KR102027011B1 - 표피 성장 인자 수용체 3 (ｈｅｒ3)에 대한 항체 - Google Patents

표피 성장 인자 수용체 3 (ｈｅｒ3)에 대한 항체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 HER 수용체의 입체형태적 에피토프를 표적화하는 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 HER3 수용체의 입체형태적 에피토프를 표적화하는 항체 또는 그의 단편 및 이를 사용하는 조성물 및 방법에 관한 것이다.

Description

표피 성장 인자 수용체 3 (ＨＥＲ3)에 대한 항체{ANTIBODIES FOR EPIDERMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR 3 (HER3)}
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 2010년 8월 20일에 출원된 미국 가출원 번호 61/375,408을 우선권 주장하며, 그의 내용은 전체가 본원에 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 수용체, 예를 들어 HER3 수용체의 HER 패밀리와 상호작용하는 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다. 특히, 이는 도메인 2 및 4 둘 다로부터의 잔기를 포함하는 HER 수용체 (예를 들어, HER3)의 입체형태적 에피토프를 인식하여 리간드-의존성 및 리간드-비의존성 신호 전달을 둘 다 억제하는 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다. 본 발명은 또한 신호 전달의 리간드-유도된 활성화를 방지하면서, 리간드 (예를 들어, 뉴레귤린)와 공동으로 HER 수용체 (예를 들어, HER3 수용체)에 결합하는 항체 및 그의 단편에 관한 것이다.
인간 표피 성장 인자 수용체 3 (ErbB3, 또한 HER3으로 공지됨)은 수용체 단백질 티로신 키나제이고, 수용체 단백질 티로신 키나제의 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 서브패밀리에 속하며, 이는 또한 EGFR (HER1, ErbB1), HER2 (ErbB2, Neu) 및 HER4 (ErbB4)를 포함한다 (문헌 [Plowman et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:4905-4909; Kraus et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:9193-9197; 및 Kraus et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:2900-2904]). 원형 표피 성장 인자 수용체와 마찬가지로, 막횡단 수용체 HER3은 세포외 리간드-결합 도메인 (ECD), ECD 내에 이량체화 도메인, 막횡단 도메인, 세포내 단백질 티로신 키나제-유사 도메인 (TKD) 및 C-말단 인산화 도메인으로 이루어진다. 다른 HER 패밀리 구성원과는 달리, HER3의 키나제 도메인은 매우 낮은 내인성 키나제 활성을 나타낸다.
리간드 뉴레귤린 1 (NRG) 또는 뉴레귤린 2는 HER3의 세포외 도메인에 결합하고, 다른 이량체화 파트너, 예컨대 HER2와의 이량체화를 촉진시켜 수용체-매개 신호전달 경로를 활성화시킨다. 이종이량체화는 HER3의 세포내 도메인의 활성화 및 인산전이로 이어지고, 신호 다양화 뿐만 아니라 신호 증폭을 위한 수단이다. 또한, HER3 이종이량체화는 또한 활성화 리간드의 부재 하에 일어날 수 있으며, 이것이 통상적으로 지칭되는 리간드-비의존성 HER3 활성화이다. 예를 들어, HER2가 유전자 증폭의 결과로서 높은 수준으로 발현되는 경우 (예를 들어, 유방, 폐, 난소 또는 위 암에서) 자발적 HER2/HER3 이량체가 형성될 수 있다. 이러한 상황에서 HER2/HER3은 가장 활성인 ErbB 신호전달 이량체인 것으로 여겨지며, 이에 따라 고도로 형질전환된다.
증가된 HER3은 몇몇 유형의 암, 예컨대 유방, 폐, 위장 및 췌장 암에서 발견되었다. 흥미롭게도, HER2/HER3의 발현과 비-침습 단계로부터 침습 단계로의 진행 사이의 상관관계가 밝혀졌다 (문헌 [Alimandi et al., (1995) Oncogene 10:1813-1821; DeFazio et al., (2000) Cancer 87:487-498; Naidu et al., (1988) Br. J. Cancer 78:1385-1390]). 따라서, HER3 매개 신호전달을 방해하는 작용제가 요망된다.
발명의 개요
본 발명은 HER3의 도메인 2 및 도메인 4 내의 아미노산 잔기를 포함하는 HER3 수용체의 입체형태적 에피토프에 결합하는 항원 결합 단백질 (예를 들어, 항체 또는 그의 단편)의 발견을 기반으로 한다. 항체 또는 그의 단편의 도메인 2 및 도메인 4와의 이러한 결합은 HER3 수용체를 불활성 또는 폐쇄된 입체형태로 안정화시켜 HER3 활성화를 억제한다. 놀랍게도, 항체 또는 그의 단편의 이러한 입체형태적 에피토프와의 결합은 리간드-의존성 (예를 들어, 뉴레귤린) 및 리간드-비의존성 HER3 신호전달 경로를 둘 다 차단한다. 또한, 리간드 유도된 신호전달의 항체 매개 억제는 리간드 결합을 차단하지 않지 않으면서 (즉, 리간드 및 항체가 둘 다 HER3에 결합할 수 있음) 발생하며, 이는 아마도 HER3이 활성화에 필요한 입체형태적 재배열을 거치지 않을 수 있기 때문일 것이다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 불활성 상태의 HER 수용체에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 단편이며, 여기서 상기 항체 또는 그의 단편은 리간드-의존성 및 리간드-비의존성 신호 전달을 둘 다 차단하는 것인 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 HER 수용체를 불활성 상태로 안정화시킨다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 HER 수용체의 입체형태적 에피토프를 인식하는 단리된 항체 또는 그의 단편이며, 여기서 상기 입체형태적 에피토프는 HER 수용체의 도메인 2 및 도메인 4 내의 아미노산 잔기를 포함하고, 상기 항체 또는 그의 단편은 리간드-의존성 및 리간드-비의존성 신호 전달을 둘 다 차단하는 것인 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 불활성 상태의 HER 수용체에 결합한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 활성 상태의 HER 수용체에 결합하고, 이를 불활성 상태로 유도한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 HER 수용체를 불활성 상태로 안정화시킨다. HER 수용체는 HER1, HER2, HER3 및 HER4로 이루어진 군으로부터 선택된다. 항체는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 및 합성 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 HER 수용체의 입체형태적 에피토프를 인식하는 단리된 항체 또는 그의 단편이며, 여기서 상기 입체형태적 에피토프는 HER 수용체의 도메인 2 및 도메인 4 내의 아미노산 잔기를 포함하고, 상기 항체의 결합은 HER 수용체를 불활성 상태로 안정화시키고, HER 리간드는 HER 수용체 상의 리간드 결합 부위에 공동으로 결합할 수 있는 것인 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 리간드 결합 부위에 대한 HER 리간드 결합은 HER 수용체에서의 활성 상태로의 입체형태적 변화를 유도하는데 실패한다. 또 다른 실시양태에서, 리간드 결합 부위에 대한 HER 리간드 결합은 신호 전달을 활성화시키는데 실패한다.
한 실시양태에서, HER 리간드는 뉴레귤린 1 (NRG), 뉴레귤린 2, 뉴레귤린 3, 뉴레귤린 4, 베타셀룰린, 헤파린-결합 표피 성장 인자, 에피레귤린, 표피 성장 인자, 암피레귤린 및 형질전환 성장 인자 알파로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 HER 수용체의 입체형태적 에피토프를 인식하는 단리된 항체 또는 그의 단편이며, 여기서 상기 입체형태적 에피토프는 HER 수용체의 도메인 2 및 도메인 4 내의 아미노산 잔기를 포함하고, 상기 항체의 결합은 HER 수용체를 불활성 상태로 안정화시켜, HER 수용체가 보조수용체와 이량체화되어 수용체-수용체 복합체를 형성하는데 실패하도록 하는 것인 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다. 수용체-수용체 복합체 형성의 실패는 리간드-의존성 및 리간드-비의존성 신호 전달 둘 다의 활성화를 방지한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 HER 수용체의 입체형태적 에피토프를 인식하는 단리된 항체 또는 그의 단편이며, 여기서 상기 입체형태적 에피토프는 HER 수용체의 도메인 2 및 도메인 4 내의 아미노산 잔기를 포함하고, 상기 항체의 HER 수용체에 대한 결합은 보조수용체와 이량체화되어 불활성 수용체-수용체 복합체를 형성하도록 하는 것인 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다. 불활성 수용체-수용체 복합체의 형성은 리간드-비의존성 신호 전달의 활성화를 방지한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 HER3 수용체의 불활성 입체형태에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 단편이며, 여기서 상기 항체는 리간드-의존성 및 리간드-비의존성 신호 전달을 둘 다 차단하는 것인 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 HER3 수용체를 불활성 상태로 안정화시킨다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 HER3 수용체의 입체형태적 에피토프를 인식하는 단리된 항체 또는 그의 단편이며, 여기서 상기 입체형태적 에피토프는 HER3 수용체의 도메인 2 및 도메인 4 내의 아미노산 잔기를 포함하고, 상기 항체 또는 그의 단편은 리간드-의존성 및 리간드-비의존성 신호 전달을 둘 다 차단하는 것인 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 불활성 상태의 HER3 수용체에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 HER3 수용체를 불활성 상태로 안정화시킨다. 항체는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 및 합성 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 HER3 수용체의 입체형태적 에피토프를 인식하는 단리된 항체 또는 그의 단편이며, 여기서 상기 입체형태적 에피토프는 HER3 수용체의 도메인 2 및 도메인 4 내의 아미노산 잔기를 포함하고, 상기 항체의 결합은 HER3 수용체를 불활성 상태로 안정화시키고, HER3 리간드는 HER3 수용체 상의 리간드 결합 부위 공동으로 결합할 수 있다. 한 실시양태에서, 리간드 결합 부위에 대한 HER3 리간드 결합은 HER3 수용체에서 활성 상태로 입체형태적 변화를 유도하는데 실패한다. 또 다른 실시양태에서, 리간드 결합 부위에 대한 HER3 리간드 결합은 신호 전달을 활성화시키는데 실패한다. 한 실시양태에서, HER3 리간드는 뉴레귤린 1 (NRG), 뉴레귤린 2, 베타셀룰린, 헤파린-결합 표피 성장 인자 및 에피레귤린으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 HER3 수용체의 입체형태적 에피토프를 인식하는 단리된 항체 또는 그의 단편이며, 여기서 상기 입체형태적 에피토프는 HER3 수용체의 도메인 2 및 도메인 4 내의 아미노산 잔기를 포함하고, 상기 항체 또는 그의 단편은 리간드-의존성 및 리간드-비의존성 신호 전달을 둘 다 차단하는 것인 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 불활성 상태의 HER3 수용체에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 HER3 수용체를 불활성 상태로 안정화시킨다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 HER3 수용체의 입체형태적 에피토프에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 단편이며, 여기서 상기 입체형태적 에피토프는 HER3 수용체의 도메인 2 및 도메인 4 내의 아미노산 잔기를 포함하고, 상기 도메인 2는 이량체화 루프를 포함하고, 상기 항체 또는 단편은 리간드-의존성 및 리간드-비의존성 신호 전달을 둘 다 차단하는 것인 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 HER3 수용체를 불활성 상태로 안정화시킨다. 한 실시양태에서, 입체형태적 에피토프는 (도메인 2의) 아미노산 잔기 265-277, 315, (도메인 4의) 571, 582-584, 596-597, 600-602, 609-615, 또는 그의 하위세트를 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편의 VH는 하기 HER3 잔기: Asn266, Lys267, Leu268, Thr269, Gln271, Glu273, Pro274, Asn275, Pro276, His277, Asn315, Asp571, Pro583, His584, Ala596, Lys597 중 적어도 하나에 결합한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편의 VL은 하기 HER3 잔기: Tyr265, Lys267, Leu268, Phe270, Gly582, Pro583, Lys597, Ile600, Lys602, Glu609, Arg611, Pro612, Cys613, His614, Glu615 중 적어도 하나에 결합한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 제1 HER 수용체의 입체형태적 에피토프를 인식하는 단리된 항체 또는 그의 단편이며, 여기서 상기 입체형태적 에피토프는 제1 HER 수용체의 도메인 2 및 도메인 4 내의 아미노산 잔기를 포함하고, 상기 항체 또는 그의 단편의 HER 수용체 리간드의 부재 하의 제1 HER 수용체에 대한 결합은 제1 HER 수용체 및 제2 HER 수용체를 발현하는 세포에서 제1 HER 수용체-제2 HER 수용체 단백질 복합체의 리간드-비의존성 형성을 감소시키는 것인 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 제1 HER 수용체를 불활성 상태로 안정화시켜, 제1 HER 수용체가 제2 HER 수용체와 이량체화되어 제1 HER 수용체-제2 HER 수용체 단백질 복합체를 형성하는데 실패하도록 한다. 한 실시양태에서, 제1 HER 수용체-제2 HER 수용체 단백질 복합체 형성의 실패는 신호 전달의 활성화를 방지한다. 한 실시양태에서, 제1 HER은 HER1, HER2, HER3 및 HER4로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 제2 HER은 HER1, HER2, HER3 및 HER4로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 HER3 수용체의 입체형태적 에피토프를 인식하는 단리된 항체 또는 그의 단편이며, 여기서 상기 입체형태적 에피토프는 HER3의 도메인 2 및 도메인 4 내의 아미노산 잔기를 포함하고, 상기 항체 또는 그의 단편의 HER3 리간드의 부재 하의 HER3 수용체에 대한 결합은 HER2 및 HER3을 발현하는 세포에서 HER2-HER3 단백질 복합체의 리간드-비의존성 형성을 감소시키는 것인 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 HER3 수용체를 불활성 상태로 안정화시켜, HER3 수용체가 HER2 수용체와 이량체화되어 HER2-HER3 단백질 복합체를 형성하는데 실패하도록 한다. 한 실시양태에서, HER2-HER3 단백질 복합체 형성의 실패는 신호 전달의 활성화를 방지한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 HER3 수용체를 불활성 상태로 안정화시켜, HER3 수용체가 여전히 HER2와 이량체화될 수는 있지만 불활성 HER2-HER3 단백질 복합체를 형성하도록 한다. 한 실시양태에서, 불활성 HER2-HER3 단백질 복합체의 형성은 신호 전달의 활성화를 방지한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 제1 HER 수용체의 입체형태적 에피토프를 인식하는 단리된 항체 또는 그의 단편이며, 여기서 상기 입체형태적 에피토프는 제1 HER 수용체의 도메인 2 및 도메인 4 내의 아미노산 잔기를 포함하고, 상기 항체 또는 그의 단편의 HER 리간드의 존재 하의 제1 HER 수용체에 대한 결합은 제1 HER 수용체 및 제2 HER 수용체를 발현하는 세포에서 제1 HER 수용체-제2 HER 수용체 단백질 복합체의 리간드-의존성 형성을 감소시키는 것인 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 제1 HER 수용체를 불활성 상태로 안정화시켜, HER 수용체가 제1 HER 리간드의 존재 하에 제2 HER 수용체와 이량체화되어 제1 HER 수용체-제2 HER 수용체 단백질 복합체를 형성하는데 실패하도록 한다. 한 실시양태에서, 제1 HER 수용체-제2 HER 수용체 단백질 복합체 형성의 실패는 신호 전달의 활성화를 방지한다. 한 실시양태에서, HER 리간드는 뉴레귤린 1 (NRG), 뉴레귤린 2, 뉴레귤린 3, 뉴레귤린 4, 베타셀룰린, 헤파린-결합 표피 성장 인자, 에피레귤린, 표피 성장 인자, 암피레귤린 및 형질전환 성장 인자 알파로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 제1 HER은 HER1, HER2, HER3 및 HER4로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 제2 HER은 HER1, HER2, HER3 및 HER4로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 HER3 수용체의 입체형태적 에피토프를 인식하는 단리된 항체 또는 그의 단편이며, 여기서 상기 입체형태적 에피토프는 HER3의 도메인 2 및 도메인 4 내의 아미노산 잔기를 포함하고, 상기 항체 또는 그의 단편의 HER3 리간드의 존재 하의 HER3 수용체에 대한 결합은 HER2 및 HER3을 발현하는 세포에서 HER2-HER3 단백질 복합체의 리간드-의존성 형성을 감소시키는 것인 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다. 리간드는 뉴레귤린 1 (NRG) 및 뉴레귤린 2로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 HER3 수용체를 불활성 상태로 안정화시켜, HER3 수용체가 HER3 리간드의 존재 하에 HER2 수용체와 이량체화되어 HER2-HER3 단백질 복합체를 형성하는데 실패하도록 한다. 한 실시양태에서, HER2-HER3 단백질 복합체 형성의 실패는 신호 전달의 활성화를 방지한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 HER3 수용체의 입체형태적 에피토프를 인식하는 단리된 항체 또는 그의 단편이며, 여기서 상기 입체형태적 에피토프는 HER3의 도메인 2 및 도메인 4 내의 아미노산 잔기를 포함하고, 상기 항체 또는 그의 단편은 HER3 리간드-비의존성 인산화 검정에 의해 평가시에 HER3의 인산화를 억제하는 것인 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다. 한 실시양태에서, HER3 리간드-비의존성 인산화 검정은 HER2 증폭된 세포를 이용하고, 여기서 HER2 증폭된 세포는 SK-Br-3 세포이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 HER3 수용체의 입체형태적 에피토프를 인식하는 단리된 항체 또는 그의 단편이며, 여기서 상기 입체형태적 에피토프는 HER3의 도메인 2 및 도메인 4 내의 아미노산 잔기를 포함하고, 상기 항체 또는 그의 단편은 HER3 리간드-의존성 인산화 검정에 의해 평가시에 HER3의 인산화를 억제하는 것이 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다. 한 실시양태에서, HER3 리간드-의존성 인산화 검정은 뉴레귤린 (NRG)으로 자극된 MCF7 세포를 이용한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 적어도 1 x 107 M-1, 108 M-1, 109 M-1, 1010 M-1, 1011 M-1, 1012 M-1, 1013 M-1의 해리상수 (KD)를 갖는, HER3 수용체에 대한 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 포스포-HER3 및 포스포-Akt로 이루어진 군으로부터 선택된 인산화 검정에서 인간 HER3에 대한 시험관내 결합에 의해 측정시에 HER3의 인산화를 억제한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 표 1에 기재된 항체와 교차 경쟁하는 HER3 수용체에 대한 단리된 항체 또는 그의 단편; 표 1에 기재된 항체와 동일한 에피토프와 상호작용하는 (예를 들어, 결합, 입체 장애, 안정화/탈안정화, 공간 분포에 의함) 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 모노클로날 항체이다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 인간 또는 인간화 항체이다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 키메라 항체이다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 인간 중쇄 불변 영역 및 인간 경쇄 불변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 단일 쇄 항체이다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 Fab 단편이다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 scFv이다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 인간 HER3 및 시노몰구스 HER3 둘 다에 결합한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 IgG 이소형이다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 아미노산이 각각의 인간 VH 또는 VL 배선 서열로부터의 항체 프레임워크로 치환된 프레임워크를 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 표 1의 항체 중 어느 것의 카바트(Kabat) 또는 코티아(Chothia)에 의해 계산된 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함하는, HER3에 대한 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열 4, 서열 10, 서열 22, 서열 28, 서열 40, 서열 46, 서열 58, 서열 64, 서열 76, 서열 82, 서열 94, 서열 100, 서열 112, 서열 118, 서열 130, 서열 136, 서열 148, 서열 166, 서열 184, 서열 202, 서열 220, 서열 238, 서열 256, 서열 274, 서열 292, 서열 310, 서열 328, 서열 346 및 서열 364로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 CDR3을 포함하는, HER3 수용체에 대한 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열 15를 포함하는 VH 및 서열 14를 포함하는 VL, 또는 그의 97-99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, HER3 수용체에 대한 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열 33을 포함하는 VH 및 서열 32를 포함하는 VL, 또는 그의 97-99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, HER3 수용체에 대한 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열 51을 포함하는 VH 및 서열 50을 포함하는 VL, 또는 그의 97-99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, HER3 수용체에 대한 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열 69를 포함하는 VH 및 서열 68을 포함하는 VL, 또는 그의 97-99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, HER3 수용체에 대한 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열 87을 포함하는 VH 및 서열 86을 포함하는 VL, 또는 그의 97-99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, HER3 수용체에 대한 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열 105를 포함하는 VH 및 서열 104를 포함하는 VL, 또는 그의 97-99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, HER3 수용체에 대한 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열 123을 포함하는 VH 및 서열 122를 포함하는 VL, 또는 그의 97-99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, HER3 수용체에 대한 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열 141을 포함하는 VH 및 서열 140을 포함하는 VL, 또는 그의 97-99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, HER3 수용체에 대한 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열 159를 포함하는 VH 및 서열 158을 포함하는 VL, 또는 그의 97-99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, HER3 수용체에 대한 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열 177을 포함하는 VH 및 서열 176을 포함하는 VL, 또는 그의 97-99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, HER3 수용체에 대한 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열 195를 포함하는 VH 및 서열 194를 포함하는 VL, 또는 그의 97-99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, HER3 수용체에 대한 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열 213을 포함하는 VH 및 서열 212를 포함하는 VL, 또는 그의 97-99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, HER3 수용체에 대한 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열 231을 포함하는 VH 및 서열 230을 포함하는 VL, 또는 그의 97-99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, HER3 수용체에 대한 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열 249를 포함하는 VH 및 서열 248을 포함하는 VL, 또는 그의 97-99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, HER3 수용체에 대한 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열 267을 포함하는 VH 및 서열 266을 포함하는 VL, 또는 그의 97-99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, HER3 수용체에 대한 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열 285를 포함하는 VH 및 서열 284를 포함하는 VL, 또는 그의 97-99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, HER3 수용체에 대한 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열 303을 포함하는 VH 및 서열 302를 포함하는 VL, 또는 그의 97-99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, HER3 수용체에 대한 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열 321을 포함하는 VH 및 서열 320을 포함하는 VL, 또는 그의 97-99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, HER3 수용체에 대한 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열 339를 포함하는 VH 및 서열 338을 포함하는 VL, 또는 그의 97-99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, HER3 수용체에 대한 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열 357을 포함하는 VH 및 서열 356을 포함하는 VL, 또는 그의 97-99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, HER3 수용체에 대한 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열 375를 포함하는 VH 및 서열 374를 포함하는 VL, 또는 그의 97-99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, HER3 수용체에 대한 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열 493을 갖는 가변 중쇄 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열 494를 갖는 가변 경쇄 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열 493을 갖는 가변 중쇄 서열 및 서열 494를 갖는 가변 경쇄 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 변이체 중쇄 가변 영역을 가지며, 여기서 상기 변이체는 CDR1, CDR2 또는 CDR3 중 하나에서 적어도 1 내지 4개의 아미노산 변화를 갖는 것인, HER3 수용체에 대한 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역 서열 2의 CDR1; 서열 3의 CDR2; 서열 4의 CDR3; 경쇄 가변 영역 서열 5의 CDR1; 서열 6의 CDR2; 및 서열 7의 CDR3을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역 서열 20의 CDR1; 서열 21의 CDR2; 서열 22의 CDR3; 경쇄 가변 영역 서열 23의 CDR1; 서열 24의 CDR2; 및 서열 25의 CDR3을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역 서열 38의 CDR1; 서열 39의 CDR2; 서열 40의 CDR3; 경쇄 가변 영역 서열 41의 CDR1; 서열 42의 CDR2; 및 서열 43의 CDR3을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역 서열 56의 CDR1; 서열 57의 CDR2; 서열 58의 CDR3; 경쇄 가변 영역 서열 59의 CDR1; 서열 60의 CDR2; 및 서열 61의 CDR3을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역 서열 74의 CDR1; 서열 75의 CDR2; 서열 76의 CDR3; 경쇄 가변 영역 서열 77의 CDR1; 서열 78의 CDR2; 및 서열 79의 CDR3을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역 서열 92의 CDR1; 서열 93의 CDR2; 서열 94의 CDR3; 경쇄 가변 영역 서열 95의 CDR1; 서열 96의 CDR2; 및 서열 97의 CDR3을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역 서열 110의 CDR1; 서열 111의 CDR2; 서열 112의 CDR3; 경쇄 가변 영역 서열 113의 CDR1; 서열 114의 CDR2; 및 서열 115의 CDR3을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역 서열 128의 CDR1; 서열 129의 CDR2; 서열 130의 CDR3; 경쇄 가변 영역 서열 131의 CDR1; 서열 132의 CDR2; 및 서열 133의 CDR3을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역 서열 146의 CDR1; 서열 147의 CDR2; 서열 148의 CDR3; 경쇄 가변 영역 서열 149의 CDR1; 서열 150의 CDR2; 및 서열 151의 CDR3을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역 서열 164의 CDR1; 서열 165의 CDR2; 서열 166의 CDR3; 경쇄 가변 영역 서열 167의 CDR1; 서열 168의 CDR2; 및 서열 169의 CDR3을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역 서열 182의 CDR1; 서열 183의 CDR2; 서열 184의 CDR3; 경쇄 가변 영역 서열 185의 CDR1; 서열 186의 CDR2; 및 서열 187의 CDR3을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역 서열 200의 CDR1; 서열 201의 CDR2; 서열 202의 CDR3; 경쇄 가변 영역 서열 203의 CDR1; 서열 204의 CDR2; 및 서열 205의 CDR3을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역 서열 218의 CDR1; 서열 219의 CDR2; 서열 220의 CDR3; 경쇄 가변 영역 서열 221의 CDR1; 서열 222의 CDR2; 및 서열 223의 CDR3을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역 서열 236의 CDR1; 서열 237의 CDR2; 서열 238의 CDR3; 경쇄 가변 영역 서열 239의 CDR1; 서열 240의 CDR2; 및 서열 241의 CDR3을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역 서열 254의 CDR1; 서열 255의 CDR2; 서열 256의 CDR3; 경쇄 가변 영역 서열 257의 CDR1; 서열 258의 CDR2; 및 서열 259의 CDR3을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역 서열 272의 CDR1; 서열 273의 CDR2; 서열 274의 CDR3; 경쇄 가변 영역 서열 275의 CDR1; 서열 276의 CDR2; 및 서열 277의 CDR3을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역 서열 290의 CDR1; 서열 291의 CDR2; 서열 292의 CDR3; 경쇄 가변 영역 서열 293의 CDR1; 서열 294의 CDR2; 및 서열 295의 CDR3을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역 서열 308의 CDR1; 서열 309의 CDR2; 서열 310의 CDR3; 경쇄 가변 영역 서열 311의 CDR1; 서열 312의 CDR2; 및 서열 313의 CDR3을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역 서열 326의 CDR1; 서열 327의 CDR2; 서열 328의 CDR3; 경쇄 가변 영역 서열 329의 CDR1; 서열 330의 CDR2; 및 서열 331의 CDR3을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역 서열 344의 CDR1; 서열 345의 CDR2; 서열 346의 CDR3; 경쇄 가변 영역 서열 347의 CDR1; 서열 348의 CDR2; 및 서열 349의 CDR3을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역 서열 362의 CDR1; 서열 363의 CDR2; 서열 364의 CDR3; 경쇄 가변 영역 서열 365의 CDR1; 서열 366의 CDR2; 및 서열 367의 CDR3을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다.
한 실시양태에서, HER3에 결합하는 항체의 단편은 Fab, F(ab2)', F(ab)2', scFv, VHH, VH, VL, dAb로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 항체 또는 단편 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 제약 조성물은 추가의 치료제, 예컨대 항체, 소분자, mTOR 억제제 또는 PI3 키나제 억제제를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 제약 조성물은 본 발명의 항체 또는 그의 단편, 및 마투주맙 (EMD72000), 에르비툭스(Erbitux)®/세툭시맙, 벡티빅스(Vectibix)®/파니투무맙, mAb 806, 니모투주맙, 이레사(Iressa)®/게피티닙, CI-1033 (PD183805), 라파티닙 (GW-572016), 타이커브(Tykerb)®/라파티닙 디토실레이트, 타르세바(Tarceva)®/에를로티닙 HCL (OSI-774), PKI-166 및 토보크(Tovok)®를 포함하나 이에 제한되지 않는 HER1 억제제를 포함한다.
한 실시양태에서, 제약 조성물은 본 발명의 항체 또는 그의 단편, 및 페르투주맙, 트라스투주맙, MM-111, 네라티닙, 라파티닙 또는 라파티닙 디토실레이트/타이커브®를 포함하나 이에 제한되지 않는 HER2 억제제를 포함한다.
한 실시양태에서, 제약 조성물은 본 발명의 항체 또는 그의 단편, 및 MM-121, MM-111, IB4C3, 2DID12 (U3 파마 아게(U3 Pharma AG)), AMG888 (암젠(Amgen)), AV-203(아베오(Aveo)), MEHD7945A (제넨테크(Genentech)); HER3을 억제하는 소분자를 포함하나 이에 제한되지 않는 HER3 억제제를 포함한다.
한 실시양태에서, 제약 조성물은 본 발명의 항체 또는 그의 단편 및 HER4 억제제를 포함한다.
한 실시양태에서, 제약 조성물은 본 발명의 항체 또는 그의 단편, 및 GDC 0941, BEZ235, BMK120 및 BYL719를 포함하나 이에 제한되지 않는 PI3 키나제 억제제를 포함한다.
한 실시양태에서, 제약 조성물은 본 발명의 항체 또는 그의 단편, 및 템시롤리무스/토리셀(Torisel)®, 리다포롤리무스/데포롤리무스, AP23573, MK8669, 에베롤리무스/아피니토르(Affinitor)®를 포함하나 이에 제한되지 않는 mTOR 억제제를 포함한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 HER3 발현 암을 갖는 대상체를 선택하는 것, 상기 대상체에게 본원의 청구항 중 어느 한 항으로부터 선택된 항체 또는 그의 단편을 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 HER3 발현 암을 갖는 대상체를 선택하는 것, 상기 대상체에게 본원의 청구항 중 어느 한 항으로부터 선택된 항체 또는 그의 단편을 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 유방암, 결장직장암, 폐암, 다발성 골수종, 난소암, 간암, 위암, 췌장암, 전립선암, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 골육종, 편평 세포 암종, 말초 신경초 종양, 슈반세포종, 두경부암, 방광암, 식도암, 교모세포종, 연부 조직의 투명 세포 육종, 악성 중피종, 신경섬유종증, 신암, 흑색종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 암은 유방암이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 HER3 발현 암을 갖는 대상체를 선택하는 것, 상기 대상체에게 HER3에 결합하는 표 1에 개시된 항체 또는 그의 단편의 조합을 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 HER3 발현 암을 갖는 대상체를 선택하는 것, 상기 대상체에게 HER3에 결합하여 HER3 리간드-의존성 신호 전달 및 리간드-비의존성 신호 전달을 억제하는 항체 또는 그의 단편을 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 유방암, 결장직장암, 폐암, 다발성 골수종, 난소암, 간암, 위암, 췌장암, 전립선암, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 골육종, 편평 세포 암종, 말초 신경초 종양, 슈반세포종, 두경부암, 방광암, 식도암, 교모세포종, 연부 조직의 투명 세포 육종, 악성 중피종, 신경섬유종증, 신암 및 흑색종으로 이루어진 군으로부터 선택되는, HER3 리간드-의존성 신호 전달 또는 리간드-비의존성 신호 전달 경로에 의해 매개되는 암의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서 본원의 청구항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 단편의 용도에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 HER3 리간드-의존성 신호 전달 또는 리간드-비의존성 신호 전달 경로에 의해 매개되는 암을 치료하는데 사용하기 위한, 서열 15의 VH 및 서열 14의 VL을 갖는 항체에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 HER3 리간드-의존성 신호 전달 또는 리간드-비의존성 신호 전달 경로에 의해 매개되는 암을 치료하는데 사용하기 위한, 서열 33의 VH 및 서열 32의 VL을 갖는 항체에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 HER3 리간드-의존성 신호 전달 또는 리간드-비의존성 신호 전달 경로에 의해 매개되는 암을 치료하는데 사용하기 위한, 서열 51의 VH 및 서열 50의 VL을 갖는 항체에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 HER3 리간드-의존성 신호 전달 또는 리간드-비의존성 신호 전달 경로에 의해 매개되는 암을 치료하는데 사용하기 위한, 서열 69의 VH 및 서열 68의 VL을 갖는 항체에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 HER3 리간드-의존성 신호 전달 또는 리간드-비의존성 신호 전달 경로에 의해 매개되는 암을 치료하는데 사용하기 위한, 서열 87의 VH 및 서열 86의 VL을 갖는 항체에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 HER3 리간드-의존성 신호 전달 또는 리간드-비의존성 신호 전달 경로에 의해 매개되는 암을 치료하는데 사용하기 위한, 서열 105의 VH 및 서열 104의 VL을 갖는 항체에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 HER3 리간드-의존성 신호 전달 또는 리간드-비의존성 신호 전달 경로에 의해 매개되는 암을 치료하는데 사용하기 위한, 서열 123의 VH 및 서열 122의 VL을 갖는 항체에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 HER3 리간드-의존성 신호 전달 또는 리간드-비의존성 신호 전달 경로에 의해 매개되는 암을 치료하는데 사용하기 위한, 서열 141의 VH 및 서열 140의 VL을 갖는 항체에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 HER3 리간드-의존성 신호 전달 또는 리간드-비의존성 신호 전달 경로에 의해 매개되는 암을 치료하는데 사용하기 위한, 서열 151의 VH 및 서열 158의 VL을 갖는 항체에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 HER3 리간드-의존성 신호 전달 또는 리간드-비의존성 신호 전달 경로에 의해 매개되는 암을 치료하는데 사용하기 위한, 서열 177의 VH 및 서열 176의 VL을 갖는 항체에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 HER3 리간드-의존성 신호 전달 또는 리간드-비의존성 신호 전달 경로에 의해 매개되는 암을 치료하는데 사용하기 위한, 서열 195의 VH 및 서열 194의 VL을 갖는 항체에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 HER3 리간드-의존성 신호 전달 또는 리간드-비의존성 신호 전달 경로에 의해 매개되는 암을 치료하는데 사용하기 위한, 서열 213의 VH 및 서열 212의 VL을 갖는 항체에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 HER3 리간드-의존성 신호 전달 또는 리간드-비의존성 신호 전달 경로에 의해 매개되는 암을 치료하는데 사용하기 위한, 서열 231의 VH 및 서열 230의 VL을 갖는 항체에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 HER3 리간드-의존성 신호 전달 또는 리간드-비의존성 신호 전달 경로에 의해 매개되는 암을 치료하는데 사용하기 위한, 서열 249의 VH 및 서열 248의 VL을 갖는 항체에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 HER3 리간드-의존성 신호 전달 또는 리간드-비의존성 신호 전달 경로에 의해 매개되는 암을 치료하는데 사용하기 위한, 서열 267의 VH 및 서열 266의 VL을 갖는 항체에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 HER3 리간드-의존성 신호 전달 또는 리간드-비의존성 신호 전달 경로에 의해 매개되는 암을 치료하는데 사용하기 위한, 서열 285의 VH 및 서열 284의 VL을 갖는 항체에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 HER3 리간드-의존성 신호 전달 또는 리간드-비의존성 신호 전달 경로에 의해 매개되는 암을 치료하는데 사용하기 위한, 서열 303의 VH 및 서열 302의 VL을 갖는 항체에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 HER3 리간드-의존성 신호 전달 또는 리간드-비의존성 신호 전달 경로에 의해 매개되는 암을 치료하는데 사용하기 위한, 서열 321의 VH 및 서열 320의 VL을 갖는 항체에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 HER3 리간드-의존성 신호 전달 또는 리간드-비의존성 신호 전달 경로에 의해 매개되는 암을 치료하는데 사용하기 위한, 서열 339의 VH 및 서열 338의 VL을 갖는 항체에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 HER3 리간드-의존성 신호 전달 또는 리간드-비의존성 신호 전달 경로에 의해 매개되는 암을 치료하는데 사용하기 위한, 서열 357의 VH 및 서열 356의 VL을 갖는 항체에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 HER3 리간드-의존성 신호 전달 또는 리간드-비의존성 신호 전달 경로에 의해 매개되는 암을 치료하는데 사용하기 위한, 서열 375의 VH 및 서열 374의 VL을 갖는 항체에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 의약으로 사용하기 위한, 서열 15의 VH 및 서열 14의 VL을 갖는 항체에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 의약으로 사용하기 위한, 서열 33의 VH 및 서열 32의 VL을 갖는 항체에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 의약으로 사용하기 위한, 서열 51의 VH 및 서열 50의 VL을 갖는 항체에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 의약으로 사용하기 위한, 서열 69의 VH 및 서열 68의 VL을 갖는 항체에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 의약으로 사용하기 위한, 서열 87의 VH 및 서열 86의 VL을 갖는 항체에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 의약으로 사용하기 위한, 서열 105의 VH 및 서열 104의 VL을 갖는 항체에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 의약으로 사용하기 위한, 서열 123의 VH 및 서열 122의 VL을 갖는 항체에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 의약으로 사용하기 위한, 서열 141의 VH 및 서열 140의 VL을 갖는 항체에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 의약으로 사용하기 위한, 서열 159의 VH 및 서열 158의 VL을 갖는 항체에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 의약으로 사용하기 위한, 서열 177의 VH 및 서열 176의 VL을 갖는 항체에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 의약으로 사용하기 위한, 서열 195의 VH 및 서열 194의 VL을 갖는 항체에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 의약으로 사용하기 위한, 서열 213의 VH 및 서열 212의 VL을 갖는 항체에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 의약으로 사용하기 위한, 서열 231의 VH 및 서열 230의 VL을 갖는 항체에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 의약으로 사용하기 위한, 서열 249의 VH 및 서열 248의 VL을 갖는 항체에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 의약으로 사용하기 위한, 서열 267의 VH 및 서열 266의 VL을 갖는 항체에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 의약으로 사용하기 위한, 서열 285의 VH 및 서열 284의 VL을 갖는 항체에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 의약으로 사용하기 위한, 서열 303의 VH 및 서열 302의 VL을 갖는 항체에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 의약으로 사용하기 위한, 서열 321의 VH 및 서열 320의 VL을 갖는 항체에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 의약으로 사용하기 위한, 서열 339의 VH 및 서열 338의 VL을 갖는 항체에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 의약으로 사용하기 위한, 서열 357의 VH 및 서열 356의 VL을 갖는 항체에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 의약으로 사용하기 위한, 서열 375의 VH 및 서열 374의 VL을 갖는 항체에 관한 것이다.
도 1: 인간, 마우스, 래트 및 시노몰구스 HER3에서 수득한 대표적인 MOR10701 SET 곡선
도 2: FACS 적정에 의한 SK-Br-3 세포 결합 결정
도 3: HER3 도메인 결합 ELISA
도 4: 수소 중수소 교환 에피토프 맵핑. a) HDX-MS 분석에 따라 회수된 HER3 ECD 펩티드는 파선으로 나타낸다. 잠재적인 N-연결된 글리코실화 부위가 강조된다. b) MS에 의해 확인된 펩티드에서 관찰된 중수소화의 상대적 정도. c) 공개된 HER3 결정 구조 상에 맵핑된 보호된 잔기.
도 5: a) HER3/MOR09823 및 HER3/MOR09825 x-선 결정 구조의 표면 대표도. HER3 (밝은 회색)은 폐쇄된 입체형태이고, MOR09823 또는 MOR09825 (어두운 회색)는 도메인 2 및 4 둘 다에 결합한다. b). (a)와 유사한 배향으로 도시된 HER3/MOR09823 구조로부터의 HER3의 표면도. MOR09823은 명확성을 위해 생략하였다. c) 패널 (a), (b) 및 (d)로부터 90° 회전시킨 관점에서 본, 리본 구조로 도시된 HER3/MOR09823 구조. d) Fab의 5Å 내에 있는 HER3 잔기를 강조한, 도메인 2/도메인 4 인터페이스의 확대도가 포함된, MOR09823 Fab에 의해 인식되는 불활성 HER3 입체형태의 리본 대표도. e) ELISA 적정에 의한 돌연변이체 HER3/MOR10703 결합 결정.
도 6: 리간드 유도된 (a) 또는 리간드-비의존성 (b) HER3 인산화의 억제.
도 7: HER2 증폭된 세포주에서의 HER3 의존성 하류 신호전달 경로의 억제.
도 8: a) BT-474 및 b) 뉴레귤린 자극된 MCF7 세포에서 종양 성장에 대한 HER3 억제의 영향.
도 9: MCF7 세포에 대한 뉴레귤린 결합에 대한 MOR09823 및 MOR09825의 효과.
도 10: 비아코어(Biacore)TM에 의해 평가된 바와 같은 HER3/뉴레귤린 복합체 형성에 대한 MOR09823 결합의 영향. 항체 없음 (흑색 막대), MOR09823 (백색 막대), 105.5 (회색) 및 대조군 IgG (줄무늬 막대).
도 11: 생체내 (a) 리간드 비의존성 (BT-474) 및 (b) 리간드 의존성 (BxPC3) HER3 신호전달의 MOR09823 매개 억제.
도 12: BT-474 종양 성장에 대한 MOR10701 및 MOR10703의 영향.
도 13: BxPC3 종양 성장에 대한 MOR10701 및 MOR10703의 영향.
도 14: MOR10703 시험관내 약물 조합물 이소볼로그램 (a) MOR09823/트라스투주맙, (b) MOR09823/라파티닙, (c) MOR10703/BEZ235, (d) MOR10703/BKM120, (e) MOR10703/BYL719, (f) MOR10703/RAD001, (g) MOR10703/세툭시맙 및 (h) MOR10703/에를로티닙.
도 15: BT-474 및 L3.3에서 (a) 트라스투주맙 및 (b) 에를로티닙과의 MOR10701 또는 MOR10703 생체내 조합물.
발명의 상세한 설명
정의
본 발명을 보다 용이하게 이해할 수 있도록 하기 위해, 우선 특정 용어를 정의한다. 추가의 정의는 발명의 상세한 설명 전반에 열거되어 있다.
본원에 사용된 어구 "신호 전달" 또는 "신호전달 활성"은 세포의 한 부분으로부터 세포의 또 다른 부분으로 신호를 전달시키는 단백질-단백질 상호작용, 예컨대 성장 인자의 수용체에 대한 결합에 의해 일반적으로 개시되는 생화학적 인과 관계를 지칭한다. HER3의 경우에, 전달은 신호 전달을 일으키는 일련의 반응에서 하나 이상의 단백질 상의 하나 이상의 티로신, 세린 또는 트레오닌 잔기의 특이적 인산화를 포함한다. 끝에서 두번째 과정은 전형적으로 유전자 발현을 변화시키는 핵 사건을 포함한다.
"HER 수용체"는 HER 수용체 패밀리에 속하는 수용체 단백질 티로신 키나제이고, 이는 EGFR, HER2, HER3 및 HER4 수용체, 및 추후에 확인될 이러한 패밀리의 다른 구성원을 포함한다. HER 수용체는 일반적으로 HER 리간드에 결합할 수 있는 세포외 도메인; 친지성 막횡단 도메인; 보존된 세포내 티로신 키나제 도메인; 및 인산화될 수 있는 여러 티로신 잔기를 보유하는 카르복실-말단 신호전달 도메인을 포함할 것이다. 바람직하게는, HER 수용체는 천연 서열 인간 HER 수용체이다.
용어 "HER1", "ErbB1", "표피 성장 인자 수용체" 및 "EGFR"은 본원에서 교환가능하게 사용되고, 예를 들어 문헌 [Carpenter et al. Ann. Rev. Biochem. 56:881-914 (1987)]에 개시된 바와 같은 EGFR (그의 자연 발생 돌연변이체 형태 포함) (예를 들어, 문헌 [Humphrey et al., (1990) PNAS (USA) 87:4207-4211]에서와 같은 결실 돌연변이체 EGFR)을 지칭한다. erbB1은 EGFR 단백질 생성물을 코딩하는 유전자를 지칭한다.
용어 "HER2" 및 "ErbB2"는 본원에서 교환가능하게 사용되고, 예를 들어 문헌 [Semba et al., (1985) PNAS (USA) 82:6497-6501 및 Yamamoto et al.(1986) Nature 319:230-234]에 기재된 인간 HER2 단백질 (진뱅크 등록 번호 X03363)을 지칭한다. 용어 "erbB2"는 인간 ErbB2를 코딩하는 유전자를 지칭하고, "neu"는 래트 p185neu를 코딩하는 유전자를 지칭한다.
본원에서 용어 "HER4" 및 "ErbB4"는 예를 들어 유럽 특허 출원 번호 599,274; 문헌 [Plowman et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:1746-1750; 및 Plowman et al., (1993) Nature, 366:473-475]에 개시된 바와 같은 수용체 폴리펩티드 (예를 들어, 1999년 4월 22일에 공개된 WO99/19488에 개시된 바와 같은 그의 이소형 포함)를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "HER3" 또는 "HER3 수용체" (또한 "ErbB3"으로 공지됨)는 포유동물 HER3 단백질을 지칭하고, "her3" 또는 "erbB3"은 포유동물 her3 유전자를 지칭한다. 바람직한 HER3 단백질은 세포의 세포 막에 존재하는 인간 HER3 단백질이다. 인간 her3 유전자는 미국 특허 번호 5,480,968 및 문헌 [Plowman et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:4905-4909]에 기재되어 있다.
인간 HER3은 등록 번호 NP_001973 (인간)으로 정의되고, 서열 1로 하기에 나타낸다. 모든 명명법은 전장, 미성숙 HER3 (아미노산 1-1342)에 대한 것이다. 미성숙 HER3은 위치 19와 20 사이에서 절단되어, 성숙 HER3 단백질 (20-1342 아미노산)을 생성한다.
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본원에 사용된 용어 "HER 리간드"는 HER 수용체, 예컨대 HER1, HER2, HER3 및 HER4에 결합하여 이를 활성화시키는 폴리펩티드를 지칭한다. HER 리간드의 예는 뉴레귤린 1 (NRG), 뉴레귤린 2, 뉴레귤린 3, 뉴레귤린 4, 베타셀룰린, 헤파린-결합 표피 성장 인자, 에피레귤린, 표피 성장 인자, 암피레귤린 및 형질전환 성장 인자 알파를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 용어는 생물학적 활성 단편 및/또는 자연 발생 폴리펩티드의 변이체를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "HER3 리간드"는 HER3에 결합하여 이를 활성화시키는 폴리펩티드를 지칭한다. HER3 리간드의 예는 뉴레귤린 1 (NRG) 및 뉴레귤린 2, 베타셀룰린, 헤파린-결합 표피 성장 인자 및 에피레귤린을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 용어는 생물학적 활성 단편 및/또는 자연 발생 폴리펩티드의 변이체를 포함한다.
"HER-HER 단백질 복합체"는 임의의 조합 (예를 들어, HER1-HER2, HER1-HER3, HER1-HER4, HER2-HER3, HER3-HER4 등)으로 HER 보조수용체를 함유하는 비공유 회합된 올리고머이다. 이 복합체는 이들 수용체를 둘 다 발현하는 세포가 HER 리간드, 예를 들어 NRG에 노출된 경우, 또는 HER 수용체가 활성이거나 또는 과다발현된 경우에 형성할 수 있다.
"HER2-HER3 단백질 복합체"는 HER2 수용체 및 HER3 수용체를 함유하는 비공유 회합된 올리고머이다. 이 복합체는 이들 수용체를 둘 다 발현하는 세포가 HER3 리간드, 예를 들어 NRG에 노출된 경우, 또는 HER2가 활성/과다발현된 경우에 형성할 수 있다.
본원에 사용된 어구 "HER3 활성" 또는 "HER3 활성화"는 올리고머화의 증가 (예를 들어, HER3 함유 복합체의 증가), HER3 인산화, 입체형태적 재배열 (예를 들어, 리간드에 의해 유도된 것), 및 HER3 매개 하류 신호전달을 지칭한다.
HER3과 관련하여 사용된 용어 "안정화" 또는 "안정화된"은 HER3에 대한 리간드 결합을 차단하지 않고 HER3의 불활성 상태 또는 입체형태를 직접적으로 유지 (잠금, 구속, 지속, 우선적으로 결합, 선호)하여, 리간드 결합이 더 이상 HER3을 활성화시킬 수 없게 하는 항체 또는 그의 단편을 지칭한다. 실시예에 기재된 검정, 예를 들어 비아코어 검정을 이용하여 안정화된 HER3 수용체에 대한 리간드 결합을 측정할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "리간드-의존성 신호전달"은 리간드를 통한 HER (예를 들어, HER3)의 활성화를 지칭한다. HER3 활성화는 하류 신호전달 경로 (예를 들어, PI3K)가 활성화되도록 상승된 올리고머화 (예를 들어, 이종이량체화) 및/또는 HER3 인산화에 의해 증명된다. 항체 또는 그의 단편은 실시예에 기재된 검정을 이용하여 측정시에, 비처리 (대조군) 세포와 비교하여 항원 결합 단백질 (예를 들어, 항체)에 노출된 자극된 세포에서 인산화 HER3의 양을 통계적으로 유의하게 감소시킬 수 있다. HER3을 발현하는 세포는 자연 발생 세포주 (예를 들어, MCF7)일 수 있거나, 숙주 세포에 HER3 단백질을 코딩하는 핵산을 도입함으로써 재조합적으로 생산될 수 있다. 세포 자극은 활성화 HER3 리간드의 외인성 첨가를 통해 또는 활성화 리간드의 내인성 발현에 의해 일어날 수 있다.
"세포에서 뉴레귤린-유도된 HER3 활성화를 감소시키는" 항체 또는 그의 단편은 실시예에 기재된 검정을 이용하여 측정시에, 비처리 (대조군) 세포와 비교하여 HER3 티로신 인산화를 통계적으로 유의하게 감소시키는 것이다. 이는 NRG 및 관심 항체에 대한 HER3의 노출에 따른 HER3 포스포티로신 수준을 기반으로 결정될 수 있다. HER3 단백질을 발현하는 세포는 자연 발생 세포 또는 세포주 (예를 들어, MCF7)일 수 있거나, 재조합적으로 생산될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "리간드-비의존성 신호전달"은 리간드 결합에 대한 필요의 부재 하의 세포 HER3 활성 (예를 들어, 인산화)을 지칭한다. 예를 들어, 리간드-비의존성 HER3 활성화는 HER3 이종이량체 파트너, 예컨대 EGFR 및 HER2에서 HER2 과다발현 또는 활성화 돌연변이의 결과일 수 있다. 항체 또는 그의 단편은 비처리 (대조군) 세포와 비교하여 항원 결합 단백질 (예를 들어, 항체)에 노출된 세포에서 인산화 HER3의 양을 통계적으로 유의하게 감소시킬 수 있다. HER3을 발현하는 세포는 자연 발생 세포주 (예를 들어, SK-Br-3)일 수 있거나, 숙주 세포에 HER3 단백질을 코딩하는 핵산을 도입함으로써 재조합적으로 생산될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "차단하다"는 상호작용 또는 과정을 중지시키거나 방지하는 것, 예를 들어 리간드-의존성 또는 리간드-비의존성 신호전달을 중지시키는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "인식하다"는 그의 입체형태적 에피토프를 발견하여 이와 상호작용 (예를 들어, 결합)하는 항체 또는 그의 단편을 지칭한다.
