EA045151B1 - Антитела анти-phf-тау и их применение - Google Patents
Антитела анти-phf-тау и их применение Download PDFInfo
- Publication number
- EA045151B1 EA045151B1 EA202092088 EA045151B1 EA 045151 B1 EA045151 B1 EA 045151B1 EA 202092088 EA202092088 EA 202092088 EA 045151 B1 EA045151 B1 EA 045151B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- seq
- variable region
- chain variable
- tau
- antibody
- Prior art date
Links
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 101
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 75
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 75
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 75
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 57
- 102100040243 Microtubule-associated protein tau Human genes 0.000 claims description 39
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 12
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 9
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 9
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 6
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 claims description 5
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 4
- 101710115937 Microtubule-associated protein tau Proteins 0.000 claims description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 3
- 108010026424 tau Proteins Proteins 0.000 description 82
- 238000000034 method Methods 0.000 description 51
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 49
- 102000013498 tau Proteins Human genes 0.000 description 46
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 36
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 description 32
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 28
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 28
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 22
- 208000034799 Tauopathies Diseases 0.000 description 22
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 20
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 19
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 18
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 16
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 15
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 15
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 15
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 15
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 14
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 14
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 14
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 13
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 12
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 11
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 11
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 11
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 11
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 11
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 230000004845 protein aggregation Effects 0.000 description 10
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 description 9
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 9
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 9
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 9
- 210000002682 neurofibrillary tangle Anatomy 0.000 description 9
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 9
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 9
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 9
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 9
- 201000011240 Frontotemporal dementia Diseases 0.000 description 8
- 238000001327 Förster resonance energy transfer Methods 0.000 description 8
- 238000003491 array Methods 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 7
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 7
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 7
- 238000003318 immunodepletion Methods 0.000 description 7
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 7
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 7
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 7
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 7
- 102100033421 Keratin, type I cytoskeletal 18 Human genes 0.000 description 6
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 6
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 6
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 208000017004 dementia pugilistica Diseases 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 6
- 208000025688 early-onset autosomal dominant Alzheimer disease Diseases 0.000 description 6
- 208000015756 familial Alzheimer disease Diseases 0.000 description 6
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 6
- 230000006911 nucleation Effects 0.000 description 6
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 6
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 6
- 230000004044 response Effects 0.000 description 6
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 5
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 5
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 5
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 5
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 5
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 5
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 5
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- 206010056696 Gaze palsy Diseases 0.000 description 4
- 101000891579 Homo sapiens Microtubule-associated protein tau Proteins 0.000 description 4
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 4
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000003710 cerebral cortex Anatomy 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 4
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 4
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 4
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000005145 Cerebral amyloid angiopathy Diseases 0.000 description 3
- 208000004051 Chronic Traumatic Encephalopathy Diseases 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 208000011990 Corticobasal Degeneration Diseases 0.000 description 3
- 208000020406 Creutzfeldt Jacob disease Diseases 0.000 description 3
- 208000003407 Creutzfeldt-Jakob Syndrome Diseases 0.000 description 3
- 208000010859 Creutzfeldt-Jakob disease Diseases 0.000 description 3
- 208000009093 Diffuse Neurofibrillary Tangles with Calcification Diseases 0.000 description 3
- 201000010374 Down Syndrome Diseases 0.000 description 3
- 206010018341 Gliosis Diseases 0.000 description 3
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 208000026072 Motor neurone disease Diseases 0.000 description 3
- 208000001089 Multiple system atrophy Diseases 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 206010068871 Myotonic dystrophy Diseases 0.000 description 3
- 208000036757 Postencephalitic parkinsonism Diseases 0.000 description 3
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 3
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 3
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 description 3
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 3
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 230000007387 gliosis Effects 0.000 description 3
- 102000057063 human MAPT Human genes 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 201000008319 inclusion body myositis Diseases 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 208000005264 motor neuron disease Diseases 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 208000002593 pantothenate kinase-associated neurodegeneration Diseases 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 208000000170 postencephalitic Parkinson disease Diseases 0.000 description 3
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 3
- 230000002739 subcortical effect Effects 0.000 description 3
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 3
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 208000037259 Amyloid Plaque Diseases 0.000 description 2
- 101710137189 Amyloid-beta A4 protein Proteins 0.000 description 2
- 101710151993 Amyloid-beta precursor protein Proteins 0.000 description 2
- 102100022704 Amyloid-beta precursor protein Human genes 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 2
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 2
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- BACYUWVYYTXETD-UHFFFAOYSA-N N-Lauroylsarcosine Chemical compound CCCCCCCCCCCC(=O)N(C)CC(O)=O BACYUWVYYTXETD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 2
- 208000010577 Niemann-Pick disease type C Diseases 0.000 description 2
- 208000007542 Paresis Diseases 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 208000007930 Type C Niemann-Pick Disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N amyloid-beta polypeptide 42 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C(C)C)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N 0.000 description 2
- 208000013968 amyotrophic lateral sclerosis-parkinsonism-dementia complex Diseases 0.000 description 2
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 2
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 208000010877 cognitive disease Diseases 0.000 description 2
- 230000003920 cognitive function Effects 0.000 description 2
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 2
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- -1 for example Substances 0.000 description 2
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 230000000971 hippocampal effect Effects 0.000 description 2
- 210000001320 hippocampus Anatomy 0.000 description 2
- 239000011539 homogenization buffer Substances 0.000 description 2
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 2
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 2
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 239000012462 polypropylene substrate Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QAPSNMNOIOSXSQ-YNEHKIRRSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-[tert-butyl(dimethyl)silyl]oxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O[Si](C)(C)C(C)(C)C)C1 QAPSNMNOIOSXSQ-YNEHKIRRSA-N 0.000 description 1
- QUTSYCOAZVHGGT-UHFFFAOYSA-N 2,6-bis(bromomethyl)pyridine Chemical compound BrCC1=CC=CC(CBr)=N1 QUTSYCOAZVHGGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000000044 Amnesia Diseases 0.000 description 1
- 102000013455 Amyloid beta-Peptides Human genes 0.000 description 1
- 108010090849 Amyloid beta-Peptides Proteins 0.000 description 1
- 206010059245 Angiopathy Diseases 0.000 description 1
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 1
- 206010002942 Apathy Diseases 0.000 description 1
- 108010060159 Apolipoprotein E4 Proteins 0.000 description 1
- 206010003062 Apraxia Diseases 0.000 description 1
- 235000017060 Arachis glabrata Nutrition 0.000 description 1
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 description 1
- 235000010777 Arachis hypogaea Nutrition 0.000 description 1
- 235000018262 Arachis monticola Nutrition 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 108091008875 B cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 208000014644 Brain disease Diseases 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 208000028698 Cognitive impairment Diseases 0.000 description 1
- 206010010219 Compulsions Diseases 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- YZCKVEUIGOORGS-OUBTZVSYSA-N Deuterium Chemical compound [2H] YZCKVEUIGOORGS-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 1
- 206010013142 Disinhibition Diseases 0.000 description 1
- 241001269524 Dura Species 0.000 description 1
- 208000014094 Dystonic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 101000854943 Enterobacteria phage T4 Valyl-tRNA ligase modifier Proteins 0.000 description 1
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 206010017577 Gait disturbance Diseases 0.000 description 1
- 208000003736 Gerstmann-Straussler-Scheinker Disease Diseases 0.000 description 1
- 206010072075 Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrome Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000617536 Homo sapiens Presenilin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000617546 Homo sapiens Presenilin-2 Proteins 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035150 Hypercholesterolemia Diseases 0.000 description 1
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 108010001127 Insulin Receptor Proteins 0.000 description 1
- 102100036721 Insulin receptor Human genes 0.000 description 1
- 102100039688 Insulin-like growth factor 1 receptor Human genes 0.000 description 1
- 101710184277 Insulin-like growth factor 1 receptor Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 208000030979 Language Development disease Diseases 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 1
- 102000011965 Lipoprotein Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010061306 Lipoprotein Receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 239000012515 MabSelect SuRe Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 206010027374 Mental impairment Diseases 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000011887 Necropsy Methods 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 208000027089 Parkinsonian disease Diseases 0.000 description 1
- 206010034010 Parkinsonism Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 206010034719 Personality change Diseases 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 101000612288 Pinus strobus Putative oxygen-evolving enhancer protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010050254 Presenilins Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101100208039 Rattus norvegicus Trpv5 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 206010040030 Sensory loss Diseases 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 208000003028 Stuttering Diseases 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 102000007238 Transferrin Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010033576 Transferrin Receptors Proteins 0.000 description 1
- 206010044565 Tremor Diseases 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000009824 affinity maturation Effects 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002744 anti-aggregatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- 208000013404 behavioral symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000012742 biochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000002038 chemiluminescence detection Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 1
- 230000022811 deglycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 229910052805 deuterium Inorganic materials 0.000 description 1
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 208000010118 dystonia Diseases 0.000 description 1
- 238000001378 electrochemiluminescence detection Methods 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002996 emotional effect Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 210000005153 frontal cortex Anatomy 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L glutamate group Chemical group N[C@@H](CCC(=O)[O-])C(=O)[O-] WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003906 humectant Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000012405 in silico analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000011503 in vivo imaging Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000006317 isomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 229940043355 kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 238000012004 kinetic exclusion assay Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000029226 lipidation Effects 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 231100000863 loss of memory Toxicity 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000006386 memory function Effects 0.000 description 1
- 230000003340 mental effect Effects 0.000 description 1
- 208000027061 mild cognitive impairment Diseases 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 1
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000012510 peptide mapping method Methods 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008447 perception Effects 0.000 description 1
- 210000001428 peripheral nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N phenylalanine group Chemical group N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 239000003757 phosphotransferase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 201000000196 pseudobulbar palsy Diseases 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 102220013334 rs368367224 Human genes 0.000 description 1
- 230000001711 saccadic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004434 saccadic eye movement Effects 0.000 description 1
- 238000010517 secondary reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008159 sesame oil Substances 0.000 description 1
- 235000011803 sesame oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000002603 single-photon emission computed tomography Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 238000002672 stereotactic surgery Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000011477 surgical intervention Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- RVZPDKXEHIRFPM-UHFFFAOYSA-N tert-butyl n-(6-aminohexyl)carbamate Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)NCCCCCCN RVZPDKXEHIRFPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011285 therapeutic regimen Methods 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- 230000031998 transcytosis Effects 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
Description
Область применения изобретения
Настоящее изобретение относится к антителам анти-PHF-таy, а также к способам их получения и применения.
Предпосылки создания изобретения
Болезнь Альцгеймера (БА) представляет собой дегенеративное расстройство мозга, клинически характеризуемое прогрессирующей потерей памяти, когнитивных функций, способности к рассуждению, принятию решений и эмоциональной устойчивости, что постепенно приводит к глубокому умственному нарушению и в конечном итоге смерти. БА является очень частой причиной прогрессирующего умственного угасания (деменции) у пожилых людей и считается четвертой по частоте медицинской причиной смерти в США. БА наблюдается в различных этнических группах по всему миру и является сегодня и останется в будущем одной из основных проблем здравоохранения.
В мозге пациентов с БА наблюдаются характерные повреждения, называемые сенильными (или амилоидными) бляшками, амилоидной ангиопатией (амилоидными отложениями в кровеносных сосудах) и нейрофибриллярными клубками. У пациентов с БА обычно обнаруживают большие количества таких повреждений, в особенности амилоидных бляшек и нейрофибриллярных клубков из парных спиральных филаментов, в нескольких областях мозга человека, важных для памяти и когнитивных функций.
Основным белковым компонентом нейрофибриллярной дегенерации при БА и ряде других нейродегенеративных заболеваний является избыточно фосфорилированная форма ассоциированного с микротрубочками тау-белка. Разработка терапевтических средств для профилактики или противодействия агрегированию тау-белка уже многие годы вызывает большой интерес, но потенциальные препараты, включая противодействующие агрегированию соединения и ингибиторы киназы, только лишь сейчас достигли стадии клинических испытаний (Brunden, et al. Nat Rev Drug Discov 8:783-93, 2009).
Недавно на трансгенных мышиных тау-моделях были получены доклинические данные, что активная и пассивная иммунизация к тау-белку может обладать терапевтическим потенциалом (Chai, et al. J Biol Chem 286:34457-67, 2011, Boutajangout, et al. J Neurochem 118:658-67, 2011, Boutajangout, et al. J Neurosci 30:16559-66, 2010, Asuni, et al. J Neurosci 27:9115-29, 2007). Недавно была описана гипотеза передачи и распространения таупатии, основанная на предложенных Брааком стадиях развития таупатии в мозге человека и распространения таупатии после инъекции тау-агрегатов в доклинических тау-моделях (Frost, et al. J Biol Chem 284:12845-52, 2009, Clavaguera, et al. Nat Cell Biol 11:909-13, 2009). Таким образом, существует потребность в терапевтических средствах для профилактики агрегирования тау-белка и развития таупатии для лечения БА и других нейродегенеративных заболеваний.
Изложение сущности изобретения
В одном общем аспекте изобретение относится к выделенному антителу, предпочтительно к выделенному моноклональному антителу или к его антигенсвязывающему фрагменту, причем антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывает PHF-тау, предпочтительно PHF-тау человека.
