ES2643237T3 - Anticuerpos del receptor 1 de interferón alfa y sus usos - Google Patents

Anticuerpos del receptor 1 de interferón alfa y sus usos Download PDF

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Abstract

Un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, en donde el anticuerpo, una o porción de unión a antígeno del mismo, compite de forma cruzada por la unión al receptor 1 de interferón alfa humano con un anticuerpo de referencia, o una porción de unión a antígeno de referencia del mismo, en donde el anticuerpo de referencia, o una porción de unión a antígeno de referencia del mismo, se selecciona entre el grupo que consiste en: a) un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 25, y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 29; b) un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 28, y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 32; en donde el anticuerpo de competencia cruzada o la porción de unión a antígeno del mismo comprenden: i) una CDR3 de la región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9, y una CDR3 de la región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO : 21; o ii) una CDR3 de la región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12, y una CDR3 de la región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 24.

Description

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DESCRIPCION
Anticuerpos del receptor 1 de interferon alfa y sus usos Antecedentes de la invencion
Los interferones tipo I (IFN) (IFN-a, IFN-b, IFN-w, IFN-t), son una familia de citocinas estructuralmente relacionadas que tienen efectos antivirales, antitumorales e inmunomoduladores (Hardy et al. (2001) Blood 97: 473; Cutrone y Langer (2001) J. Biol. Chem: 276: 17140). El locus del IFNa humano incluye dos subfamilias. La primera subfamilia consiste de 14 genes no alelicos y 4 pseudogenes que tienen por lo menos 80 % de homologla. La segunda subfamilia, aII u omega (w), contiene 5 pseudogenes y un gen funcional que exhibe 70 % de homologla con los genes del IFNa (Weissmann y Weber (1986) Prog. Nucl. Acid Res. Mol. Biol., 33: 251-300). Los subtipos de IFNa tienen diferentes actividades especlficas, pero poseen el mismo espectro biologico (Streuli et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2848) y tienen el mismo receptor celular (Agnet M. et al., en "Interferon 5" ed. I. Gresser p. 1-22, Academic Press, Londres 1983).
El interferon p (IFNb) es codificado por un solo gen que tiene aproximadamente 50 % de homologla con los genes del IFNa.
El interferon gamma, el cual es producido por linfocitos activados, no posee homologla alguna con los interferones alfa/beta, y no reacciona con su receptor.
Todos los interferones tipo I humanos se unen a un receptor de superficie celular (receptor de IFN alfa, IFNAR), que consiste de dos protelnas de transmembrana, IFNAR-1 e IFNAR-2 (Uze et al. (1990) Cell 60: 225; Novick et al. (1994) Cell 77: 391). El IFNAR-1 es esencial para la union de alta afinidad y especificidad diferencial del complejo del IFNAR (Cutrone, 2001, citado anteriormente). Aunque no se han identificado diferencias funcionales para cada uno de los subtipos de IFN tipo I, se piensa que cada uno puede exhibir diferentes interacciones con los componentes del receptor IFNAR que llevan a resultados de senalizacion potencialmente diversos (Cook et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 13448). En particular, estudios que usan formas mutantes de IFNAR 1 e IFNAR2 sugirieron que los interferones alfa y beta senalizan diferentemente a traves del receptor, interactuando diferencialmente con cadenas respectivas (Lewerenz et al. (1998) J. Mol. Biol. 282: 585).
Los primeros estudios funcionales de IFN tipo I, se enfocaron en la defensa innata contra infecciones virales (Haller et al. (1981) J. Exp. Med. 154: 199; Lindenmann et al. (1981) Methods Enzymol. 78: 181). Sin embargo, estudios mas recientes implican a los IFN tipo I como citocinas inmunorreguladoras potentes en la respuesta inmune adaptativa. Especlficamente, se ha mostrado que los IFN tipo I facilitan la diferenciacion de celulas T no afectadas a lo largo de la via Th1 (Brinkmann et al. (1993) J. Exp. Med. 178: 1655), intensifican la produccion de anticuerpos (Finkelman et al. (1991) J. Exp. Med. 174: 1179), y sustentan la actividad funcional y supervivencia de celulas T de memoria (Santini et al. (2000) J. Exp. Med. 191: 1777; Tough et al. (1996) Science 272: 1947).
Las investigaciones recientes por muchos grupos, sugieren que el IFN-a puede mejorar la maduracion o activacion de celulas dendrlticas (CD) (Santini, et al. (2000) J. Exp. Med. 191: 1777; Luft et al. (1998) J. Immunol. 161: 1947; Luft et al. (2002) Int. Immunol. 14: 367; Radvanyi et al. (1999) Scand. J. Immunol. 50: 499). Ademas, se ha descrito expresion incrementada de interferones tipo I en numerosas enfermedades autoinmunes (Foulis et al. (1987) Lancet 2: 1423; Hooks et al. (1982) Arthritis Rheum. 25: 396; Hertzog et al. (1988) Clin. Immunol. Immunopathol. 48: 192; Hopkins y Meager (1988) Clin. Exp. Immunol. 73: 88; Arvin y Miller (1984) Arthritis Rheum. 27: 582). Los ejemplos mas estudiados de estas enfermedades, son la diabetes mellitus insulinodependiente (DMID) (Foulis (1987), citado anteriormente) y el lupus eritematoso sistemico (LSE) (Hooks (1982), citado anteriormente), los cuales se asocian con niveles elevados de IFN-a, y la artritis reumatoide (RA) (Hertzog (1988), Hopkins y Meager (1988), Arvin y Miller (1984), citados anteriormente), en la cual el IFN-b puede desempenar una funcion mas significativa.
Ademas, se ha reportado que la administracion de interferon a exacerba la enfermedad subyacente en pacientes con psoriasis y esclerosis multiple, e induce un slndrome tipo LSE en pacientes sin una historia previa de enfermedad autoinmune. Se ha mostrado tambien que el interferon a induce glomerulonefritis en ratones normales, y acelera el inicio de enfermedad autoinmune espontanea de ratones NZB/W. Ademas, se ha mostrado que la terapia con IFN-a en algunos casos lleva a efectos secundarios no deseados, que incluyen fiebre y trastornos neurologicos. Por consiguiente, existen situaciones patologicas en las cuales la inhibicion de la actividad del IFN tipo I puede ser benefica para el paciente, y existe la necesidad de agentes efectivos en la inhibicion de la actividad del IFN tipo I.
El documento US 6.713.609 B1 describe anticuerpos murinos anti-IFNAR-1, dos de los cuales (2E1 y 4A7) bloquean la actividad de ciertos subtipos de IFN-a.
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Breve descripcion de la invencion
La presente invencion se refiere a la materia objeto definida en las reivindicaciones.
Por lo tanto, la presente invencion proporciona anticuerpos monoclonales humanos aislados que se unen al IFNAR- 1, e inhiben la actividad biologica del interferon tipo I, de preferencia interferones tipo I multiples. Ademas, los anticuerpos no se unen al mismo epltopo que el anticuerpo anti-IFNAR-I de murino, 64G12.
En un aspecto, la invencion pertenece a un anticuerpo humano aislado, o porcion de union a antlgeno del mismo, en donde el anticuerpo se une especlficamente al IFNAR-1, y exhibe una o mas de las siguientes propiedades:
a) se une al IFNAR-1 con una Kd de 1 x 10"7 M o mayor afinidad;
b) inhibe la actividad biologica de interferones tipo I multiples;
c) inhibe la actividad de IFN a 2b en una prueba de proliferacion de celulas de Daudi;
d) inhibe la actividad de IFN omega en una prueba de proliferacion de celulas de Daudi;
e) inhibe la secrecion de IP-10 por celulas mononucleares de sangre periferica inducida por IFN a 2b;
f) inhibe la secrecion de IP-10 por celulas mononucleares de sangre periferica inducida por IFN omega;
g) inhibe el desarrollo de celulas dendrlticas mediado por plasma del lupus eritematoso sistemico; y
h) se une a un epltopo diferente del anticuerpo monoclonal murino 64G12 (numero de deposito de ECACC 92022605).
Los anticuerpos preferidos de la invencion se unen especlficamente al receptor 1 de interferon alfa humano, y se unen con una Kd de 1 x 10-8 M o mayor afinidad, o 1 x 10-9 M o mayor afinidad, o 5 x 10-10 M o mayor afinidad, o 2 x 10-10 M o mayor afinidad.
En un aspecto, la invencion pertenece a un anticuerpo monoclonal aislado, o una porcion de union a antlgeno del mismo, que comprende una region variable de cadena pesada que es el producto de, o derivado de, un gen de VH 434 o 5-51 humano, en donde el anticuerpo se une especlficamente al receptor 1 de interferon alfa humano. En otro aspecto, la invencion pertenece a un anticuerpo monoclonal aislado, o una porcion de union a antlgeno del mismo, que comprende una region variable de cadena ligera que es el producto de, o derivado de, un gen de VK L18 o A27 humano, en donde el anticuerpo se une especlficamente al receptor 1 de interferon alfa humano. En otro aspecto, la invencion pertenece a un anticuerpo monoclonal humano aislado, o porcion de union a antlgeno del mismo, que comprende:
(a) una region variable de cadena pesada que es el producto de, o derivado de, un gen de Vh 4-34 o 5-51 humano; y
(b) una region variable de cadena ligera que es el producto de, o derivado de, un gen de VK L18 o A27 humano;
en donde el anticuerpo se une especlficamente al receptor 1 de interferon alfa humano. En modalidades preferidas, el anticuerpo comprende una region variable de cadena pesada de un gen de Vh 4-34 humano, y una region variable de cadena ligera de un gen de Vk L18 humano, o el anticuerpo comprende una region variable de cadena pesada de un gen de Vh 5-51 humano, y una region variable de cadena ligera de un gen de Vk A27 humano.
En otro aspecto, la invencion pertenece a un anticuerpo monoclonal humano aislado, o pocion de union a antlgeno del mismo, que comprende una region variable de cadena pesada humana y una region variable de cadena ligera humana, en donde:
(a) la region variable de cadena pesada humana comprende una secuencia de aminoacidos que es por lo menos 80 % homologa a una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 25 y 28;
(b) la region variable de cadena ligera humana comprende una secuencia de aminoacidos que es por lo menos 80 % homologa a una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 29 y 32;
(c) el anticuerpo se une especlficamente al receptor 1 de interferon alfa humano con una afinidad de union de por lo menos 1 x 10-8 M o mayor afinidad; y
(d) el anticuerpo inhibe la actividad biologica de por lo menos un interferon tipo I.
Las combinaciones preferidas de regiones CDR incluyen las siguientes:
(a) una CDR1 de la region variable de la cadena pesada humana que comprende la SEQ ID NO: 1;
(b) una CDR2 de la region variable de la cadena pesada humana que comprende la SEQ ID NO: 5;
(c) una CDR3 de la region variable de la cadena pesada humana que comprende la SEQ ID NO: 9;
(d) una CDR1 de la region variable de la cadena ligera humana que comprende la SEQ ID NO: 13;
(e) una CDR2 de la region variable de la cadena ligera humana que comprende la SEQ ID NO: 17; y
(f) una CDR3 de la region variable de la cadena ligera humana que comprende la SEQ ID NO: 21.
(a) una CDR1 de la region variable de la cadena pesada humana que comprende la SEQ ID NO: 4;
(b) una CDR2 de la region variable de la cadena pesada humana que comprende la SEQ ID NO: 8;
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(c) una CDR3 de la region variable de la cadena pesada humana que comprende la SEQ ID NO: 12;
(d) una CDR1 de la region variable de la cadena ligera humana que comprende la SEQ ID NO: 16;
(e) una CDR2 de la region variable de la cadena ligera humana que comprende la SEQ ID NO: 20; y
(f) una CDR3 de la region variable de la cadena ligera humana que comprende la SEQ ID NO: 24.
Otros anticuerpos preferidos de la invencion incluyen anticuerpos monoclonales humanos aislados, o porciones de union a antlgeno de los mismos, que comprenden:
(a) una region variable de cadena pesada humana que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 25 y 28; y
(b) una region variable de cadena ligera humana que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 29 y 32;
en donde el anticuerpo se une especlficamente al receptor 1 de interferon alfa humano con una afinidad de union de por lo menos 1 x 10-8 M o mayor afinidad.
Combinaciones preferidas de cadenas ligera y pesada, incluyen las siguientes:
(a) una region variable de cadena pesada humana que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 25; y
(b) una region variable de cadena ligera humana que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 29.
(a) una region variable de cadena pesada humana que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 28; y
(b) una region variable de cadena ligera humana que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 32.
En ciertas modalidades, la invencion provee un anticuerpo humano, o porcion de union a antlgeno del mismo, en donde el anticuerpo no se une al mismo epltopo que (es decir, no compite en forma cruzada con) el anticuerpo monoclonal de raton 64G12 (numero de deposito de ECACC 92022605).
Los anticuerpos de la invencion pueden ser de cualquier isotipo. Anticuerpos preferidos son del isotipo IgG1, IgG3 o IgG4. Los anticuerpos de la invencion pueden ser anticuerpos de longitud completa que comprendan regiones variables y constantes, o pueden ser fragmentos de union a antlgeno de los mismos, tales como un anticuerpo de cadena sencilla, o un fragmento Fab o Fab'2.
La invencion provee tambien un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo de la invencion, o porcion de union a antlgeno del mismo, enlazado a un agente terapeutico, tal como una citotoxina o un isotopo radiactivo. La invencion provee tambien una molecula biespeclfica que comprende un anticuerpo, o porcion de union a antlgeno del mismo, de la invencion, enlazado a una segunda porcion funcional que tiene una diferente especificidad de union que dicho anticuerpo, o porcion de union a antlgeno del mismo.
Se proveen tambien composiciones que comprenden un anticuerpo, o porcion de union a antlgeno del mismo, o inmunoconjugado o molecula biespeclfica de la invencion, y un vehlculo farmaceuticamente aceptable.
Moleculas de acido nucleico que codifican para los anticuerpos, o porciones de union a antlgeno de los mismos de la invencion, son tambien contempladas por la invencion, as! como vectores de expresion que comprenden dichos acidos nucleicos y celulas hospedadoras que comprenden dichos vectores de expresion. Ademas, la invencion provee un raton transgenico que comprende transgenes de la cadena ligera y pesada de inmunoglobulinas humanas, en donde el raton expresa un anticuerpo de la invencion, as! como hibridomas preparados de dicho raton, en donde el hibridoma produce el anticuerpo de la invencion.
La invencion provee tambien un metodo in vitro para la inhibicion de la actividad biologica de un interferon de tipo I en una celula que expresa receptor de interferon alfa 1 que comprende poner en contacto la celula con el anticuerpo o porcion de union a antlgeno del mismo, de la invencion, de manera que la actividad biologica de interferon de tipo I se inhiba. La invencion tambien proporciona el anticuerpo, o porcion de union a antlgeno del mismo, de la invencion para su uso en un metodo para el tratamiento de una enfermedad o trastorno mediado por interferon tipo I en un sujeto que necesita de tratamiento, que comprende administrar al sujeto el anticuerpo, o porcion de union a antlgeno del mismo, de la invencion, de modo que la enfermedad mediada por interferon tipo I en el sujeto sea tratada. La enfermedad mediada por interferon tipo I puede ser, por ejemplo, una enfermedad mediada por interferon alfa.
Ejemplos de enfermedades o trastornos que pueden tratarse usando los metodos de la invencion, incluyen lupus eritematoso sistemico, diabetes mellitus insulinodependiente, enfermedad inflamatoria del intestino, esclerosis multiple, psoriasis, tiroiditis autoinmune, artritis reumatoide, glomerulonefritis, infeccion por VIH, SIDA, rechazo de trasplante y enfermedad de injerto contra hospedero.
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Breve descripcion de los dibujos
La figura 1A muestra la secuencia de nucleotidos (SEQ ID NO: 33) y la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO:
25) , de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 3F11. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 1), CDR2 (SEQ ID NO: 5) y CDR3 (SEQ ID NO: 9), estan delineadas.
La figura 1B muestra la secuencia de nucleotidos (SEQ ID NO: 37) y la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO:
29) , de la region variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 3F11. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 13), CDR2 (SEQ ID NO: 17) y CDR3 (SEQ ID NO: 21), estan delineadas.
La figura 2A muestra la secuencia de nucleotidos (SEQ ID NO: 34) y la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO:
26) , de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 4G5. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 2), CDR2 (SEQ ID NO: 6) y CDR3 (SEQ ID NO: 10), estan delineadas.
La figura 2B muestra la secuencia de nucleotidos (SEQ ID NO: 38) y la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO:
30) , de la region variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 4G5. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 14), CDR2 (SEQ ID NO: 18) y CDR3 (SEQ ID NO: 22), estan delineadas.
La figura 3A muestra la secuencia de nucleotidos (SEQ ID NO: 35) y la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO:
27) , de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 11E2. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 3), CDR2 (SEQ ID NO: 7) y CDR3 (SEQ ID NO: 11), estan delineadas.
La figura 3B muestra la secuencia de nucleotidos (SEQ ID NO: 39) y la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO:
31) , de la region variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 11E2. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 15), CDR2 (SEQ ID NO: 19) y CDR3 (SEQ ID NO: 23), estan delineadas.
La figura 4A muestra la secuencia de nucleotidos (SEQ ID NO: 36) y la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO:
28) , de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 9D4. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 4), CDR2 (SEQ ID NO: 8) y CDR3 (SEQ ID NO: 12), estan delineadas.
La figura 4B muestra la secuencia de nucleotidos (SEQ ID NO: 40) y la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO:
32) , de la region variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 9D4. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 16), CDR2 (SEQ ID NO: 20) y CDR3 (SEQ ID NO: 24), estan delineadas.
La figura 5 muestra la alineacion de la secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada de 3F11, con la secuencia de aminoacidos de Vh 4-34 de la llnea germinal humana (SEQ ID NO: 41).
La figura 6 muestra la alineacion de la secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada de 4G5, con la secuencia de aminoacidos de Vh 4-34 de la llnea germinal humana (SEQ ID NO: 41).
La figura 7 muestra la alineacion de la secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada de 11E2 y 9D4, con la secuencia de aminoacidos de Vh 5-51 de la llnea germinal humana (SEQ ID NO: 42).
La figura 8 muestra la alineacion de la secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena ligera de 3F11, con la secuencia de aminoacidos de Vk L18 de la llnea germinal humana (SEQ ID NO: 43).
La figura 9 muestra la alineacion de la secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena ligera de 4G5, con la secuencia de aminoacidos de Vk L18 de la llnea germinal humana (SEQ ID NO: 43).
La figura 10 muestra la alineacion de la secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena ligera de 11E2 y 9D4, con la secuencia de aminoacidos de Vk A27 de la llnea germinal humana (SEQ ID NO: 44).
La figura 11 es una grafica que muestra los resultados de experimentos que demuestran que el anticuerpo monoclonal humano 3F11, dirigido contra el IFNAR-1 humano, no compite con el anticuerpo monoclonal de raton 64G12 por su union al IFNAR-1.
Descripcion detallada de la invencion
La presente invencion se refiere a anticuerpos monoclonales aislados que se unen al receptor 1 de interferon alfa (IFNAR-1), y que son capaces de bloquear la accion de interferones tipo I. La invencion provee anticuerpos aislados, inmunoconjugados y moleculas biespeclficas que comprenden dichos anticuerpos, y composiciones farmaceuticas que contienen los anticuerpos, inmunoconjugados o moleculas biespeclficas de la invencion. Ademas, se describen en el presente documento metodos de uso de los anticuerpos para inhibir la union de un interferon tipo I al IFNAR-1 en una celula que expresa el IFNAR-1, por ejemplo, en el tratamiento de trastornos mediados por la respuesta inmune, que incluyen trastornos autoinmunes, rechazo de trasplante y enfermedad de injerto contra hospedero (GVHD), en un sujeto.
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Para que la presente invencion pueda entenderse mas facilmente, ciertos terminos se definen primero. Otras definiciones se exponen a lo largo de la description detallada.
Los terminos “receptor 1 de interferon alfa”, “IFNAR-1” y “antlgeno de IFNAR-1” se usan reclprocamente, e incluyen variantes, isoformas, homologos de especie del IFNAR-1 humano, y analogos que tienen por lo menos un epltopo comun con el IFNAR-1. Por consiguiente, los anticuerpos humanos de la invencion pueden, en ciertos casos, reaccionar en forma cruzada con el IFNAR-1 de especies diferentes del humano, u otras protelnas que estan relacionadas estructuralmente con el IFNAR-1 humano (por ejemplo, homologos del IFNAR-1 humano). En otros casos, los anticuerpos pueden ser completamente especlficos del IFNAR-1 humano, y no exhiben reactividad cruzada con otras especies u otros tipos de reactividad cruzada.
La secuencia de ADNc completa del IFNAR-1 humano, tiene el numero de acceso de Genebank NM_000629.
El termino “interferon tipo I”, como se usa en la presente, se usa para referirse a miembros de la familia de moleculas de interferon tipo I que son ligandos para el IFNAR-1 (es decir, miembros de la familia de moleculas de interferon tipo I que son capaces de union al IFNAR-1). Ejemplos de ligandos de interferon tipo I, son interferon alfa 1, 2a, 2b, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 14, 16, 17, 21, interferon beta e interferon omega.
El termino “respuesta inmune” se refiere a la action de, por ejemplo, linfocitos, celulas que presentan antlgeno, celulas fagoclticas, granulocitos y macromoleculas solubles producidas por las celulas anteriores o el hlgado (incluyendo anticuerpos, citocinas y complementos) que resultan en dano selectivo a, destruction de, o elimination de, patogenos invasores, celulas o tejidos infectados con patogenos, celulas cancerosas o, en casos de autoinmunidad o inflamacion patologica, celulas o tejidos humanos normales, del cuerpo humano.
Una “via de transduction de senales”, se refiere a la relation bioqulmica entre varias moleculas de transduction de senales que desempenan una funcion en la transmision de una senal desde una portion de una celula hasta otra portion de una celula. Como se usa en la presente, la frase “receptor de superficie celular” incluye, por ejemplo, moleculas y complejos de moleculas capaces de recibir una senal, y la transmision de dicha senal a traves de la membrana plasmatica de una celula. Un ejemplo de un “receptor de superficie celular” de la presente invencion, es el receptor IFNAR-1.
El termino “anticuerpo”, como es referido en la presente, incluye anticuerpos enteros y cualquier fragmento de union a antlgeno (es decir, “porcion de union a antlgeno”), o cadenas sencillas del mismo. Un “anticuerpo” se refiere a una glucoprotelna que comprende por lo menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro, o una porcion de union a antlgeno del mismo. Cada cadena pesada comprende una region variable de cadena pesada (abreviada en la presente como Vh) y una region constante de cadena pesada. La region constante de cadena pesada comprende tres dominios, Ch1, Ch2 y Ch3. Cada cadena ligera comprende una region variable de cadena ligera (abreviada en la presente como Vl) y una region constante de cadena ligera. La region constante de cadena ligera comprende un dominio, Cl. Las regiones Vh y Vl pueden subdividirse ademas en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR1), entremezcladas con regiones que estan mas conservadas, denominadas regiones marco conservadas (FR). Cada Vh y Vl se forma de tres CDR y cuatro FR, dispuestas del extremo amino al extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas ligera y pesada contienen un dominio de union que interactua con un antlgeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar la union de la inmunoglobulina a tejidos o factores del hospedero, que incluyen varias celulas del sistema inmune (por ejemplo, celulas efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema clasico de complementos.
El termino “porcion de union a antlgeno” de un anticuerpo (o simplemente, “porcion de anticuerpo”), como se usa en la presente, se refiere a uno o mas fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad para unirse especlficamente a un antlgeno (por ejemplo, el IFNAR-1). Se ha mostrado que la funcion de union al antlgeno de un anticuerpo, puede ser realizada por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Ejemplos de fragmentos de union contemplados dentro del termino “porcion de union a antlgeno” de un anticuerpo, incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste de los dominios Vl, Vh, Cl y Cm; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados por un puente disulfuro en la region bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste de los dominios Vh y Cm; (iv) un fragmento Fv que consiste de los dominios Vl y Vh de un brazo individual de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), que consiste de un dominio Vh; y (vi) una region determinante de complementariedad (CDR) aislada. Ademas, aunque los dos dominios del fragmento Fv, Vl y Vh, son codificados por genes separados, pueden ser unidos usando metodos recombinantes, por medio de un enlazador sintetico que les permite son producidos como una cadena sencilla de protelna en la cual el par de regiones Vl y Vh forma moleculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv); vease, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Se pretende tambien que dichos anticuerpos de cadena sencilla sean abarcados dentro del termino “porcion de union a antlgeno” de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen usando tecnicas convencionales conocidas por los expertos en la tecnica, y los fragmentos se seleccionan por su utilidad de la misma forma como los anticuerpos intactos.