본원에 사용된 어구 "공동으로 결합하다"는 HER 항체와 함께 HER 수용체 상의 리간드 결합 부위에 결합할 수 있는 HER 리간드를 지칭한다. 이는 항체 및 항체가 둘 다 함께 HER 수용체에 결합할 수 있음을 의미한다. 오직 설명의 목적으로, HER3 리간드 NRG는 HER3 항체와 함께 HER3 수용체에 결합할 수 있다. 리간드 및 항체의 공동 결합을 측정하기 위한 검정은 실시예 섹션 (예를 들어, 비아코어)에 기재된다.
본원에 사용된 용어 "실패하다"는 특정한 사건을 행하지 않은 항체 또는 그의 단편을 지칭한다. 예를 들어, "신호 전달을 활성화시키는데 실패한" 항체 또는 그의 단편은 신호 전달을 일으키지 않은 것이고; "입체형태적 변화를 유도하는데 실패한" 항체 또는 그의 단편은 HER 수용체의 구조적 변경을 일으키지 않은 것이고; HER 수용체를 불활성 상태로 안정화시켜 HER 수용체가 "이량체화되는데 실패"하도록 한 항체 또는 그의 단편은 단백질-단백질 복합체를 형성하지 않은 것이다.
본원에 사용된 용어 "항체"는 HER3 에피토프와 상호작용하고 (예를 들어, 결합, 입체 장애, 안정화/탈안정화, 공간 분포에 의함), 신호 전달을 억제하는 전체 항체를 지칭한다. 자연 발생 "항체"는 디술피드 결합에 의해 상호연결된, 적어도 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함하는 당단백질이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 VH라 약칭함) 및 중쇄 불변 영역으로 이루어진다. 중쇄 불변 영역은 CH1, CH2 및 CH3의 3개의 도메인으로 이루어진다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 VL이라 약칭함) 및 경쇄 불변 영역으로 이루어진다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 CL로 이루어진다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)이라 불리는 보다 보존된 영역이 산재되어 있는, 상보성 결정 영역 (CDR)이라 불리는 초가변 영역으로 보다 세분화될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성되며, 이들은 아미노-말단에서부터 카르복시-말단까지 하기 순서로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 숙주 조직 또는 인자, 예를 들어 면역계의 다양한 세포 (예를 들어, 이펙터 세포) 및 고전적 보체 시스템의 제1 성분 (C1q)에 대한 이뮤노글로불린의 결합을 매개할 수 있다. 용어 "항체"는 예를 들어 모노클로날 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 낙타화 항체, 키메라 항체, 단일 쇄 Fv (scFv), 디술피드-연결 Fv (sdFv), Fab 단편, F(ab') 단편, 및 항-이디오타입 (항-Id) 항체 (예를 들어, 본 발명의 항체에 대한 항-Id 항체 포함), 및 임의의 상기 항체의 에피토프-결합 단편을 포함한다. 항체는 임의의 이소형 (예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스의 것일 수 있다.
경쇄 및 중쇄는 모두 구조적 및 기능적 상동성 영역으로 나눌 수 있다. 용어 "불변" 및 "가변"은 기능적으로 사용된다. 이와 관련하여, 경쇄 (VL) 및 중쇄 (VH) 부분 둘 다의 가변 도메인이 항원 인식 및 특이성을 결정함이 이해될 것이다. 이와 반대로, 경쇄의 불변 도메인 (CL) 및 중쇄의 불변 도메인 (CH1, CH2 또는 CH3)은 중요한 생물학적 특성, 예컨대 분비, 태반 경유 이동성, Fc 수용체 결합, 보체 결합 등을 부여한다. 통상적으로, 불변 영역 도메인의 넘버링은 이들이 항체의 항원 결합 부위 또는 아미노-말단으로부터 보다 멀어지면서 증가한다. N-말단은 가변 영역이고 C-말단은 불변 영역이고; CH3 및 CL 도메인은 실제로 각각 중쇄 및 경쇄의 카르복시-말단을 포함한다.
본원에 사용된 어구 "항체 단편"은 HER3 에피토프와 특이적으로 상호작용하고 (예를 들어, 결합, 입체 장애, 안정화/탈안정화, 공간 분포에 의함), 신호 전달을 억제하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 부분을 지칭한다. 결합 단편의 예는 Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어지는 1가 단편; F(ab)2 단편, 즉 힌지 영역에서 디술피드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; VH 및 CH1 도메인으로 이루어지는 Fd 단편; 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어지는 Fv 단편; VH 도메인으로 이루어지는 dAb 단편 (문헌 [Ward et al., (1989) Nature 341:544-546]); 및 단리된 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
또한, Fv 단편의 2개의 도메인 VL 및 VH가 별도의 유전자에 의해 코딩되지만, 이들은 재조합 방법을 이용하여, VL 및 VH 영역이 쌍을 형성하여 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 쇄 (단일 쇄 Fv (scFv)로 알려짐; 예를 들어, 문헌 [Bird et al., (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883] 참조)로 제조될 수 있도록 하는 합성 링커에 의해 연결될 수 있다. 이러한 단일 쇄 항체는 또한 용어 "항체 단편"에 포함되는 것으로 의도된다. 이들 항체 단편은 당업자에게 공지된 통상의 기술을 이용하여 수득하고, 상기 단편은 무손상 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다.
항체 단편은 또한 단일 도메인 항체, 맥시바디, 미니바디, 인트라바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, v-NAR 및 비스-scFv 내로 혼입될 수도 있다 (예를 들어, 문헌 [Hollinger and Hudson, (2005) Nature Biotechnology 23:1126-1136] 참조). 항체 단편은 피브로넥틴 유형 III (Fn3)과 같은 폴리펩티드를 기반으로 하는 스캐폴드 내로 이식될 수 있다 (피브로넥틴 폴리펩티드 모노바디를 기재하고 있는 미국 특허 번호 6,703,199 참조).
항체 단편은 상보적 경쇄 폴리펩티드와 함께 항원 결합 영역의 쌍을 형성하는 탠덤 Fv 절편 (VH-CH1-VH-CH1)의 쌍을 포함하는 단일 쇄 분자 내로 혼입될 수 있다 (문헌 [Zapata et al., (1995) Protein Eng. 8:1057-1062]; 및 미국 특허 번호 5,641,870).
용어 "에피토프"는 이뮤노글로불린에 특이적으로 결합할 수 있거나 또는 분자와 달리 상호작용할 수 있는 임의의 단백질 결정기를 포함한다. 에피토프 결정기는 일반적으로 분자의 화학적 활성 표면 기, 예컨대 아미노산 또는 탄수화물 또는 당 측쇄로 이루어지고, 특이적 3차원 구조적 특성 뿐만 아니라 특이적 전하 특성을 가질 수 있다. 에피토프는 "선형" 또는 "입체형태적"일 수 있다.
용어 "선형 에피토프"는 단백질과 상호작용 분자 (예컨대 항체) 사이의 상호작용의 모든 지점이 단백질의 1차 아미노산 서열을 따라 선형으로 발생하는 (연속적임) 에피토프를 지칭한다. 항원 상의 원하는 에피토프가 결정되면, 예를 들어 본 발명에 기재된 기술을 이용하여 이러한 에피토프에 대한 항체를 생성할 수 있다. 대안적으로, 발견 과정 동안, 항체의 생성 및 특성화는 원하는 에피토프에 대한 정보를 해석할 수 있다. 이어서, 이러한 정보로부터, 동일한 에피토프에 대한 결합에 대해 항체들을 경쟁적으로 스크리닝할 수 있다. 이를 달성하기 위한 접근법은 서로 경쟁적으로 결합하는 항체, 예를 들어 항원에 대한 결합에 대해 경쟁하는 항체를 발견하기 위한 교차-경쟁 연구를 수행하는 것이다. 교차-경쟁을 기반으로 하여 항체를 "비닝"하기 위한 고처리량 과정이 국제 특허 출원 번호 WO 2003/48731에 기재되어 있다. 당업자가 이해하게 되는 바와 같이, 실질적으로 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 것이 에피토프일 수 있다. 에피토프는 항체가 결합하는 잔기를 포함할 수 있다.
용어 "입체형태적 에피토프"는 불연속적 아미노산이 3차원 입체형태로 합쳐진 에피토프를 지칭한다. 입체형태적 에피토프에서, 상호작용 지점은 서로 분리된 단백질 상의 아미노산 잔기에 걸쳐 일어난다. 한 실시양태에서, 에피토프는 본 명세서의 실시예에 기재된 것이다. 한 실시양태에서, 입체형태적 에피토프는 서열 1의 (i) (도메인 2의) HER3 아미노산 잔기 265-277 및 315 및 (ii) (도메인 4의) HER3 아미노산 잔기 571, 582-584, 596-597, 600-602, 609-615, 또는 그의 하위세트에 의해 정의된다. 당업자가 이해하게 되는 바와 같이, 분자의 형태를 생성하는 잔기 또는 측쇄가 차지하는 공간은 에피토프가 무엇인지 결정하는 것을 돕는다.
일반적으로, 특정한 표적 항원에 특이적인 항체는 우선적으로 단백질 및/또는 거대분자의 복합체 혼합물에서 표적 항원 상의 에피토프를 인식할 것이다.
에피토프를 포함하는 제시된 폴리펩티드의 영역은 당업계에 널리 공지된 임의의 다수의 에피토프 맵핑 기술을 이용하여 확인할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E.Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey]을 참조한다. 예를 들어, 선형 에피토프는 예를 들어 단백질 분자의 일부에 대응하는 매우 많은 펩티드를 고체 지지체 상에서 동시에 합성하고 펩티드가 지지체 상에 계속 부착된 상태에서 펩티드를 항체와 반응시킴으로써 결정할 수 있다. 이러한 기술은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 미국 특허 번호 4,708,871; 문헌 [Geysen et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:3998-4002; Geysen et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:78-182; Geysen et al., (1986) Mol. Immunol. 23:709-715]에 기재되어 있다. 이와 유사하게, 입체형태적 에피토프는 예를 들어 수소/중수소 교환, x선 결정학 및 2차원 핵 자기 공명에 의해서와 같이 아미노산의 공간 입체형태를 결정함으로써 용이하게 확인된다. 예를 들어, 문헌 [Epitope Mapping Protocols, 상기 문헌]을 참조한다. 또한, 단백질의 항원 영역은 표준 항원성 및 소수친수성 플롯을 사용하여 확인될 수 있고, 예컨대 옥스포드 몰레큘라 그룹(Oxford Molecular Group)으로부터 입수가능한 오미가 (Omiga) 버전 1.0 소프트웨어 프로그램을 사용하여 계산되는 것이다. 이러한 컴퓨터 프로그램은 항원성 프로파일 결정을 위해 호프/우즈(Hopp/Woods) 방법 (문헌 [Hopp et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci USA 78:3824-3828]); 및 소수친수성 플롯을 위해 카이트-두리틀 (Kyte-Doolittle) 기술 (문헌 [Kyte et al., (1982) J.MoI. Biol. 157:105-132])을 이용한다.
본원에 사용된 용어 "파라토프"는 에피토프에 대한 결합을 결정하는 결합 영역의 일반적 구조를 지칭한다. 이러한 구조는 결합 영역이 에피토프에 결합할 수 있는지 아닌지의 여부 및 어떠한 방식으로 결합할 수 있는지에 영향을 미친다. 파라토프는 항원 결정기에 결합하기 위해, 항체 또는 그의 단편에 해당하는 항체의 항원 부위를 지칭할 수 있다. 파라토프는 또한 항체의 이디오토프, 및 에피토프에 결합하는 상보성 결정 영역 (CDR) 영역을 지칭한다. 한 실시양태에서, 파라토프는 서열 1의 (i) (도메인 2의) HER3 아미노산 잔기 265-277 및 315 및 (ii) (도메인 4의) HER3 아미노산 잔기 571, 582-584, 596-597, 600-602, 609-615, 또는 그의 하위세트를 포함하는 입체형태적 에피토프에 결합하는 항체의 영역이다. 한 실시양태에서, 파라토프는 CDR 서열을 포함한 항체의 영역이다. 한 실시양태에서, 파라토프는 표 1에 열거된 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 파라토프는 HER3 잔기와 결합하는 적어도 하나의 아미노산 잔기를 포함한다: Asn266, Lys267, Leu268, Thr269, Gln271, Glu273, Pro274, Asn275, Pro276, His277, Asn315, Asp571, Pro583, His584, Ala596, Lys597. 한 실시양태에서, 파라토프는 HER3 잔기와 결합하는 적어도 하나의 아미노산 잔기를 포함한다: Tyr265, Lys267, Leu268, Phe270, Gly582, Pro583, Lys597, Ile600, Lys602, Glu609, Arg611, Pro612, Cys613, His614, Glu615. 당업자가 이해하게 되는 바와 같이, 임의의 항체의 파라토프 또는 그의 변이체는 본원에 열거된 방식 세트로 결정될 수 있다.
본원에 사용된 어구 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"은 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖거나 동일한 유전자 공급원으로부터 유래된, 항체, 항체 단편, 이중특이적 항체 등을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 또한, 이 용어는 단일 분자 조성물의 항체 분자의 제제를 의미한다. 모노클로날 항체 조성물은 특정한 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다.
본원에 사용된 어구 "인간 항체"는 프레임워크 영역 및 CDR 영역이 둘 다 인간 기원의 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는 항체를 포함한다. 또한, 항체가 불변 영역을 함유하면, 불변 영역은 또한 이러한 인간 서열, 예를 들어 인간 배선 서열, 또는 인간 배선 서열의 돌연변이 버전, 또는 인간 프레임워크 서열 분석으로부터 유래된 컨센서스 프레임워크 서열을 함유하는 항체 (예를 들어, 문헌 [Knappik et al., (2000) J Mol Biol 296:57-86]에 기재된 바와 같음)로부터 유래된다. 이뮤노글로불린 가변 도메인, 예를 들어, CDR의 구조 및 위치는 널리 공지된 넘버링 방식, 예를 들어 카바트 넘버링 방식, 코티아 넘버링 방식, 또는 카바트 및 코티아의 조합을 이용하여 정의될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services (1991), eds. Kabat et al.; Lazikani et al., (1997) J. Mol. Bio. 273:927-948); Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edit., NIH Publication no. 91-3242 U.S. Department of Health and Human Services; Chothia et al., (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., (1989) Nature 342:877-883; 및 Al-Lazikani et al., (1997) J. Mol. Biol. 273:927-948] 참조).
본 발명의 인간 항체는 인간 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이, 또는 안정성 또는 제조를 용이하게 하기 위한 보존적 치환)를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 어구 "인간 모노클로날 항체"는 프레임워크 및 CDR 영역이 둘 다 인간 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는 단일 결합 특이성을 나타내는 항체를 지칭한다. 한 실시양태에서, 인간 모노클로날 항체는 불멸화 세포에 융합된 인간 중쇄 트랜스진 및 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 비인간 동물, 예를 들어 트랜스제닉 마우스로부터 수득된 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생성된다.
본원에 사용된 어구 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 인간 항체, 예컨대 인간 이뮤노글로불린 유전자에 대한 트랜스제닉 또는 트랜스크로모소말 동물 (예를 들어, 마우스), 또는 이로부터 제조된 하이브리도마로부터 단리된 항체, 인간 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예를 들어 트랜스펙토마로부터 단리된 항체, 재조합의 조합형 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 인간 이뮤노글로불린 유전자 서열의 전부 또는 일부를 다른 DNA 서열로 스플라이싱하는 것을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 프레임워크 및 CDR 영역이 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는다. 그러나, 특정 실시양태에서, 이러한 재조합 인간 항체를 대상으로 하여 시험관내 돌연변이유발 (또는 인간 Ig 서열에 대해 트랜스제닉인 동물을 사용하는 경우에는 생체내 체세포 돌연변이유발)을 행할 수 있기 때문에, 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 인간 배선 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 이와 관련이 있지만, 생체내에서 인간 항체 배선 레퍼토리 내에 자연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다.
2개 물질 사이에 특이적 결합은 102M-1 이상, 5x102M-1 이상, 103M-1 이상, 5x103M-1 이상, 104M-1 이상, 5x104M-1 이상, 105M-1 이상, 5x105M-1 이상, 106M-1 이상, 5x106M-1 이상, 107M-1 이상, 5x107M-1 이상, 108M-1 이상, 5x108M-1 이상, 109M-1 이상, 5x109M-1 이상, 1010M-1 이상, 5x1010M-1 이상, 1011M-1 이상, 5x1011M-1 이상, 1012M-1 이상, 5x1012M-1 이상, 1013M-1 이상, 5x1013 M-1 이상, 1014M-1 이상, 5x1014M-1 이상, 1015M-1 이상 또는 5x1015M-1 이상의 평형 상수 (KA) (kon/koff)로의 결합을 의미한다.
어구 항체 (예를 들어, HER3 결합 항체)에 "특이적으로 (또는 선택적으로) 결합하는"은 단백질 및 다른 생물제제의 불균질 집단에서 동족 항원 (예를 들어, 인간 HER3)의 존재를 결정하는 결합 반응을 지칭한다. 상기 언급된 평형 상수 (KA) 뿐만 아니라, 본 발명의 HER3 결합 항체는 또한 전형적으로 5x10-2M 미만, 10-2M 미만, 5x10-3M 미만, 10-3M 미만, 5x10-4M 미만, 10-4M 미만, 5x10-5M 미만, 10-5M 미만, 5x10-6M 미만, 10-6M 미만, 5x10-7M 미만, 10-7M 미만, 5x10-8M 미만, 10-8M 미만, 5x10-9M 미만, 10-9M 미만, 5x10-10M 미만, 10-10M 미만, 5x10-11M 미만, 10-11M 미만, 5x10-12M 미만, 10-12M 미만, 5x10-13M 미만, 10-13M 미만, 5x10-14M 미만, 10-14M 미만, 5x10-15M 미만, 또는 10-15M 미만 또는 그보다 낮은 해리율 상수 (KD) (koff/kon)를 갖고, 비특이적 항원 (예를 들어, HSA)에 대한 결합에 대한 그의 친화도보다 적어도 2배 더 큰 친화도로 HER3에 결합한다.
한 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 본원에 기재되거나 당업자에 공지된 방법 (예를 들어, 비아코어 검정, ELISA, FACS, SET) (비아코어 인터내셔널 AB (Biacore International AB, 스웨덴 웁살라))을 이용하여 평가된 바와 같이 3000 pM 미만, 2500 pM 미만, 2000 pM 미만, 1500 pM 미만, 1000 pM 미만, 750 pM 미만, 500 pM 미만, 250 pM 미만, 200 pM 미만, 150 pM 미만, 100 pM 미만, 75 pM 미만, 10 pM 미만, 1 pM 미만의 해리 상수 (Kd)를 갖는다. 본원에 사용된 용어 "Kassoc" 또는 "Ka"는 특정한 항체-항원 상호작용의 회합률을 지칭하는 반면, 본원에 사용된 용어 "Kdis" 또는 "Kd"는 특정한 항체-항원 상호작용의 해리율을 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "KD"는 해리 상수를 지칭하고, Ka에 대한 Kd의 비율 (즉, Kd/Ka)로부터 구하며, 몰 농도 (M)로 표시된다. 항체에 대한 KD 값은 당업계에 널리 확립된 방법을 이용하여 결정할 수 있다. 항체의 KD를 결정하는 방법은 표면 플라즈몬 공명을 이용하거나 바이오센서 시스템, 예컨대 비아코어® 시스템을 이용하는 것이다.
본원에 사용된 용어 "친화도"는 단일 항원 부위에서 항체와 항원 사이의 상호작용의 강도를 지칭한다. 각각의 항원성 부위 내에서, 항체 "아암"의 가변 영역이 다수의 부위에서 항원과 약한 비공유 결합력을 통해 상호작용하고; 상호작용이 많을수록, 친화력이 강해진다.
본원에 사용된 용어 "결합력"은 항체-항원 복합체의 전반적인 안정성 또는 강도에 대한 유용한 척도를 지칭한다. 이는 항체 에피토프 친화도; 항원 및 항체 둘 다의 원자가; 및 상호작용 부분의 구조적 배열의 3가지 주요 인자에 의해 제어된다. 궁극적으로, 이들 인자는 항체의 특이성, 즉 특정한 항체가 정확한 항원 에피토프에 결합할 가능성을 정의한다.
본원에 사용된 용어 "원자가"는 폴리펩티드에서 잠재적 표적 결합 부위의 수를 지칭한다. 각각의 표적 결합 부위는 하나의 표적 분자 또는 표적 분자 상의 특정 부위 (즉, 에피토프)에 특이적으로 결합한다. 폴리펩티드가 하나 초과의 표적 결합 부위를 포함하는 경우에, 각각의 표적 결합 부위는 동일하거나 상이한 분자에 특이적으로 결합할 수 있다 (예를 들어, 상이한 분자, 예를 들어 상이한 항원, 또는 동일한 분자 상의 상이한 에피토프에 결합할 수 있음).
본원에 사용된 어구 "길항제 항체"는 HER3과 결합하고, HER3 신호전달의 생물학적 활성을 중화시키는, 예를 들어 포스포-HER3 또는 포스포-Akt 검정에서, 예를 들어 HER3 유도된 신호전달 활성을 감소시키고/거나, 저하시키고/거나, 억제하는 항체를 지칭한다. 검정의 예는 하기 실시예에서 보다 상세하게 기재된다. 따라서, 당업계에 공지된 및 본원에 기재된 방법론에 따라 결정된 바와 같이 이들 HER3 기능적 특성 (예를 들어, 생화학적, 면역화학적, 세포, 생리학적 또는 다른 생물학적 활성 등) 중 하나 이상을 "억제하는" 항체가 항체의 부재 하에 (예를 들어, 또는 비관련 특이성의 대조 항체가 존재하는 경우에) 나타나는 것과 비교하여 특정한 활성이 통계적으로 유의하게 감소하는 것과 관련이 있는 것으로 이해될 것이다. HER3 활성을 억제하는 항체는 측정된 파라미터의 적어도 10%, 적어도 50%, 80% 또는 90%만큼 통계적으로 유의한 감소를 일으키고, 특정 실시양태에서 본 발명의 항체는 세포 HER3 인산화 수준의 감소에 의해 증명된 바와 같이 HER3 기능적 활성을 95%, 98% 또는 99% 초과하여 억제할 수 있다.
어구 "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭한다 (예를 들어, HER3에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 HER3 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없음). 그러나, HER3에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 항원에 대해 교차 반응성을 가질 수 있다. 또한, 단리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다.
어구 "보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산 및 핵산 서열 둘 다에 적용된다. 특정한 핵산 서열과 관련하여, 보존적으로 변형된 변이체는 동일하거나 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 지칭하거나, 또는 핵산이 아미노산 서열을 코딩하지 않는 경우에는 본질적으로 동일한 서열을 지칭한다. 유전자 코드의 축중성 때문에, 다수의 기능적으로 동일한 핵산이 임의의 주어진 단백질을 코딩한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 코딩한다. 따라서, 코돈에 의해 알라닌이 지정되는 모든 위치에서, 상기 코돈은 코딩되는 폴리펩티드를 변경하지 않으면서, 기재된 임의의 상응하는 코돈으로 변경될 수 있다. 이러한 핵산 변이는 보존적으로 변형된 변이 중 하나인 "침묵 변이"이다. 폴리펩티드를 코딩하는 본원의 모든 핵산 서열은 또한 핵산의 모든 가능한 침묵 변이도 설명한다. 당업자는 핵산 내의 각각의 코돈 (통상적으로 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG, 및 통상적으로 트립토판에 대한 유일한 코돈인 TGG 제외)이 기능적으로 동일한 분자를 생성하도록 변형될 수 있음을 인지할 것이다. 따라서, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 각각의 침묵 변이는 각각의 기재된 서열에 내포된다.
폴리펩티드 서열의 경우, "보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산을 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환시키는, 폴리펩티드 서열에 대한 개별 치환, 결실 또는 부가를 포함한다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표가 당업계에 널리 공지되어 있다. 이러한 보존적으로 변형된 변이체는 본 발명의 다형성 변이체, 종간 상동체 및 대립유전자에 부가적인 것이고 이들을 제외하지 않는다. 하기 8개의 군은 서로에 대해 보존적 치환인 아미노산을 포함한다: 1) 알라닌 (A), 글리신 (G); 2) 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E); 3) 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q); 4) 아르기닌 (R), 리신 (K); 5) 이소류신 (I), 류신 (L), 메티오닌 (M), 발린 (V); 6) 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 트립토판 (W); 7) 세린 (S), 트레오닌 (T); 및 8) 시스테인 (C), 메티오닌 (M) (예를 들어, 문헌 [Creighton, Proteins (1984)] 참조). 일부 실시양태에서, 용어 "보존적 서열 변형"은 아미노산 서열을 함유하는 항체의 결합 특성에 유의하게 영향을 미치거나 이를 변경시키지 않는 아미노산 변형을 지칭하는데 사용된다.
용어 "교차-경쟁하다" 및 "교차-경쟁하는"은 항체 또는 다른 결합제가 표준 경쟁적 결합 검정에서 HER3에 대한 다른 항체 또는 결합제의 결합을 방해하는 능력을 의미하도록 본원에서 교환가능하게 사용된다.
항체 또는 다른 결합제가 HER3에 대한 또 다른 항체 또는 결합 분자의 결합을 방해할 수 있는 능력 또는 정도, 및 이에 의해 본 발명에 따라 교차-경쟁한다고 할 수 있는지 여부는 표준 경쟁 결합 검정을 이용하여 결정할 수 있다. 적합한 검정 중 하나는 표면 플라즈몬 공명 기술을 이용하여 상호작용의 정도를 측정할 수 있는 비아코어 기술 (예를 들어, 비아코어 3000 기기 (비아코어, 스웨덴 웁살라)를 사용함)의 이용을 포함한다. 교차-경쟁을 측정하기 위한 또 다른 검정은 ELISA-기반 접근법을 이용한다.
본원에 사용된 용어 "최적화된""은, 뉴클레오티드 서열이 생산 세포 또는 유기체, 일반적으로는 진핵 세포, 예를 들어 피키아(Pichia)의 세포, 트리코더마(Trichoderma)의 세포, 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO) 또는 인간 세포에 바람직한 코돈을 사용하여 아미노산 서열을 코딩하도록 변경된 것을 의미한다. 최적화된 뉴클레오티드 서열은 출발 뉴클레오티드 서열에 의해 본래 코딩되는 아미노산 서열 ("모" 서열이라고도 공지됨)을 완전하게 또는 가능한 한 많이 보유하도록 조작된다.
예를 들어 ELISA, 웨스턴 블롯 및 RIA를 비롯한 다양한 종의 HER3을 향한 항체의 결합 능력을 평가하기 위한 표준 검정이 당업계에 공지되어 있다. 적합한 검정을 실시예에서 상세하게 기재한다. 또한, 항체의 결합 동역학 (예를 들어, 결합 친화도)은 당업계에 공지된 표준 검정, 예컨대 비아코어 분석, 또는 FACS 상대 친화도 (스캐차드)에 의해 평가될 수 있다. HER3의 기능적 특성에 대한 항체의 효과를 평가하기 위한 검정 (예를 들어, Her 경로를 조정하는 수용체 결합 검정)은 실시예에서 추가로 상세하게 기재된다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여 어구 "동일한 퍼센트", 또는 "동일성 퍼센트"는 동일한 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 2개의 서열은, 비교 윈도우 또는 지정된 영역에 걸쳐 최대한 상응하도록 비교하고 정렬하여 하기 서열 비교 알고리즘 중 하나를 이용하거나 또는 수동 정렬 및 육안 검사에 의해 결정하는 경우, 2개의 서열이 명시된 백분율의 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드 (즉, 명시된 영역에 걸쳐서 또는 명시되지 않은 경우에는 전체 서열에 걸쳐서 60%의 동일성, 임의로는 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 동일성)를 가질 경우에 "실질적으로 동일한" 것이다. 임의로, 동일성은 적어도 약 50개 뉴클레오티드 (또는 10개 아미노산) 길이의 영역에 걸쳐, 또는 보다 바람직하게는 100개 내지 500개 또는 1000개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 (또는 20개, 50개, 200개 또는 그 초과의 아미노산) 길이에 걸쳐 존재한다.
서열 비교를 위해, 전형적으로 하나의 서열이 시험 서열과 비교되는 참조 서열로 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 이용하는 경우에, 시험 및 참조 서열을 컴퓨터에 입력하고, 필요한 경우에는 하위서열 좌표를 지정하고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터를 지정한다. 디폴트 프로그램 파라미터를 사용할 수 있거나, 또는 대안적인 파라미터를 지정할 수 있다. 이어서, 서열 비교 알고리즘은 프로그램 파라미터를 기반으로 하여 참조 서열에 대한 시험 서열의 서열 동일성 퍼센트를 계산한다.
본원에 사용된 "비교 윈도우"는 2개의 서열을 최적으로 정렬시킨 후에 서열을 인접 위치의 동일한 수의 참조 서열과 비교할 수 있는, 20 내지 600개, 통상적으로는 약 50 내지 약 200개, 보다 통상적으로는 약 100 내지 약 150개로 이루어진 군으로부터 선택된 인접한 위치의 수 중 임의의 하나의 절편에 대한 것을 포함한다. 비교를 위한 서열 정렬 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 예를 들어 문헌 [Smith and Waterman, (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c]의 국부 상동성 알고리즘, 문헌 [Needleman and Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48:443]의 상동성 정렬 알고리즘, 문헌 [Pearson and Lipman, (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444]의 유사성 검색 방법, 이들 알고리즘의 전산화 실행 (위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package)의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA, 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group, 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575)) 또는 수동 정렬 및 육안 검사 (예를 들어, 문헌 [Brent et al., (2003) Current Protocols in Molecular Biology] 참조)에 의해 수행될 수 있다.
서열 동일성 및 서열 유사성 퍼센트 결정에 적합한 알고리즘의 2가지 예는 각각 문헌 [Altschul et al., (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402; 및 Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410]에 기재된 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 미국 국립 생물 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)를 통해 공개적으로 입수가능하다. 상기 알고리즘은 먼저 데이터베이스 서열 내 동일한 길이의 워드와 정렬되는 경우에 어떤 양수 값의 역치 스코어 T에 매칭되거나 이를 충족시키는, 의문 서열 내의 길이 W의 짧은 워드들을 확인함으로써 높은 스코어의 서열 쌍 (HSP)을 확인하는 것을 포함한다. T는 이웃 워드 스코어 역치를 지칭한다 (문헌 [Altschul et al., 상기 문헌]). 이들 초기 이웃 워드 히트는 이것을 함유하는 더 긴 HSP를 찾는 검색을 개시하기 위한 시드로 작용한다. 워드 히트는 누적 정렬 스코어가 증가될 수 있는 한, 각각의 서열을 따라 양쪽 방향으로 연장된다. 누적 스코어는 뉴클레오티드 서열에 대해 파라미터 M (매칭 잔기의 쌍에 대한 보상 스코어; 항상 > 0) 및 N (미스매칭 잔기에 대한 페널티 스코어; 항상 < 0)을 사용하여 계산한다. 아미노산 서열의 경우에는 스코어링 매트릭스를 이용하여 누적 스코어를 계산한다. 누적 정렬 스코어가 그의 최대 달성 값으로부터 X의 양만큼 하락하거나; 하나 이상의 음의 값으로 스코어링된 잔기 정렬의 축적으로 인해 누적 스코어가 0 이하로 떨어지거나; 또는 어느 한쪽의 서열의 끝에 도달한 경우에, 각 방향으로의 워드 히트의 연장이 중지된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T 및 X는 정렬의 감도 및 비율을 결정한다. BLASTN 프로그램 (뉴클레오티드 서열의 경우)은 디폴트로서 워드길이 (W) 11, 기대값 (E) 10, M=5, N=-4 및 양쪽 가닥의 비교를 사용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 워드 길이 3, 및 기대값 (E) 10, 및 BLOSUM62 스코어링 매트릭스 (문헌 [Henikoff and Henikoff, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915] 참조) 정렬 (B) 50, 기대값 (E) 10, M=5, N=-4, 및 양쪽 가닥의 비교를 사용한다.
BLAST 알고리즘은 또한 2개의 서열 사이의 유사성에 대한 통계적 분석을 수행한다 (예를 들어, 문헌 [Karlin and Altschul, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787] 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 한 척도는 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 매칭이 우연히 발생할 확률을 나타내는 최소 합계 확률 (P(N))이다. 예를 들어, 핵산은 참조 핵산에 대한 시험 핵산의 비교에서의 최소 합계 확률이 약 0.2 미만, 보다 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우에 참조 서열과 유사한 것으로 간주된다.
2개의 아미노산 서열 사이의 동일성 퍼센트는 또한 PAM120 가중치 잔기 표, 갭 길이 페널티 12 및 갭 페널티 4를 이용하는 ALIGN 프로그램 (버전 2.0)에 혼입된 문헌 [E. Meyers and W. Miller, (1988) Comput. Appl. Biosci. 4:11-17]의 알고리즘을 이용하여 결정할 수 있다. 또한, 2개의 아미노산 서열 사이의 동일성 퍼센트는 GCG 소프트웨어 패키지 (www.gcg.com에서 이용가능함) 내의 GAP 프로그램에 혼입된 문헌 [Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:444-453]의 알고리즘을 이용하여, 블로섬(Blossom) 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 갭 가중치 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4, 및 길이 가중치 1, 2, 3, 4, 5 또는 6을 사용하여 결정할 수 있다.
상기 나타낸 서열 동일성 백분율 이외에, 2개의 핵산 서열 또는 폴리펩티드가 실질적으로 동일하다는 또 다른 표시는 제1 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드가 하기 기재된 바와 같이 제2 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드에 대해 생성된 항체와 면역학적으로 교차 반응성이라는 것이다. 따라서, 폴리펩티드는 전형적으로, 예를 들어 2개의 펩티드가 보존적 치환에 의해서만 상이한 경우에 제2 폴리펩티드와 실질적으로 동일하다. 2개의 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 또 다른 표시는, 2개의 분자 또는 이들의 상보체가 하기 기재된 바와 같이 엄격한 조건 하에 서로 혼성화된다는 것이다. 2개의 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 또 다른 표시는 동일한 프라이머를 사용하여 서열을 증폭시킬 수 있다는 것이다.
어구 "핵산"은 본원에서 용어 "폴리뉴클레오티드"와 교환가능하게 사용되고, 단일- 또는 이중-가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 그의 중합체를 지칭한다. 상기 용어는 공지의 뉴클레오티드 유사체 또는 변형된 백본 잔기 또는 연결부를 함유하고, 합성, 자연 발생 및 비-자연 발생이며, 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 가지며, 참조 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 핵산을 포함한다. 이러한 유사체의 예는 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드, 펩티드-핵산 (PNA)을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
달리 나타내지 않는 한, 특정한 핵산 서열은 또한 명시적으로 나타낸 서열 뿐만이 아니라 그의 보존적으로 변형된 변이체 (예를 들어, 축중성 코돈 치환) 및 상보적 서열까지도 함축적으로 포함한다. 구체적으로, 하기 상세하게 기재된 바와 같이, 축중성 코돈 치환은 1개 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 제3의 위치가 혼합-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성하여 달성될 수 있다 (문헌 [Batzer et al., (1991) Nucleic Acid Res. 19:5081; Ohtsuka et al., (1985) J. Biol. Chem. 260:2605-2608; 및 Rossolini et al., (1994) Mol. Cell. Probes 8:91-98]).
어구 "작동가능하게 연결된"은 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, DNA) 절편 사이의 기능적 관계를 지칭한다. 전형적으로, 이것은 전사되는 서열에 대한 전사 조절 서열의 기능적 관계를 지칭한다. 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서 서열이 적절한 숙주 세포 또는 다른 발현 시스템에서 코딩 서열의 전사를 자극하거나 조정하는 경우, 이것은 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 일반적으로, 전사되는 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터 전사 조절 서열은 전사되는 서열에 물리적으로 인접하여 위치하며, 즉 이들은 시스-작용성이다. 그러나, 일부 전사 조절 서열, 예컨대 인핸서는 이것이 전사를 증진시키는 코딩 서열에 물리적으로 인접하거나 근접하여 위치할 필요가 없다.
용어 "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하도록 본원에서 교환가능하게 사용된다. 상기 용어는 자연 발생 아미노산 중합체 및 비-자연 발생 아미노산 중합체 뿐만 아니라, 1개 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산의 인공 화학적 모방체인 아미노산 중합체에 적용된다. 달리 나타내지 않는 한, 특정한 폴리펩티드 서열은 또한 그의 보존적으로 변형된 변이체도 함축적으로 포함한다.
용어 "대상체"는 인간 및 비-인간 동물을 포함한다. 비-인간 동물은 모든 척추동물, 예를 들어 포유동물 및 비-포유동물, 예컨대 비-인간 영장류, 양, 개, 소, 닭, 양서류 및 파충류를 포함한다. 언급되는 경우를 제외하고, 용어 "환자" 또는 "대상체"는 본원에서 교환가능하게 사용된다.
용어 "항암제"는 세포독성제, 화학요법제, 방사선요법 및 방사선치료제, 표적화 항암제, 및 면역요법제를 포함하여, 세포 증식성 장애, 예컨대 암을 치료하는데 사용될 수 있는 임의의 작용제를 의미한다.
"종양"은 신생물성 세포 성장 및 증식 (악성이든 또는 양성이든), 및 모든 전암성 및 암성 세포 및 조직을 지칭한다.
용어 "항-종양 활성"은 종양 세포 증식, 생존력, 또는 전이성 활성의 비율의 감소를 의미한다. 항-종양 활성을 보여주는 가능한 방식은 요법 동안 비정상적인 세포의 성장 속도의 감소 또는 종양 크기 안정성 또는 감소를 보여주는 것이다. 이러한 활성은 이종이식편 모델, 동종이식편 모델, MMTV 모델, 및 항-종양 활성을 조사하기 위한 당업계에 공지된 다른 모델을 포함하나 이에 제한되지 않는, 승인된 시험관내 또는 생체내 종양 모델을 사용하여 평가될 수 있다.
용어 "악성종양"은 비-양성 종양 또는 암을 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "암"은 탈조절되거나 탈제어된 세포 성장을 특징으로 하는 악성종양을 포함한다. 예시적인 암은 암종, 육종, 백혈병 및 림프종을 포함한다. 용어 "암"은 원발성 악성 종양 (예를 들어, 그 세포가 대상체의 본래 종양의 부위 이외의 다른 신체 내의 부위로 이동하지 않은 종양) 및 속발성 악성 종양 (예를 들어, 전이, 즉 종양 세포가 본래 종양의 부위와 상이한 2차 부위로 이동함으로써 발생하는 종양)을 포함한다.
본 발명의 다양한 측면은 하기 섹션 및 서브섹션에서 보다 상세하게 기재된다.
HER 수용체의 구조 및 활성화 메카니즘
모든 4가지 HER 수용체는 세포외 리간드-결합 도메인, 단일 트랜스-막 도메인 및 세포질 티로신 키나제-함유 도메인을 갖는다. HER3의 키나제 도메인은 중요 아미노산의 치환을 함유하여 키나제 활성이 결핍되어 있더라도 HER 수용체의 세포내 티로신 키나제 도메인은 고도로 보존된다 (문헌 [Guy et al., (1994): PNAS 91, 8132-8136]). HER 수용체의 리간드-유도된 이량체화는 키나제의 활성화, C-말단 꼬리에서의 티로신 잔기 상의 수용체 인산전이에 이어 세포내 신호전달 이펙터의 동원 및 활성화를 유도한다 (문헌 [Yarden and Sliwkowski, (2001) Nature Rev 2, 127-137; Jorissen et al., (2003) Exp Cell Res 284, 31-53]).
HER의 세포외 도메인의 결정 구조는 리간드-유도된 수용체 활성화의 과정에 대한 일부 견해를 제공하였다 (문헌 [Schlessinger, (2002) Cell 110, 669-672]). 각각의 HER 수용체의 세포외 도메인은 4가지 서브도메인으로 이루어진다: 서브도메인 I 및 III은 리간드-결합 부위의 형성에 협력하는 반면, 서브도메인 II (및 아마도 또한 서브도메인 IV)는 직접적인 수용체-수용체 상호작용을 통해 수용체 이량체화에 참여한다. 리간드-결합된 HER1의 구조에서, 서브도메인 II의 β 헤어핀 (이량체화 루프로 지칭됨)은 수용체 이량체화를 매개하는 파트너 수용체의 이량체화 루프와 상호작용한다 (문헌 [Garrett et al., (2002) Cell 110, 763-773; Ogiso et al., (2002) Cell 110, 775-787]). 대조적으로, 불활성 HER1, HER3 및 HER4의 구조에서, 이량체화 루프는 리간드의 부재 하에 수용체 이량체화를 방지하는 서브도메인 IV와의 분자내 상호작용에 참여한다 (문헌 [Cho and Leahy, (2002) Science 297, 1330-1333; Ferguson et al., (2003) Mol Cell 12, 541-552; Bouyan et al., (2005) PNAS102, 15024-15029]). HER2의 구조는 HER 사이에서 특징적이다. 리간드의 부재 하에, HER2는 다른 HER 수용체와 상호작용할 수 있는 돌출 이량체화 루프를 갖는 HER1의 리간드-활성화 상태를 닮은 입체형태를 갖는다 (문헌 [Cho et al., (2003) Nature 421, 756-760; Garrett et al., (2003) Mol Cell 11, 495-505]). 이는 HER2의 증진된 이종이량체화 능력을 설명할 수 있다.
HER 수용체 결정 구조가 HER 수용체 동종- 및 이종이량체화에 대한 모델을 제공하더라도, 다른 것보다 일부 HER 동종- 및 이종이량체의 보급에 대한 배경 (문헌 [Franklin et al., (2004) Cancer Cell 5, 317-328]) 뿐만 아니라 수용체 이량체화 및 자가억제에서 각각의 도메인의 입체형태적 역할 (문헌 [Burgess et al., (2003) Mol Cell 12, 541-552; Mattoon et al., (2004) PNAS101, 923-928])은 다소 명확하지 않다. 하기 기재되는 바와 같이, HER3 X선 결정 구조는 보다 많은 견해를 제공한다.
HER3 구조 및 입체형태적 에피토프
항원 결합 단백질, 예를 들어 항-HER3 항체가 결합하는 입체형태적 에피토프가 본원에 제공된다. 최초로, 항체와 복합체를 형성한 HER3의 세포외 도메인의 말단절단 형태 (잔기 20-640)의 3차원의 구조가 밝혀졌다. HER3-MOR09823 Fab 복합체 및 HER3-MOR09825는 각각 3.2Å 및 3.4 Å 해상도에서 결정되었고, 도 5a에 도시하였다. 본 개시문은 또한 불활성 상태의 HER3에 결합하고, 수용체를 불활성 상태로 안정화시키는 항체 또는 그의 단편을 최초로 보여준다. 본 발명의 항체는 또한 HER3 리간드, 예컨대 뉴레귤린의 HER3 수용체와의 공동 결합을 허용한다.
이론을 제공할 필요는 없지만, 작용 메카니즘에 대한 한가지 가능한 모델은 HER3가 전형적으로 불활성 (폐쇄, 구속) 또는 활성 (개방) 상태로 존재한다는 것이다. 리간드 결합은 HER3이 이종이량체 파트너와 결합하여 하류 신호전달을 활성화시킬 수 있는 활성 (개방) 상태로 존재하도록 입체형태적 변화를 유도한다. 항체, 예컨대 MOR09823은 불활성 (구속) 상태의 HER3에 결합하지만 리간드 결합 부위를 차단하지 않는다. 항체, 예컨대 MOR09823은 HER3의 활성 입체형태로의 전이를 위해 필요한 리간드 유도된 구조적 재배열을 방지함으로써 HER3을 억제하고, 이에 의해 신호 전달이 방지된다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 단편은 불활성 (구속) 상태의 HER3에 결합하지만 리간드 결합 부위를 차단하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 HER3의 활성 입체형태로의 전이를 위해 필요한 리간드-유도된 구조적 재배열을 방지함으로써 HER3을 억제하고, 이에 의해 신호 전달이 방지된다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 HER3 수용체를 불활성 상태 또는 입체형태로 안정화시킨다 (직접적으로 유지하거나, 잠그거나, 구속하거나, 지속하거나, 우선적으로 결합하거나 또는 선호함). 한 실시양태에서, 불활성 HER3 수용체는 이것이 세포 표면 HER3 수용체의 손실을 유도하도록 우선적인 내재화 또는 분해에 영향을 받기 쉬울 수 있다. 실시예 섹션에 제시된 생물학적 데이터는 이러한 실시양태를 뒷받침한다.
HER3의 결정은 적합한 숙주 세포에서 HER3 또는 그의 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 발현시킨 후에 관련 HER3 표적화 Fab의 존재 하에 정제된 단백질(들)을 결정화시켜 제조될 수 있다. 바람직하게는 HER3 폴리펩티드는 세포외 도메인 (인간 폴리펩티드 또는 그의 말단절단된 버전의 아미노산 20 내지 640, 바람직하게는 아미노산 20-640 포함)을 함유하지만 막횡단 및 세포내 도메인이 결핍되어 있다.
HER3 폴리펩티드는 또한 예를 들어 추출 및 정제에서 도움을 주기 위해 융합 단백질로 생산될 수 있다. 융합 단백질 파트너의 예는 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST), 히스티딘 (HIS), 헥사히스티딘 (6HIS), GAL4 (DNA 결합 및/또는 전사 활성화 도메인) 및 베타-갈락토시다제를 포함한다. 또한, 융합 단백질 서열의 제거를 허용하기 위해 융합 단백질 파트너과 관심 단백질 서열 사이에 단백질분해 절단 부위를 포함하는 것이 또한 편리할 수 있다.
발현 후에, 단백질은 예를 들어 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피 및/또는 겔 여과에 의해 정제되고/거나 농축될 수 있다.
단백질(들)은 본원에 기재된 기술을 이용하여 결정화될 수 있다. 통상적으로, 결정화 과정에서, 단백질 용액을 함유하는 점적액을 결정화 완충제와 혼합하고, 밀봉된 용기에서 평형화되도록 한다. 평형은 공지된 기술, 예컨대 "행잉 드롭(hanging drop)" 또는 "시팅 드롭(sitting drop)" 방법에 의해 달성될 수 있다. 이러한 방법에서, 점적액은 훨씬 더 큰 결정화 완충제의 저장소 위에 매달리거나 또는 옆에 위치하고, 평형은 증기 확산을 통해 달성된다. 대안적으로, 평형은 다른 방법에 의해, 예를 들어 오일 하에서 반투과성 막을 통해, 또는 자유-인터페이스 확산에 의해 일어날 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Chayen et al., (2008) Nature Methods 5, 147 - 153] 참조).
결정이 수득되면, 구조를 공지된 X선 회절 기술에 의해 해석할 수 있다. 다수의 기술은 화학적으로 변형된 결정, 예컨대 상을 근사화시키기 위한 중원자 유도체화에 의해 변형된 것을 이용한다. 실제로, 결정은 중금속 원자 염 또는 유기금속 화합물, 예를 들어 납 클로라이드, 금 티오말레이트, 티메로살 또는 우라닐 아세테이트 (이는 결정을 통해 확산될 수 있음)를 함유하는 용액에 침치되고, 단백질의 표면에 결합한다. 이어서, 결합된 중금속 원자(들)의 위치(들)는 침지된 결정의 X선 회절 분석에 의해 결정될 수 있다. 결정의 원자 (산란 중심)에 의해 X선의 단색 빔의 회절에서 수득한 패턴은 수학 방정식으로 해석하여 수학적 좌표를 제공할 수 있다. 회절 데이터를 이용하여 결정의 반복 단위의 전자 밀도 지도를 계산한다. 상 정보를 수득하는 또 다른 방법은 분자 대체로 공지된 기술을 이용하는 것이다. 이러한 방법에서, 회전 및 번역 알고리즘은 관련된 구조로부터 유래된 검색 모델에 적용되어 관심 단백질에 대한 대략적인 배향을 생성한다 (문헌 [Rossmann, (1990) Acta Crystals A 46, 73-82] 참조). 전자 밀도 지도는 결정의 단위 셀 내에 개별 원자의 위치를 확립하는데 사용된다 (문헌 [Blundel et al., (1976) Protein Crystallography, Academic Press]).
