CN113144189B - Vegf抗体与免疫检查点抑制剂的联用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及VEGF抗体与免疫检查点抑制剂抗体联用，具体而言，涉及VEGF抗体和免疫检查点抑制剂在制备治疗癌症或肿瘤的药物中的应用、根据该应用制备而成的药物和治疗方法，有助于进一步提高VEGF抗体的治疗效果，增加患者受益。

Description

VEGF抗体与免疫检查点抑制剂的联用

技术领域

本发明涉及抗体领域，具体而言，涉及VEGF抗体与免疫检查点抑制剂的联用。

背景技术

血管内皮生长因子，vascular endothelial growth factor，简称VEGF，在肿瘤组织血管新生(angiogenesis)中起着重要调节作用。VEGF在大部分肿瘤组织中表达，并且VEGF的高表达经常和癌症病人的不良预后相关。BD0801抗体(又名赛伐珠单抗)为VEGF单克隆抗体，研究发现，其选择性地与VEGF相结合，阻断VEGF与其受体的信号通路，阻止肿瘤中新生血管的生成，从而有效抑制肿瘤的生长和转移。

尽管BD0801已表现出抑制肿瘤生长和转移的特质，但基于癌症生物学及癌细胞与微环境之间的相互作用的复杂性，探讨并获得与BD0801行之有效的药物联用方案，有助于进一步提高BD0801的治疗效果，增加患者受益。有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明公开VEGF抗体和免疫检查点抑制剂在制备治疗癌症或肿瘤的药物中的应用、根据该应用制备而成的药物和治疗方法。

在第一方面，本发明公开VEGF抗体和免疫检查点抑制剂在制备治疗癌症或肿瘤的药物中的应用，所述VEGF抗体包含：

(1)SEQ ID NO：1所示VH结构域的HCDR1，或与所述HCDR1相比具有至多6个突变的序列，优选至多5个、4个、3个、2个、1个或0个突变；

(2)SEQ ID NO：1所示VH结构域的HCDR2，或与所述HCDR2相比具有至多6个突变的序列，优选至多5个、4个、3个、2个、1个或0个突变；

(3)SEQ ID NO：1所示VH结构域的HCDR3，或与所述HCDR3相比具有至多6个突变的序列，优选至多5个、4个、3个、2个、1个或0个突变；

(4)SEQ ID NO：3所示VL结构域的LCDR1，或与所述LCDR1相比具有至多6个突变的序列，优选至多5个、4个、3个、2个、1个或0个突变；

(5)SEQ ID NO：3所示VL结构域的LCDR2，或与所述LCDR2相比具有至多6个突变的序列，优选至多5个、4个、3个、2个、1个或0个突变；和，

(6)SEQ ID NO：3所示VL结构域的LCDR3，或与所述LCDR3相比具有至多6个突变的序列，优选至多5个、4个、3个、2个、1个或0个突变；

所述突变可选自插入、缺失和/或替换，所述替换优选为保守氨基酸残基的替换。

在一些具体的实施方案，所述HCDR1-3和LCDR1-3根据Kabat、Chothia或IMGT编号系统确定，例如选自表1；

优选地，所述HCDR1选自SEQ ID NO：5-7；

所述HCDR2选自SEQ ID NO：8-10；

所述HCDR3选自SEQ ID NO：11-12；

所述LCDR1选自SEQ ID NO：13-14；

所述LCDR2选自SEQ ID NO：15-16；

所述LCDR3选自SEQ ID NO：17。

在一些具体的实施方案中，所述VEGF抗体包含与SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示可变区的框架区具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列；优选地，所述VEGF抗体具有如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示序列。

在一些具体的实施方案中，所述VEGF抗体还包含重链恒定区和/或轻链恒定区，所述重链恒定区优选具有如SEQ ID NO：2所示序列，所述轻链恒定区优选具有如SEQ ID NO：4所示序列。

在一些具体的实施方案中，所述VEGF抗体为全长抗体或抗体片段，所述抗体片段可选自Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)₂、Fv或scFv。

在一些具体的实施方案中，所述免疫检测点抑制剂选自PD-1抗体或PD-L1抗体。

在一些具体的实施方案中，所述癌症或肿瘤选自实体瘤、乳腺癌、子宫癌、卵巢癌、肺癌、结直肠癌、肝癌、肾癌、胃癌、脑胶质瘤、骨肉瘤、前列腺癌或多发性骨髓瘤，优选肺癌或结直肠癌。

在一些具体的实施方案中，所述VEGF抗体与所述免疫检测点抑制剂包含于同一药物组合物中，或所述VEGF抗体与所述免疫检测点抑制剂形成药物组合，优选地，所述药物组合物或所述药物组合还包含其他治疗剂。

在第二方面，本发明还公开根据前述应用制备而成的药物。

在第三方面，本发明还公开一种治疗癌症或肿瘤的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的前述VEGF抗体和免疫检查点抑制剂或前述药物；

所述免疫检查点抑制剂优选自PD-1抗体或PD-L1抗体；

所述癌症或肿瘤优选自实体瘤、乳腺癌、子宫癌、卵巢癌、肺癌、结直肠癌、肝癌、肾癌、胃癌、脑胶质瘤、骨肉瘤、前列腺癌或多发性骨髓瘤，更优选肺癌或结直肠癌。

术语定义和说明

除非本发明另外定义，与本发明相关的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员所理解的含义。

此外，除非本文另有说明，本文单数形式的术语应包括复数形式，复数形式的术语应包括单数形式。更具体地，如在本说明书和所附权利要求中所使用的，除非另外明确指出，否则单数形式“一种”和“这种”包括复数指示物。

