TW202144429A - 抗cd25抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途 - Google Patents
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Abstract
本公開涉及抗CD25抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途。具體地,本公開涉及抗CD25抗體及其製備抗腫瘤藥物的用途。
Description
本申請要求2020年05月14日提交的中國專利申請(申請號202010408502.3)的優先權。本申請引用上述中國專利申請的全文。
本公開屬於生物醫藥領域,特別是癌症免疫治療領域,包括治療癌症(例如實體瘤)的方法,涉及抗CD25抗體或其抗原結合片段的使用。
腫瘤免疫治療是腫瘤治療領域的熱點,目前主要藉由提高腫瘤內部CD4+和CD8+T細胞或者抑制腫瘤內部抑制型免疫細胞的數目和活性,例如,抑制調節性T細胞(Treg)、骨髓來源的抑制性細胞MDSC或腫瘤相關巨噬細胞。藉由降低或消除腫瘤內部Treg細胞的治療策略已經得到臨床驗證。
CD25是由272個胺基酸組成的I型膜蛋白,其在T細胞上的表達受TCR信號的調控,因此常作為T細胞激活的標誌。IL-2具有免
疫激活作用,是腫瘤治療的免疫調節劑,其藉由細胞表面的IL-2受體(IL-2R)發生作用。IL-2R包括三個亞基,IL-2Rα(即CD25)、IL-2Rβ(即CD122)和IL-2Rγ(即CD132)。三個亞基可以形成三種受體形式:高結合力受體包含所有三個亞基IL-2Rα/β/γ,中結合力受體包含IL-2Rβ/γ,低結合力受體為IL-2Rα。IL-2Rα(即CD25)單獨與IL-2的親和力較低(Kd為10-8M),並且不傳導細胞內信號。IL-2Rβ和IL-2Rγ是IL-2激活下游信號通路所必需的,當IL-2同時結合IL-2Rβ和IL-2Rγ時,兩個受體亞基形成異源二聚體。當IL-2Rα(即CD25)與IL-2Rβ和IL-2Rγ形成高親和力受體(Kd為10-11M)時,能激活下游JAK-STAT,PI3K-AKT和MAPK信號通路,從而促進T細胞、NK細胞等淋巴細胞的增殖與活性。
部分已有的抗CD25抗體阻斷或抑制IL-2與CD25結合,例如參見WO2004/045512、WO2006/108670、WO1993/011238、WO1990/007861和WO2017/174331。巴利昔單抗(basiliximab)和達利珠單抗(daclizumab,DAC)均是抑制IL-2與CD25結合的IgG1型抗人CD25抗體,基於CD25介導IL-2的免疫激活功能,均被開發用於減少效應T細胞(Teff)的活化。巴利昔單抗是目前被批准用於移植物抗宿主疾病(GVHD)的嵌和型抗CD25抗體,而達利珠單抗是被批准用於治療多發性硬化症的人源化抗CD25抗體。
由於CD25在Treg上的表達豐度遠高於其它免疫細胞,因此CD25也可以作為Treg特異性標記物用於開發抗體,藉由抗體介導的細胞毒作用(ADCC)和抗體介導的細胞吞噬作用(ADCP)來去除腫瘤內部的Treg細胞,解除Treg對於腫瘤內部T細胞的抑制,從而促進抗腫瘤免疫。但CD25同時也介導IL-2對效應T細胞的激活,如果CD25抗體抑制了IL-2信號通路,將會抑制Teff,拮抗其抗腫瘤活性。一些文獻提到抗
CD25單獨或組合用於癌症或與Treg消耗有關的用途(WO 2004/074437、WO 2006/108670、WO 2006/050172、WO 2011/077245、WO 2016/021720、WO 2004/045512),因此需要允許IL-2與CD25結合的抗CD25抗體。臨床前研發的CD25抗體包括7D4(大鼠抗小鼠CD25,例如參見Malek et al.PNAS,1983 Sep;80(18):5694-8;Onizuka S et al.,Cancer Res.1999 Jul 1;59(13):3128-33)、7G7B6(抗人CD25,例如參見Zhang et al.,Cancer Biother Radiopharm.2009 Jun;24(3):303-309)、PC61(大鼠抗小鼠CD25,例如參見Yulius Y Setiady et al.,Eur J Immunol.2010 Mar;40(3):780-6),在小鼠癌症模型中進行測試時,PC61由於其對CD25和IL2結合抑制作用,未能顯示出抗腫瘤活性,而7D4由於其不影響IL2對CD25的結合,顯示出優於PC61的抗腫瘤活性。此外,WO2019/175216中提供了羅氏公司和TUSK公司聯合開發的靶向CD25的抗體RG6292,已經進入臨床I期,以檢測其在實體瘤中的安全性及藥效。WO2018167104中也提供了不影響IL-2與CD25結合的抗CD25抗體。
開發抑制腫瘤效果更優的、安全性更高的、不抑制IL-2與CD25的結合的、能夠藉由ADCC和ADCP效應消除Treg,同時避免抑制Teff活性的抗CD25抗體仍然是本領域亟需的。
本公開提供抗CD25抗體、其抗原結合片段,及其編碼核酸、載體、宿主細胞、醫藥組成物、用於治療癌症(特別是實體瘤)的方法和製藥用途。
抗CD25抗體、其抗原結合片段
本公開提供抗CD25抗體或其抗原結合片段,包含重鏈可變區(VH)和/或輕鏈可變區(VL),其中,
1)該VH含有SEQ ID NO:1中的HCDR1、HCDR2和HCDR3,該VL含有SEQ ID NO:2中的LCDR1、LCDR2和LCDR3;
2)該VH含有SEQ ID NO:3中的HCDR1、HCDR2和HCDR3,該VL含有SEQ ID NO:4中的LCDR1、LCDR2和LCDR3;
3)該VH含有SEQ ID NO:5中的HCDR1、HCDR2和HCDR3,該VL含有SEQ ID NO:6中的LCDR1、LCDR2和LCDR3;
4)該VH含有SEQ ID NO:7中的HCDR1、HCDR2和HCDR3,該VL含有SEQ ID NO:8中的LCDR1、LCDR2和LCDR3;
5)該VH含有SEQ ID NO:9中的HCDR1、HCDR2和HCDR3,該VL含有SEQ ID NO:10中的LCDR1、LCDR2和LCDR3;
6)該VH含有SEQ ID NO:11中的HCDR1、HCDR2和HCDR3,該VL含有SEQ ID NO:12中的LCDR1、LCDR2和LCDR3;
7)該VH含有SEQ ID NO:13中的HCDR1、HCDR2和HCDR3,該VL含有SEQ ID NO:14中的LCDR1、LCDR2、LCDR3;
8)該VH含有SEQ ID NO:15中的HCDR1、HCDR2和HCDR3,該VL含有SEQ ID NO:16中的LCDR1、LCDR2和LCDR3;
9)該VH含有SEQ ID NO:17中的HCDR1、HCDR2和HCDR3,該VL含有SEQ ID NO:18中的LCDR1、LCDR2和LCDR3;
10)該VH含有SEQ ID NO:19中的HCDR1、HCDR2和HCDR3,該VL含有SEQ ID NO:20中的LCDR1、LCDR2和LCDR3;
11)該VH含有SEQ ID NO:21中的HCDR1、HCDR2和HCDR3,該VL含有SEQ ID NO:22中的LCDR1、LCDR2和LCDR3;
12)該VH含有SEQ ID NO:23中的HCDR1、HCDR2和HCDR3,該VL含有SEQ ID NO:24中的LCDR1、LCDR2和LCDR3;
13)該VH含有SEQ ID NO:25中的HCDR1、HCDR2和HCDR3,該VL含有SEQ ID NO:26中的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或
14)該VH含有SEQ ID NO:59中的HCDR1、HCDR2和HCDR3,該VL含有SEQ ID NO:60中的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
上述CDR是根據Kabat、IMGT、Chothia、AbM或Contact編號系統定義的;一些具體實施方案中,CDR是根據Kabat編號系統定義的。
一些實施方案中,包含如1)、2)、3)、5)或6)所示的VH和VL的抗體或其抗原結合片段阻斷或部分阻斷IL-2與CD25的結合;另一些實施方案中,包含如4)、7)、8)、9)、10)、11)、12)或13)所示的VH和VL的抗體或其抗原結合片段不阻斷、不抑制或幾乎不阻斷、不抑制IL-2與CD25的結合。
一些實施方案中,提供抗CD25抗體或其抗原結合片段,其包含VH和/或VL,其中,
該VH包含選自SEQ ID NO:27、33、39或45的HCDR1,和/或選自SEQ ID NO:28、34、40或46的HCDR2,和/或選自SEQ ID NO:29、35、41或47的HCDR3;該VL包含選自SEQ ID NO:30、36、42或48的LCDR1,和/或選自SEQ ID NO:31、37、43或49的LCDR2,和/或選自SEQ ID NO:32、38、44或50的LCDR3。
一些實施方案中,提供抗CD25抗體或其抗原結合片段,包含VH和/或VL,其中,
i)該VH包含如SEQ ID NO:27所示或與其具有至多3個、2個或1個胺基酸突變的HCDR1,如SEQ ID NO:28所示或與其具有至多3個、2個或1個胺基酸突變的HCDR2,和如SEQ ID NO:29所示或與其具有至多3個、2個或1個胺基酸突變的HCDR3;和/或該VL包含如SEQ ID NO:30所示或與其具有至多3個、2個或1個胺基酸突變的LCDR1,如SEQ ID NO:31所示或與其具有至多3個、2個或1個胺基酸突變的LCDR2,和如SEQ ID NO:32所示或與其具有至多3個、2個或1個胺基酸突變的LCDR3;
ii)該VH包含如SEQ ID NO:33所示或與其具有至多3個、2個或1個胺基酸突變的HCDR1,如SEQ ID NO:34所示或與其具有至多3個、2個或1個胺基酸突變的HCDR2,和如SEQ ID NO:35所示或與其具有至多3個、2個或1個胺基酸突變的HCDR3;和/或該VL包含如SEQ ID NO:36所示或與其具有至多3個、2個或1個胺基酸突變的LCDR1,如SEQ ID NO:37所示或與其具有至多3個、2個或1個胺基酸突變的LCDR2,和如SEQ ID NO:38所示或與其具有至多3個、2個或1個胺基酸突變的LCDR3;
iii)該VH包含如SEQ ID NO:39所示或與其具有至多3個、2個或1個胺基酸突變的HCDR1,如SEQ ID NO:40所示或與其具有至多3個、2個或1個胺基酸突變的HCDR2,和如SEQ ID NO:41所示或與其具有至多3個、2個或1個胺基酸突變的HCDR3;和/或該VL包含如SEQ ID NO:42所示或與其具有至多3個、2個或1個胺基酸突變的LCDR1,如SEQ ID NO:43所示或與其具有至多3個、2個或1個胺基酸突變的LCDR2,和如SEQ ID NO:44所示或與其具有至多3個、2個或1個胺基酸突變的LCDR3;或
iv)該VH包含如SEQ ID NO:45所示或與其具有至多3個、2個或1個胺基酸突變的HCDR1,如SEQ ID NO:46所示或與其具有至多3個、2個或1個胺基酸突變的HCDR2,和如SEQ ID NO:47所示或與其具有至多3個、2個或1個胺基酸突變的HCDR3;和/或該VL包含如SEQ ID NO:48所示或與其具有至多3個、2個或1個胺基酸突變的LCDR1,如SEQ ID NO:49所示或與其具有至多3個、2個或1個胺基酸突變的LCDR2,和如SEQ ID NO:50所示或與其具有至多3個、2個或1個胺基酸突變的LCDR3。
一些具體實施方案中,上述具有胺基酸突變的抗CD25抗體或其抗原結合片段與親本抗體或抗原結合片段具有相同或基本相同的與人CD25結合的親和力和\或功能(例如ADCC、ADCP、抗腫瘤活性)。
一些實施方案中,本公開的前述抗CD25抗體或其抗原結合片段以等於或小於10-7M解離平衡常數與人CD25結合。在一些實施方案中,以等於或小於10-8M、10-9M、10-10M或10-11M解離平衡常數與人CD25結合。
一些實施方案中,提供抗CD25抗體或其抗原結合片段,包含VH和/或VL,其中,
