PT1914244E

PT1914244E - Processo para regular a actividade de moléculas funcionais sob o ponto de vista imunológico

Info

Publication number: PT1914244E
Application number: PT80022668T
Authority: PT
Inventors: Kazuyasu Nakamura; Nobuo Hanai; Motoo Yamasaki; Kazuhisa Uchida; Toyohide Shinkawa; Susumu Imabeppu; Yutaka Kanda; Naoko Yamane; Hideharu Anazawa
Original assignee: Kyowa Hakko Kirin Co Ltd
Priority date: 1999-04-09
Filing date: 2000-04-07
Publication date: 2013-07-26
Also published as: PT1176195E; DK2278003T3; ES2420835T3; EP1176195A1; EP2278003B1; NL300939I2; US7214775B2; EP2275540A3; ES2569919T3; US20070166300A1; ES2568899T3; CA2369292C; EP1914244A2; EP2275541A2; US7655228B2; ES2574826T3; EP2270147A3; CA2704600C; JP2009171976A; US7687061B2

Description

DESCRIÇÃO

PROCESSO PARA REGULAR A ACTIVIDADE DE MOLÉCULAS FUNCIONAIS SOB O PONTO DE VISTA IMUNOLÓGICO

ÂMBITO TÉCNICO A presente memória descritiva descreve um processo para controlar a actividade de uma molécula, funcional sob o ponto de vista imunológico, tal como um anticorpo, uma proteína ou um péptido e um agente de promoção da actividade de uma molécula funcional sob o ponto de vista imunológico. A presente invenção tem por objecto uma molécula funcional sob o ponto de vista imunológico que tenha essa actividade estimulada, bem como um medicamento e um agente que compreende a referida molécula.

TÉCNICA ANTERIOR

Uma vez que os anticorpos têm elevada actividade de ligação, especificidade de ligação e uma elevada estabilidade no sangue, tem sido tentada a sua aplicação no diagnóstico, prevenção e tratamento de várias doenças humanas (Monoclonal Antibodies: Principies and Applications, Wiley-Liss, Inc., capítulo 2.1 (1995)). No entanto, um anticorpo derivado de um animal, que não seja um ser humano, tal como um anticorpo de rato, é reconhecido como um material estranho, quando administrado a um ser humano, o que vai assim induzir um anticorpo humano contra o anticorpo de rato (anticorpo humano anti-rato: referido a seguir como "AHAR") no corpo humano e é sabido que o AHAR provoca efeitos secundários através da reacção com o 1 anticorpo de rato administrado (J. Clin. Oncol., 2, 881 (1984); Blood, 65, 1349 (1985); J. Natl. Comm., 80, 932 (1988) ; Proc. Natl. Acad. Sei., U.S.A., 82, 1242 (1985)), promove o desaparecimento, do sangue, do anticorpo de rato administrado (J. Nuc. Med., 26, 1011 (1985); Blood, 65, 1349 (1985); J. Natl. Câncer Inst., 80, 937 (1988)) e reduz os efeitos de diagnóstico, de prevenção e terapêuticos do anticorpo de rato (J. Immunol. , 135, 1530 (1985); Câncer

Res., 46, 6489 (1986)).

Com a finalidade de resolver estes problemas, têm sido feitas tentativas para converter um anticorpo derivado de um animal, que não seja um ser humano, num anticorpo humanizado, tal como um anticorpo quimérico humano ou um anticorpo enxertado numa região determinante de complementaridade (a seguir referida como "RDC") humana, usando técnicas de recombinação de genes. O anticorpo quimérico humano é um anticorpo em que a sua região variável (doravante referida como "região V") é de um anticorpo de um animal que não seja um ser humano e a sua região constante (a seguir referida como "região C") é de um anticorpo humano (Proc. Natl. Acad. Sei., U.S.A., 81, 6851 (1984)). Tem sido relatado que a administração desses anticorpos quiméricos a seres humanos elimina efeitos colaterais graves e o seu semi-período de vida no sangue foi prolongado cerca de 6 vezes, em comparação com um anticorpo de rato (Proc. Natl. Acad. Sei., U.S.A., 86, 4220 (1989) ). O anticorpo enxertado numa RDC humana é um anticorpo em que a RDC de um anticorpo humano está substituída por uma RDC de um anticorpo não humano (Nature, 321, 522 (1986) ) . Tem sido relatado que, numa experiência utilizando um macaco, a imunogenicidade de um anticorpo enxertado numa RDC humana foi reduzida e o seu semi-período de vida no sangue foi prolongado 4 a 5 vezes, em comparação 2 com um anticorpo de rato (J. Immunol., 147, 1352 (1991)). Estes relatórios indicam que um anticorpo humanizado deverá ter efeitos suficientes, como um anticorpo a ser aplicado no diagnóstico, prevenção e tratamento de várias doenças humanas, mesmo que não seja um anticorpo completamente humano. Na verdade, têm sido efectuados ensaios clinicos com anticorpos anti-tumorais, tais como um anticorpo quimérico humano anti-CD20, Rituxan (IDEC, Inc.) e um anticorpo enxertado numa RDC humana anti-HER2/neu, Herceptin (Genentech, Inc.). A segurança e os efeitos terapêuticos do anticorpo quimérico humano anti-CD20 e do anticorpo enxertado numa RDC humana anti-HER2/neu, em certa medida, foram confirmados no linfoma B e no cancro da mama, respectivamente (J. Clin. Oncol., 16, 2825 (1998); J. National Câncer Institute, 90, 882 (1998)). Além disso, um fragmento (Fab') de um anticorpo quimérico humano anti-GPIIb/IIIa, o ReoPro (Centocor, Inc.) está comercialmente disponível na Europa e na América como um fármaco secundário para a prevenção de uma doença após angioplastia coronária transluminal percutânea. Actualmente realiza-se um grande número de ensaios clínicos com outros anticorpos humanizados. A maioria destes anticorpos humanizados foi preparada utilizando técnicas de recombinação genética e produzida usando células apropriadas de animais.

Revelou-se que existem nos mamíferos cinco classes de anticorpos, ou seja, IgM, IgD, IgG, IgA e IgE. Os anticorpos da classe das IgG humanas são utilizados principalmente no diagnóstico, prevenção e tratamento de várias doenças humanas por causa do seu longo semi-período de vida no sangue e as suas características funcionais, tais como as várias funções efectoras e afins (Monoclonal Antibodies: Principies and Applications, Wiley-Liss, Inc., capítulo 2.1 (1995)). Os anticorpos da classe das IgG 3 humanas são ainda classificados nas 4 subclasses seguintes: IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4. Tem sido feito um grande número de estudos sobre a actividade de citotoxicidade celular dependente de anticorpos (a seguir referida como "actividade CCDA") e a actividade de citotoxicidade dependente do complemento (daqui em diante referida como "CDC"), como funções efectoras de anticorpos da classe das IgG e tem sido relatado que os anticorpos da subclasse da IgGl têm a maior actividade CCDA e a maior actividade CDC entre os anticorpos humanos da classe das IgG (Chemical Immunology, 65, 88 (1997)). Portanto, a maior parte dos anticorpos humanizados anti-tumorais, que exigem uma elevada função efectora, são anticorpos da subclasse humana das IgGl, incluindo os anteriores Herceptin e Rituxan. A expressão da actividade CCDA e da actividade CDC dos anticorpos da subclasse das IgGl humanas requer a ligação da região Fc do anticorpo a um receptor de anticorpo existente na superficie de uma célula efectora, tal como uma célula assassina, uma célula assassina natural, um macrófago activado ou similares (a seguir referida como "FcyR") e vários componentes do complemento. Tem sido sugerido que vários residuos de aminoácidos do segundo domínio da região charneira do anticorpo e da região C (a seguir referida como "domínio Cy2") (Eur. J. Immunol., 23, 1098 (1993), Immunology, 86, 319 (1995), Chemical Immunology, 65, 88 (1997)) e uma cadeia de açúcar ligada ao domínio Cy2 também são importantes para esta reacção de ligação (Chemical Immunology, 65, 88 (1997)). No que respeita à cadeia de açúcar, Boyd et al. examinaram os efeitos de uma cadeia de açúcar na actividade CCDA e na actividade CDC, por tratamento de um anticorpo humano enxertado numa RDC, CAMPATH-1H (subclasse das IgGl humanas), produzido utilizando células de ovário de hamster 4 chinês (células OHC, em inglês CHO) ou com células de mieloma de rato NSO, com várias enzimas que hidrolisam o açúcar e relataram que a eliminação do ácido siálico do terminal não redutor não tem influência em nenhuma das actividades. Além disso, contudo, a eliminação do residuo de qalactose tem sido relatada por exercer apenas influência na actividade CDC, diminuindo cerca de 50 % da sua actividade. Foi relatado que a eliminação completa da cadeia de açúcar causa o desaparecimento de ambas as actividades (Molecular Immunol., 32, 1311 (1995)). Além

disso, Lifely et al. analisaram a cadeia de açúcar de um anticorpo humano enxertado numa RDC, o CAMPATH-1H (subclasse das IgGl humanas), que foi produzido utilizando células de OHC, células NSO ou células YO de mieloma de rato, medindo a sua actividade CCDA e relataram que o CAMPATH-1H, derivado da célula YO, apresenta a maior actividade CCDA, o que sugere que a IV-acetilglicosamina, na posição bissectriz, é importante para a actividade (Glycobiology, 5, 813 (1995): WO 99/54342). Esses relatos demonstram que a estrutura da cadeia de açúcar desempenha um papel importante na função efectora de anticorpos humanos da subclasse IgGl e que pode ser possivel preparar um anticorpo possuindo uma maior função efectora alterando a estrutura da cadeia de açúcar. Na realidade, no entanto, as estruturas de cadeias de açúcar são complexas e variam muito. Portanto, existe uma necessidade de mais estudos sobre a estrutura, a fim de se obter uma maior função efectora.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Um objecto da presente invenção consiste em especificar uma cadeia de açúcar, que aumenta a actividade CCDA, por análise das cadeias de açúcar de anticorpos 5 humanos da subclasse das IgGl, produzidos por várias células de animais e desse modo também proporciona um processo para controlar a actividade de uma molécula funcional sob o ponto de vista imunológico. Uma vez melhorada a actividade CCDA está melhorada nesses anticorpos, pode-se esperar o aumento do efeito terapêutico, para várias doenças humanas, pela utilização não só de anticorpos anti-tumorais, mas também de anticorpos contra outras doenças, bem como proteínas ou péptidos contra diversas doenças. Especialmente, na aplicação clínica de anticorpos anti-tumorais, o efeito anti-tumoral de um anticorpo, por si só, é insuficiente para muitos dos casos existentes. As insuficiências dos anticorpos conhecidos têm exigido o uso concomitante de quimioterapia (Science, 280, 1197, 1998). Contudo, a dependência da quimioterapia vai ser reduzida, com uma redução dos efeitos secundários, se um efeito anti-tumoral mais forte de um anticorpo, por si só, providenciado através da melhoria da actividade CCDA. Os requerentes avaliaram a actividade in vitro de vários anticorpos humanizados da subclasse das IgGl humanas produzidos por

dois tipos de células de ovário de hamster chinês, células de OHC/dhFR (ATCC CRL 9096) e células OHC/DG44 (Somatic Cell and Molecular Genetics, 12, 555 (1986)), células NSO de mieloma de rato (RCB 0213, BIO/TECHNOLOGY, 10, 169 (1992)), células rSP2/0-Agl4 de mieloma de rato (doravante referidas aqui como "SP2/0 células"; ATCC CRL 1581) e células YB2/3HL.P2 de mieloma rato (a seguir designadas aqui por "células YB2/0 célula", ATCC CRL 1662) e verificaram, como resultado, que a actividade CCDA de um anticorpo humanizado produzido por células YB2/0 de mieloma de rato é consideravelmente mais elevada do que a dos anticorpos humanizados produzidos por outras células. Além disso, como resultado de uma avaliação in vivo da 6 actividade, utilizando Macaca faseicularis, verificou-se que o anticorpo humanizado produzido por células YB2/0 mostra o maior efeito, o que sugere a utilidade de um anticorpo que tenha uma elevada actividade CCDA para uma aplicação clinica em seres humanos. Além disso, identificou-se, em pormenor, uma cadeia de açúcar possuindo a capacidade de aumentar a actividade CCDA, por análise e comparação das estruturas das cadeias de açúcar de anticorpos humanizados produzidos por várias células de animais e realizou-se a presente invenção.

Mais especificamente, a presente invenção tem por objecto o que se segue de [1] a [25].

[1]. Um anticorpo IgG com uma actividade celular dependente de um anticorpo estimulada, ao qual está ligado um complexo biantenário do tipo de uma cadeia de açúcar ligada a N-glicósido e no qual a fucose não está ligada ao complexo biantenário do tipo de N-acetilglicosamina da extremidade redutora da cadeia de açúcar, em que a região de ligação do referido complexo biantenário do tipo de cadeias de açúcar com uma ligação N-glicósido se situar em duas posições do referido anticorpo IgG e em que o complexo biantenário do tipo de cadeias de açúcar com uma ligação N-glicósido, no qual a fucose não está ligada a N-acetilglicosamina, se junta às duas regiões de ligação da cadeia de açúcares e em que o referido complexo biantenário do tipo de cadeias de açúcar com uma ligação N-glicósido, tem essencialmente a seguinte estrutura: 7 iGaifíl—»- 4GícNAcfH —*► 2Manetl. \ ±GlcNAc|5I —*» 4Manpl—^ 4GlcNAcpl —4GlcNAc ±Gal£l—*- 4GlcNAcpi —·» 2Manal ^ [2] . 0 anticorpo, de acordo com [1], em que o anticorpo reconhece um antigénio relacionado com um tumor.

[3] . 0 anticorpo, de acordo com [2], em que o antigénio relacionado com o tumor é o gangliósido GD3.

[4] . 0 anticorpo, de acordo com a [1], em que o anticorpo reconhece um antigénio relacionado com uma alergia ou uma inflamação.

[5] . 0 anticorpo, de acordo com [4], em que o antigénio relacionado com uma alergia ou com uma inflamação é uma cadeia α do receptor da interleucina 5 humana.

[6] . 0 anticorpo, de acordo com [1], em que o anticorpo reconhece um antigénio relacionado com uma doença cardiovascular.

[7] . 0 anticorpo, de acordo com [1], em que o anticorpo reconhece um antigénio relacionado com uma doença auto- imune .

[8] . 0 anticorpo, de acordo com a [1], em que o anticorpo reconhece um antigénio relacionado com uma infecção virai ou bacteriana.

[9] . Um medicamento compreendendo o anticorpo de acordo com um qualquer de [1] a [8].

[10] . 0 medicamento, de acordo com [9], em que o referido medicamento (a) contém o referido anticorpo e se destina a ser administrado isoladamente como um fármaco terapêutico; ou (b) compreende ainda um ou mais veiculos aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico.

[11] . Um agente para o diagnóstico de um cancro, compreendendo, como princípio activo, o anticorpo de acordo com [2] . [12] . Um agente para o tratamento de um cancro, caracterizado pelo facto de compreender , como princípio activo, o anticorpo de acordo com [2]. [13] . Um agente para a prevenção de um cancro, compreendendo, como princípio activo, o anticorpo de acordo com [2].

[14] . Um agente para o diagnóstico de uma alergia ou de uma inflamação, compreendendo, como princípio activo, o anticorpo de acordo com [4].

[15] . Um agente para o tratamento de uma alergia ou de uma inflamação, compreendendo, como princípio activo, o anticorpo de acordo com [4].

[16] . Um agente para a prevenção de uma alergia ou de uma inflamação, compreendendo, como princípio activo, o anticorpo de acordo com [4].

[17] . Um agente para o diagnóstico de uma doença cardiovascular, compreendendo, como princípio activo, o anticorpo de acordo com [6].

[18] . Um agente para o tratamento de uma doença cardiovascular, compreendendo, como princípio activo, o anticorpo de acordo com [6].

[19] . Um agente para a prevenção de uma doença cardiovascular, compreendendo, como princípio activo, o anticorpo de acordo com [6].

[20] . Um agente para o diagnóstico de uma doença auto-imune, compreendendo, como princípio activo, o anticorpo de acordo com a [7].

[21] . Um agente para o tratamento de uma doença auto-imune, compreendendo, como princípio activo, o anticorpo de acordo com [7].

[22] . Um agente para a prevenção de uma doença auto- 9 imune, compreendendo, como princípio activo, o anticorpo de acordo com l [7] . [23]. Um agente para o diagnóstico de uma infecção bacteriana ou virai, compreendendo, como princípio activo, o anticorpo de acordo com [8]. [24] . Um agente para o tratamento de uma infecção bacteriana ou virai, compreendendo, como princípio activo, o anticorpo de acordo com [8]. [25]. Um agente para a prevenção de uma infecção bacteriana ou virai, compreendendo, como princípio activo, o anticorpo de acordo com [8].

Também tem por objecto o que se segue de (1) a (62) : (1) Um processo para controlar a actividade de uma molécula funcional sob o ponto de vista imunológico que compreende a regulação da presença ou da ausência de ligação de fucose a IV-acetilglicosamina do terminal de redução de uma cadeia de açúcar ligada a IV-glicósido que se liga à molécula funcional sob o ponto de vista imunológico. (2) 0 processo de acordo com (1), em que a cadeia de açúcar ligada a IV-glicósido que se liga à molécula funcional sob o ponto de vista imunológico compreende:

Manai

§Manpl 4GteNAcjí1----- 4G!cNAc (3) Um processo para aumentar a actividade de uma molécula funcional sob o ponto de vista imunológico que compreende a ligação de uma cadeia de açúcar em que a fucose não está presente na IV-acetilglicosamina do terminal de redução de uma cadeia de açúcar ligada a IV- 10 glicósido, à molécula funcional sob o ponto de vista imunológico. (4) 0 processo de acordo com (3), em que a cadeia de açúcar compreende:

Manai §Mar$1-► 4GteNAcf$1-► 4GlcNAc

Manai (5) 0 processo de acordo com (3) , em que a cadeia de açúcar é sintetizada numa célula que tem uma baixa actividade enzimática de adição de fucose a N-acetilglicosamina do terminal de redução ou não tem actividade enzimática. (6) 0 processo de acordo com (5), em que a enzima que adiciona fucose a iV-acetilglicosamina do terminal de redução é uma fucosiltransferase. (7) 0 processo de acordo com (6), em que a cadeia de açúcar compreende:fucosiltransferase é al,6-fucosil-transferase. (8) 0 processo de acordo com (3), em que a cadeia de açúcar é sintetizada numa célula de mieloma de rato. (9) 0 processo de acordo com (8), em que a célula de mieloma de rato é uma célula YB2/3HL.P2.Gll.16Ag.20 (ATCC CRL 1662). (10) Um processo para inibir a actividade de uma molécula funcional sob o ponto de vista imunológico que compreende a ligação de uma cadeia de açúcar em que a fucose está presente na W-acetilglicosamina do terminal de redução de uma cadeia de açúcar ligando a N-glicósido à molécula funcional sob o ponto de vista imunológico. 11 (11) 0 processo de acordo com (10), em que a cadeia de açúcar compreende:

Manai 3ÍVtanfi1 4GfcWAcb1 - 4GicMAc

Manai- (12) O processo de acordo com (10) , em que a cadeia de açúcar é sintetizada numa célula que tem uma alta actividade enzimática de adição de fucose a N-acetilglicosamina do terminal de redução. (13) O processo de acordo com (12), em que a enzima que adiciona fucose a IV-acetilglicosamina do terminal de redução é uma fucosiltransferase. (14) O processo de acordo com (13) , em que a cadeia de açúcar compreende:fucosiltransferase é al,6-fucosil- transferase. (15) O processo de acordo com (1) a (14), em que a molécula funcional sob o ponto de vista imunológico é um anticorpo, uma proteina ou um péptido. (16) Um agente de promoção da actividade de uma molécula funcional sob o ponto de vista imunológico que compreende uma cadeia de açúcar em que a fucose não está presente na IV-acetilglicosamina do terminal de redução de uma cadeia de açúcar ligada a IV-glicósido. (17) 0 agente de promoção da actividade de uma molécula funcional sob o ponto de vista imunológico de acordo com (16), em que a cadeia de açúcar compreende:

Manai

|Μάηβ1 4G)cNAcb1-4GícNAc 12 (18) 0 agente de promoção da actividade de uma molécula funcional sob o ponto de vista imunológico de acordo com (16), em que a cadeia de açúcar é sintetizada numa célula que tem uma baixa actividade enzimática de adição de fucose a IV-acetilglicosamina do terminal de redução ou não tem a referida actividade enzimática. (19) 0 agente de promoção da actividade de uma molécula funcional sob o ponto de vista imunológico, de acordo com de acordo com (18), em que a enzima que adiciona fucose a N-acetilglicosamina do terminal de redução é uma fucosiltransferase. (20) O agente de promoção da actividade de uma molécula funcional sob o ponto de vista imunológico, de acordo com (19), em que fucosiltransferase é al,6-fucosil-transferase. (21) O agente de promoção da actividade de uma molécula funcional sob o ponto de vista imunológico de acordo com (16), em que a cadeia de açúcar é sintetizada numa célula de mieloma de rato. (22) O agente de promoção da actividade de uma molécula funcional sob o ponto de vista imunológico, de acordo com (21), em que a célula de mieloma de rato é uma célula YB2/3HL.P2.Gll.16Ag.20 ATCC CRL 1662). (23) O agente de promoção da actividade de uma molécula funcional sob o ponto de vista imunológico de acordo com (16) a (22), em que a uma molécula funcional sob o ponto de vista imunológico é um anticorpo, uma proteína ou um péptido. (24) Uma molécula funcional sob o ponto de vista imunológico com uma actividade funcional imunologicamente modificada, a que está ligada uma molécula com uma cadeia de açúcar em que a fucose não está presente na N-acetilglicosamina do terminal de redução de uma cadeia de açúcar ligada a N-glicósido. 13 (25) Uma molécula funcional sob o ponto de vista imunológico com uma actividade funcional imunologicamente modificada, a que está ligada uma molécula com uma cadeia de açúcar em que a fucose não está presente na N-acetilglicosamina do terminal de redução de uma cadeia de açúcar ligada a iV-glicósido. (26) A molécula funcional sob o ponto de vista imunológico, de acordo com (24) , em que a molécula funcional sob o ponto de vista imunológico é um anticorpo, uma proteína i ou um péptido. (27) A molécula funcional sob o ponto de vista imunológico, de acordo com (25) , em que a molécula funcional sob o ponto de vista imunológico é um anticorpo, uma proteína ou um péptido. (28) Um processo para a produção de uma molécula funcional sob o ponto de vista imunológico, de acordo com (24), que compreende a utilização de uma célula que tem uma baixa actividade enzimática de adição de fucose a N-acetilglicosamina do terminal de redução ou não tem a referida actividade enzimática. (29) 0 processo de acordo com (28), em que a enzima que adiciona fucose a IV-acetilglicosamina do terminal de redução é uma fucosiltransferase. (30) O processo de acordo com (29), em que a fucosiltransferase é al,6-fucosiltransferase. (31) Um processo para a produção de uma molécula funcional sob o ponto de vista imunológico, de acordo com (24), em que se utiliza uma célula de mieloma de rato para a produção de uma molécula funcional sob o ponto de vista imunológico com uma actividade imunologicamente funcional estimulada. (32) O processo de acordo com (31), em que a célula de mieloma de rato é uma célula YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20. 14 (33) Um processo para a produção de uma molécula funcional sob o ponto de vista imunológico, de acordo com (25) , em que se utiliza uma célula que tem uma elevada actividade enzimática de adição de fucose a N-acetilglicosamina do terminal de redução. (34) 0 processo de acordo com (33), em que a enzima que adiciona fucose a IV-acetilglicosamina do terminal de redução é uma fucosiltransferase. (35) 0 processo de acordo com (34), em que a fucosil-transferase é al,6-fucosiltransferase. (36) A molécula funcional sob o ponto de vista imunológico, de acordo com (26), em que o anticorpo reconhece um antigénio relacionado com um tumor.

