CN105884900A - 单特异性和双特异性抗igf-1r和抗erbb3抗体 - Google Patents
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Abstract
本文提供适用作抗赘生剂且特异性结合人IGF-IR和人ErbB3的新颖单特异性和双特异性抗体。示例性抗体抑制经由IGF-IR和ErbB3中的任一者或两者进行的信号转导。示例性多价蛋白质包含至少一个抗IGF-1R结合位点和至少一个抗ErbB3结合位点。在某些实施方案中，结合位点可经由免疫球蛋白恒定区连接。还提供新颖抗ErbB3和抗IGF-1R抗体(例如，单克隆抗体)。
Description
本申请是申请日为2012年04月19日和发明名称为“单特异性和双特异性抗IGF-1R和抗ERBB3抗体”的201080028639.X号发明专利申请的分案申请。
相关申请
本申请要求2011年4月19日提交的美国临时申请号61/477,089、2011年9月26日提交的美国临时申请号61/539,297、2011年11月10日提交的美国临时申请号61/558,192和2012年4月2日提交的美国临时申请号61/619,244的优先权。在允许的情况下，前述申请各自的全文以引用的方式并入本文用于任何及所有目的。
序列表
本申请含有序列表，所述序列表以ASCII格式通过EFS-Web提交并且由此全文以引用的方式并入本文。所述ASCII拷贝创建于2012年4月5日，名称为1141PC01.txt并且大小为950,611比特。
背景
肿瘤细胞表达刺激细胞增殖的生长因子和细胞因子的受体。针对所述受体的抗体可有效阻断由生长因子和细胞因子介导的细胞增殖刺激，且可由此抑制肿瘤细胞增殖和肿瘤生长。靶向癌细胞上的受体的市售治疗性抗体包括例如曲妥珠单抗(trastuzumab)，其靶向HER2受体(也称为ErbB2)，用于治疗乳癌；和西妥昔单抗(cetuximab)，其靶向表皮生长因子受体(EGFR，也称为HER1或ErbB1)，用于治疗结肠直肠癌和头颈癌。
单克隆抗体已显著提高我们治疗癌症的能力，然而临床研究显示许多患者对单特异性疗法反应并不充分。这部分归因于癌症的多基因性质，其中癌细胞依赖于多种且通常冗余的增殖路径。能够一次阻断多种生长和存活路径的双特异性或多特异性抗体有可能更好地满足阻断癌症生长的挑战，并且实际上其中多种正在进行临床开发。然而，双特异性抗体因在其设计和优化中需要考虑的变量的数量大为增加以及其与天然存在的抗体的结构差异而存在实质性设计难题。
单克隆抗体如曲妥珠单抗、西妥昔单抗、贝伐单抗(bevacizumab)和盘尼图单抗(panitumumab)在临床上已显著改善患者结果，且当前在临床开发中有超过两百种治疗性单克隆抗体正在进行测试。然而，显而易见受单个致癌基因促成的肿瘤并非常态，并且治疗通常导致抗性机制活化，这转而还需要靶向介入。举例来说，在曲妥珠单抗抗性的多种临床前模型中，抑制IGF-1R使对曲妥珠单抗的敏感性恢复。已在临床上尝试靶向剂的组合，但迄今为止其仅获得有限的临床成功并且组合时可能过于昂贵。因抗性或因肿瘤受多个生长因子路径促成而需要抑制多个靶标使得对双特异性抗体的关注增加。当前开发的双特异性抗体通常以经验方式设计。此外，这些双特异性抗体的药用性质几乎总是不如单克隆抗体。这些因素造成开发双特异性抗癌疗法的主要难题。由靶向多种癌症存活路径获得的重要附加效益可由在鉴别和工程改造具有最佳特征的双特异性抗体之前增加的工作得出。其需要由计算模拟以鉴别最佳靶向策略和设计规格、工程改造具有这些特征的抑制剂和实验验证治疗假设组成的叠代方法。我们将此工程改造框架分为两个类别：选择具有稳固药用性质的适当分子格式，和计算模拟以鉴别最佳靶标和最佳治疗设计特征，例如在IgG样双特异性抗体中(图8)。
抗体的一个主要优势为其紧密结合几乎任何细胞外靶标的能力。此性质由抗体可变区(VR)的两个特征促成：六个互补决定区(CDR)的大平坦表面和抗体实际上具有可同时靶向两个分子的两个结合臂。在双特异性抗体中，双重靶标结合导致更紧密亲和力，这是因为一旦抗体一个臂结合于细胞外靶标，第二臂即被局限于质膜上方的狭窄区域(约100埃)且因此在细胞表面附近浓缩。这产生快得多的次级结合事件，所述事件不受扩散限制。需要对次级结合事件进行加速。亲和力和亲合性均为可合理工程改造的性质，因为前者可经由计算机化亲和力成熟进行改良且后者可通过工程改造针对细胞表面上存在的相同或不同抗原的其它靶向臂而增强。除结合能力外，抗体还可具有由其Fc结构域介导的多种效应功能：在人中通过与活化型FcγRI、FcγRIIa/c、FcγRIIIa和抑制性FcγRIIb受体相互作用而确定的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)；由抗体结合于补体系统的组分而触发的补体依赖性细胞毒性(CDC)；和经由新生儿Fc受体(FcRn)的主动再循环而介导的长半衰期。所有这些功能均可调节以使抗癌疗法的有效性优化且可保留以有益于双特异性蛋白质。
由IgG抗体的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)构成的可变片段(Fv)为显示完整抗原结合的最小抗体片段。这些可变结构域可成功地融合成单链构建体(scFv)，不过亲和力与完整原生抗体相比通常在一定程度上降低。大部分当前双特异性格式的特征在于一个或若干个scFv模块经由低复杂度接头连接于IgG重链或IgG轻链的N端或C端。另一双特异性抗体格式为双可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig)。DVD-Ig由在N端有第二VH结构域经由短接头连接的第一IgG重链和在N端有第二VL结构域类似地连接的第一IgG轻链组成。第二VH/VL结构域形成对一种抗原具有特异性的对，而第一VH/VL形成对不同抗原具有特异性的单独结合位点。
IgG样抗体的二价格式具有一个潜在限制；其可交联细胞表面抗原，所述抗原中的一些会因二聚化而活化，从而以不受控方式触发不当信号传导事件。为解决此难题，已开发出可调节单价双特异性抗体格式。通过将不对称“钮-孔(knobs and holes)”并入Fc片段中产生的单臂抗c-Met治疗性抗体MetMab已显示在胰腺癌模型中有效且正在多个临床试验中进行研究。最近已对此“钮-孔”格式进行扩充以并入靶向EGFR的抗体片段，产生靶向EGFR/ErbB1和c-Met/HGFR的功能性单价双特异性蛋白质。Gunasekaran等已描述通过将互补性带电表面工程改造至Fc片段中实施的“钮-孔”构想的替代实施方案。Davis等已描述“SEED”方法，其使用含有来自人IgG和IgA的片段的修饰的不对称Fc来形成异聚单价抗体。最后，Bostrom等已描述构建可以高亲和力结合HER2或VEGF的双功能Fab片段的新颖工程改造方法。在组合于典型抗体分子中时，这些Fab片段将以不同价数啮合HER2或VEGF，所述价数将取决于细胞环境和生长因子浓度。
双特异性抗体设计的另一重要组分为药用性质的优化。为在临床上适用，治疗性蛋白质须稳定，保持长时间可溶且具有稳固的可制造性概况。双特异性抗体通常不如单克隆抗体稳定，且最初可能不具有足以用于开发的药用性质。其可经由分子工程改造、经由下游配制活动或如最通常所实施的经由两种方法的组合加以稳定化。
已长期认识到使小分子药物候选物中的化学制造和控制不利条件降至最低的重要性并且已提出预测药物相似性的准则。许多组使用概念上类似的方法通过评估以下不利序列特征来评定基于IgG的蛋白质的适合性：如非典型二硫键和未配对半胱氨酸、另外的糖基化位点、酪氨酸硫酸化基元、溶剂可接近的甲硫氨酸、天冬酰胺去酰胺化基元和酸裂解位点。另外的糖基化位点和天冬酰胺去酰胺化位点为天然抗体序列中十分常见的特征。实际上据报导，超过20％的重链可变结构域被糖基化且超过5％的生殖系基因含有天冬酰胺-甘氨酸去酰胺化基元。抗体中的去酰胺化速率可使用Robinson提出的方法可靠地估算，Robinson提出结构限制性环形成丁二酰亚胺中间体的效率并不高且因此为稳定的。
虽然典型N连接型糖基化基元(NXS和NXT，其中X为除脯氨酸以外的任何氨基酸)可在抗体序列中容易地检测到，但O连接型位点(其因也可以负面影响药用性质而为不利条件)较难以识别。最近已报导抗体轻链可变结构域的若干O连接型修饰，主要在富含GS的序列基元附近。存在在发现阶段改良候选蛋白质的亲和力和稳定性的许多方法，包括结构指导的设计、聚焦文库筛选和酵母展示；因此，我们发现在早期概念验证蛋白质中移除具有风险的所述潜在不利条件为有益的。
其它不利条件，如聚集和免疫原性根据工程改造的观点更具挑战性。所述两种性质不仅为多方面性质，而且还难以在小规模生物化学和生物物理学测试中对其进行充分评估，且因此其倾向于首先在开发的后期检测。如所证明，降低抗体免疫原性的最佳方法为进行人源化。此方法已由多种在临床上良好耐受的人源化抗体广泛验证。最近提出的“超人源化”方法将人生殖系序列引入CDR中以产生‘完全人’抗体。此方法需要将CDR中的各氨基酸(“aa”)突变以便确定其在抗原结合中的贡献；所得抗体可具有较低免疫原性。除基于序列的特征外，抗体和抗体样蛋白质的免疫原可取决于其聚集稳定性。有趣的是，抗体模块(诸如scFv)中的“人性”和稳定性可经由在知识基础上的方法共同工程改造。
蛋白质抗体溶解性的工程改造为另一项令人生畏的任务，因为所述性质还综合涉及若干项物理-化学参数。然而，已提出多种减轻不溶性的方法。Pepinsky等使用糖基工程改造、同型转换和结构指导的诱变来增强单克隆抗体的溶解性。Chennamsetty等已描述依赖于分子动力学模拟来计算称为表面聚集倾向的参数，从而相对于聚集改良溶解性的无偏方法，并且应用此技术在抗体的易聚集区中引入稳定化氨基酸(“aas”)。有趣的是，在其抗体分析中，易聚集区通常与赋予Fc受体或抗原结合的功能上重要的区共定位，并且因此不能轻易移除。
抗体中分子功能与药用性质之间的这种联系为常见的。其可使得双特异性抗体的优化变得极为复杂，因为其序列的甚至更大的部分也位于功能上重要的区中。因此，为能够成功进行工程改造，鉴别关键分子功能和最佳设计特征为重要的。
计算模拟以鉴别最佳靶标和最佳治疗设计特征
计算模拟为在实验室和临床上指导药物开发决定的极有用工具。群体药物动力学模拟为使用模型来优化剂量时程和临床试验设计的成熟实例。对于具有已知靶标的疗法，可在设计过程中的极早期利用计算模拟。多任务高通量定量蛋白质测量技术的进展使得能够观测细胞信号传导网络中存在的复杂动力学。这些数据允许建立捕捉与诸如癌症等疾病相关的生物系统的机理行为的网络模型。通过经由网络建模模拟潜在治疗剂，可以加快的速度设计更有效的治疗剂和更精确地预测设计参数。
传统上，用于靶向疗法的药用药剂的选择始于自大量分子、生物学和生理学数据选择的已知靶标。然而，甚至在已充分研究和大量靶向的生物系统中，仍存在新发现的机会，其可自模拟路径或网络模型得到帮助。
因此，用于癌症治疗的其它治疗方法，并且尤其是经过工程改造以具有优良生物物理学和治疗性质的基于多特异性抗体的蛋白质难以获得，但对其仍有需要以克服当前抗体疗法的限制和提供其它效益。
概述
本文提供多价双特异性抗体(PBA)，所述抗体为包含两对多肽链的蛋白质，所述两对中的各对包含重链通过至少一个重链-轻链键联结于轻链；其中(a)各对包含至少一个抗IGF-1R结合位点和至少一个抗ErB3结合位点；和(b)各对包含含有PBA重链的N端部分和PBA轻链的N端部分的第一结合位点，和为完全由PBA的重链包含的C端scFv的第二结合位点，所述C端scFv含有重链VR通过scFv接头联结于轻链VR；且抗IGF-1R结合位点经由由PBA的重链包含的重链免疫球蛋白(HC Ig)恒定区(CR)连接于抗ErbB3结合位点，且所述两对由各对的HC Ig CR之间的至少一个键联接。在优选实施方案中，抗IGF-1R结合位点包含重链可变(VH)结构域，所述重链可变(VH)结构域包含一组三个VH互补决定区(CDR)，所述CDR包含(a)具有包含选自由SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:8-31和SEQ ID NO:384-385组成的组的SEQ ID NO(中所示)的氨基酸序列的氨基酸序列的重链的VHCDR1(氨基酸编号26-35)、VHCDR2(氨基酸编号51-66)和VHCDR3(氨基酸编号99-111)；或(b)一组三个VH互补决定区(CDR)，所述CDR包含含有SEQ ID NO:302的VHCDR1、含有SEQ ID NO:303的VHCDR2和含有SEQ ID NO:304的VHCDR3，和轻链可变(VL)结构域，所述轻链可变(VL)结构域包含一组三个VLCDR，所述VLCDR包含(c)具有包含选自由SEQ ID NO:2-3、SEQ ID NO:32-133和SEQ IDNO:386-387组成的组的SEQ ID NO的氨基酸序列的氨基酸序列的轻链的VLCDR1(氨基酸编号24-34)、VLCDR2(氨基酸编号50-56)和VLCDR3(氨基酸编号89-97)；或(d)一组三个VLCDR，所述VLCDR包含含有SEQ ID NO:305的VLCDR1、含有SEQ ID NO:306的VLCDR2和含有SEQ ID NO:307或SEQID NO:308的VLCDR3，且各CDR进一步包含氨基端和羧基端，其中各组CDR的CDR在相应重链或轻链中按CDR1、CDR2和CDR3的线性氨基至羧基顺序排列，或其中VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3的序列包含独立地表示在图1中的相应位置所示的任何氨基酸的可变氨基酸，且VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3的序列包含独立地表示在图2中的相应位置所示的任何氨基酸的可变氨基酸，条件为PBA(i)不包含抗IGF-1R SF模块与抗ErbB3C8模块两者；或(ii)包含一个或多个氨基酸分别不同于SF或C8模块的CDR或FR的至少一个CDR或FR。在某些实施方案中，抗ErbB3结合位点包含VH结构域，所述VH结构域包含一组三个VH CDR，所述CDR包含(e)具有包含选自由SEQ ID NO:4-5、SEQ ID NO:134-165和SEQ ID NO:388组成的组的SEQ ID NO的氨基酸序列的氨基酸序列的重链的VHCDR1(氨基酸编号26-35)、VHCDR2(氨基酸编号51-66)和VHCDR3(氨基酸编号99-111)；或(f)一组三个VH CDR，所述CDR包含含有SEQ ID NO:309的VHCDR1、含有SEQ ID NO:310的VHCDR2和含有SEQ ID NO:311的VHCDR3，和轻链可变(VL)结构域，所述轻链可变(VL)结构域包含一组三个VLCDR，所述VLCDR包含(g)具有包含选自由SEQ ID NO:6-7和SEQ ID NO:166-200组成的组的SEQ ID NO的氨基酸序列的氨基酸序列的轻链的VLCDR1(氨基酸编号23-33)、VLCDR2(氨基酸编号49-55)和VLCDR3(氨基酸编号88-98)；或(h)轻链可变(VL)结构域，所述轻链可变(VL)结构域包含一组三个VLCDR，所述VLCDR包含含有SEQ ID NO:312的VLCDR1、含有SEQ ID NO:313的VLCDR2和含有SEQ ID NO:314或SEQ ID NO:315的VLCDR3，且各CDR进一步包含氨基端和羧基端，其中各组CDR的CDR在抗体中按CDR1、CDR2和CDR3的线性氨基至羧基顺序排列，或其中VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3的序列包含独立地表示在图3中的相应位置所示的任何氨基酸的可变氨基酸，且VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3的序列包含独立地表示在图4中的相应位置所示的任何氨基酸的可变氨基酸，其中PBA(i)不包含含有包含SEQ IDNO:35的轻链和包含SEQ ID NO:11的重链的抗IGF-1R模块和b)含有包含SEQ ID NO:175的轻链和包含SEQ ID NO:145的重链的抗ErbB3C8模块。在某些实施方案中，抗IGF-1R VLCDR3包含SEQ ID NO:308或抗ErbB3VLCDR3包含SEQ ID NO:315。在某些实施方案中，两对多肽链具有基本上一致的序列。HC Ig CR键之间的至少一个键中的至少一者为二硫键且可为二硫键或范德华键(van der Waals bond)，或所述至少一个重链-轻链键中的至少一者为二硫键且可为二硫键或范德华键。在某些实施方案中，抗ErbB3结合位点为C端scFv，且在某些实施方案中，抗IGF-1R结合位点为C端scFv。PBA的抗IGF-1R结合位点、HC Ig CR和抗ErbB3结合位点可包含由单一连续多肽链包含的那一对的重链。
PBA可(i)在体外在1μM或1μM以下、或100nM或100nM以下、或10nM或10nM以下、或1nM或1nM以下的浓度下抑制肿瘤细胞的生长，或ii)以10nM或10nM以下、或1nM或1nM以下、或100pM或100pM以下的IC50，或至少70％、或至少80％、或至少90％的最大抑制百分比抑制异调蛋白(heregulin)和IGF1诱导的信号转导中的任一者或两者，如pErbB3和pIGF-1R中的任一者或两者磷酸化的抑制所指示。生长抑制可在培养物中在DU145细胞中以CTG测定进行测量。信号转导的抑制可在培养物中在BxPC-3细胞中在以80ng/ml的IGF-1和20ng/ml的异调蛋白刺激15分钟后测定。
在某些实施方案中，PBA的各HC Ig CR包含介导与另一对的CH3结构域接合的CH3结构域。各HC Ig CR还可包含CH2结构域、铰链和CH1结构域。在某些实施方案中，PBA的CH1结构域以其C端连接于铰链的N端，所述铰链以其C端连接于CH2结构域的N端，所述CH2结构域以其C端连接于CH3结构域的N端。
各第一结合位点可包含第一VH结构域，且PBA的各CH1结构域可以其N端连接于第一VH结构域的C端。PBA的各CH3结构域可以其C端连接于scFv的N端。PBA的各CH3结构域可以其C端连接于连接型接头的N端，所述接头以其C端连接于scFv的N端。各轻链可包含第一VL结构域，所述第一VL结构域与第一VH结构域缔合形成第一结合位点。各第一VL结构域可以其C端连接于CL结构域的N端。各第一结合位点可为抗IGF-1R结合位点且各scFv可为抗ErbB3scFv。各第一结合位点可为抗ErbB3结合位点且各scFv可为抗IGF-1R scFv。PBA的HC Ig CR可为IgG CR，例如IgG1或IgG2CR。
在某些实施方案中，PBA的抗IGF-1R VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:8的相应CDR的氨基酸序列，且PBA的抗IGF-1R VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:32的相应CDR的氨基酸序列。在某些实施方案中，PBA的抗IGF-1R VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ IDNO:9的相应CDR的氨基酸序列，且PBA的抗IGF-1R VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:33的相应CDR的氨基酸序列。在某些实施方案中，PBA的抗IGF-1R VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:10的相应CDR的氨基酸序列，且PBA的抗IGF-1R VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:34的相应CDR的氨基酸序列。在某些实施方案中，PBA的抗IGF-1R VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:11的相应CDR的氨基酸序列，且PBA的抗IGF-1R VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:35的相应CDR的氨基酸序列。在某些实施方案中，PBA的抗IGF-1R VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:8的相应CDR的氨基酸序列，且PBA的抗IGF-1R VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQID NO:33的相应CDR的氨基酸序列。在某些实施方案中，PBA的抗IGF-1RVHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:10的相应CDR的氨基酸序列，且PBA的抗IGF-1R VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:32的相应CDR的氨基酸序列。
在某些实施方案中，PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:134的相应CDR的氨基酸序列，且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:166的相应CDR的氨基酸序列。在某些实施方案中，PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ IDNO:135的相应CDR的氨基酸序列，且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:167的相应CDR的氨基酸序列。在某些实施方案中，PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:136的相应CDR的氨基酸序列，且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:168的相应CDR的氨基酸序列。在某些实施方案中，PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:137的相应CDR的氨基酸序列，且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:169的相应CDR的氨基酸序列。在某些实施方案中，PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:138的相应CDR的氨基酸序列，且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:170的相应CDR的氨基酸序列。在某些实施方案中，PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:139的相应CDR的氨基酸序列，且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:171的相应CDR的氨基酸序列。在某些实施方案中，PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:140的相应CDR的氨基酸序列，且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:172的相应CDR的氨基酸序列。在某些实施方案中，PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:141的相应CDR的氨基酸序列，且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:173的相应CDR的氨基酸序列。在某些实施方案中，PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:142的相应CDR的氨基酸序列，且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:174的相应CDR的氨基酸序列。在某些实施方案中，PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:143的相应CDR的氨基酸序列，且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:175的相应CDR的氨基酸序列。在某些实施方案中，PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:136的相应CDR的氨基酸序列，且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:169的相应CDR的氨基酸序列。
在某些实施方案中，PBA的抗IGF-1R VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:8的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗IGF-1R VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:32的相应CDR的氨基酸序列；且(a)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:134的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:166的相应CDR的氨基酸序列；或(b)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:135的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:167的相应CDR的氨基酸序列；或(c)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:136的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:168的相应CDR的氨基酸序列；或(d)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ IDNO:137的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:169的相应CDR的氨基酸序列；或(e)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:138的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ IDNO:170的相应CDR的氨基酸序列；或(f)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:139的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:171的相应CDR的氨基酸序列；或(g)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:140的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:172的相应CDR的氨基酸序列；或(h)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:141的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:173的相应CDR的氨基酸序列；或(i)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:142的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:174的相应CDR的氨基酸序列；或(j)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:143的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:175的相应CDR的氨基酸序列；或(k)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ IDNO:136的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:169的相应CDR的氨基酸序列。
在某些实施方案中，PBA的抗IGF-1R VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:9的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗IGF-1R VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:33的相应CDR的氨基酸序列；且(a)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:134的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:166的相应CDR的氨基酸序列；或(b)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:135的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:167的相应CDR的氨基酸序列；或(c)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:136的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:168的相应CDR的氨基酸序列；或(d)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ IDNO:137的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:169的相应CDR的氨基酸序列；或(e)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:138的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ IDNO:170的相应CDR的氨基酸序列；或(f)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:139的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:171的相应CDR的氨基酸序列；或(g)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:140的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:172的相应CDR的氨基酸序列；或(h)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:141的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:173的相应CDR的氨基酸序列；或(i)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:142的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:174的相应CDR的氨基酸序列；或(j)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:143的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:175的相应CDR的氨基酸序列；或(k)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ IDNO:136的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:169的相应CDR的氨基酸序列。
在某些实施方案中，PBA的抗IGF-1R VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:10的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗IGF-1R VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:34的相应CDR的氨基酸序列；且(a)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:134的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:166的相应CDR的氨基酸序列；或(b)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:135的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:167的相应CDR的氨基酸序列；或(c)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:136的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:168的相应CDR的氨基酸序列；或(d)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ IDNO:137的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:169的相应CDR的氨基酸序列；或(e)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:138的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ IDNO:170的相应CDR的氨基酸序列；或(f)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:139的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:171的相应CDR的氨基酸序列；或(g)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:140的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:172的相应CDR的氨基酸序列；或(h)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:141的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:173的相应CDR的氨基酸序列；或(i)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:142的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:174的相应CDR的氨基酸序列；或(j)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:143的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:175的相应CDR的氨基酸序列；或(k)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ IDNO:136的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:169的相应CDR的氨基酸序列。
在某些实施方案中，PBA的抗IGF-1R VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:11的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗IGF-1R VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:35的相应CDR的氨基酸序列；且(a)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:134的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:166的相应CDR的氨基酸序列；或(b)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:135的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:167的相应CDR的氨基酸序列；或(c)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:136的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:168的相应CDR的氨基酸序列；或(d)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ IDNO:137的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:169的相应CDR的氨基酸序列；或(e)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:138的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ IDNO:170的相应CDR的氨基酸序列；或(f)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:139的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:171的相应CDR的氨基酸序列；或(g)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:140的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:172的相应CDR的氨基酸序列；或(h)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:141的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:173的相应CDR的氨基酸序列；或(i)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:142的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:174的相应CDR的氨基酸序列；或(j)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:136的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:169的相应CDR的氨基酸序列。
在某些实施方案中，PBA的抗IGF-1R VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:8的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗IGF-1R VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:33的相应CDR的氨基酸序列；且(a)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:134的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:166的相应CDR的氨基酸序列；或(b)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:135的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:167的相应CDR的氨基酸序列；或(c)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:136的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:168的相应CDR的氨基酸序列；或(d)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ IDNO:137的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:169的相应CDR的氨基酸序列；或(e)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:138的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ IDNO:170的相应CDR的氨基酸序列；或(f)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:139的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:171的相应CDR的氨基酸序列；或(g)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:140的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:172的相应CDR的氨基酸序列；或(h)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:141的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:173的相应CDR的氨基酸序列；或(i)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:142的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:174的相应CDR的氨基酸序列；或(j)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:143的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:175的相应CDR的氨基酸序列；或(k)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ IDNO:136的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:169的相应CDR的氨基酸序列。
在某些实施方案中，PBA的抗IGF-1R VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:10的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗IGF-1R VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:32的相应CDR的氨基酸序列；且(a)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:134的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:166的相应CDR的氨基酸序列；或(b)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:135的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:167的相应CDR的氨基酸序列；或(c)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:136的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:168的相应CDR的氨基酸序列；或(d)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ IDNO:137的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:169的相应CDR的氨基酸序列；或(e)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:138的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ IDNO:170的相应CDR的氨基酸序列；或(f)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:139的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:171的相应CDR的氨基酸序列；或(g)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:140的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:172的相应CDR的氨基酸序列；或(h)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:141的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:173的相应CDR的氨基酸序列；或(i)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:142的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:174的相应CDR的氨基酸序列；或(j)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:143的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:175的相应CDR的氨基酸序列；或(k)PBA的抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ IDNO:136的相应CDR的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:169的相应CDR的氨基酸序列。
在某些实施方案中，PBA的各抗IGF-1R结合位点包含含有SEQ ID NO:1的序列的VH结构域，其中所述序列包含独立地表示在图1中的相应位置所示的任何氨基酸的可变氨基酸，和/或PBA的各抗IGF-1R结合位点包含含有SEQ ID NO:2(或3)的序列的VL结构域，其中所述序列包含独立地表示在图2中的相应位置所示的任何氨基酸的可变氨基酸。
在某些实施方案中，PBA的各抗ErbB3结合位点包含含有SEQ IDNO:4(或5)的序列的VH结构域，其中所述序列包含独立地表示在图3中的相应位置所示的任何氨基酸的可变氨基酸，和/或PBA的各抗ErbB3结合位点包含含有SEQ ID NO:6(或7)的序列的VL结构域，其中所述序列包含独立地表示在图4中的相应位置所示的任何氨基酸的可变氨基酸。
在某些实施方案中，PBA的各抗IGF-1R结合位点包含含有SEQ ID NO:1的序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:2(或3)的序列的VL结构域，且PBA的各抗ErbB3结合位点包含含有SEQ ID NO:4(或5)的序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:6(或7)的序列的VL结构域。
在某些实施方案中，PBA的各抗IGF-1R结合位点包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VH结构域，其中X1不为T、X2不为V、X6不为R、X8不为D或X10不为I，或含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VL结构域，或PBA的各抗ErbB3结合位点包含含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VH结构域或含有SEQ ID NO:7的序列的VL结构域。在某些实施方案中，PBA的各抗IGF-1R结合位点包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VH结构域，其中X1不为T、X2不为V、X6不为R、X8不为D或X10不为I，含有SEQ IDNO:3的序列的VL结构域；且PBA的各抗ErbB3结合位点包含含有SEQ IDNO:5的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:7的序列的VL结构域。
在某些实施方案中，PBA的各抗IGF-1R结合位点包含含有选自由SEQID NO:8-31组成的组的氨基酸序列的VH结构域和/或含有选自由SEQ IDNO:32-133组成的组的氨基酸序列的VL结构域，和/或各抗ErbB3结合位点包含选自由SEQ ID NO:134-165组成的组的VH氨基酸序列；和/或选自由SEQ ID NO:166-200组成的组的VL氨基酸序列。在某些实施方案中，(a)各第一VH结构域包含选自由SEQ ID NO:8-31组成的组的氨基酸序列，各第一VL结构域包含选自由SEQ ID NO:32-133组成的组的氨基酸序列，各第二VH结构域包含选自由SEQ ID NO:134-165组成的组的氨基酸序列且各第二VL结构域包含选自由SEQ ID NO:166-200组成的组的氨基酸序列，或(b)各第一VH结构域包含选自由SEQ ID NO:134-165组成的组的氨基酸序列，各第一VL结构域包含选自由SEQ ID NO:166-200组成的组的氨基酸序列，各第二VH结构域包含选自由SEQ ID NO:8-31组成的组的氨基酸序列且各第二VL结构域由选自包含SEQ ID NO:32-133的组的氨基酸序列组成。
在某些实施方案中，PBA的各抗IGF-1R VH结构域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列且PBA的各抗IGF-1R VL结构域包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列。在某些实施方案中，PBA的各抗IGF-1R VH结构域包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列且PBA的各抗IGF-1R VL结构域包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。在某些实施方案中，PBA的各抗IGF-1R VH结构域包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列且PBA的各抗IGF-1R VL结构域包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列。在某些实施方案中，PBA的各抗IGF-1R VH结构域包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列且PBA的各抗IGF-1R VL结构域包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列。在某些实施方案中，PBA的各抗IGF-1R VH结构域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列且PBA的各抗IGF-1R VL结构域包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。在某些实施方案中，PBA的各抗IGF-1R VH结构域包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列且PBA的各抗IGF-1R VL结构域包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列。
在某些实施方案中，PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:166的氨基酸序列。在某些实施方案中，PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列且PBA的抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列。在某些实施方案中，PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:168的氨基酸序列。在某些实施方案中，PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列。在某些实施方案中，PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列。在某些实施方案中，PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:139的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:171的氨基酸序列。在某些实施方案中，PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列。在某些实施方案中，PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:141的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:173的氨基酸序列。在某些实施方案中，PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列。在某些实施方案中，PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:143的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:175的氨基酸序列。在某些实施方案中，PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列。
在某些实施方案中，PBA的各抗IGF-1R VH结构域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列且PBA的各抗IGF-1R VL结构域包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；且(a)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:166的氨基酸序列；或(b)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列且PBA的ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列；或(c)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:168的氨基酸序列；或(d)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ IDNO:169的氨基酸序列；或(e)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ IDNO:138的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列；或(f)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:139的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:171的氨基酸序列；或(g)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列；或(h)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:141的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:173的氨基酸序列；或(i)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列；或(j)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQID NO:143的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:175的氨基酸序列；或(k)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列。
在某些实施方案中，PBA的各抗IGF-1R VH结构域包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列且PBA的各抗IGF-1R VL结构域包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；且(a)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:166的氨基酸序列；或(b)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列且PBA的ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列；或(c)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:168的氨基酸序列；或(d)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ IDNO:169的氨基酸序列；或(e)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ IDNO:138的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列；或(f)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:139的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:171的氨基酸序列；或(g)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列；或(h)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:141的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:173的氨基酸序列；或(i)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列；或(j)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQID NO:143的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:175的氨基酸序列；或(k)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列。
在某些实施方案中，各抗IGF-1R VH结构域包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列且各抗IGF-1R VL结构域包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；且(a)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:166的氨基酸序列；或(b)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列且PBA的ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列；或(c)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQID NO:136的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:168的氨基酸序列；或(d)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列；或(e)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列；或(f)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:139的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:171的氨基酸序列；或(g)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列；或(h)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:141的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ IDNO:173的氨基酸序列；或(i)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ IDNO:142的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列；或(j)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:143的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:175的氨基酸序列；或(k)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列。
在某些实施方案中，PBA的各抗IGF-1R VH结构域包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列且PBA的各抗IGF-1R VL结构域包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；且(a)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:166的氨基酸序列；或(b)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列且PBA的ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列；或(c)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:168的氨基酸序列；或(d)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ IDNO:169的氨基酸序列；或(e)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ IDNO:138的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列；或(f)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:139的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:171的氨基酸序列；或(g)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列；或(h)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:141的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:173的氨基酸序列；或(i)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列；或(j)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQID NO:136的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列。
