ES2622460T3 - Fusiones de anticuerpos con doble especificidad - Google Patents

Fusiones de anticuerpos con doble especificidad Download PDF

Info

Publication number
ES2622460T3
ES2622460T3 ES08806478.7T ES08806478T ES2622460T3 ES 2622460 T3 ES2622460 T3 ES 2622460T3 ES 08806478 T ES08806478 T ES 08806478T ES 2622460 T3 ES2622460 T3 ES 2622460T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
seq
fab
antibody
ser
fragment
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES08806478.7T
Other languages
English (en)
Inventor
David Paul Humphreys
Emma Dave
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
UCB Biopharma SRL
Original Assignee
UCB Biopharma SRL
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB0718834A external-priority patent/GB0718834D0/en
Priority claimed from GB0718832A external-priority patent/GB0718832D0/en
Application filed by UCB Biopharma SRL filed Critical UCB Biopharma SRL
Application granted granted Critical
Publication of ES2622460T3 publication Critical patent/ES2622460T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/12—Ophthalmic agents for cataracts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C07K16/245—IL-1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/522—CH1 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/54—F(ab')2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)

Abstract

Una proteína de fusión de anticuerpos con doble especificidad que comprende un fragmento Fab o Fab' de anticuerpo con especificidad para un antígeno de interés, estando dicho fragmento genéticamente fusionado a dos anticuerpos de un solo dominio que tienen especificidad para una proteína sérica transportadora, en donde un anticuerpo de un solo dominio se fusiona al terminal C de la cadena ligera del fragmento Fab o Fab' mediante un enlazador y el otro anticuerpo de un solo dominio se fusiona al terminal C de la cadena pesada del fragmento Fab o Fab' mediante un enlazador y en donde un anticuerpo de un solo dominio es un dominio VH y el otro anticuerpo de un solo dominio es un dominio VL y los anticuerpos de un solo dominio VH y VL son un par VH/VL complementario que se unen al antígeno de forma cooperativa y el anticuerpo de un solo dominio VH se fusiona al terminal C de la cadena pesada del fragmento Fab o Fab' y el anticuerpo de un solo dominio VL se fusiona al terminal C de la cadena ligera del fragmento Fab o Fab' y en donde la proteína sérica transportadora es una proteína sérica transportadora humana seleccionada del grupo que consiste en proteína de unión a la tiroxina, transtiretina, α-1-glucoproteína ácida, transferrina, fibrinógeno y albúmina del suero.

