CN102002104A - 一种抗vegf的单克隆抗体及含有该抗体的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因工程领域，提供一种单克隆抗体，其重链可变区含有SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，或其轻链可变区含有SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。本发明还提供一种人源化单克隆抗体，由保藏编号为CGMCC No.3233的细胞株产生。本发明所述抗体可与VEGF有很强的结合亲和力，可抑制VEGF诱导的内皮细胞增殖和迁移，抑制肿瘤生长，可用于治疗VEGF相关性疾病。本发明所述抗体活性强、特异性好、易于制备，具有广阔的临床应用和实验应用前景。

Description

一种抗VEGF的单克隆抗体及含有该抗体的药物组合物
技术领域
本发明涉及基因工程抗体技术领域，具体涉及与血管内皮生长因子VEGF特异性结合的基因工程抗体，本发明还提供含有该抗体的药物组合物和试剂盒。
背景技术
血管内皮生长因子，vascular endothelial growth factor，简称VEGF，是血管内皮细胞特异性的肝素结合生长因子(heparin-binding growth factor)，可在体内诱导血管新生。人的VEGF蛋白于1989年由美国的科学家成功纯化与鉴定，并克隆与测定了其基因序列。
血管内皮生长因子具有促进血管生成的作用。所有VEGF家族的成员都能通过结合细胞表面的相应受体(VEGFRs)来激活细胞反应，通过磷酸作用从而二聚化并活化。血管内皮生长因子受体含有7个免疫球蛋白样的胞外结构域，一个跨膜结构域和一个含酪氨酸激酶域的胞内结构域。血管内皮生长因子A能与血管内皮生长因子受体1(受体Flt-1)和血管内皮生长因子受体-2(KDR/Flk-1)结合。血管内皮生长因子受体-2几乎介导了VEGF所有已知的细胞反应。血管内皮生长因子，它的生物活性和它的受体已经被Matsumoto等人和Marti等人详细阐述和研究(参见Angiogenesis in ischemic disease.Thromb Haemost.1999Suppl 1：44-52；VEGF receptor signal transduction Sci STKE.2001：RE21)。
VEGF是高度保守的同源二聚体糖蛋白，由两条分子量各为24kDa的单链以二硫键组成二聚体。由于mRNA不同的剪切方式，分别产生出VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF185、VEGF206等至少5种蛋白形式，其中VEGF121、VEGF145、VEGF165是分泌型可溶性蛋白，能直接作用于血管内皮细胞，促进血管内皮细胞增殖和迁移，增加血管通透性。
VEGF相关疾病通常的特征为：过度的血管内皮细胞的增殖、血管通透性增加、组织水肿和炎症如由损伤、中风或肿瘤引起的脑水肿；炎症疾病引起的水肿，如银屑病或关节炎，包括类风湿性关节炎；哮喘；烧伤相关的普遍性水肿；肿瘤、炎症或外伤引起的腹水和胸腔积液；慢性气管炎；毛细血管漏综合症；败血病；蛋白质渗漏相关的肾脏疾病；眼部疾病，如老年性黄斑变性和糖尿病性视网膜病变；肿瘤，包括乳腺癌、肺癌、结直肠癌、脑胶质瘤和肾癌等。
抗体与其靶点的结合是特异性的，能够起到介导免疫效应机制的作用，并且在血清中具有较长的半衰期。这些特性使抗体具有很强的治疗应用。
目前，FDA和欧洲已批准了重组人源化鼠抗VEGF单克隆抗体AVASTIN用于治疗结直肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、脑胶质瘤、肾癌和老年性黄斑变性(AMD)，2008年的销售额达到48亿美元。但是AVASTIN抗体对VEGF亲和力不高，另外由于独家生产，病人需要花费高额的费用，目前一个病人用药一年的费用约在5万至10万美元。所以，研发新的抗VEGF单克隆抗体，从而减少病人负担，降低治疗费用是一个亟待解决的问题。
定义
在进一步阐述本发明之前，我们有必要认识到，本发明并不局限于描述的特定的实施方案，也就是说，在具体形式上可能存在着变化。还有一点需要提醒的是，由于本发明的范围受附加的权利要求书的限制，因此，本文使用的术语只是为了描述特定实施方案的目的，而不是为了限制本发明的目的。
术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文中可以互换使用。这些术语均为本领域技术人员所熟知的术语，具体是指由能特异结合抗原的一种或多种多肽构成的蛋白质。抗体的一种形式构成了抗体的基本结构单元。这种形式是四聚物，它由两对完全相同的抗体链构成，每一对都有一个轻链和一个重链。在每对抗体链中，轻链和重链的可变区联合在一起共同负责结合抗原，而恒定区则负责抗体的效应器功能。
目前已知的免疫球蛋白多肽包括κ和λ轻链，以及α，γ(IgG1，IgG2，IgG3，IgG4)，δ，ε和μ重链或它们的其它类型等价物。全长的免疫球蛋白“轻链”(大约25kDa或大约214个氨基酸)包含一个由NH2-末端上大约110个氨基酸形成的可变区，以及一个COOH-末端上的κ或λ恒定区。全长的免疫球蛋白“重链”(大约50kDa或大约446个氨基酸)，同样包含一个可变区(大约116个氨基酸)，以及重链恒定区之一，例如γ(大约330个氨基酸)。
术语“抗体”和“免疫球蛋白”包括任何同型体的抗体或免疫球蛋白，或保持与抗原特异结合的抗体片段，包括但不限于Fab，Fv，scFv和Fd片段、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体以及包含抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白质的融合蛋白质。抗体可以被标记和检测，例如，可以通过放射性同位素、能产生可检测物的酶、荧光蛋白质、生物素等等进行标记并被检测。抗体还可以结合于固相载体，包括但不限于聚苯乙烯平板或珠粒等等。该术语还包括Fab’、Fv、F(ab’)2和/或其它能与抗原特异性结合的抗体片段和单克隆抗体。
抗体还可以以多种形式存在，例如包括Fv、Fab和(Fab′)2，以及双功能杂合抗体(例如文献，Lanzavecchia等，Eur.J.Immunol.，1987；17，105)以及以单链形式(例如，Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1988；85，5879和Bird等，Science，1988；242，423，在此引用作为参考)存在。免疫球蛋白的重链或轻链可变区由三个超变区(也称为“互补决定区”或CDR)组成，这些超变区被框架区(FR)间隔。框架区和互补决定区的范围已被精确定义(参见″Sequences of Proteins of Immunological Interest，″E.Kabat等，U.S.Department of Health and Human Services，1991)。此处所讨论的所有抗体氨基酸序列的排序都参照Kabat系统。同一物种不同的轻链和重链框架区序列相对保守。抗体的框架区用于定位和校准CDR。CDR主要负责结合抗原的表位。
嵌合抗体是其重链和轻链基因经过构建的抗体，特别是利用基因工程改造的属于不同物种的抗体可变区和恒定区基因。例如，可以将鼠单克隆抗体基因的可变区片段连接到人抗体恒定区片段如γ1和γ3。例如治疗用嵌合抗体是一种嵌合蛋白质，它由来源于兔抗体可变区片段或抗原结合区片段和人抗体恒定区或效应区结合(如由A.T.C.C.保藏登记号CRL 9688的细胞制备的抗Tac嵌合抗体)，当然，嵌合抗体的基因来源也可以使用其它哺乳动物物种。
术语“人源化抗体”与“人源化免疫球蛋白”含义相同，通常人源化抗体与同一种抗体的非人源化形式相比，会降低在人宿主中产生的免疫反应。
可以理解本发明设计和生产的人源化抗体可能会替代某些保守性氨基酸，这些氨基酸对抗原结合或抗体其他功能基本上没有影响。换而言之，gly和ala；val、ile和leu；asp和glu；asn和gln；ser和thr；lys和arg；phe和tyr，以上各组合内部的氨基酸可相互取代。未存在于同一组中的氨基酸属于“基本上不同的”氨基酸。
在某些实施方案中，抗体与其靶点之间的亲和力用KD(解离常数)来表征，它低于10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或者约10-12M或更低。
抗体重链或轻链的“可变区”是该链的N端成熟区域。所有区域、CDR和残基编号均以序列比对、按已有的结构知识为基础进行定义。框架区和CDR残基的鉴定和编号按Chothia和他人所述(Chothia，Structural determinants in the sequences of immunoglobulin variable domain.J Mol Biol.1998；278，457)。
VH是抗体重链的可变区。VL是抗体轻链的可变区，它可能具有κ和λ同种型。K-1抗体具有κ-1同种型而K-2抗体具有κ-2同种型，Vλ是可变的λ轻链。
术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可以互换使用，它们都是指任何长度的聚合形式的氨基酸，可以包括编码和非编码的氨基酸、通过化学或生物化学修饰或衍生的氨基酸以及具有修饰肽骨架的多肽。该术语包括融合蛋白，包括但不限于具有异源氨基酸序列的融合蛋白；具有异源和同源前导序列，带有或不带有N-末端甲硫氨酸残基的融合蛋白；带有免疫标签的蛋白；带有可检测融合伴侣的融合蛋白，例如包括荧光蛋白质、β-半乳糖苷酶、荧光素等等作为融合伴侣的融合蛋白等等。多肽可以具有任何大小，术语“肽”是指长度为8-50个残基(如8-20个残基)的多肽。