Um antigénio relacionado com um tumor da presente invenção é um antigénio que é expresso numa célula de tumor numa quantidade maior, em comparação com células normais. Exemplos incluem os gangliósidos GD2, GD3 and GM2 (Câncer Immunol. Immunother., 43, 152 (1996)), HER2 (J. Surgical

Research, 77, 85 (1998)), CD52 (Leukemia Research, 22, 185 (1998)) e MAGE (APMIS, 106, 665 (1998)). Além disso, um factor que induz o crescimento de uma célula de tumor e o seu receptor são também antigénios relacionados com um tumor. Exemplos incluem um factor de crescimento de fibroblasto básico e o seu receptor (Pancreas, 17, 169 (1998)) e um factor de crescimento de células endoteliais vasculares e o seu receptor (Pathology International, 48, 499 (1998)). (37) A molécula funcional sob o ponto de vista imunológico, de acordo com (36), em que o antigénio relacionado com um tumor é um gangliósido GD3. 15 (38) A molécula funcional sob o ponto de vista imunológico, de acordo com (36), em que o anticorpo é produzido por 7-9-51 (FERM BP-6691). (39) A molécula funcional sob o ponto de vista imunológico, de acordo com (26), em que o anticorpo reconhece um antigénio relacionado com uma alergia ou uma inflamação.

Um antigénio relacionado com uma alergia ou uma inflamação, de acordo com a presente invenção é um antigénio que induz uma alergia ou uma inflamação e um antigénio que é induzido acompanhado por uma alergia ou uma inflamação. Exemplos incluem interleucina 5 e o seu receptor (International Archives. Allergy. Immunol., 117, 11 (1998)) e um factor de necrose do tumor e o seu receptor (Cytokine, 8, 651 (1996)). (40) A molécula funcional sob o ponto de vista imunológico, de acordo com (39), em que o antigénio relacionado com uma alergia ou uma inflamação é uma cadeia α do receptor da interleucina 5 humana. (41) A molécula funcional sob o ponto de vista imunológico, de acordo com (39), em que o anticorpo é produzido por 7No. 3 (FERM BP-6690). (42) A molécula funcional sob o ponto de vista imunológico, de acordo com (26), em que o anticorpo reconhece um antigénio relacionado com uma doença cardiovascular.

Um antigénio relacionado com uma doença cardiovascular, de acordo com a presente invenção é um antigénio que está envolvido numa doença cardiovascular, por exemplo, induzida por um trombo ou uma re-estenose. Exemplos incluem plaquetas GpIIb/IIIa (Thrombosis Research, 89, 129 (1998)), 16 um factor de crescimento derivado de plaquetas e o seu receptor (American J. Physiology, 269, 1641 (1995) ) e um factor de coagulação do sangue (Thrombosis. Haemostasis, 79, 14 (1998)). (43) A molécula funcional sob o ponto de vista imunológico, de acordo com (27), em que o anticorpo reconhece um antigénio relacionado com uma doença auto-imune .

Um antigénio relacionado com uma doença auto-imune, de acordo com a presente invenção, é um auto-antigénio que induz uma resposta imunitária como a causa de uma doença e um antigénio que aumenta a resposta. Exemplos incluem auto-ADN (Rheumatology International, 17, 223 (1998)) e CD4 (Rheumatic Diseases Clinics. North America, 24, 567 (1998)) . (44) A molécula funcional sob o ponto de vista imunológico, de acordo com (26), em que o anticorpo reconhece um antigénio relacionado com uma infecção virai ou bacteriana.

Um antigénio relacionado com uma infecção virai ou bacteriana, de acordo com a presente invenção é um antigénio relacionado com a sua infecção e crescimento numa célula-alvo virai ou bacteriana e também inclui um produto virai ou bacteriano. Exemplos incluem gpl20 (Virology, 248, 394 (1998)), CXCR4 (J. Virology, 72, 8453 (1998)) e toxina

Vero (J. Clinicai Microbiology, 34, 2053 (1996)). (45) Um agente para o diagnóstico de cancro, compreendendo, como principio activo, uma molécula 17 funcional sob o ponto de vista imunológico, de acordo com (36) . (46) Um agente para o tratamento de cancro, compreendendo, como principio activo, uma molécula funcional sob o ponto de vista imunológico, de acordo com (36) . (47) Um agente para a prevenção de cancro, compreendendo, como principio activo, uma molécula funcional sob o ponto de vista imunológico, de acordo com (36) . (48) Um agente para o diagnóstico de uma alergia ou inflamação, compreendendo, como principio activo, o anticorpo de acordo com (39). (49) Um agente para o tratamento de uma alergia ou inflamação, compreendendo, como principio activo, o anticorpo de acordo com (39). (50) Um agente para a prevenção de uma alergia ou inflamação, compreendendo, como principio activo, o anticorpo de acordo com (39). (51) Um agente para o diagnóstico de uma doença cardiovascular, compreendendo, como principio activo, o anticorpo de acordo com (42). (52) Um agente para o tratamento de uma doença cardiovascular, compreendendo, como principio activo, o anticorpo de acordo com (42). (53) Um agente para a prevenção de uma doença cardiovascular, compreendendo, como principio activo, o anticorpo de acordo com (42). (54) Um agente para o diagnóstico de uma doença auto-imune, compreendendo, como principio activo, o anticorpo de acordo com (43). (55) Um agente para o tratamento de uma doença auto-imune, compreendendo, como principio activo, o anticorpo de acordo com (43). 18 (5 6) Um agente para a prevenção de uma doença auto-imune, compreendendo, como princípio activo, o anticorpo de acordo com (43). (57) Um agente para o diagnóstico de uma infecção bacteriana ou virai, compreendendo, como princípio activo, o anticorpo de acordo com (44). (58) Um agente para o tratamento de uma infecção bacteriana ou virai, compreendendo, como princípio activo, o anticorpo de acordo com (44). (59) Um agente para a prevenção de uma infecção bacteriana ou virai, compreendendo, como princípio activo, o anticorpo de acordo com (44). (60) Um agente para o diagnóstico de várias doenças, compreendendo, como princípio activo, o péptido ou a proteína de acordo com (26) ou (27).

Exemplos das várias doenças, de acordo com a presente invenção, incluem um cancro, uma doença alérgica, uma doença inflamatória, uma doença cardiovascular, uma doença auto-imune e uma infecção virai ou bacterian. (61) Um agente para o tratamento de várias doenças, compreendendo, como princípio activo, o péptido ou a proteína de acordo com (60). (62) Um agente para a prevenção de várias doenças, compreendendo, como princípio activo, o péptido ou a proteína de acordo com (60).

Com base na forma de ligação das moléculas funcionais sob o ponto de vista imunológico, a cadeia de açúcar está grosseiramente classificada em dois tipos, a saber, uma cadeia de açúcar, que se liga a asparagina (designada por cadeia de açúcar ligada a iV-glicósido e uma cadeia de 19 açúcar, que se liga à serina, treonina (designada por cadeia de açúcar ligada a O-glicósido). A cadeia de açúcar ligada a N-glicósido, de acordo com a presente invenção, tem várias estruturas (Biochemical Experimentation Method 23 - Method for Studying

Glycoprotein Sugar Chains (Gakkai Shuppan Center), editado por Reiko Takahashi (1989) ) , mas, cada caso tem a estrutura nuclear básica comum que se segue.

Na estrutura anterior, o terminal da cadeia de açúcar, que se liga a asparagina é designado um terminal de redução, e o lado oposto é designado por um terminal não redutor. A fucose pode estar ligada IV-acetilglicosamina do terminal de redução, por exemplo, uma ligação al,3 ou uma ligação al, 6.

Exemplos de cadeias de açúcar ligadas a IV-glicósido incluem um tipo de alta manose, em que apenas a manose se liga ao terminal não redutor da estrutura do núcleo; um tipo de complexo, em que o lado do terminal não redutor do núcleo estrutural tem uma ou mais ramificações de galactose-IV-acetilglicosamina (a seguir referido como "Gal-GlcNAc") e o lado do terminal não redutor de Gal de-GlcNAc ainda tem uma estrutura tal como, por exemplo, um ácido siálico que divide ao meio IV-acetilglicosamina; um tipo hibrido, em que o lado do terminal não redutor da estrutura do núcleo tem tantos ramos de cadeias de açúcar ligadas a IV-glicósido de alta manose e um complexo de uma cadeia de açúcar ligada a IV-glicósido. 20

Uma molécula funcional sob o ponto de vista imunológico é uma molécula que derivou originalmente de um ser vivo e está envolvido em várias respostas imunitárias. Especificamente inclui, por exemplo, anticorpos, proteínas e péptidos.

Um anticorpo é uma proteína que é produzidain vivo por uma resposta imunitária, em resultado da estimulação por um antigénio estranho e tem uma actividade de se ligar especificamente ao antigénio. Exemplos do anticorpo incluem um anticorpo segregado por uma célula de hibridoma preparada a partir de células de baço de um animal imunizado, após a imunização do animal com um antigénio, bem como um anticorpo preparado por meio de técnicas de recombinação genética, isto é, um anticorpo obtido através da introdução de um vector de expressão de um anticorpo inserido num gene que codifica um anticorpo numa célula hospedeira. Os exemplos incluem um anticorpo produzido por um hibridoma, um anticorpo humanizado e um anticorpo humano.

Um hibridoma é uma célula que produz um anticorpo monoclonal com uma especificidade antigénica desejada e é obtida pela fusão de células de uma célula B preparado pela imunização de um mamífero diferente de um ser humano com um antigénio, com uma célula de mieloma derivada, por exemplo, de um rato.

Os anticorpos humanizados incluem, por exemplo, um anticorpo quimérico humano e um anticorpo enxertado numa região determinante de complementaridade humana (a seguir referida como "RDC"). 21

Um anticorpo quimérico humano é um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada do anticorpo (daqui em diante também referido como "PV" ou "VP", em que a cadeia pesada de uma cadeia P e a região variável é uma região V) e um região variável da cadeia leve do anticorpo (doravante referida também como "LV" ou "VL", em que a cadeia leve é uma cadeia L) obtida a partir de um animal que não um ser humano, uma região constante de cadeia pesada (a seguir designada também como "CP", em que a região constante é uma região C) de um anticorpo humano e uma região constante de cadeia leve (daqui em diante também referida como "CL") de um anticorpo humano. Animais diferentes de seres humanos podem ser, por exemplo, qualquer murganho, rato, hamster e coelho, desde que se possa preparar um hibridoma desse animal. 0 anticorpo quimérico humano pode ser produzido pela obtenção de ADNc que codifica VP e VL de um hibridoma que produz um anticorpo monoclonal, inserindo cada um dos ADNc num vector de expressão para uma célula hospedeira tendo um anticorpo humano de codificação de um gene CP e uma CL de anticorpo humano para construir um vector de expressão de anticorpo quimérico humano e, em seguida introduzindo o vector numa célula hospedeira para expressar o anticorpo. Qualquer CP do anticorpo quimérico humano pode ser utilizada, desde que pertença a uma imunoglobulina humana (a seguir referido como "Igh"), mas as da classe das IgGh são preferidos e pode-se utilizar qualquer das subclasses pertencendo à classe das IgGh, como, IgGlh, IgG2h, IgG3h e IgG4h. Além disso, qualquer CL de anticorpo quimérico humano pode ser utilizada, desde que pertença a Igh e podem utilizar-se as da classe κ ou λ. 22

Um anticorpo humano enxertado numa RDC é um anticorpo em que as sequências de aminoácidos das RDC das VP e VL de um anticorpo derivam de um animal, que não de um ser humano, são enxertadas nas posições apropriadas das VP e VL do anticorpo humano. 0 anticorpo humano enxertado em RDC pode ser produzido através da construção de ADNc que codificam as regiões V em que as sequências de RDC da VH e da VL de um anticorpo derivado de um animal que não um ser humano são enxertadas nas sequências da RDC da VH e da VL de um anticorpo humano, inserindo cada um dos ADNc num vector de expressão para uma célula hospedeira com um gene que codifica a CP de um anticorpo humano e a CL do anticorpo humano para a construção de um vector de expressão de um anticorpo enxertado numa RDC humana e introduzindo o vector de expressão numa célula hospedeira para expressar o anticorpo enxertado na RDC humana. A CP do anticorpo humano enxertado numa RDC pode ser qualquer região que pertença às Igh, mas as classes das IgGh são as preferidas. Pode-se utilizar qualquer uma das subclasses pertencentes à classe das IgGh tais como IgGlh, IgG2h, IgG3h e IgG4h. Além disso, a CL de anticorpo humano enxertado numa RDC pode ser qualquer região, desde que pertença a Igh e podem utilizar-se as da classe κ ou da classe λ.

Um anticorpo humano é inicialmente concebido para ser um anticorpo que existe naturalmente no corpo humano, mas também inclui anticorpos obtidos a partir de uma biblioteca de fagos de anticorpos humanos e de um animal transgénico produtor de anticorpos humanos ou a partir de plantas transgénicas que produzem anticorpos humanos, que são 23 elaboradas com base em recentes avanços na engenharia genética, engenharia celular e técnicas de engenharia de desenvolvimento. 0 anticorpo que existe no corpo humano pode ser obtido, por exemplo, através do isolamento de um linfócito de sangue periférico humano, imortalizando-o pela sua infecção com o virus EB, seguido de clonagem, cultura de um linfócito capaz de produzir o anticorpo e purificação do anticorpo a partir da mistura da cultura. A biblioteca de fagos de anticorpos humanos é uma biblioteca em que um fragmento de anticorpo, tal como, por exemplo, Fab ou um anticorpo de uma só cadeia, é expresso na superfície do fagos através da inserção de um gene de anticorpo, preparado a partir de células B humanas, num gene de fago. Um fago que expressa um fragmento de anticorpo possuindo a desejada actividade de ligação ao antigénio pode ser recuperado a partir desta biblioteca, utilizando a sua actividade para se ligar a um substrato imobilizado num antigénio como marcador. 0 fragmento de anticorpo pode ainda ser convertido numa molécula de anticorpo humano compreendendo duas cadeias P completas e duas cadeias L completas, por técnicas de engenharia genética.

Um animal transgénico não humano que produz um anticorpo humano é um animal em que um gene que codifica o anticorpo humano esá integrado nas células. Especificamente, um animal transgénico que produz um anticorpo humano pode ser preparado através da introdução de um gene de anticorpo humano numa célula ES de rato, transplantando a célula ES para um embrião de um estágio inicial de outro rato e desenvolvendo um animal. 0 24 anticorpo humano pode ser preparado e acumulados numa mistura de cultura do nimal transgénico que produz um anticorpo humano obtendo-se um hibridoma produtor de um anticorpo humano, de acordo com um processo de preparação de hibridomas geralmente realizado em mamíferos com excepção de seres humanos e, em seguida, fazendo a cultura do hibridoma.

Uma actividade dos anticorpos da presente invenção inclui a actividade CCDA.

Actividade CCDA, tal como se utiliza aqui, refere-se a uma actividade para lesionar, por exemplo, células de tumor através da activação de uma célula efectora através da ligação da região Fc de um anticorpo a um receptor de Fc existente na superfície de uma célula efectora, tal como uma célula assassina, uma célula assassina natural ou um macrófago activado (Monoclonal Antibodies: Principies and Applications, Wiley-Liss, Inc., capitulo 2.1 (1995)).

Pode-se utilizar qualquer proteína ou péptido, desde que possam activar várias respostas imunitárias. Os exemplos incluem moléculas de interferão, tais como interleucina-2 (IL-2) (Science, 193, 1007 (1976)) e interleucina-12 (IL-12) (J. Leuc. Biol., 55, 280 (1994)); factores estimuladores de colónias, tal como factor estimulante de colónias de granulócitos (FEC-G) (J. Biol. Chem., 258, 9017 (1983)), factor estimulador de colóni as de macrófgos (FEC-M) (J. Exp. Med., 173, 269 (1992)), factor estimulador de colónias de granulócitos e macrófgos (FEC-GM) (J. Biol. Chem., 252, 1998 (1977)); factores de crescimento, tal como eritropoietina (EPO) (J. Biol. Chem., 252, 5558 (1977)) e trombopoietina (TPO) (Nature, 369, 533 (1994)). 25

As actividades da proteína e do péptido da presente invenção são as actividades de várias células imuno-competentes, incluindo linfócitos (por exemplo, células T, células B) e macrófagos ou várias reacções de respostas imunitárias, quando a proteína e o péptido contendo a cadeia de açúcar são administrados ao ser vivo. A promoção das actividades da proteína e do péptido da presente invenção inclui a activação de células AS e células T por IL-2 e IL-12, a promoção das actividades de produção de eritrócitos por EPO, que também estão aumentadas. 1. Processo para analisar a cadeia de açúcar de uma molécula funcional sob o ponto de vista imunológico (1) Análise da composição de açúcares neutros e aminados

Tal como descrito antes, a cadeia de açúcar da IgG compreende um açúcar neutro, tal como, por exemplo, galactose, manose ou fucose, um açúcar aminado, tal como, por exemplo, uma IV-acetilglicosamina e um açúcar de ácido, tal como, por exemplo, ácido siálico.

No que diz respeito à análise da composição da cadeia de açúcar de um anticorpo, as proporções da composição podem ser analisadas por libertação de açúcares neutros ou açúcares aminados por hidrólise ácida da cadeia de açúcar. Os processos específicos incluem um processo que utiliza um analisador da composição de açúcar (BioLC) fabricado pela Dionex. 0 BioLC é um aparelho para análise da composição do açúcar pelo processo CPAAR-DAP (cromatografia de permuta aniónica de alta resolução - detecção amperométrica pulsada) (J. Liq. Chromatogr., 6, 1577 (1983)). 26

As proporções da composição também podem ser analisadas por um processo de marcação por fluorescência utilizando 2-aminopiridina. Especificamente, as proporções da composição podem ser calculadas por marcação por fluorescência de uma amostra hidrolisada com um ácido com 2-aminopiridina, em conformidade com um processo conhecido (Agric. Biol. Chem., 55 (1), 283-284 (1991)) e realizando a análise por CLAR. (2) Análise da estrutura da cadeia de açúcar A estrutura da cadeia de açúcar de um anticorpo pode ser analisada por um processo de mapeamento bi-dimensional da cadeia de açúcar (Anal. Biochem., 171, 73 (1988), Biochemical Experimentation Method 23 - Method for Studying Glycoprotein Sugar Chains (Gakkai Shuppan Center), editado pela Reiko Takahashi (1989)). 0 processo de mapeamento bidimensional da cadeia de açúcar é um processo em que se prevê a estrutura da cadeia de açúcar, por exemplo, através da representação gráfica do tempo de retenção ou da posição de eluição da cadeia de açúcar, por cromatografia de fase inversa, como eixo dos XX e o tempo de retenção ou a posição de eluição da cadeia de açúcar, por cromatografia em fase normal, como eixo dos YY e comparando os resultados com os de cadeias de açúcar conhecidas.

Especificamente, a cadeia de açúcar liberta-se do anticorpo por hidrazinólise do anticorpo, marcação por fluorescência da cadeia de açúcar com 2-aminopiridina (a seguir referido como "PA"), (J. Biochem., 95, 197 (1984)) e, em seguida, a cadeia de açúcar é separada a partir do reagente de PA em excesso por meio de filtração em gel e submetendo a cromatografia de fase inversa. Subsequentemente, cada pico da cadeia de açúcar fraccionada 27 é analisado por cromatografia de fase normal. Com base nestes resultados, a estrutura da cadeia de açúcar pode ser estimada através da representação gráfica bi-dimensional da cadeia de açúcar no mapa e comparando-a com os padrões de cadeias de açúcar (fabricados pela Takara Shuzo), ou uma referência (Anal. Biochem., 171, 73 (1988)).

Além disso, a estrutura estimada pelo processo de mapeamento bidimensional da cadeia de açúcar pode ser confirmada por espectrometria de massa, tal como, por exemplo, MALDI-TOF-EM, de cada cadeia de açúcar. 2. Processo para controlar a actividade de uma molécula funcional sob o ponto de vista imunológico 0 processo da presente invenção que tem por objecto controlar a actividade de uma molécula funcional sob o ponto de vista imunológico vai ser descrito a seguir utilizando, como exemplo, imunoglobulina G (a seguir referido como "IgG"). A cadeia de açúcar ligada a IV-glicósido que se liga a IgG é uma cadeia de açúcar de um complexo biantenário tendo basicamente a seguinte estrutura (daqui em diante referida como "biantenário"). ±Gaipi—*· 4CteNAf$l ±Ga!£l—*- 4G!cNAc01 *► 2Manal iGJeNAepI 2Manel 4GícNAepi ±Fucal ( tÇt) 4GlcNAe A presente invenção também inclui cadeias de açúcares semelhantes, a que se adiciona ainda um açúcar ácido, ácido siálico a Gal do terminal não redutor da cadeia de açúcar 28 uma N-acetil- adiciona-se ligada a N- glicósido ou glicosamina, que a divide a meio, a uma cadeia de açúcar ligada a iV-glicósido.