在某些实施方案中，PBA的各抗IGF-1R VH结构域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列且PBA的各抗IGF-1R VL结构域包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；且(a)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:166的氨基酸序列；或(b)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列且PBA的ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列；或(c)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:168的氨基酸序列；或(d)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ IDNO:169的氨基酸序列；或(e)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ IDNO:138的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列；或(f)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:139的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:171的氨基酸序列；或(g)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列；或(h)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:141的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:173的氨基酸序列；或(i)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列；或(j)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQID NO:143的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:175的氨基酸序列；或(k)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列。
在某些实施方案中，PBA的各抗IGF-1R VH结构域包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列且PBA的各抗IGF-1R VL结构域包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；且(a)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:166的氨基酸序列；或(b)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列且PBA的ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列；或(c)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:168的氨基酸序列；或(d)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ IDNO:169的氨基酸序列；或(e)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ IDNO:138的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列；或(f)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:139的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:171的氨基酸序列；或(g)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列；或(h)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:141的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:173的氨基酸序列；或(i)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列；或(j)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQID NO:143的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:175的氨基酸序列；或(k)PBA的各抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列且PBA的各抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列。
在某些实施方案中,(a)PBA的各重链包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SF-G1-P1(SEQ ID NO:212)；SF-G1-M1.3(SEQ ID NO:214)；SF-G1-M27(SEQ ID NO:216)；SF-G1-P6(SEQ ID NO:218)；SF-G1-B69(SEQ IDNO:220)；P4-G1-C8(SEQ ID NO:222)；P4-G1-P1(SEQ ID NO:224)；P4-G1-M1.3(SEQ ID NO:226)；P4-G1-M27(SEQ ID NO:228)；P4-G1-P6(SEQ IDNO:230)；P4-G1-B69(SEQ ID NO:232)；M78-G1-C8(SEQ ID NO:234)；M78-G1-P1(SEQ ID NO:236)；M78-G1-M1.3(SEQ ID NO:238)；M78-G1-M27(SEQ ID NO:240)；M78-G1-P6(SEQ ID NO:242)；M78-G1-B69(SEQ ID NO:244)；M57-G1-C8(SEQ ID NO:246)；M57-G1-P1(SEQID NO:248)；M57-G1-M1.3(SEQ ID NO:250)；M57-G1-M27(SEQ ID NO:252)；M57-G1-P6(SEQ ID NO:254)和M57-G1-B69(SEQ ID NO:256)和/或PBA的各轻链包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SFκ轻链(SEQ ID NO:202)；P4κ轻链(SEQ ID NO:204)；M78κ轻链(SEQ ID NO:206)；和M57κ轻链(SEQ IDNO:208)；或(b)PBA的各重链包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：P1-G1-P4(SEQ ID NO:268)；P1-G1-M57(SEQ ID NO:270)；P1-G1-M78(SEQ IDNO:272)；M27-G1-P4(SEQ ID NO:274)；M27-G1-M57(SEQ ID NO:276)；M27-G1-M78(SEQ ID NO:278)；M7-G1-P4(SEQ ID NO:280)；M7-G1-M57(SEQID NO:282)；M7-G1-M78(SEQ ID NO:284)；B72-G1-P4(SEQ ID NO:286)；B72-G1-M57(SEQ ID NO:288)；B72-G1-M78(SEQ ID NO:290)；B60-G1-P4(SEQ ID NO:292)；B60-G1-M57(SEQ ID NO:294)；B60-G1-M78(SEQ ID NO:296)；B60-G2-M78(SEQ ID NO:355)和M7-G2-M78(SEQ ID NO:357)和/或PBA的各轻链包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：P1λ轻链(SEQ ID NO:258)；M27λ轻链(SEQ ID NO:260)；M7λ轻链(SEQ ID NO:262)；B72λ轻链(SEQ ID NO:264)；和B60λ轻链(SEQ IDNO:266)。
在某些实施方案中，(a)PBA的各重链包含因至少一个氨基酸添加、缺失或取代而与选自由以下组成的组的氨基酸序列不同的氨基酸序列：SF-G1-P1(SEQ ID NO:212)；SF-G1-M1.3(SEQ ID NO:214)；SF-G1-M27(SEQID NO:216)；SF-G1-P6(SEQ ID NO:218)；SF-G1-B69(SEQ ID NO:220)；P4-G1-C8(SEQ ID NO:222)；P4-G1-P1(SEQ ID NO:224)；P4-G1-M1.3(SEQ IDNO:226)；P4-G1-M27(SEQ ID NO:228)；P4-G1-P6(SEQ ID NO:230)；P4-G1-B69(SEQ ID NO:232)；M78-G1-C8(SEQ ID NO:234)；M78-G1-P1(SEQID NO:236)；M78-G1-M1.3(SEQ ID NO:238)；M78-G1-M27(SEQ ID NO:240)；M78-G1-P6(SEQ ID NO:242)；M78-G1-B69(SEQ ID NO:244)；M57-G1-C8(SEQID NO:246)；M57-G1-P1(SEQ ID NO:248)；M57-G1-M1.3(SEQ ID NO:250)；M57-G1-M27(SEQ ID NO:252)；M57-G1-P6(SEQ ID NO:254)和M57-G1-B69(SEQ ID NO:256)且PBA的各轻链包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SFκ轻链(SEQ ID NO:202)；P4κ轻链(SEQ ID NO:204)；M78κ轻链(SEQ ID NO:206)；和M57κ轻链(SEQ ID NO:208)；或(b)PBA的各重链包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SF-G1-P1(SEQ ID NO:212)；SF-G1-M1.3(SEQ ID NO:214)；SF-G1-M27(SEQ ID NO:216)；SF-G1-P6(SEQID NO:218)；SF-G1-B69(SEQ ID NO:220)；P4-G1-C8(SEQ ID NO:222)；P4-G1-P1(SEQ ID NO:224)；P4-G1-M1.3(SEQ ID NO:226)；P4-G1-M27(SEQ IDNO:228)；P4-G1-P6(SEQ ID NO:230)；P4-G1-B69(SEQ ID NO:232)；M78-G1-C8(SEQ ID NO:234)；M78-G1-P1(SEQ ID NO:236)；M78-G1-M1.3(SEQ ID NO:238)；M78-G1-M27(SEQ ID NO:240)；M78-G1-P6(SEQ ID NO:242)；M78-G1-B69(SEQ ID NO:244)；M57-G1-C8(SEQID NO:246)；M57-G1-P1(SEQ ID NO:248)；M57-G1-M1.3(SEQ ID NO:250)；M57-G1-M27(SEQ ID NO:252)；M57-G1-P6(SEQ ID NO:254)和M57-G1-B69(SEQ ID NO:256)；且PBA的各轻链包含因至少一个氨基酸添加、缺失或取代而与选自由以下组成的组的氨基酸序列不同的氨基酸序列：SFκ轻链(SEQ ID NO:202)；P4κ轻链(SEQ ID NO:204)；M78κ轻链(SEQ IDNO:206)；和M57κ轻链(SEQ ID NO:208)；或(c)PBA的各重链包含因至少一个氨基酸添加、缺失或取代而与选自包含以下的组的氨基酸序列不同的氨基酸序列：P1-G1-P4(SEQ ID NO:268)；P1-G1-M57(SEQ ID NO:270)；P1-G1-M78(SEQ ID NO:272)；M27-G1-P4(SEQ ID NO:274)；M27-G1-M57(SEQ ID NO:276)；M27-G1-M78(SEQ ID NO:278)；M7-G1-P4(SEQ ID NO:280)；M7-G1-M57(SEQ ID NO:282)；M7-G1-M78(SEQID NO:284)；B72-G1-P4(SEQ ID NO:286)；B72-G1-M57(SEQ ID NO:288)；B72-G1-M78(SEQ ID NO:290)；B60-G1-P4(SEQ ID NO:292)；B60-G1-M57(SEQ ID NO:294)；B60-G1-M78(SEQ ID NO:296)；B60-G2-M78(SEQ ID NO:355)和M7-G2-M78(SEQ ID NO:357)且PBA的各轻链包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：P1λ轻链(SEQ ID NO:258)；M27λ轻链(SEQ ID NO:260)；M7λ轻链(SEQ ID NO:262)；B72λ轻链(SEQ IDNO:264)；和B60λ轻链(SEQ ID NO:266)；或(d)PBA的各重链包含选自包含以下的组的氨基酸序列：P1-G1-P4(SEQ ID NO:268)；P1-G1-M57(SEQ IDNO:270)；P1-G1-M78(SEQ ID NO:272)；M27-G1-P4(SEQ ID NO:274)；M27-G1-M57(SEQ ID NO:276)；M27-G1-M78(SEQ ID NO:278)；M7-G1-P4(SEQ ID NO:280)；M7-G1-M57(SEQ ID NO:282)；M7-G1-M78(SEQID NO:284)；B72-G1-P4(SEQ ID NO:286)；B72-G1-M57(SEQ ID NO:288)；B72-G1-M78(SEQ ID NO:290)；B60-G1-P4(SEQ ID NO:292)；B60-G1-M57(SEQ ID NO:294)；B60-G1-M78(SEQ ID NO:296)；B60-G2-M78(SEQ ID NO:355)和M7-G2-M78(SEQ ID NO:357)且PBA的各轻链包含因至少一个氨基酸添加、缺失或取代而与选自由以下组成的组的氨基酸序列不同的氨基酸序列：P1λ轻链(SEQ ID NO:258)；M27λ轻链(SEQ IDNO:260)；M7λ轻链(SEQ ID NO:262)；B72λ轻链(SEQ ID NO:264)；和B60λ轻链(SEQ ID NO:266)，其中PBA在至少一个氨基酸、CDR或可变结构域方面与16F不同。
在某些实施方案中，(a)通过至少一个键结合于PBA的另一重链的PBA的各重链包含与以下氨基酸序列之一至少90％一致或因1-30个氨基酸取代、缺失和/或添加而与以下氨基酸序列之一不同的氨基酸序列：SF-G1-P1(SEQID NO:212)；SF-G1-M1.3(SEQ ID NO:214)；SF-G1-M27(SEQ ID NO:216)；SF-G1-P6(SEQ ID NO:218)；SF-G1-B69(SEQ ID NO:220)；P4-G1-C8(SEQ IDNO:222)；P4-G1-P1(SEQ ID NO:224)；P4-G1-M1.3(SEQ ID NO:226)；P4-G1-M27(SEQ ID NO:228)；P4-G1-P6(SEQ ID NO:230)；P4-G1-B69(SEQ IDNO:232)；M78-G1-C8(SEQ ID NO:234)；M78-G1-P1(SEQ ID NO:236)；M78-G1-M1.3(SEQ ID NO:238)；M78-G1-M27(SEQ ID NO:240)；M78-G1-P6(SEQ ID NO:242)；M78-G1-B69(SEQ ID NO:244)；M57-G1-C8(SEQID NO:246)；M57-G1-P1(SEQ ID NO:248)；M57-G1-M1.3(SEQ ID NO:250)；M57-G1-M27(SEQ ID NO:252)；M57-G1-P6(SEQ ID NO:254)和M57-G1-B69(SEQ ID NO:256)，和(b)通过至少一个键结合于(a)的一个重链的PBA的各轻链包含与以下氨基酸序列之一至少90％一致或因1-30个氨基酸取代、缺失和/或添加而与以下氨基酸序列之一不同的氨基酸序列：SFκ轻链(SEQ ID NO:202)；P4κ轻链(SEQ ID NO:204)；M78κ轻链(SEQ ID NO:206)；和M57κ轻链(SEQ ID NO:208)；或(c)通过至少一个键结合于PBA的另一重链的PBA的各重链包含与以下氨基酸序列之一至少90％一致或因1-30个氨基酸取代、缺失和/或添加而与以下氨基酸序列之一不同的氨基酸序列：P1-G1-P4(SEQ ID NO:268)；P1-G1-M57(SEQ ID NO:270)；P1-G1-M78(SEQ IDNO:272)；M27-G1-P4(SEQ ID NO:274)；M27-G1-M57(SEQ ID NO:276)；M27-G1-M78(SEQ ID NO:278)；M7-G1-P4(SEQ ID NO:280)；M7-G1-M57(SEQID NO:282)；M7-G1-M78(SEQ ID NO:284)；B72-G1-P4(SEQ ID NO:286)；B72-G1-M57(SEQ ID NO:288)；B72-G1-M78(SEQ ID NO:290)；B60-G1-P4(SEQ ID NO:292)；B60-G1-M57(SEQ ID NO:294)；和B60-G1-M78(SEQ ID NO:296)；B60-G2-M78(SEQ ID NO:355)和M7-G2-M78(SEQ ID NO:357)，和(d)通过至少一个键结合于(c)的一个重链的PBA的各轻链包含与以下氨基酸序列之一至少90％一致或因1-30个氨基酸取代、缺失和/或添加而与以下氨基酸序列之一不同的氨基酸序列：P1λ轻链(SEQ ID NO:258)；M27λ轻链(SEQ ID NO:260)；M7λ轻链(SEQ ID NO:262)；B72λ轻链(SEQ ID NO:264)；和B60λ轻链(SEQ ID NO:266)。
在某些实施方案中，(a)PBA的各重链包含与以下氨基酸序列之一至少95％一致或因1-10个氨基酸取代、缺失和/或添加而与以下氨基酸序列之一不同的氨基酸序列：SF-G1-P1(SEQ ID NO:212)；SF-G1-M1.3(SEQ ID NO:214)；SF-G1-M27(SEQ ID NO:216)；SF-G1-P6(SEQ ID NO:218)；SF-G1-B69(SEQ IDNO:220)；P4-G1-C8(SEQ ID NO:222)；P4-G1-P1(SEQ ID NO:224)；P4-G1-M1.3(SEQ ID NO:226)；P4-G1-M27(SEQ ID NO:228)；P4-G1-P6(SEQ IDNO:230)；P4-G1-B69(SEQ ID NO:232)；M78-G1-C8(SEQ ID NO:234)；M78-G1-P1(SEQ ID NO:236)；M78-G1-M1.3(SEQ ID NO:238)；M78-G1-M27(SEQ ID NO:240)；M78-G1-P6(SEQ ID NO:242)；M78-G1-B69(SEQ ID NO:244)；M57-G1-C8(SEQ ID NO:246)；M57-G1-P1(SEQID NO:248)；M57-G1-M1.3(SEQ ID NO:250)；M57-G1-M27(SEQ ID NO:252)；M57-G1-P6(SEQ ID NO:254)和M57-G1-B69(SEQ ID NO:256)，和(b)PBA的各轻链包含与以下氨基酸序列之一至少95％一致或因1-10个氨基酸取代、缺失和/或添加而与以下氨基酸序列之一不同的氨基酸序列：SFκ轻链(SEQ IDNO:202)；P4κ轻链(SEQ ID NO:204)；M78κ轻链(SEQ ID NO:206)；和M57κ轻链(SEQ ID NO:208)；或(c)PBA的各重链包含与以下氨基酸序列之一至少95％一致或因1-10个氨基酸取代、缺失和/或添加而与以下氨基酸序列之一不同的氨基酸序列：P1-G1-P4(SEQ ID NO:268)；P1-G1-M57(SEQ ID NO:270)；P1-G1-M78(SEQ ID NO:272)；M27-G1-P4(SEQ ID NO:274)；M27-G1-M57(SEQ ID NO:276)；M27-G1-M78(SEQ ID NO:278)；M7-G1-P4(SEQ ID NO:280)；M7-G1-M57(SEQ ID NO:282)；M7-G1-M78(SEQID NO:284)；B72-G1-P4(SEQ ID NO:286)；B72-G1-M57(SEQ ID NO:288)；B72-G1-M78(SEQ ID NO:290)；B60-G1-P4(SEQ ID NO:292)；B60-G1-M57(SEQ ID NO:294)；和B60-G1-M78(SEQ ID NO:296)；B60-G2-M78(SEQ ID NO:355)和M7-G2-M78(SEQ ID NO:357)，和(d)PBA的各轻链包含与以下氨基酸序列之一至少95％一致或因1-10个氨基酸取代、缺失和/或添加而与以下氨基酸序列之一不同的氨基酸序列：P1λ轻链(SEQ IDNO:258)；M27λ轻链(SEQ ID NO:260)；M7λ轻链(SEQ ID NO:262)；B72λ轻链(SEQ ID NO:264)；B60λ轻链(SEQ ID NO:266)。
示例性PBA包括以下：(a)包含以下的SF-G1-P1PBA：两条重链，各自包含SEQ ID NO:212的重链氨基酸序列；和两条轻链，各自包含SEQ IDNO:202的轻链序列；(b)包含以下的SF-G1-M1.3PBA：两条重链，各自包含SEQ ID NO:214的重链氨基酸序列；和两条轻链，各自包含SEQ ID NO:202的轻链氨基酸序列；(c)包含以下的SF-G1-M27PBA：两条重链，各自包含SEQ ID NO:216的重链氨基酸序列；和两条轻链，各自包含SEQ ID NO:202的轻链氨基酸序列；(d)包含以下的SF-G1-P6PBA：两条重链，各自包含SEQID NO:218的重链氨基酸序列；和两条轻链，各自包含SEQ ID NO:202的轻链氨基酸序列；(e)包含以下的SF-G1-B69PBA：两条重链，各自包含SEQ IDNO:220的重链氨基酸序列；和两条轻链，各自包含SEQ ID NO:202的轻链氨基酸序列；(f)包含以下的P4-G1-C8PBA：两条重链，各自包含SEQ ID NO:222的重链氨基酸序列；和两条轻链，各自包含SEQ ID NO:204的轻链氨基酸序列；(g)包含以下的P4-G1-P1PBA：两条重链，各自包含SEQ ID NO:224的重链氨基酸序列；和两条轻链，各自包含SEQ ID NO:204的轻链氨基酸序列；(h)包含以下的P4-G1-M1.3PBA：两条重链，各自包含SEQ ID NO:226的重链氨基酸序列；和两条轻链，各自包含SEQ ID NO:204的轻链氨基酸序列；(i)包含以下的P4-G1-M27PBA：两条重链，各自包含SEQ ID NO:228的重链氨基酸序列；和两条轻链，各自包含SEQ ID NO:204的轻链氨基酸序列；(j)包含以下的P4-G1-P6PBA：两条重链，各自包含SEQ ID NO:230的重链氨基酸序列；和两条轻链，各自包含SEQ ID NO:204的轻链氨基酸序列；(h)包含以下的P4-G1-B69PBA两条重链，各自包含SEQ ID NO:232的重链氨基酸序列；和两条轻链，各自包含SEQ ID NO:204的轻链氨基酸序列；(i)包含以下的M78-G1-C8PBA：两条重链，各自包含SEQ ID NO:234的重链氨基酸序列；和两条轻链，各自包含SEQ ID NO:206的轻链氨基酸序列；(j)包含以下的M78-G1-P1PBA：两条重链，各自包含SEQ ID NO:236的重链氨基酸序列；和两条轻链，各自包含SEQ ID NO:206的轻链氨基酸序列；(k)包含以下的M78-G1-M1.3PBA：两条重链，各自包含SEQ ID NO:238的重链氨基酸序列；和两条轻链，各自包含SEQ ID NO:206的轻链氨基酸序列；(l)包含以下的M78-G1-M27PBA：两条重链，各自包含SEQ ID NO:240的重链氨基酸序列；和两条轻链，各自包含SEQ ID NO:206的轻链氨基酸序列；(m)包含以下的M78-G1-P6PBA：两条重链，各自包含SEQ ID NO:242的重链氨基酸序列；和两条轻链，各自包含SEQ ID NO:206的轻链氨基酸序列；(n)包含以下的M78-G1-B69PBA：两条重链，各自包含SEQ ID NO:244的重链氨基酸序列；和两条轻链，各自包含SEQ ID NO:206的轻链氨基酸序列；(o)包含以下的M57-G1-C8PBA：两条重链，各自包含SEQ ID NO:246的重链氨基酸序列；和两条轻链，各自包含SEQ ID NO:208的轻链氨基酸序列；(p)包含以下的M57-G1-P1PBA：两条重链，各自包含SEQ ID NO:248的重链氨基酸序列；和两条轻链，各自包含SEQ ID NO:208的轻链氨基酸序列；(r)包含以下的M57-G1-M1.3PBA：两条重链，各自包含SEQ ID NO:250的重链氨基酸序列；和两条轻链，各自包含SEQ ID NO:208的轻链氨基酸序列；(s)包含以下的M57-G1-M27PBA：两条重链，各自包含SEQ ID NO:252的重链氨基酸序列；和两条轻链，各自包含SEQ ID NO:208的轻链氨基酸序列；(t)包含以下的M57-G1-P6PBA：两条重链，各自包含SEQ ID NO:254的重链氨基酸序列；和两条轻链，各自包含SEQ ID NO:208的轻链氨基酸序列；(u)包含以下的M57-G1-B69PBA：两条重链，各自包含SEQ ID NO:256的重链氨基酸序列；和两条轻链，各自包含SEQ ID NO:208的轻链氨基酸序列；(v)包含以下的P1-G1-P4PBA：两条重链，各自包含SEQ ID NO:268的重链氨基酸序列；和两条轻链，各自包含SEQ ID NO:258的轻链氨基酸序列；(w)包含以下的P1-G1-M57PBA：两条重链，各自包含SEQ ID NO:270的重链氨基酸序列；和两条轻链，各自包含SEQ ID NO:258的轻链氨基酸序列；(x)包含以下的P1-G1-M78PBA：两条重链，各自包含SEQ ID NO:272的重链氨基酸序列；和两条轻链，各自包含SEQ ID NO:258的轻链氨基酸序列；(y)包含以下的M27-G1-P4PBA：两条重链，各自包含SEQ ID NO:274的重链氨基酸序列；和两条轻链，各自包含SEQ ID NO:260的轻链氨基酸序列；(z)包含以下的M27-G1-M57PBA：两条重链，各自包含SEQ ID NO:276的重链氨基酸序列；和两条轻链，各自包含SEQ ID NO:260的轻链氨基酸序列；(aa)包含以下的M27-G1-M78PBA：两条重链，各自包含SEQ ID NO:278的重链氨基酸序列；和两条轻链，各自包含SEQ ID NO:260的轻链氨基酸序列；(ab)包含以下的M7-G1-P4PBA：两条重链，各自包含SEQ ID NO:280的重链氨基酸序列；和两条轻链，各自包含SEQ ID NO:262的轻链氨基酸序列；(ac)包含以下的M7-G1-M57PBA：两条重链，各自包含SEQ ID NO:282的重链氨基酸序列；和两条轻链，各自包含SEQ ID NO:262的轻链氨基酸序列；(ad)包含以下的M7-G1-M78PBA：两条重链，各自包含SEQ ID NO:284的重链氨基酸序列；和两条轻链，各自包含SEQ ID NO:262的轻链氨基酸序列；(ae)包含以下的B72-G1-P4PBA：两条重链，各自包含SEQ ID NO:286的重链氨基酸序列；和两条轻链，各自包含SEQ ID NO:264的轻链氨基酸序列；(af)包含以下的B72-G1-M57PBA：两条重链，各自包含SEQ ID NO:288的重链氨基酸序列；和两条轻链，各自包含SEQ ID NO:264的轻链氨基酸序列；(ag)包含以下的B72-G1-M78PBA：两条重链，各自包含SEQ ID NO:290的重链氨基酸序列；和两条轻链，各自包含SEQ ID NO:264的轻链氨基酸序列；(ah)包含以下的B60-G1-P4PBA：两条重链，各自包含SEQ ID NO:292的重链氨基酸序列；和两条轻链，各自包含SEQ ID NO:266的轻链氨基酸序列；(ai)包含以下的B60-G1-M57PBA：两条重链，各自包含SEQ ID NO:294的重链氨基酸序列；和两条轻链，各自包含SEQ ID NO:266的轻链氨基酸序列；和(aj)包含以下的B60-G1-M78PBA：两条重链，各自包含SEQ ID NO:296的重链氨基酸序列；和两条轻链，各自包含SEQ ID NO:266的轻链氨基酸序列。
本文还提供单特异性抗体。在某些实施方案中，抗IGF-1R单克隆抗体包含按氨基至羧基顺序包含如图5A的SEQ ID NO:202中加点状下划线所示SFκ轻链的VLCDR1序列、VLCDR2序列和VLCDR3序列的第一序列，抗体进一步包含按氨基至羧基顺序包含如图5A的SEQ ID NO:210中分别前三个加点状下划线序列所示SF重链的VHCDR1序列、VHCDR2序列和VHCDR3序列的第二序列，其中第一序列与第二序列不重叠。在某些实施方案中，抗IGF-1R单克隆抗体按氨基至羧基顺序包含如图5A的SEQ ID NO:204中加点状下划线所示P4κ轻链的VLCDR1序列、VLCDR2序列和VLCDR3序列，抗体进一步按氨基至羧基顺序包含如图5A的SEQ ID NO:222中分别前三个加点状下划线序列所示P4重链的VHCDR1序列、VHCDR2序列和VHCDR3序列。在某些实施方案中，抗IGF-1R单克隆抗体按氨基至羧基顺序包含如图5A的SEQ ID NO:206中加点状下划线所示M78κ轻链的VLCDR1序列、VLCDR2序列和VLCDR3序列，抗体进一步按氨基至羧基顺序包含如图5A的SEQ ID NO:234中分别前三个加点状下划线序列所示M78重链的VHCDR1序列、VHCDR2序列和VHCDR3序列。在某些实施方案中，抗IGF-1R单克隆抗体按氨基至羧基顺序包含如图5A的SEQ ID NO:208中加点状下划线所示M57κ轻链的VLCDR1序列、VLCDR2序列和VLCDR3序列，抗体进一步按氨基至羧基顺序包含如图5A的SEQ ID NO:246中分别前三个加点状下划线序列所示M57重链的VHCDR1序列、VHCDR2序列和VHCDR3序列。
在某些实施方案中，抗IGF-1R抗体包含含有一组三个包含VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3的VH CDR的VH结构域，和/或含有一组三个包含VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3的VL CDR的VL结构域，CDR分别包含SEQ ID NO:302、303、304、305、306和307的序列，且各CDR进一步包含氨基端和羧基端，其中各组CDR的CDR在抗体中按CDR1、CDR2和CDR3的线性氨基至羧基顺序排列，其中CDR包含独立地表示图1(VH)或图2(VL)中相应位置所示的任何氨基酸的可变氨基酸，且抗体不包含SF模块。在某些实施方案中，抗IGF-1R抗体的VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3分别包含SEQ ID NO:302、303、304、305、306和308的序列。在某些实施方案中，抗IGF-1R抗体的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3结构域包含SEQ ID NO:8-10和12-31中任一者的相应氨基酸序列，且抗IGF-1R抗体的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3结构域包含SEQ IDNO:32-34和36-133中任一者的相应氨基酸序列。在某些实施方案中，(a)抗IGF-1R抗体的VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:8的相应CDR的氨基酸序列且抗IGF-1R抗体的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQID NO:32的相应CDR的氨基酸序列；或(b)抗IGF-1R抗体的VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:9的相应CDR的氨基酸序列且抗IGF-1R抗体的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:33的相应CDR的氨基酸序列；或(c)抗IGF-1R抗体的VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQID NO:10的相应CDR的氨基酸序列且抗IGF-1R抗体的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:34的相应CDR的氨基酸序列；或(d)抗IGF-1R抗体的VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:11的相应CDR的氨基酸序列且抗IGF-1R抗体的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ IDNO:35的相应CDR的氨基酸序列；或(e)抗IGF-1R抗体的VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:8的相应CDR的氨基酸序列且抗IGF-1R抗体的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:33的相应CDR的氨基酸序列；或(f)抗IGF-1R抗体的VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQID NO:10的相应CDR的氨基酸序列且抗IGF-1R抗体的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:32的相应CDR的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗IGF-1R抗体的VH结构域包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，所述序列包含独立地表示图1中相应位置所示的任何氨基酸的可变氨基酸；抗IGF-1R抗体的VL结构域包含SEQ ID NO:2(或3)的氨基酸序列，所述序列包含独立地表示图2中相应位置所示的任何氨基酸的可变氨基酸；或抗IGF-1R抗体的VH结构域包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列且抗IGF-1R抗体的VL结构域包含SEQ ID NO:2或3的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗IGF-1R抗体的VH结构域包含选自由SEQ ID NO:8-10和12-31组成的组的氨基酸序列且VL结构域包含选自由SEQ ID NO:32-34和36-133组成的组的氨基酸序列。
在某些实施方案中，(a)抗IGF-1R抗体的VH结构域包含与SEQ IDNO:8-10和12-31中任一者的氨基酸序列至少90％一致或因1-30个氨基酸的氨基酸取代、添加或缺失而与SEQ ID NO:8-10和12-31中任一者的氨基酸序列不同的氨基酸序列，和/或(b)抗IGF-1R抗体的VL结构域包含与SEQ IDNO:32-34和36-133中任一者的氨基酸序列的氨基酸序列至少90％一致或因1-30个氨基酸的氨基酸取代、添加或缺失而与SEQ ID NO:32-34和36-133中任一者的氨基酸序列的氨基酸序列不同的氨基酸序列。在某些实施方案中，(a)抗IGF-1R抗体的VH结构域包含与SEQ ID NO:8-10和12-31中任一者的氨基酸序列至少95％一致或因1-10个氨基酸的氨基酸取代、添加或缺失而与SEQ ID NO:8-10和12-31中任一者的氨基酸序列不同的氨基酸序列，和/或(b)VL结构域包含与SEQ ID NO:32-34和36-133中任一者的氨基酸序列的氨基酸序列至少95％一致或因1-10个氨基酸的氨基酸取代、添加或缺失而与SEQ ID NO:32-34和36-133中任一者的氨基酸序列的氨基酸序列不同的氨基酸序列。
抗IGF-1R抗体可为IgG1抗体，例如分离的和/或单克隆IgG1抗体。
在某些实施方案中，抗IGF-1R抗体为包含两对多肽链的蛋白质，各对包含重链和轻链；其中(a)各重链包含SEQ ID NO:359、360或361的氨基酸序列；和/或(b)各轻链包含SEQ ID NO:204、206或208的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗IGF-1R抗体为包含两对多肽链的蛋白质，各对包含重链和轻链；其中(a)各重链包含与SEQ ID NO:359、360或361中任一者的氨基酸序列至少90％一致或因1-30个氨基酸的氨基酸取代、添加或缺失而与SEQ IDNO:359、360或361中任一者的氨基酸序列不同的氨基酸序列，和/或(b)各轻链包含与SEQ ID NO:204、206或208中任一者的氨基酸序列的氨基酸序列至少90％一致或因1-30个氨基酸的氨基酸取代、添加或缺失而与SEQ IDNO:204、206或208中任一者的氨基酸序列的氨基酸序列不同的氨基酸序列。在某些实施方案中，(a)抗IGF-1R抗体的各重链包含与SEQ ID NO:359、360或361中任一者的氨基酸序列至少95％一致或因1-10个氨基酸的氨基酸取代、添加或缺失而与SEQ ID NO:359、360或361中任一者的氨基酸序列不同的氨基酸序列，和/或(b)各轻链包含与SEQ ID NO:204、206或208中任一者的氨基酸序列的氨基酸序列至少95％一致或因1-10个氨基酸的氨基酸取代、添加或缺失而与SEQ ID NO:204、206或208中任一者的氨基酸序列的氨基酸序列不同的氨基酸序列。
示例性抗体包括(a)包含各自含有SEQ ID NO:359的重链氨基酸序列的两条重链和各自含有SEQ ID NO:204的轻链氨基酸序列的两条轻链的抗IGF-R1单克隆IgG1抗体P4；(b)包含各自含有SEQ ID NO:360的重链氨基酸序列的两条重链和各自含有SEQ ID NO:206的轻链氨基酸序列的两条轻链的抗IGF-R1单克隆IgG1抗体M78；(c)包含各自含有SEQ ID NO:361的重链氨基酸序列的两条重链和各自含有SEQ ID NO:208的轻链氨基酸序列的两条轻链的抗IGF-R1单克隆IgG1抗体M57；(d)包含各自含有SEQ ID NO:361的重链氨基酸序列的两条重链和各自含有SEQ ID NO:206的轻链氨基酸序列的两条轻链的抗IGF-R1单克隆IgG1抗体M57/M78；和(e)包含各自含有SEQ IDNO:359的重链氨基酸序列的两条重链和各自含有SEQ ID NO:208的轻链氨基酸序列的两条轻链的抗IGF-R1单克隆IgG1抗体P4/M57。
抗IGF-1R抗体可包含一个或多个其它结合位点，例如抗ErbB3结合位点。
还提供抗ErbB3单克隆抗体，例如单克隆抗ErbB3抗体。在某些实施方案中，抗ErbB3按氨基至羧基顺序包含如图5B的SEQ ID NO:258中加点状下划线所示P1λ轻链的VLCDR1序列、VLCDR2序列和VLCDR3序列，抗体进一步按氨基至羧基顺序包含如图5B的SEQ ID NO:268中分别前三个加点状下划线序列所示P1重链的VHCDR1序列、VHCDR2序列和VHCDR3序列。在某些实施方案中，抗ErbB3单克隆抗体按氨基至羧基顺序包含如图5B的SEQ ID NO:260中加点状下划线所示M27λ轻链的VLCDR1序列、VLCDR2序列和VLCDR3序列，抗体进一步按氨基至羧基顺序包含如图5B的SEQ ID NO:274中分别前三个加点状下划线序列所示M27重链的VHCDR1序列、VHCDR2序列和VHCDR3序列。在某些实施方案中，抗ErbB3单克隆抗体按氨基至羧基顺序包含如图5B的SEQ ID NO:262中加点状下划线所示M7λ轻链的VLCDR1序列、VLCDR2序列和VLCDR3序列，抗体进一步按氨基至羧基顺序包含如图5B的SEQ ID NO:280中分别前三个加点状下划线序列所示M7重链的VHCDR1序列、VHCDR2序列和VHCDR3序列。在某些实施方案中，抗ErbB3单克隆抗体按氨基至羧基顺序包含如图5B的SEQID NO:264中加点状下划线所示B72λ轻链的VLCDR1序列、VLCDR2序列和VLCDR3序列，抗体进一步按氨基至羧基顺序包含如图5B的SEQ IDNO:286中分别前三个加点状下划线序列所示B72重链的VHCDR1序列、VHCDR2序列和VHCDR3序列。在某些实施方案中，抗ErbB3单克隆抗体按氨基至羧基顺序包含如图5B的SEQ ID NO:266中加点状下划线所示B60λ轻链的VLCDR1序列、VLCDR2序列和VLCDR3序列，抗体进一步按氨基至羧基顺序包含如图5B的SEQ ID NO:292中分别前三个加点状下划线序列所示B60重链的VHCDR1序列、VHCDR2序列和VHCDR3序列。
在某些实施方案中，特异性结合人ErbB3的分离的抗ErbB3抗体包含含有一组三个包含VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3的VH CDR的VH结构域，和/或含有一组三个包含VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3的VL CDR的VL结构域，CDR分别包含SEQ ID NO:309、310、311、312、313和314的序列，且各CDR进一步包含氨基端和羧基端，其中各组CDR的CDR在抗体中按CDR1、CDR2和CDR3的线性氨基至羧基顺序排列，其中CDR包含独立地表示图3(VH)或图4(VL)中相应位置所示的任何氨基酸的可变氨基酸，且抗体不包含C8模块。在某些实施方案中，抗ErbB3抗体的VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3分别包含SEQ ID NO:309、310、311、312、313和315的序列。在某些实施方案中，抗ErbB3抗体的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3结构域包含SEQ ID NO:134-142和144-165中任一者的相应氨基酸序列，且抗体的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3结构域包含SEQID NO:166-174和176-200中任一者的相应氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗ErbB3抗体的VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:134的相应CDR的氨基酸序列，且抗ErbB3抗体的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:166的相应CDR的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗ErbB3抗体的VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ IDNO:135的相应CDR的氨基酸序列，且抗ErbB3抗体的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:167的相应CDR的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗ErbB3抗体的VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:136的相应CDR的氨基酸序列，且抗ErbB3抗体的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:168的相应CDR的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗ErbB3抗体的VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:137的相应CDR的氨基酸序列，且抗ErbB3抗体的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:169的相应CDR的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗ErbB3抗体的VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:138的相应CDR的氨基酸序列，且抗ErbB3抗体的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:170的相应CDR的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗ErbB3抗体的VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:139的相应CDR的氨基酸序列，且抗ErbB3抗体的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:171的相应CDR的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗ErbB3抗体的VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:140的相应CDR的氨基酸序列，且抗体的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:172的相应CDR的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗ErbB3抗体的VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:141的相应CDR的氨基酸序列，且抗ErbB3抗体的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ IDNO:173的相应CDR的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗ErbB3抗体的VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:142的相应CDR的氨基酸序列，且抗ErbB3抗体的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:174的相应CDR的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗ErbB3抗体的VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:136的相应CDR的氨基酸序列，且抗ErbB3抗体的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:169的相应CDR的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗ErbB3抗体的VH结构域包含SEQ ID NO:4(或5)的氨基酸序列，所述序列包含独立地表示图3中相应位置所示的任何氨基酸的可变氨基酸，和/或抗ErbB3抗体的VL结构域包含SEQ ID NO:6(或7)的氨基酸序列，所述序列包含独立地表示图4中相应位置所示的任何氨基酸的可变氨基酸。在某些实施方案中，抗ErbB3抗体的VH结构域包含选自由SEQ IDNO:134-142和144-165组成的组的氨基酸序列且抗ErbB3抗体的VL结构域包含选自由SEQ ID NO:166-174和176-200组成的组的氨基酸序列。
在某些实施方案中，(a)抗ErbB3抗体的VH结构域包含与SEQ IDNO:134-142和144-165中任一者的氨基酸序列至少90％一致或因1-30个氨基酸的氨基酸取代、添加或缺失而与SEQ ID NO:134-142和144-165中任一者的氨基酸序列不同的氨基酸序列，和/或(b)抗ErbB3抗体的VL结构域包含与SEQ ID NO:166-174和176-200中任一者的氨基酸序列的氨基酸序列至少90％一致或因1-30个氨基酸的氨基酸取代、添加或缺失而与SEQ ID NO:166-174和176-200中任一者的氨基酸序列的氨基酸序列不同的氨基酸序列。在某些实施方案中，(a)抗ErbB3抗体的VH结构域包含与SEQ ID NO:134-142和144-165中任一者的氨基酸序列至少95％一致或因1-10个氨基酸的氨基酸取代、添加或缺失而与SEQ ID NO:134-142和144-165中任一者的氨基酸序列不同的氨基酸序列，和/或(b)VL结构域包含与SEQ ID NO:166-174和176-200中任一者的氨基酸序列的氨基酸序列至少95％一致或因1-10个氨基酸的氨基酸取代、添加或缺失而与SEQ ID NO:166-174和176-200中任一者的氨基酸序列的氨基酸序列不同的氨基酸序列。
抗ErbB3抗体可为IgG1抗体，例如分离的单克隆IgG1抗体。
在某些实施方案中，抗ErbB3抗体为包含两对多肽链的蛋白质，各对包含重链和轻链；其中(a)各重链包含SEQ ID NO:362、363、364、365或366的氨基酸序列；和/或(b)各轻链包含SEQ ID NO:258、260、262、264或266的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗ErbB3抗体为包含两对多肽链的蛋白质，各对包含重链和轻链；其中(a)各重链包含与SEQ ID NO:362、363、364、365或366中任一者的氨基酸序列至少90％一致或因1-30个氨基酸的氨基酸取代、添加或缺失而与SEQ ID NO:362、363、364、365或366中任一者的氨基酸序列不同的氨基酸序列，和/或(b)各轻链包含与SEQ ID NO:258、260、262、264或266中任一者的氨基酸序列的氨基酸序列至少90％一致或因1-30个氨基酸的氨基酸取代、添加或缺失而与SEQ ID NO:258、260、262、264或266中任一者的氨基酸序列的氨基酸序列不同的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗ErbB3抗体为包含两对多肽链的蛋白质，各对包含重链和轻链；其中(a)各重链包含与SEQ ID NO:362、363、364、365或366中任一者的氨基酸序列至少95％一致或因1-10个氨基酸的氨基酸取代、添加或缺失而与SEQ ID NO:362、363、364、365或366中任一者的氨基酸序列不同的氨基酸序列，和(b)各轻链包含与SEQ ID NO:258、260、262、264或266中任一者的氨基酸序列的氨基酸序列至少95％一致或因1-10个氨基酸的氨基酸取代、添加或缺失而与SEQ ID NO:258、260、262、264或266中任一者的氨基酸序列的氨基酸序列不同的氨基酸序列。
抗ErbB3抗体可包含一个或多个其它结合位点，例如抗IGF-1R结合位点。
示例性抗ErbB3抗体包括：(a)包含各自含有SEQ ID NO:362的重链氨基酸序列的两条重链和各自含有SEQ ID NO:258的轻链氨基酸序列的两条轻链的抗ErbB3单克隆IgG1抗体P1；(b)包含各自含有SEQ ID NO:363的重链氨基酸序列的两条重链和各自含有SEQ ID NO:260的轻链氨基酸序列的两条轻链的抗ErbB3单克隆IgG1抗体M27；(c)包含各自含有SEQ ID NO:364的重链氨基酸序列的两条重链和各自含有SEQ ID NO:262的轻链氨基酸序列的两条轻链的抗ErbB3单克隆IgG1抗体M7；(d)包含各自含有SEQ ID NO:365的重链氨基酸序列的两条重链和各自含有SEQ ID NO:264的轻链氨基酸序列的两条轻链的抗ErbB3单克隆IgG1抗体B72；(e)包含各自含有SEQ IDNO:366的重链氨基酸序列的两条重链和各自含有SEQ ID NO:266的轻链氨基酸序列的两条轻链的抗ErbB3单克隆IgG1抗体B60；和(f)包含各自含有SEQ ID NO:363的重链氨基酸序列的两条重链和各自含有SEQ ID NO:262的轻链氨基酸序列的两条轻链的抗ErbB3单克隆IgG1抗体M27/M7。
还提供scFv，其可为单克隆scFv。示例性scFv包括(a)包含SEQ ID NO:367的氨基酸序列的抗IGF-R1scFv抗体P4；(b)包含SEQ ID NO:368的氨基酸序列的抗IGF-R1scFv抗体M57；(c)包含SEQ ID NO:369的氨基酸序列的抗IGF-R1scFv抗体M78；(d)包含SEQ ID NO:370的氨基酸序列的抗ErbB3 scFv抗体C8；(e)包含SEQ ID NO:371的氨基酸序列的抗ErbB3scFv抗体P1；(f)包含SEQ ID NO:372的氨基酸序列的抗ErbB3scFv抗体M1.3；(g)包含SEQ IDNO:373的氨基酸序列的抗ErbB3scFv抗体M27；(h)包含SEQ ID NO:374的氨基酸序列的抗ErbB3scFv抗体P6；和(i)包含SEQ ID NO:375的氨基酸序列的抗ErbB3scFv抗体B69。
还提供包含PBA；抗IGF-1R抗体；或抗ErbB3抗体和药学上可接受的载剂的组合物。包含抗IGF-1R抗体的组合物可进一步包含抗ErbB3抗体。包含抗ErbB3抗体的组合物可进一步包含抗IGF-1R抗体。
还提供例如包含至少一个编码序列的核酸分子，至少一个编码序列编码如本文所述的抗体或其链。核酸分子可包含启动子核苷酸序列和强化子核苷酸序列中的任一者或两者，所述核苷酸序列可操作地连接于至少一个编码序列且促进或增强抗体的表达。还涵盖载体，例如包含一种或多种本文提供的核酸分子的载体，以及包含一个或多个本文提供的载体的宿主细胞。还提供产生本文提供的PBA、抗IGF-1抗体或抗ErbB3抗体的方法，其包含在适于表达PBA、抗IGF-1抗体或抗ErbB3抗体的条件下培养包含一种或多种编码本文提供的抗体(例如PBA)或其链的核酸的细胞。进一步提供治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的一种或多种本文提供的抗体或PBA或组合物。
本文还提供抗IGF-1R+抗ErbB3PBA，其中当PBA以等于或高于5mg/kg的剂量静脉内施用时，PBA在食蟹猕猴(Cynomolgus monkey)体内具有至少45小时的半衰期。在某些实施方案中，PBA在为小鼠或食蟹猕猴的生物体体内具有比另一结合相同表位的多价双特异性抗体在相同生物体体内的半衰期在统计上显著较长(例如长50％、2倍或2倍以上)的半衰期，其中抗原结合特异性的方向在fab与scfv之间相反。
PBA可使细胞(例如癌细胞)中异调蛋白诱导的pAKT信号传导抑制至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。PBA可使细胞(例如癌细胞)中IGF-1诱导的pAKT信号传导抑制至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。PBA可使细胞(例如癌细胞)中胰岛素诱导的pAKT信号传导抑制至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。PBA可使细胞(例如癌细胞)中IGF-2诱导的pAKT信号传导抑制至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。
PBA在体内或体外抑制肿瘤细胞中的mTOR活化(磷酸化)的程度可大于单特异性抗IGF-1R Ab#A或与PBA结合IGF-1R上的相同表位的单特异性抗IGF-1R Ab。PBA在体内或体外降低肿瘤细胞中的mTOR蛋白水平的程度可大于单特异性抗IGF-1R Ab#A或与PBA结合IGF-1R上的相同表位的单特异性抗IGF-1R Ab。在某些实施方案中，相对于单特异性抗IGF-1R Ab#A或相对于与PBA结合IGF-1R上的相同表位的单特异性抗IGF-1R Ab，PBA在体内或体外使肿瘤细胞中的mTOR活化或mTOR蛋白水平至少降低50％倍，或降至1/2倍、1/3倍、1/4倍或1/5倍或低于1/5倍。在某些实施方案中，PBA在nu/nu小鼠中的人异种移植物模型中比等摩尔量的抗IGF-1R IgG更有效地抑制肿瘤生长。在一些实施方案中，异种移植物模型包含人DU145、BxPC-3、SK-ES-1或Caki-1细胞异种移植物。在另一实施方案中，多价双特异性抗体在nu/nu小鼠中的人异种移植物模型中比等摩尔量的抗IGF-1R IgG与等摩尔量的抗ErbB3IgG组合的组合更有效地抑制肿瘤生长。
特别地，本发明涉及以下各项：
1.一种多价双特异性抗体(PBA)，所述抗体为包含两对多肽链的蛋白质，所述两对中的各对包含通过至少一个重链-轻链键联结于轻链的重链；其中
各对包含至少一个抗IGF-1R结合位点和至少一个抗ErB3结合位点；且
各对包含含有所述PBA的所述重链的N端部分和所述PBA的所述轻链的N端部分的第一结合位点以及为完全由所述PBA的所述重链包含的C端scFv的第二结合位点，所述C端scFv含有通过scFv接头联结于轻链可变区的重链可变区；且
所述抗IGF-1R结合位点经由由所述PBA的所述重链包含的重链免疫球蛋白(HC Ig)恒定区连接于所述抗ErbB3结合位点，且
所述两对由各对的所述HC Ig恒定区之间的至少一个键联接，且
(i)所述抗IGF-1R结合位点包含重链可变(VH)结构域，所述重链可变(VH)结构域包含一组三个VH互补决定区(CDR)，所述VH互补决定区(CDR)包含(a)具有包含选自由SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:8-31和SEQ ID NO:384-385组成的组的SEQ ID NO的氨基酸序列的氨基酸序列的重链的VHCDR1(氨基酸编号26-35)、VHCDR2(氨基酸编号51-66)和VHCDR3(氨基酸编号99-111)；或(b)一组三个VH互补决定区(CDR)，所述VH互补决定区(CDR)包含含有SEQ IDNO:302的VHCDR1、含有SEQ ID NO:303的VHCDR2和含有SEQID NO:304的VHCDR3；和轻链可变(VL)结构域，所述轻链可变(VL)结构域包含一组三个VLCDR，所述VLCDR包含(c)具有包含选自由SEQ ID NO:2-3、SEQ ID NO:32-133和SEQ ID NO:386-387组成的组的SEQ ID NO的氨基酸序列的氨基酸序列的轻链的VLCDR1(氨基酸编号24-34)、VLCDR2(氨基酸编号50-56)和VLCDR3(氨基酸编号89-97)；或(d)一组三个VLCDR，所述VLCDR包含含有SEQ IDNO:305的VLCDR1、含有SEQ ID NO:306的VLCDR2和含有SEQID NO:307或SEQ ID NO:308的VLCDR3，且
各CDR进一步包含氨基端和羧基端，其中各组CDR的所述CDR在相应重链或轻链中按CDR1、CDR2和CDR3的线性氨基至羧基顺序排列，且
(ii)所述抗ErbB3结合位点包含重链可变(VH)结构域，所述重链可变(VH)结构域包含一组三个VH CDR，所述VH CDR包含(e)具有包含选自由SEQ ID NO:4-5、SEQ ID NO:134-165和SEQ ID NO:388组成的组的SEQ ID NO的氨基酸序列的氨基酸序列的重链的VHCDR1(氨基酸编号26-35)、VHCDR2(氨基酸编号51-66)和VHCDR3(氨基酸编号99-111)；或(f)一组三个VH CDR，所述VHCDR包含含有SEQ ID NO:309的VHCDR1、含有SEQ ID NO:310的VHCDR2和含有SEQ ID NO:311的VHCDR3；和轻链可变(VL)结构域，所述轻链可变(VL)结构域包含一组三个VLCDR，所述VLCDR包含(g)具有包含选自由SEQ ID NO:6-7和SEQ IDNO:166-200组成的组的SEQ ID NO的氨基酸序列的氨基酸序列的轻链的VLCDR1(氨基酸编号23-33)、VLCDR2(氨基酸编号49-55)和VLCDR3(氨基酸编号88-98)；或(h)轻链可变(VL)结构域，所述轻链可变(VL)结构域包含一组三个VLCDR，所述VLCDR包含含有SEQ ID NO:312的VLCDR1、含有SEQ ID NO:313的VLCDR2和含有SEQ ID NO:314或SEQ ID NO:315的VLCDR3，且
各CDR进一步包含氨基端和羧基端，其中各组CDR的所述CDR在所述抗体中按CDR1、CDR2和CDR3的线性氨基至羧基顺序排列，
且
(iii)其中所述PBA不包含以下两者：a)包含含有SEQ ID NO:35的轻链和含有SEQ ID NO:11的重链的抗IGF-1R模块，和b)包含含有SEQ ID NO:175的轻链和含有SEQ ID NO:145的重链的抗ErbB3模块。
2.如第1项所述的多价双特异性抗体，其中所述抗IGF-1R VLCDR3包含SEQ ID NO:308或所述抗ErbB3VLCDR3包含SEQ ID NO:315。
3.如第1或2项所述的多价双特异性抗体，其中所述两对多肽链具有基本上一致的序列。
4.如第1至3项中任一项所述的多价双特异性抗体，其中所述HC Ig恒定区之间的所述至少一个键中的至少一者为二硫键或所述至少一个重链-轻链键中的至少一者为二硫键。
5.如第1至3项中任一项所述的多价双特异性抗体，其中所述HC Ig恒定区之间的所述至少一个键中的至少一者为范德华键(van der Waals bond)或所述至少一个重链-轻链键中的至少一者为范德华键。
6.如第1至5项中任一项所述的多价双特异性抗体，其中所述抗ErbB3结合位点为所述C端scFv。
7.如第1至5项中任一项所述的多价双特异性抗体，其中所述抗IGF-1R结合位点为所述C端scFv。
8.如第1至7项中任一项所述的多价双特异性抗体，其中所述抗IGF-1R结合位点、所述HC Ig恒定区和所述抗ErbB3结合位点包含由单一连续多肽链包含的那一对的所述重链。
9.如第1至8项中任一项所述的多价双特异性抗体，其：
(i)在体外在1μM或1μM以下、或100nM或100nM以下、或10nM或10nM以下、或1nM或1nM以下的浓度下抑制肿瘤细胞生长，或
ii)如pErbB3和pIGF-1R中任一者或两者磷酸化的抑制所指示，以10nM或10nM以下、或1nM或1nM以下、或100pM或100pM以下的IC50，或至少70％、或至少80％、或至少90％的最大抑制百分比抑制异调蛋白(heregulin)和IGF1诱导的信号转导中的任一者或两者。
10.如第9项所述的多价双特异性抗体，其中生长抑制在培养物中在DU145细胞中以CTG测定进行测量。
11.如第9项所述的PBA，其中信号转导的抑制在培养物中在BxPC-3细胞中在以80ng/ml的IGF-1和20ng/ml的异调蛋白刺激15分钟后测定。
12.如第1至11项中任一项所述的多价双特异性抗体，其中各所述HC Ig恒定区包含介导与另一对的CH3结构域的联接的CH3结构域。
13.如第12项所述的多价双特异性抗体，其中各所述HC Ig恒定区包含CH2结构域。
14.如第13项所述的多价双特异性抗体，其中各所述HC Ig恒定区包含铰链。
15.如第14项所述的多价双特异性抗体，其中各所述HC Ig恒定区包含CH1结构域。
16.如第15项所述的多价双特异性抗体，其中各所述CH1结构域以其C端连接于铰链的N端，所述铰链以其C端连接于CH2结构域的N端，所述CH2结构域以其C端连接于CH3结构域的N端。
17.如第16项所述的多价双特异性抗体，其中各所述第一结合位点包含第一VH结构域，且其中各所述CH1结构域以其N端连接于所述第一VH结构域的C端。
18.如第17项所述的多价双特异性抗体，其中各所述CH3结构域以其C端连接于所述scFv的N端。
19.如第18项所述的多价双特异性抗体，其中各所述CH3结构域以其C端连接于连接型接头的N端，所述连接型接头以其C端连接于所述scFv的N端。
20.如第19项所述的多价双特异性抗体，其中各所述轻链包含第一VL结构域，所述第一VL结构域与所述第一VH结构域缔合形成所述第一结合位点。
21.如第20项所述的多价双特异性抗体，其中各所述第一VL结构域以其C端连接于CL结构域的N端。
22.如第21项所述的多价双特异性抗体，其中各所述第一结合位点为抗IGF-1R结合位点且各所述scFv为抗ErbB3scFv。
23.如第21项所述的多价双特异性抗体，其中各所述第一结合位点为抗ErbB3结合位点且各所述scFv为抗IGF-1R scFv。
24.如第1至23项中任一项所述的多价双特异性抗体，其中各所述HC Ig恒定区为IgG恒定区。
25.如第24项所述的多价双特异性抗体，其中各所述HC IgG恒定区为HC IgG1恒定区。
26.如第24项所述的多价双特异性抗体，其中各所述HC IgG恒定区为HC IgG2恒定区。
27.如第1项所述的多价双特异性抗体，其中
a.所述抗IGF-1R VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:8的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗IGF-1R VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:32的相应CDR的氨基酸序列；或