术语“受试者”、“宿主”、“患者”以及“个体”在本文中可以交替使用，具体是指接受诊断或治疗的任何哺乳动物，尤其是指人类。其它对象可能包括猴、牛、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠和马等。
“相应的氨基酸”，是指当两个或多个氨基酸序列比对时，位于相同位置(也就是它们彼此对应)的氨基酸残基。抗体序列比对和编号的方法在Chothia，见上，Kabat，见上和其他中得到详尽阐述。本领域普通技术人员已知(参见如Kabat 1991Sequences of Proteins of Immunological Interest，DHHS，Washington，DC)，有时可以在抗体的一个或两个氨基酸中制造一个、两个或三个缺口和/或插入1、2、3或4个残基或者至多约15个残基(特别是在L3和H3CDR中)，从而完成一次比对。
“可取代位置”，指的是抗体的一个特殊位置，其可以被不同的氨基酸取代而不会使抗体的结合活性显著降低。鉴定可取代位置的方法和它们可以被如何取代在下面将进行更加详细的描述。可取代位置也可以称为“变异耐受位置”。
“亲本”抗体是指作为氨基酸取代的靶抗体。在某些实施方案中，“供体”抗体会将氨基酸“赠捐”给亲本抗体以生成改变的抗体。“相关抗体”是指具有相似序列并且由具有共同B细胞祖先的细胞产生的抗体。这种B细胞祖先含有具有重排轻链VJC区和重排重链VDJC区基因组，并且产生还未经历亲和力成熟的抗体。存在于脾脏组织中的“纯真”或“原始”B细胞是B细胞的共同祖先。相关抗体与相同的抗原表位结合通常在序列上极为相似，特别是它们的L3和H3CDR。相关抗体的H3和L3CDR都具有相同的长度和近乎一致的序列(有0-4个氨基酸残基不同)。相关抗体通过共同抗体祖先，即原初B细胞祖先产生的抗体相关联。
发明内容
本发明的目的是提供一种对VEGF亲和力更高的单克隆抗体。本发明所述VEGF单克隆抗体，其重链可变区含有SEQ ID NO.1、SEQ IDN0.2和SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，和/或其轻链可变区含有SEQID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。
本发明所述“抗体”应该解释为涵盖具有所需特异性的结合结构域的任意特异性结合因子。因而，这个术语涵盖了与之同源的抗体片段、衍生物、人源化抗体以及抗体的功能等同物和同源物，也包括含有抗原结合结构域的任何多肽，无论是天然的还是合成产生的。抗体的实例是免疫球蛋白亚型(如IgG，IgE，IgM，IgD和IgA)及其亚型亚类；也可以是包含抗原结合结构域的片段如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd；和双链抗体(diabodies)。融合至另一多肽的、包含抗原结合结构域的嵌合体分子或者等同物也包括在其中。嵌合抗体的克隆与表达在EP.A-0120694和EP.A.0125023中描述。
本发明所述单克隆抗体可以是，例如，单价的或是单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、人源化抗体、以及上述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。
抗体可以通过许多方式修饰，可用DNA重组技术来产生保留原来抗体特异性的其它抗体或嵌合分子。这种技术可以包括将编码抗体的免疫球蛋白可变区或互补性决定区(CDRs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区。参见，EP.A.184187，GB 2188638A或.EP.A.239400。还可以对杂交瘤细胞或产生抗体的其它细胞进行遗传突变或其它改变，这可以改变或者不改变所产生抗体的结合特异性。
本发明所述单克隆抗体除了重链和轻链中的高度可变区CDR1、CDR2和CDR3和连接序列外，其它为框架区。框架区可在结合所需的三维结构不受影响的条件下被其他序列置换，抗体特异性的分子基础主要来自于它的高度可变区CDR1、CDR2和CDR3，这些区域是与抗原结合的关键部位。为维持优选的结合特性，CDR的序列应尽可能保留，然而，可能需要一些氨基酸改变使结合特性最优化，本领域的技术人员可以用标准做法来达到此目的。
在某些优选例中，一个单克隆抗体包含如下内容的可变区：一个包含了如SEQ ID NO.7的重链可变区，其含有CDR1(SNNDVMCW；SEQ ID NO.1)，CDR2(GCIMTTDVVTEYANWAKS；SEQ ID NO.2)和CDR3(RDSVGSPLMSFDLW；SEQ ID NO.3)；和一个包含了如SEQ IDNO.8的轻链可变区，其CDR1(QASQSIYNNNELS；SEQ ID NO.4)，CDR2(RASTLAS；SEQ ID NO.5)，和CDR3(GGYKSYSNDGNG；SEQID NO.6)。
可变区CDR的变体与上述CDR区除了有至多6个氨基酸取代的不同外基本上是一致的(例如，1、2、3、4或5个氨基酸取代)，在该单克隆抗体的CDR区具有与VEGF结合活性。
在其它实施方案中，抗体可包含：a)一个重链可变区，其氨基酸序列与SEQ ID NO.7相比有至多6个氨基酸序列取代的不同，例如1、2、3、4、5、或6个取代；和b)一个轻链可变区，其氨基酸序列与SEQ ID NO.8相比有至多6个氨基酸序列取代的不同，例如1、2、3、4、5、或6个氨基酸取代。目标抗体可能包含这些取代中的任何一个或其组合。
拥有这些取代位置中任一个的抗体和拥有所有取代位置的抗体同样具有结合VEGF的活性。氨基酸取代可同时存在于框架区和CDR区，或单独出现在框架区或CDR区。因此，在某些优选例中，重链可变区的框架区的氨基酸序列与SEQ ID NO.7相比可能有最多6个氨基酸序列取代的不同，例如1、2、3、4、5、或6个取代，和轻链可变区的框架区的氨基酸序列与SEQ ID NO.8相比可能有最多6个氨基酸序列取代的不同，例如1、2、3、4、5、或6个取代。
在一些抗体中，氨基酸取代可能分布在多个CDR区。因此，重链可变区的多个CDR区的氨基酸序列与SEQ ID NO.7相比可能有至多6个氨基酸序列取代的不同，例如1、2、3、4、5、或6个取代，和轻链可变区的多个CDR区的氨基酸序列与SEQ ID NO.8相比可能有至多6个氨基酸序列取代的不同，例如1、2、3、4、5、或6个取代。
在特殊的优选例中，抗体可能包含a)一个重链可变区，其氨基酸序列与SEQ ID NO.7一致和b)一个轻链可变区，其氨基酸序列与SEQID NO.8一致。
在特殊的优选例中，抗体可能包含a)一个重链可变区，其氨基酸序列与SEQ ID NO.7至少有95％的一致性和b)一个轻链可变区，其氨基酸序列与SEQ ID NO.8至少有95％的一致性。因此，目标抗体可能包含a)一个重链可变区，其氨基酸序列与SEQ ID NO.7至少有约95％、96％、97％、98％、99％或100％的一致性和b)一个轻链可变区，其氨基酸序列与SEQ ID NO.8至少有约95％、96％、97％、98％、99％或100％的一致性。
在特殊的优选例中，抗体可能包含a)一个重链，其氨基酸序列与SEQ ID NO.9一致和b)一个轻链，其氨基酸序列与SEQ ID NO.10一致。
在特殊的优选例中，抗体可能包含a)一个重链，其氨基酸序列与SEQ ID NO.9至少有95％的一致性和b)一个轻链，其氨基酸序列与SEQID NO.10至少有95％的一致性。因此，目标抗体可能包含a)一个重链，其氨基酸序列与SEQ ID NO.9至少有约95％、96％、97％、98％、99％或100％的一致性和b)一个轻链，其氨基酸序列与SEQ ID NO.10至少有约95％、96％、97％、98％、99％或100％的一致性。除了上面所描述的氨基酸取代，目标抗体可能在重链或轻链的两端有附加的氨基酸。例如，目标抗体在重链和/或轻链的C或N末端分别可能包含至少1、2、3、4、5或6或更多的附加氨基酸。在某些实施例中，目标抗体可能比这里所描述的示范性氨基酸短，其主要区别为在重链和轻链的两端分别比示范性氨基酸少1、2、3、4、5或6个氨基酸。
目标抗体可能是人源化的。一般而言，人源化抗体是通过在亲本抗体的框架区进行氨基酸取代而产生修饰的抗体，并且人源化的抗体与亲本抗体相比具有较小的免疫源性。抗体可通过本领域熟知的很多技术进行人源化，包括，例如，CDR移植(EP.A-239,400；PCT公开文本WO 91/09967；U.S.Pat.No.5,225,539；5,530,101；和5,585,089)，和链替换(U.S.Pat.No.5,565,332)。在某些优选例中，框架替换是通过模拟CDR和框架残基的相互作用来确认框架残基对于抗原结合的重要性和通过序列比对确认特殊位点的非寻常框架残基。(见，例如，U.S.Pat.No.5,585,089；Riechmann et al.，Nature，1988；332，323)。抗体的人源化方法的具体细节可参照美国专利申请10/984,473，即在2004年11月8日提交，标题为“Methods for antibody engineering”，该申请已经全部引入本文作为参考。一般而言，这种人源化的方法包括通过比对能够结合相同抗原的抗体的序列来确定合适的位点，并且用相似氨基酸位于相同位点的不同氨基酸来取代该位点的氨基酸。在这些方法中，将亲本抗体的氨基酸序列与其它相关的抗体进行比较(例如，序列比对)，从而识别变异耐受位置。亲本抗体可变区的氨基酸序列通常与人类抗体数据库中的氨基酸序列进行比较，并且选出这种与亲本抗体具有相似的氨基酸序列的人源化抗体。将亲本抗体和人源化抗体的序列进行比较(例如，序列比对)，亲本抗体中一个或多个变异耐受位置上的氨基酸被人源抗体中相应位置上的氨基酸所取代。