本文术语“包括”、“包含”和“具有”之间可互换使用，旨在表示方案的包含性，意味着所述方案可存在除所列出的元素之外的其他元素。同时应当理解，在本文中使用“包括”、“包含”和“具有”描述，也提供“由……组成”方案。

术语“和/或”在本文使用时，包括“和”、“或”和“由所属术语链接的要素的全部或任何其他组合”的含义。

本文术语“抗体”按最广义使用，是指包含来自免疫球蛋白重链可变区的足够序列和/或来自免疫球蛋白轻链可变区的足够序列，从而能够特异性结合至抗原的多肽或多肽组合。本文“抗体”涵盖各种形式和各种结构，只要它们展现出期待的抗原结合活性。本文所指“期待的抗原结合活性”是指例如抗体通常以高亲和力特异性结合抗原和实质上相同的抗原，但不以高亲和力结合不相关抗原。亲和力通常以平衡解离常数(equilibriumdissociation constant，KD)来反映，其中较低KD表示较高亲和力。示例性地，高亲和力通常指具有约10^-7M或更低、约10^-8M或更低、约1×10^-9M或更低、约1×10^-10M或更低、1×10^-11M或更低或1×10^-12M或更低的KD。KD计算方式如下：KD＝Kd/Ka，其中Kd表示解离速率，Ka表示结合速率。可采用本领域周知的方法测量平衡解离常数KD，如表面等离子共振(例如Biacore)或平衡透析法测定。

本文“抗体”包括具有移植的互补决定区(CDR)或CDR衍生物的替代蛋白质支架或人工支架。此类支架包括抗体衍生的支架(其包含引入以例如稳定化抗体三维结构的突变)以及包含例如生物相容性聚合物的全合成支架。参见，例如Korndorfer et al.,2003,Proteins:Structure,Function,and Bioinformatics,53(1):121-129(2003)；Roque etal.,Biotechnol.Prog.20:639-654(2004)。此类支架还可以包括非抗体衍生的支架，例如本领域已知可用于移植CDR的支架蛋白，包括但不限于肌腱蛋白、纤连蛋白、肽适体等。

本文“抗体”包括一种典型的“四链抗体”，其属于由两条重链(HC)和两条轻链(LC)组成的免疫球蛋白；重链是指这样的多肽链，其在N端到C端的方向上由重链可变区(VH)、重链恒定区CH1结构域、铰链区(HR)、重链恒定区CH2结构域、重链恒定区CH3结构域组成；并且，当所述全长抗体为IgE同种型时，任选地还包括重链恒定区CH4结构域；轻链是在N端到C端方向上由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成的多肽链；重链与重链之间、重链与轻链之间通过二硫键连接，形成“Y”字型结构。由于免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将本文“免疫球蛋白”分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，IgA可分为IgA1和IgA2。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中每类Ig都可以有κ链或λ链。

本文“抗体”还包括不包含轻链的抗体，例如，由单峰驼(Camelus dromedarius)、双峰驼(Camelus bactrianus)、大羊驼(Lama glama)、原驼(Lama guanicoe)和羊驼(Vicugna pacos)等产生的重链抗体(heavy-chain antibodies,HCAbs)以及在鲨等软骨鱼纲中发现的免疫球蛋白新抗原受体(Ig new antigen receptor,IgNAR)。

本文“抗体”可以来源于任何动物，包括但不限于人和非人动物，所述非人动物可选自灵长类动物、哺乳动物、啮齿动物和脊椎动物，例如骆驼科动物、大羊驼、原鸵、羊驼、羊、兔、小鼠、大鼠或软骨鱼纲(例如鲨)。

本文“抗体”包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、单特异性抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、单价抗体、多价抗体、完整抗体、完整抗体的片段、裸抗体、缀合抗体、嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体。

本文术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能的变异体(例如含有天然存在的突变或在制剂的生产过程中产生，此类变体通常以少量存在)之外，包含所述群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂中的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。本文修饰语“单克隆”不应解释为需要通过任何特定方法产生所述抗体或抗原结合分子。举例来说，单克隆抗体可通过多种技术制得，包括(但不限于)杂交瘤技术、重组DNA方法、噬菌体库展示技术和利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法和其它本领域已知的方法。

本文术语“天然抗体”是指通过多细胞生物体的免疫系统制造和配对的抗体。本文术语“工程化抗体”的抗体是指通过基因工程、抗体工程等技术获得的非天然抗体，示例性地，“工程化抗体”包括人源化抗体、小分子抗体(例如scFv等)、双特异性抗体等等。

本文术语“单特异性”是指表示具有一个或多个结合位点，其中每个结合位点结合相同抗原的相同表位。

本文术语“多特异性抗体”是指具有至少两个抗原结合位点，所述至少两个抗原结合位点中的每一个抗原结合位点与相同抗原的不同表位或与不同抗原的不同表位结合。因此，诸如“双特异性”、“三特异性”、“四特异性”等术语是指抗体/抗原结合分子可以结合的不同表位的数目。

本文术语“价”表示抗体/抗原结合分子中规定数目的结合位点的存在。因此，术语“单价”、“二价”、“四价”和“六价”分别表示抗体/抗原结合分子中一个结合位点、两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点的存在。

本文“全长抗体”、“完好抗体”和“完整抗体”在本文中可互换使用，是指具有基本上与天然抗体结构相似的结构。

本文“抗原结合片段”和“抗体片段”在本文中可互换使用，其不具备完整抗体的全部结构，仅包含完整抗体的局部或局部的变体，所述局部或局部的变体具备结合抗原的能力。本文“抗原结合片段”或“抗体片段”包括但不限于Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)₂、Fd、Fv、scFv、双抗体(diabody)和单域抗体。