В одном варианте осуществления моноклональное антитело изобретения или его антигенсвязывающий фрагмент имеет тяжелую цепь, содержащую HCDR1 с SEQ ID NO: 1 или 7; HCDR2 с SEQ ID NO: 2, 8, 10, 12, 13 или 14; и HCDR3 с SEQ ID NO: 3. В другом варианте осуществления моноклональное антитело изобретения имеет легкую цепь, содержащую LCDR1 с SEQ ID NO: 4, 9 или 11; LCDR2 с SEQ ID NO: 5; и LCDR3 с SEQ ID NO: 6. В других вариантах осуществления моноклональное антитело изобретения содержит CDR, который совпадает по меньшей мере на 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% с CDR по любой из последовательностей SeQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,9, 10, 11, 12, 13 или 14.
В другом варианте осуществления моноклональное антитело изобретения или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% совпадает с любой из последовательностей SEQ ID NO: 15, 17, 19, 21, 23 или 24. В другом варианте осуществления моноклональное антитело изобретения или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% совпадает с любой из последовательностей SEQ ID NO: 16, 18, 20, 22 и 25.
В другом варианте осуществления выделенное антитело изобретения или его антигенсвязывающий фрагмент дополнительно содержит константную область, такую как константную область тяжелой цепи IgG человека или мыши, и константную область легкой цепи каппа или лямбда антитела человека или мыши.
В другом общем аспекте изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей антитело изобретения или его антигенсвязывающий фрагмент.
В другом общем аспекте изобретение относится к вектору, содержащему выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело изобретения или его антигенсвязывающий фрагмент.
В другом общем аспекте изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей выделенную нук- 1 045151 леиновую кислоту, кодирующую антитело изобретения или его антигенсвязывающий фрагмент.
В другом общем аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент изобретения и фармацевтически приемлемый носитель.
В другом общем аспекте изобретение относится к способу снижения патологического агрегирования тау-белка или распространения таупатии у пациента, включающему введение пациенту фармацевтической композиции изобретения. Таупатия включает в себя, без ограничений, одно или более заболеваний, выбранных из группы, состоящей из болезни Альцгеймера (включая семейную болезнь Альцгеймера и спорадическую болезнь Альцгеймера), лобно-височной деменции с паркинсонизмом, связанной с хромосомой 17 (FTDP-17), прогрессирующего супрануклеарного пареза взора, кортикобазальной дегенерации, синдрома Пика, прогрессирующего субкортикального глиоза, деменции с преобладанием нейрофибриллярных клубков, диффузных нейрофибриллярных клубков с кальцификацией, деменции, характеризующейся появлением аргирофильных зерен, комплекса амиотрофический боковой склероз - паркинсонизм - деменция, синдрома Дауна, синдрома Герстманна -Штреусслера - Шейнкера, синдрома Галлервордена - Шпатца, миозита с включениями, болезни Крейцфельда - Якоба, множественной системной атрофии, болезни Ниманна -Пика типа С, церебральной амилоидной ангиопатии с прионными белками, подострого склерозирующего панэнцефалита, миотонической дистрофии, не-Гуамовой болезни двигательных нейронов с нейрофибриллярными клубками, постэнцефалитического паркинсонизма, хронической травматической энцефалопатии и деменции боксеров.
Таупатия предпочтительно представляет собой болезнь Альцгеймера (включая семейную болезнь Альцгеймера и спорадическую болезнь Альцгеймера), FTDP-17 и прогрессирующий супрануклеарный парез взора.
Наиболее предпочтительно таупатия представляет собой болезнь Альцгеймера (включая семейную болезнь Альцгеймера и спорадическую болезнь Альцгеймера).
В другом общем аспекте изобретение относится к способу получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента изобретения, включающему культивацию клетки, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, в условиях для получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, и выделение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента из клетки или клеточной культуры.
В другом общем аспекте изобретение относится к способу получения фармацевтической композиции, содержащей антитело изобретения или его антигенсвязывающий фрагмент, включающему объединение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с фармацевтически приемлемым носителем для получения фармацевтической композиции.
В другом общем аспекте изобретение относится к способу обнаружения присутствия PHF-тау у пациента или способу диагностирования таупатии у пациента путем обнаружения присутствия PHF-тау у пациента с применением антитела изобретения или его антигенсвязывающего фрагмента.
Другие аспекты, признаки и преимущества изобретения будут очевидны из представленного ниже описания, включающего подробное описание изобретения и его предпочтительных вариантов осуществления, и прилагаемой формулы изобретения.
Краткое описание графических материалов
Предшествующее краткое изложение, а также последующее подробное описание изобретения, будут более понятными при рассмотрении вместе с прилагаемыми чертежами. Необходимо понимать, что изобретение не ограничено точными вариантами осуществления, показанными на чертежах.
На фиг. 1А-С показано связывание mAb PT82, экспрессируемого рекомбинантным способом, или его Fab-фрагмента с PHF-тау и растворимым тау-белком по результатам анализа с применением поверхностного плазмонного резонанса (SPR), причем концентрация антитела или Fab указана рядом с соответствующей сенсограммой (75 нМ; 15 нМ; 3 нМ; 0,6 нМ). Показано связывание (A) mAb с PHF (В) Fab с PHF и (С) Fab с 2N4R тау.
На фиг. 2 показано связывание РТ82 из супернатанта гибридомы и РТ82, экспрессируемого рекомбинантным способом, с рекомбинантным 2N4R тау по результатам ИФА с применением двух концентраций покрытия 2N4R тау, 10 нг/мл или 1 нг/мл.
На фиг. 3А, В показана способность mAb PT82 блокировать образование тау-агрегатов по результатам анализа методом Ферстеровского резонансного переноса энергии (FRET). (А) - диаграмма анализа FRET в примененной клеточной модели. (В) - эффективность РТ82 в анализе FRET по сравнению с mAb отрицательного контроля (антитело CNTO1037/C18A).
На фиг. 4А-С показана способность mAb PT82 блокировать образование тау-агрегатов по результатам анализа методом иммунодеплеции. (А) - диаграмма иммунодеплеции при применении mAb PT82 для проведения иммунодеплеции либо гомогенатов из мозга человека с БА, либо экстракта спинного мозга мыши P301S. Антитело mAb PT82 показало способность уменьшать зародыши тау-белка и в гомогенате из мозга человека с БА, и в экстракте спинного мозга мыши P301S по результатам (В) анализа методом FRET и (С) селективного к агрегированию тау-белка анализа на платформе Meso Scale Discovery (MSD).
На фиг. 5А, В показана эффективность РТ82 в сравнении с эффективностью антител AT180 и РТ3 в
- 2 045151 модели инъекции ePHF in vivo при анализе (А) полного гомогената или (В) нерастворимой фракции.
На фиг. 6A-D показана эффективность РТ82 и РТ3 при (А) периферийном введении (интраперитонеальной инъекции) антитела в сравнении с (В) совместной интракраниальной инъекции антитела и PHF.
Эффективность анализировали по (С) полным гомогенатам и по (D) нерастворимым фракциям.
На фиг. 7 показаны данные картирования эпитопов с применением линейного пептидного картирования РТ82.
На фиг. 8 показано связывание гуманизированного mAb PT82 растворимым тау-белком по результатам ИФА.
Подробное описание изобретения
При применении в настоящем документе термин антитела используется в широком смысле и включает в себя молекулы иммуноглобулинов или антител, включая поликлональные антитела, моноклональные антитела, включая мышиные, человеческие, адаптированные для человека, гуманизированные и химерные моноклональные антитела и фрагменты антител.
В целом антитела представляют собой белки или пептидные цепи, которые демонстрируют специфичность связывания с конкретным антигеном. Структуры антител хорошо известны. Иммуноглобулины могут относиться к пяти основным классам, а именно IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, в зависимости от аминокислотной последовательности константного домена тяжелой цепи. IgA и IgG дополнительно подразделяются на изотипы IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Легкие цепи антител любых видов позвоночных можно относить в зависимости от аминокислотных последовательностей их константных доменов к одному из двух четко отличающихся типов, а именно каппа (к) и лямбда (λ).
Термин фрагменты антител означает часть интактного антитела. Примеры фрагментов антител включают в себя фрагменты Fab, Fab', F(ab')2 и Fv, CDR, антигенсвязывающие сайты, вариабельные области тяжелой или легкой цепи, диатела, молекулы одноцепочечных антител и мультиспецифичные антитела, образованные из по меньшей мере двух интактных антител или их фрагментов.
Вариабельная область легкой или тяжелой цепи иммуноглобулина состоит из каркасной области, прерываемой антигенсвязывающими сайтами.
Антигенсвязывающие сайты определены с помощью различных терминов следующим образом: (i) Определяющие комплементарность области (CDR) основаны на вариабельности последовательности (Wu and Kabat J Exp Med 132:211-50, 1970). По существу антигенсвязывающий сайт имеет три области CDR в каждой вариабельной области (HCDR1, HCDR2 и HCDR3 в вариабельной области тяжелой цепи (VH) и LCDR1, LCDR2 и LCDR3 в вариабельной области легкой цепи (VL)) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991). (ii) Термин гипервариабельная область, HVR или HV относится к областям вариабельного домена антитела, которые гипервариабельны по структуре согласно определениям Chothia и Lesk (Chothia and Lesk J Mol Biol 196:901-17, 1987). По существу антигенсвязывающий сайт имеет по три гипервариабельные области в каждой из вариабельной областей тяжелой цепи VH (H1, Н2, Н3) и легкой цепи VL (L1, L2, L3). Chothia и Lesk называют структурно консервативные гипервариабельные области каноническими структурами. Системы нумерации и аннотация областей CDR и HV были недавно пересмотрены Abhinandan и Martin (Abhinandan and Martin Mol Immunol 45:3832-9, 2008). (iii) Другое определение областей, которые образуют антигенсвязывающий сайт, было предложено Lefranc (Lefranc, et al. Dev Comp Immunol 27:55-77, 2003) на основе сравнения доменов V из иммуноглобулинов и рецепторов Т-клеток. В международной базе данных ImMunoGeneTics (IMGT) представлены стандартизированная нумерация и определение этих областей. Соответствие между разграничениями областей CDR, HV и IMGT описано в Lefranc et al., см. выше, (iv) Антигенсвязывающий сайт также может быть выделен на основе применения определяющих специфичность остатков (SDRU) (Almagro J Mol Recognit 17:132-43, 2004), причем термин определяющий специфичность остаток (SDR) относится к тем аминокислотным остаткам иммуноглобулина, которые непосредственно участвуют в контакте с антигеном.
Каркас или каркасная последовательность это оставшиеся последовательности внутри вариабельной области антитела, отличные от последовательностей, отнесенных к последовательностям антигенсвязывающих сайтов. Поскольку конкретное определение антигенсвязывающего сайта может быть сформулировано на основе разных признаков, как описано выше, конкретная каркасная последовательность зависит от определения антигенсвязывающего сайта.
При применении в настоящем документе термин моноклональное антитело (mAb) означает антитело (или фрагмент антитела), полученное из популяции по существу однородных антител. Моноклональные антитела высокоспецифичны, обычно направлены против единственной антигенной детерминанты.
При применении в настоящем документе термин эпитоп означает часть антигена, с которым специфически связывается антитело. Как правило, эпитопы состоят из химически активных (таких как полярные, неполярные или гидрофобные) поверхностных группировок фрагментов, таких как боковые цепи аминокислот, фосфорилированных аминокислот или полисахаридов, и могут иметь специфические характеристики трехмерной структуры, а также специфические характеристики заряда. Эпитоп может быть по природе линейным или несмежным эпитопом, например конформационным эпитопом, который образован за счет взаимного пространственного расположения несмежных аминокислот антигена, а не за
- 3 045151 счет линейной последовательности аминокислот. Конформационные эпитопы включают в себя эпитопы, возникающие в результате сворачивания антигена, когда аминокислоты из различных частей линейной последовательности антигена оказываются рядом друг с другом в трехмерном пространстве.
Тау-белок широко представлен в центральной и периферической нервной системе и имеет множество хорошо известных изоформ. В ЦНС человека в результате альтернативного сплайсинга существует шесть основных изоформ тау-белка с диапазоном размеров от 352 до 441 (Hanger, et al. Trends Mol Med 15:112-9, 2009). Эти изоформы отличаются друг от друга регулируемым включением 0-2 N-концевых вставок и 3 или 4 тандемно организованных повторов связывания с микротрубочками и получили названия 0N3R (SEQ ID NO: 26), 1N3R (SEQ ID NO: 27), 2N3R (SEQ ID NO: 28), 0N4R (SEQ ID NO: 29), 1N4R (SEQ ID NO: 30) и 2N4R (SEQ ID NO: 31). Термины контрольный тау-белок и растворимый тау-белок в настоящем документе применяются в качестве взаимозаменяемых и относятся к изоформе тау-белка с SEQ ID NO: 31, в которой отсутствуют фосфорилирование иные посттрансляционные модификации.