上面所讨论的变异耐受位置的取代方法已很容易地与任何已知的人源化方法结合，并且也很容易地应用于生产包含CDR区的人源化抗体，该抗体的CDR区是在忠实于亲本抗体的CDR区的基础上进行修改的。因此，本发明还提供了包含从亲本抗体改变版本的多个CDR区的人源化VEGF中和抗体。
本发明所论述的人源化兔源抗VEGF单克隆抗体比现有技术产物AVASTIN与VEGF的解离常数Kd要低(本发明的单克隆抗体Kd为0.485nM，AVASTIN为47.9nM)，本发明的单克隆抗体与VEGF的亲和力更高，表明本发明对VEGF有更强的抑制作用。在小鼠模型试验上显示本发明所述抗体抑瘤率明显高于AVASTIN(见实施例5)，所以，理论上本发明的潜在临床疗效要高于AVASTIN。
在一个实施例中，本发明所述单克隆抗体由保藏编号为CGMCCNo.3233的细胞株产生，其重链氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，轻链如SEQ ID NO.10所示的，其与VEGF解离常数为0.485nM，是AVASTIN的1/100，说明EPI0030与VEGF的结合能力强于AVASTIN。
本发明还提供一种细胞株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.3233。其产生一种单克隆抗体，所述抗体重链氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，轻链如SEQ IDNO.10所示，在本发明的实施例中，命名为EPI0030抗体，细胞试验及动物体内试验证明，可在体外抑制VEGF诱导的内皮细胞增殖和迁移，并且可在动物体内抑制肿瘤生长，可用于治疗VEGF相关性疾病。
本发明还提供所述的单克隆抗体在制备用于治疗VEGF相关性疾病药物中的用途。所述VEGF相关性疾病包括肿瘤、老年性黄斑变性、神经退行性疾病、肥胖、糖尿病。该目标抗体可以用于与VEGF相关的科学研究，如发育生物学、细胞生物学、代谢、结构生物学、功能基因组学等多个领域的科学研究、或肿瘤、老年性黄斑变性(AMD)、神经退行性疾病、肥胖、糖尿病等医学和药学的应用研究。
本发明还提供一种药物组合物，其特征在于，含有有效量的上述的单克隆抗体及药学上可接受的载体。
本发明还提供一种试剂、试剂盒或芯片，包含上述的单克隆抗体。
本发明还提供了使用目标抗体来抑制VEGF活性的方法，以及使用目标抗体用于治疗VEGF相关性疾病或使用含有该抗体的试剂盒进行VEGF相关诊断与检测。
一旦制得本发明的抗体分子，就可以通过本领域已知的纯化免疫球蛋白分子的任何方法对其进行纯化，例如，通过色谱法(例如，离子交换色谱，亲和色谱，特别是通过蛋白A对特异性抗原的亲和色谱和其它柱色谱)、离心、利用溶解度差异，或通过任何其它纯化蛋白质的标准技术。在许多实施方案中，抗体从细胞分泌到培养基中，通过收集培养基并进行纯化得到抗体。
抗体可以通过许多方式修饰，可用DNA重组技术来产生保留原来抗体特异性的其它抗体或嵌合分子。这种技术可以包括将编码抗体的免疫球蛋白可变区或互补决定区(CDRs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区。参见，EP.A-184187，GB 2188638A或EP.A-239400。还可以对杂交瘤细胞或产生抗体的其它细胞进行遗传突变或其它改变，这可以改变或者不改变所产生抗体的结合特异性。
用于本发明的单克隆抗体也可用杂交瘤方法制得，因为编码本发明人源化抗体的DNA序列可用本领域技术人员熟知的常规手段，如根据本发明公开的氨基酸序列人工合成或用PCR法扩增得到，因而也可用重组DNA方法，可用本领域熟知的各种方法将该序列连入合适的表达载体中。最后，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞，然后本领域技术人员应用熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的单克隆抗体。
如上所述，本发明还提供了用于实施本发明抗体的试剂、试剂盒或芯片。试剂、试剂盒或芯片至少包括如下一种或多种：根据以上方法制成的抗体，编码该抗体的核苷酸，或包含该抗体的真核细胞、原核细胞和病毒。可以对抗体进行人源化。
试剂、试剂盒或芯片的其它任选组分包括：限制性内切酶、引物和质粒、缓冲液等，用于进行检测抗体活性的实验。该试剂、试剂盒或芯片的核酸还可以具有限制性酶切位点、多克隆位点、引物位点等等，以利于它们与非兔抗体核酸的连接。该试剂、试剂盒或芯片的各组分可以单独存在于分开的容器中，也可以根据需要，把某些相容的组分预先组装到单一的容器中。
制备目标抗体时可加入药学上可接受的载体。术语″药学上可接受载体″是指一种或多种有机或无机成分，它可以是天然的或合成的，与抗体组合后可促进其应用。可接受的载体包括无菌的生理盐水或是其它药学上可获得的且为本领域所熟知的水或非水的等渗溶液和灭菌混悬剂。“有效剂量”是指能够改善或延缓病态的、退变的或损坏的状况的进程的剂量。
有效剂量定义在个人基础之上，并且将以此为基础，具体来说即考虑治疗症状和寻找结果。有效剂量可通过本领域的一种普通技术来决定，并且使用的这些因素将不会超过常规实验。
附图说明
图1示HZD-V1、HZD-V2、HZD-V5、HZD-V6克隆表达的重组抗体竞争性抑制VEGF与KDR结合；
图2示SDS-PAGE测定HZD-V6克隆表达EPI0030抗体的纯度；泳道1为还原电泳；
泳道2为分子量标准-从上至下依次为170kD、130kD、100kD、70kD、55kD、40kD、35kD、25kD、15kD和10kD；
泳道3为非还原电泳；
图3为HZD-V6克隆表达EPI0030抗体的纯度的SEC-HPLC分析图；
图4示VEGF直接铺板结合法测定抗体与人VEGF的结合活力；
图5示EPI0030、AVASTIN抑制VEGF与KDR结合的IC50测定；
EPI0030的IC50＝166.3ng/ml，AVASTIN的IC50＝253.7ng/ml。
图6示5mg/kg的EPI0030和AVASTIN对HCT-116肿瘤生长的影响；
图7示5mg/kg的EPI0030和AVASTIN对NCI-H460肿瘤生长的影响；
图8示1.5mg/kg的EPI0030对NCI-H460肿瘤生长的影响。
生物材料保藏说明
保藏编号为CGMCC No.3233的细胞株于2009年8月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区大屯路，分类命名为中国仓鼠卵巢细胞。
具体实施方式
实施例1：制备表达抗人VEGF165兔单抗的杂交瘤细胞及其基因克隆
通过杂交瘤细胞技术制备兔单克隆抗体。有关实验方案参见USPatent：7,429,487，特别是Example 1-4。
首先通过重组技术制备IgG Fc-hVEGF-A(Human VEGF 165)融合蛋白，其中IgG Fc序列为兔源。将IgG Fc-hVEGF-A的DNA序列克隆入pTT5质粒，瞬时转染该质粒进入HEK 293-6E细胞株，无血清培养细胞，收集培养上清液，用Protein A柱纯化瞬时表达的IgG Fc-hVEGF-A融合蛋白。
用纯化的IgG Fc-hVEGF-A(作为抗原组分)与完全弗氏佐剂混合进行皮下多点注射，对新西兰白兔(New Zealand rabbits)进行首次免疫，此后每三周1次用纯化蛋白和不完全弗氏佐剂混合后皮下注射对兔进行加强免疫，在取脾脏前4天用抗原加PBS对兔静脉注射进行最终免疫。
根据美国专利US7429487的方法，将兔脾细胞与免疫脾细胞来源相同的永生化HRGTP-的B淋巴细胞240E-W2细胞按2∶1比例融合，在96孔板中以HAT培养基培养，然后进行杂交瘤细胞筛选，所得细胞克隆进入新的IgG Fc-hVEGF-A结合筛选。
鉴定筛选过程分为2个阳性克隆筛选步骤：①将IgG Fc-hVEGF-A抗原固定化于96孔酶联免疫吸附板上，加入克隆表达上清孵育1h后，用PBS洗涤3次，使用酶标记的抗体鉴定具有IgG Fc-hVEGF-A结合活性细胞克隆上清，从而获得可与IgG Fc-hVEGF-A直接结合的阳性克隆。②随后将步骤①中的阳性克隆转移入24孔板培养，以获得更多的表达产物。将IgG Fc-VEGFR2(KDR/Flk-1)胞外区固定化于96孔酶联免疫吸附板上，加入IgG Fc-hVEGF-A和克隆表达产物共同孵育1h，再用PBS洗涤3次，使用酶标记的抗体检测IgG Fc-hVEGF-A的含量，以鉴定克隆对VEGF-VEGFR2结合活性的抑制作用，从而鉴别出能够阻断VEGF-VEGFR2结合的阳性克隆。
将所筛选的阳性克隆的杂交瘤细胞裂解，提取mRNA后逆转录得cDNA。以此cDNA为模板，采用PCR方法分别扩增出兔IgG抗体的轻链和重链可变区核酸序列，对重链可变区、轻链可变区进行分析，其编码的重链可变区含有SEQ ID NO.1的亲本序列(Ser Asn Asn Asp Val Met Cys Trp)、SEQ ID NO.2的亲本序列(Gly Cys Ile Met Thr ThrAsp Val ValThr Glu Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Ser)和SEQ ID NO.3的亲本序列(Arg Asp Ser Val Gly Ser Pro Leu Met Ser Phe Asp Leu Trp)、轻链可变区含有SEQ ID NO.4的亲本序列(Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr Gly Asn Asn Glu Leu Ser)、SEQ ID NO.5的亲本序列(Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser)和SEQID NO.6的亲本序列(Gly Gly Tyr Lys Ser Tyr Ser Asn Asp Gly Asn Gly)。轻链核酸序列被克隆入pTT5质粒。重链可变区核酸序列被克隆入已有重链恒定区的pTT5质粒。共转染轻、重链质粒至HEK 293-6E细胞株，培养5天后，用Protein A纯化上清，最终获得重组表达的兔抗人VEGF165单克隆抗体。采用上述阳性克隆筛选方法，对表达的重组抗体进行亲和力确认。
