JP2018533620A - 血管新生因子に対する高力価のモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

本発明は、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）およびアンジオポエチン２（Ａｎｇ−２）に対する中和モノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を含む医薬組成物、および患者に該医薬組成物を投与することを含む治療法に関する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年９月１４日出願の米国仮特許出願第６２／２１８，２２６号（その内容全体は、引用により本明細書中に包含させる）に基づく優先権の利益を主張する。

発明の分野
本発明は、一般的に、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）と新規の生物学的製剤を開発するための組換えＤＮＡ技術との組合せに関し、より具体的には、例えば、血管内皮細胞増殖因子またはアンジオポエチン−２に結合してこれを中和するモノクローナル抗体の産生に関する。

発明の背景
血管形成は、既存の血管から新しい血管を形成するプロセスである。血管形成は、正常な発生および組織再生のためだけでなく、酸素と栄養素を腫瘍に供給するためにサイズが２〜３ｍｍを超える腫瘍の増殖のためにも必要とされる（N. Vasudev et al., Angiogenesis 17：471−494, 2014に概説されている）。従って、血管形成の阻害によって、腫瘍の増殖を抑制し得ることが提唱された（J. Folkman, N Eng J Med 285:1182−1186, 1971）。異常な血管形成はまた、加齢黄斑変性症、糖尿病性網膜症および関節リウマチを含む他の病状にも関与している。

血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子１および２（ＦＧＦ１およびＦＧＦ２）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、胎盤増殖因子（ＰＧＦまたはＰＩＧＦ）、インシュリン様増殖因子（ＩＧＦ）、アンジオポエチン１および２（Ａｎｇ−１およびＡｎｇ−２）、ならびに肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を含む多くの細胞因子が、血管形成を促進する（R. Gacche et al., Prog Biophys Mol Biol 113:333−354, 2013に概説されている）。ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄからなる相同性の増殖因子のＶＥＧＦファミリーは、内皮細胞の増殖、遊走および管形成を媒介することにより重要な役割を果たす（T. Veikkola et al., Semin Cancer Biol 9: 211−220, 1999に概説されている）。これらのうち、ＶＥＧＦ−Ａは、最もよく研究されており、正常なおよび腫瘍の血管形成において重要な役割を果たす。識別文字のないＶＥＧＦは、本明細書中、ＶＥＧＦ−Ａを意味する。

ＶＥＧＦ（すなわち、ＶＥＧＦ−Ａ）は、２つの同一の２３ｋＤａモノマーからなるホモ二量体糖タンパク質である。ＶＥＧＦ_１２１、ＶＥＧＦ_１６５、ＶＥＧＦ_１８９およびＶＥＧＦ_２０６を含むヒトＶＥＧＦのいくつかの選択的にスプライシングされたイソ型が存在する（N. Ferrara et al. Nature Med 9:669−676, 2003）。これらのうち、ＶＥＧＦ_１６５は最も豊富に存在し、かつ分裂促進性のイソ型であり、２３ｋＤａのサブユニットに相当する。ＶＥＧＦ_１８９およびＶＥＧＦ_２０６はヘパリンに結合し、それにより、細胞外マトリックスに結合する。ＶＥＧＦ_１６５は、拡散性である（ＶＥＧＦの構造および生物学については、Q.T. Ho et al., Int J Biochem Cell Biol 39:1349−1357, 2007に概説されている）。ＶＥＧＦファミリーメンバーは、３つのチロシンキナーゼ型細胞受容体：ＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１）、ＶＥＧＦＲ２（Ｆｌｋ−１；ＫＤＲ）およびＶＥＧＦＲ３に結合し、主にＶＥＧＦＲ２を介してＶＥＧＦ−Ａシグナル伝達をもたらし（C. Fontanella et al., Ann Transl Med 2:123, 2014に概説されている）、そのためＶＥＧＦＲ２は本明細書中、ＶＥＧＦＲとも称される。ＶＥＧＦのＶＥＧＦＲ２への結合は、受容体の二量体化、リン酸化ならびにＭＥＫ−ＭＡＰおよびＰＩ３Ｋ−ＡＫＴシグナル伝達の活性化をもたらし、細胞増殖および内皮細胞生存を引き起こす。

ＶＥＧＦは、腫瘍における血管形成の主要な誘導因子であるため、ＶＥＧＦの阻害剤は、癌を処置する可能性を有する。ヒトＶＥＧＦに対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、マウスにおけるヒト腫瘍異種移植片の増殖を阻害するのに有効であった（K.J. Kim et al., Nature 362:841−844, 1993）。この抗体のヒト化形態であるベバシズマブ（Avastin（登録商標））は、いくつかの癌種に対して患者の生存率を改善することが一連の臨床治験において示されており（上記の文献、N. Vasudevに概説されている）、種々の他の薬剤と組合せて、結腸直腸癌、肺癌、腎癌、頚部癌および卵巣癌の種々の癌腫の処置に、およびグリア芽細胞腫の処置に承認されている（Avastin（登録商標）パッケージラベル）。しかしながら、ベバシズマブの無増悪生存期間または全生存期間への利点は、一般的には、通常数か月と非常に短い（R.S. Kerbel, The Breast S3: S56−S60, 2011）。ベバシズマブの改良を試みて、ＭＡｂ７３９２（ＷＯ ２０１１／１５９７０４）、ヒト化ウサギｍＡｂ ｈＥＢＶ３２１（Y. Yu et al., PLOS ONE 5:e9072、2010；米国特許第７，８０３，３７１号；ＵＳ ２０１２／０２３１０１１）、ヒト化ｍＡｂ Ｙ０３１７（Y. Chen et al., J Mol Biol: 293:865−81, 1999）、ならびにヒトｍＡｂ Ｂ２０．４．１およびＢ２０．４.１．１（ＵＳ ２００９／０１４２３４３）を含む他の抗ＶＥＧＦ ｍＡｂが作製されている。しかしながら、これらのｍＡｂは、販売の承認を受けていない。

サイトカインのアンジオポエチンファミリーは、アンジオポエチン１（Ａｎｇ−１）、アンジオポエチン２（Ａｎｇ−２）およびヒトではあまり研究されていないアンジオポエチン４からなる（アンジオポエチンおよびその受容体の構造および機能の総説については、M. Thomas et al. Angiogenesis 12:125−137, 2009 および E. Fagiani et al., Cancer Letters 328: 18−26, 2013を参照のこと）。アンジオポエチンは、７０−７５ｋＤａの二量体分子量を有する分泌型糖タンパク質であるが、三量体および四量体などの異種多量体も形成する。そのようなオリゴマー化は、受容体の活性化に必要である。アンジオポエチンは、Ｔｉｅ−２チロシンキナーゼ受容体に結合してシグナル伝達を媒介する。Ｔｉｅ−１は、Ｔｉｅ−２とヘテロ二量体を形成し、シグナル伝達を調節することができるオーファン受容体である。一方、Ａｎｇ−１は、Ｔｉｅ−２を介して陽性のシグナルを伝達するが、Ａｎｇ−２は、状況に応じてアゴニストであるか、またはアンタゴニストであると報告されている。アンジオポエチンは、複雑な機序で血管系に作用する。Ａｎｇ−１は、一般的に血管を安定化させて、胚における血管の発生にとって重要であるが、内皮細胞によって放出されるＡｎｇ−２は、Ａｎｇ−１に対する競合的アンタゴニストとして作用し得て、それ故に、内皮細胞からの周皮細胞の分離を促進し、血管先端細胞（tip cell）の発芽（sprouting）を促進し、そしてＶＥＧＦの存在下で、血管形成を促進する。

Ａｂ５３６（J. Oliner et al., Cancer Cell 6:507−16, 2004）、ＭＥＤＩ−３６１７（C.C. Leow et al., Int J Oncol 40:1321−30, 2012、およびA. Buchanan et al., MAbs 5:255−62, 2013）、ＬＣ０６（M. Thomas et al., PLoS One. 8:e54923, 2013）およびＲＥＧＮ９１０（C. Daly et al., Cancer Res 73:108−18, 2012）を含む、Ａｎｇ−２に特異的に結合してこれを中和するいくつかのヒトｍＡｂが、ファージディスプレイまたはトランスジェニックマウスを用いて作製されている。これらのｍＡｂは、Ａｎｇ−２のＴｉｅ−２への結合を阻止し、血管形成を阻害し、かつ種々のモデルにおける腫瘍異種移植片の増殖を阻害する。ＶＥＧＦおよびＡｎｇ−２の両方に結合する二重特異性抗体も報告されている（Y. Kienast, Clin Cancer Res 19:6730−6740, 2013）。

発明の概要
一態様において、本発明は、本明細書に記載のＶＥ１抗体と同じエピトープを有するヒト血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）に対する中和モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を提供する。抗体の例は、ＶＥ１ならびにＶＥ１の軽鎖可変領域配列由来の３つのＣＤＲを有する軽鎖可変領域およびＶＥ１の重鎖可変領域配列由来の３つのＣＤＲを有する重鎖可変領域を含むｍＡｂ、例えばＶＥ１のキメラ形態およびヒト化形態、例えば図３に記載のヒト化軽鎖および重鎖を含むｍＡｂである。ｍＡｂは、ＶＥＧＦの細胞受容体への結合を含む、ＶＥＧＦの少なくとも１つ、好ましくはいくつかまたはすべての生物学的活性を阻害する。有利には、抗ＶＥＧＦ ｍＡｂは、マウスにおけるヒト腫瘍異種移植片の増殖を阻害する。そのようなｍＡｂを含む医薬組成物もまた提供され、ならびに疾患、例えば癌を有する患者にかかる医薬組成物を投与することにより、該患者を処置する方法もまた提供する。

別の態様において、本発明は、本明細書に記載のＡ２Ｔ抗体と同じエピトープを有するヒトアンジオポエチン２（Ａｎｇ−２）に対する中和モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を提供する。抗体の例は、Ａ２ＴならびにＡ２Ｔの軽鎖可変領域配列由来の３つのＣＤＲを有する軽鎖可変領域およびＡ２Ｔの重鎖可変領域配列由来の３つのＣＤＲを有する重鎖可変領域を含むｍＡｂ、例えば、Ａ２Ｔのキメラ形態およびヒト化形態、例えば図１３に記載のヒト化軽鎖および重鎖を含むｍＡｂである。ｍＡｂは、Ａｎｇ−２のその細胞受容体への結合および血管形成の刺激を含む、Ａｎｇ−２の少なくとも１つ、好ましくはいくつかまたはすべての生物学的活性を阻害する。そのようなｍＡｂを含む医薬組成物もまた提供され、ならびに疾患、例えば癌を有する患者にかかる医薬組成物を投与することにより、該患者を処置する方法もまた提供する。

上記の抗体の何れかに由来する１以上のドメインを、別の標的を有する異なる抗体由来の１以上の結合ドメインと共に組み込んだ二重特異性抗体もまた、提供する。好ましい態様において、他の標的は、ヒト肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）であり、異なる抗体は、ＨｕＬ２Ｇ７であり得るか、または他の標的は、ヒトＦＧＦ２であり、異なる抗体は、ヒト化ＧＡＬ−Ｆ２ ｍＡｂであり得る。例示的態様において、１以上の結合ドメインは、ヒト化ＶＥ１ ｍＡｂ由来であり、１以上の結合ドメインは、Ａｎｇ−２に対するヒト化またはヒトｍＡｂ、例えばヒト化Ａ２Ｔ ｍＡｂである。多くの場合、二重特異性抗体は、ＶＥＧＦに結合する第１の結合ドメインおよびＨＧＦまたはＦＧＦ２またはＡｎｇ−２に結合する第２の結合ドメインをそれぞれ含む、モノマーのホモダイマーである。