Num tipo de IgG, liga-se uma cadeia de açúcar ligada a iV-glicósido a uma posição na região Fc. Uma vez que um tipo de IgG compreende duas cadeias P, a porção Fc está presente em duas posições de uma molécula de anticorpo. Assim, a região de ligação da cadeia do açúcar também está presente em duas posições. A actividade de IgG muda consoante o número de cadeias de açúcar ligadas a iV-glicósido em que a fucose, que não está ligada a IV-acetilglicosamina, vai ser adicionada às regiões de ligação das duas cadeias de açúcar anteriores. Isto é, quando a cadeia de açúcar ligada a iV-glicósido em que a fucose não está ligada a iV-acetilglicosamina, adiciona-se, pelo menos uma das regiões de ligação, à cadeia de açúcar, aumentando a actividade da molécula funcional sob o ponto de vista imunológico. Como exemplo, o grau de actividade da IgG será o seguinte: anticorpo FO > anticorpo F1 > anticorpo F2, em que o anticorpo FO designa um anticorpo em que a cadeia de açúcar ligada a iV-glicósido em que a fucose não está ligado a iV-acetilglicosamina, a ambas as regiões de ligação das cadeias de açúcar; o anticorpo F1 designa um anticorpo em que a cadeia de açúcar ligada a N-glicósido em que a fucose não está ligada a N-acetilglicosamina é adicionada a uma das regiões de ligação da cadeia de açúcar; e o anticorpo F2 designa um anticorpo em que a cadeia de açúcar ligada a iV-glicósido, na qual a fucose está ligada a IV-acetilglicosamina, se adiciona a ambas as regiões de ligação das cadeias de açúcar. 29 0 anticorpo produzido nem sempre possui uma estrutura única da cadeia de açúcar e o anticorpo FO, o anticorpo F1 e o anticorpo F2 podem estar presentes sob a forma de uma mistura em que a presença ou ausência de fucose é tomada em consideração. A fim de controlar a actividade CCDA do anticorpo produzido, analisa-se a cadeia de açúcar ligada ao anticorpo utilizando o processo anterior para a análise da cadeia de açúcar de uma molécula funcional sob o ponto de vista imunológico e usando os resultados analisados como um indice. A actividade CCDA do anticorpo produzido pode ser estimulada pelo aumento da proporção existente de anticorpo F1 e de anticorpo FO. Especif icamente, o anticorpo F1 e o anticorpo FO podem ser purificados ou a expressão numa célula hospedeira pode ser regulada, de tal forma que a cadeia de açúcar ligada a N-glicósido, em que a fucose não está ligada a N-acetilglicosamina, é adicionada à molécula funcional sob o ponto de vista imunológico. A actividade CCDA do anticorpo produzido pode ser inibida pelo aumento da proporção existente do anticorpo F2. Especificamente, o anticorpo F2 pode ser purificado ou a expressão numa célula hospedeira pode ser regulada de tal forma que a cadeia de açúcar ligada a iV-glicósido, em que a fucose não está ligada a IV-acetilglicosamina, é adicionada à molécula funcional sob o ponto de vista imunológico.

Como descrito antes, a intensidade da actividade desejada pode ser controlada através da regulação da proporção existente entre anticorpo FO, anticorpo F1 e anticorpo F2. 30 3. Processo para produzir a molécula funcional sob o ponto de vista imunológico

Descreve-se a seguir um processo para a produção de uma molécula funcional sob o ponto de vista imunológico possuindo uma cadeia de açúcar ligada a IV-glicósido em que a fucose não está ligada a N- acetilglicosamina ou uma molécula funcional sob o ponto de vista imunológico com uma cadeia de açúcar ligada a IV-glicósido, em que a fucose está ligada a ΑΙ-acetilglicosamina.

Para ligar uma cadeia de açúcar desejada a um anticorpo, um péptido ou uma proteina, pode-se produzir, mediante a introdução de um gene que codifica o anticorpo, o péptido ou a proteina de interesse, numa célula hospedeira e fazendo a cultura da célula resultante. Alternativamente, também podem ser produzidos através da introdução de um gene que codifica o anticorpo, o péptido ou a proteina de interesse, num animal ou numa planta e fazendo a cultura do animal ou da planta resultantes. A célula hospedeira, de animal ou de planta aqui descrita, útil para a produção de uma molécula funcional sob o ponto de vista imunológico, possuindo uma cadeia de açúcar ligada a IV-glicósido, em que a fucose não está ligada a N-acetilglicosamina, pode ser qualquer célula, animal ou planta, desde que, por exemplo, tenha uma baixa actividade enzimática de adição de fucose à IV-acetil-glicosamina que se liga à região Fc de um anticorpo ou não tem actividade enzimática. Exemplos de células que têm uma baixa actividade enzimática para adicionar a fucose à N-acetilglicosamina que se liga à região Fc do anticorpo ou não têm actividade enzimática incluem, por exemplo, uma 31 célula de mieloma de rato, a célula YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 (ATCC CRL 1662 (doravante referida como "célula YB2/0")).

Além disso, uma célula, animal ou planta, tendo uma baixa ou nenhuma actividade enzimática, relacionada com uma ligação al,6 pode ser preparada, por exemplo, por eliminação de um gene que codifica a enzima relacionada com a ligação al,6 na célula hospedeira, no animal ou na planta ou por adição de uma mutação ao gene para reduzir ou eliminar a actividade da enzima e pode ser utilizada como célula hospedeira, animal ou planta. A enzima relacionada com a ligação al,6 inclui fucosiltransferases e é, de preferência, al,6-fucosiltransferase (a seguir referida como "FUT8"). A célula hospedeira, de animal ou de planta para utilização na produção de uma molécula funcional sob o ponto de vista imunológico, possuindo uma cadeia de açúcar ligada a N-glicósido em que a fucose se liga a N-acetil-glicosamina pode ser qualquer célula, de animal ou de planta, desde que, por exemplo, tenha uma elevada actividade de enzima para se ligar à região Fc de um anticorpo.

Além disso, uma célula, animal ou planta que tenha uma elevada actividade enzimática relacionada com uma ligação 0(1,6 pode ser preparada pela introdução de um gene que codifica a enzima relacionada com a ligação al,6 na célula hospedeira, animal ou planta ou por adição de uma mutação ao gene para aumentar a actividade da enzima e pode ser utilizada como uma célula hospedeira, animal ou planta. A enzima relacionada com a ligação al,6 inclui fucosil-transferases e é, de preferência, FUT8. 32

As células hospedeiras podem ser, por exemplo, qualquer célula de bactérias, leveduras, células de animais, células de insectos, células de plantas, desde que possam expressar o gene de interesse.

Exemplos de células hospedeiras bacterianas incluem microrganismos pertencentes ao género Escherichia, ao género Serratia, ao género Bacillus, ao género Brevibacterium, ao género Corynebacterium, ao género Microbacterium, ao género Pseudomonas, tal como Escherichia coli XLl-Blue, Escherichia coli XL2-Blue, Escherichia coli DH1, Escherichia coli MC1000, Escherichia coli KY3276, Escherichia coli W1485, Escherichia coli JM109, Escherichia coli HB101, Escherichia coli No. 49, Escherichia coli W3110, Escherichia coli NY49, Escherichia coli GI698, Escherichia coli TB1, Serratia ficaria, Serratia fonticola, Serratia liquefaciens, Serratia marcescens, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Brevibacterium ammoniagenes, Brevibacterium immariophilum ATCC 14 0 68, Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066, Brevibacterium flavum ATCC 14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869, Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium glutamicum ATCC 13869, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870, Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354, Pseudomonas putida e Pseudomonas sp. D-0110.

Exemplos de células hospedeiras de levedura incluem microrganismos que pertencem ao género Saccharomyces, ao género Schizosaccharomyces, ao género Kluyveromyces, ao género Trichosporon, ao género Schwanniomyces, ao género Pichia, ao género Candida, tal como Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Trichosporon pullulans, Schwanniomyces alluvius, Candida utilis. 33

Exemplos de células hospedeiras de animais incluem células de mieloma de rato, tal como células NSO e células SP2/0; células de ovário de hamster chinês, tais como células OHC/dhfr“ e células OHC/DG44; células de mieloma de rato, tais como células YB2/0 e células IR983F; células de macaco, tal como células COS; células do mieloma humano, tal como células Namalwa. De preferência, podem utilizar-se células de ovário de hamster chinês, tal como células OHC/DC44 .

Exemplos de células hospedeiras de insecto incluem células de ovário de Spodoptera frugiperda, tais como Sf9 e Sf21 (Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W.H. Freeman and Company, New York (1992)); uma célula de ovário Trichoplusia ni tal como High 5 (fabricada pela Invitrogen).

Exemplos de células hospedeirasde plantas incluem células de plantas de tabaco, batata, tomate, cenoura, soja, colza, alfafa, arroz, trigo, cevada.

Uma molécula funcional sob o ponto de vista imunológico pode ser produzida por cultura do transformante obtido num meio, para formar e acumular a molécula funcional sob o ponto de vista imunológico na cultura resultante e, em seguida, recuperá-la a partir da cultura.

Além disso, uma molécula funcional sob o ponto de vista imunológico também pode ser produzida através da produção de um animal ou de uma planta transgénica e a cultura do animal ou da planta resultante. 0 animal ou a planta para a produção de uma molécula funcional sob o ponto de vista imunológico, possuindo uma 34 cadeia de açúcar ligada a IV-glicósido, em que a fucose não está ligada a IV-acetilglicosamina, pode ser qualquer animal ou planta, desde que, por exemplo, tenha uma baixa actividade enzimática da adição da fucose à N-acetil-glicosamina que se liga à região Fc de um anticorpo ou não tem actividade enzimática.

Além disso, pode-se preparar um animal transgénico não humano ou uma planta transgénica tendo uma baixa ou nenhuma actividade enzimática relacionada com uma ligação al,6 por eliminação de um gene que codifica uma enzima relacionada com a ligação al,6 no animal ou na planta ou por adição de uma mutação ao gene para reduzir ou eliminar a actividade da enzima. A enzima relacionada com a ligação αΐ,β inclui fucosiltransferases e é, de preferência, FUT8.

Pode-se utilizar qualquer animal ou planta como um animal ou uma planta para ser utilizado na produção de uma molécula funcional sob o ponto de vista imunológico, possuindo uma cadeia de açúcar ligada a IV-glicósido em que a fucose está ligada a ΛΙ-acetilglicosamina desde que, por exemplo, no que respeita ao antigénio, tenha uma elevada actividade enzimática de adição de fucose a IV-acetil-glicosamina que se liga à região Fc do anticorpo.

Além disso, pode-se preparar um animal transgénico não humano ou uma planta transgénica com uma elevada actividade enzimática relacionada com uma ligação al,6, por introdução de um gene que codifica a enzima relacionada com a ligação 0(1,6 no animal ou na planta ou por adição de uma mutação ao gene para aumentar a actividade enzimática. A enzima relacionada com a ligação al,6 inclui fucosiltransferases e é, de preferência, FUT8. 35 0 animal transgénico não humano pode ser obtido por injecção directa de um gene desejado num óvulo fertilizado (Proc. Natl. Acad. Sei., USA., 77, 7380 (1980)).

Os animais transgénicos não humanos incluem, por exemplo, ratinhos, ratos, coelhos, galinhas, cabras, gado bovino.

Além disso, um animal transgénico não humano ou um animal nocaute não humano, possuindo um gene desejado, pode ser obtido através da introdução do gene desejado numa célula estaminal embrionária e a preparação do animal por um processo de agregação de quimérica ou pelo processo de injecção quimérica (Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual, segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994); Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press em Oxford University Press (1993); Biomaterial Series 8, Gene Targeting, Preparation of mutation mouse using ES cell, Yodo-sha (1995)).

Exemplos de células estaminais embrionárias incluem células estaminais embrionárias de murganho (Nature, 292, 154 (1981)), de ratos, de aves, de porco, de macaco, de caprinos, de bovinos.

Além disso, o animal transgénico não humano ou o animal nocaute não humano pode também ser preparado usando uma técnica de clonagem na qual um núcleo, no qual se introduz um gene desejado, é transplantado para um ovo enucleado (Science, 280, 1256; (1998); Science, 278, 824, (1997)).

Uma molécula funcional sob o ponto de vista

imunológico pode ser produzida mediante a introdução de ADN 36 que codifica a molécula funcional sob o ponto de vista imunológico num animal, preparada pelo processo anterior, para assim formar e acumular a molécula funcional sob o ponto de vista imunológico no animal e, em seguida, recolher a molécula funcional, sob o ponto de vista imunológico, do animal. A molécula funcional sob o ponto de vista imunológico pode ser preparada, por exemplo, para ser formada e acumulada no leite (pedido de patente japonesa publicada e não examinada N° 309192/88) ou num ovo de animal. O processo para a produção de uma planta transgénica está descrito, por exemplo, na referência (Biol. Chem., 380, 825 (1999)). O processo para a produção de uma planta transgénica está descrito, por exemplo, na referência (Plant Journal, 11, 1195 (1997)).

Em relação ao processo para a produção de uma molécula funcional sob o ponto de vista imunológico, usando uma planta, a molécula funcional sob o ponto de vista imunológico pode ser produzida, por exemplo, por cultura de uma planta transgénica na qual se introduziu o ADN que codifica a molécula funcional sob o ponto de vista imunológico, em conformidade com um processo conhecido (Tissue Culture, 20, (1994), Tissue Culture, 21, (1995),

Trends in Biotechnology, 15, 45 (1997)), para desse modo formar e acumular a molécula funcionalsob o ponto de vista imunológico na planta, e em seguida, recolher a molécula funcional sob o ponto de vista imunológico da planta.

Além disso, um animal geneticamente modificado capaz de produzir uma molécula funcional sob o ponto de vista imunológico possuindo uma cadeia de açúcar ligada a N-glicósido em que a fucose não está ligada a IV-acetil- 37 glicosamina ou uma molécula funcional sob o ponto de vista imunológico possuindo uma cadeia de açúcar ligada a N-glicósido em que a fucose está ligada a IV-acetil-glicosamina, pode ser obtida por cruzamento de um animal transgénico não humano ou de um animal nocaute não humano de uma fucosiltransferase, de preferência FUT8, com uma linha homóloga mas diferente do animal transgénico de uma molécula desejada funcional sob o ponto de vista imunológico. 0 processo de cruzamento inclui, por exemplo, o cruzamento natural, a fertilização in vitro.

Também é possivel realizar a produção em massa da cadeia de açúcar pela introdução de um grupo de genes que codifica as enzimas isoladas, por exemplo, em leveduras, E. coli e similares (Nature Biotechnology, 16, 847 (1998)). Além disso, a enzima produzida pode ser usada na modificação de um anticorpo, de um péptido ou de uma proteína com a cadeia de açúcar ou na sua produção.

Além disso, uma cadeia de açúcar, que estimula a actividade de uma molécula funcional sob o ponto de vista imunológico, de acordo com a presente invenção, pode ser substituída por um péptido, (J. Immunol., 160, 293 (1998)). Tal péptido tem utilidade no processo anterior para a utilização de cadeias de açúcar e é também excelente tendo em vista a conveniência, porque pode ser facilmente fundido com uma molécula funcional sob o ponto de vista imunológico. A seguir descreve-se um processo para a produção de uma molécula funcional sob o ponto de vista imunológico, com uma actividade funcional sob o ponto de vista imunológico, estimulada. Embora se descreva aqui, como exemplo, um processo para produzir um anticorpo humanizado, 38 podem ser preparadas outras moléculas funcionais sob o ponto de vista imunológico, pelo processo anteriormente mencionado ou de acordo com um processo semelhante. 4. Processo para a produção do anticorpo humanizado (1) Construção de um vector para expressão de um anticorpo humanizado 0 vector para a expressão do anticorpo humanizado é um vector de expressão para uso numa célula animal nas quais são inseridos os genes que codificam as regiões C de cadeia pesada (a seguir referido como "cadeia P") e de cadeia leve (daqui em diante referida como "cadeia L") de um anticorpo humano e pode ser preparado através da clonagem de cada um dos genes que codificam as regiões C de cadeia P e de cadeia L de um anticorpo humano num vector de expressão para células de animais.

As regiões C de um anticorpo humano podem ser as regiões C de cadeia P e de cadeia L de um anticorpo humano adequado e os exemplos incluem a região C de uma subclasse de IgGl de um anticorpo humano de cadeia H (a seguir referido como "ΙιΟγΙ") e a região C de uma classe de κ de um anticorpo humano de cadeia L (a seguir referido como "hCx").

Os genes que codificam as regiões C de cadeia P e de cadeia L de um anticorpo humano podem ser ADN cromossómico contendo um exão e um intrão ou um ADNc. 0 vector de expressão para células de animais pode ser qualquer vector, desde que possa ser inserido e expresso um gene que codifica a região C de um anticorpo humano. 39

Exemplos incluem pAGE107 (Cytotechnology, 3, 133 (1990)), pAGE103 (J. Biochem., 101, 1307 (1987)), pHSG274 (Gene, 27, 223 (1984)), pKCR (Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 78, 1527

(1981) e pSGl β d2-4 (Cytotechnology, 4, 173 (1990)). O

promotor e o potenciador a ser utilizado no vector de expressão para células de animais incluem, por exemplo, o promotor e intensificador precoce SV40 (J. Biochem., 101, 1307 (1987)), o virus da leucemia de rato Moloney LTR (Biochem. Biophys. Res. Comun., 149, 960 (1987)), o promotor de cadeia P de imunoglobulina (Cell, 41, 479 (1985)) e o respectivo intensificador (Cell, 33, 717 (1983)). 0 vector para a expressão do anticorpo humanizado pode ser qualquer vector em que a cadeia P e a cadeia L do anticorpo estão presentes em vectores separados ou num vector em que estão presentes no mesmo vector (a seguir referido como "vector em tandem"); no entanto, é preferível um vector em tandem para a expressão do anticorpo humanizado, uma vez que tais vectores de expressão em tandem de anticorpos humanizados são facilmente construídos e introduzidos numa célula de animal e podem equilibrar-se as quantidades de expressão da cadeia P e da cadeia L do anticorpo na célula de animal (J. Immunol. Methods, 167, 271 (1994)). O vector preparado para a expressão do anticorpo humanizado pode ser utilizado para a expressão de um anticorpo quimérico humano e um anticorpo enxertado em RDC humana, em células de animais. 40 (2) Preparação de ADNc que codifica a região V de um anticorpo derivado de um animal que não um ser humano 0 ADNc que codifica as regiões V de cadeia P e de cadeia L de um anticorpo derivado de um animal que não um ser humano, tal como um anticorpo de ratinho, pode ser obtido tal como descrito a seguir.

Sintetiza-se o ADNc através da extracção de ARNm de uma célula de hibridoma capaz de produzir o anticorpo de rato de interesse. 0 ADNc sintetizado é clonado num vector, tal como um fago ou um plasmido, para se preparar uma biblioteca de ADNc. Isola-se, respectivamente, um fago recombinante ou um plasmido recombinante contendo um ADNc que codifica uma região V de cadeia P e um fago recombinante ou um plasmido recombinante contendo um ADNc que codifica a região V de cadeia L, a partir da biblioteca, utilizando, como sonda, uma porção da região C ou uma porção da região V de um anticorpo conhecido de rato. Determinam-se as sequências completas de nucleótidos das regiões V de cadeia P e de cadeia L do anticorpo de ratinho, de interesse, no fago recombinante ou no plasmido recombinante e deduzem-se as sequências de aminoácidos completas das regiões V de cadeia L e P, a partir das sequências de nucleótidos. 0 animal não humano pode ser qualquer animal, tal como, por exemplo, ratinho, rato, hamster, coelho desde que uma célula de hibridoma possa ser produzida a partir deles. 0 processo para a preparação do ARN total a partir de uma célula de hibridoma inclui um processo com tiocianato de guanidina - trifluoroacetato de césio (Methods in Enzymol., 154, 3 (1987)). 0 processo para a preparação de 41 ARNm a partir de ARN total inclui, por exemplo, um processo em coluna de celulose imobilizada com oligo (dT) (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press, New York, 1989). Além disso, o estojo de isolamento de ARNm Fast Track (fabricado pela Invitrogen), o estojo de purificação de ARNm Quick Prep (fabricado pela Pharmacia) podem ser exemplificados como um estojo para a preparação de ARNm a partir de uma célula de hibridoma.

Exemplos do processo para a sintese de ADNc e para a preparação de uma biblioteca de ADNc incluem processos convencionais (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press, New York, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Suplemento 1-34), um processo que utiliza um estojo comercialmente disponível, tal como o sistema de plasmidos Super Script™ para a sintese de ADNc e a clonagem de plasmidos (fabricado pela GIBCO BRL) ou um estojo de ZAP-ADNc (fabricado pela Stratagene). 0 vector no qual se insere o ADNc sintetizado utilizando o ARNm extraído de uma célula de hibridoma, na preparação de uma biblioteca de ADNc, pode ser qualquer vector, desde que o ADNc possa ser inserido. Os exemplos incluem ZAP Express (Strategies, 5, 58 (1992)), pBluescript II SK(+) (Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1989)), ÀzapII (fabricado pela Stratagene), ÀgtlO e Xgtll (DNA Cloning: A Practical Approach, I, 49 (1985)), Lambda BlueMid (fabricado pela Clontech), XExCell e pT7T3 18U (fabricado pela Pharmacia), pcD2 (Mol. Cell. Biol., 3, 280 (1983)) e pUC18 (Gene, 33, 103 (1985)). A E. coli utilizada na introdução na biblioteca de ADNc construída por um vector de fago ou de plasmido pode ser de qualquer estirpe, desde que a biblioteca de ADNc 42 possa ser introduzida, expressa e mantida. Exemplos incluem XLl-Blue MRF' (Strategies, 5, 81 (1992)), C600 (Genetics, 39, 440 (1954)), Y1088 e Y1090 (Science, 222, 778 (1983)), NM522 (J. Mol. Biol., 166, 1 (1983)), K802 (J. Mol. Biol., 16, 118 (1966)) epUC18 (Gene, 38, 275 (1985)).

