JP2017521063A - 微小管結合タンパク質タウに特異的に結合する抗体及び抗原結合断片 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明において使用されるとおりの用語の定義を以下に提供する。
タウは、複数の周知のアイソフォームを有する豊富にある中枢及び末梢神経系タンパク質である。ヒトCNSにおいては、選択的スプライシングに起因して352〜441の範囲のサイズの6つの主要なタウアイソフォームが存在する(Hanger,et al.Trends Mol Med 15:112−9,2009)。これらのアイソフォームは、0〜2個のN末端インサート、及び3個又は4個のタンデムに並んだ微小管結合リピートを規定された形式で含む点が互いに異なり、ON3R(配列番号6)、1N3R(配列番号4)、2N3R(配列番号2)、ON4R(配列番号5)、1N4R(配列番号3)及び2N4R(配列番号1)と称される。用語「組換えタウ」は、本明細書で使用されるとき、リン酸化及び他の翻訳後修飾を欠いている配列番号1のタウアイソフォームを指す。タウタンパク質は、例えば、大腸菌(E.coli)、バキュロウイルス、哺乳類又は無細胞系において多量に組換え発現させることができる。「組換えタウ」は、標準方法を用いて組換え発現させて、精製し得る。(Barghorn,et al 2004,Meth Mol Biol 35−51)。
本発明の抗タウ抗体は、タウの蓄積、及び/又はタウの病的凝集が関わる神経変性疾患、例えばAD又は他のタウオパチー又はタウ関連の病気を治療又は予防するための治療用薬剤及び予防用薬剤のいずれとしても好適である。無症候患者では、治療は任意の年齢(例えば、約10歳、15歳、20歳、25歳、30歳)で開始し得る。しかしながら、通常は、患者が約40歳、50歳、60歳、又は70歳に達するまで治療を開始する必要はない。治療は、典型的には、ある期間にわたる複数回の投薬を伴う。治療は、時間の経過に伴う治療用薬剤に対する抗体又は活性化T細胞若しくはB細胞応答をアッセイすることによってモニタし得る。応答が低下する場合、ブースター投薬が適応となる。
本発明の抗体は、対象におけるAD又は他のタウオパチーを診断する方法において用いられ得る。この方法には、本発明の抗体又はその断片などの診断用試薬を使用してタウの存在を対象において検出するステップが関わる。タウは、対象からの生体試料(例えば、血液、尿、脳脊髄液)において、その生体試料を診断用抗体試薬と接触させて、対象からの試料中のPHFタウに対する診断用抗体試薬の結合を検出することにより検出し得る。検出を実施するためのアッセイには、ELISA、免疫組織化学、ウエスタンブロット、又は生体内イメージングなどの周知の方法が含まれる。例示的な診断用抗体は、本発明の抗体CBTAU−27.1 CBTAU−28.1、CBTAU−43.1、CBTAU−46.1、CBTAU−47.1、CBTAU−47.2及びCBTAU−49.1であり、IgG l、K型のものである。
タウペプチド設計及び標識
微小管からの遊離をもたらし、且つ解重合につながるタウタンパク質の過剰リン酸化は、アルツハイマー病(AD)及び他の関連タウオパチーに現れる病理学的特徴である。遊離タウと微小管結合タウとの平衡が前者に有利となるようにシフトするにつれ、会合していないタウタンパク質が誤って折り畳まれて凝集した状態で蓄積すると考えられている。疾患過程においてタウは種々のコンホメーションをとり、可溶性ダイマー及びオリゴマー形態から高次の不溶性凝集体、例えば対らせんフィラメント(PHF)及び神経原線維濃縮体(NFT)に進行すると考えられている。しかしながら、病理に寄与する、従って治療の標的とするのに最適なタウの正確な形態は未だ分かっていない。結果的に、疾患を促進するタウを標的化しようとする試みは、多くの場合に標的の選択によって制限される。新規抗タウ結合分子を調製するため、単一細胞ベースの手法を用いてリン酸化及び非リン酸化タウペプチドをベイト抗原として使用してヒト記憶B細胞からタウに対する抗体可変領域を回収した。
標識ペプチド四量体を用いたFACソーティングによる抗タウ特異的記憶B細胞の回収
サンディエゴ血液バンク(San Diego Blood Bank)及びTSRI健常供血者サービス(TSRI Normal Blood Donor Services)から入手した推定無症候(非AD)ヒト供血者から採取した末梢血単核細胞(PBMC)から単離した記憶B細胞(CD22+CD19+CD27+IgG+)から、タウに対するモノクローナル抗体を回収した。加えて、CRO、Quintilesを介してAD患者血液試料を入手し、そこから本明細書に詳述する3つの抗体を回収した。Ficoll−Paque Plus(GE Healthcare)でPBMCを単離し、90%FBS及び10%DMSO中に5000万細胞/mlで凍結保存した。血漿のアリコートを56℃で熱失活させて、血漿反応性の下流評価のため−20℃で保存した。
タウ特異的単一B細胞からの重鎖及び軽鎖遺伝子の回収
実施例2に詳述したとおり、タウペプチド四量体に反応性を示す記憶B細胞を同定し、単離し、及び個々のマイクロタイターウェルにソートした。次に、個々のB細胞から二段階PCR手法によって重鎖及び軽鎖cDNAを回収し、可変ドメイン配列をクローニングして、完全長組換えIgG1抗体としてインビトロで発現させており、従ってこれはヒトキメラ抗体である。
