재구성될 수 있다. 이 기법은 항체 및 다른 단백질 제제에 효과적인 것으로 밝혀져 있으며, 당업계에 알려진 동결건조 및 재구성 기법이 사용될 수 있다.
진단 방법 및 키트
본 발명의 항체는 대상에서 AD 또는 다른 타우병증을 진단하는 방법에 사용될 수 있다. 본 방법은 본 발명의 항체 또는 이의 단편과 같은 진단 시약을 사용하여 대상에서 PHF-타우의 존재를 검출하는 단계를 수반한다.
생물학적 샘플을 진단 항체 시약과 접촉시키고, 대상으로부터의 샘플 내의 PHF-타우에 대한 진단 항체 시약의 결합을 검출함으로써, 대상으로부터의 생물학적 샘플(예를 들어, 혈액, 소변, 또는 뇌척수액)에서 PHF-타우를 검출할 수 있다. 검출을 실행하기 위한 검정은 ELISA, 면역조직화학, 웨스턴 블롯, 또는 생체내 이미징과 같은 잘 알려진 방법을 포함한다.
진단 항체 또는 유사한 시약은 정맥내 주사에 의해 환자의 체내로 투여되거나, 상기 예시된 바와 같이 숙주에게 제제를 전달하는 임의의 적합한 경로에 의해 뇌 내로 직접 투여될 수 있다. 항체의 투여량은 치료 방법에 대한 것과 동일한 범위 이내여야 한다. 전형적으로, 항체는 표지되지만, 일부 방법에서는 PHF-타우에 대해 친화성을 갖는 1차 항체는 표지되지 않고, 1차 항체에 결합하기 위해 2차 표지제(labeling agent)가 사용된다. 표지의 선택은 검출 수단에 좌우된다. 예를 들어, 광학적 검출에는 형광 표지가 적합하다. 외과적 중재가 없는 단층촬영 검출을 위해서는 상자성 표지(paramagnetic label)의 사용이 적합하다. PET 또는 SPECT를 사용하여 방사성 표지가 또한 검출될 수 있다.
대상체로부터의 샘플에서, 또는 대상체에서, 표지된 PHF-타우, 타우 응집체, 및/또는 신경섬유 농축체의 수, 크기, 및/또는 강도를 상응하는 기저선 값과 대비함으로써 진단이 수행된다. 기저선 값은 질환이 없는 개체의 집단 내의 평균 수준을 나타낼 수 있다. 기저선 값은 또한 동일한 대상체에서 결정된 이전 수준을 나타낼 수 있다.
상기 기재된 진단 방법은 또한, 치료 전에, 치료 중에, 또는 치료 후에 대상에서 PHF-타우의 존재를 검출함으로써 요법에 대한 대상의 반응을 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. 기저선과 대비하여 값의 감소는 치료에 대한 양성 반응을 의미한다. 병리학적 타우가 뇌로부터 제거됨에 따라 생물학적 체액에서 값이 또한 일시적으로 증가할 수 있다.
본 발명은 추가로, 상기 진단 방법 및 모니터링 방법을 수행하기 위한 키트에 관한 것이다. 전형적으로, 그러한 키트는 본 발명의 항체와 같은 진단 시약, 및 선택적으로, 검출가능한 표지를 함유한다. 진단 항체 자체가 검출가능한 표지(예를 들어, 형광 분자, 비오틴 등)를 함유할 수 있으며, 이는 직접 검출가능하거나 2차 반응(예를 들어, 스트렙타비딘과의 반응)을 통해 검출가능하다. 대안적으로, 검출가능한 표지를 함유하는 2차 시약이 이용될 수 있으며, 여기서 2차 시약은 1차 항체에 대한 결합 특이성을 갖는다. 생물학적 샘플 내의 PHF-타우를 측정하기에 적합한 진단 키트에서, 키트의 항체는 마이크로타이터 디쉬(microtiter dish)의 웰과 같은 고체상(solid phase)에 사전결합되어 공급될 수 있다.
본 출원 전체에 걸쳐 인용된 (서적 참고문헌, 발행 특허, 공개된 특허 출원, 및 공계류 중인 특허 출원을 포함한) 모든 인용된 참고문헌의 내용은 본 명세서에 명시적으로 참조로 포함된다.
실시예 1
쌍 나선형 필라멘트- 타우(PHF-타우)의 정제
그린버그 및 데이비스의 변형된 방법에 의해 PHF-타우를 부분적으로 정제하였다(문헌[Greenberg and Davies Proc Natl Acad Sci U S A 87:5827-31, 1990]). 약술하면, 조직학적으로 확인된 알츠하이머 환자로부터 얻은 피질로부터의 사후 조직을 부분적으로 정제하였다. 전형적으로, 5 mg의 전두 피질을 10 vol의 차가운 완충제인 완충제 H(10 mM 트리스, 800 mM NaCl, 1 mM EGTA, 및 10% 수크로스/ pH 7.4) 중에 유리/테플론 포터 조직 균질화기(Potter tissue homogenizer)(독일 슈타우펜 소재의 IKA Works, Inc)를 사용하여 1000 rpm에서 균질화하였다. 균질화된 물질을 Sorvall 로터 SS34에서 20 min 동안 27000 g로 원심분리하였다. 펠릿을 폐기하고, 상층액을 1%(w/v) N-라우로일사르코신 및 1%(v/v) 2-머캅토에탄올의 최종 농도로 조정하고, 37℃에서 2 h 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 상층액을 Beckman 60Ti 로터에서 35 min 동안 20℃에서 108000 g로 원심분리하였다. 펠릿을 PBS 중에 신중하게 세척하고 PBS에 현탁시켰다. 상층액을 기재된 바와 같이 다시 원심분리하고, 최종 펠릿을 용해시키고, 분취하고, -80℃에서 냉동시켰다. PHF-타우 제제의 품질을 12% SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 상에서 항-타우 항체 AT8 및 HT7(미국 일리노이주 록포드 소재의 ThermoScientific)로 평가하였다. 양호한 품질의 PHF-타우 제제는 AT8과 같은 과인산화된 PHF-타우와 반응성인 항체로 검출된 웨스턴 블롯 상에서 약 60, 64, 66, 및 72 kDa의 분자량을 갖는 4개의 밴드로 구성된다. 동일한 뇌 샘플로부터 유사한 품질 및 순도를 갖는 2개의 별도의 PHF-타우 제제를 제조하였다. 제제 1을 면역화에 사용하였다.