Тау-белок связывается с микротрубочками и регулирует транспорт карго через клетки, процесс, который можно модулировать фосфорилированием тау-белка. В БА и связанных расстройствах аномальное фосфорилирование тау-белка является доминирующим и считается предшественником и/или инициатором агрегирования тау-белка в фибрилы, получившие название парных спиральных филаментов (PHF). Основным компонентом PHF является избыточно фосфорилированный тау-белок. При применении в настоящем документе термин тау парных спиральных филаментов или PHF-тау относится к хорошо известным тау-агрегатам в парных спиральных филаментах. В электронной микроскопии явно проявляются две основные области в структуре PHF: рыхлая оболочка и центральный филамент; при этом рыхлая оболочка чувствительна к протеолизу и расположена снаружи филаментов, а устойчивое к протеазе ядро филаментов образует каркас PHF (Wischik, et al. Proc Natl Acad Sci USA 85:4884-8, 1988).
При применении в настоящем документе термин антитела, которые связываются PHF-тау относится к антителам, которые связываются с PHF-тау по результатам вестерн-блоттинга. Как правило, антитела, которые связываются PHF-тау, можно определять после окрашивания Кумасси приблизительно 500 нг PHF-тау после часового блокирования в 5%-ном (мас./об.) обезжиренном сухом молоке (NFDM) в ТРИС-буферном солевом растворе (TBS-T) с добавкой 0,05% Tween-20. Антитела, которые связываются с PHF-тау, необязательно не связываются с контрольным тау-белком (SEQ ID NO: 31) по результатам вестерн-блоттинга при тестировании в условиях нагрузки антигеном, при этом и контрольный тау-белок, и PHF-тау одинаково определяют с помощью антител к тау-белку, которые не имеют предпочтительного связывания с эпитопами PHF-тау (например, антитело НТ7, (ThermoScientific, Rockford, IL) (Mercken, et al. J Neurochem 58:548-53, 1992). Примером таких условий нагрузки антигеном является 500 нг PHF-тау и 200 нг контрольного тау-белка.
В настоящем документе применяются стандартные хорошо известные одно- и трехбуквенные коды аминокислот.
Композиции изобретения
Настоящее изобретение относится к антителам анти-PHF-Tay и применению подобных антител. Такие антитела анти-PHF-Tay могут обладать свойством связываться с фосфорилированным эпитопом на PHF-тау или связываться с нефосфорилированным эпитопом на PHF-тау. Антитела анти-PHF-Tay могут найти применение в качестве терапевтических агентов и в качестве исследовательских или диагностических реагентов для определения PHF-тау в биологических пробах, например в тканях или клетках.
В предпочтительных вариантах осуществления антитела изобретения имеют последовательности, представленные в табл. 1. РТ82 представляет собой мышиное моноклональное антитело, а РТ1В778, РТ1В779, РТ1В780, РТ1В781 и РТ1В782 - это гуманизированные варианты РТ82. Области CDR в последовательностях вариабельных областей подчеркнуты. Выделенные жирным шрифтом аминокислоты в областях CDR гуманизированных моноклональных антител указывают на замену по сравнению с последовательностью CDR PT82.
- 4 045151
Таблица 1
mAb | Название | SEQ ID NO | Последовательность | |
РТ82 | ||||
Vh | CDR1 | 1 | GFTFSNYWMN | |
CDR2 | 2 | QIRLQSDNYATRYAESVKG | ||
CDR3 | 3 | GTTY | ||
Домен VH | 15 | EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWM NWIRQSPEKGLEWVAQIRLQSDNYATRYAESVKGR FTISRDESKTSVYLQMNNLRTEDTGIYYCTGGTTYW GQGTLVTVSA | ||
vL | CDR1 | 4 | KASQNVGTAVA | |
CDR2 | 5 | SASIRYT | ||
CDR3 | 6 | QQFSSYPYT | ||
Домен VL | 16 | DIVMTQSOKFMSTSVGDRVSITCKASONVGTAVAW YQQKPGQSPKLLIYSASIRYTGVPDRFTGSGSGTDFT LTINYMQSEDLADYFCQQFSSYPYTFGGGTKLEIK | ||
РТ1В778 | ||||
VH | CDR1 | 7 | NYWMN | |
CDR2 | 8 | QIRLQSDNYVTRYAASVKG | ||
CDR3 | 3 | GTTY | ||
Домен Vh | 17 | EVOLVES GGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSNYWMN WIRQAPGKGLEWVGQIRLQSDNYVTRYAASVKGRF TISRDDSKNSVYLQMNSLKTEDTAVYYCTGGTTYW GQGTLVTVSS | ||
vL | CDR1 | 9 | KASQNVGTRVA | |
CDR2 | 5 | SASIRYT | ||
CDR3 | 6 | QQFSSYPYT |
- 5 045151
Домен vL | 18 | DIQMTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVGTRVAW YQQKPGKAPKLLIYSASIRYTGVPSRFSGSGSGTEFT LTISSMQPEDFATYYCQQFSSYPYTFGQGTKLEIK | ||
PT1B779 | ||||
VH | CDR1 | 7 | NYWMN | |
CDR2 | 10 | QIRLQDDNYATRYAASVKG | ||
CDR3 | 3 | GTTY | ||
Домен VH | 19 | EVOLVES GGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWMN WIRQAPGKGLEWVGQIRLQDDNYATRYAASVKGR FTISRDDSKNSVYLQMNSLKTEDTAVYYCTGGTTY WGQGTLVTVSS | ||
Vl | CDR1 | 11 | KASQNVGTKVA | |
CDR2 | 5 | SASIRYT | ||
CDR3 | 6 | QQFSSYPYT | ||
Домен VL | 20 | DIQMTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVGTKVAW YQQKPGKAPKLLIYSASIRYTGVPSRFSGSGSGTEFT LTISSMQPEDFATYYCQQFSSYPYTFGQGTKLEIK | ||
PT1B780 | ||||
Vh | CDR1 | 7 | NYWMN | |
CDR2 | 12 | QIRLQSDNYATRYAASVKG | ||
CDR3 | 3 | GTTY | ||
Домен Vh | 21 | EVOLVES GGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWMN WIRQAPGKGLEWVGQIRLQSDNYATRYAASVKGRF TISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCTGGTTYW GQGTLVTVSS | ||
vL | CDR1 | 11 | KASQNVGTKVA | |
CDR2 | 5 | SASIRYT | ||
CDR3 | 6 | QQFSSYPYT | ||
Домен VL | 22 | DIQMTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVGTKVAW YQQKPGKAPKLLIYSASIRYTGVPSRFSGSGSGTEFT LTISSLQPEDFATYYCQQFSSYPYTFGQGTKLEIK | ||
- 6 045151
РТ1В781 | ||||
Vh | CDR1 | 7 | NYWMN | |
CDR2 | 13 | QIRLQRDNYATRYAASVKG | ||
CDR3 | 3 | GTTY | ||
Домен VH | 23 | EVOLVES GGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWMN WIRQAPGKGLEWVGQIRLQRDNYATRYAASVKGR FTISRDDSKNSVYLQMNSLKTEDTAVYYCTGGTTY WGQGTLVTVSS | ||
Vl | CDR1 | 11 | KASQNVGTKVA | |
CDR2 | 5 | SASIRYT | ||
CDR3 | 6 | QQFSSYPYT | ||
Домен VL | 20 | DIOMTOSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVGTKVAW YQQKPGKAPKLLIYSASIRYTGVPSRFSGSGSGTEFT LTISSMQPEDFATYYCOQFSSYPYTFGQGTKLEIK | ||
РТ1В782 | ||||
Vh | CDR1 | 7 | NYWMN | |
CDR2 | 14 | QIRLQYDNYATRYAASVKG | ||
CDR3 | 3 | GTTY | ||
Домен Vh | 24 | EVOLVES GGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWMN WIROAPGKGLEWVGQIRLQYDNYATRYAASVKGR FTISRDDSKNSVYLQMNSLKTEDTAVYYCTGGTTY WGQGTLVTVSS | ||
Vl | CDR1 | 11 | KASQNVGTKVA | |
CDR2 | 5 | SASIRYT | ||
CDR3 | 6 | QQFSSYPYT | ||
Домен VL | 25 | DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVGTKVAWY QQKPGKAPKLLIYSASIRYTGVPSRFSGSGSGTEFTL TISSMQPEDFATYYCOQFSSYPYTFGQGTKLEIK |
В одном варианте осуществления моноклональное антитело изобретения или его антигенсвязывающий фрагмент имеет тяжелую цепь, содержащую HCDR1 с SEQ ID NO: 1 или 7; HCDR2 с SEQ ID NO: 2, 8, 10, 12, 13 или 14; и HCDR3 с SEQ ID NO: 3. В другом варианте осуществления моноклональное антитело изобретения имеет легкую цепь, содержащую LCDR1 с SEQ ID NO: 4, 9 или 11; LCDR2 с SEQ ID NO: 5; и LCDR3 с SEQ ID NO: 6.
В предпочтительном варианте осуществления моноклональное антитело изобретения или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:
HCDR1 с SEQ ID NO:1; HCDR2 с SEQ Ш NO:2 и HCDR3 с SEQ ГО NO:3 и LCDR1 с SEQ ID NO:4; LCDR2 с SEQ Ш NO:5; и LCDR3 с SEQ ID NO:6;
HCDR1 с SEQ ГО NO:7; HCDR2 с SEQ ГО NO:8 и HCDR3 с SEQ ГО NO:3 и LCDR1 с SEQ ГО NO:9; LCDR2 с SEQ ГО NO:5; и LCDR3 с SEQ ГО NO:6;
HCDR1 с SEQ ГО NO:7; HCDR2 с SEQ ГО NO: 10 и HCDR3 с SEQ ГО NO:3 и LCDR1 с SEQ ГО NO:11; LCDR2 с SEQ ГО NO:5; и LCDR3 с SEQ ГО NO:6;
HCDR1 с SEQ ГО NO:7; HCDR2 с SEQ ГО NO: 12 и HCDR3 с SEQ ГО NO:3 и LCDR1 с SEQ ГО NO:11; LCDR2 с SEQ ГО NO:5; и LCDR3 с SEQ ГО NO:6;
HCDR1 с SEQ ГО NO:7; HCDR2 с SEQ ГО NO: 13 и HCDR3 с SEQ ГО NO:3 и LCDR1 с SEQ ГО NO:11; LCDR2 с SEQ ГО NO:5; и LCDR3 с SEQ ГО NO:6; или
HCDR1 с SEQ ГО NO:7; HCDR2 с SEQ ГО NO: 14 и HCDR3 с SEQ ГО NO:3 и LCDR1 с SEQ ГО NO:11; LCDR2 с SEQ ГО NO:5; и LCDR3 с SEQ ГО NO:6.
- 7 045151
В других вариантах осуществления моноклональное антитело изобретения, которое связывается с
PHF-тау, содержит одну или более областей CDR, которые совпадают по меньшей мере на 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% с областью CDR по любой из последовательностей SEQ ID
NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14.
В другом варианте осуществления моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент изобретения содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую любую из последовательностей SEQ ID NO: 15, 17, 19, 21, 23 или 24, и вариабельную область легкой цепи, содержащую любую из последовательностей SEQ ID NO: 16, 18, 20, 22 и 25.
В другом варианте осуществления моноклональное антитело изобретения или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:
вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность SEQ ID NO: 15, вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность SEQ ID NO: 16;
вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность SEQ ID NO: 17, вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность SEQ ID NO: 18;
вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность SEQ ID NO: 19, вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность SEQ ID NO: 20;
вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность SEQ ID NO: 21, вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность SEQ ID NO: 22;
вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность SEQ ID NO: 23, вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность SEQ ID NO: 20; или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность SEQ ID NO: 24, вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность SEQ ID NO: 25.
В другом варианте осуществления моноклональное антитело изобретения или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с PHF-тау, содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% совпадает с любой из последовательностей SEQ ID NO: 15, 17, 19, 21, 23 или 24, и/или вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере на 99% или 100% совпадает с любой из последовательностей SEQ ID NO: 16, 18, 20, 22 и 25. В конкретном варианте осуществления области CDR соответствуют описанным в таблице 1, так что замены аминокислот находятся за пределами областей, не являющимися CDR вариабельной области.
В другом варианте осуществления выделенное антитело изобретения или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с эпитопом, содержащим аминокислоты 119-126 тау-белка человека, причем нумерация аминокислот дана согласно аминокислотной последовательности, представленной в последовательности SEQ ID NO: 31.
Хотя варианты осуществления, проиллюстрированные в примерах, содержат пары вариабельных областей (одну для тяжелой и одну для легкой цепи), специалист в данной области способен распознать, что альтернативные варианты осуществления могут содержать одиночные вариабельные области тяжелой или легкой цепи. Одиночную вариабельную область можно применять для скрининга вариабельных доменов, способных к формированию двухдоменного специфического антигенсвязывающего фрагмента, способного, например, связываться с PHF-тау. Такой скрининг можно осуществлять с помощью методов скрининга с фаговым дисплеем, например с применением иерархического двойного комбинаторного подхода, описанного в публикации РСТ № WO 92/01047. Согласно этому подходу применяют отдельную колонию, содержащую клон с цепью Н либо L, для заражения полной библиотеки клонов, кодирующих другую цепь (L или Н), и полученный двухцепочечный специфичный антигенсвязывающий домен выбирают в соответствии с описанными методами фагового дисплея.