シングルソートした細胞から、以下の変更を加えた製造者のプロトコル(Superscript III、Invitrogen Corp.)に従って第1鎖相補DNA(cDNA)を作成した:単一B細胞が入った各ウェルに、0.5μlの10%NP−40、1.0μlのオリゴdT、1.0μlのdNTPを添加し、試料を65℃で5分間インキュベートした。インキュベーション後、試料を氷上に1分間置いた。次に、各ウェルに以下を添加した:2.0μlのDTT、4.0μlのMgCl2、1.0μlのSuperScript RT、及び0.5μlのRNaseOut。試料を50℃で50分間インキュベートし、続いて85℃で5分間インキュベートした。
最初のPCR(ステップI)については、2.5μlのcDNA調製物を鋳型として使用して重鎖及びκ又はλ軽鎖を増幅した。抗体重鎖(CB−5’LVHプライマー、表1)、κ軽鎖(CB−5’LVkプライマー、表2)、及びλ軽鎖(CB−5’LVlamプライマー、表3)のリーダー領域に特異的なプライマープールを使用した。ステップI PCR反応においては、重鎖、κ軽鎖及びλ軽鎖のそれぞれCH1領域、CK、及びCL領域に特異的な単一リバースプライマーを使用した。
ステップIIについては、2.5μlのステップI PCR産物を鋳型として使用して、重鎖、及びκ又はλ軽鎖可変領域を増幅した。抗体重鎖(pCB−IgG−VH及び3’SalIJHプライマー、表4)、κ軽鎖(pCB−IgG−VK及び3’Jkプライマー、表5)、及びλ軽鎖(CB−VL及び3’Clam−ステップIIプライマー、表6)のフレームワーク1領域に特異的に設計したフォワード及びリバースプライマーのプールを使用して、可変領域からDNAを調製した。さらに、ステップIIプライマーは、下流クローニングのためXbaI(VK及びVLフォワードプライマー)及びXhoI(3’SalIJHプライマー)制限部位が導入されるように設計した。ステップII増幅反応の後、重鎖及び軽鎖可変ドメインPCR産物を1%アガロースゲル上で泳動させた。重鎖及び軽鎖可変領域断片を製造者のプロトコル(Qiagen)に従って精製し、ステップIII PCR反応に使用した。
ステップIIIについては、ステップIIで作製した重鎖及び軽鎖可変領域DNA断片を、以下を用いたオーバーラップ伸長PCRによって単一カセットに連結した:1)κリンカー又はλリンカー(以下のリンカー調製方法を参照)(軽鎖ステップII断片の3’末端及び重鎖ステップII断片の5’末端にアニールするもので、κ又はλ定常領域のいずれかを含有する)、2)XbaI制限部位を含有するフォワードオーバーラッププライマー、及び3)XhoI制限部位を含有するリバースプライマー。この反応により、軽鎖可変領域とリンカーと重鎖可変領域とからなる、それぞれκ鎖又はλ鎖について約2400bp又は2200bpのアンプリコン(即ち、カセット)が得られる。増幅後、オーバーラップ伸長PCR反応産物を製造者の指示(Qiagen PCR精製キット)に従ってPCR精製した。
鋳型としての、インハウスで作成した且つ重鎖及び軽鎖遺伝子の両方を発現させるために用いられる二重CMVプロモーターベクターであるpCB−IgG及び表7に掲載するプライマーを使用してリンカー断片を増幅した。リンカー断片は、κ又はλリンカーについてそれぞれ1765又は1536塩基対長さである。κリンカーは、5’から3’に、イントロン配列と、続くκ定常領域、ポリ(A)終結配列、及び組換え抗体の1つのベクター発現を可能にするサイトメガロウイルスプロモーター配列を含有する。λリンカーは、λ定常領域、ポリ(A)終結配列、及びサイトメガロウイルスプロモーター配列を含有する。共通リバースプライマー(リンカー_VH_HAVT20_pCB−IgG−R)及びκ特異的フォワードプライマー(リンカー_CK_イントロン_pCB−IgG−F)を使用した(表7)。増幅断片は1%アガロースゲル上で分離し、製造者のプロトコル(Qiagenゲル抽出キット)に従って精製した。
オーバーラップ伸長PCR産物の精製後、断片をXhoI及びXbaIで消化し、続いて1%アガロースゲル上で分離した。オーバーラップカセット(約2.4kb)に対応するバンドを精製し、IgG1発現ベクター、pCB−IgGにライゲートした。このベクターに抗体可変遺伝子をサブクローニングし、その元の(天然)アイソタイプに関わらず、抗体をIgG1として組換え発現させた。(IgG1重鎖定常領域アミノ酸配列の例は配列番号83に示し、軽鎖κ定常領域アミノ酸配列は配列番号84に示す)。形質転換は全て、DH5a Max Efficiency細胞(Invitrogen Corp.)を使用して実施し、250μlのSOCにおいて37℃で1時間回復させた。約100μlの回復させた細胞を、20mMグルコースを補足したカルベニシリンプレートにプレーティングした。プレートを37℃で一晩インキュベートしてコロニーを成長させた。回復させた細胞混合物の残りは、50μg/mlカルベニシリンを補足した4mlのスーパーブロス(SB)培地で培養し、250rpmで振盪しながら37℃で一晩インキュベートした。翌日、1プレートにつき5つのコロニーをピッキングし、50μg/mlカルベニシリンを補足した3mlのSB培地において37℃で一晩成長させた。一晩培養物をDNAプラスミド調製(Qiagen)に使用した。
抗体シーケンシング、生殖細胞系列同定及びトランスフェクション上清における抗タウペプチド反応性の確認