完整抗体的木瓜蛋白酶消化生成两个同一的抗原结合片段，称作“Fab”片段，每个含有重和轻链可变域，还有轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)。如此,本文术语“Fab片段”指包含轻链的VL域和恒定域(CL)的轻链片段,和重链的VH域和第一恒定域(CH1)的抗体片段。Fab’片段因在重链CH1域的羧基末端增加少数残基而与Fab片段不同，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH是其中恒定域的半胱氨酸残基携带游离硫醇基团的Fab’片段。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点(两个Fab片段)和Fc区的一部分的F(ab’)₂片段。

本文术语“Fd”是指由VH和CH1结构域组成的抗体。

本文术语“Fv”是指由单臂VL和VH结构域组成的抗体片段。Fv片段通常被认为是，能形成完整的抗原结合位点的最小抗体片段。一般认为，六个CDR赋予抗体的抗原结合特异性。然而，即便是一个可变区(例如Fd片段，其仅仅含有三个对抗原特异的CDR)也能够识别并结合抗原，尽管其亲和力可能低于完整的结合位点。

本文术语“scFv”(single-chain variable fragment)是指包含VL和VH结构域的单个多肽链，其中所述VL和VH通过接头(linker)相连(参见，例如,Bird等人,Science 242:423-426(1988)；Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988)；和Pluckthun，The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies，第113卷，Roseburg和Moore编，Springer-Verlag，纽约，第269-315页(1994))。此类scFv分子可具有一般结构：NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(GGGGS)₄的接头，但也可使用其变体(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448)。可用于本发明的其他接头由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8:725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immunol.31:94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56:3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293:41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。在一些情况下，scFv的VH与VL之间还可以存在二硫键，形成二硫键连接的Fv(dsFv)。

本文术语“双抗体(diabody)”，其VH和VL结构域在单个多肽链上表达，但使用太短的连接体以致不允许在相同链的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位(参见，例如,Holliger P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)，和PoljakR.J.等人,Structure 2:1121-1123(1994))。

本文术语“单域抗体”(single domain antibody,sdAb)、“VHH”和“纳米抗体(nanobody)”具有相同的含义并可互换使用，指克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体，它是具有完整功能的最小的抗原结合片段。通常先获得天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的抗体后，再克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体。单域抗体可以衍生自骆驼科重链抗体或软骨纲鱼类IgNAR。

本文术语“裸抗体”是指不与治疗剂或示踪剂缀合的抗体；术语“缀合抗体”是指与治疗剂或示踪剂缀合的抗体。

本文术语“嵌合抗体(Chimeric antibody)”是指，这样的抗体，其轻链或/和重链的一部分源自一个抗体(其可以源自某一特定物种或属于某一特定抗体类或亚类)，且轻链或/和重链的另一部分源自另一个抗体(其可以源自相同或不同的物种或属于相同或不同的抗体类或亚类)，但无论如何，其仍保留对目标抗原的结合活性(U.S.P 4,816,567 toCabilly et al.；Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:68516855(1984))。例如，术语“嵌合抗体”可包括这样的抗体(例如人鼠嵌合抗体)，其中抗体的重链和轻链可变区来自第一抗体(例如鼠源抗体)，而抗体的重链和轻链恒定区来自第二抗体(例如人抗体)。

本文术语“人源化抗体”是指，经基因工程改造的非人源抗体，其氨基酸序列经修饰以提高与人源抗体的序列的同源性。通常而言，人源化抗体的全部或部分CDR区来自于非人源抗体(供体抗体)，全部或部分的非CDR区(例如，可变区FR和/或恒定区)来自于人源免疫球蛋白(受体抗体)。人源化抗体通常保留或部分保留了供体抗体的预期性质，包括但不限于，抗原特异性、亲和性、反应性、提高免疫细胞活性的能力、增强免疫应答的能力等。

本文术语“全人抗体”是指具有其中FR和CDR二者都源自人种系免疫球蛋白序列的可变区的抗体。此外，如果抗体包含恒定区，则恒定区也源自人种系免疫球蛋白序列。本文全人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，本文“全人抗体”不包括其中来源于另一个哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列已被移植到人框架序列上的抗体。

本文术语“可变区”是指抗体重链或轻链中牵涉使抗体结合抗原的区域，“重链可变区”与“VH”、“HCVR”可互换使用，“轻链可变区”与“VL”、“LCVR”可互换使用。天然抗体的重链和轻链的可变域(分别是VH和VL)一般具有相似的结构，每个域包含四个保守的框架区(FR)和三个高变区(HVR)。参见例如Kindt et al.,Kuby Immunology,6th ed.,W.H.Freeman and Co.,p.91(2007)。单个VH或VL域可足以赋予抗原结合特异性。

本文术语“互补决定区”与“CDR”可互换使用，通常指重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)的高变区(HVR)，该部位因在空间结构上可与抗原表位形成精密的互补，故又称为互补决定区，其中，重链可变区CDR可缩写为HCDR，轻链可变区CDR可缩写为LCDR。本文术语“构架区”或“FR区”可互换，是指抗体重链可变区或轻链可变区中除CDR以外的那些氨基酸残基。通常典型的抗体可变区由4个FR区和3个CDR区按以下顺序组成：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。

对于CDR的进一步描述，参考Kabat等人,J.Biol.Chem.,252:6609-6616(1977)；Kabat等人,美国卫生与公共服务部，“Sequences ofproteins ofimmunologicalinterest”(1991)；Chothia等人,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；Al-Lazikani B.等人,J.Mol.Biol.,273:927-948(1997)；MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996)；Abhinandan和Martin,Mol.Immunol.,45:3832-3839(2008)；Lefranc M.P.等人,Dev.Comp.Immunol.,27:55-77(2003)；以及Honegger和Plückthun,J.Mol.Biol.,309:657-670(2001)。本文“CDR”可由本领域公知的方式加以标注和定义，包括但不限于Kabat编号系统、Chothia编号系统或IMGT编号系统，使用的工具网站包括但不限于AbRSA网站(http://cao.labshare.cn/AbRSA/cdrs.php)、abYsis网站(www.abysis.org/abysis/sequence_input/key_annotation/key_annotation.cgi)和IMGT网站(http://www.imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/DomainGapAlign.cgi#results)。

