KR20170023124A - 미세소관-연관 단백질 타우에 특이적으로 결합하는 항체 및 항원-결합 단편 - Google Patents

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가브리엘 파스콸
로버트 안토니 윌리암슨
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야프 가우스미트
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Abstract

본 발명은 미세소관-연관 단백질 타우(tau)에 특이적으로 결합하는 항체 및 항원-결합 단편에 관한 것이다. 본 발명은 또한 항-타우 항체를 이용하는 진단, 예방 및 치료 방법에 관한 것이다.

Description

미세소관-연관 단백질 타우에 특이적으로 결합하는 항체 및 항원-결합 단편{ANTIBODIES AND ANTIGEN-BINDING FRAGMENTS THAT SPECIFICALLY BIND TO MICROTUBULE-ASSOCIATED PROTEIN TAU}
본 발명은 의약에 관한 것이다. 본 발명은 특히 미세소관-연관 단백질 타우에 특이적으로 결합하는 항체 및 항원-결합 단편에 관한 것이다. 본 발명은 또한 항-타우 항체를 이용하는 진단, 예방 및 치료 방법에 관한 것이다.
치매는 기억, 사고, 거동 및 일상 활동을 수행하는 능력에 영향을 미치는 여러 진행성 장애에 의해 유도될 수 있는 증후군이다. 오늘날 세계적으로 약 3,600만 명의 사람들이 치매를 겪고 있다. 2030년 경 치매 환자의 수는 2배가 될 것으로, 그리고 2050년 경에는 3배를 초과하는 11,540만 명이 될 것으로 예상된다. 알츠하이머병은 가장 일반적인 치매 유형이다. 현재, 65세 이상 고령자 9명 중 1명(11퍼센트) 및 85세 초과 고령자의 거의 절반이 알츠하이머병을 갖는다. 알츠하이머병 국제협회(Alzheimer's Disease International)에 따르면, 이러한 환자 케어에 대한 현재의 국제적 비용은 매년 6000억 달러를 초과한다. 이러한 비용은 더 많은 공식적 사회 케어 시스템이 도출되고 수입 상승이 더 높은 기회 비용으로 이어짐에 따라, 특히 개발 도상국에서 질환의 우세보다 더 빠르게 상승할 수 있다(Winblad, B and Jonsson, L, World Alzheimer Report 2010).
AD 환자의 뇌는 풍부한 2가지 비정상 구조, 아밀로이드 플라크 및 신경원섬유 매듭을 갖는다. 이는 기억에서 중요한 뇌의 특정 영역에서 특히 그러하다. 또한 대뇌 피질 및 특정한 피질하 영역에서 뉴론 및 시냅스의 상당한 손실이 있다. 신경원섬유 매듭 및 뉴론 손실은 모두 질병의 기간 및 중증도와 함께 증가하며(Gomez-Isla, t. et al, Ann Neurol 1997; 41:17-24) 신경원섬유 부하는 인지적 쇠퇴와 관련되는 것으로 나타났다(Braak, H. and Braak, E, Neurobiol Aging. 1997 Jul-Aug;18(4):351-7).
신경원섬유 매듭은 미세소관-연관 단백질, 타우의 과인산화된 불용성 축적으로 이루어진 뉴론내 병변이다. 이들 축적은 타우병증으로 전체적으로 알려져 있는, 여러 신경퇴화성 질환의 조직병리적 특징이다. 타우병증에는, 예로 알츠하이머병(AD), 픽 질환(PiD), 진행성 핵상 마비(PSP), 피질기저 퇴화(CBD) 및 전두측두엽 퇴화(FTLD)이 포함된다. 인간 타우병증에서, 병리는 질환 특이적 패턴으로 하나의 뇌 영역에서 다른 영역으로 진행되며(Braak, H. and Braak, E, Neurobiol Aging. 1997 Jul-Aug;18(4):351-7, Raj et.al. Neuron 2012; 73:1204-1215, Seeley et.al. Neuron 2009; 62: 42-52. 및 Zhou et.al., Neuron 2012; 73:1216-1227), 그 내재된 기전은 아직 명확하지 않다.
타우 병리는 여러 타우병증에 관여되며 그 원인일 수 있다. 그 정상 형태에서, 타우는 미세소관에 결합하고 어셈블리를 촉진하는(Drechsel et al., Mol Biol Cell 1992; 3:1141-1154.) 고가용성 미세소관-연관 단백질이다(Jeganathan et al., Biochemistry 2008; 47:10526-10539.). 그러나 타우병증에서, 타우는 고인산화되어 미세소관으로부터의 탈착 및 궁극적으로 비정상 신경돌기 및 세포체에서 가시화되는 신경원섬유 매듭으로서의 축적을 유도한다(Mandelkow and Mandelkow, Cold Spring Harbor Perspect Med 2, 2012: a006247). 타우 병리의 양은 인간 및 트랜스제닉 마우스 모델에서 진행성 뉴론 기능이상, 시냅스 손실 및 기능적 쇠퇴와 관련된다(Arriagada et al., Neurology. 1992 Mar;42(3 Pt 1):631-9, Bancher et al., Neurosci Lett 1993; 162:179-182., Polydoro et al., J. Neoroscience 2009; 29:10741-10749. 및 Small and Duff, Neuron. 2008 Nov 26;60(4):534-42). 알츠하이머병에서는 타우 돌연변이가 관찰되지 않았으나, 타우 유전자에서의 돌연변이는 일부 형태의 전두측두 치매를 유도하는 것으로 나타나서(Cairns et al, Am J Pathol, 2007; 171: 227-40), 타우 양성 봉입을 제시하고 타우 기능이상이 신경퇴화를 유도하기 충분함을 표시한다. 또한, 병리적 타우는 세포 배양 및 트랜스제닉 동물 모델에서 Aβ-유도 신경독성의 필수적 부분인 것으로 나타난다(Rapoport, M, PNAS, 2002; 99:9, 6364-6369., Roberson ED, et al, Science, 2007; 316:750-754, Nicholson AM, and Ferreira A, J Neurosci 2009; 29:4640-4651, Oakley H, J Neurosci 2006;26(40):10129-10140.).
능동 면역화를 위한 상이한 인산-타우 펩타이드 및 수동 면역치료법을 위한 항-타우 항체를 포함하는 몇몇 상이한 마우스 모델을 이용하여 마우스에서 타우에 대한 수동 및 능동 면역화가 분석되었다(Asuni AA, et al, J Neurosci. 2007;27(34):9115-9129., Sigurdsson EM. Curr Alzheimer Res. 2009;6(5):446-450., Boutajangout A, et al, J Neurosci. 2010;30(49):16559-16566., Rosenmann H, et al. Arch Neurol. 2006;63(10):1459-1467., Boimel M, et al, Exp Neurol. 2010;224(2): 472-485.). 30-아미노산 인산화 타우 펩타이드를 이용한 면역화를 기재하는 최초 보고에서, 가용성 및 불용성 타우의 비에 대한 효과, 면역화된 마우스에서 매듭 형성의 감소 및 이들 마우스에 대한 거동 평가에서 관찰된 기능적 이익이 나타났다(Boutajangout A. et al, J. Neuroscience, 2010; 30:16559-16566). 타우에 대한 초기 병리적 입체형태 에피토프에서 고인산화 타우 단백질의 인산화된 Ser396 및 Ser404와 반응하는 잘-분석된 항-타우 항체를 이용한 수동 면역화는 능동 면역화 연구에서 나타난 결과를 확인시켜주었다. 이들 항체가 처리된 마우스는 생화학적 방법 및 조직학에서 측정된 타우 병리에서의 현저한 감소뿐만 아니라 거동 평가에서 평가된 운동-기능 쇠퇴의 유의미한 손실 지연을 나타내었다(Boutajangout A, et al, J Neurochem. 2011;118(4):658-667., Chai X, et al. J Biol Chem. 2011;286(39):34457-34467.)
타우-기반 치료법은 현재까지 마우스 모델에서만 분석되었다. 그러나 일반적으로 타우병증의 중증도 및 특히 알츠하이머병의 사회 비용에 대한 측면에서, 타우병증을 진단, 모니터링, 예방 및 치료하기 위한 효과적인 수단에 대해 지속적인 필요성이 존재한다.
발명의 요약
본 발명은 타우에 특이적으로 결합하는 항원 결합 가변 영역을 포함하는 항체를 제공한다. 본 발명은 특히 항-타우 항체 및 이들의 항원-결합 단편을 제공하며, 이는 정상(즉 건강한) 인간 뇌 조직에서의 타우는 검출하지만, 인간 알츠하이머병(AD) 뇌 조직에서의 타우 침착물은 검출하지 않는다. 항-타우 항체 및 이들의 항원-결합 단편은 웨스턴 검정에 의해 재조합 타우 및 PHF-타우에 결합하지만 ELISA에 의해 PHF-타우에는 결합하지 않는다. 항체 및 항원-결합 단편은 인산화되지 않은 타우 펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있다. 항체 및 항원 결합 단편은 탈인산화된 AD 뇌 조직에 결합할 수 있다.
특정 구현예에서, 항체 및 항원-결합 단편은 탈인산화된 AD 뇌 조직 및 탈인산화된 PHF 타우에 결합할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 인산-선택적이 아니며, 세린 316에서 인산화된 펩타이드에는 결합하지 않는다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 인산-선택적이 아니며 세린 61 및/또는 트레오닌 63에서 인산화된 펩타이드에는 결합하지 않는다.
특정 구현예에서, 본 발명은 타우에 특이적으로 결합하는 천연 발생 인간 항체로부터의 항원 결합 가변 영역 및 인간 IgG1의 재조합 불변 영역을 포함하는 키메라 항체를 제공하며, 여기서 키메라 항체의 불변 영역은 천연 발생 항체와 상이하다.
특정 구현예에서, 본 발명은 정상 인간 뇌 조직에서의 타우는 검출하지만 인간 알츠하이머병(AD) 및 진행성 핵상 마비(PSP) 뇌 조직에서의 타우 침착물은 검출하지 않는 항-타우 항체 및 이들의 항원-결합 단편을 제공한다.
특정 구현예에서, 키메라 항-타우 항체 및 이들의 항원-결합 단편은 웨스턴 검정에 의해서는 재조합 타우 또는 PHF-타우에 결합한다. 다른 구현예에서, 항체 및 항원-결합 단편은 우선적으로 인산화되지 않은 타우 펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있다.
바람직하게는, 항체는 인간 항체이다.
본 발명의 항체 및 항원-결합 단편은 단독으로 및 다른 진단제, 예방제 및/또는 치료제와의 조합으로 모두, 진단제, 예방제 및/또는 치료제로서 유용하다.
하나의 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 201의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 202의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 203의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID NO: 204의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 205의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 206의 경쇄 CDR3 영역을 포함하는 항원-결합 부위를 포함하는 항-타우 항체 및 이들의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 구현예는 SEQ ID NO: 207의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 208의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 209의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID NO: 210의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 211의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 212의 경쇄 CDR3 영역을 포함하는 항-타우 항체 및 이들의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 구현예는 SEQ ID NO: 222의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 223의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 224의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID NO: 225의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 173의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 226의 경쇄 CDR3 영역을 포함하는 항원-결합 부위를 포함하는 항-타우 항체 및 이들의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 구현예는 SEQ ID NO: 238의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 239의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 240의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID NO: 241의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 173의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 242의 경쇄 CDR3 영역을 포함하는 항원-결합 부위를 포함하는 항-타우 항체 및 이들의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 구현예는 SEQ ID NO: 243의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 244의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 245의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID NO: 246의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 173의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 212의 경쇄 CDR3 영역을 포함하는 항-타우 항체 및 이들의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 구현예는 SEQ ID NO: 243의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 247의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 248의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID NO: 249의 경쇄 CDR1 영역 SEQ ID NO: 173의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 212의 경쇄 CDR3 영역을 포함하는 항원-결합 부위를 포함하는 항-타우 항체 및 이들의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 구현예는 SEQ ID NO: 250의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 251의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 252의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID NO: 254의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 254의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 255의 경쇄 CDR3 영역을 포함하는 항원-결합 부위를 포함하는 항-타우 항체 및 이들의 항원-결합 단편에 관한 것이다.
또 다른 양태에서 본 발명은 SEQ ID NO: 115 또는 119 또는 135 또는 147 또는 151 또는 155 또는 159의 중쇄 가변 영역(VH)의 항원-결합 부위 및 SEQ ID NO: 116 또는 120 또는 136 또는 148 또는 152 또는 156 또는 160의 경쇄 가변 영역(VL)의 항원-결합 부위를 포함하는 단리된 항-타우 항체에 관한 것이다.
또 다른 양태에서 본 발명은 SEQ ID NO: 115 또는 119 또는 135 또는 147 또는 151 또는 155 또는 159의 중쇄 가변 영역(VH)의 항원-결합 부위 및 SEQ ID NO: 116 또는 120 또는 136 또는 148 또는 152 또는 156 또는 160의 경쇄 가변 영역(VL)의 항원-결합 부위를 포함하는 단리된 키메라 항-타우 항체에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 항체는 천연 발생 항체가 아니다.
추가 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 115의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 116의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-타우 항체 및 이들의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 추가 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 119의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 120의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-타우 항체 및 이들의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 추가 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 115의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 116의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-타우 항체 및 이들의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 추가 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 119의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 120의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-타우 항체 및 이들의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 추가 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 135의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 136의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-타우 항체 및 이들의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 추가 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 147의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 148의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-타우 항체 및 이들의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 추가 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 151의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 152의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-타우 항체 및 이들의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 추가 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 155의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 156의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-타우 항체 및 이들의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 추가 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 159의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 160의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-타우 항체 및 이들의 항원-결합 단편에 관한 것이다.
하나의 구현예에서, IgG1 중쇄 불변 영역은 SEQ ID NO: 83의 아미노산 서열로 이루어진다. 또 다른 구현예에서, IgG1 경쇄 불변 영역은 SEQ ID NO: 84의 아미노산 서열로 이루어진다.
본 발명은 또한 항체 또는 이들의 항원-결합 단편을 인코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 본 발명의 또 다른 양태는 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 벡터이다. 본 발명의 추가 특징은 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포이다.
본 발명은 또한 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 숙주 세포에 의해 생산되는 항체를 회수하는 단계를 포함하는 항-타우 항체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 항체의 기능적 변이체 및 항체 및/또는 이들의 항원 결합 단편을 포함하는 면역접합체를 추가로 제공한다.
본 발명은 본 발명의 하나 이상의 항체 및/또는 이들의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물 및 키트를 추가로 제공한다. 본 발명은 추가로 항-타우 항체를 채용하는 진단, 예방 및 치료 방법을 제공한다. 예방 및 치료 방법에는 타우병증 및/또는 타우-매개 질환 또는 질병의 예방 또는 치료, 및/또는 타우병증 또는 타우-매개 질환의 하나 이상의 증상의 완화를 위해 인간 대상체에 항-타우 항체 및/또는 이들의 항원-결합 단편을 투여하는 단계가 포함된다. 복수의 상이한 항-타우 항체 및/또는 이들의 항원-결합 단편 및/또는 다른 항-타우 항체와의 조합이 조합 치료법을 위해 이용될 수 있다. 다른 예방제 또는 치료제와의 조합으로 항-타우 항체 및/또는 이들의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물이 또한 제공된다.
본 발명의 항체는 가변 영역이 건강한 개인으로부터의 항-타우 특이적 기억 B-세포로부터 회수되고 정상 인간 뇌에서의 타우는 검출하지만 인간 알츠하이머 뇌에서의 타우 침착물은 검출하지 않는다는 점에서 독특하다. 항-타우 항체는 또한 이들이 웨스턴 검정에서는 변성된 PHF 타우에 결합하지만 ELISA에서는 변성되지 않은 PHF 타우에는 결합하지 않는다는 점에서 독특하다. 항-타우 항체는 개질되지 않은 타우 펩타이드 299-369(SEQ ID NO: 331) 또는 타우 펩타이드 42-103(SEQ ID NO: 325)에 결합한다. 키메라 항체는 또한 개질되지 않은 타우 펩타이드 타우 52-71(SEQ ID NO: 382) 또는 타우 299-323(SEQ ID NO: 458) 또는 타우 82-103(SEQ ID NO: 386)에 추가로 결합한다. 본 발명의 항체는 이들이 탈인산화된 AD 뇌에 결합하고 타우의 세린 316 또는 세린 61 또는 트레오닌 63 상에서 인산화된 타우 펩타이드에는 결합하지 않는다는 점에서 독특하다.
도 1a 내지 도 1t는 해당하는 인지체 및 비-인지체 펩타이드에 대한 CBTAU-7.1, 8.1, 16.1, 18.1, 20.1, 22.1, 24.1, 27.1, 28.1, 41.1, 41.2, 42.1, 43.1, 44.1, 45.1, 46.1, 47.1, 47.2 및 49.1의 반응성을 나타낸다.
도 2a 내지 도 2j는 ELISA에 의한 재조합 타우(r타우), 농축 면역정제된 페어링된 나선형 필라멘트(ePHF) 및 면역정제된 페어링된 나선형 필라멘트(iPHF)에 대한 CBTAU-7.1, 8.1, 16.1, 18.1, 20.1, 22.1, 24.1, 27.1 및 28.1의 반응성을 나타낸다. 항-타우 mAb, AT8이 양성 대조군으로 이용되었다.
도 3은 웨스턴 블롯 분석에 의한 r타우, ePHF 및 iPHF에 대한 CBTAU-7.1, 18.1, 22.1, 24.1, 27.1 및 28.1의 면역반응성을 나타낸다.
도 4a 내지 도 4g는 인간 타우441 상의 영역 42-103 및 299-369에 해당하는 중복 펩타이드를 이용하는 CBTAU-27.1, 28.1, 43.1, 46.1, 47.1, 47.2 및 49.1의 에피토프 맵핑을 나타낸다.
도 5a 내지 도 5d는 본 출원에 상세히 나타낸 CBTAU mAb에 대한 면역조직화학 결과를 나타낸다. 도 5a 내지 도 5b는 각각 비-AD 대 AD 해마 및 피질 조직 섹션 상에서 CBTAU-7.1, 8.1, 16.1, 18.1, 20.1, 22.1, 24.1, 27.1 및 28.1의 면역염색을 나타낸다. 도 c는 비-PSP 및 PSP 피질 조직 섹션 상에서 CBTAU-7.1, 8.1, 16.1, 18.1, 20.1, 22.1 및 24.1의 면역염색을 나타낸다. 도 5d는 비-AD 및 AD 피질 조직 섹션에 대한 CBTAU-43.1, 46.1, 47.2 및 49.1의 면역염색을 나타낸다.
도 6a는 비-AD(54 y.o. 남성; 임상 증상 없음) 및 AD(93 y.o. 히스패닉계 여성) 해마 조직 섹션에 대한 CBTAU-28.1 및 대조군 mAb의 면역반응성을 나타낸다.
도 6b는 소의 장 포스파타아제 처리를 포함하는 및 포함하지 않는 AD(93 y.o. 히스패닉계 여성) 해마 조직 섹션에 대한 CBTAU-28.1 및 대조군 mAb의 반응성을 나타낸다.
도 7은 iPHF(면역정제된 페어링된 나선형 필라멘트) 및 소의 장 포스파타아제 처리된 iPHF 샘플에 대한 CBTAU-28.1 및 인산-타우 mAb, AT8의 반응성을 나타낸다.
도 8a 내지 도 8e는 표 30 내지 표 34 상에 상세히 나타낸 타우 인산펩타이드에 대한 CBTAU-27.1, 28.1, 43.1, 46.1, 47.1, 47.2 및 49.1의 반응성을 나타낸다.
정의
본 발명에서 이용되는 바와 같은 용어의 정의가 아래에 제공된다.
본원에서 이용되는 용어 "포함된" 또는 "포함하는"은 "비제한적으로"라는 단어가 뒤따르는 것으로 간주된다.
본원에서 이용되는 용어 "타우"는 타우의 원상태 단량체 형태를 구체적으로 나타내는 것과 상호 교환적으로 이용된다. 용어 "타우"는 또한 일반적으로 타우의 다른 이형태체, 예를 들어 타우의 올리고머 또는 응집물을 나타내기 위해 이용된다. 용어 "타우"는 또한 모든 유형과 형태의 타우를 종합적으로 나타내기 위해 이용된다. 대안적 스플라이싱으로 인해, 6개의 타우 이소형이 인간 뇌에 존재한다. 이들 이소형은 카복시-말단 부분에서 3개(R1, R3 및 R4) 또는 4개(R1-R4)의 반복-영역과 조합되어, 아미노-말단 부분에서 엑손 2 및 3에 의해 인코딩되는 하나 또는 2개의 29 아미노산 삽입물의 부재 또는 존재에 의해 다르다. 미세소관-결합 도메인은 엑손 10에 의해 인코딩된다. 성인 타우 이소형에는 최장 441-아미노산 성분(SEQ ID NO: 1), 또는 4R/2N, 410-아미노산 성분(SEQ ID NO: 2), 또는 3R/2N, 412-아미노산 성분(SEQ ID NO: 3), 또는 4R/1N, 381-아미노산 성분(SEQ ID NO: 4), 또는 3R/1N 및 383-아미노산 성분(SEQ ID NO: 5) 또는 4R/0N이 포함된다. 최단 352-아미노산 이소형(SEQ ID NO: 6), 또는 3R/0N은 태아 뇌에서 확인되며, 이에 따라 태아 타우 이소형으로 불린다.
"야생형" 타우 아미노산 서열은 또한 "타우441", "4R/2N", "h타우40", "타우F", "타우-4" 또는 "전장 타우"로 불리는 441 아미노산 이소형(SEQ ID NO: 1)으로 나타낸다.
용어 "재조합 타우"는 본원에서 E. 콜라이에서 발현되고 균질성까지 또는 거의 균질성까지 정제된 인간 뇌 타우의 최장 이소형(SEQ ID NO: 1)을 나타낸다(Barghorn S., Meth Mol Biol 2004 299:35-51). 재조합 타우는 가용성이고 인산화되지 않는다.
용어 "신경원섬유 매듭"(NFT)은 치매 환자의 뇌에서 알츠하이머로 최초 설명된 병리 구조를 나타낸다. NFT는 알츠하이머병의 일차 마커로서 가장 일반적으로 공지된 고인산화 타우 단백질의 페어링된 나선형 필라멘트 응집물로 불리는 규칙적으로 배열된 서브유닛으로 이루어진다.
본원에서 이용되는 용어 "페어링된 나선형 필라멘트-타우" 또는 "PHF-타우"는 치매 환자의 뇌에서 알츠하이머로 최초 설명된 신경원섬유 매듭(NFT)으로 불리는 병리 구조를 이루는 널리 공지된 타우 응집물을 나타낸다. 이들의 존재는 타우병증으로 공지된 여러 다른 질환에서도 확인된다.
"농축된 PHF-타우" 또는 "ePHF 타우"는 실시예에 상세히 나타낸 바와 같이 Greenberg 및 Davies의 프로토콜에 따라 제조된다. PHF 타우는 쯔비터이온성 세제(Kosik, K. S., et al. (1986) PNAS USA 83, 4044-4048, Rubenstein, R., et al (1986) Brain Res. 372, 80-88) 및 머캅토에탄올 중 이들의 불용성의 장점을 취함으로써 0.8 M NaCl을 함유하는 27,200 x g 상청액으로부터 농축된다. 쯔비터이온성 세제를 이용해서 단리된 PHF는 SDS-불용성 신경원섬유 매듭의 단리 동안 소실될 수 있는 항원성 부위를 유지하는 것으로 나타나며, 구조가 유사하고 NFT 중 PHF에 대한 여러 항원성 특성을 함유한다. "면역정제된 PHF-타우" 또는 "iPHF 타우"는 항-타우 모노클로날 항체를 이용하여 친화도 정제된다. 이러한 프로토콜은 전자 현미경에 의해 전통적인 페어링된 나선형 필라멘트 구조를 보유하고 저농도 SDS 중에서 완전 가용성인 PHF-타우 제조물을 제공하였다(Jicha, G., 1997, 48(2):128-32). PHF-타우는 또한 헤파린을 이용해서 시험관내 중합의 유도에 의해 재조합 타우로부터 형성된다(Mandelkow, et al Methods in Molecular Biology 299:35 - 51(2004)). 대안적으로, PHF-타우는 Rostagna 및 Ghiso(Rostagna, A. and Ghiso, J., Curr Protoc Cell Biol. Sep 2009; CHAPTER: Unit-3.3333.)에 기재된 바와 같은 프로토콜을 이용해서 AD를 갖는 환자의 뇌로부터 다양한 다른 방법에 의해 단리된다. 단리된 PHF-타우는 PHF-타우와 반응하는 것으로 공지된 항체를 이용해서 그 순도 및 고인산화 상태에 대해 특성규명된다. 전형적인 PHF-타우 제조에서, 웨스턴 블롯에서 약 60 kDa, 64 kDa, 68 kDa 및 72 kDa에서 이동하는 고인산화된 밴드(Spillantini and Goedert Trends Neurosci 21:428-33, 1998)는 탈인산화된 PHF-타우가 아니라 고인산화된 PHF-타우에 특이적으로 결합하는 AT8 항체에 의해 검출된다.
본원에서 이용되는 용어 "항체"는 광범위한 개념으로 의도되며, 쥐과, 인간, 인간-적응된, 인간화된 및 키메라 모노클로날 항체, 이중특이적 또는 다중특이적 항체 및 항체 단편을 포함하는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체를 포함하는 면역글로불린 또는 항체 분자가 포함된다. 일반적으로, 항체는 정의된 항원에 대한 결합 특이성을 나타내는 단백질 또는 펩타이드 사슬이다. 항체 구조는 널리 공지되어 있다. 면역글로불린은 중쇄 불변 도메인 아미노산 서열에 따라 5가지 주요 클래스, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM으로 지정될 수 있다. IgA 및 IgG는 이소형 IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 추가 하위 분류된다. 임의의 척수동물 종의 항체 경쇄는 이들의 불변 도메인의 아미노산 서열에 근거하여 2가지 명확히 구별되는 유형, 즉 카파(κ) 및 람다(λ) 중 하나로 지정될 수 있다.
용어 "항원-결합 단편"은 온전한 항체의 일부를 의미한다. 항체 단편의 예에는 (폴리)펩타이드에 대한 항원 결합을 부여하기 충분한 면역글로불린의 단편을 적어도 함유하는 적어도 2개의 온전한 항체 또는 이들의 단편 또는 (폴리)펩타이드 등으로부터 형성된 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편, CDR, 항원-결합 부위, 중쇄 또는 경쇄 가변 영역, 디아바디, 트리아바디 단일 사슬 항체 분자(scFv) 및 다중특이적 항체가 포함된다. 항원-결합 단편은 항체의 아미노산 서열의 적어도 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 또는 250 인접 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 항원-결합 단편은 합성적으로 또는 온전한 면역글로불린의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 제조될 수도 있고 또는 재조합 DNA 기법에 의해 유전적으로 조작될 수도 있다. 제조 방법은 당분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 본원에 참조로 포함되는 문헌[Antibodies: A Laboratory Manual, Edited by: E. Harlow and D, Lane (1988), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York]에 기재된다. 항체 또는 이들의 항원-결합 단편은 하나 이상의 결합 부위를 가질 수 있다. 하나를 초과하는 결합 부위가 있는 경우, 결합 부위는 서로 동일할 수도 있고 또는 이들은 상이할 수도 있다.
면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 가변 영역은 "항원-결합 부위"에 의해 단속되는 "프레임워크" 영역으로 구성된다. 항원-결합 부위는 하기와 같은 다양한 용어를 이용해서 정의된다: (i) 상보성 결정 영역(CDRs)은 서열 가변성에 근거한다(Wu and Kabat J Exp Med 132:211-50, 1970). 일반적으로, 항원 결합 부위는 각각의 가변 영역에 3개의 CDR을 갖는다(중쇄 가변 영역(VH)에서 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 및 경쇄 가변 영역(VL)에서 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)(Kabat et al., Sequences of Proteins of lmmunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991). (ii) 용어 "고가변 영역", "HVR", 또는 "HV"는 Chothia 및 Lesk(Chothia and Lesk J Mol Biol 96:901-17, 1987)에 의해 정의된 바와 같이 구조 상 고가변인 항체 가변 도메인의 영역을 나타낸다. 일반적으로, 항원-결합 부위는 각각의 VH(H1, H2, H3) 및 VL(L1, L2, L3)에 3개의 고가변 영역을 갖는다. Chothia 및 Lesk는 "정준 구조"로서 구조적으로 보존된 HV를 나타낸다. CDR 및 HV의 주석뿐만 아니라 넘버링 시스템은 Abhinandan 및 Martin에 의해 최근 개정되었다(Abhinandan and Martin Mol Immunol45:3832-9, 2008). (iii) 항원-결합 부위를 형성하는 영역의 또 다른 정의는 면역글로불린 및 T-세포 수용체의 V 도메인의 비교에 근거하여 Lefranc에 의해 제안되었다(Lefranc, et al. Dev Camp Immunol27:55-77, 2003). International ImMunoGeneTics(IMGT) 데이터베이스(http:_//www imgt_ org)는 이들 영역의 표준화된 넘버링 및 정의를 제공한다. CDR, HV 및 IMGT 서술 간 일치는 Lefranc 등에 기재된다. 항원-결합 부위는 또한 특이성 결정 잔기 이용(SDRU)에 근거하여 서술될 수 있고(Almagro J Mol Recognit 17:132-43, 2004), 여기서 특이성 결정 잔기(SDR)는 항원 접촉에 직접 관여되는 면역글로불린의 아미노산 잔기를 나타낸다.
Kabat 등은 또한 임의의 항체에 적용 가능한 가변 도메인 서열에 대한 넘버링 시스템을 정의하였다. 당업자의 하나는 서열 자체를 넘어서는 임의의 실험 데이터에 대한 의존 없이, "Kabat 넘버링"의 상기 시스템을 임의의 가변 도메인 서열에 대해 모호하지 않게 지정할 수 있다. 본원에서 이용되는 "Kabat 넘버링"은 문헌[Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest"(1983)]에 나타낸 넘버링 시스템을 나타낸다. 달리 명시되지 않는 한, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편, 변이체, 또는 이들의 유도체에서 특정 아미노산 잔기 위치의 넘버링에 대한 언급은 Kabat 넘버링 시스템을 따르지만, 이는 이론적인 것이며 본 발명의 모든 항체에 동일하게 적용되지 않을 수 있다. 예를 들어, 제1 CDR 위치에 따라, 다음 CDR은 어느 방향으로든 이동될 수 있다.
"프레임워크" 또는 "프레임워크 서열"은 항원-결합 부위 서열인 것으로 정의된 것 이외의 항체의 가변 영역 내의 나머지 서열이다. 항원-결합 부위의 정확한 정의가 상술된 다양한 서술에 의해 결정될 수 있으므로, 정확한 프레임워크 서열은 항원-결합 부위의 정의에 의존한다.
본원에서 이용되는 용어 "모노클로날 항체"(mAb)는 실질적으로 균질한 항체 모집단으로부터 수득되는 항체(또는 항체 단편)를 의미한다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이며, 전형적으로 단일 항원성 결정기에 대해 유도된다.
하나의 양태에서, 본 발명의 항체는 키메라 인간 항체이다. 따라서 본 발명에 따르면, 용어 "인간 키메라 항체", 또는 "인간 재조합 항체" 등은 항원-결합 특징이 인간 세포로부터 유래되는, 즉 항원 결합 부위가 인간 세포, 예컨대 B 세포로부터 제조되는 핵산, 또는 인간 세포, 예를 들어 인간 기억 B 세포의 mRNA로부터 클로닝된 부분적 cDNA로부터 유도되는 결합 분자를 표시하기 위해 이용된다. 키메라 항체는 항체에서 아미노산 치환이, 예로 생물리적 또는 약동학적 특징을 개선하기 위해 제조되는 경우에도 여전히 "인간" 항체이다. 인공적으로 생성된 인간-유사 항체, 예컨대 파지 디스플레이된 항체 라이브러리 또는 이종발생성 마우스로부터의 단일 사슬 항체 단편(scFvs)에 비해, 본 발명의 키메라 인간 항체는 (i) 항원-결합 영역이 동물 대리물에 비해 인간 면역 반응을 이용하여 수득되는, 즉 항원 결합 영역이 인체에서 그 관련 입체형태의 천연 타우에 반응하여 생성된 것, 및/또는 (ii) 개인을 보호했거나 타우의 존재에 대해 적어도 유의미한 것을 특징으로 한다.
아래에, 그리고 예를 들어 미국 특허 제5,939,598호(Kucherlapati et al.)에 기재된 바와 같이 내인성 면역글로불린을 발현하지 않고 하나 이상의 인간 면역글로불린에 대한 트랜스제닉 동물로부터 또는 인간 면역글로불린 라이브러리로부터 유래되는 항체는 이들을 본 발명의 인간-유래 항체와 구별하기 위해 인간-유사 항체로 표시된다.
예를 들어, 인간-유사 항체, 예컨대 전형적으로 파지 디스플레이로부터 단리된 합성 및 반-합성 항체의 중쇄 및 경쇄의 페어링은 이들이 원래 인간 B 세포에서 일어나는 바와 같은 원래 페어링을 반드시 반영하지는 않는다. 따라서 선행 기술에서 일반적으로 이용되는 재조합 발현 라이브러리로부터 수득되는 Fab 및 scFv 단편은 면역원성 및 안정성에 대한 모든 가능한 연관 효과를 가지며 인공적인 것으로 간주될 수 있다. 대조적으로, 본 발명은 선택된 인간 대상체로부터 친화도-성숙된 항-타우 항체의 항원-결합 영역을 제공하며, 이는 특정 구현예에서 공통 IgG1 불변 영역과의 키메라로서 재조합적으로 발현된다.
본원에서 이용되는 용어 "기능적 변이체"는 참조 항체의 뉴클레오타이드 및/또는 아미노산 서열 대비 하나 이상의 뉴클레오타이드 및/또는 아미노산이 변형되는 뉴클레오타이드 및/또는 아미노산 서열을 포함하며 결합 파트너, 즉 타우에 대한 특이적 결합에 대해 참조 항체와 경쟁할 수 있는 항체를 나타낸다. 다시 말하면, 참조 항체의 아미노산 및/또는 뉴클레오타이드 서열에서의 개질은 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩되거나 아미노산 서열을 함유하는 항체의 결합 특징에 유의미하게 영향을 미치거나 이를 변형하지 않는다, 즉 항체는 여전히 그 표적을 특이적으로 인식하고 이에 결합할 수 있다. 기능적 변이체는 뉴클레오타이드 및 아미노산 치환, 부가 및 결실을 포함하는 보존적 서열 개질을 가질 수 있다. 기능적 변이체의 예에는 고가변 영역에서 번역-후 개질 가능성을 갖는 자유 시스테인 또는 아미노산의 위험-배제뿐만 아니라 FcRn에 대한 IgG 항체의 결합 친화도를 증가/감소시키고, 혈청 반감기를 증가/감소시키기 위한 Fc 조작이 포함된다. 기능적 변이체는 또한 인간 키메라 IgG2, IgG3 또는 IgG4 이소형으로, 또는 상이한 종의 키메라 이소형으로의 항체의 생성일 수 있다. 기능적 변이체는 또한 이중특이적 항체 형성의 증대를 위한 불변 영역의 돌연변이 또는 돌연변이들일 수 있다. 이들 개질은 당분야에 공지된 표준 기법, 예컨대 PCR, 부위-지정 돌연변이화 및 무작위 PCR-매개 돌연변이화에 의해 도입될 수 있고, 천연뿐만 아니라 비-천연 뉴클레오타이드 및 아미노산을 포함할 수 있다.
