TW202313689A

TW202313689A - 抗pvrig/抗tigit雙特異性抗體和應用

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Publication number: TW202313689A
Application number: TW111129610A
Authority: TW
Inventors: 趙曉峰; 劉雷; 劉楊; 付雅媛; 曹卓曉; 唐任宏; 任晉生
Original assignee: 大陸商江蘇先聲藥業有限公司
Priority date: 2021-08-06
Filing date: 2022-08-05
Publication date: 2023-04-01

Abstract

本公開涉及一種能夠特異性地結合PVRIG和TIGIT的雙特異性抗體，所述雙特異性抗體能夠調節免疫細胞的功能，可作為藥物治療與免疫異常有關的疾病，例如腫瘤。

Description

抗PVRIG/抗TIGIT雙特異性抗體和應用

相關申請的交叉引用

本申請要求以下2件中國發明專利申請的權益和優先權，在此將它們的全部內容以援引的方式整體併入本文中：2021年8月6日向中國國家智慧財產權局提交的第202110903850.2號專利申請；以及2022年3月21日向中國國家智慧財產權局提交的第202210276638.2號專利申請。

本發明涉及領域領域，具體而言，涉及抗PVRIG/抗TIGIT雙特異性抗體。

免疫療法的基礎在於操控及/或調節免疫系統，包括先天免疫反應及後天免疫反應二者。免疫療法的目標為藉由控制對“外來劑”(例如病原體或腫瘤細胞)的免疫反應來治療疾病。免疫系統是由眾多細胞類型所組成的高度複雜系統，這些細胞具有控制那些交互作用及反應的複雜且細微的系統。癌症免疫監測的概念是基於免疫系統可辨識腫瘤細胞、啟動免疫反應及抑制腫瘤發展及/或進展的理論。然而，明確的是許多癌細胞已發展出逃避免疫系統的機制，其可容許不受抑制的腫瘤生長。癌/腫瘤免疫療法著重於發展可活化及/或啟動免疫系統的新型且新穎的激動和/或拮抗劑，以達成更有效的抗腫瘤反應，增強對腫瘤細胞的殺傷及/或抑制腫瘤生長。

PVRIG在NK細胞和T細胞的細胞上表達，並且與其它已知的免疫檢查點具有若干相似之處。用於展示PVRIG是免疫檢查點受體的鑒定和方法在WO2016/134333中進行了論述，所述文獻透過引用明確地併入本文。當PVRIG與其配體(PVRL2)結合時，引發抑制訊號，其起到減弱NK細胞和T細胞針對靶細胞的免疫反應(即類似於PD-1/PD-L1)的作用。阻斷PVRL2與PVRIG的結合會切斷PVRIG的這種抑制訊號，並因此調節NK細胞和T細胞的免疫反應。利用阻斷與PVRL2結合的PVRIG抗體是一種增強NK細胞和T細胞殺傷癌細胞的治療方法。已經產生了結合PVRIG並阻斷其配體PVRL2的結合的阻斷抗體。

類似地，TIGIT是另一個所關注的標靶，已經證明與其同源配體PVR的結合透過其細胞內ITIM域直接抑制NK細胞和T細胞的細胞毒性。TIGIT基因的敲除或TIGIT/PVR相互作用的阻斷抗體已展示在體外可以增強NK細胞殺傷，或者加劇體內自身免疫疾病。除了對T細胞和NK細胞的直接作用外，TIGIT還可在樹突狀細胞或腫瘤細胞中誘導PVR介導的訊號傳導，從而引起抑炎細胞因數(例如IL10)的產生增加。值得注意的是，TIGIT表達與另一種重要的共抑制受體PD-1的表達密切相關。TIGIT和PD-1在許多人類和鼠類的腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)上共表達。

TIGIT和PVRIG同屬於DNAM超家族，並被被證明在多種腫瘤浸潤淋巴細胞中共表達發揮免疫抑制作用，同時，TIGIT、PVRIG和PD-1共表達的腫瘤浸潤效應T細胞被認為是浸潤T細胞群體中最主要的一群效應T細胞。因此，能夠同時靶向PVRIG和TIGIT的雙特異性抗體具有有潛在的協同效果，是用於單一抗體療法的有吸引力的治療方式。此類雙特異性抗體將允許同時靶向兩個免疫檢查點受體同時能與現有的抗PD-1/L-1抗體療法有潛在的進一步協同效果，在癌症治療中提供新到的治療手段發揮重要作用。

鑒於雙特異性抗體潛在的協同效果，為了提高免疫抑制作用，解決免疫檢查點抑制劑應答效率不佳的問題，特提出本發明。

本發明提供抗PVRIG/抗TIGIT抗體，編碼其的核酸，抗體製備方法，含有所述抗體的藥物組合物，以及藥物組合物用於治療腫瘤的相關用途。

在第一個方面，本發明提供了一種抗PVRIG/抗TIGIT雙特異性抗體，其包含：

（a）第一抗原結合部分，其包括重鏈可變區（VH）和輕鏈可變區（VL），所述VH和VL形成抗TIGIT抗原結合域；其中，所述TIGIT VH包含SEQ ID NO：72或87任一項所述VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3；所述TIGIT VL包含SEQ ID NO：68或91任一項所述VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

（b）第二抗原結合部分，其包括特異性結合PVRIG的VHH，所述VHH包含SEQ ID NO：200或211任一項所述序列的CDR1、CDR2和CDR3。

在一些實施例中，（a）所述第一抗原結合部分的HCDR1包含SEQ ID NO：21或33任一項所述的序列；HCDR2包含SEQ ID NO：22或34任一項所述的序列；HCDR3包含SEQ ID NO：23或35任一項所述的序列；

（b）所述第一抗原結合部分的LCDR1包含SEQ ID NO：18或96任一項所述的序列；LCDR2包含SEQ ID NO：19或31任一項所述的序列；LCDR3包含SEQ ID NO：20或32任一項所述的序列；

（c）所述第二抗原結合部分的CDR1包含SEQ ID NO：168或147任一項所述的序列；CDR2包含SEQ ID NO：207或148任一項所述的序列；CDR3包含SEQ ID NO：208或149任一項所述的序列。

在一些實施例中，所述第一抗原結合部分包含以下序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3：（1）分別為SEQ ID NO：21、22、23、18、19和20；或（2）分別為SEQ ID NO：33、34、35、96、31和32；或（3）與上述（1）至（2）所示序列具有至少90%同一性或具有1、2、3或更多個胺基酸插入、缺失和/或替換的序列，優選地，所述替換為保守胺基酸的替換。

在一些實施例中，所述第二抗原結合部分包含以下序列的CDR1、CDR2和CDR3：（1）分別為SEQ ID NO：168、207和208；或（2）分別為SEQ ID NO：147、148和149；或（3）與上述（1）至（2）所示序列具有至少90%同一性或具有1、2、3或更多個胺基酸插入、缺失和/或替換的序列，優選地，所述替換為保守胺基酸的替換。

在一些實施例中，所述第一抗原結合部分的VH包含與SEQ ID NO：72或87所示胺基酸序列至少90%同一性的序列；所述第一抗原結合部分的VL包含SEQ ID NO：68或91所示胺基酸序列至少90%同一性的序列。

在一些實施例中，第二抗原結合部分包含SEQ ID NO：200或211所示胺基酸序列至少90%同一性的序列。

在一些實施例中，所述第一抗原結合部分是一種全長抗體，包括兩條重鏈和兩條輕鏈；所述第二抗原結合部分的C端融合到第一抗原結合部分的至少一條重鏈的N端。

在一些實施例中，重鏈融合多肽從N端到C端包括PVRIG VHH-(G4S)4 Linker-TIGIT VH-CH1-鉸鏈-CH2-CH3，輕鏈多肽從N端到C端包括TIGIT VL-CL。

在一些實施例中，所述重鏈融合多肽包括與SEQ ID NO：227、229、231或233所示胺基酸序列至少80%同一性的序列，輕鏈多肽包括與SEQ ID NO：226、228、230或232所示胺基酸序列至少80%同一性的序列。

在一些實施例中，所述雙特異性抗體為人源化抗體。

在一些實施例中，所述雙特異性抗體與人、猴PRVIG或TIGIT蛋白特異性結合；優選地，其與人、猴TIGIT結合的KD優於1.00E-7M，與人、猴PRVIG結合的KD優於1.00E-8M；更優選地，可同時與TIGIT和PVRIG相結合。

在另一方面，本發明提供了一種特異性結合TIGIT的抗體或抗原結合片段，其包含：（1）重鏈可變區（VH），其中所述重鏈可變區包含三個互補決定區(HCDR)：HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中，按照Kabat編號系統編號，所述HCDR1包含SEQ ID NO: 21、27、33、39所示的胺基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO: 22、28、34、40所示的胺基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO: 23、29、35、41所示的胺基酸序列；按照IMGT編號系統編號，所述HCDR1包含SEQ ID NO: 45、51、57、63所示的胺基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:46、52、58、64，所述HCDR3包含SEQ ID NO:47、53、59、65；以及，輕鏈可變區（VL），其中所述輕鏈可變區包含三個互補決定區(LCDR)：LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中，按照Kabat編號系統編號，所述LCDR1包含SEQ ID NO: 18、24、30、36、93、94、95、96所示的胺基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO: 19、25、31、37所示的胺基酸序列，所述LCDR3包含SEQ ID NO: 20、26、32、38所示的胺基酸序列；按照IMGT編號系統編號，所述LCDR1包含SEQ ID NO: 42、48、54、60所示的胺基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO: 43、49、55、61所示的胺基酸序列，所述LCDR3包含SEQ ID NO: 44、50、56、62所示的胺基酸序列。

在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段包含以下序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3：（1）分別為SEQ ID NO: 18、19、20、21、22和23；或（2）分別為SEQ ID NO: 24、25、26、27、28和29；或（3）分別為SEQ ID NO: 30、31、32、33、34和35；或（4）分別為SEQ ID NO: 36、37、38、39、40和41；或（5）分別為SEQ ID NO: 42、43、44、45、46和47；或（6）分別為SEQ ID NO: 48、49、50、51、52和53；或（7）分別為SEQ ID NO: 54、55、56、57、58和59；或（8）分別為SEQ ID NO: 60、61、62、63、64和65；或（9）分別為SEQ ID NO: 93、31、32、33、34和35；或（10）分別為SEQ ID NO: 94、31、32、33、34和35；或（11）分別為SEQ ID NO: 95、31、32、33、34和35；或（12）分別為SEQ ID NO: 96、31、32、33、34和35；或（13）與上述（1）至（12）所示序列具有至少80%同一性或具有1、2、3或更多個胺基酸插入、缺失和/或替換的序列，優選地，所述替換為保守胺基酸的替換。

在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段包含：（1）重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 10、11、12、13、69、70、71、72、81、82、83、84、85、87、101、102或103具有至少80％同一性的胺基酸序列；或/和（2）輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 14、15、16、17、66、67、68、78、79、80、86、88、89、90、91、98、99或100具有至少80％同一性的胺基酸序列。

在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段：（1）包含SEQ ID NO:10所示胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO:14所示胺基酸序列的輕鏈可變區；或（2）包含SEQ ID NO:11所示胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO:15所示胺基酸序列的輕鏈可變區；或（3）包含SEQ ID NO:12所示胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO:16所示胺基酸序列的輕鏈可變區；或（4）包含SEQ ID NO:13所示胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO:17所示胺基酸序列的輕鏈可變區；或（5）包含SEQ ID NO:69所示胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO:66、67或68所示胺基酸序列的輕鏈可變區；或（6）包含SEQ ID NO:70所示胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO:66、67或68所示胺基酸序列的輕鏈可變區；或（7）包含SEQ ID NO:71所示重鏈可變區及包含SEQ ID NO:66、67或68所示胺基酸序列的輕鏈可變區；或（8）包含SEQ ID NO:72所示胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO:66、67或68所示胺基酸序列的輕鏈可變區；或（9）包含SEQ ID NO: 81、82、83、84或85所示胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 78所示胺基酸序列的輕鏈可變區；或（10）包含SEQ ID NO: 81、82、83、84或85所示胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 79所示胺基酸序列的輕鏈可變區；或（11）包含SEQ ID NO: 81、82、83、84或85所示胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 80所示胺基酸序列的輕鏈可變區；或（12）包含SEQ ID NO: 87所示胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 86、88、89、90或91所示胺基酸序列的輕鏈可變區；或（13）包含SEQ ID NO: 101所示胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 98、99或100所示胺基酸序列的輕鏈可變區；或（14）包含SEQ ID NO: 102所示胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 98、99或100所示胺基酸序列的輕鏈可變區（15）包含SEQ ID NO: 103所示胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 98、99或100所示胺基酸序列的輕鏈可變區；或與上述（1）至（15）所示序列具有至少80%同一性或至多20個突變的序列；所述突變可選自插入、缺失和/或替換，所述替換優選為保守胺基酸的替換。

在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段包含重鏈可變區，其中，所述重鏈可變區與SEQ ID NO. 10所示VH相比至少具有選自下組的突變：按自然順序編號，S30T，G44K，W47Y，I48M，V67I或V71R；優選地，至少具有S30T和V71R突變；更優選地，至少具有S30T，G44K和V71R突變；更優選地，至少具有S30T，G44K，I48M，V67I和V71R突變；更優選地，至少具有S30T，G44K，W47Y和V71R突變；或與SEQ ID NO. 11所示VH相比至少具有選自下組的突變：按自然順序編號，T28A，R72A，T74K或A76S；優選地，至少具有T28A，R72A，T74K和A76S；或與SEQ ID NO. 12所示VH相比至少具有選自下組的突變：按自然順序編號，I29M，S30T，G44K，W47Y，I48M，V67I或V71R；優選地，至少具有S30T和V71R突變；更優選地，至少具有I29M，S30T和V71R突變；更優選地，至少具有I29M，S30T，G44K和V71R突變；更優選地，至少具有I29M，S30T，G44K，I48M，V67I和V71R突變；更優選地，至少具有I29M，S30T，G44K，W47Y和V71R；或與SEQ ID NO. 13所示VH相比至少具有選自下組的突變：按自然順序編號，R44G，R72V，T74K，S75L或A76S；優選地，至少具有R72V和T74K突變；更優選地，至少具有R72V，T74K，S75L和A76S突變；更優選地，至少具有R44G，R72V，T74K，S75L和A76S突變。

在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段包含輕鏈可變區，其中，所述輕鏈可變區與SEQ ID NO. 14所示VL相比至少具有選自下組的突變：按自然順序編號，L37Q，P43S或L47M；優選地，至少具有L47M突變；更優選地，至少具有L37Q和L47M突變；更優選地，至少具有P43S和L47M突變；或與SEQ ID NO. 15所示VL相比至少具有選自下組的突變：按自然順序編號，N31Q，N31T，N31D，G32A，Q38H或P43S；優選地，至少具有Q38H和P43S突變；更優選地，至少具有N31Q，Q38H和P43S突變；更優選地，至少具有N31T，Q38H和P43S突變；更優選地，至少具有N31D，Q38H和P43S突變；更優選地，至少具有G32A，Q38H和P43S突變；或與SEQ ID NO. 16所示VL相比至少具有選自下組的突變：按自然順序編號，L37Q，P43S或Q45K；優選地，至少具有L37Q和Q45K突變；更優選地，至少具有P43S突變；或與SEQ ID NO. 17所示VL相比至少具有選自下組的突變：按自然順序編號，A43S，P43S或I48V；優選地，至少具有A43S突變；更優選地，至少具有A43S和I48V突變；更優選地，至少具有P43S和I48V突變。

在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段與人、猴TIGIT蛋白特異性結合；優選地，其與人、猴TIGIT結合的KD優於1.00E-8M。

在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段為鼠抗體、人源化抗體、全人抗體或嵌合抗體。

在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段選自單克隆抗體、多克隆抗體、天然抗體、工程化抗體、單特異性抗體、多特異性分子（例如雙特異性抗體）、單價抗體、多價抗體、完整抗體、完整抗體的片段、裸抗體、綴合抗體、嵌合抗體、人源化抗體、全人抗體、Fab、Fab’、Fab’-SH、F（ab’）2、Fd、Fv、scFv、雙抗體（diabody）或單域抗體。

在另一方面，本發明提供了一種特異性結合PVRIG的奈米抗體或抗原結合片段，其包含SEQ ID NO. 107-119、198-204、211-216、219-225任一項所述VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3。

在一些實施例中，所述奈米抗體或抗原結合片段的所述HCDR1、HCDR2和HCDR3根據IMGT編號系統確定，例如選自表21；所述HCDR1、HCDR2和HCDR3根據Kabat編號系統確定，例如選自表22、表29。

在一些實施例中，所述奈米抗體或抗原結合片段，SEQ ID NO. 107所示VH的HCDR1~3按照IMGT或Kabat編號系統，具有如SEQ ID NO：120~122或SEQ ID NO：159~161所示的序列；

SEQ ID NO. 108所示VH的HCDR1~3按照IMGT或Kabat編號系統，具有如SEQ ID NO：123~125或SEQ ID NO：162~164所示的序列；

SEQ ID NO. 109所示VH的HCDR1~3按照IMGT或Kabat編號系統，具有如SEQ ID NO：126~128或SEQ ID NO：165~167所示的序列；

SEQ ID NO. 110所示VH的HCDR1~3按照IMGT或Kabat編號系統，具有如SEQ ID NO：129~131或SEQ ID NO：168~170所示的序列；

SEQ ID NO. 111所示VH的HCDR1~3按照IMGT或Kabat編號系統，具有如SEQ ID NO：132~134、SEQ ID NO：171~173所示的序列；

SEQ ID NO. 112所示VH的HCDR1~3按照IMGT或Kabat編號系統，具有如SEQ ID NO：135~137或SEQ ID NO：174~176所示的序列；

SEQ ID NO. 113所示VH的HCDR1~3按照IMGT或Kabat編號系統，具有如SEQ ID NO：138~140或SEQ ID NO：177~179所示的序列；

SEQ ID NO. 114所示VH的HCDR1~3按照IMGT或Kabat編號系統，具有如SEQ ID NO：141~143或SEQ ID NO：180~182所示的序列；

SEQ ID NO. 115所示VH的HCDR1~3按照IMGT或Kabat編號系統，具有如SEQ ID NO：144~146或SEQ ID NO：183~185所示的序列；

SEQ ID NO. 116所示VH的HCDR1~3按照IMGT或Kabat編號系統，具有如SEQ ID NO：147~149或SEQ ID NO：186~188所示的序列；

SEQ ID NO. 117所示VH的HCDR1~3按照IMGT或Kabat編號系統，具有如SEQ ID NO：150~152或SEQ ID NO：189~191所示的序列；

SEQ ID NO. 118所示VH的HCDR1~3按照IMGT或Kabat編號系統，具有如SEQ ID NO：153~155或SEQ ID NO：192~194所示的序列；

SEQ ID NO. 119所示VH的HCDR1~3按照IMGT或Kabat編號系統，具有如SEQ ID NO：156~158或SEQ ID NO：195~197所示的序列；

SEQ ID NO. 198所示VH的HCDR1~3按照Kabat編號系統，具有如SEQ ID NO：168~170所示的序列；

SEQ ID NO. 199所示VH的HCDR1~3按照Kabat編號系統，具有如SEQ ID NO：168、207和170所示的序列；

SEQ ID NO. 200所示VH的HCDR1~3按照Kabat編號系統，具有如SEQ ID NO：168、207和208所示的序列；

SEQ ID NO. 201所示VH的HCDR1~3按照Kabat編號系統，具有如SEQ ID NO：168、207和209所示的序列；

SEQ ID NO. 202所示VH的HCDR1~3按照Kabat編號系統，具有如SEQ ID NO：168、169和208所示的序列；

SEQ ID NO.203、204所示VH的HCDR1~3按照Kabat編號系統，具有如SEQ ID NO：168、210和208所示的序列；

SEQ ID NO. 211~215所示VH的HCDR1~3按照IMGT編號系統，具有如SEQ ID NO：147~149所示的序列；

SEQ ID NO. 216所示VH的HCDR1~3按照IMGT編號系統，具有如SEQ ID NO：147、148和218所示的序列；

SEQ ID NO. 219-225所示VH的HCDR1~3按照IMGT編號系統，具有如SEQ ID NO：156~158所示的序列。

在一些實施例中，所述奈米抗體或抗原結合片段包含與所述HCDR1、HCDR2和HCDR3相比具有至少80%同一性或具有1、2、3或更多個胺基酸插入、缺失和/或替換的CDRs序列，優選地，所述替換為保守胺基酸的替換。

在一些實施例中，所述奈米抗體或抗原結合片段包含SEQ ID NO. 107-119、198-204、211-216、219-225任一項所示的VH，或者與SEQ ID NO. 107-119、198-204、211-216、219-225任一項所示VH具有至少80%同一性或至多20個突變的序列；所述突變可選自插入、缺失和/或替換，所述替換優選為保守胺基酸的替換。

在一些實施例中，所述奈米抗體或抗原結合片段包含與SEQ ID NO. 110所示VH相比至少具有選自下組的突變序列：按自然順序編號，A97V、K98E、N54D、N108S、S110A、G55A或S75T；更優選地，至少具有A97V和K98E突變；更優選地，至少具有A97V、K98E和N54D突變；更優選地，至少具有A97V、K98E、N54D和N108S突變；更優選地，至少具有A97V、K98E、N54D和S110A突變；更優選地，至少具有A97V、K98E和N108S突變；更優選地，至少具有A97V、K98E、G55A和N108S突變；更優選地，至少具有S75T、A97V、K98E、G55A和N108S突變；

或包含與SEQ ID NO：116所示VH相比，至少具有選自下組的突變序列：按自然順序編號，S35T、V37F、G44E、L45R、W47F、N50T、L79V、V61S、D62H、T122I或M123Q；更優選地，至少具有V37F、G44E、L45R、W47F和N50T突變；更優選地，至少具有S35T、V37F、G44E、L45R、W47F和N50T突變；更優選地，至少具有S35T、V37F、G44E、L45R、W47F、N50T和L79V突變；更優選地，至少具有S35T、V37F、G44E、L45R、W47F、N50T、V61S和D62H突變；更優選地，至少具有S35T、V37F、G44E、L45R、W47F、N50T、T122I和M123Q突變；

或包含與SEQ ID NO：119所示VH相比，至少具有選自下組的突變序列：按自然順序編號，S35G、V37Y、G44D、L45R、W47L、N50T、Y58K、Y59I、D72G、N73D、Y79S、L78V或Y94F；更優選地，至少具有S35G、V37Y、G44D、L45R、W47L和N50T突變；更優選地，至少具有S35G、V37Y、G44D、L45R、W47L、N50T和Y58K突變；更優選地，至少具有S35G、V37Y、G44D、L45R、W47L、N50T、Y58K、D72G和N73D突變；更優選地，至少具有S35G、V37Y、G44D、L45R、W47L、N50T、Y58K、D72G、N73D和Y79S突變；更優選地，至少具有S35G、V37Y、G44D、L45R、W47L、N50T、Y58K、D72G、N73D和L78V突變；更優選地，至少具有S35G、V37Y、G44D、L45R、W47L、N50T、Y58K、Y59I、D72G和N73D突變；更優選地，至少具有S35G、V37Y、G44D、L45R、W47L、N50T、Y58K、D72G、N73D和Y94F突變。

在一些實施例中，所述奈米抗體或抗原結合片段為：（1）嵌合奈米抗體或其片段；（2）人源化奈米抗體或其片段；或（3）全人奈米抗體或其片段。

在一些實施例中，所述奈米抗體或抗原結合片段包含或不包含抗體重鏈恆定區；可選的，所述抗體重鏈恆定區可選自人、羊駝、小鼠、大鼠、兔或羊；可選地，所述抗體重鏈恆定區可選自IgG、IgM、IgA、IgE或IgD，所述IgG可選自IgG1，IgG2，IgG3或IgG4；可選地，所述重鏈恆定區可選自Fc區、CH3區或完整重鏈恆定區，優選地，所述重鏈恆定區為人Fc區；優選地，所述奈米抗體或抗原結合片段為重鏈抗體。

在另一方面，本發明所述抗PVRIG/抗TIGIT雙特異性抗體，所述特異性結合TIGIT的抗體或抗原結合片段，所述特異性結合PVRIG的奈米抗體或抗原結合片段還偶聯有治療劑或示蹤劑；優選地，所述治療劑選自藥物、毒素、放射性同位素、化療藥或免疫調節劑，所述示蹤劑選自放射學造影劑、順磁離子、金屬、螢光標記、化學發光標記、超聲造影劑和光敏劑。

在另一方面，本發明提供了一種多特異性分子，其包含所述抗PVRIG/抗TIGIT雙特異性抗體，所述特異性結合TIGIT的抗體或抗原結合片段；或所述特異性結合PVRIG的奈米抗體或抗原結合片段；優選地，所述多特異性分子可為雙特異性、三特異性或四特異性，更優選地，所述多特異性分子可為二價、四價或六價。

在一些實施例中，所述多特異性分子為串聯scFv、雙功能抗體(Db)、單鏈雙功能抗體(scDb)、雙重親和力再靶向(DART)抗體、F(ab ')2、雙重可變域(DVD)抗體、臼包杵(KiH)抗體、對接及鎖定(DNL)抗體、化學交聯抗體、雜多聚奈米抗體或異結合物抗體。

在另一方面，本發明提供了一種嵌合抗原受體（CAR），其至少包含細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和胞內訊號傳導結構域，所述細胞外抗原結合結構域包含所述特異性結合TIGIT的抗體或抗原結合片段；或包含所述特異性結合PVRIG的奈米抗體或抗原結合片段。

在另一方面，本發明提供了一種免疫效應細胞，其表達所述嵌合抗原受體，或包含編碼所述嵌合抗原受體的核酸片段；優選地，所述免疫效應細胞選自T細胞、NK細胞（natural killer cell）、NKT細胞（natural killer T cell）、DNT細胞（double negative T cell）、單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞或肥大細胞，所述T細胞優選自細胞毒性T細胞、調節性T細胞或輔助性T細胞；優選地，所述免疫效應細胞為自體免疫效應細胞或同種異體免疫效應細胞。

在另一方面，本發明提供了一種分離的核酸片段，其編碼上述任一種雙特異性抗體，上述任一種特異性結合TIGIT的抗體或抗原結合片段；上述任一種特異性結合PVRIG的奈米抗體或抗原結合片段，上述任一種多特異性分子，或上述任一種嵌合抗原受體。

在另一方面，本發明提供了一種載體（vector），其包含上述核酸片段。

在另一方面，本發明提供了一種宿主細胞，其包含上述載體；優選地，所述細胞為原核細胞或真核細胞，例如細菌（大腸桿菌）、真菌（酵母）、昆蟲細胞或哺乳動物細胞（CHO細胞系或293T細胞系）。

在另一方面，本發明提供了一種製備上述任一種雙特異性抗體的方法，上述任一種特異性結合TIGIT的抗體或抗原結合片段；上述任一種特異性結合PVRIG的奈米抗體或抗原結合片段，或上述任一種多特異性分子，其包括培養上述宿主細胞，以及分離所述細胞表達的抗體或分子。

在另一方面，本發明提供了一種製備所述免疫效應細胞的方法，其包括將編碼上述任一種CAR的核酸片段導入所述免疫效應細胞，可選地，更包括啟動所述免疫效應細胞表達上述任一種CAR。

在另一方面，本發明提供了一種藥物組合物，其包含上述任一種雙特異性抗體，上述任一種特異性結合TIGIT的抗體或抗原結合片段；上述任一種特異性結合PVRIG的奈米抗體或抗原結合片段，上述任一種多特異性分子，上述免疫效應細胞，核酸片段，載體，宿主細胞，或所述方法製備獲得的產品，和藥學上可接受的載體。

在一些實施例中，所述藥物組合物進一步包含另外的治療劑；優選地，所述另外的治療劑是抗腫瘤劑；更優選地，所述抗腫瘤劑是PD-1軸結合拮抗劑。

在另一方面，還提供了本發明公開的上述任一種雙特異性抗體，上述任一種特異性結合TIGIT的抗體或抗原結合片段；上述任一種特異性結合PVRIG的奈米抗體或抗原結合片段，上述任一種多特異性分子，上述免疫效應細胞，核酸片段，載體，宿主細胞，所述方法製備獲得的產品，或藥物組合物在製備用於治療癌症或感染性疾病的藥物中的用途；其中所述癌症選自實體腫瘤和血液腫瘤，優選地，所述腫瘤選自白血病，多發性骨髓瘤，淋巴瘤，骨髓增生異常綜合征，前列腺癌，肝癌，結直腸癌，肛門癌、卵巢癌，子宮內膜癌，宮頸癌，腹腔癌、乳腺癌，胰腺癌，胃癌，頭頸癌，甲狀腺癌，睾丸癌，泌尿道上皮癌，肺癌，黑色素瘤，非黑素瘤皮膚癌，神經膠質瘤，腎癌，間皮瘤，食道癌，非小細胞肺癌，小細胞肺癌，膀胱癌，肉瘤，成膠質細胞瘤，胸腺癌，蕈樣肉芽腫，默克爾細胞癌，高MSI癌和KRAS突變型腫瘤。

在一些實施例中，所述藥物與另外的治療劑或與手術組合使用；其中所述另外的治療劑或所述手術選自放射療法、化學療法、溶瘤藥物、細胞毒性劑、細胞因數、外科手術、免疫刺激性抗體、免疫調節藥物、共刺激分子的啟動劑、抑制性分子的抑制劑、疫苗或細胞免疫療法。

在一些實施例中，所述另外的治療劑在所述藥物之前或之後施用，或與所述藥物並行施用。

在一些實施例中，所述藥物與PD-1軸結合拮抗劑組合使用。

在一些實施例中，所述PD-1軸結合拮抗劑選自由PD-1結合拮抗劑，PD-L1結合拮抗劑，和PD-L2結合拮抗劑組成的組；優選地，所述PD-1結合拮抗劑是抗PD-1抗體；更優選地，所述PD-1結合拮抗劑選自由MDX 1106(nivolumab)，MK-3475(pembrolizumab)，CT-011(pidilizumab)，MEDI-0680(AMP-514)，PDR001，REGN2810，和BGB-108組成的組；優選地，所述PD-L1結合拮抗劑是抗PD-L1抗體；更優選地，所述PD-L1結合拮抗劑選自由MPDL3280A(atezolizumab)，YW243.55.S70，MDX-1105，MEDI4736(durvalumab)，Tecentriq和MSB0010718C(avelumab)組成的組；優選地，所述PD-L2結合拮抗劑是抗PD-L2抗體；更優選地，所述PD-L2結合拮抗劑是免疫黏附素。

在另一方面，本發明還提供了一種治療癌症或感染性疾病的方法，包含向有此需要的患者施用有效量的上述任一種雙特異性抗體，上述任一種特異性結合TIGIT的抗體或抗原結合片段；上述任一種特異性結合PVRIG的奈米抗體或抗原結合片段，上述任一種多特異性分子，上述免疫效應細胞，核酸片段，載體，宿主細胞，所述方法製備獲得的產品，或藥物組合物；其中所述癌症選自實體腫瘤和血液腫瘤，優選地，所述腫瘤選自白血病，多發性骨髓瘤，淋巴瘤，骨髓增生異常綜合征，前列腺癌，肝癌，結直腸癌，肛門癌、卵巢癌，子宮內膜癌，宮頸癌，腹腔癌、乳腺癌，胰腺癌，胃癌，頭頸癌，甲狀腺癌，睾丸癌，泌尿道上皮癌，肺癌，黑色素瘤，非黑素瘤皮膚癌，神經膠質瘤，腎癌，間皮瘤，食道癌，非小細胞肺癌，小細胞肺癌，膀胱癌，肉瘤，成膠質細胞瘤，胸腺癌，蕈樣肉芽腫，默克爾細胞癌，高MSI癌和KRAS突變型腫瘤。

在一些實施例中，所述方法更包括向有此需要的患者施用有效量的PD-1軸結合拮抗劑，其中，所述PD-1軸結合拮抗劑選自由PD-1結合拮抗劑，PD-L1結合拮抗劑，和PD-L2結合拮抗劑組成的組；優選地，所述PD-1結合拮抗劑是抗PD-1抗體；更優選地，所述PD-1結合拮抗劑選自由MDX 1106(nivolumab)，MK-3475(pembrolizumab)，CT-011(pidilizumab)，MEDI-0680(AMP-514)，PDR001，REGN2810，和BGB-108組成的組；優選地，所述PD-L1結合拮抗劑是抗PD-L1抗體；更優選地，所述PD-L1結合拮抗劑選自由MPDL3280A(atezolizumab)，YW243.55.S70，MDX-1105，MEDI4736(durvalumab)，Tecentriq和MSB0010718C(avelumab)組成的組；優選地，所述PD-L2結合拮抗劑是抗PD-L2抗體；更優選地，所述PD-L2結合拮抗劑是免疫黏附素。

在另一方面，本發明還提供了上述任一種雙特異性抗體，上述任一種特異性結合TIGIT的抗體或抗原結合片段；上述任一種特異性結合PVRIG的奈米抗體或抗原結合片段，上述任一種多特異性分子，上述免疫效應細胞，核酸片段，載體，宿主細胞，所述方法製備獲得的產品，或藥物組合物，用於預治療癌症或感染性疾病；其中所述癌症選自實體腫瘤和血液腫瘤，優選地，所述腫瘤選自白血病，多發性骨髓瘤，淋巴瘤，骨髓增生異常綜合征，前列腺癌，肝癌，結直腸癌，肛門癌、卵巢癌，子宮內膜癌，宮頸癌，腹腔癌、乳腺癌，胰腺癌，胃癌，頭頸癌，甲狀腺癌，睾丸癌，泌尿道上皮癌，肺癌，黑色素瘤，非黑素瘤皮膚癌，神經膠質瘤，腎癌，間皮瘤，食道癌，非小細胞肺癌，小細胞肺癌，膀胱癌，肉瘤，成膠質細胞瘤，胸腺癌，蕈樣肉芽腫，默克爾細胞癌，高MSI癌和KRAS突變型腫瘤。

本發明的抗PVRIGxTIGIT人源化雙特異性抗體可特異性靶向腫瘤細胞，有效介導對腫瘤細胞系的殺傷作用，在取得優異的腫瘤抑制效果的同時，具備良好的安全性。

術語定義和說明

除非本發明另外定義，與本發明相關的科學和技術術語應具有所屬技術領域具有通常知識者所理解的含義。

此外，除非本文另有說明，本文單數形式的術語應包括複數形式，複數形式的術語應包括單數形式。更具體地，如在本說明書和所附申請專利範圍中所使用的，除非另外明確指出，否則單數形式“一種”和“這種”包括複數指示物。

本文術語“包括”、“包含”和“具有”之間可互換使用，旨在表示方案的包含性，意味著所述方案可存在除所列出的元素之外的其他元素。同時應當理解，在本文中使用“包括”、“包含”和“具有”描述，也提供“由……組成”方案。示例性地，“一種組合物，包括A和B”，應當理解為以下技術方案：由A和B組成的組合物，以及除A和B外，還含有其他組分的組合物，均落入前述“一種組合物”的範圍內。

術語“和/或”在本文使用時，包括“和”、“或”和“由所屬術語連結的要素的全部或任何其他組合”的含義。

術語“具有Ig和ITIM域的T細胞免疫受體”、“TIGIT”、“TIGIT抗原”、“Vstm3”和“WUCAM”可互換使用，並且包括各種哺乳動物同種型，例如人Tigit、人Tigit的直系同源物、和包含Tigit內的至少一個表位的類似物，以及具有至少一個與TIGIT共有的表位的類似物。TIGIT(例如人TIGIT)的胺基酸序列、以及編碼其的核苷酸序列是本領域已知的。

本文術語“PVRIG”或“PVRIG蛋白質”可以任選地包括任何這類蛋白質或其變異體、結合物或片段，包括(但不限於)如本文所述的已知或野生型PVRIG，以及任何天然產生的剪接變異體、胺基酸變異體或同工型，並且尤其是PVRIG的ECD片段。結合到PVRIG並且防止被PVRL2活化(例如，最常透過阻斷PVRIG和PVLR2的相互作用)的“抗PVRIG抗體”(包括抗原結合片段)用於增強T細胞和/或NK細胞活化並且用於治療疾病，如癌症和病原體感染。

本文術語“抗PVRIG/抗TIGIT抗體”和“雙特異性PVRIG/TIGIT抗體”和“抗PVRIG/抗TIGIT雙特異性抗體”可互換地使用，本發明的抗PVRIG/抗TIGIT雙特異性抗體特異性地結合於人類TIGIT，並且優選是人類TIGIT的ECD，以及PVRIG，並且再優選是人類PVRIG的ECD。

本文術語“特異性結合”是指抗原結合分子（例如抗體）通常以高親和力特異性結合抗原和實質上相同的抗原，但不以高親和力結合不相關抗原。親和力通常以平衡解離常數（equilibrium dissociation constant，KD）來反應，其中較低KD表示較高親和力。以抗體為例，高親和力通常指具有約1×10-7 M或更低、約1×10-8 M或更低、約1×10-9M或更低、約1×10-10M或更低、1×10-11M或更低或1×10-12M或更低的KD。KD計算方式如下：KD = Kd/Ka，其中Kd表示解離速率，Ka表示結合速率。可採用本領域周知的方法測量平衡解離常數KD，如表面等離子共振（例如Biacore）或平衡透析法測定。

本文術語“抗原結合分子”按最廣義使用，是指特異性結合抗原的分子。示例性地，抗原結合分子包括但不限於抗體或抗體模擬物。“抗體模擬物”是指能夠與抗原特異性結合，但與抗體結構無關的有機化合物或結合域，示例性地，抗體模擬物包括但不限於affibody、affitin、affilin、經設計的錨蛋白重複蛋白(DARPin)、核酸適體或Kunitz型結構域肽。

本文術語“抗體”按最廣義使用，是指包含來自免疫球蛋白重鏈可變區的足夠序列和/或來自免疫球蛋白輕鏈可變區的足夠序列，從而能夠特異性結合至抗原的多肽或多肽組合。本文“抗體”涵蓋各種形式和各種結構，只要它們展現出期望的抗原結合活性。本文“抗體”包括具有移植的互補決定區(CDR)或CDR衍生物的替代蛋白質支架或人工支架。此類支架包括抗體衍生的支架(其包含引入以例如穩定化抗體三維結構的突變)以及包含例如生物相容性聚合物的全合成支架。參見，例如Korndorfer et al.,2003,Proteins:Structure,Function,and Bioinformatics,53(1):121-129(2003)；Roque et al.,Biotechnol.Prog.20:639-654(2004)。此類支架還可以包括非抗體衍生的支架，例如本領域已知可用於移植CDR的支架蛋白，包括但不限於肌腱蛋白、纖連蛋白、肽適體等。

本文“抗體”包括一種典型的“四鏈抗體”，其屬於由兩條重鏈（HC）和兩條輕鏈（LC）組成的免疫球蛋白；重鏈是指這樣的多肽鏈，其在N端到C端的方向上由重鏈可變區(VH)、重鏈恆定區CH1結構域、鉸鏈區(HR)、重鏈恆定區CH2結構域、重鏈恆定區CH3結構域組成；並且，當所述全長抗體為IgE同種型時，任選地更包括重鏈恆定區CH4結構域；輕鏈是在N端到C端方向上由輕鏈可變區(VL)和輕鏈恆定區(CL)組成的多肽鏈；重鏈與重鏈之間、重鏈與輕鏈之間透過二硫鍵連接，形成“Y”字型結構。由於免疫球蛋白重鏈恆定區的胺基酸組成和排列順序不同，故其抗原性也不同。據此，可將本文“免疫球蛋白”分為五類，或稱為免疫球蛋白的同種型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相應的重鏈分別為μ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈和ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別，又可分為不同的亞類，如IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，IgA可分為IgA1和IgA2。輕鏈透過恆定區的不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。

本文“抗體”更包括不包含輕鏈的抗體，例如，由單峰駝(Camelus dromedarius)、雙峰駝(Camelus bactrianus)、大羊駝(Lama glama)、原駝(Lama guanicoe)和羊駝(Vicugna pacos)等駱駝科動物產生的重鏈抗體（heavy-chain antibodies, HCAbs）以及在鯊等軟骨魚綱中發現的免疫球蛋白新抗原受體（Ig new antigen receptor, IgNAR）。

如本文所用，術語“重鏈抗體”是指缺乏常規抗體的輕鏈的抗體。該術語具體包括但不限於在不存在CH1結構域的情況下包含VH抗原結合結構域以及CH2和CH3恆定結構域的同型二聚體抗體。

如本文所用，術語“奈米抗體”是指駱駝體內存在天然的缺失輕鏈的重鏈抗體，克隆其可變區可以得到只有重鏈可變區組成的單域抗體，也稱為VHH(Variable domain of heavy chain of heavy chain antibody)，它是最小的功能性抗原結合片段。

本文術語“奈米抗體(nanobody)”、“單域抗體”(single domain antibody, sdAb)具有相同的含義並可互換使用，是指克隆重鏈抗體的可變區，構建僅由一個重鏈可變區組成的單域抗體，它是具有完整功能的最小的抗原結合片段。通常先獲得天然缺失輕鏈和重鏈恆定區1(CH1)的重鏈抗體後，再克隆抗體重鏈的可變區，構建僅由一個重鏈可變區組成的單域抗體。

關於“重鏈抗體”和“奈米抗體”的進一步描述可參見：Hamers-Casterman等，Nature.1993；363；446-8；Muyldermans的綜述文章(Reviews inMolecular Biotechnology 74：277-302，2001)；以及以下專利申請，其被作為一般背景技術提及：WO 94/04678，WO 95/04079和WO 96/34103；WO94/25591，WO 99/37681，WO 00/40968，WO 00/43507，WO 00/65057，WO 01/40310，WO 01/44301，EP 1134231和WO 02/48193；WO97/49805，WO 01/21817，WO 03/035694，WO 03/054016和WO 03/055527；WO 03/050531；WO 01/90190；WO03/025020；以及WO 04/041867，WO 04/041862，WO 04/041865，WO 04/041863，WO 04/062551，WO 05/044858，WO 06/40153，WO 06/079372，WO 06/122786，WO 06/122787和WO 06/122825以及這些申請中提到的其他現有技術。

本文“抗體”可以來源於任何動物，包括但不限於人和非人動物，所述非人動物可選自靈長類動物、哺乳動物、齧齒動物和脊椎動物，例如駱駝科動物、大羊駝、原鴕、羊駝、羊、兔、小鼠、大鼠或軟骨魚綱（例如鯊）。

本文“抗體”包括但不限於單克隆抗體、多克隆抗體、單特異性抗體、多特異性抗體（例如雙特異性抗體）、單價抗體、多價抗體、完整抗體、完整抗體的片段、裸抗體、綴合抗體、嵌合抗體、人源化抗體或全人抗體。

本文術語“單克隆抗體”是指從基本上同質的抗體群體獲得的抗體，即，除了可能的變異體(例如含有天然存在的突變或在製劑的生產過程中產生，此類變體通常以少量存在)之外，包含所述群體的各個抗體是相同的和/或結合相同的表位。與通常包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體製劑相反，單克隆抗體製劑中的每種單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。本文修飾語“單克隆”不應解釋為需要透過任何特定方法產生所述抗體或抗原結合分子。舉例來說，單克隆抗體可透過多種技術制得，包括(但不限於)雜交瘤技術、重組DNA方法、噬菌體庫展示技術和利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的轉殖基因動物的方法和其它本領域已知的方法。

