ES2620603T3 - Productos biológicos - Google Patents

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Abstract

Una proteína de fusión de anticuerpo multivalente que comprende un fragmento Fab o Fab', con una primera especificidad por un antígeno de interés, y que comprende además dos anticuerpos de dominio único (dAb) con especificidad por un segundo antígeno de interés, en la que los dos anticuerpos de dominio único están conectados por un enlace disulfuro y en la que los dos anticuerpos de dominio único son una pareja VH/VL y el VH de dAb está genéticamente condensado, directamente o a través de un conector, con el extremo C-terminal de la cadena pesada de Fab o Fab', y el VL de dAb está genéticamente condensado, directamente o a través de un conector, con el extremo C-terminal de la cadena ligera de Fab o Fab'.

Description

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Productos biologicos
La presente invencion se refiere a nuevas protefnas de fusion de anticuerpos de especificidad dual. Estos anticuerpos comprenden una primera especificidad por un antfgeno de interes, y una segunda especificidad por un segundo antfgeno de interes, por ejemplo, una protefna portadora serica para su uso en la extension de su semivida serica in vivo. Tambien se proporcionan metodos para la produccion de dichas moleculas y composiciones farmaceuticas que las comprenden.
La alta especificidad y afinidad de los anticuerpos los hacen agentes de diagnostico y terapeuticos ideales, concretamente para modular las interacciones protefna:protefna. Los avances en la tecnologfa de anticuerpos recombinantes han dado como resultado la produccion de fragmentos de anticuerpos, tales como fragmentos Fv, Fab, Fab' y F(ab')2 y otros fragmentos de anticuerpos. Estas moleculas mas pequenas conservan la actividad de union al antfgeno de los anticuerpos completos y tambien pueden mostrar una mejor penetracion en los tejidos y propiedades farmacocineticas, en comparacion con las moleculas de inmunoglobulina completas. En efecto, los fragmentos de anticuerpos estan demostrando ser agentes terapeuticos versatiles, tal como se observa por el reciente exito de productos tales como ReoPro® y Lucentis®. Aunque dichos fragmentos parecen mostrar una serie de ventajas frente a las inmunoglobulinas completas, tambien tienen el inconveniente de presentar una mayor velocidad de eliminacion del suero, puesto que carecen del dominio Fc que imparte una vida larga in vivo (Medasan et al., 1997, J. Immunol., 158:2211-2217).
Los anticuerpos con especificidad dual, es decir, que se unen a dos antfgenos diferentes, han sido previamente descritos (para unos analisis, vease Segal et al., 1999, Curr. Opin. Immunol., 11:558-562; Pluckthun y Pack, 1997, Immunotechnology, 3:83-105; Fischer y Leger, 2007, Pathobiology, 74, 3-14). Los anticuerpos de especificidad dual tambien se describen en los documentos WO02/02773, US2007065440, US2006257406, US2006106203 y US2006280734. Las estrategias previas para preparar moleculas basadas en anticuerpos heterobiespecfficos han empleado, en general, tecnicas de entrecruzamiento qufmico o de modificacion de protefnas. El entrecruzamiento qufmico ofrece bajos rendimientos de formacion de hetero- y homodfmeros y es necesaria su posterior separacion cromatografica. Las estrategias de modificacion de protefnas son muy complejas (por ejemplo, modificacion con la tecnica de boton en ojal; Ridgway et al., 1996, Protein Eng., 9(7):617-621) o emplean moleculas con caracterfsticas de estabilidad inapropiadas (por ejemplo, diacuerpos, scFv). En algunos casos, los anticuerpos biespecfficos tambien pueden presentar problemas de impedimentos estericos, de modo que ambos antfgenos no pueden unirse simultaneamente a cada brazo del anticuerpo.
El documento WO2007/109254 describe Fv monocatenarios estabilizados por un enlace disulfuro y moleculas que los comprenden. Schmiedl et al., Protein Engineering, vol. 13, n.° 10, 1 de octubre, 200, pp. 725 a 734, trata de la expresion de un fragmento de anticuerpo bc-Fv-bcFv biespecffico en E. coli. El documento WO2009/040562 describe una molecula de Fab unida a dos anticuerpos de dominio unico.