본 개시문은 최초로 HER3 및 항-HER3 항체의 Fab의 3차원 구조를 기재한다. HER3의 세포외 도메인의 대략적인 도메인 경계는 하기와 같다; 도메인 1: 아미노산 20-207; 도메인 2: 아미노산 208-328; 도메인 3: 아미노산 329-498; 및 도메인 4: 아미노산 499-642. HER3 및 항체의 3차원 구조는 또한 잠재적 HER3 조절제를 위한 표적 결합 부위의 확인을 허용한다. 바람직한 표적 결합 부위는 HER3의 활성화에 관련된 것이다. 한 실시양태에서, 표적 결합 부위는 HER3의 도메인 2 및 도메인 4 내에 위치한다. 따라서 도메인 2 또는 도메인 4, 및 바람직하게는 도메인 둘 다에 결합하는 항체 또는 그의 단편은 도메인이 서로 해리되는 것을 방지하거나 또는 도메인의 상대적 위치를 변형시킴으로써 HER3 활성화를 조절할 수 있다. 따라서 도메인 2 또는 도메인 4 내의 아미노산 잔기에 대한 항체 또는 그의 단편의 결합은 단백질이 활성화를 방지하는 입체형태를 채택하도록 할 수 있다. 본 개시문은 또한 최초로 HER3 리간드, 예컨대 뉴레귤린과 공동으로 결합할 수 있는 항체 또는 그의 단편을 보여준다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 항체 또는 그의 단편이 보조수용체 (HER1, HER2 및 HER4를 포함하나 이에 제한되지는 않음)와 HER3의 상호작용을 방지하도록 HER3의 특정 입체형태적 상태를 인식한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 HER3 수용체를 불활성 또는 폐쇄된 상태로 안정화시킴으로써 보조수용체와 HER3의 상호작용을 방지한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 HER3의 도메인 2 및 도메인 4 내의 아미노산 잔기에 결합함으로써 HER3 수용체를 안정화시킨다. 이러한 불활성 상태에서, 도메인 2 내에 위치한 이량체화 루프는 노출되지 않고, 이에 따라 다른 보조수용체 (HER1, HER2 및 HER4를 포함하나 이에 제한되지는 않음)와의 이량체화에 이용될 수 없다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 서열 1의 (i) (도메인 2의) HER3 아미노산 잔기 265-277 및 315 및 (ii) (도메인 4의) HER3 아미노산 잔기 571, 582-584, 596-597, 600-602, 609-615, 또는 그의 하위세트를 포함하는 입체형태적 에피토프를 갖는 인간 HER3 단백질에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 서열 1의 (도메인 2의) 아미노산 잔기 265-277 및 315 및 (ii) (도메인 4의) HER3 아미노산 잔기 571, 582-584, 596-597, 600-602, 609-615 내에 있거나 또는 이와 중첩되는 아미노산에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 서열 1의 (도메인 2의) 아미노산 잔기 265-277 및 315 및 (ii) (도메인 4의) HER3 아미노산 잔기 571, 582-584, 596-597, 600-602, 609-615, 또는 그의 하위세트 내의 아미노산 (및/또는 이로 이루어진 아미노산 서열)에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 입체형태적 에피토프에 결합하여 이것이 도메인 2 및 도메인 4의 이동성을 제한하도록 하고, 이것을 불활성 또는 폐쇄된 입체형태로 안정화시킨다. 활성 입체형태 형성의 실패는 신호 전달 활성화의 실패로 이어진다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 이것이 도메인 2 내의 이량체화 루프를 가리도록 입체형태적 에피토프에 결합하며, 이에 의해 이는 수용체-수용체 상호작용에 이용할 수 없게 된다. 동종- 또는 이종이량체 형성의 실패는 신호 전달 활성화의 실패로 이어진다.
또 다른 측면에서, 항체 또는 그의 단편은 HER 수용체, 예컨대 HER3 수용체의 입체형태적 에피토프에 결합한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 HER3 수용체를 불활성 상태로 안정화시킨다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 활성 상태의 HER3 수용체에 결합하여, 이를 불활성 상태로서 불활성 상태로 유도한다. 따라서, 항체 또는 그의 단편은 활성 또는 불활성 상태의 HER3에 결합할 수 있으나, 불활성 상태의 형성을 선호하고, HER3의 활성 상태를 불활성 상태로 유도하여, 신호 전달을 활성화시키는데 실패하도록 한다.
또 다른 측면에서, 항체 또는 그의 단편은 HER 수용체, 예컨대 HER3 수용체의 입체형태적 에피토프에 결합하며, 여기서 항체 또는 그의 단편의 결합은 HER3 수용체를 불활성 상태로 안정화시켜 HER3 수용체가 보조수용체와 이량체화되어 수용체-수용체 복합체를 형성하는데 실패하도록 한다. 수용체-수용체 복합체 형성의 실패는 리간드-의존성 및 리간드-비의존성 신호 전달의 활성화를 둘 다 방지한다.
또 다른 측면에서, 항체 또는 그의 단편은 HER 수용체, 예컨대 HER3 수용체의 입체형태적 에피토프에 결합하며, 여기서 HER3 수용체에 대한 항체 또는 그의 단편의 결합은 보조수용체와의 이량체화를 허용하여 불활성 수용체-수용체 복합체를 형성한다. 불활성 수용체-수용체 복합체의 형성은 리간드-비의존성 신호 전달의 활성화를 방지한다. 예를 들어, 리간드-비의존성 신호 전달에서, HER3은 불활성 상태로 존재할 수 있으나, HER2의 과다발현은 HER2-HER3 복합체 형성을 일으키지만, 이들 생성된 복합체는 불활성이고, 리간드-비의존성 신호 전달의 활성화를 방지한다.
도시된 구조는 또한 항체 또는 그의 단편 (예를 들어, MOR09823)의 HER3과의 상호작용 인터페이스를 위한 특정 코어 HER3 아미노산 잔기의 확인을 허용한다. 이는 MOR09823 단백질 VH 쇄의 5Å 내에 있는 잔기로 정의되었다. 코어 잔기는 하기와 같다: Asn266, Lys267, Leu268, Thr269, Gln271, Glu273, Pro274, Asn275, Pro276, His277, Asn315, Asp571, Pro583, His584, Ala596, Lys597.
구조는 또한 항체 또는 그의 단편 (예를 들어, MOR09823)과의 상호작용 인터페이스를 위한 경계 HER3 아미노산 잔기를 잔기를 확인하는데 사용될 수 있었다. 이들 잔기는 MOR09823 단백질 VH 쇄로부터 5-8Å에 있는 HER3 잔기였다. 경계 잔기는 하기와 같다: Pro262, Val264, Tyr265, Phe270, Leu272, Thr278, Lys314, Gly316, Glu321, Asn566, Ser568, Gly569, Ser570, Thr572, Arg580, Asp581, Gly582, Gly595, Gly598, Ile600.
도시된 구조는 또한 항체 또는 그의 단편 (예를 들어, MOR09823)의 HER3과의 상호작용 인터페이스를 위한 특정 코어 HER3 아미노산 잔기의 확인을 허용한다. 이는 MOR09823 단백질 VL 쇄의 5Å 내에 있는 잔기로 정의되었다. 코어 잔기는 하기와 같다: Tyr265, Lys267, Leu268, Phe270, Gly582, Pro583, Lys597, Ile600, Lys602, Glu609, Arg611, Pro612, Cys613, His614, Glu615.
구조는 또한 항체 또는 그의 단편 (예를 들어, MOR09823)과의 상호작용 인터페이스를 위한 경계 HER3 아미노산 잔기를 잔기를 확인하는데 사용될 수 있었다. 이들 잔기는 MOR09823 단백질 VL 쇄로부터 5-8Å에 있는 HER3 잔기였다. 경계 잔기는 하기와 같다: Asn266, Thr269, Asp571, Arg580, Asp581, His584, Pro590, Ala596, Pro599, Tyr601, Tyr603, Asp605, Gln607, Cys610, Asn616, Cys617, Cys621, Gly623, Pro624.
각각 표 11 및 12 (MOR09823) 및 표 13 및 14 (MOR09825)에서 볼 수 있는 바와 같이, 중쇄는 주로 도메인 4의 아미노산 잔기와 보다 적은 상호작용을 하면서 에피토프의 도메인 2 내의 아미노산 잔기에 대한 항원 결합 단백질의 결합에 관련되는 반면, 경쇄는 주로 도메인 2의 아미노산 잔기와 보다 적은 상호작용을 하면서 에피토프의 도메인 4 내의 아미노산 잔기에 대한 결합에 관련된다.
이에 따라, 당업자는 본 교시가 주어지면 HER3에 결합하는 항원 결합 단백질의 능력을 과도하게 방해하지 않으면서 항원 결합 단백질의 어떠한 잔기 및 영역이 변화될 수 있는지 예측할 수 있다.
코어 상호작용 인터페이스 아미노산은 HER3 파트너 단백질로부터 5Å 이내의 적어도 하나의 원자를 갖는 모든 아미노산 잔기인 것으로 결정되었다. 5Å은 원자가 반 데르 발스 반경 플러스 가능한 물-매개 수소 결합 내에 있도록 하는 코어 영역 컷오프 거리로서 선택되었다. 경계 상호작용 인터페이스 아미노산은 HER3 파트너 단백질로부터 8Å 이내의 적어도 하나의 원자를 갖지만 코어 상호작용 목록에 포함되지 않은 모든 아미노산 잔기인 것으로 결정되었다.
일부 실시양태에서, 상기 잔기 중 어느 것에 결합하거나, 이를 포함하거나 또는 이와 MOR09823의 상호작용을 방지하는 임의의 항원 결합 단백질은 HER3에 결합하거나 이를 중화시키는데 이용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 하기 HER3 잔기 (서열 1) 중 적어도 하나에 결합하거나 이와 상호작용한다: Asn266, Lys267, Leu268, Thr269, Gln271, Glu273, Pro274, Asn275, Pro276, His277, Asn315, Asp571, Pro583, His584, Ala596, Lys597. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 하기 HER3 잔기 (서열 1) 중 적어도 하나에 결합하거나 이와 상호작용한다: Tyr265, Lys267, Leu268, Phe270, Gly582, Pro583, Lys597, Ile600, Lys602, Glu609, Arg611, Pro612, Cys613, His614, Glu615. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 하기 HER3 잔기 (서열 1) 중 적어도 하나에 결합하거나 또는 이와 상호작용한다: Asn266, Lys267, Leu268, Thr269, Gln271, Glu273, Pro274, Asn275, Pro276, His277, Asn315, Asp571, Pro583, His584, Ala596, Lys597, Tyr265, Lys267, Leu268, Phe270, Gly582, Pro583, Lys597, Ile600, Lys602, Glu609, Arg611, Pro612, Cys613, His614, Glu615. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 하기 HER3 잔기 (서열 1)의 조합에 결합하거나 이와 상호작용한다: Asn266, Lys267, Leu268, Thr269, Gln271, Glu273, Pro274, Asn275, Pro276, His277, Asn315, Asp571, Pro583, His584, Ala596, Lys597, Tyr265, Lys267, Leu268, Phe270, Gly582, Pro583, Lys597, Ile600, Lys602, Glu609, Arg611, Pro612, Cys613, His614, Glu615. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 하기 HER3 잔기 (서열 1)의 전부에 결합하거나 이와 상호작용한다: Asn266, Lys267, Leu268, Thr269, Gln271, Glu273, Pro274, Asn275, Pro276, His277, Asn315, Asp571, Pro583, His584, Ala596, Lys597, Tyr265, Lys267, Leu268, Phe270, Gly582, Pro583, Lys597, Ile600, Lys602, Glu609, Arg611, Pro612, Cys613, His614, Glu615. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 상기 잔기 중 하나 이상의 5 옹스트롬 내에 있다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 상기 잔기 중 하나 이상으로부터 5 내지 8 옹스트롬이다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 상기 잔기 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50개와 상호작용하거나, 차단하거나 또는 그의 8 옹스트롬 내에 있다.
HER3 및 HER3:MOR09823의 복합체에 대한 3D 구조의 유용성은 예를 들어 다른 HER3 항체를 보다 상세하게 조사하기 위한 프레임워크를 제공한다. HER3의 3D 구조는 모노클로날 항체에 대한 에피토프의 맵핑 및 그의 작용 방식의 추론을 허용하는데, 이는 일부는 세포 성장을 억제하고, 일부는 세포 성장을 자극하고, 다른 것은 세포 성장에 대해 영향을 미치지 않기 때문이다. MOR09823에 대한 입체형태적 에피토프는 HER3의 도메인 2 및 4에 위치하였다. 이 수용체의 3D 구조의 유용성은 이들 억제제의 정확한 메카니즘의 결정 및 HER3 수용체 기능을 방해하는 새로운 접근법의 설계를 용이하게 할 것이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 MOR09823과 동일한 입체형태 에피토프에 결합한다.
일부 실시양태에서, 표 1에 열거된 항체 중 어느 것에 의해 결합된 입체형태적 에피토프가 특히 유용하다. 특정 실시양태에서, HER3 입체형태적 에피토프는 HER3에 결합하는 항체 또는 그의 단편을 단리하는데 이용될 수 있다. 특정 실시양태에서, HER3 입체형태적 에피토프는 HER3에 결합하는 항체 또는 그의 단편을 생성하는데 이용될 수 있다. 특정 실시양태에서, HER3 입체형태적 에피토프는 HER3 입체형태적 에피토프에 결합하는 항체 또는 그의 단편을 생성하기 위한 면역원으로 이용될 수 있다. 특정 실시양태에서, HER3 입체형태적 에피토프는 동물에게 투여될 수 있고, 이후에 HER3에 결합하는 항체는 이 동물로부터 수득될 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체와 접촉하거나 항체에 의해 매립되는 잔기를 함유하는 도메인(들)/영역(들)은 HER3 (예를 들어, 야생형 항원) 내의 특정 잔기를 돌연변이시키고, 항체 또는 그의 단편이 돌연변이된 또는 변이체 HER3 단백질에 결합할 수 있는지 여부를 결정하거나 또는 야생형으로부터의 친화도의 변화를 측정하여 확인할 수 있다. 다수의 개별 돌연변이를 만들어 결합에서 직접적인 역할을 수행하거나 또는 돌연변이가 항체와 항원 사이의 결합에 영향을 미칠 수 있도록 항체와 충분하게 인접한 잔기를 확인할 수 있다. 이들 아미노산에 대한 지식으로부터, 항체와 접촉하거나 항체에 의해 매립되는 잔기를 함유하는 항원 (HER3)의 도메인(들) 또는 영역(들)이 설명될 수 있다. 공지된 기술, 예컨대 알라닌-스캐닝을 이용하는 돌연변이유발은 기능상 적절한 에피토프를 정의하는 것을 도울 수 있다. 아르기닌/글루탐산 스캐닝 프로토콜을 이용하는 돌연변이유발이 또한 이용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Nanevicz et al., (1995), J. Biol. Chem. 270(37):21619-21625 및 Zupnick et al., (2006), J. Biol. Chem. 281(29):20464-20473] 참조). 일반적으로, 아르기닌 및 글루탐산은 야생형 폴리펩티드 내의 아미노산을 치환하고 (전형적으로 개별적으로), 이는 이들 아미노산이 하전되고 부피가 커서 돌연변이가 도입되는 항원의 영역에서 항원 결합 단백질과 항원 사이의 결합을 파괴할 가능성을 갖기 때문이다. 야생형 항원 내에 존재하는 아르기닌은 글루탐산으로 교체된다. 다양한 이러한 개별 돌연변이체를 얻고, 수집한 결합 결과를 결합에 영향을 미치는 잔기가 무엇인지 결정하기 위해 분석할 수 있다. 일련의 돌연변이체 HER3 항원을 생성할 수 있고, 여기서 각각의 돌연변이체 항원은 단일 돌연변이를 가졌다. 다양한 HER3 항체 또는 그의 단편을 갖는 각각의 돌연변이체 HER3 항원의 결합을 측정하고, 선택된 항체 또는 그의 단편이 야생형 HER3 (서열 1)에 결합하는 능력을 비교할 수 있다.
본원에 사용된 항체 또는 그의 단편과 돌연변이체 또는 변이체 HER3 사이의 결합의 변경 (예를 들어, 감소 또는 증가)은 항원 결합 단백질의 결합 친화도의 변화 (예를 들어, 하기 실시예에 기재된 비아코어 시험 또는 비드 기반 검정과 같은 공지의 방법에 의해 측정되는 바와 같음), EC50의 변화, 및/또는 총 결합 능력의 변화 (예를, 들어 감소) (예를 들어, 항원 결합 단백질 농도 대 항원 농도의 플롯에서 B최대의 감소에 의해 증명됨)가 존재함을 의미한다. 결합의 유의한 변경은 돌연변이된 잔기가 항체 또는 그의 단편에 대한 결합에 관련된다는 것을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 결합의 유의한 감소는 항체 또는 그의 단편 및 돌연변이체 HER3 항원 사이의 결합 친화도, EC50 및/또는 능력이 항체 또는 그의 단편 및 야생형 HER3 (예를 들어, 서열 1) 사이의 결합과 비교하여 10% 초과, 20% 초과, 40% 초과, 50% 초과, 55% 초과, 60% 초과, 65% 초과, 70% 초과, 75% 초과, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과 또는 95% 초과하여 감소되는 것을 의미한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편의 결합은 야생형 HER3 단백질 (예를 들어, 서열 1)과 비교하여 1개 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과)의 돌연변이를 갖는 돌연변이체 HER3 단백질의 경우에 유의하게 감소 또는 증가한다.
서열 1에 제시된 야생형 서열에 대한 변이체 형태를 참조하더라도, HER3의 대립유전자 또는 스플라이스 변이체에서 아미노산이 상이할 수 있음이 이해될 것이다. 이러한 대립유전자 형태의 HER3에 대해 유의하게 변경된 결합 (예를 들어, 보다 낮은 또는 보다 높은 결합)을 나타내는 항체 또는 그의 단편이 또한 고려된다.
항체의 일반적인 구조적 측면 뿐만 아니다, 파라토프와 에피토프 사이의 보다 특정한 상호작용이 구조적 접근법을 통해 조사될 수 있다. 한 실시양태에서, CDR의 구조는 파라토프에 기여하며, 이를 통해 항체가 에피토프에 결합할 수 있다. 이러한 파라토프의 형태는 다수의 방식으로 결정될 수 있다. 종래의 구조적 조사 접근법, 예컨대 NMR 또는 x선 결정학이 이용될 수 있다. 이러한 접근법은 파라토프 단독 또는 에피토프에 결합되어 있는 파라토프의 형태를 조사할 수 있다. 대안적으로, 분자 모델이 인 실리코 생성될 수 있다. 구조는 상업적 패키지, 예컨대 엑셀리스(Accelrys) (캘리포니아주 샌디에고)로부터의 InsightII 모델링 패키지의 도움으로 상동성 모델링을 통해 생성될 수 있다. 간략하게, 조사될 항체의 서열을이용하여 공지된 구조의 단백질의 데이터베이스, 예컨대 단백질 데이터 뱅크를 검색할 수 있다. 공지된 구조를 갖는 상동 단백질을 확인한 후에, 이들 상동 단백질을 모델링 주형으로 사용한다. 각각의 가능한 주형을 정렬시킬 수 있으며, 이에 따라 주형 사이의 서열 정렬을 기반으로 한 구조가 생산된다. 이어서, 미지의 구조를 갖는 항체의 서열을 이들 주형과 정렬시켜 미지의 구조를 갖는 항체에 대한 분자 모델을 생성할 수 있다. 당업자가 이해하게 되는 바와 같이, 이러한 인 실리코 구조를 생성하기 위한 다수의 대안적인 방법이 존재하며, 이들 중 임의의 것이 이용될 수 있다. 예를 들어, QUANTA (폴리젠 코포레이션(Polygen Corp.), 매사추세츠주 월섬) 및 CHARM (문헌 [Brooks et al., (1983), J. Comp. Chem. 4:187])을 이용하는 허여된 미국 특허 번호 5,958,708 (Hardman et al.) (그의 전체내용이 본원에 참고로 포함됨)에 기재된 것과 유사한 방법이 이용될 수 있다.
가능한 파라토프가 에피토프에 결합할 것인지의 여부 및 어떻게 잘 결합할지를 결정하는데 에피토프의 형태가 중요할 뿐만 아니라, 에피토프와 파라토프 사이의 상호작용 그 자체가 변이체 항체를 설계하는데 큰 정보의 공급원이다. 당업자가 이해하게 되는 바와 같이, 이러한 상호작용을 연구할 수 있는 다양한 방식이 존재한다. 한가지 방식은 아마도 상기 기재된 바와 같이 생성된 구조 모델을 사용하고, 이어서 프로그램, 예컨대 InsightII (엑셀리스, 캘리포니아주 샌디에고) (도킹 모듈을 가지며, 다른 것들 중에서 파라토프 및 그의 에피토프 사이의 입체형태적 및 배향적 공간에 대한 몬테 카를로(Monte Carlo) 검색을 수행할 수 있음)을 이용하는 것이다. 그 결과로 에피토프가 파라토프와 상호작용하는지의 여부 및 어떻게 상호작용하는지 평가할 수 있다. 한 실시양태에서, 오직 에피토프의 단편 또는 변이체가 관련 상호작용을 결정하는 것을 돕는데 사용된다. 한 실시양태에서, 전체 에피토프는 파라토프와 에피토프 사이의 상호작용의 모델링에 사용된다.
이들 모델링된 구조를 이용하여, 에피토프와 파라토프 사이의 상호작용에서 가장 중요한 잔기를 예측할 수 있다. 이에 따라, 한 실시양태에서, 항체의 결합 특성을 변경시키기 위해 어떠한 잔기를 변화시킬지 용이하게 선택할 수 있다. 예를 들어, 도킹 모델로부터 파라토프의 특정 잔기의 측쇄가 에피토프의 결합을 입체적으로 방해할 수 있음이 분명해질 수 있으며, 이에 따라 이들 잔기를 보다 작은 측쇄를 갖는 잔기로 변경시키는 것이 유익할 수 있다. 이는 다수의 방식으로 결정할 수 있다. 예를 들어, 간단하게 2개의 모델을 관찰하고, 관능기 및 근접성을 기반으로 상호작용을 평가할 수 있다. 대안적으로, 보다 유리한 에너지 상호작용을 수득하기 위해 상기 기재된 바와 같이 에피토프 및 파라토프의 반복되는 쌍 형성을 수행할 수 있다. 또한, 항체의 다양한 변이체에 대한 이들 상호작용을 결정하여 항체가 에피토프에 결합할 수 있는 대안적인 방식을 결정할 수 있다. 또한, 다양한 모델을 조합하여, 원하는 특정한 특성을 갖는 항체를 수득하기 위해 항체의 구조를 변경시키는 방법을 결정할 수 있다.
상기에 결정된 모델은 다양한 기술을 통해 시험될 수 있다. 예를 들어, 상호작용 에너지는 어떠한 변이체를 추가로 조사할지 결정하기 위해 상기 논의된 프로그램으로 결정될 수 있다. 또한, 쿨롱 및 반 데르 발스 상호작용은 에피토프의 에너지와 변이체 파라토프의 상호작용을 결정하는데 사용된다. 또한 부위 지정 돌연변이는 항체 구조의 예측한 변화가 실제로 결합 특성의 원하는 변화를 일으키는지 확인하는데 사용된다. 대안적으로, 변화는 모델이 정확한지 검증하고 파라토프와 에피토프 사이에 일어날 수 있는 일반적인 조합 목적을 결정하기 위해 에피토프로 이루어질 수 있다.
당업자가 이해하게 되는 바와 같이, 이러한 모델은 본 실시양태의 항체 및 그의 변이체를 제조하는데 필요한 지침을 제공하면서, 인 실리코 모델의 통상적인 시험을 아마도 시험관내 연구를 통해 수행하는 것이 여전히 바람직할 수 있다. 또한 당업자에게 명백해지는 바와 같이, 임의의 변형이 또한 항체의 활성에 대해 추가의 부작용을 가질 수 있다. 예를 들어, 보다 큰 결합을 생성할 것으로 예측된 임의의 변경이 보다 큰 결합을 유도할 수 있으면서, 이는 또한 항체의 활성을 감소 또는 변경시킬 수 있는 다른 구조적 변화를 일으킬 수 있다. 이것이 사례인지 아닌지의 결정은 당업계에서 통상적인 것이고, 다수의 방식으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 활성은 ELISA 시험을 통해 시험될 수 있다. 대안적으로, 샘플은 표면 플라즈몬 공명 장치의 이용을 통해 시험될 수 있다.
HER3 항체
본 발명은 HER3의 입체형태적 에피토프를 인식하는 항체를 제공한다. 본 발명은 HER3에 대한 특정한 부류의 항체가 리간드-의존성 및 리간드-비의존성 HER3 신호 전달 경로를 둘 다 차단한다는 놀라운 발견을 기반으로 한다. HER3의 특정한 입체형태 에피토프에 결합하는 특정한 부류의 항체는 표 1에 개시된다. 한 실시양태에서, 항체는 리간드-의존성 및 리간드-비의존성 HER3 신호전달을 둘 다 억제한다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 HER3에 결합하고, 리간드 결합 부위에 대한 HER 리간드 결합을 차단하지 않는다 (즉, 리간드 및 항체가 둘 다 HER3에 공동으로 결합할 수 있음).
본 발명은 HER3 단백질 (예를 들어, 인간 및/또는 시노몰구스 HER3)에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하며, 상기 항체는 서열 15, 33, 51, 69, 87, 105, 123, 141, 159, 177, 195, 213, 231, 249, 267, 285, 303, 321, 339, 357 및 375의 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인을 포함한다. 본 발명은 HER3 단백질 (예를 들어, 인간 및/또는 시노몰구스 HER3)에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하며, 상기 항체는 서열 14, 32, 50, 68, 86, 104, 122, 140, 158, 176, 194, 212, 230, 248, 266, 284, 302, 320, 338, 356 및 374의 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함한다. 본 발명은 또한 HER3 단백질 (예를 들어, 인간 및/또는 시노몰구스 HER3)에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하며, 상기 항체는 하기 표 1에 열거된 VH CDR 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR을 포함한다. 특히, 본 발명은 HER3 단백질 (예를 들어, 인간 및/또는 시노몰구스 HER3)에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하며, 상기 항체는 하기 표 1에 열거된 VH CDR 중 어느 것의 아미노산 서열을 갖는 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 초과의 VH CDR을 포함한다 (또는 대안적으로 이로 이루어짐).
본 발명의 다른 항체는 돌연변이되었지만 표 1에 기재된 서열에 도시된 CDR 영역과 CDR 영역에서 적어도 60, 70, 80, 90, 95 또는 98 퍼센트 동일성을 갖는 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이는 본래 항체의 에피토프에 대한 그의 특이성을 여전히 유지하면서, 표 1에 기재된 서열에 도시된 CDR 영역과 비교하였을 때 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 아미노산이 CDR 영역에서 돌연변이된 돌연변이체 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 다른 항체는 돌연변이되었지만 표 1에 기재된 서열에 도시된 프레임워크 영역과 프레임워크 영역에서 적어도 60, 70, 80, 90, 95 또는 98 퍼센트 동일성을 갖는 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이는 본래 항체의 에피토프에 대한 그의 특이성을 여전히 유지하면서, 표 1에 기재된 서열에 도시된 프레임워크 영역과 비교하였을 때 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개 이하의 아미노산이 프레임워크 영역에서 돌연변이된 돌연변이체 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명은 또한 HER3 단백질 (예를 들어, 인간 및/또는 시노몰구스 HER3)에 특이적으로 결합하는 항체의 VH, VL, 전장 중쇄 및 전장 경쇄를 코딩하는 핵산 서열을 제공한다.
본 발명의 HER3 항체는 HER3의 도메인 2 및 도메인 4로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 HER3의 입체형태적 에피토프에 결합한다.
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본 발명의 다른 항체는 아미노산 또는 아미노산을 코딩하는 핵산이 돌연변이되었으나 표 1에 기재된 서열에 대해 적어도 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 및 99 퍼센트 동일성을 갖는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이것은 표 1에 기재된 서열에 도시된 가변 영역과 비교하였을 때 가변 영역에서 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 아미노산이 돌연변이되고 실질적으로 동일한 치료 활성을 보유하는 돌연변이체 아미노산 서열을 포함한다.
각각의 이들 항체 또는 그의 단편은 HER3에 결합할 수 있으므로, VH, VL, 전장 경쇄 및 전장 중쇄 서열 (아미노산 서열을 코딩한 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열)은 "혼합 및 매치되어" 본 발명의 다른 HER3-결합 항체를 생성할 수 있다. 이러한 "혼합 및 매치된" HER3-결합 항체는 당업계 공지의 결합 검정 (예를 들어, ELISA, 및 실시예 섹션에 기재된 다른 검정)으로 시험할 수 있다. 이들 쇄가 혼합 및 매치되는 경우, 특정한 VH/VL 쌍으로부터의 VH 서열은 구조적으로 유사한 VH 서열로 대체되어야 한다. 마찬가지로, 특정한 전장 중쇄/전장 경쇄 쌍 형성으로부터의 전장 중쇄 서열은 구조적으로 유사한 전장 중쇄 서열로 대체되어야 한다. 마찬가지로, 특정한 VH/VL 쌍 형성으로부터의 VL 서열은 구조적으로 유사한 VL 서열로 대체되어야 한다. 마찬가지로, 특정한 전장 중쇄/전장 경쇄 쌍 형성으로부터의 전장 경쇄 서열은 구조적으로 유사한 전장 경쇄 서열로 대체되어야 한다. 따라서, 한 측면에서, 본 발명은 서열 15, 33, 51, 69, 87, 105, 123, 141, 159, 177, 195, 213, 231, 249, 267, 285, 303, 321, 339, 357 및 375로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 14, 32, 50, 68, 86, 104, 122, 140, 158, 176, 194, 212, 230, 248, 266, 284, 302, 320, 338, 356 및 374로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 단편을 제공하며; 여기서 항체는 HER3 (예를 들어, 인간 및/또는 시노몰구스)에 특이적으로 결합한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 표 1에 기재된 바와 같은 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 또는 그의 조합을 포함하는 HER3-결합 항체를 제공한다. 항체의 VH CDR1의 아미노산 서열은 서열 2, 8, 20, 26, 38, 44, 56, 62, 74, 80, 92, 98, 110, 116, 128, 134, 146, 152, 164, 170, 182, 188, 200, 206, 218, 224, 236, 242, 254, 260, 272, 278, 290, 296, 308, 314, 326, 332, 344, 350, 362 및 368에 제시된다. 항체의 VH CDR2의 아미노산 서열은 서열 3, 9, 21, 27, 39, 45, 57, 63, 75, 81, 93, 99, 111, 117, 129, 135, 147, 153, 165, 171, 183, 189, 201, 207, 219, 225, 237, 243, 255, 261, 273, 279, 291, 297, 309, 315, 327, 333, 345, 351, 363 및 369에 제시된다. 항체의 VH CDR3의 아미노산 서열은 서열 4, 10, 22, 28, 40, 46, 58, 64, 76, 82, 94, 100, 112, 118, 130, 136, 148, 154, 166, 172, 184, 190, 202, 208, 220, 226, 238, 244, 256, 262, 274, 280, 292, 298, 310, 316, 328, 334, 346, 352, 364 및 370에 제시된다. 항체의 VL CDR1의 아미노산 서열은 서열 5, 11, 23, 29, 41, 47, 59, 65, 77, 83, 95, 101, 113, 119, 131, 137, 149, 155, 167, 173, 185, 191, 203, 209, 221, 227, 239, 245, 257, 263, 275, 281, 293, 299, 311, 317, 329, 335, 347, 353, 365 및 371에 제시된다. 항체의 VL CDR2의 아미노산 서열은 서열 6, 12, 24, 30, 42, 48, 60, 66, 78, 84, 96, 102, 114, 120, 132, 138, 150, 156, 168, 174, 186, 192, 204, 210, 222, 228, 240, 246, 258, 264, 276, 282, 294, 300, 312, 318, 330, 336, 348, 354, 366 및 372에 제시된다. 항체의 VL CDR3의 아미노산 서열은 서열 7, 13, 25, 31, 43, 49, 61, 67, 79, 85, 97, 103, 115, 121, 133, 139, 151, 157, 169, 175, 187, 193, 205, 211, 223, 229, 241, 247, 259, 265, 277, 283, 295, 301, 313, 319, 331, 337, 349, 355, 367 및 373에 제시된다. CDR 영역은 카바트 시스템을 이용하여 기술된다 (문헌 [Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Chothia et al., (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., (1989) Nature 342: 877-883; 및 Al-Lazikani et al., (1997) J. Mol. Biol. 273, 927-948]).
구체적 실시양태에서, HER3에 결합하는 항체는 중쇄 가변 영역 서열 2의 CDR1; 서열 3의 CDR2; 서열 4의 CDR3; 경쇄 가변 영역 서열 5의 CDR1; 서열 6의 CDR2; 및 서열 7의 CDR3을 포함한다.
구체적 실시양태에서, HER3에 결합하는 항체는 중쇄 가변 영역 서열 20의 CDR1; 서열 21의 CDR2; 서열 22의 CDR3; 경쇄 가변 영역 서열 23의 CDR1; 서열 24의 CDR2; 및 서열 25의 CDR3을 포함한다.
구체적 실시양태에서, HER3에 결합하는 항체는 중쇄 가변 영역 서열 38의 CDR1; 서열 39의 CDR2; 서열 40의 CDR3; 경쇄 가변 영역 서열 41의 CDR1; 서열 42의 CDR2; 및 서열 43의 CDR3을 포함한다.
구체적 실시양태에서, HER3에 결합하는 항체는 중쇄 가변 영역 서열 56의 CDR1; 서열 57의 CDR2; 서열 58의 CDR3; 경쇄 가변 영역 서열 59의 CDR1; 서열 60의 CDR2; 및 서열 61의 CDR3을 포함한다.
구체적 실시양태에서, HER3에 결합하는 항체는 중쇄 가변 영역 서열 74의 CDR1; 서열 75의 CDR2; 서열 76의 CDR3; 경쇄 가변 영역 서열 77의 CDR1; 서열 78의 CDR2; 및 서열 79의 CDR3을 포함한다.
구체적 실시양태에서, HER3에 결합하는 항체는 중쇄 가변 영역 서열 92의 CDR1; 서열 93의 CDR2; 서열 94의 CDR3; 경쇄 가변 영역 서열 95의 CDR1; 서열 96의 CDR2; 및 서열 97의 CDR3을 포함한다.
구체적 실시양태에서, HER3에 결합하는 항체는 중쇄 가변 영역 서열 110의 CDR1; 서열 111의 CDR2; 서열 112의 CDR3; 경쇄 가변 영역 서열 113의 CDR1; 서열 114의 CDR2; 및 서열 115의 CDR3을 포함한다.
구체적 실시양태에서, HER3에 결합하는 항체는 중쇄 가변 영역 서열 128의 CDR1; 서열 129의 CDR2; 서열 130의 CDR3; 경쇄 가변 영역 서열 131의 CDR1; 서열 132의 CDR2; 및 서열 133의 CDR3을 포함한다.
구체적 실시양태에서, HER3에 결합하는 항체는 중쇄 가변 영역 서열 146의 CDR1; 서열 147의 CDR2; 서열 148의 CDR3; 경쇄 가변 영역 서열 149의 CDR1; 서열 150의 CDR2; 및 서열 151의 CDR3을 포함한다.
구체적 실시양태에서, HER3에 결합하는 항체는 중쇄 가변 영역 서열 164의 CDR1; 서열 165의 CDR2; 서열 166의 CDR3; 경쇄 가변 영역 서열 167의 CDR1; 서열 168의 CDR2; 및 서열 169의 CDR3을 포함한다.
구체적 실시양태에서, HER3에 결합하는 항체는 중쇄 가변 영역 서열 182의 CDR1; 서열 183의 CDR2; 서열 184의 CDR3; 경쇄 가변 영역 서열 185의 CDR1; 서열 186의 CDR2; 및 서열 187의 CDR3을 포함한다.
구체적 실시양태에서, HER3에 결합하는 항체는 중쇄 가변 영역 서열 200의 CDR1; 서열 201의 CDR2; 서열 202의 CDR3; 경쇄 가변 영역 서열 203의 CDR1; 서열 204의 CDR2; 및 서열 205의 CDR3을 포함한다.
구체적 실시양태에서, HER3에 결합하는 항체는 중쇄 가변 영역 서열 218의 CDR1; 서열 219의 CDR2; 서열 220의 CDR3; 경쇄 가변 영역 서열 221의 CDR1; 서열 222의 CDR2; 및 서열 223의 CDR3을 포함한다.
구체적 실시양태에서, HER3에 결합하는 항체는 중쇄 가변 영역 서열 236의 CDR1; 서열 237의 CDR2; 서열 238의 CDR3; 경쇄 가변 영역 서열 239의 CDR1; 서열 240의 CDR2; 및 서열 241의 CDR3을 포함한다.
구체적 실시양태에서, HER3에 결합하는 항체는 중쇄 가변 영역 서열 254의 CDR1; 서열 255의 CDR2; 서열 256의 CDR3; 경쇄 가변 영역 서열 257의 CDR1; 서열 258의 CDR2; 및 서열 259의 CDR3을 포함한다.
구체적 실시양태에서, HER3에 결합하는 항체는 중쇄 가변 영역 서열 272의 CDR1; 서열 273의 CDR2; 서열 274의 CDR3; 경쇄 가변 영역 서열 275의 CDR1; 서열 276의 CDR2; 및 서열 277의 CDR3을 포함한다.
구체적 실시양태에서, HER3에 결합하는 항체는 중쇄 가변 영역 서열 290의 CDR1; 서열 291의 CDR2; 서열 292의 CDR3; 경쇄 가변 영역 서열 293의 CDR1; 서열 294의 CDR2; 및 서열 295의 CDR3을 포함한다.
구체적 실시양태에서, HER3에 결합하는 항체는 중쇄 가변 영역 서열 308의 CDR1; 서열 309의 CDR2; 서열 310의 CDR3; 경쇄 가변 영역 서열 311의 CDR1; 서열 312의 CDR2; 및 서열 313의 CDR3을 포함한다.
구체적 실시양태에서, HER3에 결합하는 항체는 중쇄 가변 영역 서열 326의 CDR1; 서열 327의 CDR2; 서열 328의 CDR3; 경쇄 가변 영역 서열 329의 CDR1; 서열 330의 CDR2; 및 서열 331의 CDR3을 포함한다.
구체적 실시양태에서, HER3에 결합하는 항체는 중쇄 가변 영역 서열 344의 CDR1; 서열 345의 CDR2; 서열 346의 CDR3; 경쇄 가변 영역 서열 347의 CDR1; 서열 348의 CDR2; 및 서열 349의 CDR3을 포함한다.
구체적 실시양태에서, HER3에 결합하는 항체는 중쇄 가변 영역 서열 362의 CDR1; 서열 363의 CDR2; 서열 364의 CDR3; 경쇄 가변 영역 서열 365의 CDR1; 서열 366의 CDR2; 및 서열 367의 CDR3을 포함한다.
구체적 실시양태에서, HER3에 결합하는 항체는 서열 15의 VH 및 서열 14의 VL을 포함한다. 구체적 실시양태에서, HER3에 결합하는 항체는 서열 33의 VH 및 서열 32의 VL을 포함한다. 구체적 실시양태에서, HER3에 결합하는 항체는 서열 51의 VH 및 서열 50의 VL을 포함한다. 구체적 실시양태에서, HER3에 결합하는 항체는 서열 69 및 서열 68의 VL을 포함한다. 구체적 실시양태에서, HER3에 결합하는 항체는 서열 87의 VH 및 서열 86의 VL을 포함한다. 구체적 실시양태에서, HER3에 결합하는 항체는 서열 105의 VH 및 서열 104의 VL을 포함한다. 구체적 실시양태에서, HER3에 결합하는 항체는 서열 123의 VH 및 서열 122의 VL을 포함한다. 구체적 실시양태에서, HER3에 결합하는 항체는 서열 141의 VH 및 서열 140의 VL을 포함한다. 구체적 실시양태에서, HER3에 결합하는 항체는 서열 159의 VH 및 서열 158의 VL을 포함한다. 구체적 실시양태에서, HER3에 결합하는 항체는 서열 177의 VH 및 서열 176의 VL을 포함한다. 구체적 실시양태에서, HER3에 결합하는 항체는 서열 195의 VH 및 서열 194의 VL을 포함한다. 구체적 실시양태에서, HER3에 결합하는 항체는 서열 213의 VH 및 서열 212의 VL을 포함한다. 구체적 실시양태에서, HER3에 결합하는 항체는 서열 231의 VH 및 서열 230의 VL을 포함한다. 구체적 실시양태에서, HER3에 결합하는 항체는 서열 249의 VH 및 서열 248의 VL을 포함한다. 구체적 실시양태에서, HER3에 결합하는 항체는 서열 267의 VH 및 서열 266의 VL을 포함한다. 구체적 실시양태에서, HER3에 결합하는 항체는 서열 285의 VH 및 서열 284의 VL을 포함한다. 구체적 실시양태에서, HER3에 결합하는 항체는 서열 303의 VH 및 서열 302의 VL을 포함한다. 구체적 실시양태에서, HER3에 결합하는 항체는 서열 321의 VH 및 서열 320의 VL을 포함한다. 구체적 실시양태에서, HER3에 결합하는 항체는 서열 339의 VH 및 서열 338의 VL을 포함한다. 구체적 실시양태에서, HER3에 결합하는 항체는 서열 357의 VH 및 서열 356의 VL을 포함한다. 구체적 실시양태에서, HER3에 결합하는 항체는 서열 375의 VH 및 서열 374의 VL을 포함한다. 한 실시양태에서, HER3 항체는 길항제 항체이다. 특정 실시양태에서, HER3에 결합하는 항체는 표 1에 기재된 항체이다.
본원에 사용된 인간 항체는 항체의 가변 영역 또는 전장 쇄가 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자를 사용한 시스템으로부터 수득된 경우에 특정한 배선 서열"의 생성물"이거나 "그로부터 유래된" 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 또는 전장 중쇄 또는 경쇄를 포함한다. 이러한 시스템은 인간 이뮤노글로불린 유전자를 보유하는 트랜스제닉 마우스를 관심 항원으로 면역화시키거나, 또는 파지에 디스플레이된 인간 이뮤노글로불린 유전자 라이브러리를 관심 항원을 사용하여 스크리닝하는 것을 포함한다. 인간 배선 이뮤노글로불린 서열"의 생성물"이거나 "그로부터 유래된" 인간 항체는 인간 항체의 아미노산 서열을 인간 배선 이뮤노글로불린의 아미노산 서열과 비교하고, 인간 항체의 서열에 가장 근접한 서열 (즉, 최대 동일성 %)인 인간 배선 이뮤노글로불린 서열을 선택함으로써 확인할 수 있다. 특정한 인간 배선 이뮤노글로불린 서열"의 생성물"이거나 "그로부터 유도된" 인간 항체는 배선 서열에 비해, 예를 들어 자연 발생 체세포 돌연변이, 또는 부위-지정 돌연변이의 의도적인 도입으로 인한 아미노산 차이를 가질 수 있다. 그러나, VH 또는 VL 프레임워크 영역에서, 선택된 인간 항체는 전형적으로 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열에 대한 아미노산 서열 동일성이 적어도 90%이고, 다른 종의 배선 이뮤노글로불린 아미노산 서열 (예를 들어, 뮤린 배선 서열)과 비교하였을 때 인간 항체를 인간의 것으로 확인시켜 주는 아미노산 잔기를 함유한다. 특정 경우, 인간 항체는 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열에 대한 아미노산 서열 동일성이 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 또는 적어도 95% 또는 심지어는 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99%일 수 있다. 전형적으로, 재조합 인간 항체는 VH 또는 VL 프레임워크 영역에서 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열과는 10개 이하의 아미노산 차이를 나타낼 것이다. 특정 경우에, 인간 항체는 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 5개 이하, 또는 심지어는 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 나타낼 수 있다. HER3 항체의 대표적인 수에 대한 VH 및 VL 배선 서열을 이용하는 다양한 배선화 버전이 카바트를 이용하여 표 2에 제시된다. CDR 위치는 볼드체로 강조된다. 배선화 서열을 갖는 표에 사용된 표기법은 하기와 같다: MOR10701-VH_3-07은 VH 배선 서열 3-07의 프레임워크 영역 내의 MOR10701 CDR 루프를 의미하고 (명명법은 Vbase에 따름), MOR10703-VK_L1은 VK_L1 (여기서, VK는 카파 경쇄임)로부터의 배선 프레임워크 영역 내의 MOR10703으로부터의 CDR을 의미한다.
Figure 112013023522215-pct00019
Figure 112013023522215-pct00020
Figure 112013023522215-pct00021
Figure 112013023522215-pct00022
Figure 112013023522215-pct00023
JH 절편과 VH-배선화 서열의 임의의 조합이 이용될 수 있다. 조합의 대표적인 예는 표 5에 제시된다.
Figure 112013023522215-pct00024
JK 절편과 VL-배선화 서열의 임의의 조합이 이용될 수 있다. 조합의 대표적인 예는 표 6에 제시된다.
Figure 112013023522215-pct00025
VH가 JH와 조합되고 VK가 JK와 조합되면, 이어서 VK 또는 JK와 VH 또는 JH의 임의의 조합이 이용될 수 있다. 한 실시양태에서, 임의의 VH 배선화 영역은 각각의 항체에 대한 임의의 VK (VL) 배선화 영역과 조합될 수 있다. 조합의 예의 대표적인 수가 표 7에 제시된다.
Figure 112013023522215-pct00026
한 실시양태에서, 본 발명은 Xaa1-HCDR1-Xaa2-HCDR2-Xaa3-HCDR3-Xaa4의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역에 관한 것이고, 여기서 중쇄 HCDR1, HCDR2, HCDR3은 표 1 및 2로부터 선택된 임의의 중쇄 CDR이다. 오직 예시적 목적을 위해, 서열은 하기와 같을 수 있다:
Xaa1 - SYAMS - Xaa2 - AINSQGKSTYYADSVKG - Xaa3 - WGDEGFDI - Xaa4 (서열 493),
여기서
Xaa1은 임의의 30개의 아미노산의 프레임워크 영역이고;
Xaa2는 임의의 14개의 아미노산의 프레임워크 영역이고;
Xaa3은 임의의 32개의 아미노산의 프레임워크 영역이고;
Xaa4는 임의의 11개의 아미노산의 프레임워크 영역이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 Xaa1-LCDR1-Xaa2-LCDR2-Xaa3-LCDR3-Xaa4의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역에 관한 것이고, 여기서 경쇄 LCDR1, LCDR2, LCDR3은 표 1 및 2로부터 선택된 임의의 경쇄 CDR이다. 오직 예시적 목적을 위해, 서열은 하기와 같을 수 있다:
Xaa1 - RASQGISNWLA - Xaa2 - GASSLQS - Xaa3 - QQYSSFPTT - Xaa4 (서열 494),
여기서
Xaa1은 임의의 23개의 아미노산의 프레임워크 영역이고;
Xaa2는 임의의 15개의 아미노산의 프레임워크 영역이고;
Xaa3은 임의의 32개의 아미노산의 프레임워크 영역이고;
Xaa4는 임의의 10개의 아미노산의 프레임워크 영역이다.
본원에 개시된 항체는 단일 쇄 항체, 디아바디, 도메인 항체, 나노바디 및 유니바디의 유도체일 수 있다. "단일 쇄 항체" (scFv)는 VH 도메인에 연결된 VL 도메인을 포함하는 단일 폴리펩티드 쇄로 구성되고, 이때 VL 도메인 및 VH 도메인은 1가 분자를 형성하도록 쌍을 형성한다. 단일 쇄 항체는 당업계에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Bird et al., (1988) Science 242:423-426 및 Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883] 참조). "디스버드(disbud)"는 짧은 펩티드 링커에 의해 연결된 동일한 폴리펩티드 쇄 상의 경쇄 가변 영역에 연결된 중쇄 가변 영역을 각각 포함하는 2개의 쇄로 이루어지고, 여기서, 동일한 쇄 상의 2개의 영역은 서로 쌍을 형성하지 않지만 다른 쇄 상의 상보적 도메인과 쌍을 형성하여 이중특이적 분자를 형성한다. 디아바디의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Holliger et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 및 Poljak et al., (1994) Structure 2:1121-1123] 참조). 도메인 항체 (dAb)는 항체의 중쇄 또는 경쇄의 가변 영역에 대응하는 항체의 소형 기능적 결합 단위이다. 도메인 항체는 박테리아, 효모, 및 포유동물 세포 시스템에서 잘 발현된다. 도메인 항체 및 그의 제조 방법의 추가의 상세한 내용은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,291,158; 6,582,915; 6,593,081; 6,172,197; 6,696,245; 유럽 특허 0368684 & 0616640; WO05/035572, WO04/101790, WO04/081026, WO04/058821, WO04/003019 및 WO03/002609 참조). 나노바디는 항체의 중쇄로부터 유래한다. 나노바디는 전형적으로 단일 가변 도메인 및 2개의 불변 도메인 (CH2 및 CH3)을 포함하고, 본래 항체의 항원-결합 능력을 보유한다. 나노바디는 당업계에 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,765,087, 미국 특허 번호 6,838,254, WO 06/079372 참조). 유니바디는 IgG4 항체의 1개의 경쇄 및 1개의 중쇄로 이루어진다. 유니바디는 IgG4 항체의 힌지 영역의 제거에 의해 제조될 수 있다. 유니바디 및 그의 제조 방법의 추가의 상세한 내용은 WO2007/059782에서 찾아볼 수 있다.
상동 항체
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 표 1에 기재된 서열에 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 그의 단편을 제공하고, 상기 항체는 HER3 단백질 (예를 들어, 인간 및/또는 시노몰구스 HER3)에 결합하고, 표 1에 기재된 항체의 원하는 기능적 특성을 보유한다.
예를 들어, 본 발명은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 모노클로날 항체 (또는 그의 기능적 단편)을 제공하고, 여기서 중쇄 가변 영역은 서열 15, 33, 51, 69, 87, 105, 123, 141, 159, 177, 195, 213, 231, 249, 267, 285, 303, 321, 339, 357 및 375로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열 14, 32, 50, 68, 86, 104, 122, 140, 158, 176, 194, 212, 230, 248, 266, 284, 302, 320, 338, 356 및 374로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 항체는 HER3 (예를 들어, 인간 및/또는 시노몰구스 HER3)에 결합하고, HER3의 신호전달 활성 (이는 인산화 검정 또는 HER 신호전달의 다른 척도 (예를 들어, 실시예에 기재된 바와 같은 포스포-HER3 검정, 포스포-Akt 검정, 세포 증식, 및 리간드 차단 검정)로 측정될 수 있음)을 중화시킨다. 또한, 본 발명의 범위 내에 가변 중쇄 및 경쇄 모 뉴클레오티드 서열; 및 포유동물 세포에서 발현을 위해 최적화된 전장 중쇄 및 경쇄 서열이 포함된다. 본 발명의 다른 항체는 돌연변이되었으나, 상기 기재된 서열에 대해 적어도 60, 70, 80, 90, 95 또는 98% 퍼센트 동일성을 갖는 아미노산 또는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이는 상기 기재된 서열에 도시된 가변 영역과 비교하였을 때 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 아미노산이 가변 영역에서 아미노산 결실, 삽입 또는 치환에 의해 돌연변이된 돌연변이체 아미노산 서열을 포함한다.
다른 실시양태에서, VH 및/또는 VL 아미노산 서열은 표 1에 열거된 서열에 대해 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일할 수 있다. 다른 실시양태에서, VH 및/또는 VL 아미노산 서열은 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 아미노산 위치에서의 아미노산 치환을 제외하고는 동일할 수 있다. 표 1에 기재된 항체의 VH 및 VL 영역에 대해 높은 (즉, 80% 이상의) 동일성을 갖는 VH 및 VL 영역을 갖는 항체는 돌연변이유발 (예를 들어, 부위-지정 또는 PCR-매개 돌연변이유발)에 의해 수득할 수 있으며, 이후에 본원에 기재된 기능적 검정을 이용하여 코딩된 변경된 항체를 보유하는 기능에 대해 시험할 수 있다.
다른 실시양태에서, 중쇄 및/또는 경쇄 뉴클레오티드 서열의 가변 영역은 상기 열거된 서열에 대해 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일할 수 있다.
