CN103417965A - 一种含有抗vegf抗体的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种药物组合物，其包含有效量的抗VEGF抗体以及化疗药物，以及该组合物在制备抗癌药物中的用途。

Description

一种含有抗VEGF抗体的药物组合物

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种药物组合物，更具体地，本发明涉及含有抗VEGF抗体和化疗药物的药物组合物，及其在制备抗癌药物中的用途。

背景技术

化疗药物是治疗癌症最常用的药物之一。1943年，耶鲁大学的Gil man首先将氮芥应用于淋巴瘤的治疗，揭开了肿瘤化疗的序幕。直至今日，获批上市的化疗药物已达上百种，这些药物能杀死快速分裂的细胞，减小肿瘤的体积。但是，化疗药物有着较强的毒副作用，在杀灭肿瘤的同时，对增生活跃的骨髓、胃肠道粘膜、生殖细胞、毛发和肝、肾等脏器均有不同程度的损伤，更严重时会导致死亡。据统计，因化疗副反应及并发症引起的死亡率高达3%~10%。而且，化疗药物还容易产生耐药性，随着治疗的持续，癌细胞对化疗药物将不再敏感。另外，大量临床数据表明，化疗药物仅对特定的人群有良好的抗肿瘤效果，在其他人群中效果较差甚至无效。

血管内皮生长因子，vascular endothelial growth factor，简称VEGF，可在体内诱导血管新生。血管的发生过程对于肿瘤的生长和转移起着重要作用，由于VEGF在血管发生中起着重要的调节作用，在肿瘤组织内、外都可以大量分泌VEGF；肿瘤组织内的血管内皮细胞表达VEGFR明显高于正常内皮细胞。因此VEGF特异性抗体可以显著抑制肿瘤组织的血管密度，从而抑制肿瘤的生长和转移。

目前，FDA、欧洲、中国等国都批准了重组人源化鼠抗VEGF单克隆抗体AVASTIN用于治疗结直肠癌、非小细胞肺癌等适应症。CN102002104A公开了一种抗VEGF的单克隆抗体，其亲和力和抗肿瘤活性均优于AVASTIN，而且该药物的上市还将打破AVASTIN的市场垄断，降低治疗费用减少病人负担。

发明内容

本发明涉及一种药物组合物。具体地，本发明提供了一种包含抗VEGF抗体和化疗药物的药物组合物，以及该组合物在癌症治疗中的用途。

因此，一方面，本发明提供一种药物组合物，包含有效量的抗VEGF抗体以及化疗药物。

所述抗VEGF抗体重链可变区含有SEQ ID NO.1、SEQ ID N0.2和SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，和/或其轻链可变区含有SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。

作为优选，所述抗VEGF抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ IDNO.7所示，轻链可变区如SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列；或其重链可变区由SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列经过取代、缺失、或添加一个或几个氨基酸衍生的与SEQ ID NO.7的氨基酸序列至少有95%的一致性，且其轻链可变区由SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列经过取代、缺失、或添加一个或几个氨基酸衍生的与SEQ ID NO.8的氨基酸序列至少有95%的一致性，且所述单克隆抗体具有特异性结合VEGF的活性。

或，所述抗VEGF抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，轻链可变区如SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列；或其重链可变区由SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列经过取代、缺失、或添加一个或几个氨基酸衍生的与SEQ ID NO.9的氨基酸序列至少有95%的一致性，且其轻链可变区由SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列经过取代、缺失、或添加一个或几个氨基酸衍生的与SEQ ID NO.10的氨基酸序列至少有95%的一致性，且所述单克隆抗体具有特异性结合VEGF的活性。

在本发明的实施例中，所述抗VEGF抗体为赛伐珠单抗，“赛伐珠单抗”是指CN102002104A公开的抗VEGF的单克隆抗体EPI0030，由保藏编号为CGMCC No.3233的细胞株产生。

在本发明中，所述抗VEGF抗体包括单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、人源化抗体、以及上述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。