該VH包含分別如SEQ ID NO:27、28和29所示的HCDR1、HCDR2的HCDR3,該VL包含分別如SEQ ID NO:30、31和32所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3;
該VH包含分別如SEQ ID NO:33、34和35所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3,該VL包含分別如SEQ ID NO:36、37和38所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3;
該VH包含分別如SEQ ID NO:39、40和41所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3,該VL包含分別如SEQ ID NO:42、43和44所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或
該VH包含分別如SEQ ID NO:45、46和47所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3,該VL包含分別如SEQ ID NO:48、49和50所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
一些實施方案中,抗CD25抗體或其抗原結合片段包含VH和VL,其中,
該VH如SEQ ID NO:1所示,該VL如SEQ ID NO:2所示;
該VH如SEQ ID NO:3所示,該VL如SEQ ID NO:4所示;
該VH如SEQ ID NO:5所示,該VL如SEQ ID NO:6所示
該VH如SEQ ID NO:7所示,該VL如SEQ ID NO:8所示;
該VH如SEQ ID NO:9所示,該VL如SEQ ID NO:10所示;
該VH如SEQ ID NO:11所示,該VL如SEQ ID NO:12所示;
該VH如SEQ ID NO:13所示,該VL如SEQ ID NO:14所示;
該VH如SEQ ID NO:15所示,該VL如SEQ ID NO:16所示;或
該VH如SEQ ID NO:17所示,該VL如SEQ ID NO:18所示;該抗體為鼠源抗體或其片段。
一些具體實施方案中,提供抗CD25抗體或其抗原結合片段變體,其包含VH和/或VL,該VH和/或VL與前述抗CD25抗體或其抗原結合片段的VH和/或VL分別具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。
一些實施方案中,抗CD25抗體或其抗原結合片段為鼠源抗體、嵌合抗體、人抗體、人源化抗體或其片段,例如,為人源化抗體或其片段。
一些實施方案中,基於鼠源抗CD25抗體或其抗原結合片段製備嵌和抗體,進行人源化,後進行回復突變。此處全文引入US20030040606和US7494647中人源化的方法。
一些實施方案中,抗CD25抗體或其抗原結合片段包含VH和VL,其中,
該VH包含選自IGHV1-46*01的FR1至FR3、和選自IGHJ1*01的FR4,該VL包含選自IGKV4-1*01的FR1至FR3、和選自IGKJ4*01的FR4;
該VH包含選自IGHV1-18*01的FR1至FR2、選自IGHV1-69*02的FR3、和選自hIGHJ6*01_14的FR4,該VL包含選自IGKV3-11*01的FR1、選自IGKV5-2*01的FR2、選自IGKV6-21*01的FR3、和選自hIGKJ4*01_12的FR4;
該VH包含選自IGHV1-18*01的FR1、選自IGHV4-31*01的FR2、選自IGHV1-3*01的FR3、和選自hIGHJ6*01的FR4,該VL包含選自IGKV4-1*01的FR1至FR3、和選自hIGKJ2*01的FR4;或
該VH包含選自IGHV3-23*04的FR1至FR3、和選自IGHJ1*01的FR4,該VL包含選自IGKV2-28*01的FR1至FR3、和選自IGKJ4*01的FR4。
一些具體實施方案中,抗CD25抗體或其抗原結合片段包含VH和/或VL,其中,
該VH包含分別如SEQ ID NO:27、28和29所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3,和選自IGHV1-46*01的FR1至FR3、和選自IGHJ1*01的FR4;該VL包含分別如SEQ ID NO:30、31和32所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3,和選自IGKV4-1*01的FR1至FR3、和選自IGKJ4*01的FR4;
該VH包含分別如SEQ ID NO:33、34和35所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3,和選自IGHV1-18*01的FR1至FR2、選自IGHV1-69*02的FR3、和選自hIGHJ6*01_14的FR4;該VL包含分別如SEQ ID NO:36、37和38所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3,和選自IGKV3-11*01的FR1、選自IGKV5-2*01的FR2、選自IGKV6-21*01的FR3、和選自hIGKJ4*01_12的FR4;
該VH包含分別如SEQ ID NO:39、40和41所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3,和選自IGHV1-18*01的FR1、選自IGHV4-31*01的FR2、選自IGHV1-3*01的FR3、和選自hIGHJ6*01的FR4;該VL包含分別如SEQ ID NO:42、43和44所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3,和選自IGKV4-1*01的FR1至FR3、和選自hIGKJ2*01的FR4;或
該VH包含分別如SEQ ID NO:45、46和47所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3,和選自IGHV3-23*04的FR1至FR3、和選自IGHJ1*01的FR4;該VL包含分別如SEQ ID NO:48、49和50所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3,和選自IGKV2-28*01的FR1至FR3、和選自IGKJ4*01的FR4。可以對上述FR進行回復突變,以保持抗體活性。
一些實施方案中,抗CD25抗體或其抗原結合片段包含VH和/或VL,其中,
該VH如SEQ ID NO:19所示,該VL如SEQ ID NO:20所示;
該VH如SEQ ID NO:21所示,該VL如SEQ ID NO:22所示;
該VH如SEQ ID NO:23所示,該VL如SEQ ID NO:24所示;
該VH如SEQ ID NO:25所示,該VL如SEQ ID NO:26所示;或
該VH如SEQ ID NO:59所示,該VL如SEQ ID NO:60所示;該抗體為人源化抗體或其片段。
一些具體實施方案中,提供抗CD25抗體或其抗原結合片段變體,其包含VH和/或VL,該VH和/或VL與前述抗CD25抗體或其抗原結合片段的VH和/或VL分別具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。
一些實施方案中,抗CD25抗體或其抗原結合片段進一步包含抗體的重鏈恆定區和/或輕鏈恆定區,例如人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的重鏈恆定區及其一般變體,該抗體的輕鏈恆定區選自人抗體κ和λ鏈恆定區及其一般變體;又例如鼠的IgG,例如鼠IgG2a。
一些實施方案中,該抗原結合片段選自Fab、Fab'、F(ab')2、單鏈抗體(scFv)、二聚化的V區(雙抗體)、二硫鍵穩定化的V區(dsFv)和其他包含CDR的肽的抗原結合片段。
一些實施方案中,還提供一種分離的單株抗體或其抗原結合片段,其與前述任一項所述抗CD25抗體或其抗原結合片段競爭結合人CD25,或競爭結合相同的表位。
一些實施方案中,提供抗CD25抗體或其抗原結合片段,其包含VH和/或VL,其中,
該VH如SEQ ID NO:1所示,該VL如SEQ ID NO:2所示;
該VH如SEQ ID NO:3所示,該VL如SEQ ID NO:4所示;
該VH如SEQ ID NO:5所示,該VL如SEQ ID NO:6所示;
該VH如SEQ ID NO:9所示,該VL如SEQ ID NO:10所示;或
該VH如SEQ ID NO:11所示,該VL如SEQ ID NO:12所示;該抗體或其抗原結合片段阻斷或部分阻斷IL-2與CD25的結合。
另一些實施方案中,提供抗CD25抗體或其抗原結合片段,其包含VH和/或VL,其中,
該VH如SEQ ID NO:7所示,該VL如SEQ ID NO:8所示;
該VH如SEQ ID NO:13所示,該VL如SEQ ID NO:14所示;
該VH如SEQ ID NO:15所示,該VL如SEQ ID NO:16所示;
該VH如SEQ ID NO:17所示,該VL如SEQ ID NO:18所示;
該VH如SEQ ID NO:19所示,該VL如SEQ ID NO:20所示;
該VH如SEQ ID NO:21所示,該VL如SEQ ID NO:22所示;
該VH如SEQ ID NO:23所示,該VL如SEQ ID NO:24所示;
該VH如SEQ ID NO:25所示,該VL如SEQ ID NO:26所示;或
該VH如SEQ ID NO:59所示,該VL如SEQ ID NO:60所示;該抗體或其抗原結合片段不阻斷、不抑制,幾乎不阻斷、不抑制,或較低程度的阻斷、抑制IL-2與CD25的結合。例如,與不存在抗體的情況下的IL-2信號傳導相比,該抗CD25抗體或抗原結合片段阻斷小於約50%、約40%、約35%、約30%、約25%、約20%、約15%、約10%的IL-2信號傳導,例如小於約25%的IL-2信號傳導。
一些實施方案中,提供抗CD25抗體或其抗原結合片段變體,其包含VH和/或VL,該VH和/或VL與前述抗CD25抗體或其抗原結合片段的VH和/或VL具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。
一些實施方案中,提供抗CD25抗體或其抗原結合片段變體,其包含VH和/或VL,該VH和/或VL與前述抗CD25抗體或其抗原結合
片段的重鏈可變區VH和/或VL相比,分別包含0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸變化。該胺基酸變化可以是可變區中的胺基酸殘基保守性置換。一些實施方案中,上述包含胺基酸變化的抗體或抗原結合片段與親本抗體或抗原結合片段具有相同或基本相同的與人CD25結合的親和力和\或功能(例如ADCC、ADCP、抗腫瘤活性)。
一些實施方案中,抗CD25抗體或其抗原結合片段包含重鏈和/或輕鏈,其中,
該重鏈如SEQ ID NO:51所示,該輕鏈如SEQ ID NO:52所示;
該重鏈如SEQ ID NO:53所示,該輕鏈如SEQ ID NO:54所示;
該重鏈如SEQ ID NO:55所示,該輕鏈如SEQ ID NO:56所示;
該重鏈如SEQ ID NO:57所示,該輕鏈如SEQ ID NO:58所示;或
該重鏈如SEQ ID NO:61所示,該輕鏈如SEQ ID NO:62所示。
一些實施方案中,提供抗CD25抗體或其抗原結合片段,其包含重鏈和/或輕鏈,該重鏈和/或輕鏈與前述抗CD25抗體或其抗原結合片段的重鏈和/或輕鏈分別具有至少70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。
一些實施方案中,本公開的抗CD25抗體或其抗原結合片段是IgG1型,Fc區具有去岩藻糖化位點,具有增強的Fc γ RIIIa結合能力。上述抗CD25抗體或其抗原結合片段能增加對Treg細胞的ADCC作用,增強其抗腫瘤活性。
一些實施方案中,本公開的抗CD25抗體或其抗原結合片段是IgG1型,Fc區具有去岩藻糖化位點(例如A330I突變),具有降低的Fc γ RIIb結合能力。上述抗CD25抗體或其抗原結合片段能降低Fc γ RIIb