図１は、Ｂｓ（ｓｃＦｖ）_４−ＩｇＧ二重特異性抗体形態の概略図である。上の図（Ａ）は、個々の可変領域および定常領域を示す。下の図（Ｂ）は、各軽鎖領域を各重鎖領域と共に折り畳むことによって形成されるドメインを示す。Ｖ_Ｈ１（各々、Ｖ_Ｌ１）＝第１の抗体の重（各々、軽）鎖可変領域；および、第２の抗体のＶ_Ｈ２およびＶ_Ｌ２も同様である。Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３（各々、Ｃ_Ｌ）＝重（各々、軽）鎖定常領域ドメイン；Ｖ１（各々、Ｖ２）＝第１（各々、第２）の抗体の完全可変ドメイン。 図２は、（Ａ）対照マウスｍＡｂ ｍＩｇＧではなくＶＥ１がＶＥＧＦを捕捉することを示すＥＬＩＳＡアッセイ、（Ｂ）ＶＥ１が、ＶＥＧＦＲへのＶＥＧＦの結合をＡ４．６．１よりも強く阻害することを示すＥＬＩＳＡアッセイ、を示す。 図３は、ＨｕＶＥ１−Ｌ１およびＨｕＶＥ１−Ｌ２軽鎖（Ａ）ならびにＨｕＶＥ１−Ｈ１およびＨｕＶＥ１−Ｈ２重鎖（Ｂ）の成熟可変領域のアミノ酸配列を、マウスＶＥ１およびヒトアクセプターＶ領域とアライメントして示す。ＶＥ１配列においてＣＤＲに下線を付し、ＨｕＶＥ１配列においてマウスＶＥ１アミノ酸で置換されたアミノ酸に二重下線を付す。１文字アミノ酸コードおよびＫａｂａｔの番号付けシステムを、軽鎖および重鎖の両方に用いる。 図４は、ＣｈＶＥ１およびＨｕＶＥ１変異体＃１、＃２、＃３、＃４、ならびに陰性対照抗体ｈＩｇＧの結合活性（Ａ）および受容体阻害活性（Ｂ）を比較する、ＥＬＩＳＡアッセイを示す。 図５は、ＨｕＶＥ１変異体＃３および＃４と、ベバシズマブおよび陰性対照ｈＩｇＧの結合活性（Ａ）および受容体阻害活性（Ｂ）を比較する、ＥＬＩＳＡアッセイを示す。 図６は、（Ａ）ＨｕＶＥ１ ＃４が、ヒト臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）のＶＥＧＦ誘発増殖をベバシズマブよりも強力に阻害することを示す生物学的アッセイ、（Ｂ）ＶＥＧＦＲ２へのＶＥＧＦの結合を阻止する、示された抗ＶＥＧＦ ｍＡｂの能力を比較するＥＬＩＳＡアッセイ、を示す。 図７は、（Ａ）ＨｕＶＥ１ ＃４（および、ベバシズマブ）が、ＶＥＧＦ−Ａ（ＶＥＧＦ）に結合するが、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＨＧＦおよびＦＧＦ２には結合しないこと、および（Ｂ）ＶＥＧＦのＶＥＧＦ−１６５、ＶＥＧＦ−１２１およびＶＥＧＦ−１８９イソ型に結合することを示すＥＬＩＳＡアッセイを示す。 図８は、（Ａ）ＶＥＧＦのヒト（Ｈｕまたはｈ）／マウス（Ｍｕまたはｍ）キメラ形態の概略図を示す。影付き、ヒト配列；斜線、マウス配列；ＫＦ、カッパフラグ。（Ｂ）（Ａ）における各構築物へのＨｕＶＥ１ ＃４およびベバシズマブの結合のＥＬＩＳＡアッセイを示す。 図９ＡおよびＢは、標識されたＶＥＧＦの種々の変異体へのＨｕＶＥ１ ＃４およびベバシズマブの結合を示す。ＷＴ；野生型ＶＥＧＦ。 図１０は、（Ａ）ヒト（ｈ）、マウス（ｍ）およびカニクイザル（ｃｙｎｏ） Ａｎｇ−２構築物に対する示された抗Ａｎｇ−２ ｍＡｂの結合のＥＬＩＳＡアッセイを示す。（Ｂ）ヒト、マウス、ヒト−マウス（ｈ／ｍ）キメラおよびマウス−ヒト（ｍ／ｈ）キメラ Ａｎｇ−２構築物に対する示された抗Ａｎｇ−２ ｍＡｂの結合のＥＬＩＳＡアッセイを示す。 図１１は、（ヒト）Ｔｉｅ−２への（ヒト）Ａｎｇ−２の結合を阻止する、示されたｍＡｂの能力を比較するＥＬＩＳＡアッセイを示す。 図１２は、Ａ２Ｂ ｍＡｂの（成熟）軽鎖（Ａ）および重鎖（Ｂ）可変領域のアミノ酸配列を示す。 図１３は、ＨｕＡ２Ｔ−Ｌ１およびＨｕＡ２Ｔ−Ｌ２軽鎖（Ａ）ならびにＨｕＡ２Ｔ−Ｈ１およびＨｕＡ２Ｔ−Ｈ２重鎖（Ｂ）の成熟可変領域のアミノ酸配列の、マウスＡ２ＴおよびヒトアクセプターＶ領域とのアライメントを示す。Ａ２Ｔ配列においてＣＤＲに下線を付し、ＨｕＡ２Ｔ配列におけるマウスＡ２Ｔアミノ酸で置換されたアミノ酸に二重下線を付す。可能性のあるグリコシル化部位を排除するために、マウスＴからヒトＡに置換された位置６０のアミノ酸を影付きで示す。 図１４は、示されたＨｕＡ２Ｔ変異体のＡｎｇ−２に結合する能力（Ａ）およびＴｉｅ−２へのＡｎｇ−２の結合を阻害する能力（Ｂ）を比較するＥＬＩＳＡアッセイを示す。 図１５は、示されたＨｕＡ２Ｔ変異体のＡｎｇ−２に結合する能力（Ａ）およびＴｉｅ−２へのＡｎｇ−２の結合を阻害する能力（Ｂ）を比較するＥＬＩＳＡアッセイを示す。 図１６は、（Ａ）示された抗Ａｎｇ−２ ｍＡｂの、Ｔｉｅ−２へのＡｎｇ−２の結合を阻害する能力を比較するＥＬＩＳＡアッセイ、（Ｂ）示された抗Ａｎｇ−２ ｍＡｂの、ＨＥＫ２９３−Ｔｉｅ−２細胞における、Ａｎｇ−２誘導性のＴｉｅ−２のリン酸化を阻害する能力を比較するアッセイ、を示す。 図１７は、（Ａ）Ｂ−ＨｕＡ２Ｔ／ＨｕＶＥ１二重特異性抗体はＡｎｇ−２およびＶＥＧＦに同時に結合する能力を示すが、ＨｕＶＥ１は当該能力を示さないことを示す、ＥＬＩＳＡアッセイ、（Ｂ）Ｂ−ＨｕＡ２Ｔ／ＨｕＶＥ１、ＨｕＶＥ１およびベバシズマブのＶＥＧＦに結合する能力を比較するＥＬＩＳＡアッセイ、を示す。 図１８は、Ｂ−ＨｕＡ２Ｔ／ＨｕＶＥ１およびＨｕＶＥ１の、ＶＥＧＦＲ２へのＶＥＧＦの結合を阻害する能力を比較するＥＬＩＳＡアッセイ（Ａ）、およびＢ−ＨｕＡ２Ｔ／ＨｕＶＥ１およびＨｕＡ２Ｔの、Ｔｉｅ−２へのＡｎｇ−２の結合を阻害する能力を比較するＥＬＩＳＡアッセイ（Ｂ）を示す。 図１９は、（Ａ）ＶＥ１（５ｍｇ／ｋｇ）またはビークル（ＰＢＳ）のみで、週２回処置したマウスにおける、ＣＯＬＯ ２０５異種移植片の増殖、（Ｂ）ＨｕＶＥ１ ♯３（５ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳのみで、週２回処置したマウスにおける、ＣＯＬＯ ２０５異種移植片の増殖、を示す。 図２０は、（Ａ）ＨｕＶＥ１またはベバシズマブ（２．５ｍｇ／ｋｇ）またはビークル（ＰＢＳ）のみで、週２回処置したマウスにおける、原発性肝腫瘍異種移植片の増殖、（Ｂ）ＨｕＶＥ１またはベバシズマブ（１ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳのみで、矢印で示すように６日目および９日目に処置したマウスにおける、ＲＰＭＩ ４７８８結腸腫瘍異種移植片の増殖、を示す。 図２１は、ＨｕＶＥ１またはベバシズマブ（５ｍｇ／ｋｇ）またはビークル（ＰＢＳ）のみで、週１回処置したマウスにおける、原発性乳房腫瘍異種移植片の増殖を示す。

発明の実施態様の詳しい説明
１．抗体
本明細書で用いる、“抗体”は、抗原に結合することができる１以上のドメインを含むタンパク質を意味し、ここで、かかるドメインは、天然抗体の可変ドメインに由来するか、またはそれに相同である。モノクローナル抗体（“ｍＡｂ”）は、異なる抗体の混合物とは異なり、極めて特異的な抗体種である。本明細書に記載の抗体は、一般的に、他にこれと異なる記載がなされない限り、モノクローナルである。抗体の“抗原”とは、抗体が特異的に結合する化合物を意味し、一般的にはポリペプチドであるが、小ペプチドまたは小分子ハプテンまたは炭水化物または他の部類であってもよい。抗体の例には、天然の完全長四量体抗体；Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’および（Ｆａｂ’）_２などの抗体フラグメント；一本鎖（ｓｃＦｖ）抗体（Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA 85:5879, 1988；Bird et al., Science 242:423, 1988）；単一アーム抗体（Nguyen et al., Cancer Gene Ther 10:840, 2003）；ならびに、二重特異性抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体が含まれ、これらの用語は以下にさらに説明される。抗体は、ニワトリ、げっ歯動物（例えば、マウス、ラットおよびハムスター）、ウサギ、霊長動物およびヒトを含む全ての脊椎動物に由来し得る。定常ドメインを含む抗体は、公知のイソ型ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥならびにそれらのサブタイプ、すなわち、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４およびマウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３、ならびにそれらのアロタイプおよび同型アロタイプ（isoallotype）（アロタイプおよび同型アロタイプにおける多型位置（polymorphic position）を占める残基の組み合わせを含む）であり得る。抗体は、キメライソ型であってもよく、すなわち、その定常（Ｃ）領域の１以上が異なるイソ型由来の領域、例えばγ−１ Ｃ_Ｈ１領域とヒンジ領域、γ−２、γ−３および／またはγ−４遺伝子由来のＣ_Ｈ２および／またはＣ_Ｈ３ドメインを含んでいてよい。抗体はまた、補体媒介性細胞傷害またはＡＤＣＣのようなエフェクター機能を低下または増加させる定常領域内の置換（例えば、Winterらの、米国特許第５，６２４，８２１号；Tsoらの、米国特許第５，８３４，５９７号；ならびに、Lazar et al., Proc Natl Acad Sci USA 103:4005, 2006を参照のこと)、またはヒトにおける半減期を延長することができる定常領域内の置換（例えば、Hinton et al., J Biol Chem 279:6213, 2004を参照のこと）を含み得る。

天然の抗体分子は、一般的に、１つの重鎖と対形成した１つの軽鎖をそれぞれ含む２つの同一のヘテロ二量体からなる四量体である。各軽鎖および重鎖は、可変領域（Ｖ_ＬまたはＶ_Ｈ、または単にＶ）とそれに続く定常領域（Ｃ_ＬまたはＣ_Ｈ、または単にＣ）からなる。Ｃ_Ｈ領域自体は、Ｃ_Ｈ１領域、ヒンジ（Ｈ）領域、Ｃ_Ｈ２領域およびＣ_Ｈ３領域を含む。３次元（３Ｄ）空間では、Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈ領域は、共に折り畳まられてＶドメインを形成し、それは、抗原に結合するため、結合ドメインとしても知られている。Ｃ_Ｌ領域は、Ｃ_Ｈ１領域と共に折り畳まれ、軽鎖Ｖ_Ｌ−Ｃ_Ｌおよび重鎖のＶ_Ｈ−Ｃ_Ｈ１領域が合して、Ｆａｂとして知られる抗体の一部分を形成する：従って、天然の“Ｙ字型”抗体は、各ヘテロ二量体に由来する、２つのＦａｂを含み、Ｙ字型のアームを形成する。１つのヘテロ二量体のＣ_Ｈ２領域は、他のヘテロ二量体のＣ_Ｈ２領域の反対側に位置し、それぞれのＣＨ３領域は、互いに折り畳まれ、抗体の単一のＦｃドメインを共に形成して（Ｙの塩基）、それは、免疫系の他の成分と相互作用する。

各軽鎖または重鎖可変領域内には、相補性決定領域（“ＣＤＲ”）と呼ばれる３つの短いセグメント（平均約１０アミノ酸長）が存在する。抗体可変ドメイン中の６つのＣＤＲ（軽鎖由来の３つおよび重鎖由来の３つ）は、３Ｄ空間で共に折り畳まれて、標的抗原上に固定される実際の抗体結合部位を形成する。ＣＤＲの位置および長さは、Kabat, Eらの、Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1983−87により正確に定義されている。ＣＤＲに含まれない可変領域のの部分は、フレームワークと呼ばれ、それは、ＣＤＲのための環境を形成する。Chothia et al., J Mol Biol 196:901, 1987には、構造によって決定される超可変領域またはループの関連する概念が定義されている。

本明細書で用いる、“遺伝子操作された”ｍＡｂは、遺伝子が、組換えＤＮＡ技術の使用により構築されたか、または非天然環境に置かれた（例えば、マウス中またはヒトバクテリオファージ上のヒト遺伝子）抗体であり、従って、下記のキメラ抗体およびヒト化抗体が含まれるが、常套のハイブリドーマ技術で作製されたマウスまたは他のげっ歯動物のｍＡｂを包含しない。キメラ抗体（または各々、キメラ抗体軽鎖または重鎖）は、マウス（または他の非ヒト種）抗体（または各々、抗体軽鎖または重鎖）の可変領域がヒト抗体の定常領域と組み合わされている、抗体（または各々、抗体軽鎖または重鎖）である。遺伝子工学によるそれらの構築は、よく知られている。かかる抗体は、マウス抗体の結合特異性を保持しているが、それはヒトの約３分の２である。

ヒト化抗体は、一般的に、非ヒト“ドナー”抗体（例えば、ニワトリ、マウス、ラット、ウサギまたはハムスター）由来のＣＤＲが、ヒト“アクセプター”抗体配列中に移植されている遺伝子操作された抗体であり、該ヒト化抗体は、ドナー抗体の結合特異性を保持している（例えば、Queenの、米国特許第５，５３０，１０１号および同第５，５８５，０８９号；Winterの、米国特許第５，２２５，５３９号；Carterの、米国特許第6,407,213；Adairの、米国特許第５，８５９，２０５号、同第６，８８１，５５７号；Footeの、米国特許第６，８８１，５５７号を参照のこと）。アクセプター抗体配列は、例えば、成熟ヒト抗体配列、ヒト抗体配列のコンセンサス配列、生殖系列のヒト抗体配列、またはそのような配列の２以上の複合体であり得る。従って、ヒト化抗体は、ドナー抗体に完全にまたは実質的に由来する一部または全てのＣＤＲ、ならびに、存在する場合、ヒト抗体配列に完全にまたは実質的に由来する可変領域フレームワーク配列および定常領域を有する抗体である。同様に、ヒト化軽鎖（各々、重鎖）は、ドナー抗体軽鎖（各々、重鎖）に完全にまたは実質的に由来する少なくとも１つ、２つおよび通常は３つのＣＤＲ、ならびに存在する場合、ヒト軽鎖（各々、重鎖）アクセプター鎖に実質的に由来する軽鎖（各々、重鎖）可変領域フレームワークおよび軽鎖（各々、重鎖）定常領域を有する。ヒト化抗体は、一般的に、ヒト化重鎖およびヒト化軽鎖を含む。ヒト化抗体中のＣＤＲは、対応するアミノ酸（Kabatにより定義されている）の少なくとも８５％、９０％、９５％または１００％が、それぞれのＣＤＲ間で同一であるとき、非ヒト抗体中の対応するＣＤＲに実質的に由来する。抗体鎖の可変領域フレームワークまたは定常領域は、対応するアミノ酸（Kabatにより定義されている）の少なくとも８５％、９０％、９５％または１００％が同一であるとき、ヒト可変領域またはヒト定常領域にそれぞれ実質的に由来する。

本明細書中、本出願の他の箇所と同様に、パーセント配列同一性は、Kabatの番号付け規則（Ｃ_Ｈ領域のＥｕインデックス）により最大アライメントされた抗体配列を用いて決定される。アライメント後、対象抗体領域（例えば、重鎖または軽鎖の成熟可変領域全体）が対照抗体の同じ領域と比較されるとき、該対象抗体領域と対照抗体領域間のパーセント配列同一性は、対象抗体領域および対照抗体領域の両方において同じアミノ酸が占める位置の数を、２つの領域の整列させた位置の総数（ギャップは数えない）で割り、１００を掛けて、パーセンテージに換算したものである。

ヒト化抗体における高い結合親和性を保持するために、２つのさらなる構造要素の少なくとも１つを用いることができる。ヒト化抗体の構築のための詳細な説明を提供する、米国特許第５，５３０，１０１号および同第５，５８５，０８９号（引用により本明細書中に包含させる）を参照のこと。第一の構造要素において、アクセプターまたはヒト化抗体の重鎖可変領域のフレームワークは、多くの公知のヒト抗体の中からアクセプター抗体重鎖を好適に選択することにより、ドナー抗体の重鎖可変領域のフレームワークと高い配列同一性（６５％から９５％の同一性）を有するように選択される。第２の構造要素において、ヒト化抗体を構築する際に、特定の規則に従って、ヒトアクセプター抗体のフレームワーク内（ＣＤＲの外側）の選択されたアミノ酸を、ドナー抗体由来の対応するアミノ酸で置換する。具体的には、フレームワークにおいて置換されるアミノ酸は、ＣＤＲと相互作用するそれらの能力に基づいて選択される。例えば、置換されたアミノ酸は、３次元空間で測定される通り、ドナー抗体配列中のＣＤＲに隣接していてよいか、またはヒト化抗体中のＣＤＲの４〜６オングストローム以内であってもよい。

