EA036314B1 - Выделенные антитела к рецептору эпидермального фактора роста-3 (her3) и их фрагменты, фармацевтическая композиция, содержащая эти антитела и фрагменты, и их применение для лечения рака - Google Patents

Выделенные антитела к рецептору эпидермального фактора роста-3 (her3) и их фрагменты, фармацевтическая композиция, содержащая эти антитела и фрагменты, и их применение для лечения рака Download PDF

Info

Publication number
EA036314B1
EA036314B1 EA201300256A EA201300256A EA036314B1 EA 036314 B1 EA036314 B1 EA 036314B1 EA 201300256 A EA201300256 A EA 201300256A EA 201300256 A EA201300256 A EA 201300256A EA 036314 B1 EA036314 B1 EA 036314B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
seq
variable region
cdr3
cdr2
chain cdr1
Prior art date
Application number
EA201300256A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201300256A1 (ru
Inventor
Винфрид Элис
Сет Эттенберг
Эндрью Пол Гарнер
Николе Хаубст
Кристиан Карстен Зильвестер Кунц
Элизабет Анна Райзингер Спрагью
Original Assignee
Новартис Аг
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=44630597&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA036314(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Новартис Аг filed Critical Новартис Аг
Publication of EA201300256A1 publication Critical patent/EA201300256A1/ru
Publication of EA036314B1 publication Critical patent/EA036314B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3015—Breast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3023—Lung
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/303—Liver or Pancreas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3038—Kidney, bladder
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3046—Stomach, Intestines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3053—Skin, nerves, brain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3061—Blood cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/522—CH1 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

В изобретении описаны варианты выделенных антител к HER3-рецептору или их фрагменты, фармацевтическая композиция, содержащая эти антитела или их фрагменты, а также их применение для лечения рака или для приготовления лекарственного средства для лечения рака.