“化疗药物”是在癌症的治疗中使用的化合物，任何具有抗癌活性的化疗药物可根据本发明使用。所述化疗药物选自：烷化剂，如尼莫司汀、卡莫司汀、洛莫司汀、环磷酰胺、异环磷酰胺和甘磷酰芥等；抗代谢药，如去氧氟尿苷、多西氟鸟啶、5-氟尿嘧啶（5-Fu）及其衍生物、巯嘌呤、硫鸟嘌呤、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、安西他滨等，其中所述5-氟尿嘧啶衍生物选自替加氟、卡莫氟、去氧氟脲苷、阿托氟啶、5-氟尿嘧啶二肽衍生物、高分子5-氟尿嘧啶等；抗生素，如放线菌素D、多柔比星、柔红霉素、表柔比星、丝裂霉素、培洛霉素、平阳霉素、吡柔比星等；植物药，如伊立替康、三尖杉酯碱、喜树碱、羟基喜树碱、长春瑞滨、紫杉醇、长春碱、长春地辛、长春酰胺、替尼泊苷、依托泊苷等；抗肿瘤激素药，如阿他美坦、阿那曲唑、氨鲁米特、来曲唑、福美坦、甲他孕酮等；门冬酰胺酶；L-天冬酰胺酶；铂类化疗药物，如卡铂、顺铂、奈达铂、奥沙利铂、草酸铂等；维甲酸；甲苄肼衍生物，如丙卡巴肼等；蒽醌类，如米托蒽醌等；取代脲类，如羟基脲等。

其中，优选5-氟尿嘧啶（5-Fu）或其衍生物、铂类化疗药物、卡培他滨、紫杉醇、多西他赛、伊立替康和吉西他滨。更优选，选自5-氟尿嘧啶（5-Fu）或其衍生物如替加氟、卡莫氟、去氧氟脲苷、阿托氟啶、5-氟尿嘧啶二肽衍生物、高分子5-氟尿嘧啶等、铂类化疗药物如卡铂、顺铂、奈达铂、奥沙利铂、草酸铂等。最优选5-氟尿嘧啶、奥沙利铂和顺铂。

另一方面，本发明提供上述的药物组合物在制备抗癌症药物中的用途。所述癌症包括但不限于：实体瘤，淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、白血病或淋巴组织恶性疾病。所述实体瘤更具体包括鳞状细胞癌（如上皮鳞状细胞癌），肺癌（包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌，肺腺癌以及肺鳞癌），腹膜癌、肝细胞癌、胃癌（包括胃肠癌），胰腺癌，神经母细胞癌，宫颈癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝细胞癌，乳腺癌，结肠癌，结直肠癌，子宫内膜癌或子宫癌，唾液腺癌，肾细胞癌，前列腺癌，甲状腺癌，外阴癌，以及各种头颈癌等。其中，所述癌症优选以下疾病：结直肠癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、肾细胞癌、胶质母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、黑色素瘤、肝癌、多发性骨髓瘤、卵巢癌和头颈部癌。更优选地，选自非小细胞肺癌和结直肠癌。所述癌症可以是转移性癌症。

本发明的优点在于，将有效量的抗VEGF抗体以及化疗药物组合，两者具有协同抗肿瘤的效果，而且能显著降低化疗药物的毒副作用。在实施例中，联合应用赛伐珠单抗和5-Fu、奥沙利铂或顺铂后，疗效明显提高；更为重要的是，赛伐珠单抗不但改善了小鼠的一般状态，还明显降低了5-Fu、奥沙利铂的致死性，合用组未见小鼠死亡。说明赛伐珠单抗不但对5-Fu、奥沙利铂和顺铂有明显的增效作用，还有潜在的减毒作用。

发明概述

本发明提供的药物组合物，是将有效量的抗VEGF抗体和化疗药物组合。该药物组合物对癌症有显著的治疗效果，而且能降低化疗药物的毒性，改善病人的一般状态。组合物中的抗VEGF抗体选自赛伐珠单抗。CN102002104A已经公开了赛伐珠单抗与Avastin相比与VEGF结合的亲和力更强，在结肠癌HCT-116细胞和人非小细胞肺癌NCI-H460细胞模型上显示出了更为卓越的抗癌活性。本发明一个优选的实施方案中，赛伐珠单抗对人结肠癌Ls-174t裸小鼠移植瘤的疗效优于Avastin，而且还表现出了出乎意料优越的改善小鼠一般状态的作用，表现为荷瘤小鼠体重增长；相反地，Avastin给药组出现了体重下降的现象。

