CN103002912A - 针对ErbB3的胞外结构域的抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一类新型的结合ErbB3受体的胞外结构域并抑制各种ErbB3功能的抗体及其抗原结合片段。例如，此处所述的抗体和抗原结合片段能够结合命名为ErbB3的受体并抑制EGF样配体介导的受体磷酸化。这些抗体及其抗原结合片段具有抑制表达ErbB3的癌细胞增殖的有用特征。

Description

针对ErbB3的胞外结构域的抗体及其用途
背景技术
多肽生长因子受体的ErbB/HER亚族包括表皮生长因子(EGF)受体(EGFR、ErbB1/HER1)、neu致癌基因产物(ErbB2/HER2)及最近确认的ErbB3/HER3和ErbB4/HER4受体蛋白质(参见，例如Hynes等人(1994)Biochim.Biophys.Acta.Rev.Cancer 1198，165-184)。据推测，这些受体中的各种都由胞外结构域(细胞外配体结合结构域)、跨膜结构域、胞质蛋白酪氨酸激酶(PTK)结构域和C末端磷酸化结构域组成(参见，例如Kim等人，(1998)Biochem.J.334，189-195)。ErbB受体的胞外结构域的特征还在于被分为四个结构域(I-IV)。ErbB胞外结构域的I和III结构域参与配体结合(参见，例如Hynes等人(2005)NatureRev.Cancer 5，341-354)。这些受体的配体包括神经调节素(HRG)和β细胞素(BTC)。
体外实验表明，与其它ErbB/HER家族成员相比，ErbB3受体(ErbB3)蛋白质的蛋白酪氨酸激酶活性显著降低，且这种降低部分地由于在ErbB3的预计细胞内催化结构域中发生的非保守氨基酸置换(参见，例如Guy等人(1994)Proc.Natl.Acad Sci.USA.91，8132-8136；Sierke等人(1997)Biochem.J.322，757-763)。但是，ErbB3蛋白质表现出在多种细胞环境中被磷酸化。例如，在过量表达该蛋白质的人乳腺癌细胞系的亚群中，ErbB3在酪氨酸残基上被组成型磷酸化(参见，例如Kraus等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.90，2900-2904；和Kim等人，同上；还参见Schaefer等人(2006)Neoplasia 8(7)：613-22和Schaefer等人Cancer Res(2004)64(10)：3395-405)。
尽管人们一直在研究ErbB3在癌症中的作用(参见，例如Horst等人(2005)115，519-527；Xue等人(2006)Cancer Res.66，1418-1426)，但是在很大程度上ErbB3作为临床干预的靶点仍未受到重视。目前的免疫治疗主要集中于抑制ErbB2的作用，且特别是ErbB2/ErbB3复合物的异二聚化(参见，例如Sliwkowski等人(1994)J.Biol.Chem.269(20)：14661-14665(1994))。因此，本发明的目的在于提供有效抑制ErbB3信号传导的改进的免疫治疗并可用于治疗和诊断多种癌症。
发明内容
在某些方面，本发明提供了一类与ErbB3受体相结合并抑制各种ErbB3功能的新型抗体(例如，单克隆抗体)。例如，此处所描述的抗体能够与ErbB3结合并抑制EGF样配体介导的受体磷酸化。如此处所描述的，EGF样配体包括EGF、TGF-α、β细胞素(betacellulin)、肝素结合性表皮生长因子、biregulin和双神经调节素，其与EGFR结合并诱导EGFR和ErbB3的二聚化。这种二聚化随之引起ErbB3的磷酸化，并通过该受体激活信号传导。因此，本发明的抗体可用于治疗和诊断与ErbB3介导的细胞信号传导相关的多种癌症。因此，在一个实施方案中，本发明提供了与ErbB3相结合并抑制EGF样配体介导的ErbB3磷酸化的抗体(包括其抗原结合部分)。
在另一个实施方案中，抗体及其片段进一步具有下述一种或多种特性：(i)抑制ErbB3配体介导的信号传导，包括通过ErbB3配体(例如神经调节素、表皮调节素、epigen和biregulin)与ErbB3的结合介导的信号传导；(ii)抑制表达ErbB3的细胞的增殖；(iii)降低细胞表面上的ErbB3水平(例如通过诱导ErbB3的内在化)的能力；(iv)抑制表达ErbB3的细胞的VEGF(血管内皮生长因子)分泌；(v)抑制表达ErbB3的细胞的迁移；(vi)抑制表达ErbB3的细胞的球状体生长；和(vii)与位于胞外结构域(细胞外结构域)结构域I(对应于成熟ErbB3(SEQ ID NO：73)的氨基酸残基1至约190)上的表位相结合，例如与包含或跨过SEQ ID NO：73的残基1-183的任何部分的表位相结合，更具体地与包含或跨过SEQ ID NO：73的残基93-104或92-129的表位相结合，甚至更具体地与包含SEQ ID NO：73的残基92、93、99、101、102、104和129或SEQ ID NO：73的残基93、101、102和104的表位相结合。
在优选实施方案中，抗体与包含或跨过SEQ ID NO：73的残基93-104或92-129的表位相结合，甚至更优选地与包含或跨过SEQ IDNO：73的残基92、93、99、101、102、104和129或SEQ ID NO：73残基93、101、102和104的表位相结合，其中附带条件为抗体不是：(i)此处公开的Ab#6；(ii)包含分别如SEQ ID NO：1和2所示的VH和VL序列的抗体；或(iii)包含分别如SEQ ID NO：7、8和9所示的VHCDR1、CDR2和CDR3序列以及分别如SEQ ID NO：10、11和12所示的VL CDR1、CDR2和CDR3序列的抗体。
在另一优选实施方案中，抗体与包含或跨过SEQ ID NO：73的残基93-104或92-129的表位相结合，甚至更具体地与包含SEQ ID NO：73的残基92、93、99、101、102、104和129或SEQ ID NO：73的残基93、101、102和104的表位相结合，其中附带条件为抗体不是：(i)此处公开的Ab #6；(ii)包含分别如SEQ ID NO：1和2所示的VH和VL序列的抗体；(iii)包含分别如SEQ ID NO：7、8和9所示的VHCDR1、CDR2和CDR3序列以及分别如SEQ ID NO：10、11和12所示的VL CDR1、CDR2和CDR3序列的抗体；(iv)此处公开的Ab #3；(v)包含分别如SEQ ID NO：3和4所示的VH和VL序列的抗体；(vi)包含分别如SEQ ID NO：13、14和15所示的VH CDR1、CDR2和CDR3序列以及分别如SEQ ID NO：16、17和18所示的VL CDR1、CDR2和CDR3序列的抗体；(vii)此处公开的Ab#17；(viii)包含分别如SEQID NO：35和36所示的VH和VL序列的抗体；(ix)包含分别如SEQ IDNO：39、40和41所示的VH CDR1、CDR2和CDR3序列以及分别如SEQ ID NO：42、43和44所示的VL CDR1、CDR2和CDR3序列的抗体；(x)此处公开的Ab #19；(xi)包含分别如SEQ ID NO：37和38所示的VH和VL序列的抗体；(xii)包含分别如SEQ ID NO：45、46和47所示的VH CDR1、CDR2和CDR3序列以及分别如SEQ ID NO：48、49和50所示的VLCDR1、CDR2和CDR3序列的抗体。
通过表面等离子共振分析或细胞结合分析进行测量此处公开的优选的抗体及其抗原结合部分的KD为50nM或更低。
在进一步的实施方案中，本发明的特定的抗体及其抗原结合部分包含重链可变区(VH)，该重链可变区包含与SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：37所示的重链可变区氨基酸序列至少80％(例如85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的氨基酸序列。本发明其它特定的抗体及其抗原结合部分包含轻链可变区(VL)，该轻链可变区包含与SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：38所示的轻链可变区氨基酸序列至少80％(例如85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的氨基酸序列。抗体还可以包含上述重链和轻链可变区两者。
抗体或其抗原结合部分的重链和轻链可变区通常包含一个或多个互补性决定区(CDR)。它们包含一个或多个CDR1、CDR2和CDR3区域。因此，本公开的其它特定的抗体及其抗原结合部分包含一个或多个选自包含SEQ ID NO：7的重链可变区CDR1、包含SEQ ID NO：8的重链可变区CDR2、包含SEQ ID NO：9的重链可变区CDR3、包含SEQ ID NO：10的轻链可变区CDR1、包含SEQ ID NO：11的轻链可变区CDR2、包含SEQ ID NO：12的轻链可变区CDR3及其组合的CDR序列。
本公开的再其它的特定抗体及其抗原结合部分包含一个或多个选自包含SEQ ID NO：13的重链可变区CDR1、包含SEQ ID NO：14的重链可变区CDR2、包含SEQ ID NO：15的重链可变区CDR3、包含SEQ ID NO：16的轻链可变区CDR1、包含SEQ ID NO：17的轻链可变区CDR2、包含SEQ ID NO：18的轻链可变区CDR3及其组合的CDR序列。
本公开的再其它的特定抗体及其抗原结合部分包含一个或多个选自包含SEQ ID NO：19的重链可变区CDR1、包含SEQ ID NO：20的重链可变区CDR2、包含SEQ ID NO：21的重链可变区CDR3、包含SEQ ID NO：22的轻链可变区CDR1、包含SEQ ID NO：23的轻链可变区CDR2、包含SEQ ID NO：24的轻链可变区CDR3及其组合的CDR序列。
本公开的再其它的特定抗体及其抗原结合部分包含一个或多个选自包含SEQ ID NO：39的重链可变区CDR1、包含SEQ ID NO：40的重链可变区CDR2、包含SEQ ID NO：41的重链可变区CDR3、包含SEQ ID NO：42的轻链可变区CDR1、包含SEQ ID NO：43的轻链可变区CDR2、包含SEQ ID NO：44的轻链可变区CDR3及其组合的CDR序列。
本公开的再其它的特定抗体及其抗原结合部分包含一个或多个选自包含SEQ ID NO：45的重链可变区CDR1、包含SEQ ID NO：46的重链可变区CDR2、包含SEQ ID NO：47的重链可变区CDR3、包含SEQ ID NO：48的轻链可变区CDR1、包含SEQ ID NO：49的轻链可变区CDR2、包含SEQ ID NO：50的轻链可变区CDR3及其组合的CDR序列。
抗体及其抗原结合部分还可以包含一个或多个与上述任何CDR或CDR的组合至少80％(例如85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的CDR。
在一个实施方案中，抗体及其抗体部分完全来自人体(即包括人CDR和框架序列)。本公开的特定的人抗体包括具有源自人VH3种系基因的重链可变区和/或源自人VL2种系基因的轻链可变区的抗体。
本发明还包括与此处所描述的任何抗体或其部分所结合的表位相同或重叠的表位(例如位于ErbB3的胞外结构域的结构域I的表位)结合的抗体及其抗原结合部分，例如所述表位包含或跨过成熟ErbB3ErbB3(SEQ ID NO：73)的氨基酸序列的任何残基1-183的表位，更优选地包含或跨过SEQ ID NO：73的残基93-104或92-129的表位，甚至更优选地包含SEQ ID NO：73的残基92、93、99、101、102、104和129或SEQ ID NO：73的残基93、101、102和104的表位)。本发明还包括与此处所描述的抗体具有相同表位结合活性的抗体(例如具有与Ab#6相同的序列或包含SEQ ID NO：73的残基93-104的结合抗原的抗体)。
本发明还包含与人ErbB3的胞外结构域结合的抗体及其抗原结合部分，且其包含：
包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区；及包含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，其中：
重链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列包含分别如SEQ ID NO：60或75(CDR1)、61(CDR2)和62(CDR3)所示的共有重链CDR1、CDR2和CDR3序列，和
轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列包含分别如SEQ ID NO：66或77(CDR1)、67(CDR2)和68或79(CDR3)所示的共有轻链CDR1、CDR2和CDR3序列，其中附带条件为抗体不是(i)此处公开的Ab#6；(ii)包含分别如SEQ ID NO：1和2所示的VH和VL序列的抗体；或(iii)包含分别如SEQ ID NO：7、8和9所示的VH CDR1、CDR2和CDR3序列以及分别如SEQ ID NO：10、11和12所示的VL CDR1、CDR2和CDR3序列的抗体。
在优选实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分与包含SEQID NO：73的残基92-129或93-104的人ErbB3的胞外结构域的结构域I内的表位结合。甚至更优选地，分离的抗体或其抗原结合部分与包含SEQ ID NO：73的残基92-129或93-104的人ErbB3的胞外结构域的结构域I内的表位结合且抑制表达ErbB3的癌细胞的增殖。优选地，癌细胞是MALME-3M黑素瘤细胞、AdrR(ADRr)卵巢腺癌细胞或ACHN肾癌细胞且相对于对照(匹配的未经处理的细胞)增殖降低了至少10％。
在与人ErbB3的胞外结构域的结构域I结合的分离的抗体或其抗原结合部分的另一实施方案中，当选自SEQ ID NO：73的残基93(天冬酰胺)、残基99(苯丙氨酸)、残基101(甲硫氨酸)、残基102(亮氨酸)和残基104(酪氨酸)的人ErbB3的胞外结构域的结构域I的任何一个氨基酸残基被丙氨酸置换，或SEQ ID NO：73的残基92(酪氨酸)或129(酪氨酸)被苯丙氨酸置换以产生具有单个氨基酸置换的成熟ErbB3时，相较于抗体或其抗原结合部分与包含SEQ ID NO：73(或其对应片段)的未改变的氨基酸序列的人ErbB3的结合，抗体或其抗原结合部分与成熟ErbB3(或其片段)的结合显著下降。优选地，结合的显著下降是结合的KD值至少10倍的变化。
本发明还包括与人ErbB3的胞外结构域的结构域I结合的抗体或其抗原结合部分，且其包含：
包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区；及包含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，其中：
重链可变区互补位包含分别如SEQ ID NO：63或76(CDR1)、64(CDR2)和65(CDR3)所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，和
轻链可变区互补位包含分别如SEQ ID NO：69或78(CDR1)、70(CDR2)和71或80(CDR3)所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，其中附带条件为抗体不是(i)此处公开的Ab#6；(ii)包含分别如SEQ IDNO：1和2所示的VH和VL序列的抗体；或(iii)包含分别如SEQ ID NO：7、8和9所示的VH CDR1、CDR2和CDR3序列以及分别如SEQ IDNO：10、11和12所示的VL CDR1、CDR2和CDR3序列的抗体。
本发明还包括与人ErbB3的胞外结构域的结构域I特异性结合的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含：
包含SEQ ID NO：7或其保守氨基酸置换的重链可变区CDR1；
包含SEQ ID NO：8或其保守氨基酸置换的重链可变区CDR2；
包含SEQ ID NO：9或其保守氨基酸置换的重链可变区CDR3；
包含SEQ ID NO：10或其保守氨基酸置换的轻链可变区CDR1；
包含SEQ ID NO：11或其保守氨基酸置换的轻链可变区CDR2；及
包含SEQ ID NO：12或其保守氨基酸置换的轻链可变区CDR3，
其中抗体或其抗原结合部分与ErbB3的结合显示出通过表面等离子共振分析或细胞结合分析所测量的50nM或更高的KD。
本发明的抗体包括抗体以及其它具有抗体样性质的蛋白质支架(scaffold)的所有已知形式。例如，抗体可以是人抗体、人源化抗体、双特异性抗体、嵌合抗体或具有抗体样性质的蛋白质支架，例如，纤连蛋白或锚蛋白重复序列。抗体还可以是Fab、Fab′2、ScFv、SMIP、亲和体(affibody)、纳米抗体(nanobody)或域抗体(domainantibody)。抗体还可以具有下述任何的同种型：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD和IgE。
在又另一个实施方案中，本发明还提供了包含此处所描述的抗体或抗原结合部分的组合、并与可接受的载体和/或辅料一起配制的组合物。在特定的实施方案中，组合物包含两种或更多种与ErbB3上不同的表位结合的抗体或与不结合ErbB3的抗癌抗体组合的此处所描述的抗体。
在再另一个实施方案中，本发明提供了编码此处所描述的抗体及其抗原结合部分的分离的核酸。在特定的实施方案中，该核酸编码重链可变区，其包含与SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：37至少80％(例如85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)相同或在高严格条件下与SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：37杂交的核苷酸序列；或编码轻链可变区，其包含与SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：38至少80％(例如85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)相同或在高严格条件下与SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：38杂交的核苷酸序列；或这些重链和轻链可变区的组合。
本发明进一步提供了表达和/或产生此处所描述的抗体及抗原结合部分的非人类转基因哺乳动物、杂交瘤和转基因植物。
本发明还提供了包含一种或多种此处所描述的分离的抗体或其抗原结合部分及任选的用于治疗或诊断与ErbB3依赖性信号传导相关的疾病(例如癌症)的说明的试剂盒。
此处公开的抗体及其抗原结合部分可被用于广泛的治疗和诊断应用中，特别是用于癌症应用中。因此，本发明的另一方面提供了通过施用足以抑制EGF样介导的ErbB3磷酸化的量的一种或多种此处所描述的抗体或其抗原结合部分来抑制受试者中EGF样配体介导的ErbB3磷酸化的方法。本发明进一步提供了通过施用足以治疗癌症的量的一种或多种此处所描述的抗体或其抗原结合部分来治疗受试者中多种癌症的方法，癌症包括但不局限于黑素瘤、乳腺癌、卵巢癌、肾癌、胃肠癌/结肠癌、肺癌、透明细胞肉瘤和前列腺癌。在一个实施方案中，癌症包括包含KRAS突变的细胞。示例性的KRAS突变是人KRAS基因的密码子12和密码子13中的任一个或两者。通常各自编码甘氨酸的密码子12和密码子13的突变(包括将野生型甘氨酸12或甘氨酸13变为甘氨酸、精氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸或缬氨酸)为促进肿瘤生成的活化KRAS突变，如在人KRAS基因的密码子15、20、61和146中的突变。在另一实施方案中，癌症包括包含PI3K(磷脂酰肌醇3-激酶)突变的细胞。示例性的PI3K突变为人PIK3CA基因中外显子9或外显子20中的任一个或两者中的活化突变。抗体或其抗原结合部分可以单独施用，也可以与其它治疗剂(例如抗癌剂，比如其它抗体、化学治疗剂和/或辐射)联合施用。媒介物
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合部分与第二试剂组合施用，第二试剂选自蛋白质合成抑制剂、生长抑素类似物、免疫治疗剂和酶抑制剂。在其它实施方案中，第二试剂选自靶向IGF1R的小分子、靶向EGFR的小分子、靶向ErbB2的小分子、靶向cMET的小分子、抗代谢物、烷化剂、拓扑异构酶抑制剂、微管靶向剂、激酶抑制剂、激素疗法、糖皮质激素、芳香酶抑制剂、mTOR抑制剂、化学治疗剂、蛋白激酶B抑制剂、磷脂酰肌醇3-激酶、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂和MEK抑制剂。组合疗法中用作第二试剂的示例性抗体包括抗-Her2抗体，例如曲妥珠单抗和抗-EGFR抗体，例如帕尼单抗(panitumumab)或西妥昔单抗(cetuximab)。组合疗法中用作第二试剂的某些优选的抗癌剂包括埃罗替尼、拉帕替尼、紫杉醇和顺铂。
在又其它实施方案中，本发明提供了用于诊断和预测ErbB3相关疾病(例如癌症)的方法。在一个实施方案中，这是通过将本公开的抗体或抗原结合部分与来自受试者的细胞相接触(例如体外或体内)、并测量与细胞上ErbB3结合的水平实现的，其中异常高的ErbB3结合水平显示受试者患有与ErbB3相关的癌症。
本发明的其它特征和优势将会在下述的具体说明和权利要求书中体现出来。
附图简述
图1A和1B为柱状图，描述了使用山羊抗人Alexa 647第二抗体(GAHu-Alexa 674)的各种抗ErbB3候选抗体与MALME-3M黑素瘤细胞上表达的ErbB3的结合。在这些实验中表示为“Ab#”的抗体以Fab片段的形式使用且“GAHu-Alexa 674”表示单独用作对照的荧光染料偶联的第二抗体，而“未染色”表示在不存在第二抗体的情况下的对照。
图2A-2D为曲线图，描述了抗体与ErbB3的结合，如各种抗ErbB3候选抗体的KD值所示。图2A和2B为曲线图，分别描述了使用表面等离子共振(SPR)技术测量和式KD＝kd/ka得到的Ab #6和Ab #3的KD值。图2C和2D为曲线图，分别描述了通过细胞结合分析使用MALME-3M黑素瘤细胞测量和式Y＝Bmax*X/KD+X得到的Ab #6和Ab #3的KD值。
图3为曲线图，描述了使用ELISA得到的抗ErbB3抗体(Ab #6)与ErbB3的结合特异性。EGFR细胞外结构域、牛血清白蛋白(BSA)和TGFα用作对照。
图4为曲线图，描述了使用ELISA测量得到的抗ErbB3抗体(Ab#6)在体外降低MALME-3M黑素瘤细胞中的总ErbB3水平的能力。
图5A和5B为曲线图，描述了使用FACS分析测量得到的抗ErbB3抗体(Ab#6)下调MALME-3M细胞上的ErbB3受体的能力，如以下实施例5所述。图5A显示了使用抗体的IgG1同种型的结果。图5B显示了使用抗体的IgG2同种型的结果。
图6A-6D为曲线图，描述了使用FACS分析测量得到的抗体介导的ErbB3下调(Ab #6)的时间过程。
图7显示了药效学研究的结果。柱状图描述了注射后24小时的结果，显示针对体内异种移植物中MALME3M黑素瘤细胞中的总ErbB3水平的抗ErbB3抗体。可以看出，数据显示Ab#6下调ErbB3的能力。
图8为柱状图，描述了抗ErbB3抗体(Ab #6)在体内下调AdrR异种移植物中的ErbB3的能力。显示了AdrR异种移植物中的总ErbB3水平。
图9为曲线图，描述了抗ErbB3抗体(Ab #6)在CellTiter-
Figure BPA00001545689500121
分析中抑制MALME-3M细胞增殖的能力。
图10为曲线图，描述了抗ErbB3抗体(Ab #6)抑制AdrR细胞的细胞增殖的能力。
图11为曲线图，描述了抗ErbB3抗体(Ab #6)抑制ACHN细胞增殖的能力。
图12为柱状图，描述了抗ErbB3抗体(Ab #6)在体内抑制AdrR异种移植物中ErbB3磷酸化的能力。
图13A-13C为曲线图，描述了抗ErbB3抗体(Ab #6)抑制AdrR细胞中β细胞素、神经调节素和TGFα介导的ErbB3磷酸化的能力。
图14A-14B为曲线图，描述了抗ErbB3抗体(Ab #6IgG2同种型)抑制卵巢肿瘤细胞系OVCAR 5和OVCAR 8中ErbB3磷酸化的能力。
图15A-15C为曲线图，描述了β细胞素(BTC)结合ErbB1的能力。如图所示，β细胞素与ErbB1阴性MALME-3M细胞不结合(图15A)，而分别在10nM(图15B)和200nM(图15C)的浓度下与ErbB1阳性AdrR细胞结合。曲线图还描述了西妥昔单抗对该结合的抑制。
图16A-16D为曲线图，描述了抗ErbB3抗体(Ab #6IgG2同种型)抑制MALME-3M细胞(图16A和16B)及OVCAR8细胞(16C和16D)中神经调节素介导的信号传导的能力。图16A描述了Ab #6抑制MALME-3M细胞中神经调节素介导的ErbB3磷酸化的能力(IC50＝1.5e-8)。图16B描述了Ab #6抑制MALME-3M细胞中AKT磷酸化的能力(IC50＝1.1e-8)。图16C描述了Ab #6抑制OVCAR8细胞中神经调节素介导的ErbB3磷酸化的能力(IC50＝2.4e-8)。图16B描述了Ab #6抑制OVCAR8细胞中AKT磷酸化的能力(IC50＝6.7e-8)。
图17A-D为曲线图，描述了通过异种移植物的研究得到的抗ErbB3抗体(Ab #6)抑制(图17A)卵巢(AdrR细胞)、(图17B)前列腺(Du145细胞)、(图17C)卵巢(OVCAR8细胞)和(图17D)胰腺(Colo-357细胞)肿瘤生长的能力。
图18A和18B为曲线图，描述了使用FACS分析测量得到的Ab#6(图18A)和Ab #3的Fab(图18B)抑制神经调节素与MALME-3M细胞上的ErbB3结合的能力。
图19A描述了表皮调节素与AdrR细胞的结合，且图19B描述了Ab #6而不是ERBITUX(西妥昔单抗)抑制表皮调节素与AdrR细胞结合的能力。
图20为曲线图，描述了肝素结合性表皮生长因子(HB-EGF)与AdrR细胞结合的能力。
图21A-21C显示了抗体(Ab #6、Ab #3、Ab #14、Ab #17和Ab #19)的重链和轻链可变区的氨基酸序列。