IgG1を発現させるため、前述の4ml培養物のDNAプラスミドミニプレップを調製し(Qiagen)、ExpiFectamineを製造者の指示(Invitrogen,Corp.)に従って使用して293Expi細胞のトランスフェクションに使用した。トランスフェクションは、10ml培養物において最低でも72時間にわたり実施して、十分なIg1G発現を可能にした。トランスフェクション後に細胞培地を回収し、遠心によって細胞及び残屑を取り除いた。Octet Redシステム(ForteBio)のプロテインAセンサー先端を使用して上清を定量化した。続いて各上清をベイトペプチドによるELISAによって試験し、それにより抗タウ反応性抗体の存在を確認した。実施例3における4つの個別にピッキングした培養物からのプラスミドミニプレップDNA(Qiagen)を調製し、プライマーpC9_seq_HC−R(5’CATGTCACCGGGGTGTGG 3’)(配列番号85)及びpC9_seq_LC−R(5’TCACAGGGGATGTTAGGGACA3’)(配列番号86)で重鎖及び軽鎖をシーケンシングした。これらの4つのクローンのうちの1つを続く実験用に選択した。
クローニングされた抗タウキメラmAbのIgG1発現及び精製
ELISAスクリーニング及び抗体反応性の確認後、実施例4に示すとおり、選択されたクローンをIgG1として発現させた。最低72時間後及び最高168時間後までに細胞培養培地を回収し、遠心によって細胞を取り除いた。続いて清澄化した上清をプロテインAセファロースカラム(GE Healthcare Life Sciences)に2回通過させ、50mlのPBSで洗浄した。続いて10mlのIgG溶出緩衝液(Pierce)でIgGを溶出させて、トリスpH8.0で中和し、続いてPBSで一晩透析した。透析した試料を約1mLの最終容積となるまで10,000MWCO超遠心ユニット(Amicon)を使用して濃縮し、Octet Red384(ForteBio)のヒトIgG標準を使用してプロテインAセンサー先端で抗体濃度を決定した。非還元及び還元条件下でSDS−PAGEを実施することにより、及びサイズ排除クロマトグラフィーにより、精製抗体のさらなる品質管理を行った。
IgG結合
タウペプチドに対する反応性
上記に記載したとおり作成し品質管理を行ったIgG1を、特定のコグネイトペプチド、並びに非コグネイトペプチドと結合するその能力に関してELISAによって試験した(表10)。96ウェルELISAプレート(Costar)又はストレプトアビジン被覆プレート(Pierce)を、実施例4に詳述するとおり、それぞれ抗原(ウシアクチン及びaffinipureヤギ抗ヒトF(ab)2)又はタウペプチドで被覆した。精製抗タウIgGを0.25%BSA含有TBS中5μg/mlに希釈し、5倍タイトレートした。抗体対照及び二次抗体は実施例4に詳述するとおり使用した。1μg/mLにおける抗体反応性をELISAによって決定し、結合なし(−)、弱い(−/+)、中程度(+)、又は強い(++)としてスコア化した。(−)、2つのO.D.450nm読み取りの平均が<0.3;(−/+)、>0.5且つ<1.0;(+)、>1.0且つ<1.5;(++)、>1.5。
ELISAによる対らせんフィラメント及び組換えタウに対する反応性
キメラ抗体の一部の特異性をさらに特徴付けるため、組換えタウ、エンリッチ及び免疫精製対らせんフィラメントに対するそれらの反応性をELISAによって試験した。
ウエスタンブロット分析による対らせんフィラメント及び組換えタウに対する反応性
rTau及びPHF結合ELISAの観察を拡張し、二次構造が反応性において役割を担っているかどうかを調べるため、組換えタウ、エンリッチ及び免疫精製対らせんフィラメントをウエスタンブロット分析によって試験した。1×NuPAGE LDS試料緩衝液(0.5%LDS最終)(Novex、NP0007)の終濃度における約0.5μgのiPHF、ePHF、及び1μgのrTauを70℃で10分間加熱した。試料を26ウェル、4〜12%ビストリスNovex NuPAGEゲル(InvitrogenをMOPS SDS泳動緩衝液(Novagen、NP0001)と共にロードし、続いてニトロセルロース膜に転写した。膜は、0.05%Tween20及び4%脱脂粉乳含有1×トリス緩衝生理食塩水(TBS)で一晩ブロックした。CBTAU mAbを、0.05%Tween20及び4%脱脂粉乳含有1×TBS中25μg/mLで一次として使用し、室温で2時間インキュベートした。次に膜を3回、各5分間0.05%Tween20含有1×TBSで洗浄した。次にペルオキシダーゼAffiniPureヤギ抗ヒトIgG、Fcγ断片特異的(Jackson ImmunoResearch)を0.05%Tween20及び4%脱脂粉乳含有1×TBS中1:2000希釈で二次として使用し、室温で45分間インキュベートした。膜を3回、各5分間洗浄し、Supersignal West Picoキット(Pierce)を使用して発色させた。
ELISAによるタウ断片ペプチドに対する反応性