该药物组合物对非小细胞肺癌和结直肠癌特别有效，对于乳腺癌、肾细胞癌、胶质母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、黑色素瘤、肝癌、多发性骨髓瘤、卵巢癌和头颈部癌等癌症也有令人惊奇地效果。

在一个优选的实施方案中，赛伐珠单抗和5-氟尿嘧啶（5-Fu）联合使用，小鼠肿瘤体积显著性的减小，不仅如此，对比5-Fu组5/6的死亡率，合用组未见小鼠死亡。并且合用组小鼠体重回升，一般状态良好。在另一个优选方案中，赛伐珠单抗和奥沙利铂的药物组合物显示了卓越的抗肿瘤活性和出乎意料的低毒性。另一个优选方案中，赛伐珠单抗和顺铂的药物组合也体现同样的协同抗肿瘤活性和毒性的降低。

术语与定义

术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文中可以互换使用。这些术语均为本领域技术人员所熟知的术语，具体是指由能特异结合抗原的一种或多种多肽构成的蛋白质。抗体的一种形式构成了抗体的基本结构单元。这种形式是四聚物，它由两对完全相同的抗体链构成，每一对都有一个轻链和一个重链。在每对抗体链中，轻链和重链的可变区联合在一起共同负责结合抗原，而恒定区则负责抗体的效应器功能。

目前己知的免疫球蛋白多肽包括κ和λ轻链，以及α，γ（IgG₁，IgG₂，IgG₃，IgG₄），δ，ε和μ重链或它们的其它类型等价物。全长的免疫球蛋白“轻链”(大约25kDa或大约214个氨基酸)包含一个由NH₂末端上大约110个氨基酸形成的可变区，以及一个COOH末端上的κ和λ恒定区。全长的免疫球蛋白“重链”（大约50kDa或大约446个氨基酸），同样包含一个可变区（大约116个氨基酸)，以及重链恒定区之一，例如γ（大约330个氨基酸）。

术语“抗体”和“免疫球蛋白”包括任何同型体的抗体或免疫球蛋白，或保持与抗原特异结合的抗体片段，包括但不限于Fab，Fv，scFv和Fd片段、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体以及包含抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白质的融合蛋白质。抗体可以被标记和检测，例如，可以通过放射性同位素、能产生可检测物的酶、荧光蛋白质、生物素等等进行标记并被检测。抗体还可以结合于国相载体，包括但不限于聚苯乙烯平板或珠粒等等。该术语还包括Fab'、Fv、F(ab’)₂和/或其它能与抗原特异性结合的抗体片段和单克隆抗体。

“抗VEGF抗体”是与VEGF以足够的亲和力以及特异性结合的抗体。本发明所述的“抗VEGF抗体”是赛伐珠单抗。赛伐珠单抗是CN102002104A公开的抗VEGF的单克隆抗体EPI0030，制备方法参见说明书实施例的部分。

术语“单克隆抗体（MAbs）”和“单抗”在本文中可以互换使用，是指对于特定抗原的抗体的同类群体并且该抗体仅包含一种类型的抗原结合位点并且只结合抗原决定簇上的一个表位。通过本领域技术人员所公知的方法可以获得对于特定抗原的单克隆抗体。例如单克隆抗体可以通过杂交瘤法，或者重组DNA法制备。

术语“有效量”指可有效治疗哺乳动物中的疾病或病症的药物量。对于癌症，药物有效量可减少癌细胞数量；减小肿瘤体积；抑制（即减慢到一定程度并优选停止）癌细胞浸润到周围器官中；抑制（即减慢到一定程度并优选停止）肿瘤转移；在一定程度抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上缓解一或多种与肿瘤相关的症状。药物可以组织已存在的肿瘤的细胞的生长或杀死这些肿瘤细胞，所述药物可以使细胞抑制剂或细胞毒性剂。对于癌症治疗，体内效力可例如通过评估生存期，疾病进展时间，反应率，反应时间，和/或生活质量来测定。