Description

5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
DESCRIPCION
Fusiones de anticuerpos con doble especificidad
La presente invencion se refiere a nuevas protemas de fusion de anticuerpos con doble especificidad. Dichos anticuerpos comprenden una primera especificidad para un antigeno de interes, y una segunda especificidad para un segundo antigeno de interes, por ejemplo una protema serica transportadora para su uso en la prolongacion de su vida media en el suero in vivo. Tambien se proporcionan metodos para la produccion de dichas moleculas y composiciones farmaceuticas que las comprenden.
La gran especificidad y afinidad de los anticuerpos les hace agentes para diagnostico y terapeuticos ideales, especialmente para modular las interacciones protema:protema. Los avances en el campo de la tecnologfa de anticuerpos recombinados han dado lugar a la produccion de fragmentos de anticuerpos, tales como los fragmentos Fv, Fab, Fab' y F(ab')2y otros fragmentos de anticuerpos. Estas moleculas mas pequenas conservan la actividad de union al antfgeno de los anticuerpos completos y pueden presentar tambien propiedades mejoradas de penetracion en el tejido y farmacocineticas en comparacion con las moleculas de inmunoglobulina completas. De hecho, se proporcionan fragmentos de anticuerpos que son agentes terapeuticos versatiles, como se ve por el reciente exito de los productos tales como ReoPro® y Lucentis®. Mientras que dichos fragmentos parecen presentar numerosas ventajas sobre las inmunoglobulinas completas, tambien adolecen de un aumento de la tasa de eliminacion del suero ya que carecen del dominio Fc que confiere una larga durabilidad in vivo (Medasan et al., 1997, J. Immunol. 158: 2211-2217).
Los anticuerpos con doble especificidad, es decir, que se unen a dos antfgenos diferentes se han descrito anteriormente (para resenas, vease Segal et al., 1999, Curr. Opin. Immunol. 11:558-562; Pluckthun & Pack, 1997, Immunotechnology, 3:83-105; Fischer y Leger, 2007, Pathobiology, 74, 3-14). Anticuerpos con doble especificidad tambien se describen en losl documentos WO02/02773, US2007065440, US2006257406, US2006106203 y US2006280734. Las estrategias anteriores para preparar moleculas de anticuerpos heterobiespedficos generalmente han empleado tecnicas de reticulacion qmmica o de ingeniena de protemas. La reticulacion qmmica adolece de rendimientos bajos de formacion de hetero- y homo-dfmeros y del requisito para su separacion cromatografica posterior. Las estrategias de ingeniena de protemas han sido o bien muy elaboradas (p. ej., ingeniena de knobs-into-holes; Ridgway et al., 1996, Protein Eng. 9 (7):617-621) o han utilizado moleculas con caractensticas de estabilidad inadecuadas (p. ej., diacuerpos, scFv). En algunos casos los anticuerpos biespedficos tambien pueden adolecer de problemas de impedimento esterico de modo que ambos antfgenos no pueden unirse simultaneamente a cada brazo del anticuerpo.
Los anticuerpos de un solo dominio variable tambien conocidos como anticuerpos de un solo dominio o dAb, corresponden a las regiones variables de la cadena pesada (VH) o ligera (VL) de un anticuerpo. Los anticuerpos murinos de un solo dominio fueron descritos por Ward et al., 1989, Nature, 341, 544-546. El documento WO2004/041863 describe anticuerpos de un solo dominio dirigidos contra interferon gamma y sus utilizaciones. Anticuerpos de un solo dominio humanos y humanos 'camelizados' tambien se han descrito (Holt et al., 2003, Trends in Biotechnology, 21, 484-490). Anticuerpos de un solo dominio tambien se han obtenido de camelidos (camellos y llamas) y peces cartilaginosos (tiburon alfombra telesado y tiburon nodriza). Estos organismos han desarrollado dominios V unicos de gran afinidad (denominados VhH en los camelidos y V-NAR en los tiburones), montados en un marco de dominio constante equivalente a Fc como un componente mtegro y crucial de su sistema inmunitario (vease Holliger y Hudson, para una resena, 2005, Nature Biotechnology, 23(9):1126-1136). Harmsen et al. Vaccine vol. 23, n° 41, 30 de septiembre de 2005 paginas 4926 a 4934 describe tiempos de residencia prolongados de fragmentos de anticuerpos de un solo dominio de llama en cerdos al unirse a inmunoglobulinas porcinas. Coppieters et al. Arthritis and Rheumatism vol. 54. n° 61 junio de 2006, paginas 1856 a 1866 describe protemas VHH alfa del factor de necrosis antitumoral formateadas procedentes de camelidos que presentan potencia superior y se dirigen a articulaciones inflamadas en un modelo murino de artritis producida por colageno.
En la patente europea EP0368684 se han descrito fusiones anticuerpo-enzima de un solo dominio. Las fusiones de grupo efector de un solo dominio se han descrito tambien en el documento WO2004/058820 que comprende un solo dominio variable. Las inmunoglobulinas de dominio variable doble se han descrito en el documento WO2007/024715. Los ligandos de doble especificidad que comprenden dos anticuerpos de un solo dominio con especificidades diferentes se han descrito en la patente europea Ep 1.517.921. En el documento WO2004/00319 se describen ligandos espedficos dobles. Shen et al. Journal of immunological Methods vol. 318 n° 1-2, 3 de enero de 2007 paginas 65 a 74 describe anticuerpos de un solo dominio variable como un bloque de construccion versatil para la construccion de anticuerpos biespedficos de tipo IgG.
El documento US7.074.405 describe la utilizacion de anticuerpos biespedficos para pre-reconocimiento y diagnostico. El documento WO2004/032832 describe una molecula biespedfica que comprende un anticuerpo anti- CR1 reticulado contra un antfgeno que se une al anticuerpo.
Se conocen medios para mejorar la vida media de fragmentos de anticuerpos, tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 y otros fragmentos de anticuerpos. Una estrategia ha sido conjugar el fragmento con moleculas de polfmero. Por lo tanto, la vida media de corta circulacion de los fragmentos Fab', F(ab')2 en animales se ha mejorado por conjugacion
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
con polietilenglicol (PEG; vease, por ejemplo, WO98/25791, WO99/64460 y WO98/37200). Otra estrategia ha consistido en modificar el fragmento de anticuerpo mediante conjugacion a un agente que interactua con el receptor FcRn (vease, por ejemplo, el documento WO97/34631). Sin embargo, otra estrategia para prolongar la vida media ha sido usar polipeptidos que se unen a albumina de suero (vease, por ejemplo, Smith et al., 2001, Bioconjugate Chem. 12:750-756; EP0486525; US6.267.964; WO04/001064; WO02/076489; y el documento WO01/45746). Sin embargo, todavfa sigue habiendo necesidad de producir protemas de inmunoglobulina de union a antfgeno que tienen una larga vida media in vivo, como alternativa a las que tienen una vida media larga debido a que interactuan con el receptor FcRn, sin estar qmmicamente modificadas por conjugacion a PEG, o estar conjugadas con albumina de suero humano.
Existe una variedad de protemas en en plasma e incluyen protema de union a tiroxina, transtiretina, a-1- glucoprotema acida, transferrina, fibrinogeno y albumina, o un fragmento de cualquiera de las mismas. Las protemas sericas transportadoras circulan dentro del cuerpo con vidas medias medidas en dfas, por ejemplo, 5 dfas para la protema de union a tiroxina o 2 dfas para transtiretina (Bartalena y Robbins, 1993, Clinics in Lab. Med. 13:583-598), o 65 horas en la segunda fase de recambio de a-1-glucoprotema acida yodada (Bree et al., 1986, Clin. Pharmacokin. 11:336-342). Los datos de Gitlin et al. (1964, J. Clin Invest. 10:1938-1951) sugieren que en mujeres embarazadas, la vida media de la a-1-glucoprotema acida es de 3,8 dfas, de 12 dfas para la transferrina y de 2,5 dfas para el
fibrinogeno. La albumina serica es una protema abundante tanto en compartimientos vasculares como extravasculares con una vida media en el hombre de aproximadamente 19 dfas (Peters, 1985, Adv. Protein Chem. 37: 161-245). Esto es similar a la vida media de IgG1, que es de aproximadamente 21 dfas (Waldeman y Strober, 1969, Progr. Allergy, 13:1-110).
La presente invencion proporciona protemas de fusion de anticuerpos con doble especificidad que comprenden un fragmento Fab o Fab' de anticuerpo con especificidad para un antfgeno de interes, estando dicho fragmento geneticamente fusionado con dos anticuerpos que tienen especificidad para una protema serica transportadora, en donde un anticuerpo de un solo dominio se fusiona con elterminal C de la cadena ligera del fragmento Fab o Fab' mediante un enlazador y el otro anticuerpo de un solo dominio se fusiona al terminal C de la cadena pesada del fragmento Fab o Fab' mediante un enlazador y en donde un anticuerpo de un solo dominio es un anticuerpo con dominio VH y el otro dominio unico es un dominio VL y los anticuerpos de un solo dominio VH y VL son un par VH/VL complementario que se unen al antfgeno de forma cooperativa y el anticuerpo de un solo dominio de VH se fusiona con al terminal C de la cadena pesada del fragmento Fab o Fab' y el anticuerpo de un solo dominio VL se fusiona al terminal C de la cadena ligera del fragmento Fab o Fab' y en donde la protema serica transportadora es una protema serica transportadora humano seleccionada del grupo que consiste en protema de union a la tiroxina, transtiretina, a-1-glucoprotema acida, transferrina, fibrinogeno y albumina del suero.
Una fusion de anticuerpos de doble especificidad de la invencion podra unirse selectivamente a dos antfgenos de interes.
En una realizacion, un antfgeno de interes unido por el fragmento Fab o Fab' puede ser una protema asociada a la celula, por ejemplo una protema de la superficie celular en celulas tales como celulas bacterianas, celulas de levadura, linfocitos T, celulas endoteliales o celulas tumorales, o puede ser una protema soluble. Antfgenos de interes tambien pueden ser cualquier protema medicamente relevante, tales como las protemas que aumentan durante la enfermedad o infeccion, por ejemplo, receptores y/o sus ligandos correspondientes. Ejemplos espedficos de protemas de la superficie celular incluyen moleculas de adhesion, por ejemplo integrinas tales como integrinas p1 p. ej., VLA-4, selectina E, selectina P o selectina L, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD11a, CD11b, CD18 , CD19, CD20, CD23, CD25, CD33, CD38, CD40, CD45, CDW52, CD69, CD134 (OX40), ICOS, BCMP7, CD137, CD27L, CDCP1, DRCP1, DRCP1, dudulina2, FLJ20584, FLJ40787, HEK2, KIAA0634, KIAA0659, KIAAl246, KIAA1455, LTBP2, LTK, MAL2, MRP2, nectina tipo 2, NKCC1, PTK7, RAIG1, TCAM1, SC6, BCMP101, BCMP84, BCMP11, DTD, antfgeno carcinoembrionario (CEA), globulina de grasa de la leche humana (HMFG1 y 2 ), antfgenos MHC de clase I y MHC de clase II, y VEGF, y cuando proceda, receptores de las mismas.
Los antfgenos solubles incluyen interleucinas tales como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-12, IL-16 o IL-17, antfgenos vmcos, por ejemplo, antfgenos del virus respiratorio sincitial o del citomegalovirus, inmunoglobulinas, tales como IgE, interferones tales como interferon a, interferon p o interferon y, factor de necrosis tumoral-a, factor de necrosis tumoral-p, factores estimulantes de colonias tales como G-CSF o GM-CSF, y factores de crecimiento derivados de plaquetas tales como PDGF-a, y PDGF-p y donde proceda uno de sus receptores apropiados. Otros antfgenos incluyen antfgenos de superficie celular bacteriana, toxinas bacterianas, virus, tales como de la gripe, EBV, HepA, B y C, agentes de bioterrorismo, radionuclidos y metales pesados, y venenos y toxinas de serpientes y aranas.
En una realizacion, las protemas de fusion de anticuerpos de la invencion pueden emplearse para alterar funcionalmente la actividad del antfgeno de interes. Por ejemplo, las protemas de fusion de anticuerpos pueden neutralizar, antagonizar o agonizar la actividad de dicho antfgeno, directa o indirectamente.
La seleccion de la funcion efectora puede ser directa en la que la funcion efectora esta relacionada con una celula, llevando dicha celula una molecula de seleccion en su superficie.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Los ejemplos incluyen
TNFa, IL2, IL6, IL8, IL17, IFNy, histamina, C1q, opsonina y otros miembros de las cascadas de activacion del complemento clasicas y alternativas, C2, C4, C3-convertasa y C5 a C9.
Como se emplea en esta memoria, 'un polipeptido de seleccion' incluye un FcyR tales como FcyRI, FcyRII y FcyRIII, una protema de la ruta del complemento tales como, pero sin limitacion, Clq y C3, una protema marcadora CD (grupo de marcador de diferenciacion), tales como, pero sin limitacion, CD68, CD115, CD16, CD80, CD83, CD86, CD56, CD64, CD3, CD4, CD8, CD28, CD45, CD19, CD20 y CD22. Otros polipeptidos de seleccion que son protemas marcadoras CD incluyen CD1, CD1d, CD2, CD5, CD8, CD9, CD10, CD11, CD11a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23 , CD24, CD25, CD26, CD27, CD28, CD29, CD30, CD31, CD32, CD33, CD34, CD35, CD36, CD37, CD38, CD40, CD43, CD44, CD45, CD46, CD49, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d , CD52, CD53, CD54, CD55, CD56, CD58, CD59, CD61, CD62, D62E, CD62L, CD62P, CD63, CD64, CD66e, CD68, CD70, CD71, CD72, CD79, CD80, CD81, CD82, CD83, CD84 , CD85, CD86, CD88, CD89, CD90, CD94, CD95, CD98, CD106, CD114, CD116, CD117, CD118, CD120, CD122, CD130, CD131, CD132, CD133, CD134, CD135, CD137, CD138, CD141, CD142 , CD143, CD146, CD147, CD151, CD152, CD153, CD154, CD155, CD162, CD164, CD169, CD184, CD206, CD209, CD257, CD278, CD281, CD282, CD283 y CD304, o un fragmento de cualquiera de los mismos que conserva capacidad para seleccionar la funcion efectora mediada por celulas, ya sea directa o indirectamente. Un polipeptido de seleccion tambien incluye moleculas de inmunoglobulina, tales como IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE e IgA que poseen funcion efectora.
En una realizacion, el anticuerpo o anticuerpos de un solo dominio proporcionan una vida media prolongada al resto de inmunoglobulina con la primera especificidad.
Por consiguiente, en una realizacion, se proporciona una protema de fusion de anticuerpos con doble especificidad que comprende un fragmento de anticuerpo Fab o Fab' con especificidad para un antfgeno de interes, estando dicho fragmento fusionado a vehmulo y VL segun la presente descripcion que tiene especificidad para una protema serica transportadora, proporcionado dichos VH y VL una vida media prolongada al fragmento de anticuerpo con especificidad para dicho antfgeno de interes al unirse a dicha protema serica transportadora.
Como se emplea en esta memoria, 'protemas sericas transportadoras' incluyen la protema de union a tiroxina, transtiretina, a-1-glucoprotema acida, transferrina, fibrinogeno y albumina, o un fragmento de una cualquiera de ellas.
Como se emplea en esta memoria, una 'molecula circulante de inmunoglobulina' incluye IgG1, IgG2, IgG3, sIgG4, sIgA, IgM e IgD, o un fragmento de cualquiera de ellas.
En una realizacion preferida, la segunda protema para la que el dAb tiene especificidad es una protema serica transportadora, siendo especialmente preferida una protema serica transportadora humana. En una realizacion mas preferida, la protema serica transportadora es albumina de suero humano.
Por consiguiente se proporciona una protema de fusion de anticuerpos con doble especificidad que comprende un fragmento de anticuerpo Fab o Fab' con especificidad para un antfgeno de interes, estando dicho fragmento fusionado con al menos un anticuerpo de un solo dominio que tiene especificidad para albumina de suero humano.
En una realizacion la presente invencion proporciona una protema de fusion de anticuerpos aislada con doble especificidad que comprende un fragmento de anticuerpo Fab o Fab' con especificidad para un antfgeno de interes, estando dicho fragmento fusionado con al menos un anticuerpo de un solo dominio que tiene especificidad para albumina de suero humano.
En una realizacion, el fragmento de anticuerpo con especificidad para un antfgeno de interes es un fragmento Fab. En otra realizacion, el fragmento de anticuerpo con especificidad para un antfgeno de interes es un fragmento Fab'.
Por lo tanto, en una realizacion mas preferida, las protemas de fusion de anticuerpos de la invencion son protemas de fusion de traduccion, es decir, fusiones geneticas, la secuencia de cada una de los cuales esta codificada por un vector de expresion. Alternativamente, los componentes de la protema de fusion de anticuerpos se han fusionado empleando medios qmmicos, es decir, por conjugacion qmmica o reticulacion qmmica. Dichos medios qmmicos son conocidos en latecnica.
En un ejemplo, los fragmentos de anticuerpos son fragmentos Fab' que poseen una region bisagra nativa o modificada. Cuando el fragmento de anticuerpo para su uso en la preparacion de una protema de fusion de anticuerpos con doble especificidad de la invencion es un fragmento Fab', dicho fragmento esta generalmente prolongado en el terminal C de la cadena pesada por uno o mas aminoacidos. Por lo tanto, una fusion de
anticuerpo de la invencion puede comprender una traduccion del fragmento Fab' fusionado (o fusionado qmmicamente) a un dAb, mediante un enlazador. Ademas, ejemplos de fragmentos Fab' de anticuerpo adecuados incluyen los descritos en los documentos WO2005/003170 y WO2005/003171.
En otro ejemplo, los fragmentos de anticuerpos son fragmentos Fab. Por lo tanto, una fusion de anticuerpos de la
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
invencion puede comprender una traduccion del fragmento Fab fusionada (o qmmicamente fusionada) a una secuencia de enlazador que a su vez es la traduccion fusionada (o qmmicamente fusionada) a un dAb. Preferiblemente, el fragmento Fab es un fragmento Fab que termina en las cistemas de entre la cadena, como se describe en el documento WO2005/003169.
Los fragmentos Fab o Fab' de anticuerpos de uso en la presente invencion pueden ser de cualquier especie, pero preferiblemente provienen de un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humano o son fragmentos humanizados. Un fragmento de anticuerpo para su uso en la presente invencion puede proceder de cualquier clase (p. ej., IgG, IgE, IgM, IgD o IgA) o subclase de molecula de inmunoglobulina y puede obtenerse a partir de cualquier especie, como por ejemplo, raton, rata, tiburon, conejo, cerdo, hamster, camello, llama, cabra o ser humano.
En una realizacion, el fragmento Fab o Fab' de anticuerpo es un fragmento de anticuerpo anticuerpo monoclonal, completamente humano, humanizado o hnbrido. En una realizacion, los fragmentos Fab o Fab' de anticuerpo son completamente humanos o estan completamente humanizados.
Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar por cualquier metodo conocido en la tecnica tal como la tecnica del hibridoma (Kohler y Milstein, Nature, 1975, 256, 495-497), la tecnica del trioma, la tecnica del hibridoma de linfocitos B humanos (Kozbor et al., Inmunology Today, 1983, 4, 72) y la tecnica de EBV-hibridoma (Cole et al., "Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy', pags. 77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985).
Los anticuerpos para su uso en la invencion tambien pueden generarse usando metodos de anticuerpos de linfocitos individuales por clonacion y expresion los ADNc de la region variable de inmunoglobulina generados a partir de linfocitos individuales seleccionados para la produccion de anticuerpos espedficos, por ejemplo, por los metodos descritos por Babcook, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1996, 93(15), 7843-7848, WO 92/02551, WO2004/051268 y WO2004/106377.
Los anticuerpos humanizados son moleculas de anticuerpos de especies no humanas que tienen una o mas regiones determinantes de complementariedad (RDC) de la especie no humana y una region marco de una molecula de inmunoglobulina humana (vease, por ejemplo, el documento US. 5.585.089).
Los anticuerpos para su uso en la presente invencion tambien pueden generarse usando diversos metodos de exposicion en fagos conocidos en la tecnica e incluyen los descritos por Brinkman et al., J. Immunol. Methods, 1995, 182, 41-50; Ames et al., J. Immunol. Methods, 1995, 184, 177-186; Kettleborough et al. Eur. J. Immunol,. 1994, 24, 952-958; Persic et al., Gene, 1997 187, 9-18; y Burton et al., Advances in Immunology, 1994, 57, 191-280; WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; y WO 95/20401; y los documentos n° 5.698.426; n° 5.223.409; n° 5.403.484; n° 5.580.717; n° 5.427.908; n° 5.750.753; n° 5.821.047; n° 5.571.698; n° 5.427.908; n° 5.516.637; n° 5.780.225; n° 5.658.727; n° 5.733.743; y n° 5.969.108. Tambien, los ratones transgenicos, u otros organismos, como por ejemplo otros mairnferos, se pueden usar para generar anticuerpos humanizados.
Los anticuerpos completamente humanos son aquellos anticuerpos en los que las regiones variables y las regiones constantes (si estan presenten) tanto de las cadenas pesadas como de las ligeras son todas de origen humano, o substancialmente identicas a secuencias de origen humano, no necesariamente del mismo anticuerpo. Ejemplos de anticuerpos completamente humanos pueden incluir anticuerpos producidos por ejemplo por los metodos de exposicion en fagos descritos anteriormente y los anticuerpos producidos por ratones en los cuales genes con region variable y constante de inmunoglobulina de murina han sido reemplazados por sus contrapartidas humanas, p. ej. como se describe en terminos generales en los documentos EP0546073 B1, US 5.545.806, US 5.569.825, US 5.625.126, US 5.633.425, US 5.661.016, US 5770429, EP 0438474 B1 y EP0463151 B1.
El material de partida del fragmento de anticuerpo Fab o Fab' para su uso en la presente invencion puede obtenerse a partir de cualquier anticuerpo entero, especialmente un anticuerpo monoclonal entero, utilizando cualquier tecnica de escision enzimatica y/o de digestion adecuada, por ejemplo por tratamiento con pepsina. Alternativamente, o ademas del material de partida de anticuerpos se puede preparar mediante el uso de tecnicas de ADN recombinado que implican la manipulacion y la reexpresion de ADN que codifica regiones variables y/o constantes de anticuerpos. Tecnicas de biologfa molecular convencionales pueden usarse para modificar, anadir o eliminar aminoacidos o dominios segun se desee. Algunas alteraciones a las regiones variables o constantes todavfa estan comprendidas por los terminos regiones 'variable' y 'constante', como se emplea en esta memoria.
El material de partida de fragmentos de anticuerpos puede obtenerse de cualquier especie como por ejemplo raton, rata, conejo, hamster, camello, llama, cabra o ser humano. Las partes del fragmento de anticuerpo pueden obtenerse de mas de una especie, por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos pueden ser hfbridos. En un ejemplo, las regiones constantes son de una especie y las regiones variables de otra. El material de partida de fragmentos de anticuerpos tambien puede modificarse. En otro ejemplo, la region variable del fragmento de anticuerpo se ha creado empleando tecnicas de ingeniena de ADN recombinado. Dichas versiones por ingeniena genetica incluyen las creadas por ejemplo a partir de regiones variables de anticuerpos naturales mediante inserciones, supresiones o cambios en o a las secuencias de aminoacidos de los anticuerpos naturales. Los ejemplos espedficos de este tipo incluyen los dominios de la region variable modificados geneticamente que contienen al menos una RDC y,
opcionalmente, uno o mas aminoacidos marco de un anticuerpo y el resto del dominio de la region variable de un segundo anticuerpo. Los metodos para crear y fabricar estos fragmentos de anticuerpos son bien conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, Boss et al., US 4.816.397; Cabilly et al., US 6.331.415; Shrader et al., WO 92/02551; Ward et al., 1989, Nature, 341, 544; Orlandi et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 86, 3833; Riechmann et al., 5 1988, Nature, 322, 323 ; Bird et al., 1988, Science, 242, 423; Queen et al., US 5.585.089; Adair, WO91/09967;
Mountain y Adair, 1992, Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10, 1-142 ; Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181).
En la presente invencion, cada anticuerpo de un solo dominio fusionado al fragmento Fab o Fab' puede unirse mediante un enlazador.
10 Ejemplos de regiones enlazadoras adecuadas para unir un dAb a un Fab o Fab' incluyen, pero no se limitan a, secuencias de enlazadores flexibles y secuencias de enlazadores ngidos. Las secuencias de enlazadores flexibles incluyen las descritos en Huston et al., 1988, PNAS 85:5879-5883; Wright & Deonarain, Mol. Immunol., 2007, 44(11):2860-2869;. Alfthan et al., Prot. Eng., 1995, 8(7):725-731;. Luo et al., J. Biochem, 1995, 118(4):825-831; Tang et al., 1996, J. Biol. Chem. 271(26):15682-15686; y Turner et al., 1997, JIMM 205, 42-54 (vease la Tabla 1 15 para ejemplos representativos).
Tabla 1. Secuencias de enlazadores flexibles
SEQ ID n°:
SECUENCIA
1
SGGGGSE
2
DKTHTS
3
GGGGS
45
GGGGSGGGGS
46
GGGGSGGGGSGGGGS
47
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
48
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
4
AAAGSG-GASAS
5
AAAGSG-XGGGS-GASAS
49
AAAGSG-XGGGSXGGGS-GASAS
50
AAAGSG- XGGGSXGGGSXGGGS-GASAS
51
AAAGSG- XGGGSXGGGSXGGGSXGGGS-GASAS
6
AAAGSG-XS-GASAS
7
PGGNRGTTTTRRPATTTGSSPGPTQSHY
8
ATTTGSSPGPT
9
ATTTGS
-
GS
10
EPSGPISTINSPPSKESHKSP
11
GTVAAPSVFIFPPSD
SEQ ID n°:
SECUENCIA
12
GGGGIAPSMVGGGGS
13
GGGGKVEGAGGGGGS
14
GGGGSMKSHDGGGGS
15
GGGGNLITIVGGGGS
16
GGGGVVPSLPGGGGS
17
GGEKSIPGGGGS
18
RPLSYRPPFPFGFPSVRP
19
YPRSIYIRRRHPSPSLTT
20
TPSHLSHILPSFGLPTFN
21
RPVSPFTFPRLSNSWLPA
22
SPAAHFPRSIPRPGPIRT
23
APGPSAPSHRSLPSRAFG
24
PRNSIHFLHPLLVAPLGA
25
MPSLSGVLQVRYLSPPDL
26
SPQYPSPLTLTLPPHPSL
27
NPSLNPPSYLHRAPSRIS
28
LPWRTSLLPSLPLRRRP
29
PPLFAKGPVGLLSRSFPP
30
VPPAPVVSLRSAHARPPY
31
LRPTPPRVRSYTCCPTP-
32
PNVAHVLPLLTVPWDNLR
33
CNPLLPLCARSPAVRTFP
Ejemplos de enlazadores ngidos incluyen las secuencias de peptidos GAPAPAAPAPA (SEQ ID n°: 34), PPPP (SEQ ID n°: 35) y PPP.
En una realizacion, una secuencia bisagra de anticuerpos o parte de la misma se utiliza como enlazador, p. ej. la 5 secuencia bisagra superior. Por lo general, los fragmented Fab' de anticuerpo para su uso en la presente invencion poseen una region bisagra natural o modificada. Dichas regiones bisagra se utilizan como enlazador natural al resto dAb. La region bisagra nativa es la region bisagra normalmente asociada al dominio Ch1 de la molecula de anticuerpo. Una region bisagra modificada es cualquier bisagra que difiere en longitud y/o composicion de la region bisagra natural. Dichas bisagras pueden incluir regiones bisagra de cualquier otra especie, tales como regiones 10 bisagra de ser humano, raton, rata, conejo, hamster, camello, llama o cabra. Otras regiones bisagra modificadas
pueden comprender una region bisagra completa procedente de un anticuerpo de una clase o subclase diferente de la del dominio Ch1. As^ por ejemplo, un dominio Ch1 de clase y1 puede estar unido a una region bisagra de clase Y4. Alternativamente, la region bisagra modificada puede comprender parte de una bisagra natural o una unidad de repeticion en la que cada unidad en la repeticion procede de una region bisagra natural. En una alternativa adicional, 5 la region bisagra natural puede alterarse al convertir uno o mas restos de cistema u otros restos en restos neutros, tal como de alanina, o al convertir restos colocados adecuadamente en restos de cistema. Por dichos medios el numero de restos de cistema en la region bisagra puede aumentar o disminuir. Ademas pueden controlarse otras caractensticas de la bisagra, tales como la distancia de la(s) cistema(s) de la bisagra de la cistema entre la cadena de la cadena ligera, la distancia entre las cistemas de la bisagra y la composicion de demas aminoacidos en la 10 bisagra que puede afectar propiedades de la bisagra tales como la flexibilidad, p. ej. pueden incorporarse glicinas en la bisagra para aumentar la flexibilidad de rotacion o pueden incorporarse prolinas para reducir la flexibilidad. Alternativamente combinaciones de restos cargados o hidrofobos pueden incorporarse en la bisagra para conferir propiedades de polimerizacion, vease por ejemplo, Richter et al., 2001, Prot. Eng. 14(10):775-783 para el uso de colas cargadas o ionicas, p. ej., colas acidas como enlazadores y Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 5(1):1547-1553 15 para las secuencias de cremallera de leucina. Otras regiones bisagra modificadas pueden ser totalmente sinteticas y pueden disenarse para que posean propiedades deseadas tales como la longitud, la composicion y la flexibilidad.
Una serie de regiones bisagra modificadas se han descrito ya por ejemplo, en los documentos US5.677.425, US6.642.356, WO99/15549, WO2005/003170, WO2005/003169, WO2005/003170, WO98/25971 y WO2005/003171 y estos estan incorporados en la presente memoria por referencia. Dichas bisagras siguen generalmente en la 20 region CH1, pero tambien pueden incorporarse en el extremo de la region constante de un fragmento kappa o lambda de la cadena ligera; vease la Tabla 2 para ejemplos.
TABLA 2. Secuencias de enlazadores bisagra
SEQ ID n°:
SECUENCIA
36
DKTHTCAA
37
DKTHTCPPCPA
38
DKTHTCPPCPATCPPCPA
39
DKTHTCPPCPATCPPCPATCPPCPA
40
DKTHTCPPCPAGKPTLYNSLVMSDTAGTCY
41
DKTHTCPPCPAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY
42
DKTHTCCVECPPCPA
43
DKTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPA
44
DKTHTCPSCPA
Se pueden generar dominios variables unicos tambien conocidos como anticuerpos de un solo dominio o dAb para 25 su uso en la presente invencion utilizando metodos conocidos en la tecnica e incluyen los descritos en el documento WO2005/118642, Ward et al., 1989, Nature, 341, 544-546 y Holt et al., 2003 , Trends in Biotechnology, 21, 484-490. En una realizacion, un anticuerpo de un solo dominio para su uso en la presente invencion es un dominio variable de cadena pesada (VH) o un dominio de la cadena ligera (VL). Cada dominio de la cadena ligera puede ser del subgrupo kappa o lambda. Los metodos para aislar los dominios VH y VL se han descrito en la tecnica, vease por 30 ejemplo la patente europea EP0368684 y Ward et al., anteriormente. Dichos dominios pueden proceder de cualquier especie o material de partida de anticuerpos adecuados. En una realizacion, el anticuerpo de un solo dominio puede proceder de un roedor, un ser humano o de otras especies. En una realizacion, el anticuerpo de un solo dominio esta humanizado.
En una realizacion, el anticuerpo de un solo dominio procede de una biblioteca de exposicion en fagos, utilizando los 35 metodos descritos en, por ejemplo, el documento WO2005/118642, Jespers et al., 2004 , Nature Biotechnology, 22, 1161-1165 y Holt et al., 2003, Trends in Biotechnology, 21, 484-490. Preferiblemente, dichos anticuerpos de un solo dominio son completamente humanos, pero tambien se pueden proceder de otras especies. Se valorara que la secuencia del anticuerpo de un solo dominio, una vez aislada pueda modificarse para mejorar las caractensticas del
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
anticuerpo de un solo dominio, por ejemplo la solubilidad, como se describe en Holt et al., anteriormente.
En una realizacion, el dAb es una secuencia humana obtenida de la exposicion en fago scFv o a partir de un roedor Humouse™ o Velocimouse™ transgenico o humanizado.
En una realizacion, el dAb se obtiene de un ser humano o de un roedor humanizado, un camelido o un tiburon. Dicho dAb sera preferiblemente humanizado. En un ejemplo, el anticuerpo de un solo dominio es un dominio VHH a base de inmunoglobulinas de camelidos como se describe en la patente europea EP0656946. En un ejemplo, un camello o una llama se inmuniza con un antigeno de interes y la sangre se recoge cuando el valor es apropiado. El gen que codifica el dAb se puede clonar por RCP en una sola celula, o el/los linfocito(s) B que codifica(n) el dAb puede(n) inmortalizarse portransformacion de VEB, o por fusion a una estirpe celular inmortal.
Las cadenas pesada y ligera del fragmento Fab o Fab' de anticuerpo se fusiona cada una al terminal C a un dAb mediante un enlazador segun la presente descripcion. El enlace puede ser una conjugacion qmmica, pero lo mas preferible es una fusion de traduccion, es decir, una fusion genetica, donde la secuencia de cada uno es codificada en la secuencia por un vector de expresion.
Por lo general, el terminal N del anticuerpo de un solo dominio se fusionara al terminal C de la cadena pesada o ligera del fragmento Fab o Fab', mediante un enlazador.
En una realizacion la presente invencion proporciona una protema de fusion de anticuerpos con doble especificidad que comprende o consiste en un fragmento Fab o Fab' de anticuerpo con especificidad para un antfgeno de interes, estando dicho fragmento fusionado a dos anticuerpos de un solo dominio en donde un anticuerpo de un solo dominio esta fusionado al terminal C de la cadena pesada del fragmento Fab o Fab', teniendo especificidad dichos anticuerpos de un solo dominio para un segundo antfgeno de interes, segun la presente descripcion.
Cada una de las cadenas pesada y ligera de fragmento Fab o Fab' comprende un anticuerpo de un solo dominio en el terminal C, los dos anticuerpos de un solo dominio son un par VH/VL complementario que se unen al antfgeno cooperativamente es decir, son un par VH/VL complementario que tiene la misma especificidad de union. Por lo general sera un par VH/VL procedente del mismo anticuerpo.
La protema de fusion al anticuerpo con doble especificidad de la presente invencion comprende dos anticuerpos de un solo dominio que son un par VH/VL complementario, el anticuerpo de un solo dominio VH se fusiona al terminal C de la region constante de la cadena pesada (CH1) y el anticuerpo de un solo dominio VL se fusiona al terminal C de la region constante de la cadena ligera (C kappa o C lambda).
En las protemas de fusion con doble especificidad de la presente invencion, el anticuerpo o anticuerpos de un solo dominio se une a un segundo antfgeno, diferente del que se une por el componente del fragmento Fab o Fab'.
En un ejemplo preferido los dAb para su uso en la presente invencion presentan especificidad para una protema transportadora del suero humano tal como la protema de union a la tiroxina, transtiretina, a1-glucoprotema acida, transferrina, fibrinogeno o albumina del suero. Mas preferiblemente, el dAb presenta especificidad a la albumina del suero humano. Por lo tanto, en un ejemplo, un conejo, raton, rata, camello o una llama esta inmunizada con una protema transportadora del suero, y se recoge la sangre cuando el valor es apropiado. El gen que codifica el dAb se puede clonar por RCP en una sola celula, o el/los linfocito(s) B que codifica(n) el dAb puede inmortalizarse por transformacion de VEB, o por fusion a una estirpe celular inmortal. Alternativamente, el anticuerpo de un solo dominio se puede obtener por exposicion en fagos como se describio en la presente memoria anteriormente.
En una realizacion, los anticuerpos de un solo dominio se unen a albumina de suero humano. En una realizacion, los anticuerpos de un solo dominio se unen a albumina de suero humano, albumina de suero murino y albumina de suero de rata.
En una realizacion, el anticuerpo de un solo dominio que se une a albumina de suero es un dAb proporcionado en el documento WO2005/118642 (vease, por ejemplo las figuras 1c y 1d ) o un VHH proporcionado en el documento WO2004/041862 o un nanocuerpo humanizado descrito en, por ejemplo latabla III del documento WO2006/122787.
En una realizacion, un anticuerpo de un solo dominio que se une a albumina de suero humano para su uso en la presente invencion es un anticuerpo de un solo dominio de la cadena pesada VH que comprende al menos uno de una RDC que tiene la secuencia dada en la figura 5 (e) SEQ ID n°: 56 o la figura 5 (k) SEQ ID n°: 62 para RDC-H1, una RDC que tiene la secuencia dada en la figura 5 (f) SEQ ID n°: 57 o la figura 5 (1) SEQ ID n°: 63 para RDC-H2 y una RDC que tiene la secuencia dada en la figura 5 (g) SEQ ID n°: 58 o la figura 5 (m) SEQ ID n°: 64 para RDC-H3.
En otra realizacion, un anticuerpo de un solo dominio que se une a la albumina de suero humano para su uso en la presente invencion es un anticuerpo VH de la cadena pesada, en donde al menos dos de RDC-H1, RDC-H2 y RDC- H3 del dominio VH se seleccionan de las siguientes: la secuencia dada en SEQ ID n°: 56 o SEQ ID n°: 62 para RDC- H1, la secuencia dada en SEQ ID n°: 57 o SEQ ID n°: 63 para RDC-H2 y la secuencia dada en SEQ ID n°: 58 o SEQ ID n°: 64 para RDC-H3. Por ejemplo, el anticuerpo de un solo dominio puede comprender un dominio VH en donde RDC-H1 tiene la secuencia dada en SEQ ID n°: 56 y RDC-H2 tiene la secuencia dada en SEQ ID n°: 57.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Alternativamente, el anticuerpo de un solo dominio puede comprender un dominio VH en donde RDC-H1 tiene la secuencia dada en SEQ ID n°: 56 y RDC-H3 tiene la secuencia dada en SEQ ID n°: 58. Para evitar dudas, se entiende que todas las permutaciones estan incluidas.
En otra realizacion, un anticuerpo de un solo dominio que se une a la albumina de suero humano para su uso en la presente invencion es un anticuerpo de un solo dominio VH de cadena pesada, en donde el dominio VH comprende la secuencia dada en SEQ ID n°: 56 para RDC-H1, la secuencia dada en SEQ ID n°: 57 para RDC-H2 y la secuencia dada en SEQ ID n°: 58 para RDC-H3.
En otra realizacion, un anticuerpo de un solo dominio que se une a la albumina de suero humano para su uso en la presente invencion es un anticuerpo de un solo dominio de cadena pesada VH, en donde el dominio VH comprende la secuencia dada en SEQ ID n°: 62 para RDC-H1, la secuencia dada en SEQ ID n°: 63 para RDC-H2 y la secuencia dada en SEQ ID n°: 64 para RDC-H3.

En una realizacion, un anticuerpo de un solo dominio que se une a la albumina de suero humano para su uso en la

presente invencion es un anticuerpo de un solo dominio de cadena pesada VH humanizado, dAbHI, que tiene la
secuencia dada en la figura 5 (a)(SEQ ID n°: 52). Un ejemplo de una fusion CH1-dAbH1 adecuada que comprende un enlazador G4S se da en la figura 6 (SEQ ID n°: 68).