回収された抗体の特異性を特徴付けるため、タウリン酸化及び非リン酸化ペプチドに対するそれらの反応性(表11〜表21、図4a〜図4g)をELISAによって試験した。ビオチン化タウペプチドを商業的に合成し、1mg/mlで水に溶解し、−80℃で凍結した。簡潔に言えば、96ウェルストレプトアビジン結合プレート(Thermo−Fisher)を、TBS中に希釈した2μg/mlのタウペプチドで被覆し、4℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートをTBS−Tで洗浄し、続いてTBS中2.5%BSAによって室温で2時間ブロックした。ブロック後、精製抗タウIgGをTBS+0.25%BSA中2μg/mlに希釈し(又は表15〜表20におけるペプチド配列を使用したCBTAU−27.1、28.1、43.1、46.1、47.1、47.2、及び49.1のより詳細なマッピングのため、5μg/mlに希釈して5倍タイトレートする)、室温で2時間インキュベートする。マッピング実験の各々では、実施例11に記載するヒトキメラ化型のAT8 IgG(2μg/ml)を陽性対照として使用した。プレートをTBS−Tで5回洗浄し、続いてTBS+0.25%BSAに希釈した二次抗体[1:2000希釈のヤギ抗ヒトIgG F(ab’)2(Jackson Labs)]を添加し、室温で1時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートをTBS−Tで4回洗浄し、SureBlue Reserve TMBマイクロウェルペルオキシダーゼ基質(KPL)で約90秒間発色させた。TMB停止液(KPL)を添加することによって反応を直ちに停止させ、ELISAプレートリーダーを使用して450nmの吸光度を計測した。各実験は3つの別々の日にトリプリケートで実施した。反応性は、ELISAアッセイにおいて値が0.4のOD以上であった場合に陽性と見なした。タウリン酸化及び非リン酸化ペプチドに対する各mAbの反応性を決定するため、2μg/mLにおける抗体反応性をELISAによって決定し、結合なし(−)、弱い(−/+)、中程度(+)、又は強い(++)としてスコア化した。(−)、2つのO.D.450nm読み取りの平均が<0.3;(−/+)、>0.5且つ<1.0;(+)、>1.0且つ<1.5;(++)、>1.5。CBTAU−27.1、28.1、43.1、46.1、47.1、47.2、及び49.1(表15〜表20に詳述する)のより細かいマッピングのため、1μg/mLにおける抗体反応性をELISAによって決定し、結合なし(−)、弱い(−/+)、中程度(+)、又は強い(++)としてスコア化した。(−)、3つのO.D.450nm読み取りの平均が<0.3;(−/+)、>0.5且つ<1.0;(+)、>1.0且つ<1.5;(++)、>1.5。
ペプチドエピトープのアラニンスキャニング
回収mAbの各々の特異性及びその結合に対するアミノ酸の寄与をさらに特徴付けるため、各位置をアラニンに置き換えたタウペプチドに対するそれらの反応性をELISAによって試験した。全ての実験プロトコルは実施例9と同じであった。1μg/mLにおける抗体反応性をELISAによって決定し、結合なし(−)、弱い(−/+)、中程度(+)、又は強い(++)としてスコア化した。(−)、2つのO.D.450nm読み取りの平均が<0.3;(−/+)、>0.5且つ<1.0;(+)、>1.0且つ<1.5;(++)、>1.5。各抗体の結果を表22〜表29に示す。
免疫組織化学
タウ病理は、嗅内皮質(EC)内で始まり、海馬における接続されたニューロン経路に沿って広がった後、皮質内に進行すると考えられている。これらのニューロン経路に沿ったタウの病原性沈着物に対する回収されたIgGの反応性を決定するため、82歳の非疾患(非AD;Abcam、カタログ番号ab4305)男性及び88歳のアルツハイマー病(AD;Abcam、カタログ番号ab4583)男性から海馬組織を入手した(Abcam)。71歳の非罹患(非AD)者及び71歳のアルツハイマー病(AD)者から皮質組織を入手した(Banner Sun Health)。ADに加えて、タウオパチーとしても知られる、タウ病理によって特徴付けられる神経障害は多くある。本発明者らは、その知見の範囲で、それぞれ73歳男性及び81歳女性から得られた進行性核上性麻痺(PSP)及び非進行性核上性麻痺(非PSP)前頭葉から得た組織(Biochain)において、回収されたmAbを試験した。脳組織を、Tissue−Tek(登録商標)スライド染色セット(VWR International)を使用してキシレン(VWR International)で10分間2回洗浄し、続いて100%エタノールで3分間2回、95%エタノールで3分間2回、70%エタノールで3分間2回、及び蒸留H2Oで30秒間1回洗浄することにより、脱パラフィン化して再水和した。クエン酸塩緩衝液(10mMクエン酸、pH.6.0)を使用して組織切片を熱媒介性抗原回復に供し、抗原部位を露出させた。次に切片をブロッキング緩衝液[PBS中10%正常ヤギ血清(Jackson ImmunoResearch,Inc.)、1%BSA及び0.3%Triton−X100)]と共に室温で1時間インキュベートした。過剰な水を取り除き、ImmEdge疎水性バリアペン(Vector Labs)を用いて組織切片の周りを囲んだ。染色トレイの底をH2Oで被覆することにより加湿チャンバを調製し、次に切片をPBSで吸引によって5分間、3回洗浄した。内因性ペルオキシダーゼ活性を10%H2O2で室温で30分間でクエンチした。クエンチ後、スライドをPBSで吸引によって5分間、3回洗浄した。次に、1×PBS中10%正常ヤギ血清、0.3%TritonX−100、1%BSAの溶液によってスライドを室温で1時間ブロックした。ZenonヒトIgG標識キット(Life Technologies)を製造者の指示に従って使用して、一次抗体をビオチンで標識した。陰性対照としてヒト抗RSV特異的抗体を使用した。Fc領域ヒトキメラ化型のAT8 IgGを陽性対照として使用した。標識後、一次抗体をブロッキング緩衝液中に5μg/ml及び20μg/mlの濃度に別個に希釈した。