Pode-se utilizar um processo de hibridação de colónias ou de hibridação de placas, que utiliza uma sonda marcada com isótopos ou marcada por fluorescência para a selecção de um clone de ADNc que codifica as regiões V de cadeia P e da cadeia L de um anticorpo derivado de um animal que não seja um ser humano, a partir da biblioteca de ADNc (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press, New York, 1989). Além disso, o ADNc que codifica as regiões V de cadeia P e de cadeia L pode ser preparado através da reacção em cadeia de polimerase (daqui em diante referido como "RCP"; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press, New York, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Suplemento 1-34) preparando iniciadores e utilizando ADNc preparado a partir de uma biblioteca de ARNm ou de ADNc como matriz. A sequência de nucleótidos do ADNc seleccionado pelo processo anterior pode ser determinada, por exemplo, por digestão do ADNc com as enzimas de restrição apropriadas e clonagem dos fragmentos num plasmido, tal como pBluescript SK(-) (fabricado pela Stratagene) realizando a reacção por um processo de análise dos nucleótidos normalmente utilizados, tais como, o processo de didesoxi de Sanger et al. (Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 74, 5463 (1977)) e, em seguida, analisando a sequência utilizando um analisador automático de sequências de nucleótidos, tal como o sequenciador de ADN A.L.F. (fabricado pela Pharmacia). 43

Se o ADNc obtido codifica a sequência de aminoácidos completa das regiões V da cadeia P e da cadeia L do anticorpo que a contém, pode-se confirmar uma sequência de sinal de secreção por estimativa da sequência de aminoácidos completa das regiões V da cadeia P e da cadeia L, a partir da sequência de nucleótidos determinada e por comparação com as sequências completas de aminoácidos das regiões V da cadeia P e da cadeia L de anticorpos conhecidos (Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991). (3) Análise da sequência de aminoácidos da região V de um anticorpo derivado de um animal que não de um ser humano

No que respeita à sequência de aminoácidos completa das regiões V da cadeia P e da cadeia L do anticorpo que compreende uma sequência de sinal de secreção, pode-se estimar o comprimento e a sequência de aminoácidos de terminal N da sequência de sinal de secreção e os subgrupos aos quais pertencem podem ser conhecidos por comparação com sequências de aminoácidos completas das regiões V de cadeia de P e de cadeia L de anticorpos conhecidos (Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991). Cada sequência de aminoácidos da RDC das regiões V da cadeia P e da cadeia L pode também ser identificada através da sua comparação com sequências de aminoácidos das regiões V da cadeia P e da cadeia L de anticorpos conhecidos (Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dep. Health and Human Services, 1991). 44 (4) Preparação de um vector de expressão de um anticorpo quimérico humano

Um vector de expressão de um anticorpo quimérico humano pode ser construído por clonagem do ADNc que codifica as regiões V de cadeia P e de cadeia L de um anticorpo derivado de um animal que não um ser humano, a montante de um gene que codifica as regiões C da cadeia P e da cadeia L de um anticorpo humano no vector de expressão de um anticorpo humanizado descrito no ponto 4 (1) . Por exemplo, um vector de expressão de um anticorpo quimérico humano pode ser produzido por ligação dos ADNc que codificam as regiões V de cadeia P e de cadeia L derivadas de um anticorpo de um animal que não um ser humano, respectivamente, com um ADNc sintético que compreenda sequências de nucleótidos do lado do terminal 3' das regiões V da cadeia P e da cadeia L de um anticorpo derivado de um animal que não um ser humano, uma sequência de nucleótidos do lado do terminal 5' das regiões C da cadeia P e da cadeia L derivadas de um anticorpo humano e as sequências de reconhecimento apropriadas da enzima de restrição em ambos os terminais e clonados a montante de um gene que codifica as regiões C da cadeia P e da cadeia L de um anticorpo humano no vector de expressão de um anticorpo humanizado descrito no ponto 4 (1), de tal forma que sejam expressas de uma forma adequada.

(5) Preparação do ADNc de codificação da região V de um anticorpo humano enxertado numa RDC 0 ADNc que codifica as regiões V da cadeia P e da cadeia L derivadas de um anticorpo enxertado numa RDC humana pode ser obtido como se descreve a seguir. Em primeiro lugar, selecciona-se a sequência de aminoácidos da 45 estrutura (a seguir referida como "ES") das regiões V da cadeia P e da cadeia L de um anticorpo humano para o enxerto em RDC das regiões V da cadeia P e da cadeia L de um anticorpo derivado de um animal que não um ser humano. Qualquer sequência pode ser utilizada como sequência de aminoácidos da ES das regiões V da cadeia P e da cadeia L de um anticorpo humano, desde que seja derivada de um anticorpo humano. Por exemplo, podem utilizar-se as sequências de aminoácidos da ES das regiões V da cadeia P e da cadeia L de anticorpos humanos registados numa base de dados, tal como o Protein Data Bank, uma sequência de aminoácidos comum em cada subgrupo da ES das regiões V da cadeia P e da cadeia L de anticorpos humanos (Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991) para preparar um anticorpo enxertado numa RDC humana possuindo actividade suficiente e é desejável seleccionar uma sequência de aminoácidos que tem uma elevada homologia (pelo menos 60 % ou mais) com a sequência de aminoácidos objectivo das regiões V da cadeia P e da cadeia L de um anticorpo derivado de um animal que não é um ser humano.

Em seguida, a sequência de aminoácidos de RDC objectivo das regiões V da cadeia P e da cadeia L de um anticorpo derivado de um animal que não um ser humano é enxertada na sequência de aminoácidos da ES das regiões V da cadeia L e da cadeia P de um anticorpo humano e concebem-se as sequências de aminoácidos das regiões V da cadeia P e da cadeia L do anticorpo humano enxertado em RDC. Tomando em consideração a utilização de codões encontrados na sequência de nucleótidos do gene do anticorpo (Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991), convertem-se as sequências de aminoácidos concebidas em sequências de ADN e 46 concebem-se as sequências de ADN que codificam as sequências de aminoácidos das regiões V da cadeia P e da cadeia L do anticorpo enxertado numa RDC humana. Com base nas sequências de ADN concebidas, sintetizam-se vários fragmentos de ADN sintético com um comprimento de cerca de 100 bases e realiza-se a RCP utilizando estes fragmentos. Neste caso, com base na eficiência da reacção na RCP e o comprimento do ADN, que pode ser sintetizado, é desejável conceber 6 fragmentos sintéticos de ADN para cada cadeia P e cadeia L.

Além disso, a clonagem no vector para a expressão do anticorpo humanizado, preparado no ponto 4 (1), pode ser facilmente realizada através da introdução apropriada das sequências de reconhecimento da enzima de restrição nos terminais 5' do ADN sintético posicionado em ambos os terminais. Após a RCP, obtém-se um plasmido possuindo uma sequência de ADN que codifica a sequência de aminoácidos das regiões V da cadeia P e da cadeia L do anticorpo humano enxertado em RDC desejado por clonagem do produto amplificado num plasmido, tal como pBluescript SK(-) (fabricado pela Stratagene) e determina-se a sequência de nucleótidos pelo processo descrito no ponto 4(2).

(6) Modificação da sequência de aminoaácido da região V de um anticorpo humano enxertado em RDC

Sabe-se que, quando só a RDC das regiões V da cadeia P e da cadeia L de um anticorpo derivado de um animal que não seja um ser humano, de interesse, é simplesmente enxertada na ES das regiões V da cadeia P e da cadeia L de um anticorpo humano, a actividade de ligação ao antigénio do anticorpo enxertado na RDC humana é reduzida, em comparação com a actividade do anticorpo original derivado de um 47 animal que não um ser humano fBIO/TECHNOLOGY, 9, 266 (1991)). Como se considera que a causa disto consiste no facto de não só as sequências de aminoácidos da RDC mas também várias sequências naturais de aminoácidos da ES nas regiões V de cadeia P e de cadeia L do anticorpo original derivado de um animal que não um ser humano estarem, directa ou indirectamente relacionadas com a actividade de ligação ao antigénio e esses residuos de aminoácidos estão alterados em diferentes residuos de aminoácidos da ES das regiões V de cadeia P e da cadeia L do anticorpo humano acompanhado por enxerto na RDC. A fim de resolver este problema, em anticorpos humanos enxertados em RDC, têm sido feitas tentativas para identificar, entre as sequências de aminoácidos da ES das regiões V de cadeia P e de cadeia L de um anticorpo humano, um resíduo de aminoácido directamente relacionado com a ligação ao anticorpo, um resíduo de aminoácido interagindo com um resíduo de aminoácido da RDC e/ou um resíduo de aminoácido, que mantém a estrutura tridimensional do anticorpo e está directamente relacionado com a sua ligação ao antigénio e para aumentar a actividade de ligação ao antigénio reduzida, alterando estes resíduos de aminoácidos para resíduos de aminoácidos encontrados no anticorpo original derivado de um animal que não um ser humano (BIO/TECHNOLOGY, 9, 266 (1991)).

Na preparação de um anticorpo enxertado numa RDC humana, é preferível, para identificar eficientemente estes resíduos de aminoácidos da ES relacionados com a actividade de ligação ao antigénio, de tal modo que a construção e a análise da estrutura tridimensional dos anticorpos é efectuada, de preferência, usando uma análise de cristal por raios X (J. Mol. Biol., 112, 535 (1977)) e a modelagem por computador (Protein Engineering, 7, 1501 (1994)). 48

Embora a informação sobre estas estruturas tridimensionais dos anticorpos tenha fornecido informação útil para a preparação de anticorpos enxertados em RDC humanas, ainda não foi estabelecido um processo para produzir um anticorpo enxertado numa RDC humana aplicável a todos os anticorpos. É preferível, por conseguinte, realizar de vários ensaios e experiências de tentativa e erro num anticorpo individual, por exemplo, através da preparação de vários produtos desse anticorpo modificados e examinando a sua correlação com as respectivas actividades de ligação ao antigénio. A modificação dos resíduos de aminoácidos da ES das regiões V da cadeia P e da cadeia L de um anticorpo humano pode ser conseguida pela RCP descrita no ponto 4 (5) usando ADN sintético para posterior modificação. A obtenção da modificação pretendida é confirmada pela determinação da sequência de nucleótidos do fragmento amplificado após RCP, através do processo descrito no ponto 4(2). (7) Preparação de um vector de expressão de um anticorpo enxertado numa RDC humana

Um vector de expressão de um anticorpo enxertado numa RDC humana pode ser construído por clonagem do ADNc que codifica as regiões V da cadeia P e da cadeia L de um anticorpo enxertado numa RDC humana construído nos itens 4(5) e 4(6) a montante de um gene que codifica as regiões C da cadeia P e da cadeia L de um anticorpo humano no vector de expressão de um anticorpo humanizado descrito no ponto 4(1) . Por exemplo, entre os fragmentos de ADN sintético utilizados na construção das regiões V da cadeia P e da 49 cadeia L do anticorpo enxertado numa RDC humana em (5) e (6) do item 4, introduzem-se as sequências apropriadas que reconhecem as enzimas de restrição nos terminais 5' de um fragmento de ADN sintético posicionado em ambos os terminais e faz-se a clonagem a montante do gene que codifica as regiões C da cadeia P e da cadeia L de um anticorpo humano no vector para a expressão do anticorpo humanizado descrito no ponto 4(1), de tal forma que possam ser expressas numa forma apropriada para assim construir um vector de expressão de um anticorpo enxertado numa RDC humana. (8) Produção estável de um anticorpo humanizado

Um transformante capaz de produzir um anticorpo humanizado obtido de forma estável pode ser obtido através da introdução do vector de expressão do anticorpo humanizado descrito nos itens 4(4) e 4(7) numa célula apropriada de animal.

Os processos para a introdução de um vector de expressão numa célula de animal incluem, por exemplo, um processo de electroporação (pedido de patente japonesa não examinada, publicada No. 257891/90, Cytotechnology, 3, 133 (1990)) . A célula de animal, na qual se introduz um vector de expressão de anticorpo humanizado, pode ser qualquer célula, desde que seja uma célula de animal, que pode produzir o anticorpo humanizado. Os exemplos preferidos incluem uma célula que tem uma baixa actividade enzimática, de adição de fucose a IV-acetilglicosamina para ser ligada à região Fc do anticorpo produzido e uma célula que não possui tal actividade enzimática. 50 A célula que tem uma baixa actividade enzimática de adição de fucose a IV-acetilglicosamina para ser ligada à região Fc do anticorpo ou não tem tal actividade enzimática, é uma célula que tem menos ou não tem nenhuma enzima relacionada com a ligação cxl,6. Os exemplos incluem uma célula que tem uma baixa actividade de fucosil-transferase, preferencialmente actividade de FUT8 e uma célula que não possui tal actividade.

Exemplos da célula que tem uma baixa actividade enzimática de adição de fucose a IV-acetilglicosamina para ser ligada à região Fc do anticorpo ou não tem tal actividade enzimática, incluem, por exemplo, uma célula de mieloma de rato, a célula YB2/0. Uma célula em que está eliminado um gene envolvido na enzima relacionada com a ligação al,6 ou a actividade enzimática está reduzida ou é eliminada por adição de uma mutação ao gene, também pode ser usada como uma célula produtora de anticorpos.

Exemplos específicos incluem células de mieloma de rato, tal como células NSO e células SP2/0; células de ovário de hamster chinês, tais como células OHC/dhfr“ e células OHC/DG44; células de mieloma de rato, tais como células YB2/0 e células IR983F; células de mieloma humano, tal como células Namalwa. De preferência, podem utilizar-se células de ovário de hamster chinês, tal como células OHC/DC44.

Após a introdução do vector de expressão, o transformante capaz de produzir de forma estável o anticorpo humanizado pode ser seleccionado utilizando um meio de cultura de células de animais, contendo um fármaco, tal como o sulfato G418 (daqui em diante referido como 51 "G418", fabricado pela SIGMA) pelo processo descrito no pedido de patente japonesa não examinada, publicada No. 257891/90 0 meio para a cultura de células de animais inclui meio RPMI 1640 (fabricado pela Nissui

Pharmaceutical) , meio GIT (fabricado pela Nippon

Pharmaceutical) , meio EX-CELL 302 (fabricado pela JRH) , meio IMDM (fabricado pela GIBCO BRL), meio de hibridoma-SFM (fabricado pela GIBCO BRL) ou um meio preparado por adição de vários aditivos, tais como soro fetal de bovino (daqui em diante referido como "SFB") a cada um destes meios. O anticorpo humanizado pode ser produzido por cultura do transformante obtido num meio e acumulado num sobrenadante de cultura. A quantidade produzida e a actividade de ligação ao antigénio do anticorpo humanizado no sobrenadante da cultura pode ser medida, por exemplo, através do ensaio de imunoabsorção enzimática (doravante designado por "ELISA", Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, capítulo 14, 1998;

Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, Academic Press Limited, 1996). Além disso, a produção de anticorpos humanizados pelo transformante pode ser aumentada utilizando um sistema de amplificação do gene DHFR, segundo o processo descrito no pedido de patente japonesa, não examinada, publicada No. 257891/90 O anticorpo humanizado pode ser purificado a partir do sobrenadante de uma cultura contendo o transformante, utilizando uma coluna de proteína A (Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, capitulo 8, 1988; Monoclonal Antibodies: Principies and Practice,

Academic Press Limited, 1996). Além disso, podem utilizar-se outros processos de purificação geralmente utilizados para a purificação de proteína. Por exemplo, pode ser purificado por uma combinação de filtração em gel, 52 cromatografia de permuta iónica e ultrafiltração. 0 peso molecular da cadeia P, da cadeia L ou de uma molécula inteira de anticorpo, do anticorpo humanizado purificado, pode ser medido por electroforese em gel de poliacrilamida (daqui em diante designado por "EGPA-SDS", Nature, 227, 680 (1970)), o processo de transferência de Western (Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, capitulo 12, 1988; Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, Academic Press Limited, 1996).

Um processo de produção de anticorpos foi ilustrado antes usando, como hospedeiro, uma célula de animal e, tal como descrito no item 3 anterior, também podem ser produzidos por meio de uma bactéria, uma levedura, uma célula de insecto, uma célula de planta, um animal ou uma planta. (9) Avaliação da actividade de um anticorpo humanizado A actividade do anticorpo humanizado purificado para se ligar a um antigénio ou a uma linha de célula de cultura positiva em relação ao antigénio, pode ser medida pelo processo ELISA e pelo processo do anticorpo por fluorescência (Câncer Immunol. Immunother., 36, 373 (1993)). A actividade citotóxica para as linhas de células em cultura positivas para o antigénio pode ser avaliada medindo a sua actividade CDC, actividade CCDA (Câncer Immunol. Immunother., 36, 373 (1993)). Além disso, pode-se avaliar a segurança e os efeitos terapêuticos do anticorpo humanizado em seres humanos utilizando um modelo adequado de uma espécie animal relativamente próxima do ser humano, tal como Macaca faseicularis. 53 5. Processo de aplicação de uma molécula funcional sob o ponto de vista imunológico

Tal como se mostra no anticorpo humanizado descrito no item 4 anterior, um anticorpo com elevada actividade CCDA é útil na prevenção e no tratamento de várias doenças, incluindo um cancro, uma alergia, uma doença cardiovascular e uma infecção bacteriana ou virai.

No cancro, nomeadamente num tumor maligno, as células cancerosas proliferam. Os agentes anticancerigenos convencionais possuem uma caracteristica na inibição da proliferação de células cancerosas. Por outro lado, uma vez que um anticorpo com elevada actividade CCDA pode tratar cancros por proliferação dos danos nas células cancerosas, através do seu efeito citotóxico, é mais eficaz como um fármaco terapêutico do que os agentes anticancerigenos convencionais.

Uma vez que a reacção alérgica é induzida pela libertação de uma molécula mediadora de células imunitárias, a reacção alérgica pode ser inibida por remoção das células do sistema imunológico, utilizando um anticorpo com elevada actividade CCDA.

As doenças cardiovasculares incluem, por exemplo, arteriosclerose. A arteriosclerose é actualmente tratada por cateter de balão, mas as doenças cardiovasculares podem ser prevenidas e tratadas através da inibição da proliferação das células arteriais na re-estenose, após o tratamento, utilizando um anticorpo com elevada actividade CCDA. 54 Várias doenças, incluindo infecções virais ou bacterianas podem ser prevenidas e tratadas através da inibição da proliferação das células infectadas com virus ou bactéria, utilizando um anticorpo com elevada actividade CCDA.

Além disso, um anticorpo que iniba a actividade CCDA é útil na prevenção e no tratamento de doenças auto-imunes. 0 anticorpo que iniba a actividade CCDA também é útil na prevenção e no tratamento de doenças auto-imunes, do ponto de vista da supressão da resposta imunitária promovida em doenças auto-imunes. 0 medicamento contendo o anticorpo de acordo com a presente invenção pode ser administrado como um fármaco terapêutico por si só, mas, em geral, é desejável administrá-lo como uma preparação farmacêutica produzida por um processo apropriado bem conhecido no dominio técnico do fabrico farmacêutico, misturando-o com um ou mais veiculos aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico. É desejável seleccionar uma via de administração que seja a mais eficaz na realização de um tratamento. Os exemplos incluem a administração oral ou a administração parentérica, tal como, por exemplo, bucal, pelas vias aéreas, rectal, subcutânea, intramuscular ou intravenosa. Numa preparação de anticorpo, é preferível a administração intravenosa. A forma farmacêutica inclui, por exemplo, aerossóis, cápsulas, comprimidos, grânulos, xaropes, emulsões, supositórios, injecções, pomadas e adesivos. 55

As preparações líquidas, tais como emulsões e xaropes, podem ser produzidas utilizando, como aditivos, água; sacáridos, tais como sacarose, sorbitol, frutose, etc.; glicóis, tais como polietileno-glicol, propileno-glicol, etc.; lubrificantes, tais como óleo de sésamo, azeite, óleo de soja, etc.; antissépticos, tais como ésteres de ácido p-hidroxibenzóico, etc.; aromatizantes, tais como aroma de morango, hortelã-pimenta, etc.

As cápsulas, comprimidos, pós, grânulos e afins podem ser produzidos utilizando, como aditivos, agentes de enchimento, tais como lactose, glicose, sacarose, manitol, etc.; agentes desintegrantes, tais como amido, alginato de sódio, etc.; lubrificantes, tais como estearato de magnésio, talco, etc.; ligantes, tais como álcool poli-vinílico, hidroxipropilcelulose, gelatina, etc.; tensioactivos, tal como éster de ácido gordo, etc.; plastificantes, tais como glicerol, etc.

Exemplos de preparações farmacêuticas adequadas para administração parentérica incluem injecções, supositórios e aerossóis.

As injecções podem ser preparadas utilizando um veículo, tal como uma solução salina, uma solução de glicose ou uma mistura de ambas. Alternativamente, as injecções de pó podem ser preparadas por liofilização do anticorpo humanizado, da maneira usual e adição de cloreto de sódio.

Os supositórios podem ser preparados utilizando um veículo tal como manteiga de cacau, gordura hidrogenada ou ácido carboxílico. 56

Além disso, os aerossóis podem ser preparados utilizando o composto tal qual ou utilizando um veiculo que não estimule a mucosa bucal ou a membrana da mucosa das vias aéreas do doente e que possa facilitar a absorção do composto pela sua dispersão em particulas finas.

Exemplos de veiculo incluem lactose e glicerol. Consoante as propriedades do composto e do veiculo utilizado, é possivel produzir preparações farmacêuticas, tais como aerossóis e pós anidros. Além disso, os componentes exemplificados como agentes aditivos para preparações orais podem ser também adicionados a estas preparações parentéricas.

Apesar da dose clinica ou a frequência de administração variarem consoante, por exemplo, o efeito terapêutico pretendido, o processo de administração, o período de tratamento, a idade, o peso corporal e é geralmente de 10 yg/kg a 20 mg/kg por dia e por adulto.

Além disso, no que respeita ao processo para examinar o efeito anti-tumoral do anticorpo em várias células tumorais, os ensaios in vitro incluem, por exemplo, o processo de medição da actividade CDC, o processo de medição da actividade CCDA e os ensaios in vivo incluem, por exemplo, uma experiência anti-tumoral utilizando um sistema de tumores num animal experimental, tal como um murganho.

As medições da actividade CDC e da actividade CCDA e as experiências anti-tumores podem ser efectuadas em conformidade com os processos descritos nas referências (Câncer Immunology Immunotherapy, 36, 373 (1993), Câncer

Research, 54, 1511 (1994)) 57 6. Processo para promover ou inibir a actividade de uma molécula funcional sob o ponto de vista imunológico A actividade de uma molécula funcional sob o ponto de vista imunológico pode ser promovida através da produção de um anticorpo, péptido ou proteina ao qual se liga uma cadeia de açúcar isento de fucose, pelo processo anterior.

Quando a molécula funcional sob o ponto de vista imunológico, com a actividade estimulada, é administrada ao ser vivo, activam-se, no ser vivo, várias células imunitárias, como células efectoras, incluindo células assassinas, células assassinas naturais e macrófagos activados relacionados com a actividade CCDA, de modo que se torna possivel controlar várias respostas imunitárias.