본원에 사용된 2개의 서열 사이의 "동일성 퍼센트"는 2개 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려하여, 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다 (즉, 동일성 % = 동일한 위치의 수/위치의 총 수 x 100). 2개 서열 사이의 서열 비교 및 동일성 퍼센트의 결정은 하기 비제한적 예에 기재된 바와 같이 수학적 알고리즘을 이용하여 달성될 수 있다.
추가로 또는 대안적으로, 본 발명의 단백질 서열은 예를 들어 관련 서열을 확인하기 위해 공공 데이터베이스에 대한 검색을 수행하기 위한 "질의 서열"로서 추가로 사용될 수도 있다. 예를 들어, 이러한 검색은 문헌 [Altschul et al., (1990) J.Mol. Biol. 215:403-10]의 BLAST 프로그램 (버전 2.0)을 이용하여 수행할 수 있다.
보존적 변형을 갖는 항체
특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖고, 여기서 이들 CDR 서열 중 하나 이상은 본원에 기재된 항체 또는 그의 보존적 변형에 기반을 둔 특정 아미노산 서열을 갖고, 항체는 본 발명의 HER3-결합 항체의 원하는 기능적 특성을 보유한다.
따라서, 본 발명은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역으로 이루어진 단리된 HER3 모노클로날 항체 또는 그의 단편을 제공하며, 여기서 중쇄 가변 영역 CDR1 아미노산 서열은 서열 2, 8, 20, 26, 38, 44, 56, 62, 74, 80, 92, 98, 110, 116, 128, 134, 146, 152, 164, 170, 182, 188, 200, 206, 218, 224, 236, 242, 254, 260, 272, 278, 290, 296, 308, 314, 326, 332, 344, 350, 362 및 368, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 중쇄 가변 영역 CDR2 아미노산 서열은 서열 3, 9, 21, 27, 39, 45, 57, 63, 75, 81, 93, 99, 111, 117, 129, 135, 147, 153, 165, 171, 183, 189, 201, 207, 219, 225, 237, 243, 255, 261, 273, 279, 291, 297, 309, 315, 327, 333, 345, 351, 363 및 369, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 중쇄 가변 영역 CDR3 아미노산 서열은 서열 4, 10, 22, 28, 40, 46, 58, 64, 76, 82, 94, 100, 112, 118, 130, 136, 148, 154, 166, 172, 184, 190, 202, 208, 220, 226, 238, 244, 256, 262, 274, 280, 292, 298, 310, 316, 328, 334, 346, 352, 364 및 370, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 경쇄 가변 영역 CDR1 아미노산 서열은 서열 5, 11, 23, 29, 41, 47, 59, 65, 77, 83, 95, 101, 113, 119, 131, 137, 149, 155, 167, 173, 185, 191, 203, 209, 221, 227, 239, 245, 257, 263, 275, 281, 293, 299, 311, 317, 329, 335, 347, 353, 365 및 371, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 경쇄 가변 영역 CDR2 아미노산 서열은 서열 6, 12, 24, 30, 42, 48, 60, 66, 78, 84, 96, 102, 114, 120, 132, 138, 150, 156, 168, 174, 186, 192, 204, 210, 222, 228, 240, 246, 258, 264, 276, 282, 294, 300, 312, 318, 330, 336, 348, 354, 366 및 372, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 경쇄 가변 영역 CDR3 아미노산 서열은 서열 7, 13, 25, 31, 43, 49, 61, 67, 79, 85, 97, 103, 115, 121, 133, 139, 151, 157, 169, 175, 187, 193, 205, 211, 223, 229, 241, 247, 259, 265, 277, 283, 295, 301, 313, 319, 331, 337, 349, 355, 367 및 373, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 항체 또는 그의 단편은 HER3에 특이적으로 결합하고, HER 신호전달 경로를 억제함으로써 HER3 활성을 중화시킨다 (이는 인산화 검정 또는 HER 신호전달의 다른 척도 (예를 들어, 실시예에 기재된 바와 같은 포스포-HER3 검정, 포스포-Akt 검정, 세포 증식 및 리간드 차단 검정)로 측정될 수 있음).
동일한 에피토프에 결합하는 항체
본 발명은 표 1 및 도 7에 기재된 HER3-결합 항체와 동일한 에피토프와 상호작용하는 (예를 들어, 결합, 입체 장애, 안정화/탈안정화, 공간 분포에 의함) 항체를 제공한다. 따라서, 추가의 항체는 HER3 결합 검정에서 본 발명의 다른 항체와 교차-경쟁하는 (예를 들어, 본 발명의 다른 항체의 결합을 통계적으로 유의한 방식으로 경쟁적으로 억제하는) 능력을 기반으로 하여 확인될 수 있다. HER3 단백질 (예를 들어, 인간 및/또는 시노몰구스 HER3)에 대한 본 발명의 항체의 결합을 억제하는 시험 항체의 능력은 시험 항체가 HER3에 대한 결합을 위해 상기 항체와 경쟁할 수 있음을 입증하고, 이러한 항체는 비제한적인 이론에 따라 이것이 경쟁하는 항체와 동일하거나 관련이 있는 (예를 들어, 구조적으로 유사하거나 공간적으로 근접한), HER3 단백질 상의 에피토프에 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항체와 HER3의 동일한 에피토프에 결합하는 항체는 인간 모노클로날 항체이다. 이러한 인간 모노클로날 항체는 본원에 기재된 바와 같이 제조 및 단리될 수 있다.
한 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 HER3의 도메인 2 및 도메인 4 둘 다에 결합하여 도메인 2 내에 존재하는 이량체화 루프의 노출을 방지하는 불활성 입체형태로 HER3을 유지한다. 이는 다른 패밀리 구성원, 예컨대 HER1, HER2 및 HER4와의 이종이량체화를 방지한다. 그의 단편의 항체는 리간드 의존성 및 리간드-비의존성 HER3 신호 전달을 억제한다.
또 다른 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 HER3 리간드, 예컨대 뉴레귤린의 공동 결합을 차단하지 않고 HER3의 도메인 2 및 도메인 4 둘 다에 결합한다. 이론을 제공할 필요는 없지만, HER3의 도메인 2 및 도메인 4 둘 다에 결합하는 항체 또는 그의 단편이 HER3 상의 리간드 결합 부위를 차단하지 않고 HER3을 불활성 입체형태로 유지하는 것이 가능하다. 따라서, HER3 리간드 (예를 들어, 뉴레귤린)는 항체 또는 그의 단편과 동시에 HER3에 결합할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그의 단편은 리간드 결합을 방지하지 않고 HER3의 리간드 의존성 및 비의존성 활성화를 둘 다 억제한다. 이는 하기의 이유로 유리한 것으로 여겨진다:
(i) 치료 항체는 특징적인 종양 유형이 각각의 메카니즘에 의해 유도되므로 HER3 활성화의 단일 메카니즘 (즉, 리간드 의존성 또는 리간드 비의존성)을 표적화하는 항체보다 광범위한 종양에서 임상적 유용성을 가질 것이다.
(ii) 치료 항체는 HER3 활성화의 메카니즘이 둘 다 동시에 관여하는 종양 유형에서 효능이 있을 것이다. HER3 활성화의 단일 메카니즘 (즉, 리간드 의존성 또는 리간드 비의존성)을 표적화하는 항체는 이들 종양 유형에서 효능의 거의 없거나 전혀 없을 것이다.
(iii) 리간드 결합을 방지하지 않고 HER3의 리간드 의존성 활성화를 억제하는 항체의 효능은 리간드의 농도를 증가시킴으로써 유해한 영향을 받을 가능성이 적을 것이다. 이는 HER3 리간드의 매우 높은 농도에 의해 유도된 종양 유형에서의 상승된 효능 또는 내성이 HER3 리간드의 상향조절에 의해 매개되는 경우에 감소된 약물 내성 책임으로 해석될 것이다.
(iv) 불활성 형태를 안정화시킴으로써 HER3 활성화를 억제하는 항체는 HER3 활성화의 대안적인 메카니즘에 의해 유도된 약물 내성의 가능성이 적을 것이다.
따라서, 본 발명의 항체는 기존 치료 항체가 임상적으로 비효과적인 상태를 치료하는데 사용될 수 있다.
조작 및 변형된 항체
또한, 본 발명의 항체는, 변형된 항체를 조작하기 위한 출발 물질로서 본원에 제시된 하나 이상의 VH 및/또는 VL 서열을 갖는 항체를 사용하여 제조될 수 있고, 상기 변형된 항체는 출발 항체로부터 변경된 특성을 가질 수 있다. 항체는 1개 또는 2개의 가변 영역 (즉, VH 및/또는 VL), 예를 들어, 하나 이상의 CDR 영역 및/또는 하나 이상의 프레임워크 영역 내에 존재하는 1개 이상의 잔기를 변형시킴으로써 조작될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 항체는 불변 영역(들) 내의 잔기들을 변형시킴으로써 조작되어, 예를 들어 항체의 이펙터 기능(들)을 변경시킬 수 있다.
수행될 수 있는 가변 영역 조작의 유형 중 하나는 CDR 이식이다. 항체는 주로 6개의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 내에 위치하는 아미노산 잔기를 통해 표적 항원과 상호작용한다. 이러한 이유로, CDR 내의 아미노산 서열은 CDR 외부의 서열보다 개별 항체 사이에서 더 다양하다. CDR 서열이 대부분의 항체-항원 상호작용을 담당하기 때문에, 상이한 특성을 갖는 상이한 항체로부터의 프레임워크 서열에 이식된, 특정 천연 생성 항체로부터의 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 제작함으로써 특정 자연 발생 항체의 특성을 모방하는 재조합 항체를 발현시키는 것이 가능하다 (예를 들어, 문헌 [Riechmann et al., (1998) Nature 332:323-327; Jones et al., (1986) Nature 321:522-525; Queen et al., (1989) Proc. Natl. Acad., U.S.A. 86:10029-10033]; 미국 특허 번호 5,225,539 (Winter), 및 미국 특허 번호 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370 (Queen et al.) 참조)
따라서, 본 발명의 또 다른 실시양태는 각각 서열 2, 8, 20, 26, 38, 44, 56, 62, 74, 80, 92, 98, 110, 116, 128, 134, 146, 152, 164, 170, 182, 188, 200, 206, 218, 224, 236, 242, 254, 260, 272, 278, 290, 296, 308, 314, 326, 332, 344, 350, 362 및 368로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR1 서열; 서열 3, 9, 21, 27, 39, 45, 57, 63, 75, 81, 93, 99, 111, 117, 129, 135, 147, 153, 165, 171, 183, 189, 201, 207, 219, 225, 237, 243, 255, 261, 273, 279, 291, 297, 309, 315, 327, 333, 345, 351, 363 및 369로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 서열; 서열 4, 10, 22, 28, 40, 46, 58, 64, 76, 82, 94, 100, 112, 118, 130, 136, 148, 154, 166, 172, 184, 190, 202, 208, 220, 226, 238, 244, 256, 262, 274, 280, 292, 298, 310, 316, 328, 334, 346, 352, 364 및 370으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 각각 서열 5, 11, 23, 29, 41, 47, 59, 65, 77, 83, 95, 101, 113, 119, 131, 137, 149, 155, 167, 173, 185, 191, 203, 209, 221, 227, 239, 245, 257, 263, 275, 281, 293, 299, 311, 317, 329, 335, 347, 353, 365 및 371로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR1 서열; 서열 6, 12, 24, 30, 42, 48, 60, 66, 78, 84, 96, 102, 114, 120, 132, 138, 150, 156, 168, 174, 186, 192, 204, 210, 222, 228, 240, 246, 258, 264, 276, 282, 294, 300, 312, 318, 330, 336, 348, 354, 366 및 372로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 서열; 및 서열 7, 13, 25, 31, 43, 49, 61, 67, 79, 85, 97, 103, 115, 121, 135, 139, 151, 157, 169, 175, 187, 193, 205, 211, 223, 229, 241, 247, 259, 265, 277, 283, 295, 301, 313, 319, 331, 337, 349, 355, 367 및 373으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진 CDR3 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 HER3 결합 모노클로날 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다. 따라서, 이러한 항체는 모노클로날 항체의 VH 및 VL CDR 서열을 함유하지만, 이들 항체로부터의 다양한 프레임워크 서열을 함유할 수 있다. 이러한 프레임워크 서열은 배선 항체 유전자 서열을 포함하는 공공 DNA 데이터베이스 또는 공개된 참고문헌으로부터 수득할 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 배선 DNA 서열은 "Vase" 인간 배선 서열 데이터베이스 (인터넷 www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase 상에서 이용가능함) 뿐만 아니라 문헌 [Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Chothia et al., (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., (1989) Nature 342:877-883; 및 Al-Lazikani et al., (1997) J. Mol. Biol. 273:927-948; Tomlinson et al., (1992) J. fol. Biol. 227:776-798; 및 Cox et al., (1994) Eur. J Immunol. 24:827-836] (각각의 내용이 명백하게 본원에 참고로 포함됨)에서 찾아볼 수 있다.
본 발명의 항체에 사용하기 위한 프레임워크 서열의 예는 본 발명의 선택된 항체에 의해 사용되는 프레임워크 서열, 예를 들어 본 발명의 모노클로날 항체에 의해 사용되는 컨센서스 서열 및/또는 프레임워크 서열과 구조적으로 유사한 것이다. VH CDR1, 2 및 3 서열, 및 VL CDR1, 2 및 3 서열을 프레임워크 서열이 유래되는 배선 이뮤노글로불린 유전자에서 발견되는 것과 동일한 서열을 갖는 프레임워크 영역에 이식할 수도 있거나, 또는 CDR 서열을 배선 서열과 비교해서 하나 이상의 돌연변이를 함유하는 프레임워크 영역에 이식할 수 있다. 예를 들어, 특정 경우에는 프레임워크 영역 내의 잔기를 돌연변이시켜 항체의 항원 결합 능력을 유지 또는 증진시키는 것이 유익한 것으로 밝혀졌다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370 (Queen et al.) 참조).
또 다른 유형의 가변 영역 변형은 VH 및/또는 VL CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역 내의 아미노산 잔기를 돌연변이시켜 관심 항체의 하나 이상의 결합 특성 (예를 들어, 친화도)을 개선시키는 것이다 ("친화도 성숙"이라 공지됨). 부위-지정 돌연변이 유발 또는 PCR-매개 돌연변이유발을 수행하여 돌연변이(들)를 도입할 수 있고, 항체 결합에 대한 효과 또는 관심의 대상이 되는 다른 기능적 특성을 본원에 기재된 바와 같고 실시예에서 제공되는 바와 같은 시험관내 또는 생체내 검정으로 평가할 수 있다. 보존적 변형 (상기 논의된 바와 같음)이 도입될 수 있다. 돌연변이는 아미노산 치환, 부가 또는 결실일 수 있다. 또한, 전형적으로는 CDR 영역 내의 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 잔기를 변경시킨다.
따라서, 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 2, 8, 20, 26, 38, 44, 56, 62, 74, 80, 92, 98, 110, 116, 128, 134,146, 152, 164, 170, 182, 188, 200, 206, 218, 224, 236, 242, 254, 260, 272, 278, 290, 296, 308, 314, 326, 332, 344, 350, 362 및 368을 갖는 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 서열 2, 8, 20, 26, 38, 44, 56, 62, 74, 80, 92, 98, 110, 116, 128, 134, 146, 152, 164, 170, 182, 188, 200, 206, 218, 224, 236, 242, 254, 260, 272, 278, 290, 296, 308, 314, 326, 332, 344, 350, 362 및 368과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 VH CDR1 영역; 서열 3, 9, 21, 27, 39, 45, 57, 63, 75, 81, 93, 99, 111, 117, 129, 135, 147, 153, 165, 171, 183, 189, 201, 207, 219, 225, 237, 243, 255, 261, 273, 279, 291, 297, 309, 315, 327, 333, 345, 351, 363 및 369로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 서열 3, 9, 21, 27, 39, 45, 57, 63, 75, 81, 93, 99, 111, 117, 129, 135, 147, 153, 165, 171, 183, 189, 201, 207, 219, 225, 237, 243, 255, 261, 273, 279, 291, 297, 309, 315, 327, 333, 345, 351, 363 및 369와 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2 영역; 서열 4, 10, 22, 28, 40, 46, 58, 64, 76, 82, 94, 100, 112, 118, 130, 136, 148, 154, 166, 172, 184, 190, 202, 208, 220, 226, 238, 244, 256, 262, 274, 280, 292, 298, 310, 316, 328, 334, 346, 352, 364 및 370으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 서열 4, 10, 22, 28, 40, 46, 58, 64, 76, 82, 94, 100, 112, 118, 130, 136, 148, 154, 166, 172, 184, 190, 202, 208, 220, 226, 238, 244, 256, 262, 274, 280, 292, 298, 310, 316, 328, 334, 346, 352, 364 및 370과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3 영역을 갖는 중쇄 가변 영역; 서열 5, 11, 23, 29, 41, 47, 59, 65, 77, 83, 95, 101, 113, 119, 131, 137, 149, 155, 167, 173, 185, 191, 203, 209, 221, 227, 239, 245, 257, 263, 275, 281, 293, 299, 311, 317, 329, 335, 347, 353, 365 및 371로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 서열 5, 11, 23, 29, 41, 47, 59, 65, 77, 83, 95, 101, 113, 119, 131, 137, 149, 155, 167, 173, 185, 191, 203, 209, 221, 227, 239, 245, 257, 263, 275, 281, 293, 299, 311, 317, 329, 335, 347, 353, 365 및 371과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1 영역; 서열 6, 12, 24, 30, 42, 48, 60, 66, 78, 84, 96, 102, 114, 120, 132, 138, 150, 156, 168, 174, 186, 192, 204, 210, 222, 228, 240, 246, 258, 264, 276, 282, 294, 300, 312, 318, 330, 336, 348, 354, 366 및 372로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 서열 6, 12, 24, 30, 42, 48, 60, 66, 78, 84, 96, 102, 114, 120, 132, 138, 150, 156, 168, 174, 186, 192, 204, 210, 222, 228, 240, 246, 258, 264, 276, 282, 294, 300, 312, 318, 330, 336, 348, 354, 366 및 372와 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2 영역; 및 서열 7, 13, 25, 31, 43, 49, 61, 67, 79, 85, 97, 103, 115, 121, 135, 139, 139, 151, 157, 169, 175, 187, 193, 205, 211, 223, 229, 241, 247, 259, 265, 277, 283, 295, 301, 313, 319, 331, 337, 349, 355, 367 및 373으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 서열 7, 13, 25, 31, 43, 49, 61, 67, 79, 85, 97, 103, 115, 121, 135, 139, 139, 151, 157, 169, 175, 187, 193, 205, 211, 223, 229, 241, 247, 259, 265, 277, 283, 295, 301, 313, 319, 331, 337, 349, 355, 367 및 373과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3 영역으로 이루어진 단리된 HER3 결합 모노클로날 항체 또는 그의 단편을 제공한다.
대안적인 프레임워크 또는 스캐폴드로의 항체 단편의 이식
생성되는 폴리펩티드가 HER3에 특이적으로 결합하는 적어도 1개의 결합 영역을 포함하는 한, 매우 다양한 항체/이뮤노글로불린 프레임워크 또는 스캐폴드를 사용할 수 있다. 이러한 프레임워크 또는 스캐폴드는 인간 이뮤노글로불린의 5가지 주요 이디오타입 또는 그의 단편을 포함하고, 바람직하게는 인간화 측면을 갖는 다른 동물 종의 이뮤노글로불린을 포함한다. 신규 프레임워크, 스캐폴드 및 단편이 당업자에 의해 계속 발견되고 개발된다.
한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 CDR이 이식될 수 있는 비-이뮤노글로불린 스캐폴드를 사용하여 비-이뮤노글로불린을 기반으로 하는 항체를 생성하는 것에 관한 것이다. 표적 HER3 단백질 (예를 들어, 인간 및/또는 시노몰구스 HER3)에 특이적인 결합 영역을 포함하는 한 공지된 또는 추후의 비-이뮤노글로불린 프레임워크 및 스캐폴드가 사용될 수 있다. 공지된 비-이뮤노글로불린 프레임워크 또는 스캐폴드는 피브로넥틴 (컴파운드 테라퓨틱스, 인크.(Compound Therapeutics, Inc.), 매사추세츠주 왈탐), 안키린 (몰레큘라 파트너즈 아게(Molecular Partners AG), 스위스 취리히), 도메인 항체 (도만티스, 리미티드(Domantis, Ltd.), 매사추세츠주 캠브리지, 및 아블린크스 nv(Ablynx nv), 벨기에 즈뷔나아르드), 리포칼린 (피에리스 프로테오랩 아게(Pieris Proteolab AG), 독일 프라이싱), 작은 모듈형 면역-의약품 (트루비온 파마슈티칼스 인크.(Trubion Pharmaceuticals Inc.), 워싱턴주 시애틀), 맥시바디 (아비디아, 인크.(Avidia, Inc.), 캘리포니아주 마운틴 뷰), 프로테인 A (아피바디 아게(Affibody AG), 스웨덴) 및 아필린 (감마-크리스탈린 또는 유비퀴틴) (스실 프로테인즈 게엠베하(Scil Proteins GmbH), 독일 할레)을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
피브로넥틴 스캐폴드는 피브로넥틴 유형 III 도메인 (예를 들어, 피브로넥틴 유형 III의 10번째 모듈 (10 Fn3 도메인))을 기반으로 한다. 피브로넥틴 유형 III 도메인은 단백질의 코어를 형성하도록 서로에 대해 패킹된 2개의 베타 시트 사이에 분포된 7개 또는 8개의 베타 가닥을 갖고, 베타 가닥들을 서로 연결하고 용매 노출된 루프 (CDR과 유사)를 추가로 함유한다. 베타 시트 샌드위치의 각 가장자리에는 이러한 루프가 적어도 3개 존재하고, 여기서 상기 가장자리는 베타 가닥의 방향에 수직인 단백질의 경계이다 (US 6,818,418 참조). 이러한 피브로넥틴-기반 스캐폴드는 이뮤노글로불린은 아니지만, 전반적인 폴드는 낙타 및 라마 IgG 내의 전체 항원 인식 단위를 포함하는 중쇄 가변 영역인 최소의 기능적 항체 단편의 것과 밀접한 관련이 있다. 이러한 구조로 인해, 비-이뮤노글로불린 항체는 항체의 것과 성질 및 친화도에서 유사한 항원 결합 특성을 모방한다. 이러한 스캐폴드는 생체내 항체의 친화도 성숙 과정과 유사한 시험관내 루프 무작위화 및 셔플링 전략에서 사용될 수 있다. 이러한 피브로넥틴-기반 분자는 표준 클로닝 기술을 이용하여 분자의 루프 영역이 본 발명의 CDR로 대체될 수 있는 스캐폴드로 사용될 수 있다.
안키린 기술은 다양한 표적들에 대한 결합에 사용될 수 있는 가변 영역을 보유하도록 안키린 유래의 반복부 모듈을 갖는 단백질을 스캐폴드로 사용하는 것을 기반으로 한다. 안키린 반복부 모듈은 2개의 역평행 α-나선 및 β-턴으로 이루어진 33개 아미노산의 폴리펩티드이다. 가변 영역의 결합은 리보솜 디스플레이를 사용함으로써 대부분 최적화된다.
아비머는 천연 A-도메인 함유 단백질, 예컨대 HER3으로부터 유래된다. 이러한 도메인은 본래 단백질-단백질 상호작용을 위해 사용되고, 인간에서는 250가지가 넘는 단백질이 구조적으로 A-도메인을 기반으로 한다. 아비머는 아미노산 링커를 통해 연결된 다수의 다양한 "A-도메인" 단량체들 (2 내지 10개)로 이루어진다. 예를 들어 미국 특허 출원 공보 번호 20040175756; 20050053973; 20050048512; 및 20060008844에 기재된 방법론을 이용하여 표적 항원에 결합할 수 있는 아비머가 생성될 수 있다.
아피바디 친화도 리간드는 단백질 A의 IgG-결합 도메인 중 하나의 스캐폴드를 기반으로 하는 3개의 나선 다발로 이루어진 작고 단순한 단백질이다. 단백질 A는 박테리아 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터의 표면 단백질이다. 이 스캐폴드 도메인은 58개의 아미노산으로 이루어지며, 이중 13개는 무작위화되어 다수의 리간드 변이체를 갖는 아피바디 라이브러리를 생성한다 (예를 들어, US 5,831,012 참조). 아피바디 분자는 항체를 모방하고, 항체의 분자량이 150 kDa인데 비해 분자량은 6 kDa이다. 아피바디 분자는 작은 크기에도 불구하고 이것의 결합 부위가 항체의 결합 부위와 유사하다.
안티칼린은 피에리스 프로테오랩 아게사에 의해 개발된 생성물이다. 이들은 리포칼린 (화학적으로 감수성 또는 불용성 화합물의 생리학적 수송 또는 저장에 통상적으로 관련된 작고 강건한 단백질의 광범위한 집단)으로부터 유래된다. 여러가지 천연 리포칼린이 인간 조직 또는 체액에서 생성된다. 단백질 구조는 초가변 루프가 단단한 프레임워크의 최상부에 존재하는 이뮤노글로불린을 연상시킨다. 그러나, 항체 또는 그의 재조합 단편과는 대조적으로, 리포칼린은 160 내지 180개 아미노산 잔기의 단일 폴리펩티드 쇄로 이루어져서 단일 이뮤노글로불린 도메인보다 단지 약간만 더 크다. 결합 포켓을 이루는, 4개 루프의 세트는 두드러진 구조적 유연성을 나타내고 다양한 측쇄를 허용한다. 따라서, 독점적인 방법에서는 상이한 형태의 규정된 표적 분자를 높은 친화도 및 특이성으로 인식하도록 결합 부위를 재성형시킬 수 있다. 리포칼린 패밀리의 단백질 중 하나인, 피에리스 브라시카에(Pieris brassicae)의 빌린-결합 단백질 (BBP)이, 4개 루프 세트의 돌연변이유발에 의해 안티칼린을 개발하는데 사용되어 왔다. 안티칼린을 기재하는 특허 출원의 한 예는 PCT 공보 번호 WO 199916873이다.
아필린 분자는 단백질 및 소분자에 대한 특이적 친화도를 위해 설계된 작은 비-이뮤노글로불린 단백질이다. 신규 아필린 분자는 상이한 인간 유래의 스캐폴드 단백질을 각각 기반으로 하는 2개의 라이브러리로부터 매우 신속하게 선택될 수 있다. 아필린 분자는 이뮤노글로불린 단백질과 어떠한 구조적 상동성도 나타내지 않는다. 현재, 2가지 아필린 스캐폴드가 사용되는데, 이중 하나는 감마 결정질의 인간 구조적 눈 수정체 단백질이고, 나머지 하나는 "유비퀴틴" 슈퍼패밀리 단백질이다. 인간 스캐폴드는 둘 다 매우 작고, 고온 안정성을 나타내며, pH 변화 및 변성제에 거의 내성을 갖는다. 이러한 높은 안정성은 주로 단백질의 확장된 베타 시트 구조로 인한 것이다. 감마 결정질 유래의 단백질의 예는 WO200104144에 기재되어 있고, "유비퀴틴-유사" 단백질의 예는 WO2004106368에 기재되어 있다.
단백질 에피토프 모방체 (PEM)는 단백질-단백질 상호작용에 관여하는 주요 2차 구조인 단백질의 베타-헤어핀 2차 구조를 모방하는 중간 크기의 시클릭 펩티드-유사 분자 (MW 1-2kDa)이다.
일부 실시양태에서, Fab는 Fc 영역을 변화시켜 침묵 IgG1 포맷으로 전환시킨다. 예를 들어, 표 1의 항체는 IgG 포맷으로 전환시킬 수 있다.
인간 또는 인간화 항체
본 발명은 HER3 단백질 (예를 들어, 인간 및/또는 시노몰구스/마우스/래트 HER3)에 특이적으로 결합하는 완전 인간 항체를 제공한다. 키메라 또는 인간화 항체와 비교하여, 본 발명의 인간 HER3-결합 항체는 인간 대상체를 투여되는 경우에 항원성을 추가로 감소시켰다.
인간 HER3-결합 항체는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 비-인간 항체를 조작된 인간 항체로 전환시키는데 이용되는 인간공학 기술이 있다. 미국 특허 공보 번호 20050008625는 비인간 항체와 비교하여 동일한 결합 특성을 유지하거나 또는 보다 우수한 결합 특성을 제공하면서 항체에서 비인간 항체 가변 영역을 인간 가변 영역으로 대체하는 생체내 방법을 기재한다. 상기 방법은 비인간 참조 항체의 가변 영역을 에피토프에 따라 완전 인간 항체로 대체하는 것을 기반으로 한다. 생성되는 인간 항체는 일반적으로 참조 비인간 항체와 구조적으로 관련이 있지는 않지만, 참조 항체와 동일한 항원 상의 동일한 에피토프에 결합한다. 간략하게, 일련의 에피토프-유도된 상보성 대체 접근법은, 항원에 대한 참조 항체의 결합에 반응하는 리포터 시스템의 존재 하에 제한된 양의 항원과의 결합에 대한 "경쟁자"와 시험 항체의 다양한 하이브리드 라이브러리 ("시험 항체") 사이의 세포내 경쟁을 확립함으로써 가능하게 된다. 경쟁자는 참조 항체 또는 그의 유도체, 예컨대 단일 쇄 Fv 단편일 수 있다. 경쟁자는 또한 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항원의 천연 또는 인공 리간드일 수 있다. 경쟁자의 유일한 요건은 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하고, 항원 결합에 대해 참조 항체와 경쟁하는 것이다. 시험 항체는 비인간 참조 항체로부터의 공통적인 1개의 항원-결합 V-영역, 및 다양한 공급원, 예컨대 인간 항체의 레퍼토리 라이브러리로부터 무작위로 선택된 다른 V-영역을 갖는다. 참조 항체로부터의 공통적인 V-영역은 안내자로서 기능하여 시험 항체를 항원 상의 동일한 에피토프에 동일한 배향으로 위치시켜서, 선택시에 참조 항체에 대해 가장 높은 항원 결합 충실도 쪽으로 편향되도록 한다.
다수의 유형의 리포터 시스템이 시험 항체와 항원 사이의 원하는 상호작용을 검출하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 시험 항체가 항원에 결합할 때에만 단편 상보성에 의한 리포터 활성화가 일어나도록 상보성 리포터 단편을 항원 및 시험 항체 각각에 연결할 수 있다. 시험 항체- 및 항원-리포터 단편 융합체가 경쟁자와 동시 발현될 때, 리포터 활성화는 항원에 대한 시험 항체의 친화도에 비례하는, 경쟁자와 경쟁하는 시험 항체의 능력에 의존하게 된다. 사용될 수 있는 다른 리포터 시스템은 미국 특허 출원 일련번호 10/208,730 (공보 번호 20030198971)에 개시된 바와 같은 자가억제된 리포터 재활성화 시스템 (RAIR)의 재활성화제 또는 미국 특허 출원 일련번호 10/076,845 (공보 번호 20030157579)에 개시된 경쟁적 활성화 시스템을 포함한다.
일련의 에피토프-유도된 상보성 대체 시스템을 사용하여, 경쟁자, 항원 및 리포터 성분과 함께 단일 시험 항체를 발현하는 세포를 확인하는 선택을 수행한다. 이러한 세포에서, 각각의 시험 항체는 제한된 양의 항원과의 결합에 대해 경쟁자와 일대일로 경쟁한다. 리포터의 활성은 시험 항체에 결합된 항원의 양에 비례하고, 이는 다시 항원에 대한 시험 항체의 친화도 및 시험 항체의 안정성에 비례한다. 시험 항체는 처음에는 시험 항체로 발현될 때 참조 항체의 활성에 대한 이들의 활성을 기반으로 하여 선택된다. 제1 라운드의 선택 결과는 "하이브리드" 항체의 세트이고, 이들은 각각 참조 항체로부터의 동일한 비인간 V-영역 및 라이브러리로부터의 인간 V-영역으로 이루어지고, 이들은 각각 항원 상에서 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합한다. 제1 라운드에서 선택된 하이브리드 항체 중 하나 이상은 항원에 대한 친화도가 참조 항체와 유사하거나 그보다 더 높을 것이다.
제2의 V-영역 대체 단계에서, 제1 단계에서 선택된 인간 V-영역이 나머지 비인간 참조 항체 V-영역을 동족 인간 V-영역의 다양한 라이브러리로 인간 대체하기 위한 선택의 지침으로 사용된다. 제1 라운드에서 선택된 하이브리드 항체는 또한 제2 라운드의 선택을 위해 경쟁자로서 사용될 수도 있다. 제2 라운드의 선택 결과는 참조 항체와 구조적으로 상이하지만, 동일한 항원과의 결합에 대해 참조 항체와 경쟁하는 완전 인간 항체의 세트이다. 선택된 인간 항체 중 일부는 참조 항체와 동일한 항원 상의 동일한 에피토프에 결합한다. 이들 선택된 인간 항체 중 하나 이상은 참조 항체와 유사하거나 그보다 더 높은 친화도로 동일한 에피토프에 결합한다.
상기 기재된 마우스 또는 키메라 HER3-결합 항체 중 하나를 참조 항체로서 사용함으로써, 상기 방법은 동일한 결합 특이성 및 동일하거나 더 우수한 결합 친화도로 인간 HER3에 결합하는 인간 항체를 생성하는데 용이하게 이용될 수 있다. 또한, 이러한 인간 HER3-결합 항체는 또한 인간 항체를 통상적으로 생산하는 회사, 예를 들어 칼로바이오스, 인크.(KaloBios, Inc.) (캘리포니아주 마운틴 뷰)로부터 상업적으로 입수할 수 있다.
낙타류 항체
신세계 구성원, 예를 들어 라마 종 (라마 파코스(Lama paccos), 라마 글라마(Lama glama) 및 라마 비쿠그나(Lama vicugna))을 비롯한 낙타 및 단봉낙타 (카멜루스 박트리아누스(Camelus bactrianus) 및 칼레루스 드로마데리우스(Calelus dromaderius)) 패밀리의 구성원으로부터 수득한 항체 단백질을 인간 대상체에 대해 크기, 구조적 복합성 및 항원성에 대해 특성화하였다. 자연계에서 발견되는 바와 같이 이러한 패밀리의 포유동물로부터의 특정 IgG 항체에는 경쇄가 없어서, 다른 동물로부터의 항체의 경우에서의 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 갖는 전형적인 4쇄 4차 구조와 구조적으로 상이하다. PCT/EP93/02214 (1994년 3월 3일에 공개된 WO 94/04678)를 참조한다.
VHH로 확인된 작은 단일 가변 도메인인 낙타류 항체 영역은 "낙타류 나노바디"라고 공지된 저분자량 항체-유래 단백질을 생성하는, 표적에 대해 고친화도를 갖는 작은 단백질을 얻도록 하는 유전자 조작으로 수득할 수 있다. 1998년 6월 2일 허여된 미국 특허 번호 5,759,808을 참조하고, 또한 문헌 [Stijlemans et al., (2004) J Biol Chem 279:1256-1261; Dumoulin et al., (2003) Nature 424:783-788; Pleschberger et al., (2003) Bioconjugate Chem 14:440-448; Cortez-Retamozo et al., (2002) Int J Cancer 89:456-62; 및 Lauwereys et al., (1998) EMBO J 17:3512-3520]을 참조한다. 낙타류 항체 및 항체 단편의 조작된 라이브러리는 상업적으로 입수가능하며, 예를 들어 아블린크스(벨기에 겐트)로부터 상업적으로 입수가능하다. (예를 들어, US20060115470; 도만티스 (US20070065440, US20090148434). 비-인간 기원의 다른 항체처럼, 낙타류 항체의 아미노산 서열은 인간 서열에 보다 유사하게 닮은 서열을 얻도록 재조합적으로 변경될 수 있다 (즉, 나노바디는 "인간화"될 수 있음). 따라서, 인간에 대한 낙타류 항체의 자연적으로 낮은 항원성을 추가로 감소시킬 수 있다.
낙타류 나노바디는 분자량이 인간 IgG 분자의 대략 1/10이고, 상기 단백질은 단지 수 나노미터에 불과한 물리적 직경을 갖는다. 작은 크기가 갖는 결과 중 하나는 보다 큰 항체 단백질의 경우에는 기능적으로 보이지 않는 항원 부위에 결합하는 낙타류 나노바디의 능력이고, 즉 낙타류 나노바디는 고전적인 면역학적 기술을 이용하여 달리 알 수 없는 항원을 검출하는 시약으로서 및 가능한 치료제로서 유용하다. 따라서, 작은 크기가 갖는 또 다른 결과는, 낙타류 나노바디는 표적 단백질의 홈 또는 좁은 틈새 내의 특이적 부위에 결합한 결과로 억제할 수 있기 때문에 고전적인 항체의 기능보다 고전적인 저분자량 약물의 기능과 보다 밀접하게 유사한 능력으로 작용할 수 있다는 것이다.
이러한 저분자량 및 조밀한 크기로 인해, 극도로 열 안정적이고 극한 pH 및 단백질분해적 소화에 대해서도 안정적이고 낮은 항원성을 갖는 낙타류 나노바디가 추가로 생성된다. 또 다른 결과는 낙타류 나노바디가 순환계로부터 조직 내로 용이하게 이동하고 심지어는 혈액-뇌 장벽을 횡단하며, 신경 조직에 영향을 미치는 장애를 치료할 수 있다는 것이다. 나노바디는 또한 혈액 뇌 장벽을 횡단하는 약물 수송을 추가로 용이하게 할 수 있다. 2004년 8월 19일에 공개된 미국 특허 출원 20040161738을 참조한다. 인간에 대한 낮은 항원성과 조합된 이러한 특징은 높은 치료 잠재력을 나타낸다. 또한, 이들 분자는 원핵 세포, 예를 들어 이. 콜라이(E. coli) 내에서 완전하게 발현될 수 있고, 박테리오파지와의 융합 단백질로서 발현되며, 기능적이다.
따라서, 본 발명의 특징은 HER3에 대해 고친화도를 갖는 낙타류 항체 또는 나노바디이다. 본원의 특정 실시양태에서, 낙타류 항체 또는 나노바디는 낙타류 동물에서 자연적으로 생산되는데, 즉 다른 항체에 대해 본원에 기재된 기술을 이용하여 HER3 또는 그의 펩티드 단편으로 면역화시킨 후의 낙타류에 의해 생산된다. 대안적으로, HER3-결합 낙타류 나노바디는 조작되는데, 즉 예를 들어 본원의 실시예에 기재된 바와 같이 표적으로서 HER3을 사용하는 패닝 절차를 이용하여 적절하게 돌연변이시킨 낙타류 나노바디 단백질을 디스플레이하는 파지의 라이브러리로부터 선택함으로써 생산된다. 조작된 나노바디는 수여 대상체 내에서의 반감기가 45분 내지 2주가 되도록 유전자 조작함으로써 추가로 적합화될 수 있다. 특정 실시양태에서, 낙타류 항체 또는 나노바디는 예를 들어 PCT/EP93/02214에 기재된 바와 같이 본 발명의 인간 항체의 중쇄 또는 경쇄의 CDR 서열을 나노바디 또는 단일 도메인 항체 프레임워크 서열로 이식하여 수득하였다. 한 실시양태에서, 낙타류 항체 또는 나노바디는 하기 HER3 잔기 중 적어도 하나에 결합한다: Asn266, Lys267, Leu268, Thr269, Gln271, Glu273, Pro274, Asn275, Pro276, His277, Asn315, Asp571, Pro583, His584, Ala596, Lys597. 한 실시양태에서, 낙타류 항체 또는 나노바디는 하기 HER3 잔기 중 적어도 하나에 결합한다: Tyr265, Lys267, Leu268, Phe270, Gly582, Pro583, Lys597, Ile600, Lys602, Glu609, Arg611, Pro612, Cys613, His614, Glu615.
이중특이적 분자 및 다가 항체
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 HER3-결합 항체 또는 그의 단편을 포함하는 이중파라토픽, 이중특이적 또는 다중특이적 분자를 특징으로 한다. 본 발명의 항체 또는 그의 단편은 다른 기능적 분자, 예를 들어 다른 펩티드 또는 단백질 (예를 들어, 수용체에 대한 다른 항체 또는 리간드)에 유도체화되거나 연결되어, 적어도 2개의 상이한 결합 부위 또는 표적 분자에 결합하는 이중특이적 분자를 생성할 수 있다. 본 발명의 항체는 실제로 유도체화되거나 1개 초과의 다른 기능적 분자에 연결되어 2개 초과의 상이한 결합 부위 및/또는 표적 분자에 결합하는 이중파라토픽 또는 다중특이적 분자; 이러한 이중파라토픽 또는 다중특이적 분자를 생성할 수 있다. 본 발명의 이중특이적 분자를 생성하기 위해, 본 발명의 항체는 하나 이상의 다른 결합 분자, 예컨대 또 다른 항체, 항체 단편, 펩티드 또는 결합 모방체에 기능적으로 연결 (예를 들어, 화학적 커플링, 유전자 융합, 비공유 회합 등에 의함)될 수 있어서 이중특이적 분자가 생성된다.
추가의 임상적 이익은 하나의 항체 내의 2개 이상의 항원의 결합에 의해 제공될 수 있다 (문헌 [Coloma et al., (1997); Merchant et al., (1998); Alt et al., (1999); Zuo et al., (2000); Lu et al., (2004); Lu et al., (2005); Marvin et al., (2005); Marvin et al., (2006); Shen et al., (2007); Wu et al., (2007); Dimasi et al., (2009); Michaelson et al., (2009)]). (문헌 [Morrison et al., (1997) Nature Biotech. 15:159-163; Alt et al. (1999) FEBS Letters 454:90-94; Zuo et al., (2000) Protein Engineering 13:361-367; Lu et al., (2004) JBC 279:2856-2865; Lu et al., (2005) JBC 280:19665-19672; Marvin et al., (2005) Acta Pharmacologica Sinica 26:649-658; Marvin et al., (2006) Curr Opin Drug Disc Develop 9:184-193; Shen et al., (2007) J Immun Methods 218:65-74; Wu et al., (2007) Nat Biotechnol. 11:1290-1297; Dimasi et al., (2009) J Mol Biol. 393:672-692; 및 Michaelson et al., (2009) mAbs 1:128-141] ).
본 발명의 이중특이적 분자는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 구성성분 결합 특이체를 접합시켜 제조할 수 있다. 예를 들어, 이중특이적 분자의 각각의 결합 특이체를 개별적으로 생성한 후에 서로 접합시킬 수 있다. 결합 특이체가 단백질 또는 펩티드인 경우에는, 공유 접합을 위해 다양한 커플링제 또는 가교제를 사용할 수 있다. 가교제의 예는 단백질 A, 카르보디이미드, N-숙신이미딜-S-아세틸-티오아세테이트 (SATA), 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산) (DTNB), o-페닐렌디말레이미드 (oPDM), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP) 및 술포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 (술포-SMCC)를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Karpovsky et al., (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648] 참조). 다른 방법은 문헌 [Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78:118-132; Brennan et al., (1985) Science 229:81-83), 및 Glennie et al., (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375]에 기재된 것을 포함한다. 접합제는 SATA 및 술포-SMCC (둘 다 피어스 케미칼 캄파니(Pierce Chemical Co.) (일리노이주 록포드)에서 입수가능함)이다.
결합 특이체가 항체인 경우, 이들을 2개 중쇄의 C-말단 힌지 영역을 술프히드릴 결합시켜 접합시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 힌지 영역은 접합 이전에 홀수의 술프히드릴 잔기, 예를 들어 1개의 술프히드릴 잔기를 함유하도록 변형된다.
대안적으로, 결합 특이체가 둘 다 동일한 벡터에서 코딩되어 동일한 숙주 세포에서 발현 및 어셈블리될 수 있다. 이 방법은 이중특이적 분자가 mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 또는 리간드 x Fab 융합 단백질인 경우에 특히 유용하다. 본 발명의 이중특이적 분자는 하나의 단일 쇄 항체 및 결합 결정인자를 포함하는 단일 쇄 분자, 또는 2개의 결합 결정인자를 포함하는 단일 쇄 이중특이적 분자일 수 있다. 이중특이적 분자는 적어도 2개의 단일 쇄 분자를 포함할 수 있다. 이중특이적 분자를 제조하는 방법은 예를 들어 미국 특허 번호 5,260,203; 미국 특허 번호 5,455,030; 미국 특허 번호 4,881,175; 미국 특허 번호 5,132,405; 미국 특허 번호 5,091,513; 미국 특허 번호 5,476,786; 미국 특허 번호 5,013,653; 미국 특허 번호 5,258,498; 및 미국 특허 번호 5,482,858에 기재되어 있다.
이중특이적 분자가 그의 특이적 표적에 결합하는 것은, 예를 들어 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA), 방사성면역검정 (REA), FACS 분석, 생물검정 (예를 들어, 성장 억제) 또는 웨스턴 블롯 검정으로 확인할 수 있다. 이들 검정 각각은 일반적으로 특정한 관심 단백질-항체 복합체에 특이적인 표지된 시약 (예를 들어, 항체)을 이용함으로써 상기 복합체의 존재를 검출한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 HER3에 결합하는 본 발명의 항체의 적어도 2개의 동일하거나 상이한 단편을 포함하는 다가 화합물을 제공한다. 항체 단편은 단백질 융합 또는 공유 또는 비공유 연결을 통해 함께 연결될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체를 본 발명의 항체의 불변 영역, 예를 들어 Fc 또는 힌지 영역에 결합하는 항체와 가교시켜 4가 화합물을 수득할 수 있다. 삼량체화 도메인은 예를 들어 특허 EP 1012280B1 (Borean)에 기재되어 있다. 오량체화 모듈은 예를 들어 PCT/EP97/05897에 기재되어 있다.
한 실시양태에서, 이중파라토픽/이중특이적은 HER3의 도메인 2 및 도메인 4 내의 아미노산 잔기에 결합한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 항원 결합 부위가 하나 초과의 항원에 결합하도록 단일 모노클로날 항체가 변형된 이중 기능 항체, 예컨대 HER3 및 또 다른 항원 (예를 들어, HER1, HER2 및 HER4) 둘 다에 결합하는 이중 기능 항체에 관한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 동일한 입체형태를 갖는 항원, 예를 들어 "폐쇄된" 또는 "불활성" 상태의 HER3의 동일한 입체형태를 갖는 항원을 표적화하는 이중 기능 항체에 관한 것이다. "폐쇄된" 또는 "불활성" 상태의 HER3의 동일한 입체형태를 갖는 항원의 예는 HER1 및 HER4를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 따라서, 이중 기능 항체는 HER3 및 HER1; HER3 및 HER4, 또는 HER1 및 HER4 둘 다에 결합할 수 있다. 이중 기능 항체의 이중 결합 특이성은 이중 활성 또는 활성의 억제로 추가로 번역될 수 있다. (예를 들어, 문헌 [Jenny Bostrom et al., (2009) Science: 323; 1610-1614] 참조).
연장된 반감기를 갖는 항체
본 발명은 생체내 반감기가 연장된, HER3 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.
다수의 인자가 단백질의 생체내 반감기에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 신장 여과, 간에서의 대사, 단백질분해 효소 (프로테아제)에 의한 분해 및 면역원성 반응 (예를 들어, 항체에 의한 단백질 중화, 및 대식세포 및 수상돌기 세포에 의한 흡수). 다양한 전략을 이용하여 본 발명의 항체의 반감기를 연장시킬 수 있다. 예를 들어, 폴리에틸렌글리콜 (PEG), reCODE PEG, 항체 스캐폴드, 폴리시알산 (PSA), 히드록시에틸 전분 (HES), 알부민-결합 리간드, 및 탄수화물 쉴드로의 화학적 연결에 의해; 혈청 단백질, 예컨대 알부민, IgG, FcRn 및 트랜스페린에 결합하는 단백질과의 유전자 융합에 의해; 혈청 단백질, 예컨대 나노바디, Fab, DARPin, 아비머, 아피바디 및 안티칼린에 결합하는 다른 결합 잔기와의 (유전자 또는 화학적) 커플링에 의해; rPEG, 알부민, 알부민의 도메인, 알부민-결합 단백질 및 Fc와의 유전자 융합에 의해; 또는 나노담체, 서방성 제제 또는 의료 장치로의 혼입에 의해 이루어진다.
항체의 생체내 혈청 순환을 연장시키기 위해, 불활성 중합체 분자, 예컨대 고분자량 PEG를 다관능성 링커를 사용하거나 사용하지 않고 항체 또는 그의 단편에 항체의 N- 또는 C-말단에 대한 PEG의 부위 특이적 접합을 통해 또는 리신 잔기에 존재하는 엡실론-아미노 기를 통해 부착시킬 수 있다. 항체를 PEG화시키기 위해, 이러한 항체 또는 그의 단편을 전형적으로 1개 이상의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 기가 항체 또는 항체 단편에 부착되는 조건하에 PEG, 예컨대 PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체와 반응시킨다. PEG화는 반응성 PEG 분자 (또는 유사한 반응성 수용성 중합체)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응으로 수행될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은 다른 단백질, 예컨대 모노 (C1-C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드를 유도체화하기 위해 사용되어 온 임의의 형태의 PEG를 포괄한다. 특정 실시양태에서, PEG화된 항체는 비-글리코실화 항체이다. 최소한의 생물학적 활성의 손실을 일으키는 선형 또는 분지형 중합체 유도체화가 사용될 것이다. 항체에 대한 PEG 분자의 적합한 접합을 확인하기 위해 접합 정도를 SDS-PAGE 및 질량 분광측정법에 의해 면밀히 모니터링할 수 있다. 미반응 PEG는 크기 배제 또는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 항체-PEG 접합체로부터 분리될 수 있다. PEG-유도체화 항체는 당업자에게 공지된 방법, 예를 들어 본원에 기재된 면역검정을 이용하여 결합 활성 뿐만 아니라 생체내 효능에 대해 시험될 수 있다. 단백질을 PEG화하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 본 발명의 항체에 적용할 수 있다. 예를 들어, EP 0 154 316 (Nishimura et al.) 및 EP 0 401 384 (Ishikawa et al.)를 참조한다.
다른 변형된 PEG화 기술은, 화학적으로 명시된 측쇄를 tRNA 신테타제 및 tRNA를 포함하는 재구축 시스템을 통해 생합성 단백질에 혼입하는, 직교 지시된 조작 기술의 화학적 재구축 (ReCODE PEG)을 포함한다. 상기 기술은 이. 콜라이, 효모 및 포유동물 세포에서 30개 초과의 새로운 아미노산을 생합성 단백질에 혼입할 수 있게 한다. tRNA는 앰버 코돈이 위치한 임의의 부위에 비천연 아미노산을 혼입시켜서, 정지 코돈의 앰버가 화학적으로 명시된 아미노산의 혼입을 신호하는 코돈으로 전환되게 한다.