ペプチド競合実験のため、組織切片とのインキュベーションに先立ち、13.3μMのコグネイトペプチド(即ち、ソーティング実験においてmAbの回収に用いるペプチド)を一次抗体と共に室温で30分間プレインキュベートした。組織切片を100μlの希釈ビオチン標識一次抗体又はペプチド競合抗体と共に室温で2時間インキュベートした。吸引によって抗体を取り除いた後、PBS中4%ホルムアルデヒドにおいて組織切片の2回目の固定化を行い、室温で15分間インキュベートした。切片をPBSで吸引によって5分間、3回洗浄した。次に切片をストレプトアビジン基質Vectastain ABC試薬(Vector Labs)と共にプレ30分間インキュベートした後、PBSで洗浄した。次に組織をニッケルの存在下でDAB基質(Vector Labs)によって発色させた。次に切片をddH2Oで2回洗浄し、室温で完全に乾燥させた後、50μlのVectaMount永久封入剤(Vector Labs)でマウントした。最後に、組織切片をヘマトキシリン(Vector Labs)で対比染色した。Olympus BX−41正立顕微鏡でMetaMorphソフトウェアを使用して代表的な画像を取得した。
脱リン酸化IHC
CBTAU−28.1のIHCの結果が、非AD組織切片上のタウに免疫反応性を示したが、AD組織切片上のタウには示さなかったことを所与として、本発明者らは、疾患の進行中におけるこのエピトープの喪失が、修飾(即ちリン酸化)の結果であったという仮説を立てた。この仮説を検証するため、CBTAU−28.1の免疫反応性を評価する前にヒト脳組織切片を脱リン酸化した。パラフィン包埋ヒト脳組織切片(Abcam、カタログ番号:ab4305、54歳男性、臨床症状無しと、Abcam、カタログ番号:ab4583、93歳ヒスパニック系女性、アルツハイマー病)を、Tissue−Tek(登録商標)スライド染色セット(VWR International)を使用してキシレン(VWR International)で10分間2回洗浄し、続いて100%エタノールで3分間2回、95%エタノールで3分間2回、70%エタノールで3分間2回、及び蒸留H2Oで30秒間1回洗浄することにより、脱パラフィン化して再水和した。非特異的抗体結合を最小限に抑えるため、洗浄中に組織を絶対に乾燥させなかった。クエン酸塩緩衝液(クエン酸、pH.6.0)を使用して組織切片を熱媒介性抗原回復に供し、抗原部位を露出させた。過剰な水を取り除き、ImmEdge疎水性バリアペン(Vector Labs)を用いて組織切片の周りを囲んだ。染色トレイの底をH2Oで被覆することにより加湿チャンバを調製し、次に切片をPBSで吸引によって5分間、3回洗浄した。内因性ペルオキシダーゼ活性をH2O2で室温で15分間クエンチした。クエンチ後、スライドをPBSで吸引によって5分間、3回洗浄した。続いて切片を130単位/mLの仔ウシ腸アルカリホスファターゼ(CIAP)によって32℃で2.5時間処理した。次に、1×PBS中10%正常ヤギ血清、0.3%TritonX−100、1%BSAの溶液でスライドを室温で1時間ブロックした。マウス化CBTAU−28.1(Fc領域マウス化)、及び対照mAb AT8及びアイソタイプ対照(抗RSV mAb 4.1)を海馬切片上において1ug/mLの終濃度で一晩インキュベートした。切片を洗浄し、抗マウスFcy断片特異的抗体と共に室温で2時間インキュベートした。ニッケルの存在下でペルオキシダーゼ基質溶液DABによって試料を発色させた。試料をヘマトキシリン(Vector Labs)で対比染色した。Olympus BX−41正立顕微鏡でMetaMorphソフトウェアを使用して代表的な画像を取得した。
脱リン酸化ELISA
実施例12の結果を確認するため、対らせんフィラメントの脱リン酸化に関してCBTAU−28.1に対する反応性をELISAによって試験した。ハーフエリア96ウェル結合プレート(Costar)をTBS(2μg/mlウシアクチンaffinipureヤギ抗ヒトF(ab)2、及び仔ウシ腸ホスファターゼ、CIPによる前処理を伴う及び伴わない1μg/mlのアフィニティー精製対らせんフィラメント、iPHF)中50μlの抗原で被覆した。ホスファターゼ処理したiPHFは以下のとおり調製した。iPHF試料を1×NEB緩衝液4(50mM酢酸カリウム、20mMトリス酢酸塩、10mM酢酸マグネシウム、及び1mM DTT)に0.05μg/mlの終濃度で再懸濁した。iPHF1μg当たり1単位のCIPを添加した(CIP、NEBカタログ番号M0290S)。iPHF試料をCIPと共に37℃で90分間インキュベートした後、それでELISA結合プレートを被覆した。一晩の抗原結合後、プレートをTBS−Tで洗浄し、続いて150μlのTBS+2.5%BSAによって室温で2時間ブロックした。精製した対照及び抗タウIgG、CBTAU−28.1)をTBS/0.25%BSA中25μg/ml及びIgGで開始して5倍希釈でタイトレートし、1.5時間インキュベートした。プレートをTBS−Tで4回洗浄し、二次抗体(抗ヒトFab HRP、Jackson Immunoresearch、カタログ番号109−036−097)を添加し、室温で45分間インキュベートした。インキュベーション後、プレートをTBS−Tで4回洗浄し、SureBlue Reserve TMBマイクロウェルペルオキシダーゼ基質(KPL)で約2分間発色させた。TMB停止液(KPL)を添加することによって反応を直ちに停止させ、ELISAプレートリーダーを使用して450nmの吸光度を計測した。各実験点につきトリプリケートで実施した。