항체 및 그 결합 파트너, 예로 항원의 상호작용에 대해 본원에서 이용되는 용어 "특이적으로 결합하는", 또는 "특이적으로 인식하는"은 상호작용이 결합 파트너 상의 특정 아미노산 서열 또는 구조, 예로 항원성 결정기 또는 에피토프의 존재에 의존함을 의미한다. 다시 말하면, 항체는 결합 파트너가 다른 분자 또는 유기체의 혼합물에 존재하는 경우에도 결합 파트너에 우선적으로 결합하거나 이를 인식한다. 결합은 공유 또는 비공유 상호작용 또는 둘 모두의 조합에 의해 매개될 수 있다. 다르게 말하면, 용어 "특이적으로 결합하는" 또는 "특이적으로 인식하는"은 항체가 항원성 결정기 또는 에피토프와 특이적으로 면역반응성이고 다른 항원성 결정기 또는 에피토프와 면역반응성이 아님을 의미한다. 항원에 (면역)특이적으로 결합하는 항체는, 예로 방사선면역검정(RIA), 효소-연관된 면역흡착 검정(ELISA), BIACORE, 또는 당분야에 공지된 다른 검정에 의해 결정되는 바와 같이 더 낮은 친화도로 다른 펩타이드 또는 폴리펩타이드에 결합할 수 있다. 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이들의 단편은 동일한 에피토프를 수반하는 관련된 항원과 교차-반응성일 수 있다. 바람직하게는, 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이들의 단편은 다른 항원과 교차-반응하지 않는다.
본원에서 이용되는 용어 "에피토프"는 항체의 CDR 루프에 의해 접촉되는 항원의 부분을 의미한다. "구조적 에피토프"는 항원 표면 상의 약 15개 내지 22개 접촉 잔기를 포함하며, 항체의 파라토프로 총칭되는 CDR 상에서 큰 잔기 그룹과의 접촉을 만드는 여러 아미노산 잔기가 관여된다. 에피토프 및 파라토프 잔기 간 직접적 접촉은 정전기력, 예컨대 수소 결합, 염 가교, 소수성 표면의 반 데르 발스력 및 형태 상보성을 통해 구축된다. 계면은 항원-항체 상호작용의 특이성 및 친화도에 기여하는 결합된 물 분자 또는 다른 보조-인자를 또한 갖는다. 항원-항체 복합체의 결합 에너지는 일차적으로 에피토프-파라토프 계면에서 작은 접촉 잔기 하위세트에 의해 매개된다. 이들 "에너지성 잔기"는 종종 에피토프-파라토프 계면의 중심에 위치하며, 기능적 에피토프를 구성한다. 계면 말초에서의 접촉 잔기는 일반적으로 결합 에너지에 적은 기여를 한다; 이들의 대체는 빈번하게는 항원과의 결합에 대해 거의 효과를 갖지 않는다. 따라서 에피토프의 결합 또는 기능적 활성에는 구조적 에피토프에서 중심에 위치하고 특이성-결정 CDR에 의해 접촉되는 작은 에너지성 잔기 하위세트가 관여된다. 항원성 단백질 상의 기능적 에피토프의 지정은 알라닌 스캐닝 돌연변이화를 포함하는 몇몇 방법을 이용하여 또는 항체와의 항원의 결정 구조를 풀어서 수행될 수 있다. 에피토프는 자연에서 선형일 수도 있고 또는 불연속 에피토프, 예로 선형 시리즈의 아미노산보다 항원의 비-인접 아미노산 간 공간적 관계에 의해 형성되는 입체형태 에피토프일 수도 있다. 입체형태 에피토프에는 항원의 폴딩으로 생성되는 에피토프가 포함되며, 여기서 항원의 선형 서열의 상이한 부분으로부터의 아미노산은 3-차원 공간에서 가까이 인접하게 된다. 불연속 에피토프에 있어서, 소위 부분적 에피토프, 예로 단백질 서열의 상이한 영역에 분산된 에피토프에 대해 감소된 친화도를 갖는 하나 이상의 선형 펩타이드의 결합을 수득할 수 있다(Cragg, M. S. (2011) Blood 118(2): 219-20.).
본원에서 이용되는 용어 "친화도"는 결합 분자, 예로 면역글로불린 분자의 CDR과 개별 에피토프 또는 부분적 에피토프의 결합 강도의 척도를 나타낸다; 예로, 문헌[Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed.(1988) at pages 27-28]을 참고하라. 본원에서 이용되는 용어 "결합력"은 면역글로불린의 모집단 및 항원 간 복합체의 전반적 안정성, 즉 면역글로불린 혼합물과 항원의 기능적 조합 강도를 나타낸다; 예로, 문헌[Harlow at pages 29-34]를 참고하라. 결합력은 모집단 중 개별 면역글로불린 분자와 특정 에피토프의 친화도 및 면역글로불린 및 항원의 결합가에 모두 관련된다. 예를 들어, 2가 모노클로날 항체 및 고도 반복 에피토프 구조, 예컨대 중합체를 갖는 항원 간의 상호작용은 높은 결합력을 가질 것이다. 항원에 대한 항체의 친화도 또는 결합력은 임의의 적합한 방법을 이용해서 실험적으로 결정될 수 있다; 예를 들어, 문헌[Berzofsky et al., "Antibody-Antigen Interactions" In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press New York, N.Y.(1984), Kuby, Janis Immunology, W.H. Freeman and Company New York, N Y(1992)] 및 본원에 기재된 방법을 참고하라. 항원에 대한 항체의 친화도를 측정하기 위한 일반적 기법에는 ELISA, RIA 및 표면 플라즈몬 공명이 포함된다. 특정한 항체-항원 상호작용의 측정된 친화도는 상이한 조건 하에, 예로 염 농도, pH 하에 측정되는 경우 변할 수 있다. 따라서, 친화도 및 다른 항원-결합 파라미터, 예로 KD, IC50의 측정은 바람직하게는 항체 및 항원의 표준화된 용액 및 표준화된 완충액으로 수행된다.
본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편 또는 이들의 변이체는 또한 항원의 존재를 특이적으로 검출하는 이들의 능력의 측면에서 기재되거나 명시될 수 있다. 용어 "검출한다" 또는 "검출하는"은 표적 분자의 정량적, 반-정량적 또는 정성적 측정을 포함하기 위해 가장 광의의 개념으로 이용된다. 하나의 양태에서, 본원에 기재된 항체는, 예로 면역조직화학에 의해 생물학적 샘플 중 타우 폴리펩타이드의 존재 또는 부재만을 결정함으로써 타우 폴리펩타이드가 검출 가능할 수도 있고, 또는 대안적으로 방법에 의해 결정되는 샘플 중에서 검출 불가능할 수도 있다.
본원에서 이용되는 용어 "인산-특이적 항체 또는 "인산-의존적 항체"는 적어도 일부 또는 전체 에피토프가 인산화된 아미노산 잔기에 의존하는 특정 항체를 의미한다. 인산-특이적 또는 인산-의존적 항체는 인산화되지 않은 항원을 검출하지 않는다. 용어 "인산-선택적 항체"는 인산화된 잔기에 우선적으로 결합하고 인산화되지 않은 항원 대비 인산화된 항원에 대해 더 높은 친화도를 갖는 특정 항체를 의미한다. 용어 "인산-선택적이 아닌 항체"는 인산화되지 않은 잔기에 우선적으로 결합하고 인산화된 항원 대비 인산화되지 않은 항원에 대해 더 높은 친화도를 갖는 특정 항체를 의미한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항-타우 항체 또는 이들의 항원-결합 단편은 인산-특이적이 아니다.
용어 "폴리뉴클레오타이드"는 단수 핵산뿐만 아니라 복수 핵산을 포괄하려는 것이며, 단리된 핵산 분자 또는 구축물, 예로, 메신저 RNA(mRNA) 또는 플라스미드 DNA(pDNA)를 나타낸다. 폴리뉴클레오타이드는 통상적 포스포디에스테르 결합 또는 비-통상적 결합(예로, 아마이드 결합, 예컨대 펩타이드 핵산(PNA)에서 확인되는 것들)을 포함할 수 있다. 용어 "핵산 분자"는 임의의 하나 이상의 핵산 절편, 예로 폴리뉴클레오타이드에 존재하는 DNA 또는 RNA 단편을 나타낸다. "단리된" 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드란 그 원상태 환경으로부터 제거된 핵산 분자, DNA 또는 RNA를 나타낸다. 예를 들어, 벡터에 함유되는 항체를 인코딩하는 재조합 폴리뉴클레오타이드는 본 발명의 목적을 위해 단리된 것으로 간주된다.
특정 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산은 DNA이다. DNA의 경우, 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드에는 보통 하나 이상의 코딩 영역과 작동 가능하게 연관된 프로모터 및/또는 다른 전사 또는 번역 제어 요소가 포함될 수 있다. 유전자 산물에 대한 코딩 영역, 예로 폴리펩타이드가 조절 서열(들)의 영향 또는 제어 하에 유전자 산물의 발현을 배치하도록 하는 방식으로 하나 이상의 조절 서열과 연관되는 경우, 작동 가능한 연관이다. 따라서, 프로모터 영역은 프로모터가 해당 핵산의 전사를 일으킬 수 있는 경우, 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산과 작동 가능하게 연관될 것이다. 프로모터는 소정 세포에서만 DNA의 실질적 전사를 지시하는 세포-특이적 프로모터일 수 있다. 프로모터 이외의 다른 전사 제어 요소, 예를 들어 인핸서, 작동인자, 억제인자 및 전사 종결 신호는 세포-특이적 전사를 지시하기 위해 폴리뉴클레오타이드와 작동 가능하게 연관될 수 있다. 적합한 프로모터 및 다른 전사 제어 영역이 본원에 개시된다.
본원에서 이용되는 용어 "치료하다" 또는 "치료"는 치료적 처리 및 예방적 또는 방지적 조치를 모두 나타내며, 여기서 목적은 원하지 않는 생리적 변화 또는 장애, 예컨대 파킨슨병 또는 알츠하이머병의 발생을 예방하거나 지연(경감)시키는 것이다. 유익하거나 원하는 임상 결과에는 검출 가능하건 혹은 검출 불가능하건, 비제한적으로 증상의 완화, 질환 정도의 감소, 질환의 안정화된(즉, 악화되지 않는) 상태, 질환 진행의 지체 또는 지연, 질환 상태의 개선 또는 진정 및 경감(부분적이건 전체적이건)이 포함된다. "치료"는 또한 치료를 받지 않는 경우의 예상 생존 대비 생존의 연장을 의미할 수 있다. 치료를 필요로 하는 자들에는 또한 질병 또는 장애가 이미 있는 자들뿐만 아니라 질병 또는 장애를 갖기 쉬운 자들 또는 질병 또는 장애의 발현이 예방되어야 하는 자들이 포함된다. 본원에서 이용되는 "약제"는 원치않는 생리적 변화 또는 장애의 치료에서 이용되는 제제이다.
"대상체" 또는 "개인" 또는 "동물" 또는 "환자" 또는 "포유류"란 그에 대한 진단, 예후, 예방, 또는 치료법이 요구되는 임의의 대상체, 특히 포유류 대상체, 예로 인간 환자를 의미한다.
설명
타우는 여러 널리 공지된 이소형을 갖는 풍부한 중추 신경계 및 말초 신경계 단백질이다. 인간 CNS에서, 대안적 스플라이싱으로 인해 352 내지 441 크기 범위의 6가지 주요 타우 이소형이 존재한다(Hanger, et al. Trends Mol Med 15:112-9, 2009). 이들 이소형은 0-2 N-말단 삽입부 및 3개 또는 4개의 일렬 배열된 미세소관-결합 반복부의 조절된 도입으로 인해 서로 상이하며, ON3R(SEQ ID NO: 6), 1N3R(SEQ ID NO: 4), 2N3R(SEQ ID NO: 2), ON4R(SEQ ID NO: 5), 1N4R(SEQ ID NO: 3) 및 2N4R(SEQ ID NO: 1)로 불린다. 본원에서 이용되는 용어 "재조합 타우"는 인산화 및 다른 번역 후 개질이 없는 SEQ ID NO: 1의 타우 이소형을 나타낸다. 타우 단백질은, 예를 들어 E. 콜라이, 배큘로바이러스, 포유류 또는 무세포 시스템에서 다량으로 재조합적으로 발현될 수 있다. '재조합 타우'는 표준 방법을 이용해서 재조합적으로 발현되고 정제될 수 있다(Barghorn, et al 2004, Meth Mol Biol 35-51).
타우는 미세소관에 결합하고, 여러 79개의 잠재적 세린(Ser) 및 트레오닌(Thr) 인산화 부위에서 일어나는 타우 인산화에 의해 조정될 수 있는 공정인 세포를 통한 화물 수송을 조절한다. 타우는 뇌 발달 동안 고도로 인산화된다. 인산화 정도는 성인기에 감소한다. 일부 인산화 부위는 타우의 미세소관 결합 도메인 내에 위치하며, 타우 인산화의 증가가 미세소관의 결합을 부정적으로 조절하는 것으로 나타났다. 예를 들어, 미세소관 결합 모티프 내에 또는 주변에 놓이는 Ser262 및 Ser396은 AD 환자의 뇌에서 신경원섬유 매듭(NFTs)의 주성분인 비정상 페어링된 나선형 필라멘트(PHFs)의 타우 단백질에서 고인산화된다. PHF는 비정상적으로 고인산화되고 특정한 항-타우 항체로 염색되고 광학 현미경에 의해 검출될 수 있는 타우 단백질의 필라멘트성 응집물이다. 이는 소위 직선형 타우 필라멘트에 대해서도 마찬가지이다. PHF는 약 80 nm의 주기로 서로에 대해 트위스트되는 2개의 필라멘트로 구성된 트위스트된 리본을 형성한다. 이들 병리적 특징은 일반적으로 "타우-병리", "타우병리" 또는 "타우-관련 병리"로 불린다. 타우병증의 신경병리적 특징의 보다 상세한 설명에 대해서는 그 개시 내용이 본원에 참조로 포함되는 문헌[Lee et al., Annu. Rev. Neurosci. 24(2001), 1121-1159 및 Goetz, Brain. Res. Rev. 35(2001), 266-286]을 참고하라. 생리적 타우 단백질은 뉴론에서 미세소관을 안정화한다. 병리적 인산화는 비정상적 타우 편재 및 응집으로 이어지며, 이는 미세소관의 탈안정화 및 손상된 세포 수송을 유도한다. 응집된 타우는 시험관내 신경독성이다(Khlistunova et al., J. Biol. Chem. 281(2006), 1205-1214). 그러나 정확한 신경독성 종은 이들이 뉴론 사멸을 야기하는 기전(들)과 마찬가지로 명확하지 않은 채 남아 있다. 타우의 응집물은 여러 타우병증, 예컨대 알츠하이머병(AD), 전두측두 치매, 핵상 마비, 픽 질환, 은친화성 입자 질환(AGD), 피질기저 퇴화, FTDP-17, 파킨슨 질환, 권투선수 치매에서 신경원섬유 매듭(NFT)의 주성분으로서 관찰될 수 있다(문헌[Gendron and Petrucelli, Mol. Neurodegener. 4:13(2009)]에서 리뷰로 다뤄짐). 이러한 관찰에 더하여, 타우-매개된 뉴론 사멸이 매듭 형성의 부재 하에서도 일어날 수 있다는 증거가 도출되고 있다. 가용성 인산-타우 종이 CSF에 존재한다(Aluise et al., Biochim. Biophys. Acta. 1782(2008), 549-558). 타우 응집물은 미스폴딩된 상태를 세포 외부에서 내부로 보내고 공동-배양된 세포 간에 전달할 수 있다(Frost et al., J. Biol. Chem. 284(2009), 12845-12852).
신경퇴화성 타우병증에서의 관여에 부가하여, 허혈/재관류 동안 및 이후 그리고 진탕 두부 손상 이후 타우 인산화에서 관찰된 변형뿐만 아니라 외상성 뇌 손상(TBI)을 갖는 군인 베테랑 및 진탕 운동선수에서의 타우병증인 만성 외상성 뇌병증에서 확인되는 타우에서의 변화는 타우가 뉴론 손상 및 신경혈관 장애, 예컨대 허혈성 뇌졸중의 임상적 병태생리에서 중추적 역할을 담당함을 제시한다(Zheng et al., J. Cell. Biochem. 109(2010), 26-29).
본원에 개시된 항-타우 항체는 타우 및 이들의 에피토프 및 타우 및 이들의 에피토프의 다양한 입체형태에 특이적으로 결합한다. 예를 들어, 정상 성인 인간 뇌에서 확인된 타우에 특이적으로 결합하는 항체가 본원에 개시된다. 하나의 예에서, 본원에 개시된 타우 항체는 타우 또는 이들의 에피토프에 결합하며, 다른 단백질에 대해 약 3배 배경을 초과하는 결합을 나타내지 않는다. 타우 이형태체에 "특이적으로 결합하는" 또는 "선택적으로 결합하는" 항체는 타우의 모든 입체형태에 결합하지 않는, 즉 적어도 하나의 다른 타우 이형태체, 예컨대 재조합 타우에는 결합하지 않는 항체를 나타낸다.
본 발명의 키메라 항-타우 모노클로날 항체의 가변 도메인은 타우-특이적 면역 반응을 나타내는 건강한 인간 대상체 풀로부터 유래된다. 본 발명의 타우 항체는 이들 항체 항원 결합 영역이 대상체에 의해 실제로 발현되었고, 예를 들어 지금까지 인간-유사 항체를 제조하기 위한 시도에 있어서 하나의 일반적 방법으로 나타난 인간 면역글로불린 발현 파지 라이브러리로부터 단리되지 않았음을 강조하기 위해 "인간-유래 항체"로도 불릴 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 이들이 인간-유래 항체라는 점에서 mAb AT8, MC1 및 AT100과 상이하다.
본 발명은 모노클로날 항체를 제공하며, 여기서 항체는 a) 정상 인간 뇌 조직에서의 타우에 결합하며 b) 인간 AD 뇌 조직에서의 타우에는 결합하지 않는다. 특정 구현예에서, 항체는 a) 정상(즉 건강한) 인간 뇌 조직에서의 타우와 면역학적 복합체를 형성하며, b) 인간 AD 뇌 조직에서의 타우와는 면역학적 복합체를 형성하지 않는다.
본 발명의 항-타우 항체는, 예를 들어 ELISA에서 재조합 타우에 대한 이들의 결합 특성을 특징으로 할 수 있다. E. 콜라이로부터 정제된 재조합 타우는 그 친수성 특징으로 인해 고도로 가용성이다. 이는 타우병증에서 확인되는 타우에 특징적인 Ser, Thr 및 Tyr 잔기의 인산화가 없다. 하나의 예에서, 본원에 개시된 인간 항-타우 항체는 ELISA에서 재조합 타우에 특이적으로 결합한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항-타우 항체는 SEQ ID NO: 325 또는 SEQ ID NO: 331 또는 SEQ ID NO: 382 또는 SEQ ID NO: 458 또는 SEQ ID NO: 386의 인산화되지 않은 타우 펩타이드에 특이적으로 결합하는 것으로 나타났다. 추가 구현예에서, 본 발명의 항-타우 항체는 위치 316, 61의 세린 또는 위치 63의 트레오닌이 인산화되지 않은 경우 인산화된 펩타이드에 특이적으로 결합하는 것으로 나타났다.
따라서 특정 구현예에서, 본원에 개시된 항-타우 항체는 펩타이드 ELISA에서 타우 펩타이드에 특이적으로 결합한다. 하나의 구현예에서, 항-타우 항체는 타우 펩타이드, 예로 타우441의 아미노산 299 내지 369에 해당하는 HVPGGGSVQIVYKPVDLSKVTSKCGSLGNIHHKPGGGQVEVKSEKLDFKDRVQSKIGSLDNITHVPGGGNK(SEQ ID NO: 331)에 결합한다. 또 다른 구현예에서, 항-타우 항체는 타우 펩타이드, 예로 타우441의 아미노산 42 내지 103에 해당하는 GLKESPLQTPTEDGSEEPGSETSDAKSTPTAEDVTAPLVDEGAPGKQAAAQPHTEIPEGTTA(SEQ ID NO: 325)에 결합한다. 또 다른 예에서, 항-타우 항체는 타우 펩타이드, 예로 타우441의 아미노산 52 내지 71에 해당하는 TEDGSEEPGSETSDAKSTPT(SEQ ID NO: 382)에 결합한다. 또 다른 구현예에서, 항-타우 항체는 타우 펩타이드, 예로 타우441의 아미노산 299 내지 323에 해당하는 HVPGGGSVQIVYKPVDLSKVTSKCG(SEQ ID NO: 458)에 결합한다. 또 다른 예에서, 항-타우 항체는 타우 펩타이드, 예로 타우441의 아미노산 82 내지 103에 해당하는 EGAPGKQAAAQPHTEIPEGTTA(SEQ ID NO: 386)에 결합한다. 본 발명의 항-타우 항체는 상이한 타우 펩타이드에 결합하는 것으로 보고된 이전에 개시된 인간 항-타우 모노클로날 항체(US20130295021)가 아닐 것으로 보인다. 모노클로날 항체 NI-105.4E4, NI-105.4A3 및 NI-105.4E4는 타우441의 펩타이드 329 내지 351과 387 내지 397, 337 내지 343 및 35 내지 49에 각각 결합한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 항체는 키메라 항체이다.
특정 구현예에서, 항체는 타우에 특이적으로 결합하는 인간 항체로부터의 항원 결합 가변 영역 및 인간 IgG1의 재조합 불변 영역을 포함하는 키메라 항체이며, 여기서 키메라 항체는 인간 항체와 상이하다.
특정 구현예에서, 항체는 타우에 특이적으로 결합하는 인간 항체로부터의 항원 결합 가변 영역 및 인간 IgG1의 재조합 불변 영역을 포함하는 키메라 항체이며, 여기서 키메라 항체의 불변 영역은 인간 항체의 불변 영역과 상이하다.
특정 구현예에서, 항체는 타우에 특이적으로 결합하는 천연 발생 인간 항원 결합 가변 영역 및 인간 IgG1 항체의 재조합 불변 영역을 포함하는 키메라 항체이다.
특정 구현예에서, 항체는 키메라 항체이며, 여기서 항체는 인간 항체로부터의 천연 발생 인간 경쇄 및 중쇄 가변 영역 및 재조합 인간 IgG1 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 포함한다.
특정 구현예에서, 항체는 키메라 항체이며, 여기서 키메라 항체는 천연 발생 인간 항체로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 및 재조합 인간 IgG1 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 포함한다.
특정 구현예에서, 항체는 인간 항체로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 및 재조합 인간 IgG1 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 포함하는 키메라 항체이다.
특정 구현예에서, 항체는 인간 모노클로날 항체의 비-천연 발생 변이체이다.
특정 구현예에서, 항체는 인간 AD 뇌에서 포스파타아제-처리된 타우 침착물에 결합한다. 따라서 특정 구현예에서, 항체는 포스파타아제 처리 후 AD 뇌에서 타우를 인식한다. 특정 구현예에서, 항체는 포스파타아제 처리된 인간 AD 조직에서 타우 침착물과 면역학적 복합체를 형성한다.
본 발명의 항-타우 항체는, 예를 들어 ELISA에서 PHF-타우에 대한 이들의 결합 특성을 특징으로 할 수 있다. 항-PHF-타우 항체 클론 AT8은 PHF-타우에 결합하며 알츠하이머 환자로부터의 샘플에서 신경원섬유 매듭 중 PHF-타우를 검출하기 위해 광범위하게 이용되었다. AT8은 인산-특이적 모노클로날 항체이며 PHF-타우의 인산화된 Ser202 및 Thr205에 결합하고 ELISA, 면역조직화학, 면역블롯, 웨스턴 블롯 및 관련 적용에서의 이용을 위해 널리 공개되어 있다. 클론 AT8은 ELISA에 의해 PHF-타우뿐만 아니라 알츠하이머병 타우를 인식하며, 건강한 개인으로부터의 인산화되지 않은 타우 또는 재조합 타우에는 결합하지 않는다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 항-타우 모노클로날 항체는 ELISA에 의해 PHF 타우에는 결합하지 않는다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 항-타우 모노클로날 항체는 ELISA에 의해 탈인산화된 PHF 타우에 결합한다.
본 발명의 항-타우 항체는 웨스턴 블롯에 의해 PHF-타우 및 재조합 타우에 대한 이들의 결합 특성을 특징으로 할 수 있다. 신경퇴화성 장애에서, 몇몇 기전(인산화, 유비퀴틴화, 아세틸화, 산화, 당화)이 타우 단백질의 PHF로의 응집에 관여된다(Martin, L, et al, Neurochem Int, 58(4):458-71, 2011). 이러한 병리적 타우 단백질은 55 kDa 내지 69 kDa의 3개 주요 밴드 및 74 kDa에서의 소량 밴드로서 웨스턴 블롯팅에 의해 가시화된다. 타우 55는 최단 이소형(SEQ ID NO: 6)의 인산화로 생성되며, 타우 64는 하나의 카세트 엑손을 갖는 타우 변이체(SEQ ID NO: 4 및/또는 SEQ ID NO: 5)의 인산화로 생성되고, 타우 69는 2개의 카세트 엑손을 갖는 타우 변이체(SEQ ID NO: 2 및/또는 SEQ ID NO: 3)의 인산화로 생성된다. 최장 타우 이소형(SEQ ID NO: 1)의 인산화는 추가적인 고인산화된 타우74 변이체의 형성을 유도한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항-타우 항체는 웨스턴 분석에 의해 PHF 타우 및 재조합 타우에 결합하며, ELISA에 의해 PHF 타우에는 결합하지 않는다.
특정 구현예에서, 항체는 a) 변성된 PHF 타우에 결합하며 b) 변성되지 않은 PHF 타우에는 결합하지 않는다.
특정 구현예에서, 항체는 포스파타아제-처리된, 변성되지 않은 PHF 타우에 결합한다. 특정 구현예에서, 항체는 인간 공여체 조직으로부터 단리된 PHF 타우보다 포스파타아제-처리된 PHF 타우에 대해 더 높은 친화도로 결합한다.
특정 구현예에서, 항체는 a) 웨스턴 블롯에 의해 PHF 타우에 결합하며 d) ELISA에 의해 PHF-타우에는 결합하지 않는다. 특정 구현예에서, 항체는 웨스턴 블롯에 의해 인간 AD 조직으로부터 단리된 PHF 타우에 결합하고 b) ELISA에 의해 PHF 타우에는 결합하지 않는다.
특정 구현예에서, 항체는 ELISA에 의해 포스파타아제-처리된 PHF 타우에 결합한다. 특정 구현예에서, 항체는 ELISA에 의해 인간 AD 조직으로부터 단리된 포스파타아제-처리된 PHF 타우에 더 높은 친화도로 결합한다.
본 발명의 항-타우 항체는 정상 또는 AD 뇌로부터의 조직 섹션의 면역조직화학(IHC)에서 이용되고 이를 특징으로 할 수 있다. 인산-타우 항체는 특히, 고도의 민감성 및 특이성으로 신경원섬유 병리를 강조하는 반면, 정상의 건강한 뇌에서는 타우의 검출이 관찰되지 않는다. 임상병리적 연구는 인산-타우 침착 또는 축적이 아밀로이드-β 축적 대비 임상적 징후에 더 밀접하게 대응하며 경내분비로부터 변연, 동종피질 영역으로 단계식 방식으로 진행되어 AD 단계분석에 대한 기반을 형성함을 나타낸다[R.J. Castellani, et al, Acta Neuropathol(Berl) 111, 503(2006); H. Braak and E. Braak, Acta Neuropathol(Berl) 82, 239(1991)]. 면역조직화학에서 보편적으로 사용되는 타우 모노클로날 항체에는 AT8(p202/p205 타우), AT180(p231 타우), AT270(p181 타우), AT100(pT212 및 S214), 및 MC-1이 포함된다(Mercken M, et al, 1992 Acta Neuropatho 84:265-272, Zheng-Fischhofer 1998 Eur J Biochem 252:542-552, Goedert M, et. Al. 1994 Biochem J 301:871-877). 하나의 구현예에서, 본 발명의 항-타우 모노클로날 항체는 정상 인간 뇌 조직에서의 타우를 검출하며, 인간 AD 뇌 조직에서의 타우 침착물은 검출하지 않는다. 또 다른 예에서, 본 발명의 항-타우 모노클로날 항체는 탈인산화된 또는 포스파타아제-처리된 인간 AD 뇌 조직에서의 타우 침착물을 검출한다.
항-타우 항체는 또한 진행성 핵상 마비, 픽 질환 등을 포함하는 추가적인 타우병증의 면역조직화학에서 이용되고 이를 특징으로 할 수 있다. PSP에서 병리적 필라멘트성 타우의 봉입은 비정상적으로 인산화된 타우 단백질로 이루어지지만, 비정상적인 4R 타우 이소형의 우선적 축적이 존재한다. Alz50, Tau-2, T46, PHF-1, PHF-6, 12E8, PHF-1, RD4 및 AT8을 포함하는 항-타우 모노클로날 항체의 패널이 PSP 침착물을 특성규명하기 위해 이용되었다(J Neuropathol Exp Neurol. 1998(6):588-601.). 모든 모노클로날 항체는 뉴론내 및 아교의 봉입을 염색하였으나, 12E8 및 PHF-6은 더 적은 강도로 염색하였다. 이들 항체는 타우의 상이한 에피토프, 예로 인산-특이적, 이소형 특이적 에피토프를 검출하며, 또한 AD 뇌에서의 타우 침착물을 검출한다. 3-반복 타우 이소형을 특이적으로 검출하는 항-타우 모노클로날 항체, RD3은 PSP의 제한된 IHC 검출을 나타내지만, 인간 AD 뇌 조직에서 타우 침착물을 진하게 염색한다. 상기 항체에 의한 PSP의 제한된 검출은 PSP에서 감소된 수준의 3-반복 타우 이소형에 기인한다(De Silva, R. et al, Neuropath and Appl Neurobio(2003) 29(3)288-302).
특정 구현예에서, 항체는 a) SEQ ID NO: 201의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 202의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 203의 중쇄 CDR3 영역, 또는 b) SEQ ID NO: 207의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 208의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 209의 중쇄 CDR3 영역, c) SEQ ID NO: 222의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 223의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 224의 중쇄 CDR3 영역, d) SEQ ID NO: 238의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 239의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 240의 중쇄 CDR3 영역 e) SEQ ID NO: 243의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 244의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 245의 중쇄 CDR3 영역, f) SEQ ID NO: 243의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 247의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 248의 중쇄 CDR3 영역 및 g) SEQ ID NO: 250의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 251의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 252의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID NO: 254의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 254의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 255의 경쇄 CDR3 영역을 포함하는 중쇄를 포함한다.
특정 구현예에서, 항체는 a) SEQ ID NO: 204의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 205의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 206의 경쇄 CDR3 영역, b), SEQ ID NO: 210의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 211의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 212의 경쇄 CDR3 영역, c) SEQ ID NO: 225의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 173의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 226의 경쇄 CDR3 영역, d) SEQ ID NO: 241의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 173의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 242의 경쇄 CDR3 영역, e) SEQ ID NO: 246의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 173의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 212의 경쇄 CDR3 영역, f) SEQ ID NO: 249의 경쇄 CDR1 영역 SEQ ID NO: 173의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 212의 경쇄 CDR3 영역 및 g) SEQ ID NO: 254의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 254의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 255의 경쇄 CDR3 영역을 포함하는 경쇄를 포함한다.
특정 구현예에서, 항체는 a) SEQ ID NO: 201의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 202의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 203의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID NO: 204의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 205의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 206의 경쇄 CDR3 영역을 포함하는 항체, b) SEQ ID NO: 207의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 208의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 209의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID NO: 210의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 211의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 212의 경쇄 CDR3 영역을 포함하는 항체, c) SEQ ID NO: 222의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 223의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 224의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID NO: 225의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 173의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 226의 경쇄 CDR3 영역을 포함하는 항체, d) SEQ ID NO: 238의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 239의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 240의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID NO: 241의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 173의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 242의 경쇄 CDR3 영역을 포함하는 항체, e) SEQ ID NO: 243의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 244의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 245의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID NO: 246의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 173의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 212의 경쇄 CDR3 영역을 포함하는 항체, f) SEQ ID NO: 243의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 247의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 248의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID NO: 249의 경쇄 CDR1 영역 SEQ ID NO: 173의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 212의 경쇄 CDR3 영역을 포함하는 항체 및 g) SEQ ID NO: 250의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 251의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 252의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID NO: 254의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 254의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 255의 경쇄 CDR3 영역을 포함하는 항체로 구성된 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 115의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, SEQ ID NO: 119의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, SEQ ID NO: 135의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, SEQ ID NO: 147의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, SEQ ID NO: 151의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, SEQ ID NO: 155의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, SEQ ID NO: 159의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 116의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, SEQ ID NO: 120의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, SEQ ID NO: 136의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, SEQ ID NO: 148의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, SEQ ID NO: 152의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, SEQ ID NO: 156의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, SEQ ID NO: 169의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 325 및 SEQ ID NO: 331로 구성된 군으로부터 선택된 펩타이드에 결합한다.
특정 구현예에서, 항체는 382, 458 및 386으로 구성된 군으로부터 선택된 펩타이드에 결합한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 항-타우 항체는 타우 441의 D314, L315 및 K317 또는 L315, K317 및 P312 또는 P59, S61, E62, T63, D65 및 K67을 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 것으로 나타났다.
특정 구현예에서, 상술된 항체의 항원-결합 단편이 제공된다. 항원-결합 단편은 바람직하게는 동일한 에피토프에 결합한다. 본 발명의 항-타우 모노클로날 항체 및 항원-결합 단편은 공지된 인간 항-타우 항체, 예컨대 NI-105.4E4 및 NI-105.4A3의 에피토프에 비해 상이한 에피토프에 결합한다. 상이한 에피토프에 대한 결합은 항체가 공지된 항체에 비해 상이한 결정적 아미노산 잔기에 결합함을 의미한다. 또한 본 발명의 항체는 인산-선택적이 아닌 것으로 나타났다.
특정 구현예에서, 항체는 타우 단백질에 대해 결합하는 다른 항체와의 조합으로 이용되는 경우 상승적으로 작용한다. 본원에서 이용되는 용어 "상승적"은 조합으로 이용되는 경우 항체 또는 항원-결합 단편의 조합된 효과가 개별적으로 이용되는 경우 이들의 부가적 효과에 비해 더 크다는 것을 의미한다. 상승작용의 계산 방식은 조합 지수에 의한다. 조합 지수(CI)의 개념은 Chou 및 Talalay에 의해 설명되었다(Adv Enzyme Regul., 22:27-55, 1984).
특정 구현예에서, 항체 및 항원-결합 단편은 약제로서 이용하기 위한, 바람직하게는 신경퇴화성 질환의 진단적, 치료적 및/또는 예방적 처리에서 이용하기 위한 것이다. 본 발명의 인간 항-타우 항체 또는 Fab, (Fab')2, scFv 단편, 또는 본 발명의 항체의 항원-결합 부위를 포함하는 항체를 포함하는 이들의 단편은 뇌 내에서 타우 또는 병리적 타우의 축적 또는 타우 응집이 관여되는 신경퇴화성 질환을 갖는 환자, 예컨대 AD뿐만 아니라 타우가 과발현될 수 있는 임의의 다른 타우병증 또는 다른 타우-관련 병리를 겪고 있는 환자에서 증상을 치료하거나, 감소시키거나, 예방하기 위해 이용될 수 있다. 임의의 특정 이론에 구애받고자 하지 않고, 본 발명의 항체는 병리적 타우 또는 타우 응집, 이에 따라 뇌에서 PHF-타우의 양 감소 또는 제거에 의해 이들의 유익한 효과를 발휘할 수 있다. 본 발명의 항체는 임의의 분류에 속하는 동물 환자를 치료하기 위해 이용될 수 있다. 이러한 동물의 예에는 포유류, 예컨대 인간, 설치류, 개, 고양이 및 농장 동물이 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 AD 치료용 약제의 제조에서 유용하며, 여기서 약제는 본원에서 정의된 투여량으로 투여를 위해 제조된다.
본 발명의 또 다른 구현예는 환자에게 치료적 유효량의 본 발명의 단리된 항체를 신경퇴화성 질환의 증상을 치료하거나 감소시키기 충분한 시간 동안 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 타우의 응집이 관여되는 신경퇴화성 질환의 증상 치료 또는 감소 방법이다. 본 발명의 또 다른 구현예는 환자에게 치료적 유효량의 본 발명의 단리된 항체를 타우를 감소시키기 충분한 시간 동안 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 환자에서 타우의 감소 방법이다.