实施例2：本发明所述人源化兔抗VEGF单抗的制备
人源化技术参见美国专利US 7,462,697，特别是优化实施方式的详细描述部分(DETAILED DESCRIPTION OF PREFERREDEMBODIMENTS)。
采用美国专利US7,462,697所描述的技术，用人序列VKI-2-1-(U)-A20JK4和VH3-1-3-3-21JH4作为参比序列。表达的兔抗VEGF单抗序列经人源化后，各得到4个版本的VK和VH。轻链可变区包括VK-HZD1(如SEQ ID NO.12)、VK-HZD2(如SEQ ID NO.14)、VK-HZD5(如SEQ ID NO.16)和VK-HZD6(如SEQ ID NO.8)；重链可变区包括与VH-HZD1(如SEQ ID NO.11)所示、VH-HZD2(如SEQ ID NO.13)、VH-HZD5(如SEQ ID NO.15)和VH-HZD6(如SEQ ID NO.7)。与VK-HZD1比较，VK-HZD2在CDR1区具有2个不同的残基。在VK-HZD1和VK-HZD2N端添加2个额外的氨基酸残基后即分别成为VK-HZD5和VK-HZD6。VH-HZD1与VH-HZD2的71位残基不同，VH-HZD1的71位是K，VH-HZD2的71位是R。VK(H)-HZD1和VK(H)-HZD2序列中含有兔源信号肽，而VK(H)-HZD5和VK(H)-HZD6的序列中含有人源信号肽。
将4个版本的VK和VH的DNA序列通过人工合成后分别克隆进已有人CK序列和人CH序列的pTT5质粒中，通过人信号肽表达抗体。将上述两个质粒共转染HEK 293-6E细胞，瞬时表达人源化抗VEGF抗体，使用实施例1中的筛选方法，选定亲和力适宜的HZD-V6克隆作为最终使用的克隆，其表达的人源化抗VEGF抗体称为EPI0030，其氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示的重链和SEQ ID NO.10所示的轻链。
为提高产量，获得工业用生产细胞株，将氨基酸序列如SEQ IDNO.9所示的重链和SEQ ID NO.10所示的轻链表达质粒共转染入中国仓鼠卵巢细胞株(CHO)，于2009年8月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区大屯路，保藏编号为CGMCC No.3233。
实施例3：本发明所述单克隆抗体EPI0030与VEGF结合的检测
VEGF抗体通过结合VEGF从而阻断其与受体KDR的结合，来抑制VEGF信号通路。1∶3系列稀释重组表达的不同抗体(HZD-V1、HZD-V2、HZD-V5、HZD-V6)和AVASTIN后(90μg/ml-45ng/ml)与IgG Fc-hVEGF(1μg/ml)混合，加入混合好的抗体-VEGF复合物至铺IgG Fc-VEGFR2板的孔中，加入鼠抗人VEGF抗体后用羊抗鼠IgG抗体-AP显色进行检测。结果显示所表达的重组抗体与AVASTIN相似的竞争性抑制VEGF与KDR结合的活性。测定结果显示HZD-V1、HZD-V2、HZD-V5、HZD-V6克隆表达的抗体均可以阻断VEGF与KDR的结合(见图1)。
参照上述实验方法，测定EPI0030和AVASTIN的IC50值即半数抑制浓度，结果如图5所示，显示EPI0030和AVASTIN有相似的竞争抑制活力。
采用BIAcore-3000测定EPI0030与VEGF的解离常数Kd。人VEGF被固定在CM5芯片上，2倍系列稀释的EPI0030和AVASTIN被注射进流速为30ul/min的HBS-EP缓冲液中。Kd为koff/kon，表1中显示EPI0030和AVASTIN与人VEGF的解离常数，EPI0030与VEGF解离常数为0.485nM，是AVASTIN的1/100，说明EPI0030与VEGF的结合能力强于AVASTIN。
表1.EPI0030和AVASTIN与人VEGF的解离常数
Figure B2009101715509D0000161
实施例4：本发明所述单克隆抗体EPI0030的鉴定和体外活性的测定
HEK 293-6E细胞HZD-V6克隆瞬时表达的EPI0030抗体经过纯化后，进行了有关质量的检定，具体鉴定项目如下：
A：纯度
采用SDS-PAGE(还原和非还原)及SEC-HPLC来分析纯度，结果见图2、图3，显示EPI0030抗体的纯度大于98％，多聚体含量小于5％，主峰(保留时间10.572分钟)面积占总面积(包括从左至右的峰1、2、3)大于95％，峰1、2为多聚体。
B：体外结合活性
IgG Fc-hVEGF铺板，1％BSA封闭，1∶3系列稀释EPI0030抗体和AVASTIN 8个梯度(1μg/ml-0.46ng/ml)，加入至已铺好IgG Fc-hVEGF的孔中，加驴抗人IgG抗体-AP检测。结果显示EPI0030抗体和AVASTIN有相似的结合活力。
采用ELISA方法，包括IgG Fc-hVEGF直接铺板法(见实施例1)和KDR竞争结合法(见实施例3)，结果显示EPI0030抗体与VEGF的结合以及抑制VEGF与KDR的结合呈剂量相关性，结果见图4和图5。
实施例5：本发明所述单克隆抗体EPI0030的体内活性检测
在实验前两周从液氮罐中取出一支冻存的人结肠癌HCT-116细胞和人非小细胞肺癌NCI-H460细胞(约1×107细胞)迅速放至37℃水浴中融化，随后分别用预热至37℃添加了10％胎牛血清(购自GIBCO)的McCoy’s 5A培养基和DMEM培养基将细胞接种至75CM2的细胞培养瓶中，待细胞生长至80％融合率时按1∶5进行传代，在体外连续传代三次以上。当细胞总量达到接种所需，将细胞用胰酶消化、离心，然后用PBS洗涤细胞去除血清，最后分别用无血清、无抗生素McCoy’s 5A培养基和DMEM培养基调整处理好的人结肠癌HCT-116和人非小细胞肺癌NCI-H460细胞密度至5×107/ml，细胞悬液放置于冰上，接种于6-8周龄裸鼠腹侧部，每只小鼠接种0.1ml，即5×106细胞/只。以游标卡尺每2天测量裸小鼠的肿瘤直径，待每只小鼠的肿瘤均长至100mm3-300mm3，按瘤体积SD＜1/3入组后随机分为5组，每组6只。人结肠癌HCT-116模型组分别为模型对照组(1组)、5mg/kg AVASTIN(1组)和5mg/kg EPI-0030(1组)组，将AVASTIN和EPI-0030用生理盐水稀释至0.5mg/ml。人非小细胞肺癌NCI-H460模型组分别为模型对照组(1组)、5mg/kg AVASTIN(1组)和1.5mg/kg、5mg/kg EPI-0030(2组)组将AVASTIN和EPI-0030用生理盐水稀释至0.5mg/ml和0.15mg/ml。给药组分别每周1，3，5d分别给予一次性腹腔注射0.2ml的AVASTIN和EPI-0030，模型对照组以同样的时间和方式给予生理盐水0.2ml，连续给药3周(21天，共9次)。
测量裸鼠的肿瘤瘤结节最大直径a和最小径b，按公式V＝0.5×a×b2计算肿瘤体积，以相对肿瘤增殖率T/C％作为疗效评价指标。
结果显示，人结肠癌HCT-116模型中，5mg/kg剂量组中，EPI-0030与AVASTIN的抑瘤率分别为65.7％和15.7％(见图6)。人非小细胞肺癌NCI-H460模型中，EPI-0030与AVASTIN的抑瘤率分别为95.5％和66.7％(见图7)；1.5mg/kg剂量组中EPI-0030的抑瘤率为57.6％(见图8)。结果说明EPI-0030有显著的抑制肿瘤活性的作用。
参考AVASTIN临床适应症，选择人结肠癌HCT-116和人非小细胞肺癌NCI-H460裸鼠异种移植瘤模型验证EPI-0030对人结肠癌和人非小细胞肺癌的抑制作用，证明EPI-0030具有显著抑制人结肠癌和人非小细胞肺癌异种移植瘤的作用。EPI-0030在模型中抑瘤活性强于AVASTIN。
SEQUENCE LISTING
<110>江苏先声药物研究有限公司
宜康公司
<120>一种抗VEGF的单克隆抗体及含有该抗体的药物组合物
<130>MP091624
<160>16
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>8
<212>PRT
<213>重链可变区CDR1
<400>1
Ser Asn Asn Asp Val Met Cys Trp
1                 5
<210>2
<211>18
<212>PRT
<213>重链可变区CDR2
<400>2
Gly Cys Ile Met Thr Thr Asp Val Val Thr Glu Tyr Ala Asn Trp Ala
1                  5                      10                15
Lys Ser
<210>3
<211>14
<212>PRT
<213>重链可变区CDR3
<400>3
Arg Asp Ser Val Gly Ser Pro Leu Met Ser Phe Asp Leu Trp