リンペプチドに対するCBTAU−27.1、28.1、43.1、47.1、47.2及び49.1の反応性
CBTAU−27.1(及びCBTAU−43.1)及びCBTAU−28.1(及びCBTAU−46.1、47.2、49.1)の免疫組織化学結果から、これらのmAbが、正常な非AD組織切片に存在するタウ上のエピトープと反応するが、このエピトープは疾患状況の間に失われるか又はマスクされることが示唆される(図5)。本発明者らは、これが、エピトープのマスキングをもたらす領域内におけるリン酸化イベントの結果であったという仮説を立てた。実施例12及び13で強調される実験は、これが実際に28.1について正しいことを示した。従って、本発明者らは、潜在的にリン酸化の標的となり得る部位を具体的に同定して、CBTAU−28.1の反応性の喪失を説明しようと考えた。47.1、47.2、及び49.1はCBTAU−28.1と同じタウ上の領域(即ち、52〜71)に結合したため、本発明者らは、これらのmAb並びにこれらの実験を試験することにした。加えて、本発明者らはまた、CBTAU−43.1及びCBTAU−27.1についても、これらはIHCによるとCBTAU−28.1と類似した挙動を示すため、同じ課題を実施した。
抗タウmAbマウス−ヒトキメラ及びヒトアイソタイプの作成
マウスタウオパチーモデルにおけるヒト抗タウmAbの有効性を試験するため、ヒトFc領域をマウスIgG1 Fcに置き換えることによってマウス−ヒト抗体キメラを作成した。簡潔に言えば、pCB−IgGベクターからプライマーStep1HMchim−Fwd及びStep1HMchim−Rev(表35)を使用してヒトIgG1 CH1領域を増幅して、5’−XhoI部位を含む0.95kb断片(フラグメント1)を作成した。遺伝子合成コンストラクトからプライマーStep2HMchim−Fwd及びStep2HMchim−Rev(表30)を使用してマウスIgG1 CH2及びCH3ドメイン(Fc領域)を増幅して、0.82kb断片(フラグメント2)を作成した。プライマーStep3HMchim−Fwd及びStep3HMchim−Rev(表30)を使用してpCB−IgGベクターのポリA領域を増幅することにより第3の断片(フラグメント3)(これは3’−DraIII部位を含む)を作成した。これらの3つの断片をオーバーラップ伸長PCRによって単一のカセットに連結して、ヒトCH1にマウスCH2−CH3ドメインが続く2.3kbオーバーラップ断片を作成した。続いてこのオーバーラップ断片をXhoI及びDraIII部位を介してpCB−IgG CBTAU−7.1ベクターにクローニングして、ヒト可変、CH1、ヒンジ及びCk領域と、それに続いてマウスCH2及びCH3領域を含有するCBTAU−7.1のマウス−ヒトキメラを作成した。次に、CBTAU−7.1キメラコンストラクト及びpCB−IgG CBTAUヒトmAbコンストラクトをXhoI及びXbaIで消化することによってCBTAU−22.1、24.1、27.1、28.1、47.1、47.2、46.1、49.1、及び43.1キメラを作成し、対応する断片をサブクローニングした。全てのコンストラクトのヌクレオチド配列は、当業者に公知の標準的な技法により確認する。続いてキメラ抗体を発現させて、実施例5に詳述するとおり、プロテインAの代わりにプロテインGアガロースを使用して精製した。
IgG2、3及び4アイソタイプの調製
実施例3に記載したとおり、全てのCBTAU mAbはクローニングし、その天然アイソタイプと無関係にキメラヒトIgG1として発現させた。さらなるヒトアイソタイプ型(即ち、IgG2/3/4)を作成するため、対応する定常領域、ヒンジ、及びイントロン配列を含む遺伝子合成コンストラクトから、ヒトIgGアイソタイプの各々に対応するCH1〜CH3領域をPCR増幅する。PCRアンプリコンは5’−XhoI及び3’−DraIII部位を含み、これらの部位を使用して断片を対応するpCB−IgG CBTAU抗体コンストラクトにサブクローニングする。このようにして、抗タウmAbの各々についてヒトIgG2、3及び4アイソタイプ型を作成する。
デリスキングし且つFc操作した抗タウキメラモノクローナル抗体変異体の作成
実施例3で単離した各抗タウ抗体クローンの重鎖及び軽鎖可変領域(VH及びVL)を、遊離システインの存在並びにグリコシル化部位、アミド分解部位及び酸化部位を含めた潜在的翻訳後修飾部位に関して分析する。構造的に保存された及び/又は生殖細胞系列ベースの置換からなるアミノ酸突然変異を使用してこれらの部位を変更する。可変領域における非保存システインはセリンに突然変異させる。グリコシル化部位については、アスパラギンによる保存されたグルタミンの置換又は生殖細胞系列突然変異を含めた幾つかの突然変異が用いられる。アミド分解部位の修飾には、アスパラギン酸によるアスパラギンの置換及びセリン又はアラニンによるグリシンの置換が含まれる。潜在的な酸化部位は修飾されない。FcRnに対する結合親和性を増加させ、従ってIgG1 mAbのインビボ半減期を増加させるため、CH2及びCH3領域間の境界に位置する幾つかの突然変異を作成する。これらの突然変異には、M252Y/S254T/T256E+H433K/N434F(Vaccaro C.et al.,2005)又はT250Q/M428L(Hinton PR.et al.,2004)が含まれた(これらはFcRnに対するIgG1結合性を増加させることが示されている)。全ての置換は、部位特異的突然変異誘発によって製造者の指示(QuickChange II、Agilent Technologies、カタログ番号200521)に従って作成される。全てのコンストラクトのヌクレオチド配列は、当業者に公知の標準的な技法により確認する。