ヒト化抗体を設計するための他のアプローチ、例えば、“superhumanization”（Tan et al. J Immunol 169:1119, 2002および米国特許第６，８８１，５５７号参照）またはStudnicak et al., Protein Eng 7:805, 1994に記載の方法もまた、上記の米国特許第５，５３０，１０１号および同第５，５８５，０８９号に記載の方法と同じ結果を得るために用いられ得る。さらに、遺伝子操作された、免疫原性の低下したｍＡｂを産生するための他のアプローチには、“再形成（reshaping）”、“超キメラ化（hyperchimerization）”および“ベニヤリング（veneering）／表面再構成（resurfacing）”が挙げられ、例えば、Vaswami et al., Annals of Allergy, Asthma and Immunology 81:105, 1998；Roguska et al. Protein Eng 9:895, 1996；および、米国特許第６，０７２，０３５号および同第５，６３９，６４１号に記載されている。ベニヤリング（Veneered）された抗体は、Ｂ細胞またはＴ細胞エピトープに寄与し得る非ヒトドナー抗体の可変領域フレームワーク中の特定のアミノ酸、例えば露出した残基を置換することにより、よりヒト様に作製される（Padlan, Mol Immunol 28:489, 1991）。遺伝子組み換え抗体の他のタイプには、ファージディスプレイ法（Dower et al., ＷＯ９１／１７２７１；McCafferty et al., ＷＯ９２／００１０４７； Winter、ＷＯ９２／２０７９１；および、Winter, FEBS Lett 23:92, 1998（各々、引用により本明細書中に包含させる））を用いて、またはトランスジェニック動物（Lonberg et al., ＷＯ９３／１２２２７；Kucherlapati ＷＯ９１／１０７４１（各々、引用により本明細書中に包含させる））を用いることにより作製されたヒト抗体が含まれる。

用語“抗体”または“ｍＡｂ”には二重特異性抗体も含まれる。“二重特異性抗体”とは、第１の抗原に結合する第１のドメインおよび第２の抗原に結合する第２の（異なる）ドメインを含む抗体であり、ここで、該第１および第２のドメインは、天然抗体の可変ドメインに由来するか、またはそれに相同である。第１の抗原および第２の抗原は、同じ抗原であってもよく、その場合、第１および第２のドメインは、抗原上の異なるエピトープに結合することができる。二重特異性抗体なる用語は、第１および第２のドメインに加えて、抗原に結合する１以上の他のドメインを含み、天然抗体の可変ドメインに由来するか、またはそれに相同である、多重特異的抗体を包含する。二重特異性抗体なる用語はまた、天然抗体の可変ドメインに由来するか、またはそれに相同である第１の結合ドメイン、ならびに別のタイプのタンパク質に由来する第２の結合ドメイン、例えば受容体の細胞外ドメイン（“二重特異性抗体−イムノアドヘシン”）を含む抗体を包含する。

二重特異性抗体は、種々の形態で産生されており（例えば、Kontermann, MAbs 4:182−197, 2012およびその引用文献を参照のこと）、例えば一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ、およびｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ融合タンパク質（Coloma et al., Nat Biotechnol 15:125−6, 1997；Lu et al., J Immunol Methods 267:213−26, 2002；Mallender, J Biol Chem 269:199−206, 1994）、Ｂｓ（ｓｃＦｖ）_４−ＩｇＧ（Zuo et al., Protein Eng 13: 361−367, 2000)、二重可変ドメイン抗体（Wu et al., Nat Biotechnol 25:1290−7, 2007)および二重特異性抗体（Holliger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90:6444−8, 1993）である。二重特異性Ｆ（ａｂ’）_２抗体フラグメントは、化学的結合により（Brennan et al., Science 229:81, 1985）またはロイシンジッパーを用いて（Kostelny et al., J Immunol 148:1547−53, 1992）、産生されている。異なるＶ領域を有する各重鎖−軽鎖対を有するより自然に形成された二重特異性抗体を、例えば、別々に産生された２つの重鎖−軽鎖対を化学的に架橋することにより作製することができる（Karpovsky et al., J Exp Med 160:1686−701, 1984）。自然に形成された二重特異性抗体はまた、２つのハイブリドーマ細胞株を融合させるか（“quadroma”; Milstein et al., Nature 305: 537−40）またはトランスフェクションによって作製された、単一の細胞中に必要な重鎖および軽鎖の両方を発現させることによっても産生される。所望の二重特異性抗体を形成するために細胞中で発現された正しい軽鎖および重鎖の会合は、“knobs−into−holes”技術（Ridgway et al., Protein Eng 9:617−21, 1996； Atwell et al., J Mol Biol 270:26−35, 1997；および、米国特許第７，６９５，９３６号）を用いて促進され得る。要すれば、１つの軽鎖−重鎖対の抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）内の重鎖および軽鎖ドメインの交換または“交差”により、“ＣｒｏｓｓＭａｂｓ”と呼ばれる二重特異性抗体が得られる（Schaefer et al., Proc Natl Acad Sci USA 108:11187−92, 2011；ＷＯ ２００９／０８０２５１；ＷＯ ２００９／０８０２５２；ＷＯ ２００９／０８０２５３）。

抗体は、抗原に結合しない無関係の抗体よりも顕著に優位な程度で結合する場合に、該抗原に“特異的”に結合すると言われ、従って、一般的に、抗原に対して、少なくとも約１０^６の結合親和性（Ｋ_ａ）、好ましくは１０^７、１０^８、１０^９または１０^１０Ｍ^−１のＫ_ａを有する。一般的に、抗体が抗原に結合すると言われるとき、特異的結合が意味される。抗体が抗原に結合しないと言われる場合、それは、結合を示す何らかのシグナルが、無関係な対照抗体のシグナルと実験誤差内で区別できないことを意味する。ｍＡｂのエピトープは、ｍＡｂが結合するその抗原の領域である。２つの抗体は、それぞれが抗原への他方の結合を競合的に阻害するとき、同じかまたは重複するエピトープに結合すると判断される。競合的に結合を阻害するということは、競合的結合アッセイで測定したとき、一方の抗体の１倍または５倍過剰量が、他方の結合を少なくとも５０％、好ましくは７５％阻害することを意味するか、または一方の抗体の１０倍、２０倍または１００倍過剰量が、他方の結合を少なくとも７５％、好ましくは９０％、さらには９５％または９９％阻害することを意味する（例えば、Junghans et al., Cancer Res 50:1495, 1990を参照のこと）。あるｍＡｂ（第２のｍＡｂ）は、（別のｍＡｂ（第１のｍＡｂ）の）結合を阻害する第２のｍＡｂの阻害濃度５０（ＩＣ５０）が、競合的結合アッセイにおいて、同程度である、すなわち、それ自体の結合を阻害する第１のｍＡｂのＩＣ５０の２倍または３倍以内であるとき、抗原と該別の抗体（第１のｍＡｂ）との結合について“完全”に競合すると言われる。第２のｍＡｂは、（第１のｍＡｂの）結合を阻害する第２のｍＡｂのＩＣ５０が、実質的に高い、例えば、結合を阻害する第１のｍＡｂのＩＣ５０の３倍または５倍または１０倍を超えるとき、抗原と該第１のｍＡｂとの結合について“部分的”に競合すると言われる。一般的に、２つのｍＡｂは、それぞれが、抗原と他方との結合について完全に競合するとき、抗原上に同じエピトープを有し、少なくとも一方のｍＡｂが、他方のｍＡｂとの結合について部分的に競合するとき、重複するエピトープを有する。あるいは、２つの抗体は、一方の抗体の結合を減少または排除する抗原中の本質的にすべてのアミノ酸変異が、他方の結合を減少または排除するとき、同じエピトープを有するが、一方で、２つの抗体は、一方の抗体の結合を減少または排除する全部ではない幾つかのアミノ酸変異が、他方の結合を減少または排除するとき、重複するエピトープを有する。

２．抗ＶＥＧＦ抗体および抗Ａｎｇ−２抗体
ＶＥＧＦ、Ａｎｇ−２、ＨＧＦおよびＦＧＦ２のような本明細書に記載の増殖因子または受容体に言及するとき、他にこれと異なる記載がなされない限り、該増殖因子または受容体のヒト形態が意味される。

ＶＥＧＦに結合するモノクローナル抗体、すなわち、抗ＶＥＧＦ ｍＡｂ（または、各々、Ａｎｇ−２に結合するｍＡｂ、すなわち、抗Ａｎｇ−２ ｍＡｂ）は、結合がＶＥＧＦ（各々、Ａｎｇ−２）の１以上の生物学的活性を部分的または完全に阻害するとき、すなわち、ｍＡｂが単一の薬剤として使用されるとき、ＶＥＧＦ（各々、Ａｎｇ−２）を中和する、または中和抗体であると言われる。中和抗体が阻害し得るＶＥＧＦの生物学的特性には、ＶＥＧＦの、その細胞受容体に結合する能力、その受容体のリン酸化を誘導する能力、およびヒト臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の増殖誘導または血管形成を誘導する能力がある。中和抗体が阻害し得るＡｎｇ−２の生物学的特性には、Ａｎｇ−２の、その細胞受容体に結合する能力、その受容体のリン酸化を誘導する能力、および血管形成を誘導する能力がある。例えば、０．０１、０．１、０．５、１、２、５、１０、２０または５０μｇ／ｍｌの濃度の本発明の中和ｍＡｂは、以下の実施例に記載のまたは当技術分野で公知の方法によりアッセイして、ＶＥＧＦ（各々、Ａｎｇ−２）の生物学的機能を、少なくとも約５０％阻害する、好ましくは７５％、より好ましくは、９０％または９５％、さらには９９％、最も好ましくはおよそ１００％（本質的に完全に）阻害する。一般的に、使用されるＶＥＧＦ（各々、Ａｎｇ−２）の量が、生物学的活性を完全に刺激するのに十分であるか、または０．０５、０．１、０．５、１、３もしくは１０μｇ／ｍｌであるとき、阻害の程度が測定される。好ましくは、ｍＡｂは、上記に列記した生物学的活性の、１つではなく、２、３またはいくつかを中和する；本明細書に記載の目的のために、単一の薬剤として使用されるｍＡｂは、ＶＥＧＦ（各々、Ａｎｇ−２）の全ての生物活性を中和し、これは“完全に中和する”と呼ばれ、このようなｍＡｂが最も好ましい。

本発明の抗ＶＥＧＦ ｍＡｂは、好ましくはＶＥＧＦ（すなわち、ＶＥＧＦ−Ａ）に特異的であり、すなわち、それらは、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−ＤなどのＶＥＧＦ、ならびに他の血管新生因子、例えばＨＧＦおよびＦＧＦ２に関連するタンパク質に（特異的に）結合しないか、またははるかに低い程度（例えば１０倍未満）でしか結合しない。同様に、本発明の抗Ａｎｇ−２ ｍＡｂは、好ましくはＡｎｇ−２に特異的であり、すなわち、それらは、Ａｎｇ−１およびＡｎｇ−４などのＡｎｇ−２、ならびにＨＧＦおよびＦＧＦ２などの他の血管新生因子に関連するタンパク質に、（特異的に）結合しないか、またははるかに低い程度（例えば１０倍未満）でしか結合しない。本発明のｍＡｂは、一般的に、それらの特異的標的に対して、少なくとも１０^７Ｍ^−１、好ましくは１０^８Ｍ^−１またはそれ以上、最も好ましくは１０^９Ｍ^−１またはそれ以上、さらには１０^１０Ｍ^−１またはそれ以上の結合親和性（Ｋ_ａ）を有する。抗ＶＥＧＦ ｍＡｂは、ヒトＶＥＧＦに結合し、抗Ａｎｇ−２ ｍＡｂは、ヒトＡｎｇ−２に結合するが、有利には、他の種、例えばマウスまたはカニクイザルなどの非ヒト哺乳動物由来のＶＥＧＦ（各々、Ａｎｇ−２）にも、ヒトＶＥＧＦ（各々、ヒトＡｎｇ−２）に対する結合親和性と同様の（例えば１０倍以内の）結合親和性で結合する。本発明のｍＡｂには、ＶＥＧＦまたはＡｎｇ−２に結合する結合ドメインを有する二重特異性抗体を含む、上記の抗体の種々の形態の全てが含まれる。ヒトＶＥＧＦの配列は、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｐ１５６９２に提供されており、最初の２６塩基は、成熟ＶＥＧＦ−Ａにおいて除去されたシグナルペプチドである。

本明細書に記載の抗ＶＥＧＦ ｍＡｂ ＶＥ１は、本発明の一例である。ＶＥ１と同じか、または重複するエピトープを有する中和ｍＡｂは、他の例を提供する。ＨｕＶＥ１などのＶＥ１のキメラ、ヒト化またはヒト形態、例えばキメラまたはヒト化形態である中和抗ＶＥＧＦ ｍＡｂは、とりわけ好ましい態様である。他の好ましい態様において、ｍＡｂは、上記の特性（例えば、ＶＥＧＦを中和する）の１以上を有する本発明の抗ＶＥＧＦ ｍＡｂ（例えば、ＶＥ１またはＶＥ１のヒト化形態）由来の１以上の結合ドメイン、ならびに要すればＨＧＦ（例えば、米国特許第７，２２０，４１０号および同第７，６３２，９２６号）に記載の、Ｌ２Ｇ７ ｍＡｂまたはＨｕＬ２Ｇ７などのそのヒト化形態）またはＦＧＦ２（例えば、米国特許第８，１０１，７２５号に記載の、ＧＡＬ−Ｆ２ ｍＡｂまたはそのヒト化形態）に結合し、かつそれを中和するｍＡｂ由来の第２の結合ドメインを含む、二重特異性抗体である。最も好ましくは、抗ＶＥＧＦ ｍＡｂは、実施例に記載の何れかのアッセイにより、または当技術分野で公知の他のアッセイにより評価される通り、マウスにおけるヒト腫瘍異種移植片の増殖を阻害する。個々にまたは集合的に、アミノ酸配列が、ＶＥ１のＣＤＲと少なくとも９０％、９５％または９８％同一であるか、または完全に同一であり、その機能的特性を維持するＣＤＲを有するｍＡｂ、または、少数の機能的に重要でないアミノ酸置換（例えば、以下に定義されるような、保存的置換）、欠失、または挿入によりＶＥ１とは異なるｍＡｂもまた、本発明に包含される。