Description

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится, в целом, к антителам или их фрагментам, которые взаимодействуют с рецепторами семейства HER, например с HER3-рецептором. В частности, оно относится к антителам или их фрагментам, которые распознают конформационный эпитоп HER-рецептора (например, HER3), содержащий остатки из обоих доменов 2 и 4, что приводит к ингибированию как зависимой от лиганда, так и независимой от лиганда трансдукции сигнала.
Предпосылки создания изобретения
Рецептор человеческого эпидермального фактора роста-3 (ErbB3, который обозначают также как HER3) представляет собой рецепторную протеинтирозинкиназу и принадлежит к подсемейству рецепторных протеинтирозинкиназ эпидермального фактора роста (EGFR), которое включает также EGFR (HER1, ErbB1), HER2 (ErbB2, Neu) и HER4 (ErbB4) (Plowman и др., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1990, сс. 4905-4909; Kraus и др., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 1989, сс. 9193-9197; Kraus и др., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 1993, сс. 2900-2904). Подобно прототипическому рецептору эпидермального фактора роста трансмембранный рецептор HER3 состоит из внеклеточного лигандсвязывающего домена (ECD), домена димеризации внутри ECD, трансмембранного домена, внутриклеточного домена, напоминающего протеинтирозинкиназный домен (TKD), и C-концевого домена фосфорилирования. В отличие от других представителей семейства HER киназный домен HER3 отличается очень низкой присущей ему киназной активностью.
Лиганды нейрегулин 1 (NRG) или нейрегулин 2 связываются с внеклеточным доменом HER3 и активируют опосредуемый рецептором путь передачи сигнала в результате усиления димеризации с другими партнёрами по димеризации, такими как HER2. Гетеродимеризация приводит к активации и трансфосфорилированию внутриклеточного домена HER3, и это способствует не только диверсификации сигнала, но также и к усилению сигнала. Кроме того, гетеродимеризация HER3 может происходить также без участия активирующих лигандов, и этот процесс, как правило, называют независимой от лиганда активацией HER3. Например, при высоких уровнях экспрессии HER2 в результате генной амплификации (например, при раке молочной железы, легкого, яичника или желудка) может происходить спонтанное образование димеров HER2/HER3. Считается, что в этой ситуации HER2/HER3 является наиболее активным ErbB-сигнальным димером и поэтому обладает высокой трансформирующей способностью.
Повышенный уровень HER3 обнаружен при некоторых типах рака, таких как рак молочной железы, легкого, желудочно-кишечный рак и рак поджелудочной железы. Важно отметить, что была обнаружена корреляция между экспрессией HER2/HER3 и переходом заболевания из неинвазивной в инвазивную стадию (Alimandi и др., Oncogene 10, 1995, сс. 1813-1821; DeFazio и др., Cancer 87, 2000, сс. 487-498; Naidu и др., Br. J. Cancer 78, 1988, сс. 1385-1390). Таким образом, существует необходимость в разработке агентов, которые взаимодействуют с опосредуемой HER3 передачей сигнала.
Краткое изложение сущности изобретения
При создании изобретения были обнаружены антигенсвязывающие белки (например, антитела или их фрагменты), которые связываются с конформационным эпитопом HER3-рецепторa, содержащим аминокислотные остатки, входящие в домен 2 и домен 4 HER3. Указанное связывание антител или их фрагментов с доменом 2 и доменом 4 стабилизирует HER3-рецептор в неактивной или закрытой конформации, что приводит к ингибированию активации HER3. При создании изобретения неожиданно было установлено, что связывание антител или их фрагментов с указанным конформационным эпитопом блокирует как зависимые от лиганда (например, нейрегулина), так и независимые от лиганда пути передачи сигнала HER3. Кроме того, опосредуемое антителом ингибирование индуцируемой лигандом передачи сигнала имеет место без блокады связывания лиганда (т.е. как лиганд, так и антитело могут связываться с HER3), по-видимому, по той причине, что HER3 не может подвергаться конформационным перегруппировкам, необходимым для активации.
Таким образом, одним из объектов изобретения является выделенное антитело или его фрагмент к HER3-рецепmору, которое(ые) включают:
а) VH, которая содержит SEQ ID NO: 15, и VL, которая содержит SEQ ID NO: 14, или аминокислотную последовательность, идентичную им на 97-99%; или
б) VH, которая содержит SEQ ID NO: 33, и VL, которая содержит SEQ ID NO: 32, или аминокислотную последовательность, идентичную им на 97-99%; или
в) VH, которая содержит SEQ ID NO: 51, и VL, которая содержит SEQ ID NO: 50, или аминокислотную последовательность, идентичную им на 97-99%; или
г) VH, которая содержит SEQ ID NO: 69, и VL, которая содержит SEQ ID NO: 68, или аминокислотную последовательность, идентичную им на 97-99%; или
д) VH, которая содержит SEQ ID NO: 87, и VL, которая содержит SEQ ID NO: 86, или аминокислотную последовательность, идентичную им на 97-99%; или
е) VH, которая содержит SEQ ID NO: 105, и VL, которая содержит SEQ ID NO: 104, или аминокислотную последовательность, идентичную им на 97-99%; или
ж) VH, которая содержит SEQ ID NO: 123, и VL, которая содержит SEQ ID NO: 122, или аминокислотную последовательность, идентичную им на 97-99%; или
- 1 036314
з) VH, которая содержит SEQ ID NO: 141, и VL, которая содержит SEQ ID NO: 140, или аминокислотную последовательность, идентичную им на 97-99%; или
и) VH, которая содержит SEQ ID NO: 159, и VL, которая содержит SEQ ID NO: 158, или аминокислотную последовательность, идентичную им на 97-99%; или
к) VH, которая содержит SEQ ID NO: 177, и VL, которая содержит SEQ ID NO: 176, или аминокислотную последовательность, идентичную им на 97-99%; или
л) VH, которая содержит SEQ ID NO: 195, и VL, которая содержит SEQ ID NO: 194, или аминокислотную последовательность, идентичную им на 97-99%; или
м) VH, которая содержит SEQ ID NO: 213, и VL, которая содержит SEQ ID NO: 212, или аминокислотную последовательность, идентичную им на 97-99%; или
н) VH, которая содержит SEQ ID NO: 231, и VL, которая содержит SEQ ID NO: 230, или аминокислотную последовательность, идентичную им на 97-99%; или
о) VH, которая содержит SEQ ID NO: 249, и VL, которая содержит SEQ ID NO: 248, или аминокислотную последовательность, идентичную им на 97-99%; или
п) VH, которая содержит SEQ ID NO: 267, и VL, которая содержит SEQ ID NO: 266, или аминокислотную последовательность, идентичную им на 97-99%; или
р) VH, которая содержит SEQ ID NO: 285, и VL, которая содержит SEQ ID NO: 284, или аминокислотную последовательность, идентичную им на 97-99%; или
с) VH, которая содержит SEQ ID NO: 303, и VL, которая содержит SEQ ID NO: 302, или аминокислотную последовательность, идентичную им на 97-99%; или
т) VH, которая содержит SEQ ID NO: 321, и VL, которая содержит SEQ ID NO: 320, или аминокислотную последовательность, идентичную им на 97-99%; или
у) VH, которая содержит SEQ ID NO: 339, и VL, которая содержит SEQ ID NO: 338, или аминокислотную последовательность, идентичную им на 97-99%; или
ф) VH, которая содержит SEQ ID NO: 357, и VL, которая содержит SEQ ID NO: 356, или аминокислотную последовательность, идентичную им на 97-99%; или
х) VH, которая содержит SEQ ID NO: 375, и VL, которая содержит SEQ ID NO: 374, или аминокислотную последовательность, идентичную им на 97-99%.
В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения выделенное антитело содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 493 или последовательность вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 494.
В самом предпочтительном варианте выделенное антитело содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 493, и последовательность вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 494.
В другом варианте выделенное антитело или его фрагмент содержит:
а) в вариабельной области тяжелой цепи CDR1 SEQ ID NO: 2; CDR2 SEQ ID NO: 3; CDR3 SEQ ID NO: 4; в вариабельной области легкой цепи CDR1 SEQ ID NO: 5; CDR2 SEQ ID NO: 6; и CDR3 SEQ ID NO: 7; или
б) в вариабельной области тяжелой цепи CDR1 SEQ ID NO: 20; CDR2 SEQ ID NO: 21; CDR3 SEQ ID NO: 22; в вариабельной области легкой цепи CDR1 SEQ ID NO: 23; CDR2 SEQ ID NO: 24; и CDR3 SEQ ID NO: 25; или
в) в вариабельной области тяжелой цепи CDR1 SEQ ID NO: 38; CDR2 SEQ ID NO: 39; CDR3 SEQ ID NO: 40; в вариабельной области легкой цепи CDR1 SEQ ID NO: 41; CDR2 SEQ ID NO: 42; и CDR3 SEQ ID NO: 43 или
г) в вариабельной области тяжелой цепи CDR1 SEQ ID NO: 56; CDR2 SEQ ID NO: 57; CDR3 SEQ ID NO: 58; в вариабельной области легкой цепи CDR1 SEQ ID NO: 59; CDR2 SEQ ID NO: 60; и CDR3 SEQ ID NO: 61; или
д) в вариабельной области тяжелой цепи CDR1 SEQ ID NO: 74; CDR2 SEQ ID NO: 75; CDR3 SEQ ID NO: 76; в вариабельной области легкой цепи CDR1 SEQ ID NO: 77; CDR2 SEQ ID NO: 78; и CDR3 SEQ ID NO: 79; или
е) в вариабельной области тяжелой цепи CDR1 SEQ ID NO: 92; CDR2 SEQ ID NO: 93; CDR3 SEQ ID NO: 94; в вариабельной области легкой цепи CDR1 SEQ ID NO: 95; CDR2 SEQ ID NO: 96; и CDR3 SEQ ID NO: 97; или
ж) в вариабельной области тяжелой цепи CDR1 SEQ ID NO: 110; CDR2 SEQ ID NO: 111; CDR3 SEQ ID NO: 112; в вариабельной области легкой цепи CDR1 SEQ ID NO: 113; CDR2 SEQ ID NO: 114; и CDR3 SEQ ID NO: 115; или
з) в вариабельной области тяжелой цепи CDR1 SEQ ID NO: 128; CDR2 SEQ ID NO: 129; CDR3 SEQ ID NO: 130; в вариабельной области легкой цепи CDR1 SEQ ID NO: 131; CDR2 SEQ ID NO: 132; и CDR3 SEQ ID NO: 133; или
и) в вариабельной области тяжелой цепи CDR1 SEQ ID NO: 146; CDR2 SEQ ID NO: 147; CDR3 SEQ ID NO: 148; в вариабельной области легкой цепи CDR1 SEQ ID NO: 149; CDR2 SEQ ID NO: 150; и CDR3 SEQ ID NO: 151; или
- 2 036314
к) в вариабельной области тяжелой цепи CDR1 SEQ ID NO: 164; CDR2 SEQ ID NO: 165; CDR3 SEQ
ID NO: 166; в вариабельной области легкой цепи CDR1 SEQ ID NO: 167; CDR2 SEQ ID NO: 168; и CDR3
SEQ ID NO: 169; или
л) в вариабельной области тяжелой цепи CDR1 SEQ ID NO: 182; CDR2 SEQ ID NO: 183; CDR3 SEQ ID NO: 184; в вариабельной области легкой цепи CDR1 SEQ ID NO: 185; CDR2 SEQ ID NO: 186; и CDR3 CDR3 SEQ ID NO: 187; или
м) в вариабельной области тяжелой цепи CDR1 SEQ ID NO: 200; CDR2 SEQ ID NO: 201; CDR3 SEQ ID NO: 202; в вариабельной области легкой цепи CDR1 SEQ ID NO: 203; CDR2 SEQ ID NO: 204; и CDR3 SEQ ID NO: 205; или
н) В вариабельной области тяжелой цепи CDR1 SEQ ID NO: 218; CDR2 SEQ ID NO: 219; CDR3 SEQ ID NO: 220; в вариабельной области легкой цепи CDR1 SEQ ID NO: 221; CDR2 SEQ ID NO: 222; и CDR3 SEQ ID NO: 223; или
о) в вариабельной области тяжелой цепи CDR1 SEQ ID NO: 236; CDR2 SEQ ID NO: 237; CDR3 SEQ ID NO: 238; в вариабельной области легкой цепи CDR1 SEQ ID NO: 239; CDR2 SEQ ID NO: 240; и CDR3 SEQ ID NO: 241; или
п) в вариабельной области тяжелой цепи CDR1 SEQ ID NO: 254; CDR2 SEQ ID NO: 255; CDR3 SEQ ID NO: 256; в вариабельной области легкой цепи CDR1 SEQ ID NO: 257; CDR2 SEQ ID NO: 2584; и CDR3 SEQ ID NO: 259; или
p) в вариабельной области тяжелой цепи CDR1 SEQ ID NO: 272; CDR2 SEQ ID NO: 273; CDR3 SEQ ID NO: 274; в вариабельной области легкой цепи CDR1 SEQ ID NO: 275; CDR2 SEQ ID NO: 276; и CDR3 SEQ ID NO: 277; или
с) в вариабельной области тяжелой цепи CDR1 SEQ ID NO: 290; CDR2 SEQ ID NO: 291; CDR3 SEQ ID NO: 292; в вариабельной области легкой цепи CDR1 SEQ ID NO: 293; CDR2 SEQ ID NO: 294; и CDR3 SEQ ID NO: 295; или
т) В вариабельной области тяжелой цепи CDR1 SEQ ID NO: 308; CDR2 SEQ ID NO: 309; CDR3 SEQ ID NO: 310; в вариабельной области легкой цепи CDR1 SEQ ID NO: 311; CDR2 SEQ ID NO: 312; и CDR3 SEQ ID NO: 313; или
у) в вариабельной области тяжелой цепи CDR1 SEQ ID NO: 326; CDR2 SEQ ID NO: 327; CDR3 SEQ ID NO: 328; в вариабельной области легкой цепи CDR1 SEQ ID NO: 329; CDR2 SEQ ID NO: 330; и CDR3 SEQ ID NO: 331; или
ф) в вариабельной области тяжелой цепи CDR1 SEQ ID NO: 344; CDR2 SEQ ID NO: 345; CDR3 SEQ ID NO: 346; в вариабельной области легкой цепи CDR1 SEQ ID NO: 347; CDR2 SEQ ID NO: 348; и CDR3 SEQ ID NO: 349; или
x) в вариабельной области тяжелой цепи CDR1 SEQ ID NO: 362; CDR2 SEQ ID NO: 363; CDR3 SEQ ID NO: 364; в вариабельной области легкой цепи CDR1 SEQ ID NO: 365; CDR2 SEQ ID NO: 366; и CDR3 SEQ ID NO: 367.
Фрагмент антитела может выбираться из группы, состоящей из Fab, F(ab2)', F(ab)2', scFv, VHH, VH, VL, dAb.
Вторым объектом данного изобретения является фармацевтическая композиция для лечения рака, отличающегося экспрессией HER3, включающая антитело или фрагмент и фармацевтически приемлемый носитель.
Причем эта композиция дополнительно может содержать терапевтическое средство, выбранное из группы, состоящей из ингибитора HER1, ингибитора HER2, ингибитора HER3, ингибитора HER4, ингибитора mTOR и ингибитора PI3-кuнαзы.
В предпочтительном варианте она дополнительно содержит терапевтическое средство, выбранное из группы, состоящей из ингибитора HER1, выбранного из группы, состоящей из матузумаба (EMD72000), Erbitux®/цетуксимаба, Vertibix®/панитумумаба, mAb 806, нимотузумаба, Iressa®/гефитиниба, CI-1033 (PD183805), лапатиниба (GW-572016), Tykerb®/лапатиниба дитозилата, Tarceva®/эрлотиниба-HCl (OSI-774), PKI-166 и Tovok®; ингибитор HER2, выбранный из группы, состоящей из пертузумаба, трастузумаба, MM-111, нератиниба, лапатиниба или лапатиниба дитозилата/Tykerb®; ингибитор HER3, выбранный из группы, состоящей из MM-121, MM-111, IB4C3, 2DID12 (фирма U3 Pharma AG), AMG888 (фирма Amgen), AV-203 (фирма Aveo), MEHD7945A (фирма Genentech) и малых молекул, которые ингибируют HER3; и ингибитор HER4.
В еще одном предпочтительном варианте композиция дополнительно содержит терапевтическое средство, выбранное из группы, состоящей из ингибитора mTOR, выбранного из группы, состоящей из темсиролимуса/Torisel®, ридафоролимуса/дефоролимуса, AP23573, MK8669, эверолимуса/Affinitor®.
Композиция также дополнительно может содержать терапевтическое средство, выбранное из группы, состоящий из ингибитора PI3-кuнaзы, выбранного из группы, состоящей из GDC 0941, BEZ235, BMK120 и BYL719.
Третьим объектом данного изобретения является применение антитела или его фрагмента для лечения рака, выбранного из группы, состоящей из колоректального рака, рака легкого, множественной мие- 3 036314 ломы, рака яичника, рака печени, рака желудка, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, острого миелолейкоза, хронического миелолейкоза, остеосаркомы, плоскоклеточной карциномы, опухоли оболочки периферических нервов, шванномы, рака головы и шеи, рака мочевого пузыря, эзофагеального рака, глиобластомы, светлоклеточной саркомы мягкой ткани, злокачественной мезотелиомы, нейрофиброматоза, рака почки и меланомы.
Кроме того, особенно предпочтительно применение антитела или его фрагмента для лечения рака молочной железы.
Следующим объектом данного изобретения является применение антитела или его фрагмента для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения рака, где рак выбирается из группы, состоящей из рака молочной железы, колоректального рака, рака легкого, множественной миеломы, рака яичника, рака печени, рака желудка, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, острого миелолейкоза, хронического миелолейкоза, остеосаркомы, плоскоклеточной карциномы, опухоли оболочки периферических нервов, шванномы, рака головы и шеи, рака мочевого пузыря, эзофагеального рака, глиобластомы, светлоклеточной саркомы мягкой ткани, злокачественной мезотелиомы, нейрофиброматоза, рака почки и меланомы.
Еще одним объектом данного изобретения является выделенное моноклональное антитело или его фрагмент к HER3-рецептору, содержащее в вариабельной области тяжелой цепи CDR1, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 128; CDR2, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 129; CDR3, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 130; в вариабельной области легкой цепи CDR1, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 131; CDR2, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 132; и CDR3, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 133.
Наконец последним объектом данного изобретения является выделенное антитело или его фрагмент к HER3-рецептору, включающее VH, содержащую SEQ ID NO: 141, и VL, содержащую SEQ ID NO: 140.
Краткое описание чертежей
На чертежах показано:
на фиг. 1 - репрезентативные кривые, полученные с помощью SET (титрование уравновешенного раствора), для антитела MOR10701 при использовании HER3 человека, мыши, крысы и обезьяны циномолгус (cyno);
на фиг. 2 - результаты оценки связывания с клетками линии SK-Br-3, полученные с помощью FACS-титрования;
на фиг. 3 - полученные с помощью ELISA результаты, касающиеся домена связывания HER3;
на фиг. 4 - результаты эпитопного картирования на основе обмена водорода на дейтерий (замещение водорода дейтерием). А) Пептиды ECD HER3, выделенные после HDX-MS-анализа (МС-анализ обмена водорода на дейтерий), обозначены штриховыми линиями. Потенциальные сайты N-связанного гликозилирования выделены ярким цветом. Б) Данные об относительной степени дейтеризации, обнаруженной в пептидах, которые идентифицировали с помощью МС. В) Защищенные остатки, картированные в опубликованной кристаллической структуре HER3;
на фиг. 5: А) - изображение поверхности кристаллической структуры HER3/MOR09823 и HER3/MOR09825 в рентгеновских лучах. HER3 (окрашен более светлым серым цветом) находится в закрытой конформации, a MOR09823 или MOR09825 (окрашены более темным серым цветом) связываются с обоими доменами 2 и 4; Б) - изображение поверхности HER3 из структуры HER3/MOR09823, представленное в такой же ориентации, что и (A). MOR09823 для простоты не показан; В) - структура HER3/MOR09823, проиллюстрированная в виде ленточной структуры, повернутой на угол 90° относительно панелей (А), (Б) и (Г); Г) - ленточное изображение неактивной конформации HER3, распознаваемой Fab-фрагментом MOR09823, с увеличенным изображением поверхности раздела домена 2/домена 4, ярким цветом выделены остатки HER3, расположенные в пределах 5А от Fab; Д) - результаты связывания мутантного HER3/MOR10703, полученные с помощью ELISA-титрования;
на фиг. 6 - данные о ингибировании индуцируемого лигандом (А) или независимого от лиганда (Б) фосфорилирования HER3;
на фиг. 7 - данные о ингибировании зависящих от HER3 расположенных в прямом направлении путей передачи сигнала в клеточных линиях, в которых происходит амплификация HER2;
на фиг. 8 - данные о влиянии ингибирования HER3 на рост клеток; А) BT-474-клетки и Б) стимулированные нейрегулином MCF7-клетки;
на фиг. 9 - данные о воздействии MOR09823 и MOR09825 на связывание нейрегулина с MCF7клетками;
на фиг. 10 - данные о влиянии связывания MOR09823 на образование комплекса HER3/ нейрегулин при оценке с помощью Biacore™. Без антител (черные прямоугольники), MOR09823 (белые прямоугольники, 105,5 (серые прямоугольники) и применявшийся в качестве контроля IgG (заштрихованные прямоугольники);
на фиг. 11 - данные об опосредованном MOR09823 ингибировании (А) независимой от лиганда
- 4 036314 (BT-474) и (Б) зависимой от лиганда (ВхРСЗ) передачи сигнала HER3 in vivo., на фиг. 12 - данные о влиянии MOR10701 и MOR10703 на рост опухоли линии BT-474;
на фиг. 13 - данные о влиянии MOR10701 и MOR10703 на рост опухоли линии BxPC3;
на фиг. 14 - изоболограммы, описывающие воздействие in vitro комбинации MOR10703 с лекарственными средствами (A) MOR09823/mрастузумаб, (Б) MOR09823/лапатиниб, (В) MOR10703/BEZ235, (Г) MOR10703/BKM120, (Д) MOR10703/BYL719, (Е) MOR10703/RAD001, (Ж) MOR10703/цетуксимаб и (3) MOR10703/эрлотиниб;
на фиг. 15 - данные о воздействии in vivo комбинаций MOR10701 или MOR10703 с (А) трастузумабом и (Б) эрлотинибом на клетки BT-474 и L3.3.
Подробное описание изобретения
Определения
С целью лучшего понимания настоящего изобретения предварительно представлено определение некоторых понятий. Дополнительные определения представлены в подробном описании изобретения.
Понятие путь трансдукции сигнала или сигнальная активность относится к биохимической причинной взаимосвязи, как правило, инициируемой белок-белковым взаимодействием, такой как связывание фактора роста с рецептором, приводящее к передаче сигнала от одной части клетки к другой части клетки. В случае HER3 передача сигнала включает специфическое фосфорилирование одного или нескольких остатков тирозина, серина или треонина в одном или нескольких белках, участвующих в каскаде реакций, обусловливающих трансдукцию сигнала. Предпоследние процессы, как правило, включают связанные с ядром события, которые приводят к изменению экспрессии гена.
HER-рецептор представляет собой рецепторную протеинтирозинкиназу, относящуюся к семейству HER-рецепторов, и включает рецепторы EGFR, HER2, HER3 и HER4 и других представителей этого семейства, которые будут идентифицированы в будущем. HER-рецептор, в целом, содержит внеклеточный домен, который может связываться с лигандом HER; липофильный трансмембранный домен; консервативный внутриклеточный тирозинкиназный домен; и расположенный на карбоксильном конце сигнальный домен, который несет несколько остатков тирозина, которые могут фосфорилироваться. Предпочтительно HER-рецептор имеет нативную последовательность человеческого HER-рецептора.
Понятия HER1, ErbB1, рецептор эпидермального фактора роста и EGFR в контексте настоящего описания применяют взаимозаменяемо, и они относятся к EGFR, описанному, например, у Carpenter и др., Ann. Rev. Biochem. 56, 1987, сс. 881-914, включая его встречающиеся в естественных условиях мутантные формы (например, делеционный мутант EGFR, описанный у Humphrey и др., PNAS (USA) 87, 1990, сс. 4207-4211). Понятие erbB1 относится к гену, кодирующему белковый продукт, представляющий собой EGFR.
В контексте настоящего описания понятия HER2 и ErbB2 применяют взаимозаменяемо, и они относятся к человеческому белку HER2, описанному, например, у Semba и др., PNAS (USA) 82, 1985, сс. 6497-6501 и Yamamoto и др., Nature 319, 1986, сс. 230-234 (регистрационный номер Genebank X03363). Понятие erbB2 относится к гену, кодирующему человеческий ErbB2, neu относится к гену, кодирующему крысиный белок p185neu.
В контексте настоящего описания понятия HER4 и ErbB4 относятся к рецепторному полипептиду, описанному, например, в заявке на европейский патент № 599274; у Plowman и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 1993, сс. 1746-1750; и у Plowman и др., Nature, 366, 1993, сс. 473-475, включая его изоформы, описанные, например, в WO 99/19488, которая была опубликована 22 апреля 1999 г.
Понятие HER3 или HER3-рецептор, а также ErbB3, в контексте настоящего описания относится к белку HER3 млекопитающих, а понятие her3 или erbB3 относится к гену her3 млекопитающих. Предпочтительный белок HER3 представляет собой человеческий белок HER3, который присутствует в клеточной мембране клетки. Человеческий ген her3 описан в US № 5480968 и у Plowman и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 1990, сс. 4905-4909.
Человеческий HER3, регистрационный № NP_001973 (человеческий), имеет последовательность, представленную ниже в SEQ ID NO: 1. Вся номенклатура представлена для полноразмерного незрелого HER3 (аминокислоты 1-1342). Незрелый HER3 расщепляется между положениями 19 и 20 с образованием зрелого белка HER3 (аминокислоты 20-1342)
- 5 036314 mrandalqvl gllfslargs evgnsqavcp gtlnglsvtg daenqyqtly klyercevvm gnleivltgh nadlsflqwi revtgyvlva mnefstlplp nlrvvrgtqv ydgkfaifvm Inyntnssha Irqlrltqlt eilsggvyie kndklchmdt idwrdivrdr daeivvkdng rscppchevc kgrcwgpgse dcqtltktic apqcnghcfg pnpnqcchde caggcsgpqd tdcfacrhfn dsgacvprcp qplvynkltf qlepnphtky qyggvcvasc phnfvvdqts cvracppdkm evdknglkmc epcgglcpka cegtgsgsrf qtvdssnidg fvnctkilgn Idflitglng dpwhkipald peklnvfrtv reitgylniq swpphmhnfs vfsnlttigg rslynrgfsl limknlnvts Igfrslkeis agriyisanr qlcyhhslnw tkvlrgptee rldikhnrpr rdcvaegkvc dplcssggcw gpgpgqclsc rnysrggvcv thcnflngep refaheaecf schpecqpme gtatcngsgs dtcaqcahfr dgphcvsscp hgvlgakgpi ykypdvqnec rpchenctqg ckgpelqdcl gqtlvligkt hltmaltvia glvvifmmlg gtflywrgrr iqnkramrry lergesiepl dpsekankvl arifketelr klkvlgsgvf gtvhkgvwip egesikipvc ikviedksgr qsfqavtdhm laigsldhah ivrllglcpg sslqlvtqyl plgslldhvr qhrgalgpql llnwgvqiak gmyyleehgm vhrnlaarnv llkspsqvqv adfgvadllp pddkqllyse aktpikwmal esihfgkyth qsdvwsygvt vwelmtfgae pyaglrlaev pdllekgerl aqpqictidv ymvmvkcwmi denirptfke laneftrmar dpprylvikr esgpgiapgp ephgltnkkl eevelepeld Idldleaeed nlatttlgsa Islpvgtlnr prgsqsllsp ssgympmnqg nlgescqesa vsgssercpr pvslhpmprg clasessegh vtgseaelqe kvsmcrsrsr srsprprgds ayhsqrhsll tpvtplsppg leeedvngyv mpdthlkgtp ssregtlssv glssvlgtee ededeeyeym nrrrrhspph pprpssleel gyeymdvgsd Isaslgstqs cplhpvpimp tagttpdedy eymnrqrdgg gpggdyaamg acpaseqgye emrafqgpgh qaphvhyarl ktlrsleatd safdnpdywh srlfpkanaq rt (SEQ ID NO: 1)
Понятие лиганд HER в контексте настоящего описания относится к полипептидам, которые связываются и активируют HER-рецепторы, такие как HER1, HER2, HER3 и HER4. Примерами лигандов HER являются (но, не ограничиваясь только ими) нейрегулин 1 (NRG), нейрегулин 2, нейрегулин 3, нейрегулин 4, бетацеллюлин, гепаринсвязывающий эпидермальный фактор роста, эпирегулин, эпидермальный фактор роста, амфирегулин и трансформирующий фактор роста альфа. Понятие включает биологически активные фрагменты и/или варианты встречающегося в естественных условиях полипептида.
Понятие лиганд HER3 в контексте настоящего описания относится к полипептидам, которые связываются и активируют HER3. Примерами лигандов HER3 являются (но, не ограничиваясь только ими) нейрегулин 1 (NRG) и нейрегулин 2, бетацеллюлин, гепаринсвязывающий эпидермальный фактор роста и эпирегулин. Понятие включает биологически активные фрагменты и/или варианты встречающегося в естественных условиях полипептида.
Белковый комплекс HER-HER представляет собой нековалентно ассоциированный олигомер, содержащий корецепторы HER в любой комбинации (например, HER1-HER2, HER1-HER3, HER1-HER4, HER2-HER3, HER3-HER4 и т.п.). Этот комплекс может образовываться, когда клетку, экспрессирующую оба указанных рецептора, обрабатывают лигандом HER, например NRG, или когда HER-рецептор является активным, или когда происходит его сверхэкспрессия.
Белковый комплекс HER2-HER3 представляет собой нековалентно ассоциированный олигомер, содержащий HER2-рецептор и HER3-рецептор. Этот комплекс может образовываться в том случае, когда клетку, экспрессирующую оба указанных рецептора, обрабатывают лигандом HER3, например NRG, или когда HER2 является активным/сверхэкспрессируется.
Понятие активность HER3 или активация HER3 в контексте настоящего описания относится к
- 6 036314 повышению олигомеризации (например, увеличению количества содержащих HER3 комплексов), фосфорилирования HER3, конформационных перегруппировок (например, индуцируемых лигандами) и опосредуемой HER3 передачи сигнала в прямом направлении.
Понятие стабилизация или стабилизированный в контексте HER3 относится к антителу или его фрагменту, которое/который непосредственно поддерживает (запирает, привязывает, удерживает, предпочтительно связывает, обладает предрасположенностью к) неактивное состояние или неактивную конформацию HER3, не блокируя при этом связывание лиганда с HER3, но таким образом, чтобы связывание лиганда уже не могло активировать HER3. Описанные в примерах анализы, например Biacoreанализ, можно применять для оценки связывания лиганда со стабилизированным HER3-рецеπтором.
Понятие зависимая от лиганда передача сигнала в контексте настоящего описания относится к активации HER (например, HER3) с помощью лиганда. Активация HER3 проявляется по повышенной олигомеризации (например, гетеродимеризации) и/или фосфорилированию HER3, в результате чего активируются расположенные в прямом направлении пути передачи сигнала (например, PI3K). Антитело или его фрагмент может статистически значимо снижать количество фосфорилированных HER3 в стимулированной клетке, обработанной антигенсвязывающим белком (например, антителом), по сравнению с необработанной (контрольной) клеткой, при оценке с помощью анализов, описанных в примерах. Экспрессирующие HER3 клетки могут представлять собой встречающуюся в естественных условиях клеточному линию (например, MCF7), или их можно получать рекомбинантно путем интродукции нуклеиновых кислот, которые кодируют белок HER3, в клетке-хозяине.
Стимуляцию клетки можно осуществлять либо путем экзогенного добавления активирующего HER3 лиганда, либо путем эндогенной экспрессии активирующего лиганда.
Антитело или его фрагмент, которое/который снижает индуцируемую нейрегулином активацию HER3 в клетке относится к антителу или его фрагменту, которое/который статистически значимо снижает фосфорилирование тирозина HER3 по сравнению с необработанной (контрольной) клеткой, при оценке с помощью анализов, описанных в примерах. Определение этого может основываться на уровнях фосфотирозина в HER3 после обработки HER3 NRG и представляющим интерес антителом. Экспрессирующая HER3 клетка может представлять собой встречающуюся в естественных условиях клетку или клеточную линию (например, MCF7) или ее можно получать рекомбинантно.
Понятие независимая от лиганда передача сигнала в контексте настоящего описания относится к клеточной активности HER3 (например, фосфорилированию), для которой не требуется связывание с лигандом. Например, независимая от лиганда активация HER3 может быть результатом сверхэкспрессии HER2 или активирующих мутаций в партнерах HER3 по гетеродимеризации, таких как EGFR и HER2. Антитело или его фрагмент может статистически значимо снижать количество фосфорилированных HER3 в клетке, обработанной антигенсвязывающим белком (например, антителом), по сравнению с необработанной (контрольной) клеткой. Экспрессирующая HER3 клетка может представлять собой встречающуюся в естественных условиях клеточному линию (например, SK-Br-3), или ее можно получать рекомбинантно путем интродукции нуклеиновых кислот, которые кодируют белок HER3, в клеткухозяина.
Понятие блокирует в контексте настоящего описания относится к остановке или предотвращению взаимодействия или процесса, например, прекращение зависимой от лиганда или независимой от лиганда передачи сигнала.
Понятие распознает в контексте настоящего описания относится к антителу или его фрагменту, которое/который обнаруживает и взаимодействует (например, связывается) с его конформационным эпитопом.
Понятие конкурентно связывается в контексте настоящего описания относится к лиганду HER, который может связываться с сайтом связывания лиганда на HER-рецепторе наряду с антителом к HER. Это означает, что и лиганд, и антитело могут одновременно связываться с HER-рецептором. Например, только с целью иллюстрации, лиганд HER3 NRG может связываться с HER3-рецептором наряду с антителом к HER3. Анализ, предназначенный для оценки конкурентного связывания лиганда и антитела, описан в разделе Примеры (например, Biacore-анализ).
Понятие не обладающий способностью в контексте настоящего описания относится к антителу или его фрагменту, которое/который не могут осуществлять конкретную функцию. Например, антитело или его фрагмент, которое/который не обладает способностью активировать трансдукцию сигнала, представляет собой антитело или его фрагмент, которое/который не запускает трансдукцию сигнала; антитело или его фрагмент, которое/который не обладает способностью индуцировать конформационное изменение, представляет собой антитело или его фрагмент, которое/который не вызывает структурное изменение HER-рецептора; антитело или его фрагмент, которое/который стабилизирует HER-рецептор в неактивном состоянии, таком, что HER-рецептор не обладает способностью к димеризации, представляет собой антитело или его фрагмент, которое/который не образует белок-белковые комплексы.
Понятие антитело в контексте настоящего описания относится к полным антителам, которые взаимодействуют (например, путем связывания, создания стерической помехи, стабилизации/дестабилизации, пространственного распределения) с эпитопом HER3 и ингибируют трансдукцию
- 7 036314 сигнала. Встречающееся в естественных условиях антитело представляет собой гликопротеин, который содержит по меньшей мере две тяжелые (H) цепи и две легкие (L) цепи, связанные друг с другом дисульфидными мостиками. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (сокращенно обозначена в контексте настоящего описания как VH) и константной области тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов, т.е. CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенно обозначена в контексте настоящего описания как VL) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена, т.е. CL. VH- и VL-области можно дополнительно подразделять на области гиперварибельности, которые называют гипервариабельными участками (CDR), которые перемежаются с более консервативными участками, которые называют каркасными участками (FR). Каждая из VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, которые расположены в направлении от аминоконца к карбоксиконцу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелых и легких цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, в том числе с различными клетками иммунной системы (например, эффекторными клетками) и первым компонентом (C1q) классической системы комплемента. Понятие антитело относится, например, к моноклональным антителам, человеческим антителам, гуманизированным антителам, камелизированным антителам, химерным антителам, одноцепочечным Fv (scFv), связанным дисульфидным мостиком Fv (sdFv), Fab-фрагментам, F(ab')фрагментам и антиидиотипическим (анти-Id) антителам (включая, например, анти-Id антитела к антителам, предлагаемым в изобретении) и к эпитопсвязывающим фрагментам любого из них. Антитела могут относиться к любому изотипу (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), классу (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подклассу.
Как легкие, так и тяжелые цепи подразделяют на области структурной и функциональной гомологии. Понятия константная и вариабельная применяют для определения функции. При этом принято считать, что участки вариабельных доменов легких (VL) и тяжелых (VH) цепей определяют распознавание антигена и специфичность. И наоборот, константные домены легкой цепи (CL) и тяжелой цепи (CH1, CH2 или CH3) обусловливают важные биологические свойства, такие как секреция, прохождение через плаценту, связывание Fc-рецептора, связывание комплемента и т.п. Принято, что нумерация доменов константных областей возрастает по мере их удаления от антигенсвязывающего центра или аминоконца антитела. N-конец представляет собой вариабельную область, а на C-конце находится константная область; CH3- и CL-домены фактически содержат карбоксиконец тяжелой и легкой цепи соответственно.
Понятие фрагмент антитела в контексте настоящего описания относится к одному или нескольким участкам антитела, который(ые) сохраняет(ют) способность специфически взаимодействовать (например, путем связывания, стерической помехи, стабилизации/дестабилизации, пространственного распределения) с эпитопом HER3 и ингибировать трансдукцию сигнала. Примерами связывающих фрагментов являются (но, не ограничиваясь только ими) Fab-фрагмент, одновалентный фрагмент, состоящий из VL-, VH-, CL- и СШ-доменов; F(ab)2-фрагмент, двухвалентный фрагмент, который состоит из двух Fabфрагментов, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; Fd-фрагмент, состоящий из VHи CHI-доменов; Fv-фрагмент, состоящий из VL-и VH-доменов одного плеча антитела; dAb-фрагмент (Ward и др., Nature 341, 1989, сс. 544-546), который состоит из VH-домена; и выделенный гипервариабельный участок (CDR).
Кроме того, несмотря на то, что два домена Fv-фрагмента, т.е. VL и VH, кодируются различными генами, их можно соединять с помощью методов рекомбинации синтетическим линкером, который позволяет создавать из них одну белковую цепь, в которой пара VL- и VH-областей формирует одновалентные молекулы (известные под названием одноцепочечный Fv-фрагмент (scFv); см., например, Bird и др., Science 242, 1988, сс. 423-426; и Huston и др., Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 1988, сс. 5879-5883). Такие одноцепочечные антитела также подпадают под понятие фрагмент антитела. Указанные фрагменты антитела получают с помощью общепринятых методов, известных специалистам в данной области, и фрагменты подвергают скринингу в отношении возможности их применения, аналогичного применению интактных антител.
К фрагментам антитела относятся также однодоменные антитела, макситела, минитела, интратела, диантитела (диабоди, димерные) антитела, тримерные антитела, тетрамерные антитела, v-NAR и бисscFv (см., например, Hollinger и Hudson, Nature Biotechnology, 23, 9, 2005, сс. 1126-1136). Фрагменты антител можно трансплантировать в каркасы, основой которых являются полипептиды, такие как фибронектин типа III (Fn3) (см. US № 6703199, в котором описаны моноантитела, основой которых является полипептид фибронектина).
Фрагменты антител могут входить также в одноцепочечные молекулы, которые содержат пару расположенных в виде тандема Fv-сегментов (VH-CH1-VH-CH1), которые в сочетании с комплементарными полипептидами легкой цепи формируют пару антигенсвязывающих областей (Zapata и др., Protein Eng. 8(10), 1995, сс. 1057-1062; и US № 5641870).
Понятие эпитоп означает любую белковую детерминанту, которая обладает способностью специфически связываться с иммуноглобулином или иным образом взаимодействовать с молекулой. Эпитоп- 8 036314 ные детерминанты, как правило, состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как аминокислоты или боковые цепи углеводов или сахаров, и, как правило, имеют специфические характеристики трехмерной структуры, а также специфические характеристики заряда. Эпитоп может быть линейным или конформационным.
Понятие линейный эпитоп относится к эпитопу в случае, когда все точки взаимодействия между белком и взаимодействующей молекулой (такой как антитело) расположены линейно вдоль первичной аминокислотной последовательности белка (непрерывно). Если требуемый эпитоп антигена определен, то можно создавать антитела к этому этитопу, например, с помощью методов, описанных в настоящем изобретении. В альтернативном варианте в процессе поиска, создания и характеризации антител можно получать информацию о приемлемых эпитопах. Затем на основе этой информации можно осуществлять конкурентный скрининг антител в отношении связывания с одним и тем же эпитопом. Применяемый для этой цели подход включает осуществления опытов по перекрестной конкуренции для поиска антител, которые конкурентно связываются с другим антителом, например антител, которые конкурируют за связывание с антигеном. Высокопроизводительный процесс группировки (биннинга) антител на основе их перекрестной конкуренции описан в международной заявке на патент WO 2003/48731. Как должно быть очевидно специалисту в данной области, практически все, с чем может специфически связываться антитело, можно рассматривать как эпитоп. Эпитоп может содержать те остатки, с которыми связывается антитело.
Понятие конформационный эпитоп относится к эпитопу, состоящему из не расположенных непрерывно аминокислот, которые объединены в трехмерную конформацию. В конформационном эпитопе точки взаимодействия расположены на аминокислотных остатках белка, которые отделены друг от друга. Конформационный эпитоп может состоять из (I) аминокислотных остатков HER3 265-277 и 315 (из домена 2) и (II) аминокислотных остатков HER3 571, 582-584, 596-597, 600-602, 609-615 (из домена 4), которые представлены в SEQ ID NO: 1, или их поднабор. Как должно быть очевидно специалисту в данной области, пространство, занятое остатком или боковой цепью, который/которая определяет форму молекулы, помогает определять, что представляет собой эпитоп.
Как правило, антитела, специфические в отношении конкретного антигена-мишени, должны главным образом распознавать эпитоп на антигене-мишени в сложной смеси белков и/или макромолекул.
Области данного полипептида, которые включают эпитоп, можно идентифицировать с помощью любой из методик эпитопного картирования, которые хорошо известны в данной области (см., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, под ред. Glenn E.Morris, изд-во Humana Press, Totowa, New Jersey, т. 66, 1996). Например, линейные эпитопы можно определять, в частности, осуществляя одновременный синтез большого количества пептидов на твердых подложках, где пептиды соответствуют участкам молекулы белка, и подвергая пептиды взаимодействию с антителами, оставляя пептиды прикрепленными к подложкам. Указанные методики известны в данной области и описаны, например, в US № 4708871; у Geysen и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8, 1984, сс. 3998-4002; Geysen и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 1985, сс. 78-182; Geysen и др., Mol. Immunol. 23, 1986, сс. 709-715. Кроме того, конформационные эпитопы легко идентифицировать путем определения пространственной конформации аминокислот, например, таким методом, как обмен водород/дейтерий, рентгеновская хроматография и двумерный ядерный магнитный резонанс (см., например, Epitope Mapping Protocols, выше). Антигенные области белков можно идентифицировать также с использованием стандартных кривых антигенности и средней гидрофобности остатков, для расчета которых можно применять, например, пакет программ Omiga, версия 1.0 фирмы Oxford Molecular Group. В этой компьютерной программе использован метод Хоппа/Вудса (Норр и др., Proc. Natl. Acad. Sci USA 78, 1981, сс. 3824-3828) для определения профилей антигенности и метод Кайта-Дулиттла (Kyte и др., J.MoI. Biol. 157, 1982, сс. 105-132) для определения профилей гидрофобности.
Понятие паратоп в контексте настоящего описания относится к общей структуре связывающей области, которая определяет связывание с эпитопом. Эта структура влияет на то, связывается ли или не связывается, и каким образом связывающая область может связываться с эпитопом. Паратоп может относиться к антигенному центру антитела, который ответствен за связывание антитела или его фрагмента с антигенной детерминантной. Паратоп относится также к идиотопу антитела и к области гипервариабельного участка (CDR), которая связывается с эпитопом. Паратоп представляет собой область антитела, которая связывается с конформационным эпитопом, содержащим (I) аминокислотные остатки HER3 265277 и 315 (из домена 2) и (II) аминокислотные остатки HER3 571, 582-584, 596-597, 600-602, 609-615 (из домена 4), которые представлены в SEQ ID NO: 1, или их поднабор. Паратоп представляет собой область антитела, которая содержит последовательности CDR. Паратоп может содержать последовательности, представленные в табл. 1. Паратоп может содержать по меньшей мере один аминокислотный остаток, который связывается со следующими остатками HER3: Asn266, Lys267, Leu268, Thr269, Gln271, Glu273, Pro274, Asn275, Pro276, His277, Asn315, Asp571, Pro583, His584, Ala596, Lys597. Паратоп может также содержать по меньшей мере один аминокислотный остаток, который связывается со следующими остатками HER3: Tyr265, Lys267, Leu268, Phe270, Gly582, Pro583, Lys597, Ile600, Lys602, Glu609, Arg611, Pro612, Cys613, His614, Glu615. Как должно быть очевидно специалисту в данной области паратоп любо- 9 036314 го антитела или его вариант можно определять методом, изложенным в настоящем описании.
Понятие моноклональное антитело или композиция моноклонального антитела в контексте настоящего описания относится к полипептидам, включая антитела, фрагменты антител, биспецифические антитела и т.д., которые имеют практически идентичную аминокислотную последовательность или которые выведены из одного и того же генетического источника. Это понятие включает также препараты молекул антител одинакового молекулярного состава. Композиция моноклональных антител обладает одинаковой специфичностью связывания и аффинностью в отношении конкретного эпитопа.
Понятие человеческое антитело в контексте настоящего описания относится к антителам, несущим вариабельные области, в которых как каркасные, так и CDR-участки выведены из последовательностей, имеющих человеческое происхождение. Кроме того, если антитело содержит константную область, то константная область также выведена из таких человеческих последовательностей, например последовательностей человеческой зародышевой линии или мутантных версий последовательностей человеческой зародышевой линии, или антитела, содержащего консенсусные каркасные последовательности, выведенные на основе анализа человеческих каркасных последовательностей, который описан у Knappik и др., J Mol Biol 296, 2000, сс. 57-86. Структуры и локализацию вариабельных доменов иммуноглобулина, например CDR, можно определять с помощью хорошо известных систем нумерации, например системы нумерации Кэбота, системы нумерации Хотиа или комбинации систем Кэбота и Хотиа (см., например, Sequences of Proteins of Immunological Interest, изд-во U.S. Department of Health and Human Services, под ред. Kabat и др., 1991; Lazikani и др., J. Mol. Bio. 273, 1997, сс. 927-948); Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., NIH Publication № 91-3242 U.S. Department of Health and Human Services, 1991; Chothia и др., J. Mol. Biol. 196, 1987, сс. 901-917; Chothia и др., Nature 342, 1989, сс. 877-883 и Al-Lazikani и др., J. Mol. Biol. 273, 1997, сс. 927-948).
Человеческие антитела могут включать также аминокислотные остатки, которые не кодируются человеческими последовательностями (например, в результате мутаций, интродуцированных путем неспецифического или сайтнаправленного мутагенеза in vitro, или соматической мутации in vivo, или консервативной замены, осуществленной с целью повышения стабильности или облегчения процесса получения).
Понятие человеческое моноклональное антитело относится к антителам, обладающим одинаковой специфичностью связывания, которые имеют вариабельные области, в которых как каркасные, так и CDR-участки выведены из человеческих последовательностей. Человеческие моноклональные антитела получают с помощью гибридомы, которая включает B-клетку, полученную из трансгенного животного кроме человека, например трансгенной мыши, в геноме которой содержится трансген человеческой тяжелой цепи и трансген человеческой легкой цепи, слитую с иммортализованной клеткой.
Понятие рекомбинантное человеческое антитело в контексте настоящего описания относится ко всем человеческим антителам, которые получают, экспрессируют, создают или выделяют с помощью методов рекомбинации, например к антителам, выделенным из животного (например, мыши), которое является трансгенным или трансхромосомным благодаря интродукции генов человеческого иммуноглобулина, или которые получены из гибридом, к антителам, выделенным из клетки-хозяина, трансформированной с целью экспрессии человеческого антитела, например, с использованием трансфектомы, к антителам, выделенным из рекомбинантной комбинатарной библиотеки человеческих антител, и к антителам, полученным, экспрессированным, созданным или выделенным любыми другими путями, которые включают сплайсинг всего гена человеческого иммуноглобулина или его части посредством лигирования с другими последовательностями ДНК. Указанные рекомбинантные человеческие антитела несут вариабельные области, в которых каркасные и CDR-участки выведены из последовательностей иммуноглобулина человеческой зародышевой линии. Указанные рекомбинантные человеческие антитела можно подвергать мутагенезу in vitro (или, когда для получения человеческих последовательностей Ig используют трансгенных животных, соматическому мутагенезу in vivo), и в результате аминокислотные последовательности VH- и VL-областей рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые, хотя и выведены и являются родственными последовательностям VH и VL человеческой зародышевой линии, могут не встречаться в естественных условиях в популяции антител человеческой зародышевой линии in vivo.
Специфическое связывание между двумя субстанциями означает связывание, характеризующееся значением константы равновесия (KA) (kon/kof), составляющей по меньшей мере 102M-1, по меньшей мере 5х102М-1, по меньшей мере 103M-1, по меньшей мере 5x103M-1, по меньшей мере 104M-1, по меньшей мере 5x104M-1, по меньшей мере 105M-1, по меньшей мере 5x105M-1, по меньшей мере 106M-1, по меньшей мере 5x106M-1, по меньшей мере 107M-1, по меньшей мере 5x107M-1, по меньшей мере 108M-1, по меньшей мере 5x108M-1, по меньшей мере 109M-1, по меньшей мере 5x109M-1, по меньшей мере 1010M-1, по меньшей мере 5x1010M-1, по меньшей мере 1011M-1, по меньшей мере 5x1011M-1, по меньшей мере 1012M-1, по меньшей мере 5x1012M-1, по меньшей мере 1013M-1, по меньшей мере 5x1013M-1, по меньшей мере 1014M-1, по меньшей мере 5x1014M-1, по меньшей мере 1015M-1 или по меньшей мере 5x1015M-1.
Понятие специфически (или избирательно) связывается с антителом (например с HER3
- 10 036314 связывающим антителом) относится к реакции связывания, которая позволяет определять присутствие родственного антигена (например, человеческого HER3) в гетерогенной популяции белков и других биологических субстанций. Помимо указанной выше константы равновесия (KA) связывание антитела, предлагаемого в изобретении, с HER3, как правило, характеризуется также значением константы скорости реакции диссоциации (KD) (koff/kon), составляющей менее чем 5x10-2M, менее чем 10-2M, менее чем 5x103M, менее чем 10-3M, менее чем 5x10-4M, менее чем 10-4M, менее чем 5x10-5M, менее чем 10-5M, менее чем 5x10-6M, менее чем 10-6M, менее чем 5x10-7M, менее чем 10-7M, менее чем 5x10-8M, менее чем 10-8M, менее чем 5x10-9M, менее чем 10-9M, менее чем 5x10-10M, менее чем 10-10M, менее чем 5x10-11M, менее чем 10-11M, менее чем 5x10-12M, менее чем 10-12M, менее чем 5x10-13M, менее чем 10-13M, менее чем 5x10-14M, менее чем 10-14MM, менее чем 5x10-15M или менее чем 10-15M или менее, и антитело связывается с HER3 с аффинностью, по меньшей мере в 2 раза более высокой, чем аффинность связывания с неспецифическим антигеном (например, с человеческим сывороточным альбумином (ЧСА)).
Для антитела или его фрагмента характерно значение константы диссоциации (Kd), составляющее менее чем 3000, менее чем 2500, менее чем 2000, менее чем 1500, менее чем 1000, менее чем 750, менее чем 500, менее чем 250, менее чем 200, менее чем 150, менее чем 100, менее чем 75, менее чем 10, менее чем 1пМ при оценке с помощью метода, представленного в настоящем описании, или известного специалисту в данной области метода (например, BIAcore-анализа, ELISA, FACS, SET) (фирма Biacore International AB, Уппсала, Швеция). Понятие Kassoc или Ka в контексте настоящего описания относится к скорости ассоциации взаимодействия конкретных антитела-антигена, а понятие Kdis или Kd в контексте настоящего описания относится к скорости диссоциации взаимодействия конкретных антителаантигена. В контексте настоящего описания подразумевается, что понятие KD относится к константе диссоциации, которую получают из соотношения Kd к Ka (т.е. Kd/Ka) и выражают в виде молярной концентрации (M). Значения KD для антител можно определять с помощью методов, хорошо известных в данной области. Метод определения значения KD антитела представляет собой метод, основанный на резонансе поверхностного плазмона, или метод, основанный на применении биосенсорной системы, такой как система Biacore®.
В контексте настоящего описания понятие аффинность относится к силе взаимодействия между антителом и антигеном в одном из антигенсвязывающих центров антитела. В каждом антигенсвязывающем центре вариабельная область плеча антитела взаимодействует посредством слабых нековалентных сил с антигеном в многочисленных сайтах; чем сильнее взаимодействия, тем больше аффинность.
В контексте настоящего описания понятие авидность относится к информативному критерию общей стабильности или силе комплекса антитело-антиген. Она контролируется тремя основными факторами: аффинностью связывания антитела с эпитопом; валентностью, как антигена, так и антитела; и структурной организацией взаимодействующих участков. Эти три фактора определяют в конечном итоге специфичность антитела, то есть вероятность того, что конкретное антитело будет связываться с точным антигенным эпитопом.
В контексте настоящего описания понятие валентность относится к количеству потенциальных связывающих мишень сайтов в полипептиде. Каждый связывающий мишень сайт специфически связывается с одной молекулой-мишенью или специфическим сайтом (т.е. эпитопом) на молекуле-мишени. Когда полипептид содержит более одного связывающего мишень сайта, то каждый связывающий мишень сайт может специфически связываться с одной и той же молекулой или различными молекулами (например, может связываться с различными молекулами, например, с различными антигенами или различными эпитопами на одной и той же молекуле).
В контексте настоящего описания понятие антагонистическое антитело относится к антителу, которое связывается с HER3 и нейтрализует биологическую активность HER3, связанную с передачей сигнала, например уменьшает, снижает и/или ингибирует индуцируемую HER3 сигнальную активность, например, по данным анализа фосфо-HER3 или фосфо-Akt. Примеры анализов описаны более подробно ниже в разделе Примеры. Таким образом, подразумевается, что понятие ингибирование антителом одного или нескольких указанных функциональных свойств HER3 (например, биохимической, иммунохимической, клеточной, физиологической или другого вида биологической активности или т.п.), которое определяют на основе методологий, известных в данной области и представленных в настоящем описании, относится к статистически значимому снижению конкретной активности относительно активности, обнаруженной в отсутствии антитела (или, например, в присутствии контрольного антитела неродственной специфичности). Действие антитела, которое ингибирует активность HER3, заключается в статистически значимом снижении оцениваемого параметра по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 50%, 80% или 90%, антитело может ингибировать более чем на 95%, 98% или 99% функциональную активность HER3, оцениваемую по снижению уровня фосфорилирования клеточного HER3.
Понятие выделенное антитело в контексте настоящего описания относится к антителу, которое практически свободно от других антител с другой антигенной специфичностью (например, выделенное антитело, которое специфически связывается с HER3, практически свободно от антител, которые специфически связываются с антигенами, отличными от HER3). Однако выделенное антитело, которое специ- 11 036314 фически связывается с HER3, может давать перекрестную реакцию с другими антигенами. Кроме того, выделенное антитело может быть практически свободно от другого клеточного материала и/или химических веществ.
Понятие консервативно модифицированный вариант относится как к аминокислотным, так и к нуклеотидным последовательностям. Касательно конкретных нуклеотидных последовательностей понятие консервативно модифицированные варианты относится к таким нуклеиновым кислотам, которые кодируют идентичные или практически идентичные аминокислотные последовательности, или в случае, когда нуклеиновая кислота не кодирует аминокислотную последовательность, к практически идентичным последовательностям. Из-за вырожденности генетического кода любой конкретный белок кодируется большим количеством функционально идентичных нуклеиновых кислот. Например, кодоны GCA, GCC, GCG и GCU все кодируют аминокислоту аланин. Таким образом, в каждом положении, в котором аланин кодируется кодоном, кодон можно заменять на любые соответствующие известные кодоны без изменения кодируемого полипептида. Такие варианты нуклеиновой кислоты являются молчащими вариантами, которые представляют собой один из видов консервативно модифицированных вариантов. В контексте настоящего описания подразумевается, что каждая нуклеотидная последовательность, которая кодирует полипептид, включает также все возможные молчащие варианты нуклеиновой кислоты. Специалисту в данной области должно быть очевидно, что каждый кодон нуклеиновой кислоты (за исключением AUG, который, как правило, является единственным кодоном метионина, и TGG, который, как правило, является единственным кодоном триптофана) можно модифицировать с получением функционально идентичной молекулы. Таким образом, подразумевается, что каждая описанная последовательность включает все молчащие варианты нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид.
Касательно полипептидных последовательностей консервативно модифицированные варианты включают индивидуальные замены, делеции или добавления в полипептидную последовательность, которые приводят к замене аминокислоты на химически сходную аминокислоту. Перечень консервативных замен, обеспечивающих получение функционально сходных аминокислот, хорошо известен в данной области. Такие консервативно модифицированные варианты являются дополнительными и не исключают полиморфные варианты, межвидовые гомологи и аллели, предлагаемые в изобретении. Каждая из указанных ниже 8 групп содержит аминокислоты, которые являются консервативными заменами друг друга: 1) аланин (A), глицин (G); 2) аспарагиновая кислота (D), глутаминовая кислота (E); 3) аспарагин (N), глутамин (Q); 4) аргинин (R), лизин (K); 5) изолейцин (I), лейцин (L), метионин (M), валин (V); 6) фенилаланин (F), тирозин (Y), триптофан (W); 7) серин (S), треонин (T); и 8) цистеин (C), метионин (M) (см., например, Creighton, Proteins (1984)). Понятие консервативные модификации последовательностей применяют для обозначения аминокислотных модификаций, которые не существенно влияют или изменяют характеристики связывания антитела, содержащего аминокислотную последовательность.
Понятия перекрестно конкурирует или перекрестная конкуренция в контексте настоящего описания используют взаимозаменяемо для обозначения способности антитела или другого связывающего агента оказывать интерферирующее воздействие на связывание других антител или связывающих агентов с HER3 при оценке с помощью стандартного анализа конкурентного связывания.
Способность или степень, с которой антитело или другой связывающий агент может оказывать интерферирующее воздействие на связывание другого антитела или связывающей молекулы с HER3, и, следовательно, могут ли они рассматриваться как перекрестно конкурирующие, можно определять с помощью стандартных анализов конкурентного связывания. В одном из приемлемых анализов применяют Biacore-технологию (например, с использованием устройства BIAcore 3000 (фирма Biacore, Уппсала, Швеция)), с помощью которой можно определять степень взаимодействий с использованием метода на основе резонанса поверхностного плазмона. Другим анализом, который можно применять для оценки перекрестной конкуренции, является подход на основе ELISA.
В контексте настоящего описания понятие оптимизированная означает, что нуклеотидная последовательность изменена с позиций кодирования аминокислотной последовательности с помощью кодонов, предпочтительных для продуктивной клетки или организма, как правило, эукариотической клетки, например клетки Pichia, клетки Trichoderma, клетки яичника китайского хомячка (CHO) или клетки человека. Оптимизированную нуклеотидную последовательность создают так, чтобы она полностью или максимально возможно сохраняла способность кодировать аминокислотную последовательность, которая кодируется первоначальной исходной нуклеотидной последовательностью, которую называют также родительской последовательностью.
Стандартные анализы, применяемые для оценки способности антител связываться с HER3 различных видов, известны в данной области и они включают, например, ELISA, вестерн-блотинг и РИА. Пригодные анализы описаны подробно в разделе Примеры. Кинетические характеристики связывания (например, аффинность связывания) антител, можно оценивать также с помощью стандартных анализов, известных в данной области, таких как Biacore-анализ, или FACS-анализ для оценки аффинности (анализ Скэтчарда). Анализы оценки воздействия антител на функциональные свойства HER3 (например, анализы связывания рецептора, модуляция пути Her) дополнительно более подробно описаны в разделе Примеры.
- 12 036314
Понятия идентичность в процентах или процент идентичности в отношении двух или большего количества нуклеотидных или полипептидных последовательностей относится к двум или большему количеству последовательностей или подпоследовательностей, которые являются одинаковыми. Две последовательности являются практически идентичными, если две последовательности имеют определенный процент одинаковых аминокислотных остатков или нуклеотидов (т.е. идентичность на уровне 60%, необязательно идентичность на уровне 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 99% в определенной области или, если она не указана конкретно, в полной последовательности) при сопоставлении и выравнивании с целью выявления максимального соответствия в окне сравнения или в предназначенной для этого области, что устанавливают с использованием одного из перечисленных ниже алгоритмов сравнения или путем сравнения вручную и визуального анализа. Необязательно идентичность имеет место в области длиной примерно 50 нуклеотидов (или 10 аминокислот) или более предпочтительно в области длиной по меньшей мере от 100 до 500 или 1000 или более нуклеотидов (или 20, 50, 200 или более аминокислот).
При сравнении последовательностей, как правило, одна последовательность представляет собой последовательность, с которой проводят сравнение (референс-последовательность) тестируемых последовательностей. При использовании алгоритма сравнения последовательностей данные о тестируемой последовательности и референс-последовательности вводят в компьютер, при необходимости задают координаты подпоследовательности и параметры алгоритма, используемого в программе сравнения последовательностей. Можно использовать параметры программы, задаваемые по умолчанию, или можно создавать альтернативные параметры. После этого с помощью алгоритма сравнения последовательностей рассчитывают с использованием заданных параметров программы процент идентичности для тестируемых последовательностей и референс-последовательности.
В контексте настоящего описания понятие окно сравнения относится к фрагменту, содержащему любое количество следующих непрерывно друг за другом положений, выбранных из группы, содержащей от 20 до 600, предпочтительно от примерно 50 до примерно 200, более предпочтительно от примерно 100 до примерно 150 положений, в которых можно сравнивать последовательность с референспоследовательностью, имеющей такое же количество непрерывных положений, после оптимального выравнивания двух последовательностей. Методы сравнительного анализа первичной структуры последовательностей, пригодные для сравнения, хорошо известны в данной области. Оптимальный сравнительный анализ последовательностей можно осуществлять, например, с использованием алгоритма на основе метода локальной гомологии, разработанного Smith и Waterman, Adv. Appl. Math. 2, 1970, с. 482, алгоритма сравнительного анализа гомологии, разработанного Needleman и Wunsch., J. Mol. Biol. 48, 1970, с. 443, метода поиска сходства, разработанного Pearson и Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85, 1988, с. 2444, с использованием компьютерных реализаций этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA, входящих в пакет программ фирмы Wisconsin Genetics, фирма Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Мэдисон, Висконсин, США) или путем сравнения вручную и визуального анализа (см., например, Brent и др., Current Protocols in Molecular Biology, 2003).
Двумя примерами алгоритмов, которые можно применять для определения процента идентичности последовательностей и сходства последовательностей, могут служить алгоритмы BLAST и BLAST 2.0, описанные у Altschul и др., Nuc. Acid Res. 25, 1977, сс. 3389-3402 и у Altschul и др., J. Mol. Biol. 215, 1990, сс. 403-410, соответственно. Программное обеспечение для осуществления анализов с помощью BLAST может быть предоставлено Национальным центром биотехнологической информации (National Center for Biotechnology Information). Согласно этому алгоритму сначала осуществляют выявление пар последовательностей с высокими баллами (HSP) путем идентификации коротких слов длины W в рассматриваемой последовательности, которые или совпадают, или удовлетворяют определенной положительной пороговой оценке (баллу) T при сравнении со словом такой же длины в последовательности из базы данных. T называется пороговой оценкой (баллом) близкого слова (Altschul и др., выше). Эти исходные выборки близкого слова используются в качестве затравки для инициации поиска, предназначенного для нахождения включающих их более длинных HSP. Затем выборки слова удлиняются в обоих направлениях вдоль каждой последовательности до тех пор, пока происходит увеличение кумулятивного (накопительного) балла при сравнительном анализе. Кумулятивные баллы для нуклеотидных последовательностей вычисляют с использованием параметров M (призовой балл за пару совпадающих остатков; всегда >0) и N (штрафной балл за несовпадающие остатки; всегда <0). Для аминокислотных последовательностей для вычисления кумулятивного балла используют матрицу баллов. Удлинение выборки слова в каждом направлении прекращается в том случае, если кумулятивный балл при сравнительном анализе снижается на величину X от своего максимального достигнутого значения; если кумулятивный балл снижается до нуля или ниже из-за накопления одного или нескольких отрицательных баллов при сравнительном анализе остатков; или если достигается конец какой-либо последовательности. Параметры W, T и X алгоритма BLAST определяют чувствительность и скорость сравнительного анализа. В программе BLASTN (для нуклеотидных последовательностей) в качестве задаваемых по умолчанию параметров используются длина слова (W), равная 11, ожидание (E), равное 10, M=5, N=-4, при этом проводится сравнение обеих цепочек. Для аминокислотных последовательностей в программе BLASTP используются в качестве задаваемых по умолчанию параметров длина слова (W), равная 3,
- 13 036314 ожидание (E), равное 10, и используется матрица баллов BLOSUM62 (см. Henikoff и Henikoff, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 89, 1989, с. 10915) параметр выравнивания (B), равный 50, ожидание (E), равное 10, M=5,
N= -4, при этом проводится сравнение обеих цепочек.
С помощью алгоритма BLAST проводят также статистический анализ сходства двух последовательностей (см., например, Karlin и Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1993, сс. 5873-5787). Одним из критериев степени сходства, который позволяет получать алгоритм BLAST, является наименьшая суммарная вероятность (P(N)), которая дает оценку вероятности, с которой может произойти случайным образом совпадение между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями. Например, считается, что тестируемая нуклеотидная последовательность является сходной с референспоследовательностью, если наименьшая суммарная вероятность при сравнении тестируемой нуклеотидной последовательности с нуклеотидной референс-последовательностью меньше приблизительно 0,2, более предпочтительно меньше приблизительно 0,01 и наиболее предпочтительно меньше приблизительно 0,001.
Процент идентичности двух аминокислотных последовательностей можно определять также с помощью алгоритма, разработанного E. Meyers и W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4, 1988, сс. 11-17), который включен в программу ALIGN (версия 2.0), с использованием таблицы взвешенных остатков PAM120, штрафа за длину бреши 12 и штрафа за брешь 4. Кроме того, процент идентичности двух аминокислотных последовательностей можно определять с помощью алгоритма Needleman и Wunsch (J. Mol, Biol. 48, 1970, сс. 444-453), который включен в программу GAP, входящую в пакет программ GCG (которая доступна на сайте http://www.gcg.com), с использованием матрицы Blossom 62 или матрицы PAM250 и веса бреши 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и веса длины 1, 2, 3, 4, 5 или 6.
Кроме определения указанного выше процента идентичности последовательностей другим показателем того, что две нуклеотидные последовательности или два полипептида являются практически идентичными, является тот факт, что полипептид, кодируемый первой нуклеиновой кислотой, обладает иммунологической перекрестной реактивностью с антителами, образовавшимися против второго полипептида, кодируемого второй нуклеиновой кислотой, как будет описано ниже. Так, полипептид, как правило, является практически идентичным второму полипептиду, например, если два пептида отличаются только консервативными заменами. Другим показателем того, что две нуклеотидные последовательности являются практически идентичными, является тот факт, что две молекулы или их комплементы гибридизуются друг с другом в строгих условиях, что будет описано ниже. И еще одним показателем того, что две нуклеотидные последовательности являются практически идентичными, является тот факт, что для амплификации последовательностей можно использовать одни и те же праймеры.
Понятие нуклеиновая кислота в контексте настоящего описания используют взаимозаменяемо с понятием полинуклеотид, и оно относится к дезоксирибонуклеотидам или рибонуклеотидам и их полимерам либо в их одноцепочечной, либо в двухцепочечной форме. Под это понятие подпадают нуклеиновые кислоты, которые содержат известные нуклеотидные аналоги или модифицированные каркасные остатки или связи, которые являются синтетическими, встречающимися в естественных условиях и не встречающимися в естественных условиях, которые обладают такой же способностью к связыванию, что и нуклеиновая кислота, с которой проводится сравнение (нуклеиновая референс-кислота), и метаболизируются аналогично референс-нуклеотидам. Примерами таких аналогов являются (но, не ограничиваясь только ими) фосфоротиоаты, фосфороамидаты, метилфосфонаты, хиральные метилфосфонаты, 2-Oметилрибонуклеотиды, пептидные нуклеиновые кислоты (ПНК).
Если не указано иное, то подразумевается, что конкретная нуклеотидная последовательность включает также ее консервативно модифицированные варианты (например, замены кодонов в рамках вырожденности генетического кода) и комплементарные последовательности, а также специально указанную последовательность. Так, как это будет описано ниже, замены вырожденных кодонов можно осуществлять, создавая последовательности, в которых третье положение одного или нескольких (или всех) кодонов заменено смешанным основанием и/или дезоксиинозиновыми остатками (Batzer и др., Nucleic Acid Res. 19, 1991, с. 5081; Ohtsuka и др., J. Biol. Chem. 260, 1985, сс. 2605-2608; и Cassol и др., 1992; Rossolini и др., Mol. Cell. Probes 8, 1994, сс. 91-98).
Понятие функционально связанный относится к функциональной взаимосвязи между двумя или большим количеством сегментов полинуклеотида (например, ДНК). Как правило, оно относится к функциональной взаимосвязи транскрипциональной регуляторной последовательности с транскрибируемой последовательностью. Например, промоторная или энхансерная последовательность функционально связана с кодирующей последовательностью, если она стимулирует или модулирует транскрипцию кодирующей последовательности в соответствующей клетке-хозяине или другой системе экспрессии. Как правило, промоторные транскрипциональные регуляторные последовательности, которые функционально связаны с транскрибируемой последовательностью, являются физически смежными с транскрибируемой последовательностью, т.е. они обладают цис-активностью. Однако для некоторых транскрипциональных регуляторных последовательностей, таких как энхансеры, не является обязательным, чтобы они были физически смежными с кодирующими последовательностями, транскрипцию которых они усиливают, или были локализованы в непосредственной близости от них.
- 14 036314
Понятия полипептид и белок в контексте настоящего описания используют взаимозаменяемо для обозначения полимера, состоящего из аминокислотных остатков. Понятие применимо к аминокислотным полимерам, в которых один или несколько аминокислотных остатков представляют собой искусственный полученный химическим путем миметик соответствующей встречающейся в естественных условиях аминокислоты, а также к встречающимся в естественных условиях аминокислотным полимерам и не встречающимся в естественных условиях аминокислотным полимерам. Если специально не указано иное, то подразумевается, что конкретная полипептидная последовательность включает ее консервативно модифицированные варианты.
Понятие индивидуум относится к человеку и животным кроме человека. К животным кроме человека относятся все позвоночные животные, например млекопитающие и животные, не относящиеся к млекопитающим, в том числе приматы кроме человека, овцы, собаки, коровы, куры, амфибии и рептилии. Если специально не указано иное, в контексте настоящего описания понятие пациент и индивидуум применяют взаимозаменяемо.
Понятие противораковое средство означает любое средство, которое можно применять для лечения связанного с клеточной пролиферацией нарушения, такого как рак, в том числе цитотоксические средства, химиотерапевтические средства, лучевую терапию и средства для лучевой терапии, противораковые средства направленного действия и иммунотерапевтически средства.
Понятие опухоль относится к росту и пролиферации неопластических клеток, злокачественному или доброкачественному, и ко всем предраковым и раковым клеткам и тканям.
Понятие противоопухолевая активность означает снижение степени пролиферации, жизнеспособности или метастатической активности опухолевых клеток. Возможным путем демонстрации противоопухолевой активности является уменьшение скорости роста аномальных клеток, которое усиливается в процессе терапии, или стабильность или снижение размера опухоли. Указанную активность можно оценивать с помощью приемлемых для анализа in vitro или in vivo моделей опухолей, включая (но, не ограничиваясь только ими) модели на основе ксенотрансплантатов, модели на основе аллотрансплантатов, моделей на основе MMTV (вирус опухоли молочных желез мышей) и других моделей, которые применяют в данной области для изучения противоопухолевой активности.
Понятие злокачественное заболевание относится к недоброкачественной опухоли или раку. В контексте настоящего описания понятие рак включает злокачественное заболевание, отличающееся нерегулируемым или неконтролируемым ростом клеток. Примерами рака являются: карциномы, саркомы, лейкозы и лимфомы. Понятие рак относится к первичным злокачественным опухолям (например, к тем клеткам, которых не мигрировали в области организма пациента, отличные от области локализации исходной опухоли) и вторичным злокачественным опухолям (например, возникающим в результате метастазов, миграции опухолевых клеток во вторичные области, отличающиеся от области локализации исходной опухоли).
Различные объекты изобретения описаны более подробно в приведенных ниже разделах и подразделах.
Структура и механизм активации HER-рецепторов
Все четыре HER-рецептора имеют внеклеточный лигансвязывающий домен, один трансмембранный домен и цитоплазматический, содержащий тирозинкиназу домен. Внутриклеточный тирозинкиназный домен HER-рецепторов является высококонсервативным, хотя в киназном домене HER3 присутствуют замены имеющих критическое значение аминокислот и поэтому отсутствует киназная активность (Guy и др., PNAS 91, 1994, сс. 8132-8136). Индуцируемая лигандом димеризация HER-рецепторов приводит к активации киназы, фосфорилированию рецептора на остатках тирозина в C-концевой области, с последующим рекрутментом и активацией эффекторов внутриклеточной передачи сигналов (Yarden и Sliwkowski, Nature Rev 2, 2001, сс. 127-137; Jorissen и др., Exp Cell Res 284, 2003, сс. 31-53).
Изучение кристаллических структур внеклеточных доменов HER-рецепторов позволяет в некоторой степени пролить свет на процессы индуцируемой лигандом активации рецептора (Schlessinger, Cell 110, 2002, сс. 669-672). Внеклеточный домен каждого HER-рецептора состоит из четырех субдоменов: субдомен I и III совместно участвуют в образовании лигандсвязывающего сайта, а субдомен II (и возможно также субдомен IV) принимает участие в димеризации рецептора через непосредственные взаимодействия типа рецептор-рецептор. В структурах связанного с лигандом HER1 β-шпилька (обозначение петли димеризации) в субдомене II взаимодействует с петлей димеризации рецептора-партнера, опосредуя димеризацию рецептора (Garrett и др., Cell 110, 2002, сс. 763-773; Ogiso и др., Cell 110, 2002, сс. 775-787). В противоположность этому в структурах неактивных HER1, HER3 и HER4 петля димеризации участвует во внутримолекулярных взаимодействиях с субдоменом IV, что препятствует димеризации рецептора в отсутствии лиганда (Cho и Leahy, Science 297, 2002, сс. 1330-1333; Ferguson и др., Mol Cell 12, 2003, сс. 541-552; Bouyan и др., PNAS 102, 2005, сс.15024-15029). Структура HER2 является уникальной среди HER-рецепторов. В отсутствии лиганда HER2 имеет конформацию, напоминающую активированное лигандом состояние HER1 с выступающей петлей димеризации, которая доступна для взаимодействия с другими HER-рецепторами (Cho и др., Nature 421, 2003, сс. 756-760; Garrett и др., Mol Cell 11, 2003, сс. 495-505). Это может являться объяснением повышенной способности HER2 к гетеродимеризации.
- 15 036314
Хотя кристаллические структуры HER-рецептора представляют собой модель гомо- и гетеродимеризации HER-рецептора, остаются не полностью изученными причина превалирования гомо- и гетеродимеров некоторых HER по сравнению с другими (Franklin и др., Cancer Cell 5, 2004, сс. 317-328), а также конформационная роль каждого домена в димеризации и самоингибировании рецептора (Burgess и др., Mol Cell 12, 2003, сс. 541-552; Mattoon и др., PNAS 101, 2004, сс. 923-928). Как будет описано ниже, изучение кристаллической структуры HER3 в рентгеновских лучах позволяет получать более точные данные.
Структура HER3 и конформационные эпитопы
В настоящем изобретении описан конформационный эпитоп, с которым связываются антигенсвязывающие белки, например, антитела к HER3. Впервые определена трехмерная структура укороченной формы (остатки 20-640) внеклеточного домена HER3 в комплексе с антителом. Структуры комплексов HER3-Fab MOR09823 и HER3-MOR09825 выявлены с разрешением 3,2А и 3,4А соответственно, и они показаны на фиг. 5А. В настоящем описании впервые описаны также антитело или его фрагмент, которое/который связывается с HER3 в неактивном состоянии и стабилизирует рецептор в неактивном состоянии. Антитела также обеспечивают конкурентное связывание лиганда HER3, такого как нейрегулин, с HER3-рецептором.
Не вдаваясь в какую-либо теорию, можно предположить, что одной из возможных моделей механизма действия является то, что HER3 находится в неактивном (закрытом, скованном) или активном (открытом) состоянии. Связывание с лигандом индуцирует конформационное изменение, в результате чего HER3 находится в активном (открытом) состоянии, в котором он обладает способностью связываться с партнерами, участвующими в образовании гетеродимеров, что приводит к активации передачи сигналов в прямом направлении. Антитела, такие как MOR09823, связываются с HER3 в его неактивном (скованном) состоянии, но не блокируют сайт связывания лиганда. Антитела, такие как MOR09823, ингибируют HER3, препятствуя индуцированным лигандом структурным перегруппировкам, которые необходимы для перехода HER3 в активную конформацию, препятствуя тем самым трансдукции сигнала. Антитела или их фрагменты могут связываться с HER3 в неактивном (скованном) состоянии, но не блокируют сайт связывания лиганда. Антитела или их фрагменты могут ингибировать HER3 путем предупреждения индуцированных лигандом структурных перегруппировок, необходимых для перехода HER3 в активную конформацию, препятствуя тем самым трансдукции сигнала. Антитело или его фрагмент могут стабилизировать HER3-рецептор в неактивном состоянии или конформации (т.е. непосредственно поддерживать, закрывать, сковывать, удерживать, преимущественно связывать или обладать предрасположенностью к нему). Неактивный HER3-рецептор может обладать чувствительностью к предпочтительной интернализации или расщеплению, что приводит к снижению количества расположенных на клеточной поверхности HER3-рецепторов. Кристаллы HER3 можно получать путем осуществления экспрессии нуклеотидной последовательности, кодирующей HER3 или его вариант, в приемлемой клетке-хозяине и последующей кристаллизации очищенного(ых) белка(ов) в присутствии соответствующего Fab, мишенью которого является HER3. Предпочтительно полипептид HER3 содержит внеклеточный домен (аминокислоты 20-640 человеческого полипептида или его укороченную версию, которая предпочтительно содержит аминокислоты 20-640), но у него отсутствуют трансмембранный и внутриклеточные домены.
Полипептиды HER3 можно получать также в виде слитых белков, например, для экстракции и очистки. Примеры белков, которые являются партнерами по слиянию, включают глутатион^-трансферазу (GST), гистидин (HIS), гексагистидин (6HIS), GAL4 (ДНК-связывающие и/или активирующие транскрипцию домены) и бета-галактозидазу. Может оказаться целесообразным также включать сайт протеолитического расщепления между белком-партнером по слиянию и представляющей интерес белковой последовательностью, что позволяет удалять соответствующие последовательности из слитого белка.
После экспрессии белки можно очищать и/или концентрировать, например, с помощью аффинной хроматографии с иммобилизованным металлом, ионообменной хроматографии и/или гель-фильтрации.
Белок(и) можно кристаллизовать с помощью методов, представленных в настоящем описании. Как правило, в процессе кристаллизации каплю, содержащую раствор белка, смешивают с буфером для кристаллизации и дают уравновеситься в запечатанном контейнере. Для достижения равновесия можно применять известные методы, такие как метод висящей капли или сидящей капли. В этих методах каплю подвешивают над или сажают рядом с резервуаром, содержащим намного больший объем буфера для кристаллизации и достигают равновесного состояния в результате диффузии паров. В альтернативном варианте для достижения равновесного состояния можно применять другие методы, например, с использованием масла, осуществляя диффузию через полупроницаемую мембрану или через свободную поверхность раздела (см., например, Chayen и др., Nature Methods 5, 2008, сс. 147-153).
После получения кристаллов можно определять их структуру с помощью известных методов дифракции рентгеновских лучей. В многочисленных методиках можно применять химически модифицированные кристаллы, например модифицированные путем дериватизации тяжелым атомом до получения близких фаз. На практике кристалл замачивают в растворе, содержащем соли атомов тяжелых металлов или металлорганические соединения, например хлорид свинца, тиомалат золота, тимеросал или уранил
- 16 036314 ацетат, которые могут диффундировать через кристалл и связываться с поверхностью белка. Затем локализацию(и) связанного(ых) атома(ов) тяжелого металла можно определять с помощью анализа дифракции рентгеновских лучей на замоченном кристалле. На основе полученных картин дифракции монохроматического пучка рентгеновских лучей (центры рассеяния) на кристалле можно с помощью математических уравнений получать математические координаты. Данные о дифракции применяют для расчета карты электронной плотности повторяющейся единицы в структуре кристалла. Другой метод получения информации о фазах основан на применении техники, известной как молекулярная замена. В этом методе применяют алгоритмы поворота и переноса для поиска модели, выведенной из родственной структуры, что позволяет получить приблизительную ориентацию представляющего интерес белка (см., Rossmann, Acta Crystals A 46, 1990, сс. 73-82). Карты электронной плотности используют для определения положений индивидуальных атомов в элементарной ячейке кристалла (Blundel и др., Protein Crystallography, изд-во Academic Press, 1976).
В настоящем описании впервые представлена трехмерная структура HER3 и Fab-фрагмента антитела к HER3. Приблизительными границами доменов внеклеточного домена HER3 являются следующие: домен 1: аминокислоты 20-207; домен 2: аминокислоты 208-328; домен 3: аминокислоты 329-498 и домен 4: аминокислоты 499-642. Трехмерная структура HER3 и антитела позволяет идентифицировать также сайты связывания-мишени для потенциальных модуляторов HER3. Предпочтительными сайтами связывания-мишенями являются сайты, участвующие в активации HER3. Сайт связывания-мишень локализован в домене 2 и домене 4 HER3. Таким образом, антитело или его фрагмент, которое/который связывается либо с доменом 2, либо с доменом 4 и предпочтительно с обоими доменами, может модулировать активацию HER3, либо препятствуя диссоциации доменов друг от друга, либо модифицируя относительные положения доменов. Таким образом, связывание антитела или его фрагмента с аминокислотными остатками в домене 2 или домене 4 может приводить к тому, что белок принимает конформацию, которая препятствует активации. В настоящем описании впервые также представлено антитело или его фрагмент, которое/который может одновременно связываться с лигандом HER3, таким как нейрегулин.
Антитело или его фрагмент может распознавать специфическое конформационное состояние HER3, в результате антитело или его фрагмент препятствует взаимодействию HER3 с корецептором (включая (но, не ограничиваясь только ими) HER1, HER2 и HER4). Они могут препятствовать взаимодействию HER3 с корецептором путем стабилизации HER3-рецептора в неактивном или закрытом состоянии Антитело или его фрагмент может стабилизировать HER3-рецептор путем связывания с аминокислотными остатками в домене 2 и домене 4 HER3. В указанном неактивном состоянии петля димеризации, локализованная в домене 2, не выставляется (экспонируется) и следовательно является недоступной для димеризации с другими корецепторами (включая (но, не ограничиваясь только ими) HER1, HER2 и HER4). Антитело или его фрагмент может связываться с человеческим белком HER3, который несет конформационный эпитоп, содержащий (I) аминокислотные остатки HER3 265-277 и 315 (из домена 2) и (II) аминокислотные остатки HER3 571, 582-584, 596-597, 600-602, 609-615 (из домена 4), которые представлены в SEQ ID NO: 1, или их поднабор. Антитело или его фрагмент может связываться с аминокислотами, которые входят в фрагмент, включающий аминокислотные остатки 265-277 и 315 (из домена 2), или перекрывающимися аминокислотными остатками и (II) аминокислотными остатками HER3 571, 582-584, 596-597, 600-602, 609-615 (из домена 4), которые представлены в SEQ ID NO: 1. Антитело или его фрагмент может связываться с аминокислотами, которые входят в фрагмент, включающий (и/или аминокислотными последовательностями, которые состоят из) аминокислоты 265-277 и 315 (из домена 2), и (II) аминокислотными остатками HER3 571, 582-584, 596-597, 600-602, 609-615 (из домена 4), которые представлены в SEQ ID NO: 1, или их под набором. Антитело или его фрагмент может связываться с конформационным эпитопом таким образом, что ограничивает подвижность домена 2 и домена 4, стабилизируя их в неактивной или закрытой конформации. Невозможность формирования активной конформации приводит к невозможности активировать трансдукцию сигнала. Антитело или его фрагмент может связываться с конформационным эпитопом таким образом, что закрывает петлю димеризации в домене 2, тем самым делая ее недоступной для взаимодействия типа рецептор-рецептор. Невозможность формирования гомо- или гетеродимеров приводит к невозможности активировать трансдукцию сигнала.
Антитело или его фрагмент также может связываться с конформационным эпитопом HERрецептора, такого как HER3-рецептор. Антитело или его фрагмент способен стабилизировать HER3рецептор в неактивном состоянии. Антитело или его фрагмент может связываться с HER3-рецептором в активном состоянии и превращает его в неактивное состояние. Таким образом, антитело или его фрагмент может связываться с HER3 в активном или неактивном состоянии и превращает активное состояние HER3 в неактивное состояние, что приводит к невозможности активировать путь трансдукции сигнала.
Антитело или его фрагмент может связываться с конформационным эпитопом HER-рецептора, такого как HER3-рецептор, при этом связывание антитела или его фрагмента стабилизирует HER3рецептор в неактивном состоянии, в результате чего HER3-рецептор не может димеризоваться с корецептором с образованием комплекса рецептор-рецептор. Невозможность образовывать комплекс рецептор-рецептор препятствует активации как зависимой от лиганда, так и независимой от лиганда трансдукции сигнала.
- 17 036314