임의의 상기 구현예에서, 타우의 응집이 관여되는 신경퇴화성 질환은 타우병증이다. 본원에서 이용되는 "타우병증"은 뇌 내에서 타우의 병리적 응집이 관여되는 임의의 신경퇴화성 질환을 포괄한다. 선천성 및 산발성 AD에 부가하여, 다른 예시적 타우병증은 염색체 17에 연관된 파킨슨증을 갖는 전두측두 치매(FTDP-17), 진행성 핵상 마비, 피질기저 퇴화, 픽 질환, 진행성 피질하 신경아교종, 매듭 전용 치매, 석회화를 포함하는 확산성 신경원섬유 매듭, 은친화성 입자 치매, 근위축 측삭 경화증 파킨슨증-치매 복합, 다운 증후군, 게르스트만-스트라우슬러 샤인커 질환, 할러보르덴-슈파츠 질환, 봉입체 근염, 크로이츠펠트-야콥 질환, 다중 체계 위축, 니만-픽 질환 C형, 프리온 단백질 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 아급성 경화 범뇌염, 근긴장 디스트로피, 신경원섬유 매듭을 포함하는 비가나인 운동 뉴론 질환, 뇌염 후 파킨슨증 및 만성 외상성 뇌병증, 예컨대 권투선수 치매(복싱 질환)이다(Morris, et al. Neuron 70:410-26, 2011).
타우병증-관련된 거동 표현형에는 인지 장애, 초기 성격 변화 및 탈억제, 무관심, 의지상실, 무언증, 행위상실, 고집증, 상동 운동/거동, 과잉구강증, 해체, 순차적 업무의 계획 또는 조직 불능, 이기심/냉담, 반사회적 형질, 공감 부재, 더듬거림, 이해는 비교적 보존되지만 빈번한 착어 오류를 가지는 비문법적 말하기, 이해 장애 및 단어 선택 결핍, 서서히 진행되는 보행 불안정, 후방돌진, 멈춤, 빈번한 넘어짐, 비-레보도파 반응성 축 경축, 핵상 주시 마비, 사각파 경련, 느린 수직 신속운동, 거짓연수 마비, 수족 행위상실, 근긴장이상, 피질 감각 손실 및 경련이 포함된다.
치료를 받아들이는 환자에는 현재 증상을 나타내는 환자뿐만 아니라 AD 또는 다른 타우병증의 위험에 처한 무증상 개인이 포함된다. 치료를 받아들이는 환자에는 공지된 AD의 유전적 위험, 예컨대 AD의 가족력 또는 게놈 내 유전적 위험 인자의 존재를 갖는 개인이 포함된다. 예시적인 위험 인자는 아밀로이드 전구체 단백질(APP), 특히 위치 717 및 위치 670 및 671(각각 하디(Hardy) 및 스웨덴인(Swedish) 돌연변이)에서의 돌연변이이다. 다른 위험 인자는 presenilin 유전자 PS1 및 PS2 및 ApoE4에서의 돌연변이, 고콜레스테롤혈증 또는 죽상경화의 가족력이다. 현재 AD를 겪고 있는 개인은 상술된 위험 인자의 존재에 의해 특징적 치매로부터 인식될 수 있다. 부가적으로, AD를 갖는 개인을 확인하기 위해 여러 진단 평가가 이용 가능하다. 이들에는 뇌척수액 타우 및 Aβ42 수준의 측정이 포함된다. 상승된 타우 및 감소된 AB42 수준은 AD의 존재를 표시한다. AD를 겪는 개인은 AD 및 관련 장애 연관 분류에 의해서도 진단될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예는 환자에게 치료적 유효량의 본 발명의 단리된 항-타우 항체를 타우를 감소시키기 충분한 시간 동안 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 환자에서의 타우의 감소 방법이다. 치료를 받아들이는 환자는 타우의 과발현과 연관된 병을 겪을 수 있다. 인트론 10에서의 돌연변이를 포함하는 일부 돌연변이는 증가된 수준의 기능적으로 정상인 4-반복 타우 단백질 이소형을 유도하여 신경퇴화로 이어진다. 트랜스제닉 마우스에서 뉴론에서의 특이적으로 4-반복 인간 타우 단백질 이소형의 과발현은 뇌 및 척수에서 액손 퇴화의 발생을 야기하였다. 모델에서, 신경필라멘트, 미토콘드리아 및 소포의 축적과 함께 액손 팽창이 보고되었다. 액손병증 및 수반되는 기능이상 감각운동능은 트랜스유전자-투여량에 관련되었다. 이러한 발견은 4-반복 타우 단백질 이소형 농도의 단순 증가가 뉴론내 신경원섬유 매듭의 형성 없이 중추 신경계에서 뉴론을 손상시키기 충분함을 입증하였다(Spittaels, et al, Am J Pathology 155(6) 2153-2165,1999).
투여/약학 조성물
본 발명의 항-타우 항체는 타우의 축적 및/또는 타우의 병리적 응집이 관여되는 신경퇴화성 질환, 예컨대 AD 또는 다른 타우병증 또는 타우-연관 병의 치료 또는 예방을 위한 치료제 및 예방제로서 모두 적합하다. 무증상 환자에서, 치료는 임의의 연령에서 시작될 수 있다(예로, 약 10세, 15세, 20세, 25세, 30세에). 그러나 보통, 환자가 약 40세, 50세, 60세 또는 70세에 도달할 때까지 치료를 시작하는 것은 필요하지 않다. 치료는 전형적으로 일정 시기에 걸쳐 다회 투여량을 수반한다. 치료는 경시적으로 치료제에 대해 항체, 또는 활성화된 T-세포 또는 B-세포 반응을 검정하여 모니터링될 수 있다. 반응이 하락하면, 유발접종 투여량이 시사된다.
예방적 적용에서, 약학 조성물 또는 약제는 AD 또는 타우가 관여되는 다른 병에 감수성이 있거나 다르게는 그러한 위험에 처한 환자에게 질환의 생화학적, 조직학적 및/또는 거동적 증상, 그 합병증 및 질환의 발생 동안 나타나는 중간적인 병리적 표현형을 포함하는 질환의 위험을 제거하거나 감소시키기에, 중증도를 경감시키기에, 또는 개시를 지연시키기에 충분한 양으로 투여된다. 치료적 적용에서, 조성물 또는 약제는 질환의 임의 증상(생화학적, 조직학적 및/또는 거동적)을 감소, 중지 또는 지연시키기에 충분한 양으로, 이러한 질환으로 추정되거나 이미 이를 겪고 있는 환자에게 투여된다. 치료의 투여는 특징적 알츠하이머 병리가 아직 발생하지 않은 환자에서 경증 인지 장애를 감소시키거나 제거할 수 있다. 치료적 또는 예방적 처리를 달성하기 적절한 양은 치료적 또는 예방적 유효 용량으로서 정의된다. 예방적 및 치료적 방식 모두에서, 조성물 또는 약제는 보통 충분한 면역 반응이 달성될 때까지 몇몇 투여량으로 투여된다.
본 발명의 항-타우 항체 또는 이들의 단편은 관련된 신경퇴화성 질환의 치료를 위해 효과적인 다른 제제와의 조합으로 투여될 수 있다. AD의 경우, 본 발명의 항체는 아밀로이드 베타(Aβ)의 침착을 감소시키거나 예방하는 제제와의 조합으로 투여될 수 있다. PHF-타우 및 Aβ 병리는 상승적일 수 있다. 따라서, PHF-타우 및 Aβ-관련 병리 모두의 동시 제거를 표적으로 하는 조합 치료법은 개별적으로 각각 표적화하는 것보다 더 효과적일 수 있다.
파킨슨 질환 및 관련 신경퇴화성 질환의 경우, a-시누클레인 단백질의 명확한 응집된 형태의 면역 조정도 도출되고 있는 치료법이다. 타우 및 α-시누클레인 단백질 모두의 동시 제거를 표적으로 하는 조합 치료법은 개별적으로 어느 하나의 단백질을 표적으로 하는 것보다 더 효과적일 수 있다. 본 발명의 방법에서, 타우병증의 치료 또는 증상 완화에서 항체의 "치료 유효량"은 표준 연구 기법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 항체의 투여량은 당분야에 널리 공지된 관련 동물 모델에 제제를 투여함으로써 결정될 수 있다.
부가적으로, 최적 투여량 범위의 확인을 돕기 위해 시험관내 검정이 선택적으로 채용될 수 있다. 특정한 유효 용량의 선택이 몇몇 인자의 고려에 기반하여 당업자에 의해 결정될 수 있다(예로, 임상 시험을 통해). 이러한 인자에는 치료되거나 예방될 질환, 관여되는 증상, 환자의 체질량, 환자의 면역 상태 및 당업자에게 공지된 다른 인자가 포함된다. 제형에서 채용될 정밀 용량은 또한 투여 경로 및 질환 중증도에 의존할 것이며, 실시자 및 각 환자의 상황 판단에 따라 결정되어야 한다. 유효 용량은 시험관내 또는 동물 모델 평가 시스템에서 유도된 용량-반응 곡선으로부터 외삽될 수 있다. 본 발명의 항체의 치료적 용도를 위한 투여 모드는 숙주에 대해 제제를 전달하는 임의의 적합한 경로일 수 있다. 이들 항체의 약학 조성물은 비경구 투여, 예로 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비강내 또는 두개내 투여를 위해 유용하거나 뇌 또는 척수의 뇌척수액 내로 투여될 수 있다.
본 발명의 항체는 약제학적으로 허용 가능한 담체 중 활성 성분으로서 항체의 유효량을 함유하는 약학 조성물로서 제조될 수 있다. 용어 "담체"는 항체가 함께 투여되는 희석제, 아쥬반트, 부형제, 또는 비히클을 나타낸다. 이러한 약학 비히클은 액체, 예컨대 물 및 석유, 동물, 야채 또는 합성 기원의 오일을 포함하는 오일, 예컨대 땅콩유, 대두유, 미네랄 오일, 참기름 등일 수 있다. 예를 들어, 0.4% 식염수 및 0.3% 글리신이 이용될 수 있다. 이들 용액은 멸균 용액이며, 일반적으로 입자성 물질이 없다. 이들은 통상적인, 널리 공지된 멸균 기법(예로, 여과)에 의해 멸균화될 수 있다. 조성물은 생리 조건에 근사하기 위해 요구되는 약제학적으로 허용 가능한 보조 물질, 예컨대 pH 조정제 및 완충제, 안정화제, 증점제, 윤활제 및 착색제 등을 함유할 수 있다. 이러한 약학 제형에서 본 발명의 항체의 농도는 널리, 즉 약 0.5 중량% 미만, 보통 적어도 약 1 중량%부터 15 중량% 또는 20 중량%까지 크게 널리 변할 수 있고, 일차적으로는 선택된 특정 투여 방식에 따라 요구되는 용량, 유체 부피, 점도 등에 근거하여 선택될 것이다.
치료는 단회 용량 일정으로, 또는 일차 치료 과정이 1회 내지 10회의 별도 용량을 포함할 수 있고, 이어서 반응을 유지하고/하거나 강화시키기 위해 요구되는 후속 시간 간격, 예를 들어 제2 용량에 대해 1개월 내지 4개월에 주어지는 다른 용량 및 필요한 경우 수 개월 후 후속 용량(들)이 뒤따르는 다회 용량 일정으로 주어질 수 있다. 적합한 치료 일정의 예에는 (i) 0개월, 1개월 및 6개월, (ii) 0일, 7일 및 1개월, (iii) 0개월 및 1개월, (iv) 0개월 및 6개월, 또는 질환 증상을 감소시키거나 질환의 중증도를 감소시키기 위해 예상되는 원하는 반응을 야기하기 충분한 다른 일정이 포함된다. 따라서, 근육내 주사를 위한 본 발명의 약학 조성물은 1 ml의 멸균 완충수 및 약 1 ng 내지 약 100 mg, 약 50 ng 내지 약 30 mg 또는 약 5 mg 내지 약 25 mg의 본 발명의 항체를 함유하도록 제조될 수 있다. 유사하게, 정맥내 주입을 위한 본 발명의 약학 조성물은 약 250 ml의 멸균 링거액 및 약 1 mg 내지 약 30 mg 또는 약 5 mg 내지 약 25 mg의 본 발명의 항체를 함유하도록 제조될 수 있다. 비경구적으로 투여 가능한 조성물을 제조하기 위한 실제 방법은 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌["Remington's Pharmaceutical Science", 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA]에 보다 상세히 기재된다.
본 발명의 항체는 보관을 위해 동결건조되고 사용 전에 적합한 담체 중에 재구성될 수 있다. 상기 기법은 항체 및 다른 단백질 제조물에 효과적인 것으로 나타났으며, 당분야에 공지된 동결건조 및 재구성 기법이 채용될 수 있다.
진단 방법 및 키트
본 발명의 항체는 대상체에서 AD 또는 다른 타우병증의 진단 방법에서 이용될 수 있다. 상기 방법에는 대상체에서 진단 시약, 예컨대 본 발명의 항체 또는 이들의 단편을 이용하여 타우의 존재를 검출하는 단계가 관여된다. 타우는 생물학적 샘플과 진단 항체 시약을 접촉시키고, 대상체로부터의 샘플에서 PHF-타우에 대한 진단 항체 시약의 결합을 검출함으로써 대상체로부터의 생물학적 샘플(예로, 혈액, 소변, 뇌척수액)에서 검출될 수 있다. 검출을 수행하기 위한 검정에는 널리 공지된 방법, 예컨대 ELISA, 면역조직화학, 웨스턴 블롯, 또는 생체내 조영이 포함된다. 예시적인 진단 항체는 본 발명의 항체 CBTAU-27.1 CBTAU-28.1, CBTAU-43.1, CBTAU-46.1, CBTAU-47.1, CBTAU-47.2 및 CBTAU-49.1이며, IgGl, K 유형의 것이다.
진단 항체 또는 유사한 시약은 환자의 체내로의 정맥 주사에 의해 또는 상기 예시된 바와 같이 숙주에 대해 제제를 전달하는 임의의 적합한 경로에 의해 뇌 내로 직접 투여될 수 있다. 항체의 투여량은 치료 방법을 위한 것과 동일한 범위 내에 있어야 한다. 일부 방법에서는 타우에 대한 친화도를 갖는 일차 항체가 표지되지 않으며 이차 표지 제제가 일차 항체에 결합하기 위해 이용되지만, 전형적으로는 항체가 표지된다. 표지의 선택은 검출 수단에 의존한다. 예를 들어, 형광 표지는 광학 검출을 위해 적합하다. 상자성 표지의 이용이 수술적 개입 없이 단층촬영 검출을 위해 적합하다. 방사활성 표지는 또한 PET 또는 SPECT를 이용하여 검출될 수 있다.
진단은 대상체로부터의 샘플 중 또는 대상체 중 표지된 타우, 타우 축적, 타우 응집물 및/또는 신경원섬유 매듭의 수, 크기 및/또는 강도를 해당하는 기준선 값과 비교함으로써 수행된다. 기준선 값은 무질환 개인의 모집단에서의 평균 수준을 나타낼 수 있다. 기준선 값은 또한 동일한 대상체에서 결정된 이전 수준을 나타낼 수 있다.
상술된 진단 방법은 또한 치료 이전, 동안 또는 이후, 대상체에서 타우의 존재를 검출함으로써 치료법에 대한 대상체의 반응을 모니터링하기 위해 이용될 수 있다. 기준선 대비 값의 변화는 치료에 대한 반응을 표시한다. 값은 또한 병리적 타우가 뇌로부터 제거됨에 따라 생물학적 유체에서 일시적으로 변할 수 있다.
본 발명은 추가로 상술된 진단을 수행하고 방법을 모니터링하기 위한 키트에 대한 것이다. 전형적으로, 이러한 키트는 진단 시약, 예컨대 본 발명의 항체 및 선택적으로 검출 가능한 표지를 함유한다. 진단 항체 자체는 직접 검출 가능하거나 이차 반응(예로, 스트렙타비딘과의 반응)을 통해 검출 가능한 검출 가능한 표지(예로, 형광 분자, 바이오틴 등)를 함유할 수 있다. 대안적으로, 검출 가능한 표지를 함유하는 제2 시약이 이용될 수 있고, 여기서 제2 시약은 일차 항체에 대한 결합 특이성을 갖는다. 생물학적 샘플에서 타우를 측정하기에 적합한 진단 키트에서, 키트의 항체는 고상, 예컨대 마이크로타이터 디쉬의 웰에 사전 결합되어 공급될 수 있다.
본 출원을 통해 인용된 모든 인용된 참조(문헌 참조, 허여된 특허, 공개된 특허 출원 및 공동-계류 중인 특허 출원 포함)의 내용은 본원에 참조로서 명시적으로 포함된다.
실시예
실시예 1
타우 펩타이드 설계 및 표지
미세소관 방출을 일으키고 탈중합을 야기하는 타우 단백질의 고인산화는 알츠하이머병(AD) 및 다른 관련된 타우병증에서 일어나는 병리적 지표이다. 자유 타우의 미세소관-결합된 타우로의 평형은 전자를 선호하여 이동하므로, 연합되지 않은 타우 단백질은 미스폴딩된 응집 상태로 축적되는 것으로 여겨진다. 질환 과정 동안, 타우는 다양한 입체형태를 채택하여 가용성 이량체 및 올리고머 형태로부터 더 고차의 불용성 응집물, 예컨대 페어링된 나선형 필라멘트(PHFs) 및 신경원섬유 매듭(NFTs)으로 진행되는 것으로 여겨진다. 그러나 병리에 기여하여 치료 표적화를 위해 최적인 타우의 정확한 형태는 알려지지 않고 남아있다. 결과적으로, 질환-촉진 타우를 표적화하기 위한 시도는 종종 표적의 선택에 의해 제한된다. 신규한 항-타우 결합 분자를 제조하기 위한 시도에서, 타우에 대한 항체 가변 영역을 단세포 기반 접근을 이용해서 미끼 항원으로서 인산화된 및 인산화되지 않은 타우 펩타이드를 이용하여 인간 기억 B-세포로부터 회수하였다.
타우에 대한 인간 기억 B-세포는 인간 레퍼토피에서 드물 수 있다; 따라서, 본 발명자들은 가장 밝은 형광단으로 타우 미끼를 표지하기로 결정하였다. 모든 타우 펩타이드는 2개의 밝은 형광단, 스트렙타비딘-APC 또는 스트렙타비딘-PE(즉, 사량체로서의 타우 펩타이드)를 이용한 표지를 보조하기 위해 아미노-말단 바이오틴기를 가지고 합성하였다. 각각의 타우 펩타이드는 공여체 샘플로부터 인간 기억 B-세포(실시예 2에 상세히 나타냄)의 스크리닝 동안 노이즈 대비 신호를 증가시키기 위해 두 형광단 모두로 표지하였다. 펩타이드 대 스트렙타비딘 표지의 35:1의 몰비로 바이오틴화된 펩타이드를 온화하게 혼합하며 4℃에서 하룻밤 동안 혼합하여 표지된 타우 펩타이드 사량체를 제조하였다. 자유 펩타이드는 BioSpin 30 컬럼(Biorad)에 걸쳐 분리에 의해 제거하였다. 모든 타우 펩타이드 사량체는 최대 2개월 동안 4℃에서 보관하였다.
실시예 2
표지된 펩타이드 사량체를 이용한 FAC 정렬에 의한 항- 타우 특이적 기억 B-세포의 회수
샌디에고 혈액 은행 및 TSRI 정상 혈액 공여체 서비스로부터 수득된 추정되는 무증상(비-AD) 인간 혈액 공여체로부터 수득된 말초혈 단핵구(PBMC)로부터 단리된 기억 B-세포(CD22+CD19+CD27+IgG+)로부터 타우에 대한 모노클로날 항체를 회수하였다. 부가하여, AD 환자 혈액 샘플을 CRO, Quintiles를 통해 수득하였고, 이로부터 본원에서 상세히 나타낸 3개 항체를 회수하였다. PBMC를 Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare) 상에서 단리하고 90% FBS 및 10% DMSO 중 1 ml 당 5,000만 개 세포씩 냉동보존하였다. 혈장 분취량을 56℃에서 열 불활성화하고 혈장 반응성의 하류 평가를 위해 -20℃에서 보관하였다.
각각의 정렬 실험을 위해, 3명 내지 4명의 공여체로부터 PBMC를 해동하고 사전 가온된 완전 RPMI(RPMI, 10% 열 불활성화된 FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신)를 함유하는 튜브로 옮기고, 세척하고, 16 hr 동안 37℃에서 별도로 인큐베이션하였다. 풀링된 PBMC를 CD22+ 자성 비드(Miltenyi Biotec)를 이용한 양성 선택에 의해 성숙 B-세포에 대해 농축하였다. 세포를 2 mM EDTA 및 0.25% 소 혈청 알부민 분획 V(TBS 완충액)를 함유하는 Tris-완충 식염수 pH 7.4 중에 재현탁하였다. 세포를 세포외 마커 IgG-FITC, CD19-PerCPCy5.5 및 CD27-PECy7(모두 BD Biosciences)로 염색하여 B-세포를 표지하였다. 1,000만 개 세포를 제거하고, 음성 대조군으로서 바이오틴 스트렙타비딘 표지된 콘주게이트를 이용하였다. 잔여 세포를 각각 16.8 nM로 10개의 이중 표지된 타우 펩타이드 사량체(SA-APC 및 SA-PE) 풀과 인큐베이션하였다. 세포를 온화한 혼합과 함께 4℃에서 60분 동안 인큐베이션하고, 2회 세척하고, TBS 완충액 중 1 ml 당 2,000만 개 세포씩 재현탁하였다. 정렬 전에, DAPI(Thermo Fisher)를 살아있는 세포 마커로서 첨가하고, 세포를 Beckman Coulter MoFlo XDP 상에서 정렬하였다. 음성 대조군 샘플을 이용해서 비특이적 결합 및 신호-대-노이즈의 비를 결정하였다. CD19+, IgG+, CD27hi 및 항원 이중-양성 세포를 수집하고 96-웰 PCR 플레이트의 개별 웰 내로 침착시키고, -80℃에서 보관하였다.
실시예 3
타우 -특이적 단일 B-세포로부터의 중쇄 및 경쇄 유전자의 회수
실시예 2에 상세히 나타낸 바와 같이, 타우 펩타이드 사량체에 대해 반응성을 갖는 기억 B-세포를 확인하고, 단리하고, 개별 마이크로타이터 웰 내로 정렬하였다. 이어서 중쇄 및 경쇄 cDNA를 개별 B-세포로부터 2단계 PCR 접근에 의해 회수하고, 가변 도메인 서열을 클로닝하고 전장 재조합 IgG1 항체로서 시험관내 발현시켰으며, 이에 따라 인간 키메라 항체이다.
제1쇄 cDNA 합성
제1쇄 상보성 DNA(cDNA)를 다음 개질을 포함하여 제조업체의 프로토콜(Superscript III, Invitrogen Corp.)에 따라 단일 정렬 세포로부터 생성하였다: 단일 B-세포를 함유하는 각 웰에 0.5 ㎕의 10% NP-40, 1.0 ㎕의 올리고 dT, 1.0 ㎕의 dNTP를 첨가하고, 샘플을 5분 동안 65℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 샘플을 1분 동안 얼음 상에 두었다. 이어서 2.0 ㎕의 DTT, 4.0 ㎕의 MgCl2, 1.0 ㎕의 SuperScript RT 및 0.5 ㎕의 RNaseOut을 각 웰에 첨가하였다. 샘플을 50분 동안 50℃에서 인큐베이션한 뒤 5분 동안 85℃에서 인큐베이션하였다.
단계 I 증폭
최초 PCR(단계 I)을 위해, 2.5 ㎕의 cDNA 제조물을 주형으로 이용하여 중쇄 및 카파 또는 람다 경쇄를 증폭하였다. 항체 중쇄(CB-5'LVH 프라이머, 표 1), 카파 경쇄(CB-5'LVk 프라이머, 표 2) 및 람다 경쇄(CB-5' LVlam 프라이머, 표 3)의 리더 영역에 특이적인 프라이머 풀을 이용하였다. 중쇄, 카파 경쇄 및 람다 경쇄 각각의 CH1 영역, CK 및 CL 영역에 특이적인 단일 후방 프라이머를 단계 I PCR 반응에서 이용하였다.
VH 단계 I 전방 프라이머
프라이머 ID DNA 서열(5'-3') SEQ ID NO: 　
CB-5'LVH1a ATGGACTGGACCTGGAGGTTCCTC 7
CB-5'LVH1b ATGGACTGGACCTGGAGGATCCTC 8
CB-5'LVH1c ATGGACTGGACCTGGAGGGTCTTC 9
CB-5'LVH1d ATGGACTGGACCTGGAGCATCC 10
CB-5'LVH2 GGACATACTTTGTTCCACGCTCCTGC 11
CB-5'LVH3a AGGTGTCCAGTGTCAGGTGCAGC 12
CB-5'LVH3b AGGTGTCCAGTGTGAGGTGCAGC 13
CB-5'LVH3c AGGTGTCCAGTGTCAGGTACAGC 14
CB-5'LVH4 GCAGCTCCCAGATGGGTCCTG 15
CB-5'LVH5 TCAACCGCCATCCTCGCCCTC 16
CB-5'LVH6 GTCTGTCTCCTTCCTCATCTTCCTGC 17
3'CgCH1 GGAAGGTGTGCACGCCGCTGGTC 18
VK 단계 I 전방 프라이머
프라이머 ID DNA 서열(5'-3') SEQ ID NO:
CB-5'LVk1a ATGAGGGTCCCCGCTCAGCTC 19
CB-5'LVk1b ATGAGGGTCCCTGCTCAGCTC 20
CB-5'LVk1c ATGAGAGTCCTCGCTCAGCTC 21
CB-5'LVk2 TGGGGCTGCTAATGCTCTGG 22
CB-5'LVk3 CCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAG 23
CB-5'LVk4 TCTCTGTTGCTCTGGATCTCTGGTGC 24
CB-5'LVk5 CTCCTCAGCTTCCTCCTCCTTTGG 25
CB-5'LVk6 AACTCATTGGGTTTCTGCTGCTCTGG 26
3'Ck-Rev543 GTTTCTCGTAGTCTGCTTTGCTCAGC 27
3'Ck-Rev494 GTGCTGTCCTTGCTGTCCTGCTC 28
3'Ck-Rev GCACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTTG 29
VL 단계 I 전방 프라이머 (5'-3')
프라이머 ID DNA 서열(5'-3') SEQ ID NO:
CB-5' L Vlam1 CTCCTCGCTCACTGCACAGG 30
CB-5' L Vlam2 CTCCTCTCTCACTGCACAGG 31
CB-5' L Vlam3 CTCCTCACTCGGGACACAGG 32
CB-5' L Vlam4 ATGGCCTGGACCCCTCTCTG 33
CB-5' L Vlam5 ATGGCATGGATCCCTCTCTTCCTC 34
3'Cl-Rev CACTAGTGTGGCCTTGTTGGCTTG 35
단계 II 증폭
단계 II를 위해, 2.5 ㎕의 단계 I PCR 산물을 주형으로 이용하여 중쇄 및 카파 또는 람다 경쇄 가변 영역을 증폭하였다. 항체 중쇄(pCB-IgG-VH 및 3'SalIJH 프라이머, 표 4), 카파 경쇄(pCB-IgG-VK 및 3'Jk 프라이머, 표 5) 및 람다 경쇄(CB-VL 및 3'Clam-단계 II 프라이머, 표 6)의 프레임워크 1 영역에 특이적으로 설계된 전방 및 후방 프라이머 풀을 이용하여 가변 영역으로부터 DNA를 제조하였다. 또한, 단계 II 프라이머를 설계하여 하류 클로닝을 위해 XbaI(VK 및 VL 전방 프라이머) 및 XhoI(3'SalIJH 프라이머) 제한 부위를 도입하였다. 단계 II 증폭 반응 이후, 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 PCR 산물을 1% 아가로오스 겔 상에 걸었다. 중쇄 및 경쇄 가변 영역 단편을 제조업체의 프로토콜(Qiagen)에 따라 정제하고, 단계 III PCR 반응에서 이용하였다.
VH 단계 II 전방 및 후방 프라이머
프라이머 ID DNA 서열(5'-3') SEQ ID NO:
pCB-IgG-VH1a CCTGTCTGGAATTCAGCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTC 36
pCB-IgG-VH1b CCTGTCTGGAATTCAGCATGGCCCAGGTCCAGCTGGTGCAGTC 37
pCB-IgG-VH1c CCTGTCTGGAATTCAGCATGGCCCAGGTTCAGCTGGTGCAGTC 38
pCB-IgG-VH1d CCTGTCTGGAATTCAGCATGGCCCAGGTCCAGCTTGTGCAGTC 39
pCB-IgG-VH2a CCTGTCTGGAATTCAGCATGGCCCAGGTCACCTTGAGGGAGTCTGG 40
pCB-IgG-VH2b CCTGTCTGGAATTCAGCATGGCCCAGGTCACCTTGAAGGAGTCTGG 41
pCB-IgG-VH3a CCTGTCTGGAATTCAGCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGGAGTC 42
pCB-IgG-VH3b CCTGTCTGGAATTCAGCATGGCCGAGGTGCAGCTGTTGGAGTC 43
pCB-IgG-VH3c CCTGTCTGGAATTCAGCATGGCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTC 44
pCB-IgG-VH3d CCTGTCTGGAATTCAGCATGGCCCAGGTACAGCTGGTGGAGTCTG 45
pCB-IgG-VH4a CCTGTCTGGAATTCAGCATGGCCCAGSTGCAGCTGCAGGAG 46
pCB-IgG-VH4b CCTGTCTGGAATTCAGCATGGCCCAGGTGCAGCTACAGCAGTGG 47
pCB-IgG-VH5 CCTGTCTGGAATTCAGCATGGCCGAGGTGCAGCTGGTGCAGTC 48
pCB-IgG-VH6 CCTGTCTGGAATTCAGCATGGCCCAGGTACAGCTGCAGCAGTCAG 49
pCB-IgG-VH7 CCTGTCTGGAATTCAGCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGCAATCTG 50
3'SalIJH 1/2/4/5 TCGGGCCTCGAGACTCACCTGAGGAGACGGTGACCAG 51
3'SalIJH3 TCGGGCCTCGAGACTCACCTGAAGAGACGGTGACCATTG 52
3'SalIJH6 TCGGGCCTCGAGACTCACCTGAGGAGACGGTGACCGTG 53
VK 단계 II 전방 및 후방 프라이머
프라이머 ID DNA 서열(5'-3') SEQ ID NO:
pCB-IgG-VK1a CCGGTCTAGAGTTTTCCATGGCGGACATCCAGATGACCCAGTCTCC 54
pCB-IgG-VK1b CCGGTCTAGAGTTTTCCATGGCGGACATCCAGTTGACCCAGTCTCC 55
pCB-IgG-VK1c CCGGTCTAGAGTTTTCCATGGCGGCCATCCAGTTGACCCAGTCTCC 56
pCB-IgG-VK2a CCGGTCTAGAGTTTTCCATGGCGGATRTTGTGATGACTCAGTCTCCACTC 57
pCB-IgG-VK3a CCGGTCTAGAGTTTTCCATGGCGGAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAG 58
pCB-IgG-VK3b CCGGTCTAGAGTTTTCCATGGCGGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAG 59
pCB-IgG-VK3c CCGGTCTAGAGTTTTCCATGGCGGAAATAGTGATGACGCAGTCTCCAG 60
pCB-IgG-VK4 CCGGTCTAGAGTTTTCCATGGCGGACATCGTGATGACCCAGTCTCC 61
pCB-IgG-VK5 CCGGTCTAGAGTTTTCCATGGCGGAAACGACACTCACGCAGTCTCC 62
pCB-IgG-VK6 CCGGTCTAGAGTTTTCCATGGCGGAAATTGTGCTGACTCAGTCTCCAG 63
3'Jk1 Rev Ila CGCAAAGTGCACTTACGTTTGATTTCCACCTTGGTCCCTTGGC 64
3'Jk2 Rev Iib CGCAAAGTGCACTTACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCCCTGGC 65
3'Jk4 Rev Ilc CGCAAAGTGCACTTACGTTTGATATCCACTTTGGTCCCAGGGC 66
3'Jk3 Rev Ilc CGCAAAGTGCACTTACGTTTGATCTCCACCTTGGTCCCTCCGC 67
3'Jk5 Rev Ild CGCAAAGTGCACTTACGTTTAATCTCCAGTCGTGTCCCTTGGC 68
VL 단계 II 전방 및 후방 프라이머
프라이머 ID DNA 서열(5'-3') SEQ ID NO:
CB-VL1 CCGGTCTAGAGTTTTCCATGGCGAATTTTATGCTGACTCAGCCCCACTC 69
CB-VL2 CCGGTCTAGAGTTTTCCATGGCGTCCTATGTGCTGACTCAGCC 70
CB-VL3 CCGGTCTAGAGTTTTCCATGGCGCAGTCTGTGCTGACGCAGCC 71
CB-VL4 CCGGTCTAGAGTTTTCCATGGCGCAGTCTGTCGTGACGCAGCC 72
CB-VL5 CCGGTCTAGAGTTTTCCATGGCGCAGTCTGCCCTGACTCAGCC 73
CB-VL6 CCGGTCTAGAGTTTTCCATGGCGTCTTCTGAGCTGACTCAGGACC 74
CB-VL7 CCGGTCTAGAGTTTTCCATGGCGTCCTATGAGCTGACTCAGCCACC 75
3'Clam-단계 II CTCAGAGGAGGGYGGGAACAGAGTGAC 76
단계 III 증폭: 중복 연장 PCR
단계 III을 위해, 단계 II에서 제조된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 DNA 단편을 1) 경쇄 단계 II 단편의 3' 말단 및 중쇄 단계 II 단편의 5' 말단을 어닐링하고 카파 또는 람다 불변 영역을 함유하는 카파 링커 또는 람다 링커(아래의 링커 제조 방법 참고), 2) XbaI 제한 부위를 함유하는 전방 중복 프라이머 및 3) XhoI 제한 부위를 함유하는 후방 프라이머를 이용해서 중복 연장 PCR을 통해 단일 카세트 내로 연결하였다. 상기 반응은 경쇄 가변 영역, 링커 및 중쇄 가변 영역으로 구성되는 카파 또는 람다 사슬 각각에 대해 대략 2400 bp 또는 2200 bp 앰플리콘(즉, 카세트)을 일으킨다. 증폭 후, 중복 연장 PCR 반응 산물을 제조업체의 지침(Qiagen PCR 정제 키트)에 따라 PCR-정제하였다.
링커 제조
내부 생성하고 주형으로서 중쇄 및 경쇄 유전자를 모두 발현하기 위해 이용된 이중-CMV 프로모터 벡터, pCB-IgG 및 표 7에 기재된 프라이머를 이용해서 링커 단편을 증폭하였다. 링커 단편은 카파 또는 람다 링커 각각에 대해 1765 또는 1536 염기쌍 길이이다. 카파 링커는 5'부터 3'으로 인트론 서열에 이어 카파 불변 영역, 폴리(A) 종결 서열 및 재조합 항체의 1 벡터 발현을 허용하는 사이토메갈로바이러스 프로모터 서열을 함유한다. 람다 링커는 람다 불변 영역, 폴리(A) 종결 서열 및 사이토메갈로바이러스 프로모터 서열을 함유한다. 공통 후방 프라이머(링커_VH_HAVT20_pCB-IgG-R) 및 카파-특이적 전방 프라이머(링커_CK_인트론_pCB-IgG-F)를 이용하였다(표 7). 증폭된 단편을 1% 아가로오스 겔 상에서 분리하고, 제조업체의 프로토콜(Qiagen 겔 추출 키트)에 따라 정제하였다.