En una realizacion, el anticuerpo de un solo dominio que se une a la albumina de suero humano para su uso en la

presente invencion es un anticuerpo de un solo dominio de cadena pesada VH humanizado, dAbH2, que tiene la
secuencia dada en la figura 5 c) (SEQ ID n°: 54).
Un ejemplo de una fusion CH1-dAbH2 adecuada que comprende un enlazador G4S se da en la figura 6 (SEQ ID n°: 69).
Los restos en los dominios variables de anticuerpos se numeran convencionalmente segun un sistema ideado por Kabat et al. Este sistema se expone en Kabat et al., 1987, en Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, EE.UU. (en adelante “Kabat et al. (anteriormente)”). Este sistema de numeracion se usa en la presente memoria salvo que se indique lo contrario.
Las denominaciones de los restos de Kabat no siempre se corresponden directamente con la numeracion lineal de los restos de aminoacidos. La secuencia de aminoacidos lineal real puede contener menos o mas aminoacidos que en la numeracion estricta de Kabat correspondiente a un acortamiento de, o insercion en, un componente estructural, ya sea marco o region determinante de complementariedad (RDC), de la estructura basica del dominio variable. La numeracion correcta de Kabat de los restos puede determinarse para un anticuerpo dado por alineacion de los restos de homologfa en la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada de Kabat “patron”.
Las RDC del dominio variable de cadena pesada se encuentran en los restos 31-35 (RDC-H1), restos 50-65 (RDC- H2) y restos 95-102 (RDC-H3) segun el sistema de numeracion de Kabat. Sin embargo, segun Chothia (Chothia, C. y Lesk, A. M. J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987)), el equivalente del bucle a RDC-H1 se extiende desde el resto 26 al resto 32. Por lo tanto 'RDC-H1', como se emplea en esta memoria, comprende los restos 26 a 35, como se describe mediante una combinacion del sistema de numeracion de Kabat y la definicion de bucle topologico de Chothia.
Las RDC del dominio variable de cadena ligera se encuentran en los restos 24-34 (RDC-L1), los restos 50-56 (RDC- L2) y los restos 89-97 (RDC-L3) segun el sistema de numeracion de Kabat.
En una realizacion, un anticuerpo de un solo dominio que se une a la albumina de suero humano para su uso en la presente invencion es un anticuerpo de un solo dominio de cadena ligera VL que comprende al menos uno de una RDC que tiene la secuencia dada en la figura 5 (h) SEQ ID n°: 59 o la figura 5 (n) SEQ ID n°: 65 para RDC-L1, una RDC que tiene la secuencia dada en la figura 5 (i) SEQ ID n°: 60 o la figura 5 (o) SEQ ID n°: 66 para RDC-L2 y una RDC que tiene la secuencia dada en la figura 5 (j) SeQ ID n°: 61 o la figura 5 (p) SeQ ID n°: 67 para RDC-L3.
En otra realizacion, un anticuerpo de un solo dominio que se une a la albumina de suero humano para su uso en la presente invencion es un anticuerpo VL de la cadena ligera, en el que al menos dos de RDC-L1, RDC-L2 y RDC-L3 del dominio VL se seleccionan de las siguientes: la secuencia dada en SEQ ID n°: 59 o SEQ ID n°: 65 para RDC-L1, la secuencia dada en SEQ ID n°: 60 o SEQ ID n°: 66 para RDC-L2 y la secuencia dada en SEQ ID n°: 61 o SEQ ID n°: 67 para RDC-L3. Por ejemplo, el anticuerpo del dominio puede comprender un dominio VL, en donde RDC-L1 tiene la secuencia dada en SEQ ID n°: 59 y RDC-L2 tiene la secuencia dada en SEQ ID n°: 60. Alternativamente, el anticuerpo del dominio puede comprender un dominio VL, en donde RDC-L1 tiene la secuencia dada en SEQ ID n°: 59 y RDC-L3 tiene la secuencia dada en SEQ ID n°: 61. Para evitar dudas, se entiende que todas las permutaciones estan incluidas.
En otra realizacion, un anticuerpo de un solo dominio que se une a la albumina de suero humano para su uso en la presente invencion es un anticuerpo de dominio VL de la cadena ligera, en donde el dominio Vl comprende la secuencia dada en SEQ ID n°: 59 para RDC-L1, la secuencia dada en SEQ ID n°: 60 para RDC-L2 y la secuencia dada en SEQ ID n°: 61 para RDC-L3.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
En otra realizacion, un anticuerpo de un solo dominio que se une a la albumina de suero humano para su uso en la presente invencion es un anticuerpo de dominio VL de la cadena ligera, en donde el dominio Vl comprende la secuencia dada en SEQ ID n°: 65 para RDC-L1, la secuencia dada en SEQ ID n°: 66 para RDC-L2 y la secuencia dada en SEQ ID n°: 67 para RDC-L3.
En una realizacion, un anticuerpo de un solo dominio que se une a la albumina de suero humano para su uso en la presente invencion es un anticuerpo de un solo dominio VL de cadena ligera humanizado, dAbLI, que tiene la secuencia dada en la figura 5 (b) (SEQ ID n°: 53). Un ejemplo tanto de una fusion CH1-dAbL1 adecuada como de una fusion Ck1-dAbL1 que comprende un enlazador G4S se da en la figura 6 (SEQ ID n°: 70 y SEQ ID n°: 72).
En una realizacion, un anticuerpo de un solo dominio que se une a la albumina de suero humano para su uso en la presente invencion es un anticuerpo de un solo dominio VL de cadena ligera humanizado, dAbL2, que tiene la secuencia dada en la figura 5 (d)(SEQ ID n°: 55). Un ejemplo tanto de una fusion CH1-dAbL2 adecuada como de una fusion CK1-dAbL2 que comprende un enlazador G4S se da en la figura 6 (SEQ ID n°: 71 y SEQ ID n°: 73).
En una realizacion donde las cadenas pesadas y ligeras de fragmento Fab o Fab' comprenden cada una un anticuerpo de un solo dominio en el terminal C y los dos anticuerpos de un solo dominio son un par VH/VL complementario que se une al antfgeno cooperativamente como se describio anteriormente en esta memoria, el dAb con VH es dAbHI (SEQ ID n°: 52) y el dAb con VL es dAbLI (SEQ ID n°: 53).
En una realizacion donde las cadenas pesadas y ligeras de fragmento Fab o Fab' comprenden cada una un anticuerpo de un solo dominio en el terminal C los dos anticuerpos de un solo dominio son un par VH/VL complementario que se unen al antfgeno cooperativamente como se describio anteriormente en esta memoria, el dAb con VH es dAbH2 (SEQ ID n°: 54) y el dAb con VL es dAbL2 (SEQ ID n°: 55).
Cuando el anticuerpo o anticuerpos de un solo dominio de la protema de fusion con doble especificidad de la presente invencion se unen a la albumina la afinidad de union del anticuerpo de un solo dominio para la albumina sera suficiente para prolongar la vida media de los fragmentos Fab o Fab' in vivo. Se ha descrito que una afinidad para la albumina de menos de o igual a 2,5 pM de afinidad prolongara la vida media in vivo (Nguyen, A. et al. (2006) Protein Engineering, Design & Selection, 19(7), 291-297). Las moleculas de anticuerpo de un solo dominio de la presente invencion tienen preferiblemente una afinidad de union adecuada para su proposito y el antfgeno al que se unen. En un ejemplo los anticuerpos de un solo dominio tienen una gran afinidad de union, por ejemplo picomolar. En un ejemplo los anticuerpos de un solo dominio tienen una afinidad de union para el antfgeno que es nanomolar o micromolar. La afinidad puede medirse usando cualquier metodo adecuado conocido en la tecnica, como por ejemplo BIAcore como se describe en los ejemplos en este documento usando antfgeno natural o biotecnologico.
Preferiblemente, las moleculas de anticuerpo de un solo dominio de la presente invencion que se unen a albumina tienen una afinidad de union de aproximadamente 2 pM o mejor. En una realizacion, la molecula de anticuerpo de un solo dominio de la presente invencion tiene una afinidad de union de aproximadamente 1 pM o mejor. En una realizacion, la molecula de anticuerpo de un solo dominio de la presente invencion tiene una afinidad de union de aproximadamente 500 nM o mejor. En una realizacion, la molecula de anticuerpo de un solo dominio de la presente invencion tiene una afinidad de union de aproximadamente 200 nM o mejor. En una realizacion, la molecula de anticuerpo de dominio de la presente invencion tiene una afinidad de union de aproximadamente 1 nM o mejor. Se valorara que la afinidad de anticuerpos de un solo dominio proporcionados por la presente invencion y conocidos en la tecnica puede alterarse usando cualquier metodo adecuado conocido en la tecnica. La presente invencion por lo tanto tambien se refiere a variantes de las moleculas de anticuerpo con dominio de la presente invencion, que tienen una afinidad mejorada para la albumina. Dichas variantes pueden obtenerse por una serie de protocolos de maduracion de afinidad incluida la mutacion de las RDC (Yang et al., J. Mol. Biol., 254 392-403, 1995), mezclado de cadenas (Marks et al., Bio/Technology, 10 779-783, 1992), uso de cepas mutantes de E. coli (Low et al., J. Mol. Biol., 250 359-368, 1996), mezclado de ADN (Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), exposicion en fagos (Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996) y RCP sexual (Crameri et al., Nature, 391, 288-291, 1998). Vaughan et al. (anteriormente) expone estos metodos de maduracion de afinidad.
La presente invencion tambien proporciona una secuencia de ADN aislada que codifica una protema de fusion de anticuerpos con doble especificidad de la presente invencion. Las secuencias de ADN de la presente invencion pueden comprender ADN sintetico, por ejemplo producido por tratamiento qmmico, ADNc, ADN genomico o una cualquiera de sus combinaciones.
Las secuencias de ADN que codifican la protema de fusion de anticuerpos con doble especificidad de la presente invencion pueden obtenerse por metodos bien conocidos por los expertos en la tecnica. Por ejemplo, las secuencias de ADN que codifican parte de los fragmentos de anticuerpo o todos ellos, los enlazadores y/o los dAb pueden sintetizarse como se desee a partir de determinadas secuencias de ADN o sobre la base de las secuencias de aminoacidos correspondientes.
Pueden emplearse tecnicas normalizadas de biologfa molecular para preparar secuencias de ADN que codifican la protema de fusion de anticuerpos con doble especificidad de la presente invencion. Secuencias de ADN deseadas pueden sintetizarse completamente o en parte usando tecnicas de smtesis de oligonucleotidos. Pueden usarse
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
segun proceda tecnicas de mutagenia dirigida al sitio y reaccion en cadena de la polimerasa (RCP).
La presente invencion se refiere ademas a un vector de clonacion o de expresion que comprende una o mas secuencias de ADN de la presente invencion. Por consiguiente, se proporciona un vector de clonacion o de expresion que comprende una o mas secuencias de ADN que codifican una protema de fusion de anticuerpo con doble especificidad de la presente invencion. En una realizacion preferida, el vector de clonacion o de expresion comprende una unica secuencia de ADN que codifica la protema de fusion de anticuerpo con doble especificidad. Por lo tanto, el vector de clonacion o de expresion comprende unidades de transcripcion codificadas por ADN en la secuencia de tal manera que se produce una protema de fusion a partir de la traduccion.
Por lo tanto, una fusion a partir de la traduccion puede comprender un Fab o Fab' con terminal N y un dAb con terminal C.
Se valorara que la cadena pesada y la cadena y ligera del Fab o Fab' pueda incorporarse en el mismo o diferentes vectores. En una realizacion un vector puede comprender una fusion a partir de la traduccion que comprende una cadena pesada de Fab o Fab' y un dAb con terminal C y otro vector puede comprender una fusion a partir de traduccion que comprende una cadena ligera de Fab o Fab' y un dAb con terminal C.
Cuando se desea producir una protema de fusion de anticuerpo con doble especificidad con el resto de dAb en el extremo del terminal C del fragmento de anticuerpo, el vector comprendera unidades de transcripcion de ADN en el orden de la secuencia; una unidad de transcripcion de ADN que codifica un fragmento de anticuerpo, opcionalmente una unidad de transcripcion de ADN que codifica una secuencia enlazadora, y una unidad de transcripcion de ADN que codifica un resto dAb con especificidad para una protema serica transportadora, una molecula de inmunoglobulina circulante, o CD35/CR1, por ejemplo, albumina de suero humana. Por lo tanto, una fusion a partir de la traduccion de la invencion puede estar en diferentes configuraciones como, por ejemplo pero sin limitacion, Fab-enlazador-dAb, Fab-dAb, Fab'-dAb, Fab'-enlazador-dAb. Cuando se utilizan dos vectores por ejemplo, el primero puede comprender la cadena pesada de un Fab o Fab' fusionado a un dAb y el segundo puede comprender la cadena ligera de un Fab o Fab' fusionado a un dAb.
El codigo del ADN para un fragmento de anticuerpo comprendido dentro de una fusion a partir de la traduccion de la invencion puede incorporarse en un vector como una unidad de transcripcion en configuraciones como las conocidas por los expertos en la tecnica, por ejemplo una unidad de transcripcion puede comprender el codigo para la cadena ligera seguido del codigo para la cadena pesada, o viceversa; vease, en particular, Humphreys et al., 2002, Protein Expression and Purification, 26:309-320.
Preferiblemente, un vector segun la presente invencion comprende una secuencia principal adecuada, tal como una secuencia principal de anticuerpos. Dichas secuencias principales son bien conocidas en la tecnica.
Los metodos generales por los que los vectores pueden construirse, los metodos de transfeccion y transformacion y los metodos de cultivo son bien conocidos para los expertos en la tecnica. A este respecto, se hace referencia a “Current Protocols in Molecular Biology”, 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, Nueva York, y el Maniatis Manual producido por Cold Spring Harbor Publishing.
Tambien se proporciona una celula anfitriona que comprende uno o mas vectores de clonacion o de expresion que comprenden una o mas secuencias de ADN que codifican una protema de fusion de anticuerpos con doble especificidad de la presente invencion. Cualquier sistema de celulas anfitrionas/vector adecuado puede utilizarse para la expresion de las secuencias de ADN que codifican la protema de fusion de anticuerpo con doble especificidad. Pueden utilizarse sistemas bacterianos, por ejemplo E. coli, y otros microbianos o eucarioticos, por ejemplo de mairnferos, tambien pueden utilizarse sistemas de expresion de celulas anfitrionas. Celulas anfitrionas de marnffero adecuadas incluyen celulas NSO, CHO, de mieloma o de hibridoma. Por consiguiente, en una realizacion, la protema de fusion de la presente invencion se expresa en E. coli. En otra realizacion, la protema de fusion de la presente invencion se expresa en celulas de marnffero.
La presente invencion tambien proporciona un procedimiento para la produccion de una protema de fusion de anticuerpo con doble especificidad que comprende cultivar una celula anfitriona que comprende un vector de la presente invencion en condiciones adecuadas para la expresion de protemas a partir de la secuencia de ADN que codifica dicha protema de fusion de anticuerpo con doble especificidad. La invencion proporciona ademas metodos para aislar la protema de fusion de anticuerpo con doble especificidad.
En la produccion, una protema de fusion de anticuerpo con doble especificidad de la presente invencion puede purificarse, en caso necesario, usando cualquier metodo adecuado conocido en la tecnica. Por ejemplo, pero sin limitacion, se pueden utilizar tecnicas cromatograficas, tales como intercambio ionico, exclusion por tamano, protema G o cromatograffa de interaccion hidrofoba.
El tamano de una protema de fusion de anticuerpo con doble especificidad puede confirmarse por metodos convencionales conocidos en la tecnica tales como cromatograffa por exclusion por tamano y sDS-PAGE no reductora. Dichas tecnicas pueden utilizarse para confirmar que la protema no se ha dimerizado y/o no tiene una parte que falta, p. ej., la parte del dAb. Si se detectan dfmeros entonces la protema de fusion de anticuerpo con
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
doble especificidad monomerica se puede purificar lejos de las especies dimericas utilizando tecnicas de cromatograffa convencionales como se describio anteriormente.
Las protemas de fusion de anticuerpos con doble especificidad de la invencion son utiles en el tratamiento de enfermedades o trastornos como por ejemplo enfermedades y trastornos inflamatorios, enfermedades inmunitarias y trastornos, trastornos fibroticos y canceres.
La terminolog^a “enfermedad inflamatoria” o “trastorno” y “enfermedad o trastorno inmunitario” incluye la artritis reumatoide, la artropatfa psoriasica, la enfermedad de Still, la enfermedad Muckle Wells, psoriasis, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, LED (lupus eritematoso diseminado), asma, rinitis alergica , dermatitis atopica, esclerosis multiple, vasculitis, diabetes mellitus detipo I, trasplante y enfermedad de injerto contra anfitrion.
La expresion “trastorno fibrotico” incluye fibrosis pulmonar idiopatica (FPI), esclerosis generalizada (o esclerodermia), fibrosis renal, nefropatfa diabetica, nefropatfa por IgA, hipertension, enfermedad renal en fase terminal, fibrosis peritoneal (dialisis peritoneal ambulatoria continua), cirrosis hepatica, degeneracion macular debida a la edad (ARMD), retinopatfa, fibrosis reactiva cardfaca, cicatrices, queloides, quemaduras, ulceras de la piel, angioplastia, derivacion coronaria, artroplastia y cirugfa de cataratas.
El termino “cancer” incluye un nuevo crecimiento maligno que surge del epitelio, se encuentra en la piel o, mas frecuentemente, el revestimiento de organos del cuerpo, por ejemplo: mama, ovario, prostata, pulmon, rinon, pancreas, estomago, vejiga o intestinos. Los canceres tienden a infiltrarse en el tejido adyacente y la propagacion (metastasis) a organos distantes, por ejemplo: al hueso, Idgado, pulmon o cerebro.
Por lo tanto, segun un aspecto adicional de la invencion, se proporciona una composicion farmaceutica que comprende una fusion de anticuerpo de la invencion junto con uno o mas vehmulos, excipientes o diluyentes farmaceuticamente aceptables. Tambien se proporciona el empleo de una protema de fusion de anticuerpo de la invencion para la fabricacion de un medicamento destinado al tratamiento de una enfermedad o trastorno. Mas preferiblemente, la enfermedad o trastorno es una enfermedad o trastorno inflamatorio.
Las composiciones farmaceuticas segun la invencion pueden tomar una forma adecuada para administracion oral, bucal, parenteral, subcutanea, nasal, topica, oftalmica o rectal, o una forma adecuada para administracion por inhalacion o insuflado.
Cuando proceda, por ejemplo si el anticuerpo o anticuerpos de un solo dominio de la protema de fusion de anticuerpo se unen a la albumina, puede ser deseable preformular la protema de fusion con doble especificidad con albumina de suero humana o biotecnologica, empleando cualquier metodo adecuado conocido en la tecnica.
Para administracion oral, las composiciones farmaceuticas pueden tomar la forma de, por ejemplo, comprimidos, pastillas o capsulas preparadas por medios convencionales con excipientes farmaceuticamente aceptables tales como agentes aglutinantes (p. ej. almidon de mafz pregelatinizado, polividona o hidroxipropilmetil-celulosa); cargas (p. ej. lactosa, celulosa microcristalina o fosfato acido de calcio); lubricantes (p. ej. estearato de magnesio, talco o sflice); disgregantes (p. ej. almidon de patata o glicolato de sodio); o agentes humectantes (p. ej. laurilsulfato de sodio). Los comprimidos pueden recubrirse por metodos bien conocidos en la tecnica. Las preparaciones lfquidas para administracion oral pueden tomar la forma de, por ejemplo, soluciones, jarabes o suspensiones, o pueden presentarse como un producto anhidro para constitucion con agua u otro vehmulo adecuado antes del uso. Dichos preparados lfquidos pueden prepararse por medios convencionales con aditivos farmaceuticamente aceptables tales como agentes de suspension, agentes emulsionantes, vehmulos no acuosos o conservantes. Los preparados tambien pueden contener sales tampon, agentes aromatizantes, agentes colorantes o agentes edulcorantes, segun proceda.
Los preparados para administracion oral pueden formularse adecuadamente para proporcionar liberacion controlada del compuesto activo.
Para administracion bucal, las composiciones pueden tomar la forma de comprimidos o pastillas formulados de manera convencional.
Los anticuerpos biespedficos de la invencion pueden formularse para administracion parenteral por inyeccion, p. ej. por inyeccion rapida a emboladas o infusion. Las formulaciones para inyectables pueden presentarse en forma farmaceutica unitaria, p. ej. en ampollas de vidrio o recipientes de multiples dosis, p. ej. viales de vidrio. Las composiciones para inyectables pueden tomar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehmulos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulacion tales como agentes de suspension, estabilizantes, conservantes y/o dispersantes. Alternativamente, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para redisolucion con un vehmulo adecuado, p. ej. agua esteril exenta de pirogenos, antes de su uso.
Ademas de las formulaciones descritas anteriormente, los anticuerpos biespedficos de la invencion tambien se pueden formular como un medicamento de absorcion lenta. Dichas formulaciones de accion prolongada pueden administrarse por implantacion o por inyeccion intramuscular.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Para administracion nasal o administracion por inhalacion, los compuestos segun la presente invencion pueden suministrarse convenientemente en forma de una presentacion de pulverizacion en aerosol para envases presurizados o un nebulizador, con utilizacion de un gas propulsor adecuado, por ejemplo diclorodifluorometano, fluorotriclorometano, diclorotetrafluoroetano, dioxido de carbono u otro gas o mezcla de gases adecuados.
Las composiciones pueden presentarse, si se desea, en un envase o dispositivo dispensador que puede contener una o mas formas de dosificacion unitarias que contienen el ingrediente activo. El envase o dispositivo dispensador pueden ir acompanados de instrucciones para la administradon.
Para administradon topica los compuestos segun la presente invencion pueden formularse convenientemente en una pomada adecuada que contiene el componente activo en suspension o disuelto en uno o mas excipientes farmaceuticamente aceptables. Determinados excipientes incluyen, por ejemplo, aceite mineral, vaselina lfquida, propilenglicol, polioxietileno, polioxipropileno, cera emulsionante y agua. Alternativamente, los compuestos segun la presente invencion se pueden formular en una locion adecuada que contiene el componente activo en suspension o disuelto en uno o mas excipientes farmaceuticamente aceptables. Determinados excipientes incluyen, por ejemplo, aceite mineral, monoestearato de sorbitan, polisorbato 60, cera de esteres de cetilo, alcohol ceteanlico, alcohol bendlico, 2-octildodecanol y agua.
Para administracion oftalmica los compuestos segun la presente invencion pueden formularse convenientemente como suspensiones microionizadas en solucion salina esteril isotonica con pH ajustado, ya sea con o sin un conservante tal como un agente bactericida o fungicida, por ejemplo nitrato fenilmercurico, cloruro de benzalconio o acetato de clorhexidina. Alternativamente, para administracion oftalmica los compuestos pueden formularse en una pomada tal como vaselina.
Para administracion rectal los compuestos segun la presente invencion pueden formularse convenientemente como supositorios. Estos pueden prepararse mezclando el componente activo con un excipiente no irritante adecuado que es solido a temperatura ambiente pero lfquido a temperatura rectal y por lo tanto se fundiran en el recto para liberar el componente activo. Dichos materiales incluyen, por ejemplo, manteca de cacao, cera de abejas y polietilenglicoles.
La cantidad de un compuesto de la invencion requerida para la profilaxis o el tratamiento de una afeccion determinada variara dependiendo del compuesto elegido y del estado del paciente a tratar. En general, sin embargo, las dosis diarias pueden oscilar desde aproximadamente 10 ng/kg a 1.000 mg/kg, por lo general de 100 ng/kg a 100 mg/kg, p. ej., alrededor de 0,01 mg/kg a 40 mg/kg de peso corporal para administracion oral o bucal, de alrededor de 10 ng/kg a 50 mg/kg peso corporal para administracion parenteral, y desde alrededor de 0,05 mg a alrededor
de 1.000 mg, p. ej. de alrededor de 0,5 mg a alrededor de 1.000 mg, para administracion nasal o administracion por inhalacion o insuflado.
Las caractensticas preferidas de cada realizacion de la invencion son como para cada una de las demas realizaciones haciendo los cambios necesarios.
La invencion se describira ahora con referencia a los siguientes ejemplos, que son meramente ilustrativos y no debenan de ninguna manera considerarse restrictivos del alcance de la presente invencion.
Listado de figuras