Антитело или его фрагмент может связываться с конформационным эпитопом HER-рецептора, такого как HER3-рецептор, при этом связывание антитела или его фрагмента с HER3-рецептором позволяет происходить димеризации с корецептором с образованием неактивного комплекса рецептор-рецептор. Формирование неактивного комплекса рецептор-рецептор препятствует активации независимой от лиганда трансдукции сигнала. HER3 может находиться в неактивном состоянии, однако сверхэкспрессия HER2 позволяет образовываться комплексу HER2-HER3, при этом эти образовавшиеся комплексы являются неактивными и предупреждают активацию независимой от лиганда трансдукции сигнала.
Указанная структура также позволяет идентифицировать специфические коровые аминокислотные остатки HER3 в области контакта, в которой происходит взаимодействие антитела или его фрагмента (например, MOR09823) и HER3. Установлено, что эти остатки находятся в пределах 5А от VH-цепи белка MOR09823. Коровыми остатками являются следующие остатки: Asn266, Lys267, Leu268, Thr269, Gln271, Glu273, Pro274, Asn275, Pro276, His277, Asn315, Asp571, Pro583, His584, Ala596, Lys597.
Указанные структуры можно использовать также для идентификации пограничных аминокислотных остатков HER3 области контакта, в которой происходит взаимодействие с антителом или его фрагментом (например, MOR09823). Эти остатки могут представлять собой остатки HER3, расположенные на расстоянии 5-8А от VH-цепи белка MOR09823. Пограничными являются следующие остатки: Pro262, Val264, Tyr265, Phe270, Leu272, Thr278, Lys314, Gly316, Glu321, Asn566, Ser568, Gly569, Ser570, Thr572, Arg580, Asp581, Gly582, Gly595, Gly598, Ile600.
Указанная структура позволяет также идентифицировать специфические коровые аминокислотные остатки HER3 области контакта, в которой происходит взаимодействие антитела или его фрагмента (например, MOR09823) с HER3. Установлено, что эти остатки находятся в пределах 5А от VL-цепи белка MOR09823. Коровыми остатками являются следующие остатки: Tyr265, Lys267, Leu268, Phe270, Gly582, Pro583, Lys597, Ile600, Lys602, Glu609, Arg611, Pro612, Cys613, His614, Glu615.
Указанные структуры можно применять также для идентификации пограничных аминокислотных остатков HER3 области контакта, в которой происходит взаимодействие с антителом или его фрагментом (например, MOR09823). Эти остатки могут представлять собой остатки HER3, расположенные на расстоянии 5-8А от VL-цепи белка MOR09823. Пограничными являются следующие остатки: Asn266, Thr269, Asp571, Arg580, Asp581, His584, Pro590, Ala596, Pro599, Tyr601, Tyr603, Asp605, Gln607, Cys610, Asn616, Cys617, Cys621, Gly623, Pro624.
Как можно видеть из табл. 11 и 12 (MOR09823) и табл. 13 и 14 (MOR09825) соответственно, тяжелая цепь участвует главным образом в связывании антигенсвязывающего белка с аминокислотными остатками в домене 2 эпитопа и в меньшей степени участвует во взаимодействиях с аминокислотными остатками в домене 4, в то время как легкая цепь главным образом участвует в связывании с аминокислотными остатками в домене 4 эпиопа и в меньшей степени участвует во взаимодействиях с аминокислотными остатками в домене 2.
Специалист в данной области на основе настоящего описания может предсказать, какие остатки и области антигенсвязывающих белков можно варьировать без чрезмерного воздействия на способность антигенсвязывающего белка связываться с HER3.
В качестве коровых аминокислот области контакта, в которой происходит взаимодействие, рассматриваются все аминокислотные остатки, по меньшей мере один атом которых находится на расстоянии, меньшем или равным 5А, от белка-партнера (по связыванию) HER3. 5А выбрано в качестве предельного расстояния в коровой области, позволяющего атомам находиться в радиусе действия сил Вандер-Ваальса, а также возможной опосредуемой водой водородной связи. В качестве пограничных аминокислот области контакта, в которой происходит взаимодействие, рассматриваются все аминокислотные остатки, по меньшей мере один атом которых находится на расстоянии, меньшем или равным 8А, от белка-партнера (по связыванию) HER3, но не входящие в группу коровых участвующих во взаимодействии остатков.
Любой антигенсвязывающий белок, который связывается, перекрывает или препятствует взаимодействию MOR09823 с любым из вышеуказанных остатков, можно применять для связывания или нейтрализации HER3. Антитела или их фрагменты могут связываться или взаимодействовать по меньшей мере с одним из следующих остатков HER3 (SEQ ID NO: 1): Asn266, Lys267, Leu268, Thr269, Gln271, Glu273, Pro274, Asn275, Pro276, His277, Asn315, Asp571, Pro583, His584, Ala596, Lys597. Антитела или их фрагменты могут связываться или взаимодействовать по меньшей мере с одним из следующих остатков HER3 (SEQ ID NO: 1): Tyr265, Lys267, Leu268, Phe270, Gly582, Pro583, Lys597, Ile600, Lys602, Glu609, Arg611, Pro612, Cys613, His614, Glu615. Антитела или их фрагменты могут связываться или взаимодействовать по меньшей мере с одним из следующих остатков HER3 (SEQ ID NO: 1): Asn266, Lys267, Leu268, Thr269, Gln271, Glu273, Pro274, Asn275, Pro276, His277, Asn315, Asp571, Pro583, His584, Ala596, Lys597, Tyr265, Lys267, Leu268, Phe270, Gly582, Pro583, Lys597, Ile600, Lys602, Glu609, Arg611, Pro612, Cys613, His614, Glu615. Антитела или их фрагменты могут связываться или взаимодействовать по меньшей мере с комбинацией следующих остатков HER3 (SEQ ID NO: 1): Asn266, Lys267, Leu268, Thr269, Gln271, Glu273, Pro274, Asn275, Pro276, His277, Asn315, Asp571, Pro583, His584, Ala596, Lys597, Tyr265, Lys267, Leu268, Phe270, Gly582, Pro583, Lys597, Ile600, Lys602, Glu609, Arg611, Pro612, Cys613,
- 18 036314
His614, Glu615. Антитела или их фрагменты могут связываться или взаимодействовать со всеми следующими остатками HER3 (SEQ ID NO: 1): Asn266, Lys267, Leu268, Thr269, Gln271, Glu273, Pro274, Asn275, Pro276, His277, Asn315, Asp571, Pro583, His584, Ala596, Lys597, Tyr265, Lys267, Leu268, Phe270, Gly582, Pro583, Lys597, Ile600, Lys602, Glu609, Arg611, Pro612, Cys613, His614, Glu615. Антитела или их фрагменты могут находиться на расстоянии в пределах 5А от одного или нескольких вышеуказанных остатков. Антитела или их фрагменты могут находиться на расстоянии в пределах 5-8 А от одного или нескольких вышеуказанных остатков. Антитело или его фрагмент могут взаимодействовать, блокировать или находиться на расстоянии в пределах 8А от 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 вышеуказанных остатков.
Наличие сведений о 3D-структурах HER3 и комплекса HER3:MOR09823, например, является основой для более детального изучения других антител к HER3. На основе 3D-структуры HER3 можно картировать эпитопы для моноклональных антител и делать заключение об их механизме действия, поскольку некоторые из них ингибируют, некоторые из них стимулируют, а другие не оказывают воздействия на клеточный рост. Конформационный эпитоп для MOR09823 локализован в доменах 2 и 4 HER3. Наличие сведений о 3D-структурах этого рецептора должно облегчать определение точного механизма действия указанных обладающих ингибирующим действием агентов и создавать новые подходы для воздействия на функцию HER3-рецептора. Антитела, предлагаемые в изобретении, связываются с тем же конформационным эпитопом, что и MOR09823.
Наиболее приемлемым является конформационный эпитоп, с которым связываются любые антитела, перечисленные в табл. 1. Конформационный эпитоп HER3 можно применять для выделения антител или их фрагментов, которые связываются с HER3. Конформационный эпитоп HER3 можно применять для создания антител или их фрагментов, которые связываются с HER3. Конформационный эпитоп HER3 можно применять в качестве иммуногена для создания антител или их фрагментов, которые связываются с конформационным эпитопом HER3. Конформационный эпитоп HER3 можно вводить животному и затем получать из организма животного антитела, которые связываются с HER3.
Домен(ы)/область(и), содержащий(ие) остатки, которые находятся в контакте с антителом или захвачены антителом, можно идентифицировать путем осуществления мутации специфических остатков HER3 (например, в антигене дикого типа) и определения того, может ли антитело или его фрагмент связываться с мутантом или вариантом белка HER3, или оценивая изменения аффинности по сравнению с вариантом дикого типа. Путем создания ряда индивидуальных мутаций, таких как мутации, которые могут влиять на связывание между антителом и антигеном, можно идентифицировать остатки, которые принимают непосредственное участие в связывании или которые находятся в достаточной тесной близости к антителу, На основе сведений об этих аминокислотах можно выявлять домен(ы) или область(и) антигена (HER3), которые содержат остатки, имеющие контакт с антителом или перекрывающиеся антителом. Мутагенез на основе известных технологий, таких как сканированием аланином, может способствовать выявлению функционально приемлемых эпитопов. Можно применять также мутагенез, основанный на применении протокола сканирования аргинином/глутаминовой кислотой (см., например, Nanevicz и др., J. Biol. Chem. 270(37), 1995, сс. 21619-21625 и Zupnick и др., J. Biol. Chem. 281(29), 2006, сс. 20464-20473). Как правило, аминокислоту в полипептиде дикого типа заменяют (как правило, по отдельности) на аргинин и глутаминовую кислоту, поскольку эти аминокислоты являются заряженными и имеют большой объем и поэтому обладают способностью нарушать связывание между антигенсвязывающим белком и антигеном в области антигена, в которую интродуцирована мутация. Остатки аргинина, которые присутствуют в антигене дикого типа, заменяют на глутаминовую кислоту. Можно получать широкое разнообразие индивидуальных мутантов и анализировать обобщенные результаты связывания, определяя, какие остатки влияют на связывание. Можно создавать серии мутантных антигенов HER3, в которых каждый мутантный антиген несет одну мутацию. Можно оценивать связывание каждого мутантного антигена HER3 с различными антителами к HER3 или их фрагментами и сравнивать способность отобранного антитела или его фрагмента связываться с HER3 дикого типа (SEQ ID NO: 1).
В контексте настоящего описания подразумевается, что изменение (например, уменьшение или увеличение) связывания антитела или его фрагмента с мутантом или вариантом HER3 свидетельствует об изменении аффинности связывания (например, для измерения которой используют известные методы, такие как Biacore-анализ или основанный на применении гранул анализ, который описан ниже в разделе Примеры), значении EC50 и/или изменении (например, снижении) общей силы (способности к) связывания антигенсвязывающего белка (например, оцененной по снижению значения Bmax на графике зависимости связывания от концентрации антигенсвязывающего белка и концентрации антигена). Существенное изменение связывания свидетельствует о том, что подвергнутый мутации остаток участвует в связывания с антителом или его фрагментом.
Наличие снижения связывания означает, что аффинность связывания, EC50 и/или сила (способность) связывания между антителом или его фрагментом и мутантным антигеном HER3 снижена более чем на 10%, более чем на 20%, более чем на 40%, более чем на 50%, более чем на 55%, более чем на 60%, более чем на 65%, более чем на 70%, более чем на 75%, более чем на 80%, более чем на 85%, более чем на 90% или более чем на 95% относительно связывания антитела или его фрагмента с HER3 дикого типа (на- 19 036314 пример, SEQ ID NO: 1).
Связывание антитела или его фрагмента с мутантным белкоым HER3, который имеет одну ли несколько (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) мутаций, существенно снижается или возрастает по сравнению с белком HER3 дикого типа (например, SEQ ID NO: 1).
Касательно последовательности дикого типа, которая представлена в SEQ ID NO: 1, должно быть очевидно, что в аллельных или сплайсинговых вариантах HER3 аминокислоты могут различаться. Под объем изобретения подпадают также антитела или фрагменты, для которых обнаружена существенное изменение связывания (например, пониженное или повышенное связывание) с такими аллельными формами HER3.
Помимо общих структурных аспектов антител на основе структурных подходов можно оценивать более специфические взаимодействия между паратопом и эпитопом. Структура CDR-участков определяет паратоп, посредством которого антитело может связываться с эпитопом. Форму указанного паратопа можно определять различными путями. Можно использовать традиционные основанные на изучении структуры подходы, такие как ЯМР или рентгеновская кристаллография. С помощью таких подходов можно оценивать форму индивидуального паратопа или паратопа, связанного с эпитопом. В альтернативном варианте можно создавать молекулярные модели путем компьютерного моделирования (in silico). Структуру можно создавать посредством моделирования по гомологии с помощью поступающего в продажу пакета программ, таких как программа моделирования InsightII фирмы Accelrys (Сан-Диего, шт. Калифорния). В целом, метод состоит в следующем: можно применять последовательность антитела, подлежащего изучению, для поиска в базах данных белков с известными структурами, таких как банк данных белков (Protein Data Bank). После идентификации гомологичных белков с известными структурами эти гомологичные белки применяют в качестве матриц для моделирования. Каждую из возможных матриц можно выравнивать, осуществляя тем самым основанный на структуре сравнительный анализ последовательностей между матрицами. Затем последовательность антитела с неизвестной структурой можно выравнивать с этими матрицами для создания молекулярной модели антитела с неизвестной структурой. Как должно быть очевидно специалисту в данной области, существует много альтернативных методов создания таких структур in silico, можно применять любую из них. Например, можно применять процесс, аналогичный описанному у Hardman и др., в US № 5958708 (публикация включена в настоящее описание в качестве ссылки), в котором применяют программу QUANTA (фирма Polygen Corp., Уолтхэм, шт. Массачусетс) и программу CHARM (Brooks и др., J. Сотр. Chem. 4, 1983, с. 187).
Не только форма паратопа важна для решения вопроса о том, будет ли иметь место связывание, и насколько успешно будет связываться возможный паратоп с эпитопом, но также и само взаимодействие между эпитопом и паратопом является источником важной информации при разработке вариантов антител. Как должно быть очевидно специалисту в данной области, существуют различные пути изучения указанного взаимодействия. Одним из путей является создание структурных моделей, в том числе описанных выше, и последующее применение программы, такой как InsightII (фирма Accelrys, Сан-Диего, шт. Калифорния), которая имеет стыковочный модуль, который, среди прочего, позволяет осуществлять поиск методом Монте Карло в конформационном и ориентационном пространстве между паратопом и его эпитопом. В результате можно определять, где и как эпитоп взаимодействует с паратопом. Для оценки соответствующих взаимодействий можно применять только фрагмент или вариант эпитопа. Для моделирования взаимодействия между паратопом и эпитопом можно применять полный эпитоп.
Путем применения этих смоделированных структур можно предсказывать, какие остатки являются наиболее важным для взаимодействия между эпитопом и паратопом. Так, можно легко определять, какие остатки требуется изменять для изменения характеристик связывания антитела. Например, из стыковочных моделей может быть ясно, что боковые цепи определенных остатков в паратопе могут стерически препятствовать связыванию эпитопа, поэтому замена этих остатков на остатки с меньшими боковыми цепями может оказывать благоприятное действие. Это можно определять различными путями. Например, можно просто визуально оценивать две модели и определять взаимодействия на основе функциональных групп и их близости. В альтернативном варианте можно осуществлять повторные спаривания эпитопа и паратопа согласно описанному выше методу для получения более предпочтительных с точки зрения энергии взаимодействий. Можно также определять эти взаимодействия для широкого разнообразия вариантов антител для выявления альтернативных путей, посредством которых антитело может связываться с эпитопом. Можно также объединять различные модели для решения вопроса о том, как следует изменять структуру антител для получения антитела с конкретными требуемыми характеристиками.
Указанные выше модели можно тестировать с помощью различных методов. Например, можно определять энергию взаимодействия с помощью описанных выше программ для выявления вариантов для дополнительной оценки. Кроме того, оценивают кулоновские (электростатические) взаимодействия и взаимодействия Ван-дер-Ваальса для определения энергии взаимодействия эпитопа и вариантов паратопов. Кроме того, применяют сайтнаправленный мутагенез для решения вопроса о том, могут ли предсказанные изменения в структуре антитела фактически приводить к требуемым изменениям характеристик связывания. В альтернативном варианте изменения могут затрагивать эпитоп для подтверждения того, что модели являются корректными или для определения общих основ связывания, которые могут иметь
- 20 036314 место между паратопом и эпитопом.
Как должно быть очевидно специалисту в данной области, хотя эти модели должны представлять собой руководство, необходимое для создания антител и их вариантов все еще может являться необходимым осуществлять рутинное тестирование моделей in silico, вероятно, с помощью опытов in vitro. Кроме того, как должно быть очевидно специалисту в данной области, что любая модификация может оказывать также дополнительные побочные действия на активность антитела. Например, хотя некоторые изменения, которые как ожидается, должны приводить к усилению связывания, могут приводить к повышенному связыванию, это может также вызывать другие структурные изменения, которые могут снижать или изменять активность антитела. Решение вопроса о том, имеет ли это место в конкретном случае, является рутинным в данной области, и для этого можно применять различные пути. Например, активность можно оценивать с помощью метода ELISA. В альтернативном варианте образцы можно оценивать с помощью устройства, которое является детектором резонанса поверхностного плазмона.
Антитела к HER3
При создании изобретения неожиданно было установлено, что класс антител к HER3 блокирует как зависимые от лиганда, так и независимые от лиганда пути трансдукции сигнала HER3. Класс антител, которые связываются с конкретным конформационным эпитопом HER3, представлен в табл. 1. Эти антитела ингибируют как зависимую от лиганда, так и независимую от лиганда передачу сигнала HER3. Они также могут связываться с HER3 и не блокируют связывание лиганда HER с лигандсвязывающим сайтом (т.е. и лиганд, и антитело могут связываться с HER3 одновременно).
Антитела, которые специфически связываются с белком HER3 (например, с HER3 человека и/или обезьяны циномолгус), могут содержать VH-область, которая имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15, 33, 51, 69, 87, 105, 123, 141, 159, 177, 195, 213, 231, 249, 267, 285, 303, 321, 339, 357 и 375. Антитела, которые специфически связываются с белком HER3 (например, с HER3 человека и/или обезьяны циномолгус), могут содержать VL-область, которая имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14, 32, 50, 68, 86, 104, 122, 140, 158, 176, 194, 212, 230, 248, 266, 284, 302, 320, 338, 356 и 374. Антитела, которые специфически связываются с белком HER3 (например, с HER3 человека и/или обезьяны циномолгус), могут содержать CDR VH, который имеет аминокислотную последовательность любого из CDR VH, представленных ниже в табл. 1. В частности, антитела, которые специфически связываются с белком HER3 (например, с HER3 человека и/или обезьяны циномолгус), могут содержать (или в альтернативном варианте состоят из) один, два, три, четыре, пять или большее количество CDR VH, которые имеют аминокислотную последовательность любого из CDR VH, представленных ниже в табл. 1.
Другие антитела включают подвергнутые мутации аминокислоты, но их CDR-участки еще по меньшей мере на 60, 70, 80, 90, 95 или 98% идентичны CDR-участкам, которые имеют последовательности, представленные в табл. 1. Они включают мутантные аминокислотные последовательности, в которых не более 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот в CDR-участках были подвергнуты мутации по сравнению с CDR-участками, последовательности которых представлены в табл. 1, при этом все еще сохраняется их специфичность в отношении исходного эпитопа антитела.
Другие антитела включают подвергнутые мутации аминокислоты, но их каркасные участки еще по меньшей мере на 60, 70, 80, 90, 95 или 98% идентичны каркасным участкам, которые имеют последовательности, представленные в табл. 1. Они включают мутантные аминокислотные последовательности, в которых не более 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот в каркасных участках были подвергнуты мутации по сравнению с каркасными участками, последовательности которых представлены в табл. 1, при этом все еще сохраняется их специфичность в отношении исходного эпитопа антитела. В настоящем изобретении описаны также нуклеотидные последовательности, которые кодируют VH, VL, полноразмерную тяжелую цепь и полноразмерную легкую цепь антител, которые специфически связываются с белком HER3 (например, с HER3 человека и/или обезьяны циномолгус).
Антитела к HER3 связываются с конформационным эпитопом HER3, который содержит аминокислотные остатки из домена 2 и домена 4 HER3.
Таблица 1. Примеры антител к HER3, предлагаемых в настоящем изобретении
SEQ ID NO: Область Ат
MOR09823
SEQ ID NO: 2 (Кэбот) HCDRl SYAMS
SEQ ID NO: 3 (Кэбот) HCDR2 VTGAVGRTYYPDSVKG
SEQ ID NO: 4 (Кэбот) HCDR3 WGDEGFDI
SEQ ID NO: 5 (Кэбот) LCDR1 RASQGISNWLA
SEQ ID NO: 6 (Кэбот) LCDR2 GASSLQS
SEQ ID NO: 7 (Кэбот) LCDR3 QQYSSFPTT
- 21 036314
SEQ ID NO: 8 (Хотиа) HCDR1 GFTFSSY
SEQ ID NO: 9 (Хотиа) HCDR2 GAVGR
SEQ ID NO: 10 (Хотиа) HCDR3 WGDEGFDI
SEQ ID NO: 11 (Хотиа) LCDR1 SQGISNW
SEQ ID NO: 12 (Хотиа) LCDR2 GAS
SEQ ID NO: (Хотиа) 13 LCDR3 YSSFPT
SEQ ID NO: 14 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIYG ASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQYSSFPTTFGQ GTKVEIK
SEQ ID NO: 15 VH QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSV TGAVGRTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWGD EGFDIWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 16 ДНК VL GATATCCAGATGACCCAGAGCCCGTCTAGCCTGAGCGCGAGCGTGGGTGA TCGTGTGACCATTACCTGCAGAGCGAGCCAGGGTATTTCTAATTGGCTGG CTTGGTACCAGCAGAAACCAGGTAAAGCACCGAAACTATTAATTTATGGT GCTTCTTCTTTGCAAAGCGGGGTCCCGTCCCGTTTTAGCGGCTCTGGATC CGGCACTGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAACCTGAAGACTTTG CGGTTTATTATTGCCAGCAGTATTCTTCTTTTCCTACTACCTTTGGCCAG GGTACGAAAGTTGAAATTAAA
SEQ ID NO: 17 ДНК VH CAGGTGCAATTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAACCGGGCGGCAG CCTGCGTCTGAGCTGCGCGGCCTCCGGATTTACCTTTAGCAGCTATGCGA TGAGCTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTGAGCGTT ACTGGTGCTGTTGGTCGTACTTATTATCCTGATTCTGTTAAGGGTCGTTT TAC CAT T T CAC G T GATAAT T C GAAAAACAC С С T G TAT С T G CAAAT GAACA GCCTGCGTGCGGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTTGGGGTGAT GAGGGTTTTGATATTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA
SEQ ID NO: 18 Легкая каппацепь DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIYG ASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQYSSFPTTFGQ GTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKV flHKLQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 19 Тяжелая цепь IgGl QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSV TGAVGRTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWGD EGFDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFP EPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICN VNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
MOR09824
SEQ ID NO: 20 (Кэбот) HCDR1 SYAMS
SEQ ID NO: 21 (Кэбот) HCDR2 VISAWGHVKYYADSVKG
SEQ ID NO: 22 (Кэбот) HCDR3 WGDEGFDI
SEQ ID NO: 23 (Кэбот) LCDR1 RASQGISNWLA
SEQ ID NO: 24 (Кэбот) LCDR2 GASSLQS
SEQ ID NO: 25 (Кэбот) LCDR3 QQYSSFPTT
SEQ ID NO: 26 (Хотиа) HCDR1 GFTFSSY
SEQ ID NO: 27 (Хотиа) HCDR2 SAWGHV
SEQ ID NO: 28 (Хотиа) HCDR3 WGDEGFDI
SEQ ID NO: 29 (Хотиа) LCDR1 SQGISNW
SEQ ID NO: 30 (Хотиа) LCDR2 GAS
SEQ ID NO: 31 (Хотиа) LCDR3 YSSFPT
SEQ ID NO: 32 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIYG ASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQYSSFPTTFGQ GTKVEIK
- 22 036314
SEQ ID NO: 33 VH QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSV ISAWGHVKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWG DEGFDIWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 34 ДНК VL GATATCCAGATGACCCAGAGCCCGTCTAGCCTGAGCGCGAGCGTGGGTGA TCGTGTGACCATTACCTGCAGAGCGAGCCAGGGTATTTCTAATTGGCTGG CTTGGTACCAGCAGAAACCAGGTAAAGCACCGAAACTATTAATTTATGGT GCTTCTTCTTTGCAAAGCGGGGTCCCGTCCCGTTTTAGCGGCTCTGGATC CGGCACTGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAACCTGAAGACTTTG CGGTTTATTATTGCCAGCAGTATTCTTCTTTTCCTACTACCTTTGGCCAG GGTACGAAAGΤTGAAATTAAA
SEQ ID NO: 35 ДНК VH CAGGTGCAATTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAACCGGGCGGCAG CCTGCGTCTGAGCTGCGCGGCCTCCGGATTTACCTTTAGCAGCTATGCGA TGAGCTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTGAGCGTT ATTTCTGCTTGGGGTCATGTTAAGTATTATGCTGATTCTGTTAAGGGTCG TTTTACCATTTCACGTGATAATTCGAAAAACACCCTGTATCTGCAAATGA ACAGCCTGCGTGCGGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTTGGGGT GATGAGGGTTTTGATATTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTC A
SEQ ID NO: 36 Легкая каппацепь DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIYG ASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQYSSFPTTFGQ GTKVEIKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKV flHKLQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 37 Тяжелая цепь IgGl QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSV ISAWGHVKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWG DEGFDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYIC NVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYT LPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
MOR09825
SEQ ID NO: 38 (Кэбот) HCDR1 SYAMS
SEQ ID NO: 39 (Кэбот) HCDR2 AINSQGKSTYYADSVKG
SEQ ID NO: 40 (Кэбот) HCDR3 WGDEGFDI
SEQ ID NO: 41 (Кэбот) LCDR1 RASQGISNWLA
SEQ ID NO: 42 (Кэбот) LCDR2 GASSLQS
SEQ ID NO: 43 (Кэбот) LCDR3 QQYSSFPTT
SEQ ID NO: 44 (Хотиа) HCDR1 GFTFSSY
SEQ ID NO: 45 (Хотиа) HCDR2 NSQGKS
SEQ ID NO: 46 (Хотиа) HCDR3 WGDEGFDI
SEQ ID NO: 47 (Хотиа) LCDR1 SQGISNW
SEQ ID NO: 48 (Хотиа) LCDR2 GAS
SEQ ID NO: 49 (Хотиа) LCDR3 YSSFPT
SEQ ID NO: 50 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIYG ASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQYSSFPTTFGQ GTKVEIK
SEQ ID NO: 51 VH QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSA INSQGKSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWG DEGFDIWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 52 ДНК VL GATATCCAGATGACCCAGAGCCCGTCTAGCCTGAGCGCGAGCGTGGGTGA TCGTGTGACCATTACCTGCAGAGCGAGCCAGGGTATTTCTAATTGGCTGG CTTGGTACCAGCAGAAACCAGGTAAAGCACCGAAACTATTAATTTATGGT GCTTCTTCTTTGCAAAGCGGGGTCCCGTCCCGTTTTAGCGGCTCTGGATC CGGCACTGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAACCTGAAGACTTTG CGGTTTATTATTGCCAGCAGTATTCTTCTTTTCCTACTACCTTTGGCCAG GGTACGAAAGΤTGAAATTAAA
SEQ ID NO: 53 ДНК VH CAGGTGCAATTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAACCGGGCGGCAG CCTGCGTCTGAGCTGCGCGGCCTCCGGATTTACCTTTAGCAGCTATGCGA TGAGCTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTGAGCGCT ATTAATTCTCAGGGTAAGTCTACTTATTATGCTGATTCTGTTAAGGGTCG TTTTACCATTTCACGTGATAATTCGAAAAACACCCTGTATCTGCAAATGA ACAGCCTGCGTGCGGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTTGGGGT GATGAGGGTTTTGATATTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTC A
- 23 036314
SEQ ID NO: 54 Легкая каппацепь DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIYG ASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQYSSFPTTFGQ GTKVEIKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKV flHKLQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 55 Тяжелая цепь IgGl QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSA INSQGKSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWG DEGFDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYIC NVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYT LPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
MOR09974
SEQ ID NO: 56 (Кэбот) HCDR1 SYAMS
SEQ ID NO: 57 (Кэбот) HCDR2 V1NPSGNFTNYADSVKG
SEQ ID NO: 58 (Кэбот) HCDR3 WGDEGFDI
SEQ ID NO: 59 (Кэбот) LCDR1 RASQGISNWLA
SEQ ID NO: 60 (Кэбот) LCDR2 GASSLQS
SEQ ID NO: 61 (Кэбот) LCDR3 QQYSSFPTT
SEQ ID NO: 62 (Хотиа) HCDR1 GFTFSSY
SEQ ID NO: 63 (Хотиа) HCDR2 NPSGNF
SEQ ID NO: 64 (Хотиа) HCDR3 WGDEGFDI
SEQ ID NO: 65 (Хотиа) LCDR1 SQGISNW
SEQ ID NO: 66 (Хотиа) LCDR2 GAS
SEQ ID NO: 67 (Хотиа) LCDR3 YSSFPT
SEQ ID NO: 68 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIYG ASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQYSSFPTTFGQ GTKVEIK
SEQ ID NO: 69 VH QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSV INPSGNFTNYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWG DEGFDIWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 70 ДНК VL GATATCCAGATGACCCAGAGCCCGTCTAGCCTGAGCGCGAGCGTGGGTGA TCGTGTGACCATTACCTGCAGAGCGAGCCAGGGTATTTCTAATTGGCTGG CTTGGTACCAGCAGAAACCAGGTAAAGCACCGAAACTATTAATTTATGGT GCTTCTTCTTTGCAAAGCGGGGTCCCGTCCCGTTTTAGCGGCTCTGGATC CGGCACTGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAACCTGAAGACTTTG CGGTTTATTATTGCCAGCAGTATTCTTCTTTTCCTACTACCTTTGGCCAG GGTACGAAAGTTGAAATTAAA
SEQ ID NO: 71 ДНК VH CAGGTGCAATTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAACCGGGCGGCAG CCTGCGTCTGAGCTGCGCGGCCTCCGGATTTACCTTTAGCAGCTATGCGA TGAGCTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTGAGCGTT ATTAATCCTTCTGGTAATTTTACTAATTATGCTGATTCTGTTAAGGGTCG TTTTACCATTTCACGTGATAATTCGAAAAACACCCTGTATCTGCAAATGA ACAGCCTGCGTGCGGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTTGGGGT GATGAGGGTTTTGATATTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTC A
SEQ ID NO: 72 Легкая каппацепь DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIYG ASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQYSSFPTTFGQ GTKVEIKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKV flHKLQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 73 Тяжелая цепь IgGl QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSV INPSGNFTNYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWG DEGFDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYIC NVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYT LPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
MOR10452
SEQ ID NO: 74 (Кэбот) HCDR1 SYAMS
- 24 036314
SEQ ID NO: 75 (Кэбот) HCDR2 NTSPIGYTYYAGSVKG
SEQ ID NO: 76 (Кэбот) HCDR3 WGDEGFDI
SEQ ID NO: 77 (Кэбот) LCDR1 RASQGISNWLA
SEQ ID NO: 78 (Кэбот) LCDR2 GASSLQS
SEQ ID NO: 79 (Кэбот) LCDR3 QQYSSFPTT
SEQ ID NO: 80 (Хотиа) HCDR1 GFTFSSY
SEQ ID NO: 81 (Хотиа) HCDR2 SPIGY
SEQ ID NO: 82 (Хотиа) HCDR3 WGDEGFDI
SEQ ID NO: 83 (Хотиа) LCDR1 SQGISNW
SEQ ID NO: 84 (Хотиа) LCDR2 GAS
SEQ ID NO: 85 (Хотиа) LCDR3 YSSFPT
SEQ ID NO: 86 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIYG ASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQYSSFPTTFGQ GTKVEIK
SEQ ID NO: 87 VH QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSN TSPIGYTYYAGSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWGD EGFDIWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 88 ДНК VL GATATCCAGATGACCCAGAGCCCGTCTAGCCTGAGCGCGAGCGTGGGTGA TCGTGTGACCATTACCTGCAGAGCGAGCCAGGGTATTTCTAATTGGCTGG CTTGGTACCAGCAGAAACCAGGTAAAGCACCGAAACTATTAATTTATGGT GCTTCTTCTTTGCAAAGCGGGGTCCCGTCCCGTTTTAGCGGCTCTGGATC CGGCACTGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAACCTGAAGACTTTG CGGTTTATTATTGCCAGCAGTATTCTTCTTTTCCTACTACCTTTGGCCAG GGTACGAAAGTTGAAATTAAA
SEQ ID NO: 89 ДНК VH CAGGTGCAATTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAACCGGGCGGCAG CCTGCGTCTGAGCTGCGCGGCCTCCGGATTTACCTTTAGCAGCTATGCGA TGAGCTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTGAGCAAT ACTTCTCCTATTGGTTATACTTATTATGCTGGTTCTGTTAAGGGTCGTTT TACCATTTCACGTGATAATTCGAAAAACACССTGTATСTGCAAATGAACA GCCTGCGTGCGGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTTGGGGTGAT GAGGGTTTTGATATTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA
SEQ ID NO: 90 Легкая каппацепь DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIYG ASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQYSSFPTTFGQ GTKVEI KRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKV flHKLQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGEA
SEQ ID NO: 91 Тяжелая цепь (только VH- и СН1-домены) QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSN TSPIGYTYYAGSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWGD EGFDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFP EPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICN VNHKPSNTKVDKKVEPKS
MOR10701
SEQ ID NO: 92 (Кэбот) HCDR1 SYAMS
SEQ ID NO: 93 (Кэбот) HCDR2 VTGAVGRSTYYPDSVKG
SEQ ID NO: 94 (Кэбот) HCDR3 WGDEGFDI
SEQ ID NO: 95 (Кэбот) LCDR1 RASQGISNWLA
SEQ ID NO: 96 (Кэбот) LCDR2 GASSLQS
SEQ ID NO: 97 (Кэбот) LCDR3 QQYSSFPTT
SEQ ID NO: 98 (Хотиа) HCDR1 GFTFSSY
SEQ ID NO: 99 (Хотиа) HCDR2 GAVGRS
SEQ ID NO: 100 (Хотиа) HCDR3 WGDEGFDI
SEQ ID NO: 101 (Хотиа) LCDR1 SQGISNW
- 25 036314
SEQ ID NO: 102 (Хотиа) LCDR2 GAS
SEQ ID NO: 103 (Хотиа) LCDR3 YSSFPT
SEQ ID NO: 104 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIYG ASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSFPTTFGQ GTKVEIK
SEQ ID NO: 105 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGETFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSV TGAVGRSTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWG DEGFDIWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 106 ДНК VL GATATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGA CAGAGTGACCATCACCTGTCGGGCCAGCCAGGGCATCAGCAACTGGCTGG CCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACGGC GCCAGCTCCCTGCAGAGCGGCGTGCCAAGCAGATTCAGCGGCAGCGGCTC CGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCG CCACCTACTACTGCCAGCAGTACAGCAGCTTCCCCACCACCTTCGGCCAG GGCACCAAGGTGGAAATCAAG
SEQ ID NO: 107 ДНК VH GAGGTGCAATTGCTGGAAAGCGGCGGAGGCCTGGTGCAGCCTGGCGGCAG CCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGCCA TGAGCTGGGTCCGCCAGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAATGGGTGTCCGTG ACAGGCGCCGTGGGCAGAAGCACCTACTACCCCGACAGCGTGAAGGGCCG GTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGA ACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGATGGGGC GACGAGGGCTTCGACATCTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCAGCTC A
SEQ ID NO: 108 Легкая каппацепь DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIYG ASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSFPTTFGQ GTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKV flHKLQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 109 Тяжелая цепь IgGl EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSV TGAVGRSTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWG DEGFDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYIC NVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYT LPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
MOR10702
SEQ ID NO: 110 (Кэбот) HCDR1 SYAMS
SEQ ID NO: 111 (Кэбот) HCDR2 VISAWGHVKYYADSVKG
SEQ ID NO: 112 (Кэбот) HCDR3 WGDEGFDI
SEQ ID NO: 113 (Кэбот) LCDR1 RASQGISNWLA
SEQ ID NO: 114 (Кэбот) LCDR2 GASSLQS
SEQ ID NO: 115 (Кэбот) LCDR3 QQYSSFPTT
SEQ ID NO: 116 (Хотиа) HCDR1 GFTFSSY
SEQ ID NO: 117 (Хотиа) HCDR2 SAWGHV
SEQ ID NO: 118 (Хотиа) HCDR3 WGDEGFDI
SEQ ID NO: 119 (Хотиа) LCDR1 SQGISNW
SEQ ID NO: 120 (Хотиа) LCDR2 GAS
SEQ ID NO: 121 (Хотиа) LCDR3 YSSFPT
SEQ ID NO: 122 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIYG ASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSFPTTFGQ GTKVEIK
SEQ ID NO: 123 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSV ISAWGHVKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWG DEGFDIWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 124 ДНК VL GATATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGA CAGAGTGACCATCACCTGTCGGGCCAGCCAGGGCATCAGCAACTGGCTGG CCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACGGC GCCAGCTCCCTGCAGAGCGGCGTGCCAAGCAGATTCAGCGGCAGCGGCTC CGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCG CCACCTACTACTGCCAGCAGTACAGCAGCTTCCCCACCACCTTCGGCCAG
- 26 036314
GGCACCAAGGTGGAAATCAAG
SEQ ID NO: 125 ДНК VH GAGGTGCAATTGCTGGAAAGCGGCGGAGGCCTGGTGCAGCCTGGCGGCAG CCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGCCA TGAGCTGGGTCCGCCAGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAATGGGTGTCCGTG ATCAGCGCCTGGGGCCACGTGAAGTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCG GTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGA ACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGATGGGGC GACGAGGGCTTCGACATCTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCAGCTC A
SEQ ID NO: 126 Легкая каппацепь DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIYG ASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSFPTTFGQ GTKVEI KRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKV flHKLQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 127 Тяжелая цепь IgGl EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSV ISAWGHVKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWG DEGFDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYIC NVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYT LPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
MOR10703
SEQ ID NO: 128 (Кэбот) HCDR1 SYAMS
SEQ ID NO: 129 (Кэбот) HCDR2 AINSQGKSTYYADSVKG
SEQ ID NO: 130 (Кэбот) HCDR3 WGDEGFDI
SEQ ID NO: 131 (Кэбот) LCDR1 RASQGISNWLA
SEQ ID NO: 132 (Кэбот) LCDR2 GASSLQS
SEQ ID NO: 133 (Кэбот) LCDR3 QQYSSFPTT
SEQ ID NO: 134 (Хотиа) HCDR1 GFTFSSY
SEQ ID NO: 135 (Хотиа) HCDR2 NSQGKS
SEQ ID NO: 136 (Хотиа) HCDR3 WGDEGFDI
SEQ ID NO: 137 (Хотиа) LCDR1 SQGISNW
SEQ ID NO: 138 (Хотиа) LCDR2 GAS
SEQ ID NO: 139 (Хотиа) LCDR3 YSSFPT
SEQ ID NO: 140 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIYG ASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSFPTTFGQ GTKVEIK
SEQ ID NO: 141 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSA INSQGKSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWG DEGFDIWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 142 ДНК VL GATATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGA CAGAGTGACCATCACCTGTCGGGCCAGCCAGGGCATCAGCAACTGGCTGG CCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACGGC GCCAGCTCCCTGCAGAGCGGCGTGCCAAGCAGATTCAGCGGCAGCGGCTC CGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCG CCACCTACTACTGCCAGCAGTACAGCAGCTTCCCCACCACCTTCGGCCAG GGCACCAAGGTGGAAATCAAG
SEQ ID NO: 143 ДНК VH GAGGTGCAATTGCTGGAAAGCGGCGGAGGCCTGGTGCAGCCTGGCGGCAG CCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGCCA TGAGCTGGGTCCGCCAGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAATGGGTGTCCGCC ATCAACAGCCAGGGCAAGAGCACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCG GTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGA ACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGATGGGGC GACGAGGGCTTCGACATCTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCAGCTC A
SEQ ID NO: 144 Легкая каппацепь DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIYG ASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSFPTTFGQ GTKVEI KRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKV flHKLQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 145 Тяжелая цепь IgGl EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSA INSQGKSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWG DEGFDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF
- 27 036314
PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYIC NVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYT LPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
MOR10703 N52S
SEQ ID NO: 146 (Кэбот) HCDR1 SYAMS
SEQ ID NO: 147 (Кэбот) HCDR2 AISSQGKSTYYADSVKG
SEQ ID NO: 148 (Кэбот) HCDR3 WGDEGFDI
SEQ ID NO: 149 (Кэбот) LCDR1 RASQGISNWLA
SEQ ID NO: 150 (Кэбот) LCDR2 GASSLQS
SEQ ID NO: 151 (Кэбот) LCDR3 QQYSSFPTT
SEQ ID NO: 152 (Хотиа) HCDR1 GFTFSSY
SEQ ID NO: 153 (Хотиа) HCDR2 SSQGKS
SEQ ID NO: 154 (Хотиа) HCDR3 WGDEGFDI
SEQ ID NO: 155 (Хотиа) LCDR1 SQGISNW
SEQ ID NO: 156 (Хотиа) LCDR2 GAS
SEQ ID NO: 157 (Хотиа) LCDR3 YSSFPT
SEQ ID NO: 158 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIYG ASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSFPTTFGQ GTKVEIK
SEQ ID NO: 159 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSA ISSQGKSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWG DEGFDIWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 160 ДНК VL GATATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGA CAGAGTGACCATCACCTGTCGGGCCAGCCAGGGCATCAGCAACTGGCTGG CCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACGGC GCCAGCTCCCTGCAGAGCGGCGTGCCAAGCAGATTCAGCGGCAGCGGCTC CGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCG CCACCTACTACTGCCAGCAGTACAGCAGCTTCCCCACCACCTTCGGCCAG GGCACCAAGGTGGAAATCAAG
SEQ ID NO: 161 ДНК VH GAGGTGCAATTGCTGGAAAGCGGCGGAGGCCTGGTGCAGCCTGGCGGCAG CCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGCCA TGAGCTGGGTCCGCCAGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAATGGGTGTCCGCC ATCAGCAGCCAGGGCAAGAGCACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCG GTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGA ACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGATGGGGC GACGAGGGCTTCGACATCTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCAGCTC A
SEQ ID NO: 162 Легкая каппацепь DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIYG ASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSFPTTFGQ GTKVEI KRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKV flHKLQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 163 Тяжелая цепь IgGl EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSA ISSQGKSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWG DEGFDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYIC NVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYT LPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
MOR10703 N52G
SEQ ID NO: 164 (Кэбот) HCDR1 SYAMS
SEQ ID NO: 165 (Кэбот) HCDR2 AIGSQGKSTYYADSVKG
SEQ ID NO: 166 (Кэбот) HCDR3 WGDEGFDI
SEQ ID NO: 167 (Кэбот) LCDR1 RASQGISNWLA
- 28 036314
SEQ ID NO: 168 (Кэбот) LCDR2 GASSLQS
SEQ ID NO: 169 (Кэбот) LCDR3 QQYSSFPTT
SEQ ID NO: 170 (Хотиа) HCDR1 GFTFSSY
SEQ ID NO: 171 (Хотиа) HCDR2 GSQGKS
SEQ ID NO: 172 (Хотиа) HCDR3 WGDEGFDI
SEQ ID NO: 173 (Хотиа) LCDR1 SQGISNW
SEQ ID NO: 174 (Хотиа) LCDR2 GAS
SEQ ID NO: 175 (Хотиа) LCDR3 YSSFPT
SEQ ID NO: 176 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIYG ASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSFPTTFGQ GTKVEIK
SEQ ID NO: 177 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSA IGSQGKSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWG DEGFDIWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 178 ДНК VL GATATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGA CAGAGTGACCATCACCTGTCGGGCCAGCCAGGGCATCAGCAACTGGCTGG CCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACGGC GCCAGCTCCCTGCAGAGCGGCGTGCCAAGCAGATTCAGCGGCAGCGGCTC CGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCG CCACCTACTACTGCCAGCAGTACAGCAGCTTCCCCACCACCTTCGGCCAG GGCACCAAGGTGGAAATCAAG
SEQ ID NO: 179 ДНК VH GAGGTGCAATTGCTGGAAAGCGGCGGAGGCCTGGTGCAGCCTGGCGGCAG CCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGCCA TGAGCTGGGTCCGCCAGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAATGGGTGTCCGCC ATCGGCAGCCAGGGCAAGAGCACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCG GTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGA ACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGATGGGGC GACGAGGGCTTCGACATCTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCAGCTC A
SEQ ID NO: 180 Легкая каппацепь DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIYG ASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSFPTTFGQ GTKVEI KRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKV flHKLQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 181 Тяжелая цепь IgGI EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSA IGSQGKSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWG DEGFDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYIC NVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYT LPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
MOR10703 N52S S52aN
SEQ ID NO: 182 (Кэбот) HCDR1 SYAMS
SEQ ID NO: 183 (Кэбот) HCDR2 AISNQGKSTYYADSVKG
SEQ ID NO: 184 (Кэбот) HCDR3 WGDEGFDI
SEQ ID NO: 185 (Кэбот) LCDR1 RASQGISNWLA
SEQ ID NO: 186 (Кэбот) LCDR2 GASSLQS
SEQ ID NO: 187 (Кэбот) LCDR3 QQYSSFPTT
SEQ ID NO: 188 (Хотиа) HCDR1 GFTFSSY
SEQ ID NO: 189 (Хотиа) HCDR2 SNQGKS
SEQ ID NO: 190 (Хотиа) HCDR3 WGDEGFDI
SEQ ID NO: 191 (Хотиа) LCDR1 SQGISNW
SEQ ID NO: 192 LCDR2 GAS
- 29 036314
(Хотиа)
SEQ ID NO: 193 (Хотиа) LCDR3 YSSFPT
SEQ ID NO: 194 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIYG ASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSFPTTFGQ GTKVEIK
SEQ ID NO: 195 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSA 1SNQGKSTYYADSVKGRFT1SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWG DEGFDIWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 196 ДНК VL GATATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGA CAGAGTGACCATCACCTGTCGGGCCAGCCAGGGCATCAGCAACTGGCTGG CCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACGGC GCCAGCTCCCTGCAGAGCGGCGTGCCAAGCAGATTCAGCGGCAGCGGCTC CGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCG CCACCTACTACTGCCAGCAGTACAGCAGCTTCCCCACCACCTTCGGCCAG GGCACCAAGGTGGAAATCAAG
SEQ ID NO: 197 ДНК VH GAGGTGCAATTGCTGGAAAGCGGCGGAGGCCTGGTGCAGCCTGGCGGCAG CCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGCCA TGAGCTGGGTCCGCCAGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAATGGGTGTCCGCC ATCAGCAACCAGGGCAAGAGCACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCG GTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGA ACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGATGGGGC GACGAGGGCTTCGACATCTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCAGCTC A
SEQ ID NO: 198 Легкая каппацепь DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIYG ASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSFPTTFGQ GTKVEI KRTVAAPSVFI FP PSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKV flHKLQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 199 Тяжелая цепь IgGl EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSA 1SNQGKSTYYADSVKGRFT1SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWG DEGFDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYIC NVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYT LPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
MOR10703 A50V N52S
SEQ ID NO: 200 (Кэбот) HCDR1 SYAMS
SEQ ID NO: 201 (Кэбот) HCDR2 VISSQGKSTYYADSVKG
SEQ ID NO: 202 (Кэбот) HCDR3 WGDEGFDI
SEQ ID NO: 203 (Кэбот) LCDR1 RASQGISNWLA
SEQ ID NO: 204 (Кэбот) LCDR2 GASSLQS
SEQ ID NO: 205 (Кэбот) LCDR3 QQYSSFPTT
SEQ ID NO: 206 (Хотиа) HCDR1 GFTFSSY
SEQ ID NO: 207 (Хотиа) HCDR2 SSQGKS
SEQ ID NO: 208 (Хотиа) HCDR3 WGDEGFDI
SEQ ID NO: 209 (Хотиа) LCDR1 SQGISNW
SEQ ID NO: 210 (Хотиа) LCDR2 GAS
SEQ ID NO: 211 (Хотиа) LCDR3 YSSFPT
SEQ ID NO: 212 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIYG ASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSFPTTFGQ GTKVEIK
SEQ ID NO: 213 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSV ISSQGKSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWG DEGFDIWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 214 ДНК VL GATATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGA CAGAGTGACCATCACCTGTCGGGCCAGCCAGGGCATCAGCAACTGGCTGG CCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACGGC GCCAGCTCCCTGCAGAGCGGCGTGCCAAGCAGATTCAGCGGCAGCGGCTC CGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCG CCACCTACTACTGCCAGCAGTACAGCAGCTTCCCCACCACCTTCGGCCAG
- 30 036314
GGCACCAAGGTGGAAATCAAG
SEQ ID NO: 215 ДНК VH GAGGTGCAATTGCTGGAAAGCGGCGGAGGCCTGGTGCAGCCTGGCGGCAG CCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGCCA TGAGCTGGGTCCGCCAGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAATGGGTGTCCGTC ATCAGCAGCCAGGGCAAGAGCACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCG GTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGA ACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGATGGGGC GACGAGGGCTTCGACATCTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCAGCTC A
SEQ ID NO: 216 Легкая каппацепь DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIYG ASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSFPTTFGQ GTKVEI KRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKV flHKLQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 217 Тяжелая цепь IgGl EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSV ISSQGKSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWG DEGFDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYIC NVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYT LPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
MOR10703 A50V N52G
SEQ ID NO: 218 (Кэбот) HCDR1 SYAMS
SEQ ID NO: 219 (Кэбот) HCDR2 VIGSQGKSTYYADSVKG
SEQ ID NO: 220 (Кэбот) HCDR3 WGDEGFDI
SEQ ID NO: 221 (Кэбот) LCDR1 RASQGISNWLA
SEQ ID NO: 222 (Кэбот) LCDR2 GASSLQS
SEQ ID NO: 223 (Кэбот) LCDR3 QQYSSFPTT
SEQ ID NO: 224 (Хотиа) HCDR1 GFTFSSY
SEQ ID NO: 225 (Хотиа) HCDR2 GSQGKS
SEQ ID NO: 226 (Хотиа) HCDR3 WGDEGFDI
SEQ ID NO: 227 (Хотиа) LCDR1 SQGISNW
SEQ ID NO: 228 (Хотиа) LCDR2 GAS
SEQ ID NO: 229 (Хотиа) LCDR3 YSSFPT
SEQ ID NO: 230 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIYG ASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSFPTTFGQ GTKVEIK
SEQ ID NO: 231 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSV IGSQGKSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWG DEGFDIWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 232 ДНК VL GATATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGA CAGAGTGACCATCACCTGTCGGGCCAGCCAGGGCATCAGCAACTGGCTGG CCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACGGC GCCAGCTCCCTGCAGAGCGGCGTGCCAAGCAGATTCAGCGGCAGCGGCTC CGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCG CCACCTACTACTGCCAGCAGTACAGCAGCTTCCCCACCACCTTCGGCCAG GGCACCAAGGTGGAAATCAAG
SEQ ID NO: 233 ДНК VH GAGGTGCAATTGCTGGAAAGCGGCGGAGGCCTGGTGCAGCCTGGCGGCAG CCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGCCA TGAGCTGGGTCCGCCAGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAATGGGTGTCCGTC ATCGGCAGCCAGGGCAAGAGCACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCG GTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGA ACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGATGGGGC GACGAGGGCTTCGACATCTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCAGCTC A
SEQ ID NO: 234 Легкая каппацепь DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIYG ASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSFPTTFGQ GTKVEI KRTVAAPSVFIFP PS DEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKV flHKLQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 235 Тяжелая цепь IgGl EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSV IGSQGKSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWG
- 31 036314
DEGFDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYIC NVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYT LPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
MOR10703 S52aA
SEQ ID NO: 236 (Кэбот) HCDR1 SYAMS
SEQ ID NO: 237 (Кэбот) HCDR2 AINAQGKSTYYADSVKG
SEQ ID NO: 238 (Кэбот) HCDR3 WGDEGFDI
SEQ ID NO: 239 (Кэбот) LCDR1 RASQGISNWLA
SEQ ID NO: 240 (Кэбот) LCDR2 GASSLQS
SEQ ID NO: 241 (Кэбот) LCDR3 QQYSSFPTT
SEQ ID NO: 242 (Хотиа) HCDR1 GFTFSSY
SEQ ID NO: 243 (Хотиа) HCDR2 NAQGKS
SEQ ID NO: 244 (Хотиа) HCDR3 WGDEGFDI
SEQ ID NO: 245 (Хотиа) LCDR1 SQGISNW
SEQ ID NO: 246 (Хотиа) LCDR2 GAS
SEQ ID NO: 247 (Хотиа) LCDR3 YSSFPT
SEQ ID NO: 248 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIYG ASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSFPTTFGQ GTKVEIK
SEQ ID NO: 249 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSA INAQGKSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWG DEGFDIWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 250 ДНК VL GATATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGA CAGAGTGACCATCACCTGTCGGGCCAGCCAGGGCATCAGCAACTGGCTGG CCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACGGC GCCAGCTCCCTGCAGAGCGGCGTGCCAAGCAGATTCAGCGGCAGCGGCTC CGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCG CCACCTACTACTGCCAGCAGTACAGCAGCTTCCCCACCACCTTCGGCCAG GGCACCAAGGTGGAAATCAAG
SEQ ID NO: 251 ДНК VH GAGGTGCAATTGCTGGAAAGCGGCGGAGGCCTGGTGCAGCCTGGCGGCAG CCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGCCA TGAGCTGGGTCCGCCAGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAATGGGTGTCCGCC ATCAACGCCCAGGGCAAGAGCACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCG GTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGA ACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGATGGGGC GACGAGGGCTTCGACATCTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCAGCTC A
SEQ ID NO: 252 Легкая каппацепь DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIYG ASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSFPTTFGQ GTKVEI KRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKV flHKLQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 253 Тяжелая цепь IgGl EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSA INAQGKSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWG DEGFDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYIC NVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYT LPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
MOR10703 S52aT
SEQ ID NO: 254 (Кэбот) HCDR1 SYAMS
SEQ ID NO: 255 (Кэбот) HCDR2 AINTQGKSTYYADSVKG
SEQ ID NO: 256 (Кэбот) HCDR3 WGDEGFDI
SEQ ID NO: 257 LCDR1 RASQGISNWLA
- 32 036314
(Кэбот)
SEQ ID NO: 258 (Кэбот) LCDR2 GASSLQS
SEQ ID NO: 259 (Кэбот) LCDR3 QQYSSFPTT
SEQ ID NO: 260 (Хотиа) HCDR1 GFTFSSY
SEQ ID NO: 261 (Хотиа) HCDR2 NTQGKS
SEQ ID NO: 262 (Хотиа) HCDR3 WGDEGFDI
SEQ ID NO: 263 (Хотиа) LCDR1 SQGISNW
SEQ ID NO: 264 (Хотиа) LCDR2 GAS
SEQ ID NO: 265 (Хотиа) LCDR3 YSSFPT
SEQ ID NO: 266 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIYG ASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSFPTTFGQ GTKVEIK
SEQ ID NO: 267 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSA INTQGKSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWG DEGFDIWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 268 ДНК VL GATATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGA CAGAGTGACCATCACCTGTCGGGCCAGCCAGGGCATCAGCAACTGGCTGG CCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACGGC GCCAGCTCCCTGCAGAGCGGCGTGCCAAGCAGATTCAGCGGCAGCGGCTC CGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCG CCACCTACTACTGCCAGCAGTACAGCAGCTTCCCCACCACCTTCGGCCAG GGCACCAAGGTGGAAATCAAG
SEQ ID NO: 269 ДНК VH GAGGTGCAATTGCTGGAAAGCGGCGGAGGCCTGGTGCAGCCTGGCGGCAG CCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGCCA TGAGCTGGGTCCGCCAGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAATGGGTGTCCGCC ATCAACACCCAGGGCAAGAGCACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCG GTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGA ACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGATGGGGC GACGAGGGCTTCGACATCTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCAGCTC A
SEQ ID NO: 270 Легкая каппацепь DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIYG ASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSFPTTFGQ GTKVEI KRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKV flHKLQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 271 Тяжелая цепь IgGl EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSA INTQGKSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWG DEGFDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYIC NVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYT LPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
MOR10701 R55S
SEQ ID NO: 272 (Кэбот) HCDR1 SYAMS
SEQ ID NO: 273 (Кэбот) HCDR2 VT GAVGSS TYYPDSVKG
SEQ ID NO: 274 (Кэбот) HCDR3 WGDEGFDI
SEQ ID NO: 275 (Кэбот) LCDR1 RASQGISNWLA
SEQ ID NO: 276 (Кэбот) LCDR2 GASSLQS
SEQ ID NO: 277 (Кэбот) LCDR3 QQYSSFPTT
SEQ ID NO: 278 (Хотиа) HCDR1 GFTFSSY
SEQ ID NO: 279 (Хотиа) HCDR2 GAVGSS
SEQ ID NO: 280 (Хотиа) HCDR3 WGDEGFDI
SEQ ID NO: 281 (Хотиа) LCDR1 SQGISNW
SEQ ID NO: 282 LCDR2 GAS
- 33 036314
(Хотиа)
SEQ ID NO: 283 (Хотиа) LCDR3 YSSFPT
SEQ ID NO: 284 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIYG ASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSFPTTFGQ GTKVEIK
SEQ ID NO: 285 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSV TGAVGSSTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWG DEGFDIWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 286 ДНК VL GATATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGA CAGAGTGACCATCACCTGTCGGGCCAGCCAGGGCATCAGCAACTGGCTGG CCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACGGC GCCAGCTCCCTGCAGAGCGGCGTGCCAAGCAGATTCAGCGGCAGCGGCTC CGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCG CCACCTACTACTGCCAGCAGTACAGCAGCTTCCCCACCACCTTCGGCCAG GGCACCAAGGTGGAAATCAAG
SEQ ID NO: 287 ДНК VH GAGGTGCAATTGCTGGAAAGCGGCGGAGGCCTGGTGCAGCCTGGCGGCAG CCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGCCA TGAGCTGGGTCCGCCAGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAATGGGTGTCCGTG ACAGGCGCCGTGGGCAGCAGCACCTACTACCCCGACAGCGTGAAGGGCCG GTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGA ACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGATGGGGC GACGAGGGCTTCGACATCTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCAGCTC A
SEQ ID NO: 288 Легкая каппацепь DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIYG ASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSFPTTFGQ GTKVEI KRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKV ДHKLQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 289 Тяжелая цепь IgGl EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSV TGAVGSSTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWG DEGFDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYIC NVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYT LPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
MOR10701 R55G
SEQ ID NO: 290 (Кэбот) HCDR1 SYAMS
SEQ ID NO: 291 (Кэбот) HCDR2 VT GAVGGS TYYPDSVKG
SEQ ID NO: 292 (Кэбот) HCDR3 WGDEGFDI
SEQ ID NO: 293 (Кэбот) LCDR1 RASQGISNWLA
SEQ ID NO: 294 (Кэбот) LCDR2 GASSLQS
SEQ ID NO: 295 (Кэбот) LCDR3 QQYSSFPTT
SEQ ID NO: 296 (Хотиа) HCDR1 GFTFSSY
SEQ ID NO: 297 (Хотиа) HCDR2 GAVGGS
SEQ ID NO: 298 (Хотиа) HCDR3 WGDEGFDI
SEQ ID NO: 299 (Хотиа) LCDR1 SQGISNW
SEQ ID NO: 300 (Хотиа) LCDR2 GAS
SEQ ID NO: 301 (Хотиа) LCDR3 YSSFPT
SEQ ID NO: 302 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIYG ASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSFPTTFGQ GTKVEIK
SEQ ID NO: 303 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSV TGAVGGSTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWG DEGFDIWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 304 ДНК VL GATATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGA CAGAGTGACCATCACCTGTCGGGCCAGCCAGGGCATCAGCAACTGGCTGG CCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACGGC GCCAGCTCCCTGCAGAGCGGCGTGCCAAGCAGATTCAGCGGCAGCGGCTC CGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCG CCACCTACTACTGCCAGCAGTACAGCAGCTTCCCCACCACCTTCGGCCAG GGCACCAAGGTGGAAATCAAG
- 34 036314
SEQ ID NO: 305 ДНК VH GAGGTGCAATTGCTGGAAAGCGGCGGAGGCCTGGTGCAGCCTGGCGGCAG CCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGCCA TGAGCTGGGTCCGCCAGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAATGGGTGTCCGTG ACAGGCGCCGTGGGCGGAAGCACCTACTACCCCGACAGCGTGAAGGGCCG GTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGA ACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGATGGGGC GACGAGGGCTTCGACATCTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCAGCTC A
SEQ ID NO: 306 Легкая каппацепь DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIYG ASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSFPTTFGQ GTKVEI KRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKV flHKLQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 307 Тяжелая цепь IgGI EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSV TGAVGGSTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWG DEGFDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYIC NVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYT LPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
MOR10701 R55K
SEQ ID NO: 308 (Кэбот) HCDR1 SYAMS
SEQ ID NO: 309 (Кэбот) HCDR2 VT GAVGKS TYYPDSVKG
SEQ ID NO: 310 (Кэбот) HCDR3 WGDEGFDI
SEQ ID NO: 311 (Кэбот) LCDR1 RASQGISNWLA
SEQ ID NO: 312 (Кэбот) LCDR2 GASSLQS
SEQ ID NO: 313 (Кэбот) LCDR3 QQYSSFPTT
SEQ ID NO: 314 (Хотиа) HCDR1 GFTFSSY
SEQ ID NO: 315 (Хотиа) HCDR2 GAVGKS
SEQ ID NO: 316 (Хотиа) HCDR3 WGDEGFDI
SEQ ID NO: 317 (Хотиа) LCDR1 SQGISNW
SEQ ID NO: 318 (Хотиа) LCDR2 GAS
SEQ ID NO: 319 (Хотиа) LCDR3 YSSFPT
SEQ ID NO: 320 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIYG ASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSFPTTFGQ GTKVEIK
SEQ ID NO: 321 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSV TGAVGKSTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWG DEGFDIWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 322 ДНК VL GATATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGA CAGAGTGACCATCACCTGTCGGGCCAGCCAGGGCATCAGCAACTGGCTGG CCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACGGC GCCAGCTCCCTGCAGAGCGGCGTGCCAAGCAGATTCAGCGGCAGCGGCTC CGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCG CCACCTACTACTGCCAGCAGTACAGCAGCTTCCCCACCACCTTCGGCCAG GGCACCAAGGTGGAAATCAAG
SEQ ID NO: 323 ДНК VH GAGGTGCAATTGCTGGAAAGCGGCGGAGGCCTGGTGCAGCCTGGCGGCAG CCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGCCA TGAGCTGGGTCCGCCAGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAATGGGTGTCCGTG ACAGGCGCCGTGGGCAAAAGCACCTACTACCCCGACAGCGTGAAGGGCCG GTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGA ACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGATGGGGC GACGAGGGCTTCGACATCTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCAGCTC A
SEQ ID NO: 324 Легкая каппацепь DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIYG ASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSFPTTFGQ GTKVEI KRTVAAPSVFIFP PS DEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKV flHKLQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 325 Тяжелая цепь IgGI EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSV TGAVGKSTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWG DEGFDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYIC NVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDT
- 35 036314
LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYT LPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
MOR10701 deletion S56
SEQ ID NO: 326 (Кэбот) HCDR1 SYAMS
SEQ ID NO: 327 (Кэбот) HCDR2 VTGAVGRTYYPDSVKG
SEQ ID NO: 328 (Кэбот) HCDR3 WGDEGFDI
SEQ ID NO: 329 (Кэбот) LCDR1 RASQGISNWLA
SEQ ID NO: 330 (Кэбот) LCDR2 GASSLQS
SEQ ID NO: 331 (Кэбот) LCDR3 QQYSSFPTT
SEQ ID NO: 332 (Хотиа) HCDR1 GFTFSSY
SEQ ID NO: 333 (Хотиа) HCDR2 GAVGRT
SEQ ID NO: 334 (Хотиа) HCDR3 WGDEGFDI
SEQ ID NO: 335 (Хотиа) LCDR1 SQGISNW
SEQ ID NO: 336 (Хотиа) LCDR2 GAS
SEQ ID NO: 337 (Хотиа) LCDR3 YSSFPT
SEQ ID NO: 338 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIYG ASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSFPTTFGQ GTKVEIK
SEQ ID NO: 339 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSV TGAVGRTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWGD EGFDIWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 340 ДНК VL GATATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGA CAGAGTGACCATCACCTGTCGGGCCAGCCAGGGCATCAGCAACTGGCTGG CCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACGGC GCCAGCTCCCTGCAGAGCGGCGTGCCAAGCAGATTCAGCGGCAGCGGCTC CGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCG CCACCTACTACTGCCAGCAGTACAGCAGCTTCCCCACCACCTTCGGCCAG GGCACCAAGGTGGAAATCAAG
SEQ ID NO: 341 ДНК VH GAGGTGCAATTGCTGGAAAGCGGCGGAGGCCTGGTGCAGCCTGGCGGCAG CCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGCCA TGAGCTGGGTCCGCCAGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAATGGGTGTCCGTG ACAGGCGCCGTGGGCAGAACCTACTACCCCGACAGCGTGAAGGGCCGGTT CACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACA GCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGATGGGGCGAC GAGGGCTTCGACATCTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCAGCTCA
SEQ ID NO: 342 Легкая каппацепь DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIYG ASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSFPTTFGQ GTKVEIKRTVAAPSVFI EPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKV flHKLQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 343 Тяжелая цепь IgGl EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSV TGAVGRTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWGD EGFDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFP EPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICN VNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
MOR12609
SEQ ID NO: 344 (Кэбот) HCDR1 SYAMS
SEQ ID NO: 345 (Кэбот) HCDR2 VINGLGYTTFYADSVKG
SEQ ID NO: 346 (Кэбот) HCDR3 WGDEGFDI
SEQ ID NO: 347 (Кэбот) LCDR1 RASQGISNWLA
SEQ ID NO: 348 LCDR2 GASSLQS
- 36 036314
(Кэбот)
SEQ ID NO: 349 (Кэбот) LCDR3 QQYSSFPTT
SEQ ID NO: 350 (Хотиа) HCDR1 GFTFSSY
SEQ ID NO: 351 (Хотиа) HCDR2 NGLGYT
SEQ ID NO: 352 (Хотиа) HCDR3 WGDEGFDI
SEQ ID NO: 353 (Хотиа) LCDR1 SQGISNW
SEQ ID NO: 354 (Хотиа) LCDR2 GAS
SEQ ID NO: 355 (Хотиа) LCDR3 YSSFPT
SEQ ID NO: 356 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIYG ASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQYSSFPTTFGQ GTKVEIK
SEQ ID NO: 357 VH QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSV INGLGYTTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWG DEGFDIWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 358 ДНК VL GATATCCAGATGACCCAGAGCCCGTCTAGCCTGAGCGCGAGCGTGGGTGA TCGTGTGACCATTACCTGCAGAGCGAGCCAGGGTATTTCTAATTGGCTGG CTTGGTACCAGCAGAAACCAGGTAAAGCACCGAAACTATTAATTTATGGT GCTTCTTCTTTGCAAAGCGGGGTCCCGTCCCGTTTTAGCGGCTCTGGATC CGGCACTGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAACCTGAAGACTTTG CGGTTTATTATTGCCAGCAGTATTCTTCTTTTCCTACTACCTTTGGCCAG GGTACGAAAGΤTGAAATTAAA
SEQ ID NO: 359 ДНК VH CAGGTGCAATTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAACCGGGCGGCAG CCTGCGTCTGAGCTGCGCGGCCTCCGGATTTACCTTTAGCAGCTATGCGA TGAGCTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTGAGCGTT ATTAATGGTCTTGGTTATACTACTTTTTATGCTGATTCTGTTAAGGGTCG TTTTACCATTTCACGTGATAATTCGAAAAACACCCTGTATCTGCAAATGA ACAGCCTGCGTGCGGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTTGGGGT GATGAGGGTTTTGATATTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTC A
SEQ ID NO: 360 Легкая каппа- цепь DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIYG ASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQYSSFPTTFGQ GTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKV flHKLQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 361 Тяжелая цепь IgGl QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSV INGLGYTTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWG DEGFDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYIC NVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYT LPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
MOR12610
SEQ ID NO: 362 (Кэбот) HCDR1 SYAMS
SEQ ID NO: 363 (Кэбот) HCDR2 GTGPYGGTYYPDSVKG
SEQ ID NO: 364 (Кэбот) HCDR3 WGDEGFDI
SEQ ID NO: 365 (Кэбот) LCDR1 RASQGISNWLA
SEQ ID NO: 366 (Кэбот) LCDR2 GASSLQS
SEQ ID NO: 367 (Кэбот) LCDR3 QQYSSFPTT
SEQ ID NO: 368 (Хотиа) HCDR1 GFTFSSY
SEQ ID NO: 369 (Хотиа) HCDR2 GPYGG
SEQ ID NO: 370 (Хотиа) HCDR3 WGDEGFDI
SEQ ID NO: 371 (Хотиа) LCDR1 SQGISNW
SEQ ID NO: 372 (Хотиа) LCDR2 GAS
SEQ ID NO: 373 LCDR3 YSSFPT
- 37 036314
(Хотиа)
SEQ ID NO: 374 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIYG ASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQYSSFPTTFGQ GTKVEIK
SEQ ID NO: 375 VH QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSG TGPYGGTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWGD EGFDIWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 376 ДНК VL GATATCCAGATGACCCAGAGCCCGTCTAGCCTGAGCGCGAGCGTGGGTGA TCGTGTGACCATTACCTGCAGAGCGAGCCAGGGTATTTCTAATTGGCTGG CTTGGTACCAGCAGAAACCAGGTAAAGCACCGAAACTATTAATTTATGGT GCTTCTTCTTTGCAAAGCGGGGTCCCGTCCCGTTTTAGCGGCTCTGGATC CGGCACTGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAACCTGAAGACTTTG CGGTTTATTATTGCCAGCAGTATTCTTCTTTTCCTACTACCTTTGGCCAG GGTACGAAAGTTGAAATTAAA
SEQ ID NO: 377 ДНК VH CAGGTGCAATTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAACCGGGCGGCAG CCTGCGTCTGAGCTGCGCGGCCTCCGGATTTACCTTTAGCAGCTATGCGA TGAGCTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTGAGCGGT ACTGGTCCTTATGGTGGTACTTATTATCCTGATTCTGTTAAGGGTCGTTT TACCATTTCACGTGATAATTCGAAAAACACССTGTATСTGCAAATGAACA GCCTGCGTGCGGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTTGGGGTGAT GAGGGTTTTGATATTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA
SEQ ID NO: 378 Легкая каппацепь DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIYG ASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQYSSFPTTFGQ GTKVEI KRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKV flHKLQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 379 Тяжелая цепь IgGl QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSG TGPYGGTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWGD EGFDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFP EPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICN VNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Другие антитела представляют собой антитела, в которых аминокислоты или нуклеиновые кислоты, кодирующие аминокислоты, подвергнуты мутации, но последовательности которых еще по меньшей мере на 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 и 99% идентичны последовательностям, представленным в табл. 1. Они включают мутантные аминокислотные последовательности, в которых не более 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот в вариабельных областях были подвергнуты мутации по сравнению с вариабельными областями, последовательности которых представлены в табл. 1, при этом все еще сохраняется их практически такая же терапевтическая активность.
Поскольку каждое/каждый из указанных антител или их фрагментов может связываться с HER3, то последовательности VH, VL, полноразмерной легкой цепи и полноразмерной тяжелой цепи (аминокислотные последовательности и нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотные последовательности) можно смешивать и совмещать для создания других связывающих HER3 антител. Связывание с HER3 указанных полученных в результате смешения и совмещения антител можно оценивать с помощью известных в данной области анализов связывания (например, ELISA и других анализов, описанных в разделе Примеры). Когда эти цепи смешивают и совмещают, то последовательность VH из конкретной пары VH/VL следует замещать структурно сходной последовательностью VH. Аналогично этому, полноразмерную последовательность тяжелой цепи из конкретной пары полноразмерная последовательность тяжелой цепи/полноразмерная последовательность легкой цепи следует замещать структурно сходной полноразмерной последовательностью тяжелой цепи. Аналогично этому, последовательность VL из конкретной пары VH/VL следует замещать структурно сходной последовательностью VL. Аналогично этому, полноразмерную последовательность легкой цепи из конкретной пары полноразмерная последовательность тяжелой цепи/полноразмерная последовательность легкой цепи следует замещать структурно сходной полноразмерной последовательностью легкой цепи. Таким образом, выделенное моноклональное антитело или его фрагмент, которое/который имеет вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 15, 33, 51, 69, 87, 105, 123, 141, 159, 177, 195, 213, 231, 249, 267, 285, 303, 321, 339, 357 и 375; и вариабельную область легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 14, 32, 50, 68, 86, 104, 122, 140, 158, 176, 194, 212, 230, 248, 266, 284, 302, 320, 338, 356 и 374; при этом антитело специфически связывается с HER3 (например, человека и/или обезьяны циномолгус).
HER3-связывающие антитела, которые содержат CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи и легкой цепи, представленные в табл. 1, или их комбинации. Аминокислотные последовательности CDR1 VH антител представлены в SEQ ID NO: 2, 8, 20, 26, 38, 44, 56, 62, 74, 80, 92, 98, 110, 116, 128, 134, 146, 152, 164, 170, 182, 188, 200, 206, 218, 224, 236, 242, 254, 260, 272, 278, 290, 296, 308, 314, 326, 332, 344, 350, 362 и 368. Аминокислотные последовательности CDR2 VH антител представлены в SEQ ID NO: 3, 9, 21, 27, 39, 45, 57, 63, 75, 81, 93, 99, 111, 117, 129, 135, 147, 153, 165, 171, 183, 189, 201, 207, 219, 225, 237, 243, 255, 261, 273, 279, 291, 297, 309, 315, 327, 333, 345, 351, 363 и 369. Аминокислотные последовательности CDR3 VH антител представлены в SEQ ID NO: 4, 10, 22, 28, 40, 46, 58, 64, 76, 82, 94, 100, 112, 118, 130, 136, 148, 154, 166, 172, 184, 190, 202, 208, 220, 226, 238, 244, 256, 262, 274, 280, 292, 298, 310, 316, 328, 334, 346, 352, 364 и 370. Аминокислотные последовательности CDR1 VL антител представлены в SEQ ID NO: 5, 11, 23, 29, 41, 47, 59, 65, 77, 83, 95, 101, 113, 119, 131, 137, 149, 155, 167, 173, 185, 191, 203, 209, 221, 227,
- 38 036314
239, 245, 257, 263, 275, 281, 293, 299, 311, 317, 329, 335, 347, 353, 365 и 371. Аминокислотные последовательности CDR2 VL антител представлены в SEQ ID NO: 6, 12, 24, 30, 42, 48, 60, 66, 78, 84, 96, 102, 114, 120, 132, 138, 150, 156, 168, 174, 186, 192, 204, 210, 222, 228, 240, 246, 258, 264, 276, 282, 294, 300, 312, 318, 330, 336, 348, 354, 366 и 372. Аминокислотные последовательности CDR2 VL антител представлены в SEQ ID NO: 7, 13, 25, 31, 43, 49, 61, 67, 79, 85, 97, 103, 115, 121, 133, 139, 151, 157, 169, 175, 187, 193, 205, 211, 223, 229, 241, 247, 259, 265, 277, 283, 295, 301, 313, 319, 331, 337, 349, 355, 367 и 373. CDRучастки описывают с помощью системы Кэбота (Kabat E. А. и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-е изд., изд-во U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, 1991; Chothia и др., J. Mol. Biol. 196, 1987, сс. 901-917; Chothia и др., Nature 342, 1989, сс. 877-883; и Al-Lazikani и др., J. Mol. Biol. 273, 1997, сс. 927-948).
Антитело, которое связывается с HER3, может содержать в вариабельной области тяжелой цепи CDR1, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 2; CDR2, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 3; CDR3, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 4; в вариабельной области легкой цепи CDR1, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 5; CDR2, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 6; и CDR3 последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 7.
Антитело, которое связывается с HER3, может содержать в вариабельной области тяжелой цепи CDR1, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 20; CDR2, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 21, CDR3, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 22; в вариабельной области легкой цепи CDR1, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 23; CDR2, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 24; и CDR3 последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 25.
Антитело, которое связывается с HER3, может содержать в вариабельной области тяжелой цепи CDR1, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 38; CDR2, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 39; CDR3, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 40; в вариабельной области легкой цепи CDR1, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 41; CDR2, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 42; и CDR3 последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 43.
Антитело, которое связывается с HER3, может содержать в вариабельной области тяжелой цепи CDR1, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 56; CDR2, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 57; CDR3, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 58; в вариабельной области легкой цепи CDR1, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 59; CDR2, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 60; и CDR3 последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 61.
Антитело, которое связывается с HER3, может содержать в вариабельной области тяжелой цепи CDR1, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 74; CDR2, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 75; CDR3, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 76; в вариабельной области легкой цепи CDR1, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 77; CDR2, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 78; и CDR3 последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 79.
Антитело, которое связывается с HER3, может содержать в вариабельной области тяжелой цепи CDR1, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 92; CDR2, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 93; CDR3, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 94; в вариабельной области легкой цепи CDR1, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 95; CDR2, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 96; и CDR3 последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 97.
Антитело, которое связывается с HER3, может содержать в вариабельной области тяжелой цепи CDR1, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 110; CDR2, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 111; CDR3, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 112; в вариабельной области легкой цепи CDR1, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 113; CDR2, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 114; и CDR3 последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 115.
Антитело, которое связывается с HER3, может содержать в вариабельной области тяжелой цепи CDR1, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 128; CDR2, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 129; CDR3, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 130; в вариабельной области легкой цепи CDR1, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 131; CDR2, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 132; и CDR3 последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 133.
Антитело, которое связывается с HER3, может содержать в вариабельной области тяжелой цепи CDR1, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 146; CDR2, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 147; CDR3, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 148; в вариабельной области легкой цепи CDR1, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:
- 39 036314
149; CDR2, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 150; и CDR3 последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 151.
Антитело, которое связывается с HER3, может содержать в вариабельной области тяжелой цепи CDR1, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 164; CDR2, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 165; CDR3, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 166; в вариабельной области легкой цепи CDR1, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 167; CDR2, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 168; и CDR3 последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 169.
Антитело, которое связывается с HER3, может содержать в вариабельной области тяжелой цепи CDR1, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 182; CDR2, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 183; CDR3, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 184; в вариабельной области легкой цепи CDR1, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 185; CDR2, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 186; и CDR3 последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 187.
Антитело, которое связывается с HER3, может содержать в вариабельной области тяжелой цепи CDR1, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 200; CDR2, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 201; CDR3, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 202; в вариабельной области легкой цепи CDR1, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 203; CDR2, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 204; и CDR3 последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 205.
Антитело, которое связывается с HER3, может содержать в вариабельной области тяжелой цепи CDR1, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 218; CDR2, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 219; CDR3, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 220; в вариабельной области легкой цепи CDR1, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 221; CDR2, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 222; и CDR3 последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 223.
Антитело, которое связывается с HER3, может содержать в вариабельной области тяжелой цепи CDR1, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 236; CDR2, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 237; CDR3, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 238; в вариабельной области легкой цепи CDR1, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 239; CDR2, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 240; и CDR3 последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 241.
Антитело, которое связывается с HER3, может содержать в вариабельной области тяжелой цепи CDR1, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 254; CDR2, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 255; CDR3, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 256; в вариабельной области легкой цепи CDR1, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 257; CDR2, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 258; и CDR3 последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 259.
Антитело, которое связывается с HER3, может содержать в вариабельной области тяжелой цепи CDR1, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 272; CDR2, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 273; CDR3, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 274; в вариабельной области легкой цепи CDR1, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 275; CDR2, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 276; и CDR3 последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 277.
Антитело, которое связывается с HER3, может содержать в вариабельной области тяжелой цепи CDR1, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 290; CDR2, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 291; CDR3, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 292; в вариабельной области легкой цепи CDR1, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 293; CDR2, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 294; и CDR3 последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 295.
Антитело, которое связывается с HER3, может содержать в вариабельной области тяжелой цепи CDR1, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 308; CDR2, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 309; CDR3, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 310; в вариабельной области легкой цепи CDR1, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 311; CDR2, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 312; и CDR3 последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 313.
Антитело, которое связывается с HER3, может содержать в вариабельной области тяжелой цепи CDR1, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 326; CDR2, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 327; CDR3, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 328; в вариабельной области легкой цепи CDR1, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 329; CDR2, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 330; и CDR3 последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 331.
- 40 036314
Антитело, которое связывается с HER3, может содержать в вариабельной области тяжелой цепи CDR1, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 344; CDR2, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 345; CDR3, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 346; в вариабельной области легкой цепи CDR1, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 347; CDR2, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 3148; и CDR3 последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 349.
Антитело, которое связывается с HER3, может содержать в вариабельной области тяжелой цепи CDR1, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 362; CDR2, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 363; CDR3, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 364; в вариабельной области легкой цепи CDR1, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 365; CDR2, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 366; и CDR3 последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 367. Антитело, которое связывается с HER3, может содержать VH, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 15, и VL, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 14. Антитело, которое связывается с HER3, может содержать VH, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 33, и VL, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 32. Антитело, которое связывается с HER3, может содержать VH, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 51, и VL, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 50. Антитело, которое связывается с HER3, может содержать VH, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 69, и VL, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 68.
Антитело, которое связывается с HER3, может содержать VH, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 87, и VL, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 86. Антитело, которое связывается с HER3, может содержать VH, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 105, и VL, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 104. Антитело, которое связывается с HER3, может содержать VH, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 123, и VL, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 122. Антитело, которое связывается с HER3, может содержать VH, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 141, и VL, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 140. Антитело, которое связывается с HER3, может содержать VH, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 159, и VL, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 158. Антитело, которое связывается с HER3, может содержать VH, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 177, и VL, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 176. Антитело, которое связывается с HER3, может содержать VH, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 195, и VL, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 194. Антитело, которое связывается с HER3, может содержать VH, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 213, и VL, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 212. Антитело, которое связывается с HER3, может содержать VH, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 231, и VL, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 230. Антитело, которое связывается с HER3, может содержать VH, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 249, и VL, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 248. Антитело, которое связывается с HER3, может содержать VH, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 267, и VL, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 266. Антитело, которое связывается с HER3, может содержать VH, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 285, и VL, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 284. Антитело, которое связывается с HER3, может содержать VH, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 303, и VL, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 302. Антитело, которое связывается с HER3, может содержать VH, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 321, и VL, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 320. Антитело, которое связывается с HER3, может содержать VH, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 339, и VL, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 338. Антитело, которое связывается с HER3, может содержать VH, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 357, и VL, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 356. Антитело, которое связывается с HER3, может содержать VH, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 375, и VL, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 374. Антитела к HER3 могут быть антагонистическими антителами. Антитело, которое связывается с HER3, может представлять собой антитело, которое описано в табл. 1.