링커 및 중복 프라이머
프라이머 ID 서열(5'-3') SEQ ID NO:
링커_VH_HAVT20_pCB-IgG-R GGCCATGCTGAATTCCAGACAGG 78
링커_CK_인트론_pCB-IgG-F AAACGTAAGTGCACTTTGCGGCCGCTAGG 79
링커_CL_인트론_pCB-IgG-F_opt ACTCTGTTCCCRCCCTCCTCTGAGG 80
pCB-중복 F CCGGTCTAGAGTTTTCCATGGCG 81
pCB-중복 R TCGGGCCTCGAGACTCACC 82
포유류 발현 벡터 내로의 클로닝
중복 연장 PCR 산물의 정제 후, 단편을 XhoI 및 XbaI로 소화시킨 뒤 1% 아가로오스 겔 상에서 분리하였다. 중복 카세트(약 2.4 kb)에 해당하는 밴드를 정제하고 IgG1 발현 벡터, pCB-IgG 내로 결찰하였다. 항체 가변 유전자를 상기 벡터 내로 서브클로닝하고 항체를 이들의 원래(원상태) 이소형과 무관하게 IgG1로서 재조합적으로 발현시켰다(IgG1 중쇄 불변 영역 아미노산 서열의 예를 SEQ ID NO: 83에 나타내고, 경쇄 카파 불변 영역 아미노산 서열을 SEQ ID NO: 84에 나타낸다). 모든 형질전환을 DH5a Max Efficiency 세포(Invitrogen Corp.)를 이용해서 수행하고 37℃에서 1 hr 동안 250 ㎕의 SOC 중에 회수하였다. 대략 100 ㎕의 회수된 세포를 20 mM 글루코오스가 보강된 카베니실린 플레이트 상에 플레이팅하였다. 플레이트를 37℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하여 콜로니 성장을 허용하였다. 나머지 회수된 세포 혼합물을 50 ㎍/ml의 카베니실린이 보강된 4 ml의 Super Broth(SB) 배지로 배양하고 250 rpm에서 진탕하면서 37℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 다음 날, 플레이트 당 5개 콜로니를 골라서 37℃에서 하룻밤 동안 50 ㎍/ml의 카베니실린이 보강된 3 ml의 SB 배지 중에 성장시켰다. 하룻밤 배양물을 DNA 플라스미드 제조(Qiagen)를 위해 이용하였다.
실시예 4
항체 서열분석, 생식계열 동정 및 전달감염 상청액 중 항- 타우 펩타이드 반응성의 확인
IgG1을 발현하기 위해, 상기 언급된 4 ml 배양물의 DNA 플라스미드 미니프렙을 제조하고(Qiagen) 제조업체의 지침(Invitrogen, Corp.)에 따라 ExpiFectamine을 이용하여 293Expi 세포를 전달감염시켰다. 충분한 Ig1G 발현을 허용하기 위해 10 ml 배양에서 최소 72 hr 동안 전달감염을 수행하였다. 세포 배지를 전달감염 후 수확하고 원심분리하여 세포 및 파편을 제거하였다. Octet Red 시스템(ForteBio) 상에서 단백질 A 센서 팁을 이용하여 상청액을 정량하였다. 이후 각각의 상청액을 항-타우 반응성 항체의 존재를 확인하기 위해 미끼 펩타이드로 ELISA에 의해 평가하였다. 실시예 3에서 4개의 개별 선택된 배양물로부터 플라스미드 미니프렙 DNA(Qiagen)를 제조하고, 중쇄 및 경쇄를 프라이머 pC9_seq_HC-R(5'CATGTCACCGGGGTGTGG3')(SEQ ID NO: 85) 및 pC9_seq_LC-R(5'TCACAGGGGATGTTAGGGACA3')(SEQ ID NO: 86)로 서열분석하였다. 4개 중 하나의 클론을 후속 실험을 위해 선택하였다.
항체 클론 CBTAU-7.1(SEQ ID NO: 87, 88, 89, 90), CBTAU-8.1(SEQ ID NO: 91, 92, 93, 94), CBTAU-16.1(SEQ ID NO: 95, 96, 97, 98), CBTAU-18.1(SEQ ID NO: 99, 100, 101, 102), CBTAU-20.1(SEQ ID NO: 103, 104, 105, 106), CBTAU-22.1(SEQ ID NO: 107, 108, 109, 110), CBTAU-24.1(SEQ ID NO: 111, 112, 113, 114), CBTAU-27.1(SEQ ID NO: 115, 116, 117, 118,), CBTAU-28.1(SEQ ID NO: 119, 120, 121, 122), CBTAU-41.1(SEQ ID NO: 123, 124, 125, 126), CBTAU-41.2(SEQ ID NO: 127, 128, 129, 130), CBTAU-42.1(SEQ ID NO: 131, 132, 133, 134), CBTAU-43.1(SEQ ID NO: 135, 136, 137, 138), CBTAU-44.1(SEQ ID NO: 139, 140, 141, 142), CBTAU-45.1(SEQ ID NO: 143, 144, 145, 146), CBTAU-46.1(SEQ ID NO: 147, 148, 149, 150), CBTAU-47.1(SEQ ID NO: 151, 152, 153, 154), CBTAU-47.2(SEQ ID NO: 155, 156, 157, 158) 및 CBTAU-49.1(SEQ ID NO: 159, 160, 161, 162)의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 단백질 및 핵산 서열은 선택된 항-타우 항체에 대한 신규한 CDR을 정의한다(표 8).
SEQ ID NO: 87의 VH 및 SEQ ID NO: 88의 VL 및 인간 IgG1 불변 영역을 포함하는 항-타우 항체 CBTAU-7.1을 생성하였다. SEQ ID NO: 91의 VH 및 SEQ ID NO: 92의 VL 및 인간 IgG1 불변 영역을 포함하는 항-타우 항체 CBTAU-8.1을 생성하였다. SEQ ID NO: 95의 VH 및 SEQ ID NO: 96의 VL 및 인간 IgG1 불변 영역을 포함하는 항-타우 항체 CBTAU-16.1을 생성하였다. SEQ ID NO: 99의 VH 및 SEQ ID NO: 100의 VL 및 인간 IgG1 불변 영역을 포함하는 항-타우 항체 CBTAU-18.1을 생성하였다. SEQ ID NO: 103의 VH 및 SEQ ID NO: 104의 VL 및 인간 IgG1 불변 영역을 포함하는 항-타우 항체 CBTAU-20.1을 생성하였다. SEQ ID NO: 107의 VH 및 SEQ ID NO: 108의 VL 및 인간 IgG1 불변 영역을 포함하는 항-타우 항체 CBTAU-22.1을 생성하였다. SEQ ID NO: 111의 VH 및 SEQ ID NO: 112의 VL 및 인간 IgG1 불변 영역을 포함하는 항-타우 항체 CBTAU-24.1을 생성하였다. SEQ ID NO: 115의 VH 및 SEQ ID NO: 116의 VL 및 인간 IgG1 불변 영역을 포함하는 항-타우 항체 CBTAU-27.1을 생성하였다. SEQ ID NO: 119의 VH 및 SEQ ID NO: 120의 VL 및 인간 IgG1 불변 영역을 포함하는 항-타우 항체 CBTAU 28.1을 생성하였다. SEQ ID NO: 123의 VH 및 SEQ ID NO: 124의 VL 및 인간 IgG1 불변 영역을 포함하는 항-타우 항체 CBTAU-41.1을 생성하였다. SEQ ID NO: 127의 VH 및 SEQ ID NO: 128의 VL 및 인간 IgG1 불변 영역을 포함하는 항-타우 항체 CBTAU-41.2를 생성하였다. SEQ ID NO: 131의 VH 및 SEQ ID NO: 132의 VL 및 인간 IgG1 불변 영역을 포함하는 항-타우 항체 CBTAU-42.1을 생성하였다. SEQ ID NO: 135의 VH 및 SEQ ID NO: 136의 VL 및 인간 IgG1 불변 영역을 포함하는 항-타우 항체 CBTAU 43.1을 생성하였다. SEQ ID NO: 139의 VH 및 SEQ ID NO: 140의 VL 및 인간 IgG1 불변 영역을 포함하는 항-타우 항체 CBTAU 44.1을 생성하였다. SEQ ID NO: 143의 VH 및 SEQ ID NO: 144의 VL 및 인간 IgG1 불변 영역을 포함하는 항-타우 항체 CBTAU 45.1을 생성하였다. SEQ ID NO: 147의 VH 및 SEQ ID NO: 148의 VL 및 인간 IgG1 불변 영역을 포함하는 항-타우 항체 CBTAU 46.1을 생성하였다. SEQ ID NO: 151의 VH 및 SEQ ID NO: 152의 VL 및 인간 IgG1 불변 영역을 포함하는 항-타우 항체 CBTAU 47.1을 생성하였다. SEQ ID NO: 155의 VH 및 SEQ ID NO: 156의 VL 및 인간 IgG1 불변 영역을 포함하는 항-타우 항체 CBTAU 47.2를 생성하였다. SEQ ID NO: 159의 VH 및 SEQ ID NO: 160의 VL 및 인간 IgG1 불변 영역을 포함하는 항-타우 항체 CBTAU 49.1을 생성하였다.
중쇄 및 경쇄 가변 영역 CDR의 아미노산 서열
클론 타우 aa 영역 CDR1
(SEQ ID NO: )		 CDR2
(SEQ ID NO: )		 CDR3
(SEQ ID NO: )
CBTAU 7.1
 194 내지 212 SYWMH
(163)		 RINSDGSDTNYADSVKG
(164)		 GRSYGFFDY
(165)
RASQIISSNYLA
(166)		 GASSRAT
(167)		 QQYGTSPRT
(168)
CBTAU 8.1 194 내지 212 TYGMH
(169)		 VIWFDGNNKYYADSVKG
(170)		 DWWEAGCRPCYFFDY
(171)
KSSQSVLYSSNNKNYLA(172) WASTRES
(173)		 QQYYSPPLT
(174)
CBTAU 16.1 204 내지 221 DYWMS
(175)		 NINQDGSAAYYVDSVRG
(176)		 DAHYYDRNRNNYYYYFDF
(177)
RASQSVGANLA
(178)		 SASTRAT
(179)		 QQYNNWPRT
(180)
CBTAU 18.1 200 내지 217 SGNYYWS
(181)		 RMSSSGSTNYNPSLKS
(182)		 ESGSSWQNHYYYYGMDV
(183
KSSQSVLYSSNNKNYLA(172) WASTRES
(173)		 QQYYSTPLT
(184)
CBTAU 20.1 58 내지 78 NYAMS
(185)		 GISSDGNTFYADSVKG
(186)		 ESGRWGGGTLYGAHY
(187)
KSSQSLLYNSNNKNYLT(188) WASTRES
(173)		 QQYYSSPLT
(189)
CBTAU 22.1 406 내지 429 DYNVH
(190)		 RISPNSGGTKYAQKFQG
(191)		 GHCDGTTCSRAY
(192)
RSSQSLLHRSGHKYLH
(193)		 LGSNRAS
(194)		 MQTLQTPWT
(195)
CBTAU 24.1 221 내지 245 GYYLH
(196)		 WVNPRSGGTSYPPKFQG
(197)		 GRIPDVTAFDI
(198)
KSSESLLYDSNNKNYLA(199) WASTRES
(173)		 QQYFSTPWT
(200)
CBTAU 27.1 299 내지 328 DYWTA
(201)		 IIYSGDSDTRYHPSVQG(202) LDARVDAGWQLDS
(203)
KSSQSVFSRDNNKNYLA(204) WASSRES
(205)		 QHYFNTPHN
(206)
CBTAU 28.1 52 내지 71 NYWIG
(207)		 IIYPGDSDTRYSPPFQG
(208)		 VGRPSKGGWFDP
(209)
ESSQTLLYSSNEKNYLA
(210)		 WASTPES
(211)		 QQYYNSPYT
(212)
CBTAU 41.1 406 내지 429 DSYMS
(213)		 YISRSSSHTNYADSVKG
(214)		 VQTTMIEGKTKLNYFDY
(215)
ESSHSLLYRSNNRNYLA
(216)		 WASTRES
(173)		 QQFYTTPYT
(217)
CBTAU 41.2 406 내지 429 DSYMS
(213)		 YISRSSSHTNYADSVKG
(214)		 VQTTMIEGKTKLNYFDY
(215)
ESSHSLLYRSNNKNYLA
(218)		 WASTRES
(173)		 QQFYTTPYT
(217)
CBTAU 42.1 406 내지 429 KAWMS
(219)		 RIKSKVDGETTDYAAPVRG(220) LIHCDLSACLPHF
(221)
ESSHSLLYRSNNKNYLA
(218)		 WASTRES
(173)		 QQFYTTPYT
(217)
CBTAU 43.1 299 내지 328 NYWIA
(222)		 IIYPGDSDTTYSPSFQG
(223)		 LPRTDGDNSIGYFEY
(224)
KSSQSVLYSSNSENYLA
(225)		 WASTRES
(173)		 QQYYSTPFT
(226)
CBTAU 44.1 406 내지 429 SYSMN
(227)		 YISSSTTTIYYADSVKG
(228)		 VPAPRLGGSYTY
(229)
RASQSVSSSYLA
(230)		 GASSRAT
(167)		 QQYGTSPLT
(231)
CBTAU 45.1 406 내지 429 DAWMS
(232)		 RIKSKNVGETTDYAEHVRG(233) GLGGGTYG
(234)
RSSAGLRNNDGDILLS
(235)		 RVSRRDS
(236)		 MRGPY
(237)
CBTAU 46.1 82 내지 103 IYEMN
(238)		 YITNRGSTIYYADSVKG
(239)		 PRIGARVFDV
(240)
KSSQTLLYKSNNENYLA
(241)		 WASTRES
(173)		 QQYFTTALT
(242)
CBTAU 47.1 52 내지 71 DHWIG
(243)		 IIFPEDSDTRYSGSFEG
(244)		 VSVVRKGGWFDP
(245)
KSSQSLLYTSNNKNYLA
(246)		 WASTRES
(173)		 QQYYNSPYT
(212)
CBTAU 47.2 52 내지 71 DHWIG
(243)		 IIFPGDSDIRYSPSFEG
(247)		 VAVVRKGGWFDS
(248)
KSTQSLLWSANNKNYLA
(249)		 WASTRES
(173)		 QQYYNSPYT
(212)
CBTAU 49.1 52 내지 71 SYWIG
(250)		 IIYPDDSDTRYNASLEG
(251)		 RDRNCSGTTCYPRWFDS
(252)
KSSQSLFYSGNSKDFLA
(253)		 WASTRDS
(254)		 HQYHSTPLS
(255)
CBTAU-7.1 항체는 SEQ ID NO: 163의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 164의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 165의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID NO: 166의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 167의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 168의 경쇄 CDR3 영역을 포함한다. CBTAU-8.1 항체는 SEQ ID NO: 169의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 170의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 171의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID NO: 172의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 173의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 174의 경쇄 CDR3 영역을 포함한다. CBTAU-16.1 항체는 SEQ ID NO: 175의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 176의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 177의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID NO: 178의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 179의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 180의 경쇄 CDR3 영역을 포함한다. CBTAU-18.1 항체는 SEQ ID NO: 181의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 182의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 183의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID NO: 172의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 173의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 184의 경쇄 CDR3 영역을 포함한다. CBTAU-20.1 항체는 SEQ ID NO: 185의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 186의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 187의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID NO: 188의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 173의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 189의 경쇄 CDR3 영역을 포함한다. CBTAU-22.1 항체는 SEQ ID NO: 190의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 191의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 192의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID NO: 193의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 194의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 195의 경쇄 CDR3 영역을 포함한다. CBTAU-24.1 항체는 SEQ ID NO: 196의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 197의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 198의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID NO: 199의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 173의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 200의 경쇄 CDR3 영역을 포함한다. CBTAU-27.1 항체는 SEQ ID NO: 201의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 202의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 203의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID NO: 204의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 205의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 206의 경쇄 CDR3 영역을 포함한다. CBTAU-28.1 항체는 SEQ ID NO: 207의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 208의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 209의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID NO: 210의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 211의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 212의 경쇄 CDR3 영역을 포함한다. CBTAU-41.1 항체는 SEQ ID NO: 213의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 214의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 215의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID NO: 216의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 173의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 217의 경쇄 CDR3 영역을 포함한다. CBTAU-41.2 항체는 SEQ ID NO: 213의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 214의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 215의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID NO: 218의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 174의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 217의 경쇄 CDR3 영역을 포함한다. CBTAU-42.1 항체는 SEQ ID NO: 219의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 220의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 221의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID NO: 218의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 173의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 217의 경쇄 CDR3 영역을 포함한다. CBTAU-43.1 항체는 SEQ ID NO: 222의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 223의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 224의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID NO: 225의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 173의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 226의 경쇄 CDR3 영역을 포함한다. CBTAU-44.1 항체는 SEQ ID NO: 227의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 228의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 229의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID NO: 230의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 167의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 231의 경쇄 CDR3 영역을 포함한다. CBTAU-45.1 항체는 SEQ ID NO: 232의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 233의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 234의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID NO: 235의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 236의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 237의 경쇄 CDR3 영역을 포함한다. CBTAU-46.1 항체는 SEQ ID NO: 238의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 239의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 240의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID NO: 241의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 173의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 242의 경쇄 CDR3 영역을 포함한다. CBTAU-47.1 항체는 SEQ ID NO: 243의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 244의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 245의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID NO: 246의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 173의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 212의 경쇄 CDR3 영역을 포함한다. CBTAU-47.2 항체는 SEQ ID NO: 243의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 247의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 248의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID NO: 249의 경쇄 CDR1 영역 SEQ ID NO: 173의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 212의 경쇄 CDR3 영역을 포함한다. CBTAU-49.1 항체는 SEQ ID NO: 250의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 251의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 252의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID NO: 254의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 254의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 255의 경쇄 CDR3 영역을 포함한다.
항-타우 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 핵산 서열을 NCBI에서 이용 가능한 면역글로불린 가변 도메인 서열 분석 도구인 IgBLAST를 이용해서 공지된 생식계열 서열과 비교하였다(Nucleic Acids Res. 2013 Jul;41(Web Server issue):W34-40). 이들 각각의 제안된 생식계열 서열 및 PCR 프라이머와 정렬된 중쇄 및 경쇄 프레임워크 H1 및 L1 영역의 서열 정렬을 표 9에 나타낸다. 확인된 서열을 발현 및 정제를 위해 스케일 업하였다(실시예 5에 상세히 나타냄). 선택된 클론을 50 ml 배양으로 확장시키고 플라스미드 미디프렙 DNA를 제조하였다(Machery Nagel Midi Prep 키트). 이어서 플라스미드 DNA를 이용해서 실시예 5에 상세히 나타낸 바와 같이 293Expi 세포의 30 ml 배양물을 전달감염시켰다.
생식계열 및 프라이머와 정렬된 H1 및 L1의 프레임워크 핵산. (위가 아미노산) 차이는 소문자로 표시하였다. 원상태는 항체를 나타낸다.
mAb SEQ ID NO 아미노 말단 단백질 및 N-말단 핵산 서열
CBTAU-7.1
VH 87 (Q V Q L V E S)
pCB-IgG-VH1b 37 CAGGTCCAGCTGGTGCAGTC
CBTAU-7.1VH 89 CAGGTCCAGCTGGTGGAGTCCGGGGGAGGCTTAGTTCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCT
IGHV3-74*01. 256 gAGGTgCAGCTGGTGGAGTCCGGGGGAGGCTTAGTTCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCT
원상태 7.1 VH 257 (e V Q L V E )
VL 88 (D I V M T Q S P)
pCB-IgG-Vk4 61 GACATCGTGATGACCCAGTCTCC
CBTAU-7.1 VL 90 GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAGAGAGCCACCCTCT
IGKV3-NL5*01 258 GAaATtGTGtTGACgCAGTCTCCAGcCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAaAGAGCCACCCTCT
원상태 7.1 VL 259 (e I V l T Q S P)
CBTAU-8.1
VH 91 (Q V A L V E S)
pCB-IgG-VH3a 42 CAGGTGCAGCTGGTGGAGTC
CBTAU-8.1 VH 93 CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCGAGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGACGTCCCTGAGACTCTCCT
IGHV3-33*01 260 CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCtgGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGACGTCCCTGAGACTCTCCT
원상태 8.1 VH 261 (Q V A L V E S)
VL 92 (E T T L T Q S P)
pCB-IgG-Vk5 62 GAAACGACACTCACGCAGTCTCC
CBTAU-8.1 VL 94 GAAACGACACTCACGCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCA
IGKV4-1*01 262 GAcAtcgtgaTgACcCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCA
원상태 8.1 VL 263 (d i v m T Q S P)
CBTAU-16.1
VH 95 (E V Q L V Q)
pCB-IgG-VH5 48 GAGGTGCAGCTGGTGCAGTC
CBTAU-16.1 VH 97 GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCT
IGHV3-64*01 264 GAGGTGCAGCTGGTGgAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCT
원상태 16.1 VH 265 (E V Q L V e S)
VL 96 (E I V M T Q S P)
pCB-IgG-VK3c 60 GAAATAGTGATGACGCAGTCTCCGG
CBTAU-16.1VL 98 GAAATAGTGATGACGCAGTCTCCGGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCT
IGKV3-15*01 266 GAAATAGTGATGACGCAGTCTCCaGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCT
원상태 16.1 VL 267 (E I V M T Q S P)
CBTAU-18.1
VH 99 (Q V Q L L E S)
정확한 프라이머 매치 없음
CBTAU-18.1 VH 101 CAGGTGCAGCTGTTGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAACCCTTCACAGACCCTGTCCCTCACCT
IGHV4-31*05 268 CAGGTGCAGCTGcaGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCCTGTCCCTCACCT
원상태 18.1 VH 269 (Q V Q L q E S)
VL 100 (E I V L T Q S P)
pCB-IgG-VK3b 59 GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAG
CBTAU-18.1 VL 102 GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCAACATTA
IGKV4-1*01 262 GAcATcGTGaTGACcCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCAcCATcA
원상태 18.1 VL 270 (d I V m T Q S P)
CBTAU-20.1
VH 103 (Q V Q L V E S)
pCB-IgG-VH3d 45 CAGGTACAGCTGGTGGAGTCTG
CBTAU-20.1 VH 105 CAGGTACAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCT
IGHV3-23*04 271 gAGGTgCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCT
원상태 20.1 VH 272 (e V Q L V E S)
VL 104 (D I Q M T Q S P)
pCB-IgG-VK1a 54 GACATCCAGATGACCCAGTCTCC
CBTAU-20.1 VL 106 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCA
IGKV4-1*01 262 GACATCgtGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCA
원상태 20.1 VL 273 (D I v M T Q S P)
CBTAU-22.1
VH 107 (Q V Q L V Q S)
pCB-IgG-VH1a 36 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTC
CBTAU-22.1 VH 109 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCCCAGTGAAGGTCTC
IGHV1-2*02 274 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCtCAGTGAAGGTCTC
원상태 22.1 VH 275 (Q V Q L V Q S)
VL 108 (D V V M T Q S P L)
정확한 프라이머 매치 없음
CBTAU-22.1 VL 110 GATGTTGTGATGACGCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATC
IGKV2-28*01 276 GATaTTGTGATGACtCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATC
원상태 22.1 VL 277 (D i V M T Q S P L)
CBTAU-24.1
VH 111 (Q V Q L V S G)
pCB-IgG-VH1d 39 CAGGTCCAGCTTGTGCAGTC
CBTAU-24.1 VH 113 CAGGTCCAGCTTGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCC
IGHV1-3*01 278 CAGGTCCAGCTTGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTtTCC
원상태 24.1 VH 279 (Q V Q L V S G)
VL 112 (D I Q M T Q S P)
pCB-IgG-VK1a 54 GACATCCAGATGACCCAGTCTCC
CBTAU-24.1 VL 114 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATC
IGKV4-1*01 262 GACATCgtGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATC
원상태 24.1 VL 280 (D I v M T Q S P)
CBTAU27 .1
VH 115 (Q V Q L V E S)
pCB-IgG-VH3a 42 CAGGTGCAGCTGGTGGAGTC
CBTAU27.1 VH 117 CAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGACCGGAGATGAGAAAGCCCGGGGAGTCTCTGAAAATTTCC
IGHV5-51*01 281 gAGGTgCAGCTGGTGcAGTCTGGAgCaGAGgTGAaAAAGCCCGGGGAGTCTCTGAAgATcTCC
원상태 27.1 VH 282 (e V Q L V q S)
VL 116 (D I Q L T Q S P)
pCB-IgG-VK1b 55 GACATCCAGTTGACCCAGTCTCC
CBTAU27.1 VL 118 GACATCCAGTTGACCCAGTCTCCAGATTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGCGGGCCACCATC
IGKV4-1*01 262 GACATCgtGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATC
원상태 27.1 VL 283 (D I v m T Q S)P
CBTAU28 .1
VH 119 (Q V Q L Q Q S)
pCB-IgG-VH6 49 CAGGTaCAGCTgCAGCAGTCAG
CBTAU28.1 VH 121 CAGGTGCAGCTACAGCAGTCAGGAGCAGAAGTGAAAAAGCCCGGGGAGTCTCTGAAGATCTCC
IGHV5-51*01 281 gAGGTGCAGCTggtGCAGTCtGGAGCAGAAGTGAAAAAGCCCGGGGAGTCTCTGAAGATCTCC
원상태 28.1 VH 284 (e V Q L v Q S)
VL 120 (D I Q M T Q S P)
pCB-IgG-VK1a 54 GACATCCAGATGACCCAGTCTCC
CBTAU28.1 VL 122 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATC
IGKV4-1*01 262 GACATCgtGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATC
원상태 28.1 VL 285 (D I v M T Q S P)
CBTAU41 .1
VH 123 (E V Q L L E S)
pCB-IgG-VH3b 43 GAGGTGCAGCTGTTGGAGTC
CBTAU41.1 VH 125 GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCC
IGHV3-11*06 286 cAGGTGCAGCTGgTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCC
원상태 41.1 VH 287 (q V Q L v E S)
VL 124 (D I Q M T Q S P)
pCB-IgG-VK1a 54 GACATCCAGATGACCCAGTCTCC
CBTAU41.1 VL 126 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGTCACCATC
IGKV4-1*01 262 GACATCgtGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGTCACCATC
원상태 41.1 VL 288 (D I v M T Q S P)
CBTAU41 .2
VH 127 (E V Q L V Q S)
pCB-IgG-VH3b 43 GAGGTGCAGCTGGTGCAGTC
CBTAU41.2 VH 129 GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCC
IGHV3-11*06 286 cAGGTGCAGCTGGTGgAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCC
원상태 41.2 VH 289 (q V Q L v E S)
VL 128 (A I Q L T Q S P)
pCB-IgG-VK1c 56 GCCATCCAGTTGACCCAGTCTCC
CBTAU41.2 VL 130 GCCATCCAGTTGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGTCACCATC
IGKV4-1*01 262 gaCATCgtGaTGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGTCACCATC
원상태 41.2 VL 290 (d I v m T Q S P)
CBTAU42 .1
VH 131 (Q L V Q S E G)
pCB-IgG-VH1a-c 36 CAGCTGGTGCAGTC
CBTAU42.1 VH 133
CAGCTGGTGCAGTCTGAGGGAGGCCTGGCAGAGCCTGGGGGGTCCCTTAGACTC
IGHV3-15*01 291 CAGCTGGTGgAGTCTGgGGGAGGCCTGGCAGAGCCTGGGGGGTCCCTTAGACTC
원상태 42.1 VH 292 (Q L V e S g g)
VL 132 (E I V L T Q S P)
pCB-IgG-VK3a 58 GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAG
CBTAU41.1 VL 134 GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGTCACCATC
IGKV4-1*01 262 GAcATcGTGaTGACcCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGTCACCATC
원상태 42.1 VL 293 (d I V m T Q S P)
CBTAU43 .1
VH 135 (Q V Q L V Q S)
pCB-IgG-VH1a 36 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTC
CBTAU43.1 VH 137 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGGAGAGGTGAAAAAGCCGGGGGAGTCTCTGAAGATCTCC
IGHV5-51*03 294 gAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGGAGAGGTGAAAAAGCCGGGGGAGTCTCTGAAGATCTCC
원상태 43.1 VH 295 (e V Q L V Q S)
VL 136 (E I V L T Q S P)
pCB-IgG-VK3b 59 GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAG
CBTAU43.1 VL 138 GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATC
IGKV4-1*01 262 GAcATcGTGaTGACcCAGTCTCCAGCCTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATC
원상태 43.1 VL 296 (d I V m T Q S P)
CBTAU44 .1
VH 139 (E V Q L V E S)
pCB-IgG-VH3c 44 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTC
CBTAU44.1 VH 141 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCC
IGHV3-48*01 297 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCC
원상태 44.1 VH 298 (E V Q L V E S)
VL 140 (D I Q M T Q S)
pCB-IgG-VK1a 54 GACATCCAGATGACCCAGTCTCC
CBTAU44.1 VL 142 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTC
IGKV3-20*01 299 GAaATtgtGtTGACgCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTC
원상태 44.1 VL 300 (e I v L T Q S)
CBTAU45 .1
VH 143 (E V Q L V E S)
pCB-IgG-VH3c 44 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTC
CBTAU45.1 VH 145 GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGCCACCCTTGGACAGCCGGCCTCCATC
IGHV3-15*02 301 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGACTTGGTAAAGCCTGGGGGGTCCCTTAGACTCTCC
원상태 45.1 VH 302 (E V Q L V E S)
VL 144 (E I V L T Q S P)
pCB-IgG-VK3b 59 GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAG
CBTAU45.1 VL 146 GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGCCACCCTTGGACAGCCGGCCTCCATC
IGKV2-30*01 303 GAtgTTGTGaTGACtCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGCCACCCTTGGACAGCCGGCCTCCATC
원상태 45.1 VL 304 (d v V m T Q S P)
CBTAU46 .1
VH 147 (Q V Q L V E S)
pCB-IgG-VH3d 45 CAGGTACAGCTGGTGGAGTCTG
CBTAU46.1 VH 149 CAGGTACAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGAGAGTCCCTGAGACTCTCC
IGHV3-48*03 305 gAGGTgCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGAGAGTCCCTGAGACTCTCC
원상태 46.1 VH 306 (E V Q L V E S)
VL 148 (D I Q L T Q S P)
pCB-IgG-VK1b 55 GACATCCAGTTGACCCAGTCTCC
CBTAU46.1 VL 150 GACATCCAGTTGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATC
IGKV4-1*01 262 GACATCgtGaTGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATC
원상태 46.1 VL 307 (D I v m T Q S P)
CBTAU47 .1
VH 151 (Q V Q L V Q S)
pCB-IgG-VH1a 36 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTC
CBTAU47.1 VH 153 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCAGTGGTGAAAAAGCCCGGGGAGTCTCTGAAGATCTC
IGHV5-51*01 308 gAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCAGTGGTGAAAAAGCCCGGGGAGTCTCTGAAGATCTC
원상태 47.1 VH 309 (E V Q L V Q S)
VL 152 (A I Q L T Q S P)
pCB-IgG-VK1c 56 GCCATCCAGTTGACCCAGTCTCC
CBTAU44.1 VL 154 GCCATCCAGTTGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATC
IGKV4-1*01 262 GaCATCgtGaTGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATC
원상태 47.1 VL 310 (d I v m T Q S P)
CBTAU47 .2
VH 155 (Q V Q L V E S)
pCB-IgG-VH3d 45 CAGGTACAGCTGGTGGAGTCTG
CBTAU47.1 VH 157 CAGGTACAGCTGGTGGAGTCTGGAGCAGAACTGAAAAAGCCCGGGGAGTCTCTGAAGATCTCC
IGHV5-51*01 281 gAGGTgCAGCTGGTGcAGTCTGGAGCAGAACTGAAAAAGCCCGGGGAGTCTCTGAAGATCTCC
원상태 47.2 VH 311 (e V Q L V q S)
VL 156 (E I V M T Q S P)
pCB-IgG-VK3c 60 GAAATAGTGATGACGCAGTCTCCAG
CBTAU44.1 VL 158 GAAATTGTGATGACCCAGTCTCCAGAGTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATC
IGKV4-1*01 262 GAcATcGTGATGACCCAGTCTCCAGAGTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATC
원상태 47.2 VL 312 (d I V M T Q S P)
CBTAU49 .1
VH 159 (Q V Q L V Q S)
pCB-IgG-VH1a 36 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTC
CBTAU49.1 VH 161 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCAGAGGTGAAAAAGCCGTGGGAGTCTCTGAAGATCTCC
IGHV5-51*03 294 gAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCAGAGGTGAAAAAGCCGTGGGAGTCTCTGAAGATCTCC
원상태 49.1 VH 313 (e V Q L V Q S)
VL 160 (E I V L T Q S P)
pCB-IgG-VK6 63 GAAATTGTGCTGACTCAGTCTCCAG
CBTAU49.1 VL 162 GAAATTGTGCTGACTCAGTCTCCAGACTTCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATC
IGKV4-1*01 262 GAcATcGTGaTGACcCAGTCTCCAGACTTCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATC
원상태 49.1 VL 314 (d I V m T Q S P)
전달감염된 IgG1 상청액을 ELISA에 의해 타우 펩타이드에 대한 반응성에 대해 검정하였다. 먼저, 96 절반-웰 ELISA 플레이트(Costar)를 음성 대조군으로서 50 ㎕의 소 액틴(1 ㎍/ml, Sigma) 및 Affinipure 염소 항-인간 F(ab)2(2 ㎍/ml, Jackson Immunoresearch)로 코팅하여 항체 제조를 확인하였다. 플레이트를 4℃에서 하룻밤 동안 TBS 중에 코팅하였다. 다음 날, 플레이트를 TBS/0.05% Tween(TBS-T)으로 5회 세척하고, 2 hr 동안 150 ㎕의 TBS-T와 2.5% BSA(차단 완충액)로 차단하였다. 타우 펩타이드를 100 ㎕의 TBS 중 0.43 μM의 농도로 스트렙타비딘 코팅된 플레이트(Pierce) 상에서 포획하였다. ELISA 검정을 설정하기 위해 이용된 타우 펩타이드는 해당하는 정렬 실험에서의 미끼로 이용된 것과 동일하였다. 이어서 타우 펩타이드 코팅된 플레이트를 1.5 hr 동안 RT에서 인큐베이션하였다. 그 뒤 모든 플레이트를 TBS/0.05% Tween으로 5회 세척하고 150 ㎕ 및 300 ㎕(타우 펩타이드 플레이트만)의 차단 완충액으로 차단하고 2 hr 동안 RT에서 인큐베이션하였다. IgG 전달감염 상청액을 5 ㎍/ml(Octet Red에 의한 정량에 근거)로 희석하고, TBS/0.25% BSA 중에서 5배 적정하였다. 소 액틴 코팅된 플레이트에 대한 양성 대조군으로서 마우스 항-액틴(Sigma, Cat. No. A3853)을 1.25 ㎍/ml로 이용하였다. AT8 모노클로날 항체(Thermo, MN1020), AT100 모노클로날 항체(Thermo, MN1060) 및 AT180 모노클로날 항체(Thermo, MN1040)를 포함하는 상업 등급 항체를 ELISA 검정을 위한 양성 대조군으로서 1 ㎍/ml로 이용하였다. 일차 항체를 RT에서 2 hr 동안 인큐베이션하고 TBS-T 중에 5회 세척하였다. 마지막으로, 염소-항 인간 IgG Fab 또는 염소 항-마우스 HRP(Jackson Labs)를 각각 1:2000 및 1:4000으로 이용하고 RT에서 1 hr 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 TBS-T 중 5회 세척하고, SureBlue Reserve TMB 마이크로웰 퍼옥시다아제 기질(KPL)로 발색시켰다. 50 ㎕ 및 100 ㎕(펩타이드 플레이트)의 TMB 중지 용액(KPL)의 첨가에 의해 반응을 중지시키고, 450 nm에서의 흡광도를 ELISA 플레이트 판독기를 이용해서 측정하였다. 상기 언급된 결합 활성을 가지는 상청액을 이후 독립적 ELISA 실험에서 재확인하였다. 일단 재확인되면, 클론을 후속 IgG 발현 및 정제를 위해 선택하였다(실시예 5).