本明細書に記載の抗Ａｎｇ−２ ｍＡｂ Ａ２ＴおよびＡ２Ｂもまた、本発明の例である。Ａ２ＴまたはＡ２Ｂのいずれかと同じか、または重複するエピトープを有する中和ｍＡｂは、他の例を提供する。キメラ、ヒト化またはヒト形態、例えば、ＨｕＡ２ＴなどのＡ２ＴまたはＡ２Ｂのキメラまたはヒト化形態である中和抗Ａｎｇ−２ ｍＡｂは、とりわけ好ましい態様である。特定の態様において、ｍＡｂは、上記の特性の１以上（例えば、Ａｎｇ−２の中和）を有する本発明の抗Ａｎｇ−２ ｍＡｂ（例えば、Ａ２ＴまたはＡ２Ｂまたはそれらのヒト化形態）由来の１以上の結合ドメイン、ならびに上記の抗ＨＧＦおよび抗ＦＧＦ２ ｍＡｂなどの別のｍＡｂ由来の第２の結合ドメインを含む、二重特異性抗体である。理想的には、抗Ａｎｇ−２ ｍＡｂは、実施例に記載の何れかのアッセイまたは当技術分野で公知の他のアッセイにより評価される通り、マウスにおいてヒト腫瘍異種移植片の増殖を阻害する。個々にまたは集合的に、アミノ酸配列が、Ａ２ＴまたはＡ２ＢのＣＤＲと少なくとも９０％、９５％または９８％同一であるか、または完全に同一であり、その機能的特性を維持するＣＤＲを有するｍＡｂ、または、少数の機能的に重要でないアミノ酸置換（例えば、以下に定義されるような、保存的置換）、欠失、または挿入によりＡ２ＴまたはＡ２Ｂとは異なるｍＡｂもまた、本発明に包含される。

一旦、本明細書に記載の所望の特性を有する単一の典型的な抗ＶＥＧＦまたは抗Ａｎｇ−２ ｍＡｂ、例えばＶＥ１またはＡ２Ｔがそれぞれ単離されると、ＶＥＧＦとの結合についてＶＥ１と競合するｍＡｂ、および／またはＶＥ１と同じエピトープを有するｍＡｂを含む、当技術分野で公知の方法により同様の特性を有する他のｍＡｂを作製することは容易である。例えば、マウスをＶＥＧＦで免疫化することができ、ハイブリドーマを産生し、得られたｍＡｂを、ＶＥＧＦへの結合についてＶＥ１と競合する能力についてスクリーニングする。マウスは、ＶＥ１が結合するエピトープを含むＶＥＧＦのより小さいフラグメントで免疫化されてもよい。エピトープは、例えば、ＶＥＧＦの配列に至る一連の重複ペプチドへの結合についてスクリーニングすることにより、特定され得る。これらの方法で作製されたマウスｍＡｂは、その後、ヒト化され得る。あるいは、Jespers et al., Biotechnology 12:899, 1994（引用により本明細書中に包含させる）に記載の方法を用いて、mＶＥ１と同じエピトープを有し、そのため同様の特性を有するｍＡｂの選択を導くことができる。ファージディスプレイを用いて、まずＶＥ１の重鎖をＶＥＧＦ結合ｍＡｂを選択するために、（好ましくは、ヒト）軽鎖のレパートリーと対合させ、次いで、新しい軽鎖を、ＶＥ１と同じエピトープを有する（好ましくはヒト）ＶＥＧＦ結合ｍＡｂを選択するために、（好ましくはヒト）重鎖のレパートリーを対合させる。あるいは、ＶＥ１の変異体は、ＶＥ１の重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡの突然変異誘発により得られ得る。Ａｎｇ−２への結合についてＡ２ＴもしくはＡ２Ｂと競合し、および／またはＡ２ＴもしくはＡ２Ｂと同じエピトープを有するｍＡｂを開発するために、同じ方法を適用してもよい。

ＨｕＶＥ１のような本発明の好ましい抗ＶＥＧＦ ｍＡｂは、ベバシズマブとは異なるエピトープに結合する、すなわちベバシズマブのエピトープと同一ではないエピトープに結合するが、該エピトープは、該抗体が、ＶＥＧＦへの結合についてベバシズマブと競合するように重複してよい。具体的には、ＶＥＧＦへのベバシズマブの結合を実質的に損なうＶＥＧＦにおける１または複数のアミノ酸置換は、本発明のｍＡｂについて、結合を損なわないか、または同程度に損なうことができ、またその逆もある。本発明の好ましい抗体は、ＶＥＧＦ対して、ベバシズマブよりも、少なくとも２倍、より好ましくは３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、さらには１０倍高い結合親和性を有する。同様に、本発明の好ましい抗体は、一般的に、好ましい抗体による阻害についてのＩＣ５０に対するベバシツマブによる阻害の阻害濃度−５０％（ＩＣ５０）の比によって測定される通り、ＶＥＧＦＲ２へのＶＥＧＦの結合を、ベバシズマブよりも、少なくとも２倍、より好ましくは３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、さらには１０倍強く阻害する。

遺伝的に操作されたｍＡｂ、例えば、キメラまたはヒト化または二重特異性ｍＡｂは、当技術分野で公知の種々の方法により発現され得る。例えば、それらの軽鎖および重鎖Ｖ領域をコードする遺伝子は、重複オリゴヌクレオチドから合成され、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリＡ部位などの必要な調節領域を提供する発現ベクター（例えば、Invitrogenから市販されている）中に利用可能なＣ領域と共に挿入されてよい。ＣＭＶプロモーター−エンハンサーの使用が好ましい。その後、発現ベクターは、リポフェクションまたはエレクトロポレーションのような種々の周知の方法を用いて、ＣＨＯまたはＳｐ２／０およびＮＳ０を含む非生産性骨髄腫細胞のような多様な哺乳動物細胞株に形質移入（transfection）することができ、抗体を発現する細胞は、適当な抗生物質による選別によって選択される。例えば、米国特許第５，５３０，１０１号を参照のこと。市販のバイオリアクターで細胞を増殖させることにより、より大量の抗体を産生することができる。

一旦発現されると、二重特異性ｍＡｂを含む本発明のｍＡｂは、精密濾過、限外濾過、プロテインＡもしくはＧ親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、および／または有機染料に基づく他の形態の親和性クロマトグラフィーなどのような、当技術分野の標準的技術により精製することができる。薬学的用途のためには、少なくとも約９０％または９５％の均質性を有する実質的に純粋な抗体が好ましく、９８％または９９％、あるいはそれ以上の均質性のあるものがより好ましい。ｍＡｂが従来の方法で製造されるとき、重鎖のＣ末端リシンのような、軽鎖および／または重鎖のアミノ末端もしくはカルボキシ末端の１から数個のアミノ酸が欠損している可能性があるか、または分子の一部分もしくは全部で誘導体化されていてよく、このような組成物はなお同じｍＡｂであると考えられる。

３．二重特異性抗体
上記のｍＡｂ、好ましくはＶＥ１もしくはＡ２ＴもしくはＡ２Ｂ、またはＶＥ１もしくはＡ２ＴもしくはＡ２Ｂと同じエピトープを有するｍＡｂに由来する結合ドメインを含むか、またはＨｕＶＥ１もしくはＨｕＡ２ＴなどのＶＥ１もしくはＡ２ＴもしくはＡ２Ｂのヒト化形態を含むＶＥ１もしくはＡ２ＴもしくはＡ２Ｂ由来のＣＤＲを有する、二重特異性抗体は、本発明に包含される。そのような二重特異性抗体の第２の結合ドメインは、例えば、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）などの別の増殖因子、ＦＧＦ２、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などの何れかの線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２またはＴＧＦ−β３）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）またはニューレグリンまたはヘレグリンの何れかの形態、およびアンジオポエチン１または２、あるいはこれらの増殖因子の任意の受容体の任意の細胞外ドメインに結合し得る。好ましくは、第２の結合ドメインは、ヒト化またはヒトｍＡｂ由来である。これらの増殖因子または受容体のヒト形態への結合が好ましい。これらの増殖因子および受容体の例示的な配列は、例えば、Swiss−Protデータベースから容易に入手可能である。米国特許第８，１０１，７２５号（全ての目的のために、引用により本明細書中に包含させる）に記載の抗ＨＧＦ ｍＡｂ ＨｕＬ２Ｇ７の結合（可変）ドメイン、またはそのＣＤＲの１以上を含む結合ドメイン、例えば抗ＦＧＦ２ ｍＡｂ ＧＡＬ−Ｆ２のヒト化形態の結合ドメイン（米国特許第８，１０１，７２５号の図１１に示される配列）は、とりわけ好ましい。特に好ましい態様において、一方の結合ドメインは、ＨｕＶＥ１などの本明細書に記載のＶＥＧＦ ｍＡｂの何れか由来であり、第２の結合ドメインは、ＨｕＡ２Ｔなどの本明細書に記載の抗Ａｎｇ２ ｍＡｂのいずれか由来である。

本発明の二重特異性抗体は、任意の形態であってよく、例えば、上記のKontermannの文献に列挙される抗体の何れかである。１つの好ましい態様において、二重特異性抗体は、上記のZuoらの文献および図１に記載の記載のＢｓ（ｓｃＦｖ）４-ＩｇＧ形態である。この形態において、一本鎖（ｓｃＦｖ）形態の一方の結合ドメインはＣ_Ｌ領域に連結され、従って、軽鎖のＮ末端ドメインになり、一方で、ｓｃＦｖ形態の他方の結合ドメインは、Ｃ_Ｈ１ドメインに連結され、従って、重鎖のＮ末端ドメインとなる。２つの軽鎖および２つの重鎖は、通常のＩｇＧ抗体のようにホモ二量体を形成し、それぞれ２つの結合ドメインを含む。従って、Ｂｓ（ｓｃＦｖ）_４−ＩｇＧ形態の利点は、それが各単量体に同じ重鎖および軽鎖を有するホモ二量体であるため、正しいヘテロ二量体化を確実にするための事前注意が必要ないことである。Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈ領域を繋げる各ｓｃＦｖ内のリンカーは、（Ｇ_４Ｓ）_３ＧＳとして選択されることが多い。各ｓｃＦｖ結合ドメインは、Ｖ_Ｌ−リンカー−Ｖ_Ｈ形態またはＶ_Ｈ−リンカー−Ｖ_Ｌ形態（図１Ａに示される）であり得て、何れかの結合ドメインは、軽鎖の一部分であってよく、他方は重鎖の一部分であってよく、合計で、Ｂｓ（ｓｃＦｖ）_４−ＩｇＧ抗体の２×２×２＝８変異体を、異なる特性を有し得る所定の２つの結合ドメイン（例えば、ＨｕＶＥ１およびＨｕＬ２Ｇ７またはＨｕＡ２Ｔの結合ドメイン）から作製することができる。本発明のとりわけ好ましい態様において、ｓｃＦｖ Ｖ_Ｈ−リンカー−Ｖ_Ｌ形態中のＨｕＶＥ１ Ｖドメインは、Ｃ_Ｈ１に連結されており、ｓｃＦｖ Ｖ_Ｈ−リンカー−Ｖ_Ｌ形態中のＨｕＬ２Ｇ７またはＨｕＡ２Ｔ Ｖドメインなどの他の抗体ドメインは、Ｃ_Ｌに連結されている。

本発明の別の態様において、二重特異性抗体は、例えば、上記のWuらの文献に記載の二重可変ドメイン形態である（ラベルを付して示す図１Ａを参照のこと）。そのような二重特異性ｍＡｂは、各結合ドメインのうち２つを含み、それぞれの結合ドメインの１つは連続して連結されている。第１および第２のドメインを連結するために、種々のペプチドリンカー、例えば、重鎖のＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰおよび軽鎖のＲＴＶＡＡＰＳＶＩＦＩＰＰ、または両方の鎖の（Ｇ_４Ｓ）_３ＧＳが用いられ得る。例えば、ＨｕＬ２Ｇ７またはＨｕＡ２Ｔの可変ドメインは、第１のドメイン（ＶＬ１−ＶＨ１）であり、一方、ＨｕＶＥ１の可変ドメインは、第２のドメイン（ＶＬ２−ＶＨ２）であり得る。リンカーは、上記の前者のものであってもよい。

本発明の他の好ましい態様において、軽鎖および重鎖を含むＨｕＶＥ１ ｍＡｂの１つの単量体は、軽鎖および重鎖を含むＨｕＬ２Ｇ７またはＨｕＡ２Ｔ ｍＡｂの１つの単量体と対を形成して、ＩｇＧ分子の通常の立体配置を有するヘテロ二量体を形成する。４つの鎖全てが、細胞内で発現されるとき、ホモ二量体の代わりに所望のヘテロ二量体二重特異性抗体の形成は、それぞれの重鎖のＣ_Ｈ３領域に突起（knob）および空隙（hole）を挿入することによって促進されるが（Ridgway et al., Protein Eng 9:617−21, 1996; Atwell et al., J Mol Biol 270:26−35, 1997;および、米国特許第７，６９５，９３６号）、各ＨｕＶＥ１およびＨｕＬ２Ｇ７またはＨｕＡ２Ｔ単量体を形成するための軽鎖および重鎖の正確な対合は、単量体の１つ中の重鎖および軽鎖ドメインの“交差”によって促進される（Schaefer et al., Proc Natl Acad Sci USA 108:11187−92, 2011; ＷＯ２００９／０８０２５１；ＷＯ２００９／０８０２５２；ＷＯ２００９／０８０２５３）。

本発明はまた、軽鎖および重鎖が、上記で具体的に記載したものと、通常Ｃ領域またはＶ領域フレームワークにおける、おそらくＣＤＲにおける、数個の（例えば、一般的には、１個、２個、３個、５個または１０個以下の）置換、欠失または挿入により異なる、変異型（variant）二重特異性抗体も提供する。変異体配列で行われる置換は、置換されたアミノ酸に関して保存的であることが多い。アミノ酸は、保存的置換、すなわち、グループ内の置換を決定するために、以下のようにグループ分けされ得る：グループＩ（疎水性側鎖）：ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；グループＩＩ（中性親水性側鎖）：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；グループＩＩＩ（酸性側鎖）：ａｓｐ、ｇｌｕ；グループＩＶ（塩基性側鎖）：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；グループＶ（鎖配向に影響を与える残基）：ｇｌｙ、ｐｒｏ；および、グループＶＩ（芳香族側鎖）：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。

好ましくは、二重特異性抗体における置換は、抗体の結合親和性または効力に、すなわち、ＶＥＧＦおよびＨＧＦまたはＡｎｇ−２などの第２の結合ドメインの標的の生物学的活性を中和するその能力に実質的に影響を及ぼさない。好ましくは、変異体配列は、元の配列と少なくとも９０％、より好ましくは、少なくとも９５％、最も好ましくは、少なくとも９８％同一である。加えて、定常領域の他のアロタイプまたはイソ型を使用してもよい。

４．治療法
好ましい態様において、本発明は、本明細書に記載の抗体を含む医薬製剤を提供する。医薬製剤は、生理的に許容される担体中に、要すれば賦形剤または安定化剤と共に、凍結乾燥または水溶液の形態で、ｍＡｂを含む。許容される担体、賦形剤または安定化剤は、用いられる用量および濃度でレシピエントに無毒であり、一般的にはｐＨ５．０から８．０、最も多くはｐＨ６．０から７．０のリン酸緩衝液、クエン酸緩衝液または酢酸緩衝液等の緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；等張性にするための塩化ナトリウム、塩化カリウム等の塩類；抗酸化剤、防腐剤、低分子量ポリペプチド、タンパク質、ポリソルベート８０などの親水性ポリマー、アミノ酸、炭水化物、キレート剤、糖類、および当業者に知られている他の標準成分（Remington’s Pharmaceutical Science 16^th edition, Osol, A. Ed. 1980）を含む。ｍＡｂは、一般的には、１−１００ｍｇ／ｍｌの濃度で存在し、最も多くは１０−５０ｍｇ／ｍｌ、例えば、１０、２０、３０、４０または５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。