b.所述抗IGF-1R VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:9的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗IGF-1R VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:33的相应CDR的氨基酸序列；或
c.所述抗IGF-1R VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:10的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗IGF-1R VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:34的相应CDR的氨基酸序列；或
d.所述抗IGF-1R VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:11的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗IGF-1R VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:35的相应CDR的氨基酸序列；或
e.所述抗IGF-1R VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:8的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗IGF-1R VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:33的相应CDR的氨基酸序列；或
f.所述抗IGF-1R VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:10的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗IGF-1R VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:32的相应CDR的氨基酸序列；或
g.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:134的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:166的相应CDR的氨基酸序列；或
h.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:135的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:167的相应CDR的氨基酸序列；或
i.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:136的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:168的相应CDR的氨基酸序列；或
j.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:137的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:169的相应CDR的氨基酸序列；或
k.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:138的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:170的相应CDR的氨基酸序列；或
l.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:139的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:171的相应CDR的氨基酸序列；或
m.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:140的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:172的相应CDR的氨基酸序列；或
n.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:141的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:173的相应CDR的氨基酸序列；或
o.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:142的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:174的相应CDR的氨基酸序列；或
p.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:143的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:175的相应CDR的氨基酸序列；或
q.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:136的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:169的相应CDR的氨基酸序列。
28.如第1至27项中任一项所述的多价双特异性抗体，其中所述抗IGF-1R VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:8的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗IGF-1R VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ IDNO:32的相应CDR的氨基酸序列；且
a.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:134的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:166的相应CDR的氨基酸序列；或
b.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:135的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:167的相应CDR的氨基酸序列；或
c.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:136的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:168的相应CDR的氨基酸序列；或
d.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:137的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:169的相应CDR的氨基酸序列；或
e.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:138的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:170的相应CDR的氨基酸序列；或
f.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:139的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:171的相应CDR的氨基酸序列；或
g.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:140的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:172的相应CDR的氨基酸序列；或
h.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:141的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:173的相应CDR的氨基酸序列；或
i.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:142的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:174的相应CDR的氨基酸序列；或
j.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:143的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:175的相应CDR的氨基酸序列；或
k.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:136的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:169的相应CDR的氨基酸序列。
29.如第1项所述的多价双特异性抗体，其中所述抗IGF-1R VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:9的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗IGF-1R VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:33的相应CDR的氨基酸序列；且
a.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:134的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:166的相应CDR的氨基酸序列；或
b.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:135的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:167的相应CDR的氨基酸序列；或
c.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:136的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:168的相应CDR的氨基酸序列；或
d.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:137的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:169的相应CDR的氨基酸序列；或
e.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:138的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:170的相应CDR的氨基酸序列；或
f.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:139的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:171的相应CDR的氨基酸序列；或
g.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:140的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:172的相应CDR的氨基酸序列；或
h.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:141的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:173的相应CDR的氨基酸序列；或
i.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:142的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:174的相应CDR的氨基酸序列；或
j.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:143的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:175的相应CDR的氨基酸序列；或
k.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:136的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:169的相应CDR的氨基酸序列。
30.如第1项所述的多价双特异性抗体，其中所述抗IGF-1R VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:10的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗IGF-1R VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:34的相应CDR的氨基酸序列；且
a.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:134的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:166的相应CDR的氨基酸序列；或
b.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:135的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:167的相应CDR的氨基酸序列；或
c.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:136的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:168的相应CDR的氨基酸序列；或
d.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:137的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:169的相应CDR的氨基酸序列；或
e.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:138的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:170的相应CDR的氨基酸序列；或
f.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:139的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:171的相应CDR的氨基酸序列；或
g.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:140的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:172的相应CDR的氨基酸序列；或
h.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:141的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:173的相应CDR的氨基酸序列；或
i.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:142的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:174的相应CDR的氨基酸序列；或
j.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:143的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:175的相应CDR的氨基酸序列；或
k.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:136的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:169的相应CDR的氨基酸序列。
31.如第1项所述的多价双特异性抗体，其中所述抗IGF-1R VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:11的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗IGF-1R VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:35的相应CDR的氨基酸序列；且
a.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:134的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:166的相应CDR的氨基酸序列；或
b.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:135的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:167的相应CDR的氨基酸序列；或
c.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:136的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:168的相应CDR的氨基酸序列；或
d.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:137的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:169的相应CDR的氨基酸序列；或
e.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:138的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:170的相应CDR的氨基酸序列；或
f.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:139的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:171的相应CDR的氨基酸序列；或
g.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:140的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:172的相应CDR的氨基酸序列；或
h.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:141的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:173的相应CDR的氨基酸序列；或
i.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:142的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:174的相应CDR的氨基酸序列；或
j.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:136的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:169的相应CDR的氨基酸序列。
32.如第1项所述的多价双特异性抗体，其中所述抗IGF-1R VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:8的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗IGF-1R VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:33的相应CDR的氨基酸序列；且
a.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:134的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:166的相应CDR的氨基酸序列；或
b.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:135的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:167的相应CDR的氨基酸序列；或
c.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:136的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:168的相应CDR的氨基酸序列；或
d.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:137的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:169的相应CDR的氨基酸序列；或
e.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:138的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:170的相应CDR的氨基酸序列；或
f.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:139的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:171的相应CDR的氨基酸序列；或
g.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:140的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:172的相应CDR的氨基酸序列；或
h.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:141的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:173的相应CDR的氨基酸序列；或
i.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:142的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:174的相应CDR的氨基酸序列；或
j.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:143的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:175的相应CDR的氨基酸序列；或
k.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:136的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:169的相应CDR的氨基酸序列。
33.如第1项所述的多价双特异性抗体，其中所述抗IGF-1R VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:10的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗IGF-1R VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:32的相应CDR的氨基酸序列；且
a.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:134的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:166的相应CDR的氨基酸序列；或
b.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:135的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:167的相应CDR的氨基酸序列；或
c.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:136的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:168的相应CDR的氨基酸序列；或
d.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:137的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:169的相应CDR的氨基酸序列；或
e.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:138的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:170的相应CDR的氨基酸序列；或
f.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:139的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:171的相应CDR的氨基酸序列；或
g.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:140的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:172的相应CDR的氨基酸序列；或
h.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:141的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:173的相应CDR的氨基酸序列；或
i.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:142的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:174的相应CDR的氨基酸序列；或
j.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:143的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:175的相应CDR的氨基酸序列；或
k.所述抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:136的相应CDR的氨基酸序列，且所述抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:169的相应CDR的氨基酸序列。
34.如第1至33项中任一项所述的多价双特异性抗体，其中各所述抗IGF-1R结合位点包含含有SEQ ID NO:1的序列的VH结构域，其中所述序列包含独立地表示在图1中相应位置所示的任何氨基酸的可变氨基酸。
35.如第1至34项中任一项所述的多价双特异性抗体，其中各所述抗IGF-1R结合位点包含含有SEQ ID NO:2的序列的VL结构域，其中所述序列包含独立地表示在图2中相应位置所示的任何氨基酸的可变氨基酸。
36.如第35项所述的多价双特异性抗体，其中各所述抗IGF-1R结合位点包含含有SEQ ID NO:1的序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:2的序列的VL结构域，其中所述序列包含独立地表示在图1(VH)和图2(VL)中相应位置所示的任何氨基酸的可变氨基酸。
37.如第1至36项中任一项所述的多价双特异性抗体，其中各所述抗IGF-1R结合位点包含含有SEQ ID NO:3的序列的VL结构域，其中所述序列包含独立地表示在图2中相应位置所示的任何氨基酸的可变氨基酸。
38.如第37项所述的多价双特异性抗体，其中各所述抗IGF-1R结合位点包含含有SEQ ID NO:1的序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:3的序列的VL结构域。
39.如第1至38项中任一项所述的多价双特异性抗体，其中各所述抗ErbB3结合位点包含含有SEQ ID NO:4的序列的VH结构域，其中所述序列包含独立地表示在图3中相应位置所示的任何氨基酸的可变氨基酸。
40.如第1至39项中任一项所述的多价双特异性抗体，其中各所述抗ErbB3结合位点包含含有SEQ ID NO:6的序列的VL结构域，其中所述序列包含独立地表示在图4中相应位置所示的任何氨基酸的可变氨基酸。
41.如第40项所述的多价双特异性抗体，其中各所述抗ErbB3结合位点包含含有SEQ ID NO:4的序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:6的序列的VL结构域。
42.如第1至41项中任一项所述的多价双特异性抗体，其中各所述抗ErbB3结合位点包含含有SEQ ID NO:5的序列的VH结构域，其中所述序列包含独立地表示在图3中相应位置所示的任何氨基酸的可变氨基酸。
43.如第1至42项中任一项所述的多价双特异性抗体，其中各所述抗ErbB3结合位点包含含有SEQ ID NO:7的序列的VL结构域，其中所述序列包含独立地表示在图4中相应位置所示的任何氨基酸的可变氨基酸。
44.如第43项所述的多价双特异性抗体，其中各所述抗ErbB3结合位点包含含有SEQ ID NO:5的序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:7的序列的VL结构域。
45.如第41项所述的多价双特异性抗体，其中各所述抗IGF-1R结合位点包含含有SEQ ID NO:1的序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:2的序列的VL结构域，且各所述抗ErbB3结合位点包含含有SEQ ID NO:4的序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:6的序列的VL结构域。
46.如第44项所述的多价双特异性抗体，其中各所述抗IGF-1R结合位点包含含有SEQ ID NO:1的序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:3的序列的VL结构域，且所述抗ErbB3结合位点包含含有SEQ ID NO:5的序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:7的序列的VL结构域。
47.如第1至46项中任一项所述的多价双特异性抗体，其中各所述抗IGF-1R结合位点包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VH结构域，其中X1不为T、X2不为V、X6不为R、X8不为D或X10不为I，或含有SEQ IDNO:3的氨基酸序列的VL结构域，或其中各所述抗ErbB3结合位点包含含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VH结构域或含有SEQ ID NO:7的序列的VL结构域。
48.如第47项所述的多价双特异性抗体，其中各所述抗IGF-1R结合位点包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VH结构域，其中X1不为T、X2不为V、X6不为R、X8不为D或X10不为I，或含有SEQ ID NO:3的序列的VL结构域，且各所述抗ErbB3结合位点包含含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:7的序列的VL结构域。
49.如第1至48项中任一项所述的多价双特异性抗体，其中各所述抗IGF-1R结合位点包含含有选自由SEQ ID NO:8-31组成的组的氨基酸序列的VH结构域。
50.如第1至49项中任一项所述的多价双特异性抗体，其中各所述抗IGF-1R结合位点包含含有选自由SEQ ID NO:32-133组成的组的氨基酸序列的VL结构域。
51.如第1至50项中任一项所述的多价双特异性抗体，其中各所述抗ErbB3结合位点包含选自由SEQ ID NO:134-165组成的组的VH氨基酸序列。
52.如第1至51项中任一项所述的多价双特异性抗体，其中各所述抗ErbB3结合位点包含选自由SEQ ID NO:166-200组成的组的VL氨基酸序列。
53.如第1至52项中任一项所述的多价双特异性抗体，其中
a.各所述第一VH结构域包含选自包含SEQ ID NO:8-31的组的氨基酸序列，各所述第一VL结构域包含选自由SEQ ID NO:32-133组成的组的氨基酸序列，各所述第二VH结构域包含选自由SEQ ID NO:134-165组成的组的氨基酸序列，且各所述第二VL结构域包含选自包含SEQ ID NO:166-200的组的氨基酸序列，或
b.各所述第一VH结构域包含选自包含SEQ ID NO:134-165的组的氨基酸序列，各所述第一VL结构域包含选自由SEQ ID NO:166-200组成的组的氨基酸序列，各所述第二VH结构域包含选自包含SEQ ID NO:8-31的组的氨基酸序列，且各所述第二VL结构域包含选自包含SEQ ID NO:32-133的组的氨基酸序列。
54.如第1至53项中任一项所述的多价双特异性抗体，其中
a.各所述抗IGF-1R VH结构域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列且各所述抗IGF-1R VL结构域包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；或
b.各所述抗IGF-1R VH结构域包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列且各所述抗IGF-1R VL结构域包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；或
c.各所述抗IGF-1R VH结构域包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列且各所述抗IGF-1R VL结构域包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；或
d.各所述抗IGF-1R VH结构域包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列且各所述抗IGF-1R VL结构域包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；或
e.各所述抗IGF-1R VH结构域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列且各所述抗IGF-1R VL结构域包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；或
f.各所述抗IGF-1R VH结构域包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列且各所述抗IGF-1R VL结构域包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；或
g.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:166的氨基酸序列；或
h.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列且所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列；或
i.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:168的氨基酸序列；或
j.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列；或
k.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列；或
l.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:139的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:171的氨基酸序列；或
m.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列；或
n.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:141的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:173的氨基酸序列；或
o.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列；或
p.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:143的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:175的氨基酸序列；或
q.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列。
55.如第1至53项中任一项所述的多价双特异性抗体，其中各所述抗IGF-1R VH结构域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列且各所述抗IGF-1R VL结构域包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；且
a.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:166的氨基酸序列；或
b.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列且所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列；或
c.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:168的氨基酸序列；或
d.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列；或
e.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列；或
f.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:139的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:171的氨基酸序列；或
g.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列；或
h.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:141的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:173的氨基酸序列；或
i.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列；或
j.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:143的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:175的氨基酸序列；或
k.各所述抗ErbB3 VH结构域包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列。
56.如第1至53项中任一项所述的多价双特异性抗体，其中各所述抗IGF-1R VH结构域包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列且各所述抗IGF-1R VL结构域包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；且
a.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:166的氨基酸序列；或
b.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列且所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列；或
c.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:168的氨基酸序列；或
d.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列；或
e.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列；或
f.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:139的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:171的氨基酸序列；或
g.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列；或
h.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:141的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:173的氨基酸序列；或
i.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列；或
j.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:143的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:175的氨基酸序列；或
k.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列。
57.如第1至53项中任一项所述的多价双特异性抗体，其中各所述抗IGF-1R VH结构域包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列且各所述抗IGF-1R VL结构域包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；且
a.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:166的氨基酸序列；或
b.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列且所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列；或
c.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:168的氨基酸序列；或
d.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列；或
e.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列；或
f.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:139的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:171的氨基酸序列；或
g.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列；或
h.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:141的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:173的氨基酸序列；或
i.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列；或
j.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:143的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:175的氨基酸序列；或
k.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列。
58.如第1至53项中任一项所述的多价双特异性抗体，其中各所述抗IGF-1R VH结构域包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列且各所述抗IGF-1R VL结构域包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；且
a.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:166的氨基酸序列；或
b.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列且所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列；或
c.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:168的氨基酸序列；或
d.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列；或
e.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列；或
f.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:139的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:171的氨基酸序列；或
g.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列；或
h.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:141的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:173的氨基酸序列；或
i.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列；或
j.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列。
59.如第1至53项中任一项所述的多价双特异性抗体，其中各所述抗IGF-1R VH结构域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列且各所述抗IGF-1R VL结构域包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；且
a.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:166的氨基酸序列；或
b.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列且所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列；或
c.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:168的氨基酸序列；或
d.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列；或
e.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列；或
f.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:139的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:171的氨基酸序列；或
g.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列；或
h.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:141的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:173的氨基酸序列；或
i.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列；或
j.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:143的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:175的氨基酸序列；或
k.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列。
60.如第1至53项中任一项所述的多价双特异性抗体，其中各所述抗IGF-1R VH结构域包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列且各所述抗IGF-1R VL结构域包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；且
a.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:166的氨基酸序列；或
b.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列且所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列；或
c.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:168的氨基酸序列；或
d.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列；或
e.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列；或
f.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:139的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:171的氨基酸序列；或
g.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列；或
h.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:141的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:173的氨基酸序列；或
i.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列；或
j.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:143的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:175的氨基酸序列；或
k.各所述抗ErbB3VH结构域包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列且各所述抗ErbB3VL结构域包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列。
61.如第1至60项中任一项所述的多价双特异性抗体，其中
a.各所述重链包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SF-G1-P1(SEQID NO:212)；SF-G1-M1.3(SEQ ID NO:214)；SF-G1-M27(SEQ ID NO:216)；SF-G1-P6(SEQ ID NO:218)；SF-G1-B69(SEQ ID NO:220)；P4-G1-C8(SEQ IDNO:222)；P4-G1-P1(SEQ ID NO:224)；P4-G1-M1.3(SEQ ID NO:226)；P4-G1-M27(SEQ ID NO:228)；P4-G1-P6(SEQ ID NO:230)；P4-G1-B69(SEQ IDNO:232)；M78-G1-C8(SEQ ID NO:234)；M78-G1-P1(SEQ ID NO:236)；M78-G1-M1.3(SEQ ID NO:238)；M78-G1-M27(SEQ ID NO:240)；M78-G1-P6(SEQ ID NO:242)；M78-G1-B69(SEQ ID NO:244)；M57-G1-C8(SEQID NO:246)；M57-G1-P1(SEQ ID NO:248)；M57-G1-M1.3(SEQ ID NO:250)；M57-G1-M27(SEQ ID NO:252)；M57-G1-P6(SEQ ID NO:254)和M57-G1-B69(SEQ ID NO:256)，且各所述轻链包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SFκ轻链(SEQ ID NO:202)；P4κ轻链(SEQ ID NO:204)；M78κ轻链(SEQ ID NO:206)；和M57κ轻链(SEQ ID NO:208)；或
b.各所述重链包含选自包含以下的组的氨基酸序列：P1-G1-P4(SEQ IDNO:268)；P1-G1-M57(SEQ ID NO:270)；P1-G1-M78(SEQ ID NO:272)；M27-G1-P4(SEQ ID NO:274)；M27-G1-M57(SEQ ID NO:276)；M27-G1-M78(SEQ ID NO:278)；M7-G1-P4(SEQ ID NO:280)；M7-G1-M57(SEQID NO:282)；M7-G1-M78(SEQ ID NO:284)；B72-G1-P4(SEQ ID NO:286)；B72-G1-M57(SEQ ID NO:288)；B72-G1-M78(SEQ ID NO:290)；B60-G1-P4(SEQ ID NO:292)；B60-G1-M57(SEQ ID NO:294)；B60-G1-M78(SEQ ID NO:296)；B60-G2-M78(SEQ ID NO:355)和M7-G2-M78(SEQ ID NO:357)，且各所述轻链包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：P1λ轻链(SEQ ID NO:258)；M27λ轻链(SEQ ID NO:260)；M7λ轻链(SEQ ID NO:262)；B72λ轻链(SEQ ID NO:264)；和B60λ轻链(SEQ IDNO:266)。
62.如第1至61项中任一项所述的多价双特异性抗体，其中
a.各所述重链包含因至少一个氨基酸添加、缺失或取代而与选自由以下组成的组的氨基酸序列不同的氨基酸序列：SF-G1-P1(SEQ ID NO:212)；SF-G1-M1.3(SEQ ID NO:214)；SF-G1-M27(SEQ ID NO:216)；SF-G1-P6(SEQID NO:218)；SF-G1-B69(SEQ ID NO:220)；P4-G1-C8(SEQ ID NO:222)；P4-G1-P1(SEQ ID NO:224)；P4-G1-M1.3(SEQ ID NO:226)；P4-G1-M27(SEQ IDNO:228)；P4-G1-P6(SEQ ID NO:230)；P4-G1-B69(SEQ ID NO:232)；M78-G1-C8(SEQ ID NO:234)；M78-G1-P1(SEQ ID NO:236)；M78-G1-M1.3(SEQ ID NO:238)；M78-G1-M27(SEQ ID NO:240)；M78-G1-P6(SEQ ID NO:242)；M78-G1-B69(SEQ ID NO:244)；M57-G1-C8(SEQID NO:246)；M57-G1-P1(SEQ ID NO:248)；M57-G1-M1.3(SEQ ID NO:250)；M57-G1-M27(SEQ ID NO:252)；M57-G1-P6(SEQ ID NO:254)和M57-G1-B69(SEQ ID NO:256)，且各所述轻链包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SFκ轻链(SEQ ID NO:202)；P4κ轻链(SEQ ID NO:204)；M78κ轻链(SEQ ID NO:206)；和M57κ轻链(SEQ ID NO:208)；或
b.各所述重链包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SF-G1-P1(SEQID NO:212)；SF-G1-M1.3(SEQ ID NO:214)；SF-G1-M27(SEQ ID NO:216)；SF-G1-P6(SEQ ID NO:218)；SF-G1-B69(SEQ ID NO:220)；P4-G1-C8(SEQ IDNO:222)；P4-G1-P1(SEQ ID NO:224)；P4-G1-M1.3(SEQ ID NO:226)；P4-G1-M27(SEQ ID NO:228)；P4-G1-P6(SEQ ID NO:230)；P4-G1-B69(SEQ IDNO:232)；M78-G1-C8(SEQ ID NO:234)；M78-G1-P1(SEQ ID NO:236)；M78-G1-M1.3(SEQ ID NO:238)；M78-G1-M27(SEQ ID NO:240)；M78-G1-P6(SEQ ID NO:242)；M78-G1-B69(SEQ ID NO:244)；M57-G1-C8(SEQID NO:246)；M57-G1-P1(SEQ ID NO:248)；M57-G1-M1.3(SEQ ID NO:250)；M57-G1-M27(SEQ ID NO:252)；M57-G1-P6(SEQ ID NO:254)和M57-G1-B69(SEQ ID NO:256)；且各所述轻链包含因至少一个氨基酸添加、缺失或取代而与选自由以下组成的组的氨基酸序列不同的氨基酸序列：SFκ轻链(SEQ ID NO:202)；P4κ轻链(SEQ ID NO:204)；M78κ轻链(SEQ IDNO:206)；和M57κ轻链(SEQ ID NO:208)；或
c.各所述重链包含因至少一个氨基酸添加、缺失或取代而与选自包含以下的组的氨基酸序列不同的氨基酸序列：P1-G1-P4(SEQ ID NO:268)；P1-G1-M57(SEQ ID NO:270)；P1-G1-M78(SEQ ID NO:272)；M27-G1-P4(SEQID NO:274)；M27-G1-M57(SEQ ID NO:276)；M27-G1-M78(SEQ ID NO:278)；M7-G1-P4(SEQ ID NO:280)；M7-G1-M57(SEQ ID NO:282)；M7-G1-M78(SEQID NO:284)；B72-G1-P4(SEQ ID NO:286)；B72-G1-M57(SEQ ID NO:288)；B72-G1-M78(SEQ ID NO:290)；B60-G1-P4(SEQ ID NO:292)；B60-G1-M57(SEQ ID NO:294)；B60-G1-M78(SEQ ID NO:296)；B60-G2-M78(SEQ ID NO:355)和M7-G2-M78(SEQ ID NO:357)，且各所述轻链包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：P1λ轻链(SEQ ID NO:258)；M27λ轻链(SEQ ID NO:260)；M7λ轻链(SEQ ID NO:262)；B72λ轻链(SEQ IDNO:264)；和B60λ轻链(SEQ ID NO:266)；或
d.各所述重链包含选自包含以下的组的氨基酸序列：P1-G1-P4(SEQ IDNO:268)；P1-G1-M57(SEQ ID NO:270)；P1-G1-M78(SEQ ID NO:272)；M27-G1-P4(SEQ ID NO:274)；M27-G1-M57(SEQ ID NO:276)；M27-G1-M78(SEQ ID NO:278)；M7-G1-P4(SEQ ID NO:280)；M7-G1-M57(SEQID NO:282)；M7-G1-M78(SEQ ID NO:284)；B72-G1-P4(SEQ ID NO:286)；B72-G1-M57(SEQ ID NO:288)；B72-G1-M78(SEQ ID NO:290)；B60-G1-P4(SEQ ID NO:292)；B60-G1-M57(SEQ ID NO:294)；B60-G1-M78(SEQ ID NO:296)；B60-G2-M78(SEQ ID NO:355)和M7-G2-M78(SEQ ID NO:357)，且各所述轻链包含因至少一个氨基酸添加、缺失或取代而与选自由以下组成的组的氨基酸序列不同的氨基酸序列：P1λ轻链(SEQ ID NO:258)；M27λ轻链(SEQ ID NO:260)；M7λ轻链(SEQ IDNO:262)；B72λ轻链(SEQ ID NO:264)；和B60λ轻链(SEQ ID NO:266)。
63.如第62项所述的多价双特异性抗体，其中
a.通过至少一个键结合于另一重链的各所述重链包含与以下氨基酸序列之一至少90％一致或因1-30个氨基酸取代、缺失和/或添加而与以下氨基酸序列之一不同的氨基酸序列：SF-G1-P1(SEQ ID NO:212)；SF-G1-M1.3(SEQ IDNO:214)；SF-G1-M27(SEQ ID NO:216)；SF-G1-P6(SEQ ID NO:218)；SF-G1-B69(SEQ ID NO:220)；P4-G1-C8(SEQ ID NO:222)；P4-G1-P1(SEQ IDNO:224)；P4-G1-M1.3(SEQ ID NO:226)；P4-G1-M27(SEQ ID NO:228)；P4-G1-P6(SEQ ID NO:230)；P4-G1-B69(SEQ ID NO:232)；M78-G1-C8(SEQ IDNO:234)；M78-G1-P1(SEQ ID NO:236)；M78-G1-M1.3(SEQ ID NO:238)；M78-G1-M27(SEQ ID NO:240)；M78-G1-P6(SEQ ID NO:242)；M78-G1-B69(SEQ ID NO:244)；M57-G1-C8(SEQ ID NO:246)；M57-G1-P1(SEQID NO:248)；M57-G1-M1.3(SEQ ID NO:250)；M57-G1-M27(SEQ ID NO:252)；M57-G1-P6(SEQ ID NO:254)和M57-G1-B69(SEQ ID NO:256)，且
b.通过至少一个键结合于(a)的一条重链的各所述轻链包含与以下氨基酸序列之一至少90％一致或因1-30个氨基酸取代、缺失和/或添加而与以下氨基酸序列之一不同的氨基酸序列：SFκ轻链(SEQ ID NO:202)；P4κ轻链(SEQID NO:204)；M78κ轻链(SEQ ID NO:206)；和M57κ轻链(SEQ ID NO:208)；或
c.通过至少一个键结合于另一重链的各所述重链包含与以下氨基酸序列之一至少90％一致或因1-30个氨基酸取代、缺失和/或添加而与以下氨基酸序列之一不同的氨基酸序列：P1-G1-P4(SEQ ID NO:268)；P1-G1-M57(SEQ IDNO:270)；P1-G1-M78(SEQ ID NO:272)；M27-G1-P4(SEQ ID NO:274)；M27-G1-M57(SEQ ID NO:276)；M27-G1-M78(SEQ ID NO:278)；M7-G1-P4(SEQ ID NO:280)；M7-G1-M57(SEQ ID NO:282)；M7-G1-M78(SEQID NO:284)；B72-G1-P4(SEQ ID NO:286)；B72-G1-M57(SEQ ID NO:288)；B72-G1-M78(SEQ ID NO:290)；B60-G1-P4(SEQ ID NO:292)；B60-G1-M57(SEQ ID NO:294)；和B60-G1-M78(SEQ ID NO:296)；B60-G2-M78(SEQ ID NO:355)和M7-G2-M78(SEQ ID NO:357)，且