실시예 5
IgG1 발현 및 클로닝된 항- 타우 키메라 mAb의 정제
ELISA 스크리닝 및 항체 반응성의 확인 후, 선택된 클론을 실시예 4에 나타낸 바와 같이 IgG1으로서 발현시켰다. 최소 72 hr 후 최대 168 hr까지 세포 배양 배지를 수확하고 원심분리하여 세포를 제거하였다. 이후 청정화된 상청액을 단백질 A 세파로오스 컬럼(GE Healthcare Life Sciences)을 통해 2회 통과시키고 50 ml의 PBS로 세척하였다. 이후, IgG를 10 ml의 IgG 용출 완충액(Pierce)으로 용출하고 Tris pH 8.0으로 중화한 후 하룻밤 동안 PBS에 대해 투석하였다. 투석된 샘플을 10,000 MWCO 초원심 장치(Amicon)를 이용해서 최종 부피 약 1 mL로 농축하고, 항체 농도를 Octet Red384(ForteBio) 상에서 인간 IgG 표준을 이용하여 단백질 A 센서 팁으로 결정하였다. 비환원성 및 환원성 조건 하에 SDS-PAGE를 수행해서 그리고 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제된 항체를 추가로 품질-제어하였다.
실시예 6
IgG 결합
타우 펩타이드에 대한 반응성
상술된 바와 같이 생성되고 품질 제어된 IgG1을 명시된 인지체 펩타이드(들)뿐만 아니라 비-인지체 펩타이드에 대해 결합하는 이들의 능력에 대해 ELISA에 의해 평가하였다(표 10). 96-웰 ELISA 플레이트(Costar) 또는 스트렙타비딘 코팅된 플레이트(Pierce)를 실시예 4에 상세히 나타낸 바와 같이 항원(소 액틴 및 affinipure 염소 항-인간 F(ab)2) 또는 타우 펩타이드로 각각 코팅하였다. 정제된 항-타우 IgG를 0.25% BSA 함유 TBS 중 5 ㎍/ml로 희석하고 5배 적정하였다. 항체 대조군 및 이차 항체를 실시예 4에 상세히 나타낸 바와 같이 이용하였다. 1 ㎍/mL에서의 항체 반응성을 ELISA에 의해 결정하고, 결합 없음(-), 약함(-/+), 중간정도(+), 또는 강함(++)으로 스코어링하였다. 2회 O.D. 450 nm 판독치의 평균 <0.3에 대해 (-); >0.5 및 <1.0에 대해 (-/+); >1.0 및 <1.5에 대해 (+); >1.5에 대해 (++).
ELISA에서 이용된 인지체 및 비- 인지체 펩타이드
mAb 펩타이드 펩타이드 서열
(pX)는 인산화된 아미노산을 표시함 		SEQ ID NO 결과
CBTAU-7.1 p타우 194 내지 212(pS202,pT205) RSGYSSPG(pS)PG(pT)PGSRSRT 315 +
타우 194 내지 212
 RSGYSSPGSPGTPGSRSRT 316 -
CBTAU-8.1 p타우 194 내지 212(pS202,pT205) RSGYSSPG(pS)PG(pT)PGSRSRT 315 -/+
타우 194 내지 212
 RSGYSSPGSPGTPGSRSRT 316 -
CBTAU-16.1 p타우 204 내지 221(pT212,pS214) GTPGSRSR(pT)P(pS)LPTPPTR 317 ++
타우 204 내지 221
 GTPGSRSRTPSLPTPPTR 318 ++
CBTAU-18.1 p타우 200 내지 217
(pS210)		 PGSPGTPGSR(pS)RTPSLPT 319 -/+
타우 200 내지 217 PGSPGTPGSRSRTPSLPT 320 -
타우 186 내지 253 GEPPKSGDRSGYSSPGSPGTPGSRSRTPSLPTPPTREPKKVAVVRTPPKSPSSAKSRLQTAPVPMPDL 321 -
CBTAU-20.1 p타우 58 내지 76
(pS68,pT69)		 EPGSETSDAK(pS)(pT)PTAEDVT 322 ++
p타우 59 내지 78
(pT69, pT71)		 PGSETSDAKS(pT)P(pT)AEDVTAP 323 ++
p타우 61 내지 78
(pT71)		 SETSDAKSTP(pT)AEDVTAP 324 -/+
타우 42 내지 103 GLKESPLQTPTEDGSEEPGSETSDAKSTPTAEDVTAPLVDEGAPGKQAAAQPHTEIPEGTTA 325 -
CBTAU-22.1 p타우 406 내지 429(pS416,pS422) RHLSNVSSTG(pS)IDMVD(pS)PQLATLA 326 ++
타우 389 내지 441 GAEIVYKSPVVSGDTSPRHLSNVSSTGSIDMVDSPQLATLADEVSASLAKQGL 327 -
CBTAU-24.1 p타우 221 내지 245(pT231,pS238) REPKKVAVVR(pT)PPKSPS(pS)AKSRLQT 328 ++
p타우 228 내지 245
(pS238)		 VVRTPPKSPS(pS)AKSRLQT 329 ++
p타우 225 내지 245(pS235,pS238) KVAVVRTPPK(pS)PS(pS)AKSRLQT 330 ++
타우 186 내지 253 GEPPKSGDRSGYSSPGSPGTPGSRSRTPSLPTPPTREPKKVAVVRTPPKSPSSAKSRLQTAPVPMPDL 321 ++
CBTAU-27.1 타우 299 내지 369 HVPGGGSVQIVYKPVDLSKVTSKCGSLGNIHHKPGGGQVEVKSEKLDFKDRVQSKIGSLDNITHVPGGGNK 331 +
p타우 194 내지 212(pS202,pT205) RSGYSSPG(pS)PG(pT)PGSRSRT 315 -
CBTAU-28.1 타우 42 내지 103 GLKESPLQTPTEDGSEEPGSETSDAKSTPTAEDVTAPLVDEGAPGKQAAAQPHTEIPEGTTA 325 ++
p타우 257 내지 272 KSKIG(pS)TENLKHQPGG 332 -
CBTAU-41.1 p타우 406 내지 429
(p416, p422)		 RHLSNVSSTG(pS)IDMVD(pS)PQLATLA 326 +
타우 389 내지 441 GAEIVYKSPVVSGDTSPRHLSNVSSTGSIDMVDSPQLATLADEVSASLAKQGL 327 -
CBTAU-41.2 p타우 406 내지 429
(p416, p422)		 RHLSNVSSTG(pS)IDMVD(pS)PQLATLA 326 +
타우 389 내지 441 GAEIVYKSPVVSGDTSPRHLSNVSSTGSIDMVDSPQLATLADEVSASLAKQGL 327 -
CBTAU-42.1 p타우 406 내지 429
(p416, p422)		 RHLSNVSSTG(pS)IDMVD(pS)PQLATLA 326 ++
타우 389 내지 441 GAEIVYKSPVVSGDTSPRHLSNVSSTGSIDMVDSPQLATLADEVSASLAKQGL 327 -
CBTAU-43.1 타우 299 내지 369 HVPGGGSVQIVYKPVDLSKVTSKCGSLGNIHHKPGGGQVEVKSEKLDFKDRVQSKIGSLDNITHVPGGGNK 331 +
p타우 194 내지 212
(pS202,pT205)		 RSGYSSPG(pS)PG(pT)PGSRSRT 315 -
CBTAU-44.1 p타우 406 내지 429
(p416, p422)		 RHLSNVSSTG(pS)IDMVD(pS)PQLATLA 326 -/+
타우 389 내지 441 GAEIVYKSPVVSGDTSPRHLSNVSSTGSIDMVDSPQLATLADEVSASLAKQGL 327 -
CBTAU-45.1 p타우 406 내지 429
(p416, p422)		 RHLSNVSSTG(pS)IDMVD(pS)PQLATLA 326 ++
타우 389 내지 441 GAEIVYKSPVVSGDTSPRHLSNVSSTGSIDMVDSPQLATLADEVSASLAKQGL 327 -
CBTAU-46.1 타우 42 내지 103 GLKESPLQTPTEDGSEEPGSETSDAKSTPTAEDVTAPLVDEGAPGKQAAAQPHTEIPEGTTA 325 +
p타우 224 내지 241
(pT231, pS235)		 KKVAVVR(pT)PPK(pS)PSSAKS 333 -
CBTAU-47.1 타우 42 내지 103 GLKESPLQTPTEDGSEEPGSETSDAKSTPTAEDVTAPLVDEGAPGKQAAAQPHTEIPEGTTA 325 ++
p타우 257 내지 272
(pS262)		 KSKIG(pS)TENLKHQPGG 332 -
CBTAU-47.2 타우 42 내지 103 GLKESPLQTPTEDGSEEPGSETSDAKSTPTAEDVTAPLVDEGAPGKQAAAQPHTEIPEGTTA 325 ++
p타우 257 내지 272
(pS262)		 KSKIG(pS)TENLKHQPGG 332 -
CBTAU-49.1 타우 42 내지 103 GLKESPLQTPTEDGSEEPGSETSDAKSTPTAEDVTAPLVDEGAPGKQAAAQPHTEIPEGTTA 325 ++
p타우 224 내지 241
(pT231, pS235)		 KKVAVVR(pT)PPK(pS)PSSAKS 333 -
AT8 p타우 194 내지 212(pS202,pT205) RSGYSSPG(pS)PG(pT)PGSRSRT 315 ++
타우 194 내지 212 RSGYSSPGSPGTPGSRSRT 316 -
* 인간 타우441 이소형 상의 아미노산 영역
결과를 도 1a 내지 도 1t에 나타낸다. 본원에 기재된 항-타우 mAb는 다음의 2가지 주요 그룹으로 분류될 수 있다: 인산화된 펩타이드에만 반응하는 것들(인산-의존적 mAb) 및 인산화된 및 인산화되지 않은 펩타이드에 모두 반응하는 것들(인산-비의존적 mAb). 항-타우 mAb CBTAU-7.1, CBTAU-8.1, CBTAU-18.1 및 CBTAU-22.1을 실시예 3에 상세히 나타낸 접근을 이용해서 비-AD 개인으로부터 회수하였다. 이들 mAb는 ELISA에 의해 나타낸 바와 같이 인산-의존적이며(도 1), 인산화된 펩타이드와만 반응하지만 그 영역에 걸쳐 인산화되지 않은 펩타이드 또는 펩타이드의 인산화되지 않은 버전에 대해서는 반응하지 않는다. 항-타우 mAb CBTAU-7.1 및 CBTAU-8.1은 AT8 결합 에피토프를 함유하는 인산화된 펩타이드와 특이적으로 반응한다. 상기 펩타이드는 아미노산 194 내지 212에 걸치고 위치 202 및 205에 인산화된 잔기를 함유한다. CBTAU-18.1은 위치 210에 인산화된 세린 잔기를 가지며 아미노산 200 내지 217에 걸친 인산화된 펩타이드와 반응한다. 마지막으로, CBTAU-22.1은 위치 416 및 422에 2개의 인산화된 세린을 가지며 아미노산 406 내지 429에 걸친 펩타이드와 반응한다.
유사하게, CBTAU-20.1은 비-AD 개인으로부터 동정되었으며, 이것이 아미노산 59 내지 77에 걸친 3개의 상이한 인산화된 펩타이드와 반응하므로 주로 인산-의존적이다. 이들 펩타이드 중 2개는 위치 68 및 69에서 하나가, 그리고 위치 69 및 71에서 두 번째가 이중 인산화된다. CBTAU-20.1은 또한 위치 71에 단독 인산화되는 제3 펩타이드와 반응하여, 트레오닌 71에서의 인산화가 CBTAU-20.1 반응성을 위해 중요하고 충분함을 제시한다. CBTAU-20.1은 영역 42 내지 103에 걸친 인산화되지 않은 펩타이드에 대해 약한 반응성을 나타낸다.
상기 언급된 mAb와 마찬가지로, CBTAU-16.1 및 CBTAU-24.1도 비-AD 개인으로부터 회수되었다; 그러나 두 mAb는 모두 인산-비의존적이고, ELISA에 의해 관찰된 바와 같이, 명시된 영역에 걸쳐 인산화된 및 인산화되지 않은 펩타이드 둘 다와 반응한다. CBTAU-16.1은 아미노산 영역 204 내지 221과 반응하는 반면, CABTAU-24.1은 아미노산 221 내지 245에 걸쳐 3개의 상이한 펩타이드와 반응한다. 부가적으로, 2개의 추가적인 항-타우 mAb(CBTAU-27.1 및 CBTAU-28.1)가 아미노산 영역 42 내지 103 및 299 내지 369에 각각 해당하는 60 내지 70 아미노산-길이의 인산화되지 않은 펩타이드를 이용하여 비-AD 공여체 샘플로 수행된 스크리닝에서 동정되었다; 따라서, 두 mAb는 모두 인산화되지 않은 타우에 특이적이다.
마지막으로, CBTAU mAb 41.1, 41.2, 42.1, 43.1, 44.1, 45.1, 46.1, 47.1, 47.2 및 49.1은 25명의 젊은 비-AD(18 내지 27 y.o.), 25명의 비-AD(55+ y.o.) 및 25명의 AD(55+ y.o.) 개인이 스크리닝된 소규모 연구로부터 동정되었다. 상기 연구를 위해 이용된 펩타이드 세트에는 8개의 인산화된 펩타이드(CBTAU-22.1 인지체 펩타이드 포함) 및 2개의 인산화되지 않은 펩타이드(CBTAU-27.1 및 CBTAU-28.1 인지체 펩타이드)가 포함되었다. CBTAU mAb 41.1, 41.2 및 42.1은 AD 공여체로부터 회수되었으며, CBTAU-22.1 인지체 펩타이드와 반응하였다. CBTAU-22.1과 유사하게, 이들 mAb는 도 1j 내지 1l에 나타낸 바와 같이 인산-의존적이다. 2개의 추가적 mAb(CBTAU-44.1 및 CBTAU-45.1)가 CBTAU-22.1 인지체 펩타이드에 대한 반응성을 가지는 비-AD(55+ y.o.) 개인으로부터 동정되었다. 예상된 바와 같이, 이들 2개도 인산-의존적이었다(도 1n 내지 도 1o). CBTAU-43.1이 또한 비-AD(55+ y.o.) 개인에서 수행된 스크리닝으로부터 동정되었다; 그러나, mAb는 CBTAU-27.1 인지체 펩타이드로 회수되었고 인산화되지 않은 타우에 특이적이다(도 1m). 마지막으로, CBTAU-46.1, 47.1, 47.2 및 49.1은 CBTAU-28.1 펩타이드에 대한 반응성을 갖는 비-AD(18 내지 27 y.o.) 개인으로부터 회수되었고, CBTAU-28.1과 유사하게, 인산화되지 않은 타우에 특이적이다(도 1p 내지 도 1s).
실시예 7
ELISA에 의한 페어링된 나선형 필라멘트 및 재조합 타우에 대한 반응성
일부 키메라 항체의 특이성을 추가 특성규명하기 위해, 농축된 재조합 타우 및 면역정제된 페어링된 나선형 필라멘트에 대한 이들의 반응성을 ELISA에 의해 평가하였다.
PHF-타우를 Greenberg 및 Davies의 프로토콜에 따라 면역정제하였다. 간략하게, 알츠하이머병 개인에 해당하는 피질 조직을 10부피의 저온 완충액(10 mM Tris, pH 7.4, 1 mM EGTA, 0.8 M NaCL 및 10% 수크로오스)으로 균질화하고 4℃에서 20분 동안 27,200 x g에서 원심분리하였다. N-라우로일사르코신 및 2-머캅토에탄올을 상청액에 최종 농도가 각각 1%(wt/vol) 및 1%(vol/vol)에 도달하도록 첨가하였다. 혼합물을 일정하게 흔들면서 2 hr 내지 2.5 hr 동안 37℃에서 인큐베이션한 뒤 실온에서 30분 동안 108,000 x g에서 원심분리하였다. PHF-타우 함유 펠렛을 PBS로 3회 세척하고 단백질 저해제를 포함하지 않은 PBS 중에 용해시키고 5분 동안 12,000 x g에서 추가 원심분리하였다. 농축된 PHF-타우(ePHF-타우)를 함유하는 회수된 상청액을 h타우10 친화도 컬럼에 걸쳐 면역친화도 정제하고 4℃에서 하룻밤 동안 3 M 또는 4 M KSCN으로 용출한 뒤 3부피의 완충액을 이용하여 4℃에서 1 L PBS에 대해 투석하였다. h타우10은 재조합 타우를 이용한 면역화에 의해 내부 생성된 항체이다. 이는 아미노-말단 에피토프에서 재조합 및 PHF-타우 둘 다에 결합한다. 면역정제된 PHF-타우(iPHF-타우)를 Sartorius 원심분리 여과 장치를 이용해서 농축하였다.
ELISA를 위해, 절반-영역 96-웰 결합 플레이트(Costar)를 TBS(2 ㎍/ml 재조합 타우, 2 ㎍/ml 소 작용 affinipure 염소 항-인간 F(ab)2, 1 ㎍/ml의 친화도 정제된 페어링된 나선형 필라멘트 및 1 ㎍/ml의 모노클로날 항-타우 항체, HT7(Thermo Scientific, MN1000) 중 50 ㎕의 항원으로 코팅하였다. 다음 날, 플레이트를 TBS-T로 세척한 뒤 RT에서 2 hr 동안 150 ㎕의 TBS와 2.5% BSA로 차단하였다. 차단 후, ePHF-타우를 항-타우 항체 코팅된 플레이트 상에서 RT에서 2 hr 동안 포획하였다. 정제된 항-타우 IgG를 TBS와 0.25% BSA 중 10 ㎍/ml로 희석하고, IgG를 2 hr 동안 RT에서 5배 적정하였다. AT8(10 ㎍/ml)을 iPHF-타우에 대한 양성 대조군으로서 이용하여 ePHF-타우를 포획하였다. 플레이트를 TBS-T 및 이차 항체로 5회 세척하고, TBS와 0.25% BSA 중에 희석하고, 첨가하고, 1 hr 동안 RT에서 인큐베이션하였다. 염소 항-인간 IgG F(ab')2(Jackson Labs)를 1:2000 희석도로 이용하고, 염소 항-마우스 HRP(Jackson Labs)를 1:4000 희석도로 이용하였다(항-액틴 대조군으로 이용함). 인큐베이션 후, 플레이트를 TBS-T 중에 4회 세척하고, 대략 2분 동안 SureBlue Reserve TMB 마이크로웰 퍼옥시다아제 기질(KPL)로 발색시켰다. TMB 중지 용액(KPL)의 첨가에 의해 반응을 즉시 중지시키고, 450 nm에서의 흡광도를 ELISA 플레이트 판독기를 이용해서 측정하였다.
결과를 도 2a 내지 도 2j에 나타낸다. 예상된 바와 같이, 인산-의존적 mAb CBTAU-7.1, CBTAU-8.1 및 CBTAU-18.1은 ELISA에 의해 재조합 타우와 반응하지 않는다(도 2a, 도 2b, 도 2d). CBTAU-20.1은 영역 42 내지 103에 걸친 인산화되지 않은 펩타이드에 대한 그 약한 반응성과 일관되게 재조합 타우에 대해 적은 반응성을 나타낸다. 흥미롭게도, 이들 인산-의존적 mAb는 더 높은 항체 농도에서 ePHF-타우에 대해 적은 반응성을 나타내는 CBTAU-7.1을 예외로 하여, 페어링된 나선형 필라멘트(즉, ePHF-타우 및 iPHF-타우)에 대해 임의의 반응성을 나타내지 않는다. 마지막으로, 인산-의존적 CBTAU-22.1은 재조합 타우에 대해 반응성을 나타내지 않지만, iPHF-타우 및 ePHF-타우 둘 다와 반응한다(도 2f).
인산-비의존적 항-타우 mAb, CBTAU-16.1 및 CBTAU-24.1은 두 재조합 타우 및 페어링된 나선형 필라멘트(즉, iPHF-타우 및 ePHF-타우; 도 2c 및 도 2g)의 두 형태와 모두 반응한다. CBTAU-28.1은 재조합 타우에 대해 강한 결합을 나타내며, PHF-타우 형태 모두에 대해 약한 면역반응성을 갖는다(도 2i). 마지막으로, CBTAU-27.1은 재조합 타우 및 PHF-타우 모두에 대해 약한 면역반응성을 나타낸다(도 1h).
실시예 8
웨스턴 블롯 분석에 의한 페어링된 나선형 필라멘트 및 재조합 타우에 대한 반응성
r타우 및 PHF 결합 ELISA의 관찰을 연장하기 위해 그리고 이차 구조가 그 반응성에서 역할을 담당하는지를 조사하기 위해, 농축된 재조합 타우 및 면역정제된 페어링된 나선형 필라멘트를 웨스턴 블롯 분석에 의해 평가하였다. 1X NuPAGE LDS 샘플 완충액(최종 0.5% LDS)(Novex, NP0007)의 최종 농도로 대략 0.5 ㎍의 iPHF, ePHF 및 1 ㎍의 r타우를 10분 동안 70℃에서 가열하였다. 샘플을 26-웰, 4% 내지 12% Bis-Tris Novex NuPAGE 겔(Invitrogen, MOPS SDS 수행 완충액(Novagen, NP0001) 상에 로딩한 후, 니트로셀룰로오스 막 상으로 옮겼다. 막을 0.05% Tween20 및 4% 무지방 건조유를 포함하는 1X Tris 완충 식염수(TBS) 중에 하룻밤 동안 차단하였다. CBTAU mAb를 0.05% Tween20 및 4% 무지방 건조유를 포함하는 1X TBS 중 25 ㎍/mL로 일차 항체로 이용하고 실온에서 2 hr 동안 인큐베이션하였다. 이어서 막을 0.05% Tween20을 포함하는 1X TBS 중에서 각각 5분 동안 3회 세척하였다. 퍼옥시다아제 AffiniPure 염소 항-인간 IgG, Fcγ 단편 특이적 항체(Jackson ImmunoResearch)를 0.05% Tween20 및 4% 무지방 건조유를 포함하는 1X TBS 중 1:2000 희석도로 2차 항체로 이용하고 RT에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 막을 각각 5분 동안 3회 세척하고, Supersignal West Pico 키트(Pierce)를 이용해서 발색시켰다.
웨스턴 블롯 분석에 대한 결과를 도 3에 나타낸다. 도면은 3개의 대조군 항체, AT8, AT100 및 HT7(각각 2개는 인산-타우 특이적이고, 하나는 전체 타우 특이적임)의 반응성을 나타낸다. AT8 및 AT100은 모두 대략 68 kDa, 64 kDa 및 60 kDa에 해당하는 PHF-타우에 특징적인 3중 밴드를 나타낸다. ELISA 결과와는 대조적으로, 인산-의존적 mAb, CBTAU-7.1 및 CBTAU-18.1은 웨스턴 블롯에 의해 iPHF-타우 및 ePHF-타우 둘 다와 반응하여, 타우가 PHF-타우에 존재하는 더 고차원 입체형태를 채택하는 경우 이들 mAb에 대한 에피토프가 접근 불가능함을 제시한다. 그러나 이들 에피토프는 SDS-PAGE의 강한 변성 조건 하에 접근 가능해진다. CBTAU-27.1은 웨스턴 블롯에 의해 재조합 타우 및 PHF에 대해 결합을 나타내지만 ELISA에 의해 각각에 대해 약한 반응성을 나타내어, 상기 항체에 대한 에피토프는 강한 변성 조건 하에서만 노출됨을 시사한다. CBTAU-28.1은 웨스턴 블롯 및 ELISA 둘 다에 의해 재조합 타우에 강력히 반응하며, 또한 두 검정 모두에 의해 PHF-타우에 대한 반응성을 나타낸다. CBTAU-28.1은 모든 타우 이소형에 존재하지 않는 타우의 E1/E2 영역(아미노산 42 내지 103)에 반응한다; 따라서, PHF-타우 상의 68 kDa 및 64 kDa 밴드만 CBTAU-28.1에 의해 검출된다. 마지막으로, CBTAU-22.1 및 CBTAU-24.1은 각각 재조합 타우가 아니라 PHF-타우에 대해 그리고 PHF-타우 및 재조합 타우 둘 다에 대해 반응하는 ELISA 검정에 대해 유사한 결과를 나타낸다.
실시예 9
ELISA에 의한 타우 단편 펩타이드에 대한 반응성
회수된 항체의 특이성을 특성규명하기 위해, 타우 인산화된 및 인산화되지 않은 펩타이드에 대한 이들의 반응성(표 11 내지 표 21, 도 4a 내지 도 4g)을 ELISA에 의해 평가하였다. 바이오틴화된 타우 펩타이드를 상업적으로 합성하고 1 mg/ml로 수중 용해시키고 -80℃에서 냉동시켰다. 간략하게, 96-웰 스트렙타비딘 결합 플레이트(Thermo-Fisher)를 TBS 중에 희석된 2 ㎍/ml의 타우 펩타이드로 코팅하고 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 다음 날, 플레이트를 TBS-T로 세척한 뒤 RT에서 2 hr 동안 TBS 중 2.5% BSA로 차단하였다. 차단 후, 정제된 항-타우 IgG를 TBS와 0.25% BSA 중에 2 ㎍/ml로 희석하고(또는 5 ㎍/ml로 희석하고 표 15 내지 표 20에서 펩타이드 서열을 이용하여 CBTAU-27.1, 28.1, 43.1, 46.1, 47.1, 47.2 및 49.1의 더 미세한 맵핑을 위해 5배 적정하고) 2 hr 동안 RT에서 인큐베이션하였다. 실시예 11에 기재된 AT8 IgG의 인간 키메라화된 버전(2 ㎍/ml)을 각각의 맵핑 실험에서 양성 대조군으로 이용하였다. 플레이트를 TBS-T로 5회 세척한 뒤 TBS와 0.25% BSA 중 희석된 이차 항체[1:2000 희석도의 염소 항-인간 IgG F(ab')2(Jackson Labs)]를 첨가하고, 1 hr 동안 RT에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 TBS-T 중 4회 세척하고, 대략 90초 동안 SureBlue Reserve TMB 마이크로웰 퍼옥시다아제 기질(KPL)로 발색시켰다. TMB 중지 용액(KPL)의 첨가에 의해 반응을 즉시 중지시키고, 450 nm에서의 흡광도를 ELISA 플레이트 판독기를 이용해서 측정하였다. 각각의 실험을 3개의 다른 날에 걸쳐 3회씩 수행하였다. 값이 ELISA 검정에서 OD 0.4 이상인 경우, 반응성을 양성으로 간주하였다. 타우 인산화된 및 인산화되지 않은 펩타이드에 대한 각각의 mAb의 반응성을 결정하기 위해, 2 ㎍/mL에서의 항체 반응성을 ELISA에 의해 결정하고 결합 없음(-), 약함(-/+), 중간 정도(+), 또는 강함(++)으로 스코어링하였다. 2회의 O.D. 450 nm 판독치의 평균 <0.3에 대해 (-); >0.5 및 <1.0에 대해 (-/+); >1.0 및 <1.5에 대해 (+); >1.5에 대해 (++). CBTAU-27.1, 28.1, 43.1, 46.1, 47.1, 47.2 및 49.1의 더 미세한 맵핑을 위해(표 15 내지 표 20에 상세히 나타냄), 1 ㎍/mL에서의 항체 반응성을 ELISA에 의해 결정하고 결합 없음(-), 약함(-/+), 중간 정도(+), 또는 강함(++)으로 스코어링하였다. 3회의 O.D. 450 nm 판독치의 평균 <0.3에 대해 (-); >0.5 및 <1.0에 대해 (-/+); >1.0 및 <1.5에 대해 (+); >1.5에 대해 (++).
CBTAU -7.1: ELISA에 의한 반응성에 대한 펩타이드
펩타이드 SEQ ID NO. 펩타이드 서열
(pX)는 인산화된 아미노산을 나타냄 		결과
타우 186 내지 253 321 GEPPKSGDRSGYSSPGSPGTPGSRSRTPSLPTPPTREPKKVAVVRTPPKSPSSAKSRLQTAPVPMPDL -
p타우 187 내지 212 334 EPPKSGDRSG(pY)SSPGSPG(pT)PGSRSRT -/+
p타우 188 내지 205 335 PPKSGDRSGY(pS)SPGSPGT -
p타우 188 내지 206 336 PPKSGDRSGY(pS(pS)PGSPGTP -
p타우 188 내지 209 337 PPKSGDRSGY(pS)SPG(pS)PGTPGSR ++
p타우 188 내지 212 338 PPKSGDRSGY(pS)SPGSPG(pT)PGSRSRT -/+
p타우 189 내지 206 339 PKSGDRSGYS(pS)PGSPGTP -
p타우 189 내지 209 340 PKSGDRSGYS(pS)PG(pS)PGTPGSR -
p타우 189 내지 212 341 PKSGDRSGYS(pS)PGSPG(pT)PGSRSRT +
타우 190 내지 209 342 KSGDRSGYSSPGSPGTPGSR -
p타우 192 내지 209 343 GDRSGYSSPG(pS)PGTPGSR -
p타우 192 내지 212 344 GDRSGYSSPG(pS)PG(pT)PGSRSRT +
p타우 192 내지 215 345 GDRSGYSSPG(pS)PGTPG(pS)RSRTPSL -
p타우 192 내지 217 346 GDRSGYSSPG(pS)PGTPGSR(pS)RTPSLPT -
p타우 194 내지 212 315 RSGYSSPG(pS)PG(pT)PGSRSRT +
타우 194 내지 212 316 RSGYSSPGSPGTPGSRSRT -
CBTAU -18.1: ELISA에 의한 반응성에 대한 펩타이드
펩타이드 SEQ ID NO. 펩타이드 서열
(pX)는 인산화된 아미노산을 나타냄 		결과
p타우 186 내지 253 321 GEPPKSGDRSGYSSPGSPGTPGSRSRTPSLPTPPTREPKKVAVVRTPPKSPSSAKSRLQTAPVPMPDL -
p타우 192 내지 217 346 GDRSGYSSPG(pS)PGTPGSR(pS)RTPSLPT ++
p타우 194 내지 212 315 RSGYSSPG(pS)PG(pT)GSRSRT -
타우 194 내지 212* 316 RSGYSSPGSPGTPGSRSRT -
p타우 195 내지 212 347 SGYSSPGSPG(pT)PGSRSRT -
p타우 195 내지 215 348 SGYSSPGSPG(pT)PG(pS)RSRTPSL -
p타우 195 내지 217 349 SGYSSPGSPG(pT)PGSR(pS)RTPSLPT ++
p타우 195 내지 219 350 SGYSSPGSPG(pT)PGSRSR(pT)PSLPTPP -
타우 195 내지 214 351 SGYSSPGSPGTPGSRSRTPS -
p타우 198 내지 215 352 SSPGSPGTPG(pS)RSRTPSL -
p타우 198 내지 217 353 SSPGSPGTPG(pS)R(pS)RTPSLPT ++
p타우 198 내지 219 354 SSPGSPGTPG(pS)RSR(pT)PSLPTPP -/+
p타우 198 내지 221 355 SSPGSPGTPG(pS)RSRTP(pS)LPTPPTR -
타우 198 내지 217 356 SSPGSPGTPGSRSRTPSLPT -
p타우 200 내지 217 319 PGSPGTPGSR(pS)RTPSLPT +
타우 200 내지 217 320 PGSPGTPGSRSRTPSLPT -
p타우 200 내지 219 357 PGSPGTPGSR(pS)R(pT)PSLPTPP -/+
p타우 200 내지 221 358 PGSPGTPGSR(pS)RTP(pS)LPTPPTR -
p타우 200 내지 224 359 PGSPGTPGSR(pS)RTPSLP(pT)PPTREPK -
CBTAU-22.1: ELISA에 의한 반응성에 대한 펩타이드
펩타이드 SEQ ID NO. 펩타이드 서열
(pX)는 인산화된 아미노산을 나타냄 		결과
p타우 404 내지 421 360 SPRHLSNVSS(pT)GSIDMVD -
p타우 404 내지 429 361 SPRHLSNVSS(pT)GSIDMVD(pS)PQLATLA ++
타우 405 내지 423 362 PRHLSNVSSTGSIDMVDSP -
p타우 406 내지 423 363 RHLSNVSSTG(pS)IDMVDSP -
p타우 406 내지 429 326 RHLSNVSSTG(pS)IDMVD(pS)PQLATLA ++
타우 409 내지 428 364 SNVSSTGSIDMVDSPQLATL -
p타우 412 내지 429 365 SSTGSIDMVD(pS)PQLATLA ++
p타우 412 내지 434 366 SSTGSIDMVD(pS)PQLA(pT)LADEVSA ++
CBTAU -24.1: ELISA에 의한 반응성에 대한 펩타이드
펩타이드 SEQ ID NO. 펩타이드 서열
(pX)는 인산화된 아미노산을 나타냄 		결과
타우 221 내지 253 367 GEPPKSGDRSGYSSPGSPGTPGSRSRTPSLPTPPTREPKKVAVVRTPPKSPSSAKSRLQTAPVPMPDL ++
p타우 221 내지 238 368 REPKKVAVVR(pT)PPKSPSS -
p타우 221 내지 242 369 REPKKVAVVR(pT)PPK(pS)PSSAKSR -
p타우 221 내지 244 370 REPKKVAVVR(pT)PPKSP(pS)SAKSRLQ -
p타우 221 내지 245 328 REPKKVAVVR(pT)PPKSPS(pS)AKSRLQT ++
p타우 225 내지 242 371 KVAVVRTPPK(pS)PSSAKSR -
p타우 225 내지 244 372 KVAVVRTPPK(pS)P(pS)SAKSRLQ -/+
p타우 225 내지 245 330 KVAVVRTPPK(pS)PS(pS)AKSRLQT ++
p타우 227 내지 244 373 AVVRTPPKSP(pS)SAKSRLQ ++
p타우 227 내지 245 374 AVVRTPPKSP(pS)(pS)AKSRLQT ++
p타우 228 내지 245 329 VVRTPPKSPS(pS)AKSRLQT ++
CBTAU -27.1: ELISA에 의한 반응성에 대한 펩타이드
펩타이드 SEQ ID NO. 펩타이드 서열
(pX)는 인산화된 아미노산을 나타냄 		결과
클러스터 1
타우 299 내지 369 331 HVPGGGSVQIVYKPVDLSKVTSKCGSLGNIHHKPGGGQVEVKSEKLDFKDRVQSKIGSLDNITHVPGGGNK ++
클러스터 2
p타우 404 내지 421 p414 360 SPRHLSNVSS(pT)GSIDMVD -
p타우 404 내지 429 p414, 422 361 SPRHLSNVSS(pT)GSIDMVD(pS)PQLATLA -/+
p타우 406 내지 423 p416 363 RHLSNVSSTG(pS)IDMVDSP -
p타우 406 내지 429 p416, 422 326 RHLSNVSSTG(pS)IDMVD(pS)PQLATLA -/+
p타우 412 내지 429 p422 365 SSTGSIDMVD(pS)PQLATLA -/+
p타우 412 내지 434 p422, 427 366 SSTGSIDMVD(pS)PQLA(pT)LADEVSA -/+
타우 299 내지 318 375 HVPGGGSVQIVYKPVDLSKV +
타우 309 내지 328 376 VYKPVDLSKVTSKCGSLGNI -/+
타우 319 내지 338 377 TSKCGSLGNIHHKPGGGQVE -
타우 329 내지 348 378 HHKPGGGQVEVKSEKLDFKD -
타우 339 내지 358 379 VKSEKLDFKDRVQSKIGSLD -
타우 349 내지 369 380 RVQSKIGSLDNITHVPGGGNK -
CBTAU -28.1: ELISA에 의한 반응성에 대한 펩타이드
펩타이드 SEQ ID NO. 펩타이드 서열 결과
타우 42 내지 103 325 GLKESPLQTPTEDGSEEPGSETSDAKSTPTAEDVTAPLVDEGAPGKQAAAQPHT EIPEGTTA ++
타우 42 내지 61 381 GLKESPLQTPTEDGSEEPGS -
타우 52 내지 71 382 TEDGSEEPGSETSDAKSTPT ++
p타우 58 내지 75 383 EPGSETSDAK(pS)TPTAEDV -
타우 62 내지 81 384 ETSDAKSTPTAEDVTAPLVD -
타우 72 내지 91 385 AEDVTAPLVDEGAPGKQAAA -
타우 82 내지 103 386 EGAPGKQAAAQPHTEIPEGTTA -
CBTAU -43.1: ELISA에 의한 반응성에 대한 펩타이드
펩타이드 SEQ ID NO. 펩타이드 서열 결과
타우 299 내지 369 331 HVPGGGSVQIVYKPVDLSKVTSKCGSLGNIHHKPGGGQVEVKSEKLDFKDRVQSKIGSLDNITHVPGGGNK ++
타우 299 내지 318 375 HVPGGGSVQIVYKPVDLSKV ++
타우 309 내지 328 376 VYKPVDLSKVTSKCGSLGNI ++
타우 319 내지 338 377 TSKCGSLGNIHHKPGGGQVE -
타우 329 내지 348 378 HHKPGGGQVEVKSEKLDFKD -
타우 339 내지 358 379 VKSEKLDFKDRVQSKIGSLD -
타우 349 내지 369 380 RVQSKIGSLDNITHVPGGGNK -
CBTAU -46.1: ELISA에 의한 반응성에 대한 펩타이드
펩타이드 SEQ ID NO. 펩타이드 서열 결과
타우 42 내지 103 325 GLKESPLQTPTEDGSEEPGSETSDAKSTPTAEDVTAPLVDEGAPGKQAAAQPHTEIPEGTTA ++
타우 42 내지 61 381 GLKESPLQTPTEDGSEEPGS -
타우 52 내지 71 382 TEDGSEEPGSETSDAKSTPT -
타우 62 내지 81 384 ETSDAKSTPTAEDVTAPLVD -
타우 72 내지 91 385 AEDVTAPLVDEGAPGKQAAA -
타우 82 내지 103 386 EGAPGKQAAAQPHTEIPEGTTA ++
CBTAU -47.1 및 CBTAU -47.2: ELISA에 의한 반응성에 대한 펩타이드
펩타이드 SEQ ID NO. 펩타이드 서열 결과
타우 42 내지 103 325 GLKESPLQTPTEDGSEEPGSETSDAKSTPTAEDVTAPLVDEGAPGKQAAAQPHTEIPEGTTA ++
타우 42 내지 61 381 GLKESPLQTPTEDGSEEPGS -
타우 52 내지 71 382 TEDGSEEPGSETSDAKSTPT ++
타우 62 내지 81 384 ETSDAKSTPTAEDVTAPLVD -
타우 72 내지 91 385 AEDVTAPLVDEGAPGKQAAA -
타우 82 내지 103 386 EGAPGKQAAAQPHTEIPEGTTA -
CBTAU -49.1: ELISA에 의한 반응성에 대한 펩타이드
펩타이드 SEQ ID NO. 펩타이드 서열 결과
타우 42 내지 103 325 GLKESPLQTPTEDGSEEPGSETSDAKSTPTAEDVTAPLVDEGAPGKQAAAQPHTEIPEGTTA ++
타우 42 내지 61 381 GLKESPLQTPTEDGSEEPGS -
타우 52 내지 71 382 TEDGSEEPGSETSDAKSTPT ++
타우 62 내지 81 384 ETSDAKSTPTAEDVTAPLVD -
타우 72 내지 91 385 AEDVTAPLVDEGAPGKQAAA -
타우 82 내지 103 386 EGAPGKQAAAQPHTEIPEGTTA -
ELISA에 의한 반응성에 대한 AT8 펩타이드
펩타이드 SEQ ID NO. 펩타이드 서열
(pX)는 인산화된 아미노산을 나타냄 		결과
p타우 189 내지 212 341 PKSGDRSGYS(pS)PGSPG(pT)PGSRSRT -
타우 192 내지 211 387 GDRSGYSSPGSPGTPGSRSR -
p타우 192 내지 209 343 GDRSGYSSPG(pS)PGTPGSR -
p타우 192 내지 212 344 GDRSGYSSPG(pS)PG(pT)PGSRSRT ++
p타우 192 내지 215 345 GDRSGYSSPG(pS)PGTPG(pS)RSRTPSL -
p타우 192 내지 217 346 GDRSGYSSPG(pS)PGTPGSR(pS)RTPSLPT --
p타우 194 내지 212 315 RSGYSSPG(pS)PG(pT)PGSRSRT ++
타우 194 내지 212* 316 RSGYSSPGSPGTPGSRSRT -
p타우 195 내지 212 347 SGYSSPGSPG(pT)PGSRSRT -
CBTAU-7.1을 AT8 에피토프를 함유하는 펩타이드(표 21; 192 내지 212; pS202, pT205)를 이용해서 회수했지만, CBTAU-7.1에 대한 결합에 기여하는 인산-잔기는 위치 S202+T205, 뿐만 아니라 S198+S202, S198+T205, S199+T205 및 가능하게는 Y197+T205의 조합이 관여되는 무차별적인 것으로 나타났다. 인산화되지 않은 펩타이드는 CBTAU-7.1에 대한 반응성을 나타내지 않았다. CBTAU-18.1에 있어서, 최소 에피토프는 아미노산 198 내지 217로 구성되며 pS210에 의존적이지만, T212, S214 또는 T217이 또한 인산화된 경우에는 그렇지 않은 것으로 나타났다. CBTAU-22.1 반응성은 pS422에 대해 의존적인 것으로 나타난 반면, 항체 CBTAU-24.1은 그 해당하는 인산화되지 않은 펩타이드에 대한 강한 결합을 나타냈으며, 이에 따라 인산화에 의해 영향받지 않음을 드러내었다.