В контексте настоящего описания человеческое антитело содержит вариабельные области тяжелой или легкой цепи или полноразмерные тяжелые или легкие цепи, которые являются продуктом или выведены из конкретной последовательности зародышевой линии, если вариабельные области или полноразмерные цепи получают из системы, в которой в качестве источника последовательностей используют гены иммуноглобулина человеческой зародышевой линии. Для создания одной из таких систем осуществляют иммунизацию трансгенной мыши, несущей человеческие гены иммуноглобулинов, представляющим интерес антигеном или осуществляют скрининг фаговой дисплейной библиотеки человеческих генов иммуноглобулинов с использованием представляющего интерес антигена. Человеческое антитело, которое является продуктом или выведено из последовательности иммуноглобулина человеческой
- 41 036314 зародышевой линии, можно идентифицировать индивидуально путем сравнения аминокислотной последовательности человеческого антитела и аминокислотных последовательностей иммуноглобулинов человеческой зародышевой линии и отбора последовательности иммуноглобулина человеческой зародышевой линии, которая является наиболее близкой по последовательности (т.е. имеет самый высокий % идентичности) с последовательностью человеческого антитела.
Человеческое антитело, которое является продуктом или выведено из конкретной последовательности иммуноглобулина человеческой зародышевой линии, может иметь различия в аминокислотах по сравнению с последовательностью зародышевой линии, например, в результате встречающихся в естественных условиях соматических мутаций или искусственных сайтнаправленных мутаций. Однако в каркасных участках VH или VL аминокислотная последовательность отобранного человеческого антитела, как правило, по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности, кодируемой геном иммуноглобулина человеческой зародышевой линии, и содержит аминокислотные остатки, которые свидетельствуют о том, что человеческое антитело является человеческим, при сравнении с аминокислотными последовательностями иммуноглобулинов зародышевых линий других видов (например, последовательности мышиной зародышевой линии). В определенных случаях аминокислотная последовательность человеческого антитела может быть по меньшей мере на 60, 70, 80, 90% или по меньшей мере на 95% или даже по меньшей мере на 96, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности, кодируемой геном иммуноглобулина зародышевой линии. Как правило, рекомбинантное человеческое антитело должно иметь не более 10 аминокислотных различий по сравнению с аминокислотной последовательностью, кодируемой геном иммуноглобулина человеческой зародышевой линии, в каркасных участках VH или VL. В некоторых случаях антитело может отличаться не более чем на 5 или даже не более чем на 4, 3, 2 или 1 аминокислоту от аминокислотной последовательности, кодируемой геном иммуноглобулина зародышевой линии. Различные полученные из зародышевых линий версии с использованием последовательностей зародышевой линии VH и VL для репрезентативного количества антител к HER3 представлены в табл. 2, где нумерация соответствует системе Кэбота. Положения CDR выделены жирным шрифтом. Условные обозначения, примененные в таблицах для последовательностей зародышевых линий, представляют собой: MOR10701-VH_3-07 обозначает CDR-петли MOR10701 в каркасных участках последовательности зародышевой линии VH 3-07 (номенклатура согласно Vbase), MOR10703-VK_L1 обозначает CDR из MOR10703 в зародышевых каркасных участках из VK_L1, где VK обозначает легкую каппа-цепь.
- 42 036314
Таблица 2. Различные полученные из зародышевых линий версии отобранной группы репрезентативных антител
SEQ ID NO: Обозначение последовательности Аминокислотная последовательность
VH-область MOR10701
SEQ ID NO: 380 MOR10701-VH3-07 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV AVTGAVGRSTYYPDSVKGRFTISRflHKKNSLYLQMNSLRAEDTAVYY CARWGDEGFDI
SEQ ID NO: 381 MOR10701-VH3-09 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV SVTGAVGRSTYYPDSVKGRFTISRflHKKNSLYLQMNSLRAEDTALYYC AKWGDEGFDI
SEQ ID NO: 382 MOR10701-VH3-11 QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWIRQAPGKGLEWV SVTGAVGRSTYYPDSVKGRFTISRflHKKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYC ARWGDEGFDI
SEQ ID NO: 383 MOR10701-VH3-13 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQATGKGLEWV SVTGAVGRSTYYPDSVKGRFTISRENAKNSLYLQMNSLRAGDTAVYYC ARWGDEGFDI
SEQ ID NO: 384 MOR10701-VH3-15 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV GVTGAVGRSTYYPDSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYC TTWGDEGFDI
SEQ ID NO: 385 MOR10701-VH3-20 EVQLVESGGGVVRPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV SVTGAVGRSTYYPDSVKGRFTISRflHKKNSLYLQMNSLRAEDTALYHC ARWGDEGFDI
SEQ ID NO: 386 MOR10701-VH3-21 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV SVTGAVGRSTYYPDSVKGRFTISRflHKKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYC ARWGDEGFDI
SEQ ID NO: 387 MOR10701-VH3-23 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV SVTGAVGRSTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC AKWGDEGFDI
SEQ ID NO: 388 MOR10701-VH3-30 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEW VAVTGAVGRSTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVY YCAKWGDEGFDI
SEQ ID NO: 389 MOR10701-VH3-30.3 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEW VAVTGAVGRSTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVY YCARWGDEGFDI
SEQ ID NO: 390 MOR10701-VH3-30.5 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEW VAVTGAVGRSTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVY YCAKWGDEGFDI
SEQ ID NO: 391 MOR10701-VH3-33 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEW VAVTGAVGRSTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVY YCARWGDEGFDI
SEQ ID NO: 392 MOR10701-VH3-43 EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEW VSVTGAVGRSTYYPDSVKGRFTISRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYY CAKWGDEGFDI
SEQ ID NO: 393 MOR10701-VH3-48 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV SVTGAVGRSTYYPDSVKGRFTISRflHKKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYC ARWGDEGFDI
SEQ ID NO: 394 MOR10701-VH3-49 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFSSYAMSWFRQAPGKGLEWV GVTGAVGRSTYYPDSVKGRFTISRDGSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYC TRWGDEGFDI
SEQ ID NO: 395 MOR10701-VH3-53 EVQLVETGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV SVTGAVGRSTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC ARWGDEGFDI
SEQ ID NO: 396 MOR10701-VH3-64 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEYV SVTGAVGRSTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMGSLRAEDMAVYY CARWGDEGFDI
SEQ ID NO: 397 MOR10701-VH3-66 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV SVTGAVGRSTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC ARWGDEGFDI
- 43 036314
SEQ ID NO: 398 MOR10701-VH3-72 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV GVTGAVGRSTYYPDSVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYC ARWGDEGFDI
SEQ ID NO: 399 MOR10701-VH3-73 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQASGKGLEWV GVTGAVGRSTYYPDSVKGRFTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYY CTRWGDEGFDI
SEQ ID NO: 400 MOR10701-VH3-74 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLVW VSVTGAVGRSTYYPDSVKGRFTISRflHKKNTLYLQMNSLRAEDTAVYY C ARWGDEGFDI
SEQ ID NO: 401 MOR10701-VH_3-d EVQLVESRGVLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV SVTGAVGRSTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLHLQMNSLRAEDTAVYYC KKWGDEGFDI
VH-область MOR10703
SEQ ID NO: 402 MOR10703-VH3-07 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV AAINSQGKSTYYADSVKGRFTISRflHKKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYC ARWGDEGFDI
SEQ ID NO: 403 MOR10703-VH3-09 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV SAINSQGKSTYYADSVKGRFTISRflHKKNSLYLQMNSLRAEDTALYYC AKWGDEGFDI
SEQ ID NO: 404 MOR10703-VH3-U QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWIRQAPGKGLEWV SAINSQGKSTYYADSVKGRFTISRflHKKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYC ARWGDEGFDI
SEQ ID NO: 405 MOR10703-VH3-13 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQATGKGLEWV SAINSQGKSTYYADSVKGRFTISRENAKNSLYLQMNSLRAGDTAVYYC ARWGDEGFDI
SEQ ID NO: 406 MOR10703-VH3-15 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV GAINSQGKSTYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYC TTWGDEGFDI
SEQ ID NO: 407 MOR10703-VH3-20 EVQLVESGGGVVRPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV SAINSQGKSTYYADSVKGRFTISRflHKKNSLYLQMNSLRAEDTALYHC ARWGDEGFDI
SEQ ID NO: 408 MOR10703-VH3-21 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV SAINSQGKSTYYADSVKGRFTISRflHKKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYC ARWGDEGFDI
SEQ ID NO: 409 MOR10703-VH3-23 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV SAINSQGKSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC AKWGDEGFDI
SEQ ID NO: 410 MOR10703-VH3-30 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEW VAAINSQGKSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYY CAKWGDEGFDI
SEQ ID NO: 411 MOR10703-VH3-30.3 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEW VAAINSQGKSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYY CARWGDEGFDI
SEQ ID NO: 412 MOR10703-VH3-30.5 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEW VAAINSQGKSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYY CAKWGDEGFDI
SEQ ID NO: 413 MOR10703-VH3-33 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEW VAAINSQGKSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYY CARWGDEGFDI
SEQ ID NO: 414 MOR10703-VH3-43 EVQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEW VSAINSQGKSTYYADSVKGRFTISRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYY CAKWGDEGFDI
SEQ ID NO: 415 MOR10703-VH3-48 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV SAINSQGKSTYYADSVKGRFTISRflHKKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYC ARWGDEGFDI
SEQ ID NO: 416 MOR10703-VH3-49 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFSSYAMSWFRQAPGKGLEWV GAINSQGKSTYYADSVKGRFTISRDGSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYC TRWGDEGFDI
SEQ ID NO: 417 MOR10703-VH3-53 EVQLVETGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV SAINSQGKSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC ARWGDEGFDI
SEQ ID NO: 418 MOR10703-VH3-64 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEYV SAINSQGKSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMGSLRAEDMAVYYC ARWGDEGFDI
- 44 036314
SEQ ID NO: 419 MOR10703-VH3-66 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV SAINSQGKSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC ARWGDEGFDI
SEQ ID NO: 420 MOR10703-VH3-72 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV GAINSQGKSTYYADSVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYC ARWGDEGFDI
SEQ ID NO: 421 MOR10703-VH3-73 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQASGKGLEWV GAINSQGKSTYYADSVKGRFTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYC TRWGDEGFDI
SEQ ID NO: 422 MOR10703-VH3-74 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLVW VSAINSQGKSTYYADSVKGRFTISRflHKKNTLYLQMNSLRAEDTAVYY CARWGDEGFDI
SEQ ID NO: 423 MOR10703-VH_3-d EVQLVESRGVLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV SAINSQGKSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLHLQMNSLRAEDTAVYYC KKWGDEGFDI
VK-область MOR10701
SEQ ID NO: 424 MOR10701-VKI 012 (такая же как MOR 10701 wt) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIY GASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSFPTT
SEQ ID NO: 425 MOR10701-VKI 02 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIY GASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSFPTT
SEQ ID NO: 426 MOR10701-VKI 018 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIY GASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYSSFPTT
SEQ ID NO: 427 MOR10701-VKI 08 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIY GASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYSSFPTT
SEQ ID NO: 428 MOR10701-VKIA20 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKVPKLLIY GASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQYSSFPTT
SEQ ID NO: 429 MOR10701-VKIA30 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKRLIY GASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSFPTT
SEQ ID NO: 430 MOR10701-VKIL14 NIQMTQSPSAMSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWFQQKPGKVPKHLI YGASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSFPTT
SEQ ID NO: 431 MOR10701-VKIL1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWFQQKPGKAPKSLIY GASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSFPTT
SEQ ID NO: 432 MOR10701-VKIL15 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPEKAPKSLIY GASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSFPTT
SEQ ID NO: 433 MOR10701-VKIL4 AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIY GASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSFPTT
SEQ ID NO: 434 MOR10701-VKIL18 AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIY GASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSFPTT
SEQ ID NO: 435 MOR10701-VKIL5 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIY GASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSFPTT
SEQ ID NO: 436 MOR10701-VKIL19 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIY GASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSFPTT
SEQ ID NO: 437 MOR10701-VKIL8 DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIY GASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSFPTT
SEQ ID NO: 438 MOR10701-VKIL23 AIRMTQSPFSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPAKAPKLFIY GASSLQSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSFPTT
SEQ ID NO: 439 MOR10701-VKIL9 AIRMTQSPSSFSASTGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIY GASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISCLQSEDFATYYCQQYSSFPTT
SEQ ID NO: 440 MOR10701-VKI_L24 VIWMTQSPSLLSASTGDRVTISCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPELLIY GASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISCLQSEDFATYYCQQYSSFPTT
SEQ ID NO: 441 MOR10701-VKILU AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIY GASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSFPTT
SEQ ID NO: 442 MOR10701-VKIL12 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIY GASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYSSFPTT
VK-область MOR10701
SEQ ID NO: 443 MOR10703-VKIO12 (такая же как MOR10703 wt) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIY GASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSFPTT
SEQ ID NO: 444 MOR10703-VKIO2 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIY GASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSFPTT
SEQ ID NO: 445 MOR10703-VKI 018 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIY GASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYSSFPTT
SEQ ID NO: 446 MOR10703-VKI 08 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIY GASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYSSFPTT
- 45 036314
SEQ ID NO: 447 MOR10703-VKIA20 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKVPKLLIY GASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQYSSFPTT
SEQ ID NO: 448 MOR10703-VKIA30 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKRLIY GASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSFPTT
SEQ ID NO: 449 MOR10703-VKIL14 NIQMTQSPSAMSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWFQQKPGKVPKHLI YGASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSFPTT
SEQ ID NO: 450 MOR10703-VKIL1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWFQQKPGKAPKSLIY GASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSFPTT
SEQ ID NO: 451 MOR10703-VKIL15 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPEKAPKSLIY GASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSFPTT
SEQ ID NO: 452 MOR10703-VKIL4 AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIY GASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSFPTT
SEQ ID NO: 453 MOR10703-VKIL18 AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIY GASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSFPTT
SEQ ID NO: 454 MOR10703-VKIL5 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIY GASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSFPTT
SEQ ID NO: 455 MOR10703-VKIL19 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIY GASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSFPTT
SEQ ID NO: 456 MOR10703-VKIL8 DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIY GASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSFPTT
SEQ ID NO: 457 MOR10703-VKIL23 AIRMTQSPFSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPAKAPKLFIY GASSLQSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSFPTT
SEQ ID NO: 458 MOR10703-VKIL9 AIRMTQSPSSFSASTGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIY GASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISCLQSEDFATYYCQQYSSFPTT
SEQ ID NO: 459 MOR10703-VKIL24 VIWMTQSPSLLSASTGDRVTISCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPELLIY GASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISCLQSEDFATYYCQQYSSFPTT
SEQ ID NO: 460 MOR10703-VKIL11 AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIY GASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSFPTT
SEQ ID NO: 461 MOR10703-VKI_L12 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIY GASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYSSFPTT
Таблица 3. JH-сегменты
SEQ ID NO: 462 JH1 WGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 463 JH2 WGRGTLVTVSS
SEQ ID NO: 464 JH3 WGQGTMVTVSS
SEQ ID NO: 465 JH4 WGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 466 JH5 WGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 467 JH6 WGQGTTVTVSS
Таблица 4. JK-сегменты
SEQ ID NO 468 JK1 FGQGTKVEIK
SEQ ID NO 469 JK2 FGQGTKLEIK
SEQ ID NO 470 JK3 FGPGTKVDIK
SEQ ID NO 471 JK4 FGGGTKVEIK
SEQ ID NO 472 JK5 FGQGTRLEIK
Можно использовать любую комбинацию последовательностей, полученных из зародышевых последовательностей VH, с JH-сегментами. Репрезентативные примеры комбинаций представлены в табл. 5.
Таблица 5. Репрезентативные примеры комбинаций последовательностей, полученных из зародышевых последовательностей VH, с JH-сегментами.
SEQ ID NO: 473 MOR 10701 -VH 315JH1 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGL EWVGVTGAVGRSTYYPDSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTE DTAVYYCTTWGDEGFDI WGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 474 MOR 10701-VH315JH3 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGL EWVGVTGAVGRSTYYPDSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTE DTAVYYCTTWGDEGFDI WGQGTMVTVSS
SEQ ID NO: 475 MOR10703-VH3- 15 JH1 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGL EWVGAINSQGKSTYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTE DTAVYYCTTWGDEGFDI WGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 476 MOR10703-VH315JH3 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGL EWVGAINSQGKSTYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTE DTAVYYCTTWGDEGFDI WGQGTMVTVSS
Можно использовать любую комбинацию последовательностей, полученных из зародышевых последовательностей VL, с JK-сегментами. Репрезентативные примеры комбинаций представлены в табл. 6.
- 46 036314
Таблица 6, Репрезентативные примеры комбинаций последовательностей, полученных из зародышевых последовательностей VK, с JK-сегментами
SEQ ID NO: 477 MOR10701- VKIO2JK1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKL LIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSF PTTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO: 478 MOR10701- VKIO2JK4 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKL LIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSF PTTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO: 479 MOR10703- VKIA20JK4 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKVPKL LIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQYSS FPTTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO: 480 MOR10703- VKIA20JK1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKVPKL LIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQYSS FPTTFGQGTKVEIK
При объединении VH с JH, и VK с JK, можно использовать любую комбинацию VH или JH с VK или JK. Для каждого антитела любую из полученных из зародышевой линии областей VH можно объединять с любой из полученных из зародышевой линии областей VK (VL). Некоторое количество репрезентативных примеров комбинаций представлено в табл. 7.
Таблица 7. Репрезентативные примеры комбинаций, полученных из зародышевых линий последовательностей
Комбинация 1
SEQ ID NO: 481 MOR10701-VH 315JH3 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGL EWVGVTGAVGRSTYYPDSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTED TAVYYCTTWGDEGFDIWGQGTMVTVSS
SEQ ID NO: 482 SEQ ID NO: 483 SEQ ID NO: 484 MOR10701- VKIA30JK4 Комбинация 2 MOR 10701-VH330JH1 MOR10701- VKI LI JK2 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPK RLIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSS FPTTFGGGTKVEIK QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGL EWVAVTGAVGRSTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAE DTAVYYCAKWGDEGFDIWGQGTLVTVSS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWFQQKPGKAPKS LIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSF PTTFGQGTKLEIK
Комбинация 3
SEQ ID NO: 485 MOR10701-VH3- 30JH2 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGL EWVAVTGAVGRSTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAE DTAVYYCAKWGDEGFDIWGRGTLVTVSS
SEQ ID NO: 486 MOR10701- VKIL1JK2 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWFQQKPGKAPKS LIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSF PTTFGQGTKLEIK
Комбинация 4
SEQ ID NO: 487 MOR10703-VH320JH5 EVQLVESGGGVVRPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGL EWVSAINSQGKSTYYADSVKGRFTISRДHKKNSLYLQMNSLRAED TALYHCARWGDEGFDIWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 488 MOR10703- VKIL15JK3 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPEKAPKS LIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSF PTTFGPGTKVDIK
Комбинация 5
SEQ ID NO: 489 MOR10703-VH3- 3 3JH2 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGL EWVAAINSQGKSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED TAVYYCARWGDEGFDIWGRGTLVTVSS
SEQ ID NO: 490 MOR10703- VKI A20 JK1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKVPKL LIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQYSS FPTTFGQGTKVEIK
Комбинация 6
SEQ ID NO: 491 MOR10703-VH3- 3 3JH3 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGL EWVAAINSQGKSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED TAVYYCARWGDEGFDIWGQGTMVTVSS
SEQ ID NO: 492 MOR10703- VKIA20JK2 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKVPKL LIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQYSS FPTTFGQGTKLEIK
Вариабельная область тяжелой цепи может содержать последовательность Xaa-H1CDR1-Xaa2HCDR2-Xaa3-HCDR3-Xaa4, в которой HCDR1, HCDR2, HCDR3 тяжелой цепи представляют собой любые CDR тяжелой цепи, выбранные из представленных в табл. 1 и 2. Последовательность может представлять собой следующую последовательность, приведенную только с целью иллюстрации:
Xaa1 - SYAMS - Xaa2 - AINSQGKSTYYADSVKG - Xaa3 - WGDEGFDI - Xaa4 (SEQ ID NO: 493), в которой Xaa1 обозначает каркасный участок, состоящий из любых 30 аминокислот;
Xaa2 обозначает каркасный участок, состоящий из любых 14 аминокислот;
Xaa3 обозначает каркасный участок, состоящий из любых 32 аминокислот;
- 47 036314
Xaa4 обозначает каркасный участок, состоящий из любых 11 аминокислот.
Вариабельная область легкой цепи может содержать последовательность Xaa1-LCDR1-Xaa2LCDR2-Xaa3-LCDR3-Xaa4, в которой LCDR1, LCDR2, LCDR3 легкой цепи представляют собой любые
CDR легкой цепи, выбранные из представленных в табл. 1 и 2. Последовательность может представлять собой следующую последовательность, приведенную только с целью иллюстрации:
Xaa1 - RASQGISNWLA - Xaa2 - GASSLQS - Xaa3 - QQYSSFPTT - Xaa4 (SEQ ID NO: 494), в которой Xaa1 обозначает каркасный участок, состоящий из любых 23 аминокислот;
Xaa2 обозначает каркасный участок, состоящий из любых 15 аминокислот;
Xaa3 обозначает каркасный участок, состоящий из любых 32 аминокислот; и
Xaa4 обозначает каркасный участок, состоящий из любых 10 аминокислот.
Антитела, можно выводить из одноцепочечных антител, димерных антител (диабоди), доменных антител, нанотел (нанободи) и юнибоди (антитела, сознанные с помощью технологии UniBody™). Одноцепочечное антитело (scFv) состоит из одной полипептидной цепи, содержащей VL-область, связанную с VH-областью, в которой пара VL-область и VH-область образуют одновалентную молекулу. Одноцепочечное антитело можно получать с помощью методов, известных в данной области (см., например, Bird и др., Science 242, 1988, сс. 423-426 и Huston и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 1988, сс. 58795883). Димерное (disbud) антитело состоит из двух цепей, при этом каждая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи, соединенную с вариабельной областью легкой цепи на одной и той же полипептидной цепи, которые связаны коротким линкером, при этом две области на одной и той же цепи не спарены друг с другом, но спарены с комплементарными областями на другой цепи с образованием биспецифической молекулы. Методы получения димерных антител известны в данной области (см., например, Holliger и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1993, сс. 6444-6448; Poljak и др., Structure 2, 1994, сс. 1121-1123). Доменные антитела (dAb) представляют собой небольшие функциональные связывающие единицы антител, соответствующие вариабельным областям либо тяжелых, либо легких цепей антител. Доменные антитела легко экпрессировать в системах клеток бактерий, дрожжей и млекопитающих. Дополнительные сведения о доменных антитела и методах их получения известны в данной области (см., например, US № 6291158; 6582915; 6593081; 6172197; 6696245; европейские патенты 0368684 и 0616640; WO 05/035572, WO 04/101790, WO 04/081026, WO 04/058821, WO 04/003019 и WO 03/002609). Нанотела выводят из тяжелых цепей антитела. Нанотело, как правило, состоит из одного вариабельного домена и двух константных доменов (CH2 и CH3) и сохраняет антигенсвязывающую способность исходного антитела. Нанотела можно получать с помощью методов, известных в данной области (см., например, US № 6765087, US № 6838254, WO 06/079372). Юнибоди состоят из одной легкой цепи и одной тяжелой цепи антитела изотипа IgG4. Юнибоди можно получать путем удаления шарнирной области антитела изотипа IgG4. Дополнительные сведения о юнибоди и методах их получения можно почерпнуть из WO 2007/059782.
Г омологичные антитела
Антитело или его фрагмент может содержать аминокислотные последовательности, гомологичные последовательностям, которые представлены в табл. 1, и антитело связывается с белком HER3 (например, с HER3 человека и/или обезьяны циномолгус) и сохраняет требуемые функциональные свойства антител, представленных в табл. 1.
Например, выделенное моноклональное антитело (или его функциональный фрагмент) может содержать вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 15, 33, 51, 69, 87, 105, 123, 141, 159, 177, 195, 213, 231, 249, 267, 285, 303, 321, 339, 357 и 375; вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 14, 32, 50, 68, 86, 104, 122, 140, 158, 176, 194, 212, 230, 248, 266, 284, 302, 320, 338, 356 и 374; антитело связывается с белком HER3 (например, с HER3 человека и/или обезьяны циномолгус) и нейтрализует сигнальную активность HER3, что можно измерять с помощью анализа фосфорилирования или по другим показателям, свидетельствующим о передаче сигналов HER (например, анализы фосфо-HER3, анализы фосфо-Akt, анализы клеточной пролиферации и блокады лиганда, которые описаны в разделе Примеры). Нуклеотидные последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепи родительского антитела и последовательности полноразмерных тяжелых и легких цепей могут быть оптимизированы для экспрессии в клетках млекопитающих. Другие антитела могут содержать аминокислоты или нуклеиновые кислоты, измененные в результате мутаций, но которые все еще идентичны по меньшей мере на 60, 70, 80, 90, 95 или 98% указанным выше последовательностям. Некоторые антитела могут включать мутантные аминокислотные последовательности, в которых не более 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот изменены в результате мутаций, таких как делеция, инсерция или замена аминокислот, в вариабельных областях по сравнению с вариабельными областями, представленными в указанных выше последовательностях.
- 48 036314
Аминокислотные последовательности VH и/или VL могут быть на 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичными последовательностям, представленным в табл. 1. Аминокислотные последовательности VH и/или VL могут быть идентичны за исключением аминокислотных замен, затрагивающих не более чем 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотных положений. Антитело, содержащее VH- и VL-области, обладающие высокой (т.е. 80% или более) идентичностью VH- и VL-областям антител, описанным в табл. 1, можно получать путем мутагенеза (например, сайтнаправленного или опосредуемого ПЦР мутагенеза) с последующим тестированием кодируемого измененного антитела в отношении сохранения функции с помощью приведенных в настоящем описании функциональных анализов.
Нуклеотидные последовательности вариабельных областей тяжелой цепи и/или легкой цепи могут быть на 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичны указанным выше последовательностям.
В контексте настоящего описания процент идентичности между двумя последовательностями является функцией количества идентичных положений в последовательностях (т.е. % идентичности обозначает количество идентичных положений/общее количество положений х 100), принимая во внимание количество брешей и длину каждой бреши, которую необходимо интродуцировать для оптимального выравнивания двух последовательностей.
Сравнение последовательностей и определение процента идентичности двух последовательностей можно осуществлять с помощью описанного ниже в примерах математического алгоритма (но, не ограничиваясь только им).
Белковые последовательности, можно применять также в качестве запрашиваемой последовательности при осуществлении поиска в доступных научной общественности базах данных, например, в отношении идентичности с родственными последовательностями. Такой поиск можно осуществлять с использованием программы BLAST (версия 2.0), разработанной Altschul и др., J.Mol. Biol. 215, 1990, сс. 403-410.
Антитела с консервативными модификациями
Антитело может иметь вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, и вариабельную область легкой цепи, которая содержит последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, где одна или нескольких указанных последовательностей CDR представляют собой специфические аминокислотные последовательности, или их консервативные модификации, и где антитела сохраняют требуемые функциональные свойства HER3-связывающих антител.
Выделенное моноклональное антитело к HER3 или его фрагмент может состоять из вариабельной области тяжелой цепи, которая содержит последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, и вариабельной области легкой цепи, которая содержит последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, где: аминокислотные последовательности CDR1 вариабельной области тяжелой цепи выбирают из группы, которая включает SEQ ID NO: 2, 8, 20, 26, 38, 44, 56, 62, 74, 80, 92, 98, 110, 116, 128, 134, 146, 152, 164, 170, 182, 188, 200, 206, 218, 224, 236, 242, 254, 260, 272, 278, 290, 296, 308, 314, 326, 332, 344, 350, 362 и 368 и их консервативные модификации; аминокислотные последовательности CDR2 вариабельной области тяжелой цепи выбирают из группы, которая включает SEQ ID NO: 3, 9, 21, 27, 39, 45, 57, 63, 75, 81, 93, 99, 111, 117, 129, 135, 147, 153, 165, 171, 183, 189, 201, 207, 219, 225, 237, 243, 255, 261, 273, 279, 291, 297, 309, 315, 327, 333, 345, 351, 363 и 369 и их консервативные модификации; аминокислотные последовательности CDR3 вариабельной области тяжелой цепи выбирают из группы, которая включает SEQ ID NO: 4, 10, 22, 28, 40, 46, 58, 64, 76, 82, 94, 100, 112, 118, 130, 136, 148, 154, 166, 172, 184, 190, 202, 208, 220, 226, 238, 244, 256, 262, 274, 280, 292, 298, 310, 316, 328, 334, 346, 352, 364 и 370 и их консервативные модификации; аминокислотные последовательности CDR1 вариабельной области легкой цепи выбирают из группы, которая включает SEQ ID NO: 5, 11, 23, 29, 41, 47, 59, 65, 77, 83, 95, 101, 113, 119, 131, 137, 149, 155, 167, 173, 185, 191, 203, 209, 221, 227, 239, 245, 257, 263, 275, 281, 293, 299, 311, 317, 329, 335, 347, 353, 365 и 371 и их консервативные модификации; аминокислотные последовательности CDR2 вариабельной области легкой цепи выбирают из группы, которая включает SEQ ID NO: 6, 12, 24, 30, 42, 48, 60, 66, 78, 84, 96, 102, 114, 120, 132, 138, 150, 156, 168, 174, 186, 192, 204, 210, 222, 228, 240, 246, 258, 264, 276, 282, 294, 300, 312, 318, 330, 336, 348, 354, 366 и 372 и их консервативные модификации; аминокислотные последовательности CDR3 вариабельной области легкой цепи выбирают из группы, которая включает SEQ ID NO: 7, 13, 25, 31, 43, 49, 61, 67, 79, 85, 97, 103, 115, 121, 133, 139, 151, 157, 169, 175, 187, 193, 205, 211, 223, 229, 241, 247, 259, 265, 277, 283, 295, 301, 313, 319, 331, 337, 349, 355, 367 и 373 и их консервативные модификации; где антитело или его фрагмент специфически связывается с HER3 и нейтрализует активность HER3 путем ингибирования пути передачи сигнала HER, что можно измерять с помощью анализа фосфорилирования или по другим показателям, свидетельствующим о передаче сигнала HER (например, анализы фосфо-HER3, анализы фосфо-Akt, анализы клеточной пролиферации и блокады лиганда, которые описаны в разделе Примеры).
Антитела, которые связываются с тем же эпитопом антитела, которые взаимодействуют (например, путем связывания, создания стерической помехи, стабилизации/дестабилизации, пространственного распределения) с тем же эпитопом, что и HER3-связывающие антитела, представлены в табл. 1 и указаны на фиг. 7. Так, дополнительные антитела можно идентифицировать по их способности к перекрестной кон
- 49 036314 куренции (например, к статистически значимому конкурентному ингибированию связывания) с другими антителами, с помощью анализов связывания HER3. Способность тестируемого антитела ингибировать связывание антител с белком HER3 (например, HER3 человека и/или обезьяны циномолгус) свидетельствует о том, что тестируемое антитело может конкурировать с указанным антителом за связывание с HER3; согласно одной из возможных теорий такое антитело может связываться с тем же или родственным (например, структурно подобным или находящимся в пространственной близости) эпитопом на белке HER3, что и антитело, с которым оно конкурирует. Антитело, которое связывается с тем же эпитопом на HER3, может представлять собой человеческое моноклональное антитело. Указанные человеческие моноклональные антитела можно получать и выделять согласно представленным в настоящем описании методам.
Антитело или его фрагмент может связываться как с доменом 2, так и с доменом 4 HER3, поддерживая тем самым HER3 в неактивной конформации, которая препятствует экспонированию петли димеризации, присутствующей в домене 2. Это препятствует гетеродимеризации с другими представителями семейства, такими как HER1, HER2 и HER4. Антитела или их фрагменты ингибируют как зависимую от лиганда, так и независимую от лиганда трансдукцию сигнала HER3.
Антитело или его фрагмент может связываться как с доменом 2, так и с доменом 4 HER3, но не блокирует одновременное связывание лиганда HER3, такого как нейрегулин. Не вдаваясь в какую-либо теорию, можно предположить, что антитело или его фрагмент связывается как с доменом 2, так и с доменом 4 HER3, поддерживая тем самым HER3 в неактивной конформации, но, не блокируя сайт связывания лиганда на HER3. В результате лиганд HER3 (например, нейрегулин) обладает способностью связываться с HER3 одновременно с антителом или его фрагментом.
Антитела или их фрагменты могут ингибировать как зависимую от лиганда, так и независимую от лиганда активацию HER3, не препятствуя связыванию лиганда. Это рассматривается как преимущество по следующим причинам:
I) терапевтическое антитело может найти клиническое применение в отношении более широкого спектра опухолей, чем антитело, направленное только на один механизм активации HER3 (т.е. зависимой от лиганда или независимой от лиганда), поскольку каждый механизм обусловливает различные типы опухолей;
(II) терапевтическое антитело может обладать эффективностью в отношении разных типов опухолей, при которых одновременно участвуют оба механизма активации HER3. Антитело, направленное только на один механизм активации HER3 (т.е. зависимой от лиганда или независимой от лиганда), должно обладать меньшей эффективностью или не обладать эффективностью в отношении этих типов опухолей;
(III) на эффективность антитела, которое ингибирует зависимую от лиганда активацию HER3, не препятствуя при этом связыванию лиганда, с меньшей вероятностью будет оказывать вредное воздействие возрастающие концентрации лиганда. Это может приводить либо к повышенной эффективности в отношении типа опухоли, вызываемой очень высокими концентрациями лиганда HER3, либо к пониженной предрасположенности к развитию устойчивости к лекарственным средствам в том случае, когда устойчивость опосредована повышающей регуляцией лигандов HER3;
(IV) антитело, которое ингибирует активацию HER3 путем стабилизации неактивной формы, должно быть менее подвержено к устойчивости к лекарственным средствам, связанными с альтернативными механизмами активации HER3.
Следовательно, такие антитела можно применять для лечения состояний, в отношении которых существующие в настоящее время терапевтические антитела являются клинически неэффективными.
Сконструированные и модифицированные антитела
Антитело можно получать также с использованием антитела, которое имеет одну или несколько указанных в настоящем описании последовательностей VH и/или VL, в качестве исходного материала для создания модифицированного антитела, где модифицированное антитело может иметь измененные свойства по сравнению с исходным антителом. Антитело можно создавать путем модификации одного или нескольких остатков в одной или обеих вариабельных областях (т.е. VH и/или VL), например в одном или нескольких CDR-участках и/или в одном или нескольких каркасных участках. В дополнительном или альтернативном варианте антитело можно создавать путем модификации остатков в константной(ых) области(ях), например, для изменения эффекторной(ых) функции(ий) антитела.
Для осуществления одного из типов конструирования вариабельной области можно применять трансплатацию CDR. Антитела взаимодействуют с антигенами-мишенями в основном посредством аминокислотных остатков, локализованных в шести гипервариабельных участках (CDR) тяжелой и легкой цепи. По этой причине между аминокислотными остатками в CDR индивидуальных антител существуют более значительные различия, чем в последовательностях вне CDR. Поскольку последовательности CDR ответственны за большую часть взаимодействий антитело-антиген, можно экспрессировать рекомбинантные антитела, которые имитируют свойства конкретных встречающихся в естественных условиях антител, путем конструирования экспрессионных векторов, которые содержат последовательности CDR из конкретного встречающегося в естественных условиях антитела, полученные путем трансплантации в
- 50 036314 последовательности каркасных участков из других антител с другими свойствами (см., например, Riechmann и др., Nature 332, 1998, сс. 323-327; Jones и др., Nature, 321, 1986, сс. 522-525; Queen и др., Proc.
Natl. Acad. See. U.S.A. 86, 1989, сс. 10029-10033; US № 5225539 на имя Winter и US №№ 5530101;
5585089; 5693762 и 6180370 на имя Queen с соавторами).
Таким образом, выделенное HER3-связывающее моноклональное антитело или его фрагмент может содержать вариабельную область тяжелой цепи, включающую последовательности CDR1, которые имеют аминокислотные последовательности, выбранные из группы, включающей SEQ ID NO: 2, 8, 20, 26, 38, 44, 56, 62, 74, 80, 92, 98, 110, 116, 128, 134, 146, 152, 164, 170, 182, 188, 200, 206, 218, 224, 236, 242, 254, 260, 272, 278, 290, 296, 308, 314, 326, 332, 344, 350, 362 и 368; последовательности CDR2, которые имеют аминокислотные последовательности, выбранные из группы, включающей SEQ ID NO: 3, 9, 21, 27, 39, 45, 57, 63, 75, 81, 93, 99, 111, 117, 129, 135, 147, 153, 165, 171, 183, 189, 201, 207, 219, 225, 237, 243, 255, 261, 273, 279, 291, 297, 309, 315, 327, 333, 345, 351, 363 и 369; последовательности CDR3, которые имеют аминокислотные последовательности, выбранные из группы, включающей SEQ ID NO: 4, 10, 22, 28, 40, 46, 58, 64, 76, 82, 94, 100, 112, 118, 130, 136, 148, 154, 166, 172, 184, 190, 202, 208, 220, 226, 238, 244, 256, 262, 274, 280, 292, 298, 310, 316, 328, 334, 346, 352, 364 и 370 соответственно; вариабельную область легкой цепи, включающую последовательности CDR1, которые имеют аминокислотные последовательности, выбранные из группы, включающей SEQ ID NO: 5, 11, 23, 29, 41, 47, 59, 65, 77, 83, 95, 101, 113, 119, 131, 137, 149, 155, 167, 173, 185, 191, 203, 209, 221, 227, 239, 245, 257, 263, 275, 281, 293, 299, 311, 317, 329, 335, 347, 353, 365 и 371; последовательности CDR2, которые имеют аминокислотные последовательности, выбранные из группы, включающей SEQ ID NO: 6, 12, 24, 30, 42, 48, 60, 66, 78, 84, 96, 102, 114, 120, 132, 138, 150, 156, 168, 174, 186, 192, 204, 210, 222, 228, 240, 246, 258, 264, 276, 282, 294, 300, 312, 318, 330, 336, 348, 354, 366 и 372; и последовательности CDR3, которые имеют аминокислотные последовательности, выбранные из группы, включающей SEQ ID NO: 7, 13, 25, 31, 43, 49, 61, 67, 79, 85, 97, 103, 115, 121, 135, 139, 151, 157, 169, 175, 187, 193, 205, 211, 223, 229, 241, 247, 259, 265, 277, 283, 295, 301, 313, 319, 331, 337, 349, 355, 367 и 373 соответственно. Таким образом, указанные антитела содержат последовательности CDR VH и VL моноклональных антител, кроме того, они могут содержать различные последовательности каркасных участков указанных антител. Указанные последовательности каркасных участков можно получать из публичных баз данных ДНК или опубликованных ссылок, которые содержат последовательности генов зародышевой линии антител. Например, последовательности ДНК генов зародышевой линии вариабельных областей человеческих тяжелых и легких цепей можно найти в базе данных последовательностей человеческой зародышевой линии Vbase (доступной в Интернете на сайте www.mrnc-cpe.cam.ac.uk/vbase), а также у Kabat E. А. и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 1991, 15-oe изд., изд-во U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 913242; Chothia и др., J. Mol. Biol. 196, 1987, сс. 901-917; Chothia и др., Nature 342, 1989, сс. 877-883; и AlLazikani и др., J. Mol. Biol. 273, 1997, сс. 927-948; Tomlinson и др., J. fol. Biol. 227, 1992, сс. 776-798; и Cox и др., Eur. J Immunol. 24, 1994, сс. 827-836; содержание каждой из публикаций специально включено в настоящее описание в качестве ссылки.
Примером последовательностей каркасных участков, предназначенных для применения в антителах, являются последовательности, структурно подобные последовательностям каркасных участков, которые входят в отобранные антитела, например консенсусные последовательности и/или последовательности каркасных участков, которые входят в моноклональные антитела. Последовательности CDR1, 2 и 3 VH и последовательности CDR1, 2 и 3 VL можно трансплантировать в каркасные участки, которые имеют последовательность, идентичную последовательности гена иммуноглобулина зародышевой линии, из которого выведена последовательность каркасного участка, или последовательности CDR можно трансплантировать в каркасные участки, которые содержат одну или несколько мутаций по сравнению с последовательностями зародышевой линии. Например, было установлено, что в определенных случаях целесообразно изменять посредством мутации остатки в каркасных участках для поддержания или повышения способности антитела связываться с антигеном (см., например, US № 5530101; 5585089; 5693762 и 6180370 на имя Queen с соавторами).
Другим типом модификации вариабельной области является мутация аминокислотных остатков в CDR1, CDR2 и/или CDR3 VH- и/или VL-областей, которая повышает одну или несколько способностей к связыванию (например, аффинность) представляющего интерес антитела, что называют созреванием аффинности. Для интродукции мутации(й) можно применять сайтнаправленный мутагенез или ПЦРопосредуемый мутагенез, и воздействия на связывание антитела или на другое представляющее интерес функциональное свойство можно оценивать с помощью анализов in vitro или in vivo, представленных в настоящем описании и описанных в разделе Примеры. Можно интродуцировать консервативные модификации (указанные выше). Мутации могут представлять собой аминокислотные замены, добавления или делеции. Кроме того, как правило, изменяют не более 1, 2, 3, 4 или 5 остатков в CDR-участке.
Таким образом, выделенные HER3-связывающие моноклональные антитела или их фрагменты могут включать вариабельную область тяжелой цепи, содержащую: CDR1-участок VH-области, который имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 2, 8, 20, 26, 38, 44, 56, 62, 74, 80, 92, 98, 110, 116, 128, 134,146, 152, 164, 170, 182, 188, 200, 206, 218, 224, 236, 242,
- 51 036314
254, 260, 272, 278, 290, 296, 308, 314, 326, 332, 344, 350, 362 и 368, или аминокислотную последовательность с 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотными заменами, делециями или добавлениями по сравнению с SEQ ID NO: 2, 8, 20, 26, 38, 44, 56, 62, 74, 80, 92, 98, 110, 116, 128, 134, 146, 152, 164, 170, 182, 188, 200, 206, 218, 224, 236, 242, 254, 260, 272, 278, 290, 296, 308, 314, 326, 332, 344, 350, 362 и 368; CDR2-участок VHобласти, который имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 3, 9, 21, 27, 39, 45, 57, 63, 75, 81, 93, 99, 111, 117, 129, 135, 147, 153, 165, 171, 183, 189, 201, 207, 219, 225, 237, 243, 255, 261, 273, 279, 291, 297, 309, 315, 327, 333, 345, 351, 363 и 369, или аминокислотную последовательность с 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотными заменами, делециями или добавлениями по сравнению с SEQ ID NO: 3, 9, 21, 27, 39, 45, 57, 63, 75, 81, 93, 99, 111, 117, 129, 135, 147, 153, 165, 171, 183, 189, 201, 207, 219, 225, 237, 243, 255, 261, 273, 279, 291, 297, 309, 315, 327, 333, 345, 351, 363 и 369; CDR3 -участок VH-области, который имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 4, 10, 22, 28, 40, 46, 58, 64, 76, 82, 94, 100, 112, 118, 130, 136, 148, 154, 166, 172, 184, 190, 202, 208, 220, 226, 238, 244, 256, 262, 274, 280, 292, 298, 310, 316, 328, 334, 346, 352, 364 и 370; или аминокислотную последовательность с 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотными заменами, делециями или добавлениями по сравнению с SEQ ID NO: 4, 10, 22, 28, 40, 46, 58, 64, 76, 82, 94, 100, 112, 118, 130, 136, 148, 154, 166, 172, 184, 190, 202, 208, 220, 226, 238, 244, 256, 262, 274, 280, 292, 298, 310, 316, 328, 334, 346, 352, 364 и 370; CDRl-участок VL-области, который имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 5, 11, 23, 29, 41, 47, 59, 65, 77, 83, 95, 101, 113, 119, 131, 137, 149, 155, 167, 173, 185, 191, 203, 209, 221, 227, 239, 245, 257, 263, 275, 281, 293, 299, 311, 317, 329, 335, 347, 353, 365 и 371, или аминокислотную последовательность с 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотными заменами, делециями или добавлениями по сравнению с SEQ ID NO: 5, 11, 23, 29, 41, 47, 59, 65, 77, 83, 95, 101, 113, 119, 131, 137, 149, 155, 167, 173, 185, 191, 203, 209, 221, 227, 239, 245, 257, 263, 275, 281, 293, 299, 311, 317, 329, 335, 347, 353, 365 и 371; CDR2-участок VL-области, который имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 6, 12, 24, 30, 42, 48, 60, 66, 78, 84, 96, 102, 114, 120, 132, 138, 150, 156, 168, 174, 186, 192, 204, 210, 222, 228, 240, 246, 258, 264, 276, 282, 294, 300, 312, 318, 330, 336, 348, 354, 366 и 372, или аминокислотную последовательность с 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотными заменами, делециями или добавлениями по сравнению с SEQ ID NO: 6, 12, 24, 30, 42, 48, 60, 66, 78, 84, 96, 102, 114, 120, 132, 138, 150, 156, 168, 174, 186, 192, 204, 210, 222, 228, 240, 246, 258, 264, 276, 282, 294, 300, 312, 318, 330, 336, 348, 354, 366 и 372; и CDR3-участок VL-области, который имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 7, 13, 25, 31, 43, 49, 61, 67, 79, 85, 97, 103, 115, 121, 135, 139, 139, 151, 157, 169, 175, 187, 193, 205, 211, 223, 229, 241, 247, 259, 265, 277, 283, 295, 301, 313, 319, 331, 337, 349, 355, 367 и 373, или аминокислотную последовательность с 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотными заменами, делециями или добавлениями по сравнению с SEQ ID NO: 7, 13, 25, 31, 43, 49, 61, 67, 79, 85, 97, 103, 115, 121, 135, 139, 139, 151, 157, 169, 175, 187, 193, 205, 211, 223, 229, 241, 247, 259, 265, 277, 283, 295, 301, 313, 319, 331, 337, 349, 355, 367 и 373.
Трансплантация фрагментов антител в альтернативные остовы или каркасы
Широкое разнообразие остовов или каркасов антител/иммуноглобулинов можно применять, если образовавшийся полипептид включает по меньшей мере один связывающий участок, который специфически связывается с HER3. Такие остовы или каркасы включают 5 основных идиотипов человеческих иммуноглобулинов или их фрагментов, и включают иммуноглобулины других видов животных, которые предпочтительно имеют гуманизированные аспекты. Специалисты в данной области продолжают открывать и создавать новые остовы, каркасы и фрагменты.
Антитела можно создавать на основе неиммуноглобулиновых остовов с использованием неиммуноглобулиновых каркасов, в которые можно трансплантировать CDR. Можно применять известные или те, которые могут быть открыты в будущем, неиммуноглобулиновые остовы и каркасы, если они содержат связывающий участок, специфический для белка-мишени HER3 (например, HER3 человека и/или обезьяны циномолгус). Известные неиммуноглобулиновые остовы или каркасы включают (но, не ограничиваясь только ими) фибронектин (фирма Compound Therapeutics, Inc., Уолтем, шт. Массачусетс), анкирин (фирма Molecular Partners AG, Цюрих, Швейцария), доменные антитела (фирма Domantis, Ltd. (Кэмбридж, шт. Массачусетс и фирма Ablynx nv (Цвинаарде, Бельгия)), липокалин (фирма Pieris Proteolab AG, Фрейзинг, Германия), небольшие модульные иммунологические фармацевтические агенты (фирма Trubion Pharmaceuticals Inc., Сиэтл, шт. Вашингтон), макситела (фирма Avidia, Inc. (МаунтинВью, шт. Калифорния), белок А (фирма Affibody AG, Швеция) и аффилин (гамма-кристаллин или убикитин) (фирма Scil Proteins GmbH, Галле, Германия).
Основой фибронектиновых каркасов является домен фибронектина типа III (например, десятый модуль фибронектина типа III (домен 10 Fn3). Домен фибронектина типа III несет 7 или 8 бета-цепей, которые распределены между двумя бета-складками, которые сами упакованы друг напротив друга с образованием ядра белка, и дополнительно содержат петли (аналоги CDR), которые соединяют бета-цепи друг с другом и являются доступными для растворителя. Известно по меньшей мере три таких петли на каждом крае бета-складчатого сэндвича, при этом край является границей белка, перпендикулярной к направлению бета-цепей (US № 6818418). Эти каркасы, основой которых является фибронектин, не представляют собой иммуноглобулин, хотя общая укладка очень похожа на укладку наименьшего обладаю
- 52 036314 щего функциональной активностью фрагмента антитела, т.е. вариабельной области тяжелой цепи, который содержит полный распознающий антиген компонент в IgG представителей верблюжьих и лам. Благодаря указанной структуре антитело, не представляющее собой иммуноглобулин, имитирует антигенсвязывающие свойства, которые напоминают по природе и аффинности свойства антител. Эти каркасы можно применять для стратегии рандомизации и перестановки петель in vitro, что подобно процессу созревания аффинности антител in vivo. Такие молекулы, основой которых является фибронектин, можно применять в качестве каркасов, в которых области петель молекулы можно заменять на CDR с помощью стандартных методов клонирования.
Технология анкиринования основана на применении белков, несущих выведенные из анкирина повторяющиеся модули в качестве каркасов для вариабельных областей, которые можно использовать для связывания с различными мишенями. Повторяющийся анкириновый модуль представляет собой состоящий из 33 аминокислот полипептид, который содержит две антипараллельные α-спирали и β-петли. Связывание вариабельных областей максимально оптимизируют с помощью рибосомального дисплея.
Авимеры получают из встречающегося в естественных условиях содержащего A-домен белка, такого как HER3. Эти домены используются в естественных условиях для белок-белковых взаимодействий, и у человека структурной основой более чем 250 белков являются A-домены. Авимеры состоят из нескольких различных мономеров A-домена (2-10), сцепленных с помощью аминокислотных линкеров. Можно создавать авимеры, которые могут связываться с антигеном-мишенью, с использованием методологии, описанной, например, в публикациях заявок на патент США № 20040175756; 20050053973; 20050048512; и 20060008844.
Обладающие аффинностью лиганды фирмы Affibody представляют собой небольшие простые белки, состоящие из трехспирального пучка, основой которого является каркас одного из IgG-связывающих доменов белка A. Белок A представляет собой поверхностный белок бактерии Staphylococcus aureus. Этот каркасный домен состоит из 58 аминокислот, 13 из которых произвольно использовали для создания библиотек Affibody с большим количеством вариантов лиганда (см., например, US № 5831012). Молекулы Affibody напоминают антитела, их молекулярная масса составляет 6 кДа, для сравнения молекулярная масса антител составляет 150 кДа. Несмотря на небольшой размер, сайт связывания молекул Affibody подобен сайту связывания антитела.
Антикалины представляют собой продукты, разработанные компанией Pieris ProteoLab AG. Их получают из липокалинов, широко распространенной группы небольших и эффективных белков, которые, как правило, принимают участие в физиологическом транспорте или хранении чувствительных к химическим агентам или нерастворимых соединений. Несколько встречающихся в естественных условиях липокалинов обнаружено в тканях или общей воде организма человека. Их белковая архитектура напоминает структуру иммуноглобулинов с гипервариабельными петлями на вершине жесткого остова. Однако в отличие от антител или их рекомбинантных фрагментов липокалины состоят из одной полипептидной цепи, содержащей 160-180 аминокислотных остатков, т.е. несколько более крупной, чем один домен иммуноглобулина. Набор из четырех петель, которые образуют связывающий карман, обладает выраженной структурной пластичностью и допускает широкое разнообразие боковых цепей. Таким образом, при использовании соответствующего процесса сайту связывания можно придавать новую форму, предназначенную для распознавания с высокой аффинностью и специфичностью заранее определенных молекул-мишеней различной формы. Один из белков семейства липокалинов, а именно связывающий билин белок (BBP) из Pieris brassicae (капустная белянка), использовали для создания антикалинов путем мутагенеза, затрагивающего четыре петли. Одной из заявок на патент, в которых описаны антикалины, приведенной в качестве примера, является опубликованная заявка PCT WO 1999/16873.
Молекулы аффилинов представляют собой небольшие неиммуноглобулиновые белки, которые разработаны с целью достижения специфических аффинностей к белкам и небольшим молекулам. Новые молекулы аффилинов можно очень быстро отбирать из двух библиотек, основой каждой из которых являются различные полученные из человеческого организма белки-каркасы. Молекулы аффилинов не обладают какой-либо структурной гомологией с белками иммуноглобулинов. В настоящее время применяют два аффилиновых каркаса, одним из которых является гамма-кристаллин, человеческий структурный белок хрусталика глаза, а другим являются белки суперсемейства убикитина. Оба человеческих каркаса имеют очень малый размер, характеризуются высокой теплостойкостью и практически устойчивы к изменениям значений pH и действию денатурирующих агентов. Указанная высокая стабильность главным образом является результатом расширенной бета-складчатой конформации белков. Примеры выведенных из гамма-кристаллина белков описаны в WO 2001/04144, а примеры убикитиноподобных белков описаны в WO 2004/106368.
Миметики белковых эпитопов (PEM) представляют собой имеющие средний размер, циклические, напоминающие пептиды молекулы (MM 1 -2 кДа), которые имитируют вторичные структуры белков типа бета-шпилек, т.е. основную вторичную структуру, участвующую в белок-белковых взаимодействиях.
Fab-фрагменты можно превращать в молчащий IgG1-формат путем изменения Fc-области. Например, антитела, представленные в табл., можно превращать в IgG-формат.
- 53 036314
Человеческие или гуманизированные антитела
Полностью человеческие антитела специфически связываются с белком HER3 (например, HER3 человека и/или обезьяны циномолгус/мыши/крысы). По сравнению с химерными или гуманизированными антителами человеческие HER3-связывающие антитела обладают также пониженной антигенностью при введении человеку.
Человеческие HER3-связывающие антитела можно создавать с помощью методов, известных в данной области. Например, технологию гуманирования применяют для превращения нечеловеческих антител в сконструированные человеческие антитела. В публикации патента США № 2005/0008625 описан метод in vivo замены вариабельной области нечеловеческого антитела на вариабельную область человеческого антитела с сохранением или даже улучшением характеристик связывания по сравнению с нечеловеческим антителом. Метод основан на зависящей от эпитопа замене вариабельных областей нечеловеческого референс-антитела на полностью человеческое антитело. Образовавшееся человеческое антитело, как правило, имеет неродственную структуру относительно нечеловеческого референс-антитела, но оно связывается с тем же эпитопом на том же антигене, что и референс-антитело. В целом, метод состоит в следующем: серийный основанный на зависящей от эпитопа комплементарной замене подход осуществляют путем создания конкуренции в клетках между конкурентом и библиотекой разнообразных гибридов референс-антитела (тестируемые антитела) за связывание с лимитирующими количествами антигена в присутствии репортерной системы, которая реагирует на связывание тестируемого антитела с антигеном. Конкурент может представлять собой референс-антитело или его производное, такое как одноцепочечный Fv-фрагмент. Конкурент может представлять собой также встречающийся в естественных условиях или искусственный лиганд антигена, который связывается с тем же эпитопом, что и референсантитело. Единственные требования, предъявляемые к конкуренту, заключаются в том, что он должен связываться с тем же эпитопом, что и референс-антитело, и что он должен конкурировать с референсантителом за связывание с антигеном. Тестируемые антитела имеют одну антигенсвязывающую Vобласть, общую с V-областью нечеловеческого референс-антитела, и другую V-область, произвольно выбранную из другого источника, такого как библиотека набора человеческих антител. V-область, общая с V-областью нечеловеческого референс-антитела, служит в качестве проводника, позиционирующего тестируемые антитела на тот же эпитоп антигена и в той же ориентации, в результате чего селекция идет в направлении наиболее высокого сродства к референс-антителу.
Для выявления требуемых взаимодействий между тестируемыми антителами и антигеном можно применять большое количество типов репортерных систем. Например, комплементирующие репортерные фрагменты можно связывать с антигеном и тестируемым антителом соответственно, так что активация репортера в результате комплементации фрагментом происходит только тогда, когда тестируемое антитело связывается с антигеном. Когда слияния тестируемое антитело- и антиген-репортерный фрагмент совместно экспрессируют с конкурентом, активация репортера начинает зависеть от способности тестируемого антитела конкурировать с конкурентом, которая пропорциональна аффинности тестируемого антитела к антигену. Другие репортерные системы, которые можно применять, включают реактиватор самоингибирующейся репортерной системы реактивации (RAIR), описанный в заявке на патент США сер. № 10/208730 (публикация № 2003/0198971), или конкурентную систему активации, описанную в заявке на патент США, сер. № 10/076845 (публикация № 2003/0157579).
С помощью серийной системы, основанной на зависящей от эпитопа комплементарной замене, осуществляют селекцию с целью идентификации клеток, экспрессирующих индивидуальное тестируемое антитело в сочетании с конкурентом, антигеном и компонентами, представляющими собой репортер. В этих клетках каждое тестируемое антитело конкурирует один на один с конкурентом за связывание с лимитирующим количеством антигена. Активность репортера пропорциональна количеству антигена, связанного с тестируемым антителом, что, в свою очередь, пропорционально аффинности тестируемого антитела к антигену и стабильности тестируемого антитела. Тестируемые антитела сначала отбирают на основе их активности относительно активности референс-антитела, когда оно экспрессируется аналогично тестируемому антителу. В результате первого цикла селекции получают массив гибридных антител, каждое из которых включает одну и ту же нечеловеческую V-область из референс-антитела и человеческую V-область из библиотеки, и каждое из которых связывается с тем же эпитопом на антигене, что и референс-антитело. Одно или несколько гибридных антител, отобранных в первом цикле, должны обладать аффинностью к антигену, сопоставимой или превышающей аффинность референс-антитела.
На второй стадии замены V-области применяют человеческие V-области, отобранные на первой стадии, в качестве проводников при отборе замен на человеческие области оставшейся V-области нечеловеческого референс-антитела, используя другую библиотеку родственных человеческих V-областей. Гибридные антитела, отобранные в первом цикле, можно применять также в качестве конкурентов для второго цикла селекции. В результате второго цикла селекции получают массив полностью человеческих антител, структурно отличных от референс-антитела, но обладающих способностью конкурировать с референс-антителом за связывание с одним и тем же антигеном. Некоторые из отобранных человеческих антител связываются с тем же эпитопом на том же антигене, с которым связывается референс-антитело. Из этих отобранных человеческих антител одно или несколько связывается(ются) с тем же эпитопом с
- 54 036314 аффинностью, сопоставимой или превышающей аффинность референс-антитела.
Используя одно из мышиных или химерных HER3-связывαющий антител, описанных выше, в качестве референс-антитела, этот метод легко адаптировать для создания человеческих антител, которые связываются с человеческим HER3 с такой же специфичностью связывания и с такой же или с улучшенной аффинностью связывания. Кроме того, указанные человеческие HER3-связывающие антитела можно также получать на коммерческой основе от компаний, которые производят человеческие антитела с целью продажи, таких, например, как фирма KaloBios, Inc. (Маунтин-Вью, шт. Калифорния).
Верблюжьи антитела
Белки антител, полученные из представителей семейства двугорбых и одногорбых верблюдов (Camelus bactrianus и Calelus dromaderius), включая представителей животных Нового Света, таких как различные виды лам (Lama paccos, Lama glama и Lama vicugna), охарактеризованы в отношении их размера, структурной комплексности и антигенности в отношении человека. Установлено, что некоторые антитела типа IgG из этого семейства млекопитающих в естественных условиях лишены легких цепей и поэтому отличаются по структуре от типичной состоящей из четырех цепей четвертичной структуры с двумя тяжелыми и двумя легкими цепями, характерной для антител из организма других животных (см. PCT/EP93/02214 (WO 94/04678, опубликована 3 марта 1994 г.)).
Участок верблюжьего антитела, представляющий собой небольшую индивидуальную вариабельную область, обозначенную как VHH, можно создавать с помощью генной инженерии с получением небольшого белка, обладающего высокой аффинностью к мишени, что приводит к получению низкомолекулярного выведенного из антитела белка, который обозначают как верблюжье нанотело (см. US № 5759808, выданный 2 июня 1998 г.; см. также Stijlemans и др., J Biol Chem 279, 2004, сс. 1256-1261; Dumoulin и др., Nature 424, 2003, сс. 783-788; Pleschberger и др. Bioconjugate Chem 14, 2003, сс. 440-448; Cortez-Retamozo и др., Int J Cancer 89, 2002, сс. 456-462; и Lauwereys и др., EMBO J 17, 1998, сс. 35123520). Созданные библиотеки верблюжьих антител и фрагментов антител доступны на коммерческой основе, например, от фирмы Ablynx, Гент, Бельгия (например, US № 2006/0115470; фирмы Domantis (US № 2007/0065440, US № 2009/0148434). Аналогично другим антителам, полученным из видов кроме человека, аминокислотную последовательность верблюжьего антитела можно изменять рекомбинантно с получением последовательности, в большей степени напоминающей человеческую последовательность, т.е. нанотело можно гуманизировать. Таким путем можно дополнительно понижать естественную низкую антигенность верблюжьих антител для людей. Верблюжье нанотело имеет молекулярную массу, составляющую примерно 1/10 от молекулярной массы человеческого IgG, а физический диаметр белка составляет лишь несколько нанометров. Одной из связанных с малым размером особенностей является способность верблюжьих нанотел связываться с антигенными сайтами, которые являются функционально незаметными для более крупных белковых антител, т.е. верблюжьи нанотела можно применять в качестве реагентов, выявляющих антигены, которые остаются скрытыми при использовании классических иммунологических методов, и возможно в качестве терапевтических агентов. Таким образом, другой особенностью верблюжьего нанотела, связанной с его малым размером, является способность ингибировать связывание со специфическим сайтом в бороздке или узкой расщелине белка-мишени, и поэтому их можно применять в качестве субстанции, более напоминающей по своей функции классическое низкомолекулярное лекарственное средство, чем классическое антитело.
Небольшая молекулярная масса и компактный размер обусловливают также очень высокую термостабильность, стабильность при экстремальных значениях pH и стабильность к протеолитическому расщеплению и низкую антигенность верблюжьих нанотел. Еще одним следствием указанных особенностей является то, что верблюжьи нанотела легко проникают из кровеносной системы в ткани и даже проникают через гематоэнцефалический барьер и их можно применять для лечения заболеваний, поражающих нервную ткань. Нанотела могут облегчать также транспорт лекарственных средств через гематоэнцефалический барьер (см. заявку на патент США № 2004/0161738, опубликованную 19 августа 2004 г). Эти особенности в сочетании с низкой антигенностью в отношении людей свидетельствуют об их большом терапевтическом потенциале. Кроме того, эти молекулы можно полностью экспрессировать в прокариотических клетках, таких как Е. coli, и экспрессировать в виде слитых белков с бактериофагом, и они являются функционально активными.
Таким образом, о верблюжье антитело или нанотело обладает высокой аффинностью к HER3. Верблюжье антитело или нанотело получают в естественных условиях в животном из семейства верблюдовых, т.е. оно продуцируется в организме представителя верблюдовых после иммунизации HER3 или его пептидным фрагментом с использованием методов, представленных в настоящем описании для других антител. Верблюжье связывающее HER3 нанотело можно конструировать, т.е. получать путем отбора, например, из фаговых дисплейных библиотек соответствующим образом мутированных белками верблюжьих нанотел, с помощью метода пэннинга с использованием в качестве мишени HER3, как описано в приведенных в настоящем описании примерах. Сконструированные нанотела можно дополнительно усовершенствовать с помощью генной инженерии таким образом, чтобы время их полужизни в реципиенте составляло от 45 мин до 2 недель. Верблюжье антитело или нанотело можно получать путем трансплантации последовательностей CDR тяжелой или легкой цепи человеческих антител в нанотело
- 55 036314 или в последовательности каркасных участков имеющего один домен антитела согласно методам, описанным, например в PCT/EP93/02214. Верблюжье антитело или нанотело способно связываться по меньшей мере с одним из следующих остатков HER3: Asn266, Lys267, Leu268, Thr269, Gln271, Glu273, Pro274, Asn275, Pro276, His277, Asn315, Asp571, Pro583, His584, Ala596, Lys597. Верблюжье антитело или нанотело может связываеться по меньшей мере с одним из следующих остатков HER3: Tyr265, Lys267, Leu268, Phe270, Gly582, Pro583, Lys597, Ile600, Lys602, Glu609, Arg611, Pro612, Cys613, His614, Glu615.
Биспецифические молекулы и многовалентные антитела
Антитело или его фрагмент можно дериватизировать или связывать с другой функционально активной молекулой, например, другим пептидом или белком (например, другим антителом или лигандом рецептора), с получением биспецифической молекулы, которая связывается по меньшей мере с двумя различными сайтами связывания или молекулами-мишенями. Антитело фактически может быть дериватизировано или связано более чем с одной другой функционально активной молекулой с образованием бипаратопных или мультиспецифических молекул, которые связываются более чем с двумя различными сайтами связывания и/или молекулами-мишенями; подразумевается, что в контексте настоящего описания указанные бипаратопные или мультиспецифические молекулы также подпадают под понятие биспецифическая молекула. Для создания биспецифической молекулы антитело можно функционально связывать (например, путем химического сочетания, генетического слияния, нековалентной ассоциации или иным образом) с одной или несколькими другими связывающими молекулами, такими как другое антитело, фрагмент антитела, пептид или связывающий миметик, с получением биспецифической молекулы.
Дополнительное терапевтическое благоприятное действие можно получать путем связывания с одним антителом двух или большего количества антигенов (Coloma и др., 1997; Merchant и др., 1998; Alt и др., 1999; Zuo и др., 2000; Lu и др., 2004; Lu др., 2005; Marvin и др., 2005; Marvin и др., 2006; Shen и др., 2007; Wu и др., 2007; Dimasi и др., 2009; Michaelson и др., 2009; Morrison и др., Nature Biotech. 15, 1997, сс. 159-163; Alt и др., FEBS Letters 454, 1999, сс. 90-94; Zuo и др., Protein Engineering 13, 2000, сс. 361367; Lu и др., JBC 279, 2004, сс. 2856-2865; Lu и др., JBC 280, 2005, сс. 19665-19672; Marvin и др., Acta Pharmacologica Sinica 26, 2005, сс. 649-658; Marvin и др., Curr Opin Drug Disc Develop 9, 2006, сс. 184-193; Shen и др., J Immun Methods 218, 2007, сс. 65-74; Wu и др., Nat Biotechnol. 11, 2007, сс. 1290-1297; Dimasi и др., J Mol Biol. 393, 2009, сс. 672-692 и Michaelson и др., mAbs 1, 2009, сс. 128-141).
Биспецифические молекулы можно получать путем конъюгации компонентов, представляющих собой обладающие способностью к связыванию специфичности, с помощью методов, известных в данной области. Например, каждую обладающую способностью к связыванию специфичность биспецифической молекулы можно создавать по отдельности и затем конъюгировать друг с другом. Когда обладающие способностью к связыванию специфичности представляют собой белки или пептиды, для ковалентной конъюгации можно использовать целый ряд агентов для связывания или перекрестного сшивания. Примерами перекрестносшивающих агентов являются белок A, карбодиимид, Х-сукцинимидил^-ацетилтиоацетат (SATA), 5,5'-дитиобис(2-нитробензойная кислота) ^ТНБ),орто-фенилендималеимид (oPDM), Н-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP) и сульфосукцинимидил-4-(Н-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (сульфо-SMCC) (см., например, Karpovsky и др., J. Exp. Med. 160, 1984, с. 1686; Liu M.A. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 1985, с. 8648). Другие методы представляют собой методы, описанные у Paulus, Behring Ins. Mitt. No. 78, 1985, сс. 118-132; Brennan и др., Science 229, 1985, сс. 81-83) и Glennie и др., J. Immunol. 139, 1987, сс. 2367-2375). Такие предназначенные для конъюгации агенты, как SATA и сульфо-SMCC, оба поступают в продажу от фирмы Pierce Chemical Co. (Рокфорд, шт. Иллинойс).
Когда обладающие способностью к связыванию специфичности представляют собой антитела, то их можно конъюгировать с помощью сульфгидрильной связи C-концевых шарнирных областей двух тяжелых цепей. Шарнирную область можно модифицировать таким образом, чтобы она до конъюгации содержала нечетное количество сульфгидрильных остатков, например, один.
Обе обладающие способностью к связыванию специфичности можно кодировать в одном и том же векторе и экспрессировать и собирать в одной и той же клетке-хозяине. Этот метод является наиболее целесообразным, когда биспецифическая молекула представляет собой слитый белок, такой как МАтхМАт, MArnxFab, FabxF(ab')2 или лигандxFab. Биспецифическая молекула может представлять собой одноцепочечную молекулу, которая содержит одноцепочечное антитело и связывающую детерминанту, или одноцепочечную биспецифическую молекулу, которая содержит две связывающие детерминанты. Биспецифические молекулы могут содержать по меньшей мере две одноцепочечные молекулы. Методы получения биспецифических молекул описаны, например, в US № 5260203; US № 5455030; US № 4881175; US № 5132405; US № 5091513; US № 5476786; US № 5013653; US № 5258498 и US № 5482858.
Связывание биспецифических молекул с их специфическими мишенями можно подтверждать, например, твердофазным иммуноферментным анализом (ELISA), радиоиммуноанализом (РИА), FACSанализом, биологическим анализом (например, анализом ингибирования роста) или анализом методом
- 56 036314 вестерн-блоттинга. Каждый из указанных анализов позволяет выявлять присутствие конкретных представляющих интерес комплексов белок-антитело при использовании меченого реагента (например, антитела), специфического в отношении представляющего интерес комплекса.
Фрагменты антител можно соединять вместе путем белкового слияния или ковалентной или нековалентной связи. Четырехвалентные соединения можно получать, например, путем перекрестного сшивания антител с антителами, которые связываются с константными областями антител, например, с Fc или с шарнирной областью. Тримеризующийся домен описан, например, в патенте EP 1012280В1 на имя Borean. Пентамеризующиеся модули описаны, например, в PCT/EP97/05897.
Бипаратопные/биспецифические антитела могут связываться с аминокислотными остатками в домене 2 и домене 4 HER3.
Индивидуальное моноклональное антитело модифицируют таким образом, чтобы антигенсвязывающие центры связывались более чем с одним антигеном, в результате чего получают двухфункциональное антитело, которое связывается как с HER3, так и с другим антигеном (например, HER1, HER2 и HER4). Мишенями дувухфункционального антитела могут быть антигены, имеющие одинаковую конформацию, например, антиген, который имеет такую же конформацию, что и HER3 в закрытом или неактивном состоянии. Примерами антигенов с такой же конформацией, что и HER3 в закрытом или неактивном состоянии, являются (но, не ограничиваясь только ими) HER1 и HER4. Такое двухфункциональное антитело может связываться и с HER3, и с HER1; и с HER3, и с HER4, или с HER1 и ER4. Двойная специфичность связывания двухфункционального антитела может приводить также в двум видам активности или ингибирующей активности (см., например, Jenny Bostrom и др., Science: 323, 2009, сс. 1610-1614).
Антитела с удлиненным временем полужизни
На время полужизни белка in vivo могут оказывать влияние многие факторы. Например, почечная фильтрация, метаболизм в печени, расщепление протеолитическими ферментами (протеазами) и иммуногенные ответы (например, нейтрализация белков антителами и поглощение макрофагами и дендритными клетками). Для удлинения времени полужизни антител можно применять различные стратегии. Например, это можно осуществлять с помощью химической связи с полиэтиленгликолем (ПЭГ), ReCODE-ПЭГ, с использованием каркасов антител, полисиаловой кислоты (ПСК), гидроксиэтилкрахмала (ГЭК), связывающих альбумин лигандов и углеводных покрытий; путем генетического слияния с белками, связывающими сывороточные белки, такие как альбумин, IgG, FcRn, и их переноса; путем сшивания (генетического или химического) с другими связывающими фрагментами, которые связываются с сывороточными белками, такими как нанотела, Fab-фрагменты, DARPin, авимеры, молекулы фирмы Affibody и антикалины; путем генетического слияния с рПЭГ, альбумином, доменом альбумина, альбуминсвязывающими белками и Fc; или путем включения в наноносители, препаративные формы с медленным высвобождением или медицинские устройства.
Для удлинения времени циркуляции антител в сыворотке in vivo инертные полимерные молекулы, такие как высокомолекулярный ПЭГ, можно присоединять к антителам или их фрагментам с помощью многофункционального линкера или без него либо посредством сайтспецифической конъюгации ПЭГ с N- или C-концом антител, либо через эпсилон-аминогруппы, присутствующие на остатках лизина. Для пэгилирования антитела, как правило, антитело или его фрагмент подвергают взаимодействию с полиэтиленгликолем (ПЭГ), таким как реакционноспособный сложный эфир или альдегидное производное ПЭГ, в условиях, при которых одна или несколько ПЭГ-групп присоединяется(ются) к антителу или фрагменту антитела. Пэгилирование можно осуществлять с помощью реакции ацилирования или реакции алкилирования с реакционноспособной молекулой ПЭГ (или аналогичным реакционноспособным водорастворимым полимером). В контексте настоящего описания подразумевается, что понятие полиэтиленгликоль относится к любым формам ПЭГ, которые используют для дериватизации других белков, таким как μο^^^ι^λ^κ^- или арилоксиполиэтиленгликоль или полиэтиленгликольмалеимид. Антитело, подлежащее пэгилированию, представляет собой агликолизированное антитело. Можно применять дериватизацию с помощью линейных или разветвленных полимеров, которая приводит к минимальной потере биологической активности. Степень конъюгирования можно постоянно определять с помощью ДСН-ПААГ и масс-спектрометрии для гарантии правильной конъюгации молекул ПЭГ с антителами. Непрореагировавший ПЭГ можно отделять от конъюгатов антитело-ПЭГ путем гель-фильтрации или ионообменной хроматографии. Дериватизированные с помощью ПЭГ антитела можно оценивать в отношении связывающей активности, а также эффективности in vivo, с помощью методов, хорошо известных специалистам в данной области, например с помощью представленных в настоящем описании иммуноанализов. Методы пэгилирования белков известны в данной области, и их можно применять к антителам, предлагаемым в изобретении (см., например, EP 0154316 на имя Nishimura с соавторами и EP 0401384 на имя Ishikawa с соавторами).
Другие модифицированные технологии пэгилирования включают восстанавливающую технологию конструирования, направленную на создание химических ортогональных связей (ReCODE-ПЭГ), которая позволяет включать специфические с химической точки зрения боковые цепи в получаемые биосинтезом белки с помощью восстанавливающей системы, которая включает тРНК-синтетазу и тРНК. Эта техноло- 57 036314 гия позволяет включать более 30 новых аминокислот в белки, получаемые биосинтезом в клетках E.coli, дрожжей и млекопитающих. тРНК включает не встречающуюся в естественных условиях аминокислоту в любое место в амбер-кодоне, превращая амбер-кодон из стоп-кодона в кодон, обеспечивающий включение специфической с химической точки зрения аминокислоты.
Для удлинения времени полужизни в сыворотке можно применять также технологию, основанную на применении рекомбинантного пэгилирования (рПЭГ). Эта технология включает генетическое слияние состоящего из 300-600 аминокислот неструктурированного белкового хвоста с существующим фармацевтическим белком. Поскольку кажущаяся молекулярная масса такой неструктурированной белковой цепи примерно в 15 раз выше, чем его фактическая молекулярная масса, время полужизни белка в сыворотке значительно возрастает. В отличие от традиционного пэгилирования, для которого требуется химическая конъюгация и повторная очистка, процесс производства значительно упрощается и продукт является гомогенным.
Полисиалирование представляет собой другую технологию, в которой применяют встречающуюся в естественных условиях полимерную полисиаловую кислоту (ПСК) для пролонгирования времени активной жизни и повышения стабильности терапевтических пептидов и белков. ПСК представляет собой полимер сиаловой кислоты (сахар). При ее применении для введения лекарственных средств в виде белка и терапевтического пептида полисиаловая кислота обеспечивает защитное микроокружение при конъюгации. Это повышает продолжительность активной жизни терапевтического белка в кровотоке и препятствует его распознаванию иммунной системой. Полимер ПСК встречается в естественных условиях в организме человека. Он адаптирован некоторыми видами бактерий, у которых в результате эволюции в течение миллионов лет развилась способность использовать его в покрытии их оболочки. Эти встречающиеся в естественных условиях полисиалированные бактерии в результате обладают способностью благодаря молекулярной мимикрии обойти защитную систему организма. ПСК, являющуюся естественным компонентом разработанной stealth-технологии (технология создания невидимки), можно легко получать из указанных бактерий в больших количествах и с предварительно определенными физическими характеристиками. Бактериальная ПСК является совершенно неиммуногенной даже при сшивании с белками, поскольку она химически идентична ПСК, присутствующей в человеческом организме.
Другая технология основана на применении производных гидроксиэтилкрахмала (ТЭК), связанных с антителами. ГЭК представляет собой модифицированный природный полимер, полученный из воскообразного кукурузного крахмала, и он может метаболизироваться ферментами организма. Растворы ГЭК, как правило, вводят для замещения дефицита объема крови и для улучшения реологических свойств крови. ГЭКилирование антител может пролонгировать время полужизни в кровотоке путем повышения стабильности молекулы, а также в результате снижения почечного клиренса, что приводит к повышению биологической активности. Изменяя различные параметры, такие как молекулярная масса ГЭК, можно создавать широкое разнообразие конъюгатов ГЭК-антитело.
Антитела с удлиненным временем полужизни in vivo можно создавать также путем интродукции одной или нескольких аминокислотных модификаций (т.е. замен, инсерций или делеций) в константную область IgG или в его FcRn-связывающий фрагмент (предпочтительно Fc или фрагмент шарнирной области Fc) (см. международную публикацию WO 98/23289; международную публикацию WO 97/34631 и US № 6277375).
Кроме того, антитела можно конъюгировать с альбумином для повышения стабильности антитела или фрагмента антитела in vivo или для удлинения их времени полужизни in vivo. Методы хорошо известны в данной области (см., например, международные публикации WO 93/15199, WO 93/15200 и WO 01/77137; и европейский патент EP 413622).
Антитело к HER3 или его фрагмент можно сливать также с одним или несколькими полипептидами человеческого сывороточного альбумина (ЧСА) или их фрагментами. ЧСА представляет собой белок, состоящий в зрелой форме из 585 аминокислот, он ответствен в большей степени за осмотическое давление сыворотки, а также функционирует в качестве носителя эндогенных и экзогенных лигандов. Роль альбумина в качестве молекулы-носителя и его инертная природа являются благоприятными свойствами с позиций его применения в качестве носителя и транспортера полипептидов in vivo. Применение альбумина как компонента слияния альбумин-белок в качестве носителя для различных белков предложено в WO 93/15199, WO 93/15200 и EP 413 622. Предложено также применение N-концевых фрагментов ЧСА для слияния с полипептидами (EP 399666). Таким образом, путем генетического или химического слияния или конъюгации антител или их фрагментов с альбумином можно стабилизировать или удлинять продолжительность жизни и/или сохранять активность молекулы в течение более длительных периодов в растворе, in vitro и/или in vivo.
Для слияния альбумина с другим белком можно применять генетические манипуляции, такие как слияние ДНК, кодирующей ЧСА, или ее фрагмента с ДНК, кодирующей белок. Затем приемлемого хозяина трансформируют или трансфектируют слитыми нуклеотидными последовательности, располагая их на приемлемой плазмиде таким образом, чтобы экспрессировать слитый полипептид. Экспрессию можно осуществлять in vitro, например, с использованием прокариотических или эукариотических клеток, или in vivo, например, с использованием трансгенного организма. Дополнительные методы, пригод- 58 036314 ные для осуществления слияниями с ЧСА, представлены, например, в WO 2001077137 и WO 200306007, которые включены в настоящее описание в качестве ссылки. Экспрессию слитого белка осуществляют в линиях клеток млекопитающих, например линиях CHO-клеток. Можно также изменять дифференциальное связывание антитела с рецептором при низких или высоких значениях pH. Например, аффинность антитела можно модифицировать таким образом, чтобы сохранялось его связывание с рецептором при низких значениях pH, например при значениях pH, характерных для лизосом, путем модификации антитела, предусматривающей включение дополнительных аминокислот, таких как гистидин, в CDR антитела (см., например, Tomoyuki Igawa и др., Nature Biotechnology; 28, 2010, сс. 1203-1207).
Конъюгаты антител
Антителам или их фрагменты могут специфически связываться с белком HER3, рекомбинантно слитым или химически конъюгированным (включая как ковалентные, так и нековалентные конъюгации), с гетерологичным белком или полипептидом (или его фрагментом, предпочтительно с полипептидом, состоящим по меньшей мере из 10, по меньшей мере из 20, по меньшей мере из 30, по меньшей мере из 40, по меньшей мере из 50, по меньшей мере из 60, по меньшей мере из 70, по меньшей мере из 80, по меньшей мере из 90 или по меньшей мере из 100 аминокислот), в результате чего образуются слитые белки. Слитые белки могут содержать фрагмент антитела (например, Fab-фрагмент, Fd-фрагмент, Fvфрагмент, F(ab)-2фрагмент, VH-область, CDR VH-области, VL-область или CDR VL-области) и гетерологичный белок, полипептид или пептид. Методы слияния или конъюгирования белков, полипептидов или пептидов с антителом или фрагментом антитела известны в данной области (см., например, US №№ 5336603, 5622929, 5359046, 5349053, 5447851 и 5112946; европейские патенты EP 307434 и EP 367166; международные публикации WO 96/04388 и WO 91/06570; Ashkenazi и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 1991, сс. 10535-10539; Zheng и др., J. Immunol. 154, 1995, сс. 5590-5600; и Vil и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1992, сс. 11337-11341).