d.通过至少一个键结合于(c)的一条重链的各所述轻链包含与以下氨基酸序列之一至少90％一致或因1-30个氨基酸取代、缺失和/或添加而与以下氨基酸序列之一不同的氨基酸序列：P1λ轻链(SEQ ID NO:258)；M27λ轻链(SEQ ID NO:260)；M7λ轻链(SEQ ID NO:262)；B72λ轻链(SEQ ID NO:264)；和B60λ轻链(SEQ ID NO:266)。
64.如第63项所述的多价双特异性抗体，其中
a.各所述重链包含与以下氨基酸序列之一至少95％一致或因1-10个氨基酸取代、缺失和/或添加而与以下氨基酸序列之一不同的氨基酸序列：SF-G1-P1(SEQ ID NO:212)；SF-G1-M1.3(SEQ ID NO:214)；SF-G1-M27(SEQID NO:216)；SF-G1-P6(SEQ ID NO:218)；SF-G1-B69(SEQ ID NO:220)；P4-G1-C8(SEQ ID NO:222)；P4-G1-P1(SEQ ID NO:224)；P4-G1-M1.3(SEQ IDNO:226)；P4-G1-M27(SEQ ID NO:228)；P4-G1-P6(SEQ ID NO:230)；P4-G1-B69(SEQ ID NO:232)；M78-G1-C8(SEQ ID NO:234)；M78-G1-P1(SEQID NO:236)；M78-G1-M1.3(SEQ ID NO:238)；M78-G1-M27(SEQ ID NO:240)；M78-G1-P6(SEQ ID NO:242)；M78-G1-B69(SEQ ID NO:244)；M57-G1-C8(SEQID NO:246)；M57-G1-P1(SEQ ID NO:248)；M57-G1-M1.3(SEQ ID NO:250)；M57-G1-M27(SEQ ID NO:252)；M57-G1-P6(SEQ ID NO:254)和M57-G1-B69(SEQ ID NO:256)，且
b.各所述轻链包含与以下氨基酸序列之一至少95％一致或因1-10个氨基酸取代、缺失和/或添加而与以下氨基酸序列之一不同的氨基酸序列：SFκ轻链(SEQ ID NO:202)；P4κ轻链(SEQ ID NO:204)；M78κ轻链(SEQ IDNO:206)；和M57κ轻链(SEQ ID NO:208)；或
c.各所述重链包含与以下氨基酸序列之一至少95％一致或因1-10个氨基酸取代、缺失和/或添加而与以下氨基酸序列之一不同的氨基酸序列：P1-G1-P4(SEQ ID NO:268)；P1-G1-M57(SEQ ID NO:270)；P1-G1-M78(SEQ IDNO:272)；M27-G1-P4(SEQ ID NO:274)；M27-G1-M57(SEQ ID NO:276)；M27-G1-M78(SEQ ID NO:278)；M7-G1-P4(SEQ ID NO:280)；M7-G1-M57(SEQID NO:282)；M7-G1-M78(SEQ ID NO:284)；B72-G1-P4(SEQ ID NO:286)；B72-G1-M57(SEQ ID NO:288)；B72-G1-M78(SEQ ID NO:290)；B60-G1-P4(SEQ ID NO:292)；B60-G1-M57(SEQ ID NO:294)；和B60-G1-M78(SEQ ID NO:296)；B60-G2-M78(SEQ ID NO:355)和M7-G2-M78(SEQ ID NO:357)，且
d.各所述轻链包含与以下氨基酸序列之一至少95％一致或因1-10个氨基酸取代、缺失和/或添加而与以下氨基酸序列之一不同的氨基酸序列：P1λ轻链(SEQ ID NO:258)；M27λ轻链(SEQ ID NO:260)；M7λ轻链(SEQ IDNO:262)；B72λ轻链(SEQ ID NO:264)；和B60λ轻链(SEQ ID NO:266)。
65.一种SF-G1-P1多价双特异性抗体，其包含：
两条重链，其各自包含SEQ ID NO:212的重链氨基酸序列；和
两条轻链，其各自包含SEQ ID NO:202的轻链序列。
66.一种SF-G1-M1.3多价双特异性抗体，其包含：
两条重链，其各自包含SEQ ID NO:214的重链氨基酸序列；和
两条轻链，其各自包含SEQ ID NO:202的轻链氨基酸序列。
67.一种SF-G1-M27多价双特异性抗体，其包含：
两条重链，其各自包含SEQ ID NO:216的重链氨基酸序列；和
两条轻链，其各自包含SEQ ID NO:202的轻链氨基酸序列。
68.一种SF-G1-P6多价双特异性抗体，其包含：
两条重链，其各自包含SEQ ID NO:218的重链氨基酸序列；和
两条轻链，其各自包含SEQ ID NO:202的轻链氨基酸序列。
69.一种SF-G1-B69多价双特异性抗体，其包含：
两条重链，其各自包含SEQ ID NO:220的重链氨基酸序列；和
两条轻链，其各自包含SEQ ID NO:202的轻链氨基酸序列。
70.一种P4-G1-C8多价双特异性抗体，其包含：
两条重链，其各自包含SEQ ID NO:222的重链氨基酸序列；和
两条轻链，其各自包含SEQ ID NO:204的轻链氨基酸序列。
71.一种P4-G1-P1多价双特异性抗体，其包含：
两条重链，其各自包含SEQ ID NO:224的重链氨基酸序列；和
两条轻链，其各自包含SEQ ID NO:204的轻链氨基酸序列。
72.一种P4-G1-M1.3多价双特异性抗体，其包含：
两条重链，其各自包含SEQ ID NO:226的重链氨基酸序列；和
两条轻链，其各自包含SEQ ID NO:204的轻链氨基酸序列。
73.一种P4-G1-M27多价双特异性抗体，其包含：
两条重链，其各自包含SEQ ID NO:228的重链氨基酸序列；和
两条轻链，其各自包含SEQ ID NO:204的轻链氨基酸序列。
74.一种P4-G1-P6多价双特异性抗体，其包含：
两条重链，其各自包含SEQ ID NO:230的重链氨基酸序列；和
两条轻链，其各自包含SEQ ID NO:204的轻链氨基酸序列。
75.一种P4-G1-B69多价双特异性抗体，其包含：
两条重链，其各自包含SEQ ID NO:232的重链氨基酸序列；和
两条轻链，其各自包含SEQ ID NO:204的轻链氨基酸序列。
76.一种M78-G1-C8多价双特异性抗体，其包含：
两条重链，其各自包含SEQ ID NO:234的重链氨基酸序列；和
两条轻链，其各自包含SEQ ID NO:206的轻链氨基酸序列。
77.一种M78-G1-P1多价双特异性抗体，其包含：
两条重链，其各自包含SEQ ID NO:236的重链氨基酸序列；和
两条轻链，其各自包含SEQ ID NO:206的轻链氨基酸序列。
78.一种M78-G1-M1.3多价双特异性抗体，其包含：
两条重链，其各自包含SEQ ID NO:238的重链氨基酸序列；和
两条轻链，其各自包含SEQ ID NO:206的轻链氨基酸序列。
79.一种M78-G1-M27多价双特异性抗体，其包含：
两条重链，其各自包含SEQ ID NO:240的重链氨基酸序列；和
两条轻链，其各自包含SEQ ID NO:206的轻链氨基酸序列。
80.一种M78-G1-P6多价双特异性抗体，其包含：
两条重链，其各自包含SEQ ID NO:242的重链氨基酸序列；和
两条轻链，其各自包含SEQ ID NO:206的轻链氨基酸序列。
81.一种M78-G1-B69多价双特异性抗体，其包含：
两条重链，其各自包含SEQ ID NO:244的重链氨基酸序列；和
两条轻链，其各自包含SEQ ID NO:206的轻链氨基酸序列。
82.一种M57-G1-C8多价双特异性抗体，其包含：
两条重链，其各自包含SEQ ID NO:246的重链氨基酸序列；和
两条轻链，其各自包含SEQ ID NO:208的轻链氨基酸序列。
83.一种M57-G1-P1多价双特异性抗体，其包含：
两条重链，其各自包含SEQ ID NO:248的重链氨基酸序列；和
两条轻链，其各自包含SEQ ID NO:208的轻链氨基酸序列。
84.一种M57-G1-M1.3多价双特异性抗体，其包含：
两条重链，其各自包含SEQ ID NO:250的重链氨基酸序列；和
两条轻链，其各自包含SEQ ID NO:208的轻链氨基酸序列。
85.一种M57-G1-M27多价双特异性抗体，其包含：
两条重链，其各自包含SEQ ID NO:252的重链氨基酸序列；和
两条轻链，其各自包含SEQ ID NO:208的轻链氨基酸序列。
86.一种M57-G1-P6多价双特异性抗体，其包含：
两条重链，其各自包含SEQ ID NO:254的重链氨基酸序列；和
两条轻链，其各自包含SEQ ID NO:208的轻链氨基酸序列。
87.一种M57-G1-B69多价双特异性抗体，其包含：
两条重链，其各自包含SEQ ID NO:256的重链氨基酸序列；和
两条轻链，其各自包含SEQ ID NO:208的轻链氨基酸序列。
88.一种P1-G1-P4多价双特异性抗体，其包含：
两条重链，其各自包含SEQ ID NO:268的重链氨基酸序列；和
两条轻链，其各自包含SEQ ID NO:258的轻链氨基酸序列。
89.一种P1-G1-M57多价双特异性抗体，其包含：
两条重链，其各自包含SEQ ID NO:270的重链氨基酸序列；和
两条轻链，其各自包含SEQ ID NO:258的轻链氨基酸序列。
90.一种P1-G1-M78多价双特异性抗体，其包含：
两条重链，其各自包含SEQ ID NO:272的重链氨基酸序列；和
两条轻链，其各自包含SEQ ID NO:258的轻链氨基酸序列。
91.一种M27-G1-P4多价双特异性抗体，其包含：
两条重链，其各自包含SEQ ID NO:274的重链氨基酸序列；和
两条轻链，其各自包含SEQ ID NO:260的轻链氨基酸序列。
92.一种M27-G1-M57多价双特异性抗体，其包含：
两条重链，其各自包含SEQ ID NO:276的重链氨基酸序列；和
两条轻链，其各自包含SEQ ID NO:260的轻链氨基酸序列。
93.一种M27-G1-M78多价双特异性抗体，其包含：
两条重链，其各自包含SEQ ID NO:278的重链氨基酸序列；和
两条轻链，其各自包含SEQ ID NO:260的轻链氨基酸序列。
94.一种M7-G1-P4多价双特异性抗体，其包含：
两条重链，其各自包含SEQ ID NO:280的重链氨基酸序列；和
两条轻链，其各自包含SEQ ID NO:262的轻链氨基酸序列。
95.一种M7-G1-M57多价双特异性抗体，其包含：
两条重链，其各自包含SEQ ID NO:282的重链氨基酸序列；和
两条轻链，其各自包含SEQ ID NO:262的轻链氨基酸序列。
96.一种M7-G1-M78多价双特异性抗体，其包含：
两条重链，其各自包含SEQ ID NO:284的重链氨基酸序列；和
两条轻链，其各自包含SEQ ID NO:262的轻链氨基酸序列。
97.一种B72-G1-P4多价双特异性抗体，其包含：
两条重链，其各自包含SEQ ID NO:286的重链氨基酸序列；和
两条轻链，其各自包含SEQ ID NO:264的轻链氨基酸序列。
98.一种B72-G1-M57多价双特异性抗体，其包含：
两条重链，其各自包含SEQ ID NO:288的重链氨基酸序列；和
两条轻链，其各自包含SEQ ID NO:264的轻链氨基酸序列。
99.一种B72-G1-M78多价双特异性抗体，其包含：
两条重链，其各自包含SEQ ID NO:290的重链氨基酸序列；和
两条轻链，其各自包含SEQ ID NO:264的轻链氨基酸序列。
100.一种B60-G1-P4多价双特异性抗体，其包含：
两条重链，其各自包含SEQ ID NO:292的重链氨基酸序列；和
两条轻链，其各自包含SEQ ID NO:266的轻链氨基酸序列。
101.一种B60-G1-M57多价双特异性抗体，其包含：
两条重链，其各自包含SEQ ID NO:294的重链氨基酸序列；和
两条轻链，其各自包含SEQ ID NO:266的轻链氨基酸序列。
102.一种B60-G1-M78多价双特异性抗体，其包含：
两条重链，其各自包含SEQ ID NO:296的重链氨基酸序列；和
两条轻链，其各自包含SEQ ID NO:266的轻链氨基酸序列。
103.一种抗IGF-1R单克隆抗体，其包含按氨基至羧基顺序包含如图5A的SEQ ID NO:202中加点状下划线所示SFκ轻链的VLCDR1序列、VLCDR2序列和VLCDR3序列的第一序列，所述抗体进一步包含按氨基至羧基顺序包含如图5A的SEQ ID NO:210中分别前三个加点状下划线序列所示SF重链的VHCDR1序列、VHCDR2序列和VHCDR3序列的第二序列，其中所述第一序列与所述第二序列不重叠。
104.一种抗IGF-1R单克隆抗体，其按氨基至羧基顺序包含如图5A的SEQ ID NO:204中加点状下划线所示P4κ轻链的VLCDR1序列、VLCDR2序列和VLCDR3序列，所述抗体进一步按氨基至羧基顺序包含如图5A的SEQID NO:222中分别前三个加点状下划线序列所示P4重链的VHCDR1序列、VHCDR2序列和VHCDR3序列。
105.一种抗IGF-1R单克隆抗体，其按氨基至羧基顺序包含如图5A的SEQ ID NO:206中加点状下划线所示M78κ轻链的VLCDR1序列、VLCDR2序列和VLCDR3序列，所述抗体进一步按氨基至羧基顺序包含如图5A的SEQID NO:234中分别前三个加点状下划线序列所示M78重链的VHCDR1序列、VHCDR2序列和VHCDR3序列。
106.一种抗IGF-1R单克隆抗体，其按氨基至羧基顺序包含如图5A的SEQ ID NO:208中加点状下划线所示M57κ轻链的VLCDR1序列、VLCDR2序列和VLCDR3序列，所述抗体进一步按氨基至羧基顺序包含如图5A的SEQID NO:246中分别前三个加点状下划线序列所示M57重链的VHCDR1序列、VHCDR2序列和VHCDR3序列。
107.一种分离的抗IGF-1R抗体，其特异性结合人IGF-1R，其中
a.所述抗IGF-1R抗体包含含有一组三个包含VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3的VH CDR的VH结构域，和含有一组三个包含VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3的VL CDR的VL结构域，所述CDR分别包含SEQ ID NO:302、303、304、305、306和307的序列，且各CDR进一步包含氨基端和羧基端，其中各组CDR的所述CDR在所述抗体中按CDR1、CDR2和CDR3的线性氨基至羧基顺序排列，其中
b.所述CDR包含独立地表示在图1(VH)或图2(VL)中相应位置所示的任何氨基酸的可变氨基酸，且
c.所述抗体不包含SF模块。
108.如第107项所述的抗IGF-1R抗体，其中所述VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3分别包含SEQ ID NO:302、303、304、305、306和308的序列。
109.如第108项所述的抗IGF-1R抗体，其中所述VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3结构域包含SEQ ID NO:8-10和12-31中任一者的相应氨基酸序列，且所述VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3结构域包含SEQ ID NO:32-34和36-133中任一者的相应氨基酸序列。
110.如第109项所述的抗IGF-1R抗体，其中
a.所述VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:8的相应CDR的氨基酸序列，且所述VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:32的相应CDR的氨基酸序列；或
b.所述VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:9的相应CDR的氨基酸序列，且所述VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:33的相应CDR的氨基酸序列；或
c.所述VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:10的相应CDR的氨基酸序列，且所述VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:34的相应CDR的氨基酸序列；或
d.所述VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:11的相应CDR的氨基酸序列，且所述VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:35的相应CDR的氨基酸序列；或
e.所述VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:8的相应CDR的氨基酸序列，且所述VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:33的相应CDR的氨基酸序列；或
f.所述VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:10的相应CDR的氨基酸序列，且所述VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:32的相应CDR的氨基酸序列。
111.如第110项所述的抗IGF-1R抗体，其中所述VH结构域包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列，所述序列包含独立地表示在图1中相应位置所示的任何氨基酸的可变氨基酸。
112.如第107至111项中任一项所述的抗IGF-1R抗体，其中所述VL结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，所述序列包含独立地表示在图2中相应位置所示的任何氨基酸的可变氨基酸。
113.如第112项所述的抗IGF-1R抗体，其中所述VH结构域包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列，且所述VL结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
114.如第107至113项中任一项所述的抗IGF-1R抗体，其中所述VL结构域包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，所述序列包含独立地表示在图2中相应位置所示的任何氨基酸的可变氨基酸。
115.如第114项所述的抗IGF-1R抗体，其中所述VH结构域包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列，且所述VL结构域包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
116.如第115项所述的抗IGF-1R抗体，其中所述VH结构域包含选自由SEQ ID NO:8-10和12-31组成的组的氨基酸序列且所述VL结构域包含选自由SEQ ID NO:32-34和36-133组成的组的氨基酸序列。
117.如第107至116项中任一项所述的抗IGF-1R抗体，其中
a.所述VH结构域包含与SEQ ID NO:8-10和12-31中任一者的氨基酸序列至少90％一致或因1-30个氨基酸的氨基酸取代、添加或缺失而与SEQ IDNO:8-10和12-31中任一者的氨基酸序列不同的氨基酸序列，且
b.所述VL结构域包含与SEQ ID NO:32-34和36-133中任一者的氨基酸序列至少90％一致或因1-30个氨基酸的氨基酸取代、添加或缺失而与SEQ IDNO:32-34和36-133中任一者的氨基酸序列不同的氨基酸序列。
118.如第117项所述的抗IGF-1R抗体，其中
a.所述VH结构域包含与SEQ ID NO:8-10和12-31中任一者的氨基酸序列至少95％一致或因1-10个氨基酸的氨基酸取代、添加或缺失而与SEQ IDNO:8-10和12-31中任一者的氨基酸序列不同的氨基酸序列，且
b.所述VL结构域包含与SEQ ID NO:32-34和36-133中任一者的氨基酸序列至少95％一致或因1-10个氨基酸的氨基酸取代、添加或缺失而与SEQ IDNO:32-34和36-133中任一者的氨基酸序列不同的氨基酸序列。
119.如第103至118项中任一项所述的抗IGF-1R抗体，其为IgG1。
120.如第107至119项中任一项所述的抗IGF-1R抗体，所述抗体为包含两对多肽链的蛋白质，各所述对包含重链和轻链；其中
a.各所述重链包含SEQ ID NO:359、360或361的氨基酸序列；或
b.各所述轻链包含SEQ ID NO:204、206或208的氨基酸序列。
121.如第120项所述的抗IGF-1R抗体，其中
a.各所述重链包含SEQ ID NO:359、360或361的氨基酸序列，且
b.且各轻链包含SEQ ID NO:204、206或208的氨基酸序列。
122.如第107至121项中任一项所述的抗IGF-1R抗体，所述抗体为包含两对多肽链的蛋白质，各所述对包含重链和轻链；其中
a.各所述重链包含与SEQ ID NO:359、360或361中任一者的氨基酸序列至少90％一致或因1-30个氨基酸的氨基酸取代、添加或缺失而与SEQ IDNO:359、360或361中任一者的氨基酸序列不同的氨基酸序列，且
b.各所述轻链包含与SEQ ID NO:204、206或208中任一者的氨基酸序列至少90％一致或因1-30个氨基酸的氨基酸取代、添加或缺失而与SEQ IDNO:204、206或208中任一者的氨基酸序列不同的氨基酸序列。
123.如第122项所述的抗IGF-1R抗体，其中
a.各所述重链包含与SEQ ID NO:359、360或361中任一者的氨基酸序列至少95％一致或因1-10个氨基酸的氨基酸取代、添加或缺失而与SEQ IDNO:359、360或361中任一者的氨基酸序列不同的氨基酸序列，且
b.各所述轻链包含与SEQ ID NO:204、206或208中任一者中的氨基酸序列至少95％一致或因1-10个氨基酸的氨基酸取代、添加或缺失而与SEQ IDNO:204、206或208中任一者中的氨基酸序列不同的氨基酸序列。
124.一种抗IGF-R1单克隆IgG1抗体P4，其包含两条各自包含SEQ IDNO:359的重链氨基酸序列的重链和两条各自包含SEQ ID NO:204的轻链氨基酸序列的轻链。
125.一种抗IGF-R1单克隆IgG1抗体M78，其包含两条各自包含SEQ IDNO:360的重链氨基酸序列的重链和两条各自包含SEQ ID NO:206的轻链氨基酸序列的轻链。
126.一种抗IGF-R1单克隆IgG1抗体M57，其包含两条各自包含SEQ IDNO:361的重链氨基酸序列的重链和两条各自包含SEQ ID NO:208的轻链氨基酸序列的轻链。
127.一种抗IGF-R1单克隆IgG1抗体M57/M78，其包含两条各自包含SEQ ID NO:361的重链氨基酸序列的重链和两条各自包含SEQ ID NO:206的轻链氨基酸序列的轻链。
128.一种抗IGF-R1单克隆IgG1抗体P4/M57，其包含两条各自包含SEQID NO:359的重链氨基酸序列的重链和两条各自包含SEQ ID NO:208的轻链氨基酸序列的轻链。
129.如第103至128项中任一项所述的抗IGF-1R抗体，其包含一个或多个其它结合位点。
130.如第129项所述的抗IGF-1R抗体，其包含抗ErbB3结合位点。
131.一种抗ErbB3单克隆抗体，其按氨基至羧基顺序包含如图5B的SEQID NO:258中加点状下划线所示P1λ轻链的VLCDR1序列、VLCDR2序列和VLCDR3序列，所述抗体进一步按氨基至羧基顺序包含如图5B的SEQ IDNO:268中分别前三个加点状下划线序列所示P1重链的VHCDR1序列、VHCDR2序列和VHCDR3序列。
132.一种抗ErbB3单克隆抗体，其按氨基至羧基顺序包含如图5B的SEQID NO:260中加点状下划线所示M27λ轻链的VLCDR1序列、VLCDR2序列和VLCDR3序列，所述抗体进一步按氨基至羧基顺序包含如图5B的SEQ IDNO:274中分别前三个加点状下划线序列所示M27重链的VHCDR1序列、VHCDR2序列和VHCDR3序列。
133.一种抗ErbB3单克隆抗体，其按氨基至羧基顺序包含如图5B的SEQID NO:262中加点状下划线所示M7λ轻链的VLCDR1序列、VLCDR2序列和VLCDR3序列，所述抗体进一步按氨基至羧基顺序包含如图5B的SEQ IDNO:280中分别前三个加点状下划线序列所示M7重链的VHCDR1序列、VHCDR2序列和VHCDR3序列。
134.一种抗ErbB3单克隆抗体，其按氨基至羧基顺序包含如图5B的SEQID NO:264中加点状下划线所示B72λ轻链的VLCDR1序列、VLCDR2序列和VLCDR3序列，所述抗体进一步按氨基至羧基顺序包含如图5B的SEQ IDNO:286中分别前三个加点状下划线序列所示B72重链的VHCDR1序列、VHCDR2序列和VHCDR3序列。
135.一种抗ErbB3单克隆抗体，其按氨基至羧基顺序包含如图5B的SEQID NO:266中加点状下划线所示B60λ轻链的VLCDR1序列、VLCDR2序列和VLCDR3序列，所述抗体进一步按氨基至羧基顺序包含如图5B的SEQ IDNO:292中分别前三个加点状下划线序列所示B60重链的VHCDR1序列、VHCDR2序列和VHCDR3序列。
136.一种分离的抗ErbB3抗体，其特异性结合人ErbB3，其中
a.所述抗IGF-1R抗体包含含有一组三个包含VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3的VH CDR的VH结构域，和含有一组三个包含VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3的VL CDR的VL结构域，所述CDR分别包含SEQ ID NO:309、310、311、312、313和314的序列，且各CDR进一步包含氨基端和羧基端，其中各组CDR的所述CDR在所述抗体中按CDR1、CDR2和CDR3的线性氨基至羧基顺序排列，其中
b.所述CDR包含独立地表示在图3(VH)或图4(VL)中相应位置所示的任何氨基酸的可变氨基酸，且
c.所述抗体不包含C8模块。
137.如第136项所述的抗ErbB3抗体，其中所述VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3分别包含SEQ ID NO:309、310、311、312、313和315的序列。
138.如第137项所述的抗ErbB3抗体，其中所述VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3结构域包含SEQ ID NO:134-142和144-165中任一者的相应氨基酸序列，且所述VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3结构域包含SEQ IDNO:166-174和176-200中任一者的相应氨基酸序列。
139.如第138项所述的抗ErbB3抗体，其中
a.所述VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:134的相应CDR的氨基酸序列，且所述VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:166的相应CDR的氨基酸序列；或
b.所述VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:135的相应CDR的氨基酸序列，且所述VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:167的相应CDR的氨基酸序列；或
c.所述VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:136的相应CDR的氨基酸序列，且所述VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:168的相应CDR的氨基酸序列；或
d.所述VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:137的相应CDR的氨基酸序列，且所述VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:169的相应CDR的氨基酸序列；或
e.所述VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:138的相应CDR的氨基酸序列，且所述VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:170的相应CDR的氨基酸序列；或
f.所述VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:139的相应CDR的氨基酸序列，且所述VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:171的相应CDR的氨基酸序列；或
g.所述VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:140的相应CDR的氨基酸序列，且所述VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:172的相应CDR的氨基酸序列；或
h.所述VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:141的相应CDR的氨基酸序列，且所述VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:173的相应CDR的氨基酸序列；或
i.所述VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:142的相应CDR的氨基酸序列，且所述VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:174的相应CDR的氨基酸序列；或
j.所述VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO:136的相应CDR的氨基酸序列，且所述VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:169的相应CDR的氨基酸序列。
140.如第136至139项中任一项所述的抗ErbB3抗体，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，所述序列包含独立地表示在图3中相应位置所示的任何氨基酸的可变氨基酸。
141.如第136至140项中任一项所述的抗ErbB3抗体，其中所述VL结构域包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，所述序列包含独立地表示在图4中相应位置所示的任何氨基酸的可变氨基酸。
142.如第141项所述的抗ErbB3抗体，其中所述VH结构域包含SEQ IDNO:4的氨基酸序列，且所述VL结构域包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
143.如第136至142项中任一项所述的抗ErbB3抗体，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，所述序列包含独立地表示在图3中相应位置所示的任何氨基酸的可变氨基酸。
144.如第136至143项中任一项所述的抗ErbB3抗体，其中所述VL结构域包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，所述序列包含独立地表示在图4中相应位置所示的任何氨基酸的可变氨基酸。
145.如第144项所述的抗ErbB3抗体，其中所述VH结构域包含SEQ IDNO:5的氨基酸序列，且所述VL结构域包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
146.如第145项所述的抗ErbB3抗体，其中所述VH结构域包含选自由SEQ ID NO:134-142和144-165组成的组的氨基酸序列且所述VL结构域包含选自由SEQ ID NO:166-174和176-200组成的组的氨基酸序列。
147.如第136至146项中任一项所述的抗ErbB3抗体，其中
a.所述VH结构域包含与SEQ ID NO:134-142和144-165中任一者的氨基酸序列至少90％一致或因1-30个氨基酸的氨基酸取代、添加或缺失而与SEQ ID NO:134-142和144-165中任一者的氨基酸序列不同的氨基酸序列，且
b.所述VL结构域包含与SEQ ID NO:166-174和176-200中任一者的氨基酸序列的氨基酸序列至少90％一致或因1-30个氨基酸的氨基酸取代、添加或缺失而与SEQ ID NO:166-174和176-200中任一者的氨基酸序列的氨基酸序列不同的氨基酸序列。
148.如第147项所述的抗ErbB3抗体，其中
a.所述VH结构域包含与SEQ ID NO:134-142和144-165中任一者的氨基酸序列至少95％一致或因1-10个氨基酸的氨基酸取代、添加或缺失而与SEQ ID NO:134-142和144-165中任一者的氨基酸序列不同的氨基酸序列，且
b.所述VL结构域包含与SEQ ID NO:166-174和176-200中任一者的氨基酸序列的氨基酸序列至少95％一致或因1-10个氨基酸的氨基酸取代、添加或缺失而与SEQ ID NO:166-174和176-200中任一者的氨基酸序列的氨基酸序列不同的氨基酸序列。
149.如第131至149项中任一项所述的抗ErbB3抗体，其为IgG1。
150.如第136至149项中任一项所述的抗ErbB3抗体，所述抗体为包含两对多肽链的蛋白质，各所述对包含重链和轻链；其中
a.各所述重链包含SEQ ID NO:362、363、364、365或366的氨基酸序列；或
b.各所述轻链包含SEQ ID NO:258、260、262、264或266的氨基酸序列。
151.如第150项所述的抗ErbB3抗体，其中
a.各所述重链包含SEQ ID NO:362、363、364、365或366的氨基酸序列，且
b.且各轻链包含SEQ ID NO:258、260、262、264或266的氨基酸序列。
152.如第136至151项中任一项所述的抗ErbB3抗体，所述抗体为包含两对多肽链的蛋白质，各所述对包含重链和轻链；其中
a.各所述重链包含与SEQ ID NO:362、363、364、365或366中任一者的氨基酸序列至少90％一致或因1-30个氨基酸的氨基酸取代、添加或缺失而与SEQ ID NO:362、363、364、365或366中任一者的氨基酸序列不同的氨基酸序列，且
b.各所述轻链包含与SEQ ID NO:258、260、262、264或266中任一者的氨基酸序列的氨基酸序列至少90％一致或因1-30个氨基酸的氨基酸取代、添加或缺失而与SEQ ID NO:258、260、262、264或266中任一者的氨基酸序列的氨基酸序列不同的氨基酸序列。
153.如第152项所述的抗ErbB3抗体，其中
a.各所述重链包含与SEQ ID NO:362、363、364、365或366中任一者的氨基酸序列至少95％一致或因1-10个氨基酸的氨基酸取代、添加或缺失而与SEQ ID NO:362、363、364、365或366中任一者的氨基酸序列不同的氨基酸序列，且
b.各所述轻链包含与SEQ ID NO:258、260、262、264或266中任一者的氨基酸序列的氨基酸序列至少95％一致或因1-10个氨基酸的氨基酸取代、添加或缺失而与SEQ ID NO:258、260、262、264或266中任一者的氨基酸序列的氨基酸序列不同的氨基酸序列。
154.如第131至153项中任一项所述的抗ErbB3抗体，其包含一个或多个其它结合位点。
155.如第154项所述的抗ErbB3抗体，其包含抗IGF-1R结合位点。
156.一种抗ErbB3单克隆IgG1抗体P1，其包含两条各自包含SEQ IDNO:362的重链氨基酸序列的重链和两条各自包含SEQ ID NO:258的轻链氨基酸序列的轻链。
157.一种抗ErbB3单克隆IgG1抗体M27，其包含两条各自包含SEQ IDNO:363的重链氨基酸序列的重链和两条各自包含SEQ ID NO:260的轻链氨基酸序列的轻链。
158.一种抗ErbB3单克隆IgG1抗体M7，其包含两条各自包含SEQ IDNO:364的重链氨基酸序列的重链和两条各自包含SEQ ID NO:262的轻链氨基酸序列的轻链。
159.一种抗ErbB3单克隆IgG1抗体B72，其包含两条各自包含SEQ IDNO:365的重链氨基酸序列的重链和两条各自包含SEQ ID NO:264的轻链氨基酸序列的轻链。
160.一种抗ErbB3单克隆IgG1抗体B60，其包含两条各自包含SEQ IDNO:366的重链氨基酸序列的重链和两条各自包含SEQ ID NO:266的轻链氨基酸序列的轻链。
161.一种抗ErbB3单克隆IgG1抗体M27/M7，其包含两条各自包含SEQID NO:363的重链氨基酸序列的重链和两条各自包含SEQ ID NO:262的轻链氨基酸序列的轻链。
162.一种抗IGF-R1单克隆scFv抗体P4，其包含SEQ ID NO:367的氨基酸序列。
163.一种抗IGF-R1单克隆scFv抗体M57，其包含SEQ ID NO:368的氨基酸序列。
164.一种抗IGF-R1单克隆scFv抗体M78，其包含SEQ ID NO:369的氨基酸序列。
165.一种抗ErbB3单克隆scFv抗体C8，其包含SEQ ID NO:370的氨基酸序列。
166.一种抗ErbB3单克隆scFv抗体P1，其包含SEQ ID NO:371的氨基酸序列。
167.一种抗ErbB3单克隆scFv抗体M1.3，其包含SEQ ID NO:372的氨基酸序列。
168.一种抗ErbB3单克隆scFv抗体M27，其包含SEQ ID NO:373的氨基酸序列。
169.一种抗ErbB3单克隆scFv抗体P6，其包含SEQ ID NO:374的氨基酸序列。
170.一种抗ErbB3单克隆scFv抗体B69，其包含SEQ ID NO:375的氨基酸序列。
171.一种组合物，其包含如第1至102项中任一项所述的多价双特异性抗体和药学上可接受的载剂。
172.一种组合物，其包含如第103至130项中任一项所述的抗IGF-1R抗体和药学上可接受的载剂。
173.如第172项所述的组合物，其进一步包含抗ErbB3抗体，所述抗ErbB3抗体任选地为如第131至161项中任一项所述的抗ErbB3抗体。
174.一种组合物，其包含如第131至161项中任一项所述的抗ErbB3抗体和药学上可接受的载剂。
175.如第174项所述的组合物，其进一步包含抗IGF-1R抗体，所述抗IGF-1R抗体任选地为如第103至130项中任一项所述的抗IGF-1R抗体。
176.一种核酸分子，其包含至少一个编码序列，所述至少一个编码序列编码如第1至170项中任一项所述的抗体。
177.如第176项所述的核酸分子，所述核酸分子包含启动子核苷酸序列和强化子核苷酸序列中的任一者或两者，所述核苷酸序列可操作地连接于所述至少一个编码序列且促进或增强所述抗体的表达。
178.一种载体，其包含一个或多个如第176或177项所述的核酸分子。
179.一种分离的细胞，其包含一个或多个如第178项所述的载体。
180.一种产生如第1至170项中任一项所述的多价双特异性抗体、抗IGF-1R抗体或抗ErbB3抗体的方法，其包括在适于表达所述多价双特异性抗体、抗IGF-1R抗体或抗ErbB3抗体的条件下培养如第179项所述的细胞。
181.一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的以下一者或多者：(a)一种或多种如第103至170项中任一项所述的抗体，或(b)至少一种如第1至102项中任一项所述的多价双特异性抗体，或(c)如第171至175项中任一项所述的组合物。
182.如第1至102项中任一项所述的多价双特异性抗体，其中所述抗体当以等于或高于5mg/kg的剂量静脉内施用时在食蟹猕猴(Cynomolgusmonkey)体内具有至少45小时的半衰期。
183.如第1至102和182项中任一项所述的多价双特异性抗体，其中所述抗体在为小鼠或食蟹猕猴的生物体体内的所述半衰期在统计上长于结合相同表位的另一多价双特异性抗体在相同生物体体内的半衰期，其中抗原结合特异性的方向在所述fab与所述scfv之间相反。
184.如第1至102和182至183项中任一项所述的多价双特异性抗体，其使癌细胞中异调蛋白诱导的pAKT信号传导抑制至少50％。
185.如第1至102和182至184项中任一项所述的多价双特异性抗体，其使癌细胞中IGF-1诱导的pAKT信号传导抑制至少50％。
186.如第1至102和182至185项中任一项所述的多价双特异性抗体，其使癌细胞中胰岛素诱导的pAKT信号传导抑制至少50％。
187.如第1至102和182至185项中任一项所述的多价双特异性抗体，其使癌细胞中IGF-2诱导的pAKT信号传导抑制至少50％。
188.如第1至102和182至187项中任一项所述的多价双特异性抗体，其在体内或体外抑制肿瘤细胞中mTOR活化的程度大于单特异性抗IGF-1RAb#A。
189.如第188项所述的多价双特异性抗体，其在体内或体外降低肿瘤细胞中mTOR蛋白水平的程度大于单特异性抗IGF-1R Ab#A。
190.如第188或189项所述的多价双特异性抗体，其在体内或体外使肿瘤细胞中的mTOR活化或蛋白水平降至相对于单特异性抗IGF-1R Ab#A的至多1/2。
191.如第190项所述的多价双特异性抗体，其在体内或体外使肿瘤细胞中的mTOR活化或蛋白水平降至相对于单特异性抗IGF-1R Ab#A的至多1/3。
192.如第1至102项中任一项所述的多价双特异性抗体，其中所述多价双特异性抗体在nu/nu小鼠中的人异种移植物模型中比等摩尔量的抗IGF-1RIgG更有效地抑制肿瘤生长。
193.如第192项所述的多价双特异性抗体，其中所述异种移植物模型包含人DU145、BxPC-3、SK-ES-1或Caki-1细胞异种移植物。
194.如第193项所述的多价双特异性抗体，其中所述多价双特异性抗体在nu/nu小鼠中的人异种移植物模型中比等摩尔量的抗IGF-1R IgG与等摩尔量的抗ErbB3IgG组合的组合更有效地抑制肿瘤生长。
附图简述
图1A-B：示例性IGF-1R VH序列(SEQ ID NO:8-31和384-385，自上至下连续编号)与其所来源的共同序列(SEQ ID NO:1)的比对。CDR加有下划线且CDR的SEQ ID NO作为方括号中的编号(例如“[S.302]”)提供于CDR上方。
图2A-E：示例性IGF-1R VL序列(SEQ ID NO:32-133和386-387，自上至下连续编号)与其所来源的两个共同序列(SEQ ID NO:2和3)的比对。SEQ IDNO:2包括16F的VL结构域，而SEQ ID NO:3不包括。CDR加有下划线且CDR的SEQ ID NO作为方括号中的编号提供于CDR上方。
图3A-B：示例性ErbB3VH序列(SEQ ID NO:134-165和388，自上至下连续编号)与其所来源的两个共同序列(SEQ ID NO:4和5)的比对。SEQ IDNO:4包括16F的VH结构域，而SEQ ID NO:5不包括。CDR加有下划线且CDR的SEQ ID NO作为方括号中的编号提供于CDR上方。
图4A-B：示例性ErbB3VL序列(SEQ ID NO:166-200，自上至下连续编号)与其所来源的两个共同序列(SEQ ID NO:6和7)的比对。SEQ ID NO:6包括16F的VL结构域，而SEQ ID NO:7不包括。CDR加有下划线且CDR的SEQ IDNO作为括号中的编号提供于CDR上方。
图5：示例性抗IGF-1R-IgG1-抗ErbB3(图5A)和抗ErbB3-IgG1-抗-IGF-1R(图5B)多价双特异性抗体的轻链和重链的氨基酸序列。
图5A示出以下抗IGF-1R-IgG1-抗ErbB3杂交重链的氨基酸序列：SF-G1-C8(即16F-SEQ ID NO:210)；SF-G1-P1(SEQ ID NO:212)；SF-G1-M1.3(SEQ ID NO:214)；SF-G1-M27(SEQ ID NO:216)；SF-G1-P6(SEQID NO:218)；SF-G1-B69(SEQ ID NO:220)；P4-G1-C8(SEQ ID NO:222)；P4-G1-P1(SEQ ID NO:224)；P4-G1-M1.3(SEQ ID NO:226)；P4-G1-M27(SEQ IDNO:228)；P4-G1-P6(SEQ ID NO:230)；P4-G1-B69(SEQ ID NO:232)；M78-G1-C8(SEQ ID NO:234)；M78-G1-P1(SEQ ID NO:236)；M78-G1-M1.3(SEQ ID NO:238)；M78-G1-M27(SEQ ID NO:240)；M78-G1-P6(SEQ ID NO:242)；M78-G1-B69(SEQ ID NO:244)；M57-G1-C8(SEQID NO:246)；M57-G1-P1(SEQ ID NO:248)；M57-G1-M1.3(SEQ ID NO:250)；M57-G1-M27(SEQ ID NO:252)；M57-G1-P6(SEQ ID NO:254)和M57-G1-B69(SEQ ID NO:256)。
图5B示出以下抗ErbB3-IgG1-抗IGF-1R杂交重链的氨基酸序列：P1-G1-P4(SEQ ID NO:268)；P1-G1-M57(SEQ ID NO:270)；P1-G1-M78(SEQ IDNO:272)；M27-G1-P4(SEQ ID NO:274)；M27-G1-M57(SEQ ID NO:276)；M27-G1-M78(SEQ ID NO:278)；M7-G1-P4(SEQ ID NO:280)；M7-G1-M57(SEQID NO:282)；M7-G1-M78(SEQ ID NO:284)；B72-G1-P4(SEQ ID NO:286)；B72-G1-M57(SEQ ID NO:288)；B72-G1-M78(SEQ ID NO:290)；B60-G1-P4(SEQ ID NO:292)；B60-G1-M57(SEQ ID NO:294)；B60-G1-M78(SEQ ID NO:296)；B60-G2-M78(SEQ ID NO:355)和M7-G2-M78(SEQ ID NO:357)。
图5A和5B的这些杂交重链各自包含三个命名模块且各自根据其模块组成(参见图8)进行命名，其中左边第一个名称为氨基端模块，中间第二个名称为中间模块(如所示，在序列提供于图5A和5B中的多价双特异性抗体中，始终为G1或G2)且右边第三个名称为羧基端模块。各第一氨基端模块包含自左至右包含各自由点状下划线所指示的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3的重链VR。各第二中间模块命名为G1或G2且包含IgG1CR，且不形成多价双特异性抗体中的抗原结合位点。G1或G2模块序列的铰链、CH2和CH3部分加有单底线。CH1部分始于ASTK(SEQ ID NO:392)。连接G1模块与第三模块的Gly-Ser接头序列加有双底线。各第三羧基端模块出现在此Gly-Ser接头序列的右侧且包含scFv，所述scFv包含自左至右包含VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3(各自加有点状下划线)的重链VR、Gly-Ser scFv接头(加有双波状底线)和包含VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3(各自加有点状下划线)的轻链VR。
各氨基端或羧基端重链模块的结合特异性与图5A或5B的相应命名轻链相同。
图5A示出以下成熟抗IGF-R1κ轻链的氨基酸(“aa”)序列：SF(SEQ IDNO:202)、P4(SEQ ID NO:204)、M78(SEQ ID NO:206)和M57(SEQ ID NO:208)。
图5B示出以下成熟抗ErbB3λ轻链的氨基酸序列：P1(SEQ ID NO:258)、M27(SEQ ID NO:260)、M7(SEQ ID NO:262)、B72(SEQ ID NO:264)和B60(SEQID NO:266)。
图5A和5B的各轻链自左至右包含VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3(各自加点状下划线)。CL结构域在抗IGF-1R VL结构域中始于“RTVAA”(SEQ IDNO:393)且在抗ErbB3VL结构域中始于“QPKAA”(SEQ ID NO:394)。
为形成包含图5A和5B的重链和轻链的完整多价双特异性抗体，将各重链与共享重链的氨基端模块的名称的轻链共表达。所得各多价双特异性抗体采取IgG抗体的形式(其如同原生IgG抗体，包含两个基本上相同的抗原结合位点)，具有scFv附接于IgG的两条重链各自的羧基端。
图6：示例性6A)抗IGF-1R IgG1抗体和6B)抗ErbB3IgG1抗体的氨基酸序列；和6C)抗IGF-1R scFv和6D)抗ErbB3scFv的氨基酸序列。
图7：SF-G1-C8(16F)的7A)重链和7B)轻链的氨基酸序列，各自具有在成熟抗体中不存在的前导序列。重链氨基酸序列(SEQ ID NO:300)为具有附加N端前导序列的SF-G1-C8(SEQ ID NO:210)的重链氨基酸序列。轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:298)为具有附加N端前导序列的SFκ轻链(SEQ ID NO:202)的轻链氨基酸序列。前导序列以粗体加下划线显示；加有点状下划线的序列为如上所示的CDR；接头(铰链、连接型接头和scFv接头)在其粗体序列上方说明，且个别CH3氨基酸残基E356和M358以黑体显示(其为可如下取代为E356D和M358L的氨基酸)。图7A中的CH1、CH2、CH3、VH和VL结构域和图7B中的CL结构域的身份在各结构域的上方说明，各自的起点由直角箭头指示。
图8：示出得到Ig样四价双特异性抗体的模块的示意图。结合结构域(“N端模块”和“C端模块”)所来源的抗体标记为单克隆抗体1和单克隆抗体2。图和模块在本质上为概念性的；联结在一起以制备这种双特异性抗体的实际DNA片段可能与模块的限制不一致，但最终结果基本上如所示。此外，单克隆抗体1和单克隆抗体2可能不呈所示的IgG格式，例如任一者或两者可为scFv。如果使用scFv作为N端模块的来源，那么通过移除编码scFv接头的DNA序列以产生分别由重链和轻链多肽链包含的VH和VL区来将其由scFv格式转变为Fv格式。
图9：模拟ErbB网络以预测最佳ErbB3治疗剂的设计。9A)图解描绘ErbB网络的复杂性：配体结合、受体二聚化、受体运输和细胞内信号传导各自表述于基于质量-作用的动力学模型中。9B)使用ErbB网络中各蛋白质的模拟扰动来鉴别在异调蛋白或乙胞素(betacellulin)刺激下下游信号磷酸化Akt对各蛋白质的敏感性。经由解离速率的变化检查在异调蛋白(9C)或乙胞素(9D)刺激下Akt对抗ErbB3抗体的剂量反应性的多种亲和力结合常数。各图自上至下所列Kd的顺序对应于各图中自左至右曲线的顺序。
图10：预测双特异性抗体共抑制两条路径的能力取决于相对受体水平。计算模拟表达三种不同摩尔比的各受体:另一受体的细胞中计算模拟的双特异性抗体对A)IGF-1R、B)ErbB3和C)共有下游信号传导路径成分Akt(Akt激酶)的活性水平的影响。各图中的三条曲线可由其右手末端各自与图边框相交的相对位置加以鉴别。最左边x轴/最下边y轴交线＝IGF-1R为ErbB310倍多的模拟，中间交线＝等量IGF-1R与ErbB3的模拟，最右边x轴/最上边y轴交线＝ErbB3为IGF-1R 10倍多的模拟。归因于双特异性剂对IGF-1R的亲和力较低，因此当ErbB3水平降低时IGF-1R抑制的效力降低，表明亲合性的作用。未能有效抑制IGF-1R导致抑制pAkt的能力降低(右)。因双特异性剂对ErbB3的亲和力较强，因此抑制ErbB3的能力不受IGF-1R水平影响。
图11：通过共价酵母展示对scFv亲和力和稳定性进行同时优化。11A)通过荧光活化细胞分选测量的热激发后分离的酵母展示scFv模块对可溶性GFR2(ErbB3)-Fc的亲和力。11B)对共价连接于酵母表面的优化scFv模块进行的热激发测定证实其较高热稳定性。通过荧光活化细胞分选测量65℃下热应激5分钟后残留的对ErbB3-Fc的残余结合活性。MFI＝平均荧光强度。
图12：可使用微差扫描荧光来估算血清稳定性。12A)通过微差扫描荧光测定法获得的微观稳定性测量值。12B)根据在37℃下在小鼠血清中孵育前(100％)和3天后的结合活性百分比测量的宏观稳定性。概念验证双特异性蛋白质在微观(A)与宏观(B)性质两方面均显示与稳定化类似物相比较低的稳定性。
图13：优化的双特异性抗体显示与概念验证双特异性抗体相比较强的细胞结合。与表达IGF-1R与ErbB3两者的BxPC-3细胞的结合通过荧光活化细胞分选进行测量。
图14：与ADRr和MCF7细胞的结合。14A)与ADRr细胞的结合。如此图和以下图14B、18、19、20A和20B中所用，“模块2-21的IgG”是指具有与ILE-12中相同的抗ErbB3VR的抗ErbB3抗体。“模块2-3的IgG”是指具有与ELI-7和ILE-10中相同的抗ErbB3VR的抗ErbB3抗体。“模块5-7的IgG”是指具有与ELI-7、ILE-10和ILE-12中相同的抗IGF-1R VR的抗IGF-1R抗体。14B)与MC7细胞的结合。
图15：ILE-7和ELI-7对pAKT的抑制。
图16：ELI-7对DU145细胞生长的影响(通过CTG测定测量)。RLU＝相对发光单位。
图17：通过CTG测定测量的ELI-7对BxPC-3细胞生长的抑制。
图18：异种移植肿瘤生长曲线。IgG抗体的描述提供于图14A的图例中。
图19：第41天时的BxPC-3最终异种移植肿瘤体积。
图20：异种移植肿瘤生长速率和尺寸。20A)DU145肿瘤生长曲线。20B)第36天时的DU145肿瘤体积。
图21：多价双特异性抗体在宽泛的ErbB3和IGF-1R受体水平范围内抑制信号传导。ELI-7显示在经过修饰以含有宽泛范围的IGF1R和ErbB3受体水平的BxPC-3细胞系中抑制pAkt。“BxPC-3对照”是指具有不变IGF-1R和ErbB3水平的BxPC-3细胞。“BxPC-3-IGF1R-Mod1”是指IGF-1R水平降低37％的BxPC-3细胞。“BxPC-3-ErbB3-Mod1”是指ErbB3水平降低48％的BxPC-3细胞。“BxPC-3-ErbB3-Mod2”是指ErbB3水平降低88％的BxPC-3细胞。
图22：在BcPC3细胞中由16F(SF-G1-C8)“再工程改造双特异性剂”和ELI-7“原始双特异性剂”所致的pIGF-1R水平降低。
图23：BxPC-3细胞中16F(SF-G1-C8)、抗IGF-1R Ab#B(西妥木单抗(cixutumumab)；SEQ ID 324+SEQ ID 325)、抗ErbB3Ab#A(SEQ ID 336+SEQID 337)或抗IGF-1R Ab#B+抗ErbB3Ab#A对23A)IGF1R、23B)ErbB3和23C)AKT的磷酸化的抑制，和DU145细胞中16F(SF-G1-C8)、抗IGF-1RAb#B(西妥木单抗；SEQ ID 324+SEQ ID 325)、抗ErbB3Ab#A(SEQ ID336+SEQ ID 337)或抗IGF-1R Ab#B+抗ErbB3Ab#A对23D)IGF1R、23E)ErbB3和23F)AKT的磷酸化的抑制。
图24A-F：16F(SF-G1-C8)(图24A-C)与抗IGF-1R Ab#A(加尼图单抗(ganitumab)；SEQ ID 327+SEQ ID 328)、抗ErbB3Ab#A(SEQ ID 336+SEQ ID337)和抗IGF-1R Ab#A+抗ErbB3Ab#A(图24D-F)的信号传导抑制的比较。IGF1R磷酸化的抑制于上图中示出(图24A和D)，ErbB3磷酸化的抑制于中图中示出(图24B和E)，且AKT磷酸化的抑制于下图中示出(图24C和F)；所有均在BxPC-3细胞中。
图25：双特异性抗体显示与BxPC-3细胞强结合。如通过FACS所测量，在将指定抗体与BxPC-3细胞一起孵育后产生结合曲线。
图26：双特异性抗体显示与重组ErbB3蛋白强结合，指定抗体在ErbB3-His涂布的盘中孵育且通过ELISA测量结合抗体水平后产生结合曲线。
图27A-C：双特异性抗体显示对双重路径信号传导的强抑制。pIGF1R(图27A)、pErbB3(图27B)和pAKT(图27C)产生的BxPC-3信号抑制如所示。
图28：指定双特异性抗体在血清中在37℃下72小时的稳定性百分比。
图29：A-D示出如FACS所测量，各种双特异性抗体(如所示)与BxPC-3细胞的结合。在29A)中，M27/M7-IgG-P4、M27/M7-IgG-M57和M27/M7-IgG-M78双特异性抗体的N端模块含有M27重链和M7轻链。
图30A-I：吃出如根据pIGF1R水平的变化所测量，各种双特异性抗体(如所示)的BxPC-3信号抑制数据。
图31A-K：示出如根据pErbB3水平的变化所测量，各种双特异性抗体(如所示)的BxPC-3信号抑制数据。
图32A-I：示出如根据pAKT水平的变化所测量，各种双特异性抗体(如所示)的BxPC-3信号抑制数据。
图33：A-D示出如根据pIGF1R水平的变化所测量，各种双特异性抗体(如所示)与抗ErbB3Ab#A(SEQ ID NO:336+SEQ ID NO:337)和抗IGF-1R Ab#A(加尼图单抗；SEQ ID NO:327+SEQ ID NO:328)的组合的BxPC-3信号抑制数据的比较。
图34：A-D示出如根据pErbB3水平的变化所测量，各种双特异性抗体(如所示)与抗ErbB3Ab#A(SEQ ID NO:336+SEQ ID NO:337)和抗IGF-1R Ab#A(加尼图单抗；SEQ ID NO:327+SEQ ID NO:328)的组合的BxPC-3信号抑制数据的比较。
图35：A-D示出如根据pAKT水平的变化所测量，各种双特异性抗体与抗ErbB3Ab#A(SEQ ID NO:336+SEQ ID NO:337)和抗IGF-1R Ab#A(加尼图单抗；SEQ ID NO:327+SEQ ID NO:328)的组合的BxPC-3信号抑制数据的比较。
图36：A-B示出各种双特异性抗体(如所示)在小鼠血清中在37℃下5天的校正稳定性。
图37A-C：根据本文的公开内容可并入多价双特异性抗体中的抗IGF-1R抗体的重链、轻链和scFv的公布氨基酸序列。
图38A-D：根据本文的公开内容并入多价双特异性抗体中的抗ErbB3抗体的重链、轻链和scFv的公布氨基酸序列。
图39：A-B示出在DU145细胞中由PBA A)M7-G1-M78(“M7-M78”)、P4-G1-M1.3(“P4-M1.3”)、P4-G1-C8(“P4-C8”)和B)SF-G1-C8(“SF-C8”)与不存在PBA(“IGF1+HRG”)；不存在诱导剂和PBA(“无Tx”)；仅有抗EGF1R mAB；仅有抗ErbB3mAb；和抗IGF-1R+抗ErbB3的组合的情况下对IGF1和异调蛋白(HRG)信号转导的抑制的比较，如根据对AKT磷酸化的抑制所测量。C-D示出与A-B中类似，但在BxPC-3细胞中获得的抑制数据。此图和图40-44和51中的抗IGF1R和抗ErbB3mAb分别为抗IGF-1R Ab#A(加尼图单抗；SEQ ID NO:327+SEQ ID NO:328)和抗ErbB3Ab#A(SEQ ID NO:336+SEQ IDNO:337)。
图40：A-C示出如通过对AKT磷酸化的抑制所测量，PBA M7-G1-M78、P4-M1.3、P4-C8和SF-C8在具有A-D)野生型水平的IGF-1R和ErbB3；B-E)水平降低约50％的IGF-1R；或C-F)水平降低约50％的ErbB3的BxPC-3细胞中对IGF1和异调蛋白(HRG)诱导的信号转导的抑制。
图41：A-D示出如根据AKT磷酸化的抑制所测量，BxPC-3细胞中PBAM7-G1-M78、P4-M1.3、P4-C8和SF-C8对由A-B)40ng/ml IGF1或C-D)400ng/ml IGF1诱导的信号转导的抑制。
图42：A-D示出如根据AKT磷酸化的抑制所测量，BxPC-3细胞中PBAM7-G1-M78、P4-M1.3、P4-C8和SF-C8对由A-B)20ng/ml IGF1或C-D)200ng/ml异调蛋白(HRG)诱导的信号转导的抑制。
图43：A-B示出A)与PBA M7-G1-M78、P4-M1.3、P4-C8和SF-C8一起孵育15分钟后；或B)与PBA一起孵育2小时后A549细胞中基本信号传导的抑制。C-D示出C)与PBA M7-G1-M78、P4-M1.3、P4-C8和SF-C8一起孵育15分钟后；或D)与PBA一起孵育2小时后BsPC-3细胞中基本信号传导的抑制。所有信号传导均通过测量pAKT水平来测定。
图44A-B：示出用P4-G1-C3或P4-G1-M1.3处理24小时后A549细胞(图44A)和BxPC-3细胞(图44B)中的总IGF1R水平。
图45：示出血清饥饿(“饥饿”)或仅用IGF1或IGF2处理或在PBA P4-M1.3或P4-C8存在下用IGF1或IGF2处理的DU145或MIA PaCa-2(高IR)细胞中pIGF1R、pAKt和B-肌动蛋白的蛋白质水平的蛋白质印迹。
图46：示出血清饥饿(“饥饿”)或用IGF1处理；在P4-M1.3存在下用IGF1处理；用胰岛素处理或在P4-M1.3存在下用胰岛素处理的DU145细胞中pIGF1R、pAKt和B-肌动蛋白的蛋白质水平的蛋白质印迹。
图47：示出在不存在配体下(泳道1-3)或在存在IGF1和异调蛋白(HRG)下(泳道4-6)和在不存在PBA下或在存在PBA M7-78或P4-C8下孵育的BxPC-3细胞中IGF1R、pIGF1R、ErbB3、pErbB3、pAkt和B-肌动蛋白的蛋白质水平的蛋白质印迹。
图48：A-F示出小鼠或食蟹猕猴血清中孵育0或5天后所存在的A-B)M7-G1-M78；C-D)P4-G1-M1.3；E-F)P4-G1-C8的量。G-H示出在涂有IGF-1R(G)或ErbB3(H)的盘中人血清中0或6天后所存在的P4G1-M1.3的量。
图49：A-F示出PBA P4-C8(A、D)、P4-M1.3(B、E)和M7-M78(C、F)与A-C)人、小鼠、大鼠和食蟹猕猴ErbB3以及D-F)人、小鼠、大鼠和食蟹猕猴EGF-1R的结合的水平。未提供M7-M78与大鼠和食蟹猕猴IGF-1R的结合。
图50：A-B示出使A)IGF1和B)IGF2自与盘结合的IGF-1R脱离所必需的PBA P4-G1-M1.3的浓度。
图51：A-F示出在体外在经过IGF-1+HRG或IGF-1+HRG+P4-G1-M1.3处理的BxPC-3细胞中随时间每毫克总蛋白质中磷酸化IGF-1R(A)、磷酸化ErbB3(B)、磷酸化Akt(C)、磷酸化ERK(p44/p42；D)、磷酸化mTOR(Ser2448，E)和磷酸化S6(Ser235/236；5F)的ng数。
图52：在用血清、IGF1、IGF1与P4M1.3(P4-G1-M1.3)、IGF2、IGF2与P4M1.3(P4-G1-M1.3)、胰岛素和胰岛素与P4M1.3(P4-G1-M1.3)处理的BxPC-3和A673细胞中pIGF1R、pAKT和B肌动蛋白的水平。
图53：A-B示出在注射了PBS、P4-G1-M1.3或抗IGF-1R Ab#A之一的小鼠的研究结束BxPC-3肿瘤中mTOR(A)和磷酸化mTOR(“pmTOR”)的水平。
图54A-K：示出在注射了PBS、P4-G1-M1.3、抗IGF-1R Ab#A+抗ErbB3IgG和mTOR抑制剂依维莫司(everolimus)之一的小鼠的研究结束Caki-1肿瘤中，IGF-1R(A)和胰岛素受体(B)、ErbB3(C)和EGFR(D)、在残基S473上磷酸化的AKT(“pAKT S473”)(E)和T308(“pAKT T308”)(F)、磷酸化Fox01和Fox03a(“磷酸化Fox01(Thr24)/Fox03a(Thr32)”)、在残基S2448(H)和S2481(I)上磷酸化的mTOR以及在残基S235/236(J)和S240/244(K)上磷酸化的S6(“pS6S235/236”和“pS6S240/244”)的水平。
图55A-E：示出在注射了PBS、P4-G1-M1.3或抗IGF-1R Ab#A之一的小鼠的研究结束BxPC-3肿瘤中，IGF-1R(A)和ErbB3(B)、磷酸化EGFR(“pEGFR”)(C)以及磷酸化mTOR(“pmTOR S2448”)(D)和磷酸化S6(“pS6S235/236”)(E)的水平。
图56A-B：示出在盘用IGF-1R-His涂布且向各孔中添加了P4-G1-M1.3的连续稀释液的ELISA测定中IGF-1(“IGF1”，左图)(A)和IGF-2(“IGF2”，右图)(B)的水平。
图57：A-D示出在DU145(A)、BxPC-3(B)、SK-ES-1(C)和Caki-1(D)异种移植物模型中随时间的平均肿瘤体积。向小鼠注射以下之一：PBS、500μgP4-G1-M1.3、100μg P4-G1-M1.3、500μg P4-G1-C8或100μg P4-G1-C8(A)；PBS、500μg P4-G1-M1.3、300μg P4-G1-M1.3、100μg P4-G1-M1.3、500μgP4-G1-C8、300μg P4-G1-C8、100μg P4-G1-C8、375μg抗IGF-1R Ab#A(加尼图单抗；SEQ ID NO:327+SEQ ID NO:328)、225μg抗IGF-1R Ab#A(加尼图单抗；SEQ ID NO:327+SEQ ID NO:328)或75μg抗IGF-1R Ab#A(加尼图单抗；SEQ ID NO:327+SEQ ID NO:328)(B)；PBS、500μg P4-G1-M1.3、300μgP4-G1-M1.3或100μg P4-G1-M1.3(C)；或PBS、500μg P4-G1-M1.3、300μgP4-G1-M1.3、100μg P4-G1-M1.3、以等暴露量给药的抗IGF-1R+抗ErbB3或以等摩尔量给药的抗IGF-1R+抗ErbB3(D)。