CBTAU-27.1 및 CBTAU-43.1을 아미노산 299 내지 369에 걸친 인산화되지 않은 펩타이드를 이용해서 회수하였다. 흥미롭게는, 상기 영역 내의 중복 펩타이드는 두 mAb(즉 각각 아미노산 299 내지 318 및 309 내지 328에 걸친 펩타이드에 반응한 CBTAU-27.1 및 CBTAU-43.1) 모두에 대해 유사한 결합 요건을 드러내어 두 mAb에 대한 에피토프가 타우441 상의 영역 299 내지 328 내에 있음을 제시하였다(도 4a 및 도 4c).
CBTAU-28.1, 46.1, 47.1, 47.2 및 49.1을 타우441 상의 영역 42 내지 103에 걸친 펩타이드를 이용하여 인간 공여체 샘플로부터 회수하였다. 더 작은 중복 펩타이드 세트에 대한 각각의 mAb의 반응성 평가는 CBTAU-28.1과 마찬가지로(즉, 영역 52 내지 71에 걸치는 펩타이드에 대한 반응성) CBTAU-47.1, 47.2 및 49.1에 대한 유사한 결합을 나타내어, 필적하는 결합 요건을 제시하였다; 그러나 CBTAU-46.1은 상기 언급된 mAb에 대한 C-말단 영역(즉, 82 내지 1031; 도 4b 및 도 4d 내지 4g)에 결합하였다.
실시예 10
펩타이드 에피토프의 알라닌 스캐닝
각각의 회수된 mAb의 결합에 대한 특이성 및 아미노산 기여를 추가로 특성규명하기 위해, 각 위치가 알라닌으로 대체된 타우 펩타이드에 대한 이들의 반응성을 ELISA에 의해 평가하였다. 모든 실험 프로토콜은 실시예 9와 동일하였다. 1 ㎍/mL에서의 항체 반응성을 ELISA에 의해 결정하고, 결합 없음(-), 약함(-/+), 중간 정도(+), 또는 강함(++)으로 스코어링하였다. 2회의 O.D. 450 nm 판독치의 평균 <0.3에 대해 (-); >0.5 및 <1.0에 대해 (-/+); >1.0 및 <1.5에 대해 (+); >1.5에 대해 (++). 각각의 항체에 대한 결과를 표 22 내지 표 29에 나타낸다.
CBTAU -7.1 및 CBTAU -8.1에 대한 알라닌 스캐닝 결과
영역
(타우441)		 SEQ ID NO 펩타이드 서열(pX)은 인산화된 아미노산을 나타냄 결과 7.1 결과 8.1
p타우 187 내지 212 334 EPPKSGDRSGYSSPG(pS)PG(pT)PGSRSRT ++ ++
p타우 187 내지 212(A187) 388 APPKSGDRSGYSSPG(pS)PG(pT)PGSRSRT + ++
p타우 187 내지 212(A188) 389 EAPKSGDRSGYSSPG(pS)PG(pT)PGSRSRT + ++
p타우 187 내지 212(A189) 390 EPAKSGDRSGYSSPG(pS)PG(pT)PGSRSRT + ++
p타우 187 내지 212(A190) 391 EPPASGDRSGYSSPG(pS)PG(pT)PGSRSRT ++ ++
p타우 187 내지 212(A191) 392 EPPKAGDRSGYSSPG(pS)PG(pT)PGSRSRT ++ ++
p타우 187 내지 212(A192) 393 EPPKSADRSGYSSPG(pS)PG(pT)PGSRSRT ++ ++
p타우 187 내지 212(A193) 394 EPPKSGARSGYSSPG(pS)PG(pT)PGSRSRT ++ ++
p타우 187 내지 212(A194) 395 EPPKSGDASGYSSPG(pS)PG(pT)PGSRSRT ++ ++
p타우 187 내지 212(A195) 396 EPPKSGDRAGYSSPG(pS)PG(pT)PGSRSRT ++ ++
p타우 187 내지 212(A196) 397 EPPKSGDRSAYSSPG(pS)PG(pT)PGSRSRT ++ ++
p타우 187 내지 212(A197) 398 EPPKSGDRSGASSPG(pS)PG(pT)PGSRSRT ++ ++
p타우 187 내지 212(A198) 399 EPPKSGDRSGYASPG(pS)PG(pT)PGSRSRT ++ ++
p타우 187 내지 212(A199) 400 EPPKSGDRSGYSAPG(pS)PG(pT)PGSRSRT + ++
p타우 187 내지 212(A200) 401 EPPKSGDRSGYSSAG(pS)PG(pT)PGSRSRT + ++
p타우 187 내지 212(A201) 402 EPPKSGDRSGYSSPA(pS)PG(pT)PGSRSRT ++ ++
p타우 187 내지 212(A202) 403 EPPKSGDRSGYSSPGAPG(pT)PGSRSRT + ++
p타우 187 내지 212(A203) 404 EPPKSGDRSGYSSPG(pS)AG(pT)PGSRSRT ++ ++
p타우 187 내지 212(A204) 405 EPPKSGDRSGYSSPG(pS)PA(pT)PGSRSRT -/+ +
p타우 187 내지 212(A205) 406 EPPKSGDRSGYSSPG(pS)PGAPGSRSRT -/+ -/+
p타우 187 내지 212(A206) 407 EPPKSGDRSGYSSPG(pS)PG(pT)AGSRSRT -/+ -
p타우 187 내지 212(A207) 408 EPPKSGDRSGYSSPG(pS)PG(pT)PASRSRT ++ -/+
p타우 187 내지 212(A208) 409 EPPKSGDRSGYSSPG(pS)PG(pT)PGARSRT ++ ++
p타우 187 내지 212(A209) 410 EPPKSGDRSGYSSPG(pS)PG(pT)PGSASRT ++ -
p타우 187 내지 212(A210) 411 EPPKSGDRSGYSSPG(pS)PG(pT)PGSRART ++ ++
p타우 187 내지 212(A211) 412 EPPKSGDRSGYSSPG(pS)PG(pT)PGSRSAT ++ ++
p타우 187 내지 212(A212) 413 EPPKSGDRSGYSSPG(pS)PG(pT)PGSRSRA ++ ++
CBTAU -22.1에 대한 알라닌 스캐닝 결과
영역
(타우441)		 SEQ ID NO 펩타이드 서열(pX)은 인산화된 아미노산을 나타냄 결과
p타우 406 내지 429 326 RHLSNVSSTG(pS)IDMVD(pS)PQLATLA ++
p타우 406 내지 429(A406) 414 AHLSNVSSTG(pS)IDMVD(pS)PQLATLA ++
p타우 406 내지 429(A407) 415 RALSNVSSTG(pS)IDMVD(pS)PQLATLA ++
p타우 406 내지 429(A408) 416 RHASNVSSTG(pS)IDMVD(pS)PQLATLA ++
p타우 406 내지 429(A409) 417 RHLANVSSTG(pS)IDMVD(pS)PQLATLA ++
p타우 406 내지 429(A410) 418 RHLSAVSSTG(pS)IDMVD(pS)PQLATLA ++
p타우 406 내지 429(A411) 419 RHLSNASSTG(pS)IDMVD(pS)PQLATLA ++
p타우 406 내지 429(A412) 420 RHLSNVASTG(pS)IDMVD(pS)PQLATLA ++
p타우 406 내지 429(A413) 421 RHLSNVSATG(pS)IDMVD(pS)PQLATLA ++
p타우 406 내지 429(A414) 422 RHLSNVSSAG(pS)IDMVD(pS)PQLATLA ++
p타우 406 내지 429(A415) 423 RHLSNVSSTA(pS)IDMVD(pS)PQLATLA ++
p타우 406 내지 429(A416) 424 RHLSNVSSTGAIDMVD(pS)PQLATLA ++
p타우 406 내지 429(A417) 425 RHLSNVSSTG(pS)ADMVD(pS)PQLATLA ++
p타우 406 내지 429(A418) 426 RHLSNVSSTG(pS)IAMVD(pS)PQLATLA ++
p타우 406 내지 429(A419) 427 RHLSNVSSTG(pS)IDAVD(pS)PQLATLA ++
p타우 406 내지 429(A420) 428 RHLSNVSSTG(pS)IDMAD(pS)PQLATLA ++
p타우 406 내지 429(A421) 429 RHLSNVSSTG(pS)IDMVA(pS)PQLATLA -/+
p타우 406 내지 429(A422) 430 RHLSNVSSTG(pS)IDMVDAPQLATLA -
p타우 406 내지 429(A423) 431 RHLSNVSSTG(pS)IDMVD(pS)AQLATLA ++
p타우 406 내지 429(A424) 432 RHLSNVSSTG(pS)IDMVD(pS)PALATLA ++
p타우 406 내지 429(A425) 433 RHLSNVSSTG(pS)IDMVD(pS)PQAATLA ++
p타우 406 내지 429(A427) 434 RHLSNVSSTG(pS)IDMVD(pS)PQLAALA ++
p타우 406 내지 429(A428) 435 RHLSNVSSTG(pS)IDMVD(pS)PQLATAA ++
CBTAU -24.1 알라닌 스캐닝 결과
영역
(타우441)		 SEQ ID NO 펩타이드 서열(pX)은 인산화된 아미노산을 나타냄 결과
p타우 221 내지 245 328 REPKKVAVVR(pT)PPKSPS(pS)AKSRLQT ++
p타우 221 내지 245(A222) 436 RAPKKVAVVR(pT)PPKSPS(pS)AKSRLQT ++
p타우 221 내지 245(A223) 437 REAKKVAVVR(pT)PPKSPS(pS)AKSRLQT ++
p타우 221 내지 245(A224) 438 REPAKVAVVR(pT)PPKSPS(pS)AKSRLQT ++
p타우 221 내지 245(A225) 439 REPKAVAVVR(pT)PPKSPS(pS)AKSRLQT ++
p타우 221 내지 245(A226) 440 REPKKAAVVR(pT)PPKSPS(pS)AKSRLQT ++
p타우 221 내지 245(A228 ) 441 REPKKVAAVR(pT)PPKSPS(pS)AKSRLQT ++
p타우 221 내지 245(A229) 442 REPKKVAVAR(pT)PPKSPS(pS)AKSRLQT ++
p타우 221 내지 245(A230) 443 REPKKVAVVA(pT)PPKSPS(pS)AKSRLQT ++
p타우 221 내지 245(A231) 444 REPKKVAVVRAPPKSPS(pS)AKSRLQT ++
p타우 221 내지 245(A232) 445 REPKKVAVVR(pT)APKSPS(pS)AKSRLQT ++
p타우 221 내지 245(A233) 446 REPKKVAVVR(pT)PAKSPS(pS)AKSRLQT ++
p타우 221 내지 245(A234) 447 REPKKVAVVR(pT)PPASPS(pS)AKSRLQT ++
p타우 221 내지 245(A235) 448 REPKKVAVVR(pT)PPKAPS(pS)AKSRLQT ++
p타우 221 내지 245(A236) 449 REPKKVAVVR(pT)PPKSAS(pS)AKSRLQT -
p타우 221 내지 245(A237) 450 REPKKVAVVR(pT)PPKSPA(pS)AKSRLQT ++
p타우 221 내지 245(A238) 451 REPKKVAVVR(pT)PPKSPSAAKSRLQT ++
p타우 221 내지 245(A240) 452 REPKKVAVVR(pT)PPKSPS(pS)AASRLQT ++
p타우 221 내지 245(A241) 453 REPKKVAVVR(pT)PPKSPS(pS)AKARLQT ++
p타우 221 내지 245(A242) 454 REPKKVAVVR(pT)PPKSPS(pS)AKSALQT ++
p타우 221 내지 245(A243) 455 REPKKVAVVR(pT)PPKSPS(pS)AKSRAQT ++
p타우 221 내지 245(A244) 456 REPKKVAVVR(pT)PPKSPS(pS)AKSRLAT ++
p타우 221 내지 245(A245) 457 REPKKVAVVR(pT)PPKSPS(pS)AKSRLQA ++
CBTAU -27.1 알라닌 스캐닝 결과
영역
(타우441)		 SEQ ID NO: 펩타이드 서열 결과
타우 299 내지 323 458 HVPGGGSVQIVYKPVDLSKVTSKCG ++
타우 299 내지 323(A299) 459 AVPGGGSVQIVYKPVDLSKVTSKCG ++
타우 299 내지 323(A300) 460 HAPGGGSVQIVYKPVDLSKVTSKCG ++
타우 299 내지 323(A301) 461 HVAGGGSVQIVYKPVDLSKVTSKCG ++
타우 299 내지 323(A302) 462 HVPAGGSVQIVYKPVDLSKVTSKCG ++
타우 299 내지 323(A303) 463 HVPGAGSVQIVYKPVDLSKVTSKCG ++
타우 299 내지 323(A304) 464 HVPGGASVQIVYKPVDLSKVTSKCG ++
타우 299 내지 323(A305) 465 HVPGGGAVQIVYKPVDLSKVTSKCG ++
타우 299 내지 323(A306) 466 HVPGGGSAQIVYKPVDLSKVTSKCG ++
타우 299 내지 323(A307) 467 HVPGGGSVAIVYKPVDLSKVTSKCG ++
타우 299 내지 323(A308) 468 HVPGGGSVQAVYKPVDLSKVTSKCG ++
타우 299 내지 323(A309) 469 HVPGGGSVQIAYKPVDLSKVTSKCG ++
타우 299 내지 323(A310) 470 HVPGGGSVQIVAKPVDLSKVTSKCG ++
타우 299 내지 323(A311) 471 HVPGGGSVQIVYAPVDLSKVTSKCG ++
타우 299 내지 323(A312) 472 HVPGGGSVQIVYKAVDLSKVTSKCG ++
타우 299 내지 323(A313) 473 HVPGGGSVQIVYKPADLSKVTSKCG ++
타우 299 내지 323(A314) 474 HVPGGGSVQIVYKPVALSKVTSKCG -/+
타우 299 내지 323(A315) 475 HVPGGGSVQIVYKPVDASKVTSKCG -
타우 299 내지 323(A316) 476 HVPGGGSVQIVYKPVDLAKVTSKCG ++
타우 299 내지 323(A317) 477 HVPGGGSVQIVYKPVDLSAVTSKCG -
타우 299 내지 323(A318) 478 HVPGGGSVQIVYKPVDLSKATSKCG ++
타우 299 내지 323(A319) 479 HVPGGGSVQIVYKPVDLSKVASKCG ++
타우 299 내지 323(A320) 480 HVPGGGSVQIVYKPVDLSKVTAKCG ++
타우 299 내지 323(A321) 481 HVPGGGSVQIVYKPVDLSKVTSACG ++
타우 299 내지 323(A322) 482 HVPGGGSVQIVYKPVDLSKVTSKAG ++
타우 299 내지 323(A323) 483 HVPGGGSVQIVYKPVDLSKVTSKCA ++
CBTAU -28.1 알라닌 스캐닝 결과
영역
(타우441)		 SEQ ID NO 펩타이드 서열 결과
타우 52 내지 71 382 TEDGSEEPGSETSDAKSTPT ++
타우 52 내지 71(A52) 484 AEDGSEEPGSETSDAKSTPT ++
타우 52 내지 71(A53) 485 TADGSEEPGSETSDAKSTPT ++
타우 52 내지 71(A54) 486 TEAGSEEPGSETSDAKSTPT ++
타우 52 내지 71(A55) 487 TEDASEEPGSETSDAKSTPT ++
타우 52 내지 71(A56) 488 TEDGAEEPGSETSDAKSTPT ++
타우 52 내지 71(A57) 489 TEDGSAEPGSETSDAKSTPT ++
타우 52 내지 71(A58) 490 TEDGSEAPGSETSDAKSTPT ++
타우 52 내지 71(A59) 491 TEDGSEEAGSETSDAKSTPT -/+
타우 52 내지 71(A60) 492 TEDGSEEPASETSDAKSTPT ++
타우 52 내지 71(A61) 493 TEDGSEEPGAETSDAKSTPT ++
타우 52 내지 71(A62) 494 TEDGSEEPGSATSDAKSTPT -
타우 52 내지 71(A63) 495 TEDGSEEPGSEASDAKSTPT -/+
타우 52 내지 71(A64) 496 TEDGSEEPGSETADAKSTPT ++
타우 52 내지 71(A65) 497 TEDGSEEPGSETSAAKSTPT -
타우 52 내지 71(A67) 498 TEDGSEEPGSETSDAASTPT -
타우 52 내지 71(A68) 499 TEDGSEEPGSETSDAKATPT ++
타우 52 내지 71(A69) 500 TEDGSEEPGSETSDAKSAPT ++
타우 52 내지 71(A70) 501 TEDGSEEPGSETSDAKSTAT ++
타우 52 내지 71(A71) 502 TEDGSEEPGSETSDAKSTPA ++
CBTAU -43.1 알라닌 스캐닝 결과
영역
(타우441)		 SEQ ID NO: 펩타이드 서열 결과
타우 299 내지 323 458 HVPGGGSVQIVYKPVDLSKVTSKCG ++
타우 299 내지 323(A299) 459 AVPGGGSVQIVYKPVDLSKVTSKCG ++
타우 299 내지 323(A300) 460 HAPGGGSVQIVYKPVDLSKVTSKCG ++
타우 299 내지 323(A301) 461 HVAGGGSVQIVYKPVDLSKVTSKCG ++
타우 299 내지 323(A302) 462 HVPAGGSVQIVYKPVDLSKVTSKCG ++
타우 299 내지 323(A303) 463 HVPGAGSVQIVYKPVDLSKVTSKCG ++
타우 299 내지 323(A304) 464 HVPGGASVQIVYKPVDLSKVTSKCG ++
타우 299 내지 323(A305) 465 HVPGGGAVQIVYKPVDLSKVTSKCG ++
타우 299 내지 323(A306) 466 HVPGGGSAQIVYKPVDLSKVTSKCG ++
타우 299 내지 323(A307) 467 HVPGGGSVAIVYKPVDLSKVTSKCG ++
타우 299 내지 323(A308) 468 HVPGGGSVQAVYKPVDLSKVTSKCG ++
타우 299 내지 323(A309) 469 HVPGGGSVQIAYKPVDLSKVTSKCG ++
타우 299 내지 323(A310) 470 HVPGGGSVQIVAKPVDLSKVTSKCG ++
타우 299 내지 323(A311) 471 HVPGGGSVQIVYAPVDLSKVTSKCG ++
타우 299 내지 323(A312) 472 HVPGGGSVQIVYKAVDLSKVTSKCG -/+
타우 299 내지 323(A313) 473 HVPGGGSVQIVYKPADLSKVTSKCG ++
타우 299 내지 323(A314) 474 HVPGGGSVQIVYKPVALSKVTSKCG ++
타우 299 내지 323(A315) 475 HVPGGGSVQIVYKPVDASKVTSKCG -
타우 299 내지 323(A316) 476 HVPGGGSVQIVYKPVDLAKVTSKCG ++
타우 299 내지 323(A317) 477 HVPGGGSVQIVYKPVDLSAVTSKCG -
타우 299 내지 323(A318) 478 HVPGGGSVQIVYKPVDLSKATSKCG ++
타우 299 내지 323(A319) 479 HVPGGGSVQIVYKPVDLSKVASKCG ++
타우 299 내지 323(A320) 480 HVPGGGSVQIVYKPVDLSKVTAKCG ++
타우 299 내지 323(A321) 481 HVPGGGSVQIVYKPVDLSKVTSACG ++
타우 299 내지 323(A322) 482 HVPGGGSVQIVYKPVDLSKVTSKAG ++
타우 299 내지 323(A323) 483 HVPGGGSVQIVYKPVDLSKVTSKCA ++
CBTAU -47.1 및 47.2 알라닌 스캐닝 결과
영역
(타우441)		 SEQ ID NO 펩타이드 서열 결과
CBTAU-47.1		 결과
CBTAU-47.2
타우 52 내지 71 382 TEDGSEEPGSETSDAKSTPT ++ ++
타우 52 내지 71(A52) 484 AEDGSEEPGSETSDAKSTPT ++ ++
타우 52 내지 71(A53) 485 TADGSEEPGSETSDAKSTPT ++ ++
타우 52 내지 71(A54) 486 TEAGSEEPGSETSDAKSTPT ++ ++
타우 52 내지 71(A55) 487 TEDASEEPGSETSDAKSTPT ++ ++
타우 52 내지 71(A56) 488 TEDGAEEPGSETSDAKSTPT ++ ++
타우 52 내지 71(A57) 489 TEDGSAEPGSETSDAKSTPT ++ ++
타우 52 내지 71(A58) 490 TEDGSEAPGSETSDAKSTPT ++ ++
타우 52 내지 71(A59) 491 TEDGSEEAGSETSDAKSTPT - -
타우 52 내지 71(A60) 492 TEDGSEEPASETSDAKSTPT ++ ++
타우 52 내지 71(A61) 493 TEDGSEEPGAETSDAKSTPT -/+ ++
타우 52 내지 71(A62) 494 TEDGSEEPGSATSDAKSTPT - -
타우 52 내지 71(A63) 495 TEDGSEEPGSEASDAKSTPT - -
타우 52 내지 71(A64) 496 TEDGSEEPGSETADAKSTPT ++ ++
타우 52 내지 71(A65) 497 TEDGSEEPGSETSAAKSTPT - -
타우 52 내지 71(A67) 498 TEDGSEEPGSETSDAASTPT - -
타우 52 내지 71(A68) 499 TEDGSEEPGSETSDAKATPT ++ ++
타우 52 내지 71(A69) 500 TEDGSEEPGSETSDAKSAPT ++ ++
타우 52 내지 71(A70) 501 TEDGSEEPGSETSDAKSTAT ++ ++
타우 52 내지 71(A71) 502 TEDGSEEPGSETSDAKSTPA ++ ++
CBTAU-49.1 알라닌 스캐닝 결과
영역
(타우441)		 SEQ ID NO 펩타이드 서열 결과
타우 52 내지 71 382 TEDGSEEPGSETSDAKSTPT ++
타우 52 내지 71(A52) 484 AEDGSEEPGSETSDAKSTPT ++
타우 52 내지 71(A53) 485 TADGSEEPGSETSDAKSTPT ++
타우 52 내지 71(A54) 486 TEAGSEEPGSETSDAKSTPT ++
타우 52 내지 71(A55) 487 TEDASEEPGSETSDAKSTPT ++
타우 52 내지 71(A56) 488 TEDGAEEPGSETSDAKSTPT ++
타우 52 내지 71(A57) 489 TEDGSAEPGSETSDAKSTPT ++
타우 52 내지 71(A58) 490 TEDGSEAPGSETSDAKSTPT ++
타우 52 내지 71(A59) 491 TEDGSEEAGSETSDAKSTPT -
타우 52 내지 71(A60) 492 TEDGSEEPASETSDAKSTPT ++
타우 52 내지 71(A61) 493 TEDGSEEPGAETSDAKSTPT -
타우 52 내지 71(A62) 494 TEDGSEEPGSATSDAKSTPT -
타우 52 내지 71(A63) 495 TEDGSEEPGSEASDAKSTPT +
타우 52 내지 71(A64) 496 TEDGSEEPGSETADAKSTPT +
타우 52 내지 71(A65) 497 TEDGSEEPGSETSAAKSTPT -
타우 52 내지 71(A67) 498 TEDGSEEPGSETSDAASTPT -
타우 52 내지 71(A68) 499 TEDGSEEPGSETSDAKATPT +
타우 52 내지 71(A69) 500 TEDGSEEPGSETSDAKSAPT +
타우 52 내지 71(A70) 501 TEDGSEEPGSETSDAKSTAT +
타우 52 내지 71(A71) 502 TEDGSEEPGSETSDAKSTPA +
CBTAU-7.1 및 CBTAU-8.1은 AT8 에피토프(즉, pS202, pT205) 함유 타우 인산펩타이드를 이용해서 회수했지만, 두 mAb는 모두 알라닌 스캐닝 결과에 따라 상이한 에피토프 요건을 나타내었다(표 22). S202 및 T205에 부가하여, 위치 G204 및 P206에서의 치환은 CBTAU-7.1에 대해 감소된 결합을 야기하였다. 대조적으로, 위치 G204, T205, P206 및 R209에서의 알라닌 치환은 펩타이드에 대해 CBTAU-8.1의 반응성을 감소시켰지만, S202A 치환은 효과를 갖지 않았다. AT8과 마찬가지로, 두 mAb는 모두 인산-의존적이지만, 결합을 위해 추가(인산화되지 않은 잔기)를 필요로 한다. CBTAU-22.1에 대한 알라닌 스캐닝 결과는 상기 위치에서의 치환이 결합을 완전히 저해하였으므로, S422에서의 인산화에 대한 의존성을 나타내었다(표 23). D421에서의 치환은 결합에서 완전한 저해가 아닌 감소를 야기하였다. 마지막으로, CBTAU-24.1에 대한 알라닌 스캐닝 결과는 P236이 결합을 위해 유일한 결정적 잔기임을 나타내었다(표 24).
CBTAU-27.1 및 43.1에 대한 결정적 접촉 잔기를 맵핑하기 위해, 타우의 영역 299 내지 323 내에서 알라닌 스캐닝을 또한 수행하였다(각각 표 25 및 표 27). CBTAU-27.1 결합에 대한 결정적 접촉 잔기는 D314, L315 및 K317인 것으로 나타났다. 결과는 잔기 D314 및 K317이 mAb 상의 CDR 잔기 및 에피토프 간에 염 가교 상호작용을 형성할 수 있음을 제시한다. CBTAU-43.1은 CBAU-27.1에 대한 인지체 펩타이드를 이용해서 회수했지만, 알라닌 스캐닝에 따른 결정적 잔기는 상이하였다. L315 및 K317에 부가하여, 위치 312에서의 프롤린이 CBTAU-43.1 결합을 위해 중요한 접촉인 것으로 나타났다. 마지막으로, CBTAU-47.1, 47.1 및 49.1뿐만 아니라 CBTAU-28.1에 대해 알라닌 스캐닝을 또한 수행하였다(표 26, 28, 29). 실시예 9에 나타낸 바와 같이, CBTAU mAb 47.1, 47.2, 49.1은 CBTAU-28.1과 동일한 펩타이드 영역(즉, 52 내지 71)에 맵핑되었다. 흥미롭게도, 모든 mAb는 CBTAU-28.1과 동일한 결합 요건을 공유하였다. 결정적 접촉 잔기는 P59, S61, E62, T63, D65 및 K67인 것으로 나타났다. 몇몇 이들 잔기는 하전된 것으로 나타나서, 에피토프 및 mAb 간의 중요한 염 가교 상호작용을 시사하였다.
실시예 11
면역조직화학
타우 병리는 코내 피질(EC) 내에서 개시되고 피질 내로 진행되기 전에 해마에서 연결된 뉴론 경로를 따라 확산되는 것으로 여겨진다. 이들 뉴론 경로를 따른 타우의 병리적 침착물에 대한 회수된 IgG의 반응성을 결정하기 위해, 82세, 비질환(비-AD; Abcam, Cat No. ab4305) 남성 및 88세 알츠하이머병(AD; Abcam, Cat. No. ab4583) 남성(Abcam)으로부터 해마 조직을 수득하였다. 피질 조직을 71세 비-질환(비-AD) 및 71세 알츠하이머병(AD) 개인(Banner Sun Health)으로부터 수득하였다. AD에 부가하여, 타우병증으로도 알려져 있는 타우 병리를 특징으로 하는 여러 신경학적 장애가 존재한다. 본 발명자들의 발견을 연장하기 위해, 각각 73세 남성 및 81세 여성으로부터 수득된 진행성 핵상 마비(PSP) 및 비-진행성 핵상 마비(비-PSP) 전두엽으로부터 수득된 조직에서 회수된 mAb를 평가하였다(Biochain). 뇌 조직을 탈-파라핀화하고 Tissue-Tek® 슬라이드 염색 세트(VWR International)를 이용하여 자일렌 중에서 10 분 동안 2회 세척하여 재수화한 뒤(VWR International), 100% 에탄올 중 3분 동안 2회, 95% 에탄올 중 3분 동안 2회, 70% 에탄올 중 3분 동안 2회, 그리고 증류 H2O수 중에서 30초 동안 1회 세척하였다. 조직 섹션으로 시트레이트 완충액(10 mM 시트르산, pH 6.0)을 이용하여 열 매개된 항원 회수를 거쳐 항원 부위를 노출시켰다. 이어서 섹션을 1 hr 동안 RT에서 차단 완충액[PBS 중 10% 정상 염소 혈청(Jackson ImmunoResearch, Inc.), 1% BSA 및 0.3% Triton-X100)]과 인큐베이션하였다. 과량의 물을 제거하고 조직 섹션을 ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen(Vector Labs)으로 선회하였다. H2O로 염색 트레이의 바닥을 덮어서 가습된 챔버를 제조한 뒤 섹션을 흡입에 의해 5분 동안 3회 PBS로 세척하였다. 내인성 퍼옥시다아제 활성을 RT에서 30분 동안 10% H2O2 중에 켄칭하였다. 켄칭 후, 슬라이드를 흡입에 의해 5분 동안 3회 PBS로 세척하였다. 그 뒤, 슬라이드를 RT에서 1 hr 동안 1X PBS 중 10% 정상 염소 혈청, 0.3% TritonX-100, 1% BSA 용액으로 차단하였다. 일차 항체를 제조업체의 지침에 따라 Zenon 인간 IgG 표지 키트(Life Technologies)를 이용해서 바이오틴으로 표지하였다. 음성 대조군으로서, 인간 항-RSV 특이적 항체를 이용하였다. AT8 IgG의 Fc-영역 인간 키메라화 버전을 양성 대조군으로 이용하였다. 표지 후, 일차 항체를 차단 완충액 중에 5 ㎍/ml 및 20 ㎍/ml의 농도로 별도 희석하였다. 펩타이드 경쟁 실험을 위해, 13.3 μM의 인지체 펩타이드(즉, 정렬 실험에서 mAb를 회수하기 위해 이용된 펩타이드)를 조직 섹션과의 인큐베이션 전에 RT에서 30분 동안 일차 항체와 사전-인큐베이션하였다. 조직 섹션을 100 ㎕의 희석된 바이오틴 표지 일차 항체 또는 펩타이드 경쟁 항체와 2 hr 동안 RT에서 인큐베이션하였다. 항체를 흡입에 의해 제거한 후, PBS 중 4% 포름알데하이드에서 조직 섹션의 이차 고정을 수행하고, RT에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 섹션을 흡입에 의해 5분 동안 3회 PBS로 세척하였다. 이어서 섹션을 PBS로 세척 전에 스트렙타비딘 기질 Vectastain ABC 시약(Vector Labs)과 30분 동안 인큐베이션하였다. 그 뒤 조직을 니켈의 존재 하에 DAB 기질(Vector Labs)로 발색시켰다. 이어서 섹션을 ddH2O로 2회 세척하고 50 ㎕의 VectaMount 영구 실장 배지(Vector Labs)로 실장 전에 RT에서 완전 건조되도록 했다. 마지막으로, 조직 섹션을 헤마톡실린(Vector Labs)으로 카운터염색하였다. 대표 영상을 MetaMorph 소프트웨어를 이용해서 Olympus BX-41 업라이트 현미경으로 입수하였다.