本文术语“Kabat编号系统”通常是指由ElvinA.Kabat提出的免疫球蛋白比对及编号系统(参见，例如Kabat et al.,Sequences ofProteins ofImmunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.,1991)。

本文术语“Chothia编号系统”通常是指由Chothia等人提出的免疫球蛋白编号系统，其是基于结构环区的位置鉴定CDR区边界的经典规则(参见，例如Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883)。

本文术语“IMGT编号系统”通常是指基于由Lefranc等人发起的国际免疫遗传学信息系统(The international ImMunoGeneTics information system(IMGT))的编号系统，可参阅Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003。

示例性地，SEQ ID NO：1或3所示VH或VL序列的CDR如下表所示：其中Kabat和Chothia使用abYsis网站，IMGT使用IMGT网站。

表1抗VEGF抗体重链及轻链CDR区氨基酸序列表

本文术语“重链恒定区”是指抗体重链的羧基端部分，其不直接参与抗体与抗原的结合，但是表现出效应子功能，诸如与Fc受体的相互作用，其相对于抗体的可变结构域具有更保守的氨基酸序列。“重链恒定区”至少包含：CH1结构域，铰链区，CH2结构域，CH3结构域，或其变体或片段。“重链恒定区”包括“全长重链恒定区”和“重链恒定区片段”，前者具有基本上与天然抗体恒定区基本相似的结构，而后者仅包括“全长重链恒定区的一部分”。示例性地，典型的“全长抗体重链恒定区”由CH1结构域-铰链区-CH2结构域-CH3结构域组成；当抗体为IgE时，其还包括CH4结构域；当抗体为重链抗体时，则其不包括CH1结构域。示例性地，典型的“重链恒定区片段”可选自CH1、Fc或CH3结构域。

本文术语“轻链恒定区”是指抗体轻链的羧基端部分，其不直接参与抗体与抗原的结合，所述轻链恒定区可选自恒定κ结构域或恒定λ结构域。

本文术语“Fc”是指完整抗体经木瓜蛋白酶水解而成的抗体羧基端部分，典型地，其包含抗体的CH3和CH2结构域。Fc区包括例如天然序列Fc区、重组Fc区和变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可以略微变化，但是人IgG重链的Fc区通常被定义为从Cys226位置的氨基酸残基或从Pro230延伸至其羧基末端。Fc区的C末端赖氨酸(根据Kabat编号系统的残基447)可以例如在抗体的产生或纯化过程中，或通过对编码抗体重链的核酸重组工程化而除去，因此，Fc区可包括或不包括Lys447。

本文术语“保守氨基酸”通常是指属于同一类或具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性、亲水性、主链构象和刚性)的氨基酸。示例性地，下述每组内的氨基酸属于彼此的保守氨基酸残基，组内氨基酸残基的替换属于保守氨基酸的替换：

(1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；

(2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；

(3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；

(4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)；

(5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和

(6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。

本文术语“同一性”可通过以下方式计算获得：为确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的“同一性”百分数，将所述序列出于最佳比较目的比对(例如，可以为最佳比对而在第一和第二氨基酸序列或核酸序列之一或二者中引入空位或可以为比较目的而抛弃非同源序列)。随后比较在对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置由第二序列中对应位置处的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在这个位置处是相同的。

考虑到为最佳比对这两个序列而需要引入的空位的数目和每个空位的长度，两个序列之间的同一性百分数随所述序列共有的相同位置变化而变化。

可以利用数学算法实现两个序列间的序列比较和同一性百分数的计算。例如，使用已经集成至GCG软件包的GAP程序中的Needlema和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48:444-453)算法(在www.gcg.com可获得)，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵和空位权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数。又例如，使用GCG软件包中的GAP程序(在www.gcg.com可获得)，使用NWSgapdna.CMP矩阵和空位权重40、50、60、70或80和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个核苷酸序列之间的同一性百分数。特别优选的参数集合(和除非另外说明否则应当使用的一个参数集合)是采用空位罚分12、空位延伸罚分4和移码空位罚分5的Blossum62评分矩阵。

还可以使用PAM120加权余数表、空位长度罚分12，空位罚分4，利用已经并入ALIGN程序(2.0版)的E.Meyers和W.Miller算法,((1989)CABIOS,4:11-17)确定两个氨基酸序列或核苷酸序列之间的同一性百分数。

额外地或备选地，可以进一步使用本发明所述的核酸序列和蛋白质序列作为“查询序列”以针对公共数据库执行检索，以例如鉴定其他家族成员序列或相关序列。例如，可以使用Altschul等人,(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的NBLAST及XBLAST程序(版本2.0)执行此类检索。BLAST核苷酸检索可以用NBLAST程序，评分＝100、字长度＝12执行，以获得与本发明核酸(SEQ ID NO:1)分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质检索可以用XBLAST程序、评分＝50、字长度＝3执行，以获得与本发明蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了出于比较目的获得带空位的比对结果，可以如Altschul等人,(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402中所述那样使用空位BLAST。当使用BLAST和空位BLAST程序时，可以使用相应程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。