別の好ましい態様において、本発明は、医薬製剤中のＶＥ１またはＡ２Ｔなどの本発明の抗ＶＥＧＦまたは抗Ａｎｇ−２ ｍＡｂあるいはそれらのヒト化形態および／または二重特異性形態を投与することにより、一般的には、疾患に関連する血管形成を阻害することによって、該疾患を有する患者を処置する方法を提供する。医薬製剤として調製されたｍＡｂは、好適な経路で、とりわけ非経腸的に、静脈内点滴またはボーラス注射により、筋肉内または皮下注射により、患者に投与され得る。静脈内点滴は、わずか１５分間で行われることもあるが、より多くは３０分間で、または１、２もしくは３時間以上かけることもある。ｍＡｂはまた、疾患（例えば、腫瘍）の部位に直接注射されてもよく、またはリポソームなどの担持剤にカプセル化されてもよい。与えられる用量は、処置される状態を緩和するのに十分であり（“治療的に有効な用量”）、０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、１、２、３、４または５ｍｇ／ｋｇであることが多いが、１０ｍｇ／ｋｇ、さらには１５または２０または３０ｍｇ／ｋｇの高用量、例えば１〜１０ｍｇ／ｋｇまたは１〜２０ｍｇ／ｋｇであってもよい。固定された単位用量、例えば、５０、１００、２００、５００または１０００ｍｇが与えられてもよいか、または用量は、患者の体表面積に基づいて計算されて、例えば１０００ｍｇ／ｍ^２でもよい。通常、１から８用量（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８）を投与して癌を処置するが、１０、２０またはそれ以上の用量が投与されてもよい。ｍＡｂは、毎日、隔週、毎週、隔週、毎月、または他の何らかの間隔で、例えば１週間、２週間、４週間、６週間、８週間、３〜６ヶ月もしくはそれ以上の間のｍＡｂの半減期に対応して、投与され得る。長期投与と同様に、反復投与法も可能である。

本発明の抗ＶＥＧＦおよび／または抗Ａｎｇ−２ ｍＡｂによる処置に特に感受性の疾患としては、血管形成ならびに／または高レベルのＶＥＧＦおよび／もしくはＡｎｇ−２に関連する疾患が挙げられ、固形腫瘍、例えば卵巣癌、乳癌、肺癌（小細胞または非小細胞）、大腸癌、前立腺癌、膵癌、胃癌、肝癌（肝細胞癌）、腎癌（腎細胞癌）、頭頸部癌、黒色腫、肉腫および脳腫瘍（例えば、神経膠芽腫）が含まれる。白血病およびリンパ腫などの造血器腫瘍もまた感受性であり得る。好ましい態様において、ｍＡｂは、他の治療剤と組み合わせて（すなわち、共投与で、すなわち投与前に、投与中に、または投与後に）投与される。例えば、癌を処置するために、本発明のｍＡｂは、公知の化学療法剤のいずれか１以上と共に、例えば、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、プロカルバジンおよびシクロホスファミドなどのアルキル化剤；フルオロウラシル、フロクスウリジン、フルダラビン、ゲムシタビン、メトトレキサートおよびヒドロキシウレアなどの代謝拮抗剤；植物アルカロイドならびにブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、エトポシド、マイトマイシン、ミトキサントロン、ビンブラスチン、ビンクリスチンおよびタキソール（パクリタキセル）などの抗生物質またはタキソテール（登録商標）等の関連化合物を含む天然産物；トポイソメラーゼ１阻害剤 イリノテカン；ならびに、Gleevec（登録商標）（イマチニブ）、Sutent（登録商標）（スニチニブ）、Nexavar（登録商標）（sorafenib）、Tarceva（登録商標）（エルロチニブ）、Tykerb（登録商標）（ラパチニブ）、Iressa（登録商標）（ゲフィチニブ）およびXalkori（登録商標）（crizotinib）などのチロシンキナーゼの阻害剤；ラパマイシン（登録商標）(シロリムス)および他のｍＴＯＲ阻害剤；ならびに、血管形成の阻害剤；ならびに、ＷＯ２００５／０１７１０７Ａ２（引用により本明細書中に包含させる）に列記された全ての承認された試験的抗癌剤と共に投与され得る。本発明の抗体は、１、２、３またはそれ以上のこれらの他の薬剤と組み合わせて、好ましくは標準化学療法レジメンで用いることができる。通常、他の薬剤は、処置されている癌の種類に対して有効であると既に考えられているか、または知られている薬剤である。

癌を処置するために投与され得る本発明の抗ＶＥＧＦおよび／または抗Ａｎｇ−２ ｍＡｂには、ＨＥＲ２抗原に対するハーセプチン（登録商標）またはパージェタ（登録商標）(ペルツズマブ)を含むモノクローナル抗体；ＶＥＧＦに対するアバスチン（登録商標）；または、アービタックス（登録商標）(セツキシマブ)およびベクティビックス（登録商標）(パニツムマブ)などの上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）受容体に対する抗体、ならびにＫａｄｃｙｌａ（商標）(ado−トラスツズマブ・エムタンシン)など抗体−薬剤複合体などの生物学的製剤が含まれる。ＨＧＦに対するｍＡｂは、ｍＡｂ Ｌ２Ｇ７（Kim et al., Clin Cancer Res 12:1292, 2006および米国特許第７，２２０，４１０号）ならびにＨｕＬ２Ｇ７などの特にそのキメラ形態およびヒト化形態（米国特許第７，６３２，９２６号）を含む、抗ＶＥＧＦ ｍＡｂまたは抗Ａｎｇ−２ ｍＡｂ；ＷＯ２００５／０１７１０７Ａ２に記載のヒト抗ＨＧＦ ｍＡｂ、特に２.１２．１；および、ＷＯ０７１４３０９０Ａ２またはＷＯ０７１４３０９８Ａ２に記載のＨＧＦ結合タンパク質；ならびに、上記のｍＡｂの何れかと結合について競合する他の中和抗ＨＧＦ ｍＡｂと共に使用するのに特に好ましい。ＨＧＦのＲＯＮまたはＭｅｔ受容体に結合するｍＡｂ、例えば１個のみの“アーム”、すなわち結合ドメインを有するように遺伝子改変された抗ｃＭｅｔ ｍＡｂ ＯＡ−５Ｄ５（Martens et al., Clin cancer Res 12:6144, 2006）もまた好ましい。米国特許第８，１０１，７２５号に記載のＧＡＬ−Ｆ２のヒト化形態などのＦＧＦ２に結合するｍＡｂもまた、好ましい。さらに、抗ＶＥＧＦ ｍＡｂまたは抗Ａｎｇ−２ ｍＡｂは、あらゆる形態の外科手術および／または放射線療法と共に用いられ得る。

本発明の抗体である抗ＶＥＧＦ ｍＡｂおよび／または抗Ａｎｇ−２ ｍＡｂを含む処置（例えば、標準的化学療法）は、上記のような特定のタイプの癌を有する患者の癌の進行のない生存期間または全生存期間の中央値を、ｍＡｂを含まない同じ処置（例えば、化学療法）と比較して、少なくとも２０％または３０％または４０％、好ましくは５０％、６０％から７０％、さらには１００％またはそれ以上増加させるか、または（少なくとも）２、３、４、６もしくは１２か月延長する。これに加えて、またはこれに代えて、ｍＡｂを含む処置（例えば、標準的化学療法）は、（特に、再発性または難治性のとき）患者の完全奏効率、部分奏効率、または客観的奏功率（完全＋部分）を、抗ＶＥＧＦ ｍＡｂを含まない同じ処置（例えば、化学療法）と比較して、少なくとも３０％または４０％、好ましくは５０％、６０％から７０％、さらには１００％増加させ得る。

一般的には、臨床治験（例えば、第ＩＩ相、第ＩＩ／ＩＩＩ相または第ＩＩＩ相治験）において、化学療法単独（またはプラセボ添加）を受容している対照患者群と比較して、化学療法と本発明の抗ＶＥＧＦ ｍＡｂおよび／または抗Ａｎｇ−２ ｍＡｂで処置した患者の無増悪期間または全生存期間の中央値および／または奏効率の上記の増加は、例えばｐ＝０．０５または０．０１、さらには０．００１のレベルで統計的に有意である。奏効率は、例えば、国立癌研究所および／または食品医薬品局（例えば、ＲＥＣＩＳＴ基準（固形腫瘍における応答評価基準））によって承認されているような、癌の臨床治験において一般的に使用される客観的基準によって判定されることも理解される。

本発明の抗ＶＥＧＦ ｍＡｂおよび／または抗Ａｎｇ−２ ｍＡｂはまた、子宮内膜症および炎症性疾患および自己免疫性疾患、とりわけＶＥＧＦの役割が示されている炎症性腸疾患（クローン病および潰瘍性大腸炎）（Gorlatova et al., PLoS One 6：e27269, 2011およびHauser et al., Genes Immun 13:321−7, 2012）、関節リウマチ、乾癬、および糸球体腎炎などの腎疾患、ならびに加齢黄斑変性症または糖尿病関連網膜症などの眼疾患を含む、血管形成またはＶＥＧＦまたはＡｎｇ−２と関連する疾患の処置にも使用され得る。眼疾患のためには、眼に直接点眼され得るＦａｂまたは（Ｆａｂ’）_２のようなｍＡｂのフラグメントが特に好適であり得る。

５．他の方法
本発明のｍＡｂはまた、診断法、予後診断法および実験室的な方法に使用することができる。それらは、腫瘍内または腫瘍を有する患者の循環系内におけるＶＥＧＦまたはＡｎｇ−２のレベルを測定するために用いられ、それ故に、腫瘍の処置を追跡し、または処置に繋ぐために用いられる。例えば、ＶＥＧＦ（各々、Ａｎｇ−２）の上昇または高レベルに関連する腫瘍は、とりわけ抗ＶＥＧＦ（各々、抗Ａｎｇ−２） ｍＡｂでの処置に感受性であり得る。特定の態様では、ｍＡｂは、例えば腫瘍生検標本においてまたは血清中またはＶＥＧＦ分泌細胞の培地上清中の、ＶＥＧＦまたはＡｎｇ−２のレベルを測定するために、ＥＬＩＳＡまたは放射免疫アッセイにおいて用いられ得る。異なるエピトープに結合する（すなわち、結合について競合しない）２つの抗ＶＥＧＦ（各々、抗Ａｎｇ−２) ｍＡｂの使用は、ＶＥＧＦ（各々、Ａｎｇ−２）を検出するための感受性“サンドイッチ”ＥＬＩＳＡを開発するのに、特に有用である。種々のアッセイのために、ｍＡｂは、蛍光分子、スピン標識分子、酵素または放射性同位元素で標識されてよく、ＶＥＧＦまたはＡｎｇ−２のアッセイを実施するのに必要な全ての試薬を含むキットの形態で提供されてよい。他の用途では、抗ＶＥＧＦ（各々、抗Ａｎｇ−２） ｍＡｂは、親和性クロマトグラフィーによりＶＥＧＦ（各々、Ａｎｇ−２）を精製するために用いられる。

６．実施例
実施例１：抗ＶＥＧＦ ｍＡｂの作製
ヒトＶＥＧＦに結合して、その活性を阻止するｍＡｂを作製し、アッセイするために、グルタチオン合成酵素−ＶＥＧＦ融合タンパク質、ＧＳＴ−ＶＥＧＦを最初に作製した。この目的のために、標準的な分子生物学的方法を用いて、完全長ヒトＶＥＧＦ１６５をコードするｃＤＮＡを構築し、ｐＧＥＸ発現ベクター（Invitrogen）の誘導体中に挿入し、ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞（Novagen）を形質転換して発現させた。ＧＳＴ−ＶＥＧＦを、グルタチオン−アガロースカラム（Sigma−Aldrich）を用いて大腸菌溶解物から精製した。２つの他の融合タンパク質、ＶＥＧＦ−ＦＬＡＧ（各々、ＦＬＡＧ−ＶＥＧＦ）を、ｐＣＩベクターの誘導体（Invitrogen）中、ＦＬＡＧタグ（アミノ酸ＤＹＫＤＤＤＤＫ）をヒトＶＥＧＦ１６５のカルボキシ末端（各々、アミノ末端）に結合させて、哺乳動物の２９３Ｆ細胞中で発現させることで産生した。培養液中に分泌されたＶＥＧＦ−ＦＬＡＧまたはＦＬＡＧ−ＶＥＧＦの量を、ＶＥＧＦ特異的ＥＬＩＳＡを用いて定量した。ブロッキングアッセイのために、ヒトＶＥＧＦ受容体２（ＶＥＧＦＲ２）の細胞外ドメイン（アミノ酸１から７６０）を、ヒトＩｇγ−１ Ｆｃ定常領域（ヒンジ−ｃＨ２−ｃＨ３）に結合させて、ヒトＶＥＧＦＲ−Ｆｃを産生し、それを哺乳動物細胞中で産生させて、プロテインＡカラムを用いて精製した。ヒトＶＥＧＦ−１２１、ＶＥＧＦ−１６５、ＶＥＧＦ−１８６、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦＲ１およびマウスＶＥＧＦ−Ａを購入した（R&D Systems）。

Ｂａｌｂ／ｃマウスを、各後足の足蹠に、Ｒｉｂｉアジュバント中の精製ＧＳＴ−ＶＥＧＦ（最初の注射については１０μｇ、その後の注射では５μｇ）を用いて、週２回、１６〜１８回免疫化した。最後の免疫化の３日後、膝窩リンパ節細胞を、３５％ポリエチレングリコールを用いてネズミ骨髄腫細胞Ｐ３Ｘ６３ＡｇＵ.１（ATCC CRL 1597）と融合させた。ハイブリドーマを、記載のようにＨＡＴ培地で選択した（Chuntharapai and Kim, J Immunol 163:766, 1997）。融合の１０日後に、ハイブリドーマ培養上清を、ＶＥＧＦ結合ＥＬＩＳＡでスクリーニングし、その後下記のＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲブロッキングＥＬＩＳＡでスクリーニングした。選択されたハイブリドーマを、ＶＥＧＦ結合ならびにＶＥＧＦ/ＶＥＧＦＲブロッキングのスクリーニングによって２回クローニングした。１３個の融合物から約２万個のハイブリドーマをスクリーニングした後、ＶＥ１．７を最良の抗ＶＥＧＦ抗体として選択した。この抗体は本明細書中ＶＥ１と記載する。ＶＥ１のイソ型は、アイソタイピングキットを用いてＩｇＧ２ａ、κであると決定された。