术语“化疗药物”是在癌症的治疗中使用的化合物，任何具有抗癌活性的化疗药物可根据本发明使用。所述化疗剂选自：烷化剂，如尼莫司汀、卡莫司汀、洛莫司汀、环磷酰胺、异环磷酰胺和甘磷酰芥等；抗代谢药，如去氧氟尿苷、多西氟鸟啶、5-氟尿嘧啶（5-Fu）、巯嘌呤、硫鸟嘌呤、氟鸟苷、替加氟、吉西他滨、卡莫氟、羟基脲、甲氨蝶呤、安西他滨等；抗生素，如放线菌素D、多柔比星、柔红霉素、表柔比星、丝裂霉素、培洛霉素、平阳霉素、吡柔比星等；植物药，如伊立替康、三尖杉酯碱、喜树碱、羟基喜树碱、长春瑞滨、紫杉醇、长春碱、长春地辛、长春酰胺、替尼泊苷、依托泊苷等；抗肿瘤激素药，如阿他美坦、阿那曲唑、氨鲁米特、来曲唑、福美坦、甲他孕酮等；门冬酰胺酶；L-天冬酰胺酶；铂类化疗药物，如卡铂、顺铂、奈达铂、奥沙利铂等；维甲酸；甲苄肼衍生物，如丙卡巴肼等；蒽醌类，如米托蒽醌等；取代脲类，如羟基脲等。

（安维汀，贝伐珠单抗）是由美国Genentech公司开发的鼠源VEGF单克隆抗体，目前已在中国上市。

附图说明

图1.赛伐珠单抗、Avastin对人结肠癌Ls-174t裸小鼠移植瘤的疗效

图2.赛伐珠单抗、Avastin对荷瘤裸小鼠（Ls-174t）体重的影响

图3.赛伐珠单抗与5-氟尿嘧啶(5-Fu)合用对人结肠癌Ls-174t裸小鼠移植瘤的疗效。

图4.赛伐珠单抗与5-氟尿嘧啶(5-Fu)合用对荷瘤裸小鼠（Ls-174t）体重的影响。

图5.赛伐珠单抗与奥沙利铂合用对人结肠癌Ls-174t裸小鼠移植瘤的疗效。

图6.赛伐珠单抗与奥沙利铂合用对荷瘤裸小鼠（Ls-174t）体重的影响。

图7.赛伐珠单抗与顺铂合用对人结肠癌HT-29裸小鼠移植瘤的疗效

图8.赛伐珠单抗与顺铂合用对荷瘤裸小鼠（HT-29）体重的影响

图9.赛伐珠单抗与顺铂合用对裸小鼠（HT-29）移植瘤的抑制作用

图1 0.实验终点时荷瘤鼠（HT-29）照片

图11.实验终点时肿瘤（HT-29）照片

具体实施方式

本发明公开了一种含有抗VEGF抗体和化疗药物的药物组合物，及其在制备抗癌药物中的用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1：  制备本发明所述人源化VEGF单抗

通过杂交瘤细胞技术制备兔单克隆抗体。有关实验方案参见USPatent:7,429,487，特别是Example 1-4。

首先通过重组技术制备IgG Fc-hVEGF-A(Human VEGF165)融合蛋白，其中IgG Fc序列为兔源。将IgG Fc-hVEGF-A的DNA序列克隆入pTT5质粒，瞬时转染该质粒进入HEK 293-6E细胞株，无血清培养细胞，收集培养上清液，用Protein A柱纯化瞬时表达的IgG Fc-hVEGF-A融合蛋白。

用纯化的IgG Fc-hVEGF-A（作为抗原组分）与完全弗氏佐剂混合进行皮下多点注射，对新西兰白兔（New Zealand rabbits）进行首次免疫，此后每三周1次用纯化蛋白和不完全弗氏佐剂混合后皮下注射对兔进行加强免疫，在取脾脏前4天用抗原加PBS对兔静脉注射进行最终免疫。

根据美国专利US7429487的方法，将兔脾细胞与免疫脾细胞来源相同的永生化HRGTP-的B淋巴细胞240E-W2细胞按2：1比例融合，在96孔板中以HAT培养基培养，然后进行杂交瘤细胞筛选，所得细胞克隆进入新的IgG Fc-hVEGF-A结合筛选。