图22A-22B显示了抗体(Ab #6、Ab #3和Ab #14)的重链和轻链可变区的核苷酸序列。
图23显示了抗体(Ab #6、Ab #17和Ab #19)轻链可变区的氨基酸序列，其回复为相应的种系氨基酸序列。实现这种回复的氨基酸残基的改变处(与图21比较)添加了下划线。
图24A和图24B为曲线图，显示了Ab #6抑制肿瘤细胞VEGF分泌的能力(参见实施例11)。图24C显示了Ab #6抑制VEGF分泌与抑制肿瘤细胞中pErbB3之间的关联。
图25为曲线图，显示了Ab #6对细胞迁移的作用(参见实施例12)。对照0μM＝单独的RPMI培养基，对照8μM＝RPMI培养基+8μMAb#6，FBS 0mM＝RPMI培养基+10％FBS，FBS 8μM＝RPMI培养基+10％FBS+8μM Ab #6。
图26A-图26C为曲线图，显示了(图26A)AdrR细胞中球状体生长的抑制、(图26B)AdrR中HRG诱导的球状体生长的抑制，和(图26C)Du145细胞中HRG诱导的球状体生长的抑制。
图27A和图27B为曲线图，显示了Ab #6对HRG(图27A)和BTC(图27B)与AdrR细胞的结合的作用。
图28为曲线图，显示了Ab #6对AdrR细胞中HGF(肝细胞生长因子)诱导的ErbB3磷酸化的作用。确定HGF的IC50为2.439e-10。
图29A和图29B显示了Ab #6对(图29A)pErbB1和pErbB3的磷酸化以及(图29B)HRG诱导的ErbB2/3复合体形成的作用。
图30为曲线图，显示了单独的Ab#6、单独的埃罗替尼或Ab #6和埃罗替尼对裸鼠中ACHN移植瘤生长的作用。数据显示300μg剂量Ab #6(单独施用时亚适量)和埃罗替尼的组合在27天后在统计学显著程度上协同地抑制肿瘤生长。
图31为曲线图，显示了单独的Ab #6、单独的紫杉醇或Ab #6和紫杉醇对裸鼠中DU145移植瘤生长的作用。数据显示27天后300μg剂量Ab #6(单独施用时亚适量)和紫杉醇的组合在统计学显著程度上协同地抑制肿瘤生长。
图32A为曲线图，显示了Ab #6单独治疗对KRAS突变A549肺癌细胞的多细胞肿瘤球状体生长的作用。用0、0.001、0.01、0.1或1μM Ab #6处理细胞7天。X轴上的“-4”对应于“0”剂量。结果显示Ab#6剂量反应对KRAS突变肿瘤球状体生长的作用。
图32B是在治疗的第1天和第7天一组未经1μM Ab #6治疗或经1μM Ab #6治疗的代表性A549球状体的照片。
图32C是曲线图，显示了Ab #6单独治疗对裸鼠中KRAS突变A549皮下异种移植瘤生长的作用。在第22天停止给予Ab #6(600μg，每3天1次)剂量。
图33A是曲线图，显示了Ab #6单独治疗、埃罗替尼单独治疗或用Ab#6与埃罗替尼组合治疗对裸鼠中KRAS突变A549皮下异种移植瘤生长的作用。
图33B是曲线图，显示了Ab#6单独治疗、紫杉醇单独治疗或用Ab #6与紫杉醇组合治疗对裸鼠中KRAS突变A549皮下异种移植瘤生长的作用。
图34A-34E显示了Ab #6和对照抗ErbB3抗体(SGP1)与表达野生型ErbB3的CHO细胞(图34A)或表达具有以下点突变D93A(图34B)、M101A(图34C)、L102A(图34D)或Y104A(图34E)之一的ErbB3的CHO细胞结合的FACS分析的结果。
图35A为曲线图，显示了Ab #6单独治疗对小鼠中PI3K突变SKOV3移植瘤生长的作用。
图35B为曲线图，显示了Ab #6单独治疗或与顺铂(CDDP)组合治疗对小鼠中PI3K突变SKOV3移植瘤生长的作用。
图36呈现了来自互补位映射实验的数据。显示了相较于Ab#6的相同突变体与蛋白A的结合，单个氨基酸突变(关于指定的突变的特征，参见实施例20、表2)对Ab #6突变体与ErbB3结合的作用。平分曲线图的对角线表示对ErbB3和蛋白A结合的作用的1∶1对应。通过将对角线向y轴下移了0.33和0.66来定位创建另外的平行线以便于将突变分组成三个类别(对结合作用大、对结合作用小及对结合无作用)。该图显示了对标准化为野生型Ab #6的突变的结合的作用。Y轴上的值是野生型Ab #6与ErbB3的结合与Ab #6突变体与ErbB3结合的比率。＜1的比率意味着与野生型Ab #6相比突变体丧失了与ErbB3的结合，而＞1意味着突变体比野生型Ab #6显示出与ErbB3更强的结合。
图37A和图37B为以下序列的示意图：Ab #6野生型重链可变区(VH)CDR1、CDR2和CDR3序列(分别为SEQ ID NO：7、8和9)，共有VH CDR1、CDR2和CDR3序列(分别为图37A的SEQ ID NO：60、61和62，及分别为图37B的SEQ ID NO：75、61和62)，VH CDR1、CDR2和CDR3互补位序列(分别为图37A的SEQ ID NO：63、64和65及图37B的SEQ ID NO：76、64、65)，Ab #6野生型轻链可变区(VL)CDR1、CDR2和CDR3序列(分别为SEQ ID NO：10、11和12)，共有VL CDR1、CDR2和CDR3序列(分别为图37A的SEQ ID NO：66、67和68及图37B的SEQ ID NO：77、67和79)以及VL CDR1、CDR2和CDR3互补位序列(分别为图37A的SEQ ID NO：69、70和71及图37B的SEQ ID NO：78、70和80)。在这些图中，使用标准单字母氨基酸缩写并且通过破折号分隔表示氨基酸的单字母来表示序列中的连续残基，而通过一个或多个破折号分隔的两个或更多个邻近的表示氨基酸的单字母的任何组表示，这样分隔的分组的邻近氨基酸中的任一个可被置换为序列中该位置处的其它氨基酸中的任一个。例如，标记法“(Xaa)7-W-T/A/G/S-L-(Xaa)7”表示如下从氨基端到羧基端连接的序列：7个非特异性氨基酸，接着是色氨酸，接着是(苏氨酸或丙氨酸或甘氨酸或丝氨酸)，接着是亮氨酸，接着是7个非特异性氨基酸。此处使用的“非特异性氨基酸”表示任何氨基酸可在命名为Xaa的每个位置处、甚至在若干这种位置处独立地出现。Xaa或命名为Xaa#(例如“(Xaa)7”)的任何组的重复不表示这些序列中一个位置处非特异性氨基酸的指定组与任何其它位置处非特异性氨基酸的指定组之间的任何对应。因此在序列“(Xaa)7-W-T/A/G/S-L-(Xaa)7”的开头和结尾处的(Xaa)7的重复不表示每个(Xaa)7的序列之间的任何对应而是每个含有7个非特异性氨基酸。
图38A-D显示了Ab #6(如所示，沿着X轴浓度降低)对AdrR细胞中配体诱导的ErbB3磷酸化(pErbB3水平；如所示，沿着Y轴浓度升高)的作用。在图38A中，配体是HRG，在图38B中，配体是BTC，在图38C中，配体是HGF，且在图38D中，配体是EGF。
图39为FACS曲线图，显示了Ab#6与ErbB3的胞外结构域的结构域I结合。
具体实施方案
为了使本发明更容易理解，首先对一些术语进行了定义。其它定义在通篇详细描述中给出。
I.定义
术语“ErbB3”、“HER3”、“ErbB3受体”和“HER3受体”在此处可互换使用，是指人ErbB3蛋白质，如美国专利No.5480968和Plowman等人，Proc.Natl.Acad Sci.USA，87：4905-4909(1990)中所述；还参见Kani等人，Biochemistry 44：15842-857(2005)，Cho和Leahy，Science 297：1330-1333(2002)。SEQ ID NO：73中显示了全长、成熟人ErbB3蛋白序列(无前导序列)。此序列对应于图4和美国专利No.5,480,968的SEQ ID NO：4中显示的序列，所述序列减去由成熟蛋白裂解的19个氨基酸的前导序列。
此处所使用的术语“EGF样配体”是指表皮生长因子受体(EGFR)的配体，包括表皮生长因子(EGF)和密切相关的蛋白质，例如转化生长因子-α(TGFα)、β细胞素(BTC)、肝素结合性表皮生长因子(HB-EGF)、biregulin(BIR)和双神经调节素(AR)，它们与细胞表面的EGRF结合并刺激受体的内在蛋白质-酪氨酸激酶活性。通常，EGF样配体诱导形成EGFR与ErbB3的蛋白质复合体(例如参见Kim等人，(1998)Biochem J.，334：189-195)，因此导致复合体中酪氨酸残基的磷酸化。
此处公开的优选抗体及其抗原结合部分抑制EGF样配体介导的ErbB3磷酸化，并在某些实施方案中，显示出一种或多种下述附加性质：(i)抑制神经调节素、表皮调节素、epigen和biregulin中的一种或多种介导的通过ErbB3的信号传导；(ii)抑制表达ErbB3的细胞的增殖；(iii)降低细胞表面ErbB3水平的能力；(iv)抑制表达ErbB3的细胞的VEGF分泌；(v)抑制表达ErbB3的细胞的迁移；(vi)抑制表达ErbB3的细胞的球状体生长；和/或(vii)与位于ErbB3的胞外结构域的结构域I上的表位特异性结合，例如与包含或跨过成熟ErbB3(SEQ ID NO：73)氨基酸序列的残基1-183的表位结合，更优选地与包含或跨过或含有或含或包括SEQ ID NO：73的残基92-129或93-104的表位结合，甚至更优选地与包含或跨过或含有或含或包括SEQ ID NO：73的残基92、93、101、102和104和129或残基93、101、102和104的表位结合。一种这样的抗体Ab#6作为MM-121目前正在进行I期临床试验。
此处所使用的术语“抑制”是指生物活性的任何统计学显著的降低，包括活性的完全阻断。例如，“抑制”可以指生物活性降低大约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
因此，此处所使用的短语“EGF样配体介导的ErbB3磷酸化的抑制”是指相对于未处理(对照)细胞中的磷酸化而言，抗体或抗原结合部分统计学显著地降低EGF样配体诱导的ErbB3磷酸化的能力。表达ErbB3的细胞可以为天然发生的细胞或细胞系，或者可以通过向宿主细胞引入编码ErbB3的核苷酸进行重组制造。在一个实施方案中，抗体或其抗原结合部分抑制EGF样配体介导的ErbB3磷酸化至少为10％、或至少为20％、或至少为30％、或至少为40％、或至少为50％、或至少为60％、或至少为70％、或至少为80％、或至少为90％或约100％，这是通过例如Kim等人，(1998)Biochem J.，334：189-195以及下文的实施例中描述的蛋白质印迹法及随后使用抗磷酸酪氨酸抗体进行探测而确定的。
此处所使用的短语“神经调节素、表皮调节素、epigen和biregulin介导的通过ErbB3的信号传导的抑制”是指相对于不存在抗体(对照)的信号传导而言，抗体或其抗原结合部分统计学显著地降低由ErbB3配体(例如神经调节素、表皮调节素、epigen和biregulin)介导的通过ErbB3的信号传导的能力。此处的ErbB3-配体也称作“神经调节素样配体”。这意味着在抗体或其抗原结合部分存在的情况下，相对于对照(没有抗体)而言，在表达ErbB3的细胞中由神经调节素、表皮调节素、epigen和biregulin中的一种或多种介导的信号统计学显著地降低。可以通过分析ErbB3底物和/或存在于涉及ErbB3的细胞级联(cascade)中的蛋白质的水平或活性来测量ErbB3-配体介导的信号。在一个实施方案中，相对于不存在抗体或其抗原结合部分时(对照)的水平或活性而言，抗体或其抗原结合部分降低ErbB3底物和/或在涉及ErbB3的细胞级联中的蛋白质的水平或活性至少为10％、或至少为20％、或至少为30％、或至少为40％、或至少为50％、或至少为60％、或至少为70％、或至少为80％、或至少为90％或100％。这样的ErbB3-配体介导的信号传导可以使用本领域公认的技术进行测量，这些技术使用用于这些蛋白质的激酶分析(参见，例如Horst等人，同上；Sudo等人(2000)Methods Enzymol，322：388-92；和Morgan等人(1990)Eur.J.Biochem.，191：761-767)测量ErbB3的底物(例如SHC或PI3K)或在涉及ErbB3的细胞级联中的蛋白质(例如AKT途径-AKT是指一组丝氨酸/苏氨酸激酶，也称为蛋白激酶B或PKB)的水平或活性。
在特定的实施方案中，抗体或其抗原结合部分通过抑制ErbB3-配体(例如神经调节素、表皮调节素、epigen或biregulin中的一种或多种)与ErbB3的结合抑制ErbB3-配体(例如神经调节素、表皮调节素、epigen或biregulin)介导的通过ErbB3的信号传导。一些配体(例如biregulin，一种人工嵌合配体：Barbacci等人，J Biol Chem 1995270(16)9585-9)既作为EGF样配体(即与EGFR/ErbB1结合)也作为ErbB3样配体(即与ErbB3结合)起作用。
此处所使用的短语“神经调节素、表皮调节素、epigen和biregulin与ErbB3结合的抑制”是指相对于不存在抗体(对照)的结合而言，抗体或抗原结合部分统计学显著地降低ErbB3配体(例如神经调节素、表皮调节素、epigen或biregulin中的一种或多种)与ErbB3结合的能力。这意味着在不存在抗体或其抗原结合部分的情况下，相对于对照(没有抗体)而言，与ErbB3结合的ErbB3-配体(例如神经调节素、表皮调节素、epigen或biregulin)的量统计学显著地降低。在存在本公开的抗体或其抗原结合部分的情况下，相对于不存在抗体或其抗原结合部分(对照)时的量而言，与ErbB3相结合的ErbB3配体的量可以降低至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％或100％。ErbB3-配体结合的降低可以使用本领域公认的技术进行测量，这些技术测量存在或不存在(对照)抗体或其抗原结合部分的情况下标记的ErbB3-配体(例如放射性标记的神经调节素、表皮调节素、epigen或biregulin)与表达ErbB3的细胞结合的水平。
此处所使用的短语“抑制表达ErbB3的细胞的增殖”是指相对于不存在抗体时的增殖而言，抗体或其抗原结合部分统计学显著地降低表达ErbB3的细胞的增殖的能力。在一个实施方案中，相对于不存在抗体或其抗原结合部分时(对照)所测量到的增殖而言，当细胞与本公开的抗体或其抗原结合部分接触时，表达ErbB3的细胞(例如癌细胞)的增殖可以降低至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％或100％。细胞增殖可以使用本领域公认的技术进行分析，这些技术测量细胞分裂的速率、细胞群体中发生细胞分裂的比例和/或在细胞群体中由于终末分化或细胞死亡而造成的细胞损失率(例如使用CellTiter-
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分析或胸苷掺入法)。
此处所使用的短语“降低细胞表面ErbB3水平的能力”是指相对于未处理(对照)细胞而言，抗体或其抗原结合部分统计学显著地降低在与抗体接触的细胞的表面上发现的ErbB3量的能力。例如，细胞表面ErbB3水平的降低有可能是由于ErbB3内在化的增加(或ErbB3内吞作用的提高)。在一个实施方案中，相对于不存在抗体或其抗原结合部分时(对照)的细胞表面表达或内在化而言，抗体或其抗原结合部分降低细胞表面ErbB3的表达至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％或100％，和/或增加ErbB3受体的内在化至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％或100％。在存在或不存在抗体或其抗原结合部分时细胞表面的ErbB3水平和/或ErbB3受体的内在化可以使用本领域公认的技术(例如Horst等人(同上)和此处的实施例中描述的技术)很容易地进行测量。
此处所使用的短语“表达ErbB3的细胞的VEGF分泌的抑制”是指相对于不存在抗体时的VEGF分泌而言，抗体或其抗原结合部分统计学显著地降低表达ErbB3的细胞的VEGF分泌的能力。在一个实施方案中，相对于在不存在抗体或其抗原结合部分时(对照)测量得到的VEGF分泌而言，当表达ErbB3的细胞(例如癌细胞)与本公开的抗体或其抗原结合部分接触时细胞的VEGF分泌可以降低至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％或100％。VEGF分泌可以使用本领域公认的技术(例如此处所描述的那些技术)进行分析。
此处所使用的短语“表达ErbB3的细胞的迁移的抑制”是指相对于不存在抗体时的细胞迁移而言，抗体或其抗原结合部分统计学显著地降低表达ErbB3的细胞的迁移的能力。在一个实施方案中，相对于不存在抗体或其抗原结合部分时(对照)所测量得到的细胞迁移而言，当表达ErbB3的细胞(例如癌细胞)与本公开的抗体或其抗原结合部分接触时细胞的迁移可以降低至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％或100％。细胞迁移可以使用本领域公认的技术(例如此处所描述的技术)进行分析。
此处所使用的短语“表达ErbB3的细胞的球状体(spheroid)生长的抑制”是指相对于不存在抗体时的细胞迁移而言，抗体或其抗原结合部分统计学显著地降低表达ErbB3的细胞的迁移的能力。在一个实施方案中，相对于不存在抗体或其抗原结合部分时(对照)所测量得到的细胞迁移，当表达ErbB3的细胞(例如癌细胞)与本公开的抗体或其抗原结合部分相接触时细胞的迁移可以降低至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％或100％。细胞迁移可以使用本领域公认的技术(例如此处所描述的技术)进行分析。
此处可互换使用的术语“抗体”或“免疫球蛋白”包括完整的抗体及其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链。“典型的抗体”包含由二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链。各重链由重链可变区(此处简称为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。各轻链由轻链可变区(此处简称为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可以进一步细分为高变区(称为互补性决定区(CDR))，夹杂着更加保守区域的区域(称为框架区(FR))。各VH和VL由三个CDR和四个FR构成，其从氨基端至羧基端的排列顺序为：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括各种免疫系统细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一成分(Clq))的结合。本公开的示例性的抗体包括抗体#1、3、6和14及其抗原结合部分。
此处所使用的术语抗体的“抗原结合部分”(或简称为“抗体部分”)是指保持与抗原(例如ErbB3)特异性结合的能力的一个或多个抗体片段。已经显示抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段完成。术语抗体的“抗原结合部分”涵盖的结合片段的例子包括(i)Fab片段，一种由VL、VH、CL和CH1结构域构成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，一种包含在铰链区由二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域构成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域构成的Fv片段；(v)包含VH和VL结构域的dAb；(vi)由VH结构域构成的dAb片段(Ward等人(1989)Nature 341，544-546)；(vii)由VH或VL结构域构成的dAb；和(viii)分离的互补性决定区(CDR)或(ix)两个或更多个分离的CDR的组合，其任选地由合成的连接体接合。此外，尽管Fv片段的两个结构域(VL和VH)由独立的基因编码，它们可使用重组方法通过合成的连接体接合，该合成连接体使它们能够成为单个蛋白链，其中VL和VH区配对以形成单价分子(也被称为单链Fv(scFv)；参见，例如Bird等人(1988)Science 242，423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，5879-5883。这样的单链抗体还意图包含在术语抗体的“抗原结合部分”之内。使用本技术领域技术人员已知的常规方法来获得这些抗体片段，并且以筛选完整抗体的相同方式来对片段的效用进行筛选。可以通过重组DNA技术或完整免疫球蛋白的酶或化学切割来产生抗原结合部分。
此处所使用的术语“单克隆抗体”是指从基本同源的抗体群获得的抗体或制备成基本同源的抗体群，即组成该抗体群的各个抗体除了少量存在的可能的天然发生的突变以外都是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂相反，各单克隆抗体通常针对抗原上的单一决定簇。可以使用任何本领域公认的技术和那些在此描述的技术(例如，如Kohler等人(1975)Nature，256：495中描述的杂交瘤方法、如Lonberg等人(1994)Nature 368(6474)：856-859中描述的转基因动物、重组DNA方法(参见，例如U.S.Pat.No.4,816,567)制备单克隆抗体或者使用例如Clackson等人，Nature，352：624-628(1991)和Marks等人J.Mol.Biol，222：581-597(1991)中描述的技术利用噬菌体抗体库制备单克隆抗体。单克隆抗体包括嵌合抗体、人抗体和人源化抗体，且可以是天然发生的或重组产生的。
术语“重组抗体”是指通过重组方式制备、表达、创建或分离的抗体，例如(a)从免疫球蛋白基因(例如人免疫球蛋白基因)的转基因或转染色体的动物(例如小鼠)中或从由该动物制备的杂交瘤中分离的抗体、(b)从进行转化以表达所述抗体的宿主细胞(例如从转染瘤)分离的抗体、(c)使用噬菌体展示从重组、组合抗体库(例如包含人抗体序列)分离的抗体，和(d)使用涉及将免疫球蛋白基因序列(例如人免疫球蛋白基因)与其它DNA序列进行剪接的任何其它方式制备、表达、创建或分离的抗体。这样的重组抗体可以具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。但是，在特定实施方案中，可以对这样的重组人抗体进行体外诱变，并因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是可能并非天然存在于体内的人抗体种系集合(repertoire)中的序列，尽管它们源自人种系VH和VL序列并与其相关。
术语“嵌合免疫球蛋白”或“嵌合抗体”是指其可变区源自第一物种而其恒定区源自第二物种的免疫球蛋白或抗体。可以例如通过基因工程由属于不同物种的免疫球蛋白基因片段构建嵌合免疫球蛋白或抗体。
此处所使用的术语“人抗体”意图包括具有可变区的抗体，其中框架和CDR区均源自人种系的免疫球蛋白序列，例如如Kabat等人(参见Kabat等人(1991)Sequences of proteins of ImmunologicalInterest，Fifth Edition，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242)所描述的。此外，如果抗体包含恒定区，该恒定区也源自人种系免疫球蛋白序列。人抗体可以包含非由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。但是，此处所使用的术语“人抗体”并不意图包括其中源自另一哺乳动物物种(例如小鼠)的CDR序列嫁接到人框架序列上的抗体。
人抗体可以包含至少一个或多个由氨基酸残基(例如非由人种系免疫球蛋白序列编码的活性增强氨基酸残基)置换的氨基酸。通常，人抗体可以包含最多达20个由不属于人种系免疫球蛋白序列的部分的氨基酸残基置换的位置。在特定的实施方案中，这些置换在CDR区域中，如下面所详细描述的。
术语“人源化免疫球蛋白”或“人源化抗体”是指包含至少一个人源化免疫球蛋白或抗体链(即至少一条人源化轻链或重链)的免疫球蛋白或抗体。术语“人源化免疫球蛋白链”或“人源化抗体链”(即“人源化免疫球蛋白轻链”或“人源化免疫球蛋白重链”)是指具有包含基本上来自人免疫球蛋白或抗体的可变框架区和基本上源自非人免疫球蛋白或抗体的互补性决定区(CDR)(例如，至少一个CDR、优选两个CDR，更优选三个CDR))和进一步包含恒定区(例如在轻链的情况下，包含至少一个恒定区或其部分，和在重链的情况下，优选包含三个恒定区)的可变区的免疫球蛋白或抗体链(即，分别为轻或重链)。术语“人源化可变区”(例如，“人源化轻链可变区”或“人源化重链可变区”)是指包括基本源自人免疫球蛋白或抗体的可变框架区和基本源自非人免疫球蛋白或抗体的互补性决定区(CDR)的可变区。
“双特异性”或“双功能性抗体”是具有两种不同的重/轻链对和两种不同的结合位点的人工杂交抗体。可以通过多种方法(包括杂交瘤的融合或Fab’片段的连接)来制备双特异性抗体。参见，例如Songsivilai & Lachmann，(1990)Clin.Exp.Immunol.79，315-321；Kostelny等人(1992)J.Immunol.148，1547-1553。在特定的实施方案中，本发明的双特异性抗体包含ErbB3和IGF1-R(即胰岛素样生长因子1-受体)的结合位点。在另一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含ErbB3和C-MET的结合位点。在其它实施方案中，双特异性抗体包含ErbB3的结合位点及ErbB2、ERbB3、ErbB4、EGFR、LewisY、MUC-1、EpCAM、CA125、前列腺特异性膜抗原、PDGFR-α、PDGFR-B、C-KIT或任何FGF受体的结合位点。
此处所使用的“异种抗体”相对于产生这种抗体的转基因非人生物体或植物进行定义。
此处所使用的“分离的抗体”是指基本上不含具有不同的抗原特异性的其它抗体的抗体(例如，特异性地与ErbB3相结合的分离的抗体基本上不含与ErbB3以外的其它抗原特异性地结合的抗体)。此外，分离的抗体通常基本上不含其它的细胞物质和/或蛋白质。在本发明的一个实施方案中，具有不同的ErbB3结合特异性的“分离的”抗体的组合是在良好定义的组合物中进行组合。
此处所使用的“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类(例如IgM或IgG1)。在一个实施方案中，抗体或其抗原结合部分是选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD或IgE抗体同种型的同种型。在某些实施方案中，抗体为IgG1同种型。在其它实施方案中，抗体为IgG2同种型。