受體介導的對ADCC/ADCP抑制性信號,以增強對Treg細胞的ADCC作用,增強其抗腫瘤活性。
一些實施方案中,本公開的抗CD25抗體或抗原結合片段具有下述特徵中的至少一個:
(a)結合人CD25的KD值小於1×10-7M;
(b)不抑制(或基本上不抑制)IL-2與CD25的結合;
(c)消耗腫瘤浸潤性Treg,不影響(或基本上不影響)Teff的功能;
(d)以高於1的活化抑制率(A/I)結合Fc γ受體;
(e)以比結合Fc γ RI、Fc γ RIIc和/或Fc γ RIIb更高的親和力結合Fc γ RIIIa,以比結合Fc γ RIIb更高的親和力結合Fc γ RIIIa;
(f)抑制多種腫瘤生長。
本公開的CD25結合蛋白或抗CD25抗體結合CD25的KD值可以小於1×10-7M,小於1×10-8M,小於1×10-9M,或小於1×10-10M。
本公開的抗CD25抗體或其抗原結合片段能夠抑制腫瘤生長至少約10%,至少約20%,至少約30%,至少約40%,至少約50%,至少約60%,至少約70%,至少約80%。
一些實施方案中,本公開的抗CD25抗體或抗原結合片段以高親和力結合Fc γ R,例如,以高親和力結合活化受體。一些具體實施方案中,本公開的抗體以高親和力結合Fc γ RI和/或Fc γ RIIA和/或Fc γ RIIIA。在具體的實施方式中,抗體與至少一種活化性Fc γ受體以小於約10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M的解離常數結合。
一些實施方案中,本公開的抗CD25抗體或抗原結合片段是IgG1抗體,能夠與至少一種Fc活化受體結合。例如,該抗體可與選自Fc γ RI、Fc γ RIIa、Fc γ RIIc、Fc γ RIIIa和Fc γ RIIIb中的一種或多種受體
結合。在一些具體實施方案中,本公開的抗體能夠與Fc γ RIIIA結合。一些實施方案中,本公開的抗體能夠與Fc γ RIIIA和Fc γ RIIA和任選的Fc γ RI結合。在一個方面,抗體能夠以高親和力與這些受體結合,例如以小於約10-7M、10-8M、10-9M或10-10M的解離常數結合。
一些實施方案中,本公開的抗CD25抗體或抗原結合片段以低親和力結合抑制性受體Fc γ RIIb。在一個方面,抗體以高於約10-7M、高於約10-6M或高於約10-5M的解離常數結合Fc γ RIIb。
一些實施方案中,本公開的抗CD25抗體或抗原結合片段來自IgG1亞類,較佳具有ADCC和/或ADCP活性。在另一些實施方案中,本公開的抗CD25抗體來自IgG2亞類。
一些實施方案中,本公開的抗CD25抗體或抗原結合片段抑制或阻斷少於50%的藉由CD25的IL-2信號傳導。例如,與不存在抗體的情況下的IL-2信號傳導相比,抗CD25抗體或抗原結合片段抑制或阻斷小於約40%、35%、30%,較佳小於約25%的IL-2信號傳導。
多核苷酸和載體
本公開提供經分離的多核苷酸,其編碼本公開的抗CD25抗體或其抗原結合片段。該多核苷酸可以是DNA或RNA。
本公開提供含有如上所述的多核苷酸的表達載體,表達載體可以是真核表達載體、原核表達載體、病毒載體,例如質粒、黏粒、噬菌體。
宿主細胞
本公開提供用如上該的表達載體轉化的宿主細胞,其可以是真核細胞、原核細胞。
一些實施方案中,該宿主細胞為細菌、酵母菌、哺乳動物細胞。一些具體實施方案中,該宿主細胞為大腸桿菌、畢赤酵母、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或人胚腎(HEK)293細胞。
製備方法
本公開提供一種用於製備抗CD25抗體或其抗原結合片段的方法包括:在如前所述的宿主細胞中表達該抗體或其抗原結合片段,並自該宿主細胞中分離該抗體或其抗原結合片段。
可選地,還可以包含純化步驟,例如,用含調整過的緩衝液的A或G Sepharose FF管柱進行純化,洗去非特異性結合的組分,再用PH梯度法沖提結合的抗體,用SDS-PAGE檢測,收集。可選地,用一般方法進行過濾濃縮。可溶的混合物和多聚體,也可以用一般方法去除,比如分子篩、離子交換。得到的產物需立即冷凍,如-70℃,或者凍乾。
生產和純化抗體和抗原結合片段的方法在現有技術中熟知和能找到,如冷泉港的抗體實驗技術指南(5-8章和15章)。如,可以用人FcRn或其片段免疫小鼠,所得到的抗體能被覆性、純化,並且可以用一般的方法進行胺基酸測序。抗原結合片段同樣可以用一般方法製備。
本公開工程化的抗體或抗原結合片段可用一般方法製備和純化。比如,編碼重鏈和輕鏈的cDNA序列,可以選殖並重組至表達載體。重組的免疫球蛋白表達載體可以穩定地轉染CHO細胞。哺乳動物類表達系統會導致抗體的糖基化,特別是在Fc區的高度保守N端。藉由表達與人源抗原特異性結合的抗體得到穩定的純株。陽性的純株在生物反應器的無血清培養基中擴大培養以生產抗體。分泌了抗體的培養液可以用一般技術純化、收集。抗體可用一般方法進行過濾濃縮。可溶的混合物和多聚體,也可以用一般方法去除,比如分子篩,離子交換。
組成物
本公開提供一種組成物,例如醫藥組成物,其含有治療有效量的如上所述的抗CD25抗體或其抗原結合片段和可藥用的賦形劑、稀釋或載體。在一些具體實施方式中,該醫藥組成物單位計量中可含有0.01至99重量%的抗CD25抗體或其抗原結合片段,或醫藥組成物單位劑量中含抗CD25抗體或其抗原結合片段的量為0.1-2000mg,在一些具體實施方式中為1-1000mg。
治療方法和製藥用途
本公開提供抗CD25抗體或其抗原結合片段、含有該抗CD25抗體或其抗原結合片段的醫藥組成物、編碼多核苷酸中的任一項或其任意組合,用於診斷、治療、預防疾病的方法和製備藥物、醫藥組成物的用途(例如,用於治療或預防增殖性病症(例如癌症或腫瘤)或延緩相關病症進展。
一些實施方案中,提供預防、治療或緩解受試者病症的方法,包含向該受試者施用本公開的抗CD25抗體或其抗原結合片段、含有該抗CD25抗體或其抗原結合片段的醫藥組成物和/或編碼多核苷酸。一些具體實施方案中,該受試者病症是增殖性疾病,例如腫瘤或癌症。一些實施方案中,上述受試者患有已形成的腫瘤,例如實體瘤。
一些實施方案中,提供減少受試者腫瘤內部或腫瘤侵潤性Treg的細胞數量方法;一些實施方案中,提供消除或抑制受試者腫瘤內部或腫瘤侵潤性的Treg的細胞活性的方法,均包括向該受試者施用本公開的抗CD25抗體或其抗原結合片段、含有該抗CD25抗體或其抗原結合片段的醫藥組成物和/或編碼多核苷酸。
一些實施方案中,提供增加受試者腫瘤內部Teff/Treg的比例的方法,包括向該受試者施用本公開的抗CD25抗體或其抗原結合片段、含有該抗CD25抗體或其抗原結合片段的醫藥組成物和/或編碼多核苷酸。在一些具體實施方式中,腫瘤中效應T細胞與調節性T細胞的比例(Teff/Treg)增加至超過5、10、15、20、40或80。
一些實施方案中,提供增強受試者體內針對腫瘤細胞的CDC、ADCC和/或ADCP的方法,包括向該受試者施用本公開的抗CD25抗體或其抗原結合片段、含有該抗CD25抗體或其抗原結合片段的醫藥組成物和/或編碼多核苷酸。一些具體實施方案中,受試者體內針對腫瘤細胞的ADCC和/或ADCP效應增強。一些更具體實施方案中,受試者體內針對腫瘤細胞的ADCC效應增強。
一些實施方案中,提供本公開抗CD25抗體或其抗原結合片段、含有該抗CD25抗體或其抗原結合片段的醫藥組成物和/或編碼多核苷酸用於製備預防、治療或緩解受試者病症的製藥用途,用於製備減少受試者腫瘤內部或腫瘤侵潤性Treg的細胞數量的製藥用途,用於製備消除或抑制受試者腫瘤內部或腫瘤侵潤性的Treg的細胞活性的藥物的製藥用途,用於製備增加受試者腫瘤內部Teff/Treg的比例的製藥用途,用於製備增強受試者體內針對腫瘤細胞的CDC、ADCC和/或ADCP的製藥用途。
一些具體實施方案中,上述受試者的病症為增殖性病症(例如癌症或腫瘤)或患有增殖性病症(例如癌症或腫瘤)。該腫瘤包括但不限於癌、淋巴瘤、白血病、胚細胞瘤和肉瘤。這類癌症的更具體的實例包括鱗狀細胞癌、骨髓瘤、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神經膠質瘤、肝細胞癌(HCC)、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、急性髓性白血病(AML)、多種骨髓瘤、胃腸(道)癌、腎癌、卵巢癌、肝臟癌、淋巴母細胞白血病、淋巴
細胞白血病、結直腸癌、子宮內膜癌、腎癌、前列腺癌、甲狀腺癌、黑色素瘤、軟骨肉瘤、神經母細胞瘤、胰腺癌、多形性膠質母細胞瘤、宮頸癌、腦癌、胃癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、結腸癌和頭頸癌。
一些具體實施方案中,該癌症或腫瘤可以是實體瘤,包括但不限於肉瘤(包括由組織(例如松質骨、軟骨、脂肪、肌肉、血管、造血細胞或纖維結締組織)中的間充質來源的轉化細胞產生的癌症)、癌(包括由上皮細胞產生的腫瘤)、間皮瘤、神經母細胞瘤、視網膜母細胞瘤等。涉及實體瘤的癌症包括但不限於,腦癌、肺癌、胃癌、十二指腸癌、食道癌、乳腺癌、結腸和直腸癌、腎癌、膀胱癌、腎臟癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、口腔癌、肉瘤、眼癌、甲狀腺癌、尿道癌、陰道癌、頸癌、淋巴瘤等。
一些具體實施方案中,該癌症涉及表達CD25的腫瘤,包括但不限於淋巴瘤,例如霍奇金淋巴瘤和淋巴細胞性白血病,例如慢性淋巴細胞白血病(CLL)。
檢測用途
本公開提供抗CD25抗體或其抗原結合片段的檢測用途。
本公開提供檢測CD25的試劑,該試劑包含抗CD25抗體或其抗原結合片段。本公開還提供用於體內或體外檢測CD25的方法、系統或裝置,其包括使用抗CD25抗體或其抗原結合片段。
一些實施方案中,體外檢測方法、系統或裝置可能例如包括(1)使樣品與抗CD25抗體或其抗原結合片段接觸;(2)檢測在抗CD25抗體或其抗原結合片段和樣品之間形成的複合物;和/或(3)使參比樣品(例如,對照樣品)與抗體接觸;和(4)藉由與參比樣品比較,確定抗體和樣品
之間複合物形成的程度。如與對照樣品或受試者中相比,樣品或受試者中複合物形成的變化(例如,統計學上的顯著變化)表示樣品中存在CD25。
一些實施方案中,出於檢測目的,本公開的CD25結合蛋白或抗CD25抗體可以用螢光團和發色團標記。
一些實施方案中,還提供試劑盒,該試劑盒包含與CD25結合蛋白或抗CD25抗體,還可以包含診斷使用說明。試劑盒還可以含有至少一種額外的試劑,如標記物或額外的診斷劑。對於體內使用,抗體可以配製為醫藥組成物。
本公開實施例提供的抗CD25抗體或其抗原結合片段具有高特異性、高親和力、低免疫原性的特點。同時,本公開的抗體具有良好的抑制Treg,不影響Teff,增強受試者體內ADCC、ADCP和\或CDC,抑制腫瘤發生發展的效果。
圖1A和圖1B:ELISA鑑定重組蛋白活性。其中,圖1A為重組人CD25蛋白的活性檢測結果,圖1B為重組猴和重組小鼠CD25蛋白的活性檢測結果。
圖2:FACS測定穩定表達人CD25蛋白的細胞株2F8,其中,白色峰為CD25陽性峰,灰色峰為對照峰,一抗為人IgG1陰性對照抗體。
圖3A至圖3C:FACS測定檢測抗體功能。圖3A為FACS測定抗體DAC、7G7B6、Tab06與CHO-K1細胞的結合結果,圖3B為FACS測定抗體DAC、7G7B6、Tab06與穩定表達人CD25蛋白的CHO-
K1-CD25細胞的結合結果,圖3C為FACS測定抗體DAC、7G7B6、Tab06與Su-DHL-1的結合結果,其中,使用小鼠IgG或人IgG同種型作為陰性對照。
圖4A至圖4C:ELISA測定檢測抗體與CD25結合。圖4A為7G7B6、Tab06與重組人CD25蛋白的結合結果,圖4B為7G7B6、Tab06與重組猴CD25蛋白的結合結果,圖4C為7D4與重組小鼠CD25蛋白的結合結果,所使用的陰性對照為小鼠IgG和人IgG。
圖5A至圖5C:FACS檢測嵌合型抗CD25抗體與SU-DHL-1細胞結合。圖5A為cAb001、cAb002、cAb004、cAb006的檢測結果,圖5B為cAb028、cAb029、cAb037的檢測結果,圖5C為cAb042、cAb046的檢測結果,所使用的陽性對照為Tab06和DAC,陰性對照為人IgG(即hIgG)。