Los anticuerpos de dominio variable unico, que tambien se denominan anticuerpos de dominio unico o dAb, se corresponden con las regiones variables de la cadena pesada (VH) o ligera (VL) de un anticuerpo. Se han descrito anticuerpos de dominio unico murinos en Ward et al., 1989, Nature, 341, 544-546. Tambien se han descrito anticuerpos de domino unico humanos y humanos 'camelizados' (Holt et al., 2003, Trends in Biotechnology, 21, 484490). Tambien se han obtenido anticuerpos de dominio unico de camelidos (camellos y llamas) y peces cartilaginosos (tiburones alfombra y nodriza). Estos organismos han desarrollado dominios unicos similares a V de alta afinidad (denominados VhH en camelidos y V-NAR en tiburones), montados en un marco de dominio constante equivalente a Fc como componente integral y fundamental de su sistema inmunologico (vease Holliger y Hudson, para un analisis; 2005, Nature Biotechnology, 23(9):1126-1136).
Se han descrito fusiones de enzima-anticuerpo de dominio unico en el documento EP0368684. Tambien se han descrito fusiones de grupo efector-dominio unico en el documento WO2004/058820 que comprenden un unico dominio variable. Se han descrito inmunoglobulinas de dominio variable duales en el documento WO2007/024715. Se han descrito ligandos especfficos duales que comprenden dos anticuerpos de dominio unico con diferentes especificidades en el documento EP1517921.
Se conocen medios para mejorar la semivida de fragmentos de anticuerpos, tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 y otros fragmentos de anticuerpos. Una estrategia ha consistido en conjugar el fragmento a moleculas polimericas. Asf, los fragmentos de semivida corta en la circulacion Fab', F(ab')2 en animales han mejorado por medio de la conjugacion a polietilenglicol (PEG; veanse, por ejemplo, los documentos WO98/25791, WO99/64460 y WO98/37200). Otra estrategia ha consistido en modificar el fragmento de anticuerpo mediante su conjugacion con un agente que interacciona con el receptor FcRn (vease, por ejemplo, el documento WO97/34631). Otra estrategia para extender la semivida ha consistido en emplear polipeptidos que se unen a la albumina del suero (vease, por ejemplo, Smith et al., 2001, Bioconjugate Chem., 12:750-756; documento EP0486525; documento US6267964; documento WO04/001064; documento WO02/076489; y documento WO01/45746). Sin embargo, aun es necesario producir protefnas de inmunoglobulinas de union a antfgenos que tengan una semivida larga in vivo, como alternativa a las
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que poseen una semivida larga porque interaccionan con el receptor FcRn, sin que deban modificarse qufmicamente por medio de una conjugacion con PEG, o por medio de su conjugacion con la albumina del suero humana.
En el plasma existe una diversidad de protefnas y estas incluyen la protefna de union a tiroxina, la transtiretina, la glicoprotefna acida-a1, la transferrina, el fibrinogeno y la albumina, o cualquiera de sus fragmentos. Las protefnas portadoras sericas circulan dentro del cuerpo con unas semividas medidas en dfas, por ejemplo, 5 dfas para la protefna de union a tiroxina, o 2 dfas para la transtiretina (Bartalena y Robbins, 1993, Clinics in Lab. Med., 13:583598), o 65 horas en la segunda fase de recambio de la glicoprotefna acida-a1 yodada (Bree et al., 1986, Clin. Pharmacokin., 11:336-342). Los datos de Gitlin et al. (1964, J. Clin. Invest., 10:1938-1951) sugieren que, en mujeres embarazadas, la semivida de la glicoprotefna acida-a1 es de 3,8 dfas, 12 dfas para la transferrina y 2,5 dfas para el fibrinogeno. La albumina del suero es una protefna abundante en los compartimentos vasculares y extravasculares, con una semivida en el ser humano de aproximadamente 19 dfas (Peters, 1985, Adv. Protein Chem., 37:161-245). Esto resulta similar a la semivida de IgG1, que es de aproximadamente 21 dfas (Waldeman y Strober, 1969, Progr. Allergy, 13:1-110).
La presente realizacion proporciona protefnas de fusion de anticuerpos de especificidad dual mejoradas que pueden ser producidas de modo recombinantes y que son capaces de unirse a dos antfgenos simultaneamente, en particular dos antfgenos diferenciados/diferentes.