本文術語“單特異性”是指表示具有一個或多個結合位點，其中每個結合位點結合相同抗原的相同表位。

本文術語“多特異性”是指具有至少兩個抗原結合位點，所述至少兩個抗原結合位點中的每一個抗原結合位點與相同抗原的不同表位或與不同抗原的不同表位結合。因此，諸如“雙特異性”、“三特異性”、“四特異性”等術語是指抗體/抗原結合分子可以結合的不同表位元的數目。

本文術語“價”表示抗體/抗原結合分子中規定數目的結合位元點的存在。因此,術語“單價”、“二價”、“四價”和“六價”分別表示抗體/抗原結合分子中一個結合位點、兩個結合位點、四個結合位點和六個結合位點的存在。

本文“全長抗體”、“完好抗體”和“完整抗體”在本文中可互換使用，是指具有基本上與天然抗體結構相似的結構。

本文“抗原結合片段”和“抗體片段”在本文中可互換使用，其不具備完整抗體的全部結構，僅包含完整抗體的局部或局部的變體，所述局部或局部的變體具備結合抗原的能力。本文“抗原結合片段”或“抗體片段”包括但不限於Fab、Fab’、Fab’-SH、F（ab’）2、Fd、Fv、scFv、雙抗體（diabody）和單域抗體。

完整抗體的木瓜蛋白酶消化生成兩個同一的抗原結合片段，稱作“Fab”片段，每個含有重和輕鏈可變域，還有輕鏈的恆定域和重鏈的第一恆定域(CH1)。如此,本文術語“Fab片段”指包含輕鏈的VL域和恆定域(CL)的輕鏈片段,和重鏈的VH域和第一恆定域(CH1)的抗體片段。Fab'片段因在重鏈CH1域的羧基末端增加少數殘基而與Fab片段不同,包括來自抗體鉸鏈區的一個或多個半胱氨酸。Fab’-SH是其中恆定域的半胱氨酸殘基攜帶游離硫醇基團的Fab’片段。胃蛋白酶處理產生具有兩個抗原結合位點(兩個Fab片段)和Fc區的一部分的F(ab’)2片段。

本文術語“Fd”是指由VH和CH1結構域組成的抗體。本文術語“Fv”是指由單臂VL和VH結構域組成的抗體片段。Fv片段通常被認為是，能形成完整的抗原結合位點的最小抗體片段。一般認為，六個CDR賦予抗體的抗原結合特異性。然而，即便是一個可變區(例如Fd片段，其僅僅含有三個對抗原特異的CDR)也能夠識別並結合抗原，儘管其親和力可能低於完整的結合位點。

本文術語“scFv”（single-chain variable fragment）是指包含VL和VH結構域的單個多肽鏈，其中所述VL和VH透過接頭(linker)相連(參見，例如,Bird等人,Science 242:423-426(1988)；Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988)；和Pluckthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Roseburg和Moore編，Springer-Verlag，紐約，第269-315頁(1994))。此類scFv分子可具有一般結構：NH2-VL-接頭-VH-COOH或NH2-VH-接頭-VL-COOH。合適的現有技術接頭由重複的GGGGS胺基酸序列或其變體組成。例如，可使用具有胺基酸序列(GGGGS)4的接頭，但也可使用其變體(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448)。可用於本發明的其他接頭由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8:725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immunol.31:94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56:3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293:41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。在一些情況下，scFv的VH與VL之間還可以存在二硫鍵，形成二硫鍵連接的Fv（dsFv）。

本文術語“雙抗體（diabody）”，其VH和VL結構域在單個多肽鏈上表達，但使用太短的連接體以致不允許在相同鏈的兩個結構域之間配對，從而迫使結構域與另一條鏈的互補結構域配對並且產生兩個抗原結合部位(參見，例如,Holliger P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)，和Poljak R.J.等人,Structure 2:1121-1123(1994))。

本文術語“裸抗體”是指不與治療劑或示蹤劑綴合的抗體；術語“綴合抗體”是指與治療劑或示蹤劑綴合的抗體，優選地，所述治療劑選自藥物、毒素、放射性同位素、化療藥或免疫調節劑，所述示蹤劑選自放射學造影劑、順磁離子、金屬、螢光標記、化學發光標記、超聲造影劑和光敏劑。

本文術語“嵌合抗體(Chimeric antibody)”是指，這樣的抗體，其輕鏈或/和重鏈的一部分源自一個抗體(其可以源自某一特定物種或屬於某一特定抗體類或亞類)，且輕鏈或/和重鏈的另一部分源自另一個抗體(其可以源自相同或不同的物種或屬於相同或不同的抗體類或亞類)，但無論如何，其仍保留對目標抗原的結合活性(U.S.P 4,816,567 to Cabilly et al.；Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851 6855(1984))。例如，術語“嵌合抗體”可包括這樣的抗體(例如人鼠嵌合抗體)，其中抗體的重鏈和輕鏈可變區來自第一抗體(例如鼠源抗體)，而抗體的重鏈和輕鏈恆定區來自第二抗體(例如人抗體)。

本文術語“人源化抗體”是指，經基因工程改造的非人源抗體，其胺基酸序列經修飾以提高與人源抗體的序列的同源性。通常而言，人源化抗體的全部或部分CDR區來自於非人源抗體(供體抗體)，全部或部分的非CDR區(例如，可變區FR和/或恆定區)來自於人源免疫球蛋白(受體抗體)。人源化抗體通常保留或部分保留了供體抗體的預期性質，包括但不限於，抗原特異性、親和性、反應性、提高免疫細胞活性的能力、增強免疫應答的能力等。

本文術語“全人抗體”是指具有其中FR和CDR二者都源自人種系免疫球蛋白序列的可變區的抗體。此外，如果抗體包含恆定區，則恆定區也源自人種系免疫球蛋白序列。本文全人抗體可以包括不由人種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基(例如，透過體外隨機或位點特異性誘變或透過體內體細胞突變引入的突變)。然而，本文“全人抗體”不包括其中來源於另一個哺乳動物物種(例如小鼠)的種系的CDR序列已被移植到人框架序列上的抗體。

本文術語“可變區”是指抗體重鏈或輕鏈中牽涉使抗體結合抗原的區域，“重鏈可變區”與“VH”、“HCVR”可互換使用，“輕鏈可變區”與“VL”、“LCVR”可互換使用。天然抗體的重鏈和輕鏈的可變域(分別是VH和VL)一般具有相似的結構,每個域包含四個保守的框架區(FR)和三個高變區(HVR)。參見例如Kindt et al.,Kuby Immunology,6th ed.,W.H.Freeman and Co.,p.91(2007)。單個VH或VL域可足以賦予抗原結合特異性。本文術語“互補決定區”與“CDR”可互換使用，通常指重鏈可變區（VH）或輕鏈可變區（VL）的高變區（HVR），該部位因在空間結構上可與抗原表位形成精密的互補，故又稱為互補決定區，其中，重鏈可變區CDR可縮寫為HCDR，輕鏈可變區CDR可縮寫為LCDR。本術語“構架區”或“FR區”可互換，是指抗體重鏈可變區或輕鏈可變區中除CDR以外的那些胺基酸殘基。通常典型的抗體可變區由4個FR區和3個CDR區按以下順序組成：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。

對於CDR的進一步描述，參考Kabat等人, J. Biol. Chem.,252:6609-6616 (1977)；Kabat等人, 美國衛生與公共服務部，“Sequences of proteins of immunological interest ”（1991）; Chothia等人,J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Al-Lazikani B.等人, J.Mol. Biol., 273: 927-948 (1997); MacCallum 等人, J. Mol.Biol. 262:732-745 (1996); Abhinandan和Martin, Mol. Immunol., 45: 3832-3839 (2008); Lefranc M.P.等人, Dev. Comp.Immunol., 27: 55-77 (2003); 以及Honegger和Plückthun, J. Mol. Biol., 309:657-670 (2001)。本文“CDR”可由本領域公知的方式加以標注和定義，包括但不限於Kabat編號系統、Chothia編號系統或IMGT編號系統，使用的工具網站包括但不限於AbRSA網站（http://cao.labshare.cn/AbRSA/cdrs.php）、abYsis網站（www.abysis.org/abysis/sequence_input/key_annotation/key_annotation.cgi）和IMGT網站（http://www.imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/DomainGapAlign.cgi#results）。本文CDR包括不同定義方式的胺基酸殘基的重疊（overlap）和子集。

本文術語“Kabat編號系統”通常是指由Elvin A.Kabat提出的免疫球蛋白比對及編號系統(參見，例如Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)。

本文術語“IMGT編號系統”通常是指基於由Lefranc等人發起的國際免疫遺傳學資訊系統(The international ImMunoGeneTics information system(IMGT))的編號系統，可參閱Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003。

本文術語“重鏈恆定區”是指抗體重鏈的羧基端部分，其不直接參與抗體與抗原的結合，但是表現出效應子功能，諸如與Fc受體的相互作用，其相對於抗體的可變結構域具有更保守的胺基酸序列。“重鏈恆定區”至少包含：CH1結構域，鉸鏈區，CH2結構域，CH3結構域，或其變體或片段。“重鏈恆定區”包括“全長重鏈恆定區”和“重鏈恆定區片段”，前者具有基本上與天然抗體恆定區基本相似的結構，而後者僅包括“全長重鏈恆定區的一部分”。示例性地，典型的“全長抗體重鏈恆定區”由CH1結構域-鉸鏈區-CH2結構域-CH3結構域組成；當抗體為IgE時，其更包括CH4結構域；當抗體為重鏈抗體時，則其不包括CH1結構域。示例性地，典型的“重鏈恆定區片段”可選自CH1、Fc或CH3結構域。

本文術語“輕鏈恆定區”是指抗體輕鏈的羧基端部分，其不直接參與抗體與抗原的結合，所述輕鏈恆定區可選自恆定κ結構域或恆定λ結構域。

本文術語“Fc”是指完整抗體經木瓜蛋白酶水解而成的抗體羧基端部分，典型地，其包含抗體的CH3和CH2結構域。Fc區包括例如天然序列Fc區、重組Fc區和變體Fc區。儘管免疫球蛋白重鏈的Fc區的邊界可以略微變化，但是人IgG重鏈的Fc區通常被定義為從Cys226位置的胺基酸殘基或從Pro230延伸至其羧基末端。Fc區的C末端賴氨酸(根據Kabat編號系統的殘基447)可以例如在抗體的產生或純化過程中，或透過對編碼抗體重鏈的核酸重組工程化而除去，因此，Fc區可包括或不包括Lys447。

本文術語“保守胺基酸”通常是指屬於同一類或具有類似特徵（例如電荷、側鏈大小、疏水性、親水性、主鏈構象和剛性）的胺基酸。示例性地，下述每組內的胺基酸屬於彼此的保守胺基酸殘基，組內胺基酸殘基的替換屬於保守胺基酸的替換：

示例性地，以下六組是被認為是互為保守性置換的胺基酸的實例： 1)丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)； 2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)； 3)天冬醯胺(N)、穀氨醯胺(Q)； 4)精氨酸(R)、賴氨酸(K)、組氨酸（H）； 5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V)；和 6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。

本文術語“同一性”可透過以下方式計算獲得：為確定兩個胺基酸序列或兩個核酸序列的“同一性”百分數，將所述序列出於最佳比較目的比對(例如，可以為最佳比對而在第一和第二胺基酸序列或核酸序列之一或二者中引入空位或可以為比較目的而拋棄非同源序列)。隨後比較在對應胺基酸位置或核苷酸位置處的胺基酸殘基或核苷酸。當第一序列中的位置由第二序列中對應位置處的相同胺基酸殘基或核苷酸佔據時，則所述分子在這個位置處是相同的。

考慮到為最佳比對這兩個序列而需要引入的空位的數目和每個空位的長度，兩個序列之間的同一性百分數隨所述序列共有的相同位置變化而變化。

可以利用數學演算法實現兩個序列間的序列比較和同一性百分數的計算。例如，使用已經集成至GCG套裝軟體的GAP程式中的Needlema和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48:444-453)演算法(在www.gcg.com可獲得)，使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣和空位權重16、14、12、10、8、6或4和長度權重1、2、3、4、5或6，確定兩個胺基酸序列之間的同一性百分數。又例如，使用GCG套裝軟體中的GAP程式(在www.gcg.com可獲得)，使用NWSgapdna.CMP矩陣和空位權重40、50、60、70或80和長度權重1、2、3、4、5或6，確定兩個核苷酸序列之間的同一性百分數。特別優選的參數集合(和除非另外說明否則應當使用的一個參數集合)是採用空位罰分12、空位延伸罰分4和移碼空位罰分5的Blossum62評分矩陣。

還可以使用PAM120加權餘數表、空位長度罰分12，空位罰分4，利用已經併入ALIGN程式(2.0版)的E.Meyers和W.Miller演算法,((1989)CABIOS,4:11-17)確定兩個胺基酸序列或核苷酸序列之間的同一性百分數。

額外地或備選地，可以進一步使用本發明所述的核酸序列和蛋白質序列作為“查詢序列”以針對公共資料庫執行檢索，以例如鑒定其他家族成員序列或相關序列。例如，可以使用Altschul等人,(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的NBLAST及XBLAST程式(版本2.0)執行此類檢索。BLAST核苷酸檢索可以用NBLAST程式，評分=100、字長度=12執行，以獲得與本發明核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白質檢索可以用XBLAST程式、評分=50、字長度=3執行，以獲得與本發明蛋白質分子同源的胺基酸序列。為了出於比較目的獲得帶空位的比對結果，可以如Altschul等人,(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402中所述那樣使用空位BLAST。當使用BLAST和空位BLAST程式時，可以使用相應程式(例如，XBLAST和NBLAST)的默認參數。參見www.ncbi.nlm.nih.gov。

本文術語“嵌合抗原受體（CAR）”是指經改造以在免疫效應細胞上表達並且特異性結合抗原的人工細胞表面受體，其包含至少(1)細胞外抗原結合結構域，例如抗體的可變重鏈或輕鏈，(2)錨定CAR進入免疫效應細胞的跨膜結構域，和(3)胞內訊號傳導結構域。CAR能夠利用細胞外抗原結合結構域以非MHC限制性的方式將T細胞和其它免疫效應細胞重定向至所選擇的靶標，例如癌細胞。

本文術語“免疫刺激性抗體”包括：1)靶向抑制性免疫檢查點的拮抗性抗體包括抗CTLA4mAb(如伊匹單抗、曲美單抗)、抗PD-1(如納武單抗BMS-936558/MDX-1106/ONO-4538、CT-011、lambrozilumab MK-3475、MEDI-0680(AMP-514)，PDR001，REGN2810，、BGB-108)、抗PDL-1拮抗劑(如BMS-936559/MDX-1105、MEDI4736、RG-7446/MPDL3280A、MSB0010718C、YW243.55.S70)；抗LAG-3(如IMP-321)、抗TIM-3、抗BTLA、抗B7-H4、抗B7-H3、抗VISTA。2)增強免疫刺激性蛋白的激動性抗體包括抗CD40mAb(如CP-870,893、魯卡木單抗、達西珠單抗)、抗CD137mAb(如BMS-663513烏瑞魯單抗、PF-05082566)、抗OX40mAb(如抗OX40)、抗GITR mAb(如TRX518)、抗CD27mAb(如CDX-1127)以及抗ICOS mAb。“免疫刺激性抗體”可透過直接調節免疫功能，即阻斷其它抑制性靶標或增強免疫刺激性蛋白質，促進抗腫瘤免疫。

本文術語“免疫調節藥物”可以為，如胸腺素α1。原理：胸腺素α1(Tα1)是天然產生的胸腺肽，充當先天性和適應性免疫系統的內源性調節因數。它在世界範圍內用於治療與免疫功能障礙相關的疾病，包括病毒感染，如B型和C型肝炎、某些癌症，並且用於疫苗增強。尤其，免疫調節研究的最新進展指出了Ta1處理在膿毒性患者中的有利作用(Wu等人《危急護理》2013，17：R8)。

本文術語“核酸”包括包含核苷酸的聚合物的任何化合物和/或物質。每個核苷酸由堿基，特別是嘌呤或嘧啶堿基(即胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))、糖(即去氧核糖或核糖)和磷酸基團組成。通常，核酸分子由堿基的序列描述，由此所述堿基代表核酸分子的一級結構(線性結構)。堿基的序列通常表示為5′至3′。在本文中，術語核酸分子涵蓋去氧核糖核酸(DNA)，包括例如互補DNA(cDNA)和基因組DNA、核糖核酸(RNA)，特別是信使RNA(mRNA)、DNA或RNA的合成形式，以及包含兩種或更多種這些分子的混合的聚合物。核酸分子可以是線性的或環狀的。此外，術語核酸分子包括有義鏈和反義鏈二者，以及單鏈和雙鏈形式。而且，本文所述的核酸分子可含有天然存在的或非天然存在的核苷酸。非天然存在的核苷酸的例子包括具有衍生的糖或磷酸骨架鍵合或化學修飾的殘基的修飾的核苷酸堿基。核酸分子還涵蓋DNA和RNA分子，其適合作為載體用於在體外和/或體內，例如在宿主或患者中，直接表達本發明的抗體。此類DNA(例如cDNA)或RNA(例如mRNA)載體可以是未修飾的或修飾的。例如，可以對mRNA進行化學修飾以增強RNA載體的穩定性和/或被編碼分子的表達，從而可以將mRNA注入到受試者內以在體內產生抗體(參見例如Stadler等人，Nature Medicine 2017，published online 2017年6月12日，doi：10.1038/nm.4356或EP 2 101 823 B1)。本文“分離的”核酸指已經與其天然環境的組分分開的核酸分子。分離的核酸包括在下述細胞中含有的核酸分子，所述細胞通常含有該核酸分子，但該核酸分子存在於染色體外或存在於不同於其天然染色體位置的染色體位置處。

本文術語“載體”是指能夠擴增與其連接的另一個核酸的核酸分子。該術語包括作為自我複製型核酸結構的載體以及整合入已引入該載體的宿主細胞的基因組中的載體。某些載體能夠指導與它們可操作連接的核酸的表達。這樣的載體在本文中稱為“表達載體”。

本文術語“宿主細胞”是指細胞中引入外源核酸的細胞，包括這種細胞的後代。宿主細胞包括“轉化體”和“經轉化的細胞”，其包括原代的經轉化的細胞和來源於其的後代，而不考慮傳代的次數。後代在核酸內容物上可能與親本細胞不完全相同，而是可以包含突變。本文中包括具有與在初始轉化的細胞中篩選或選擇的相同功能或生物學活性的突變體後代。

本文術語“藥物組合物”是指這樣的製劑，其以允許包含在其中的活性成分的生物學活性有效的形式存在，並且不含有對施用所述藥物組合物的受試者具有不可接受的毒性的另外的成分。

本文術語“治療”是指外科手術或藥物處理（surgical or therapeutic treatment），其目的是預防、減緩（減少）治療物件中不希望的生理變化或病變，如癌症的進展。有益的或所希望的臨床結果包括但不限於症狀的減輕、疾病程度減弱、疾病狀態穩定（即，未惡化）、疾病進展的延遲或減慢、疾病狀態的改善或緩和、以及緩解（無論是部分緩解或完全緩解），無論是可檢測的或不可檢測的。需要治療的物件包括已患有病症或疾病的物件以及易於患上病症或疾病的物件或打算預防病症或疾病的對象。當提到減緩、減輕、減弱、緩和、緩解等術語時，其含義也包括消除、消失、不發生等情況。

本文術語“受試者”是指接受對如本發明所述的特定疾病或病症的治療的生物體。物件和患者的實例包括接受疾病或病症治療的哺乳動物，如人、靈長類動物（例如，猴）或非靈長類哺乳動物。

本文術語“有效量”指單獨給予或與另一治療劑組合給予細胞、組織或物件時能有效防止或緩解疾病病症或該疾病進展的治療劑用量。“有效量”還指足以緩解症狀，例如治療、治癒、防止或緩解相關醫學病症，或治療、治癒、防止或緩解這些病症的速度增加的化合物用量。當將活性成分單獨給予個體時，治療有效劑量單指該成分。當應用某一組合時，治療有效劑量指產生治療作用的活性成分的組合用量，而無論是組合、連續或同時給予。

本文術語“癌症”指向或描述哺乳動物中典型地以不受調節的細胞生長為特徵的生理狀況。此定義中包括良性和惡性癌症。本文術語“腫瘤”或“瘤”是指所有贅生性(neoplastic)細胞生長和增殖,無論是惡性的還是良性的,及所有癌前(pre-cancerous)和癌性細胞和組織。術語“癌症”和“腫瘤”在本文中提到時並不互相排斥。

本文術語“EC50”是指半最大有效濃度，其包括在指定暴露時間之後誘導基線與最大值之間的半途回應的抗體濃度。EC50本質上代表其中觀察到起最大作用的50％的抗體濃度，可透過本領域已知方法測量。

本文術語“G4S連接肽”是指甘氨酸（G）和絲氨酸（S）的GS組合，用於將多個蛋白連接在一起形成融合蛋白。常用的GS組合是（GGGGS）n，透過改變n的大小來改變接頭序列的長度。同時，甘氨酸和絲氨酸還可以透過其他組合產生不同的接頭序列，比如在本發明中使用的(G4S)4 Linker，GS組合為GGGGS。

下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。實施例中未注明具體條件者，按照常規條件或製造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以透過市售購買獲得的常規產品。

本發明實施例僅是範例性的，並不對本發明的範圍構成任何限制。所屬技術領域具有通常知識者應該理解的是，在不偏離本發明的精神和範圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護範圍內。

實施例 1TIGIT抗原的製備

以人TIGIT蛋白（NCBI 序號：XP_024309156.1) 、食蟹猴TIGIT蛋白 (NCBI：XP_015300911.1)作為本公開TIGIT的範本，設計本公開涉及的抗原及檢測用蛋白的胺基酸序列，可選的在TIGIT蛋白基礎上融合不同的標籤，分別克隆到PTT5載體上（Invitrogen），在293細胞瞬轉表達或CHO細胞穩定表達純化，獲得編碼本公開抗原及檢測用蛋白。

人TIGIT胞外區與小鼠IgG2a Fc段的融合蛋白：人TIGIT ECD-mFc，用於檢測。

MEFGLSWLFLVAILKGVQCMMTGTIETTGNISAEKGGSIILQCHLSSTTAQVTQVNWEQQDQLLAICNADLGWHISPSFKDRVAPGPGLGLTLQSLTVNDTGEYFCIYHTYPDGTYTGRIFLEVLESSVAEHGARFQIP EPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK*(SEQ ID NO: 1) 注釋：劃橫線部分為訊號肽，斜體部分為mFc。

人TIGIT胞外區與人IgG1 Fc段的融合蛋白：人TIGIT ECD-hFc，用於檢測。

MEFGLSWLFLVAILKGVQCMMTGTIETTGNISAEKGGSIILQCHLSSTTAQVTQVNWEQQDQLLAICNADLGWHISPSFKDRVAPGPGLGLTLQSLTVNDTGEYFCIYHTYPDGTYTGRIFLEVLESSVAEHGARFQIP EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*(SEQ ID NO: 2) 注釋：劃橫線部分為訊號肽，斜體部分為Fc。

人TIGIT胞外區與His標籤的融合蛋白：人TIGIT ECD-his，用於檢測。

MEFGLSWLFLVAILKGVQCMMTGTIETTGNISAEKGGSIILQCHLSSTTAQVTQVNWEQQDQLLAICNADLGWHISPSFKDRVAPGPGLGLTLQSLTVNDTGEYFCIYHTYPDGTYTGRIFLEVLESSVAEHGARFQIP HHHHHH*(SEQ ID NO: 3) 注釋：劃橫線部分為訊號肽，斜體部分為His標籤。

食蟹猴TIGIT胞外區與小鼠IgG2a Fc 段的融合蛋白：食蟹猴TIGIT ECD-mFc，用於檢測。

MEFGLSWLFLVAILKGVQCMMTGTIETTGNISAKKGGSVILQCHLSSTMAQVTQVNWEQHDHSLLAIRNAELGWHIYPAFKDRVAPGPGLGLTLQSLTMNDTGEYFCTYHTYPDGTYRGRIFLEVLESSVAEHSARFQIP EPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK* (SEQ ID NO: 4) 注釋：劃橫線部分為訊號肽，斜體部分為mFc。

食蟹猴TIGIT胞外區與人IgG1 Fc段的融合蛋白：食蟹猴TIGIT ECD-hFc，用於檢測。

MEFGLSWLFLVAILKGVQCMMTGTIETTGNISAKKGGSVILQCHLSSTMAQVTQVNWEQHDHSLLAIRNAELGWHIYPAFKDRVAPGPGLGLTLQSLTMNDTGEYFCTYHTYPDGTYRGRIFLEVLESSVAEHSARFQIP EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK* (SEQ ID NO: 5) 注釋：劃橫線部分為訊號肽，斜體部分為hFc。

實施例2 CHO-K1工程細胞株的構建

編碼人TIGIT全長胺基酸序列 (NCBI：XP_024309156.1)，食蟹猴TIGIT全長胺基酸序列 (NCBI：XP_015300911.1)，人CD155全長胺基酸序列(NCBI：NP_006496.4)，人CD112全長胺基酸序列(NCBI：NP_001036189.1)的核苷酸序列被克隆到pcDNA3.1載體（購自Clontech）並製備質粒。對CHO-K1細胞系(購自ATCC)進行質粒轉染(Lipofectamine® 3000 Transfection Kit，購自Invitrogen，貨號：L3000-015)後，在含10 µg/ml puromycin的含10%(w/w)胎牛血清的DMEM/F12培養基中選擇性培養2周後鋪單克隆細胞到96孔板，並置於37℃，5%（v/v）CO2培養，大約2周後選擇部分單克隆孔進行擴增。對擴增後的克隆經流式細胞分析法進行篩選。選擇長勢較好、螢光強度較高、單克隆的細胞系繼續擴大培養並液氮凍存。

全長人TIGIT (NCBI：XP_024309156.1)：用於構建人TIGIT過表達細胞株CHO-K1人TIGIT，透過FACS檢測，挑選出高表達株1D2，中表達株2D10和低表達株1C6（圖25）

MRWCLLLIWAQGLRQAPLASGMMTGTIETTGNISAEKGGSIILQCHLSSTTAQVTQVNWEQQDQLLAICNADLGWHISPSFKDRVAPGPGLGLTLQSLTVNDTGEYFCIYHTYPDGTYTGRIFLEVLESSVAEHGARFQIP LLGAMAATLVVICTAVIVVVA LTRKKKALRIHSVEGDLRRKSAGQEEWSPSAPSPPGSCVQAEAAPAGLCGEQRGEDCAELHDYFNVLSYRSLGNCSFFTETG*(SEQ ID NO: 6) 注釋：訊號肽（單底線）+胞外區+跨膜區（雙底線）+胞內區(斜體部分）

全長食蟹猴TIGIT ( NCBI 序號：XP_015300911.1)：用於構建食蟹猴TIGIT過表達細胞株CHO-K1食蟹猴TIGIT

MRWCLFLIWAQGLRQAPLASGMMTGTIETTGNISAKKGGSVILQCHLSSTMAQVTQVNWEQHDHSLLAIRNAELGWHIYPAFKDRVAPGPGLGLTLQSLTMNDTGEYFCTYHTYPDGTYRGRIFLEVLESSVAEHSARFQIP LLGAMAMMLVVICIAVIVVVV LARKKKSLRIHSVESGLQRKSTGQEEQIPSAPSPPGSCVQAEAAPAGLCGEQQGDDCAELHDYFNVLSYRSLGSCSFFTETG*(SEQ ID NO: 7) 注釋：訊號肽（單底線）+胞外區+跨膜區（雙底線）+胞內區(斜體部分）

全長人CD155 ( NCBI 序號：NP_006496.4)：用於構建人CD155過表達細胞株CHO-K1 CD155.

MARAMAAAWPLLLVALLVLSWPPPGTGDVVVQAPTQVPGFLGDSVTLPCYLQVPNMEVTHVSQLTWARHGESGSMAVFHQTQGPSYSESKRLEFVAARLGAELRNASLRMFGLRVEDEGNYTCLFVTFPQGSRSVDIWLRVLAKPQNTAEVQKVQLTGEPVPMARCVSTGGRPPAQITWHSDLGGMPNTSQVPGFLSGTVTVTSLWILVPSSQVDGKNVTCKVEHESFEKPQLLTVNLTVYYPPEVSISGYDNNWYLGQNEATLTCDARSNPEPTGYNWSTTMGPLPPFAVAQGAQLLIRPVDKPINTTLICNVTNALGARQAELTVQVKEGPPSEHSGISRN AIIFLVLGILVFLILLGIGIYFYW SKCSREVLWHCHLCPSSTEHASASANGHVSYSAVSRENSSSQDPQTEGTR*(SEQ ID NO: 8) 注釋：訊號肽（單底線）+胞外區+跨膜區（雙底線）+胞內區(斜體部分）

全長人CD112 ( NCBI 序號：NP_001036189.1/NCBI Ref Seq: Q92692)：用於構建CD112過表達細胞株CHO-K1 CD112

MARAAALLPSRSPPTPLLWPLLLLLLLETGAQDVRVQVLPEVRGQLGGTVELPCHLLPPVPGLYISLVTWQRPDAPANHQNVAAFHPKMGPSFPSPKPGSERLSFVSAKQSTGQDTEAELQDATLALHGLTVEDEGNYTCEFATFPKGSVRGMTWLRVIAKPKNQAEAQKVTFSQDPTTVALCISKEGRPPARISWLSSLDWEAKETQVSGTLAGTVTVTSRFTLVPSGRADGVTVTCKVEHESFEEPALIPVTLSVRYPPEVSISGYDDNWYLGRTDATLSCDVRSNPEPTGYDWSTTSGTFPTSAVAQGSQLVIHAVDSLFNTTFVCTVTNAVGMGRAEQVIFVRETPNTAGAGATGG IIGGIIAAIIATAVAATGILI CRQQRKEQTLQGAEEDEDLEGPPSYKPPTPKAKLEAQEMPSQLFTLGASEHSPLKTPYFDAGASCTEQEMPRYHELPTLEERSGPLHPGATSLGSPIPVPPGPPAVEDVSLDLEDEEGEEEEEYLDKINPIYDALSYSSPSDSYQGKGFVMSRAMYV*(SEQ ID NO: 9) 注釋：訊號肽（單底線）+胞外區+跨膜區（雙底線）+胞內區(斜體部分）

實施例3 抗人TIGIT鼠源單克隆抗體的生成

抗人TIGIT抗體透過雜交瘤技術得到，用人TIGIT-ECD-mFc融合蛋白免疫小鼠，分離免疫小鼠脾細胞，透過電融合的方式與小鼠骨髓瘤細胞進行細胞融合，HAT選擇培養基培養，取培養上清進行鑒定，挑選分泌目的抗體的克隆進行亞克隆，最終經生產純化獲得鼠源單克隆抗體。詳細描述如下：

A. 動物免疫

實驗用SJL白小鼠，雌性，6 ~ 8周齡（上海斯萊克實驗動物有限責任公司，動物生產許可證號：SCXK (滬)2017-0005)。飼養環境：SPF級。小鼠購進後，在實驗動物房（和元生物技術（上海）股份有限公司），實驗室環境適應性飼養1周，12/12小時光/暗週期調節，溫度20-25 °C；濕度40-60 %。將已適應環境的小鼠按以下方案免疫。

免疫抗原帶mFc標籤的人TIGIT-ECD (Acro Cat No. TIT-H5253）。免疫方案：用TiterMax® Gold Adjuvant (Sigma Cat No. T2684)與Thermo mject® Alum (Thermo Cat No. 77161)佐劑交叉免疫。抗原與佐劑(TiterMax® Gold Adjuvant)比例為1:1，抗原與佐劑（Thermo Imject® Alum) 比例為2:1，50 µg /只/次(首次免疫)，25 µg /只/次（加強免疫）。抗原乳化後進行接種，時間為第1、8、15、22、29、36、43、50。第1天腹腔注射（I.P.）50 µg/只的乳化後抗原。第8天皮下多點注射（S.C.，一般背部和腹股溝4點）25 µg /只。腹腔注射和皮下注射隔周交叉進行，第20，27，34，48天取血，用ELISA方法確定小鼠血清的抗體Titer。在第6 ~ 8次免疫以後，選擇血清中抗體Titer高的小鼠的脾臟和淋巴結細胞進行融合，在融合前3天進行衝擊免疫，腹腔內(I.P.)注射50 µg/只的生理鹽水配製的抗原溶液。

B. 細胞融合

採用優化的電融合（BTX ECM2001+）步驟將脾和淋巴結細胞與骨髓瘤細胞SP2/0細胞(ATCC® CRL-1581)進行融合得到雜交瘤細胞。融合後的雜交瘤細胞以5×105 /ml的密度用完全培養基含20% FBS（Excell Cat No. FND500），1× ΗΑΤ(Sigma Cat No. H0262-10VL，1×NEAA的DMEM(Gibco Cat No. 10569044)培養基重懸，100 µL/孔接種於96孔平底板中，37 °C，5 %CO2孵育6-7天後，去除上清，加入200 µ1每孔的含有ΗΤ完全培養基含10%FBS，l× HT(Sigma Cat No. H0137-10VL)，1×NEAA的DMEM培養基，37 °C，5 %CO2培養過夜後，進行ELISA檢測。

C. 雜交瘤細胞的篩選

融合7~10天後，取雜交瘤細胞上清液，透過ELISA方法檢測與人TIGIT ECD-hFc（內部生產）的結合活性，挑選出陽性克隆；第二天檢測陽性克隆上清液與CHO-K1人TIGIT（內部構建）的結合活性、與CHO-K1食蟹猴TIGIT（內部構建）的結合活性、以及阻斷人TIGIT ECD-hFc與CHO-K1 CD155（內部構建）結合的效應，挑選目標克隆進行亞克隆。

亞克隆細胞培養7~10天後，透過ELISA方法篩選，挑選目標雜交瘤單克隆細胞擴大培養至24孔，2~3天後，檢測培養上清與人TIGIT ECD-hFc的結合活性、與CHO-K1人TIGIT（內部構建）的結合活性、與CHO-K1食蟹猴TIGIT（內部構建）的結合活性、與食蟹猴TIGIT ECD-hFc（內部生產）的結合活性、阻斷Bio-CD155-His（義翹神州，10109-H08H）與CHO-K1人TIGIT（內部構建）相互作用的效應、以及阻斷人TIGIT ECD-hFc與CHO-K1 CD155（內部構建）相互作用的效應，選擇目標克隆進行生產並純化獲得116株單克隆抗體。

D. 鼠源單克隆抗體的鑒定

對以上獲得的116株單克隆抗體透過ELISA、FACS、BIAcore等進行鑒定，獲得13株候選抗體，分別是TIGIT-F2-002、TIGIT-F2-005、TIGIT-F2-006、TIGIT-F2-011、TIGIT-F3-034、TIGIT-F4-044、TIGIT-F5-057、TIGIT-F5-067、TIGIT-F5-070、TIGIT-F5-072、TIGIT-F6-084、TIGIT-F6-088、TIGIT-F6-104。

（a）抗TIGIT鼠源單克隆抗體與人TIGIT ECD-hFc和食蟹猴TIGIT ECD-hFc的結合活性檢測

用PBS pH7.4 （Hyclone，CAT#SH30256）稀釋羊抗人IgG抗體(Jackson，CAT:109-006-098)至4 µg/mL, 加入酶標板（corning, CAT#9018），50 µL/孔，4℃過夜，甩掉包被液，加入5%脫脂奶粉（生工生物，CAT#A600669-0250）-PBS，250 µL/孔，37℃孵育2~4小時，在洗板機（Biotek, CAT#405TUS）上用0.05% Tween20-PBS（生工生物，CAT# A100777-0500，B548117-0500）洗三次，加入人TIGIT ECD-hFc（內部構建，工作濃度30ng/mL）和食蟹猴TIGIT ECD-hFc（內部構建，工作濃度30ng/mL），50 µL/孔，4℃孵育過夜，在洗板機上用0.05%Tween20-PBS洗三次，加入純化鼠源單克隆抗體（1%BSA稀釋至13nM，經3倍連續梯度稀釋12個濃度點），50 µL/孔，37℃孵育1.5~2小時，在洗板機上用0.05%Tween20-PBS洗三次，以1:5000稀釋比用1%BSA(生工生物，CAT# A500023-0100)-PBS稀釋HRP酶標抗體（Jackson, CAT#115-035-003），加入酶標板中，50 µL/孔，37℃孵育1小時，在洗板機上用0.05%Tween20-PBS洗三次，加入TMB顯色液（KPL, CAT# 52-00-03）, 50 µL/孔，室溫孵育7~10分鐘，加入1M HCL，50 µL/孔，終止反應，酶標儀(Biotek, Powerwave HT)讀取OD450nm。實驗結果表明，和對照抗TIGIT抗體羅氏RG6058相比，抗TIGIT鼠源單克隆抗體能有效結合人TIGIT ECD-hFc和食蟹猴TIGIT ECD-hFc。

RG6058對應的胺基酸序列如下所示：

RG6058 VH SEQ ID NO 234: EVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGKTYYRFKWYSDYAVSVKGRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVFYCTRESTTYDLLAGPFDYWGQGTLVTVSS

RG6058 VL SEQ ID NO 235: DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQTVLYSSNNKKYLAWYQQKPGQPPNLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSTPFTFGPGTKVEIK

（b）ELISA方法檢測抗TIGIT鼠源單克隆抗體與CHO-K1 人TIGIT和CHO-K1食蟹猴TIGIT的結合活性

收集細胞，用10%FBS-DMEM/F12培養基（Excell, CAT#FSP500; Gibco, CAT# 11330）調整濃度至5×105/mL，加入96孔細胞培養板（corning, CAT#3599），100 µL/孔，37℃ 5%CO2培養過夜，甩掉培養上清，加入細胞固定液（碧雲天，CAT#P0098），50 µL/孔，室溫固定1小時，在洗板機上用0.05%Tween20-PBS洗一次，加入5%脫脂奶粉-PBS，250 µL/孔，37℃孵育2~4小時，在洗板機上用0.05%Tween20-PBS洗三次，加入純化鼠源單克隆抗體稀釋液用1%BSA稀釋至13nM，經3倍連續梯度稀釋12個濃度點，50 µL/孔，37℃孵育1.5~2小時，在洗板機上用0.05%Tween20-PBS洗三次，以1:5000稀釋比用1%BSA(生工生物，CAT# A500023-0100)-PBS稀釋HRP酶標抗體（Jackson, CAT#115-035-003），加入細胞板中，50 µL/孔，37℃孵育1小時，在洗板機上用0.05%Tween20-PBS洗三次，加入TMB顯色液（KPL, CAT# 52-00-03），50 µL/孔，37℃孵育10分鐘，加入1M HCL，50 µL/孔，終止反應，酶標儀(Biotek, Powerwave HT)讀取OD450nm。實驗結果表明和對照抗TIGIT抗體羅氏RG6058相比，純化鼠源抗TIGIT單克隆抗體可以有效結合CHO-K1人TIGIT高表達細胞株， CHO-K1人TIGIT中表達細胞株，CHO-K1人TIGIT低表達細胞株及CHO-K1-食蟹猴TIGIT細胞株。

（c） FACS方法檢測抗TIGIT鼠源單克隆抗體阻斷Bio-CD155-His與CHO-K1 人TIGIT的相互作用

收集細胞，PBS（Hyclone，CAT#SH30256）洗一次，1%BSA-PBS重懸至2×105/40 µL，1%BSA-PBS稀釋抗體至210nM，3倍連續梯度稀釋12個濃度點，1%BSA-PBS稀釋Bio-CD155-His（義翹神州，10109-H08H）至3 µg/mL，隨後將40 µL細胞與40 µL抗體稀釋液以及40 µL Bio-CD155-His稀釋液混合，4℃孵育60分鐘，PBS洗兩次，加入APC標記的鏈黴親和素（工作稀釋度1:1700，Biolegend，405243），100 µL/孔重懸細胞，4℃孵育40分鐘，PBS洗兩次，用1%BSA-PBS，100 µL/孔重懸，在流式細胞儀（BD, Canto Ⅱ）上分析細胞樣品。實驗結果表明，純化的鼠源單克隆抗體與對照抗體RG6058都可以有效阻斷Bio-CD155-His蛋白與CHO-K1-人TIGIT高表達細胞株的結合。

（d） ELISA方法檢測抗TIGIT鼠源單克隆抗體抑制人TIGIT與CHO-K1 CD155的相互作用

收集CHO-K1 CD155細胞，用10%FBS-DMEM/F12培養基（Excell, CAT#FSP500; Gibco, CAT# 11330）調整濃度至5×105/mL，加入96孔細胞培養板（corning, CAT#3599）, 100 µL/孔，37℃ 5%CO2培養過夜，甩掉培養上清，加入細胞固定液（碧雲天，CAT#P0098），50 µL/孔，室溫固定1小時，在洗板機上用0.05%Tween20-PBS洗一次，加入5%脫脂奶粉-PBS，250 µL/孔，37℃孵育2~4小時，在洗板機上用0.05%Tween20-PBS洗三次；將鼠源單克隆抗體與人TIGIT ECD-hFc（工作濃度30ng/mL）混合孵育半小時；隨後將抗原抗體混合液加入細胞板中，50 µL/孔，37℃孵育1.5~2小時，在洗板機上用0.05%Tween20-PBS洗三次，以1:5000稀釋比用1%BSA(生工生物，CAT# A500023-0100)-PBS稀釋HRP酶標抗體（Merck，CAT#AP113P），加入細胞板中，50 µL/孔，37℃孵育1小時，在洗板機上用0.05%Tween20-PBS洗三次，加入TMB顯色液（KPL, CAT# 52-00-03）, 50 µL/孔，37℃孵育10分鐘，加入1M HCL，50 µL/孔，終止反應，酶標儀(Biotek, Powerwave HT)讀取OD450nm。實驗結果表明，純化的鼠源單克隆抗體與對照抗體RG6058都可以有效阻斷人TIGIT蛋白與CHO-K1-CD155細胞的結合。