또한, 재조합 PEG화 기술 (rPEG)은 혈청 반감기 연장을 위해 이용될 수도 있다. 이 기술은 300-600개 아미노산의 비구조화 단백질 꼬리를 기존의 제약 단백질에 유전자 융합시키는 것을 포함한다. 이러한 비구조화 단백질 쇄의 겉보기 분자량은 그의 실제 분자량보다 약 15배 더 높기 때문에, 상기 단백질의 혈청 반감기는 크게 증가된다. 화학적 접합 및 재정제를 필요로 하는 통상적인 PEG화와는 달리, 제조 방법이 크게 간소화되고 생성물은 균질하다.
폴리시알화는 활성 수명을 연장시키고 치료 펩티드 및 단백질의 안정성을 개선시키기 위해 천연 중합체 폴리시알산 (PSA)을 사용하는 또 다른 기술이다. PSA는 시알산의 중합체 (당)이다. 단백질 및 치료 펩티드 약물 전달을 위해 사용되는 경우, 폴리시알산은 접합체에 보호 미세환경을 제공한다. 이것은 순환계 내 치료 단백질의 활성 수명을 증가시키고, 이것이 면역계에 의해 인식되지 않도록 방지한다. PSA 중합체는 인간 신체에서 자연적으로 발견된다. 특정 박테리아는 수백만년에 걸쳐서 자신의 벽을 이것으로 코팅하도록 진화하였다. 이어서, 이러한 천연 폴리시알화 박테리아는 분자 모방에 의해 신체의 방어 시스템을 이겨낼 수 있었다. 자연계의 궁극적인 스텔스 기술인 PSA는 이러한 박테리아로부터 대량으로 소정의 물리적 특징을 갖는 것으로서 용이하게 생산될 수 있다. 박테리아 PSA는 인간 신체 내의 PSA와 화학적으로 동일하기 때문에 단백질에 커플링될 때조차도 완전하게 비-면역원성이다.
또 다른 기술은 항체에 연결된 히드록시에틸 전분 ("HES") 유도체의 사용을 포함한다. HES는 찰옥수수 전분에서 유래된 변형된 천연 중합체이며, 신체의 효소에 의해 대사될 수 있다. HES 용액은 일반적으로 부족한 혈액량을 채우고 혈액의 유동성을 개선시키기 위해 투여된다. 항체의 HES화는 상기 분자의 안정성을 증가시키고 또한 신장 제거율을 감소시켜 순환 반감기의 연장을 가능하게 하여 생물학적 활성을 증가시킨다. 여러가지 파리미터, 예컨대 HES의 분자량을 변경시킴으로써, 광범위한 범위의 HES 항체 접합체가 맞춤 제조될 수 있다.
증가된 생체내 반감기를 갖는 항체는 또한 1개 이상의 아미노산 변형 (즉, 치환, 삽입 또는 결실)을 IgG 불변 도메인, 또는 그의 FcRn 결합 단편 (바람직하게는 Fc 또는 힌지 Fc 도메인 단편)에 도입하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 국제 공보 번호 WO 98/23289; 국제 공보 번호 WO 97/34631; 및 미국 특허 번호 6,277,375를 참조한다.
또한, 항체는 항체 또는 항체 단편을 생체내에서 보다 안정적이게 하고 보다 긴 생체내 반감기를 갖게 하도록 알부민에 접합시킬 수 있다. 상기 기술은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 국제 공보 번호 WO 93/15199, WO 93/15200, 및 WO 01/77137; 및 유럽 특허 번호 EP 413,622를 참조한다.
HER3 항체 또는 그의 단편은 또한 하나 이상의 인간 혈청 알부민 (HSA) 폴리펩티드, 또는 그의 일부에 융합될 수 있다. HSA (그의 성숙 형태에서 585개의 아미노산을 갖는 단백질)는 혈청 삼투압의 유의한 부분을 담당하며, 또한 내인성 및 외인성 리간드의 담체로서 기능한다. 담체 분자로서 알부민의 역할 및 그의 불활성 성질은 생체내에서 폴리펩티드의 담체 및 수송체로서 사용하기에 바람직한 특성이다. 다양한 단백질을 위한 담체로서 알부민 융합 단백질의 성분으로서의 알부민의 용도는 WO 93/15199, WO 93/15200, 및 EP 413 622에서 제안되었다. 폴리펩티드로의 융합을 위한 HSA의 N-말단 단편의 용도 또한 제안되었다 (EP 399 6666). 따라서, 항체 또는 그의 단편을 유전적으로 또는 화학적으로 알부민에 융합 또는 접합시킴으로써 안정화 또는 저장 수명을 연장하고/하거나, 용액 내에서, 시험관 내에서 및/또는 생체 내에서 연장된 기간 동안 분자의 활성을 유지시킬 수 있다.
알부민을 또 다른 단백질에 융합시키는 것은 HSA를 코딩하는 DNA, 또는 그의 단편이 단백질을 코딩하는 DNA에 연결되도록 하는 유전자 조작에 의해 달성될 수 있다. 이어서, 융합 폴리펩티드를 발현하도록 적합한 플라스미드 상에 배열된 융합된 뉴클레오티드 서열로 적합한 숙주를 형질전환 또는 형질감염시킨다. 발현은 예를 들어 원핵 또는 진핵 세포로부터 시험관내에서, 또는 생체내에서, 예를 들어 트랜스제닉 유기체로부터 실시될 수 있다. HSA 융합에 관한 추가의 방법은 예를 들어 본원에 참조로 포함되는 WO 2001077137 및 WO 200306007에서 확인할 수 있다. 구체적 실시양태에서, 융합 단백질의 발현은 포유동물 세포주, 예를 들어 CHO 세포주에서 수행된다. 낮은 또는 높은 pH에서의 수용체에 대한 항체의 변경된 차별적 결합이 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다. 예를 들어, 항체의 친화도는 항체가 항체의 CDR에 추가의 아미노산, 예컨대 히스티딘을 포함하도록 변형시킴으로써, 항체가 그의 수용체에 낮은 pH, 예를 들어 리소자임 내의 낮은 pH에서 결합된 상태로 있도록 변형될 수 있다 (문헌 [Tomoyuki Igawa et al. (2010) Nature Biotechnology; 28, 1203-1207] 참조).
항체 접합체
본 발명은 이종 단백질 또는 폴리펩티드 (또는 그의 단편, 바람직하게는 10개 이상, 20개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 50개 이상, 60개 이상, 70개 이상, 80개 이상, 90개 이상 또는 100개 이상의 아미노산의 폴리펩티드)에 재조합 방식으로 융합되거나 화학적으로 접합 (공유 접합 및 비공유 접합 둘 다를 포함함)되어 융합 단백질을 생성하는, HER3 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편을 제공한다. 특히, 본 발명은 본원에 기재된 항체 단편 (예를 들어, Fab 단편, Fd 단편, Fv 단편, F(ab)2 단편, VH 도메인, VH CDR, VL 도메인 또는 VL CDR) 및 이종 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 항체 또는 항체 단편에 융합 또는 접합시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,336,603, 5,622,929, 5,359,046, 5,349,053, 5,447,851, 및 5,112,946; 유럽 특허 번호 EP 307,434 및 EP 367,166; 국제 공보 번호 WO 96/04388 및 WO 91/06570; 문헌 [Ashkenazi et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535-10539; Zheng et al., (1995) J. Immunol. 154:5590-5600; 및 Vil et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337- 11341]을 참조한다.
추가의 융합 단백질은 유전자-셔플링, 모티프-셔플링, 엑손-셔플링 및/또는 코돈-셔플링 (통칭하여, "DNA 셔플링"이라 지칭함)의 기술을 통해 생성될 수 있다. DNA 셔플링은 본 발명의 항체 또는 그의 단편의 활성 변경 (예를 들어, 더 높은 친화도 및 더 낮은 해리율을 갖는 항체 또는 그의 단편)에 사용될 수 있다. 일반적으로, 미국 특허 번호 5,605,793, 5,811,238, 5,830,721, 5,834,252, 및 5,837,458; 문헌 [Patten et al., (1997) Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33; Harayama, (1998) Trends Biotechnol. 16(2):76-82; Hansson et al., (1999) J. Mol. Biol. 287:265-76; 및 Lorenzo and Blasco, (1998) Biotechniques 24(2):308- 313] (각각의 이들 특허 및 공보는 전체내용이 본원에 참고로 포함됨)을 참조한다. 항체 또는 그의 단편, 또는 코딩된 항체 또는 그의 단편은 재조합 전에 오류-유발 PCR, 무작위 뉴클레오티드 삽입 또는 다른 방법에 의한 무작위 돌연변이유발의 실시로 변경될 수 있다. HER3 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 이종 분자의 하나 이상의 성분, 모티프, 절편, 부분, 도메인, 단편 등과 재조합될 수 있다.
또한, 항체 또는 그의 단편을 마커 서열, 예컨대 정제를 용이하게 하는 펩티드와 융합시킬 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 마커 아미노산 서열은 헥사-히스티딘 펩티드, 예컨대 특히 pQE 벡터 (퀴아젠, 인크.(QIAGEN, Inc.), 91311 캘리포니아주 채츠워스 에톤 애비뉴 9259)에서 제공되는 태그이며, 다수가 상업적으로 입수가능하다. 예를 들어 문헌 [Gentz et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824]에 기재된 바와 같이, 헥사-히스티딘은 융합 단백질의 편리한 정제를 제공한다. 정제에 유용한 다른 펩티드 태그는 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유래된 에피토프에 상응하는 헤마글루티닌 ("HA") 태그 (문헌 [Wilson et al., (1984) Cell 37:767]) 및 "플래그" 태그를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 단편은 진단제 또는 검출가능한 작용제에 접합된다. 이러한 항체는 특정한 요법의 효능을 결정하는 것과 같은 임상 시험 절차의 일부로서 질환 또는 장애의 발병, 발생, 진행 및/또는 중증도를 모니터링하거나 예측하는데 유용할 수 있다. 이러한 진단 및 검출은 항체를 검출가능한 물질, 예를 들어 다양한 효소, 예컨대 (비제한적으로) 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 아세틸콜린에스테라제 (이에 제한되지 않음); 보결 분자단, 예컨대 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴 (이에 제한되지 않음); 형광 물질, 예컨대 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린 (이에 제한되지 않음); 발광 물질, 예컨대 루미놀 (이에 제한되지 않음); 생물발광 물질, 예컨대 루시페라제, 루시페린 및 에쿼린 (이에 제한되지 않음); 방사성 물질, 예컨대 아이오딘 (131I, 125I, 123I, 및 121I), 탄소 (14C), 황 (35S), 삼중수소 (3H), 인듐 (115In, 113In, 112In 및 111In), 테크네튬 (99Tc), 탈륨 (201Ti), 갈륨 (68Ga, 67Ga), 팔라듐 (103Pd), 몰리브데넘 (99Mo), 크세논 (133Xe), 플루오린 (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn 및 117Tin (이에 제한되지 않음); 및 양전자 방출 금속 (다양한 양전자 방출 단층촬영을 이용함), 및 비-방사성 상자성 금속 이온에 커플링시켜 달성될 수 있다.
본 발명은 치료 모이어티에 접합된 항체 또는 그의 단편의 사용을 추가로 포함한다. 항체 또는 그의 단편은 치료 모이어티, 예컨대 세포독소, 예를 들어 세포증식 억제제 또는 세포파괴제, 치료제 또는 방사성 금속 이온, 예를 들어 알파-방출자에 접합될 수 있다. 세포독소 또는 세포독성제는 세포에 해로운 임의의 작용제를 포함한다.
또한, 항체 또는 그의 단편은 주어진 생물학적 반응을 변형시키는 치료 모이어티 또는 약물 모이어티에 접합될 수 있다. 치료 모이어티 또는 약물 모이어티는 고전적인 화학적 치료제로 제한되는 것으로 간주되지 않는다. 예를 들어, 약물 모이어티는 원하는 생물학적 활성을 보유하는 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 단백질은 예를 들어 독소, 예컨대 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소, 콜레라 독소 또는 디프테리아 독소, 단백질, 예컨대 종양 괴사 인자, α-인터페론, β-인터페론, 신경 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자, 조직 플라스미노겐 활성화제, 아폽토시스성 작용제, 항혈관신생제, 또는 생물학적 반응 조절제, 예컨대 림포카인을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 항-HER3 항체 또는 그의 단편은 치료 모이어티, 예컨대 세포독소, 약물 (예를 들어, 면역억제제) 또는 방사성독소에 접합된다. 이러한 접합체는 본원에서 "면역접합체"로 지칭된다. 하나 이상의 세포독소를 포함하는 면역접합체는 "면역독소"로 지칭된다. 세포독소 또는 세포독성제는 세포에 해로운 (예를 들어, 세포를 사멸시키는) 임의의 작용제를 포함한다. 예는 탁손, 시토칼라신 B, 그라미시딘 D, 브로민화에티듐, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 티. 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤 및 퓨로마이신, 및 그의 유사체 또는 상동체를 포함한다. 치료제는 또한, 예로서 항대사물 (예를 들어, 메토트렉세이트, 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오르우라실 데카르바진), 알킬화제 (예를 들어, 메클로레타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴 (BSNU) 및 로무스틴 (CCNU), 시클로포스파미드, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스-디클로로디아민 백금 (II) (DDP) 시스플라틴, 안트라시클린 (예를 들어, 다우노루비신 (이전에 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제 (예를 들어, 닥티노마이신 (이전에 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신, 및 안트라마이신 (AMC)), 및 항유사분열제 (예를 들어, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)를 포함한다. (예를 들어, US20090304721 (시애틀 제네틱스(Seattle Genetics)) 참조).
본 발명의 항체에 접합될 수 있는 치료 세포독소의 다른 예는 두오카르마이신, 칼리케아미신, 메이탄신 및 아우리스타틴, 및 그의 유도체를 포함한다. 칼리케아미신 항체 접합체의 예는 상업적으로 입수가능하다 (밀로타르그(Mylotarg)TM; 와이어쓰-에이어스트(Wyeth-Ayerst)).
세포독소는 당업계에서 이용가능한 링커 기술을 이용하여 본 발명의 항체에 접합될 수 있다. 세포독소를 항체에 접합시키는데 사용되는 링커 유형의 예는 히드라존, 티오에테르, 에스테르, 디술피드 및 펩티드-함유 링커를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예를 들어 리소좀 구획 내의 낮은 pH에 의한 절단에 영향을 받기 쉽거나 또는 프로테아제, 예컨대 종양 조직에서 우선적으로 발현되는 프로테아제, 예컨대 카텝신 (예를 들어, 카텝신 B, C, D)에 의한 절단에 영향을 받기 쉬운 링커가 선택될 수 있다.
세포독소의 유형, 링커 및 항체에 대한 치료제의 접합 방법의 추가의 논의에 대해, 또한 문헌 [Saito et al., (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail et al., (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, (2003) Cancer Cell 3:207-212; Allen, (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan and Kreitman, (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter and Springer, (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264]을 참조한다.
본 발명의 항체는 방사성면역접합체로도 지칭되는 세포독성 방사성제약을 생성하기 위하여 방사성 동위원소에 접합될 수도 있다. 진단적 또는 치료적 사용을 위하여 항체에 접합될 수 있는 방사성 동위원소의 예는 아이오딘131, 인듐111, 이트륨90 및 루테튬177을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 방사성면역접합체를 제조하는 방법은 당업계에 확립되어 있다. 제발린(Zevalin)TM (DEC 파마슈티칼스(DEC Pharmaceuticals)) 및 벡사르(Bexxar)TM (코릭사 파마슈티칼스(Corixa Pharmaceuticals))을 비롯한 방사성면역접합체의 예가 상업적으로 입수가능하고, 본 발명의 항체를 사용하여 방사성면역접합체를 제조하는데 유사한 방법을 이용할 수 있다. 특정 실시양태에서, 마크로시클릭 킬레이터는 링커 분자를 통해 항체에 부착될 수 있는 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-N,N',N",N"'-테트라아세트산 (DOTA)이다. 이러한 링커 분자는 당업계에 통상적으로 공지되어 있고, 문헌 [Denardo et al., (1998) Clin Cancer Res. 4(10):2483-90; Peterson et al., (1999) Bioconjug. Chem. 10(4):553-7; 및 Zimmerman et al., (1999) Nucl. Med. Biol. 26(8):943-50] (각각 그의 전체내용이 본원에 참고로 포함됨)에 기재되어 있다.
항체에 치료 모이어티를 접합시키는 기술은 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), 및 Thorpe et al., (1982) Immunol. Rev. 62:119-58] 참조).
항체는 또한 면역검정 또는 표적 항원의 정제에 특히 유용한 고체 지지체에 부착될 수도 있다. 이러한 고체 지지체는 유리, 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드 또는 폴리프로필렌을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
항체 조합
또 다른 측면에서, 본 발명은 다른 치료제, 예컨대 또 다른 항체, 소분자 억제제, mTOR 억제제 또는 PI3 키나제 억제제와 사용된 본 발명의 HER3 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다. 예는 하기를 포함하나 이에 제한되지 않는다:
HER1 억제제: HER3 항체 또는 그의 단편은 마투주맙 (EMD72000), 에르비툭스®/세툭시맙 (임클론(Imclone)), 벡티빅스®/파니투무맙 (암젠), mAb 806 및 니모투주맙 (TheraCIM), 이레사®/게피티닙 (아스트라제네카(Astrazeneca)); CI-1033 (PD183805) (화이자(Pfizer)), 라파티닙 (GW-572016) (글락소스미스클라인(GlaxoSmithKline)), 타이커브®/라파티닙 디토실레이트 (스미스클라인비참(SmithKlineBeecham)), 타르세바®/에를로티닙 HCL (OSI-774) (OSI 파마(OSI Pharma)) 및 PKI-166 (노파르티스(Novartis)) 및 N-[4-[(3-클로로-4-플루오로페닐)아미노]-7-[[(3"S")-테트라히드로-3-푸라닐]옥시]-6-퀴나졸리닐]-4(디메틸아미노)-2-부텐아미드 (베링거 잉겔하임(Boehringer Ingelheim)에 의해 상표명 토보크®로 판매됨)를 포함하나 이에 제한되지 않은 HER1 억제제와 사용될 수 있다.
HER2 억제제: HER3 항체 또는 그의 단편은 페르투주맙 (제넨테크에 의해, 상표명 옴니타르그(Omnitarg)®로 판매됨), 트라스투주맙 (제넨테크/로슈에 의해 상표명 헤르셉틴(Herceptin)®으로 판매됨), MM-111, 네라티닙 (또한 HKI-272로 공지됨, (2E)-N-[4-[[3-클로로-4-[(피리딘-2-일)메톡시]페닐]아미노]-3-시아노-7-에톡시퀴놀린-6-일]-4-(디메틸아미노)부트-2-엔아미드, 및 PCT 공보 번호 WO 05/028443에 기재됨), 라파티닙 또는 라파티닙 디토실레이트(글락소스미스클라인에 의해 상표명 타이커브®로 판매됨)를 포함하나 이에 제한되지 않는 HER2 억제제와 사용될 수 있다.
HER3 억제제: HER3 항체 또는 그의 단편은 MM-121, MM-111, IB4C3, 2DID12 (U3 파마 아게), AMG888 (암젠), AV-203 (아베오), MEHD7945A (제넨테크), 및 HER3을 억제하는 소분자를 포함하나 이에 제한되지 않는 HER3 억제제와 사용될 수 있다.
HER4 억제제: HER3 항체 또는 그의 단편은 HER4 억제제와 사용될 수 있다.
PI3K 억제제: HER3 항체 또는 그의 단편은 4-[2-(1H-인다졸-4-일)-6-[[4-(메틸술포닐)피페라진-1-일]메틸]티에노[3,2-d]피리미딘-4-일]모르폴린 (또한 GDC 0941로 공지되어 있고, PCT 공보 번호 WO 09/036082 및 WO 09/055730에 기재됨), 2-메틸-2-[4-[3-메틸-2-옥소-8-(퀴놀린-3-일)-2,3-디히드로이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일]페닐]프로피오니트릴 (또한 BEZ 235 또는 NVP-BEZ 235로 공지되어 있고, PCT 공보 번호 WO 06/122806에 기재됨), BMK120 및 BYL719를 포함하나 이에 제한되지 않는 PI3 키나제 억제제와 사용될 수 있다.
mTOR 억제제: HER3 항체 또는 그의 단편은 템시롤리무스 (화이자에 의해 상표명 토리셀(Torisel)®로 판매됨), 리다포롤리무스 (공식적으로 데포롤리무스, (1R,2R,4S)-4-[(2R)-2-[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-디히드록시-19,30-디메톡시-15,17,21,23,29,35-헥사메틸-2,3,10,14,20-펜타옥소-11,36-디옥사-4-아자트리시클로[30.3.1.04,9]헥사트리아콘다-16,24,26,28-테트라엔-12-일]프로필]-2-메톡시시클로헥실 디메틸포스피네이트 (또한 데포롤리무스, AP23573 및 MK8669 (아리아드 팜.(Ariad Pharm.))로 공지되어 있고, PCT 공보 번호 WO 03/064383에 기재됨), 에베롤리무스 (RAD001) (노파르티스에 의해 상표명 아피니토르®로 판매됨)를 포함하나 이에 제한되지 않는 mTOR 억제제와 사용될 수 있다. 하나 이상의 치료제는 동시에 또는 본 발명의 HER3 항체 또는 그의 단편의 투여 전후에 투여될 수 있다.
본 발명의 항체를 생산하는 방법
(i) 항체를 코딩하는 핵산
본 발명은 상기 기재된 HER3-결합 항체 쇄의 절편 또는 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는, 실질적으로 정제된 핵산 분자를 제공한다. 본 발명의 핵산의 일부는 HER3 항체 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및/또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 구체적 실시양태에서, 핵산 분자는 표 1에서 확인된 것이다. 본 발명의 일부 다른 핵산 분자는 표 1에서 확인된 것의 뉴클레오티드 서열과 실질적으로 동일한 (예를 들어, 적어도 65, 80%, 95% 또는 99% 동일함) 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 적절한 발현 벡터로부터 발현되는 경우, 이러한 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 HER3 항원 결합 능력을 나타낼 수 있다.
또한, 본 발명에서는 상기 열거된 HER3-결합 항체의 중쇄 또는 경쇄로부터의 적어도 1개의 CDR 영역 및 통상적으로 모든 3개의 CDR 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 일부 다른 폴리뉴클레오티드는 상기 열거된 HER3-결합 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 영역 서열을 모두 또는 실질적으로 모두 코딩한다. 코드의 축중성으로 인해, 다양한 핵산 서열이 각각의 이뮤노글로불린 아미노산 서열을 코딩할 것이다.
본 발명의 핵산 분자는 항체의 가변 영역 및 불변 영역을 둘 다 코딩할 수 있다. 본 발명의 핵산 서열의 일부는 표 1에 열거된 HER3 항체의 성숙 중쇄 가변 영역 서열에 실질적으로 동일한 (예를 들어, 적어도 80%, 90% 또는 99%) 성숙 중쇄 가변 영역 서열을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 다른 핵산 서열은 표 1에 열거된 HER3 항체의 성숙 경쇄 가변 영역 서열에 실질적으로 동일한 (예를 들어, 적어도 80%, 90% 또는 99%) 성숙 경쇄 가변 영역 서열을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함한다.
폴리뉴클레오티드 서열은 HER3-결합 항체 또는 그의 결합 단편을 코딩하는 기존의 서열 (예를 들어, 하기 실시예에 기재된 바와 같은 서열)의 신생 고체-상 DNA 합성 또는 PCR 돌연변이유발에 의해 생산될 수 있다. 핵산의 직접적인 화학적 합성은 당업계에 공지된 방법, 예컨대 문헌 [Narang et al., (1979) Meth. Enzymol. 68:90]의 포스포트리에스테르 방법, 문헌 [Brown et al., (1979) Meth. Enzymol. 68:109]의 포스포디에스테르 방법, 문헌 [Beaucage et al., (1981) Tetra. Lett., 22:1859]의 디에틸포스포르아미다이트 방법, 및 미국 특허 번호 4,458,066의 고체 지지체 방법으로 달성될 수 있다. PCR에 의해 폴리뉴클레오티드 서열에 돌연변이를 도입하는 것은 예를 들어 문헌 [PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H.A. Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, NY, 1992; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (Ed.), Academic Press, San Diego, CA, 1990; Mattila et al., (1991) Nucleic Acids Res. 19:967; 및 Eckert et al., (1991) PCR Methods and Applications 1:17]에 기재된 바와 같이 하여 수행될 수 있다.
또한, 본 발명에서는 상기 기재된 HER3-결합 항체를 생산하기 위한 발현 벡터 및 숙주 세포가 제공된다. HER3-결합 항체 쇄 또는 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현시키기 위해 다양한 발현 벡터를 사용할 수 있다. 포유동물 숙주 세포에서 항체를 생성하기 위해 바이러스-기재 및 비바이러스 발현 벡터 둘 다 사용될 수 있다. 비바이러스 벡터 및 시스템은 플라스미드, 에피솜 벡터 (전형적으로, 단백질 또는 RNA 발현을 위한 발현 카세트를 가짐), 및 인간 인공 염색체 (예를 들어, 문헌 [Harrington et al., (1997) Nat Genet 15:345] 참조)를 포함한다. 예를 들어, 포유동물 (예를 들어, 인간) 세포에서 HER3-결합 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 발현시키는데 유용한 비바이러스 벡터는 pThioHis A, B & C, pcDNA3.1/His, pEBVHis A, B & C (인비트로젠(Invitrogen), 캘리포니아주 샌디에고), MPSV 벡터, 및 다른 단백질 발현과 관련하여 당업계에 공지된 다수의 다른 벡터를 포함한다. 유용한 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 바이러스를 기반으로 하는 벡터, SV40, 유두종 바이러스, HBP 엡스타인 바르(Epstein Barr) 바이러스를 기반으로 하는 벡터, 백시니아 바이러스 벡터 및 셈리키 포레스트(Semliki Forest) 바이러스 (SFV)를 기반으로 하는 벡터를 포함한다. 문헌 [Brent et al., (1995) 상기 문헌; Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807; 및 Rosenfeld et al., (1992) Cell 68:143]을 참조한다.
발현 벡터의 선택은 벡터가 발현되는 의도된 숙주 세포에 따라 달라진다. 전형적으로, 발현 벡터는 HER3-결합 항체 쇄 또는 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터 및 다른 조절 서열 (예를 들어, 인핸서)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유도성 프로모터는 유도 조건 하인 경우 이외에는 삽입된 서열의 발현을 저해하기 위해 사용된다. 유도성 프로모터는 예를 들어 아라비노스, lacZ, 메탈로티오네인 프로모터 또는 열 충격 프로모터를 포함한다. 형질전환된 유기체의 배양물은, 발현 생성물이 숙주 세포에 의해 보다 우수하게 허용되는 서열을 코딩하는 집단으로 편향되지 않으면서 비-유도 조건하에서 증식될 수 있다. 프로모터에 뿐만 아니라, HER3-결합 항체 쇄 또는 단편의 효율적인 발현을 위해 다른 조절 요소가 또한 요구되거나 요망될 수 있다. 이들 요소는 전형적으로 ATG 개시 코돈 및 인접한 리보솜 결합 부위 또는 다른 서열을 포함한다. 또한, 발현 효율은 사용하는 세포 시스템에 적절한 인핸서를 포함시켜 증진될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Scharf et al., (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:125; 및 Bittner et al., (1987) Meth. Enzymol., 153:516] 참조). 예를 들어, SV40 인핸서 또는 CMV 인핸서가 포유동물 숙주 세포에서의 발현 증가를 위해 사용될 수 있다.
발현 벡터는 또한 삽입된 HER3-결합 항체 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드와 융합 단백질을 형성하는 분비 신호 서열 위치를 제공할 수도 있다. 보다 흔히, 삽입된 HER3-결합 항체 서열을 신호 서열에 연결시킨 후에 벡터에 포함시킨다. HER3-결합 항체 경쇄 및 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 서열을 수용하는데 사용되는 벡터는 때때로 또한 불변 영역 또는 그의 일부를 코딩한다. 이러한 벡터는 불변 영역과의 융합 단백질로서의 가변 영역의 발현을 허용함으로써 무손상 항체 또는 그의 단편을 생성할 수 있다. 전형적으로, 이러한 불변 영역은 인간의 것이다.
HER3-결합 항체 쇄를 보유하고 발현하는 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 이. 콜라이는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 클로닝하고 발현시키는데 유용한 원핵 숙주 중 하나이다. 사용하기 적합한 다른 미생물 숙주는 바실루스, 예를 들어 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 및 다른 엔테로박테리아세아에, 예를 들어 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia) 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 종을 포함한다. 이들 원핵 숙주에서, 전형적으로 숙주 세포와 상용가능한 발현 제어 서열 (예를 들어, 복제 기점)을 함유하는 발현 벡터를 또한 제조할 수 있다. 또한, 임의의 수의 다양한 널리 공지된 프로모터, 예컨대 락토스 프로모터 시스템, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템, 베타-락타마제 프로모터 시스템, 또는 파지 람다로부터의 프로모터 시스템이 존재할 것이다. 프로모터는 전형적으로 임의로는 오퍼레이터 서열과 함께 발현을 제어하고, 전사 및 번역을 개시하고 종료하기 위한 리보솜 결합 부위 서열 등을 갖는다. 본 발명의 HER3-결합 폴리펩티드를 발현시키기 위해 다른 미생물, 예컨대 효모가 또한 사용될 수 있다. 바큘로바이러스 벡터와 조합된 곤충 세포가 또한 사용될 수 있다.
일부 바람직한 실시양태에서, 포유동물 숙주 세포가 본 발명의 HER3-결합 폴리펩티드를 발현시키고 생산하는데 사용된다. 예를 들어, 이들은 내인성 이뮤노글로불린 유전자를 발현하는 하이브리도마 세포주 (예를 들어, 실시예에 기재된 바와 같은 1D6.C9 골수종 하이브리도마 클론) 또는 외인성 발현 벡터를 보유하는 포유동물 세포주 (예를 들어, 하기 예시된 SP2/0 골수종 세포)일 수 있다. 이들은 임의의 정상적인 사망할 동물 또는 인간 세포, 또는 정상적이거나 비정상적인 불멸 동물 또는 인간 세포를 포함한다. 예를 들어, CHO 세포주, 다양한 Cos 세포주, HeLa 세포, 골수종 세포주, 형질전환된 B-세포 및 하이브리도마를 포함하여 무손상 이뮤노글로불린을 분비할 수 있는 다수의 적합한 숙주 세포주가 개발되었다. 포유동물 조직 세포 배양을 이용하여 폴리펩티드를 발현시키는 것은 예를 들어 문헌 [Winnacker, FROM GENES TO CLONES, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987]에서 일반적으로 논의된다. 포유동물 숙주 세포를 위한 발현 벡터는 발현 제어 서열, 예컨대 복제 기점, 프로모터 및 인핸서 (예를 들어, 문헌 [Queen, et al., (1986) Immunol. Rev. 89:49-68] 참조), 및 필요한 프로세싱 정보 부위, 예컨대 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위 및 전사 종결자 서열을 포함할 수 있다. 이러한 발현 벡터는 통상적으로 포유동물 유전자 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터를 함유한다. 적합한 프로모터는 구성적, 세포 유형-특이적, 단계-특이적 및/또는 조정가능하거나 조절가능한 것일 수 있다. 유용한 프로모터는 메탈로티오네인 프로모터, 구성적 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 덱사메타손-유도성 MMTV 프로모터, SV40 프로모터, MRP polIII 프로모터, 구성적 MPSV 프로모터, 테트라시클린-유도성 CMV 프로모터 (예컨대, 인간 극초기 CMV 프로모터), 구성적 CMV 프로모터, 및 당업계에 공지된 프로모터-인핸서 조합물을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
관심 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 벡터를 도입하는 방법은 세포 숙주의 유형에 따라 달라진다. 예를 들어, 염화칼슘 형질감염은 통상적으로 원핵 세포에 대해 사용되고, 인산칼슘 처리 또는 전기천공은 다른 세포 숙주에 대해 사용될 수 있다 (일반적으로, 문헌 [Sambrook, et al., 상기 문헌] 참조). 다른 방법은 예를 들어 전기천공, 인산칼슘 처리, 리포솜-매개 형질전환, 주사 및 미세주사, 발리스틱(ballistic) 방법, 비로솜, 이뮤노리포솜, 다가양이온:핵산 접합체, 네이키드 DNA, 인공 비리온, 헤르페스 바이러스 구조 단백질 VP22에 대한 융합 (문헌 [Elliot and O'Hare, (1997) Cell 88:223]), DNA의 작용제-증진된 흡수, 및 생체외 형질도입을 포함한다. 재조합 단백질의 장기간 고수율 생성을 위해, 종종 안정적인 발현을 원할 것이다. 예를 들어, HER3-결합 항체 쇄 또는 결합 단편을 안정적으로 발현하는 세포주는, 바이러스 복제 기점 또는 내인성 발현 요소 및 선택가능한 마커 유전자를 함유하는 본 발명의 발현 벡터를 사용하여 제조할 수 있다. 벡터의 도입 후에 세포를 1-2일 동안 영양강화 배지에서 성장시킨 후, 선택 배지로 전환할 수 있다. 선택 마커의 목적은 선택에 대한 내성을 부여하기 위한 것이고, 이것의 존재는 도입된 서열을 성공적으로 발현하는 세포가 선택 배지에서 성장하게 한다. 안정적으로 형질감염된 내성 세포는 세포 유형에 적절한 조직 배양 기술을 이용하여 증식될 수 있다.
(ii) 본 발명의 모노클로날 항체의 생성
모노클로날 항체 (mAb)는 통상적인 모노클로날 항체 방법, 예를 들어 문헌 [Kohler and Milstein, (1975) Nature 256:495]의 표준 체성 세포 혼성화 기술을 비롯한 다양한 기술에 의해 생산할 수 있다. 모노클로날 항체를 생산하는 다수의 기술, 예를 들어 B 림프구의 바이러스성 또는 종양원성 형질전환을 이용할 수 있다.
하이브리도마를 제조하기 위한 동물 시스템은 뮤린 시스템이다. 마우스에서 하이브리도마를 생성하는 것은 널리 확립된 절차이다. 면역화 프로토콜, 및 융합을 위해 면역화된 비장세포를 단리하는 기술은 당업계에 공지되어 있다. 융합 파트너 (예를 들어, 뮤린 골수종 세포) 및 융합 절차 또한 공지되어 있다.
본 발명의 키메라 또는 인간화 항체는 상기 기재된 바와 같이 제조된 뮤린 모노클로날 항체의 서열을 기반으로 하여 제조할 수 있다. 표준 분자 생물학 기술을 이용하여, 중쇄 및 경쇄 이뮤노글로불린을 코딩하는 DNA를 관심 뮤린 하이브리도마로부터 얻고 이것을 조작하여 비-뮤린 (예를 들어, 인간) 이뮤노글로불린 서열을 함유하게 할 수 있다. 예를 들어, 키메라 항체를 생성하기 위해, 당업계에 공지된 방법을 이용하여 뮤린 가변 영역을 인간 불변 영역에 연결시킬 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 (Cabilly et al.) 참조). 인간화 항체를 생성하기 위해, 뮤린 CDR 영역을 당업계에 공지된 방법을 이용하여 인간 프레임워크 내로 삽입할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5225539 (Winter), 및 미국 특허 번호 5530101; 5585089; 5693762 및 6180370 (Queen et al.)을 참조한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인간 모노클로날 항체이다. HER3에 대해 지시된 이러한 인간 모노클로날 항체는 마우스 면역계보다는 인간 면역계의 일부를 보유하는 트랜스제닉 또는 트랜스크로모소믹 마우스를 사용하여 생성할 수 있다. 이들 트랜스제닉 및 트랜스크로모소믹 마우스는 본원에서 HuMAb 마우스 및 KM 마우스라고 각각 지칭되는 마우스를 포함하고, 본원에서는 이들을 통칭하여 "인간 Ig 마우스"라고 지칭한다.
HuMAb 마우스® (메다렉스, 인크.(Medarex, Inc.))는 내인성 μ 및 κ 쇄 로커스를 불활성화시키는 표적화 돌연변이와 함께, 재배열되지 않는 인간 중쇄 (μ 및 γ) 및 κ 경쇄 이뮤노글로불린 서열을 코딩하는 인간 이뮤노글로불린 유전자 미니로커스를 함유한다 (예를 들어, 문헌 [Lonberg et al., (1994) Nature 368(6474): 856-859] 참조). 따라서, 상기 마우스는 마우스 IgM 또는 κ의 발현 감소를 나타내고, 면역화에 반응하여, 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스진에서 클래스 스위칭 및 체세포 돌연변이가 일어나서 고친화도 인간 IgGκ 모노클로날을 생성한다 (문헌 [Lonberg et al., (1994) 상기 문헌]; 문헌 [Lonberg, (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg and Huszar, (1995) Intern. Rev. Immunol.13:65-93, 및 Harding and Lonberg, (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546]에서 검토됨). HuMAb 마우스의 제조 및 사용, 및 이러한 마우스에 의해 보유되는 게놈 변형은 그 모든 내용이 본원에 참고로 구체적으로 포함되는 하기 문헌에 추가로 기재되어 있다: 문헌 [Taylor et al., (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen et al., (1993) International Immunology 5:647-656; Tuaillon et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3720-3724; Choi et al., (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen et al., (1993) EMBO J. 12:821-830; Tuaillon et al., (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor et al., (1994) International Immunology 579-591; 및 Fishwild et al., (1996) Nature Biotechnology 14:845-851] (이들 모두의 전체 내용이 본원에 구체적으로 참고로 포함됨). 또한, 미국 특허 번호 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; 및 5,770,429; (모두 Lonberg and Kay); 미국 특허 번호 5,545,807 (Surani et al.); PCT 공보 번호 WO 92103918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97113852, WO 98/24884 및 WO 99/45962 (모두 Lonberg and Kay); 및 PCT 공보 번호 WO 01/14424 (Korman et al.)을 참조한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 인간 항체는 트랜스진 및 트랜스크로모솜 상에 인간 이뮤노글로불린 서열을 보유하는 마우스, 예를 들어 인간 중쇄 트랜스진 및 인간 경쇄 트랜스크로모솜을 보유하는 마우스를 사용하여 생성할 수 있다. 이러한 마우스는 본원에서 "KM 마우스"라 지칭되며, PCT 공보 WO 02/43478 (Ishida et al.)에 상세하게 기재되어 있다.
또한 또한, 인간 이뮤노글로불린 유전자를 발현하는 대안적인 트랜스제닉 동물 시스템이 당업계에서 이용가능하고, 본 발명의 HER3-결합 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 제노마우스(Xenomouse) (아브게닉스, 인크.(Abgenix, Inc.))라고 지칭되는 대안적인 트랜스제닉 시스템을 사용할 수 있다. 이러한 마우스는 예를 들어 미국 특허 번호 5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6, 150,584 및 6,162,963 (Kucherlapati et al.)에 기재되어 있다.
또한, 인간 이뮤노글로불린 유전자를 발현하는 대안적인 트랜스크로모소믹 동물 시스템이 당업계에서 이용가능하고, 본 발명의 HER3-결합 항체를 생성하기 위해 사용할 수 있다. 예를 들어, "TC 마우스"라고 지칭되는, 인간 중쇄 트랜스크로모솜 및 인간 경쇄 트랜스크로모솜 둘 다를 보유하는 마우스를 사용할 수 있고, 이러한 마우스는 문헌 [Tomizuka et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727]에 기재되어 있다. 또한, 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스크로모솜을 보유하는 소가 당업계에 기재되어 있고 (문헌 [Kuroiwa et al., (2002) Nature Biotechnology 20:889-894]), 본 발명의 HER3-결합 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 인간 모노클로날 항체는 인간 이뮤노글로불린 유전자의 라이브러리를 스크리닝하기 위한 파지 디스플레이 방법을 이용하여 제조할 수도 있다. 인간 항체를 단리하기 위한 이러한 파지 디스플레이 방법은 당업계에서 확립되어 있거나 하기 실시예에서 기재된다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,223,409; 5,403,484; 및 5,571,698 (Ladner et al.); 미국 특허 번호 5,427,908 및 5,580,717 (Dower et al.); 미국 특허 번호 5,969,108 및 6,172,197 (McCafferty et al.); 및 미국 특허 번호 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915 및 6,593,081 (Griffiths et al.)을 참조한다.
본 발명의 인간 모노클로날 항체는 인간 면역 세포를 재구축한 SCID 마우스를 사용하여 제조할 수도 있는데, 이로써 면역화시에 인간 항체 반응이 발생할 수 있다. 이러한 마우스는 예를 들어 미국 특허 번호 5,476,996 및 5,698,767 (Wilson et al.)에 기재되어 있다.
(iii) 프레임워크 또는 Fc 조작
본 발명의 조작된 항체는 예를 들어 항체의 특성을 개선시키기 위해 VH 및/또는 VL 내의 프레임워크 잔기에 대해 변형이 이루어진 것을 포함한다. 전형적으로, 이러한 프레임워크 변형은 항체의 면역원성을 감소시키기 위해 이루어진다. 예를 들어, 한가지 접근법은 1개 이상의 프레임워크 잔기를 상응하는 배선 서열로 "역돌연변이"시키는 것이다. 보다 구체적으로는, 체세포 돌연변이가 일어난 항체는 이러한 항체가 유래된 배선 서열과는 상이한 프레임워크 잔기를 함유할 수 있다. 이러한 잔기는 항체 프레임워크 서열을 항체가 유래된 배선 서열과 비교함으로써 확인할 수 있다. 프레임워크 영역 서열을 이것의 배선 배위로 되돌리기 위해, 예를 들어 부위-지정 돌연변이유발에 의해 체세포 돌연변이를 배선 서열로 "역돌연변이"시킬 수 있다. 이러한 "역돌연변이" 항체 역시 본 발명에 포함된다.
또 다른 유형의 프레임워크 변형은 프레임워크 영역 내 또는 심지어는 1개 이상의 CDR 영역 내의 1개 이상의 잔기를 돌연변이시켜 T 세포-에피토프를 제거함으로써 항체의 잠재적 면역원성을 감소시키는 것을 포함한다. 이러한 접근법은 또한 "탈면역화"라고도 지칭되고, 미국 특허 공보 번호 20030153043 (Carr et al.)에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
프레임워크 또는 CDR 영역 내에서 이루어진 변형에 추가하여 또는 이러한 변형에 대한 대안으로, 본 발명의 항체는 전형적으로 항체의 하나 이상의 기능적 특성, 예컨대 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합, 및/또는 항원-의존성 세포 세포독성을 변경시키는 변형을 Fc 영역 내에 포함하도록 조작될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체를 화학적으로 변형시킬 수도 있고 (예를 들어, 하나 이상의 화학적 모이어티를 항체에 부착시킬 수 있음), 이것의 글리코실화를 변경시켜 항체의 하나 이상의 기능적 특성이 다시 변경되도록 변형시킬 수도 있다. 각각의 이러한 실시양태는 하기에서 추가로 상세하게 기재된다. Fc 영역 내 잔기의 넘버링은 카바트의 EU 인덱스의 넘버링이다.
한 실시양태에서, CH1의 힌지 영역은 힌지 영역 내 시스테인 잔기의 수가 변경되도록, 예를 들어 증가 또는 감소되도록 변형된다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 5,677,425 (Bodmer et al.)에 추가로 기재되어 있다. CH1의 힌지 영역 내의 시스테인 잔기 수는, 예를 들어 경쇄 및 중쇄의 어셈블리를 용이하게 하거나 항체의 안정성을 증가 또는 감소시키도록 변경된다.
또 다른 실시양태에서, 항체의 Fc 힌지 영역을 돌연변이시켜 항체의 생물학적 반감기를 감소시킨다. 보다 구체적으로, 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 Fc-힌지 단편의 CH2-CH3 도메인 인터페이스 영역 내로 도입하여 항체가 천연 Fc-힌지 도메인 스타필로코실 단백질 A (SpA) 결합과 비교하여 손상된 SpA 결합을 갖도록 한다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 6,165,745 (Ward et al.)에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
또 다른 실시양태에서, Fc 영역은 적어도 하나의 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기로 대체시켜 항체의 이펙터 기능을 변경시킴으로써 변경된다. 예를 들어, 하나 이상의 아미노산을 상이한 아미노산 잔기로 대체하여 항체가 이펙터 리간드에 대해 변경된 친화도를 갖지만 모 항체의 항원-결합 능력은 보유하게 할 수 있다. 친화도가 변경된 이펙터 리간드는 예를 들어 Fc 수용체 또는 보체의 C1 성분일 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 5,624,821 및 5,648,260 (둘 다 Winter et al.)에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
또 다른 실시양태에서, 아미노산 잔기로부터 선택된 하나 이상의 아미노산을 상이한 아미노산 잔기로 대체시켜 항체가 변경된 C1q 결합 및/또는 저하되거나 제거된 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 갖도록 할 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 6,194,551 (Idusogie et al.)에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 잔기를 변경시켜 보체를 고정시키는 항체의 능력을 변경시킨다. 이러한 접근법은 PCT 공보 WO 94/29351 (Bodmer et al.)에 추가로 기재되어 있다.
또 다른 실시양태에서, Fc 영역은 하나 이상의 아미노산을 변형시킴으로써 항체 의존성 세포 세포독성 (ADCC)을 매개하는 항체의 능력이 증가되고/되거나 Fcγ 수용체에 대한 항체의 친화도가 증가되도록 변형된다. 이러한 접근법은 PCT 공보 WO 00/42072 (Presta)에 추가로 기재되어 있다. 또한, 인간 IgG1에서 FcγRI, FcγRII, FcγRIII 및 FcRn에 대한 결합 부위가 맵핑되었고, 결합이 개선된 변이체가 문헌에 기재된 바 있다 (문헌 [Shields et al., (2001) J. Biol. Chen. 276:6591-6604] 참조).
또 다른 실시양태에서, 항체의 글리코실화가 변형된다. 예를 들어, 비-글리코실화 항체가 생성될 수 있다 (즉, 항체에 글리코실화가 결핍됨). 글리코실화는 예를 들어 "항원"에 대한 항체의 친화도가 증가되도록 변형시킬 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들어 항체 서열 내의 1개 이상의 글리코실화 부위를 변경시켜 달성될 수 있다. 예를 들어, 1개 이상의 가변 영역 프레임워크 글리코실화 부위를 제거하여 이 부위에서 글리코실화가 일어나지 않도록 하는 1개 이상의 아미노산 치환이 일어날 수 있다. 이러한 비글리코실화는 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 5,714,350 및 6,350,861 (Co et al.)에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
추가로 또는 대안적으로, 변경된 유형의 글리코실화를 갖는 항체, 예컨대 푸코실 잔기 수가 감소된 저푸코실화 항체 또는 이분화 GlcNac 구조가 증가된 항체가 생성될 수 있다. 이러한 변경된 글리코실화 패턴이 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 입증된 바 있다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들어 변경된 글리코실화 기구를 갖는 숙주 세포 내에서 항체를 발현시켜 달성될 수 있다. 변경된 글리코실화 기구를 갖는 세포는 당업계에 기재되어 있으며, 본 발명의 재조합 항체를 발현시켜 변경된 글리코실화를 갖는 항체를 생성하는 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 예를 들어, EP 1,176,195 (Hang et al.)는 푸코실 트랜스퍼라제를 코딩하는, 기능적으로 파괴된 FUT8 유전자를 갖는 세포주를 기재하며, 이러한 세포주에서 발현된 항체는 저푸코실화를 나타낸다. PCT 공보 WO 03/035835 (Presta)는 Asn(297)-연결된 탄수화물에 푸코스를 부착시키는 능력이 감소되어 숙주 세포 내에서 발현된 항체에서 저푸코실화가 일어나는 변이체 CHO 세포주인 Lecl3 세포를 기재하고 있다 (또한, 문헌 [Shields et al., (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740] 참조). PCT 공보 WO 99/54342 (Umana et al.)는 당단백질-변형 글리코실 트랜스퍼라제 (예를 들어, 베타(1,4)-N 아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제 III (GnTIII))를 발현하도록 조작된 세포주를 기재하며, 이와 같이 조작된 세포주에서 발현된 항체는 증가된 이분화 GlcNac 구조를 보여 항체의 ADCC 활성을 증가시킨다 (또한 문헌 [Umana et al., (1999) Nat. Biotech. 17:176-180] 참조).
또 다른 실시양태에서, 항체는 그의 생물학적 반감기가 증가되도록 변형된다. 다양한 접근법이 가능하다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,277,375 (Ward)에 기재된 바와 같이, 하나 이상의 하기 돌연변이가 도입될 수 있다: T252L, T254S, T256F. 대안적으로, 미국 특허 번호 5,869,046 및 6,121,022 (Presta et al.)에 기재된 바와 같이, 생물학적 반감기를 증가시키기 위해 항체를 CH1 또는 CL 영역 내에서 IgG의 Fc 영역의 CH2 도메인의 2개 루프로부터의 샐비지 수용체 결합 에피토프를 함유하도록 변경시킬 수 있다.
(iv) 변경된 항체를 조작하는 방법
상기 논의된 바와 같이, 본원에서 제시된 VH 및 VL 서열 또는 전장 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는 HER3-결합 항체를 사용하여, 전장 중쇄 및/또는 경쇄 서열, VH 및/또는 VL 서열, 또는 그에 부착된 불변 영역(들)을 변형시켜 새로운 HER3-결합 항체를 생성할 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명의 HER3-결합 항체의 구조적 특징을 이용하여 본 발명의 항체의 하나 이상의 기능적 특성, 예컨대 인간 HER3에 대한 결합 및 또한 HER3의 하나 이상의 기능적 특성의 억제를 보유하는, 구조적으로 관련된 HER3-결합 항체를 생성한다. 예를 들어, 본 발명의 항체의 1개 이상의 CDR 영역 또는 그의 돌연변이는 공지의 프레임워크 영역 및/또는 다른 CDR과 재조합 방식으로 조합되어, 상기 논의된 바와 같이 재조합 방식으로 조작된 본 발명의 추가의 HER3-결합 항체를 생성할 수 있다. 다른 유형의 변형은 상기 섹션에 기재된 것을 포함한다. 조작 방법을 위한 출발 물질은 본원에서 제공되는 하나 이상의 VH 및/또는 VL 서열, 또는 그의 하나 이상의 CDR 영역이다. 조작된 항체를 생성하기 위해, 본원에서 제공되는 하나 이상의 VH 및/또는 VL 서열 또는 그의 하나 이상의 CDR 영역을 갖는 항체를 실제로 제조할 (즉, 단백질로서 발현시킬) 필요는 없다. 오히려, 서열(들) 내에 함유된 정보를 출발 물질로서 사용하여 본래 서열(들)로부터 유래된 "제2 세대" 서열(들)을 생성한 후에 이러한 "제2 세대" 서열(들)을 단백질로서 제조 및 발현시킨다.