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Un “anticuerpo aislado”, como se usa en la presente, se usa para referirse a un anticuerpo que esta sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigenicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une especlficamente al IFNAR-1, esta sustancialmente libre de anticuerpos que se unen especlficamente a antlgenos diferentes del IFNAR-1). Un anticuerpo aislado que se une especlficamente al IFNAR-1 puede tener, sin embargo, reactividad cruzada con otros antlgenos, tales como moleculas de IFNAR-1 de otra especie. Ademas, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otros materiales y/o qulmicos celulares.
Los terminos “anticuerpo monoclonal” o “composicion de anticuerpo monoclonal”, como se usan en la presente, se refieren a una preparacion de moleculas de anticuerpo de composicion molecular individual. Una composicion de anticuerpo monoclonal exhibe una especificidad de union y afinidad individual por un epltopo particular.
El termino “anticuerpo humano”, como se usa en la presente, se usa para incluir anticuerpos que tienen regiones variables en las cuales las regiones CDR y de estructura se derivan de secuencias de inmunoglobulina de la llnea germinal humana. Ademas, si el anticuerpo contiene una region constante, la region constante se deriva tambien de secuencias de inmunoglobulina de la llnea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invencion pueden incluir residuos de aminoacido no codificados por secuencias de inmunoglobulina de la llnea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagenesis aleatoria o especlfica de sitio in vitro, o por mutaciones somaticas in vivo). Sin embargo, el termino “anticuerpo humano”, como se usa en la presente, no se usa para incluir anticuerpos en los cuales secuencias de CDR derivadas de la llnea germinal de otra especie de mamlfero, tal como un raton, han sido injertadas en secuencias de estructura humanas.
El termino “anticuerpo monoclonal humano” se refiere a anticuerpos que exhiben una especificidad de union individual que tiene regiones variables en las cuales las regiones CDR y de estructura se derivan de secuencias de inmunoglobulina de la llnea germinal humana. En una modalidad, los anticuerpos monoclonales humanos son producidos por un hibridoma que incluye una celula B obtenida de un animal no humano transgenico, por ejemplo, un raton transgenico, que tiene un genoma que comprende un transgen de la cadena pesada humana y un transgen de la cadena ligera fusionados a una celula inmortalizada.
El termino “anticuerpo humano recombinante”, como se usa en la presente, incluye todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o alslan por medios recombinantes, tales como (a) anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un raton) que es transgenico o transcromosomico para genes de inmunoglobulina humana, o un hibridoma preparado de los mismos (descritos mas adelante), (b) anticuerpos aislados de una celula hospedadora transformada que expresa el anticuerpo humano, por ejemplo, de un transfectoma, (c) anticuerpos aislados de una coleccion combinatoria de anticuerpos humanos recombinantes, y (d) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por medio de cualquier otro medio que implique empalme de secuencias de genes de inmunoglobulina humana u otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables en las cuales las regiones CDR y de estructura se derivan de secuencias de inmunoglobulina de la llnea germinal humana. En ciertas modalidades, sin embargo, dichos anticuerpos humanos recombinantes pueden someterse a mutagenesis in vitro (o, cuando se usa un animal transgenico para secuencias de Ig humana, mutagenesis somatica in vivo), y de esta manera las secuencias de aminoacidos de las regiones Vh y Vl de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque derivadas de y relacionadas con secuencias de Vh y Vl de la llnea germinal humana, pueden no existir en forma natural dentro del repertorio de la llnea germinal de anticuerpos humanos in vivo.
Como se usa en la presente, el termino “isotipo” se refiere a la clase de anticuerpos (por ejemplo, IgM o IgGI) que es codificada por los genes de la region constante de cadena pesada.
Como se usa en la presente, el termino “union especlfica” se refiere a la union del anticuerpo a un antlgeno predeterminado. Normalmente, el anticuerpo se une con una constante de disociacion (KD) de 10"7 M o menos, y se une al antlgeno predeterminado con una KD que es por lo menos dos veces menor que su KD para union a un antlgeno no especlfico (por ejemplo, BSA, caselna) diferente del antlgeno predeterminado o un antlgeno estrechamente relacionado. Las frases “un anticuerpo que reconoce un antlgeno” y “un anticuerpo especlfico de un antlgeno”, se usan reclprocamente en la presente con el termino “un anticuerpo que se une especlficamente a un antlgeno”.
El termino “Kasoc” o “Ka”, como se usa en la presente, se usa para referirse a la velocidad de asociacion de una interaccion particular de antlgeno-anticuerpo, mientras que el termino “Kdis” o “Kd”, como se usa en la presente, se usa para referirse a la velocidad de disociacion de una interaccion particular de antlgeno-anticuerpo. El termino “KD”, como se usa en la presente, se usa para referirse a la constante de disociacion, la cual se obtiene de la relacion de Kd a Ka (es decir, Kd/Ka), y se expresa como una concentracion molar (M). Los valores de KD para anticuerpos pueden determinarse usando metodos bien establecidos en la tecnica. Un metodo preferido para determinar la Kd de un anticuerpo, es usando la tecnica de resonancia de plasmon superficial, de preferencia usando un sistema biosensor, tal como un sistema Biacore®.
Como se usa en la presente, el termino “alta afinidad” por un anticuerpo de IgG, se refiere a un anticuerpo que tiene una Kd de 10"8 M o menos, mas preferiblemente 10"9 M o menos, y aun mas preferiblemente 10"10 M o menos. Sin
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embargo, la union de “alta afinidad” puede variar para otros isotipos del anticuerpo. Por ejemplo, la union de “alta afinidad” para un isotipo de IgM, se refiere a un anticuerpo que tiene una Kd de 10-7 M o menos, mas preferiblemente 10-8 M o menos.
Como se usa en la presente, el termino “sujeto” incluye cualquier animal humano o no humano. El termino “animal no humano” incluye todos los vertebrados, por ejemplo, mamlferos y no mamlferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, caballos, vacas, pollos, anfibios, reptiles, etc.
Varios aspectos de la invencion se describen en mas detalle en las siguientes subsecciones.
Anticuerpos anti-IFNAR-1
Los anticuerpos de la invencion se caracterizan por propiedades o caracterlsticas funcionales particulares de los anticuerpos. Por ejemplo, los anticuerpos se unen especlficamente al IFNAR-1, de preferencia el IFNAR-1 humano. Ademas, los anticuerpos pueden reaccionar en forma cruzada con el IFNAR-1 de uno o mas primates no humanos, tales como monos cynomolgus y/o monos rhesus. De preferencia, un anticuerpo de la invencion se une al IFNAR-1 con alta afinidad, por ejemplo, con una KD de 10"7 M o menos, mas preferiblemente con una KD de 10"8 M o menos, o 10"9 M o menos, o aun 5 x 10"10 M o menos, o 2 x 10"10 M o menos.
Ademas, los anticuerpos de la invencion son capaces de inhibir la actividad biologica de interferones tipo I. Los anticuerpos inhiben la actividad biologica de por lo menos un interferon tipo I, y de preferencia inhiben la actividad biologica de interferones tipo I multiples (es decir, por lo menos dos, mas preferiblemente por lo menos tres, o por lo menos cuatro, o por lo menos cinco, o por lo menos seis, o por lo menos siete, o por lo menos ocho, o por lo menos nueve, o por lo menos diez, o por lo menos 11, o por lo menos 12, o por lo menos 13 o por lo menos 14, o por lo menos 15, diferentes subtipos de interferon tipo I). En una modalidad preferida, el anticuerpo inhibe la actividad biologica de los siguientes interferones tipo I: a1, a2a, a2b, a4, a5, a6, a7, a8, a10, a14, a16, a17, a21, beta y omega. En otras modalidades preferidas, el anticuerpo inhibe la actividad del IFN linfoblastoide y/o el IFN de leucocitos.
La capacidad de un anticuerpo para inhibir la actividad biologica de interferones tipo I, puede examinarse en una o mas pruebas establecidas en la tecnica. Ejemplos no limitativos incluyen inhibition de la proliferation de celulas de Daudi mediada por IFN tipo I, inhibicion de la expresion de IP-10 inducida por IFN tipo I por celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC), inhibicion del desarrollo de celulas dendrlticas mediado por plasma del lupus eritematoso sistemico (LSE), e inhibicion de la actividad antiviral de IFN tipo I. Un anticuerpo “inhibe la actividad biologica de interferones tipo I”, si inhibe la actividad por cuando menos 20 %, mas preferiblemente por cuando menos 30 %, aun mas preferiblemente por cuando menos 40 %, por lo menos 50 %, por lo menos 60 %, por lo menos 70 %, por lo menos 80 % o por lo menos 90 %, en comparacion con un anticuerpo control no especlfico.
En modalidades preferidas, el anticuerpo inhibe la actividad de IFN a 2b en una prueba de proliferacion de celulas de Daudi, inhibe la actividad de IFN omega en una prueba de proliferacion de celulas de Daudi, inhibe la secretion de IP-10 por PBMC inducida por IFN a 2b o IFN omega, y/o inhibe el desarrollo de celulas dendrlticas mediado por plasma del LSE.
En otra modalidad preferida, el anticuerpo no compite en forma cruzada con (es decir, se une a un epltopo diferente que) el anticuerpo anti-IFNAR-1 de murino 64G12 (depositado como numero de deposito de ECACC 92022605).
Pruebas para evaluar las actividades funcionales de anticuerpos anti-IFNAR, se describen en mas detalle en los ejemplos. Los anticuerpos preferidos de la invencion exhiben por lo menos una, mas preferiblemente dos, tres, cuatro, cinco o mas, de las siguientes propiedades:
a) se une especlficamente al IFNAR1 (de preferencia al IFNAR1 humano);
b) se une al IFNAR1 con alta afinidad, tal como una Kd de 1 x 10-8 M o mayor afinidad;
c) inhibe la actividad biologica de interferones tipo I multiples;
d) inhibe la actividad de IFN a 2b en una prueba de proliferacion de celulas de Daudi;
e) inhibe la actividad de IFN omega en una prueba de proliferacion de celulas de Daudi;
f) inhibe la secrecion de IP-10 por celulas mononucleares de sangre periferica inducida por IFN a 2b;
g) inhibe la secrecion de IP-10 por celulas mononucleares de sangre periferica inducida por IFN omega;
h) inhibe el desarrollo de celulas dendrlticas mediado por plasma del lupus eritematoso sistemico; y
i) se une a un epltopo diferente que (es decir, no compite en forma cruzada con) el anticuerpo monoclonal murino 64G12 (numero de deposito de EcACC 92022605).
Cualquier combination de las caracterlsticas funcionales descritas anteriormente y/o las caracterlsticas funcionales como se describen en los ejemplos, puede ser exhibida por un anticuerpo de la invencion.
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Anticuerpo monoclonal 3F11, 4G5, 11E2 y 9D4
Anticuerpos preferidos de la invention, son los anticuerpos monoclonales humanos 3F11, 4G5, 11E2 y 9D4, aislados y caracterizados estructuralmente como se describe en los ejemplos. Las secuencias de aminoacidos de Vh de 3F11, 4G5, 11E2 y 9D4 se muestran en las SEQ ID NO: 25, 26, 27 y 28, respectivamente. Las secuencias de aminoacidos de Vl de 3F11, 4G5, 11E2 y 9D4 se muestran en las SEQ ID NO: 29, 30, 31 y 32, respectivamente.
Dado que cada uno de estos anticuerpos puede unirse al IFNAR-1, las secuencias de Vh y Vl pueden “mezclarse y compararse”, para crear otras moleculas de union anti-IFNAR-1 de la invencion. La union de dichos anticuerpos “mezclados y comparados” al IFNAR-1, puede ponerse a prueba usando las pruebas de union descritas en la presente (por ejemplo, ELISA), y/o usando las pruebas de inhibition funcional de IFN tipo I descritas en los ejemplos. De preferencia, cuando las cadenas de Vh y Vl se mezclan y comparan, una secuencia de Vh de un apareamiento de Vh/Vl particular, es reemplazada con una secuencia de Vh estructuralmente similar. Asimismo, de preferencia una secuencia de Vl de un apareamiento de Vh/Vl particular, es reemplazada con una secuencia de Vl estructuralmente similar. Por ejemplo, las secuencias de Vh y Vl de 3F11 y 4G5 estan particularmente sujetas para mezclado y comparacion, puesto que estos anticuerpos usan secuencias de Vh y Vl derivadas de las mismas secuencias de la llnea germinal (Vh 4-34 y Vk L18), y de esta manera exhiben similitud estructural. Ademas, las secuencias de Vh y Vl de 11E2 y 9D4 estan particularmente sujetas para mezclado y comparacion, puesto que estos anticuerpos usan secuencias de Vh y Vl derivadas de las mismas secuencias de la llnea germinal (Vh 5-51 y Vk A27), y de esta manera exhiben similitud estructural.
Combinaciones preferidas de cadena ligera y pesada, incluyen:
(a) una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 25; y (b)
una region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 29; o
(a) una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 28; y (b)
una region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 32
En otro aspecto, la invencion provee anticuerpos que comprenden las CDR1, CDR2 y CDR3 de 3F11 y 9D4 de las cadenas ligera y pesada, respectivamente. Las secuencias de aminoacidos de las CDR1 de 3F11, 4G5, 11E2 y 9D4 de Vh, se muestran en las sEq ID NO: 1, 2, 3 y 4. Las secuencias de aminoacidos de las CDR2 de 3F11, 4G5, 11E2 y 9D4 de Vh, se muestran en las SEQ ID NO: 5,6, 7 y 8. Las secuencias de aminoacidos de las CDR3 de 3F11, 4G5, 11E2 y 9D4 de Vh, se muestran en las SEQ ID NO: 9,10, 11 y 12. Las secuencias de aminoacidos de las CDR1 de 3F11, 4G5, 11E2 y 9D4 de Vk, se muestran en las SEQ ID NO: 13, 14, 15 y 16. Las secuencias de aminoacidos de las CDR2 de 3F11, 4G5, 11E2 y 9D4 de Vk, se muestran en las SEQ ID NO: 17, 18, 19 y 20. Las secuencias de aminoacidos de las CDR3 de 3F11, 4G5, 11E2 y 9D4 de Vk, se muestran en las SEQ ID No: 21, 22, 23 y 24. Las regiones CDR son delineadas usando el sistema de Kabat (Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edition, U. S. Department of Health and Human Services, publication de NIH No. 913242).
Dado que cada uno de estos anticuerpos puede unirse al IFNAR-1, y la especificidad de union al antlgeno es provista principalmente por las regiones CDR1, 2 y 3, las secuencias de CDR1, 2 y 3 de Vh y las secuencias de CDR1, 2 y 3 de Vk pueden “mezclarse y compararse” (es decir, CDR de diferentes anticuerpos pueden mezclarse y compararse, aunque cada anticuerpo debe contener una CDR1, 2 y 3 de Vh y una CDR1, 2 y 3 de Vk), para crear otras moleculas de union anti-IFNAR-1 de la invencion. La union de dichos anticuerpos “mezclados y comparados” al IFNAR-1, puede ponerse a prueba usando las pruebas de union descritas anteriormente y en los ejemplos (por ejemplo, ELISA). De preferencia, cuando se mezclan y comparan secuencias de CDR de Vh, la secuencia de CDR1, CDR2 y/o CDR3 de una secuencia de Vh particular es reemplazada con una secuencia de CDR estructuralmente similar. Asimismo, cuando se mezclan y comparan secuencias de CDR de Vk, la secuencia de CDR1, CDR2 y/o CDR3 de una secuencia de Vk particular es reemplazada de preferencia con una secuencia de cDr estructuralmente similar. Por ejemplo, las CDR1 de 3F11 y 4G5 de Vh comparten cierta similitud estructural, y por lo tanto estan sujetas a mezclado y comparacion. Como otro ejemplo, las CDR1 de 11E2 y 9D4 de Vh comparten cierta similitud estructural, y por lo tanto estan sujetas a mezclado y comparacion. Como otro ejemplo, las CDR1 de 3F11 y 4G5 de Vk comparten cierta similitud estructural. Como otro ejemplo, las CDR1 de 11E2 y 9D4 de Vh comparten cierta similitud estructural. Sera facilmente evidente para los expertos en la tecnica, que pueden crearse secuencias de Vh y Vl novedosas sustituyendo una o mas secuencias de la region CDR de Vh y/o Vl con secuencias estructuralmente similares de las secuencias de CDR descritas en la presente, para los anticuerpos monoclonales 3F11, 4G5, 11E2 y 9D4.
En una modalidad preferida, el anticuerpo comprende:
(a) una region variable CDR1 de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 1;
(b) una region variable CDR2 de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 5;
(c) una region variable CDR3 de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 9;
(d) una region variable CDR1 de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 13;
(e) una region variable CDR2 de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 17; y
(f) una region variable CDR3 de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 21.
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En otra modalidad preferida, el anticuerpo comprende:

(a) una region variable CDR1 de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 4;

(b) una region variable CDR2 de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 8;

(c) una region variable CDR3 de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 12;
(d) una region variable CDR1 de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 16;

(e) una region variable CDR2 de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 20; y
(f) una region variable CDR3 de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 24.
Anticuerpos que se unen al mismo epitopo que 3F11 y 9D4
Anticuerpos que se unen al mismo epitopo en el IFNAR-1 humano como los anticuerpos monoclonales 3F11 o 9D4 (que tienen secuencias de Vh como se muestra en las SEQ ID NO: 25 y 28, respectivamente, y secuencias de Vl como se muestra en las SEQ ID NO: 29, 32, respectivamente), pueden identificarse con base en su capacidad para competir en forma cruzada con 3F11 o 9D4 en pruebas estandar de union al IFNAR-1. La capacidad de un anticuerpo de prueba para inhibir la union de 3F11 o 9D4 al IFNAR-1 humano, demuestra que el anticuerpo de
prueba puede competir con 3F11 o 9D4 por la union al IFNAR-1 humano, y se une de esta manera al mismo epitopo
en el IFNAR-1 humano, como 3F11 o 9D4. Preferentemente, el anticuerpo que se une al mismo epitopo en el IFNAR-1 humano como 3F11 o 9D4, es un anticuerpo monoclonal humano. Dichos anticuerpos monoclonales humanos pueden prepararse y aislarse como se describe en los ejemplos.
En otra modalidad preferida, el anticuerpo se une a un epitopo diferente que (es decir, no compite en forma cruzada con) el anticuerpo monoclonal de raton 64G12 (numero de deposito de ECACC 92022605).
Anticuerpos que tienen secuencias particulares de la linea germinal
En ciertas modalidades, un anticuerpo de la invencion comprende una region variable de cadena pesada de un gen de inmunoglobulina de cadena pesada de la linea germinal particular, y/o una region variable de cadena ligera de un gen de inmunoglobulina de cadena ligera de la linea germinal particular.
Por ejemplo, en una modalidad preferida, la invencion provee un anticuerpo monoclonal anti-IFNAR-1 aislado, o una porcion de union a antigeno del mismo, en donde el anticuerpo:
(a) comprende una region variable de cadena pesada de un gen de Vh 4-34 o 5-51 humano;
(b) comprende una region variable de cadena ligera de un gen de Vk L18 o A27 humano; y
(c) el anticuerpo se une especificamente al IFNAR-1.
Ejemplos de anticuerpos que tienen Vh y Vk de Vh 4-34 y Vk L18, respectivamente, incluyen 3F11 y 4G5. Ejemplos de anticuerpos que tienen Vh y Vk de Vh 5-51 y Vk A27, respectivamente, incluyen 11E2 y 9D4.
Como se usa en la presente, un anticuerpo humano comprende regiones variables de cadena ligera o pesada “de” o “derivadas de” o “el producto de” una secuencia particular de la linea germinal, si las regiones variables del anticuerpo se obtienen de un sistema que usa genes de inmunoglobulina de la linea germinal humana. Dichos sistemas incluyen inmunizacion de un raton transgenico que posee genes de inmunoglobulina humana con el antigeno de interes, o seleccion de una coleccion de genes de inmunoglobulina humana exhibidos en fagos con el antigeno de interes. Un anticuerpo humano que es “de” o “derivado de” o “el producto de” una secuencia de inmunoglobulina de la linea germinal humana puede identificarse como tal, comparando la secuencia de aminoacidos del anticuerpo humano con las secuencias de aminoacidos de inmunoglobulinas de la linea germinal humana, y seleccionando la secuencia de inmunoglobulina de la linea germinal humana que esta mas cerca en secuencia (es decir, % de identidad mas grande) con la secuencia del anticuerpo humano. Un anticuerpo humano que es “de” o “derivado de” o “el producto de” una secuencia de inmunoglobulina de la linea germinal humana particular, puede contener diferencias de aminoacidos en comparacion con la secuencia de la linea germinal debido a, por ejemplo, mutaciones somaticas de ocurrencia natural o introduccion intencional de mutacion dirigida a sitio. Sin embargo, un anticuerpo humano seleccionado es normalmente por lo menos 90 % identico en secuencia de aminoacidos con una secuencia de aminoacidos codificada por un gen de inmunoglobulina de la linea germinal humana, y contiene residuos de aminoacido que identifican al anticuerpo humano como de ser humano, cuando se compara con las secuencias de aminoacidos de inmunoglobulina de la linea germinal de otra especie (por ejemplo, secuencias de la linea germinal de murino). En ciertos casos, un anticuerpo humano puede ser por lo menos 95 %, o incluso por lo menos 96 %, 97 %, 98 % o 99 % identico en secuencia de aminoacidos, con la secuencia de aminoacidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la linea germinal. Normalmente, un anticuerpo humano derivado de una secuencia de la linea germinal humana particular, exhibira no mas de 10 diferencias de aminoacidos de la secuencia de aminoacidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la linea germinal humana. En ciertos casos, el anticuerpo humano puede exhibir no mas de 5, o incluso no mas de 4, 3, 2 o 1 diferencias de aminoacidos de la secuencia de aminoacidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la linea germinal.
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Anticuerpos homoloaos
En otra modalidad, un anticuerpo de la invention comprende regiones variables de cadena ligera y pesada que comprenden secuencias de aminoacidos que son homologas a las secuencias de aminoacidos de los anticuerpos preferidos descritos en la presente, y en donde los anticuerpos retienen las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos anti-IFNAR-1 de la invencion. Por ejemplo, la invencion provee un anticuerpo monoclonal aislado, o portion de union a antlgeno del mismo, que comprende una region variable de cadena pesada y una region variable de cadena ligera, en donde:
(a) la region variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoacidos que es por lo menos 80 % homologa a una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 25 y 28;
(b) la region variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoacidos que es por lo menos 80 % homologa a una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 29 y 32;
(c) el anticuerpo se une especlficamente al IFNAR-1 y exhibe por lo menos una de las propiedades funcionales descritas en la presente, de preferencia varias de las propiedades funcionales descritas en la presente.
En otras modalidades, las secuencias de aminoacidos de VH y/o VL pueden ser 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % homologas a las secuencias expuestas anteriormente. Un anticuerpo que tenga regiones VH y VL que tengan alta (es decir, 80 % o mas) homologia con las regiones Vh y Vl de las secuencias expuestas anteriormente, puede obtenerse por mutagenesis (por ejemplo, mutagenesis dirigida a sitio o mutagenesis mediada por PCR) de moleculas de acido nucleico que codifiquen para las SEQ ID NO: 33, 36, 37 o 40, seguida de prueba del anticuerpo alterado codificado para funcion retenida (es decir, las funciones expuestas en los incisos (c), (d) y (e) anteriores), usando las pruebas funcionales descritas en la presente.
Como se usa en la presente, el por ciento de homologia entre dos secuencias de aminoacidos, es equivalente al por ciento de identidad entre las dos secuencias. El por ciento de identidad entre las dos secuencias es una funcion del numero de posiciones identicas compartidas por las secuencias (es decir, % de homologia = numero de posiciones identicas/numero total de posiciones x 100), tomando en cuenta el numero de espacios, y la longitud de cada espacio, que necesita introducirse para la alineacion optima de las dos secuencias. La comparacion de las secuencias y la determination del por ciento de identidad entre las dos secuencias, pueden lograrse usando un algoritmo matematico, como se describe en los ejemplos no limitativos mas adelante.
El por ciento de identidad entre dos secuencias de aminoacidos, puede determinarse usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4: 11-17 (1988)), el cual se ha incorporado en el programa ALIGN (version 2.0), usando una tabla de peso de residuos PAM120, una penalization de longitud de espacio de 12 y una penalization de espacio de 4. Ademas, el por ciento de identidad entre dos secuencias de aminoacidos puede determinarse usando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 444-453 (1970)), el cual se ha incorporado en el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en
http://www.gcg.com), usando una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250, y un peso de espacio de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6.