鉴定筛选过程分为2个阳性克隆筛选步骤：①将IgG Fc-hVEGF-A抗原固定化于96孔酶联免疫吸附板上，加入克隆表达上清孵育1h后，用PBS洗涤3次，使用酶标记的抗体鉴定具有IgG Fc-hVEGF-A结合活性细胞克隆上清，从而获得可与IgG Fc-hVEGF-A直接结合的阳性克隆。②随后将步骤①中的阳性克隆转移入24孔板培养，以获得更多的表达产物。将IgG Fc-VEGFR2（KDR/Flk-1）胞外区固定化于96孔酶联免疫吸附板上，加入IgG Fc-hVEGF-A和克隆表达产物共同孵育1h，再用PB S洗涤3次，使用酶标记的抗体检测IgG Fc-hVEGF-A的含量，以鉴定克隆对VEGF-VEGFR2结合活性的抑制作用，从而鉴别出能够阻断VEGF-VEGFR2结合的阳性克隆。

将所筛选的阳性克隆的杂交瘤细胞裂解，提取mRNA后逆转录得cDNA。以此cDNA为模板，采用PCR方法分别扩增出兔IgG抗体的轻链和重链可变区核酸序列，对重链可变区、轻链可变区进行分析，其编码的重链可变区含有SEQ ID NO.1的亲本序列（Ser Asn Asn Asp ValMet Cys Trp）、SEQ ID N0.2的亲本序列（Gly Cys Ile Met Thr Thr AspVal Val Thr Glu Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Ser）和SEQ ID NO.3的亲本序列（Arg Asp SerVal Gly Ser Pro Leu Met Ser Phe Asp Leu Trp）、轻链可变区含有SEQ ID NO.4的亲本序列（Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr Gly AsnAsn Glu Leu Ser）、SEQ ID NO.5的亲本序列（Arg Ala Ser Thr Leu AlaSer）和SEQ ID NO.6的亲本序列（Gly Gly Tyr Lys Ser Tyr Ser Asn AspGly Asn Gly）。轻链核酸序列被克隆入pTT5质粒。重链可变区核酸序列被克隆入已有重链恒定区的pTT5质粒。共转染轻、重链质粒至HEK293-6E细胞株，培养5天后，用Protein A纯化上清，最终获得重组表达的兔抗人VEGF165单克隆抗体。采用上述阳性克隆筛选方法，对表达的重组抗体进行亲和力确认。

人源化技术参见美国专利US 7,462,697，特别是优化实施方式的详细描述部分（DETAILED DESCRIPTION OF PREFERREDEMBODIMENTS）。

采用美国专利US7,462,697所描述的技术，用人序列VKI-2-1-（U）-A20_JK4和VH3-1-3-3-21_JH4作为参比序列。表达的兔抗VEGF单抗序列经人源化后，各得到4个版本的VK和VH。轻链可变区包括VK-HZD1（如SEQ ID NO.12）、VK-HZD2（如SEQ ID NO.14）、VK-HZD5（如SEQ ID NO.1 6）和VK-HZD6（如SEQ ID NO.8）；重链可变区包括与VH-HZD1（如SEQ ID NO.11）所示、VH-HZD2（如SEQ ID NO.13）、VH-HZD5（如SEQ ID NO.15）和VH-HZD6（如SEQ ID NO.7）。与VK-HZD1比较，VK-HZD2在CDR1区具有2个不同的残基。在VK-HZD1和VK-HZD2 N端添加2个额外的氨基酸残基后即分别成为VK-HZD5和VK-HZD6。VH-HZD1与VH-HZD2的71位残基不同，VH-HZD1的71位是K，VH-HZD2的71位是R。VK(H)-HZD1和VK(H)-HZD2序列中含有兔源信号肽，而VK(H)-HZD5和VK(H)-HZD6的序列中含有人源信号肽。

将4个版本的VK和VH的DNA序列通过人工合成后分别克隆进已有人CK序列和人CH序列的pTT5质粒中，通过人信号肽表达抗体。将上述两个质粒共转染HEK 293-6E细胞，瞬时表达人源化抗VEGF抗体，使用实施例1中的筛选方法，选定亲和力适宜的HZD-V6克隆作为最终使用的克隆，其表达的人源化抗VEGF抗体称为EPI0030，其氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示的重链和SEQ ID NO.10所示的轻链。