此处所使用的“同种型转换”是指抗体的类型或同种型从一个Ig类变为其它Ig类中的一个的现象。
此处所使用的“非转换同种型”是指当未发生同种型转换时产生的重链同种型类型；编码非转换同种型的CH基因通常为紧挨着功能性重排的VDJ基因下游的第一个CH基因。同种型转换被分为典型的或非典型的同种型转换。典型的同种型转换通过编码抗体的基因中涉及至少一个转换序列区的重组事件而发生。非典型的同种型转换可以通过例如人σμ和人∑μ同源重组(δ-相关缺失)发生。替代的非典型转换机制(例如，特别是转基因间的和/或染色体间的重组)可以发生并完成同种型转换。
此处所使用的术语“转换序列”是指负责转换重组的那些DNA序列。“转换供体”序列(典型地为μ转换区)为在转换重组过程中被删除的构建体(construct)区的5‘端(即上游)。“转换受体”区是在将删除的构建区和置换恒定区(例如，γ、ε等)之间。由于没有总是发生重组的特定位点，因此最终的基因序列通常不能从构建体进行预测。
“抗原”为抗体或其抗原结合部分结合的实体(例如，蛋白质的实体或肽)。在此处公开的各种不同的实施方案中，抗原为ErbB3或ErbB3样分子。在本发明的特定的实施方案中，抗原为人ErbB3。
术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上被免疫球蛋白或抗体特异性结合的位点。表位可以由相邻氨基酸形成或通过蛋白质的三级折叠而并置的不相邻氨基酸形成。由相邻的氨基酸形成的表位在接触变性溶剂时通常仍会保留，而由三级折叠形成的表位通常在经变性溶剂处理时会丧失。表位通常包括处于独特的空间构型的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。确定表位空间构型的方法包括本领域的技术和此处所描述的技术，例如，X射线晶体学和二维核磁共振。参见，例如Epitopes Mapping Protocols in Methodsin Molecular Biology，Vol.66，G.E.Morris，Ed.(1996)。
本发明还包括结合与针对本公开的氨基酸序列的抗体具有相同或重叠的表位的抗体(即竞争结合ErbB3的抗体)或结合与此处所描述的抗体所结合的表位重叠的表位(即位于ErbB3的胞外结构域，优选地位于ErbB3的胞外结构域的结构域I)的抗体。可以使用常规技术(例如免疫分析，比如表明一种抗体阻断另一种抗体与靶抗原结合的能力，即竞争结合分析)来确认识别相同的表位的抗体。竞争结合在其中所测试的免疫球蛋白抑制基准抗体对共同抗原(例如ErbB3)的特异性结合的分析中确定。已知存在许多种竞争结合分析，例如固相直接或间接放射免疫分析(RIA)、固相直接或间接酶免疫分析(EIA)、夹心竞争分析(参见Stahli等人，(1983)Methods in Enzymology 9：242)、固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(参见Kirkland等人(1986)J.Immunol.137：3614)、固相直接标记分析、固相直接标记夹心分析(参见Harlow和Lane，(1988)Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborPress)、使用I-125标记物的固相直接标记RIA(参见Morel等人(1988)Mol.Immunol.25(1)：7)、固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(Cheung等人(1990)Virology 176：546)和直接标记RIA(Moldenhauer等人，(1990)Scand.J.Immunol.32：77)。通常，这样的分析涉及使用与携带未标记的测试免疫球蛋白和标记的基准免疫球蛋白中的任一种的固相表面或细胞相结合的纯化抗原(例如ErbB3)。通过确定在存在测试免疫球蛋白的情况下与固相表面或细胞相结合的标记物的量来测量竞争抑制。通常测试免疫球蛋白过量存在。通常，当竞争抗体过量存在时，其会抑制基准抗体与共同抗原的特异性结合至少50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％或更多。
术语“互补位”是指抗体的一部分或氨基酸残基，所述抗体似乎直接参与识别和接触与抗体特异性结合的抗原上的表位。互补位通常包含一些但不是所有的重链和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基。互补位可包含所有VH和VL CDR或仅一些CDR(例如，某些CDR可不参与结合抗原)中的氨基酸残基。例如可通过抗体(具体地CDR)中氨基酸残基的扫描诱变(例如丙氨酸扫描诱变)来定义特定抗原的互补位，认为所述互补位表面暴露(例如，通过晶体学建模确定)且可能参与抗原结合。然后评估突变体与抗原的结合可确定是否突变的氨基酸位置参与抗原结合且因而形成抗体的互补位的一部分。在实施例20中进一步详细描述了确定抗体互补位的方法。
在优选实施方案中，抗ErbB3抗体包含重链互补位，所述重链互补位包含分别如SEQ ID NO：63或76(CDR1)、64(CDR2)和65(CDR3)所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，其中附带条件为抗体不是：(i)此处公开的Ab #6；(ii)包含分别如SEQ ID NO：1和2所示的VH和VL序列的抗体；或(iii)包含分别如SEQ ID NO：7、8和9所示的VHCDR1、CDR2和CDR3序列以及分别如SEQ ID NO：10、11和12所示的VL CDR1、CDR2和CDR3序列的抗体。
在另一优选实施方案中，抗ErbB3抗体包含轻链互补位，所述轻链互补位包含分别如SEQ ID NO：69或78(CDR1)、70(CDR2)和71或80(CDR3)所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，其中附带条件为抗体不是：(i)此处公开的Ab #6；(ii)包含分别如SEQ ID NO：1和2所示的VH和VL序列的抗体；或(iii)包含分别如SEQ ID NO：7、8和9所示的VH CDR1、CDR2和CDR3序列以及分别如SEQ ID NO：10、11和12所示的VL CDR1、CDR2和CDR3序列的抗体。
在另一实施方案中，抗ErbB3抗体包含重链互补位和轻链互补位，所述重链互补位包含分别如SEQ ID NO：63、64和65所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，所述轻链互补位包含分别如SEQ ID NO：69、70和71所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，其中附带条件为抗体不是：(i)此处公开的Ab #6；(ii)包含分别如SEQ ID NO：1和2所示的VH和VL序列的抗体；或(iii)包含分别如SEQ ID NO：7、8和9所示的VH CDR1、CDR2和CDR3序列以及分别如SEQ ID NO：10、11和12所示的VL CDR1、CDR2和CDR3序列的抗体。
在另一实施方案中，抗ErbB3抗体包含重链互补位和轻链互补位，所述重链互补位包含分别如SEQ ID NO：76、64和65所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，所述轻链互补位包含分别如SEQ ID NO：78、70和80所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，其中附带条件为抗体不是：(i)此处公开的Ab #6；(ii)包含分别如SEQ ID NO：1和2所示的VH和VL序列的抗体；或(iii)包含分别如SEQ ID NO：7、8和9所示的VH CDR1、CDR2和CDR3序列以及分别如SEQ ID NO：10、11和12所示的VLCDR1、CDR2和CDR3序列的抗体。
此处关于互补决定区(CDR)使用的术语“共有序列”是指基于对于CDR中的氨基酸残基可适当修饰而不会损害抗原结合的信息所定义的CDR的复合或通用的序列。因此，在CDR的“共有序列”中，某些氨基酸的位置被该位置的一种或多种可能的氨基酸残基占用。例如，CDR中，如果发现抗原结合不受在特定位置出现酪氨酸或苯丙氨酸的影响，那么共有序列中的特定位置可以是酪氨酸或苯丙氨酸(T/F)。例如可通过抗体CDR中氨基酸残基的扫描诱变(丙氨酸扫描诱变)定义CDR的共有序列，接着通过评估突变体与抗原的结合来确定是否突变的氨基酸位置影响抗原结合。实施例20中进一步详细描述了确定抗体CDR共有序列的方法。
在优选实施方案中，抗ErbB3抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO：60或75(CDR1)、61(CDR2)和62(CDR3)所示的共有重链CDR1、CDR2和CDR3序列，其中附带条件为抗体不是(i)此处公开的Ab #6；(ii)包含分别如SEQ ID NO：1和2所示的VH和VL序列的抗体；或(iii)包含分别如SEQ ID NO：7、8和9所示的VH CDR1、CDR2和CDR3序列以及分别如SEQ ID NO：10、11和12所示的VL CDR1、CDR2和CDR3序列的抗体。
在另一优选实施方案中，抗ErbB3抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：66或77(CDR1)、67(CDR2)和68或79(CDR3)所示的共有轻链CDR1、CDR2和CDR3序列，其中附带条件为抗体不是(i)此处公开的Ab #6；(ii)包含分别如SEQ ID NO：1和2所示的VH和VL序列的抗体；或(iii)包含分别如SEQ ID NO：7、8和9所示的VH CDR1、CDR2和CDR3序列以及分别如SEQ ID NO：10、11和12所示的VL CDR1、CDR2和CDR3序列的抗体。
在另一实施方案中，抗ErbB3抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO：60、61和62所示的共有重链CDR1、CDR2和CDR3序列，所述轻链可变区包含分别如SEQID NO：66、67和68所示的共有轻链CDR1、CDR2和CDR3序列，其中附带条件为抗体不是(i)此处公开的Ab #6；(ii)包含分别如SEQ IDNO：1和2所示的VH和VL序列的抗体；或(iii)包含分别如SEQ ID NO：7、8和9所示的VH CDR1、CDR2和CDR3序列以及分别如SEQ IDNO：10、11和12所示的VL CDR1、CDR2和CDR3序列的抗体。
在另一实施方案中，抗ErbB3抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO：75、61和62所示的共有重链CDR1、CDR2和CDR3序列，所述轻链可变区包含分别如SEQID NO：77、67和79所示的共有轻链CDR1、CDR2和CDR3序列，其中附带条件为抗体不是(i)此处公开的Ab#6；(ii)包含分别如SEQ IDNO：1和2所示的VH和VL序列的抗体；或(iii)包含分别如SEQ ID NO：7、8和9所示的VH CDR1、CDR2和CDR3序列以及分别如SEQ IDNO：10、11和12所示的VL CDR1、CDR2和CDR3序列的抗体。
此处所使用的术语“特异性的结合”、“特异性结合”、“选择性的结合”和“选择性结合”是指抗体或其抗原结合部分对特定的抗原或表位表现出可感知的亲和力，且通常不表现出与其它抗原或表位的显著的交叉反应性。“可感知的”或优选的结合包括亲和力为至少106、107、108、109M-1或1010M-1的结合。大于107M-1、优选为108M-1的亲和力为更优选的。本发明的范围还包括此处所列的这些值之间的值，优选的结合亲和力可以表示为亲和力的范围，例如106至1010M-1、优选为107至1010M-1、更优选为108至1010M-1。“不表现出显著的交叉反应性”的抗体为不会与不希望的实体(例如不希望的蛋白质实体)可感知地结合的抗体。例如，在一个实施方案中，与ErbB3特异性结合的抗体或其抗原结合部分可感知地与该ErbB3分子相结合，而不会显著地与其它ErbB分子及非ErbB蛋白质或肽反应。可根据任何本领域公认的确定特异性或选择性结合的方式来确定这样的结合，包括，例如根据斯卡查德分析和/或竞争结合分析确定特异性或选择性结合。
此处所使用的术语“KD”是指特定的抗体-抗原相互作用的解离平衡常数或抗体对于抗原的亲和力，优选地使用表面等离子共振分析(使用重组ErbB3作为分析物且抗体作为配体在BIACORE 3000仪器(GE Healthcare)中测定)或细胞结合分析。以下实施例3中详述了这两种分析。在一个实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合部分与抗原(例如ErbB3)相结合的亲和力(KD)为50nM或更好(即，更小)(例如40nM或30nM或20nM或10nM或更小)。在特定的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合部分与ErbB3相结合的亲和力(KD)为8nM或更好(例如7nM、6nM、5nM、4nM、2nM、1.5nM、1.4nM、1.3nM、1nM或更小)。在其它实施方案中，抗体或其抗原结合部分与抗原(例如ErbB3)相结合的亲和力(KD)大约小于10-7M-1，例如大约小于10-8M，10-9M或10-10M或甚至更小；并且，抗体或其抗原结合部分以至少为与非特异性的抗原(例如BSA、酪蛋白)(预先确定的抗原或其密切相关的抗原以外的抗原)结合的亲和力的两倍的亲和力与预先确定的抗原相结合。
此处所使用的术语“Koff”是指抗体从抗体/抗原复合物解离的解离速率常数。
此处所使用的术语“EC50”是指在体外或体内分析中，诱导出最大响应的50％响应(即最大响应与基线的中间值)的抗体或其抗原结合部分的浓度。
如此处所使用的，“糖基化模式”定义为与蛋白质(更具体地，与免疫球蛋白蛋白质)共价结合的糖单元模式。
此处所使用的用于某一物体的术语“天然发生的”是指某一物体可以在自然界中发现的事实。例如，存在于可以从自然界的来源中分离出来且没有在实验室中经过人类进行有意改变的生物体(包括病毒)中的多肽或多核苷酸序列为天然发生的。
此处所使用的术语“重排的”是指重链或轻链免疫球蛋白基因座的构型，其中，在实质上编码完整的VH或VL结构域的构型中，V片段分别紧挨着D-J或J片段。重排的免疫球蛋白基因座可以通过与种系DNA相比较进行识别；重排的基因座将具有至少一个重组的七聚体/九聚体同源元件。
此处所使用的涉及V片段的术语“未重排的”或“种系构型”是指其中V片段未经重组以至于紧挨着D或J片段的构型。
此处所使用的术语“核酸分子”意图包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，但是优选为双链DNA。
此处所使用的涉及编码与ErbB3相结合的抗体或抗体部分(例如VH、VL、CDR3)的核酸的术语“分离的核酸分子”是指其中编码抗体或抗体部分的核苷酸序列不含编码与ErbB3之外的抗原相结合的抗体的其它核苷酸序列的核酸分子，该其它序列在人基因组DNA中可能天然侧邻该核酸。
此处所使用的术语“修饰的”或“修饰”是指在抗体或其抗原结合部分中改变一个或更多个氨基酸。改变可以通过在一个或多个位点添加、置换或删除氨基酸实现。可以通过已知的技术来实现改变，例如PCR诱变。例如，在一些实施方案中，使用本公开的方法识别的抗体或其抗原结合部分可以进行修饰，从而改变抗体或其抗原结合部分对ErbB3的结合亲和力。
本发明在本发明的抗体或其片段的序列中还包含“保守氨基酸置换”，即不会损害该核苷酸序列编码的抗体或包含该氨基酸序列的抗体对抗原(即ErbB3)的结合的核苷酸和氨基酸序列修饰。保守氨基酸置换包括一个类型的氨基酸被相同类型的氨基酸置换，其中所述类型由共同的氨基酸侧链物理化学性质以及自然界中发现的同源蛋白质中的高置换频率确定，例如通过标准Dayhoff频率交换矩阵(frequencyexchange matrix)或BLOSUM矩阵确定的。氨基酸侧链被分为六大类，并包括I类(Cys)；II类(Ser，Thr，Pro，Ala，Gly)；III类(Asn，Asp，Gln，Glu)；IV类(His，Arg，Lys)；V类(Ile，Leu，Val，Met)和VI类(Phe，Tyr，Trp)。例如，Asp置换另一III类的残基(例如Asn、Gln或Glu)为保守置换。因此，在抗ErbB3抗体中预计的非关键氨基酸残基优选使用同一类中的另一氨基酸残基进行取代。识别不消除抗原结合的核苷酸和氨基酸保守置换的方法是本领域公知的(参见，例如Brummell等人Biochem.32：1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10)：879-884(1999)；和Burks等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA94：412-417(1997))。
术语“非保守氨基酸置换”是指一类的氨基酸被另一类的氨基酸置换；例如，使用III类的残基(例如Asp、Asn、Glu或Gln)来置换II类的残基Ala。
或者，在另一个实施方案中，可以沿着整个或部分抗-ErbB3抗体编码序列随机引入突变(保守或非保守)，例如通过饱和诱变，且得到的修饰的抗-ErbB3抗体可以针对其结合活性进行筛选。
“共有序列”为相关序列的族中最常见的氨基酸(或核苷酸)形成的序列(参见，例如Winnaker，From Genes to Clones(Verlagsgesellschaft，Weinheim，Germany 1987)。在蛋白质家族中，共有序列中的各位置都由家族中在该位置中最常见的氨基酸占据。如果两个氨基酸出现的频率相同，在该共有序列中可以包含其中的任一个。免疫球蛋白的“共有框架”是指共有免疫球蛋白序列中的框架区。
同样地，CDR的共有序列可以通过本发明的ErbB3抗体的CDR氨基酸序列的最优比对得到，所述ErbB3抗体的CDR氨基酸序列公开于此处。
对于核酸而言，术语“基本同源性”是指当进行优化比对或对比时，两个核酸或其指定序列有至少大约80％的核苷酸是相同的，通常至少大约90％至95％、更优选为至少大约98％至99.5％的核苷酸是相同的，其具有适当的核苷酸插入或缺失。或者，片断在选择性杂交条件下与互补链杂交时存在基本同源性。
两个核苷酸序列之间的百分同一性是该序列共有的相同位置数的函数(即，％同源性＝相同的位置#/总位置#x100)，同时考虑在对两个序列进行最优比对时需要引入的空位(gap)的数目和各空位的长度。序列的对比和两个序列间百分同一性的确定可以使用下述非限定性的实施例所描述的数学算法来完成。
可以采用GCG软件的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩阵和40、50、60、70或80的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重，确定两个核苷酸序列间的百分同一性。两个核苷酸或氨基酸序列之间的百分同一性也可以使用已经引入ALIGN程序(版本2.0)中的E.Meyers和W.Miller的算法(CABIOS，4：11-17(1989))、使用PAM120残基权重表(weight residue table)、12的空位长度罚分和4的空位罚分来确定。此外，两个氨基酸序列之间的百分同一性可以使用已经引入到GCG软件包的GAP程序中的Needleman和Wunsch算法(J.Mol.Biol.(48)：444-453(1970))、使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵及16、14、12、10、8、6或4的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重来确定。
本公开的核酸和蛋白质序列还可以进一步用作“探询序列”对公众数据库进行检索，例如来识别相关序列。这样的检索可以使用Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-10的NBLAST和XBLAST程序(版本2.0)进行。BLAST核苷酸检索可以使用NBALST程序进行(分数＝100，字长＝12)以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质检索可以使用XBLAST程序进行(分数＝50，字长＝3)以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的空位比对，可以使用如Altschul等人(1997)NucleicAcids Res.25(17)：3389-3402中描述的空位BLAST。当使用BLAST和空位BLAST程序时，可以使用各程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。
核酸可以存在于完整细胞中、细胞溶解产物中或以部分纯化或完全纯化的形式存在。当使用标准技术(包括碱/SDS处理、CsCl显带、柱色谱法、琼脂糖凝胶电泳和其它本领域公知的技术)从其它细胞组分或其它污染物(例如其它细胞核酸或蛋白质)中纯化出来时，核酸为“分离的”或“基本上纯的”。参见，F.Ausubel等人，ed.CurrentProtocols in Molecular Biology，Greene Publishing and WileyInterscience，New York(1987)。
尽管本公开的核酸组合物通常为天然序列(除了修饰的限制性位点等)，但来自cDNA、基因组或其混合物的本发明的核酸组合物可以按照标准技术进行突变来提供基因序列。对于编码序列，这些突变可以按照需要来影响氨基酸序列。特别地，可以设想与天然的V、D、J、恒定序列、转换序列和其它此处所描述的这类序列同源的或源自它们的DNA序列(其中“源自”表示一个序列与另一序列相同或由另一序列修饰得到)。
术语“可操作地连接的”是指核酸序列与另一核酸序列具有功能性的关系。例如，如果前序列或分泌性前导体的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则该前序列或分泌性前导体的DNA可操作地与该多肽的DNA相连接；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则该启动子或增强子可操作地与该编码序列相连接；或者如果核糖体结合位点的位置促进翻译，则该核糖体结合位点可操作地与编码序列相连接。通常，“可操作地连接”是指相连的DNA序列为相邻的，且在分泌性前导体的情况中，相连的DNA序列是相邻的并处于阅读相(reading phase)中。但是，增强子并非一定是相邻的。通过在方便的限制性位点的接合完成连接。如果不存在这样的位点的话，可根据常规操作使用合成的寡核苷酸接头或连接体。当核酸和另一核酸序列具有功能性的关系时，该核酸是“可操作地连接的”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，该启动子或增强子可操作地与该编码序列连接。当涉及转录调控序列时，可操作地连接是指连接的DNA序列是相邻的，且在需要合并两个蛋白质编码区时，连接的DNA序列是相邻的并处于阅读框中。对于转换序列而言，可操作地连接是指该序列能够实现转换重组。
此处所使用的术语“载体”是指能够转运与其连接的另一个核酸的核酸分子。载体的一种类型为“质粒”，其是指附加的DNA片断可接合到其中的环形双链DNA环。另一种载体类型是病毒载体，其中附加的DNA片断可以接合到病毒基因组中。特定的载体能够在其进入的宿主细胞内进行自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和游离型(episomal)哺乳动物载体)。其它的载体(例如，非游离型哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞时整合到宿主细胞的基因组中，从而可以与宿主基因组一起进行复制。此外，特定的载体能够引导与它们可操作地连接的基因的表达。这样的载体被此处称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。一般而言，在重组DNA技术中应用的表达载体通常是质粒的形式。术语“质粒”和“载体”可互换使用。但是，本发明意图包括这类其它形式的表达载体，例如病毒载体(例如，复制缺陷型反转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，它们都具有等同的功能。
此处所使用的术语“重组宿主细胞”(或简称“宿主细胞”)是指引入重组表达载体的细胞。需要明白的是，这些术语并不仅指特定的所述细胞，还指这些细胞的后代。由于突变或环境影响导致在后代中可能会出现某些改变，因而事实上，这些后代可能与母细胞不相同，但是它们仍然包括在此处所使用的术语“宿主细胞”的范围内。
此处所使用的术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)是指此处所描述的治疗性或预防性措施。“治疗”方法包括对受试者(例如，患有与ErbB3依赖性信号传导相关的疾病或障碍或倾向患有这样的疾病或防碍的受试者)施用此处公开的抗体或其抗原结合部分，从而预防、治疗、延迟该疾病或障碍或该疾病或障碍的复发、或降低其严重性，或减轻该疾病或障碍或该疾病或障碍的一种或多种症状，或者从而延长受试者的存活时间超过不接受这种治疗时预期的时间。
此处所使用的术语“与ErbB3依赖性信号传导相关的疾病”或“与ErbB3依赖性信号传导相关的障碍”包括如下疾病状态和/或与疾病状态相关的症状，其中发现ErbB3水平升高和/或涉及ErbB3的细胞级联的激活。已经知道当发现ErbB3水平升高时，ErbB3与其它ErbB蛋白质(例如EGFR和ErbB2)形成异二聚体。因此，术语“与ErbB3依赖性信号传导相关的疾病”还包括其中发现EGFR/ErbB3和/或ErbB2/ErbB3异二聚体的水平升高的疾病状态和/或与疾病状态相关的症状。一般而言，“与ErbB3依赖性信号传导相关的疾病”是指任何需要ErbB3参与的障碍、发作、发展或症状的持续。示例性的ErbB3介导的障碍包括，但不局限于例如癌症。