Figura 1: Representacion esquematica de los Fab-dAb en donde el dAb se encuentra en el terminal C Figura 2: Representacion esquematica de los Fab didAb
Figura 3. Analisis por SDS PAGE de FabA-dAbL3 (CK-SG4SE) (1) y FabA-dAbL3 (CK-G[APAPA]2) (2).
Figura 4: Analisis de transferencia Western de FabA-dAbL3 (CK-SG4SE) (1) y FabA-dAbL3 (CK-G[APAPA]2) (2). Figura 4a : SDS PAGE de los FabB-didAb
Banda M = marcadores de SeeBlue Bandas 1 y 2 = IgG de referencia Banda 3 = FabB
Banda 4 = FabB-didAb, -dAbL1 (CK-G4Sx2) y dAbH1 (CH1-G4Sx2)
Banda 5 = FabB-didAb, -dAbL2 (CK-G4Sx2) y dAbH2 (CH1-G4Sx2)
Figura 5: Secuencias de anticuerpos de dominio dAbH1, dAbH2, dAbL1 y dAbL2 y las RDC procedentes de cada uno de esos anticuerpos.
Figura 6: Montajes FabB-dAb que comprenden dominio variable FabB de cadena pesada o ligera fusionado a un
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
anticuerpo de dominio.
Figura 7: Secuencias de cadena pesada y ligera de Fab'A y secuencia de la cadena pesada de FabA.
Ejemplos
Ejemplo 1. Produccion de un dAb espedfico para albumina de suero humano
Se produjo una unidad de transcripcion codificada por ADN en el marco que codifica un dAb con especificidad para albumina de suero humano utilizando ingeniena genetica.
Cuando se desee una unidad de transcripcion codificada por ADN en el marco que codifica un dAb con especificidad para una protema de seleccion puede producirse utilizando ingeniena genetica.
Ejemplo 2. Produccion de fragmentos de anticuerpos
Para la fusion de un dAb al terminal C de la cadena ligera, se sintetizo ADN que codifica una region constante de cadena ligera kappa humana (con el alotipo Km3 de la region constante kappa), un enlazador peptfdico y un dAb y se clono como un fragmento de restriccion SacI- PvuII en el vector de expresion pTTOD (Fab) de la propia empresa UCB-Celltech (derivado de pTTO-1, descrito en Popplewell et al., Methods Mol. Biol. 2005; 308:17-30), que contiene ADN que codifica la region constante gamma-1 CH1 humana. Esto dio lugar a una disposicion dicistronica de gen que consiste en que el gen para la cadena ligera humanizada se fusiona mediante un enlazador a un dAb seguido del gen para el fragmento Fab de cadena pesada humanizada, ambos bajo el control del activador tac. Tambien esta codificado una zona BspEI unica aguas arriba del enlazador Gly4Ser, o una zona AscI aguas arriba del enlazador rico en Ala-Pro.
Para la fusion de un dAb al terminal C de la cadena pesada, se sintetizo ADN que codifica un fragmento CH1 humano (del isotipo y1) seguido de una secuencia codificadora del enlazador y un dAb. Esto se sublclono como un fragmento de restriccion Apal-EcoRI en el vector de expresion pTTOD (Fab) de la propia empresa UCB-Celltech (un derivado de pTTO-1, descrito en Popplewell et al., anteriormente), que contiene ADN que codifica la region constante gamma-1 CH1 humana. Esto dio lugar a una disposicion dicistronica del gen que consiste en el gen de la cadena ligera humanizada una secuencia intergenica no codificante y seguido de una cadena pesada fusionada mediante un enlazador a un dAb, ambos bajo el control del activador tac. El plasmido de expresion recombinada se transformo en la cepa W3110 de E. coli en la que la expresion se produce por adicion de IPTG. Se realizaron experimentos de expresion a pequena escala inicialmente (volumenes de cultivo de 5 ml) con adicion de IPTG 200 |jM a una D.O. (600 nm) de aprox. 0,5, se recogieron las celulas 2 horas despues de la induccion y se extrajeron durante la noche a 30°C en Tris/EDTA. Los extractos clarificados se utilizaron para analisis de afinidad por Biacore. Para fermentacion se seleccionaron montajes que dan rendimientos de expresion y actividades prometedores.
Metodos
En los siguientes ejemplos se indica la cadena de anticuerpos a la que se fusiona el dAb ya sea como CK o LC para la cadena ligera cKappa y como CH1 o HC para el dominio constante de cadena pesada, CH1.
Construccion de plasmidos de fusion FabA-dAb para la expresion en E. coli
Se construyeron protemas de fusion Fab-dAb fusionando dAbL3 o dAbH4 al terminal C de la region constante de la cadena ligera o pesada de FabA. Se utilizo un enlazador flexible (SGGGGSE (SEQ ID n°: 1)) o ngido (G(APAPA)2 (SEQ ID n°: 34)) para enlazar el dAb a la region cKappa (SEQ ID n°: 75), mientras que el enlazador DKTHTS (SeQ ID n°: 2) se utilizo para enlazar el dAb a la region cHi (SEQ ID n°: 76). La secuencia de ADN que codifica la fusion region constante-dAb se preparo por smtesis como fragmentos que permiten la subclonacion en la secuencia FabA del vector pTTOD de la propia empresa.
Se construyeron fusiones cadena ligera-dAb subclonando el fragmento Sacl-^pal de los genes sintetizados, que codifica una cKappa en el terminal C fusionada a dAbL3 o dAbH4 mediante un enlazador flexible (SGGGGSE (SEQ ID n°: 1)) o ngido (G(APAPA)2 (SEQ ID n°: 34)), en las zonas correspondientes de un plasmido capaz de expresar FabA. Pesados fusiones de cadena-dAb se construyeron por sub-clonacion del fragmento Apal-EcoRI de los genes sintetizados, que codifica un CHI terminal C fusionada a cualquiera dAbL3 o dAbH4 traves de un enlazador DKTHTS, en los sitios correspondientes de un plasmido capaz de expresar FabA.
Fab'A procede de un anticuerpo que se une a IL-1 beta, las secuencias de la cadena pesada y ligera las cuales se proporcionan en las SEQ ID n°: 74 y n° 75 respectivamente como se muestra en la figura 7. En Fab'A donde la cadena ligera tiene un dAb unido, la bisagra de la cadena pesada se altero a DKTHTS incluso cuando ningun dAb esta unido a la cadena pesada (SEQ ID n°: 76).
FabA comprende la misma secuencia de cadena ligera (SEQ ID n°: 75) y una secuencia de cadena pesada truncada que termina en la cistema entre cadenas (SEQ ID n°: 77). dAbL3 y dAbH4 son anticuerpos con dominio de cadena ligera y pesada, respectivamente, que se unen a albumina de suero humano.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Construccion de plasmidos de fusion FabA-didAb para la expresion en E. coli
Se construyeron FabA-didAb con dAbL3 o dAbH4 tanto en las cadenas ligeras como pesadas subclonando el fragmento Apal-EcoRI que codifica las fusiones CH1-dAb en los plasmidos Fab-dAb existentes donde el dAb se fusiona a la cadena ligera mediante el enlazador flexible.
Construccion de plasmidos de fusion FabB-dAb para la expresion en celulas de mairnfero
Los FabB-dAb, FabB-dAbH1 (CH1-G4Sx2), FabB-dAbH2 (CH1-G4Sx2), FabB-dAbL1 (CH1-G4Sx2), FabB-dAbL2 (CH1-G4Sx2) se ensamblaron todos por RCP, a continuacion se clonaron en un vector de expresion de mamffero bajo el control del activador HCMV-MIE y la secuencia SV40E poliA. Estos se emparejaron con un vector similar que contema la cadena ligera de FabB para la expresion en celulas de mamffero (vease a continuacion). FabB procede de un anticuerpo que se une a una molecula coestimuladora de la superficie celular. dAbHI, dAbH2, dAbLI y dAbL2 se obtuvieron como se describe en el ejemplo 3.
Construccion de plasmidos de fusion FabB-dAb para expresion en celulas de mamffero
Los FabB-dAb, FabB-dAbH1 (CH1-G4Sx2), FabB-dAbH2 (CH1-G4Sx2), FabB-dAbL1 (CK-G4Sx2), FabB-dAbL2 (CK- G4Sx2) se ensamblaron todos por RCP, a continuacion se clonaron en un vector de expresion de mamffero bajo el control del activador HCMV-MlE y la secuencia SV40E poliA.
Expresion en mamfferos de FabB-dAb y didAb
Se transfectaron celulas HEK293 con los plasmidos de cadena pesada y ligera utilizando reactivo de transfeccion 293fectin de Invitrogen segun las instrucciones del fabricante. En resumen, se incubaron 2 |jg de plasmido de cadena pesada + 2 jg del plasmido de cadena ligera con 10 ul de 293fectin + 340 jl de medio Optimem durante 20 minutos a t. a. La mezcla se anadio a continuacion a 5*10° celulas HEK293 en suspension y se incubo durante 4 dfas con agitacion a 37°C.
Biacore
Las afinidades y los parametros cineticos para las interacciones de los montajes Fab-dAb de union se determinaron por resonancia de plasmones superficiales (SPR) llevada a cabo en un Biacore T100 empleando chips detectores CM5 y tampon corriente HBS-EP (HEPES 10 mM (pH 7,4), NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, 0,05% v/v de tensioactivo P20). Se capturaron muestras de Fab-dAb para la superficie del chip detector utilizando un Fab de cabra espedfico para F(ab')2 humano (Jackson ImmunoResearch, 109-006-097) o un anticuerpo monoclonal CH1 antihumano generado en la propia empresa. La inmovilizacion covalente del anticuerpo de captura se consiguio mediante la qmmica de acoplamiento de aminas convencional.
Cada ciclo de ensayo consistio en capturar en primer lugar el Fab-dAb empleando una inyeccion de 1 min, antes de una fase de asociacion consistente en una inyeccion de 3 min de antfgeno, despues de lo cual se hizo el seguimiento de la disociacion durante 5 min. Despues de cada ciclo, la superficie de captura se regenero con 2 inyecciones de 1 min de HCl 40 mM seguido por 30 s de NaOH 5 mM. Los caudales utilizados fueron 10 jl/min para la captura, 30 jl/min para las fases de asociacion y disociacion y 10 jl/min para la regeneracion.
Para los ensayos cineticos, se llevo a cabo una valoracion de antfgenos (para albumina de suero humano normalmente 62,5 nM-2 jM, para IL-1p 1,25-40 nM), se uso una celda de flujo con el blanco para la sustraccion de referencia y se incluyeron inyecciones de tampon-blanco para sustraer el ruido y la desviacion del instrumento.
Se determinaron parametros cineticos por ajuste global simultaneo de los sensogramas resultantes a un modelo de union 1:1 patron usando el programa informatico T100 Evaluacion de Biacore. Con el fin de probar la union simultanea, se inyectaron inyecciones de 3 min por separado de HSA 5 jM, IL-1p 100 nM o una solucion mixta de HSA 5 jM e IL-1p 100 nM sobre el Fab-dAb capturado.
Purificacion de Fab-dAb de E. coli
Extraccion periplasmica
Sedimentos celulares de E. coli que contienen los Fab-dAb en el periplasma se volvieron a poner en suspension en un volumen de cultivo original con Tris/HCl 100 mM, EDTA 10 mM pH 7,4. Estas suspensiones se incubaron a continuacion a 4°C durante 16 horas a 250 rpm. Los sedimentos celulares en suspension se centrifugaron a 10.000 x g durante 1 hora a 4°C. Los sobrenadantes se retiraron y filtraron a 0,45 jm.
Captura de protema G
Se capturaron los Fab-dAb del sobrenadante filtrado por cromatograffa de protema G. En resumen, se aplicaron los sobrenadantes, con un tiempo de residencia de 20 minutos, a una columna GammaBind Plus Sepharose (GE Healthcare) equilibrada en fosfato 20 mM, NaCl 150 mM pH 7,1. La columna se lavo con fosfato 20 mM, NaCl 150 mM pH 7,1 y el material ligado se eluyo con glicina 0,1 M/HCl pH 2,8. Se recogio el pico de elucion y se ajusto el pH
5
10
15
20
25
30
35
40
45
a ~pH5 con acetato de sodio 1M. Las eluciones con pH ajustado se concentraron y se diafiltraron en pH 4,5 de acetato de sodio 50 mM usando una membrana 10 k MWCO.
Intercambio ionico
Se purificaron mas los Fab dAb por cromatograffa de intercambio cationico a pH 4,5 con un gradiente de elucion de NaCl. En resumen, los eluidos de Protein-G diafiltrados se aplicaron a una columna Source15S (GE Healthcare) equilibrada en acetato de sodio 50 mM pH 4,5. La columna se lavo con acetato de sodio 50 mM pH 4,5 y el material ligado se eluyo con un gradiente lineal de 20 volumenes de columna desde 0 a 1 M de NaCl en acetato de sodio 50 mM pH 4,5.Las terceras fracciones de volumen de columna se recogieron en todo el gradiente. Las fracciones se analizaron por A280 y SDS-PAGE y se agruparon las fracciones relevantes.
Filtracion en gel
Si es necesario los Fab dAb se purificaron mas por filtracion en gel. En resumen, las fracciones reunidas de la elucion de intercambio ionico FabA-dAbL3 (CK-SG4SE) se aplicaron a una columna Superdex200 (GE Healthcare) equilibrada en acetato de sodio 50 mM, NaCl 125 mM pH 5,0 y se eluyo con un gradiente isocratico de acetato de sodio 50 mM, NaCl 125 mM pH 5,0. Se recogieron fracciones de 1/120 del volumen de la columna en todo el gradiente. Las fracciones se analizaron por A280 y SDS-PAGE y se agruparon las fracciones relevantes. Para las Fab-dAb que no se sometieron a filtracion en gel, las fracciones de elucion de intercambio ionico reunidas se concentraron y se diafiltraron en acetato de sodio 50 mM, NaCl 125 mM pH 5,0 usando una membrana 10 k MWCO.
SDS-PAGE
Las muestras se diluyeron con agua cuando era necesario y a continuacion a 10 pl se anadieron 2 veces 10 pl de muestra de tampon corriente. Para las muestras no reducidas, se anadieron 2 pl de NEM 100 mM en este momento, para muestras reducidas se anadieron 10 veces 2 pl de agente reductor. La muestra se agito intensamente, se incubo a 85°C durante 5 minutos, se enfrio y se centrifugo a 12.500 rpm durante 30 segundos. Las muestras preparadas se cargaron en un gel de 4-20% de acrilamina Tris/Glicina SDS y se ejecutaron durante 100 min a 125 V. Los geles se transfirieron a membranas de PVDF para inmunotransferencia Western o se tineron con tinte de protemas azul de Coomassie.
Inmunotransferencia Western
Los geles se transfirieron a membranas de PVDF en Tris 12 mM, glicina 96 mM pH 8,3 durante 16 horas a 150 mA. La membrana de PVDF se bloqueo durante 1 hora con 2% de Marvel™ en PBS + 0,1% de Tween 20 (tampon de bloqueo).
Anti-cadena ligera
Anti-cadenas ligeras kappa humanas en HRP-conejo, dilucion 1/5.000 en tampon de bloqueo durante 1 h. Anti-cadena pesada
Anti-cadena pesada humana en raton, dilucion 1/7.000 en tampon de bloqueo durante 1 h. Seguido de anti-raton en HRP-cabra, dilucion 1/2.000 en tampon de bloqueo durante 1 h.
Etiqueta anti-His
anti-His6 de conejo, dilucion 1/1000 en tampon de bloqueo durante 1 h. Seguido de anti-IgG de conejo en HRP- cabra, dilucion 1/1.000 en tampon de bloqueo durante 1 h.
Todas las transferencias se lavaron 6 veces con 100 ml de PBS + 0,1% de Tween20 durante 10 minutos por lavado. Las transferencias se revelaron con reactivo ECL durante 1 min antes de exponer a Amersham Hyperfilm, o reactivo DAB mejorado con metal durante 20-30 minutos, seguido de agua.
HPLC en fase inversa a alta temperatura
Se analizaron muestras (2 g) en una columna C8 Poroshell de 2,1 mm a 80°C, con un caudal de 2 ml/min y un gradiente de 18-38% de B durante 4 minutos.
A = 0,1% de TFA en H2O
B = 0,065% de TFA en 80:20 IPA:MeOH
La deteccion es por absorcion a 214 nm.
ELISA
Los rendimientos de Fab-dAb se midieron usando un ELISA de tipo sandwich. En resumen, el Fab-dAb se capturo
con un anticuerpo anti-CH1, a continuacion se revelo con un anti-kappa-HRP.
Ejemplo 3
Generacion de anticuerpos anti-albumina
A conejos lop se inmunizaron con albumina de suero humano chromapure biotecnologica (adquirida en Jackson). 5 Los conejos recibieron 3 inmunizaciones de 100 |jg de protema HSA por via subcutanea, la primera inmunizacion en adyuvante completo de Freund y las inmunizaciones siguientes en adyuvante incomplete de Freund. Se aislaron los anticuerpos 1 y 2 que se unen a albumina de suero humano, de raton y de rata utilizando los metodos descritos en el documento WO04/051268. Los genes para el dominio variable de cadena pesada (VH) y el dominio variable de cadena ligera (VL) de los anticuerpos 1 y 2 se aislaron y secuenciaron despues de la clonacion por RCP de 10 transcripcion inversa.
Las secuencias de cadena ligera injertadas se subclonaron en el vector de expresion pVRbcK de la cadena ligera de conejo que contiene el ADN que codifica la region constante C-Kappa de conejo. Las secuencias de cadena pesada injertadas se subclonaron en el vector de expresion pVRbHFab de la cadena pesada de conejo, que contiene el ADN que codifica la region constante de la cadena pesada de Fab' de conejo. Los plasmidos se cotransfectaron en 15 celulas CHO y los anticuerpos producidos se seleccionaron para union y afinidad a la albumina (Tabla 1). Se realizaron transfecciones de celulas CHO empleando el procedimiento de Lipofectamine™ 2000 segun las instrucciones del fabricante (Invitrogen, n° de Catalogo 11668).
Generacion de anticuerpos con dominio humanizado dAbL1, dAbH1, dAbL2 y dAbH2
Se disenaron regiones VL y VH humanizadas utilizando marcos aceptores de la region V humana y restos del 20 donante en las regiones del marco. Una region VL injertada (L1 (SEQ ID n°: 53) y L2 (SEQ ID n°: 55)) y una region VH (H1 (SEC ID n°: 52) y H2 (SEQ ID n°: 54)) se disenaron para cada uno de los anticuerpos 1 y 2 y los genes se construyeron por ensamblaje de oligonucleotidos y mutagenia por RCP. Los anticuerpos con dominios injertados y sus RDC se muestran en la figura 5.
Tabla A: Afinidades de anticuerpos anti-albumina
como Fab de conejo como IgG humanizada
SA humana nM SA murina nM SA humana nM
Anticuerpo 1
0,31 2,6 0,82
Anticuerpo 2
0,33 12 0,13
25
Ejemplo 4: Analisis de FabB-dAb expresados en celulas de mairnfero
Se produjeron montajes de FabB-dAb como se describe en los metodos y los sobrenadantes de las celulas HEK293 transfectadas que contienen los FabB-dAb se analizaron directamente en BIAcore.
Se realizo un analisis cinetico para evaluar la interaccion de HSA con los montajes de FabB-dAb. Estos consistieron 30 en dAbL1, dAbH2 o dAbL3 fusionado al terminal C de CH1 de FabB (vease la figura 6). El FabB-dAbL1 tiene una mayor afinidad por HSA, Kd = 170 nM, que FabB-dAbL3, Kd = 392 nM. Se demostro que FabB-dAbH2 posee la
menor afinidad hacia HSA, Kd = 1.074 nM, Tabla B Montaje
vease la Tabla B. ka (x104M'1s'1) kd (x 10,3 s'1) kD (x10-9 M)
FabB-dAbL1 (CH1-G4Sx2)
1,91 ± 0,74 2,18 ± 1,21 170 ± 78
FabB-dAbH2 (CH1-G4Sx2)
2,66 ± 0,39 29 ±4,76 1074± 42
FabB-dAbL3 (CH1-G4Sx2)
2,63 ± 0,39 9,87 ± 1,63 392 ± 119
La afinidad y los parametros cineticos se determino para la union de HSA a los FabBs fusionados a dAbL1, dAbH2 o 35 dAbL3. Los datos mostrados son los valores medios ± SEM. (Para FabB-dAbL1 y FabB-dAbH2 n = 4. Para FabB- dAbL3 n = 2).
5
10
15
20
25
30
SDS-PAGE y la inmunotransferencia Western de las protemas FabB-dAb confirmaron que los FABB-dAb producidos eran del tamano esperado.
Ejemplo 5: Analisis de los FabB-didAb expresados en celulas de mairnfero
Se produjeron montajes de FabB-didAb como se describe en los metodos y los sobrenadantes de las celulas HEK293 transfectadas que contienen los didAb se analizaron directamente en BIAcore.
Se realizo un analisis mas utilizando montajes de didAb en el que dAb unicos se fusionaron a terminales C de Fab tanto de cadena pesada como de cadena ligera. Los montajes en los que el didAb procedfa de un emparejamiento de dominio variable pesado y ligero natural presentaban una notable mejora en la afinidad en comparacion con el unico dAb solo (tabla B y C). La fusion didAb que consta de dos dAbLIs identicos no presentaba ninguna mejora en la afinidad sobre la que se observa para el unico dAbLI (datos no mostrados).
Tabla C
Montaje
4 -1 -1 ka (*10 M s ) -3 -1 k d(x10 s ) -9 k d(x10 '
FabB-didAb, -dAbLI (CK-G4Sx2) y dAbHI (CH1-G4Sx2)
1,78 0,16 9
FabB-didAb, -dAbL2 (CK-G4Sx2) y dAbH2 (CH1-G4Sx2)
0,54 0,21 39
Se determino la afinidad y los parametros cineticos para la union de HSA a los FabB fusionados tanto a dAbLI y dAbHI como a dAbL2 y dAbH2.
SDS-PAGE de las protemas FabB-didAb confirmo que los FabB-didAb expresaban bien y eran del tamano esperado (vease la figura 4a). Observese que este gel de SDS PAGE es la protema completa expresada por la celula.
Ejemplo 6
Analisis de FabA-dAb purificados
Los plasmidos para la expresion de los Fab-dAb, Fab'A-dAbL3 (CK-SG4SE) Fab'A-dAbL3 (CK-G [APAPA]2) en E. coli, se construyeron como se describe en los procedimientos. Los Fab-dAb se expresaron en el periplasma de la E. coli y se purificaron hasta homogeneidad como se describe en los procedimientos. La pureza de los Fab-dAb se evaluo por de HPLC en fase inversa a alta temperatura, SDS-PAGE e inmunotransferencia Western. Tambien se evaluo la union al antfgeno en los Fab dAb por Biacore.
HPLC en fase inversa a alta temperatura
La HPLC en fase inversa a alta temperatura se realizo como se describe en los metodos de analisis cuantitativo de todas las especies contenidas en FabA-dAbL3 (CK-SG4SE) y FabA-dAbL3 (CK-G[APAPA]2). El porcentaje de cada una de las especies presentes se muestra en la Tabla D.
Tabla D. Cuantificacion de las especies presentes en lotes de Fab-dAb
Especie
Fab'A-dAbL3 (CK-SG4SE) Fab'A-dAbL3 (CK-G[APAPA]2)
1
0,6% 1,8%
2
0,6% 0,0%
3
1,0% 0,3%
4
0,9% 0,8%
Fab-dAb
85,5% 92,9%
Di Fab-dAb
11,5% 4,2%
SDS-PAGE
Se prepararon muestras de Fab-dAb en condiciones no reducidas y reducidas y se introdujeron en un gel como se describe en los procedimientos. El gel estaba tenido con Coomassie. Las caractensticas del bandeo cromosomico de ambas muestras de Fab-Dab, Fab'A-dAbL3 (CK-SG4SE) y Fab'A-dAbL3 (CK-G[APAPA]2), corresponden bien con 5 el perfil observado por la HPLC en fase inversa a alta temperatura (figura 3).
Inmunotransferencia Western
Las muestras de Fab-dAb se sometieron a SDS-PAGE no reducida seguida de analisis de inmunotransferencia Western con anticuerpos de anti-cadena ligera y de anti-cadena pesada como se describe en los procedimientos. Esto confirmo que el dAb estaba en la cadena ligera del Fab y que la cadena pesada estaba inalterada en ambas 10 muestras (figura 4). Tambien demuestra que todas las bandas detectadas por SDS PAGE no reducida, tenidas con Coomassie, son productos relacionados con Fab-dAb.
Biacore
Se utilizo analisis cinetico por SPR como se describe en los procedimientos para evaluar la union de la albumina de suero humano a Fab'A-dAbL3 (CK-SG4SE) y Fab'A-dAbL3 (CK-G[APApA]2). Los resultados de la Tabla E 15 demuestran que ambos montajes son capaces de unir albumina de suero humano con una afinidad similar (Kd) de
aproximadamente 1 pM.
Tabla E
Montaje
ka (*104M'V1) kd (*10'V) kD (x10-9M)
Fab'A-dAbL3 (CK-SG4SE)
3,44 1,42 411
Fab'A-dAbL3 (CK-G[APAPA]2)
9,61 2,85 296
El analisis cinetico adicional demostro que todos los montajes de fusion conservaban las caractensticas de 20 interaccion del FabA original hacia IL-1p, tabla F, con solo diferencias menores observadas en los parametros
cineticos y de afinidad. Tabla F Montaje
ka (*10bM'V) kd (*10V) kD (x10'12M)
Fab'A-dAbL3 (CK-SG4SE)
1,90 4,21 221
Fab'A-dAbL3 (CK-G[APAPA]2)
2,17 3,99 184
Fab'A
2,02 6,46 320
El potencial de cada montaje para unirse simultaneamente tanto a la albumina de suero humano como al antfgeno 25 de IL-1p se evaluo capturando cada montaje a la superficie del chip detector, antes de realizar cualquiera de las
inyecciones de 3 min por separado de 5 pM de albumina de suero humano o IL-1p 100 nM, o una solucion mixta tanto de albumina de suero humano 5 pM como de IL-1p 100 nM. Para cada montaje de Fab-dAb la respuesta observada para la solucion de HSA/IL-1p combinada era casi identica a la suma de las respuestas de las inyecciones independientes, vease la tabla G. Esto demuestra que los Fab dAb son capaces de la union simultanea 30 tanto a IL-1p como a la albumina de suero humano, y que la union de IL-1p o albumina de suero humano no inhibe
la interaccion de la otra. El FabA original se une solo a IL-1p, con union insignificante a la albumina de suero humano.
TablaG
Montaje
Analito Union (RU)
Fab'A-dAbL3 (CK-SG4SE)
HSA + IL-1 p 37,6
HSA 13,2 (37,9)
IL-1p 24,7
Fab'A-dAbL3 (CK-G[APAPA]2)
HSA + IL-1 p 61,9
HSA 30,7 (63,6)
IL-1p 32,9
Fab'A
HSA + IL-1 p 30,3
HSA 1,3 (30,0)
IL-1p 28,7
La tabla anterior muestra la respuesta de la union (RU) vista para cada montaje despues de inyecciones por separado de HSA o IL-1p, o la inyeccion de HSA e IL-1p premezclada. En cada caso la concentracion final fue de 5 5 |jM para HSA y 100 nM para IL-1 p. La suma de las respuestas individuals de HSA e IL-1 se muestra entre parentesis.
Ejemplo 7: FabAdidAb
Expresion de los FabA-didAb en E. coli
Las fusiones FabA-dAbs y FabA-didAb que terminan con una etiqueta His6 en el terminal C se expresaron en 10 Escherichia coli. Tras la extraccion periplasmica, las protemas de fusion de dAb se purificaron por la etiqueta His6 en
el terminal C. La expresion de Fab se analizo por inmunotransferencia Western de un gel no reducido con anticuerpos anti-CH1 y anti-cKappa. FabA-dAb y FabA-didAb se expresaron como protemas completas y se demostro que reaccionan con ambos reactivos de deteccion de anticuerpos.
Analisis de los FabA-didAb expresados en E. coli
15 Se realizo un analisis mas para caracterizar la union de HSA a montajes de FabA al que se fusionaron uno o mas dAb. Los ensayos de union se llevaron a cabo en una variedad de montajes en los que dAbL3 o dAbH4 se fusionaron a la cadena ligera o pesada del FabA (para detalles de los montajes y resumen de los datos de union vease la Tabla 8). Aunque las montajes que llevan solamente dAbH4, ya sea en la cadena ligera o pesada, se observo que unen HSA comparativamente con poca afinidad (“ 9 jM y 3 jM, respectivamente), se observo union 20 de mayor afinidad para los montajes que llevan dAbL3, ya sea como una unica fusion (en la cadena ligera o pesada) o asociada con un segundo dAb (dAbL3 o dAbH4) en la cadena opuesta.
Tabla H
Montaje ka (*104M'V) kd (x10'V) kD (x10'9M)
FabA nu