Do mesmo modo, a actividade de uma molécula funcional sob o ponto de vista imunológico pode ser inibida através da produção de um anticorpo, um péptido ou uma proteina a que se liga, pelo processo anterior, uma cadeia de açúcar em que existe fucose.

Quando a molécula funcional sob o ponto de vista imunológico, tendo a actividade inibida, é administrada ao ser vivo, as actividades de diversas células imunitárias envolvidas na actividade CCDA estão enfraquecidas no ser vivo, de modo que se torna possivel controlar várias respostas imunitárias.

Os exemplos da presente invenção estão ilustrados a seguir, mas o âmbito da presente invenção não está limitado a eles. 58

BREVE EXPLICAÇÃO DOS DESENHOS A fig. 1 representa um gráfico que mostra os padrões de electroforese de EGPA-SDS de cinco anticorpos quiméricos anti-GD3 purificados (utilizando um gradiente de gel de 4 a 15 %) . 0 desenho superior e o desenho inferior mostram um resultado da electroforese em condições não redutoras e em condições de redução, respectivamente. As colunas 1 a 7 mostram um padrão de electroforese de marcadores de elevado peso molecular, um padrão de electroforese do anticorpo quimérico YB2/0-GD3, um padrão de electroforese do anticorpo quimérico OHC/DG44-GD3, um padrão de electroforese do anticorpo quimérico SP2/0-GD3, um padrão de electroforese do anticorpo quimérico NS0-GD3 (302), um padrão de electroforese do anticorpo quimérico NS0-GD3 (GIT) e um padrão de electrof orese de marcadores de baixo peso molecular, respectivamente. A fig. 2 representa um gráfico que mostra a actividade de cinco anticorpos quiméricos anti-GD3 purificados para se ligarem a GD3, medida por alteração da concentração de anticorpo. O eixo das ordenadas e o eixo das abcissas mostra a actividade de ligação com GD3 e a concentração do anticorpo, respectivamente. Os círculos abertos, os círculos fechados, os quadrados abertos, os quadrados fechados e os triângulos abertos mostram a actividade do anticorpo quimérico YB2/0-GD3, a actividade do anticorpo quimérico OHC/DG44-GD3, a actividade do anticorpo quimérico SP2/0-GD3, a actividade do anticorpo quimérico NS0-GD3 (302) e a actividade do anticorpo quimérico NS0-GD3 (GIT), respectivamente. A fig. 3 é um gráfico que mostra a actividade CCDA de cinco anticorpos quiméricos anti-GD3 purificados para 59 uma linha de células de melanoma humano G-361. O eixo das ordenadas e o eixo das abcissas mostram a actividade citotóxica e a concentração do anticorpo, respectivamente. Os círculos abertos, os círculos fechados, os quadrados abertos, os quadrados fechados e os triângulos abertos mostram a actividade do anticorpo quimérico YB2/0-GD3, a actividade do anticorpo quimérico OHC/DG44-GD3, a actividade do anticorpo quimérico SP2/0-GD3, a actividade do anticorpo quimérico NS0-GD3 (302) e a actividade do anticorpo quimérico NS0-GD3 (GIT), respectivamente. A fig. 4 representa um gráfico que mostra os padrões de electroforese de EGPA-SDS de três anticorpos enxertados em RDC anti-hIL-5Ra purificados (utilizando um gradiente de gel de 4 a 15 %) . O desenho superior e o desenho inferior mostram os resultados da electroforese feita em condições não redutoras e em condições de redução, respectivamente. As colunas 1 a 5 mostram um padrão de electroforese de marcadores de elevado peso molecular, um padrão de electroforese do anticorpo YB2/0-hIL-5RRDC, um padrão de electroforese do anticorpo OHC/0-hIL-5RRDC, um padrão de electroforese do anticorpo NSO-hIL-SRRDC e um padrão de electroforese de marcadores de baixo peso molecular, respectivamente. A fig. 5 representa um gráfico que mostra a actividade de três anticorpos enxertados em RDC anti-hIL-5Ra purificados para se ligarem a hIL-5Rcx, medida por alteração da concentração de anticorpos. O eixo das ordenadas e o eixo das abcissas mostra a actividade de ligação com hIL-5Ra e a concentração do anticorpo, respectivamente. Os círculos abertos, os círculos fechados e os quadrados abertos mostram a actividade do anticorpo YB2/0-hIL-5RaCDR, a actividade do anticorpo 60 0HC/d-hIL-5RRDC e a actividade do anticorpo NSO-hlL-SRRDC, respectivamente . A fig. 6 é um gráfico que mostra a actividade CCDA de três anticorpos enxertados em RDC anti-hIL-5Ra purificados para um hIL-5R que expressa uma linha de células T de murganho CTLL-2(h5R). 0 eixo das ordenadas e o eixo das abcissas mostram a actividade citotóxica e a concentração do anticorpo, respectivamente. Os círculos abertos, os círculos fechados e os quadrados abertos mostram a actividade do anticorpo YB2/0-hIL-5RaCDR, a actividade do anticorpo 0HC/d-hIL-5RRDC e a actividade do anticorpo NSO-hIL-SRRDC, respectivamente. A fig. 7 é um gráfico que mostra a inibição da actividade de três anticorpos enxertados em RDC anti-hIL-5Ra purificados num modelo de Macaca fascicularis que aumenta o eosinófilo induzido por hIL-5. 0 eixo das ordenadas e o eixo das abscissas mostram a actividade dos eosinófilos no sangue periférico e o número de dias (o dia de início da administração de anticorpo e de hIL-5 foi definido como o dia 0) . Os resultados no grupo a que se não se administraram anticorpos estão ilustrados por 101 e 102, os resultados no grupo a que se administrou o anticorpo YB2/0-hIL-5RRDC estão ilustrados em 301, 302 e 303, os resultados no grupo a que se administrou o anticorpo OHC/d-hIL-5RRDC em 401, 402 e 403 e os resultados no grupo a que se administrou o anticorpo NS0-hIL-5RRDC estão ilustrados por 501, 502 e 503. A fig. 8 é um gráfico que ilustra um padrão de eluição de CLAR de fase inversa de eluição de uma cadeia de açúcar-PA tratado (lado esquerdo), e um padrão de eluição obtido por tratamento da cadeia de açúcar tratada com PA com α-L-fucosidase e depois analisadas por CLAR de fase reversa (lado direito), do anticorpo 61 enxertado em RDC anti-hIL-5Ra purificado, produzido por YB2/0 (lado superior) e o anticorpo enxertado em RDC anti-hIL-5Ra purificado, produzido por NSO (lado inferior) . 0 eixo das ordenadas e o eixo das abcissas mostram a intensidade de fluorescência relativa e o tempo de eluição, respectivamente. A fig. 9 representa um gráfico que mostra um perfil de eluição obtido por preparação de uma cadeia de açúcar tratada com PA a partir do anticorpo enxertado em RDC anti-hIL-5Roí produzido por células de OHC/d e a sua análise por CLAR de fase inversa. 0 eixo das ordenadas e o eixo das abcissas mostram a intensidade de fluorescência relativa e o tempo de eluição, respectivamente. A fig. 10 representa um gráfico que mostra a actividade de ligação a GD3 de uma fracção não adsorvida e de uma parte da fracção adsorvida, medida por alteração da concentração do anticorpo. O eixo das ordenadas e o eixo das abcissas mostra a actividade de ligação com GD3 e a concentração do anticorpo, respectivamente. Os círculos a cheio e os círculos abertos mostram a fracção não adsorvida e uma parte da fracção adsorvida, respectivamente. O gráfico que se segue mostra a actividade CCDA de uma fracção não adsorvida e uma parte da fracção adsorvida para uma linha de melanoma humano L-361. O eixo das ordenadas e o eixo das abcissas mostram a actividade citotóxica e a concentração do anticorpo, respectivamente. Os círculos a cheio e os círculos abertos mostram a fracção não adsorvida e uma parte da fracção adsorvida, respectivamente. A fig. 11 representa um gráfico que mostra os padrões de eluição obtidos por análise das cadeias de açúcar tratadas com PA preparadas a partir da fracção não 62 adsorvida e uma parte da fracção adsorvida por meio de CLAR inversa. 0 desenho do lado esquerdo e o desenho do lado direito mostram um padrão de eluição da fracção não adsorvida e um padrão de eluição de uma parte da fracção adsorvida, respectivamente. 0 eixo das ordenadas e o eixo das abcissas mostram a intensidade de fluorescência relativa e o tempo de eluição, respectivamente. A fig. 12 é um gráfico que mostra a quantidade de produto de transcrição de FUT8 pelas respectivas linhas de células hospedeiras quando uma sequência de FUT8 de rato é usada como padrão de controlo interno. 0 circulo fechado e os circulos abertos mostram o resultado quando foi utilizado uma linha de células de OHC e o resultado quando se utilizou uma linha de células YB2/0, como célula hospedeira, respectivamente.

MELHOR PRÁTICA PARA A REALIZAÇÃO DA PRESENTE INVENÇÃO

Exemplo 1

Produção do anticorpo quimérico humano anti-gangliósidos GD3 1. Construção do vector de expressão em tandem, pChiLHGM4, para o anticorpo quimérico humano anti-gangliósido GD3

Produziu-se um plasmido, pChi641LGM40, ligando um fragmento de cerca de 4,03 kb contendo um ADNc de cadeia L, obtido por digestão de um vector de expressão de cadeia L, pChi641LGM4 (J. Immunol. Methods, 167, 271 (1994)) para o anticorpo quimérico humano anti-gangliósido GD3 (a seguir referido como "anticorpo quimérico anti-GD3") com as enzimas de restrição, MuiI (fabricada pela Takara Shuzo) e 63

Sal I (fabricado pela Takara Shuzo), com um fragmento de cerca de 3,40 kb contendo um gene resistente a G418 e um sinal de combinação, obtido por digestão de um vector de expressão pAGEl07 (Cytotechnology, 3, 133 (1990)) para a célula animal, com as enzimas de restrição, MULI (fabricada pela Takara Shuzo) e Sall (fabricada pela Takara Shuzo), utilizando um estojo de ligação de ADN (fabricado pela Takara Shuzo) e depois transformando HB101 de E. coli (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press, New York, 1989) com o produto ligado usando o estojo de ligação de ADN (fabricado pela Takara Shuzo).

Em seguida, tornou-se cego um terminal de um fragmento de cerca de 5,68 kb contendo um ADNc da cadeia L, obtido por digestão do plasmido preparado, Chi641LGM40, com uma enzima de restrição Ciai (fabricada pela Takara Shuzo), usando um estojo para tornar cego o ADN (fabricado pela Takara Shuzo ) e ainda fez-se a sua digestão com MluI (fabricado pela Takara Shuzo), e ligou-se a um fragmento de cerca de 8,4 0 kb contendo um ADNc da cadeia P, obtido por digestão de um vector de expressão da cadeia P de um anticorpo quimérico anti-GD3 (J. Immunol. Methods, 167, 271 (1994)) com uma enzima de restrição Xhol (fabricada pela Takara Shuzo), tornando-se o terminal cego utilizando um estojo para tornar cego o ADN (fabricado pela Takara Shuzo) e ainda fazendo a digestão com MluI (fabricado pela Takara Shuzo), utilizando um estojo de ligação de ADN (fabricado pela Takara Shuzo) e depois transformou-se HB101 deE. coli (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press, New York, 1989) com o produto ligado, para assim construir um vector de expressão em tandem, pChi641LRGM4, para o anticorpo quimérico anti-GD3. 64 2. Produção de células que produzem estavelmente anticorpos quiméricos anti-GD3

Utilizando o vector de expressão em tandem, pChi641LHGM4, para o anticorpo quimérico anti-GD3 construido no item 1 do exemplo 1, prepararam-se as células capazes de produzir, de maneira estável, um anticorpo quimérico anti-GD3, tal como descrito a seguir. (1) Produção de células produtoras usando células de mieloma de rato YB2/0

Após a introdução de 5 yg do vector de expressão do anticorpo quimérico anti-GD3, pChi64lLHGM4, em 4xl06 células de mieloma de rato YB2/0 por electroporação (Cytotechnology, 3, 133 (1990)), fez-se uma suspensão das células em 40 ml de RPMI 1640 - SFB (10) (meio RPMI 1640 contendo SFB a 10 % (fabricado pela GIBCO BRL)) e distribuiram-se a 200 μΐ/poço numa placa de cultura de 96 poços (fabricada pela Sumitomo Bakelite). Vinte e quatro horas após a cultura, a 37 °C numa incubadora com C02 a 5 %, adicionou-se G418 até a uma concentração de 0,5 mg/ml, seguido de cultura durante 1 a 2 semanas. Recolheu-se o sobrenadante da cultura a partir dos respectivos poços em que se tinham formado colónias de transformantes que mostram a resistência a G418 e observou-se o crescimento das colónias e mediu-se a actividade de ligação ao antigénio do anticorpo quimérico anti-GD3 no sobrenadante por ELISA, como se mostra no item 3 do exemplo 1.

No que respeita aos transformantes nos poços em que se observou a produção do anticorpo quimérico anti-GD3 nos sobrenadantes da cultura, para aumentar a quantidade de produção do anticorpo utilizando um sistema de amplificação 65 do gene da DHFR e fez-se uma suspensão de cada um deles em meio RPMI1640 - SFB (10) contendo 0,5 mg/ml de G418 e inibidor de DHFR 50 nM, metotrexato (a seguir referido como "MTX", fabricado pela Sigma), para se obter uma densidade de 1 a 2xl06 células/ml e distribuiu-se a suspensão, a 2 ml, em poços de uma placa com 24 poços (fabricada pela Greiner). Os transformantes que mostram resistência a MTX 50 nM foram induzidos por cultura, a 37 °C, durante 1 a 2 semanas numa incubadora de CO2 a 5 %. A actividade de ligação ao antigénio do anticorpo quimérico anti-GD3 nos sobrenadantes da cultura, em poços em que foi observado o crescimento de transformantes, foi medida por ELISA e está ilustrada no item 3 do exemplo 1. Em relação aos transformantes nos poços em que se observou a produção do anticorpo quimérico anti-GD3, nos sobrenadantes da cultura, a concentração de MTX aumentou para 100 nM e depois para 200 nM e um transf ormante capaz de crescer no meio RPMI 164 0 - SFB (10) contendo 0,5 mg/ml de G418 e MTX 200 nM e que obteve-se finalmente a produção do anticorpo quimérico anti-GD3, em grande quantidade, pelo mesmo processo que foi descrito anteriormente. O transformante obtido foi produzido numa única célula (clonagem), limitando a diluição a duas vezes. O clone 7-9-51 da célula transformada que produz o anticorpo quimérico anti-GD3 obtido tinha sido depositado em 5 de Abril de 1999, como FERM BP-6691, no Instituto Nacional de Biociências e Tecnologias Humanas, da Agência de Ciência e Tecnologia Industrial (Higashi 1-1-3, Tsukuba, Ibaraki, Japão). 66 (2) Produção de células produtoras usando células de OHC/DG44

Após a introdução de 4 yg do vector de expressão do anticorpo quimérico anti-GD3, pChi641LHGM4, em 1,6><106 células OHC/DG44, por electroporação (Cytotechnology, 3, 133 (1990)), fez-se uma suspensão das células em 10 ml de IMDM - SFB (10) (meio IMDM contendo SFB a 10 % e lx a concentração do suplemento de HT (fabricado pela GIBCO BRL) ) e distribuíram-se, a 200 μΐ/poço, numa placa de cultura de 96 poços (fabricada pela Iwaki Glass). Vinte e quatro horas após a cultura, a 37 °C, numa incubadora com CO2 a 5 %, adicionou-se G418 até a uma concentração de 0. 5 mg/ml, seguido de cultura durante 1 a 2 semanas. Recuperou-se o sobrenadante da cultura a partir dos respectivos poços em que se tinham formado colónias de transformantes que mostram a resistência a G418 e observou-se o crescimento das colónias e mediu-se a actividade de ligação ao antigénio do anticorpo quimérico anti-GD3 no sobrenadante por ELISA, como se mostra no item 3 do exemplo 1.

No que respeita aos transformantes nos poços em que se observou a produção do anticorpo quimérico anti-GD3 nos sobrenadantes da cultura, para aumentar a quantidade de produção do anticorpo utilizando um sistema de amplificação do gene de DHFR e fez-se uma suspensão de cada um deles em meio IMDM-SFBd (10) (meio IMDM contendo soro bovino fetal, a 10 %, dialisado (a seguir referido como "SFBd", fabricado pela GIBCO BRL), contendo 0,5 mg/ml de G418 e MTX 10 nM para se obter uma densidade de 1 a 2><105 células/ml e distribuiu-se a suspensão, a 0,5 ml, em poços de uma placa com 24 poços (fabricada pela Iwaki Glass). Os transformantes que mostram uma resistência a MTX 10 nM 67 foram induzidas por cultura, a 37 °C, durante 1 a 2 semanas, numa incubadora de CO2 a 5 %. Em relação aos transf ormantes nos poços em que se observou o seu crescimento, a concentração de MTX aumentou para 100 nM e finalmente obteve-se um transformante capaz de crescer em meio IMDM - SFBd (10) contendo 0,5 mg/ml de G418 e MTX 100 nM e capaz de produzir o anticorpo quimérico anti-GD3, em grande quantidade, pelo mesmo processo que foi descrito antes. O transformante obtido foi produzido numa única célula (clonagem), limitando a diluição a duas vezes.

(3) Produção de células produtoras usando células de mleloma de rato NSO

Após a introdução de 5 yg do vector de expressão do anticorpo quimérico anti-GD3, pChi641LHGM4, em 4*106 células de mieloma de rato NSO, por electroporação (Cytotechnology, 3, 133 (1990)), fez-se uma suspensão das células em 40 ml de EX-CELL302 - SFB (10) (meio EX-CELL302-contendo SFB a 10 % e L-glutamina 2 mM (daqui para a frente referida como "L-Gln"; (fabricado pela GIBCO BRL)) e distribuiu-se, a 200 μΐ/poço, numa placa de cultura de 96 poços (fabricada pela Sumitomo Bakelite) . Vinte e quatro horas após a cultura, a 37 °C, numa incubadora com CO2 a 5 %, adicionou-se G418 até a uma concentração de 0,5 mg/ml, seguido de cultura durante 1 a 2 semanas. Recolheu-se o sobrenadante da cultura a partir dos respectivos poços em que se tinham formado colónias de transformantes que mostram a resistência a G418 e observou-se o crescimento das colónias e mediu-se a actividade de ligação ao antigénio do anticorpo quimérico anti-GD3 no sobrenadante, por ELISA, como se mostra no item 3 do exemplo 1. 68

No que respeita aos transformantes nos poços em que se observou a produção do anticorpo quimérico anti-GD3 nos sobrenadantes da cultura, para aumentar a quantidade de produção do anticorpo utilizando um sistema de amplificação do qene da DHFR e fez-se uma suspensão de cada um deles em meio IMDM-SFBd (10) (meio EX-CELL302 contendo SBF a 10 % e L-Gln 2 mM), contendo 0,5 mg/ml de G418 e MTX 50 nM para se obter uma densidade de 1 a 2><105 células/ml e distribuiu-se a suspensão, a 2 ml, em poços de uma placa com 24 poços (fabricada pela Greiner). Os transformantes que mostram uma resistência a MTX 50 nM foram induzidos por cultura, a 37 °C, durante 1 a 2 semanas, numa incubadora de CO2 a 5 %. A actividade de ligação ao antigénio do anticorpo quimérico anti-GD3 no sobrenadante da cultura, em poços em que foi observado o crescimento de transformantes, foi medida por ELISA, como ilustrado no item 3 do exemplo 1. Em relação aos transformantes nos poços em que se observou a produção do anticorpo quimérico anti-GD3, nos sobrenadantes da cultura, a concentração de MTX aumentou para 100 nM e depois para 200 nM e um transformante capaz de crescer no meio EX-CELL302 - SFBd (10) contendo 0,5 mg/ml de G418 e MTX 200 nM e obteve-se finalmente a produção do anticorpo quimérico anti-GD3, em grande quantidade, pelo mesmo processo que foi descrito anteriormente. O transformante obtido foi produzido numa única célula (clonagem), limitando a diluição a duas vezes. 3. Medição da actividade de ligação do anticorpo a GD3 (ELISA) A actividade de ligação do anticorpo ao GD3 foi medida tal como descrito a seguir. 69

Em 2 ml de solução de etanol, contendo 10 yg de di-palmitoilfosfatidilcolina (fabricada pela Sigma) e 5 yg de colesterol (fabricado pela SIGMA), dissolveu-se 4 nmole de GD3. Em cada poço de uma placa de 96 poços para ELISA (fabricado pela Greiner), distribuiu-se 20 yl da solução (40 pmole/poço de concentração final), seguido de secagem ao ar, distribuiu-se albumina de soro bovino a 1 % (adiante designado por "ASB"; fabricado pela Sigma) contendo SFB (a seguir referido como "ASB-SFB a 1 %") a 100 yl/poço e, em seguida, realizou-se a reacção, à temperatura ambiente, durante 1 hora, para bloquear os grupos activos remanescentes. Após descartar ASB-SFB a 1 %, distribuiu-se o sobrenadante de cultura de um transformante ou uma solução diluida de um anticorpo quimérico humano em 50 yl/poço para realizar a reacção, à temperatura ambiente, durante 1 hora. Após a reacção, lavou-se cada poço com Tween 20 a 0,05 % (fabricado pela Wake Pure Chemical Industries) contendo SFB (a seguir referido como "Tween-SFB"), distribuiu-se uma solução do anticorpo IgG anti-humana de cabra marcado com peroxidase (H & L) (fabricada pela American Qualex), diluída 3000 vezes com ASB-SFB a 1 % a 50 yl/poço, como uma solução secundária de anticorpo e, em seguida, realizou-se a reacção, à temperatura ambiente, durante 1 hora. Após a reacção e a subsequente lavagem com Tween-SFB, distribuiu-se uma solução de substrato de ABTS (uma solução preparada por dissolução de 0,55 g de sal de amónio de 2,2'-azino-bis(ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) , em 1 litro de tampão de citrato 0,1 M (pH 4,2) e adicionou-se à solução 1 yl/ml de peróxido de hidrogénio, imediatamente antes da utilização) a 50 yl/poço, para o desenvolvimento da cor e, em seguida, mediu-se a absorvância a 415 nm (a seguir referido como "DO415") . 70 4. Purificação do anticorpo quimérico anti-GD3 (1) Cultura de células produtoras derivadas de YB2/0 e purificação do anticorpo