术语“癌症”和“癌性”指的是或描述的是通常以失控的细胞生长为特征的哺乳动物的生理状况。癌症的例子包括，但不局限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。这样的癌症的更特定的例子包括扁平细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃癌、胰腺癌、胶质细胞肿瘤(例如成胶质细胞瘤和神经纤维瘤)、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、黑素瘤、结肠直肠癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肾脏癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌和各种类型的头部和颈部癌症。在特定的实施方案中，使用此处公开的方法治疗或诊断的癌症选自黑素瘤、乳腺癌、卵巢癌、肾癌、胃肠/结肠癌、肺癌和前列腺癌。
此处使用的术语“KRAS突变”是指在某些癌症中在v-Ki-ras2Kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因人类同源物中的发现的突变。人KRAS基因mRNA序列的非限定性实例包括Genbank登记号NM_004985和NM_033360。据报道在73％胰腺肿瘤、35％结肠直肠肿瘤、16％卵巢肿瘤和17％肺肿瘤中发现KRAS突变。
此处使用的术语“PI3K突变”是指在某些癌症中在磷脂酰肌醇-3-激酶基因中发现的突变，通常导致癌细胞中PI3K的活化。据报道在12％结肠直肠肿瘤、15％头颈部肿瘤和26％乳腺肿瘤中发现PI3K突变。
此处所使用的术语“有效量”是指当施用于受试者时，如此处所描述的结合ErbB3的抗体或其抗原结合部分足以发挥治疗、预后或诊断与ErbB3依赖性信号传导相关的疾病的作用的量。治疗有效量根据接受治疗的受试者和疾病、受试者的体重和年龄、疾病状态的严重性、施用方式等的不同而变化，本领域的普通技术人员可以很容易确定治疗有效量。根据本发明，施用剂量的范围可以为大约1ng至大约10000mg、大约5ng至大约9500mg、大约10ng至大约9000mg、大约20ng至大约8500mg、大约30ng至大约7500mg、大约40ng至大约7000mg、大约50ng至大约6500mg、大约100ng至大约6000mg、大约200ng至大约5500mg、大约300ng至大约5000mg、大约400ng至大约4500mg、大约500ng至大约4000mg、大约1μg至大约3500mg、大约5μg至大约3000mg、大约10μg至大约2600mg、大约20μg至大约2575mg、大约30μg至大约2550mg、大约40μg至大约2500mg、大约50μg至大约2475mg、大约100μg至大约2,450mg、大约200μg至大约2425mg、大约300μg至大约2000mg、大约400μg至大约1175mg、大约500μg至大约1,150mg、大约0.5mg至大约1125mg、大约1mg至大约1100mg、大约1.25mg至大约1075mg、大约1.5mg至大约1050mg、大约2.0mg至大约1025mg、大约2.5mg至大约1000mg、大约3.0mg至大约975mg、大约3.5mg至大约950mg、大约4.0mg至大约925mg、大约4.5mg至大约900mg、大约5mg至大约875mg、大约10mg至大约850mg、大约20mg至大约825mg、大约30mg至大约800mg、大约40mg至大约775mg、大约50mg至大约750mg、大约100mg至大约725mg、大约200mg至大约700mg、大约300mg至大约675mg、大约400mg至大约650mg、大约500mg或大约525mg至大约625mg的抗体或其抗原结合部分。可以调整施用方案以提供最佳治疗反应。有效量也是抗体或其抗原结合部分的任何毒性或有害效应(即副作用)最小和/或被有益效果远远超过的量。在以下药物组合物相关的部分中进一步描述了附加的优选剂量方案。
术语“患者”包括接受预防或治疗处理的人和其它哺乳动物受试者。
此处所使用的术语“受试者”或“患者”包括任何人或非人类动物。例如，此处公开的方法和组合物可用于治疗患有癌症的受试者。在优选的实施方案中，受试者是人。术语“非人类动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物或非哺乳动物，例如非人类灵长类、羊、狗、牛等。
术语“样品”是指来自患者或受试者的组织、体液或细胞。通常组织或细胞会从患者身上取出，但是也可能进行体内诊断。在实体肿瘤的情况下，组织样品可以从通过手术取出的肿瘤取得并通过常规技术制备以进行测试。在淋巴瘤和白血病的情况下，可以获得淋巴细胞、白血病细胞或淋巴组织并适当地制备。其它的患者样品(包括尿、眼泪、血清、脑脊髓液、粪便、痰、细胞提取液等)也可用于特定的肿瘤。
术语“抗癌剂”和“抗肿瘤剂”是指用于治疗恶性肿瘤(例如癌生长)的药物。药物治疗可以单独使用，也可以与其它治疗(例如手术或放射治疗)联合使用。取决于所涉及的器官的性质，可以在癌症治疗中使用几类药物。例如，乳腺癌通常受到雌激素的刺激，因此可以使用灭活性激素的药物来治疗。同样地，前列腺癌可以使用灭活雄激素(雄性的性激素)的药物治疗。本发明的某些方法中使用的抗癌剂特别包括下述物质：
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一种或多种抗癌剂可以同时施用，或者在施用此处公开的抗体或其抗原结合部分之前或之后施用。
本发明的各个不同的方面将会在下述部分中进行更详细的阐述。
II.制备抗体的方法
(i)单克隆抗体
本公开的单克隆抗体可以通过多种已知技术进行制备，例如Kohler和Milstein(1975)Nature 256：495中描述的标准体细胞杂交技术、B淋巴细胞的病毒或致瘤性转化或使用人抗体基因库的噬菌体展示技术。在特定的实施方案中，抗体为完全的人单克隆抗体。
因此，在一个实施方案中，杂交瘤方法用于制备与ErbB3相结合的抗体。在这个方法中，小鼠或其它适当的宿主动物可以使用合适的抗原进行免疫，以诱导产生或能够产生与用于免疫的抗原特异性结合的抗体的淋巴细胞。或者，淋巴细胞可以在体外进行免疫。然后使用合适的融合剂(例如聚乙二醇)，淋巴细胞可以与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，pp.59-103(Academic Press，1986))。分析杂交瘤细胞在其中生长的培养基以检测针对抗原的单克隆抗体的生成。在确认杂交瘤细胞产生具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体之后，克隆可以通过有限稀释过程进行亚克隆化，并使用标准方法进行生长(Goding，1986，同上)。用于此目的合适的培养基包括，例如D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可以在动物体内作为腹水肿瘤生长。亚克隆分泌的单克隆抗体可以从培养基、腹水液或血清中通过常规免疫球蛋白纯化过程(例如，举例来说，蛋白A-琼脂糖、羟磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析或亲和色谱法)分离出来。
在另一个实施方案中，与ErbB3相结合的抗体和抗体部分可以从抗体噬菌体库中分离出来，该噬菌体库是使用例如McCafferty等人，Nature，348：552-554(1990)，Clackson等人，Nature，352：624-628(1991)，Marks等人，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)和Hoet等人(2005)Nature Biotechnology 23，344-348；Ladner等人的美国专利No.5,223,409；5,403,484；和5,571,698；Dower等人的美国专利No.5,427,908和5,580,717；U.S.McCafferty等人的美国专利No.5,969,108和6,172,197；及Griffiths等人的美国专利No.5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915和6,593,081中描述的技术产生的。此外，还可以使用通过链改组(Marks等人，Bio/Technology，10：779-783(1992))以及作为用于构建非常大的噬菌体库的策略的组合感染和体内重组(Waterhouse等人，Nuc.Acids.Res.，21：2265-2266(1993))产生高亲和力(nM范围)人抗体。
在特定的实施方案中，使用Hoet等人(同上)描述的噬菌体展示技术制备与ErbB3相结合的抗体或其抗原结合部分。这项技术涉及产生具有从人类供体分离出来的免疫球蛋白序列的独特组合并在重链CDR中具有合成多样性的人Fab库。这个库然后用于筛选与ErbB3相结合的Fab。
在再另一个实施方案中，可以使用携带部分人免疫系统而不是小鼠免疫系统的转基因或转染色体小鼠产生针对ErbB3的人单克隆抗体(参见，例如Lonberg等人(1994)Nature 368(6474)：856-859；Lonberg，N.等人(1994)，同上；reviewed in Lonberg，N.(1994)Handbook of Experimental Pharmacology 113：49-101；Lonberg，N.和Huszar，D.(1995)Intern.Rev.Immunol.13：65-93，及Harding，F.和Lonberg，N.(1995)Ann.NY.Acad Sci.764：536-546。进一步参见Lonberg和Kay的美国专利No.5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299和5,770,429；Surani等人的美国专利No.5,545,807；Lonberg和Kay的PCT公布No.WO 92/03918，WO 93/12227，WO 94/25585，WO97/13852，WO 98/24884和WO 99/45962；及Korman等人的PCT公布No.WO 01/14424)。
在另一个实施方案中，可以使用在转基因或转染色体上携带人免疫球蛋白序列的小鼠(例如携带人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠)产生此处公开的人抗体(参见，例如Ishida等人的PCT公布WO02/43478)。
再进一步，表达人免疫球蛋白基因的可选的转基因动物系统是本领域可获得的，并可用于产生本发明的抗ErbB3抗体或其片段。例如，可以使用称作XENOMOUSE(Abgenix，Inc.)的可选转基因系统；这样的小鼠在例如Kucherlapati等人的美国专利No.5,939,598；6,075,181；6,114,598；6,150,584和6,162,963中有所描述。
此外，表达人免疫球蛋白基因的可选的转染色体动物系统是本领域可获得的，并可用于产生本发明的抗ErbB3抗体或其片段。例如，可以使用携带人重链转染色体和人轻链转染色体的小鼠；如Tomizuka等人(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：722-727中所述。此外，携带人重链和轻链转染色体的牛在本领域中也有所描述(Kuroiwa等人(2002)Nature Biotechnology 20：889-894)，并可用于产生本发明的抗ErbB3抗体或其片段。
在再另一个实施方案中，可以使用产生这样的抗体的转基因植物和/或培养的植物细胞(例如，举例来说，烟草、玉米和浮萍)来制备此处公开的抗体。例如，表达抗体或其抗原结合部分的转基因烟草叶可通过例如使用诱导型启动子(参见，例如Cramer等人，Curr.Top.Microbol.Immunol.240：95118(1999))被用于制备这样的抗体。同样，转基因玉米也可被用于表达这样的抗体及其抗原结合部分(参见，例如Hood等人，Adv.Exp.Med.Biol.464：127-147(1999))。还可以从包括抗体部分(例如单链抗体(例如scFv′-s)的转基因植物种子，例如使用烟草种子或马铃薯茎，大量制备抗体(参见，例如Conrad等人，Plant Mol.Biol.38：101-109(1998))。在植物中制备抗体或抗原结合部分的方法可以参见例如Fischer等人，Biotechnol.Appl.Biochem.30：99108(1999)，Ma等人，Trends Biotechnol.13：522-7(1995)；Ma等人，Plant Physiol.109：341-6(1995)；Whitelam等人，Biochem.Soc.Trans.22：940-944(1994)和美国专利No.6,040,498和6,815,184。
可以通过免疫沉淀或体外结合分析(例如辐射免疫分析(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))确定使用任何技术(包括此处所述的技术)制备的与ErbB3相结合的抗体或其部分的结合特异性。还可以通过Munson等人，Anal.Biochem.，107：220(1980)的斯卡查德分析来确定抗体或其部分的结合亲和力。
在特定实施方案中，使用上述任何方法制备的ErbB3抗体或其部分可以通过本领域公认的技术(例如那些此处所描述的技术)进一步进行改造或优化，以获得所需的结合特异性和/或亲和力。
在一个实施方案中，源自ErbB3抗体的部分抗体序列可用于制备结构上和功能上相关的抗体。例如，抗体主要通过位于六个重链和轻链互补性决定区(CDR)中的氨基酸残基与靶抗原相互作用。由于这个原因，在抗体个体之间CDR中的氨基酸序列比CDR外的序列更多样化。由于CDR序列负责大部分的抗体-抗原相互作用，通过构建包括嫁接到来自具有不同性质的不同载体的框架序列上的来自特定的天然发生抗体的CDR序列的表达载体(参见，例如，Riechmann，L.等人，1998，Nature 332：323-327；Jones，P.等人，1986，Nature 321：522-525；和Queen，C.等人，1989，Proc.Natl.Acad.See.U.S.A.86：10029-10033)，表达模拟特定的天然发生抗体的性质的重组抗体是可能的。这样的框架序列可以从包括种系抗体基因序列的公开的DNA数据库中获得。
因此，本发明的抗ErbB3抗体或其片段的一种或多种结构特征(例如CDR)可用于创建维持本发明其它抗体或其片段的至少一种功能性质(例如抑制EGF样配体介导的ErbB3磷酸化；抑制一种或多种神经调节素、表皮调节素、epigen或biregulin介导的通过ErbB3的信号传导；抑制表达ErbB3的细胞的增殖；和/或降低细胞表面的ErbB3水平)的结构相关的抗ErbB3抗体。
在特定的实施方案中，一种或多种选自SEQ ID NO：7-12、SEQ IDNO：13-18、SEQ ID NO：19-24、SEQ ID NO：39-44和SEQ ID NO：45-50的CDR区与已知的人框架区和CDR重组结合，以产生本发明的附加的、重组工程化的抗ErbB3抗体或其片段。重链和轻链可变框架区可以源自相同或不同的抗体序列。
本领域已知，抗体重链和轻链CDR3结构域对抗体与抗原的结合特异性/亲和力具有特别重要的作用(参见Hall等人，J.Imunol，149：1605-1612(1992)；Polymenis等人，J.Immunol，152：5318-5329(1994)；Jahn等人，Immunobiol，193：400-419(1995)；Klimka等人，Brit.J.Cancer，83：252-260(2000)；Beiboer等人，J.Mol Biol，296：833-849(2000)；Rader等人，Proc.Natl.Acad Sci.USA，95：8910-8915(1998)；Barbas等人，J.Am.Chem.Soc，116：2161-2162(1994)；Ditzel等人，J.Immunol，157：739-749(1996))。因此，在某些实施方案中，产生的抗体包含此处所述的特定抗体的重链和/或轻链CDR3(例如SEQ ID NO：9，15，21，41，47和/或SEQ ID NO：12，18，24，44，50)。抗体还可能进一步包含此处具体公开的抗体的重链和/或轻链CDR1和/或CDR2(例如SEQ ID NO：7-8和/或SEQ ID NO：10-11；SEQ ID NO：13-14和/或SEQ ID NO：16-17；SEQ ID NO：20-21和/或SEQ ID NO：22-23；SEQID NO：39-40和/或SEQ ID NO：42-43；或SEQ ID NO：45-46和/或SEQ ID NO：48-49)。
上述工程化抗体的CDR1、2和/或3区可以包含此处所公开的确切的氨基酸序列(例如Ab #6、Ab #3、Ab #14、Ab #17或Ab #19的CDR，分别在SEQ ID NO：7-12，13-18，19-24，39-44和45-50中给出)。但是，普通技术人员知道，与确切的CDR序列有一些偏差而同时保持抗体与ErbB3有效结合的能力是可能的(例如保守氨基酸置换)。因此，在另一个实施方案中，工程化抗体可以由例如，与Ab #6、Ab #3或Ab #14的一个或多个CDR 90％、95％、98％、99％或99.5％相同的一个或多个CDR构成。
在另一个实施方案中，可以改变CDR的一个或多个残基来改变结合，从而实现更有利的结合速率。使用这一策略，可以获得具有超高结合亲和力(例如1010 M-1或更高)的抗体。本领域公知的和那些在此描述的亲和力成熟技术可用于改变CDR区域，然后再筛选所得到的结合分子以发现所需的结合改变。因此，随着CDR改变，可以监测结合亲和力及免疫原性的变化并评分，从而获得优化出具有最优结合力和低免疫原性组合的抗体。
如实施方案20中进一步详细地描述，已在Ab #6的重链和轻链CDR上进行诱变(例如丙氨酸扫描诱变)以识别参与ErbB3结合的氨基酸残基以由此定义抗体的互补位。
基于这种诱变分析，在图37A和37B中显示了抗ErbB3抗体的互补位CDR序列。如图37A中所阐述，本发明的抗ErbB3抗体或其片段可包含重链互补位和轻链互补位，所述重链互补位包含分别如SEQ ID NO：63、64和65所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，所述轻链互补位包含分别如SEQ ID NO：69、70和71所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，其中附带条件为抗体不是：(i)此处公开的Ab#6；(ii)包含分别如SEQ ID NO：1和2所示的VH和VL序列的抗体；或(iii)包含分别如SEQ ID NO：7、8和9所示的VH CDR1、CDR2和CDR3序列以及分别如SEQ ID NO：10、11和12所示的VL CDR1、CDR2和CDR3序列的抗体。
如图37B中所阐述，本发明的抗ErbB3抗体或其片段可包含重链互补位和轻链互补位，所述重链互补位包含分别如SEQ ID NO：76、64和65所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，所述轻链互补位包含分别如SEQ ID NO：78、70和80所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，其中附带条件为抗体不是：(i)此处公开的Ab #6；(ii)包含分别如SEQ ID NO：1和2所示的VH和VL序列的抗体；或(iii)包含分别如SEQ ID NO：7、8和9所示的VH CDR1、CDR2和CDR3序列以及分别如SEQ ID NO：10、11和12所示的VL CDR1、CDR2和CDR3序列的抗体。
在又一实施方案中，本发明提供包含重链互补位的抗ErbB3抗体，所述重链互补位包含分别如SEQ ID NO：63或76(CDR1)、64(CDR2)和65(CDR3)所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，其中附带条件为抗体不是：(i)此处公开的Ab #6；(ii)包含分别如SEQ ID NO：1和2所示的VH和VL序列的抗体；或(iii)包含分别如SEQ ID NO：7、8和9所示的VH CDR1、CDR2和CDR3序列以及分别如SEQ ID NO：10、11和12所示的VL CDR1、CDR2和CDR3序列的抗体。
在又一实施方案中，本发明提供包含轻链互补位的抗ErbB3抗体，所述轻链互补位包含分别如69或78(CDR1)、70(CDR2)和71或80(CDR3)所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，其中附带条件为抗体不是：(i)此处公开的Ab #6；(ii)包含分别如SEQ ID NO：1和2所示的VH和VL序列的抗体；或(iii)包含分别如SEQ ID NO：7、8和9所示的VH CDR1、CDR2和CDR3序列以及分别如SEQ ID NO：10、11和12所示的VL CDR1、CDR2和CDR3序列的抗体。
基于这种诱变分析，在图37A和37B中还显示了本发明的抗ErbB3抗体或其片段的共有CDR序列。如图37A中所阐述，本发明的抗ErbB3抗体或其片段可包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO：60、61和62所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，所述轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：66、67和68所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，其中附带条件为抗体不是(i)此处公开的Ab #6；(ii)包含分别如SEQ ID NO：1和2所示的VH和VL序列的抗体；或(iii)包含分别如SEQ ID NO：7、8和9所示的VH CDR1、CDR2和CDR3序列以及分别如SEQ ID NO：10、11和12所示的VLCDR1、CDR2和CDR3序列的抗体。
如图37B中所阐述，本发明的抗ErbB3抗体或其片段可包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO：75、61和62所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，所述轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：77、67和79所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，其中附带条件为抗体不是(i)此处公开的Ab #6；(ii)包含分别如SEQ IDNO：1和2所示的VH和VL序列的抗体；或(iii)包含分别如SEQ ID NO：7、8和9所示的VH CDR1、CDR2和CDR3序列以及分别如SEQ IDNO：10、11和12所示的VL CDR1、CDR2和CDR3序列的抗体。
在又一实施方案中，本发明提供包含重链可变区的抗ErbB3抗体，所述抗ErbB3抗体包含分别如SEQ ID NO：60或75(CDR1)、61(CDR2)和62(CDR3)所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，其中附带条件为抗体不是(i)此处公开的Ab #6；(ii)包含分别如SEQ ID NO：1和2所示的VH和VL序列的抗体；或(iii)包含分别如SEQ ID NO：7、8和9所示的VH CDR1、CDR2和CDR3序列以及分别如SEQ ID NO：10、11和12所示的VLCDR1、CDR2和CDR3序列的抗体。
在又一实施方案中，本发明提供包含轻链可变区的抗ErbB3抗体，所述抗ErbB3抗体包含分别如SEQ ID NO：66或77(CDR1)、67(CDR2)和68或79(CDR3)所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，其中附带条件为抗体不是(i)此处公开的Ab#6；(ii)包含分别如SEQ IDNO：1和2所示的VH和VL序列的抗体；或(iii)包含分别如SEQ ID NO：7、8和9所示的VH CDR1、CDR2和CDR3序列以及分别如SEQ IDNO：10、11和12所示的VLCDR1、CDR2和CDR3序列的抗体。
除了CDR的修饰之外或者代替CDR的修饰，还可以在抗体的重链和/或轻链可变区的一个或多个框架区FR1、FR2、FR3和FR4内进行修饰，只要这些修饰不消除抗体的结合亲和力即可。
在另一个实施方案中，抗体针对效应功能进行进一步修饰，从而例如提高抗体在癌症治疗中的效力。例如，可以将半胱氨酸残基引入Fc区域，从而使得该区内形成链间二硫键。因此，如此产生的同型二聚抗体可以具有改进的内在化能力和/或增强的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。参见Caron等人，J.Exp Med.176：1191-1195(1992)和Shopes，B.J.Immunol.148：2918-2922(1992)。还可以使用Wolff等人Cancer Research 53：2560-2565(1993)中描述的异型双功能交联剂制备具有增强的抗肿瘤活性的同型二聚抗体。或者，可以对具有双Fc区的抗体进行工程化，并可能由此具有提高的补体溶解和ADCC能力。参见Stevenson等人Anti-Cancer Drug Design3：219-230(1989)。