Por tanto, la presente invencion proporciona protefnas de fusion de anticuerpos de especificidad dual que comprenden un resto de inmunoglobulina, por ejemplo, un fragmento Fab o Fab', con una primera especificidad por un antfgeno de interes, y que comprenden ademas un anticuerpo de dominio unico (dAb) con especificidad por un segundo antfgeno de interes, en particular cuando el primer antfgeno y el segundo antfgeno son entidades diferentes.
Multivalente, tal como se emplea en la presente, significa una entidad que presenta dos o mas sitios de union, por ejemplo, dos o tres sitios de union, tal como dos sitios de union. Cada sitio de union puede unirse al mismo epitopo o a diferentes epitopos sobre el mismo antfgeno, o puede unirse a antfgenos diferentes (diferenciados).
La presente realizacion tambien proporciona protefnas de fusion de anticuerpos de especificidad dual que comprenden un resto de inmunoglobulina, por ejemplo un fragmento Fab o Fab', con una primera especificidad por un antfgeno de interes, y que comprenden ademas al menos un anticuerpo de dominio unico con una especificidad por un segundo antfgeno de interes.
Una fusion de anticuerpo de especificidad dual de la invencion sera capaz de unirse selectivamente a dos antfgenos de interes.
En una realizacion, el primer y el segundo antfgeno son el mismo antfgeno.
En una realizacion, un antfgeno de interes unido por el fragmento Fab o Fab' puede ser una protefna asociada a una celula, por ejemplo, una protefna de la superficie celular sobre celulas tales como celulas bacterianas, celulas de levadura, celulas T, celulas endoteliales o celulas tumorales, o puede ser una protefna soluble. Los antfgenos de interes tambien pueden ser cualquier protefna importante desde el punto de vista medico, tales como las protefnas sobrerreguladas durante una enfermedad o infeccion, por ejemplo receptores y/o sus correspondientes ligandos. Los ejemplos concretos de protefnas de la superficie celular incluyen moleculas de adhesion, por ejemplo, integrinas, tales como integrinas p1, por ejemplo, VLA-4, E-selectina, P-selectina o L-selectina, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD11a, CD11b, CD18, CD19, CD20, CD23, CD25, CD33, CD38, CD40, CD45, CDW52, CD69, CD134 (OX40), ICOS, BCMP7, CD137, CD27L, CDCP1, DPCR1, DPCR1, dudulina2, FLJ20584, FLJ40787, HEK2, KIAA0634, KIAA0659, KIAA1246, KIAA1455, LTBP2, LTK, MAL2, MRP2, similar a nectina-2, NKCC1, PTK7, RAIG1, TCAM1, SC6, BCMP101, BCMP84, BCMP11, DTD, antfgeno carcinoembrionario (CEA), globulina de la grasa de leche humana (HMFG1 y 2), antfgenos de MHC de clase I y MHC de clase II, y VEGF, y sus receptores, cuando resulte apropiado.
Los antfgenos solubles incluyen interleuquinas, tales como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-12, IL-16 o IL-17, antfgenos vfricos, por ejemplo, antfgenos del virus respiratorio sincitial o citomegalovirus, inmunoglobulinas, tales como IgE, interferones, tales como interferon a, interferon p o interferon y, factor de necrosis tumoral-a, factor de necrosis tumoral-p, factores estimulantes de colonias, tales como G-CSF o GM-CSF, y factores del crecimiento derivados de plaquetas, tales como PDGF-a, y PDGF-p y sus receptores, cuando resulte apropiado. Otros antfgenos incluyen antfgenos de la superficie celular bacteriana, toxinas bacterianas, virus, tales como gripe, EBV, HepA, B y C, agentes de terrorismo biologico, radionuclidos y metales pesados, y venenos y toxinas de serpientes y aranas.
En una realizacion, la protefna de fusion de anticuerpo de la invencion puede emplearse para alterar funcionalmente la actividad del antfgeno de interes. Por ejemplo, la protefna de fusion de anticuerpo puede neutralizar, antagonizar o agonizar la actividad de dicho antfgeno, directa o indirectamente.