1                 5                      10
<210>4
<211>13
<212>PRT
<213>轻链可变区CDRl
<400>4
Gln Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Asn Asn Asn Glu Leu Ser
1                   5                      10
<210>5
<211>7
<212>PRT
<213>轻链可变区CDR2
<400>5
Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser
1                  5
<210>6
<211>12
<212>PRT
<213>轻链可变区CDR3
<400>6
Gly Gly Tyr Lys Ser Tyr SerAsn Asp Gly Asn Gly
1                   5                  10
<210>7
<211>141
<212>PRT
<213>重链可变区
<400>7
Met Glu Leu Gly Leu Arg Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Glu Gly
1                 5                   10                      15
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys
           20                     25                      30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe
          35                     40                      45
Ser Asn Asn Asp Val Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
    50                      55                      60
Leu Glu Trp Ile Gly Cys Ile Met Thr Thr Asp Val Val Thr Glu Tyr
65                  70                  75                     80
Ala Asn Trp Ala Lys Ser Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Ser Ala Lys
               85                     90                       95
Asn Ser Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
             100                     105                     110
Val Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Ser Val Gly Ser Pro Leu Met Ser Phe
         115                     120                     125
Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
    130                     135                     140
<210>8
<211>134
<212>PRT
<213>轻链可变区
<400>8
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1              5                     10                      15
Leu Pro Asp Thr Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
             20                      25                      30
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser
         35                      40                      45
Gln Ser Ile Tyr Asn Asn Asn Glu Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
     50                      55                      60
Gly Lys Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser
65                    70                     75                    80
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
                 85                    90                     95
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys
            100                     105                     110
Gly Gly Tyr Lys Ser Tyr Ser Asn Asp Gly Asn Gly Phe Gly Gly Gly
        115                     120                     125
Thr Lys Val Glu Ile Lys
     130
<210>9
<211>471
<212>PRT
<213>重链
<400>9
Met Glu Leu Gly Leu Arg Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Glu Gly
1                 5                     10                     15
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys
             20                     25                     30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe
         35                     40                     45
Ser Asn Asn Asp Val Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
     50                     55                     60
Leu Glu Trp Ile Gly Cys Ile Met Thr Thr Asp Val Val Thr Glu Tyr
65                     70                     75                     80
Ala Asn Trp Ala Lys Ser Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Ser Ala Lys
                  85                    90                    95
Asn Ser Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
             100                    105                    110
Val Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Ser Val Gly Ser Pro Leu Met Ser Phe
         115                    120                    125
Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
    130                    135                    140
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
145                  150                 155                   160
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
                 165                    170                    175