可使用标准重组DNA技术来实现如此处所公开的CDR、框架区、Fc区或其它抗体区中的一个或多个残基的诱变，所述诱变包括但不限于定点诱变和PCR介导的诱变。还可使用标准方法来实现突变对抗原结合(例如与ErbB3结合)和其它功能性特征的作用的筛选。例如，含有突变的CDR的抗体(例如scFv形式)可在细胞(如哺乳动物细胞、酵母细胞或细菌细胞)表面上表达且可使用标准方法来确定抗原与细胞的结合，例如使用标记的第二抗体在流式细胞仪中检测到抗原与细胞结合。另外地或可选地，抗体可以可溶形式表达且可使用标准结合分析(如ELISA或BIACORE分析)来评估抗体与抗原的结合。为此目的先前的和相关的技术的详细描述可见于大量熟知的教科书和实验室手册中，例如Handbook of Therapeutic Antibodies Vols.1-3，StefanDubel编，Wiley-VCH 2007；Making and Using Antibodies：A PracticalHandbook，Gary C.Howard，CRC 2006；Antibody Engineering：Methodsand Protocols，Benny K.C.Lo，Humana Press 2003；TherapeuticAntibodies：Methods and Protocols，Antony S.Dimitrov编，HumanaPress 2009；Antibody Phage Display：Methods and Protocols，第2版Robert Aitken编，Humana Press 2009；Flow Cytometry Protocols，第2版Teresa S.Hawley和Robert G.Hawley编，Humana Press 2004；FlowCytometry：Principles and Applications，Marion G.Macey编，HumanaPress 2007。还参见“Selecting and Screening Recombinant AntibodyLibraries，”H.R.Hoogenboom，Nature Biotechnol.23：1105-1116；2005。
本发明还包括下述的双特异性抗体和免疫偶联物。
(ii)双特异性抗体
本公开的双特异性抗体包括至少一种ErbB3的结合特异性和至少一种另一抗原(例如致癌基因的产物)的结合特异性。双特异性抗体可被制备成全长抗体或抗体片段(例如F(ab′)2双特异性抗体)。
制备双特异性抗体的方法是本领域公知的(参见，例如WO05117973和WO 06091209)。例如，制备全长双特异性抗体可以基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中，两条链具有不同的特异性(参见，例如Millstein等人，Nature，305：537-539(1983))。产生双特异性抗体的进一步细节可以参见例如Suresh等人，Methods inEnzymology，121：210(1986)和Brennan等人，Science，229：81(1985)，其描述了用于制备双特异性抗体的化学键合过程。用于制备和从重组细胞培养物中直接分离双特异性抗体片段的各种不同方法也已经有所描述。例如，已经使用亮氨酸拉链制备了双特异性抗体(参见，例如Kostelny等人，J.Immunol，148(5)：1547-1553(1992))。还报导了使用单链Fv(scFv)二聚体来制备双特异性抗体片段的另一种策略(参见，例如Gruber等人，J.Immunol，152：5368(1994))。
在特定的实施方案中，双特异性抗体包含与ErbB3相结合的第一抗体或其结合部分以及与ErbB2、ERbB3、ErbB4、EGFR、IGF1-R、C-MET、Lewis Y、MUC-1、EpCAM、CA125、前列腺特异性膜抗原、PDGFR-α、PDGFR-β、C-KIT或任何FGF受体相结合的第二抗体或其结合部分。
(iii)免疫偶联物
可以通过将此处所描述的抗体或其抗原结合部分与另一种治疗剂结合而形成本公开的免疫偶联物。合适的试剂包括，例如细胞毒性剂(例如化学治疗剂)、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)和/或放射性同位素(例如放射性偶联物)。用于产生这样的免疫偶联物的化学剂已经在上面有所描述。可以使用的酶活性毒素及其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合性活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲霉毒、油桐(Aleurites fordii)蛋白、香石竹毒蛋白(dianthin protein)、美洲商路蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制剂、麻风树毒素、巴豆毒素、石碱花(Sapaonaria officinalis)抑制剂、多花白树毒素、mitogellin、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢霉烯族化合物(tricothecenes)。多种放射性核素可用于制备放射性偶联的抗ErbB3抗体。例子包括212Bi、131I、131In、90Y和186Re。
本发明的免疫偶联物可以使用多种双功能性蛋白偶联剂进行制备，例如，N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、2-亚氨基硫烷(IT)、酰亚胺酯的双功能性衍生物(例如二亚胺代己二酸二甲酯盐酸盐)、活性酯(例如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(例如戊二醛)、双叠氮基化合物(例如双(对-叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双-重氮衍生物(例如双-(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(例如甲代亚苯基2，6-异氰酸酯)和双-活性氟化合物(例如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒素免疫毒素可以按照Vitetta等人，Science 238：1098(1987)中的描述进行制备。碳-14标记的1-异硫氰酸苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸为用于结合放射性核苷酸和抗体的示例性螯合剂(参见，例如WO94/11026)。
(iv)针对ErbB3胞外结构域肽产生的抗体
那些技术人员将意识到利用常规免疫方法、使用肽(例如合成肽)或其偶联物(例如KLH偶联物)可易于获得具有Ab#6多种所需的特性的单克隆和单特异性的多克隆抗体(例如抑制癌细胞增殖和下调细胞上的ErbB3的抗体)或与Ab#6竞争结合ErbB3的抗体。在此实施方案中，用作免疫原的肽为包含来自SEQ ID NO：73的残基1-183的任何10个或更多个连续的氨基酸残基的肽。优选地10个或更多个连续的氨基酸残基来自ErbB3的胞外结构域的结构域I，优选地残基至少部分地落入或跨过SEQ ID NO：73的残基92-104。
III.筛选抗体的方法
在制备与ErbB3相结合的抗体或抗原结合部分之后，这类抗体或其部分可以使用本领域公知的多种分析方法来对其各种不同性质(例如此处所描述的性质)进行筛选。
在一个实施方案中，对抗体或其抗原结合部分抑制EGF样配体介导的ErbB3磷酸化的能力进行筛选。这可以通过在存在或不存在抗体或其抗原结合部分的情况下，用EGF样配体处理表达ErbB3的细胞来完成。然后可以溶解细胞，离心粗溶解产物以去除不溶物质。可以通过例如蛋白质印迹法、然后再使用抗磷酸酪氨酸抗体进行探测来测量ErbB3磷酸化，如Kim等人(同上)和下述实施例中所描述的。
在其它实施方案中，进一步筛选抗体或其抗原结合部分的一种或多种下述性质：(1)抑制ErbB3-配体(例如神经调节素、表皮调节素、epigen或biregulin)介导的通过ErbB3的信号传导；(2)抑制表达ErbB3的细胞的增殖；(3)降低细胞表面上的ErbB3水平的能力(例如通过诱导ErbB3的内在化)；(4)抑制表达ErbB3的细胞的VEGF分泌；(5)抑制表达ErbB3的细胞的迁移；(6)抑制表达ErbB3的细胞的球状体生长；和/或(7)与位于ErbB3的胞外结构域的结构域I上的表位结合，上述性质的每一种都可以使用本领域公认的技术或此处所讨论的技术方便地进行测量。
可以使用常规分析方法(例如Horst等人，同上所描述的)容易地测量神经调节素、表皮调节素、epigen或biregulin中的一种或多种介导的通过ErbB3的信号传导的抑制。例如，抗体或其抗原结合部分抑制神经调节素、表皮调节素、epigen或biregulin介导的通过ErbB3信号传导的能力可以在神经调节素、表皮调节素、epigen或biregulin中的一种或多种刺激之后，如Horst等人，同上，Sudo等人，(2000)Methods Enzymol，322：388-92；和Morgan等人(1990)Eur.J.Biochem.，191：761-767中所描述的通过ErbB3的已知底物(例如SHC和PI3K)的激酶分析来测量。因此，可以使用神经调节素、表皮调节素、epigen或biregulin的一种或多种刺激表达ErbB3的细胞，并与候选抗体或其抗原结合部分一起孵育。随后由这些细胞得到的细胞溶解产物可与ErbB3底物(或涉及ErbB3的细胞途径中的蛋白质)的抗体(例如，举例来说，抗JNK-1抗体)一起免疫沉淀，并通过本领域公认的技术分析其激酶活性(例如JNK激酶活性或PI3-激酶活性)。相对于不存在抗体或其抗原结合部分时的水平或活性而言，存在抗体或其抗原结合部分时ErbB3底物或涉及ErbB3的途径中的蛋白质的水平或活性(例如激酶活性)的降低或完全消失是抑制神经调节素、表皮调节素、epigen或biregulin中的一种或多种介导的信号传导的抗体或其抗原结合部分的指征。
在特定实施方案中，抗体或其抗原结合部分通过降低神经调节素、表皮调节素、epigen或biregulin中的一种或多种与ErbB3的结合来抑制ErbB3-配体(例如神经调节素、表皮调节素、epigen或biregulin)介导的信号传导。
为了选择抑制神经调节素、表皮调节素、epigen或biregulin中的一种或多种与ErbB3结合的抗体或其抗原结合部分，表达ErbB3的细胞(例如MALME-3M细胞，如下文实施例中描述的)可以在不存在(对照)或存在抗ErbB3抗体或其抗原结合部分的情况下与标记的ErbB3-配体(例如放射性标记的神经调节素、表皮调节素、epigen或biregulin)接触。如果抗体或其抗原结合部分抑制神经调节素、表皮调节素、epigen或biregulin与ErbB3的结合，则相对于不存在抗体或其抗原结合部分时的量，将观察到回收的标记物(例如放射性标记的神经调节素、表皮调节素、epigen或biregulin)的量统计学显著地降低。
抗体或其抗原结合部分可以通过任何机理来抑制ErbB3-配体(例如神经调节素、表皮调节素、epigen或biregulin)的结合。例如，抗体或其抗原结合部分可通过结合ErbB3上与ErbB3配体所结合的位点相同或重叠的位点来抑制ErbB3配体(例如神经调节素、表皮调节素、epigen或biregulin中的一种或多种)与ErbB3的结合。或者，抗体或其抗原结合部分可以通过改变或扭曲ErbB3的构型，以使其不能与ErbB3配体相结合，从而抑制ErbB3配体的结合。
降低细胞表面ErbB3水平的抗体及其抗原结合部分可以通过其下调肿瘤细胞上的ErbB3的能力来进行识别。在特定实施方案中，抗体或其抗原结合部分通过诱导Erbb3的内在化(或提高内吞作用)来降低ErbB3的细胞表面表达。为了对此进行测试，ErbB3可以被生物素化，且很容易确定细胞表面上ErbB3分子的数量，例如在存在或不存在抗体或其抗原结合部分的情况下测量培养物中细胞单层上的生物素量(例如，如Waterman等人，J.Biol.Chem.(1998)，273：13819-27中所描述的)，然后再免疫沉淀ErbB3和使用抗生蛋白链菌素来进行探测。在存在抗体或其抗原结合部分的情况下检测到生物素化ErbB3随着时间逐渐降低意味着抗体降低了细胞表面上ErbB3的水平。
还可以使用本领域公认的技术(例如下述实施例中描述的CellTiter-
Figure BPA00001545689500681
分析)测试本公开的抗体或其抗原结合部分抑制表达ErbB3的细胞的增殖的能力(还参见，例如Macallan等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(1998)20；95(2)：708-13；Perez等人(1995)Cancer Research55，392-398)。
在另一个实施方案中，筛选抗体或其抗原结合部分抑制表达ErbB3的细胞的VEGF分泌的能力。这可以通过使用公知的分析方法(例如可以从R&D Systems，Minneapolis，MN，#DY293B获得的VEGFELISA试剂盒)进行。类似地，可以使用此处所描述的trans-well分析(Millipore Corp.，Billerica，MA，#ECM552)筛选抗体或部分抑制表达ErbB3的细胞(例如MCF-7细胞)的迁移的能力。
在另一个实施方案中，筛选抗体或其抗原结合部分抑制表达ErbB3的细胞的球状体生长的能力。这可以使用此处所描述的接近促进肿瘤生长的条件的分析来完成(参见，例如Herman等人(2007)Journal of Biomolecular Screening Electronic publication)。
还可以使用本领域已知的和此处所描述的标准技术来识别结合到与此处具体公开的一种或多种抗体相同的或重叠的表位上的抗体或其抗原结合部分。例如，为了筛选与感兴趣的抗体所结合的ErbB3上的相同或重叠表位相结合的抗体，可以进行交叉阻断分析，例如如Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，EdHarlow and David Lane(1988)中所描述的。
IV.药物组合物
在另一个方面，本发明提供了包含与药学上可接受的载体一起配制的此处公开的抗体或其抗原结合部分中的一种或其组合的组合物(例如药物组合物)。在一个实施方案中，该组合物包含多种(例如两种或更多种)与ErbB3上不同的表位结合的分离的抗体的组合。
此处所使用的“药学上可接受的载体”包括任何和所有生理相容的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。优选地，载体适于静脉、肌肉、皮下、非消化道、脊髓或表皮施用(例如通过注射或输注)。取决于不同的施用途径，可以将活性剂(即抗体、抗体片段、双特异性和多特异性分子)包被在某种材料中，以保护该活性剂免受酸作用和其它可能灭活该活化剂的自然条件的影响。
“药学上可接受的盐”是指保留母体化合物所需的生理活性、且不会引起任何不希望的毒性效应的盐(参见，例如Berge，S.M.等人1977)J.Pharm.Sci.66：1-19)。这样的盐的例子包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括衍生自非毒性的无机酸(例如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等)和衍生自非毒性有机酸(如，脂族单羧酸和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳香酸、脂族和芳香磺酸等)的盐。碱加成盐包括衍生自碱土金属(例如钠、钾、锰、钙等)的盐以及衍生自非毒性的有机胺(如，N，N′-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等)的盐。
本发明的药物组合物可以包含其它试剂。例如，组合物包括至少一种或多种附加的治疗剂(例如下文描述的抗癌剂)。药物组合物还可以与放射治疗和/或手术联合施用。可选地，本发明的组合物可分别地与至少一种或多种附加的治疗剂(例如下文描述的抗癌剂)共施用。
本公开的组合物可以通过本领域已知的许多方法施用。本领域的技术人员知道施用的途径和/或模式根据所希望的结果而改变。活性剂可与保护该活性剂以防止其快速释放的载体一起制备，例如控释制剂(包括植入物、透皮贴片和微囊递送系统)。可以使用可生物降解的、生物相容的聚合体，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。许多用于制备这类制剂的方法已经获得了专利或是本领域技术人员普遍知道的。参见，例如Sustained and ControlledRelease Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
为通过特定施用途径来施用本发明的抗体或其片段，可能需要用某种材料包裹它或使它与某种材料共同施用以防止其失活。例如，可以将该抗体或其片段在适当的载体(例如脂质体)或稀释剂中施用受试者。药学上可接受的稀释剂包括盐水和水性缓冲液。脂质体包括水包油包水CGF乳液以及普通的脂质体(Strejan等人(1984)J.Neuroimmunol.7：27)。
药学上可接受的载体包括灭菌水溶液或分散液以及用于即时制备灭菌注射溶液或分散液的灭菌粉末或冻干片(lyophylysate)。这样的介质和试剂用于药学活性抗体是本领域已知的。除了任何与活性剂不相容的常规介质或试剂外，其它常规介质或试剂都可用于本发明的药物组合物中。辅助活性物质也可以引入组合物中。
治疗组合物通常必须是灭菌的，并且在生产和储存条件下稳定。组合物可被配制成为溶液、微乳液、脂质体或适用于高药物浓度的其它有序的结构。载体可以是包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)的溶剂或分散介质及其合适的混合物。可以例如通过使用涂层(例如卵磷脂)，在分散剂的情况中维持需要的颗粒大小和通过使用表面活性剂维持适当的流动性。在许多情况下，组合物中优选包含等渗剂，例如糖、多元醇(例如甘露醇)、山梨醇或氯化钠。可以通过向组合物中引入延缓吸收的试剂(例如单硬脂酸盐和明胶)来延长可注射的组合物的吸收。
灭菌的注射溶液的制备过程是将所需量的活性剂和根据需要的上述所列成分的一种或组合加入到适当的溶剂中，然后再进行灭菌微过滤。一般而言，分散液是通过将活性剂添加到包含基本分散介质和选自上述列举的成分的其它所需成分的灭菌媒介物中制备的。对于用于制备灭菌注射溶液的灭菌粉末的情况，优选的制备方法为真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其产生活性成分加上来自之前灭菌过滤溶液的任何需要的附加成分的粉末。
调节给药方案以提供所需的最佳反应(例如治疗反应)。例如，可以单次施用大丸剂，可以分几次剂量在不同的时间进行施用，或者施用剂量可以根据治疗状况的紧急程度成比例地降低或增加。例如，此处公开的人抗体可以经皮下注射每周施用一次或两次，或者经皮下注射每月施用一次或两次。
合适剂量范围和方案的非限定性实例包括施用2-50mg/kg(受试者的体重)，每周一次或每周两次或每三天一次或每两周一次，及施用1-100mg/kg，每周一次或每周两次或每三天一次或每两周一次。在各种实施方案中，将抗体以3.2mg/kg、6mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg或40mg/kg的剂量以每周一次、或每周两次或每三天一次或每两周一次的时间安排施用。附加的剂量范围包括：1-1000mg/kg、1-500mg/kg、1-400mg/kg、1-300mg/kg和1-200mg/kg。合适的剂量时间表包括每3天一次、每5天一次、每7天一次(即每周一次)、每10天一次、每14天一次(即每两周一次)、每21天一次(即每三周一次)、每28天一次(即每四周一次)及1个月一次。
如在实施方案中阐述，此处公开的抗体与附加的治疗剂组合使用可导致抗肿瘤活性的加性效应。因此，对于组合疗法，可使用抗体或第二治疗剂或两者的亚适量以实现由于试剂的加性效应而引起的所需剂量结果。例如，当与另一治疗剂组合使用时，在各种实施方案中可以以单独施用抗体时使用的剂量的90％或80％或70％或60％或50％的剂量施用本发明的抗体或其片段。
将非肠道组合物配制成单位剂量形式以便于施用和剂量的均匀性是非常有利的。此处所使用的单位剂量形式是指适于作为单一剂量施用于待治疗的受试者的物理上分散的单元；每个单元包含经计算与所需药物载体结合能够产生所需的治疗效果的预定量的活性剂。本发明的单位剂量形式的规格由(a)活性剂的独特性质和需要达到的特定治疗效果，和(b)配制这种活性剂用于个体中的灵敏治疗的技术领域中固有的局限规定，或直接取决于这些因素。
药学上可接受的抗氧化剂的例子包括：(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、偏亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、丙基没食子酸酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
对于治疗性组合物而言，本公开的制剂包括那些适于口服、经鼻、局部(包括口腔和舌下)、直肠、阴道和/或非肠道施用的制剂。制剂可以方便以单位剂量形式存在，且可以通过药学领域已知的方法进行制备。可以与载体材料组合以制成单一剂量形式的活性成分的量将会根据治疗的受试者和特定的施用模式而变化。可以与载体材料组合以制备单一剂量形式的活性成分的量通常为产生治疗效果的组合物的量。一般而言，该量为大约0.001百分比至大约90百分比的活性成分，优选为大约0.005百分比至大约70百分比，最优选为大约0.01百分比至大约30百分比。
适于阴道施用的本公开的制剂还包括包含本领域已知为合适的载体的阴道栓剂、止血塞、乳剂、凝胶剂、糊剂、泡沫或喷雾制剂。用于局部或经皮施用的本发明的组合物的剂型包括粉末、喷雾、药膏、糊剂、乳剂、乳液、凝胶、溶液、贴片和吸入剂。活性剂可以在灭菌条件下与药学上可接受的载体、与可能需要的任何防腐剂、缓冲液或推进剂混合。
此处所使用的术语“非肠道施用”和“肠道外施用”是指肠内和局部施用方式之外的其它施用方式，通常是经注射施用，包括但不局限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眼窝内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
本发明的药物组合物中可以使用的合适的水性和非水性载体的例子包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油(例如橄榄油)和可注射有机酯(例如乙基油酸酯)。可以例如通过使用包衣材料(例如卵磷脂)、在分散剂的情况中通过维持所需的颗粒大小以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。
这些组合物还可以包含辅剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。本领域公知的辅剂的特定例子包括例如无机辅剂(例如铝盐，例如磷酸铝和氢氧化铝)、有机辅剂(例如角鲨烯)、油基辅剂、病毒颗粒(例如包含源自流感病毒的膜结合性血凝素和神经氨酸酶的病毒颗粒)。
可以通过上面的灭菌过程和加入不同的抗菌剂和抗病毒剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等)来防止微生物的出现。还可能希望在组合物中包含等渗剂，例如糖、氯化钠等。此外，可以通过包含延缓吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来延长可注射的药物形式的吸收。
当本公开的抗体作为药品施用于人和动物时，它们可以单独施用，或者作为包含例如与药学上可接受的载体结合的0.001至90％(更优选0.005至70％，例如0.01至30％)的活性成分的药物组合物联合施用。
与选择的施用途径无关，本公开的抗体(其可以合适的水合形式使用)和/或本公开的药物组合物可以使用本领域技术人员已知的常规方法配制成为药学上可接受的剂型。
本公开的药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以改变以获得对于特定的患者、组合物和施用模式有效地实现希望的治疗反应而不会对患者产生毒性效应的活性成分的量。所选的剂量水平取决于多种药代动力学因素，包括采用的特定的组合物、或与此处提供的抗体或其片段共同施用的组合物、或其酯、盐或酰胺的活性、施用途径、施用时间、所使用的特定试剂的排泄率、治疗持续时间、与使用的特定组合物联合使用的其它的药物、化合物和/或材料、接受治疗的患者的年龄、性别、体重、状态、总体健康水平和之前的病史等医学领域已知的类似因素。具有本领域普通技能的医生或兽医能够很容易地确定和指定所需的药物组合物的有效量。例如，医生或兽医可以以低于达到希望的治疗效果所需的水平开始药物组合物中使用的本发明的抗体或其片段的剂量，然后再逐渐增加剂量直到实现希望的效果为止。一般而言，本发明的组合物的合适日剂量为提供有效地产生治疗效果的最低剂量的量。这样的有效剂量一般取决于上述因素。优选的施用方式为静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下施用，优选为接近目标位置施用。如果需要的话，治疗性组合物的有效的日剂量可以在整日时间内以适当的间隔以两个、三个、四个、五个、六个或更多个亚剂量独立地施用，任选地以单位剂量形式施用。尽管本公开的抗体单独施用是可能的，但是优选作为药物制剂(组合物)来施用该抗体。
可以使用本领域已知的医学装置来施用治疗性组合物。例如，在优选实施方案中，本发明的治疗性组合物可以使用无针的皮下注射装置进行施用，例如美国专利No.5,399,163，5,383,851，5,312,335，5,064,413，4,941,880，4,790,824或4,596,556中公开的装置。可用于本发明的公知植入物和模块的例子包括：美国专利No.4,487,603，其公开了用于以可控的速率的分配药物的可植入性微输注泵；美国专利No.4.,486,194，其公开了用于经皮施用的治疗装置；美国专利No.4,447,233，其公开了以精确的输注速率递送药物的药物输注泵；美国专利No.4,447,224，其公开了用于连续药物输送的可变流量的可植入输注装置；美国专利No.4,439,196，其公开了具有多腔隔室的渗透的药物递送系统；和美国专利No.4,475,196，其公开了渗透的药物递送系统。许多其它的这样的植入物、递送系统和模块是本领域技术人员已知的。