С помощью методов перестановки генов, перестановки мотивов, перестановки экзонов и/или перестановки кодонов (которые вместе обозначены как перестановка ДНК) можно создавать дополнительные слитые белки. Перестановку ДНК можно осуществлять для изменения активности антител или их фрагментов (например, антител или их фрагментов, обладающих более высокими аффинностями и более низкими скоростями диссоциации) (см. общее описание в US № 5605793, 5811238, 5830721, 5834252, и 5837458; Patten и др., Curr. Opinion Biotechnol. 8, 1997, сс. 724-733; Harayama, Trends Biotechnol. 16(2), 1998, сс. 76-82; Hansson и др., J. Mol. Biol. 287, 1999, сс. 265-276; и Lorenzo и Blasco, Biotechniques 24(2), 1998, сс. 308-313 (все указанные патенты и публикации полностью включены в настоящее описание в качестве ссылки)). Антитела или их фрагменты или кодируемые антитела или их фрагменты можно изменять, подвергая их перед рекомбинацией неспецифическому мутагенезу с помощью ПЦР пониженной точности, неспецифической инсерции нуклеотидов или обработке другими методами перед осуществлением рекомбинации. Полинуклеотид, кодирующий антитело или его фрагмент, которое/который специфически связывается с белком HER3, можно объединять путем рекомбинации с одним или несколькими компонентами, мотивами, сегментами, частями, доменами, фрагментами и т.д. одной или нескольких гетерологичных молекул.
Кроме того, антитела или их фрагменты можно сливать с маркерными последовательностями, такими как пептид, предназначенный для облегчения очистки. Маркерная аминокислотная последовательность может представлять собой, среди прочего, гекса-гистидиновый пептид, такой как метка, которая присутствует в векторе pQE (фирма QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Чатсуорт, шт. Калифорния, 91311), многие такие метки поступают в продажу. Как описано у Gentz и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1989, сс. 821-824, например, гекса-гистидин удобно применять для очистки слитого белка. Другими пептидными метками, которые можно применять для очистки, могут служить (но, не ограничиваясь только ими) гемагглютининовая (HA) метка, которая соответствует эпитопу, выведенному из белка гемагглютинина вируса гриппа (Wilson и др., Cell 37, 1984, с. 767), и flag''-метка.
Антитела или их фрагменты можно конъюгировать с диагностическим или выявляемым агентом. Указанные антитела можно применять для мониторинга или прогнозирования возникновения, развития, прогрессирования и/или серьезности заболевания или нарушения в качестве части процедуры клинической оценки, такой как определение эффективности конкретной терапии. Такие диагностирование и выявление можно осуществлять путем сшивания антитела с выявляемыми субстанциями, такими как (но, не ограничиваясь только ими) различные ферменты, такие как (но, не ограничиваясь только ими) пероксидаза из хрена, щелочная фосфатаза, бета-галактозидаза или ацетилхолинэстераза; простетические группы, такие как (но, не ограничиваясь только ими) стрептавидин/биотин и авидин/биотин; флуоресцентные материалы, такие как (но, не ограничиваясь только ими) умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеина изотиоцианат, родамин, дихлортриазиниламин флуоресцеина, дансилхлорид или фикоэритрин; люминесцентные материалы, такие как (но, не ограничиваясь только ими) люминол; биолюминесцентные материалы, такие как (но, не ограничиваясь только ими) люцифераза, люцеферин и аэкворин; радиоактивные материалы, такие как (но, не ограничиваясь только ими) йод (131I, 125 1, 123I и 121I,), углерод (14C), сера (35S), тритий (3H), индий (115In, 113In, 112In и 'In.), технеций (99Tc), таллий (201Ti), галлий (68Ga, 67Ga), палладий (103Pd), молибден (99Mo), ксенон (133Xe), фтор (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho,
- 59 036314 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn и 117Tin;
и испускающие позитроны металлы с применением различных вариантов позитронно-эмиссионной томографии, и ионы нерадиоактивных парамагнитных металлов.
Антитело или его фрагмент можно конъюгировать с обладающим терапевтической активностью фрагментом, таким как цитотоксин, например, цитостатический или цитоцидный агент, терапевтическое средство или ион радиоактивного металла, например, с эмиттерами альфа-излучения. Цитотоксин или цитотоксическое средство может представлять собой любое средство, вызывающее гибель клеток.
Кроме того, антитело или его фрагмент можно конъюгировать с обладающим терапевтической активностью фрагментом или фрагментом лекарственного средства, который модифицирует данный биологический ответ. Обладающие терапевтической активностью фрагменты или фрагменты лекарственного средства не ограничены классическими химическими терапевтическими агентами. Например, фрагмент лекарственного средства может представлять собой белок, пептид или полипептид, обладающий требуемой биологической активностью. Такие белки могут включать, например, токсин, такой как абрин, рицин A, экзотоксин Pseudomonas, холерный токсин или дифтерийный токсин; белок, такой как фактор некроза опухоли, α-интерферон, β-интерферон, фактор роста нервов, тромбоцитарный фактор роста, тканевой активатор плазминогена, проапоптозный агент, антиангиогенный агент; или модификатор биологического ответа, такой, например, как лимфокин.
Антитело к HER3 или его фрагмент можно конъюгировать с обладающим терапевтическим действием фрагментом, таким как цитотоксин, лекарственное средство (например, иммунодепрессант) или радиотоксин. Такие конъюгаты обозначены в контексте настоящего описания как иммуноконъюгаты. Иммуноконъюгаты, которые содержат один или несколько цитотоксинов, обозначают как иммунотоксины. К цитотоксинам или цитотоксическим агентам относится любой агент, который повреждает (например, уничтожает) клетки. Их примерами являются таксон, цитохаласин B, грамицидин D, этидия бромид, эметин, митомицин, этопосид, тенопосид, винкристин, винбластин, t. колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидроксиантрациндион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин D, 1дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол и пуромицин и их аналоги или гомологи. Терапевтические средства представляют собой, например, антиметаболиты (например, метотрексат, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, цитарабин, 5-фторурацил, декарбазин), деструктирующие агенты (например, мехлорэтамин, тиотепа, хлорамбуцил, миефалан, кармустин (BSNU) и ломустин (CCNU), циклотосфамид, бусулфан, дибромманит, стрептозотоцин, митомицин C и цисдихлордиамин платины(П) (DDP), цисплатин, антрациклины (например, даунорубицин (прежнее название дауномицин) и доксорубицин), антибиотики (например, дактиномицин (прежнее название актиномицин), блеомицин, митрамицин и антрамицин (AMC)) и антимитотические агенты (например, винкристин и винбластин) (см., например, US № 20090304721 на имя фирмы Seattle Genetics).
Другими примерами терапевтических цитотоксинов, которые можно конъюгировать с антителом являются дуокармицины, калихеамицины, майтансины и ауристатины и их производные. Например, в продаже имеется конъюгат антитела с калихеамицином (Mylotarg™; фирма Wyeth-Ayerst).
Цитотоксины можно конъюгировать с антителами с использованием известной в данной области технологии, предусматривающей применение линкеров. Примерами типов линкеров, которые можно использовать для конъюгации цитотоксина с антителом, являются (но, не ограничиваясь только ими) гидразоны, сложные тиоэфиры, сложные эфиры, дисульфиды и пептидсодержащие линкеры. Можно выбирать линкер, который, например, чувствителен к расщеплению при низком значении pH в компартменте лизосомы или чувствителен к расщеплению протеазами, например протеазами, которые преимущественно экспрессируются в опухолевых тканях, такими как катепсины (например, катепсины B, C, D).
Дополнительные данные о типах цитотоксинов, линкерах и методах конъюгации терапевтических агентов и антител приведены также у Saito и др., Adv. Drug Deliv. Rev. 55, 2003, сс. 199-215; Trai и др., Cancer Immunol. Immunother. 52 2003, сс. 328-337; Payne, Cancer Cell 3, 2003, сс. 207-212; Allen, Nat. Rev. Cancer 2, 2002, сс. 750-763; Pastan и Kreitman, Curr. Opin. Investig. Drugs 3, 2002, сс. 1089-1091; Senter и Springer, Adv. Drug Deliv. Rev. 53, 2001, сс. 247-264.
Антитела можно конъюгировать также с радиоактивными изотопами с получением цитотоксических радиоактивных фармацевтических агентов, которые называют также радиоиммуноконъюгатами. Примерами радиоактивных изотопов, которые можно конъюгировать с антителами для применения в диагностических или терапевтических целях, являются (но, не ограничиваясь только ими) йод131, индий111, иттрий90 и лютеций177. В данной области разработаны методы получения радиоиммуноконъюгатов. Примерами имеющихся на рынке радиоиммуноконъюгатов являются Zevalin™ (фирма DEC Pharmaceuticals) и Bexxar™ (фирма Corixa Pharmaceuticals), и аналогичные методы можно применять для получения радиоиммуноконъюгатов антител. Макроциклический хелатор представляет собой 1,4,7,10тетраазациклододекан-Н,№,№,№'-тетрауксусную кислоту (DOTA), которую можно присоединять к антителу через линкерную молекулу. Указанные линкерные молекулы хорошо известны в данной области и описаны у Denardo и др., Clin Cancer Res. 4(10), 1998, сс. 2483-2490; Peterson и др., Bioconjug. Chem. 10(4), 1999, сс. 553-557; и Zimmerman и др., Nucl. Med. Biol. 26(8), 1999, сс. 943-950, каждая публикация
- 60 036314 полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки.
Методы конъюгирования обладающих терапевтической активностью фрагментов с антителами хорошо известны (см., например, Amon и др., Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy, в: Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, под ред. Reisfeld и др., изд-во Alan R. Liss, Inc., сс. 243-56, 1985; Hellstrom и др., Antibodies For Drug Delivery, в: Controlled Drug Delivery (2-е изд.), под ред. Robinson и др., под ред. Marcel Dekker, Inc., сс. 623-53, 1987; Thorpe, Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review, в: Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, под ред. Pinchera и др., 1985, сс. 475-506; Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy, в: Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, под ред. Baldwin и др., изд-во Academic Press, 1985, сс. 303-316 и Thorpe и др., The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates, Inmunol. Rev., 62, 1982, сс. 119-158).
Антитела можно связывать с твердыми подложками, которые можно применять, в частности, для иммуноанализов или очистки антигена-мишени.
Такие твердые подложки включают (но, не ограничиваясь только ими) стекло, целлюлозу, полиакриламид, найлон, полистирол, поливинилхлорид или полипропилен.
Комбинации антител
Антитела к HER3 или их фрагменты можно применять с другими терапевтическими средствами, такими как другие антитела, низкомолекулярные ингибиторы, ингибиторы mTOR или ингибиторы PI3киназы.
Их примерами являются (но, не ограничиваясь только ими):
Ингибиторы HER1: антитела к HER3 или их фрагменты можно применять в сочетании с ингибиторами HER1, включая (но, не ограничиваясь только ими) матузумаб (EMD72000), Erbitux®/цетуксимаб (фирма Imclone), Vectibix®/паниmумумаб (фирма Amgen), mAb 806 и нимотузумаб (фирма TheraCIM), Iressa®/гефитиниб (фирма Astrazeneca); CI-1033 (PD183805) (фирма Pfizer), лапатиниб (GW-572016) (фирма GlaxoSmithKline), Tykerb®/лапатиниба дитозилат (фирма SmithKlineBeecham),
Tarceva®/эрлотиниб HCl (OSI-774) (фирма OSI Pharma) и PKI-166 (фирма Novartis) и Ν-[4-[(3-χλορ-4фторфенил)амино]-7-[[(3'^)-тетрагидро-3-фуранил]окси]-6-хиназолинил]-4-(диметиламино)-2-бутенамид, который поступает в продажу товарным знаком Tovok® фирмы Boehringer Ingelheim);
Ингибиторы HER2: антитела к HER3 или их фрагменты можно применять в сочетании с ингибиторами HER2, включая (но, не ограничиваясь только ими) пертузумаб (поступает в продажу товарным знаком Omnitarg® фирмы Genentech), трастузумаб (поступает в продажу товарным знаком Herceptin® фирмы Genentech/Roche), MM-111, нератиниб (известен также как HKI-272, (2Е)-Ы-[4-[[3-хлор-4-[(пиридин2-ил)метокси]фенил]амино]-3-циан-7-этоксихинолин-6-ил]-4-(диметиламино)бут-2-енамид и описан в публикации PCT WO 05/028443), лапатиниб или лапатиниба дитозилат (поступает в продажу товарным знаком Tykerb® фирмы GlaxoSmithKline);
Ингибиторы HER3: антитела к HER3 или их фрагменты можно применять в сочетании с ингибиторами HER3, включая (но, не ограничиваясь только ими) MM-121, MM-111, IB4C3, 2DID12 (фирма U3 Pharma AG), AMG888 (фирма Amgen), AV-203(фирма Aveo), MEHD7945A (фирма Genentech) и малые молекулы, которые ингибируют HER3;
Ингибиторы HER4: антитела к HER3 или их фрагменты можно применять в сочетании с ингибиторами HER4;
Ингибиторы PI3-киназы: антитела к HER3 или их фрагменты можно применять в сочетании с ингибиторами PI3-киназы, включая (но, не ограничиваясь только ими) 4-[2-(1Н-индазол-4-ил)-6-[[4(метилсульфонил)пиперазин-1-ил]метил]тиено[3,2^]пиримидин-4-ил]морфолин (известный также как GDC 0941 и описанный в публикациях PCT WO 09/036082 и WO 09/055730), 2-метил-2-[4-[3-метил-2оксо-8-(хинолин-3 -ил)-2,3-дигидроимидазо [4,5<]хинолин-1 -ил] фенил]пропионитрил (известный также как BEZ 235 или NVP-BEZ 235 и описанный в публикации PCT WO 06/122806), BMK120 и BYL719;
Ингибиторы mTOR: антитела к HER3 или их фрагменты можно применять в сочетании с ингибиторами mTOR, включая (но, не ограничиваясь только ими) темсиролимус (поступает в продажу товарным знаком Torisel® фирмы Pfizer), ридафоролимус (прежнее название деферолимус, (1R,2R,4S)-4-[(2R)-2 [(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R, 23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-дигидрокси-19,30-диметокси15,17,21,23,29,35-гексаметил-2,3,10,14,20-пентаоксо-11,36-диокса-4-азатрицикло[30.3.1.04,9]гексатриаконта-16,24,26,28-тетраен-12-ил]пропил]-2-метоксициклогексилдиметилфосфинат, известный также как дефоролимус, AP23573 и MK8669 (фирма Ariad Pharm.), и описанный в публикации PCT WO 03/064383), эверолимус (RAD001) (поступает в продажу товарным знаком Afinitor® фирмы Novartis). Одно или несколько терапевтических средств можно вводить либо одновременно, либо до, либо после введения HER3 или его фрагмента, предлагаемого в настоящем изобретении.
Методы получения антител, предлагаемых в изобретении (I) Нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела
Некоторые нуклеиновые кислоты содержат нуклеотидную последовательность, которая кодирует вариабельную область тяжелой цепи, и/или нуклеотидную последовательность, которая кодирует вариа
- 61 036314 бельную область легкой цепи HER3. Молекулы нуклеиновых кислот могут представлять собой молекулы, которые приведены в табл. 1. Некоторые другие молекулы нуклеиновых кислот могут содержать нуклеотидные последовательности, которые практически идентичны (например, по меньшей мере на 65%, 80%, 95% или 99%) нуклеотидным последовательностям, которые представлены в табл. 1. При экспрессии с использованием соответствующих экспрессионных векторов полипептиды, кодируемые этими полинуклеотидами, обладают способностью связываться с антигеном HER3.
Изобретение относится также к полинуклеотидам, которые кодируют по меньшей мере один CDRучасток и, как правило, все три CDR-участка тяжелой или легкой цепи представленного выше HER3связывающего антитела. Некоторые другие полинуклеотиды кодируют всю или практически всю последовательность вариабельной области тяжелой цепи и/или легкой цепи представленного выше HER3связывающего антитела. Из-за вырожденности генетического кода каждую из аминокислотных последовательностей иммуноглобулина могут кодировать различные нуклеотидные последовательности.
Молекулы нуклеиновых кислот могут кодировать как вариабельную область, так и константную область антитела. Некоторые нуклеотидные последовательности содержат нуклеотиды, кодирующие последовательность вариабельной области зрелой тяжелой цепи, которая практически идентична (например, по меньшей мере на 80%, 90% или 99%) последовательности вариабельной области зрелой тяжелой цепи антитела к HER3, представленного в табл. 1. Некоторые другие нуклеотидные последовательности содержат нуклеотиды, кодирующие последовательность вариабельной области зрелой легкой цепи, которая практически идентична (например, по меньшей мере на 80%, 90% или 99%) последовательности вариабельной области зрелой легкой цепи антитела к HER3, представленного в табл. 1.
Полинуклеотидные последовательности можно получать de novo твердофазным синтезом ДНК или с помощью ПЦР-мутагенеза существующей последовательности (например, последовательностей, описанных ниже в примерах), кодирующей HER3-связывαющее антитело или его связывающий фрагмент. Прямой химический синтез нуклеиновых кислот можно осуществлять методами, известными в данной области, такими как фосфотриэфирный метод, описанный у Narang и др., Meth. Enzymol. 68, 1979, с. 90; фосфодиэфирный метод, описанный у Brown и др., Meth. Enzymol. 68, 1979, с. 109; диэтилфосфорамидитный метод, описанный у Beaucage и др., Tetra. Lett, 22, 1981, с. 1859; и метод, основанный на применении твердых подложек, который описан в US № 458066. Введение мутаций в полинуклеотидную последовательность с помощью ПЦР можно осуществлять, например, согласно методам, описанным в: PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, под ред. Н.А. Erlich, изд-во Freeman Press, NY, NY, 1992; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, под ред. Innis и др., изд-во Academic Press, San Diego, CA, 1990; Mattila и др., Nucleic Acids Res. 19, 1991, с 967; и Eckert и др., PCR Methods and Applications 1, 1991, с. 17.
Для экспрессии полинуклеотидов, кодирующих цепи HER3-связывaющего антитела или их связывающие фрагменты, можно применять различные экспрессионные векторы. Для получения антител в клетках-хозяевах млекопитающих можно применять как вирусные, так и невирусные экспрессионные векторы. К невирусным векторам и системам относятся плазмиды, эписомальные векторы, как правило, с кассетой экспрессии, предназначенной для экспрессии белка или РНК, и человеческие искусственные хромосомы (см., например, Harrington и др., Nat Genet 15, 1997, с. 345). Например, в качестве невирусных векторов, которые можно применять для экспрессии HER3-связывaющих полинуклеотидов и полипептидов в клетках млекопитающих (например, человека), можно использовать pThioHis A, B и C, pcDNA3. I/His, pEBVHis A, B и C (фирма Invitrogen, Сан-Диего, шт. Калифорния), MPSV-векторы и многочисленные другие векторы, известные в данной области, которые экспрессируют другие белки. Пригодными векторами являются векторы на основе ретровирусов, аденовирусов, аденоассоциированных вирусов, вируса герпеса, векторы на основе SV40, вируса папилломы, НВР-вируса Эпштейна-Барра, векторы на основе вируса коровьей оспы и вируса леса Семлики (SFV) (см. Brent и др., выше; Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49, 1995, с. 807; и Rosenfeld и др., Cell 68, 1992, с. 143).
Выбор экспрессионного вектора зависит от клетки-хозяина, предназначенной для экспрессии вектора. Как правило, экспрессионные векторы содержат промотор и другие регуляторные последовательности (например, энхансеры), функционально связанные с полинуклеотидами, которые кодируют цепь HER3-связывaющего антитела или его фрагмент. Индуцибельный промотор применяют для того, чтобы предупреждать экспрессию встроенных последовательностей во всех случаях за исключением случая, когда имеют место индуцирующие условия. Индуцибельными промоторами являются, например, промотор арабинозы, lacZ, промотор металлотионеина или промотор белка теплового шока. Культуры трансформированных организмов можно размножать в неиндуцирующих условиях, при этом не требуется осуществлять сдвиг популяции в сторону кодирующих последовательностей, продукты экспрессии которых лучше переносятся клеткой. Помимо промоторов для эффективной экспрессии цепи или фрагмента HER3-связывaющего антитела могут требоваться или быть желательными также и другие регуляторные элементы. Эти элементы, как правило, включают инициирующий кодон ATG и примыкающий сайт связывания рибосомы или другие последовательности. Кроме того, эффективность экспрессии можно повышать путем включения энхансеров, которые соответствуют применяемой клеточной системе (см., например, Scharf и др., Results Probl. Cell Differ. 20, 1994, с. 125; и Bittner и др., Meth. Enzymol., 153, 1987, с.
- 62 036314
516). Например, энхансер SV40 или энхансер CMV можно применять для повышения уровня экспрессии в клетках-хозяевах млекопитающих.
В экспрессионные векторы можно встраивать также секретируемую сигнальную последовательность для получения слитого белка с полипептидами, кодируемыми встроенными последовательностями HER3-связывαющего антитела. Чаще встроенные последовательности HER3-связывaющего антитела связывают с сигнальными последовательностями перед включением в вектор. Векторы, которые можно применять для получения последовательностей, кодирующих вариабельные области легкой и тяжелой цепи HER3-связывaющего антитела, в некоторых случаях могут кодировать также константные области или их участки. Такие векторы позволяют также экспрессировать вариабельные области в виде слитых с константными областями белков, что позволяет тем самым продуцировать интактные антитела или их фрагменты. Как правило, указанные константные области являются человеческими.
Клетки-хозяева, которые несут или экспрессируют цепи HER3-связывaющего антитела, могут представлять собой либо прокариотические, либо эукариотические клетки. Микроорганизм Е. coli является одним из прокариотических хозяев, которые применяют для клонирования и экспрессии полинуклеотидов, предлагаемых в настоящем изобретении. Другими пригодными для применения хозяевамимикроорганизмами являются бациллы, такие как Bacillus subtilis, и другие представители сем. Enter obacteriaceae, такие как Salmonella, Serratia и различные виды Pseudomonas. Для этих прокариотических хозяев можно создавать такие экспрессионные векторы, которые, как правило, содержат контролирующие экспрессию последовательности, совместимые с клеткой-хозяином (например, сайт инициации репликации). Кроме того, должны присутствовать любые из широкого разнообразия хорошо известных промоторов, такие как промоторная система лактозы, промоторная система триптофана (trp), промоторная система бета-лактамазы или промоторная система фага лямбда. Промоторы, как правило, контролируют экспрессию, необязательно в сочетании с последовательностью оператора, и имеют последовательности сайта связывания рибосомы и т.п., предназначенные для инициации и завершения транскрипции и трансляции. Для экспрессии HER3-связывaющих полипептидов можно применять также другие микроорганизмы, такие как дрожжи. Можно применять также клетки насекомых в сочетании с бакуловирусными векторами.
Для экспрессии и получения HER3-связывaющих полипептидов можно применять клетки-хозяева млекопитающих. Например, они могут представлять собой либо линию клеток гибридомы, экспрессирующей эндогенные гены иммуноглобулина (например, описанный в примерах клон гибридомы, полученный в результате слияния с миеломой, например, 1D6.C9), либо линию клеток млекопитающих, которая несет экзогенный экспрессионный вектор (например, описанные ниже в примере клетки миеломы SP2/0). Они включают любую клетку животного или человека, характеризующуюся обычной смертностью, или обычные или аномальные иммортализованные клетки. Например, разработано несколько приемлемых линий клеток-хозяев, обладающих способностью секретировать интактные иммуноглобулины, включая линии CHO-клеток, различные линии Cos-клеток, HeLa-клетки, линии клеток миелом, трансформированные B-клетки и гибридомы. Применение культур клеток из тканей млекопитающих для экспрессии полипептидов описано в целом, например, у Winnacker, From Genes to Clones, изд-во VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987. Экспрессионные векторы для клеток-хозяев млекопитающих могут включать контролирующие экспрессию последовательности, такие как сайт инициации репликации, промотор и энхансер (см., например, Queen и др., Immunol. Rev. 89, 1986, сс. 49-68), необходимые для процессинга информационные сайты, такие как сайт связывания рибосомы, сайты РНК-сплайсинга, сайты полиаденилирования и последовательности терминаторов транскрипции. Эти экспрессионные векторы, как правило, содержат промоторы, выведенные из генов млекопитающих или из вирусов млекопитающих. Приемлемые промоторы могут быть конститутивными, специфическими для типа клеток, специфическими для стадии развития и/или могут быть модулируемыми или регулируемыми. Пригодными промоторами являются (но, не ограничиваясь только ими) промотор металлотионеина, конститутивный главный поздний промотор аденовирусов, индуцируемый дексаметазоном промотор MMTV, промотор SV40, промотор MRP polIII, конститутивный промотор MPSV, индуцируемый тетрациклином помотор CMV (такой как человеческий немедленно-ранний промотор CMV), конститутивный промотор CMV и комбинации промотор-энхансер, известные в данной области.
Методы интродукции экспрессионных векторов, содержащих представляющие интерес полинуклеотидные последовательности, следует выбирать в зависимости от типа клетки-хозяина. Например, трансфекции с использованием хлорида кальция, как правило, применяют для прокариотических клеток, в то время как обработку фосфатом кальция или электропорацию можно применять для других типов клеток-хозяев (см. общие положения у Sambrook и др., выше). Другие методы представляют собой, например, электропорацию, обработку фосфатом кальция, опосредуемую липосомой трансформацию, инъекцию и микроинъекцию, баллистические методы, применение вирусом, иммунолипосом, конъюгатов поликатион: нуклеиновая кислота, оголенной ДНК, искусственных вирионов, слитого с вирусом герпеса структурного белка VP22 (Elliot и O'Hare, Cell 88, 1997, с. 223), агента, облегчающего проникновение ДНК, и трансдукцию ex vivo. Для длительного производства с высоким выходом рекомбинантных белков часто является желательной стабильная экспрессия. Например, клеточные линии, которые стабильно
- 63 036314 экспрессируют цепи HER3-связывающего антитела или его связывающие фрагменты, можно получать, используя экспрессионные векторы, которые содержат вирусные сайты инициации репликации или эндогенные экспрессионные элементы и селектируемый маркерный ген. После интродукции вектора клеткам можно давать расти в течение 1 -2 дней в обогащенных средах, после чего переносить их в селективные среды. Селектируемый маркер вносят с целью придания устойчивости к фактору селекции, и его присутствие обеспечивает рост клеток, в которых происходит успешная экспрессия интродуцированных последовательностей в селективных средах. Устойчивые стабильно трансфектированные клетки можно размножать с помощью методов культивирования тканей, пригодных для конкретного типа клеток.
(II) Создание моноклональных антител, предлагаемых в изобретении
Моноклональные антитела (МАт) можно получать с помощью различных методов, включая общепринятые методы получения моноклональных антител, например, с помощью стандартного метода гибридизации соматических клеток, описанного у Kohler и Milstein, Nature 256, 1975, с. 495. Для получения моноклональных антител можно применять многочисленные методики, например, трансформацию Bлимфоцитов вирусами или онкогенами.
Применяемая для получения гибридом система животного происхождения представляет собой систему, основанную на использовании мышей. Создание гибридомы в мыши является хорошо известной процедурой. Протоколы иммунизации и методы выделения иммунизированных спленоцитов, предназначенных для слияния, известны в данной области. Известны также компоненты, участвующие в слиянии (например, клетки мышиной миеломы), и процедуры слияния.
Химерные или гуманизированные антитела можно создавать на основе последовательности мышиного моноклонального антитела, полученного согласно описанному выше методу. ДНК, кодирующую тяжелые и легкие цепи иммуноглобулинов, можно получать из представляющей интерес мышиной гибридомы и создавать так, чтобы она содержала немышиные (например, человеческие) последовательности иммуноглобулинов, с помощью стандартных методов молекулярной биологии. Например, для создания химерного антитела можно связывать мышиные вариабельные области с человеческими константными областями с использованием известных в данной области методов (см., например, US № 4816567 на имя Cabilly с соавторами). Для создания гуманизированного антитела мышиные CDR-участки можно встраивать в человеческий каркасный участок с помощью известных в данной области методов (см., например, US № 5225539 на имя Winter и US №№ 5530101; 5585089; 5693762 и 6180370 на имя Queen с соавторами).
Антитела могут представлять собой человеческие моноклональные антитела. Такие человеческие моноклональные антитела к HER3 можно создавать с использованием трансгенных или трансхромосомных мышей, несущих фрагменты человеческой, а не мышиной иммунной системы. К этим трансгенным и трансхромосомным мышам относятся мыши, обозначенные в контексте настоящего описания как HuMAb-мыши и KM-мыши соответственно, и мышей обеих указанных линий обозначают в контексте настоящего описания как мыши, несущие человеческий Ig.
Мыши линии HuMAb (HuMAb mouse®, фирма Medarex, Inc.) несут минилокусы генов человеческого иммуноглобулина, которые кодируют неперегруппированные последовательности человеческой тяжелой (μ и γ) и легкой κ-цепи иммуноглобулина, в сочетании с целевыми мутациями, которые инактивируют эндогенные локусы μ- и κ-цепи (см., например, Lonberg и др., Nature 368(6474), 1994, сс. 856-859). Таким образом, у мыши снижена способность экспрессировать мышиный IgM или κ-цепь, и в ответ на иммунизацию интродуцированные трансгены человеческой тяжелой и легкой цепи подвергаются переключению класса и соматической мутации с образованием обладающего высокой аффинностью человеческого моноклонального IgGK (Lonberg и др., 1994, выше; обзорная статья Lonberg, Handbook of Experimental Pharmacology 113, 1994, сс. 49-101; Lonberg и Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13, 1995, сс. 65-93 и Harding и Lonberg, Ann. N. Y. Acad. Sci. 764, 1995, сс. 536-546). Получение и применение мышей линии HuMAb и геномные модификации, которые несут такие мыши, описаны также у Taylor и др., Nucleic Acids Research 20, 1992, сс. 6287-6295; Chen и др., International Immunology 5, 1993, сс. 647-656; Tuaillon и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 1993, сс. 3720-3724; Choi и др., Nature Genetics 4, 1993, сс. 117-123; Chen и др., EMBO J. 12, 1993, сс. 821-830; Tuaillon и др., J. Immunol. 152, 1994, сс. 2912-2920; Taylor и др., International Immunology, 1994, сс. 579-591; и Fishwild и др., Nature Biotechnology 14, 1996, сс. 845851, содержание всех публикаций специально полностью включено в настоящее описание в качестве ссылки (см. также US №№ 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; 5789650; 5877397; 5661016; 5814318; 5874299 и 5770429, все на имя Lonberg и Kay; US № 5545807 на имя Surani с соавторами; опубликованные заявки PCT WO 92103918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97113852, WO 98/24884 и WO 99/45962, все на имя Lonberg и Kay; и опубликованную заявку PCT WO 01/14424 на имя Korman с соавторами).
Человеческие антитела можно получать с использованием мыши, которая несет трансгенные и трансхромосомные последовательности человеческого иммуноглобулина, например мыши, которая несет трансген человеческой тяжелой цепи и трансхромосому человеческой легкой цепи. Такие мыши, обозначенные в контексте настоящего описания как KM-мыши, описаны подробно в публикации PCT WO 02/43478 на имя Ishida с соавторами.
- 64 036314
В данной области известны также и другие альтернативные системы на основе трансгенных животных, экспрессирующих гены человеческого иммуноглобулина, и их можно применять для получения
HER3-связывающих антител. Например, можно использовать другую трансгенную систему, обозначенную как Xenomouse (фирма Abgenix, Inc.); такие мыши описаны, например, в US №№ 5939598; 6075181;
6114598; 6150584 и 6162963 на имя Kucherlapati с соавторами.
Кроме того, в данной области известны также другие трансхромосомные системы, созданные на основе животных, для экспрессии генов человеческого иммуноглобулина, и их можно применять для получения HER3-связывающих антител. Например, можно использовать мышей, несущих как трансхромосому человеческой тяжелой цепи, так и трансхромосому человеческой легкой цепи, которые обозначены как TC-мыши; такие мыши описаны, например, у Tomizuka и др. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 2000, сс. 722-727. Кроме того, в данной области известны коровы, несущие трансхромосомы человеческой тяжелой и легкой цепи (Kuroiwa и др., Nature Biotechnology 20, 2002, сс. 889-894), и их можно применять для получения HER3-связывающих антител. Человеческие моноклональные антитела можно получать также с использованием методов фагового дисплея для скрининга библиотек генов человеческих иммуноглобулинов. Такие методы фагового дисплея, предназначенные для выделения человеческих антител, известны в данной области (см., например, US №№ 5223409; 5403484 и 5571698 на имя Ladner с соавторами, US №№ 5427908 и 5580717 на имя Dower с соавторами, US №№ 5969108 и 6172197 на имя McCafferty с соавторами, и US №№ 5885793; 6521404; 6544731; 6555313; 6582915 и 6593081 на имя Griffiths с соавторами) или они описаны в приведенных ниже примерах.
Человеческие моноклональные антитела можно получать также с использованием SCID-мышей (мыши с тяжелым комбинированным иммунодефицитом), в которых восстанавливали человеческие иммуноциты с тем, чтобы при иммунизации можно было получать человеческий гуморальный иммунный ответ. Такие мыши описаны, например, в № US 5476996 и 5698767 на имя Wilson с соавторами.
(III) Конструирование каркасных участков или Fc
К сконструированным антителам относятся антитела, в которых сделаны модификации в остатках каркасных участков в VH и/или VL, например, с целью улучшения свойств антитела. Как правило, такие модификации каркасных участков осуществляют для снижения иммуногенности антитела. Например, один из подходов представляет собой обратное мутирование одного или нескольких остатков каркасного участка с получением соответствующей последовательности зародышевой линии. Более конкретно, антитело, которое было подвергнуто соматической мутации, может содержать остатки каркасного участка, отличающиеся от последовательности зародышевой линии, из которой выведено антитело. Такие остатки можно идентифицировать путем сравнения последовательностей каркасных участков антитела с последовательностями зародышевой линии, из которой выведено антитело. Для возвращения последовательностей каркасного участка к исходной конфигурации зародышевой линии можно подвергать соматические мутации обратному мутированию с получением последовательности зародышевой линии, например, с помощью сайтнаправленного мутагенеза. Такие антитела, полученные путем обратного мутирования, также подпадают под объем настоящего изобретения.
Другой тип модификации каркасного участка включает изменение путем мутации одного или нескольких остатков в каркасном участке или даже в одном или нескольких CDR-участках для удаления Tклеточных эпитопов с целью снижения потенциальной иммуногенности антитела. Этот подход обозначают также как деиммунизация, и он описан более подробно в опубликованном патенте US № 2003/0153043 на имя Carr с соавторами.
В дополнительном или альтернативном варианте помимо модификаций в каркасных участках или CDR-участках антитела могут включать модификации в Fc-фрагменте, как правило, для изменения одного или нескольких функциональных свойств антитела, таких как время полужизни в сыворотке, фиксация комплемента, связывание Fc-рецептора и/или антитело-обусловленная клеточнозависимая цитотоксичность. Кроме того, антитело можно модифицировать химически (например, к антителу можно присоединять один или несколько химических фрагментов) или можно модифицировать для изменения его гликозилирования, и в этом случае с целью изменения одного или нескольких функциональных свойств антитела. Нумерация остатков в Fc-фрагменте соответствует нумерации EU по Кэботу.
Шарнирную область CH1 можно модифицировать так, чтобы изменять, например увеличивать или снижать, количество цистеиновых остатков в шарнирной области. Этот подход описан также в US № 5677425 на имя Bodmer с соавторами. Количество цистеиновых остатков в шарнирной области CH1 изменяют, например, для облегчения сборки легких и тяжелых цепей или для повышения или снижения стабильности антитела.
Шарнирную область Fc-фрагмента антитела также можно изменять с помощью мутации для уменьшения биологического времени полужизни антитела. Более конкретно, интродуцируют одну или несколько аминокислотных мутаций в область контакта CH2-CH3-доменов шарнирной области Fcфрагмента для ухудшения связывания антитела с белком А золотистого стафилококка Staphylococcyl (SpA) по сравнению со связыванием нативной шарнирной области Fc-фрагмента с SpA. Этот подход описан более подробно в US № 6165745 на имя Ward с соавторами.
Fc-фрагмент можно изменять путем замены по меньшей мере одного аминокислотного остатка на
- 65 036314 другой аминокислотный остаток для изменения эффекторных функций антитела. Например, один или несколько аминокислотных остатков можно заменять на другой аминокислотный остаток таким образом, чтобы у такого антитела изменялась аффинность к эффекторному лиганду, но сохранялась антигенсвязывающая способность родительского антитела. Эффекторный лиганд, аффинность к которому изменяют, может представлять собой, например, Fc-рецептор или С1-компонент системы комплемента. Этот подход описан более подробно в US № 5624821 и 5648260, оба на имя Winter с соавторами.
Один или несколько аминокислотных остатков аминокислотной последовательности можно заменять другим аминокислотным остатком так, чтобы антитело имело измененную способность к C1qсвязыванию и/или пониженную комплементзависимую цитотоксичность (CDC) или чтобы у него отсутствовала CDC. Этот подход описан более подробно в US № 6194551 на имя Idusogie с соавторами.
Один или несколько аминокислотных остатков можно также модифицировать, изменяя тем самым способность антитела к фиксации комплемента. Этот подход описан также в публикации заявки PCT WO 94/29351 на имя Bodmer с соавторами.
Fc-фрагмент можно модифицировать для повышения способности антитела вызывать антителообусловленную клеточнозависимую цитотоксичность (ADCC) и/или для повышения аффинности антитела к FcY-рецептору посредством модификации одной или нескольких аминокислот. Этот подход описан более подробно в публикации заявки PCT WO 00/42072 на имя Presta. Кроме того, были картированы сайты связывания человеческого IgGy с FcyRI, FcyRII, FcyRIII и FcRn и описаны варианты с улучшенной способностью к связыванию (см. Shields и др., J. Biol. Chen. 276, 2001, сс. 6591-6604).
Существет возможность модифицировать гликозилирование антитела. Например, можно создавать агликозилированное антитело (т.е. антитело, в котором отсутствует гликозилирование). Гликозилирование можно изменять, например, для повышения аффинности антитела к антигену. Такие углеводные модификации можно осуществлять путем, например, изменения одного или нескольких сайтов гликозилирования в последовательности антитела. Например, можно осуществлять одну или несколько аминокислотных замен, которые приводят к элиминации одного или нескольких сайтов гликозилирования каркасного участка вариабельной области, устраняя тем самым гликозилирование в этом сайте. Указанное агликозилирование может повышать аффинность антитела к антигену. Этот подход описан более подробно в US № 5714350 и 6350861 на имя Co с соавторами.
В дополнительном или альтернативном варианте можно создавать антитело с измененным типом гликозилирования, например гипофукозилированное антитело, которое имеет пониженное количество фукозильных остатков, или антитело с повышенным содержанием двурассекающих GlcNac-структур. Было продемонстрировано, что такие измененные схемы гликозилирования повышают ADCCактивность антител. Указанные углеводные модификации можно осуществлять, например, путем экспрессии антитела в клетке-хозяине с измененным механизмом гликозилирования. Клетки с измененным механизмом гликозилирования известны в данной области, и их можно применять в качестве клетокхозяев, в которых экспрессируют рекомбинантные антитела для получения тем самым антител с измененным гликозилированием. Например, в EP 1176195 на имя Hang с соавторами описана линия клеток с функционально нарушенным геном FUT8, который кодирует фукозилтрансферазу, в результате чего экспрессируемые в такой клеточной линии антитела характеризуются гипофукозилированием. В публикации заявки PCT WO 03/035835 на имя Presta описан вариант линии CHO-клеток, а именно Lecl3клетки, которые характеризуются пониженной способностью присоединять фукозу к связанным с Asn(297) углеводам, что приводит также к гипофукозилированию антител, экспрессируемых в этой клетке-хозяине (см. также Shields и др., J. Biol. Chem. 277, 2002, сс. 26733-26740). В публикации заявки PCT WO 99/54342 на имя Umana с соавторами, описаны линии клеток, сконструированные для экспрессии модифицирующих гликопротеин гликозилтрансфераз (например, бета(1,4)-Ы-ацетилглюкозаминилтрансферазы Ill (GnTIII)), в результате чего антитела, которые экспрессируются в сконструированных линиях клеток, характеризуются повышенным содержанием двурассекающих GlcNac-структур, что приводит к повышенной ADCC-активности антител (см. также Umana и др., Nat. Biotech. 17, 1999, сс. 176-180).
Антитело можно модифицировать для удлинения биологического времени полужизни. При этом возможно применение различных подходов. Например, можно интродуцировать одну или несколько из следующих мутаций: T252L, T254S, T256F, описанных в US № 6277375 на имя Ward. В другом варианте для удлинения биологического времени полужизни можно изменять антитело в СН1-или CL-области путем интродукции связывающегося с рецептором-спасателем эпитопа, полученного из двух петель Cffi-домена Fc-фрагмента IgG, как описано в US №№ 5869046 и US 6121022 на имя Presta с соавторами.
(IV) Методы конструирования измененных антител
Как указано выше, HER3-связывающие антитела, которые имеют последовательности VH и VL или последовательности полноразмерной тяжелой и легкой цепи можно применять для создания новых HER3-связывающих антител путем модификации последовательностей полноразмерной тяжелой цепи и/или легкой цепи, последовательностей VH и/или VL или присоединенной(ых) к ним константной(ых) области(ей). Таким образом, структурные особенности HER3-связывающего антитела используют для
- 66 036314 создания структурно родственных HER3-связывающих антител, которые сохраняют по меньшей мере одно из функциональных свойств основных антител, таких как связывание с человеческим HER3, а также способность ингибировать одно или несколько функциональных свойств HER3. Например, один или несколько CDR-участков антител или их мутантов можно объединять рекомбинантно с известными каркасными участками и/или другими CDR для получения дополнительных, созданных с использованием рекомбинантной ДНК HER3 -связывающих антител. Другие типы модификаций включают модификации, описанные в предыдущем разделе. Исходным материалом для конструирования является одна или несколько последовательностей VH и/или VL, представленных в настоящем описании, или один или несколько их CDR-участков. Для создания сконструированного антитела не является необходимым фактическое получение (т.е. экспрессия в виде белка) антитела, которое имеет одну или несколько из последовательностей VH и/или VL, представленных в настоящем описании, или один или несколько их CDRучастков. Предпочтительно информацию, содержащуюся в последовательности(ях), используют в качестве исходного материала для создания последовательности(ей) второго поколения, выведенной(ых) из исходной(ых) последовательности(ей), и затем получают последовательность(и) второго поколения и экспрессируют в виде белка.
Таким образом, можно получать HER3-связывающее антитело, состоящее из: последовательности вариабельной области тяжелой цепи антитела, которая содержит последовательность CDR1, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 2, 8, 20, 26, 38, 44, 56, 62, 74, 80, 92, 98, 110, 116, 128, 134, 146, 152, 164, 170, 182, 188, 200, 206, 218, 224, 236, 242, 254, 260, 272, 278, 290, 296, 308, 314, 326, 332, 344, 350, 362 и 368; последовательность CDR2, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 3, 9, 21, 27, 39, 45, 57, 63, 75, 81, 93, 99, 111, 117, 129, 135, 147, 153, 165, 171, 183, 189, 201, 207, 219, 225, 237, 243, 255, 261, 273, 279, 291, 297, 309, 315, 327, 333, 345, 351, 363 и 369; и/или последовательность CDR3, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 4, 10, 22, 28, 40, 46, 58, 64, 75, 82, 94, 100, 112, 118, 130, 136, 148, 154, 166, 172, 184, 190, 202, 208, 220, 226, 238, 244, 256, 262, 274, 280, 292, 298, 310, 316, 328, 334, 346, 352, 364 и 370; и последовательности вариабельной области легкой цепи антитела, которая содержит последовательность CDR1, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 5, 11, 23, 29, 41, 47, 59, 65, 77, 83, 95, 101, 113, 119, 131, 137, 149, 155, 167, 173, 185, 191, 203, 209, 221, 227, 239, 245, 257, 263, 275, 281, 293, 299, 311, 317, 329, 335, 347, 353, 365 и 371; последовательность CDR2, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 6, 12, 24, 30, 42, 48, 60, 66, 78, 84, 96, 102, 114, 120, 132, 138, 150, 156, 168, 174, 186, 192, 204, 210, 222, 228, 240, 246, 258, 264, 276, 282, 294, 300, 312, 318, 330, 336, 348, 354, 366 и 372; и/или последовательность CDR3, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 7, 13, 25, 31, 43, 49, 61, 67, 79, 85, 97, 103, 115, 121, 133, 139, 151, 157, 169, 175, 187, 193, 205, 211, 223, 229, 241, 247, 259, 265, 277, 283, 295, 301, 313, 319, 331, 337, 349, 355, 367 и 373; для этого изменяют по меньшей мере один аминокислотный остаток в последовательности вариабельной области тяжелой цепи антитела и/или вариабельной области легкой цепи антитела, создавая по меньшей мере одну измененную последовательность антитела, и экспрессируют измененную последовательность антитела в виде белка. Измененную последовательность антитела можно создавать также путем скрининга библиотек антител, которые имеют фиксированные последовательности CDR3 или минимальные имеющие решающее значение связывающие детерминанты, описанные в US № 20050255552, и разнообразные последовательности CDR1 и CDR2. Скрининг можно осуществлять с использованием любого метода скрининга, пригодного для скрининга антител из библиотек антител, такого как технология фагового дисплея.
Для получения и экспрессии измененной последовательности антитела можно применять стандартные методы молекулярной биологии. Антитело, кодируемое измененной(ыми) последовательностью(ями), представляет собой антитело, которое сохраняет одну, несколько или все функциональные свойства HER3-связывающих антител, представленных в настоящем описании, где функциональные свойства представляют собой (но, не ограничиваясь только ими) специфическое связывание с HER3 человека и/или обезьяны циномолгус; при этом антитело связывается с HER3 и нейтрализует биологическую активность HER3 путем ингибирования сигнальной активности HER по данным анализа фосфоHER.
Функциональные свойства измененных антител можно оценивать с помощью стандартных анализов, известных в данной области и/или представленных в настоящем описании, таких как описанные в разделе Примеры (например, ELISA).
Мутации можно интродуцировать произвольно или избирательно во всю или в часть кодирующей последовательности HER3-связывающего антитела и полученные в результате модифицированные HER3-связывающие антитела можно подвергать скринингу в отношении связывающей активности и/или других описанных выше функциональных свойств. Методы интродукции мутаций известны в данной области. Например, в публикации заявки PCT WO 02/092780 на имя Short описаны методы создания и скрининга мутаций антител с помощью насыщающего мутагенеза, синтетической сборки лигированием или с помощью комбинации этих методов. Альтернативно этому в опубликованной заявке PCT WO 03/074679 на имя Lazar с соавторами описаны методы, основанные на компьютерном скрининге, для оптимизации физико-химических свойств антител.
- 67 036314
Характеризация антител, предлагаемых в изобретении
Антитела можно характеризовать с помощью различных функциональных анализов. Например, их можно характеризовать по их способности нейтрализовать биологическую активность путем ингибирования передачи сигнала HER на основе анализа фосфо-HER, который представлен в настоящем описании, по их аффинности к белку HER3 (например, HER3 человека и/или обезьяны циномолгус), по эпитопной группировке, по их устойчивости к протеолизу и по их способности блокировать передачу сигнала HER3 в прямом направлении. Различные методы можно применять для оценки опосредуемой HER3 передачи сигнала. Например, путь передачи сигнала HER можно определять путем (I) оценки фосфоHER3; (II) оценки фосфорилирования HER3 или других белков, расположенных в пути передачи сигнала (например, Akt), (III) с помощью анализов блокады лигандов, которые представлены в настоящем описании, (IV) по образованию гетеродимеров, (V) по схеме HER3-зависимой экспрессии генов, (VI) по интернализации рецептора и (VII) по определяемых HER3 клеточным фенотипам (например, по пролиферации).
Способность антитела связываться с HER3 можно выявлять путем непосредственного мечения представляющего интерес антитела, или антитело может находиться в немеченой форме, а связывание можно выявлять косвенными методами, используя форматы сэндвич-анализов, которые известны в данной области.
HER3-связывающие антитела блокируют связывание или конкурируют за связывание полипептида или белка HER3 с референс-антителом, связывающимся с HER3. Они могут представлять собой полностью человеческие HER3-связывающие антитела, описанные выше. Они могут представлять собой также другие мышиные, химерные или гуманизированные HER3-связывающие антитела, которые связываются с тем же эпитопом, что и референс-антитело. Способность блокировать связывание референс-антитела с эпитопом или конкурировать за связывание с референс-антителом свидетельствует о том, что тестируемое HER3-связывающее антитело связывается с тем же или подобным эпитопом, который распознается референс-антителом, или с эпитопом, который расположен в достаточной близости от эпитопа, с которым связывается референс-антитело, связывающееся с HER3. Указанные антитела с большой долей вероятности будут обладать преимуществами, выявленными у референс-антитела. Способность блокировать связывание или конкурировать с референс-антителом можно определять, например, с помощью анализа конкурентного связывания. При осуществлении анализа конкурентного связывания определяют способность тестируемого антитела ингибировать специфическое связывание референс-антитела с общим антигеном, таким как полипептид или белок HER3. Тестируемое антитело конкурирует с референсантителом за специфическое связывание с антигеном, если при применении в избыточном количестве тестируемое антитело в значительной степени ингибирует связывание референс-антитела. Понятие в значительной степени ингибирует означает, что тестируемое антитело снижает связывание референсантитела, как правило, по меньшей мере на 10%, 25%, 50%, 75% или 90%.
Известно несколько конкурентных анализов связывания, которые можно применять для оценки конкуренции HER3-связывающего антитела и референс-антитела, связывающегося с HER3, за связывание с белком HER3. К ним относятся, например, твердофазный прямой или косвенный радиоиммуноанализ (РИА), твердофазный прямой или косвенный иммуноферментный анализ (ИФА), конкурентный сэндвич-анализ (см. Stahli и др., Methods in Enzymology 9, 1983, сс. 242-253); твердофазный прямой ИФА с использованием биотина-авидина (см. Kirkland и др., J. Immunol. 137, 1986, сс. 3614-3619); твердофазный прямой анализ с использованием метки, твердофазный прямой сэндвич-анализ с использованием метки (см. Harlow и Lane, выше); твердофазный прямой РИА с использованием в качестве метки I125 (см. Morel и др., Molec. Immunol. 25, 1988, сс. 7-15); твердофазный прямой ИФА с использованием биотина и авидина (Cheung и др., Virology 176, 1990, сс. 546-552); и прямой РИА с использованием метки (Moldenhauer и др., Scand. J. Immunol. 32, 1990, сс. 77-82). Как правило, такой анализ предусматривает применение очищенного антигена, связанного с твердой поверхностью, или клеток, несущих любые из них, немеченого тестируемого HER3-связывающего антитела и меченого референс-антитела. Конкурентное ингибирование оценивают, определяя количество метки, связанной с твердой поверхностью или клетками, в присутствии тестируемого антитела. Как правило, тестируемое антитело применяют в избыточном количестве. К антителам, идентифицированным с помощью конкурентного анализа (конкурирующие антитела), относятся антитела, которые связываются с тем же эпитопом, что и референсантитело, и антитела, которые связываются с соседним эпитопом, расположенным в достаточной близости от эпитопа, с которым связывается референс-антитело, чтобы это создавало стерическую помеху.
Для решения вопроса о том, связываются ли отобранные моноклональные HER3-связывающие антитела с уникальными эпитопами, каждое антитело можно биотинилировать с использованием поступающих в продажу реагентов (например, реагентов фирмы Pierce, Рокфорд, шт. Иллинойс). Анализы конкурентного связывания с использованием немеченых моноклональных антител и биотинилированных моноклональных антител можно осуществлять, применяя сенсибилизированные полипептидом HER3 планшеты для ELISA. Связывание биотинилированного МАт можно выявлять с помощью зонда стрептавидин-щелочная фосфатаза. Для определения изотипа очищенного HER3-связывающего антитела можно применять специфические для изотипа ELISA. Например, лунки титрационных планшетов можно сенси
- 68 036314 билизировать с использованием взятого в концентрации 1 мкг/мл антитела к человеческому IgG в течение ночи при 4°C. После блокирования с помощью 1% БСА содержимое планшетов подвергают взаимодействию с моноклональным HER3-связывающим антителом или с очищенными применяемыми для контроля изотипа антителами в концентрации 1 мкг/мл или менее в течение 1-2 ч при температуре окружающей среды. Затем содержимое лунок можно подвергать взаимодействию с конъюгированными с щелочной фосфатазой зондами, специфическими в отношении либо человеческого IgGY, либо человеческого IgM. Затем планшеты проявляют и подвергают анализу, с помощью которого можно определять изотип очищенного антитела.
Для демонстрации связывания моноклональных HER3-связывающих антител с живыми клетками, экспрессирующими полипептид HER3, можно применять проточную цитометрию. В целом, метод состоит в следующем: линии клеток, экспрессирующие HER3 (выращенные в стандартных условиях культивирования), можно смешивать с HER3-связывающим антителом, взятым в различных концентрациях, в ЗФР, содержащем 0,1% БСА и 10% фетальной телячьей сыворотки, и инкубировать в течение 1 ч. После отмывки клетки подвергают взаимодействию с меченным флуоресцеином антителом к человеческому IgG в таких же условиях, которые применяют для окрашивания первичным антителом. Образцы можно анализировать с помощью устройства типа FACScan, основанном на использовании света и свойств бокового рассеяния, устанавливая дискриминационное окно на индивидуальные клетки. В альтернативном варианте для анализа можно использовать флуоресцентный микроскоп (в дополнение к проточной цитометрии или вместо нее). Клетки можно окрашивать полностью согласно описанному выше методу и оценивать с помощью флуоресцентного микроскопа. Этот метод позволяет визуализировать индивидуальные клетки, но может обладать пониженной чувствительностью в зависимости от плотности антигена.
Реактивность HER3-связывающих антител в отношении полипептида HER3 или его антигенного фрагмента можно оценивать также с помощью вестерн-блоттинга. В целом, метод состоит в следующем: можно получать очищенные полипептиды HER3 или слитые белки, или можно приготавливать клеточные экстракты из клеток, экспрессирующих HER3, и подвергать гель-электрофорезу в присутствии додецилсульфата натрия. После электрофореза разделенные антигены переносят на нитроцеллюлозные мембраны, блокируют 10% фетальной телячьей сыворотки и зондируют тестируемыми моноклональными антителами. Связывание человеческого IgG можно выявлять с помощью антитела к человеческому IgG, конъюгированного с щелочной фосфатазой, и проявлять, используя таблетки субстрата BCIP/NBT (фирма Sigma Chem. Co., Сент-Луис, шт. Миссури).
Целый ряд выходных данных можно применять для оценки эффективности и специфичности антител к HER3 с использованием анализов в клетках индуцируемого лигандом образования гетеродимера. Активность можно оценивать с помощью одного или нескольких следующих методов:
(I) Ингибирование индуцируемой лигандом гетеродимеризации HER2 с другими представителями семейства EGF в линии клетки-мишени, например линии клеток рака молочной железы MCF-7. Иммунопреципитацию комплексов с HER2 из клеточных лизатов можно осуществлять с использованием специфического для рецептора антитела, и отсутствие/присутствие других EGF-рецепторов и их биологически соответствующих лигандов в комплексе можно анализировать с помощью электрофореза/вестернблоттинга путем зондирования антителами к другим EGF-рецепторам.
(II) Ингибирование активации путем передачи сигнала с помощью активированных лигандом гетеродимеров. Ассоциация с HER3, вероятно, имеет решающее значение для других представителей семейства рецепторов EGF в отношении образования максимального клеточного ответа после связывания с лигандом. В случае HER3 с дефицитом киназной активности HER2 является источником функционального тирозинкиназного домена, что обеспечивает передачу сигнала после связывания с лигандами фактора роста. Таким образом, клетки, в которых происходит совместная экспрессия HER2 и HER3, можно обрабатывать лигандом, например херегулином, в отсутствии и в присутствии ингибитора, и воздействие фосфорилирования тирозина HER3 оценивать разными путями, включая иммунопреципитацию HER3 из обработанных клеточных лизатов и последующий анализ методом вестерн-блоттинга с использованием антител к фосфотирозину (см. более подробно у Agus op. cit.) В альтернативном варианте можно осуществлять широкомасштабный анализ, основанный на трэппинге HER3 из солюбилизированных лизатов в лунках 96-луночного планшета, сенсибилизированного антителом к HER3-рецептору, и оценивать фосфорилирование тирозина с использованием, например, меченных европием антител к фосфотирозину, согласно методу, описанному у Waddleton и др., Anal. Biochem. 309, 2002, сс. 150-157.
В более широком смысле указанных подход состоит в том, что эффекторные молекулы, которые, как известно, должны активировать в прямом направлении активированные рецепторные гетеродимеры, такие как активируемые митогеном протеинкиназы (MAPK) и Akt, можно анализировать непосредственно путем иммунопреципитация из обработанных лизатов и блоттирования с использованием антител, которые выявляют активированные формы этих белков, или путем анализа способности этих белков модифицировать/активировать специфические субстраты.
(III) Ингибирование индуцируемой лигандом клеточной пролиферации. Известно, что в целом ряде клеточных линий происходит совместная экспрессия ErbB-рецепторов, например, во многих клеточных линиях рака молочной железы и предстательной железы. Анализы можно осуществлять в 24/48/96-
- 69 036314 луночных форматах, в которых в качестве выходных данных используют синтез ДНК (включение тритированного тимидина), увеличение количества клеток (окрашивание кристаллическим фиолетовым) и т.д.
Для оценки эффективности и специфичности антител к HER3 с использованием анализов независимого от лиганда образования гетеродимера в клетках можно применять целый ряд выходных данных. Например, сверхэкспрессия HER2 запускает независимую от лиганда активацию киназного домена в результате спонтанного образования димера. При его сверхэкспрессиии HER2 создает либо гомо-, либо гетеродимеры с другими молекулами HER, такими как HER1, HER3 и HER4.
Можно оценивать способность антител или их фрагментов блокировать in vivo рост опухолевых ксенотрансплантатов человеческих опухолевых линий клеток, онкогенный фенотин которых, как известно, по меньшей мере частично зависит от активации лигандом клеточной передачи сигнала гетеродимером HER3, например клеток рака поджелудочной железы линии BxPC3 и т.д. Это можно оценивать на мышах с ослабленным иммунитетом, используя антитела либо индивидуально, либо в комбинации с соответствующим цитотоксическим агентом для рассматриваемой клеточной линии. Примеры функциональных анализов представлены также ниже в разделе Примеры. Профилактическое и терапевтическое применение Способ лечения или предупреждения рака (такого, например, как рак молочной железы, колоректальный рак, рак легкого, множественная миелома, рак яичника, рак печени, рак желудка, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, острый миелолейкоз, хронический миелолейкоз, остеоаркома, плоскоклеточная карцинома, опухоли оболочки периферических нервов, шваннома, рак головы и шеи, рак мочевого пузыря, эзофагеальный рак, глиобластома, светлоклеточная саркома мягкой ткани, злокачественная мезотелиома, нейрофиброматоз, рак почки и меланома) заключается в том, что индивидууму, который нуждается в этом, вводят в эффективном количестве антитела.
Способы лечения или предупреждения рака, ассоциированного с путем передачи сигнала HER, заключаетсяв том, что индивидууму, который нуждается в этом, вводят в эффективном количестве антитела.
При этом раком, ассоциированным с путем передачи сигнала HER, является (но не ограничиваясь только ими) рак молочной железы, колоректальный рак, рак легкого, множественная миелома, рак яичника, рак печени, рак желудка, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, острый миелолейкоз, хронический миелолейкоз, остеоаркома, плоскоклеточная карцинома, опухоли оболочки периферических нервов, шваннома, рак головы и шеи, рак мочевого пузыря, эзофагеальный рак, глиобластома, светлоклеточная саркома мягкой ткани, злокачественная мезотелиома, нейрофиброматоз, рак почки и меланома.
Антитела к HER3 можно применять также для лечения или предупреждения других нарушений, ассоциированных с аберрантной или нарушенной передачей сигнала HER, включая (но не ограничиваясь только ими) респираторные заболевания, остеопороз, остеоартрит, поликистоз почек, диабет, шизофрению, сосудистое заболевание, болезнь сердца, неонкогенные пролиферативные болезни, фиброз и нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера.
Приемлемыми средствами для комбинированной терапии с использованием HER3-связывающих антител являются стандартные лекарственные средства, известные в данной области, которые могут модулировать путь передачи сигнала ErbB. Приемлемыми примерами стандартных лекарственных средств для HER2 являются (но не ограничиваясь только ими) герцептин и тайкерб. Приемлемыми примерами стандартных лекарственных средств для EGFR являются (но не ограничиваясь только ими) иресса, тарцева, эрбитукс и вектибикс. Другими средствами, которые можно применять для комбинированной терапии с использованием HER3-связывающих антител являются (но не ограничиваясь только ими) средства, которые модулируют рецепторные тирозинкиназы, рецепторы, связанные с G-белком, пути трансдукции сигналов роста/выживания, рецепторы ядерных гормонов, пути апоптоза, клеточный цикл и ангиогенез.
Диагностическое применение
Диагностические анализы, предназначены для обнаружения белка HER3 и/или экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей HER3, а также функции белка HER3 в биологическом образце (например, в крови, сыворотке, клетках, ткани) или в организме индивидуума, пораженного раком или имеющего риск развития рака.
Диагностические анализы, такие как конкурентные анализы, основаны на способности меченого аналога (индикатор) конкурировать с анализируемым веществом тест-образца за ограниченное количество сайтов связывания на общем партнере по связыванию. Как правило, осуществляют инсолюбилизацию партнера по связыванию до или после конкурентного анализа и затем индикатор и анализируемое вещество, связанное с партнером по связыванию, отделяют от несвязанного индикатора и анализируемого вещества. Такое разделение осуществляют путем сцеживания (когда партнер по связыванию предварительно был инсолюбилизирован) или путем центрифугирования (когда партнер по связыванию осажден после реакции конкурирования). Количество анализируемого вещества в тест-образце обратно пропорционально количеству связанного индикатора при оценке по количеству маркерной субстанции. Получают кривые дозовой зависимости с использованием известных количеств анализируемого вещества и сравнивают с результатами теста для количественной оценки уровни анализируемого вещества, присутствующего в тест-образце. Такие анализы называют анализами на основе ELISA-систем, когда в качестве
- 70 036314 выявляемых маркеров используют ферменты. В анализе такого формата конкурентное связывание между антителами и HER3-связывαющими антителами приводит к связыванию с белком HER3, предпочтительно эпитопами HER3, которое является мерой уровня антител в образце сыворотки, наиболее предпочтительно нейтрализирующих антител в образце сыворотки.
Важным преимуществом анализа является то, что можно осуществлять непосредственное измерение титра нейтрализующих антител (т.е. антител, которые оказывают интерферирующее действие на связывание с белком HER3, в частности его эпитопами). Такой анализ, прежде всего в формате ELISA, обычно используют в клинических условиях, и он является рутинным при осуществлении скрининга образцов крови.
Можно также определять уровень экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей HER3, или активности белка HER3 у индивидуума с целью выбора соответствующих терапевтических или профилактических средств для индивидуума (обозначены в контексте настоящего описания как фармакогеномные способы). Фармакогеномные исследования позволяют осуществлять выбор агентов (например, лекарственных средств), предназначенных для терапевтического или профилактического лечения индивидуума, на основе генотипа индивидуума (например, генотипа индивидуума, исследованного для определения способности индивидуума реагировать на конкретный агент).
Кроме того, возможно проводить мониторинг воздействия агентов (например, лекарственных средств) на экспрессию или активность белка HER3 в клинических исследованиях.
Фармацевтические композиции
Для приготовления фармацевтических или стерильных композиций, содержащих HER3связывющие антитела (интактные или связывающие фрагменты), HER3-связывaющие антитела (интактные или связывающие фрагменты) смешивают с фармацевтически приемлемым носителем или эксципиентом. Композиции могут дополнительно содержать одно или несколько других терапевтических средств, которые можно применять для лечения или предупреждения рака (рак молочной железы, колоректальный рак, рак легкого, множественная миелома, рак яичника, рак печени, рак желудка, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, острый миелолейкоз, хронический миелолейкоз, остеоаркома, плоскоклеточная карцинома, опухоли оболочки (влагалища) периферических нервов, шваннома, рак головы и шеи, рак мочевого пузыря, эзофагеальный рак, глиобластома, светлоклеточная саркома мягкой ткани, злокачественная мезотелиома, нейрофиброматоз, рак почки и меланома).
Препаративные формы терапевтических и диагностических агентов можно приготавливать путем смешения с физиологически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами в форме, например, лиофилизированных порошков, густых суспензий, водных растворов, лосьонов или суспензий (см., например, Hardman и др., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, изд-во McGraw-Hill, New York, N.Y., 2001; Gennaro, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, изд-во Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, N.Y, 2000; Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, под ред. Avis и др., изд-во Marcel Dekker, NY, 1993; Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, под ред. Lieberman и др., изд-во Marcel Dekker, NY, 1990; Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, под ред. Lieberman и др., изд-во Marcel Dekker, NY, 1990; Weiner и Kotkoskie, Excipient Toxicity and Safety, изд-во Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 2000).
Выбор схемы введения терапевтического средства зависит от нескольких факторов, включая скорость циркуляции субстанции в сыворотке или ткани, уровень симптомов, иммуногенность субстанции и доступность клеток-мишеней в биологическом матриксе. Схема введения предусматривает введение пациенту терапевтического средства в максимальных количествах, отличающихся приемлемым уровнем побочных действий. Таким образом, количество вводимого биологического агента зависит частично от конкретной субстанции и от серьезности состояния, подлежащего лечению. Известны руководства по выбору соответствующих доз антител, цитокинов и малых молекул (см., например, Wawrzynczak, Antibody Therapy, изд-во Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK, 1996; Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, под ред. Kresina, изд-во Marcel Dekker, New York, N.Y., 1991; Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, под ред. Bach, изд-во Marcel Dekker, New York, N.Y., 1993; Baert и др., New Engl. J. Med. 348, 2003, сс. 601-608; Milgrom и др., New Engl. J. Med. 341, 1999, сс. 1966-1973; Slamon и др., New Engl. J. Med. 344, 2001, сс. 783-792; Beniaminovitz и др., New Engl. J. Med. 342, 2000, сс. 613-619; Ghosh и др., New Engl. J. Med. 348, 2003, сс. 24-32; Lipsky и др., New Engl. J. Med. 343, 2000, сс. 1594-1602).
Определение соответствующей дозы осуществляет лечащий врач, например, на основе параметров или факторов, которые как это известно или предполагается в данной области, влияют на лечение, или предполагается, что они должны влиять на лечение. Как правило, введение доз начинают с уровня, несколько более низкого, чем оптимальная доза, и затем повышают с небольшими инкрементами до достижения требуемого или оптимального действия, принимая во внимание любые отрицательные побочные действия. Важными диагностическим критериями являются указанные симптомы, например, воспаление или уровень производства воспалительных цитокинов.
Фактические уровни доз действующих веществ в фармацевтических композициях можно варьировать таким образом, чтобы получать количество действующего вещества, эффективное для достижения
- 71 036314 требуемого терапевтического ответа у конкретного пациента при использовании конкретной композиции и пути введения, и они не должны быть токсичными для пациента. Выбранный уровень доз должен зависеть от различных фармакокинетических факторов, включая активность применяемых конкретных композиций или сложного эфира, соли или амида, пути введения, продолжительности введения, скорости выделения конкретного применяемого соединения, продолжительности лечения, других лекарственных средств, соединений и/или материалов, применяемых в сочетании с конкретными используемыми композициями, возраста, пола, веса, состояния, общего состояния здоровья и предыдущей истории болезни подлежащего лечению пациента и аналогичных факторов.
Композиции, содержащие антитела или их фрагменты можно вводить путем непрерывной инфузии или с интервалами между введениями доз, составляющими, например, один день, одну неделю или 1-7 раз в неделю. Дозы можно вводить внутривенно, подкожно, местно, орально, назально, ректально, внутримышечно, внутрицеребрально или путем ингаляции. Конкретный протокол введения доз включает применение максимальной дозы или частоты введения доз, при которых удается избежать выраженных нежелательных побочных действий. Общая недельная доза может составлять по меньшей мере 0,05 мкг/кг веса тела, по меньшей мере 0,2 мкг/кг, по меньшей мере 0,5 мкг/кг, по меньшей мере 1 мкг/кг, по меньшей мере 10 мкг/кг, по меньшей мере 100 мкг/кг, по меньшей мере 0,2 мг/кг, по меньшей мере 1,0 мг/кг, по меньшей мере 2.0 мг/кг, по меньшей мере 10 мг/кг, по меньшей мере 25 мг/кг или по меньшей мере 50 мг/кг (см., например, Yang и др., New Engl. J. Med. 349, 2003, сс. 427-434; Herold и др., New Engl. J. Med. 346, 2002, сс. 1692-1698; Liu и др., J. Neurol. Neurosurg. Psych. 67, 1999, сс. 451-456; Portielji и др., Cancer Immunol. Immunother. 52, 2003, сс. 133-144). Требуемая доза антител или их фрагментов является примерно такой же, что и доза антитела или полипептида, при пересчете в виде количества молей/кг веса тела. Требуемая концентрация в плазме антител или их фрагментов является примерно такой же, что и при пересчете в виде количества молей/кг веса тела. Доза может составлять меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25, по меньшей мере 30, по меньшей мере 35, по меньшей мере 40, по меньшей мере 45, по меньшей мере 50, по меньшей мере 55, по меньшей мере 60, по меньшей мере 65, по меньшей мере 70, по меньшей мере 75, по меньшей мере 80, по меньшей мере 85, по меньшей мере 90, по меньшей мере 95 или по меньшей мере 100 мкг. Дозы можно вводить индивидууму по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 раз или более.
Доза антител или их фрагментов может составлять от 0,0001 до 100 мг/кг веса тела пациента. Доза может составлять от 0,0001 до 20 мг/кг, от 0,0001 до 10 мг/кг, от 0,0001 до 5 мг/кг, от 0,0001 до 2 мг/кг, от 0,0001 до 1 мг/кг, от 0,0001 до 0,75 мг/кг, от 0,0001 до 0,5 мг/кг, от 0,0001 до 0,25 мг/кг, от 0,0001 до 0,15 мг/кг, от 0,0001 до 0,10 мг/кг, от 0,001 до 0,5 мг/кг, от 0,01 до 0,25 мг/кг или от 0,01 до 0,10 мг/кг веса тела пациента.
Дозу антител или их фрагментов можно рассчитывать на основе веса тела пациента в килограммах (кг), умножая на количество доз, подлежащих введению (в мг/кг). Доза антител или их фрагментов, предлагаемых в изобретении, может составлять 150 мкг/кг или менее, 125 мкг/кг или менее, 100 мкг/кг или менее, 95 мкг/кг или менее, 90 мкг/кг или менее, 85 мкг/кг или менее, 80 мкг/кг или менее, 75 мкг/кг или менее, 70 мкг/кг или менее, 65 мкг/кг или менее, 60 мкг/кг или менее, 55 мкг/кг или менее, 50 мкг/кг или менее, 45 мкг/кг или менее, 40 мкг/кг или менее, 35 мкг/кг или менее, 30 мкг/кг или менее, 25 мкг/кг или менее, 20 мкг/кг или менее, 15 мкг/кг или менее, 10 мкг/кг или менее, 5 мкг/кг или менее, 2,5 мкг/кг или менее, 2 мкг/кг или менее, 1,5 мкг/кг или менее, 1 мкг/кг или менее, 0,5 мкг/кг или менее или 0,5 мкг/кг веса тела пациента или менее.
Стандартная доза антител или их фрагментов может составлять от 0,1 до 20 мг, от 0,1 до 15 мг, от 0,1 до 12 мг, от 0,1 до 10 мг, от 0,1 до 8 мг, от 0,1 до 7 мг, от 0,1 до 5 мг, от 0,1 до 2.5 мг, от 0,25 до 20 мг, от 0,25 до 15 мг, от 0,25 до 12 мг, от 0,25 до 10 мг, от 0,25 до 8 мг, от 0,25 до 7 мг, от 0,25 до 5 мг, от 0,5 до 2,5 мг, от 1 до 20 мг, от 1 до 15 мг, от 1 до 12 мг, от 1 до 10 мг, от 1 до 8 мг, от 1 до 7 мг, от 1 до 5 мг или от 1 до 2,5 мг.
Доза антител или их фрагментов можно обеспечивать титр в сыворотке индивидуума, составляющий по меньшей мере 0,1, по меньшей мере 0,5, по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25, по меньшей мере 50, по меньшей мере 100, по меньшей мере 125, по меньшей мере 150, по меньшей мере 175, по меньшей мере 200, по меньшей мере 225 по меньшей мере 250, по меньшей мере 275, по меньшей мере 300, по меньшей мере 325, по меньшей мере 350, по меньшей мере 375 или по меньшей мере 400 мкг/мл. В альтернативном варианте доза антител или их фрагментов может обеспечивать титр в сыворотке индивидуума, составляющий по меньшей мере 0,1, по меньшей мере 0,5, по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25, по меньшей мере 50, по меньшей мере 100, по меньшей мере 125, по меньшей мере 150, по меньшей мере 175, по меньшей мере 200, по меньшей мере 225, по меньшей мере 250, по меньшей мере 275, по меньшей мере 300, по меньшей мере 325, по меньшей мере 350, по меньшей мере 375 или по меньшей мере 400 мкг/мл.
Введение доз антител или их фрагментов можно повторять и интервал между их введением может составлять по меньшей мере 1 день, 2 дня, 3 дня, 5 дней, 10 дней, 15 дней, 30 дней, 45 дней, 2 месяца, 75
- 72 036314 дней, 3 месяца или по меньшей мере 6 месяцев.
Эффективное для конкретного пациента количество может варьироваться в зависимости от таких факторов как состояние, подлежащее лечению, общее состояние здоровья пациента, путь введения и вводимая доза и серьезность побочных действий (см., например, Maynard и др., A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, изд-во Interpharm Press, Boca Raton, Fla.; Dent, Good Laboratory and Good Clinical Practice, изд-во Urch Publ., London, UK, 2001).
Путь введения может представлять собой, например, местное или кожное нанесение, внутривенную, внутрибрюшинную, интрацеребральную, внутримышечную, внутриглазную, внутриартериальную, внутрь спинного мозга, внутрь повреждения инъекцию или инфузию, или введение с помощью систем с замедленным высвобождением или с помощью имплантата (см., например, Sidman и др., Biopolymers 22, 1983, сс. 547-556; Langer и др., J. Biomed. Mater. Res. 15, 1981, сс. 167-277; Langer , Chem. Tech. 12, 1982, сс. 98-105; Epstein и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 1985, сс. 3688-3692; Hwang и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 1980, сс. 4030-4034; US №№ 6350466 и 6316024). При необходимости композиция может включать также солюбилизирующий агент и местное анестезирующее средство, такое как лидокаин, для облегчения боли в области инъекции. Кроме того, можно применять также легочное введение, например, с помощью ингалятора или распылителя, и препаративной формы с создающим аэрозоль агентом (см., например, US №. 6019968, 5985320, 5985309, 5934272, 5874064, 5855913, 5290540 и 4880078; и публикации PCT WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346 и WO 99/66903, каждый из документов полностью включен в настоящее описание в качестве ссылки).
Композицию можно вводить также с помощью одного или нескольких путей введения с использованием одного или нескольких различных методов, известных в данной области. Как должно быть очевидно специалисту в данной области, путь и/или механизм введения должен варьироваться в зависимости от требуемых результатов. Выбранные пути введения антител или их фрагментов, предлагаемых в изобретении, представляют собой внутривенный, внутримышечный, внутрикожный, внутрибрюшинный, подкожный, спинальный или другие парентеральные пути введения, например, с помощью инъекции или инфузии. Под парентеральным введением подразумевают пути введения, отличные от энтерального и местного применения, как правило, путем инъекции, и они включают (но не ограничиваясь только ими) внутривенную, внутримышечную, внутриартериальную, внутриоболочечную, внутрикапсульную, внутриглазничную, внутрисердечную, внутрикожную, внутрибрюшинную, транстрахеальную, подкожную, подкутикулярную, внутрисуставную, подкапсульную, подпаутинную, интраспинальную, эпидуральную и надчревную инъекцию и инфузию. В альтернативном варианте композицию можно вводить непарентеральным путем, таким как местный, эпидермальный путь применения или нанесение на слизистую оболочку, например, интраназально, орально, вагинально, ректально, подъязычно или местно. Антитела или их фрагменты можно также вводить путем инфузии. Мульспецифический эпитопсвязывающий белок можно вводить подкожно.
Если антитела или их фрагменты вводят с помощью системы с контролируемым высвобождением или замедленным высвобождением, то для достижения контролируемого высвобождения или замедленного высвобождения можно применять насос (см. Langer, выше; Sefton, CRC Crit. Ref Biomed. Eng. 14, 1987, с. 20; Buchwald и др., Surgery 88, 1980, с. 507; Saudek и др., N. Engl. J. Med. 321, 1989, с. 574). Для достижения контролируемого или замедленного высвобождения терапевтических средств можно использовать полимерные материалы (см., например, Medical Applications of Controlled Release, под ред. Langer и Wise, изд-во CRC Pres., Boca Raton, Fla. 1974; Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, под ред. Smolen и Ball, изд-во Wiley, New York, 1984; Ranger и Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23, 1983, с. 61; см. также Levy и др., Science 228, 1985, с. 190; During и др., Ann. Neurol. 25, 1989, с. 351; Howard и др., J. Neurosurg. 71, 1989, с. 105; US №№ 5679377; 5916597; 5912015; 5989463; 5128326; публикации PCT WO 99/15154 и WO 99/20253). Примерами полимеров, применяемых в препаративных формах с замедленным высвобождением являются (но не ограничиваясь только ими) поли(2-гидроксиэтилметакрилат), поли(метилметакрилат), поли(акриловая кислота), сополимер этилена и винилацетата, поли(метакриловая кислота), полигликолиды (PLG), полиангидриды, поли(Н-винилпирролидон). поли(виниловый спирт), полиакриламид, поли(этиленгликоль), полилактиды (PLA), сополимер лактида и гликолидов (PLGA) и сложные полиортоэфиры. Полимер, применяемый в препаративной форме с замедленным высвобождением, является инертным, свободным от выщелачиваемых примесей, стабильным при хранении, стерильным и биоразложимым. Систему с контролируемым или замедленным высвобождением можно помещать вблизи профилактической или терапевтической мишени, при этом требуется только часть дозы, необходимой для системного введения (см., например, Goodson, в: Medical Applications of Controlled Release, выше, т. 2, 1984, сс. 115-138).
Сведения о системах с контролируемым высвобождением обсуждены в обзоре у Langer, Science 249, 1990, сс. 1527-1533). Для получения препаративных форм с замедленным высвобождением, содержащих одно или несколько антител или их фрагментов можно применять любой метод, известный специалисту в данной области (см., например, US № 4526938, публикацию PCT WO 91/05548, публикацию PCT WO 96/20698, Ning и др., Radiotherapy & Oncology 39, 1996, сс. 179-189, Song и др., PdA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50, 1995, сс. 372-397, Cleek и др., Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact.
- 73 036314
Mater. 24, 1997, сс. 853-854 и Lam и др., Proc. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24, 1997, сс. 759-760, каждая публикация полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки).
Если антитела или их фрагменты применяют местно, то их можно приготавливать в форме мази, крема, трансдермального пластыря, лосьона, геля, шампуня, спрея, аэрозоля, раствора, эмульсии или другой формы, хорошо известной специалисту в данной области (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19-oe изд., изд-во Mack Pub. Co., Easton, Pa. ,1995). В случае нераспыляемых местных лекарственных форм, как правило, применяют формы от вязких до полутвердых или твердые формы, которые содержат носитель или один или несколько эксципиентов, пригодных для местного нанесения, и которые имеют в некоторых случаях динамическую вязкость, более высокую, чем вода. Приемлемыми препаративными формами являются (но не ограничиваясь только ими) растворы, суспензии, эмульсии, кремы, мази, порошки, линименты, целебные мази и т.п., которые при необходимости стерилизуют или смешивают с вспомогательными агентами (например, консервантами, стабилизаторами, смачивающими агентами, буферами или солями) для воздействия на различные свойства, например, осмотическое давление. Другими приемлемыми местными лекарственными формами являются распыляемые аэрозольные препараты, в которых действующее вещество, в некоторых случаях в сочетании с твердым или жидким инертным носителем, упаковывают в смеси с находящимся под давлением летучим веществом (например, газообразным пропеллентом, таким как фреон) или в находящийся под давлением флакон. В фармацевтические композиции и лекарственные формы можно добавлять также при необходимости увлажнители или смачиватели. Примеры таких дополнительных ингредиентов хорошо известны в данной области.
Если композиции, содержащие антитела или их фрагменты, вводят интраназально, то их можно приготавливать в виде аэрозоля, спрея, образующего туман аэрозоля или в форме капель. В частности, профилактические или терапевтические средства, предназначенные для применения, удобно применять в форме аэрозольного спрея, образующегося из находящихся под давлением упаковок или распылителей, с использованием приемлемого пропеллента (например, дихлордифторметана, трихлорфторметана, дихлортетрафторэтана, диоксида углерода или других пригодных газов). В случае находящегося под давлением аэррозоля стандартную дозу можно определять, используя клапан для введения отмеренного количества. Капсулы и картриджи (состоящие, например, из желатина), предназначенные для применения в ингаляторе или инсуффляторе, можно приготавливать так, чтобы они содержали порошкообразную смесь соединения и приемлемую порошкообразную основу, такую как лактоза или крахмал.
Методы совместного введения или лечения с использованием второго терапевтического средства, например цитокина, стероида, химиотерапевтического средства, антибиотика или излучения, известны в данной области (см., например, Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, под ред. Hardman и др., 10-ое переработанное и дополненное изд., изд-во McGraw-Hill, New York, N.Y., 2001; Pharmacotherapeutics for Advanced Practice:A Practical Approach, под ред. Poole и Peterson, изд-во Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., Pa., 2001; Cancer Chemotherapy and Biotherapy, под ред. Chabner и Longo, изд-во Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., Pa., 2001). Эффективное количество терапевтического средства может уменьшать симптомы по меньшей мере на 10%; по меньшей мере на 20%; по меньшей мере примерно на 30%; по меньшей мере на 40% или по меньшей мере на 50%.
Дополнительные лекарственные средства (например, профилактические или терапевтические средства), которые можно применять в сочетании с антителами или их фрагментами можно вводить с интервалом между их введением и введением антител или их фрагментов, составляющим менее 5 мин, менее 30 мин, 1 ч, примерно 1 ч, от примерно 1 до примерно 2 ч, от примерно 2 до примерно 3 ч, от примерно 3 до примерно 4 ч, от примерно 4 до примерно 5 ч, от примерно 5 до примерно 6 ч, от примерно 6 до примерно 7 ч, от примерно 7 до примерно 8 ч, от примерно 8 до примерно 9 ч, от примерно 9 до примерно 10 ч, от примерно 10 до примерно 11 ч, от примерно 11 до примерно 12 ч, от примерно 12 до 18 ч, от 18 до 24 ч, от 24 до 36 ч, от 36 до 48 ч, от 48 до 52 ч, от, 52 до 60 ч, от 60 до 72 ч, от 72 до 84 ч, от 84 до 96 ч или от 96 до 120 ч. Пациента можно подвергать воздействию двух или большего количество терапий во время одного визита.
Антитела или их фрагменты и другие терапевтические средства можно вводить циклически. Циклическая терапия предусматривает применение первой терапии (например, первого профилактического или терапевтического средства) в течение некоторого периода времени, после чего применение второй терапии (например, второго профилактического или терапевтического средства) в течение некоторого периода времени, необязательно с последующим применением третьей терапии (например, профилактического или терапевтического средства) в течение некоторого периода времени и т.д. и повторение указанной последовательности введения, т.е. цикла, для снижения развития устойчивости к одной из терапий, для избежания или снижения побочных действий одной из терапий и/или повышения эффективности терапий.