本文术语“免疫检查点”是指免疫系统中存在的一些抑制性信号通路。机体在正常情况下，免疫检查点可以通过调节自身免疫反应的强度来维持免疫耐受，然而机体在受到肿瘤侵袭时，免疫检查点的激活会抑制自身免疫，有利于肿瘤细胞的生长和逃逸。通过使用免疫检查点抑制剂，可以恢复机体正常的抗肿瘤免疫反应，从而控制和清除肿瘤。免疫检查点包括但不限于程序性死亡受体1(PD1)、PD-L1、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)；也包括一些新发现的免疫检查点例如淋巴细胞活化基因3(LAG3)、CD160、T细胞免疫球蛋白和粘蛋白-3(TIM-3)、T细胞活化的V结构域免疫球蛋白抑制剂(VISTA)、腺苷A2a受体(A2aR)等等。

本文术语“药物”是指用以预防、治疗及诊断疾病的物质，包括“药物组合物”或“药物组合”。“药物组合物”是指这样的制剂，其以允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不含有对施用所述药物组合物的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。本文所用的术语“组合”或“药物组合”是指非固定组合，其中活性剂和至少一种另外的活性剂可以同时或在时间间隔内单独施用，特别是在这些时间间隔允许组合配偶体显示合作(例如，协同)效应的情况下。术语“非固定组合”意指活性成分(例如，一种活性剂和至少一种另外的活性剂)均作为分开的实体同时或在没有特定时间限制的情况下顺序地施用于患者，其中这种施用提供了患者体内两种化合物的治疗有效水平。

本文术语“治疗”是指外科手术或药物处理(surgical or therapeutictreatment)，其目的是预防、减缓(减少)治疗对象中不希望的生理变化或病变，如癌症或肿瘤的进展。有益的或所希望的临床结果包括但不限于症状的减轻、疾病程度减弱、疾病状态稳定(即，未恶化)、疾病进展的延迟或减慢、疾病状态的改善或缓和、以及缓解(无论是部分缓解或完全缓解)，无论是可检测的或不可检测的。需要治疗的对象包括已患有病症或疾病的对象以及易于患上病症或疾病的对象或打算预防病症或疾病的对象。当提到减缓、减轻、减弱、缓和、缓解等术语时，其含义也包括消除、消失、不发生等情况。

本文术语“受试者”是指接受对如本发明所述的特定疾病或病症的治疗的生物体。对象和患者的实例包括接受疾病或病症治疗的哺乳动物，如人、灵长类动物(例如，猴)或非灵长类哺乳动物。

本文术语“有效量”指单独给予或与另一治疗剂组合给予细胞、组织或对象时能有效防止或缓解疾病病症或该疾病进展的治疗剂用量。“有效量”还指足以缓解症状，例如治疗、治愈、防止或缓解相关医学病症，或治疗、治愈、防止或缓解这些病症的速度增加的化合物用量。当将活性成分单独给予个体时，治疗有效剂量单指该成分。当应用某一组合时，治疗有效剂量指产生治疗作用的活性成分的组合用量，而无论是组合、连续或同时给予。

本文术语“癌症”指向或描述哺乳动物中典型地以不受调节的细胞生长为特征的生理状况。此定义中包括良性和恶性癌症。本文术语“肿瘤”或“瘤”是指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。

本文术语“EC50”是指半最大有效浓度，其包括在指定暴露时间之后诱导基线与最大值之间的半途响应的抗体浓度。EC50本质上代表其中观察到其最大作用的50％的抗体浓度，可通过本领域已知方法测量。

附图说明

图1为ELISA检测BD0801与人VEGF₁₆₅或小鼠VEGF₁₆₄的结合情况；

图2为ELISA检测BD0801阻断VEGF/VEGFR2结合的情况；

图3为WB检测BD0801对VEGF介导的VEGFR2激活和下游信号通路的抑制情况；

图4为CellTiter Glo染色检测BD0801抑制HUVEC增殖的情况；

图5为Boyden Chamber Transwell法检测BD0801抑制HUVEC迁移的情况；

图6为图5的量化结果；

图7为BD0801对肺癌PC9异种移植小鼠模型的肿瘤抑制作用；

图8为BD0801对肺癌PC9异种移植小鼠模型的体重影响；

图9为BD0801、抗PD-1抗体和抗PD-L1抗体在鼠肺癌3LL同系小鼠皮下瘤模型中的抗肿瘤效果，其中图9A反映单药对小鼠肿瘤体积的抑制作用，图9B反映单药对小鼠体重的影响，9C反映BD0801与PD-1抗体联用对小鼠肿瘤体积的抑制作用，图9D反映BD0801与PD-L1抗体联用对小鼠肿瘤体积的抑制作用；

图10为BD0801、抗PD-1抗体和抗PD-L1抗体在鼠结肠癌CT26同系小鼠皮下瘤模型中的抗肿瘤效果，其中图10A反映单药对小鼠肿瘤体积的抑制作用，图10B反映BD0801与PD-1抗体联用对小鼠肿瘤体积的抑制作用，图10C反映BD0801与PD-L1抗体联用对小鼠肿瘤体积的抑制作用。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

下述实施例使用BD0801抗体，由江苏先声药业有限公司(中国江苏，南京)提供，序列如下所示：

重链可变区(SEQ ID NO：1)：

EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFSFSNNDVMCWVRQAPGKGLEWIGCIMTTDVVTEYANWAKSRFTVSRDSAKNSVYLQMNSLRAEDTAVYFCARDSVGSPLMSFDLWGPGTLVTVSS；

重链恒定区(SEQ ID NO：2)：

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK；

轻链可变区(SEQ ID NO：3)：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSIYNNNELSWYQQKPGKPPKLLIYRASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCGGYKSYSNDGNGFGGGTKVEIK；