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
               180                    185                    190
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
          195                    200                    205
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
     210                    215                    220
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
225               230                 235                    240
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
                    245                    250                    255
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
                 260                   265                   270
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
         275                   280                   285
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
     290                   295                   300
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
305                  310                   315                  320
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
                325                   330                   335
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
             340                   345                   350
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
         355                   360                   365
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
     370                   375                   380
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
385                 390                  395                   400
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
                  405                   410                   415
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
              420                    425                      430
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
         435                    440                      445
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
     450                    455                     460
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465                     470
<210>10
<211>241
<212>PRT
<213>轻链
<400>10
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1                5                   10                     15
Leu Pro Asp Thr Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
             20                      25                      30
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser
         35                      40                      45
Gln Ser Ile Tyr Asn Asn Asn Glu Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
    50                      55                      60
Gly Lys Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser
65                      70              75                    80
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
                    85             90                      95
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys
                100                   105                    110
Gly Gly Tyr Lys Ser Tyr Ser Asn Asp Gly Asn Gly Phe Gly Gly Gly
          115                    120                    125
Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile
    130                      135                      140
Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val
145              150                  155                     160
Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys
                  165                 170                    175
Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu
          180                   185                       190
Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu
          195                   200                    205
Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr
     210                    215                     220
His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu
225                 230                   235                    240
Cys
<210>11
<211>140
<212>PRT
<213>HZD1重链可变区
<400>11
Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Ser
1                 5                  10                      15