下表1顯示，13株抗體都展現了良好的TIGIT結合能力、以及阻斷TIGIT與CD155相互作用的效應，且達到或超過抗TIGIT對照抗體羅氏RG6058。

表1 TIGIT鼠源單克隆抗體的鑒定

TIGIT單抗	人TIGIT ECD-His	人TIGIT ECD-hFc/CHO-K1 CD155阻斷實驗	Bio-CD155-His/CHO-K1 人TIGIT阻斷實驗	CHO-K1 人TIGIT（高表達株）	CHO-K1 人TIGIT（中表達株）	CHO-K1 人TIGIT（低表達株）	人TIGIT ECD-hFc結合實驗	CHO-K1 食蟹猴TIGIT結合實驗	食蟹猴TIGIT ECD-hFc結合實驗
ka (1/Ms)	kd (1/s)	KD (M)	IC50 (nM)	IC50 (nM)	EC50 (nM)	EC50 (nM)	EC50 (nM)	EC50 (nM)	EC50 (nM)	EC50 (nM)
TIGIT-F2-002	1.70E+06	8.08E-05	4.76E-11	0.1411	0.2038	0.3124	0.3162	0.2733	0.0171	0.1095	0.0170
TIGIT-F2-005	1.34E+06	4.47E-05	3.33E-11	0.1328	0.1738	0.3883	0.3860	0.2310	0.0150	0.0778	0.0147
TIGIT-F2-006	8.00E+05	3.32E-05	4.14E-11	0.1497	0.2150	0.4796	0.5396	0.3202	0.0208	0.0616	0.0327
TIGIT-F2-011	6.29E+05	2.44E-05	3.88E-11	0.1685	0.3111	0.6472	0.7398	0.4434	0.0215	0.1252	0.0381
TIGIT-F3-034	1.98E+06	3.66E-04	1.85E-10	0.1610	0.1790	0.4876	0.4113	0.1788	0.0189	0.0620	0.0252
TIGIT-F4-044	1.17E+06	1.17E-03	9.97E-10	0.1582	0.2126	0.5412	0.4834	0.2793	0.0180	0.0913	0.0771
TIGIT-F5-057	1.13E+06	1.04E-03	9.21E-10	0.1281	0.2369	0.5338	0.4975	0.2937	0.0128	0.0698	0.0375
TIGIT-F5-067	1.41E+06	1.23E-04	8.74E-11	0.1518	0.2252	0.4189	0.3866	0.2318	0.0130	0.2971	0.0836
TIGIT-F5-070	7.55E+05	1.17E-04	1.55E-10	0.1363	0.3395	0.6127	0.6636	0.3750	0.0039	0.0274	0.0043
TIGIT-F5-072	1.33E+06	6.54E-04	4.92E-10	0.1255	0.2034	0.3662	0.3471	0.1944	0.0050	0.0330	0.0134
TIGIT-F6-084	7.37E+05	9.06E-05	1.23E-10	0.1343	0.3130	0.6227	0.6107	0.4540	0.0059	0.0328	0.0057
TIGIT-F6-088	5.40E+05	1.53E-04	2.83E-10	0.2197	0.4289	0.9256	0.6327	0.5585	0.0188	0.0927	0.0183
TIGIT-F6-104	7.80E+05	1.01E-04	1.29E-10	0.1860	0.2943	0.9268	0.7281	0.4038	0.0204	0.0909	0.0170
RG6058-mIgG2a	6.69E+05	1.41E-04	2.11E-10	0.2116	0.4493	1.0500	0.9838	0.6718	0.0108	0.0791	0.0152

實施例 4抗人TIGIT嵌合抗體的鑒定

上述鼠源抗體經構建人-鼠嵌合抗體鑒定確認了4株嵌合抗體：TIGIT-CHI-002、TIGIT-CHI-005、TIGIT-CHI-006和TIGIT-CHI-070。表2示出嵌合抗體的VH/VL序列，表3示出嵌合抗體的KABAT分析結果，表4示出嵌合抗體的IMGT分析結果。

表2 TIGIT嵌合抗體VH/VL序列

VH
抗體編號	序列編號	sequence
TIGIT-CHI-002	SEQ ID NO:10	EVQLQESGPGLAKPSQTLSLACSVTGYSITSDSWNWIRKFPGNKLEYMGYISYSGNTYYNPSLKSRISITRDTSKNQFYLQLNSVTTEDTATYYCARLDFSNYGGAVDYWGQGTSVTVSS
TIGIT-CHI-005	SEQ ID NO:11	QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYAFTNYLIEWVKQRPGQGLEWIGVINPGSGGTNYKEKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARGEYFFFDYWGQGTTLTVSS
TIGIT-CHI-006	SEQ ID NO:12	EVQLQESGPGLAKPSQTPSLTCSVTGYSMTSDYWNWIRKFPGNKLEYMGYISYSGRTYYNPSLKSRISITRDTSKNQFYLQLNSVTTEDTATYYCARGDYSNYGGAMYDWGQGTSVTVSS
TIGIT-CHI-070	SEQ ID NO:13	QVQLQQPGTELVKPGASVKLSCRASGYTFTNYYMHWVKQRPGRGLEWIGRIDPDSGGSKYNEKFKSKATLTVDKLSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREGHYGFYSDYWGQGTTLTVSS
VL
TIGIT-CHI-002	SEQ ID NO:14	DIVMTQSHTFMSTSVGDRVSITCKASQNVRTAVAWYQQKPGQSPKLMIYSASYRYTGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQQYYTTPWTFGGGAKLEIQ
TIGIT-CHI-005	SEQ ID NO:15	DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQHVSNGVAWYQHKPGQSPKLLIYSASYRYTGVPDRFTGTGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQQHYNTPHTFGGGTKLEIK
TIGIT-CHI-006	SEQ ID NO:16	DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCRASQGVSTTIAWYQQKPGQSPKLLIYSASYRYTGVPDRFTGSGSGTDFTFTISGVQAEDLAVYYCQQYYSSPFTFGGGTKLEIK
TIGIT-CHI-070	SEQ ID NO:17	DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRVSENIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGNYYCQHHYGNPLTFGAGTKLDLK

表3 TIGIT嵌合抗體的Kabat分析結果

抗體編號	輕鏈CDR	序列	重鏈CDR	序列
TIGIT-CHI-002	LCDR1	KASQNVRTAVA SEQ ID NO:18	HCDR1	SDSWN SEQ ID NO:21
LCDR2	SASYRYT SEQ ID NO:19	HCDR2	YISYSGNTYYNPSLKS SEQ ID NO:22
LCDR3	QQYYTTPWT SEQ ID NO:20	HCDR3	LDFSNYGGAVDY SEQ ID NO:23
TIGIT-CHI-006	LCDR1	RASQGVSTTIA SEQ ID NO:24	HCDR1	SDYWN SEQ ID NO:27
LCDR2	SASYRYT SEQ ID NO:25	HCDR2	YISYSGRTYYNPSLKS SEQ ID NO:28
LCDR3	QQYYSSPFT SEQ ID NO:26	HCDR3	GDYSNYGGAMYD SEQ ID NO:29
TIGIT-CHI-005	LCDR1	KASQHVSNGVA SEQ ID NO:30	HCDR1	NYLIE SEQ ID NO:33
LCDR2	SASYRYT SEQ ID NO:31	HCDR2	VINPGSGGTNYKEKFKG SEQ ID NO:34
LCDR3	QQHYNTPHT SEQ ID NO:32	HCDR3	GEYFFFDY SEQ ID NO:35
TIGIT-CHI-070	LCDR1	RVSENIYSYLA SEQ ID NO:36	HCDR1	NYYMH SEQ ID NO:39
LCDR2	NAKTLAE SEQ ID NO:37	HCDR2	RIDPDSGGSKYNEKFKS SEQ ID NO:40
LCDR3	QHHYGNPLT SEQ ID NO:38	HCDR3	EGHYGFYSDY SEQ ID NO:41

表4 TIGIT嵌合抗體的IMGT分析結果

抗體編號	輕鏈CDR	序列	重鏈CDR	序列
TIGIT-CHI-002	LCDR1	QNVRTA SEQ ID NO:42	HCDR1	GYSITSDS SEQ ID NO:45
LCDR2	SAS SEQ ID NO:43	HCDR2	ISYSGNT SEQ ID NO:46
LCDR3	QQYYTTPWT SEQ ID NO:44	HCDR3	ARLDFSNYGGAVDY SEQ ID NO:47
TIGIT-CHI-006	LCDR1	QGVSTT SEQ ID NO:48	HCDR1	GYSMTSDY SEQ ID NO:51
LCDR2	SAS SEQ ID NO:49	HCDR2	ISYSGRT SEQ ID NO:52
LCDR3	QQYYSSPFT SEQ ID NO:50	HCDR3	ARGDYSNYGGAMYD SEQ ID NO:53
TIGIT-CHI-005	LCDR1	QHVSNG SEQ ID NO:54	HCDR1	GYAFTNYL SEQ ID NO:57
LCDR2	SAS SEQ ID NO:55	HCDR2	INPGSGGT SEQ ID NO:58
LCDR3	QQHYNTPHT SEQ ID NO:56	HCDR3	ARGEYFFFDY SEQ ID NO:59
TIGIT-CHI-070	LCDR1	ENIYSY SEQ ID NO:60	HCDR1	GYTFTNYY SEQ ID NO:63
LCDR2	NAK SEQ ID NO:61	HCDR2	IDPDSGGS SEQ ID NO:64
LCDR3	QHHYGNPLT SEQ ID NO:62	HCDR3	AREGHYGFYSDY SEQ ID NO:65

（a）抗TIGIT嵌合抗體與人TIGIT ECD-mFc和食蟹猴TIGIT ECD-mFc的結合活性檢測

用PBS pH7.4 （Hyclone，CAT#SH30256）稀釋羊抗鼠IgG抗體(Jackson，CAT: 115-006-071)至4 µg/mL, 加入酶標板（corning, CAT#9018），50 µL/孔，4℃過夜，甩掉包被液，加入5%脫脂奶粉（生工生物，CAT#A600669-0250）-PBS，250 µL/孔，37℃孵育2~4小時，在洗板機（Biotek, CAT#405TUS）上用0.05%Tween20-PBS（生工生物，CAT# A100777-0500，B548117-0500）洗三次，加入人TIGIT ECD-mFc（內部構建，工作濃度30ng/mL）和食蟹猴TIGIT ECD-mFc（內部構建，工作濃度30ng/mL），50 µL/孔，4℃孵育過夜，在洗板機上用0.05%Tween20-PBS洗三次，加入待測抗體（1%BSA稀釋至13nM, 經3倍連續梯度稀釋12個濃度點），50 µL/孔，37℃孵育1.5~2小時，在洗板機上用0.05%Tween20-PBS洗三次，以1:5000稀釋比用1%BSA(生工生物，CAT# A500023-0100)-PBS稀釋HRP酶標抗體（Merck，CAT#AP113P），加入酶標板中，50 µL/孔，37℃孵育1小時，在洗板機上用0.05%Tween20-PBS洗三次，加入TMB顯色液（KPL, CAT# 52-00-03），50 µL/孔，室溫孵育7~10分鐘，加入1M HCL，50 µL/孔，終止反應，酶標儀(Biotek, Powerwave HT)讀取OD450nm。實驗結果表明和對照抗體羅氏RG6058相一致，抗TIGIT嵌合抗體能有效結合人TIGIT ECD-mFc（圖1）和食蟹猴TIGIT ECD-mFc（圖2）。

（b）FACS檢測抗TIGIT嵌合抗體與CHO-K1人TIGIT高中低表達水準的細胞和CHO-K1 食蟹猴TIGIT的結合活性

收集細胞，PBS（Hyclone，CAT#SH30256）洗一次，1%BSA-PBS重懸至2×105/50 µL，1%BSA-PBS稀釋抗體至80nM，3倍連續梯度稀釋12個濃度點，將50 µL細胞與50 µL待測抗體稀釋液混合，4℃孵育60分鐘，PBS洗兩次，加入Alexa Fluor® 647螢光素標記的二抗（1:800）（Jackson，CAT# 109-605-088），100 µL/孔重懸細胞，4℃孵育40分鐘，PBS洗兩次，用1%BSA-PBS，100 µL/孔重懸，在流式細胞儀（BD, Canto Ⅱ）上分析細胞樣品。實驗結果表明和對照抗體羅氏RG6058一致，抗TIGIT嵌合抗體可以有效結合CHO-K1-TIGIT高表達細胞株（圖3）， CHO-K1-TIGIT中表達細胞株（圖4），CHO-K1-TIGIT低表達細胞株（圖5）及CHO-K1-食蟹猴TIGIT細胞株（圖6）。

（c）FACS方法檢測抗TIGIT嵌合抗體阻斷Bio-CD155-His與CHO-K1 人TIGIT高表達株的相互作用

收集細胞，PBS（Hyclone，CAT#SH30256）洗一次，1%BSA-PBS重懸至2×105/40 µL，1%BSA-PBS稀釋抗體至210nM，3倍連續梯度稀釋12個濃度點，1%BSA-PBS稀釋Bio-CD155-His（義翹神州，10109-H08H）至3 µg/mL，隨後將40 µL細胞與40 µL抗體稀釋液以及40 µL Bio-CD155-His稀釋液混合，4℃孵育60分鐘，PBS洗兩次，加入APC標記的鏈黴親和素（工作稀釋度1:1700，Biolegend，405243），100 µL/孔重懸細胞，4℃孵育40分鐘，PBS洗兩次，用1%BSA-PBS，100 µL/孔重懸，在流式細胞儀（BD, Canto Ⅱ）上分析細胞樣品。如圖7所示，抗TIGIT嵌合抗體與對照抗體RG6058都可以有效阻斷Bio-CD155-His蛋白與CHO-K1-人TIGIT細胞的結合。

（d）FACS方法檢測抗TIGIT嵌合抗體阻斷TIGIT ECD-mFc與CHO-K1 CD155的相互作用

收集CHO-K1 CD155細胞，PBS（Hyclone，CAT#SH30256）洗一次，1%BSA-PBS重懸至2×105/40 µL，1%BSA-PBS稀釋待測抗體至600nM，2.5倍連續梯度稀釋12個濃度點，1%BSA-PBS稀釋TIGIT ECD-mFc至6 µg/mL，隨後將40 µL細胞與40 µL抗體稀釋液以及40 µL TIGIT ECD-mFc稀釋液混合，4℃孵育60分鐘，PBS洗兩次，加入Alexa Fluor® 647螢光素標記的二抗（工作稀釋度1：800，Jackson, CAT# 115-605-003），100 µL/孔重懸細胞，4℃孵育40分鐘，PBS洗兩次，用1%BSA-PBS，100 µL/孔重懸，在流式細胞儀（BD, Canto Ⅱ）上分析細胞樣品。如圖8所示，抗TIGIT嵌合抗體與對照抗體RG6058都可以有效阻斷人TIGIT蛋白與CHO-K1-CD155細胞的結合。

表5顯示TIGIT嵌合抗體鑒定匯總。

表5 TIGIT嵌合抗體鑒定匯總

TIGIT嵌合抗體	人TIGIT ECD-His	人TIGIT ECD-mFc/CHO-K1 CD155阻斷實驗	Bio-CD155-His/CHO-K1人 TIGIT阻斷實驗	CHO-K1 人TIGIT（高表達株）	CHO-K1 人TIGIT（中表達株）	CHO-K1 人TIGIT（低表達株）	人TIGIT ECD-mFc結合實驗	CHO-K1 食蟹猴TIGIT結合實驗	食蟹猴TIGIT ECD-mFc結合實驗
ka (1/Ms)	kd (1/s)	KD (M)	IC50 (nM)	IC50 (nM)	EC50 (nM)	EC50 (nM)	EC50 (nM)	EC50 (nM)	EC50 (nM)	EC50 (nM)
TIGIT-CHI-002	4.53E+06	3.15E-04	6.97E-11	0.3682	0.1519	0.2991	0.2904	0.2183	0.0181	0.0290	0.0165
TIGIT-CHI-005	3.59E+06	1.92E-04	5.36E-11	0.3628	0.1582	0.3421	0.3160	0.2290	0.0173	0.0264	0.0170
TIGIT-CHI-006	1.29E+06	1.70E-04	1.32E-10	0.5723	0.2465	0.5022	0.4810	0.3287	0.0167	0.0731	0.0389
TIGIT-CHI-070	1.52E+06	4.56E-04	3.00E-10	0.5819	0.3837	0.5168	0.3941	0.3524	0.0145	0.0359	0.0163
RG6058-hIgG1	9.03E+05	1.47E-04	1.63E-10	0.5658	0.3884	0.6731	0.6164	0.4953	0.0151	0.0509	0.0158

（e）NK細胞表面PVRIG及TIGIT的表達及WIDR細胞表面PVR和PVRL2的表達檢測

利用FACS檢測NK細胞（Natural killer cell）上PVRIG，TIGIT的表達情況。首先，使用細胞計數儀（Beckman Coulter，Vi-CELL）將NK細胞計數，取三個流式管，每個流式管加入1E+5個NK細胞，加PBS洗滌細胞兩次，去上清，取一管加入300μl Staining buffer（PBS+2% FBS）做為未染色管待用，另外兩管每管加入染液100 µl（PBS+1*的Zombie Violet（Biolegend，423114））混勻後室溫孵育15分鐘。隨後加Staining buffer洗滌細胞兩次，去上清，每管加入Fc阻斷劑50 µl（Staining buffer + Fcx blocker（Biolegend，422302））混勻後4℃孵育15分鐘。接著分別向每管加入染液，第一管加入50ul的2*染液（Staining buffer + PE-Cy7 Mouse anti-hCD3檢測抗體+ PE Mouse anti-hCD56檢測抗體+ APC Mouse anti-hTIGIT檢測抗體+ AF488 Rabbit anti-hPVRIG檢測抗體，CD3檢測抗體：Biolegend 300316，CD56檢測抗體：Biolegend 318306，TIGIT檢測抗體：Biolegend 372706，PVRIG檢測抗體：RD FAB93651G），第二管加入50μl的2*同型對照染液（Staining buffer+PE-Cy7 Mouse anti-hCD3檢測抗體 + PE Mouse anti-hCD56檢測抗體+ APC Mouse IgG2a κ 同型對照抗體+ AF488 Rabbit IgG κ 同型對照抗體，APC mIgG2a κ 同型對照抗體：Biolegend 400222，AF488 Rabbit IgG κ同型對照抗體: RD IC1051G），混勻後4℃孵育30分鐘。時間到後用Staining buffer洗滌兩次，離心後加300 µl Staining buffer 混勻。隨後上機檢測（Thermo Attune NxT），最終讀取Zombie Violet陰性細胞群中CD56陽性CD3陰性的細胞群的占比和Zombie Violet陰性細胞群中CD56陽性CD3陰性的細胞群的APC、AF488訊號。圖9中A表明，不同供體donor-010及donor-050的NK細胞表面均有PVRIG及TIGIT的表達。

利用FACS檢測WIDR細胞上PVR和PVRL2的表達。首先，將WIDR細胞用胰酶消化成細胞懸液，使用細胞計數儀（Beckman Coulter，Vi-CELL）將細胞計數，取三個流式管，每個流式管加入1E+5個細胞，加PBS洗滌細胞兩次。離心後去上清，取一管加入300ul Staining buffer（PBS+2% FBS）做為未染色管待用，另外兩管每管加入染液100ul（PBS+1*的Zombie Violet（Biolegend，423114））混勻後室溫孵育15分鐘。隨後加Staining buffer洗滌細胞兩次，去上清，分別向每管加入染液：第一管加入100μl染液（Staining buffer +PerCP-Cy5.5 Mouse anti-hPVR檢測抗體+ APC Mouse anti-hPVRL2檢測抗體，PVR檢測抗體：Biolegend 337612，PVRL2檢測抗體：Biolegend 337412），第二管加入100μl同型對照染液（Staining buffer + PerCP-Cy5.5 Mouse IgG1 κ同型對照抗體+ APC κ Mouse IgG1同型對照抗體，PerCP-Cy5.5 mIgG1 κ同型對照抗體：Biolegend 400150，APC mIgG1 κ 同型對照抗體：Biolegend 400122），混勻後4℃孵育30分鐘。時間到後用Staining buffer洗滌兩次，離心後加300 µl Staining buffer 混勻。隨後上機檢測（Thermo Attune NxT），最終讀取Zombie Violet陰性細胞群的PerCP-Cy5.5、APC訊號。圖9中B顯示，WIDR細胞表面的高表達PVR及PVRL2。

（f）NK細胞脫粒實驗檢測抗TIGIT嵌合抗體對NK細胞功能的促進作用

利用FACS檢測NK細胞（Natural killer cell）的CD107a訊號來指示受試抗體對NK細胞脫顆粒過程的影響。提前一天復甦PBMC，分選NK細胞（Stemcell，17955），加入200IU/ml的h-IL2（RD, 202-IL）和10ng/ml的h-IL12 (Peprotech，200-12-50UG) 刺激過夜，第二天進行鋪板實驗。首先，用assay buffer（RPMI1640-Glutamax +10%FBS+1×P/S）將抗體稀釋到最高濃度275nM（四倍濃度），然後繼續用assay buffer開始進行10倍梯度稀釋，將稀釋好的抗體加至超低吸附96孔U底板（Costar，7007）中，每孔50 µl，待用。其次，使用細胞計數儀（Beckman Coulter，Vi-CELL）將NK細胞計數，取一定數目的NK細胞，以350g的速度離心5分鐘，棄上清後用assay buffer重懸至0.5E+6個細胞/ml的密度，向細胞懸液中加入蛋白轉運抑制劑（Invitrogen，00498093）和APC mouse anti-human 檢測抗體（Biolegend，328620）。向鋪好藥的96孔U底板中加入處理好的NK細胞懸液，每孔50 µl，混合均勻後室溫孵育15分鐘。孵育期間，將靶細胞WIDR用胰酶消化成細胞懸液，使用細胞計數儀（Beckman Coulter，Vi-CELL）將靶細胞計數，取出適量數目的細胞，以200g的速度離心5分鐘，棄上清後用assay buffer將細胞重懸至0.25E+6個細胞/ml的密度。孵育結束後，向孔板中加入靶細胞懸液，每孔100 µl，此時每孔中含有25000個NK細胞，25000個靶細胞以及不同濃度的受試抗體，只含有NK細胞的孔作為靜息對照，含有NK細胞及靶細胞的孔作為無藥物對照。將每個孔混合均勻後放入37℃培養箱孵育16h。FACS染色檢測CD107a的變化情況：將孔板中的細胞平行轉移至96孔V底板，用PBS洗滌兩次，棄上清，每孔加入染液（PBS+2%FBS+1*濃度的zombie violet（Biolegend，423114）+ PE mouse anti-CD56 檢測抗體（Biolegend，318306））混合均勻後4℃孵育30分鐘。時間到後，staining buffer洗滌兩次，棄上清，每孔加入150 µl 的staining buffer重懸上機檢測（Thermo Attune NxT）。最終讀取CD56陽性細胞中CD107a強陽性細胞群的占比，CD107a強陽性細胞占比越高，代表NK細胞的脫粒作用越強，NK細胞的啟動程度越高。圖10顯示，陰性對照anti-HEL-hIgG1對NK表面的CD107a沒有影響，三個受試抗體均能不同程度的提高NK細胞CD107a的表達，這表明三個受試抗體均可以有效促進NK的啟動。

（g）NK細胞殺傷實驗檢測抗TIGIT嵌合抗體的NK細胞對靶細胞殺傷促進作用

利用FACS檢測靶細胞（WIDR）的裂解水準來推測受試抗體對NK（Natural killer cell）細胞殺傷功能的影響。提前一天復甦PBMC，分選NK細胞（Stemcell，17955），加入200IU/ml的h-IL2（RD, 202-IL）和10ng/ml的h-IL12(Peprotech，200-12-50UG)過夜刺激，第二天進行鋪板實驗。首先，用assay buffer（RPMI1640-Glutamax +10%FBS+1×P/S）將抗體稀釋到最高濃度275nM（四倍濃度），隨後用assay buffer開始進行10倍梯度稀釋，將稀釋好的抗體加至超低吸附96孔U底板（Costar，7007）中，每孔50 µl，待用。將靶細胞WIDR用胰酶消化成細胞懸液，使用細胞計數儀（Beckman Coulter，Vi-CELL）將WIDR細胞計數，取出適量數目的細胞，置於離心機以200g的速度離心5分鐘，棄上清後用適量PBS重懸後加入CellTrace Violet （Invitrogen，C34557A）染液，使CellTrace Violet 終濃度為5 µM。將加入染液的WIDR懸液混合均勻置於37℃培養箱孵育10分鐘，期間搖晃混合。與此同時，使用細胞計數儀將NK細胞計數，取一定數目的NK細胞，以350g的速度離心5分鐘，棄上清後用assay buffer重懸至0.5E+6個細胞/ml的密度。向鋪好藥的96孔U底板中加入處理好的NK細胞懸液，每孔50 µl，混合均勻後室溫孵育15分鐘。WIDR細胞染色結束後，向細胞懸液中加入5倍體積完全培養基（MEM+10%FBS+1*P/S+1*非必須胺基酸+1*谷氨酸鈉）進行終止反應，以200g的速度離心5分鐘，棄上清後用assay buffer將細胞重懸至0.25E+6個細胞/ml的密度。NK與藥物孵育結束後，向孔板中加入WIDR細胞懸液，每孔100 µl，此時每孔中含有25000個NK細胞，25000個WIDR細胞以及不同濃度的受試抗體，只含WIDR細胞的孔作為靜息對照，含有NK及WIDR的孔作為無藥物對照。將每個孔混合均勻後放入37℃培養箱孵育4h。FACS染色檢測WIDR細胞裂解水準：每孔加入染液（PBS+ PI（Propidium Iodide，Invitrogen，P3566））混合均勻後室溫孵育20分鐘。時間到後，上機檢測（Thermo Attune NxT），最終讀取CTV陽性細胞中PI陽性細胞群的占比，PI陽性細胞占比越多，代表NK細胞的殺傷作用越強。圖11顯示，陰性對照anti-HEL-hIgG1對NK殺傷沒有顯著影響，受試的4個嵌合抗體均能有效促進NK細胞對靶細胞WIDR的殺傷，並且4個嵌合抗體對NK細胞的殺傷促進作用不弱於陽性對照RG6058-hIgG1。

（h）CMV antigen-recall assay檢測抗TIGIT嵌合抗體對抗原特異性CD8 T細胞的功能改善作用

Anti-CMV IgG陽性donor的PBMC經CMV pp65(495-503)多肽誘導的CMV pp65特異性CD8 T作為效應細胞，經pp65 pulsed後的colo205腫瘤細胞系作為靶細胞的實驗體系中，檢測TIGIT抗體對抗原特異性CD8 T細胞的功能改善作用。

PBMC復甦後，用含有1mg/mL CMV pp65(495-503)多肽(Anaspec, 貨號AS-28328)、2ng/mL human IL-2(R&D, 貨號IL-202)、10ng/mL human IL-7 (Peprotech, 貨號200-07)的完全培養基（RPMI1640-Glutamax + 5%AB serum + 1% P/S+(1×) 2-β巰基乙醇）重懸至2×106/mL，5mL/孔接種於6孔板中，37℃ 5%CO2培養6天。第6天，收集所有細胞，撤去培養基中的pp65和IL-7，將細胞一分為二，並重懸於含有100 IU/mL human IL-2的完全培養基中，繼續培養2天。第8天，收集所有細胞，重懸於含有100IU/mL human IL-2的完全培養基中、並調整細胞密度為2×106/mL，繼續培養。第11天，收集所有細胞，流式檢測PBMC中CD8 T細胞的比例，CMV pp65(495-503)特異性CD8T的比例（圖12中A）及該細胞上PVRIG、TIGIT、PD-1的表達（圖12中B）。流式檢測抗體如下：Livedead Near IR (Invitrogen，貨號L34976)，CD8-PerCp Cy5.5(BD，貨號565310)，CD3-PE-Cy7(Biolegend,貨號300316)，T-select HLA-A*0201 CMV pp65 Tetramer-PE(MBL，貨號TS-0010-1C)，PVRIG-AF488(R&D，貨號FAB93651G-100UG)，TIGIT-APC (Biolegend,貨號372706)，PD-1-BV421 (BD,貨號562516)。

上述誘導後的PBMC經CD8 T分選試劑盒（Stemcell，貨號17953）分離出CD8 T作為效應細胞，用AIM-V重懸並調整細胞密度至0.4×106/mL。Colo205作為靶細胞，經TrypLETM Express Enzyme(Gibco, 貨號12605010)消化，重懸於含有50ng/mL pp65的AIM-V(Gibco, 貨號31035-025)並調整細胞密度至1×106/ml，37℃ 5% CO2處理1-2小時，之後250g離心5分鐘，棄上清。之後細胞用AIM-V重懸至0.2×106/mL，流式檢測Colo205細胞高表達PVRL2，PVR如圖12中C所示。TIGIT抗體或陽性對照用AIM-V稀釋至280nM。在低吸附96孔U底板（Corning, 貨號7007）中依次加入50 µL抗體，50µL CD8 T，100 µL pp65處理過的colo205，並用排槍輕輕混勻，37℃ 5%CO2孵育18小時。此體系中藥物終濃度為70nM，CD8 T為20000/孔，colo205為20000/孔。孵育結束後400g離心取上清，用ELISA試劑盒（達科為，貨號1110003）檢測上清中human IFN-γ的水準。此體系中的陽性對照為RG6058-hIgG1，陰性對照為no treatment。如圖12中D所示，相較於RG6058-hIgG1，3個TIGIT受試抗體作用後，細胞上清中IFN-γ的分泌在統計學上均無顯著性差異但均顯著高於no treatment組，每個柱狀圖上的百分比意為相較於no treatment組IFN-γ分泌提升的百分比。

Colo205上PVRL2、PVR表達的流式檢測抗體如下：livedead-BV421 (Invitrogen,貨號L34964)，PVRL2-APC（Biolegend，貨號337412），PVR- PerCp Cy5.5(Biolegend，貨號337612), PD-L1-PE-Cy7(BD，貨號558017)。

實施例 5抗人TIGIT單克隆抗體的人源化

透過比對IMGT（http://imgt.cines.fr）人類抗體重輕鏈可變區種系基因資料庫，分別挑選與鼠源抗體同源性高的重鏈和輕鏈可變區種系基因作為範本，將鼠源抗體的CDR分別移植到相應的人源範本中，形成次序為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的可變區序列。根據需要，將骨架序列中關鍵胺基酸回復突變為鼠源抗體對應的胺基酸，以保證原有的親和力，即得到人源化抗TIGIT單克隆抗體。其中抗體的CDR胺基酸殘基通常由Kabat編號系統確定並注釋。

1. TIGIT-002 的人源化

鼠源抗體TIGIT-002的人源化輕鏈範本為IGKV2-29*02/IGKV4-1*01和IGKJ4*01，人源化重鏈範本為IGHV4-38-2*01和IGHJ6*01，將鼠源抗體TIGIT-002的CDR分別移植到其人源範本中，即獲得對應的人源化版本。根據需要，將TIGIT-002的人源化抗體的FR區序列中關鍵胺基酸進行回復突變為鼠源抗體對應的胺基酸，以保證原有的親和力，具體回復突變設計見表6。

表6 TIGIT-002的人源化抗體回復突變設計

VL	VH
VL1	Grafted(IGKV2-29*02) + L47M	VH1	Grafted(IGHV4-38-2*01) + S30T,V71R
VL2	Grafted(IGKV2-29*02)+L37Q, L47M	VH2	Grafted(IGHV4-38-2*01) + S30T,G44K,V71R
VL3	Grafted(IGKV4-1*01) + P43S, L47M	VH3	Grafted(IGHV4-38-2*01) + S30T, G44K, I48M, V67I, V71R
-	-	VH4	Grafted(IGHV4-38-2*01) + S30T, G44K, W47Y, V71R

注：Grafted(IGKV2-29*02)代表將鼠抗體CDR植入人種系IGKV2-29*02 FR區序列；L47M表示將Grafted第47位L突變回M，其它依此類推。回復突變胺基酸的編號為自然順序編號。

TIGIT-002人源化抗體可變區具體序列如下：

TIGIT-002.VL1胺基酸序列如SEQ ID NO：66所示： DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQNVRTAVAWYLQKPGQSPQLMIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQYYTTPWTFGGGTKVEIK

TIGIT-002.VL2胺基酸序列如SEQ ID NO：67所示： DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQNVRTAVAWYQQKPGQSPQLMIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQYYTTPWTFGGGTKVEIK

TIGIT-002.VL3胺基酸序列如SEQ ID NO：68所示： DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQNVRTAVAWYQQKPGQSPKLMIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYTTPWTFGGGTKVEIK

TIGIT-002.VH1胺基酸序列如SEQ ID NO：69所示： EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSITSDSWNWIRQPPGKGLEWIGYISYSGNTYYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARLDFSNYGGAVDYWGQGTTVTVSS

TIGIT-002.VH2胺基酸序列如SEQ ID NO：70所示： EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSITSDSWNWIRQPPGKKLEWIGYISYSGNTYYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARLDFSNYGGAVDYWGQGTTVTVSS

TIGIT-002.VH3胺基酸序列如SEQ ID NO：71所示： EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSITSDSWNWIRQPPGKKLEWMGYISYSGNTYYNPSLKSRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARLDFSNYGGAVDYWGQGTTVTVSS

TIGIT-002.VH4胺基酸序列如SEQ ID NO：72所示： EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSITSDSWNWIRQPPGKKLEYIGYISYSGNTYYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARLDFSNYGGAVDYWGQGTTVTVSS

人源化輕鏈範本IGKV2-29*02胺基酸序列如SEQ ID NO：73所示： DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLLHSDGKTYLYWYLQKPGQSPQLLIYEVSSRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGIHLP

人源化輕鏈範本IGKV4-1*01胺基酸序列如SEQ ID NO：74所示： DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSTP

人源化輕鏈範本IGKJ4*01胺基酸序列如SEQ ID NO：75所示： FGGGTKVEIK

人源化重鏈範本IGHV4-38-2*01胺基酸序列如SEQ ID NO：76所示： QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSISSGYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYHSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR

人源化重鏈範本IGHJ6*01胺基酸序列如SEQ ID NO：77所示： WGQGTTVTVSS

本發明分別從上述002的人源化抗體輕鏈和重鏈可變區的回復突變設計中，選擇不同的輕鏈和重鏈序列進行交叉組合，最終獲得多種002人源化抗體，各抗體的可變區胺基酸序列如下：

表7 TIGIT-002人源化抗體可變區對應胺基酸序列

Fv	002.VH1	002.VH2	002.VH3	002.VH4
002.VL1	TIGIT-002-H1L1*	TIGIT-002-H2L1	TIGIT-002-H3L1	TIGIT-002-H4L1
002.VL2	TIGIT-002-H1L2	TIGIT-002-H2L2	TIGIT-002-H3L2	TIGIT-002-H4L2
002.VL3	TIGIT-002-H1L3	TIGIT-002-H2L3	TIGIT-002-H3L3	TIGIT-002-H4L3

*TIGIT-002-H1L1表示重鏈選自TIGIT-002.VH1，輕鏈選自TIGIT-002.VL1。下同。

根據Kabat編號系統，上述12個人源化抗體VH和VL序列分析結果如表8所示。

表8 TIGIT-002人源化抗體VH和VL序列的Kabat分析結果

重鏈/輕鏈可變區	CDR1	CDR2	CDR3
VH1/2/3/4	SDSWN SEQ ID NO:21	YISYSGNTYYNPSLKS SEQ ID NO:22	LDFSNYGGAVDY SEQ ID NO:23
VL1/2/3	KASQNVRTAVA SEQ ID NO:18	SASYRYT SEQ ID NO:19	QQYYTTPWT SEQ ID NO:20

2. TIGIT-006 的人源化

鼠源抗體TIGIT-006的人源化輕鏈範本為IGKV2-29*02/IGKV4-1*01和IGKJ4*01，人源化重鏈範本為IGHV4-38-2*01和IGHJ6*01，將鼠源抗體TIGIT-006的CDR分別移植到其人源範本中，即獲得對應的人源化版本。根據需要，將TIGIT-006的人源化抗體的FR區序列中關鍵胺基酸進行回復突變為鼠源抗體對應的胺基酸，以保證原有的親和力，具體回復突變設計見表9。

表9 TIGIT-006的人源化抗體回復突變設計

VL	VH
VL1	Grafted(IGKV2-29*02)	VH1	Grafted(IGHV4-38-2*01) + S30T,V71R
VL2	Grafted(IGKV2-29*02)+L37Q, Q45K	VH2	Grafted(IGHV4-38-2*01) + I29M,S30T,V71R
VL3	Grafted(IGKV4-1*01) + P43S	VH3	Grafted(IGHV4-38-2*01) + I29M, S30T, G44K, V71R
-	-	VH4	Grafted(IGHV4-38-2*01) + I29M, S30T, G44K, I48M, V67I, V71R
		VH5	Grafted(IGHV4-38-2*01) + I29M, S30T, G44K, W47Y, V71R

注：Grafted(IGKV2-29*02)代表將鼠抗體CDR植入人種系IGKV2-29*02 FR區序列；L37Q表示將Grafted第37位L突變回Q，其它依此類推。回復突變胺基酸的編號為自然順序編號。

TIGIT-006人源化抗體可變區具體序列如下：

TIGIT-006.VL1胺基酸序列如SEQ ID NO：78所示： DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRASQGVSTTIAWYLQKPGQSPQLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQYYSSPFTFGGGTKVEIK

TIGIT-006.VL2胺基酸序列如SEQ ID NO：79所示： DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRASQGVSTTIAWYQQKPGQSPKLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQYYSSPFTFGGGTKVEIK

TIGIT-006.VL3胺基酸序列如SEQ ID NO：80所示： DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASQGVSTTIAWYQQKPGQSPKLLIYSASYRYTGVPRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSSPFTFGGGTKVEIK

TIGIT-006.VH1胺基酸序列如SEQ ID NO：81所示： EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSITSDYWNWIRQPPGKGLEWIGYISYSGRTYYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGDYSNYGGAMYDWGQGTTVTVSS

TIGIT-006.VH2胺基酸序列如SEQ ID NO：82所示： EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSMTSDYWNWIRQPPGKGLEWIGYISYSGRTYYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGDYSNYGGAMYDWGQGTTVTVSS

TIGIT-006.VH3胺基酸序列如SEQ ID NO：83所示： EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSMTSDYWNWIRQPPGKKLEWIGYISYSGRTYYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGDYSNYGGAMYDWGQGTTVTVSS

TIGIT-006.VH4胺基酸序列如SEQ ID NO：84所示： EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSMTSDYWNWIRQPPGKKLEWMGYISYSGRTYYNPSLKSRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGDYSNYGGAMYDWGQGTTVTVSS

TIGIT-006.VH5胺基酸序列如SEQ ID NO：85所示： EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSMTSDYWNWIRQPPGKKLEYIGYISYSGRTYYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGDYSNYGGAMYDWGQGTTVTVSS

本發明分別從上述TIGIT-006的人源化抗體輕鏈和重鏈可變區的回復突變設計中，選擇不同的輕鏈和重鏈序列進行交叉組合，最終獲得多種TIGIT-006人源化抗體，各抗體的可變區胺基酸序列如下：

表10 TIGIT-006人源化抗體可變區對應胺基酸序列

Fv	006.VH1	006.VH2	006.VH3	006.VH4	006.VH5
006.VL1	TIGIT-006-H1L1*	TIGIT-006-H2L1	TIGIT-006-H3L1	TIGIT-006-H4L1	TIGIT-006-H5L1
006.VL2	TIGIT-006-H1L2	TIGIT-006-H2L2	TIGIT-006-H3L2	TIGIT-006-H4L2	TIGIT-006-H5L2
006.VL3	TIGIT-006-H1L3	TIGIT-006-H2L3	TIGIT-006-H3L3	TIGIT-006-H4L3	TIGIT-006-H5L3

*TIGIT-006-H1L1表示重鏈選自TIGIT-006.VH1，輕鏈選自TIGIT-006.VL1。下同。

根據Kabat編號系統，上述15個人源化抗體VH和VL序列分析結果如表11所示。

表11 TIGIT-006人源化抗體VH和VL序列的Kabat分析結果

重鏈/輕鏈可變區	CDR1	CDR2	CDR3
VH1/2/3/4/5	SDYWN SEQ ID NO:27	YISYSGRTYYNPSLKS SEQ ID NO:28	GDYSNYGGAMYD SEQ ID NO:29
VL1/2/3	RASQGVSTTIA SEQ ID NO:24	SASYRYT SEQ ID NO:25	QQYYSSPFT SEQ ID NO:26

3. TIGIT-005 的人源化

鼠源抗體TIGIT-005的人源化輕鏈範本為IGKV4-1*01和IGKJ4*01，人源化重鏈範本為IGHV1-3*01和IGHJ6*01，將鼠源抗體TIGIT-005的CDR分別移植到其人源範本中，即獲得對應的人源化版本。根據需要，將TIGIT-005的人源化抗體的FR區序列中關鍵胺基酸進行回復突變為鼠源抗體對應的胺基酸，以保證原有的親和力，具體回復突變設計見表12。

表12 TIGIT-005的人源化抗體回復突變設計

VL	VH
VL1	Grafted(IGKV4-1*01) + Q38H, P43S	VH2	Grafted(IGHV1-3*01) + T28A, R72A, T74K, A76S

注：Grafted(IGKV4-1*01)代表將鼠抗體CDR植入人種系IGKV4-1*01 FR區序列，Q38H表示將Grafted第38位Q突變回H，其它依此類推。回復突變胺基酸的編號為自然順序編號。

TIGIT-005人源化抗體可變區具體序列如下：

TIGIT-005.VL1胺基酸序列如SEQ ID NO：86所示： DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQHVSNGVAWYQHKPGQSPKLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHYNTPHTFGGGTKVEIK

TIGIT-005.VH2胺基酸序列如SEQ ID NO：87所示： EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYAFTNYLIEWVRQAPGQRLEWMGVINPGSGGTNYKEKFKGRVTITADKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGEYFFFDYWGQGTTVTVSS

人源化重鏈範本IGHV1-3*01胺基酸序列如SEQ ID NO：106所示： QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYAMHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNGNTKYSQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR

TIGIT-005抗體存在易發生化學修飾的位元點NG，我們對NG進行點突變以消除修飾風險。在其中五個實施例中，我們分別對005.VL1的NG進行突變，加粗所示為突變位點，突變後的序列如下：

TIGIT-005.VL1a胺基酸序列如SEQ ID NO：88所示： DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQHVSQGVAWYQHKPGQSPKLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHYNTPHTFGGGTKVEIK

TIGIT-005.VL1b胺基酸序列如SEQ ID NO：89所示： DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQHVSTGVAWYQHKPGQSPKLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHYNTPHTFGGGTKVEIK

TIGIT-005.VL1c胺基酸序列如SEQ ID NO：90所示： DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQHVSDGVAWYQHKPGQSPKLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHYNTPHTFGGGTKVEIK

TIGIT-005.VL1d胺基酸序列如SEQ ID NO：91所示： DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQHVSNAVAWYQHKPGQSPKLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHYNTPHTFGGGTKVEIK

TIGIT-005.VL1e胺基酸序列如SEQ ID NO：92所示： DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQHVSNYVAWYQHKPGQSPKLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHYNTPHTFGGGTKVEIK

本發明分別從上述TIGIT-005的人源化抗體輕鏈和重鏈可變區的回復突變設計中，選擇不同的輕鏈和重鏈序列進行交叉組合，最終獲得6種TIGIT-005人源化抗體，各抗體的可變區胺基酸序列如下：

表13 TIGIT-005人源化抗體可變區對應胺基酸序列

Fv	005.VL1	005.VL1a	005.VL1b	005.VL1c	005.VL1d	005.VL1e
005.VH2	TIGIT-005-H2L1*	TIGIT-005-H2L1a	TIGIT-005-H2L1b	TIGIT-005-H2L1c	TIGIT-005-H2L1d	TIGIT-005-H2L1e