실시예 2
PHF-타우에 대한 단일클론 항체의 생성
정상 Balb/c 마우스에서 표준 하이브리도마 기술을 사용하여 항-PHF-타우 항체를 생성하였다(문헌[Kohler and Milstein Nature 256:495-7, 1975]). 얻어진 하이브리도마를 96-웰 플레이트에 시딩하고, 하기 기재된 바와 같이 25 ng/웰 코팅된 PHF-타우 상의 직접 ELISA에서 10 일 후에 스크리닝하였다. E. 콜라이(E. Coli) BL21 세포에서 발현된 대조군 타우(서열 번호 31)로 코팅된 10 ng/웰 상에서 양성 세포를 교차-반응성에 대해 시험하였고, 열처리 및 암모늄 설페이트 침전에 의해 정제하였다. PT82는 PHF 타우 및 대조군 타우(서열 번호 31) 둘 모두에 결합하는 것으로 확인되었다.
양성 세포를 즉시 서브클로닝하고, 양성 클론을 액체 질소 중에 냉동시켰다. 10% 우태아 혈청(유럽 소재의 Hyclone), 하이브리도마 융합 클로닝 보충제(2%)(벨기에 브뤼셀 소재의 Roche) 2% HT(미국 소재의 Sigma), 1 mM 소듐 피루베이트, 2 mM L-글루타민 및 페니실린(100 U/ml) 및 스트렙토마이신(50 mg/ml)으로 보충된 둘베코 변형 이글 배지 중에 모든 하이브리도마를 성장시켰다.
선택된 하이브리도마 세포로부터 항체 가변 영역을 마우스 IgG1/IgG2/κ 백그라운드 상으로 클로닝하고, 일상적인 방법을 사용하여 발현 및 정제하였다. 약술하면, PT/82 하이브리도마 세포를 RLT 완충제(Qiagen 카탈로그 번호 79216) 중에 용해시키고 -70℃에서 냉동시켰다. 용해물을 37℃에서 해동하고, RNeasy 96 Kit(Qiagen 카탈로그 번호 74182)를 사용하여 RNA를 단리하였다.
RNA의 분취물을 사용하여, 마우스 IgG 중쇄, 마우스 카파 경쇄, 및 마우스 람다 경쇄에 대한 불변 영역에 어닐링하도록 설계된 프라이머를 사용하는 유전자 특이적 역방향 프라이머 믹스를 사용하여 cDNA를 합성하였다.
IgG 중쇄 가변 영역, 카파 경쇄 가변 영역, 또는 람다 경쇄 가변 영역을 증폭하도록 설계된 마우스 프라이머 세트를 이용하는 PCR 반응에 cDNA의 분취물을 사용하였다. 정방향 프라이머는 프레임워크 1에 어닐링하도록 설계된 다중 프라이머로 이루어졌고, 역방향 프라이머는 불변 영역에 어닐링하도록 설계하였다. PCR 산물의 분취물을 2% 아가로스 겔 상에서 실행하였고, 중쇄 및 카파 PCR 산물은 정확한 크기의 가시적인 밴드를 나타냈다.
각각의 불변 영역에 어닐링하도록 설계된 중쇄 또는 카파 경쇄 역방향 프라이머를 사용하여 중쇄 및 카파 경쇄 PCR 산물을 서열분석하였다(생거 방법). 서열을 분석하고 정렬하여 가장 가깝게 일치하는 마우스 생식세포계열을 확인하였다. 일치하는 생식세포계열 서열을 사용하여 중쇄 및 카파 사슬 프레임워크 1 서열의 최초 10개의 아미노산을 대체하였다. IgG 중쇄 및 카파 가변 영역 아미노산 서열을 코돈 최적화하고 합성하였다. 코돈 최적화된 IgG 중쇄 및 카파 경쇄 가변 영역을 합성하고, 단편을 마우스 IgG2a 동종형 중쇄 및 카파 경쇄 동종형 발현 벡터 내로 클로닝하였다.
선택된 하이브리도마 세포로부터 항체 가변 영역을 클로닝하고, 표준 방법을 사용하여 서열분석하고, mAb 및 Fab에 대한 발현 벡터 내로 서브클로닝하였다. 마우스 IgG2a/κ 백그라운드 상에서 Mab를 생성하고, 발현시키고, 친화성 크로마토그래피(단백질 A)에 의해 정제하였다. 인간 IgG1/κ 불변 도메인에 융합된 마우스 가변 도메인 및 중쇄의 C-말단에서의 His 태그를 갖는 키메라 버전으로서 Fab를 생성하였다. HEK293F 세포에서 Fab를 일시적으로 발현시키고, 친화성 크로마토그래피(HisTrap)에 의해 정제하였다.