따라서, 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 2, 8, 20, 26, 38, 44, 56, 62, 74, 80, 92, 98, 110, 116, 128, 134, 146, 152, 164, 170, 182, 188, 200, 206, 218, 224, 236, 242, 254, 260, 272, 278, 290, 296, 308, 314, 326, 332, 344, 350, 362 및 368로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR1 서열; 서열 3, 9, 21, 27, 39, 45, 57, 63, 75, 81, 93, 99, 111, 117, 129, 135, 147, 153, 165, 171, 183, 189, 201, 207, 219, 225, 237, 243, 255, 261, 273, 279, 291, 297, 309, 315, 327, 333, 345, 351, 363 및 369로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR2 서열; 및/또는 서열 4, 10, 22, 28, 40, 46, 58, 64, 75, 82, 94, 100, 112, 118, 130, 136, 148, 154, 166, 172, 184, 190, 202, 208, 220, 226, 238, 244, 256, 262, 274, 280, 292, 298, 310, 316, 328, 334, 346, 352, 364 및 370으로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR3 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 항체 서열; 및 서열 5, 11, 23, 29, 41, 47, 59, 65, 77, 83, 95, 101, 113, 119, 131, 137, 149, 155, 167, 173, 185, 191, 203, 209, 221, 227, 239, 245, 257, 263, 275, 281, 293, 299, 311, 317, 329, 335, 347, 353, 365 및 371로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR1 서열; 서열 6, 12, 24, 30, 42, 48, 60, 66, 78, 84, 96, 102, 114, 120, 132, 138, 150, 156, 168, 174, 186, 192, 204, 210, 222, 228, 240, 246, 258, 264, 276, 282, 294, 300, 312, 318, 330, 336, 348, 354, 366 및 372로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR2 서열; 및/또는 서열 7, 13, 25, 31, 43, 49, 61, 67, 79, 85, 97, 103, 115, 121, 133, 139, 151, 157, 169, 175, 187, 193, 205, 211, 223, 229, 241, 247, 259, 265, 277, 283, 295, 301, 313, 319, 331, 337, 349, 355, 367 및 373로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR3 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 항체 서열로 이루어진 HER3-결합 항체를 제조하는 방법을 제공하며; 이 방법은 상기 중쇄 가변 영역 항체 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 항체 서열 내의 적어도 하나의 아미노산 잔기를 변경시켜 적어도 하나의 변경된 항체 서열을 생성하는 것; 및 변경된 항체 서열을 단백질로 발현시키는 것을 포함한다. 변경된 항체 서열은 또한 고정된 CDR3 서열 또는 최소 필수 결합 결정기 (US20050255552에 기재된 바와 같음) 및 CDR1 및 CDR2 서열 상의 다양성을 갖는 항체 라이브러리를 스크리닝하여 제조될 수 있다. 스크리닝은 항체 라이브러리로부터의 항체의 스크리닝에 적절한 임의의 스크리닝 기술, 예컨대 파지 디스플레이 기술에 따라 수행될 수 있다.
표준 분자 생물학 기술은 변경된 항체 서열을 제조 및 발현시키는데 사용될 수 있다. 변경된 항체 서열(들)에 의해 코딩되는 항체는 본원에 기재된 HER3-결합 항체의 기능적 특성 중 하나, 일부 또는 모두를 보유하는 것이며, 이러한 기능적 특성은 인간 및/또는 시노몰구스 HER3에 대한 특이적 결합을 포함하나 이에 제한되지 않으며, 이러한 항체는 HER3에 결합하고, 포스포-HER 검정에서 HER 신호전달 활성을 억제함으로써 HER3 생물학적 활성을 중화시킨다.
변경된 항체의 기능적 특성은 당업계에 이용가능하고/하거나 본원에 기재된 표준 검정, 예컨대 실시예에 기재된 것 (예를 들어, ELISA)을 이용하여 평가할 수 있다.
본 발명의 항체의 조작 방법의 특정 실시양태에서, 돌연변이는 HER3-결합 항체 코딩 서열의 전부 또는 일부를 따라 무작위적으로 또는 선택적으로 도입될 수 있고, 생성되는 변형된 HER3-결합 항체는 결합 활성 및/또는 본원에 기재된 바와 같은 다른 기능적 특성에 대해 스크리닝될 수 있다. 돌연변이 방법은 당업계에 기재되어 있다. 예를 들어, PCT 공보 WO 02/092780 (Short)은 포화 돌연변이유발, 합성 라이게이션 어셈블리, 또는 그의 조합을 이용하여 항체 돌연변이를 생성하고 스크리닝하는 방법을 기재한다. 대안적으로, PCT 공보 WO 03/074679 (Lazar et al.)는 항체의 이화학적 특성을 최적화하는 전산 스크리닝 방법을 이용한 방법을 기재한다.
본 발명의 항체의 특성화
본 발명의 항체는 다양한 기능적 검정에 의해 특성화될 수 있다. 예를 들어, 이들은 본원에 기재된 바와 같은 포스포-HER 검정에서 HER 신호전달을 억제함으로써 생물학적 활성을 중화시키는 그의 능력, HER3 단백질 (예를 들어, 인간 및/또는 시노몰구스 HER3)에 대한 그의 친화도, 에피토프 비닝, 단백질분해에 대한 그의 저항성, 및 HER3 하류 신호전달을 차단하는 그의 능력을 특징으로 할 수 있다. HER3-매개 신호전달을 측정하기 위해 다양한 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, HER 신호전달 경로는 (i) 포스포-HER3의 측정; (ii) HER3 또는 다른 하류 신호전달 단백질 (예를 들어, Akt) 의 인산화의 측정, (iii) 본원에 기재된 바와 같은 리간드 차단 검정, (iv) 이종이량체 형성, (v) HER3 의존성 유전자 발현 서명, (vi) 수용체 내재화, 및 (vii) HER3 유도된 세포 표현형 (예를 들어, 증식)에 의해 모니터링될 수 있다.
HER3에 결합하는 항체의 능력은 관심 항체를 직접 표지하여 검출할 수도 있고, 또는 항체를 표지하지 않고 결합을 당업계 공지의 다양한 샌드위치 검정 포맷을 이용하여 간접적으로 검출할 수도 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 HER3-결합 항체는 HER3 폴리펩티드 또는 단백질에 대한 참조 HER3-결합 항체의 결합을 차단하거나 그와 경쟁한다. 이들은 상기 기재된 완전 인간 HER3-결합 항체일 수 있다. 이들은 또한 참조 항체로서 동일한 에피토프에 결합하는 다른 마우스, 키메라 또는 인간화 HER3-결합 항체일 수 있다. 참조 항체 결합을 차단하거나 그와 경쟁하는 능력은 시험 중인 HER3-결합 항체가 참조 항체에 의해 규정된 것과 동일하거나 유사한 에피토프, 또는 참조 HER3-결합 항체에 의해 결합되는 에피토프에 충분하게 근접한 에피토프에 결합한다는 것을 나타낸다. 이러한 항체는 특히 참조 항체에 대해 확인된 유리한 특성을 공유할 가능성이 있다. 참조 항체를 차단하거나 그와 경쟁하는 능력은 예를 들어 경쟁 결합 검정으로 결정할 수 있다. 경쟁 결합 검정에서, 시험 중인 항체는 공통 항원, 예컨대 HER3 폴리펩티드 또는 단백질에 대한 참조 항체의 특이적 결합을 억제하는 능력에 대해 조사된다. 시험 항체는 과량의 시험 항체가 참조 항체의 결합을 실질적으로 억제할 경우 항원에 대한 특이적 결합을 위해 참조 항체와 경쟁한다. 실질적인 억제는 시험 항체가 참조 항체의 특이적 결합을 일반적으로 적어도 10%, 25%, 50%, 75% 또는 90% 감소시킨다는 것을 의미한다.
HER3 단백질에 대한 결합에 대한 HER3-결합 항체와 참조 HER3-결합 항체의 경쟁을 평가하는데 사용될 수 있는 다수의 공지된 경쟁 결합 검정이 존재한다. 이들은 예를 들어 고체 상 직접 또는 간접 방사성면역검정 (RIA), 고체 상 직접 또는 간접 효소 면역검정 (EIA), 샌드위치 경쟁 검정 (문헌 [Stahli et al., (1983) Methods in Enzymology 9:242-253] 참조); 고체 상 직접 비오틴-아비딘 EIA (문헌 [Kirkland et al., (1986) J. Immunol. 137:3614-3619] 참조); 고체 상 직접 표지 검정, 고체 상 직접 표지 샌드위치 검정 (문헌 [Harlow & Lane, 상기 문헌] 참조); I-125 표지를 사용한 고체 상 직접 표지 RIA (문헌 [Morel et al., (1988) Molec. Immunol. 25:7-15] 참조); 고체 상 직접 비오틴-아비딘 EIA (문헌 [Cheung et al., (1990) Virology 176:546-552]); 및 직접 표지 RIA (문헌 [Moldenhauer et al., (1990) Scand. J. Immunol. 32:77-82])를 포함한다. 전형적으로, 이러한 검정은 고체 표면에 결합된 정제된 항원, 또는 미표지 시험 HER3-결합 항체 및 표지된 참조 항체 중 하나를 보유하는 세포의 사용을 포함한다. 경쟁적 억제는 시험 항체의 존재 하에 고체 표면 또는 세포에 결합된 표지의 양을 결정하여 측정된다. 통상적으로, 시험 항체는 과량으로 존재한다. 경쟁 검정 (경쟁 항체)으로 확인된 항체는 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 및 참조 항체가 결합하는 에피토프에 입체 장애를 일으키기에 충분히 근접하게 위치한 인접한 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다.
선택된 HER3-결합 모노클로날 항체가 특징적인 에피토프에 결합하는지 여부를 결정하기 위해, 각각의 항체를 상업적으로 입수가능한 시약 (예를 들어, 피어스 (일리노이주 록포드)의 시약)을 사용하여 비오티닐화시킬 수 있다. 미표지 모노클로날 항체 및 비오티닐화 모노클로날 항체를 사용한 경쟁 연구는 HER3 폴리펩티드 코팅된 ELISA 플레이트를 사용하여 수행할 수 있다. 비오티닐화 MAb 결합은 스트렙타비딘-알칼리성 포스파타제 프로브로 검출할 수 있다. 정제된 HER3-결합 항체의 이소형을 결정하기 위해, 이소형 ELISA를 수행할 수 있다. 예를 들어, 미량역가 플레이트의 웰을 1 μg/ml의 항-인간 IgG로 4℃에서 밤새 코팅할 수 있다. 1% BSA로 차단한 후, 상기 플레이트를 1 μg/ml 이하의 모노클로날 HER3-결합 항체 또는 정제된 이소형 대조군과 주위 온도에서 1 내지 2시간 동안 반응시킨다. 이어서, 웰을 인간 IgG1 또는 인간 IgM-특이적 알칼리성 포스파타제-접합된 프로브와 반응시킬 수 있다. 이어서, 플레이트를 발색시키고 분석하여 정제된 항체의 이소형을 결정할 수 있다.
HER3 폴리펩티드를 발현하는 살아있는 세포에 대한 모노클로날 HER3-결합 항체의 결합을 입증하기 위해, 유동 세포측정법을 이용할 수 있다. 간략하게, HER3을 발현하는 세포주 (표준 성장 조건 하에 성장시킴)를 0.1% BSA 및 10% 소 태아 혈청을 함유하는 PBS 중 다양한 농도의 HER3-결합 항체와 혼합하고, 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션할 수 있다. 세척한 후에, 세포를 1차 항체 염색과 동일한 조건 하에 플루오레세인-표지된 항-인간 IgG 항체와 반응시킨다. 샘플은 단일 세포에 대해 게이팅되는, 광 및 측면 산란 특성을 이용한 FACScan 기기로 분석할 수 있다. 유동 세포측정법 검정에 추가하여 또는 그 대신에 형광 현미경검사를 이용한 대안적인 검정이 이용될 수 있다. 세포는 상기 기재된 바와 같이 정확하게 염색하고 형광 현미경검사에 의해 검사될 수 있다. 상기 방법은 개별 세포의 시각화를 허용하지만, 항원의 밀도에 따라 감도를 감소시킬 수 있다.
본 발명의 HER3-결합 항체는 웨스턴 블롯팅에 의해 HER3 폴리펩티드 또는 항원 단편과의 반응성에 대해 추가로 시험될 수 있다. 간략하게, 정제된 HER3 폴리펩티드 또는 융합 단백질, 또는 HER3을 발현하는 세포로부터의 세포 추출물을 제조하여 나트륨 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 전기영동 후에, 분리된 항원을 니트로셀룰로스 막으로 옮기고, 10% 소 태아 혈청으로 차단하고, 시험될 모노클로날 항체로 프로빙할 수 있다. 인간 IgG 결합은 항-인간 IgG 알칼리성 포스파타제를 사용하여 검출할 수 있고, BCIP/NBT 기질 정제 (시그마 케미칼 캄파니(Sigma Chem. Co.), 미주리주 세인트 루이스)로 발색시킬 수 있다.
다수의 판독은 리간드-유도된 이종이량체 형성의 세포-기반 검정에서 HER3 항체의 효능 및 특이성을 평가하는데 사용될 수 있다. 활성은 하기 중 하나 이상에 의해 평가될 수 있다:
(i) 표적 세포주, 예를 들어 MCF-7 유방암 세포에서 다른 EGF 패밀리 구성원을 갖는 HER2의 리간드-유도된 이종이량체화의 억제. 세포 용해물로부터의 HER2 복합체의 면역침전은 수용체-특이적 항체로 수행될 수 있고, 복합체 내의 다른 EGF 수용체의 부재/존재 및 그의 생물학적으로 관련된 리간드는 다른 EGF 수용체에 대한 항체로의 프로빙에 의해 전기영동/웨스턴 전달에 따라 분석될 수 있다
(ii) 리간드-활성화 이종이량체에 의한 신호전달 경로의 활성화의 억제. HER3과의 회합은 수용체의 EGF 패밀리의 다른 구성원이 리간드 결합에 따라 최대 세포 반응을 도출하는데 중요한 것으로 나타났다. 키나제-결핍 HER3의 경우에, HER2는 신호전달을 가능하게 하여 이어지는 성장 인자 리간드의 결합에 일어나게 하는 기능적 티로신 키나제 도메인을 제공한다. 따라서, HER2 및 HER3을 공발현하는 세포는 억제제의 부재 및 존재 하에 리간드, 예를 들어 헤레귤린으로 처리될 수 있고, HER3 티로신 인산화에 대한 효과는 처리된 세포 용해물로부터의 HER3의 면역침전 및 이후의 항-포스포티로신 항체를 이용하는 연속적 웨스턴 블롯팅 (자세한 내용에 대해 Agus op. cit. 참조)을 포함하여 다수의 방법에 의해 모니터링된다. 대안적으로, 고처리량 검정은 항-HER3 수용체 항체로 코팅된 96-웰 플레이트의 웰 상에 가용화 용해물로부터의 HER3을 포획하여 개발될 수 있고, 티로신 인산화의 수준은 예를 들어 유로품-표지된 항-포스포티로신 항체를 이용하여 측정된다 (문헌 [Waddleton et al., (2002) Anal. Biochem. 309:150-157]에 구체적으로 기재된 바와 같음).
이러한 접근법의 보다 광범위한 확장에서, 활성화 수용체 이종이량체의 활성화된 하류일 것으로 공지된 이펙터 분자, 예컨대 미토겐-활성화 단백질 키나제 (MAPK) 및 Akt는 처리된 용해물로부터의 면역침전 및 이러한 단백질의 활성화 형태를 검출하는 항체로의 블롯팅, 또는 이러한 단백질이 특정 기질을 변형/활성화시키는 능력의 분석에 의해 직접 분석될 수 있다.
(iii) 리간드-유도된 세포 증식의 억제. 다양한 세포주, 예를 들어 다수의 유방 및 전립선암 세포주는 ErbB 수용체의 조합을 공발현하는 것으로 알려져 있다. 검정은 DNA 합성 (삼중수소화 티미딘 혼입), 세포 수의 증가 (크리스탈 바이올렛 염색) 등을 기반으로 하는 판독을 이용하여 24/48/96-웰 포맷에서 수행될 수 있다.
다수의 판독은 리간드-비의존성 동종- 및 이종이량체 형성의 세포-기반 검정에서 HER3 항체의 효능 및 특이성을 평가하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, HER2 과다발현은 자발적 이량체 형성의 결과로서 키나제 도메인의 리간드-비의존성 활성화를 일으킨다. 과다발현된 HER2는 다른 HER 분자, 예컨대 HER1, HER3 및 HER4와 동종- 또는 이종이량체를 생성한다.
항체 또는 그의 단편이 종양형성 표현형이 예를 들어 적어도 부분적으로 HER3 이종이량체 세포 신호전달의 리간드 활성화에 의존하는 것을 알려져 있는 인간 종양 세포주, 예를 들어 BxPC3 췌장암 세포 등의 종양 이종이식편의 생체내 성장을 차단하는 능력. 이는 단독으로 또는 해당 세포주에 적절한 세포독성제와 조합하여 면역손상 마우스에서 평가될 수 있다. 기능적 검정의 예는 또한 하기 실시예 섹션에 기재된다.
예방 및 치료 용도
본 발명은 본 발명의 항체의 유효량을 HER3 신호전달 경로와 관련된 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써 상기 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 구체적 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 항체의 유효량을 암 (예를 들어, 유방암, 결장직장암, 폐암, 다발성 골수종, 난소암, 간암, 위암, 췌장암, 전립선암, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 골육종, 편평 세포 암종, 말초 신경초 종양, 슈반세포종, 두경부 암, 방광암, 식도암, 교모세포종, 연부 조직의 투명 세포 육종, 악성 중피종, 신경섬유종증, 신암 및 흑색종)의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써 상기 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 항체의 유효량을 HER 신호전달 경로와 관련된 암의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써 상기 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
구체적 실시양태에서, 본 발명은 유방암, 결장직장암, 폐암, 다발성 골수종, 난소암, 간암, 위암, 췌장암, 전립선암, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 골육종, 편평 세포 암종, 말초 신경초 종양 슈반세포종, 두경부암, 방광암, 식도암, 교모세포종, 연부 조직의 투명 세포 육종, 악성 중피종, 신경섬유종증, 신암 및 흑색종을 포함하나 이에 제한되지 않는, HER 신호전달 경로와 연관된 암을 치료하는 방법을 제공한다.
HER3 항체는 또한 호흡기 질환, 골다공증, 골관절염, 다낭성 신장 질환, 당뇨병, 정신분열증, 혈관 질환, 심장 질환, 비-종양원성 증식성 질환, 섬유증, 및 신경변성 질환, 예컨대 알츠하이머병을 포함하나 이에 제한되지 않는, 비정상적인 또는 결함이 있는 HER 신호전달과 연관된 다른 장애를 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다.
HER3-결합 항체와의 조합 치료에 적합한 작용제는 ErbB 신호전달 경로를 조정할 수 있는 당업계에 공지된 치료 작용제의 표준물을 포함한다. HER2에 대한 치료 작용제의 표준물의 적합한 예는 헤르셉틴 및 타이커브를 포함하나 이에 제한되지 않는다. EGFR에 대한 치료 작용제의 표준물의 적합한 예는 이레사, 타르세바, 에르비툭스 및 벡티빅스를 포함하나 이에 제한되지 않는다. HER3-결합 항체와의 조합 치료에 적합할 수 있는 다른 작용제는 수용체 티로신 키나제, G-단백질 커플링된 수용체, 성장/ 생존 신호 전달 경로, 핵 호르몬 수용체, 아폽토시스성 경로, 세포 주기 및 혈관신생을 조정하는 것을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
진단 용도
한 측면에서, 본 발명은 생물학적 샘플 (예를 들어, 혈액, 혈청, 세포, 조직)에서 또는 암을 앓고 있거나 암 발생의 위험이 있는 개체로부터 HER3 단백질 및/또는 핵산 발현 뿐만 아니라 HER3 단백질 기능을 결정하기 위한 진단 검정을 포함한다.
진단 검정, 예컨대 경쟁적 검정은 표지된 유사체 ("트레이서")가 시험 샘플 분석물과 공통의 결합 파트너에 존재하는 제한된 수의 결합 부위에 대해 경쟁하는 능력에 따라 달라진다. 일반적으로 경쟁 전 또는 경쟁 후에 결합 파트너를 불용화시킨 후에 결합 파트너에 결합된 추적자 및 분석물을 미결합 트레이서 및 분석물로부터 분리한다. 이러한 분리는 경사분리 (결합 파트너가 사전에 불용화된 경우) 또는 원심분리 (결합 파트너가 경쟁 반응 후에 침전된 경우)에 의해 달성된다. 시험 샘플 분석물의 양은 마커 물질의 양으로 결정되는 바와 같은 결합 트레이서의 양에 반비례한다. 공지된 양의 분석물을 이용한 용량-반응 곡선을 작성하고, 이것을 시험 결과와 비교하여 시험 샘플에 존재하는 분석물의 양을 정량적으로 결정한다. 이러한 검정은, 검출가능한 마커로서 효소가 사용되는 경우에 ELISA 시스템이라 지칭된다. 이러한 형태의 검정에서는, 항체와 HER3-결합 항체 사이의 경쟁적 결합으로 인해 결합된 HER3 단백질, 바람직하게는 본 발명의 HER3 에피토프가 생성되는데, 이는 혈청 샘플 중의 항체, 가장 특히 혈청 샘플 중의 중화 항체의 척도가 된다.
상기 검정의 유의한 이점은 중화 항체 (즉, HER3 단백질, 구체적으로는 에피토프의 결합을 방해하는 항체)를 직접 측정한다는 점이다. 특히 ELISA 시험 형태의 이러한 검정은 임상 환경 및 통상적인 혈액 스크리닝에 상당한 정도로 적용되고 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 개체에서 HER3 핵산 발현 또는 HER3 단백질 활성을 결정함으로써 상기 개체에게 적절한 치료제 또는 예방제를 선택하는 방법을 제공한다 (본원에서 "약리유전체학"이라 지칭됨). 약리유전체학은 개체의 유전자형 (예를 들어, 개체가 특정한 작용제에 대해 반응하는 능력을 결정하기 위해 조사한 개체의 유전자형)을 기반으로 하여 개체를 치료적 또는 예방적 치료하기 위한 작용제 (예를 들어, 약물)을 선택할 수 있게 한다.
본 발명의 또 다른 측면은 임상 시험에서 HER3 단백질의 발현 또는 활성에 대한 작용제 (예를 들어, 약물)의 영향을 모니터링하는 것에 관한 것이다.
제약 조성물
HER3-결합 항체 (무손상 또는 결합 단편)을 포함하는 제약 또는 멸균 조성물을 제조하기 위해, HER3-결합 항체 (무손상 또는 결합 단편)는 제약상 허용되는 담체 또는 부형제와 혼합된다. 조성물은 추가로 암 (유방암, 결장직장암, 폐암, 다발성 골수종, 난소암, 간암, 위암, 췌장암, 전립선암, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 골육종, 편평 세포 암종, 말초 신경초 종양 슈반세포종, 두경부암, 방광암, 식도암, 교모세포종, 연부 조직의 투명 세포 육종, 악성 중피종, 신경섬유종증, 신암 및 흑색종)를 치료 또는 예방하는데 적합한 하나 이상의 다른 치료제를 함유한다.
치료제 및 진단제의 제제는 예를 들어 동결건조 분말, 슬러리, 수용액, 로션 또는 현탁액의 형태로 생리학상 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제와 혼합함으로써 제조될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Hardman et al., (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N.Y.; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, N.Y.; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.] 참조).
치료용 투여 요법을 선택하는 것은 물질의 혈청 또는 조직 교체율, 증상 수준, 물질의 면역원성 및 생물학적 매트릭스에서의 표적 세포의 접근성을 비롯한 여러 요인에 따라 달라진다. 특정 실시양태에서, 투여 요법은 허용되는 부작용 수준에 부합하도록 환자에 전달되는 치료제의 양을 최대화한다. 따라서, 전달되는 생물제제의 양은 부분적으로는 특정 물질 및 치료되는 상태의 중증도에 따라 달라진다. 항체, 시토카인, 및 소분자의 적절한 용량의 선택에 대한 지침이 이용가능하다 (예를 들어, 문헌 [Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK; Kresina (ed.) (1991) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, N.Y.; Bach (ed.) (1993) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, N.Y.; Baert et al., (2003) New Engl. J. Med. 348:601-608; Milgrom et al., (1999) New Engl. J. Med. 341:1966-1973; Slamon et al., (2001) New Engl. J. Med. 344:783-792; Beniaminovitz et al., (2000) New Engl. J. Med. 342:613-619; Ghosh et al., (2003) New Engl. J. Med. 348:24-32; Lipsky et al., (2000) New Engl. J. Med. 343:1594-1602] 참조).
적절한 용량은 예를 들어, 치료에 영향을 미치는 것으로 당업계에 공지되어 있거나 그러한 것으로 의심되거나, 또는 치료에 영향을 미칠 것으로 예측되는 파라미터 또는 인자를 사용하여 임상의에 의해 결정된다. 일반적으로, 용량은 최적 용량보다 약간 적은 양에서 시작하며, 그후 임의의 부정적인 부작용에 비해 바람직하거나 최적인 효과가 달성될 때까지 소량씩 증가시킨다. 중요한 진단 척도로는, 예를 들어, 염증의 증상 또는 생산된 염증성 시토카인의 수준이 포함된다.
본 발명의 제약 조성물 중 활성 성분의 실제 투여량 수준은 환자에게 독성이 없으면서 특정한 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 원하는 치료 반응을 달성하는데 효과적인 활성 성분의 양이 달성되도록 달라질 수 있다. 선택된 투여량 수준은 사용되는 본 발명의 특정한 조성물, 또는 그의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정한 화합물의 배출 속도, 치료 기간, 사용되는 특정한 조성물과 조합 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료받는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 전반적인 건강 및 이전의 병력 및 의료 분야에 공지된 다른 요인을 비롯한 다양한 약동학 요인에 따라 결정될 것이다.
본 발명의 항체 또는 그의 단편을 포함하는 조성물은 연속 주입에 의해, 또는 예를 들어 매일, 매주, 또는 매주 1-7회 간격의 투여에 의해 제공될 수 있다. 용량은 정맥내, 피하, 국부, 경구, 비강내, 직장, 근육내, 뇌내, 또는 흡입에 의해 제공될 수 있다. 특정 용량 프로토콜은 유의한 바람직하지 않은 부작용을 방지하는 최대 용량 또는 투여 빈도를 수반하는 것이다. 전체 매주 용량은 0.05 μg/kg (체중) 이상, 0.2 μg/kg 이상, 0.5 μg/kg 이상, 1 μg/kg 이상, 10 μg/kg 이상, 100 μg/kg 이상, 0.2 mg/kg 이상, 1.0 mg/kg 이상, 2.0 mg/kg 이상, 10 mg/kg 이상, 25 mg/kg 이상 또는 50 mg/kg 이상일 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Yang et al., (2003) New Engl. J. Med. 349:427-434; Herold et al., (2002) New Engl. J. Med. 346:1692-1698; Liu et al., (1999) J. Neurol. Neurosurg. Psych. 67:451-456; Portielji et al., (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:133-144] 참조). 항체 또는 그의 단편의 원하는 용량은 몰/kg (체중) 기준으로 항체 또는 폴리펩티드에 대한 것과 거의 동일하다. 항체 또는 그의 단편의 원하는 혈장 농도는 대략 몰/kg (체중) 기준으로 한다. 용량은 15 μg 이상, 20 μg 이상, 25 μg 이상, 30 μg 이상, 35 μg 이상, 40 μg 이상, 45 μg 이상, 50 μg 이상, 55 μg 이상, 60 μg 이상, 65 μg 이상, 70 μg 이상, 75 μg 이상, 80 μg 이상, 85 μg 이상, 90 μg 이상, 95 μg 이상 또는 100 μg 이상일 수 있다. 대상체에게 투여되는 용량은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12회분, 또는 그 초과일 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그의 단편에 대해, 환자에게 투여되는 투여량은 0.0001 mg/kg 내지 100 mg/kg (환자 체중)일 수 있다. 투여량은 0.0001 mg/kg 내지 20 mg/kg, 0.0001 mg/kg 내지 10 mg/kg, 0.0001 mg/kg 내지 5 mg/kg, 0.0001 내지 2 mg/kg, 0.0001 내지 1 mg/kg, 0.0001 mg/kg 내지 0.75 mg/kg, 0.0001 mg/kg 내지 0.5 mg/kg, 0.0001 mg/kg 내지 0.25 mg/kg, 0.0001 내지 0.15 mg/kg, 0.0001 내지 0.10 mg/kg, 0.001 내지 0.5 mg/kg, 0.01 내지 0.25 mg/kg, 또는 0.01 내지 0.10 mg/kg (환자 체중)일 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그의 단편의 투여량은 환자의 체중 (킬로그램(kg))에 투여되는 용량 (mg/kg)을 곱하는 것을 이용하여 계산될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 그의 단편의 투여량은 150 μg/kg 이하, 125 μg/kg 이하, 100 μg/kg 이하, 95 μg/kg 이하, 90 μg/kg 이하, 85 μg/kg 이하, 80 μg/kg 이하, 75 μg/kg 이하, 70 μg/kg 이하, 65 μg/kg 이하, 60 μg/kg 이하, 55 μg/kg 이하, 50 μg/kg 이하, 45 μg/kg 이하, 40 μg/kg 이하, 35 μg/kg 이하, 30 μg/kg 이하, 25 μg/kg 이하, 20 μg/kg 이하, 15 μg/kg 이하, 10 μg/kg 이하, 5 μg/kg 이하, 2.5 μg/kg 이하, 2 μg/kg 이하, 1.5 μg/kg 이하, 1 μg/kg 이하, 0.5 μg/kg 이하, 또는 0.5 μg/kg 이하 (환자 체중)일 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그의 단편의 단위 용량은 0.1 mg 내지 20 mg, 0.1 mg 내지 15 mg, 0.1 mg 내지 12 mg, 0.1 mg 내지 10 mg, 0.1 mg 내지 8 mg, 0.1 mg 내지 7 mg, 0.1 mg 내지 5 mg, 0.1 내지 2.5 mg, 0.25 mg 내지 20 mg, 0.25 내지 15 mg, 0.25 내지 12 mg, 0.25 내지 10 mg, 0.25 내지 8 mg, 0.25 mg 내지 7 m g, 0.25 mg 내지 5 mg, 0.5 mg 내지 2.5 mg, 1 mg 내지 20 mg, 1 mg 내지 15 mg, 1 mg 내지 12 mg, 1 mg 내지 10 mg, 1 mg 내지 8 mg, 1 mg 내지 7 mg, 1 mg 내지 5 mg 또는 1 mg 내지 2.5 mg일 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그의 단편의 투여량은 대상체에서 0.1 μg/ml 이상, 0.5 μg/ml 이상, 1 μg/ml 이상, 2 μg/ml 이상, 5 μg/ml 이상, 6 μg/ml 이상, 10 μg/ml 이상, 15 μg/ml 이상, 20 μg/ml 이상, 25 μg/ml 이상, 50 μg/ml 이상, 100 μg/ml 이상, 125 μg/ml 이상, 150 μg/ml 이상, 175 μg/ml 이상, 200 μg/ml 이상, 225 μg/ml 이상, 250 μg/ml 이상, 275 μg/ml 이상, 300 μg/ml 이상, 325 μg/ml 이상, 350 μg/ml 이상, 375 μg/ml 이상 또는 400 μg/ml 이상의 혈청 역가를 달성할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 항체 또는 그의 단편의 투여량은 대상체에서 0.1 μg/ml 이상, 0.5 μg/ml 이상, 1 μg/ml 이상, 2 μg/ml 이상, 5 μg/ml 이상, 6 μg/ml 이상, 10 μg/ml 이상, 15 μg/ml 이상, 20 μg/ml 이상, 25 μg/ml 이상, 50 μg/ml 이상, 100 μg/ml 이상, 125 μg/ml 이상, 150 μg/ml 이상, 175 μg/ml 이상, 200 μg/ml 이상, 225 μg/ml 이상, 250 μg/ml 이상, 275 μg/ml 이상, 300 μg/ml 이상, 325 μg/ml 이상, 350 μg/ml 이상, 375 μg/ml 이상 또는 400 μg/ml 이상의 혈청 역가를 달성할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그의 단편의 용량은 반복 투여될 수 있고, 투여는 적어도 1일, 2일, 3일, 5일, 10일, 15일, 30일, 45일, 2개월, 75일, 3개월 또는 적어도 6개월 간격으로 시행될 수 있다.
특정한 환자에 대한 유효량은 치료될 상태, 환자의 전반적인 건강, 투여 방법 경로 및 용량 및 부작용의 중증도와 같은 요인에 따라 달라질 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Maynard et al., (1996) A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpharm Press, Boca Raton, Fla.; Dent (2001) Good Laboratory and Good Clinical Practice, Urch Publ., London, UK] 참조).
투여 경로는 예를 들어 국소 또는 피부 적용, 정맥내, 복강내, 뇌내, 근육내, 안내, 동맥내, 뇌척수내, 병변내 주사 또는 주입, 또는 지속 방출 시스템 또는 임플란트에 의한 것일 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Sidman et al., (1983) Biopolymers 22:547-556; Langer et al., (1981) J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277; Langer (1982) Chem. Tech. 12:98-105; Epstein et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692; Hwang et al., (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030-4034]; 미국 특허 번호 6,350,466 및 6,316,024 참조). 필요한 경우, 조성물은 또한 가용화제 및 국소 마취제, 예컨대 주사 부위의 통증을 완화하는 리도카인을 포함할 수 있다. 또한, 예를 들어 흡입기 또는 연무기의 사용, 및 에어로졸화제를 사용한 제제화에 의한 폐 투여도 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,019,968, 5,985,320, 5,985,309, 5,934,272, 5,874,064, 5,855,913, 5,290,540, 및 4,880,078; 및 PCT 공보 번호 WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346, 및 WO 99/66903 (각각 그의 전체내용이 본원에 참고로 포함됨)을 참조한다.
또한, 본 발명의 조성물은 당업계에 공지된 하나 이상의 다양한 방법을 사용하여 하나 이상의 투여 경로를 통해 투여될 수 있다. 당업자가 이해하게 되는 바와 같이, 투여 경로 및/또는 투여 방식은 원하는 결과에 따라 달라질 것이다. 본 발명의 항체 또는 그의 단편에 대해 선택된 투여 경로는 예를 들어 주사 또는 주입에 의한 정맥내, 근육내, 피내, 복강내, 피하, 척수 또는 다른 비경구 투여 경로를 포함한다. 비경구 투여는 경장 및 국소 투여 이외의 다른, 통상적으로 주사에 의한 투여 방식을 나타내고, 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 대안적으로, 본 발명의 조성물은 비-비경구 경로를 통해, 예컨대 국소, 표피 또는 점막 투여 경로, 예를 들어, 비강내, 경구, 질, 직장, 설하 또는 국부 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 단편은 주입에 의해 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 다중특이적 에피토프 결합 단백질은 피하 투여된다.
본 발명의 항체 또는 그의 단편이 제어 방출 또는 지속 방출 시스템으로 투여되면, 펌프는 제어 또는 지속 방출을 달성하기 위해 사용될 수 있다 (문헌 [Langer, 상기 문헌; Sefton, (1987) CRC Crit. Ref Biomed. Eng. 14:20; Buchwald et al., (1980), Surgery 88:507; Saudek et al., (1989) N. Engl. J. Med. 321:574] 참조). 중합체 물질은 본 발명의 요법의 제어 또는 지속 방출을 달성하기 위해 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, (1983) J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61] 참조; 또한 문헌 [Levy et al., (1985) Science 228:190; During et al., (1989) Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., (1989) J. Neurosurg. 71:105); 미국 특허 번호 5,679,377; 미국 특허 번호 5,916,597; 미국 특허 번호 5,912,015; 미국 특허 번호 5,989,463; 미국 특허 번호 5,128,326; PCT 공보 번호 WO 99/15154; 및 PCT 공보 번호 WO 99/20253] 참조). 지속 방출 제제에 사용된 중합체의 예는 폴리(2-히드록시 에틸 메타크릴레이트), 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(아크릴산), 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트), 폴리(메타크릴산), 폴리글리콜리드 (PLG), 폴리무수물, 폴리(N-비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알콜), 폴리아크릴아미드, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리락티드 (PLA), 폴리(락티드-코-글리콜리드) (PLGA) 및 폴리오르토에스테르를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 한 실시양태에서, 지속 방출 제제에 사용되는 중합체는 불활성이고, 여과가능한 불순물이 없고, 저장, 멸균 및 생분해성에 대해 안정하다. 제어 또는 지속 방출 시스템은 예방적 또는 치료적 표적에 인접하게 위치할 수 있고, 이에 따라 오직 전신 용량의 분획만을 필요로 한다 (예를 들어, 문헌 [Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, 상기 문헌, vol. 2, pp. 115-138 (1984)] 참조).
제어 방출 시스템은 문헌 [Langer, (1990), Science 249:1527-1533]에 의한 검토에서 논의된다. 당업자에게 공지된 임의의 기술은 본 발명의 하나 이상의 항체 또는 그의 단편을 포함하는 지속 방출 제제를 생산하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 4,526,938, PCT 공보 WO 91/05548, PCT 공보 WO 96/20698, 문헌 [Ning et al., (1996), Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al., (1995) PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397, Cleek et al., (1997) Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854, 및 Lam et al., (1997) Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760] (각각 그의 전체내용이 본원에 참고로 포함됨)을 참조한다.
본 발명의 항체 또는 그의 단편이 국소 투여될 경우, 이것은 연고, 크림, 경피 패치, 로션, 겔, 샴푸, 스프레이, 에어로졸, 용액, 에멀젼, 또는 당업자에게 공지된 다른 형태로 제형화될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19th ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa. (1995)]을 참조한다. 비-분무가능한 국소 투여 형태의 경우, 국소 적용에 적합한 담체 또는 하나 이상의 부형제를 포함하고 몇몇 경우에 물보다 큰 동적 점도를 갖는 점성 내지 반고체 또는 고체 형태가 일반적으로 사용된다. 적합한 제제는, 원하는 경우에 멸균되거나 예를 들어 삼투압과 같은 다양한 특성에 영향을 주는 보조제 (예를 들어, 보존제, 안정화제, 습윤제, 완충제, 또는 염)와 혼합되는 용액, 현탁액, 에멀젼, 크림, 연고, 분말, 도찰제, 살브 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 다른 적합한 국소 투여 형태는 몇몇 경우에 활성 성분이 고체 또는 액체 불활성 담체와 조합되어 압축 휘발물질 (예를 들어, 기체상 추진제, 예컨대 프레온)의 혼합물에 또는 압착병에 충전되는 분무가능한 에어로졸 제제를 포함한다. 원하는 경우에 보습제 또는 보습제가 또한 제약 조성물 및 투여 형태에 첨가될 수 있다. 이러한 추가의 성분의 예는 당업계에 공지되어 있다.
항체 또는 그의 단편을 포함하는 조성물이 비강내 투여될 경우, 이것은 에어로졸 형태, 스프레이, 연무제 또는 점적제의 형태로 제제화될 수 있다. 특히, 본 발명에 따라 사용하기 위한 예방제 또는 치료제는 적합한 추진제 (예를 들어, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체)를 사용하여 가압 팩 또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이 제공 형태로 편리하게 전달될 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투여량 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하는 것에 의해 결정될 수 있다. 흡입기 또는 취입기에 사용하기 위한, 캡슐 및 카트리지 (예를 들어, 젤라틴으로 구성됨)는 화합물의 분말 혼합물 및 적합한 분말 기제, 예컨대 락토스 또는 전분을 함유하여 제제화될 수 있다.
제2 치료제, 예를 들어 시토카인, 스테로이드, 화학요법제, 항생제, 또는 방사선과 함께 공투여하거나 치료하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Hardman et al., (eds.) (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10.sup.th ed., McGraw-Hill, New York, N.Y.; Poole and Peterson (eds.) (2001) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice:A Practical Approach, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., Pa.; Chabner and Longo (eds.) (2001) Cancer Chemotherapy and Biotherapy, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., Pa.] 참조). 유효량의 치료제는 증상을 적어도 10%; 적어도 20%; 적어도 약 30%; 적어도 40%, 또는 적어도 50% 감소시킬 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그의 단편과 조합하여 투여될 수 있는 추가의 요법제 (예를 들어, 예방제 또는 치료제)는 본 발명의 항체 또는 그의 단편과 5분 미만, 30분 미만, 1시간, 약 1시간, 약 1 내지 약 2시간, 약 2시간 내지 약 3시간, 약 3시간 내지 약 4시간, 약 4시간 내지 약 5시간, 약 5시간 내지 약 6시간, 약 6시간 내지 약 7시간, 약 7시간 내지 약 8시간, 약 8시간 내지 약 9시간, 약 9시간 내지 약 10시간, 약 10시간 내지 약 11시간, 약 11시간 내지 약 12시간, 약 12시간 내지 18시간, 18시간 내지 24시간, 24시간 내지 36시간, 36시간 내지 48시간, 48시간 내지 52시간, 52시간 내지 60시간, 60시간 내지 72시간, 72시간 내지 84시간, 84시간 내지 96시간, 또는 96시간 내지 120시간의 간격으로 투여될 수 있다. 2가지 이상의 요법제는 환자 방문시에 투여될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그의 단편 및 다른 요법제는 주기적으로 투여될 수 있다. 주기적 요법은 소정의 기간 동안의 제1 요법제 (예를 들어, 제1 예방제 또는 치료제)의 투여, 이어서 소정의 기간 동안의 제2 요법제 (예를 들어, 제2 예방제 또는 치료제)의 투여, 이어서 소정의 기간 동안의 제3 요법제 (예를 들어, 예방제 또는 치료제)의 투여 등, 및 상기 순차적 투여의 반복, 즉 요법제 중 하나에 대한 내성의 발생을 감소시키고/거나, 요법제 중 하나의 부작용을 방지 또는 감소시키고/거나, 요법제의 효능을 개선시키기 위한 순환을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 단편은 생체내에서 적합한 분포를 보장하도록 제제화될 수 있다. 예를 들어, 혈액-뇌 장벽 (BBB)은 고도로 친수성인 다수의 화합물을 배제시킨다. 본 발명의 치료 화합물이 (원하는 경우에) BBB를 확실히 횡단하도록 하기 위해는, 이들을 예를 들어 리포솜 내에 제제화할 수 있다. 리포솜의 제조 방법에 대해 예를 들어 미국 특허 번호 4,522,811; 5,374,548; 및 5,399,331을 참조한다. 리포솜은 특정 세포 또는 기관 내로 선택적으로 수송되어 표적화 약물 전달을 증진시키는 하나 이상의 모이어티를 포함할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Ranade, (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685] 참조). 예시적인 표적화 모이어티는 폴레이트 또는 비오틴 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,416,016 (Low et al.) 참조); 만노시드 (문헌 [Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038]); 항체 (문헌 [Bloeman et al., (1995) FEBS Lett. 357:140; Owais et al., (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180]); 계면활성제 단백질 A 수용체 (문헌 [Briscoe et al., (1995) Am. J. Physiol. 1233:134); p 120 (Schreier et al., (1994) J. Biol. Chem. 269:9090])를 포함하며, 또한 문헌 [K. Keinanen; M. L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J. J. Killion; I. J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273]을 참조한다.
본 발명은 본 발명의 항체 또는 그의 단편을 포함하는 제약 조성물을 단독으로 또는 다른 요법제와 조합하여 그를 필요로 하는 대상체에게 투여하기 위한 프로토콜을 제공한다. 본 발명의 조합 요법의 요법제 (예를 들어, 예방제 또는 치료제)는 대상체에게 공동으로 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 본 발명의 조합 요법의 요법제 (예를 들어, 예방제 또는 치료제)는 또한 주기적으로 투여될 수 있다. 주기적 요법은 소정의 기간 동안의 제1 요법제 (예를 들어, 제1 예방제 또는 치료제)의 투여, 이어서 소정의 기간 동안의 제2 요법제 (예를 들어, 제2 예방제 또는 치료제)의 투여 및 상기 순차적인 투여의 반복, 즉 요법제 (예를 들어, 작용제) 중 하나에 대한 내성의 발생을 감소시키고/거나, 요법제 (예를 들어, 작용제) 중 하나의 부작용을 방지 또는 감소시키고/거나, 요법제의 효능을 개선시키기 위한 순환을 포함한다.
본 발명의 조합 요법의 요법제 (예를 들어, 예방제 또는 치료제)는 대상체에게 공동으로 투여할 수 있다. 용어 "공동으로"는 정확히 동일한 시간에 요법제 (예를 들어, 예방제 또는 치료제)의 투여로 제한되지 않고, 본 발명의 항체 또는 그의 단편이 달리 투여된 경우보다 증가된 이익을 제공하기 위해 다른 요법제(들)와 함께 작용할 수 있는 순서 및 시간 간격으로 본 발명의 항체 또는 그의 단편을 포함하는 제약 조성물이 대상체에게 투여됨을 의미한다. 예를 들어, 각각의 요법제는 동시에 또는 상이한 시점에서 임의의 순서로 순차적으로 대상체에게 투여될 수 있지만; 동시에 투여되지 않을 경우에도, 이들은 목적하는 치료 또는 예방 효과를 제공하기 위해 충분히 가까운 시간 간격으로 투여되어야 한다. 각각의 요법제는 임의의 적절한 형태로 및 임의의 적합한 경로에 의해 대상체에게 별개로 투여될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 요법제 (예를 들어, 예방제 또는 치료제)는 대상체에게 15분 미만, 30분 미만, 1시간 미만, 약 1시간, 약 1 내지 약 2시간, 약 2시간 내지 약 3시간, 약 3시간 내지 약 4시간, 약 4시간 내지 약 5시간, 약 5시간 내지 약 6시간, 약 6시간 내지 약 7시간, 약 7시간 내지 약 8시간, 약 8시간 내지 약 9시간, 약 9시간 내지 약 10시간, 약 10시간 내지 약 11시간, 약 11시간 내지 약 12시간, 24시간, 48시간, 72시간, 또는 1주의 간격으로 투여될 수 있다. 다른 실시양태에서, 2가지 이상의 요법제 (예를 들어, 예방제 또는 치료제)는 환자 방문시에 투여된다.
조합 요법의 예방제 또는 치료제는 대상체에게 동일한 제약 조성물 내에서 투여될 수 있다. 대안적으로, 조합 요법의 예방제 또는 치료제는 대상체에게 별도의 제약 조성물 내에서 공동으로 투여할 수 있다. 예방제 또는 치료제는 대상체에게 동일한 또는 상이한 투여 경로로 투여될 수 있다.
본 발명이 상세하게 기재되긴 하였지만, 하기 실시예 및 특허청구범위에 의해 추가로 예시되며, 이는 예시적인 것이지 추가의 제한을 의미하는 것이 아니다.
실시예
실시예 1: 방법, 물질 및 항체에 대한 스크리닝
(i) 세포주
BXPC-3, SK-Br-3, BT-474, MDA-MB-453, FaDu 및 MCF-7 세포주는 ATCC로부터 구입하고, 통상적으로 10% 태아 소 혈청 (FBS)이 보충된 성장 배지에서 유지하였다.
( ii ) 재조합 인간, 시노몰구스 , 마우스 및 래트 HER3 벡터의 생성
뮤린 HER3 세포외 도메인을 Refseq NM_010153과의 비교에 의해 검증된 마우스 뇌 cDNA (클론테크(Clontech)) 및 서열로부터 PCR 증폭시켰다. 래트 HER3 ECD를 NM_017218과의 비교에 의해 검증된 래트-2 세포 mRNA 및 서열로부터 역전사시켰다. 시노몰구스 HER3 cDNA 주형을 다양한 시노몰구스 조직으로부터의 RNA (지아젠 래보러토리즈(Zyagen Laboratories))를 이용하여 생성하고, RT-PCR 생성물을 양쪽 가닥의 서열분석 이전에 pCR®-TOPO-XL (인비트로젠)에 클로닝하였다. 인간 HER3은 NM_001982와의 비교에 의해 검증된 인간 태아 뇌 cDNA 라이브러리 (소스(Source)) 및 서열로부터 유래하였다.
태그부착된 재조합 단백질을 생성하기 위해, 인간, 마우스, 래트 및 시노몰구스 HER3을 Pwo Taq 폴리머라제 (로슈 디아그노스틱스(Roche Diagnostics))를 이용하여 PCR 증폭시켰다. 증폭된 PCR 생성물을 겔 정제하고, 인-프레임 N-말단 CD33 리더 서열 및 C-말단 태그, 예를 들어 플래그 태그를 포함하도록 이전에 변형된 pDonR201 (인비트로젠) 게이트웨이 진입 벡터에 클로닝하였다. 태그는 항-태그 모노클로날 항체를 통한 단량체 단백질의 정제를 허용한다. 표적 유전자를 게이트웨이(Gateway)® 클로닝 기술 (인비트로젠)을 이용하여 AttB1 및 AttB2로 말단절단시켜 게이트웨이 맞춤 독점적 데스티네이션 벡터 (예를 들어, pcDNA3.1)로의 재조합을 허용하였다. 재조합 반응은 임의의 상업적으로 입수가능한 벡터를 이용할 수 있으나 태그 발현 벡터를 생성하기 위해 CMV 프로모터를 함유하는 독점적 데스티네이션 벡터와의 게이트웨이 LR 반응을 이용하여 수행하였다.
C-말단 인자 X 절단 부위의 HER3 ECD 상류 및 인간 IgG 힌지 및 Fc 도메인를 융합한 추가의 재조합 HER3 단백질을 생성하여 Fc-태그부착된 단백질을 생성하였다. 이를 달성하기 위해, 다양한 HER3 ECD를 PCR 증폭시키고, 인자 X 부위-힌지-hFc의 인-프레임 C-말단 융합을 함유하도록 변형된 벡터 (예를 들어, pcDNA3.1)에 클로닝하였다. 생성된 오픈 리딩 프레임을 게이트웨이® 재조합 클로닝 기술 (인비트로젠)로의 추가의 클로닝을 위해 AttB1 및 AttB2 부위로 말단절단시켰다. LR 게이트웨이 반응을 이용하여 HER3-Fc를 CMV 프로모터를 함유하는 데스티네이션 발현 구축물로 전달하였다. HER3 점 돌연변이 발현 구축물을 표준 부위 지정 돌연변이유발 프로토콜 및 검증된 생성된 벡터 서열을 이용하여 생성하였다.