実施例２：抗ＶＥＧＦ ｍＡｂを特徴付けるために用いるアッセイ
本特許出願に記載の各ＥＬＩＳＡアッセイの各工程を、最初のプレートコーティング工程（複数可）を４℃で一晩行った以外、好適な試薬を用いて室温で１時間インキュベートし、その後２％ ＢＳＡで１時間ブロッキングすることにより実施した。各工程間で、プレートを、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ中で３回洗浄した。データ点は、一般的にトリプリケートであった。一般的に、トリプリケートのデータ点間にはばらつきはほとんどなかった。ＶＥＧＦへのｍＡｂの直接結合を測定するために、最初に、プレートをヘパリン（５０μｇ／ｍｌ）を用いて一晩コーティングし、次いで、ヒトＶＥＧＦ１６５（０．３μｇ／ｍｌ）と共に一晩インキュベートし、その後、ＢＳＡでブロッキングした。ウェルを、スクリーニングのためにハイブリドーマ上清と共に、あるいは漸増濃度の試験すべき精製ＶＥ１ ｍＡｂまたは他の抗ＶＥＧＦ ｍＡｂと共にインキュベートし、結合したｍＡｂを、ＨＲＰヤギ抗マウスＩｇＧの添加、次いでＴＭＢ基質の添加により、検出した。溶液中でＶＥＧＦに結合するｍＡｂの能力を測定するために（捕捉アッセイ）、最初に、プレートをヤギ抗ｍＩｇＧ−Ｆｃ（２μｇ／ｍｌ）でコーティングした。ウェルを、漸増濃度の試験すべき精製ＶＥ１ ｍＡｂまたは他の抗ＶＥＧＦ ｍＡｂと共にインキュベートし、その後、精製ｍＡｂについてはＶＥＧＦ−Ｆｌａｇ（０．５μｇ／ｍｌ）、またはハイブリドーマ上清についてはＶＥＧＦ−ＦＬＡＧ＋ＦＬＡＧ−ＶＥＧＦと、マウスＩｇＧ（３０μｇ／ｍｌ）共にインキュベートした。結合したＶＥＧＦ−Ｆｌａｇを、マウスＩｇＧ（１５μｇ／ｍｌ）の存在下で、次いでＴＭＢ基質の存在下で、ＨＲＰ−抗Ｆｌａｇ Ｍ２（Ｓｉｇｍａ）の添加により検出した。ｍＡｂのブロッキング活性を測定するために、プレートを、最初に、ヤギ抗ｈＩｇＧ−Ｆｃ（２μｇ／ｍｌ）でコーティングした。次いで、ウェルをＶＥＧＦＲ−Ｆｃ（０．５μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートし、その後、スクリーニングのためにハイブリドーマ上清と共に、あるいはＶＥＧＦ−Ｆｌａｇ（０．５μｇ／ｍ）と予め混合した、漸増濃度の処置すべき精製ＶＥ１ ｍＡｂまたは他の抗ＶＥＧＦ ｍＡｂと共にインキュベートした。結合したＶＥＧＦ−Ｆｌａｇを、ＨＲＰ−抗Ｆｌａｇ Ｍ２を添加し、その後ＴＭＢ基質を添加することによって検出した。

実施例３：ＶＥ１抗体の結合活性およびブロッキング活性
ＶＥＧＦに結合するＶＥ１の能力を、上記の直接結合および捕捉アッセイにおいて実証した（図２Ａ）。中和抗ＶＥＧＦ ｍＡｂの重要な特性である、ＶＥＧＦのその受容体ＶＥＧＦＲ（ＶＥＧＦＲ２）への結合を阻害するＶＥ１の能力を、上記のブロッキングアッセイを用いて、ベバシズマブを作製するためのヒト化したＡ４．６．１ ｍＡｂの能力と比較した。図２Ｂに示すように、ＶＥ１は、ＶＥＧＦのＶＥＧＦＲへの結合を、Ａ４．６．１よりも実質的に低濃度で完全に阻害した。

実施例４：ヒト化ＶＥ１抗体の構築および特性化
ＶＥ１ ｍＡｂの軽鎖および重鎖可変領域のクローニング、キメラｍＡｂの構築および発現、ならびにヒト化ＶＥ１ ｍＡｂの設計、構築、発現および精製は、全ての目的に関して引用により本明細書中に包含させる米国特許第７，６３２，９２６号にＬ２Ｇ７ ｍＡｂについて記載のように、分子生物学の標準的な方法を用いて全て行った。ＶＥ１の（成熟）軽鎖および重鎖可変（Ｖ）領域アミノ酸配列を、図３Ａおよび３Ｂにそれぞれ示し、上列にＶＥ１を示す。より具体的には、ヒト化ＶＥ１ ｍＡｂを設計するために、Queenらの、米国特許第５，５３０，１０１号および同第５，５８５，０８９号に記載の方法を、一般的に実施した。図３Ａおよび３Ｂの下列にそれぞれ示されているように、ヒトＶＫ配列ＡＡＳ０１７７１およびＶＨ配列ＡＡＣ１８２９２は、それらが特に高いフレームワーク相同性（すなわち、配列同一性）を有するために、ＶＥ１ ＶＬおよびＶＨ配列のアクセプター配列として機能するようにそれぞれ選択された。ＶＥ１可変ドメインのコンピューターにより作成した分子モデルを用いて、ＶＥ１フレームワーク内のアミノ酸が、ＣＤＲと十分に接近してそれらろ相互作用し得るように配置させた。ヒト化ＶＥ１軽鎖および重鎖可変領域を設計するために、マウスＶＥ１ ｍＡｂ由来のＣＤＲを、最初は、構想上、アクセプターフレームワーク領域中に移植した。コンピュータモデルが、ＣＤＲコンフォメーションを維持するために必要であり得るＣＤＲとの有意な接触を示唆するフレームワーク位置では、マウス抗体由来のアミノ酸が、ヒトフレームワークアミノ酸に代わって置換された。このようにして、ヒト化軽鎖およびヒト化重鎖のそれぞれの２バージョンを設計した。軽鎖については、そのような置換はされなかったか（ＨｕＶＥ１−Ｌ1）、または残基４６および８１で置換が行われた（ＨｕＶＥ１−Ｌ２）；重鎖については、重鎖の残基４６、６９および７１が置換されたか（ＨｕＶＥ１−Ｈ１）またはこれらの残基と、さらに残基２および６７が置換された（ＨｕＶＥ１−Ｈ２）。これらの番号付けは全て、Ｋａｂａｔの番号付けを参照する。これらのヒト化軽鎖および重鎖Ｖ領域の配列を、それぞれ図３Ａおよび３Ｂの中段に示し、それらは、それぞれＶＥ１ドナーおよびヒトアクセプターＶ領域に対して整列され、ＣＤＲ（Kabatによって定義される）に下線を付し、上記の置換アミノ酸に二重下線が付されている。Ｖ領域配列を、ヒトκおよびγ−１ Ｃ領域と連結させた。ヒト化軽鎖の各々をヒト化重鎖の各々と組み合わせることにより、以下の表に示すように、ＨｕＶＥ１ ♯１、♯２、♯３および♯４と呼ばれる４種類の異なるヒト化ＶＥ１抗体を作製した（各鎖の置換基の数を括弧内に示す）。さらに、ＣｈＶＥ１と命名されたキメラＶＥ１ ｍＡｂを、（マウス）ＶＥ１のＶ領域をヒトκおよびγ−１ Ｃ領域と組み合わせることにより、構築した。

ＣｈＶＥ１およびＨｕＶＥ１の４つの変異体のＶＥＧＦへの結合能力を、上記の実施例２に記載の捕捉アッセイにおいて、ｍＡｂに結合するためにプレートに用いられた抗ｍＩｇＧ−Ｆｃの代わりにヤギ抗ｈＩｇＧ−Ｆｃを用いて、比較した。ＶＥ１の代わりにＣｈＶＥ１を用いて、すべてのｍＡｂを同じ試薬を用いた１つのアッセイで比較することができた。ＣｈＶＥ１は、同じＶ領域を有するため、ＶＥ１と同じものに結合することが予期される。図４Ａから明らかなように、全ての抗体がＶＥＧＦによく結合し、ＨｕＶＥ１ ♯３および♯４はＣｈＶＥ１とほぼ同じ程度結合し、一方、ＨｕＶＥ１ ♯１およびＨｕＶＥ１ ♯２は、よく結合しなかった。ＣｈＶＥ１およびＨｕＶＥ１の４つの変異体の、ＶＥＧＦのＶＥＧＦＲへの結合を阻止する能力を、上記の実施例２に記載のアッセイにおいて比較した。図４Ｂから明らかなように、全ての抗体がＶＥＧＦのＶＥＧＦＲへの結合を阻止し、ＨｕＶＥ１ ♯３および♯４は、ＣｈＶＥ１とほぼ同じ程度阻害し、一方、ＨＵＶＥ１ ♯１およびＨｕＶＥ１ ♯２は、よく阻害しなかった。これらの結果は、ＨｕＶＥ１−Ｌ２における２つのアミノ酸置換が、この軽鎖を含むヒト化ｍＡｂの活性を改善し、ＨｕＶＥ１−Ｌ２を軽鎖に使用した場合に、ＶＥ１をヒト化するとき親和性が失われないことを示す。さらなる試験は、主にＨｕＶＥ１ ♯４を用いて行われ、以下ではＨｕＶＥ１と称される。

ＨｕＶＥ１ ♯３およびＨｕＶＥ１ ♯４のＶＥＧＦへの（捕捉）結合能力およびＶＥＧＦのＶＥＧＦＲへの結合を阻止する能力を、in 上記で用いたのと同じアッセイを用いてベバシズマブと比較し、結合について図５Ａに示し、阻止について、図５Ｂに示す。ソフトウェアを用いて、結合についての有効濃度５０％（ＥＣ５０）を、このデータから、ベバシズマブについて０．０９μｇ/ｍＬ、ＨｕＶＥ１ ♯３およびＨｕＶＥ１ ♯４の両方についてたった０．０２μｇ／ｍＬと計算した。同様に、ブロッキングの阻害濃度５０％（ＩＣ５０）を、ベバシズマブについて０．３４μｇ/ｍＬ、ＨｕＶＥ１ ♯３についてたった０．０５μｇ／ｍＬおよびＨｕＶＥ１ ♯４について０．０６μｇ/ｍＬと計算し、ＶＥＧＦのＶＥＧＦＲへの結合を阻害する臨界活性において、ＨｕＶＥ１ ♯３およびＨｕＶＥ１ ♯４はそれぞれ、ベバシズマブよりも約７倍および６倍強力であった。

最後に、ＨｕＶＥ１ （ＨｕＶＥ１ ♯４）の、ヒト臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）のＶＥＧＦ誘発性増殖を阻害する能力を、ｍＡｂの活性を中和するアッセイにより、ベバシズマブと比較して測定した。このアッセイを実施するために、１％ ＦＣＳおよび０．１％ ＢＳＡを含むＥＢＭ-２培地中、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートの１ウェル当たり５，０００ＨＵＶＥＣを播種して一晩インキュベートし、その後、０．１％ ＦＣＳおよび０．１％ ＢＳＡを含むＥＢＭ-２中で２４時間インキュベートした。その後、細胞を、２０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦと漸増濃度のｍＡｂを含む同じ培地中で３日間インキュベートした。ＷＳＴ−８を製造業者の指示書の通りに用いて増殖の程度を判定した。図６Ａに示す通り、ＨｕＶＥ１は、ベバシズマブについて０．３６μｇ／ｍＬと比較して、０．０５７μｇ／ｍＬと計算されたＩＣ５０を有するバックグラウンドレベル（ＶＥＧＦなし）へ増殖を阻害することができ、すなわち、ＨｕＶＥ１は、受容体ブロッキングアッセイにおける上記の結果と完全に一致して、このバイオアッセイにおいてベバシズマブより約６倍高かった。

本発明者らはまた、上記のアッセイにおいてＶＥＧＦのＶＥＧＦＲ２への結合を阻害する能力によって測定されるように、ＨｕＶＥ１の活性を、高い結合親和性または活性を有すると主張されるいくつかの既報の抗ＶＥＧＦ ｍＡｂの活性と比較した。他のｍＡｂは、それらの公表された配列：ヒト化ウサギｍＡｂ ｈＥＢＶ３２１（ＵＳ ２０１２／０２３１０１１）、親和性成熟ヒト化ｍＡｂ Ｙ０３１７ （ＥＰ １ ７８７ ９９９）、ならびにヒトｍＡｂ Ｂ２０．４．１およびＢ２０．４.１．１ （ＵＳ ２００９／０１４２３４３）に基づいて最初に合成された。図６Ｂから明らかな通り、これらのｍＡｂのいずれも、アッセイにおいてＨｕＶＥ１と同程度の活性であり、いくつかは顕著に低い活性であった。

ＨｕＶＥ１がＶＥＧＦ−Ａに特異的に結合することを示すために、０．２μｇ／ｍＬのそのタンパク質、ならびにＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄならびに２つの他の増殖因子ＨＧＦおよびＦＧＦ２を、最初に、ヘパリン（５０μｇ／ｍＬ）でコーティングしたＥＬＩＳＡプレート上でインキュベートした。その後、ウェルを、２μｇ／ｍＬのＨｕＶＥ１または対照ｍＡｂ ベバシズマブ、ＨｕＬ２Ｇ７、ヒト化ＧＡＬ−Ｆ２ 抗ＦＧＦ２、または陰性対照ｈＩｇＧと共にインキュベートし、次いで、ＨＲＰ−ヤギ抗ヒトＩｇＧおよびその後ＴＭＢ基質で検出した。図７Ａに示す通り、対照ｍＡｂ ＨｕＬ２Ｇ７およびヒト化ＧＡＬ−Ｆ２はそれぞれＨＧＦおよびＦＧＦ２にのみ結合し、一方、ＨｕＶＥ１（および、ベバシズマブ）は、バックグラウンドレベル（ｈＩｇＧの結合）を上回るレベルでＶＥＧＦ−Ａにのみ結合して、ＶＥＧＦ−Ａに対するＨｕＶＥ１の特異性を示す。（マウス）ＶＥ１は、そのヒト化形態と同じ様式で結合するため、ＶＥＧＦ−Ａに対して特異的であるはずである。同様の方法であるが、ＶＥＧＦを捕捉するためにヘパリンではなくＡ４．６．１（２μｇ／ｍＬ）でＥＬＩＳＡプレートをコーティングする別の試験では、ＨｕＶＥ１（および、ベバシズマブ）は、ＶＥＧＦ−Ａの３つの異なるイソ型：最も短い形態のＶＥＧＦ_１２１、最も豊富な形態のＶＥＧＦ_１６５、およびＶＥＧＦ_１８９に結合した（図７Ｂ）。

実施例５：ＨｕＶＥ１のエピトープ
ＨｕＶＥ１（および、従ってＶＥ１）のエピトープを決定するために、本発明者らは、カルボキシ末端で、Ｆｌａｇペプチドがそれに続くヒトκ定常領域に結合したＶＥＧＦ（ＶＥＧＦ−ＫＦ）の一連の誘導体に結合するその能力を測定した。この目的のために、ＥＬＩＳＡウェルを、ヤギ抗ヒト−Ｉｇ−Ｆｃ（２μｇ／ｍＬ）でコーティングし、２％ ＢＳＡでブロッキングし、０．１μｇ／ｍＬ ＨｕＶＥ１(ＨｕＶＥ１ ♯４）または比較のためのベバシズマブと共にインキュベートし、次いでＶＥＧＦ−ＫＦの好適な形態と共にインキュベートし、ＨＲＰ−Ｍ２−抗Ｆｌａｇおよび基質で検出した。ＨｕＶＥ１およびベバシズマブは、マウスＶＥＧＦに結合しないことが最初に明らかにされた（図８Ｂの第２カラム）。当技術分野で広く用いられている手法にしたがって、本発明者らはヒトＶＥＧＦとマウスＶＥＧＦとの間に一連のキメラ分子を作製し（図８Ａ）、ＨｕＶＥ１とベバシズマブとのそれぞれに対する結合を測定した。図８Ｂに示す通り、これらのｍＡｂは、アミノ酸領域７９−１０４（図８Ａ中、短い両矢印で示す）がヒトＶＥＧＦに由来するキメラＶＥＧＦにのみ結合し、それ故に、この領域をｍＡｂのエピソードを含むものと同定し、このことはベバシズマブに関する以前の報告と一致していた。