图58示出靶标介导的药物处置模型与由来自注射了M1.3-G1-P4的小鼠的小鼠血液获得的实验数据的拟合。实线为给予500μg剂量的小鼠的拟合，而点线为给予100μg剂量的小鼠的拟合。
序列简述：
本文提及和序列表中所列的氨基酸(“aa”)序列说明如下。
SEQ ID NO:1为来源于示例性IGF-1R VH序列的氨基酸共同序列。
SEQ ID NO:2为来源于示例性IGF-1R VL序列的氨基酸共同序列。
SEQ ID NO:3为来源于示例性IGF-1R VL序列的氨基酸共同序列，所述示例性IGF-1R VL序列不包括16F的IGF-1R结合位点的VL序列。
SEQ ID NO:4为来源于示例性ErbB3VH序列的氨基酸共同序列。
SEQ ID NO:5为来源于示例性ErbB3VH序列的氨基酸共同序列，所述示例性ErbB3VH序列不包括16F的ErbB3结合位点的VH序列。
SEQ ID NO:6为来源于示例性ErbB3VL序列的氨基酸共同序列。
SEQ ID NO:7为来源于示例性ErbB3VL序列的氨基酸共同序列，所述示例性ErbB3VL序列不包括16F的ErbB3结合位点的VL序列。
SEQ ID NO:8-31为图1的IGF-1R VH氨基酸序列。
SEQ ID NO:32-133为图2的IGF-1R VL氨基酸序列。
SEQ ID NO:134-165为图3的ErbB3VH氨基酸序列。
SEQ ID NO:166-200为图4的ErbB3VL氨基酸序列。
SEQ ID NO:201-256为图5A中提供的抗IGF-1R/抗ErbB3IgG1(scFv)2的成熟轻链和重链的核苷酸序列(奇数编号)和氨基酸序列(偶数编号)，其序列ID编号如下。κ轻链：SF(SEQ ID NO:201和202)；P4(SEQ ID NO:203和204)；M78(SEQ ID NO:205和206)；和M57(SEQ ID NO:207和208)。重链scFv融合物(杂交体)：SF-G1-C8(即16F；SEQ ID NO:209和210)；SF-G1-P1(SEQ IDNO:211和212)；SF-G1-M1.3(SEQ ID NO:213和214)；SF-G1-M27(SEQ IDNO:215和216)；SF-G1-P6(SEQ ID NO:217和218)；SF-G1-B69(SEQ ID NO:219和220)；P4-G1-C8(SEQ ID NO:221和222)；P4-G1-P1(SEQ ID NO:223和224)；P4-G1-M1.3(SEQ ID NO:225和226)；P4-G1-M27(SEQ ID NO:227和228)；P4-G1-P6(SEQ ID NO:229和230)；P4-G1-B69(SEQ ID NO:231和232)；M78-G1-C8(SEQ ID NO:233和234)；M78-G1-P1(SEQ ID NO:235和236)；M78-G1-M1.3(SEQ ID NO:237和238)；M78-G1-M27(SEQ ID NO:239和240)；M78-G1-P6(SEQ ID NO:241和242)；M78-G1-B69(SEQ ID NO:243和244)；M57-G1-C8(SEQ ID NO:245和246)；M57-G1-P1(SEQ ID NO:247和248)；M57-G1-M1.3(SEQ ID NO:249和250)；M57-G1-M27(SEQ ID NO:251和252)；M57-G1-P6(SEQ ID NO:253和254)和M57-G1-B69(SEQ ID NO:255和256)。
SEQ ID NO:257-296为图5B中提供的抗ErbB3/抗IGF-1R IgG1(scFv)2的成熟轻链和重链的核苷酸序列(奇数编号)和氨基酸序列(偶数编号)，其序列ID编号如下。λ轻链：P1(SEQ ID NO:257和258)；M27(SEQ ID NO:259和260)；M7(SEQ ID NO:261和262)；B72(SEQ ID NO:263和264)；和B60(SEQID NO:265和266)。重链scFv融合物(杂交体)：P1-G1-P4(SEQ ID NO:267和268)；P1-G1-M57(SEQ ID NO:269和270)；P1-G1-M78(SEQ ID NO:271和272)；M27-G1-P4(SEQ ID NO:273和274)；M27-G1-M57(SEQ ID NO:275和276)；M27-G1-M78(SEQ ID NO:277和278)；M7-G1-P4(SEQ ID NO:279和280)；M7-G1-M57(SEQ ID NO:281和282)；M7-G1-M78(SEQ ID NO:283和284)；B72-G1-P4(SEQ ID NO:285和286)；B72-G1-M57(SEQ ID NO:287和288)；B72-G1-M78(SEQ ID NO:289和290)；B60-G1-P4(SEQ ID NO:291和292)；B60-G1-M57(SEQ ID NO:293和294)；和B60-G1-M78(SEQ ID NO:295和296)。
SEQ ID NO:297和298为如图7B中所示具有信号序列的16F的轻链的核苷酸和氨基酸序列。
SEQ ID NO:299和300为如图7A中所示具有信号序列的16F的重链的核苷酸和氨基酸序列。
SEQ ID NO:301为示例性重链结构域的一部分，其中在CH3结构域的C端与接头的N端之间插入赖氨酸SLSLSPGKGGGGS(SEQ ID NO:301-附加赖氨酸加有下划线)。
SEQ ID NO:302-304分别为抗IGF-1R VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3结构域的共同序列，其为SEQ ID NO:1的和图1中所示的VH共同序列的CDR序列。
SEQ ID NO:305-307分别为抗IGF-1R VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3的共同序列，其为SEQ ID NO:2的和图2中所示的VL共同序列的CDR序列。
SEQ ID NO:308为抗IGF-1R VLCDR3的共同序列，其为SEQ ID NO:3的和图2中所示的VL共同序列的CDR3序列。
SEQ ID NO:209-311分别为抗ErbB3VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3结构域的共同序列，其为SEQ ID NO:4的和图3中所示的VH共同序列的CDR序列。
SEQ ID NO:312-314分别为抗ErbB3VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3结构域的共同序列，其为SEQ ID NO:6的和图4中所示的VL共同序列的CDR序列。
SEQ ID NO:315为抗ErbB3VLCDR3的共同序列，其为SEQ ID NO:7的和图4中所示的VL共同序列的CDR3序列。
SEQ ID NO:316为抗ErbB3/抗IGF-1R IgG2四价双特异性蛋白ELI-7的重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:317为抗ErbB3/抗IGF-1R IgG2四价双特异性蛋白ELI-7的轻链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:318为抗IGF-1R/抗ErbB3四价双特异性蛋白ILE-10的重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:319为抗IGF-1R/抗ErbB3四价双特异性蛋白ILE-12的重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:320为抗IGF-1R/抗ErbB3四价双特异性蛋白ILE-10和ILE-12的轻链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:321-335为表1的抗IGF-1R抗体的Fab重链(Fab HC)、Fab轻链(Fab LC)和scFv的氨基酸序列，所述序列列于图37中。
表1-抗IGF-1R抗体
SEQ ID NO:336-353为表2的抗ErbB3抗体的Fab重链(Fab HC)、Fab轻链(Fab LC)和scFv的氨基酸序列，所述序列列于图38中。
表2-抗ErbB3抗体
SEQ ID NO:354和355为图5B中所示的B60-IgG2-M78多价双特异性抗体的核苷酸和氨基酸序列。
SEQ ID NO:356和357为图5B中所示的M7-IgG2-M78多价双特异性抗体的核苷酸和氨基酸序列。
SEQ ID NO:358-360为图6A中所示的SF、P4、M78和M57抗IGF-1RIgG1单克隆抗体重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:362-366为图6B中所示的P1、M27、M7、B72和B60抗ErbB3IgG1单克隆抗体重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:367-369为图6C中所示的P4、M57和M78抗IGF-1R scFv单克隆抗体的氨基酸序列。
SEQ ID NO:370-375为图6D中所示的C8、P1、M1.3、M27、P6和B69抗ErbB3scFv单克隆抗体的氨基酸序列。
SEQ ID NO:376-379分别为重链P4M-G1-M1.3、P4M-G1-C8、P33M-G1-M1.3和P33M-G1-C8的氨基酸序列。
SEQ ID NO:380和381分别为P33Mκ轻链和P4Mκ轻链的氨基酸序列。SEQ ID NO:382和383分别为抗IGF-1R scFv M76和抗ErbB3scFv P6L的氨基酸序列。结合位点M76的VH和VL结构域分别由SEQ ID NO:31和133的氨基酸序列组成。
SEQ ID NO:384和385分别为抗IGF-1R结合位点模块P4M和P33M的VH结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:386和387分别为抗IGF-1R结合位点模块P4M和P33M的VL结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO:388为抗ErbB3结合位点模块P6L的VH结构域的氨基酸。VL结构域由SEQ ID NO:173的氨基酸序列组成。
SEQ ID NO:389和390分别为抗IGF-1R重链P4M-G1-P6L和P33M-G1-P6L的氨基酸序列。
SEQ ID NO:391为抗ErbB3重链P1-G1-M76的氨基酸序列。
SEQ ID NO:392为图5A和5B的杂交重链的CH1部分开始的氨基酸序列。
SEQ ID NO:393和394分别为图5A和5B的轻链的抗IGF-1R和ErbB3VL结构域中CL结构域开始的氨基酸序列。
SEQ ID NO:395-402为示例性Gly-Ser多肽接头的氨基酸序列。
SEQ ID NO:403为六聚组氨酸标签的氨基酸序列。
SEQ ID NO:404为IgG2恒定结构域(包括CH1、铰链、CH2和CH3区)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:405-408分别为SF-G1-P1、SF-G1-M27、M57–G1-C8、M7-G1-M78重链的重链的氨基酸序列，包括前导序列(各序列的N端19个氨基酸)。
SEQ ID NO:409为M7-G1-M78重链的核苷酸序列，包括前导序列。SEQID NO:410-411分别为P4-G1-M1.3重链的氨基酸和核苷酸序列，包括前导序列(氨基酸序列的N端19个氨基酸)。
SEQ ID NO:412-413分别为P4-G1-C8重链的氨基酸和核苷酸序列，包括前导序列(氨基酸序列的N端19个氨基酸)。
SEQ ID NO:414-415分别为M7λ轻链的氨基酸和核苷酸序列，包括前导序列(氨基酸序列的N端21个氨基酸)。
SEQ ID NO:416-417分别为P4κ轻链的氨基酸和核苷酸序列，包括前导序列(氨基酸序列的N端20个氨基酸)。
SEQ ID NO:418为IgG1模块的氨基酸序列，具有铰链、CH2和CH3区(序列的C端231个氨基酸)。
SEQ ID NO:419-424分别为重链P4M-G1-M1.3、P4M-G1-C8、P4M-G1-P6L、P33M-G1-M1.3、P33M-G1-C8和P33M-G1-P6L的核苷酸序列。
SEQ ID NO:425为P1-G1-M76抗ErbB3-G1/抗EGF-1R双特异性抗体的核苷酸序列。
SEQ ID NO:426和427分别为P33Mκ和P4Mκ轻链的核苷酸序列。
SEQ ID NO:428为M76抗IGF-1R scFv的核苷酸序列。
SEQ ID NO:429为P6L抗ErbB3scFv的核苷酸序列。
详细描述
本文提供特异性结合IGF-1R或ErbB3的新颖单特异性抗体。所述抗体包括IgG抗体和scFv抗体。还提供特异性结合人IGF-1R和人ErbB3的双特异性抗体，例如多价双特异性抗体(“PBA”)。这些蛋白质为经由IGF-1R和ErbB3中的任一者或两者进行的肿瘤细胞增殖和信号转导的有效抑制剂。所述蛋白质可用于治疗细胞增殖性病症，例如癌症。
定义
为方便起见，说明书、实施例和随附权利要求书中所用的某些术语和短语的含义提供如下。
“药剂”是指活性分子，例如治疗性蛋白质，例如药物。
“氨基酸取代”是指蛋白质中的一个特定氨基酸(“aa”)置换为另一氨基酸。取代可为保守性取代，如下文所定义。
“抗ErbB3结合位点”是指特异性结合人ErbB3的结合位点。
“抗IGF-1R结合位点”是指特异性结合人IGF-1R的结合位点。
“抗原结合位点”是指包含抗体的VH和/或VL结构域或其至少一个CDR的结合位点。举例来说，抗原结合位点可包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：仅VHCDR3或连同VHCDR2一起和任选地连同VHCDR1。在某些实施方案中，抗原结合位点包含VH结构域和VL结构域，其可存在于同一多肽上或两个不同多肽上，例如VH结构域存在于重链上且VL结构域存在于轻链上。
抗体的“抗原结合部分”是指保留特异性结合抗原(例如IGF-1R或ErbB3)的能力的抗体的一个或多个片段。已证实抗体的抗原结合功能可由全长抗体的片段保留。术语抗体的“抗原结合部分”内涵盖的结合片段的实例包括(i)Fab片段，一种由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，一种由两个通过二硫桥键在铰链区连接的Fab片段组成的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单一臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH结构域组成的dAb片段；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管VL和VH为Fv片段的两个结构域，但VL和VH由单独的基因编码，其可使用重组方法通过使得能将其制成VL和VH区配对形成单价蛋白质的单一蛋白质链的合成接头联结，所述单价蛋白质称为单链Fv(scFv)，参见美国专利号5,892,019。所述单链抗体也意欲涵盖于术语抗体的“抗原结合部分”内。还涵盖单链抗体的其它形式，如双功能抗体。双功能抗体为二价双特异性抗体，其中VH和VL结构域表达于单一多肽链上，但使用过短以致不允许同一链上的两个结构域之间发生配对的接头，由此迫使所述结构域与另一链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。
“结合亲和力”是指结合相互作用的强度且包括实际结合亲和力以及表观结合亲和力两者。实际结合亲和力为缔合速率相对于解离速率的比率。表观亲和力可包括例如由多价相互作用产生的亲合性。解离常数(Kd)通常为结合亲和力的倒数，且可使用表面等离子体共振测定(例如，如在BIACORE 3000仪器(GE Healthcare)中，例如使用重组ErbB3作为分析物和抗ErbB3抗体作为配体所测定)或细胞结合测定便利地测量，所述测定各自描述于美国专利号7,846,440的实施例3中。
“结合部分”、“结合结构域”或“结合位点”是指结合多肽或当如此说明时其重链或轻链中直接参与介导抗体与靶分子(即抗原)的特异性结合的部分、区或位点。示例性结合结构域包括抗原结合位点、配体的受体结合结构域、受体的配体结合结构域或酶促结构域。在优选实施方案中，结合结构域包含抗原结合位点或由抗原结合位点组成(例如包含来自抗体的可变重(VH)链序列和可变轻(VL)链序列或六个CDR安置于替代框架区中(例如任选地包含一个或多个氨基酸取代的人框架区)。在某些实施方案中，结合位点可基本上仅由VH或VL链序列构成。结合位点可完全来自一种物种，例如其仅具有来源于一种物种的生殖系序列的序列。举例来说，结合位点可为人(即来自人物种)、小鼠或大鼠。结合位点还可被人源化，即CDR是来自一种物种且框架(FR)是来自另一物种。举例来说，结合位点可具有来源于小鼠抗体的CDR和来自人物种的FR。某些人源化结合位点在一个或多个CDR中包含突变以使得CDR看起来更类似于供体抗体的CDR。某些人源化抗体还可在一个或多个FR中包含突变。一般来说，结合位点中的突变可增强结合位点与其靶抗原的结合的亲和力，和/或其可使结合位点稳定，例如延长其半衰期。
“CDR”或“互补决定区”是指重链和轻链多肽两者的VR内发现的不连续抗原结合位点。这些特定区已由以下文献描述：Kabat等,J.Biol.Chem.252,6609-6616(1977)和Kabat等,Sequences of protein of immunological interest.(1991)，和Chothia等,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)和MacCallum等,J.Mol.Biol.262:732-745(1996)，其中定义包括当彼此比较时氨基酸残基的重叠和子集。阐述涵盖如上文引用参考文献各自所定义的CDR的氨基酸残基以供比较。如本文所用，且如果无其它规定，那么“CDR”如Kabat所定义。
表3.CDR定义
1残基编号遵循Kabat等,1991,同上的命名法
2残基编号遵循Chothia等,同上的命名法
3残基编号遵循MacCallum等,同上的命名法
“CH1结构域”是指位于VH结构域与铰链之间的重链免疫球蛋白恒定结构域。其涵盖EU位置118-215。CH1结构域可为天然存在的CH1结构域，或一个或多个氨基酸已被取代、添加或缺失的天然存在的CH1结构域，条件为所述CH1结构域具有所要生物性质。所要生物活性相对于天然存在的序列可为天然生物活性、增强的生物活性或降低的生物活性。
“CH2结构域”是指位于铰链与CH3结构域之间的重链免疫球蛋白恒定结构域。其涵盖EU位置231-340。CH2结构域可为天然存在的CH2结构域，或一个或多个氨基酸已被取代、添加或缺失的天然存在的CH2结构域，条件为所述CH2结构域具有所要生物性质。所要生物活性相对于天然存在的序列可为天然生物活性、增强的生物活性或降低的生物活性。
“CH3结构域”是指位于CH2结构域的C端的重链免疫球蛋白恒定结构域且涵盖来自CH2结构域的N端的约110个残基，例如约位置341-446b(EU编号系统)。CH3结构域可为天然存在的CH3结构域，或一个或多个氨基酸(“aas”)已被取代、添加或缺失的天然存在的CH3结构域，条件为所述CH3结构域具有所要生物性质。所要生物活性相对于天然存在的序列可为天然生物活性、增强的生物活性或降低的生物活性。CH3结构域可包含或可不包含C端赖氨酸。
“CH4结构域”是指IgM和IgE抗体中位于CH3结构域的C端的重链免疫球蛋白恒定结构域。CH4结构域可为天然存在的CH4结构域，或一个或多个氨基酸已被取代、添加或缺失的天然存在的CH4结构域，条件为所述CH4结构域具有所要生物性质。所要生物活性相对于天然存在的序列可为天然生物活性、增强的生物活性或降低的生物活性。
“CL结构域”是指位于VH结构域的C端的重链免疫球蛋白恒定结构域。其涵盖约Kabat位置107A-216。CL结构域可为天然存在的CH1结构域，或一个或多个氨基酸已被取代、添加或缺失的天然存在的CL结构域，条件为所述CL结构域具有所要生物性质。所要生物活性相对于天然存在的序列可为天然生物活性、增强的生物活性或降低的生物活性。CL结构域可包含或可不包含C端赖氨酸。
“保守性取代”或“保守性氨基酸取代”是指蛋白质或肽中的一个或多个氨基酸残基被特定置换氨基酸置换，对于各特定取代前氨基酸残基来说，所述特定置换氨基酸已知不可能改变这个特定氨基酸残基被这个特定置换氨基酸取代的蛋白质或肽的构形或功能。所述保守性取代通常涉及一个氨基酸被置换为在电荷和/或大小方面与第一氨基酸类似的另一氨基酸，且包括异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)或亮氨酸(L)中的任一者彼此置换、天冬氨酸(D)取代谷氨酸(E)和反之亦然；谷氨酰胺(Q)取代天冬酰胺(N)和反之亦然；和丝氨酸(S)取代苏氨酸(T)和反之亦然。所属领域中已知在特定序列或结构环境中保守的其它取代。举例来说，甘氨酸(G)和丙氨酸(A)经常可彼此取代以产生保守性取代，丙氨酸与缬氨酸(V)也可如此。相对疏水性的甲硫氨酸(M)经常可保守性取代亮氨酸或异亮氨酸或被亮氨酸或异亮氨酸保守性取代，且有时保守性取代缬氨酸或被缬氨酸保守性取代。赖氨酸(K)和精氨酸(R)在氨基酸残基的重要特征为其电荷且预期这两种碱性氨基酸残基的不同pK不重要的位置中经常可互换。所述取代的作用可使用取代计分矩阵(如PAM120、PAM-200和PAM-250)进行计算。其它此类保守性取代(例如具有类似疏水性特征的整个区(例如跨膜结构域)的取代)为熟知的。
免疫球蛋白轻链上的CR结构域可互换地称为“CL”、“轻链CR结构域”、“CL区”或“CL结构域”。免疫球蛋白的重链上的恒定结构域(例如铰链、CH1、CH2或CH3结构域)可互换地称为“CH”、“重链恒定结构域”、“CH”区或“CH结构域”。免疫球蛋白轻链上的可变结构域可互换地称为“VL”、“轻链可变结构域”、“VL区”或“VL结构域”。免疫球蛋白重链上的可变结构域可互换地称为“VH”、“重链可变结构域”、“VH区”或“VH结构域”。
“结构域”是指重链或轻链多肽的区，例如独立地折叠的球蛋白区或非球蛋白区(例如接头结构域)，其可包含可由例如β-折叠片和/或链间二硫键稳定的肽环(例如1至4个肽环)。免疫球蛋白重链和轻链的恒定区和VR通常折叠成结构域。具体来说，CH1、CH2、CH3、CH4、CL、VH和VL结构域中的每一者通常形成环结构。
“EC50”或“EC50”是指提供蛋白质对特定系统(如结合测定或信号转导路径)的最大作用的50％的分子(例如PBA)的浓度。
“ErbB3”和“HER3”是指如美国专利号5,480,968中所述的ErbB3蛋白。人ErbB3蛋白序列示出于图4和美国专利号5,480,968的SEQ ID NO:4中，其中前19个氨基酸对应于自成熟蛋白质裂解的前导序列。ErbB3为受体的ErbB家族的成员，所述家族的其它成员包括ErbB1(EGFR)、ErbB2(HER2/Neu)和ErbB4。虽然ErbB3本身缺乏酪氨酸激酶活性，但其本身在ErbB与另一ErbB家族受体(例如ErbB1、ErbB2和ErbB4，其为受体酪氨酸激酶)二聚化后磷酸化。ErbB家族的配体包括异调蛋白(HRG)、乙胞素(BTC)、表皮生长因子(EGF)、乙酰肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)、转化生长因子α(TGF-α)、双调蛋白(amphiregulin；AR)、上皮有丝分裂蛋白(epigen；EPG)和外调蛋白(epiregulin；EPR)。人ErbB3的氨基酸序列以Genbank保藏编号NP_001973.2(受体酪氨酸蛋白激酶erbB-3同种型1前驱体)提供且指定基因ID：2065。
“EU”指示重链CR中的氨基酸位置(包括CH1、铰链、CH2和CH3结构域中的氨基酸位置)在本文中是根据EU指数编号系统进行编号(参见Kabat等,“Sequences of Proteins of Immunological Interest”,U.S.Dept.Health and HumanServices,第5版,1991)。
“Fab”是指抗体的抗原结合部分，其包含两条链：包含VH结构域和CH1结构域的第一链和包含VL结构域和CL结构域的第二链。尽管Fab通常描述为经过木瓜蛋白酶处理的抗体的N端片段且包含一部分铰链区，但其在本文中还用于表示重链不包含一部分铰链的结合结构域。
“Fc区”是指单一免疫球蛋白重链中始于铰链区中紧接木瓜蛋白酶裂解位点上游(即IgG中的残基216，取重链CR的第一个残基为114)且结束于抗体的C端的部分。因此，完整Fc区至少包含铰链、CH2结构域和CH3结构域。二聚化的两个Fc区称为“Fc”或“Fc二聚体”。Fc区可为天然存在的Fc区，或一个或多个氨基酸已被取代、添加或缺失的天然存在的Fc区，条件为所述Fc区具有所要生物性质。所要生物活性相对于天然存在的序列可为天然生物活性、增强的生物活性或降低的生物活性。
“框架区”或“FR”或“FR区”包括作为VR的部分但不为CDR的部分的氨基酸残基(例如使用CDR的Kabat定义)。因此，VR框架的长度在约100-120个氨基酸之间但仅包括CDR以外的那些氨基酸。对于重链VR的特定实例和如Kabat等,1991,同上所定义的CDR来说，框架区1对应于VR中涵盖氨基酸1-30的结构域；框架区2对应于VR中涵盖氨基酸36-49的结构域；框架区3对应于VR中涵盖氨基酸66-94的结构域，且框架区4对应于VR中自氨基酸103至VR末端的结构域。轻链的框架区类似地由各轻链VR CDR分隔。类似地，使用Chothia等或McCallum等关于CDR的定义，框架区边界如上所述由各别CDR末端分隔。在优选实施方案中，CDR如Kabat所定义。
“全长抗体”为包含一个或多个重链和一个或多个轻链的抗体。各重链由重链VR(在本文中缩写为VH)和重链CR构成。重链CR由三个结构域CH1、CH2和CH3和任选地存在的第四结构域CH4构成。各轻链由轻链VR(在本文中缩写为VL)和轻链CR构成。轻链CR由一个结构域CL构成。VH和VL区可进一步细分为具有高变性的区，称为互补决定区(CDR)，其间插有较保守的区，称为框架区(FR)。各VH和VL通常由三个CDR和四个FR构成，自氨基端至羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。免疫球蛋白可为任何类型类别(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)或子类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或子类。
“Gly-Ser接头”或“Gly-Ser肽”是指由甘氨酸和丝氨酸残基组成的肽。示例性Gly-Ser肽包含氨基酸序列(Gly4Ser)n(SEQ ID NO:395)，其中n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或20以上。在某些实施方案中，n为1与5之间的数值，n为6与10之间的数值，n为11与15之间的数值，n为16与20之间的数值，n为21与25之间的数值，或n为26与30之间的数值。
“重链免疫球蛋白CR”或“HC Ig CR”可包含CH1结构域和Fc区，所述Fc区可包含铰链、CH2结构域、CH3结构域和/或CH4结构域。轻链免疫球蛋CR可包含CL结构域。
“铰链”或“铰链区”或“铰链结构域”是指重链中位于CH1结构域与CH2结构域之间的柔性部分。其长度为约25个氨基酸，且分为“上铰链”、“中铰链”和“下铰链”。铰链可为天然存在的铰链，或一个或多个氨基酸已被取代、添加或缺失的天然存在的铰链，条件为所述铰链具有所要生物性质。所要生物活性相对于天然存在的序列可为天然生物活性、增强的生物活性或降低的生物活性。
“IC50”或“IC50”是指提供最大活性(例如对刺激物的反应或组成性活性)的50％抑制的分子(例如PBA)的浓度，即使活性降至最大活性与基线之间的半程程度的浓度。IC50值可使用例如Cheng-Prusoff方程转化为绝对抑制常数(Ki)。在受结合剂(诸如本文提供的抗体或双特异性结合蛋白)抑制的系统中，IC50可能与EC50不可区分。
“IGF-1R”或“IGF1R”是指胰岛素样生长因子1(IGF-1，先前称为促生长因子C(somatomedin C))的受体。IGF-1R还结合胰岛素样生长因子2(IGF-2)且由胰岛素样生长因子2(IGF-2)活化。IGF1-R为受体酪氨酸激酶，其在受IGF-1或IGF-2活化后自体磷酸化。人IGF-1R前驱体的氨基酸序列以Genbank保藏编号NP_000866提供且指定基因ID：3480。
“IgG-(scFv)2”表示由具有两个各自由IgG重链和IgG轻链构成的N端Fab结合位点的IgG组成的四价PBA，其中各重链的C端连接于由VH结构域与VL结构域构成的结合位点的scFv。当免疫球蛋白CR为IgG1的CR时，PBA称为“IgG1-(scFv)2”。示例性IgG1-(scFv)2PBA为四个结合位点包含两个基本上相同的抗IGF-1R结合位点和两个基本上相同的抗ErbB3结合位点者。下文在详细描述中在子标题“包含IgG1CR的示例性IGF-1R+ErbB3PBA”下所述的38个四价PBA(还参见图5A和5B)各自包含两个联结的基本上相同的亚基，各亚基包含彼此以二硫键键结的重链和轻链，例如M7-G1-M78(SEQ IDNO:284和SEQ ID NO:262)、P4-G1-M1.3(SEQ ID NO:226和SEQ ID NO:204)和P4-G1-C8(SEQ ID NO:222和SEQ ID NO:204)，为所述IgG1-(scFv)2蛋白的示例性实施方案。当免疫球蛋白CR为IgG2的CR时，蛋白质称为“IgG2-(scFv)2”。示例性“IgG2-(scFv)2蛋白为ELI-7。当免疫球蛋白CR部分来自IgG1且部分来自IgG的另一同型(例如IgG2)时，蛋白质称为例如“IgG1/2-(scFv)2”。
“免疫球蛋白CR”或“Ig CR”是指免疫球蛋白(即抗体)中其可变结构域以外的部分。在某些实施方案中，免疫球蛋白CR包含“重链免疫球蛋白CR”和“轻链免疫球蛋白CR”。
生物活性受结合蛋白“抑制”是指生物活性由结合蛋白介导的任何可再现的可检测降低。在一些实施方案中，抑制使生物活性产生统计显著性降低，例如生物活性相对于在不存在结合蛋白下测得的生物活性降低约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
在提及多核苷酸、多肽或蛋白质时的“分离的”意谓所述多核苷酸、多肽或蛋白质实质上自在自然界中与其或其类似物伴随出现的多核苷酸、多肽、蛋白质或其它大分子移除。尽管术语“分离的”不欲要求特定纯度，但通常蛋白质将为至少约75％纯，更优选为至少约80％纯，更优选为至少约85％纯，更优选为至少约90％纯，更优选为至少约95％纯，且最优选为至少约99％纯。
与免疫球蛋白氨基酸序列位置的指定有关的“Kabat”指示轻链CR(例如CL结构域)中的氨基酸位置是根据Kabat指数编号系统(参见Kabat等,1991.,op.cit.)进行编号。
“连接于”在上下文中是指氨基酸或核苷酸的直接或间接连接或联结。“间接连接”是指经由包含例如一个或多个氨基酸或核苷酸的接头或结构域介导的连接。“直接连接”或“直接地连接”当提及两个多肽区段时是指在所述两个多肽区段之间存在共价键，例如两个多肽区段连续联结而无插入序列。
“接头”是指将两个结构域或区连接在一起的一个或多个氨基酸。接头可为柔性的以允许由接头连接的结构域形成适当三维结构，由此允许其具有所需生物活性。连接scFv的VH和VL的接头在本文中称为“scFv接头”。连接VH结构域的N端或CH3结构域的C端与第二VH结构域(例如scFv的VH结构域)的接头称为“连接型接头(connecting linker)”。
“模块”是指PBA中在结构上和/或功能上不同的部分，如结合位点(例如scFv结构域或Fab结构域)和Ig恒定结构域。本文提供的模块可与其它模块以大量组合重排(通过重组核酸或完全或部分重新合成新多核苷酸对其编码序列进行重组)以产生广泛多种PBA，例如如本文所公开。举例来说，“SF”模块是指结合位点“SF”，即至少包含SF VH和SF VL结构域的CDR。“C8”模块是指结合位点“C8”。
“PBA”是指多价双特异性抗体，其为包含至少两个不同结合部分或结构域且因此包含至少两个不同结合位点(例如两个不同抗体结合位点)的人工杂交蛋白质，其中多个结合位点中的一者或多者例如经由肽键彼此共价连接。本文所述的优选PBA为抗IGF-1R+抗ErbB3PBA，其为包含一个或多个特异性结合IGF-1R蛋白(例如人IGF-1R蛋白)的第一结合位点和一个或多个特异性结合ErbB3蛋白(例如人ErbB3蛋白)的第二结合位点的多价双特异性抗体。抗IGF-1R+抗ErbB3PBA的命名与抗IGF-1R和抗ErbB3结合位点在分子中的方向无关，而在PBA名称包含两个由斜线(/)分开的抗原时，斜线左边的抗原位于斜线右边抗原的氨基端。PBA可为二价结合蛋白、三价结合蛋白、四价结合蛋白或具有4个以上结合位点的结合蛋白。示例性PBA为四价双特异性抗体，即具有4个结合位点但仅结合两种不同抗原或表位的抗体。示例性双特异性抗体为四价“抗IGF-1R/抗ErbB3”PBA和“抗ErbB3/抗IGF-1R”PBA。通常，四价PBA的N端结合位点为Fab且C端结合位点为scFv。
“一致性百分比”或“一致性％”是指两个或两个以上核酸或多肽序列或子序列在将所述两个序列对准以获得最大对应性且比较时相同(100％一致)或具有指定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基。为对准以获得最大对应性，可将空隙引入所比较的一个序列中。接着比较相应位置上的氨基酸残基或核苷酸并定量。当第一序列中的位置由与第二序列中相应位置相同的残基占据时，那么所述序列在那个位置一致。两个序列之间的一致性百分比为所述序列所共享的一致位置的数目的函数(例如，一致性％＝一致位置的数目/位置总数(例如重叠位置)×100)。在某些实施方案中，两个序列具有相同长度。一个序列与另一序列的实测一致性％的测定可使用数学算法进行测定。用于两个序列的所述比较的数学算法的一个非限制性实例并入作为GCG序列比对软件包的一部分的ALIGN程序(2.0版)中。当利用ALIGN程序例如用于比较氨基酸序列时，可使用PAM120加权残基表、空隙长度罚分12和空隙罚分4。用于序列分析的其它算法在所属领域中为熟知的并且许多可在线获得。
参考部分的(例如结构域的)“部分”或“片段”是指完整参考部分(例如结构域，例如天然存在的结构域)中占参考部分尺寸的至少或至多10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的离散部分。
“scFv接头”是指插入scFv的VL与VH结构域之间的肽或多肽结构域。scFv接头优选允许VL和VH结构域的定向呈抗原结合构形。在一个实施方案中，scFv接头包含仅包含甘氨酸和丝氨酸的肽或多肽接头(“Gly-Ser接头”)或由其组成。在某些实施方案中，scFv接头包含二硫键。
“scFv蛋白”是指由包含一个轻链可变结构域(VL)和一个重链可变结构域(VH)的单一多肽组成的结合蛋白，其中各可变结构域是来源于相同或不同抗体。scFv蛋白通常包含插入VH结构域与VL结构域之间的scFv接头。ScFv蛋白在所属领域中为已知的且描述于例如美国专利号5,892,019中。
“相似性”或“相似性百分比”在两个或两个以上多肽序列的情况下是指两个或两个以上序列或子序列在比较和对准以获得最大对应性时具有指定百分比的相同或保守性取代的氨基酸残基。举例来说，当第一氨基酸序列与第二氨基酸序列中与第一序列中所含数目相同数目的氨基酸进行比较或与通过所属领域中所已知的计算机相似性程序对准的多肽的对准进行比较，与第二氨基酸序列至少50％、60％、70％、75％、80％、90％或甚至95％一致或保守性取代时，第一氨基酸序列可视为与第二氨基酸序列相似。所述术语还适用于两个或两个以上多核苷酸序列。
当提及结合位点与其靶表位或结合位点组合与其靶表位的结合时，“特异性结合(Specific binding)”、“特异性地结合(specifically binds)”、“选择性结合(selective binding)”和“选择性地结合(selectively binds)”以及“特异性地结合(binds specifically)”、“选择性地结合(binds selectively)”意谓结合位点展现与靶表位的免疫特异性结合。特异性结合表位的结合位点对靶表位展现显著亲和力，且通常因其并不对任何不相关表位展现显著亲和力且优选不对任何不相关表位展现等于、大于对靶表位的亲和力或比对靶表位的亲和力低两个数量级以内的亲和力而展现与其它表位的交叉反应性。“显著”或优选结合包括解离常数“Kd”为10-8、10-9M、10-10、10-11、10-12M、10-13M或Kd值甚至更低的结合。应注意，较低Kd(解离常数)值指示较高结合亲和力，因此10-7的Kd为比10-8的Kd高的Kd值，但指示比10-8的Kd低的结合亲和力。值为约10-7M且甚至低至约10-8M的解离常数为适于治疗性抗体的解离常数的高端。结合亲和力可由解离常数的范围指示，例如10-6至10-12M、10-7至10-12M、10-8至10-12M或更优选(即，或较低值解离常数)。纳摩尔浓度(10-9M)至皮摩尔浓度(10-12M)范围内或更低的解离常数通常最适用于治疗性抗体。适合解离常数为50nM或50nM以下的Kd(即结合亲和力为50nM或50nM以上，例如Kd为45nM)，或40nM、30nM、20nM、10nM、1nm、100pM、10pM或1pM或1pM以下的Kd。特异性或选择性结合可根据用于测定这种结合的所属领域中公认的方式，包括例如根据史卡查分析和/或竞争结合测定进行测定。
多价双特异性抗体
本文提供多价双特异性抗体(“PBA”)，其可为分离的单克隆抗体。示例性PBA包含至少一个抗IGF-1R结合位点和至少一个抗ErbB3结合位点或至少两个抗IGF-1R结合位点和至少两个抗ErbB3结合位点。在一优选实施方案中，抗IGF-1R结合位点特异性结合人IGF-1R且抗ErbB3结合位点特异性结合人ErbB3。在某些实施方案中，PBA包含两个彼此缔合形成单一蛋白质的重链-轻链对，其中各重链-轻链对包含抗IGF-1R结合位点和抗ErB3结合位点。在某些实施方案中，第一重链-轻链对的抗IGF-1R结合位点和抗ErbB3结合位点经由免疫球蛋白CR连接，所述免疫球蛋白CR与另一重链-轻链对的免疫球蛋白CR缔合(例如通过二硫键)形成例如单一IgG样蛋白质。如本文所述的优选PBA具有有利性质，如与其分离的抗IGF-1R结合部分或其分离的抗ErbB3结合部分相比相等地或更有效地抑制肿瘤细胞增殖和降低或稳定肿瘤生长的能力，且在某些实施方案中，抑制肿瘤侵袭力和肿瘤转移中任一者或两者的能力。本文所述的示例性PBA与其分离的抗IGF-1R结合部分或其分离的抗ErbB3结合部分相比可相等地或更有效地抑制IGF-1R和ErbB3介导的信号转导中的任一者或两者，如IGF-1R、ErbB3和AKT磷酸化。示例性PBA将(i)使肿瘤细胞生长抑制例如至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或90％以上；或(ii)使IGF-1r、ErbB3或Akt磷酸化抑制例如至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或90％以上，例如与其分离的抗IGF-1R结合部分或其分离的抗ErbB3结合部分相比程度类似或更有效，或(i)与(ii)两者。示例性PBA将(iii)为稳定的，例如在溶液中在4℃、室温或37℃下1、2、3、4、5天或5天以上后至少80％为单体，或(iv)具有至少50℃、55℃、65℃或65℃以上的Tm(例如，如DSF所测定)，或(iii)与(iv)两者。本文所述的PBA可用于例如治疗患有癌症的受试者。
在某些实施方案中，PBA的免疫球蛋白CR可包含IgG重链的CR，其可包含Fc区。免疫球蛋白恒定结构域可以重链-轻链对形式存在，其重链Fc区可包含与另一所述重链-轻链对的CH3结构域缔合(例如通过二硫键)的CH3结构域。免疫球蛋白CR部分还可包含CH2结构域、铰链和/或CH1结构域。如本文进一步描述，PBA的CH1、铰链、CH2或CH3结构域各自可为天然存在的(或野生型)结构域，或其可因一个或多个氨基酸取代(例如保守性取代)、添加或缺失而与天然存在的结构域不同，条件为特定结构域保留其所要生物活性，如CH3和CL缔合活性中的任一者或两者。存在时，CH1、铰链、CH2和CH3结构域的顺序优选如其在天然情况下所存在为N端至C端，即CH1、铰链、CH2、CH3。所述结构域可彼此直接或间接联结或连接。间接连接为经由具有一个或多个氨基酸的接头介导的连接。在一个实施方案中，各CH结构域直接连接于其相邻结构域。因此，在一个实施方案中，CH1结构域以其C端连接于铰链结构域的N端，所述铰链结构域以其C端连接于CH2结构域的N端，所述CH2结构域以其C端连接于CH3结构域的N端。
某些PBA包含至少两个抗IGF-1R和至少两个抗ErbB3结合位点，各自分别与IGF-1R或ErbB3特异性结合。所述结合位点可为任何类型的免疫球蛋白来源的结合位点或模拟结合位点，条件为各结合位点特异性结合其各别靶标。举例来说，结合位点可为Fab结构域、scFv或单结构域抗体的片段。PBA的抗IGF-1R和抗ErbB3结合位点可为相同类型的结合位点或为不同类型。举例来说，抗IGF-1R结合位点可为Fab且抗ErbB3结合位点可为scFv。或者，抗IGF-1R结合位点可为scFv且抗ErbB3结合位点可为Fab。在另一实施方案中，一个抗ErbB3结合位点为Fab且另一抗ErbB3结合位点为scFv；在另一实施方案中，一个抗IGF-1R结合位点为Fab且另一抗IGF-1R结合位点为scFv。在一些实施方案中，第一和第二Fab分别连接至免疫球蛋白CR结构域的N端和C端。在一些实施方案中，第一和第二scFv分别连接至免疫球蛋白CR结构域的N端和C端。在一些实施方案中，至少一个Fab结构域连接至免疫球蛋白CR的N端(例如呈Fab和CR的天然排列)且至少一个scFv连接至免疫球蛋白CR的C端。在一些实施方案中，至少一个scFv连接至免疫球蛋白CR的N端且至少一个Fab连接至免疫球蛋白CR的C端。Fab和scFv和抗IGF-1R和抗ErbB3双特异性抗体的示例性排列列于表4中。
表4：PBA中的示例性抗IGF-1R和抗ErbB3排列
在某些实施方案中，PBA的免疫球蛋白CR包含连接至第一重链可变结构域(VH)结构域的CH1结构域。举例来说，CH1结构域可以N端连接于第一VH结构域的C端。
在某些实施方案中，PBA的免疫球蛋白CR包含连接至第二VH结构域的CH3。当提及本文提供的基于IgG(例如来源于IgG或包含IgG CR的至少一部分和IgG)的PBA的第一和第二结合位点时，“第一”结合位点是指位于免疫球蛋白CR部分的N端的结合位点，而“第二”结合位点为位于免疫球蛋白CR部分的C端的结合位点。举例来说，CH3结构域可以其C端连接于第二VH结构域的N端。CH3结构域可以其C端连接于接头的N端，所述接头以其C端连接于第二VH结构域的N端。这种接头可适用于提供恒定免疫球蛋白区与第二VH结构域之间的柔性，以使得可获得适当三维结构以允许蛋白质具有生物活性。
在某些实施方案中，PBA包含两个作为如抗体中通常所发现的抗原结合位点的结合位点(即其包含两个Fab)。所述PBA通常包含两条轻链，其中各轻链包含与两条重链各自的VH结构域缔合(例如通过二硫键键结)以形成两个结合位点的轻链可变(VL)结构域。VL结构域可连接于恒定轻链(CL)结构域且形成轻链Fab区。举例来说，VL结构域可以其C端连接于CL结构域的N端。在第一与第二结合位点为Fab的实施方案中，PBA具有两条不同轻链，称为第一和第二轻链，其中第一和第二轻链分别包含第一和第二VL结构域，且任选地分别包含第一和第二CL结构域，且分别与第一和第二VH结构域且任选地与第一和第二CH1结构域缔合(例如二聚化)。
在PBA包含一个或多个scFv的实施方案中，各scFv的VH结构域连接于scFv接头，所述scFv接头连接于VL结构域，且VH结构域与VL结构域彼此缔合形成抗原结合位点。在一个实施方案中，VH结构域以其C端连接于scFv接头的N端，所述scFv接头以其C端连接于VL结构域的N端。在一个scFv连接于免疫球蛋白CR的N端且一个scFv连接于其C端的实施方案中，免疫球蛋白CR的N端连接于第一VH结构域，所述第一VH结构域连接于第一scFv接头，所述第一scFv接头连接于第一VL结构域，且所述第一VH结构域与所述第一VL结构域形成第一结合位点；且免疫球蛋白CR的C端连接于第二VH结构域，所述第二VH结构域连接于第二scFv接头，所述第二scFv接头连接于第二VL结构域，且所述第二VH结构域与所述第二VL结构域形成第二结合位点且两个所述免疫球蛋白CR二聚化或以其它方式缔合(例如通过至少一个键，例如二硫键或范德华键)以形成单一四价蛋白质。
在优选实施方案中，免疫球蛋白CR为人免疫球蛋白CR，即其基本上由获自人免疫球蛋白谱系的氨基酸序列组成。免疫球蛋白CR可为任何免疫球蛋白同型、类别或子类的CR。在一个实施方案中，免疫球蛋白CR为IgG CR，如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4CR。在某些实施方案中，CR为由至少两种不同类别或子类或类型的免疫球蛋白构成的杂交体。举例来说，免疫球蛋白CR可具有一个来自IgG1的结构域和一个或多个来自IgG4蛋白的其它结构域。如本文进一步描述，在某些实施方案中，免疫球蛋白CR内的结构域(例如CH1、铰链、CH2或CH3)可主要来自免疫球蛋白的一种同型，但可具有一个或多个氨基酸突变(例如取代、添加或缺失)，例如以提供归属于另一类型或类别的免疫球蛋白CR的突变型免疫球蛋白CR。
在某些实施方案中，PBA具有IgG-(scFv)2结构。所述蛋白质包含具有两个第一结合位点的IgG抗体，具有第二结合位点的scFv连接于所述IgG抗体，例如连接于IgG蛋白的两个C端中的每一者。示例性IgG-(scFv)2为IgG1-(scFv)2，其中IgG为IgG1。
在某些实施方案中，PBA包含具有由scFv-Fc-scFv表示的结构的重链且所述PBA可具有结构(scFv-Fc-scFv)2。Fc可为包含铰链、CH2和CH3结构域的Fc区。在某些实施方案中，所述蛋白质不包含CH1或CL结构域。
在一个实施方案中，PBA包含两个相同的形成IgG样分子的重链-轻链对，其中各对包含一个为抗IGF-1R Fab的结合部分和另一为抗ErbB3scFv的结合部分，且其中所述两个结合部分经由免疫球蛋白CR连接，所述免疫球蛋白CR按N端至C端顺序包含铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域。scFv可经由接头连接于CH3结构域。在一示例性实施方案中，PBA包含形成二聚体的两条相同重链和两条相同轻链，其中各轻链与重链缔合，且其中各重链包含：第一VH结构域，所述第一VH结构域以其C端连接于CH1结构域的N端，所述CH1结构域以其C端连接于铰链结构域的N端，所述铰链结构域以其C端连接于CH2结构域的N端，所述CH2结构域以其C端连接于CH3结构域的N端，所述CH3结构域以其C端连接于接头的N端，所述接头以其C端连接于第二VH结构域的N端，所述第二VH结构域以其C端连接于scFv接头的N端，所述scFv接头以其C端连接于第二VL结构域的N端，所述第二VL结构域与所述第二VH结构域缔合形成第二结合位点；且其中各轻链包含第一VL结构域，所述第一VL结构域以其C端连接于CL结构域的N端，其中所述VH结构域与所述第一VL结构域形成第一结合位点。在一个实施方案中，第一结合位点为抗IGF-1R结合位点且第二结合位点为抗ErbB3结合位点。在另一实施方案中，第一结合位点为抗ErbB3结合位点且第二结合位点为抗IGF-1R结合位点。
在某些实施方案中，PBA包含含有由SEQ ID NO:304的共同序列组成的VHCDR3和任选地存在的分别由SEQ ID NO:302和303的共同序列组成的VHCDR1和/或VHCDR2的IGF-1R结合位点(参见图1)。在某些实施方案中，SEQ ID NO:304的最末(C端)X氨基酸不为I。PBA还可包含含有由SEQ IDNO:307或308的共同序列组成的VLCDR3和任选地存在的分别由SEQ IDNO:305和306的序列组成的VHCDR1和VHCDR2中任一者或两者的抗IGF-1R结合位点(参见图2)。在某些实施方案中，PBA包含含有分别由SEQ IDNO:302、303、304、305、306和307(或308)的共同序列组成的VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3的抗IGF-1R结合位点。
在某些实施方案中，PBA包含含有由SEQ ID NO:311的共同序列组成的VHCDR3和任选地存在的分别由SEQ ID NO:309和310的序列组成的VHCDR1和/或VHCDR2的抗ErbB3结合位点(参见图3)。PBA还可包含含有由SEQ ID NO:314或315的共同序列组成的VLCDR3和任选地存在的分别由SEQ ID NO:312和313的序列组成的VHCDR1和/或VHCDR2的抗IGF-1R结合位点(参见图4)。在某些实施方案中，PBA包含含有分别由SEQ IDNO:309、310、311、312、313和314(或315)的序列组成的VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3的抗IGF-1R结合位点。
SEQ ID NO:302-315的序列阐述如下：
抗IGF-1R CDR
VHCDR1共同序列：GFX1FSX2YPMH(SEQ ID NO:302)
VHCDR2共同序列：ISX1X2GGATX3YADSVKG(SEQ ID NO:303)
VHCDR3共同序列：DFYX1X2LTGNAFDX3(SEQ ID NO:304)
VLCDR1序列：RASQGISSYLA(SEQ ID NO:305)
VLCDR2共同序列：AX1STX2QS(SEQ ID NO:306)
VLCDR3共同序列：QQYX1X2X3PLT(SEQ ID NO:307)和QQYWX1X2PLT(SEQ ID NO:308)
抗ErbB3CDR
VHCDR1序列：GFTFDDYAMH(SEQ ID NO:309)
VHCDR2共同序列：ISWX1SGSX2GYADSVKG(SEQ ID NO:310)
VHCDR3共同序列：DLGX1X2QWX3X4GFDY(SEQ ID NO:311)
VLCDR1序列：QGDSLRSYYAS(SEQ ID NO:312)
VLCDR2序列：GKNNRPS(SEQ ID NO:313)
VLCDR3共同序列：X1SRDX2X3GX4X5WV(SEQ ID NO:314)和X1SRDX2PGX3X4WV(SEQ ID NO:315)
之后接有数字的各氨基酸“X”为可变氨基酸，其独立地表示任何氨基酸，如位于图1、2、3或4中相应位置的任何氨基酸。SEQ ID NO:302的X1-X2、SEQ ID NO:303的X1-X2和SEQ ID NO:304的X1-X3的示例性氨基酸提供于图1中氨基酸序列中的相应位置处。SEQ ID NO:306的X1-X2、SEQ ID NO:307的X1-X3和SEQ ID NO:308的X1-X2的示例性氨基酸提供于图2中氨基酸序列中的相应位置处。SEQ ID NO:310的X1-X2和SEQ ID NO:311的X1-X4的示例性氨基酸提供于图3中氨基酸序列中的相应位置处。SEQ ID NO:314的X1-X5或SEQ ID NO:315的X1-X4的示例性氨基酸提供于图4中氨基酸序列中的相应位置处。
示例性PBA包含含有分别由SEQ ID NO:302、303、304、305、306和307(或308)的序列组成的VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3的抗IGF-1R结合位点和含有分别由SEQ ID NO:309、310、311、312、313和314(或315)的序列组成的VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3的抗ErbB3结合位点。
示例性PBA包含一个或多个来自图1-4中提供的一个或多个VR的CDR。在某些实施方案中，抗IGF-1R结合位点包含1、2或3个图1的VH结构域之一的CDR和/或1、2或3个图2的VL结构域之一的CDR。举例来说，抗IGF-1R结合部分可包含来自SEQ ID NO:11的CDR1、CDR2和/或CDR3和/或来自SEQ ID NO:35的CDR1、CDR2和/或CDR3(16F的CDR)。在某些实施方案中，抗IGF-1R结合部分包含图1和2的CDR的组合，条件为(即其中)(i)结合部分不为16F的结合部分，或(ii)抗IGF-1R结合实体的CDR中的1、2、3、4、5或6者不存在于16F的抗IGF-1R结合实体中，或(iii)抗IGF-1R结合实体的VH或VL结构域分别与16F中的相应VH或VL结构域不同。
示例性PBA包含含有包含图1中的序列(例如SEQ ID NO:8、9、10和11中的一者)的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3氨基酸序列的VH结构域的抗IGF-1R结合实体(所述CDR的位置示出于图1中)。PBA还可包含含有包含SEQ ID NO:32、33、34和35中的一者的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列的VL结构域的抗IGF-1R结合实体(所述CDR的位置示出于图2中)。在某些实施方案中，PBA包含含有包含SEQ ID NO:8、9、10和11中的一者的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3氨基酸序列的VH结构域和包含SEQID NO:32、33、34和35中的一者的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列的VL结构域的抗IGF-1R结合实体。在特定实施方案中，抗IGF-1R结合结构域包含含有SEQ ID No:8的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID No:32的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列的VL结构域。在特定实施方案中，抗IGF-1R结合结构域包含含有SEQ ID No:9的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID No:33的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列的VL结构域。在特定实施方案中，抗IGF-1R结合结构域包含含有SEQ ID No:10的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ IDNo:34的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列的VL结构域。在特定实施方案中，抗IGF-1R结合结构域包含含有SEQ ID No:11的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID No:35的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列的VL结构域。在特定实施方案中，抗IGF-1R结合结构域包含含有SEQ ID No:8的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID No:33的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列的VL结构域。在特定实施方案中，抗IGF-1R结合结构域包含含有SEQ ID No:10的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID No:32的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列的VL结构域。
在某些实施方案中，抗ErbB3结合位点包含1、2或3个图3的VH结构域之一的CDR和/或1、2或3个图4的VL结构域之一的CDR。举例来说，抗ErbB3结合部分可包含来自SEQ ID NO:143的CDR1、CDR2和/或CDR3和/或来自SEQ ID NO:175的CDR1、CDR2和/或CDR3(16F的CDR)。在某些实施方案中，抗ErbB3结合部分包含图1和2的CDR的组合，条件为(即其中)(i)结合部分不为16F的结合部分，或(ii)抗抗ErbB3结合实体的CDR中的1、2、3、4、5或6者不存在于16F的抗ErbB3结合实体中，或(iii)抗IGF-1R结合实体的VH或VL结构域分别与16F中的相应VH或VL结构域不同。示例性PBA包含含有包含图3中的序列(例如SEQ ID NO:134-143中的一者)的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3氨基酸序列的VH结构域的抗ErbB3结合实体(所述CDR的位置示出于图3中)。PBA还可包含含有包含SEQ IDNO:166-175中的一者的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列的VL结构域的抗ErbB3结合实体(所述CDR的位置提供于图4中)。在某些实施方案中，PBA包含含有包含SEQ ID NO:134-143中的一者的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:166-175中的一者的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列的VL结构域的抗ErbB3结合实体。在特定实施方案中，抗ErbB3结合结构域包含含有SEQ ID No:134的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ IDNo:166的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列的VL结构域。在特定实施方案中，抗ErbB3结合结构域包含含有SEQ ID No:135的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID No:167的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列的VL结构域。在特定实施方案中，抗ErbB3结合结构域包含含有SEQ ID No:136的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID No:168的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列的VL结构域。在特定实施方案中，抗ErbB3结合结构域包含含有SEQ ID No:137的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID No:169的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列的VL结构域。在特定实施方案中，抗ErbB3结合结构域包含含有SEQ ID No:138的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID No:170的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列的VL结构域。在特定实施方案中，抗ErbB3结合结构域包含含有SEQID No:139的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID No:171的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列的VL结构域。在特定实施方案中，抗ErbB3结合结构域包含含有SEQ ID No:140的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ IDNo:172的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列的VL结构域。在特定实施方案中，抗ErbB3结合结构域包含含有SEQ ID No:141的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID No:173的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列的VL结构域。在特定实施方案中，抗ErbB3结合结构域包含含有SEQ ID No:142的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID No:174的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列的VL结构域。在特定实施方案中，抗ErbB3结合结构域包含含有SEQ ID No:143的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID No:175的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列的VL结构域。在特定实施方案中，抗ErbB3结合结构域包含含有SEQ ID No:136的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID No:169的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列的VL结构域。
结合位点还可包含图1-4的VR的一个或多个CDR，其中1、2或3个氨基酸已改变，例如取代、添加或缺失，条件为所述结合位点仍能够特异性结合其靶标。
在某些实施方案中，抗IGF-1R结合位点包含含有以下共同序列的VH结构域：EVQLLQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFX1FSX2YPMHWVRQAPGKGLEWVX3SISX4X5GGATX6YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRX7EDTAVYYCAKDFYX8X9LTGNAFDX10WGQGTX11VTVSS(SEQ ID NO:1；CDR加有下划线)。
这个共同序列是通过比对24个高亲和力抗IGF-1R结合位点的VH序列而获得。比对示出于图1中。
在某些实施方案中，SEQ ID NO:1的氨基酸X1-X11各自独立地表示任何氨基酸。在其它实施方案中，SEQ ID NO:1的氨基酸X1-X11各自独立地表示在图1的任何序列中的那些位置上所示的任何氨基酸。在一个所述实施方案中，X1为T，X2为V，X3为S，X4为S，X5为S，X6为R，X7为A，X8为D，X9为I，X10为I，且X11为T(SF重链16F；SEQ ID NO:11)。示例性IGF-1R VH序列阐述为SEQ ID NO:8-31。
在某些实施方案中，抗IGF-1R结合位点的VH结构域包含SEQ ID NO:1的共同序列，条件为(即其中)所述序列不为SF重链16F的序列，例如有至少一个氨基酸不同。在某些实施方案中，抗IGF-1R结合位点的VH结构域包含SEQ ID NO:1的共同序列，条件为(即其中)X1不为T，X2不为V，X6不为R，X8不为D或X10不为I。示例性抗IGF-1R VH序列阐述为SEQ ID NO:8-10和12-31。
在某些实施方案中，抗IGF-1R结合位点包含含有以下共同序列的VL结构域：
DIQX1TQSPSSLSASX2GDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYAX3STX4QSGVPSRFSGSGSGTX5FTLTISSLQPEDX6X7TYYCQQYX8 X9X10PLTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:2；CDR加有下划线)。
这个共同序列是通过比对约100个高亲和力抗IGF-1R结合位点的VL序列而获得。比对示出于图2中。
在某些实施方案中，SEQ ID NO:2的氨基酸X1-X10各自独立地表示任何氨基酸。在其它实施方案中，SEQ ID NO:2的氨基酸X1-X10各自独立地表示在图2的任何序列中的那些位置上所示的任何氨基酸。在一个所述实施方案中，X1为M，X2为T，X3为A，X4为L，X5为D，X6为F，X7为A，X8为F，X9为T，且X10为F(SFκ轻链16F；SEQ ID NO:35)。示例性IGF-1RVL序列阐述为SEQ ID NO:32-133。
在某些实施方案中，抗IGF-1R结合位点的VL结构域包含SEQ ID NO:2的共同序列，条件为(即其中)所述序列不为SF轻链16F的序列，例如有至少一个氨基酸不同。在某些实施方案中，抗IGF-1R结合位点的VL结构域包含SEQ ID NO:2的共同序列，条件为(即其中)X2不为T，X6不为F，或X8不为F。当X2不为T，X6不为F，和/或X8不为F时，X2可为L，X6可为F，和/或X8可为F，如以下共同序列中所述：DIQX1TQSPSSLSASLGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYAX 2STX3QSGVPSRFSGSGSGTX4FTLTISSLQPEDSX5TYYCQQYWX6X7PLTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:3；CDR加有下划线)。