FabA-dAbL3 (LC-SG4SE) 4,46 16,2 363

FabA-dAbH4 (LC-SG4SE) 9.142

FabA-dAbL3 (HC-DKTHTS) 8,24 15,4 187

FabA-dAbH4 (HC-DKTHTS) 2.866

FabA-didAb,-dAbL3 (LC-SG4SE) y-dAbL3 (HC-DKTHTS) 3,00 15,1 502
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Montaje
ka (x104M'V) kd (*10'V) kD (x10"9M)
FabA
nu
FabA-dAbL3 (LC-SG4SE)
4,46 16,2 363
FabA-dAbH4 (LC-SG4SE)
9.142
FabA-didAb, -dAbL3 (LC-SG4SE) y -dAbH4 (HC-DKTHTS)
4,36 16,3 373
Se determino la afinidad y los parametros cineticos para la union de HSA a los FabA que llevan dAbL3 o dAbH4 ya sea en la cadena ligera (LC) o la cadena pesada (HC) o en ambos como se indica. No se detecto union (nu) de hSa al FabA original. La cinetica de interaccion para la union de HSA al FabA con (dAbH4 en HC) o (dAbH4 en LC), se determinant demasiado rapidamente, por lo tanto la afinidad (Kd) se determino a partir de union en estado estacionario.
Listado de secuencias
<110> UCB Pharma S.A.
Humphreys, David P Dave, Emma
<120> Fusiones de anticuerpos con doble especificidad <130> G0045-WO01 <160> 77
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1 <211>7 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> ligante <400> 1
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 1 5
<210> 2 <211>6 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> ligante <400> 2
Asp Lys Thr His Thr Ser 1 5
<210> 3 <211>5 <212> PRT <213> Artificial
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<220>
<223> ligante <400> 3
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210>4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> ligante <400> 4
Ala Ala Ala Gly Ser Gly Gly Ala Ser Ala Ser
1 5 10
<210>5 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> ligante <220>
<221> caractenstica_misc <222> (7).. (7)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoacido que se produce de forma natural <400> 5
Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Gly Gly Gly Ser Gly Ala Ser Ala Ser 15 10 15
<210> 6 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> ligante <220>
<221> caractenstica_misc <222> (7) .. (7)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoacido que se produce de forma natural <400> 6
Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Ser Gly Ala Ser Ala Ser 15 10
<210> 7 <211> 28 <212> PRT
<213> Artificial <220>
<223> ligante 5
<400>7
Pro Gly Gly Asn Arg Gly Thr Thr Thr Thr Arg Arg Pro Ala Tbr Thr
15 10 15
Tbr Gly Ser Ser Pro Gly Pro Thr Gin Ser His Tyr 20 25
10 <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial
15 <220>
<223> ligante
<400> 8
Ala Thr Thr Thr Gly Ser Ser Pro Gly Pro Thr
15 10
20
<210>9 <211>6 <212> PRT 25 <213> Artificial
<220>
<223> ligante 30 <400> 9
Ala Thr Thr Thr Gly Ser 1 5
<210> 10 35 <211> 21
<212> PRT <213> Artificial
<220>
40 <223> ligante
<400> 10
Glu Pro Ser Gly Pro lie Ser Thr lie Asn Ser Pro Pro Ser Lys GTu 15 10 15
Ser His Lys Ser Pro
45
<210> 11 <211> 15
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> ligante <400> 11
Gly Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp 15 10 15
<210> 12 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> ligante <400> 12
Gly Gly Gly Gly lie Ala Pro Ser Met Val Gly Gly Gly Gly Ser 15 10 15
<210> 13 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> ligante <400> 13
Gly Gly Gly Gly Lys Val Glu Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser 15 10 15
<210> 14 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> ligante <400> 14
Gly Gly Gly Gly Ser Met Lys Ser His Asp Gly Gly Gly Gly Ser 15 10 15
<210> 15 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> ligante <400> 15
10
15
20
25
30
35
40
Gly Gly Gly Gly Asn Leu lie Thr lie Val Gly Gly Gly Gly Ser 15 10 15
<210> 16 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> ligante <400> 16
Gly Gly Gly Gly Val Val Pro Ser Leu Pro Gly Gly Gly Gly Ser 15 10 15
<210> 17 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> ligante <400> 17
Gly Gly Glu Lys Ser He Pro Gly Gly Gly Gly Ser 15 10
<210> 18 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> ligante <400> 18
Arg Pro Leu Ser Tyr Arg Pro Pro Phe Pro Phe Gly Phe Pro Ser Val 15 10 15
Arg Pro
<210> 19 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Tyr Pro Arg Ser lie Tyr lie Arg Arg Arg His Pro Ser Pro Ser Leu
15 10 15
Thr Thr
<210> 20 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> ligante <400> 20
Thr Pro Ser Hig Leu Ser His lie Leu Pro Ser Phe Gly Leu Pro Thr 15 ID 15
Phe Asn
<210> 21 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> ligante <400> 21
Arg Pro Val Ser Pro Phe Thr Phe Pro Arg Leu Ser Asn Ser Trp Leu 15 10 15
Pro Ala
<210> 22 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> ligante <400> 22
Ser Pro Ala Ala His Phe Pro Arg Ser lie Pro Arg Pro Gly Pro lie 1 5 10 15
Arg Thr
<210> 23 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial
<220>
5
10
15
20
25
30
35
40
<223> ligante <400> 23
Ala Pro Gly Pro Ser Ala Pro Ser His Arg Ser Leu Pro Ser Arg Ala 15 10 15
Phe Gly
<210> 24 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> ligante <400> 24
Pro Arg Asn Ser lie His Phe Leu His Pro Leu Leu Val Ala Pro Leu 15 10 15
Gly Ala
<210> 25 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> ligante <400> 25
Met Pro Ser Leu Ser Gly Val Leu Gin Val Arg Tyr Leu Ser Pro Pro ! 5 10 15
Asp Leu
<210> 26 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> ligante <400> 26
Ser Pro Gin Tyr Pro Ser Pro Leu Thr Leu Thr Leu Pro Pro His Pro 15 10 15
Ser Leu
5
10
15
20
25
30
35
40
45
<210> 27 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> ligante <400> 27
Asn Pro Ser Leu Asn Pro Pro Ser Tyr Leu His Arg Ala Pro Ser Arg 15 10 15
lie Ser
<210> 28 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> ligante <400> 28
Leu Pro Trp Arg Thr Ser Leu Leu Pro Ser Leu Pro Leu Arg Arg Arg 15 10 15
Pro
<210> 29 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> ligante <400> 29
Pro Pro Leu Phe Ala Lys Gly Pro Val Gly Leu Leu Ser Arg Ser Phe 15 10 15
Pro Pro
<210> 30 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Val Pro Pro Ala Pro Val Val Ser Leu Arg Ser Ala His Ala Arg Pro 15 10 15
Pro Tyr
<210> 31 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> ligante <400> 31
Leu Arg Pro Thr Pro Pro Arg Val Arg Ser Tyr Thr Cys Cys Pro Thr 15 10 15
Pro
<210> 32 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> ligante <400> 32
Pro Asn Val Ala His Val Leu Pro Leu Leu Thr Val Pro Trp Asp Asn 15 10 15
Leu Arg
<210> 33 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> ligante <400> 33
Cys Asn Pro Leu Leu Pro Leu Cys Ala Arg Ser Pro Ala Val Arg Thr 15 10 15
Phe Pro
<210> 34 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
<223> ligante <400> 34
Gly Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala 15 10
<210> 35 <211>4 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> ligante <400> 35
Pro Pro Pro Pro 1
<210> 36 <211>8 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> ligante <400> 36
Asp Lys Thr His Thr Cys Ala Ala 1 5
<210> 37 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> ligante <400> 37
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 15 10
<210> 38 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial
5
10
15
20
25
30
35
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Thr Cys Pro Pro Cys 15 10 15
Pro Ala
<210> 39 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> ligante <400> 39
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Thr Cys Pro Pro Cys 15 10 15
Pro Ala Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 20 25
<210> 40 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> ligante <400> 40
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Gly Lys Pro Thr Leu 15 10 15
Tyr Asn Ser Leu Val Met Ser Asp Thr Ala Gly Thr Cys Tyr 20 25 30
<210> 41 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> ligante <400> 41
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Gly Lys Pro Thr His 15 10 15
Val Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Val Asp Gly Thr Cys Tyr 20 25 30
<210> 42
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
<211> 15 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> ligante <400> 42
Asp Lys Thr His Thr Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala 15 10 15
<210> 43 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> ligante <400> 43
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp 15 10 15
Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala 20 25
<210> 44 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> ligante <400> 44
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Ser Cys Pro Ala 15 10
<210> 45 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> ligante <400> 45
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 15 10
<210> 46 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial
5
10
15
20
25
30
35
40
45
<220>
<223> ligante <400> 46
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 15 10 15
<210> 47 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> ligante <400> 47
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 15 10 15
Gly Gly Gly Ser 20
<210> 48 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> ligante <400> 48
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 15 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25
<210> 49 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> ligante <220>
<221> caractenstica_misc <222> (7).. (7)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoacido que se produce de forma natural <220>
<221> caractenstica_misc <222> (12).. (12)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoacido que se produce de forma natural
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
<400> 49
Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Gly Gly Gly Ser Xaa Gly Gly Gly Ser 15 10 15
Gly Ala Ser Ala Ser 20
<210> 50 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> ligante <220>
<221> caractenstica_misc <222> (7).. (7)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoacido que se produce de forma natural <220>
<221> caractenstica_misc <222> (12).. (12)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoacido que se produce de forma natural <220>
<221> caractenstica_misc <222> (17)..(17)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoacido que se produce de forma natural <400> 50
Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Gly Gly Gly Ser Xaa Gly Gly Gly Ser 15 10 15
Xaa Gly Gly Gly Ser Gly Ala Ser Ala Ser 20 25
<210> 51 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> ligante <220>
<221> caractenstica_misc <222> (7) .. (7)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoacido que se produce de forma natural <220>
<221> caractenstica_misc <222> (12)..(12)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoacido que se produce de forma natural <220>
<221> caractenstica misc
<222> (17).. (17)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoacido que se produce de forma natural <220>
5 <221> caractenstica_misc
<222> (22) .. (22)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoacido que se produce de forma natural <400> 51
10
Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Gly Gly Gly Ser Xaa Gly Gly Gly Ser 15 10 15
Xaa Gly Gly Gly Ser Xaa Gly Gly Gly Ser Gly Ala Ser Ala Ser 20 25 30
<210> 52 <211> 119 15 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> dAbH1
20
<400> 52

Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly lie Asp Leu Ser Asn Tyr 20 25 30

Ala lie Asn. Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45

Gly He lie Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys 50 55 60

Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Ser Thr Thr Val Tyr Leu Gin Met 65 70 75 80

Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr 85 90 95

Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 53 <211> 110 5 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> dAbL1
10
<400> 53
Asp He Val Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Gin Ser Ser Pro Ser Val Trp Ser Asn. 20 25 30

Phe Leu Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45

lie Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gly Gly Tyr Ser Ser lie

85 90 95

Ser Asp Thr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 110
<210> 54 <211> 120 5 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> dAbH2
10
<400> 54

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Arg Tyr 20 25 30

Ala Met Thr Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45

Gly Thr lie Thr Thr Gly Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Asn Trp Ala Lys 50 55 60

Gly Arg Phe Thr lie Ser Lys Asp Ser Thr Thr Val Tyr Leu Gin Met 65 70 75 80

Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly 85 90 95

Gly Tyr Val Ser Tyr Ala Asp Ala Thr Glu Leu Ser Leu Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 55 <211> 110 5 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> dAbL2
10
<400> 55
Asp He Val Met Thr Gin Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Gin Ala Ser Gin Ser lie Gly Ser Arg 20 25 30
5
10
15
20
25
30
35

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Tyr Ala Ser Thr Val Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro

65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Tyr Ser Ser Ser

85 90 9S

Ser Ser Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lyg Val Glu lie Lys 100 105 110
<210> 56 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> CDRH1 dAbH1 <400> 56
Gly He Asp Leu Ser Asn Tyr Ala lie Abu 15 10
<210> 57 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> CDRH2 dAbH1 <400> 57
lie lie Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly 15 10 15
<210> 58 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> CDRH3 dAbH1 <400> 58
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu 15 10
<210> 59 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> CDRL1 dAbLI <400> 59
Gin Ser Ser Pro Ser Val Trp Ser Asn Phe Leu Ser 15 10
<210> 60 <211>7 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> CDRL2 dAbL1 <400> 60
Glu Ala Ser Lys Leu Thr Ser 1 5
<210> 61 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> CDRL3 dAbL1 <400> 61
Gly Gly Gly Tyr Ser Ser lie Ser Asp Thr Thr 15 10
<210> 62 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> CDRH1 dAbH2 <400> 62
Gly Phe Ser Leu Ser Arg Tyr Ala Met Thr 15 10
<210> 63 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> CDRH2 dAbH2
<400> 63 5
Thr lie Thr Thr Gly Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly 15 10 15
<210> 64 <211> 14 10 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> CDRH3 dAbH2 15
<400> 64
Gly Gly Tyr Val Ser Tyr Ala Asp Ala Thr Glu Leu Ser Leu 15 10
20 <210> 65
<211> 11 <212> PRT <213> Artificial
25 <220>
<223> CDRL1 dAbL2
<400> 65
30
Gin Ala Ser Gin Ser lie Gly Ser Arg Leu Ala 15 10
<210> 66 <211>7 <212> PRT 35 <213> Artificial
<220>
<223> CDRL2 dAbL2
40 <400> 66
Tyr Ala Ser Thr Val Ala Ser 1 5
<210> 67 45 <211> 12
<212> PRT <213> Artificial
<220>
50 <223> CDRL3 dAbL2
<400> 67
Gin Ser Tyr Asp Tyr Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ala 15 10
<210> 68 <211> 232 <212> PRT 5 <213> Artificial
<220>
<223> CH1-dAbH1 10 <400> 68
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 15 10 15

Claims (11)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    1. Una protema de fusion de anticuerpos con doble especificidad que comprende un fragmento Fab o Fab' de anticuerpo con especificidad para un antigeno de interes, estando dicho fragmento geneticamente fusionado a dos anticuerpos de un solo dominio que tienen especificidad para una protema serica transportadora, en donde un anticuerpo de un solo dominio se fusiona al terminal C de la cadena ligera del fragmento Fab o Fab' mediante un enlazador y el otro anticuerpo de un solo dominio se fusiona al terminal C de la cadena pesada del fragmento Fab o Fab' mediante un enlazador y en donde un anticuerpo de un solo dominio es un dominio VH y el otro anticuerpo de un solo dominio es un dominio VL y los anticuerpos de un solo dominio VH y VL son un par Vh/VL complementario que se unen al antfgeno de forma cooperativa y el anticuerpo de un solo dominio VH se fusiona al terminal C de la cadena pesada del fragmento Fab o Fab' y el anticuerpo de un solo dominio VL se fusiona al terminal C de la cadena ligera del fragmento Fab o Fab' y en donde la protema serica transportadora es una protema serica transportadora humana seleccionada del grupo que consiste en protema de union a la tiroxina, transtiretina, a-1-glucoprotema acida, transferrina, fibrinogeno y albumina del suero.
  2. 2. Una protema de fusion segun la reivindicacion 1, en donde cada anticuerpo de un solo dominio es completamente humano o esta completamente humanizado.
  3. 3. Una protema de fusion segun la reivindicacion 1 o 2, en donde el Fab o Fab' es completamente humano o esta completamente humanizado.
  4. 4. La protema de fusion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde cada anticuerpo de un solo dominio fusionado al fragmento Fab o Fab' se fusiona mediante un enlazador independientemente seleccionado del grupo que consiste en la secuencia de aminoacidos GS, PPP, SEQ ID n°: 1, SEQ ID n°: 2, SEQ ID n°: 3, SEQ ID n°:
  5. 4. SEQ ID n°: 5, SEQ ID n°: 6, SEQ ID n°: 7, SEQ ID n°: 8, SEQ ID n°: 9, SEQ ID n°: 10, SEQ ID n°: 11, SEQ ID n°: 12, SEQ ID n°: 13, SEQ ID n°: 14, SEQ ID n°: 15, SEQ ID n°: 16, SEQ ID n°: 17, SEQ ID n°: 18, SEQ ID n°: 19, SEQ ID n°: 20, SEQ ID n°: 21, SEQ ID n°: 22, SEQ ID n°: 23, SEQ ID n°: 24, SEQ ID n°: 25, SEQ ID n°: 26, SEQ ID n°: 27, SEQ ID n°: 28, SEQ ID n°: 29, SEQ ID n°: 30, SEQ ID n°: 31, SEQ ID n°: 32, SEQ ID n°: 33, SEQ ID n°: 34, SEQ ID n°: 35, SEQ ID n°: 36, SEQ ID n°: 37, SEQ ID n°: 38, SEQ ID n°: 39, SEQ ID n°: 40, SEQ ID n°: 41, SEQ ID n°: 42, SEQ ID n°: 43, SEQ ID n°: 44, SEQ ID n°: 45, SEQ ID n°: 46, SEQ ID n°: 47, SEQ ID n°: 48, SEQ ID n°: 49, SEQ ID n°: 50 y SEQ ID n°: 51.
  6. 5. La protema de fusion segun la reivindicacion 4, en donde la secuencia del enlazador se selecciona del grupo consistente en la SEQ ID n°: 1, SEQ ID n°: 2, SEQ ID n°: 3 y SEQ ID n°: 45.
  7. 6. Una protema de fusion segun la reivindicacion 5, en la que el dominio vehmulo esta unido al terminal C de la cadena pesada del fragmento Fab o Fab' mediante un enlazador que tiene la secuencia dada en SEQ ID n°: 2 o SEQ ID n°: 45 y el dominio VL esta unido al terminal C de la cadena ligera del fragmento Fab o Fab' mediante un enlazador que tiene la secuencia dada en SEQ ID n°: 1 o SEQ ID n°: 45.
  8. 7. La protema de fusion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la protema serica transportadora es la albumina del suero humana.
  9. 8. Un vector de expresion que comprende un codigo para una protema de fusion de anticuerpo con doble especificidad tal como la definida en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
  10. 9. Una celula anfitriona que comprende un vector tal como el definido en la reivindicacion 8.
  11. 10. La protema de fusion de anticuerpo con doble especificidad tal como la definida en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para su utilizacion en un tratamiento.
    imagen1
    imagen2
    dAbL y dAbH estan umdos al terminal C de la region constante de cada cadena de modo que
    una fusion LC-dAbL o LC-dAbH esta empareiada con la HC-dAbL o HC-dAbH.
    variable de cadena ligera FI o cadena pesadafU-Regiones constantes cKappa | 1
    Region
    y CH11 l . Fragmentos de anticuerpo con dominio, dAbL
    y dAbH,
    imagen3
    imagen4
    Pab-cLAb
    klra
    Fab-dAb
    a micro
    ■■ . IlM*
    S" ''I
    V
    cadena Ikera-dAb
    ij.rS' ]■
    cadena pesada
    !. ' ■
    • -,d' y
    Anti cadena pesada Anti-cadena ligera -
    Anti-cadena pesada Anti-cadena ligera
    Reducida
    Reducida
    No reducida
    No reducida
    imagen5
    98
    64
    SO
    36
    16
    imagen6
    imagen7
    Fignra5
    a) dAbHJ
    EVQLLESGGGLVQFGGSLRLSCAVSGIDLSNYAtNWVRQAPGKGLEWIGIIWA SGTTFY ATW AKGRFT1SRD STTV Y LQMN S LRAEDT A V YY CARTVF GYSTAP Y FDLWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:52)
    b) dAbLl
    DIVMTQS PSSVSASV GDRVT1TCQS SP S VW SNFLSWYQQKP GKAPKLLIY E AS KLT SGVFSRFKGSGS GTDFTLTIS S LQPED F ATYY CG GGY SSISDTTF GGGTKV EiK (SEQ ID NO:53)
    c) dAhH2
    EVQLVESGGGLV QPGGSUEtLS CAVSGFSLSRY AMTWVRQAPGKGLEWIGTIT TGGNTNYANWAKGRFTISKDSTTYYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGYVSYA DATELSLWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO; 54)
    d) dAbL2
    DIVMTQSPSTLSASV GDR VTITCQ A S QSIGS RLAWY QQ KP GKAPKLLI YYAST VASGVPSRFKGSGSGTEFTLTISSLQPDDF ATYY C QS YDY SSSSSYAFGG GTKV EIK (SEQ ID NO:55)
    dAbHl
    e)
    CDRH1
    f)
    CDRH2
    &)
    CDRH3
    dAbLl
    h)
    CDRLI
    i)
    CDRL2
    j)
    CDRL3
    dAbH2
    k)
    CDRH1
    1)
    CDRH2
    m)
    CDRH3
    dAbL2
    n)
    CDRLI
    o)
    CDRL2
    P)
    CDRL3
    GLDLSNYAIN (SEQ ID NO: 56) IIWASGTTFYATWAKG (SEQ ID NO:57) TVPGYSTAPYFDL (SEQ ID NO:58)
    QSSPSVWSNFLS (SEQ ID NO:59) EASKLTS (SEQ ID N0:60) GGGYSSISDTT (SEQ ID NO: 61)
    GFSLSRYAMT (SEQ ID NO:62)
    TITTGGNTNYANWAKG (SEQ ID NO:63) GGYVSYADATELSL (SEQ ID NO;64)
    QASQSIGSRLA (SEQ ID NO:65) YASTVAS (SEQ ID NO;66) QSYDYSSSSSYA (SEQ ID NO:67)
    FabB-dAhHl (CHl-GaSx2)
    FABB-DOMINIO VARIABLE DE CADENA PESADA +
    ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF PAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTOTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCGGG GSGGGGSEVQLLESGGGLVOPGGSLRLSCAVSGIDLSNYAINWVRQAPGKGL EWIGIIW ASGTTF Y ATWAKGRFTISRDSTTV YLQMNSLRAEDTAVYY CARTV PGYSTAPYFDLWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:68)
    FabB-dAbH2 fCHl-GgSx2)
    FABB-DOMINIO VARIABLE DE CADENA PESADA +
    ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF PAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCGGG GSGGGGSEVOLVESGGGLVOPGGSLRLSCAVSGFSLSRYAMTWVROAPGKG LEW IGTFTTGGNTNY ANW AKGRFTIS KD STTVYLQMN SLR AEDT A VYYC AR GGYVSYADATELSLWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:69)
    FabB-dAbLl (CIIl-G*Sx21
    FABB-DOMINIO VARIABLE DE CADENA PESADA
    ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF PAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTOTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCGGG GSGGGGSDIVMTQSPSSVSASVGDRVTITCQSSPSVWSNFLSWYQQKPGKAP KLLIYEASKLTSGVPSRFKGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCGGGYSS1SDTT FGGGTKVEIK (SEQ ID NO:70)
    FabB-dAbL2 (CHl-G4Sx21
    FABB-DOMINIO VARIABLE DE CADENA PESADA +
    ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF PAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTOTY1CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCGGG GSGGGGSDIVMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSIGSRLAWYQQKPGKAPKL LIYYASTVASGVPSRFKGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQSYDYSSSSSYA FGGGTKVEIK (SEQ ID NO:71)
    FabB-dAbLl (CK-CLSx2)
    FABB-DOMINIO VARIABLE DE CADENA LIGERA +
    RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS
    QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRG
    ECGGGGSGGGGSDIVMTQSPSSVSASVGDRVTITCQSSPSVWSNFLSWYQQK
    Figura 6 continuacion
    PGKAPKLLIYEASKLTSGVPSRFKGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCGGGYS SISDTTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:72)
    FabB-dAbL2 (CK-GaSxZ)
    FABB-DOMINIO VARIABLE DE CADELA LIGERA +
    RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTY SLSSTLTLSKADYEKHKVY ACEVTHQGLSSPVTKSFNRG ECGGGGSGGGGSDrVMTQSPSTLSASVGDRVTTTCQASQSIGSRLAWYQQKP GKAPKLLIYYASTVASGVPSRFKGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQSYDYS SSSSYAFGGGTKVEIK {SEQ ID NO:73)
    Catena pesada de FabA
    MKKT AT AIAVAL A GF AT VAQ AE VQL VESG GGLVQPGG S LRL SC AF S GFSLSTS GVG VG WVRQ APGKGLE W V AH IW WD GDES YNP S LKTQFTISKDTSKNT V YL QMN SLRAEDTAVYYC ARNRYDPPWFVD WGQGTLVT VS SASTKGP S VFPLAP S SKSTS GGT A ALG C L VKD YFPEP VTV S WN SGALTSGVHTFP A VLQSSGLY S LS S VVTVP S S SLOT QT YICNVNHKP SNTKVDKKVEP KT CDKTHTCPP CP A (S EQ LP NO; 74)
    Cadena ligera de FabA
    MKKTAIAIAVALAGFATVAQADIQMTQSPSSLSASVGDRYTITCRASQDISNY LSWY QQKPGKAPKLLTYYTSKLHSGVPSRFSGS GSGTDYTLTISSLQPEDFATY YCQ QGKMLP WT FGQ GTKVEIKRT VA AP S VF IF PPS D EQLKS GT A S V V CLLNNF YP RE AKV QWKV DN A V Q S GNS QES VTEQDSKD STY SLSSTLTLS KAD Y EKHK VYACEVTHQGLS SPVTK.SFNRGEC (SEQ TD NO:75)
    Cadena pesada de FabA (enlazador bisabra modificado)
    MKKT A1AIA V AL AGF ATV AQ AE VQ LVE S GG GLV QPGG S LRLS CAF SGFS LSTS GV G V GWVRQAPGKG LE WVAHIW WDGDES YNP S LKTQ FTIS KDT S KNT VYL QMN S LRAEDTAVYY C ARNRYDPP WF VDWGQGTLVT VS SASTKGPS VFPLAP SSKSTSGGTAALGCL VKD YFPEP VTVSWN SGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLS SVVTVPS S S LGTQTYICNVNHKP SNTKVDKKV EP K TCDKTHTS (SHQ ID NO:76)
    Cadena pesada de FabA
    MKKTAIAIAVALAGF ATV AQ A EV QLVESGGGLVQPGGS LRLSC AF SGFSLSTS GVGVGWVRQAPGKGLEWVAHIWWDGDESYNPSLKTQFTISKDTSKNTVYL QMN S LRAEDT AVY YCARNRYDPPWFVDWGQ GTLVT V S SASTKGP S VFP LAP SSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLS S VVT VP S S S LGTQTYICN VNHKP S NTKVDKKVE PKT C (SEQ ID NO:77)
ES08806478.7T 2007-09-26 2008-09-26 Fusiones de anticuerpos con doble especificidad Active ES2622460T3 (es)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB0718834 2007-09-26
GB0718834A GB0718834D0 (en) 2007-09-26 2007-09-26 Antibody fusions
GB0718832A GB0718832D0 (en) 2007-09-26 2007-09-26 Antibody fusions
GB0718832 2007-09-26
PCT/GB2008/003331 WO2009040562A1 (en) 2007-09-26 2008-09-26 Dual specificity antibody fusions

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2622460T3 true ES2622460T3 (es) 2017-07-06

Family

ID=40291217

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES08806478.7T Active ES2622460T3 (es) 2007-09-26 2008-09-26 Fusiones de anticuerpos con doble especificidad
ES12183573.0T Active ES2667729T3 (es) 2007-09-26 2008-09-26 Fusiones de anticuerpos con doble especificidad

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES12183573.0T Active ES2667729T3 (es) 2007-09-26 2008-09-26 Fusiones de anticuerpos con doble especificidad

Country Status (7)

Country Link
US (5) US8629246B2 (es)
EP (4) EP2535349A1 (es)
JP (2) JP5592792B2 (es)
CN (2) CN101842387B (es)
CA (1) CA2700714C (es)
ES (2) ES2622460T3 (es)
WO (1) WO2009040562A1 (es)