Антитела или их фрагменты можно приготавливать в виде форм, гарантирующих соответствующее распределение in vivo. Например, гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) не пропускает многие обладающие высокой гидрофильностью соединения. Для гарантии того, что обладающие терапевтической активностью соединения пересекут ГЭБ (если это требуется), их можно включать, например, в липосомы. Ме- 74 036314 тоды приготовления липосом описаны, например, в US № 4522811; 5374548 и 5399331. Липосомы могут содержать один или несколько фрагментов, которые избирательно транспортируются в определенные клетки или органы, что повышает направленное введение лекарственного средства (см., например, Ranade, J. Cline Pharmacol. 29, 1989, с. 685). Примерами обеспечивающих направленный перенос молекул являются фолат или биотин (см., например, US № 5416016 на имя Low с соавторами); маннозиды (Umezawa и др., Biochem. Biophys. Res. Commun. 153, 1988, с. 1038); антитела (Bloeman и др., FEBS Lett. 357, 1995, с. 140; Owais и др., Antimicrob. Agents Chernother. 39, 1995, с. 180); обладающий поверхностной активностью рецептор белка A (Briscoe и др., Am. J. Physiol. 1233, 1995, с. 134); p120 (Schreier и др., J. Biol. Chem. 269, 1994, с. 9090); (см. также K. Keinanen; M.L. Laukkanen, FEBSLett. 346, 1994, с. 123; J.J. Killion; I.J. Fidler, Imrnunomethods 4, 1994, с. 273).
Предложены протоколы введения фармацевтической композиции, содержащей антитела или их фрагменты индивидуально или в сочетании с другими терапевтическими средствами, в которых нуждается индивидуум. Лекарственные средства (например, профилактические или терапевтические средства), которые применяют в комбинированных терапиях можно вводить индивидууму совместно или их можно применять последовательно. Лекарственные средства (например, профилактические или терапевтические средства), которые применяют в комбинированных терапиях можно применять циклически. Циклическая терапия предусматривает применение первой терапии (например, первого профилактического или терапевтического средства) в течение некоторого периода времени, после чего применение второй терапии (например, второго профилактического или терапевтического средства) в течение некоторого периода времени и повторение указанной последовательности введения, т.е. цикла, для снижения развития устойчивости к одной из терапий (например, к агенту), для избежания или снижения побочных действий одной из терапий (например, агентов) и/или повышения эффективности терапий.
Отдельные терапевтические компоненты (например, профилактические или терапевтические средства) комбинированных терапий можно применять для обработки индивидуума совместно (конкурентно). Понятие совместно не ограничено применением терапий (например, профилактических или терапевтических средств) точно в одно и то же время, а скорее означает, что фармацевтическую композицию, которая содержит антитела или их фрагменты, вводят индивидууму в такой последовательности и с таким временным интервалом, что антитела могут действовать совместно в другой(им) терапией(ями), что обеспечивает повышенное благоприятное действие по сравнению с вариантом, когда их вводят как-то по-иному. Например, каждую терапию можно применять для обработки индивидуума в одно и то же время или последовательно в любом порядке в различные моменты времени; однако, если их не применяют в одно и то же время, их следует применять в достаточно близкие моменты времени, так, чтобы обеспечивать требуемое терапевтическое или профилактическое действие. Каждой терапии можно подвергать индивидуума по отдельности, в любой приемлемой форме и любым пригодным путем. Терапию (например, профилактические или терапевтические средства) можно осуществлять с интервалом индивидууму с интервалом, составляющим менее 15 мин, менее 30 мин, менее 1 ч, примерно 1 ч, от примерно 1 до примерно 2 ч, от примерно 2 до примерно 3 ч, от примерно 3 до примерно 4 ч, от примерно 4 до примерно 5 ч, от примерно 5 до примерно 6 ч, от примерно 6 до примерно 7 ч, от примерно 7 до примерно 8 ч, от примерно 8 до примерно 9 ч, от примерно 9 до примерно 10 ч, от примерно 10 до примерно 11 ч, от примерно 11 до примерно 12 ч, 24 ч, 48 ч, 72 ч или 1 неделю. Можно подвергать воздействию двух или большего количество терапий (например, профилактических или терапевтических средств) во время одного визита.
Профилактические или терапевтические средства, применяемые в комбинированных терапиях, можно вводить индивидууму в одной и той же фармацевтической композиции. Профилактические или терапевтические средства, применяемые в комбинированных терапиях, можно вводить индивидууму совместно в виде различных фармацевтических композиций. Профилактические или терапевтические средства можно вводить индивидууму с использованием одного и того же или различных путей введения.
Полностью описанное выше изобретение дополнительно проиллюстрировано в формуле изобретения, а также с помощью приведенных ниже примеров, которые служат только для иллюстрации изобретения и не направлены на его дополнительное ограничение.
Примеры
Пример 1. Методы, материалы и скрининг антител (I) Клеточные линии
Клеточные линии BXPC-3, SK-Br-3, BT-474, MDA-MB-453, FaDu и MCF-7 получали из АТСС и поддерживали стандартным образом в ростовых средах, дополненных 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS).
(II) Получение рекомбинантных векторов, включающих HER3 человека, обезьяны циномолгус (Cyno), мыши и крысы
Внеклеточный домен мышиного HER3 амплифицировали с помощью ПЦР из кДНК головного мозга мышей (фирма Clontech) и последовательность подтверждали путем сравнения с референспоследовательностью (Refseq NM_010153). ECD крысиного HER3 получали путем обратной транскрип
- 75 036314 ции из мРНК клеток линии Rat-2 и последовательность подтверждали путем сравнения с NM_017218. кДНК-матрицу HER3 обезьяны циномолгус создавали, используя РНК из различных тканей обезьян циномолгус (фирма Zyagen Laboratories), и полученный с помощью ОТ-ПЦР продукт клонировали в векторе pCR®-TOPO-XL (фирма Invitrogen) перед секвенированием обеих цепей. Человеческий HER3 получали из библиотеки кДНК головного мозга человеческого эмбриона (фирма Source) и последовательность подтверждали путем сравнения с NM_001982.
Для создания меченых рекомбинантных белков HER3 человека, мыши, крысы и обезьяны циномолгус амплифицировали с помощью ПЦР с использованием Pwo Taq-полимеразы (фирма Roche Diagnostics). Амплифицированные ПЦР-продукты очищали на геле и клонировали во входящем в систему Gateway® векторе pDonR201 (фирма Invitrogen), который предварительно модифицировали так, что он включал в рамке считывания N-концевую лидерную последовательность CD33 и C-концевую метку, например, FLAG-метку. Метка позволяла осуществлять очистку мономерных белков с помощью моноклонального антитела к метке. Гены-мишени фланкировали AttB1 и AttB2, что позволяло осуществлять рекомбинацию в адаптированных специальных запатентованных Gateway-векторах (например, pcDNA3.1), предназначенных для применения с использованием технологии клонирования Gateway® (фирма Invitrogen). Реакции рекомбинации осуществляли с использованием применяемой в технологии Gateway реакции с LR-клоназой (LR -реакции) с помощью запатентованных специальных векторов, которые содержали промотор CMV, для создания экспрессионных векторов для метки, хотя можно использовать любой поступающий в продажу вектор.
Кроме того, получали рекомбинантные белки HER3, в которых сливали ECD HER3 против хода транскрипции относительно C-концевого сайта расщепления фактора X и шарнирной области человеческого IgG и Fc-области, для создания белка с меченой Fc. Для этой цели различные ECD HER3 подвергали ПЦР-амплификации и клонировали в векторе (например, pcDNA3.1), модифицированном таким образом, что он содержал в рамке считывания C-концевое слияние: сайт фактора X-шарнир-hFc. Созданную открытую рамку считывания фланкировали сайтами AttB1 и AttB2 для дальнейшего клонировании согласно технологии рекомбинантного клонирования Gateway (фирма Invitrogen). Применяли LR-реакцию Gateway для переноса HER3-Fc в специальную экспрессионную конструкцию, содержащую промотор CMV. Создавали экспрессионные конструкции для несущего точечную мутацию HER3 с помощью стандартных протоколов сайтнаправленного мутагенеза и подтверждали последовательности полученных векторов.
Таблица 8. Создание экспрессионных векторов HER3. Нумерация аминокислот HER3 соответствует NP_001973 (человеческий), NP_034283 (мышиный) и NP_058914 (крысиный)
Обозначение Описание
Hu HER3 СОЗЗ-[чедовеческий HER3, остатки 20-640]-метка
Mu HER3 СОЗЗ-[мышиный HER3, остатки 20-643]-метка
Rat HER3 СОЗЗ-[крысиный HER3, остатки 20-643]-метка
Cyno HER3 CD33-[Cyno HER3, остатки 20-6431- метка
HER3 D1-2 СОЗЗ-[чедовеческий HER3, остатки 20-329]-метка
HER3 D2 СОЗЗ-[чедовеческий HER3, остатки 185-329]-метка
HER3 D3-4 СОЗЗ-[чедовеческий HER3, остатки 330-643]-метка
HER3 D4 СОЗЗ-[чедовеческий HER3, остатки 496-643]-метка
Hu HER3-FC [человеческий HER3, остатки l-643]-Fc
Mu HER3-FC [мышиный HER3, остатки l-643]-Fc
Cyno HER3-FC [Cyno HER3, остатки l-643]-Fc
Rat HER3-FC [крысиный! HER3, остатки l-643]-Fc
HER3 D2-Fc [человеческий HER3 остатки 207-329]-Fc
HER3 К267А СПЗЗ-[человеческий HER3, остатки 20-640, К267А]метка
HER3 L268A СПЗЗ-[человеческий HER3, остатки 20-640, L268A]метка
HER3 K267A/L268A СОЗЗ-[чедовеческий HER3, остатки 20-640, К267А/ Ь268А]-метка
(III) Экспрессия рекомбинантных белков HER3
Требуемые рекомбинантные белки HER3 экспрессировали в полученных из HEK293 клеточных линиях, предварительно адаптированных к культивированию в суспензионной культуре, и выращивали в запатентованной фирмой Novartis бессывороточной среде. Для подтверждения маломасштабной экспрессии осуществляли анализы кратковременной трансфекции на основе липофекции в 6-луночных планшетах. Для крупномасштабного производства белка применяли кратковременную трансфекцию в системе, основанной на использовании 10-20-литровых биореакторов Wave™ (фирма Wave Biotech). В качестве носителя ДНК в плазмиде использовали полиэтиленимин (ПЭИ) (фирма Polysciences) в соотношении 1:3
- 76 036314 (мас./мас). Супернатанты культуры собирали через 7-10 после трансфекции и концентрировали до очистки путем фильтрации в перекрестном потоке и диафильтрации.
(IV) Очистка меченого белка
Рекомбинантные меченые белки HER3 (например, меmка-HER3) очищали, собирая супернатант клеточной культуры и 10-кратно концентрируя с помощью фильтрации в перекрестном потоке с использованием фильтра с номинально отсекаемой молекулярной массой 10 кДа (фирма Fresenius). Колонку с антителом к метке приготавливали, сшивая моноклональное антитело к метке с активированной CNBr сефарозой 4B в конечном соотношении 10 мг антитела на 1 мл смолы. Концентрированный супернатант вносили в 35-миллилитровую колонку с антителом к метке со скоростью потока 1-2 мл/мин. После исходной отмывки с помощью ЗФР связанный продукт элюировали с помощью 100мМ глицина (pH 2,7), нейтрализовали и стерилизовали фильтрацией. Концентрации белка определяли, измеряя абсорбцию при длине волны 280 нм, и превращали с помощью теоретического коэффициента, равного 0,66 AU/мг. Очищенный белок окончательно характеризовали с помощью ДСН-ПААГ, N-концевого секвенирования и ЖХ-МС.
(V) Очистка на основе Fc-метки
Концентрированный супернатант клеточной культуры вносили в 50-миллилитровую колонку с белком A-сефарозой типа Fast Flow со скоростью потока 1 мл/мин. После исходной отмывки с помощью ЗФР колонку отмывали 10мМ NaH2PO4/30 об.% изопропанола, pH 7,3, используя объем, равный 10 объемам колонки, а затем ЗФР, используя объем, равный 5 объемам колонки. И, наконец, связанный продукт элюировали с помощью 50мМ цитрата/140мМ NaCl (pH 2,7), нейтрализовали и стерилизовали фильтрацией.
(VI) Получение сверхэкспрессирующих клеточных линий
Для создания клеточной линии с высокими уровнями экспрессии HER3 на клеточной поверхности конструировали экспрессионный вектор млекопитающих, содержащий вставку, которая кодирует лидерную последовательность CD33 в обратном направлении относительно аминокислотных остатков 20-667 человеческого HER3, слитую в рамке считывания с аминокислотными остатками 669-1210 человеческого EGFR. При экспрессии в клетках млекопитающих образовавшийся химерный белок содержал на N-конце внеклеточный и трансмембранный домен HER3, а на C-конце цитоплазматический домен EGFR. Вектором HER3/1 трансфектировали клетки линии CHO-S (фирма Invitrogen) и после селекции с помощью антибиотика получали стабильные пулы. Для полученной клеточной линии (CHO HER3/1) характерны высокие уровни экспрессии внеклеточного домена HER3 на поверхности клеток.
(VII) Пэннинг с использованием библиотеки HuCAL GOLD®
Для отбора антител, распознающих человеческий HER3, применяли несколько стратегий пэннинга. Терапевтические антитела к человеческому белку HER3 создавали путем селекции клонов, обладающих высокой аффинностью связывания, используя в качестве источника вариантов белков антител поступающую в продажу фаговую дисплейную библиотеку (человеческая комбинаторная библиотека антител) HuCAL GOLD® (фирма MorphoSys).
Фагмидная библиотека основана на концепции HuCAL® (Knappik и др., J Mol Biol 296, 2000, сс. 5786), и в ней применяют технологию CysDisplay® для презентации Fab на поверхности фага (WO 01/05950 на имя Lohning).
Для выделения антител к HER3 использовали стандартный пэннинг, а также RapMAT-стратегии пэннинга, используя такие подходы как твердофазный пэннинг, пэннинг в растворе, пэннинг целых клеток и дифференцированный пэннинг целых клеток.
(VIII) Твердофазный пэннинг
Для идентификации антител к HER3 применяли различные стратегии твердофазного пэннинга с использованием различных рекомбинантных белков HER3. Для осуществления каждого цикла твердофазного пэннинга сенсибилизировали Maxisorp-планшеты (фирма Nunc) белком HER3. Меченые белки иммобилизовывали с использованием планшетов, предварительно сенсибилизированных антителом к Fc (козье или мышиное антитело к человеческому IgG, фирма Jackson Immuno Research), антителом к метке, либо посредством пассивной адсорбции. Сенсибилизированные планшеты отмывали ЗФР и блокировали. Сенсибилизированные планшеты дважды отмывали ЗФР перед добавлением в течение 2 ч при комнатной температуре на шейкере связанных с фагами антител из библиотеки HuCAL GOLD®. Связанные фаги элюировали, добавляли к клеткам Е. coli TG-1 и инкубировали для заражения фагом. Затем зараженные бактерии выделяли и высевали на агаровые пластины. Колонии соскабливали с пластин и фаги высвобождали (процедура спасения) и амплифицировали. Каждая из стратегий пэннинга HER3 включала индивидуальные циклы пэннинга, и для нее применяли уникальные антигены, концентрации антигенов и строгость отмывки.
(IX) Жидкофазный пэннинг
Каждый цикл жидкофазного пэннинга осуществляли с использованием различных биотинилированных рекомбинантных белков HER3 и нейрегулина 1-β1 (фирма R&D Systems) или без него. Белки биотинилировали с помощью набора для биотинилирования EZ-link sulfo-NHS-LC (фирма Pierce) со- 77 036314 гласно инструкциям производителя. 800 мкл сшитых со стрептавидином магнитных гранул (Dynabeads, фирма Dynal) отмывали однократно ЗФР и блокировали в течение ночи с помощью реагента Chemiblocker (фирма Chemicon). Связанные с фагами антитела из библиотеки HuCAL GOLD и соответствующий биотинилированный HER3 инкубировали в реакционной пробирке. Стрептавидиновые магнитные гранулы добавляли в течение 20 мин и собирали с помощью сепаратора магнитных частиц (фирма Dynal). Связанные фаги элюировали из гранул Dynabeads, добавляя содержащий ДТТ буфер в каждую пробирку, и добавляли в клетки Е. coli TG-1. Заражение фагом осуществляли аналогично методу, описанному для твердофазного пэннинга. Каждая из стратегий пэннинга HER3 включала индивидуальные циклы пэннинга, и для нее применяли уникальные антигены, концентрации антигенов и строгость отмывки.
(X) Клеточный пэннинг
Для клеточных пэннингов связанные с фагами антитела из библиотеки HuCAL GOLD® инкубировали примерно с 107 клеток на ротационном шейкере в течение 2 ч при комнатной температуре с последующим центрифугированием. Клеточный дебрис изолировали, фаги элюировали из клеток. Супернатант собирали и добавляли в культуру Е. coli TG-1 с помощью описанного выше процесса. Для идентификации антител к HER3 применяли две стратегии, основанные на применении клеток:
а) пэннинг целых клеток: В этой стратегии различные интактные клеточные линии применяли в качестве антигенов;
б) дифференцированный пэннинг целых клеток:
В этой стратегии последовательно использовали антигены, состоящие из клеток и рекомбинантных белков HER3 (см., например, 1981.09). Основанные на применении клеток пэннинги осуществляли согласно описанному выше методу, но в случае, когда в качестве антигенов применяли рекомбинантные белки, использовали протоколы твердофазного пэннинга. Для отмывки применяли ЗФР (2-3х) и PBST (23х).
(XI) Создание библиотеки RapMAT™ и осуществление циклов пэннинга
Для повышения аффинности связывания антител с сохранением диверсификации библиотек продукты, полученные в результате второго цикла как пэннинга в растворе, так и твердофазного пэннинга, использовали при осуществлении технологии RapMAT™ (технология быстрого созревания), в то время как для третьего цикла использовали продукты, полученные в результате пэннинга целых клеток и дифференцированного пэннинга целых клеток (Prassler и др., Immunotherapy; 1, 2009, сс. 571-583). RapMAT™-библиотеки создавали путем субклонирования содержащих кодирующие Fab вставки фагов, отобранных с помощью пэннинга, в дисплейном векторе pMORPH®25_bla_LHC, и их дополнительно расщепляли для создания либо библиотек H-CDR2 RapMAT™, либо библиотек L-CDR3 RapMAT™ с помощью обеспечивающих специфическую рестрикцию ферментов. Вставки заменяли с использованием кассет для созревания TRIM (Virnekas и др., Nucleic Acids Research 22, 1994, сс. 5600-5607) для H-CDR2 или L-CDR3 в зависимости от состава пула. Установлено, что размеры библиотек составляли от 8х106 до 1х108 клонов. Получали комплекс RapMAT-антитело-фаг и подвергали двум дополнительным циклам пэннинга в растворе, твердофазного или клеточного пэннинга с использованием описанных выше экспериментальных методов.
Пример 2. Кратковременная экспрессия антител к HER3 IgG-типа
Адаптированные для выращивания в виде суспензионной культуры клетки HEK293-6E культивировали в среде BioWave20 до достижения плотности примерно 2х106 жизнеспособных клеток/мл. Клетки кратковременно трансфектировали соответствующей стерильной смесью ДНК: ПЭИ и дополнительно культивировали. Через 7 дней после трансфекции клетки удаляли путем фильтрации в перекрестном потоке, используя фильтры Fresenius (0,2 мкм). Свободный от клеток продукт концентрировали с помощью фильтрации в перекрестном потоке с использованием фильтра с номинально отсекаемой молекулярной массой 10 кДа (фирма Fresenius) и концентрат стерилизовали фильтрацией через Stericup®-фильтр (0,22 мкм). Стерильный супернатант хранили при 4°C.
Пример 3. Очистка антитела к HER3 IgG-типа
Очистку IgG осуществляли с использованием применяемой для исследовательских целей воздушной хроматографической системы AKTA 100 при 6°C в помещении с охлаждением, используя самонабивную колонку XK16/20 с 25 мл смолы Self-Pack® MabSelect SuRe (все фирмы GE Healthcare). Во всех случаях скорость потока составляла 3,5 мл/мин за исключение стадии загрузки, давление было ограничено величиной 5 бар. Колонку уравновешивали ЗФР, используя объем, равный трем объемам колонки, перед загрузкой профильтрованного супернатанта после ферментации со скоростью 2,0 мл/мин. Колонку промывали ЗФР, используя объем, равный 8 объемам колонки. IgG элюировали с помощью градиента pH, используя в качестве исходной смесь 50 мМ цитрат/70 мМ NaCl (pH 4,5), линейно его снижая с использованием 12 объемов колонки до 50 мМ цитрат/70 мМ NaCl (pH 2,5), после чего осуществляли постоянную стадию обработки буфером с использованием 2 объемов колонки при таком же значении pH 2,5. Содержащие IgG фракции объединяли, сразу же нейтрализовали и стерилизовали фильтрацией (Millipore Steriflip, 0,22 мкм). Измеряли ОП280 и рассчитывали концентрацию белка на основе данных о последовательности. Пулы тестировали по отдельности в отношении агрегации (SEC-MALS (гель
- 78 036314 фильтрация - многоугольное лазерное светорассеяние) и чистоты (ДСН-ПААГ и МС).
Пример 4. Экспрессия и очистка антител HuCAL®-Fab в Е. coli
Экспрессию Fab-фрагментов, кодируемых pMORPH®X9_Fab_MH в TG-1-клетках, осуществляли во встряхиваемых культурах с использованием 500 мл среды 2xYT, дополненной 34 мкг/мл хлорамфеникола. Культуры встряхивали при 30°C до достижения ОП600 нм, равной 0,5. Экспрессию индуцировали добавлением 0,75мМ ИПТГ (изопропил-e-D-тиогалактопиранозид) в течение 20 ч при 30°C. Клетки разрушали лизоцимом. Меченные His6 Fab-фрагменты выделяли с помощью IMAC (аффинная хроматография с иммобилизованным металлом) (фирма Bio-Rad). Осуществляли обмен буфера на 1 хЗФР Дульбекко (pH 7,2), используя колонки PD10. Образцы стерилизовали фильтрацией (0,2 мкм). Концентрации белков определяли с помощью УФ-спектрофотометрии.
Чистоту образцов анализировали с помощью 15% ДСН-ПААГ в денатурирующих восстанавливающих условиях. Гомогенность препаратов Fab определяли в необработанном состоянии с помощью гель-фильтрации (HP-SEC) с использованием калибровочных стандартов.
Пример 5. Измерение аффинности (KD) антител к HER3 методом титрования уравновешенного раствора (SET)
Определение аффинности в растворе осуществляли, в целом, согласно методу, описанному в литературе (Friguet и др., J Immunol Methods 77, 1985, сс. 305-319). Для повышения чувствительности и точности метода SET этот метод изменяли, используя вместо классического ELISA-анализа технологию, основанную на применении электрохемилюминисценции (ECL) (Haenel и др., Anal biochem 339, 2005, сс. 182-184).
Для определения аффинности с помощью SET применяли описанные ранее конструкции немеченый HER3-метка (человеческий, крысиный, мышиный или обезьяны циномолгус).
Данные оценивали с помощью программы XLfit (фирма ID Business Solutions), применяя общепринятые модели подбора. Для определения величины KD для каждого IgG применяли следующую модель (модифицированную согласно методу, описанному у Piehler с соавторами (Piehler и др., J Immunol Methods 201, 1997, сс. 189-206).
[IgG]: применяемая общая концентрация IgG, x: применяемая общая концентрация растворимого антигена (сайты связывания),
Bmax: максимальный сигнал IgG без антигена,
KD: аффинность.
Пример 6. Определение связывания антитела с клетками с помощью FACS
Связывание антител с эндогенным человеческим антигеном, экпрессируемым на человеческих раковых клетках, оценивали с помощью FACS.
Для определения значений EC50 для антител SK-Br-3-клетки собирали с использованием аккутазы и разводили до концентрации 1 х106 клеток/мл в FACS-буфере (ЗФР/3% FBS/0,2% NaN3). Добавляли по 1х105 клеток в каждую лунку 96-луночного планшета (фирма Nunc) и центрифугировали при 210 х g в течение 5 мин при 4°C перед удалением супернатанта. К пеллетированным клеткам добавляли серийные разведения тестируемых антител (фактор разведения 1:4 в FACS-буфере) и инкубировали в течение 1 ч на льду. Клетки отмывали и пеллетировали трижды, используя по 100 мкл FACS-буфера. В клетки добавляли конъюгированный с PE (фосфатидилэтаноламин) козий античеловеческий IgG (фирма Jackson ImmunoResearch), разведенный в соотношении 1/200 FACS-буфером, и инкубировали на льду в течение 1 ч. Осуществляли дополнительные стадии отмывки, используя трижды 100 мкл FACS-буфера с последующими стадиями центрифугирования при 210 х g в течение 5 мин при 4°C. И, наконец, клетки ресуспендировали в 200 мкл FACS-буфера и уровни флуоресценции измеряли с помощью устройства FACSArray (фирма BD Biosciences). Количество связанного с клеточной поверхностью антитела к HER3 определяли, измеряя средний уровень флуоресценции в канале.
Пример 7. Связывание домена и мутанта HER3
96-луночные Maxisorp-планшеты (фирма Nunc) сенсибилизировали в течение ночи при 4°C с использованием 200 нг соответствующего рекомбинантного человеческого белка (HER3-метка, D1-2-метка, D2-метка, D3-4-метка, D4-метка, HER3 K267A-метка, HER3 L268A-метка, HER3 K267A/L268A и меченый контроль несоответствующего изотипа). Затем все лунки отмывали трижды ЗФР/0,1% Твин-20, блокировали в течение 1 ч с помощью ЗФР/1% БСА/0,1% Твин-20 и отмывали трижды ЗФР/0,1% Твин-20. Добавляли антитела к HER3 в требуемые лунки вплоть до конечной концентрации 10 мкг/мл и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч. Планшеты отмывали трижды ЗФР/ 0,1% Твин-20 перед добавлением соответствующего связанного с пероксидазой идентифицирующего антитела, разведенного в соотношении 1/10000 в ЗФР/1% БСА/0,1% Твин-20. Применяемые идентифицирующие антитела пред
- 79 036314 ставляли собой козье антимышиное (фирма Pierce, № 31432), кроличье антикозье (фирма Pierce, № 31402) и козье античеловеческое антитело (фирма Pierce, № 31412). Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч перед трехкратной отмывкой ЗФР/0,1% Твин-20. Добавляли во все лунки по 100 мкл раствора субстрата TMB (3,3', 5,5'-тетраметилбензидин) (фирма BioFx) в течение 6 мин, после чего реакцию прекращали, добавляя 50 мкл 2,5% H2SO4. Степень связывания антитела к HER3 с каждым рекомбинантным белком оценивали по ОП450 с помощью планшет-ридера SpectraMax (фирма Molecular Devices). При необходимости кривые дозовой зависимости анализировали с помощью программы Graphpad Prism.
Пример 8. Эпитопное картирование HER3 с помощью масс-спектрометрического определения обмена водорода на дейтерий
Материалы □20-буфер получали путем растворения 25мМ TBS (буферный раствор триэтаноламина) (pH 7,5)/500мМ NaCl в тяжелой воде (фирма Sigma). Восстанавливающий раствор представлял собой 50мМ формиатный буфер (pH 4), дополненный 500мМ TCEP, и раствор для прекращения реакции представлял собой 0,5 об.% трифторуксусной кислоты (ТФК) в воде. Буфер А включал 0,25% муравьиной кислоты/10% метанола/10% этиленгликоля в воде, а буфер Б включал 0,25% муравьиной кислоты в ацетонитриле. Все химические соединения получали от фирмы Sigma, в растворители, имеющие чистоту, пригодную для ЖХВР, получали от фирмы Fisher Scientific.
Манипуляции с жидкостями и хроматография
Эксперименты с использованием автоматического масс-спектрометрического определения обмена водорода на дейтерий (HDX MS) разрабатывали на основе методов и оборудования, которые описаны у Wales и др., Anal. Chem. 78, 2006, сс. 1005-1014). В целом, при проведении всех операций, связанных с работой с жидкостями, использовали манипулятор для работы с жидкостями типа Pal HTS (фирма LEAP Technologies), помещенный в охлаждаемый корпус, в котором поддерживали температуру на уровне 2°C. На корпусе манипулятора для работы с жидкостями были смонтированы клапан с 6 инъекционными портами и промывающая станция, облегчающие осуществление инъекции образцов в хроматографическую систему и отмывку шприцев. Хроматографическая система включала дополнительный клапан с 10 портами, Poroszyme®-колонку (2,1 мм х 30 мм) (картридж Poros® с иммобилизованным пепсином) (фирма Applied Biosystems), картридж Cap Trap для хроматографии с обращенной фазой, 0,5 мм х 2 мм (фирма Michrom Bioresources) и самонабивной эмиттер электроспрея в качестве аналитической колонки (100 мкм х ~60 мм, Kinetex 2,6 мкм C18, фирма Phenomenex). Головку клапана с 10 портами, сорбционный картридж и аналитическую колонку помещали в отдельный кожух, сделанный из алюминия, и поддерживали температуру на уровне -5°C с помощью пакетов термоэлектрических элементов Пельтье. Клапаны и колонки располагали таким образом, чтобы можно было осуществлять последовательно расщепление белков, обессоливание пептидов и хроматографию с обращенной фазой до внесения образца в источник ионизации в электроспрее (ESI) масс-спектрометра (типа LTQ-Orbitrap, фирма Thermo Scientific).
Потоки жидкости, необходимые для работы, обеспечивали с помощью двух отдельных насосов для ЖХВР. Первый насос для ЖХВР (насос Surveyor MS, фирма Thermo Scientific) подавал буфер А с постоянной скоростью 125 мкл/мин и его использовали для переноса образца через картридж с иммобилизованным пепсином на сорбционный картридж с обращенной фазой, установленный за клапаном с 10 портами. После осуществления загрузки и обессоливания клапан с 10 портами переключали для элюции образца с помощью градиентного насоса (типа AQUITY UPLC, фирма Waters) из сорбционного картриджа с обращенной фазой через аналитическую колонку в источник ионов масс-спектрометра. Картридж с иммобилизованным ферментом удаляли после истощения в процессе градиентной элюции. Градиентный насос создавал участки линейного градиента от 0 до 40% подвижной фазы Б в течение 35 мин при скорости 5 мкл/мин и от 40 до 95% подвижной фазы Б при скорости 5 мкл/мин в течение 10 мин. Градиентный поток, выходящий из насоса, разделяли в клапане с 10 портами с использованием пассивного делителя (сплиттера) таким образом, чтобы фактический поток через сорбционный картридж и аналитическую колонку при градиентной элюции составлял ~1 мкл/мин. Весь хроматографический цикл занимал 70 мин, включая стадии отмывки и уравновешивания.
Масс-спектрометрия
Для идентификации протеолитических фрагментов, полученных путем осуществляемого в режиме онлайн (в ходе эксперимента) расщепления, проводили несколько зависящих от данных МС/МСэкспериментов. Для сбора этих данных осуществляли регистрацию тандемных МС-спектров с помощью анализатора LTQ гибридного масс-спектрометра LTQ-Orbitrap. Предварительное разделение масс осуществляли на основе результатов МС-сканирований, которые регистрировали с помощью анализатора Orbitrap. Сбор данных после проведения одной МС-стадии для определения уровней дейтерирования, осуществляли при разрешении 60000 с помощью анализатора Orbitrap (в диапазоне величин m/z 400-2000).
Приготовление образцов белков и комплексов белок/Fab
Образцы белка HER3 приготавливали, растворяя 50 мкг связанного с меткой HER3 (НЕК3-метка) в 25мМ TBS (pH 7,5)/500мМ NaCl, с получением конечного объема 50 мкл. Для приготовления комплексов
- 80 036314 бе.токТаЬ смешивали 50 мкг HER3-MeTKa в молярном соотношении 1:1 с изучаемым Fab. Затем смеси белокТаЬ разводили до конечного объема 50 мкл 25мМ TBS (pH 7,5)/500мМ NaCl.
После получения комплексов белок:Fab их выдерживали по меньшей мере в течение 2 ч при 4°C. Перед началом каждого эксперимента четыре 96-луночных планшета, содержащих образец, разбавитель, агент для прекращения реакции и восстанавливающие растворы, вносили в устройство для работы с жидкостями. В экспериментах по обмену 50 мкл HER3 или комплекса HER3:Fab разводили 150 мкл D2Oбуфера. Смесь восстанавливали, добавляя 200 мкл восстанавливающего буфера за 1 мин до прекращения реакции, которую останавливали с помощью 600 мкл буфера для прекращения реакции. Общий объем после всех стадий работы с жидкостями составлял ~1 мл. После смешения раствор для прекращения реакции инъецировали в хроматографическую систему, с помощью которой его автоматически расщепляли, разделяли и анализировали методом ЖХ-МС. Рассчитывали среднее изменение дейтаризации между образцом и контролем в виде различия между уровнями поглощения дейтерия образцом и контролем.
Обработка результатов
Файлы необработанных данных (RAW-файлы), полученные с помощью Orbitrap, преобразовывали в файлы mzXML с помощью разработанной для этой цели на фирме программы (RawXtract). Затем собранные результаты тандемной MS анализировали с помощью SEQUEST (фирма Yates Lab, Scripps Research Institute, Ла-Джолла, Калифорния) и результаты исследования подвергали автоматической фильтрации с помощью программы DTASelect 2.0 (фирма Yates Lab, Scripps Research Institute, Ла-Джолла, Калифорния). С использованием результатов идентификации пептидных последовательностей применяли разработанную на фирме программу для автоматического выделения одноионных хроматограмм для каждой идентифицированной последовательности и создания усредненных спектров в области хроматографического пика. Усредненные спектры сглаживали и центрировали. Уровень поглощения дейтерия оценивали по разнице между массой, соответствующей дейтерированному образцу, и массой, соответствующей недейтерированному эталону. Обработанные данные валидировали вручную и корректировали для исправления неточностей и ошибок, обусловленных автоматизированными стадиями обработки. Каждому остатку в белковой последовательности приписывали уровни поглощения дейтерия путем делокализации содержания дейтерия по длине каждого пептида (т.е. путем деления обнаруженного уровня дейтеризации на количество аминокислот в пептиде). В том случае, когда остаток входил в (перекрывался) более чем один пептид, производили усреднение стандартизованных уровней поглощения дейтерия всеми пептидами, перекрывающими этот остаток.
Пример 9. Определение кристаллической структуры комплексов человеческий HER3/MOR09823 Fab и человеческий HER3/MOR09825 Fab с помощью рентгеновской кристаллографии
В настоящем примере описаны кристаллические структуры комплексов, включающих полноразмерный HER3, связанный с Fab-фрагментом MOR09823 и с Fab-фрагментом MOR09825, полученные с разрешением 3,2А и 3,4А соответственно. Меченый человеческий HER3 дополнительно очищали на колонке HiLoad 26/60 Супердекс 200 PrepGrade (фирма GE Healthcare), уравновешенной в ЗФР (pH 7,3). Экспрессируемые в Е. coli Fab-фрагменты MOR09823 и MOR09825 выделяли путем лизиса клеток с помощью лизоцима и меченные His6 Fab-фрагменты иммобилизовывали на колонке HisTrap_HP (фирма GE Healthcare). Fab-фрагменты MOR09823 дополнительно очищали путем гель-фильтрации с использованием колонки Супердекс 75 16/60 (фирма GE Healthcare), уравновешенной 25мМ Трис (pH 7,5), 150 мМ NaCl.
Комплексы HER3-Fab получали, смешивая избыток Fab с меченым HER3 в молярном соотношении 1,3-1,8:1 (концентрацию определяли по абсорбции при 280 нм, используя рассчитанные коэффициенты экстинкции, составляющие 0,9 и d 1,4 (мг/мл)-1см-1 для HER3 и Fab соответственно) и осуществляя очистку комплексов на колонке Супердекс 200 10/300 (фирма GE Healthcare), уравновешенной 25мМ Трис (pH 7,5), 150 мМ. Пиковые фракции анализировали с помощью ДСН-ПААГ и ЖХ-МС. Для каждого комплекса фракции, содержащие и HER3, и Fab примерно в эквимолярном соотношении, объединяли и концентрировали. Кристаллы HER3/MOR09823 выращивали при 293K методом сидящей капли путем диффузии паров из капель, содержащих 150 нл комплекса HER3/MOR09823, и 150 нл раствора в резервуаре (100 мМ цитрат натрия, pH 5,6, 20% ПЭГ 4000 и 20% изопропанола). Кристаллы переносили в раствор в резервуаре, содержащий дополнительно 8% глицерина, и быстро охлаждали в жидком азоте. Кристаллы HER3/MOR09825 выращивали при 293K методом сидящей капли путем диффузии паров из капель, содержащих 150 нл комплекса HER3/MOR09825, и 150 нл раствора в резервуаре (100мМ бис-Трис, pH 6,5, 16% ПЭГ 10000). Кристаллы переносили в 100мМ бис-Трис, pH 6,5, 18% ПЭГ 10000 и 22% глицерина и быстро охлаждали в жидком азоте.
Данные собирали на оси пучка 17-ID усовершенствованного рентгеновского источника фотонов (Advanced Photon Source) (фирма Argonne National Laboratory). Данные, измеренные для комплекса HER3/Fab MOR09823, обрабатывали и получали структуру с разрешением 3,2А с использованием HKL2000 (фирма HKL Research Inc) в пространственной группе I222 с размерами ячейки a=124,16, b=139,44, c=180,25 А при высоком уровне статистической достоверности. Структуру HER3/Fab MOR09823 определяли методом молекулярного замещения с помощью программы Phaser (McCoy и др., J. Appl. Cryst. 40, 2007, сс. 658-674) с использованием Fab-фрагментов и опубликованной структуры ECD
- 81 036314
HER3 1mb6 в качестве поисковых моделей. Конечную модель, которая содержала 1 молекулу комплекса HER3/Fab MOR09823 на асимметричную единицу, строили с помощью программы COOT (Crystallographic Object-oriented Toolkit (набор инструментов, предназначенных для работы с кристаллографическими объектами), Emsley и Cowtan, Acta Cryst. 60, 2004, сс. 2126-2132) и уточняли до величин R и Rfree, составляющих 19,0 и 24,5% соответственно при величинах rmsd, составляющих 0,010 А и 1,37° для длин связей и углов связей соответственно, с помощью программы BUSTER (фирма Global Phasing, LTD). Остатки HER3, которые содержали атомы, находящиеся на расстоянии в пределах до 5А от любого из атомов Fab MOR09823 по результатам идентификации с помощью программы PyMOL (Schrodinger, LLC), приведены в табл. 11 и 12. Данные, измеренные для комплекса HER3/Fab MOR09825, обрабатывали и получали структуру с разрешением 3,4А с помощью программы autoPROC (фирма Global Phasing, LTD) в пространственной группе I222 с размерами ячейки a=124,23, b=140,94, c=180,25 А при высоком уровне статистической достоверности. Структуру HER3/Fab MOR09825 определяли методом молекулярного замещения с помощью программы Phaser (McCoy и др., J. Appl. Cryst. 40, 2007, сс. 658-674) с использованием структуры HER3/Fab MOR09823 в качестве поисковой модели. Конечную модель, которая содержала 1 молекулу комплекса HER3/Fab MOR09825 на асимметричную единицу, строили с помощью программы COOT (Emsley и Cowtan, Acta Cryst. 60, 2004, сс. 2126-2132) и уточняли до величин R и Rfree, составлявших 18,8 и 24,9% соответственно при величинах rmsd, составлявших 0,009 А и 1,21° для длин связей и углов связей соответственно, с использованием программы BUSTER (фирма Global Phasing, LTD). Остатки HER3, которые содержали атомы, находящиеся на расстоянии в пределах до 5А от любого из атомов Fab MOR09825 по результатам идентификации с помощью программы PyMOL (Schrodinger, LLC), приведены в табл. 13 и 14.
Пример 10. Анализы фосфо-HER3 in vitro в клетках Клетки линии MCF-7 поддерживали стандартным методом в среде DMEM/F12, 15мМ HEPES, L-глутамин, 10% FCS, а клетки линии SK-Br-3 в среде МакКоя 5а, 10% FCS, 1,5мМ L-глутамин. Выращенные в полной среде до субконфлюэнтности клетки MCF7 или SK-Br-3 собирали с использованием аккутазы (фирма PAA Laboratories) и ресуспендировали в соответствующей среде для роста в конечной концентрация 5х 105 клеток/мл. Затем по 100 мкл суспензии клеток добавляли в каждую лунку 96-луночного плоскодонного планшета (фирма Nunc) с получением конечной плотности 5x104 клеток/лунку. MCF7-клеткам давали прикрепиться в течение примерно 3 ч, после чего среду заменяли на минимальную среду, содержащую 0,5% FBS. Затем все планшеты инкубировали в течение ночи при 37°C, после чего обрабатывали взятыми в требуемой концентрации антителами к HER3 (разведенными в соответствующих средах) в течение 80 мин при 37°C. MCF7-клетки обрабатывали 50 нг/мл нейрегулина 1-β1, содержащего домен EGF (фирма R&D Systems), в течение последних 20 мин для стимуляции фосфорилирования HER3. Все среды осторожно аспирировали и клетки промывали охлажденным на льду ЗФР, который содержал 1 мМ CaCl2 и 0,5 мМ MgCl2 (фирма Gibco). Клетки лизировали, добавляя 50 мкл охлажденного на льду лизирующего буфера (20 мМ Трис (pH 8,0)/137 мМ NaCl/10% глицерина/2 мМ ЭДТК/1% NP-40/1 мМ ортованадат натрия/апротинин (10 мкг/мл)/ лейпептин (10 мкг/мл)), и инкубировали на льду при встряхивании в течение 30 мин. Затем лизаты собирали и центрифугировали при 1800 g в течение 15 мин при 4°C для удаления клеточного дебриса. В предварительно подготовленный планшет для иммобилизации добавляли по 20 мкл лизата.
Для создании планшетов для иммобилизации HER3 использовали планшет из углеродного волокна (фирма Mesoscale Discovery), сенсибилизированный в течение ночи при 4°C 20 мкл (4 мкг/мл) иммобилизованным антителом MAB3481 (фирма R&D Systems), которое разводили в ЗФР и затем блокировали с помощью 3% бычьего сывороточного альбумина в 1х Трис-буфере (фирма Mesoscale Discovery)/0,1% Твин-20. HER3 иммобилизовывали из лизата, инкубируя планшет при комнатной температуре в течение 1 ч при встряхивании, после чего лизат аспирировали и лунки отмывали 1хТрис-буфером (фирма Mesoscale Discovery)/0,1% Твин-20. Фосфорилированный HER3 выявляли, используя 0,75 мкг/мл биотинилированного антитела к фосфотирозину (фирма R&D Systems), приготовленного в 1% БСА/1хТрис/0,1% Твин-20, путем инкубации при встряхивании при комнатной температуре в течение 1 ч. Лунки отмывали 4 раза с помощью 1хТрис/0,1% Твин-20 и биотинилированные белки выявляли путем инкубации с меченным S-меткой стрептавидином (фирма Mesoscale Discovery), разведенным в 1% БСА/1хТрис/0,1% Твин-20, в течение 1 ч при комнатной температуре. Содержимое каждой лунки аспирировали и отмывали 4 раза 1хТрис/0,1% Твин-20 перед добавлением 20 мкл T-буфера для считывания с сурфактантом (фирма Mesoscale Discovery) и количественно оценивали сигналы с помощью устройства Mesoscale Sector Imager. Антитела MOR06391 или MOR03207 включали в эксперименты по оценке передачи сигнала в качестве контролей изотипов.
Пример 11. Анализы фосфо-Akt (S473) in vitro в клетках
Выращенные в полной среде до субконфлюэнтности клетки линий SK-Br-3 и BT-474 собирали с использованием аккутазы (фирма PAA Laboratories) и ресуспендировали в соответствующей среде для роста в конечной концентрация 5х 105 клеток/мл. Затем по 100 мкл суспензии клеток добавляли в каждую лунку 96-луночного плоскодонного планшета (фирма Nunc) с получением конечной плотности 5х104 клеток/лунку. Затем все планшеты инкубировали в течение ночи при 37°C, после чего обрабатывали взя
- 82 036314 тыми в требуемой концентрации антителами к HER3 (разведенными в соответствующих средах) в течение 80 мин при 37°C. Все среды осторожно аспирировали и клетки промывали охлажденным на льду ЗФР, который содержал 1 мМ CaCl2 и 0,5мМ MgCl2 (фирма Gibco). Клетки лизировали, добавляя 50 мкл охлажденного на льду лизирующего буфера (20 мМ Трис (pH 8,0)/137 мМ NaCl/10% глицерина/2 мМ ЭДТК/1% NP-40/1 мМ ортованадат натрия/апротинин (10 мкг/мл)/лейпептин (10 мкг/мл)), и инкубировали на льду при встряхивании в течение 30 мин. Затем лизаты собирали и центрифугировали при 1800 g в течение 15 мин при 4°C для удаления клеточного дебриса. По 20 мкл лизата добавляли в многоточечный 384-луночный планшет из углеродного материала, предназначенный для оценки фосфо-Akt (фирма Mesoscale Discovery), который предварительно блокировали 3% БСА/1хТрис/0,1% Твин-20. Планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч при встряхивании, после чего лизат аспирировали и лунки отмывали 4 раза 1хТрис-буфером (фирма Mesoscale Discovery)/ 0,1% Твин-20. Фосфорилированную Akt выявляли, используя 20 мкл несущего сульфо-метку антитела к фосфо-Akt (S473) (фирма Mesoscale Discovery), разведенного в 50 раз в 1% БСА/1хТрис/0,1% Твин-20, осуществляя инкубацию при встряхивании при комнатной температуре в течение 2 ч. Лунки отмывали 4 раза 1хТрис/0,1% Твин20 перед добавлением 20 мкл T-буфера для считывания с сурфактантом (фирма Mesoscale Discovery) и количественно оценивали сигналы с помощью устройства Mesoscale Sector Imager. Антитела MOR06391 или MOR03207 включали в эксперименты по оценке передачи сигнала в качестве контролей изотипов.
Пример 12. Анализы пролиферации клеточных линий
Клетки линии SK-Br-3 культивировали стандартным методом в модифицированной среде МакКоя 5A, дополненной 10% фетальной телячьей сыворотки, а клетки линии BT-474 культивировали в среде DMEM, дополненной 10% FBS. Субконфлюэнтные клетки обрабатывали трипсином, отмывали ЗФР, разводили до 5х104 клеток/мл средами для роста и высевали в 96-луночный черный планшет с прозрачным дном (Costar 3904) с плотностью 5000 клеток/лунку. Клетки инкубировали в течение ночи при 37°C, после чего добавляли взятое в требуемой концентрации антитело к HER3 (как правило, конечные концентрации составляли 10 или 1 мкг/мл). Планшеты возвращали в инкубатор, где выдерживали в течение 6 дней перед оценкой жизнеспособности клеток с помощью набора CellTiter-Glo (фирма Promega). Добавляли по 100 мкл раствора CellTiter-Glo в каждую лунку и инкубировали при комнатной температуре при осторожном встряхивании в течение 10 мин. Уровень люминесценции определяли с помощью планшетридера SpectraMax (фирма Molecular Devices). Степень ингибирования роста при применении каждого антитела рассчитывали путем сравнения уровней люминесценции, полученных при использовании каждого антитела к HER3, с уровнями, полученными при использовании стандартного применяемого для контроля изотипа контрольного антитела (MOR06391).
Для анализов пролиферации MCF-7 культивировали стандартным методом в среде DMEM/F12 (1:1), содержащей 4 мМ L-глутамин/15 мМ HEPES/10% FBS. Субконфлюэнтные клетки обрабатывали трипсином, отмывали ЗФР, разводили до 1х105 клеток/мл смесью сред DMEM/F12 (1:1), содержащей 4 мМ L-глутамин/ 15 мМ HEPES/10 мкг/мл человеческого трансферрина/0,2% БСА. Клетки высевали в 96-луночный черный планшет с прозрачным дном (Costar) с плотностью 5000 клеток/лунку. Затем добавляли взятое в требуемой концентрации антитело к HER3 (как правило, конечные концентрации составляли 10 или 1 мкг/мл) В соответствующие лунки добавляли также для стимуляции роста 10 нг/мл NRG1-e1, содержащего EGF-домен, фирма (R&D Systems). Планшеты возвращали в инкубатор, где выдерживали в течение 6 дней перед оценкой жизнеспособности клеток с помощью набора CellTiter-Glo (фирма Promega). Степень ингибирования роста при применении каждого антитела рассчитывали путем вычитания фоновых уровней люминесценции (без нейрегулина) и сравнения уровней, полученных при использовании каждого антитела к HER3, с уровнями, полученными при использовании стандартного применяемого для контроля изотипа контрольного антитела (MOR06391).
Пример 13. Клеточные анализы блокирования лиганда
Клетки линии MCF-7, которые культивировали в среде MEM, дополненной 10% FBS и 1 мкг/мл инсулина (фирма Sigma), смывали и собирали в небольшом объеме буфера для клеточной диссоциации FACSmax (фирма Genlantis), после чего добавляли 5 мл FACS-буфера (ЗФР/1% FBS/0,1% азида натрия). Определяли плотность клеток и доводили до конечной концентрации 1 х 106 клеток/мл. Добавляли по 100 мкл клеточной суспензии в каждую лунку 96-луночного планшета и клетки пеллетировали центрифугированием (220 g, 3 мин, 4°C). Клеточный дебрис ресуспендировали в 100 мкл соответствующих тестируемых антител, разведенных в FACS-буфере (как правило, конечные концентрации антител составляли от 100 до 0,1 нМ), и планшет инкубировали на льду в течение 45 мин. Блокирующее лиганд антитело MAB3481 (фирма R&D Systems) включали в опыт в качестве положительного контроля. Клетки отмывали дважды буфером для окрашивания, после чего добавляли 10нМ NRG1-e1, содержащий EGF-домен (фирма R&D Systems), разведенный в FACS-буфере, и инкубировали на льду в течение 45 мин. Клетки отмывали дважды буфером для окрашивания и связанный нейрегулин выявляли путем инкубации клеток с 10нМ антителом к EGF-домену человеческого NRG1-e1 (фирма R&D Systems), на льду в течение 45 мин. Клетки отмывали дважды буфером для окрашивания и инкубировали на льду в течение 45 мин со связанным с PE-антикозьим антителом (фирма Jackson ImmunoResearch), разведенным в соотношении
- 83 036314
1/500 FACS-буфером. Затем клетки пеллетировали путем центрифугирования и дебрис ресуспендировали в 200 мкл FACS-буфера. Для количественной оценки каждого образца по 10000 живых клеток оценивали с помощью проточного цитометра LSR II (фирма BD Biosciences) и количество связанного с клеточной поверхностью нейрегулина определяли, измеряя средний уровень флуоресценции в канале.
Пример 14. Биохимический анализ блокирования лиганда
Настоящий метод включает использование биосенсора (Biacore™, GE Healthcare, Уппсала, Швеция), применяемого для измерения резонанса поверхностного плазмона (SPR) для определения способности комплексов антител к HER3 связываться с нейрегулином.
Метод Biacore™ основан на явлении резонанса поверхностного плазмона (SPR) для выявления и количественной оценки взаимодействий при связывании. В типичном Biacore-эксперименте одну из взаимодействующих молекул (нейрегулин) иммобилизуют на матриксе, а партнер по взаимодействию (HER3) протекает по поверхности. Взаимодействие при связывании приводит к увеличению массы на поверхности сенсора и соответствующему непосредственному изменению показателя преломления среды вблизи поверхности сенсора. Изменения показателя преломления или сигнала считывают в виде единиц резонанса (R.U.). Мониторинг изменения сигнала, связанных с ассоциацией и диссоциацией комплексов, осуществляют неинвазивным путем, непрерывно и в реальном времени, полученные результаты выражают в виде сенсограмм.
Устройство Biacore™ T100 (фирма GE Healthcare, Уппсала, Швеция) использовали для осуществления всех описанных экспериментов. Подготовку сенсорной поверхности и анализ взаимодействия осуществляли при 25 С. Буфер и реагенты для Biacore-анализа покупали у фирмы GE Healthcare. В анализе использовали подвижный буфер, содержащий 10мМ Hepes, pH 7,4/150мМ NaCl, 0,05% P20, 0,5% БСА.
Внеклеточный домен NRG-1e1 (фирма R&D Systems) инкубировали на льду в течение 45 мин с реагентом для биотинилирования EZ-Link® Sulfo-NHS-LC-LC-биотин (фирма Pierce) в молярном соотношении 5:1. Реакцию прекращали, добавляя избыток этаноламина, и несвязанный биотин удаляли из биотинилированного NRG с помощью обессоливающих вращающихся колонок (фирма Zeba). Биотинилированный NRG иммобилизовывали на сенсорном чипе CAP, предварительно иммобилизованным с помощью примерно 3000 R.U. ssНКД-стрептавидина (набор Biotin CAPture), с получением поверхностной плотности нейрегулина, составляющей 400 - 600 R.U. Проточную референс-ячейку приготавливали, исключая из стадий инъекции инъекцию биотинилированного NRG, в результате чего на поверхности проточной ячейки присутствовал только ssДНК-стрептавидин.
Комплексы HER3/антитело создавали, инкубируя 10нМ человеческий HER3-Fc с взятым в возрастающих концентрациях (0 - 50нМ) соответствующим тестируемым антителом в течение 15 мин при комнатной температуре, перед инкубацией в Biacore™ при 10°C. Для анализа взаимодействия инъецировали комплексы HER3/антитело на поверхность референс-ячейки и на содержащие нейрегулин поверхности в виде серий по 180 с со скоростью потока 60 мкл/мин. Осуществляли мониторинг диссоциации комплексов в течение 180 с при скорости потока 60 мкл/мин. В конце каждого цикла анализов осуществляли регенерацию поверхности путем инъекции в течение 120 с смеси 8М гуанидин:1М NaOH (3:1) с последующей инъекцией в течение 120 с смеси 30% ацетонитрила/0,25М NaOH со скоростью потока 30 мкл/мин.
Пример 15. Фармакодинамические (ФД) исследования in vivo
Клетки линии BxPC3 и BT-474 культивировали и имплантировали самкам бестимусных мышей nu/nu Balb/C (фирма Harlan Laboratories) согласно методу, описанному в примерах 16 и 17.
После достижения опухолями требуемого размера у животных оценивали качество опухолей. Животных с изъязвленными опухолями или животных с заполненными жидкостью опухолями исключали из эксперимента. Оставшимся животным вводили внутривенно дозы антител путем инъекции в латеральную хвостовую вену. В указанные моменты времени животных умерщвляли посредством асфиксии, вызванной CO2, и получали образцы цельной крови путем сердечной пункции и помещали их в 1,5миллилитровые пробирки Эппендорфа для сбора образцов. Опухолевую ткань немедленно иссекали, помещали в пропиленовую пробирку для образцов с закручивающейся крышкой и быстро замораживали в жидком азоте. Ткань хранили при -80°C до приготовления лизатов.
Пример 16. Изучение эффективности in vivo с использованием клеток линии BT-474
Клетки линии BT-474 культивировали в среде DMEM, содержащей 10% инактивированной тепловой обработкой фетальной бычьей сыворотки без антибиотиков, вплоть до момента имплантации.
За 1 день до инокуляции клеток самкам бестимусных мышей nu/nu Balb/C (фирма Harlan Laboratories) имплантировали подкожно гранулу, обеспечивающую постоянное высвобождение 17β-эстрадиола (фирма Innovative Research of America) для поддержания уровней сывороточного эстрогена. Через 1 день после имплантации содержащей 17 β-эстрадиол гранулы инъецировали ортотопически в 4-ую жировую подушку грудной железы 5х106 клеток в суспензии, содержащей свободный от 50% фенолового красного матригель (фирма BD Biosciences) в сбалансированном солевом растворе Хэнкса. Общий инъекционный объем, содержащий клетки в суспензии, составлял 200 мкл. Через 20 дней после имплантации клеток животных, объем опухолей, у которых достигал примерно 200 мм3, включали в опыт по исследова- 84 036314 нию эффективности. Всего в опытах по исследованию эффективности использовали по 10 животных на группу.
Для исследований с использованием одного агента животным вводили путем инъекции в латеральную хвостовую вену дозы либо MOR10701, либо MOR10703. Начальную ударную дозу 40 мг/кг применяли в качестве первой дозы. После введения начальной дозы животным вводили 20 мг/кг через день в течение всего времени эксперимента. Для изучения эффективности комбинаций животным вводили дозы либо MOR10701, либо MOR10703 (20 мг/кг, iv, q2d) и субоптимальную дозу трастузумаба (1 мг/кг, iv, 2qw).
На протяжении всего опыта объем опухоли измеряли дважды в неделю с помощью кронциркуля. Процент величин, обнаруженный в обрабатываемой группе/контрольной группе (T/C), рассчитывали с помощью следующей формулы:
% Т/С = ЮОх ΔΤ/AC, если ΔΤ >0 в которой
T обозначает средний объем опухолей в обработанной лекарственным средством группе в последний день опыта;
ΔΤ обозначает средний объем опухолей в обработанной лекарственным средством группе в последний день опыта минус средний объем опухолей в обработанной лекарственным средством группе в первый день дозирования;
C обозначает средний объем опухолей в контрольной группе в последний день опыта; и
ΔC обозначает средний объем опухолей в контрольной группе в последний день опыта минус средний объем опухолей в контрольной группе в первый день дозирования.
Вес тела определяли дважды в неделю и дозу пересчитывали, исходя из веса тела. Изменение веса тела (в %) рассчитывали в виде (BWтекущuй - BWначαльный)/(BWначальный) х 100. Данные представлены в виде изменения веса тела в % относительно веса в день начала обработок.
Все данные выражали в виде среднего значения ± стандартное отклонение среднего (SEM). Разницу в объемах опухолей и весе тела использовали для статистических анализов. Сравнение между группами осуществляли с помощью одностороннего дисперсионного анализа с использованием апостериорного критерия Тьюки. При всех статистических оценках принимали, что различия являются значимыми при p<0,05. Представлены данные о значимости различий относительно обработанной наполнителем контрольной группы.
Пример 17. Изучение эффективности in vivo с использованием клеток линии BxPC3
Клетки линии BxPC3 культивировали в среде RPMI-1640, содержащей 10% инактивированной тепловой обработкой фетальной бычьей сыворотки без антибиотиков, вплоть до момента имплантации.
Самкам бестимусных мышей nu/nu Balb/C (фирма Harlan Laboratories) имплантировали подкожно 10х106 клеток в смеси 50% забуференного фосфатом физиологического раствора и 50% матригеля. Общий инъекционный объем, содержащий клетки в суспензии, составлял 200 мкл. Когда объем опухолей достигал примерно 200 мм3, животных включали в опыт по исследованию эффективности. Всего в опытах по исследованию эффективности использовали по 10 животных на группу. Животных не включали в опыт, если у них были обнаружены необычные характеристики роста опухолей перед включением в опыт.
Животным вводили дозы путем инъекции в латеральную хвостовую вену. Начальную ударную дозу 40 мг/кг применяли в качестве первой дозы. После введения начальной дозы животным вводили 20 мг/кг через день в течение всего времени эксперимента (25 дней обработки). Объем опухолей и значения Т/С рассчитывали согласно подробно описанному выше методу.
Пример 18. ФД-анализы in vivo фосфо-Akt (S473)
Примерно 50 мм3 замороженной ткани опухоли (например, BT-474 или ВХРС-3) подвергали оттаиванию на льду и в каждый образец добавляли 100-300 мкл T-PER-буфера (фирма Pierce), содержащего ингибиторы фосфатазы (фирма Roche) и протеазы (фирма Roche). Объем добавляемого буфера для лизиса зависел от размера образца опухоли. Ткань разрушали с помощью 1,5-миллилитрового пестика (фирма Fisher Scientific) и полученные суспензии инкубировали на льду в течение 15 мин, после чего замораживали в течение ночи при -80°C. Образцы подвергали оттаиванию и центрифугировали в течение 15 мин при 13000 g, 4°C, после чего измеряли в супернатанте концентрацию белка с помощью BCA-анализа (фирма Thermo Scientific). Супернатанты тканей разводили лизирующим буфером (фирма Mesoscale Discovery) и добавляли по 25 мкг в многоточечный 96-луночный планшет из углеродного материала для анализа фосфо-Akt (фирма Mesoscale Discovery), который предварительно блокировали с помощью блокирующего раствора-A (фирма Mesoscale Discovery). Планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч при встряхивании, после чего лизат аспирировали и лунки отмывали 4 раза отмывочным Трис-буфером (фирма Mesoscale Dsicovery). Фосфорилированную Akt выявляли с помощью 25 мкл меченного с помощью сульфо-метки антитела к фосфо-Akt (S473) (фирма Mesoscale Discovery), разведенного в буфере для разведения, путем инкубации при встряхивании при комнатной температуре в течение 1 ч. Лунки отмывали 4 раза отмывочным Трис-буфером, после чего добавляли 150 мкл T-буфера для
- 85 036314 считывания (с сурфактантом) (фирма Mesoscale Discovery) и количественно оценивали сигналы с помощью визуализирующего устройства Mesoscale Sector.
Пример 19. ФД-анализы in vivo фосфо- HER3 (Y1197)
Примерно 50 мм замороженной ткани опухоли (например, ВХРС-3) подвергали оттаиванию на льду и в каждый образец добавляли 100- 300 мкл T-PER-буфера (фирма Pierce), содержащего ингибиторы фосфатазы (фирма Roche) и протеазы (фирма Roche). Объем добавляемого буфера для лизиса зависел от размера образца опухоли. Ткань разрушали с помощью 1,5-миллилитрового пестика (фирма Fisher Scientific) и полученные суспензии инкубировали на льду в течение 15 мин, после чего замораживали в течение ночи при -80°C. Образцы подвергали оттаиванию и центрифугировали в течение 15 мин при 13000 g, 4°C, после чего измеряли в супернатанте концентрацию белка с помощью BCA-анализа (фирма Thermo Scientific). Супернатанты тканей разводили лизирующим буфером (фирма Mesoscale Discovery) и добавляли по 150 мкг в многоточечный 96-луночный планшет из углеродного материала (фирма Mesoscale Discovery), который предварительно сенсибилизировали в течение ночи 4 мкг/мл антитела MAB3481 (фирма R&D Systems) и блокировали 3% молока. Планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч при встряхивании, после чего лизат аспирировали и лунки отмывали 4 раза отмывочным Трис-буфером (фирма Mesoscale Discovery). Фосфорилированный HER3 связывали с помощью антитела к HER3 pY1197, разведенного в соотношении 1/8000 в блокирующем буфере. После инкубации при комнатной температуре в течение 1 ч лунки отмывали отмывочным Трис-буфером и антитело к pY1197 выявляли с использованием меченного с помощью S-метки антикроличьего антитела (фирма Mesoscale Discovery), разведенного в соотношении 1/1000 блокирующим буфером, путем инкубации при встряхивании при комнатной температуре в течение 1 ч. Лунки отмывали 4 раза отмывочным Трис-буфером, после чего добавляли 150 мкл разведенного в соотношении 1/4 T-буфера для считывания (с сурфактантом) (фирма Mesoscale Discovery) и количественно оценивали сигналы с помощью визуализирующего устройства.
Пример 20. Изучение in vitro комбинации лекарственных средств
Для оценки возможности сочетания антител, мишенью которых является HER3, с терапевтическими средствами направленного действия, объединяли MOR09825 или MOR10703 с трастузумабом, лапатинибом, BEZ235, BKM120, BYL719, RAD001, эрлотинибом и цетуксимабом и осуществляли анализы жизнеспособности клеток. Примерно 1000-1500 клеток линий SK-Br-3 (среда МакКоя), MDA-MB-453 (среда RPMI), FaDu (среда EMEM) или L3.3 (среда RPMI) высевали в 384-луночные планшеты с соответствующими культуральными средами, дополненными 2% FBS, и давали им прикрепиться в течение ночи при 37°C. Затем в лунки добавляли соответствующие комбинации лекарственных средств (как правило, конечные концентрации лекарственных средств составляли: для лапатиниба, BKM120 и BYL719 от 3 мкМ до 13 нМ; для RAD001 от 27 до 0,0041 нМ; для эрлотиниба от 1 мкМ до 0,0025 нМ; для MOR1073 от 100 до 0,01 нМ; для цетуксимаба от 100 до 0,0015 нМ; и для трастузумаба от 300 до 0,046 нМ)), так, чтобы в каждом планшете лекарственные средства присутствовали в концентрациях, позволяющих построить кривую дозовой зависимости для каждого лекарственного средства в двухмерной матрице. Планшеты возвращали в инкубатор, где их выдерживали в течение 3-6 дней, после чего оценивали жизнеспособность клеток с помощью набора CellTiter-Glo (фирма Promega). Добавляли в каждую лунку раствор CellTiter-Glo и инкубировали при комнатной температуре при осторожном встряхивании в течение 10 мин. Уровень люминесценции определяли с помощью планшет-ридера SpectraMax (фирма Molecular Devices). Рассчитывали степень ингибирования роста при применении каждой комбинации и оценивали активность комбинации с помощью модели аддитивного действия Лёве.
Пример 21. Изучение in vivo комбинации лекарственных средств на клетках линии L3.3
Клетки поджелудочной железы линии L3.3 культивировали в среде DMEM, содержащей 10% инактивированной тепловой обработкой фетальной бычьей сыворотки, до момента имплантации. Самкам голых мышей линии Foxn1 (фирма Harlan Laboratories) имплантировали подкожно 3х106 клеток в не содержащей FBS среде DMEM. Общий инъекционный объем, содержащий клетки в суспензии, составлял 100 мкл. Через 12 дней после имплантации клеток животных, средний объем опухолей, у которых в каждой группе достигал примерно 100 мм3, включали в опыт по исследованию эффективности. Всего в опытах по исследованию эффективности использовали по 8 животных на группу.
Животных не включали в опыт, если у них были обнаружены необычные характеристики роста опухолей перед включением в опыт.
Животным вводили внутривенно MOR10703 путем инъекции в латеральную хвостовую вену дозы 20 мг/кг через день в течение всего времени эксперимента (обработка в течение 14 дней). Эрлотиниб применяли в дозе 50 мг/кг (PO) ежедневно в качестве индивидуального средства или в комбинации с MOR10703. Объем опухолей и величины T/C рассчитывали согласно подробно описанному выше методу.
Результаты и их обсуждение
В целом, полученные результаты свидетельствуют о создании класса антител, которые связываются с аминокислотными остатками в домене 2 и домене 4 конформационного эпитопа HER3 и стабилизируют HER3 в неактивной или закрытой конформации. Связывание указанных антител ингибирует как зави- 86 036314 симую от лиганда, так и независимую от лиганда передачу сигнала. Эти антитела обладают также способностью связываться одновременно с лигандом HER3.
(I) Определение аффинности
Аффинность антител определяли на основе титрования уравновешенного раствора (SET) согласно описанному выше методу. Результаты обобщены в табл. 9 и пример кривых титрования для MOR10701 представлен на фиг. 1. Данные свидетельствуют о том, что идентифицирован ряд антител, которые отличаются выраженной способностью к связыванию с HER3 человека, обезьяны циномолгус, крысы и мыши.
Таблица 9. Значения KD антител к HER3 IgG-типа по данным титрования уравновешенного раствора (SET). Hu (человеческий), Cy (циномолгус), Mu (мышиный) и ra (крысиный)
MOR№ SET KD (пМ)
hu HER3-метка Су HER3метка mu HER3- метка ra HER3 - метка
09823 9 4 2 11
09824 3 3 2 7
09825 25 56 24 96
09974 350 200 120 n.d.
10701 4 4 6 10
10702 3 3 5 6
10703 26 23 20 40
12609 10 n.d n.d n.d
12610 37 n.d n.d n.d
10703 N52S 57 n.d n.d n.d
10703 N52G 60 n.d n.d n.d
10703 A50V N52S 16 n.d n.d n.d
10703 A50V N52G 22 n.d n.d n.d
10701 R55G 18 n.d n.d n.d
10701R55K 11 n.d n.d n.d
(II) Определение значений EC50 для клеток линии SK-Br-3
Способность идентифицированных антител связываться с экспрессирующими HER3 клетками оценивали, рассчитывая значения EC50, характеризующие связывание с амплифицирующей HER2 линией клеток SK-Br-3 (см. фиг. 2 и табл. 10).
Таблица 10. Определенные с помощью FACS значения EC50 антител к HER3 IgG-типа для клеток линии SK-Br-3. (n.d. обозначает: не определяли)
MOR № SK-Br-3 FACS EC50 (nM)
09823 630
09824 324
09825 839
09974 n.d.
10701 n.d.
10702 n.d.
10703 2454
(III) Связывание с доменами HER3
Поднабор антител к HER3 характеризовали с помощью ELISA-анализа по их способности связываться с различными внеклеточными доменами человеческого HER3. Для этой цели внеклеточный домен HER3 подразделяли на его 4 конститутивных домена, и различные комбинации этих доменов клонировали, экспрессировали и очищали в зависимости от белков согласно описанному выше методу. С помощью указанной стратегии были созданы следующие домены в виде растворимых белков: домены 1 и 2 (D1-2), домен 2 (D2), домены 3 и 4 (D3-4) и домен 4 (D4). Ряд созданных при создании изобретения мышиных антител к человеческому HER3 (8D7, 1F5 и 8P2) оценивали также в качестве положительных контролей для демонстрации целостности выделенного домена.
Как продемонстрировано на фиг. 3, и MOR09823, и MOR09825 успешно связываются с внеклеточным доменом HER3, но в этом анализе с использованием указанных антител обнаружено их слабое связывание с выделенными доменами. Есть несколько возможных объяснений такой картины связывания:
а) MOR09823 и MOR09825 могут связываться с линейным эпитопом, который простирается в микроокружение домена, таким образом, частично связывание эпитопа может теряться, когда домены экспрессируют в виде выделенных белков;
б) MOR09823 и MOR09825 могут связываться с нелинейным эпитопом, в котором связаны несколько доменов. Следовательно, разделение HER3 на составляющие его единичные структуры может разрушать сайт связывания;
в) форма/конформация HER3 может представлять собой элемент связывания MOR09823 и
- 87 036314
MOR09825 с HER3, так что только полноразмерный внеклеточный домен HER3 обладает способностью адоптировать эту форму/конформацию, в то время как выделенные домены не могут полностью принимать эту конформацию.
(VI) Эпитопное картирование HER3 с помощью масс-спектрометрического определения обмена водорода на дейтерий
Эпитоп HER3 исследовали также с помощью HDX-MS-анализа ECD HER3 в присутствии версий Fab MOR09823, MOR09824, MOR09825 и MOR09974 и без них. На фиг. 4А продемонстрировано, что в отсутствии связанного Fab примерно 69% последовательности ECD HER3 перекрывается по меньшей мере одним пептидом. Бреши в покрытии могут являться результатом гликозилирования остатков в этих областях или недостаточным восстановлением дисульфидных связей в богатых цистеином областях, что, в частности, обнаружено в домене 2. Важно отметить, что хотя для каждого Fab характерны индивидуальные схемы защиты, одна область сильной защиты обнаружена во всех MOR09823, MOR09824, MOR09825 и MOR09974 (см. фиг. 4Б), что свидетельствует о том, что это семейство отличающихся высоким сходством антител связывается с HER3 идентичным образом. Наиболее сильная защита обнаружена для остатков 269-286 домена 2 (TFQLEPNPHTKYQYGGVC) (SEQ ID NO: 146),что свидетельствует о том, что остатки в этой области могут быть важными для связывания с МАт. Картированние защищенных остатков Fab в опубликованной кристаллической структуре HER3 (Cho и Leahy, Science 297, 2002, сс. 1330-1333) продемонстрировало, что остатки 269-286 находится в функционально важной петле βшпильки в домене 2 или вблизи нее (см. фиг. 4В).
(VII) Кристаллическая структура HER3/MOR09823
Исследование с разрешением 3,2А кристаллической структуры в рентгеновских лучах Fabфрагмента MOR09823, связанного с внеклеточным доменом HER3, позволило получить дополнительные данные о эпитопе HER3, распознаваемом семейством родственных антител (см. фиг. 5А). Кроме того, определяли с разрешением 3,4А структуру Fab-фрагмента MOR09825, связанного с человеческим HER3. В кристаллических структурах обоих комплексов MOR09823/HER3 и MOR09825/HER3 HER3 находится в связанной (неактивной) конформации (см. фиг. 5А, Б, В и Г). Эта конформация характеризуется выраженной областью контакта, в которой происходит взаимодействие между доменами 2 и 4, опосредованное петлей димеризации β-шпильки в домене 2. Обнаруженная конформация HER3 сходна с описанной ранее у Cho с соавторами (Cho и Leahy, Science 297, 2002, сс. 1330-1333), опубликовавшими данные о кристаллической структуре внеклеточного домена HER3 в отсутствии нейрегулина. Поскольку нейрегулин может активировать HER3, то связанная конформация HER3, вероятно, должна быть неактивной. Сходные связанные конформации обнаружены также при кристаллизации представителей родственного семейства EGFR HER4 (Bouyain и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102, 2005, сс. 15024-15029) и HER1 (Ferguson и др., Molec. Cell 11, 2003, сс. 507-517).
Пространственные взаимодействия между доменами 1-4 HER3 в неактивном (скованном) состоянии сильно отличаются от взаимодействий в вытянутом (активном) состоянии. Эти данные базируются на кристаллических структурах представителей родственного семейства EGFR HER2 и связанного с лигандом HER1 (Cho и др., Nature 421, 2003, сс. 756-760; Ogiso и др., Cell 110, 2002, сс. 775-787; Garrett и др., Cell 110, 2002, сс. 763-773), которые оба находились в вытянутом (активном) состоянии. В вытянутом состоянии петля димеризации β-шпильки домена 2 освобождается от ингибирующего его взаимодействия с доменом 4 и в результате становится свободной для взаимодействия с белками-партнерами по димеризации. Таким образом, петля димеризации β-шпильки домена 2 является функционально важной как для поддержания связанного (неактивного) состояния, так и для опосредования димеризации EGFрецепторов в вытянутом состоянии, что приводит к активации внутриклеточного киназного домена. Таким образом, кристаллические структуры комплексов MOR09823/ HER3 и MOR09825/ HER3 (см. фиг. 5) позволяет предположить, что и MOR09823, и MOR09825 функционируют, стабилизируя неактивную конформацию HER3.
Кристаллическая структура свидетельствует также о том, что эпитоп HER3, распознаваемый и MOR09823 и MOR09825, представляет собой нелинейный эпитоп, который включает остатки из обоих доменов 2 и 4 (см. фиг. 5В и 5Г, табл. 11, 12, 13 и 14). Таким образом, эпитоп HER3, распознаваемый антителами из этого семейства родственных антител, можно описать как:
домен 2: остатки 265-277, 315, домен 4: остатки 571, 582-584, 596-597, 600-602, 609-615.
Следовательно, связывание обоих доменов 2 и 4 с MOR09823 или MOR09825 должно стабилизовать связанную конформацию HER3, что приводит к антагонистическому действию способности передавать сигнал.
Механизм связывания MOR09823/MOR09825, обнаруженный при изучении кристаллической структуры, согласуется с проведенными при создании изобретения исследованиями по эпитопному картированию. В частности, осуществленные с помощью ELISA эксперименты по изучению связывания доменов продемонстрировали, что аффинность MOR09823 и MOR09825 существенно выше в отношении интактного внеклеточного белка HER3, чем в отношении выделенных доменов (например, D1-, D1-D2-,
- 88 036314
D3- или D3-D4^parMeHToe) (см. фиг. 3). Это согласуется также с оценкой HER3 с помощью метода HDX-MS (см. фиг. 4Б), который позволил идентифицировать β-шпильку домена 2 в качестве части распознаваемого антителом эпитопа. И, наконец, обе кристаллические структуры демонстрируют, что лигандсвязывающая поверхность HER3, которая была картирована по аналогии с доменами 1 и 3 HER1 (Ogiso и др., Cell, 110, 2002, сс. 775-787; Garrett и др., Cell, 110, 2002, сс. 763-773), не закрывается при связывании с MOR09823 или с MOR09825 (см. фиг. 5Б). Это согласуется с полученными при создании изобретения данными о том, что ни MOR09823, ни MOR09825 не блокируют связывание нейрегулина с MCF7-клетками (см. фиг. 9), и что комплексы HER3/MOR09823 могут связываться с иммобилизованным нейрегулином по данным Biacore-анализа (см. фиг. 10).
Таблица 11. Взаимодействия между тяжелой цепью Fab MOR09823 и человеческим HER3. Остатки VH Fab пронумерованы в соответствии с линейной аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 15). HER3-остатки пронумерованы в соответствии с NP_001973. Представлены HER3-остатки, которые имеют по меньшей мере один атом в пределах 5А от атома Fab MOR09823____________________
Fab MOR09823 Человеческий HER3
Остаток Номер Цепь Остаток Номер Домен
Ser 30 VH Pro 276 2
Ser 31 VH Pro 274 2
Asn 275 2
Pro 276 2
Туг 32 VH Pro 276 2
His 277 2
Ala 33 VH Asn 266 2
Leu 268 2
Ser 35 VH Leu 268 2
Vai 50 VH Leu 268 2
Thr 269 2
Gly 52 VH Glu 273 2
Thr 269 2
Ala 53 VH Glu 273 2
Pro 274 2
Vai 54 VH Glu 273 2
Tyr 58 VH Pro 583 4
Asp 571 4
His 584 4
Thr 269 2
Gin 271 2
Asn 73 VH Asn 315 2
Ser 74 VH Asn 315 2
Trp 98 VH Leu 268 2
Lys 267 2
Asn 266 2
Asp 100 VH Ala 596 4
Lys 597 4
Pro 276 2
His 277 2
Glu 101 VH Lys 267 2
Lys 597 4
Phe 103 VH Leu 268 2
Таблица 12. Взаимодействия между легкой цепью Fab MOR09823 и человеческим HER3. Остатки VL Fab пронумерованы в соответствии с линейной аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 14). НЕЮ-остатки пронумерованы в соответствии с NP_001973. Представлены НЕЮ-остатки, которые имеют по меньшей мере один атом, находящийся в пределах 5А от атома Fab MOR09823_________
Fab MOR09823 Человеческий HER3
Остаток Номер Цепь Остаток Номер Домен
Gin 27 VL Arg 611 4
Glu 609 4
Gly 28 VL Arg 611 4
- 89 036314
Pro 612 4
Не 29 VL Pro 612 4
Ser 30 VL Pro 612 4
Cys 613 4
His 614 4
Glu 615 4
Asn 31 VL Glu 615 4
Cys 613 4
Trp 32 VL Lys 267 2
Tyr 265 2
Pro 612 4
Cys 613 4
He 600 4
Lys 602 4
Туг 49 VL Lys 597 4
Gly 66 VL Glu 615 4
Ser 67 VL His 614 4
Glu 615 4
Gin 89 VL Leu 268 2
Tyr 91 VL Lys 267 2
Leu 268 2
Phe 270 2
Ser 92 VL Phe 270 2
Lys 602 4
Pro 612 4
Ser 93 VL Phe 270 2
Glu 609 4
Phe 94 VL Phe 270 2
Leu 268 2
Gly 582 4
Pro 583 4
Thr 96 VL Leu 268 2
Таблица 13. Взаимодействия между тяжелой цепью Fab MOR09825 и человеческим HER3. Остатки VH Fab пронумерованы в соответствии с линейной аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 51). HER3-остатки пронумерованы в соответствии с NP_001973. Представлены HER3-остатки, которые имеют по меньшей мере один атом, находящийся в пределах 5А от атома Fab MOR09825
Fab MOR09825 Человеческий HER3
Остаток Номер Цепь Остаток Номер Домен
Ser 30 VH Asn 315 2
Ser 31 VH Pro 274 2
Pro 276 2
Tyr 32 VH Pro 276 2
His 277 2
Ala 33 VH Asn 266 2
Thr 269 2
Ser 35 VH Leu 268 2
- 90 036314
Trp 47 VH Leu 268 2
Ala 50 VH Leu 268 2
Asn 52 VH Glu 273 2
Gin 271 2
Thr 269 2
Ser 53 VH Glu 273 2
Pro 274 2
Gin 54 VH Glu 273 2
Pro 274 2
Ser 57 VH Gin 271 2
Tyr 59 VH Pro 583 4
Asp 571 4
His 584 4
Thr 269 2
Gin 271 2
Asn 74 VH Asn 315 2
Trp 99 VH Leu 268 2
Lys 267 2
Asn 266 2
Asp 101 VH Ala 596 4
Lys 597 4
Pro 276 2
His 277 2
Glu 102 VH Lys 267 2
Lys 597 4
Phe 104 VH Leu 268 2
Таблица 14. Взаимодействия между легкой цепью Fab MOR09825 и человеческим HER3. Остатки VL Fab пронумерованы в соответствии с линейной аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 50). HER3-остатки пронумерованы в соответствии с NP_001973. Представлены HER3-остатки, которые имеют по меньшей мере один атом, находящийся в пределах 5А от атома Fab MOR09825_________
Fab MOR09825 Человеческий HER3
Остаток Номер Цепь Остаток Номер Домен
Gin 27 VL Arg 611 4
Gly 28 VL Arg 611 4
Pro 612 4
He 29 VL Pro 612 4
Ser 30 VL Pro 612 4
Cys 613 4
His 614 4
Glu 615 4
Asn 31 VL Glu 615 4
His 614 4
Cys 613 4
Trp 32 VL Lys 267 2
Tyr 265 2
Pro 612 4
Cys 613 4
He 600 4
- 91 036314
Lys 602 4
Туг 49 VL Lys 597 4
Gly 66 VL Glu 615 4
Ser 67 VL His 614 4
Glu 615 4
Gin 89 VL Leu 268 2
Туг 91 VL Lys 267 2
Leu 268 2
Phe 270 2
Ser 92 VL Phe 270 2
Lys 602 4
Pro 612 4
Arg 611 4
Ser 93 VL Phe 270 2
Glu 609 4
Phe 94 VL Phe 270 2
Gly 582 4
Pro 583 4
Thr 96 VL Leu 268 2
Визуальная оценка кристаллических структур MOR09823/MOR09825 продемонстрировала, что остатки HER3 Lys267 и Leu268 участвуют в многочисленных взаимодействиях с различными CDR антител, что позволяет предположить, что они могут быть важны для связывания с антителом. Поэтому Lys267 и/или Leu268 заменяли на аланин, экспрессировали и полученные рекомбинантные белки очищали для оценки их влияния на связывание с антителом. Анализы по оценке связывания, проведенные с помощью ELISA, продемонстрировали, что мутация либо Lys267, либо Leu268 элиминировала связывание MOR10703 с HER3 (фиг. 5Е), что позволяет предположить, что оба остатка представляют собой интегральную часть эпитопа HER3 и, вероятно, вносят вклад во взаимодействия между MOR09823/MOR09825 и HER3.
(VIII) Ингибирование передачи сигнала в клетке
Для оценки воздействия антител к HER3 на зависящую от лиганда активность HER3 клетки линии MCF7 инкубировали с IgG перед стимуляцией нейрегулином. Пример кривых ингибирования проиллюстрирован на фиг. 6А, и данные обобщены в табл. 15. Исследовали также воздействие антител к HER3 на опосредуемую HER2 активацию HER3 с использованием клеточной линии SK-Br-3, в которой происходит амплификация HER2 (фиг. 6Б и табл. 15).
Таблица 15. Значения IC50 для pHER3 и степень ингибирования антителом к HER3 IgG-типа в клетках линий MCF7 и SK-Br-3
MOR MCF7 pHER3 SK-Br-3 pHER3
№ IC50 (nM) % ингибирования IC50 (nM) % ингибирования
09823 181 89 56 59
09824 103 91 110 64
09825 399 80 169 66
09974 3066 69 1928 67
10701 n.d. n.d. 370 74
10702 n.d. n.d. n.d. n.d.
10703 333 80 167 69
12609 5 86 241 71
12610 126 84 192 75
Для решения вопроса о том, влияет ли ингибирование активности HER3 на киназу Akt, расположенную в прямой направлении пути передачи сигнала в клетке, ее фосфорилирование оценивали также в клетках, амплифицирующих HER2, после обработки антителами к HER3 (см. фиг. 7 и табл. 16).
- 92 036314
Таблица 16. Значения IC50 для pAkt (S473) и степень ингибирования антителом к HER3 IgG-типа в клетках линий SK-Br-3, BT-474 и MCF7
MOR № SK-Br-3 pAkt BT-474 pAkt MCF7 pAkt
1С50 (пМ) % ингибирования % ингибирования IC50 (nM) % ингибирования
09823 55 92 57 n.d. n.d.
09824 62 93 46 n.d. n.d.
09825 156 91 69 294 79
09974 814 85 n.d. n.d. n.d.
10701 n.d. n.d. 59 n.d. n.d.
10702 n.d. n.d. 55 n.d. n.d.
10703 70 89 62 449 79
В целом, установлено, что каждое из антител MOR09823, MOR09824, MOR09825, MOR09974, MOR10701, MOR10702 MOR10703, MOR12609 и MOR12610 обладает способностью ингибировать клеточную активность HER3 как зависимым от лиганда, так и независимым от лиганда образом.
(IX) Ингибирование пролиферации
Поскольку все антитела MOR09823, MOR09824, MOR09825, MOR09974, MOR10701, MOR10702 и MOR10703 ингибируют активность HER3 и передачу сигнала в прямом направлении, изучали их способность блокировать зависимый и независимый от лиганда рост клеток in vitro (приведенные в качестве примера данные представлены на фиг. 8 и обобщены в табл. 17). Все изученные антитела к HER3 эффективно ингибировали клеточную пролиферацию.
Таблица 17. Ингибирование пролиферации после обработки взятыми в дозе мкг/мл антителами к HER3 IgG-типа клеток линий SK-Br-3, BT-474 и MCF7.
MOR№ % Ингибирования
SK-Br-3 BT-474 MCF7
09823 39 39,8 82
09824 33 36,8 82
09825 41 37,2 63
09974 35 n.d. 20
10701 n.d. 43,6 n.d.
10702 n.d. 43,8 n.d.
10703 35 41,6 81
(X) Оценки блокады лиганда
Способность описанных антител к HER3 блокировать связывание лиганда исследовали, оценивая связывание нейрегулина с клетками линии MCF7, предварительно обработанными либо MOR09823, либо MOR09825. Присутствие как MOR09823, так и MOR09825 не оказывало существенного воздействия на способность нейрегулина связываться с MCF7-клеками, в то время как применяемое в этом эксперименте в качестве положительного контроля антитело (Mab3481) обладало способность заметно влиять на связывание нейрегулина (см. фиг. 9). Эти результаты согласуются с данными о кристаллической структуре, из которых следует, что MOR09823 взаимодействует с доменами 2 и 4, в то время как основные точки контакта при взаимодействии HER3 с нейрегулином, как предполагается, сгруппированы в основном в доменах 1 и 3. С учетом того, что нейрегулин обладает способностью связываться с неактивной конформацией HER3 (Kani и др., Biochemistry 44, 2005, сс. 15842-15857), возможно, что MOR09823 и MOR09825 функционируют, предупреждая перегруппировку доменов HER3, необходимую для передачи сигнала, или оказывая воздействие на димеризацию рецептора.
(XI) Оценка блокады лиганда (биохимическая)
Для решения вопроса о том, могут ли MOR09823 и нейрегулин одновременно связываться с HER3, проводили биохимический анализ с использованием Biacore™-технологии. Анализы взаимодействия осуществляли путем иммобилизации биотинилированного нейрегулина на поверхности сенсорного чипа CAP (фирма GE Healthcare), применяемого в Biacore™, используя набор Biotin CAPture (фирма GE Healthcare). Получали комплексы HER с антителами путем инкубации человеческого HER3-Fc с взятыми в возрастающих концентрациях MOR09823, 105.5 (фирма Thermo Scientific) или человеческим IgG. Предварительно полученные комплексы ИНКЗ/антитело инъецировали на референс-поверхность и активную поверхность и оценивали взаимодействие HER3 с нейрегулином.
Контрольный IgG не оказывал воздействия на формирование комплекса ИБК3/нейрегулин, в то время как антитело 105.5 существенно ингибировало способность HER3 связываться с нейрегулином, что согласуется с известными сведениями о том, что оно представляет собой блокирующее лиганд антитело (фиг. 10). В отличие от этого при образовании комплексов HER3/MOR09823 имело место связывание нейрегулина, что демонстрирует, что MOR09823 не препятствует связыванию лиганда. Важно отметить уникальное зависящее от дозы увеличение значений RU при инъекции комплексов MOR09823/HER3. Эти данные свидетельствуют об образовании на поверхности чипа тримерного комплекса, содержащего нейрегулин, HER3 и MOR09823. Возможность образования этого тримерного ком- 93 036314 плекса предсказано по кристаллической структуре HER3/MOR09823, поскольку связывание MOR09823 не закрывает сайт связывание лиганда на HER3, это позволяет предположить, что связывание нейрегулина и MOR09823 не являются взаимно исключающими.
Согласно другому варианту осуществления изобретения антитело или его фрагмент связывается как с доменом 2, так и с доменом 4 HER3 и не блокирует конкурентное связывание лиганда HER3, такого как нейрегулин. Не вдаваясь в теорию, можно предположить, что антитело или его фрагмент связывается как с доменом 2, так и с доменом 4 HER3, поддерживает HER3 в неактивной конформации, не блокируя сайт связывания лиганда на HER3. В результате лиганд HER3 (например, нейрегулин) может связываться с HER3 одновременно с антителом.
Антитела, предлагаемые в изобретении, или их фрагменты ингибируют как зависимую от лиганда, так и независимую от лиганда активацию HER3, не препятствуя связыванию лиганда. Это рассматривается как преимущество по следующим причинам:
I) терапевтическое антитело может найти клиническое применение в отношении широкого спектра опухолей, чем антитело, направленное только на один механизм активации HER3 (т.е. зависимой от лиганда или независимой от лиганда), поскольку каждый механизм опосредует различные типы опухолей;
(II) терапевтическое антитело может обладать эффективностью в отношении разных типов опухолей, когда одновременно вовлечены оба механизма активации HER3. Антитело, направленное только на один механизм активации HER3 (т.е. зависимой от лиганда или независимой от лиганда), должно обладать меньшей эффективностью или не обладать эффективностью в отношении этих типов опухолей;
(III) на эффективность антитела, которое ингибирует зависимую от лиганда активацию HER3, не препятствуя при этом связыванию лиганда, с меньшей вероятностью будет оказывать вредное воздействие возрастающие концентрации лиганда. Это может приводить либо к повышенной эффективности в отношении типа опухоли, вызываемой очень высокими концентрациями лиганда HER3, либо к пониженной предрасположенности к развитию устойчивости к лекарственным средствам в том случае, когда устойчивость опосредована повышающей регуляцией лигандов HER3;
(IV) антитело, которое ингибирует активацию HER3 путем стабилизации неактивной формы, должно быть менее подвержено устойчивости к лекарственным средствам, связанными с альтернативными механизмами активации HER3.
Следовательно, антитела, предлагаемые в изобретении, можно применять для лечения состояний, в отношении которых существующие в настоящее время терапевтические антитела являются клинически неэффективными.
(XII) Ингибирование in vivo активности HER3 и воздействие на рост опухолей
Для оценки активности in vivo описанных антител к HER3 антитело MOR09823 оценивали на моделях опухолей как ВхРС-3, так и BT-474. Установлено, что MOR09823 ингибирует активность HER3, о чем свидетельствует существенное снижение уровней pHER3 в опухолях (фиг. 11). Ингибируется также передачи сигнала HER3 в прямом направлении, что продемонстрировано по снижению уровней pAkt как при использовании ВхРС-3, так и BT-474 (фиг. 11). В опыте по оценке опосредуемой HER2 эффективности при использовании BT-474, установлено, что повторная обработка MOR10701 приводила к ингибированию на 74% роста опухолей (см. фиг. 12А), а обработка MOR10703 приводила к ингибированию на 83%. При изучении роста опухолей на модели BxPC3 установлено, что и MOR10701, и MOR10703 очень эффективно ингибировали опосредуемый лигандом рост опухолей (см. фиг. 13).
(XIII) Изучение in vitro комбинаций лекарственных средств и их воздействие на рост клеток
Поскольку рост опухолевых клеток часто запускается несколькими путями передачи сигнала, исследовали, обладают ли комбинации MOR09823 или MOR10703 с различными средствами целенаправленного воздействия благоприятным действием в отношении блокады клеточной пролиферации. Выбранные средства целенаправленного действия ингибируют главным образом HER2 (трастузумаб, лапатиниб), EGFR (цетуксимаб, эрлотиниб), PI3K/mTOR (BEZ235), PI3K (BKM120), PIK3CA (BYL719) и mTOR (RAD001), поскольку эти мишени, как правило, активируются в человеческих опухолях. Анализ изоболограмм (см. фиг. 14) продемонстрировал, что для MOR09823 и MOR10703 характерно синергетическое действие при их применении в комбинациях с трастузумабом, лапатинибом, эрлотинибом, цетуксимабом, BEZ235, BKM120, BYL719 и RAD001. Эти данные позволяют предположить, что ингибирование передачи сигнала HER3 является особенно благоприятным при применении ингибиторов, мишенью которых являются рецепторные тирозинкиазы или путь передачи сигнала PI3K.
(XIV) Изучение in vivo комбинаций лекарственных средств и MOR10703 Поскольку in vitro установлено наличие совместного действия ингибиторов HER3 со средствами, мишенью которых являются рецепторные тирозинкиназы, то при создании изобретения исследовали воздействие in vivo, применяя либо MOR10701, либо MOR10703 в сочетании с трастузумабом и эрлотинибом. Как установлено с использованием ксенотрансплантатов BT-474 (см. фиг. 15А), комбинация либо MOR10701, либо MOR10703 (20 мг/кг) с взятым в субоптимальной дозе (1 мг/кг) трастузумабом обладала действием, достаточным для индукции регресса опухолей (%T/C= -50 и -37 соответственно). При применении ксенотрансплантатов клеток рака поджелудочной железы L3.3 установлено, что комбинация MOR10703 (20 мг/кг) с применяемым ежедневно эрлотинибом (50 мг/кг) привела к стазу опухолей (%T/C= 3, см. фиг.
- 94 036314
15Б). На обеих моделях установлено, что комбинация двух лекарственных средств обладала существенно более высокой эффективностью, чем индивидуальное применение любого из лекарственных средств, что подтверждает полученные ранее при создании изобретения данные in vitro о благоприятном действии комбинации антител, мишенью которых является HER3, с антителами, мишенью которых является ErbB.
В целом, можно сделать вывод о том, что уникальная способность этого семейства антител стабилизировать неактивную конформацию HER3 приводит к выраженной эффективности in vivo на моделях, в которых HER3 активируется либо зависимым, либо независимым от лиганда образом. Кроме того, ингибирование HER3 этим семейством антител оказывает благоприятное действие в комбинации с широким разнообразием целенаправленных терапий.
Включение в качестве ссылки
Все процитированные в настоящем описании ссылки, включая патенты, заявки на патент, статьи, руководства и т.п., а также ссылки, процитированные в указанных публикациям, полностью включены в настоящее описание в качестве ссылок.
Эквиваленты
Приведенное описание изобретения рассматривается как достаточное для практического воплощения изобретения специалистом в данной области. Приведенное описание и примеры детализируют конкретные предпочтительные варианты осуществления изобретения и демонстрируют наилучший путь осуществления изобретения. Однако должно быть очевидно, что вне зависимости от того, насколько подробно оно было изложено выше в настоящем описании, изобретение можно осуществлять на практике многими путями, и изобретение следует трактовать в соответствии с прилагаемой формулой изобретения и ее эквивалентами.