Ademas o en forma alternativa, las secuencias de protelnas de la presente invencion pueden usarse ademas como una “secuencia de consulta” para realizar una busqueda contra bases de datos publicas para, por ejemplo, identificar secuencias relacionadas. Dichas busquedas pueden llevarse a cabo usando el programa XBLAST (version 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10. Pueden realizarse busquedas de protelnas BLAST con el programa XBLAST, puntuacion = 50, longitud de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoacidos homologas a las moleculas de anticuerpo de la invencion. Para obtener alineaciones con espacios para propositos de comparacion, puede usarse BLAST con espacios como se describe en Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25 (17): 33893402. Cuando se usen los programas BLAST y BLAST con espacios, pueden usarse los parametros predeterminados de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST). Vease
http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
Anticuerpos con modificaciones conservativas
Un anticuerpo de la invencion comprende una region variable de cadena pesada que comprende secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, y una region variable de cadena ligera que comprende secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, en donde al menos las secuencias CDR3 de la region variable de la cadena pesada y CDR3 de la region variable de la cadena ligera comprenden secuencias de aminoacidos especificadas basadas en los anticuerpos preferidos descritos en la presente (por ejemplo, 3F11 y 9D4). Anticuerpos que retienen las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos anti-IFNAR-1 de la invencion pueden contener modificaciones conservativas de las secuencias de CDR de 3F11 o 9D4.
Como se usa en la presente, el termino “modificaciones conservativas de secuencia” se usa para referirse a modificaciones de aminoacidos que no afectan o alteran en forma significativa las caracterlsticas de union del anticuerpo que contiene la secuencia de aminoacidos. Dichas modificaciones conservativas incluyen sustituciones, adiciones y deleciones de aminoacidos. Pueden introducirse modificaciones en el anticuerpo de la invencion
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mediante tecnicas estandar conocidas en la materia, tales como mutagenesis dirigida a sitio y mutagenesis mediada por PCR. Las sustituciones conservativas de aminoacidos, son aquellas en las cuales el residuo de aminoacido es reemplazado con un residuo de aminoacido que tenga una cadena lateral similar. Familias de residuos de aminoacido que tienen cadenas laterales similares, se han definido en la tecnica. Estas familias incluyen aminoacidos con cadenas laterales basicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales acidas (por ejemplo, acido aspartico, acido glutamico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cistelna, triptofano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina), y cadenas laterales aromaticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). De esta manera, uno o mas residuos de aminoacido dentro de las regiones CDR de un anticuerpo de la invencion, pueden reemplazarse con otros residuos de aminoacido de la misma familia de la cadena lateral, y el anticuerpo alterado puede ponerse a prueba para funcion retenida (es decir, las funciones expuestas en los incisos (c)a (d) y (e) anteriores), usando las pruebas funcionales descritas en la presente.
Anticuerpos disenados y modificados
Un anticuerpo de la invencion puede prepararse ademas usando un anticuerpo que tenga una o mas de las secuencias de VH y/o VL descritas en la presente como material de partida, para disenar un anticuerpo modificado, cuyo anticuerpo modificado puede tener propiedades alteradas del anticuerpo de partida. Un anticuerpo puede disenarse modificando uno o mas residuos dentro de una de las regiones variables, o ambas (es decir, Vh y/o Vl), por ejemplo, dentro de una o mas regiones CDR, y/o dentro de una o mas regiones marco conservadas. Ademas o en forma alternativa, un anticuerpo puede disenarse modificando residuos dentro de las regiones constantes, por ejemplo, para alterar las funciones efectoras del anticuerpo.
Un tipo de diseno de la region variable que puede realizarse, es injerto de CDR. Los anticuerpos interaction con antlgenos diana predominantemente a traves de residuos de aminoacido que se localizan en las seis regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la cadena ligera y pesada. Por esta razon, las secuencias de aminoacidos dentro de las CDR son mas diversas entre anticuerpos individuales que secuencias fuera de las CDR. Puesto que las secuencias de CDR son responsables de la mayorla de las interacciones antlgeno-anticuerpo, es posible expresar anticuerpos recombinantes que imiten las propiedades de anticuerpos especlficos de ocurrencia natural, construyendo vectores de expresion que incluyan secuencias de CDR a partir del anticuerpo de ocurrencia natural especlfico injertado en secuencias de estructura de un diferente anticuerpo con diferentes propiedades (vease, por ejemplo, Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332: 323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 32l: 522-525; Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Vease U.S.A. 86: 10029-10033; patente de E.U.A. No. 5.225.539 a Winter, y patentes de E.U.A. Nos. 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 y 6.180.370 a Queen et al.).
Por consiguiente, otra modalidad de la invencion pertenece a un anticuerpo monoclonal aislado, o porcion de union a antlgeno del mismo, que contiene las secuencias de CDR de Vh y Vl de anticuerpos monoclonales 3F11 o 9D4, y sin embargo pueden contener diferentes secuencias de estructura de estos anticuerpos.
Dichas secuencias de estructura pueden obtenerse de bases de datos de ADN publicas o referencias publicadas, que incluyen secuencias de genes de anticuerpos de la llnea germinal. Por ejemplo, secuencias de ADN de la llnea germinal para genes de la region variable de la cadena ligera y pesada, pueden encontrarse en la base de datos de secuencias de la llnea germinal humana “VBase” (disponible en la Internet en
www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase), as! como en Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edicion, U.S. Department of Health and Human Services, publicacion de NIH No. 91-3242; Tomlinson, I. M., et al. (1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol. Biol. 227: 776-798; y Cox, J. P. L. et al. (1994) "A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24: 827-836.
Secuencias de estructura preferidas para su uso en los anticuerpos de la invencion, son aquellas que son estructuralmente similares a las secuencias de estructura por anticuerpos seleccionados de la invencion, por ejemplo, similares a las secuencias de estructura de Vh 4-34 y Vl L18 usadas por el anticuerpo monoclonal 3F11, o las secuencias de estructura de Vh 5-51 y Vl A27 usadas por el anticuerpo monoclonal 9D4. Las secuencias de CDR1, 2 y 3 de Vh de las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 y 12, y las secuencias de CDR1, 2 y 3 de Vl de las SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 y 24, pueden injertarse en regiones marco conservadas que tengan la misma secuencia que se encuentra en el gen de inmunoglobulina de la llnea germinal de la cual la secuencia de estructura se deriva, o las secuencias de CDR pueden injertarse en regiones marco conservadas que contengan una o mas mutaciones en comparacion con las secuencias de la llnea germinal. Por ejemplo, se ha encontrado que en ciertos casos, es benefico mutar residuos dentro de las regiones marco conservadas para mantener o mejorar la capacidad de union a antlgeno del anticuerpo (vease, por ejemplo, las patentes de E.U.A. Nos. 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 y 6.180.370 a Queen et al.).
Otro tipo de modification de la region variable, es mutar residuos de aminoacido dentro de las regiones CDR1, CDR2 y/o CDR3 de Vh y/o Vl para mejorar de esta manera una o mas propiedades de union (por ejemplo, afinidad) del anticuerpo de interes. Puede realizarse mutagenesis dirigida a sitio o mutagenesis mediada por PCR para
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introducir las mutaciones, y el efecto sobre la union al anticuerpo u otra propiedad funcional de interes, puede evaluarse en pruebas in vitro o in vivo como se describe en la presente y se provee en los ejemplos. De preferencia, se introducen modificaciones conservativas (como se discutio anteriormente). Las mutaciones pueden ser sustituciones, adiciones o deleciones de aminoacidos, pero son de preferencia sustituciones. Ademas, normalmente no mas de cinco residuos son alterados dentro de una region CDR.
Anticuerpos disenados de la invencion, incluyen aquellos en los cuales se han hecho modificaciones a los residuos de estructura dentro de Vh y/o Vl, por ejemplo, para mejorar las propiedades del anticuerpo. Normalmente, dichas modificaciones de estructura se hacen para disminuir la inmunogenicidad del anticuerpo. Por ejemplo, un procedimiento es “retromutar” uno o mas residuos de estructura a la secuencia de la llnea germinal correspondiente. Mas especlficamente, un anticuerpo que ha sufrido mutacion somatica, puede contener residuos de estructura que difieren de la secuencia de la llnea germinal de la cual el anticuerpo se deriva. Dichos residuos pueden identificarse comparando las secuencias de estructura del anticuerpo con las secuencias de la llnea germinal de la cual el anticuerpo se deriva. Por ejemplo, para 3F11, el residuo de aminoacido #43 (dentro de FR2) de Vh es una treonina, mientras que este residuo en la secuencia de la llnea germinal de Vh 4-34 correspondiente, es una alanina (vease figura 5). Para regresar las secuencias de la region marco conservada a su configuracion de la llnea germinal, las mutaciones somaticas pueden ser “retromutadas” a la secuencia de la llnea germinal, por ejemplo, por mutagenesis dirigida a sitio o mutagenesis mediada por PCR (por ejemplo, el residuo 43 de la Vh de 3F11 puede ser “retromutado” de treonina a alanina). Como otro ejemplo, para 4G5, el residuo de aminoacido #81 (dentro de FR3) de Vh es una asparagina, mientras que este residuo en la secuencia de la llnea germinal de Vh 4-34 correspondiente, es una lisina (vease figura 6). Para regresar las secuencias de la region marco conservada a su configuracion de la llnea germinal, las mutaciones somaticas pueden ser “retromutadas” de asparagina a lisina. Como otro ejemplo, para 11E2 y 9D4, el residuo de aminoacido #28 (dentro de FR1) de Vh es una isoleucina, mientras que este residuo en la secuencia de la llnea germinal de Vh 5-51 correspondiente, es una serina (vease figura 7). Para regresar las secuencias de la region marco conservada a su configuracion de la llnea germinal, las mutaciones somaticas pueden ser “retromutadas” de isoleucina a serina. Se pretende tambien que dichos anticuerpos “retromutados”, sean abarcados por la invencion.
Otro tipo de modificacion de estructura implica mutar uno o mas residuos dentro de la region marco conservada, o incluso dentro de una o mas regiones CDR, para remover epltopos de celulas T, para reducir de esta manera la inmunogenicidad potencial del anticuerpo. Este procedimiento es referido tambien como “desinmunizacion”, y se describe en mas detalle en la publicacion de la patente de E.U.A. No. 20030153043 por Carr et al.
Ademas o en forma alternativa a modificaciones hechas dentro de las regiones CDR o de estructura, los anticuerpos de la invencion pueden disenarse para que incluyan modificaciones dentro de la region Fc, normalmente para alterar una o mas propiedades funcionales del anticuerpo, tales como vida media en suero, fijacion del complemento, union al receptor Fc, y/o citotoxicidad celular dependiente del antlgeno. Ademas, un anticuerpo de la invencion puede modificarse qulmicamente (por ejemplo, una o mas porciones qulmicas pueden unirse al anticuerpo), o puede modificarse para que se altere su glucosilacion, de nuevo para alterar una o mas propiedades funcionales del anticuerpo. Cada una de estas modalidades se describe en mas detalle mas adelante. La numeracion de residuos en la region Fc, es la del Indice EU de Kabat.
En una modalidad, la region bisagra de CH1 es modificada, de modo que el numero de residuos de cistelna en la region bisagra sea alterado, por ejemplo, incrementado o disminuido. Este procedimiento se describe ademas en la patente de E.U.A. No. 5.677.425 por Bodmer et al. El numero de residuos de cistelna en la region bisagra de CH1 es alterado para, por ejemplo, facilitar el ensamble de las cadenas ligera y pesada, o para incrementar o disminuir la estabilidad del anticuerpo.
En otra modalidad, la region bisagra Fc de un anticuerpo es mutada para disminuir la vida media biologica del anticuerpo. Mas especlficamente, una o mas mutaciones de aminoacidos son introducidas en la region de interfaz del dominio CH2-CH3 del fragmento de bisagra-Fc, de modo que el anticuerpo tenga deteriorada la union a la protelna A estafilococcica (SpA) respecto a la union a SpA del dominio de bisagra-Fc. Este procedimiento se describe en mas detalle en la patente de E.U.A. No. 6.165.745, por Ward et al.
En otra modalidad, el anticuerpo es modificado para que incremente su vida media biologica. Varios procedimientos son posibles. Por ejemplo, pueden introducirse una o mas de las siguientes mutaciones: T252L, T254S, T256F, como se describe en la patente de E.U.A. No. 6.277.375 a Ward. En forma alternativa, para incrementar la vida media biologica, el anticuerpo puede ser alterado dentro de la region CH1 o CL para que contenga un epltopo silvestre de union al receptor, tomado de dos asas de un dominio CH2 de una region Fc de una IgG, como se describe en las patentes de E.U.A. Nos. 5.869.046 y 6.121.022, por Presta et al.
En otras modalidades, la region Fc es alterada reemplazando por lo menos un residuo de aminoacido con un residuo de aminoacido diferente que altere las funciones efectoras del anticuerpo. Por ejemplo, uno o mas aminoacidos seleccionados de los residuos de aminoacido 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 y 322 pueden reemplazarse con un residuo de aminoacido diferente, de modo que el anticuerpo tenga una afinidad alterada por un ligando efector, pero retenga la capacidad de union al antlgeno del anticuerpo precursor. El ligando efector para el cual la afinidad es
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alterada puede ser, por ejemplo, un receptor Fc o el componente C1 del complemento. Este procedimiento se describe en mas detalle en las patentes de E.U.A. Nos. 5.624.821 y 5.648.260, por Winter et al.
En otro ejemplo, uno o mas aminoacidos seleccionados de los residuos de aminoacido 329, 331 y 332 pueden reemplazarse con un residuo de aminoacido diferente, de modo que el anticuerpo tenga alterada la union a Clq, y/o reducida o suprimida la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Este procedimiento se describe en mas detalle en la patente de E.U.A. No. 6.194.551, por Idusogie et al.
En otro ejemplo, uno o mas residuos de aminoacido dentro de las posiciones de aminoacido 231 y 239, son alterados para alterar de esta manera la capacidad del anticuerpo para fijar el complemento. Este procedimiento se describe en mas detalle en la publicacion del PCT WO 94/29351 por Bodmer et al.
En otro ejemplo, la region Fc es modificada para incrementar la capacidad del anticuerpo para mediar la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC), y/o para incrementar la afinidad del anticuerpo por un receptor Fcg, modificando uno o mas aminoacidos en las siguientes posiciones: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301,
303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376,
378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 o 439. Este procedimiento se describe ademas en la
publicacion del PCT WO 00/42072 por Presta. Ademas, los sitios de union en la IgG1 humana para FcgRl, FcgRII,
FcgRIII y FcRn han sido mapeados, y se han descrito variantes con union alterada (vease Shields, R. L. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276: 6591-6604). Se mostro que mutaciones especlficas en las posiciones 256, 290, 298, 333, 334 y 339 mejoran la union a FcgRIII. Ademas, se mostro que los siguientes mutantes de combinacion mejoran la union a FcgRIII: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A y S298A/E333A/K334A.
En otra modalidad, la glucosilacion de un anticuerpo es modificada. Por ejemplo, puede obtenerse un anticuerpo aglucosilado (es decir, el anticuerpo carece de glucosilacion). La glucosilacion puede ser alterada para, por ejemplo, incrementar la afinidad del anticuerpo por el antlgeno. Dichas modificaciones de carbohidratos pueden lograrse, por ejemplo, alterando uno o mas sitios de glucosilacion dentro de la secuencia del anticuerpo. Por ejemplo, pueden hacerse una o mas sustituciones de aminoacido que resulten en la eliminacion de uno o mas sitios de glucosilacion de estructura de la region variable, para eliminar de esta manera la glucosilacion en ese sitio. Dicha aglucosilacion puede incrementar la afinidad del anticuerpo por el antlgeno. Dicho procedimiento se describe en mas detalle en las patentes de E.U.A. Nos. 5.714.350 y 6.350.861 por Co et al.
Ademas o en forma alternativa, puede obtenerse un anticuerpo que tenga un tipo de glucosilacion alterado, tal como un anticuerpo hipofucosilado que tenga cantidades reducidas de residuos fucosilo, o un anticuerpo que tenga estructuras de GlcNac bisectoras incrementadas. Se ha demostrado que dichos patrones de glucosilacion alterados incrementan la capacidad de ADCC de los anticuerpos. Dichas modificaciones de carbohidratos pueden lograrse, por ejemplo, expresando el anticuerpo en una celula hospedadora con maquinaria de glucosilacion alterada. Celulas con maquinaria de glucosilacion alterada se han descrito en la tecnica, y pueden usarse como celulas hospedadoras en las cuales se expresan anticuerpos recombinantes de la invencion para producir de esta manera un anticuerpo con glucosilacion alterada. Por ejemplo, el documento EP 1.176.195 por Hanai et al., describe una llnea de celulas con un gen de FUT8 funcionalmente disuelto que codifica para una fucosil transferasa, de modo que los anticuerpos expresados en dicha llnea de celulas exhiban hipofucosilacion. La publicacion del PCT WO 03/035835 por Presta describe una llnea de celulas CHO variante, celulas Lec 13, con capacidad reducida para unir fucosa a carbohidratos enlazados por Asn(297), resultando tambien en hipofucosilacion de anticuerpos expresados en esa celula hospedadora (vease tambien Shields, R. L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277: 26733-26740). La publicacion del PCT WO 99/54342 por Umana et al., describe llneas de celulas disenadas que expresan glucosiltransferasas modificables por glucoprotelna (por ejemplo, beta(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII)), de modo que los anticuerpos expresados en las llneas de celulas disenadas exhiban estructuras de GlcNac bisectoras incrementadas que resulten en actividad de ADCC incrementada de los anticuerpos (vease tambien Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17: 176-180).
Otra modificacion de los anticuerpos de la presente que es contemplada por la invencion, es la pegilacion. Un anticuerpo puede ser pegilado para, por ejemplo, incrementar la vida media biologica (por ejemplo, suero) del anticuerpo. Para pegilar un anticuerpo, el anticuerpo, o fragmento del mismo, se hace reaccionar normalmente con polietilenglicol (PEG), tal como un ester reactivo o derivado de aldehldo de PEG, bajo condiciones en las cuales uno o mas grupos de PEG lleguen a ser unidos al anticuerpo o fragmento de anticuerpo. De preferencia, la pegilacion se lleva a cabo por medio de una reaccion de acilacion o una reaccion de alquilacion con una molecula de PEG reactiva (o un pollmero soluble en agua reactivo analogo). Como se usa en la presente, se pretende que el termino “polietilenglicol” abarque cualquiera de las formas de PEG que se hayan usado para derivatizar otras protelnas, tales como mono alcoxi de C1-C10 o ariloxi-polietilenglicol o polietilenglicol-maleimida. En ciertas modalidades, el anticuerpo que sera pegilado es un anticuerpo aglucosilado. Metodos para la pegilacion de protelnas se conocen en la tecnica, y pueden aplicarse a los anticuerpos de la invencion. Vease, por ejemplo, los documentos EP 0 154 316 por Nishimura et al. y Ep 0 401 384 por Ishikawa et al.
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Metodos para el diseno de anticuerpos
De esta manera, en otro aspecto de la invencion, las caracterlsticas estructurales de anticuerpos anti-IFNAR-1 de la invencion, por ejemplo, 3F11 y 9D4, se usan para crear anticuerpos anti-IFNAR-1 estructuralmente relacionados que retengan por lo menos una propiedad funcional de los anticuerpos de la invencion, tal como union al IFNAR-1. Por ejemplo, una o mas regiones CDR de 3F11 o 9D4, o mutaciones de las mismas, pueden combinarse en forma recombinante con regiones marco conservadas conocidas y/u otras CDR, para crear otros anticuerpos anti-IFNAR-1 disenados en forma recombinante de la invencion, como se discutio anteriormente. Otros tipos de modificaciones, incluyen aquellas descritas en la seccion anterior. El material de partida para el metodo de diseno, es una o mas de las secuencias de Vh y/o Vl provistas en la presente, o una o mas regiones CDR de las mismas. Para crear el anticuerpo disenado, no es necesario preparar realmente (es decir, expresar como una protelna) un anticuerpo que tenga una o mas de las secuencias de Vh y/o Vl provistas en la presente, o una o mas regiones CDR de las mismas. Mas bien, la informacion contenida en las secuencias se usa como el material de partida para crear secuencias de “segunda generation” derivadas de las secuencias originales, y entonces las secuencias de “segunda generation” se preparan y expresan como una protelna.
Por consiguiente, un metodo para la preparation un anticuerpo anti-IFNAR-1 disenado comprende:
(a) proveer: (i) una secuencia de anticuerpo de la region variable de la cadena pesada de la invencion y (ii) una secuencia de anticuerpo de la region variable de la cadena ligera de la invencion;
(b) alterar por lo menos un residuo de aminoacido dentro de la primera secuencia de anticuerpo y/o la segunda secuencia de anticuerpo, para crear por lo menos una secuencia de anticuerpo alterada; y
(c) preparar la secuencia de anticuerpo alterada; y
(d) expresar la secuencia de anticuerpo alterada como una protelna.
Pueden usarse tecnicas estandar de biologla molecular, para preparar y expresar la secuencia de anticuerpo alterada.
De preferencia, el anticuerpo codificado por la secuencia de anticuerpo alterada, es uno que retenga una de, algunas de, o todas, las propiedades funcionales de los anticuerpos anti-IFNAR-1 descritos en la presente, cuyas propiedades funcionales incluyen, pero no estan limitadas a:
(i) union al IFNAR-1;
(ii) inhibition de la union de interferones tipo I al IFNAR-1;
(iii) union a celulas vivas que expresan el IFNAR-1 humano;
(iv) union al IFNAR-1 humano con una Kd de 10-8 M o menos (por ejemplo, 10-9 M o 10'10 M o menos);
(v) union a un epltopo unico en el IFNAR-1 (para eliminar la posibilidad de que los anticuerpos monoclonales con actividades complementarias, cuando se usen en combination, compitan por la union al mismo epltopo).
Las propiedades funcionales de los anticuerpos alterados, pueden evaluarse usando pruebas estandar disponibles en la tecnica y/o descritas en la presente. Por ejemplo, la capacidad del anticuerpo para unirse al IFNAR-1 puede determinarse usando pruebas de union estandar, tales como las que se exponen en los ejemplos (por ejemplo, ELISA).
En los metodos para el diseno de anticuerpos de la invencion, pueden introducirse mutaciones aleatoriamente o selectivamente a lo largo de una secuencia codificante de anticuerpos anti-IFNAR-1 completa, o parte de la misma (por ejemplo, secuencia codificante de 3F11o 9D4), y los anticuerpos anti-IFNAR-1 modificados resultantes pueden seleccionarse para actividad de union y/u otras propiedades funcionales como se describen en la presente. Se han descrito en la tecnica metodos mutacionales. Por ejemplo, la publication del PCT WO 02/092780 por Short, describe metodos para la creation y selection de mutaciones de anticuerpos usando mutagenesis por saturation, ensamble sintetico por ligation, o una combinacion de los mismos. En forma alternativa, la publicacion del PCT WO 03/074679 por Lazar et al., describe metodos de uso de metodos de seleccion computacionales, para optimizar las propiedades fisicoqulmicas de los anticuerpos.
Moleculas de acido nucleico que codifican para los anticuerpos de la invencion
Otro aspecto de la invencion, pertenece a moleculas de acido nucleico que codifican para los anticuerpos de la invencion. Los acidos nucleicos pueden estar presentes en celulas enteras, en un lisado de celulas, o en una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura. Un acido nucleico es “aislado” o “se hace que sea sustancialmente puro”, cuando se purifica de otros componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo, otros acidos nucleicos o protelnas celulares, por medio de tecnicas estandar, que incluyen tratamiento alcalino/con SDS, patron de bandas de CsCl, cromatografla en columna, electroforesis en gel de agarosa, y otros bien conocidos en la tecnica. Vease, F. Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York. Un acido nucleico de la invencion puede ser, por ejemplo, ADN o ARN, o puede contener o no secuencias intronicas. En una modalidad preferida, el acido nucleico es una molecula de ADNc.
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Los acidos nucleicos de la invencion pueden obtenerse usando tecnicas estandar de biologla molecular. Para anticuerpos expresados por hibridomas (por ejemplo, hibridomas preparados de ratones transgenicos que poseen genes de inmunoglobulina humana como se describe mas adelante), moleculas de ADNc que codifican para las cadenas ligera y pesada del anticuerpo producido por el hibridoma, pueden obtenerse por medio de tecnicas estandar de amplification por PCR o donation de ADNc. Para anticuerpos obtenidos de una coleccion de genes de inmunoglobulina (por ejemplo, usando tecnicas de exhibition de fagos), puede recuperarse de la coleccion acido nucleico que codifique para el anticuerpo.
Moleculas de acido nucleico preferidas de la invencion, son aquellas que codifican para las secuencias de VH y VL de los anticuerpos monoclonales 3F11 y 9D4. Secuencias de ADN que codifican para las secuencias de VH y VL de 3F11, se muestran en las SEQ ID NO: 33 y 37, respectivamente. Secuencias de ADN que codifican para las secuencias de VH y VL de 4G5, se muestran en las SEQ ID NO: 34 y 38, respectivamente. Secuencias de ADN que codifican para las secuencias de VH y VL de 11E2, se muestran en las SEQ ID NO: 35 y 39, respectivamente. Secuencias de ADN que codifican para las secuencias de VH y VL de 9D4, se muestran en las SEQ ID NO: 36 y 40, respectivamente.