在某些实施方案中，此处公开的组合物可被配制用于确保适当的体内分布。例如，血脑屏障(BBB)排除了许多高亲水性化合物。为了确保本发明的组合物中的治疗化合物能够通过BBB(如果需要的话)，它们必须被配制例如到脂质体中。制备脂质体的方法可以参见，例如美国专利4,522,811；5,374,548和5,399,331。脂质体可以包含一个或多个被选择性地转运至特定的细胞或器官中的部分，因此能够提高靶向药物的转运(参见，例如V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29：685)。示例性的靶向部分包括叶酸或生物素(参见，例如Low等人的美国专利5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等人，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038)；抗体(P.G.Bloeman等(1995)FEBSLett.357：140；M.Owais等人(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39：180)；表面活性蛋白A受体(Briscoe等(1995)Am.J.Physiol.1233：134)，其不同种类可以包含于本发明的制剂中，以及本发明分子的成分；p120(Schreier等人(1994)J.Biol.Chem.269：9090)；还参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346：123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4：273。
V.使用抗体的方法
本发明还提供了在多种体外和体内诊断和治疗应用中使用与ErbB3相结合的抗体及其抗原结合部分的方法。例如，此处公开的抗体可用于治疗与ErbB3依赖性信号传导相关的疾病，包括多种癌症。
在一个实施方案中，本发明提供了通过施用受试者有效治疗疾病的量的本发明的抗体或其抗原结合部分来治疗与ErbB3依赖性信号传导相关的疾病。适当的疾病包括例如多种癌症，包括但不局限于黑素瘤、乳腺癌、卵巢癌、肾癌、胃肠癌、结肠癌、肺癌(例如非小细胞肺癌)和前列腺癌。
在优选实施方案中，测试从患者获得的肿瘤样品并且根据在2009年8月17日提交的题目为“Methods，Systems And Products ForPredicting Response Of Tumor Cells To A Therapeutic Agent AndTreating A Patient According To The Predicted Response”的国际申请No.PCT/US09/054051中的方法提供治疗，所述专利通过引用方式并入此处。例如，从待治疗的恶性肿瘤患者获得肿瘤的样品，测定样品中的磷酸-ErbB3水平，并且接着给患者施用至少一种抗肿瘤治疗剂，然而，如果样品中测定的pErbB3水平不低于在无血清培养基培养20-24小时后ACHN细胞培养物中测量的pErbB3水平的50％，那么随后给患者使用的至少一种抗肿瘤治疗剂包含本发明的抗ErbB3抗体(例如Ab#6)，并且如果样品中测定的pErbB3水平低于ACHN细胞培养物中测量的pErbB3水平的50％，那么随后给患者施用的至少一种抗肿瘤治疗剂不包含本发明的抗ErbB3抗体。
在一个实施方案中，癌肿包括KRAS突变。如实施例17中所显示，当用作单一试剂(单一疗法)或与另一治疗剂组合时，此处公开的抗体(例如Ab #6)能够抑制包含KRAS突变的肿瘤细胞的生长。在另一实施方案中，癌肿包括PI3K突变。如实施例19中所显示，当用作单一试剂(单一疗法)或与另一治疗剂组合时，此处公开的抗体(例如Ab #6)能够抑制包含PI3K突变的肿瘤细胞的生长。
抗体可以单独施用或与另一种与该抗体结合或协同发挥作用的治疗剂一起治疗ErbB3介导的信号传导相关的疾病。这样的治疗剂包括例如下文描述的抗癌剂(例如细胞毒素、化学治疗剂、小分子和放射治疗)。如如实施例16、17和19中所显示，与单一疗法中的使用相比较，此处公开的抗体(例如Ab #6)当与另一治疗剂组合使用时可显示提高的肿瘤生长抑制。组合疗法的优选的治疗剂包括埃罗替尼
Figure BPA00001545689500761
紫杉醇和顺铂(CDDP)。
在某些方面，给患者施用此处公开的抗体。
在另一个实施方案中，本发明提供了通过将此处公开的抗体或其抗原结合部分与来自受试者的细胞相接触(例如体外或体内)并测量结合细胞上的ErbB3的水平，来诊断受试者中与ErbB3上调相关的疾病(例如癌症)的方法。异常高的ErbB3结合水平意味着受试者患有与ErbB3上调相关的疾病。
本发明的范围内还包括包含本发明的抗体及其抗原结合部分的试剂盒。试剂盒可包括指示试剂盒内容物的预期用途的标签及任选地包括使用试剂盒治疗或诊断与ErbB3上调和/或ErbB3依赖性信号传导相关的疾病(例如治疗肿瘤)的说明书。术语标签包括任何试剂盒上或随试剂盒提供的文字、销售材料或记录材料，或其它随试剂盒的材料。
下述实施例将会进一步阐明本发明，但是不应该理解为限定本发明。序列表、附图和所有本申请所引用的参考文献、专利和专利申请公开的内容在此清楚地引入作为参考。
实施例
材料和方法
在整个实施例部分中，除非特别说明，使用下述材料和方法。
一般而言，除非特别说明，本发明各个方面的实施使用化学、分子生物学、重组DNA技术、免疫学(特别是例如抗体技术)的常规技术和多肽制备的标准技术。参见，例如Sambrook，Fritsch和Maniatis，Molecular Cloning：Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)；Antibody Engineering Protocols(Methods in Molecular Biology)，510，Paul，S.，Humana Pr(1996)；Antibody Engineering：A Practical Approach(Practical Approach Series，169)，McCafferty，Ed.，Irl Pr(1996)；Antibodies：A Laboratory Manual，Harlow等人，C.S.H.L.Press，Pub.(1999)；和Current Protocols in Molecular Biology，eds.Ausubel等人，John Wiley & Sons(1992)。用于分析HCV生物学特征的体外和体内模型系统描述于例如Cell culture models and animal models of viralhepatitis.Part II：hepatitis C，Lab.Anim.(NY).；34(2)：39-47(2005)和The chimpanzee model of hepatitis C virus infections，ILAR J.；42(2)：117-26(2001)中。
神经调节素
如这些实施方案和附图中所使用，HRG是指神经调节素的同种型，不同地名称为神经调节素1β1、HRG1-B、HRG-β1、神经调节蛋白1、NRG1、神经调节蛋白1β1、NRG1-b1、HRG ECD等。HRG可商购，例如R&D Systems #377-HB-050/CF。
细胞系
下述实验中所使用的所有细胞系如所说明的均自国家癌症研究所(National Cancer Institute，ATCC，Manassas，VA)、美国国家癌症研究所(National Cancer Institute，NCI，www.cancer.gov)获得，例如自癌症治疗和诊断(DCTD)部门或自出版物引用所说明的研究者。
·MCF7-ATCC cat.No.HTB-22
·T47D-ATCC cat.No.HTB-133
·Colo357-Kolb等人(2006)Int.J.Cancer，120：514-523。还参见Morgan等人(1980)Int.J.Cancer，25：591-598。
·Du145-ATCC cat.No.HTB-81
·OVCAR8-NCI
·H1975-ATCC cat.No.CRL-5908
·A549-ATCC cat.No.CCL-185
·MALM-3M-NCI
·AdrR-NCI
·ACHN-ATCC cat.No.CRL-1611
肿瘤细胞的粉碎
冷冻粉碎机(Covaris Inc)被用于粉碎肿瘤。肿瘤被储存在特殊的袋子中(在添加肿瘤之前预先称重)，在对它们进行操作时置于液氮中。对于小的肿瘤，向容纳肿瘤的袋子中先加入200uL裂解缓冲液，在液氮中冷冻，然后再粉碎以提高袋中肿瘤的回收率。粉碎的肿瘤被转移至2mL的微量离心管中，并置于液氮中，直至准备进行进一步的加工。
肿瘤细胞裂解
肿瘤细胞在补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液中进行裂解。裂解缓冲液被添加至肿瘤的等分试样中，最终浓度为大约62.5mg/mL。肿瘤样品通过涡旋匀浆30秒，并在冰上孵育大约30分钟。裂解产物在QIAGEN QIASHREDDER柱上旋转大约10分钟，以进一步对样品进行均质处理。澄清的裂解产物在干净管中被分为等分试样以用于下一步处理。
BCA分析
按照厂商的方案对所有的肿瘤样品进行BCA分析(Pierce)。各肿瘤样品的总蛋白浓度(以mg/mL计)随后用于ELISA结果的标准化。
ELISA分析
所有的用于总的和磷酸-ErbB3的ELISA的ELISA试剂均作为DUOSET试剂盒购自于R&D Systems。使用50μL抗体包被96孔NUNC MAXISORB板，在室温下孵育过夜。第二日早上，在BIOTEK板洗涤器中使用加入了吐温洗涤剂(0.05％ Tween-20)的不含钙或镁的杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水(PBS)(PBST)洗涤(1000μl/孔)板三次。然后在室温下使用PBS中的2％BSA封闭板大约一个小时。在BIOTEK板洗涤器中使用PBST(0.05％ Tween-20)洗涤(1000μl/孔)板三次。然后使用50/μL细胞裂解产物和稀释于50％的裂解缓冲液和1％BSA中的标准品(一式三份)用于进一步处理。样品在4℃下在板振动器上孵育2个小时，且如上洗涤板。加入大约50μl在2％BSA中稀释的检测抗体，加入PBST，在室温下孵育大约1小时。对于磷酸-ErbB3，检测抗体与辣根过氧化物酶(HRP)直接偶联，并在室温下孵育2小时。如上洗涤板。加入大约50μl抗生蛋白链菌素-HRP，并在室温下孵育30分钟(除了pErbB3以外)。如上洗涤板。加入大约50μLSUPERSIGNAL ELISA Pico(Thermo Scientific)底物，使用FUSION板阅读器读板。使用EXCEL分析数据。重复样品取平均值，且误差条用于代表两次重复试验的标准偏差。
实施例1：使用噬菌体展示制备抗体
为了获得此处中称作Ab #6、Ab #3、Ab #14、Ab #17和Ab #19的人抗ErbB3抗体，对包含来自人供体的免疫球蛋白序列的独特组合的人Fab噬菌体库(Hoet等人，同上)进行ErbB3结合物的初步筛选。
使用纯化的ErbB3和表达细胞表面ErbB3的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系，从库中识别到73种独特的Fab序列(使用上述的方法或其轻微变化获得)。然后将这73种克隆重排(reformat)为仅无噬菌体的Fab。使用高通量方法，这些Fab被小规模地表达，并使用ELISA和FLEXCHIP方法(是一种高通量表面等离子共振(SPR)技术)测试其结合。将无噬菌体的73种Fab点样在芯片表面上，并测量结合动力学以及对ErbB3-his融合靶蛋白质或ErbB3-Fc蛋白质(R&D Systems)的表位封闭。从所得数据计算平衡结合常数以及Fab的结合/解离速率。
使用大约500nM Fab和1∶750稀释的山羊抗人Alexa 647第二抗体稀释液来研究各种不同Fab对MALME-3M细胞的结合。如图1A和1B所示，使用上述的方法或其轻微变化获得的数据表明几种候选Fab显示出明显的MALME-3M细胞染色。
实施例2：抗ErbB3 Fab的优化
在识别出阻断ErbB3配体(神经调节素)与ErbB3的结合的Fab之后，下面对Fab的VH和VL序列进行密码子优化。
使用表达为IgG1或IgG2同种型的表达构建体来重排VH和VL区域。该构建体包括具有用于替换适当的重链和轻链序列的表达盒的SELEXIS骨架。SELEXIS载体包含CMV启动子和匹配的poly-A信号。
密码子优化的Ab #6的VH和VL核酸序列(使用上述的方法或其轻微变化获得)分别显示于SEQ ID NO：25和26，Ab#3的这些序列分别显示于SEQ ID NO：27和28，如图22所示。
实施例3：ErbB3的结合亲和力
使用两项独立技术(即表面等离子共振分析和利用MALME-3M细胞的细胞结合分析)测量抗ErbB3抗体的解离常数。
表面等离子共振分析
按照Wassaf等人(2006)Analytical Biochem.，351：241-253中的描述在BIACORE 3000仪器等中使用重组ErbB3作为分析物且受试者抗体作为配体大体上进行表面等离子共振分析(例如FLEXCHIP分析)。基于公式KD＝Kd/Ka来计算KD值。
使用表面等离子共振分析使用上述的方法或其轻微变化测得的Ab #6和Ab #3的KD值分别示于图2A和2B中。Ab #6的KD值显示为大约为4nM，Ab #3的KD值显示为大约为8nM。此外，表面等离子共振表明Ab #6与HRG竞争与ErbB3的结合。
细胞结合分析
进行细胞结合分析确定Ab #6和Ab #3的KD值，如下所示。
使用2mL胰蛋白酶-EDTA+2mL RMPI+5mM EDTA在室温下使MALME-3M细胞脱壁5分钟。立即向胰蛋白酶化的细胞中加入完全RPMI(10mL)，温和地重悬，并使用Beckman台式离心机在1100rpm下旋转5分钟。细胞重悬于BD染色缓冲液(PBS+2％FBS+0.1％叠氮化钠，Becton Dickinson)中，浓度为每毫升2x106细胞，将50μl(1x105细胞)等分试样接种到96孔滴定板中。
在微量离心管中制备溶于BD染色缓冲液的150μl 200nM抗ErbB3抗体(Ab #6或Ab #3)的溶液，并连续2倍稀释至75μl BD染色缓冲液中。稀释的抗体的浓度范围为200nM至0.4nM。向50μl细胞悬浮液中直接加入50μl等分的不同蛋白质稀释液，达到最终浓度100nM、50nM、25nM、12nM、6nM、3nM、1.5nM、0.8nM、0.4nM和0.2nM的抗体。
在室温下，96孔板中的等分细胞在平板振动器上与蛋白质稀释液一起孵育30分钟，并使用300μl BD染色缓冲液洗涤3次。在冷室中，细胞在平板振动器上与BD染色缓冲液中的100μl Alexa 647-标记的山羊抗人IgG的1∶750稀释液一起孵育45分钟。最后，洗涤细胞两次，沉淀并重悬于250μl BD染色缓冲液+0.5μg/ml碘化丙锭中。10000个细胞的分析是在FACSCALIBUR流式细胞仪中使用FL4通道完成的。MFI值以及对应的抗ErbB3抗体的浓度分别绘在y轴和x轴上。使用GraphPad PRISM软件使用非线性回归曲线的单位点结合模型来确定分子的KD值。
基于公式Y＝Bmax*X/KD+X(Bmax＝饱和时的荧光值，X＝抗体浓度，Y＝结合度)来计算KD值。如由图2C和2D所示的数据计算，在使用MALME-3M细胞的细胞结合分析(使用上述的方法或其轻微变化)中，得到的Ab#6和Ab#3的KD值分别为大约4nM和1.3nM。
Figure BPA00001545689500831
分析
在研究Ab #6结合动力学的附加实验中，使用动力学排除分析测定Ab #6的结合和解离速率。使用
Figure BPA00001545689500833
仪(SapidyneInstruments，Boise，ID)测得结合速率为1.43x105M-1s-2且解离速率为1.10x10-4s-1，其中解离常数(Kd)测定为769pM。
实施例4：对于ErbB3的结合特异性/表位结合
如下所述，使用ELISA对Ab #6的IgG2同种型与ErbB3的结合特异性进行分析。并分析Ab #6所结合的表位的识别。
使用50μl/孔的5μg/ml单独的蛋白质(蛋白质为重组人EGFR胞外结构域、BSA、重组人ErbB3胞外结构域和TGF-α)包被96孔NUNCMAXISORB板，并在室温下孵育过夜。第二日早上，在BIOTEK板洗涤器中使用PBST(0.05％ Tween-20)洗涤板(1000μl/孔)三次。然后在室温下使用PBS中的2％BSA封闭孔大约一个小时且如上再次洗涤板。在2％BSA，PBST中以不同的稀释比例(1μM，2倍系列稀释)加入大约50μl Ab #6。所有的样品重复试验两次，在4℃下平板振动器上孵育2小时。如上洗涤板。加入50μl人IgG-Fc检测抗体(HRP偶联的Bethyl Inc；1∶75000稀释于2％BSA，PBST中)，且板在室温下孵育1小时。如上再次洗涤板。加入50μl SUPERSIGNAL ELISA Pico底物，并在FUSION板阅读器(Packard/Perkin Elmer)上读板。数据使用EXCEL程序进行分析。重复样品取平均值，误差条用于代表两次重复试验的标准偏差。
如图3所示，使用上述的方法或其轻微变化获得的数据表明在ELISA中Ab #6结合重组ErbB3，但没有显示出与EGFR、BSA或TGF-α的明显结合。
将编码对应于成熟ErbB3的氨基酸残基1-183(SEQ ID NO：73)的ErbB3胞外结构域片段的DNA片段克隆到酵母展示载体pYD2(pYD1(Invitrogen)的改良版本，具有经工程化置于His标记之前的终止密码子)中Nhe和BsiWI限制性位点之间。将质粒转化到酵母菌株EBY100(Invitrogen)中，包含质粒的克隆在Trp-选择性培养基中进行选择。克隆在含葡萄糖的培养基中于30℃生长过夜，并通过将其转移至含半乳糖的培养基中18℃生长2天以诱导ErbB3截断突变体的表达。使用50nM Ab #6对显示ErbB3截断突变体的酵母进行染色，然后再使用Alexa染料-647标记的山羊抗人抗体进行染色。使用山羊抗人抗体对单独的样品进行染色仅仅用于显示不存在第二抗体对酵母的非特异性结合。在FACSCALIBUR细胞分选仪(BDBiosciences)上使用流式细胞仪进行分析。
如图39呈现的数据(使用上述的方法或其轻微变化获得)所示，Ab#6结合ErbB3胞外结构域，即结合成熟ErbB3的氨基酸残基1-183(SEQ ID NO：73)。
实施例5：肿癌细胞上总ErbB3的下调
测试Ab #6在体外和体内下调肿瘤细胞中ErbB3表达的能力，如下所述。
将MALME-3M细胞接种于96孔组织培养板上，并在37℃的补充有抗生素、2mM L-谷氨酰胺和10％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养基和5％二氧化碳中生长24小时。然后培养基更换为没有FBS且有或没有1μM、250nM、63nM、16nM、4.0nM、1.0nM、240pM、61pM和15pM浓度的抗体的相同培养基。将不含FBS或抗体的培养基用作对照。细胞于37℃、5％二氧化碳中生长24小时，用冷的PBS洗涤，然后使用加入了150mM NaCl、5mM焦磷酸钠、10μM bpV(phen)、50μM苯胂、1mM原钒酸钠和蛋白酶抑制剂混合物(cocktail)(Sigma，P2714)的哺乳动物蛋白提取物(MPER)裂解缓冲液(Pierce，78505)缓冲液收获细胞。使用PBST中(0.1％ tween-20)的磷酸缓冲盐水中的4％牛血清白蛋白将细胞裂解产物稀释两倍，然后通过ELISA使用小鼠抗人ErbB3捕获抗体和生物素化小鼠抗人ErbB3第二检测抗体进行分析。抗生蛋白链菌素与可与SUPERSIGNAL ELISA Pico化学发光底物(Pierce，37070)反应的辣根过氧化物酶偶联，从而产生了信号。使用光度计来定量ELISAS。
如图4所示，使用上述的方法或其轻微变化获得的数据显示通过体外ELISA测量显示，Ab #6在体外降低了MALME-3M细胞的总ErbB3水平大约46.9％。
在进一步的实验中，通过FACS分析来研究使用Ab#6的IgG1和IgG2同种型对MALME-3M细胞上ErbB3受体的下调。MALME-3M细胞在15cm皿中进行胰蛋白酶化，并使用RPMI+10％FBS洗涤一次。重悬细胞沉淀，使其密度为每毫升1x106个细胞。两等分的2x105细胞被加入到12孔组织培养板中的分别的孔内，并每等分重悬于最终体积为800μl的RPMI+10％ FBS中。向一个孔中加入Ab #6 IgG1或Ab #6 IgG2同种型，最终浓度为100nM(处理的样品)，向其它孔中加入等体积的PBS(未处理的样品)。
第二日，处理的和未处理的细胞被胰蛋白酶化、洗涤，并在冰上与BD染色缓冲液中的100mM Ab #6孵育30分钟。使用1ml BD染色缓冲液洗涤两次，并在冰上与100μl 1∶500稀释的Alexa 647标记的山羊抗人Alexa 647稀释液一起孵育45分钟。然后再洗涤细胞，重悬浮于300μl BD染色缓冲液+0.5μg/ml碘化丙锭中。10000个细胞的分析是在FACSCALIBUR流式细胞仪中使用FL4通道完成的。
如图5A和5B所示，使用上述方法及其轻微变化获得的数据显示Ab #6的IgG1和IgG2同种型分别下调MALME-3M细胞上的ErbB3大约62％和大约66％。
为了确定这种ErbB3的下调是否是由于MALME-3M细胞表面上的ErbB3受体的内在化，进行细胞表面荧光淬灭分析。将MALME-3M细胞接种于6孔板(0.2x106/孔)上RPMI+10％FBS中过夜。第二天，移除旧的培养基并且将细胞在冰上在含有与荧光染料Alexa 488偶联的100nM Ab #6的RPMI+2％FBS中预孵育。然后将细胞放回37℃孵育器且孵育0.5h、2h或24h。在每个时间点末期时，将细胞胰蛋白酶化、用PBS+2％BSA+0.1％叠氮化钠(FACS染色缓冲液)洗涤且储存于冰上直至准备好所有的样品。对于0h时间点，将预孵育60分钟后的细胞立即胰蛋白酶化且储存于冰上。从所有的时间点收获细胞后，将每个时间点的样品分到两个管中。一组管用25μg/ml抗Alexa 488抗体在冰上孵育60分钟以淬灭细胞表面上的任何荧光源(即Alexa488偶联的Ab #6)。另一组管保持不淬灭且在该孵育期间储存于冰上。在淬灭期间的末期，用FACS染色缓冲液洗涤细胞两次且重悬浮于最终体积为300μl的FACS染色缓冲液中。对于每种样品收获10,000个细胞且用FACSCALIBUR流式细胞仪分析。此方案给出多少比例的AB#6(通过荧光测定)仍在细胞表面上(通过在每个时间点淬灭细胞和未淬灭细胞之间的荧光差异来显示)和对少AB #6内在化(通过淬灭细胞的荧光水平来显示)的指征。
如图6所示，分别在0小时(图6A)、0.5小时(图6B)、2小时(图6C)和24小时(图6D)测量了在Ab#6存在下ErbB3的下调。如图6A-6D所示，在大约30分钟之后，细胞表面ErbB3受体被下调了大约50％，且在大约24小时时，细胞表面受体被下调了大约93％。
如下所述，还对Ab#6在体内引起黑素瘤细胞中ErbB3下调的能力进行了研究。
T细胞缺陷型nu/nu小鼠(源自NIH的3-4周大的雌性小鼠；远系杂交；白化背景)购自Charles River实验室(Wilmington，MA)。用于植入的MALME-3M细胞在收获之前在培养基(RPMI培养基，10％ FBS，L-谷氨酰胺和抗生素，37℃，5％ CO2)中生长达到大约80％汇合(confluency)。细胞在植入之前一直维持在冰上。在小鼠右侧腹皮下注射植入100μl MALME-3M细胞(PBS中3.5x106个细胞)，并使其恢复，同时监控初始肿瘤生长。
使用数字测径器测量肿瘤(长度×宽度)，且用鼠IgG2a(Sigma，M7769-5mg)通过静脉内注射预治疗小鼠以体内阻断鼠Fc受体消耗测试的抗体。每隔一天对小鼠腹膜内施用15μg或100μg Ab #1、Ab #6、Ab #11和Ab #13，每种各自为IgG1和IgG2形式，每周对肿瘤进行三次测量，将测量记录在微软EXCEL电子表格中。
记录最终的肿瘤测量数据(LxW)，使用CO2窒息法对小鼠进行安乐死，切除肿瘤，在液氮中速冻，并储存于-80℃(用于生化分析)。分析最终肿瘤测量数据，并根据例如Burtrum等人，(2003)Cancer Res.，63：8912-8921中所描述的绘制肿瘤面积和肿瘤体积的曲线图。还可以通过“标准化”和“非标准化”的方式来分析肿瘤体积和肿瘤面积的数据。对于各测量时间点的数据的“标准化”，各组中的各个肿瘤除以由测径器确定的初始肿瘤大小。
如图7所示，PBS用作对照且这种异种移植物模型中测试的各种抗体包括IgG2同种型中的Ab #11和IgG1和IgG2同种型中的AB #1、Ab #6和Ab #13中的每一个。其中，单独的Ab #6导致总ErbB3的显著下降，在用Ab #6的IgG1或IgG2同种型形式治疗的肿瘤中注射24小时后立即看到效果。
在进一步实验中，研究了Ab #6在体内下调AdrR异种移植物中ErbB3的能力。
简而言之，样品在冷冻粉碎机(Covaris Inc)中粉碎。肿瘤被储存在特殊的袋子中(在加入肿瘤之前预称重)，并在操作过程中置于液氮中。对于小的肿瘤，首先向容纳肿瘤的袋子中加入200μL裂解缓冲液，在液氮中冷冻，然后再粉碎以提高袋中肿瘤的回收率。粉碎的肿瘤被转移至2mL的微量离心管中，并置于液氮中，直到进行裂解。肿瘤在补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液中进行溶解。裂解缓冲液被添加至肿瘤的等分试样中，最终浓度为大约62.5mg/mL。肿瘤样品被涡旋30秒使其均质化，然后在冰上静置大约30分钟。细胞裂解产物在QIAGEN QIASHREDDER柱上旋转大约30分钟，以进一步使样品均质化。澄清的细胞裂解产物在干净管中被分为等分试样。
根据上述材料和方法部分所述大体上进行BCA分析。
ErbB3的总水平通过ELISA确定。ELISA试剂作为DUOSET试剂盒购自R&D Systems。使用50μL各捕获抗体包被96孔NUNCMAXISORB板，并在室温下孵育过夜。第二日早上，在BIOTEK板洗涤器中使用PBST(0.05％ Tween-20)洗涤板(1000μl/孔)三次，然后在室温下使用PBS中的2％BSA封闭板一个小时。随后如上再次洗涤板。然后将细胞裂解产物(50μL)和标准样稀释于50％的裂解缓冲液和1％BSA中；所有的样品重复进行两次。板在4℃下在板振动器上孵育2个小时，然后如上再次洗涤板。加入50μl用2％ BSA，PBST稀释的检测抗体，且板在室温下孵育1小时。如上再次洗涤板。加入50μl抗生蛋白链菌素-HRP，且板在室温下孵育30分钟。如上再次洗涤板。加入50μL SUPERSIGNAL ELISA Pico底物，使用Fusion板阅读器进行读数。使用Microsoft EXCEL分析数据。重复试验样品取平均值，误差条用于代表两次重复试验的标准偏差。
试验的结果示于图8中。如图8所示，在AdrR异种移植物中Ab #6在体内下调ErbB3。
实施例6：肿瘤细胞增殖的抑制
如下所示，研究了Ab#6抑制表达ErbB3的细胞(例如癌症细胞)的细胞增殖的能力。