Другой вариант осуществления изобретения представляет собой выделенное антитело, которое связывается с PHF-тау, содержащее антигенсвязывающий сайт, имеющий вариабельную область тяжелой цепи (VH) по любой из последовательностей SEQ ID NO: 15, 17, 19, 21, 23 или 24 и/или вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность по любой из последовательностей SEQ ID NO: 16, 18, 20, 22 и 25. В одном варианте осуществления выделенное антитело изобретения или его антигенсвязывающий фрагмент содержит область VH, имеющую идентификатор зародышевой линии по IMGT (Barbie and Lefranc, 1998, Exp. Clin. Immunogenet, 15: 171-183) IGHV6-3*01, и область VL, имеющую идентификатор зародышевой линии по IMGT IGKV6-13*01.
В любом из предшествующих вариантов осуществления выделенное антитело, которое связывается с PHF-тау, может быть гуманизировано.
Антитела настоящего изобретения могут быть сформированы различными методами, например с помощью гибридомного способа (Kohler and Milstein Nature 256:495-7, 1975). Химерные mAb, содержащие вариабельные области легкой и тяжелой цепей, полученные от антитела-донора (как правило, мышиного), ассоциированные с константными областями легкой и тяжелой цепей, полученными от антите- 8 045151 ла-акцептора (как правило, другого вида млекопитающих, такого как человек) могут быть получены способом, раскрытым в патенте США № 4,816,567. Антитела mAb с трансплантированной областью CDR, имеющие области CDR, полученные из донорного иммуноглобулина, отличного от человеческого (как правило, мышиного), при этом остальные полученные из иммуноглобулина части молекулы полученные из одного или более иммуноглобулинов человека, могут быть получены методами, известными специалистам в данной области, такими как раскрытые в патенте США № 5,225,539. Полностью человеческие mAb, в которых отсутствуют любые не относящиеся к человеку последовательности, могут быть получены из трансгенных по иммуноглобулину человека мышей методами, указанными в (Lonberg, et al. Nature 368:856-9, 1994, Fishwild, et al. Nat Biotechnol 14:845-51, 1996, Mendez, et al. Nat Genet 15:146-56, 1997). Человеческие mAb также можно получить и оптимизировать из библиотек фагового дисплея (Knappik, et al. J Mol Biol 296:57-86, 2000, Krebs, et al. J Immunol Methods 254:67-84, 2001, Shi, et al. J Mol Biol 397:385-96, 2010).
Гуманизацию антитела можно осуществить с помощью хорошо известных способов, таких как перекладка определяющих специфичность остатков (SDRR) (публ. пат. США № 2010/0261620), перекладка вариабельного домена (resurfacing) (Padlan et al. Mol. Immunol. 28:489-98, 1991), супергуманизация (super humanization) (межд. публ. пат. № WO 04/006955) и оптимизация содержания человеческой последовательности (патент США № 7,657,380). Специалисты в данной области могут выбрать пригодные для трансплантации/гуманизации каркасные последовательности человека из соответствующих баз данных. Выбранные каркасы можно дополнительно модифицировать для сохранения или повышения аффинности связывания методами, которые описаны, например, в работе Квин et al. (Queen, et al. Proc Natl Acad Sci USA 86:10029-33, 1989) или в публ. пат. США № 2011/0092372.
Получение PHF-тау для применения в качестве антигена для иммунизации или выделения антител из библиотек фагового дисплея можно осуществить любым соответствующим методом. В примере способа PHF-тау выделяют из мозга пациентов с БА, применяя хорошо известные протоколы, такие, как описаны в работе Гринберг и Дэвис (Greenberg and Davies Proc Natl Acad Sci USA 87:5827-31, 1990). PHF-тау можно выделить из коры головного мозга при посмертном вскрытии пациента с болезнью Альцгеймера. Чистоту и статус избыточного фосфорилирования выделенного PHF-тау характеризуют с помощью антител, которые, как известно, реагируют с PHF-тау. В традиционной процедуре получения PHF-тау полосы для избыточно фосфорилированной изоформы, мигрирующие в вестерн-блоттинге приблизительно при 60, 64, 68 и 72 кДа (Spillantini and Goedert Trends Neurosci 21:428-33, 1998), определяют применением антитела АТ8, которое специфически связывается с избыточно фосфорилированным PHFтау, но не с дефосфорилированным PHF-тау.
Антитела настоящего изобретения могут характеризоваться отсутствием связывания с контрольным тау-белком с SEQ ID NO: 31. Такие антитела можно получать с применением описанных выше способов и тестировать антитела на отсутствие их связывания с контрольным тау-белком в вестерн-блоттинге после окрашивания Кумасси, как описано выше. Контрольный тау-белок может быть экспрессирован рекомбинантным способом и очищен с применением стандартных способов.
Антитело изобретения или его антигенсвязывающий фрагмент можно дополнительно оценивать на специфичность, например с применением иммуногистохимии на контрольных срезах и срезах тканей мозга пациентов с БА.
Антитела изобретения могут иметь аффинность к PHF-тау с константой диссоциации (KD) менее чем или равной приблизительно 10-7, 10-8, 10-9, 10-10, 10-11 или 10-12 М. Аффинность данной молекулы к PHF-тау может быть определена экспериментально с применением любого соответствующего способа. Такие способы могут включать применение оборудования Biacore, ProteOn или KinExA, ИФА или анализы конкурентного связывания, известные специалистам в данной области.
Другим аспектом изобретения является выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент, который конкурирует по связыванию с PHF-тау с моноклональным антителом, содержащим антигенсвязывающий сайт, имеющий вариабельную область тяжелой цепи по любой из последовательностей SEQ ID NO: 15, 17, 19, 21, 23 или 24 и вариабельную область легкой цепи по любой из последовательностей SEQ ID NO: 16, 18, 20, 22 и 25.
Другим аспектом изобретения является выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент, который конкурирует по связыванию с PHF-тау с моноклональным антителом, содержащим антигенсвязывающий сайт, имеющий вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 15 и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16; вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 17 и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18; вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 19 и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20; вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 21 и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22; вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 23 и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20; или вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 24 и вариабельную об- 9 045151 ласть легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25.
Конкуренцию в связывании с PHF-тау можно количественно определять in vitro с помощью хорошо известных способов. Например, связывание антитела MSD Sulfo-Tag™, меченного с помощью NHSэфиров, с PHF-тау в присутствии немеченого антитела можно количественно определять методом иммуноанализа с электрохемилюминесцентным детектированием.
В дополнение к конкурентному связыванию для определение эпитопа связывания антител изобретения можно применять ряд хорошо известных способов. Например, в случае, когда известны структуры обоих отдельных компонентов, можно применять анализ in silico прикрепления одного белка к другому белку для идентификации способных к взаимодействию участков. Может быть проведено избирательное замещение водорода дейтерием (H/D) в комплексе антигена и антитела с целью картирования участков антигена, способных связываться с антителом. Для определения местоположения важных для связывания с антителом аминокислот может быть применен сегментный и точечный мутагенез антигена. Для идентификации остатков, участвующих в образовании эпитопа и паратопа, применяется сокристаллическая структура комплекса антиген -антитело.
Антитела изобретения могут представлять собой моноклональные антитела изотипов IgG, IgD, IgA или IgM. Антитела изобретения могут быть биспецифическими или мультиспецифическими. Пример биспецифического антитела может связываться с двумя различными эпитопами на PHF-тау или с PHFтау и амилоидом бета (АР). Другой пример биспецифического антитела может связываться с PHF-тау и с эндогенным рецептором трансцитоза гематоэнцефалического барьера, таким как инсулиновый рецептор, рецептор трансферрина, рецептор инсулинподобного фактора роста-1 и рецептор липопротеина. Пример антитела представляет собой антитело типа IgG1.
Иммуноэффекторные свойства антител изобретения также могут быть усилены или ослаблены за счет модификаций Fc с применением методик, хорошо известных специалистам в данной области. Например, эффекторные функции Fc, такие как связывание C1q, комплемент-зависимая цитотоксичность (CDC), антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (ADCC), фагоцитоз, понижение регуляции рецепторов клеточной поверхности (например, рецептора В-клеток; BCR) и т.п., могут обеспечиваться и/или управляться модифицирующими остатками в Fc, ответственными за эти действия. Например, Fc-область может содержать Fc-область человеческого IgG4, имеющую замены, которые исключают эффекторную функцию. Таким образом, выделенное антитело дополнительно содержит Fc-область, имеющую модифицированную Fc-область человеческого IgG4, содержащую одну или более из следующих замен: замену пролина на глутамат в положении 233, аланина или валина на фенилаланин в положении 234 и аланина или глутамата на лейцин в положении 235 (нумерация ЕС, Kabat, E. A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. U.S. Dept. of Health and Human Services, Bethesda, Md., NIH Publication no. 91-3242). Удаление участка N-связанного гликозилирования в Fc-области IgG4 путем замены аланина на аспарагин в положении 297 (нумерация ЕС) является еще одним способом устранения остаточной эффекторной активности. Мутировавшие остатки в Fc-домене, увеличивающие период полужизни антител, могут также улучшить фармакокинетические свойства (Strohl Curr Opin Biotechnol 20:685-91, 2009).
Кроме того, антитела изобретения могут быть модифицированы пост-трансляционно за счет таких процессов, как гликозилирование, изомеризация, дегликозилирование или ненатуральная ковалентная модификация, такая как присоединение молекулы полиэтиленгликоля (пегилирование) или липидизация. Такие модификации могут происходить in vivo или in vitro. Например, антитела изобретения могут быть конъюгированы с полиэтиленгликолем (пэгилированы) для улучшения их фармакокинетических профилей. Конъюгация может быть выполнена методами, известными специалистам в данной области. Отмечено, что конъюгация терапевтических антител с ПЭГ улучшает фармакодинамику, не оказывая влияния на функцию (Knight, et al. Platelets 15:409-18, 2004, Leong, et al. Cytokine 16:106-19, 2001, Yang, et al. Protein Eng 16:761-70, 2003).
Другой вариант осуществления изобретения представляет собой выделенный полинуклеотид, кодирующий антитела изобретения или их комплементы или фрагменты. Примерами выделенных полинуклеотидов являются полинуклеотиды, кодирующие полипептиды, включающие тяжелую цепь иммуноглобулина, включающую HCDR1 с SEQ ID NO: 1 или 7; HCDR2 с SEQ ID NO: 2, 8, 10, 12, 13 или 14; и HCDR3 с SEQ ID NO: 3, и которые имеют легкую цепь, включающую LCDR1 с SEQ ID NO: 4, 9 или 11; LCDR2 с SEQ ID NO: 5; и LCDR3 с SEQ ID NO: 6. Дополнительными примерами выделенных полинуклеотидов являются полинуклеотиды, кодирующие полипептиды, содержащие вариабельную область тяжелой цепи по любой из последовательностей SEQ ID NO: 15, 17, 19, 21, 23 или 24 и вариабельную область легкой цепи по любой из последовательностей SEQ ID NO: 16, 18, 20, 22 и 25.
Другие полинуклеотиды, которые, принимая во внимание вырожденность генетического кода или предпочтительность применения кодонов в данной экспрессирующей системе, кодируют антитела изобретения, также находятся в пределах объема изобретения. Выделенные нуклеиновые кислоты настоящего изобретения можно получить с применением хорошо известных рекомбинантных или синтетических методов. Кодирующие моноклональные антитела ДНК легко выделяются и секвенируются с применением способов, известных специалистам в данной области. При получении гибридомы такие клетки
- 10 045151 могут служить источником такой ДНК. Альтернативно, применение дисплейных методов, в которых кодирующая последовательность и продукт трансляции связаны друг с другом, таких как библиотеки фагового или рибосомального дисплея, упрощает выбор связывающего фрагмента и нуклеиновой кислоты. После выбора фага кодирующие области антитела из фага можно выделять и применять их для получения полных антител, включая человеческие антитела или любого иного требуемого антигенсвязывающего фрагмента, и экспрессировать их в любом необходимом организме-хозяине, включая клетки млекопитающих, клетки насекомых, клетки растений, дрожжи и бактерии.
Другой вариант осуществления изобретения представляет собой вектор, содержащий по меньшей мере один полинуклеотид изобретения. Такие векторы могут представлять собой плазмидные векторы, вирусные векторы, векторы на основе транспозонов или любые другие векторы, приемлемые для введения полинуклеотидов изобретения в данный организм или генетическое окружение каким-либо образом.
Другой вариант осуществления изобретения представляет собой клетку-хозяина, включающую любой из полинуклеотидов изобретения. Такими клетками-хозяевами могут быть эукариотические, бактериальные, растительные клетки или клетки архей. Примерами эукариотических клеток могут быть клетки млекопитающих, насекомых, птиц или другие клетки животного происхождения. Эукариотические клетки млекопитающих включают иммортализованные клеточные линии, такие как гибридомы или клеточные линии миеломы, например мышиные клеточные линии SP2/0 (Американская коллекция типовых культур (АТСС), г. Манассас, штат Вирджиния, CRL-1581), NS0 (Европейская коллекция клеточных культур (ЕСАсС), г. Солсбери, Уилтшир, Великобритания, ЕСАСС № 85110503), FO (АТСС CRL-1646) и Ag653 (ATCC CRL-1580). Примером клеточной линии миеломы человека является U266 (АТТС CRLTIB-196). Другие используемые клеточные линии включают в себя линии, полученные из клеток яичника китайского хомячка (СНО), например CHO-K1SV (Lonza Biologies), CHO-K1 (АТСС CRL-61, Invitrogen) или DG44.