Una vez que se obtienen fragmentos de ADN que codifican para segmentos de VH y VL, estos fragmentos de ADN pueden manipularse ademas por medio de tecnicas estandar de ADN recombinante, por ejemplo, para convertir los genes de la region variable a genes de la cadena de anticuerpo de longitud completa, a genes del fragmento Fab o a un gen de scFv. En estas manipulaciones, un fragmento de ADN que codifica para VL o VH es enlazado operativamente a otro fragmento de ADN que codifica para otra protelna, tal como una region constante de anticuerpo o un enlazador flexible. Se pretende que el termino “enlazado operativamente”, como se usa en este contexto, signifique que dos fragmentos de ADN se unan de modo que las secuencias de aminoacidos codificadas por los dos fragmentos de ADN permanezcan en la estructura.
El ADN aislado que codifica para la region VH puede ser convertido a un gen de cadena pesada de longitud completa, enlazando operativamente el ADN que codifica para VH a otra molecula de ADN que codifique para regiones constantes de cadena pesada (CH1, CH2 y CH3). Las secuencias de genes de la region constante de cadena pesada humana se conocen en la tecnica (vease, por ejemplo, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edition, U. S. Department of Health and Human Services, publication de NIH No. 91-3242), y fragmentos de ADN que abarquen estas regiones pueden obtenerse por medio de amplificacion por PCR estandar. La region constante de cadena pesada puede ser una region constante de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM o IgD, pero mas preferiblemente es una region constante de IgG1 o IgG4. Para un gen de cadena pesada del fragmento Fab, el ADN que codifica para VH puede ser enlazado operativamente a otra molecula de ADN que codifique para solo la region constante CH1 de cadena pesada.
El ADN aislado que codifica para la region VL puede ser convertido a un gen de cadena ligera de longitud completa (as! como un gen de cadena ligera de Fab), enlazando operativamente el ADN que codifica para VL a otra molecula de ADN que codifique para la region constante de cadena ligera, CL. Las secuencias de genes de la region constante de cadena ligera humana se conocen en la tecnica (vease, por ejemplo, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edicion, U. S. Department of Health and Human Services, publicacion de NIH No. 91-3242) y fragmentos de ADN que abarcan estas regiones, pueden obtenerse por medio de amplificacion por PCR estandar. La region constante de cadena ligera puede ser una region constante kappa o lambda, pero mas preferiblemente es una region constante kappa.
Para crear un gen de scFV, los fragmentos de ADN que codifican para VH y VL son enlazados operativamente a otro fragmento que codifique para un enlazador flexible, por ejemplo, que codifique para la secuencia de aminoacidos (Gly4-Ser)3, de modo que las secuencias de VH y VL puedan expresarse como una protelna de cadena sencilla contigua, con las regiones VL y VH unidas por el enlazador flexible (vease, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348: 552-554).
Production de anticuerpos monoclonales de la invencion
Pueden producirse anticuerpos monoclonales (mAbs) de la presente invencion, mediante varias tecnicas, que incluyen metodologla convencional de anticuerpos monoclonales, por ejemplo, la tecnica estandar de hibridacion de celulas somaticas de Kohler y Milstein (1975) Nature 256: 495. Aunque se prefieren procedimientos de hibridacion de celulas somaticas, en principio, pueden usarse otras tecnicas para la produccion de anticuerpos monoclonales, por ejemplo, transformation viral u oncogenica de linfocitos B.
El sistema animal preferido para la preparation de hibridomas, es el sistema de murino. La produccion de hibridomas en el raton es un procedimiento muy bien establecido. Protocolos y tecnicas de inmunizacion para el aislamiento de esplenocitos inmunizados para fusion, se conocen en la tecnica. Se conocen tambien miembros de fusion (por ejemplo, celulas de mieloma de murino) y procedimientos de fusion.
Pueden prepararse anticuerpos quimericos o humanizados de la presente invencion, con base en la secuencia de un
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anticuerpo monoclonal murino preparado como se describio anteriormente. Puede obtenerse ADN que codifique para las inmunoglobulinas de cadena ligera y pesada del hibridoma de murino de interes, y pueden disenarse para que contengan secuencias de inmunoglobulina no de murino (por ejemplo, humano), usando tecnicas estandar de biologla molecular. Por ejemplo, para crear un anticuerpo quimerico, las regiones variables de murino pueden ser enlazadas a regiones constantes de humano usando metodos conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 4.816.567 a Cabilly et al.). Para crear un anticuerpo humanizado, pueden insertarse regiones CDR de murino en una estructura de humano usando metodos conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 5.225.539 a Winter, y las patentes de E.U.A. Nos. 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 y 6.180.370 a Queen et al.).
En una modalidad preferida, los anticuerpos de la invencion son anticuerpos monoclonales humanos. Dichos anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra el IFNAR-1 pueden generarse usando ratones transgenicos o transcromosomicos que posean parte del sistema inmune humano, mas que el sistema de raton. Estos ratones transgenicos y transcromosomicos incluyen ratones referidos en la presente como ratones HuMAb y ratones KM, respectivamente, y son referidos en conjunto en la presente como “ratones de Ig humana”.
El raton HuMAb® (Medarex, Inc.) contiene miniloci de genes de inmunoglobulina humana que codifican para secuencias de inmunoglobulina de cadena pesada (m y g) y ligera (k) humana no reagrupadas, junto con mutaciones dirigidas que inactivan a los loci de la cadena m y k endogenos (vease, por ejemplo, Lonberg, et al. (1994) Nature 368 (6474): 856-859). Por consiguiente, los ratones exhiben expresion reducida de IgM o k de raton, y en respuesta a la inmunizacion, los transgenes de la cadena ligera y pesada humana introducidos, sufren cambio de clase y mutacion somatica para generar anticuerpos monoclonales de IgGk humanos de alta afinidad (Lonberg, N. et al. (1994), citado anteriormente; revisado en Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49-101; Lonberg, N. y Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, y Harding, F. y Lonberg, N. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci. 764: 536-546). La preparacion y el uso de ratones HuMab, y las modificaciones genomicas llevadas por dichos ratones, se describe ademas en Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20: 6287-6295; Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4: 117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152: 2912-2920; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591; y Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851.
Veanse ademas las patentes de E.U.A. Nos. 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.789.650; 5.877.397; 5.661.016; 5.814.318; 5.874.299; y 5.770.429; todas a Lonberg y Kay; patente de E.U.A. No. 5.545.807 a Surani et al.; publicacion del PCT Nos. WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 y WO 99/45962, todas a Lonberg y Kay; y publicacion del PCT No. WO 01/14424 a Korman et al.
En otra modalidad, pueden producirse anticuerpos humanos de la invencion usando un raton que posea secuencias de inmunoglobulina humana en transgenes y transcromosomas, tal como un raton que posea un transgen de cadena pesada humana y un transcromosoma de cadena ligera humana. Dichos ratones, referidos en la presente como “ratones KM”, se describen en detalle en la publicacion del PCT WO 02/43478 a Ishida et al.
Aun mas, sistemas animales transgenicos alternativos que expresan genes de inmunoglobulina humana, estan disponibles en la tecnica y pueden usarse para producir anticuerpos anti-IFNAR-1 de la invencion. Por ejemplo, puede usarse un sistema transgenico alternativo referido como el Xenomouse (Abgenix, Inc.); dichos ratones se describen, por ejemplo, en las patentes de E.U.A. Nos. 5.939.598; 6.075.181; 6.114.598; 6.150.584 y 6.162.963 a Kucherlapati et al.
Ademas, sistemas animales transcromosomicos alternativos que expresan genes de inmunoglobulina humana, estan disponibles en la tecnica y pueden usarse para producir anticuerpos anti-IFNAR-1 de la invencion. Por ejemplo, pueden usarse ratones que posean un transcromosoma de cadena pesada humana y un transcromosoma de cadena ligera humana, referidos como “ratones TC”; dichos ratones se describen en Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 722-727. Ademas, vacas que poseen transcromosomas de cadena ligera y pesada humana, se han descrito en la tecnica (Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20: 889-894), y pueden usarse para producir anticuerpos anti-IFNAR-1 de la invencion.
Pueden prepararse tambien anticuerpos monoclonales humanos de la invencion, usando metodos de exhibicion de fagos para la seleccion de colecciones de genes de inmunoglobulina humana. Dichos metodos de exhibicion de fagos para el aislamiento de anticuerpos humanos, estan establecidos en la tecnica. Vease, por ejemplo: patentes de E.U.A. Nos. 5.223.409; 5.403.484; y 5.571.698 a Ladner et al.; patentes de E.U.A. Nos. 5.427.908 y 5.580.717 a Dower et al.; patentes de E.U.A. Nos. 5.969.108 y 6.172.197 a McCafferty et al.; y patentes de E.U.A. Nos. 5.885.793; 6.521.404; 6.544.731; 6.555.313; 6.582.915 y 6.593.081 a Griffiths et al.
Pueden prepararse tambien anticuerpos monoclonales humanos de la invencion, usando ratones SCID en los cuales se hayan reconstituido celulas inmunes humanas, de modo que pueda generarse una respuesta de anticuerpos humanos tras la inmunizacion. Dichos ratones se describen, por ejemplo, en las patentes de E.U.A. Nos. 5.476.996 y
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Inmunizacion de ratones de Ig humana
Cuando se usan ratones de Ig humana para producir anticuerpos humanos de la invencion, dichos ratones pueden inmunizarse con una preparacion purificada o enriquecida de antlgeno del IFNAR-1, y/o celulas que expresen el IFNAR-1, como es descrito por Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368 (6474): 856-859; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851; y publicacion del PCT Wo 98/24884 y WO 01/14424. De preferencia, los ratones tendran de 6 a 16 semanas de edad tras la primera infusion. Por ejemplo, puede usarse una preparacion purificada o enriquecida (5-50 mg) de antlgeno del IFNAR-1, para inmunizar a los ratones de Ig humana intraperitonealmente. En caso de que las inmunizaciones que usan una preparacion purificada o enriquecida de antlgeno del IFNAR-1 no resulten en anticuerpos, pueden inmunizarse tambien a los ratones con celulas que expresen el IFNAR-1, por ejemplo, una llnea de celulas T humanas, para promover respuestas inmunes.
Procedimientos detallados para generar anticuerpos monoclonales completamente humanos para el IFNAR-1, se describen en el ejemplo 1 mas adelante. La experiencia acumulativa con varios antlgenos, ha mostrado que los ratones transgenicos responden cuando inicialmente son inmunizados intraperitonealmente (IP) con antlgeno en adyuvante completo de Freund, seguido de inmunizaciones IP cada dos semanas (hasta un total de 6) con antlgeno en adyuvante incompleto de Freund. Sin embargo, se encuentra tambien que adyuvantes diferentes del de Freund, son efectivos. Ademas, se encuentra que celulas enteras en ausencia de adyuvante son altamente inmunogenas. La respuesta inmune puede monitorearse durante el curso del protocolo de inmunizacion con muestras de plasma que se obtienen por sangrlas retroorbitales. El plasma puede seleccionarse por medio de ELISA (como se describe mas adelante), y ratones con tltulos suficientes de inmunoglobulina humana anti-IFNAR-1 pueden usarse para las fusiones. Los ratones pueden recibir por via intravenosa un refuerzo de antlgeno 3 dlas antes de su sacrificio y la remocion del bazo. Se espera que pueda necesitarse realizar 2 a 3 fusiones para cada inmunizacion. Entre 6 y 24 ratones son inmunizados normalmente por cada antlgeno. Usualmente, se usan cepas de HCo7 y HCo7 12. Ademas, pueden multiplicarse en conjunto transgenes de HCo7 y HCo12 en un solo raton que tenga dos diferentes transgenes de cadena pesada humana (HCo7/HCo12).
Generation de hibridomas que producen anticuerpos monoclonales humanos de la invencion
Para generar hibridomas que producen anticuerpos monoclonales humanos de la invencion, esplenocitos y/o celulas de nodulos linfaticos de ratones inmunizados, pueden aislarse y fusionarse con una llnea adecuada de celulas inmortalizadas, como es el caso de una llnea de celulas de mieloma de raton. Los hibridomas resultantes pueden seleccionarse para la production de anticuerpos especlficos del antlgeno. Por ejemplo, pueden fusionarse suspensiones de celulas individuales de linfocitos esplenicos de ratones inmunizados, con un sexto del numero de celulas de mieloma de raton que no secretan P3X63-Ag8.653 (ATCC, CRL 1580) con 50 % de PEG. Las celulas se siembran a aproximadamente 2 x 105 en placas de microtltulo de fondo plano, seguido de un perlodo de incubation de dos semanas en medio selectivo que contenga suero de clon fetal a 20 %, medio acondicionado “653” a 18 %, origen a 5 % (IGEN), L-glutamina a 4 mM, piruvato de sodio a 1 mM, HEPES a 5 mM, 2-mercaptoetanol a 0,055 mM, 50 unidades/ml de penicilina, 50 mg/ml de estreptomicina, 50 mg/ml de gentamicina y 1X HAT (Sigma; la HAT se anade 24 horas despues de la fusion). Despues de aproximadamente dos semanas, las celulas pueden cultivarse en medio en el cual la HAT sea reemplazada con HT. Cavidades individuales pueden seleccionarse entonces por medio de ELISA, para anticuerpos IgG e IgM monoclonales humanos. Una vez que ocurre crecimiento extensivo del hibridoma, puede observarse el medio usualmente despues de 10 a 14 dlas. Los hibridomas que secreten anticuerpos pueden resembrarse, seleccionarse de nuevo, y si aun son positivos para IgG humana, los anticuerpos monoclonales pueden subclonarse por lo menos dos veces por dilution limitativa. Los subclones estables pueden cultivarse entonces in vitro para generar pequenas cantidades de anticuerpo en medio de cultivo de tejidos para caracterizacion.
Para purificar anticuerpos monoclonales humanos, pueden desarrollarse hibridomas seleccionados en matraces rotatorios de dos litros para purification de anticuerpos monoclonales. Los sobrenadantes pueden filtrarse y concentrarse antes de la cromatografla de afinidad con protelna A-sepharose (Pharmacia, Piscataway, N. J.). La IgG eluida puede verificarse por medio de electroforesis en gel y cromatografla de llquidos de alto rendimiento para asegurar pureza. La solution de regulador de pH puede intercambiarse en PBS, y puede determinarse la concentration por DO 280, usando un coeficiente de extincion de 1,43. Los anticuerpos monoclonales pueden distribuirse en allcuotas, y almacenarse a -80 °C.
Generacion de transfectomas que producen anticuerpos monoclonales de la invencion
Pueden producirse tambien anticuerpos de la invencion en un transfectoma de celulas hospedadoras usando, por ejemplo, una combination de tecnicas de ADN recombinante y metodos de transfection de genes, como es bien sabido en la tecnica (vease, por ejemplo, Morrison, S. (1985) Science 229: 1202).
Por ejemplo, para expresar los anticuerpos, o fragmentos de anticuerpo de los mismos, pueden obtenerse moleculas de aDn que codifiquen para cadenas ligera y pesada de longitud parcial o completa, por medio de tecnicas estandar
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de biologla molecular (por ejemplo, amplificacion por PCR o clonacion de ADNc usando un hibridoma que exprese el anticuerpo de interes), y las moleculas de ADN pueden insertarse en vectores de expresion, de modo que los genes sean enlazados operativamente a secuencias de control de la transcripcion y traduccion. En este contexto, se pretende que el termino “enlazado operativamente” signifique que el gen del anticuerpo sea ligado en un vector, de modo que secuencias de control de la transcripcion y traduccion dentro del vector cumplan su funcion deseada de regulacion de la transcripcion y traduccion del gen del anticuerpo. El vector de expresion y las secuencias de control de la expresion se eligen para que sean compatibles con la celula hospedadora de expresion usada. El gen de la cadena ligera del anticuerpo y el gen de la cadena pesada del anticuerpo pueden insertarse en un vector separado o, mas normalmente, ambos genes se insertan en el mismo vector de expresion. Los genes del anticuerpo se insertan en el vector de expresion por metodos estandar (por ejemplo, ligacion de sitios de restriction complementarios en el fragmento del gen del anticuerpo y vector, o ligacion de extremos rasurados si no estan presentes sitios de restriccion). Las regiones variables de cadena ligera y pesada de los anticuerpos descritos en la presente, pueden usarse para crear genes de anticuerpo de longitud completa de cualquier isotipo de anticuerpo, insertandolos en vectores de expresion que codifiquen ya para regiones constantes de cadena ligera y regiones constantes de cadena pesada del isotipo deseado, de modo que el segmento Vh sea enlazado operativamente a los segmentos CH dentro del vector, y el segmento Vl sea enlazado operativamente al segmento CL dentro del vector. Ademas o en forma alternativa, el vector de expresion recombinante puede codificar para un peptido de senal que facilite la secretion de la cadena de anticuerpos de una celula hospedadora. El gen de la cadena del anticuerpo puede clonarse en el vector, de modo que el peptido de senal sea enlazado en el marco de lectura al extremo amino del gen de la cadena del anticuerpo. El peptido de senal puede ser un peptido de senal de inmunoglobulina, o un peptido de senal heterologo (es decir, un peptido de senal de una protelna diferente de inmunoglobulina).
Ademas de los genes de la cadena del anticuerpo, los vectores de expresion recombinantes de la invention poseen secuencias reguladoras que controlan la expresion de los genes de la cadena del anticuerpo en una celula hospedadora. Se pretende que el termino “secuencia reguladora” incluya promotores, intensificadores u otros elementos de control de la expresion (por ejemplo, senales de poliadenilacion) que controlen la transcripcion o traduccion de los genes de la cadena del anticuerpo. Dichas secuencias reguladores se describen, por ejemplo, en Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)). Los expertos en la tecnica apreciaran que el diseno del vector de expresion, incluyendo la selection de secuencias reguladoras, puede depender de factores tales como la election de la celula hospedadora que se transformara, el nivel de expresion de la protelna que se desee, etc. Secuencias reguladoras preferidas para expresion en celulas hospedadoras de mamlfero, incluyen elementos virales que dirigen altos niveles de expresion de protelnas en celulas de mamlfero, tales como promotores y/o intensificadores derivados de citomegalovirus (CMV), virus simiano 40 (SV40), adenovirus (por ejemplo, el promotor tardlo principal de adenovirus (AdMLP) y polioma. En forma alternativa, pueden usarse secuencias no reguladoras no virales, tales como el promotor de ubiquitina o el promotor de b-globina. Aun mas, pueden usarse elementos reguladores formados de secuencias de diferentes orlgenes, tales como el sistema de promotor SRa, que contiene secuencias del promotor temprano de SV40, y la repetition terminal larga del virus de la leucemia de celulas T humanas tipo 1 (Takebe, Y. et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8: 466-472).
Ademas de los genes de la cadena del anticuerpo y secuencias reguladoras, los vectores de expresion recombinantes de la invencion pueden poseer secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la replication del vector en celulas hospedadoras (por ejemplo, orlgenes de replication) y genes marcadores seleccionables. El gen marcador seleccionable facilita la seleccion de celulas hospedadoras en las cuales el vector se ha introducido (vease, por ejemplo, patentes de E.U.A. Nos. 4.399.216, 4.634.665 y 5.179.017, todas por Axel et al.). Por ejemplo, normalmente, el gen marcador seleccionable confiere resistencia a farmacos tales como G418, higromicina o metotrexato, en una celula hospedadora en la cual el vector se ha introducido. Genes marcadores seleccionables preferidos, incluyen el gen de dihidrofolato reductasa (DHFR) (para su uso en celulas hospedadoras dhfr- con amplificacion/seleccion por metotrexato), y el gen neo (para seleccion por G418).
Para la expresion de las cadenas ligera y pesada, los vectores de expresion que codifican para las cadenas ligera y pesada, son transfectados en una celula hospedadora por medio de tecnicas estandar. Se pretende que las varias formas del termino “transfection” abarquen una amplia variedad de tecnicas usadas comunmente para la introduction de ADN exogeno en una celula hospedadora procariota o eucariotica, por ejemplo, por electroporation, precipitation con fosfato de calcio, transfeccion por DEAE-dextrano, y similares. Aunque teoricamente es posible expresar los anticuerpos de la invencion en celulas hospedadoras procariotas o eucarioticas, la expresion de anticuerpos en celulas eucarioticas, y mas preferiblemente celulas hospedadoras de mamlfero, es la mas preferida debido a que es mas probable que a diferencia de las celulas procariotas, dichas celulas eucarioticas, y en particular celulas de mamlfero, ensamblen y secreten un anticuerpo adecuadamente plegado e inmunologicamente activo. Se ha reportado que la expresion de genes de anticuerpo en procariontes es ineficaz para la production de altos rendimientos de anticuerpo activo (Boss, M. A. y Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6: 12-13).
Celulas hospedadoras de mamlfero preferidas para la expresion de anticuerpos recombinantes de la invencion, incluyen celulas de ovario de hamster chino (celulas CHO) (incluyendo celulas CHO dhfr-, descritas en Urlaub y Chasin (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220, usadas con un marcador seleccionable de DHFR, por ejemplo, como se describe en R. J. Kaufman y P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159: 601-621), celulas de mieloma NSO, celulas COS y celulas SP2. En particular, para su uso con celulas de mieloma NSO, otro sistema de expresion
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preferido es el sistema de expresion de genes GS, descrito en los documentos WO 87/04462, WO 89/01036 y EP 338.841. Cuando vectores de expresion recombinantes que codifican para genes de anticuerpo se introducen en celulas hospedadoras de mamlfero, los anticuerpos se producen cultivando las celulas hospedadoras por un perlodo suficiente que permita la expresion del anticuerpo en las celulas hospedadoras o, mas preferiblemente, la secrecion del anticuerpo en el medio de cultivo en el cual las celulas hospedadoras estan creciendo. Pueden recuperarse anticuerpos del medio de cultivo usando metodos estandar de purification de protelnas.
Caracterizacion de la union del anticuerpo al antigeno
Los anticuerpos de la invention pueden ponerse a prueba para union al IFNAR-1, por ejemplo, por medio de ELISA estandar. En resumen, placas de microtltulo se revisten con IFNAR-1 purificado a 0,25 mg/ml en PBS, y se bloquean entonces con albumina de suero de bovino a 5 % en PBS. Se anaden diluciones de anticuerpo (por ejemplo, diluciones de plasma de ratones inmunizados con IFNAR-1) a cada cavidad, y se incuban por 1 a 2 horas a 37 °C. Las placas se lavan con PBS/Tween, y se incuban entonces con reactivo secundario (por ejemplo, para anticuerpos humanos, un reactivo policlonal especlfico de Fc de IgG anti-humana de cabra) conjugado con fosfatasa alcalina por 1 hora a 37 °C. Despues del lavado, las placas se desarrollan con substrato pNPP (1 mg/ml), y se analizan a DO de 405 a 650. De preferencia, los ratones que desarrollen los tltulos mas altos, se usaran para las fusiones.
Una prueba de ELISA como se describio anteriormente, puede usarse tambien para seleccionar para hibridomas que muestren reactividad positiva con inmunogeno del IFNAR-1. Los hibridomas que se unan con alta avidez al IFNAR-1, son subclonados y caracterizados adicionalmente. Un clon de cada hibridoma, que retenga la reactividad de las celulas precursoras (por ELISA), puede seleccionarse para producir un banco de celulas de 5 a 10 viales almacenados a -140 °C, y para la purificacion de anticuerpos.
Para purificar anticuerpos anti-IFNAR-1, pueden desarrollarse hibridomas seleccionados en matraces rotatorios de dos litros para la purificacion de anticuerpos monoclonales. Los sobrenadantes pueden filtrarse y concentrarse antes de la cromatografla de afinidad con protelna A-sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ). La IgG eluida puede verificarse por electroforesis en gel y cromatografla de llquidos de alto rendimiento, para asegurar pureza. La solution de regulador de pH puede intercambiarse en PBS, y la concentration puede determinarse por DO280 usando un coeficiente de extincion de 1,43. Los anticuerpos monoclonales pueden distribuirse en allcuotas y almacenarse a -80 °C.
Para determinar si los anticuerpos monoclonales anti-IFNAR-1 seleccionados se unen a epltopos unicos, cada anticuerpo puede ser biotinilado usando reactivos disponibles comercialmente (Pierce, Rockford, IL). Pueden realizarse estudios de competencia usando anticuerpos monoclonales no marcados y anticuerpos monoclonales biotinilados usando placas de ELISA revestidas con el IFNAR-1 como se describio anteriormente. La union a mAb biotinilado, puede detectarse con una sonda de fosfatasa alcalina-estreptavidina.