Os clones de células transformadas que produzem anticorpos quiméricos anti-GD3 obtidos no item anterior 2(1) do exemplo 1 foram suspensos em meio de hibridoma-SFM contendo ASB a 0,2 %, MTX 200 nM e tri-iodotironina 100 nM (adiante designado como "T3"; fabricado pela Sigma), para se obter uma densidade de 3><105 células/ml e fez-se a sua cultura utilizando um frasco giratório com uma capacidade de 2,0 litro (fabricado pela Iwaki Glass), sob agitação, a uma velocidade de 50 rpm. Dez dias após a cultura, a 37°C, numa sala com a temperatura controla, recuperou-se o sobrenadante da cultura. O anticorpo quimérico anti-GD3 foi purificado a partir do sobrenadante da cultura, utilizando uma coluna Prosep-A (fabricada pela Bioprocessing), de acordo com as instruções do fabricante. O anticorpo quimérico anti-GD3 purificado foi designado por anticorpo quimérico YB2/0-GD3. (2) Cultura de células produtoras derivadas de células de OHC/DG44 e purificação do anticorpo 0 clone de células transformadas que produzem anticorpos quiméricos anti-GD3 obtido no item anterior 2(2) do exemplo 1 foi suspenso em meio EX-CELL302 contendo L-Gln 3 mM, uma solução concentrada de ácido gordo a 0,05 % (a seguir designada como "CDLC"; fabricada pela GIBCO BRL) e Pluronic F68 a 0,3 % (a seguir referido como "PF68"; fabricado por GIBCO BRL) para se obter uma densidade de lxlO6 células/ml e distribuiu-se 50 ml da suspensão por frascos de 175 mm3 (fabricados pela Greiner) . Quatro dias 71 após a cultura, a 37 °C, numa incubadora com CO2 a 5 %, recuperou-se o sobrenadante da cultura. 0 anticorpo quimérico anti-GD3 foi purificado a partir do sobrenadante da cultura, utilizando uma coluna Prosep-A (fabricada pela Bioprocessing), de acordo com as instruções do fabricante. 0 anticorpo quimérico anti-GD3 purificado foi designado por anticorpo quimérico OHC/DG44-GD3. (3) Cultura de células produtoras derivadas de células NSO e purificação do anticorpo 0 clone de células transformadas que produzem anticorpos quiméricos anti-GD3, obtido no item anterior 2(3) do exemplo 1, foi suspenso em meio EX-CELL302 contendo L-Gln 2 mM, 0,5 mg/ml de G418, MTX 200 nM e SFB a 1 %, para se obter uma densidade de lxlO6 células/ml e distribuiu-se 200 ml da suspensão por frascos de 175 mm3 (fabricados pela Greiner) . Quatro dias após a cultura, a 37°C, numa incubadora com CO2 a 5 %, recuperou-se o sobrenadante da cultura. O anticorpo quimérico anti-GD3 foi purificado a partir do sobrenadante da cultura, utilizando uma coluna Prosep-A (fabricado pela Bioprocessing), de acordo com as instruções do fabricante. O anticorpo quimérico anti-GD3 purificado foi designado por anticorpo quimérico NS0-GD3 (302) . Além disso, o clone de células transformado foi suspenso em meio GIT contendo 0,5 mg/ml de G418 e MTX 200 nM para se obter uma densidade de 3*105 células/ml e distribuiu-se 200 ml da suspensão em frascos de 175 mm3 (fabricados pela Greiner). Dez dias após a cultura, a 37°C, numa incubadoara com CO2 a 5 %, recuperou-se o sobrenadante da cultura. O anticorpo quimérico anti-GD3 foi purificado a partir do sobrenadante da cultura, utilizando uma coluna Prosep-A (fabricada pela Bioprocessing), de acordo com as instruções do fabricante. O anticorpo quimérico anti-GD3 72 purificado foi designado por anticorpo quimérico NS0-GD3 (GIT) . (4) Cultura de células produtoras derivadas de células SP2/0 e purificação do anticorpo 0 clone de células transformadas que produzem o anticorpo quimérico anti-GD3, descrito no pedido de patente japonesa não examinada e publicada n°. 304989/93 foi suspenso em meio GIT contendo 0,5 mg/ml de G418 e MTX 200 nM para se obter uma densidade de 3χ105 células/ml e distribuiu-se 200 ml da suspensão por frascos de 175 mm3 (fabricados pela Greiner) . Oito dias após a cultura, a 37°C, numa incubadora com CO2 a 5 0 0 r recuperou-se 0 sobrenadante da cultura. O anticorpo quimérico anti-GD3 foi purificado a partir do sobrenadante da cultura, utilizando uma coluna Prosep-A (fabricada pela Bioprocessing), de acordo com as instruções do fabricante. O anticorpo quimérico anti-GD3 purificado foi designado por anticorpo quimérico SP2/0-GD3. 5. Análise dos anticorpos quiméricos anti-GD3 purificados

De acordo com um processo conhecido (Nature, 227, 680, 1970), submeteu-se 4 yg de cada um dos cinco anticorpos quiméricos anti-GD3 produzidos e purificado a partir das respectivas células de animais, obtidas no item anterior 4 do exemplo 1, a EGPA-SDS para analisar o peso molecular e o grau de purificação. Os resultados estão ilustrados na fig.l. Como se mostra na fig. 1, encontrou-se uma única banda de cerca de 150 quilodaltons (doravante referidos como "Rd"), em peso molecular, em condições não redutoras e duas bandas de cerca de 50 kd e cerca de 25 Kd em condições redutoras, em cada um dos anticorpos quiméricos anti-GD3 73 purificados. Estes pesos moleculares quase coincidiram com os pesos moleculares deduzidos a partir das sequências de nucleótidos de ADNc da cadeia P e da cadeia L do anticorpo (cadeia P: cerca de 4 9 Kd, cadeia L: cerca de 23 Kd, molécula total: cerca de 144 Kd) e também coincidiram com os relatos de que o anticorpo IgG tem um peso molecular de cerca de 150 kD em condições não redutoras e está degradado nas cadeias P tendo um peso molecular de cerca de 50 kd e nas cadeias L, com um peso molecular de cerca de 25 Kd, em condições redutoras, devido ao corte da ligação de dissulfureto (daqui em diante referida como "ligação S-S") na molécula (Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, capitulo 14, 1998; Monoclonal

Antibodies: Principies and Practice, Academic Press

Limited, 1996), de modo que foi confirmado que cada anticorpo quimérico anti-GD3 foi expresso e purificado como uma molécula de anticorpo possuindo a verdadeira estrutura.

Exemplo 2

Avaliação da actividade de anticorpos quiméricos anti-GD3: 1. Actividade de ligação de anticorpos quiméricos anti-GD3 a GD3 (ELISA) A actividade dos cinco anticorpos quiméricos anti-GD3 purificados obtidos no ponto anterior 4 do exemplo 1 para se ligar a GD3 (fabricados por Snow Brand Milk Products) foi medida por ELISA e está ilustrada no item 3 do exemplo 1. A fig. 2 mostra um resultado da análise da actividade de ligação medida por alteração da concentração do anticorpo quimérico anti-GD3 a ser adicionado. Como se mostra na fig. 2, os cinco anticorpos quiméricos anti-GD3 mostraram praticamente a mesma actividade de ligação a GD3. Este 74 resultado mostra que as actividades de ligação ao antigénio destes anticorpos são constantes, independentemente das células de animais produtoras dos anticorpos e dos seus processos de cultura. Além disso, tem sido sugerido, a partir da comparação do anticorpo quimérico NS0-GD3 (302) com o anticorpo quimérico NS0-GD3 (GIT), que as actividades de ligação ao antigénio são constantes, independentemente dos meios de cultura usados. 2. Actividade citotóxica (actividade CCDA) in vitro do anticorpo quimérico anti-GD3 A fim de avaliar a actividade citotóxica in vitro dos cinco anticorpos quiméricos anti-GD3 purificados, obtidos no item 4 anterior do exemplo 1, mediu-se a actividade CCDA de acordo com o seguinte processo. (1) Preparação de uma solução de células-alvo

Fez-se uma cultura de uma linha de células de melanoma humano G361 (ATCC CRL 1424) usando o meio RPMI 1640 - SFB (10) para preparar 1*106 células e marcaram-se as células com radioisótopos fazendo-as reagir com 3,7 MBq equivalentes de uma substância radioactiva Na251Cr04, a 37 °C, durante 1 hora. Após a reacção, lavaram-se as células três vezes através da sua suspensão no meio RPMI 1640 - SFB (10) e centrifugação, suspenderam-se novamente no meio e em seguida deixaram-se em repouso, a 4 °C, durante 30 minutos, em gelo, para a dissolução espontânea da substância radioactiva. Após centrifugação, ajustou-se o precipitado para 2*105 células/ml por adição de 5 ml de meio RPMI 1640 - SFB (10) e usou-se como a solução de células-alvo. 75 (2) Preparação de uma solução de células efectoras

Recolheu-se 50 ml de sangue da veia de uma pessoa saudável e misturou-se, cuidadosamente, com 0,5 ml de heparina sódica (fabricada pela Takeda Pharmaceutical) . Centrifugou-se a mistura para isolar uma camada de células mononucleares utilizando Lymphoprep (fabricado pela Nycomed Pharma AS) , em conformidade com as instruções do fabricante. Após lavagem com o meio RPMI 1640 - SFB (10) por centrifugação, três vezes, fez-se uma nova suspensão do precipitado resultante para se obter uma densidade de 2*106 células/mL, utilizando o meio e utilizou-se como solução de células efectoras.

(3) Medição da actlvldade CCDA

Em cada poço de uma placa de 96 poços, de fundo em forma de U (fabricada pela Falcon) , colocou-se 50 μΐ da solução de células-alvo preparada no ponto (1) anterior (lxlO4 células/poço). Em seguida, adicionou-se 100 μΐ da solução de células efectoras preparada no ponto (2) anterior (2><105 células/poço, tornando-se a proporção de células efectoras para células-alvo em 20:1). Em seguida, adicionou-se cada um dos anticorpos quiméricos anti-GD3 para se obter uma concentração final de 0,0025 a 2,5 pg/ml, seguido de reacção, a 37 °c, durante 4 horas. Após a reacção, a placa foi centrifugada e mediu-se a quantidade de 51Cr no sobrenadante utilizando um contador γ. A quantidade de 51Cr espontaneamente libertada foi calculada pela mesma operação usando apenas o meio em vez da solução de células efectoras e a solução de anticorpo e medindo a quantidade de 51Cr no sobrenadante. A quantidade total de 51Cr espontaneamente libertada foi calculada pela mesma operação usando apenas o meio em vez da solução de células 76 efectoras e a solução de anticorpo e medindo a quantidade de 51Cr no sobrenadante. A actividade de CCDA foi calculada a partir da seguinte equação.

Actividade CCDA (%)=51Cr no sobrenadante da amostra - 51Cr libertado espontaneamente X 100 51Cr total libertado - 51Cr libertado espontaneamente

Os resultados estão ilustrados na fig.3. Como se mostra na fig. 3, entre os cinco anticorpos quiméricos anti-GD3, o anticorpo quimérico YB2/0-GD3 apresentou a maior actividade CCDA, seguido do anticorpo quimérico SP2/0-GD3, do anticorpo quimérico NS0-GD3 e do anticorpo quimérico 0HC-GD3, por esta ordem. Não foi encontrada diferença na actividade CCDA entre o anticorpo quimérico NS0-GD3 (302) e o anticorpo quimérico NS0-GD3 (GIT), preparados utilizando diferentes meios de cultura. Os resultados anteriores mostram que a actividade CCDA dos anticorpos varia muito, consoante as células de animais que são utilizadas na sua produção. Como seu mecanismo, uma vez que as suas actividades de ligação ao antigénio eram idênticas, considerou-se que isto é causado por uma diferença na estrutura da região Fc do anticorpo.

Exemplo 3

Produção do anticorpo anti-humano enxertado numa RDC humana da cadeia α do receptor de interleucina 5 1. Produção de células que produzem estavelmente o anticorpo anti-humano enxertado numa RDC humana da cadeia α do receptor de interleucina 5 (1) Produção de células produtoras usando células de mieloma de rato YB2/0 77

Usando o vector de expressão do anticorpo anti-humano enxertado numa RDC humana da cadeia α do receptor de interleucina 5 (doravante referido como "anticorpo enxertado numa RDC anti-hIL-5R a"), pKANTEX1259HV3LVO, descrito na WO 97/10354, prepararam-se, como se descreve a seguir, as células capazes de produzir estavelmente o anticorpo enxertado numa RDC anti-hIL-5R a.

Após a introdução de 5 yg do vector de expressão do anticorpo enxertado numa RDC anti-hIL-5R a, pKANTEX1259HV3LV0, em 4><106 células de mieloma de rato YB2/0 por electroporação (Cytotechnology, 3, 133 (1990)), fez-se uma suspensão das células em 40 ml de RPMI 1640 -SFB (10) e distribuiram-se, a 200 μΐ/poço, numa placa de cultura de 96 poços (fabricada pela Sumitomo Bakelite) . Vinte e quatro horas após a cultura, a 37 °C, numa incubadora com CO2 a 5 %, adicionou-se G418 até se obter a uma concentração de 0,5 mg/ml, seguido de cultura, durante 1 a 2 semanas. Recolheu-se o sobrenadante da cultura a partir dos respectivos poços em que se tinham formado colónias de transformantes que mostram a resistência a G418 e observou-se o crescimento das colónias e mediu-se a actividade de ligação ao antigénio do anticorpo enxertado numa RDC anti-hIL-5R α no sobrenadante, por ELISA, como se mostra no item 2 do exemplo 3.

No que respeita aos transformantes nos poços em que se observou a produção do anticorpo enxertado numa RDC anti-hIL-5R α nos sobrenadantes da cultura, para aumentar a quantidade de produção do anticorpo utilizando um sistema de amplificação do gene da DHFR fez-se uma suspensão de cada um deles em meio RPMI 1640 - SFB (10) contendo 0,5 mg/ml de G418 e MTX 50 nM, para se obter uma densidade de 1 a 2xl05 células/ml e distribuiu-se a suspensão, a 78 2 ml, em poços de uma placa com 24 poços (fabricada pela Greiner). Os transformantes que mostram uma resistência a MTX de 50 nM foram induzidos por cultura, a 37 °C, durante 1 a 2 semanas, numa incubadora de CO2 a 5 %. A actividade de ligação ao antigénio, do anticorpo enxertado numa RDC anti-hIL-5R oí no sobrenadante da cultura em poços, em que foi observado o crescimento de transformantes, foi medida por ELISA e está ilustrada no item 2 do exemplo 3. Em relação aos transformantes nos poços em que se observou a produção do anticorpo enxertado numa RDC anti-hIL-5R a, nos sobrenadantes da cultura, a concentração de MTX aumentou para 100 nM e depois para 200 nM e um transformante capaz de crescer no meio RPMI 1640 - SFB (10) contendo 0,5 mg/ml de G418 e MTX 200 nM e obteve-se finalmente a produção do anticorpo enxertado numa RDC anti-hIL-5R a, em grande quantidade, pelo mesmo processo que foi descrito anteriormente. O transformante obtido foi produzido numa única célula (clonagem), limitando a diluição a duas vezes. O clone n° 3 das células transformadas que produzem o anticorpo enxertado numa RDC anti-hIL-5R α foi depositado em 5 de Abril de 1999, como FERM BP-6690, no Instituto Nacional de Biociências e Tecnologias Humanas, da Agência de Ciência e Tecnologia Industrial (Higashi 1-1-3, Tsukuba, Ibaraki, Japão). (2) Produção de células produtoras utilizando células OHC/dhfr"

Após a introdução de 4 yg do vector de expressão do anticorpo anti-hIL-5R a enxertado numa RDC, pKANTEX1259HV3LV0, descrito na WO 97/10354, em Ι,βχΙΟ6 células OHC/dhfr“ por electroporação (Cytotechnology, 3, 133 (1990)), as células foram suspensas em 10 ml de IMDM -SFB (10) e distribuídas em 200 μΐ/poço numa placa de 79 cultura de 96 cavidades (fabricada pela Iwaki Glass). Vinte e quatro horas após a cultura, a 37 °C, numa incubadora com CO2 a 5 %, adicionou-se G418 até se obter uma concentração de 0,5 mg/ml, seguido de cultura, durante 1 a 2 semanas. Recolheu-se o sobrenadante da cultura a partir dos respectivos poços em que se tinham formado colónias de transformantes que mostram a resistência de G418 e observou-se o crescimento das colónias e mediu-se a actividade de ligação ao antigénio do anticorpo enxertado numa RDC anti-hIL-5R cx no sobrenadante, por ELISA, como se mostra no item 2 do exemplo 3.

No que respeita aos transformantes nos poços em que se observou a produção do anticorpo enxertado numa RDC anti-hIL-5R a, nos sobrenadantes da cultura, para aumentar a quantidade de produção do anticorpo, utilizando um sistema de amplificação do gene DHFR, fez-se uma suspensão de cada um dos transformantes em meio RPMI 1640 - BFB (10) contendo 0,5 mg/ml de G418 e MTX 10 nM, para se obter uma densidade de 1 a 2xl05 células/ml e distribuiu-se a suspensão, a 0,5 ml, em poços de uma placa com 24 poços (fabricada pela Greiner). Os transformantes que mostram uma resistência a MTX 10 nM foram induzidos por cultura, a 37 °C, durante 1 a 2 semanas, numa incubadora de CO2 a 5 %. Em relação aos transformantes nos poços em que se observou o seu crescimento, a concentração de MTX aumentou para 100 nM e depois para 500 nM e finalmente obteve-se um transformante capaz de crescer em meio IMDM - SFBd (10) contendo 0,5 mg/ml de G418 e MTX 500 nM e capaz de produzir, em grande quantidade, o anticorpo quimérico anti-hIL-5R a, enxertado numa RDC, pelo mesmo processo que foi descrito antes. O transformante obtido foi produzido numa única célula (clonagem), limitando a diluição a duas vezes. 80

(3) Produção de células produtoras usando células de mleloma de rato NSO

Preparou-se um vector de expressão do anticorpo anti-hIL-5R a enxertado numa RDC, de acordo com o processo de Yarranton et al. (BIO/TECHNOLOGY, 10, 169 (1992)) e utilizando o ADNc da cadeia P e da cadeia L do anticorpo no

vector de expressão do anticorpo anti-hIL-5R cx enxertado numa RDC, pKANTEX1259HV3LV0, descrito na patente WO 97/10354 e a célula NSO foi transformada para se obter um transformante capaz de produzir, em grande quantidade, o anticorpo anti-hIL-5R α enxertado numa RDC. O transformante obtido foi produzido numa única célula (clonagem), limitando a diluição a duas vezes. 2. Medição da actividade de ligação do anticorpo a hIL-5R α (ELISA) A actividade de ligação do anticorpo ao hIL-5R α foi medida tal como descrito a seguir.

Preparou-se uma solução através da diluição do anticorpo de ratinho anti-hIL-5R α, KM1257, descrito em WO 97/10354, com SBF, para dar uma concentração de 10 yg/ml e distribuiu-se 50 μΐ da solução resultante por cada poço de uma placa de 96 poços para realizar uma análise por ELISA (fabricado pela Greiner), seguido de reacção, a 4°C, durante 20 horas. Após a reacção, distribuiu-se ASB a 1% -SFB, a 100 μΐ/poço e, em seguida, realizou-se a reacção, à temperatura ambiente, durante 1 hora, para bloquear os grupos activos remanescentes. Após descartar ASB a 1% - SFB, preparou-se uma solução por diluição de hIL-5R α solúvel descrita no documento WO 97/10354 com ASB a 1% -SFB para dar uma concentração de 0,5 pg/ml e distribuiu-se 81 a 50 μΐ/poço, seguido da reacção, a 4 °C, durante 20 horas. Após a reacção, lavou-se cada poço com Tween-SBF, distribuíram-se os sobrenadantes da cultura de transformantes ou soluções diluídas de anticorpos humanos enxertados em RDC purificados, a 50 yg/poço para levar a cabo a reacção, à temperatura ambiente, durante 2 horas. Após a reacção, lavou-se cada poço com Tween - SFB, distribuiu-se uma solução do anticorpo IgG anti-humano de cabra marcado com peroxidase (H & L) (fabricada pela

American Qualex), diluída 3 000 vezes com ASB-SFB a 1 %, a 50 μΐ/poço, como uma solução de anticorpo secundária e, em seguida, realizou-se a reacção, à temperatura ambiente, durante 1 hora. Após a reacção e a subsequente lavagem com Tween-SFB, distribuiu-se uma solução de substrato de ABTS (uma solução preparada por dissolução de 0,55 g de sal de amónio de 2,2'-azino-bis(ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico), em 1 litro de tampão de citrato 0,1 M (pH 4,2) e adicionou-se, à solução, 1 μΐ/ml de peróxido de hidrogénio, imediatamente antes da utilização) a 50 μΐ/poço, para o desenvolvimento da cor e, em seguida, mediu-se a absorvância a D04i5.