*TIGIT-005-H2L1表示重鏈選自TIGIT-005.VH2，輕鏈選自TIGIT-005.VL1。下同。

根據Kabat編號系統，上述6個人源化抗體VH和VL序列分析結果如表14所示。

表14 TIGIT-005人源化抗體VH和VL序列的Kabat分析結果

重鏈/輕鏈可變區	CDR1	CDR2	CDR3
VH2	NYLIE SEQ ID NO:33	VINPGSGGTNYKEKFKG SEQ ID NO:34	GEYFFFDY SEQ ID NO:35
VL1	KASQHVSNGVA SEQ ID NO:30	SASYRYT SEQ ID NO:31	QQHYNTPHT SEQ ID NO:32
VL1a	KASQHVSQGVA SEQ ID NO:93	SASYRYT SEQ ID NO:31	QQHYNTPHT SEQ ID NO:32
VL1b	KASQHVSTGVA SEQ ID NO:94	SASYRYT SEQ ID NO:31	QQHYNTPHT SEQ ID NO:32
VL1c	KASQHVSDGVA SEQ ID NO:95	SASYRYT SEQ ID NO:31	QQHYNTPHT SEQ ID NO:32
VL1d	KASQHVSNAVA SEQ ID NO:96	SASYRYT SEQ ID NO:31	QQHYNTPHT SEQ ID NO:32
VL1e	KASQHVSNYVA SEQ ID NO:97	SASYRYT SEQ ID NO:31	QQHYNTPHT SEQ ID NO:32

4. TIGIT-070 的人源化

鼠源抗體TIGIT-070的人源化輕鏈範本為 IGKV1-39*01/IGKV4-1*01和IGKJ3*01，人源化重鏈範本為IGHV1-3*01和IGHJ6*01，將鼠源抗體TIGIT-070的CDR分別移植到其人源範本中，即獲得對應的人源化版本。根據需要，將TIGIT-070的人源化抗體的FR區序列中關鍵胺基酸進行回復突變為鼠源抗體對應的胺基酸，以保證原有的親和力，具體回復突變設計見表15。

表15 TIGIT-070的人源化抗體回復突變設計

VL	VH
VL1	Grafted(IGKV1-39*01) + A43S	VH1	Grafted(IGHV1-3*01) + R72V,T74K
VL2	Grafted(IGKV1-39*01) + A43S, I48V	VH2	Grafted(IGHV1-3*01)+R72V, T74K, S75L, A76S
VL3	Grafted(IGKV4-1*01) + P43S, I48V	VH3	Grafted(IGHV1-3*01)+R44G, R72V, T74K, S75L, A76S

注：Grafted(IGKV1-39*01)代表將鼠抗體CDR植入人種系IGKV1-39*01 FR區序列；A43S表示將Grafted第43位A突變回S，其它依此類推。回復突變胺基酸的編號為自然順序編號。

TIGIT-070人源化抗體可變區具體序列如下：

TIGIT-070.VL1胺基酸序列如SEQ ID NO：98所示： DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRVSENIYSYLAWYQQKPGKSPKLLIYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYGNPLTFGPGTKVDIK

TIGIT-070.VL2胺基酸序列如SEQ ID NO：99所示： DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRVSENIYSYLAWYQQKPGKSPKLLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYGNPLTFGPGTKVDIK

TIGIT-070.VL3胺基酸序列如SEQ ID NO：100所示： DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRVSENIYSYLAWYQQKPGQSPKLLVYNAKTLAEGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHHYGNPLTFGPGTKVDIK

TIGIT-070.VH1胺基酸序列如SEQ ID NO：101所示： EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMHWVRQAPGQRLEWMGRIDPDSGGSKYNEKFKSRVTITVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGHYGFYSDYWGQGTTVTVSS

TIGIT-070.VH2胺基酸序列如SEQ ID NO：102所示： EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMHWVRQAPGQRLEWMGRIDPDSGGSKYNEKFKSRVTITVDKLSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGHYGFYSDYWGQGTTVTVSS

TIGIT-070.VH3胺基酸序列如SEQ ID NO：103所示： EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMHWVRQAPGQGLEWMGRIDPDSGGSKYNEKFKSRVTITVDKLSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGHYGFYSDYWGQGTTVTVSS

人源化輕鏈範本IGKV1-39*01胺基酸序列如SEQ ID NO：104所示： DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYST

人源化輕鏈範本IGKJ3*01胺基酸序列如SEQ ID NO：105所示： FGPGTKVDIK

本發明分別從上述TIGIT-070的人源化抗體輕鏈和重鏈可變區的回復突變設計中，選擇不同的輕鏈和重鏈序列進行交叉組合，最終獲得多種TIGIT-070人源化抗體，各抗體的可變區胺基酸序列如下：

表16 TIGIT-070人源化抗體可變區對應胺基酸序列

Fv	070.VH1	070.VH2	070.VH3
070.VL1	TIGIT-070-H1L1*	TIGIT-070-H2L1	TIGIT-070-H3L1
070.VL2	TIGIT-070-H1L2	TIGIT-070-H2L2	TIGIT-070-H3L2
070.VL3	TIGIT-070-H1L3	TIGIT-070-H2L3	TIGIT-070-H3L3

*TIGIT-070-H1L1表示重鏈選自TIGIT-070.VH1，輕鏈選自TIGIT-070.VL1。下同。

根據Kabat編號系統，上述9個人源化抗體VH和VL序列分析結果如表17所示。

表17 TIGIT-070人源化抗體VH和VL序列的Kabat分析結果

重鏈/輕鏈可變區	CDR1	CDR2	CDR3
VH1/2/3	NYYMH SEQ ID NO:39	RIDPDSGGSKYNEKFKS SEQ ID NO:40	EGHYGFYSDY SEQ ID NO:41
VL1/2/3	RVSENIYSYLA SEQ ID NO:36	NAKTLAE SEQ ID NO:37	QHHYGNPLT SEQ ID NO:38

5. 抗人 TIGIT 單克隆抗體的人源化變體鑒定

採用BIAcore檢測上述人源化抗體與人TIGIT ECD-His的親和力，並參考實施例4（a）、（b）、（d）的方法檢測上述人源化抗體與人TIGIT ECD-mFc的結合活性、與CHO-K1人TIGIT的結合活性、與CHO-K1食蟹猴TIGIT的結合活性、與食蟹猴TIGIT ECD-mFc的結合活性、以及阻斷人TIGIT ECD-mFc與CHO-K1 CD155結合的效應，結果如表18所示。

可見，TIGIT-002-H4L3、TIGIT-005-H2L1d、TIGIT-006-H5L3、TIGIT-070-H1L1四株人源化抗體保持了和嵌合抗體相當的親和力、結合活性和阻斷效應，未受人源化明顯影響，且表現總體優於RG6058。

表18 SJL小鼠衍生的抗人TIGIT單克隆抗體的人源化變體鑒定匯總

TIGIT人源化變體	人TIGIT ECD-His	人TIGIT ECD-hFc/CHO-K1 CD155阻斷實驗	CHO-K1 人TIGIT（高表達株）	人TIGIT ECD-mFc結合實驗	CHO-K1 食蟹猴TIGIT結合實驗	食蟹猴TIGIT ECD-mFc結合實驗
ka (1/Ms)	kd (1/s)	KD (M)	與嵌合抗體KD的倍數	IC50(nM)	EC50(nM)	EC50(nM)	EC50(nM)	EC50(nM)
TIGIT-002-H1L1	無數據 ^*	無數據	無數據	無數據	0.5258	0.0201	0.0155	0.1866	0.2087
TIGIT-002-H1L2	無數據	無數據	無數據	無數據	0.4212	0.0167	0.0158	0.2206	0.0811
TIGIT-002-H1L3	3.59E+06	9.73E-04	2.71E-10	6.44	0.3953	0.0253	0.0157	0.1429	0.0511
TIGIT-002-H2L1	無數據	無數據	無數據	無數據	0.6459	0.0468	0.0188	0.1809	0.0877
TIGIT-002-H2L2	無數據	無數據	無數據	無數據	0.5600	0.0215	0.0222	0.1198	0.0554
TIGIT-002-H2L3	4.03E+06	1.07E-03	2.66E-10	6.30	0.5401	0.0278	0.0159	0.1498	0.0337
TIGIT-002-H3L1	無數據	無數據	無數據	無數據	0.4593	0.0204	0.0120	0.2320	0.0253
TIGIT-002-H3L2	無數據	無數據	無數據	無數據	0.3938	0.0329	0.0170	0.1134	0.0218
TIGIT-002-H3L3	4.52E+06	8.52E-04	1.88E-10	4.47	0.3385	0.0361	0.0173	0.0919	0.0220
TIGIT-002-H4L1	無數據	無數據	無數據	無數據	0.4449	0.0253	0.0164	0.0543	0.0206
TIGIT-002-H4L2	無數據	無數據	無數據	無數據	0.4397	0.0294	0.0179	0.0474	0.0254
TIGIT-002-H4L3	5.65E+06	3.00E-04	5.31E-11	1.26	0.3540	0.0249	0.0138	0.0473	0.0189
TIGIT-CHI-002	7.13E+06	3.00E-04	4.21E-11	1.00	0.5635	0.0218	0.0161	0.0372	0.0200
TIGIT-005-H1L1	無數據	無數據	無數據	無數據	不結合	0.0021	45632	0.0011	18459
TIGIT-005-H2L1	4.26E+06	1.61E-04	3.78E-11	1.37	0.3211	0.0281	0.0141	0.0199	0.0145
TIGIT-005-H2L2	4.33E+06	1.74E-03	4.02E-10	14.57	0.3530	0.0232	0.0110	0.0218	0.0107
TIGIT-005-H3L1	4.62E+06	1.55E-04	3.35E-11	1.21	0.3931	0.0223	0.0144	0.0261	0.0151
TIGIT-005-H4L1	2.07E+06	1.52E-04	7.33E-11	2.66	0.3845	0.0257	0.0124	0.0251	0.0136
TIGIT-CHI-005	4.76E+06	1.13E-04	2.76E-11	1.00	0.3596	0.0260	0.0190	0.0265	0.0165
TIGIT-005-H2L1	3.54E+06	2.63E-04	7.42E-11	1.00	0.3890	0.0272	0.0247	0.0470	0.0393
TIGIT-005-H2L1a	2.83E+06	1.05E-02	3.71E-09	50.01	0.7165	0.0129	0.0289	0.0561	0.0357
TIGIT-005-H2L1b	3.38E+06	2.48E-03	7.34E-10	9.89	0.3581	0.0279	0.0238	0.0368	0.0320
TIGIT-005-H2L1c	2.49E+06	4.59E-04	1.84E-10	2.48	0.3468	0.0246	0.0268	0.0673	0.0296
TIGIT-005-H2L1d	4.03E+06	3.61E-04	8.96E-11	1.21	0.3758	0.0439	0.0291	0.0566	0.0403
TIGIT-006-H1L1	1.22E+05	7.57E-04	6.21E-09	80.27	1.5340	0.0702	0.0186	不結合	不結合
TIGIT-006-H1L2	1.17E+05	6.66E-04	5.71E-09	73.78	1.5820	0.1049	0.0183	不結合	不結合
TIGIT-006-H1L3	1.44E+05	3.84E-04	2.66E-09	34.43	1.2320	0.0596	0.0185	不結合	不結合
TIGIT-006-H2L1	4.03E+05	3.82E-04	9.50E-10	12.28	0.5284	0.0383	0.0106	0.3421	2.8790
TIGIT-006-H2L2	3.63E+05	3.24E-04	8.93E-10	11.54	0.9045	0.0444	0.0117	9.02E+14	3.3840
TIGIT-006-H2L3	4.20E+05	2.16E-04	5.15E-10	6.65	0.6332	0.0353	0.0103	0.2553	24.4200
TIGIT-006-H3L1	3.42E+05	2.41E-04	7.05E-10	9.11	0.6367	0.0468	0.0096	結合弱	2.8070
TIGIT-006-H3L2	2.79E+05	2.08E-04	7.48E-10	9.66	0.7088	0.0494	0.0099	1.3810	7.4440
TIGIT-006-H3L3	3.65E+05	1.76E-04	4.82E-10	6.23	0.6815	0.0317	0.0095	6.2950	0.7790
TIGIT-006-H4L1	3.93E+05	2.58E-04	6.57E-10	8.49	0.7039	0.0349	0.0086	7.63E+09	1.5260
TIGIT-006-H4L2	3.37E+05	2.21E-04	6.58E-10	8.50	0.6708	0.0251	0.0113	結合弱	0.9967
TIGIT-006-H4L3	4.41E+05	1.88E-04	4.28E-10	5.52	0.6142	0.0316	0.0101	2.1050	0.7326
TIGIT-006-H5L1	2.29E+06	1.63E-04	7.13E-11	0.92	0.5370	0.0399	0.0108	0.1615	0.0182
TIGIT-006-H5L2	2.30E+06	1.84E-04	8.00E-11	1.03	0.5756	0.0239	0.0111	0.0849	0.0172
TIGIT-006-H5L3	2.51E+06	1.60E-04	6.39E-11	0.83	0.5866	0.0220	0.0092	0.0578	0.0132
TIGIT-CHI-006	2.09E+06	1.62E-04	7.74E-11	1.00	0.5789	0.0299	0.0152	0.1498	0.0258
TIGIT-070-H1L1	1.98E+06	1.16E-04	5.83E-11	0.59	0.5025	0.0260	0.0149	0.0596	0.0123
TIGIT-070-H1L2	1.67E+06	1.48E-04	8.83E-11	0.90	0.4206	0.0272	0.0118	0.0879	0.0116
TIGIT-070-H1L3	1.78E+06	1.29E-04	7.24E-11	0.74	0.4451	0.0240	0.0148	0.1121	0.0137
TIGIT-070-H2L1	1.66E+06	1.34E-04	8.08E-11	0.82	0.3927	0.0236	0.0129	0.0799	0.0124
TIGIT-070-H2L2	1.67E+06	1.42E-04	8.51E-11	0.87	0.4478	0.0312	0.0125	0.0662	0.0112
TIGIT-070-H2L3	1.77E+06	1.34E-04	7.56E-11	0.77	0.3504	0.0209	0.0119	0.0774	0.0119
TIGIT-070-H3L1	1.26E+06	1.52E-04	1.21E-10	1.23	0.4630	0.0132	0.0131	0.0741	0.0139
TIGIT-070-H3L2	1.30E+06	1.68E-04	1.29E-10	1.32	0.4233	0.0276	0.0143	0.0665	0.0157
TIGIT-070-H3L3	1.31E+06	1.51E-04	1.15E-10	1.17	0.4166	0.0300	0.0151	0.0556	0.0142
TIGIT-CHI-070	1.48E+06	1.45E-04	9.80E-11	1.00	0.6374	0.0330	0.0159	0.0741	0.0184

無數據：未檢測

實施例 6抗TIGIT人源化抗體的鑒定

（a）抗TIGIT人源化抗體與人TIGIT ECD-mFc和食蟹猴TIGIT ECD-mFc的結合活性檢測

實驗方法參見實施例4（a）。實驗結果表明和對照抗體羅氏RG6058相一致，抗TIGIT人源化抗體能有效結合人TIGIT ECD-mFc（圖13）和食蟹猴TIGIT ECD-mFc（圖14）。

（b）FACS檢測抗TIGIT人源化抗體與CHO-K1人TIGIT高中低表達水準的細胞和CHO-K1 食蟹猴TIGIT的結合活性

實驗方法參見實施例4（b）。實驗結果表明和對照抗體羅氏RG6058一致，抗TIGIT人源化抗體可以有效結合CHO-K1-TIGIT高表達細胞株（圖15）， CHO-K1-TIGIT中表達細胞株（圖16），CHO-K1-TIGIT低表達細胞株（圖17）及CHO-K1-食蟹猴TIGIT細胞株（圖18）。

（c）FACS方法檢測抗TIGIT人源化抗體阻斷Bio-CD155-His與CHO-K1 人TIGIT的相互作用

實驗方法參見實施例4（c）。如圖19所示，抗TIGIT人源化抗體與對照抗體RG6058都可以有效阻斷Bio-CD155-His蛋白與CHO-K1-人TIGIT細胞的結合。

（d）FACS方法檢測抗TIGIT人源化抗體阻斷TIGIT ECD-mFc與CHO-K1 CD155的相互作用

實驗方法參見實施例4（d）。如圖20所示，抗TIGIT人源化抗體與對照抗體RG6058都可以有效阻斷人TIGIT蛋白與CHO-K1-CD155細胞的結合。

（e）FACS方法檢測抗TIGIT人源化抗體阻斷TIGIT ECD-mFc與CHO-K1 CD112相互作用的效應

收集CHO-K1 CD112細胞，PBS（Hyclone，CAT#SH30256）洗一次，1%BSA-PBS重懸至2×105/40 µL，1%BSA-PBS稀釋人源化抗體至600nM，2.5倍連續梯度稀釋12個濃度點，1%BSA-PBS稀釋TIGIT ECD-mFc至6 µg/mL，隨後將40 µL細胞與40 µL抗體稀釋液以及40 µL TIGIT ECD-mFc稀釋液混合，4℃孵育60分鐘，PBS洗兩次，加入Alexa Fluor® 647螢光素標記的二抗（工作稀釋度1：800，Jackson, CAT# 115-605-003），100 µL/孔重懸細胞，4℃孵育40分鐘，PBS洗兩次，用1%BSA-PBS，100 µL/孔重懸，在流式細胞儀（BD, Canto Ⅱ）上分析細胞樣品。如圖21所示，抗TIGIT人源化抗體與對照抗體RG6058都可以有效阻斷人TIGIT蛋白與CHO-K1-CD112細胞的結合。

（f）FACS方法檢測抗TIGIT人源化抗體與人PBMC的結合活性

取新鮮的人PBMC（AllCells，PB004-C），將細胞調整至5×105/mL，同時加入SEA（Toxin Technology, Inc. ，CAT：AT101）至100ng/mL，37℃ 5%CO2培養三天；三天後收集細胞，PBS（Hyclone，CAT#SH30256）洗一次, 加入Fc Block（BD，564220），4℃孵育10分鐘，PBS洗兩次，1%BSA-PBS重懸至2×105/50 µL，1%BSA-PBS稀釋人源化抗體至80nM，3倍連續梯度稀釋12個濃度點，將50 µL細胞與50 µL抗體稀釋液混合，4℃孵育60分鐘，PBS洗兩次，加入Alexa Fluor® 647螢光素標記的二抗（工作稀釋度1：800，Jackson，CAT# 109-605-088），100 µL/孔重懸細胞，4℃孵育60分鐘，PBS洗兩次，用1%BSA-PBS，100 µL/孔重懸，在流式細胞儀（BD, Canto Ⅱ）上分析細胞樣品。如圖22所示，和對照抗體羅氏RG6058相一致，抗TIGIT人源化抗體能有效結合SEA刺激後的人PBMC。

表19匯總了這四株人源化抗體的特性。TIGIT-002-H4L3、TIGIT-005-H2L1d、TIGIT-006-H5L3、TIGIT-070-H1L1四株人源化抗體與PBMC、以及與人TIGIT高中低表達水準的穩轉株細胞的結合趨勢一致，TIGIT-002-H4L3和TIGIT-005-H2L1d強於TIGIT-006-H5L3和TIGIT-070-H1L1，都強於RG6058，與人TIGIT ECD-His單價親和力依次為0.0994nM、0.0852nM、0.1145nM、0.2505nM，RG6058為0.1560nM，且都與食蟹猴TIGIT有較強的交叉反應性；在體外阻斷表徵方面，四株人源化抗體都表現出了較顯著的阻斷TIGIT-CD155以及TIGIT-CD112相互作用的能力。

表19 TIGIT-002-H4L3、TIGIT-005-H2L1d、TIGIT-006-H5L3、TIGIT-070-H1L1四株人源化抗體的生物活性

TIGIT人源化抗體	人TIGIT ECD-His	人TIGIT ECD-mFc/CHO-K1 CD155阻斷實驗	Bio-CD155-His /CHO-K1 人TIGIT 阻斷實驗	人TIGIT ECD-mFc/CHO-K1 CD112阻斷實驗	人PBMC結合實驗	CHO-K1 人TIGIT(高表達株)	CHO-K1 人TIGIT(中表達株)	CHO-K1 人TIGIT(低表達株)	人TIGIT ECD-mFc結合實驗	CHO-K1食蟹猴TIGIT結合實驗	食蟹猴TIGIT ECD-mFc結合實驗
ka(1/Ms)	kd (1/s)	KD (M)	IC50 (nM)	IC50 (nM)	IC50 (nM)	EC50 (nM)	EC50 (nM)	EC50 (nM)	EC50 (nM)	EC50 (nM)	EC50 (nM)	EC50 (nM)
TIGIT-002-H4L3	2.95E+06	2.93E-04	9.94E-11	0.4919	0.1373	3.4930	0.0436	0.2970	0.2282	0.1696	0.0370	0.7234	0.0427
TIGIT-005-H2L1d	3.02E+06	2.57E-04	8.52E-11	0.4666	0.1501	3.4880	0.0602	0.3210	0.2848	0.1856	0.0311	0.6315	0.0395
TIGIT-006-H5L3	1.60E+06	1.83E-04	1.15E-10	0.4583	0.1714	4.6480	0.0916	0.4430	0.3963	0.2677	0.0319	0.9222	0.0406
TIGIT-070-H1L1	8.75E+05	2.19E-04	2.51E-10	0.4558	0.2123	4.3030	0.1211	0.4945	0.4500	0.3048	0.0284	1.0490	0.0347
RG6058-hIgG1	8.66E+05	1.35E-04	1.56E-10	0.5840	0.3340	6.0000	0.2849	0.7945	0.6523	0.4807	0.0393	2.2850	0.0486

（g）NK細胞殺傷實驗檢測抗TIGIT人源化抗體對NK殺傷靶細胞的促進作用

實驗方法參見實施例4（g）。圖23表明：陰性對照anti-HA HcAb-hIgG1對NK殺傷沒有顯著影響，四個人源化抗體TIGIT-002-H4L3、TIGIT-005-H2L1d、TIGIT-006-H5L3和TIGIT-070-H1L1能不同程度地促進NK對靶細胞的殺傷，其中TIGIT-002-H4L3、TIGIT-005-H2L1d與其人源化前嵌合抗體TIGIT-CHI-002、TIGIT-CHI-005的NK殺傷促進能力相當。

（h）CMV antigen-recall assay檢測抗TIGIT人源化抗體對抗原特異性CD8 T細胞的功能改善作用

PBMC復甦後，用含有1mg/mL CMV pp65(495-503)多肽(Anaspec, 貨號AS-28328)、2ng/mL human IL-2(R&D, 貨號IL-202)、10ng/mL human IL-7 (Peprotech, 貨號200-07)的完全培養基（RPMI1640-Glutamax + 5%AB serum + 1% P/S+1×2-β巰基乙醇）重懸至2×106/mL，5mL/孔接種於6孔板中，37℃ 5%CO2培養6天。第6天，收集所有細胞，撤去培養基中的pp65和IL-7，將細胞一分為二，並重懸於含有100 IU/mL human IL-2的完全培養基中，繼續培養2天。第8天，收集所有細胞，重懸於含有100IU/mL human IL-2的完全培養基中、並調整細胞密度為2×106/mL，繼續培養。第11天，收集所有細胞，流式檢測PBMC中CD8T細胞的比例，CMV pp65(495-503)特異性CD8T的比例（圖24中A）及該細胞上PVRIG、TIGIT、PD-1和CD226的表達（圖24中B）。流式檢測抗體如下：Livedead Near IR (Invitrogen，貨號L34976)，CD8-PerCp Cy5.5(BD，貨號565310)，CD3-PE-Cy7(Biolegend,貨號300316)，T-select HLA-A*0201 CMV pp65 Tetramer-PE(MBL，貨號TS-0010-1C)，PVRIG-AF488(R&D，貨號FAB93651G-100UG)，TIGIT-APC (Biolegend,貨號372706)，PD-1-BV421 (BD,貨號562516)。

上述誘導後的PBMC經CD8 T分選試劑盒（Stemcell，貨號17953）分離出CD8 T作為效應細胞，用AIM-V重懸並調整細胞密度至0.4×106/mL。分選後的CD8檢測純度及CD226的表達。Colo205作為靶細胞，經TrypLETM Express Enzyme(Gibco, 貨號12605010)消化，重懸於含有20ng/mL pp65的AIM-V(Gibco, 貨號31035-025)並調整細胞密度至1×106/mL，37℃ 5% CO2處理3小時，之後250g離心5分鐘，棄上清。之後細胞用AIM-V重懸至0.5×106/mL。抗TIGIT人源化抗體或陽性對照用AIM-V稀釋至280nM。在低吸附96孔U底板（Corning, 貨號7007）中依次加入50 µL抗體，50 µL CD8 T，100 µL pp65處理過的colo205，並用排槍輕輕混勻，37℃ 5%CO2孵育18小時。此體系中藥物終濃度為70nM，CD8 T為20000/孔，colo205為50000/孔。孵育結束後400g離心取上清，用ELISA試劑盒（達科為，貨號1110003）檢測上清中human IFN-γ的水準。此體系中的陽性對照為RG6058-hIgG1和TIGIT人源化前的抗體（TIGIT-CHI-002），陰性對照為no treatment。如圖24中C所示，相較於RG6058-hIgG1，4個TIGIT人源化抗體(TIGIT-002-H4L3、TIGIT-005-H2L1d、TIGIT-006-H5L3、TIGIT-070-H1L1)作用後，細胞上清中的IFN-γ的分泌在統計學上均無顯著性差異（One-way ANOVA Analysis）；相較於TIGIT人源化前的嵌合抗體（TIGIT-CHI-002），4個抗TIGIT人源化抗體作用後，細胞上清中的IFN-γ的分泌在統計學上均無顯著性差異（One-way ANOVA Analysis）但均顯著高於no treatment組，每個柱狀圖上的百分比意為相較於no treatment組IFN-γ分泌提升的百分比。

分選後CD8 T純度及其上CD226表達的流式檢測抗體如下：livedead-BV421 (Invitrogen,貨號L34964)，CD8-FITC(BD,貨號555366 )，CD226-PE-Cy7（Biolegend，貨號338316）。Colo205上PVRL2、PVR、PD-L1、HLA-A2表達的流式檢測抗體如下：livedead-BV421 (Invitrogen,貨號L34964)，PVRL2-APC（Biolegend，貨號337412），PVR- PerCp Cy5.5(Biolegend，貨號337612), PD-L1-PE-Cy7(BD，貨號558017), HLA-A2-PE(Biolegend, 貨號343306)。

實施例 7 PVRIG 羊駝 VHH 抗體的製備

選取兩隻成年健康羊駝（Alpaca）（委託成都阿派克公司購買）在第一次免疫注射用弗氏完全佐劑（complete freund'sadjuvant，CFA，購自SIGMA，貨號：F5881）混合人PVRIG重組蛋白（Acro Biosystems, 貨號：PVG H5257），後三次免疫注射的佐劑則用弗氏不完全佐劑（incomplete freund's adjuvant，IFA，購自SIGMA，貨號：F5506）混合與第一次相同的人PVRIG重組蛋白，4次免疫均採用皮下注射。免疫前取血10 mL，留為陰性血清對照，在第二次免疫後取血10 mL檢測血清抗體滴度，在第三和四次免疫後分別取外周血50 mL分離淋巴細胞，根據淋巴細胞量加入5 mL RNA iso Plus（Takara，貨號：9109），分裝於1.5 mL EP管中於-80ºC保存。從凍存的淋巴細胞中提取總RNA反轉錄成cDNA，然後以cDNA為範本分別進行兩輪VHH PCR擴增。酶切第二輪PCR擴增的VHH產物進行噬菌體文庫的構建。收集建立的細菌庫，並對庫插入率和多樣性進行測序分析。

對噬菌體進行兩輪親和淘選，對特異性結合靶蛋白人PVRIG-his（AcroBiosystems，貨號 PVG-H52H4）的噬菌體克隆進行鑒定。將淘選中和人PVRIG-His蛋白結合較好的優選克隆測序後透過同源重組方法克隆到表達載體中，其中CH2和CH3恆定區都來自於人IgG1，完整表達序列是訊號肽-VHH-鉸鏈區-CH2-CH3。經過一系列理化和功能篩選後共獲得13個陽性候選抗體分子，其序列的CDRs分別用IMGT和KABAT軟體分析，對應的序列資訊如下表20至22所示，其中表20示出候選抗體分子的VHH序列，表21示出候選抗體分子的IMGT分析結果，表22示出候選抗體分子的KABAT分析結果。

表 20 候選抗體分子 VHH 序列

抗體編號	序列編號	sequence
PVRIG-A11	SEQ ID NO：107	QLQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTDDYYAIGWFRQAPGKEREGVSCISGSGGSTNYEDSVKGRFAISRDNAKNMVYLQMNDLKPEDTAVYYCAADPFWSAPCTGHNDRYFDVWGQGTLVTVSS
PVRIG-A15	SEQ ID NO： 108	QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCVASGRTFSANTMAWFRQAPGKEREFVAYTRWTDDNTDYASYADFVKGRFTAFRDNTRNTMYLQMNRLRPEDTAVYYCAAATTRGTYYSAGDYNSWGQGTQVTVSS
PVRIG-A30	SEQ ID NO： 109	QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTDSMNVMGWFRRAPGKEREFVARIKWNGDTTYTAYADFLKGRFTLYGAVARNRVYLQMNSLQPEDTAVYYCAAGEVSGSSYSPDYGMHYWGKGTLVTVSS
PVRIG-A50	SEQ ID NO： 110	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSYYDMSWVRQAPGKGLEWVSTINSNGGRTSYVDSVKGRFTISRDNTKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCVEGDPHNFGLENLSLRDFGSWGQGTQVTVSS
PVRIG-A60	SEQ ID NO： 111	QVQLVESGGGLVQSGGSLRLSCAASGRTRSMYVMGWFRQAPGKEREFVGRIKWSGDTTYTSYADFVKGRFTLYGNQARNTVYLQMNSLKPEDAAVYYCNLRRLDGVNYWGKGTLVTVSS
PVRIG-A75	SEQ ID NO： 112	QLQLVESGGGLVQSGGSLRLSCAASGRTRSMYVMGWFRQAPGKEREFVGRIKWSGDTTYTSYADFVKGRFTLYGNQARNTVYLQMNSLKPEDTAVYSCAASKFPVSGVPEHYDYWGQGTQVTVSS
PVRIG-A35	SEQ ID NO： 113	EVQVVESGGGLVQSGGSLRLSCAASGRTRSMYVMGWFRQAPGKEREFVGRIKWSGDTTYTSYADFVKGRFTLYGNQARNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNGRSRFNVINAWGTGTLVTVAS
PVRIG-A43	SEQ ID NO： 114	QVQLVESGGGLVQSGGSLRLSCAASGRTRSMYVMGWFRQAPGKEREFVGRIKWSGDTTYTSYADFVKGRFTLYGNQARNTVYLQMNSLKVEDTAVYYCAGRVVPLPSRQRDRYDYWGQGTQVTVSS
PVRIG-A104	SEQ ID NO： 115	EVQVVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTRSMYVMGWFRQAPGKEREFVGRIKWSGDTTYTSYADFVKGRFTLYGNQARNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCYRRSWTNTKLYWGKGIQVTVSS
PVRIG-A105	SEQ ID NO： 116	EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFDRHTMTWFRQAPGKEREFVATASRIPGDTYYSHSVKGRFTISRDNAKNTVYLQLNNLKPEDTAVYYCAATSAYCSEVDCYEKGSWYDNWGQGIQVTVSS
PVRIG-A113	SEQ ID NO： 117	QLQLVESGGGLVQSGGSLRLSCAASGRTRSMYVMGWFRQAPGKEREFVGRIKWSGDTTYTSYADFVKGRFTLYGNQARNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAALPSDYDYRAASYGVDYWGKGTLVTVSS
PVRIG-A117	SEQ ID NO： 118	EVQVVESGGGLVQAGGSLRLSCTASEHIYDLYIMGWYRQAPGKDRELVATITYTGSIYIADSVKDRFTISRGNAKNTVSLQMSGLKPEDTAVYYCNADPSGLGRKLYWGQGTQVTVSS
PVRIG-A118	SEQ ID NO： 119	QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASETYFDLYVMGWYRQAPGKDRELVATITYTGSIKIVDSVKDRFTISRGDAKNTVSLQMSSLKPEDTAVYFCNADPSGLGRKVYWGQGTQVTVSS

表 21 候選抗體分子的 IMGT 分析結果

抗體編號	CDR1-IMGT	CDR2-IMGT	CDR3-IMGT
PVRIG-A11	GFTDDYYA SEQ ID NO：120	ISGSGGST SEQ ID NO：121	AADPFWSAPCTGHNDRYFDV SEQ ID NO：122
PVRIG-A15	GRTFSANT SEQ ID NO：123	TRWTDDNTDYA SEQ ID NO：124	AAATTRGTYYSAGDYNS SEQ ID NO：125
PVRIG-A30	GRTDSMNV SEQ ID NO：126	IKWNGDTTYT SEQ ID NO：127	AAGEVSGSSYSPDYGMHY SEQ ID NO：128
PVRIG-A50	GFTFSYYD SEQ ID NO：129	INSNGGRT SEQ ID NO：130	VEGDPHNFGLENLSLRDFGS SEQ ID NO：131
PVRIG-A60	GRTRSMYV SEQ ID NO：132	IKWSGDTTYT SEQ ID NO：133	NLRRLDGVNY SEQ ID NO：134
PVRIG-A75	GRTRSMYV SEQ ID NO：135	IKWSGDTTYT SEQ ID NO：136	AASKFPVSGVPEHYDY SEQ ID NO：137
PVRIG-A35	GRTRSMYV SEQ ID NO：138	IKWSGDTTYT SEQ ID NO：139	NGRSRFNVINA SEQ ID NO：140
PVRIG-A43	GRTRSMYV SEQ ID NO：141	IKWSGDTTYT SEQ ID NO：142	AGRVVPLPSRQRDRYDY SEQ ID NO：143
PVRIG-A104	GRTRSMYV SEQ ID NO：144	IKWSGDTTYT SEQ ID NO：145	YRRSWTNTKLY SEQ ID NO：146
PVRIG-A105	GRTFDRHT SEQ ID NO：147	ASRIPGDT SEQ ID NO：148	AATSAYCSEVDCYEKGSWYDN SEQ ID NO：149
PVRIG-A113	GRTRSMYV SEQ ID NO：150	IKWSGDTTYT SEQ ID NO：151	AALPSDYDYRAASYGVDY SEQ ID NO：152
PVRIG-A117	EHIYDLYI SEQ ID NO：153	ITYTGSI SEQ ID NO：154	NADPSGLGRKLY SEQ ID NO：155
PVRIG-A118	ETYFDLYV SEQ ID NO：156	ITYTGSI SEQ ID NO：157	NADPSGLGRKVY SEQ ID NO：158

表 22 候選抗體分子的 KABAT 分析結果

抗體編號	CDR1-KABAT	CDR2-KABAT	CDR3-KABAT
PVRIG-A11	YYAIG SEQ ID NO：159	CISGSGGSTNYEDSVKG SEQ ID NO：160	DPFWSAPCTGHNDRYFDV SEQ ID NO：161
PVRIG-A15	ANTMA SEQ ID NO：162	YTRWTDDNTDYASYADFVKG SEQ ID NO：163	ATTRGTYYSAGDYNS SEQ ID NO：164
PVRIG-A30	MNVMG SEQ ID NO：165	RIKWNGDTTYTAYADFLKG SEQ ID NO：166	GEVSGSSYSPDYGMHY SEQ ID NO：167
PVRIG-A50	YYDMS SEQ ID NO：168	TINSNGGRTSYVDSVKG SEQ ID NO：169	GDPHNFGLENLSLRDFGS SEQ ID NO：170
PVRIG-A60	MYVMG SEQ ID NO：171	RIKWSGDTTYTSYADFVKG SEQ ID NO：172	RRLDGVNY SEQ ID NO：173
PVRIG-A75	MYVMG SEQ ID NO：174	RIKWSGDTTYTSYADFVKG SEQ ID NO：175	SKFPVSGVPEHYDY SEQ ID NO：176
PVRIG-A35	MYVMG SEQ ID NO：177	RIKWSGDTTYTSYADFVKG SEQ ID NO：178	RSRFNVINA SEQ ID NO：179
PVRIG-A43	MYVMG SEQ ID NO：180	RIKWSGDTTYTSYADFVKG SEQ ID NO：181	RVVPLPSRQRDRYDY SEQ ID NO：182
PVRIG-A104	MYVMG SEQ ID NO：183	RIKWSGDTTYTSYADFVKG SEQ ID NO：184	RSWTNTKLY SEQ ID NO：185
PVRIG-A105	RHTMT SEQ ID NO：186	TASRIPGDTYYSHSVKG SEQ ID NO：187	TSAYCSEVDCYEKGSWYDN SEQ ID NO：188
PVRIG-A113	MYVMG SEQ ID NO：189	RIKWSGDTTYTSYADFVKG SEQ ID NO：190	LPSDYDYRAASYGVDY SEQ ID NO：191
PVRIG-A117	LYIMG SEQ ID NO：192	TITYTGSIYIADSVKD SEQ ID NO：193	DPSGLGRKLY SEQ ID NO：194
PVRIG-A118	LYVMG SEQ ID NO：195	TITYTGSIKIVDSVKD SEQ ID NO：196	DPSGLGRKVY SEQ ID NO：197

實施例 8 ELISA 檢測抗 PVRIG 抗體與人和食蟹猴 PVRIG 蛋白的特異性結合

酶標板中預先包被100 μL/孔的0.5 μg/mL人PVRIG-his（AcroBiosystems，貨號 PVG-H52H4）或食蟹猴PVRIG蛋白（Novoprotein，貨號C09B）；將受試抗PVRIG抗體（實施例7所述VHH連接人IgG1-Fc構成）進行梯度稀釋（起始濃度20 nM、3.33倍梯度稀釋或3 nM、3倍梯度稀釋），100 μL/孔加樣，室溫振盪孵育1.5小時；洗板後加入鼠抗人（mouse anti-human）IgG Fc-HRP (Jackson ImmunoResearch，貨號209-035-098) 工作液（1:10000稀釋），100 μL/孔加樣，室溫振盪孵育1.0小時；再次洗板，加入HRP的底物TMB (Thermo，貨號34029) 進行顯色，加入終止液終止反應後用酶標儀（MD i3x）讀取吸光值。以抗體濃度為橫坐標，對應的OD值為縱坐標繪製抗體的結合曲線，四參數擬合 (GraphPad Prism9)，計算EC50值。EC50值越小，抗體與人/食蟹猴PVRIG結合的能力越強。陽性對照抗體有COM701-hIgG1 (Patent No.:US20180244774A1)、COM701-hIgG4 (patent No.: US20180244774A1) 和SRF813-hIgG1 (Patent No.: US20200040081A1)；陰性對照抗體有anti-HA HcAb-hIgG1(成都阿派克，貨號NBR022)、anti-CD38 HcAb-hIgG1 (in-house)和anti- Fluorescein-hIgG1（in-house）。

COM701對應的胺基酸序列如下所示：

COM701 VH SEQ ID NO 236: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNINWVRQAPGQGLEWMGYIYPYIGGSGYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREDKTARNAMDYWGQGTLVTVSS

COM701 VL SEQ ID NO 237: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRVSENIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYEATNLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPYTFGQGTKLEIK

SRF813 VH SEQ ID NO 238: QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSAAISWVRQAPGQGLEWMGNIIPIVGIANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDTGRGYTRHFWFDPWGQGTLVTVSS

SRF813 VL SEQ ID NO 239: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSDILYTFGGGTKVEIK

13個抗PVRIG抗體與人PVRIG蛋白的結合結果見圖26A和表23，與食蟹猴PVRIG的結合結果見圖26B和表23。資料表明，所有受試抗體均能和人或食蟹猴PVRIG蛋白特異性結合。

表 23 抗 PVRIG 抗體與人或食蟹猴 PVRIG 蛋白特異性結合的 ELISA 結果

抗體編號	EC50 (pM)
與人PVRIG蛋白結合	與食蟹猴PVRIG蛋白結合
PVRIG-A11	121.40	28.91
PVRIG-A15	207.70	128.60
PVRIG-A30	254.70	93.00
PVRIG-A50	195.70	53.35
PVRIG-A60	55.66	34.29
PVRIG-A75	62.11	28.83
PVRIG-A35	54.31	28.83
PVRIG-A43	53.65	35.99
PVRIG-A104	65.93	35.33
PVRIG-A105	57.07	19.24
PVRIG-A113	92.00	44.31
PVRIG-A117	52.84	41.81
PVRIG-A118	51.35	34.10

實施例 9 FACS 檢測抗 PVRIG 抗體與 FlpinCHO-PVRIG 細胞及 FlpinCHO-cyno PVRIG 細胞的結合

取轉染了人或食蟹猴PVRIG高表達質粒的CHO-K1穩定細胞（分別命名為FlpinCHO-PVRIG， FlpinCHO-cyno PVRIG），人PVRIG全長質粒（NCBI Ref Seq: NP_076975）, 以及食蟹猴PVRIG全長質粒（NCBI Ref Seq: XP_014989941）均由通用生物合成，在細胞密度不超過80%時進行實驗。棄去細胞培養基，用PBS潤洗並加入1ml Versene（Gibico，15040-066）消化8-10分鐘，用含10% FBS的Ham’s F12（Gibico，21127-022）完全培養基終止消化後製成細胞懸液。細胞計數儀（Beckman Coulter，Vi-CELL）計數後，取適量細胞懸液，350×g離心去上清，PBS洗細胞兩遍後，用死活染料Zombie violet（Biolegend，423114）進行染色，室溫孵育20分鐘。孵育結束後，用染色緩衝液（2% FBS + PBS）終止染色，350×g離心去上清，洗細胞兩遍後，用染色緩衝液將細胞重懸為2×10 ⁶個細胞/ml的密度，鋪入96孔板，每孔加入50μl的細胞懸液，待用。用染色緩衝液將抗體從最高濃度46nM（兩倍濃度）開始進行3.3倍梯度稀釋，將稀釋好的抗體加至已含有50μl細胞懸液的孔中，置於微孔板振盪器上400rpm震盪1分鐘，使抗體與細胞充分混合，4°C孵育30分鐘。孵育結束後用染色緩衝液清洗細胞兩次，每孔200μl，350×g離心5分鐘棄上清。用染色緩衝液將PE goat anti-Human IgG Fc抗體（ebioscience，12-4998-82）稀釋250倍，以每孔100μl的體積加至洗完的細胞孔中，混合均勻，4°C染色30分鐘。染色結束後同樣用染色緩衝液清洗兩次，最後用200μl染色緩衝液重懸細胞，流式上機檢測訊號（BD CantoII）。螢光訊號越強，表示抗體與PVRIG的結合能力越強。以抗體濃度為橫坐標，對應的平均螢光強度MFI倍數為縱坐標繪製抗體的結合曲線，四參數擬合 (GraphPad Prism9)，計算結合曲線的AUC值。AUC值越大，受試抗體與FlpinCHO-PVRIG、FlpinCHO-cyno PVRIG細胞結合的能力越強。如圖27A、圖27B所示，所有受試抗體均可與過表達細胞表面人/食蟹猴PVRIG結合。將抗體的結合活性歸一化到與陽性分子COM701-hIgG1以及SRF813-hIgG1抗體的百分比，百分比值越高，說明抗體結合的活性越強。表24結果表明，受試抗體PVRIG-A11、A35、A43、A105、A117、A118與人PVRIG的結合活性強於COM701-hIgG1及SRF813-hIgG1。其中，PVRIG-A105、A117與食蟹猴PVRIG的結合活性也強於COM701-hIgG1及SRF813-hIgG1。