실시예 3
표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의한 결합 평가
PT82 및 그의 Fab 단편과 PHF 및 가용성 (2N4R) 타우에 대해, ProteOn XPR36(미국 캘리포니아주 허큘레스 소재의 Bio-Rad) 또는 Biacore T200(스웨덴 웁살라 소재의 Biacore) 기기 상의 SPR에 의해 PHF-타우 및 재조합 타우와의 상호작용을 평가하였다. 표 2는 PT82 및 그의 Fab와 PHF-타우 및 가용성-타우의 친화성 평가의 대표적인 결과를 나타낸다.
[표 2]
Figure pct00003
PT82 및 그의 Fab 둘 모두는 PHF-타우에 결합하였다. 한편 PT82의 Fab 단편은 또한 가용성 타우에 결합하였다(또한 도 1 참조). 본 연구로부터의 결과는 PT82가 PHF-타우 및 가용성 타우에 결합함을 입증하였다.
실시예 4
항체 선택을 위한 직접 ELISA
50 μl/웰 코팅 완충제(10 mM 트리스, 10 mM NaCl, 및 10 mM NaN3, pH 8.5) 중에 NUNC Maxisorp(Life Technologies) 편평-바닥 고-결합 96-웰 마이크로 타이터 플레이트에서 25 ng/웰의 PHF-타우를 4℃에서 하룻밤 코팅하였다. 다음 날에, 75 μl/웰의 PBS 중의 0.1% 카세인으로 실온에서 60 min 동안 플레이트를 차단하였다. 그 다음에, 50 μl의 하이브리도마 상층액을 첨가하고, 37℃에서 1 h 동안 인큐베이션하였다. 세척 후에, 결합된 단일클론 항체를 37℃에서 1 hr 동안 호스래디쉬 퍼옥시다제와 접합된 50 μl/웰의 양-항-마우스 IgG로 검출하였다(Amersham-Pharmacia Biotech). 둘 모두의 시약을 0.1% 카세인/PBS에 희석하였다. 플레이트를 세척하고, 100 mM 시트르산 및 100 mM 다이소듐 하이드로겐 포스페이트(pH 4.3) 중의 0.42 mM 3,5,3',5'-테트라메틸-벤지딘, 0.003%(v/v) H2O2의 용액 50 μl를 기질로서 첨가하였다. 반응은 플레이트 진탕기 상에서 최대 15 min 동안 실온에서 진행될 수 있었으며, 그 후에 2 N H2SO4 50 μl/웰로 발색을 중지시키고, 450 nm에서 마이크로 타이터 플레이트 판독기 상에서 플레이트를 판독하였다(Thermomax, Molecular Devices).
실시예 5
재조합 WT(2N4R; 서열 번호 31) 타우에 대한 결합을 ELISA에 의해 분석하였으며, 여기서는 전장 타우 단백질(1 ng/mL 또는 10 ng/mL)을 플레이트에 직접 코팅하고, 상이한 농도의 재조합적으로- 또는 하이브리도마 생성된 PT82 항체와 함께 인큐베이션하였다(도 2). 항체와의 인큐베이션 후에, 플레이트를 다시 세척하고, 50 μL/웰의 HRPO 표지 항-마우스 항체(GE Healthcare)(차단 완충제에 1:10000으로 희석됨)를 첨가하였다. 추가 세척 단계 후에, 제조자의 설명서에 따라 "원 스텝" TMB(Thermo Scientific)를 사용하여 검출을 수행하였다. 플레이트를 EnVision® 2102 멀티라벨 판독기(Multilabel Reader)(미국 매사추세츠주 월섬 소재의 Perkin Elmer)에서 분석하였다. GraphPad Prism7.0 소프트웨어를 사용하여 결합 곡선을 생성하였다. 예상되는 바와 같이, 타우의 더 낮은 코팅 농도는 더 낮은 최대 값을 유발했다(예를 들어, 각각 1 ng/mL 또는 10 ng/ml에 대한 재조합 항체의 결합을 나타내는 적색 대 녹색 곡선을 비교함). 재조합 및 하이브리도마 생성된 항체의 결합 프로파일 사이에 실질적인 차이가 관찰되지 않았다.
실시예 6
척수 동시-인큐베이션 검정(FRET 검정)
동시-인큐베이션을 위한 타우 시드를 함유하는 균질물은 응집된 유전자도입 인간 타우를 함유하는 주령 22 내지 23 주의 P301S 유전자도입 동물로부터의 척수 조직으로부터 유래되었다(도 3a). 검정에 사용된 수용자 세포는 K18/P301L-YFP 및 K18/P301L-CFP를 안정하게 발현하는 HEK 세포였다(문헌[Holmes et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 111(41):E4376-85, 2014]). 타우 시드를 함유하는 균질물을 음성 대조군 또는 PT82 항체와 함께 동시-인큐베이션하고, 수용하는 발색단-K18-함유 HEK 세포에 이 혼합물을 72 h 동안 첨가하였다. FACS에 의해 FRET-양성 세포를 계수함으로써 K18 응집체 형성을 측정하였다.
PT82는 3 nM에 불과한 농도에서 타우 응집체 유도를 차단하였다(도 3b).