在某些实施方案中，抗IGF-1R结合位点的VL结构域包含SEQ ID NO:3的共同序列，其中SEQ ID NO:3的氨基酸X1-X7各自独立地表示任何氨基酸。在其它实施方案中，SEQ ID NO:3的氨基酸X1-X7各自独立地表示在图2的任何序列中的那些位置上所示的任何氨基酸。示例性IGF-1R VL序列阐述为SEQ ID NO:32-34和36-133。
在某些实施方案中，抗ErbB3结合位点包含含有以下共同序列的VH结构域：X1VQLVX2SGGGLVQPGX3SLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVX4GISWX5SGSX6GYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRX7EDTAX8YYCARDLGX9X10QWX11X12GFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:4；CDR加有下划线)。
这个共同序列是通过比对32个高亲和力抗IGF-1R结合位点的VH序列而获得。比对示出于图3中。
在某些实施方案中，SEQ ID NO:4的氨基酸X1-X12各自独立地表示任何氨基酸。在其它实施方案中，SEQ ID NO:4的氨基酸X1-X12各自独立地表示在图3的任何序列中的那些位置上所示的任何氨基酸。在一个所述实施方案中，X1为Q，X2为Q，X3为G，X4为A，X5为N，X6为I，X7为P，X8为V，X9为Y，X10为N，X11为V，且X12为E(C8重链16F；SEQ IDNO:143)。示例性ErbB3VH序列阐述为SEQ ID NO:134-165。
在某些实施方案中，抗ErbB3结合位点的VH结构域包含SEQ ID NO:4的共同序列，条件为(即其中)所述序列不为C8重链16F的序列，例如有至少一个氨基酸不同。在某些实施方案中，抗ErbB3结合位点的VH结构域包含SEQ ID NO:4的共同序列，条件为(即其中)氨基酸X7不为P，或X8不为V。当X7不为P和/或X8不为V时，X7可为A和/或X8可为L，如以下共同序列中所述：X1VQLVX2SGGGLVQPGX3SLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVX4GISWX5SGSX6GYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDLGX7X8QWX9X10GFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:5；CDR加有下划线)。
在某些实施方案中，抗ErbB3结合位点的VH结构域包含SEQ ID NO:5的共同序列，其中SEQ ID NO:5的氨基酸X1-X10各自独立地表示任何氨基酸。在其它实施方案中，SEQ ID NO:5的氨基酸X1-X10各自独立地表示在图3的任何序列中的那些位置上所示的任何氨基酸。示例性ErbB3VH序列阐述为SEQ ID NO:134-142和144-165。
在某些实施方案中，抗ErbB3结合位点包含含有以下共同序列的VL结构域：SX1ELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYG KNNRPSGIPDRFSGSX2SGNX3ASLTITGAQAEDEADYYCX4SRDX5X6GX7 X8WVFGGGTKVTVX9G(SEQ ID NO:6；CDR加有下划线)。
这个共同序列是通过比对35个高亲和力抗IGF-1R结合位点的VL序列而获得。比对示出于图4中。
在某些实施方案中，SEQ ID NO:6的氨基酸X1-X9各自独立地表示任何氨基酸。在其它实施方案中，SEQ ID NO:6的氨基酸X1-X10各自独立地表示在图4的任何序列中的那些位置上所示的任何氨基酸。在一个实施方案中，X1为Y，X2为T，X3为S，X4为N，X5为S，X6为S，X7为N，X8为H，且X9为L(C8λ轻链16F；SEQ ID NO:175)。示例性ErbB3VL序列阐述为SEQ ID NO:166-200。
在某些实施方案中，抗ErbB3结合位点的VL结构域包含SEQ ID NO:6的共同序列，条件为(即其中)所述序列不为C8λ轻链16F的序列，例如有至少一个氨基酸不同。在某些实施方案中，抗ErbB3结合位点的VL结构域包含SEQ ID NO:6的共同序列，条件为(即其中)X6不为S。当X6不为S时，X6可为P，如以下共同序列中所述：SX1ELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYG KNNRPSGIPDRFSGSX2SGNX3ASLTITGAQAEDEADYYCX4SRDX5PGX6 X7WVFGGGTKVTVX8G(SEQ ID NO:7；CDR加有下划线)。
在某些实施方案中，抗ErbB3结合位点的VL结构域包含SEQ ID NO:7的共同序列，SEQ ID NO:7的氨基酸X1-X8各自独立地表示任何氨基酸。在其它实施方案中，SEQ ID NO:7的氨基酸X1-X8各自独立地表示在图4的任何序列中的那些位置上所示的任何氨基酸。示例性ErbB3VL序列阐述为SEQID NO:166-174和176-200。
示例性抗IGF-1R VH结构域包括M57VH结构域(SEQ ID NO:8)、M78VH结构域(SEQ ID NO:9)、P4VH结构域(SEQ ID NO:10)和SF VH结构域(SEQ ID NO:11)。示例性抗IGF-1R VL结构域包括M57VL结构域(SEQ IDNO:32)、M78VL结构域(SEQ ID NO:33)、P4VL结构域(SEQ ID NO:34)和SFVL结构域(SEQ ID NO:35)。
示例性抗ErbB3VH结构域包括B60VH结构域(SEQ ID NO:134)、B72VH结构域(SEQ ID NO:135)、M27VH结构域(SEQ ID NO:136)、M7VH结构域(SEQ ID NO:137)、P1VH结构域(SEQ ID NO:138)、M27VH结构域(SEQ IDNO:139)、B69VH结构域(SEQ ID NO:140)、P6VH结构域(SEQ ID NO:141)、M1.3VH结构域(SEQ ID NO:142)和C8VH结构域(SEQ ID NO:143)。示例性抗ErbB3VL结构域包括B60VL结构域(SEQ ID NO:166)、B72VL结构域(SEQ ID NO:167)、M27VL结构域(SEQ ID NO:168)、M7VL结构域(SEQ IDNO:169)、P1VL结构域(SEQ ID NO:170)、M27VL结构域(SEQ ID NO:171)、B69VL结构域(SEQ ID NO:172)、P6VL结构域(SEQ ID NO:173)、M1.3VL结构域(SEQ ID NO:174)和C8VL结构域(SEQ ID NO:175)。
结合位点可包含具有相同模块名称(例如“M57”、“M78”和“P4”)的VH和VL结构域，即其为其最初分离的结合位点的抗体的VH和VL结构域，或其可混合和匹配。举例来说，抗IGF-1R结合部分可包含：(i)模块M57的VH结构域(SEQ ID NO:8)和模块M57的VL结构域(SEQ ID NO:32)；模块M78的VH结构域(SEQ ID NO:9)和模块M78的VL结构域(SEQ ID NO:33)；(iii)模块P4的VH结构域(SEQ ID NO:10)和模块P4的VL结构域(SEQ ID NO:34)；(iv)模块SF的VH结构域(SEQ ID NO:11)和模块SF的VL结构域(SEQ IDNO:35)。抗ErbB3结合部分可包含：(i)模块B60的VH结构域(SEQ ID NO:134)和模块B60的VL结构域(SEQ ID NO:166)；(ii)模块B72的VH结构域(SEQ IDNO:135)和模块B72的VL结构域(SEQ ID NO:167)；(iii)模块M27的VH结构域(SEQ ID NO:136)和模块M27的VL结构域(SEQ ID NO:168)；(iv)模块M7的VH结构域(SEQ ID NO:137)和模块M7的VL结构域(SEQ ID NO:169)；(v)模块P1的VH结构域(SEQ ID NO:138)和模块P1的VL结构域(SEQ IDNO:170)；(vi)模块M27的VH结构域(SEQ ID NO:139)和模块M27的VL结构域(SEQ ID NO:171)；(vii)模块B69的VH结构域(SEQ ID NO:140)和模块B69的VL结构域(SEQ ID NO:172)；(viii)模块P6的VH结构域(SEQ IDNO:141)和模块P6的VL结构域(SEQ ID NO:173)；(ix)模块M1.3的VH结构域(SEQ ID NO:142)和模块M1.3的VL结构域(SEQ ID NO:174)；和(x)模块C8的VH结构域(SEQ ID NO:143)和模块C8的VL结构域(SEQ ID NO:175)。
PBA的结合部分还可包含混合和匹配的VH和VL结构域，即结合部分可包含来自一个模块的VH结构域和来自另一模块的VL结构域。举例来说，抗IGF-1R结合部分可包含模块M57的VH结构域(SEQ ID NO:8)和模块M78的VL结构域(SEQ ID NO:33)或模块P4的VH结构域(SEQ ID NO:10)和模块M57的VL结构域(SEQ ID NO:32)。抗ErbB3结合部分可包含模块M27的VH结构域(SEQ ID NO:136)和模块M7的VL结构域(SEQ ID NO:169；参见例如实施例7)。以高亲和力结合靶标的混合链结合部分为优选的。
PBA还可包含属于本文所述的IGF-1R VH(SEQ ID NO:1)、IGF-1RVL(SEQ ID NO:2)、ErbB3VH(SEQ ID NO:4)和ErbB3VL(SEQ ID NO:6)共同序列中一种以上的氨基酸序列，条件为所述PBA特异性结合IGF-1R和ErbB3。举例来说，PBA可包含以下任一者：
-包含SEQ ID NO:1的IGF-1R VH结构域和包含SEQ ID NO:2的IGF-1RVL结构域；
-包含SEQ ID NO:1的IGF-1R VH结构域和包含SEQ ID NO:4的ErbB3VH结构域；
-包含SEQ ID NO:1的IGF-1R VH结构域和包含SEQ ID NO:6的ErbB3VL结构域；
-包含SEQ ID NO:1的IGF-1R VH结构域、包含SEQ ID NO:2的IGF-1RVL结构域和包含SEQ ID NO:4的ErbB3VH结构域；
-包含SEQ ID NO:1的IGF-1R VH结构域、包含SEQ ID NO:2的IGF-1RVL结构域和包含SEQ ID NO:6的ErbB3VL结构域；
-包含SEQ ID NO:1的IGF-1R VH结构域、包含SEQ ID NO:2的IGF-1RVL结构域、包含SEQ ID NO:4的ErbB3VH结构域和包含SEQ ID NO:6的ErbB3VL结构域；
-包含SEQ ID NO:2的IGF-1R VL结构域和包含SEQ ID NO:4的ErbB3VH结构域；
-包含SEQ ID NO:2的IGF-1R VL结构域和包含SEQ ID NO:6的ErbB3VL结构域；
-包含SEQ ID NO:2的IGF-1R VL结构域、包含SEQ ID NO:4的ErbB3VH结构域和包含SEQ ID NO:6的ErbB3VL结构域；或
-包含SEQ ID NO:4的ErbB3VH结构域和包含SEQ ID NO:6的ErbB3VL结构域；
其中可变氨基酸独立地为任何氨基酸，或其中可变氨基酸独立地为图1-4的这些共同序列各自的相应位置上所示的任何氨基酸，条件为所述PBA特异性结合IGF-1R和ErbB3。
PBA还可包含属于本文所述的IGF-1R VH(SEQ ID NO:1)、IGF-1RVL(SEQ ID NO:2)、ErbB3VH(SEQ ID NO:4)和ErbB3VL(SEQ ID NO:6)共同序列中一种以上的氨基酸序列，条件为所述PBA特异性结合IGF-1R和ErbB3，条件为(即其中)所述PBA不为16F。举例来说，PBA还可包含属于本文所述的IGF-1R VH(SEQ ID NO:1)、IGF-1R VL(SEQ ID NO:3)、ErbB3VH(SEQ ID NO:5)和ErbB3VL(SEQ ID NO:7)共同序列中一种以上的氨基酸序列，条件为其特异性结合IGF-1R和ErbB3。举例来说，PBA可包含：
-包含SEQ ID NO:1的IGF-1R VH结构域和包含SEQ ID NO:3的IGF-1RVL结构域；
-包含SEQ ID NO:1的IGF-1R VH结构域和包含SEQ ID NO:5的ErbB3VH结构域；
-包含SEQ ID NO:1的IGF-1R VH结构域和包含SEQ ID NO:7的ErbB3VL结构域；
-包含SEQ ID NO:1的IGF-1R VH结构域、包含SEQ ID NO:3的IGF-1RVL结构域和包含SEQ ID NO:5的ErbB3VH结构域；
-包含SEQ ID NO:1的IGF-1R VH结构域、包含SEQ ID NO:3的IGF-1RVL结构域和包含SEQ ID NO:7的ErbB3VL结构域；
-包含SEQ ID NO:1的IGF-1R VH结构域、包含SEQ ID NO:3的IGF-1RVL结构域、包含SEQ ID NO:5的ErbB3VH结构域和包含SEQ ID NO:7的ErbB3VL结构域；
-包含SEQ ID NO:3的IGF-1R VL结构域和包含SEQ ID NO:5的ErbB3VH结构域；
-包含SEQ ID NO:3的IGF-1R VL结构域和包含SEQ ID NO:7的ErbB3VL结构域；
-包含SEQ ID NO:3的IGF-1R VL结构域、包含SEQ ID NO:5的ErbB3VH结构域和包含SEQ ID NO:7的ErbB3VL结构域；或
-包含SEQ ID NO:5的ErbB3VH结构域和包含SEQ ID NO:7的ErbB3VL结构域；
其中可变氨基酸独立地为任何氨基酸，或其中可变氨基酸独立地为图1-4的这些共同序列各自的相应位置上所示的任何氨基酸，条件为所述PBA特异性结合IGF-1R和ErbB3。
示例性PBA包含含有包含图1中的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:8、9、10和11中的一者的氨基酸序列)的VH结构域的抗IGF-1R结合实体。PBA还可包含含有包含图2中的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:32、33、34和35中的一者的氨基酸序列)的VL结构域的抗IGF-1R结合实体。在某些实施方案中，PBA包含含有包含SEQ ID NO:8、9、10和11中的一者的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:32、33、34和35中的一者的氨基酸序列的VL结构域的抗IGF-1R结合实体。在特定实施方案中，抗IGF-1R结合结构域包含含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VL结构域。在特定实施方案中，抗IGF-1R结合结构域包含含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VL结构域。在特定实施方案中，抗IGF-1R结合结构域包含含有SEQ IDNO:10的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VL结构域。在特定实施方案中，抗IGF-1R结合结构域包含含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VL结构域。在特定实施方案中，抗IGF-1R结合结构域包含含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VL结构域。在特定实施方案中，抗IGF-1R结合结构域包含含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VL结构域。
示例性PBA包含含有包含SEQ ID NO:134-143中的一者的氨基酸序列的VH结构域的抗ErbB3结合实体。PBA还可包含含有包含SEQ ID NO:166-175中的一者的氨基酸序列的VL结构域的抗ErbB3结合实体。在某些实施方案中，PBA包含含有包含SEQ ID NO:134-143中的一者的氨基酸序列的VH结构域和包含SEQ ID NO:166-175中的一者的氨基酸序列的VL结构域的抗ErbB3结合实体。在特定实施方案中，抗ErbB3结合结构域包含含有SEQ ID NO:134的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:166的氨基酸序列的VL结构域。在特定实施方案中，抗ErbB3结合结构域包含含有SEQ ID NO:135的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:167的氨基酸序列的VL结构域。在特定实施方案中，抗ErbB3结合结构域包含含有SEQ ID NO:136的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:168的氨基酸序列的VL结构域。在特定实施方案中，抗ErbB3结合结构域包含含有SEQ ID NO:137的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:169的氨基酸序列的VL结构域。在特定实施方案中，抗ErbB3结合结构域包含含有SEQ ID NO:138的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:170的氨基酸序列的VL结构域。在特定实施方案中，抗ErbB3结合结构域包含含有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:171的氨基酸序列的VL结构域。在特定实施方案中，抗ErbB3结合结构域包含含有SEQ ID NO:140的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:172的氨基酸序列的VL结构域。在特定实施方案中，抗ErbB3结合结构域包含含有SEQ ID NO:141的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:173的氨基酸序列的VL结构域。在特定实施方案中，抗ErbB3结合结构域包含含有SEQ ID NO:142的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQID NO:174的氨基酸序列的VL结构域。在特定实施方案中，抗ErbB3结合结构域包含含有SEQ ID NO:143的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ IDNO:175的氨基酸序列的VL结构域。在特定实施方案中，抗ErbB3结合结构域包含含有SEQ ID NO:136的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ IDNO:169的氨基酸序列的VL结构域。
在一示例性实施方案中，PBA包含含有免疫球蛋白CR的重链，所述免疫球蛋白CR包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：IgG1的CH1结构域、铰链、CH2结构域和CH3结构域(称为“IgG1CR”)。示例性PBA包含IgG1CR和以下氨基酸序列中的一者或多者：包含SEQ ID NO:1的共同序列的IGF-1R VH结构域；包含SEQ ID NO:2的共同序列的IGF-1R VL结构域；包含SEQ ID NO:4的共同序列的ErbB3VH结构域；和包含SEQ ID NO:6的共同序列的ErbB3VL结构域，且包含含有图5A、5B、7A和7B的重链和轻链氨基酸序列的PBA。
其它示例性PBA包含含有IgG1CR和以下氨基酸序列中的一者或多者的重链：包含SEQ ID NO:1的共同序列的IGF-1R VH结构域；包含SEQ ID NO:3的共同序列的IGF-1R VL结构域；包含SEQ ID NO:5的共同序列的ErbB3VH结构域；和包含SEQ ID NO:7的共同序列的ErbB3VL结构域，且包含含有图5A和5B的重链和轻链氨基酸序列但排除16个重链和轻链的PBA。
包含本来以赖氨酸或精氨酸结尾的羧基端的PBA的羧基端氨基酸可能被羧肽酶修剪。为避免此现象，在所述羧基端上添加一个或多个氨基酸可为有益的。举例来说，当蛋白质本来在其羧基端上具有“VEIK”时，可向羧基端添加1、2、3、4、5个或5个以上氨基酸以防止赖氨酸移除。在某些实施方案中，这些附加的氨基酸可来源于CL结构域。因此，举例来说，在PBA结束于以“VEIK”结尾的抗IGF-1R VL序列的情况下，可在羧基端上添加氨基酸“RT”(参见例如P1-G1-P4；SEQ ID NO:268)。
抗IGF-1R/ErbB3PBA可包含含有选自由以下重链融合物(杂交体)组成的组的氨基酸序列的重链：SF-G1-C8(即16F；SEQ ID NO:210)；SF-G1-P1(SEQID NO:212)；SF-G1-M1.3(SEQ ID NO:214)；SF-G1-M27(SEQ ID NO:216)；SF-G1-P6(SEQ ID NO:218)；SF-G1-B69(SEQ ID NO:220)；P4-G1-C8(SEQ IDNO:222)；P4-G1-P1(SEQ ID NO:224)；P4-G1-M1.3(SEQ ID NO:226)；P4-G1-M27(SEQ ID NO:228)；P4-G1-P6(SEQ ID NO:230)；P4-G1-B69(SEQ IDNO:232)；M78-G1-C8(SEQ ID NO:234)；M78-G1-P1(SEQ ID NO:236)；M78-G1-M1.3(SEQ ID NO:238)；M78-G1-M27(SEQ ID NO:240)；M78-G1-P6(SEQ ID NO:242)；M78-G1-B69(SEQ ID NO:244)；M57-G1-C8(SEQID NO:246)；M57-G1-P1(SEQ ID NO:248)；M57-G1-M1.3(SEQ ID NO:250)；M57-G1-M27(SEQ ID NO:252)；M57-G1-P6(SEQ ID NO:254)和M57-G1-B69(SEQ ID NO:256)。抗IGF-1R/ErbB3PBA可包含含有选自由以下κ轻链组成的组的氨基酸序列的轻链：SF(SEQ ID NO:202)；P4(SEQ IDNO:204)；M78(SEQ ID NO:206)；和M57(SEQ ID NO:208)。
抗ErbB3/IGF-1R PBA可包含含有选自由以下重链融合物(杂交体)组成的组的氨基酸序列的重链：P1-G1-P4(SEQ ID NO:268)；P1-G1-M57(SEQ IDNO:270)；P1-G1-M78(SEQ ID NO:272)；M27-G1-P4(SEQ ID NO:274)；M27-G1-M57(SEQ ID NO:276)；M27-G1-M78(SEQ ID NO:278)；M7-G1-P4(SEQ ID NO:280)；M7-G1-M57(SEQ ID NO:282)；M7-G1-M78(SEQID NO:284)；B72-G1-P4(SEQ ID NO:286)；B72-G1-M57(SEQ ID NO:288)；B72-G1-M78(SEQ ID NO:290)；B60-G1-P4(SEQ ID NO:292)；B60-G1-M57(SEQ ID NO:294)；B60-G1-M78(SEQ ID NO:296)；B60-G2-M78(SEQ ID NO:355)和M7-G2-M78(SEQ ID NO:357)。抗ErbB3/IGF-1R PBA可包含含有选自由以下λ轻链组成的组的氨基酸序列的轻链：P1(SEQ ID NO:258)、M27(SEQ ID NO:260)、M7(SEQ ID NO:262)、B72(SEQ ID NO:264)和B60(SEQ ID NO:266)。
重链可与包含与重链的VH结构域相同的模块的VL结构域的轻链配对。然而，重链和轻链还可混合和匹配，条件为结合位点保留与其靶标的高亲和力结合。
包含IgG1CR的示例性IGF-1R+ErbB3PBA
38个包含IgG1CR的示例性IGF-1R+ErbB3PBA的名称在此处下表5中阐明，所述名称各自之后接有(在括号中，按序)重链SEQ ID NO和轻链SEQ IDNO。所述IgG样PBA包含两条基本上相同的重链和两条基本上相同的轻链。
表5-包含IgG1CR的示例性IGF-1R+ErbB3PBA
在一示例性实施方案中，PBA包含两条相同重链和两条相同轻链，其中各重链的序列包含SEQ ID NO:210或300，基本上由SEQ ID NO:210或300组成或由SEQ ID NO:210或300组成，且其中各轻链的序列包含SEQ IDNO:202或298，基本上由SEQ ID NO:202或298组成或由SEQ ID NO:202或298组成。PBA还可包含含有分别恰好或至多有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、50、100、200或300个氨基酸与SEQ ID NO:202或298或者SEQ ID NO:210或300不同的氨基酸序列的重链和/或轻链，条件为所述PBA具有所要生物特征，如本文进一步描述。在一个实施方案中，PBA包含因在CH3结构域末端添加赖氨酸(K)，即产生序列…SLSLSPGKGGGGS….(SEQ ID NO:301)，而与SEQ ID NO:210或300不同的氨基酸序列。PBA还可包含因在CH3结构域中包含一个或多个以下氨基酸取代而与SEQ ID NO:210或300不同的氨基酸序列：S239D、N297Q、S298A,T299A、T299C、T299K、A330L、I332E、E333A、K334A、E356D、M358L、N434A、N343K(EU编号；参见图7A)。
PBA还可包含两条相同重链和两条相同轻链，其中各重链和各轻链的序列包含图5A或5B中所示的序列，基本上由其组成或由其组成(即选自SEQ IDNO:202-296的任何偶数SEQ ID编号的序列)。PBA还可包含含有分别恰好或至多有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、50、100、200或300个氨基酸与图5A或5B中的序列不同的氨基酸序列的重链和/或轻链，条件为所述PBA具有所要生物特征，如本文进一步描述。氨基酸的差异可为氨基酸缺失、添加或取代(例如保守性取代)。举例来说，PBA可包含因在CH3结构域末端添加(或缺失)赖氨酸和/或因在CH3结构域中包含一个或多个以下氨基酸取代而与图5A或5B的氨基酸序列不同的氨基酸序列：S239D、N297Q、S298A,T299A、T299C、T299K、A330L、I332E、E333A、K334A、E356D、M358L、N434A、N343K(参见图7A)。一个或多个氨基酸差异可存在于两个VH结构域中的一者或两者中或两个VL结构域中的一者或两者中，例如一个或多个CDR中或一个或多个框架区(FR)中。一个或多个氨基酸差异还可存在于一个或多个免疫球蛋白CR结构域中，例如CH1结构域、CL结构域、铰链、CH2结构域和/或CH3结构域中。可对免疫球蛋白CR进行例如以改变免疫球蛋白的一种或多种特征的特定氨基酸变化在本文中进一步描述。氨基酸变化还可存在于连接CH3结构域的C端与scFv的N端的接头中和/或连接scFv的VH结构域的C端与scFv的VL结构域的N端的scFv接头中。可对连接型接头和scFv接头进行的示例性修饰在本文中进一步描述。
还可使用以下PBA：
-包含重链和/或轻链的PBA，所述重链和/或轻链包含与具有SEQ IDNO:210或300的重链结构域和/或具有SEQ ID NO:202或298(16F的SEQ IDNO)的轻链结构域的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列，其中所述PBA具有所要生物特征；
-为由两个重链结构域和两个轻链结构域组成的PBA的生物类似物或生物等同物的PBA，所述两个重链结构域各自由SEQ ID NO:210或300组成，所述两个轻链结构域各自由SEQ ID NO:202或298组成；
-包含一个或多个包含与SEQ ID NO:202、210、298或300中的相应结构域的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列的结构域的PBA，所述一个或多个结构域为例如VH结构域、VL结构域、CDR结构域、FR结构域、CH1结构域、CL结构域、铰链、CH2结构域、CH3结构域、接头、scFv VH结构域、scFv接头和scFvVL结构域；
-包含重链结构域和/或轻链结构域的PBA，所述重链结构域和/或轻链结构域包含与图5A或5B中所述的重链结构域和/或图5A或5B中所述的轻链结构域的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列，其中所述PBA具有所要生物特征；
-为由两个重链结构域和两个轻链结构域组成的PBA的生物类似物或生物等同物的PBA，所述两个重链结构域各自包含图5A或5B的氨基酸序列，所述两个轻链结构域各自包含图5A或5B的氨基酸序列；
-包含一个或多个包含与图5A或5B的任一氨基酸序列中的相应结构域的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列的结构域的PBA，所述一个或多个结构域为例如VH结构域、VL结构域、CDR结构域、FR结构域、CH1结构域、CL结构域、铰链、CH2结构域、CH3结构域、接头结构域、scFv VH结构域、scFv接头结构域和scFv VL结构域。
在PBA包含与本文所述的氨基酸序列(如图5或6的氨基酸)不同的氨基酸序列的某些实施方案中，PBA不为16F(即，不包含两条由SEQ ID NO:210组成的重链和两条由SEQ ID NO:202组成的轻链)。
在某些实施方案中，PBA包含两个彼此缔合的重链-轻链对，其中各重链-轻链对包含抗IGF-1R结合位点和抗ErbB3结合位点，且其中所述重链-轻链对彼此不同。重链-轻链对可有一个或多个氨基酸不同(例如有恰好或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50个或直至100个氨基酸不同)。举例来说，第一重链-轻链对可包含重链CR且第二重链-轻链对可包含第二重链CR，其中第一和第二重链CR具有有利于其彼此缔合的氨基酸差异(例如“钮孔(knobs and holes)”)。
在某些实施方案中，多价蛋白质包含四个以上结合位点。举例来说，六价结合蛋白可包含IgG-(scFv)2，即蛋白质包含两个作为IgG的一部分的结合位点，一个scFv连接于IgG的各CH3结构域的C端，且进一步包含例如经由接头连接于IgG蛋白的N端或各scFv的C端的另一Fab或scFv。八价结合蛋白可包含与六价结合蛋白相同的结构，进一步包含两个另外的结合位点。
在某些实施方案中，PBA可包含一个来源于所属领域中已知的结合蛋白或抗体的结合位点，如本文进一步所述者。举例来说，PBA可包含一个或多个来自选自由以下组成的组的抗IGF-1R抗体的CDR：CP-751,871；IMC-A12；抗IGF-1R Ab#A；BIIB-G11；和C06，其重链和轻链氨基酸序列阐明于图37中。举例来说，用于PBA中的抗IGF-1R结合位点可包含SEQ ID NO:321-335中任一者的VHCDR3和/或VLCDR3结构域和任选地存在的VHCDR1、VLCDR1、VHCDR2和/或VLCDR2。在某些实施方案中，PBA包含含有1、2、3、4、5或6个包含因1、2或3个氨基酸添加、缺失或取代而与SEQ IDNO:321-335中的一者中所述的相应CDR不同的氨基酸序列的CDR的抗IGF-1R结合位点，条件为所述结合位点特异性结合其靶标(抗原)。在某些实施方案中，PBA包含含有1、2、3、4、5或6个包含与SEQ ID NO:321-335中的一者的相应CDR至少70％、80％、90％或95％一致或类似的氨基酸序列的CDR的抗IGF-1R结合位点。在某些实施方案中，PBA包含含有SEQ IDNO:321-335中的任一者的氨基酸序列的VH和/或VL链。在其它实施方案中，PBA包含含有因至多1、2、3、4、5、10、15、20、25或30个氨基酸缺失、添加或取代而与SEQ ID NO:321-335中的任一者不同或与SEQ IDNO:321-335中的序列至少70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列的VH和/或VL链，条件为结合位点特异性结合其靶标。在某些实施方案中，PBA包含含有轻链和/或重链的结合位点，所述重链和/或轻链包含SEQ ID NO:321-335的氨基酸序列或因至多1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100个氨基酸缺失、添加或取代而与其不同或与SEQ ID NO:321-335中的序列至少70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列，条件为所述结合位点保留与其靶标的特异性结合。举例来说，PBA可包含来自选自由CP-751,871；IMC-A12；抗IGF-1R Ab#A；BIIB-G11；和C06组成的抗体组的抗体的(i)VH结构域和VL结构域；(ii)重链和轻链；或(iii)包含VH和VL链的scFv。这种PBA可包含本文所述的抗ErbB3结合位点。
PBA可包含一个或多个来自抗ErbB3抗体的CDR，所述抗ErbB3抗体为例如抗ErbB3Ab#A；H3(美国专利号7,332,580)，MM Ab#3；MM Ab#14；MMAb#17或MM Ab#19，其重链和轻链氨基酸序列阐明于图38中。举例来说，用于PBA中的抗ErbB3结合位点可包含SEQ ID NO:336-353中任一者的VHCDR3和/或VLCDR3结构域和任选地存在的VHCDR1、VLCDR1、VHCDR2和/或VLCDR2。在某些实施方案中，PBA包含含有1、2、3、4、5或6个包含因1、2或3个氨基酸添加、缺失或取代而与SEQ ID NO:336-353中的一者的相应CDR不同的氨基酸序列的CDR的抗ErbB3结合位点，条件为所述结合位点特异性结合其靶标。在某些实施方案中，PBA包含含有1、2、3、4、5或6个包含与SEQ ID NO:336-353中的一者的相应CDR至少70％、80％、90％或95％一致或类似的氨基酸序列的CDR的抗ErbB3结合位点。在某些实施方案中，PBA包含含有SEQ ID NO:336-353中的任一者的氨基酸序列的VH和/或VL链。在其它实施方案中，PBA包含含有因至多1、2、3、4、5、10、15、20、25或30个氨基酸缺失、添加或取代而与SEQ ID NO:336-335中的任一者不同或与SEQ ID NO:336-335中的序列至少70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列的VH和/或VL链，条件为结合位点保留与其靶标的特异性结合。在某些实施方案中，PBA包含含有轻链和/或重链的结合位点，所述重链和/或轻链包含SEQ ID NO:336-353的氨基酸序列或因至多1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100个氨基酸缺失、添加或取代而与其不同或与SEQ ID NO:336-353中的序列至少70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列，条件为所述结合位点特异性结合其靶标。举例来说，PBA可包含来自选自由抗ErbB3Ab#A；H3(美国专利号7,332,585)，MM Ab#3；MM Ab#14；MM Ab#17和MM Ab#19组成的抗体组的抗体的(i)VH结构域和VL结构域；(ii)重链和轻链；或(iii)包含VH和VL链的scFv。可使用的其它抗ErbB3结合位点(或其部分，诸如CDR、V域或链)为来自以下抗ErbB3抗体者：1B4C3(目录号sc-23865，Santa Cruz Biotechnology)和2D1D12(U3PharmaAG)，两者均描述于例如美国专利公布号20040197332中且由杂交瘤细胞系DSM ACC 2527或DSM ACC 2517(保藏于DSMZ)产生，AV-203(WO2011/136911中的SEQ ID NO:190(重链)和SEQ ID NO:206(轻链)，AveoPharmaceuticals)或8B8(由杂交瘤#HB-12070TM产生，且描述于WO1997/035885中)，美国专利号7,846,440中所述的抗体，单克隆抗体Mab205.10.2(美国专利公布号20110171222中的SEQ ID NO:8(重链)和SEQ IDNO:10(轻链)，Roche Glycart)，美国专利公布号20100310557中所述的鼠类抗ErbB3抗体(Trellis Biosciences)或双特异性抗ErbB3/抗EGFR抗体(例如SEQID NO:14(重链)和SEQ ID NO:13(轻链)，Genentech)。这种PBA可包含本文所述的抗IGF-1R结合位点。
PBA还可包含与本文提供的结合部分结合人IGF-1R或人ErbB3上的相同表位的结合位点，例如，其可与具有如图5A和5B的序列的结合部分竞争。本文涵盖的结合部分还可与本文所述的结合部分竞争与抗原的结合，例如，其可与具有如图5A和5B的序列的结合部分竞争。包含与本文所述的结合部分竞争与靶抗原或表位的结合的结合部分的结合蛋白可为在本文所述的结合部分之前或之后添加至ELISA中时能够置换本文所述的结合部分的结合部分。
在某些实施方案中，本文提供的PBA不包括PCT/US2010/052712中的PBA，在其它实施方案中，本文提供的PBA不包括PCT/US2010/052712中的PBA的可变结构域。
示例性免疫球蛋白CR
在某些实施方案中，PBA包含两条重链，其中各自包含免疫球蛋白CR。多价结合结构域还可包含两条轻链，其中各轻链包含CL结构域。免疫球蛋白CR可来自人Ig，例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，或来自一种以上免疫球蛋白同型。举例来说，一个结构域可来自IgG1，且其它结构域可来自其它IgG同型。在某些实施方案中，一个结构域的一部分是来自一种IgG同型且其它结构域是来自另一IgG同型。
可包含CH1结构域、铰链、CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域中的一者或多者的重链免疫球蛋白CR可包含与特定IgG同型(例如IgG1)的天然存在的或野生型恒定结构域中的重链免疫球蛋白CR或本文所述氨基酸序列中一者的CR至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列或由其组成。CL结构域还可包含与天然存在或野生型κ或λ轻链中的CL结构域或本文所述氨基酸序列中一者中的CL结构域至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列或由其组成。
可包含CH1结构域、铰链、CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域中的一者或多者的重链免疫球蛋白CR相对于特定IgG同型(例如IgG1)的天然存在的或野生型恒定结构域中的相同重链免疫球蛋白CR或相对于本文(例如图5-7中)所述的重链免疫球蛋白CR可包含恰好或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11-15、16-20、21-25、26-30、31-35、36-40、41-45、46-50、50-100或100个以上氨基酸取代、添加和/或缺失。CL结构域相对于天然存在或野生型κ或λ轻链中的CL结构域或本文所述的CL结构域可包含恰好或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11-15、16-20、21-25、26-30、31-35、36-40、41-45、46-50、50-100或100个以上氨基酸取代、添加和/或缺失。
CR的各结构域(即CH1结构域、铰链、CH2结构域、CH3结构域和CL结构域)相对于特定IgG同型(例如IgG1)的天然存在的或野生型恒定结构域或本文所述的恒定结构域可包含一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或10个以上)氨基酸取代、添加和/或缺失。恒定区的各结构域(即CH1结构域、铰链、CH2结构域、CH3结构域和CL结构域)可包含与特定IgG同型(例如IgG1)的天然存在的或野生型恒定结构域中的相同结构域或本文所述的结构域至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列。
氨基酸取代、添加或缺失在空间上相对于彼此的定位可间隔至少1个氨基酸位置或1个以上，例如至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸位置或10个以上。在某些实施方案中，工程改造的氨基酸在空间上的定位彼此隔开至少5、10、15、20或25个氨基酸位置或25个以上的间隔。
在某些实施方案中，PBA包含含有本文所述的氨基酸序列的CR，例如Fc区或其结构域。在某些实施方案中，PBA包含含有其中1个或1个以上氨基酸已被缺失、添加或取代的本文所述氨基酸序列或含有与本文所述序列至少约80％、90％、95％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列的CR，例如Fc区或其结构域。举例来说，SEQ ID NO:300或图5和6中任何其它氨基酸序列的CH3结构域中的氨基酸356和358可被取代，例如E356D和M358L，以反映野生型IgG1CH3序列。本文还涵盖表示任何单倍体型的任何恒定结构域变异体。
某些氨基酸变化对恒定结构域的影响可如本文所进一步描述或如所属领域中所已知进行测定。
置换Fc部分中的氨基酸残基以改变抗体效应功能在所属领域中为已知的(美国专利号5,648,260和5,624,821)。抗体的Fc部分介导若干重要效应功能，例如细胞因子诱导、ADCC、吞噬作用、补体依赖性细胞毒性(CDC)以及抗体和抗原-抗体复合物的半衰期/清除速率。取决于治疗靶标，在一些情况下，这些效应功能对于治疗性抗体为需要的，但在其它情况下可能不必要或甚至有害。某些人IgG同型(尤其IgG1和IgG3)分别经由与FcγR和补体CIq结合而介导ADCC和CDC。新生儿Fc受体(FcRn)为决定抗体的循环半衰期的关键组分。在另一实施方案中，抗体的CR(例如抗体的Fc区)中的至少一个氨基酸残基被置换，以使得抗体的效应功能改变。免疫球蛋白的两个相同重链的二聚化由CH3结构域的二聚化介导且由铰链区内的二硫键稳定化。
在一个实施方案中，PBA保留以下属性中的一者或多者，且优选保留全部：在人中通过与活化型FcγRI、FcγRIIa/c、FcγRIIIa和抑制性FcγRIIb受体相互作用而测定的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)；由抗体结合于补体系统的组分而触发的补体依赖性细胞毒性(CDC)；和经由新生儿Fc受体(FcRn)的主动再循环而介导的长半衰期。所有这些功能均可调节以优化抗癌疗法的有效性且优选在PBA中得到保留。
可对免疫球蛋白CR进行某些氨基酸修饰以降低或增加恒定结构域的天然生物活性，如上文所述者。因此，在某些实施方案中，恒定免疫球蛋白区在位于Fc的“15埃接触区”内的氨基酸位置上包含氨基酸取代、缺失或添加。15埃区包括位于全长野生型Fc部分的EU位置243至261、275至280、282-293、302至319、336至348、367、369、372至389、391、393、408和424-440的残基。
在某些实施方案中，结合蛋白(例如PBA、抗IgG-1R结合位点和抗ErbB3结合位点)在Fc结构域中包含改变结构域的一种或多种抗原独立性效应功能(例如包含所述结构域的蛋白质的循环半衰期)的氨基酸变化(例如氨基酸取代、添加或缺失)。示例性抗体在与缺乏所述氨基酸变化的抗体比较时展现与FcRn的结合增加或减少，且因此分别具有增加或减少的血清半衰期。包含对FcRn的亲和力提高的Fc变异体的抗体预期具有较长血清半衰期，而包含FcRn结合亲和力降低的Fc变异体的抗体预期具有较短半衰期。在一个实施方案中，FcRn结合改变的结合蛋白包含至少一个在Fc结构域的“FcRn结合环”内具有一个或多个氨基酸变化的Fc结构域。FcRn结合环由野生型全长Fc的氨基酸残基280-299(EU)构成。在其它实施方案中，FcRn结合亲和力改变的结合蛋白包含至少一个在15FcRn“接触区”内具有一个或多个氨基酸取代的Fc结构域。术语15FcRn“接触区”包括野生型全长Fc结构域的以下位置上的残基：243-261、275-280、282-293、302-319、336-348、367、369、372-389、391、393、408、424、425-440(EU)。在某些实施方案中，FcRn结合亲和力改变的结合蛋白包含至少一个在对应于任一以下EU位置的氨基酸位置上具有一个或多个氨基酸变化的Fc结构域(例如一个或两个Fc部分)：256、277-281、283-288、303-309、313、338、342、376、381、384、385、387、434(例如N434A或N434K)和438。改变FcRn结合活性的示例性氨基酸变化公开于国际PCT公布号WO05/047327中。
在一些实施方案中，结合蛋白包含含有例如与野生型Fc区相比时改变多肽的抗原依赖性效应功能(尤其ADCC或补体活化)的氨基酸变化的Fc变异体。在示例性实施方案中，所述抗体展现与Fcγ受体(例如CD16)的结合改变。所述受体展现与野生型多肽相比时与FcγR的结合增加或减少，且因此分别介导增强或减弱的效应功能。对FcγR的亲和力提高的Fc变异体预期增强效应功能，且所述蛋白质可在希望破坏靶分子的治疗哺乳动物的方法中(例如在肿瘤疗法中)具有适用应用。相反，FcγR结合亲和力降低的Fc变异体预期减弱效应功能。在一个实施方案中，结合蛋白包含至少一种与包含野生型Fc区的结合蛋白相比改变的选自由以下组成的组的抗原依赖性效应功能：调理作用、吞噬作用、补体依赖性细胞毒性、抗原依赖性细胞毒性(ADCC)或效应细胞调节。
在一个实施方案中，结合蛋白展现与活化型FcγR(例如FcγRI、FcγRIIa或FcγRIIIa)的结合改变。在另一实施方案中，结合蛋白展现对抑制性FcγR(例如FcγRIIb)的结合亲和力改变。在其它实施方案中，FcγR结合亲和力增加(例如FcγRIIIa结合亲和力增加)的结合蛋白包含至少一个在对应于一个或多个以下位置的氨基酸位置上具有氨基酸变化的Fc结构域：239、268、298、332、334和378(EU)。在某些实施方案中，FcγR结合亲和力降低(例如FcγRI、FcγRII或FcγRIIIa结合亲和力降低)的结合蛋白包含至少一个在对应于一个或多个以下位置的氨基酸位置上具有氨基酸取代的Fc结构域：234、236、239、241、251、252、261、265、268、293、294、296、298、299、301、326、328、332、334、338、376、378和435(EU)。
在某些实施方案中，补体结合亲和力增加(例如C1q结合亲和力增加)的结合蛋白包含在对应于一个或多个以下位置的氨基酸位置上具有氨基酸变化的Fc结构域：251、334、378和435(EU)。在某些实施方案中，补体结合亲和力降低(例如C1q结合亲和力降低)的结合蛋白包含在对应于一个或多个以下位置的氨基酸位置上具有氨基酸取代的Fc结构域：239、294、296、301、328、333和376(EU)。改变FcγR或补体结合活性的示例性氨基酸变化公开于国际PCT公布号WO05/063815中。在某些实施方案中，结合蛋白可包含以下特定Fc区取代中的一者或多者：S239D、S239E、M252T、H268D、H268E、I332D、I332E、N434A和N434K(EU)。
结合蛋白还可包含改变结合蛋白的糖基化的氨基酸取代。举例来说，结合蛋白的免疫球蛋白CR可包含具有导致糖基化(例如N连接型或O连接型糖基化)减少的突变的Fc结构域或可包含改变的野生型Fc结构域的糖型式(例如低海藻糖或无海藻糖聚糖)。“工程改造的糖型式”是指共价连接于Fc区的碳水化合物组成，其中所述碳水化合物组成在化学上不同于亲本Fc区的碳水化合物组成。工程改造的糖型式可适用于多种目的，包括(但不限于)增强或减弱效应功能。工程改造的糖型式可由所属领域中已知的多种方法产生(US6,602,684；美国专利公布号2010-0255013；美国专利公布号20030003097；WO 00/61739A1；WO 01/29246A1；WO 02/31140A1；WO 02/30954A1)；(PotelligentTM技术(Biowa,Inc.,Princeton,NJ)；和GlycoMAbTM糖基化工程改造技术(Glycart Biotechnology AG,Zurich,Switzerland)。许多这些技术是基于通过以下方式控制共价连接于Fc区的海藻糖基化和/或对分寡糖的水平：例如在经过工程改造或以其它方式改造的各种生物体或细胞系(例如Lec-13CHO细胞或大鼠杂交瘤YB2/0细胞)中表达Fc多肽、调控糖基化路径中所涉及的酶(例如FUT8[a1,6-海藻糖基转移酶]和/或31-4-N-乙酰葡糖氨基转移酶III[GnTIII])、或在表达了Fc多肽之后对碳水化合物进行修饰。
在示例性实施方案中，氨基酸变化(例如氨基酸取代)产生通常在氨基酸位置297(EU)上发现的N连接型聚糖的糖基化减少的Fc区。Fc区还可在氨基酸位置297(EU)包含低海藻糖或无海藻糖聚糖。在某些实施方案中，结合蛋白在糖基化基元(例如含有氨基酸序列NXT或NXS的N连接型糖基化基元)附近或之内具有氨基酸取代。在一特定实施方案中，结合蛋白在对应于Fc的297或299(EU)的氨基酸位置上包含氨基酸取代。减少或改变糖基化的示例性氨基酸取代公开于国际PCT公布号WO05/018572和美国专利公布号20070111281中。
在其它实施方案中，结合蛋白包含至少一个具有一个或多个位于溶剂暴露表面的工程改造半胱氨酸残基或其类似物的Fc结构域。工程改造的半胱氨酸残基或其类似物优选不干扰结合蛋白的所要生物活性。举例来说，可能需要改变不干扰Fc结合Fc受体(例如FcγRI、FcγRII或FcγRIII)或补体蛋白(例如C1q)或者触发免疫效应功能(例如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、吞噬作用或补体依赖性细胞毒性(CDCC))的能力。在某些实施方案中，抗体包含含有至少一个实质上不含与第二半胱氨酸残基的二硫键键结的工程改造游离半胱氨酸残基或其类似物的Fc结构域。抗体可包含在CH3结构域中的一个或多个以下位置上具有工程改造半胱氨酸残基或其类似物的Fc结构域：349-371、390、392、394-423、441-446和446b(EU)。抗体可包含在任一以下位置上具有工程改造半胱氨酸残基或其类似物的Fc变异体：350、355、359、360、361、389、413、415、418、422、441、443和EU位置446b。
还可通过自特定免疫球蛋白类别或子类选择Fc或通过组合来自特定免疫球蛋白类别或子类(例如IgG1、IgG2等)的特定区获得所要效应功能。举例来说，因为ADCC和CDC(分别经由IgG与FcγR和C1q的结合)是由位于铰链和CH2结构域中的残基介导，且因为IgG4基本上缺乏效应功能，所以可通过组合IgG4的铰链和CH2结构域与IgG1的CH3结构域来构建无效应Fc。包含IgG4铰链的蛋白质中的Fab臂交换可通过所述铰链中的取代S228P而减少。
还可例如在CH3结构域中进行所属领域中称为“钮-孔(knobs-into-holes)”且描述于例如美国专利号7,183,076中的变化对免疫球蛋白CR进行修饰。在此策略中，对两条重链的Fc部分进行工程改造以得到一个突出的“钮”和另一互补的“孔”，由此有利于所述重链的缔合。
示例性接头
可使用接头来将两个结构域或区连接在一起，例如可变结构域连接至恒定结构域、可变结构域连接至可变结构域和恒定结构域连接至恒定结构域。连接scFv的VH结构域与scFv的VL结构域的接头称为“scFv接头”。连接scFv与恒定结构域(例如CH3结构域)的接头称为“连接型接头”。
接头优选具有足够长度以允许所连接的结构域或区适当折叠。举例来说，接头可为1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90或至少90-100个氨基酸长。
在某些实施方案中，接头为生物惰性的，例如通常不能诱发生物反应，例如免疫反应。
多肽接头可包含Gly-Ser接头或由其组成。“Gly-Ser接头”是指由甘氨酸和丝氨酸残基组成的肽。示例性Gly-Ser接头包含具有式(Gly4Ser)n(SEQ IDNO:395)的氨基酸序列，其中n为正整数(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)。举例来说，在某些实施方案中，连接型接头包含以下或由以下组成：(Gly4Ser)3(SEQ ID NO:396)或(Gly4Ser)4(SEQ ID NO:397)或(Gly4Ser)5(SEQ ID NO:398)。在某些实施方案中，scFv接头包含以下或由以下组成：(Gly4Ser)3或(Gly4Ser)4(SEQ ID NO:397)或(Gly4Ser)5(SEQ ID NO:398)。除(Gly4Ser)n序列外，接头还可包含一个或多个位于(Gly4Ser)n序列的N端或C端的附加氨基酸。举例来说，scFv接头可包含位于(Gly4Ser)n(SEQ ID NO:399)序列的N端的3个氨基酸，例如AST(参见例如，图7的16F的重链序列中和如SEQ ID NO:300。在所述序列中，scFv接头由氨基酸序列AST(Gly4Ser)3(SEQ ID NO:400)组成。
PBA的示例性生物特征
在某些实施方案中，PBA在体外抑制肿瘤细胞的生长。如实施例3(C)和图16和17中所示，抗ErbB3/抗IGF-1R IgG2(scfv)2PBA抑制2D培养物中两种不同肿瘤细胞系的增殖，而任一单独结合位点均不显著抑制其增殖。因此，在某些实施方案中，PBA在体外比任一单独结合位点更有效地抑制肿瘤细胞增殖(例如，如通过对6天培养物，例如实施例3(C)中所述的培养物的抑制百分比所测量)。PBA存在下的增殖相对于不存在PBA下细胞的增殖可抑制至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或90％以上。
在某些实施方案中，PBA在体内抑制肿瘤细胞增殖。如实施例3(D)和图18A至20B所示，抗ErbB3/抗IGF-1R IgG2(scfv)2PBA抑制癌症小鼠模型中两种不同肿瘤细胞系的增殖的程度比个别结合位点的抑制程度高。因此，在某些实施方案中，PBA在体内比任一单独结合位点更有效地抑制肿瘤细胞增殖(例如，如通过比较实验(例如实施例3(D)中所述的实验)结束时的肿瘤尺寸所测量)。PBA存在下的肿瘤生长相对于不存在PBA下的肿瘤生长可抑制至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或90％以上。
“与任一单独结合位点相比”是指与PBA的一个或另一结合位点相比较，此时所述结合位点包含与PBA中结合位点的VR相同的可变区且例如呈抗体形式，例如IgG1抗体(如例如实施例中所示)。
在某些实施方案中，PBA抑制经由IGF-1R和ErbB3中的任一者或两者介导的信号转导。如实施例3(B)、4和5(C)中所示，各种PBA抑制经由IGF-1R和ErbB3进行信号转导，如通过对IGF-1R、ErbB3和AKT的磷酸化的抑制作用所测量。所述实施例展示PBA抑制信号转导的程度或范围相对于现有技术抗IGF-1R抗体(抗IGF-1R Ab#A-SEQ ID NO:327(HC)和SEQ IDNO:328(LC))或抗ErbB3抗体(抗ErbB3Ab#A-SEQ ID NO:336(HC)和337(LC))或其组合可类似或较高。在某些实施方案中，pIGF-1R、pErbB3和pAKT中的任一者或其中两者或三者的组合的水平的降低百分比与抗IGF-1R Ab#A或抗ErbB3Ab#A或其组合的水平降低百分比相比可类似(例如在1％、5％或10％以内)、较高(例如高10％、20％、30％、40％或50％)或较低(例如低10％、20％、30％、40％、50％)。在一些实施方案中，实验(例如，如实施例中所述)结束时磷酸化的抑制(例如抑制％)与现有技术抗IGF-1R或抗ErbB3抗体或其组合的磷酸化抑制相比可类似或较高或较低。在某些实施方案中，当在例如实验(例如，如实施例中所述)结束时测定时，相对于不存在PBA下的磷酸化，PBA使IGF-1R、ErbB3和/或AKT的磷酸化抑制至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或99％以上。例如通过IGF-1R和ErbB3磷酸化的抑制作用所测量，优选PBA抑制IGF-1R和/或ErbB3信号转导接近完全，例如至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％。
分别对a)配体介导的ErbB3磷酸化和b)IGF-1或IGF-2介导的IGF-1R磷酸化的抑制作用可由PBA使a)由ErbB家族配体(例如异调蛋白)诱导的ErbB3磷酸化、b)由IGF-1R配体(即IGF-1或IGF-2)诱导的IGF-1R磷酸化或c)由IGF-1R配体或ErbB3配体诱导的AKT磷酸化的水平各自相对于不与PBA接触的对照细胞中的磷酸化可再现地降低的能力来证明。表达ErbB3和/或IGF-1R的细胞可为天然存在的细胞或细胞系的细胞，或可通过将编码ErbB3和/或IGF-1R的核酸引入宿主细胞中来重组产生。在一个实施方案中，PBA使ErbB家族配体介导的ErbB3磷酸化抑制至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或99％以上，如例如通过蛋白质印迹接着如下文实施例中所述用抗磷酸酪氨酸抗体进行探测所测定。在另一实施方案中，PBA使IGF-1或IGF-2介导的IGF-1R磷酸化抑制至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或99％以上，如例如通过蛋白质印迹接着如下文实施例中所述用抗磷酸酪氨酸抗体进行探测所测定。
PBA可使细胞(例如癌细胞)中异调蛋白诱导的pAKT信号传导抑制至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。PBA可使细胞(例如癌细胞)中IGF-1诱导的pAKT信号传导抑制至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。PBA可使细胞(例如癌细胞)中胰岛素诱导的pAKT信号传导抑制至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。PBA可使细胞(例如癌细胞)中IGF-2诱导的pAKT信号传导抑制至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。对pAKT信号传导的抑制可如本文(例如实施例)所进一步描述进行测定。
PBA可使配体诱导的IGF-1R磷酸化抑制至少70％或80％，使配体诱导的ErbB3磷酸化抑制至少70％或80％，且任选地使配体诱导的AKT磷酸化抑制至少30％或40％。PBA还可使配体诱导的IGF-1R磷酸化抑制至少85％，使配体诱导的ErbB3磷酸化抑制至少85％，且任选地使配体诱导的AKT磷酸化抑制至少75％。在某些实施方案中，PBA使配体诱导的IGF-1R磷酸化抑制至少50％且使配体诱导的ErbB3磷酸化抑制至少90％，且任选地使配体诱导的AKT磷酸化抑制至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
PBA还可由其抑制IGF-1R、ErbB3和AKT中一者或多者磷酸化的EC50(即获得最大抑制的50％时PBA的浓度)定义，所述EC50可如本文进一步所述测定。举例来说，本文公开的PBA抑制IGF-1R磷酸化的EC50可为10-9M、10-10M或10-10M以下。其抑制ErbB3磷酸化的EC50可为10-9M、10-10M或10-10M以下。其抑制AKT磷酸化的EC50可为10-7M、10-8M、10-9M、10-10M或10-10M以下。本文公开的一些PBA使IGF-1R磷酸化抑制至少80％或85％的EC50为10-9M、10-10M或10-10M以下；使ErbB3磷酸化抑制至少80％或85％的EC50为10-9M、10-10M或10-10M以下；且任选地使AKT磷酸化抑制至少55％或65％或75％的EC50为10-7M、10-8M、10-9M、10-10M或10-10M以下。在一些情况下，可用本文公开的PBA获得IGF-1R磷酸化和ErbB3磷酸化中任一者或两者的基本上完全阻断。
在一些实施方案中，本文提供的PBA结合表达其靶标(即由PBA结合的抗原)中的一者或两者的细胞的EC50为约0.02nM或0.02nM以下至约10nM，或Kd为约10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或10-12M或10-12M以下；各自如例如通过使用表达所述PBA的靶抗原中的一者或两者的所述细胞的流式细胞测量术所测量。在其它实施方案中，本文提供的PBA结合其靶标(例如人IGF-1R和人ErbB3中的任一者或两者)的Kd为约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或10-12M或10-12M以下，如例如通过或通过使用BIAcore设备的表面等离子体共振所测量。举例来说，本文提供的抗ErbB3/抗IGF-1R IgG2(scfv)2PBA展示结合ADRr和MCF7细胞的Kd分别为2.5和2.1nM(参见实施例3A)。实施例5(A)展示若干其它PBA结合BxPC-3细胞的EC50为约2-5nM。实施例5(B)展示若干PBA结合ErbB3的EC50为约0.2-0.4nM。其它PBA结合BxPC-3细胞的EC50在0.02nM(例如P4-G1-P6)至约1nM或至约2nM范围内。
在某些实施方案中，PBA结合抗原(例如ErbB3或IGF-1R)的解离常数(Kd)为50nM或50nM以下(即结合亲和力至少高达由50nM的Kd所指示的结合亲和力)(例如Kd为40nM或30nM或20nM或10nM或1nm，或100pM或10pM或1pM或1pM以下)。在一特定实施方案中，PBA结合抗原(ErbB3或IGF-1R)的Kd为8nM或更好(例如7nM、6nM、5nM、4nM、2nM、1.5nM、1.4nM、1.3nM、1nM、100pM、10pM或1pM或0.1pM或0.1pM以下)。在其它实施方案中，结合蛋白、结合部分或结合位点结合抗原(例如ErbB3或IGF-1R)的解离常数(Kd)低于约10-7M，如低于约10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或10-12M或甚至更低，且结合所述抗原的亲和力比其对非特异性抗原(例如KLH、BSA或酪蛋白)的结合亲和力至少高一个数量级(即Kd值为至多十分之一)。
PBA可抑制配体与IGF-1R和/或ErbB3的结合。举例来说，PBA可使配体与IGF-1R和/或ErbB3的结合抑制至少70％、80％、90％、95％、97％、98％或99％，如例如在细胞上或体外所测量。某些PBA抑制在所述PBA之前或之后添加配体时所述配体与IGF-1R和/或ErbB3结合的水平。
在某些实施方案中，包含浓度为0.3、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15mg/ml或15mg/ml以上(或在任何所述两个数值之间的浓度范围)的PBA的溶液包含多于70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的呈未聚集形式的PBA(在本文中称为单体)，如例如在如下文所述的稳定性测试后例如通过尺寸排阻色谱(SEC)所测定。单体的百分比可在溶液中在一种以下稳定性测试之后测定：a)在4℃下孵育1、2、3、4、5或6天，或1、2、3周或3周以上；b)在室温下孵育1、2、3、4、5或6天，或1、2、3周或3周以上；c)在37℃下孵育1、2、3、4、5或6天，或1、2、3周或3周以上；d)1、2、3、4或5个冷冻/解冻循环，和e)搅动，例如在室温下在轨道式振荡器上轻缓搅动例如1、2、3、4、5个小时或5个小时以上。
在某些实施方案中，PBA在37℃下在血清中孵育1、2、3、4或5天后相对于其在第0天的稳定性展现至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的稳定性，其中蛋白质的稳定性通过例如测量孵育后其结合其一种或多种靶抗原的能力来测定，如例如通过ELISA所测定(参见例如实施例7)。
在某些实施方案中，PBA具有如例如通过微差扫描荧光测定法(DSF)所测定至少50℃、55℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃或70℃的熔融温度(Tm)，如实施例中所述。
在某些实施方案中，PBA有效抑制当配体以高浓度或低浓度存在时经由IGF-1R和/或ErbB3进行的信号转导。在某些实施方案中，PBA抑制基本信号传导，例如抑制在配体诱导不存在下细胞中存在的pAKT的水平。PBA还可使细胞表面上的IGF-1R和/或ErbB3(例如磷酸化和/或非磷酸化受体)相对于未暴露于所述PBA的细胞下调例如至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或90％以上。PBA还可使细胞中的胰岛素信号传导相对于未暴露于所述PBA的细胞抑制例如至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或90％以上。