圖6A至圖6G:FACS檢測嵌合型抗CD25抗體與Treg細胞、激活的CD4+和CD8+效應T細胞上的CD25抗原結合。圖6A為cAb006的結果,圖6B為cAb037的結果,圖6C為cAb042的結果,圖6D為cAb046的結果,圖6E為陽性對照7G7B6的結果,圖6F為陽性對照DAC的結果,圖6G為陽性對照Tab06的結果。
圖7A至圖7B:FACS檢測嵌合型抗CD25抗體對於IL-2和受體CD25的結合能力的影響。圖7A為cAb001、cAb002、cAb028、cAb029的檢測結果圖,圖7B為cAb006、cAb037、cAb042、cAb046的檢測結果圖,所使用的阻礙IL-2和CD25結合的抗CD25抗體對照為DAC,
不阻礙IL-2和CD25結合的抗CD25抗體對照為Tab06,陰性對照為人IgG(即hIgG-1)。
圖8:FACS檢測人源化抗CD25抗體與SU-DHL-1細胞的結合。
圖9:FACS檢測人源化抗CD25抗體對人外周血T淋巴細胞pStat5信號通路的影響。
圖10:藉由檢測ADCC報告基因在細胞中的螢光活性,檢測人源化抗CD25抗體介導的對SU-DHL-1細胞的ADCC作用。
圖11A和圖11B:人源化抗CD25抗體介導的對hCD25小鼠的MC38移植瘤的抗腫瘤活性結果,其中,圖11A腫瘤抑制效果圖,圖11B為對應的小鼠體重圖。
圖12A和圖12B:人源化抗CD25抗體介導的對hCD25小鼠的MC38移植瘤的腫瘤內淋巴細胞分析結果,其中,圖12A為抗體對Treg的殺傷結果,圖12B為抗體對CD3的上調。
發明詳述
為了更容易理解本公開,以下具體定義了某些技術和科學。除顯而易見在本文件中的它處另有明確定義,否則本文使用的所有其它技術和科學都具有本公開所屬領域的一般技術人員通常理解的含義。
本公開所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.Biol.Chem,243,p3558(1968)中所述。
“CD25”或“CD25蛋白質”或“CD25多肽”可以任選地包括任何這類蛋白質或其變異體、結合物或片段,包括(但不限於)如本文所述的已知或野生型CD25,以及任何天然產生的剪接變異體、胺基酸變異體或同工型。完整的人類CD25序列可以在Uniprot登錄號P01589找到,其第22至240個胺基酸對應成熟人CD25的胞外域。
“與CD25結合”,指能與CD25或其表位相互作用,該CD25或其表位可以是人源的。“抗原結合位點”指抗原上不連續的,由本公開抗體或抗原結合片段識別的三維空間位點。
“抗體”指免疫球蛋白,是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈藉由鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。免疫球蛋白重鏈恆定區的胺基酸組成和排列順序不同,故其抗原性也不同。據此,可將免疫球蛋白分為五類,或稱為免疫球蛋白的同種型,即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE,其相應的重鏈分別為μ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈和ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別,又可分為不同的亞類,如IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。輕鏈藉由恆定區的不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中第每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。抗體重鏈和輕鏈靠近N端的約110個胺基酸的序列變化很大,為可變區(V區);靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定,為恆定區(C區)。可變區包括3個高變區(HVR)和4個序列相對保守的骨架區(FR)。3個高變區決定抗體的特異性,又稱為互補性決定區(CDR)。每條輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)由3個CDR區4個FR區組成,從胺基端到羧基端依次排列的順序為:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。輕鏈的3個CDR
區指LCDR1,LCDR2,和LCDR3;重鏈的3個CDR區指HCDR1,HCDR2和HCDR3。在一些實施例中,本公開的抗體特異性地或基本上特異性地結合到CD25。
“結合CD25的抗體”是指能夠結合IL-2受體的CD25亞基的抗體。該亞基也稱為IL-2受體的α亞基。這種抗體在本文中也稱為“抗CD25抗體”。
本公開的抗體或抗原結合片段的VL區和VH區的CDR胺基酸殘基在數量和位置符合已知的Kabat編號系統。Kabat中的EU編號一般也用於恆定結構域和/或Fc結構域。
對於“CDR”的確定或定義,能夠藉由分辨抗體的結構和/或分辨抗體-配體複合物的結構來完成CDR的確定性描繪和包含抗體的結合位點的殘基的鑑定。這可藉由本領域技術人員已知的各種技術中的任一種,例如X射線晶體學來實現。多種分析方法可用於鑑定CDR,包括但不限於Kabat編號系統、Chothia編號系統、AbM編號系統、IMGT編號系統、接觸定義、構象定義。Kabat編號系統是用於編號抗體中殘基的標準並且通常用於鑑定CDR區域(參見例如Johnson&Wu,2000,Nucleic Acids Res.,28:214-8)。Chothia編號系統與Kabat編號系統類似,但Chothia編號系統考慮了某些結構環區域的位置。(參見例如Chothia等,1986,J.Mol.Biol.,196:901-17;Chothia等人,1989,Nature,342:877-83)。AbM編號系統使用建模抗體結構的由Oxford MolecuLar Group生產的計算機程序集成套件(參見例如Martin等,1989,ProcNatl Acad Sci(USA),86:9268-9272;“AbMTM,A Computer Program for ModelingVariable
Regions of Antibodies,”Oxford,UK;Oxford MolecuLar,Ltd)。AbM編號系統使用知識數據庫和從頭開始方法的組合,從基本序列建模抗體的三級結構(參見Samudrala等,1999,在PROTEINS,Structure,Function and Genetics Suppl.,3:194-198中的“Ab Initio Protein Structure Prediction Using a Combined HierarchicalApproach”描述的那些)。接觸定義基於可用複雜晶體結構的分析(參見例如MacCallum等,1996,J.Mol.Biol.,5:732-45)。構象定義中,CDR的位置可鑑定為對抗原結合做出焓貢獻的殘基(參見例如Makabe等,2008,Journal ofBiological Chemistry,283:1156-1166)。另外其它的CDR邊界定義可能不嚴格遵循上述方法之一,但仍然與Kabat CDR的至少一部分重疊,儘管根據特定殘基或殘基組不顯著影響抗原結合的預測或實驗結果,它們可縮短或延長。如本文使用的,CDR可指藉由本領域已知的任何方法(包括方法的組合)定義的CDR。本文使用的方法可利用根據這些方法中的任一種定義的CDR。本公開的實施例中採用kabat編號規則定義CDR,但本領域技術人員能夠理解的是,也可以根據Chothia、延伸的、AbM、IMGT、接觸和/或構象定義中的任一個來重新定義CDR。
IgG抗體的Fc區與幾種細胞Fc γ受體(Fc γ R)相互作用以刺激和調節下游效應子機制。有五種活化受體,即Fc γ RI(CD64)、Fc γ RIIa(CD32a)、Fc γ RIIc(CD32c)、Fc γ RIIIa(CD16a)和Fc γ RIIIb(CD16b),以及一種抑制性受體Fc γ RIIb(CD32b)。IgG抗體與免疫系統的通訊由Fc γ R控制和介導,Fc γ R將抗體感知和收集的信息傳遞給免疫系統,從而提供先天和適應性免疫系統之間的聯繫,尤其是在生物治療的背景下
(Hayes J et al.,2016.JInflamm Res 9:209-219)。IgG亞類結合Fc γ R的能力不同,這種差異結合決定了它們引發一系列功能性反應的能力。例如,在人類中,Fc γ RIIIa是參與抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用(ADCC)活化的主要受體,IgG1緊接著IgG3顯示出對該受體的最高親和力,反映出它們有效誘導ADCC的能力,IgG2對該受體具有弱結合,但已發現具有人IgG2同種型的抗CD25抗體也能有效地消耗Treg。
“調節性T細胞”、“Treg”或“Treg細胞”是指專門控制自身免疫、變態反應和感染的CD4+T淋巴細胞譜系。通常,它們調節T細胞群的活性,但它們也可以影響某些先天免疫系統細胞類型。可藉由生物標誌物CD4、CD25和Foxp3的表達來鑑定Treg。天然存在的Treg細胞通常占外周CD4+T淋巴細胞的約5至10%。然而,在腫瘤微環境(即腫瘤浸潤性Treg細胞)內,它們可占總CD4+T淋巴細胞群的20至30%。活化的人Treg細胞可藉由穿孔因子或顆粒酶B依賴性途徑直接殺死靶細胞,如Teff和APC(抗原遞呈細胞);細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4(CTLA4+)Treg細胞藉由APC來誘導吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)表達,這些轉而藉由減少色胺酸抑制T細胞活化;Treg細胞可以在體內釋放白細胞介素-10(IL-10)和轉化生長因子(TGF β),從而藉由抑制MHC分子、CD80、CD86和IL-12的表達來直接抑制T細胞活化並抑制APC功能。Treg細胞還可以藉由表達高水平的CTLA4來抑制免疫,CTLA4可以與抗原呈遞細胞上的CD80和CD86結合並阻止效應T細胞的正確活化。
本文的“免疫效應細胞”是指參與免疫應答的效應階段的免疫細胞。示例性免疫細胞包括髓樣或淋巴樣細胞,例如淋巴細胞(例如、
B細胞和包括細胞溶解性T細胞(CTL)的T細胞)、殺傷細胞、天然殺傷細胞、巨噬細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞、嗜中性粒細胞、多形核細胞、粒細胞、肥大細胞和嗜鹼性粒細胞。
本文的“不抑制”、“不阻斷”、“非阻斷性”、“非IL-2阻斷性”、“無阻斷”和類似(關於在抗CD25抗體存在下不阻斷或不抑制IL-2與CD25的結合,例如“不抑制IL-2與CD25的結合”)包括其中抗CD25抗體不阻斷或不抑制IL-2藉由CD25進行信號傳導,特別是不抑制表達CD25的細胞中的白細胞介素-2信號傳導。也就是說,與不存在抗體的情況下的IL-2信號傳導相比,本公開的抗CD25抗體抑制少於50%的藉由CD25的IL-2信號傳導。較佳地,與不存在抗體的情況下的IL-2信號傳導相比,抗CD25抗體抑制小於約40%、35%、30%,較佳小於約25%的IL-2信號傳導。
“抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用”(ADCC)是指一種細胞介導的反應,其中表達Fc受體(FcR)的非特異性細胞毒性細胞(例如自然殺傷(NK)細胞、嗜中性粒細胞和巨噬細胞)識別靶細胞上結合的抗體從而導致靶細胞裂解。“抗體依賴性細胞介導的吞噬作用”(ADCP)是指一種細胞介導的反應,其中表達Fc受體(FcR)的吞噬細胞(例如巨噬細胞)識別靶細胞上結合的抗體從而導致對靶細胞的吞噬作用。“補體依賴性細胞毒作用”(CDC)是指在補體存在下,抗體對表達抗原的細胞的裂解。CDC、ADCC和ADCP可以使用本領域已知並可用的測定方法(Clynes et al.(1998)Proc Natl Acad Sci USA95,652-6)來測量,抗體的恆定區在抗體