Другой вариант осуществления изобретения представляет собой способ получения антител, которые связываются с PHF-тау, включающий культивирование клеток-хозяев изобретения и отбор антител, производимых клетками-хозяевами. Способы получения антител и их очистки хорошо известны специалистам в данной области.
Способы лечения
Анти-PHF-Tay антитела изобретения или их антигенсвязывающие фрагменты, включая фрагменты Fab, (Fab')2, scFv, или антитела, содержащие антигенсвязывающие сайты антител изобретения, можно применять для лечения, ослабления или профилактики появления симптомов у пациентов, имеющих нейродегенеративное заболевание, которое связано с патологическим агрегированием тау-белка в мозге.
Заболевания (таупатия), которые можно лечить способами изобретения, включают в себя, без ограничений, одно или более заболеваний, выбранных из группы, состоящей из болезни Альцгеймера (включая семейную болезнь Альцгеймера и спорадическую болезнь Альцгеймера), лобно-височной деменции с паркинсонизмом, связанной с хромосомой 17 (FTDP-17), прогрессирующего супрануклеарного пареза взора, кортико-базальной дегенерации, синдрома Пика, прогрессирующего субкортикального глиоза, деменции с преобладанием нейрофибриллярных клубков, диффузных нейрофибриллярных клубков с кальцификацией, деменции, характеризующейся появлением аргирофильных зерен, комплекса амиотрофический боковой склероз - паркинсонизм - деменция, синдрома Дауна, синдрома Герстманна - Штреусслера - Шейнкера, синдрома Галлервордена - Шпатца, миозита с включениями, болезни Крейцфельда Якоба, множественной системной атрофии, болезни Ниманна - Пика типа С, церебральной амилоидной ангиопатии с прионными белками, подострого склерозирующего панэнцефалита, миотонической дистрофии, не-Гуамовой болезни двигательных нейронов с нейрофибриллярными клубками, постэнцефалитического паркинсонизма, хронической травматической энцефалопатии и деменции боксеров.
Заболевание (таупатия) предпочтительно представляет собой болезнь Альцгеймера (включая семейную болезнь Альцгеймера и спорадическую болезнь Альцгеймера), FTDP-17 или прогрессирующий супрануклеарный парез взора.
Наиболее предпочтительно заболевание (таупатия) представляет собой болезнь Альцгеймера (включая семейную болезнь Альцгеймера и спорадическую болезнь Альцгеймера).
Не стремясь ограничить себя какой-то конкретной теорией, авторы изобретения считают, что антитела настоящего изобретения или их антигенсвязывающие фрагменты могут оказывать свой благоприятный эффект путем снижения патологического агрегирования тау-белка (например, путем профилактики агрегирования и/или путем уменьшения уже произошедшего агрегирования), и тем самым количества PHF-тау, в мозге. Антитела изобретения или их антигенсвязывающие фрагменты можно применять для лечения пациента-животного, принадлежащего к любой классификации. К примерам таких животных относятся млекопитающие, такие как люди, грызуны, собаки, кошки и сельскохозяйственные животные. Например, антитела изобретения или их антигенсвязывающие фрагменты могут найти применение для приготовления лекарственного препарата для лечения БА, причем лекарственный препарат готовится для введения в дозировках, определенных в настоящем документе.
Другой вариант осуществления изобретения представляет собой способ уменьшения агрегирования тау-белка у нуждающегося в этом пациента, включающий введение пациенту терапевтически эффектив- 11 045151 ного количества выделенного антитела изобретения или его антигенсвязывающего фрагмента в течение времени, достаточного для уменьшения агрегирования тау-белка.
Другой вариант осуществления изобретения представляет собой способ лечения или ослабления симптомов нейродегенеративного заболевания, которое связано с агрегированием тау-белка у пациента, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества выделенного антитела изобретения или его антигенсвязывающего фрагмента в течение времени, достаточного для лечения или ослабления симптомов нейродегенеративного заболевания.
В любом из указанных выше вариантов осуществления нейродегенеративное заболевание, которое связано с агрегированием тау-белка, представляет собой таупатию.
При применении в настоящем документе термин таупатия охватывает любые нейродегенеративные заболевания, которые связаны с патологическим агрегированием тау-белка в мозге. Помимо семейной и спорадической БА другими примерами таупатии являются лобно-височная деменция с паркинсонизмом, связанная с хромосомой 17 (FTDP-17), прогрессирующий супрануклеарный парез взора, кортико-базальная дегенерация, синдром Пика, прогрессирующий субкортикальный глиоз, деменция с преобладанием нейрофибриллярных клубков, диффузные нейрофибриллярные клубки с кальцификацией, деменция, характеризующаяся появлением аргирофильных зерен, комплекс амиотрофический боковой склероз - паркинсонизм - деменция, синдром Дауна, синдром Герстманна - Штреусслера - Шейнкера, синдром Галлервордена - Шпатца, миозит с включениями, болезнь Крейцфельда - Якоба, множественная системная атрофия, болезнь Ниманна - Пика типа С, церебральная амилоидная ангиопатия с прионными белками, подострый склерозирующий панэнцефалит, миотоническая дистрофия, не-Гуамова болезнь двигательных нейронов с нейрофибриллярными клубками, постэнцефалитический паркинсонизм и хроническая травматическая энцефалопатия, такая как деменция боксеров. (Morris, et al. Neuron 70:410-26, 2011).
Связанный с таупатией поведенческий фенотип включает в себя нарушения когнитивных функций, ранние изменения личности и расторможенность, апатию, патологическое безволие, задержку речи, нарушение целенаправленных движений, навязчивое повторение, стереотипные движения/поведение, гиперорализм, дезорганизацию, неспособность планировать или организовать последовательные задачи, эгоизм/черствость, антисоциальные черты, отсутствие эмпатии, запинание, аграмматическую речь с частыми парафазийными ошибками, но относительной сохранностью понимания, нарушение восприятия и трудности в подборе слов, медленно прогрессирующую неустойчивость походки, ретропульсию, застывание, частые падения, нечувствительную к леводопе аксиальную ригидность, супрануклеарный парез взора, прямоугольные саккадические осцилляции взора, медленные вертикальные саккады, псевдобульбарный синдром, апраксию конечностей, дистонию, кортикальную потерю чувствительности и тремор.
К подлежащим лечению пациентам относятся не имеющие симптомов лица, подверженные риску БА или иной таупатии, а также пациенты, имеющие выраженные симптомы. Подлежащие лечению пациенты включают лиц, у которых имеется известный генетический риск БА, например присутствие заболевания в семейном анамнезе, или наличие генетических факторов риска в геноме. Примерами факторов риска являются мутации в белке-предшественнике амилоида (АРР), особенно в положении 717 и положениях 670 и 671 (мутации Hardy и Swedish соответственно). Другими факторами риска являются мутации в генах пресенилина, PS1 и PS2, и АроЕ4, присутствие в семейном анамнезе гиперхолестеролемии или атеросклероза. Лиц, в настоящее время страдающих от БА, можно отличить от лиц с характерной деменцией по наличию описанных выше факторов риска. Кроме того, для выявления лиц, имеющих БА, имеется ряд диагностических тестов. Среди них - измерение уровней тау-белка и Ав42 в спинномозговой жидкости. Повышенный уровень тау-белка и пониженный уровень Ав42 указывают на наличие БА. Лиц, страдающих БА также можно диагностировать по критериям Ассоциации болезни Альцгеймера и связанных расстройств (AD and Related Disorders Association).
Введение/фармацевтические композиции
Анти-PHF-тау антитела изобретения или их антигенсвязывающие фрагменты можно применять в качестве как терапевтических, так и профилактических средств для лечения или профилактики нейродегенеративных заболеваний, которые связаны с патологическим агрегированием тау-белка, таких как БА или иные таупатии. Для не имеющих симптомов пациентов лечение можно начинать в любом возрасте (например, приблизительно в 10, 15, 20, 25, 30 лет). Однако обычно необходимость в начале лечения не возникает, пока пациент не достигнет возраста приблизительно 40, 50, 60 или 70 лет. Лечение, как правило, включает введение множества доз в течение некоторого периода времени. Ход лечения можно контролировать путем измерения ответа на терапевтический агент во времени по антителам или активированным Т-клеткам или В-клеткам. При падении ответа показаны повторные дозы.
В профилактических приложениях фармацевтические композиции или лекарственные средства вводят пациенту, уязвимому к или иным образом подверженному риску БА или иной таупатии в количестве, достаточном для устранения или снижения риска, уменьшения степени тяжести или задержки развития заболевания, включая биохимические, гистологические и/или поведенческие симптомы заболевания, его осложнения и промежуточные патологические фенотипы, присутствующие в процессе развития заболевания. В терапевтических приложениях композиции или лекарственные средства вводят пациенту,
- 12 045151 у которого подозревается или уже подтверждено наличие такого заболевания в мере, достаточной для ослабления, прекращения или задержки развития любого из симптомов заболевания (биохимического, гистологического и/или поведенческого). Введение терапевтического агента может уменьшить или устранить умеренные нарушения когнитивных функций у пациентов, у которых еще не развилась характерная патология расстройства. Количество, достаточное для проведения терапевтического или профилактического лечения, определяется как терапевтически или профилактически эффективная доза. И в профилактическом, и в терапевтическом режиме композиции или лекарственные средства обычно вводят несколькими дозами до достижения достаточного иммунного ответа.
Анти-PHF-тау антитела изобретения или их фрагменты можно вводить в комбинации с другими агентами, которые эффективны для лечения связанных нейродегенеративных заболеваний.
В способах изобретения терапевтически эффективное количество антитела при лечении или облегчении симптомов таупатии можно определить стандартными исследовательскими методами. Например, дозировку антитела можно определить путем введения агента соответствующим животным моделям, хорошо известным специалистам в данной области.
Кроме того, для определения диапазона оптимальной дозы, необязательно могут быть применены анализы in vitro. Выбор конкретной эффективной дозы (например, посредством клинических испытаний) могут осуществлять специалисты в данной области на основании нескольких факторов. Такие факторы включают: подлежащее лечению или предотвращению заболевание, соответствующие симптомы, массу тела пациента, иммунологический статус пациента и другие известные специалисту факторы. Точная доза, предназначенная для применения в составе, также будет зависеть от пути введения и степени тяжести заболевания и должна определяться на основании решения медработника и состояния каждого пациента. Эффективные дозы можно рассчитать на кривых дозовой зависимости, полученных в тестовых системах in vitro или животных моделей.
Для введения предназначенных для терапевтического применения антител изобретения можно применять любой подходящий путь введения, который обеспечивает доставку агента пациенту. Фармацевтические композиции таких антител применяются для парентерального введения, например внутрикожного, внутримышечного, внутрибрюшинного, внутривенного, подкожного, интраназального или интракраниального, или их могут вводить в спинномозговую жидкость головного или спинного мозга.
Антитела изобретения или их антигенсвязывающие фрагменты могут быть получены в качестве фармацевтических композиций, содержащих эффективное количество антитела или фрагмента в качестве активного ингредиента в фармацевтически приемлемом носителе. Термин носитель относится к разбавителю, вспомогательному веществу, эксципиенту или несущей среде, вместе с которыми вводят антитело. Такие фармацевтические носители могут представлять собой жидкости, такие как, например, вода или масла, включая масла, получаемые из нефти, масла животного, растительного или синтетического происхождения, например арахисовое, соевое, минеральное, кунжутное масло и т.п. Например, можно применять 0,4%-ный солевой раствор и 0,3%-ный раствор глицина. Эти растворы стерильны и по существу не содержат твердых частиц. Их можно стерилизовать с применением хорошо известных стандартных методик стерилизации (например, фильтрации). Композиции могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, необходимые для соответствующих физиологических условий, такие как регуляторы рН, буферные вещества, стабилизаторы, загустители, увлажнители, пигменты и т.п. Концентрация антител изобретения в таком фармацевтическом составе может значительно варьироваться, т.е. от менее чем около 0,5%, обычно по меньшей мере около 1% и до 15% или 20% по массе, и определяется преимущественно на основе необходимой дозы, объемов текучей среды, вязкости и т.п., в соответствии с конкретным выбранным способом введения.
Введение можно осуществлять по схеме с единственной дозой или по схеме со множеством доз, при которой основной курс лечения может включать 1-10 отдельных доз, после чего следуют другие дозы, вводимые в последующие временные интервалы, необходимые для поддержания и/или усиления ответа, например, вторая доза через 1-4 месяца и, если необходимо, последующая(е) доза(ы) через несколько месяцев. К примерам приемлемых схем лечения относятся: (i) 0, 1 месяц и 6 месяцев, (ii) 0, 7 дней и 1 месяц, (iii) 0 и 1 месяц, (iv) 0 и 6 месяцев, или другие схемы, индуцирующие получение желательных ответов, благодаря которым предположительно уменьшатся симптомы или тяжесть заболевания.