表 24 抗 PVRIG 抗體與過表達細胞表面人 / 食蟹猴 PVRIG 的結合

抗體編號	human PVRIG binding	cyno PVRIG binding
%AUC	%AUC
to COM701-hIgG1	to SRF813-hIgG1	to COM701-hIgG1	to SRF813-hIgG1
PVRIG-A11	116.77	142.90	41.30	48.56
PVRIG-A15	36.32	42.69	24.80	29.15
PVRIG-A30	29.30	34.44	28.73	33.78
PVRIG-A50	89.54	114.99	59.31	69.73
PVRIG-A60	63.30	68.58	63.40	82.88
PVRIG-A75	50.64	54.46	47.58	62.40
PVRIG-A35	121.76	133.55	19.27	25.28
PVRIG-A43	165.18	181.18	19.62	25.73
PVRIG-A104	18.07	23.94	18.45	23.87
PVRIG-A105	122.51	162.31	121.63	157.39
PVRIG-A113	42.38	57.40	38.63	52.69
PVRIG-A117	133.29	180.80	127.75	174.25
PVRIG-A118	152.73	232.45	66.41	80.43

實施例 10 BIAcore 檢測抗 PVRIG 抗體與人 PVRIG 蛋白的親和力

利用Biacore檢測受試抗PVRIG抗體與人PVRIG蛋白之間的特異性結合。該實驗採用Protein A晶片，透過手工操作（manual run）測定出晶片捕獲稀釋後的抗體所需要的時間，以使得能飽和結合抗原Rmax為50 RU。將人PVRIG蛋白（Human PVRIG-His, Acro C227P1-9ARF1-T4）梯度稀釋至20，10，5，2.5，1.25 nM。採用多迴圈動力學測得抗體與抗原的親和力。在每一個迴圈中，注射抗體後再注入梯度濃度的PVRIG蛋白，使抗原與抗體發生結合與解離過程。每個迴圈後用Glycine pH1.5進行Protein A晶片的再生（去除晶片上的蛋白）。應用BIAcore T200分析軟體擬合抗體抗原的親和力KD。表25結果可知，所有受試抗PVRIG抗體與人PVRIG蛋白之間存在特異性結合，且親和力水準較高。

表 25 抗 PVRIG 抗體與人 PVRIG 蛋白特異性結合的 BIAcore 結果

抗體編號	抗原	KD (M)	ka (1/Ms)	kd (1/s)
PVRIG-A11	人PVRIG	1.06E-10	3.18E+07	3.38E-03
PVRIG-A15	3.77E-10	6.12E+04	2.31E-05
PVRIG-A30	4.04E-10	1.57E+05	6.36E-05
PVRIG-A50	2.54E-11	5.07E+05	1.29E-05
PVRIG-A60	2.83E-10	1.41E+05	3.97E-05
PVRIG-A75	5.31E-10	1.07E+05	5.67E-05
PVRIG-A35	8.46E-10	8.90E+03	7.53E-06
PVRIG-A43	3.66E-10	2.34E+04	8.58E-06
PVRIG-A104	2.76E-11	1.54E+05	4.24E-06
PVRIG-A105	8.41E-10	5.27E+05	4.43E-04
PVRIG-A113	2.03E-10	4.42E+05	8.96E-05
PVRIG-A117	3.67E-10	3.74E+06	1.37E-03
PVRIG-A118	4.80E-10	2.38E+06	1.14E-03
COM701-hIgG1	3.19E-10	2.04E+06	6.51E-04
SRF813-hIgG1	2.78E-10	1.14E+06	3.17E-04

實施例 11 ELISA 檢測抗 PVRIG 抗體阻斷 PVRIG 與 PVRL2 的結合

酶標板中預先包被0.5 μg/mL 100 μL/孔的人PVRIG-his 蛋白(AcroBiosystems，貨號PVG-H52H4)，將所有受試抗PVRIG抗體從最高濃度16 nM進行2倍梯度稀釋，稀釋後的抗體分別與18 ng/mL人 PVRL2-mFc（AcroBiosystems, 貨號CD2-H5257）等體積混合，按100 μL/孔加入酶標板中，室溫振盪孵育2.0小時；洗板後加入羊抗鼠IgG Fc-HRP (Jackson ImmunoResearch，貨號115-035-071) 工作液 (1:10000稀釋)，100 μL/孔，室溫振盪孵育1.0小時；再次洗板，加入HRP的底物TMB（Thermo, 貨號34029）進行顯色，加入終止液終止反應後用酶標儀（MD i3X）讀取吸光值。以抗體濃度為橫坐標，對應的OD值為縱坐標繪製抗體的抑制曲線，四參數擬合 (GraphPad Prism9)，計算IC50值。IC50值越小，抗體抑制人PVRIG與人PVRL2結合的能力越強。陽性對照抗體及陰性對照抗體，同實施例8。13個受試抗體的阻斷曲線見圖28，抑制活性見表26。從圖28及表26可知，所有受試抗體均能顯著地抑制人PVRIG與人PVRL2蛋白的結合。

表 26 受試抗體阻斷 PVRIG 和 PVRL2 的結合

樣品編號	IC50 (pM)
PVRIG-A11	121.40
PVRIG-A15	207.70
PVRIG-A30	254.70
PVRIG-A50	195.70
PVRIG-A60	55.66
PVRIG-A75	62.11
PVRIG-A35	54.31
PVRIG-A43	53.65
PVRIG-A104	65.93
PVRIG-A105	57.07
PVRIG-A113	92.00
PVRIG-A117	52.84
PVRIG-A118	51.35

實施例 12 FACS 檢測抗 PVRIG 抗體阻斷 CHO-K1-CD112 細胞與人 PVRIG-mFc 蛋白的結合

取轉染了人CD112高表達質粒的CHO-K1穩定細胞（命名為CHO-K1-CD112），人CD112全長質粒由通用生物合成（NP_001036189.1/NCBI Ref Seq: Q92692），在細胞密度不超過80%時進行實驗。棄去細胞培養基，用PBS潤洗並加入1ml 胰酶（Gibico，25200-72）消化2分鐘，用含10% FBS的Ham’s F12（Gibico，21127-022）完全培養基終止消化後製成細胞懸液。細胞計數儀（Beckman Coulter，Vi-CELL）計數後，取適量細胞懸液，350×g離心去上清，PBS洗細胞兩遍後，用死活染料Zombie violet（Biolegend，423114）進行染色，室溫孵育20分鐘。孵育結束後，用染色緩衝液（2% FBS + PBS）終止染色，350×g離心去上清，洗細胞兩遍後，用染色緩衝液將細胞重懸為1×10 ⁶個細胞/ml的密度，待用。鋪入96孔板，每孔加入50μl的細胞懸液，待用。用染色緩衝液配製人PVRIG-mFc蛋白（Acro，PVG-H5253）工作液，濃度為1µg/ml（四倍濃度），加入96孔板，每孔加入50μl的PVRIG-mFc工作液。用染色緩衝液將抗體從最高濃度275nM（四倍濃度）開始進行3倍梯度稀釋，將稀釋好的抗體加至已含有50μl PVRIG-mFc的孔中，置於微孔板振盪器上400rpm震盪1分鐘，使抗體與PVRIG-mFc蛋白充分混合，4°C孵育30分鐘。孵育結束後，直接加入上述準備的細胞懸液，每孔加入100μl，槍頭輕柔混勻後，4°C孵育30分鐘。孵育結束後用染色緩衝液清洗細胞兩次，每孔200μl，350×g離心5分鐘棄上清。用染色緩衝液將PE goat anti-mouse IgG Fc抗體（Biolegend，405337）稀釋250倍，以每孔100μl的體積加至洗完的細胞孔中，混合均勻，4°C染色30分鐘。染色結束後同樣用染色緩衝液清洗兩次，最後用200μl染色緩衝液重懸細胞，流式上機檢測訊號（BD CantoII）。螢光訊號越弱，表示抗體與競爭CHO-K1-CD112細胞結合PVRIG-mFc蛋白的能力越強。以抗體濃度為橫坐標，對應的平均螢光強度MFI倍數為縱坐標繪製抗體的結合曲線，四參數擬合 (GraphPad Prism9)，計算抗體的IC50值以及結合曲線AUC值。IC50值及AUC值越小，表示抗體競爭CHO-K1-CD112細胞結合PVRIG-mFc蛋白的能力越強，即抗體的阻斷效果越好。如圖29所示，所有受試抗體均可阻斷CHO-K1-CD112細胞結合人PVRIG-mFc蛋白。將受試抗體的競爭阻斷活性歸一化到與對照分子COM701-hIgG1以及SRF813-hIgG1抗體的百分比，百分比值越小，說明抗體的阻斷活性越強。表27結果表明，受試抗體PVRIG-A11、A15、A30、A50的阻斷活性均強於COM701-hIgG1以及SRF813-hIgG1。

表 27抗 PVRIG 抗體競爭 CHO-K1-CD112 細胞結合人 PVRIG-mFc 蛋白

抗體編號	CHO-K1-CD112 cell blocking
%IC50	%AUC
to COM701-hIgG4	to SRF813-hIgG1	to COM701-hIgG4	to SRF813-hIgG1
PVRIG-A11	62.81	64.08	77.99	58.87
PVRIG-A15	54.07	72.38	77.22	77.27
PVRIG-A30	48.12	64.41	58.86	58.90
PVRIG-A50	99.07	91.85	103.64	81.01
PVRIG-A60	98.87	96.37	117.47	102.84
PVRIG-A75	89.61	93.74	100.89	86.58
PVRIG-A35	138.27	136.23	145.00	125.72
PVRIG-A43	121.18	119.40	127.93	110.92
PVRIG-A104	117.82	115.52	151.79	110.90
PVRIG-A105	99.67	97.72	115.09	84.08
PVRIG-A113	124.29	97.94	172.27	105.69
PVRIG-A117	133.89	117.75	129.93	72.66
PVRIG-A118	110.95	97.42	109.54	75.58

實施例 13 NK 細胞表面 PVRIG 和 TIGIT 及腫瘤細胞系 Reh 和 WIDR 細胞表面 PVR 和 PVRL2 的表達檢測

利用FACS檢測NK細胞（Natural killer cell）上PVRIG，TIGIT的表達情況。實驗方法參考實施例4（e），結果如圖9A所示，不同供體donor-010及donor-050的NK細胞表面均有PVRIG及TIGTI的表達。

利用FACS檢測Reh/WIDR細胞上PVR和PVRL2的表達情況。實驗方法參考實施例4（e），其中直接吹勻Reh製備細胞懸液。WIDR細胞表面的PVR及PVRL2的表達如圖9B所述。圖30顯示，Reh細胞表面的PVR表達為陰性，PVRL2的表達為陽性。

實施例 14 NK 細胞脫粒實驗檢測抗 PVRIG 抗體對 NK 細胞的功能促進作用

利用FACS檢測NK細胞（Natural killer cell）CD107a的訊號來指示受試抗體對NK細胞脫顆粒過程的影響。實驗方法參考實施例4（f），其中Reh細胞直接混合均勻製備細胞懸液。圖31顯示，陰性對照anti-HA HcAb-hIgG1對NK細胞的CD107a沒有影響，12個PVRIG受試抗體及對照抗體COM701-hIgG1和SRF813-hIgG1均能不同程度的提高NK細胞CD107a的表達，這表明受試抗體和對照抗體均可以有效促進NK細胞的啟動。

實施例 15 NK 細胞殺傷實驗檢測 PVRIG 抗體介導的 NK 細胞對腫瘤細胞系的殺傷作用

利用FACS檢測靶細胞（WIDR）的被裂解水準來反應受試抗體對NK細胞殺傷功能的影響。實驗方法參考實施例4（g）。圖32顯示，陰性對照anti-HA HcAb-hIgG1對NK殺傷沒有影響，13個受試抗體均能有效促進NK對靶細胞WIDR的殺傷，並且除了PVRIG-A35和A43外，剩餘11個受試抗體的對WIDR細胞的殺傷促進功能均強於或與對照抗體COM701-hIgG1相當。

實施例 16 CMV antigen-recall assay 檢測抗 PVRIG 抗體對抗原特異性 CD8 T 細胞的功能改善作用

Anti-CMV IgG陽性donor的PBMC經CMV pp65(495-503)多肽誘導的CMV pp65特異性CD8T作為效應細胞，經pp65 pulsed後的colo205腫瘤細胞系作為靶細胞的實驗體系中，檢測抗PVRIG抗體對抗原特異性CD8 T細胞的功能改善作用。

復甦CMV IgG+ PBMC，用含有1mg/mL CMV pp65(495-503)多肽(Anaspec, 貨號AS-28328)、2ng/mL human IL-2(R&D, 貨號IL-202)、10ng/mL human IL-7 (Peprotech, 貨號200-07)的完全培養基（RPMI1640-Glutamax + 5%AB serum + 1% P/S+(1×) 2-β巰基乙醇）重懸至2×106/mL，5mL/孔接種於6孔板中，37℃ 5%CO2培養6天。第6天，收集所有細胞，撤去培養基中的pp65多肽和IL-7，將細胞一分為二，並重懸於含有100 IU/mL human IL-2的完全培養基中，繼續培養2天。第8天，收集所有細胞，重懸於含有100IU/mL human IL-2的完全培養基中、並調整細胞密度為2×106/mL，繼續培養。第11天，收集所有細胞，流式檢測PBMC中CD8 T細胞的比例，CMV pp65(495-503)特異性CD8 T的比例及該細胞上PVRIG、TIGIT、PD-1的表達如圖33中A、B所示，經pp65誘導後，CMV pp65(495-503)特異性CD8 T的比例超過80%，圖33中B所示pp65+CD8+ T（donor021）表達不同水準的PVRIG，TIGIT，PD-1及CD226。流式檢測抗體如下：Live/dead Near IR (Invitrogen，貨號L34976)，CD8-PerCp Cy5.5 (BD，貨號565310)，CD3-PE-Cy7 (Biolegend, 貨號300316)，T-select HLA-A*0201 CMV pp65 Tetramer-PE (MBL，貨號TS-0010-1C)，PVRIG-AF488 (R&D，貨號FAB93651G-100UG)，TIGIT-APC (Biolegend, 貨號372706)，PD-1-BV421 (BD,貨號562516)。

上述誘導後的PBMC經CD8 T分選試劑盒（Stemcell，貨號17953）分離出CD8 T作為效應細胞，用AIM-V重懸並調整細胞密度至0.4×106/mL。檢測分選後的CD8 T純度及CD226的表達。Colo205作為靶細胞，經TrypLETM Express Enzyme (Gibco, 貨號12605010) 消化，重懸於含有20ng/mL pp65的AIM-V (Gibco, 貨號31035-025) 並調整細胞密度至1×106/ml，37℃ 5% CO2處理3小時，之後250g離心5分鐘，棄上清。細胞用AIM-V重懸至0.5×106/mL，流式檢測Colo205細胞高表達PVRL2，PVR及HLA-A2如圖33中C所示。抗PVRIG抗體或陰性對照用AIM-V稀釋至280nM。在低吸附96孔U底板（Corning, 貨號7007）中依次加入50μL抗體，50μL CD8 T，100μL pp65處理過的colo205細胞，並用排槍輕輕混勻，37℃ 5%CO2孵育18小時。此體系中藥物終濃度為70nM, CD8 T為20000/孔，colo205細胞為50000/孔。孵育結束後400g離心取上清，用ELISA試劑盒（達科為，貨號1110003）檢測上清中human IFN-γ的水準。此體系中的陽性對照為COM701-hIgG4, SRF813-hIgG1, 陰性對照為no treatment。如圖33中D所示，相較於no treatment組，絕大部分受試PVRIG抗體作用後，細胞上清中IFN-γ的分泌明顯增加。

分選後CD8 T純度及其CD226表達的流式檢測抗體如下：livedead-BV421 (Invitrogen,貨號L34964)，CD8-FITC (BD,貨號555366 )，CD226-PE-Cy7 （Biolegend，貨號338316）。Colo205細胞PVRL2、PVR、PD-L1、HLA-A2表達的流式檢測抗體如下：livedead-BV421 (Invitrogen,貨號L34964)，PVRL2-APC（Biolegend，貨號337412），PVR- PerCp Cy5.5(Biolegend，貨號337612), PD-L1-PE-Cy7(BD，貨號558017), HLA-A2-PE(Biolegend, 貨號343306)。

實施例 17 羊駝抗人 PVRIG 抗體的人源化

透過比對IMGT（http://imgt.cines.fr）人類抗體重輕鏈可變區種系基因資料庫，分別挑選與羊駝抗體同源性高的重鏈可變區種系基因作為範本，將羊駝抗體的CDR分別移植到相應的人源範本中，形成次序為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的可變區序列。根據需要，將骨架序列中關鍵胺基酸回復突變為羊駝抗體對應的胺基酸，以保證原有的親和力，即得到人源化抗PVRIG單克隆抗體。

1 、 PVRIG-A50 的人源化

羊駝抗體PVRIG-A50的人源化重鏈範本為IGHV3-23*04和IGHJ3*01，將羊駝抗體PVRIG-A50的CDR分別移植到其人源範本中，即獲得對應的人源化版本，此處抗體CDR胺基酸是由Kabat編號系統確定並注釋。根據需要，將PVRIG-A50的人源化抗體的FR區序列中關鍵胺基酸進行回復突變為羊駝抗體對應的胺基酸，以保證原有的親和力。對於PVRIG-A50抗體中存在易發生化學修飾的位元點NG和糖基化位點NLS，我們對NG/NLS進行點突變以消除修飾風險。具體設計見表28。

表28 PVRIG-A50的人源化抗體設計

VHH
H1	Grafted(IGHV3-23*04) + A97V,K98E
H1a	Grafted(IGHV3-23*04) + A97V,K98E + N54D
H1b	Grafted(IGHV3-23*04) + A97V,K98E + N54D,N108S
H1c	Grafted(IGHV3-23*04) + A97V,K98E + N54D,S110A
H1d	Grafted(IGHV3-23*04) + A97V,K98E + N108S
H1e	Grafted(IGHV3-23*04) + A97V,K98E + G55A, N108S
H2a	Grafted(IGHV3-23*04) + S75T,A97V,K98E + G55A, N108S

注：Grafted(IGHV3-23*04)代表將目標抗體CDR植入人種系IGHV3-23*04 FR區序列；第一個+後面A97V表示將Grafted第97位A突變回V；第二個+後面N54D表示對NG位點進行的點突變，其它依此類推。突變胺基酸的編號為自然順序編號，下同。

PVRIG-A50人源化抗體可變區具體序列如下：

A50.VH1（PVRIG-A50-H1）胺基酸序列如SEQ ID NO：198所示： EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSYYDMSWVRQAPGKGLEWVSTINSNGGRTSYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVEGDPHNFGLENLSLRDFGSWGQGTMVTVSS

A50.VH1a（PVRIG-A50-H1a）胺基酸序列如SEQ ID NO：199所示： EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSYYDMSWVRQAPGKGLEWVSTINSDGGRTSYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVEGDPHNFGLENLSLRDFGSWGQGTMVTVSS

A50.VH1b（PVRIG-A50-H1b）胺基酸序列如SEQ ID NO：200所示： EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSYYDMSWVRQAPGKGLEWVSTINSDGGRTSYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVEGDPHNFGLESLSLRDFGSWGQGTMVTVSS

A50.VH1c（PVRIG-A50-H1c）胺基酸序列如SEQ ID NO：201所示： EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSYYDMSWVRQAPGKGLEWVSTINSDGGRTSYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVEGDPHNFGLENLALRDFGSWGQGTMVTVSS

A50.VH1d（PVRIG-A50-H1d）胺基酸序列如SEQ ID NO：202所示： EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSYYDMSWVRQAPGKGLEWVSTINSNGGRTSYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVEGDPHNFGLESLSLRDFGSWGQGTMVTVSS

A50.VH1e（PVRIG-A50-H1e）胺基酸序列如SEQ ID NO：203所示： EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSYYDMSWVRQAPGKGLEWVSTINSNAGRTSYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVEGDPHNFGLESLSLRDFGSWGQGTMVTVSS

A50.VH2a（PVRIG-A50-H2a）胺基酸序列如SEQ ID NO：204所示： EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSYYDMSWVRQAPGKGLEWVSTINSNAGRTSYVDSVKGRFTISRDNTKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVEGDPHNFGLESLSLRDFGSWGQGTMVTVSS

人源化重鏈範本IGHV3-23*04胺基酸序列如SEQ ID NO：205所示： EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK

人源化重鏈範本IGHJ3*01胺基酸序列如SEQ ID NO：206所示： WGQGTMVTVSS

根據Kabat編號系統，上述7個人源化抗體VH序列分析結果如表29所示。

表29 PVRIG-A50人源化抗體VH序列的Kabat分析結果

重鏈	CDR1	CDR2	CDR3
VH1	YYDMS SEQ ID NO：168	TINSNGGRTSYVDSVKG SEQ ID NO：169	GDPHNFGLENLSLRDFGS SEQ ID NO：170
VH1a	YYDMS SEQ ID NO：168	TINSDGGRTSYVDSVKG SEQ ID NO：207	GDPHNFGLENLSLRDFGS SEQ ID NO：170
VH1b	YYDMS SEQ ID NO：168	TINSDGGRTSYVDSVKG SEQ ID NO：207	GDPHNFGLESLSLRDFGS SEQ ID NO：208
VH1c	YYDMS SEQ ID NO：168	TINSDGGRTSYVDSVKG SEQ ID NO：207	GDPHNFGLENLALRDFGS SEQ ID NO：209
VH1d	YYDMS SEQ ID NO：168	TINSNGGRTSYVDSVKG SEQ ID NO：169	GDPHNFGLESLSLRDFGS SEQ ID NO：208
VH1e/H2a	YYDMS SEQ ID NO：168	TINSNAGRTSYVDSVKG SEQ ID NO：210	GDPHNFGLESLSLRDFGS SEQ ID NO：208

2 、 PVRIG-A105 的人源化

羊駝抗體PVRIG-A105的人源化重鏈範本為IGHV3-7*01和IGHJ3*01，將羊駝抗體PVRIG-A105的CDR分別移植到其人源範本中，即獲得對應的人源化版本，此處抗體CDR胺基酸是由IMGT編號系統確定並注釋。根據需要，將PVRIG-A105的人源化抗體的FR區序列中關鍵胺基酸進行回復突變為羊駝抗體對應的胺基酸，以保證原有的親和力。PVRIG-A105抗體存在兩個游離的半胱氨酸，為了提高抗體的穩定性，我們對Cys進行點突變。具體設計見表30。

表30 PVRIG-A105的人源化抗體設計

VHH
H1	Grafted(IGHV3-7*01) + V37F,G44E,L45R,W47F,N50T
H2	Grafted(IGHV3-7*01) + S35T,V37F,G44E,L45R,W47F,N50T
H3	Grafted(IGHV3-7*01) + S35T,V37F,G44E,L45R,W47F,N50T,L79V
H3a	Grafted(IGHV3-7*01) + S35T,V37F,G44E,L45R,W47F,N50T,L79V + C103S,C108S
H4	Grafted(IGHV3-7*01) + S35T,V37F,G44E,L45R,W47F,N50T,V61S,D62H
H5	Grafted(IGHV3-7*01) + S35T,V37F,G44E,L45R,W47F,N50T,T122I,M123Q

注：Grafted(IGHV3-7*01)代表將目標抗體CDR植入人種系IGHV3-7*01 FR區序列；第一個+後面V37F表示將Grafted第37位V突變回F；第二個+後面C103S表示對Cys位點進行的點突變，其它依此類推。突變胺基酸的編號為自然順序編號，下同。

PVRIG-A105人源化抗體可變區具體序列如下：

A105.VH1（PVRIG-A105-H1）胺基酸序列如SEQ ID NO：211所示： EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFDRHTMSWFRQAPGKEREFVATASRIPGDTYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAATSAYCSEVDCYEKGSWYDNWGQGTMVTVSS

A105.VH2（PVRIG-A105-H2）胺基酸序列如SEQ ID NO：212所示： EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFDRHTMTWFRQAPGKEREFVATASRIPGDTYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAATSAYCSEVDCYEKGSWYDNWGQGTMVTVSS

A105.VH3（PVRIG-A105-H3）胺基酸序列如SEQ ID NO：213所示： EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFDRHTMTWFRQAPGKEREFVATASRIPGDTYYVDSVKGRFTISRDNAKNSVYLQMNSLRAEDTAVYYCAATSAYCSEVDCYEKGSWYDNWGQGTMVTVSS

A105.VH4（PVRIG-A105-H4）胺基酸序列如SEQ ID NO：214所示： EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFDRHTMTWFRQAPGKEREFVATASRIPGDTYYSHSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAATSAYCSEVDCYEKGSWYDNWGQGTMVTVSS

A105.VH5（PVRIG-A105-H5）胺基酸序列如SEQ ID NO：215所示： EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFDRHTMTWFRQAPGKEREFVATASRIPGDTYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAATSAYCSEVDCYEKGSWYDNWGQGIQVTVSS

A105.VH3a（PVRIG-A105-H3a）胺基酸序列如SEQ ID NO：216所示： EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFDRHTMTWFRQAPGKEREFVATASRIPGDTYYVDSVKGRFTISRDNAKNSVYLQMNSLRAEDTAVYYCAATSAYSSEVDSYEKGSWYDNWGQGTMVTVSS

人源化重鏈範本IGHV3-7*01胺基酸序列如SEQ ID NO：217所示： EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR

根據IMGT編號系統，上述6個人源化抗體VH序列分析結果如表31所示。

表31 PVRIG-A105人源化抗體VH序列的IMGT分析結果

重鏈	CDR1	CDR2	CDR3
VH1/2/3/4/5	GRTFDRHT SEQ ID NO：147	ASRIPGDT SEQ ID NO：148	AATSAYCSEVDCYEKGSWYDN SEQ ID NO：149
VH3a	GRTFDRHT SEQ ID NO：147	ASRIPGDT SEQ ID NO：148	AATSAYSSEVDSYEKGSWYDN SEQ ID NO：218

3 、 PVRIG-A118 的人源化

羊駝抗體PVRIG-A118的人源化重鏈範本為IGHV3-7*01和IGHJ3*01，將羊駝抗體PVRIG-A118的CDR分別移植到其人源範本中，即獲得對應的人源化版本，此處抗體CDR胺基酸是由IMGT編號系統確定並注釋。根據需要，將PVRIG-A118的人源化抗體的FR區序列中關鍵胺基酸進行回復突變為羊駝抗體對應的胺基酸，以保證原有的親和力。具體設計見表32。

表32 PVRIG-A118的人源化抗體設計

VHH
H1	Grafted(IGHV3-7*01) + S35G,V37Y,G44D,L45R,W47L,N50T
H2	Grafted(IGHV3-7*01) + S35G,V37Y,G44D,L45R,W47L,N50T,Y58K
H3	Grafted(IGHV3-7*01) + S35G,V37Y,G44D,L45R,W47L,N50T,Y58K,D72G,N73D
H4	Grafted(IGHV3-7*01) + S35G,V37Y,G44D,L45R,W47L,N50T,Y58K,D72G,N73D,Y79S
H5	Grafted(IGHV3-7*01) + S35G,V37Y,G44D,L45R,W47L,N50T,Y58K,D72G,N73D,L78V
H6	Grafted(IGHV3-7*01) + S35G,V37Y,G44D,L45R,W47L,N50T,Y58K,Y59I,D72G,N73D
H7	Grafted(IGHV3-7*01) + S35G,V37Y,G44D,L45R,W47L,N50T,Y58K,D72G,N73D,Y94F

注：Grafted(IGHV3-7*01)代表將目標抗體CDR植入人種系IGHV3-7*01 FR區序列；第一個+後面S35G表示將Grafted第35位S突變回G；其它依此類推。回復突變胺基酸的編號為自然順序編號，下同。

PVRIG-A118人源化抗體可變區具體序列如下：

A118.VH1（PVRIG-A118-H1）胺基酸序列如SEQ ID NO：219所示： EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASETYFDLYVMGWYRQAPGKDRELVATITYTGSIYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCNADPSGLGRKVYWGQGTMVTVSS

A118.VH2（PVRIG-A118-H2）胺基酸序列如SEQ ID NO：220所示： EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASETYFDLYVMGWYRQAPGKDRELVATITYTGSIKYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCNADPSGLGRKVYWGQGTMVTVSS

A118.VH3（PVRIG-A118-H3）胺基酸序列如SEQ ID NO：221所示： EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASETYFDLYVMGWYRQAPGKDRELVATITYTGSIKYVDSVKGRFTISRGDAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCNADPSGLGRKVYWGQGTMVTVSS

A118.VH4（PVRIG-A118-H4）胺基酸序列如SEQ ID NO：222所示： EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASETYFDLYVMGWYRQAPGKDRELVATITYTGSIKYVDSVKGRFTISRGDAKNSLSLQMNSLRAEDTAVYYCNADPSGLGRKVYWGQGTMVTVSS

A118.VH5（PVRIG-A118-H5）胺基酸序列如SEQ ID NO：223所示： EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASETYFDLYVMGWYRQAPGKDRELVATITYTGSIKYVDSVKGRFTISRGDAKNSVYLQMNSLRAEDTAVYYCNADPSGLGRKVYWGQGTMVTVSS

A118.VH6（PVRIG-A118-H6）胺基酸序列如SEQ ID NO：224所示： EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASETYFDLYVMGWYRQAPGKDRELVATITYTGSIKIVDSVKGRFTISRGDAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCNADPSGLGRKVYWGQGTMVTVSS

A118.VH7（PVRIG-A118-H7）胺基酸序列如SEQ ID NO：225所示： EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASETYFDLYVMGWYRQAPGKDRELVATITYTGSIKYVDSVKGRFTISRGDAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYFCNADPSGLGRKVYWGQGTMVTVSS

根據IMGT編號系統，上述7個人源化抗體VH序列分析結果如表33所示。

表33 PVRIG-A118人源化抗體VH序列的IMGT分析結果

重鏈	CDR1	CDR2	CDR3
VH1/2/3/4/5/6/7	ETYFDLYV SEQ ID NO：156	ITYTGSI SEQ ID NO：157	NADPSGLGRKVY SEQ ID NO：158

實施例 18 ELISA 檢測 PVRIG 人源化抗體與人和食蟹猴 PVRIG 蛋白的特異性結合

酶標板中預先包被100 μL/孔的0.5 μg/ml人PVRIG-his（AcroBiosystems，貨號PVG-H52H4）或食蟹猴PVRIG蛋白（Novoprotein，貨號C09B）；將受試抗PVRIG人源化抗體進行梯度稀釋（起始濃度3nM，3倍梯度稀釋），100 μL/孔加樣，室溫振盪孵育1.5小時；洗板後加入鼠抗人（mouse anti-human）IgG Fc-HRP(Jackson ImmunoResearch，貨號209-035-098)工作液（1:10000稀釋），100μL/孔加樣，室溫振盪孵育1.0小時；再次洗板，加入HRP的底物TMB(Thermo，貨號34029)進行顯色，加入終止液終止反應後用酶標儀（MD i3x）讀取吸光值。以抗體濃度為橫坐標，對應的OD值為縱坐標繪製抗體的結合曲線，四參數擬合 (GraphPad Prism9)，計算EC50值。EC50值越小，抗體與人/食蟹猴PVRIG結合的能力越強。將人源化抗體的結合效果均歸一化到其對應的人源化前parental抗體，百分比值高於100%，說明人源化抗體結合的效果比parental抗體好。如圖34A、圖34B和表34所示，PVRIG-A50、PVRIG-A105、和PVRIG-A118的絕大部分人源化抗體均與人/食蟹猴PVRIG蛋白特異性地結合。

表 34 抗 PVRIG 人源化抗體與人或食蟹猴 PVRIG 蛋白特異性結合 ELISA 結果

序號	抗體編號	與人PVRIG蛋白結合	與食蟹猴PVRIG蛋白結合
EC50	%相對活性	EC50	%相對活性
(pM)	parental抗體* /受試抗體	(pM)	parental抗體 /受試抗體
1	PVRIG-A50-H1	87.12	105.02%	129.6	95.06%
2	PVRIG-A50-H1a	99.04	92.38%	185.5	66.42%
3	PVRIG-A50-H1c	104.8	87.30%	177.4	69.45%
4	PVRIG-A50-H1d	77.4	118.20%	110.6	111.39%
5	PVRIG-A50-H1e	79.06	115.72%	137.6	89.53%
6	PVRIG-A50-H2a	65.51	139.66%	180.4	68.29%
7	PVRIG-A50-H1b	81.94	111.29%	161.3	75.76%
8	PVRIG-A105-H1	48.71	149.85%	30.28	106.51%
9	PVRIG-A105-H2	51.51	141.70%	34.33	93.94%
10	PVRIG-A105-H3	58.53	124.71%	35.16	91.72%
11	PVRIG-A105-H3a	7408	0.99%	1273	2.53%
12	PVRIG-A105-H4	52.07	140.18%	36.07	89.41%
13	PVRIG-A105-H5	67.76	107.72%	37.65	85.66%
14	PVRIG-A118-H1	45.63	109.69%	584.9	4.62%
15	PVRIG-A118-H2	49.08	101.98%	593.7	4.55%
16	PVRIG-A118-H3	49.97	100.16%	79.41	34.05%
17	PVRIG-A118-H4	52.22	95.84%	72.9	37.09%
18	PVRIG-A118-H5	48.05	104.16%	67.31	40.17%
19	PVRIG-A118-H6	55.14	90.77%	55.9	48.37%
20	PVRIG-A118-H7	50.11	99.88%	81.67	33.11%

*parental抗體: 各自對應的人源化前的母抗體

實施例 19 FACS 檢測 PVRIG 人源化抗體與 FlpinCHO-PVRIG 細胞表面人 PVRIG 、以及 FlpinCHO-cyno PVRIG 細胞表面食蟹猴 PVRIG 的結合

實驗方法參見實施例9。計算出的AUC值越大，表示人源化抗體與FlpinCHO-human/cyno PVRIG細胞結合的能力越強。如圖35A所示，受試抗體PVRIG-A50、A105和A118的絕大部分人源化分子與FlpinCHO-PVRIG細胞表面人PVRIG的結合與其parental抗體結合能力相當。圖35B表明，受試抗體除PVRIG-A118人源化分子與食蟹猴PVRIG結合顯著弱於對應parental抗體外，PVRIG-A50、A105的絕大部分人源化分子與食蟹猴PVRIG的結合較好，且與其parental抗體結合能力相當。將人源化抗體的結合活性歸一化到與對照分子COM701-hIgG1以及SRF813-hIgG1抗體的百分比，如表35所示，百分比值越高，說明抗體結合的活性越強。

表 35 抗 PVRIG 人源化抗體與過表達細胞表面人 / 食蟹猴 PVRIG 的結合

PVRIG 人源化抗體	human PVRIG binding	cyno PVRIG binding
AUC%	AUC%
to COM701-hIgG1	to SRF813-hIgG1	to parental Ab*	to COM701-hIgG1	to SRF813-hIgG1	to parental Ab
PVRIG-50	73.39	129.95	100.00	47.06	57.77	100.00
PVRIG-A50-H1	74.39	131.71	101.35	45.16	55.45	95.98
PVRIG-A50-H1a	70.42	124.68	95.95	40.69	49.96	86.48
PVRIG-A50-H1c	69.16	122.46	94.24	38.81	47.64	82.47
PVRIG-A50-H1d	63.06	111.65	85.92	48.59	59.66	103.27
PVRIG-A50-H1e	60.31	106.79	82.18	43.31	53.17	92.03
PVRIG-A50-H2a	61.92	109.64	84.37	42.42	52.08	90.16
PVRIG-A50-H1b	60.53	107.17	82.47	34.38	42.21	73.06
PVRIG-A118	136.50	190.93	100.00	62.41	76.11	100.00
PVRIG-A118-H1	127.17	177.87	93.16	11.52	14.05	18.46
PVRIG-A118-H2	124.64	174.34	91.31	14.61	17.82	23.41
PVRIG-A118-H3	128.93	180.34	94.45	20.97	25.58	33.60
PVRIG-A118-H4	132.42	185.22	97.01	21.32	26.00	34.17
PVRIG-A118-H5	128.19	179.30	93.91	21.84	26.63	34.99
PVRIG-A118-H6	128.62	179.90	94.22	19.86	24.22	31.82
PVRIG-A118-H7	126.47	176.90	92.65	19.71	24.03	31.57
PVRIG-A105	123.99	186.43	100.00	87.47	108.46	100.00
PVRIG-A105-H1	122.83	184.68	99.07	81.31	100.83	92.96
PVRIG-A105-H2	127.59	191.84	102.91	84.20	104.41	96.26
PVRIG-A105-H3	125.38	188.52	101.12	86.38	107.11	98.75
PVRIG-A105-H3a	15.92	23.94	12.84	3.27	4.05	3.74
PVRIG-A105-H4	115.40	173.51	93.07	80.31	99.59	91.82
PVRIG-A105-H5	111.54	167.70	89.96	78.82	97.74	90.11

*parentalAb: 各自對應的人源化前的母抗體

實施例 20 BIAcore 檢測 PVRIG 人源化抗體與人 PVRIG 蛋白的親和力

實驗方法參見實施例10。表36結果可知，所有受試PVRIG人源化抗體與人PVRIG蛋白之間存在特異性結合，且親和力水準較高。

表 36 抗 PVRIG 人源化抗體與人 PVRIG 蛋白特異性結合的 BIAcore 結果

抗體編號	抗原	KD (M)	ka (1/Ms)	kd (1/s)
PVRIG-A50	人PVRIG	4.30E-11	4.43E+05	1.90E-05
PVRIG-A50-H1	3.62E-11	4.10E+05	1.48E-05
PVRIG-A50-H1a	4.51E-11	4.25E+05	1.92E-05
PVRIG-A50-H1c	4.62E-11	4.38E+05	2.03E-05
PVRIG-A50-H1d	5.45E-11	2.62E+05	1.43E-05
PVRIG-A50-H1e	5.51E-11	2.65E+05	1.46E-05
PVRIG-A50-H2a	5.85E-11	2.76E+05	1.61E-05
PVRIG-A50-H1b	8.04E-11	3.50E+05	2.82E-05
PVRIG-A118	4.83E-10	2.12E+06	1.02E-03
PVRIG-A118-H1	4.78E-10	1.38E+06	6.58E-04
PVRIG-A118-H2	5.17E-10	1.59E+06	8.20E-04
PVRIG-A118-H3	1.35E-09	2.59E+06	3.49E-03
PVRIG-A118-H4	1.21E-09	2.69E+06	3.27E-03
PVRIG-A118-H5	1.37E-09	2.79E+06	3.83E-03
PVRIG-A118-H6	1.10E-09	2.71E+06	2.99E-03
PVRIG-A118-H7	1.08E-09	2.41E+06	2.60E-03
PVRIG-A105	6.75E-10	7.21E+05	4.86E-04
PVRIG-A105-H1	9.32E-10	1.39E+06	1.30E-03
PVRIG-A105-H2	6.93E-10	1.33E+06	9.20E-04
PVRIG-A105-H3	6.22E-10	9.25E+05	5.76E-04
PVRIG-A105-H4	7.96E-10	9.72E+05	7.73E-04
PVRIG-A105-H5	8.18E-10	1.11E+06	9.10E-04

實施例 21 ELISA 檢測抗 PVRIG 人源化抗體阻斷 PVRIG 與 PVRL2 的結合

實驗方法參見實施例11。將人源化抗體的抑制效果均歸一化到其對應的人源化前parental抗體，百分比值高於100%，說明人源化抗體抑制的效果比parental抗體好。人源化抗體的阻斷曲線見圖36，抑制活性見表37。如圖36和表37所示，PVRIG-A50、PVRIG-A105和PVRIG-A118的絕大部分人源化抗體均能顯著地抑制人PVRIG與人PVRL2結合。

表 37 抗 PVRIG 人源化抗體阻斷 PVRIG 和 PVRL2 的結合

序號	樣品編號	阻斷人PVRIG和人PVRL2蛋白的結合
IC50 (pM)	%相對活性	AUC	%相對活性
parental抗體*/受試抗體	parental抗體/受試抗體
1	PVRIG-A50-H1	1003	77.45%	2.423	82.62%
2	PVRIG-A50-H1a	1064	73.01%	2.426	82.52%
3	PVRIG-A50-H1c	1178	65.94%	2.625	76.27%
4	PVRIG-A50-H1d	1035	75.05%	2.405	83.24%
5	PVRIG-A50-H1e	977.2	79.49%	2.323	86.18%
6	PVRIG-A50-H2a	910.8	85.29%	2.317	86.40%
7	PVRIG-A50-H1b	847.3	124.63%	1.999	104.60%
8	PVRIG-A105-H1	555.10	132.57%	2.271	111.76%
9	PVRIG-A105-H2	577.00	127.54%	2.270	111.81%
10	PVRIG-A105-H3	751.70	97.90%	2.523	100.59%
11	PVRIG-A105-H3a	no blocking	5.374	47.23%
12	PVRIG-A105-H4	686.50	107.20%	2.320	109.40%
13	PVRIG-A105-H5	646.90	113.76%	2.397	105.88%
14	PVRIG-A118-H1	355.4	156.67%	1.308	120.87%
15	PVRIG-A118-H2	357.0	155.97%	1.351	117.02%
16	PVRIG-A118-H3	385.8	144.32%	1.494	105.82%
17	PVRIG-A118-H4	462.1	120.49%	1.418	111.50%
18	PVRIG-A118-H5	380.6	146.30%	1.389	113.82%
19	PVRIG-A118-H6	422.4	131.82%	1.467	107.77%
20	PVRIG-A118-H7	430.1	129.46%	1.381	114.48%

*parental抗體: 各自對應的人源化前的母抗體

實施例 22 FACS 檢測 PVRIG 人源化抗體阻斷 CHO-K1-CD112 細胞與人 PVRIG-mFc 蛋白的結合

實驗方法參照實施例12。實驗結果如圖37所示，大部分人源化抗體可阻斷CHO-K1-CD112細胞結合人PVRIG-mFc蛋白。將人源化抗體的阻斷活性歸一化到與對照分子COM701-hIgG1以及SRF813-hIgG1抗體的百分比，百分比值越小，說明抗體阻斷效果越好。