3. Purificação do anticorpo anti-hIL-5R <x enxertado numa RDC (1) Cultura de células produtoras derivadas de células YB2/0 e purificação do anticorpo O clone de células transformadas que produzem anticorpos anti-hIL-5R α enxertados numa RDC, obtidos no item anterior 1(1) do exemplo 3 foi suspenso em meio GIT contendo 0,5 mg/ml de G418 e MTX 200 nM para se obter uma densidade de 3><105 células/ml e distribuiu-se 200 ml da suspensão por frascos de 175 mm3 (fabricados pela Greiner). 82

Oito dias após a cultura, a 37°C, numa incubadora com CO2 a 5 %, recuperou-se o sobrenadante da cultura. 0 anticorpo anti-hIL-5R α enxertado numa RDC foi purificado a partir do sobrenadante da cultura utilizando cromatografia de permuta iónica e um processo de filtração em gel. 0 anticorpo anti-hIL-5R α enxertado numa RDC foi designado por anticorpo YB2/0-hIL-5RRDC. (2) Cultura de células produtoras derivadas de células de OHC/dhfr" e purificação do anticorpo

Os clones de células transformadas que produzem anticorpos anti-hIL-5R α enxertados numa RDC obtidos no item anterior 1(2) do exemplo 3 foram suspensos em meio EX-CELL302 contendo L-Gln 3 mM, CDLC a 0,5 % e PF68 a 0,3 % para se obter uma densidade de 3><105 células/ml e fez-se a sua cultura utilizando um frasco giratório com a capacidade de 4,0 litro (fabricado pela Iwaki Glass), sob agitação, a uma velocidade de 100 rpm. Dez dias após a cultura, a 37°C, numa sala com a temperatura controla, recuperou-se o sobrenadante da cultura. O anticorpo anti-hIL-5R α enxertado numa RDC foi purificado a partir do sobrenadante da cultura utilizando cromatografia de permuta iónica e um processo de filtração em gel. O anticorpo anti-hIL-5R a, enxertado numa RDC, purificado, foi designado por anticorpo OHC/0-hIL-5RRDC. (3) Cultura de de células produtoras derivadas de células de NSO e purificação do anticorpo

Fez-se uma cultura do clone da célula transformada que produz anticorpos anti-hIL-5R α enxertado numa RDC, obtido no item anterior 1(3) do exemplo 3, de acordo com o processo de Yarranton et al. (BIO/TECHNOLOGY, 10, 169 83 (1992)) e, em seguida, recuperou-se o sobrenadante da cultura. 0 anticorpo anti-hIL-5R oí, enxertado numa RDC, foi purificado a partir do sobrenadante da cultura utilizando cromatografia de permuta iónica e um processo de filtração em gel. 0 anticorpo anti-hIL-5R α enxertado numa RDC purificado foi designado por anticorpo NSO/0-hIL-5RRDC. 4. Análise dos anticorpos anti-hIL-5R α enxertados numa RDC purificados

De acordo com um processo conhecido (Nature, 221, 680, (1970)), submeteu-se 4 yg de cada um dos três anticorpos anti-hIL-5R α enxertados numa RDC produzidos e purificados a partir das respectivas células de animais, obtidas no item anterior 3 do exemplo 3, a EGPA-SDS, para analisar o peso molecular e o grau de purificação. Os resultados estão ilustrados na fig.4. Como se mostra na fig. 4, encontrou-se uma única banda de cerca de 150 Kd de peso molecular, em condições não redutoras e duas bandas de cerca de 50 kd e cerca de 25 Kd em condições redutoras, em cada um dos anticorpos anti-hIL-5R α enxertados numa RDC e purificados. Estes pesos moleculares quase coincidiram com os pesos moleculares deduzidos a partir das sequências de nucleótidos de ADNc de cadeia P e da cadeia L do anticorpo (cadeia P: cerca de 49 Kd, cadeia L: cerca de 23 Kd, molécula total: cerca de 144 Kd) e também coincidiram com os relatos de que o anticorpo IgG tem um peso molecular de cerca de 150 kD em condições não redutoras e está degradado nas cadeias P tendo um peso molecular de cerca de 50 kd e nas cadeias L, com um peso molecular de cerca de 25 Kd, em condições redutoras, devido ao corte da ligação de dissulfureto (daqui em diante referida como "ligação S-S") na molécula (Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, capitulo 14, 1998; Monoclonal 84

Antibodies: Principies and Practice, Academic Press

Limited, 1996), de modo que foi confirmado que cada anticorpo anti-hIL-5R α enxertado numa RDC foi expresso e purificado como uma molécula de anticorpo possuindo a verdadeira estrutura.

Exemplo 4

Avaliação da actividade do anticorpo anti-hIL-5R α enxertado numa RDC: 1. Actividade de ligação do anticorpo anti-hIL-5R α enxertado numa RDC (ELISA) A actividade dos três anticorpos anti-hIL-5R a, enxertados numa RDC, purificados obtidos no ponto anterior 2 do exemplo 3, para se ligar a hIL-5R, foi medida por ELISA e está ilustrada no item 2 do exemplo 3. A fig. 5 mostra um resultado do exame da actividade de ligação medida por alteração da concentração do anticorpo anti-hlL-5R α enxertado numa RDC a ser adicionado. Como se mostra na fig. 5, os três anticorpos anti-hIL-5R α enxertados numa RDC mostraram praticamente a mesma actividade de ligação a hIL-5R a. Este resultado mostra que as actividades de ligação ao antigénio, destes anticorpos, são constantes, independentemente das células de animais produtoras dos anticorpos e dos seus processos de cultura, semelhante ao resultado do item 1 do exemplo 2.

2. Actividade citotóxica (actividade CCDA) in vitro do anticorpo anti-hIL-5R α enxertado numa RDC A fim de avaliar a actividade citotóxica in vitro dos três anticorpos anti-hIL-5R a, enxertados numa RDC e 85 purificados, obtidos no item 3 anterior do exemplo 3, mediu-se a actividade CCDA, de acordo com o seguinte processo. (1) Preparação de uma solução de células-alvo

Fez-se uma cultura de uma linha de células T de rato CTLL-2 (h5R) que expressa a cadeia cx e a cadeia β de hIL-5R descrita em WO 97/10354 usando meio RPMI 1640 - SFB (10) para preparar ΙχΙΟ6 células/0,5 ml de suspensão e marcaram-se as células com radioisótopos fazendo-as reagir com 3,7 MBq equivalentes de uma substância radioactiva

Na251Cr04, a 37 °C, durante 1,5 horas. Após a reacção, lavaram-se as células, três vezes, por meio da sua suspensão em meio RPMI 1640 - SFB (10) e centrifugação, suspenderam-se novamente no meio e em seguida deixaram-se em repouso, a 4 °C, durante 30 minutos, em gelo, para a dissolução espontânea da substância radioactiva Após a centrifugação, ajustou-se o precipitado para 2><105 células/ml por adição de 5 ml de meio RPMI 1640 - SFB (10) e usou-se como solução de células-alvo. (2) Preparação de uma solução de células efectoras

Recolheu-se 50 ml de sangue da veia de uma pessoa saudável e misturou-se cuidadosamente com 0,5 ml de heparina sódica (fabricada pela Takeda Pharmaceutical). Centrifugou-se a mistura para separar uma camada de células mononucleares utilizando Polymorphprep (fabricado pela Nycomed Pharma AS) , em conformidade com as instruções do fabricante. Após lavagem com o meio RPMI 1640 - SFB (10) por centrifugação, três vezes, fez-se uma nova suspensão das células resultantes para se obter uma densidade de 86 9χ106 células/mL, utilizando o meio e utilizou-se como solução de células efectoras.

(3) Medição da actividade CCDA

Em cada poço de uma placa de 96 poços, de fundo em forma de U (fabricada pela Falcon) , colocou-se 50 μΐ da solução de células-alvo preparada no ponto (1) anterior (lxlO4 células/poço). Em seguida, distribuiu-se 100 μΐ da solução de células efectoras preparada no ponto (2) anterior (9χ105 células/poço, tornando-se a proporção de células efectoras para células-alvo em 90:1). Em seguida, adicionou-se cada um dos anticorpos anti-hIL-5R a, enxertados numa RDC, para se obter uma concentração final de 0,001 a 0,1 pg/ml, seguido de reacção, a 37 °C, durante 4 horas. Após a reacção, a placa foi centrifugada e mediu-se a quantidade de 51Cr no sobrenadante utilizando um contador γ. A quantidade de 51Cr espontaneamente libertada foi calculada pela mesma operação usando apenas o meio em vez da solução de células efectoras e a solução de anticorpo e mediu-se a quantidade de 51Cr no sobrenadante. A quantidade total de 51Cr espontaneamente libertada foi calculada pela mesma operação usando apenas o meio em vez da solução de células efectoras e a solução de anticorpo e mediu-se a quantidade de 51Cr no sobrenadante. A actividade de CCDA foi calculada a partir da seguinte equação.

Actividade CCDA (%) =51Cr no sobrenadante da amostra - 51Cr libertado espontaneamente X 100 alCr total libertado - slCr libertado espontaneamente

Os resultados estão ilustrados na fig.6. Como se mostra na fig. 6, entre os três anticorpos anti-hIL-5R a enxertados numa RDC, o anticorpo YB2/hIL-5RRDC apresentou a maior actividade CCDA, seguido do anticorpo OHC/d-hIL-5RRDC 87 e do anticorpo NS0-hIL-5RRDC, por esta ordem. Do mesmo modo que com os resultados do item 2 do exemplo 2, os resultados anteriores mostram que a actividade CCDA dos anticorpos varia muito consoante as células de animais que são utilizadas na sua produção. Além disso, uma vez que os anticorpos produzidos pelas células YB2/0 apresentaram a maior actividade CCDA em ambos os casos dos dois anticorpos humanizados, ficou revelado que um anticorpo com elevada actividade CCDA pode ser produzido pela utilização da célula YB2/0.

3. Avaliação da actividade in vivo do anticorpo anti-hIL-5R α enxertado numa RDC A fim de avaliar a actividade in vivo dos três anticorpos anti-hIL-5R α enxertados numa RDC, purificados, obtidos no anterior item 3 do exemplo 3, examinou-se a actividade de inibição, num modelo de aumento de eosinofilia induzido por hIL-5 de Macaca faseicularis, de acordo com o sequinte processo.

Administrou-se hIL-5 (o processo de preparação está descrito na patente WO 97/10354) a Macaca faseicularis, sob a pele dorsal, numa dose de 1 yg/kg, começando no primeiro dia e administrando uma vez por dia, para um total de 14 vezes. Cada anticorpo anti-hIL-5R α enxertado numa RDC foi administrado, intravenosamente, numa dose de 0,3 mg/kg, uma hora antes da administração de hIL-5, no dia zero. Utilizou-se como controlo um grupo a que não se adicionaram anticorpos. Nos grupos a que se administraram os anticorpos, utilizaram-se três animais Macaca faseicularis em cada grupo (No. 301 , No. 302, No. 303, No. 401, No. 402, No. 403 , No. 501, No. 502 e No. 503 ) e utilizaram-se dois animais (No. 101 e No. 102) no grupo a que não se 88 adicionaram anticorpos. Começando 7 dias antes do inicio da administração e até 42 dias após a administração, colheu-se, periodicamente, cerca de 1 ml de sangue de uma veia safena ou de uma veia femoral e mediu-se o número de eosinófilos em 1 μΐ de sangue periférico. Os resultados estão ilustrados na fig. 7. Como se mostra na fig. 7, o aumento de eosinófilos no sangue foi completamente inibido no grupo a que foi administrado o anticorpo YB2/0-hIL-5RRDC. Por outro lado, verificou-se uma inibição completa da actividade num animal do grupo ao qual se tinha administrado o anticorpo 0HC/d-hIL-5RRDC, mas a actividade de inibição não foi suficiente em dois animais. No grupo ao qual se administrou o anticorpo NS0-hIL-5RRDC, não se verificou a inibição completa da actividade e o seu efeito não foi suficiente. Os resultados anteriores mostram que a actividade dos anticorpos, in vivo, varia muito, consoante as células de animais que são utilizadas na sua produção. Além disso, uma vez que foi verificada uma correlação positiva entre o grau de actividade in vivo do anticorpo anti-hIL-5R α enxertado numa RDC e o seu grau de actividade CCDA descrito no ponto 2 do exemplo 4, foi verificado que o grau de actividade CCDA é marcadamente importante para a sua actividade de expressão.

Com base nos resultados anteriores, espera-se que um anticorpo que possui uma elevada actividade CCDA também seja útil no campo clinico de várias doenças do ser humano.

Exemplo 5

Análise da cadela de açúcar que aumenta a actividade CCDA 1. Preparação da cadela de açúcar marcada com 2-aminopiridina (cadeia de açúcar tratada com AP) 89 0 anticorpo humanizado da presente invenção foi hidrolisado com ácido, com ácido cloridrico para remover o ácido siálico. Depois de o ácido cloridrico ter sido completamente removido, cortou-se a cadeia de açúcar da proteína por hidrazinólise (Method of Enzymology, 83, 263, 1982). Eliminou-se a hidrazina e realizou-se a IV-acetilação por adição de uma solução aquosa de acetato de amónio e anidrido acético. Após a liofilização, realizou-se a marcação por fluorescência com 2-aminopiridina (J. Biochem., 95, 197 (1984)). A cadeia de açúcar marcada por fluorescência (cadeia de açúcar tratada com AP) foi separada como uma impureza utilizando uma coluna de péptido Surperdex HR 10/30 (fabricada pela Pharmacia). A fracção da cadeia de açúcar foi seca usando um concentrador centrífugo e foi utilizada como uma cadeia de açúcar purificada tratada com AP.

2. Análise por CLAR de fase inversa da cadeia de açúcar tratada com AP do anticorpo anti-hIL-5R <x enxertado numa RDC

Utilizando as respectivas cadeias de açúcar, tratadas com AP, do anticorpo anti-hIL-5R α enxertado numa RDC, preparadas no anterior item 1 do exemplo 5, realizou-se a análise por CLAR de fase inversa por meio de uma coluna CLC-ODS (fabricada pela Shimadzu). Adicionou-se à cadeia de açúcar, tratada com AP, uma quantidade em excesso de a-L-fucosidase (derivada de rim de bovino, fabricada pela SIGMA) para a digestão (37 °C, 15 horas) e, em seguida, analisaram-se os produtos por CLAR de fase inversa (figura 8) . Usando padrões da cadeia de açúcar tratada com AP, fabricados pela Takara Shuzo, confirmou-se que a cadeia de açúcar ligada a asparagina é eluída durante um período entre 30 minutos e 80 minutos. Calculou-se a taxa de 90 cadeias de açúcar, cujas posições de eluição pela CLAR de fase inversa foram deslocadas (cadeias de açúcar eluidas durante um período de 48 minutos a 78 minutos) pela digestão de α-L-fucasidase. Os resultados estão ilustrados no quadro 1.

Quadro 1 Células produtoras de anticorpos Cadeia de açúcar ligada a α-l,6-fucose YB2/0 47 NSO 73

Cerca de 47 % do anticorpo anti-hIL-5R α enxertado numa RDC produzido pela célula YB2/0 e cerca de 73 % do anticorpo anti-hIL-5R α enxertado numa RDC produzido pela célula NSO eram cadeias de açúcar possuindo α-l,6-fucose. Assim, as cadeias de açúcar que não tinham α-l,6-fucose eram mais frequentes no anticorpo produzido pela célula YB2/0 em comparação com o anticorpo produzido pela célula NSO . 3. Análise da composição de monossacáridos do anticorpo anti-hIL-5R α enxertados numa RDC, purificado

As cadeias de açúcar de anticorpos anti-hIL-5R α enxertados numa RDC, produzidas pelas células YB2/0, as células NSO e as células OHC/d foram hidrolisadas em monossacáridos por hidrólise com ácido, com o ácido tri-fluoroacético e fez-se a análise da composição de monossacáridos, utilizando BioLC (fabricado pela Dionex).

Entre as cadeias de açúcar ligadas a N-glicósido há 3 unidades de manose numa cadeia de açúcar no complexo do tipo cadeia do açúcar ligada a N-glicósido. A proporção relativa de cada monossacárido obtida por meio do cálculo do número de manose como 3 está ilustrada no quadro 2.

Quadro 2 91 Células produtoras de anticorpos Fuc GlcNAcGal Man Actividade CCDA (%)* YB2/0 0, 60 4,98 0,30 3, 00 42,27 NSO 1,06 3, 94 0, 66 3, 00 16,22 OHC/dhFr 0, 85 3,59 0,49 3, 00 25, 73 0, 913,80 0,27 3, 00 *: Concentração do anticorpo: 0,01 pg/ml

Uma vez que as proporções relativas de fucose estavam na ordem de YB2/0 < OHC/d < NSO, as cadeias de açúcar produzidas no anticorpo produzido pelas células YB2/0 mostraram o menor teor de fucose como também se mostra nos resultados presentes.

Exemplo 6

Análise da cadeia de açúcar do anticorpo produzido pela célula OHC/dhfr':

As cadeias de açúcar tratadas com AP foram preparadas a partir de um anticorpo anti-hIL-5R α enxertado numa RDC, purificado, produzido por células OHC/dhfr” e fez-se a análise por CLAR de fase inversa utilizando uma coluna CLC-ODS (fabricada pela Shimadzu) (fig. 9). Na fig. 9, um tempo de eluição de 35 a 45 minutos correspondeu a cadeias de açúcar que não tinham fucose e um tempo de eluição de 45 a 60 minutos correspondeu a cadeias de açúcar possuindo fucose. Do mesmo modo que no caso do anticorpo produzido pela célula NSO de mieloma de murganho, o anticorpo anti-hIL-5R a enxertado numa RDC produzido por células OHC/dhfr“ tinha um teor menor de cadeias de açúcar isentas de fucose do que o anticorpo produzido por células YB2/0 de mieloma de rato.

Exemplo 7

Separação de anticorpos com elevada actividade CCDA 92 0 anticorpo anti-hIL-5R α enxertado numa RDC produzido por células YB2/0 de mieloma de rato foi separado usando uma coluna de lectina que se liga às cadeias de açúcar possuindo fucose. A CLAR foi realizada utilizando uma LC-6A fabricada pela Shimadzu, com um caudal de 1 ml/min e à temperatura ambiente, como temperatura da coluna. Após o equilíbrio com tampão de sulfato de Tris 50 mM (pH 7,3), o anticorpo anti-hIL-5R α enxertado numa RDC purificado foi injectado e depois eluído por meio de um gradiente de densidade linear (60 minutos) de a-metilmanósido 0,2 M (fabricado por Nakalai Tesque). O anticorpo anti-hIL-5R α enxertado numa RDC foi separado numa fracção não adsorvida e numa fracção adsorvida. Quando a fracção não adsorvida e uma porção da fracção adsorvida foram recolhidas e transformadas em amostras e se mediu a sua actividade de ligação a hIL-5R, demonstrou-se uma actividade de ligação semelhante (fig. 10, gráfico superior). Quando se mediu a actividade CCDA, a fracção não adsorvida mostrou uma actividade CCDA mais elevada do que a da porção da fracção adsorvida (fig. 10, gráfico inferior). Além disso, as cadeias de açúcar tratadas com AP foram preparadas a partir da fracção não adsorvida e uma porção da fracção adsorvida e a análise por CLAR inversa foi realizada utilizando uma coluna CLC-ODS (fabricada por Shimadau) (fig. 11). A fracção não adsorvida era um anticorpo possuindo principalmente cadeias de açúcar isentas de fucose e a porção da fracção adsorvida era um anticorpo possuindo principalmente cadeias de açúcar contendo fucose.

Exemplo 8

Determinação do produto de transcrição do gene <xl,6-fucosiltransferase (FUT8) na linha de células hospedeiras: 93 (1) Preparação de ADNc de cadeia simples derivado de várias linhas celulares

Fez-se uma suspensão de células OHC/DG44 derivadas de ovário de hamster chinês, em meio IMDM (fabricado por Life Technologies) complementado com SFB a 10 % (fabricado pela Life Technologies) e 1 x concentração do suplemento HT (fabricado pela Life Technologies) e inocularam-se num balão de cultura T75 para a adesão da cultura celular (fabricado pela Greiner) a uma densidade de 2><105 células/ml. Fez-se também uma suspensão de células YB2/0 derivadas de mieloma de rato em meio RPMI 1640 (fabricado pela Life Technologies) complementado com SFB a 10 % (fabricado pela Life Technologies) e glutamina 4 mM (fabricada pela Life Technologies) e inocularam-se num balão de cultura T75 para a suspensão da cultura celular (fabricado pela Greiner) a uma densidade de 2χ105 células/ml. Estas células foram cultivadas a 37 °C numa incubadora com C02 a 5 % e recuperou-se lxlO7 células de cada célula hospedeira, no 1 °, 2 °, 3 °, 4 ° e 5 dias, para extrair o ARN total utilizando o RNAeasy (fabricado pela QUIAGEN).

Dissolveu-se o ARN total em 45 μΐ de água esterilizada, misturou-se com 0,5 U/μΙ de RQ1 ADNase isenta de ARNase (fabricados pela Promega) e 5 μΐ de 10 x tampão de ADNase ligado e 0,5 μΐ de inibidor da ribonuclease RNasin (fabricado pela Promega), seguido de reacção, a 37 °C, durante 30 minutos. Após a reacção, o ARN total foi novamente purificado utilizando RNAeasy (fabricado pela Quiagen) e dissolveu-se em 50 μΐ de água esterilizada. 94

De acordo com o sistema de pré-amplificação SUPERSCRIPT para a srntese da primeira cadeia de ADNc (fabricado pela Life Technology), submeteu-se 3 yg de cada ARN total obtido a uma reacção de transcrição inversa num sistema de 20 μΐ usando oligo (dT) como niciador para assim sintetizar ADNc. Utilizou-se uma solução de 1 x a concentração da solução após a reacção de transcrição inversa para a clonagem de FUT8 e derivado de β-actina obtido a partir de cada célula hospedeira e diluiu-se ainda 50 vezes com água uma solução, após a reacção de transcrição inversa, que se utilizou para a determinação da quantidade de transcrição de cada gene, usando uma RCP comparativa e armazenou-se cada uma das soluções a -8 0 °C até à sua utilização. (2) Preparação dos respectivos fragmentos parciais de ADNc de FTU8 de hamster chinês e FTU8 de rato

Os respectivos fragmentos parciais de ADNc de FUT8 de hamster chinês e FUT8 de rato foram obtidos tal como descrito a seguir. Primeiro, conceberam-se os iniciadores (mostrados na SEQ ID NO: 1 e na SEQ ID NO: 2) específicos para sequências nucleotidicas comuns num ADNc de FUT8 humano (Journal of Biochemistry, 121, 626 (1997)) e um ADNc de FUT8 de suino (Journal of Biological Chemistry , 271, 27810 (1996)).