ＨｕＶＥ１のエピトープとベバシズマブのエピトープをより正確に比較するために、ＶＥＧＦの一連の変異体に対するこれらのｍＡｂの結合を測定した（図９）。Ｍ８１ＡおよびＫ８４Ａ（図９Ａ）およびＧ８８ＳまたはＧ８８Ａ（図９Ｂ）のような特定の突然変異は、ＨｕＶＥ１およびベバシズマブの両方の結合を実質的に減少させ、アミノ酸位置８１、８４および８８が両方のこれらのｍＡｂのエピトープに存在することを示した。しかしながら、アミノ酸８３および９２などのアミノ酸の変異は、ベバシツマブの結合を実質的に減少させたが、ＨｕＶＥ１の結合にはほとんどまたは全く影響を及ぼさなかった。これは、本質的にベバシズマブの結合を排除したが、ＨｕＶＥ１の結合にはほとんど影響を与えなかった、二重突然変異Ｍ８３Ａ／Ｇ９２Ａでさらに明確に見られた。本発明者らは、Ｍ８３およびＧ９２等の特定のアミノ酸が、ベバシズマブのエピトープ中にあるが、ＨｕＶＥ１のエピトープになく、従ってこれらのｍＡｂは、ＶＥＧＦ上に重複するが同一ではないエピトープを有するはずであると結論付ける。

実施例６：抗Ａｎｇ−２ ｍＡｂの作製
ヒトＡｎｇ−２に結合してその活性を阻害するｍＡｂを作製し、アッセイするために、標準的な分子生物学的方法を用いていくつかのＦｃ融合タンパク質を構築した。この目的のために、ヒト、マウスおよびマウス−ヒトまたはヒト−マウスキメラ Ａｎｇ−２（各々、ｈＡｎｇ−２（Ｆ）、ｍＡｎｇ−２（Ｆ）、ヒトＡｎｇ−２のアミノ酸４１１−４９６に結合されたマウスＡｎｇ−２のアミノ酸２７４−４１０、またはその逆からなるそれぞれのキメラ形態を含む、ｍ／ｈＡｎｇ−２（Ｆ）およびｈ／ｍＡｎｇ−２（Ｆ）と示す）のフィブリノーゲン様（Ｆ）ドメイン（アミノ酸２７４から４９６）をコードするｃＤＮＡを構築した。これらのｃＤＮＡは、Ｎ末端またはＣ末端のいずれかでヒトＩｇγ−１ Ｆｃ領域（ヒンジ−ｃＨ２−ｃＨ３）に結合させるか（各々、適当な修飾を有して、Ｆｃ−Ａｎｇ−２（Ｆ）およびＡｎｇ−２（Ｆ）−Ｆｃと示す）、またはＣ末端でＦｌａｇペプチドが続くヒトκ定常領域に結合させて（ｈＡｎｇ−２（Ｆ）−ＫＦなどと示す）、ｐＣＩベクター（Invitrogen）の誘導体中に挿入し、トランスフェクトして、２９３Ｆ哺乳動物細胞中で発現させた。Ｆｃ融合タンパク質を、プロテインＡカラム（Sigma−Aldrich）を用いて２９３Ｆ培養上清から精製した。別の融合タンパク質であるＦｌａｇ−ｍ／ｈＡｎｇ−２（Ｆ）を、ｐＣＩベクター（Invitrogen）の誘導体においてマウス／ヒトキメラＡｎｇ−２（Ｆ）のＮ末端にＦＬＡＧタグ（アミノ酸ＤＹＫＤＤＤＤＫ）を連結させて、２９３Ｆ細胞で発現させて、抗ＦＬＡＧカラムを用いて精製することにより作製した。別のタンパク質であるペプチド−ＫＬＨを、ｈＡｎｇ−２由来のペプチド（アミノ酸４６４−４８３）をＫＬＨに化学的に結合させることにより作製した。ブロッキングアッセイのために、ヒトＴｉｅ−２受容体の細胞外ドメイン（アミノ酸１から７６０）を、ヒトＩｇγ−１ Ｆｃ定常領域（ヒンジ−ｃＨ２−ｃＨ３）に連結させて、ヒトＴｉｅ−２−Ｆｃを作製し、それを哺乳動物細胞で産生させ、プロテインＡカラムを用いて精製した。

Ｂａｌｂ／ｃメスマウスを、Ｒｉｂｉアジュバント中の抗原で週２回、各後肢足蹠にて免疫化した（最初の注射については１０μｇ、その後の注射については５μｇ、または記載の通り）。１群のマウスを、ｈＡｎｇ−２（Ｆ）−Ｆｃで１２回免疫化し、最後にＦｃ−ｈＡｎｇ−２（Ｆ）で追加免疫した。第２の群のマウスをｈＡｎｇ−２（Ｆ）−ＦｃとｍＡｎｇ−２（Ｆ）−Ｆｃで交互に６回免疫化し、その後Ｆｌａｇ−ｍ／ｈＡｎｇ−２（Ｆ）で３回、ｈＡｎｇ−２（Ｆ）−ＦｃとｍＡｎｇ−２（Ｆ）−Ｆｃで交互に３回、次いで、ペプチド−ＫＬＨ（６μｇ）で２回、最後にｍ／ｈＡｎｇ−２（Ｆ）−Ｆｃで追加免疫した。この最後の追加免疫の３日後、膝窩リンパ節細胞をマウスミエローマ細胞Ｐ３Ｘ６３ＡｇＵ.１と融合させ、ハイブリドーマを上記の通りにＨＡＴ培地中で選択した。ハイブリドーマ培養上清を、最初に、ｈＡｎｇ２（Ｆ）−ＫＦ捕捉ＥＬＩＳＡでスクリーニングし、次いで、下記のようにＡｎｇ−２ Ｔｉｅ２ブロッキングＥＬＩＳＡを行った。選択されたハイブリドーマを、Ａｎｇ２（Ｆ）−ＫＦ結合ならびにＡｎｇ−２／Ｔｉｅ２ブロッキング活性についてスクリーニングすることにより２回クローン化した。２６個の融合物から約２６，０００個のハイブリドーマをスクリーニングした後、それらの高い結合活性およびブロッキング活性に基づいて、ｍＡｂ Ａ２Ｂ１４．６（本明細書中Ａ２Ｂと称する）を、第１群のマウスの１つの融合物から選択し、ｍＡｂ Ａ２Ｔ.１０．２（本明細書中、Ａ２Ｔと称する）を、第２群のマウスの１つの融合物から選択した。Ａ２ＢおよびＡ２Ｔは、アイソタイピングキットを用いてＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ２ａイソ型のそれぞれであると決定された。

Ａ２ＢおよびＡ２Ｔと強力な抗血管新生効果を有することが以前に示された他の抗Ａｎｇ−２ ｍＡｂとを比較するために、本発明者らは、それらの公表された配列：Ａｂ３５６（上記のJ. Olinerらの、国際公開第０３／０３０８３３号に記載の配列番号１１および配列番号１２）；ＲＥＧＮ９１０（上記のC. Dalyらの、NCI Drug Dictionaryのネズバクマブとして同定されたREGN910 http://www.cancer.gov/publications/dictionaries/ cancer−drug−cdrid=693224、およびその後得られた配列 http://www.genome.jp/dbget by search for nesvacumab）；ＭＥＤＩ−３１６７（上記のA. Buchananらの、図１Ａおよび要約およびテキスト）、ならびにＬＣ０６（上記のM. ThomasらおよびS. Fennらの、Plos One 8: e61953−e61953、2013; タンパク質データバンク中、４ＩＭＫ）に基づいて、いくつかのそのようなｍＡｂの可変ドメイン遺伝子を合成した。本発明者らはまた、構築および発現のための標準的な方法を用いて、各ｍＡｂのヒトＶ領域がマウスＣ領域に連結された、ヒト−マウスキメラ抗体ｍｕＡｂ３５６、ｍｕＭＥＤＩ−３１６７およびｍｕＲＥＧＮ９１０を作製し、これらのｍＡｂを、同じアッセイにおいてマウス抗体Ａ２ＢおよびＡ２Ｔと比較することができた。もちろん、キメラｍＡｂは、それぞれのヒトｍＡｂと同じ結合活性およびブロッキング活性を有することが予期される。

実施例８：抗Ａｎｇ−２ ｍＡｂの特性化
Ａｎｇ−２に結合する抗Ａｎｇ−２ ｍＡｂの能力を測定するために、ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｆｃ（２μｇ／ｍＬ）でコーティングしたプレートを、ハイブリドーマ上清または試験されるべき精製したｍＡｂ（２μｇ／ｍＬ）と共にインキュベートし、その後ｈＡｎｇ−２（Ｆ）−ＫＦ（１μｇ／ｍＬ）と共にインキュベートした。結合したｈＡｎｇ２（Ｆ）−ＫＦを、ＨＲＰ−ヤギ抗ＩｇＧ−κ（Sigma）を添加し、その後、ＴＭＢ基質を添加して検出した。ｍＡｂのマウスＡｎｇ−２への結合およびカニクイザルのＡｎｇ−２への結合もまた、適当なＡｎｇ−２（Ｆ）−ＫＦ構築物を用いて、この方法で測定した。以前に報告された抗体Ａｂ５３６、ＭＥＤＩ−３１６７およびＲＥＧＮ９１０とは異なり、ｍＡｂ Ａ２ＢおよびＡ２Ｔは両方とも、ヒトおよびカニクイザルＡｎｇ−２に結合するが、マウスＡｎｇ−２に検出可能に結合しない（図１０Ａ）。このため、Ａ２ＢおよびＡ２Ｔは、これらの以前のｍＡｂとは異なるエピトープを有しているはずである。同様のアッセイにおいて、これらのｍＡｂのいずれもＡｎｇ−１に結合しないことが示された。

抗Ａｎｇ−２ ｍＡｂのエピトープを決定するために、本発明者らはまた、これらのｍＡｂの、上記のキメラ ｍ／ｈＡｎｇ２（Ｆ）―ＫＦおよびｈ／ｍＡｎｇ２（Ｆ）―ＫＦタンパク質への結合能力を測定するためにＥＬＩＳＡアッセイを用いた。Ａ２Ｂ ｍＡｂは、ｈ／ｍＡｎｇ−２−ＫＦに結合したが、ｍ／ｈＡｎｇ−２−ＫＦに結合せず、一方、Ａ２Ｔ ｍＡｂは、ｍ／ｈＡｎｇ−２−ＫＦに結合したが、ｈ／ｍＡｎｇ−２−ＫＦに結合せず（図１０Ｂ）、このことは、Ａ２ＢおよびＡ２Ｔが異なるエピトープを有し、Ａ２Ｔのエピトープがアミノ酸４１１−４９６領域に含まれることを示す。

Ａ２ＢおよびＡ２Ｔの、（ヒト）Ａｎｇ−２のその受容体（ヒト）Ｔｉｅ−２への結合を阻止する能力を測定するために、最初に、ＥＬＩＳＡプレートをヤギ抗ｈＩｇＧ−Ｆｃ（２μｇ／ｍＬ）でコーティングし、その後Ｔｉｅ−２−Ｆｃ（０．３μｇ／ｍＬ）でコーティングし、次いで、５０または１００ｎｇ／ｍＬのＡｎｇ−２を、ハイブリドーマ上清または精製した抗Ａｎｇ−２ ｍＡｂと混合した。結合したＡｎｇ−２を０．５μｇ／ｍＬのビオチニル化抗Ａｎｇ−２抗体（R&D Systems）を用いて検出し、その後、ＨＲＰ−ストレプトアビジンおよびＴＭＢ基質を添加した。このアッセイにおいて、Ａ２ＢおよびＡ２Ｔの両方が、ＭＥＤＩ−３１６７およびＲＥＧＮ９１０よりも僅かに強力に、Ａｂ５３６よりも顕著により強力に、Ａｎｇ−２のＴｉｅ−２への結合を完全に阻害した（図１１）。

実施例９：ヒト化Ａ２Ｔ抗体の構築および特性化
重鎖Ａ２ＢおよびＡ２Ｔ ｍＡｂの軽鎖および重鎖可変領域を、ＶＥ１について上記の通りにクローニングし、配列決定し、Ａ２Ｂの配列を図１２に示す。キメラＡ２Ｔ ｍＡｂの構築および発現、ならびにヒト化Ａ２Ｔ ｍＡｂの設計、構築、発現および精製もまた、ＶＥ１ ｍＡｂにちて上記の通り、標準的な分子生物学的方法を用いて行った。Ａ２Ｔの（成熟）軽鎖および重鎖可変（Ｖ）領域のアミノ酸配列をそれぞれ図１３Ａおよび１３Ｂに示し、上列にＡ２Ｔを示す。図１３Ａおよび１３Ｂにそれぞれ下線を付して示される、ヒトＶＫ配列ＡＩＴ３９０２４およびＶＨ配列ＡＩＴ３８７５１は、Ａ２Ｔ ＶＬおよびＶＨ配列との高いフレームワーク相同性のために、それらのアクセプター配列として機能するようにそれぞれ選択された。軽鎖について、マウス配列からの置換を、残基４９ （ＨｕＡ２Ｔ−Ｌ１）、または残基４３および４９（ＨｕＡ２Ｔ−Ｌ２）で行った。重鎖について、重鎖の残基２８、４８および４９が置換されるか（ＨｕＡ２Ｔ−Ｈ１）、またはこれらの残基に加えて残基３７および６６が置換された（ＨｕＡ２Ｔ−Ｈ２）（これらの番号は全てＫａｂａｔの番号付けに従う）。加えて、各重鎖の２つのバージョンを構築した：パターンＮ−Ｘ−Ｓ／Ｔから予測される位置５８の可能性のあるＮ−結合グリコシル化部位を排除するための、マウス配列由来の位置６０のＴ（重鎖ＣＤＲ２中）、またはヒトアクセプター配列由来の位置６０のＡのいずれか。これらのヒト化軽鎖および重鎖Ｖ領域配列をそれぞれ図１３Ａおよび１３Ｂの中レーンに示し（重鎖の位置６０にＡを有する）、ここで、それらは、それぞれのＶＥ１ドナーおよびヒトアクセプターＶ領域に対して整列され、ＣＤＲ（Ｋａｂａｔにより定義される）に下線を引き、上記に列挙した置換アミノ酸に二重下線を引いた。Ｖ領域配列は、ヒトκおよびγ−１ Ｃ領域と連結させた。ヒト化軽鎖の各々とヒト化重鎖の各々とを組合ることにより、４つの異なるヒト化Ａ２Ｔ抗体の２セットを作成し、位置６０にＴを有するＨｕＡ２Ｔ ♯１、♯２、♯３および♯４ならびに位置６０にＡを有するＨｕＡ２Ｔ ＃１（ｄ）、＃２（ｄ）、＃３（ｄ）および＃４（ｄ）と命名した（下表に示す通り、各鎖における置換数を括弧内に示す）。さらに、ＣｈＡ２Ｔと命名したキメラＡ２Ｔ ｍＡｂを、（マウス）ＶＥ１のＶ領域とヒトκおよびγ−１ Ｃ領域とを組合せることにより構築した。