면역조직화학 결과를 도 5a 내지 도 5d에 나타낸다. CBTAU-7.1 및 CBTAU-8.1은 건강한 뇌 조직이 아니라 AD 뇌 조직 상에서 특이적으로 양성 면역반응성을 나타내었으며, 이는 질환 뇌 조직에 존재하는 병리적 타우 침착물에 대한 결합을 제시하였다. 이들 항체는 해마(도 5a; 코내 피질) 및 대뇌 피질(도 5b)의 하위영역에서 AT8 양성 타우 매듭 및 호중구 스레드를 인식한다. 또한, 양성 면역반응성은 뉴론 세포질 및 돌기에서 여러 실험에 걸쳐 일관되게 확인되었다. 부가적으로, CBTAU-18.1, 22.1 및 24.1을 또한 해마 및 피질 조직 섹션에 대해 평가하였다(도 5a 내지 도 5b). CBTAU-7.1 및 CBTAU-8.1과 유사하게, 모든 mAb는 비-AD 조직 섹션 상의 타우가 아니라 AD 조직 섹션 상의 타우와 특이적으로 반응하였다. 흥미롭게도, 인산화된 타우에 특이적인 것이 아닌 CBTAU-24.1은 비-AD 섹션 상의 타우가 아니라 AD 조직 섹션 상의 질환 타우와 특이적으로 반응한다. 마지막으로, CBTAU-16.1 및 CBTAU-20.1은 비-AD 및 AD 조직 섹션 모두에서 타우에 대한 반응성을 나타낸다.
부가적으로, CBTAU-7.1, 8.1, 16.1, 18.1, 20.1, 22.1 및 24.1을 진행성 핵상 마비에 해당하는 피질 조직 섹션 상에서 평가하였다(도 5c). AT8과는 다르게, CBTAU-7.1 및 CBTAU-8.1은 인간 PSP 뇌에서 타우 매듭을 검출하는데 실패하여, 두 mAb에 대한 에피토프가 PSP 상에 존재하지 않음을 제시하였다. CBTAU-16.1 및 CBTAU-20.1은 비-PSP 및 PSP 피질 뇌 섹션 상에서 타우에 대한 양성 면역반응성을 나타내어, 정상 타우 및 타우의 병리적 형태 둘 다에 대한 결합을 제시하였다. 비-AD 뇌 섹션에서, 이들 항체는 뉴론 세포질 및 돌기에서 타우의 양성 면역염색을 나타내었지만(도 5a 및 5b), 두 mAb는 모두 AT8과 유사하게 AD 뇌 섹션에서 매듭 및 호중구 스레드를 검출하였다. 타우 매듭에 대해 AT8과 유사한 면역반응성이 또한 PSP 뇌 조직 섹션에서 검출되어, CBTAU-16.1 및 CBTAU-20.1 둘 다 다른 비-AD 타우병증에서 공통적인 병리적 타우 형태를 인식함을 제시하였다. 또한, CBTAU-22.1 및 CBTAU-24.1은 매듭 및 호중구 스레드에 대한 양성 면역반응성과 함께 AD 뇌 조직에서 배타적으로 면역반응성을 나타내었다. CBTAU-18.1은 비-AD 뇌 조직에서 약한 면역반응성을 나타내었지만 AD 조직 샘플과 더 강하게 반응하였다. CBTAU-18.1, CBTAU-22.1 및 CBTAU-24.1도 PSP 뇌 조직 섹션에서 타우 매듭에 대해 양성이었다(도 5c).
CBTAU-27.1 및 CBTAU-28.1은 뉴론 세포질 및 돌기에서 확산성 면역염색을 가지며 비-AD 조직 섹션에서 선택적 면역염색을 나타내었다. 흥미롭게도, 두 항체 모두 AD 조직 섹션(해마 및 피질 모두)에서 면역반응성을 나타내지 못하여, 질환 진행 동안 소실되는 신규한 에피토프를 정의하였다. 본 발명자들이 동정한 대부분의 인간 항-타우 mAb와는 다르게, CBTAU-27.1 및 CBTAU-28.1을 인간 타우441의 전체 영역에 걸쳐 인산화되지 않은 펩타이드 세트를 이용해서 공여체 샘플을 스크리닝함으로써 회수하였다. 이들 항체는 결합을 위해 인산화를 필요로 하지 않으며(도 1), 도 2에 나타낸 바와 같이 ELISA에 의해 PHF와 반응하지 않는다. 따라서, 이들 두 mAb에 대해 관찰된 확산성 면역염색 패턴이 예상되었다. 부가적으로, 원래 CBTAU-27.1 인지체 펩타이드를 이용해서 회수된 CBTAU-43.1을 피질 조직 섹션에 대해 평가하였다. CBTAU-43.1은 CBTAU-27.1과 유사하게 반응하여, AD 조직 섹션 상의 타우가 아니라 비-AD 상의 타우를 염색하였다. 마찬가지로, CBTAU-28.1 인지체 펩타이드를 이용해서 회수된 CBTAU-46.1, 47.2(하나의 변이체만 평가함) 및 49.1은 AD 조직 섹션이 아닌 비-AD 상의 타우와 특이적으로 반응하였다(도 5d). 이들 mAb는 모두 공통 중쇄 및 경쇄 생식계열(즉, VH5-51 및 VK4-1)을 공유하며, 타우 상에서 동일한 영역에 결합하고, 도 5d에 나타낸 바와 같이 유사한 면역조직화학 특성을 공유함을 주지하는 것이 흥미롭다.
CBTAU-7.1, 8.1, 18.1, 22.1, 24.1, 27.1 및 28.1에 대해 여기 나타낸 면역조직화학 결과를 몇몇 비-AD 및 AD 개인에 해당하는 뇌 및 조직 샘플의 여러 영역 상에서 확인하였다. CBTAU mAb 43.1, 46.1, 47.2 및 49.1의 면역반응성을 동일한 조직 샘플을 이용하여 한 번 확인하였으나 다른 AD 및 비-AD 개인에 해당하는 샘플 상에서는 아직 확인하지 않았다.
실시예 12
탈인산화 IHC
CBTAU-28.1에 대한 IHC 결과가 AD 조직 섹션 상의 타우가 아닌 비-AD 조직 섹션 상의 타우에 대한 면역반응성을 나타내었으므로, 본 발명자들은 질환 진행 동안 상기 에피토프의 손실이 개질(들)(즉, 인산화)의 결과라고 가정하였다. 상기 가설을 평가하기 위해, 인간 뇌 조직 섹션을 CBTAU-28.1의 면역반응성 평가 전에 탈인산화하였다. 파라핀 포매된 인간 뇌 조직 섹션(Abcam, cat#:ab4305, 54세 남성, 임상 증상 없음 대 Abcam, cat#:ab4583, 93세 히스패닉계 여성, 알츠하이머병)을 탈파라핀화하고 Tissue-Tek® 슬라이드 염색 세트(VWR International)를 이용하여 자일렌(VWR International) 중 10분 동안 2회 세척에 이어 100% 에탄올 중 3분 동안 2회, 95% 에탄올 중 3분 동안 2회, 70% 에탄올 중 3분 동안 2회 및 증류 H2O 중 30초 동안 1회 세척하여 재수화하였다. 비-특이적 항체 결합을 최소화하기 위해, 세척 동안 조직이 건조하게 두지 않았다. 조직 섹션으로 시트레이트 완충액(시트르산, pH 6.0)을 이용해서 열 매개된 항원 회수를 수행하여 항원성 부위를 노출시켰다. 과량의 물을 제거하고 조직 섹션을 ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen(Vector Labs)으로 선회하였다. H2O로 염색 트레이의 바닥을 덮어서 가습된 챔버를 제조한 뒤 섹션을 흡입에 의해 5분 동안 3회 PBS로 세척하였다. 내인성 퍼옥시다아제 활성을 RT에서 15분 동안 H2O2 중에 켄칭하였다. 켄칭 후, 슬라이드를 흡입에 의해 5분 동안 3회 PBS로 세척하였다. 이후 섹션을 32도에서 2.5 hr 동안 소 장 알칼리 포스파타아제(CIAP) 130 단위/mL로 처리하였다. 그 뒤 슬라이드를 1X PBS 중 10% 정상 염소 혈청, 0.3% TritonX-100, 1% BSA 용액으로 RT에서 1 hr 동안 차단하였다. 쥐과화된 CBTAU-28.1(Fc 영역이 쥐과화됨) 및 대조군 mAb AT8 및 이소형 대조군(항-RSV mAb 4.1)을 최종 농도 1 ug/mL로 헤마 섹션 상에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 섹션을 세척하고, 실온에서 2 hr 동안 항-마우스, Fcy 단편-특이적 항체와 인큐베이션하였다. 샘플을 니켈의 존재 하에 퍼옥시다아제 기질 용액 DAB로 발색시켰다. 샘플을 헤마톡실린(Vector Labs)으로 카운터염색하였다. 대표 영상을 MetaMorph 소프트웨어를 이용해서 Olympus BX-41 업라이트 현미경으로 입수하였다.
결과를 도 6a 및 도 6b에 나타낸다. 예상된 바와 같이, CBTAU-28.1은 비-AD 해마 조직 섹션에 존재하는 타우와 반응하지만 AD 조직 섹션에서의 타우와 반응하지 않는다. 대조적으로, 대조군 mAb, AT8은 비-AD 섹션에서의 타우와 반응하지 않지만, AD 섹션에 존재하는 병리적 타우 침착물과 확실히 반응한다(도 6a). 그러나, 포스파타아제를 이용한 AD 조직 섹션의 사전 처리는 CBTAU-28.1의 반응성을 복원하여, 이것이 이들 섹션에 존재하는 병리적 타우 침착물을 염색할 수 있도록 한다. 예상된 바와 같이, AT8의 반응성은 포스파타아제를 이용한 AD 조직 섹션의 사전 처리로 감소되었다(도 6b).
실시예 13
탈인산화 ELISA
실시예 12의 결과를 확인하기 위해, 페어링된 나선형 필라멘트의 탈인산화를 ELISA에 의해 CBTAU-28.1에 대한 반응성에 대해 평가하였다. 절반-영역 96-웰 결합 플레이트(Costar)를 TBS 중 50 ㎕의 항원(2 ㎍/ml 소 작용 affinipure 염소 항-인간 F(ab)2 및 1 ㎍/ml의 친화도 정제된 페어링된 나선형 필라멘트, iPHF, 소의 장 포스파타아제, CIP을 포함하고 및 포함하지 않고 사전처리됨)으로 코팅하였다. 포스파타아제 처리된 iPHF를 다음과 같이 제조하였다. iPHF 샘플을 최종 농도 0.05 ㎍/ml에서 1XNEB 완충액 4(50 mM 칼륨 아세테이트, 20 mM Tris-아세테이트, 10 mM 마그네슘 아세테이트 및 1 mM DTT) 중에 재현탁하였다. 1단위의 CIP/iPHF ㎍을 첨가하였다(CIP, NEB Cat. No. M0290S). iPHF 샘플을 ELISA 결합 플레이트 상의 코팅 전에 37℃에서 90분 동안 CIP와 인큐베이션하였다. 하룻밤 동안 항원 결합 후, 플레이트를 TBS-T로 세척한 뒤 RT에서 2 hr 동안 150 ㎕의 TBS와 2.5% BSA로 차단하였다. 정제된 대조군 및 항-타우 IgG, CBTAU-28.1)를 TBS/0.25% BSA 및 IgG 중 25 ㎍/ml로 시작해서 5배 희석도로 적정하고 1.5 hr 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 TBS-T로 4회 세척하고 이차 항체(항-인간 Fab HRP, Jackson Immunoresearch, Cat. No. 109-036-097)를 첨가하고 45분 동안 RT에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 TBS-T 중에 4회 세척하고 대략 2분 동안 SureBlue Reserve TMB 마이크로웰 퍼옥시다아제 기질(KPL)로 발색시켰다. TMB 중지 용액(KPL)의 첨가에 의해 반응을 즉시 중지시키고 450 nm에서의 흡광도를 ELISA 플레이트 판독기를 이용해서 측정하였다. 각각의 실험 지점을 3회씩 수행하였다.
결과를 도 7에 나타낸다. 실시예 7에 이미 나타낸 바와 같이, CBTAU-28.1은 AT8과 대조적으로 ELISA에 의해 iPHF와 불량하게 반응한다. 그러나 CIP를 이용한 iPHF의 탈인산화는 필라멘트성 샘플에 대한 CBTAU-28.1의 반응성을 복원한다. 예상된 바와 같이, 인산-타우 대조군 mAb, AT8의 반응성은 CIP를 이용한 iPHF의 탈인산화 후 폐지된다.
실시예 14
인산펩타이드에 대한 CBTAU-27.1, 28.1, 43.1, 47.1, 47.2 및 49.1의 반응성
CBTAU-27.1(및 CBTAU-43.1) 및 CBTAU-28.1(및 CBTAU-46.1, 47.2, 49.1)에 대한 면역조직화학 결과는 이들 mAb가 정상, 비-AD, 조직 섹션에 존재하는 타우 상의 에피토프와 반응하지만 질환 설정 동안 소실되거나 차폐됨을 제시한다(도 5). 본 발명자들은 이것이 에피토프(들)의 차폐를 야기하는 영역 내에서 인산화 이벤트의 결과라고 가정하였다. 실시예 12 및 13에서 강조된 실험은 이것이 28.1에 대해 실제로 해당됨을 나타내었다. 따라서 본 발명자들은 인산화에 대해 잠재적으로 표적화되고 CBTAU-28.1에 대한 반응성의 손실을 설명할 수 있는 부위(들)를 특이적으로 동정하고자 하였다. 47.1, 47.2 및 49.1은 타우 상에서 CBTAU-28.1와 동일한 영역(즉, 52 내지 71)에 결합하였으므로, 이들 실험에서 이들 mAb를 또한 평가하기로 결정하였다. 부가적으로, CBTAU-43.1 및 CBTAU-27.1에 있어서 IHC에 의해 CBTAU-28.1에 대해 유사하게 거동하였으므로, 동일한 훈련을 수행하였다.
단독으로 그리고 이중으로 인산화된 타우 펩타이드를 영역 52 내지 71 및 299 내지 323(각각 CBTAU-28.1 및 CBTAU-27.1 결합 영역)으로 모든 잠재적 인산화 부위를 커버하도록 설계하였다. CBTAU-27.1 및 CBTAU-43.1 mAb를 표 30 및 표 32에 기재된 펩타이드에 대해 평가하였다. 96-웰 스트렙타비딘 코팅된 ELISA 플레이트(Pierce)를 실시예 9에 상세히 나타낸 바와 같이 인산화된 타우 펩타이드로 코팅하였다. 정제된 항-타우 IgG를 0.25% BSA를 함유하는 TBS 중 5 ㎍/ml로 희석하였고 5배 적정하였다. 항체 대조군 및 이차 항체를 실시예 9에 상세히 나타낸 바와 같이 이용하였다. 1 ㎍/mL에서의 항체 반응성을 ELISA에 의해 결정하고 결합 없음(-), 약함(-/+), 중간 정도(+), 또는 강함(++)으로 스코어링하였다. 2회의 O.D. 450 nm 판독치의 평균 <0.3에 대해 (-); >0.5 및 <1.0에 대해 (-/+); >1.0 및 <1.5에 대해 (+); >1.5에 대해 (++). 각 항체에 대한 결과를 표 30 내지 표 34 및 도 8에 나타낸다.
CBTAU -27.1: ELISA에 의한 반응성에 대한 펩타이드
펩타이드 SEQ ID NO. 결과
타우 299 내지 369 331 HVPGGGSVQIVYKPVDLSKVTSKCGSLGNIHHKPGGGQVEVKSEKLDFKDRVQSKIGSLDNITHVPGGGNK ++
타우 299 내지 323 458 HVPGGGSVQIVYKPVDLSKVTSKCG ++
p타우 299 내지 323 p305 503 HVPGGG(pS)VQIVYKPVDLSKVTSKCG ++
p타우 299 내지 323 p310 504 HVPGGGSVQIV(pY)KPVDLSKVTSKCG ++
p타우 299 내지 323 p316 505 HVPGGGSVQIVYKPVDL(pS)KVTSKCG -
p타우 299 내지 323 p319 506 HVPGGGSVQIVYKPVDLSKV(pT)SKCG ++
p타우 299 내지 323 p320 507 HVPGGGSVQIVYKPVDLSKVT(pS)KCG ++
p타우 299 내지 323 p305, 310 508 HVPGGG(pS)VQIV(pY)KPVDLSKVTSKCG ++
p타우 299 내지 323 p305, 316 509 HVPGGG(pS)VQIVYKPVDL(pS)KVTSKCG -
p타우 299 내지 323 p305, 320 510 HVPGGG(pS)VQIVYKPVDLSKV(pT)SKCG ++
p타우 299 내지 323 p305, 321 511 HVPGGG(pS)VQIVYKPVDLSKVT(pS)KCG ++
p타우 299 내지 323 p310, 316 512 HVPGGGSVQIV(pY)KPVDL(pS)KVTSKCG -
p타우 299 내지 323 p310, 320 513 HVPGGGSVQIV(pY)KPVDLSKV(pT)SKCG ++
p타우 299 내지 323 p310, 321 514 HVPGGGSVQIV(pY)KPVDLSKVT(pS)KCG ++
p타우 299 내지 323 p316, 320 515 HVPGGGSVQIVYKPVDL(pS)KV(pT)SKCG -
p타우 299 내지 323 p316, 321 516 HVPGGGSVQIVYKPVDL(pS)KVT(pS)KCG -
p타우 299 내지 323 p320, 321 517 HVPGGGSVQIVYKPVDLSKV(pT)(pS)KCG -/+
CBTAU -28.1: ELISA에 의한 반응성에 대한 펩타이드
펩타이드 SEQ ID NO. 결과
타우 42 내지 103 325 GLKESPLQTPTEDGSEEPGSETSDAKSTPTAEDVTAPLVDEGAPGKQAAAQPHT EIPEGTTA ++
타우 48 내지 71 518 LQTPTEDGSEEPGSETSDAKSTPT ++
p타우 48 내지 71(p71) 519 LQTPTEDGSEEPGSETSDAKSTP(pT) ++
p타우 48 내지 71(p63) 520 LQTPTEDGSEEPGSE(pT)SDAKSTPT -
p타우 48 내지 71(p61) 521 LQTPTEDGSEEPG(pS)ETSDAKSTPT -
p타우 48 내지 71(p56) 522 LQTPTEDG(pS)EEPGSETSDAKSTPT ++
p타우 48 내지 71(p52) 523 LQTP(pT)EDGSEEPGSETSDAKSTPT ++
p타우 48 내지 71(p68) 524 LQTPTEDGSEEPGSETSDAK(pS)TPT ++
p타우 48 내지 71(p69) 525 LQTPTEDGSEEPGSETSDAKS(pT)PT ++
p타우 48 내지 71(p64) 526 LQTPTEDGSEEPGSET(pS)DAKSTPT ++
p타우 48 내지 71(p61,p64) 527 LQTPTEDGSEEPG(pS)ET(pS)DAKSTPT -
p타우 48 내지 71(p61,p63) 528 LQTPTEDGSEEPG(pS)E(pT)SDAKSTPT -
p타우 48 내지 71(p63,p64) 529 LQTPTEDGSEEPGSE(pT)(pS)DAKSTPT -
CBTAU -43.1: ELISA에 의한 반응성에 대한 펩타이드
펩타이드 SEQ ID NO. 결과
타우 299 내지 369 331 HVPGGGSVQIVYKPVDLSKVTSKCGSLGNIHHKPGGGQVEVKSEKLDFKDRVQSKIGSLDNITHVPGGGNK ++
타우 299 내지 323 458 HVPGGGSVQIVYKPVDLSKVTSKCG ++
p타우 299 내지 323 p305 503 HVPGGG(pS)VQIVYKPVDLSKVTSKCG ++
p타우 299 내지 323 p310 504 HVPGGGSVQIV(pY)KPVDLSKVTSKCG ++
p타우 299 내지 323 p316 505 HVPGGGSVQIVYKPVDL(pS)KVTSKCG -
p타우 299 내지 323 p319 506 HVPGGGSVQIVYKPVDLSKV(pT)SKCG ++
p타우 299 내지 323 p320 507 HVPGGGSVQIVYKPVDLSKVT(pS)KCG ++
p타우 299 내지 323 p305, 310 508 HVPGGG(pS)VQIV(pY)KPVDLSKVTSKCG ++
p타우 299 내지 323 p305, 316 509 HVPGGG(pS)VQIVYKPVDL(pS)KVTSKCG -
p타우 299 내지 323 p305, 320 510 HVPGGG(pS)VQIVYKPVDLSKV(pT)SKCG ++
p타우 299 내지 323 p305, 321 511 HVPGGG(pS)VQIVYKPVDLSKVT(pS)KCG ++
p타우 299 내지 323 p310, 316 512 HVPGGGSVQIV(pY)KPVDL(pS)KVTSKCG -
p타우 299 내지 323 p310, 320 513 HVPGGGSVQIV(pY)KPVDLSKV(pT)SKCG ++
p타우 299 내지 323 p310, 321 514 HVPGGGSVQIV(pY)KPVDLSKVT(pS)KCG ++
p타우 299 내지 323 p316, 320 515 HVPGGGSVQIVYKPVDL(pS)KV(pT)SKCG -/+
p타우 299 내지 323 p316, 321 516 HVPGGGSVQIVYKPVDL(pS)KVT(pS)KCG -
p타우 299 내지 323 p320, 321 517 HVPGGGSVQIVYKPVDLSKV(pT)(pS)KCG ++
CBTAU -47.1 및 CBTAU -47.2: ELISA에 의한 반응성에 대한 펩타이드
펩타이드 SEQ ID NO. 결과
CBTAU-47.1 		결과
CBTAU-47.2
타우 42 내지 103 325 GLKESPLQTPTEDGSEEPGSETSDAKSTPTAEDVTAPLVDEGAPGKQAAAQPHTIPEGTTA ++ ++
타우 48 내지 71 518 LQTPTEDGSEEPGSETSDAKSTPT ++ ++
p타우 48 내지 71(p71) 519 LQTPTEDGSEEPGSETSDAKSTP(pT) ++ ++
p타우 48 내지 71(p63) 520 LQTPTEDGSEEPGSE(pT)SDAKSTPT - -
p타우 48 내지 71(p61) 521 LQTPTEDGSEEPG(pS)ETSDAKSTPT - -
p타우 48 내지 71(p56) 522 LQTPTEDG(pS)EEPGSETSDAKSTPT ++ ++
p타우 48 내지 71(p52) 523 LQTP(pT)EDGSEEPGSETSDAKSTPT ++ ++
p타우 48 내지 71(p68) 524 LQTPTEDGSEEPGSETSDAK(pS)TPT ++ ++
p타우 48 내지 71(p69) 525 LQTPTEDGSEEPGSETSDAKS(pT)PT ++ ++
p타우 48 내지 71(Ser64) 526 LQTPTEDGSEEPGSET(pS)DAKSTPT ++ ++
p타우 48 내지 71(p61,Ser64) 527 LQTPTEDGSEEPG(pS)ET(pS)DAKSTPT - -
p타우 48 내지 71(p61,p63) 528 LQTPTEDGSEEPG(pS)E(pT)SDAKSTPT - -
p타우 48 내지 71(p63,p64) 529 LQTPTEDGSEEPGSE(pT)(pS)DAKSTPT - -
CBTAU-49.1: ELISA에 의한 반응성에 대한 펩타이드
펩타이드 SEQ ID NO. 결과
타우 42 내지 103 325 GLKESPLQTPTEDGSEEPGSETSDAKSTPTAEDVTAPLVDEGAPGKQAAAQPHT EIPEGTTA ++
타우 48 내지 71 518 LQTPTEDGSEEPGSETSDAKSTPT ++
p타우 48 내지 71(p71) 519 LQTPTEDGSEEPGSETSDAKSTP(pT) ++
p타우 48 내지 71(p63) 520 LQTPTEDGSEEPGSE(pT)SDAKSTPT -
p타우 48 내지 71(p61) 521 LQTPTEDGSEEPG(pS)ETSDAKSTPT -
p타우 48 내지 71(p56) 522 LQTPTEDG(pS)EEPGSETSDAKSTPT ++
p타우 48 내지 71(p52) 523 LQTP(pT)EDGSEEPGSETSDAKSTPT ++
p타우 48 내지 71(p68) 524 LQTPTEDGSEEPGSETSDAK(pS)TPT ++
p타우 48 내지 71(p69) 525 LQTPTEDGSEEPGSETSDAKS(pT)PT -/+
p타우 48 내지 71(Ser64) 526 LQTPTEDGSEEPGSET(pS)DAKSTPT ++
p타우 48 내지 71(p61,Ser64) 527 LQTPTEDGSEEPG(pS)ET(pS)DAKSTPT -
p타우 48 내지 71(p61,p63) 528 LQTPTEDGSEEPG(pS)E(pT)SDAKSTPT -
p타우 48 내지 71(p63,p64) 529 LQTPTEDGSEEPGSE(pT)(pS)DAKSTPT -
CBTAU-27.1 및 CBTAU-43.1에 대한 결과는 S316에서의 인산화가 반응성을 완전 저해하기 충분한 것을 나타낸다(표 30 및 표 32). 이는 AD 조직 섹션 상의 타우에 대한 반응성의 손실(실시예 11)이 질환 경과 동안 조기에 일어날 수 있는 이벤트인 S316에서의 인산화에 기인할 수 있음을 제시한다. CBTAU-28.1, 47.1, 47.2, 49.1에 있어서, S61 또는 T63에서의 인산화는 반응성을 완전 저해하기 충분하다. 함께 고려하면, CBTAU-28.1, 47.1, 47.2 및 49.1에 대한 결과는 S61 및/또는 T63에서의 인산화가 질환 경과 동안 상기 에피토프의 손실을 설명하는 기전임을 제시한다.
실시예 15
항- 타우 mAb 마우스-인간 키메라 및 인간 이소형의 생성
타우병증의 마우스 모델에서 인간 항-타우 mAb의 유효성을 평가하기 위해, 인간 Fc 영역을 마우스 IgG1 Fc로 대체하여 마우스-인간 항체 키메라를 생성하였다. 간략하게, 인간 IgG1 CH1 영역을 프라이머 단계1HMchim-Fwd 및 단계1HMchim-Rev(표 35)를 이용하여 pCB-IgG 벡터로부터 증폭하여 5'-XhoI 부위를 함유하는 0.95 kb 단편(단편 1)을 생성하였다. 마우스 IgG1 CH2 및 CH3 도메인(Fc 영역)을 프라이머 단계2HMchim-Fwd 및 단계2HMchim-Rev(표 30)를 이용하여 유전자-합성된 구축물로부터 증폭하여 0.82 kb 단편(단편 2)을 생성한다. 3'-DraIII 부위를 포함하는 프라이머 단계3HMchim-Fwd 및 단계3HMchim-Rev(표 30)를 이용하여 pCB-IgG 벡터의 폴리A 영역을 증폭하여 제3 단편(단편 3)을 생성하였다. 3개 단편을 중복 연장 PCR에 의해 단일 카세트 내로 연결하여 인간 CH1에 이어 마우스 CH2-CH3 도메인을 보유하는 2.3 kb 중복 단편을 생성하였다. 이어서 중복 단편을 XhoI 및 DraIII 부위를 통해 pCB-IgG CBTAU-7.1 벡터 내로 클로닝하여 인간 가변, CH1, 힌지 및 Ck 영역에 이어 마우스 CH2 및 CH3 영역을 함유하는 CBTAU-7.1의 마우스-인간 키메라를 생성하였다. 그 뒤 XhoI 및 XbaI로 CBTAU-7.1 키메라 구축물 및 pCB-IgG CBTAU 인간 mAb 구축물을 소화시켜 CBTAU-22.1, 24.1, 27.1, 28.1, 47.1, 47.2, 46.1, 49.1 및 43.1 키메라를 생성하고, 해당하는 단편을 서브클로닝하였다. 모든 구축물에 대한 뉴클레오타이드 서열을 당업자에게 공지된 표준 기법에 따라 확인한다. 이후 단백질 A 대신 단백질 G 아가로오스를 이용하여 실시예 5에 상세히 나타낸 바와 같이 키메라 항체를 발현시키고 정제하였다.
마우스-인간 키메라화를 위한 프라이머
프라이머 ID DNA 서열(5'-3') SEQ ID NO:
단계1HMchim-Fwd TCTCCGCCGGTGAGTCTCGAGGC 530
단계1HMchim-Rev TGTCCCTGGATGCAGGCTACTCTAGG 531
단계2HMchim-Fwd AGAGTAGCCTGCATCCAGGGACAG 532
단계2HMchim-Rev TCTAGATCATTTACCAGGAGAGTGGGAGAG 533
단계3HMchim-Fwd TCTCCTGGTAAATGATCTAGAGTTTAAACCGCTG 534
단계3HMchim-Rev ATGGCCCACTACGTGAACCATCACC 535
실시예 16:
IgG2 , 3 및 4 이소형의 제조
실시예 3에 언급된 바와 같이, 모든 CBTAU mAb를 클로닝하고, 이들의 원상태 이소형과 무관하게 키메라 인간 IgG1로 발현시켰다. 추가적인 인간 이소형 버전(즉, IgG2/3/4)을 생성하기 위해, 각각의 인간 IgG 이소형에 해당하는 CH1 내지 CH3 영역을 해당하는 불변 영역, 힌지 및 인트론 서열을 함유하는 유전자-합성된 구축물로부터 PCR 증폭시킨다. PCR 앰플리콘은 5'-XhoI 및 3'-DraIII 부위를 함유하며, 이를 이용하여 해당하는 pCB-IgG CBTAU 항체 구축물 내로 단편을 서브클로닝한다. 상기 방식으로, 각각의 항-타우 mAb에 대해 인간 IgG2, 3 및 4 이소형 버전을 생성한다.
실시예 17
위험-제거 및 Fc 조작된 항- 타우 키메라 모노클로날 항체 변이체의 생성
실시예 3에서 단리된 각각의 항-타우 항체 클론에 대한 중쇄 및 경쇄 가변 영역(VH 및 VL)을 자유 시스테인 및 글리코실화, 탈아미드화 및 산화 부위를 포함하는 잠재적인 번역-후 개질 부위의 존재에 대해 분석한다. 구조적으로 보존된 및/또는 생식계열 기반 치환으로 구성된 아미노산 돌연변이를 이용하여 이들 부위를 변화시킨다. 가변 영역에서 보존되지 않은 시스테인을 세린으로 돌연변이시킨다. 글리코실화 부위에 있어서, 보존적 글루타민에 대한 아스파라긴의 대체 또는 생식계열 돌연변이를 포함하는 몇몇 돌연변이를 이용한다. 탈아미드화 부위에 대한 개질에는 아스파라긴에 대한 아스파르트산 및 글리신에 대한 세린 또는 알라닌의 대체가 포함된다. 잠재적 산화 부위는 개질되지 않는다. FcRn에 결합 친화도를 증가시키고 이에 따라 생체내 IgG1 mAb의 반감기를 증가시키기 위해, CH2 내지 CH3 영역의 경계에 위치한 몇몇 돌연변이를 생성한다. 이들 돌연변이에는 M252Y/S254T/T256E와 H433K/N434F(Vaccaro C. et al., 2005) 또는 T250Q/M428L(Hinton PR. et al., 2004)이 포함되었고, 이는 FcRn에 대한 IgG1 결합을 증가시키는 것으로 나타났다. 모든 치환을 제조업체의 지침(QuickChange II, Agilent Technologies, cat. no. 200521)에 따라 부위-지정 돌연변이화에 의해 생성한다. 모든 구축물에 대한 뉴클레오타이드 서열을 당업자에게 공지된 표준 기법에 따라 확인한다.