Claims (16)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Выделенное антитело или его фрагмент к HER3-рецептору, включающий:
    а) VH, которая содержит SEQ ID NO: 15, и VL, которая содержит SEQ ID NO: 14, или аминокислотную последовательность, идентичную им на 97-99%; или
    б) VH, которая содержит SEQ ID NO: 33, и VL, которая содержит SEQ ID NO: 32, или аминокислотную последовательность, идентичную им на 97-99%; или
    в) VH, которая содержит SEQ ID NO: 51, и VL, которая содержит SEQ ID NO: 50, или аминокислотную последовательность, идентичную им на 97-99%; или
    г) VH, которая содержит SEQ ID NO: 69, и VL, которая содержит SEQ ID NO: 68, или аминокислотную последовательность, идентичную им на 97-99%; или
    д) VH, которая содержит SEQ ID NO: 87, и VL, которая содержит SEQ ID NO: 86, или аминокислотную последовательность, идентичную им на 97-99%; или
    е) VH, которая содержит SEQ ID NO: 105, и VL, которая содержит SEQ ID NO: 104, или аминокислотную последовательность, идентичную им на 97-99%; или
    ж) VH, которая содержит SEQ ID NO: 123, и VL, которая содержит SEQ ID NO: 122, или аминокислотную последовательность, идентичную им на 97-99%; или
    з) VH, которая содержит SEQ ID NO: 141, и VL, которая содержит SEQ ID NO: 140, или аминокислотную последовательность, идентичную им на 97-99%; или
    и) VH, которая содержит SEQ ID NO: 159, и VL, которая содержит SEQ ID NO: 158, или аминокислотную последовательность, идентичную им на 97-99%; или
    к) VH, которая содержит SEQ ID NO: 177, и VL, которая содержит SEQ ID NO: 176, или аминокислотную последовательность, идентичную им на 97-99%; или
    л) VH, которая содержит SEQ ID NO: 195, и VL, которая содержит SEQ ID NO: 194, или аминокислотную последовательность, идентичную им на 97-99%; или
    м) VH, которая содержит SEQ ID NO: 213, и VL, которая содержит SEQ ID NO: 212, или аминокислотную последовательность, идентичную им на 97-99%; или
    н) VH, которая содержит SEQ ID NO: 231, и VL, которая содержит SEQ ID NO: 230, или аминокислотную последовательность, идентичную им на 97-99%; или
    о) VH, которая содержит SEQ ID NO: 249, и VL, которая содержит SEQ ID NO: 248, или аминокислотную последовательность, идентичную им на 97-99%; или
    п) VH, которая содержит SEQ ID NO: 267, и VL, которая содержит SEQ ID NO: 266, или аминокислотную последовательность, идентичную им на 97-99%; или
    р) VH, которая содержит SEQ ID NO: 285, и VL, которая содержит SEQ ID NO: 284, или аминокислотную последовательность, идентичную им на 97-99%; или
    с) VH, которая содержит SEQ ID NO: 303, и VL, которая содержит SEQ ID NO: 302, или аминокислотную последовательность, идентичную им на 97-99%; или
    т) VH, которая содержит SEQ ID NO: 321, и VL, которая содержит SEQ ID NO: 320, или аминокислотную последовательность, идентичную им на 97-99%; или
    у) VH, которая содержит SEQ ID NO: 339, и VL, которая содержит SEQ ID NO: 338, или аминокис- 95 036314 лотную последовательность, идентичную им на 97-99%; или
    ф) VH, которая содержит SEQ ID NO: 357, и VL, которая содержит SEQ ID NO: 356, или аминокислотную последовательность, идентичную им на 97-99%; или
    х) VH, которая содержит SEQ ID NO: 375, и VL, которая содержит SEQ ID NO: 374, или аминокислотную последовательность, идентичную им на 97-99%.
  2. 2. Выделенное антитело или его фрагмент по п.1, где антитело содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 493.
  3. 3. Выделенное антитело или его фрагмент по п.1, где антитело содержит последовательность вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 494.
  4. 4. Выделенное антитело или его фрагмент по п.1, где антитело содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 493 и последовательность вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 494.
  5. 5. Выделенное антитело или его фрагмент по п.1, которое/который содержит:
    а) в вариабельной области тяжелой цепи CDR1 SEQ ID NO: 2; CDR2 SEQ ID NO: 3; CDR3 SEQ ID NO: 4; в вариабельной области легкой цепи CDR1 SEQ ID NO: 5; CDR2 SEQ ID NO: 6; и CDR3 SEQ ID NO: 7; или
    б) в вариабельной области тяжелой цепи CDR1 SEQ ID NO: 20; CDR2 SEQ ID NO: 21; CDR3 SEQ ID NO: 22; в вариабельной области легкой цепи CDR1 SEQ ID NO: 23; CDR2 SEQ ID NO: 24; и CDR3 SEQ ID NO: 25; или
    в) в вариабельной области тяжелой цепи CDR1 SEQ ID NO: 38; CDR2 SEQ ID NO: 39; CDR3 SEQ ID NO: 40; в вариабельной области легкой цепи CDR1 SEQ ID NO: 41; CDR2 SEQ ID NO: 42; и CDR3 SEQ ID NO: 43 или
    г) в вариабельной области тяжелой цепи CDR1 SEQ ID NO: 56; CDR2 SEQ ID NO: 57; CDR3 SEQ ID NO: 58; в вариабельной области легкой цепи CDR1 SEQ ID NO: 59; CDR2 SEQ ID NO: 60; и CDR3 SEQ ID NO: 61; или
    д) в вариабельной области тяжелой цепи CDR1 SEQ ID NO: 74; CDR2 SEQ ID NO: 75; CDR3 SEQ ID NO: 76; в вариабельной области легкой цепи CDR1 SEQ ID NO: 77; CDR2 SEQ ID NO: 78; и CDR3 SEQ ID NO: 79; или
    е) в вариабельной области тяжелой цепи CDR1 SEQ ID NO: 92; CDR2 SEQ ID NO: 93; CDR3 SEQ ID NO: 94; в вариабельной области легкой цепи CDR1 SEQ ID NO: 95; CDR2 SEQ ID NO: 96; и CDR3 SEQ ID NO: 97; или
    ж) в вариабельной области тяжелой цепи CDR1 SEQ ID NO: 110; CDR2 SEQ ID NO: 111; CDR3 SEQ ID NO: 112; в вариабельной области легкой цепи CDR1 SEQ ID NO: 113; CDR2 SEQ ID NO: 114; и CDR3 SEQ ID NO: 115; или
    з) в вариабельной области тяжелой цепи CDR1 SEQ ID NO: 128; CDR2 SEQ ID NO: 129; CDR3 SEQ ID NO: 130; в вариабельной области легкой цепи CDR1 SEQ ID NO: 131; CDR2 SEQ ID NO: 132; и CDR3 SEQ ID NO: 133; или
    и) в вариабельной области тяжелой цепи CDR1 SEQ ID NO: 146; CDR2 SEQ ID NO: 147; CDR3 SEQ ID NO: 148; в вариабельной области легкой цепи CDR1 SEQ ID NO: 149; CDR2 SEQ ID NO: 150; и CDR3 SEQ ID NO: 151; или
    к) в вариабельной области тяжелой цепи CDR1 SEQ ID NO: 164; CDR2 SEQ ID NO: 165; CDR3 SEQ ID NO: 166; в вариабельной области легкой цепи CDR1 SEQ ID NO: 167; CDR2 SEQ ID NO: 168; и CDR3 SEQ ID NO: 169; или
    л) в вариабельной области тяжелой цепи CDR1 SEQ ID NO: 182; CDR2 SEQ ID NO: 183; CDR3 SEQ ID NO: 184; в вариабельной области легкой цепи CDR1 SEQ ID NO: 185; CDR2 SEQ ID NO: 186; и CDR3 CDR3 SEQ ID NO: 187; или
    м) в вариабельной области тяжелой цепи CDR1 SEQ ID NO: 200; CDR2 SEQ ID NO: 201; CDR3 SEQ ID NO: 202; в вариабельной области легкой цепи CDR1 SEQ ID NO: 203; CDR2 SEQ ID NO: 204; и CDR3 SEQ ID NO: 205; или
    н) в вариабельной области тяжелой цепи CDR1 SEQ ID NO: 218; CDR2 SEQ ID NO: 219; CDR3 SEQ ID NO: 220; в вариабельной области легкой цепи CDR1 SEQ ID NO: 221; CDR2 SEQ ID NO: 222; и CDR3 SEQ ID NO: 223; или
    о) в вариабельной области тяжелой цепи CDR1 SEQ ID NO: 236; CDR2 SEQ ID NO: 237; CDR3 SEQ ID NO: 238; в вариабельной области легкой цепи CDR1 SEQ ID NO: 239; CDR2 SEQ ID NO: 240; и CDR3 SEQ ID NO: 241; или
    п) в вариабельной области тяжелой цепи CDR1 SEQ ID NO: 254; CDR2 SEQ ID NO: 255; CDR3 SEQ ID NO: 256; в вариабельной области легкой цепи CDR1 SEQ ID NO: 257; CDR2 SEQ ID NO: 258; и CDR3 SEQ ID NO: 259; или
    р) в вариабельной области тяжелой цепи CDR1 SEQ ID NO: 272; CDR2 SEQ ID NO: 273; CDR3 SEQ ID NO: 274; в вариабельной области легкой цепи CDR1 SEQ ID NO: 275; CDR2 SEQ ID NO: 276; и CDR3 SEQ ID NO: 277; или
    с) в вариабельной области тяжелой цепи CDR1 SEQ ID NO: 290; CDR2 SEQ ID NO: 291; CDR3 SEQ
    - 96 036314
    ID NO: 292; в вариабельной области легкой цепи CDR1 SEQ ID NO: 293; CDR2 SEQ ID NO: 294; и CDR3
    SEQ ID NO: 295; или
    т) в вариабельной области тяжелой цепи CDR1 SEQ ID NO: 308; CDR2 SEQ ID NO: 309; CDR3 SEQ
    ID NO: 310; в вариабельной области легкой цепи CDR1 SEQ ID NO: 311; CDR2 SEQ ID NO: 312; и CDR3
    SEQ ID NO: 313; или
    у) в вариабельной области тяжелой цепи CDR1 SEQ ID NO: 326; CDR2 SEQ ID NO: 327; CDR3 SEQ ID NO: 328; в вариабельной области легкой цепи CDR1 SEQ ID NO: 329; CDR2 SEQ ID NO: 330; и CDR3 SEQ ID NO: 331; или
    ф) в вариабельной области тяжелой цепи CDR1 SEQ ID NO: 344; CDR2 SEQ ID NO: 345; CDR3 SEQ ID NO: 346; в вариабельной области легкой цепи CDR1 SEQ ID NO: 347; CDR2 SEQ ID NO: 348; и CDR3 SEQ ID NO: 349; или
    х) в вариабельной области тяжелой цепи CDR1 SEQ ID NO: 362; CDR2 SEQ ID NO: 363; CDR3 SEQ ID NO: 364; в вариабельной области легкой цепи CDR1 SEQ ID NO: 365; CDR2 SEQ ID NO: 366; и CDR3 SEQ ID NO: 367.
  6. 6. Фрагмент антитела по одному из предыдущих пунктов, где фрагмент выбирается из группы, состоящей из Fab, F(ab2)', F(ab)2', scFv, VHH, VH, VL, dAb.
  7. 7. Фармацевтическая композиция для лечения рака, отличающегося экспрессией HER3, включающая антитело или фрагмент по любому из пп.1-6 и фармацевтически приемлемый носитель.
  8. 8. Композиция по п.7, дополнительно содержащая терапевтическое средство, выбранное из группы, состоящей из ингибитора HER1, ингибитора HER2, ингибитора HER3, ингибитора HER4, ингибитора mTOR и ингибитора PI3-кинαзы.
  9. 9. Композиция по п.7, дополнительно содержащая терапевтическое средство, выбранное из группы, состоящей из ингибитора HER1, выбранного из группы, состоящей из матузумаба (EMD72000), Erbitux®/цетуксимаба, Vertibix®/панитумумаба, mAb 806, нимотузумаба, Iressa®/гефитиниба, CI-1033 (PD183805), лапатиниба (GW-572016), Tykerb®/лαnатиниба дитозилата, Tarceva®/эрлотиниба-HCl (OSI774), PKI-166 и Tovok®; ингибитора HER2, выбранного из группы, состоящей из пертузумаба, трастузумаба, MM-111, нератиниба, лапатиниба или лапатиниба дитозилата/Tykerb ®; ингибитора HER3, выбранного из группы, состоящей из MM-121, MM-111, IB4C3, 2DID12 (фирма U3 Pharma AG), AMG888 (фирма Amgen), AV-203 (фирма Aveo), MEHD7945A (фирма Genentech) и малых молекул, которые ингибируют HER3; и ингибитора HER4.
  10. 10. Композиция по п.7, дополнительно содержащая терапевтическое средство, выбранное из группы, состоящей из ингибитора mTOR, выбранного из группы, состоящей из темсиролимуса/Torisel®, ридафоролимуса/дефоролимуса, AP23573, MK8669, эверолимуса/Affinitor®.
  11. 11. Композиция по п.8, дополнительно содержащая терапевтическое средство, выбранное из группы, состоящий из ингибитора PI3-кинαзы, выбранного из группы, состоящей из GDC 0941, BEZ235, BMK120 и BYL719.
  12. 12. Применение антитела или его фрагмента по любому из пп.1-6 для лечения рака, выбранного из группы, состоящей из колоректального рака, рака легкого, множественной миеломы, рака яичника, рака печени, рака желудка, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, острого миелолейкоза, хронического миелолейкоза, остеосаркомы, плоскоклеточной карциномы, опухоли оболочки периферических нервов, шванномы, рака головы и шеи, рака мочевого пузыря, эзофагеального рака, глиобластомы, светлоклеточной саркомы мягкой ткани, злокачественной мезотелиомы, нейрофиброматоза, рака почки и меланомы.
  13. 13. Применение антитела или его фрагмента по любому из пп.1-6 для лечения рака молочной железы.
  14. 14. Применение антитела или его фрагмента по любому из пп.1-6 для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения рака, где рак выбирается из группы, состоящей из рака молочной железы, колоректального рака, рака легкого, множественной миеломы, рака яичника, рака печени, рака желудка, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, острого миелолейкоза, хронического миелолейкоза, остеосаркомы, плоскоклеточной карциномы, опухоли оболочки периферических нервов, шванномы, рака головы и шеи, рака мочевого пузыря, эзофагеальный рака, глиобластомы, светлоклеточной саркомы мягкой ткани, злокачественной мезотелиомы, нейрофиброматоза, рака почки и меланомы.
  15. 15. Выделенное моноклональное антитело или его фрагмент к HER3-рецеnтору, содержащее в вариабельной области тяжелой цепи CDR1, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 128; CDR2, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 129; CDR3, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 130; в вариабельной области легкой цепи CDR1, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 131; CDR2, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 132; и CDR3 последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 133.
  16. 16. Выделенное антитело или его фрагмент к HER3-рецептору, включающее VH, содержащую SEQ ID NO: 141, и VL, содержащую SEQ ID NO: 140.
EA201300256A 2010-08-20 2011-08-22 Выделенные антитела к рецептору эпидермального фактора роста-3 (her3) и их фрагменты, фармацевтическая композиция, содержащая эти антитела и фрагменты, и их применение для лечения рака EA036314B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US37540810P 2010-08-20 2010-08-20
PCT/EP2011/064407 WO2012022814A1 (en) 2010-08-20 2011-08-22 Antibodies for epidermal growth factor receptor 3 (her3)