En una realizacion, un segundo antfgeno de interes unido por el anticuerpo o anticuerpos de dominio unico en las protefnas de fusion de anticuerpos de especificidad dual de la invencion puede ser una protefna asociada a celulas, por ejemplo, una protefna de la superficie celular sobre celulas tales como celulas bacterianas, celulas de levadura,
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celulas T, celulas endoteliales o celulas tumorales, o puede ser una protefna soluble. Los antfgenos de interes tambien pueden ser cualquier protefna importante desde el punto de vista medico, tales como las protefnas sobrerreguladas durante una enfermedad o infeccion, por ejemplo receptores y/o sus correspondientes ligandos. Los ejemplos concretos de protefnas de la superficie celular incluyen moleculas de adhesion, por ejemplo, integrinas, tales como integrinas p1, por ejemplo, vLA-4, E-selectina, P-selectina o L-selectina, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CDIIa, CDIIb, CD18, CD19, CD20, CD23, CD25, CD33, CD38, CD40, CD45, CDW52, CD69, CD134 (OX40), ICOS, BCMP7, CD137, CD27L, CDCP1, DPCR1, DPCR1, dudulina2, FLJ20584, FLJ40787, HEK2, KIAA0634, KIAA0659, KIAA1246, KIAA1455, LTBP2, LTK, MAL2, MRP2, similar a nectina-2, NKCC1, PTK7, RAIG1, TCAM1, SC6, BCMP101, BCMP84, BCMP11, DTD, antfgeno carcinoembrionario (CEA), globulina de la grasa de leche humana (HMFG1 y 2), antfgenos de MHC de clase I y MHC de clase II, y VEGF, y sus receptores, cuando resulte apropiado.
Los antfgenos solubles incluyen interleuquinas, tales como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-12, IL-16 o IL-17, antfgenos vfricos, por ejemplo, antfgenos del virus respiratorio sincitial o citomegalovirus, inmunoglobulinas, tales como IgE, interferones, tales como interferon a, interferon p o interferon y, factor de necrosis tumoral-a, factor de necrosis tumoral-p, factores estimulantes de colonias, tales como G-CSF o GM-CSF, y factores del crecimiento derivados de plaquetas, tales como PDGF-a, y PDGF-p y sus receptores, cuando resulte apropiado. Otros antfgenos incluyen antfgenos de la superficie celular bacteriana, toxinas bacterianas, virus, tales como gripe, EBV, HepA, B y C, agentes de terrorismo biologico, radionuclidos y metales pesados, y venenos y toxinas de serpientes y aranas.
Otros antfgenos que pueden ser unidos por el anticuerpo o anticuerpos de dominio unico incluyen protefnas portadoras sericas, polipeptidos que permiten el reclutamiento de funciones efectoras mediado por celulas y protefnas quelantes de nuclidos.
Asf, en un ejemplo, la presente invencion proporciona protefnas de fusion de anticuerpos de especificidad dual que comprenden un resto de inmunoglobulina con una primera especificidad por un antfgeno de interes y que comprenden ademas un anticuerpo de dominio unico con especificidad por una segunda protefna, y esta ultima proporciona la capacidad de reclutar funciones efectoras, tales como la activacion de la via del complemento y/o el reclutamiento de celulas efectoras. Ademas, las protefnas de fusion de la presente invencion pueden emplearse para quelar radionuclidos en virtud de un anticuerpo de dominio unico que se une a una protefna quelante de nuclidos. Estas protefnas de fusion pueden utilizarse en la formacion de imagenes o en estrategias de transporte dirigido de radionuclidos en terapias.
Por consiguiente, en un ejemplo se proporciona una protefna de fusion de anticuerpo de especificidad dual aislada que comprende un fragmento de anticuerpo Fab o Fab' con especificidad por un antfgeno de interes, y dicho fragmento esta condensado con al menos dAb que posee especificidad por un polipeptido de reclutamiento, y dicho dAb proporciona la capacidad de reclutar una o mas funciones efectoras mediadas por celulas, directa o indirectamente, mediante la union a dicho polipeptido de reclutamiento.
El reclutamiento de funciones efectoras puede ser directo, porque dicha funcion efectora este asociada con una celula y dicha celula porta una molecula de reclutamiento sobre su superficie. El reclutamiento indirecto puede producirse cuando la union de un dAb a una molecula de reclutamiento provoque la liberacion, por ejemplo, de un factor que, a su vez, puede reclutar, directa o indirectamente, funciones efectoras, o puede producirse a traves de la activacion de una via de senalizacion. Los ejemplos incluyen TNFa, IL2, IL6, IL8, IL17, IFNy, histamina, C1q, opsonina y otros miembros de las cascadas de activacion del complemento clasicas y alternativas, tales como C2, C4, C3-convertasa, y C5 a C9.