PBA在小鼠或人血清中可具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天的稳定性。PBA当以每公斤小鼠5mg或25mg注射时，在食蟹猕猴中可具有至少10小时、20小时、30小时、40小时、45小时、50小时、60小时、70小时、80小时、90小时、100小时、110小时、115小时或115小时以上的半衰期。在某些实施方案中，PBA在为小鼠或食蟹猕猴的生物体体内具有比另一结合相同表位的多价双特异性抗体在相同生物体体内的半衰期在统计上显著较长(例如长至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％(即2倍)、150％或200％)的半衰期，其中抗原结合特异性的方向在fab与scfv之间相反。
在某些实施方案中，相对于与PBA结合IGF-1R上的相同表位的单特异性抗IGF-1R抗体，PBA使mTOR的蛋白质水平或磷酸化mTOR的水平抑制至或使mTOR活化降至或抑制至(即使pmTOR的水平降至)例如约50％、1/2倍、1/3倍、1/4倍、1/5倍或1/5倍以下。
PBA可具有本文所述的特征中的两种或两种以上的组合。举例来说，PBA可使配体诱导的IGF-1R磷酸化抑制至少80％和使配体诱导的ErbB3磷酸化抑制至少80％，并且还展现一种或多种以下特征：(i)如通过DSF所测定至少60℃或65℃的Tm；(ii)在PBS中在10mg/mL下在室温下5天后至少80％、90％或95％呈单体；(iii)和在血清中在37℃下孵育5天后具有至少70％、80％或90％的稳定性。在某些实施方案中，PBA具有至少60℃的Tm和至少90％的血清稳定性。在其它实施方案中，PBA(i)使肿瘤细胞的生长抑制例如至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或90％以上；(ii)使经由IGF-1R和/或ErbB3介导的信号转导抑制例如至少70％、80％、90％或90％以上，(iii)为稳定的，例如在4℃、室温或37℃下1、2、3、4、5天或5天以上后在溶液中至少80％为单体，和/或(iv)具有如通过DSF所测定至少50℃、55℃、60℃、65℃或65℃以上的Tm；例如程度与结合实体单独或一起相比类似或更有效或效力更高。
可使用标准测定来测定抗IGF-1R+抗ErbB3PBA的生物活性和特征。用于以下测试的示例性测定提供于本文的实施例中：(a)用于测定结合位点与其靶标的结合亲和力或Kd的测定；(b)用于测定结合蛋白结合细胞的能力的测定；(c)用于通过测量对IGF-1R、ErbB3或AKT磷酸化的抑制作用测定结合蛋白抑制信号转导的能力的测定；(d)用于体外测定PBA抑制抑制细胞增殖的能力的测定；(e)用于体内测定PBA对肿瘤细胞的影响的测定；和(f)用于测定PBA的稳定性的测定。
单价和二价单特异性抗体
本文进一步提供单价和二价单特异性抗体，其为1)二价IgG抗体，其可通过共表达至少一种编码重链的核酸分子和至少一种可与编码所述重链的分子相同或不同的编码所述抗体的轻链的核酸分子来制备，或2)单价单链Fv(scFv)抗体，其可通过表达至少一种编码所述scFv的核酸分子来制备；各自如本文所述在适合表达系统中表达，所述表达系统包括市售表达系统和所属领域中熟知的其它表达系统。所述抗体可为单克隆抗体。
抗IGF-1R抗体
本文提供特异性结合人IGF-1R的抗IGF-1R抗体。在某些实施方案中，IGF-1R结合蛋白包含重链和轻链，所述重链和轻链彼此缔合形成结合部分，例如抗体或其抗原结合结构域。本文提供的描述适用于抗IGF-1R抗体，但也适用于PBA中包含的抗IGF-1R结合部分。反之，抗IGF-1R结合部分的描述适用于抗IGF-1R抗体或其抗原结合位点。
在某些实施方案中，抗IGF-1R结合蛋白包含1、2、3、4、5或6个选自由以下组成的组的CDR：SEQ ID NO:302的共同序列中所涵盖的VHCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:303的共同序列中所涵盖的VHCDR2氨基酸序列、SEQ ID NO:304的共同序列中所涵盖的VHCDR3氨基酸序列、SEQ IDNO:305的共同序列中所涵盖的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:306的共同序列中所涵盖的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:307(或308)的共同序列中所涵盖的VLCDR3氨基酸序列。举例来说，抗IGF-1R结合蛋白可包含1、2、3、4、5或6个选自由以下组成的组的CDR：图1的氨基酸序列中的一者(例如SEQ ID NO:8-31中的任一者)中的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3氨基酸序列，和图2的氨基酸序列中的一者(例如SEQ ID NO:32-133中的一者)中的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列。在一特定实施方案中，抗IGF-1R结合蛋白包含含有1、2或3、4、5或6个选自由以下组成的组的CDR的VH结构域：SEQ ID NO:11的VHCDR1、VHCDR2或VHCDR3氨基酸序列和SEQ ID NO:35的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列(16F的CDR)。在某些实施方案中，抗IGF-1R结合蛋白包含含有1、2、3、4、5或6个选自由以下组成的组的CDR的VH结构域：图1中的序列(例如SEQ IDNO:8-10和12-31)的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3氨基酸序列，和图2中的序列(例如SEQ ID NO:32-34和36-133)的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗IGF-1R结合蛋白包含含有由SEQ ID NO:1的共同序列所涵盖的氨基酸序列的VH结构域和/或含有由SEQ ID NO:2的共同序列所涵盖的氨基酸序列的VL结构域。示例性VH氨基酸序列为图1的序列，例如SEQ ID NO:8-31。示例性VL氨基酸序列为图2的序列，例如SEQ IDNO:32-133。在一个实施方案中，抗IGF-1R结合蛋白包含含有SEQ ID NO:11的VH氨基酸序列和/或含有SEQ ID NO:35的VL氨基酸序列(16F的可变结构域)。
在某些实施方案中，抗IGF-1R结合蛋白包含含有由SEQ ID NO:1的共同序列所涵盖的氨基酸序列的VH结构域和/或含有由SEQ ID NO:3的共同序列所涵盖的氨基酸序列的VL结构域。示例性VH氨基酸序列为如SEQ IDNO:8-10和12-31所述的序列。示例性VL氨基酸序列为如SEQ ID NO:32-34和36-133所述的序列。
本文还提供特异性结合IGF-1R的抗IGF-1R抗体，其中VH结构域包含与图1的VH氨基酸序列(例如SEQ ID NO:8-31)的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列，和/或其中VL结构域包含与图2的VL氨基酸序列(例如SEQ ID NO:32-133)的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列。在某些实施方案中，排除SEQ ID NO:11的VH序列和/或SEQ IDNO:35的VL序列。
本文还提供特异性结合IGF-1R的抗IGF-1R抗体，其中VH结构域包含因1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或因1-5、6-10、11-15、16-20、21-25、26-30、31-35、36-40、41-45、46-50或50-100个氨基酸取代、添加或缺失而与图1的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:8-31)不同的氨基酸序列，且VL结构域包含因1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或因1-5、6-10、11-15、16-20、21-25、26-30、31-35、36-40、41-45、46-50或50-100个氨基酸的氨基酸取代、添加或缺失而与图2的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:32-133)不同的氨基酸序列。在某些实施方案中，排除SEQ ID NO:11的VH序列和/或SEQ ID NO:35的VL序列。
抗IGF-1R抗体可具有抗体(例如全长抗体)或其抗原结合片段的结构。举例来说，抗IGF-1R结合蛋白可包含重链和轻链，其中所述重链按N端至C端顺序包含：VH结构域、CH1结构域、铰链、CH2结构域、CH3结构域和任选地存在的CH4结构域，且其中所述轻链按N端至C端顺序包含：VL结构域和CL结构域。恒定结构域优选为人的且可来自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其组合。恒定结构域可为天然存在的序列或突变型序列，其中已对天然存在的序列进行一个或多个氨基酸取代、添加或缺失。
抗IGF-1R结合蛋白可包含含有选自由以下组成的组的氨基酸序列的重链：SF重链(SEQ ID NO:358)；P4重链(SEQ ID NO:359)；M78重链(SEQ IDNO:360)和M57重链(SEQ ID NO:361)(图6A)。抗IGF-1R结合蛋白还可包含含有选自由以下组成的组的氨基酸序列的轻链：SFκ轻链(SEQ ID NO:202)；P4κ轻链(SEQ ID NO:204)；M78κ轻链(SEQ ID NO:206)；和M57κ轻链(SEQID NO:208)(图5A)。抗IGF-1R结合蛋白可包含含有选自由以下组成的组的氨基酸序列的重链：SF重链(SEQ ID NO:358)；P4重链(SEQ ID NO:359)；M78重链(SEQ ID NO:360)和M57重链(SEQ ID NO:361)，和含有选自由以下组成的组的氨基酸序列的轻链：SFκ轻链(SEQ ID NO:202)；P4κ轻链(SEQ IDNO:204)；M78κ轻链(SEQ ID NO:206)；和M57κ轻链(SEQ ID NO:208)。在特定实施方案中，IGF-1R抗体包含具有名称相同的氨基酸序列的重链和轻链，例如SF重链与SF轻链、P4重链与P4轻链、M78重链与M78轻链和M57重链与M57轻链。然而，重链和轻链还可混合和匹配。举例来说，M57重链可与M7轻链配对，且P4重链可与M57轻链配对。
特别提供抗IGF-1R IgG抗体SF(重链SEQ ID NO:358，κ轻链SEQ IDNO:202)；P4(重链SEQ ID NO:359，κ轻链SEQ ID NO:204)；M78(重链SEQID NO:360，κ轻链SEQ ID NO:206)和M57(重链SEQ ID NO:361，κ轻链SEQID NO:208)；所有均为IgG1同型。
在某些实施方案中，抗IGF-1R结合蛋白包含含有与SEQ ID NO:358、359、360和361的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列的重链和/或含有与SEQ ID NO:202、204、206和208的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列的轻链。
在其它实施方案中，IGF-1R结合蛋白包含含有因1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或因1-5、6-10、11-15、16-20、21-25、26-30、31-35、36-40、41-45、46-50或50-100个氨基酸取代、添加或缺失而与SEQ ID NO:358、359、360和361的氨基酸序列不同的氨基酸序列的重链和/或含有因1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或因1-5、6-10、11-15、16-20、21-25、26-30、31-35、36-40、41-45、46-50或50-100个氨基酸取代、添加或缺失而与选自由SEQ ID NO:202、204、206和208组成的组的氨基酸序列不同的氨基酸序列的轻链。
抗ErbB3抗体的生物活性和特征可利用测定(例如本文关于PBA所述的测定)来测定。抗ErbB3蛋白可配体抑制ErbB3的磷酸化、肿瘤细胞的增殖和/或体内抑制肿瘤生长。
抗IGF-1R结合部分可包含或连接于1、2、3、4个或4个以上可呈Fab、scFv形式或其它结合位点形式的其它结合位点。举例来说，抗IGF-1R结合蛋白可包含抗ErbB3结合位点，例如抗ErbB3scFv。
抗ErbB3抗体
本文还提供特异性结合人ErbB3的抗ErbB3抗体。在某些实施方案中，ErbB3结合蛋白包含重链和轻链，所述重链和轻链彼此缔合且形成结合蛋白，例如抗体或其抗原结合结构域。下文提供的描述适用于抗ErbB3抗体，但也适用于PBA中包含的抗ErbB3结合位点。反之，抗ErbB3结合位点的描述适用于抗ErbB3抗体或其抗原结合位点。
在某些实施方案中，抗ErbB3结合蛋白包含1、2、3、4、5或6个选自由以下组成的组的CDR：SEQ ID NO:309的VHCDR1氨基酸序列、SEQ IDNO:310的共同序列中所涵盖的VHCDR2氨基酸序列、SEQ ID NO:311的共同序列中所涵盖的VHCDR3氨基酸序列、SEQ ID NO:312的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:313的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:314(或315)的共同序列中所涵盖的VLCDR3氨基酸序列。举例来说，抗ErbB3结合蛋白可包含1、2、3、4、5或6个选自由以下组成的组的CDR：图3中的序列(例如SEQ ID NO:134-165中的任一者)的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3氨基酸序列，和图4中的序列(例如SEQ ID NO:166-200)的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列。在一特定实施方案中，抗ErbB3结合蛋白包含含有1、2或3、4、5或6个选自由以下组成的组的CDR的VH结构域：SEQ IDNO:143的VHCDR1、VHCDR2或VHCDR3氨基酸序列和SEQ ID NO:175的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列(16F的CDR)。在某些实施方案中，抗ErbB3结合蛋白包含含有1、2、3、4、5或6个选自由以下组成的组的CDR的VH结构域：图3的VHCDR1、VHCDR2或VHCDR3氨基酸序列序列(例如SEQ ID NO:134-142和144-165中的任一者)，和图4的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列(例如SEQ ID NO:166-174和176-200中的任一者)。
在某些实施方案中，抗ErbB3结合蛋白包含含有由SEQ ID NO:4的共同序列所涵盖的氨基酸序列的VH结构域和/或含有由SEQ ID NO:6的共同序列所涵盖的氨基酸序列的VL结构域。示例性VH氨基酸序列为图3的序列，例如SEQ ID NO:134-165。示例性VL氨基酸序列为表4的序列，例如SEQ IDNO:166-200。在一个实施方案中，抗ErbB3结合蛋白包含含有SEQ ID NO:143的VH氨基酸序列和/或含有SEQ ID NO:175的VL氨基酸序列(16F的可变结构域)。
在某些实施方案中，抗ErbB3结合蛋白包含含有由SEQ ID NO:5的共同序列所涵盖的氨基酸序列的VH结构域和/或含有由SEQ ID NO:7的共同序列所涵盖的氨基酸序列的VL结构域。示例性VH氨基酸序列为如SEQ IDNO:134-142和145-165所述的序列。示例性VL氨基酸序列为如SEQ IDNO:166-174和176-200所述的序列。
本文还提供特异性结合ErbB3的抗ErbB3抗体，其中VH结构域包含与图3的VH氨基酸序列(例如SEQ ID NO:134-165)的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列，和/或其中VL结构域包含与图4的VL氨基酸序列(例如SEQ ID NO:166-200)的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列。在某些实施方案中，排除SEQ ID NO:143的VH序列和/或SEQID NO:175的VL序列。
本文还提供特异性结合ErbB3的抗ErbB3抗体，其中VH结构域包含因1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或少于1-5、6-10、11-15、16-20、21-25、26-30、31-35、36-40、41-45、46-50或50-100个氨基酸取代、添加或缺失而与图3的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:134-165)不同的氨基酸序列，且VL结构域包含因1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或少于1-5、6-10、11-15、16-20、21-25、26-30、31-35、36-40、41-45、46-50或50-100个氨基酸取代、添加或缺失而与图4的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:166-200)不同的氨基酸序列。在某些实施方案中，排除SEQ ID NO:143的VH序列和/或SEQ ID NO:175的VL序列。
抗ErbB3抗体可具有抗体(例如完全抗体(全长抗体))或其抗原结合片段的结构。举例来说，抗ErbB3结合蛋白可包含重链和轻链，其中所述重链按N端至C端顺序包含：VH结构域、CH1结构域、铰链、CH2结构域、CH3结构域和任选地存在的CH4结构域，且其中所述轻链按N端至C端顺序包含：VL结构域和CL结构域。恒定结构域优选为人的且可来自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其组合。恒定结构域可为天然存在的序列或突变型序列，其中已对天然存在的序列进行一个或多个氨基酸取代、添加或缺失。
抗ErbB3结合蛋白可包含含有选自由以下组成的组的氨基酸序列的重链：P1重链(SEQ ID NO:362)；M27重链(SEQ ID NO:363)；M7重链(SEQ IDNO:364)；B72重链(SEQ ID NO:365)和B60重链(SEQ ID NO:366)(图5B)。抗ErbB3结合蛋白还可包含含有选自由以下组成的组的氨基酸序列的轻链：P1λ轻链(SEQ ID NO:258)；M27λ轻链(SEQ ID NO:260)；M7λ轻链(SEQ IDNO:262)；B72λ轻链(SEQ ID NO:264)和B60λ轻链(SEQ ID NO:266)(图5B)。抗ErbB3结合蛋白可包含含有选自由以下组成的组的氨基酸序列的重链：P1重链(SEQ ID NO:362)；M27重链(SEQ ID NO:363)；M7重链(SEQ ID NO:364)；B72重链(SEQ ID NO:365)和B60重链(SEQ ID NO:366)，和含有选自由以下组成的组的氨基酸序列的轻链：P1λ轻链(SEQ ID NO:258)；M27λ轻链(SEQID NO:260)；M7λ轻链(SEQ ID NO:262)；B72λ轻链(SEQ ID NO:264)和B60λ轻链(SEQ ID NO:266)。在特定实施方案中，IGF-1R抗体包含具有名称相同的氨基酸序列的重链和轻链，例如P1重链与P1轻链、M27重链与M27轻链、M7重链与M7轻链、B72重链与B72轻链和B60重链与B60轻链。然而，重链和轻链还可混合和匹配。举例来说，M57重链可与M7轻链配对，且P4重链可与M57轻链配对。
还提供抗ErbB3抗体P1(重链SEQ ID NO:362，λ轻链SEQ ID NO:258)；M27(重链SEQ ID NO:363，λ轻链SEQ ID NO:260)；M7(重链SEQ ID NO:364，λ轻链SEQ ID NO:262)；B72(重链SEQ ID NO:365，λ轻链SEQ ID NO:264)；和B60(重链SEQ ID NO:366，λ轻链SEQ ID NO:266)；所有均为IgG1同型。
在某些实施方案中，抗ErbB3结合蛋白包含含有与SEQ ID NO:362、363、364、365和366的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列的重链和/或含有与SEQ ID NO:258、260、262、264和266的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列的轻链。
在其它实施方案中，ErbB3结合蛋白包含含有因1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或因1-5、6-10、11-15、16-20、21-25、26-30、31-35、36-40、41-45、46-50或50-100个氨基酸取代、添加或缺失而与SEQ ID NO:362、363、364、365和366的氨基酸序列不同的氨基酸序列的重链和/或含有因1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或因1-5、6-10、11-15、16-20、21-25、26-30、31-35、36-40、41-45、46-50或50-100个氨基酸取代、添加或缺失而与选自由SEQ IDNO:258、260、262、264和266组成的组的氨基酸序列不同的氨基酸序列的轻链。
抗ErbB3抗体的生物活性和特征可利用测定(例如本文关于PBA所述的测定)来测定。抗ErbB3蛋白可配体抑制ErbB3的磷酸化、肿瘤细胞的增殖和/或体内抑制肿瘤生长。抗ErbB3结合部分可包含或连接于1、2、3、4个或4个以上可呈Fab、scFv形式或其它结合位点形式的其它结合位点。举例来说，抗ErbB3结合蛋白可包含抗IGF-1R结合位点，例如抗IGF-1R scFv。
scFv抗体
还提供scFv，例如分离的单克隆scFv。示例性scFv为抗IGF-1R scFv和抗ErbB3scFv。示例性scFv为包含由scFv接头连接在一起的VH结构域和VL结构域的多肽。scFv的VH和VL链由插入VH与VL链之间的scFv接头联结在一起。scFv接头可由10-30个氨基酸(如15至20个氨基酸)的连续氨基酸序列组成。示例性scFv接头为Gly-Ser接头(SEQ ID NO:399)，其可为(Gly4Ser)n(SEQ ID NO:401)，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。优选scFv接头包含(Gly4Ser)3(SEQ ID NO:396)或(Gly4Ser)4(SEQ ID NO:397)。其它优选scFv接头包含1-5个氨基酸附加于(Gly4Ser)3(SEQ ID NO:396)或(Gly4Ser)4(SEQ ID NO:397)，例如AST，且可包含以下氨基酸序列：AST(Gly4Ser)3(SEQ ID NO:400)或AST(Gly4Ser)4(SEQ ID NO:402)。
抗IGF-1R scFv抗体可包含含有一组三个包含VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3的VHCDR的VH结构域，和含有一组三个包含VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3的VLCDR的VL结构域，所述CDR分别包含SEQ ID NO:302、303或304、305、306或307(或308)的氨基酸序列，且其中各CDR进一步包含氨基端和羧基端，其中各组CDR的CDR在可变结构域中按CDR1、CDR2和CDR3的线性氨基至羧基顺序排列，且其中SEQ ID NO:302、304、305、306、307(或308)中的X氨基酸表示可为位于图1(VH)和图2(VL)中相应位置中的任何氨基酸的可变氨基酸。抗IGF-1R scFv可包含由图1中VH氨基酸序列的组的氨基酸序列组成(例如由SEQ ID NO:8-31组成)的VH结构域的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，和/或由图2中VL氨基酸序列的组的氨基酸序列组成(例如由SEQ ID NO:32-133组成)的VL结构域的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3。在某些实施方案中，抗IGF-1R scFv不包含16F的全部六个CDR或不包含16F的VH结构域和/或16F的VL结构域。举例来说，scFv包含有至少一个氨基酸与16F中的序列不同的VH和VL氨基酸序列。
抗IGF-1R scFv抗体可包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VH结构域和/或含有SEQ ID NO:2(或3)的氨基酸序列的VL结构域，其中SEQ IDNO:1、2和3中的X氨基酸为可为图1(VH结构域)和图2(VL结构域)中相应位置上的任何氨基酸的可变氨基酸。抗IGF-1R scFv抗体可包含含有图1(例如选自由SEQ ID NO:8-31组成的组)的氨基酸序列的VH结构域和/或含有图2(例如选自由SEQ ID NO:32-133组成的组)的氨基酸序列的VL结构域。
示例性抗IGF-1R scFv包含由以下组成或至少包含以下的VH结构域：具有选自由SEQ ID NO:8、9、10和11组成的VH氨基酸序列组的氨基酸序列的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3氨基酸序列(这些CDR的位置示出于图1中)。抗IGF-1R scFv还可包含由以下组成或至少包含以下的VL结构域：具有选自由SEQ ID NO:32、33、34和35组成的VL氨基酸序列组的氨基酸序列的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列(这些CDR的位置示出于图2中)。在某些实施方案中，抗IGF-1R scFv包含由以下组成或至少包含以下的VH结构域：具有选自由SEQ ID NO:8、9、10和11组成的VH氨基酸序列组的氨基酸序列的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3氨基酸序列，和由以下组成或至少包含以下的VL结构域：具有选自由SEQ ID NO:32、33、34和35组成的VL氨基酸序列组的氨基酸序列的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列。在特定实施方案中，抗IGF-1R scFv包含VH结构域，所述VH结构域包含由以下组成或至少包含以下的VH结构域：SEQ ID No:8的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3氨基酸序列；和由以下组成或至少包含以下的VL结构域：具有由SEQ ID No:32组成的氨基酸序列的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列(M57模块)。在特定实施方案中，抗IGF-1RscFv包含VH结构域，所述VH结构域包含由以下组成或至少包含以下的VH结构域：SEQ ID No:9的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3氨基酸序列；和由以下组成或至少包含以下的VL结构域：具有由SEQ ID No:33组成的氨基酸序列的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列(模块M78)。在特定实施方案中，抗IGF-1R scFv包含VH结构域，所述VH结构域包含由以下组成或至少包含以下的VH结构域：SEQ ID No:10的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3氨基酸序列；和由以下组成或至少包含以下的VL结构域：具有由SEQ IDNo:34组成的氨基酸序列的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列(模块P4)。在特定实施方案中，抗IGF-1R scFv包含VH结构域，所述VH结构域包含由以下组成或至少包含以下的VH结构域：SEQ ID No:8的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3氨基酸序列；和由以下组成或至少包含以下的VL结构域：具有由SEQ ID No:33组成的氨基酸序列的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列(模块M57/M78)。在特定实施方案中，抗IGF-1R scFv包含VH结构域，所述VH结构域包含由以下组成或至少包含以下的VH结构域：SEQ ID No:10的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3氨基酸序列；和由以下组成或至少包含以下的VL结构域：具有由SEQ ID No:32组成的氨基酸序列的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列(模块P4/M57)。
抗ErbB3scFv抗体可包含含有一组三个包含VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3的VHCDR的VH结构域，和含有一组三个包含VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3的VLCDR的VL结构域，所述CDR分别包含SEQ ID NO:309、310或311、312、313或314(或315)的氨基酸序列，且其中各CDR进一步包含氨基端和羧基端，其中各组CDR的CDR在可变结构域中按CDR1、CDR2和CDR3的线性氨基至羧基顺序排列，且其中SEQ ID NO:309、310或311、312、313或314(或315)中的X氨基酸表示可为位于图1(VH)和图2(VL)中相应位置中的任何氨基酸的可变氨基酸。抗ErbB3scFv可包含由图3中VH氨基酸序列的组的氨基酸序列组成(例如由SEQ ID NO:134-165组成)的VH结构域的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，和/或由图4中VL氨基酸序列的组的氨基酸序列组成(例如由SEQ ID NO:166-200组成)的VL结构域的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3。在某些实施方案中，抗ErbB3scFv不包含16F的全部六个CDR或不包含16F的VH结构域和/或16F的VL结构域。举例来说，scFv包含有至少一个氨基酸与16F中的序列不同的VH和VL氨基酸序列。
抗ErbB3scFv抗体可包含含有SEQ ID NO:4(或5)的氨基酸序列的VH结构域和/或含有SEQ ID NO:6(或7)所示的氨基酸序列的VL结构域，其中SEQID NO:4、5、6和7中的X氨基酸为可为图3(VH结构域)和图4(VL结构域)中相应位置上的任何氨基酸的可变氨基酸。抗ErbB3scFv抗体可包含含有图3中(例如选自由SEQ ID NO:134-165组成的组)的氨基酸序列的VH结构域和/或含有图4中(例如选自由SEQ ID NO:166-200组成的组)的氨基酸序列的VL结构域。
示例性抗ErbB3scFv包含由以下组成或至少包含以下的VH结构域：具有选自由SEQ ID NO:134-143组成的VH氨基酸序列组的氨基酸序列的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3氨基酸序列(这些CDR的位置示出于图3中)。抗ErbB3scFv还可包含由以下组成或至少包含以下的VL结构域：具有选自由SEQ ID NO:166-175组成的VL氨基酸序列组的氨基酸序列的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列(这些CDR的位置示出于图4中)。在某些实施方案中，抗ErbB3scFv包含由以下组成或至少包含以下的VH结构域：具有选自由SEQ ID NO:134-143组成的VH氨基酸序列组的氨基酸序列的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3氨基酸序列，和由以下组成或至少包含以下的VL结构域：具有选自由SEQ ID NO:166-175组成的VL氨基酸序列组的氨基酸序列的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列。在特定实施方案中，抗ErbB3scFv包含VH结构域，所述VH结构域包含由以下组成或至少包含以下的VH结构域：SEQ ID No:134的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3氨基酸序列；和由以下组成或至少包含以下的VL结构域：具有由SEQ ID No:166组成的氨基酸序列的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列(模块B60)。在特定实施方案中，抗ErbB3scFv包含VH结构域，所述VH结构域包含由以下组成或至少包含以下的VH结构域：SEQ ID No:135的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3氨基酸序列；和由以下组成或至少包含以下的VL结构域：具有由SEQ ID No:167组成的氨基酸序列的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列(B72)。在特定实施方案中，抗ErbB3scFv包含VH结构域，所述VH结构域包含由以下组成或至少包含以下的VH结构域：SEQ ID No:136的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3氨基酸序列；和由以下组成或至少包含以下的VL结构域：具有由SEQ ID No:168组成的氨基酸序列的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列(模块M27)。在特定实施方案中，抗ErbB3scFv包含VH结构域，所述VH结构域包含由以下组成或至少包含以下的VH结构域：SEQ ID No:137的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3氨基酸序列；和由以下组成或至少包含以下的VL结构域：具有由SEQ ID No:169组成的氨基酸序列的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列(M7模块)。在特定实施方案中，抗ErbB3scFv包含VH结构域，所述VH结构域包含由以下组成或至少包含以下的VH结构域：SEQ ID No:138的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3氨基酸序列；和由以下组成或至少包含以下的VL结构域：具有由SEQ ID No:170组成的氨基酸序列的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列(P1模块)。在特定实施方案中，抗ErbB3scFv包含VH结构域，所述VH结构域包含由以下组成或至少包含以下的VH结构域：SEQ ID No:139的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3氨基酸序列；和由以下组成或至少包含以下的VL结构域：具有由SEQ ID No:171组成的氨基酸序列的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列(M27模块)。在特定实施方案中，抗ErbB3scFv包含VH结构域，所述VH结构域包含由以下组成或至少包含以下的VH结构域：SEQ ID No:140的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3氨基酸序列；和由以下组成或至少包含以下的VL结构域：具有由SEQ ID No:172组成的氨基酸序列的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列(B69模块)。在特定实施方案中，抗ErbB3scFv包含VH结构域，所述VH结构域包含由以下组成或至少包含以下的VH结构域：SEQ ID No:141的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3氨基酸序列；和由以下组成或至少包含以下的VL结构域：具有由SEQ ID No:173组成的氨基酸序列的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列(P6模块)。在特定实施方案中，抗ErbB3scFv包含VH结构域，所述VH结构域包含由以下组成或至少包含以下的VH结构域：SEQ ID No:142的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3氨基酸序列；和由以下组成或至少包含以下的VL结构域：具有由SEQ ID No:174组成的氨基酸序列的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列(M1.3模块)。在特定实施方案中，抗ErbB3scFv包含VH结构域，所述VH结构域包含由以下组成或至少包含以下的VH结构域：SEQ ID No:143的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3氨基酸序列；和由以下组成或至少包含以下的VL结构域：具有由SEQ ID No:175组成的氨基酸序列的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列(C8模块)。在特定实施方案中，抗ErbB3scFv包含VH结构域，所述VH结构域包含由以下组成或至少包含以下的VH结构域：SEQ ID No:136的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3氨基酸序列；和由以下组成或至少包含以下的VL结构域：具有由SEQ ID No:169组成的氨基酸序列的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3氨基酸序列(M27/M7模块)。
示例性scFv为抗IGF-1R scFv抗体P4(SEQ ID NO:367)、M57(SEQ IDNO:368)、M78(SEQ ID NO:369)和M76(SEQ ID NO:382)；以及抗ErbB3scFv抗体C8(SEQ ID NO:370)、P1(SEQ ID NO:371)、M1.3(SEQ ID NO:372)、M27(SEQ ID NO:373)、P6(SEQ ID NO:374)、B69(SEQ ID NO:375)和P6L(SEQID NO:383)。
scFv还可包含因一个或多个氨基酸添加、缺失或取代而分别与本文所述的CDR、可变结构域或全长scFv不同，同时仍保留其结合性质的CDR、可变结构域或其全长氨基酸。举例来说，CDR可有1或2个氨基酸与本文提供的CDR序列不同；可变结构域可有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸与本文提供的可变结构域序列不同；且scFv可有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或50个氨基酸分别与本文提供的scFv不同。scFv还可包含与本文提供的CDR、可变结构域或全长scFv序列至少70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％一致的CDR、可变结构域或其全长氨基酸序列。在一个实施方案中，scFv包含与选自由SEQ ID NO:367、368、369、370、372、373、374和375组成的scFv序列的组的氨基酸序列至少70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列。
在某些实施方案中，scFv在VL结构域的氨基端或羧基端上包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。举例来说，如果相关scFv的羧基端为可由酶(诸如羧肽酶)修剪掉的氨基酸(例如赖氨酸或精氨酸)，那么可添加一个或多个氨基酸以防止氨基酸被修剪。举例来说，可将来自CL结构域的氨基酸“RT”添加至抗IGF-1R scFv中的羧基端“VEIK”，如例如SEQ ID NO:367-369中所示。
核酸、表达载体和宿主细胞
本文提供编码本文所述的多肽的核酸，例如DNA或RNA。本文提供的示例性核苷酸序列为编码图1-7的氨基酸序列的核苷酸序列，如附录的核苷酸序列，或其部分，如编码1、2、3、4或5个结构域的部分。还涵盖与编码本文所述的氨基酸序列的核苷酸序列(例如本文所述的核苷酸序列)至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％一致的核苷酸序列。所述核苷酸序列可编码本文所述的蛋白质或可编码与本文所述的蛋白质或其部分(例如域)至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％一致或类似的蛋白质，如图1-7中任一者的氨基酸序列。
编码具有前导序列的16F的重链(氨基酸序列SEQ ID NO:300)的核苷酸序列阐述为SEQ ID NO:299。编码具有前导序列的16F的轻链(氨基酸序列SEQ ID NO:298)的核苷酸序列阐述为SEQ ID NO:297。
在某些实施方案中，核酸编码包含前导序列(或信号肽)的抗体的重链和/或轻链。示例性前导序列为图7中关于16F所示的前导序列。因此，本文还提供连接于前导序列(如图7中所示者)的抗体(例如图5和6中所示者)，和编码所述抗体的核酸。
在某些实施方案中，核酸连接于增强或启动核苷酸序列在细胞中的表达以产生蛋白质的序列。所述核酸可涵盖于载体(例如表达载体)中。为表达作为跨膜蛋白的蛋白质，优选还包括信号序列，例如图7A的信号序列，所述信号序列常删除以形成成熟蛋白质。
本文还涵盖包含本文提供的核酸或载体的细胞，例如宿主细胞。
本文所述的抗体可通过重组方式产生。用于重组产生的方法在现有技术状态中广泛已知且包含在原核和真核细胞进行蛋白质表达，并随后分离抗体且通常纯化至药学上可接受的纯度。为在宿主细胞中表达抗体，通过标准方法将编码各别多肽(例如轻链和重链)的核酸插入表达载体中。在适当原核或真核宿主细胞(如CHO细胞、NSO细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、COS细胞、PER.C6细胞、酵母或大肠杆菌(E.coli)细胞)中进行表达，且自细胞(溶解后的上清液或细胞)回收结合蛋白。用于重组产生抗体的一般方法在所属领域中为熟知的。
抗体可通过常规免疫球蛋白纯化程序，如蛋白质A-琼脂糖、羟磷灰石色谱、凝胶电泳、透析或亲和色谱自培养基分离。编码抗体的DNA和RNA易于使用常规程序分离和测序。杂交瘤细胞可用作所述DNA和RNA的来源。分离后，可将DNA插入表达载体中，接着将所述表达载体转染至不以其它方式产生免疫球蛋白的宿主细胞(如HEK 293细胞、CHO细胞或骨髓瘤细胞)中，以在宿主细胞中获得重组抗体的合成。
可通过将适当核苷酸变化引入抗体DNA中或通过核苷酸合成来制备抗体的氨基酸序列变异体(例如突变体)。
“宿主细胞”表示可工程改造以产生本文所述的抗体的任何种类的细胞系统。在一个实施方案中，使用HEK293细胞和CHO细胞作为宿主细胞，在另一实施方案中使用CHO或NSO细胞。
适于原核生物的控制序列例如包括启动子，任选地包括操纵子序列，和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、强化子和聚腺苷酸化信号。
当核酸与另一核酸序列处于功能性关系中时，所述核酸为“可操作地连接”的。举例来说，序列前体或分泌前导序列的DNA在其表达为参与多肽的分泌中的蛋白质前体的情况下可操作地连接于所述多肽的DNA；启动子或强化子在其影响编码序列的转录的情况下可操作地连接于所述编码序列；或核糖体结合位点在其位置促进翻译的情况下可操作地连接于编码序列。一般来说，“可操作地连接”意谓所连接的DNA序列为毗连的，且在分泌前导序列的情况下为毗连的且处于阅读框中。然而，强化子不必为毗连的。连接通过在适宜限制性位点进行连接来实现。如果所述位点不存在，那么根据常规实践使用合成寡核苷酸接头或接头。
可通过标准技术进行抗体的纯化以消除细胞组分或其它污染物，例如其它细胞核酸或蛋白质，所述标准技术包括碱性/SDS处理、CsCl分层、管柱色谱、琼脂糖凝胶电泳和所属领域中熟知的其它技术。不同方法已充分确立且广泛用于蛋白质纯化，如利用微生物蛋白质的亲和色谱(例如蛋白质A或蛋白质G亲和色谱)、离子交换色谱(例如阳离子交换(羧甲基树脂)、阴离子交换(氨基乙基树脂)和混合模式色谱)、亲硫吸附(例如利用β-巯基乙醇和其它SH配体)、疏水性相互作用或芳香族吸附色谱(例如利用苯基-琼脂糖凝胶、亲氮杂芳烃树脂或间氨基苯基硼酸)、金属螯合亲和色谱(例如利用Ni(II)和Cu(II)亲和材料)、尺寸排阻色谱和电泳方法(如凝胶电泳、毛细管电泳)。
使用本文提供的抗体的方法
本文提供使用本文所述的抗体，例如抗IGF-1R+抗ErbB3PBA、抗IGF-1R抗体和抗ErbB3抗体用于治疗性应用的方法。本文公开的抗体可用于治疗与ErbB3和/或IGF-1R依赖性信号传导相关的疾病或病症，包括多种癌症。
在一个实施方案中，提供用于抑制表达IGF-1R和ErbB3的肿瘤细胞的增殖的方法，其包括使肿瘤细胞与抗IGF-1R+抗ErbB3双特异性(任选地为多价)抗体接触，以使得肿瘤细胞的增殖受到抑制、减缓或停止，或使得肿瘤细胞死亡。
本文提供用于治疗与ErbB3和/或IGF-1R依赖性信号传导相关的疾病或病症的方法，其通过向患者施用有效治疗所述疾病或病症的量的本文公开的抗体来进行。适合疾病或病症包括例如多种癌症，包括(但不限于)乳癌和下文所述的癌症。在一个实施方案中，用于治疗患有增生性疾病(如癌症)的受试者的方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的一种或多种本文所述的抗体，如抗IGF-1R+抗ErbB3双特异性抗体。
还提供用于治疗患者的表达IGF-1R和ErbB3的肿瘤的方法(或双特异性抗体，例如在用于治疗所述肿瘤的药物中)，所述方法包括施用有效量的如本文所述的抗体(例如有效使肿瘤生长减缓或停止，或使肿瘤收缩，或使肿瘤侵袭或肿瘤转移减缓或停止)。可治疗任何表达IGF-1R和ErbB3的肿瘤，包括以下癌症的肿瘤：肺癌、肉瘤、结肠直肠癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、黑素瘤和乳癌。所述肿瘤的特定实例包括：非小细胞肺癌、尤文氏肉瘤(Ewing’s sarcoma)、他莫昔芬(tamoxifen)抗性雌激素受体阳性乳癌、曲妥珠单抗抗性或拉帕替尼(lapatinib)抗性HER2阳性转移性乳癌、吉非替尼(gefitinib)抗性或埃罗替尼(erlotinib)抗性肺癌、西妥昔单抗抗性或盘尼图单抗抗性结肠直肠癌、西妥昔单抗抗性头颈鳞状细胞癌(HNSCC)和埃罗替尼抗性胰腺癌。
还提供包含一种或多种本文公开的抗体的试剂盒。所述试剂盒可包括指示试剂盒内含物的预定用途且任选地包括使用所述试剂盒治疗与ErbB3和/或IGF-1R依赖性信号传导相关的疾病或病症(例如治疗肿瘤)的说明的标签。术语标签包括于试剂盒上或与试剂盒一起供应或以其它方式伴随试剂盒的任何书面、销售材料或记录材料。
本文提供的治疗肿瘤的方法可进一步包括施用第二抗癌剂与所述抗体的组合。因此涵盖新颖药物组合物，其包含本文公开的抗体，连同第二抗癌剂(通常为生物药剂)一起，连同至少一种药学上可接受的载剂或赋形剂一起。
药物组合物
在另一态样中，提供用于治疗患者的肿瘤的组合物(例如药物组合物)以及使用各所述组合物治疗患者的肿瘤的方法。本文提供的组合物含有与药学上可接受的载剂配制于一起的一种或多种本文公开的抗体。如本文所用，“药学上可接受的载剂”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、和其生理上相容的类似物。优选地，载剂适于静脉内、肌肉内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(例如通过注射或输注)。取决于施用途径，抗体可包覆于物质中以保护其免遭酸或其它可能使蛋白质失活的自然条件的作用。
药物组合物可单独施用或与疗法组合(即与其它药剂组合)施用。举例来说，组合疗法可包括本发明的抗体与至少一种其它治疗剂，如抗癌剂。药物组合物还可与另一抗癌治疗模态(如放射疗法和/或手术)结合施用。
本发明的组合物可通过所属领域中已知的多种方法施用。如本领域的技术人员所了解，施用的途径和/或模式将根据所要结果而变。
为通过某些施用途径施用本文提供的组合物，可能有必要或需要将抗体用防止其失活的物质涂布或将抗体与防止其失活的物质共同施用。举例来说，抗体可于适当载剂中(例如于脂质体或稀释剂中)施用给患者。药学上可接受的稀释剂包括生理食盐水和水性缓冲溶液。脂质体包括水包油包水CGF乳液以及常规脂质体。
药学上可接受的载剂包括无菌水性溶液或分散液以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。所述介质和药剂用于药物活性物质的用途在所属领域中为已知的。除非任何赋形剂、稀释剂或药剂与活性化合物不相容，否则涵盖其在本文提供的药物组合物中的使用。还可将补充性活性化合物(例如其它抗癌剂)并入组合物中。
治疗性组合物通常必须无菌且在制造和储存条件下稳定。组合物可配制为溶液、微乳液、脂质体或适于高药物浓度的其它有序结构。载剂可为含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)和其适合混合物的溶剂或分散介质。生理食盐水溶液和水性右旋糖和甘油溶液可用作液体载剂，尤其用于可注射溶液。必要时，组合物还可含有少量湿润剂或溶解度增强剂、稳定剂、防腐剂或pH缓冲剂。在许多情况下，在组合物中包括等渗剂(例如氯化钠)、糖、多元醇(如甘露糖醇、山梨糖醇、甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)为适用的。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中包括延迟吸收的药剂(例如单硬酯酸盐和明胶)来达成。
实施例
以下实施例不应解释为限制本发明的范围。
材料和方法
在实施例通篇中，除非另外说明，否则使用以下材料和方法。一般来说，除非另外指示，否则本发明技术的实施采用化学、分子生物学、重组DNA技术、免疫学(尤其例如抗体技术)、药理学、制药学的常规技术以及多肽制备中的标准技术。
配体
如这些实施例和图式中所用，“HRG”是指称为异调蛋白1β1的异调蛋白同种型(有时称为HRG1-B、HRG-β1、神经调节蛋白1(neuregulin 1)、NRG1、神经调节蛋白1β1、NRG1-b1或HRG ECD)，例如R&D Systems,377-HB-050/CF。如这些实施例和图式中所用，IGF-1是指胰岛素样生长因子1，例如R&D Systems,291-GI-050/CF。
细胞系
下文所述的实施例中所用的所有人细胞系可如所述自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection；ATCC,Manassas,VA)或美国国家癌症研究院(US National Cancer Institute；NCI)，例如自癌症治疗和诊断学分部(Division of Cancer Treatment and Diagnostics；DCTD)获得。
·目录号HTB-22TM
·ADRr-NCI(登记为NCI/ADR-RES)
·目录号CRL-1687TM
·目录号HTB-81TM
·目录号HTB-46TM
·目录号HTB-86TM
使用小鼠抗人IGF-1R单克隆抗体mAb391(IgG1，R&D Systems MAB391)作为抗IGF-1R IgG抗体对照。
实施例1：靶向多种信号传导路径的抗体治疗剂的合理工程改造
ErbB路径因ErbB受体在特定癌症类型中的高表达而长期受到癌症研究关注：HER2/ErbB2为在一些乳癌中扩增的基因，且EGFR/ErbB1在结肠癌和NSCLC中高表达。对于所述路径的两个成员EGFR/ErbB1和HER2/ErbB2，已批准单克隆抗体药剂(例如西妥昔单抗和曲妥珠单抗)和小分子酪氨酸激酶抑制剂(例如埃罗替尼、拉帕替尼)。这些治疗剂干扰细胞外刺激物活化下游细胞内信号传导网络的能力；然而，鉴于ErbB信号传导网络十分复杂(图9A)，因此难以确定何者代表最佳治疗策略。除EGFR/ErbB1和HER2/ErbB2(缺乏配体结合活性)外，ErbB路径还存在两个其它成员-ErbB3(激酶死亡(kinase-dead))和ErbB4。所有四种受体在配体活化后均可不同程度地彼此二聚化，促成细胞内信号传输所需要的必需步骤。二聚化后，受体可内化且以取决于二聚体类型以及下游信号传导路径(诸如PI3K路径)的活化状态的速率再循环。
ErbB网络的复杂性与测量关键组分的丰度和活化状态的能力组合使得所述网络适合进行计算模拟。通过使用计算模拟，多种生物现象可得到充分描述，如受体转运的二聚化依赖性、信号扩增经由反馈环路的控制和信号传播的配体依赖性。举例来说，为确定抑制ErbB路径的最佳策略，建立网络模型来描述PI3K/AKT路径响应于配体乙胞素和异调蛋白的活化，所述配体分别选择性活化EGFR/ErbB1或ErbB3异二聚体。所述机械模型表示以下过程：配体结合；受体二聚化；受体转运和信号传播，以及由质量作用动力学定义的一系列反应。为作出可靠预测，须首先使用捕捉关键动态事件，具体来说ErbB受体和PI3K/AKT路径的活化的时间和剂量依赖性实验对机械模型进行训练。通过敏感性分析鉴别具有最大影响的网络组分，在所述敏感性分析中精细干扰网络的各组分且评定对下游输出的相对贡献(图9B)。
使用这些方法，产生ErbB网络的计算模型，其鉴别出激酶死亡ErbB3为PI3K/AKT路径的最强活化因子。实际上，尽管在异调蛋白或乙胞素存在下ErbB3的表达水平低，但ErbB3仍提供对模型中PI3K/AKT路径活化的最强贡献。值得注意的是，此计算机(in silico)观测甚至适用于表达相对低水平的ErbB3和水平高达10倍的EGFR/ErbB1或HER2/ErbB2的细胞系。
除鉴别最佳靶标外，机械模拟还可用于确定最佳治疗设计特征。在靶向激酶死亡ErbB3的情况下，治疗性单克隆抗体的优化模拟利用若干设计特征，如与ErbB3的结合、阻止异调蛋白结合和阻断二聚化，其中特别关注阻断配体诱导的EGFR/ErbB3二聚化。模拟用于经由模拟一定解离速率常数范围内的抑制剂确定达成AKT磷酸化的最大抑制所需的亲和力。根据此模拟，预测1纳摩尔浓度的亲和力足以达成最大抑制剂效力，而更高亲和力抑制剂仅显示有限提高(图9C和图9D)。
双特异性药剂与生物系统相互作用的复杂性增加产生甚至更大的利用机械模拟来指导工程改造努力的机会。所有双特异性蛋白质以与对各靶标的亲和力、亲合性增强的交联能力和各靶标的相对丰度相关的方式结合其靶标。设计针对有效抑制优化的双特异性剂还需要关于竞争性配体和二聚化搭配物(如果其存在)的亲和力以及活化共同下游信号传导级联中各靶标的相对强度和后续细胞生长和存活机制的知识。合意表观Kd可经由多轮亲和力和亲合性改良达成，且模拟模型可指导工程改造努力朝向最适合分子格式和流线优化途径发展。模拟可用于探究双特异性蛋白质构想用于转换靶标亲和力、亲合性和靶标表达水平的性能。
旨在以针对各靶标的单一结合部分抑制两种细胞表面生长因子受体(IGF-1R、
ERBB3)的双特异性抗体
所有双特异性蛋白质以与对各靶标的亲和力、亲合性增强的交联能力和各靶标的相对丰度相关的方式结合其靶标；双特异性剂与生物系统相互作用的复杂性增加产生甚至更大的利用机械模拟来指导工程改造努力的机会。设计针对有效抑制优化的双特异性剂还需要关于竞争性配体和二聚化搭配物(如果其存在)的亲和力以及活化共同下游信号传导级联中各靶标的相对强度和后续细胞生长和存活机制的知识。合意表观Kd可经由多轮亲和力和亲合性改良达成，且模拟模型可指导工程改造努力朝向最适合分子格式和流线优化途径发展。模拟可用于探究双特异性蛋白质构想用于转换靶标亲和力、亲合性和靶标表达水平的性能。
在所述系统中模拟旨在以针对各靶标的单一结合部分抑制两种细胞表面生长因子受体(IGF-1R和ErbB3)的双特异性抗体的剂量反应行为揭示出当ErbB3表达较高时IGF-1R受到更有效抑制，且当ErbB3表达较低时抑制效力较低(图10A)。因此，双特异性抗体抑制IGF-1R的能力取决于其有效结合。此现象对靶标的相对表达和双特异性抗体针对靶标的相对亲和力具特异性：IGF-1R的表达对ErbB3抑制影响较小，因为双特异性抗体模拟成结合ErbB3的亲和力比IGF-1R高(图10B)。对于双特异性抑制剂，此受体水平依赖性行为可严重限制总体功效，如对两种路径所共有的下游细胞内读数AKT的模拟影响所示：预测当ErbB3表达不足时对pAKT的抑制作用不好，因为IGF-1R未受到充分抑制(图10C)。此模型系统的模拟揭示出针对各靶标的双特异性抑制剂的性能可高度取决于两种靶标的相对表达；所述信息可用于治疗性设计。
受体水平依赖性对双特异性剂效力的影响可经由模拟多种假定癌细胞来广泛研究，其中各靶标的表达水平在临床上相关的范围内变化且计算各靶标和下游读数的IC50并在反应表面上绘图。IC50反应表面的形状取决于潜在路径相互作用。ErbB3为下游信号传导的较强活化因子，且界定双特异性抑制剂将最有效的区域。模拟具有针对各靶标的单一结合部分的双特异性剂揭示出对下游靶标的最有效抑制作用集中于具有相等靶标表达的区域。实际上，当任一靶标过度表达少至5倍时，IC50值可增加多达100倍，效力产生实质性损失。
将肿瘤细胞系或临床样品中的实际靶标水平定位于IC50反应表面上可用于通过揭示出最有效抑制作用区域是否与相关患者群体重叠来指导治疗性改良努力。可首先经由模拟研究变换所预测最佳效力的区域以治疗不同或更广泛患者群体的策略。IgG样双特异性抗体具有两个针对各靶标的结合部分且因此除交叉靶标亲合性外还展现相同靶标亲合性，从而提高对各靶标的有效结合亲和力。模拟具有等于二价双特异性蛋白质的单价结合亲和力的IgG样双特异性抗体展示此格式关于性能对交叉靶标亲合性的依赖性较低：最佳效力的区域比单价双特异性广。因此，如果目的在于治疗广泛的患者群体，那么模型预测将可使用IgG样双特异性设计。
在改良最佳效力区域时对抗体功能进行亲和力成熟的效益还可经由模拟来检验。模拟非最佳四价双特异性剂在受体空间范围内的下游靶标抑制鉴别出不良抑制的区域，尤其在IGF-1R表达较高时。经由降低解离速率使双特异性剂针对IGF-1R的单价结合亲和力增加至10倍预测亲和力成熟将达成的提高。在IGF-1R表达较高和ErbB3表达较高的两种情况下下游靶标均受到显著更有效地抑制，表明针对一个靶标的亲和力成熟经由交叉靶标亲合性增强针对第二靶标的效力。
将这些考虑因素设定为概念验证IgG样双特异性治疗性蛋白质的优化方案的准则，所述治疗性蛋白质显示有效抑制生长因子诱导的信号传导和在异种移植物模型中抑制肿瘤，从而确认所述设计准则。此蛋白质包含针对IGF-1R的IgG抗体框架和针对ErbB3的两个C端融合scFv模块，但不适于下游开发，因为其含有不具有足够固有稳定性的不稳定scFv模块。此现象已充分了解且已描述使用多种技术针对稳定性对scFv模块进行工程改造，所述技术包括接头优化、二硫键工程改造、靶向诱变、共变异分析、稳定框架上的环移植、结构指导的设计、聚焦设计和噬菌体展示。
为将scFv模块亲和力和稳定性的优化组合于单个方案内，使用结构指导的设计、酵母表面展示和微小规模生物物理学表征的组合。设计结构指导的scFv变异体，其中引入稳定性增强突变，对赋予潜在CMC不利作用的基元进行突变，移除或置换非典型框架氨基酸，且在CDR的低多样性部分中引入变异。因为酵母细胞具有真核生物翻译后修饰和多肽输出机构，因此监测表面表达水平，所述表达水平据报导预测热稳定性和可溶性分泌效率。除热激发外，还开发“烧煮结合(cook-and-bind)”方案。在此实验中，不稳定scFv模块伸展，而稳定的高亲和力蛋白质保持结合于抗原且因此富集(图11A)。分离个别克隆后，对融合于酵母表面的scFv进行激发且基于通过流式细胞测量术测量的残余亲和力选择克隆(图11B)。酵母表面上展示Kd提高10倍的热稳定性scFv模块产生为可溶性蛋白质且选择显示抗原结合改良、抑制生长因子信号传导和可接受的稳定性的蛋白质。使这些优化scFv模块以C端融合于IGF-R1抗体。在瞬时表达系统中表达所得IgG样蛋白质，使用蛋白质A色谱进行纯化，且使用生物物理学、生物活性和细胞信号传导测定进行概况分析。在多种适用生物物理学技术中，发现微差扫描荧光和热失活测定在1至5微克规模下提供最多信息。由微差扫描荧光概况分析和热失活测定构成的微小规模筛分允许选择具有提高的血清和聚集稳定性的双特异性剂。微差扫描荧光概况分析和热失活测定得到关于稳定性最低蛋白质结构域的伸展速率和聚集速率的互补信息。这些数据定性预测IgG样双特异性抗体的血清和聚集稳定性(图12)。具有稳固敏感性微小规模测定的重要性难以高估，因为其直接转变成在单个设计方案内审查较大数量的不同候选物的能力。使用正常规模测定：与表达两种靶标的BxPC-3细胞的结合来确认经过工程改造的IgG样双特异性蛋白质的改良的效力和稳定性(图13)。这表明，特征在于对多功能性蛋白质的模块进行平行聚焦工程改造，接着进行高通量制备和表征的方法通常适用于在一个治疗性设计循环的情形中提高靶标双特异性抗体样蛋白质的效力和可制造性。
实施例2：IgG四价双特异性蛋白质的制备、表达和纯化
基本上如下制备用于实施例3中所述的实验中的三种抗ErbB3-抗IGF-1RIgG2四价双特异性蛋白质(“ELI-7”、“ILE-10”和“ILE-12”)和其它对照蛋白质。ELI-7、ILE-10和ILE-12具有结构IgG2(scFv)2。
ELI-7为包含抗ErbB3IgG2抗体的抗ErbB3/抗IGF-1R IgG2四价双特异性蛋白质，其中抗IGF-1R scFv连接于IgG2蛋白质的重链的各C端。
ILE-10和ILE-12为包含抗IGF-1R IgG2抗体的抗IGF-1R/抗ErbB3IgG2四价双特异性蛋白质，其中抗ErbB3scFv连接于IgG2蛋白质的重链的各C端。
ELI-7、ILE-10和ILE-12的结构和关系阐明于表6中。简单地说，其均包含相同抗IGF-1R VH序列(“模块5-7”)。ILE-10与ILE-12仅在ErbB3scFv的序列上不同。ILE-10与ELI-7包含相同抗IGF-1R和抗ErbB3VH序列，且不同之处在于ILE-10具有IGF-1R Fab和ErbB3scFv(“ILE”)且ELI-7具有相反构型(“ELI”)。对照抗体为单特异性且各自包含与双特异性抗体中所存在的结合位点同源的结合位点。
表6：实施例2和3中所用的蛋白质的描述
本文实施例2-3的许多公开内容(包括ELI-7、ILE-10和ILE-12)可见于PCT申请PCT/US2010/052712中。
各蛋白质的轻链和重链的氨基酸序列如下：ELI-7的重链：SEQ IDNO:316。ELI-7的轻链：SEQ ID NO:317。ILE-10的重链：SEQ ID NO:318。ILE-12的重链：SEQ ID NO:319。ILE-10和IL-12的轻链：SEQ ID NO:320。
使用标准重组DNA技术将编码所述蛋白质(称为“融合蛋白”)的核酸作为单一蛋白质克隆到表达质粒中。所用表达载体为pMP 10K(SELEXIS)。将表达质粒线性化，使用纯化试剂盒(QIAGEN)纯化，且使用LipofectamineTM LTX(Invitrogen)共转染至CHO细胞中。转染的细胞在无选择压力下利用含有10％FBS的F12Hams培养基恢复2天，接着在选择压力下恢复4天。4天后，在选择压力下将其更换至含有谷氨酰胺的无血清培养基(Hyclone)中。一周后，检查细胞的表达且放大至所要体积。使用三个色谱步骤的组合纯化所有蛋白质：蛋白质A亲和色谱、阳离子交换色谱和阴离子交换色谱。各自根据制造商的说明进行。蛋白质A亲和色谱步骤用于将融合蛋白自收集的细胞培养物流体(HCCF)中选择性地且有效地结合出来。此步骤在单一步骤中以高产率和高通量移除>95％的产物杂质。此步骤后融合蛋白的所要分子形式的部分在百分之60至98范围内。使用来自GE的MABSELECT作为蛋白质A亲和树脂。在第二色谱步骤中使用来自GE的SPFF(磺丙基速流(sulphopropyl fast flow))(一种基于琼脂糖的树脂)作为阳离子交换树脂。此步骤后融合蛋白的所要分子形式的部分在百分之90至99范围内。在第三和最终色谱步骤中使用来自GE的QSFF(季胺琼脂糖凝胶速流(Quaternary-aminesepharose fast flow))(一种基于琼脂糖的阴离子交换树脂)。将经过纯化的物质浓缩且透析至PBS中。此步骤后融合蛋白的最终产率在20mg-100mg/L的范围内。
实施例3：抗ErbB3+抗IGF-1R IgG四价双特异性蛋白质的结合和生物活性
此实施例展示抗IGF-1R+抗ErbB3IgG四价双特异性蛋白质(ELI-7)以高亲和力结合IGF-1R和ErbB3(也如对于两种类似蛋白质ILE-10和ILE-12所示)，有效抑制1)自IGF-1R和ErbB3受体开始的信号转导，2)AKT磷酸化，和3)体外和体内的肿瘤细胞增殖。基本上如下获得结果。
A)ELI-7、ILE-10和ILE-12与IGF-1R和ErbB3的结合