固定補體和介導細胞依賴性細胞毒作用和吞噬作用的能力中是重要的。因此,可以基於抗體是否需要介導ADCC、ADCP來選擇抗體的同種型。
ADCC可以藉由從抗體聚糖中消除岩藻糖部分的方法來增加,例如藉由在YB2/0細胞系中產生抗體,或者藉由在人IgG1的Fc部分上引入特定突變(例如S298A/E333A/K334A、S239D/I332E/A330L、G236A/S239D/A330L/I332E)(Lazar et al.(2006)Proc Natl AcadSci USA 103,2005-2010;Smith et al.(2012)Proc Natl 25Acad Sci USA 109,6181-6)。ADCP也可以藉由在人IgG1的Fc部分上引入特定突變來增加(Richards et al.(2008)MolCancer Ther 7,2517-27)。
“鼠源抗體”在本公開中為根據本領域知識和技能製備的針對人CD25或其表位的單株抗體。製備時用CD25抗原注射試驗對象,然後分離表達具有所需序列或功能特性的抗體的融合瘤。在本公開一個具體的實施方案中,該鼠源抗人CD25抗體或其抗原結合片段,可進一步包含鼠源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區,或進一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的重鏈恆定區。
“嵌合抗體(chimeric antibody)”,是將鼠源性抗體的可變區與人抗體的恆定區融合而成的抗體,可以減輕鼠源性抗體誘發的免疫應答反應。建立嵌合抗體,要選建立分泌鼠源性特異性單抗的融合瘤,然後從小鼠融合瘤細胞中選殖可變區基因,再要據需要選殖人抗體的恆定區基因,將小鼠可變區基因與人恆定區基因連接成嵌合基因後插入人載體中,最後在真核工業系統或原核工業系統中表達嵌合抗體分子。人抗體的恆定區可選自人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的重鏈恆定區,較佳包
含人源IgG2或IgG4重鏈恆定區,或者使用胺基酸突變後無ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用)毒性的IgG1。
“人源化抗體(humanized antibody)”,也稱為CDR移植抗體(CDR-grafted antibody),是指將小鼠的CDR序列移植到人的抗體可變區框架中產生的抗體。可以克服嵌合抗體由於攜帶大量小鼠蛋白成分,從而誘導的強烈的免疫應答反應。為避免在免疫原性下降的同時引起活性的下降,可對該人抗體可變區可進行最少反向突變,以保持活性。本公開的抗體可以是親和力成熟的人源化抗體,親和力成熟的抗體親本序列(包含所有序列)的CDR至少80%相同,例如90%相同。親和力成熟的抗體是在一個或多個CDR中具有一個或多個改變的胺基酸的抗體,其導致抗體與不具有改變的胺基酸的親本抗體相比對CD25的親和力改善。
“人抗體”包括具有人種系免疫球蛋白序列的可變和恆定區的抗體。本公開的人抗體可包括不由人種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基(如藉由體外隨機或位點特異性誘變或藉由體內體細胞突變所引入的突變)。然而,“人抗體”不包括這樣的抗體,即其中已將衍生自另一種哺乳動物物種(諸如小鼠)種系的CDR序列移植到人骨架序列上(即“人源化抗體”)。
“抗原結合片段”包括單鏈抗體(即全長重鏈和輕鏈);Fab、修飾的Fab、Fab’、修飾的Fab’、F(ab’)2、Fv、Fab-Fv、Fab-dsFv、單結構域抗體(例如VH或VL或VHH)、scFv、二價或三價或四價抗體、Bis-scFv、diabody、tribody、triabody、tetrabody和上述任意一種的表位
結合片段(參見例如Holliger and Hudson,2005,Nature Biotech.23(9):1126-1136;Adair and Lawson,2005,Drug Design Reviews-Online 2(3),209-217)。產生和製備這些抗體片段的方法在本領域是公知的(參見例如Verma等人,1998,Journal ofImmunological Methods,216,165-181)。Fab-Fv形式首先公開於WO2009/040562,其二硫鍵穩定化形式Fab-dsFv首先公開於WO2010/035012。本公開的抗原結合片段還包括描述於WO2005/003169、WO2005/003170和WO2005/003171中的Fab和Fab’片段。多價抗體可包含多特異性例如雙特異性或可以是單特異性的(參見例如WO92/22583和WO05/113605),後者的一個實例是描述於WO 92/22583中的Tri-Fab(或TFM)。在一些具體實施方式中,本公開的抗CD25抗體涵蓋雙、多特異性抗體。
“表位”是指抗原上與免疫球蛋白或抗體特異性結合的位點。表位可以由相鄰的胺基酸、或藉由蛋白質的三級折疊而並列的不相鄰的胺基酸形成。由相鄰的胺基酸形成的表位通常在暴露於變性溶劑後保持,而藉由三級折疊形成的表位通常在變性溶劑處理後喪失。表位通常以獨特的空間構象包括至少3-15個胺基酸。確定什麼表位由給定的抗體結合的方法在本領域中是熟知的,包括免疫印跡和免疫沉澱檢測分析等。確定表位的空間構象的方法包括本領域中的技術和本文所述的技術,例如X射線晶體分析法和二維核磁共振等。
“特異性結合”、“選擇性結合”是指抗體與預定的抗原上的表位結合。通常,當使用重組人CD25或其表位作為分析物並使用抗體作為配體,在儀器中藉由表面等離子體共振(SPR)技術測定時,抗體以大
約低於10-7M或甚至更小的平衡解離常數(KD)與預定的抗原或其表位結合,並且其與預定抗原或其表位結合的親和力是其與預定抗原(或其表位)或緊密相關的抗原之外的非特異性抗原(如BSA等)結合的親和力的至少兩倍。“識別抗原的抗體”在本文中可以與“特異性結合的抗體”互換使用。
“結合親和力”是指表觀締合常數或Ka。Ka是解離常數(Kd)的倒數。例如結合蛋白對特定靶分子可具有至少10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10和10-11M的結合親和力。相對於第二靶標,結合配體與第一靶標的更高的親和結合可藉由比結合第二靶標的Ka(或更小數值的Kd)更高的結合第一靶標的Ka(或Kd的數值)來顯示。在這些情況下,相對於第二靶標(例如第二構象或其類似物的相同蛋白;或第二蛋白),結合蛋白對第一靶標有特異性(例如第一構象或其類似物的蛋白)。結合親和力的差異(例如對特異性或其它比較)至少是1.5、2、3、4、5、10、15、20、50、70、80、100、500、1000或105倍。
“保守性置換”指置換為具有與原始胺基酸殘基相似的特性的另一個胺基酸殘基。例如,賴胺酸、精胺酸和組胺酸具有相似的特性,在於它們具有鹼性側鏈,並且天冬胺酸和谷胺酸具有相似的特性,在於它們具有酸性側鏈。此外,甘胺酸、天冬醯胺、穀胺醯胺、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸和色胺酸具有相似的特性,在於它們具有不帶電荷極性側鏈,並且丙胺酸、纈胺酸、亮胺酸、蘇胺酸、異亮胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸和甲硫胺酸具有相似的特性,在於它們具有非極性側鏈。另外,酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸和組胺酸具有相似的特性,在於它們具有芳族側鏈。因
此,本領域技術人員將顯而易見,甚至當置換如上文所述的顯示相似特性的組中的胺基酸殘基時,它將不顯示特性的特定變化。
“序列同源性”或“序列同一性”是指兩個多核苷酸序列之間或兩個多肽之間的序列相似性。當兩個比較序列中的位置均被相同鹼基或胺基酸單體亞基佔據時,例如如果兩個DNA分子的每一個位置都被腺嘌呤佔據時,那麼該分子在該位置是同源的。兩個序列之間的同源性百分率是兩個序列共有的匹配或同源位置數除以比較的位置數×100%的函數。例如,在序列最佳比對時,如果兩個序列中的10個位置有6個匹配或同源,那麼兩個序列為60%同源。一般而言,當比對兩個序列而得到最大的同源性百分率時進行比較。
“交叉反應”是指本公開的抗體與來自不同物種的CD25結合的能力。例如,結合人CD25的本公開的抗體也可以結合另一物種的CD25。交叉反應性是藉由在結合測定(例如SPR和ELISA)中檢測與純化抗原的特異性反應性,或與生理表達CD25的細胞的結合或功能性相互作用來測量。確定交叉反應性的方法包括如本文所述的標準結合測定,例如表面等離子體共振分析,或流式細胞術。
“抑制”或“阻斷”可互換使用,並涵蓋部分和完全抑制/阻斷這兩者。對CD25的抑制/阻斷較佳地降低或改變無抑制或阻斷的情況下發生CD25結合時出現活性的正常水平或類型。抑制和阻斷也旨在包括與抗CD25抗體接觸時,與未與抗CD25抗體接觸的CD25相比,任何可測量的CD25結合親和力降低。
“抑制生長”(例如涉及細胞)旨在包括細胞生長任何可測量的降低。
生產和純化抗體和抗原結合片段的方法在現有技術中熟知和能找到,如冷泉港的抗體實驗技術指南(5-8章和15章)。如,可以用人CD25或其片段免疫小鼠,所得到的抗體能被覆性、純化,並且可以用一般的方法進行胺基酸測序。抗原結合片段同樣可以用一般方法製備。發明所述的抗體或抗原結合片段用基因工程方法在非人源的CDR區加上一個或多個人FR區。人FR種系序列可以從ImMunoGeneTics(IMGT)的網站http://imgt.cines.fr得到,或者從免疫球蛋白雜誌,2001ISBN012441351上獲得。
本公開的抗體可以是多株的、單株的、異種的、同種異體的、同基因的或其經過修飾的形式,其中單株抗體尤其適用於多個實施例中。一般來說,本公開的抗體是重組抗體。如本文所用的“重組”泛指例如細胞或核酸、蛋白質或載體等產品,表示該細胞、核酸、蛋白質或載體已經藉由引入異源核酸或蛋白質或改變天然核酸或蛋白質而加以修飾,或該細胞來源於如此修飾的細胞。例如,重組細胞表達天然(非重組)細胞形式內不存在的基因或表達原本異常表達、低表達或完全不表達的天然基因。
“單株抗體”或“單抗”指由單一的純株細胞株得到的抗體,該細胞株不限於真核的、原核的或噬菌體的純株細胞株。單株抗體或抗原結合片段可以用如融合瘤技術、重組技術、噬菌體展示技術,合成技術(如CDR-嫁接),或其它現有技術進行重組得到。
本公開的抗體或抗原結合片段可用一般方法製備和純化。比如,編碼重鏈和輕鏈的cDNA序列,可以選殖並重組至表達載體。重組的免疫球蛋白表達載體可以穩定地轉染CHO細胞。哺乳動物類表達系統會導致抗體的糖基化,特別是在Fc區的高度保守N端。藉由表達與人源抗原特異性結合的抗體得到穩定的純株。陽性的純株在生物反應器的無血清培養基中擴大培養以生產抗體。分泌了抗體的培養液可以用一般技術純化、收集。抗體可用一般方法進行過濾濃縮。可溶的混合物和多聚體,也可以用一般方法去除,比如分子篩,離子交換。得到的產物需立即冷凍,如-70℃,或者凍乾。
可使用本領域技術人員已知的一般技術,就與相同表位的結合競爭性篩選抗體。例如,可進行競爭和交叉競爭研究,以獲得彼此競爭或交叉競爭與抗原結合的抗體。基於它們的交叉競爭來獲得結合相同表位的抗體的高通量方法描述於國際專利公開WO03/48731中。因此,可使用本領域技術人員已知的一般技術,獲得與本公開的抗體分子競爭結合CD25上的相同表位的抗體及其抗原結合片段。此處全文引入WO2018167104中檢測抗體競爭結合的方法。
“給予”、“施用”和“處理”當應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時,是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組成物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。“給予”、“施用”和“處理”可以指例如治療、藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸,以及試劑與流體的接觸,其中該流體與細胞接觸。“給予”、“施用”和“處理”還意指藉