Families Citing this family (251)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5592792B2 (ja) 2007-09-26 2014-09-17 ユセベ ファルマ ソシエテ アノニム 二重特異性抗体の融合体
LT2334705T (lt) * 2008-09-26 2017-03-27 Ucb Biopharma Sprl Biologiniai produktai
EP2398498B1 (en) 2009-02-17 2018-09-05 UCB Biopharma SPRL Antibody molecules having specificity for human ox40
GB0904214D0 (en) 2009-03-11 2009-04-22 Ucb Pharma Sa Biological products
TW201106971A (en) * 2009-05-28 2011-03-01 Glaxo Group Ltd Antigen-binding proteins
JP5901517B2 (ja) * 2009-05-28 2016-04-13 グラクソ グループ リミテッドＧｌａｘｏ Ｇｒｏｕｐ Ｌｉｍｉｔｅｄ 抗原結合性タンパク質
US20120134984A1 (en) * 2009-06-01 2012-05-31 Olga Lubman Molecules with extended half-lives and uses thereof
US9493578B2 (en) 2009-09-02 2016-11-15 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
ES2667258T3 (es) * 2009-09-10 2018-05-10 Ucb Biopharma Sprl Anticuerpos multivalentes
GB201005063D0 (en) * 2010-03-25 2010-05-12 Ucb Pharma Sa Biological products
GB0920127D0 (en) * 2009-11-17 2009-12-30 Ucb Pharma Sa Antibodies
GB201000467D0 (en) * 2010-01-12 2010-02-24 Ucb Pharma Sa Antibodies
TW201134488A (en) 2010-03-11 2011-10-16 Ucb Pharma Sa PD-1 antibodies
CA2791930A1 (en) 2010-03-11 2011-09-15 Kerry Louise Tyson Pd-1 antibody
GB201005064D0 (en) * 2010-03-25 2010-05-12 Ucb Pharma Sa Biological products
US20130115215A1 (en) * 2010-07-14 2013-05-09 Hongxing Zhou Domain insertion immunoglobulin
EP3029066B1 (en) 2010-07-29 2019-02-20 Xencor, Inc. Antibodies with modified isoelectric points
JP2014501725A (ja) 2010-11-24 2014-01-23 グラクソ グループ リミテッド Ｈｇｆを標的とする多特異的抗原結合タンパク質
JP2014501515A (ja) 2010-12-01 2014-01-23 グラクソ グループ リミテッド 改良された抗血清アルブミン結合単一可変ドメイン
GB201100282D0 (en) 2011-01-07 2011-02-23 Ucb Pharma Sa Biological methods
US10208349B2 (en) 2011-01-07 2019-02-19 Ucb Biopharma Sprl Lipocalin 2 as a biomarker for IL-17 inhibitor therapy efficacy
ME02734B (me) 2011-01-14 2017-10-20 Ucb Biopharma Sprl Antitelo koje vezuje il-17a i il-17f
WO2012158818A2 (en) 2011-05-16 2012-11-22 Fabion Pharmaceuticals, Inc. Multi-specific fab fusion proteins and methods of use
ES2758884T3 (es) * 2011-06-24 2020-05-06 Stephen D Gillies Proteínas de fusión de inmunoglobulina a través de cadena ligera y métodos de uso de ellas
PL2731973T3 (pl) 2011-07-13 2018-04-30 Ucb Biopharma Sprl Bakteryjny szczep gospodarz wykazujący ekspresję dsbc
US10752676B2 (en) 2011-09-16 2020-08-25 Ucb Biopharma Sprl Neutralising antibodies to the major exotoxins TCDA and TCDB of Clostridium difficile
US10851178B2 (en) 2011-10-10 2020-12-01 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
US12466897B2 (en) 2011-10-10 2025-11-11 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
SI2776466T1 (sl) * 2011-11-11 2017-12-29 Ucb Biopharma Sprl Protitelesa, ki se vežejo na albumin in njihovi vezavni fragmenti
UA112203C2 (uk) 2011-11-11 2016-08-10 Юсб Фарма С.А. Злитий білок біоспецифічного антитіла, який зв'язується з ox40 людини та сироватковим альбуміном людини
GB201208367D0 (en) 2012-05-14 2012-06-27 Ucb Pharma Sa Biological product
GB201208370D0 (en) 2012-05-14 2012-06-27 Ucb Pharma Sa Antibodies
LT2852615T (lt) * 2012-05-22 2019-02-11 Bristol-Myers Squibb Company Il-17a/f il-23 bispecifiniai antikūnai ir jų panaudojimai
EP4001307A1 (en) * 2012-12-17 2022-05-25 Cell Medica Inc. Antibodies against il-1 beta
GB201223276D0 (en) * 2012-12-21 2013-02-06 Ucb Pharma Sa Antibodies and methods of producing same
US9701759B2 (en) 2013-01-14 2017-07-11 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
CN105051069B (zh) 2013-01-14 2019-12-10 Xencor股份有限公司 新型异二聚体蛋白
US10487155B2 (en) 2013-01-14 2019-11-26 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US11053316B2 (en) 2013-01-14 2021-07-06 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US10968276B2 (en) 2013-03-12 2021-04-06 Xencor, Inc. Optimized anti-CD3 variable regions
US9605084B2 (en) 2013-03-15 2017-03-28 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10131710B2 (en) 2013-01-14 2018-11-20 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US9738722B2 (en) 2013-01-15 2017-08-22 Xencor, Inc. Rapid clearance of antigen complexes using novel antibodies
CN110845618A (zh) * 2013-02-26 2020-02-28 罗切格利卡特公司 双特异性t细胞活化抗原结合分子
EP3421495A3 (en) 2013-03-15 2019-05-15 Xencor, Inc. Modulation of t cells with bispecific antibodies and fc fusions
US10519242B2 (en) 2013-03-15 2019-12-31 Xencor, Inc. Targeting regulatory T cells with heterodimeric proteins
US10106624B2 (en) 2013-03-15 2018-10-23 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
WO2015006337A2 (en) * 2013-07-08 2015-01-15 Nanjingjinsirui Science & Technology Biology Corporation Compositions and methods for increasing protein half-life in a serum
GB201315487D0 (en) 2013-08-30 2013-10-16 Ucb Pharma Sa Antibodies
JP6422977B2 (ja) * 2013-08-30 2018-11-14 エイプリルバイオ カンパニー リミテッド 抗血清アルブミンｆａｂエフェクター部分融合コンストラクト、およびその製造方法
WO2015048685A1 (en) * 2013-09-30 2015-04-02 Becton, Dickinson And Company Blocking reagent compositions and methods of making and using the same
SI3021859T1 (en) 2013-10-25 2018-04-30 Psioxus Therapeutics Limited Oncolytic adenoviruses equipped with heterologous genes
GB201320066D0 (en) 2013-11-13 2013-12-25 Ucb Pharma Sa Biological products
CA2940242C (en) 2014-02-20 2026-01-13 H. Lundbeck A/S Anti-acth antibodies and use thereof
KR102497443B1 (ko) 2014-03-28 2023-02-08 젠코어 인코포레이티드 Cd38 및 cd3에 결합하는 이중특이적 항체
EP3126826B1 (en) 2014-04-04 2020-12-16 Mayo Foundation for Medical Education and Research Isotyping immunoglobulins using accurate molecular mass
GB201406608D0 (en) 2014-04-12 2014-05-28 Psioxus Therapeutics Ltd Virus
GB201409558D0 (en) 2014-05-29 2014-07-16 Ucb Biopharma Sprl Method
GB201411320D0 (en) 2014-06-25 2014-08-06 Ucb Biopharma Sprl Antibody construct
GB201411420D0 (en) * 2014-06-26 2014-08-13 Ucb Biopharma Sprl Antibody constructs
MX2016017393A (es) 2014-07-01 2017-09-05 Pfizer Diacuerpos heterodimericos biespecificos y sus usos.
GB201412659D0 (en) 2014-07-16 2014-08-27 Ucb Biopharma Sprl Molecules
GB201412658D0 (en) 2014-07-16 2014-08-27 Ucb Biopharma Sprl Molecules
JP6657195B2 (ja) * 2014-09-19 2020-03-04 シティ・オブ・ホープＣｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ Ｌ１３Ｒα２を標的とする共刺激性キメラ抗原レセプターＴ細胞
CA2967426A1 (en) 2014-11-26 2016-06-02 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and tumor antigens
BR112017011166A2 (pt) 2014-11-26 2018-02-27 Xencor, Inc. anticorpos heterodiméricos que se ligam a cd3 e cd38
US10259887B2 (en) 2014-11-26 2019-04-16 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
EP3237449A2 (en) 2014-12-22 2017-11-01 Xencor, Inc. Trispecific antibodies
UA120286C2 (uk) 2015-01-08 2019-11-11 Ґенмаб А/С Біспецифічне антитіло проти cd3 і cd20
WO2016141387A1 (en) 2015-03-05 2016-09-09 Xencor, Inc. Modulation of t cells with bispecific antibodies and fc fusions
EP3283522A1 (en) * 2015-04-17 2018-02-21 Spring Bioscience Corporation Antibodies, compositions, and immunohistochemistry methods for detecting c4.4a
GB201506869D0 (en) 2015-04-22 2015-06-03 Ucb Biopharma Sprl Method
GB201506870D0 (en) 2015-04-22 2015-06-03 Ucb Biopharma Sprl Method
JP2018515082A (ja) 2015-04-30 2018-06-14 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 代謝障害を処置するための抗ａｐ２抗体及び抗原結合剤
US10676723B2 (en) 2015-05-11 2020-06-09 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
GB201508180D0 (en) 2015-05-13 2015-06-24 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
ES2889906T3 (es) 2015-05-21 2022-01-14 Harpoon Therapeutics Inc Proteínas de unión triespecíficas y usos médicos
CN113940996A (zh) 2015-05-27 2022-01-18 Ucb生物制药私人有限公司 用于治疗神经系统疾病的方法
CN106188305A (zh) * 2015-06-01 2016-12-07 中山大学 具有融合至常规Fab片段的单域抗原结合片段的二价抗体
GB201510758D0 (en) 2015-06-18 2015-08-05 Ucb Biopharma Sprl Novel TNFa structure for use in therapy
PE20221007A1 (es) 2015-06-24 2022-06-15 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-receptor de transferrina con afinidad disenada
TN2017000543A1 (en) 2015-07-06 2019-04-12 Ucb Biopharma Sprl Tau-binding antibodies
MA41670A1 (fr) 2015-07-06 2018-05-31 Ucb Biopharma Sprl Anticorps se liant a tau
GB201601077D0 (en) 2016-01-20 2016-03-02 Ucb Biopharma Sprl Antibody molecule
GB201601075D0 (en) 2016-01-20 2016-03-02 Ucb Biopharma Sprl Antibodies molecules
GB201601073D0 (en) 2016-01-20 2016-03-02 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
AR106189A1 (es) 2015-10-02 2017-12-20 Hoffmann La Roche ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS CONTRA EL A-b HUMANO Y EL RECEPTOR DE TRANSFERRINA HUMANO Y MÉTODOS DE USO
WO2017055542A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific anti-human cd20/human transferrin receptor antibodies and methods of use
DK3359688T3 (da) 2015-10-05 2021-08-23 Biogen Ma Inc Molekylære signaturer til anvendelse til diagnose og analyse af respons på behandling af autoimmune sygdomme
RU2754683C2 (ru) 2015-10-27 2021-09-06 Юсб Биофарма Срл Способы лечения с использованием анти-il-17a антител
GB201521391D0 (en) 2015-12-03 2016-01-20 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
GB201521382D0 (en) 2015-12-03 2016-01-20 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
GB201521393D0 (en) 2015-12-03 2016-01-20 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
GB201521383D0 (en) 2015-12-03 2016-01-20 Ucb Biopharma Sprl And Ucb Celltech Method
GB201521389D0 (en) 2015-12-03 2016-01-20 Ucb Biopharma Sprl Method
CN108699136B (zh) 2015-12-07 2022-03-18 Xencor股份有限公司 结合cd3和psma的异二聚抗体
GB201522394D0 (en) 2015-12-18 2016-02-03 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
JP7328761B2 (ja) 2016-01-11 2023-08-17 インヒブルクス インコーポレイテッド 多価多重特異性ｏｘ４０結合融合タンパク質
GB201602414D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Nascient Ltd Biological materials and uses thereof
CN109476756B (zh) 2016-03-15 2022-05-31 埃泰美德(香港)有限公司 一种多特异性Fab融合蛋白及其用途
JP7133544B2 (ja) * 2016-05-01 2022-09-08 ユーシービー バイオファルマ エスアールエル 親和性を操作した血清タンパク質担体結合ドメイン
CA3024723A1 (en) 2016-05-20 2017-11-23 Robert B. Dubridge Single domain serum albumin binding protein
US11623958B2 (en) 2016-05-20 2023-04-11 Harpoon Therapeutics, Inc. Single chain variable fragment CD3 binding proteins
PT3461261T (pt) 2016-05-20 2025-07-31 Harpoon Therapeutics Inc Proteínas de ligação ao cd3 de fragmento variável de cadeia única
GB201610198D0 (en) 2016-06-10 2016-07-27 Ucb Biopharma Sprl Anti-ige antibodies
CA3026151A1 (en) 2016-06-14 2017-12-21 Xencor, Inc. Bispecific checkpoint inhibitor antibodies
MX2018016265A (es) 2016-06-28 2019-07-04 Xencor Inc Anticuerpos heterodimericos que se unen al receptor 2 de somatostatina.
CA3030636A1 (en) 2016-07-14 2018-01-18 Genmab A/S Multispecific antibodies against cd40 and cd137
IL303187A (en) 2016-08-29 2023-07-01 Akamis Bio Ltd Adenovirus with bispecific T cell activator
US10793632B2 (en) 2016-08-30 2020-10-06 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
PE20240950A1 (es) 2016-10-14 2024-05-06 Xencor Inc PROTEINAS DE FUSION FC HETERODIMERICAS IL 15/IL 15R(alfa)
WO2018083257A1 (en) 2016-11-03 2018-05-11 Psioxus Therapeutics Limited Oncolytic adenovirus encoding transgenes
WO2018083258A1 (en) 2016-11-03 2018-05-11 Psioxus Therapeutics Limited Oncolytic adenovirus encoding at least three transgenes
EP3544997A4 (en) 2016-11-23 2020-07-01 Harpoon Therapeutics, Inc. PROSTATE SPECIFIC MEMBRANE ANTIGEN BINDING PROTEIN
KR20190087539A (ko) 2016-11-23 2019-07-24 하푼 테라퓨틱스, 인크. Psma 표적화 삼중특이성 단백질 및 사용 방법
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
GB201621635D0 (en) 2016-12-19 2017-02-01 Ucb Biopharma Sprl Crystal structure
GB201621728D0 (en) 2016-12-20 2017-02-01 Ucb Biopharma Sprl Methods
EP3824906A1 (en) 2016-12-21 2021-05-26 Amgen Inc. Anti-tnf alpha antibody formulations
PE20191716A1 (es) * 2017-02-08 2019-12-05 Bristol Myers Squibb Co Polipeptidos de relaxina modificada que comprenden un mejorador farmacocinetico y sus usos
US11535668B2 (en) 2017-02-28 2022-12-27 Harpoon Therapeutics, Inc. Inducible monovalent antigen binding protein
WO2018162749A1 (en) 2017-03-09 2018-09-13 Genmab A/S Antibodies against pd-l1
WO2018183366A1 (en) 2017-03-28 2018-10-04 Syndax Pharmaceuticals, Inc. Combination therapies of csf-1r or csf-1 antibodies and a t-cell engaging therapy
WO2018178396A1 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Genmab Holding B.V. Bispecific anti-cd37 antibodies, monoclonal anti-cd37 antibodies and methods of use thereof
CN115028727A (zh) 2017-05-12 2022-09-09 哈普恩治疗公司 靶向msln的三特异性蛋白质及使用方法
BR112019023855B1 (pt) 2017-05-12 2021-11-30 Harpoon Therapeutics, Inc Proteínas de ligação à mesotelina
JP7537874B2 (ja) 2017-05-19 2024-08-21 シンダックス ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 併用療法
CA3063652A1 (en) 2017-06-01 2018-12-06 Psioxus Therapeutics Limited Oncolytic virus and method
US20200165347A1 (en) 2017-06-30 2020-05-28 Aslan Pharmaceuticals Pte Ltd Method of treatment using il-13r antibody
AU2018291497A1 (en) 2017-06-30 2020-01-16 Xencor, Inc. Targeted heterodimeric Fc fusion proteins containing IL-15/IL-15Ra and antigen binding domains
WO2019025545A1 (en) 2017-08-04 2019-02-07 Genmab A/S BINDING AGENTS BINDING TO PD-L1 AND CD137 AND THEIR USE
PE20200849A1 (es) 2017-10-10 2020-08-20 Numab Therapeutics AG Anticuerpo multiespecifico
EP3470426A1 (en) 2017-10-10 2019-04-17 Numab Therapeutics AG Multispecific antibody
IL315737A (en) 2017-10-13 2024-11-01 Harpoon Therapeutics Inc B-cell maturation antigen-binding proteins
JP7084990B2 (ja) 2017-10-13 2022-06-15 ハープーン セラピューティクス，インク． 三重特異性タンパク質と使用方法
US10981992B2 (en) 2017-11-08 2021-04-20 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
KR20200085828A (ko) 2017-11-08 2020-07-15 젠코어 인코포레이티드 신규의 항-pd-1 서열을 사용한 이중특이적 및 단일특이적 항체
EP3728302A1 (en) 2017-12-19 2020-10-28 Xencor, Inc. Engineered il-2 fc fusion proteins
EP4495142A3 (en) 2017-12-22 2025-05-07 Argenx BVBA Bispecific antigen binding construct
CN109970856B (zh) 2017-12-27 2022-08-23 信达生物制药(苏州)有限公司 抗lag-3抗体及其用途
GB201802486D0 (en) 2018-02-15 2018-04-04 Ucb Biopharma Sprl Methods
GB201802487D0 (en) 2018-02-15 2018-04-04 Argenx Bvba Cytokine combination therapy
WO2019179391A1 (en) * 2018-03-19 2019-09-26 Wuxi Biologics (Shanghai) Co., Ltd. Novel bispecific pd-1/ctla-4 antibody molecules
WO2019182996A1 (en) * 2018-03-19 2019-09-26 The Regents Of The University Of California Antibody-interferon fusion proteins for enhancing adoptive t cell therapies for the treatment of cancer
EP3773911A2 (en) 2018-04-04 2021-02-17 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind fibroblast activation protein
MX2020010910A (es) 2018-04-18 2021-02-09 Xencor Inc Proteinas de fusion heterodimericas dirigidas a pd-1 que contienen proteinas de fusion il-15 / il-15ra fc y dominios de union al antigeno pd-1 y usos de los mismos.
KR20210003814A (ko) 2018-04-18 2021-01-12 젠코어 인코포레이티드 IL-15/IL-15Rα Fc-융합 단백질 및 TIM-3 항원 결합 도메인을 함유하는 TIM-3 표적화 이종이량체 융합 단백질
WO2019222283A1 (en) 2018-05-14 2019-11-21 Harpoon Therapeutics, Inc. Binding moiety for conditional activation of immunoglobulin molecules
PT3806898T (pt) 2018-06-18 2025-12-02 UCB Biopharma SRL Antagonista de gremlin-1 para utilização no tratamento do cancro
GB201811368D0 (en) 2018-07-11 2018-08-29 Ucb Biopharma Sprl Antibody
BR112021002164A2 (pt) 2018-08-13 2021-08-03 Inhibrx, Inc. polipeptídeos de ligação a ox40 e usos dos mesmos
DK3841120T3 (da) 2018-08-21 2025-10-20 Citryll B V Antistoffer, der binder sig til citrullineret histon 2a og/eller 4
US12460000B2 (en) 2018-09-07 2025-11-04 Itabmed (Hk) Limited Anti-CD19 and anti-CD3 bispecific antigen binding proteins and uses thereof
US12195544B2 (en) 2018-09-21 2025-01-14 Harpoon Therapeutics, Inc. EGFR binding proteins and methods of use
CN113286817B (zh) 2018-09-25 2025-01-28 哈普恩治疗公司 Dll3结合蛋白及使用方法
MX2021003765A (es) 2018-10-03 2021-07-15 Xencor Inc Proteínas il-12 de fusión a fc heterodimérico.
MX2021003756A (es) 2018-10-04 2021-08-11 Genmab Holding B V Composiciones farmaceuticas que comprenden anticuerpos anti cumulo de diferenciacion 37 (cd37) biespecificos.
KR20260014044A (ko) 2018-10-16 2026-01-29 유씨비 바이오파마 에스알엘 중증근무력증의 치료 방법
GB201817311D0 (en) 2018-10-24 2018-12-05 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
GB201817309D0 (en) 2018-10-24 2018-12-05 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
MA54139A (fr) 2018-11-06 2021-09-15 BioNTech SE Formulation d'anticorps
WO2020132810A1 (en) 2018-12-24 2020-07-02 Generon (Shanghai) Corporation Ltd. Multispecific antigen binding proteins capable of binding cd19 and cd3, and use thereof
GB201900732D0 (en) 2019-01-18 2019-03-06 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
TWI756621B (zh) * 2019-01-25 2022-03-01 大陸商信達生物製藥（蘇州）有限公司 新型雙特異性抗體分子以及同時結合pd-l1和lag-3的雙特異性抗體
WO2020176478A1 (en) 2019-02-25 2020-09-03 The University Of Chicago Methods and compositions for treating inflammatory and autoimmune conditions with ecm-affinity peptides linked to anti-inflammatory agents
AU2020232605A1 (en) 2019-03-01 2021-10-21 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind ENPP3 and CD3
US12516128B2 (en) 2019-05-14 2026-01-06 Harpoon Therapeutics, Inc. EpCAM binding proteins and methods of use
CN113416258B (zh) * 2019-10-24 2023-08-29 北京免疫方舟医药科技有限公司 一种多特异性抗体及其制备方法和用途
EP3816185A1 (en) 2019-11-04 2021-05-05 Numab Therapeutics AG Multispecific antibody directed against pd-l1 and a tumor-associated antigen
GB201917480D0 (en) 2019-11-29 2020-01-15 Univ Oxford Innovation Ltd Antibodies
CN110950967B (zh) * 2019-12-13 2022-05-13 山东民康生物科技有限公司 抗人血清白蛋白纳米抗体与il-2融合蛋白及制备方法
GB201919058D0 (en) 2019-12-20 2020-02-05 Ucb Biopharma Sprl Multi-specific antibodies
GB201919061D0 (en) 2019-12-20 2020-02-05 Ucb Biopharma Sprl Multi-specific antibody
GB201919062D0 (en) 2019-12-20 2020-02-05 Ucb Biopharma Sprl Antibody
GB202001447D0 (en) 2020-02-03 2020-03-18 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
WO2021155916A1 (en) 2020-02-04 2021-08-12 BioNTech SE Treatment involving antigen vaccination and binding agents binding to pd-l1 and cd137
CA3167317C (en) * 2020-02-12 2025-05-27 Eli Lilly And Company CRYSTALLIZATION OF ANTIBODIES OR ANTIGEN-BINDING FRAGMENTS
US20230151109A1 (en) 2020-02-13 2023-05-18 UCB Biopharma SRL Bispecific antibodies against cd9
US20230125234A1 (en) 2020-02-13 2023-04-27 UCB Biopharma SRL Anti cd44-ctla4 bispecific antibodies
EP4103608A1 (en) 2020-02-13 2022-12-21 UCB Biopharma SRL Bispecific antibodies against cd9 and cd137
US20230096030A1 (en) 2020-02-13 2023-03-30 UCB Biopharma SRL Bispecific antibodies against cd9 and cd7
ES2975410T3 (es) 2020-02-13 2024-07-05 UCB Biopharma SRL Anticuerpos biespecíficos que se unen a HVEM y CD9
IL295448A (en) 2020-02-21 2022-10-01 Harpoon Therapeutics Inc flt3 binding proteins and methods of use
WO2021164722A1 (zh) 2020-02-21 2021-08-26 江苏恒瑞医药股份有限公司 抗il-2抗体、其抗原结合片段及其医药用途
TWI908779B (zh) * 2020-03-17 2025-12-21 美商西雅圖免疫公司 引導及導航控制(gnc)抗體樣蛋白質及製造與使用其之方法
CA3168613A1 (en) 2020-03-18 2021-09-23 Genmab A/S Antibodies binding to b7h4
CA3175034A1 (en) 2020-03-27 2021-09-30 UCB Biopharma SRL Autonomous knob domain peptides
CN113461824A (zh) * 2020-03-31 2021-10-01 普米斯生物技术(珠海)有限公司 一种构建多特异性抗体的平台
CA3176436A1 (en) 2020-05-08 2021-11-11 Tahamtan Ahmadi Bispecific antibodies against cd3 and cd20
CN115397860B (zh) 2020-05-14 2025-06-13 江苏恒瑞医药股份有限公司 抗cd25抗体、其抗原结合片段及其医药用途
US11919956B2 (en) 2020-05-14 2024-03-05 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (PSMA) and CD3
EP3915580A1 (en) 2020-05-29 2021-12-01 Numab Therapeutics AG Multispecific antibody
US20230220111A1 (en) 2020-07-02 2023-07-13 Beijing Tuo Jie Biopharmaceutical Co. Ltd. Anti-fxi/fxia antibody, antigen-binding fragment thereof, and pharmaceutical use thereof
BR112023001359A2 (pt) 2020-07-27 2023-02-14 Tuojie Biotech Shanghai Co Ltd Conjugado de anticorpo-fármaco anti-cd79b, método de preparação do mesmo e uso farmacêutico do mesmo
CN116194477A (zh) 2020-08-06 2023-05-30 生物技术欧洲股份公司 冠状病毒s蛋白的结合剂
GB202012326D0 (en) 2020-08-07 2020-09-23 Citryll B V Diagnostic
JP7773528B2 (ja) 2020-08-19 2025-11-19 ゼンコア インコーポレイテッド 抗ｃｄ２８組成物
US20240034812A1 (en) 2020-09-10 2024-02-01 Genmab A/S Bispecific antibody against cd3 and cd20 in combination therapy for treating diffuse large b-cell lymphoma
JP2023541858A (ja) 2020-09-10 2023-10-04 ジェンマブ エー／エス 慢性リンパ球性白血病を治療するためのｃｄ３及びｃｄ２０に対する二重特異性抗体
CN116348494A (zh) 2020-10-13 2023-06-27 阿尔米雷尔有限公司 双特异性分子和使用其的治疗方法
JP2023547795A (ja) 2020-10-15 2023-11-14 ユーシービー バイオファルマ エスアールエル Ｃｄ４５を多量体化する結合分子
EP3988568A1 (en) 2020-10-21 2022-04-27 Numab Therapeutics AG Combination treatment
WO2022089767A1 (en) 2020-11-02 2022-05-05 UCB Biopharma SRL Use of anti-trem1 neutralizing antibodies for the treatment of motor neuron neurodegenerative disorders
KR20230118128A (ko) 2020-12-07 2023-08-10 유씨비 바이오파마 에스알엘 인터루킨-22에 대한 항체
EP4255926A1 (en) 2020-12-07 2023-10-11 UCB Biopharma SRL Multi-specific antibodies and antibody combinations
KR20230166075A (ko) 2021-02-02 2023-12-06 누맙 세러퓨틱스 아게 Ror1 및 cd3에 대한 특이성을 가지는 다중 특이적 항체
GB202102227D0 (en) 2021-02-17 2021-03-31 UCB Biopharma SRL Antibodies
CA3212665A1 (en) 2021-03-09 2022-09-15 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cldn6
KR20230154311A (ko) 2021-03-10 2023-11-07 젠코어 인코포레이티드 Cd3 및 gpc3에 결합하는 이종이량체 항체
JP2024518724A (ja) 2021-04-25 2024-05-02 江▲蘇▼恒瑞医▲薬▼股▲フン▼有限公司 抗ｍａｓｐ２抗体、その抗原結合断片および医薬用途
JP2024516305A (ja) 2021-05-03 2024-04-12 ユーシービー バイオファルマ エスアールエル 抗体
EP4085973A1 (en) 2021-05-04 2022-11-09 Citryll B.V. Inhibition of eosinophil extracellular traps
MX2023013021A (es) 2021-05-04 2024-02-12 Citryll B V Inhibicion de trampas extracelulares.
EP4334359A1 (en) 2021-05-07 2024-03-13 Genmab A/S Pharmaceutical compositions comprising bispecific antibodies binding to b7h4 and cd3
BR112023027006A2 (pt) 2021-06-21 2024-03-12 BioNTech SE Método para reduzir ou prevenir a progressão de um tumor ou tratar um câncer em um sujeito, e, agente de ligação
BR112023026111A2 (pt) 2021-06-28 2024-03-05 Jiangsu Hengrui Pharmaceuticals Co Ltd Anticorpo anti-cd40, fragmento de ligação ao antígeno e uso médico do mesmo
WO2023285878A1 (en) 2021-07-13 2023-01-19 Aviation-Ophthalmology Methods for detecting, treating, and preventing gpr68-mediated ocular diseases, disorders, and conditions
CN113527503A (zh) * 2021-07-27 2021-10-22 福建医科大学 一种用于类风湿性关节炎的抗VEGF和TNF-α双特异性纳米抗体融合蛋白
GB202111905D0 (en) 2021-08-19 2021-10-06 UCB Biopharma SRL Antibodies
CN117642424A (zh) 2021-08-25 2024-03-01 江苏恒瑞医药股份有限公司 一种含融合蛋白的药物组合物
CA3231320A1 (en) 2021-09-15 2023-03-23 Zhiliang CAO Protein specifically binding to pd-1 and pharmaceutical use thereof
US11814437B2 (en) 2021-10-08 2023-11-14 Genmab A/S Antibodies binding to CD30 and CD3
EP4183800A1 (en) 2021-11-19 2023-05-24 Medizinische Hochschule Hannover Novel sars-cov-2 neutralizing antibodies
CN118510815A (zh) 2022-02-11 2024-08-16 江苏恒瑞医药股份有限公司 免疫缀合物及其用途
WO2023174521A1 (en) 2022-03-15 2023-09-21 Genmab A/S Binding agents binding to epcam and cd137
GB202205200D0 (en) 2022-04-08 2022-05-25 Ucb Biopharma Sprl Combination with chemotherapy
GB202205203D0 (en) 2022-04-08 2022-05-25 UCB Biopharma SRL Combination with inhibitor
WO2024038095A1 (en) 2022-08-16 2024-02-22 Iome Bio NOVEL ANTI-RGMb ANTIBODIES
EP4580753A1 (en) 2022-08-31 2025-07-09 Washington University Alphavirus antigen binding antibodies and uses thereof
GB202214756D0 (en) 2022-10-07 2022-11-23 Univ Oxford Innovation Ltd Product
GB202216284D0 (en) 2022-11-02 2022-12-14 Ucl Business Ltd Self-regulation
EP4626549A1 (en) 2022-11-28 2025-10-08 UCB Biopharma SRL Treatment of fibromyalgia
EP4643877A1 (en) 2022-12-28 2025-11-05 Suzhou Suncadia Biopharmaceuticals Co., Ltd. Composition of cd40-binding molecule and pharmaceutical use thereof
EP4681729A1 (en) 2023-03-15 2026-01-21 Shanghai Mabgen Biotech Ltd. Pharmaceutical composition containing pd-1/pvrig/tigit binding protein and medical use thereof
EP4442705A1 (en) 2023-04-03 2024-10-09 Citryll B.V. Dosage
TW202506178A (zh) 2023-04-05 2025-02-16 丹麥商珍美寶股份有限公司 包含與ｃｄ３０和ｃｄ３結合之抗體之醫藥組成物
US12351650B2 (en) 2023-06-30 2025-07-08 Genmab A/S Antibodies binding to fibroblast activation protein alpha and death receptor 4
AU2024323336A1 (en) * 2023-08-15 2026-02-26 Minghui Pharmaceutical (Hangzhou) Limited Single-domain antibody specifically binding to cdcp1 and use thereof
WO2025056180A1 (en) 2023-09-15 2025-03-20 BioNTech SE Methods of treatment using agents binding to epcam and cd137 in combination with pd-1 axis binding antagonists
AR133903A1 (es) * 2023-09-22 2025-11-12 Ablynx Nv Agentes de unión de albúmina bi- y multivalentes
GB202316779D0 (en) 2023-11-01 2023-12-13 Ucl Business Ltd Antigen binding protein
GB202318703D0 (en) 2023-12-07 2024-01-24 Citryll B V Diagnostic agent
GB202318820D0 (en) 2023-12-08 2024-01-24 UCB Biopharma SRL Antibodies
WO2025133290A1 (en) 2023-12-21 2025-06-26 Temper Bio Protein for immune regulation
TW202540204A (zh) 2024-01-26 2025-10-16 西班牙商阿爾米雷爾有限公司 雙特異性分子及使用其的治療方法
GB202403366D0 (en) 2024-03-08 2024-04-24 Univ Oxford Innovation Ltd Product
WO2025196217A1 (en) 2024-03-21 2025-09-25 UCB Biopharma SRL Treatment of tauopathies with tau-binding antibodies
WO2025238133A1 (en) 2024-05-17 2025-11-20 UCB Biopharma SRL Multispecific antibody with binding specificity for il-11 and il-17
WO2025238135A2 (en) 2024-05-17 2025-11-20 UCB Biopharma SRL Antibody with binding specificity for il-11
WO2026027660A1 (en) 2024-08-02 2026-02-05 UCB Biopharma SRL Formulations of anti-gremlin-1 antibodies