位置６０にＴを有するＨｕＡ２Ｔバージョンを、結合および阻止アッセイにおいて位置６０にＡを有するそれぞれのバージョンと比較したところ、例えば結合については図１４Ａに、ブロッキングについては図１４Ｂに見られる通り、有意な差異は観察されなかった。さらに、ＨｕＡ２Ｔバージョンは、Ａｎｇ−２に結合し、ならびにＣｈＡ２Ｔも結合したが（図１４Ａ）、実際に、アッセイにおいて、ＣｈＡ２Ｔよりも僅かに多くＴｉｅ−２へのＡｎｇ−２の結合を阻止し（図１４Ｂ）、このことは、ヒト化により活性が失われなかったことを示した。可能性のあるタンパク質の不均一性および他の問題のために抗体Ｖ領域にグリコシル化を有しないことが好ましいので、ＨｕＡ２Ｔの脱グリコシル化（ｄ）バージョンでさらなる試験を行った。４つ全てのｍＡｂ ＨｕＡ２Ｔ ♯１（ｄ）、♯２（ｄ）、♯３（ｄ）および♯４（ｄ）が、同じ程度に結合し（図１５Ａ）、阻止し（図１５Ｂ）、おそらくＨｕＡ２Ｔ ♯４（ｄ）が他のものよりわずかに優れていた。従って、以下の全てにおいて、ＨｕＡ２Ｔ ♯４（ｄ）を単にＨｕＡ２Ｔと称する。本発明者らはまた、Ｔｉｅ−２へのＡｎｇ−２の結合を阻止するＨｕＡ２Ｔの活性が、以前に報告されたヒト抗Ａｎｇ−２ ｍＡｂ ＲＥＧＮ９１０およびＬＣ０６と同程度であることも示した（図１６Ａ）。

最後に、本発明者らは、ＨｕＡ２Ｔ、ＲＥＧＮ９１０およびＬＣ０６の活性をより生物学的なアッセイで比較した：Ａｎｇ−２の阻害は、Ｔｉｅ−２リン酸化を誘導した。初めに、ＨＥＫ２９３ヒト胎児腎細胞（ATCC CRL 1573）を、発現ベクター中のＴｉｅ−２遺伝子でトランスフェクションし、そうしてこれらのＨＥＫ２９３−Ｔｉｅ−２細胞は、完全長ヒトＴｉｅ−２受容体を発現した。細胞を、２４ウェルプレート中、１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ培地中で増殖させた。培地を血清不含有のＤＭＥＭ−０．１％ＢＳＡと交換し、細胞を１８時間インキュベートした。種々の濃度のｍＡｂの存在下で、ヒト組換えＡｎｇ−２（R&D Systems；１μｇ／ｍＬ）で細胞を２０分間（３７℃、５％ＣＯ_２）刺激した。リン酸化されたＴｉｅ−２のレベルを、製造業者の指示書に従ってＥＬＩＳＡキット(R&D Systems #DYC2720)により判定した。３つのｍＡｂが、同程度にリン酸化を阻害し、ＨｕＡ２ＴはＬＣ０６より僅かに強力に阻害した（図１６Ｂ）。

実施例１０：二重特異性ＨｕＶＥ１／ＨｕＡ２Ｔ抗体
Ｂ−ＨｕＡ２Ｔ／ＨｕＶＥ１と称される二重特異性抗体を、図１に概略的に示されるＢｓ（ｓｃＦｖ）４−ＩｇＧフォーマットを用いて、ＨｕＶＥ１ 抗ＶＥＧＦ ｍＡｂおよびＨｕＡ２Ｔ 抗Ａｎｇ−２ ｍＡｂ由来の結合ドメインを含んで構築した。図１Ａの表記に関して、Ｖ_Ｌ１およびＶ_Ｈ１はそれぞれ、ＨｕＶＥ１−Ｌ１およびＨｕＶＥ１−Ｈ２であり（図３）、一方、Ｖ_Ｌ２およびＶ_Ｈ２はそれぞれ、ＨｕＡ２Ｔ−Ｌ１およびＨｕＡ２Ｔ−Ｈ２であり（図１３）、それぞれの重鎖および軽鎖ドメイン間のリンカーは（Ｇ_４Ｓ）_３ＧＳであり、そして定常領域は、ヒトＩｇＧ１、κアイソタイプのものである。二重特異性Ｂ−ＨｕＡ２Ｔ／ＨｕＶＥ１ ｍＡｂがＶＥＧＦおよびＡｎｇ−２に同時に結合することができることを示すために、ＥＬＩＳＡプレートをＧＳＴ−ＶＥＧＦ（グルタミン合成酵素とＶＥＧＦの融合タンパク質）でコーティングし、その後、漸増濃度の二重特異性ｍＡｂまたは対照ｍＡｂ ＨｕＶＥ１と共に、次いでｈＡｎｇ−２（Ｆ）−ＫＦと共にインキュベートし、ＨＲＰ−抗Ｆｌａｇ Ｍ２およびＴＭＢ基質を用いて検出した。プレート上のＧＳＴ−ＶＥＧＦおよび溶液中のＡｎｇ−２の両方に結合し得る分子のみが、このアッセイにおいて陽性シグナルを生じ得る。Ｂ−ＨｕＡ２Ｔ／ＨｕＶＥ１の場合が陽性であったが、ＶＥＧＦのみに結合できるＨｕＶＥ１は陽性ではなかった（図１７Ａ）。

個々のｍＡｂとしてのＨｕＶＥ１およびＨｕＡ２Ｔの活性をＢ−ＨｕＡ２Ｔ／ＨｕＶＥ１の一部分としてのそれらの活性と比較するために、本発明者らは、初めに、実施例２に記載のＶＥＧＦ捕捉アッセイを用いてＨｕＶＥ１およびＢ−ＨｕＡ２Ｔ／ＨｕＶＥ１の結合活性を比較した。Ｂ−ＨｕＡ２Ｔ／ＨｕＶＥ１の結合活性は、ＥＣ５０による測定としてＨｕＶＥ１の結合活性より約２倍だけ低下し、重要なことには、ヒトの癌に対して当然ながら有効であることが知られているベバシズマブよりも依然として強い（図１７Ｂ）。同様に、実施例８に記載の結合アッセイを用いて、Ｂ−ＨｕＡ２Ｔ／ＨｕＶＥ１のＡｎｇ−２に対する結合活性は、ＨｕＡ２Ｔの結合活性よりも約３倍低下した。最後に、実施例８に記載の阻止アッセイを用いて、Ｂ−ＨｕＡ２Ｔ／ＨｕＶＥ１がＶＥＧＦのＶＥＧＦＲ２への結合を阻害する能力（図１８Ａ）およびＡｎｇ−２のＴｉｅ−２への結合を阻害する能力（図１８Ｂ）を測定した。Ｂ−ＨｕＡ２Ｔ／ＨｕＶＥ１は、ＶＥＧＦおよびＡｎｇ−２の両方のそれらの受容体への結合を本質的に完全に阻害することができたが、それぞれＨｕＶＥ１およびＨｕＡ２Ｔよりも約２倍低い活性であった。ＨｕＶＥ１およびＨｕＡ２Ｔの結合ドメインは、Ｂ−ＨｕＡ２Ｔ／ＨｕＶＥ１において一本鎖形態であるため、いくらかの活性低下が予想されない訳ではない。

実施例１１：ＶＥ１およびＨｕＶＥ１の、腫瘍異種移植片の増殖を阻害する能力
異種移植実験は、既報のように（Kim et al., Nature 362:841, 1993）、種々の投与レジメンで行われる。一般的には、完全ＤＭＥＭ培地中で増殖させたヒト腫瘍細胞をＨＢＳＳ中で回収する。メスの胸腺欠損ヌードマウス（５−６週齢）に、背部領域に、０．１ｍｌのＨＢＳＳ中の２−１０×１０^６細胞を皮下注射した。一般的には腫瘍サイズが１００ｍｍ^３に達すると、マウスを無作為に分類し、５ｍｇ／ｋｇ（合計１００μｇ）のｍＡｂを容量０．１ｍｌで週２回腹腔内投与するか、または示されている他の投与量レジメンを用いて投与する。腫瘍サイズを、２次元[長さ（ａ）と幅（ｂ）]で測定することにより週に２回測定する。腫瘍体積は、Ｖ＝ａｂ^２／２に従って計算され、平均腫瘍体積±ＳＥＭとして表される。各処置群におけるマウスの数は、一般的に、５〜７匹である。統計分析は、例えば、最終データ点についてスチューデントのｔ検定を用いて行うことができる。

図１９Ａは、ＶＥ１（５ｍｇ／ｋｇ、週２回）による処置が、ＣＯＬＯ ２０５結腸腫瘍（ATCC CCL−222）異種移植片の増殖を阻害したことを示す。同様に、図１９Ｂは、同じ投与量レジメンでのＨｕＶＥ１ ♯３による処置が、ＶＥ１とほぼ同様に、ＣＯＬＯ ２０５異種移植片の増殖を阻害したことを示す。いくつかのモデルにおいてＨｕＶＥ１が腫瘍異種移植の阻害についてベバシズマブより優れていることを示すために、より高用量ではベバシズマブ自体が非常に有効であるため、低用量の２つのｍＡｂを用いた。ヒト腫瘍をマウスに継代し、細胞系に変換されない、原発性肝腫瘍モデルにおいて、ｍＡｂを２．５ｍｇ／ｋｇの用量で週２回投与したとき、ベバシズマブと比較してＨｕＶＥ１の有効性がより優れる傾向があった（図２０Ａ、ｐ＝０．１）。一方で、ベバシズマブは、６日目および９日目に１ｍｇ／ｋｇで投与されたとき、ＲＰＭＩ４７８８結腸腫瘍細胞の異種移植片に対して有効でなかったのに対し（Roswell Park Institute, M. Aonuma et al., Anticancer Res 19:4039−4044, 1999）、ＨｕＶＥ１は部分的に有効であった（図２０Ｂ、ＨｕＶＥ１ 対 ベバシズマブについて、ｐ＝０．０１）。

同様に、原発性乳癌異種移植モデルにおいて、ｍＡｂを５ｍｇ／ｋｇの用量で週に１回投与したとき、ベバシズマブと比較してＨｕＶＥ１の有効性がより優れる傾向があった（図２１）。

本発明は、現在好ましい態様を参照して説明されているが、本発明から逸脱することなく種々の変更が可能であることが理解されるべきである。文脈から特にこれと異なることが明らかでない限り、本発明の任意の工程、要素、態様、特徴または局面は、他のいずれかと共に用いられ得る。受託番号などを含む引用された全ての文献、特許および特許出願は、各個々の文献、特許および特許出願が全ての目的に関して引用によりその内容全体を本明細書中に包含されるように具体的かつ個別に示されているのと同程度に、全ての目的に関してその内容全体を引用により本明細書中に包含させる。用語“本明細書中”とは、該用語“本明細書中”が出現するセクション内のみでなく、本特許出願のどこにでも示されるものとする。２以上の配列が異なる時間に受託番号で関連するとき、本願の有効な出願日における受託番号に関連する配列が意図され、有効な出願日とは、実際の出願日または問題の受託番号を開示する優先権主張出願の出願日より前の日を意味する。

Claims (20)

1. ＶＥＧＦに結合してこれを中和するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）であって、ＶＥ１抗体と同じエピトープを有する、モノクローナル抗体。
2. 図３Ａに記載のＶＥ１の軽鎖可変領域配列由来の３つのＣＤＲを有する軽鎖可変領域および図３Ｂに記載のＶＥ１の重鎖可変領域配列由来の３つのＣＤＲを有する重鎖可変領域を含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
3. ヒト化抗体である、請求項２に記載のモノクローナル抗体。
4. 図３Ａに記載のＨｕＶＥ１−Ｌ１またはＨｕＶＥ１−Ｌ２の配列を有する軽鎖可変領域および図３Ｂに記載のＨｕＶＥ１−Ｈ１またはＨｕＶＥ１−Ｈ２の配列を有する重鎖可変領域を含む、請求項２に記載のモノクローナル抗体。
5. Ｆｖ、ＦａｂもしくはＦ（ａｂ’）_２断片または一本鎖抗体である、請求項２に記載のモノクローナル抗体。
6. マウスにおけるヒト腫瘍異種移植片の増殖を阻害する、請求項２に記載のモノクローナル抗体。
7. 二重特異性抗体である、請求項２に記載のモノクローナル抗体。
8. ＶＥＧＦに結合する第１の結合ドメインおよびＨＧＦまたはＦＧＦ２またはＡｎｇ−２に結合する第２の結合ドメインを含む、請求項７に記載のモノクローナル抗体。
9. ＶＥＧＦに結合する第１の結合ドメインおよびＨＧＦまたはＦＧＦ２またはＡｎｇ−２に結合する第２の結合ドメインをそれぞれ含む、モノマーからなるホモダイマーである、請求項７に記載のモノクローナル抗体。
10. 請求項２に記載のモノクローナル抗体を含む、医薬組成物。
11. 請求項１０に記載の医薬組成物を、疾患を有する患者に投与することを含む、該患者の処置法。
12. 前記疾患が癌である、請求項１１に記載の方法。
13. Ａｎｇ−２に結合してこれを中和するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）であって、Ａ２Ｔ抗体と同じエピトープを有する、モノクローナル抗体。
14. 図１３Ａに記載のＡ２Ｔの軽鎖可変領域配列由来の３つのＣＤＲを有する軽鎖可変領域および図１３Ｂに記載のＡ２Ｔの重鎖可変領域配列由来の３つのＣＤＲを有する重鎖可変領域を含む、請求項１３に記載のモノクローナル抗体。
15. ヒト化抗体である、請求項１４に記載のモノクローナル抗体。
16. 図１３Ａに記載のＨｕＡ２Ｔ−Ｌ１またはＨｕＡ２Ｔ−Ｌ２の配列を有する軽鎖可変領域および図１３Ｂに記載のＨｕＡ２Ｔ−Ｈ１またはＨｕＡ２Ｔ−Ｈ２の配列を有する重鎖可変領域を含む、請求項１５に記載のモノクローナル抗体。
17. 二重特異性抗体である、請求項１４に記載のモノクローナル抗体。
18. 請求項１４に記載のモノクローナル抗体を含む、医薬組成物。
19. 請求項１８に記載の医薬組成物を投与することを含む、疾患を有する患者の処置法。
20. 前記疾患が癌である、請求項１９に記載の方法。