由試劑、診斷、結合組成物或藉由另一種細胞體外和離體處理例如細胞。“處理”當應用於人、獸醫學或研究受試者時,是指治療處理、預防或預防性措施,研究和診斷應用。
“治療”意指給予受試者內用或外用治療劑,諸如包含本公開的任一種抗體或其抗原結合片段或其偶聯物的組成物,該受試者已經患有、疑似患有、傾向於患有一種或多種疾病或其症狀,而已知該治療劑對這些症狀具有治療作用。通常,在受治療受試者或群體中以有效緩解一種或多種疾病症狀的量給予治療劑,無論是藉由誘導這類症狀退化還是抑制這類症狀發展到任何臨床右測量的程度。有效緩解任何具體疾病症狀的治療劑的量(也稱作“治療有效量”)可根據多種因素變化,例如受試者的疾病狀態、年齡和體重,以及藥物在受試者產生需要療效的能力。藉由醫生或其它專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方法,可評價疾病症狀是否已被減輕。盡本公開的實施方案(例如治療方法或製品)在緩解某個受試者中目標疾病症狀方面可能無效,但是根據本領域已知的任何統計學檢驗方法如Student t檢驗、卡方檢驗、依據Mann和Whitney的U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗(H檢驗)、Jonckheere-Terpstra檢驗和Wilcoxon檢驗確定,其在統計學顯著數目的受試者中應當減輕目標疾病症狀。
在本文中使用的術語“治療癌症”包括(a)抑制癌症,即阻止其發展,包括但不限於阻斷或延緩癌症的進展、阻斷或延緩癌症的轉移;和/或(b)緩解癌症,即引起癌症消退,包括但不限於減輕或緩解該癌症相關的一種或多種症狀、減輕或緩解轉移的癌症、和/或使腫瘤減小或消除。
本文的“預防”是指延遲或預防癌症症狀的發作。預防可能是絕對的(由此不會發生疾病)或僅在某些個體中或有限的時間內有效。
“有效量”包含足以改善或預防醫字病症的症狀或病症的量。有效量還意指足以允許或促進診斷的量。用於特定受試者或獸醫學受試者的有效量可依據以下因素而變化:如待治療的病症、受試者的總體健康情況、給藥的方法途徑和劑量以及副作用嚴重性。有效量可以是避免顯著副作用或毒性作用的最大劑量或給藥方案。
“細胞”、“細胞系”和“細胞培養物”可互換使用,並且所有這類名稱都包括其後代。還應當理解的是,由於故意或非有意的突變,所有後代在DNA含量方面不可能精確相同。包括具有與最初轉化細胞中篩選的相同的功能或生物學活性的突變後代。
“任選”或“任選地”意味著隨後所描述地事件或環境可以但不必發生,該說明包括該事件或環境發生或不發生地場合。例如,“任選包含1-3個抗體重鏈可變區”意味著特定序列的抗體重鏈可變區可以但不必須存在。
“醫藥組成物”表示含有一種或多種本文所述抗體或抗原結合片段或其生理學上/可藥用的鹽或前體藥物與其他化學組分的混合物,以及其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。醫藥組成物的目的是促進對生物體的給藥,利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。
“腫瘤”適用於被診斷出或被懷疑患有腫瘤的受試者,癌症是指任何大小的惡性或潛在惡性贅生物或組織腫塊,並且包括原發性腫瘤和繼發性贅生物。“癌症”、“惡性腫瘤”、“贅生物”、“腫瘤”和“癌
症”在本文中也可互換使用,指的是表現出相對異常、不受控制和/或自主生長的腫瘤和腫瘤細胞,因此它們表現出以顯著喪失對細胞增殖的控制為特徵的異常生長表型。通常,用於檢測或治療的目的細胞包括癌前(例如良性)、惡性、轉移前、轉移和非轉移細胞。“實體瘤”是組織的異常生長或腫塊,其通常不包含囊腫或液體區域,特別是除白血病或非實體淋巴癌之外的腫瘤和/或轉移(無論位於何處)。實體瘤可以是良性或惡性的。不同類型的實體瘤以形成它們的細胞類型和/或它們所在的組織或器官命名。實體瘤的實例包括但不限於肉瘤(包括從組織,例如松質骨、軟骨、脂肪、肌肉、血管、造血細胞或纖維結締組織中的間充質來源的轉化細胞產生的癌症)、癌(包括來自上皮細胞的腫瘤)、黑色素瘤、淋巴瘤、間皮瘤、神經母細胞瘤和視網膜母細胞瘤。
如無具體說明,在本文使用的冠詞“一種”(a)和“一”(an)是指一個或多於一個(即至少一個/種)該冠詞的語法對象。舉例來說,“一種元素”是指一個或多於一個元素。
實施例
以下結合實施例用於進一步描述,但這些實施例並非限制的範圍。
實施例或測試例中未註明具體條件的實驗方法,通常按照一般條件,或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。參見Sambrook等,分子選殖,實驗室手冊,冷泉港實驗室;當代分子生物學方法,Ausubel等著,Greene出版協會,Wiley Interscience,NY。未註明具體來源的試劑,為市場購買的一般試劑。
實施例1. 重組CD25蛋白的活性檢測
重組人CD25-Fc融合蛋白(購於ACRO Biosystems)是將人IgG1 Fc標簽蛋白融合在人CD25蛋白(GenBank,登錄號:NP_000408.1)的C端。重組人CD25-His蛋白(購於北京義翹神州)是將多組胺酸標簽融合在人CD25蛋白(GenBank,登錄號:NP_000408.1)Met1-Cys213的C端。重組猴CD25-His蛋白(購於北京義翹神州)是將His標簽融合在猴CD25蛋白(GenBank,登錄號:NP_001270633.1)Met1-Arg213的C端。重組小鼠CD25-His蛋白(購於北京義翹神州)是將His標簽融合在小鼠CD25蛋白(GenBank,登錄號:NP_032393.3)Met1-Lys236的C端。使用抗CD25抗體DAC(Efalizumab,達利珠單抗)對購入的重組蛋白進行一系列的質控檢測,如活性驗證。
藉由ELISA(酶聯免疫吸附實驗)驗證重組蛋白活性。具體為:用PBS將重組人CD25-Fc融合蛋白、人CD25-His蛋白、猴CD25-His蛋白、鼠CD25-His蛋白分別稀釋至1μg/mL,加入ELISA微孔板,每孔各100μL,4℃孵育過夜;加入ELISA封閉液(含1%BSA(w/v),pH7.4的PBS磷酸鹽緩衝液),37℃封閉2小時後,依次加入梯度稀釋的檢測抗體DAC和7D4(抗小鼠CD25抗體),37℃溫育1小時,用洗板液洗板2-3次;加入辣根過氧化物酶標記(HRP)的二抗,37℃溫育1小時,用洗板液洗板2-3次。加入TMB受質每孔100μL,室溫孵育15分鐘後,每孔加入50μL終止液(2M HCl)。用ELISA板機(SpectraMax M5e)讀取OD450nm值,結果如圖1A和1B所示。
結果顯示,兩種重組人CD25蛋白、重組猴CD25-His蛋白均能夠與DAC結合,且檢測信號隨檢測抗體的濃度變化而變化;重組小鼠CD25-His蛋白不能夠與DAC結合,但可以與7D4結合,證明上述重組CD25蛋白均具有活性。
實施例2. 建立表達重組人CD25蛋白的穩定細胞株
用編碼重組人CD25蛋白的質粒轉染CHO-K1細胞後,藉由篩選獲得穩定表達重組人CD25蛋白的細胞株。編碼人CD25的核苷酸序列被選殖連接到pCDNA3.4載體(購自Invitrogen)並製備質粒。用Lipofectamine 2000對CHO-K1細胞系(均購自Invitrogen)進行轉染,使用含G418的CD-CHO培養基選擇性培養2週,有限稀釋法在96孔培養板中進行亞選殖,並置於37℃含5%CO2(v/v)培養箱內培養,2週後選擇部分單純株孔擴增至24孔板內,隨後擴增至6孔板中培養。對擴增後的純株藉由流式分析法進行檢測篩選。圖2結果顯示篩選出的細胞株2F8能夠穩定表達人CD25蛋白。
實施例3. 對檢測抗體進行功能驗證
DAC、7G7B6、Tab06、7D4均為抗CD25抗體。DAC的序列在US5530101中列出,該專利藉由引用結合至本公開。7G7B6已被建議作為使放射性核素靶向表達CD25的淋巴瘤的靶向部分(Zhang et al,2009,Cancer Biother Radiopharm 24(3),303-309)。Tab06是一種不抑制IL-2與CD25的結合的抗CD25抗體,序列在WO2018167104中列出(該專利的序列27和29),該專利藉由引用結合至本公開。7D4是大鼠IgM抗小鼠CD25抗體,在PC61存在下或用PC61治療後或具有相似結合特性的抗體存在下,7D4已被廣泛用於檢測CD25陽性細胞
(Malek,1983,Immunology,Vol.80,pp.5694-5698;Onizuka S et al.,1999.Canc Res.59,3128-3133)。
藉由FACS對檢測抗體DAC、7G7B6、Tab06、7D4進行功能驗證。具體為:離心收集對數生長期的SU-DHL-1細胞、CHO-K1細胞和穩定表達人CD25的CHO-K1細胞(CHO-K1-CD25細胞),PBS清洗後200g離心5分鐘。用100μL含2 x 105細胞數的培養液鋪板,400g離心5分鐘後加入檢測抗體(100nM,梯度稀釋),其中對照組抗體為人IgG同種型。冰上孵育1h,用PBS洗去多餘的抗體,400g離心5分鐘。加入二抗Alexa Fluor 488羊抗人(Fc)抗體(購自Life Technology,貨號A11013)冰浴染色1小時,PBS洗去多餘的二抗,400g離心5分鐘。向每個孔加入200μL流式檢測液後,上機檢測。
如圖3A-3C所示,在與Su-DHL-1細胞和穩定表達人CD25的CHO-K1細胞(CHO-K1-CD25細胞)(即單株2F8)的結合實驗中,DAC的信號最強,Tab06次之,7G7B6的信號最弱;3種抗體均與能Su-DHL-1細胞和穩定表達人CD25的CHO-K1細胞結合,都不與CHO-K1細胞結合。
對7G7B6和Tab06使用ELISA進行功能驗證。具體為:用PBS將重組人CD25-His蛋白、重組猴CD25-His蛋白和重組小鼠CD25-his蛋白稀釋至1μg/mL,加入ELISA微孔板,每孔100μL,4℃孵育過夜;加入ELISA封閉液(含1%BSA,pH7.4的PBS磷酸緩衝液),37℃封閉2小時後,依次分別加入梯度稀釋的檢測抗體,37℃溫育1小時;用洗板液洗板2-3次;加入辣根過氧化物酶標記(HRP)的二抗,37℃溫育1小
時,用洗板液洗板2-3次。每孔加入TMB受質100μL,室溫孵育15分鐘後,每孔加入50μL終止液2M HCl,讀取OD450nm值。
如圖4A-4C所示,7G7B6與Tab06分別可以與人CD25蛋白和猴CD25蛋白結合,表明7G7B6與Tab06具有人猴交叉反應活性;7D4可以與小鼠CD25蛋白結合,表明7D4具有小鼠CD25蛋白的結合活性。
實施例4. 重組CD25蛋白免疫小鼠獲得鼠源抗CD25單株抗體
使用重組人CD25-Fc作為免疫原免疫6-8週齡的Balb/c和SJL/J小鼠,使用重組人CD25-His作為免疫原免疫SJL/J小鼠。初次免疫劑量為每隻小鼠50μg。初次免疫2週後,加強免疫,免疫劑量為每隻小鼠25μg。以後每次加強免疫間隔3週。
每次加強免疫一週後採集血清樣品,用ELISA檢測小鼠血清中抗體活性。用1ug/mL重組人CD25-His包板,4℃過夜,用含1% BSA的PBST緩衝液封閉1小時,洗板3次。在封閉緩衝液中以1:100開始,10倍梯度稀釋小鼠血清,37℃孵育1小時,洗板3次,與抗小鼠IgG-Fc-HRP的二抗溫育1小時。PBST洗滌3次,每孔加入100μL TMB受質,15分鐘後用2M HCl終止反應。使用酶標儀讀取450nm處的吸光度。經免疫原重組人CD25-Fc免疫的小鼠血清對免疫原有不同程度的結合,血清的最高稀釋倍數為在1:105時,仍能呈現抗原抗體反應。
最後一次免疫腹腔注射100μg重組人CD25-Fc與重組人CD25-His,5天後處死小鼠後取脾臟,碾磨收集脾細胞。加入終濃度1%(w/w)的NH4OH裂解脾細胞中混雜的紅細胞,獲得脾細胞懸液,1000轉離心清洗細胞3次。按活細胞數目5:1比率將小鼠脾臟細胞與小鼠骨髓瘤
細胞SP2/0混合,使用高效電融合方法進行細胞融合。使用20%胎牛血清、含1×HAT(w/w)的DMEM培養基稀釋融合後的細胞至96孔細胞培養板中,200μL每孔共計1 x 105個細胞,置於5%(v/v)CO2的37℃培養箱中。14天後使用ELISA篩選融合後的細胞,將OD450nm>1.0的陽性純株擴增至24孔細胞板,在37℃,5%(v/v)CO2條件下,使用含10%(w/w)HT胎牛血清的DMEM培養基繼續擴大培養。3天後取24孔細胞板培養液離心收集上清,用ELISA、FACS確定對重組人CD25蛋白和CD25陽性細胞的結合活性。兩輪單純株化,並使用上述ELISA檢測方法與流式檢測方法篩選出優異單純株。抗體經測序的胺基酸序列示於表1,下劃線為互補決定區CDR序列(使用Kabat編號系統)。