Figure 112013023522215-pct00027
( iii ) 재조합 HER3 단백질의 발현
원하는 HER3 재조합 단백질을 이전에 현탁액 배양을 위해 맞춘 HEK293 유래의 세포주에서 발현시키고, 노파르티스 독점적 무혈청 배지에서 성장시켰다. 소규모의 발현 검증은 리포펙션을 기반으로 하여 일시적인 6-웰-플레이트 형질감염 검정에서 수행하였다. 일시적인 형질감염을 통한 대규모 단백질 생산은 웨이브(Wave)TM 생물반응기 시스템 (웨이브 바이오테크(Wave Biotech))에서 10-20 L 규모로 수행하였다. DNA 폴리에틸렌이민 (폴리사이언시즈(Polysciences))을 플라스미드 운반자로서 1:3 (w:w)의 비로 사용하였다. 세포 배양 상청액을 형질감염 7-10일 후에 수확하고, 정제 이전에 교차-흐름 여과 및 정용여과에 의해 농축시켰다.
( iv ) 태그부착된 단백질 정제
재조합 태그부착된 HER3 단백질 (예를 들어, 태그-HER3)은 세포 배양 상청액을 수집하고, 10 kDa 컷 오프 필터 (프레제니우스(Fresenius))로의 교차-흐름 여과에 의해 10배 농축시켜 정제하였다. 항-태그 칼럼은 항-태그 모노클로날 항체를 CNBr 활성화 세파로스 4B에 수지 mL당 10 mg 항체의 최종 비로 커플링시켜 제조하였다. 농축된 상청액을 35ml 항-태그 칼럼에 1-2 mL/분의 유량으로 적용하였다. PBS로의 기준선 세척 후에, 결합된 물질을 100 mM 글리신 (pH 2.7)으로 용리하고, 중화시키고, 멸균 여과하였다. 단백질 농도는 280 nm에서의 흡광도를 측정하고, 0.66 AU/mg의 이론적 인자를 이용하여 전환시킴으로써 결정하였다. 정제된 단백질을 최종적으로 SDS-PAGE, N-말단 서열분석 및 LC-MS에 의해 특성화하였다.
(v) Fc 태그 정제
농축된 세포 배양 상청액을 50 ml 단백질 A 세파로스 패스트 플로우(Sepharose Fast Flow) 칼럼에 1 ml/분의 유량으로 적용하였다. PBS로의 기준선 세척 후에, 칼럼을 10 칼럼 부피의 10 mM NaH2PO4/30% (v/v) 이소프로판올 (pH 7.3)에 이어 5 칼럼 부피의 PBS로 세척하였다. 최종적으로, 결합된 물질을 50 mM 시트레이트/140 mM NaCl (pH 2.7)로 용리하고, 중화시키고, 멸균 여과하였다.
( vi ) 과다발현 세포주의 생성
세포 표면 상에서 높은 수준의 HER3을 발현하는 세포주를 생성하기 위해, 인간 EGFR의 아미노산 잔기 669-1210에 인-프레임으로 융합된 인간 HER3의 아미노산 잔기 20-667 상류의 CD33 리더 서열을 코딩하는 삽입물을 함유하는 포유동물 발현 벡터를 구축하였다. 포유동물 세포에서 발현된 경우에 생성된 키메라 단백질은 N-말단 HER3 세포외 및 막횡단 도메인 및 C-말단 EGFR 세포질 도메인을 함유한다. HER3/1 벡터를 CHO-S 세포 (인비트로젠)에 형질감염시키고, 항생제 선택에 따라 안정한 풀을 생성하였다. 생성된 세포주 (CHO HER3/1)는 그의 세포 표면 상에서 높은 수준의 HER3 세포외 도메인을 발현하였다.
( vii ) HuCAL GOLD ® 패닝
인간 HER3을 인식하는 항체의 선택을 위해 다중 패닝 전략을 이용하였다. 인간 HER3 단백질에 대한 치료 항체는 항체 변이체 단백질의 공급원으로서 상업적으로 입수가능한 파지 디스플레이 라이브러리인 모르포시스(MorphoSys) HuCAL GOLD® 라이브러리를 이용하여 높은 결합 친화도를 갖는 클론을 선택함으로써 생성하였다. 파지미드 라이브러리는 HuCAL® 개념 (문헌 [Knappik et al., (2000) J Mol Biol 296:57-86])을 기반으로 하고, 파지 표면 상에 Fab를 디스플레이하기 위해 시스디스플레이(CysDisplay)® 기술을 이용한다 (WO01/05950, Lohning).
항-HER3 항체의 단리를 위해, 표준 뿐만 아니라 RapMAT 패닝 전략을 고체 상, 용액, 전세포 및 차별적 전세포 패닝 접근법을 이용하여 수행하였다.
( viii ) 고체 상 패닝
항-HER3 항체를 확인하기 위해, 다양한 고체 상 패닝 전략을 다양한 재조합 HER3 단백질을 이용하여 수행하였다. 고체 상 패닝의 각 라운드를 수행하기 위해, 맥시소르프(Maxisorp) 플레이트 (눈크(Nunc))를 HER3 단백질로 코팅하였다. 항-Fc (염소 또는 마우스 항-인간 IgG, 잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch)), 항-태그 항체로 이전에 코팅된 플레이트를 이용하거나 또는 수동적 흡착을 통해 태그부착된 단백질을 포획하였다. 코팅된 플레이트를 PBS로 세척하고, 차단시켰다. 코팅된 플레이트를 PBS로 2회 세척한 후에 HuCAL GOLD® 파지-항체를 진탕기 상에서 2시간 동안 실온에서 첨가하였다. 결합된 파지를 용리하고, 이. 콜라이 TG-1에 첨가하고, 파지 감염을 위해 인큐베이션하였다. 이후에, 감염된 박테리아를 단리하고, 한천 플레이트 상에 플레이팅하였다. 콜로니를 플레이트에서 긁어내고, 파지를 구제하고, 증폭시켰다. 각각의 HER3 패닝 전략은 패닝의 개별 라운드로 구성되고, 특징적인 항원, 항원 농도 및 세척 엄격도를 함유하였다.
( ix ) 용액 상 패닝
용액 상 패닝의 각 라운드를 뉴레귤린 1-β1 (R&D 시스템즈(R&D Systems))의 존재 또는 부재 하에 다양한 비오티닐화 재조합 HER3 단백질을 이용하여 수행하였다. 단백질은 제조업체의 지시에 따라 EZ-연결 술포-NHS-LC 비오티닐화 키트 (피어스)를 이용하여 비오티닐화시켰다. 800μl의 스트렙타비딘 연결된 자기 비드 (다이나비드(Dynabead), 다이날(Dynal))를 PBS로 1회 세척하고, 케미블로커(Chemiblocker) (케미콘(Chemicon))로 밤새 차단시켰다. HuCAL GOLD® 파지-항체 및 적절한 비오티닐화 HER3을 반응 튜브에서 인큐베이션하였다. 스트렙타비딘 자기 비드를 20분 동안 첨가하고, 자기 입자 분리기 (다이날)로 수집하였다. 각각의 튜브에 DTT 함유 완충제를 첨가하여 다이나비드로부터 결합된 파지를 용리하고, 이. 콜라이 TG-1에 첨가하였다. 파지 감염을 고체 상 패닝에서 기재된 바와 동일한 방식으로 수행하였다. 각각의 HER3 패닝 전략은 패닝의 개별 라운드로 구성되고, 특징적인 항원, 항원 농도 및 세척 엄격도를 함유하였다.
(x) 세포 기반 패닝
세포 패닝을 위해, HuCAL GOLD® 파지-항체를 대략 107개 세포와 회전기 상에서 2시간 동안 실온에서 인큐베이션한 후에 원심분리하였다. 세포 펠릿을 단리하고, 파지를 세포로부터 용리하였다. 상청액을 수집하고, 이. 콜라이 TG-1에 첨가하고, 상기 기재된 방법에 따라 계속 배양하였다. 2가지 세포 기반 전략을 이용하여 항-HER3 항체를 확인하였다:
a) 전세포 패닝: 이 전략에서 다양한 무손상 세포주가 항원으로 사용되었다.
b) 차별적 전세포 패닝: 이 전략에서 항원은 순차적으로 세포 및 재조합 HER3 단백질 (예로서 1981.09 참조)로 이루어진다. 재조합 단백질이 항원으로 이용되는 경우에 고체 상 패닝 프로토콜을 이용하면서 세포 기반 패닝을 상기 기재된 바와 같이 수행하였다. 세척은 PBS (2-3X) 및 PBST (2-3X)를 이용하여 수행하였다.
( xi ) RapMAT TM 라이브러리 생성 및 패닝
라이브러리 다양성을 유지하면서 항체 결합 친화도를 증가시키기 위해, 전세포 및 차별적 전세포 패닝 전략의 제3 라운드 결과를 입력하면서 용액 및 고체 상 패닝 둘 다의 제2 라운드 결과를 RapMATTM 프로세스에 입력하였다 (문헌 [Prassler et al., (2009) Immunotherapy; 1: 571-583]). 패닝을 통해 선택된 파지의 Fab-코딩 삽입물을 디스플레이 벡터 pMORPH®25_bla_LHC에 서브클로닝하여 RapMATTM 라이브러리를 생성하고, 특정 제한 효소를 사용하여 추가로 소화시켜 H-CDR2 RapMATTM 라이브러리 및 L-CDR3 RapMATTM 라이브러리를 생성하였다. 삽입물을 풀 조성에 따라 H-CDR2 또는 L-CDR3에 대해 TRIM 성숙 카세트로 대체하였다 (문헌 [Virnekas et al., (1994) Nucleic Acids Research 22:5600- 5607]). 라이브러리 크기는 8x106 -1x108개 클론의 범위로 추정되었다. RapMAT 항체-파지를 생산하고, 이에 대해 용액, 고체 상 또는 세포 기반 패닝의 2가지 추가 라운드를 이전에 기재된 실험 방법을 이용하여 수행하였다.
실시예 2: 항- HER3 IgG 의 일시적인 발현
HEK293-6E 세포에 맞춘 현탁액을 바이오웨이브20(BioWave20)에서 대략 2x 106개 생존 세포/mL의 밀도로 배양하였다. 세포를 적절한 멸균 DNA:PEI-MIX를 사용하여 일시적으로 형질감염시키고, 추가로 배양하였다. 형질감염 7일 후에, 세포를 프레제니우스 필터 (0.2 μm)를 이용하여 교차흐름 여과에 의해 제거하였다. 세포 무함유 물질을 10kDa 컷 오프 필터 (프레제니우스)를 이용하여 교차흐름 여과로 농축시키고, 농축물을 스테리컵 필터 (0.22 μm)를 통해 멸균 여과하였다. 멸균 상청액을 4℃에 저장하였다.
실시예 3: 항- HER3 IgG 의 정제
IgG의 정제는 AEKTA 100 익스플로러 에어 크로마토그래피 시스템 상에서 25 mL의 자가-패킹 맵셀렉트(MabSelect) SuRe 수지를 갖는 XK16/20 칼럼 (모두 지이 헬쓰케어(GE Healthcare))을 이용하여 냉각 캐비닛 중에서 6℃에서 수행하였다. 부하를 제외하고 모든 유량은 5 bar의 압력 제한에서 3.5 mL/분이었다. 칼럼을 3 칼럼 부피의 PBS로 평형화시킨 후에 여과된 발효 상청액을 2.0 mL/분으로 부하하였다. 칼럼을 8 칼럼 부피의 PBS로 세척하였다. IgG는 50 mM 시트레이트/70 mM NaCl (pH 4.5)에서 시작하여 12 칼럼 부피에서 50 mM 시트레이트/70 mM NaCl (pH 2.5)까지 선형으로 내려가는 pH 구배를 이용한 후에 동일한 pH 2.5 완충제의 2 칼럼 부피 불변 단계에 의해 용리하였다. IgG 함유 분획을 모으고, 바로 중화시키고, 멸균 여과 (밀리포어 스테리플립(Millipore Steriflip), 0.22 um)하였다. OD280을 측정하고, 단백질 농도를 서열 데이터를 기반으로 하여 계산하였다. 풀을 개별적으로 응집 (SEC-MALS) 및 순도 (SDS-PAGE 및 MS)에 대해 시험하였다.
실시예 4: 이. 콜라이에서 HuCAL® - Fab 항체의 발현 및 정제
TG-1 세포에서 pMORPH®X9_Fab_MH에 의해 코딩되는 Fab 단편의 발현을 34 μg/mL 클로람페니콜이 보충된 2x YT 배지 500 mL를 사용하여 진탕기 플라스크 배양물에서 수행하였다. 배양물을 OD600nm이 0.5에 도달할 때까지 30℃에서 진탕시켰다. 30℃에서 20시간 동안 0.75 mM IPTG (이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드)를 첨가하여 발현을 유도하였다. 세포를 리소자임을 이용하여 분쇄하였다. His6-태그부착된 Fab 단편을 IMAC (바이오-라드(Bio-Rad))를 통해 단리하였다. 1x 둘베코 PBS (pH 7.2)로의 완충제 교환을 PD10 칼럼을 이용하여 수행하였다. 샘플을 멸균 여과하였다 (0.2 μm). 단백질 농도를 UV-분광광도측정법에 의해 결정하였다. 샘플의 순도를 변성, 환원 15% SDS-PAGE에서 분석하였다. Fab 제제의 균질성을 보정 표준을 갖는 크기 배제 크로마토그래피 (HP-SEC)에 의해 본래 상태에서 결정하였다.
실시예 5: 용액 평형 적정 ( SET )에 의한 HER3 항체 친화도 ( K D ) 측정
용액에서의 친화도 결정은 본질적으로 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다 (문헌 [Friguet et al., (1985) J Immunol Methods 77:305-19]). SET 방법의 민감성 및 정확도를 개선시키기 위해, 이를 고전적 ELISA로부터 ECL 기반 기술로 전달하였다 (문헌 [Haenel et al., (2005) Anal biochem 339:182-84]).
이전에 기재된 비표지된 HER3-태그 (인간, 래트, 마우스 또는 시노몰구스)를 SET에 의한 친화도 결정에 사용하였다.
데이터는 지정된 적합 모델을 적용하여 XLfit 소프트웨어 (ID 비지니스 솔루션즈(ID Business Solutions))로 평가하였다. 각 IgG의 KD 결정을 위해 하기 모델을 이용하였다 (문헌 [Piehler, et al. (Piehler et al., (1997) J Immunol Methods 201:189-206]에 따라 변형됨).
Figure 112013023522215-pct00028
[IgG]: 적용된 전체 IgG 농도
x: 적용된 전체 가용성 항원 농도 (결합 부위)
B최대: 항원이 없는 IgG의 최대 신호
KD: 친화도
실시예 6: FACS 에 의한 항체 세포 결합 결정
인간 암 세포 상에서 발현된 내인성 인간 항원에 대한 항체의 결합을 FACS에 의해 평가하였다. 항체 EC50 값을 결정하기 위해 SK-Br-3 세포를 아쿠타제로 수확하고, FACS 완충제 (PBS/3% FBS/0.2% NaN3)에서 1x106개 세포/mL로 희석하였다. 1 x105개 세포/웰을 96-웰 플레이트 (눈크)의 각 웰에 첨가하고, 210 g에서 5분 동안 4℃에서 원심분리한 후에 상청액을 제거하였다. 시험 항체의 일련의 희석액 (FACS 완충제를 사용하여 1:4 희석 단계로 희석됨)을 펠릿화된 세포에 첨가하고, 얼음 상에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 세척하고, 100 μL FACS 완충제로 3회 펠릿화하였다. FACS 완충제로 1/200 희석된 PE 접합된 염소 항-인간 IgG (잭슨 이뮤노리서치)를 세포에 첨가하고, 얼음 상에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 추가의 세척 단계를 100 μL FACS 완충제로 3회 수행한 후에 210 g에서 5분 동안 4℃에서 원심분리 단계를 수행하였다. 최종적으로, 세포를 200 μL FACS 완충제에 재현탁시키고, 형광 값을 FACSArray (BD 바이오사이언시즈(BD Biosciences))로 측정하였다. 세포 표면 결합된 항-HER3 항체의 양을 평균 채널 형광 측정에 의해 평가하였다.
실시예 7: HER3 도메인 및 돌연변이체 결합
96-웰 맥시소르프 플레이트 (눈크)를 200 ng의 적절한 재조합 인간 단백질 (HER3-태그, D1-2-태그, D2-태그, D3-4-태그, D4-태그, HER3 K267A-태그, HER3 L268A-태그, HER3 K267A/L268A 및 태그부착된 비관련 대조군)로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 이어서 모든 웰을 PBS/0.1% 트윈-20으로 3회 세척하고, PBS/1% BSA/0.1% 트윈-20으로 1시간 동안 차단시키고, PBS/0.1% 트윈-20으로 3회 세척하였다. 항-HER3 항체를 관련 웰에 10 μg/mL의 최종 농도까지 첨가하고, 적절한 웰에 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS/0.1% 트윈-20으로 3회 세척한 후에 PBS/1% BSA/0.1% 트윈-20에 1/10000 희석된 적절한 퍼옥시다제 연결된 검출 항체를 첨가하였다. 사용된 검출 항체는 염소 항-마우스 (피어스, 31432), 토끼 항-염소 (피어스, 31402) 및 염소 항-인간 (피어스, 31412)이었다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후에 PBS/0.1% 트윈-20으로 3회 세척하였다. 100 μl TMB (3,3', 5,5' 테트라메틸 벤지딘) 기질 용액 (BioFx)을 모든 웰에 6분 동안 첨가한 후에 50 μl 2.5% H2SO4로 반응을 중지시켰다. 각각의 재조합 단백질에 대한 HER3 항체 결합의 정도를 스펙트라맥스(SpectraMax) 플레이트 판독기 (몰레큘라 디바이시즈(Molecular Devices))를 이용하여 OD450을 측정함으로써 결정하였다. 적절한 경우에, 용량 반응 곡선을 그래프패드 프리즘(Graphpad Prism)을 이용하여 분석하였다.
실시예 8: 수소/중수소 교환 질량 분광측정법을 이용하는 HER3 에피토프 맵핑
물질
D2O 완충제를 중수 (시그마)에 25 mM TBS (pH 7.5)/500 mM NaCl을 용해시켜 제조하였다. 환원 용액은 50mM 포르메이트 완충제 (pH 4) 500mM TCEP이고, 켄칭 용액은 물 중 0.5% (v/v) 트리플루오로아세트산 (TFA)이었다. 완충제 A는 물 중 0.25% 포름산/10% 메탄올/10% 에틸렌 글리콜이고, 완충제 B는 아세토니트릴 중 0.25% 포름산이었다. 모든 화학물질은 시그마로부터 구입하였고, HPLC 등급 용매는 피셔 사이언티픽(Fisher Scientific)으로부터 구입하였다.
액체 취급 및 크로마토그래피
자동화 수소-중수소 교환 질량 분광측정법 (HDX MS) 실험을 문헌 [Wales et al., (2006) Anal. Chem. 78:1005-1014]에 기재된 방법 및 장비를 기반으로 하여 설계하였다. 간략하게, 모든 액체 취급 작업은 2℃로 유지되는 냉각 인클로저에 하우징된 Pal HTS 액체-취급기 (LEAP 테크놀로지스(LEAP Technologies))를 사용하였다. 6-포트 주사 밸브 및 세척 스테이션을 액체-취급기 레일 상에 올려, 크로마토그래피 시스템으로의 샘플 주사 및 시린지 세척을 용이하게 하였다. 크로마토그래피 시스템은 추가의 10-포트 밸브, 2.1 mm x 30 mm 포로스자임(Poroszyme) 펩신 칼럼 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)), 역상 0.5 mm x 2 mm 캡 트랩(Cap Trap) 카트리지 (마이크롬 바이오리소시즈(Michrom Bioresources)), 및 분석 칼럼으로서의 자가-패킹 전기분무 이미터 (100 μm x 약 60 mm, 키네텍스(Kinetex) 2.6 μm C18, 페노메넥스(Phenomenex))로 이루어진다. 10-포트 밸브 헤드, 트랩 카트리지 및 분석 칼럼을 알루미늄으로 구축되고 펠티어 스택에 의해 -5℃로 유지되는 별도의 인클로저에 하우징하였다. 밸브 및 칼럼은 인-라인 단백질 소화, 펩티드 탈염, 및 역상 크로마토그래피에 이어 질량 분광측정계 (LTQ-오비트램(LTQ-Orbitrap), 써모 사이언티픽(Thermo Scientific))의 전기분무 이온화 (ESI) 공급원으로의 샘플의 도입을 허용하도록 하는 방식으로 구성된다.
작업에 필요한 유체 스트림은 2개의 별도의 HPLC 펌프에 의해 제공되었다. 제1 HPLC (서베이어(Surveyor) MS 펌프, 써모 사이언티픽)는 완충제 A를 125 μL/분의 일정한 유량으로 전달하였고, 샘플을 고정화된 펩신 카트리지를 통해 10-포트 밸브에 걸쳐 올려진 역상 트랩 카트리지로 전달하는데 사용하였다. 로딩 및 탈염 기간 후에, 샘플이 구배 펌프 (액퀴티 UPLC(AQUITY UPLC), 워터스(Waters))의 도움을 받아 역상 트랩 카트리지로부터 분석 칼럼을 통해 질량 분광측정계의 이온 공급원으로 용리되도록 10-포트 밸브를 스위칭하였다. 고정화된 효소 카트리지를 단리하여 구배 용리 동안 폐기하였다. 구배 펌프는 35분에 걸쳐 5 μL/분에서 0 내지 40% 이동상 B 및 10분에 걸쳐 5 μL/분에서 40 내지 95% 이동상 B의 선형 구배 절편을 전달하였다. 펌프로부터의 구배 흐름을 수동 분배기를 이용하여 10-포트 밸트에서 분배함으로써 구배 용리 동안 트랩 카트리지 및 분석 칼럼을 통한 실제 흐름이 약 1 μL/분이 되도록 하였다. 전체 크로마토그래피 실행은 세척 및 평형화 단계를 포함하여 70분이었다.
질량 분광측정법
온라인 소화로부터 생성된 단백질분해 단편의 확인을 위해 여러 데이터-의존성 MS/MS 실험을 수행하였다. 이러한 획득을 위해, 탠덤 MS 스펙트럼을 LTQ-오비트랩 하이브리드 질량 분광측정계의 LTQ 분석기로 획득하였다. 전구체 질량 선택은 오비트랩 분석기에 의해 획득한 MS 스캔을 기반으로 하였다. 중수소화 수준 결정을 위해 수행된 단일 단계 MS 획득은 오비트랩 (m/z 400-2000 상) 분석기에 의해 60,000의 해상도로 획득하였다.
단백질 및 단백질: Fab 복합체의 제조
50 μg HER3-태그를 25 mM TBS (pH 7.5)/500 mM NaCl을 사용하여 50 μL의 최종 부피가 되도록 희석함으로써 HER3 단백질을 제조하였다. 50 μg HER3-태그를 연구된 Fab와 1:1 몰비로 혼합하여 단백질:Fab 복합체를 제조하였다. 이어서, 단백질:Fab 혼합물을 25 mM TBS (pH 7.5)/500 mM NaCl을 사용하여 50 μL의 최종 부피로 희석하였다.
단백질:Fab 복합체를 제조하고, 적어도 2시간 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 샘플, 희석제, 켄칭 및 환원 용액을 함유하는 4개의 96-웰 플레이트를 액체-취급기에 로딩한 후에 각각의 실험을 시작하였다. 온-교환 실험 시작을 위해 50 μL의 HER3 또는 HER3:Fab 복합체를 150 μL D2O 완충제로 희석하였다. 혼합물을 200 μL 환원 완충제를 1분 동안 첨가하여 환원시킨 후에 600 μL의 켄칭 완충제로 켄칭하였다. 모든 액체 취급 단계 이후의 전체 부피는 약 1mL였다. 혼합되면, 켄칭된 용액을 크로마토그래피 시스템에 주사하여, 여기서 이를 자동 소화시키고, 분리하고, LCMS에 의해 분석하였다. 샘플과 대조군 사이의 중수소화의 평균 변화를 샘플과 대조군의 중수소 흡수 수준 사이의 차이로 계산하였다.
데이터 처리
오비트랩 RAW 파일을 인-하우스 프로그램 (RawXtract)을 이용하여 mzXML 파일로 전환시켰다. 이후에, SEQUEST (야테스 랩(Yates Lab), 스크립스 리서치 인스티튜트(Scripps Research Institute), 캘리포니아주 라 졸라)를 이용하여 탠덤 MS 획득을 검색하고, 검색 결과를 DTASelect 2.0 (야테스 랩, 스크립스 리서치 인스티튜트, 캘리포니아주 라 졸라)을 이용하여 자동 여과하였다. 펩티드 서열 확인을 이용하여, 인-하우스 작성 프로그램을 각각의 확인된 서열에 대한 단일-이온 크로마토그램의 자동 추출 및 크로마토그래피 피크에 걸친 평균 스펙트럼의 생성에 이용하였다. 평균 스펙트럼을 평활화시키고, 중심화하였다. 중수소 흡수의 수준을 중수소화 샘플과 비-중수소화 참조물 사이의 질량의 차이로 구하였다. 처리된 데이터를 수동으로 유효화하고, 자동화 처리 단계로부터의 부정확성 및 오류가 보정되도록 조정하였다. 중수소 흡수 수준을 각각의 펩티드에 걸친 중수소 함량의 비편재화 (즉, 관찰된 중수소화 수준을 그 펩티드 내의 아미노산의 수로 나눔)에 의해 단백질 서열의 각 잔기에 할당하였다. 잔기가 하나 초과의 펩티드에 의해 커버된다면, 그 잔기를 커버하는 모든 펩티드의 정규화된 중수소 흡수의 평균을 구하였다.
실시예 9: 인간 HER3/MOR09823 Fab 및 인간 HER3 / MOR09825 Fab 복합체의 X선 결정학적 구조 결정
본 실시예는 각각 3.2Å 및 3.4Å 해상도에서 결정된, MOR09823의 Fab 단편 및 MOR09825의 Fab 단편에 결합된 전장 HER3의 결정 구조를 제시한다. 태그부착된 인간 HER3을 PBS (pH 7.3)에서 평형화된 하이로드(HiLoad) 26/60 슈퍼덱스 200 프렙그레이드(PrepGrade) 칼럼 (지이 헬쓰케어) 상에서 추가로 정제하였다. 이. 콜라이 발현된 MOR09823 및 MOR09825 Fab를 리소자임으로 세포를 용해시켜 단리하고, His6-태그부착된 Fab 단편을 HisTrap_HP (지이 헬쓰케어) 칼럼 상에 포획하였다. MOR09823 Fab-단편을 25 mM 트리스 (pH 7.5), 150 mM NaCl에서 평형화된 슈퍼덱스 75 16/60 칼럼 (지이 헬쓰케어)을 이용하여 겔 여과 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하였다.
과량의 Fab를 태그부착된 HER3와 1.3-1.8:1의 몰비 (각각 HER3 및 Fab에 대해 0.9 및 1.4 (mg/ml)-1cm-1의 계산된 소광 계수를 이용하여 280 nm에서의 흡광도에 의해 추정된 농도)로 혼합하고, 복합체를 25 mM 트리스 (pH 7.5), 150 mM NaCl에서 평형화된 슈퍼덱스 200 10/300 칼럼 (지이 헬쓰케어) 상에서 정제하여 HER3 Fab 복합체를 제조하였다. 최대 분획을 SDS-PAGE 및 LCMS에 의해 분석하였다. 각각의 복합체의 경우에, HER3 및 Fab를 둘 다 대략적인 등몰비로 함유하는 분획을 모으고, 농축시켰다. 150 nl HER3/MOR09823 복합체 및 150 nl의 저장소 용액 (100 mM 시트르산나트륨 (pH 5.6), 20% PEG 4000 및 20% 이소프로판올)을 함유하는 점적액으로부터 시팅 드롭 증기 확산에 의해 293K에서 HER3/MOR09823 결정을 성장시켰다. 결정을 추가의 8% 글리세롤을 함유하는 저장소 용액으로 전달하고, 액체 질소에서 급속 냉각시켰다. 150 nl HER3/MOR09825 복합체 및 150 nl의 저장소 용액 (100 mM 비스-트리스 (pH 6.5), 16% PEG 10,000)을 함유하는 점적액으로부터 시팅 드롭 증기 확산에 의해 293K에서 HER3/MOR09825 결정을 성장시켰다. 결정을 100 mM 비스-트리스 (pH 6.5), 18% PEG 10,000 및 22% 글리세롤로 전달하고, 액체 질소에서 급속 냉각시켰다.
데이터를 어드밴스드 포톤 소스(Advanced Photon Source) (아르곤 국립 연구소(Argonne National Laboratory))에서 빔라인 17-ID에서 수집하였다. HER3/MOR09823 Fab 복합체 데이터를 처리하고, 우수한 통계치로 셀 치수가 a=124.16, b=139.44, c=180.25 Å인 공간군 I222에서 HKL2000 (HKL 리서치 인크(HKL Research Inc))을 이용하여 3.2Å에서 스케일링하였다. HER3/MOR09823 Fab 구조를 Fab의 단편 및 검색 모델로서 공개된 HER3 ECD 구조 1mb6을 사용하는 페이저(Phaser) (문헌 [McCoy et al., (2007) J. Appl. Cryst. 40:658-674])를 이용하여 분자 대체에 의해 해석하였다. 비대칭 단위당 HER3/MOR09823 Fab 복합체 1개 분자를 함유하는 최종 모델을 COOT에서 구축하고 (문헌 [Emsley & Cowtan (2004) Acta Cryst. 60:2126-2132]), BUSTER (글로벌 페이징, 리미티드(Global Phasing, LTD))을 이용하여 각각 결합 길이 및 결합 각에 대한 0.010 Å 및 1.37°의 rmsd로 각각 19.0 및 24.5%의 R 및 Rfree 값에 대해 정밀화하였다. PyMOL (슈뢰딩거, LLC(Schroedinger, LLC))에서 확인된 바와 같이 MOR09823 Fab에서 임의의 원자의 5Å 내에 원자를 함유하는 HER3의 잔기를 표 11 및 12에 열거하였다. HER3/MOR09825 Fab 복합체 데이터를 처리하고, 우수한 통계치로 셀 치수가 a=124.23, b=140.94, c=180.25 Å인 공간군 I222에서 autoPROC (글로벌 페이징, 리미티드)를 이용하여 3.4Å에서 스케일링하였다. HER3/MOR09823 Fab 구조를 검색 모델로 사용하는 페이저 (문헌 [McCoy et al., (2007) J. Appl. Cryst. 40:658-674])를 이용하여 분자 대체에 의해 HER3/MOR09825 Fab 구조를 해석하였다. 비대칭 단위당 HHER3/MOR09825 Fab 복합체 1개 분자를 함유하는 최종 모델을 COOT에서 구축하고 (문헌 [Emsley & Cowtan (2004) Acta Cryst. 60:2126-2132]), BUSTER (글로벌 페이징, 리미티드)을 이용하여 각각 결합 길이 및 결합 각에 대한 0.009 Å 및 1.21°의 rmsd로 각각 18.8 및 24.9%의 R 및 Rfree 값에 대해 정밀화하였다. PyMOL (슈뢰딩거, LLC)에서 확인된 바와 같이 MOR09825 Fab에서 임의의 원자의 5Å 내에 원자를 함유하는 HER3의 잔기를 표 13 및 14에 열거하였다.
실시예 10: 포스포 - HER3 시험관내 세포 검정.
MCF-7 세포를 통상적으로 맥코이 5a, 10% FCS, 1.5mM L-글루타민 중 DMEM/F12, 15mM HEPES, L-글루타민, 10% FCS 및 SK-Br-3에서 유지하였다. 완전 배지에서 성장시킨 준-전면성장 MCF7 또는 SK-Br-3 세포를 아쿠타제 (PAA 래보러토리즈(PAA Laboratories))로 수확하고, 적절한 성장 배지에 5x105개 세포/mL의 최종 농도에 재현탁시켰다. 이어서, 100 μL의 세포 현탁액을 96-웰 편평 바닥 플레이트 (눈크)의 각각의 웰에 첨가하여 5x104개 세포/웰의 최종 밀도를 제공하였다. MCF7 세포를 대략 3시간 동안 부착시킨 후에 배지를 0.5% FBS를 함유하는 고갈 배지로 교환하였다. 이어서, 모든 플레이트를 37℃에서 밤새 인큐베이션한 후에 적절한 농도의 HER3 항체 (적절한 배지에 희석됨)로 80분 동안 37℃에서 처리하였다. MCF7 세포를 최종 20분 동안 50 ng/mL 뉴레귤린 1-β1 EGF 도메인 (R&D 시스템즈)으로 처리하여 HER3 인산화를 자극하였다. 모든 배지를 부드럽게 흡인하고, 세포를 1mM CaCl2 및 0.5 mM MgCl2 (깁코(Gibco))를 함유하는 빙냉 PBS로 세척하였다. 50 μL 빙냉 용해 완충제 (20 mM 트리스 (pH8.0)/137 mM NaCl/10% 글리세롤/2mM EDTA/1% NP-40/1 mM 나트륨 오르토바나데이트/아프로티닌 (10μg/mL)/류펩틴 (10μg/mL))를 첨가하여 세포를 용해시키고, 얼음 상에서 30분 동안 진탕시키면서 인큐베이션하였다. 이어서, 용해물을 수집하고, 1800 g에서 15분 동안 4℃에서 회전시켜 세포 잔해를 제거하였다. 20 μL의 용해물을 미리-제조된 포획 플레이트에 첨가하였다.
PBS에 희석시킨 후에 1x 트리스 완충제 (메조스케일 디스커버리(Mesoscale Discovery))/0.1% 트윈-20 중 3% 소 혈청 알부민으로 차단시킨 4 μg/mL MAB3481 포획 항체 (R&D 시스템즈) 20 μL로 4℃에서 밤새 코팅된 탄소 플레이트 (메조스케일 디스커버리)를 이용하여 HER3 포획 플레이트를 생성하였다. 플레이트를 진탕시키면서 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하여 용해물로부터 HER3을 포획한 후에 한 후에 용해물을 흡인하고, 웰을 1x 트리스 완충제 (메조스케일 디스커버리)/0.1% 트윈-20으로 세척하였다. 진탕시키면서 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하여 1% BSA/1x 트리스/0.1% 트윈-20에서 제조된 0.75 μg/mL 비오티닐화 항-포스포티로신 항체 (R&D 시스템즈)를 이용하여 인산화 HER3을 검출하였다. 웰을 1x 트리스/0.1% 트윈-20으로 4회 세척하고, 비오티닐화 단백질을 1% BSA/1x 트리스/0.1% 트윈-20에서 1시간 동안 실온에 희석된 S-태그 표지된 스트렙타비딘 (메조스케일 디스커버리)과 인큐베이션하여 비오티닐화 단백질을 검출하였다. 각각의 웰을 흡인하고, 1x 트리스/0.1% 트윈-20으로 4회 세척한 후에 20 μL의 판독 완충제 T (계면활성제 포함) (메조스케일 디스커버리)를 첨가하고, 메조스케일 섹터 이미저(Mesoscale Sector Imager)를 이용하여 신호를 정량화하였다. 항체 MOR06391 또는 MOR03207을 이소형 대조군으로 신호전달 실험에 포함시켰다.
실시예 11: 포스포 - Akt ( S473 ) 시험관내 세포 검정.
완전 배지에서 성장시킨 준-전면성장 SK-Br-3 및 BT-474 세포를 아쿠타제 (PAA 래보러토리즈)로 수확하고, 적절한 성장 배지에 5x105개 세포/mL의 최종 농도로 재현탁시켰다. 이어서, 100μL의 세포 현탁액을 96-웰 편평 바닥 플레이트 (눈크)의 각각의 웰에 첨가하여 5x104개 세포/웰의 최종 밀도를 생성하였다. 이어서, 모든 플레이트를 37℃에서 밤새 인큐베이션한 후에 적절한 농도의 HER3 항체 (적절한 배지에 희석됨)로 80분 동안 37℃에서 처리하였다. 모든 배지를 부드럽게 흡인하고, 세포를 1mM CaCl2 및 0.5 mM MgCl2 (깁코)를 함유하는 빙냉 PBS로 세척하였다. 50 μL 빙냉 용해 완충제 (20 mM 트리스 (pH8.0)/137 mM NaCl/10% 글리세롤/2mM EDTA/1% NP-40/1 mM 나트륨 오르토바나데이트/아프로티닌 (10μg/mL)/류펩틴 (10μg/mL))를 첨가하여 세포를 용해시키고, 얼음 상에서 진탕시키면서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 용해물을 수집하고, 1800 g에서 15분 동안 4℃에서 회전시켜 세포 잔해를 제거하였다. 20 μL의 용해물을 3% BSA/1x 트리스/0.1% 트윈-20으로 이전에 차단시킨 멀티-스팟 384-웰 포스포-Akt 탄소 플레이트 (메조스케일 디스커버리)에 첨가하였다. 플레이트를 진탕시키면서 2시간 동안 실온에서 인큐베이션한 후에 용해물을 흡인하고, 웰을 1x 트리스 완충제 (메조스케일 디스커버리)/0.1% 트윈-20으로 4회 세척하였다. 인산화 Akt를 진탕시키면서 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하여 1% BSA/1x 트리스/0.1% 트윈-20에 50배 희석된 술포-태그 항-포스포-Akt (S473) 항체 (메조스케일 디스커버리) 20 μL를 이용하여 검출하였다. 웰을 1x 트리스/0.1% 트윈-20으로 4회 세척한 후에 20 μL의 판독 완충제 T (계면활성제 포함) (메조스케일 디스커버리)를 첨가하고, 메조스케일 섹터 이미저를 이용하여 신호를 정량화하였다. 항체 MOR06391 또는 MOR03207을 이소형 대조군으로 신호전달 실험에 포함시켰다.
실시예 12: 세포주 증식 검정.
SK-Br-3 세포를 통상적으로 10% 태아 소 혈청이 보충된 변형된 맥코이 5A 배지에서 배양하고, BT-474 세포를 10% FBS가 보충된 DMEM에서 배양하였다. 준-전면성장 세포를 트립신화하고, PBS로 세척하고, 성장 배지를 사용하여 5x104개 세포/mL로 희석하고, 96-웰 투명 바닥 흑색 플레이트 (코스타(Costar) 3904)에 5000개 세포/웰의 밀도로 플레이팅하였다. 세포를 37℃에서 밤새 인큐베이션한 후에 적절한 농도의 HER3 항체 (전형적인 최종 농도는 10 또는 1 μg/mL임)를 첨가하였다. 플레이트를 6일 동안 다시 인큐베이터에 넣은 후에 셀타이터-글로(CellTiter-Glo) (프로메가(Promega))를 이용하여 세포 생존율을 평가하였다. 100 μL의 셀타이터-글로 용액을 각각의 웰에 첨가하고, 10분 동안 부드럽게 진탕시키면서 실온에서 인큐베이션하였다. 발광의 양을 스펙트라맥스 플레이트 판독기 (몰레큘라 디바이시즈)를 이용하여 결정하였다. 각각의 항체에서 수득한 성장 억제의 정도는 각각의 HER3 항체에서 수득한 발광 값을 표준 이소형 대조 항체 (MOR06391)와 비교하여 계산하였다.
증식 검정을 위해 MCF-7 세포를 통상적으로 4 mM L-글루타민/15mM HEPES/10% FBS를 함유하는 DMEM/F12 (1:1)에서 배양하였다. 준-전면성장 세포를 트립신화하고, PBS로 세척하고, 4 mM L-글루타민/15mM HEPES/10 μg/mL 인간 트랜스페린/0.2% BSA를 함유하는 DMEM/F12 (1:1)를 사용하여 1x105개 세포/mL로 희석하였다. 세포를 96-웰 투명 바닥 흑색 플레이트 (코스타)에 5000개 세포/웰의 밀도로 플레이팅하였다. 이어서, 적절한 농도의 HER3 항체 (전형적인 최종 농도는 10 또는 1 μg/mL임)를 첨가하였다. 10 ng/mL의 NRG1-β1 EGF 도메인 (R&D 시스템즈)을 또한 적절한 웰에 첨가하여 세포 성장을 자극하였다. 플레이트를 6일 동안 다시 인큐베이터에 넣은 후에 셀타이터-글로 (프로메가)를 이용하여 세포 생존율을 평가하였다. 각각의 항체에서 수득한 성장 억제의 정도는 백그라운드 (뉴레귤린 없음) 발광 값을 감하고, 각각의 항-HER3 항체에서 수득한 결과 값을 표준 이소형 대조 항체 (MOR06391)와 비교하여 계산하였다.
실시예 13: 리간드 차단 세포 검정
10% FBS 및 1 μg/mL 인슐린 (시그마)이 보충된 MEM에서 배양한 MCF-7 세포를 세정하고, 작은 부피의 FACSmax 세포 해리 완충제 (젠란티스(Genlantis))에 수집한 후에 5 mL의 FACS 완충제 (PBS/1% FBS/0.1% 나트륨 아지드)를 첨가하였다. 세포 밀도를 계수하고, 1x106개 세포/mL의 최종 농도로 조정하였다. 100 μl의 세포 현탁액을 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 세포를 원심분리 (220g, 3분, 4℃)를 통해 펠릿화하였다. 세포 펠릿을 FACS 완충제에 희석된 적절한 시험 항체 (전형적인 최종 항체 농도는 100 내지 0.1 nM임) 100 μL에 재현탁시키고, 플레이트를 얼음 상에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 리간드 차단 항체 MAB3481 (R&D 시스템즈)를 양성 대조군으로 포함시켰다. 세포를 염색 완충제로 2회 세척한 후에 FACS 완충제에 희석된 10 nM NRG1-β1 EGF 도메인 (R&D 시스템즈)을 첨가하고, 얼음 상에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 염색 완충제로 2회 세척하고, 결합된 뉴레귤린을 10 nM 항-인간 NRG1-β1 EGF 도메인 항체 (R&D 시스템즈)와 세포를 얼음 상에서 45분 동안 인큐베이션하여 검출하였다. 세포를 염색 완충제로 2회 세척하고, FACS 완충제로 1/500 희석된 PE-연결된 항-염소 항체 (잭슨 이뮤노리서치)와 얼음 상에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 이어서 세포를 원심분리를 통해 펠릿화하고, 펠릿을 200 μL FACS 완충제에 재현탁시켰다. 각각의 샘플을 정량화하기 위해 10,000개의 살아있는 세포를 LSR II 유동 세포측정기 (BD 바이오사이언시즈) 상에서 계수하고, 세포 표면 결합된 뉴레귤린의 양을 평균 채널 형광을 측정하여 평가하였다.
실시예 14: 리간드 차단 생화학적 검정
본 방법은 HER3/항체 복합체가 뉴레귤린에 결합하는 능력을 조사하기 위한 표면 플라즈몬 공명 (SPR)-기반 바이오센서 (비아코어TM, 지이 헬쓰케어, 스웨덴 웁살라)의 유용성을 포함한다.
비아코어TM는 표면 플라즈몬 공명 (SPR)의 현상을 이용하여 결합 상호작용을 검출 및 측정한다. 전형적인 비아코어 실험에서는, 상호작용 파트너 (HER3)를 표면 상에서 유동시키면서 상호작용 분자 중 하나 (뉴레귤린)를 매트릭스 상에 고정화시켰다. 결합 상호작용은 센서 표면 상의 질량을 증가시키고, 센서 표면 부근에서 배지 굴절률의 상응하는 직접적인 변화를 일으켰다. 굴절률 또는 신호의 변화를 공명 단위 (R.U.)로 기록하였다. 복합체의 회합 및 해리로 인한 신호 변화를 비-침습 방식으로, 연속적으로 및 실시간으로 모니터링하고, 그 결과를 센소그램의 형태로 보고하였다.
비아코어TM T100 (지이 헬쓰케어, 스웨덴 웁살라)을 이용하여 본원에 보고된 모든 실험을 수행하였다. 센서 표면 제조 및 상호작용 분석을 25℃에서 수행하였다. 완충제 및 비아코어 시약은 지이 헬쓰케어로부터 구입하였다. 10mM Hepes (pH7.4)/150mM NaCl, 0.05% P20, 0.5% BSA를 함유하는 러닝 완충제를 검정 전반에 걸쳐 이용하였다.
NRG-1β1 세포외 도메인 (R&D 시스템즈)을 EZ-연결 술포-NHS-LC-LC-비오틴 (피어스)과 5:1의 몰비로 얼음 상에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 반응을 과량의 에탄올아민 첨가를 통해 켄칭하고, 탈염 회전 칼럼 (제바(Zeba))을 이용하여 커플링되지 않은 비오틴을 비오티닐화-NRG로부터 제거하였다. 비오티닐화-NRG를 대략 3000 R.U.의 ssDNA-스트렙타비딘 (비오틴 CAPture 키트)로 미리 고정화시킨 센서 칩 CAP 상에 포획하여 400 - 600 R.U. 범위의 뉴레귤린 표면 밀도를 제공하였다. 주사 단계에서 비오티닐화-NRG를 생략하여 오직 ssDNA-스트렙타비딘만이 유동세포 표면 상에 존재하도록 함으로써 참조 유동세포를 생성하였다.
10nM 인간 HER3-Fc를 증가하는 농도 (0 - 50nM)의 적절한 시험 항체와 15분 동안 실온에서 인큐베이션한 후에 비아코어TM 중에서 10℃에서 인큐베이션하여 HER3/항체 복합체를 생성하였다. 상호작용 분석을 HER3/항체 복합체를 참조 및 뉴레귤린 표면 상에서 연속적으로 180초 동안 60μL/분의 유량으로 주사하여 수행하였다. 복합체 해리를 180초 동안 60μL/분의 유량으로 모니터링하였다. 표면 재생은 각각의 분석 주기 마지막에 8M 구아니딘:1M NaOH (3:1)의 120초 주사에 이어 30% 아세토니트릴/0.25M NaOH의 120초 주사를 30μL/분 유량으로 이용하여 수행하였다.
실시예 15: 생체내 PD 연구
BxPC3 및 BT-474 세포를 실시예 16 및 17에 기재된 바와 같이 배양하고, 암컷 무흉선 nu/nu Balb/C 마우스 (하를란 래보러토리즈(Harlan Laboratories))에 이식하였다.
종양이 적절한 크기에 도달하면, 동물을 종양 품질에 대해 조사하였다. 궤양이 생긴 종양을 갖는 동물 또는 수포가 생긴 종양을 갖는 동물은 연구에서 제외하였다. 나머지 동물에게 항체를 측면 꼬리 정맥 주사를 통해 정맥내 투여하였다. 주어진 시점에, 동물을 CO2 질식을 통해 안락사시키고, 심장 천자를 통해 전혈을 수집하고, 1.5 mL 에펜도르프 수집 튜브에 넣었다. 종양 조직을 바로 해부하고, 스크류-탑 폴리프로필렌 샘플 튜브에 넣고, 액체 질소에서 순간 동결시켰다. 용해물이 제조될 때까지 조직을 -80℃에 저장하였다.
실시예 16: 생체내 BT -474 효능 연구
BT-474 세포를 이식 시간까지 항생제없이 10% 열-불활성화 태아 소 혈청을 함유하는 DMEM에서 배양하였다.
세포 접종 1일 전에, 암컷 무흉선 nu/nu Balb/C 마우스 (하를란 래보러토리즈)에게 지속 방출 17β-에스트라디올 펠릿 (이노베이티브 리서치 오브 아메리카(Innovative Research of America))을 피하 이식하여 혈청 에스트로겐 수준을 유지하였다. 17β-에스트라디올 펠릿 이식 1일 후에, 5 x106개 세포를 행크 균형 염 용액 중 50% 페놀-레드 무함유 매트리겔 (BD 바이오사이언시즈)을 함유하는 현탁액 중에서 제4 유방 지방체에 정위 주사하였다. 현탁액 중 세포를 함유하는 전체 주사 부피는 200 μL였다. 세포 이식 20일 후에 대략 200 mm3의 종양 부피를 갖는 동물을 효능 연구에 등록하였다. 일반적으로, 군당 총 10마리의 동물을 효능 연구에 등록하였다.
단일-작용제 연구를 위해, 동물에게 MOR10701 또는 MOR10703을 측면 꼬리 정맥 주사를 통해 정맥내 투여하였다. 제1 용량에 대해 40 mg/kg의 초회 부하 용량이 주어졌다. 초회 투여 후에, 동물에게 연구 기간 동안 20 mg/kg, 격일 스케줄을 적용하였다. 조합 연구를 위해, 동물에게 MOR10701 또는 MOR10703 (20mg/kg, iv, q2d) 및 준최적 용량의 트라스투주맙 (1mg/kg, iv, 2qw)을 투여하였다.
연구 기간 동안, 종양 부피를 일주일에 2회 캘리퍼를 이용하여 측정하였다. 처리/대조 (T/C) 퍼센트 값을 하기 식을 이용하여 계산하였다:
% T/C = 100 x ΔT/ΔC (ΔT>0인 경우)
식 중,
T = 연구 마지막 날의 약물-처리군의 평균 종양 부피;
ΔT = 연구 마지막 날의 약물-처리군의 평균 종양 부피 - 투여 시작 일의 약물-처리군의 평균 종양 부피;
C = 연구 마지막 날의 대조군의 평균 종양 부피; 및
ΔC = 연구 마지막 날의 대조군의 평균 종양 부피 - 투여 시작 일의 대조군의 평균 종양 부피.
체중을 일주일에 2회 측정하고, 용량을 체중에 따라 조정하였다. 체중 변화 %를 (BW현재 - BW시작)/(BW시작) x 100으로 계산하였다. 데이터를 치료 시작 일로부터의 체중 변화 퍼센트로 제시하였다.
모든 데이터를 평균 ± 평균의 표준 오차 (SEM)로 표현하였다. 델타 종양 부피 및 체중을 통계적 분석에 사용하였다. 군들 사이의 비교를 일원 ANOVA에 이어 사후 Tukey를 이용하여 수행하였다. 모든 통계적 평가에서 유의 수준을 p < 0.05로 설정하였다. 비히클 대조군과 비교한 유의성을 보고하였다.