表 38抗 PVRIG 人源化抗體阻斷 CHO-K1-CD112 細胞結合人 PVRIG-mFc 蛋白

PVRIG 人源化抗體	CHO-K1-CD112 FACS blocking
%IC50	%AUC
to COM701-hIgG4	to SO35-hIgG1	to parental Ab	to COM701-hIgG4	to SO35-hIgG1	to parental Ab
PVRIG-50	117.03	90.60	100.00	122.20	72.06	100.00
PVRIG-A50-H1	100.74	77.99	86.08	114.89	67.75	94.02
PVRIG-A50-H1a	120.08	92.96	102.60	124.64	73.49	101.99
PVRIG-A50-H1c	122.31	94.69	104.52	131.78	77.71	107.84
PVRIG-A50-H1d	115.12	89.12	98.37	120.57	71.09	98.66
PVRIG-A50-H1e	130.27	100.85	111.31	125.71	74.13	102.87
PVRIG-A50-H2a	118.46	91.71	101.22	111.98	66.03	91.64
PVRIG-A50-H1b	95.25	73.74	81.39	104.45	61.59	85.47
PVRIG-A118	140.78	95.33	100.00	118.66	61.71	100.00
PVRIG-A118-H1	140.86	95.38	100.05	119.93	62.37	101.07
PVRIG-A118-H2	161.48	109.34	114.70	141.80	73.74	119.50
PVRIG-A118-H3	145.90	98.79	103.64	126.51	65.79	106.61
PVRIG-A118-H4	140.95	95.44	100.12	116.15	60.40	97.88
PVRIG-A118-H5	143.88	97.43	102.20	127.17	66.13	107.17
PVRIG-A118-H6	144.51	97.85	102.65	118.71	61.73	100.04
PVRIG-A118-H7	143.39	97.09	101.85	123.72	64.34	104.26
PVRIG-A105	104.42	88.32	100.00	113.72	65.59	100.00
PVRIG-A105-H1	104.11	88.06	99.70	111.36	64.22	97.92
PVRIG-A105-H2	109.09	92.27	104.47	115.03	66.34	101.15
PVRIG-A105-H3	108.68	91.92	104.08	109.00	62.87	95.85
PVRIG-A105-H3a	3060.00	2588.24	2930.42	3530.47	2036.21	3104.48
PVRIG-A105-H4	110.13	93.15	105.47	111.95	64.57	98.44
PVRIG-A105-H5	110.44	93.42	105.77	118.62	68.42	104.31

實施例 23 NK 細胞殺傷實驗檢測 PVRIG 人源化抗體介導的 NK 細胞對腫瘤細胞系的殺傷作用

實驗方法參考實施例4（g）。實驗結果顯示，圖38中的所有人源化抗體均能不同程度地促進NK細胞對靶細胞的殺傷，其中圖38中A顯示七個人源化抗體中PVRIG-A50-H1b、PVRIG-A50-H2a對NK細胞殺傷靶細胞的促進作用與人源化前的parental抗體PVRIG-A50相當；圖38中B表明七個人源化抗體中PVRIG-A118-H3、H4、H5及H6對NK細胞殺傷靶細胞的促進作用與人源化前的parental抗體PVRIG-A118相當；圖38中C表明：五個人源化抗體中PVRIG-A105-H1、H2、H3對NK細胞殺傷靶細胞的促進作用與人源化前的parental抗體PVRIG-A105相當。

實施例 24 CMV antigen-recall assay 檢測抗 PVRIG 人源化抗體對抗原特異性 CD8 T 細胞的功能改善作用

復甦PBMC，用含有1mg/mL CMV pp65(495-503)多肽(Anaspec, 貨號AS-28328)、2ng/mL human IL-2(R&D, 貨號IL-202)、10ng/mL human IL-7 (Peprotech, 貨號200-07)的完全培養基（RPMI1640-Glutamax + 5%AB serum + 1% P/S+1×2-β巰基乙醇）重懸至2×10 ⁶/mL，5mL/孔接種於6孔板中，37℃ 5%CO ₂培養6天。第6天，收集所有細胞，撤去培養基中的pp65和IL-7，將細胞一分為二，並重懸於含有100 IU/mL human IL-2的完全培養基中，繼續培養2天。第8天，收集所有細胞，重懸於含有100IU/mL human IL-2的完全培養基中、並調整細胞密度為2×10 ⁶/mL。第11天，收集所有細胞，流式檢測PBMC中CD8 T細胞的比例，CMV pp65(495-503)特異性CD8 T的比例（圖24中A）及該細胞上PVRIG、TIGIT、PD-1的表達水準（圖24中B）。流式檢測抗體如下：Livedead Near IR (Invitrogen，貨號L34976)，CD8-PerCp Cy5.5(BD，貨號565310)，CD3-PE-Cy7(Biolegend,貨號300316)，T-select HLA-A*0201 CMV pp65 Tetramer-PE(MBL，貨號TS-0010-1C)，PVRIG-AF488(R&D，貨號FAB93651G-100UG)，TIGIT-APC (Biolegend,貨號372706)，PD-1-BV421 (BD,貨號562516)

上述誘導後的PBMC經CD8 T細胞分選試劑盒（Stemcell，貨號17953）分離出CD8 T細胞作為效應細胞，用AIM-V重懸並調整細胞密度至0.4×10 ⁶/mL。檢測分選後CD8 T細胞純度及CD226的表達。Colo205作為靶細胞，經TrypLE ^TMExpress Enzyme(Gibco, 貨號12605010)消化，重懸於含有20ng/mL pp65的AIM-V培養基(Gibco, 貨號31035-025)並調整細胞密度至1×10 ⁶/mL，37℃ 5% CO ₂處理3小時，250g離心5分鐘，棄上清。細胞用AIM-V培養基重懸至0.5×10 ⁶/mL。PVRIG人源化抗體或陰性對照抗體用AIM-V培養基稀釋至280nM。在低吸附96孔U底板（Corning, 貨號7007）中依次加入50μL抗體，50μL CD8 T，100μL pp65處理過的colo205細胞，混勻後37℃ 5%CO2孵育18小時。此體系中藥物終濃度為70nM, CD8 T為20000/孔，colo205為50000/孔。孵育結束後400g離心取上清，用ELISA試劑盒（達科為，貨號1110003）檢測上清中human IFN-γ的水準。此體系中的陽性對照為PVRIG人源化前的parental抗體，陰性對照為no treatment。如圖39所示，相較於no treatment組，PVRIG人源化抗體可顯著增加細胞上清中的IFN-γ的水準。受試抗體中，除PVRIG-A105-H2的作用效果顯著弱於PVRIG-A105外 (*p＜0.05, one-way ANOVA Analysis)，其餘的人源化抗體與各自的人源化前parental抗體在統計學上無顯著性差異（One-way ANOVA Analysis）。分選後CD8 T純度及CD226表達的流式檢測抗體資訊如下：live/dead-BV421 (Invitrogen,貨號L34964)，CD8-FITC(BD,貨號555366 )，CD226-PE-Cy7（Biolegend，貨號338316）。Colo205上PVRL2、PVR、PD-L1、HLA-A2表達的流式檢測抗體資訊如下：live/dead-BV421 (Invitrogen,貨號L34964)，PVRL2-APC（Biolegend，貨號337412），PVR- PerCp Cy5.5(Biolegend，貨號337612)，PD-L1-PE-Cy7(BD，貨號558017)， HLA-A2-PE(Biolegend, 貨號343306)。

實施例 25 抗 PVRIGxTIGIT 人源化雙特異性抗體構建體的設計

兩個抗PVRIG人源化VHH抗體（PVRIG-A50-H1b, PVRIG-A105-H1）及兩個抗TIGIT人源化單克隆抗體（TIGIT-002-H4L3, TIGIT-005-H2L1d），用G4S連接肽將抗PVRIG人源化VHH抗體連接到抗TIGIT人源化抗體重鏈的N端，產生抗PVRIGxTIGIT人源化雙特異性抗體（圖40），分別命名為LC-BsAb-002、LC-BsAb-006、LC-BsAb-009和LC-BsAb-010。表39所示為4種雙特異性抗體重鏈融合多肽（HC）和輕鏈多肽（LC）的序列。

表 39 雙特異抗體融合多肽序列

HC/LC	序列編號	sequence
LC-BsAb-002 LC	SEQ ID NO：226	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQNVRTAVAWYQQKPGQSPKLMIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYTTPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 注釋：TIGIT-002-H4L3 VL(單底線)
LC-BsAb-002 HC	SEQ ID NO：227	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSYYDMSWVRQAPGKGLEWVSTINSDGGRTSYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVEGDPHNFGLESLSLRDFGSWGQGTMVTVSS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSITSDSWNWIRQPPGKKLEYIGYISYSGNTYYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARLDFSNYGGAVDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 注釋：PVRIG-A50-H1b(雙底線)+(G4S)4 Linker(斜體部分)+TIGIT-002-H4L3 VH(單底線)
LC-BsAb-006 LC	SEQ ID NO：228	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQHVSNAVAWYQHKPGQSPKLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHYNTPHTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 注釋：TIGIT-005-H2L1d VL(單底線)
LC-BsAb-006 HC	SEQ ID NO：229	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSYYDMSWVRQAPGKGLEWVSTINSDGGRTSYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVEGDPHNFGLESLSLRDFGSWGQGTMVTVSS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYAFTNYLIEWVRQAPGQRLEWMGVINPGSGGTNYKEKFKGRVTITADKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGEYFFFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 注釋：PVRIG-A50-H1b(雙底線)+(G4S)4 Linker(斜體部分)+ TIGIT-005-H2L1d VH(單底線)
LC-BsAb-009 LC	SEQ ID NO：230	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQNVRTAVAWYQQKPGQSPKLMIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYTTPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 注釋：TIGIT-002-H4L3 VL(單底線)
LC-BsAb-009 HC	SEQ ID NO：231	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFDRHTMSWFRQAPGKEREFVATASRIPGDTYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAATSAYCSEVDCYEKGSWYDNWGQGTMVTVSS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSITSDSWNWIRQPPGKKLEYIGYISYSGNTYYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARLDFSNYGGAVDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 注釋：PVRIG-A105-H1(雙底線)+(G4S)4 Linker(斜體部分)+TIGIT-002-H4L3 VH(單底線)
LC-BsAb-010 LC	SEQ ID NO：232	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQHVSNAVAWYQHKPGQSPKLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHYNTPHTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 注釋：TIGIT-005-H2L1d VL(單底線)
LC-BsAb-010 HC	SEQ ID NO：233	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFDRHTMSWFRQAPGKEREFVATASRIPGDTYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAATSAYCSEVDCYEKGSWYDNWGQGTMVTVSS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYAFTNYLIEWVRQAPGQRLEWMGVINPGSGGTNYKEKFKGRVTITADKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGEYFFFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 注釋：PVRIG-A105-H1 (雙底線) + (G4S)4 Linker (斜體部分) + TIGIT-005-H2L1d VH(單底線)

在構建雙抗的同時，構建陽性對照抗體，此處抗TIGIT陽性對照抗體為羅氏的RG6058-hIgG1，抗PVRIG陽性對照抗體為Compugen的COM701-hIgG4，對應的胺基酸序列參見前文。

實施例 26 ELISA 檢測抗 PVRIGxTIGIT 人源化雙特異性抗體與人和食蟹猴 PVRIG 蛋白的特異性結合

酶標板中預先包被50 μL/孔的1.0 μg/mL人PVRIG（AcroBiosystems，貨號 PVG-H52H4）或50 μL/孔的0.5 μg/mL食蟹猴 PVRIG（Novoprotein，貨號 C09B）；將受試抗體進行梯度稀釋（起始濃度13 nM、3倍梯度稀釋，12個濃度點），50 μL/孔加樣，37℃孵育2.0小時；洗板後加入羊抗人（Goat anti-human IgG Fc-HRP(Merck，貨號AP113P)）工作液（1:5000稀釋），50 μL/孔加樣，37℃孵育1.0小時；再次洗板，加入HRP的底物TMB(KPL，貨號5120-0077)37℃顯色10min，加入終止液終止反應後用酶標儀（PE，Ensight-HH3400）讀取吸光值。以抗體莫耳濃度為橫坐標，對應的OD值為縱坐標繪製抗體的結合曲線，四參數擬合 (GraphPad Prism9)，計算EC50值。EC50值越小，抗體與人或食蟹猴PVRIG結合的能力越強。陽性對照抗體有COM701-hIgG1、PVRIG-A50-H1b、PVRIG-A105-H1；陰性對照抗體有anti-Fluorescein-hIgG1（inhouse）。4個人源化雙抗與人PVRIG蛋白的結合結果見圖41和表40、41，與食蟹猴PVRIG的結合結果見圖42和表40、41。資料表明，4個人源化雙抗均能和人或食蟹猴PVRIG蛋白特異性結合。LC-BsAb-002和LC-BsAb-006與人PVRIG蛋白的結合相對其對照單抗PVRIG-A50-H1b及陽性對照COM701-hIgG1稍弱；LC-BsAb-009和LC-BsAb-010與人或食蟹猴PVRIG蛋白的結合，均與其相對照單抗PVRIG-A105-H1基本相當、並優於陽性對照COM701-hIgG1。

表 40 人源化雙抗與人或食蟹猴 PVRIG 蛋白特異性結合的 ELISA 結果

名稱	與人PVRIG蛋白結合	與食蟹猴PVRIG蛋白結合
EC50	%相對活性	EC50	%相對活性
(nM)	PVRIG-A50-H1b/受試抗體	COM701-hIgG1/受試抗體	(nM)	PVRIG-A50-H1b/受試抗體	COM701-hIgG1/受試抗體
LC-BsAb-002	0.5738	66.1%	43.2%	0.04402	86.4%	82.5%
LC-BsAb-006	0.5072	74.8%	48.9%	0.03851	98.7%	94.3%
PVRIG-A50-H1b	0.3793	100.0%	65.4%	0.03802	100.0%	95.5%
COM701-hIgG1	0.2481	152.9%	100.0%	0.0363	104.7%	100.0%
anti-Fluorescein-hIgG1	~40328	/	/	~ 3.999	/	/

表 41 人源化雙抗與人或食蟹猴 PVRIG 蛋白特異性結合的 ELISA 結果

名稱	與人PVRIG蛋白結合	與食蟹猴PVRIG蛋白結合
EC50	%相對活性	EC50	%相對活性
(nM)	PVRIG-A105-H1/受試抗體	COM701-hIgG1/受試抗體	(nM)	PVRIG-A105-H1/受試抗體	COM701-hIgG1/受試抗體
LC-BsAb-009	0.06073	104.8%	408.5%	0.02563	93.4%	141.6%
LC-BsAb-010	0.06166	103.2%	402.4%	0.02322	103.1%	156.3%
PVRIG-A105-H1	0.06362	100.0%	390.0%	0.02395	100.0%	151.6%
COM701-hIgG1	0.2481	25.6%	100.0%	0.0363	66.0%	100.0%
anti-Fluorescein-hIgG1	~ 40328	/	/	~ 3.999	/	/

實施例 27 ELISA 檢測抗 PVRIGxTIGIT 人源化雙特異性抗體與人和食蟹猴 TIGIT 蛋白的特異性結合

酶標板中預先包被50 μL/孔的4.0 μg/mL羊抗鼠IgG Fc（Jackson，貨號115-006-071）；封閉洗滌後，加入50 μL/孔30ng/ml 人TIGIT ECD-mFc（in house）或食蟹猴TIGIT ECD-mFc（in house），37℃孵育2小時；洗板後，加入50 μl/孔梯度稀釋的受試抗體（起始濃度13 nM、3倍梯度稀釋，12個濃度點），37℃孵育2.0小時；洗板後加入羊抗人IgG Fc-HRP(Merck，貨號AP113P)）工作液（1:5000稀釋），50 μL/孔加樣，37℃孵育1.0小時；再次洗板，加入HRP的底物TMB(KPL，貨號5120-0077)進行顯色，加入終止液終止反應後用酶標儀（PE，Ensight-HH3400）讀取吸光值。以抗體莫耳濃度為橫坐標，對應的OD值為縱坐標繪製抗體的結合曲線，四參數擬合 (GraphPad Prism9)，計算EC50值。EC50值越小，抗體與人或食蟹猴TIGIT結合的能力越強。陽性對照抗體有RG6058-hIgG1、TIGIT-002-H4L3和TIGIT-005-H2L1d；陰性對照抗體為anti-Fluorescein-hIgG1（in house）。4個人源化雙抗與人TIGIT蛋白的結合結果見圖43和表42、43，與食蟹猴TIGIT的結合結果見圖44和表42、43。資料表明，4個人源化雙抗均能和人或食蟹猴TIGIT蛋白特異性結合。其中LC-BsAb-002和009與人TIGIT蛋白的結合優於陽性對照RG6058-hIgG1，與其對應單抗TIGIT-002-H4L3相當；與食蟹猴TIGIT蛋白的結合，LC-BsAb-009與其對應單抗TIGIT-002-H4L3及陽性對照RG6058-hIgG1基本相當，LC-BsAb-002則比對應單抗及陽性對照稍弱。LC-BsAb-006和010與人TIGIT蛋白/食蟹猴TIGIT蛋白的結合，均優於其對應的單抗TIGIT-005-H2L1d及陽性對照RG6058-hIgG1。

表42 人源化雙抗與人或食蟹猴 TIGIT 蛋白特異性結合的 ELISA 結果

名稱	與人TIGIT蛋白結合	與食蟹猴TIGIT蛋白結合
EC50	%相對活性	EC50	%相對活性
(nM)	TIGIT-002-H4L3/受試抗體	RG6058-hIgG1/受試抗體	(nM)	TIGIT-002-H4L3/受試抗體	RG6058-hIgG1/受試抗體
LC-BsAb-002	0.03565	105.0%	141.3%	0.05535	74.9%	83.2%
LC-BsAb-009	0.04549	82.3%	110.7%	0.04185	99.1%	110.0%
TIGIT-002-H4L3	0.03742	100.0%	134.6%	0.04146	100.0%	111.1%
RG6058-hIgG1	0.05038	74.3%	100.0%	0.04605	90.0%	100.0%
anti-Fluorescein-hIgG1	~ 0.000	/	/	~ 0.6872	/	/

表43 人源化雙抗與人或食蟹猴 TIGIT 蛋白特異性結合的 ELISA 結果

名稱	與人TIGIT蛋白結合	與食蟹猴TIGIT蛋白結合
EC50	%相對活性	EC50	%相對活性
(nM)	TIGIT-005-H2L1d/受試抗體	RG6058-hIgG1/受試抗體	(nM)	TIGIT-005-H2L1d/受試抗體	RG6058-hIgG1/受試抗體
LC-BsAb-006	0.03563	120.5%	141.4%	0.04126	108.0%	111.6%
LC-BsAb-010	0.02761	155.5%	182.5%	0.03359	132.7%	137.1%
TIGIT-005-H2L1d	0.04292	100.0%	117.4%	0.04456	100.0%	103.3%
RG6058-hIgG1	0.05038	85.2%	100.0%	0.04605	96.8%	100.0%
anti-Fluorescein-hIgG1	~ 0.000	/	/	~ 0.6872	/	/

實施例 28 FACS 檢測抗 PVRIGxTIGIT 人源化雙特異性抗體與 FlpinCHO 人 PVRIG 和 FlpinCHO 食蟹猴 PVRIG 的結合活性

取轉染了人或食蟹猴PVRIG高表達質粒的CHO-K1穩定細胞（ATCC® CCL-61™），分別命名為FlpinCHO-hPVRIG，FlpinCHO-cyno PVRIG，人PVRIG全長質粒（NCBI Ref Seq: NP_076975）, 以及食蟹猴PVRIG全長質粒（NCBI Ref Seq: XP_014989941）均由通用生物合成，在細胞密度不超過80%時進行實驗。棄去細胞培養基，用PBS潤洗並加入1ml Versene（Gibico，15040-066）消化8-10分鐘，用含10% FBS的Ham’s F12（Gibico，21127-022）完全培養基終止消化後製成細胞懸液。計數後，取適量細胞懸液，350×g離心去上清，PBS洗細胞兩遍後，用死活染料Zombie violet（Biolegend，423114）進行染色，室溫孵育20分鐘。孵育結束後，用染色緩衝液（2% FBS + PBS）終止染色，350×g離心去上清，洗細胞兩遍後，用染色緩衝液將細胞重懸為2×10 ⁶個細胞/ml的密度，鋪入96孔板，每孔加入50μl的細胞懸液，待用。用染色緩衝液將抗體從最高濃度46nM（兩倍濃度）開始進行3.3倍梯度稀釋，將稀釋好的抗體加至已含有50μl細胞懸液的孔中，置於微孔板振盪器上400rpm震盪1分鐘，使抗體與細胞充分混合，4°C孵育30分鐘。孵育結束後用染色緩衝液清洗細胞兩次，每孔200μl，350×g離心5分鐘棄上清。用染色緩衝液將PE goat anti-Human IgG Fc抗體（ebioscience，12-4998-82）稀釋250倍，以每孔100μl的體積加至洗完的細胞孔中，混合均勻，4°C染色30分鐘。染色結束後同樣用染色緩衝液清洗兩次，最後用200μl染色緩衝液重懸細胞，流式上機檢測訊號（BD CantoII），訊號越強，表示抗體與PVRIG的結合能力越強。圖45顯示，4個人源化雙抗均有較好的人PVRIG結合活性，亦能較好結合食蟹猴PVRIG（圖46），且均優於其對應的抗PVRIG人源化單抗。

實施例 29 FACS 檢測抗 PVRIGxTIGIT 人源化雙特異性抗體與 CHO-K1 人 TIGIT( 高 / 中 / 低表達株 ) 和 CHO-K1 食蟹猴 TIGIT 細胞的結合活性

收集細胞，PBS（Hyclone，SH30256）洗一次，1%BSA-PBS重懸至2×10 ⁵/50μL，1%BSA-PBS稀釋抗體至80nM，3倍連續梯度稀釋12個濃度點，將50μL細胞與50μL抗體稀釋液混合，4℃孵育60分鐘，PBS洗兩次，加入Alexa Fluor® 647螢光素標記的二抗（1:800）（Jackson，109-605-088），100μL/孔重懸細胞，4℃孵育40分鐘，PBS洗兩次，用1%BSA-PBS，100μL/孔重懸，在流式細胞儀（BD, Canto Ⅱ）上分析細胞樣品。4個人源化雙抗與CHO-K1人TIGIT(高/中/低表達株，圖47，48，49)和CHO-K1食蟹猴TIGIT細胞均有較好的結合活性（圖50）。

實施例 30 HTRF 方法檢測抗 PVRIGxTIGIT 人源化雙特異性抗體阻斷 PVRIG 蛋白與 PVRL2 蛋白的相互作用

分別將PVRIG-mFc (ACRO Biosystems, 貨號PVG-H5253)和Bio-CD112-His（Sino Biological, 貨號10005-H08H）稀釋至0.5μg/ml；分別將Streptavidin-Tb cryptate（Cisbio, 貨號）和PAb anti mouse IgG-XL665（Cisbio, 貨號）稀釋至20μg/ml和0.8μg/ml。待測抗體起始濃度為120nM，3倍梯度稀釋，共12個濃度點。將上述稀釋好的PVRIG-mFc、Bio-CD112-His、Streptavidin-Tb Crytate和PAb anti mouse IgG-XL665按1:1:1:1混合，10μl/孔加入384孔板中（PE, 貨號6007299）；之後10μl/孔加入梯度稀釋的待測抗體, 1500 rpm離心30s，37℃孵育1h；酶標儀上讀板（PE, Envision2105），波長選用665nm和620nm。根據公式Ratio=Signal 665nm/Signal 620nm×10 ⁴進行資料換算。以抗體的莫耳濃度為橫坐標、Ratio為縱坐標，進行4參數擬合，並計算IC50。IC50越小，說明抗體阻斷PVRIG與PVRL2結合的效果越好。本實驗中的陽性對照為COM701-hIgG1、PVRIG-A50-H1b，PVRIG-A105-H1；陰性對照抗體有anti-Fluorescein-hIgG1（in house）。4個人源化雙抗阻斷PVRIG-PVRL2結合的效果見圖51和表44、45。資料表明，4個人源化雙抗均能阻斷人PVRIG與PVRL2蛋白的結合。其中LC-BsAb-002的阻斷效果均優於其對應單抗PVRIG-A50-H1b及陽性對照COM701-hIgG1，LC-BsAb-006的阻斷效果優於其對應單抗PVRIG-A50-H1b，但稍弱於陽性對照COM701-hIgG1；LC-BsAb-009和LC-BsAb-010的阻斷效果均不如其對應單抗PVRIG-A105-H1及陽性對照COM701-hIgG1。

表 44 人源化雙抗阻斷 PVRIG 和 PVRL2 的結合

名稱	阻斷人PVRIG蛋白與人PVRL2蛋白的結合
IC50	%相對活性
(nM)	PVRIG-A50-H1b/受試抗體	COM701-hIgG1/受試抗體
LC-BsAb-002	0.1104	186.5%	124.4%
LC-BsAb-006	0.1805	114.1%	76.1%
PVRIG-A50-H1b	0.2059	100.0%	66.7%
COM701-hIgG1	0.1373	150.0%	100.0%
anti-Fluorescein-hIgG1	~ 0.03023	/	/

表 45 人源化雙抗阻斷 PVRIG 和 PVRL2 的結合

名稱	阻斷人PVRIG蛋白與人PVRL2蛋白的結合
IC50	%相對活性
(nM)	PVRIG-A105-H1/受試抗體	COM701-hIgG1/受試抗體
LC-BsAb-009	0.1956	65.6%	70.2%
LC-BsAb-010	0.1452	88.4%	94.6%
PVRIG-A105-H1	0.1283	100.0%	107.0%
COM701-hIgG1	0.1373	93.4%	100.0%
anti-Fluorescein-hIgG1	~ 0.03023	/	/

實施例 31 FACS 檢測抗 PVRIGxTIGIT 人源化雙特異性抗體阻斷 CHO-K1 人 CD112 細胞結合人 PVRIG-mFc 蛋白

取轉染了人CD112高表達質粒的CHO-K1穩定細胞（命名為CHO-K1-CD112），人CD112全長質粒由通用生物合成（NP_001036189.1/NCBI Ref Seq: Q92692），在細胞密度不超過80%時進行實驗。棄去細胞培養基，用PBS潤洗並加入1ml 胰酶（Gibico，25200-72）消化2分鐘，用含10% FBS的Ham’s F12（Gibico，21127-022）完全培養基終止消化後製成細胞懸液。細胞計數儀（Beckman Coulter，Vi-CELL）計數後，取適量細胞懸液，350×g離心去上清，PBS洗細胞兩遍後，用死活染料Zombie violet（Biolegend，423114）進行染色，室溫孵育20分鐘。孵育結束後，用染色緩衝液（2% FBS + PBS）終止染色，350×g離心去上清，洗細胞兩遍後，用染色緩衝液將細胞重懸為1×10 ⁶個細胞/ml的密度，待用。鋪入96孔板，每孔加入50μl的細胞懸液，待用。用染色緩衝液配製人PVRIG-mFc蛋白（Acro，PVG-H5253）工作液，濃度為1µg/ml（四倍濃度），加入96孔板，每孔加入50μl的PVRIG-mFc工作液。用染色緩衝液將抗體從最高濃度275nM（四倍濃度）開始進行3倍梯度稀釋，將稀釋好的抗體加至已含有50μl PVRIG-mFc的孔中，置於微孔板振盪器上400rpm震盪1分鐘，使抗體與PVRIG-mFc蛋白充分混合，4°C孵育30分鐘。孵育結束後，直接加入上述準備的細胞懸液，每孔加入100μl，槍頭輕柔混勻後，4°C孵育30分鐘。孵育結束後用染色緩衝液清洗細胞兩次，每孔200μl，350×g離心5分鐘棄上清。用染色緩衝液將PE goat anti-mouse IgG Fc抗體（Biolegend，405337）稀釋250倍，以每孔100μl的體積加至洗完的細胞孔中，混合均勻，4°C染色30分鐘。染色結束後同樣用染色緩衝液清洗兩次，最後用200μl染色緩衝液重懸細胞，流式上機檢測訊號（BD CantoII）。螢光訊號越弱，表示抗體阻斷CHO-K1人CD112細胞結合PVRIG-mFc蛋白的能力越強。圖52顯示，4個人源化雙抗均可阻斷CHO-K1人CD112細胞結合人PVRIG-mFc蛋白。

實施例 32 ELISA 方法檢測抗 PVRIGxTIGIT 人源化雙特異性抗體阻斷人 TIGIT 與 CHO-K1 CD155 結合的活性

收集實施例2構建的CHO-K1 CD155細胞，用10%FBS-DMEM/F12培養基（Excell, FSP500; Gibco, 11330）調整濃度至5×10 ⁵/mL，加入96孔細胞培養板（corning, 3599），100μL/孔，37℃ 5%CO ₂培養過夜，甩掉培養上清，加入細胞固定液（碧雲天， P0098），50μL/孔，室溫固定1小時，在洗板機上用0.05%Tween20-PBS洗一次，加入5%脫脂奶粉-PBS，250μL/孔，37℃孵育2~4小時，在洗板機上用0.05%Tween20-PBS洗三次；將人TIGIT ECD-mFc（工作濃度100ng/mL）與樣品混合孵育半小時；隨後將抗原抗體混合液加入細胞板中，50μL/孔，37℃孵育1.5~2小時，在洗板機上用0.05%Tween20-PBS洗三次，以1:5000稀釋比用1%BSA(生工生物，A500023-0100)-PBS稀釋HRP酶標抗體（Jackson, 115-035-003），加入細胞板中，50μL/孔，37℃孵育1小時，在洗板機上用0.05%Tween20-PBS洗三次，加入TMB顯色液（KPL, 52-00-03）, 50μL/孔，37℃孵育10分鐘，加入1M HCL，50μL/孔，終止反應，酶標儀(Biotek, Powerwave HT)讀取OD450nm。圖53表明，4個人源化雙抗均可阻斷人TIGIT與CHO-K1 CD155結合。

實施例 33 FACS 方法檢測抗 PVRIGxTIGIT 人源化雙特異性抗體阻斷 Bio-CD155-His 與 CHO-K1 人 TIGIT 結合的活性

收集細胞，PBS（Hyclone，SH30256）洗一次, 1%BSA-PBS重懸至2×10 ⁵/40μL，1%BSA-PBS稀釋抗體至210nM，3倍連續梯度稀釋12個濃度點，1%BSA-PBS稀釋Bio-CD155-His（義翹神州，10109-H08H）至3μg/mL，隨後將40μL細胞與40μL抗體稀釋液以及40μL Bio-CD155-His稀釋液混合，4℃孵育60分鐘，PBS洗兩次，加入APC標記的鏈黴親和素（工作稀釋度1:1700，Biolegend，405243），100μL/孔重懸細胞，4℃孵育40分鐘，PBS洗兩次，用1%BSA-PBS，100μL/孔重懸，在流式細胞儀（BD, Canto Ⅱ）上分析細胞樣品。圖54表明， 4個人源化雙抗均可阻斷Bio-CD155-His與CHO-K1 人TIGIT結合。

實施例 34 FACS 方法檢測抗 PVRIGxTIGIT 人源化雙特異性抗體與人 PBMC 的結合活性

取新鮮的人PBMC（AllCells，PB004-C），將細胞調整至5×10 ⁵/mL，同時加入SEA（Toxin Technology, Inc.，AT101）至100ng/mL，37℃ 5%CO ₂培養三天；三天後收集細胞，PBS（Hyclone，SH30256）洗一次, 加入Fc Block（BD，564220），4℃孵育10分鐘，PBS洗兩次，1%BSA-PBS重懸至2×10 ⁵/50μL，1%BSA-PBS稀釋人源化抗體至80nM，3倍連續梯度稀釋12個濃度點，將50μL細胞與50μL抗體稀釋液混合，4℃孵育60分鐘，PBS洗兩次，加入Alexa Fluor® 647螢光素標記的二抗（工作稀釋度1：800，Jackson，109-605-088），100μL/孔重懸細胞，4℃孵育60分鐘，PBS洗兩次，用1%BSA-PBS，100μL/孔重懸，在流式細胞儀（BD, Canto Ⅱ）上分析細胞樣品。圖55顯示，4個人源化雙抗與人PBMC均有較好的結合活性。

實施例 35 BIAcore 檢測抗 PVRIGxTIGIT 人源化雙特異性抗體與人，食蟹猴和小鼠 TIGIT 及 PVRIG 蛋白的親和力

該實驗採用Protein A晶片，透過手工操作（manual run）測定出晶片捕獲稀釋後的抗體所需要的時間，以使得能飽和結合抗原Rmax為50 RU。將人、食蟹猴和小鼠TIGIT及PVRIG蛋白梯度稀釋至20，10，5，2.5，1.25 nM。採用多迴圈動力學測得抗體與抗原的親和力。在每一個迴圈中，注射抗體後再注入梯度濃度的人、食蟹猴和小鼠TIGIT及PVRIG蛋白，使抗原與抗體發生結合與解離過程。每個迴圈後用Glycine pH1.5進行Protein A晶片的再生（去除晶片上的蛋白）。應用BIAcore T200分析軟體擬合抗體抗原的親和力KD。表46結果可知，2個人源化雙抗與人和食蟹猴TIGIT及PVRIG蛋白之間存在特異性結合，且親和力水準較高，但與小鼠TIGIT及PVRIG蛋白不結合。

表 46 人源化雙抗與不同種屬 TIGIT 及 PVRIG 蛋白的親和力

抗體	抗原	結合動力學
ka (1/Ms)	kd (1/s)	KD (M)	Rmax (RU)	Capture Level (RU)
LC-BsAb-002	hTIGIT	1.75E+06	2.59E-04	1.48E-10	100.3	727
cynoTIGIT	4.92E+05	6.43E-03	1.31E-08	112.9	726
mTIGIT	/	/	/	0.1	726
hPVRIG	3.09E+05	5.87E-05	1.90E-10	106.6	557
cynoPVRIG	3.57E+04	1.31E-04	3.66E-09	109.7	659
mPVRIG	/	/	/	0.1	579
LC-BsAb-006	hTIGIT	1.65E+06	2.14E-04	1.30E-10	99.4	696
cynoTIGIT	1.09E+06	1.84E-03	1.69E-09	108.0	695
mTIGIT	/	/	/	0.9	695
hPVRIG	3.40E+05	5.01E-05	1.48E-10	103.6	538
cynoPVRIG	3.60E+04	1.42E-04	3.95E-09	109.8	631
mPVRIG	/	/	/	0.2	1140

實施例 36 BIAcore 檢測抗 PVRIGxTIGIT 人源化雙特異性抗體與人 TIGIT 及 PVRIG 蛋白的共結合

應用BIAcore表徵雙特異性抗體與兩抗原同時結合特性。首先用Protein A晶片捕獲抗體LC-BsAb-002和LC-BsAb-006，然後分別注射TIGIT和PVRIG his標籤蛋白，以及分別連續注射TIGIT和PVIRIG、PVRIG和TIGIT，記錄抗體和抗原的結合訊號，最後用Glycine pH1.5完成晶片再生，其中流動相為HBS-EP+ (10mM HEPES, 150mM NaCl, 3mM EDTA, 0.05% surfactant P20)，流速為30μL/min，與不同抗原結合時間均為300s，再生時間為30s，檢測溫度為25 °C，hTIGIT分析濃度為20 nM，hPVRIG分析濃度為50 nM。應用BIAcore 8K分析軟體（版本號2.0）對資料進行分析，記錄抗體捕獲水準Capture Level、不同抗原的結合訊號Binding Responses（RU），並根據抗原抗體分子量計算抗原抗體分子化學計量比，初步估計一個抗體分子可以結合幾個抗原。為了確認抗體LC-BsAb-002與抗原TIGIT&PVRIG的相互作用關係，開展了以下四步檢測：只結合hTIGIT單個抗原、只結合hPVRIG單個抗原、先結合hTIGIT後結合hPVRIG、先結合hPVRIG後結合hTIGIT，並且各抗原均達到飽和狀態。收集抗體抗原的結合曲線，記錄2個雙特異性抗體的捕獲水準、以及各試驗中TIGIT和PVIRIG的結合訊號，並以此計算了抗原抗體分子化學計量比，如表47所示，圖56中A、B分別為LC-BsAb-002和LC-BsAb-006分別與TIGIT和PVIRG結合、以及分別連續注射TIGIT和PVRIG的抗體抗原結合曲線。如表47和圖56A和56B所示，連續注射TIGIT和PVIRG產生的結合訊號，與單獨注射TIGIT和PVIRG產生的結合訊號幾乎一致；並且正反連續TIGIT和PVIRG產生的結合訊號也幾乎一致，這說明LC-BsAb-002和LC-BsAb-006可同時與hTIGIT和hPVRIG相結合，並且兩個抗原之間不存在互相影響；綜合考慮抗體和抗原的分子量、以及抗體的捕獲水準和抗原的結合水準，初步估算出TIGIT與LC-BsAb-002的化學計量比為1.76；TIGIT與LC-BsAb-006的化學計量比為1.86；PVIRIG與LC-BsAb-002的化學計量比為2.14，PVIRIG與LC-BsAb-006的化學計量比為2.18，兩抗原抗體化學計量比都接近於2，考慮到檢測方法帶來的誤差，我們推測一個LC-BsAb-002或一個LC-BsAb-006雙抗分子可以同時結合兩個TIGIT分子和兩個PVRIG分子。

表 47 人源化雙抗與 TIGIT 及 PVRIG 蛋白的 BIAcore 結合情況

Antibody	Capture Level（RU）	Antigen 01	Antigen 02
Name	Binding Responses（RU）	Antibody-Antigen Stoichiometry	Name	Binding Responses（RU）	Antibody-Antigen Stoichiometry
LC-BsAb-002	673.6	TIGT	94.96	1.76	/	/	/
673.1	PVRIG	128.67	2.14	/	/	/
673.3	TIGT	94.87	1.76	PVRIG	121.11	2.02
673.7	PVRIG	128.79	2.15	TIGT	91.28	1.69
LC-BsAb-006	603.7	TIGT	89.83	1.86	/	/	/
602.9	PVRIG	117.08	2.18	/	/	/
603.4	TIGT	89.83	1.86	PVRIG	109.42	2.04
602.3	PVRIG	116.96	2.18	TIGT	83.88	1.74

實施例 37 NK 細胞脫粒實驗檢測抗 PVRIGxTIGIT 人源化雙特異性抗體對 NK 細胞的功能促進作用

利用FACS檢測NK細胞CD107a的表達水準指示受試抗體對NK細胞啟動的影響（圖57中A展示了實驗流程）。

A. 利用FACS檢測NK細胞（Natural killer cell）上PVRIG，TIGIT及WIDR細胞表面PVR和PVRL2的表達情況。

首先，使用細胞計數儀（Beckman Coulter，Vi-CELL）將NK細胞計數，取三個流式管，每個流式管加入1e+5個NK細胞，加PBS洗滌細胞兩次，去上清，取一管加入300μl Staining buffer（PBS+2% FBS）做為未染色管待用，另外兩管每管加入染液100μl（PBS+1*的Zombie Violet（Biolegend，423114））混勻後室溫孵育15分鐘。隨後加Staining buffer洗滌細胞兩次，去上清，每管加入Fc阻斷劑50μl（Staining buffer + Fcx blocker（Biolegend，422302））混勻後4℃孵育15分鐘。接著分別向每管加入染液，第一管加入50μl的2*染液（Staining buffer + PE-Cy7 Mouse anti-hCD3檢測抗體 + PE Mouse anti-hCD56檢測抗體+ APC Mouse anti-hTIGIT檢測抗體+ AF488 Rabbit anti-hPVRIG檢測抗體，CD3檢測抗體：Biolegend 300316，CD56檢測抗體：Biolegend 318306，TIGIT檢測抗體：Biolegend 372706，PVRIG檢測抗體：RD FAB93651G），第二管加入50μl的2*同型對照染液（Staining buffer+PE-Cy7 Mouse anti-hCD3檢測抗體 + PE Mouse anti-hCD56檢測抗體+ APC Mouse IgG2a κ 同型對照抗體+ AF488 Rabbit IgG κ 同型對照抗體，APC mIgG2a κ 同型對照抗體：Biolegend 400222，AF488 Rabbit IgG κ同型對照抗體: RD IC1051G），混勻後4℃孵育30分鐘。時間到後用Staining buffer洗滌兩次，離心後加300μl Staining buffer 混勻。隨後上機檢測（Thermo Attune NxT），最終讀取Zombie Violet陰性細胞群中CD56陽性CD3陰性的細胞群的占比和Zombie Violet陰性細胞群中CD56陽性CD3陰性的細胞群的APC、AF488訊號。

將WIDR細胞用胰酶消化成細胞懸液，使用細胞計數儀（Beckman Coulter，Vi-CELL）將細胞計數，取三個流式管，每個流式管加入1e+5個細胞，加PBS洗滌細胞兩次。離心後去上清，取一管加入300μl Staining buffer（PBS+2% FBS）做為未染色管待用，另外兩管每管加入染液100μl（PBS+1*的Zombie Violet（Biolegend，423114））混勻後室溫孵育15分鐘。隨後加Staining buffer洗滌細胞兩次，去上清，分別向每管加入染液：第一管加入100μl染液（Staining buffer +PerCP-Cy5.5 Mouse anti-hPVR檢測抗體+ APC Mouse anti-hPVRL2檢測抗體，PVR檢測抗體：Biolegend 337612，PVRL2檢測抗體：Biolegend 337412），第二管加入100μl同型對照染液（Staining buffer + PerCP-Cy5.5 Mouse IgG1 κ同型對照抗體+ APC κ Mouse IgG1同型對照抗體，PerCP-Cy5.5 mIgG1 κ同型對照抗體：Biolegend 400150，APC mIgG1 κ 同型對照抗體：Biolegend 400122），混勻後4℃孵育30分鐘。時間到後用Staining buffer洗滌兩次，離心後加300μl Staining buffer混勻。隨後上機檢測（Thermo Attune NxT），最終讀取Zombie Violet陰性細胞群的PerCP-Cy5.5、APC訊號。圖57中B顯示實驗所使用的NK細胞表達一定水準的PVRIG和TIGIT，同時靶細胞WIDR高表達配體PVR和PVRL2。