實施例5. 製備重組嵌合型抗CD25抗體以及人源化過程
對於嵌合抗體,藉由替換鼠源單株抗體的恆定區,獲得重組嵌合型抗體,隨後將編碼鼠源單株抗體可變區的核苷酸序列選殖到含有編碼人重、輕鏈恆定區(Human IgG1,kappa)蛋白序列的pTT5載體上後轉染HEK293細胞,即,所獲得的嵌合抗體的重鏈、輕鏈可變區分別與鼠源抗體的重鏈、輕鏈可變區相同。對於人源化抗體:藉由同源建模預測鼠源單抗的結構後,將鼠抗CDR嵌合到合適的人GermLine框架上(Bioinformation.2014;10(4):180-186;Methods Mol Biol.2019;1904:213-230),隨後在有可能影響抗體-抗原結合的位點引入回復突變,最後將人源化單株抗體編碼可變區的核苷酸序列選殖到含有編碼人重、輕鏈恆定區(Human IgG1,kappa)蛋白序列的pTT5載體上後轉染HEK293細胞。5天後離心去除細胞收集並過濾細胞培養液。pH調節至7.0後,將收穫的細胞培養液上清液上樣至蛋白A管柱(MabSelect SuRe,GE),使用甘胺酸沖提結合的抗體,1M Tris中和沖提液。
抗體可變區框架選擇見表2,抗體可變區序列參見表3,重鏈CDR(HCDR1\HCDR2\HCDR3)和輕鏈CDR(LCDR1\LCDR2\LCDR3)見表4,抗體胺基酸序列全長見表5。其中,PR006是cAb006的人源化的抗體,PR071是cAb037的人源化抗體,PR031是cAb042的人源化抗體,PR058、PR157是cAb046的人源化抗體。
實施例6. 嵌合型抗CD25抗體對人(human)和食蟹猴(cyno)CD25蛋白親和力檢測
用ELISA方法檢測嵌合型抗CD25抗體與CD25重組蛋白的結合活性。以1g/mL人CD25-His/猴CD25-His濃度,每孔50μL,包被
96孔板。用清洗液將未結合抗原清洗掉(清洗液:1×PBST)。清洗後以1 x PBST配置的1% BSA封閉液37℃封閉1小時。清洗液洗板3次後,加入不同稀釋濃度的待測嵌合抗體,37℃溫箱孵育1小時。清洗液洗板3次後,加入100μL1:5000稀釋的羊抗人IgG二抗,37℃溫箱孵育0.5小時洗板後,取TMB顯色液A液和B液1:1比例混合後顯色。15分鐘用1M鹽酸終止顯色反應,檢測450nm的螢光值。結果顯示,所檢測的嵌合型抗CD25抗體均可以和人以及猴的CD25蛋白結合,ELISA檢測的半數有效濃度(EC50)見表6和表7。
實施例7. 嵌合型抗CD25抗體與SU-DHL-1細胞的結合
由於淋巴瘤細胞系SU-DHL-1高表達CD25,因此我們用流式細胞術來檢測嵌合型抗CD25抗體與SU-DHL-1細胞的結合。選取對數生長期的SU-DHL-1細胞,收集細胞,PBS清洗後離心。每孔用100μL2×105細胞鋪板,400g離心5分鐘。加入不同濃度的待檢抗體,冰上孵育1h後,PBS洗滌,400g離心5min。加入帶有螢光基團的羊抗人二抗Alexa Fluor 488,冰浴染色1h,PBS清洗後上機檢測。如圖5A-5C所示,所檢測的本公開的嵌合型抗CD25抗體均可和SU-DHL-1細胞結合。表8為結合的EC50值。
實施例8. 嵌合型抗CD25抗體與Treg細胞/激活的CD4
+
T細胞/CD8
+
T細胞的結合
由於CD25在激活的Treg和激活的效應T細胞中都有表達,為了檢測本公開的抗CD25抗體對於表達在Treg和CD4+和CD8+效應T細胞上的CD25是否存在結合差別,以下用FACS的方法比較了抗體對Treg和激活後的效應T細胞上的結合能力。
取人外週血單核細胞(PBMC)用磁珠法分離提取天然CD4+細胞,並加入誘導Treg的培養基((AIM V+10% FBS+human IL-2
(400U/mL)+Rapamycin(0.1g/mL)或TGFβ(20ng/mL)+atRA(200nM)),同時加入包被了抗CD3/CD28抗體的磁珠。培養期間保持細胞密度為2×106/mL,37℃,5% CO2條件下培養。培養7天後用DynabeadsTM ReguLatory CD4+/CD25+ T Cell Kit(Thermo Fisher,11363D)分離細胞得到激活型的CD4+CD25+ Treg細胞,得到FOXP3陽性率大於90%的Treg細胞。
新鮮PBMC中分別用CD4+細胞負性篩選富集試劑盒細胞和CD8+T細胞篩選試劑盒富集,分離得到高純度的CD4+和CD8+效應T細胞,細胞純度大於90%。並加入包被了抗CD3/CD28抗體的磁珠使細胞激活和擴增。3天後得到CD25高表達的效應CD4+T細胞和效應CD8+T細胞。
將體外誘導的Treg細胞和體外激活的CD4+和CD8+效應T細胞分別加入不同稀釋濃度的待檢抗體冰上孵育1h後,用PBS洗滌。再加入羊抗人抗體Alexa Fluor 488冰浴染色1h,用PBS洗滌,每孔加入200μL流式檢測液在同樣條件下同時上機檢測。
結果如圖6A-6G所示,所有檢測嵌合抗體均可和Treg細胞、激活的CD4+和CD8+效應T細胞上的CD25抗原結合。但從結合程度而言,與Treg的結合力要遠遠大於和CD4+T細胞的結合,和CD4+T細胞的結合略大於和CD8+T細胞的結合。
實施例9. 嵌合型抗CD25抗體對於IL-2和受體結合能力的影響
收集對數生長期的SU-DHL-1細胞與200nM IL-2-biotin以及不同濃度的待測嵌合型抗CD25抗體,4℃孵育1h後,PBS洗一次細胞。
加入Alexa Fluor 488 Streptavidin(1:1000)4℃孵育1h,用PBS去多餘的二抗,用FACS檢測螢光細胞。如果抗體影響了IL-2和CD25的結合,螢光強度變弱。
使用如下公式計算抑制率:
抑制率%=100×(未加抗體時最大結合螢光強度-抗體結合後螢光強度)/未加抗體時的結合強度。
結果如圖7A-7B所示,DAC、cAb001、cAb002、cAb028、cAb029不同程度地抑制IL-2與SU-DHL-1的結合,提示以上嵌合型抗體對於對IL-2信號通路有抑制,而cAb006、cAb037、cAb042、cAb046與Tab006一樣不抑制IL-2與SU-DHL-1的結合,提示以上嵌合型抗體屬非拮抗型抗體。
實施例10. 人源化抗CD25抗體對SUDH-L1的細胞結合
用實施例7中的流式細胞術方法來檢測嵌合型抗CD25抗體與SU-DHL-1細胞的結合。圖8顯示本公開人源化抗CD25抗體RP006、PR031、PR058以及PR071均具有良好的SU-DHL-1結合活性。
實施例11. 人源化抗CD25抗體對人外周血T淋巴細胞pStat5信號通路的影響
CD25作為IL-2細胞因子受體的α鏈,與β和γ鏈形成高親和力受體後,與IL-2結合後,激活下游JAK-STAT,PI3K-AKT和MAPK信號通路,因此進一步檢測嵌合型抗體對於IL-2在PBMC中上調磷酸化STAT-5的作用。
復蘇凍存PBMC,將人源化抗CD25抗體和PBMC共孵育(37℃,5% CO2)。30分鐘後分別就加入100U/mL的IL-2誘導10分鐘。將激活後的PBMC固定每孔加入200μL染色液(含2%FBS的PBS)加入5μL的V450小鼠抗人CD3標記T細胞,將未結合抗體洗去後,加入300μL預冷破膜劑Perm Buffer III,渦旋混勻,冰浴30分鐘。再用Alexa Fluor® 647小鼠抗Stat5染色60分鐘。去除多餘的抗體,用流式細胞儀檢測。
如圖9所示,DAC能明顯抑制IL-2誘導的CD3細胞內Stat5的磷酸化,而Tab06不能抑制IL-2誘導的Stat5的磷酸化。PR006在300nM和100nM能微弱地抑制Stat5的磷酸化,PR031、PR058、PR071不抑制IL-2介導的Stat5的磷酸化。
實施例12. 人源化抗CD25抗體介導的對SU-DHL-1細胞的ADCC作用
抗體介導細胞細胞毒殺傷(ADCC)是抗體治療的一個重要功能,藉由ADCC的活性殺傷CD25高表達的Treg細胞達到激活腫瘤免疫的作用是我們期望的,以下檢測了本公開的人源化抗CD25抗體介導ADCC的活性。
使用ADCC報告基因細胞(Promega公司G7010 ADCC Bioassay Effector Cells)與SU-DHL-1細胞1:1比例混合,加入不同濃度的抗體孵育6小時後,檢測細胞螢光活性,從圖10和表9可以看出,PR006、PR031、PR058以及PR071均具有良好的ADCC活性,其中,PR058、PR071活性明顯強於抗體686。
抗體686序列參見US20190284287A的序列5、序列9。
實施例13. 人源化抗CD25抗體介導對hCD25小鼠的MC38移植瘤模型的抗腫瘤活性
在B-hIL2RA人源化小鼠的MC38結腸癌小鼠模型中評估人源化抗CD25抗體的抗腫瘤活性。將前述PR058、686的可變區連接到小鼠IgG2a上構建PR058 mIgG2a、686 mIgG2a抗體,用於動物實驗。
將PBS重懸的MC38結腸癌細胞以5×105個/0.1mL濃度,0.1mL/隻的體積接種於B-hIL2RA人源化小鼠的右側皮下。當平均腫瘤體積達到大約113mm3時,挑選個體腫瘤體積合適的48隻小鼠隨機分組,每組8隻,共6組,分別為:G1同種型mIgG2a(3mg/kg)對照組、G2 PR058 mIgG2a(3mg/kg)組、G3 686 mIgG2a(3mg/kg)組。所有組給藥途徑均為腹腔注射,每週給藥1次,連續給藥3次,末次給藥7天後結束實驗。每週測量腫瘤體積及體重2次,記錄小鼠體重和腫瘤體積。實驗結束時,動物安樂死,剝取腫瘤稱重、拍照,計算相對腫瘤抑制率(TGI%)。
研究結果如圖11A所示,PR058在3mg/kg劑量水平下,對MC38皮下移植瘤的生長具有最優的抑制作用,優於686。圖11B顯示實驗動物在給藥期間活動和進食狀態良好,實驗動物體重均有一定程度的上升,表明受試藥物未對實驗動物產生明顯毒性作用,安全性較好。如圖12A、
圖12B的腫瘤內淋巴細胞分析結果顯示,PR058能更強地介導Treg殺傷,以及CD3數目上調。其中,*表示p<0.05,與mIgG2a組相比有統計學差異;**表示p<0.01,與mIgG2a組相比有顯著統計學差異;***表示p<0.001,與mIgG2a組相比有及其顯著統計學差異;ns表示與mIgG2a組相比無統計學差異。
雖然以上描述了本公開的具體實施方式,但是本領域的技術人員應當理解,這些僅是舉例說明,在不背離本發明的原理和實質的前提下,可以對這些實施方式做出多種變更或修改。因此,本公開的保護範圍由所附申請專利範圍限定。
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大陸商上海盛迪醫藥有限公司(SHANGHAI SHENGDI PHARMACEUTICAL CO.,LTD)
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Claims (23)
- 一種抗CD25抗體或其抗原結合片段,包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL),其中,1)該VH含有SEQ ID NO:17中的HCDR1、HCDR2和HCDR3,和該VL含有SEQ ID NO:18中的LCDR1、LCDR2和LCDR3;2)該VH含有SEQ ID NO:1中的HCDR1、HCDR2和HCDR3,和該VL含有SEQ ID NO:2中的LCDR1、LCDR2和LCDR3;3)該VH含有SEQ ID NO:3中的HCDR1、HCDR2和HCDR3,和該VL含有SEQ ID NO:4中的LCDR1、LCDR2和LCDR3;4)該VH含有SEQ ID NO:5中的HCDR1、HCDR2和HCDR3,和該VL含有SEQ ID NO:6中的LCDR1、LCDR2和LCDR3;5)該VH含有SEQ ID NO:7中的HCDR1、HCDR2和HCDR3,和該VL含有SEQ ID NO:8中的LCDR1、LCDR2和LCDR3;6)該VH含有SEQ ID NO:9中的HCDR1、HCDR2和HCDR3,和該VL含有SEQ ID NO:10中的LCDR1、LCDR2和LCDR3;7)該VH含有SEQ ID NO:11中的HCDR1、HCDR2和HCDR3,和該VL含有SEQ ID NO:12中的LCDR1、LCDR2和LCDR3;8)該VH含有SEQ ID NO:13中的HCDR1、HCDR2和HCDR3,和該VL含有SEQ ID NO:14中的LCDR1、LCDR2和LCDR3;或9)該VH含有SEQ ID NO:15中的HCDR1、HCDR2和HCDR3,和該VL含有SEQ ID NO:16中的LCDR1、LCDR2和LCDR3;該CDR是根據Kabat、IMGT、Chothia、AbM或Contact編號系統定義的;較佳地,該CDR是根據Kabat編號系統定義的。