将1×105个MCF7细胞或1×105个ADRr细胞在室温下与2uM的ELI-7、ILE-10和ILE-12(两种抗ErB3抗体和一种抗IGF-1R抗体)各自一起孵育2小时，接着进行12次后续3倍稀释。接着使用山羊抗HSA-Alexa647结合的抗体作为检测抗体，将细胞在冰上孵育40分钟。通过FACS评定抗体对MCF7和ADRr细胞的细胞结合解离常数(结合亲和力的量度)且测定各蛋白质的表观解离常数。获得以下结果(还参见图14A和14B)。
表7：双特异性蛋白质的结合Kd
结果展示IgG双特异性剂(即ELI-7、ILE-10、ILE-12)结合于两种细胞类型，在一些情况下在低浓度下具有较强结合，表明有效结合和能够结合各受体。IgG双特异性剂对于等同的单克隆抗体组分具有类似Kd。
B)ELI-7和ILE-7对IGF-1R、ErbB3和Akt的信号抑制作用
ELI-7和ILE-7拮抗IGF-1R和ErbB3以及抑制下游组分IGF-1R、ErbB3和Akt活化(磷酸化)的能力；检查磷酸化。将3.5×104个BxPC-3细胞与0.3μM的抗体一起预孵育1小时，接着进行9次后续3倍稀释以得到10点曲线。细胞用80ng/ml的IGF-1和20ng/ml的异调蛋白处理15分钟。通过ELISA(R&D Systems；目录号DYC1770)测量产生磷酸化IGF-1R(pIGF-1R)的IGF-1R磷酸化，以评估药剂抑制pIGF-1R形成的能力。通过ELISA(R&D Systems；目录号DYC1769)测量ErbB3的磷酸化，以评估药剂抑制pErbB3形成的能力。使用以下抗体通过ELISA测量AKT的磷酸化：抗AKT，克隆SKB1(Millipore，目录号05-591)；生物素化抗磷酸化AKT(Ser473特异性；Cell SignalingTechnology目录号5102)。ILE-7为具有与ELI-7相同的结合位点的三价蛋白质且描述于PCT/US2010/052712中。图15A-15C示出基本上如上文关于ILE-7和ELI-7所述获得的结果。所获得的结果也概述于下表中。
表8：ELI-7对ErbB3、IGF-1R和AKT磷酸化的抑制作用
结果表明ELI-7抑制ErbB3、IGF-1R和Akt的磷酸化，即使在用IGF-1和HRG同时刺激时也是如此。
C)在二维培养物中ELI-7的细胞生长抑制作用
使用CTG测定体外检查ELI-7对肿瘤细胞增殖的作用，所述测定为基于荧光的测定，其测量所存在的细胞ATP的量(Promega；目录号PR-G7572)，如相对光单位(RLU)所指示。将每孔500个细胞的DU145细胞在具有80ng/mlIGF-1和20ng/ml HRG且含有始于2μM的3倍抑制剂稀释液的培养基中孵育6天。对照由在无生长因子或抗体存在下孵育的DU145细胞组成。
基本上如上文所述获得的结果表明，ELI-7抑制DU145细胞的生长(Ki＝12nM，参见图16)，而IGF-1R或ErbB3的抑制剂对细胞生长无影响。
对另一细胞系进行类似实验。每孔2000个BxPC-3细胞在含有始于1μM的3倍抑制剂稀释液的培养基中孵育6天。对照由来自人骨髓瘤浆的IgG2κ(Sigma Aldrich目录号I5405)组成。
基本上如上文所述获得的结果表明，ELI-7使BxPC-3生长抑制46％(p<0.001，学生T测试(Student’s T-test))(图17)。
D)癌症的人异种移植物小鼠模型中双特异性蛋白质的肿瘤生长抑制作用
本实施例展示ELI-7在癌症的小鼠模型中在两个不同模型中抑制肿瘤生长。
首先计算各双特异性蛋白质在小鼠体内的药物动力学性质。将600μgELI-7或500μg各连接HSA的三价对照蛋白质(ILE-3、ILE-7和ILE-9；描述于PCT/US2010/052712中)经由尾静脉注射至各小鼠体内(每个抑制剂和时间点4只小鼠)。此后在不同时间点抽取血液(首先处死小鼠且接着通过心脏穿刺抽取血液)。ELI-7的时间点为：0.5、4、24、72、120、168和240小时。三价对照蛋白质的时间点为：0.5、4、8、24、28、72和120小时。对于ELI-7，使用抗人IgG ELISA试剂盒(Bethyl labs目录号E80-104)根据制造商的说明测量血液浓度。对于三价蛋白质，使用特异性检测IGF-1R和ErbB3结合的ELISA试剂盒测量血液中的浓度，将盘用以His标签标记的人IGF-1R涂布，与三价蛋白质或ELI-7一起孵育，接着用人ErbB3-Fc(R&D Systems)和抗Fc-HRP检测试剂进行检测。使用单隔室模型计算各蛋白质的药物动力学性质(半衰期和Cmax)。获得以下结果：
表9：小鼠血液中ELI-7的半衰期和Cmax
模拟药物特异性半衰期导致预测以下剂量将产生相等暴露量(或在ILE-7的情况下50％相当暴露量)：
表10：相等暴露量的预测剂量
接着通过向各小鼠侧腹的皮下空间中注射5×106个BxPC-3细胞(悬浮于PBS与减去生长因子的基质胶的1:1混合物中；BD Biosciences目录号354230)来评定ELI-7对小鼠模型中人胰腺癌异种移植肿瘤生长的影响。允许肿瘤发展7-10天(直至其达到约100-200mm3的体积)，且接着测量各小鼠的肿瘤尺寸(π/6×长度×宽度2，其中宽度为最小测量值)。接着对小鼠进行尺寸匹配且随后随机分配至治疗组中。接着每3天注射ELI-7、三价对照蛋白质(ILE-7)、抗ErbB3抗体、抗IGF-1R抗体或PBS对照直至研究完成。
结果(图18和19)显示与PBS对照相比，ELI-7显著抑制BxPC-3肿瘤的异种移植肿瘤生长：用ELI-7治疗的肿瘤与PBS对照相比最终肿瘤体积小77％(p值通过学生T测试测定)。第0天是指给药第一天。
通过向各小鼠侧腹的皮下空间中注射5×106个DU145细胞(悬浮于PBS与减去生长因子的基质胶的1:1混合物中；BD Biosciences目录号354230)来评定ELI-7对小鼠模型中人前列腺癌异种移植肿瘤生长的影响。允许肿瘤发展7-10天(直至各自达到约100-200mm3的体积)，且接着测量各小鼠的肿瘤尺寸(π/6×长度×宽度2，其中宽度为最小测量值)。接着对小鼠进行肿瘤尺寸匹配且随后随机分配至治疗组中。接着每3天注射ELI-7、三价对照蛋白质(ILE-7)、抗ErbB3抗体、抗IGF-1R抗体或PBS对照直至研究完成。
结果(图20A和20B)显示ELI-7显著抑制DU145细胞的异种移植肿瘤生长，而对照抗IGF-1R和抗ErbB3抗体不能：用ELI-7治疗的肿瘤与PBS对照相比最终肿瘤体积小50％(p值通过学生T测试测定)。第0天是指给药第一天。
E)ELI-7在宽泛的ErbB3和IGF-1R受体水平范围内抑制信号传导
为确定ELI-7是否可在宽泛的ErbB3和IGF-1R受体水平范围内抑制下游信号传导，进行以下实验：
通过使用pLKO.1PURO载体(Sigma)在BxPC-3细胞中进行shRNA介导的IGF-1R或ErbB3基因表达阻断(knockdown)来改变BxPC-3细胞受体水平。shRNA序列提供于PCT/US2010/052712中。接着通过定量FACS测量ErbB3和IGF-1R水平且自所得分布计算平均受体水平(参见表11的相对表达水平)。为确定ELI-7的效力，对细胞进行血清饥饿且用ELI-7在37℃下预处理1小时，接着用20ng/ml HRG+80ng/ml IGF1刺激15分钟。通过针对pAKT的ELISA评定信号抑制。
结果指示ELI-7对于具有改变的受体水平的BxPC-3细胞系具有类似效力，如通过其IC50值和重叠信赖区间所指示(参见表11)，表明ELI-7具有针对一系列受体概况的宽泛活性(图21)。
表11：四种BxPC-3细胞系的相对受体水平和pAkt IC50值：
实施例4：相对于ELI-7具有增强的活性的抗IGF-1R/抗ErbB3四价双特异 性蛋白质(16F)的生物活性
进一步改良实施例2和3中所述的概念验证蛋白质(ELI-7)以增加其对IGF-1R和ErbB3的结合亲和力、生物活性、稳定性和溶解度；如实施例1中所述。进行以下改变：(i)将方向由抗ErbB3作为IgG组分转换为抗IGF-1R作为IgG组分；(ii)使用结合不同表位的抗ErbB3结合部分；(iii)对其CDR3VH区进行亲和力成熟；(iv)对抗IGF-1R IgG组分进行突变以使其稳定(稳定化突变)；和(v)将其骨架由IgG2转换为IgG1。所得蛋白质为16F，其氨基酸序列阐明于图7中。
如实施例3中所述，测量作为IGF-1R磷酸化抑制作用的函数，16F相对于ELI-7的抗IGF-1R效力的增加。基本上如上文所述获得的结果(图22)指示经过再工程改造的蛋白质为IGF-1R信号转导的显著更有效抑制剂。
基本上如实施例3所述测量16F、ELI-7和抗IGF-1R Ab#A(加尼图单抗；SEQ ID 327+SEQ ID 328)与抗ErbB3Ab#A(SEQ ID 336+SEQ ID 337)的组合经由ErbB3和经由抑制AKT磷酸化抑制信号转导的效力。这些测量在BxPC-3细胞中在HRG和IGF1存在下进行。基本上如上文所述获得的结果(表12)指示与ELI-7相比，16F在抑制信号转导方面具有改良的功效，所述功效与临床级抑制剂抗IGF-1R Ab#A+抗ErbB3Ab#A的组合的功效相当。
表12：16F与Eli-7和临床级抑制剂的比较
如实施例1所述，还显示经过再工程改造的双特异性剂(即16F)的热稳定性和血清稳定性比ELI-7高。此外，16F的聚集倾向较低：(i)16F在19mg/ml下在PBS中在4℃下稳定，在33天内仅有约2％聚集；(ii)3次冷冻解冻循环后未观测到单体％发生显著变化；(iii)在4℃下振荡一天后未观测到单体％发生显著变化；和(iv)在37℃下孵育6天时未观测到单体％发生显著变化。
由下文所述的其它比较实验得到的结果还显示16F在抑制信号转导方面至少与市售抗IGF-1R与抗ErbB3的组合一样有效。
在第一组实验中，在两个不同细胞系(BxPC-3和DU145)中比较在抑制IGF-1R、ErbB3或AKT磷酸化方面16F(SF-G1-C8)与抗IGF-1R Ab#B(西妥木单抗；SEQ ID 324+SEQ ID 325)、抗ErbB3Ab#A(SEQ ID 336+SEQ ID 337)或抗IGF-1R Ab#B+抗ErbB3Ab#A的有效性。
BxPC-3和DU145细胞维持于补充有10％胎牛血清、青霉素/链霉素和L-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基中。对于信号传导实验，将3.5×104个细胞于完全培养基中接种于96孔组织培养盘中。第二天，将完全培养基置换为无血清培养基且细胞在37℃下孵育过夜。细胞用指定剂量的抗体预处理1小时，并接着用100ng/ml IGF-1(Calbiochem)和30ng/ml HRG(R&D Systems)刺激15分钟。将细胞用PBS洗涤并在补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的MPer缓冲液中溶解。
根据制造商的方案(R&D Systems)进行磷酸化IGF-1R(pIGF-1R)和磷酸化ErbB3(pErbB3)的ELISA。用以下试剂进行磷酸化AKT(pAKT)的ELISA：抗AKT捕捉抗体(Millipore)、抗pAKT(Ser473)检测抗体(Cell Signaling)和抗生蛋白链菌素-HRP(R&D Systems)。添加SUPERSIGNAL ELISA PICO化学发光底物(Pierce)并在PerkinElmer En盘读取器上读取各盘。将发光值绘图且使用Graphpad Prism 5软件计算IC50值。
基本上如上文所述获得且示出于图23(BxPC-3细胞)和图24(DU145细胞)和表13中的结果指示与抗IGF-1R Ab#B与抗ErbB3Ab#A的组合相比，16F显示显著更有效地抑制经由pErbB3和pAKT的双重路径信号传导。
表13：图23中呈示的抑制剂处理的IC50值。
在第二组实验中，在BxPC-3细胞中比较在抑制IGF-1R、ErbB3或AKT磷酸化方面16F(SF-G1-C8)与抗IGF-1R抗体抗IGF-1R Ab#A、抗ErB3抗体抗ErbB3Ab#A或后两种抗体的组合的有效性。
基本上如上文所述获得且示出于图24和表14中的结果指示与抗IGF-1RAb#A与抗ErbB3Ab#A的组合相比，16F显著更有效抑制经由pErbB3和pIGF-1R的双重路径信号传导。
表14：图24中呈示的抑制剂处理的IC50值。
实施例5：包含SF模块的其它抗IGF-1R/抗ErbB3IgG四价双特异性抗体的 结合和生物活性
构建其它抗IGF-1R+抗ErbB3IgG四价双特异性抗体。基本上如图8中所示通过组合三个模块来组装这些PBA中的每一者。各PBA包含一对重链融合多肽(各自包含所述三个模块各自的至少一部分)，所述重链对的各成员彼此结合且各自进一步结合于一对轻链中的一者。组装成各PBA的三个模块为：
1.包含两条(基本上相同的)轻链和两条重链的N端的N端(氨基端)Fab可变结构域模块；
2.scFv模块；和
3.插入N端Fab可变结构域模块与scFv模块之间的HC IgG CR模块。
作为融合多肽的重链包含N端Fab模块的重链部分、IgG CR模块和C端scFv模块。
新的抗IGF-1R+抗ErbB3抗体由表15的抗IGF-1R和抗ErbB3部分组装成按不同方向排列的模块的组合构成。对于表15和16中的每一者，所建立的各PBA包含含有一对基本上相同的重链多肽的融合蛋白，所述重链多肽各自包含按N端至C端(氨基至羧基)顺序左栏中命名的具有IgG1CR(G1)的各Fab模块与同一表的右栏中命名的任一scFv模块的组合。所述其它PBA的重链和轻链的氨基酸序列阐明于图5A(抗IGF-1R+抗ErbB3)和图5B(抗ErbB3和抗IGF-1R)中。
表15：抗IGF-1R-抗ErbB3蛋白
表16：抗ErbB3-抗IGF-1R蛋白
本实施例展示包含N端“SF”模块的抗体结合BxPC-3细胞，结合ErbB3，抑制IGF-1R、ErbB3和AKT磷酸化，且为稳定的。利用其它蛋白质获得的结果阐述于实施例6中。
A)BxPC-3细胞结合数据
基本上如下测量SF-G1-P1、SF-G1-P6、SF-G1-M27、SF-G1-B69、SF-G1-M1.3和SF-G1-C8(16F)与BxPC-3的结合。
BxPC-3细胞维持于补充有10％胎牛血清、青霉素/链霉素和L-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基中。移除培养基且用PBS洗涤BxPC-3细胞。添加胰蛋白酶直至细胞自培养盘脱离，并接着用培养基+10％血清中和。短暂离心细胞且再悬浮于FACS缓冲液(1×PBS+2％血清+0.1％叠氮化物)中。通过上下抽吸和推挤细胞穿过细胞过滤器使聚集物拆散成单细胞。短暂离心细胞且以2×106个细胞/毫升的密度再悬浮于FACS缓冲液中。在96孔锥形底盘中，每孔等分50μl细胞悬浮液以得到105个细胞/孔。
将抗体在FACS缓冲液中稀释至1μM，且进行10次3倍稀释，其中最后的孔仅由FACS缓冲液组成(无一次抗体)。将50μl抗体添加至50μl细胞中以使得第一孔中的最高最终抗体浓度为500nM。在轻缓搅拌下将细胞与抗体在室温下孵育2小时。将盘在1,500RPM下旋转5分钟，且移除上清液。离心块在FACS缓冲液中洗涤三次。最后一次洗涤后，移除FACS缓冲液，且添加50μl在FACS缓冲液中按1:100稀释的抗Fc-DyLight 649二次抗体(Abcam)。将细胞在冷室中在黑暗中在轻缓搅拌下孵育1小时，再洗涤三次且再悬浮于100μl固定缓冲液(含1％三聚甲醛、2％FBS的PBS)中。将样品转移至96孔U形底FACS盘(Becton Dickinson)中且在4度下保持在黑暗中直至使用。使用FACSCalibur(Becton Dickinson)读取样品且使用FlowJo确定中值荧光强度(MFI)。利用GraphPad PRISM使用对数(促效剂)相对于反应(三参数)非线性回归曲线拟合进行分析。
结果(图25和表17中)指示所述双特异性抗体显示与BxPC-3细胞的强结合。
表17：图25中呈示的双特异性抗体结合的EC50值。
| 双特异性抗体 | EC50(nM) |
| SF-G1-C8 | 3.1 |
| SF-G1-P1 | 4.9 |
| SF-G1-P6 | 2.9 |
| SF-G1-M27 | 2.7 |
| SF-G1-B69 | 2.1 |
| SF-G1-M1.3 | 3.5 |
B)ErbB3结合数据
基本上如下测量SF-G1-P1、SF-G1-P6、SF-G1-M27、SF-G1-B69、SF-G1-M1.3和SF-G1-C8(16F)与重组ErbB3的结合。
将96孔REACTI-BIND盘(Pierce)用50μl ErbB3-His(具有C端六聚组氨酸标签的ErbB3-于PBS中2μg/ml)(如SEQ ID NO:403中所公开的“六聚组氨酸”)涂布且在4℃下孵育过夜。第二天，将盘用PBS+0.05％Tween-20(PBS-T)洗涤且在室温下用100μl无蛋白质阻断缓冲液(Pierce)阻断1小时。将盘用PBS-T洗涤且添加50μl各双特异性抗体重复两份。浓度始于500nM(于PBS-T中)且包括十份另外的两倍稀释液和一份空白(仅PBS-T)。将盘在室温下孵育两小时且接着用PBS-T洗涤。添加50μl于PBS-T中按1:40,000稀释的抗Fc-HRP(Jackson Labs)，且将盘在黑暗中在室温下孵育1小时。盘再次用PBS-T洗涤且添加100μl TMB底物(Thermo Scientific，以1:1混合的TMB与过氧化物溶液)。将盘在室温下孵育5-15分钟直至出现蓝色，且用100μl停止溶液(Cell Signaling Technology)使反应停止。在PerkinElmer Envision盘读取器上读取450nm下的吸光度，且利用GraphPad PRISM使用对数(促效剂)相对于反应(三参数)非线性回归曲线拟合产生结合曲线。
结果(图26和表18)指示所述双特异性抗体显示与重组ErbB3蛋白的强结合。
表18：图26中呈示的双特异性抗体结合的EC50值。
| 双特异性抗体 | EC50(nM) |
| SF-G1-C8 | 0.3 |
| SF-G1-P1 | 0.4 |
| SF-G1-P6 | 0.3 |
| SF-G1-M27 | 0.4 |
| SF-G1-B69 | 0.4 |
| SF-G1-M1.3 | 0.2 |
C)对信号转导的抑制作用
基本上如下测量SF-G1-P1、SF-G1-P6、SF-G1-M27、SF-G1-B69、SF-G1-M1.3和SF-G1-C8(16F)对信号转导的抑制作用。
BxPC-3细胞维持于补充有10％胎牛血清、青霉素/链霉素和L-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基中。将3.5×104个细胞于完全培养基中接种于96孔组织培养盘中。第二天，将完全培养基置换为无血清培养基且细胞在37℃下孵育过夜。细胞用指定剂量的药物预处理1小时，并接着用100ng/mlIGF1(Calbiochem)和30ng/ml HRG(R&D Systems)刺激15分钟。将细胞用PBS洗涤并在补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的MPer缓冲液(“哺乳动物蛋白质提取试剂”Pierce Thermo Scientific)中溶解。
如上文实施例4中所述进行磷酸化IGF1R(pIGF1R)、磷酸化ErbB3(pErbB3)和磷酸化AKT(pAKT)的ELISA。将相对发光单位(RLU)绘图且使用Graphpad Prism 5软件计算IC50值。
结果(图27和表19)指示所述双特异性蛋白质强烈抑制双重路径信号传导。
表19：图27中所示的抑制剂处理的IC50值和抑制百分比值。
| pIGF1R | pIGF1R | |
| 抑制剂 | IC50 | 抑制％ |
| SF-G1-P6 | 8.2E-10 | 91.2 |
| SF-G1-M1.3 | 8.0E-10 | 87.9 |
| SF-G1-B69 | 1.2E-09 | 91.1 |
| SF-G1-P1 | 9.2E-10 | 91.3 |
| SF-G1-M27 | 6.0E-10 | 90.7 |
| SF-G1-C8 | 9.5E-10 | 93.0 |
| pErbB3 | pErbB3 | |
| 抑制剂 | IC50 | 抑制％ |
| SF-G1-P6 | 2.9E-10 | 96.6 |
| SF-G1-M1.3 | 2.5E-10 | 97.0 |
| SF-G1-B69 | 5.2E-10 | 97.8 |
| SF-G1-P1 | 6.9E-10 | 95.3 |
| SF-G1-M27 | 2.5E-10 | 98.1 |
| SF-G1-C8 | 2.4E-10 | 94.9 |
| pAKT | pAKT | |
| 抑制剂 | IC50 | 抑制％ |
| SF-G1-P6 | 1.9E-09 | 75.6 |
| SF-G1-M1.3 | 1.2E-09 | 77.4 |
| SF-G1-B69 | 2.7E-09 | 72.7 |
| SF-G1-P1 | 2.4E-09 | 71.7 |
| SF-G1-M27 | 1.4E-09 | 73.8 |
| SF-G1-C8 | 1.5E-09 | 72.3 |
D)双特异性蛋白质的稳定性
已进行各种稳定性研究且其显示SF-G1-P1、SF-G1-P6、SF-G1-M27、SF-G1-B69、SF-G1-M1.3在血清中为稳定的，具热稳定性且在低pH下为稳定的。
为测定血清稳定性，将蛋白质在小鼠血清(Sigma)中以2.5μM的最终浓度在37℃下孵育0小时或72小时。接着使用上文所述的比色ELISA结合测定分析样品，且用GraphPad Prism产生结合曲线。针对0小时各曲线的拐点将吸光度值校正以确定血清中37℃下72小时后保留的结合百分比。
基本上如上文所述获得的结果(图28)指示所测试的各PBA在72小时后具有至少70％的(校正)血清稳定性。某些PBA具有约100％的稳定性。
为测定热稳定性，使用在上文所述的ELISA结合实验中产生的结合曲线计算各PBA的EC90值。各PBA于PBS中制备为其EC90值的5倍且以每孔50μl转移至PCR盘(Bio-Rad)中。短暂离心各盘且置于ICYCLER IQ梯度PCR机(Biorad)中以历时1小时将抗体自47℃加热至72℃。各抗体的等份试样还在25℃和37℃下保持1小时。接着将各盘在2,000RPM下离心5分钟且将上清液在PBS-T中稀释五倍至其EC90浓度。接着使用上文所述的比色ELISA结合测定分析样品，且针对25℃校正吸光度。用GraphPad Prism产生结合曲线以确定T50值。
基本上如上所述获得的结果(表20)指示T50值在46.7℃至62.6℃间变化。
表20：在25-72℃下孵育1小时的各双特异性抗体的T50值
| 双特异性抗体 | T50 |
| SF-G1-C8 | 62.1℃ |
| SF-G1-P1 | 46.7℃ |
| SF-G1-P6 | 62.4℃ |
| SF-G1-M27 | 56℃ |
| SF-G1-B69 | 62.6℃ |
| SF-G1-M1.3 | 46.7℃ |
通过微差扫描荧光测定法(DSF)测定PBA伸展时的温度。在IQ5实时检测系统(Bio-Rad)中进行DSF分析。将20μl的15μM双特异性抗体、1×SyproOrange(Invitrogen Life Technologies)和1×PBS的溶液添加至96孔盘的孔中。以1℃/min的加热速率将盘自20℃加热至90℃。将数据转移至GraphPad Prism进行分析。
基本上如上所述获得的结果(表21)指示蛋白质在不同温度下伸展。
表21：如通过DSF所测定，各双特异性抗体的Tm值
| 双特异性抗体 | Tm |
| SF-G1-C8 | 69℃ |
| SF-G1-P1 | 54℃ |
| SF-G1-P6 | 61℃ |
| SF-G1-M27 | 55℃ |
| SF-G1-B69 | 61℃ |
| SF-G1-M1.3 | 64℃ |
为测定pH3稳定性，将SF-G1-C8储备溶液稀释至0.1M乙酸(pH 3.0)中且孵育1小时。接着用1M Tris碱中和溶液，以PBS透析且浓缩。针对蛋白质A纯化后立即中和的SF-G1-C8的样品通过SEC(尺寸排阻色谱)和比色ELISA测试透析物。使用Agilent 1100系列HPLC系统进行SEC。将50μgSF-G1-C8注射至TSK Super SW3000凝胶管柱(Tosoh Biosciences,P/N 18675)上。使用PBS作为操作和平衡缓冲液，流动速率为0.35ml/min。如上所述，用重组IGF1R-His或ErbB3-His涂布盘来执行ELISA。
基本上如上所述获得的结果指示SF-G1-C8在低pH孵育(pH 3)1小时后为稳定的，与IGF1R和ErbB3-His的结合实质上未受影响。
为测定SF-G1-C8在4℃下长时间的稳定性，将SF-G1-C8(19mg/ml)于PBS中在4℃下孵育1、6或33天且进行SEC。如上所述通过SEC测定单体百分比。结果指示SF-G1-C8在4℃下33天后显示98％的稳定性。
实施例6：其它抗IGF-1R/ErbB3和抗ErbB3/IGF-1R PBA的表征
A)与BxPC-3细胞的结合
如下测定PBA与BxPC-3细胞的结合。BxPC-3细胞维持于补充有10％胎牛血清、青霉素/链霉素和L-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基中。移除培养基且用PBS洗涤BxPC-3细胞。添加胰蛋白酶直至细胞自培养盘脱离，并接着用培养基+10％血清中和。短暂离心细胞且再悬浮于FACS缓冲液(1×PBS+2％血清+0.1％叠氮化物)中。通过上下抽吸和推挤细胞穿过细胞过滤器使聚集物拆散成单细胞。短暂离心细胞且以1×106个细胞/毫升的密度再悬浮于FACS缓冲液中。在96孔锥形底盘中，每孔等分50μl细胞悬浮液以得到5×104个细胞/孔。
将PBA在FACS缓冲液中稀释至2μM，且进行10次3倍稀释，其中最后的孔仅由FACS缓冲液组成(无一次抗体)。将50μl连续稀释的抗体添加至50μl细胞中以使得第一孔中的最高最终抗体浓度为1μM。在轻缓搅拌下将细胞与抗体在室温下孵育2小时。将盘在1,500RPM下旋转5分钟，且移除上清液。离心块在FACS缓冲液中洗涤三次。最后一次洗涤后，移除FACS缓冲液，且添加50μl在FACS缓冲液中按1:100稀释的抗Fc-DyLight 649二次抗体(Abcam)。将细胞在冷室中在黑暗中在轻缓搅拌下孵育1小时，再洗涤三次且再悬浮于100μl固定缓冲液(含1％三聚甲醛、2％FBS的PBS)中。将样品转移至96孔U形底FACS盘(Becton Dickinson)中且在4度下保持在黑暗中直至使用。使用FACS Calibur(Becton Dickinson)读取样品且使用FlowJo确定中值荧光强度(MFI)。使用单位点-总结合(One Site-Total Binding)利用GraphPad PRISM来确定EC50值。
基本上如上所述获得且示出于图29(A-C)和下表22中的结果指示所述PBA显示与BxPC-3细胞的强结合。图29(D)和下表22显示使用单位点-总结合曲线拟合分析的结合数据。
表22：自图29A-D各自中呈示的各别结合实验获得的EC50值
B)对细胞信号传导的抑制作用
基本上如下测定PBA对细胞信号传导的抑制作用。BxPC-3细胞维持于补充有10％胎牛血清、青霉素/链霉素和L-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基中。将3.5×104个细胞于完全培养基中接种于96孔组织培养盘中。第二天，将完全培养基置换为无血清培养基且细胞在37℃下孵育过夜。细胞用指定剂量的药物预处理1小时，并接着用100ng/ml IGF1(Calbiochem)和30ng/mlHRG(R&D Systems)刺激15分钟。将细胞用PBS洗涤并在补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的MPer缓冲液中溶解。
如上文实施例4中所述进行磷酸化IGF1R(pIGF1R)、磷酸化ErbB3(pErbB3)和磷酸化AKT(pAKT)的ELISA。
使用ILE-10(14F或14f)和ELI-7(5F或5f)(两者均于上文描述)作为参考蛋白质。
基本上如上所述获得且示出于图30(pIGF-1R)、图31(pErbB3)和图32(pAKT)以及下表23中的结果指示所述PBA显示对双重路径信号传导的强抑制作用。
表23：图30、31和32中所示的抑制剂处理的IC50值和抑制百分比值。
在另一组实验中，将PBA对配体诱导的信号转导的抑制水平与用现有技术抗IGF-1R(抗ErbB3Ab#A-SEQ ID NO:336(HC)和337(LC))和现有技术抗ErbB3(抗IGF-1R Ab#A-SEQ ID NO:327(HC)和SEQ ID NO:328(LC))抗获得的抑制水平进行比较。基本上如本实施例中紧接的上文所述进行实验。
结果(图33、34和35以及表24)指示所述PBA显示相对于抗IGF-1R Ab#A与抗ErbB3Ab#A的组合，对双重路径信号传导的抑制水平特别高。
表24：图33、34和35中呈示的抑制剂处理的IC50值。
C)双特异性蛋白质的稳定性
基本上如上文实施例5D中所述进行各种稳定性研究，且其结果显示所测试的PBA在血清中为稳定的且具有热稳定性。
血清稳定性结果(图36)指示所述PBA显示血清稳定性存在一些差异。最低稳定性为约65％且最高稳定性为约100％。具有约1(或1以上)的数值的PBA视为具有约100％稳定性。
熔融温度结果阐明于表25中。所述结果指示所述PBA在不同温度下伸展。
表25：如通过DSF所测定，各双特异性抗体的Tm值。M27/M7是指具有M27重链和M7轻链的结合位点。
SEC稳定性结果示出于表26中，且指示所述PBA大部分为单体。
表26：通过SEC所测定的各双特异性抗体的单体百分比
实施例8：其它高亲和力抗IGF-1R和抗ErbB3结合结构域的鉴别
经由噬菌体筛选分离许多更多高亲和力抗IGF-1R和抗ErbB3结合结构域。这些蛋白质的重链和轻链的序列阐明于图1-4中的16F序列下方。抗IGF-1R结合位点的序列始于“5-7”且抗ErbB3结合位点的序列始于“E3B”。
实施例9：抗EGF1R+抗ErbB3BPA对双重IGF1和HRG刺激的信号传导 的有效抑制
此实施例展示抗EGF1R+抗ErbB3PBA为DU145和BxPC-3细胞中双重IGF1和HRG刺激的信号转导的有效抑制剂。
基本上如下获得结果。将35,000个BxPC-3细胞于10％血清中在37℃下接种过夜。第二天，使细胞在含有0.5％血清的培养基中饥饿处理且在37℃下孵育过夜。将细胞用指定浓度的Ab预处理一小时并接着用30ng/mlHRG1b1-ECD+100ng/ml IGF1刺激15分钟。在本实施例中且在实施例10-13和21中，对照抗IGF1R和抗ErbB3mAb分别为抗IGF-1R Ab#A和抗ErbB3Ab#A。将细胞在M-Per缓冲液(+蛋白酶/磷酸酶抑制剂)中溶解且进行关于pAKT的ELISA。对于pAKT ELISA测定，将盘用抗AKT(Millipore)涂布，用PBS+2％BSA阻断，与溶解产物和标准物一起孵育，且用生物素化抗pAKT(Ser473)和抗生蛋白链菌素-HRP检测。添加ELISA pico化学发光底物且在Perkin-Elmer Envision盘读取器上读取各盘。在Graphpad Prism中产生所有IC50曲线和计算值。
结果(图39)指示如通过测量磷酸化AKT(pAKT)所测定，PBAM7-G1-M78、P4-G1-M1.3、P4-G1-C8和SF-G1-C8在DU145和BxPC-3细胞中均有效抑制由IGF-1和HRG诱导的信号转导。
实施例10：抗IGF1R+抗ErbB3BPA效力在宽泛的受体概况范围内维持
此实施例展示抗IGF1R+抗ErbB3PBA为具有各种水平的IGF1R或ErbB3的细胞中双重IGF1和HRG刺激的信号转导的有效抑制剂。
基本上如下获得结果。将BxPC-3细胞用表达对照发夹的慢病毒或用对IGF1R或ErbB3具特异性的shRNA(Sigma)(其使所述蛋白质的表达降低约50％)感染。通过FACS和蛋白质印迹分析确认阻断基因表达。接种细胞且如实施例9中所述进行处理。如实施例9中所述测定pAKT的水平。
结果(图40和表27)指示如通过测量磷酸化AKT(pAKT)所测定，PBAM7-G1-M78、P4-G1-M1.3、P4-G1-C8和SF-G1-C8在具有高或较低水平(水平降低50％)的IGF1R或ErbB3的BxPC-3细胞中均有效抑制由IGF-1和HRG诱导的信号转导。
表27：图40中所示的结果的PBA IC50(以M计)和抑制百分比
BPA在表27指定具有“G1”。举例来说，“M7-M78”是指“M7-G1-M78”。实施例11：抗IGF1R+抗ErbB3PBA为低剂量或高剂量IGF1或HRG诱导 的信号传导的有效抑制剂
此实施例展示抗IGF1R+抗ErbB3PBA为回应于高或低配体(IGF1或HRG)浓度的双重IGF1和HRG刺激的信号转导的有效抑制剂。
基本上如下获得结果。将35,000个BxPC-3细胞于10％血清中在37℃下接种过夜。第二天，使细胞在含有0.5％血清的培养基中饥饿处理且在37℃下孵育过夜。细胞用指定浓度的PBA预处理一小时且接着用低(40ng/ml)或高(400ng/ml)IGF1，或低(20ng/ml)或高(200ng/ml)HRG1b1-ECD刺激15分钟。pErbB3、pIGF1R和tIGF1R的ELISA是来自商业来源(R&D Systems)。对于pAKT ELISA测定，将盘用抗AKT(Millipore)涂布，用PBS+2％BSA阻断，与溶解产物和标准物一起孵育，且用生物素化抗pAKT(Ser473)和抗生蛋白链菌素检测。添加ELISA pico化学发光底物且在Perkin-Elmer Envision盘读取器上读取各盘。在Graphpad Prism中产生所有IC50曲线和计算值。
结果(图41、42和表28)指示如通过测量pAKT(pAKT)、pIGF-1R和pErbB3水平所测定，PBA M7-G1-M78、P4-G1-M1.3、P4-G1-C8和SF-G1-C8在BxPC-3细胞中有效抑制由较高或较低水平的IGF-1和HRG诱导的信号转导。
表28：图41和42中所示的结果的PBA IC50(以M计)和抑制百分比
实施例12：抗IGF1R+抗ErbB3PBA抑制基本信号传导
此实施例展示抗IGF1R+抗ErbB3PBA抑制基本水平的信号转导。
基本上如下获得结果。将35,000个BxPC-3细胞于10％血清中在37℃下接种过夜。第二天，使细胞在含有0.5％血清的培养基中饥饿处理且在37℃下孵育过夜。细胞在存在指定浓度的Ab但不存在配体刺激的情况下预处理15分钟或24小时。将细胞在M-Per缓冲液(+蛋白酶/磷酸酶抑制剂)中溶解且进行关于pAKT的ELISA，如实施例9中所述。
结果(图43)指示PBA M7-G1-M78、P4-G1-M1.3和P4-G1-C8抑制pAKT的基本水平。
实施例13：抗IGF1R+抗ErbB3PBA有效下调IGF1R
此实施例展示抗IGF1R+抗ErbB3PBA下调IGF1R。
基本上如下获得结果。将35,000个BxPC-3细胞于10％血清中在37℃下接种过夜。第二天，使细胞在含有0.5％血清的培养基中饥饿处理且在37℃下孵育过夜。接着将细胞在含有0.5％血清和指定浓度的抗体(始于5E-07M的高剂量，随后为3倍稀释液)的培养基中孵育24小时。使细胞溶解且通过ELISA使用来自R&D Systems的市售试剂盒测量总IGF1R。自Prism使用下式计算下调百分比：100*(拟合最大值-观测最小值)/(拟合最大值-无刺激)。
结果(图44和表29)指示PBA M7-G1-M78、P4-G1-M1.3和P4-G1-C8使A549和BxPC-3细胞中的IGF1R水平降低。
表29：PBA对IGF1R的有效下调作用
实施例14：抗IGF1R+抗ErbB3BPA抑制IGF1和IGF2介导的信号传导
此实施例展示抗IGF1R+抗ErbB3BPA抑制由IGF1和IGF2诱导的信号传导。
基本上如下获得结果。在12孔培养盘中于10％血清中每孔接种500,000个DU145和Mia PaCa-2细胞过夜。第2天使细胞血清饥饿过夜。第3天进行抗体预孵育1小时(250nM P4-G1-M1.3或P4-G1-C8)且添加生长因子(100ng/ml的IGF1或IGF2)，15分钟后溶解。将所有细胞用PBS洗涤并在100μl补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的MPer缓冲液中溶解。在4-12％Bis-Tris凝胶上操作样品前，添加含有b-巯基乙醇(b-ME)的加载缓冲液且将溶解产物在95℃下煮沸5分钟。凝胶在150恒定电压下电泳约90分钟且使用iBlot(Invitrogen)转移系统8分钟转移程序转移至硝化纤维素膜上。将膜于Odyssey阻断缓冲液(Licor Biosciences)中在室温下阻断1小时，且接着与一次抗体一起在4℃下于含5％BSA的TBS-T中孵育过夜。所用抗体为pAkt、pIGF1R、β肌动蛋白(全部来自Cell Signaling Technologies)。B-肌动蛋白以1:5,000使用，磷酸化Akt以1:2,000使用，且所有其它抗体以1:1,000使用。第二天，将膜用TBS-T洗涤3次每次5分钟，且接着与在含5％牛奶的TBS-T中以1:15,000稀释的抗兔IgG-DyLight800(Cell Signaling)在室温下一起孵育1小时。接着将膜用TBS-T洗涤3次每次5分钟，且使用Licor Odyssey系统(LicorBiosciences)进行扫描。计算积分强度且针对β-肌动蛋白水平进行校正。
结果(图45)展示BPA P4-G1-M1.3和P4-G1-C8抑制由IGF1或IGF2诱导的AKT磷酸化。
实施例15：抗IGF1R+抗ErbB3BPA部分抑制胰岛素信号传导
此实施例展示抗IGF1R+抗ErbB3BPA部分抑制DU145细胞中的胰岛素信号传导。
基本上如下获得结果。在12孔培养盘中于10％血清中每孔接种500,000个DU145细胞过夜。第2天使细胞血清饥饿过夜。第3天进行Ab预孵育1小时(500nM P4-G1-M1.3)且添加生长因子(100ng/ml的IGF1或5μg/ml的胰岛素)，15分钟后溶解。如实施例14中所述制备溶解产物和蛋白质印迹。
结果(图46)指示BPA P4-G1-M1.3部分抑制由胰岛素诱导的信号转导，如通过pAKT水平所测量。
实施例16：抗IGF1R+抗ErbB3BPA下调ErbB3和IGF1R的总受体水平
此实施例展示抗IGF1R+抗ErbB3BPA下调由IGF1和HRG诱导或未诱导的细胞上的ErbB3和IGF1R水平。
基本上如下获得结果。在12孔培养盘中于10％血清中每孔接种500,000个BxPC-3细胞过夜。第2天使细胞血清饥饿过夜。第3天进行抗体预孵育6小时(250nM M7-G1-M78或P4-G1-C8)。还向一半样品中添加生长因子(100ng/ml的IGF1和30ng/ml的HRG)，15分钟后溶解。如实施例14中所述制备溶解产物和蛋白质印迹。IGF1R、ErbB3和pErbB3还来自Cell SignalingTechnologies。
结果(图47)指示BPA M7-G1-M78和P4-G1-C8使ErbB3和IGF1R的总水平(磷酸化和非磷酸化)降低。
实施例17：抗IGF1R+抗ErbB3BPA在人、小鼠和猴血清中显示稳定性
此实施例展示抗IGF1R+抗ErbB3BPA在人、小鼠和猴血清中为稳定的。
基本上如下获得结果。将PBA在汇集的人血清(Innovative Research)、小鼠血清(Sigma)或食蟹猕猴血清(Innovative Research)中以2.5μM的最终浓度在37℃下孵育0天或5天。接着使用比色ELISA结合测定对样品进行分析。将96孔Reacti-bind盘(Pierce,Fisher目录号PI-15041)用50μl对应于抗体scFv的蛋白质(于PBS中2μg/ml的ErbB3-His或IGF1R-His(R&D Systems，目录号分别为348-RB和305-GR))涂布且在4℃下孵育过夜。第二天，将盘用PBS+0.05％Tween-20(PBS-T)洗涤且在室温下用100μl无蛋白质阻断缓冲液(Pierce)阻断1小时。将盘用PBS-T洗涤且添加50μl各BPA重复两份。浓度始于于PBS-T中500nM(2.5μM bsAb于血清中1:5稀释)且包括十份另外的两倍稀释液(于PBS-T+20％血清中)和一份空白(仅PBS-T+血清)。将盘在室温下孵育两小时且接着用PBS-T洗涤。添加50μl于PBS-T中按1:40,000稀释的抗Fc-HRP(Jackson Labs)，且将盘在黑暗中在室温下孵育1小时。盘再次用PBS-T洗涤且添加100μl TMB底物(Thermo Scientific，以1:1混合的TMB与过氧化物溶液)。将盘在室温下孵育5-15分钟直至出现蓝色，且用100μl停止溶液(Cell Signaling Technology)使反应停止。在PerkinElmer Envision盘读取器上读取450nm下的吸光度且用GraphPad Prism产生结合曲线。
结果(图48)展示BPA M7-G1-M78、P4-G1-M1.3和P4-G1-C8在小鼠和猕猴血清中稳定至少5天且P4-G1-M1.3在人血清中稳定至少6天。
实施例18：抗IGF1R+抗ErbB3BPA与人、小鼠、大鼠和猴IGF1R和ErbB3 显示交叉反应性
此实施例展示抗IGF1R+抗ErbB3BPA可与人、小鼠、大鼠和猴IGF1R和ErbB3交叉反应。
基本上如下获得结果。将96孔盘(Pierce,Fisher目录号PI-15041)用50μl于PBS中2μg/ml的物种特异性ErbB3-His或IGF-1R-His(R&D Systems，目录号分别为348-RB和305-GR)涂布且在4℃下孵育过夜。第二天，将盘用PBS+0.05％Tween-20(PBS-T)洗涤且在室温下用100μl无蛋白质阻断缓冲液(Pierce)阻断1小时。将盘用PBS-T洗涤且添加50μl各PBA重复两份。浓度始于500nM(于PBS-T中)且包括十份另外的两倍稀释液和一份空白(仅PBS-T)。将盘在室温下孵育两小时且接着用PBS-T洗涤。添加50μl于PBS-T中按1:40,000稀释的抗Fc-HRP(Jackson Labs)，且将盘在黑暗中在室温下孵育1小时。盘再次用PBS-T洗涤且添加100μl TMB底物(Thermo Scientific，以1:1混合的TMB与过氧化物溶液)。将盘在室温下孵育5-15分钟直至出现蓝色，且用100μl停止溶液(Cell Signaling Technology)使反应停止。在PerkinElmer Envision盘读取器上读取450nm下的吸光度且使用GraphPad Prism产生结合曲线。
结果(图49)展示BPA P4-G1-C8、P4-G1-M1.3和M7-G1-M78有效结合人、小鼠、大鼠和猴IGF1R和ErbB3。
实施例19：抗IGF1R+抗ErbB3BPA阻断IGF1和IGF2与其受体IGF1R 的结合
此实施例展示抗IGF1R+抗ErbB3BPA阻断IGF1与IGF2两者与的IGF1R结合。
基本上如下获得结果。将ELISA盘用IGF1R-His涂布且如实施例18中所述阻断。阻断步骤后，洗涤各盘且与IGF1(100ng/ml)或IGF2(100ng/ml)(EMD Chemicals)一起在室温下孵育1小时。将盘用PBS-T洗涤且添加100μl各Ab重复两份。浓度始于500nM(于PBS-T中)且包括十份另外的两倍稀释液和一份空白(仅PBS-T)。将盘在室温下孵育1小时且接着用PBS-T洗涤。添加50μl在PBS-T中以1:1,000稀释的兔抗人IGF1(Thermo Scientific)或兔抗人IGF2(Abcam)在室温下1小时。再次洗涤各盘且在PBS-T于中以1:1,000稀释的抗兔HRP(Cell Signaling)中在室温下孵育1小时。如上文所述将各盘显色、读取和分析。
结果(图50)指示P4-G1-M1.3抑制IGF1与IGF2两者与IGF1R的结合。实施例20：抗IGF1R+抗ErbB3BPA在小鼠体内显示剂量依赖性和不同的 半衰期且在食蟹猕猴体内显示长半衰期
此实施例提供抗IGF1R+抗ErbB3BPA在小鼠和食蟹猕猴体内的药物动力学性质。
基本上如下获得结果。给药和样品收集：通过静脉内快速注射向小鼠给予每只小鼠100μg或每只小鼠500μg的P4-G1-M1.3或M7-G1-M78，且在0.25、1、4、8、24、48、72、96和168小时时取血。每个时间点对四只小鼠放血。对食蟹猕猴(WIL Research Laboratories)静脉内输注P4-C8和P4-M1.3。各组中的两只猴给予5mg/kg或25mg/kg且在0.08、1、4、8、24、48、72、96和168小时时放血。ELISA结合测定和模拟分析：将96孔盘(Pierce,Fisher目录号PI-15041)用50μl于PBS中2μg/ml的IGF1R(无标签)涂布且在4℃下孵育过夜。将盘用PBS-0.05％Tween-20(PBS-T)洗涤且在室温下用100μl的Pierce无蛋白质阻断缓冲液阻断1小时。再次用PBS-T洗涤各盘。将100μl样品和标准物添加至盘中且在室温下孵育2小时。对于标准曲线，将抗体于PBS-T中稀释至12μg/ml，接着为10次另外的3倍稀释，最后的孔为空白。将血清样品于PBS-T中以1:50稀释，附加10次另外的3倍稀释，且最后的孔为空白。将盘用PBS-T洗涤且添加100μl于PBS-T中1μg/ml的ErbB3-His在室温下1小时。洗涤各盘且添加100μl于PBS-T中以1:10,000稀释的抗His-HRP(Abcam)且在室温下孵育(覆盖)1小时。盘再次用PBS-T洗涤且添加100μl TMB底物(Thermo Scientific，以1:1混合的TMB与过氧化物溶液)。将盘在室温下孵育5-15分钟直至出现蓝色，且用100μl停止溶液(CellSignaling Technology)使反应停止。在PerkinElmer Envision盘读取器上读取450nm下的吸光度，且使用MATLAB(Mathworks-www.mathworks.com)和WinNonLin(Pharsight-www.pharsight.com)根据标准方案进行数据分析。
小鼠中的结果(表30)指示BPA M7-G1-M78和P4-G1-M1.3在小鼠体内具有平均3.33至41.90小时范围内的半衰期，取决于BPA和施用小鼠的BPA的浓度。食蟹猕猴中的结果(表31)指示P4-G1-C8和P4-G1-M1.3的半衰期在5mg/kg时分别为51和61小时，且在25mg/kg PBA时分别为115和78小时。因此，具有方向抗IGF1R-抗ErbB3的PBA(即其中抗IGF1R部分为全长Ab且抗ErbB3部分由两个scFv构成)比具有相反构形的PBA(即其中抗ErbB3为全长Ab且抗IGF1R部分由两个scFv构成)更稳定。
表30：小鼠体内BPA的半衰期(以小时计)
表31：食蟹猕猴体内BPA的半衰期(以小时计)
MATLAB
WinNonLin
实施例21：P4-G1-M1.3显示在体外随时间抑制配体诱导的受体活化和 Akt/mTOR/ERK信号传导。
此实施例展示P4-G1-M1.3随时间抑制BxPC-3培养细胞中配体诱导的IGF-1R和ErbB3以及下游蛋白质Akt、Erk、mTOR和S6的磷酸化。
方法
BxPC-3细胞维持于补充有10％胎牛血清、青霉素/链霉素和L-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基中。将3.5×104个细胞于完全培养基中接种于96孔组织培养盘中。第二天，将完全培养基置换为无血清培养基且细胞在37℃下孵育过夜。将细胞用1μM P4-G1-M1.3预处理1小时且保持于无抑制剂的无血清培养基中，且接着将所有细胞用100ng/ml IGF1(Calbiochem)和70ng/mlHRG(R&D Systems)刺激5、15、30、60或120分钟。将细胞用PBS洗涤并在补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的MPer缓冲液中溶解。
如上文实施例4中所述进行磷酸化IGF1R(pIGF1R)、磷酸化ErbB3(pErbB3)和磷酸化AKT(pAKT)的ELISA。根据制造商的说明进行磷酸化ERK(pERK，Cell Signaling Technology目录号7246)、磷酸化S6(pS6，R&DSystems目录号DYC3918)和磷酸化mTOR(pmTOR，R&D Systems目录号DYC1665)的ELISA。各磷酸化蛋白质的所得浓度针对使用BCA方法测得的总蛋白质水平进行校正。
结果(图51)指示P4-G1-M1.3能够在IGF-1和HRG存在下显著阻断配体诱导的磷酸化IGF-1R(51A)、磷酸化ErbB3(51B)、磷酸化Akt(51C)、磷酸化ERK(p44/p42；51D)、磷酸化mTOR(Ser2448，51E)和磷酸化S6(Ser235/236；51F)产生。
实施例22：抗IGF1R+抗ErbB3PBA阻断由IGF1R-胰岛素受体异二聚体介 导的信号传导
此实施例展示由抗IGF1R+抗ErbB3PBA对胰岛素和IGF2信号传导的抑制作用是由IGF1R-胰岛素受体异二聚体介导。
基本上如下获得结果。在12孔培养盘中于10％血清中每孔接种500,000个BxPC-3和A673细胞过夜。第2天使细胞血清饥饿过夜。第3天进行抗体预孵育1小时(500nM P4-G1-M1.3)且添加生长因子(100ng/ml的IGF1、IGF2或5μg/ml的胰岛素)，15分钟后溶解。
结果(图52)指示P4-G1-M1.3能够在表达高水平胰岛素受体(IR)的A673细胞中显著阻断IGF2和胰岛素信号传导。此抑制水平未见于表达低IR水平的BxPC-3细胞中。
实施例23：PBA P4-G1-M1.3显示优于抗IGF-1R mAb的降低mTOR活化 和mTOR蛋白水平的作用
此实施例展示在研究结束BxPC-3肿瘤中，P4-G1-M1.3显示优于抗IGF-1R mAb的控制mTOR活化的作用。
基本上如下进行来自BxPC-3异种移植物研究的肿瘤的概况分析。制备具有人肿瘤细胞系异种移植物的小鼠且基本上如上文实施例3D中所述施用各种处理。自PBS对照组收集五个研究结束肿瘤，基本上如下制备P4-G1-M1.3的最高剂量组(每只小鼠500μg，q3d)和抗IGF1R Ab#A(加尼图单抗；SEQ ID 327+SEQ ID 328)的最高剂量组(每只小鼠368μg，q3d)。通过组织粉碎和于TER1缓冲液(Invitrogen)中溶解产生溶解产物。通过BCA方法定量总蛋白质，且将相等总蛋白质在4-12％SDS-PAGE凝胶上电泳。使用标准方法将凝胶转移至硝化纤维素上。使用以下进行蛋白质印迹：抗mTOR和抗磷酸化mTOR(Ser2448)一次抗体(所有均来自Cell Signaling Technology)。所用二次抗体为抗兔IgG-DyeLight800(Cell Signaling Technology)。使用Li-CorOdyssey系统使印迹显色。通过将靶标条带的强度除以其相关β-肌动蛋白对照条带来进行针对β-肌动蛋白的校正。
结果(图53A和53B以及表32)指示来自经过PBA P4-G1-M1.3处理的小鼠的肿瘤中的mTOR和磷酸化mTOR(Ser2448)水平显著低于经抗IGF-1R Ab#A处理的小鼠。
表32.在研究结束BxPC-3肿瘤中，P4-G1-M1.3显示优于抗IGF-1R Ab#A的控制mTOR活性的作用。
实施例24：P4-G1-M1.3在Caki-1和BxPC-3异种移植物模型中下调受体且
抑制PI3K/Akt/mTOR信号传导
此实施例展示在Caki-1人肾透明细胞癌和BxPC-3人胰腺腺癌异种移植物模型的研究结束肿瘤中，P4-G1-M1.3下调受体且抑制PI3K/Akt/mTOR信号传导。
基本上如下进行来自Caki-1异种移植物研究的肿瘤的概况分析。制备具有人肿瘤细胞系异种移植物的小鼠且基本上如上文实施例3D中所述施用各种处理。对于Caki-1异种移植物研究，建立3个组，各自含有5只小鼠。所述组包括对照组、P4-G1-M1.3组(600μg)和抗IGF-1R Ab#A组(291μg剂量1，320μg剂量2)。抗体以三日时间间隔腹膜内给予两次。依维莫司每日口服给予一次。第二次抗体剂量24小时后收集肿瘤。
基本上如实施例23中所述进行来自BxPC-3异种移植物研究的肿瘤的概况分析。
最初对肿瘤称重且在CryoPrep组织粉碎机(CP-02型，Covaris)中进行粉碎。将含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的组织提取试剂1(TER1，LifeTechnologiesTM)以每100mg组织1ml TER1的比率添加至肿瘤中。样品在冰上孵育30分钟以使组织溶解且根据制造商的方案推挤穿过QIAshredderTM管柱(Qiagen)。根据制造商的方案进行BCA分析(Pierce)以测定蛋白质浓度。
通过蛋白质印迹分析样品。添加含有β-巯基乙醇(β-ME)的加载缓冲液且将溶解产物在95℃下煮沸5分钟。在18孔凝胶(BioRad)的各孔上电泳约40μg蛋白质和两份梯形标记(Invitrogen)。凝胶在150恒定电压下电泳约90分钟且使用(Invitrogen)转移系统8分钟转移程序转移至硝化纤维素膜上。将膜于阻断缓冲液(Biosciences)中在室温下阻断1小时，且接着与一次抗体一起在4℃下于含5％BSA的TBS-T中孵育过夜。所有抗体均购自Cell Signaling且以推荐稀释度使用。第二天，将膜用TBS-T洗涤3次每次5分钟，且接着与在含5％牛奶的TBS-T中以1:10,000-15,000稀释的抗兔IgG-800(Cell Signaling)或抗兔800(Biosciences)在室温下一起孵育1小时。接着将膜用TBS-T洗涤3次每次5分钟，且使用 系统(Biosciences)进行扫描。使用Image Studio 2.0定量条带强度且针对β-肌动蛋白水平进行校正。在Caki-1异种移植物中，将对照肿瘤与经过P4-G1-M1.3、抗IGF-1R Ab#A+抗ErbB3Ab#A或依维莫司处理的肿瘤进行比较。
Caki-1概况分析研究的结果(图54A-F)指示IGF-1R、胰岛素受体、ErbB3、EGFR、pAKT(Ser473或Thr308)、pFox01(Thr24)/Fox03a(Thr32)和磷酸化mTOR(Ser2448或Ser2481)的水平均与对照小鼠中的水平类似，或在来自经过P4-G1-M1.3处理的小鼠的肿瘤中比经过抗IGF-1R Ab#A+抗ErbB3Ab#A组合或mTOR抑制剂依维莫司处理的小鼠低。
BxPC-3概况分析研究的结果(图55A-C)指示IGF-1R、ErbB3、pEGFR、pmTOR(S2448)和pS6(S235/236)均在来自经过P4-G1-M1.3处理的小鼠的肿瘤中比经过抗IGF-1R Ab#A或仅PBS处理的小鼠低。
实施例25：P4-G1-M1.3阻断IGF-1和IGF-2与受体的结合
此实施例借助于ELISA测定展示P4-G1-M1.3有效阻断IGF-1和IGF-2与IGF-1R的结合。
将96孔Reacti-盘(Pierce)用50μl IGF-1R-His(R&D Systems目录号305-GR；于PBS中2μg/ml)涂布且在4℃下孵育过夜。第二天，将盘用PBS+0.05％Tween-20(PBS-T)洗涤且在室温下用100μl无蛋白质阻断缓冲液(Pierce)阻断1小时。将盘用PBS-T洗涤且添加100μl P4-G1-M1.3，重复两份。抗体浓度始于500nM(于PBS-T中)且包括十份另外的两倍稀释液和一份空白(仅PBS-T)。将盘在室温下孵育两小时且接着用PBS-T洗涤。以100ng/ml添加100μl IGF-1或IGF-2(EMD Chemicals)且在室温下孵育一小时。洗涤后，添加100μl兔抗IGF-1或兔抗IGF-2(均为Abcam，5μg/ml)至盘中且在室温下孵育一小时。接着洗涤盘且与100μl抗兔HRP(Cell Signaling)一起在室温下孵育1小时，再次洗涤且添加100μl TMB底物(Cell Signaling)。将盘在室温下孵育5-15分钟直至出现蓝色，且用100μl停止溶液(Cell SignalingTechnology)使反应停止。在PerkinElmer Envision盘读取器上读取450nm下的吸光度且使用GraphPad产生结合曲线。
ELISA测定的结果(图56)展示P4-G1-M1.3以剂量依赖性方式阻断IGF-1与IGF-2两者与IGF-1R的结合。
实施例26：DU145、BxPC-3、SK-ES-1和Caki-1肿瘤异种移植物模型中的
P4-G1-M1.3和P4-G1-C8
对于以下各研究A-D，将细胞用PBS:减去生长因子的基质胶1:1再悬浮且皮下注射至Nu/Nu小鼠体内。允许肿瘤发展8天。抗体以每只小鼠指定剂量每3天一次(q3d)腹膜内注射。每周两次通过卡尺手动测量肿瘤长度和宽度，且使用下式计算肿瘤体积：π/6(LxW2)。研究的各组含有10只动物。
A.P4-G1-C8和P4-G1-M1.3在体内抑制DU145前列腺癌细胞的肿瘤生
长。
对于此DU145异种移植物研究，制备8×106个DU145细胞且如上所述使用。
结果(图57A)展示P4-G1-C8与P4-G1-M.3均在体内抑制前列腺癌细胞的生长。
B.P4-G1-C8和P4-G1-M1.3比抗IGF-1R IgG更好地在体内抑制BxPC-3
胰腺癌细胞的肿瘤生长。
对于此异种移植物研究，制备5×106个BxPC-3细胞且如上所述使用。
结果(图57B)展示P4-G1-C8和P4-G1-M1.3在体内抑制BxPC-3胰腺癌细胞的肿瘤生长且在抑制肿瘤细胞生长方面均优于抗IGF-1R Ab#A。
C.P4-G1-M1.3在体内抑制SK-ES-1尤文氏肉瘤癌细胞的肿瘤生长
对于此异种移植物研究，制备10×106个SK-ES-1细胞且如上所述使用。
结果(图57C)展示P4-G1-M1.3以剂量依赖性方式抑制肿瘤细胞生长。
D.P4-G1-M1.3在体内抑制Caki-1肾细胞癌的癌细胞的生长且显示抑制
优于抗IGF-1R IgG与抗ErbB3IgG的组合。
对于此研究，制备8×106个Caki-1细胞且如上所述使用。
结果(图57D)展示P4-G1-M1.3以剂量依赖性方式抑制肿瘤细胞生长且在抑制肿瘤细胞生长方面比抗IGF-1R Ab#A(加尼图单抗；SEQ ID 327+SEQ iD328)与抗ErbB3Ab#A(SEQ ID 336+SEQ ID 337)抗体的组合更有效，其中这些抗体以相等暴露量或以等摩尔浓度剂量给予。
实施例27：用于设计小鼠中的PD/功效研究的PK数据的计算分析
此实施例描述用于拟合数学模拟与实验数据以估算M1.3-G1-P4的药物动力学(PK)参数的计算方法。
拟合数学模拟与PK数据
经由实施静脉内(IV)快速注射靶标介导的药物配置(TMDD)模型来推断M1.3-G1-P4的PK参数。IV TMDD为结构化为一组4个相关微分方程的2隔室PK模型，如下：
在方程1A-1D中，Dc和Dp为中心和周边隔室中药物的浓度，Vc和Vp为中心和周边隔室的体积，而R和D:R表示中心隔室中游离靶受体和药物-受体复合物的浓度。此外，Cld、Cl、kin、kout、kon、koff和kel分别表示转运穿过隔室的速率常数、药物自中心隔室的清除率、受体合成、受体降解、药物-受体缔合、药物-受体解离和药物-受体自中心隔室的清除率。IV TMDD模型描述当相关药物直接注射于中心隔室(血液)中时，中心隔室中药物与靶受体结合和药物清除的动态过程以及药物自中心隔室转运至周边隔室的过程。拟合TMDD模型与自小鼠血液获得的实验数据使得能够估算M1.3-G1-P4的PK性质。
图58示出TMDD模型与实验数据的拟合(实线＝静脉内给予每只小鼠500μg剂量的拟合，点线＝静脉内给予每只小鼠100μg剂量的拟合)。M1.3-G1-P4PK参数列于下表24中。
表24.自拟合IV TMDD模拟与自小鼠血液获得的PK数据推断出的M1.3-G1-P4的PK参数
等同物
本领域的技术人员将认识到，或能够仅使用常规实验即可确认和实施本文所述特定实施方案的许多等同物。所述等同物意欲由以下权利要求书涵盖。附属权利要求中公开的实施方案的任何组合预期在本发明的范围内。
以引用的方式并入
本文提及的每一美国和外国专利和申请中的专利申请和公布各自的公开内容明确以引用的方式整体并入本文。
Claims (10)
1.一种多价双特异性抗体(PBA)，所述抗体为包含两对多肽链的蛋白质，所述两对中的各对包含通过至少一个重链-轻链键联结于轻链的重链；其中
各对包含至少一个抗IGF-1R结合位点和至少一个抗ErB3结合位点；且
各对包含含有所述PBA的所述重链的N端部分和所述PBA的所述轻链的N端部分的第一结合位点以及为完全由所述PBA的所述重链包含的C端scFv的第二结合位点，所述C端scFv含有通过scFv接头联结于轻链可变区的重链可变区；且
所述抗IGF-1R结合位点经由由所述PBA的所述重链包含的重链免疫球蛋白(HC Ig)恒定区连接于所述抗ErbB3结合位点，且
所述两对由各对的所述HC Ig恒定区之间的至少一个键联接，且
(i)所述抗IGF-1R结合位点包含重链可变(VH)结构域，所述重链可变(VH)结构域包含一组三个VH互补决定区(CDR)，所述VH互补决定区(CDR)包含(a)具有包含选自由SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:8-31和SEQ ID NO:384-385组成的组的SEQ ID NO的氨基酸序列的氨基酸序列的重链的VHCDR1(氨基酸编号26-35)、VHCDR2(氨基酸编号51-66)和VHCDR3(氨基酸编号99-111)；或(b)一组三个VH互补决定区(CDR)，所述VH互补决定区(CDR)包含含有SEQ IDNO:302的VHCDR1、含有SEQ ID NO:303的VHCDR2和含有SEQID NO:304的VHCDR3；和轻链可变(VL)结构域，所述轻链可变(VL)结构域包含一组三个VLCDR，所述VLCDR包含(c)具有包含选自由SEQ ID NO:2-3、SEQ ID NO:32-133和SEQ ID NO:386-387组成的组的SEQ ID NO的氨基酸序列的氨基酸序列的轻链的VLCDR1(氨基酸编号24-34)、VLCDR2(氨基酸编号50-56)和VLCDR3(氨基酸编号89-97)；或(d)一组三个VLCDR，所述VLCDR包含含有SEQ IDNO:305的VLCDR1、含有SEQ ID NO:306的VLCDR2和含有SEQID NO:307或SEQ ID NO:308的VLCDR3，且
各CDR进一步包含氨基端和羧基端，其中各组CDR的所述CDR在相应重链或轻链中按CDR1、CDR2和CDR3的线性氨基至羧基顺序排列，且
(ii)所述抗ErbB3结合位点包含重链可变(VH)结构域，所述重链可变(VH)结构域包含一组三个VH CDR，所述VH CDR包含(e)具有包含选自由SEQ ID NO:4-5、SEQ ID NO:134-165和SEQ ID NO:388组成的组的SEQ ID NO的氨基酸序列的氨基酸序列的重链的VHCDR1(氨基酸编号26-35)、VHCDR2(氨基酸编号51-66)和VHCDR3(氨基酸编号99-111)；或(f)一组三个VH CDR，所述VHCDR包含含有SEQ ID NO:309的VHCDR1、含有SEQ ID NO:310的VHCDR2和含有SEQ ID NO:311的VHCDR3；和轻链可变(VL)结构域，所述轻链可变(VL)结构域包含一组三个VLCDR，所述VLCDR包含(g)具有包含选自由SEQ ID NO:6-7和SEQ IDNO:166-200组成的组的SEQ ID NO的氨基酸序列的氨基酸序列的轻链的VLCDR1(氨基酸编号23-33)、VLCDR2(氨基酸编号49-55)和VLCDR3(氨基酸编号88-98)；或(h)轻链可变(VL)结构域，所述轻链可变(VL)结构域包含一组三个VLCDR，所述VLCDR包含含有SEQ ID NO:312的VLCDR1、含有SEQ ID NO:313的VLCDR2和含有SEQ ID NO:314或SEQ ID NO:315的VLCDR3，且
各CDR进一步包含氨基端和羧基端，其中各组CDR的所述CDR在所述抗体中按CDR1、CDR2和CDR3的线性氨基至羧基顺序排列，
且
(iii)其中所述PBA不包含以下两者：a)包含含有SEQ ID NO:35的轻链和含有SEQ ID NO:11的重链的抗IGF-1R模块，和b)包含含有SEQ ID NO:175的轻链和含有SEQ ID NO:145的重链的抗ErbB3模块。
2.如权利要求1所述的多价双特异性抗体，其中所述抗IGF-1R VLCDR3包含SEQ ID NO:308或所述抗ErbB3VLCDR3包含SEQ ID NO:315。
3.如权利要求1或2所述的多价双特异性抗体，其中所述两对多肽链具有基本上一致的序列。
4.如权利要求1至3中任一项所述的多价双特异性抗体，其中所述HC Ig恒定区之间的所述至少一个键中的至少一者为二硫键或所述至少一个重链-轻链键中的至少一者为二硫键。
5.如权利要求1至3中任一项所述的多价双特异性抗体，其中所述HC Ig恒定区之间的所述至少一个键中的至少一者为范德华键(van der Waals bond)或所述至少一个重链-轻链键中的至少一者为范德华键。
6.如权利要求1至5中任一项所述的多价双特异性抗体，其中所述抗ErbB3结合位点为所述C端scFv。
7.如权利要求1至5中任一项所述的多价双特异性抗体，其中所述抗IGF-1R结合位点为所述C端scFv。
8.如权利要求1至7中任一项所述的多价双特异性抗体，其中所述抗IGF-1R结合位点、所述HC Ig恒定区和所述抗ErbB3结合位点包含由单一连续多肽链包含的那一对的所述重链。
9.如权利要求1至8中任一项所述的多价双特异性抗体，其：
(i)在体外在1μM或1μM以下、或100nM或100nM以下、或10nM或10nM以下、或1nM或1nM以下的浓度下抑制肿瘤细胞生长，或
ii)如pErbB3和pIGF-1R中任一者或两者磷酸化的抑制所指示，以10nM或10nM以下、或1nM或1nM以下、或100pM或100pM以下的IC50，或至少70％、或至少80％、或至少90％的最大抑制百分比抑制异调蛋白(heregulin)和IGF1诱导的信号转导中的任一者或两者。
10.如权利要求9所述的多价双特异性抗体，其中生长抑制在培养物中在DU145细胞中以CTG测定进行测量。
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