Family Cites Families (112)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
WO1988001649A1 (en) 1986-09-02 1988-03-10 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
EP1541682A3 (en) 1988-09-02 2005-07-06 Dyax Corp. Generation and selection of recombinant varied binding proteins
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
FI903489A0 (fi) 1988-11-11 1990-07-10 Medical Res Council Ligander med en enda sektion, receptorer innehaollande naemnda ligander, foerfaranden foer deras framstaellning samt anvaendning av liganderna och receptorerna.
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US6267964B1 (en) 1989-08-01 2001-07-31 Affibody Technology Sweden Ab Stabilized protein or peptide conjugates able to bond albumin having extended biological half-lives
SE509359C2 (sv) 1989-08-01 1999-01-18 Cemu Bioteknik Ab Användning av stabiliserade protein- eller peptidkonjugat för framställning av ett läkemedel
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
WO1991010737A1 (en) 1990-01-11 1991-07-25 Molecular Affinities Corporation Production of antibodies using gene libraries
US5780225A (en) 1990-01-12 1998-07-14 Stratagene Method for generating libaries of antibody genes comprising amplification of diverse antibody DNAs and methods for using these libraries for the production of diverse antigen combining molecules
ES2087997T3 (es) 1990-01-12 1996-08-01 Cell Genesys Inc Generacion de anticuerpos xenogenicos.
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
WO1992002551A1 (en) 1990-08-02 1992-02-20 B.R. Centre Limited Methods for the production of proteins with a desired function
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
ES2108048T3 (es) 1990-08-29 1997-12-16 Genpharm Int Produccion y utilizacion de animales inferiores transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
US5698426A (en) 1990-09-28 1997-12-16 Ixsys, Incorporated Surface expression libraries of heteromeric receptors
DE69129154T2 (de) 1990-12-03 1998-08-20 Genentech, Inc., South San Francisco, Calif. Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
ATE414768T1 (de) 1991-04-10 2008-12-15 Scripps Research Inst Bibliotheken heterodimerer rezeptoren mittels phagemiden
DE4118120A1 (de) * 1991-06-03 1992-12-10 Behringwerke Ag Tetravalente bispezifische rezeptoren, ihre herstellung und verwendung
GB9113120D0 (en) 1991-06-18 1991-08-07 Kodak Ltd Photographic processing apparatus
JPH07501451A (ja) 1991-11-25 1995-02-16 エンゾン・インコーポレイテッド 多価抗原結合タンパク質
ATE463573T1 (de) 1991-12-02 2010-04-15 Medimmune Ltd Herstellung von autoantikörpern auf phagenoberflächen ausgehend von antikörpersegmentbibliotheken
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
DE69308573T2 (de) 1992-08-17 1997-08-07 Genentech Inc Bispezifische immunoadhesine
EP1498427B1 (en) 1992-08-21 2009-12-16 Vrije Universiteit Brussel Immunoglobulins devoid of light chains
GB9221657D0 (en) * 1992-10-15 1992-11-25 Scotgen Ltd Recombinant bispecific antibodies
DK0672142T3 (da) 1992-12-04 2001-06-18 Medical Res Council Multivalente og multispecifikke bindingsproteiner samt fremstilling og anvendelse af disse
WO1995009917A1 (en) 1993-10-07 1995-04-13 The Regents Of The University Of California Genetically engineered bispecific tetravalent antibodies
WO1995015982A2 (en) 1993-12-08 1995-06-15 Genzyme Corporation Process for generating specific antibodies
DE69531148T2 (de) 1994-01-31 2004-04-29 Trustees Of Boston University, Boston Bibliotheken aus polyklonalen antikörpern
US5972901A (en) * 1994-03-23 1999-10-26 Case Western Reserve University Serpin enzyme complex receptor--mediated gene transfer
US5516637A (en) 1994-06-10 1996-05-14 Dade International Inc. Method involving display of protein binding pairs on the surface of bacterial pili and bacteriophage
JPH0825785A (ja) * 1994-07-21 1996-01-30 Brother Ind Ltd 立体画像形成用シート
US5641870A (en) * 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
JP2978435B2 (ja) 1996-01-24 1999-11-15 チッソ株式会社 アクリロキシプロピルシランの製造方法
AU728657B2 (en) 1996-03-18 2001-01-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US6239259B1 (en) * 1996-04-04 2001-05-29 Unilever Patent Holdings B.V. Multivalent and multispecific antigen-binding protein
EP0922111B1 (en) * 1996-07-23 2004-12-01 Tanox Pharma B.V. Induction of t cell tolerance using a soluble molecule that can simultaneously block two costimulatory pathways
GB9625640D0 (en) 1996-12-10 1997-01-29 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
DE19653722C2 (de) 1996-12-10 2000-06-29 Brose Fahrzeugteile Beidseitig wirkende Verstellvorrichtung
IL131406A0 (en) 1997-02-21 2001-01-28 Genentech Inc Antibody fragment-polymer conjugates and humanized anti-il-8 monoclonal antibodies
GB9720054D0 (en) 1997-09-19 1997-11-19 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
EP1027439B1 (en) * 1997-10-27 2010-03-17 Bac Ip B.V. Multivalent antigen-binding proteins
DK1049787T3 (da) * 1998-01-23 2005-04-04 Vlaams Interuniv Inst Biotech Antistofderivater med flere anvendelsesmuligheder
DE19819846B4 (de) * 1998-05-05 2016-11-24 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Multivalente Antikörper-Konstrukte
GB9812545D0 (en) 1998-06-10 1998-08-05 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
US7074405B1 (en) * 1998-06-22 2006-07-11 Immunomedics, Inc. Use of bi-specific antibodies for pre-targeting diagnosis and therapy
US20060228364A1 (en) 1999-12-24 2006-10-12 Genentech, Inc. Serum albumin binding peptides for tumor targeting
ES2270893T3 (es) 1999-12-24 2007-04-16 Genentech, Inc. Procedimiento y composiciones para prolongar la vida media de compuestos bioactivos.
ES2637801T3 (es) 2000-04-11 2017-10-17 Genentech, Inc. Anticuerpos multivalentes y usos de los mismos
DE10021678A1 (de) 2000-05-05 2002-04-18 Stefan Duebel Antikörperkonstrukte mit variablen Regionen
JP2004511430A (ja) * 2000-05-24 2004-04-15 イムクローン　システムズ　インコーポレイティド 二重特異性免疫グロブリン様抗原結合蛋白および製造方法
CN101525384A (zh) 2000-06-29 2009-09-09 艾博特公司 双特异性抗体及其制备方法和用途
US20020010334A1 (en) * 2000-06-30 2002-01-24 Xun Li Processes to prepare pyrimidinediones
AU2001270609A1 (en) 2000-06-30 2002-01-14 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Heterodimeric fusion proteins
ATE545703T1 (de) 2000-07-25 2012-03-15 Immunomedics Inc Multivalentes zielbindendes protein
CA2440582A1 (en) 2001-03-09 2002-10-03 Dyax Corp. Serum albumin binding moieties
CA2447851C (en) * 2001-06-28 2012-08-28 Domantis Limited Dual-specific ligand and its use
DE60124912T2 (de) * 2001-09-14 2007-06-14 Affimed Therapeutics Ag Multimerische, einzelkettige, Tandem-Fv-Antikörper
JP2005289809A (ja) * 2001-10-24 2005-10-20 Vlaams Interuniversitair Inst Voor Biotechnologie Vzw (Vib Vzw) 突然変異重鎖抗体
AU2003201092A1 (en) 2002-01-17 2003-07-30 Koninklijke Philips Electronics N.V. Optical scanning device
CA2490009A1 (en) 2002-06-21 2003-12-31 Dyax Corporation Serum protein-associated target-specific ligands and identification method therefor
EP1517921B1 (en) 2002-06-28 2006-06-07 Domantis Limited Dual specific ligands with increased serum half-life
EP1545430A4 (en) * 2002-09-16 2006-01-04 Elusys Therapeutics Inc BISPECIFIC MOLECULE COMPRISING ANTI-CR1TICTIC ANTIBODY TO ANTIGENIC BINDING ANTIBODY FRAGMENT
WO2004041862A2 (en) 2002-11-08 2004-05-21 Ablynx N.V. Single domain antibodies directed against tumour necrosis factor-alpha and uses therefor
JP4603894B2 (ja) 2002-12-03 2010-12-22 ユセベ ファルマ ソシエテ アノニム 抗体産生細胞を同定するためのアッセイ
GB0230203D0 (en) 2002-12-27 2003-02-05 Domantis Ltd Fc fusion
GB0230201D0 (en) * 2002-12-27 2003-02-05 Domantis Ltd Retargeting
EP1578801A2 (en) * 2002-12-27 2005-09-28 Domantis Limited Dual specific single domain antibodies specific for a ligand and for the receptor of the ligand
RU2357974C2 (ru) * 2003-01-10 2009-06-10 Аблинкс Н.В. Терапевтические полипептиды, их гомологи, их фрагменты и их применение для модуляции агрегации, опосредованной тромбоцитами
GB0312481D0 (en) 2003-05-30 2003-07-09 Celltech R&D Ltd Antibodies
US20050163782A1 (en) 2003-06-27 2005-07-28 Biogen Idec Ma Inc. Modified binding molecules comprising connecting peptides
SI1639011T1 (sl) 2003-06-30 2009-04-30 Domantis Ltd Pegilirana protitelesa z enojno domeno (dAb)
GB0315457D0 (en) 2003-07-01 2003-08-06 Celltech R&D Ltd Biological products
GB0315450D0 (en) 2003-07-01 2003-08-06 Celltech R&D Ltd Biological products
AU2004253738A1 (en) 2003-07-01 2005-01-13 Ucb Pharma S.A. Modified antibody Fab fragments
GB0411186D0 (en) 2004-05-19 2004-06-23 Celltech R&D Ltd Biological products
US7107710B2 (en) 2004-05-24 2006-09-19 Normand Savard Mounting bracket for side blade
TW200607523A (en) * 2004-06-01 2006-03-01 Domantis Ltd Drug compositions, fusions and conjugates
RU2007119989A (ru) * 2004-12-02 2009-01-10 Домантис Лимитед (Gb) Композиции, слитые конструкции и конъюгаты plad домена
EP3479844B1 (en) * 2005-04-15 2023-11-22 MacroGenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
RU2464276C2 (ru) 2005-05-18 2012-10-20 Аблинкс Н.В. Улучшенные нанотела против фактора некроза опухоли-альфа
US7612181B2 (en) * 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
EP2500352A1 (en) 2005-08-19 2012-09-19 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
GB0601513D0 (en) 2006-01-25 2006-03-08 Univ Erasmus Medical Ct Binding molecules 3
WO2007095338A2 (en) 2006-02-15 2007-08-23 Imclone Systems Incorporated Functional antibodies
GEP20135917B (en) 2006-03-17 2013-09-10 Biogen Idec Inc Stabilized polypeptide compositions
EP2418223A3 (en) 2006-06-12 2013-01-16 Emergent Product Development Seattle, LLC Single-chain multivalent binding proteins with effector function
AT503889B1 (de) 2006-07-05 2011-12-15 Star Biotechnologische Forschungs Und Entwicklungsges M B H F Multivalente immunglobuline
CA2691819A1 (en) * 2007-07-06 2009-02-19 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding peptides having a c-terminally disposed specific binding domain
EP2014680A1 (en) 2007-07-10 2009-01-14 Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Recombinant, single-chain, trivalent tri-specific or bi-specific antibody derivatives
WO2009018386A1 (en) 2007-07-31 2009-02-05 Medimmune, Llc Multispecific epitope binding proteins and uses thereof
CA2696263C (en) 2007-08-15 2017-06-13 Bing Liu Monospecific and multispecific antibodies and method of use
JP5592792B2 (ja) * 2007-09-26 2014-09-17 ユセベ ファルマ ソシエテ アノニム 二重特異性抗体の融合体
EP2050764A1 (en) 2007-10-15 2009-04-22 sanofi-aventis Novel polyvalent bispecific antibody format and uses thereof
CN101970490A (zh) 2007-11-27 2011-02-09 埃博灵克斯股份有限公司 针对异二聚体细胞因子和/或其受体的氨基酸序列以及包括所述氨基酸序列的多肽
EP2641919A3 (en) 2007-11-30 2014-05-07 Glaxo Group Limited Antigen-binding constructs
US8227577B2 (en) 2007-12-21 2012-07-24 Hoffman-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
LT2334705T (lt) * 2008-09-26 2017-03-27 Ucb Biopharma Sprl Biologiniai produktai
JP2012510821A (ja) 2008-12-04 2012-05-17 アボット・ラボラトリーズ 二重可変ドメイン免疫グロブリンおよびその使用
EP2435473B1 (en) 2009-05-27 2013-10-02 F.Hoffmann-La Roche Ag Tri- or tetraspecific antibodies
ES2667258T3 (es) 2009-09-10 2018-05-10 Ucb Biopharma Sprl Anticuerpos multivalentes
GB201005063D0 (en) 2010-03-25 2010-05-12 Ucb Pharma Sa Biological products

Also Published As

Publication number Publication date
EP2535349A1 (en) 2012-12-19
US20190127489A1 (en) 2019-05-02
CN101842387A (zh) 2010-09-22
JP6106640B2 (ja) 2017-04-05
CN104004088A (zh) 2014-08-27
CN101842387B (zh) 2014-05-07
US20160311930A1 (en) 2016-10-27
CA2700714A1 (en) 2009-04-02
JP2015002744A (ja) 2015-01-08
US20180118853A1 (en) 2018-05-03
EP2195341B1 (en) 2017-03-22
US8629246B2 (en) 2014-01-14
JP2010539921A (ja) 2010-12-24
EP2195341A1 (en) 2010-06-16
WO2009040562A1 (en) 2009-04-02
US20100239582A1 (en) 2010-09-23
JP5592792B2 (ja) 2014-09-17
US20140194596A1 (en) 2014-07-10
CA2700714C (en) 2018-09-11
US9309327B2 (en) 2016-04-12
EP2535351A2 (en) 2012-12-19
EP2535350B1 (en) 2018-01-24
US11427650B2 (en) 2022-08-30
ES2667729T3 (es) 2018-05-14
US9828438B2 (en) 2017-11-28
US10100130B2 (en) 2018-10-16
EP2535350A1 (en) 2012-12-19
CN104004088B (zh) 2017-11-07
EP2535351A3 (en) 2013-04-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2622460T3 (es) Fusiones de anticuerpos con doble especificidad
ES2736649T3 (es) Anticuerpos multivalentes estabilizados con disulfuro
ES2620603T3 (es) Productos biológicos