실시예 7
면역고갈 세포 검정
최대 백분율 억제 값이 시드 상의 에피토프의 밀도 또는 PT82 에피토프를 함유하는 시드의 수에 관련되는지를 조사하기 위하여, 면역고갈 검정을 수행하였다(도 4a). 면역고갈 검정에서는, 타우 시드를 음성 대조군 또는 PT82 항체와 함께 인큐베이션하고 단백질 G 비드로 용액으로부터 제거하였다. 고갈된 상층액을 발색단-K18-함유 HEK 세포에서 잔류 시딩 능력에 대해 시험하고 이전에 기재된 바와 같이 FACS에 의해 분석하거나(문헌[Holmes et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 111(41):E4376-85, 2014]), 응집 선택적 타우 검정을 사용하여 응집된 타우의 수준에 대해 시험하였다.
주령 22 내지 23 주의 P301S 유전자도입 동물 또는 동결보존된 인간 AD 뇌 조직으로부터의 척수로부터 면역고갈을 위한 타우 시드를 함유하는 균질물을 생성하였다. 인간 AD 뇌 면역고갈 검정에서, 고갈 후의 상층액을 형질감염 시약 Lipofectamine2000의 존재 하에서 시험하여 허용가능한 검정 범위(assay window)를 얻었다.
타우 시딩 잠재력(FRET 검정에서 측정됨; 도 4b) 및 타우 응집 수준(응집된-타우 선택적 MSD 검정에 의해 측정됨; 도 4c)은 척수 추출물 내의 PT82 및 인간 AD 뇌로부터의 총 균질물로 고갈될 수 있었다. PT82는 인간 AD 뇌 및 TgP301S 척수 용해물 둘 모두로부터 유래된 타우 시드를 억제하였다. 타우 시딩은 척수 추출물 내의 PT82로 거의 완전히 고갈될 수 있었다.
실시예 8
ePHF 주사 모델에서 뮤린 PT82의 생체내 효능
합성 K18 피브릴과 같은 타우의 전-응집(pro-aggregating) 단편(문헌[Li and Lee, Biochemistry. 45(51):15692-701, 2006]) 또는 인간 AD 뇌로부터 유래된 PFH-타우 시드를 세포 자율 응집이 시작되지 않은 연령의 P301L 유전자도입 마우스 모델의 피질 또는 해마 영역에 주사하는, 유전자도입 P301L 마우스 주사 모델이 확립되었다. 이러한 주사 모델은 타우 확산의 중요한 세포외 시딩 성분을 모방하는 것을 목표로 한다. 주사된 K18 또는 PHF-타우 시드는 주사 부위에서, 그리고 더 작은 정도로, 결합된 대측 영역에서 타우병증을 유도한다(문헌[Peeraer et al., Neurobiol Dis. 73:83-95, 2015]). 이 모델은 AD-뇌-유래 PHF-타우 시드 또는 K18 피브릴과 함께 동시-주사될 경우에, 본 발명의 항-타우 항체와 같은 항체의 항-시딩 잠재력의 시험을 가능하게 한다(문헌[Iba et al., 2015, J Neurosci. 33(3):1024-37, 2013]; 문헌[Iba et al., Acta Neuropathol. 130(3):349-62]).
사후 AD 뇌의 사르코실-불용성 분획의 피질 주사는 타우 응집의 서서히 진행되는 증가를 촉발한다. 주사된 반구에서, 제1 신호는 주사 후 1개월째에 측정되고, 주사 후 3개월째에 추가로 진행한다. 주사 후 5개월째에, 일부 동물은 P301L 돌연변이에 의해 유도된 농축체를 형성하기 시작한다(문헌[Terwel et al., 2005, 상동]). AT8 염색 수준은 1 내지 3개월에 증가하므로(PT3 특허 참조), 항체 효능 실험은 동시-주사 후 2개월에 분석된다. 부가적으로, 사후 AD 뇌의 사르코실-불용성 분획의 해마 주사는 주사된 반구로부터의 사르코실 불용성 분획의 MesoScale Discoveries(MSD) 분석에 의해 측정된 타우 응집의 용량-의존적 진행성 증가를 촉발한다.
동물 처리 및 두개내 주사
주사 연구를 위하여, P301L 돌연변이를 갖는 최장 인간 타우 아이소형(타우-4R/2N-P301L)을 발현하는 유전자도입 tau-P301L 마우스(문헌[Terwel et al., 2005, 상동])를 생후 3개월째에 수술에 사용하였다. 모든 실험은 지방윤리위원회에 의해 승인된 프로토콜에 따라 수행하였다. 정위적 수술의 경우, 마우스는 해마(AP -2.0, ML +2.0(브레그마로부터), DV 1.8 mm(듀라로부터))에, 단일클론 항체의 존재 또는 부재 하에, 3 μl(속도 0.25 μl/min)로, 사후 AD 조직으로부터의 사르코실 불용성 제제(풍부화된 쌍 나선형 필라멘트, ePHF)에 의한 단측(우측 반구) 주사를 받았다. 해부를 위해 마우스를 희생시켰다(두개내 주사 후 2 개월).