Para determinar el isotipo de los anticuerpos purificados, pueden realizarse pruebas de ELISA de isotipos usando reactivos especlficos para anticuerpos de un isotipo particular. Por ejemplo, para determinar el isotipo de un anticuerpo monoclonal humano, pueden revestirse las cavidades de placas de microtltulo con 1 mg/ml de inmunoglobulina anti-humana durante la noche a 4 °C. Despues de bloqueo con BSA a 1 %, las placas se hacen reaccionar con 1 mg/ml o menos de anticuerpos monoclonales de prueba o controles de isotipo purificados, a temperatura ambiente por una a dos horas. Las cavidades pueden hacerse reaccionar entonces con sondas conjugadas con fosfatasa alcalina especlfica de IgM humana o IgG1 humana. Las placas se desarrollan y se analizan como se describio anteriormente.
Para demostrar la union de anticuerpos monoclonales a celulas vivas que expresan el IFNAR-1, puede usarse citometrla de flujo. En resumen, llneas de celulas que expresan el IFNAR-1 (desarrolladas bajo condiciones de crecimiento estandar) se mezclan con varias concentraciones de anticuerpos monoclonales en PBS conteniendo BSA a 0,1 % y suero de ternera fetal a 10 %, y se incuban a 37 °C por 1 hora. Despues del lavado, las celulas se hacen reaccionar con anticuerpo de IgG anti-humana marcado con fluorescelna bajo las mismas condiciones que la tincion primaria del anticuerpo. Las muestras pueden analizarse por medio del instrumento FACScan usando las propiedades de dispersion lateral y de luz que regulan celulas individuales. Puede usarse una prueba alternativa que use microscopla de fluorescencia (ademas de o en lugar de) la prueba de citometrla de flujo. Las celulas pueden tenirse exactamente como se describio anteriormente, y pueden examinarse por microscopla de fluorescencia. Este metodo permite la visualization de las celulas individuales, pero puede tener sensibilidad disminuida, dependiendo de la densidad del antigeno.
Pueden ponerse a prueba ademas moleculas de IgG humana anti-IFNAR-1 para reactividad con el antigeno del IFNAR-1, por medio de Western blotting. En resumen, extractos de celulas de celulas que expresan el IFNAR-1, pueden prepararse y someterse a electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sodio. Despues de la electroforesis, los antigenos separados se transfieren a membranas de nitrocelulosa, se bloquean con suero de ternera fetal a 10 %, y se sondean con los anticuerpos monoclonales que se van a poner a prueba. Puede detectarse la union a la IgG humana usando fosfatasa alcalina de IgG anti-humana, y puede desarrollarse con tabletas de substrato BCIP/NBT (Sigma Chem. Co., St. Louis, Mo.).
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Inmunoconiuaados
En otro aspecto, la presente invencion describe un anticuerpo anti-IFNAR-1, o un fragmento del mismo, conjugado con una porcion terapeutica, tal como una citotoxina, un farmaco (por ejemplo, un inmunosupresor) o una radiotoxina. Dichos conjugados son referidos en la presente como “inmunoconjugados”. Los inmunoconjugados que incluyan una o mas citotoxinas, son referidos como “inmunotoxinas”. Una citotoxina o agente citotoxico, incluye cualquier agente que sea perjudicial para las celulas (por ejemplo, que las destruya). Ejemplos incluyen taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etoposido, tenoposido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1- dehidrotestosterona, glucocorticoides, procalna, tetracalna, lidocalna, propranolol y puromicina, y analogos u homologos de los mismos. Los agentes terapeuticos incluyen tambien, por ejemplo, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracilo decarbazina), agentes alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tiotepa, clorambucilo, melfalan, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino), antraciclinas (por ejemplo, daunorrubicina (antes daunomicina) y doxorrubicina), antibioticos (por ejemplo, dactinomicina (antes actinomicina), bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC)) y agentes antimitoticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina).
Otros ejemplos preferidos de citotoxinas terapeuticas que pueden conjugarse con un anticuerpo de la invencion, incluyen duocarmicinas, calicamicinas, maytansinas y auristatinas, y derivados de las mismas. Un ejemplo de un conjugado de anticuerpo y calicamicina, esta disponible comercialmente (Mylotarg™; Wyeth-Ayerst).
Pueden conjugarse citotoxinas con anticuerpos de la invencion, usando la tecnologia de enlazadores disponibles en la tecnica. Ejemplos de tipos de enlazadores que se han usado para conjugar una citotoxina con un anticuerpo incluyen, pero no estan limitados a, enlazadores que contengan hidrazonas, tioeteres, esteres, disulfuros y peptidos. Puede elegirse un enlazador que sea, por ejemplo, susceptible a digestion por un pH bajo dentro del compartimiento lisosomico o susceptible a digestion por proteasas, tales como proteasas expresadas preferiblemente en tejido tumoral, tales como catepsinas (por ejemplo, catepsinas B, C, D).
Para mas discusion de los tipos de citotoxinas, enlazadores y metodos para la conjugacion de agentes terapeuticos con anticuerpos, vease tambien Saito, G. et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55: 199-215; Trail, P. A. et al. (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52: 328-337; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3: 207-212; Allen, T. M. (2002) Nat. Rev. Cancer 2: 750-763; Pastan, I. y Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3: 1089-1091; y Senter, P. D. y Springer, C. J. (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53: 247-264.
Los anticuerpos de la presente invencion pueden conjugarse tambien con un isotopo radiactivo para generar radiofarmacos citotoxicos, referidos tambien como radioinmunoconjugados. Ejemplos de isotopos radiactivos que pueden conjugarse con anticuerpos para su uso en diagnostico o terapeutica incluyen, pero no estan limitados a, yodo131, indio, itrio90 y lutecio177. Metodos para la preparacion de radioinmunoconjugados estan establecidos en la tecnica. Ejemplos de radioinmunoconjugados estan disponibles comercialmente, e incluyen Zevalin™ (IDEC Pharmaceuticals) y Bexxar™ (Corixa Pharmaceuticals), y metodos similares pueden usarse para preparar radioinmunoconjugados usando los anticuerpos de la invencion.
Los conjugados de anticuerpos de la invencion pueden usarse para modificar una respuesta biologica determinada, y no se considerara que la porcion de farmaco se limite a los agentes terapeuticos qulmicos clasicos. Por ejemplo, la porcion de farmaco puede ser una protelna o polipeptido que posea una actividad biologica deseada. Dichas protelnas pueden incluir, por ejemplo, una toxina enzimaticamente activa, o fragmento activo de la misma, tal como abrina, ricina A, exotoxina de Pseudomonas o toxina de la difteria; una protelna tal como el factor de necrosis tumoral o el interferon-gamma; o modificadores de respuesta biologica tales como, por ejemplo, linfocinas, interleucina-1 (“IL-1”), interleucina-2 (“IL-2”), interleucina-6 (“IL-6”), factor estimulador de colonias de macrofagos- granulocitos (“GM-CSF”), factor estimulador de colonias de granulocitos (“G-CSF”), u otros factores de crecimiento.
Tecnicas para la conjugacion de dicha porcion terapeutica con anticuerpos, son bien conocidas; vease, por ejemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery (2a. ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), y Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982).
Moleculas biespecificas
En otro aspecto, la presente invencion describe moleculas biespecificas que comprenden un anticuerpo anti-IFNAR- 1, o un fragmento del mismo, de la invencion. Un anticuerpo de la invencion, o porciones de union a antlgeno del
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mismo, pueden ser derivatizados o enlazados a otra molecula funcional, por ejemplo, otro peptido o protelna (por ejemplo, otro anticuerpo o ligando para un receptor), para generar una molecula biespeclfica que se une a por lo menos dos diferentes sitios de union o moleculas diana. De hecho, el anticuerpo de la invencion puede ser derivatizado o enlazado a una o mas de una molecula funcional para generar moleculas multiespeclficas que se unen a mas de dos diferentes sitios de union y/o moleculas diana; se pretende tambien que dichas moleculas multiespeclficas sean abarcadas por el termino “molecula biespeclfica”, como se usa en la presente. Para crear una molecula biespeclfica de la invencion, un anticuerpo de la invencion puede ser enlazado funcionalmente (por ejemplo, por acoplamiento qulmico, fusion genetica, asociacion no covalente o de otra forma) a una u otras mas moleculas de union, tales como otro anticuerpo, fragmento de anticuerpo, peptido o mimetico de union, de modo que resulte una molecula biespeclfica.
Por consiguiente, la presente invencion incluye moleculas biespeclficas que comprenden por lo menos una primera especificidad de union por el IFNAR-1, y una segunda especificidad de union por un segundo epltopo diana. En una modalidad particular de la invencion, el segundo epltopo diana es un receptor Fc, por ejemplo, FcgR1 (CD64) humano o un receptor Fca humano (CD89). Por lo tanto, la invencion incluye moleculas biespeclficas capaces de unirse a celulas efectoras que expresan FcgR, FcaR o FceR (por ejemplo, monocitos, macrofagos o celulas polimorfonucleares (PMNs)), y a celulas diana que expresan el IFNAR-1. Estas moleculas biespeclficas dirigen celulas que expresan el IFNAR-1 hacia celulas efectoras, y desencadenan actividades de celulas efectoras mediadas por receptores de Fc, tales como fagocitosis de celulas que expresan el IFNAR-1, citotoxicidad mediada por celulas dependiente de anticuerpos (ADCC), liberacion de citocinas, o generation de anion superoxido.
En una modalidad de la invencion en la cual la molecula biespeclfica es multiespeclfica, la molecula puede incluir ademas una tercera especificidad de union, ademas de una especificidad de union anti-Fc y una especificidad de union anti-IFNAR-1. En una modalidad, la tercera especificidad de union es una portion del factor anti-intensification (EF), por ejemplo, una molecula que se une a una protelna de superficie implicada en actividad citotoxica, e incrementa de esta manera la respuesta inmune contra la celula diana. La “porcion del factor anti-intensificacion”, puede ser un anticuerpo, fragmento de anticuerpo funcional, o un ligando que se une a una molecula determinada, por ejemplo, un antlgeno o un receptor, y resulta de esta manera en una mejora del efecto de los determinantes de union para el receptor Fc o antlgeno de la celula diana. La “porcion del factor anti-intensificacion” puede unirse a un receptor Fc o el antlgeno de una celula diana. En forma alternativa, la porcion del factor anti-intensificacion puede unirse a una entidad que sea diferente de la entidad a la cual la primera y la segunda especificidades de union se unen. Por ejemplo, la porcion del factor anti-intensificacion puede unirse a una celula T citotoxica (por ejemplo, por medio de CD2, CD3, CDB, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 u otra celula inmune que resulte en una respuesta inmune incrementada contra la celula diana).
En una modalidad, las moleculas biespeclficas de la invencion comprenden como una especificidad de union por lo menos un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo de la misma e incluye, por ejemplo, un fragmento Fab, Fab', F(ab')2, Fv, o un Fv de cadena sencilla. El anticuerpo puede ser tambien un dlmero de cadena ligera o de cadena pesada, o cualquier fragmento mlnimo del mismo, tal como un Fv o una construction de cadena sencilla, como se describe en Ladner et al., patente de E.U.A. No. 4.946.778.
En una modalidad, la especificidad de union por un receptor Fcg es provista por un anticuerpo monoclonal, cuya union no sea bloqueada por la inmunoglobulina G (IgG) humana. Como se usa en la presente, el termino “receptor de IgG” se refiere a cualquiera de los ocho genes de la cadena g localizados en el cromosoma 1. Estos genes codifican para un total de 12 isoformas del receptor soluble o de transmembrana que se agrupan en tres clases del receptor Fcg FcgRI (CD64), FcgRII (CD32) y FcgRIII (CD16). En una modalidad preferida, el receptor Fcg es un FcgRI humano de alta afinidad. El FcgRI humano es una molecula de 72 kDa, que muestra alta afinidad por la IgG monomerica (108 - 109 M-1).
La production y caracterizacion de ciertos anticuerpos monoclonales anti-Fcg preferidos, son descritas por Fanger et al. en la publication del PCT WO 88/00052, y en la patente de E.U.A. No. 4.954.617. Estos anticuerpos se unen a un epltopo de FcgRI, FcgRI I o FcgRI 11 en un sitio que sea distinto del sitio de union a Fcg del receptor y, de esta manera, su union no es bloqueada sustancialmente por los niveles fisiologicos de IgG. Anticuerpos anti-FcgRI especlficos utiles en esta invencion, son mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 y mAb 197. El hibridoma que produce mAb 32 esta disponible de The American Type Culture Collection, numero de acceso de ATCC HB9469. En otras modalidades, el anticuerpo del receptor anti-Fcg es una forma humanizada del anticuerpo monoclonal 22 (H22). La produccion y caracterizacion del anticuerpo H22 se describe en Graziano, R. F. et al. (1995) J. Immunol 155 (10): 4996-5002, y en la publicacion del PCT WO 94/10332. La llnea de celulas que producen el anticuerpo H22, fue depositada en The American Type Culture Collection bajo la designation HA022CL1, y tiene el numero de acceso CRL 11177.
En otras modalidades preferidas, la especificidad de union por un receptor Fc es provista por un anticuerpo que se une a un receptor de IgA humana, por ejemplo, un receptor Fc-alfa (FcaRI (CD89)), cuya union es de preferencia no bloqueada por la inmunoglobulina A (IgA) humana. Se pretende que el termino “receptor de IgA”, incluya el producto genico de un gen a (FcaRI) localizado en el cromosoma 19. Este gen es conocido por codificar para varias isoformas de transmembrana alternativamente empalmadas de 55 a 110 kDa. El FcaRI (CD89) es expresado
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constitutivamente en monocitos/macrofagos, granulocitos eosinofilos y neutrofilos, pero no en poblaciones de celulas no efectoras. El FcaRI tiene afinidad media (~ 5 * 107 M-1) por IgA1 e IgA2, la cual se incrementa tras la exposicion a citocinas tales como el G-CSF o el GM-CSF (Morton, H. C. et al. (1996) Critical Reviews in Immunology 16: 423440). Se han descrito cuatro anticuerpos monoclonales especlficos de FcaRI, identificados como A3, A59, A62 y A77, que se unen a FcaRI fuera del dominio de union al ligando de la IgA (Monteiro, R. C. et al. (1992) J. Immunol. 148: 1764).
El FcaRI y el FcgRI son receptores desencadenantes preferidos para su uso en las moleculas biespeclficas de la invencion, porque (1) se expresan principalmente en celulas efectoras inmunes, por ejemplo, monocitos, PMNs, macrofagos y celulas dendrlticas; (2) se expresan a altos niveles (por ejemplo, 5.000-100.000 por celula); (3) son mediadores de actividades citotoxicas (por ejemplo, ADCC, fagocitosis); (4) median la presentation mejorada de antlgenos, incluyendo autoantlgenos, dirigidos hacia ellos.
Aunque se prefieren anticuerpos monoclonales humanos, otros anticuerpos que pueden usarse en las moleculas biespeclficas de la invencion, son anticuerpos monoclonales de murino, quimericos y humanizados.
Las moleculas biespeclficas de la presente invencion pueden prepararse conjugando las especificidades de union constituyentes, por ejemplo, las especificidades de union anti-FcR y anti-IFNAR-1, usando metodos conocidos en la tecnica. Por ejemplo, cada especificidad de union de la molecula biespeclfica puede generarse por separado, y puede conjugarse entonces con alguna otra. Cuando las especificidades de union son protelnas o peptidos, puede usarse varios agentes de acoplamiento o de entrelazamiento para conjugation covalente. Ejemplos de agentes de entrelazamiento incluyen protelna A, carbodiimida, S-acetil-tioacetato de N-succinimidilo (SATA), acido 5,5'- ditiobis(2-nitrobenzoico) (DTNB), o-fenilendimaleimida (oPDM), 3-(2-piridilditio)propionato (SPDP) de N-succinimidilo, y 4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato de sulfosuccinimidilo (sulfo-SMCC) (vease, por ejemplo, Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160: 1686; y Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 8648). Otos metodos incluyen aquellos descritos en Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al. (1985) Science 229: 81-83), y Glennie et al. (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375). Agentes de conjugacion preferidos son SATA y sulfo- SMCC, disponibles de Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).
Cuando las especificidades de union son anticuerpos, pueden conjugarse por medio de union por enlaces sulfhidrilo a las regiones bisagra C-terminales de las dos cadenas pesadas. En una modalidad particularmente preferida, la region bisagra es modificada para que contenga un numero impar de residuos sulfhidrilo, de preferencia uno, antes de la conjugacion.
En forma alternativa, ambas especificidades de union pueden ser codificadas en el mismo vector, y pueden expresarse y ensamblarse en la misma celula hospedadora. Este metodo es particularmente util en donde la molecula biespeclfica es una protelna de fusion de mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 o ligando x Fab. Una molecula biespeclfica de la invencion puede ser una molecula de cadena sencilla que comprenda un anticuerpo de cadena sencilla y un determinante de union, o una molecula biespeclfica de cadena sencilla que comprenda dos determinantes de union. Las moleculas biespeclficas pueden comprender por lo menos dos moleculas de cadena sencilla. Metodos para la preparation de moleculas biespeclficas se describen, por ejemplo, en la patente de E.U.A. numero 5.260.203; patente de E.U.A. numero 5.455.030; patente de E.U.A. numero 4.881.175; patente de E.U.A. numero 5.132.405; patente de E.U.A. numero 5.091.513; patente de E.U.A. numero 5.476.786; patente de E.U.A. numero 5.013.653; patente de E.U.A. numero 5.258.498; y patente de E.U.A. numero 5.482.858.
La union de las moleculas biespeclficas a sus dianas especlficas puede confirmarse, por ejemplo, por medio de prueba de inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), analisis por FACS, bioensayo (por ejemplo, inhibition del crecimiento) o prueba Western Blot. Cada una de estas pruebas detecta en general la presencia de complejos de protelna-anticuerpo de interes particular, usando un reactivo marcado (por ejemplo, un anticuerpo) especlfico para el complejo de interes. Por ejemplo, los complejos de FcR-anticuerpo pueden detectarse usando, por ejemplo, un anticuerpo ligado a enzima o fragmento de anticuerpo que reconozca y se una especlficamente a los complejos de anticuerpo-FcR. En forma alternativa, los complejos pueden detectarse usando cualquiera de varios otros inmunoensayos. Por ejemplo, el anticuerpo puede marcarse radiactivamente y usarse en un radioinmunoensayo (RIA) (vease, por ejemplo, Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, marzo de 1986). El isotopo radiactivo puede detectarse por medios tales como el uso de un contador gamma o un contador de centelleo, o por autorradiografla.
Composiciones farmaceuticas
En otro aspecto, la presente invencion provee una composition, por ejemplo, una composition farmaceutica, que contiene una combination de anticuerpos monoclonales, o porciones de union a antlgeno de los mismos, de la presente invencion, formulados junto con un vehlculo farmaceuticamente aceptable. Dichas composiciones pueden incluir un anticuerpo o una combinacion de (por ejemplo, dos o mas diferentes) anticuerpos, o inmunoconjugados o moleculas biespeclficas de la invencion. Por ejemplo, una composicion farmaceutica de la invencion puede comprender una combinacion de anticuerpos (o inmunoconjugados o moleculas biespeclficas) que se unan a
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diferentes epltopos en el antlgeno diana, o que tengan actividades complementarias.
Las composiciones farmaceuticas de la invention pueden administrarse tambien en terapia de combination, es decir, pueden combinarse con otros agentes. Por ejemplo, la terapia de combinacion puede incluir un anticuerpo anti-IFNAR-1 de la presente invencion, combinado con por lo menos algun otro agente inmunosupresor.
Como se usa en la presente, el termino “vehlculo farmaceuticamente aceptable” incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersion, revestimientos, agentes antibacterianos y antimicoticos, agentes isotonicos y retardadores de absorcion, y similares, que sean fisiologicamente compatibles. De preferencia, el vehlculo es adecuado para administration intravenosa, intramuscular, subcutanea, parenteral, espinal o epidermica (por ejemplo, por inyeccion o infusion). Dependiendo de la via de administracion, el compuesto activo, es decir, anticuerpo, inmunoconjugado o molecula biespeclfica, puede revestirse en un material que proteja al compuesto de la action de acidos y otras condiciones naturales que pueden inactivar al compuesto.
Los compuestos farmaceuticos de la invencion pueden incluir una o mas sales farmaceuticamente aceptables. El termino una “sal farmaceuticamente aceptable”, se refiere a una sal que retiene la actividad biologica deseada del compuesto precursor, y no imparte efecto toxicologico no deseado alguno (vease, por ejemplo, Berge, S. M. et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66: 1-19). Ejemplos de dichas sales incluyen sales acidas de adicion y sales basicas de adicion. Las sales acidas de adicion incluyen aquellas derivadas de acidos inorganicos no toxicos, tales como acido clorhldrico, nltrico, fosforico, sulfurico, bromhldrico, yodhldrico, fosforoso, y similares, as! como de acidos organicos no toxicos tales como acidos monocarboxllicos y dicarboxllicos alifaticos, acidos alcanoicos sustituidos con fenilo, acidos hidroxialcanoicos, acidos aromaticos, acidos sulfonicos alifaticos y aromaticos, y similares. Las sales basicas de adicion incluyen aquellas derivadas de metales alcalinoterreos, tales como sodio, potasio, magnesio, calcio, y similares, as! como de aminas organicas no toxicas, tales como N,N'-dibenciletilendiamina, N-metilglucamina, cloroprocalna, colina, dietanolamina, etilendiamina, procalna, y similares.
Una composition farmaceutica de la invencion puede incluir tambien un antioxidante farmaceuticamente aceptable. Ejemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceptables incluyen: (1) antioxidantes solubles en agua, tales como acido ascorbico, clorhidrato de cistelna, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio, y similares; (2) antioxidantes liposolubles, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol, y similares; y (3) agentes quelantes de metales, como es el caso de acido cltrico, acido etilendiaminotetraacetico (EDTA), sorbitol, acido tartarico, acido fosforico, y similares.
Ejemplos de vehlculos acuosos y no acuosos adecuados que pueden usarse en las composiciones farmaceuticas de la invencion, incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y esteres organicos inyectables, tales como oleato de etilo. Puede mantenerse una fluidez adecuada, por ejemplo, por el uso de materiales de revestimiento tales como lecitina, por el mantenimiento del tamano de partlcula requerido en el caso de dispersiones, y por el uso de agentes tensioactivos.
Estas composiciones pueden contener tambien adyuvantes tales como conservadores, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes de dispersion. La prevention de la presencia de microorganismos puede garantizarse por medio de procedimientos de esterilizacion, citados anteriormente, y por la inclusion de varios agentes antibacterianos y antimicoticos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, acido fenol sorbico, y similares. Puede ser tambien deseable incluir agentes isotonicos, tales como azucares, cloruro de sodio, y similares, en las composiciones. Ademas, la absorcion prolongada de la forma farmaceutica inyectable puede lograrse por la inclusion de agentes que retarden la absorcion, tales como monoestearato de aluminio y gelatina.
Vehlculos farmaceuticamente aceptables incluyen soluciones acuosas esteriles o dispersiones y polvos esteriles para la preparation extemporanea de soluciones inyectables esteriles o dispersiones. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmaceuticamente activas, se conoce en la tecnica. Excepto hasta donde algun medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso del mismo en las composiciones farmaceuticas de la invencion. Pueden incorporarse tambien compuestos activos complementarios en las composiciones.
Normalmente, las composiciones terapeuticas deben ser esteriles y estables bajo las condiciones de fabrication y almacenamiento. La composicion puede formularse como una solution, microemulsion, liposoma, u otra estructura ordenada adecuada para alta concentration de farmaco. El vehlculo puede ser un solvente o medio de dispersion que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol llquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, por el uso de un revestimiento tal como lecitina, por el mantenimiento del tamano de partlcula requerido en el caso de dispersiones, y por el uso de agentes tensioactivos. En muchos casos, se preferira incluir agentes isotonicos, por ejemplo, azucares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio, en la composicion. La absorcion prolongada de las composiciones inyectables puede producirse incluyendo en la composicion un agente que retarde la absorcion, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.
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Pueden prepararse soluciones inyectables esteriles incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un solvente adecuado con un ingrediente o una combinacion de los ingredientes enumerados anteriormente, segun se requiera, seguido de microfiltracion con esterilizacion. En general, se preparan dispersiones incorporando el compuesto activo en un vehlculo esteril que contenga un medio de dispersion basico y los otros ingredientes requeridos de aquellos enumerados anteriormente. En el caso de polvos esteriles para la preparacion de soluciones inyectables esteriles, los metodos de preparacion preferidos son, secado al vaclo y secado por congelation (liofilizacion), que de un polvo del ingrediente activo mas algun ingrediente deseado adicional de una solution filtrada del mismo previamente esteril.