실시예 17: 생체내 BxPC3 효능 연구
BxPC3 세포를 이식 시간까지 항생제없이 10% 열-불활성화 태아 소 혈청을 함유하는 RPMI-1640 배지에서 배양하였다.
암컷 무흉선 nu/nu Balb/C 마우스 (하를란 래보러토리즈)에게 50% 포스페이트 완충 염수의 50% 매트리겔과의 혼합물 중 10x106개 세포를 피하 이식하였다. 현탁액 중 세포를 함유하는 전체 주사 부피는 200 μL였다. 종양의 크기가 대략 200mm3에 도달하면, 동물을 효능 연구에 등록하였다. 일반적으로, 군당 총 10마리의 동물을 연구에 등록하였다. 동물이 등록 전에 비정상적인 종양 성장 특성을 나타낸다면 이들을 등록에서 제외하였다.
동물에게 측면 꼬리 정맥 주사를 통해 정맥내 투여하였다. 제1 용량에 대해 40 mg/kg의 초회 부하 용량이 주어졌다. 초회 투여 후에, 동물에게 연구 기간 동안 (처리 하에 25일) 20 mg/kg, 격일 스케줄을 적용하였다. 종양 부피 및 T/C 값을 이전에 상세하게 기재된 바와 같이 계산하였다.
실시예 18: 포스포 - Akt ( S473 ) 생체내 PD 검정.
대략 50 mm3 동결된 종양 (예를 들어, BT-474 또는 BXPC-3) 조직을 얼음 상에서 해동시키고, 포스파타제 (로슈) 및 프로테아제 억제제 (로슈)를 함유하는 T-PER 완충제 (피어스) 100- 300 μL를 각각의 샘플에 첨가하였다. 첨가된 용해 완충제의 부피는 종양 샘플의 크기에 따라 달라졌다. 조직을 1.5 mL 막자 (피셔 사이언티픽)을 이용하여 분쇄하고, 생성된 현탁액을 얼음 상에서 15분 동안 인큐베이션한 후에 -80℃에서 밤새 동결시켰다. 샘플을 해동시키고, 15분 동안 13000 g, 4℃에서 회전시킨 후에 BCA 검정 (써모 사이언티픽)에 의해 상청액 단백질 농도를 정량화하였다. 조직 상청액을 용해 완충제 (메조스케일 디스커버리)로 희석하고, 25 μg을 이전에 차단 용액-A (메조스케일 디스커버리)로 차단시킨 멀티-스팟 96-웰 포스포-Akt 탄소 플레이트 (메조스케일 디스커버리)에 첨가하였다. 플레이트를 진탕시키면서 1시간 동안 실온에서 인큐베이션한 후에 용해물을 흡인하고, 웰을 트리스 세척 완충제 (메조스케일 디스커버리)로 4회 세척하였다. 인산화 Akt를 항체 희석 완충제에 희석된 술포-태그 항-포스포-Akt (S473) 항체 (메조스케일 디스커버리) 25 μL를 사용하여 1시간 동안 실온에서 진탕시키면서 인큐베이션함으로써 검출하였다. 웰을 트리스 세척 완충제로 4회 세척한 후에 150 μL의 판독 완충제 T (계면활성제 포함) (메조스케일 디스커버리)를 첨가하고, 신호를 메조스케일 섹터 이미저를 이용하여 정량화하였다.
실시예 19: 포스포 HER3 ( Y1197 ) 생체내 PD 검정
대략 50 mm3 동결된 종양 (예를 들어, BXPC-3) 조직을 얼음 상에서 해동시키고, 포스파타제 (로슈) 및 프로테아제 억제제 (로슈)를 함유하는 T-PER 완충제 (피어스) 100-300 μL를 각각의 샘플에 첨가하였다. 조직을 1.5 mL 막자 (피셔 사이언티픽)를 이용하여 분쇄하고, 생성된 현탁액을 얼음 상에서 15분 동안 인큐베이션한 후에 -80℃에서 밤새 동결시켰다. 샘플을 해동시키고, 15분 동안 13000 g, 4℃에서 회전시킨 후에 BCA 검정 (써모 사이언티픽)에 의해 상청액 단백질 농도를 정량화하였다. 조직 현탁액을 용해 완충제로 희석하고, 150 μg을 이전에 4 μg/mL MAB3481 (R&D 시스템즈)로 밤새 코팅하고 3% 유액으로 차단시킨 멀티-스팟 96-웰 탄소 플레이트 (메조스케일 디스커버리)에 첨가하였다. 플레이트를 진탕시키면서 2시간 동안 실온에서 인큐베이션한 후에 용해물을 흡인하고, 웰을 트리스 세척 완충제 (메조스케일 디스커버리)로 4회 세척하였다. 인산화 HER3을 차단 완충제에 1/8000 희석된 항-HER3 pY1197을 사용하여 결합시켰다. 1시간 동안 실온에서 인큐베이션한 후에 웰을 트리스 세척 완충제로 세척하고, 항-pY1197 항체를 차단 완충제에 1/1000 희석된 S-태그 표지된 항-토끼 항체 (메조스케일 디스커버리)를 이용하여 1시간 동안 실온에서 진탕시키면서 인큐베이션함으로써 검출하였다. 웰을 트리스 세척 완충제로 4회 세척한 후에 150 μl의 1/4 희석된 판독 완충제 T (계면활성제 포함) (메조스케일 디스커버리)를 첨가하고, 신호를 메조스케일 섹터 이미저를 이용하여 정량화하였다.
실시예 20: 시험관내 약물 조합물 연구
HER3-표적화 항체가 표적화 요법과 조합하는 능력을 평가하기 위해 MOR09825 또는 MOR10703을 세포 생존율 검정에서 트라스투주맙, 라파티닙, BEZ235, BKM120, BYL719, RAD001, 에를로티닙 및 세툭시맙과 조합하였다. 대략 1000-1500개의 SK-Br-3 (맥코이), MDA-MB-453 (RPMI), FaDu (EMEM) 또는 L3.3 (RPMI) 세포를 2% FBS가 보충된 적절한 배양 배지 중에 384-웰 플레이트에 시딩하고, 37℃에서 밤새 부착시켰다. 이후에 적절한 약물 조합물 (전형적인 최종 약물 농도는 라파티닙, BKM120 및 BYL719의 경우에 3μM 내지 13 nM 범위이고; RAD001의 경우에 27nM 내지 0.0041nM 범위이고; 에를로티닙의 경우에 1 μM 내지 0.0025nM 범위이고; MOR1073의 경우에 100nm 내지 0.01nm 범위이고; 세툭시맙의 경우에 100nM 내지 0.0015nM이고; 트라스투주맙의 경우에 300nM 내지 0.046nM 범위임)을 각각의 플레이트가 2-차원 매트릭스의 각 약물의 용량 반응 곡선을 함유하도록 웰에 첨가하였다. 플레이트를 3-6일 동안 다시 인큐베이터에 넣은 후에 셀타이터-글로 (프로메가)를 이용하여 세포 생존율을 평가하였다. 셀타이터-글로 용액을 각각의 웰에 첨가하고, 10분 동안 부드럽게 진탕시키면서 실온에서 인큐베이션하였다. 발광의 양을 스펙트라맥스 플레이트 판독기 (몰레큘라 디바이시즈)를 이용하여 결정하였다. 각각의 조합에서 수득한 성장 억제의 정도를 계산하고, 조합 활성을 로에베(Loewe) 가산성 모델을 이용하여 강조하였다.
실시예 21: L3 .3 세포에서의 생체내 약물 조합물 연구.
췌장 L3.3 세포를 이식 시간까지 10% 열-불활성화 태아 소 혈청을 함유하는 DMEM 배지에서 배양하였다. 암컷 Foxn1 누드 마우스 (하를란 래보러토리즈)에게 FBS 무함유 DMEM 중 3 x106개 세포를 피하 이식하였다. 현탁액 중 세포를 함유하는 총 주사 부피는 100 μL였다. 세포 이식 12일 후에, 모든 군에 대해 대략 100mm3의 평균 종양 부피를 갖는 동물을 효능 연구에 등록하였다. 일반적으로, 군당 총 8마리 동물을 연구에 등록하였다. 동물이 등록 전에 비정상적인 종양 성장 특성을 나타낸다면 이들을 등록에서 제외하였다.
동물에게 연구 기간 동안 (처리 하에 14일) 20 mg/kg, 격일 스케줄로 측면 꼬리 정맥 주사를 통해 MOR10703을 정맥내 투여하였다. 에를로티닙을 단일-작용제로 또는 MOR10703과 조합하여 일일 스케줄로 50mg/kg (PO)에서 투여하였다. 종양 부피 및 T/C 값을 이전에 상세하게 기재된 바와 같이 계산하였다.
결과 및 논의
총괄적으로, 이러한 결과는 특정한 부류의 항체가 HER3의 입체형태적 에피토프의 도메인 2 및 도메인 4 내의 아미노산 잔기에 결합하고, HER3을 불활성 또는 폐쇄된 입체형태로 안정화시킨다는 것을 보여준다. 이러한 항체의 결합은 리간드-의존성 및 리간드-비의존성 신호전달을 둘 다 억제한다. 이러한 항체는 또한 HER3 리간드와 공동으로 결합할 수 있다.
(i) 친화도 결정
항체 친화도를 상기 기재된 바와 같이 용액 평형 적정 (SET)에 의해 결정하였다. 결과를 표 9에 요약하고, MOR10701에 대한 실시예 적정 곡선은 도 1에 함유된다. 데이터는 인간, 시노몰구스, 래트 및 뮤린 HER3에 단단하게 결합된 항체의 수가 확인되었음을 나타낸다.
Figure 112013023522215-pct00029
( ii ) SK - Br -3 세포 EC 50 결정
확인된 항체가 HER3 발현 세포에 결합하는 능력을 HER2 증폭된 세포주 SK-Br-3에 대한 그의 결합에 대한 EC50 값을 계산하여 결정하였다 (도 2 및 표 10 참조).
Figure 112013023522215-pct00030
( iii ) HER3 도메인 결합
항-HER3 항체의 하위세트는 ELISA 검정에서 인간 HER3가 다양한 세포외 도메인에 결합하는 그의 능력에 대해 특성화하였다. 이를 달성하기 위해, HER3의 세포외 도메인을 그의 4개의 구성적 도메인으로 분류하고, 이들 도메인의 다양한 조합을 클로닝하고, 발현시키고, 상기 기재된 바와 같이 독립적 단백질로 정제하였다. 이러한 전략을 이용하여, 하기 도메인이 가용성 단백질로서 성공적으로 생성되었다: 도메인 1 및 2 (D1-2), 도메인 2 (D2), 도메인 3 및 4 (D3-4) 및 도메인 4 (D4). 다수의 내부적으로 생성된 마우스 항-인간 HER3 항체 (8D7, 1F5 및 8P2)를 또한 양성 대조군으로 시험하여 각각의 단리된 도메인의 완전성을 입증하였다.
도 3에 나타난 바와 같이 MOR09823 및 MOR09825는 둘 다 HER3 세포외 도메인에 성공적으로 결합하는 것으로 관찰되었으나, 이들 항체를 사용한 이러한 검정에서 단리된 도메인에 대한 결합은 거의 관찰되지 않았다. 이러한 결합 패턴에 대한 여러 가능한 설명이 있다:
a) MOR09823 및 MOR09825는 도메인 경계를 가로지르는 선형 에피토프에 결합할 수 있으며, 이에 따라 결합 에피토프의 일부가 도메인이 단리된 단백질로 발현되는 경우에 손실될 것이다.
b) MOR09823 및 MOR09825는 여러 도메인을 가교시키는 비-선형 에피토프에 결합할 수 있다. 따라서, HER3의 그의 성분 단위로의 분리는 결합 부위를 파괴할 수 있다.
c) HER3의 형태/입체형태는 오직 HER3의 전장 세포외 도메인이 이러한 형태/입체형태를 채택할 수 있는 반면에 단리된 도메인은 이러한 입체형태를 완전하게 추정할 수 없도록 하는 HER3에 대한 MOR09823 및 MOR09825의 결합의 성분일 수 있다.
( vi ) 수소/중수소 교환 질량 분광측정법을 이용하는 HER3 에피토프 맵핑
HER3 에피토프를 MOR09823, MOR09824, MOR09825 및 MOR09974의 Fab 버전의 존재 또는 부재 하에 HER3 ECD의 HDX-MS 분석에 의해 추가로 조사하였다. 도 4a는 결합된 Fab의 부재 하에, 대략 69%의 HER3 ECD 서열이 적어도 하나의 펩티드에 의해 커버된다는 것을 보여준다. 커버리지 내의 갭은 이러한 영역 내의 잔기의 글리코실화 또는 시스테인 풍부 영역에서 디술피드 결합의 불충분한 환원으로 인한 것일 수 있으며, 이는 특히 도메인 2에서 명백하다. 흥미롭게는, 각각의 Fab가 개별 보호 패턴을 나타낼지라도, 강한 보호의 하나의 영역이 MOR09823, MOR09824, MOR09825 및 MOR09974에서 일관되게 관찰되었으며 (도 4b 참조), 이는 이들 밀접하게 관련된 패밀리의 항체가 동일한 방식으로 HER3에 결합한다는 것을 나타낸다. 가장 강한 보호가 도메인 2 잔기 269-286 (TFQLEPNPHTKYQYGGVC) (서열 146)에서 관찰되었으며, 이는 이 부근의 잔기가 mAb 결합에 중요할 수 있음을 나타낸다. Fab 보호된 잔기의 공개된 HER3 결정 구조에 대한 맵핑 (문헌 [Cho & Leahy, (2002) Science 297:1330-1333])은 잔기 269-286이 도메인 2 내의 기능적으로 중요한 β-헤어핀 루프 내에 및 이에 근접하여 있음을 강조한다 (도 4c 참조).
( vii ) HER3/MOR09823 결정 구조
HER3 세포외 도메인에 결합된 MOR09823 Fab 단편의 3.2Å 해상도 x선 결정 구조를 해석하여 이러한 패밀리의 관련 항체에 의해 인식되는 HER3 에피토프를 추가로 정의하였다 (도 5a 참조). 또한, 인간 HER3에 결합된 MOR09825 Fab 단편의 3.4Å 구조를 해석하였다. MOR09823/HER3 및 MOR09825/HER3 결정 구조 둘 다에서, HER3은 구속 (불활성) 입체형태이다 (도 5a, b, c 및 d 참조). 이러한 입체형태는 도메인 2에서 β-헤어핀 이량체화 루프에 의해 매개되는 도메인 2 및 4 사이의 유의한 상호작용 인터페이스를 특징으로 한다. HER3의 관찰된 입체형태는 뉴레귤린의 부재 하의 HER3 세포외 도메인의 결정 구조를 공개한 초(Cho) 등 (문헌 [Cho & Leahy, (2002), Science 297:1330-1333])이 이전에 기재한 바와 유사하다. 뉴레귤린이 HER3을 활성화시킬 수 있으므로, HER3의 구속 입체형태는 불활성인 것으로 가정된다. 유사한 구속 입체형태가 또한 관련 EGFR 패밀리 구성원 HER4 (문헌 [Bouyain et al., (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102:15024-15029]) 및 HER1 (문헌 [Ferguson et al., (2003) Molec. Cell 11:507-517])가 결정화된 경우에 관찰되었다.
불활성 (구속) 상태의 HER3의 도메인 1 내지 4 사이의 공간 관계는 확장 (활성) 상태의 것과 유의하게 상이하다. 이러한 발견은 둘 다 확장 (활성) 상태인 관련 EGFR 패밀리 구성원 HER2 및 리간드-결합된 HER1의 결정 구조를 기반으로 한다 (문헌 [Cho et al., (2003) Nature 421:756-760; Ogiso et al., (2002) Cell 110:775-787; Garrett et al., (2002) Cell 110:763-773)). 확장 상태에서, 도메인 2 β-헤어핀 이량체화 루프는 4와의 그의 억제 상호작용으로부터 방출되고, 이에 따라 유리되어 그의 이량체화 파트너 단백질과 상호작용한다. 따라서, 도메인 2 β-헤어핀 이량체화 루프는 구속 (불활성) 상태의 유지 및 확장 상태의 EGF 수용체 이량체화의 매개 둘 다에서 기능적으로 중요하며, 이는 세포내 키나제 도메인의 활성화로 이어진다. 이에 따라 MOR09823/HER3 및 MOR09825/HER3 결정 구조 (도 5 참조)는 MOR09823 및 MOR09825가 둘 다 HER3의 불활성 입체형태의 안정화에 의해 기능함을 제안한다.
결정 구조는 또한 MOR09823 및 MOR09825 둘 다에 의해 인식되는 HER3 에피토프가 도메인 2 및 4 둘 다로부터의 잔기를 포함하는 비-선형 에피토프라는 것을 밝혀내었다 (도 5c 및 d, 표 11, 12, 13 및 14 참조). 따라서, 밀접하게 관련된 항체의 이러한 패밀리에 의해 인식되는 HER3 에피토프는 하기와 같이 정의될 수 있다:
도메인 2: 잔기 265-277, 315
도메인 4 잔기: 571, 582-584, 596-597, 600-602, 609-615
따라서 MOR09823 또는 MOR09825에 의한 도메인 2 및 4 둘 다의 결합은 HER3의 구속 입체형태를 안정화시킬 것이며, 이에 따라 그의 신호전달 능력을 길항할 것이다.
결정 구조에서 관찰된 MOR09823/MOR09825 결합 모드는 본 발명자들의 다른 에피토프 맵핑 연구와 일치한다. 구체적으로, ELISA 도메인 결합 실험은 무손상 HER3 세포외 단백질에 대한 MOR09823 및 MOR09825의 친화도가 임의의 단리된 도메인 (예를 들어, D1, D1-D2, D3 또는 D3-D4 단편)에 대한 친화도보다 유의하게 더 크다는 것을 입증한다 (도 3 참조). 또한, 항체 인식 에피토프의 일부로서 도메인 2 β-헤어핀을 확인한 HER3 HDX-MS 데이터와 일치한다 (도 4b 참조). 최종적으로, 결정 구조는 둘 다 HER1에 대한 유추에 의해 도메인 1 및 3에 맵핑된 HER3의 리간드-결합 표면 (문헌 [Ogiso et al., (2002) Cell, 110:775-787; Garrett et al., (2002) Cell, 110:763-773])이 MOR09823 또는 MOR09825 결합에 의해 가려지지 않는다는 것을 나타낸다 (도 5b 참조). 이는 MOR09823 및 MOR09825가 MCF7 세포에 대한 뉴레귤린 결합을 차단하지 않고 (도 9 참조), HER3/MOR09823 복합체가 비아코어 연구에서 고정화된 뉴레귤린에 결합할 수 있다 (도 10 참조)는 본 발명자들의 발견과 일치한다.
Figure 112013023522215-pct00031
Figure 112013023522215-pct00032
Figure 112013023522215-pct00033
Figure 112013023522215-pct00034
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MOR09823/MOR09825 결정 구조의 육안 검사는 HER3 잔기 Lys267 및 Leu268이 다양한 항체 CDR과 다중 상호작용을 형성하였음을 강조하였으며, 이는 이들이 항체 결합에 중요할 수 있음을 제안한다. 따라서, Lys267 및/또는 Leu268을 알라닌으로 돌연변이화시키고, 발현시키고, 생성된 재조합 단백질을 항체 결합에 대한 그의 영향을 평가하기 위해 정제하였다. ELISA 결합 검정은 Lys267 또는 Leu268의 돌연변이가 HER3에 대한 MOR10703 결합이 일어나지 않도록 한다는 것을 보여주었으며 (도 5f), 이는 이들 잔기가 둘 다 HER3 에피토프의 완전한 부분임을 제안하고, 이에 따라 MOR09823/MOR09825와 HER3 사이의 제안된 상호작용을 뒷받침한다.
( viii ) 세포 신호전달의 억제
리간드 의존성 HER3 활성에 대한 항-HER3 항체의 효과를 확인하기 위해 MCF7 세포를 IgG와 인큐베이션한 후에 뉴레귤린으로 자극하였다. 예시 억제 곡선을 도 6a에 도시하고, 표 15에 요약하였다. HER2-매개 HER3 활성화에 대한 항-HER3 항체의 효과를 또한 HER2 증폭된 세포주 SK-Br-3을 이용하여 연구하였다 (도 6b 및 표 15).
Figure 112013023522215-pct00037
HER3 활성의 억제가 하류 세포 신호전달 Akt에 영향을 미치는지 여부를 결정하기 위해, 또한 항-HER3 항체로 처리한 후에 HER2 증폭된 세포에서 인산화를 측정하였다 (도 7 및 표 16 참조).
Figure 112013023522215-pct00038
요약하여 MOR09823, MOR09824, MOR09825, MOR09974, MOR10701, MOR10702 MOR10703, MOR12609 및 MOR12610은 각각 리간드-의존성 및 리간드-비의존성 방식 둘 다로 세포 HER3 활성을 억제할 수 있었다.
( ix ) 증식의 억제
MOR09823, MOR09824, MOR09825, MOR09974, MOR10701, MOR10702 및 MOR10703이 모두 HER3 활성 및 하류 신호전달을 억제하였으므로 이들을 리간드 의존성 및 비의존성 시험관내 세포 성장을 차단하는 그의 능력에 대해 시험하였다 (실시예 데이터는 도 8에 제시되고, 표 17에 요약되어 있음). 시험된 항-HER3 항체는 모두 세포 증식의 효과적인 억제제였다.
Figure 112013023522215-pct00039
(x) 리간드 차단 평가
기재된 항-HER3 항체가 리간드 결합을 차단하는 능력을 이전에 MOR09823 또는 MOR09825로 처리된 MCF7 세포에 대한 뉴레귤린의 결합을 조사함으로써 평가하였다. MOR09823 또는 MOR09825의 존재는 뉴레귤린이 MCF7 세포에 결합하는 능력에 대해 유의한 효과를 갖지 않는 반면에 실험에 사용된 양성 대조군 (Mab3481)은 뉴레귤린 결합을 크게 방해할 수 있었다 (도 9 참조). MOR09823이 도메인 2 및 4와 상호작용하는 반면에 뉴레귤린과의 HER3의 상호작용에 대한 주요 접촉점이 도메인 1 및 3 내에 주로 밀집되는 것으로 가정되므로 이러한 결과는 결정 구조와 일치한다. 뉴레귤린이 HER3의 불활성 입체형태에 결합할 수 있으므로 (문헌 [Kani et al., (2005) Biochemistry 44: 15842-15857]), MOR09823 및 MOR09825가 신호전달에 필요한 HER3 도메인 재배열을 방지하거나 또는 수용체 이량체화를 방해함으로써 기능할 수도 있다.
( xi ) 리간드 차단 평가 (생화학적)
MOR09823 및 뉴레귤린이 HER3에 공동으로 결합할 수 있는지 여부를 조사하기 위해 비아코어TM 기술을 이용하여 생화학적 검정을 확립하였다. 상호작용 분석은 비오틴 CAPture 키트 (지이 헬쓰케어)를 이용하여 비오티닐화 뉴레귤린을 비아코어TM 센서 칩 CAP (지이 헬쓰케어)의 표면 상에 포획함으로써 수행하였다. 인간 HER3-Fc을 증가하는 농도의 MOR09823, 105.5 (써모 사이언티픽) 또는 인간 IgG와 인큐베이션하여 HER3 복합체를 생성하였다. 미리형성된 HER3/항체 복합체를 참조 및 활성 표면 상에서 주사하고, HER3의 뉴레귤린과의 상호작용을 관찰하였다.
대조 IgG는 HER3/뉴레귤린 복합체 형성에 대해 효과를 갖지 않는 반면 105.5는 HER3이 뉴레귤린에 결합하는 능력을 유의하게 억제하는 것으로 관찰되었으며, 이에 따라 그의 설명은 리간드 결합 항체로 확인되었다 (도 10). 대조적으로 HER3/MOR09823 복합체는 뉴레귤린에 결합할 수 있었으며, 이는 MOR09823이 리간드 결합을 방지하지 않는다는 것을 입증한다. 흥미롭게도, RU 값의 용량-의존성 증가가 MOR09823/HER3 복합체를 주사한 경우에 특징적으로 관찰되었다. 이러한 데이터는 뉴레귤린, HER3 및 MOR09823을 함유하는 삼량체 복합체가 칩 표면 상에서 생성되었음을 나타낸다. MOR09823 결합이 HER3의 리간드 결합 부위를 가리지 않으므로 이러한 삼량체 복합체를 형성하는 능력은 HER3/MOR09823 결정 구조에 의해 예측되며, 이는 뉴레귤린 및 MOR09823의 결합이 상호 배타적이 아님을 제안한다.
또 다른 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 HER3의 도메인 2 및 도메인 4 둘 다에 결합하고, HER3 리간드, 예컨대 뉴레귤린의 공동 결합을 차단하지 않는다. 이론을 제공할 필요는 없지만, HER3의 도메인 2 및 도메인 4 둘 다에 결합하는 항체 또는 그의 단편은 HER3의 리간드 결합 부위를 차단하지 않으면서 HER3을 불활성 입체형태로 지속하는 것이 가능하다. 따라서, HER3 리간드 (예를 들어, 뉴레귤린)는 항체와 동시에 HER3에 결합할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그의 단편은 리간드 결합을 방지하지 않고 HER3의 리간드 의존성 및 비의존성 활성화를 둘 다 억제한다. 이는 하기의 이유로 유리한 것으로 여겨진다:
(i) 치료 항체는 특징적인 종양 유형이 각각의 메카니즘에 의해 유도되므로 HER3 활성화의 단일 메카니즘 (즉, 리간드 의존성 또는 리간드 비의존성)을 표적화하는 항체보다 광범위한 종양에서 임상적 유용성을 가질 것이다.
(ii) 치료 항체는 HER3 활성화의 메카니즘이 둘 다 동시에 관여하는 종양 유형에서 효능이 있을 것이다. HER3 활성화의 단일 메카니즘 (즉, 리간드 의존성 또는 리간드 비의존성)을 표적화하는 항체는 이들 종양 유형에서 효능의 거의 없거나 전혀 없을 것이다.
(iii) 리간드 결합을 방지하지 않고 HER3의 리간드 의존성 활성화를 억제하는 항체의 효능은 리간드의 농도를 증가시킴으로써 유해한 영향을 받을 가능성이 적을 것이다. 이는 HER3 리간드의 매우 높은 농도에 의해 유도된 종양 유형에서의 상승된 효능 또는 내성이 HER3 리간드의 상향조절에 의해 매개되는 경우에 감소된 약물 내성 책임으로 해석될 것이다.
(iv) 불활성 형태를 안정화시킴으로써 HER3 활성화를 억제하는 항체는 HER3 활성화의 대안적인 메카니즘에 의해 유도된 약물 내성의 가능성이 적을 것이다.
따라서, 본 발명의 항체는 기존 치료 항체가 임상적으로 비효과적인 상태를 치료하는데 사용될 수 있다.
( xii ) HER3 활성의 생체내 억제 및 종양 성장에 대한 효과
기재된 항-HER3 항체의 생체내 활성을 결정하기 위해, MOR09823을 BxPC-3 및 BT-474 종양 모델 둘 다에서 시험하였다. MOR09823은 종양 pHER3 수준의 유의한 감소에 의해 증명된 바와 같이 HER3 활성을 억제하는 것으로 입증되었다 (도 11). HER3 신호전달 하류는 BxPC-3 및 BT-474 둘 다에서 감소된 pAkt 수준에 의해 입증된 바와 유사하게 억제되었다 (도 11). HER2 유도된 BT-474 효능 연구에서, 반복된 MOR10701 처리는 종양 성장의 74% 억제를 일으킨 반면 (도 12a 참조), MOR10703은 83% 억제를 일으켰다. BxPC3 종양 성장 모델에서, MOR10701 및 MOR10703은 둘 다 리간드 유도된 종양 성장을 매우 효과적으로 억제하였다 (도 13 참조).
( xiii ) 시험관내 약물 조합물 및 세포 성장에 대한 영향.
종양 세포 성장이 다중 신호전달 경로에 의해 빈번하게 유도되기 때문에 본 발명자들은 MOR09823 또는 MOR10703의 다양한 표적화 작용제와의 조합이 세포 증식을 차단하는데 유익한지 여부에 대해 평가하였다. 선택된 표적화 작용제는 HER2 (트라스투주맙, 라파티닙) EGFR (세툭시맙, 에를로티닙), PI3K/mTOR (BEZ235), PI3K (BKM120), PIK3CA (BYL719) 및 mTOR (RAD001)을 주로 억제하였으며, 이는 이들 표적이 인간 종양에서 공통적으로 활성화되기 때문이다. 이소볼로그램 분석 (도 14 참조)은 MOR09823 및 MOR10703이 트라스투주맙, 라파티닙, 에를로티닙, 세툭시맙, BEZ235, BKM120, BYL719 및 RAD001과 상승작용적 약물 조합물을 나타내었음을 보여준다. 이러한 데이터는 HER3 신호전달의 억제가 수용체 티로신 키나제 또는 PI3K 신호전달 경로를 표적화하는 억제제에 특히 유익함을 제안한다.
( xiv ) 생체내 MOR10703 약물 조합물
HER3 억제를 시험관내에서 수용체 티로신 키나제 표적화 작용제와 조합한 이후에 본 발명자들은 생체내에서 트라스투주맙 및 에를로티닙과 조합된 MOR10701 또는 MOR10703의 영향을 평가하였다. BT-474 이종이식편에서 (도 15a 참조), MOR10701 또는 MOR10703 (20mg/kg)의 준최적 용량의 트라스투주맙 (1mg/kg)과의 조합이 종양 퇴행을 유발시키기에 충분하였다 (각각 T/C% = -50 및 -37). L3.3 췌장 이종이식편에서, MOR10703 (20mg/kg)의 일일 에를로티닙 (50mg/kg)과의 조합은 종양 정지를 유발하였다 (T/C% = 3, 도 15b 참조). 2가지 모델에서, 2가지 약물의 조합이 단독 약물보다 유의하게 더 효능이 있었으며, 이에 따라 HER3-표적화 항체의 ErbB-표적화 작용제와의 조합의 유익함에 대한 본 발명자들의 이전의 시험관내 발견을 뒷받침한다.
요약하여, 이러한 패밀리의 항체가 HER3의 불활성 입체형태를 안정화시키는 특징적인 능력은 HER3이 리간드 의존성 또는 비의존성 방식으로 활성화된 모델에서 유의한 생체내 효능을 나타낸다. 또한, 이러한 패밀리의 항체에 의한 HER3 억제가 매우 다양한 표적화 요법과 조합하여 유익한 것으로 나타났다.
참고문헌 개재
특허, 특허 출원, 논문, 교과서 등 및 이들에 인용된 참고문헌을 포함하여 본원에 인용된 모든 참고문헌은 그의 전체내용이 본원에 참고로 포함된다.
등가물
상기 기재된 명세서는 당업자가 본 발명을 실시할 수 있도록 하는데 충분하다고 여겨진다. 상기 설명 및 실시예는 본 발명의 특정의 바람직한 실시양태를 상세하게 기재하는 것이고, 본 발명자들에 의해 고려되는 최적의 방식을 기재한다. 그러나, 상기의 것을 문서에서 아무리 상세하게 나타낼 수 있을지라도, 본 발명이 다수의 방식으로 실행될 수 있고, 첨부된 특허청구범위 및 임의의 그의 등가물에 따라 본 발명이 해석되어야 함이 이해될 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Novartis AG GARNER, et al., Andrew <120> ANTIBODIES FOR EPIDERMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR 3 (HER3) <130> 54345 <160> 494 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1342 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 1 Met Arg Ala Asn Asp Ala Leu Gln Val Leu Gly Leu Leu Phe Ser Leu 1 5 10 15 Ala Arg Gly Ser Glu Val Gly Asn Ser Gln Ala Val Cys Pro Gly Thr 20 25 30 Leu Asn Gly Leu Ser Val Thr Gly Asp Ala Glu Asn Gln Tyr Gln Thr 35 40 45 Leu Tyr Lys Leu Tyr Glu Arg Cys Glu Val Val Met Gly Asn Leu Glu 50 55 60 Ile Val Leu Thr Gly His Asn Ala Asp Leu Ser Phe Leu Gln Trp Ile 65 70 75 80 Arg Glu Val Thr Gly Tyr Val Leu Val Ala Met Asn Glu Phe Ser Thr 85 90 95 Leu Pro Leu Pro Asn Leu Arg Val Val Arg Gly Thr Gln Val Tyr Asp 100 105 110 Gly Lys Phe Ala Ile Phe Val Met Leu Asn Tyr Asn Thr Asn Ser Ser 115 120 125 His Ala Leu Arg Gln Leu Arg Leu Thr Gln Leu Thr Glu Ile Leu Ser 130 135 140 Gly Gly Val Tyr Ile Glu Lys Asn Asp Lys Leu Cys His Met Asp Thr 145 150 155 160 Ile Asp Trp Arg Asp Ile 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ttaagggtcg ttttaccatt tcacgtgata attcgaaaaa caccctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgcggaagat acggccgtgt attattgcgc gcgttggggt 300 gatgagggtt ttgatatttg gggccaaggc accctggtga cggttagctc a 351 <210> 36 <211> 214 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 36 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu 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240 gaagactttg cggtttatta ttgccagcag tattcttctt ttcctactac ctttggccag 300 ggtacgaaag ttgaaattaa a 321 <210> 53 <211> 351 <212> DNA <213> Homo sapien <400> 53 caggtgcaat tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcaac cgggcggcag cctgcgtctg 60 agctgcgcgg cctccggatt tacctttagc agctatgcga tgagctgggt gcgccaagcc 120 cctgggaagg gtctcgagtg ggtgagcgct attaattctc agggtaagtc tacttattat 180 gctgattctg ttaagggtcg ttttaccatt tcacgtgata attcgaaaaa caccctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgcggaagat acggccgtgt attattgcgc gcgttggggt 300 gatgagggtt ttgatatttg gggccaaggc accctggtga cggttagctc a 351 <210> 54 <211> 214 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 54 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp 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cgggcggcag cctgcgtctg 60 agctgcgcgg cctccggatt tacctttagc agctatgcga tgagctgggt gcgccaagcc 120 cctgggaagg gtctcgagtg ggtgagcgtt attaatggtc ttggttatac tactttttat 180 gctgattctg ttaagggtcg ttttaccatt tcacgtgata attcgaaaaa caccctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgcggaagat acggccgtgt attattgcgc gcgttggggt 300 gatgagggtt ttgatatttg gggccaaggc accctggtga cggttagctc a 351 <210> 360 <211> 214 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 360 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys 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Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 478 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 478 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 479 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 479 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 480 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 480 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro 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Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 483 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 483 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Thr Gly Ala Val Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 484 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 484 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 485 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 485 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Thr Gly Ala Val Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile Trp Gly Arg Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 486 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 486 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 487 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 487 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Asn Ser Gln Gly Lys Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr His Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 488 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 488 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr 85 90 95 Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 <210> 489 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 489 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ala Ile Asn Ser Gln Gly Lys Ser Thr Tyr 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Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ala Ile Asn Ser Gln Gly Lys Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 492 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 492 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 493 <211> 34 <212> PRT <213> Homo sapien <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is a framework region of any 30 amino acids <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa is a framework region of any 14 amino acids <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> Xaa is a framework region of any 32 amino acids <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> Xaa is a framework region of any 11 amino acids <400> 493 Xaa Ser Tyr Ala Met Ser Xaa Ala Ile Asn Ser Gln Gly Lys Ser Thr 1 5 10 15 Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Xaa Trp Gly Asp Glu Gly Phe Asp 20 25 30 Ile Xaa <210> 494 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapien <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is a framework region of any 23 amino acids <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> Xaa is a framework region of any 15 amino acids <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> Xaa is a framework region of any 32 amino acids <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> Xaa is a framework region of any 10 amino acids <400> 494 Xaa Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp Leu Ala Xaa Gly Ala Ser 1 5 10 15 Ser Leu Gln Ser Xaa Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Pro Thr Thr Xaa 20 25 30

Claims (171)

  1. HER3 수용체의 입체형태적 에피토프를 인식하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편이며, 여기서 상기 입체형태적 에피토프는 서열 1의 HER3 수용체의 도메인 2 내의 아미노산 잔기 265-277 및 315, 및 도메인 4 내의 아미노산 잔기 571, 582-584, 596-597, 600-602 및 609-615를 포함하고, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 리간드-의존성 및 리간드-비의존성 신호 전달을 둘 다 차단하는 것인 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 불활성 상태의 HER3 수용체에 결합하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  3. 제1항에 있어서, HER3 수용체를 불활성 상태로 안정화시키는 것인 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  4. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 HER3 수용체에 결합할 때, HER3 수용체 상의 리간드 결합 부위에 HER3 리간드가 공동으로 결합할 수 있게 하는 것인 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  5. 제4항에 있어서, HER3 리간드가 뉴레귤린 1 (NRG), 뉴레귤린 2, 베타셀룰린, 헤파린-결합 표피 성장 인자 및 에피레귤린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  6. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 VH가 서열 1의 하기 HER3 수용체 잔기: Asn266, Lys267, Leu268, Thr269, Gln271, Glu273, Pro274, Asn275, Pro276, His277, Asn315, Asp571, Pro583, His584, Ala596, 및 Lys597에 결합하는 것인 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  7. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 VL이 서열 1의 하기 HER3 수용체 잔기: Tyr265, Lys267, Leu268, Phe270, Gly582, Pro583, Lys597, Ile600, Lys602, Glu609, Arg611, Pro612, Cys613, His614, 및 Glu615에 결합하는 것인 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  8. HER3 수용체의 입체형태적 에피토프를 인식하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편이며, 여기서 상기 입체형태적 에피토프는 서열 1의 HER3 수용체의 도메인 2 내의 아미노산 잔기 265-277 및 315, 및 도메인 4 내의 아미노산 잔기 571, 582-584, 596-597, 600-602 및 609-615를 포함하고, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 HER3 리간드의 부재 하의 HER3 수용체에 대한 결합은 HER2 및 HER3를 발현하는 세포에서 HER2-HER3 단백질 복합체의 리간드-비의존적 형성을 감소시키는 것인 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  9. 제8항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 HER3 수용체를 불활성 상태로 안정화시켜, HER3 수용체가 HER2 수용체와 이량체화되어 HER2-HER3 단백질 복합체를 형성하는데 실패하도록 하는 것인 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  10. 제9항에 있어서, HER2-HER3 단백질 복합체 형성의 실패가 신호 전달의 활성화를 방지하는 것인 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  11. HER3 수용체의 입체형태적 에피토프를 인식하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편이며, 여기서 상기 입체형태적 에피토프는 서열 1의 HER3 수용체의 도메인 2 내의 아미노산 잔기 265-277 및 315, 및 도메인 4 내의 아미노산 잔기 571, 582-584, 596-597, 600-602 및 609-615를 포함하고, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 HER3 리간드의 존재 하의 HER3 수용체에 대한 결합은 HER2 및 HER3를 발현하는 세포에서 HER2-HER3 단백질 복합체의 리간드-의존적 형성을 감소시키는 것인 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  12. 제11항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 HER3 수용체를 불활성 상태로 안정화시켜, HER3 수용체가 HER3 리간드의 존재 하에 HER2 수용체와 이량체화되어 HER2-HER3 단백질 복합체를 형성하는데 실패하도록 하는 것인 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  13. 제11항에 있어서, HER2-HER3 단백질 복합체 형성의 실패가 신호 전달의 활성화를 방지하는 것인 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  14. 제11항에 있어서, 리간드가 뉴레귤린 1 (NRG), 뉴레귤린 2, 베타셀룰린, 헤파린-결합 표피 성장 인자, 및 에피레귤린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  15. 제11항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 HER3 리간드-비의존성 인산화 검정에 의해 평가시에 HER3의 인산화를 억제하는 것인 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  16. 제15항에 있어서, HER3 리간드-비의존성 인산화 검정이 HER2 증폭된 세포를 이용하며, 여기서 HER2 증폭된 세포가 SK-Br-3 세포인 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  17. HER3 수용체의 입체형태적 에피토프를 인식하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편이며, 여기서 상기 입체형태적 에피토프는 서열 1의 HER3 수용체의 도메인 2 내의 아미노산 잔기 265-277 및 315, 및 도메인 4 내의 아미노산 잔기 571, 582-584, 596-597, 600-602 및 609-615를 포함하고, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 HER3 리간드-의존성 인산화 검정에 의해 평가시에 HER3의 인산화를 억제하는 것인 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  18. 제17항에 있어서, HER3 리간드-의존성 인산화 검정이 뉴레귤린 (NRG)의 존재 하에 자극된 MCF7 세포를 이용하는 것인 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  19. 서열 141의 VH 및 서열 140의 VL을 포함하는 항-HER3 항체와 동일한 입체형태적 에피토프에 결합하는 단리된 항-HER3 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  20. 중쇄 가변 영역 서열 2의 CDR1; 서열 3의 CDR2; 서열 4의 CDR3; 경쇄 가변 영역 서열 5의 CDR1; 서열 6의 CDR2; 및 서열 7의 CDR3;
    중쇄 가변 영역 서열 20의 CDR1; 서열 21의 CDR2; 서열 22의 CDR3; 경쇄 가변 영역 서열 23의 CDR1; 서열 24의 CDR2; 및 서열 25의 CDR3;
    중쇄 가변 영역 서열 38의 CDR1; 서열 39의 CDR2; 서열 40의 CDR3; 경쇄 가변 영역 서열 41의 CDR1; 서열 42의 CDR2; 및 서열 43의 CDR3;
    중쇄 가변 영역 서열 56의 CDR1; 서열 57의 CDR2; 서열 58의 CDR3; 경쇄 가변 영역 서열 59의 CDR1; 서열 60의 CDR2; 및 서열 61의 CDR3;
    중쇄 가변 영역 서열 74의 CDR1; 서열 75의 CDR2; 서열 76의 CDR3; 경쇄 가변 영역 서열 77의 CDR1; 서열 78의 CDR2; 및 서열 79의 CDR3;
    중쇄 가변 영역 서열 92의 CDR1; 서열 93의 CDR2; 서열 94의 CDR3; 경쇄 가변 영역 서열 95의 CDR1; 서열 96의 CDR2; 및 서열 97의 CDR3;
    중쇄 가변 영역 서열 110의 CDR1; 서열 111의 CDR2; 서열 112의 CDR3; 경쇄 가변 영역 서열 113의 CDR1; 서열 114의 CDR2; 및 서열 115의 CDR3;
    중쇄 가변 영역 서열 128의 CDR1; 서열 129의 CDR2; 서열 130의 CDR3; 경쇄 가변 영역 서열 131의 CDR1; 서열 132의 CDR2; 및 서열 133의 CDR3;
    중쇄 가변 영역 서열 146의 CDR1; 서열 147의 CDR2; 서열 148의 CDR3; 경쇄 가변 영역 서열 149의 CDR1; 서열 150의 CDR2; 및 서열 151의 CDR3;
    중쇄 가변 영역 서열 164의 CDR1; 서열 165의 CDR2; 서열 166의 CDR3; 경쇄 가변 영역 서열 167의 CDR1; 서열 168의 CDR2; 및 서열 169의 CDR3;
    중쇄 가변 영역 서열 182의 CDR1; 서열 183의 CDR2; 서열 184의 CDR3; 경쇄 가변 영역 서열 185의 CDR1; 서열 186의 CDR2; 및 서열 187의 CDR3;
    중쇄 가변 영역 서열 200의 CDR1; 서열 201의 CDR2; 서열 202의 CDR3; 경쇄 가변 영역 서열 203의 CDR1; 서열 204의 CDR2; 및 서열 205의 CDR3;
    중쇄 가변 영역 서열 218의 CDR1; 서열 219의 CDR2; 서열 220의 CDR3; 경쇄 가변 영역 서열 221의 CDR1; 서열 222의 CDR2; 및 서열 223의 CDR3;
    중쇄 가변 영역 서열 236의 CDR1; 서열 237의 CDR2; 서열 238의 CDR3; 경쇄 가변 영역 서열 239의 CDR1; 서열 240의 CDR2; 및 서열 241의 CDR3;
    중쇄 가변 영역 서열 254의 CDR1; 서열 255의 CDR2; 서열 256의 CDR3; 경쇄 가변 영역 서열 257의 CDR1; 서열 258의 CDR2; 및 서열 259의 CDR3;
    중쇄 가변 영역 서열 272의 CDR1; 서열 273의 CDR2; 서열 274의 CDR3; 경쇄 가변 영역 서열 275의 CDR1; 서열 276의 CDR2; 및 서열 277의 CDR3;
    중쇄 가변 영역 서열 290의 CDR1; 서열 291의 CDR2; 서열 292의 CDR3; 경쇄 가변 영역 서열 293의 CDR1; 서열 294의 CDR2; 및 서열 295의 CDR3;
    중쇄 가변 영역 서열 308의 CDR1; 서열 309의 CDR2; 서열 310의 CDR3; 경쇄 가변 영역 서열 311의 CDR1; 서열 312의 CDR2; 및 서열 313의 CDR3;
    중쇄 가변 영역 서열 326의 CDR1; 서열 327의 CDR2; 서열 328의 CDR3; 경쇄 가변 영역 서열 329의 CDR1; 서열 330의 CDR2; 및 서열 331의 CDR3;
    중쇄 가변 영역 서열 344의 CDR1; 서열 345의 CDR2; 서열 346의 CDR3; 경쇄 가변 영역 서열 347의 CDR1; 서열 348의 CDR2; 및 서열 349의 CDR3; 및
    중쇄 가변 영역 서열 362의 CDR1; 서열 363의 CDR2; 서열 364의 CDR3; 경쇄 가변 영역 서열 365의 CDR1; 서열 366의 CDR2; 및 서열 367의 CDR3
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는, HER3 수용체에 대한 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  21. 중쇄 가변 영역 서열 128의 CDR1; 서열 129의 CDR2; 서열 130의 CDR3; 경쇄 가변 영역 서열 131의 CDR1; 서열 132의 CDR2; 및 서열 133의 CDR3을 포함하는, HER3 수용체에 대한 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  22. 서열 15를 포함하는 VH 및 서열 14를 포함하는 VL;
    서열 33을 포함하는 VH 및 서열 32를 포함하는 VL;
    서열 51을 포함하는 VH 및 서열 50을 포함하는 VL;
    서열 69를 포함하는 VH 및 서열 68을 포함하는 VL;
    서열 87을 포함하는 VH 및 서열 86을 포함하는 VL;
    서열 105를 포함하는 VH 및 서열 104를 포함하는 VL;
    서열 123을 포함하는 VH 및 서열 122를 포함하는 VL;
    서열 141을 포함하는 VH 및 서열 140을 포함하는 VL;
    서열 159를 포함하는 VH 및 서열 158을 포함하는 VL;
    서열 177을 포함하는 VH 및 서열 176을 포함하는 VL;
    서열 195를 포함하는 VH 및 서열 194를 포함하는 VL;
    서열 213을 포함하는 VH 및 서열 212를 포함하는 VL;
    서열 231을 포함하는 VH 및 서열 230을 포함하는 VL;
    서열 249를 포함하는 VH 및 서열 248을 포함하는 VL;
    서열 267을 포함하는 VH 및 서열 266을 포함하는 VL;
    서열 285를 포함하는 VH 및 서열 284를 포함하는 VL;
    서열 303을 포함하는 VH 및 서열 302를 포함하는 VL;
    서열 321을 포함하는 VH 및 서열 320을 포함하는 VL;
    서열 339를 포함하는 VH 및 서열 338을 포함하는 VL;
    서열 357을 포함하는 VH 및 서열 356을 포함하는 VL; 및
    서열 375를 포함하는 VH 및 서열 374를 포함하는 VL
    로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는, HER3 수용체에 대한 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  23. 서열 141을 포함하는 VH 및 서열 140을 포함하는 VL을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  24. 서열 493을 갖는 가변 중쇄 서열 및 서열 494를 갖는 가변 경쇄 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, Fab, F(ab2)', 및 scFv로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단리된 항원 결합 단편.
  26. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는, 암 치료용 제약 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 추가의 치료제를 추가로 포함하는 제약 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 추가의 치료제가 마투주맙 (EMD72000), 에르비툭스(Erbitux)®/세툭시맙, 벡티빅스(Vectibix)®/파니투무맙, mAb 806, 니모투주맙, 이레사(Iressa)®/게피티닙, CI-1033 (PD183805), 라파티닙 (GW-572016), 타이커브(Tykerb)®/라파티닙 디토실레이트, 타르세바(Tarceva)®/에를로티닙 HCL (OSI-774), PKI-166 및 토보크(Tovok)®로 이루어진 군으로부터 선택된 HER1 억제제; 페르투주맙, 트라스투주맙, MM-111, 네라티닙, 라파티닙 또는 라파티닙 디토실레이트/타이커브®로 이루어진 군으로부터 선택된 HER2 억제제; MM-121, MM-111, IB4C3, 2DID12 (U3 파마 아게(U3 Pharma AG)), AMG888 (암젠(Amgen)), AV-203 (아베오(Aveo)), MEHD7945A (제넨테크(Genentech)) 및 HER3을 억제하는 소분자로 이루어진 군으로부터 선택된 HER3 억제제; 또는 HER4 억제제인 제약 조성물.
  29. 제27항에 있어서, 추가의 치료제가 HER2 억제제인 제약 조성물.
  30. 제29항에 있어서, 추가의 치료제가 페르투주맙, 트라스투주맙, MM-111, 네라티닙, 라파티닙 또는 라파티닙 디토실레이트로 이루어진 군으로부터 선택된 HER2 억제제인 제약 조성물.
  31. 제27항에 있어서, 추가의 치료제가 템시롤리무스, 리다포롤리무스 및 에베롤리무스로 이루어진 군으로부터 선택된 mTOR 억제제인 제약 조성물.
  32. 제27항에 있어서, 추가의 치료제가 GDC 0941, BEZ235, BMK120 및 BYL719로 이루어진 군으로부터 선택된 PI3 키나제 억제제인 제약 조성물.
  33. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는, 유방암, 결장직장암, 폐암, 다발성 골수종, 난소암, 간암, 위암, 췌장암, 전립선암, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 골육종, 편평 세포 암종, 말초 신경초 종양, 슈반세포종, 두경부암, 방광암, 식도암, 교모세포종, 연부 조직의 투명 세포 육종, 악성 중피종, 신경섬유종증, 신암 및 흑색종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 HER3 리간드-의존성 신호 전달 또는 리간드-비의존성 신호 전달 경로에 의해 매개되는 암을 치료하기 위한 제약 조성물.
  34. 서열 141의 VH 및 서열 140의 VL을 갖는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는, 암 치료용 제약 조성물.
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