적출 절차
주사된 반구로부터의 마우스 조직을 칭량하고, 6 부피의 균질화 완충제(10 mM 트리스 HCl(pH 7.6); 0.8 M NaCl; 10% w/v 수크로스; 1 mM EGTA; PhosStop 포스파타제 억제제 칵테일; 완전 무-EDTA 미니 프로테아제 억제제) 중에 균질화하였다. 균질물을 28 000 × g로 20 분 동안 원심분리하고, 생성되는 상층액(총 균질물)으로부터 분취물을 취한 후, 1% N-라우로일사르코신을 첨가하였다. 90분(900 rpm, 37℃) 후에, 용액을 다시 184 000 × g로 1시간 동안 원심분리하였다. 상층액은 사르코실-가용성 분획으로 유지한 반면, 사르코실-불용성 물질을 함유하는 펠릿은 균질화 완충액 중에 재현탁시켰다.
생화학적 분석
코팅 항체(AT8)를 PBS에 희석하고(1 ㎍/ml), MSD 플레이트(L15XA, Mesoscale Discoveries) 내로 분취하고(30 uL/웰), 이를 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 5 × 200 μl의 PBS/0.5% Tween-20으로 세척한 후, PBS 중 0.1% 카세인으로 플레이트를 차단시키고, 5 × 200 μl의 PBS/0.5% Tween-20으로 다시 세척하였다. 샘플 및 표준물(둘 모두 PBS 중 0.1% 카세인 중에 희석됨)을 첨가한 후, 플레이트를 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 이어서, 플레이트를 5 × 200 μl의 PBS/0.5% Tween-20으로 세척하고, PBS 중의 0.1% 카세인 중의 SULFO-TAG™ 접합된 검출 항체(AT8)를 첨가하고, 600 rpm으로 진탕하면서 실온에서 2 hr 동안 인큐베이션하였다. 최종 세척(5 × 200 μl의 PBS/0.5% Tween-20) 후에, 150 μl의 2 × 완충액 T를 첨가하고, 플레이트를 MSD 이미저로 판독하였다. 원시 신호를 사후 AD 뇌로부터의 사르코실 불용성 프렙(ePHF)의 16개의 희석물로 이루어진 표준 곡선에 대해 정규화하고, 임의적인 단위(AU) ePHF로 표현하였다. 그래프패드 프리즘 소프트웨어 및 자동화 분석을 위해 '자체' 개발한 어플리케이션으로 통계적 분석(본페로니 사후 검정을 이용하는 ANOVA)을 수행하였다.
결과
일 연구에서는 해마 동시-주사 모델 하의 마우스 PT82의 활성(IgG2a로서 재조합적으로 발현됨)을 AT180 및 PT3의 활성에 비교하였다(도 5, 표 3). 항체(4.5 피코몰)를 ePHF 타우(0.6 피코몰)와 함께 피질 내로 동시-주사하였다. 각각의 군에 15 마리의 동물을 사용하였다. PT82의 동시-주사는 따라서 P301L 마우스에서 ePHF-유도 타우 응집을 약화시켰다(도 5a 및 도 5b). 총 균질물(도 5a) 및 사르코실 불용성 균질물(도 5b)에서 효과를 관찰하였다.
[표 3]
Figure pct00004
추적관찰 연구에서는, PHF의 두개내 주사(도 6a) 및 항체+ PHF의 두개내 동시-주사(도 6b) 후에 항체의 말초 투여(20 mg/㎏; 2x/주) 시의 PT3 및 PT82에 의한 효능을 비교하였다. 말초 투여는 PHF의 두개내 주사 전 2 주에 시작되었고, 실험의 생존기 중에 계속되었다. 표 4는 실험에 사용된 항체의 양을 나타낸다. 제1 연구와 일치하여, PT3 및 PT82의 동시-투여 둘 모두는 사르코실 불용성 분획(도 6c 및 표 5) 및 총 뇌 균질물(도 6d 및 표 5)에서 ePHF-유도 응집 신호를 감소시켰다. 이에 부가하여, 항체의 말초 투여는 ePHF에 의해 유도된 시딩을 유의하게 억제하였다.
[표 4]
Figure pct00005
[표 5]
Figure pct00006
실시예 9
어레이 펩티드의 합성
표적 분자의 에피토프를 재구성하기 위하여, 타우 441 서열을 커버하는 펩티드의 라이브러리(18개의 아미노산의 중첩을 갖는 20-량체)를 합성하였다. 독점적인(proprietary) 친수성 중합체 제형으로 그래프팅한 후, 다이사이클로헥실카르보다이이미드(DCC)와 N-하이드록시벤조트라이아졸(HOBt)을 사용하는 t-부틸옥시카르보닐-헥사메틸렌다이아민(BocHMDA)과의 반응 및 트라이플루오로아세트산(TFA)을 사용하는 Boc-기의 후속 절단에 의해, 아미노 기능화된 폴리프로필렌 지지체를 얻었다. 표준 Fmoc-펩티드 합성을 사용하여, 맞춤 변형된 JANUS 액체 취급 스테이션(Perkin Elmer)에 의해 아미노-기능화 고체 지지체 상에 펩티드를 합성하였다. 구조 모방체의 합성은 Pepscan의 독점적인 스캐폴드 상의 화학적으로 연결된 펩티드(CLIPS: Chemically Linked Peptides on Scaffolds) 기술을 사용하여 실행하였다(문헌[Timmerman P, Puijk WC, Meloen RH (2007) Functional reconstruction and synthetic mimicry of a conformational epitope using CLIPS technology. J Mol Recognit 20: 283-299. 10.1002/jmr.846 [doi]]). CLIPS 기술은 단일 루프, 이중 루프, 삼중 루프, 시트형 폴드, 나선형 폴드, 및 이들의 조합으로 펩티드를 구조화하는 것을 가능하게 한다. CLIPS 주형은 시스테인 잔기에 커플링된다. 펩티드 내의 다중 시스테인의 측쇄는 1 또는 2개의 CLIPS 주형에 커플링된다. 예를 들어, P2 CLIPS(2,6-비스(브로모메틸)피리딘)의 0.5 mM 용액을 암모늄 바이카르보네이트(20 mM, pH 7.8)/아세토니트릴(1:3(v/v))에 용해시킨다. 이 용액을 펩티드 어레이 상에 첨가한다. CLIPS 주형은 펩티드-어레이의 고체상 결합 펩티드에 존재하는 2개의 시스테인의 측쇄에 결합할 것이다(3 μl 웰을 가진 455 웰 플레이트). 용액 중에 완전히 덮여 있는 중에 펩티드 어레이를 30 내지 60 분 동안 용액 중에서 온화하게 진탕한다. 최종적으로, 펩티드 어레이를 과량의 H2O로 광범위하게 세척하고, PBS(pH 7.2) 중에 1% SDS/0.1% 베타-머캅토에탄올을 함유하는 붕괴-완충제 중에 70℃에서 30 분 동안 초음파 처리한 후, H2O 중에 추가로 45 분 동안 초음파 처리한다. T3 CLIPS를 보유하는 펩티드는 유사한 방식으로 제조되었지만, 여기에는 3개의 시스테인이 있다.