为提高产量，获得工业用生产细胞株，将氨基酸序列如SEQ IDNO.9所示的重链和SEQ ID NO.10所示的轻链表达质粒共转染入中国仓鼠卵巢细胞株（CHO），于2009年8月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区大屯路，保藏编号为CGMCC No.3233。

实施例2.赛伐珠单抗、Avastin单用对人结肠癌Ls-174t裸小鼠移植瘤的疗效评价

实验材料和动物：赛伐珠单抗由江苏先声药物研究有限公司提供；Avastin购自Genentech Co.；BALB/cA-nude裸小鼠，6-7周，♀，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。

配制方法：赛伐珠单抗、Avastin均用生理盐水配成所需浓度。

实验步骤：裸小鼠皮下接种人结肠癌Ls-174t细胞，待肿瘤生长至60-200 mm3后，将动物随机分组(d0)。给药剂量和给药方案见表1。每周测2－3次瘤体积，称鼠重，记录数据。肿瘤体积（V）计算公式为：

V＝1/2×a×b²

其中a、b分别表示长、宽。

T/C(%)=(T-T0)/(C-C0)×100  其中T、C为实验结束时的肿瘤体积；T0、C0为实验开始时的肿瘤体积。

表1.赛伐珠单抗、Avastin对人结肠癌Ls-174t裸小鼠移植瘤的疗效

d0:第一次给药时间；P值指与对照相比。对照组n=12，治疗组n=6。

IV：静脉注射；IP：腹腔注射。

结果：赛伐珠单抗单药明显抑制人结肠癌Ls-174t裸小鼠移植瘤的生长，抑制作用有明显的剂量依赖性；Avastin同样剂量依赖地抑制Ls-174t生长，但其疗效明显不及赛伐珠单抗（P<0.05 vs 7.5 mg/kg赛伐珠单抗组）（图1）。荷瘤小鼠对赛伐珠单抗和Avastin均能较好地耐受；事实上，赛伐珠单抗还能改善荷瘤小鼠的一般状态，表现为体重增长（图2）。

实施例3.赛伐珠单抗单用或与5-氟尿嘧啶合用对于人结肠癌Ls-1 74t裸小鼠抑制瘤的疗效评价

实验材料和动物：  5-Fu上海恒瑞医药有限公司提供。动物和其他材料参见实施例1。

配制方法：  5-Fu用生理盐水配制。

实验步骤：详细步骤参见实施例1的实验步骤。给药剂量和给药方案见表2。

表2.赛伐珠单抗单用或与5-氟尿嘧啶(5-Fu)合用对人结肠癌Ls-174t裸小鼠移植瘤的疗效

d0:第一次给药时间；P值指与对照相比。对照组n=1 2，治疗组n=6。

IV：静脉注射；IP：腹腔注射。

结果：单独应用5-Fu对Ls-174t有一定疗效，抑瘤率为33.4%(d11)，但毒性很大，至给药后第15天（d15），5-Fu组的6只小鼠中5只死亡。合用赛伐珠单抗后，疗效明显增加（图3）；联合用药的疗效相比于单药的赛伐珠单抗或5-Fu，有显著性差异（P<0.01 vs 2.5mg/kg赛伐珠单抗，d8和d11）；更为重要的是，实验结束时，合用组没有1只小鼠死亡，说明赛伐珠单抗不但改善了小鼠的一般状态（体重增长，图4），还明显降低了5-Fu的致死性。

结论：赛伐珠单抗对5-Fu有明显的增效作用，还有潜在的减毒作用。

实施例4.赛伐珠单抗单用或与奥沙利铂合用对于人结肠癌Ls-174t裸小鼠抑制瘤的疗效评价

实验材料和动物：奥沙利铂由江苏豪森医药股份有限公司提供；动物和其他材料参见实施例1。

配制方法：奥沙利铂用5％葡萄糖溶液配制。

实验步骤：参见实施例1的实验步骤，给药剂量和方案见表3。

表3.赛伐珠单抗单用或与奥沙利铂合用对人结肠癌Ls-174t裸小鼠移植瘤的疗效

d0:第一次给药时间；P值指与对照相比。对照组n=12，治疗组n=6。

IV：静脉注射；IP：腹腔注射。

结果：单独应用奥沙利铂对Ls-174t有一定疗效，抑瘤率为30.1%(d11)，但毒性很大，至给药后第15天（d15），奥沙利铂组有2只小鼠死亡。合用赛伐珠单抗后，疗效明显增加（图5）；联合用药的疗效相比于单药的赛伐珠单抗或奥沙利铂，均有显著性差异（P<0.01 vs 2.5mg/kg赛伐珠单抗，d8和d11）；更为重要的是，实验结束时，合用组没有1只小鼠死亡，并且赛伐珠单抗还能改善荷瘤小鼠的一般状态，表现为体重增长（图6），说明赛伐珠单抗明显降低了奥沙利铂的致死性。