Таким образом, фармацевтическую композицию изобретения для внутримышечной инъекции можно получить с содержанием 1 мл стерильной буферной воды и от около 1 нг до около 100 мг, от около 50 нг до около 30 мг, или от около 5 мг до около 25 мг антитела изобретения. Подобным образом, предложенная в изобретении фармацевтическая композиция для внутривенного введения может содержать приблизительно 250 мл стерильного раствора Рингера и от около 1 мг до около 30 мг, или от около 5 мг до около 25 мг антитела изобретения. Существующие способы получения композиций для парентерального введения хорошо известны и описаны более подробно, например, в Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA.
Антитела изобретения и их фрагменты можно лиофилизировать для хранения и восстанавливать в приемлемом носителе перед применением. Было показано, что этот способ эффективен для антител и других белковых препаратов, при этом могут быть применены известные специалистам способы лиофи
- 13 045151 лизации и восстановления.
Диагностические методы и наборы
Антитела изобретения можно применять в способах диагностики БА или иной таупатии у пациента. Такой способ включает обнаружение у пациента наличия PHF-тау с применением диагностического реагента, такого как антитело настоящего изобретения или его фрагмент.
PHF-тау может быть определен во взятой у пациента биологической пробе (например, крови, моче, спинномозговой жидкости) путем приведения биологической пробы в контакт с диагностическим реагентом на основе антител и обнаружении связывания диагностического реагента на основе антител с PHF-тау во взятой у пациента пробе. Анализ для проведения такого обнаружения включает в себя хорошо известные способы, такие как ИФА, иммуногистохимию, вестерн-блоттинг или in vivo визуализацию.
Диагностические антитела или аналогичные реагенты могут быть введены путем внутривенной инъекции в тело пациента или напрямую в мозг соответствующим путем, который обеспечивает доставку агента в организм-хозяина, как описано в приведенных выше примерах. Дозировки антител должны находиться в тех же диапазонах, как и для способов лечения. Как правило, антитела метят, хотя в некоторых способах первичное антитело с аффинностью к PHF-тау выбирают немеченым, но применяют вторичный метящий агент для связывания с первичным антителом. Выбор метки зависит от способа обнаружения. Например, флуоресцентная метка пригодна для оптического обнаружения. Применение парамагнитных меток пригодно для томографического обнаружения без хирургического вмешательства. Радиоактивные метки могут быть также определены с применением ПЭТ или однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (SPECT).
Диагностирование выполняют путем сравнения количества, размера и/или интенсивности меченых PHF-тау, агрегатов тау-белка и/или нейрофибриллярных клубков во взятой у пациента пробе или у пациента с соответствующими базовыми значениями. Базовые значения могут представлять собой средние уровни значений в некоторой популяции не имеющих заболевания лиц. Базовые значения могут также представлять собой предшествующие уровни значений, определенные у того же пациента.
Описанные выше диагностические способы можно также применять для контроля ответа пациента на лечение путем обнаружения присутствия PHF-тау у пациента до, в ходе или после лечения. Уменьшение значений по сравнению с базовыми значениями указывает на положительный ответ на лечение. В биологических жидкостях значения могут также временно возрастать при выводе патологического таубелка из мозга.
Настоящее изобретение дополнительно направлено на создание набора для выполнения описанных выше методов диагностики и контроля. Как правило, такие наборы содержат диагностический реагент, такой как антитела изобретения, и необязательно детектируемую метку. Диагностическое антитело может само содержать детектируемую метку (например, флуоресцентную молекулу, биотин и т. д.), которая определяется напрямую или с помощью вторичной реакции (например, реакции со стрептавидином). Альтернативно можно применять второй реагент, содержащий детектируемую метку, причем второй реагент обладает специфичностью связывания с первичным антителом. В диагностическом наборе, приемлемом для измерения уровня PHF-тау в биологической пробе, антитела набора могут поставляться предварительно связанными с твердой фазой, например с лунками микротитрационного планшета.
Содержание всех указанных ссылок (в том числе ссылок на литературу, выданные патенты, опубликованные патентные заявки и одновременно находящиеся на рассмотрении патентные заявки), упомянутых в настоящей заявке, явным образом полностью включено в настоящий документ путем ссылки.
Пример 1.
Очистка парных спиральных филаментов тау (PHF-тау).
PHF-тау частично очищали с применением модифицированного способа Гринберг и Дэвис (Greenberg and Davies Proc Natl Acad Sci U S A 87:5827-31, 1990). Вкратце, частично очищали полученную после вскрытия ткань коры головного мозга пациента с гистологически подтвержденной болезнью Альцгеймера. Как правило, 5 мг лобной коры гомогенизировали в 10 объемах холодного буфера Н (10 мМ Трис, 800 мМ NaCl, 1 мМ ЭГТК и 10% сахарозы/рН 7,4) с применением стеклянного/тефлонового гомогенизатора Поттера (LKA Works, Inc; г. Штауфен, Германия) при 1000 об/мин. Гомогенизированный материал центрифугировали при 27 000 g в течение 20 мин на роторе Sorvall SS34. Осадок удаляли, супернатант доводили до итоговой концентрации 1% (мас./об.) N-лаурилсаркозина и 1% (об./об.) 2меркаптоэтанола и инкубировали в течение 2 ч при температуре 37°С. Затем супернатант центрифугировали при 108 000 g в течение 35 мин при температуре 20°С в роторе Beckman 60Ti. Осадок аккуратно промывали в PBS и суспендировали в PBS. Супернатант центрифугировали второй раз, как описано, и полученный осадок растворяли, разделяли на аликвоты и замораживали при -80°С. Качество препаратов PHF-тау оценивали методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия 12% (ДНС-ПААГ) и последующим вестерн-блоттингом с антителами АТ8 и НТ7 к тау-белку (ThermoScientific, г. Рокфорд, штат Иллинойс). Препарат PHF-тау хорошего качества состоит из 4 полос, имеющих молекулярные массы приблизительно 60, 64, 66 и 72 кДа, на вестерн-блоттинге, определяемом с антителами, реагирующими с избыточно фосфорилированными PHF-тау, такими как АТ8. Из одного и
- 14 045151 того же образца мозга готовили по два отдельных препарата PHF-тау со сравнимым качеством и чистотой. Препарат 1 применяли для иммунизации.
Пример 2.
Получение моноклональных антител к PHF-тау.
Анти-PHF-Tay антитела получали с применением стандартной гибридомной технологии в нормальной мышиной популяции Balb/c (Kohler and Milstein Nature 256:495-7, 1975). Полученные гибридомы высевали в 96-луночные планшеты и через 10 дней проводили скрининг прямым ИФА на нанесенном в количестве 25 нг/лунку PHF-тау, как описано ниже. Положительные клетки проверяли на кроссреактивность на нанесенном в количестве 10 нг/лунку контрольном тау-белке (SEQ ID NO: 31), экспрессированном в клетках Е. Coli BL21 и очищенном термообработкой и осаждением сульфатом аммония. Было обнаружено, что РТ82 связывается как с PHF тау, так и с контрольным тау-белком (SEQ ID NO: 31).
Положительные клетки немедленно субклонировали, а положительные клоны замораживали в жидком азоте. Все гибридомы выращивали в модифицированной среде Игла по способу Дульбекко с добавкой 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Hyclone, Европа), добавки для слияния и клонирования гибридомы (2%) (Roche, г. Брюссель, Бельгия) 2% НТ (Sigma, США), 1 мМ пирувата натрия, 2 мМ Lглутамина и пенициллина (100 Ед/мл) и стрептомицина (50 мг/мл).
Вариабельные области антитела клонировали из выбранных гибридомных клеток на каркас мышиного IgG1/IgG2/K и экспрессировали и очищали стандартными способами. Вкратце, гибридомные клетки РТ/82 лизировали в буфере RLT (№ 79216 по каталогу Qiagen) и замораживали при -70°С. Лизат оттаивали при 37°С и выделяли РНК с применением набора RNeasy 96 Kit (№ 74182 по каталогу Qiagen).
Аликвоту РНК применяли для синтеза кДНК, применяя смесь праймеров для ген-специфичной обратной транскрипции с применением праймеров, сконструированных для отжига к константной области тяжелой цепи IgG мыши, легкой цепи каппа мыши или легкой цепи лямбда мыши.
Аликвоту кДНК применяли в реакциях ПЦР с наборами мышиных праймеров, выполненных с возможностью амплификации вариабельных областей тяжелой цепи IgG, вариабельных областей легкой цепи каппа или вариабельных областей легкой цепи лямбда. Прямые праймеры состояли из множества праймеров, выполненных с возможностью отжига к каркасной области 1, а обратный праймер был выполнен с возможностью отжига к константной области. Аликвоту продуктов ПЦР проверяли на 2%-ном агарозном геле, и продукты ПЦР для тяжелой цепи и легкой цепи каппа давали видимую полосу правильного размера.
Продукты ПЦР для тяжелой цепи и легкой цепи каппа секвенировали (методом Сэнгера), применяя обратный праймер для тяжелой цепи или легкой цепи каппа, выполненный с возможностью отжига к соответствующей константной области. Полученные последовательности анализировали и совмещали для выявления зародышевой линии мыши с наилучшим соответствием. Первые десять аминокислот в последовательности каркасной области 1 для тяжелой цепи и легкой цепи каппа заменяли с применением соответствующей им последовательности зародышевой линии. Аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой цепи IgG и легкой цепи каппа оптимизировали по кодонам и синтезировали. Оптимизированные по кодонам вариабельные области тяжелой цепи IgG и легкой цепи каппа синтезировали и клонировали полученные фрагменты в экспрессионные векторы для тяжелой цепи изотипа IgG2a и изотипа легкой цепи каппа мыши.
Вариабельные области антитела клонировали из выбранных гибридомных клеток, секвенировали с применением стандартных способов и субклонировали в экспрессионные векторы для mAb и Fab. Mab получали на каркасе мышиного IgG2a/K и экспрессировали и очищали аффинной хроматографией (белок A). Fab получали как химерные варианты с мышиными вариабельными областями, слитыми с константными доменами IgG1/K человека и с гистидиновой меткой на С-конце тяжелой цепи. Fab временно экспрессировали в клетках HEK293F и очищали аффинной хроматографией (HisTrap).
Пример 3.
Количественная оценка связывания методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR).
Взаимодействия с PHF-тау и рекомбинантным тау-белком оценивали методом SPR на анализаторе ProteOn XPR36 (Bio-Rad, г. Геркулес, штат Калифорния) или Biacore T200 (Biacore, г. Уппсала, Швеция) для РТ82 и его Fab-фрагмента с PHF и растворимым (2N4R) тау-белком. В табл. 2 приведены показательные результаты оценки аффинности РТ82 и его Fab-фрагмента к PHF-тау и растворимому тау-белку.
Таблица 2
Значения аффинности для РТ82 и его Fab-фрагмента по данным SPR
mAb/Fab | PHF-тау Kd (пМ) | Раств-тау Ко (пМ) |
mAb РТ82 | 2853 ±281 | NT |
РТ82 Fab | 5006 ± 626 | 1841 (1410-2270) |
И РТ82, и его Fab-фрагмент связываются с PHF-тау. При этом Fab-фрагмент РТ82 также связывается с растворимым тау-белком (см. также фиг. 1). Результаты данного исследования показали, что РТ82 связывается с PHF-тау и с растворимым тау-белком.
- 15 045151
Пример 4.
Прямой ИФА для выбора антител.
PHF-тау в течение ночи наносили по 25 нг/лунку при температуре 4°С в плоскодонных 96луночных микротитрационных планшетах высокого связывания NUNC Maxisorp (Life Technologies) в 50 мкл/лунку буфера для нанесения (10 мМ Трис, 10 мМ NaCl и 10 мМ NaN3, pH 8,5). На следующий день планшеты блокировали 75 мкл/лунку 0,1% казеина в PBS в течение 60 минут при комнатной температуре. Затем добавляли 50 мкл супернатанта гибридомы и инкубировали в течение 1 часа при температуре 37°С. После промывки связанные моноклональные антитела определяли 50 мкл/лунку овечьим анти-мышиным IgG, конъюгированным с пероксидазой хрена, в течение 1 часа при температуре 37°С (Amersham-Pharmacia Biotech). Оба реагента разводили в растворе 0,1% казеина/PBS. Планшеты промывали и добавляли 50 мкл раствора 0,42 мМ 3,5,3',5'-тетраметилбензидина, 0,003% (об./об.) Н2О2 в 100 мМ лимонной кислоты и 100 мМ динатрия гидрофосфата (рН 4,3) в качестве субстрата. Реакция могла продолжаться максимум в течение 15 мин на планшетном шейкере при комнатной температуре, после чего развитие окраски останавливали добавлением 2 н. H2SO4, 50 мкл/лунку, а планшеты считывали с помощью сканирующего спектрофотометра при длине волны 450 нм (Thermomax, Molecular Devices).
Пример 5.