Elisa 스크리닝
합성된 펩티드 각각에 대한 항체의 결합(IgG2a로서 재조합적으로 발현됨)을 pepscan-기반 ELISA에서 시험하였다. 펩티드 어레이를 1차 항체 용액과 함께 인큐베이션하였다(4℃에서 하룻밤). 세척 후에, 펩티드 어레이를 25℃에서 1 시간 동안 적절한 항체 퍼옥시다제 접합체(SBA)의 1/1000 희석액과 함께 인큐베이션하였다. 세척 후에, 퍼옥시다제 기질 2,2'-아지노-다이-3-에틸벤즈티아졸린 설포네이트(ABTS) 및 20 μl/ml의 3% H2O2를 첨가하였다. 1 시간 후에, 발색을 측정하였다. 전하 결합 소자(CCD: charge coupled device)-카메라 및 이미지 처리 시스템으로 발색을 정량화하였다.
결과
도 7의 데이터는 타우441 서열 내의 잔기 103으로부터 시작하여 잔기 140까지의 일련의 펩티드에 대한 PT82의 결합을 나타낸다. 이들 항체의 경우, 다른 타우 펩티드에 대한 결합은 관찰되지 않았다. 상세한 맵핑은 PT82가 공통 모티프 119AGHVTQ124(서열 번호 32)를 갖는 펩티드에 결합함을 입증하였다.
실시예 10
PT82의 인간화
인간화 중쇄 및 경쇄의 최상의 조합을 찾기 위하여, 시험을 위해 몇몇 인간 V-영역 서열을 선택하였다. 인간 생식세포계열 및 J-영역의 선택은 전적으로 프레임워크(FR) 영역 내의 마우스 항체에 대한 전체 서열 유사성에 기초하였다. CDR 서열도, 그의 길이 또는 표준 구조도 이들 어느 것도 이 선택에서는 고려하지 않았다.
HFA에 사용된 CDR 정의는 문헌[Fransson J, et al. J. Mol. Biol. 2010; 398:214-231]에 기재되어 있으며, 마틴(Martin)의 정의에 상응한다(문헌[Abhinandan KR and Martin AC. Mol. Immunol. 2008; 45:3832-3839]). CDR은 하기와 같이 정의된다(초티아 넘버링 스킴을 사용함(문헌[Chothia C, and Lesk A. J. Mol. Biol. 1987; 196:901-917]). VL/VH 쌍 및 CDR 입체배좌에 있어서 중요한 것으로 알려진 프레임워크 위치에서, 인간화된 V-영역의 결합 친화성을 유지하기 위해 인간 대 마우스 복귀 돌연변이를 포함하도록 아미노산을 이진 잔기 라이브러리(binary residue library)에서 변동시켰다. PT82의 경우, CDR을 인간 HV3-72*01a 생식세포계열 유전자 내로 그래프팅하였다. VH: 인간/마우스 이진 조합 라이브러리(binary combinatorial library)는 위치 37: I, V; 78: V, L; 93: T, A; 94: R, G를 포함하였다. 경쇄의 경우, 위치 4: L, M 및 78: L, M에서 VL: 인간/마우스 이진 조합 라이브러리를 가진 인간 KV1-9*01a 유전자 내로 CDR을 그래프팅하였다.
부가적으로, 인간화 PT82의 친화성을 개선하는 데 도움을 주기 위해, VH 및 VL 내의 몇몇 위치를 파지 디스플레이 라이브러리에서 무작위화하였다(표 6).