结论：赛伐珠单抗对奥沙利铂有明显的增效作用，还有潜在的减毒作用。

实施例5.赛伐珠单抗单用或与顺铂合用对于人结肠癌HT-29裸小鼠抑制瘤的疗效评价

实验材料和动物：赛伐珠单抗由江苏先声药物研究有限公司提供；阳性对照药物：注射用顺铂（冻干型）由齐鲁制药有限公司提供；实验动物：BALB/c－nude裸小鼠，SPF级，5-6周，雌性，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。

配制方法：赛伐珠单抗和顺铂均用无菌生理盐水配置成所需浓度。

实验方案：将实验动物分为7组，每组6只

1．Control，给予生理盐水，i.v.，b.i.w×3。

2．顺铂，6mg/kg:0.1ml/10g，i.p.,qw×3（药物浓度0.6mg/ml）

3．赛伐珠单抗，2.5mg/kg:0.1ml/10g，i.v.,b.i.w×3。（药物浓度0.25mg/ml）

4．赛伐珠单抗，5mg/kg:0.1ml/10g，i.v.,b.i.w×3。（药物浓度0.5mg/ml）

5．赛伐珠单抗，7.5mg/kg:0.1ml/10g，i.v.,b.i.w×3。（药物浓度0.75mg/ml）

6．赛伐珠单抗，10mg/kg:0.1ml/10g，i.v.,b.i.w×3。（药物浓度1.0mg/ml）

7.  赛伐珠单抗，2.5mg/kg+顺铂6mg/kg：i.p.,qw×3+i.v.,b.i.w×3。

实验方法：

1.HT-29裸鼠移植瘤模型

a)  复苏并扩增HT-29细胞；

b)  传代3次后，待扩增到足够的细胞，收集细胞，用不含血清的M5A培养基配成浓度为2×10⁷cell/ml的单细胞悬液；

c)  裸鼠背部右侧皮下接种，0.1 ml/只，即每只裸鼠接种细胞数为2×10⁶；

d)  共接种62只裸鼠，接种后观察出瘤情况和肿瘤大小。

2.分组：待肿瘤长至体积170mm³左右时，从62只裸鼠中选出42只肿瘤体积相近、形状较好的裸鼠，分成7组，每组6只；

3.给药：分组后当天给药，设为day0，给药方式同实验方案。

4.测量：每周测量3次肿瘤体积和体重。day21，取血清，处死裸鼠，取出肿瘤称重、拍照，计算抑瘤率。肿瘤用中性福尔马林固定。

检测指标及计算方法：

1.肿瘤体积(tumor volume,TV)，计算公式为：TV=1/2×a×b²其中a、b分别表示长、宽。

2.相对肿瘤体积（relative tumor volume，RTV），计算公式为：RTV=TV_t/TV₁。

其中TV₁为分笼给药时(即d₁)肿瘤体积，TV_t为每一次测量时的肿瘤体积。

3.相对肿瘤增殖率T/C（%），计算公式为：

$T/C(\%)=\frac{T_{\mathrm{RTV}}}{C_{\mathrm{RTV}}}\&times;100$

T_RTV：治疗组RTV；C_RTV：空白对照组RTV。

4.瘤重抑瘤率IR（%），计算公式为：

$\mathrm{IR}(\%)=\frac{C_{\mathrm{TW}}-T_{\mathrm{TW}}}{C_{\mathrm{TW}}}\&times;100$