SEQUENCE LISTING <110> Crucell Holland B.V. <120> Antibodies and antigen-binding fragments that specifically bind to microtubule-associated protein tau <130> 0238 WO 00 ORD <160> 535 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 441 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly 1 5 10 15 Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His 20 25 30 Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu 35 40 45 Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser 50 55 60 Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val 65 70 75 80 Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu 85 90 95 Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro 100 105 110 Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val 115 120 125 Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly 130 135 140 Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro 145 150 155 160 Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro 165 170 175 Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly 180 185 190 Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser 195 200 205 Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys 210 215 220 Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys 225 230 235 240 Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val 245 250 255 Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly 260 265 270 Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln 275 280 285 Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly 290 295 300 Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser 305 310 315 320 Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln 325 330 335 Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser 340 345 350 Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn 355 360 365 Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala 370 375 380 Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser 385 390 395 400 Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser 405 410 415 Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val 420 425 430 Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu 435 440 <210> 2 <211> 410 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly 1 5 10 15 Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His 20 25 30 Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu 35 40 45 Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser 50 55 60 Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val 65 70 75 80 Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu 85 90 95 Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro 100 105 110 Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val 115 120 125 Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly 130 135 140 Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro 145 150 155 160 Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro 165 170 175 Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly 180 185 190 Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser 195 200 205 Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys 210 215 220 Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys 225 230 235 240 Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val 245 250 255 Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly 260 265 270 Gly Lys Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr 275 280 285 Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly 290 295 300 Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln 305 310 315 320 Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly 325 330 335 Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys 340 345 350 Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val 355 360 365 Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly 370 375 380 Ser Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu 385 390 395 400 Val Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu 405 410 <210> 3 <211> 412 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly 1 5 10 15 Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His 20 25 30 Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu 35 40 45 Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser 50 55 60 Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly 65 70 75 80 Asp Thr Pro Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala 85 90 95 Arg Met Val Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys 100 105 110 Ala Lys Gly Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly 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PCR-generated and human sequence <400> 106 gacatccaga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60 atcaactgca agtccagcca gagtttgtta tacaactcca ataataagaa ctacttaact 120 tggtaccagc aaaaaccagg acagcctcct aagttgctca tttactgggc atctacccgg 180 gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaata ttatagtagt 300 cctctcactt tcggcggagg gaccaaggtg gagatcaaa 339 <210> 107 <211> 121 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Combination of PCR-generated and human sequence <400> 107 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Pro Val Lys Val Ser Cys Glu Thr Ser Gly Tyr Arg Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Asn Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Pro Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Ser Pro Asn Ser Gly Gly Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Met Ser Met Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Gly Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 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gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcctgagtg gataggacgg atcagcccta acagcggtgg cacaaagtat 180 gcacagaagt ttcaaggcag ggtcaccatg accagggaca tgtccatgaa cacagcctac 240 atggagctga gcgggctgag atctgacgac acggccgtgt attattgtgt aagaggacat 300 tgtgatggta ccacttgctc tcgtgcctac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 110 <211> 336 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Combination of PCR-generated and human sequence <400> 110 gatgttgtga tgacgcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60 atctcctgca ggtctagtca gagcctcctg catagaagtg gacacaagta tttgcattgg 120 tacctgcaga ggccagggca gtctccacag gtcctgatct atttgggttc taatcgggcc 180 tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 240 agcagagtgg aggctgagga tgttgggctt tattactgca tgcaaactct acaaaccccc 300 tggacattcg gccaagggac caaggtggaa atcaaa 336 <210> 111 <211> 120 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Combination of PCR-generated and human sequence <400> 111 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Val Asn Pro Arg Ser Gly Gly Thr Ser Tyr Pro Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Asp Leu Thr Trp Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Val Gly Arg Ile Pro Asp Val Thr Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 112 <211> 113 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Combination of PCR-generated and human sequence <400> 112 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Glu Ser Leu Leu Tyr Asp 20 25 30 Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr His Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Phe Ser Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 113 <211> 360 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Combination of PCR-generated and human sequence <400> 113 caggtccagc ttgtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgtacgg cctctggata cactttcacc ggctattatt tacactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag gacttgagtg gatggggtgg gtcaacccta ggagtggtgg cacaagctat 180 ccaccgaagt ttcagggcag ggtcaccatg accagggaca cgtccatcaa cacagcctac 240 atggacctga cctggctgac atctgacgac acggccgtct attattgtgc ggtcggaaga 300 atacctgatg taactgcttt cgatatctgg ggccagggga caccggtcac cgtctcctca 360 <210> 114 <211> 339 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Combination of PCR-generated and human sequence <400> 114 gacatccaga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60 atcaactgca agtccagcga gagtctttta tacgactcca acaataagaa ctacttagct 120 tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aagttgctca tttattgggc atctacccgg 180 gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg agacagattt cactctcacc 240 atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttatcact gtcaacaata tttcagtact 300 ccttggacgt tcggccaggg gaccaagctg gagatcaaa 339 <210> 115 <211> 122 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Combination of PCR-generated and human sequence <400> 115 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Pro Glu Met Arg Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ile Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Trp Thr Ala Trp Val Arg Gln Leu Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Tyr Ser Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr His Pro Ser Val 50 55 60 Gln Gly His Val Thr Met Ser Thr Asp Ser Ser Leu Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Gly Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Asp Ala Arg Val Asp Ala Gly Trp Gln Leu Asp Ser Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 116 <211> 113 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Combination of PCR-generated and human sequence <400> 116 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Phe Ser Arg 20 25 30 Asp Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Ser Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Phe Phe Trp Ala Ser Ser Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Ser Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Asp Asn Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Leu Tyr Tyr Cys Gln His 85 90 95 Tyr Phe Asn Thr Pro His Asn Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 117 <211> 366 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Combination of PCR-generated and human sequence <400> 117 caggttcagc tggtggagtc tggaccggag atgagaaagc ccggggagtc tctgaaaatt 60 tcctgcaaga cttctggcta catatttagc gactactgga ctgcctgggt gcgccagctg 120 cccgggaagg gccttcagtg gatgggaatc atctattctg gtgactctga taccagatat 180 catccgtccg tccaaggcca cgtcaccatg tcaaccgaca gttccctcac caccgcctac 240 ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accggcatat attactgtgc gcgccttgat 300 gcaagagttg atgctggatg gcaattagat tcgtggggcc aggggaccct ggtcaccgtc 360 tcttca 366 <210> 118 <211> 339 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Combination of PCR-generated and human sequence <400> 118 gacatccagt tgacccagtc tccagattcc ctggctgtgt ctctgggcga gcgggccacc 60 atcaactgca agtccagcca gagtgttttc tccagggaca acaataaaaa ctacctagct 120 tggtaccagc acaaatcagg gcagcctcct aagttgctct ttttctgggc gtccagtcgt 180 gaatctgggg tctcagaccg attcagcggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240 atcgacaacc tgcaggctga agatgtggca ctttattact gtcaacatta ttttaatact 300 ccccacaatt ttggccaggg gaccaagctg gagatcaaa 339 <210> 119 <211> 121 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Combination of PCR-generated and human sequence <400> 119 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Pro Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Thr Ala Asp Arg Ser Ile Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Gly Arg Pro Ser Lys Gly Gly Trp Phe Asp Pro Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 120 <211> 113 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Combination of PCR-generated and human sequence <400> 120 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Glu Ser Ser Gln Thr Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Glu Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Ser Trp Ala Ser Thr Pro Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Asn Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 121 <211> 363 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Combination of PCR-generated and human sequence <400> 121 caggtgcagc tacagcagtc aggagcagaa gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60 tcctgtgagg cctctggata cagcttcacc aattactgga tcggctgggt gcgccagatg 120 cccggtaaag gcctggagtg gatgggaatc atctatcctg gtgactctga caccagatac 180 agtccgccct tccaaggcca ggtcaccatc acagccgaca ggtccatcac caccgcctac 240 ttggagtgga gcagtctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc aagagttggg 300 agaccttcta aaggaggctg gttcgacccc tggggccagg gaaccctggt caccgtctct 360 tca 363 <210> 122 <211> 339 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Combination of PCR-generated and human sequence <400> 122 gacatccaga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60 atcaactgtg agtccagcca gactctttta tacagttcca acgaaaagaa ctacctagct 120 tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aagttgctca tttcctgggc ttctaccccg 180 gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agtgggtctg ggacaagttt cactctcacc 240 atcagcagcc tgcaggctga ggatgtggca gtttattact gtcagcaata ttataacagt 300 ccatacactt ttggccaagg gacacgactg gagattaaa 339 <210> 123 <211> 126 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Combination of PCR-generated and human sequence <400> 123 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asp Ser 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Arg Ser Ser Ser His Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Gly Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Gln Thr Thr Met Ile Glu Gly Lys Thr Lys Leu Asn Tyr 100 105 110 Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 124 <211> 113 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Combination of PCR-generated and human sequence <400> 124 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Glu Ser Ser His Ser Leu Leu Tyr Arg 20 25 30 Ser Asn Asn Arg Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Phe Tyr Thr Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 125 <211> 378 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Combination of PCR-generated and human sequence <400> 125 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtcaagc ctggagggtc cctgagactc 60 tcctgtgtcg cctctggaat caccttcagt gactcctaca tgagctggat ccgccagact 120 ccagggaagg ggctagagtg gctttcatac attagtcgta gtagttctca cacaaattac 180 gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ttcactatat 240 ctccaaatga atagcctgag aggcgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagtccag 300 acaactatga tagaagggaa aacgaaactt aactactttg actactgggg ccagggaacc 360 caggtcaccg tctcctca 378 <210> 126 <211> 339 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Combination of PCR-generated and human sequence <400> 126 gacatccaga tgacccagtc tccagactcc 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attagtcgta gtagttctca cacaaattac 180 gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ttcactatat 240 ctccaaatga atagcctgag aggcgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagtccag 300 acaactatga tagaagggaa aacgaaactt aactactttg actactgggg ccagggaacc 360 ctggtcaccg tctcctca 378 <210> 130 <211> 339 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Combination of PCR-generated and human sequence <400> 130 gccatccagt tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggtcacc 60 atcagctgcg agtccagcca cagtctttta tacaggtcca acaataagaa ctacttagct 120 tggtaccagc agaaaccaag acagcctcct aagttgctca tttactgggc atctacccgg 180 gagtccgggg tcccagaccg attcagcggc agcgggtctg agacagattt cactctcacc 240 atcagcagcc tgcgggctga agatgtggca gtgtattact gtcaacaatt ttatactact 300 ccttacactt ttggccaggg gaccaagctg gagatcaaa 339 <210> 131 <211> 122 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Combination of PCR-generated and human sequence <400> 131 Gln Leu Val Gln Ser Glu Gly Gly Leu Ala Glu Pro Gly Gly Ser Leu 1 5 10 15 Arg Leu Ser Cys Ala Ala 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gagtccgggg tcccagaccg attcagcggc agcgggtctg agacagattt cactctcacc 240 atcagcagcc tgcgggctga agatgtggca gtgtattact gtcaacaatt ttatactact 300 ccttacactt ttggccaggg gaccaagctg gagatcaaa 339 <210> 135 <211> 124 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Combination of PCR-generated and human sequence <400> 135 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Cys Met 35 40 45 Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Thr Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Val Ser Thr Thr Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Ser Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Pro Arg Thr Asp Gly Asp Asn Ser Ile Gly Tyr Phe Glu 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 136 <211> 113 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Combination of PCR-generated and human sequence <400> 136 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Ser Glu Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Ser Thr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 137 <211> 372 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Combination of PCR-generated and human sequence <400> 137 caggtgcagc tggtgcagtc tggaggagag gtgaaaaagc cgggggagtc tctgaagatc 60 tcctgtaagg gttctgggta ctcctttagt aactactgga tcgcctgggt gcgccagatg 120 cccgggaaag gcctggagtg catgggaatc atctatcctg gtgactctga taccacatac 180 agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatt tctgccgaca agtccgtcag taccacctac 240 ctacaatgga gcagcctgaa ggcctcggac agcgccatgt attattgtgc gaggctaccc 300 cgtacagatg gcgacaattc catcggctac tttgaatatt ggggccaggg aaccatggtc 360 accgtctctt ca 372 <210> 138 <211> 345 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Combination of PCR-generated and human sequence <400> 138 gaaattgtgt tgacacagtc tccagcctcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60 atcaactgca agtccagcca gagtgtttta tacagctcca acagtgagaa ctacttagct 120 tggtatcagc agaaaccagg acagcctccc aagttgctca tttactgggc gtctacccgg 180 gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaata ttatagtact 300 ccattcactt tcggccaagg gacacgactg gagattaaac gtaag 345 <210> 139 <211> 118 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Combination of PCR-generated and human sequence <400> 139 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Thr Thr Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 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gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agttatagca tgaactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtttcatac attagtagta gtactactac catatactac 180 gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagggaca atgtcaagaa ctctctgtat 240 ctgcaaatgc acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgt cccggccccc 300 cggttgggtg ggagctacac ttactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357 <210> 142 <211> 324 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Combination of PCR-generated and human sequence <400> 142 gacatccaga tgacccagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggca cctcaccgct cactttcggc 300 ggagggacca aggtggaaat caaa 324 <210> 143 <211> 119 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Combination of PCR-generated and human sequence <400> 143 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Val Phe Thr Asp Ala 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Arg Ile Lys Ser Lys Asn Val Gly Glu Thr Thr Asp Tyr Ala Glu 50 55 60 His Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ala Arg Asp Asp Ser Asn Arg Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Ser Asn Leu Lys Ile Asp Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Thr Gly Leu Gly Gly Gly Thr Tyr Gly Trp Gly Arg Gly 100 105 110 Thr Arg Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 144 <211> 108 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Combination of PCR-generated and human sequence <400> 144 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Ala Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Ala Gly Leu Arg Asn Asn 20 25 30 Asp Gly Asp Ile Leu Leu Ser Trp Phe His Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Arg Leu Phe Tyr Arg Val Ser Arg Arg Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe 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ggccaggcca gtctccgagg cgcctatttt atagagtttc taggcgtgac 180 tctggagtcc cagacagatt caacggcagt gggtcagcca ctgatttcac actgagaatc 240 aattctgtgg aggctgaaga tgttggcatt tactactgca tgcgaggacc atattggggc 300 caagggacac gactggagat taaa 324 <210> 147 <211> 119 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Combination of PCR-generated and human sequence <400> 147 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Asn Phe Ser Ile Tyr 20 25 30 Glu Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Thr Asn Arg Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Gln Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Pro Arg Ile Gly Ala Arg Val Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 148 <211> 113 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Combination of PCR-generated and human sequence <400> 148 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Thr Leu Leu Tyr Lys 20 25 30 Ser Asn Asn Glu Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Phe Thr Thr Ala Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 149 <211> 357 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Combination of PCR-generated and human sequence <400> 149 caggtacagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggagagtc cctgagactc 60 tcctgtgtag cctctggatt caacttcagt atttatgaga tgaattgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtttcatac attaccaatc gaggtagtac catatactac 180 gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagggaca acgcccagaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaagac acggctgttt attactgtgc 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PCR-generated and human sequence <400> 153 caggtgcagc tggtgcagtc tggagcagtg gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60 tcctgtgagg cttctggata catgttcctc gatcactgga tcggctgggt gcgccagatg 120 cccgggaaag gcctggagtg gatgggaatc atctttcctg aggactctga taccagatat 180 agtgggtcct tcgaaggcca ggtcaccatc tcagccgaca ggtccgtcaa caccgtctac 240 ctggagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attattgtgc gagagtctca 300 gtagttcgta aagggggctg gttcgaccca tggggccagg gaaccacggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 154 <211> 339 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Combination of PCR-generated and human sequence <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> n is a, c, g, or t <400> 154 gaaanncaac tgacgcagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60 atcaactgca agtccagcca gagtctttta tacacctcca acaataagaa ctacttagct 120 tggtaccagc agaaaccagg acagactcct aaactgctca ttatctgggc ctctacccga 180 gaatccgggg tccctgaccg attcactggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaata ttataatagt 300 ccgtacactt ttggccaagg gacacgactg gagattaaa 339 <210> 155 <211> 121 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Combination of PCR-generated and human sequence <400> 155 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Glu Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Ala Asp His 20 25 30 Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Phe Pro Gly Asp Ser Asp Ile Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Glu Gly Gln Val Thr Ile Ser Val Asp Arg Ser Val Ser Thr Ala Phe 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Val Ala Val Val Arg Lys Gly Gly Trp Phe Asp Ser Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Arg Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 156 <211> 113 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Combination of PCR-generated and human sequence <400> 156 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Glu Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Thr Gln Ser Leu Leu Trp Ser 20 25 30 Ala Asn 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and human sequence <400> 158 gaaattgtga tgacccagtc tccagagtcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60 atcaactgca agtccaccca gagtctttta tggagcgcca acaacaagaa ctacttagct 120 tggtaccggc agaaaccacg acagactcct gaactgctca ttacgtgggc ttccacccgg 180 gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240 atcaccagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattatt gtcaacaata ttataatagt 300 ccgtacactt ttggccaagg gacacgactg gagattaaa 339 <210> 159 <211> 126 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Combination of PCR-generated and human sequence <400> 159 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Trp Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Leu Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Ala Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Ile Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Asn Ala Ser Leu 50 55 60 Glu Gly Arg Val Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Thr Ser Leu Lys Val Ser Asp Thr Gly Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Asp 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tcggctgggt gcgccagatg 120 cccgggaaag gcctggagtg ggtggggatc atctatcctg atgactctga taccagatac 180 aatgcgtcac tagaaggccg ggtcaccatg tcagtcgaca cgtccaccaa taccgcctac 240 ctgcagtgga ccagcctgaa ggtctcggac accggcatgt attactgtgc gagacgggat 300 cgcaattgta gtgggactac gtgttatccg aggtggttcg actcctgggg ccagggaacc 360 ctggtcaccg tctcttca 378 <210> 162 <211> 339 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Combination of PCR-generated and human sequence <400> 162 gaaattgtgc tgactcagtc tccagacttc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60 atcaactgca agtccagcca gagtcttttc tacagcggca acagtaagga cttcttagct 120 tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct cgcttgctcg tttactgggc atctacccgg 180 gattccgggg tccctgagcg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt tactctcacc 240 atcagccgcc tgcaggctga agatgtggct ctttattact gtcaccaata tcatagtact 300 cctctctctt tcggcggagg gaccaaggtg gaaatcaaa 339 <210> 163 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 163 Ser Tyr Trp Met His 1 5 <210> 164 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 164 Arg Ile Asn Ser 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Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Gly Arg Ser Tyr Gly Phe Phe Asp Tyr 100 105 <210> 258 <211> 288 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 258 gaaattgtgt tgacgcagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat gatgcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtcta ttactgtcag cagcgtagca actggcat 288 <210> 259 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 259 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ile Ile Ser Ser Asn 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu 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gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtggtt actactggag ctggatccgc 120 cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt gggtacatct attacagtgg gagcacctac 180 tacaacccgt ccctcaagag tcgagttacc atatcagtag acacgtctaa gaaccagttc 240 tccctgaagc tgagctctgt gaccgcggac gcggccgtgt attactgtgc g 291 <210> 269 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 269 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Asn Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 Asn Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ala Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Arg Met Ser Ser Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Met Ser Glu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Glu Ser Gly Ser Ser Trp Gln Asn His Tyr Tyr Tyr Tyr 100 105 110 Gly Met Asp Val 115 <210> 270 <211> 103 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 270 Asp Ile Val Met Thr Gln 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cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcacctcc 290 <210> 300 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 300 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Thr Ser Pro 85 90 95 Leu Thr <210> 301 <211> 302 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 301 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggagcc ttggtaaagc ctggggggtc ccttagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt aacgcctgga tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggttggccgt attaaaagca aaactgatgg tgggacaaca 180 gactacgctg cacccgtgaa aggcagattc accatctcaa gagatgattc aaaaaacacg 240 ctgtatctgc aaatgaacag cctgaaaacc gaggacacag ccgtgtatta ctgtaccaca 300 ga 302 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462 His Val Pro Ala Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp 1 5 10 15 Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly 20 25 <210> 463 <211> 25 <212> PRT <213> synthetic <400> 463 His Val Pro Gly Ala Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp 1 5 10 15 Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly 20 25 <210> 464 <211> 25 <212> PRT <213> synthetic <400> 464 His Val Pro Gly Gly Ala Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp 1 5 10 15 Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly 20 25 <210> 465 <211> 25 <212> PRT <213> synthetic <400> 465 His Val Pro Gly Gly Gly Ala Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp 1 5 10 15 Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly 20 25 <210> 466 <211> 25 <212> PRT <213> synthetic <400> 466 His Val Pro Gly Gly Gly Ser Ala Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp 1 5 10 15 Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly 20 25 <210> 467 <211> 25 <212> PRT <213> synthetic <400> 467 His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Ala Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp 1 5 10 15 Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly 20 25 <210> 468 <211> 25 <212> 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<210> 474 <211> 25 <212> PRT <213> synthetic <400> 474 His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Ala 1 5 10 15 Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly 20 25 <210> 475 <211> 25 <212> PRT <213> synthetic <400> 475 His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp 1 5 10 15 Ala Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly 20 25 <210> 476 <211> 25 <212> PRT <213> synthetic <400> 476 His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp 1 5 10 15 Leu Ala Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly 20 25 <210> 477 <211> 25 <212> PRT <213> synthetic <400> 477 His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp 1 5 10 15 Leu Ser Ala Val Thr Ser Lys Cys Gly 20 25 <210> 478 <211> 25 <212> PRT <213> synthetic <400> 478 His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp 1 5 10 15 Leu Ser Lys Ala Thr Ser Lys Cys Gly 20 25 <210> 479 <211> 25 <212> PRT <213> synthetic <400> 479 His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp 1 5 10 15 Leu Ser Lys Val Ala Ser Lys Cys Gly 20 25 <210> 480 <211> 25 <212> PRT <213> synthetic <400> 480 His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp 1 5 10 15 Leu Ser Lys Val Thr Ala Lys Cys Gly 20 25 <210> 481 <211> 25 <212> PRT <213> synthetic <400> 481 His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp 1 5 10 15 Leu Ser Lys Val Thr Ser Ala Cys Gly 20 25 <210> 482 <211> 25 <212> PRT <213> synthetic <400> 482 His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp 1 5 10 15 Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Ala Gly 20 25 <210> 483 <211> 25 <212> PRT <213> synthetic <400> 483 His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp 1 5 10 15 Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Ala 20 25 <210> 484 <211> 20 <212> PRT <213> synthetic <400> 484 Ala Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser Asp Ala Lys 1 5 10 15 Ser Thr Pro Thr 20 <210> 485 <211> 20 <212> PRT <213> synthetic <400> 485 Thr Ala Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser Asp Ala Lys 1 5 10 15 Ser Thr Pro Thr 20 <210> 486 <211> 20 <212> PRT <213> synthetic <400> 486 Thr Glu Ala Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser Asp Ala Lys 1 5 10 15 Ser Thr Pro Thr 20 <210> 487 <211> 20 <212> PRT <213> synthetic <400> 487 Thr Glu Asp Ala Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser Asp Ala Lys 1 5 10 15 Ser Thr Pro Thr 20 <210> 488 <211> 20 <212> PRT <213> synthetic <400> 488 Thr Glu Asp Gly Ala Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser Asp Ala Lys 1 5 10 15 Ser Thr Pro Thr 20 <210> 489 <211> 20 <212> PRT <213> synthetic <400> 489 Thr Glu Asp Gly Ser Ala Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser Asp Ala Lys 1 5 10 15 Ser Thr Pro Thr 20 <210> 490 <211> 20 <212> PRT <213> synthetic <400> 490 Thr Glu Asp Gly Ser Glu Ala Pro Gly Ser Glu Thr Ser Asp Ala Lys 1 5 10 15 Ser Thr Pro Thr 20 <210> 491 <211> 20 <212> PRT <213> synthetic <400> 491 Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Ala Gly Ser Glu Thr Ser Asp Ala Lys 1 5 10 15 Ser Thr Pro Thr 20 <210> 492 <211> 20 <212> PRT <213> synthetic <400> 492 Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Ala Ser Glu Thr Ser Asp Ala Lys 1 5 10 15 Ser Thr Pro Thr 20 <210> 493 <211> 20 <212> PRT <213> synthetic <400> 493 Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ala Glu Thr Ser Asp Ala Lys 1 5 10 15 Ser Thr Pro Thr 20 <210> 494 <211> 20 <212> PRT <213> synthetic <400> 494 Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Ala Thr Ser Asp Ala Lys 1 5 10 15 Ser Thr Pro Thr 20 <210> 495 <211> 20 <212> PRT <213> synthetic <400> 495 Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Ala Ser Asp Ala Lys 1 5 10 15 Ser Thr Pro Thr 20 <210> 496 <211> 20 <212> PRT <213> synthetic <400> 496 Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ala Asp Ala Lys 1 5 10 15 Ser Thr Pro Thr 20 <210> 497 <211> 20 <212> PRT <213> synthetic <400> 497 Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser Ala Ala Lys 1 5 10 15 Ser Thr Pro Thr 20 <210> 498 <211> 20 <212> PRT <213> synthetic <400> 498 Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser Asp Ala Ala 1 5 10 15 Ser Thr Pro Thr 20 <210> 499 <211> 20 <212> PRT <213> synthetic <400> 499 Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser Asp Ala Lys 1 5 10 15 Ala Thr Pro Thr 20 <210> 500 <211> 20 <212> PRT <213> synthetic <400> 500 Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser Asp Ala Lys 1 5 10 15 Ser Ala Pro Thr 20 <210> 501 <211> 20 <212> PRT <213> synthetic <400> 501 Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser Asp Ala Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ala Thr 20 <210> 502 <211> 20 <212> PRT <213> synthetic <400> 502 Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser Asp Ala Lys 1 5 10 15 Ser Thr Pro Ala 20 <210> 503 <211> 25 <212> PRT <213> synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> PHOSPHORYLATION <400> 503 His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp 1 5 10 15 Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly 20 25 <210> 504 <211> 25 <212> PRT <213> synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> PHOSPHORYLATION <400> 504 His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp 1 5 10 15 Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly 20 25 <210> 505 <211> 25 <212> PRT <213> synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (18)..(18) <223> PHOSPHORYLATION <400> 505 His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp 1 5 10 15 Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly 20 25 <210> 506 <211> 25 <212> PRT <213> synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> PHOSPHORYLATION <400> 506 His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp 1 5 10 15 Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly 20 25 <210> 507 <211> 25 <212> PRT <213> synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> PHOSPHORYLATION <400> 507 His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp 1 5 10 15 Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly 20 25 <210> 508 <211> 25 <212> PRT <213> synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> PHOSPHORYLATION <400> 508 His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp 1 5 10 15 Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly 20 25 <210> 509 <211> 25 <212> PRT <213> synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (18)..(18) <223> PHOSPHORYLATION <400> 509 His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp 1 5 10 15 Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly 20 25 <210> 510 <211> 25 <212> PRT <213> synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> PHOSPHORYLATION <400> 510 His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp 1 5 10 15 Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly 20 25 <210> 511 <211> 25 <212> PRT <213> synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> PHOSPHORYLATION <400> 511 His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp 1 5 10 15 Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly 20 25 <210> 512 <211> 25 <212> PRT <213> synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (18)..(18) <223> PHOSPHORYLATION <400> 512 His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp 1 5 10 15 Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly 20 25 <210> 513 <211> 25 <212> PRT <213> synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> PHOSPHORYLATION <400> 513 His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp 1 5 10 15 Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly 20 25 <210> 514 <211> 25 <212> PRT <213> synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> PHOSPHORYLATION <400> 514 His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp 1 5 10 15 Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly 20 25 <210> 515 <211> 25 <212> PRT <213> synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (18)..(18) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> PHOSPHORYLATION <400> 515 His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp 1 5 10 15 Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly 20 25 <210> 516 <211> 25 <212> PRT <213> synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (18)..(18) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> PHOSPHORYLATION <400> 516 His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp 1 5 10 15 Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly 20 25 <210> 517 <211> 25 <212> PRT <213> synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> PHOSPHORYLATION <400> 517 His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp 1 5 10 15 Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly 20 25 <210> 518 <211> 24 <212> PRT <213> synthetic <400> 518 Leu Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr 1 5 10 15 Ser Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr 20 <210> 519 <211> 24 <212> PRT <213> synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (24)..(24) <223> PHOSPHORYLATION <400> 519 Leu Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr 1 5 10 15 Ser Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr 20 <210> 520 <211> 24 <212> PRT <213> synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> PHOSPHORYLATION <400> 520 Leu Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr 1 5 10 15 Ser Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr 20 <210> 521 <211> 24 <212> PRT <213> synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> PHOSPHORYLATION <400> 521 Leu Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr 1 5 10 15 Ser Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr 20 <210> 522 <211> 24 <212> PRT <213> synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> PHOSPHORYLATION <400> 522 Leu Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr 1 5 10 15 Ser Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr 20 <210> 523 <211> 24 <212> PRT <213> synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> PHOSPHORYLATION <400> 523 Leu Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr 1 5 10 15 Ser Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr 20 <210> 524 <211> 24 <212> PRT <213> synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> PHOSPHORYLATION <400> 524 Leu Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr 1 5 10 15 Ser Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr 20 <210> 525 <211> 24 <212> PRT <213> synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> PHOSPHORYLATION <400> 525 Leu Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr 1 5 10 15 Ser Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr 20 <210> 526 <211> 24 <212> PRT <213> synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> PHOSPHORYLATION <400> 526 Leu Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr 1 5 10 15 Ser Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr 20 <210> 527 <211> 24 <212> PRT <213> synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> PHOSPHORYLATION <400> 527 Leu Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr 1 5 10 15 Ser Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr 20 <210> 528 <211> 24 <212> PRT <213> synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> PHOSPHORYLATION <400> 528 Leu Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr 1 5 10 15 Ser Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr 20 <210> 529 <211> 24 <212> PRT <213> synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> PHOSPHORYLATION <400> 529 Leu Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr 1 5 10 15 Ser Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr 20 <210> 530 <211> 23 <212> DNA <213> synthetic <400> 530 tctccgccgg tgagtctcga ggc 23 <210> 531 <211> 26 <212> DNA <213> synthetic <400> 531 tgtccctgga tgcaggctac tctagg 26 <210> 532 <211> 24 <212> DNA <213> synthetic <400> 532 agagtagcct gcatccaggg acag 24 <210> 533 <211> 30 <212> DNA <213> synthetic <400> 533 tctagatcat ttaccaggag agtgggagag 30 <210> 534 <211> 34 <212> DNA <213> synthetic <400> 534 tctcctggta aatgatctag agtttaaacc gctg 34 <210> 535 <211> 25 <212> PRT <213> synthetic <400> 535 Ala Thr Gly Gly Cys Cys Cys Ala Cys Thr Ala Cys Gly Thr Gly Ala 1 5 10 15 Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala Cys Cys 20 25

Claims (45)

  1. 모노클로날 항체로서, 항체가 a) 정상 인간 뇌 조직에서의 타우(tau)에 결합하고 b) 인간 AD 뇌 조직에서의 타우에는 결합하지 않는, 항체.
  2. 제1항에 있어서, 항체가 a) 정상 인간 뇌 조직에서 타우와 면역학적 복합체를 형성하고, b) 인간 AD 뇌 조직에서 타우와 면역학적 복합체를 형성하지 않는, 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항체가 타우에 특이적으로 결합하는 인간 항체로부터의 항원 결합 가변 영역 및 인간 IgG1의 재조합 불변 영역을 포함하는 키메라 항체이며, 키메라 항체는 인간 항체와 상이한, 항체.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항체가 타우에 특이적으로 결합하는 인간 항체로부터의 항원 결합 가변 영역 및 인간 IgG1의 재조합 불변 영역을 포함하는 키메라 항체이며, 키메라 항체의 불변 영역은 인간 항체의 불변 영역과 상이한, 항체.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항체가 타우에 특이적으로 결합하는 천연 발생 인간 항원 결합 가변 영역 및 인간 IgG1 항체의 재조합 불변 영역을 포함하는 키메라 항체인, 항체.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항체가 키메라 항체이며, 항체는 인간 항체로부터의 천연 발생 인간 경쇄 및 중쇄 가변 영역 및 재조합 인간 IgG1 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 포함하는, 항체.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항체가 키메라 항체이며, 키메라 항체는 천연 발생 인간 항체로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 및 재조합 인간 IgG1 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 포함하는, 항체.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항체가 인간 항체로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 및 재조합 인간 IgG1 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 포함하는 키메라 항체인, 항체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 인간 모노클로날 항체의 비-천연 발생 변이체인, 항체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 인간 AD 뇌에서 포스파타아제-처리된 타우 침착물에 결합하는, 항체.
  11. 제10항에 있어서, 항체가 포스파타아제-처리된 인간 AD 조직에서 타우 침착물과 면역학적 복합체를 형성하는, 항체.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 a) 변성된 PHF 타우에 결합하고 b) 변성되지 않은 PHF 타우에는 결합하지 않는, 항체.
  13. 제12항에 있어서, 항체가 포스파타아제-처리된, 변성되지 않은 PHF 타우에 결합하는, 항체.
  14. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 a) 웨스턴 블롯에 의해 PHF 타우에 결합하며 d) ELISA에 의해 PHF-타우에는 결합하지 않는, 항체.
  15. 제14항에 있어서, 항체가 ELISA에 의해 포스파타아제-처리된 PHF 타우에 결합하는, 항체.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체가 SEQ ID NO: 325 및 SEQ ID NO: 331로 구성된 군으로부터 선택되는 펩타이드에 결합하는, 항체.
  17. 제16항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO: 382, SEQ ID NO: 458 및 SEQ ID NO: 386으로 구성된 군으로부터 선택되는 펩타이드에 결합하는, 항체.
  18. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 a) SEQ ID NO: 201의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 202의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 203의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID NO: 204의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 205의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 206의 경쇄 CDR3 영역을 포함하는 항체, b) SEQ ID NO: 207의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 208의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 209의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID NO: 210의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 211의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 212의 경쇄 CDR3 영역을 포함하는 항체, c) SEQ ID NO: 222의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 223의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 224의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID NO: 225의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 173의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 226의 경쇄 CDR3 영역을 포함하는 항체, d) SEQ ID NO: 238의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 239의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 240의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID NO: 241의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 173의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 242의 경쇄 CDR3 영역을 포함하는 항체, e) SEQ ID NO: 243의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 244의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 245의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID NO: 246의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 173의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 212의 경쇄 CDR3 영역을 포함하는 항체, f) SEQ ID NO: 243의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 247의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 248의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID NO: 249의 경쇄 CDR1 영역 SEQ ID NO: 173의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 212의 경쇄 CDR3 영역을 포함하는 항체 및 g) SEQ ID NO: 250의 중쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 251의 중쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 252의 중쇄 CDR3 영역, SEQ ID NO: 254의 경쇄 CDR1 영역, SEQ ID NO: 254의 경쇄 CDR2 영역 및 SEQ ID NO: 255의 경쇄 CDR3 영역을 포함하는 항체로 구성된 군으로부터 선택되는, 항체.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO: 115의 VH 및 SEQ ID NO: 116의 VL의 항원-결합 부위를 포함하는, 항체.
  20. 제19항에 있어서, SEQ ID NO: 115의 VH 및 SEQ ID NO: 116의 VL의 항원-결합 부위를 포함하며, 항체는 SEQ ID NO: 282의 VH 및 SEQ ID NO: 283의 VL을 포함하는 모노클로날 항체의 비-천연 발생 변이체인, 항체.
  21. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO: 119의 VH 및 SEQ ID NO: 120의 VL의 항원-결합 부위를 포함하는, 항체.
  22. 제21항에 있어서, SEQ ID NO: 119의 VH 및 SEQ ID NO: 120의 VL의 항원-결합 부위를 포함하며, 항체는 SEQ ID NO: 284의 VH 및 SEQ ID NO: 285의 VL을 포함하는 모노클로날 항체의 비-천연 발생 변이체인, 항체.
  23. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO: 135의 VH 및 SEQ ID NO: 136의 VL의 항원-결합 부위를 포함하는, 항체.
  24. 제23항에 있어서, SEQ ID NO: 135의 VH 및 SEQ ID NO: 136의 VL의 항원-결합 부위를 포함하며, 항체는 SEQ ID NO: 295의 VH 및 SEQ ID NO: 296의 VL을 포함하는 모노클로날 항체의 비-천연 발생 변이체인, 항체.
  25. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO: 147의 VH 및 SEQ ID NO: 148의 VL의 항원-결합 부위를 포함하는, 항체.
  26. 제25항에 있어서, SEQ ID NO: 147의 VH 및 SEQ ID NO: 148의 VL의 항원-결합 부위를 포함하며, 항체는 SEQ ID NO: 306의 VH 및 SEQ ID NO: 307의 VL을 포함하는 모노클로날 항체의 비-천연 발생 변이체인, 항체.
  27. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO: 151의 VH 및 SEQ ID NO: 152의 VL의 항원-결합 부위를 포함하는, 항체.
  28. 제27항에 있어서, SEQ ID NO: 151의 VH 및 SEQ ID NO: 152의 VL의 항원-결합 부위를 포함하며, 항체는 SEQ ID NO: 309의 VH 및 SEQ ID NO: 310의 VL을 포함하는 모노클로날 항체의 비-천연 발생 변이체인, 항체.
  29. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO: 155의 VH 및 SEQ ID NO: 156의 VL의 항원-결합 부위를 포함하는, 항체.
  30. 제29항에 있어서, SEQ ID NO: 155의 VH 및 SEQ ID NO: 156의 VL의 항원-결합 부위를 포함하며, 항체는 SEQ ID NO: 311의 VH 및 SEQ ID NO: 312의 VL을 포함하는 모노클로날 항체의 비-천연 발생 변이체인, 항체.
  31. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO: 159의 VH 및 SEQ ID NO: 160의 VL의 항원-결합 부위를 포함하는, 항체.
  32. 제31항에 있어서, SEQ ID NO: 159의 VH 및 SEQ ID NO: 160의 VL의 항원-결합 부위를 포함하며, 항체는 SEQ ID NO: 313의 VH 및 SEQ ID NO: 314의 VL을 포함하는 모노클로날 항체의 비-천연 발생 변이체인, 항체.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 항체의 항원-결합 단편.
  34. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 항체의 기능적 변이체.
  35. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 항체 및/또는 제33항에 따른 항원-결합 단편 및/또는 제34항에 따른 기능적 변이체를 포함하는 면역접합체로서, 적어도 하나의 치료제 및/또는 검출 가능한 제제를 추가로 포함하는 면역접합체.
  36. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 항체 및/또는 제33항에 따른 항원-결합 단편 및/또는 제34항에 따른 기능적 변이체를 인코딩하는 단리된 핵산.
  37. 제36항에 따른 핵산을 포함하는 벡터.
  38. 제37항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  39. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 항체 및/또는 제33항에 따른 항원-결합 단편 및/또는 제34항에 따른 기능적 변이체의 제조 방법으로서, 제38항의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 숙주 세포에 의해 제조된 항체 또는 이의 단편을 회수하는 단계를 포함하는 방법.
  40. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 항체 및/또는 제33항에 따른 항원-결합 단편 및/또는 제34항에 따른 기능적 변이체 및/또는 제35항에 따른 면역접합체를 포함하는 약학 조성물로서, 적어도 하나의 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 추가로 포함하는 약학 조성물.
  41. 약제로서 이용하기 위한, 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 항체 및/또는 제33항에 따른 항원-결합 단편 및/또는 제34항에 따른 기능적 변이체 및/또는 제35항에 따른 면역접합체 또는 제40항에 따른 약학 조성물.
  42. 알츠하이머병, 또는 타우와 연관된 기억 및/또는 인지 장애의 예방 또는 치료 또는 이들의 조합에서 이용하기 위한, 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 항체 및/또는 제33항에 따른 항원-결합 단편 및/또는 제34항에 따른 기능적 변이체 및/또는 제35항에 따른 면역접합체 또는 제40항에 따른 약학 조성물.
  43. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 항체 적어도 하나 및/또는 제33항에 따른 항원-결합 단편 및/또는 제34항에 따른 기능적 변이체 및/또는 제35항에 따른 면역접합체 또는 제40항에 따른 약학 조성물 또는 이들의 조합을 포함하는 키트.
  44. 알츠하이머병, 또는 타우와 연관된 기억 및/또는 인지 장애의 검출 또는 진단 방법으로서, a) 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 항체 및/또는 제33항에 따른 항원-결합 단편 및/또는 제34항에 따른 기능적 변이체 및/또는 제35항에 따른 면역접합체를 이용하여 샘플에서 타우 항원의 수준을 검정하는 단계 및 b) 인간 생물학적 샘플을 이용하여 알츠하이머병, 또는 기억 및/또는 인지 장애를 검출하거나 진단하는 단계를 포함하는 방법.
  45. 제44항에 있어서, 인간 생물학적 샘플이 말초혈, 혈청, 혈장, 소변, 뇌척수액, 조직 생검, 수술 시편, 미세 바늘 흡입물, 부검 물질, 세포 배양 상청액, 단리된 세포, 발효 상청액, 또는 조직 균질물인 방법.
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