Claims (45)
- モノクローナル抗体であって、a)正常ヒト脳組織内のタウに結合し、且つb)ヒトAD脳組織内のタウに結合しない、モノクローナル抗体。
- a)正常ヒト脳組織内のタウと免疫複合体を形成し、且つb)ヒトAD脳組織内のタウと免疫複合体を形成しない、請求項1に記載の抗体。
- タウに特異的に結合するヒト抗体由来の抗原結合可変領域とヒトIgG1の組換え定常領域とを含むキメラ抗体であり、前記キメラ抗体が前記ヒト抗体と異なる、請求項1又は2に記載の抗体。
- タウに特異的に結合するヒト抗体由来の抗原結合可変領域とヒトIgG1の組換え定常領域とを含むキメラ抗体であり、前記キメラ抗体の定常領域が前記ヒト抗体の定常領域と異なる、請求項1又は2に記載の抗体。
- タウに特異的に結合する天然に存在するヒト抗原結合可変領域とヒトIgG1抗体の組換え定常領域とを含むキメラ抗体である、請求項1又は2に記載の抗体。
- キメラ抗体であり、ヒト抗体由来の天然に存在するヒト軽鎖及び重鎖可変領域と組換えヒトIgG1重鎖及び軽鎖定常領域とを含む、請求項1又は2に記載の抗体。
- キメラ抗体であり、前記キメラ抗体が、天然に存在するヒト抗体由来の重鎖及び軽鎖可変領域と組換えヒトIgG1重鎖及び軽鎖定常領域とを含む、請求項1又は2に記載の抗体。
- ヒト抗体由来の重鎖及び軽鎖可変領域と組換えヒトIgG1重鎖及び軽鎖定常領域とを含むキメラ抗体である、請求項1又は2に記載の抗体。
- ヒトモノクローナル抗体の天然に存在しない変異体である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の抗体。
- ヒトAD脳内のホスファターゼ処理されたタウ沈着物に結合する、請求項1〜9のいずれか一項に記載の抗体。
- ホスファターゼ処理されたヒトAD組織内のタウ沈着物と免疫複合体を形成する、請求項10に記載の抗体。
- a)変性PHFタウに結合し、且つb)非変性PHFタウに結合しない、請求項1〜11のいずれか一項に記載の抗体。
- ホスファターゼ処理された非変性PHFタウに結合する、請求項12に記載の抗体。
- a)ウエスタンブロットによるとPHFタウに結合し、且つd)ELISAによるとPHFタウに結合しない、請求項1〜11のいずれか一項に記載の抗体。
- ELISAによるとホスファターゼ処理されたPHFタウに結合する、請求項14に記載の抗体。
- 前記モノクローナル抗体が、配列番号325及び配列番号331からなる群から選択されるペプチドに結合する、請求項1〜15のいずれか一項に記載の抗体。
- 配列番号382、配列番号458及び配列番号386からなる群から選択されるペプチドに結合する、請求項16に記載の抗体。
- a)配列番号201の重鎖CDR1領域、配列番号202の重鎖CDR2領域、及び配列番号203の重鎖CDR3領域、配列番号204の軽鎖CDR1領域、配列番号205の軽鎖CDR2領域、及び配列番号206の軽鎖CDR3領域を含む抗体、b)配列番号207の重鎖CDR1領域、配列番号208の重鎖CDR2領域、及び配列番号209の重鎖CDR3領域、配列番号210の軽鎖CDR1領域、配列番号211の軽鎖CDR2領域、及び配列番号212の軽鎖CDR3領域を含む抗体、c)配列番号222の重鎖CDR1領域、配列番号223の重鎖CDR2領域、及び配列番号224の重鎖CDR3領域、配列番号225の軽鎖CDR1領域、配列番号173の軽鎖CDR2領域、及び配列番号226の軽鎖CDR3領域を含む抗体、d)配列番号238の重鎖CDR1領域、配列番号239の重鎖CDR2領域、及び配列番号240の重鎖CDR3領域、配列番号241の軽鎖CDR1領域、配列番号173の軽鎖CDR2領域、及び配列番号242の軽鎖CDR3領域を含む抗体、e)配列番号243の重鎖CDR1領域、配列番号244の重鎖CDR2領域、及び配列番号245の重鎖CDR3領域、配列番号246の軽鎖CDR1領域、配列番号173の軽鎖CDR2領域、及び配列番号212の軽鎖CDR3領域を含む抗体、f)配列番号243の重鎖CDR1領域、配列番号247の重鎖CDR2領域、及び配列番号248の重鎖CDR3領域、配列番号249の軽鎖CDR1領域、配列番号173の軽鎖CDR2領域、及び配列番号212の軽鎖CDR3領域を含む抗体、並びにg)配列番号250の重鎖CDR1領域、配列番号251の重鎖CDR2領域、及び配列番号252の重鎖CDR3領域、配列番号254の軽鎖CDR1領域、配列番号254の軽鎖CDR2領域、及び配列番号255の軽鎖CDR3領域を含む抗体からなる群から選択される、請求項1〜18のいずれか一項に記載の抗体。
- 配列番号115のVH及び配列番号116のVLの抗原結合部位を含む、請求項1〜18のいずれか一項に記載の抗体。
- 配列番号115のVH及び配列番号116のVLの抗原結合部位を含み、配列番号282のVH及び配列番号283のVLを含むモノクローナル抗体の天然に存在しない変異体である、請求項19に記載の抗体。
- 配列番号119のVH及び配列番号120のVLの抗原結合部位を含む、請求項1〜18のいずれか一項に記載の抗体。
- 配列番号119のVH及び配列番号120のVLの抗原結合部位を含み、配列番号284のVH及び配列番号285のVLを含むモノクローナル抗体の天然に存在しない変異体である、請求項21に記載の抗体。