[표 6]
Figure pct00007
중첩 PCR에서 축퇴 올리고뉴클레오티드를 사용하여 인간화/성숙 라이브러리를 생성하였다. 이어서, VH 또는 VL 라이브러리 DNA 단편을 상보성 마우스 V-영역과 조합하여 pCNTO 파지미드 내로 클로닝하였다(문헌[Shi et al., J. Mol. Biol. 397:385-396, 2010]; 국제 특허 출원 공개 제WO2009/085462호; 미국 특허 출원 공개 제US2010/0021477호; 미국 특허 출원 공개 제US2012/0108795호). 라이브러리 결찰을 정제하고 MC1061F' 세포 내로 형질전환시켰다. 세포를 대수기 성장(OD600nm ≒ 0.6)이 달성되었을 때까지 2xYT(Carb) 중에 성장시켰다. 헬퍼 파지를 첨가하고, 배양물을 37℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 카나마이신 및 IPTG를 각각 35 ug/mL 및 1 mM의 최종 농도로 각각의 배양물에 첨가하고, 30℃에서 진탕하면서 하룻밤 성장시켰다. PEG/NaCl을 사용하여 박테리아 배지로부터 파지를 침전시키고 PBS에 재현탁시켰다.
친화성 성숙 패닝을 위해, Bt-타우 펩티드를 50 μl의 SA-코팅된 자기 비드 상에 포획하였다. 항원 농도는 라운드 1의 경우에 10 nM, 라운드 2의 경우에 0.1 nM, 그리고 라운드 3의 경우에 0.1 nM이었다. 비드를 PBST로 6회 세척하고 PBS로 1회 세척한 후, 상기 기재된 바와 같이 E. 콜라이 감염시켰다. 파지 디스플레이 선택 후에, 파지미드 DNA를 감염된 MC1061F' 세포로부터 단리하고, 제한 효소로 분해하여 pIX를 인코딩하는 서열을 제거하고, 선형화된 플라스미드 DNA를 잘라내고 아가로스 겔로부터 정제하였다. 이어서, 이 DNA를 T4 DNA 리가제로 자기-라이게이션시켰다. 라이게이션된 DNA를 MC1061F' 세포 내로 전기천공하고 LB(Carb/글루코스) 아가 플레이트 상에 플레이팅하였다.
이 전기천공으로부터의 콜로니를 ELISA 스크리닝 및 Fab 발현의 평가를 위해 채취하였다. 약술하면, Maxisorp 96 웰 플레이트를 가용성 타우 단백질로 코팅하였다. Fab 콜로니를 2xYT 배지 중에 성장시키고, IPTG로 Fab 발현을 유도하였다. ELISA 플레이트를 세척하고, E. 콜라이 배지 내로 분비된 Fab를 각각의 ELISA 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 세척하고 항-Fab'2:HRP(Jackson ImmunoResearch)를 ELISA 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 세척하고 화학발광 검출 시약을 첨가하고 Perkin Elmer EnVision 플레이트 판독기 상에서 발광에 대해 플레이트를 판독하였다.
양성 클론을 VH 및 VL 둘 모두에서 서열분석하였다. VH 및 VL 서열은 표 1에 열거되어 있다. 전장 IgG1 분자로서의 발현 및 정제를 위해 독특한 서열을 IgG 유전자 발현 작제물 내로 클로닝하였다. IgG 작제물을 CHO-Expi 세포 내로 형질감염시키고, MabSelectSure 수지를 사용하여 IgG 단백질을 정제하였다. 이어서, IgG 결합을 검출하기 위해, 항-인간 Fc:HRP(Jackson ImmunoResearch)를 사용하여, 가용성 타우에 대한 결합에 대해 ELISA에서 항체를 시험하였다. 이 데이터는 표 8에 나타낸다. 가용성 타우에 대한 PT82 결합에 비교하여 인간화는 가용성 타우에 대한 결합에 실질적으로 영향을 미치지 않았다.
PGS 중의 5 ㎍/mL에서 시작하여 5개의 5-배 희석으로 항체를 시험하고 항-인간 Fc:HRP(Jackson ImmunoResearch)를 사용하여 IgG 결합을 검출한 점을 제외하고는, Fab에 대해 기재된 바와 같이 ELISA를 실행하였다.
본 발명이 상세히 그리고 그의 구체적인 실시 형태를 참조하여 설명되어 있지만, 본 발명의 사상 및 범주로부터 벗어나지 않고서 거기서 다양한 변화 및 변형이 이루어질 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다.