B. NK細胞脫顆粒實驗（以WIDR為靶細胞）。

實驗的前一天將人PBMC復甦，用分選試劑盒（Stemcell，17955）分選人NK細胞，加入200IU/ml的h-IL2（R&D, 202-IL）和10ng/ml的h-IL12 (Peprotech，200-12-50UG) 過夜刺激，第二天進行鋪板實驗。首先，用assay buffer（RPMI1640-Glutamax +10%FBS+1×P/S）將抗體稀釋到最高濃度275nM（四倍濃度），然後繼續用assay buffer開始進行10倍梯度稀釋，將稀釋好的抗體加至超低吸附96孔U底板（Costar，7007）中，每孔50μl，待用。其次，使用細胞計數儀（Beckman Coulter，Vi-CELL）將NK細胞計數，取一定數目的NK細胞，以350g的速度離心5分鐘，棄上清後用assay buffer重懸至0.5E+6個細胞/ml的密度，向細胞懸液中加入蛋白轉運抑制劑（Invitrogen，00498093）和APC mouse anti-human 檢測抗體（Biolegend，328620）。向鋪好藥的96孔U底板中加入處理好的NK細胞懸液，每孔50μl，混合均勻後室溫孵育15分鐘。孵育期間，將靶細胞WIDR用胰酶消化成細胞懸液（Reh細胞直接混合均勻），使用細胞計數儀（Beckman Coulter，Vi-CELL）將靶細胞細胞計數，取出適量數目的細胞，以200g的速度離心5分鐘，棄上清後用assay buffer將細胞重懸至0.25e+6個細胞/ml的密度。孵育結束後，向孔板中加入靶細胞懸液，每孔100μl，此時每孔中含有25000個NK細胞，25000個靶細胞以及不同濃度的受試抗體，只含有NK細胞的孔作為靜息對照，只含NK及WIDR作為無藥物對照。將每個孔混合均勻後放入37℃培養箱孵育16h。最後進行FACS染色：將孔板中的細胞平行轉移至96孔V底板，用PBS洗滌兩次，棄上清，每孔加入染液（PBS+2%FBS+1*濃度的zombie violet（Biolegend，423114）+ PE mouse anti-CD56 檢測抗體（Biolegend，318306））混合均勻後4℃孵育30分鐘。時間到後，staining buffer洗滌兩次，棄上清，每孔加入150μl 的staining buffer重懸上機檢測（Thermo Attune NxT）。最終讀取CD56陽性細胞中CD107a強陽性細胞群的占比，CD107a強陽性細胞占比越高，代表NK的脫粒作用越強，NK的啟動程度越高。圖57中C顯示，陰性對照anti-Fluorescein-hIgG1對NK細胞的CD107a表達沒有影響，候選人源化雙抗均能不同程度的提高NK細胞CD107a的表達，這表明受試抗體可以有效促進NK細胞的啟動。

C. NK細胞脫顆粒實驗（以TF-1為靶細胞）。

實驗方法參考實施例37 B，實驗結果如圖57中D顯示，表明人源化雙抗能NK細胞脫顆粒，作用優於PVRIG陽性對照抗體COM701-hIgG4和TIGIT陽性對照抗體RG6058-hIgG1，等同於COM701-hIgG4 和 RG6058-hIgG1聯用組。同時，人源化雙抗對NK細胞脫顆粒的促進作用也優於其PVRIG臂抗體PVRIG-A50-H1b和TIGIT臂抗體TIGIT-002-H4L3，與PVRIG-A50-H1b 和TIGIT-002-H4L3聯用組相當。

實施例 38 NK 細胞殺傷實驗檢測抗 PVRIGxTIGIT 人源化雙特異性抗體介導的 NK 細胞對腫瘤細胞系的殺傷作用

利用FACS檢測靶細胞（WIDR）的裂解水準來指示受試抗體對NK細胞對靶細胞殺傷功能的影響。

實驗的前一天將PBMC復甦，用分選試劑盒（Stemcell，17955）將NK細胞分選出來，加入200IU/ml的h-IL2（RD, 202-IL）和10ng/ml的h-IL12(Peprotech，200-12-50UG)過夜刺激，第二天進行鋪板實驗。用實施例13中提到的方法檢測3個NK供體（Donor-050，Donor-831，Donor-715）上PVRIG和TIGIT的表達水準，同時，用assay buffer（RPMI1640-Glutamax +10%FBS+1×P/S）將待測抗體稀釋到最高濃度275nM（四倍濃度），隨後用assay buffer開始進行10倍梯度稀釋，將稀釋好的抗體加至超低吸附96孔U底板（Costar，7007）中，每孔50μl，待用。其次，將靶細胞WIDR用胰酶消化成細胞懸液，使用細胞計數儀（Beckman Coulter，Vi-CELL）將WIDR細胞計數，取出適量數目的細胞，置於離心機以200g的速度離心5分鐘，棄上清後用適量PBS重懸後加入CellTrace Violet（Invitrogen，C34557A）染液，使CellTrace Violet 終濃度為5μM。將加入染液的WIDR懸液混合均勻置於37℃培養箱孵育10分鐘，期間搖晃混合，取出一部分WIDR細胞用實施例13中描述的方法檢測WIDR上PVR和PVRL2的表達水準。與此同時，使用細胞計數儀將NK細胞計數，取一定數目的NK細胞，以350g的速度離心5分鐘，棄上清後用assay buffer重懸至0.5e+6個細胞/ml的密度。向鋪好藥的96孔U底板中加入處理好的NK細胞懸液，每孔50μl，混合均勻後室溫孵育15分鐘。WIDR細胞染色結束後，向細胞懸液中加入5倍體積完全培養（MEM+10%FBS+1*P/S+1*非必須胺基酸+1*谷氨酸鈉）基進行終止反應，以200g的速度離心5分鐘，棄上清後用assay buffer將細胞重懸至0.25e+6個細胞/ml的密度。NK與藥物孵育結束後，向孔板中加入WIDR細胞懸液，每孔100μl，此時每孔中含有25000個NK細胞，25000個WIDR細胞以及不同濃度的受試抗體，只含WIDR細胞的孔作為靜息對照，含有NK細胞及WIDR的孔作為無藥物對照。將每個孔混合均勻後放入37℃培養箱孵育4h。最後，做FACS染色：每孔加入染液（PBS+ PI（Propidium Iodide，Invitrogen，P3566））混合均勻後室溫孵育20分鐘。時間到後，上機檢測（Thermo Attune NxT），最終讀取CTV陽性細胞中PI陽性細胞群的占比，PI陽性細胞占比越多，代表NK的殺傷作用越強。圖58中A示3個NK供體（Donor-050，Donor-831，Donor-715）都表達一定水準的PVRIG和TIGIT，圖58中B示靶細胞WIDR上高表達PVR和PVRL2，圖58中C為NK細胞對WIDR細胞的殺傷實驗的簡要實驗流程，圖58中D顯示，陰性對照anti-Fluorescein-hIgG1對NK殺傷沒有明顯影響，受試的2個人源化雙抗均能有效促進NK（3個donor來源）對靶細胞WIDR的殺傷，表中標示了不同NK供體下兩個人源化雙抗對WIDR細胞殺傷的EC50和曲線下面積（AUC）。

以TF-1為靶細胞，檢測抗PVRIGxTIGIT人源化雙特異性抗體介導的NK細胞對TF-1的殺傷作用，結果如圖58中E所示，表明人源化雙抗能促進NK細胞殺傷腫瘤細胞，活性優於PVRIG陽性對照抗體COM701-hIgG4、TIGIT陽性對照抗體RG6058-hIgG1和COM701-hIgG4與RG6058-hIgG1聯用組。同時，人源化雙抗的活性也優於其PVRIG臂抗體PVRIG-A50-H1b、TIGIT臂抗體TIGIT-002-H4L3和PVRIG-A50-H1b與TIGIT-002-H4L3聯用組。

實施例 39 NK 細胞 ADCC 實驗檢測抗 PVRIGxTIGIT 人源化雙特異性抗體介導的對人 Treg 細胞的直接殺傷作用

利用FACS檢測靶細胞（Treg）的裂解水準來指示受試抗體對NK細胞對靶細胞的直接ADCC殺傷效應（圖59中A）。

實驗的前一天將PBMC復甦，用分選試劑盒（Stemcell，17955）將NK細胞分選出來作為效應細胞，加入200IU/ml的h-IL2（RD, 202-IL）和10ng/ml的h-IL12 (Peprotech，200-12-50UG)過夜刺激，第二天進行鋪板實驗。用PBMC中分離Treg（調節性T細胞）作為靶細胞（Stemcell，18063）經Dynabeads（Gibco，11129D）體外擴增12天後獲得擴增的Treg細胞用於實驗，實驗前用實施例13中提到的方法和試劑檢測Treg細胞上TIGIT和PVRIG的表達。效應細胞與靶細胞以5：1的比例共孵育，並加入系列梯度稀釋的受試人源化雙特異性抗體或同型對照anti-Fluorescein-hIgG1，anti-Fluorescein-hIgG4抗體，37℃培養箱中孵育4小時後，加入PI染色，最終讀取PI陽性的Treg細胞占比，以此來評估受試雙特異性抗體對靶細胞Treg的ADCC（抗體依賴型細胞介導的細胞毒性作用）殺傷效應。結果顯示，分離擴增的人Treg細胞高表達TIGIT和PVRIG（圖59中B），受試人源化雙抗只有在hIgG1的Fc下才能顯示出對Treg細胞的濃度依賴性ADCC殺傷，而對應的hIgG4 Fc形式沒有表現出明顯的對Treg細胞的ADCC效應，與兩個陰性對照抗體anti-Fluorescein-hIgG1，anti-Fluorescein-hIgG4相當（圖59中C），表中列出了兩個受試人源化抗體在hIgG1 Fc形式下的對Treg細胞ADCC殺傷效應的EC50和AUC。

實施例 40 抗 PVRIGxTIGIT 人源化雙特異性抗體的 ADCP 活性

從供體的PBMC中分離單核細胞，並用75 ng/mL GM-CSF誘導七天分化成巨噬細胞，用CellTrace Violet標記後作為效應細胞。透過調節性T細胞分離試劑盒從人PBMC中分選的人Treg細胞，用Dynabeads Human Treg Expander體外擴增並活化13天作為靶細胞，然後用CFSE染料標記靶細胞。將效應細胞與靶細胞以4:1的比例共孵育。加入連續梯度稀釋的待測抗體、陰性對照Hel hIgG1抗體、其單臂抗體（PVRIG-A50-H1b和TIGIT-002-H4L3）或兩個單抗的聯用組合，在37 ℃下孵育4小時。孵育結束後，加入細胞染料PI，採用流式細胞術檢測CFSE陽性Treg細胞中CellTrace Violet陽性細胞比例，評價待測抗體的ADCP作用。

如圖60中A顯示，待測抗體以劑量依賴的方式啟動Treg細胞的ADCP作用。PVRIG-A50-H1b或COM701-hIgG4幾乎沒有ADCP活性。TIGIT-002-H4L3或RG6058-hIgG1表現出劑量依賴性ADCP活性。根據ADCP曲線的曲線下面積(AUC)，待測抗體的ADCP活性略弱於TIGIT-002-H4L3以及兩種單臂抗體組合(PVRIG-A50-H1b + TIGIT-002-H4L3)。待測抗體的ADCP效應與RG6058-hIgG1和兩種陽性抗體組合(COM701-hIgG4 + RG6058-hIgG1)相當。根據ADCP曲線的E _max，待測抗體的ADCP活性與兩種單臂抗體組合(PVRIG-A50-H1b + TIGIT-002-H4L3)和兩種陽性抗體組合(COM701-hIgG4 + RG6058-hIgG1)相當（圖60中B）。

實施例 41 抗 PVRIGxTIGIT 人源化雙特異性抗體對來自健康供體的人 PBMC 中細胞因數釋放的影響

本實驗研究待測抗體對健康人未刺激的PBMC中細胞因數分泌的影響。採用3個健康志願者的PBMC，在液相或固相條件下與待測抗體孵育24小時，然後運用流式方法檢測PBMC上清中IFN-γ，IL-2，IL-6，IL-10和TNF-α 5種細胞因數的分泌水準。脂多糖和CD3單克隆抗體作為陽性對照，Anti-Hel hIgG1抗體作為陰性對照，同時RG6058-hlgG1和COM701-hlgG4分別作為TIGIT端和PVRIG端的單抗對照。

結果顯示，陽性對照CD3單克隆抗體在液相或固相條件下，LPS在液相條件下與3個健康志願者的未刺激PBMC孵育24小時後，PBMC中IFN-γ，IL-2，IL-6，IL-10和TNF-α 5種細胞因數的分泌水準有不同程度的升高。在液相條件下，不同濃度的待測抗體與未刺激PBMC孵育24小時後，PBMC中IFN-γ，IL-2，IL-6，IL-10和TNF-α的分泌水準與陰性對照相當或在檢測限以下。固相條件下，不同濃度的待測抗體與未刺激PBMC孵育24小時後，PBMC中IFN-γ、 IL-2和IL-10的分泌水準與陰性對照相當或在檢測限以下；固相條件下高濃度點（2850 nM）的待測抗體作用後， TNF-α和IL-6的分泌水準顯著高於陰性對照或與陰性對照相當；但與相同條件下的RG6058-hlgG1和COM701-hlgG4相比，待測抗體在體外不會額外增加健康人未刺激PBMC中IFN-γ，IL-2， IL-6， IL-10和TNF-α 5種細胞因數的分泌。

綜上，相較於TIGIT端單抗RG6058-hIgG1和PVRIG端單抗COM701-hIgG4，相同條件下的待測抗體在體外不會額外增加健康人未刺激PBMC IFN-γ，IL-2， IL-6， IL-10和TNF-α 5種細胞因數的分泌。

實施例 42 CMV antigen-recall assay 檢測抗 PVRIGxTIGIT 人源化雙特異性抗體對抗原特異性 CD8 T 細胞的功能促進作用

本實驗原理：CMV IgG陽性donor的PBMC經CMV pp65(495-503)多肽誘導的CMV pp65特異性CD8T作為效應細胞，經pp65 pulsed後的colo205作為靶細胞的實驗體系中，考察抗PVRIG & TIGIT雙抗對pp65特異性CD8 T細胞的功能促進作用（圖61中A）。

PBMC復甦後，用含有1μg/mL CMV pp65(495-503)多肽(Anaspec, 貨號AS-28328)、2ng/mL human IL-2(R&D, 貨號IL-202)、10ng/mL human IL-7 (Peprotech, 貨號200-07)的完全培養基（RPMI1640-Glutamax + 5%AB serum + 1% P/S+(1×) 2-β巰基乙醇）重懸至2×10 ⁶/mL，5mL/孔接種於6孔板中，37℃ 5%CO ₂培養6天。第6天，收集所有細胞，撤去培養基中的pp65和IL-7，將細胞一分為二，並重懸於含有100 IU/mL human IL-2的完全培養基中，繼續培養2天。第8天，收集所有細胞，重懸於含有100IU/mL human IL-2的完全培養基中、並調整細胞密度為2×10 ⁶/mL，繼續培養。第11天，收集所有細胞，流式檢測CMV pp65(495-503)特異性CD8 T該細胞上PVRIG、TIGIT、PD-1的表達（圖61中B）。流式檢測抗體如下：Livedead Near IR (Invitrogen，貨號L34976)，CD8-PerCp Cy5.5(BD，貨號565310)，CD3-PE-Cy7(Biolegend,貨號300316)，T-select HLA-A*0201 CMV pp65 Tetramer-PE(MBL，貨號TS-0010-1C)，PVRIG-AF488(R&D，貨號FAB93651G-100UG)，TIGIT-APC (Biolegend,貨號372706)，PD-1-BV421 (BD,貨號562516)。

上述誘導後的PBMC經CD8分選試劑盒（Stemcell，貨號17953）分離出CD8作為效應細胞，用AIM-V培養基重懸並調整細胞密度至0.4×10 ⁶/mL(若CD8誘導後經凍存，則需將細胞數加大至0.7×10 ⁶/mL)。分選後的CD8檢測純度及CD226的表達。Colo205作為靶細胞，經TrypLE ^TMExpress Enzyme(Gibco, 貨號12605010)消化，重懸於含有20ng/mL pp65的AIM-V(Gibco, 貨號31035-025)並調整細胞密度至1×10 ⁶/ml，37℃ 5% CO ₂處理3小時，之後250g離心5分鐘，棄上清。之後細胞用AIM-V重懸至0.5×10 ⁶/mL，並用流式檢測其PVRL2， PVR及PD-L1的表達（圖61中B）。將待測抗體（人源化雙抗及Tecentriq）用AIM-V培養基稀釋至280nM。在低吸附96孔U底板（Corning, 貨號7007）中依次加入50μL抗體，50uL CD8，100μL pp65處理過的colo205，並用排槍輕輕混勻，37℃ 5%CO ₂孵育18小時。此體系中藥物終濃度為70nM，CD8為20000/孔，colo205為50000/孔。孵育結束後400g離心取上清，用ELISA試劑盒（達科為，貨號1110003）檢測上清中human IFN-γ的水準。此體系中的陽性對照為COM701-hIgG4和RG6058-hIgG1, 陰性對照為no treatment。分選後CD8T純度的流式檢測抗體如下：livedead-BV421 (Invitrogen,貨號L34964)，CD8-FITC(BD,貨號555366 )。

如圖61中C和表48所示，2個雙抗分子LC-BsAb-002和LC-BsAb-006在各濃度點上，IFN-γ的釋放水準在統計學上無顯著性差異，雙抗分子在高濃度點(LC-BsAb-002在70nM, LC-BsAb-006在70和7nM)的因數釋放顯著多於相同條件下的聯用組合，2個候選分子對應的聯用組合與陽性對照抗體RG605-hIgG1和COM701-hIgG4的聯用組合在各濃度點無顯著性差異，整體趨勢來看2個雙抗分子相較於陽性對照抗體RG605-hIgG1和COM701-hIgG4的聯用有更好的促進CD8 T釋放IFN-γ的作用。

如圖61中D，2個雙抗分子，LC-BsAb-002和LC-BsAb-006與Tencentriq聯用後，相較於雙抗本身Human IFN-γ的分泌均顯著增加（t-test, **P＜0.01），PVRIG單抗、TIGIT單抗和PD-L1單抗三個藥物的聯用，相較於PVRIG單抗和TIGIT單抗二個藥物的聯用，Human IFN-γ的分泌均顯著增加（t-test, *P＜0.05），圖中柱狀圖上的百分比為相較於抗TIGIT陽性對照抗體RG6058-hIgG1 IFN-γ提高的百分比。

表 48 細胞上清中 human IFN-γ 的檢測結果的統計學分析資料（ two-way ANOVA ）

Two-way ANOVA analysis-01
Conc.(nM)	LC-BsAb-002	LC-BsAb-006	two-way ANOVA
0.0007	137.4	111.7	128.3	131.5	ns
0.007	197.9	165	162.5	176.2	ns
0.07	554.3	411.2	371.1	338.2	ns
0.7	628.3	642.7	672	539.3	ns
7	784.3	691.5	820	727.9	ns
70	1119.1	881.8	733.6	798.2	ns
Two-way ANOVA analysis-02
Conc.(nM)	LC-BsAb-002	TIGIT-002-H4L3+PVRIG-A50-H1b	two-way ANOVA
0.0007	137.4	111.7	148.2	121	ns
0.007	197.9	165	132.2	146.5	ns
0.07	554.3	411.2	311	280.8	ns
0.7	628.3	642.7	444.6	455.5	ns
7	784.3	691.5	632.7	540.4	ns
70	1119.1	881.8	648.5	440.4	**
Two-way ANOVA analysis-03
Conc.(nM)	LC-BsAb-006	TIGIT-005-H2L1d+PVRIG-A50-H1b	two-way ANOVA
0.0007	128.3	131.5	120.3	121.6	ns
0.007	162.5	176.2	151.5	146.4	ns
0.07	371.1	338.2	229.9	276.2	ns
0.7	672	539.3	427.7	545.9	ns
7	820	727.9	571.5	388.2	**
70	733.6	798.2	441.9	415.2	***
Two-way ANOVA analysis-04
Conc.(nM)	TIGIT-002-H4L3+PVRIG-A50-H1b	RG6058+COM701	two-way ANOVA
0.0007	148.2	121	173.6	148.3	ns
0.007	132.2	146.5	189.9	113.3	ns
0.07	311	280.8	199.4	172.6	ns
0.7	444.6	455.5	396.7	529.4	ns
7	632.7	540.4	593.6	416.1	ns
70	648.5	440.4	630.3	436.7	ns
Two-way ANOVA analysis-05
Conc.(nM)	TIGIT-005-H2L1d+PVRIG-A50-H1b	RG6058+COM701	two-way ANOVA
0.0007	120.3	121.6	173.6	148.3	ns
0.007	151.5	146.4	189.9	113.3	ns
0.07	229.9	276.2	199.4	172.6	ns
0.7	427.7	545.9	396.7	529.4	ns
7	571.5	388.2	593.6	416.1	ns
70	441.9	415.2	630.3	436.7	ns

實施例 43 CMV antigen-recall assay 檢測抗 PVRIG×TIGIT 人源化雙特異性抗體與 Tecentriq 聯用後對抗原特異性 CD8 T 細胞的功能促進作用

實驗原理：同實施例40（圖61中A）。

抗原特異性CD8 T細胞的誘導：同實施例40。鋪板當天用流式檢測其上PVRIG、TIGIT和PD-1的表達（圖62中A）。

誘導後的PBMC經CD8 T分選試劑盒（Stemcell，貨號17953）分離出CD8 T作為效應細胞，用AIM-V培養基重懸並調整細胞密度至0.8×10 ⁶/mL(根據抗原特異性CD8 T細胞的比例，對微孔板中CD8 T細胞數進行調整)。完全培養基添加終濃度100ng/mL IFN-γ預處理過夜的Colo205作為靶細胞，經TrypLE ^TMExpress Enzyme(Gibco, 貨號12605010)消化，洗滌2遍後重懸於含有20ng/mL pp65的AIM-V(Gibco, 貨號31035-025)並調整細胞密度至1×10 ⁶/ml，37℃ 5% CO ₂處理3小時，之後250g離心5分鐘，棄上清。之後細胞用AIM-V重懸至0.5×10 ⁶/mL，並用流式檢測其PVRL2， PVR及PD-L1的表達（圖62中A）。將待測抗體（人源化雙抗、Tecentriq、雙抗與Tecentriq的聯用，2個陽性對照單抗（COM701-hIgG4和RG6058-hIgG1）的聯用、三個單抗（COM701-hIgG4、RG6058-hIgG1和Tecentriq）的聯用）用AIM-V培養基稀釋至280nM(4×)作為起始濃度，後續10倍梯度稀釋，共6個濃度點。在低吸附96孔U底板（Corning, 貨號7007）中依次加入50μL抗體，50μL CD8，100μL pp65處理過的colo205，並用排槍輕輕混勻，37℃ 5%CO ₂共孵育18小時。此體系中藥物終濃度分別為70nM、7nM、0.7nM、0.07 nM、0.007 nM和0.0007 nM，CD8為40000/孔，colo205為50000/孔。共孵育結束後400g離心取上清，用ELISA試劑盒（達科為，貨號1110003）檢測上清中human IFN-γ的水準。

如圖62中B及表49所示，根據IFN-γ擬合曲線的AUC進行排序： LC-BsAb-002+Tecentriq＞RG6058-hIgG1+COM701-hIgG4+Tecentriq＞LC-BsAb-002＞RG6058-hIgG1+COM701-hIgG4 ＞ Tecentriq。AUC越大，說明效力越強，LC-BsAb-002與Tencentriq聯用後，相較於雙抗LC-BsAb-002本身Human IFN-γ的分泌明顯增加；COM701-hIgG4、RG6058-hIgG1和Tecentriq三個藥物的聯用，相較於COM701-hIgG4和RG6058-hIgG1二個藥物的聯用，Human IFN-γ的分泌明顯增加。

表 49 細胞上清中 human IFN-γ 檢測結果的曲線擬合情況

	Tecentriq	LC-BsAb-002	RG6058+COM701	LC-BsAb-002 +Tecentriq	RG6058+COM701 +Tecentriq
EC50(nM)	- ^*	0.1494	1.571	0.1101	0.9041
AUC	97.17	320.4	176.4	728.4	447.9

^*資料曲線無法擬合

實施例 44 抗 PVRIGxTIGIT 人源化雙特異性抗體的小鼠體內藥效評估

A375細胞以5×10 ⁶個/0.1mL濃度接種於雌性5-6周NPG小鼠（品系：NPG；北京維通達生物技術有限公司）的右側皮下。A375細胞接種後一天，Hu PBMC細胞以5×10 ⁶個/0.2mL濃度尾靜脈注射於小鼠體內，待腫瘤生長到大約82 mm ³時按腫瘤體積挑選56只隨機分組，每組8只，共7組，分別為：Vehicle (PBS)、RG6058-hIgG1(10 mg/kg)、COM701-hIgG4(10mg/kg)、RG6058-hIgG1+ COM701-hIgG4(10mg/kg+10mg/kg)、Tecentriq(5 mg/kg；lotNO. HK65567，Roche) 、LC-BsAb-002(11.7mg/kg)、LC-BsAb-006(11.7mg/kg)。所有組給藥途徑均為腹腔注射，每週給藥2次，連續給藥4次，末次給藥3天後結束實驗。給藥和觀察期間每週測量3次小鼠體重和腫瘤體積，並記錄測量值，計算腫瘤體積（長徑×短徑 ²/2）和生長抑制率（TGI _TV(%)=（1-(Tn-T0)/(Vn-V0)）×100%。

藥效結果：如圖63所示，受試候選分子LC-BsAb-002、LC-BsAb-006給藥後對A375腫瘤生長有明顯抑制作用，抑制水準與陽性分子RG6058-hIgG1+COM701-hIgG4聯用、Tecentriq在同一水準。在分組給藥第13天，透過各受試藥組與陰性對照PBS組的腫瘤抑制率（TGI）及差異性分析 (表11)， LC-BsAb-002和LC-BsAb-006的TGI分別為82.16%和78.59%且較PBS有顯著性（P＜0.005），TGI水準好於RG6058-hIgG1（TGI=42.55）、COM701-hIgG4（TGI=0.23%）單藥，與RG6058-hIgG1+COM701-hIgG4聯用（TGI=83.32%）相當。單只小鼠腫瘤生長曲線如圖64所示顯示出和圖63相同的趨勢。

表 50 受試物對 A375 細胞移植 HuPBMC NPG 小鼠腫瘤體積的影響

組別	受試物	瘤體積（mm3） ^a	P ^b
給藥前	Day13	TGI (%)
G1	PBS	83±4	196±41	-	-
G2	RG6058-hIgG1	81±4	146±20	42.55	0.2614
G3	COM701-hIgG4	82±4	195±64	0.23	0.6052
G4	RG6058-hIgG1+ COM701-hIgG4	82±4	101±17	83.32	***0.0004
G5	Tecentriq	83±5	91±20	92.48	***0.0002
G6	LC-BsAb-002	82±5	103±21	82.16	**0.0035
G7	LC-BsAb-006	82±3	106±36	78.59	***0.0001

注：a：平均數±標準差； b：給藥組腫瘤體積與Vehicle對照組腫瘤體積在分組給藥第13天進行統計學比較，Two-way ANOVA分析，*P＜0.05, **P＜0.01，***P＜0.001,****P＜0.0001。

體重結果：如圖65及表51所示，除對照分子Tecentriq有顯著體重下降，表現出毒副作用外，其餘對照及候選分子LC-BsAb-002、LC-BsAb-006給藥體重變化趨勢基本和PBS一致，後續的體重下降為PBMC重建導致的GVHD現象。

表 51 受試物對 A375 細胞移植 HuPBMC NPG 小鼠體重的影響

組別	受試物	體重（g） ^a	第13天體重變化（%）
給藥前	13天	P ^b
G1	PBS	22.5±0.3	23.3±0.8	-	+3.8
G2	RG6058-hIgG1	22.4±0.4	21.4±1.1	0.8251	-4.6
G3	COM701-hIgG4	22.7±0.5	23.8±0.4	0.9999	+5.4
G4	RG6058-hIgG1+ COM701-hIgG4	22.6±0.6	22.4±1.4	0.9798	-1.5
G5	Tecentriq	22.7±0.8	18.7±1.0	**0.0061	-18.9
G6	LC-BsAb-002	22.2±0.5	20.7±0.7	0.0744	-6.4
G7	LC-BsAb-006	23.0±0.6	23.1±1.1	0.9999	+1.7

注：a：平均數±標準差； b：給藥組體重與Vehicle對照組體重在分組給藥第13天進行統計學比較，Two-way ANOVA分析。

最終結果表明，抗PVRIGxTIGIT人源化雙特異性抗體分子LC-BsAb-002和LC-BsAb-006對A375皮下移植瘤生長有顯著抑制作用，抑瘤效果優於陽性藥RG6058-hIgG1和COM701-hIgG4單藥，與陽性對照抗體Tecentriq和RG6058-hIgG1+COM701-hIgG4聯用相當。同時，在給藥觀察過程中未觀察到候選分子毒副作用，表明在該模型下候選分子表現安全耐受。

實施例 45 抗 PVRIGxTIGIT 人源化雙特異性抗體與 Tecentriq 聯用的小鼠體內藥效評估

A375細胞以5×10 ⁶個/0.1mL濃度接種於雌性5-6周NPG小鼠（品系：NPG；北京維通達生物技術有限公司）的右側皮下。A375細胞接種後一天，Hu PBMC細胞以5.5×10 ⁶個/0.2mL濃度尾靜脈注射於小鼠體內，待腫瘤生長到大約82.78 mm ³時按腫瘤體積挑選45只隨機分組，共5組，分別為：Vehicle (PBS，9只)、LC-BsAb-002 (11.7 mg/kg，9只)、LC-BsAb-002 (5.9 mg/kg，9只)、Tecentriq (3 mg/kg，10只；lotNO. HK65567，Roche)、LC-BsAb-002 + Tecentriq (5.9 mg/kg + 3mg/kg，8只)。所有組給藥途徑均為腹腔注射，每週給藥2次，連續給藥5次，末次給藥3天後結束實驗。給藥和觀察期間每週測量3次小鼠體重和腫瘤體積，並記錄測量值，計算腫瘤體積（長徑×短徑 ²/2）和生長抑制率（TGI _TV(%)=（1-(Tn-T0)/(Vn-V0)）×100%。

藥效結果：如圖66所示，受試候選分子LC-BsAb-002給藥後對A375腫瘤生長有明顯抑制作用，且給藥劑量越高，對A375腫瘤生長的抑制作用越強。而LC-BsAb-002與Tecentriq聯用對A375腫瘤生長的抑制水準顯著優於LC-BsAb-002和Tecentriq的單藥。在分組給藥第17天，透過各受試藥組與陰性對照PBS組的腫瘤抑制率（TGI）及差異性分析 (表52)，發現LC-BsAb-002（11.7 mg/kg）、LC-BsAb-002（5.9 mg/kg）和Tecentriq（3 mpk）的TGI分別為66.56%、60.51%和41.53，與PBS組相比有顯著差異（P＜0.0001、P=0.0003和P=0.0015）；LC-BsAb-002與Tecentriq聯用組的TGI為80.44%，與PBS組相比有顯著差異（P＜0.0001），且優於LC-BsAb-002（5.9 mg/kg）和Tecentriq（3 mpk）的單用TGI。單只小鼠腫瘤生長曲線如圖67所示，各組腫瘤生長趨勢與圖66相同。

表 52 受試物對 A375 細胞移植 HuPBMC NPG 小鼠腫瘤體積的影響

組別	受試物	瘤體積（mm3） ^a	P ^b
給藥前	Day17	TGI (%)
G1	PBS	83±3	718±116	-	-
G2	LC-BsAb-002 11.7 mpk	84±3	296±76	66.56	****＜0.0001
G3	LC-BsAb-002 5.9 mpk	83±3	334±78	60.51	***0.0003
G4	Tecentriq 3mpk	83±3	455±134	41.53	**0.0015
G5	LC-BsAb-002 5.9 mpk +Tecentriq 3 mpk	81±4	206±54	80.44	****＜0.0001

注：a：平均數±標準差； b：給藥組腫瘤體積與Vehicle對照組腫瘤體積在分組給藥第13天進行統計學比較，Two-way ANOVA分析，*P＜0.05, **P＜0.01，***P＜0.001, ****P＜0.0001。

體重結果：如圖68及表53所示，LC-BsAb-002+ Tecentriq聯用組的小鼠體重有一定下降，但並沒有表現出明顯的毒副作用。Tecentriq組、LC-BsAb-002(11.7 mpk) 和 LC-BsAb-002 (5.9 mpk) 給藥組小鼠體重變化趨勢與PBS組基本一致。

表 53 受試物對 A375 細胞移植 HuPBMC NPG 小鼠體重的影響

組別	受試物	體重（g） ^a	第17天體重變化（%）
給藥前	17天	P ^b
G1	PBS	23.1±0.4	22.4±0.6	-	+6.1
G2	LC-BsAb-002 11.7 mpk	23.7±0.7	23.4±1.2	0.9598	-1.8
G3	LC-BsAb-002 5.9 mpk	22.4±0.6	22.5±0.6	0.2524	+1.0
G4	Tecentriq 3mpk	23.2±0.6	22.7±1.0	0.1582	-2.3
G7	LC-BsAb-002 5.9 mpk +Tecentriq 3 mpk	22.4±0.5	20.2±1.0	0.0002	-10.0

注：a：平均數±標準差； b：給藥組體重與Vehicle對照組體重在分組給藥第13天進行統計學比較，Two-way ANOVA分析分析。

最終結果表明，抗PVRIGxTIGIT人源化雙特異性抗體分子LC-BsAb-002對A375皮下移植瘤生長有顯著抑制作用，且隨給藥劑量的提升，抑制作用呈明顯的劑量依賴關係。而LC-BsAb-002和Tecentriq聯用的抑瘤效果顯著優於各自的單用，有顯著的聯用效果，同時，在給藥觀察過程中未觀察到候選分子的毒副作用，表明在該模型下候選分子表現安全耐受。