La cantidad de ingrediente activo que puede combinarse con un material de vehlculo para producir una forma de dosificacion individual variara, dependiendo del sujeto que se este tratando, y el modo de administration particular. La cantidad de ingrediente activo que puede combinarse con un material de vehlculo para producir una forma de dosificacion individual, sera en general aquella cantidad de la composition que produzca un efecto terapeutico. En general, de entre 100 por ciento, esta cantidad variara de aproximadamente 0,01 por ciento a aproximadamente 99 por ciento de ingrediente activo, de preferencia de aproximadamente 0,1 por ciento a aproximadamente 70 por ciento, mas preferiblemente de aproximadamente 1 por ciento a aproximadamente 30 por ciento de ingrediente activo, en combinacion con un vehlculo farmaceuticamente aceptable.
Los reglmenes de dosificacion se ajustan para proveer la respuesta deseada optima (por ejemplo, una respuesta terapeutica). Por ejemplo, puede administrarse un bolo individual, puede administrarse varias dosis divididas con el tiempo, o la dosis puede reducirse o incrementarse proporcionalmente, segun sea indicado por las exigencias de la situation terapeutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de unidad de dosificacion, para facilidad de administracion y uniformidad de dosificacion. La expresion forma de unidad de dosificacion, como se usa en la presente, se refiere a unidades flsicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos que se trataran; cada unidad contiene una unidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapeutico deseado en asociacion con el vehlculo farmaceutico requerido. La especificacion para las formas de unidad de dosificacion de la invention es dictada por, y depende directamente de, (a) las caracterlsticas unicas del compuesto activo y el efecto terapeutico particular que se lograra, y (b) las limitaciones inherentes en la tecnica de combinacion de dicho compuesto activo para el tratamiento de sensibilidad en individuos.
Para la administracion del anticuerpo, la dosificacion varla de aproximadamente 0,0001 a 100 mg/kg, y mas usualmente de 0,01 a 5 mg/kg, del peso corporal del hospedero. Por ejemplo, las dosificaciones pueden ser de 0,3 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg de peso corporal, 3 mg/kg de peso corporal, 5 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal, o dentro de la escala de 1-10 mg/kg. Un ejemplo de regimen de tratamiento acarrea la administracion de una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez al mes, una vez cada tres meses o una vez cada tres a seis meses. Los reglmenes de dosificacion preferidos para un anticuerpo anti-IFNAR-1 de la invencion, incluyen 1 mg/kg de peso corporal o 3 mg/kg de peso corporal por medio de administracion intravenosa, siendo administrado el anticuerpo usando uno de los siguientes planes de dosificacion: (i) cada cuatro semanas por seis dosificaciones, entonces cada tres meses; (ii) cada tres semanas; (iii) 3 mg/kg de peso corporal una vez, seguidos de 1 mg/kg de peso corporal cada tres semanas.
En algunos metodos, dos o mas anticuerpos monoclonales con diferentes especificidades de union se administran simultaneamente, en cuyo caso la dosificacion de cada anticuerpo administrado esta dentro de las escalas indicadas. El anticuerpo se administra usualmente en ocasiones multiples. Los intervalos entre las dosificaciones individuales pueden ser, por ejemplo, semanalmente, mensualmente, cada tres meses o anualmente. Los intervalos pueden ser tambien irregulares, segun se indica midiendo los niveles del anticuerpo en sangre para el antlgeno diana en el paciente. En algunos metodos, la dosificacion se ajusta para lograr una concentration de anticuerpo en plasma de aproximadamente 1-1000 mg/ml, y en algunos metodos de aproximadamente 25-300 mg/ml.
En forma alternativa, el anticuerpo puede administrarse como una formulation de liberation sostenida, en cuyo caso se requiere administracion menos frecuente. La dosificacion y frecuencia varlan, dependiendo de la vida media del anticuerpo en el paciente. En general, los anticuerpos humanos muestran la vida media mas larga, seguidos de los anticuerpos humanizados, anticuerpos quimericos y anticuerpos no humanos. La dosificacion y la frecuencia de administracion pueden variar, dependiendo de si el tratamiento es profilactico o terapeutico. En aplicaciones profilacticas, una dosificacion relativamente baja se administra a intervalos relativamente no frecuentes, durante un perlodo largo. Algunos pacientes continuan recibiendo el tratamiento por el resto de su vida. En aplicaciones terapeuticas, una dosificacion relativamente alta a intervalos relativamente cortos se requiere a veces hasta que la progresion de la enfermedad sea reducida o terminada, y de preferencia hasta que el paciente muestre mejora parcial o completa de los slntomas de enfermedad. Despues, puede administrarse al paciente un regimen profilactico.
Los niveles de dosificacion reales de los ingredientes activos en las composiciones farmaceuticas de la presente invencion, pueden hacerse variar hasta obtener una cantidad del ingrediente activo que sea efectiva para lograr la respuesta terapeutica deseada para un paciente, composicion y modo de administracion particular, sin que sea
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toxica para el paciente. El nivel de dosificacion seleccionado dependera de varios factores farmacocineticos que incluyen la actividad de las composiciones particulares de la presente invencion usadas, o el ester, sal o amida de las mismas, la via de administracion, la hora de administration, la rapidez de excretion del compuesto particular que se este usando, la duration del tratamiento, otros farmacos, compuestos y/o materiales usados en combination con las composiciones particulares usadas, la edad, sexo, peso, condition, salud general e historia medica previa del paciente que se este tratando, y factores similares bien conocidos en las tecnicas medicas.
Una “dosificacion terapeuticamente efectiva” de un anticuerpo anti-IFNAR-1 de la invencion, resulta de preferencia en una disminucion en severidad de slntomas de enfermedad, un incremento en frecuencia y duracion de perlodos libres de slntomas de enfermedad, o una prevention de deterioro o incapacidad debida a la afliccion por la enfermedad. En el caso de, por ejemplo, lupus eritematoso sistemico (LSE), una dosis terapeuticamente efectiva previene de preferencia mas deterioro de slntomas flsicos asociados con el LSE tales como, por ejemplo, dolor, fatiga o debilidad. Una dosis terapeuticamente efectiva previene o retarda tambien de preferencia el inicio del LSE, tal como puede desearse cuando estan presentes signos tempranos o preliminares de la enfermedad. Asimismo, incluye el retardo de la progresion cronica asociada con el LSE. Pruebas de laboratorio usadas en el diagnostico del LSE, incluyen qulmicas, hematologla, serologla y radiologla. Por consiguiente, cualquier prueba cllnica o bioqulmica que monitoree cualquiera de lo anterior, puede usarse para determinar si un tratamiento particular es una dosis terapeuticamente efectiva para el tratamiento del LSE. El experto en la tecnica serla capaz de determinar dichas cantidades con base en factores tales como la estatura del sujeto, la severidad de los slntomas del sujeto y la composition o via de administracion particular seleccionadas.
Una composicion de la presente invencion puede administrarse por medio de una o mas vlas de administracion, usando uno o mas de varios metodos conocidos en la tecnica. Como lo apreciaran los expertos en la tecnica, la via y/o el modo de administracion variaran, dependiendo de los resultados deseados. Vlas de administracion preferidas para los anticuerpos de la invencion, incluyen las vlas intravenosa, intramuscular, intradermica, intraperitoneal, subcutanea, espinal, u otras vlas de administracion parenterales, por ejemplo, por inyeccion o infusion. La frase “administracion parenteral”, como se usa en la presente, significa modos de administracion diferentes de la administracion enteral y topica, usualmente por inyeccion e incluyen, sin limitation, inyeccion intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradermica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutanea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal, e infusion.
En forma alternativa, un anticuerpo de la invencion puede administrarse por medio de una via no parenteral, tal como una via de administracion topica, epidermica o a traves de mucosas, por ejemplo, intranasalmente, oralmente, vaginalmente, rectalmente, sublingualmente o topicamente.
Los compuestos activos pueden prepararse con vehlculos que protejan al compuesto contra la liberation rapida, tal como una formulation de liberacion controlada, que incluye implantes, parches transdermicos y sistemas de suministro microencapsulados. Pueden usarse pollmeros biocompatibles biodegradables, tales como acetato etilenvinllico, polianhldridos, acido poliglicolico, colageno, poliortoesteres y acido polilactico. Muchos metodos para la preparation de dichas formulaciones estan patentados, o son conocidos generalmente por los expertos en la tecnica. Vease, por ejemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
Pueden administrarse composiciones terapeuticas con dispositivos medicos conocidos en la tecnica. Por ejemplo, en una modalidad preferida, una composicion terapeutica de la invencion puede administrarse con un dispositivo de inyeccion hipodermico sin aguja, tales como los dispositivos descritos en las patentes de E.U.A. Nos. 5.399.163; 5.383.851; 5.312.335; 5.064.413; 4.941.880; 4.790.824; o 4.596.556. Ejemplos de implantes y modulos bien conocidos utiles en la presente invencion, se incluyen en la patente de E.U.A. No. 4.487.603, que describe una bomba de microinfusion implantable para la dispensation de medication a un regimen controlado; la patente de E.U.A. No. 4.486.194, que describe un dispositivo terapeutico para la administracion de medicamentos a traves de la piel; la patente de E.U.A. No. 4.447.233, que describe una bomba de infusion de medicacion para el suministro de medicacion a un regimen de infusion preciso; la patente de E.U.A. No. 4.447.224, que describe un aparato de infusion implantable de flujo variable para el suministro continuo de farmaco; la patente de E.U.A. No. 4.439.196, que describe un sistema de suministro osmotico de farmaco que tiene compartimientos de camaras multiples; y la patente de E.U.A. No. 4.475.196, que describe un sistema de suministro osmotico de farmaco. Muchos otros de dichos implantes, sistemas de suministro y modulos, son conocidos por los expertos en la tecnica.
En ciertas modalidades, los anticuerpos monoclonales humanos de la invencion pueden formularse para asegurar distribucion adecuada in vivo. Por ejemplo, la barrera hematoencefalica (BBB) excluye muchos compuestos altamente hidrofilos. Para asegurar que los compuestos terapeuticos de la invencion crucen la BBB (si se desea) pueden formularse, por ejemplo, en liposomas. Para metodos de fabrication de liposomas vease, por ejemplo, las patentes de E.U.A. Nos. 4.522.811; 5.374.548; y 5.399.331. Los liposomas pueden comprender una o mas porciones que sean transportadas selectivamente en celulas u organos especlficos, mejorando de esta manera el suministro dirigido de farmacos (vease, por ejemplo, V. V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29: 685). Ejemplos de porciones de direccionamiento, incluyen folato o biotina (vease, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 5.416.016 a
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Low et a/.); manosidos (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153: 1038); anticuerpos (P. G. Bloeman et a/. (1995) fEbS Lett. 357: 140; M. Owais et a/. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39: 180); receptor de protelna A - agente tensioactivo (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233: 134); p120 (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 9090); vease tambien K. Keinanen; M. L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346: 123; J. J. Killion; e I. J. Fidler (1994) Immunomethods 4: 273.
Usos y metodos de los anticuerpos y porciones de anticuerpos de union a antigenos
Los anticuerpos (e inmunoconjugados y moleculas biespeclficas) de la presente invencion, tienen utilidades terapeuticas y de diagnostico in vitro e in vivo. Por ejemplo, estas moleculas pueden administrarse a celulas en cultivo, por ejemplo, in vitro o ex vivo, o en un sujeto, por ejemplo, in vivo, para tratar, prevenir o diagnosticar varios trastornos. Se pretende que el termino “sujeto”, como se usa en la presente, incluya animales humanos y no humanos. Animales no humanos incluyen todos los vertebrados, por ejemplo, mamlferos y no mamlferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, vacas, caballos, pollos, anfibios y reptiles. Los metodos son particularmente adecuados para el tratamiento de pacientes humanos que tienen un trastorno asociado con la expresion aberrante o inadecuada de interferon tipo I (por ejemplo, sobreexpresion).
Cuando los anticuerpos para el IFNAR-1 se administran junto con otro agente, los dos pueden administrarse en orden o simultaneamente. Por ejemplo, un anticuerpo anti-IFNAR-1 de la invencion puede usarse en combinacion con uno o mas de los siguientes agentes: anticuerpo anti-IFNa, anticuerpo del receptor anti-IFNg, receptor de IFNg soluble, anticuerpo anti-FNT, anticuerpo del receptor anti-FNT, y/o receptor de FNT soluble (vease, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 5.888.511). Ademas, un anticuerpo anti-IFNAR-1 de la invencion puede usarse en combinacion con un antagonista del ligando Flt3 (vease, por ejemplo, la publicacion de solicitud de patente de E.U.A. No. 2002/0160974).
En una modalidad, los anticuerpos (e inmunoconjugados y moleculas biespeclficas) de la invencion pueden usarse para detectar niveles del IFNAR-1, o niveles de celulas que expresan el IFNAR-1. Esto puede lograrse, por ejemplo, poniendo en contacto una muestra (tal como una muestra in vitro) y una muestra control con el anticuerpo anti- IFNAR-1 bajo condiciones que permitan la formacion de un complejo entre el anticuerpo y el IFNAR-1. Cualquier complejo formado entre el anticuerpo y el IFNAR-1 es detectado y comparado en la muestra y el control. Por ejemplo, pueden realizarse metodos de detection estandar bien conocidos en la tecnica, tales como ELISA y pruebas de citometrla de flujo, usando las composiciones de la invencion.
Por consiguiente, la divulgation provee ademas metodos para:
la deteccion de la presencia del IFNAR-1 (por ejemplo, antlgeno del IFNAR-1 humano) en una muestra, o la medicion de la cantidad del IFNAR-1, que comprenden poner en contacto la muestra y una muestra control con un anticuerpo de la invencion, o una portion de union a antlgeno del mismo, que se une especlficamente al IFNAR-1, bajo condiciones que permitan la formacion de un complejo entre el anticuerpo o porcion del mismo y el IFNAR-1. La formacion de un complejo se detecta entonces, en donde una diferencia en la formacion del complejo entre la muestra comparada y la muestra control, es indicativa de la presencia del IFNAR-1 en la muestra.
Tambien dentro del alcance de la invencion, estan equipos que comprenden las composiciones (por ejemplo, anticuerpos, anticuerpos humanos, inmunoconjugados y moleculas biespeclficas) de la invencion, e instrucciones para su uso. El equipo puede contener ademas por lo menos un reactivo adicional, o uno o mas anticuerpos adicionales de la invencion (por ejemplo, un anticuerpo que tenga una actividad complementaria que se una a un epltopo en el antlgeno diana distinto del primer anticuerpo). Los equipos incluyen normalmente una etiqueta que indique el uso deseado de los contenidos del equipo. El termino etiqueta incluye cualquier material escrito o registrado provisto sobre o con el equipo, o que de otra manera acompana al equipo.
El IFNAR-1 forma parte del receptor celular para interferones tipo I, y los interferones tipo I son conocidos por ser citocinas inmunorreguladoras que estan implicadas, entre otras cosas, en diferenciacion de celulas T, production de anticuerpos y actividad y supervivencia de celulas T de memoria. Ademas, la expresion incrementada de interferones tipo I se ha descrito en numerosas enfermedades autoinmunes, en infection por VIH, en rechazo de trasplante y en enfermedad de injerto contra hospedero (GVHD). Por consiguiente, los anticuerpos anti-IFNAR-1 (e inmunoconjugados y moleculas biespeclficas) de la invencion, que inhiben la actividad funcional de interferones tipo I, pueden usarse en varias indicaciones cllnicas que implican actividad de interferon tipo I aberrante o no deseada. Por lo tanto, la invencion provee los anticuerpos, o porciones de union a antlgeno de los mismos, de la invencion para su uso en un metodo para la inhibition de una enfermedad o trastorno mediado por interferon tipo I, en donde el metodo comprende la administration de un anticuerpo, o porcion de union a antlgeno del mismo, de la invencion (o inmunoconjugado o molecula biespeclfica de la invencion), de modo que la enfermedad o trastorno mediado por interferon tipo I, sea tratado.
Ejemplos especlficos de condiciones autoinmunes en las cuales los anticuerpos de la invencion pueden usarse incluyen, pero no estan limitadas a, las siguientes: lupus eritematoso sistemico (LSE), diabetes mellitus
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insulinodependiente (DMID), enfermedad inflamatoria del intestino (EII) (que incluye enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa y enfermedad celiaca), esclerosis multiple (MS), psoriasis, tiroiditis autoinmune, artritis reumatoide (RA) y glomerulonefritis. Ademas, las composiciones de anticuerpos de la invencion pueden usarse para la inhibicion o prevencion del rechazo de trasplante, o en el tratamiento de enfermedad de injerto contra hospedero (GVHD), o en el tratamiento de infeccion por VIH/SIDA.
Altos niveles de IFNa se han observado en el suero de pacientes con lupus eritematoso sistemico (LSE) (vease, por ejemplo, Kim et al. (1987) Clin. Exp. Immunol. 70: 562-569). Ademas, se ha mostrado que la administracion de IFNa, por ejemplo, en el tratamiento de cancer o infecciones virales, induce LSE (Garcia-Porrua et al. (1998) Clin. Exp. Rheumatol. 16: 107-108). Por consiguiente, en otra modalidad, los anticuerpos anti-IFNAR-1 de la invencion pueden usarse en el tratamiento de LSE, administrando el anticuerpo a un sujeto que necesita de tratamiento. El anticuerpo puede usarse solo o en combinacion con otros agentes anti-LSE, tales como farmacos antiinflamatorios no esteroideos (AINEs), analgesicos, corticoesteroides (por ejemplo, prednisona, hidrocortisona), inmunosupresores (tales como ciclofosfamida, azatioprina y metotrexato), antipaludicos (tales como hidroxicloroquina), y farmacos biologicos que inhiben la produccion de anticuerpos de ADN de doble cadena (por ejemplo, LJP 394).
El IFNa se ha implicado tambien en la patologia de diabetes tipo I. Por ejemplo, se ha reportado la presencia de IFNa inmunorreactivo en celulas beta pancreaticas de pacientes con diabetes tipo I (Foulis et al. (1987) Lancet 2: 1423-1427). Se ha mostrado tambien que el uso prolongado de IFNa en terapia antiviral, induce diabetes tipo I (Waguri et al. (1994) Diabetes Res. Clin. Pract. 23: 33-36). Por consiguiente, en otra modalidad, los anticuerpos anti- IFNAR-1 de la invencion pueden usarse en el tratamiento de diabetes tipo I, administrando el anticuerpo a un sujeto que necesita de tratamiento. El anticuerpo puede usarse solo o en combinacion con otros agentes antidiabeticos, tales como insulina.
Se ha mostrado que los anticuerpos para el IFNAR son efectivos en un modelo animal de enfermedad inflamatoria del intestino (vease la solicitud de patente provisional de E.U.A. 60/465.155) cuya prioridad se reivindica por el documento WO 2004/093908). De esta manera, los anticuerpos anti-IFNAR-1 de la invencion pueden usarse en el tratamiento de enfermedad inflamatoria del intestino (EII), que incluye colitis ulcerativa y enfermedad de Crohn, administrando el anticuerpo a un sujeto que necesita de tratamiento. El anticuerpo puede usarse solo o en combinacion con otros agentes anti-EII, tales como farmacos que contienen mesalamina (incluyendo sulfasalazina y otros agentes que contengan acido 5-aminosalidlico (5-ASA), tales como olsalazina y balsalazida), farmacos antiinflamatorios no esteroideos (AINEs), analgesicos, corticoesteroides (por ejemplo, prednisona, hidrocortisona), inhibidores del FNT (incluyendo adilimumab (Humira®, etanercept (Enbrel®) e infliximab (Remicade®)), inmunosupresores (tales como 6-mercaptopurina, azatioprina y ciclosporina A), y antibioticos.
Se ha observado tambien que el tratamiento con IFNa induce tiroiditis autoinmune (Monzani et al. (2004) Clin. Exp. Med. 3: 199-210; Prummel y Laurberg (2003) Thyroid 13: 547-551). Por consiguiente, en otra modalidad, los anticuerpos anti-IFNAR de la invencion pueden usarse en el tratamiento de enfermedad tiroidea autoinmune, que incluye hipotiroidismo autoinmune primario, enfermedad de Graves, tiroiditis de Hashimoto y tiroiditis destructiva con hipotiroidismo, administrando el anticuerpo a un sujeto que necesita de tratamiento. El anticuerpo puede usarse solo o en combinacion con otros agentes o tratamientos, tales como farmacos antitiroideos, yodo radiactivo y tiroidectomia subtotal.
Se han observado niveles incrementados de interferones tipo I, especialmente IFB-b, en el suero de pacientes con RA (vease, por ejemplo, Hertzog et al. (1988) Clin. Immunol. Immunopath. 48: 192). De esta manera, en una modalidad, los anticuerpos anti-IFNAR-1 de la presente invencion pueden usarse en el tratamiento de RA, administrando el anticuerpo a un sujeto que necesita de dicho tratamiento. El anticuerpo puede usarse solo o en combinacion con uno o mas de otros agentes anti-RA, tales como un farmaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE), un inhibidor de COX-2, un analgesico, un corticoesteroide (por ejemplo, prednisona, hidrocortisona), oro, un inmunosupresor (por ejemplo, metotrexato), un agente de deplecion de celulas B (por ejemplo, Rituxan™), un agonista de celulas B (por ejemplo, LymphoStat-BTM) y un agente anti-FNT-a (por ejemplo, EMBREL™, HUMIRA® y REMICADE™).
Se ha reportado que la administracion de IFNa exacerba la psoriasis. Por consiguiente, en otra modalidad, los anticuerpos anti-IFNAR-1 de la invencion pueden usarse en el tratamiento de psoriasis y artritis psoriatica, administrando el anticuerpo a un sujeto que necesita de dicho tratamiento. El anticuerpo puede usarse solo o en combinacion con uno o mas de otros agentes antipsoriasis, tales como fototerapia, terapia topica (por ejemplo, glucocorticoides topicos) o terapia sistemica (por ejemplo, metotrexato, retinoide sintetico, ciclosporina), un agente anti-FNT-a (por ejemplo, EMBREL™, HUMIRA® y REMICADE™), y un inhibidor de celulas T (por ejemplo, Raptiva™).
Se han observado tambien altos niveles de IFNa en la circulacion de pacientes con infeccion por VIH, y su presencia es un marcador profetico de progresion del SIDA (DeStefano et al. (1982) J. Infec. Disease 146: 451; Vadhan-Raj et al. (1986) Cancer Res. 46: 417). De esta manera, en otra modalidad, un anticuerpo anti-IFNAR-1 de la invencion se usa en el tratamiento de infeccion por VIH o SIDA, administrando el anticuerpo a un sujeto que necesita de
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tratamiento. El anticuerpo puede usarse solo o en combinacion con otros agentes anti-VIH, tales como inhibidores de transcriptasa inversa de nucleosidos, inhibidores de transcriptasa inversa no de nucleosidos, inhibidores de proteasa e inhibidores de fusion.
Se ha demostrado que los anticuerpos para el IFNAR-1, son efectivos para inhibir el rechazo de aloinjertos y prolongar la supervivencia del aloinjerto (vease, por ejemplo, Tovey et al. (1996) J. Leukoc. Biol. 59: 512-517; Benizri et al. (1998) J. Interferon Cytokine Res. 18: 273-284). Por consiguiente, los anticuerpos anti-IFNAR-1 de la invencion pueden usarse tambien en receptores de trasplante para inhibir el rechazo de aloinjertos y/o prolongar la supervivencia del aloinjerto. La invencion provee un metodo para inhibir el rechazo de trasplante, administrando un anticuerpo anti-IFNAR-1 de la invencion a un receptor de trasplante que necesita de tratamiento. Ejemplos de trasplantes de tejidos que pueden tratarse incluyen, pero no estan limitados a, hlgado, pulmon, rinon, corazon, intestino delgado y celulas de los islotes pancreaticos, as! como el tratamiento de enfermedad de injerto contra hospedero (GVHD). El anticuerpo puede usarse solo o en combinacion con otros agentes para inhibir el rechazo de trasplante, tales como agentes inmunosupresores (por ejemplo, ciclosporina, azatioprina, metilprednisolona, prednisolona, prednisona, mofetil micofenolato, sirolimus, rapamicina, tacrolimus), agentes antiinfecciosos (por ejemplo, aciclovir, clotrimazol, ganciclovir, nistatina, trimetoprima y sulfametoxazol), diureticos (por ejemplo, bumetanida, furosemida, metolazona) y medicaciones contra la ulcera (por ejemplo, cimetidina, famotidina, lanzoprazol, omeprazol, ranitidina, sucralfato).
La presente invencion se ilustra ademas mediante los siguientes ejemplos, los cuales no deben considerarse como limitativos de la invencion como se define en las reivindicaciones.
Ejemplo 1: Generacion de anticuerpos monoclonales humanos contra el IFNAR-1
Antigeno
Se genero IFNAR-1 soluble, que contiene al dominio extracelular del IFNAR-1, mediante metodos recombinantes, y se uso como antigeno para inmunizacion.