将MALME3M、ACHN和NCI/AdrR细胞接种于96孔组织培养板中，并在37℃、5％二氧化碳中于补充有抗生素、2mM L-谷氨酰胺和10％FBS的RPMI-1640培养基中生长24小时。然后培养基更换为具有抗生素和2mM L-谷氨酰胺、不具有FBS和在1μM、250nM、63nM、16nM、4.0nM、1.0nM、240pM、61pM和15pM浓度下存在或不存在Ab #6抗体的RPMI-1640培养基。细胞于37℃、5％二氧化碳中生长96小时，然后使用CellTiter-
Figure BPA00001545689500891
Luminescent CellViability Assay(Promega，G7573)收获细胞，并在光度计上进行分析。不含血清和抗体的培养基作为对照。
如图9、10和11所示，使用上述方法或其轻微改变获得的数据显示Ab#6抑制了表达ErbB3的MALME-3M细胞(图9)、AdrR卵巢癌细胞(图10)和ACHN细胞(图11)的增殖。具体而言，使用CellTiter-
Figure BPA00001545689500892
分析测量得到，Ab #6抑制MALME-3M细胞大约19.6％的增殖，抑制AdrR卵巢癌细胞大约30.5％的增殖。同时，如图11所示，Ab#6抑制了ACHN细胞大约25.4％的增殖。
实施例7：肿瘤细胞中ErbB3磷酸化的抑制
如下所述，研究了Ab#6在体内抑制ErbB3磷酸化的能力。
参照图8，随后如上述实施例5所述粉碎样品。如上述材料和方法部分所述大体上进行BCA分析，并参照图8根据上述实施例5中的描述大体上进行ELISA分析。
这个试验的结果(使用上述方法或其轻微变化获得)示于图12中。如图12所示，如按照以ng/mg总蛋白质计的磷酸化ErbB3(pErbB3)的量测量的，Ab #6在体内显著地抑制AdrR卵巢异种移植物中的ErbB3磷酸化。
如下所述，体外研究了Ab#6抑制BTC或HRG诱导的ErbB3磷酸化。
在用50mM BTC、10mM HRG或333nM TGF-α刺激之前，卵巢AdrR细胞与Ab #6一起预孵育30分钟。预孵育之后，去除培养基，且细胞在37℃、5％CO2下使用50nM BTC或333nM TGF-α刺激5分钟。还使用HRG对照(5分钟，5nM)、10％血清和0％血清对照。使用1X冷PBS洗涤细胞，并通过在冰上孵育30分钟在30μl冷裂解缓冲液(M-PER缓冲液(Pierce)加钒酸钠(NaVO4，Sigma)、2-甘油磷酸、氧化苯胂、BpV和蛋白酶抑制剂)中进行裂解。细胞裂解产物置于-80℃下储存过夜。
如图13A-13C所示，使用上述方法或其轻微变化获得的数据显示Ab #6能够显著抑制β细胞素和神经调节素介导的ErbB3的磷酸化。
如下所述，在进一步的试验中，研究了Ab#6抑制卵巢肿瘤细胞系OVCAR 5和OVCAR 8中的ErbB3磷酸化的能力。
OVCAR 5和OVCAR 8细胞系得自国家癌症研究所的癌症治疗和诊断部门(“DCTD”)。按照上述材料和方法部分所述的内容大体上进行ELISA。
该试验的结果(使用上述方法或其轻微变化获得)描述于图14A和14B中。如所示，Ab#6抑制OVCAR 5和OVCAR 8卵巢癌细胞系中的ErbB3磷酸化。
如上所述，Ab#6抑制β细胞素介导的ErbB3磷酸化。为了研究β细胞素介导的ErbB3磷酸化是通过ErbB1还是通过ErbB3发生，进行了下述试验。
AdrR细胞或MALME-3M细胞(1x105)在冰上与25μM抗ErbB3Ab #6或25μM西妥昔单抗(抗ErbB1)在50μl BD染色缓冲液中预孵育30分钟。30分钟以后，向细胞中加入50μl 400mM生物素化的BTC，并在冰上再孵育30分钟。这产生12.5μM抗体和200nM BTC的最终浓度。然后使用500μl BD染色缓冲液洗涤细胞两次，并与100μl抗生蛋白链菌素-PE(PE＝藻红蛋白)(Invitrogen)在BD染色缓冲液中的1∶200稀释液一起孵育45分钟。最后，洗涤细胞两次，重悬于300μl BD染色缓冲液中，并在FACSCALIBUR流式细胞仪中进行分析。作为阳性对照，1x105 AdrR或MALME-3M细胞在冰上与200nMBTC一起孵育30分钟，洗涤两次并与1∶200稀释的抗生蛋白链菌素-PE一起孵育45分钟。为了评估来自抗生蛋白链菌素-PE偶联物的背景染色，细胞与单独的100μl的1∶200稀释的抗生蛋白链菌素-PE孵育45分钟。
试验的结果(使用上述方法或其轻微变化获得)示于图15A-15C中。如图15A所示，BTC不显示任何明显的与ErbB1阴性MALME-3M细胞的结合。但是，如图15B和15C所示，BTC确实显示出与ErbB1阳性AdrR细胞的结合。
同样，如图15B和15C所示，与ErbB1的结合受到西妥昔单抗
Figure BPA00001545689500911
的阻断，西妥昔单抗是特异性地与EGFR结合的抗EGFR抗体，并作为对照以证明EGF样配体与EGFR结合，且其在例如Adams等人(2005)，Nature Biotechnology 23，1147-1157中有所描述。
实施例8：肿癌细胞中神经调节素介导的信号传导的抑制
如下所述，研究了Ab #6抑制神经调节素介导的肿瘤细胞信号传导的能力。
MALME-3M细胞和OVCAR8细胞分别接种于96孔组织培养板中(35,000细胞/孔)，并在37℃、5％二氧化碳中于补充有抗生素、2mML-谷氨酰胺和10％FBS的RPMI-1640培养基中生长24小时。细胞在37℃、5％二氧化碳中于含抗生素、2mM L-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基中血清饥饿24小时。细胞用或不用浓度为1μM、250nM、63nM、16nM、4.0nM、1.0nM、240pM、61pM和15pM的抗ErbB3抗体(Ab #6的IgG2同种型)预处理30分钟，然后在37℃和5％二氧化碳下使用HRG刺激10分钟。对照为没有添加抗体的HRG和未治疗的细胞(无HRG和无Ab)。使用冷PBS洗涤细胞，然后使用包含150mM NaCl、5mM焦磷酸钠(Sigma，221368-100G)、10μM bpV(phen)(Calbiochem，203695)、50μM氧化苯胂(Calbiochem，521000)、1mM原钒酸钠(Sigma，S6508-10G)和蛋白酶抑制剂混合物(Sigma，P2714)的哺乳动物蛋白提取物(M-PER)裂解缓冲液(Pierce，78505)收获细胞。使用PBST(0.2％ tween-20)中的4％牛血清白蛋白将细胞裂解产物稀释两倍，然后使用ELISA分析ErbB3或AKT(ErbB3的下游效应子)的磷酸化。
为了测试AKT磷酸化，细胞裂解产物使用AKT特异性捕获抗体和对磷酸AKT(pAKT)的磷酸-丝氨酸473特异性的生物素化检测抗体在ELISA板上进行试验。用与SUPERSIGNAL ELISA Pico化学发光底物(Pierce，37070)反应的辣根过氧化物酶偶联的抗生蛋白链菌素产生信号。为了分析ErbB3的磷酸化，细胞裂解产物用ErbB3特异性的捕获抗体和与辣根过氧化物酶偶联的抗磷酸酪氨酸检测抗体在ELISA板上进行试验。其然后再与相同的化学发光底物反应。使用分光计测量ELISA上的发光信号。
如图16A-D中呈现的数据(使用上述方法或其轻微变化获得)所示，根据降低的ErbB3(图16A)和AKT(图16B)磷酸化确定，Ab #6是MALME-3M细胞和OVCAR8细胞中神经调节素介导的信号传导的强力抑制剂。值得注意的是，观察到Ab#6基本上完全抑制AKT和ErbB3中的每一个的磷酸化。
实施例9：卵巢、前列腺和胰腺肿瘤生长的抑制
为了评估Ab #6的体内效力，在裸鼠中建立了几种人癌症的异种移植物模型，且在Ab #6的多剂量下评估其对肿瘤生长的抑制。例如，T细胞缺陷型nu/nu小鼠(源自NIH的3-4周龄雌性小鼠；远系杂交；白化背景)购自Charles River实验室(Wilmington，MA)以用于异种移植物研究。在收获之前，用于植入的AdrR细胞在培养(RPMI培养基，10％FBS，L-谷氨酰胺和抗生素，37℃，5％ CO2)中生长至大约85％汇合。细胞在植入之前在冰上维持。在小鼠右侧腹皮下注射植入100μlAdrR细胞(PBS中的6x106个细胞)，并使其恢复，同时监控初始肿瘤生长。
使用数字测径器测量肿瘤(长度×宽度)，且小鼠静脉注射施用IgG2a(Sigma，M7769-5MG)。每三天对小鼠腹膜内施用30μg或300μg抗体#6，每周对肿瘤进行三次测量并记录在微软EXCEL电子表格中。
记录最终的肿瘤测量值(LxW)，使用CO2窒息法对小鼠进行安乐死，切除肿瘤，在液氮中速冻，并储存于-80℃(用于生化分析)。分析的最终肿瘤测量值，如上述Burtrum等人描述的绘制肿瘤的面积和肿瘤的体积曲线图。还通过“标准化”和“非标准化”的方式来分析肿瘤体积和肿瘤面积的数据。对于在测量的各时间点的数据的“标准化”，各组中的各肿瘤除以由测径器测定的初始肿瘤大小。
源自人肿瘤细胞系，AdrR(卵巢)、Du145(前列腺)和OvCAR8(卵巢)数据的三种不同模型的数据(使用上述方法或其轻微变化获得)显示于图17A-C中，且Colo357(胰脏)异种移植物研究数据显示于图17D中。这些图中的每一个中，右图显示在Ab#6的特定剂量下实现的血清水平且左图显示肿瘤体积随着不同的治疗的变化。来自这些研究的数据显示，每三天(Q3d)300μg剂量的Ab#6显著地抑制肿瘤的生长(在研究过程中多时间点p＜0.05)。此外，当在Du145前列腺癌模型以及肾脏(ACHN)和胰腺癌(COLO357)异种移植物模型中剂量增加为600μg(Q3d)时，Ab#6的这一抑制效应进一步提高。但是，将剂量进一步增加至1500μg Q3d并不能提高效率(OvCAR8-图17C；COLO357-图17D)，说明600μg对于肿瘤生长抑制为饱和剂量。从这些研究中动物血清的药代动力学(PK)分析显示Ab #6的血清保留有剂量依赖性的提高。同样，来自这些不同研究中的Ab #6的肿瘤内水平的生化分析显示0至～6pg Ab #6/μg总肿瘤裂解产物的剂量依赖性范围。
实施例10：ErbB3配体与肿瘤细胞上的ErbB3相结合的抑制
在进一步的试验中，如下所述研究了Ab #6和Ab #3抑制ErbB3配体与ErbB3的结合、而不是EGF样配体与EGFR的结合的特异性。
在一个试验中，为了研究Ab#6和Ab/Fab #3抑制神经调节素与ErbB3结合的能力，研究了Ab #6和Ab #3的Fab形式(Ab/Fab #3)抑制ErbB3配体(例如神经调节素和表皮调节素)与ErbB3结合的特异性。
MALME3M细胞(1x105)在冰上与10μM抗ErbB3抗体(例如Ab#6或Ab/Fab #3)在50μl BD染色缓冲液中孵育30分钟。30分钟之后，向细胞中加入50μl 40nM的生物素化神经调节素EGF，再在冰上孵育10分钟。这产生5μM抗体和20nM神经调节素EGF的最终浓度。然后使用500μl BD染色缓冲液洗涤细胞两次，并与100μl1∶200稀释的抗生蛋白链菌素-PE(PE＝藻红蛋白)(Invitrogen)在BD染色缓冲液中孵育45分钟。最后，洗涤细胞两次，重悬于300μl BD染色缓冲液中，并使用FACSCALIBUR流式细胞仪进行分析。作为阳性对照，1x105 MALME3M细胞在冰上与20nM神经调节素EGF一起孵育10分钟，洗涤两次并与1∶200稀释的抗生蛋白链菌素-PE一起孵育45分钟。为了评估来自抗生蛋白链菌素-PE偶联物的背景染色，1x105个MALME3M细胞与单独的100μl的1∶200稀释的抗生蛋白链菌素-PE一起孵育45分钟。
这一试验的结果(使用上述方法或其轻微变化获得)显示于图18A和18B中。如图18A和18B所示，Ab #6和Ab/Fab#3都能够抑制神经调节素与ErbB3的结合。
同样，如下所示还研究了Ab #6抑制另一ErbB3配体(表皮调节素)与ErbB3结合的能力。
AdrR细胞(1x105)在冰上与25μM抗ErbB3抗体、Ab #6或25μM抗ErbB1抗体西妥昔单抗或不添加抗体(作为对照)在50μl BD染色缓冲液中预孵育30分钟。30分钟后，向细胞中加入50μl 2μM生物素化的Epi，并在冰上再孵育30分钟。这产生12.5μM抗体和1μMEpi的最终浓度。然后使用500μl BD染色缓冲液洗涤细胞两次，并与100μl 1∶200稀释的抗生蛋白链菌素-PE(PE＝藻红蛋白、荧光蛋白)(Invitrogen)在BD染色缓冲液中孵育45分钟。最后，洗涤细胞两次，重悬于300μl BD染色缓冲液中，并使用FACSCALIBUR流式细胞仪进行分析。作为阳性对照，1x105 AdrR细胞在冰上与1μM Epi一起孵育30分钟，洗涤两次并与1∶200稀释的抗生蛋白链菌素-PE一起孵育45分钟。为了评估来自抗生蛋白链菌素-PE偶联物的背景染色，细胞与单独的100μl的1∶200稀释的抗生蛋白链菌素-PE一起孵育45分钟。
该试验的结果(使用上述方法或其轻微变化获得)示于图19A和19B中。如图19A所示，表皮调节素与ErbB3阳性AdrR细胞结合。此外，如图19B所示，这一结合受到西妥昔单抗和Ab #6两者的抑制，说明表皮调节素可能与EGFR和ErbB3两者都结合。
还进行了进一步的试验来研究Ab #6是否能够抑制EGF样配体(例如HB-EGF)与肿瘤细胞的结合。
AdrR细胞(1x105)在冰上与25μM Ab #6或25μM西妥昔单抗(作为对照)在50μl BD染色缓冲液中预孵育30分钟。30分钟之后，向细胞中加入50μl 400nM生物素化的HB-EGF，并在冰上再孵育30分钟。这产生12.5μM抗体和200nM HB-EGF的最终浓度。然后使用500μl BD染色缓冲液洗涤细胞两次，并与100μl 1∶200稀释的抗生蛋白链菌素-PE(PE＝藻红蛋白)(Invitrogen)在BD染色缓冲液中孵育45分钟。最后，洗涤细胞两次，重悬于300μl BD染色缓冲液中，并使用FACSCALIBUR流式细胞仪进行分析。作为阳性对照，1x105个AdrR细胞与200nM HB-EGF在冰上孵育30分钟，洗涤两次并与1∶200稀释的抗生蛋白链菌素-PE孵育45分钟。为了评估来自抗生蛋白链菌素-PE偶联物的背景染色，细胞与单独的100μl的1∶200稀释的抗生蛋白链菌素-PE孵育45分钟。
如图20中所列的数据(使用上述方法或其轻微变化获得)所示，HB-EGF与AdrR细胞结合，据推测与AdrR细胞上的ErbB1和ErbB4中的任一个或两者结合。Ab#6并不抑制这种结合，证明了Ab#6对抑制ErbB3配体(例如神经调节素和表皮调节素)与ErbB3的结合是特异性的。
实施例11：肿瘤细胞中VEGF分泌的抑制
使用VEGF分泌分析试验(VEGF ELISA，R&D Systems，DY293B)研究了Ab#6抑制表达ErbB3的细胞(例如癌细胞)的VEGF分泌的能力，如以上材料和方法中“ELISA分析”中所描述。首先，分析了Ab#6抑制未处理的和HRG处理的MCF-7、T47D和COLO-357细胞中VEGF分泌的能力。如图24A中所示，这些研究显示COLO-357向培养基中分泌最高量的VEGF。由于这些细胞还显示非常高的HRG水平，向培养基中添加HRG几乎不诱导VEGF分泌。相反，HRG能够诱导MCF-7和T47D细胞中的VEGF分泌。相比之下，HRG能够在MCF-7和T47D细胞中诱导多于两倍的VEGF分泌。在所有三种细胞系中，Ab#6均显示出在高水平下的强力抑制效果，最强的抑制是在COLO-357(图24A，FU＝荧光单位)中。
在三种不同的异种移植物中，Ab#6也显示类似的体内抑制VEGF分泌的效果，最强的抑制是在COLO-357异种移植物(图24B)中。VEGF的抑制与ErbB3磷酸化的抑制相关(图24C)。已表明骨髓瘤细胞分泌因子(例如VEGF和bFGF)引发血管发生(参见，例如Leung等人(1989)Science 246(4935)：1306-9；Yen等人(2000)Oncogene19(31)：3460-9)。本领域还已知VEGF分泌的抑制与肿瘤诱导的血管生成(一种肿瘤生长的促进因子)的抑制相关。
实施例12：细胞迁移的抑制
使用trans-well分析(Millipore Corp.，Billerica，MA，#ECM552)研究了Ab #6抑制表达ErbB3的细胞(例如MCF-7细胞)的迁移的能力。首先，使MCF-7细胞血清饥饿过夜，然后在存在或不存在Ab #6(最终浓度为8μM)的情况下在室温下孵育15分钟。然后将细胞转移至通过I型胶原涂覆的膜与下室分隔的上室中，细胞可通过所述I型胶原涂覆的膜迁移。在Ab #6的存在或不存在的情况下，向下室中的培养基中加入作为化学引诱物的10％ FBS。所述室在37℃孵育16小时，然后使用脱壁缓冲液去除通过所述膜迁移到更低的室中的细胞，并与细胞结合荧光染料一起孵育。使用荧光读板器来定量荧光。平均荧光±SEM(n＝2)显示于图25中。
如图25中呈现的数据(使用上述方法或其轻微变化获得)所示，与未处理的对照(1道)相比，10％FBS刺激细胞迁移(3道)，且8μM Ab#6抑制FBS诱导的细胞迁移(4道)。
实施例13：球状体生长的抑制
使用接近于进行肿瘤生长的条件的分析(Herrmann等人J BiomolScreen.2008年1月；13(1)：1-8.Epub 2007年11月26日)研究了Ab #6抑制表达ErbB3的细胞的球状体生长的能力。使用悬滴法(Herrman等人，同上)，以96孔板每孔一个球状体的频率启动AdrR(卵巢癌细胞系)和DU145(前列腺癌细胞系)球状体。使亚汇合细胞胰蛋白酶化、计数和重悬浮于过滤的培养基中。将细胞浓度调整至100,000细胞/ml，将一20μl液滴(含有2000细胞)加入96孔板的盖的下侧的每个环中。然后将具有这些悬挂液滴的盖放回到原来的96孔板，所述96孔板的每个孔中含100μl的PBS以保持湿润。初始接种后4天，将含悬挂液滴的盖重新接种新的96孔板。该重新接种包括将含悬挂液滴的盖转移到新鲜的1％琼脂糖/RPMI包被的96孔板，所述96孔板含150μl培养基/孔。然后将板和盖在500rpm一起离心1分钟以将含球状体的液滴从盖转移到孔中。然后将板在湿润的CO2孵育器中在37℃下进一步孵育。在倒置相差显微镜中给球状体拍照。在相同的放大率下给微米尺度拍照以测定球状体大小。使用Metamorph Analysis软件(MDS Analytical Technologies)测定球状体的直径。
然后如所述的那样使用Ab #6(最终浓度8μM)、神经调节素-β1EGF域(R&D Systems，396-HB，最终浓度3.4nM)或两者的组合处理由此获得的单个球状体。使用光学显微镜检查(10X物镜)在第1天和第13天测量球状体的直径。
图26A和26B中呈现的数据(使用上述方法或其轻微变化获得)显示Ab #6抑制AdrR细胞中的球状体生长，并且显示3.4nM HRG刺激球状体的生长而Ab #6抑制了HRG效应(图26B)。图26C中呈现的数据(使用上述方法或其轻微变化获得)显示在13天试验过程中，源自DU145的球状体大小没有增加；但是，HRG显著地刺激了其生长。在这些细胞中，8μM Ab #6抑制了HRG诱导的球状体生长。
在附加的实验中，研究了Ab #6抑制OVCAR8细胞、另一人卵巢癌细胞系的球状体生长的能力。如上产生多细胞肿瘤球状体。为了测试Ab #6对球状体生长的作用，在球状体形成的第1天和第4天将抗体加至25μg/ml的最终浓度。使用上述方法或其轻微变化获得的数据显示Ab#6导致OVCAR8球状体的面积下降30-40％。
实施例14：信号传导的抑制
研究了Ab #6抑制由不同配体诱导的信号传导的能力。例如，测试了Ab #6对HRG和BTC与表达ErbB3受体的AdrR细胞结合的效果。如图27A和图27B中呈现的FACS分析结果所示，Ab #6与HRG而不是BTC竞争结合AdrR细胞。因此，因为Ab #6不活化HRG诱导的信号转导(如以下实验所显示)Ab #6阻断HRG与ErbB3的结合将会阻止HRG诱导的信号传导。
测试了各种不同的配体对ErbB3磷酸化的诱导。至少三种配体HRG、BTC和HGF能够刺激AdrR细胞中ErbB3诱导的磷酸化，而EGF不能。如图28所示，Ab #6抑制了AdrR细胞中HGF诱导的pErbB3磷酸化。此外，如本领域已知的(参见，例如Wallenius等人(2000)Am J Pathol.156(3)：821-9)，在各种不同的上皮肿瘤或非上皮肿瘤中报道了增强的HGF信号传导。
ErbB3/c-MET相互作用以及Ab #6在调控这种相互作用中的作用
已经证明携带EGFR的活化突变的非小细胞肺癌通过募集c-MET和HER3并因此激活PI3K-AKT细胞存活途径而产生对酪氨酸激酶抑制剂的抗性(Engelmann等人(2007)Science 316：1039-1043；Gou(2007)PNAS：105(2)：692-697)。通过共免疫沉淀已经很好地确认了携带活化EGFR突变的细胞系中EGFR和c-MET之间的关联(Engelmann等人2007；Gou 2007)。Guo等人最近使用共免疫沉淀证明，c-MET和ErbB3也存在于已知依赖于扩增的c-MET的胃细胞系MKN45中的复合物中。
c-MET-ErbB3相互作用还发生在携带野生型EGFR的AdrR细胞中，且不依赖于扩增的c-MET。HGF(肝细胞生长因子)在AdrR细胞中以剂量依赖性的方式诱导ErbB3的磷酸化，如图28所示。此外，Ab #6抑制HGF诱导的erbB3磷酸化。
还研究了HRG和BTC对于ErbB1和ErbB3磷酸化的作用，发现HRG和BTC诱导ErbB1和ErbB3两者的磷酸化。发现HRG是ErbB3磷酸化的更加强力的诱导剂，而BTC是ErbB1磷酸化的强力诱导剂(图29A)。这一磷酸化很可能是由ErbB1和ErbB3的复合体驱动的。HRG结合ErbB3诱导了ErbB1和ErbB3之间复合体的形成，导致了两种受体的激活。相同的现象也很可能出现于BTC上，其中，BTC结合ErbB1刺激了ErbB1和ErbB3之间复合体的形成，导致了ErbB1和ErbB3两者的磷酸化。
HRG、BTC、EGF和HGF刺激的ErbB3磷酸化的抑制
下述方法研究了Ab #6抑制配体(HRG、BTC、EGF和HGF)诱导的ErbB3磷酸化的能力：
1.将AdrR细胞接种在96孔板上，密度为30000细胞/孔/100uL，培养基为含10％FBS的RPMI培养基，使细胞生长过夜；
2.第二日，通过改变培养基为不含FBS的培养基对细胞进行血清饥饿，并使其生长过夜；
3.使用不同浓度(0.01nM至100mM)的Ab#6或缓冲液(未处理，“0”)预处理细胞两小时；
4.然后使用10nM HRG或HGF刺激预处理的和未处理的细胞10分钟，或用10mM BTC或EGF刺激细胞5分钟，且不刺激未处理的细胞的单独的孔(“对照”)；
5.通过去除培养基并使用冰冷PBS洗涤细胞一次来终止反应；
6.然后使用含1X蛋白酶抑制剂和1X磷酸酶抑制剂的25mMTris，pH+7.5、150mM NaCl、1mM EDTA、1.0％ Triton X-100、1.0％CHAPS、10％v/v甘油来裂解细胞；以及
7.根据厂商的说明，使用Human Phospho-ErbB3 ELISA试剂盒(R&D Systems，DYC1769)来测量细胞裂解产物中的ErbB3磷酸化。
在图38A-D中列出了由上述方法或其轻微变化而获得的结果。
ErbB2-ErbB3蛋白复合物形成的抗体抑制
AdrR细胞与缓冲液(对照)或250nM Ab #6在室温下预孵育60分钟，然后再用10nM HRG或10nM BTC或对照缓冲液处理10分钟。细胞在含0.2mM PMSF、50mTU/mL抑肽酶和100μM亮肽酶素(leupeptin)的25mM Tris，pH+7.5、150mM NaCl、1mM EDTA、1.0％Triton X-100、1.0％ CHAPS、10％ v/v甘油中裂解，且裂解粗产物短暂离心以去除不溶物质。将上清液转移至新的微量离心管中，以1∶500稀释度加入抗ErbB3抗体(Santa Cruz sc-285)。上清液在4℃下温和摇动孵育过夜。首先使用1X PBS洗涤60μl Immobilized Protein A/G琼脂糖珠子(Pierce，Rockford，IL，#20421)。将细胞裂解产物-抗体混合物加入到PBS洗涤的珠子中，在4℃下温和摇动孵育2小时。然后使用冰冷裂解缓冲液洗涤免疫沉淀物三次，重悬于30μl 2XSDS样品缓冲液中，在95℃热变性7分钟，在4-12％ Bis-TrisGels SDS-PAGE上电泳，并在含10％ MeOH的Tri-甘氨酸缓冲液中电转移到PVDF膜上。膜在10ml封闭缓冲液中(Li-Cor Biosciences，Lincoln，NE，#927-40000)封闭1小时，然后与1∶1000的抗ErbB2抗体(Cell SignalingTechnology，Danvers，MA，# 29D8)在10ml封闭缓冲液(Li-CorBiosciences，# 927-40000)中孵育。使用1∶5000的山羊抗-兔IRDye800(2μl)在10ml封闭缓冲液(Li-Cor Biosciences，# 927-40000)中检测信号。
通过上述方法或其轻微变化，Ab#6显示完全抑制HRG刺激的ErbB2/3复合物形成(图29B)。
实施例15：Ab #6的抑制特征与西妥昔单抗、拉帕替尼和帕妥珠 单抗不同
在此实施例中，在存在Ab#6、西妥昔单抗、拉帕替尼或帕妥珠单抗的情况下用HRG或BTC刺激的AdrR细胞进行抑制剂剂量反应研究。将血清饥饿的AdrR细胞与4倍连续稀释的Ab #6、2mM至7.6pM拉帕替尼或西妥昔单抗或100nM至1.5pM帕妥珠单抗预孵育30分钟，且然后用25nM HRG或BTC刺激10分钟。通过ELISA(R&D Systems，DYC1769-5，按照制造商的方案)测量ErbB3的磷酸化且使用Prism(GraphPad Software Inc.)测定IC50值。
使用上述方法或其轻微变化获得的数据显示：
Ab #6抑制HRG诱导的ErbB3磷酸化和BTC诱导的ErbB3磷酸化，其中IC50分别为2.4nM和5.9nM(分别具有1.5-3.8nM和2.5-13.6nM的95％置信区间)。
拉帕替尼(ErbB1和ErbB2的可逆酪氨酸激酶抑制剂)抑制HRG和BTC诱导的ErbB3磷酸化，其中IC50分别为150nM和360nM(分别具有46-504nM和119-1069nM的95％置信区间)。
西妥昔单抗(抗ErbB1抗体)抑制BTC诱导的ErbB3磷酸化，其中IC50为1.8nM(具有0.9-3.8nM的95％置信区间)。但西妥昔单抗不抑制HRG诱导的ErbB3诱导的ErbB3磷酸化，证实了早期的观察HRG信号转导主要由ErbB2/ErbB3而不是ErbB1/ErbB3异源二聚体介导。