無

圖1 顯示了抗TIGIT的人-鼠嵌合抗體與人TIGIT ECD-mFc融合蛋白的結合活性。圖2 顯示了抗TIGIT的人-鼠嵌合抗體與食蟹猴TIGIT ECD-mFc融合蛋白的結合活性。圖3 顯示了抗TIGIT的人-鼠嵌合抗體與CHO-K1 人TIGIT高表達株細胞的結合活性。圖4 顯示了抗TIGIT的人-鼠嵌合抗體與CHO-K1 人TIGIT中表達株細胞的結合活性。圖5 顯示了抗TIGIT的人-鼠嵌合抗體與CHO-K1 人TIGIT低表達株細胞的結合活性。圖6 顯示了抗TIGIT的人-鼠嵌合抗體與CHO-K1 食蟹猴TIGIT細胞的結合活性。圖7 顯示了抗TIGIT的人-鼠嵌合抗體阻斷Bio-CD155-His與CHO-K1 TIGIT相互作用的效應。圖8 顯示了抗TIGIT的人-鼠嵌合抗體阻斷TIGIT ECD-mFc與CHO-K1 CD155相互作用的效應。圖9 FACS檢測不同供體來源（donor-010和donor-050）的NK細胞表面PVRIG，TIGIT及腫瘤細胞系WIDR細胞表面PVR及PVRL2表達水準。A，圖中黑色空心峰圖是指NK細胞表面PVRIG/TIGIT的表達，灰色實心峰圖是指兩個檢測抗體對應的同型對照。B，圖中黑色空心峰圖是指WIDR細胞表面PVR/PVRL2的表達，灰色實心峰圖是指兩個檢測抗體對應的同型對照。圖10 顯示了抗TIGIT的人-鼠嵌合抗體與WIDR細胞和NK細胞共孵育對NK細胞脫顆粒（CD107a）作用的影響。橫坐標為受試抗體濃度，縱坐標為CD107a的陽性細胞占比。其中，RG6058-hIgG1為陽性對照抗體，anti-HEL-hIgG1為陰性同型對照抗體。圖11 顯示了抗TIGIT的人-鼠嵌合抗體對NK細胞殺傷WIDR靶細胞作用的影響。橫坐標為受試抗體的濃度，縱坐標為靶細胞的死亡率，RG6058-hIgG1為陽性對照抗體，anti-HEL-hIgG1為陰性同型對照抗體。圖12 CMV antigen-recall assay檢測抗TIGIT的人-鼠嵌合抗體對抗原特異性CD8 T細胞功能活性的影響。 A，CMV IgG陽性donor 128 PBMC經CMV pp65(495-503)誘導11天後的PBMC中CD8T細胞的比例，CMV pp65特異性CD8 T細胞比例及FMO對照；B，CMV pp65特異性CD8上PVRIG、TIGIT和PD-1的表達；C，Colo205上PVRL2和PVR的表達；D，鋪板共孵育18小時後細胞上清中IFN-γ的分泌水準。陽性對照為RG6058-hIgG1, 陰性對照為no treatment（不加任何藥物處理），柱狀圖上的百分比為受試抗體相較於no treatment組IFN-γ分泌提升的百分比。圖13顯示了抗TIGIT的人源化抗體與人TIGIT ECD-mFc融合蛋白的結合活性。圖14顯示了抗TIGIT的人源化抗體與食蟹猴TIGIT ECD-mFc融合蛋白的結合活性。圖15顯示了抗TIGIT的人源化抗體與CHO-K1 人TIGIT高表達株細胞的結合活性。圖16顯示了抗TIGIT的人源化抗體與CHO-K1 人TIGIT中表達株細胞的結合活性。圖17顯示了抗TIGIT的人源化抗體與CHO-K1 人TIGIT低表達株細胞的結合活性。圖18顯示了抗TIGIT的人源化抗體與CHO-K1 食蟹猴TIGIT細胞的結合活性。圖19顯示了抗TIGIT的人源化抗體阻斷Bio-CD155-His與CHO-K1 人TIGIT相互作用的效應。圖20 顯示了抗TIGIT的人源化抗體阻斷TIGIT ECD-mFc與CHO-K1 CD155相互作用的效應。圖21 顯示了抗TIGIT的人源化抗體阻斷TIGIT ECD-mFc與CHO-K1 CD112相互作用的效應。圖22顯示了抗TIGIT的人源化抗體與人PBMC的結合活性。圖23顯示了抗TIGIT的人源化抗體對NK細胞殺傷WIDR靶細胞作用的影響。圖中橫坐標為受試抗體的濃度，縱坐標為靶細胞的死亡率，TIGIT-CHI-002、TIGIT-CHI-005、TIGIT-CHI-006和TIGIT-CHI-070為人源化前的嵌合抗體，RG6058-hIgG1為陽性對照抗體，anti-HA HcAb-hIgG1為陰性同型對照抗體。圖24 CMV antigen-recall assay檢測抗TIGIT的人源化抗體對抗原特異性CD8 T細胞功能活性的影響。A，CMV IgG陽性donor 622 PBMC經CMV pp65(495-503)誘導11天後的PBMC中CD8 T細胞的比例，CMV pp65特異性CD8 T細胞比例，FMO對照； B，CMV pp65特異性CD8 T細胞上PVRIG、TIGIT、PD-1、CD226的表達；C，鋪板共孵育18小時後細胞上清中IFN-γ的分泌水準。陽性對照為RG6058-hIgG1和TIGIT-CHI-002, 陰性對照為no treatment（不加任何藥物處理）。柱狀圖上的百分比為受試抗體相較於no treatment組IFN-γ分泌提升的百分比。圖25 FACS檢測人TIGIT過表達細胞株CHO-K1人TIGIT 圖26A PVRIG受試抗體和人PVRIG重組蛋白的結合能力。圖中顯示了受試抗體PVRIG-A11、A15、A30、A35、A43、A50、A60、A75、A104、A105、A113、A117、A118與人PVRIG蛋白的結合能力。其中COM701-hIgG1、COM701-hIgG4和SRF813-hIgG1為該實驗的陽性對照；anti-HA HcAb-hIgG1和anti-CD38 HcAb-hIgG1為該實驗的陰性對照。圖26B PVRIG受試抗體和食蟹猴PVRIG重組蛋白的結合能力。圖中顯示了受試抗體PVRIG-A11、A15、A30、A35、A43、A50、A60、A75、A104、A105、A113、A117、A118與食蟹猴PVRIG蛋白的結合能力。其中COM701-hIgG1、COM701-hIgG4和SRF813-hIgG1為該實驗的陽性對照；anti-HA HcAb-hIgG1、anti-CD38 HcAb-hIgG1和anti-Fluorescein-hIgG1為該實驗的陰性對照。圖27A PVRIG受試抗體與Flpin CHO-PVRIG細胞表面人PVRIG的結合活性。圖中顯示了受試抗體PVRIG-A11、A15、A30、A35、A43、A50、A60、A75、A104、A105、A113、A117、A118與FlpinCHO-PVRIG細胞表面人PVRIG的結合能力。其中，COM701-hIgG1及SRF813-hIgG1為陽性對照抗體，anti-CD38 HcAb-hIgG1為陰性同型對照抗體。圖27B PVRIG受試抗體與FlpinCHO-cyno PVRIG細胞表面食蟹猴PVRIG的結合活性。圖中顯示了受試抗體PVRIG-A11、A15、A30、A50、A60、A105、A117、A118與FlpinCHO-cyno PVRIG細胞表面食蟹猴PVRIG的結合能力。其中，COM701-hIgG1及SRF813-hIgG1為陽性對照抗體，anti-CD38 HcAb-hIgG1為陰性同型對照抗體。圖28 PVRIG受試抗體阻斷人PVRIG與人PVRL2重組蛋白間的相互作用。圖中顯示了受試抗體PVRIG-A11、A15、A30、A35、A43、A50、A60、A75、A104、A105、A113、A117、A118對PVRIG和PVRL2的結合阻斷作用，其中COM701-hIgG4和SRF813-hIgG1為該實驗的陽性對照；anti-HA HcAb-hIgG1和anti-CD38 HcAb-hIgG1為該實驗的陰性對照。圖29 PVRIG受試抗體阻斷CHO-K1-CD112細胞與人PVRIG-mFc蛋白的結合。圖中顯示了受試抗體PVRIG-A11、A15、A30、A35、A43、A50、A60、A75、A104、A105、A113、A117、A118競爭CHO-K1-CD112細胞結合人PVRIG-mFc蛋白的能力。其中，COM701-hIgG4及SRF813-hIgG1為陽性對照抗體，anti-CD38 HcAb-hIgG1為陰性同型對照抗體。圖30 腫瘤細胞系Reh細胞表面PVR及PVRL2表達水準。圖中黑色空心峰圖是指Reh細胞表面PVR/PVRL2的表達，灰色實心峰圖是指檢測抗體對應的同型對照。圖31 PVRIG受試抗體對NK細胞脫顆粒作用的影響。圖A是指NK細胞（donor-010）與靶細胞Reh孵育時，受試抗體PVRIG-A11、A15、A30對NK細胞CD107a表達的影響；圖B是指NK（donor-010）與靶細胞WIDR孵育時，受試抗體PVRIG-A60、A75、A43、A35對NK細胞CD107a表達的影響；圖C是指NK細胞（donor-050）與靶細胞WIDR孵育時，受試抗體PVRIG-A104、A105、A118、A113、A117對NK細胞CD107a表達的影響；橫坐標為受試抗體濃度，縱坐標為CD107a的強陽性細胞占比，其中，COM701-hIgG1及SRF813-hIgG1為陽性對照抗體，anti-HA HcAb-hIgG1為陰性同型對照抗體。圖32 PVRIG受試抗體對NK細胞對靶細胞的殺傷作用的影響。圖A是指在6.87nM濃度時，受試抗體PVRIG-A11、A15、A30對NK細胞（donor-010）殺傷靶細胞WIDR的促進作用。各受試抗體與陰性同型對照anti-HA HcAb-hIgG1相比具有統計學差異（**p＜0.01, ***p＜0.001, ****p＜0.0001, One-Way ANOVA Analysis）；圖B是指在不同濃度下，受試抗體PVRIG-A50對NK細胞（donor-010）殺傷靶細胞WIDR的促進作用；圖C是指在不同濃度下，受試抗體PVRIG-A60、A75、A35、A43、A104、A105、A113、A117、A118對NK細胞（donor-050）殺傷靶細胞WIDR的促進作用。圖B和C的橫坐標為受試抗體的濃度，縱坐標為靶細胞的死亡率，COM701-hIgG1及SRF813-hIgG1為陽性對照抗體，anti-HA HcAb-hIgG1為陰性同型對照抗體。圖33 CMV antigen-recall assay檢測PVRIG抗體對抗原特異性CD8 T細胞的功能改善作用。圖A，CMV IgG陽性donor 021 PBMC經CMV pp65(495-503)誘導11天後的PBMC中CD8的比例，CMV pp65特異性CD8比例；圖B，CMV pp65特異性CD8（donor 021）上PVRIG、TIGIT、PD-1、CD226的表達; 圖C，colo205上PVRL2、PVR和HLA-A2的表達。圖D，鋪板共孵育18小時後細胞上清中IFN-γ的分泌水準。此實驗體系中的陽性對照為COM701-hIgG4, SRF813-hIgG1, 陰性對照為no treatment（不加任何藥物處理），抗體的作用終濃度均為70nM。和no treatment組相比，抗體PVRIG-A15, A30, A60, 75, 105, 117和118作用後，細胞上清中IFN-γ的分泌顯著增加（*p＜0.05, **p＜0.01, ***p＜0.001, ****p＜0.0001,one-way ANOVA Analysis）。圖34A PVRIG人源化抗體與人PVRIG重組蛋白的結合能力。圖中分別為受試人源化分子與其對照parental抗體PVRIG-A50、A105、A118與人PVRIG蛋白的結合活性；其中anti-HA HcAb-hIgG1、anti-CD38 HcAb-hIgG1和anti-Fluorescein-hIgG1為該實驗的陰性對照。圖34B PVRIG人源化抗體與食蟹猴PVRIG重組蛋白的結合能力。圖中分別為受試人源化分子與其對照parental抗體PVRIG-A50、A105、A118與食蟹猴PVRIG蛋白的結合活性；其中anti-HA HcAb-hIgG1、anti-CD38 HcAb-hIgG1和anti-Fluorescein-hIgG1為該實驗的陰性對照。圖35A PVRIG人源化抗體與FlpinCHO-PVRIG細胞表面人PVRIG的結合活性。圖中分別為受試人源化分子與其對照parental抗體PVRIG-A50、A105、A118與FlpinCHO-PVRIG細胞表面人PVRIG的結合能力。其中，COM701-hIgG1及SRF813-hIgG1為陽性對照抗體，anti-CD38 HcAb-hIgG1及anti-Fluorescein-hIgG1為陰性同型對照抗體。圖35B PVRIG人源化抗體與FlpinCHO-cyno PVRIG細胞表面食蟹猴PVRIG的結合。圖中分別為受試人源化分子與其對照parental抗體PVRIG-A50、A105、A118與FlpinCHO-cyno PVRIG細胞表面食蟹猴PVRIG的結合能力。其中，COM701-hIgG1及SRF813-hIgG1為陽性對照抗體，anti-CD38 HcAb-hIgG1及anti-Fluorescein-hIgG1為陰性同型對照抗體。圖36 PVRIG人源化抗體阻斷人PVRIG與人PVRL2結合。圖中分別為受試人源化分子與其對照parental抗體PVRIG-A50、A105、A118對人PVRIG蛋白和人PVRL2蛋白結合的阻斷作用；anti-HA HcAb-hIgG1和anti-Fluorescein-hIgG1為該實驗的陰性對照。圖37 PVRIG人源化抗體阻斷CHO-K1-CD112細胞與人PVRIG-mFc蛋白的結合。圖中分別為受試人源化分子與其對照parental抗體PVRIG-A50、A105、A118競爭CHO-K1-CD112細胞結合人PVRIG-mFc蛋白的能力。其中，COM701-hIgG4及SRF813-hIgG1為陽性對照抗體，anti-CD38 HcAb-hIgG1及anti-Fluorescein-hIgG1為陰性同型對照抗體。圖38 PVRIG人源化抗體對NK細胞殺傷作用的影響。在不同濃度下，受試人源化分子與其對照parental抗體PVRIG-A50（A），A118（B），A105（C）對NK（donor-050）殺傷靶細胞WIDR的促進作用。圖中橫坐標為受試抗體的濃度，縱坐標為靶細胞的死亡率，COM701-hIgG1及SRF813-hIgG1為陽性對照抗體，anti-HA HcAb-hIgG1和anti-Fluorescein-hIgG1為陰性同型對照抗體。圖39 CMV antigen-recall assay檢測PVRIG人源化抗體對抗原特異性CD8 T細胞的功能改善作用。鋪板共孵育18小時後細胞上清中IFN-γ的分泌水準。此實驗體系中的陽性對照為人源化前的PVRIG parental抗體, 陰性對照為no treatment（不加任何藥物處理），抗體的作用終濃度均為70nM。*p＜0.05, **p＜0.01, ***p＜0.001, ****p＜0.0001 vs. no treatment, one-way ANOVA Analysis。PVRIG-A50的4個人源化抗體（PVRIG-A50-H1a, H1b, H1d, H2a）的作用效果與PVRIG-A50無顯著性差異（One-way ANOVA Analysis）；PVRIG-A118的2個人源化抗體（PVRIG-A118-H3, H5）與PVRIG-A118無顯著性差異；PVRIG-A105-H2的作用效果顯著弱於PVRIG-A105(*p＜0.05, one-way ANOVA Analysis)，其餘的2個人源化抗體（PVRIG-A105-H1,H3）與PVRIG-A105無顯著性差異（One-way ANOVA Analysis）。圖40 四個人源化雙特異性抗體的組成及結構示意圖。圖41 ELISA檢測四個人源化雙抗與人PVRIG-ECD-mFc蛋白的結合。圖42 ELISA檢測四個人源化雙抗與食蟹猴PVRIG-ECD-mFc蛋白的結合。圖43 ELISA檢測四個人源化雙抗與人TIGIT-ECD-mFc蛋白的結合。圖44 ELISA檢測四個人源化雙抗與食蟹猴TIGIT-ECD-mFc蛋白的結合圖45 FACS檢測四個人源化雙抗與FlpinCHO-人PVRIG細胞的結合活性。圖46 FACS檢測四個人源化雙抗與FlpinCHO-食蟹猴PVRIG細胞的結合活性。圖47 FACS檢測四個人源化雙抗與CHO-K1-人TIGIT高表達細胞株的結合活性。圖48 FACS檢測四個人源化雙抗與CHO-K1-人TIGIT中表達細胞株的結合活性。圖49 FACS檢測四個人源化雙抗與CHO-K1-人TIGIT低表達細胞株的結合活性。圖50 FACS檢測四個人源化雙抗與CHO-K1-食蟹猴TIGIT細胞株的結合活性。圖51 HTRF檢測四個人源化雙抗阻斷PVRIG蛋白與PVRL2蛋白的結合。圖52 FACS檢測四個人源化雙抗阻斷PVRIG-ECD-mFc與CHO-K1-CD112的結合活性。圖53 ELISA檢測四個人源化雙抗阻斷TIGIT-ECD-mFc與CHO-K1-CD155的結合活性。圖54 FACS檢測四個人源化雙抗阻斷Bio-CD155-His蛋白與CHO-K1人TIGIT的結合活性。圖55 FACS檢測四個人源化雙抗與人PBMC的結合活性。圖56 BIAcore檢測人源化雙特異性抗體與PVRIG和TIGIT的共結合。LC-BsAb-002人源化雙抗（A）和LC-BsAb-006人源化雙抗（B）與人TIGIT蛋白，人PVRIG蛋白的結合曲線及分別連續注射人TIGIT和人PVRIG蛋白的抗體抗原結合曲線，黑色三角代表對應蛋白注射的時間點。圖57 NK細胞脫粒實驗檢測抗PVRIGxTIGIT人源化雙特異性抗體對NK細胞的功能促進作用。NK細胞脫顆粒實驗流程（A），FACS檢測NK細胞PVRIG，TIGIT和WIDR細胞PVR，PVRL2的表達水準（B），人源化雙特異性抗體LC-BsAb-002和LC-BsAb-006對於NK細胞CD107a表達水準的影響（EC50，AUC，靶細胞WIDR，C），人源化雙特異性抗體LC-BsAb-002對於NK細胞CD107a表達水準的影響（靶細胞TF-1，D）。圖58 NK細胞殺傷實驗檢測抗PVRIGxTIGIT人源化雙特異性抗體介導的NK細胞對WIDR細胞的殺傷作用。不同供體（Donor-050，831，715）NK細胞PVRIG和TIGIT的表達水準（A），靶細胞WIDR上PVR和PVRL2的表達水準（B），NK細胞毒實驗流程（C），LC-BsAb-002和LC-BsAb-006對三個不同供體NK細胞介導的WIDR細胞的殺傷（EC50，AUC，D），LC-BsAb-002對NK細胞介導的TF-1細胞的殺傷（E）。圖59 NK細胞ADCC實驗檢測抗PVRIGxTIGIT人源化雙特異性抗體介導的對人Treg細胞的直接殺傷作用。NK細胞介導的ADCC殺傷實驗流程（A），人Treg細胞PVRIG和TIGIT表達水準（B），不同IgG Fc的LC-BsAb-002和LC-BsAb-006對人Treg的ADCC殺傷對比（EC50，AUC，C）。圖60 抗PVRIGxTIGIT人源化雙特異性抗體介導的對人Treg細胞的ADCP活性。圖61 CMV antigen-recall assay檢測抗PVRIGxTIGIT人源化雙特異性抗體對抗原特異性CD8 T細胞的功能促進作用。CMV antigen-recall實驗流程（A），pp65特異性CD8 T細胞PVRIG、TIGIT、PD-1表達水準及IFN-γ預處理後Colo205細胞PVRL2，PVR及PD-L1的表達水準（B），鋪板共孵育18小時後細胞上清中IFN-γ的分泌水準。此實驗體系中的對照為抗TIGIT抗體：RG6058，TIGIT-002-H4L3，TIGIT-005-H2L1d，抗PVRIG抗體：COM701， PVRIG-A50-H1b，陰性對照為no treatment（不加任何藥物處理）（C），人源化雙抗，單藥聯用及其分別與抗PD-L1抗體聯用鋪板共孵育18小時後細胞上清中IFN-γ的分泌水準。此實驗體系中的對照為抗TIGIT抗體：RG6058，TIGIT-002-H4L3，TIGIT-005-H2L1d，抗PVRIG抗體：COM701， PVRIG-A50-H1b，抗PD-L1抗體：Tecentriq，陰性對照為no treatment（不加任何藥物處理）（D）。圖62 CMV antigen-recall assay檢測抗PVRIG×TIGIT人源化雙特異性抗體與Tecentriq聯用後對抗原特異性CD8 T細胞的功能促進作用。pp65特異性CD8 T細胞PVRIG、TIGIT、PD-1表達水準及IFN-γ預處理後Colo205細胞PVRL2，PVR及PD-L1的表達水準（A）, 人源化雙抗，聯用及其分別與抗PD-L1抗體聯用鋪板共孵育18小時後細胞上清中IFN-γ的分泌水準。此實驗體系中的對照為抗TIGIT抗體：RG6058，抗PVRIG抗體：COM701，抗PD-L1抗體：Tecentriq（B）。圖63 A375 hPBMC人源化動物模型中各受試組腫瘤生長曲線。圖64 A375 hPBMC人源化動物模型中各受試組單只小鼠腫瘤生長曲線。圖65 A375 hPBMC人源化動物模型中各受試組給藥後小鼠體重變化情況。圖66 A375 hPBMC人源化動物模型中不同劑量雙特異性抗體單藥及與Tecentriq聯用各受試組腫瘤生長曲線。圖67 A375 hPBMC人源化動物模型中不同劑量雙特異性抗體單藥及與Tecentriq聯用各受試組單只小鼠腫瘤生長曲線。圖68 A375 hPBMC人源化動物模型中不同劑量雙特異性抗體單藥及與Tecentriq聯用各受試組給藥後小鼠體重變化情況。

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Claims

一種抗PVRIG/抗TIGIT雙特異性抗體，其包含：（a）第一抗原結合部分，其包括重鏈可變區（VH）和輕鏈可變區（VL），所述VH和VL形成抗TIGIT抗原結合域；其中，所述TIGIT VH包含SEQ ID NO：72或87任一項所述VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3；所述TIGIT VL包含SEQ ID NO：68或91任一項所述VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3；（b）第二抗原結合部分，其包括特異性結合PVRIG的VHH，所述VHH包含SEQ ID NO：200或211任一項所述序列的CDR1、CDR2和CDR3。
如請求項1所述的雙特異性抗體，其中：（a）所述第一抗原結合部分的HCDR1包含SEQ ID NO：21或33任一項所述的序列；HCDR2包含SEQ ID NO：22或34任一項所述的序列；HCDR3包含SEQ ID NO：23或35任一項所述的序列；（b）所述第一抗原結合部分的LCDR1包含SEQ ID NO：18或96任一項所述的序列；LCDR2包含SEQ ID NO：19或31任一項所述的序列；LCDR3包含SEQ ID NO：20或32任一項所述的序列；（c）所述第二抗原結合部分的CDR1包含SEQ ID NO：168或147任一項所述的序列；CDR2包含SEQ ID NO：207或148任一項所述的序列；CDR3包含SEQ ID NO：208或149任一項所述的序列。
如請求項2所述的雙特異性抗體，其中，所述第一抗原結合部分包含以下序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3：（1）分別為SEQ ID NO：21、22、23、18、19和20；或（2）分別為SEQ ID NO：33、34、35、96、31和32；或（3）與上述（1）至（2）所示序列具有至少90%同一性或具有1、2、3或更多個胺基酸插入、缺失和/或替換的序列，優選地，所述替換為保守胺基酸的替換。
如請求項2或請求項3所述的雙特異性抗體，其中，所述第二抗原結合部分包含以下序列的CDR1、CDR2和CDR3：（1）分別為SEQ ID NO：168、207和208；或（2）分別為SEQ ID NO：147、148和149；或（3）與上述（1）至（2）所示序列具有至少90%同一性或具有1、2、3或更多個胺基酸插入、缺失和/或替換的序列，優選地，所述替換為保守胺基酸的替換。
如請求項1至請求項4中任一項所述的雙特異性抗體，其中，所述第一抗原結合部分的VH包含與SEQ ID NO：72或87所示胺基酸序列至少90%同一性的序列；所述第一抗原結合部分的VL包含SEQ ID NO：68或91所示胺基酸序列至少90%同一性的序列。
如請求項1至請求項5中任一項所述的雙特異性抗體，其中，第二抗原結合部分包含SEQ ID NO：200或211所示胺基酸序列至少90%同一性的序列。
如請求項1至請求項6中任一項所述的雙特異性抗體，其中，所述第一抗原結合部分是一種全長抗體，包括兩條重鏈和兩條輕鏈；所述第二抗原結合部分的C端融合到第一抗原結合部分的至少一條重鏈的N端。
如請求項7所述的雙特異性抗體，其中，重鏈融合多肽從N端到C端包括PVRIG VHH-(G4S)4 Linker-TIGIT VH-CH1-鉸鏈-CH2-CH3，輕鏈多肽從N端到C端包括TIGIT VL-CL。
如請求項7或請求項8所述的雙特異性抗體，其中，所述重鏈融合多肽包括與SEQ ID NO：227、229、231或233所示胺基酸序列至少80%同一性的序列，輕鏈多肽包括與SEQ ID NO：226、228、230或232所示胺基酸序列至少80%同一性的序列。
如請求項1至請求項9中任一項所述的雙特異性抗體，其為人源化抗體。
如請求項1至請求項10中任一項所述的雙特異性抗體，其與人、猴PRVIG或TIGIT蛋白特異性結合；優選地，其與人、猴TIGIT結合的KD優於1.00E-7M，與人、猴PRVIG結合的KD優於1.00E-8M；更優選地，其可同時與TIGIT和PVRIG相結合。
一種特異性結合TIGIT的抗體或抗原結合片段，其包含：（1）重鏈可變區（VH），其中所述重鏈可變區包含三個互補決定區(HCDR)：HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中，按照Kabat編號系統編號，所述HCDR1包含SEQ ID NO: 21、27、33、39所示的胺基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO: 22、28、34、40所示的胺基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO: 23、29、35、41所示的胺基酸序列；按照IMGT編號系統編號，所述HCDR1包含SEQ ID NO: 45、51、57、63所示的胺基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:46、52、58、64，所述HCDR3包含SEQ ID NO:47、53、59、65；以及，（2）輕鏈可變區（VL），其中所述輕鏈可變區包含三個互補決定區(LCDR)：LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中，按照Kabat編號系統編號，所述LCDR1包含SEQ ID NO: 18、24、30、36、93、94、95、96所示的胺基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO: 19、25、31、37所示的胺基酸序列，所述LCDR3包含SEQ ID NO: 20、26、32、38所示的胺基酸序列；按照IMGT編號系統編號，所述LCDR1包含SEQ ID NO: 42、48、54、60所示的胺基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO: 43、49、55、61所示的胺基酸序列，所述LCDR3包含SEQ ID NO: 44、50、56、62所示的胺基酸序列。
如請求項12所述的抗體或抗原結合片段，其包含以下序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3：（1）分別為SEQ ID NO: 18、19、20、21、22和23；或（2）分別為SEQ ID NO: 24、25、26、27、28和29；或（3）分別為SEQ ID NO: 30、31、32、33、34和35；或（4）分別為SEQ ID NO: 36、37、38、39、40和41；或（5）分別為SEQ ID NO: 42、43、44、45、46和47；或（6）分別為SEQ ID NO: 48、49、50、51、52和53；或（7）分別為SEQ ID NO: 54、55、56、57、58和59；或（8）分別為SEQ ID NO: 60、61、62、63、64和65；或（9）分別為SEQ ID NO: 93、31、32、33、34和35；或（10）分別為SEQ ID NO: 94、31、32、33、34和35；或（11）分別為SEQ ID NO: 95、31、32、33、34和35；或（12）分別為SEQ ID NO: 96、31、32、33、34和35；或（13）與上述（1）至（12）所示序列具有至少80%同一性或具有1、2、3或更多個胺基酸插入、缺失和/或替換的序列，優選地，所述替換為保守胺基酸的替換。
如請求項12或請求項13所述的抗體或抗原結合片段，其包含：（1）重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 10、11、12、13、69、70、71、72、81、82、83、84、85、87、101、102或103具有至少80％同一性的胺基酸序列；或/和（2）輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 14、15、16、17、66、67、68、78、79、80、86、88、89、90、91、98、99或100具有至少80％同一性的胺基酸序列。
如請求項12至請求項14中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其：（1）包含SEQ ID NO:10所示胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO:14所示胺基酸序列的輕鏈可變區；或（2）包含SEQ ID NO:11所示胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO:15所示胺基酸序列的輕鏈可變區；或（3）包含SEQ ID NO:12所示胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO:16所示胺基酸序列的輕鏈可變區；或（4）包含SEQ ID NO:13所示胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO:17所示胺基酸序列的輕鏈可變區；或（5）包含SEQ ID NO:69所示胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO:66、67或68所示胺基酸序列的輕鏈可變區；或（6）包含SEQ ID NO:70所示胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO:66、67或68所示胺基酸序列的輕鏈可變區；或（7）包含SEQ ID NO:71所示重鏈可變區及包含SEQ ID NO:66、67或68所示胺基酸序列的輕鏈可變區；或（8）包含SEQ ID NO:72所示胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO:66、67或68所示胺基酸序列的輕鏈可變區；或（9）包含SEQ ID NO: 81、82、83、84或85所示胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 78所示胺基酸序列的輕鏈可變區；或（10）包含SEQ ID NO: 81、82、83、84或85所示胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 79所示胺基酸序列的輕鏈可變區；或（11）包含SEQ ID NO: 81、82、83、84或85所示胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 80所示胺基酸序列的輕鏈可變區；或（12）包含SEQ ID NO: 87所示胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 86、88、89、90或91所示胺基酸序列的輕鏈可變區；或（13）包含SEQ ID NO: 101所示胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 98、99或100所示胺基酸序列的輕鏈可變區；或（14）包含SEQ ID NO: 102所示胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 98、99或100所示胺基酸序列的輕鏈可變區（15）包含SEQ ID NO: 103所示胺基酸序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO: 98、99或100所示胺基酸序列的輕鏈可變區；或（16）與上述（1）至（15）所示序列具有至少80%同一性或至多20個突變的序列；所述突變可選自插入、缺失和/或替換，所述替換優選為保守胺基酸的替換。
如請求項12至請求項15中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其包含重鏈可變區，其中，所述重鏈可變區與SEQ ID NO. 10所示VH相比至少具有選自下組的突變：按自然順序編號，S30T，G44K，W47Y，I48M，V67I或V71R；優選地，至少具有S30T和V71R突變；更優選地，至少具有S30T，G44K和V71R突變；更優選地，至少具有S30T，G44K，I48M，V67I和V71R突變；更優選地，至少具有S30T，G44K，W47Y和V71R突變；或與SEQ ID NO. 11所示VH相比至少具有選自下組的突變：按自然順序編號，T28A，R72A，T74K或A76S；優選地，至少具有T28A，R72A，T74K和A76S；或與SEQ ID NO. 12所示VH相比至少具有選自下組的突變：按自然順序編號，I29M，S30T，G44K，W47Y，I48M，V67I或V71R；優選地，至少具有S30T和V71R突變；更優選地，至少具有I29M，S30T和V71R突變；更優選地，至少具有I29M，S30T，G44K和V71R突變；更優選地，至少具有I29M，S30T，G44K，I48M，V67I和V71R突變；更優選地，至少具有I29M，S30T，G44K，W47Y和V71R；或與SEQ ID NO. 13所示VH相比至少具有選自下組的突變：按自然順序編號，R44G，R72V，T74K，S75L或A76S；優選地，至少具有R72V和T74K突變；更優選地，至少具有R72V，T74K，S75L和A76S突變；更優選地，至少具有R44G，R72V，T74K，S75L和A76S突變。
如請求項12至請求項16中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其包含輕鏈可變區，其中，所述輕鏈可變區與SEQ ID NO. 14所示VL相比至少具有選自下組的突變：按自然順序編號，L37Q，P43S或L47M；優選地，至少具有L47M突變；更優選地，至少具有L37Q和L47M突變；更優選地，至少具有P43S和L47M突變；或與SEQ ID NO. 15所示VL相比至少具有選自下組的突變：按自然順序編號，N31Q，N31T，N31D，G32A，Q38H或P43S；優選地，至少具有Q38H和P43S突變；更優選地，至少具有N31Q，Q38H和P43S突變；更優選地，至少具有N31T，Q38H和P43S突變；更優選地，至少具有N31D，Q38H和P43S突變；更優選地，至少具有G32A，Q38H和P43S突變；或與SEQ ID NO. 16所示VL相比至少具有選自下組的突變：按自然順序編號，L37Q，P43S或Q45K；優選地，至少具有L37Q和Q45K突變；更優選地，至少具有P43S突變；或與SEQ ID NO. 17所示VL相比至少具有選自下組的突變：按自然順序編號，A43S，P43S或I48V；優選地，至少具有A43S突變；更優選地，至少具有A43S和I48V突變；更優選地，至少具有P43S和I48V突變。
如請求項12至請求項17中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其與人、猴TIGIT蛋白特異性結合；優選地，其與人、猴TIGIT結合的KD優於1.00E-8M。
如請求項12至請求項18中任一項所述的抗體或抗原結合部分，其為鼠抗體、人源化抗體、全人抗體或嵌合抗體。
如請求項12至請求項19中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其選自單克隆抗體、多克隆抗體、天然抗體、工程化抗體、單特異性抗體、多特異性分子（例如雙特異性抗體）、單價抗體、多價抗體、完整抗體、完整抗體的片段、裸抗體、綴合抗體、嵌合抗體、人源化抗體、全人抗體、Fab、Fab’、Fab’-SH、F（ab’）2、Fd、Fv、scFv、雙抗體（diabody）或單域抗體。
一種特異性結合PVRIG的奈米抗體或抗原結合片段，其包含SEQ ID NO. 107-119、198-204、211-216、219-225任一項所述VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
如請求項21所述的奈米抗體或抗原結合片段，其中，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3根據IMGT編號系統確定，例如選自表21；所述HCDR1、HCDR2和HCDR3根據Kabat編號系統確定，例如選自表22、表29。
如請求項21或請求項22所述的奈米抗體或抗原結合片段，其中，SEQ ID NO. 107所示VH的HCDR1~3按照IMGT或Kabat編號系統，具有如SEQ ID NO：120~122或SEQ ID NO：159~161所示的序列； SEQ ID NO. 108所示VH的HCDR1~3按照IMGT或Kabat編號系統，具有如SEQ ID NO：123~125或SEQ ID NO：162~164所示的序列； SEQ ID NO. 109所示VH的HCDR1~3按照IMGT或Kabat編號系統，具有如SEQ ID NO：126~128或SEQ ID NO：165~167所示的序列； SEQ ID NO. 110所示VH的HCDR1~3按照IMGT或Kabat編號系統，具有如SEQ ID NO：129~131或SEQ ID NO：168~170所示的序列； SEQ ID NO. 111所示VH的HCDR1~3按照IMGT或Kabat編號系統，具有如SEQ ID NO：132~134、SEQ ID NO：171~173所示的序列； SEQ ID NO. 112所示VH的HCDR1~3按照IMGT或Kabat編號系統，具有如SEQ ID NO：135~137或SEQ ID NO：174~176所示的序列； SEQ ID NO. 113所示VH的HCDR1~3按照IMGT或Kabat編號系統，具有如SEQ ID NO：138~140或SEQ ID NO：177~179所示的序列； SEQ ID NO. 114所示VH的HCDR1~3按照IMGT或Kabat編號系統，具有如SEQ ID NO：141~143或SEQ ID NO：180~182所示的序列； SEQ ID NO. 115所示VH的HCDR1~3按照IMGT或Kabat編號系統，具有如SEQ ID NO：144~146或SEQ ID NO：183~185所示的序列； SEQ ID NO. 116所示VH的HCDR1~3按照IMGT或Kabat編號系統，具有如SEQ ID NO：147~149或SEQ ID NO：186~188所示的序列； SEQ ID NO. 117所示VH的HCDR1~3按照IMGT或Kabat編號系統，具有如SEQ ID NO：150~152或SEQ ID NO：189~191所示的序列； SEQ ID NO. 118所示VH的HCDR1~3按照IMGT或Kabat編號系統，具有如SEQ ID NO：153~155或SEQ ID NO：192~194所示的序列； SEQ ID NO. 119所示VH的HCDR1~3按照IMGT或Kabat編號系統，具有如SEQ ID NO：156~158或SEQ ID NO：195~197所示的序列； SEQ ID NO. 198所示VH的HCDR1~3按照Kabat編號系統，具有如SEQ ID NO：168~170所示的序列； SEQ ID NO. 199所示VH的HCDR1~3按照Kabat編號系統，具有如SEQ ID NO：168、207和170所示的序列； SEQ ID NO. 200所示VH的HCDR1~3按照Kabat編號系統，具有如SEQ ID NO：168、207和208所示的序列； SEQ ID NO. 201所示VH的HCDR1~3按照Kabat編號系統，具有如SEQ ID NO：168、207和209所示的序列； SEQ ID NO. 202所示VH的HCDR1~3按照Kabat編號系統，具有如SEQ ID NO：168、169和208所示的序列； SEQ ID NO.203、204所示VH的HCDR1~3按照Kabat編號系統，具有如SEQ ID NO：168、210和208所示的序列； SEQ ID NO. 211~215所示VH的HCDR1~3按照IMGT編號系統，具有如SEQ ID NO：147~149所示的序列； SEQ ID NO. 216所示VH的HCDR1~3按照IMGT編號系統，具有如SEQ ID NO：147、148和218所示的序列； SEQ ID NO. 219-225所示VH的HCDR1~3按照IMGT編號系統，具有如SEQ ID NO：156~158所示的序列。
如請求項21至請求項23中任一項所述的奈米抗體或抗原結合片段，其包含與所述HCDR1、HCDR2和HCDR3相比具有至少80%同一性或具有1、2、3或更多個胺基酸插入、缺失和/或替換的CDRs序列，優選地，所述替換為保守胺基酸的替換。
如請求項21至請求項24中任一項所述的奈米抗體或抗原結合片段，其包含SEQ ID NO. 107-119、198-204、211-216、219-225任一項所示的VH，或者與SEQ ID NO. 107-119、198-204、211-216、219-225任一項所示VH具有至少80%同一性或至多20個突變的序列；所述突變可選自插入、缺失和/或替換，所述替換優選為保守胺基酸的替換。
如請求項25所述的奈米抗體或抗原結合片段，其包含與SEQ ID NO. 110所示VH相比至少具有選自下組的突變序列：按自然順序編號，A97V、K98E、N54D、N108S、S110A、G55A或S75T；更優選地，至少具有A97V和K98E突變；更優選地，至少具有A97V、K98E和N54D突變；更優選地，至少具有A97V、K98E、N54D和N108S突變；更優選地，至少具有A97V、K98E、N54D和S110A突變；更優選地，至少具有A97V、K98E和N108S突變；更優選地，至少具有A97V、K98E、G55A和N108S突變；更優選地，至少具有S75T、A97V、K98E、G55A和N108S突變；或包含與SEQ ID NO：116所示VH相比，至少具有選自下組的突變序列：按自然順序編號，S35T、V37F、G44E、L45R、W47F、N50T、L79V、V61S、D62H、T122I或M123Q；更優選地，至少具有V37F、G44E、L45R、W47F和N50T突變；更優選地，至少具有S35T、V37F、G44E、L45R、W47F和N50T突變；更優選地，至少具有S35T、V37F、G44E、L45R、W47F、N50T和L79V突變；更優選地，至少具有S35T、V37F、G44E、L45R、W47F、N50T、V61S和D62H突變；更優選地，至少具有S35T、V37F、G44E、L45R、W47F、N50T、T122I和M123Q突變；或包含與SEQ ID NO：119所示VH相比，至少具有選自下組的突變序列：按自然順序編號，S35G、V37Y、G44D、L45R、W47L、N50T、Y58K、Y59I、D72G、N73D、Y79S、L78V或Y94F；更優選地，至少具有S35G、V37Y、G44D、L45R、W47L和N50T突變；更優選地，至少具有S35G、V37Y、G44D、L45R、W47L、N50T和Y58K突變；更優選地，至少具有S35G、V37Y、G44D、L45R、W47L、N50T、Y58K、D72G和N73D突變；更優選地，至少具有S35G、V37Y、G44D、L45R、W47L、N50T、Y58K、D72G、N73D和Y79S突變；更優選地，至少具有S35G、V37Y、G44D、L45R、W47L、N50T、Y58K、D72G、N73D和L78V突變；更優選地，至少具有S35G、V37Y、G44D、L45R、W47L、N50T、Y58K、Y59I、D72G和N73D突變；更優選地，至少具有S35G、V37Y、G44D、L45R、W47L、N50T、Y58K、D72G、N73D和Y94F突變。
如請求項21至請求項26中任一項所述的奈米抗體或抗原結合片段，其與人、猴PVRIG蛋白特異性結合；優選地，其與人、猴PVRIG結合的KD優於2.00E-9 M。
如請求項21至請求項27中任一項所述的奈米抗體或抗原結合片段，其為：（1）嵌合奈米抗體或其片段；（2）人源化奈米抗體或其片段；或（3）全人奈米抗體或其片段。
如請求項21至請求項28中任一項所述的奈米抗體或抗原結合片段，其包含或不包含抗體重鏈恆定區；可選的，所述抗體重鏈恆定區可選自人、羊駝、小鼠、大鼠、兔或羊；可選地，所述抗體重鏈恆定區可選自IgG、IgM、IgA、IgE或IgD，所述IgG可選自IgG1，IgG2，IgG3或IgG4；可選地，所述重鏈恆定區可選自Fc區、CH3區或完整重鏈恆定區，優選地，所述重鏈恆定區為人Fc區；優選地，所述奈米抗體或抗原結合片段為重鏈抗體。
如請求項1至請求項11中任一項所述的抗PVRIG/抗TIGIT雙特異性抗體，請求項12至請求項20中任一項所述的特異性結合TIGIT的抗體或抗原結合片段，請求項21至請求項29中任一項所述的特異性結合PVRIG的奈米抗體或抗原結合片段，其還偶聯有治療劑或示蹤劑；優選地，所述治療劑選自藥物、毒素、放射性同位素、化療藥或免疫調節劑，所述示蹤劑選自放射學造影劑、順磁離子、金屬、螢光標記、化學發光標記、超聲造影劑和光敏劑。
一種多特異性分子，其包含請求項1至請求項11中任一項所述的抗PVRIG/抗TIGIT雙特異性抗體，請求項12至請求項20中任一項所述的特異性結合TIGIT的抗體或抗原結合片段；或包含請求項21至請求項29中任一項所述的特異性結合PVRIG的奈米抗體或抗原結合片段；優選地，所述多特異性分子可為雙特異性、三特異性或四特異性，更優選地，所述多特異性分子可為二價、四價或六價。
如請求項31所述的多特異性分子，其為串聯scFv、雙功能抗體(Db)、單鏈雙功能抗體(scDb)、雙重親和力再靶向(DART)抗體、F(ab ')2、雙重可變域(DVD)抗體、臼包杵(KiH)抗體、對接及鎖定(DNL)抗體、化學交聯抗體、雜多聚奈米抗體或異結合物抗體。
一種嵌合抗原受體（CAR），其至少包含細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和胞內訊號傳導結構域，所述細胞外抗原結合結構域包含請求項12至請求項20中任一項所述的抗體或抗原結合片段；或包含請求項21至請求項29中任一項所述的奈米抗體或抗原結合片段。
一種免疫效應細胞，其表達請求項33所述的嵌合抗原受體，或包含編碼請求項33所述嵌合抗原受體的核酸片段；優選地，所述免疫效應細胞選自T細胞、NK細胞（natural killer cell）、NKT細胞（natural killer T cell）、DNT細胞（double negative T cell）、單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞或肥大細胞，所述T細胞優選自細胞毒性T細胞、調節性T細胞或輔助性T細胞；優選地，所述免疫效應細胞為自體免疫效應細胞或同種異體免疫效應細胞。
一種分離的核酸片段，其編碼請求項1至請求項11中任一項所述的雙特異性抗體，請求項12至請求項20中任一項所述的抗體或抗原結合片段，請求項21至請求項29中任一項所述的奈米抗體或抗原結合片段，請求項31至請求項32中任一項所述的多特異性分子，或請求項33所述的嵌合抗原受體。
一種載體（vector），其包含請求項35所述的核酸片段。
一種宿主細胞，其包含請求項36所述的載體；優選地，所述細胞為原核細胞或真核細胞，例如細菌（大腸桿菌）、真菌（酵母）、昆蟲細胞或哺乳動物細胞（CHO細胞系或293T細胞系）。
一種製備請求項1至請求項11中任一項所述的雙特異性抗體，請求項12至請求項20中任一項所述的抗體或抗原結合片段，請求項21至請求項29中任一項所述的奈米抗體或抗原結合片段，或請求項31至請求項32中任一項所述的多特異性分子的方法，其包括培養請求項37的細胞，以及分離所述細胞表達的抗體或分子。
一種製備請求項34所述的免疫效應細胞的方法，其包括將編碼請求項33所述的CAR的核酸片段導入所述免疫效應細胞，可選地，更包括啟動所述免疫效應細胞表達請求項34所述的CAR。
一種藥物組合物，其包含請求項1至請求項11中任一項所述的雙特異性抗體，或請求項12至請求項20中任一項所述的抗體或抗原結合片段，或請求項21至請求項29中任一項所述的奈米抗體或抗原結合片段，或請求項31至請求項32中任一項所述的多特異性分子，或請求項34所述的免疫效應細胞，或請求項35所述的核酸片段，或請求項36所述的載體，或請求項37所述的宿主細胞，或請求項38至請求項39中任一項所述的方法製備獲得的產品，和藥學上可接受的載體。
如請求項40所述的藥物組合物，其進一步包含另外的治療劑；優選地，所述另外的治療劑是抗腫瘤劑；更優選地，所述抗腫瘤劑是PD-1軸結合拮抗劑。
如請求項1至請求項11中任一項所述的雙特異性抗體，或請求項12至請求項20中任一項所述的抗體或抗原結合片段，或請求項21至請求項29中任一項所述的奈米抗體或抗原結合片段，或請求項31至請求項32中任一項所述的多特異性分子，或請求項34所述的免疫效應細胞，或請求項35所述的核酸片段，或請求項36所述的載體，或請求項37所述的宿主細胞，或請求項38至請求項39中任一項所述的方法製備獲得的產品，或請求項40至請求項41中任一項所述的藥物組合物在製備用於治療癌症或感染性疾病的藥物中的用途；其中所述癌症選自實體腫瘤和血液腫瘤，優選地，所述腫瘤選自白血病，多發性骨髓瘤，淋巴瘤，骨髓增生異常綜合征，前列腺癌，肝癌，結直腸癌，肛門癌、卵巢癌，子宮內膜癌，宮頸癌，腹腔癌、乳腺癌，胰腺癌，胃癌，頭頸癌，甲狀腺癌，睾丸癌，泌尿道上皮癌，肺癌，黑色素瘤，非黑素瘤皮膚癌，神經膠質瘤，腎癌，間皮瘤，食道癌，非小細胞肺癌，小細胞肺癌，膀胱癌，肉瘤，成膠質細胞瘤，胸腺癌，蕈樣肉芽腫，默克爾細胞癌，高MSI癌和KRAS突變型腫瘤。
如請求項42所述的用途，其中，所述藥物與另外的治療劑或與手術組合使用；其中所述另外的治療劑或所述手術選自放射療法、化學療法、溶瘤藥物、細胞毒性劑、細胞因數、外科手術、免疫刺激性抗體、免疫調節藥物、共刺激分子的啟動劑、抑制性分子的抑制劑、疫苗或細胞免疫療法。
如請求項43所述的用途，其中，所述另外的治療劑在所述藥物之前或之後施用，或與所述藥物並行施用。
如請求項42至請求項44中任一項所述的用途，其中，所述藥物與PD-1軸結合拮抗劑組合使用。
如請求項45所述的用途，其中，所述PD-1軸結合拮抗劑選自由PD-1結合拮抗劑，PD-L1結合拮抗劑，和PD-L2結合拮抗劑組成的組；優選地，所述PD-1結合拮抗劑是抗PD-1抗體；更優選地，所述PD-1結合拮抗劑選自由MDX 1106(nivolumab)，MK-3475(pembrolizumab)，CT-011(pidilizumab)，MEDI-0680(AMP-514)，PDR001，REGN2810，和BGB-108組成的組；優選地，所述PD-L1結合拮抗劑是抗PD-L1抗體；更優選地，所述PD-L1結合拮抗劑選自由MPDL3280A(atezolizumab)，YW243.55.S70，MDX-1105，MEDI4736(durvalumab)，Tecentriq和MSB0010718C(avelumab)組成的組；優選地，所述PD-L2結合拮抗劑是抗PD-L2抗體；更優選地，所述PD-L2結合拮抗劑是免疫黏附素。
一種治療癌症或感染性疾病的方法，包含向有此需要的患者施用有效量的請求項1至請求項11中任一項所述的雙特異性抗體，或請求項12至請求項20中任一項所述的抗體或抗原結合片段，或請求項21至請求項29中任一項所述的奈米抗體或抗原結合片段，或請求項31至請求項32中任一項所述的多特異性分子，或請求項34所述的免疫效應細胞，或請求項35所述的核酸片段，或請求項36所述的載體，或請求項37所述的宿主細胞，或請求項38至請求項39中任一項所述的方法製備獲得的產品，或請求項40至請求項41中任一項所述的藥物組合物；其中所述癌症選自實體腫瘤和血液腫瘤，優選地，所述腫瘤選自白血病，多發性骨髓瘤，淋巴瘤，骨髓增生異常綜合征，前列腺癌，肝癌，結直腸癌，肛門癌、卵巢癌，子宮內膜癌，宮頸癌，腹腔癌、乳腺癌，胰腺癌，胃癌，頭頸癌，甲狀腺癌，睾丸癌，泌尿道上皮癌，肺癌，黑色素瘤，非黑素瘤皮膚癌，神經膠質瘤，腎癌，間皮瘤，食道癌，非小細胞肺癌，小細胞肺癌，膀胱癌，肉瘤，成膠質細胞瘤，胸腺癌，蕈樣肉芽腫，默克爾細胞癌，高MSI癌和KRAS突變型腫瘤。
如請求項47所述的方法，其中更包括向有此需要的患者施用有效量的PD-1軸結合拮抗劑，其中，所述PD-1軸結合拮抗劑選自由PD-1結合拮抗劑，PD-L1結合拮抗劑，和PD-L2結合拮抗劑組成的組；優選地，所述PD-1結合拮抗劑是抗PD-1抗體；更優選地，所述PD-1結合拮抗劑選自由MDX 1106(nivolumab)，MK-3475(pembrolizumab)，CT-011(pidilizumab)，MEDI-0680(AMP-514)，PDR001，REGN2810，和BGB-108組成的組；優選地，所述PD-L1結合拮抗劑是抗PD-L1抗體；更優選地，所述PD-L1結合拮抗劑選自由MPDL3280A(atezolizumab)，YW243.55.S70，MDX-1105，MEDI4736(durvalumab)，Tecentriq和MSB0010718C(avelumab)組成的組；優選地，所述PD-L2結合拮抗劑是抗PD-L2抗體；更優選地，所述PD-L2結合拮抗劑是免疫黏附素。
請求項1至請求項11中任一項所述的雙特異性抗體，或請求項12至請求項20中任一項所述的抗體或抗原結合片段，或請求項21至請求項29中任一項所述的奈米抗體或抗原結合片段，或請求項31至請求項32中任一項所述的多特異性分子，或請求項34所述的免疫效應細胞，或請求項35所述的核酸片段，或請求項36所述的載體，或請求項37所述的宿主細胞，或請求項38至請求項39中任一項所述的方法製備獲得的產品，或請求項40至請求項41中任一項所述的藥物組合物，用於預治療癌症或感染性疾病；其中所述癌症選自實體腫瘤和血液腫瘤，優選地，所述腫瘤選自白血病，多發性骨髓瘤，淋巴瘤，骨髓增生異常綜合征，前列腺癌，肝癌，結直腸癌，肛門癌、卵巢癌，子宮內膜癌，宮頸癌，腹腔癌、乳腺癌，胰腺癌，胃癌，頭頸癌，甲狀腺癌，睾丸癌，泌尿道上皮癌，肺癌，黑色素瘤，非黑素瘤皮膚癌，神經膠質瘤，腎癌，間皮瘤，食道癌，非小細胞肺癌，小細胞肺癌，膀胱癌，肉瘤，成膠質細胞瘤，胸腺癌，蕈樣肉芽腫，默克爾細胞癌，高MSI癌和KRAS突變型腫瘤。