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201300256A1 EA201300256A1 (ru) 2013-08-30
EA036314B1 true EA036314B1 (ru) 2020-10-26

Family

ID=44630597

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201300256A EA036314B1 (ru) 2010-08-20 2011-08-22 Выделенные антитела к рецептору эпидермального фактора роста-3 (her3) и их фрагменты, фармацевтическая композиция, содержащая эти антитела и фрагменты, и их применение для лечения рака

Country Status (37)

Country Link
US (3) US8735551B2 (ru)
EP (1) EP2606070B1 (ru)
JP (4) JP6057896B2 (ru)
KR (1) KR102027011B1 (ru)
CN (2) CN105037552B (ru)
AU (1) AU2011290672B2 (ru)
BR (1) BR112013004012B1 (ru)
CA (1) CA2806637C (ru)
CL (2) CL2013000459A1 (ru)
CO (1) CO6680688A2 (ru)
CR (1) CR20130071A (ru)
CU (1) CU24094B1 (ru)
CY (1) CY1118761T1 (ru)
DK (1) DK2606070T3 (ru)
DO (1) DOP2013000044A (ru)
EA (1) EA036314B1 (ru)
ES (1) ES2620255T3 (ru)
GE (1) GEP201706605B (ru)
GT (1) GT201300046A (ru)
HR (1) HRP20170462T1 (ru)
HU (1) HUE031855T2 (ru)
IL (2) IL226712B (ru)
LT (1) LT2606070T (ru)
MA (1) MA34524B1 (ru)
ME (1) ME02637B (ru)
MX (1) MX2013002046A (ru)
MY (1) MY162825A (ru)
NI (1) NI201300023A (ru)
NZ (1) NZ607337A (ru)
PE (1) PE20140230A1 (ru)
PL (1) PL2606070T3 (ru)
PT (1) PT2606070T (ru)
RS (1) RS55930B1 (ru)
SG (1) SG187908A1 (ru)
SI (1) SI2606070T1 (ru)
UA (1) UA114883C2 (ru)
WO (1) WO2012022814A1 (ru)

Families Citing this family (71)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SI2516469T1 (sl) 2009-12-22 2016-05-31 Roche Glycart Ag Protitelesa proti her3 in uporabe le-teh
ME02637B (me) * 2010-08-20 2017-06-20 Novartis Ag Antitela za receptor 3 faktora rasta epiderma (her3)
CA2816520C (en) * 2010-11-01 2017-11-21 Symphogen A/S Anti-her3 antibodies and compositions
ITRM20100577A1 (it) * 2010-11-02 2012-05-03 Takis Srl Immunoterapia contro il recettore erbb-3
EP2699602B1 (en) * 2011-04-19 2017-03-01 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Bispecific anti-igf-1r and anti-erbb3 antibodies
CN103781800A (zh) * 2011-06-20 2014-05-07 协和发酵麒麟株式会社 抗erbB3抗体
SG11201400150TA (en) 2011-09-30 2014-03-28 Regeneron Pharma Anti-erbb3 antibodies and uses thereof
US9273143B2 (en) 2011-09-30 2016-03-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions comprising a combination of an anti-ErbB3 antibody and an anti-EGFR antibody
GB2504139B (en) * 2012-07-20 2014-12-31 Argen X Bv Antibodies to highly conserved targets produced by the immunisation of Camelidae species
CA2855298A1 (en) * 2011-11-09 2013-05-16 The Uab Research Foundation Her3 antibodies and uses thereof
BR112014012539B1 (pt) 2011-11-23 2022-12-20 Medimmune, Llc Anticorpo que se liga especificamente a her3, composição compreendendo o mesmo, e usos do anticorpo
TW201328707A (zh) * 2011-12-05 2013-07-16 Novartis Ag 針對表皮生長因子受體３（ｈｅｒ３）之區域ｉｉ之ｈｅｒ３抗體
CN104159924B (zh) * 2011-12-05 2018-03-16 诺华股份有限公司 表皮生长因子受体3(her3)的抗体
EP2817335A1 (en) * 2012-02-22 2014-12-31 U3 Pharma GmbH Combination of hb-egf binding protein and egfr inhibitor
CA2882594C (en) 2012-08-21 2019-07-16 Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. Antibodies to risperidone and use thereof
US9346890B2 (en) * 2012-10-25 2016-05-24 Sorrento Therapeutics, Inc. Antigen binding proteins that bind ErbB3
US9725511B2 (en) * 2012-11-08 2017-08-08 Hoffmann-La Roche Inc. Anti-HER3/HER4 antibodies binding to the beta-hairpin of HER3 and the beta-hairpin of HER4
EP2917243B1 (en) * 2012-11-08 2018-03-14 F.Hoffmann-La Roche Ag Her3 antigen binding proteins binding to the beta-hairpin of her3
CN102993305B (zh) * 2012-11-16 2015-05-13 上海赛伦生物技术有限公司 人源抗人表皮生长因子受体抗体及其编码基因与应用
AR094403A1 (es) 2013-01-11 2015-07-29 Hoffmann La Roche Terapia de combinación de anticuerpos anti-her3
EP3046468A4 (en) * 2013-09-18 2017-06-21 Sloan-kettering Institute For Cancer Research Methods and compositions for imaging disorders using polyspecific agents
WO2015048008A2 (en) 2013-09-24 2015-04-02 Medimmune, Llc Binding molecules specific for her3 and uses thereof
EP3049442A4 (en) 2013-09-26 2017-06-28 Costim Pharmaceuticals Inc. Methods for treating hematologic cancers
WO2015066543A1 (en) * 2013-11-01 2015-05-07 Board Of Regents, The University Of Texas System Targeting her2 and her3 with bispecific antibodies in cancerous cells
JOP20200094A1 (ar) 2014-01-24 2017-06-16 Dana Farber Cancer Inst Inc جزيئات جسم مضاد لـ pd-1 واستخداماتها
JOP20200096A1 (ar) 2014-01-31 2017-06-16 Children’S Medical Center Corp جزيئات جسم مضاد لـ tim-3 واستخداماتها
AU2015223566B2 (en) 2014-02-28 2020-10-08 Merus N.V. Antibodies that bind EGFR and ErbB3
DK3110849T3 (da) 2014-02-28 2020-11-23 Merus Nv Antistof, der binder erbb-2 og erbb-3
US20150259420A1 (en) 2014-03-14 2015-09-17 Novartis Ag Antibody molecules to lag-3 and uses thereof
WO2015157634A1 (en) 2014-04-11 2015-10-15 Kolltan Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbb antibodies and methods of use thereof
FR3020063A1 (fr) 2014-04-16 2015-10-23 Gamamabs Pharma Anticorps humain anti-her4
EP3143048B1 (en) * 2014-05-14 2019-08-28 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-her3 antibodies binding to the beta-hairpin of her3
JP6695812B2 (ja) * 2014-05-14 2020-05-20 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｈｅｒ３のベータヘアピン及びｈｅｒ２のドメインｉｉに結合するｈｅｒ３／ｈｅｒ２二重特異性抗体
ES2729202T3 (es) 2014-07-16 2019-10-30 Dana Farber Cancer Inst Inc Et Al Inhibición de HER3 en cánceres ováricos serosos de grado bajo
CN110642952B (zh) * 2014-08-14 2021-05-25 上海生物制品研究所有限责任公司 抗her3抗体、其制法及其应用
WO2016040882A1 (en) 2014-09-13 2016-03-17 Novartis Ag Combination therapies of egfr inhibitors
EP3200775B1 (en) * 2014-10-03 2019-11-20 Novartis AG Combination therapies
MA41044A (fr) 2014-10-08 2017-08-15 Novartis Ag Compositions et procédés d'utilisation pour une réponse immunitaire accrue et traitement contre le cancer
BR112017007379A2 (pt) 2014-10-14 2017-12-19 Dana Farber Cancer Inst Inc moléculas de anticorpo para pd-l1 e usos das mesmas
CN108367003B (zh) * 2014-12-12 2022-01-21 麻省总医院 乳腺癌脑转移的治疗
WO2016145102A1 (en) 2015-03-10 2016-09-15 Aduro Biotech, Inc. Compositions and methods for activating "stimulator of interferon gene" -dependent signalling
CA2991799A1 (en) 2015-07-15 2017-01-19 Zymeworks Inc. Drug-conjugated bi-specific antigen-binding constructs
TW201716439A (zh) 2015-07-20 2017-05-16 美國禮來大藥廠 Ｈｅｒ３抗體
EP3316902A1 (en) 2015-07-29 2018-05-09 Novartis AG Combination therapies comprising antibody molecules to tim-3
PL3317301T3 (pl) 2015-07-29 2021-11-15 Novartis Ag Terapie skojarzone zawierające cząsteczki przeciwciał przeciw lag-3
EP3328418A1 (en) 2015-07-29 2018-06-06 Novartis AG Combination therapies comprising antibody molecules to pd-1
WO2017030909A1 (en) * 2015-08-14 2017-02-23 Allergan, Inc. Heavy chain only antibodies to pdgf
LT3365373T (lt) 2015-10-23 2021-05-25 Merus N.V. Surišančios molekulės, kurios inhibuoja vėžio augimą
KR20180069070A (ko) 2015-11-03 2018-06-22 얀센 바이오테크 인코포레이티드 Tim-3과 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도
JP6629581B2 (ja) * 2015-11-30 2020-01-15 サントリーホールディングス株式会社 ヒドロキシチロソール含有茶飲料
TWI726942B (zh) 2015-11-30 2021-05-11 美商輝瑞股份有限公司 位點專一性ｈｅｒ２抗體藥物共軛體
KR101746152B1 (ko) * 2015-12-07 2017-06-13 주식회사 이수앱지스 ＥｒｂＢ3에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도
JP2018536682A (ja) 2015-12-11 2018-12-13 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． Ｅｇｆｒ及び／またはｅｒｂｂ３遮断に耐性のある腫瘍の成長を低減または防止するための方法
CN108495651A (zh) 2015-12-17 2018-09-04 诺华股份有限公司 抗pd-1的抗体分子及其用途
KR20180119570A (ko) 2016-03-15 2018-11-02 메리맥 파마슈티컬즈, 인크. 항-ErbB3 항체를 포함하는 병용 요법을 이용한 ER+, HER2-, HRG+ 유방암의 치료
US11098077B2 (en) 2016-07-05 2021-08-24 Chinook Therapeutics, Inc. Locked nucleic acid cyclic dinucleotide compounds and uses thereof
BR112019015915A2 (pt) 2017-02-28 2020-04-07 Daiichi Sankyo Co Ltd método para o tratamento de câncer de pulmão de células não pequenas resistentes a egfr-tki através da administração do conjugado de anticorpo anti-her3-fármaco
BR112019020507A2 (pt) 2017-03-31 2020-08-04 Merus N.V. agente de alvejamento de erbb-2 e um anticorpo bispecífico com locais de ligação de antígenos que ligam um epítopo em uma parte extracelular de erbb-2 e erbb-3 para tratamento de um indivíduo com um tumor positivo erbb-2, erbb-2 / erbb-3
EA201992063A1 (ru) 2017-03-31 2020-03-26 Мерус Н.В. СВЯЗЫВАЮЩИЕ ErbB-2 И ErbB-3 БИСПЕЦИФИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ КЛЕТОК, КОТОРЫЕ СОДЕРЖАТ СЛИТЫЙ ГЕН NRG-1
UY37695A (es) 2017-04-28 2018-11-30 Novartis Ag Compuesto dinucleótido cíclico bis 2’-5’-rr-(3’f-a)(3’f-a) y usos del mismo
EP3642240A1 (en) 2017-06-22 2020-04-29 Novartis AG Antibody molecules to cd73 and uses thereof
BR112020002695A2 (pt) 2017-08-09 2020-08-25 Merus N.V. anticorpos que se ligam à egfr e cmet
EP3692048A4 (en) 2017-08-30 2021-10-20 Beijing Xuanyi Pharmasciences Co., Ltd. CYCLIC DI-NUCLEOTIDES AS STIMULATORS OF INTERFERON GENE MODULATORS
JP7378394B2 (ja) 2017-11-03 2023-11-13 オーリジーン オンコロジー リミテッド Ｔｉｍ－３およびｐｄ－１経路の二重阻害剤
JP7378395B2 (ja) 2017-11-06 2023-11-13 オーリジーン オンコロジー リミテッド 免疫調節のためのコンジョイントセラピー
WO2019185164A1 (en) * 2018-03-29 2019-10-03 Hummingbird Bioscience Holdings Pte. Ltd. Her3 antigen-binding molecules
AR126019A1 (es) 2018-05-30 2023-09-06 Novartis Ag Anticuerpos frente a entpd2, terapias de combinación y métodos de uso de los anticuerpos y las terapias de combinación
CA3113207A1 (en) 2018-09-20 2020-03-26 Daiichi Sankyo Company, Limited Treatment of her3-mutated cancer by administration of anti-her3 antibody-drug conjugate
CN110760003A (zh) * 2019-09-10 2020-02-07 广东药科大学 一种抗her3单链抗体的制备方法
JP2022548881A (ja) 2019-09-18 2022-11-22 ノバルティス アーゲー Ｅｎｔｐｄ２抗体、組合せ療法並びに抗体及び組合せ療法を使用する方法
CN113788895B (zh) * 2021-10-14 2023-09-15 陕西健吉跃生物科技有限公司 一种兔多克隆抗体及其制备方法和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006087637A2 (en) * 2005-02-21 2006-08-24 Hellenic Pasteur Institute Anti her2/neu antibody
WO2007077028A2 (en) * 2005-12-30 2007-07-12 U3 Pharma Ag Antibodies directed to her-3 and uses thereof
WO2008019290A2 (en) * 2006-08-04 2008-02-14 Astrazeneca Ab Human antibodies to erbb 2

Family Cites Families (182)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
EP0092918B1 (en) 1982-04-22 1988-10-19 Imperial Chemical Industries Plc Continuous release formulations
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4708871A (en) 1983-03-08 1987-11-24 Commonwealth Serum Laboratories Commission Antigenically active amino acid sequences
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
EP0154316B1 (en) 1984-03-06 1989-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified lymphokine and production thereof
US5128326A (en) 1984-12-06 1992-07-07 Biomatrix, Inc. Drug delivery systems based on hyaluronans derivatives thereof and their salts and methods of producing same
US5374548A (en) 1986-05-02 1994-12-20 Genentech, Inc. Methods and compositions for the attachment of proteins to liposomes using a glycophospholipid anchor
MX9203291A (es) 1985-06-26 1992-08-01 Liposome Co Inc Metodo para acoplamiento de liposomas.
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4881175A (en) 1986-09-02 1989-11-14 Genex Corporation Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
US5013653A (en) 1987-03-20 1991-05-07 Creative Biomolecules, Inc. Product and process for introduction of a hinge region into a fusion protein to facilitate cleavage
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5132405A (en) 1987-05-21 1992-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
EP0623679B1 (en) 1987-05-21 2003-06-25 Micromet AG Targeted multifunctional proteins
US4880078A (en) 1987-06-29 1989-11-14 Honda Giken Kogyo Kabushiki Kaisha Exhaust muffler
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
US5336603A (en) 1987-10-02 1994-08-09 Genentech, Inc. CD4 adheson variants
US5476996A (en) 1988-06-14 1995-12-19 Lidak Pharmaceuticals Human immune system in non-human animal
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
KR900005995A (ko) 1988-10-31 1990-05-07 우메모또 요시마사 변형 인터류킨-2 및 그의 제조방법
JP2919890B2 (ja) 1988-11-11 1999-07-19 メディカル リサーチ カウンスル 単一ドメインリガンド、そのリガンドからなる受容体、その製造方法、ならびにそのリガンドおよび受容体の使用
CA2006596C (en) 1988-12-22 2000-09-05 Rika Ishikawa Chemically-modified g-csf
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
ATE92107T1 (de) 1989-04-29 1993-08-15 Delta Biotechnology Ltd N-terminale fragmente von menschliches serumalbumin enthaltenden fusionsproteinen.
US6291158B1 (en) 1989-05-16 2001-09-18 Scripps Research Institute Method for tapping the immunological repertoire
US5112946A (en) 1989-07-06 1992-05-12 Repligen Corporation Modified pf4 compositions and methods of use
FR2650598B1 (fr) 1989-08-03 1994-06-03 Rhone Poulenc Sante Derives de l'albumine a fonction therapeutique
WO1991005548A1 (en) 1989-10-10 1991-05-02 Pitman-Moore, Inc. Sustained release composition for macromolecular proteins
WO1991006570A1 (en) 1989-10-25 1991-05-16 The University Of Melbourne HYBRID Fc RECEPTOR MOLECULES
CA2071867A1 (en) 1989-11-06 1991-05-07 Edith Mathiowitz Method for producing protein microspheres
US5183884A (en) 1989-12-01 1993-02-02 United States Of America Dna segment encoding a gene for a receptor related to the epidermal growth factor receptor
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
DE69133566T2 (de) 1990-01-12 2007-12-06 Amgen Fremont Inc. Bildung von xenogenen Antikörpern
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US5349053A (en) 1990-06-01 1994-09-20 Protein Design Labs, Inc. Chimeric ligand/immunoglobulin molecules and their uses
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
KR100272077B1 (ko) 1990-08-29 2000-11-15 젠팜인터내셔날,인코포레이티드 이종 항체를 생산할 수 있는 전이유전자를 가진 인간이외의 동물
DE69123241T2 (de) 1990-12-14 1997-04-17 Cell Genesys Inc Chimärische ketten zur transduktion von rezeptorverbundenen signalwegen
CA2109528A1 (en) 1991-05-01 1992-11-02 Gregory A. Prince A method for treating infectious respiratory diseases
DK0616640T3 (da) 1991-12-02 2004-12-20 Medical Res Council Fremstilling af anti-selv antistoffer fra repertoirer af antistofsegmenter og fremvist på fag
ES2341666T3 (es) 1991-12-02 2010-06-24 Medimmune Limited Produccion de autoanticuerpos de repertorios de segmentos de anticue rpos expresados en la superficie de fagos.
CA2124967C (en) 1991-12-17 2008-04-08 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5622929A (en) 1992-01-23 1997-04-22 Bristol-Myers Squibb Company Thioether conjugates
FR2686901A1 (fr) 1992-01-31 1993-08-06 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides antithrombotiques, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
US5912015A (en) 1992-03-12 1999-06-15 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Modulated release from biocompatible polymers
US5447851B1 (en) 1992-04-02 1999-07-06 Univ Texas System Board Of Dna encoding a chimeric polypeptide comprising the extracellular domain of tnf receptor fused to igg vectors and host cells
EP0640094A1 (en) 1992-04-24 1995-03-01 The Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
WO1994004678A1 (en) 1992-08-21 1994-03-03 Casterman Cecile Immunoglobulins devoid of light chains
US6765087B1 (en) 1992-08-21 2004-07-20 Vrije Universiteit Brussel Immunoglobulins devoid of light chains
US5958708A (en) 1992-09-25 1999-09-28 Novartis Corporation Reshaped monoclonal antibodies against an immunoglobulin isotype
CA2103323A1 (en) 1992-11-24 1994-05-25 Gregory D. Plowman Her4 human receptor tyrosine kinase
US5934272A (en) 1993-01-29 1999-08-10 Aradigm Corporation Device and method of creating aerosolized mist of respiratory drug
EP0754225A4 (en) 1993-04-26 2001-01-31 Genpharm Int HETEROLOGIC ANTIBODY-PRODUCING TRANSGENIC NON-HUMAN ANIMALS
ES2162863T3 (es) 1993-04-29 2002-01-16 Unilever Nv Produccion de anticuerpos o fragmentos (funcionalizados) de los mismos derivados de inmunoglobulinas de cadena pesada de camelidae.
AU691811B2 (en) 1993-06-16 1998-05-28 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
SE9400088D0 (sv) 1994-01-14 1994-01-14 Kabi Pharmacia Ab Bacterial receptor structures
US5834252A (en) 1995-04-18 1998-11-10 Glaxo Group Limited End-complementary polymerase reaction
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US5837458A (en) 1994-02-17 1998-11-17 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
CN1117155C (zh) 1994-07-29 2003-08-06 史密丝克莱恩比彻姆有限公司 新型化合物
US6132764A (en) 1994-08-05 2000-10-17 Targesome, Inc. Targeted polymerized liposome diagnostic and treatment agents
ATE252894T1 (de) 1995-01-05 2003-11-15 Univ Michigan Oberflächen-modifizierte nanopartikel und verfahren für ihre herstellung und verwendung
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6019968A (en) 1995-04-14 2000-02-01 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Dispersible antibody compositions and methods for their preparation and use
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
EP0850051A2 (en) 1995-08-31 1998-07-01 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Composition for sustained release of an agent
AU2063197A (en) 1996-03-04 1997-09-22 Massachusetts Institute Of Technology Materials and methods for enhancing cellular internalization
CA2249195A1 (en) 1996-03-18 1997-09-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobin-like domains with increased half lives
US5855913A (en) 1997-01-16 1999-01-05 Massachusetts Instite Of Technology Particles incorporating surfactants for pulmonary drug delivery
US5874064A (en) 1996-05-24 1999-02-23 Massachusetts Institute Of Technology Aerodynamically light particles for pulmonary drug delivery
US5985309A (en) 1996-05-24 1999-11-16 Massachusetts Institute Of Technology Preparation of particles for inhalation
US6056973A (en) 1996-10-11 2000-05-02 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic liposome composition and method of preparation
WO1998023289A1 (en) 1996-11-27 1998-06-04 The General Hospital Corporation MODULATION OF IgG BINDING TO FcRn
ATE287257T1 (de) 1997-01-16 2005-02-15 Massachusetts Inst Technology Zubereitung von partikelhaltigen arzneimitteln zur inhalation
US6136558A (en) 1997-02-10 2000-10-24 Genentech, Inc. Heregulin variants
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
JP2002512624A (ja) 1997-05-21 2002-04-23 バイオベーション リミテッド 非免疫原性タンパク質の製造方法
AU736707B2 (en) 1997-06-11 2001-08-02 Anaphore, Inc. Trimerising module
US6673901B2 (en) 1997-06-12 2004-01-06 Research Corporation Technologies, Inc. Artificial antibody polypeptides
US5989463A (en) 1997-09-24 1999-11-23 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Methods for fabricating polymer-based controlled release devices
DE19742706B4 (de) 1997-09-26 2013-07-25 Pieris Proteolab Ag Lipocalinmuteine
AU9805398A (en) 1997-10-15 1999-05-03 Children's Medical Center Corporation Novel human egf receptors and use thereof
GB9722131D0 (en) 1997-10-20 1997-12-17 Medical Res Council Method
SE512663C2 (sv) 1997-10-23 2000-04-17 Biogram Ab Inkapslingsförfarande för aktiv substans i en bionedbrytbar polymer
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
ATE458007T1 (de) 1998-04-20 2010-03-15 Glycart Biotechnology Ag Glykosylierungs-engineering von antikörpern zur verbesserung der antikörperabhängigen zellvermittelten zytotoxizität
JP2002518432A (ja) 1998-06-24 2002-06-25 アドバンスト インハレーション リサーチ，インコーポレイテッド 吸入器から放出される大多孔性粒子
US6818418B1 (en) 1998-12-10 2004-11-16 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
ES2694002T3 (es) 1999-01-15 2018-12-17 Genentech, Inc. Polipéptido que comprende una región Fc de IgG1 humana variante
CA2704600C (en) 1999-04-09 2016-10-25 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. A method for producing antibodies with increased adcc activity
DE19932688B4 (de) 1999-07-13 2009-10-08 Scil Proteins Gmbh Design von Beta-Faltblatt-Proteinen des gamma-II-kristallins antikörperähnlichen
DE60041119D1 (de) 1999-07-20 2009-01-29 Morphosys Ag Verfahren zur präsentation von (poly)peptiden/proteinen auf bakteriophagenpartikeln via disulfidbindungen
EP1792991A1 (en) 1999-08-24 2007-06-06 Medarex, Inc. Human CTLA-4 antibodies and their uses
AU2001259063A1 (en) 2000-04-12 2001-10-30 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
EP1328626B1 (en) 2000-05-26 2013-04-17 National Research Council Of Canada Single-domain brain-targeting antibody fragments derived from llama antibodies
US7041870B2 (en) 2000-11-30 2006-05-09 Medarex, Inc. Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies
ES2705016T3 (es) 2001-02-19 2019-03-21 Novartis Int Pharmaceutical Ag Derivado de rapamicina para el tratamiento de cáncer de pulmón
US20050048512A1 (en) 2001-04-26 2005-03-03 Avidia Research Institute Combinatorial libraries of monomer domains
US20050053973A1 (en) 2001-04-26 2005-03-10 Avidia Research Institute Novel proteins with targeted binding
US20040175756A1 (en) 2001-04-26 2004-09-09 Avidia Research Institute Methods for using combinatorial libraries of monomer domains
EP1421203A4 (en) 2001-05-17 2005-06-01 Diversa Corp NEW ANTIGEN-BINDING MOLECULES FOR THERAPEUTIC, DIAGNOSTIC, PROPHYLACTIC, ENZYMATIC, INDUSTRIAL AND AGRICULTURAL APPLICATIONS AND METHOD FOR THE PRODUCTION AND SCREENING THEREOF
DK1399484T3 (da) 2001-06-28 2010-11-08 Domantis Ltd Dobbelt-specifik ligand og anvendelse af denne
ITMI20011483A1 (it) 2001-07-11 2003-01-11 Res & Innovation Soc Coop A R Uso di composti come antagonisti funzionali ai recettori centrali deicannabinoidi
US7125680B2 (en) 2001-07-27 2006-10-24 The Regents Of The University Of California Methods and materials for characterizing and modulating interaction between heregulin and HER3
EP1283053A1 (en) 2001-08-09 2003-02-12 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Inhibitors of HER3 activity
HUP0600342A3 (en) 2001-10-25 2011-03-28 Genentech Inc Glycoprotein compositions
WO2003048731A2 (en) 2001-12-03 2003-06-12 Abgenix, Inc. Antibody categorization based on binding characteristics
CA2472341C (en) 2002-02-01 2011-06-21 Ariad Gene Therapeutics, Inc. Phosphorus-containing compounds & uses thereof
US20030157579A1 (en) 2002-02-14 2003-08-21 Kalobios, Inc. Molecular sensors activated by disinhibition
US7335478B2 (en) 2002-04-18 2008-02-26 Kalobios Pharmaceuticals, Inc. Reactivation-based molecular interaction sensors
WO2003074679A2 (en) 2002-03-01 2003-09-12 Xencor Antibody optimization
DE60305919T2 (de) 2002-06-28 2007-01-18 Domantis Limited, Cambridge Dual-specifische liganden mit erhöhter halbwertszeit
WO2004041865A2 (en) 2002-11-08 2004-05-21 Ablynx N.V. Stabilized single domain antibodies
CA2511910A1 (en) 2002-12-27 2004-07-15 Domantis Limited Dual specific single domain antibodies specific for a ligand and for the receptor of the ligand
WO2004072266A2 (en) 2003-02-13 2004-08-26 Kalobios Inc. Antibody affinity engineering by serial epitope-guided complementarity replacement
EP2357237A1 (en) 2003-05-14 2011-08-17 Domantis Limited A process for recovering polypeptides that unfold reversibly from a polypeptide repertoire
DE10324447A1 (de) 2003-05-28 2004-12-30 Scil Proteins Gmbh Generierung künstlicher Bindungsproteine auf der Grundlage von Ubiquitin
JP5087274B2 (ja) 2003-06-30 2012-12-05 ドマンティス リミテッド ポリペプチド
US7399865B2 (en) 2003-09-15 2008-07-15 Wyeth Protein tyrosine kinase enzyme inhibitors
JP4782700B2 (ja) 2004-01-20 2011-09-28 カロバイオス ファーマシューティカルズ インコーポレイティッド 最低限必須な結合決定基を用いた抗体特異性の移入
US20060008844A1 (en) 2004-06-17 2006-01-12 Avidia Research Institute c-Met kinase binding proteins
AU2005325801A1 (en) 2005-01-31 2006-08-03 Ablynx N.V. Method for generating variable domain sequences of heavy chain antibodies
GB0510390D0 (en) 2005-05-20 2005-06-29 Novartis Ag Organic compounds
EA200800766A1 (ru) 2005-09-07 2008-06-30 Лаборатуар Сероно С.А. Ингибиторы pi3k для лечения эндометриоза
JP2009506790A (ja) 2005-09-07 2009-02-19 メディミューン，エルエルシー 毒素とコンジュゲートしたｅｐｈ受容体抗体
KR20080090406A (ko) 2005-11-28 2008-10-08 젠맵 에이/에스 재조합 １가 항체 및 그의 제조 방법
JP2009539412A (ja) 2006-06-12 2009-11-19 レセプター バイオロジックス， インコーポレイテッド 汎細胞表面レセプター特異的な治療薬
DK2056874T3 (da) * 2006-08-21 2012-10-15 Hoffmann La Roche Tumorterapi med et anti-vegf-antistof
US7825127B2 (en) 2006-12-28 2010-11-02 Takeda Pharmaceutical Company, Limited Method for treating cancer
WO2008100624A2 (en) 2007-02-16 2008-08-21 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Antibodies against erbb3 and uses thereof
WO2008109440A2 (en) 2007-03-02 2008-09-12 Genentech, Inc. Predicting response to a her dimerisation inhibitor based on low her3 expression
US20080245375A1 (en) 2007-04-05 2008-10-09 Medtronic Vascular, Inc. Benign Prostatic Hyperplasia Treatments
AU2008298948B2 (en) 2007-09-12 2014-09-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Combinations of phosphoinositide 3-kinase inhibitor compounds and chemotherapeutic agents, and methods of use
TW200932257A (en) 2007-10-16 2009-08-01 Receptor Biologix Inc Compositions comprising optimized Her1 and Her3 multimers and methods of use thereof
CN101909631B (zh) 2007-10-25 2012-09-12 健泰科生物技术公司 制备噻吩并嘧啶化合物的方法
UY31800A (es) 2008-05-05 2009-11-10 Smithkline Beckman Corp Metodo de tratamiento de cancer usando un inhibidor de cmet y axl y un inhibidor de erbb
CA2759792A1 (en) 2009-04-29 2010-11-04 Trellis Bioscience, Inc. Improved antibodies immunoreactive with heregulin-coupled her3
CN103002912A (zh) 2009-08-21 2013-03-27 梅里麦克制药股份有限公司 针对ErbB3的胞外结构域的抗体及其用途
WO2011036911A1 (ja) 2009-09-25 2011-03-31 シャープ株式会社 液晶表示装置
CA2777242A1 (en) 2009-10-14 2011-04-21 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Bispecific binding agents targeting igf-1r and erbb3 signalling and uses thereof
CN102812045B (zh) 2009-11-13 2018-04-13 第一三共欧洲有限公司 用于治疗或预防人表皮生长因子受体‑3(her‑3)相关疾病的材料和方法
SI2516469T1 (sl) 2009-12-22 2016-05-31 Roche Glycart Ag Protitelesa proti her3 in uporabe le-teh
CN102892779B (zh) 2010-02-18 2016-12-21 基因泰克公司 神经调节蛋白拮抗剂及其在治疗癌症中的用途
DK2544680T3 (en) 2010-03-11 2015-04-27 Merrimack Pharmaceuticals Inc USE OF ErbB3 INHIBITORS IN TREATMENT OF TRIPLE-NEGATIVE BREAST CANCER
BR112012025730B1 (pt) 2010-04-09 2020-12-08 Aveo Pharmaceuticals, Inc anticorpo isolado que se liga ao erbb3 humano, seus usos, seu processo de produção e vetor de expressão
US20130108547A1 (en) 2010-05-13 2013-05-02 Fox Chase Cancer Center Recombinantly Produced Antibodies Targeting ErbB Signaling Molecules and Methods of Use Thereof for the Diagnosis and Treatment of Disease
KR20130080790A (ko) 2010-05-20 2013-07-15 아블린쓰 엔.브이. Ｈｅｒ３와 관련된 생물학적 물질들
UY33492A (es) 2010-07-09 2012-01-31 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
WO2012019024A2 (en) 2010-08-04 2012-02-09 Immunogen, Inc. Her3-binding molecules and immunoconjugates thereof
CA2815154A1 (en) 2010-08-06 2012-02-09 U3 Pharma Gmbh Use of her3 binding agents in prostate treatment
ME02637B (me) 2010-08-20 2017-06-20 Novartis Ag Antitela za receptor 3 faktora rasta epiderma (her3)
TW201302793A (zh) 2010-09-03 2013-01-16 Glaxo Group Ltd 新穎之抗原結合蛋白
US9155802B2 (en) 2010-11-01 2015-10-13 Symphogen A/S Pan-HER antibody composition
ITRM20100577A1 (it) 2010-11-02 2012-05-03 Takis Srl Immunoterapia contro il recettore erbb-3
AR083705A1 (es) 2010-11-04 2013-03-13 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
PT2707391T (pt) 2011-05-13 2018-02-06 Inserm Institut National De La Santa© Et De La Rech Ma©Dicale Anticorpos contra her3
EP2736928B1 (en) 2011-07-28 2019-01-09 i2 Pharmaceuticals, Inc. Sur-binding proteins against erbb3
CN104159924B (zh) 2011-12-05 2018-03-16 诺华股份有限公司 表皮生长因子受体3(her3)的抗体
TW201328707A (zh) 2011-12-05 2013-07-16 Novartis Ag 針對表皮生長因子受體３（ｈｅｒ３）之區域ｉｉ之ｈｅｒ３抗體

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006087637A2 (en) * 2005-02-21 2006-08-24 Hellenic Pasteur Institute Anti her2/neu antibody
WO2007077028A2 (en) * 2005-12-30 2007-07-12 U3 Pharma Ag Antibodies directed to her-3 and uses thereof
WO2008019290A2 (en) * 2006-08-04 2008-02-14 Astrazeneca Ab Human antibodies to erbb 2

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BURGESS A W , ET AL: "An open-and-shut case? Recent insights into the activation of EGF/ErbB receptors.", MOLECULAR CELL, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 12, no. 3, 1 September 2003 (2003-09-01), AMSTERDAM, NL, pages 541 - 552, XP002396190, ISSN: 1097-2765, DOI: 10.1016/S1097-2765(03)00350-2 *
CHO HYUN-SOO, LEAHY D J: "Structure of the extracellular region of HER3 reveals an interdomain tether", SCIENCE, AMERICAN ASSOCIATION FOR THE ADVANCEMENT OF SCIENCE, US, vol. 297, no. 5585, 23 August 2002 (2002-08-23), US, pages 1330 - 1333, XP002662196, ISSN: 0036-8075, DOI: 10.1126/science.1074611 *
FRANKLIN M C,ET AL: "Insights into ErbB signaling from the structure of the ErbB2-pertuzumab complex", CANCER CELL, CELL PRESS, US, vol. 5, no. 4, 1 April 2004 (2004-04-01), US, pages 317 - 328, XP002372929, ISSN: 1535-6108, DOI: 10.1016/S1535-6108(04)00083-2 *
KIAN KANI, EUISUN PARK, RALF LANDGRAF: "The extracellular domains of ErbB3 retain high ligand binding affinity at endosome pH and in the locked conformation", BIOCHEMISTRY, vol. 44, no. 48, 1 January 2005 (2005-01-01), pages 15842 - 15857, XP002662197, ISSN: 0006-2960, DOI: 10.1021/BI0515220 *
MCKAY BROWN, MARVIN B RITTENBERG, CHING CHEN, VISTORIA A ROBERTS: "Tolerance to single, but not multiple, amino acid replacements in antibody V-H CDR2: A means of minimizing B cell wastage from somatic hypermutation?", THE JOURNAL OF IMMUNOLOGY, AMERICAN ASSOCIATION OF IMMUNOLOGISTS, US, vol. 156, no. 9, 1 January 1996 (1996-01-01), US, pages 3285 - 3291, XP002649029, ISSN: 0022-1767 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP6057896B2 (ja) 2017-01-11
EP2606070B1 (en) 2016-12-21
US20170166653A1 (en) 2017-06-15
KR102027011B1 (ko) 2019-09-30
CL2014002750A1 (es) 2015-04-06
CL2013000459A1 (es) 2014-01-31
DOP2013000044A (es) 2013-05-31
PT2606070T (pt) 2017-03-31
BR112013004012A2 (pt) 2016-06-28
US20190194347A1 (en) 2019-06-27
MA34524B1 (fr) 2013-09-02
EP2606070A1 (en) 2013-06-26
CO6680688A2 (es) 2013-05-31
CU20130023A7 (es) 2013-05-31
CA2806637A1 (en) 2012-02-23
GT201300046A (es) 2015-06-02
JP2017019815A (ja) 2017-01-26
HRP20170462T1 (hr) 2017-05-19
CN105037552B (zh) 2019-03-29
SG187908A1 (en) 2013-03-28
US10077317B2 (en) 2018-09-18
MX2013002046A (es) 2013-04-03
PL2606070T4 (pl) 2017-06-30
LT2606070T (lt) 2017-04-10
CN103080134A (zh) 2013-05-01
CY1118761T1 (el) 2017-07-12
US8735551B2 (en) 2014-05-27
MY162825A (en) 2017-07-31
JP6770944B2 (ja) 2020-10-21
US20120107306A1 (en) 2012-05-03
HUE031855T2 (en) 2017-08-28
WO2012022814A1 (en) 2012-02-23
CA2806637C (en) 2020-08-25
CR20130071A (es) 2013-03-13
AU2011290672B2 (en) 2015-07-09
GEP201706605B (en) 2017-01-25
BR112013004012B1 (pt) 2021-03-23
SI2606070T1 (sl) 2017-04-26
JP6771002B2 (ja) 2020-10-21
KR20130108304A (ko) 2013-10-02
CN105037552A (zh) 2015-11-11
CU24094B1 (es) 2015-04-29
EA201300256A1 (ru) 2013-08-30
PE20140230A1 (es) 2014-02-26
PL2606070T3 (pl) 2017-06-30
NZ607337A (en) 2015-06-26
NI201300023A (es) 2013-04-15
UA114883C2 (uk) 2017-08-28
AU2011290672A1 (en) 2013-03-21
ES2620255T3 (es) 2017-06-28
IL261916A (en) 2018-10-31
DK2606070T3 (en) 2017-03-27
JP2018090590A (ja) 2018-06-14
RS55930B1 (sr) 2017-09-29
JP2013537546A (ja) 2013-10-03
JP6416161B2 (ja) 2018-10-31
JP2019001791A (ja) 2019-01-10
CN103080134B (zh) 2015-11-25
IL226712B (en) 2018-10-31
ME02637B (me) 2017-06-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6771002B2 (ja) 上皮細胞増殖因子受容体３（ｈｅｒ３）に対する抗体
US20210008201A1 (en) Antibodies for epidermal growth factor receptor 3 (her3)
US20130273029A1 (en) Antibodies for epidermal growth factor receptor 3 (her3) directed to domain ii of her3
JP2015500830A (ja) 上皮細胞増殖因子受容体３（ｈｅｒ３）のドメインｉｉｉおよびドメインｉｖに対するｈｅｒ３の抗体

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KG MD TJ TM