Val Gln Cys Gln Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro
           20                     25                      30
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser
         35                     40                      45
Asn Asn Asp Val Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
    50                     55                      60
Glu Trp Ile Gly Cys Ile Met Thr Thr Asp Val Val Thr Glu Tyr Ala
65                  70                 75                     80
Asn Trp Ala Lys Ser Arg Phe Thr Val Ser Lys Asp Ser Ala Lys Asn
               85                     90                       95
Ser Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
              100                    105                      110
Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Ser Val Gly Ser Pro Leu Met Ser Phe Asp
          115                    120                    125
Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
     130                    135                   140
<210>12
<211>134
<212>PRT
<213>HZD1轻链可变区
<400>12
Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1                 5                  10                     15
Leu Pro Gly Ala Arg Cys Ala Leu Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
              20                     25                     30
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr 1le Asn Cys Gln Ala Ser
         35                     40                     45
Gln Ser Val Tyr Gly Asn Asn Glu Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
     50                     55                     60
Gly Lys Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser
65                   70                  75                   80
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
                85                     90                     95
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys
             100                    105                    110
Gly Gly Tyr Lys Ser Tyr Ser Asn Asp Gly Asn Gly Phe Gly Gly Gly
         115                    120                    125
Thr Lys Val Glu Ile Lys
     130
<210>13
<211>140
<212>PRT
<213>HZD2重链可变区
<400>13
Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Ser
1                5                     10                     15
Val Gln Cys Gln Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro
             20                     25                     30
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser
         35                     40                     45
Asn Asn Asp Val Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
    50                     55                     60
Glu Trp Ile Gly Cys Ile Met Thr Thr Asp Val Val Thr Glu Tyr Ala
65                    70                    75                    80
Asn Trp Ala Lys Ser Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Ser Ala Lys Asn
                 85                    90                     95
Ser Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
            100                    105                    110
Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Ser Val Gly Ser Pro Leu Met Ser Phe Asp
         115                    120                    125
Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
     130                    135                    140
<210>14
<211>134
<212>PRT
<213>HZD2轻链可变区
<400>14
Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1                  5                     10                     15
Leu Pro Gly Ala Arg Cys Ala Leu Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
             20                     25                     30
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser
          35                     40                     45
Gln Ser Ile Tyr Asn Asn Asn Glu Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
     50                     55                     60
Gly Lys Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser
65                    70                    75                    80
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
               85                     90                     95
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys
             100                    105                    110
Gly Gly Tyr Lys Ser Tyr Ser Asn Asp Gly Asn Gly Phe Gly Gly Gly
           115                    120                    125
Thr Lys Val Glu Ile Lys
     130
<210>15
<211>141
<212>PRT
<213>HZD5重链可变区
<400>15
Met Glu Leu Gly Leu Arg Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Glu Gly
1                 5                     10                     15
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys
              20                     25                     30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe
          35                     40                     45
Ser Asn Asn Asp Val Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
    50                     55                     60
Leu Glu Trp Ile Gly Cys Ile Met Thr Thr Asp Val Val Thr Glu Tyr
65                    70                    75                    80
Ala Asn Trp Ala Lys Ser Arg Phe Thr Val Ser Lys Asp Ser Ala Lys
                  85                     90                     95
Asn Ser Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
              100                    105                    110
Val Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Ser Val Gly Ser Pro Leu Met Ser Phe
          115                    120                    125
Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
    130                    135                    140
<210>16
<211>134
<212>PRT
<213>HZD5轻链可变区
<400>16
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1                 5                     10                     15
Leu Pro Asp Thr Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
              20                     25                     30
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser
          35                     40                     45
Gln Ser Val Tyr Gly Asn Asn Glu Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
     50                     55                     60
Gly Lys Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser
65                    70                    75                    80
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
                85                     90                     95
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys
             100                    105                    110
Gly Gly Tyr Lys Ser Tyr Ser Asn Asp Gly Asn Gly Phe Gly Gly Gly
         115                    120                    125
Thr Lys Val Glu Ile Lys
      130

Claims (12)

1.一种单克隆抗体，其特征在于，其重链可变区含有SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，和/或其轻链可变区含有SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体包括单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、人源化抗体、以及上述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。
3.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体，其特征在于，其重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；或其重链可变区由SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列经过取代、缺失、或添加一个或几个氨基酸衍生的与SEQ ID NO.7的氨基酸序列至少有95％的一致性，且所述单克隆抗体具有特异性结合VEGF的活性。
4.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体，其特征在于，其轻链可变区如SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列；或其轻链可变区由SEQ IDNO.8所示的氨基酸序列经过取代、缺失、或添加一个或几个氨基酸衍生的与SEQ ID NO.8的氨基酸序列至少有95％的一致性，且所述单克隆抗体具有特异性结合VEGF的活性。
5.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体，其特征在于，其重链如SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列；或其重链由SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列经过取代、缺失、或添加一个或几个氨基酸衍生的与SEQ IDNO.9的氨基酸序列至少有95％的一致性，且所述单克隆抗体具有特异性结合VEGF的活性。
6.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体，其特征在于，其轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；或其轻链由SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列经过取代、缺失、或添加一个或几个氨基酸衍生的与SEQ IDNO.10的氨基酸序列至少有95％的一致性，且所述单克隆抗体具有特异性结合VEGF的活性。
7.根据权利要求1-6任一项所述的单克隆抗体，其特征在于由保藏编号为CGMCC No.3233的细胞株产生。
8.一种细胞株，其特征在于，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.3233。
9.权利要求1至7任一项所述的单克隆抗体在制备用于治疗VEGF相关性疾病药物中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述VEGF相关性疾病包括肿瘤、老年性黄斑变性、神经退行性疾病、肥胖、糖尿病。
11.一种药物组合物，其特征在于，含有有效量的权利要求1-7任一项所述的单克隆抗体及药学上可接受的载体。
12.一种试剂、试剂盒或芯片，包含权利要求1至7任一项所述的单克隆抗体。
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