Связывание с рекомбинантным WT (2N4R; SEQ ID NO: 31) тау-белком анализировали методом ИФА, непосредственно нанося полноразмерный тау-белок (1 нг/мл или 10 нг/мл) на планшет и инкубируя с различными концентрациями рекомбинантно- или гибридомно-полученного антитела РТ82 (фиг. 2). После инкубации с антителами планшет опять промывали и добавляли по 50 мкл на лунку меченного пероксидазой хрена (HRPO) анти-мышиного антитела (GE Healthcare) (разбавленного 1:10000 в блокирующем буфере). После еще одной стадии промывки выполняли обнаружение тетраметилбензидином с применением One step TMB (Thermo Scientific), следуя рекомендациям производителя. Планшеты анализировали с помощью многометочного сканирующего спектрофотометра EnVision® 2102 Multilabel Reader (Perkin Elmer, г. Уолтем, штат Массачусетс, США). Кривые связывания строили с применением программного пакета GraphPad Prism7.0. Как и ожидалось, меньшие наносимые концентрации тау-белка давали меньшие максимальные величины (например, если сравнить красные и зеленые кривые, на которых показано связывание рекомбинантных антител соответственно при 1 нг/мл и 10 нг/мл). Значимых различий между профилями связывания антител, полученных рекомбинантным или гибридомным способом не наблюдалось.
Пример 6.
Анализ по совместной инкубации с тканями спинного мозга (анализ FRET).
Содержащие зародыши тау-белка гомогенаты для совместной инкубации были получены из тканей спинного мозга трансгенных животных P301S в возрасте 22-23 недели, которые содержат агрегированный трансгенный тау-белок человека (Фиг. 3А). В качестве клеток-реципиентов в данном анализе применяли клетки НЕК со стабильной экспрессией K18/P301L-YFP и K18/P301L-CFP (Holmes et al., Proc Natl Acad Sci U S A 111(41):E4376-85, 2014). Содержащие зародыши тау-белка гомогенаты инкубировали совместно с отрицательным контролем или с антителом РТ82 и полученную смесь добавляли к содержащим хромофор-£18 клеткам-реципиентам HEK на 72 ч. Образование агрегатов K18 измеряли путем подсчета FRET-положительных клеток с применением флуоресцентно-активированной сортировки (FACS).
РТ82 блокировал индукцию агрегирования тау-белка при концентрация начиная от 3 нМ (фиг. 3В).
Пример 7.
Клеточный анализ методом иммунодеплеции.
Чтобы изучить, связана ли максимальная процентная величина ингибирования с плотностью эпитопов на зародышах или с количеством зародышей, которые содержат эпитоп для РТ82, были проведены анализы методом иммунодеплеции (фиг. 4А). В анализе методом иммунодеплеции зародыши тау-белка инкубировали с отрицательным контролем или с антителом РТ82 и удаляли их из раствора гранулами с белком G. Супернатант после деплеции проверяли на остаточную способность к зародышеобразованию в содержащих хромофорЖ18 клетках НЕК и анализировали методом FACS, как описано ранее (Holmes et al., Proc Natl Acad Sci USA 111(41):E4376-85, 2014), или проверяли на уровни агрегированного тау-белка, применяя селективный по агрегированию тау-белка анализ.
Гомогенаты для иммунодеплеции, содержащие зародыши тау-белка, получали из тканей спинного мозга трансгенных животных P301S в возрасте 22-23 недели или из криоконсервированных тканей мозга человека с БА. В анализе иммунодеплеции с применением тканей мозга человека с БА супернатант после деплеции проверяли в присутствии трансфекционного реагента Липофектамин2000 для получения приемлемого аналитического окна.
Для потенциала к зародышеобразованию тау-белка (измерен в анализе FRET; Фиг. 4В) и уровней агрегирования тау-белка (измерены методом селективного к агрегированию тау-белка анализа MSD; фиг. 4С) оказалось возможным провести деплецию РТ82 в экстрактах спинного мозга и полных гомогенатах тканей мозга человека с БА. РТ82 ингибировало зародыши тау-белка, полученные из лизатов как тканей
- 16 045151 мозга человека с БА, так и спинного мозга животных TgP301S. Деплеция зародышей тау-белка РТ82 в экстрактах спинного мозга была практически полной.
Пример 8.
Эффективность in vivo мышиных РТ82 в модели инъекции ePHF.
Была создана трансгенная модель инъекции в мышь P301L, в которой вызывающий агрегирование фрагмент тау-белка, такой как синтетические фибрилы K18 (Li and Lee, Biochemistry. 45(51): 15692-701, 2006) или зародыши PFH-тау, полученные из тканей мозга человека с БА, вводят в область коры головного мозга или гиппокампа модели трансгенной мыши P301L в возрасте, когда автономное агрегирование клеток еще не началось. Модель инъекции призвана имитировать критический компонент внеклеточного зародышеобразования в распространении тау-белка. Введенные фибрилы K18 или зародыши тау-белка индуцируют таупатию на участке инъекции и, в меньшей степени, в связанной контралатеральной области (Peeraer et al., Neurobiol Dis. 73:83-95, 2015). Модель позволяет проверять потенциал к подавлению зародышеобразования антител, таких как антитела к тау-белку настоящего изобретения, при совместной инъекции с полученными из тканей мозга человека с БА зародышами PFH-тау или фибрилами K18 (Iba et al., 2015, J Neurosci. 33(3): 1024-37, 2013; Iba et al., Acta Neuropathol. 130(3):349-62).
Кортикальная инъекция нерастворимой в саркозиле фракции полученной после вскрытия ткани пациента с БА вызывает медленно прогрессирующее возрастание агрегирования тау-белка. В инъектированном полушарии первые измеримые сигналы появляются через 1 месяц после инъекции и прогрессируют далее через 3 месяца после инъекции. Через пять месяцев после инъекции у некоторых животных начинается образование клубков, вызываемое мутацией P301L (Terwel et al., 2005, Id.). Уровень окрашивания АТ8 возрастает между 1 и 3 месяцами (отн. пациента с РТ3), поэтому эксперименты по эффективности антител анализируются через 2 месяца после совместной инъекции. Кроме того, гиппокампальная инъекция нерастворимой в саркозиле фракции полученной после вскрытия ткани пациента с БА вызывает дозозависимое прогрессирующее возрастание агрегирования тау-белка по результатам анализа на платформе MesoScale Discoveries (MSD) нерастворимых в саркозиле фракций из инъектированных полушарий.
Лечение животных и интракраниалъная инъекция.
Для инъекционных исследований применяли трансгенных мышей tay-P301L, у которых экспрессировалась самая длинная изоформа человеческого тау-белка с мутацией P301L (тау-4R/2N-P301L) (Terwel et al., 2005, Id.), для проведении хирургии в возрасте 3 месяцев. Все эксперименты проводили в соответствии с протоколами, одобренными локальными комитетами по этике. Для стереотактической хирургии мыши получали одностороннюю (правое полушарие) инъекцию в гиппокамп (АР -2,0, ML +2,0 (через темя), DV 1,8 мм (через твердую оболочку)) 3 мкл (скорость 0,25 мкл/мин) нерастворимого в саркозиле препарата из полученной после вскрытия ткани пациента с БА (обогащенный парными спиральными филаментами, ePHF) при наличии или отсутствии моноклональных антител. Мышей умерщвляли для вскрытия (через 2 месяца после интракраниальной инъекции).
Процедура экстракции.
Ткань из инъектированного полушария мыши взвешивали и гомогенизировали в 6 объемах гомогенизационного буфера (10 мМ Трис HCl (рН 7,6); 0,8 мМ NaCl; 10% мас./об. сахарозы; 1 мМ ЭГТК; смесь для ингибирования фосфатазы PhosStop; не содержащие ЭДТК мини ингибиторы протеаз). Гомогенат центрифугировали при 28 000 х г в течение 20 минут и после отбора аликвоты из полученного супернатанта (полный гомогенат) добавляли 1% N-лаурилсаркозина. Через 90 минут (900 об/мин, 37°С) растворы повторно центрифугировали при 184 000 х г в течение 1 часа. Супернатанты сохраняли как растворимую в саркозиле фракцию, а содержащий нерастворимый в саркозиле материал осадок ресуспендировали в гомогенизационном буфере.
Биохимический анализ.
Наносимые антитела (АТ8) разводили в PBS (1 мкг/мл) и разливали аликвоты в планшеты для анализа MSD (30 мкл на лунку) (L15XA, Mesoscale Discoveries), которые инкубировали в течение ночи при температуре 4°С. После промывки 5x200 мкл PBS/0,5% Tween-20 планшеты блокировали 0,1% казеина в PBS и еще раз промывали 5x200 мкл PBS/0,5% Tween-20. После добавления проб и стандартов (и те и другие растворенные в 0,1% казеина в PBS) планшеты инкубировали в течение ночи при температуре 4°С. Затем планшеты промывали 5x200 мкл PBS/0,5% Tween-20, добавляли конъюгированные с меткой SULFO-TAG™ детекторные антитела (АТ8) в 0,1% казеина в PBS и инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре при встряхивании на 600 об/мин. После последней промывки (5x200 мкл PBS/0,5% Tween-20) добавляли 150 мкл 2 X буфера Т и считывали планшеты на визуализаторе платформы MSD. Необработанные сигналы нормировали по стандартной кривой, содержащей 16 разбавлений нерастворимого в саркозиле препарата из полученной после вскрытия ткани пациента с БА (ePHF) и выражали в единицах условной концентрации (отн. ед.) ePHF. Статистический анализ (дисперсионный анализ (ANOVA) с постпроверкой по критерию Бонферрони) проводили в программном пакете GraphPad prism и с помощью разработанного в лаборатории приложения для автоматизированного анализа.
- 17 045151
Результаты.
Активность мышиного РТ82 (экспрессируемого рекомбинантным способом как IgG2a) в модели совместной инъекции в гиппокамп сравнивали с активностью AT180 и РТ3 в одном исследовании (фиг. 5, табл. 3). Антитела (4,5 пмоль) вводили совместно с ePHF тау (0,6 пмоль) в кору головного мозга. В каждой группе применяли по пятнадцать животных. Совместная инъекция РТ82 соответственно ослабила индуцированное ePHF агрегирование тау-белка у мышей P301L (фиг. 5А и 5В). Этот эффект наблюдали в полном гомогенате (фиг. 5А) и нерастворимых в саркозиле гомогенатах (фиг. 5В).
Таблица 3
Сводка результатов по функциональному тестированию в модели инъекции
АТ 180 РТЗ РТ82
полный гомогенат | % ингибирования | 63,796076 | 54,4989249 | 49,85795 |
Р-значение | 0,000145 | 0,000806 | 0,001078 | |
нерастворимая фракция | % ингибирования | 55,915265 | 52,9579764 | 51,86379 |
Р-значение* | < 0,0001 | < 0,0001 | < 0,0001 |
*Статистический анализ выполняли методом однофакторного дисперсионного анализа с поправкой Бонферрони для множественных сравнений
В последующем исследовании сравнивали эффективность по РТ3 и РТ82 при периферийном введении (20 мг/кг; 2х/неделю) антитела после интракраниальной инъекции PHF (фиг. 6А) и совместной интракраниальной инъекции (фиг. 6В) антитела+PHF. Периферийное введение начинали за 2 недели до интракраниальной инъекции PHF и продолжали в течение активной фазы эксперимента. В таблице 4 показаны количества антител, используемых в экспериментах. В согласии с первым исследованием совместное введение РТ3 и РТ82 снижало сигнал индуцированного ePHF агрегирования в нерастворимых в саркозиле фракциях (фиг. 6С и табл. 5) и в полных гомогенатах тканей мозга (фиг. 6D и табл. 5). В дополнение к этому периферийное введение антител значительно ингибировало индуцированное ePHF зародышеобразование.
Таблица 4
Количества используемых реагентов
Группа | Количество ePHF (пмоль) | Количество антитела для совместной инъекции (пмоль) | Доза антитела для периферийной инъекции (мг/кг) | η |
IgG-G2a | 0,4 | 3 | 20 | 15 |
РТЗ | 0,4 | 3 | - | 12 |
РТЗ | 0,4 | - | 20 | 14 |
РТ82 | 0,4 | 3 | - | 12 |
РТ82 | 0,4 | - | 20 | 15 |
Таблица 5
Сводка результатов по функциональному тестированию в модели инъекции
РТЗ совм. инъекц. | РТЗ ин | РТ82 совм. инъекц. | РТ82ИП | ||
полный | % ингибирования | 73,34 | 66,68 | 58,23 | 49,10 |
гомогенат | Р-значение* | < 0,0001 | < 0,0001 | < 0,0001 | < 0,0001 |
нерастворимая | % ингибирования | 77,07 | 69,36 | 60,64 | 66,53 |
фракция | Р-значение* | < 0,0001 | < 0,0001 | < 0,0001 | < 0,0001 |
*Статистический анализ выполняли методом однофакторного дисперсионного анализа с поправкой Бонферрони для множественных сравнений
Пример 9. Синтез пептидных массивов.