Em seguida, usando uma ExTaq polimerase de ADN (fabricada pela Takara Shuzo) , preparou-se 25 μΐ de uma solução de reacção constituída pelo tampão ExTaq (fabricado pela Takara Shuzo), dNTPs 0,2 mM, 0,5 μΜ de cada um dos iniciadores específicos anteriores (SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2) e 1 μΐ de cada um dos ADNc derivados de células OHC e o ADNc derivado de células YB2/0, cada um deles obtido no 95 segundo dia da cultura em (1) e realizou-se a reacção em cadeia da polimerase (RCP). A RCP foi realizada em condições em que, depois de se aquecer a 94 °C, durante 1 minuto, repete-se um ciclo que consiste em reacções a 94 °C durante 30 segundos, 55 °C durante 30 segundos e 72 °C durante 2 minutos, 30 vezes e depois aquece-se a solução reaccional a 72 °C durante 10 minutos. Cada fragmento específico amplificado de 979 pb obtido por RCP foi ligado a um plasmido pCR2.1 usando um estojo de clonagem TOPO TA (fabricado pela Invitrogen) para se obter um plasmido contendo o respectivo fragmento parcial de ADNc de FUT8 de hamster chinês ou de FUT 8 de rato (CHFT8-pCR2.1 ou YBFT8-pCR2.1). A sequência de nucleótidos de cada ADNc obtido foi determinada utilizando o sequenciador de ADN 377 (fabricado pela Perkin Elmer) e o estojo de reacção pronta RS de sequenciação de ciclos de terminação Big Dye (fabricado pela Perkin Elmer) para confirmar que os ADNc obtidos codificam as sequências parciais dos quadros de leitura aberta (QLA) de FUT8 de hamster chinês e FUT8 de rato (ilustrados nas SEQ ID NOs: 3 e 4). (3) Preparação de ADNc de β-actina de hamster chinês e ADNc e β-actina de rato

Uma vez que se considera que o gene de β-actina é constantemente transcrito em cada célula e a quantidade da sua transcrição é quase a mesma entre as células, a quantidade de transcrição do gene de β-actina é determinada 96 como um padrão da eficácia da reacção de síntese de ADNc derivado das respectivas células. A β-actina de hamster chinês e a β-actina de rato foram obtidas pelo processo seguinte. Em primeiro lugar, concebeu-se um iniciador directo (ilustrado na SEQ ID NO: 5) específico para uma sequência comum, contendo um codão de iniciação de tradução e iniciadores inversos (mostrados na SEQ ID NO: 6 e na SEQ ID NO: 7) específicos para a respectiva sequência contendo um codão de terminação da tradução, a partir de uma sequência genómica de β-actina de hamster chinês (GenBank, U20114) e uma sequência genómica de β-actina de rato (Nucleic Acid Research, 11, 1759 (1983)).

Em seguida, usando uma polimerase de ADN, KOD (fabricada pela TOYOBO), preparou-se 25 μΐ de uma solução de reacção constituída pelo tampão de KOD #1 (fabricado

pela TOYOBO), dNTPs 0,2 mM, MgCl2 1 mM, 0,4 μΜ de cada um dos iniciadores específicos dos genes anteriores (SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 7), DMSO a 5 % e 1 μΐ de cada um dos ADNc derivados de células OHC e do ADNc derivado de células YB2/0, cada um obtido no segundo dia da cultura em (1) e realizou-se a reacção em cadeia da polimerase (RCP). A RCP foi realizada em condições em que, depois de se aquecer a 94 °C, durante 4 minutos, repete-se 25 ciclos que consistem em reacções a 98°C durante 15 segundos, 65°C durante 2 segundos e 74°C durante 30 segundos. O terminal 5' de cada fragmento específico amplificado, de 1 128 pb, obtido por RCP foi fosforilado usando MEGALABEL (fabricado pela Takara Shuzo) e, em seguida, digerido com uma enzima de restrição, EcoRV e ligou-se o fragmento resultante (2,9 Kb) a pBluescript II, (KS (+) (fabricado pela Stratagene), utilizando uma 97 ligação forte (fabricada pela TOYOBO), para se obter um plasmido contendo um QLA de comprimento total do respectivo ADNc de β-actina de hamster chinês ou β-actina de rato (CHAC-pBS ou YBAc-pBS). A sequência de nucleótidos do respectivo ADNc obtido foi determinada utilizando o sequenciador de ADN 377 (fabricado pela Perkin Elmer) e o estojo de reacção pronta RS de sequenciação de ciclos de terminação Big Dye (fabricado pela Perkin Elmer) para confirmar que codificam, respectivamente, as sequências completas dos QLA do ADNc de β-actina de hamster chinês ou de β-actina de rato. (4) Preparação de iam padrão e do controlo interno da sequência

Para medir a quantidade de transcrição de ARNm a partir do gene FUT8 em células produtoras, preparou-se primeiro uma curva de calibração.

Como padrão de FUT8 para ser utilizado na curva de calibração, os plasmidos, CHFT8-pCR2.1 e YBFT8-pCR2.1, obtidos em (2), por inserção dos respectivos fragmentos parciais de ADNc de FUT8 de hamster chinês ou de FUT8 de rato em pCR2.1, foram digeridos com uma enzima de restrição, EcoRI e os fragmentos de ADN resultantes foram usados depois de transformados em cadeias lineares.

Como controlo interno para ser utilizado na determinação de FUT8, entre CHFT8-pCR2.1 e YBFT8-pCR2.1, utilizou-se CHFT8d-pCR2.1 e YBFT8d-pCR2.1 obtidos por eliminação de 203 pb entre, Seal-HindiII das sequências internas de nucleótidos de FUT8 de hamster chinês ou de FUT8 de rato, digeridas com a enzima de restrição EcoRI e 98 utilizaram-se os fragmentos de ADN resultantes depois de os transformar em cadeias lineares.

Como padrão da quantidade de ARNm transcrito a partir do gene de β-actina em células produtoras, os plasmidos CHAC-pBS e YBAc-pBS obtidos em (3) , por integração do QLA de comprimento completo dos respectivos ADNc de β-actina de hamster chinês e de β-actina de rato em pBluescript II KS(+), foram digeridos, respectivamente, o primeiro com HindiII e PstI e o último com HindIII e Kpnl e utilizaram-se os fragmentos de ADN resultantes transformando-os em cadeias lineares.

Como controlo interno para a determinação de β-actina, entre CHAC-pBS e YBAc-pBS, digeriu-se CHAcd-pBS e YBAcd-pBS, obtidos por eliminação de 180 pb entre DralII-DralII das sequências internas de nucleótidos de β-actina de hamster chinês e de β-actina de rato, o primeiro com HindIII e PstI e o último com HindiII e Kpnl e utilizaram-se os fragmentos resultantes, depois de transformados em cadeias lineares. (5) Determinação da quantidade de transcrição por RCP-TI comparativa

Em primeiro lugar, concebeu-se um conjunto de iniciadores (ilustrado nas SEQ ID NOs: 8 e 9) especifico de sequências comuns para as sequências internas das sequências parciais do QLA de FUT8 de hamster chinês e FUT8 de rato obtidos em (2).

Em seguida, realizou-se a RCP utilizando uma polimerase de ADN ExTaq (fabricada pela Takara Shun) em 20 μΐ do volume total de uma solução de reacção constituída 99 por tampão de ExTaq (fabricado pela Takara Shuzo), dNTPs 0,2 mM, 0,5 μΜ de cada um dos iniciadores anteriores especificos do gene (SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9), DMSO a 5 % e 5 μΐ de uma solução, diluída 50 vezes, de cada um dos ADNc derivados das respectivas linhas de células hospedeiras obtidas em (1) e 5 μΐ (10 fg) do plasmido para o controlo interno. Realizou-se a RCP por aquecimento a 94 °C, durante 3 minutos e repetindo depois 30 ciclos utilizando reacções a 94 °C durante 1 nminuto, 60 °C durante 1 minuto e 72 °C durante 1 minuto, como um ciclo único.

Determinou-se o produto da transcrição de β-actina como se descreve a seguir. Concebeu-se, respectivamente, os conjuntos de iniciadores específicos de genes para sequências internas de comprimentos completos do QLA de β-actina de hamster chinês e de β-actina de rato obtidos em (3) (os primeiros estão ilustrados nas SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO:ll, os últimos nas SEQ ID NO:12 e SEQ ID NO:13).

Em seguida, realizou-se a RCP utilizando uma polimerase de ADN ExTaq (fabricada pela Takara Shuzo), num volume total de 20 μΐ de uma solução de reacção constituída por tampão de ExTaq (fabricado pela Takara Shuzo), dNTPs 0,2 mM, 0,5 μΜ de cada um dos iniciadores específicos dos genes anteriores (SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13), DMSO a 5 % e 5 μΐ de uma solução, diluída 50 vezes, de cada um dos ADNc derivados das respectivas linhas de células hospedeiras obtidas em (1) e 5 μΐ (1 pg) do plasmido para controlo interno. Realizou-se a RCP por aquecimento, a 94 °C, durante 3 minutos e repetiram-se depois 17 ciclos utilizando reacções a 94 °C durante 30 segundos, 65 °C durante 1 minuto e 72 °C durante 2 minutos, como um ciclo único. 100

Quadro 3

Genes-alvo * Conjunto de iniciadores Tamanho (pb) do produto amplificado da RCP Alvo Comparativo FUT8 F: 5'-GTCCATGGTGATCCTGCAGTGTGG-3' 638 431 R: 5'-CACCAATGATATCTCCAGGTTCC-3' β-actina (hamster chinês) F: 5'-GATATCGCTGCGCTCGTTGTCGAC-3' 789 609 R: 5 '-CAGGAAGGAAGGCTGGAAAAGAGC-3 ' β-actina de rato F: 5 ' -GATATCGCTGCGCTCGTCGTCGAC-3 ' 789 609 R: 5 ' -CAGGAAGGAAGGCTGGAAGAGAGC-3 ' *F: Iniciador directo, R: iniciador inverso A RCP determinativa foi realizada utilizando os conjuntos de iniciadores ilustrados no quadro 3. Como resultado, o fragmento de ADN com o tamanho mostrado na coluna alvo do quadro 3, foi amplificado a partir do respectivo produto de transcrição do gene e do padrão correspondente e o fragmento de ADN com o tamanho mostrado na coluna do elemento comparativo do quadro 3, foi amplificado a partir do correspondente controlo interno.

Depois submeteu-se 7 μΐ da solução, após a RCP, a electroforese em gel de agarose a 1,75 %, corou-se o gel com corante de gel de ácido nucleico SYBR Green (fabricado pela Molecular Probes) . A quantidade de fragmentos de ADN amplificados foi medida através do cálculo da intensidade de luminescência de cada um dos fragmentos de ADN amplificados, utilizando um Fluorlmager SI (fabricado pela Molecular Dynamics).

Além disso, realizou-se a RCP alterando a quantidade de plasmido padrão, preparado em (4), para 0,1 fg, 1 fg, 5 fg, 10 fg, 50 fg, 100 fg e 500 fg, em vez do ADNc derivado de células e determinou-se a quantidade de produtos amplificados. A curva de calibração foi preparada fazendo um gráfico dos valores medidos em função das quantidades de plasmido-padrão. 101

Usando esta curva de calibração, calculou-se a quantidade de ADNc do gene de interesse em cada uma das células a partir da quantidade de produto amplificado, quando se utilizou o ADNc total derivado de cada célula como matriz e a quantidade foi definida como a quantidade de transcrição de ARNm em cada célula.

As quantidades do produto de transcrição de FUT8 em cada linha de células hospedeiras, utilizando sequências de FUT 8 de rato como padrão e como controlo interno, estão ilustradas na fig. 12. A linha de células de OHC revelou uma quantidade de transcrição 10 ou mais vezes mais elevada do que a da linha de células YB2/0, durante o período de cultura. Esta tendência também foi verificada quando as sequências de FUT8 de hamster chinês foram usadas como padrão e controlo interno.

Além disso, a quantidade de transcrição de FUT8 está ilustrada no quadro 4 como um valor relativo em relação à quantidade de produto de transcrição de β-actina.

Quadro 4

Linha celular Dia Dias de cultura 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 5 OHC 2,0 0,90 0,57 0,52 0,54 YB2/0 0,07 0, 13 0,13 0,05 0,02

Enquanto a quantidade de transcrição de FUT8 da linha celular YB2/0 foi de cerca de 0,1 % de β-actina, a da linha de células de OHC foi de 0,5 a 2 %. 102

Com base nos resultados anteriores, verificou-se que a quantidade do produto de transcrição de FUT8 na linha celular YB2/0 era significativamente menor do que na linha de células de OHC.

APLICABILIDADE INDUSTRIAL A presente invenção tem por objecto uma cadeia de açúcar que controla a actividade de uma molécula funcional sob o ponto de vista imunológico, tal como um anticorpo, uma proteína ou um péptido, bem como um anticorpo, uma proteína ou um péptido que possua essa cadeia de açúcar. A presente invenção também tem por objecto processos para a produção da cadeia de açúcar e de um anticorpo, uma proteína ou um péptido possuindo essa cadeia de açúcar, bem como um agente de diagnóstico, um agente preventivo e um agente terapêutico que contêm estes produtos como princípio activo. A presente invenção está concretizada nas reivindicações.

LISTA DE SEQUÊNCIAS

<110> KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD <120> Processos de regulação da actividade de moléculas funcionais sob o ponto de vista imunológico <130> F2814 EP/1 <150> JP19990103158 <151> 1999-04-09 103 <16 Ο > 13 <170> Patent In Ver. 3.3

<210> 1 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <221> fonte <223> /nota = "Descrição da sequência artificial: ADN sintético" <4 0 0> 1 actcatcttg gaatctcaga attgg 25

<210> 2 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <221> fonte <223> /nota = "Descrição da sequência artificial: ADN sintético" <400> 2 cttgaccgtt tctatcttct ctcg 24

<210> 3 <211> 979 <212> ADN <213> Cricetulus griseus 104 <4Ο0> 3 actcatcttg gaatctcaga attggcgcta tgctactgga ggatgggaga ctgtgtttag 60 acetgtaagt gagacatgca «agacaggtc tggcctctcc actggaeact ggtcaggiga .120 agtgaaggac aaaaatgttc aagtggtcga gctccccatt gtagacagec tccatcctcg 180 tcctcettac ttacccttgg cfcgfcaceaga agaçcttpa gategactçç tgagagtcca 240 tggtgatcct gcagtgtggt gggtatccca gtttgtcaaa tacttgat.ee gtccacaacc 300 ttggctggaa agggaaatag aagaaaccac caagaagctt ggcttcaaac atccagttat 360 tggagtecat gteagaegca ctgacaaagt ggp&cagaa gcagccttcc atcccattga 420 ggaatacatg gtacacgttg aagaasattt tcagettete gaacgcagaa tgaaagtgga 480 taaaaaaaga gtgtatctgg ceactgatga ccc ttctttg ttaaaggagg caaagaeaaa 540 gtaetceaat tatgaattfca ttagtgataa etctatttct tggieagctg gâctacacaa 600 ccgatacaea gaaaattcac ttcggggcgt gatcctggat atacactttc tetcccaggc 860 tgacttcctt gtgtgtactt tttcatecca ggtctgtagg gttgcttatg aaatcatgea 720 aaeaetgeat cctgatgcct ctgcaaactt ccattcttta gatgaeatet act&ttttgg 780 aggccaaaat gcecaeaace agattgcagt ttatcetcac eaacctcgaa etaaagagga 840 aatccecatg gaacciggag atatcattgg tgtggetgga aaccattgga atggttectc §00 taaaggtgtê aacagaaaac taggaaaaac aggcctgt&e ccttcctaca a&gtccgaga §60 g&agatagaa acggtcaag §79

<210> 4 <211> 979 <212> ADN 105 <213> Rattus <4Ο0> 4 actcatettg gaatctcaga attggcgcta tgctactggt ggatgggaga ctgtgtttag δΟ acetgtaagt gâgaeaigca cagacagatc tggcctctec actggacact ggtcaggtga 120 actgaatgae aaaaatattc aagtggtgga gctccccatt giagacagec tieaiecteg 180 gecfcecttae ttaceactgg etgttecaga agacetigea gategaeteg taagagtcea 240 tggtgatcct gcagtgtggt gggtgtccca gttcgtcaaa tatttpttc gteeaeaact 300 ttggctagaa aaggaa&tag aâgaagecac oaagaagett ggcttcaaac atceagtcat 300 t.ggagtccat gicagacgcã eagaeaaagt gggaacagag gcagcett«c afceeeatega 429 agagtacaig gtacatgttg aagaaeattt tcagcttcte gcacgcagaa tgcaagtgga <489 taaaa&aaga gtataictgg cfcaccgatga ccctgctttg ttaaaggagg ea&agaeaaa 549 gfcaslecaat tatgaattta ttagfcgâtaa etetatttct tggteagctg gaetacaeaa 600 tcggtacaca gaaaattcac tteggggcgt gatcctggat atacactttc tctctcaggc 688 tgacttccta gtgtgtacit tttcatccca ggtct.gtegg gttgcttatg aaatcatgca 729 aaccctgcat cctgatgcct ctgeaaactt ccactettta gatgacatct actattttgg 780 aggccaaaat gcccacaacc agattgccgt ttatcctcac aaacctcgaa ctgatgagga 840 aattccaatg gaaectggag atatcattgg fcgtggctgga aaccattggg atggtiattc 900 taaaggtgtc aacagaaaac ttggââaaae aggettatat ccetcetaca aagtccgaga 860 gaagatagaa acggtcaag 879

<210> 5 <211> 40 <212> ADN <213> Sequência artificial 106 <22 0> <221> fonte

<223> /nota = "Descrição da sequência artificial: ADN sintético" <400> 5 aagtataagc ttacatggat gacgatatcg ctgcgctcgt 40

<210> 6 <211> 40 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <221> fonte <223> /nota = "Descrição da sequência artificial: ADN sintético" <400> 6

atttaactgc aggaagcatt tgcggtggac gatggagggg 40 <210> 7 <211> 40 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <221> fonte <223> /nota = "Descrição da sequência artificial: ADN sintético" <400> 7 atttaaggta ccgaagcatt tgcggtgcac gatggagggg 40 <210> 8 107 <211> 24

<212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <221> fonte <223> /nota = "Descrição da sequência artificial: ADN sintético" <400> 8 gtccatggtg atcctgcagt gtgg 24

<210> 9 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <221> fonte <223> /nota = "Descrição da sequência artificial: ADN sintético" <400> 9 caccaatgat atctccaggt tcc 23 <210> 10 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <221> fonte 108 <223> /nota = "Descrição da sequência artificial: ADN sintético" <4 0 0> 10 gatatcgctg cgctcgttgt cgac 24

<210> 11 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <221> fonte <223> /nota = "Descrição da sequência artificial: ADN sintético" <4 0 0> 11 caggaaggaa ggctggaaaa gagc 24

<210> 12 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <221> fonte <223> /nota = "Descrição da sequência artificial: ADN sintético" <4 0 0> 12 gatatcgctg cgctcgtcgt cgac 24 <210> 13 <211> 24 109

<212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <221> fonte <223> /nota = "Descrição da sequência artificial: ADN sintético" <4 0 0> 13 caggaaggaa ggctggaaga gagc 24

Lisboa, 22 de Julho de 2013. 110

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo IgG com uma actividade celular dependente de um anticorpo estimulada, ao qual está ligado um complexo biantenário do tipo de uma cadeia de açúcar ligada a N-glicósido e no qual a fucose não está ligada ao complexo biantenário do tipo de N-acetilglicosamina da extremidade redutora da cadeia de açúcar, caracterizado pelo facto de a região de ligação do referido complexo biantenário do tipo de cadeia de açúcar ligada a N-glicósido estar presente em duas posições do referido anticorpo IgG e em que o complexo biantenário do tipo de cadeia de açúcar ligada a N-glicósido, no qual a fucose não está ligada a N-acetilglicosamina, se juntar às duas regiões de ligação da cadeia de açúcar e em que o referido complexo biantenário do tipo de cadeia de açúcar ligada a N-glicósido, tem essencialmente a seguinte estrutura: 4GlcNAcpl —- 2Manat +GicNA<#l—4Msnpl—► 4GIcNAc£l —·» 4GlcNAc ±Gal{5l—► 4-GIcNAcfU —2Manal ^
2. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o anticorpo reconhecer um antigénio relacionado com um tumor.
3. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de o antigénio relacionado com o tumor ser o gangliósido GD3.
4. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o anticorpo reconhecer um 1 antigénio relacionado com uma alergia ou uma inflamação.
5. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de o antigénio relacionado com uma alergia ou com uma inflamação ser uma cadeia α do receptor da interleucina 5 humana.
6. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o anticorpo reconhecer um antigénio relacionado com uma doença cardiovascular.
7. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o anticorpo reconhecer um antigénio relacionado com uma doença auto-imune.
8. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o anticorpo reconhecer um antigénio relacionado com uma infecção virai ou bacteriana.
9. Medicamento caracterizado pelo facto de compreender o anticorpo de acordo com uma das reivindicações 1 a 8.
10. Medicamento, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de o referido medicamento (a) conter o referido anticorpo e de destinar a ser administrado isoladamente como um fármaco terapêutico; ou (b) compreender ainda um ou mais veiculos aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico.
11. Agente para o diagnóstico de cancro, caracterizado pelo 2 facto de compreender, como princípio activo, o anticorpo de acordo com a reivindicação 2.
12. Agente para o tratamento de cancro, caracterizado pelo facto de compreender, como princípio activo, o anticorpo de acordo com a reivindicação 2.
13. Agente para a prevenção de cancro, caracterizado pelo facto de compreender, como princípio activo, o anticorpo de acordo com a reivindicação 2. de uma alergia ou de uma pelo facto de compreender, anticorpo de acordo com a de uma alergia ou de uma pelo facto de compreender, anticorpo de acordo com a de uma alergia ou de uma pelo facto de compreender, anticorpo de acordo com a
14. Agente para o diagnóstico inflamação, caracterizado como princípio activo, o reivindicação 4.
15. Agente para o tratamento inflamação, caracterizado como princípio activo, o reivindicação 4.
16. Agente para a prevenção inflamação, caracterizado como princípio activo, o reivindicação 4.
17. Agente para o diagnóstico de uma doença cardiovascular, caracterizado pelo facto de compreender, como princípio activo, o anticorpo de acordo com a reivindicação 6.
18. Agente para o tratamento de uma doença cardiovascular, caracterizado pelo facto de compreender, como princípio activo, o anticorpo de acordo com a reivindicação 6. 3
19. Agente para a prevenção de uma doença cardiovascular, caracterizado pelo facto de compreender, como princípio activo, o anticorpo de acordo com a reivindicação 6.
20. Agente para o diagnóstico de uma doença auto-imune, caracterizado pelo facto de compreender, como princípio activo, o anticorpo de acordo com a reivindicação 7.
21. Agente para o tratamento de uma doença auto-imune, caracterizado pelo facto de compreender, como princípio activo, o anticorpo de acordo com a reivindicação 7.
22. Agente para a prevenção de uma doença auto-imune, caracterizado pelo facto de compreender, como princípio activo, o anticorpo de acordo com a reivindicação 7.
23. Agente para o diagnóstico de uma infecção bacteriana ou virai, compreendendo, como princípio activo, o anticorpo de acordo com a reivindicação 8.
24. Agente para o tratamento de uma infecção bacteriana ou virai, compreendendo, como princípio activo, o anticorpo de acordo com a reivindicação 8.
25. Agente para a prevenção de uma infecção bacteriana ou virai, compreendendo, como princípio activo, o anticorpo de acordo com a reivindicação 8. Lisboa, 22 de Julho de 2013. 4