轻链恒定区(SEQ ID NO：4)：

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC。

实施例1 BD0801结合人VEGF₁₆₅和小鼠VEGF₁₆₄

采用ELISA方法检测BD0801对不同种属VEGF的结合能力：人VEGF₁₆₅(PrimeGene，中国上海)或小鼠VEGF₁₆₄(PrimeGene，中国上海)包被空白ELISA平板，用含1％BSA的PBS封闭。将不同浓度BD0801添加到平板，洗去未结合的BD0801。加入HRP标记驴抗人IgG(JacksonImmunoResearch,美国宾夕法尼亚州西格罗夫)，孵育后洗去多余的HRP复合物，加入底物TMB(Thermo Fisher Scientific,美国麻省沃尔瑟姆)，通过SpectraMax I3X(MolecularDevices,LLC,美国加州森尼韦尔)测量OD值，检测波长450nm，参考波长630nm。根据不同浓度下OD值计算EC₅₀(软件：GraphPad Prism 8.0(GraphPad Software Inc.,美国加州圣迭戈))。每个浓度测3个重复。检测结果如图1所示，BD0801结合人VEGF₁₆₅、小鼠VEGF₁₆₄，与人VEGF₁₆₅结合的EC₅₀为7.044ng/mL，与小鼠的VEGF₁₆₄结合的EC₅₀为8.115ng/mL。

实施例2 BD0801阻断VEGF/VEGFR2的结合

检测BD0801对VEGF和VEGFR2结合的阻断作用：VEGFR2-his(Sino Biological，中国北京)包被空白ELISA板，加入含1％BSA的PBS封闭。将不同浓度的BD0801或Avastin(Genentech/Roche,美国加州旧金山)与人VEGF(PrimeGene，中国上海)37℃孵育1小时后加入到包被VEGFR2-his的ELISA板中孵育。洗去未结合的VEGF，将抗VEGF兔单抗(SinoBiological，中国北京)作为一抗加入板中孵育，洗板后，添加过HRP标记驴抗兔IgGJackson(Immunoresearch laboratories.Inc.,美国，宾夕法尼亚州西格罗夫)作为二抗孵育。洗去多余二抗，添加底物TMB，通过SpectraMax I3X测量OD值。检测波长为450nm，参考波长为630nm。基于不同浓度下的OD值计算IC₅₀(软件：GraphPad Prism 8.0)。每个浓度测定两个重复，实验重复3次。结果如图2所示，BD0801和Avastin均可阻断VEGF与VEGFR2的结合，IC₅₀分别为275±10ng/ml和1451±32ng/ml。BD0801显示出比Avastin更好的VEGF/VEGFR2结合阻断作用(P<0.001,t TEST)。

实施例3 BD0801抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC细胞)由VEGF介导的VEGFR2激活和下游信号通路

将VEGF与不同浓度的BD0801或阳性对照Avastin共同孵育，然后添加至HUVEC细胞培养物，检测BD0801对HUVECs中VEGF下游信号通路的影响：用6孔板培养HUVEC细胞(AllCells,Alameda,CA,USA)，培养基为HUVEC培养基(Allcells,#H004B)加入10％FBS(Allcells,#H005)和HUVEC生长因子(Allcells,#H005)。不同浓度的BD0801或Avastin与50ng/ml VEGF(Peprotech,美国新泽西州克兰伯里)孵育30分钟后添加至HUVEC培养物中孵育3分钟。孵育结束后，裂解细胞，细胞裂解物在沸水浴中加热变性。细胞裂解的上清液经SDS-PAGE后，使用湿转移系统将蛋白质转移到PVDF膜。PVDF膜与一抗孵育过夜，用TBST缓冲液洗涤，与二抗室温孵育1小时，经TBST缓冲液洗涤后进行发光检测。抗体信息如表2。结果如图3所示：VEGF显著诱导HUVECs细胞VEGFR2磷酸化，0.1μg/ml BD0801能显著抑制VEGF诱导的VEGFR2磷酸化，且其活性强于同浓度的Avastin。BD0801和Avastin在1μg/ml或更高浓度下抑制VEGF/VEGFR2下游ERK1/2激活。

表2 Western Blot抗体信息表

实施例4 BD0801抑制VEGF介导的HUVEC增殖和迁移

CellTiter Glo染色检测HUVEC增殖抑制：将处于对数生长期的HUVEC细胞(Sciencell Research Laboratories,美国加州卡尔斯巴德)接种至96孔板，培养基为ECM培养基(ScienCell,#1001)加上5％FBS(ScienCell,#0025)，1％penicillin/streptomycin(GIBCO,Invitrogen Inc.,美国加州卡尔斯巴德,#15140-122)和1％ECGS(ScienCell,#5352)。将不同浓度的BD0801或Avastin与50ng/ml VEGF(PrimeGene，中国上海)37℃孵育2小时后，添加至已培养18-20小时的前述HUVEC培养物，在37℃，5％CO₂下培养72小时。根据说明手册制备CellTiter Glo工作溶液(Promega,Madison,WI,USA)，室温下添加至HUVEC培养物。通过PheraStar FS((BMG Labtech,德国奥芬堡)检测发光情况。基于不同浓度的发光情况计算IC₅₀(软件：GraphPad Prism 8.0)。每个浓度测量3个重复，实验重复3次。结果如图4(三次实验中代表性的一次实验结果)所示，BD0801显著抑制VEGF诱导的HUVEC增殖，三次实验结果的平均IC₅₀为87±4ng/ml，抑制活性明显强于阳性对照Avastin(IC₅₀＝476±41ng/ml,P<0.01,t TEST)。