T_TW：治疗组瘤重；C_TW：空白对照组瘤重；TW(tumor weight)：肿瘤重量。

实验结果：

实验期间，相比化疗药物顺铂，赛伐珠单抗各剂量组动物耐受良好（表4）。实验开始时各组别肿瘤体积的组内RSD基本在1/5以内，试验终点时，Control组的肿瘤体积1200mm³左右，阳性药（顺铂）在HT-29模型上表现出较好的抑瘤效应，相对Control组，其T/C＝42.3%，结果有统计学显著性。表明本次实验体系可靠。赛伐珠单抗在2.5mg/kg，5mg/kg，7.5mg/kg剂量范围内在HT-29模型上显示了良好的量效关系，但剂量超过7.5mg/kg后，到1 0mg/kg，肿瘤抑制作用未进一步增强。并且各剂量在b.i.w的给药方案下均表现了较强的肿瘤抑制作用，在高剂量时，肿瘤抑制作用可达80%。赛伐珠单抗与顺铂联用的肿瘤抑制作用强于二者分别单用，且差异有统计学显著性。赛伐珠单抗各给药剂量组，动物的体重均增长正常，给药期间，动物状态良好，动物表现了对赛伐珠单抗良好的耐受情况。（图7-11）

结论：赛伐珠单抗对顺铂有明显的增效作用，还有潜在的减毒作用。

表4.赛伐珠单抗单用或与顺铂合用对人结肠癌HT-29裸小鼠移植瘤的疗效

*:P<0.05  **:P<0.01

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (12)

1.一种药物组合物，其特征在于包含有效量的抗VEGF抗体以及化疗药物，所述抗VEGF抗体重链可变区含有SEQ ID NO.1、SEQ IDN0.2和SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，和/或其轻链可变区含有SEQID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述抗VEGF抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，轻链可变区如SEQID NO.8所示的氨基酸序列；或其重链可变区由SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列经过取代、缺失、或添加一个或几个氨基酸衍生的与SEQID NO.7的氨基酸序列至少有95%的一致性，且其轻链可变区由SEQID NO.8所示的氨基酸序列经过取代、缺失、或添加一个或几个氨基酸衍生的与SEQ ID NO.8的氨基酸序列至少有95%的一致性，且所述单克隆抗体具有特异性结合VEGF的活性。

3.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其特征在于，所述抗VEGF抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，轻链可变区如SEQ ID NO.1 0所示的氨基酸序列；或其重链可变区由SEQ IDNO.9所示的氨基酸序列经过取代、缺失、或添加一个或几个氨基酸衍生的与SEQ ID NO.9的氨基酸序列至少有95%的一致性，且其轻链可变区由SEQ ID NO.1 0所示的氨基酸序列经过取代、缺失、或添加一个或几个氨基酸衍生的与SEQ ID NO.1 0的氨基酸序列至少有95%的一致性，且所述单克隆抗体具有特异性结合VEGF的活性。

4.根据权利要求1-3任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述抗VEGF抗体包括单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、人源化抗体、以及上述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。

5.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述抗VEGF抗体由保藏编号为CGMCC No.323 3的细胞株产生。

6.权利要求1的药物组合物，其特征在于所述化疗药物选自：烷化剂、抗代谢药、抗生素、植物药、抗肿瘤激素药、门冬酰胺酶、L-天冬酰胺酶、铂类化疗药物、维甲酸、甲苄肼衍生物、蒽醌类和取代脲类化疗药物。

7.权利要求6的药物组合物，其特征在于所述化疗药物选自5-氟尿嘧啶（5-Fu）或其衍生物、铂类化疗药物、卡培他滨、紫杉醇、多西他赛、伊立替康和吉西他滨。

8.权利要求7的药物组合物，其特征在于所述化疗药物为5-氟尿嘧啶（5-Fu）或其衍生物，所述衍生物选自替加氟、卡莫氟、去氧氟脲苷、阿托氟啶、5-氟尿嘧啶二肽衍生物和高分子5-氟尿嘧啶。

9.权利要求7的药物组合物，其特征在于所述铂类化疗药物为奥沙利铂、顺铂、奈达铂、奥沙利铂或草酸铂。

10.权利要求1-9中任一项所述的药物组合物在制备抗癌症药物中的用途。

11.权利要求10的用途，其特征在于所述癌症选自结直肠癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、肾细胞癌、胶质母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、黑色素瘤、肝癌、多发性骨髓瘤、卵巢癌和头颈部癌。

12.权利要求11的用途，其特征在于所述癌症是转移性癌症。

Images