Для реконструкции эпитопов целевой молекулы синтезировали библиотеку пептидов (20-меров с перекрыванием по 18 аминокислотам), покрывающих последовательность тау 441. Для этого получили модифицированную аминогруппами полипропиленовую подложку путем прививки с применением композиции гидрофильного полимера собственной разработки с последующей реакцией с третбутилоксикарбонил-гексаметилендиамином (BocHMDA) с применением дициклогексилкарбодиимида (DCC) с N-гидроксибензотриазолом (HOBt) и последующим отщеплением Вос-групп с помощью трифторуксусной кислоты (TFA). Для синтеза пептидов на модифицированной аминогруппами полипропиленовой подложке применяли стандартный Fmoc-пептидный синтез на специально модифицированных для этого автоматизированных рабочих станциях дозирования жидкостей JANUS (Perkin Elmer). Синтез
- 18 045151 структурных миметиков проводили с применением технологии химически связанных пептидов на каркасах (CLIPS) разработки Pepscan (Timmerman P, Puijk WC, Meloen RH (2007) Functional reconstruction and synthetic mimicry of a conformational epitope using CLIPS technology. J Mol Recognit 20: 283-299. 10.1002/jmr.846 [doi]). Технология CLIPS позволяет структурировать пептиды в одиночные петли, двойные петли, тройные петли, листоподобные складки, спиралеподобные складки и их комбинации. Шаблоны CLIPS связываются с цистеиновыми остатками. Боковые цепи множества цистеинов в пептидах связываются с одним или двумя шаблонами CLIPS. Например, 0,5 мМ раствора Р2 CLIPS (2,6бис(бромометил)пиридина) растворяют в бикарбонате аммония (20 мМ, рН 7,8) / ацетонитриле (1:3 (об./об.)). Этот раствор добавляют на пептидные массивы. Шаблон CLIPS связывается с боковыми цепями двух цистеинов, присутствующих в связанных на твердой фазе пептидах пептидных массивов (455луночные планшеты с лунками по 3 мкл). Пептидные массивы осторожно встряхивали в растворе в течение от 30 до 60 минут, при этом они были полностью покрыты раствором. Затем пептидные массивы тщательно промывали в избытке Н2О и разрушали ультразвуком в буфере, содержащем 1% SDS/0,1% бета-меркаптоэтанола в PBS (рН 7,2) при температуре 70°С в течение 30 мин, с последующей ультразвуковой обработкой в Н2О в течение еще 45 минут. Несущие пептиды массивы Т3 CLIPS получали аналогичным образом, но теперь с тремя цистеинами.
ИФА -скрининг.
Связывание антител (экспрессируемых рекомбинантным образом как IgG2a) с каждым из синтезированных пептидов проверяли методом ИФА на основе Pepscan. Пептидные массивы инкубировали с раствором первичных антител (в течение ночи при температуре 4°С). После промывки пептидные массивы инкубировали с раствором соответствующего конъюгата антитела с пероксидазой (SBA) в разбавлении 1/1000 в течение одного часа при температуре 25°С. После промывки добавляли субстрат пероксидазы, 2,2'-азино-ди-3-этилбензтиазолин сульфонат (ABTS) и 20 мкл/мл 3-процентного Н2О2. Через час измеряли образовавшуюся окраску. Окраску определяли количественно с помощью ПЗС камеры (CCD) и системы обработки изображений.
Результаты.
Представленные на фиг. 7 данные показывают связывание РТ82 с рядом пептидов начиная с остатка 103 и до остатка 140 в последовательности тау 441. Для этих антител связывания с другими таупептидами не наблюдали. Подробное картирование показало, что РТ82 связывается с пептидами с общим мотивом 119AGHVTQ124 (SEQ ID NO: 32).
Пример 10.
Гуманизация РТ82.
Несколько последовательностей вариабельной области человека были выбраны для тестирования с целью поиска наилучшей комбинации гуманизированных тяжелой и легкой цепи. Выбор зародышевых линий и J-областей человека основывался исключительно на общем сходстве последовательностей с мышиным антителом в каркасной области (FR). При отборе не учитывались ни последовательности CDR, ни их длина или канонические структуры.
Используемое в HFA определение CDR описано в (Fransson J, et al. J. Mol. Biol. 2010; 398:214-231) и соответствует определению Мартин (Abhinandan KR and Martin AC. Mol. Immunol. 2008; 45:3832-3839). Области CDR определены следующим образом (применяя схему нумерации Chothia [Chothia С, and Lesk A. J. Mol. Biol. 1987; 196:901-917]. В положениях каркасных областей, важность которых для спаривания областей VL/VH и конформации CDR известна, варьировали аминокислоты в бинарной библиотеке остатков для введения обратных мутаций от человека к мыши для сохранения аффинности связывания гуманизированных V-областей. Для РТ82 области CDR прививали в ген зародышевой линии HV3-72*01a человека. Комбинаторная библиотека VH: человек/мышь включала положения 37: I, V; 78: V, L; 93: Т, А; 94: R, G. Для легкой цепи области CDR прививали в ген KV1-9*01a человека с комбинаторной библиотекой VL: человек/мышь в положениях 4: L, М и 78: L, М.
Кроме того, ряд положений в областях VH и VL рандомизировали в библиотеке фагового дисплея для улучшения аффинности гуманизированного РТ82 (табл. 6).
- 19 045151
Таблица 6
Библиотеки гуманизации/созревания генерировали с применением вырожденных олигонуклеотидов в перекрывающемся ПЦР. Фрагменты ДНК библиотек VH или VL затем клонировали в фагмиду pCNTO (Shi et al., J. Mol. Biol. 397:385-396, 2010; межд. публ. пат. № WO 2009/085462; публ. пат. США № US 2010/0021477; публ. пат. США № US2012/0108795) в комбинации с комплементарной V-областью мыши. Библиотечные лигаты очищали и трансформировали в клетки MC1061F'. Клетки выращивали в 2xYT (Carb) до достижения логарифмической фазы роста (OD600 нм~0,6). Затем добавляли вспомогательный фаг и инкубировали культуры при температуре 37°С в течение 30 мин. В каждую культуру добавляли канамицин и изопропилтиогалактозид до конечных концентраций 35 мкг/мл и 1 мМ соответственно и выращивали культуры в течение ночи при температуре 30°С с встряхиванием. Фаг из бактериальной среды осаждали с применением ПЭГ/NaCl и ресуспендировали в PBS.
Для пэннинга созревания аффинности пептид Bt-тау захватывали на 50 мкл покрытых SA магнитных гранул. Концентрации антигена составляли 10 нМ для тура 1, 0,1 нМ для тура 2 и 0,1 нМ для тура 3. Гранулы 6 раз промывали PBST и один раз PBS и затем инфицировали Е. coli, как описано выше. После отбора на фаговом дисплее фагмидную ДНК выделяли из инфицированных клеток MC1061F' и расщепляли рестрикционными ферментами для удаления последовательности, кодирующей pIX, а линеаризованную плазмидную ДНК вырезали и очищали от агарозных гелей. Впоследствии эта ДНК самолигировалась с ДНК-лигазой Т4. Лигированную ДНК электропорировали в клетки MC1061F' и наносили на планшеты с агаром-LB (углевод/глюкоза).
Колонии от этой электропорации выбирали для ИФА-скрининга и оценки экспрессии Fab. Вкратце, 96-луночные планшеты Maxisorp покрывали растворимым тау-белком. Колонии Fab выращивали в среде 2xYT и индуцировали экспрессию Fab изопропилтиогалактозидом. Планшеты для ИФА промывали и в каждый планшет добавляли Fab, секретированый в среду Е. coli. Планшеты промывали и в планшеты ИФА добавляли анти-Fab'2:HRP (Jackson ImmunoResearch). Планшеты промывали, добавляли реагент для хемилюминесцентного детектирования и считывали планшеты по люминесценции на сканирующем спектрофотометре Perkin Elmer En Vision.
Положительные клоны секвенировали как в VH, так и в VL. Последовательности областей VH и VL перечислены в табл. 1. Уникальные последовательности клонировали в конструкции для экспрессии гена IgG для экспрессии и очистки в виде полноразмерных молекул IgG1. Конструкции IgG трансфицировали в клетки CHO-Expi и белок IgG очищали с применением смолы MabSelectSure. Затем антитела проверяли в ИФА на связывание с растворимым тау-белком с применением анти-человеческого Fc:HRP (Jackson ImmunoResearch) для определения связывания с IgG. Эти данные показаны на фиг. 8. Гуманизация не сказалась существенно на связывании с растворимым тау-белком по сравнению со связыванием РТ82 с растворимым тау-белком.
ИФА проводили, как описано для Fab, за исключением того, что антитела проверяли при пяти 5кратных разбавлениях, начиная с 5 мкг/мл, в PGS, а для определения связывания с IgG применяли античеловеческий Fc:HRP (Jackson ImmunoResearch).
Хотя изобретение включает подробное описание со ссылкой на конкретные варианты его осуществления, специалисту в данной области будет очевидно, что в него могут быть внесены различные изменения и модификации, без отступления от сущности и объема настоящего изобретения.
-
Claims (7)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое связывается с PHF-тау, содержащее вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область 1 (HCDR1), HCDR2 и HCDR3, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область 1 (LCDR1), LCDR2 и LCDR3, причем:(a) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит HCDR1 с SEQ ID NO: 1; HCDR2 с SEQ ID NO: 2 и HCDR3 с SEQ ID NO: 3 и LCDR1 с SEQ ID NO: 4; LCDR2 с SEQ ID NO: 5; и LCDR3 с SEQ ID NO: 6;(b) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит HCDR1 с SEQ ID NO:7; HCDR2 с SEQ ID NO:8 и HCDR3 с SEQ ID NO: 3 и LCDR1 с SEQ ID NO:9; LCDR2 с SEQ ID NO: 5; и LCDR3 с SEQ ID NO: 6;(c) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит HCDR1 с SEQ ID NO:7; HCDR2 с SEQ ID NO: 10 и HCDR3 с SEQ ID NO: 3 и LCDR1 с SEQ ID NO: 11; LCDR2 с SEQ ID NO: 5; и LCDR3 с SEQ ID NO: 6;(d) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит HCDR1 с SEQ ID NO:7; HCDR2 с SEQ ID NO: 12 и HCDR3 с SEQ ID NO: 3 и LCDR1 с SEQ ID NO: 11; LCDR2 с SEQ ID NO: 5; и LCDR3 с SEQ ID NO: 6;(e) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит HCDR1 с SEQ ID NO:7; HCDR2 с SEQ ID NO: 13 и HCDR3 с SEQ ID NO: 3 и LCDR1 с SEQ ID NO: 11; LCDR2 с SEQ ID NO: 5; и LCDR3 с SEQ ID NO: 6; или (f) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит HCDR1 с SEQ ID NO:7; HCDR2 с SEQ ID NO: 14 и HCDR3 с SEQ ID NO: 3 и LCDR1 с SEQ ID NO: 11; LCDR2 с SEQ ID NO: 5; и LCDR3 с SEQ ID NO: 6.
- 2. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.1, содержащие:(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность, которая по меньшей мере на 95% совпадает с SEQ ID NO: 15, и вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность, которая по меньшей мере на 95% совпадает с SEQ ID NO: 16;(b) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность, которая по меньшей мере на 95% совпадает с SEQ ID NO: 17, и вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность, которая по меньшей мере на 95% совпадает с SEQ ID NO: 18;(c) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность, которая по меньшей мере на 95% совпадает с SEQ ID NO: 19, и вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность, которая по меньшей мере на 95% совпадает с SEQ ID NO: 20;(d) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность, которая по меньшей мере на 95% совпадает с SEQ ID NO: 21, и вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность, которая по меньшей мере на 95% совпадает с SEQ ID NO: 22;(e) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность, которая по меньшей мере на 95% совпадает с SEQ ID NO: 23, и вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность, которая по меньшей мере на 95% совпадает с SEQ ID NO: 20; или (f) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность, которая по меньшей мере на 95% совпадает с SEQ ID NO: 24, и вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность, которая по меньшей мере на 95% совпадает с SEQ ID NO: 25.
- 3. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.1 или 2, содержащие:(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 15, и вариабельную область легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 16;(b) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 17, и вариабельную область легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 18;(c) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 19, и вариабельную область легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 20;(d) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 21, и вариабельную область легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 22;(e) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 23, и вариабельную область легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 20; или (f) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 24, и вариабельную область легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 25.
- 4. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-3.
- 5. Вектор экспрессии, содержащий выделенную нуклеиновую кислоту по п.4.
- 6. Клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по п.4 или вектор по п.5.
- 7. Фармацевтическая композиция, содержащая выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-3 и фармацевтически приемлемый носитель.-
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US62/638,535 | 2018-03-05 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA045151B1 true EA045151B1 (ru) | 2023-10-31 |
Family
ID=
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US10196440B2 (en) | Anti-PHG-tau antibodies and their uses | |
TWI771389B (zh) | 抗phf-tau抗體及其用途 | |
US10633435B2 (en) | Anti-PHF-tau antibodies and uses thereof | |
WO2016112078A2 (en) | Anti-phf-tau antibodies and their uses | |
KR20220166308A (ko) | 항-phf-타우 항체 및 이의 용도 | |
US20240150451A1 (en) | Anti-tau antibodies and uses thereof | |
EA045151B1 (ru) | Антитела анти-phf-тау и их применение |