Boyden Chamber Transwell法检测细胞迁移：将悬浮于无血清HUVEC完全培养基(Allcells)的HUVECs细胞(Allcells)置于小室的内室培养，该内室为8.0-μm孔聚碳酸酯膜。不同浓度的BD0801或Avastin与20ng/ml VEGF(Peprotech,美国新泽西州克兰伯里)37℃孵育30分钟后加入外室。将内室放入外室，在37℃孵育16小时后，移除内室培养基，用棉球擦去未迁移细胞，移除外室培养基，PBS洗涤外室细胞，乙醇固定，再次用PBS洗涤。室温下结晶紫染色20分钟，PBS洗涤去除残留染料。显微镜下观察HUVECs迁移。每种条件重复三次。结果如图5-6所示，VEGF诱导HUVEC迁移，BD0801和Avastin抑制VEGF诱导的迁移。0.1μg/mlBD0801几乎消除HUVEC迁移，其抑制活性比阳性对照Avastin强10倍(P<0.001,one-wayANOVA)。

实施例5 BD0801抑制肺癌PC9异种移植小鼠模型的肿瘤生长

检测BD0801在肺癌PC9异种移植小鼠中的抗肿瘤效果：人非小细胞肺癌细胞系PC9购自Riken BioResource Research Center(日本茨城町，#RCB4455)，培养基为RPMI-1640(Gibco,#22400-089)，加入10％FBS(Hyclone,Thermo Fisher Scientific,美国麻省沃尔瑟姆,#SV30087.03),100U/ml penicillin和100μg/ml streptomycin(Gibco,#15240-062)。购买6-8周龄的雌性Balb/c裸鼠(Sippr-BK实验动物有限公司，中国上海)，皮下注射5×10⁶个PC9细胞皮下注射至其右侧，建立PC9异种移植小鼠模型。肿瘤体积平均达到100-150mm³时，将小鼠随机分组，每组6只小鼠，

每周两次静脉注射空白对照(生理盐水)，或每天口服一次AZD9291(Selleck,Houston,TX,USA,#S7297，5mg/kg溶于0.5％甲基纤维素和0.1％Tween80的水中)或每周两次静脉注射不同浓度的BD0801(溶于生理盐水)。治疗第一天定义为第0天，每周两次测量肿瘤体积和体重。第27天测定最终肿瘤体积和体重后将所有动物安乐死。肿瘤的长径(a)和短径(b)使用游标卡尺测量，并使用以下公式计算肿瘤体积：

V＝0.5×a×b²。

T/C(％)＝T_RTV/C_RTV×100％。

RTV为相对肿瘤体积，RTV＝V_t/V₀，V₀为第0天肿瘤体积；V_t为第t天肿瘤体积；T_RTV：为治疗组平均RTV；C_RTV为对照组平均RTV。肿瘤体积统计分析使用two-way ANOVA(GraphPadPrism 8.0)。

结果表明，PC9异种移植小鼠模型对阳性对照AZD9291(奥希替尼)反应良好(P<0.01)；与空白对照相比，每周两次接受静脉注射0.8mg/kg BD0801的小鼠未表现出明显的肿瘤生长抑制，接受2.5、7.5或22.5mg/kg BD0801的小鼠显示明显的肿瘤生长抑制(P<0.01)，T/C值分别为36.4％，23.7％和11.6％，表明BD0801具有剂量依赖性的抗肿瘤反应(图7)。小鼠表现出耐受BD0801，且未发现体重减少(图8)。

实施例6 BD0801与抗PD-1或抗PD-L1抗体联合给药在鼠肺癌3LL同系模型产生协同的肿瘤生长抑制作用

使用小鼠肺癌细胞3LL同系小鼠模型检测BD0801、抗小鼠PD-1抗体或抗小鼠PD-L1抗体的抗肿瘤生长能力，从而检测BD0801是否与免疫检查点抑制剂协同抑制肿瘤生长：鼠肺癌细胞系3LL购自JCRB Cell Bank of the National Institutes of BiomedicalInnovation,Health,and Nutrition(日本东京,#JCRB-1348)，培养基为RPMI-1640(Gibco,#22400-089)，加入10％FBS(Hyclone,Thermo Fisher Scientific,美国麻省沃尔瑟姆,#SV30087.03),100U/ml penicillin和100μg/ml streptomycin(Gibco,#15240-062)。2×10⁶3LL细胞皮下注射至6-8周龄雌性C57BL/6小鼠(上海灵畅生物科技有限公司，中国上海)右侧，建立3LL同系小鼠模型。肿瘤体积平均达到50-80mm³时，根据肿瘤体积将小鼠随机分组，分别用BD0801，抗PD-1抗体(BioXcell,美国新罕布什尔州莱巴嫩,clone#RMP1-14,#BE0146)，抗PD-L1抗体(BioXcell,美国新罕布什尔州莱巴嫩,clone#10F.9G2,#BE0101)或其组合进行治疗。空白对照组注射生理盐水，联合给药组在同一天依次注射抗体，每周给药两次，共给药两周，每周测量三次动物的肿瘤体积和体重。

根据3LL模型BD0801单剂量递增研究结果可知，BD0801表现出剂量依赖性抗肿瘤效应，其中0.8mg/kg，2.5mg/kg和7.5mg/kg剂量下，T/C分别为59.1％，34.0％和19.8％(图9A，**，P<0.01)。同时在所有剂量下，抗PD-1抗体或BD0801均不降低动物体重(图9B)。但为减少BD0801引起的过敏反应，在后续组合研究中将BD0801给药方法从静脉注射(IV)改为腹腔注射(IP)，抗小鼠PD-1抗体或抗小鼠PD-L1抗体在所有实验中都是腹腔注射(IP)。