- 一種抗CD25抗體或其抗原結合片段,包含VH和VL,其中,1)該VH包含分別如SEQ ID NO:45、46、47所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3,和該VL包含分別如SEQ ID NO:48、49、50所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3;2)該VH包含分別如SEQ ID NO:27、28、29所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3,和該VL包含分別如SEQ ID NO:30、31、32所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3;3)該VH包含分別如SEQ ID NO:33、34、35所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3,和該VL包含分別如SEQ ID NO:36、37、38所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3;或4)該VH包含分別如SEQ ID NO:39、40、41所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3,和該VL包含分別如SEQ ID NO:42、43、44所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3。
- 如請求項1或2所述的抗CD25抗體或其抗原結合片段,其中所述抗CD25抗體為鼠源抗體、嵌合抗體、人抗體或人源化抗體;較佳地,該抗CD25抗體為人源化抗體。
- 如請求項1或2所述的抗CD25抗體或其抗原結合片段,其中,1)該VH包含選自IGHV1-46*01的FR1至FR3、和選自IGHJ1*01的FR4,和該VL包含選自IGKV4-1*01的FR1至FR3、和選自IGKJ4*01的FR4;2)該VH包含選自IGHV1-18*01的FR1至FR2、選自IGHV1-69*02的FR3、和選自hIGHJ6*01_14的FR4,和該VL包含選自IGKV3-11*01 的FR1、選自IGKV5-2*01的FR2、選自IGKV6-21*01的FR3、和選自hIGKJ4*01_12的FR4;3)該VH包含選自IGHV1-18*01的FR1、選自IGHV4-31*01的FR2、選自IGHV1-3*01的FR3、和選自hIGHJ6*01的FR4,和該VL包含選自IGKV4-1*01的FR1至FR3、和選自hIGKJ2*01的FR4;或4)該VH包含選自IGHV3-23*04的FR1至FR3、選自IGHJ1*01的FR4,和該VL包含選自IGKV2-28*01的FR1至FR3、和選自IGKJ4*01的FR4。
- 如請求項1至4中任一項所述的抗CD25抗體或其抗原結合片段,其中,該VH如SEQ ID NO:25所示或與之具有至少90%、至少95%序列同一性,和該VL如SEQ ID NO:26所示或與之具有至少90%、至少95%序列同一性;該VH如SEQ ID NO:59所示或與之具有至少90%、至少95%序列同一性,和該VL如SEQ ID NO:60所示或與之具有至少90%、至少95%序列同一性;該VH如SEQ ID NO:1所示或與之具有至少90%、至少95%序列同一性,和該VL如SEQ ID NO:2所示或與之具有至少90%、至少95%序列同一性;該VH如SEQ ID NO:3所示或與之具有至少90%、至少95%序列同一性,和該VL如SEQ ID NO:4所示或與之具有至少90%、至少95%序列同一性;該VH如SEQ ID NO:5所示或與之具有至少90%、至少95%序列同一性,和該VL如SEQ ID NO:6所示或與之具有至少90%、至少95%序列同一性;該VH如SEQ ID NO:7所示或與之具有至少90%、至少95%序列同一性,和該VL如SEQ ID NO:8所示或與之具有至少90%、至少95%序列同一性;該VH如SEQ ID NO:9所示或與之具有至少90%、至少95%序列同一性,和該VL如SEQ ID NO:10所示或與之具有至少90%、至少95%序列同一性;該VH如SEQ ID NO:11所示或與之具有至少90%、至少95%序列同一性,和該VL如SEQ ID NO:12所示或與之具有至少90%、至少95%序列同一性;該VH如SEQ ID NO:13所示或與之具有至少90%、至少95%序列同一性,和該VL如SEQ ID NO:14所示或與之具有至少90%、至少95%序列同一性;該VH如SEQ ID NO:15所示或與之具有至少90%、至少95%序列同一性,和該VL如SEQ ID NO:16所示或與之具有至少90%、至少95%序列同一性;該VH如SEQ ID NO:17所示或與之具有至少90%、至少95%序列同一性,和該VL如SEQ ID NO:18所示或與之具有至少90%、至少95%序列同一性;該VH如SEQ ID NO:19所示或與之具有至少90%、至少95%序列同一性,和該VL如SEQ ID NO:20所示;該VH如SEQ ID NO:21所示或與之具有至少90%、至少95%序列同一性,和該VL如SEQ ID NO:22所示或與之具有至少90%、至少95%序列同一性;或該VH如SEQ ID NO:23所示或與之具有至少90%、至少95%序列同一性,和該VL如SEQ ID NO:24所示或與之具有至少90%、至少95%序列同一性。
- 如請求項1至5中任一項所述的抗CD25抗體或其抗原結合片段,其中該抗原結合片段為scFv、Fv、Fab或Fab’片段。
- 如請求項1至5中任一項所述的抗CD25抗體或其抗原結合片段,其中該抗CD25抗體為IgG抗體,較佳為IgG1、IgG2、IgG4;較佳地,該抗CD25抗體在Fc區具有去岩藻糖化位點,以增強與Fc γ RIIIa的結合能力,和/或降低與Fc γ RIIb的結合能力;更佳地,該去岩藻糖化位點為297位。
- 如請求項1至7中任一項所述的抗CD25抗體或其抗原結合片段,包含重鏈和輕鏈,其中,1)該重鏈如SEQ ID NO:51所示或與之具有至少80%、至少90%、至少95%序列同一性,和該輕鏈如SEQ ID NO:52所示或與之具有至少80%、至少90%、至少95%序列同一性;2)該重鏈如SEQ ID NO:53所示或與之具有至少80%、至少90%、至少95%序列同一性,和該輕鏈如SEQ ID NO:54所示或與之具有至少80%同一性;3)該重鏈如SEQ ID NO:55所示或與之具有至少80%、至少90%、至少95%序列同一性,和該輕鏈如SEQ ID NO:56所示或與之具有至少80%、至少90%、至少95%序列同一性;4)該重鏈如SEQ ID NO:57所示或與之具有至少80%、至少90%、至少95%序列同一性,和該輕鏈如SEQ ID NO:58所示或與之具有至少80%、至少90%、至少95%序列同一性;或5)該重鏈如SEQ ID NO:61所示或與之具有至少80%、至少90%、至少95%序列同一性,和該輕鏈如SEQ ID NO:62所示或與之具有至少80%、至少90%、至少95%序列同一性。
- 如請求項1至8中任一項所述的抗CD25抗體或其抗原結合片段,其中,該抗CD25抗體或其抗原結合片段具有下述特徵中的至少一項:(a)結合人CD25的KD值小於1×10-7M;(b)不抑制或基本上不抑制IL-2與CD25的結合;(c)消耗腫瘤浸潤性Treg,不影響或基本上不影響Teff的功能;(d)以高於1的活化抑制率(A/I)結合Fc γ受體;(e)以比結合Fc γ RI、Fc γ RIIc和/或Fc γ RIIb更高的親和力結合Fc γ RIIIa,較佳地,以比結合Fc γ RIIb更高的親和力結合Fc γ RIIIa;(f)抑制腫瘤生長;和(g)引發增強的CDC、ADCC和/或ADCP反應;較佳地,引發增加的ADCC反應。
- 一種抗CD25抗體或其抗原結合片段,其與如請求項1至9中任一項所述的抗CD25抗體或其抗原結合片段競爭性結合人CD25,或競爭性結合、或結合相同的人CD25表位。
- 一種多核苷酸,其編碼如請求項1至10中任一項所述的抗CD25抗體或其抗原結合片段。
- 一種載體,其含有如請求項11所述的多核苷酸。
- 一種宿主細胞,其包含如請求項12所述的載體,較佳地,該宿主細胞為細菌、酵母或哺乳動物細胞;更佳地,該宿主細胞為大腸桿菌、畢赤酵母、中國倉鼠卵巢細胞或人胚腎293細胞。
- 一種製備抗CD25抗體或其抗原結合片段的方法,包括:在如請求項13所述的宿主細胞中表達如請求項1至10任一項所述的抗CD25抗體或其抗原結合片段,以及從所述宿主細胞中分離所述抗CD25抗體或其抗原結合片段。
- 一種醫藥組成物,其含有:如請求項1至10中任一項所述的抗CD25抗體或其抗原結合片段;以及,一種或多種可藥用的賦形劑、稀釋劑或載體。
- 一種如請求項1至10中任一項所述的抗CD25抗體或其抗原結合片段、如請求項11所述的多核苷酸和如請求項15所述的醫藥組成物在製備藥物或醫藥組成物中的用途,其中該藥物或醫藥組成物用於治療癌症。
- 一種治療患有癌症的受試者的方法,包括:向受試者施用治療有效量的如請求項1至10中任一項所述的抗CD25抗體或抗原結合片段、如請求項11所述的多核苷酸、如請求項15所述的醫藥組成物或其任意組合。
- 一種減少受試者腫瘤內部或腫瘤侵潤性Treg細胞數量和/或抑制其活性的方法,包括:向受試者施用治療有效量的如請求項1至10任一項所述的抗CD25抗體或抗原結合片段、如請求項11所述的多核苷酸、如請求項15所述的醫藥組成物或其任意組合。
- 一種增加受試者腫瘤內部Teff/Treg的比例的方法,包括:向受試者施用治療有效量的如請求項1至10任一項所述的抗CD25抗體或抗原結合片段、如請求項11所述的多核苷酸、如請求項15所述的醫藥組成物或其任意組合。
- 一種增強受試者體內針對腫瘤細胞的CDC、ADCC和/或ADCP的方法,包括:向受試者施用治療有效量的如請求項1至10任一項所述的抗CD25抗體或抗原結合片段、如請求項11所述的多核苷酸、如請求項15所述的醫藥組成物或其任意組合。
- 如請求項16的用途和請求項17至20任一項所述的方法,其中該受試者患有癌症或腫瘤,較佳地,該癌症或腫瘤選自鱗狀細胞癌、骨髓瘤、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神經膠質瘤、肝細胞癌(HCC)、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、急性髓性白血病(AML)、多種骨髓瘤、胃腸(道)癌、腎癌、卵巢癌、肝臟癌、淋巴母細胞白血病、淋巴細胞白血病、結直腸癌、子宮內膜癌、腎癌、前列腺癌、甲狀腺癌、黑色素瘤、軟骨肉瘤、神經母細胞瘤、胰腺癌、多形性膠質母細胞瘤、宮頸癌、腦癌、胃癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、結腸癌和頭頸癌。
- 一種在體內或體外檢測CD25的方法,該方法包括使用如請求項1至10中任一項所述的抗CD25抗體或抗原結合片段、和/或如請求項11所述的多核苷酸,較佳地,如果CD25存在,檢測該抗CD25抗體或抗原結合片段、多核苷酸和該CD25之間的相互作用。
- 一種用於檢測CD25的試劑盒,其包含如請求項1至10中任一項所述的抗CD25抗體或抗原結合片段和\或如請求項11所述的多核苷酸。
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