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His 20 25 30 Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu 35 40 45 Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser 50 55 60 Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val 65 70 75 80 Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu 85 90 95 Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro 100 105 110 Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val 115 120 125 Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly 130 135 140 Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro 145 150 155 160 Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro 165 170 175 Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly 180 185 190 Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser 195 200 205 Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys 210 215 220 Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys 225 230 235 240 Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val 245 250 255 Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly 260 265 270 Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln 275 280 285 Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly 290 295 300 Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser 305 310 315 320 Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln 325 330 335 Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser 340 345 350 Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn 355 360 365 Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala 370 375 380 Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser 385 390 395 400 Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser 405 410 415 Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val 420 425 430 Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu 435 440 <210> 31 <211> 441 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2N4R Tau <400> 31 Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly 1 5 10 15 Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His 20 25 30 Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu 35 40 45 Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser 50 55 60 Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val 65 70 75 80 Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu 85 90 95 Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro 100 105 110 Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val 115 120 125 Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly 130 135 140 Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro 145 150 155 160 Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro 165 170 175 Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly 180 185 190 Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser 195 200 205 Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys 210 215 220 Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys 225 230 235 240 Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val 245 250 255 Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly 260 265 270 Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln 275 280 285 Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly 290 295 300 Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser 305 310 315 320 Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln 325 330 335 Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser 340 345 350 Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn 355 360 365 Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala 370 375 380 Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser 385 390 395 400 Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser 405 410 415 Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val 420 425 430 Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu 435 440 <210> 32 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Binding epitope of PT82 to tau <400> 32 Ala Gly His Val Thr Gln 1 5

Claims (14)

  1. 상보성 결정 영역 1(HCDR1), HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 상보성 결정 영역 1(LCDR1), LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하며, 여기서
    (a) 서열 번호 1의 HCDR1; 서열 번호 2의 HCDR2 및 서열 번호 3의 HCDR3 및 서열 번호 4의 LCDR1; 서열번호 5의 LCDR2; 및 서열번호 6의 LCDR3을 포함하거나;
    (b) 서열 번호 7의 HCDR1; 서열 번호 8의 HCDR2 및 서열 번호 3의 HCDR3 및 서열 번호 9의 LCDR1; 서열번호 5의 LCDR2; 및 서열번호 6의 LCDR3을 포함하거나;
    (c) 서열 번호 7의 HCDR1; 서열 번호 10의 HCDR2 및 서열 번호 3의 HCDR3 및 서열 번호 11의 LCDR1; 서열번호 5의 LCDR2; 및 서열번호 6의 LCDR3을 포함하거나;
    (d) 서열 번호 7의 HCDR1; 서열 번호 12의 HCDR2 및 서열 번호 3의 HCDR3 및 서열 번호 11의 LCDR1; 서열번호 5의 LCDR2; 및 서열번호 6의 LCDR3을 포함하거나;
    (e) 서열 번호 7의 HCDR1; 서열 번호 13의 HCDR2 및 서열 번호 3의 HCDR3 및 서열 번호 11의 LCDR1; 서열번호 5의 LCDR2; 및 서열번호 6의 LCDR3을 포함하거나;
    (f) 서열 번호 7의 HCDR1; 서열 번호 14의 HCDR2 및 서열 번호 3의 HCDR3 및 서열 번호 11의 LCDR1; 서열 번호 5의 LCDR2; 및 서열 번호 6의 LCDR3을 포함하는, PHF-타우에 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  2. 제1항에 있어서,
    (a) 서열 번호 15와 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 16과 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (b) 서열 번호 17과 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 18과 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (c) 서열 번호 19와 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 20과 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (d) 서열 번호 21과 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 22와 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (e) 서열 번호 23과 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 20과 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
    (f) 서열 번호 24와 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 25와 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    (a) 중쇄 가변 영역 서열 번호 15 및 서열 번호 16을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (b) 서열 번호 17을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 18을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (c) 서열 번호 19를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 20을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (d) 서열 번호 21을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 22를 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (e) 중쇄 가변 영역 서열 번호 23 및 서열 번호 20을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
    (f) 서열 번호 24를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 25를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원-결합 단편을 인코딩하는, 단리된 핵산.
  5. 제4항의 단리된 핵산을 포함하는 벡터.
  6. 제4항의 핵산 또는 제5항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 단리된 항체 또는 항원-결합 단편 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  8. 제7항의 약제학적 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 병리학적 타우 응집 또는 타우병증의 확산의 감소를 필요로 하는 대상에서 병리학적 타우 응집 또는 타우병증의 확산을 감소시키는 방법.
  9. 제7항의 약제학적 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 타우병증의 치료를 필요로 하는 대상에서 타우병증을 치료하는 방법.
  10. 제7항의 약제학적 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하며, 타우병증이 알츠하이머병(가족성 알츠하이머병 및 산발성 알츠하이머병을 포함함), 17번 염색체와 연관된 파킨슨증을 동반하는 전측두엽 치매(FTDP-17), 진행성 핵상 마비, 피질기저핵 변성, 픽병(Pick's disease), 진행성 피질하 신경교증, 농축체 단독 치매(tangle only dementia), 석회화를 동반하는 미만성 신경섬유 농축체, 은친화성 과립성 치매(argyrophilic grain dementia), 근위축성 측삭 경화증 파킨슨증-치매 복합군, 다운 증후군, 게르스트만-슈투로이슬러-샤잉커병(Gerstmann-
    Figure pct00008
    -Scheinker disease), 할러포르덴-스파츠병(Hallervorden-Spatz disease), 봉입체 근염, 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeld-Jakob disease), 다계통 위축증, C형 니만-픽병(Niemann-Pick disease type C), 프리온 단백질 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 아급성 경화성 범뇌염, 근긴장성 이영양증, 신경섬유 농축체를 동반하는 비-괌(non-Guamanian) 운동 신경세포병, 뇌염후 파킨슨증, 만성 외상성 뇌병증, 및 권투선수 치매(복싱병)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 타우병증의 치료를 필요로 하는 대상에서 타우병증을 치료하는 방법.
  11. 항체 또는 항원-결합 단편을 생성하는 조건 하에 항체 또는 항원-결합 단편을 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 배양하는 단계, 및 세포 또는 세포 배양물로부터 항체 또는 항원-결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원-결합 단편을 생성하는 방법.
  12. 항체 또는 항원-결합 단편을 약제학적으로 허용가능한 담체와 조합하여 약제학적 조성물을 얻는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 인간화 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 약제학적 조성물을 생성하는 방법.
  13. 생물학적 샘플을 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계 및 대상으로부터의 샘플에서 PHF-타우에 대한 항체 또는 항원-결합 단편의 결합을 검출하는 단계를 포함하는, 대상으로부터의 생물학적 샘플에서 PHF-타우의 존재를 검출하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 생물학적 샘플이 혈액, 소변, 또는 뇌척수액 샘플인 방법.
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