Ratones HuMab transgenicos
Se prepararon anticuerpos monoclonales completamente humanos para el IFNAR-1, usando las cepas HCo7, HCo12 y HCo7 x HCo12 de ratones transgenicos HuMab, cada uno de los cuales expresa genes de anticuerpos humanos. En cada una de estas cepas de raton, el gen endogeno de la cadena ligera kappa de raton ha sido disuelto homocigoticamente, como se describe en Chen et al. (1993) EMBO J. 12: 811-820, y el gen endogeno de la cadena pesada de raton ha sido disuelto homocigoticamente como se describe en el ejemplo 1 de la publication del PCT WO 01/09187. Cada una de estas cepas de raton posee un transgen de la cadena ligera kappa humana, KCo5, como se describe en Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851. La cepa HCo7 posee el transgen de la cadena pesada humana HCo7, como se describe en las patentes de E.U.A. Nos. 5.545.806; 5.625.825; y 5.545.807. La cepa HCo12 posee el transgen de la cadena pesada humana HCo12, como se describe en el ejemplo 2 de la publicacion del PCT WO 01/09187. La cepa HCo7 x HCo12 posee los transgenes de HCo7 y HCo12, y se obtuvo cruzando las dos cepas.
Inmunizacion de ratones HuMab:
Para generar anticuerpos monoclonales completamente humanos para el IFNAR-1, se inmunizo a ratones HuMab con IFNAR-1 recombinante purificado como antigeno. Esquemas generales de inmunizacion para ratones HuMab, se describen en Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368 (6474): Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845851, y la publicacion del PCT WO 98/24884. Los ratones tenian de 6 a 16 semanas de edad, tras la primera infusion de antigeno. Se uso una preparation recombinante purificada (5-50 mg) de antigeno del IFNAR-1 soluble, para inmunizar a los ratones HuMab intraperitonealmente, subcutaneamente (Sc) o por medio de inyeccion en el cojinete de la pata.
Se inmunizo dos veces a los ratones transgenicos con antigeno, en adyuvante completo de Freund o adyuvante de Ribi, ya sea intraperitonealmente (IP), subcutaneamente (Sc) o por medio de inyeccion en el cojinete de la pata (FP), seguido de inmunizacion IP, Sc o FP por 3 a 21 dias (hasta un total de 11 inmunizaciones), con el antigeno en adyuvante incompleto de Freund o adyuvante de Ribi. La respuesta inmune se monitoreo por medio de sangrias retroorbitales. El plasma se selecciono por ELISA (como se describe mas adelante), y se usaron para las fusiones ratones con titulos suficientes de inmunoglobulina humana anti-IFNAR-1. Los ratones recibieron un refuerzo con antigeno por via intravenosa 3 y 2 dias antes de su sacrificio y la remocion del bazo. Normalmente, se realizaron 10 a 35 fusiones para cada antigeno. Se inmunizaron varias docenas de ratones por cada antigeno.
Selection de ratones HuMab que producen anticuerpos anti-IFNAR-1:
Para seleccionar ratones HuMab que producen anticuerpos que se unen al IFNAR-1, se pusieron a prueba sueros de ratones inmunizados por medio de ELISA, como es descrito por Fishwild, D. et al. (1996). En resumen, se
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revistieron placas de microtltuio con IFNAR-1 recombinante purificado de E. coli a 1-2 mg/ml en PBS, 50 pl/cavidades incubadas a 4 °C durante la noche, y bloqueadas entonces con 200 pl/cavidad de suero de polio a 5 % en PBS/Tween (0,05 %). Se anadieron a cada cavidad diluciones de plasma de ratones inmunizados con el IFNAR-1, y se incubaron por 1 a 2 horas a temperatura ambiente. Las placas se lavaron con PBS/Tween y se incubaron entonces con un anticuerpo policlonal de Fc de IgG anti-humana de cabra conjugado con peroxidasa de rabano picante (HRP), por 1 hora a temperatura ambiente. Despues del lavado, las placas se desarrollaron con substrato ABTS (Sigma, A-1888, 0,22 mg/ml), y se analizaron por espectrofotometro a DO de 415 a 495. Los ratones que desarrollaron los tltulos mas altos de anticuerpos anti-IFNAR-1, se usaron para las fusiones. Se realizaron fusiones como se describe mas adelante, y se pusieron a prueba los sobrenadantes del hibridoma para actividad anti-IFNAR- 1 por medio de ELISA.
Generation de hibridomas que producen anticuerpos monoclonales humanos para el IFNAR-1:
Los esplenocitos de raton, aislados de los ratones HuMab, fueron fusionados con PEG a una llnea de celulas de mieloma de raton basada en protocolos estandar. Los hibridomas resultantes se seleccionaron entonces para la production de anticuerpos especlficos del antlgeno. Se fusionaron suspensiones de celulas individuales de linfocitos esplenicos de ratones inmunizados, con una cuarta parte del numero de celulas de mieloma de raton que no secretaban SP2/0 (ATCC, CRL 1581) con PEG a 50 % (Sigma). Las celulas se sembraron a aproximadamente 1 x 105 celulas/cavidad en placas de microtltulo de fondo plano, seguido de casi dos semanas de incubation en medio selectivo que contenla suero de bovino fetal a 10 %, medio acondicionado P388D1 a 10 % (ATCC, CRL TIB-63), origen a 3 a 5 % (IGEN) en DMEM (Mediatech, CRL 10013, con alto contenido de glucosa, L-glutamina y piruvato de sodio) mas HEPES a 5 mM, 2-mercaptoetanol a 0,055 mM, 50 mg/ml de gentamicina y 1xHAT (Sigma, CRL P7185). Despues de 1 a 2 semanas, las celulas se cultivaron en medio en el cual la HAT fue reemplazada con HT. Las cavidades individuales se seleccionaron entonces por medio de ELISA (descrita anteriormente) para anticuerpos de IgG monoclonales anti-IFNAR-1 humanos. Una vez que ocurrio el crecimiento extensivo de hibridomas, el medio se monitoreo usualmente despues de 10 a 14 dlas. Los hibridomas que secretaban anticuerpos se resembraron, se seleccionaron de nuevo y, si aun eran positivos para IgG humana, los anticuerpos monoclonales anti-IFNAR-1 fueron subclonados por lo menos dos veces por dilution limitativa. Los subclones estables se cultivaron entonces in vitro para generar pequenas cantidades de anticuerpo en medio de cultivo de tejidos para mas caracterizacion.
Se seleccionaron los clones de hibridoma 3F11,4G5, 11E2 y 9D4 para mas analisis.
Ejemplo 2: Caracterizacion estructural de anticuerpos monoclonales humanos 3F11, 4G5, 11E2 y 9D4
Las secuencias de ADNc que codifican para las regiones variables de cadena ligera y pesada de los anticuerpos monoclonales 3F11, 4G5, 11E2 y 9D4, se obtuvieron de los hibridomas 3F11, 4G5, 11E2 y 9D4, respectivamente, usando tecnicas estandar de PCR, y se secuenciaron usando tecnicas estandar de secuenciacion de ADN.
Las secuencias de nucleotidos y de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada de 3F11 se muestran en la figura 1A y en SEQ ID NO: 33 y 25, respectivamente.
Las secuencias de nucleotidos y de aminoacidos de la region variable de la cadena ligera de 3F11 se muestran en la figura 1B y en SEQ ID NO: 37 y 29, respectivamente.
La comparacion de la secuencia de inmunoglobulina de la cadena pesada de 3F11 con las secuencias conocidas de cadena pesada de inmunoglobulina de la llnea germinal humana, demostro que la cadena pesada de 3F11 usa un segmento VH de VH 4-34 de la llnea germinal humana, un segmento D indeterminado, y un segmento JH de JH 6b de la llnea germinal humana. La alineacion de la secuencia de VH de 3F11 con la secuencia de VH 4-34 de la llnea germinal, se muestra en la figura 5. Otro analisis de la secuencia de VH de 3F11 usando el sistema de Kabat de determination de la region CDR, llevo al delineamiento de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada, como se muestra en las figuras 1A y 5 y en las SEQ ID NO: 1, 5 y 9, respectivamente.
La comparacion de la secuencia de inmunoglobulina de la cadena ligera de 3F11 con las secuencias conocidas de cadena ligera de inmunoglobulina de la llnea germinal humana, demostro que la cadena ligera de 3F11 usa un segmento VL de VK L18 de la llnea germinal humana y un segmento JK de JK5 de la llnea germinal humana. La alineacion de la secuencia de VL de 3F11 con la secuencia de VK L18 de la llnea germinal, se muestra en la figura 8. Otro analisis de la secuencia de VL de 3F11 usando el sistema de Kabat de determinacion de la region CDR, llevo al delineamiento de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera, como se muestra en las figuras 1B y 8 y en las SEQ ID NO: 13, 17 y 21, respectivamente.
Las secuencias de nucleotidos y de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada de 4G5 se muestran en la figura 2A y en SEQ ID NO: 34 y 26, respectivamente.
Las secuencias de nucleotidos y de aminoacidos de la region variable de la cadena ligera de 4G5 se muestran en la figura 2B y en SEQ ID NO: 38 y 30, respectivamente.
La comparacion de la secuencia de inmunoglobulina de la cadena pesada de 4G5 con las secuencias conocidas de
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cadena pesada de inmunoglobulina de la ilnea germinal humana, demostro que la cadena pesada de 4G5 usa un segmento VH de VH 4-34 de la llnea germinal humana, un segmento D indeterminado, y un segmento JH de JH 4b de la llnea germinal humana. La alineacion de la secuencia de VH de 4G5 con la secuencia de VH 4-34 de la llnea germinal, se muestra en la figura 6. Otro analisis de la secuencia de VH de 4G5 usando el sistema de Kabat de determinacion de la region CDR, llevo al delineamiento de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada, como se muestra en las figuras 2A y 6 y en las SEQ ID NO: 2, 6 y 10, respectivamente.
La comparacion de la secuencia de inmunoglobulina de la cadena ligera de 4G5 con las secuencias conocidas de cadena ligera de inmunoglobulina de la llnea germinal humana, demostro que la cadena ligera de 4G5 usa un segmento VL de VK L18 de la llnea germinal humana y un segmento JK de JK2 de la llnea germinal humana. La alineacion de la secuencia de VL de 4G5 con la secuencia de VK L18 de la llnea germinal, se muestra en la figura 9. Otro analisis de la secuencia de VL de 4G5 usando el sistema de Kabat de determinacion de la region CDR, llevo al delineamiento de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera, como se muestra en las figuras 2B y 9 y en las SEQ ID NO: 14, 18 y 22, respectivamente.
Las secuencias de nucleotidos y de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada de 11E2 se muestran en la figura 3A y en SEQ ID NO: 35 y 27, respectivamente.
Las secuencias de nucleotidos y de aminoacidos de la region variable de la cadena ligera de 11E2 se muestran en la figura 3B y en SEQ ID NO: 39 y 31, respectivamente.
La comparacion de la secuencia de inmunoglobulina de la cadena pesada de 11E2 con las secuencias conocidas de cadena pesada de inmunoglobulina de la llnea germinal humana, demostro que la cadena pesada de 11E2 se derivo del segmento VH de VH 5-51 de la llnea germinal humana (o es altamente similar al mismo), un segmento D indeterminado, y un segmento JH de JH 4b de la llnea germinal humana. La alineacion de la secuencia de VH de 11E2 con la secuencia de VH 5-51 de la llnea germinal, se muestra en la figura 7. Otro analisis de la secuencia de VH de 11E2 usando el sistema de Kabat de determinacion de la region CDR, llevo al delineamiento de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada, como se muestra en las figuras 3A y 7 y en las SEQ ID NO: 3, 7 y 11, respectivamente.
La comparacion de la secuencia de inmunoglobulina de la cadena ligera de 11E2 con las secuencias conocidas de cadena ligera de inmunoglobulina de la llnea germinal humana, demostro que la cadena ligera de 11E2 usa un segmento VL de VK A27 de la llnea germinal humana y un segmento JK de JK5 de la llnea germinal humana. La alineacion de la secuencia de VL de 11E2 con la secuencia de VK A27 de la llnea germinal, se muestra en la figura 10. Otro analisis de la secuencia de VL de 11E2 usando el sistema de Kabat de determinacion de la region CDR, llevo al delineamiento de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera, como se muestra en las figuras 3B y 10 y en las SEQ ID NO: 15, 19 y 23, respectivamente.
Las secuencias de nucleotidos y de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada de 9D4 se muestran en la figura 4A y en SEQ ID NO: 36 y 28, respectivamente.
Las secuencias de nucleotidos y de aminoacidos de la region variable de la cadena ligera de 9D4 se muestran en la figura 4B y en SEQ ID NO: 40 y 32, respectivamente.
La comparacion de la secuencia de inmunoglobulina de la cadena pesada de 9D4 con las secuencias conocidas de cadena pesada de inmunoglobulina de la llnea germinal humana, demostro que la cadena pesada de 9D4 se derivo del segmento VH de VH 5-51 de la llnea germinal humana (o es altamente similar al mismo), un segmento D indeterminado, y un segmento JH de JH 4b de la llnea germinal humana. La alineacion de la secuencia de VH de 9D4 con la secuencia de VH 5-51 de la llnea germinal, se muestra en la figura 7. Otro analisis de la secuencia de VH de 9D4 usando el sistema de Kabat de determinacion de la region CDR, llevo al delineamiento de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada, como se muestra en las figuras 4A y 7 y en las SEQ ID NO: 4, 8 y 12, respectivamente.
La comparacion de la secuencia de inmunoglobulina de la cadena ligera de 9D4 con las secuencias conocidas de cadena ligera de inmunoglobulina de la llnea germinal humana, demostro que la cadena ligera de 9D4 usa un segmento VL de VK A27 de la llnea germinal humana y un segmento JK de JK5 de la llnea germinal humana. La alineacion de la secuencia de VL de 9D4 con la secuencia de VK A27 de la llnea germinal, se muestra en la figura 10. Otro analisis de la secuencia de VL de 9D4 usando el sistema de Kabat de determinacion de la region CDR, llevo al delineamiento de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera, como se muestra en las figuras 3B y 10 y en las SEQ ID NO: 16, 20 y 24, respectivamente.
Ejemplo 3: Los anticuerpos monoclonales humanos anti-IFNAR-1, inhiben la actividad biologica del interferon a2b
La llnea de celulas de Daudi, derivada de un linfoma de Burkitt de linfoblastos B humanos, expresa altos niveles del IFNAR-1, y el crecimiento de estas celulas es inhibido por los interferones tipo I. Para medir la capacidad de bloqueo
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funcional de los anticuerpos anti-IFNAR-1 humanos se realizaron dos pruebas diferentes, una prueba de proliferacion de celulas y una prueba de indicador.
En la primera prueba, las celulas de Daudi se cultivaron con interferon a2b en presencia o ausencia de anticuerpos, y se midio la proliferacion por captacion de 3[H]-timidina. Las celulas de Daudi (ATCC CCL-213) se desarrollaron en RPMI que contenla FCS a 10 % y beta-mercaptoetanol a 2 mM (medio). Las celulas se centrifugaron y se resuspendieron a una concentracion de 1 x 106 celulas/ml en medio con albumina de suero humano a 1 % anadida (medio y HS). A cada cavidad de una placa de 96 cavidades, se anadieron 100 ml de 200 U/ml de interferon a2b (Schering Corporation) que contenla la concentracion adecuada de anticuerpos. Se anadieron a las cavidades 100 ml de celulas de Daudi en medio y HS, y las placas se incubaron por 48 horas a 37 °C. Las placas se pulsaron con 1 mCi de 3[H]-timidina y se incubaron por otras 24 horas. Las placas se cosecharon, se colectaron sobre una placa con filtro de fibra de 96 cavidades, y se contaron usando un contador de centelleo TopCount (Packard). Los conteos por minuto se graficaron como una funcion de la concentracion de anticuerpos, y los datos se analizaron por regresion no lineal, respuesta a la dosis sigmoidal (pendiente variable), usando el software Prism (San Diego, CA).
En la segunda prueba, se transfecto a celulas U937 con una construccion en la cual un elemento de respuesta estimulado por interferon fue enlazado a un gen indicador (ISRE-RG), y se midio la capacidad de los anticuerpos anti-IFNAR-1 humanizados para bloquear la expresion del gen indicador inducida por el IFN. Las celulas se desarrollaron en RPMI que contenla FCS a 10 % y beta-mercaptoetanol a 2 mM (medio). Las celulas (1 x 106 celulas/ml) se resuspendieron en el medio con suero humano a 2 % anadido. Se anadieron 100 ml de las celulas a una placa de 96 cavidades. Los anticuerpos se diluyeron en serie en medios que contenlan 200 U/ml de interferon a2b (Schering Corporation), y se anadieron 100 ml a cada cavidad. Las placas se incubaron durante la noche a 37 °C. Despues de esta incubacion, se evaluo la expresion del gen indicador por citometrla de flujo. Se grafico la intensidad de fluorescencia media geometrica como una funcion de la concentracion de anticuerpos, y los datos se analizaron por regresion no lineal, respuesta a la dosis sigmoidal (pendiente variable), usando el software Prism (San Diego, CA).
Mediante el uso de las dos pruebas descritas anteriormente, se comparo la potencia del anticuerpo monoclonal humano 3F11 con el anticuerpo anti-IFNAR-1 de murino 64G12 (numero de deposito de ECACC 92022605), y con el anticuerpo anti-IFNAR-1 humanizado DI H3K1 (descrito ademas en la solicitud de patente provisional de E.U.A. N.° 60/465.058, cuya prioridad se reivindica por el documento WO 2004/094473). La potencia de 3F11 mostro una potencia 5 a 10 veces mayor que el anticuerpo de raton, y una potencia 6 a 30 veces mayor que el anticuerpo humanizado. Los resultados se resumen en el cuadro 1 siguiente:
Tabla 1 Capacidad de bloqueo del anticuerpo anti-IFNAR-1 humano sobre el IFN alfa 2b
Isotipo Proliferacion de celulas (Daudi) CE50 (nM) Indicador ISRE-RG (U937) CE50 (nM)
64G12
m IgG1 3,1 6,0
DI H3K1
h IgG1 9,3 8,0
3F11
h IgG1 0,3 1,2
Ejemplo 4: Los anticuerpos monoclonales humanos anti-IFNAR-1 inhiben la actividad biologica del IFN omega
Mediante el uso de la prueba de proliferacion de celulas de Daudi descrita anteriormente en el ejemplo 3, se puso a prueba la capacidad de los anticuerpos anti-IFNAR-1 humanos para inhibir las respuestas del IFN omega. A cada cavidad de una placa de 96 cavidades, se anadieron 100 ml de 200 U/ml de interferon omega (PBL) que contenla la concentracion adecuada de anticuerpos. Los anticuerpos humanos 3F11, 4G5, 11E2 y 9D4 fueron 4 a 18 veces mas potentes (segun se mide por CE50), que el anticuerpo 64G12 de raton. Los resultados se resumen en el cuadro 2 siguiente:
Tabla 2 Capacidad de bloqueo del anticuerpo anti-IFNAR-1 humano sobre el IFN omega
Isotipo Proliferacion de celulas (Daudi) CE50 (nM)
64G12
m IgG1 5,5
DI H3K1
h IgG1 30,7
3F11
h IgG1 0,6
4G5
h IgG1 1,4
11E2
h IgG1 0,3
9D4
h IgG1 0,3
5
10
15
20
25
30
35
40
Ejemplo 5: Los anticuerpos monoclonales humanos anti-IFNAR-1 inhiben la actividad biologica de IFN tipo I multiples
Como se describio en el ejemplo 3, el interferon alfa inhibe la proliferacion de celulas de Daudi (linfoma de Burkitt, ATCC # CCL-213) en una forma dependiente de la dosis. Un anticuerpo neutralizante, que bloquee la union del interferon a su receptor, restaurara la proliferacion. Mediante el uso de esta prueba de proliferacion de celulas, se examino la especificidad de los anticuerpos anti-IFN alfa humanos purificados, mediante la realizacion de pruebas para el bloqueo de IFNa linfoblastoide natural, interferon natural de leucocitos, 13 subtipos de IFN alfa recombinante, IFN beta e IFN omega.
Se desarrollaron celulas de Daudi en medio de cultivo (RPMI 1640 complementado con FCS a 10 %, 1 x 2-ME, L- glutamina y penicilina-estreptomicina) con y sin la adicion de IFNa en una placa de cultivo de celulas de 96 cavidades de fondo plano. Cada interferon tipo I se puso a prueba a CE5o, y se mezclo con una titulacion gradual doble de anticuerpo anti-IFNAR-1 3F11, normalmente de 50 mg/ml (312 nM) a 381 pg/ml (2,4 pM). La mezcla de anticuerpos/IFN se anadio a las celulas de Daudi en una placa de 96 cavidades de fondo plano a una densidad final de 1 x 104 de celulas de Daudi/100 ml/cavidad, y se incubo a 37 °C, CO2 a 5 %, por 72 horas. Se puso a prueba la proliferacion con la adicion de MTS (Promega), 20 ul/cavidad, y se midio la DO a 490 nm despues de otras 3 horas de incubacion. El numero de celulas viables fue proporcional a la lectura de DO. Se calculo el porcentaje de bloqueo del interferon respecto a la proliferacion de celulas de Daudi en ausencia de IFN (=100 % de bloqueo) y en presencia de IFN solo (=0 % de bloqueo). El anticuerpo 3F11 se evaluo de acuerdo al grado de bloqueo, resultando en un perfil de especificidad del subtipo de IFNa. Los resultados demostraron que el anticuerpo del receptor 1 anti-interferon alfa humano 3F11, inhibe la accion de subtipos multiples de interferon alfa, que incluyen IFNa 6, 2b, 2a, 1, 16, 10, 8, 5, 14,17, 7, 4 y 21, as! como IFN linfoblastoide, IFN de leucocitos e IFN omega. 3F11 es un inhibidor de menor nivel de IFN beta, aunque se observo inhibicion mayor de 50 %. El % de bloqueo y la desviacion estandar del interferon, se muestran en el cuadro 3 siguiente:
Tabla 3 Inhibicion de interferones tipo I multiples por anticuerpos
Bloqueo del IFN por 3F11 ( %) a 1000 x Ab
IFN
media desviacion estandar
IFN linfoblastoide
94,9 2,9
IFNa 6
107,1 6,6
IFNa 2b
101,9 0,4
IFNa 2a
103,1 3,0
IFNa 1
111,6 1,9
IFN de leucocitos
109,4 1,4
IFNa 16
105,7 1,4
IFNa 10
96,7 5,5
IFNa 8
87,5 2,6
IFNa 5
105,1 3,9
IFNa 14
100,3 1,4
IFNa 17
99,8 2,4
IFNa 7
102,8 3,2
IFNa 4
100,5 2,5
IFNa 21
104,4 2,3
IFN-beta
53,0 1,7
IFN-omega
107,1 1,3
Ejemplo 6: Inhibicion de la secrecion de IP-10 inducida por IFN por anticuerpos anti-IFNAR-1
Se ha mostrado que la adicion de IFN alfa 2b a medios de cultivo de celulas, induce la secrecion de IP-10 por celulas mononucleares de sangre periferica (PBMNC) normales. La actividad del anticuerpo anti-IFNAR-1 humano 3F11 se puso a prueba para la inhibicion de la secrecion de IP-10 inducida por interferon, por cultivos de PBMNC normales mediante una prueba de union por ELISA.
Se incubaron PBMNC en medio de cultivo (RPMI 1640 + FBS a 10 % + suero humano a 10 %) con IFN de leucocitos, IFN alfa 2b o IFN w por 24 a 48 horas. Se colectaron sobrenadantes, y se analizaron para concentracion de IP-10/CXCL10 usando un equipo de ELISA en sandwich cuantitativa (Quantikine®, R&D Systems) a una dilucion 1:30, de acuerdo a las recomendaciones del fabricante. Los resultados demostraron que el anticuerpo monoclonal humano 3F11 inhibe la secrecion de IP-10 inducida por IFN de leucocitos, IFNa2b recombinante e IFNw recombinante, por el cultivo de celulas PBMNC normales. Estos resultados se muestran en el cuadro 4:
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Tabla 4 Inhibicion por anticuerpos, de la expresion de IP-10 inducida por IFN en PBMNC normales
Tratamiento con
Sin IFN IFN de leucocitos IFN alfa 2b IP-10 IFN omega IP-10
Ab
IP-10 (pg/ml) IP-10 (pg/ml) (pg/ml) (pg/ml)
Sin anticuerpo
907 2665 2739 2904
3F11 (5 pg/ml)
387 854 745 674
Ig control (5 pg/ml)
838 3512 3117 3960
Se anadieron 100 U/ml de cada subtipo de IFN a los cultivos.
Ejemplo 7: Prueba de competencia cruzada de anticuerpos monoclonales humanos anti-IFNAR-1
Para evaluar si los anticuerpos monoclonales humanos se unen al mismo epltopo que el anticuerpo monoclonal 64G12 de raton, se uso una prueba de ELISA de competencia cruzada para determinar si los anticuerpos competlan por el mismo epltopo de union.