- 配列番号135のVH及び配列番号136のVLの抗原結合部位を含む、請求項1〜18のいずれか一項に記載の抗体。
- 配列番号135のVH及び配列番号136のVLの抗原結合部位を含み、配列番号295のVH及び配列番号296のVLを含むモノクローナル抗体の天然に存在しない変異体である、請求項23に記載の抗体。
- 配列番号147のVH及び配列番号148のVLの抗原結合部位を含む、請求項1〜18のいずれか一項に記載の抗体。
- 配列番号147のVH及び配列番号148のVLの抗原結合部位を含み、配列番号306のVH及び配列番号307のVLを含むモノクローナル抗体の天然に存在しない変異体である、請求項25に記載の抗体。
- 配列番号151のVH及び配列番号152のVLの抗原結合部位を含む、請求項1〜18のいずれか一項に記載の抗体。
- 配列番号151のVH及び配列番号152のVLの抗原結合部位を含み、配列番号309のVH及び配列番号310のVLを含むモノクローナル抗体の天然に存在しない変異体である、請求項27に記載の抗体。
- 配列番号155のVH及び配列番号156のVLの抗原結合部位を含む、請求項1〜18のいずれか一項に記載の抗体。
- 配列番号155のVH及び配列番号156のVLの抗原結合部位を含み、配列番号311のVH及び配列番号312のVLを含むモノクローナル抗体の天然に存在しない変異体である、請求項29に記載の抗体。
- 配列番号159のVH及び配列番号160のVLの抗原結合部位を含む、請求項1〜18のいずれか一項に記載の抗体。
- 配列番号159のVH及び配列番号160のVLの抗原結合部位を含み、配列番号313のVH及び配列番号314のVLを含むモノクローナル抗体の天然に存在しない変異体である、請求項31に記載の抗体。
- 請求項1〜32のいずれか一項に記載の抗体の抗原結合断片。
- 請求項1〜32のいずれか一項に記載の抗体の機能変異体。
- 請求項1〜32のいずれか一項に記載の抗体、及び/又は請求項33に記載の抗原結合断片、及び/又は請求項34に記載の機能変異体を含むイムノコンジュゲートであって、少なくとも1つの治療用薬剤及び/又は検出可能薬剤をさらに含む、イムノコンジュゲート。
- 請求項1〜32のいずれか一項に記載の抗体、及び/又は請求項33に記載の抗原結合断片、及び/又は請求項34に記載の機能変異体をコードする単離核酸。
- 請求項36に記載の核酸を含むベクター。
- 請求項37に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項1〜32のいずれか一項に記載の抗体、及び/又は請求項33に記載の抗原結合断片、及び/又は請求項34に記載の機能変異体を作製する方法であって、請求項38に記載の宿主細胞を培養するステップと、前記宿主細胞によって産生された前記抗体又はその断片を回収するステップとを含む、方法。
- 請求項1〜32のいずれか一項に記載の抗体、及び/又は請求項33に記載の抗原結合断片、及び/又は請求項34に記載の機能変異体、及び/又は請求項35に記載のイムノコンジュゲートを含む医薬組成物であって、少なくとも1つの薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含む、医薬組成物。
- 医薬として使用される、請求項1〜32のいずれか一項に記載の抗体、及び/又は請求項33に記載の抗原結合断片、及び/又は請求項34に記載の機能変異体、及び/又は請求項35に記載のイムノコンジュゲート、又は請求項40に記載の医薬組成物。
- アルツハイマー病、又はタウに関連する記憶及び/若しくは認知障害の予防若しくは治療、又はそれらの組み合わせに使用される、請求項1〜32のいずれか一項に記載の抗体、及び/又は請求項33に記載の抗原結合断片、及び/又は請求項34に記載の機能変異体、及び/又は請求項35に記載のイムノコンジュゲート、又は請求項40に記載の医薬組成物。
- 少なくとも1つの請求項1〜32のいずれか一項に記載の抗体、及び/若しくは請求項33に記載の抗原結合断片、及び/若しくは請求項34に記載の機能変異体、及び/若しくは請求項35に記載のイムノコンジュゲート、若しくは請求項40に記載の医薬組成物、又はそれらの組み合わせを含む、キット。
- アルツハイマー病、又はタウに関連する記憶及び/若しくは認知障害を検出又は診断する方法であって、a)請求項1〜32のいずれか一項に記載の抗体、及び/又は請求項33に記載の抗原結合断片、及び/又は請求項34に記載の機能変異体、及び/又は請求項35に記載のイムノコンジュゲートを使用して試料中のタウ抗原のレベルをアッセイするステップと、b)ヒト生体試料を使用してアルツハイマー病、又は記憶及び/若しくは認知障害を検出又は診断するステップとを含む、方法。
- 前記ヒト生体試料が、末梢血、血清、血漿、尿、脳脊髄液、組織生検、手術標本、細針吸引物、剖検材料、細胞培養上清、単離細胞、発酵上清、又は組織ホモジネートである、請求項44に記載の方法。
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JP2021052757A (ja) * | 2014-06-26 | 2021-04-08 | ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェーJanssen Vaccines & Prevention B.V. | 微小管結合タンパク質タウに特異的に結合する抗体及び抗原結合断片 |
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