帕妥珠单抗(对ErbB2募集到ErbB配体复合物形成位阻的单克隆抗体)抑制HRG诱导的ErbB3磷酸化，其中IC50为3.6nM(具有1.0-13.5nM的95％置信区间)，但不抑制BTC诱导的ErbB3磷酸化。
因此，Ab #6是测试的能够强力抑制ErbB3磷酸化的唯一的抑制剂，对于HRG和BTC刺激具有低纳摩尔IC50值。
实施例16：Ab #6与其它治疗剂的组合疗法
在此实施例中，与其它治疗剂(即埃罗替尼或紫杉醇)组合评估Ab#6在抑制异种移植瘤模型中的肿瘤生长的功效。
在第一个实验中，通过在裸鼠(Charles River Laboratories)侧面的皮下建立肿瘤产生具有ACHN(肾肿瘤细胞系)移植瘤的小鼠。具有肿瘤的小鼠每三天腹腔内施用一次剂量，其中亚适量为300μg Ab #6或媒介物。每天口服施用埃罗替尼(25mg/kg)一次，单独地或与Ab #6治疗组合。每周测量两次肿瘤大小(长度x宽度)且将测量用于计算肿瘤体积(p/6(L x W2)。图30中呈现的数据(使用上述方法或其轻微变化获得)表明尽管单独的Ab #6或埃罗替尼抑制肿瘤生长，组合疗法(Ab #6和埃罗替尼)的抑制作用高于单独的单一试剂，其引起附加效应。
在第二个实验中，通过在裸鼠(Charles River Laboratories)的侧面皮下建立肿瘤产生具有DU145(前列腺肿瘤细胞系)异种移植瘤的小鼠。具有肿瘤的小鼠每三天腹腔内施用一次剂量Ab #6(300μg)或媒介物。每周施用单独地或与Ab #6治疗组合的紫杉醇(20mg/kg)一次。而且，每周测量两次肿瘤大小(长度×宽度)且将测量用于计算肿瘤体积。图31中呈现的数据(使用上述方法或其轻微变化获得)表明尽管单独的Ab #6或紫杉醇抑制肿瘤生长，组合疗法(Ab #6和紫杉醇)的抑制作用高于比单独的单一试剂，其引起附加效应。
实施例17：KRAS突变肿瘤细胞的生长的抑制
在此实施例中，研究了单独或与其它试剂组合的Ab #6抑制包含KRAS突变的肿瘤细胞的生长的能力。
A549是包含KRAS突变的肺癌细胞系，所述KRAS突变为人KRAS基因的密码子12中的突变，其中密码子从编码甘氨酸(G)的密码子变为编码丝氨酸(S)的密码子。此细胞系对单独的埃罗替尼或紫杉醇治疗敏感。为了测试单独的Ab#6抑制体外A549细胞生长的能力，使细胞生长为多细胞肿瘤球状体(2000个细胞/球形体/96孔板的孔)且然后用0μM、0.001μM、0.01μM、0.1μM或1μM Ab #6治疗7天。在第1天和第7天使用METAMORPH软件在4×放大率下测量球状体的面积并且计算球状体面积的变化百分比((初始面积-最终面积/初始面积×100)。结果(使用上述方法或其轻微变化获得)显示于图32A(图中x轴上的“-4”对应于“0”剂量)和图32B的照片中。图32A的数据表明单独的Ab #6治疗足以抑制体外KRAS突变A549肿瘤细胞的生长，并且球状体面积的减少百分比为线性剂量反应，表示在Ab#6浓度上的10倍增加。代表性球状体的照片显示于图32B。未治疗的球状体在7天中生长大约5％而用1μM Ab #6处理的球状体的大小减小35％。
为了测试单独的Ab#6抑制体内KRAS突变A549细胞生长的能力，用600μg Ab #6治疗具有A549皮下异种移植瘤的裸鼠，每3天1次，接着测量肿瘤体积。结果(使用上述或其轻微变化获得)显示于图32C的图中，其表明单独Ab #6治疗显著抑制肿瘤生长，在第22天停止剂量后仍保持生长抑制。因地，单独的Ab #6能够抑制体内KRAS突变肿瘤细胞的生长。
为了测试Ab #6与埃罗替尼或紫杉醇组合抑制体内KRAS突变A549细胞生长的能力，用以下任一种治疗具有A549皮下异种移植瘤的裸鼠：(i)300μg单独的Ab #6，每3天1次；(ii)25mg/kg单独的埃罗替尼，每天1次；(iii)20mg/kg单独的紫衫醇，每7天1次；(iv)Ab #6与埃罗替尼组合(以相同剂量)；或(v)Ab #6与紫衫醇组合(以相同剂量)。埃罗替尼实验和紫杉醇实验的结果(使用上述方法或其轻微变化获得的所有结果)显示于图33A和33B。来自两个实验的结果表明KRAS突变A549异种移植物对单独的埃罗替尼或紫杉醇治疗敏感，表明Ab#6与埃罗替尼或紫杉醇组合治疗比Ab#6单一疗法研究的结果引起更强地肿瘤生长抑制。
实施例18：Ab #6结合ErbB3的表位图谱
在此实施例中，使用丙氨酸扫描诱变映射Ab #6结合的ErbB3中的表位。
因为Ab #6抑制HRG结合ErbB3，开始将丙氨酸扫描诱变聚焦于预测ErbB3的细胞外结构域(胞外结构域)中的HRG结合位点，且特别是ErbB3的胞外结构域的结构域I。为了帮助选择使哪一个残基突变，将与TGFα复合的EGFR的晶体结构(Garret等人(2002)Cell110：763-773)用作模型，因为与HRG复合的ErbB3晶体结构不可用。ErbB3和EGFR在结构上是同源的，因此即使相互作用残基不相同，结构元件(某些环或螺旋的面)应该是相同的。因此，识别如Garret等人(同上)所述指定参与配体结合的EGFR中的残基，且ErbB3和EGFR的序列比对显示对应的ErbB3残基。除了配体结合位点，使用ErbB3的晶体结构作为指导使ErbB3胞外结构域的结构域I的其它面突变(Cho和Leahy(2002)Science 297：1330-1333)。
因此，产生以下ErbB3点突变：L14A、N15A、L17A、S18A、V19A、T20A、N25A、K32A、L33A、V47A、L48A、M72A、Y92A、Y92P、D93A、M101A、L102A、Y104A、Y104P、N105A、T106A、Y129A、Y129P、K132A、Q59A、T77A、Q90A、Q114A、Q119A、R145A、R151A、V156A、H168A、K172A和L186A。在此标记法中，使用标准的单字母氨基酸缩写，例如L14A表示成熟ErbB3(SEQ IDNO：73)的氨基酸位置14处的亮氨酸(L)特异性地突变为丙氨酸(A)，其它置换突变以相同的方式表示。使用本领域已知的其它标准方法实现诱变，且使用本领域已知的标准方法在酵母细胞的表面ErbB3胞外结构域的结构域I环境中的ErbB3突变。所有突变以与野生型ErbB3结构域I的水平相同的水平在酵母的表面良好地表达。ErbB3结构域I突变在酵母上的表达允许使用FACS而不首先纯化重组蛋白来研究Ab#6与突变体的结合。
通过标准FACS分析来测定Ab #6与包含单一突变的ErbB3胞外结构域的结构域I片段的结合。将与ErbB3上的表位结合的第二抗ErbB3抗体(SGP1；LabVision)用作对照以确保突变不仅使ErbB3结构通常不稳定，所述ErbB3上的表位与Ab #6结合的表位没有重叠(通过缺乏与ErbB3结合的竞争所证实)。因此，从进一步表征排除影响两种抗体结合的ErbB3突变。为了FACS分析，同时用Ab #6(之后用山羊抗人Ab-Alexa 488作为第二抗体)和SGP1-Alexa 647标记在其表面上表达ErbB3结构域I的不同突变形式的酵母细胞。数据(使用上述方法或其轻微变化获得)显示上述的四个丙氨酸点突变抑制Ab #6结合ErbB3胞外结构域的结构域I而不抑制对照抗-ErbB3抗体(SGP1)的结合。这四个点突变为：D93A、M101A、L102A和Y104A。
为了进一步证实Ab #6表位包含成熟ErbB3(SEQ ID NO：73)的残基93、101、102和104，使这四个点突变(D93A、M101A、L102A、Y104A)稳定转染到CHO K1细胞之后在全长成熟ErbB3的环境中表达以研究它们对该环境的影响。将表达野生型全长ErbB3的CHO K1细胞用作阳性对照。选择每个突变的高表达克隆并且用Ab #6或SGP1标记用于标准分析(以证实ErbB3的适当折叠)。SGP1直接用Alexa 647染料标记且Ab #6直接用Alexa 488染料标记。
结果(使用上述方法或其轻微变化获得)显示于图34A-34E中，其显示SGP1或Ab #6分别与野生型ErbB3、D93A突变体、M101A突变体、L102A突变体或Y104A突变体结合。结果表明对照抗ErbB3抗体(SGP1)能够结合所有4种突变，而Ab #6显示出基本不结合3种突变体(D93A、L102A和Y104A)且仅最低限度地结合第4种突变体(M101A)。因此，全长ErbB3CHO表达实验表明ErbB3上的Ab#6表位包含SEQ ID NO：73中显示的成熟人ErbB3序列的残基93、101、102和104。这4种残基位于与ErbB3中5个β折叠平行的链3上。以类似的方式进行的进一步实验所产生的数据显示表位进一步包含SEQ ID NO：73中显示的成熟人ErbB3序列的残基92、99和129。因此，Ab #6结合的表位可视为包含跨过SEQ ID NO：73中显示的成熟人ErbB3序列的残基92-104和129(邻近折叠的蛋白质中的92-104定位)的序列。
实施例19：PI3K突变肿瘤细胞的生长的抑制
在此实施例中，研究了单独或与另一试剂组合的Ab #6抑制包含PI3K突变的肿瘤细胞的生长的能力。
SKOV3(SKOV-3)是包含下调PI3K表达的突变的卵巢癌细胞系。为了测试单独的Ab #6抑制体内PI3K突变SKOV3细胞生长的能力，用600μg Ab #6治疗具有SKOV3皮下异种移植瘤的裸鼠，每3天1次，接着测量肿瘤体积。结果(使用上述或其轻微变化获得)显示于图35A的图中，并且表明单独的Ab #6治疗引起部分肿瘤生长抑制。在此实验中，观察到即使在媒介物治疗的小鼠中肿瘤生长的“停滞期”大约为30天，这表明肿瘤在体内生长缓慢。然而，与载体治疗的小鼠相比Ab#6治疗小鼠30天后肿瘤体积减小，这表明单独的Ab #6治疗能够抑制体内PI3K突变肿瘤细胞的生长。
为了测试Ab #6与顺铂组合抑制体内PI3K突变SKOV3细胞生长的能力，用以下任一种治疗具有SKOV3皮下异种移植瘤的裸鼠：(i)300μg单独的Ab #6，每3天1次(Ab #6的亚适量)；(ii)1.5mg/kg单独的顺铂(CDDP)；或(iii)Ab #6与顺铂组合(以相同剂量)。假设在上述的Ab #6的单一疗法实验中观察到30天“停滞期”，直到30天的停滞期后才开始组合实验中的Ab #6剂量施用。组合疗法实验的结果(使用上述或其轻微变化获得)显示于图35B中。结果表明单独的Ab#6和单独的顺铂两者能够抑制SKOV3异种移植物的生长，且表明与单独的试剂中的任一种相比组合治疗导致甚至更强的肿瘤生长抑制，由此证明当与第二治疗剂(例如顺铂)组合时Ab #6治疗的效力增强。
实施例20：Ab #6的互补位映射
在此实施例中，使用抗体的单链(scFv)形式进行Ab#6的互补位映射。在这种scFv形式(SEQ ID NO：72)中，VH区(SEQ ID NO：1)和VL区(SEQ ID NO：2)与(G4S)3连接子(SEQ ID NO：72的氨基酸123-137，连接子序列在SEQ ID NO：74中显示)连接，并且这种scFv仍保持与ErbB3特异性结合的能力。使用这种形式来研究对CDR环中ErbB3与丙氨酸(在一些情况下为苯丙氨酸)结合的影响。
为了预测Ab #6的CDR环中的哪一个残基是表面暴露的，研究了两种非常同源的抗体的晶体结构，因为Ab#6的晶体结构还有待经验确定。其晶体结构可用且似乎与Ab #6最同源的抗体是VH链的1mhp(抗-α1整联蛋白，Karpusas等人，J.Mol.Biol.327：1031(2003))和VL链的1mco(Guddat等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：4271(1993))。表1中显示了Ab #6的CDR环，其中选择用于突变的残基以粗体突出或加下划线。还在表1中显示了1mhp抗体的VH CDR的序列和1mco抗体的VL CDR的序列，以及与每个CDR的SEQ ID NO后的括号内显示的Ab #6相比错配氨基酸的数量，并且表面残基以斜体、粗体突出和加下划线。
表1：抗体#6中的CDR环
  VH   Ab #6
  CDR H1   HYVMA(SEQ ID NO：7)
  CDR H2   SISSSGGWTLYADSVKG(SEQ ID NO：8)
  CDR H3   GLKMATIFDY(SEQ ID NO：9)
  VL   Ab #6
  CDR L1   TGTSSDVGSYNVVS(SEQ ID NO：10)
  CDR L2   EVSQRPS(SEQ ID NO：11)
  CDR L3   CSYAGSSIFVI(SEQ ID NO：12)
  VH   1mhp
  CDR H1   RYTMS(SEQ ID NO：54)(3)
  CDR H2   TISG-GGHTYYLDSVKG(SEQ ID NO：55)(6)
  CDR H3   GFGDGGYFDV(SEQ ID NO：56)(7)
  VL   1mco
  CDR L1   TGTSSDVGGYNYVS(SEQ ID NO：57)(2)
  CDR L2   EVNKRPS(SEQ ID NO：58)(2)
  CDR L3   SSYEGSDNFV(SEQ ID NO：59)(5)
Ab #6中产生的突变概括于以下表2中。突变的氨基酸残基编号对应于scFv形式内的VH和VL残基线性编号，而不是Kabat编号。标记法Thr28Ala表示scFv的氨基酸位置28处的苏氨酸(Thr)特异性地突变为丙氨酸(Ala)，其余的置换突变以相同的方式表示。
表2：Ab #6突变
Figure BPA00001545689501101
Figure BPA00001545689501111
如表2所示，所有的突变为丙氨酸突变，除了酪氨酸残基还突变为苯丙氨酸，因为Phe和Tyr结构上非常相似(例如两者都为芳族的)，且因此预计这种突变在抗原结合方面破坏性较小。除了在CDR内产生适当突变，CDR外的重链残基28和30也产生突变(表2中的突变M1和M2)，如同它们落入CDR环区域。使用标准重组DNA技术产生所有突变且使用本领域已知的标准筛选技术测试突变体与ErbB3的结合。
如图36所示，识别出对scFv与ErbB3结构域的结合的影响比改变scFv与蛋白A(其结合但不包含CDR)的结合的影响更优先的若干突变。它们的特征和作用(基于图36所示的3个分组)在以下的表3中显示。“对结合没有作用”表示没有显著地影响与ErbB3的结合或与没有对应地降低造成scFv蛋白不稳定的蛋白A的结合。大多数结合残基位于H1、H2和H3环并且一些结合残基位于L1和L3环。如在许多其它抗体抗原复合物中所见，L2 CDR不直接促进结合。
表3：对ErbB3与Ab #6突变体的结合的作用
Figure BPA00001545689501121
Figure BPA00001545689501131
基于表3中所示的结果，取得重链和轻链CDR中每一个的共有序列。这些共有序列在图37A和37B中显示，在野生型CDR序列的下面。共有序列与野生型CDR序列的不同之处在于突变为丙氨酸且发现不显著影响结合的那些氨基酸已被一般化以允许在这些位置存在任何氨基酸(Xaa)。此外，对于含有芳族酪氨酸残基的这些氨基酸位置，在这些位置处突变为芳族苯丙氨酸不影响结合，但是突变为丙氨酸影响结合，图37A中显示的共有序列中的该位置处允许出现芳族氨基酸酪氨酸、组氨酸、色氨酸和苯丙氨酸中的任一个，而在图37B中显示的共有序列中的那些氨基酸位置允许出现酪氨酸或苯丙氨酸。
此外，基于表3中所示的结果，取得重链和轻链CDR中每一个的互补位序列。这些互补位序列在图37A和37B中显示，在野生型CDR序列的下面。互补位序列对应于CDR中的那些氨基酸残基位置，当突变为丙氨酸时显示显著地降低与ErbB3的结合，由此表明这些位置的实质作用是抗原结合。此外，对于含有芳族络氨酸残基的这些氨基酸位置，在这些位置处突变为芳族苯丙氨酸不影响结合，但是突变为脂族丙氨酸影响结合，允许在图37A中显示的芳族氨基酸酪氨酸、组氨酸、色氨酸和苯丙氨酸中的任一个(或可选地在图37B中的酪氨酸或苯丙氨酸)出现在互补位中的每个这种位置。
还分别在SEQ ID NO：7、8和9中显示Ab #6的野生型重链CDR1、CDR2和CDR3序列，及还分别在SEQ ID NO：10、11和12中显示Ab #6的野生型轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。还分别在SEQ ID NO：60和75(CDR1)、61(CDR2)和62(CDR3)中显示Ab #6的共有重链CDR1、CDR2和CDR3序列，还分别在SEQ ID NO：66和77(CDR1)、67(CDR2)与68和79(CDR3)中显示Ab#6的共有轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。还分别在SEQ ID NO：63和76(CDR1)、64(CDR2)和65(CDR3)中显示Ab #6的重链CDR1、CDR2和CDR3互补位序列，且还分别在SEQ ID NO：69和77(CDR1)、70(CDR2)与71和80(CDR3)中显示轻链CDR1、CDR2和CDR3互补位序列。
等同方式
本领域的技术人员将认识到或仅使用常规试验就能够确定和实施此处所描述的本发明特定实施方案的多种等同方式。这样的等同方式也意图包含在下述的权利要求中。从属权利要求中公开的实施方案的任意组合都包含在本发明的范围之内。
参考文献的引入
此处提到的每个美国和外国专利和待决专利申请和出版物都以引用方式全文引入此处中。
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Figure ISB00000806299000251

Claims (25)

1.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其与人ErbB3的胞外结构域的结构域I结合且包含：
包含重链CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区；及
包含轻链CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，其中：
所述重链CDR1序列包含SEQ ID NO：60或75，
所述重链CDR2序列包含SEQ ID NO：61，
所述重链CDR3序列包含SEQ ID NO：62，
所述轻链CDR1序列包含SEQ ID NO：66或77，
所述轻链CDR2序列包含SEQ ID NO：67，
所述轻链CDR3序列包含SEQ ID NO：68或79，
其中附带条件为所述抗体不是：(i)此处公开的Ab#6；(ii)包含分别如SEQ ID NO：1和2所示的VH和VL序列的抗体；或(iii)包含分别如SEQ ID NO：7、8和9所示的VH CDR1、CDR2和CDR3序列以及分别如SEQ ID NO：10、11和12所示的VL CDR1、CDR2和CDR3序列的抗体。
2.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其结合包含SEQID NO：73的残基92-104的人ErbB3的表位并且特征为抑制表达ErbB3的癌细胞的增殖，其中附带条件为所述抗体不是：(i)此处公开的Ab #6；(ii)包含分别如SEQ ID NO：1和2所示的VH和VL序列的抗体；或(iii)包含分别如SEQ ID NO：7、8和9所示的VH CDR1、CDR2和CDR3序列以及分别如SEQ ID NO：10、11和12所示的VL CDR1、CDR2和CDR3序列的抗体。
3.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其结合包含SEQID NO：73的残基92-104的人ErbB3的表位并且特征为抑制表达ErbB3的癌细胞的增殖，其中附带条件为所述抗体不是：(i)此处公开的Ab#6；(ii)包含分别如SEQ ID NO：1和2所示的VH和VL序列的抗体；或(iii)包含分别如SEQ ID NO：7、8和9所示的VH CDR1、CDR2和CDR3序列以及分别如SEQ ID NO：10、11和12所示的VL CDR1、CDR2和CDR3序列的抗体；(iv)此处公开的Ab#3；(v)包含分别如SEQ ID NO：3和4所示的VH和VL序列的抗体；(vi)包含分别如SEQID NO：13、14和15所示的VH CDR1、CDR2和CDR3序列以及分别如SEQ ID NO：16、17和18所示的VL CDR1、CDR2和CDR3序列的抗体；(vii)此处公开的Ab#17；(viii)包含分别如SEQ ID NO：35和36所示的VH和VL序列的抗体；(ix)包含分别如SEQ ID NO：39、40和41所示的VH CDR1、CDR2和CDR3序列以及分别如SEQ ID NO：42、43和44所示的VLCDR1、CDR2和CDR3序列的抗体；(x)此处公开的Ab#19；(xi)包含分别如SEQ ID NO：37和38所示的VH和VL序列的抗体；或(xii)包含分别如SEQ ID NO：45、46和47所示的VHCDR1、CDR2和CDR3序列以及分别如SEQ ID NO：48、49和50所示的VL，CDR1、CDR2和CDR3序列的抗体。
4.根据权利要求2或3所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述表位进一步包含SEQ ID NO：73的残基129。
5.根据权利要求2或3或4所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述癌细胞是MALME-3M细胞、AdrR细胞或ACHN细胞并且相对于对照所述增殖减少了至少10％。
6.根据权利要求1或2或3或4所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中，当选自SEQ ID NO：73的残基93(天冬酰胺)、残基101(甲硫氨酸)、残基102(亮氨酸)和残基104(酪氨酸)的人ErbB3的任何一个氨基酸残基被丙氨酸置换以产生具有单个氨基酸置换的突变ErbB3时，相较于所述抗体或其抗原结合部分与包含所述SEQID NO：73的氨基酸序列的人ErbB3的结合，所述抗体或其抗原结合部分与所述突变ErbB3的结合显著下降。
7.根据权利要求6所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述结合的显著下降是结合的KD值的至少10倍变化。
8.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其与人ErbB3的胞外结构域的结构域I结合且包含：
包含重链CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区；及
包含轻链CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，其中：
所述重链CDR1序列包含SEQ ID NO：63或76，
所述重链CDR2序列包含SEQ ID NO：64，
所述重链CDR3序列包含SEQ ID NO：65，
所述轻链CDR1序列包含SEQ ID NO：69或78，
所述轻链CDR2序列包含SEQ ID NO：70，
所述轻链CDR3序列包含SEQ ID NO：71或80，
其中附带条件为所述抗体不是：(i)此处公开的Ab#6；(ii)包含分别如SEQ ID NO：1和2所示的VH和VL序列的抗体；或(iii)包含分别如SEQ ID NO：7、8和9所示的VH CDR1、CDR2和CDR3序列以及分别如SEQ ID NO：10、11和12所示的VL CDR1、CDR2和CDR3序列的抗体。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的抗体，其中所述抗体是人抗体、人源化抗体、双特异性抗体或嵌合抗体。
10.根据权利要求1-8中任一项所述的抗原结合部分，其为人抗体、人源化抗体、双特异性抗体或嵌合抗体的部分。
11.根据权利要求1-8中任一项所述的抗体或抗原结合部分，其中所述抗体或抗原结合部分选自Fab、Fab′2、scFv、SMIP、亲和体、avimer、纳米体和域抗体。
12.根据权利要求1-8中任一项所述的抗体，其中所述抗体是选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD和IgE的同种型。
13.一种组合物，其包含在药学上可接受的载体中的根据权利要求1-12中任一项所述的抗体或抗原结合部分。
14.一种治疗受试者的癌症的方法，其包括给所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求13所述的组合物。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述癌症包括包含KRAS突变或PI3K突变的任一种或两者的细胞。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述受试者是人并且所述KRAS突变包括人KRAS基因的密码子12或密码子13的突变。
17.根据权利要求14所述的方法，其中所述受试者是人并且所述PI3K突变包括人PIK3CA基因的外显子9或外显子20内的突变。
18.一种治疗受试者的癌症的方法，其包括给所述受试者施用治疗有效量的第一试剂与治疗有效量的第二试剂的组合，所述第一试剂为根据权利要求1-12中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，所述第二试剂为抗癌剂而不是所述第一试剂。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述第二试剂包含抗体或其抗原结合部分。
20.根据权利要求18所述的方法，其中所述第二试剂选自：蛋白质合成抑制剂、生长抑素类似物、免疫治疗剂和酶抑制剂。
21.根据权利要求18所述的方法，其中所述第二试剂选自：靶向IGF1R的小分子、靶向EGFR的小分子、靶向ErbB2的小分子、靶向cMET的小分子、抗代谢物、烷化剂、拓扑异构酶抑制剂、微管靶向剂、激酶抑制剂、激素疗法、糖皮质激素、芳香酶抑制剂、mTOR抑制剂、化学治疗剂、蛋白激酶B抑制剂、磷脂酰肌醇3-激酶、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂和MEK抑制剂。
22.根据权利要求19所述的方法，其中所述第二试剂为帕尼单抗、曲妥珠单抗或西妥昔单抗。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述第二试剂为紫杉醇。
24.根据权利要求21所述的方法，其中所述第二试剂为顺铂。
25.根据权利要求21所述的方法，其中所述第二试剂为埃罗替尼或拉帕替尼。
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