Se revistieron placas de 96 cavidades con IFNAR-1 humano soluble derivado de celulas CHO, a una concentracion de 1 pg/mL en DPBS recien preparado a 100 pl/cavidad (Mediatech). Se anadieron anticuerpos monoclonales humanos 3F11, 4G5, 11E2 y 9D4 a 20 pg/mL a las cavidades de la columna 1, y se diluyeron en serie a una relacion 1:2 en las cavidades de la columna 1 a la columna 12, seguido de incubacion por 45 minutos. Se anadio anticuerpo monoclonal de raton 64G12, a una concentracion CE75 de 0,3 pg/mL, a 50 pL por cavidad, y las placas se incubaron por 30 minutos. Las placas se lavaron tres veces con el lavador automatico de placas Elx 405 (BIO-TEK Instruments). Un anticuerpo de IgG anti-raton de cabra de F(ab')2 purificado por afinidad y peroxidasa (especlfico de Fcg) se diluyo 1:3000 en PBS, y se anadio como el conjugado de deteccion (Jackson ImmunoResearch Laboratories, no. de catalogo 115-036-0710). Despues de una hora de incubacion, las placas se lavaron 3 veces con el lavador automatico de placas Elx 405. Una solucion de ABTS (existencia de 800 pl de ABTS, 8 pl de H2O2 a 30 % y 100 mL de regulador de pH de fosfato-citrato) a 27,8 mg/mL se anadio a cada cavidad, y se incubo por 20 minutos. Las placas se leyeron a 415 nm usando 490 nm como longitud de onda de referencia. Los resultados se muestran en la figura 11. Los resultados demostraron que los anticuerpos monoclonales anti-IFNAR-1 humanos, 3F11, 4G5, 11E2 y 9D4, no compiten con 64G12 por la union al IFNAR-1, y de esta manera se unen a un epltopo diferente en el IFNAR- 1 que 64G12.
Ejemplo 8: Inhibicion por anticuerpos, del desarrollo de celulas dendrfticas mediado por plasma del LSE
El plasma del LSE induce desarrollo de celulas dendrlticas a partir de monocitos humanos normales. En este ejemplo, el anticuerpo anti-IFNAR-1 humano monoclonal purificado, 3F11, se puso a prueba para la inhibicion del desarrollo de celulas dendrlticas, y se evaluo por la capacidad de los anticuerpos para inhibir la induccion de marcadores de superficie celular cD38, MHC clase I y CD123, por plasma del LSE.
Se diluyeron 25 ml de cubierta amarilla cuatro veces con PBS. La muestra se separo en tubos conicos de 4 x 50 ml, y se estratificaron bajo los mismos 15 ml de medio de separation de linfocitos (ICN Biomedicals). Despues de centrifugation por 30 minutos a 500 x g, la cubierta amarilla que contenla a los PBMC se removio, y se lavo con PBS. Las celulas se resuspendieron en medio de cultivo a 4 x 106 celulas/ml. Los monocitos se aislaron incubando PBMC (2,0 x 107 celulas/5 ml/matraz de 25 cm2) por 1,5 horas a 37 °C en medio de cultivo, y entonces arrastrando con el lavado dos veces las celulas no adherentes. Despues del segundo lavado, las celulas se cultivaron en medios que contenlan suero humano a 1 % inactivado con calor. Se anadieron a los matraces de cultivo 25 % de plasma de pacientes con LSE mas/menos anticuerpos neutralizantes y controles de isotipos (30 pg/ml): se uso IFN alfa 2b (100 y 10 UI/ml) mas plasma humano normal a 25 %, como control positivo para la induccion de marcadores. Los matraces se incubaron a 37 °C, CO2 a 5 %, por tres a siete dlas. El medio acondicionado se cosecho de cada matraz, y las celulas en suspension se recuperaron por centrifugacion a 1000 rpm en un rotor Sorvall RTH-750. Las celulas transformadas a pellas se retuvieron sobre hielo, y el sobrenadante se congelo a -80 °C para ELISA. Las celulas adherentes se removieron del matraz con un lavado en PBS (2 ml), seguido de 15 minutos de incubacion en versene (3 ml), de ser necesario. El matraz se raspo al final de la incubacion en versene, y se enjuago finalmente con PBS (2 ml). Cada uno de los lavados en PBS y el versene se combinaron con las celulas recuperadas de la cosecha del medio acondicionado. La suspension de celulas agrupadas se centrifugo a 1000 rpm en un rotor Sorvall RTH-750, y la pella resultante se resuspendio en 300 pl en regulador de pH de tincion (PBS + EDTA a 0,1 M + FBS a 2 % + HS a 1 %), y se dispensaron 100 pl/cavidad en una placa de 96 cavidades de fondo en V. La placa se centrifugo por impulsos a 2800 rpm en un rotor Sorvall RTH-750, y las celulas transformadas a pellas se resuspendieron 25 pl/cavidad en anticuerpos marcados con fluorocromo, de la manera siguiente: (1) anti-MHC I- FITC de raton + anti-CD38-PE de raton, y (2) controles de isotipos, IgG-FITC de raton + IgG-PE de raton. La placa se incubo en hielo por 45 minutos, y se protegio de la luz. Las celulas se lavaron tres veces con la adicion de 200 pl de regulador de pH de tincion, seguido de centrifugacion por impulsos, y finalmente se resuspendieron en 200 pl de paraformaldehldo a 2 % en PBS. La tincion de celulas dendrlticas se analizo por citometrla de flujo con el FACScalibur™ de Becton Dickinson. Se trazaron compuertas en la grafica de dispersion hacia delante contra dispersion lateral, para remover las celulas contaminantes del analisis. El anticuerpo monoclonal humano anti- IFNAR-1 3F11 inhibe el proceso de desarrollo de celulas dendrlticas dependiente de IFN alfa, segun se demuestra
5
10
15
20
25
por la expresion normalizada de marcadores de superficie celular MHC clase I, CD38 y CD123 en presencia de 3F11. Los resultados se muestran a continuacion en el cuadro 5, en donde (A) y (B) resumen los resultados de dos muestras representativas de donadores con LSE.
Tabla 5: Inhibicion de la maduracion de celulas dendrfticas
Plasma del donador #40* (13,3 UI/mL**)
Condiciones de cultivo MHC clase I CD123 CD38
0 IFN/mL 10 IFN/mL 100 IFN/mL 0 3F11 HulgG1 (control de isotipos)
MFI MFI MFI
148
14 40
200
19 44
229
26 63
206
22 47
115
13 32
194
22 62
(B)
Plasma del donador #59* (75,3 UI/mL**)
Condiciones de cultivo MHC clase I CD123 CD38
0 IFN/mL 10 IFN/mL 100 IFN/mL 0 3F11 HulgG1 (control de isotipos)
229
11 58
271
12 86
294
13 112
202
15 62
112
8 22
266
14 55
Ejemplo 9: Analisis de Scatchard de la union de anticuerpos humanos anti-IFNAR-1 a celulas de Daudi o celulas mononucleares de sangre periferica humanas
Se prepararon celulas mononucleares de sangre periferica humanas a partir de sangre fresca por medio de protocolos estandar, usando separacion con Ficol. Se obtuvieron celulas de Daudi de ATCC, y se desarrollaron en RPMI que contenla suero de bovino fetal (FBS) a 10 %. Las celulas se lavaron dos veces con RPMI que contenla FBS a 10 % a 4 grados, y las celulas se ajustaron a 4 x 107 celulas/ml en medio del RPMI que contenla suero de bovino fetal a 10 % (regulador de pH de union). Se revistieron placas Millipore (MAFB NOB) con leche desgrasada en polvo a 1 % en agua, y se almacenaron a 4 °C durante la noche. Las placas se lavaron con regulador de pH de union, y a las cavidades control se anadieron 25 ml de anticuerpo no marcado (exceso de 1000 veces) en regulador de pH de union, en una placa con filtro de fibra de vidrio de 96 cavidades Millipore (NBS de union no especlfica). Se anadieron veinticinco microlitros de regulador de pH solo a la cavidad control de union maxima (union total). Se anadieron veinticinco microlitros de concentracion variable de anticuerpo 125I-anti-I FNAR-1 y 25 ml de celulas de Daudi o celulas mononucleares de sangre periferica humanas (4 x 107 celulas/ml) en regulador de pH de union. Las placas se incubaron por 2 horas a 200 RPM en un agitador a 4 °C. Al termino de la incubacion, las placas Millipore se lavaron dos veces con 0,2 ml de regulador de pH de union frlo. Los filtros se removieron y se contaron en un contador gamma. Se realizo evaluacion de la union en equilibrio usando parametros de union de sitio individual con el software Prism (San Diego, CA).
Mediante el uso de la prueba de Scatchard de union anterior, la Kd del anticuerpo para celulas de Daudi y para celulas mononucleares de sangre periferica humanas, fue de aproximadamente 0,2 nM y 0,5 nM, respectivamente.
RESUMEN DEL LISTADO DE SECUENCIAS
SEQ ID NO:
SECUENCIA SEQ ID NO: SECUENCIA
1
VH CDR1 a.a. 3F11 21 VK CDR3 a.a. 3F11
2
VH CDR1 a.a. 4G5 22 VK CDR3 a.a. 4G5
3
VH CDR1 a.a. 11E2 23 VK CDR3 a.a. 11E2
4
VH CDR1 a.a. 9D4 24 VK CDR3 a.a. 9D4
5
VH CDR2 a.a. 3F11 25 VH a.a. 3F11
6
VH CDR2 a.a. 4G5 26 VH a.a. 4G5
5
10
15
20
25
30
7
VH CDR2 a.a. 11E2 27 VH a.a. 11E2
8
VH CDR2 a.a. 9D4 28 VH a.a. 9D4
9
VH CDR3 a.a. 3F11 29 VK a.a. 3F11
10
VH CDR3 a.a. 4G5 30 VK a.a. 4G5
11
VH CDR3 a.a. 11E2 31 VK a.a. 11E2
12
VH CDR3 a.a. 9D4 32 VK a.a. 9D4
13
VK CDR1 a.a. 3F11 33 VH n.t. 3F11
14
VK CDR1 a.a. 4G5 34 VH n.t. 4G5
15
VK CDR1 a.a. 11E2 35 VH n.t. 11E2
16
VK CDR1 a.a. 9D4 36 VH n.t. 9D4
17
VK CDR2 a.a. 3F11 37 VK n.t. 3F11
18
VK CDR2 a.a. 4G5 38 VK n.t. 4G5
19
VK CDR2 a.a. 11E2 39 VK n.t. 11E2
20
VK CDR2 a.a. 9D4 40 VK n.t. 9D4
41
VH 4-34 llnea germinal a.a.
42
VH 5-51 llnea germinal a.a.
43
VK L18 llnea germinal a.a.
44
Vk A27 llnea germinal a.a.
La presente divulgacion se refiere adicionalmente a las siguientes realizaciones:
1. Un anticuerpo humano monoclonal aislado, o una porcion de union a antlgeno del mismo, que se une especlficamente al receptor 1 de interferon alfa humano (IFNAR-1), en el que el anticuerpo presenta una o mas de las siguientes propiedades:
a) se une a IFNAR1 con una KD de 1 * 10-7 M o mayor afinidad;
b) inhibe la actividad biologica de multiples interferones de tipo I;
c) inhibe la actividad de IFN a2b en un ensayo de proliferacion de celulas de Daudi;
d) inhibe la actividad de IFN omega en un ensayo de proliferacion de celulas de Daudi;
e) inhibe la secrecion de IP-10 por las celulas mononucleares de la sangre periferica inducida por IFN a2b;
f) inhibe la secrecion de IP-10 por las celulas mononucleares de la sangre periferica inducida por IFN omega;
g) inhibe el desarrollo de celulas dendrlticas mediado por plasma del lupus eritematoso sistemico; y
h) se une a un epltopo diferente del anticuerpo monoclonal murino 64G12 (numero de deposito de ECACC 92022605).
2. El anticuerpo de la realizacion 1, en el que el anticuerpo se une al receptor 1 de interferon alfa humano con una Kd de 1 * 10"8 M o mayor afinidad.
3. El anticuerpo de la realizacion 1, en el que el anticuerpo se une al receptor 1 de interferon alfa humano con una Kd de 1 * 10-9 M o mayor afinidad.
4. Un anticuerpo monoclonal aislado, o porcion de union a antlgeno del mismo, en el que el anticuerpo compite de forma cruzada por la union al receptor 1 de interferon alfa humano con un anticuerpo de referencia, en el que el anticuerpo de referencia se selecciona entre el grupo que consiste en:
a) un anticuerpo que comprende una region variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 25; y una region variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 29;
b) un anticuerpo que comprende una region variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 26; y una region variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 30;
c) un anticuerpo que comprende una region variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
aminoacidos de la SEQ ID NO: 27; y una region variable aminoacidos de la SEQ ID NO: 31; y
d) un anticuerpo que comprende una region variable de aminoacidos de la SEQ ID NO: 28; y una region variable aminoacidos de la SEQ ID NO: 32.
5. El anticuerpo monoclonal aislado, o una porcion de union a antlgeno del mismo, de la realizacion 1, que comprende una region variable de la cadena pesada que es el producto o derivado de un gen de Vh 4-34 o 5-51 humano.
6. El anticuerpo monoclonal aislado, o una porcion de union a antlgeno del mismo, de la realizacion 1, que comprende una region variable de la cadena ligera que es el producto o derivado de un gen Vk L18 o A27 humano.
7. El anticuerpo monoclonal aislado humano, o porcion de union a antlgeno del mismo, de la realizacion 5, que comprende: una region variable de la cadena ligera que es el producto o derivado de un gen Vk L18 o A27 humano.
8. El anticuerpo de la realizacion 7, que comprende una region variable de la cadena pesada de un gen Vh 4-34 humano y una region variable de la cadena ligera de un gen Vk L18 humano.
9. El anticuerpo de la realizacion 7, que comprende una region variable de la cadena pesada de un gen Vh 5-51 humano y una region variable de la cadena ligera de un gen Vk A27 humano.
10. El anticuerpo de la realizacion 2, que comprende:
(a) una CDR1 de la region variable de la cadena pesada humana que comprende la SEQ ID NO: 1;
(b) una CDR2 de la region variable de la cadena pesada humana que comprende la SEQ ID NO: 5;
(c) una CDR3 de la region variable de la cadena pesada humana que comprende la SEQ ID NO: 9;
(d) una CDR1 de la region variable de la cadena ligera humana que comprende la SEQ ID NO: 13;
(e) una CDR2 de la region variable de la cadena ligera humana que comprende la SEQ ID NO: 17; y
(f) una CDR3 de la region variable de la cadena ligera humana que comprende la SEQ ID NO: 21.
11. El anticuerpo de la realizacion 2, que comprende:
(a) una CDR1 de la region variable de la cadena pesada humana que comprende la SEQ ID NO: 2;
(b) una CDR2 de la region variable de la cadena pesada humana que comprende la SEQ ID NO: 6;
(c) una CDR3 de la region variable de la cadena pesada humana que comprende la SEQ ID NO: 10;
(d) una CDR1 de la region variable de la cadena ligera humana que comprende la SEQ ID NO: 14;
(e) una CDR2 de la region variable de la cadena ligera humana que comprende la SEQ ID NO: 18; y
(f) una CDR3 de la region variable de la cadena ligera humana que comprende la SEQ ID NO: 22.
12. El anticuerpo de la realizacion 2, que comprende:
(a) una CDR1 de la region variable de la cadena pesada humana que comprende la SEQ ID NO: 4;
(b) una CDR2 de la region variable de la cadena pesada humana que comprende la SEQ ID NO: 8;
(c) una CDR3 de la region variable de la cadena pesada humana que comprende la SEQ ID NO: 12;
(d) una CDR1 de la region variable de la cadena ligera humana que comprende la SEQ ID NO: 16;
(e) una CDR2 de la region variable de la cadena ligera humana que comprende la SEQ ID NO: 20; y
(f) una CDR3 de la region variable de la cadena ligera humana que comprende la SEQ ID NO: 24.
13. El anticuerpo de la realizacion 2, que comprende:
(a) una CDR1 de la region variable de la cadena pesada humana que comprende la SEQ ID NO: 4;
(b) una CDR2 de la region variable de la cadena pesada humana que comprende la SEQ ID NO: 8;
(c) una CDR3 de la region variable de la cadena pesada humana que comprende la SEQ ID NO: 12;
(d) una CDR1 de la region variable de la cadena ligera humana que comprende la SEQ ID NO: 16;
(e) una CDR2 de la region variable de la cadena ligera humana que comprende la SEQ ID NO: 20; y
(f) una CDR3 de la region variable de la cadena ligera humana que comprende la SEQ ID NO: 24.
14. El anticuerpo de la realizacion 2, que comprende:
(a) una region variable de la cadena pesada humana que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 25; y
(b) una region variable de la cadena ligera humana que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 29.
de la cadena ligera que comprende la secuencia de
la cadena pesada que comprende la secuencia de de la cadena ligera que comprende la secuencia de
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65
15. El anticuerpo de la realizacion 2, que comprende:
(a) una region variable de la cadena pesada humana que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 26; y
(b) una region variable de la cadena ligera humana que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 30.
16. El anticuerpo de la realizacion 2, que comprende:
(a) una region variable de la cadena pesada humana que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 27; y
(b) una region variable de la cadena ligera humana que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 31.
17. El anticuerpo de la realizacion 2, que comprende:
(a) una region variable de la cadena pesada humana que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 28; y
(b) una region variable de la cadena ligera humana que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 32.
18. El anticuerpo humano de la realizacion 1, en el que dicho anticuerpo no se une al mismo epltopo que el anticuerpo monoclonal murino 64G12 (numero de deposito de ECACC 92022605).
19. Una composicion que comprende al anticuerpo, o porcion de union a antlgeno del mismo, de la realizacion 1, y un vehlculo farmaceuticamente aceptable.
20. Un inmunoconjugado que comprende al anticuerpo, o porcion de union a antlgeno del mismo, de la realizacion 1, unido a un agente terapeutico.
21. El inmunoconjugado de la realizacion 20, que ademas comprende un vehlculo farmaceuticamente aceptable.
22. El inmunoconjugado de la realizacion 20, en el que el agente terapeutico es una citotoxina.
23. El inmunoconjugado de la realizacion 22 que ademas comprende un vehlculo farmaceuticamente aceptable.
24. El inmunoconjugado de la realizacion 20, en el que el agente terapeutico es un isotopo radiactivo.
25. El inmunoconjugado de la realizacion 24 que ademas comprende un vehlculo farmaceuticamente aceptable.
26. Una molecula biespeclfica que comprende al anticuerpo, o porcion de union a antlgeno del mismo, de una cualquiera de las realizaciones 1-18, unido a un segundo resto funcional que tiene una especificidad de union distinta a la de dicho anticuerpo, o porcion de union a antlgeno del mismo.
27. Una composicion que comprende la molecula biespeclfica de la realizacion 26, y un vehlculo farmaceuticamente aceptable.
28. Una molecula aislada de acido nucleico que codifica al anticuerpo, o porcion de union a antlgeno del mismo, de una cualquiera de las realizaciones 1-18.
29. Un vector de expresion que comprende la molecula de acido nucleico de la realizacion 28.
30. Una celula hospedadora que comprende al vector de expresion de la realizacion 29.
31. Un raton transgenico que comprende transgenes de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina humana, en el que el raton expresa el anticuerpo de una cualquiera de las realizaciones 1-18.
32. Un hibridoma preparado a partir del raton de la realizacion 31, en el que el hibridoma produce dicho anticuerpo.
33. Un metodo para preparar un anticuerpo anti-IFNAR-1 que comprende:
(a) proporcionar: (i) una secuencia de anticuerpo de region variable de cadena pesada que comprende una secuencia de CDR1 que se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1, 2, 3 y 4, una secuencia de CDR2 que se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 5, 6, 7 y 8; y una secuencia de CDR3 que se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 9, 10, 11, y 12; o (ii) una secuencia de anticuerpo de region variable de cadena ligera que comprende una secuencia de CDR1 que se selecciona entre

Claims (18)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
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    REIVINDICACIONES
    1. Un anticuerpo monoclonal aislado, o una porcion de union a antlgeno del mismo, en donde el anticuerpo, una o porcion de union a antlgeno del mismo, compite de forma cruzada por la union al receptor 1 de interferon alfa humano con un anticuerpo de referencia, o una porcion de union a antlgeno de referencia del mismo, en donde el anticuerpo de referencia, o una porcion de union a antlgeno de referencia del mismo, se selecciona entre el grupo que consiste en:
    a) un anticuerpo, o una porcion de union a antlgeno del mismo, que comprende una region variable de la pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 25, y una region variable de la ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 29;
    b) un anticuerpo, o una porcion de union a antlgeno del mismo, que comprende una region variable de la pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 28, y una region variable de la ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 32;
    en donde el anticuerpo de competencia cruzada o la porcion de union a antlgeno del mismo comprenden:
    i) una CDR3 de la region variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 9, y una CDR3 de la region variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO : 21; o
    ii) una CDR3 de la region variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 12, y una CDR3 de la region variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 24.
  2. 2. El anticuerpo de competencia cruzada o la porcion de union a antlgeno del mismo de la reivindicacion 1, que comprenden:
    a) una CDR2 de la region variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 5, y una CDR2 de la region variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 17; o
    b) una CDR2 de la region variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 8, y una CDR2 de la region variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 20.
  3. 3. El anticuerpo de competencia cruzada o la porcion de union a antlgeno del mismo de las reivindicaciones 1 o 2, que comprenden:
    a) una CDR1 de la region variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1, y una CDR1 de la region variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 13; o
    b) una CDR1 de la region variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 4, y una CDR1 de la region variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 16.
  4. 4. El anticuerpo de competencia cruzada o la porcion de union a antlgeno del mismo de la reivindicacion 1, que es un anticuerpo humano o una porcion del mismo.
  5. 5. El anticuerpo de competencia cruzada o la porcion de union a antlgeno del mismo de la reivindicacion 1, que es un anticuerpo humanizado o una porcion del mismo.
  6. 6. El anticuerpo de competencia cruzada o la porcion de union a antlgeno del mismo de la reivindicacion 1, que es un anticuerpo quimerico o una porcion del mismo.
  7. 7. Un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo de competencia cruzada, o una porcion de union a antlgeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 unido a un agente terapeutico.
  8. 8. El inmunoconjugado de la reivindicacion 7, en el que el agente terapeutico es una citotoxina o un isotopo radioactivo.
  9. 9. Una molecula biespeclfica que comprende el anticuerpo de competencia cruzada, o una porcion de union a antlgeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, unido a un segundo resto funcional que tiene una especificidad de union diferente de la del anticuerpo de competencia cruzada, o de una porcion de union a antlgeno del mismo.
    cadena
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    cadena
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    5
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    35
  10. 10. Una composicion que comprende:
    a) el anticuerpo de competencia cruzada, o una porcion de union a antigeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, o
    b) el inmunoconjugado de la reivindicacion 7 o de la reivindicacion 8, o
    c) la molecula biespecifica de la reivindicacion 9;
    y un vehiculo farmaceuticamente aceptable.
  11. 11. Una molecula de acido nucleico aislada que codifica el anticuerpo de competencia cruzada, o una porcion de union a antigeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6.
  12. 12. Un vector de expresion que comprende la molecula de acido nucleico de la reivindicacion 11.
  13. 13. Una celula hospedadora que comprende el vector de expresion de la reivindicacion 12.
  14. 14. Un raton transgenico que comprende transgenes de cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina humana, en donde el raton expresa el anticuerpo de competencia cruzada de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6.
  15. 15. Un hibridoma preparado a partir del raton de la reivindicacion 14, en donde el hibridoma produce el anticuerpo.
  16. 16. Un metodo in vitro para la inhibicion de la actividad biologica de un interferon de tipo I en una celula que expresa receptor 1 de interferon alfa, que comprende poner en contacto la celula con el anticuerpo de competencia cruzada, o una porcion de union a antigeno del mismo, de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, de manera que se inhiba la actividad biologica del interferon de tipo I.
  17. 17. El anticuerpo de competencia cruzada, o una porcion de union a antigeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 para su uso en un metodo de tratamiento de una enfermedad o un trastorno mediados por interferon de tipo I.
  18. 18. El anticuerpo de competencia cruzada, o una porcion de union a antigeno del mismo, para el uso de la reivindicacion 17, en donde la enfermedad mediada por interferon de tipo I es una enfermedad mediada por interferon alfa; o en donde la enfermedad o el trastorno se seleccionan entre lupus eritematoso sistemico, diabetes mellitus insulinodependiente, enfermedad inflamatoria del intestino, esclerosis multiple, psoriasis, tiroiditis autoinmune, artritis reumatoide, glomerulonefritis, infeccion por VIH, SIDA, rechazo de trasplante y enfermedad de injerto contra hospedador.
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