在3LL小鼠模型中将不同浓度BD0801与抗小鼠PD-1抗体或抗小鼠PD-L1抗体组合使用。与空白对照相比，0.8mg/kg BD0801、2.5mg/kg BD0801、5mg/kg抗PD-1抗体或5mg/kg抗PD-L1抗体均显著降低肿瘤生长(图9C-图9D，P<0.01)。与单一治疗相比，0.8mg/kgBD0801和5mg/kg抗PD-1抗体的组合在统计学上显示出显著增强的肿瘤生长的抑制作用(图9C，P<0.05，0.8mg/kg BD0801，T/C为44.4％，5mg/kg抗PD-1抗体的T/C为54.2％，组合的T/C为23.6％)。与单一治疗相比，2.5mg/kg BD0801和5mg/kg抗PD-L1抗体的组合显示出增强的肿瘤生长抑制作用(图9D，2.5mg/kg BD0801，T/C为30.6％；5mg/kg抗PD-L1抗体，T/C为53.2％；组合，T/C为15.1％)。

实施例7 BD0801与抗PD-1或抗PD-L1抗体联合给药在鼠结肠癌CT26同系模型产生协同的肿瘤生长抑制作用

使用小鼠结肠癌细胞CT26同系小鼠模型检测BD0801，抗小鼠PD-1抗体或抗小鼠PD-L1抗体的抗肿瘤生长能力，从而检测BD0801是否可以与免疫检查点抑制剂协同抑制肿瘤生长：鼠结肠癌细胞系CT26是从ATCC(Manassas,VA,USA,#CRL-2638)购买，培养基为RPMI-1640(Gibco,#22400-089)，加入10％FBS(Hyclone,Thermo Fisher Scientific,美国麻省沃尔瑟姆，,#SV30087.03),100U/ml penicillin和100μg/ml streptomycin(Gibco,#15240-062)。3×10⁵CT26细胞皮下注射到6-8周龄雌性Balb/c小鼠右侧(购自上海灵畅生物科技有限公司)，建立CT26同系小鼠模型。肿瘤体积平均达到50-80mm³时，根据肿瘤体积将小鼠随机分组，分别用BD0801，抗PD-1抗体，抗PD-L1抗体或其组合进行治疗。空白对照组注射生理盐水，联合给药组在同一天依次注射抗体，每周给药两次，共给药两周，每周测量三次动物的肿瘤体积和体重。

如图10A所示，0.8mg/kg和2.5mg/kg BD0801不能抑制肿瘤的生长，T/C值分别为94.7％和106.9％。仅7.5mg/kg BD0801影响肿瘤生长，T/C为64.7％，但无统计学意义。10mg/kg抗PD-1抗体或5mg/kg PD-L1抗体均未显著影响肿瘤生长，T/C值分别为87.8％和112.7％(图10B-10C)。而2.5mg/kg BD0801和10mg/kg抗PD-1抗体联合给药显著抑制肿瘤生长，T/C为46.8％(图10B)，2.5mg/kg BD0801和5mg/kg抗PD-L1抗体联合给药也显著抑制肿瘤生长，T/C为31.3％，和单药组相比有统计学差异(图10C，P<0.01)。

Claims (9)

1.VEGF抗体和免疫检查点抑制剂在制备治疗癌症或肿瘤的药物中的应用，其特征在于，所述癌症或肿瘤为肺癌或结直肠癌，所述VEGF抗体包含：

(1)SEQ ID NO：1所示VH结构域的HCDR1；

(2)SEQ ID NO：1所示VH结构域的HCDR2；

(3)SEQ ID NO：1所示VH结构域的HCDR3；

(4)SEQ ID NO：3所示VL结构域的LCDR1；

(5)SEQ ID NO：3所示VL结构域的LCDR2；和，

(6)SEQ ID NO：3所示VL结构域的LCDR3；

所述HCDR1-3和LCDR1-3根据Kabat、Chothia或IMGT编号系统确定；

当所述HCDR1-3和LCDR1-3根据Kabat编号系统确定时，所述HCDR1的序列如SEQ ID NO:5所示，所述HCDR2的序列如SEQ ID NO:8所示，所述HCDR3的序列如SEQ ID NO:11所示，所述LCDR1的序列如SEQ ID NO:13所示，所述LCDR2的序列如SEQ ID NO:15所示，所述LCDR3的序列如SEQ ID NO：17所示；

当所述HCDR1-3和LCDR1-3根据Chothia编号系统确定时，所述HCDR1的序列如SEQ IDNO:6所示，所述HCDR2的序列如SEQ ID NO:9所示，所述HCDR3的序列如SEQ ID NO:11所示，所述LCDR1的序列如SEQ ID NO:13所示，所述LCDR2的序列如SEQ ID NO:15所示，所述LCDR3的序列如SEQ ID NO：17所示；

当所述HCDR1-3和LCDR1-3根据IMGT编号系统确定时，所述HCDR1的序列如SEQ ID NO:7所示，所述HCDR2的序列如SEQ ID NO:10所示，所述HCDR3的序列如SEQ ID NO:12所示，所述LCDR1的序列如SEQ ID NO:14所示，所述LCDR2的序列如SEQ ID NO:16所示，所述LCDR3的序列如SEQ ID NO：17所示；

所述免疫检查点抑制剂选自PD-1抗体或PD-L1抗体。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述VEGF抗体包含与SEQ ID NO：1和SEQID NO：3所示可变区的框架区具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述VEGF抗体具有如SEQ ID NO：1和SEQID NO：3所示序列。

4.根据权利要求1～3任一项所述的应用，其特征在于，所述VEGF抗体还包含重链恒定区和/或轻链恒定区。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述重链恒定区具有如SEQ ID NO：2所示序列，所述轻链恒定区具有如SEQ ID NO：4所示序列。

6.根据权利要求1～3任一项所述的应用，其特征在于，所述VEGF抗体为全长抗体或抗体片段。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抗体片段选自Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)₂、Fv或scFv。

8.根据权利要求1～3任一项所述的应用，其特征在于，所述VEGF抗体与所述免疫检查点抑制剂包含于同一药物组合物中，或所述VEGF抗体与所述免疫检查点抑制剂形成药物组合。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述药物组合物或所述药物组合还包含其他治疗剂。

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