Tal como se emplea en la presente, un 'polipeptido de reclutamiento' incluye un FcyR, tal como FcyRI, FcyRII y FcyRIII, una protefna de la via del complemento, tal como, pero sin limitarse a C1q y C3, una protefna marcadora de CD (marcador de la agrupacion de diferenciacion), tal como, pero sin limitarse a CD68, CD115, CD16, CD80, CD83, CD86, CD56, CD64, CD3, CD4, CD8, CD28, CD45, CD19, CD20 y CD22. Otros polipeptidos de reclutamiento que son protefnas marcadoras de CD incluyen CD1, CD1d, CD2, CD5, CD8, CD9, CD10, CD11, CD11a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD26, CD27, CD28, CD29, CD30, CD31, CD32, CD33, CD34, CD35, CD36, CD37, CD38, CD40, CD43, CD44, CD45, CD46, CD49, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD52, CD53, CD54, CD55, CD56, CD58, CD59, CD61, CD62, D62E, CD62L, CD62P, CD63, CD64, CD66e, CD68, CD70, CD71, CD72, CD79, CD80, CD81, CD82, CD83, CD84, CD85, CD86, CD88, CD89, CD90, CD94, CD95, CD98, CD 106, CD 114, CD116, CD 117, CD118, CD120, CD 122, CD130, CD131, CD132, CD133, CD134, CD135, CD137, CD138, CD141, CD142, CD143, CD146, CD147, CD151, CD152, CD153, CD154, CD155, CD162, CD164, CD169, CD184, CD206, CD209, CD257, CD278, CD281, CD282, CD283 y CD304, o cualquiera de sus fragmentos que conserven la capacidad de reclutar una funcion efectora mediada por celulas, directa o indirectamente. Un polipeptido de reclutamiento tambien incluye moleculas de inmunoglobulina, tales como IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE e IgA, que posean una funcion efectora.
En una realizacion, la segunda protefna por la cual el dAb presenta especificidad es una protefna de la via del complemento, siendo C1q particularmente preferida.
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En una realizacion preferida, la segunda protefna por la cual el dAb presenta especificidad es una protefna marcadora de CD, siendo CD68, CD80, CD86, CD64, CD3, CD4, CD8 CD45, CD16 y CD35 particularmente preferidas.
Por consiguiente, tambien se proporciona una protefna de fusion de anticuerpo de especificidad dual aislada que comprende un fragmento de anticuerpo con especificidad por un antfgeno de interes, y dicho fragmento esta condensado con al menos un dAb que presenta especificidad por una molecula de CD seleccionada del grupo que consiste en CD68, CD80, CD86, CD64, CD3, CD4, CD8 CD45, CD16 y CD35.
En una realizacion, el anticuerpo o anticuerpos de dominio unico proporcionan una semivida extendida al resto de inmunoglobulina con la primera especificidad.
Por consiguiente, en una realizacion se proporciona una protefna de fusion de anticuerpo de especificidad dual que comprende un fragmento de anticuerpo Fab o Fab' con especificidad por un antfgeno de interes, y dicho fragmento esta condensado con al menos un anticuerpo de dominio unico que presenta especificidad por una protefna portadora serica, una molecula de inmunoglobulina de la circulacion, o CD35/CR1, y dicho anticuerpo de dominio unico proporciona una semivida extendida al fragmento de anticuerpo con especificidad por dicho antfgeno de interes por medio de su union a dicha protefna portadora serica, molecula de inmunoglobulina de la circulacion o CD35/CR1.
En una realizacion se proporciona una protefna de fusion de anticuerpo de especificidad dual aislada que comprende un fragmento de anticuerpo Fab o Fab' con especificidad por un antfgeno de interes, y dicho fragmento esta condensado con al menos un anticuerpo de dominio unico que presenta especificidad por una protefna portadora serica, una molecula de inmunoglobulina de la circulacion, o CD35/CR1, y dicho anticuerpo de dominio unico proporciona una semivida extendida al fragmento de anticuerpo con especificidad por dicho antfgeno de interes por medio de su union a dicha protefna portadora serica, molecula de inmunoglobulina de la circulacion o CD35/CR1.
Tal como se emplea en la presente, las 'protefnas portadoras sericas' incluyen la protefna de union a tiroxina, la transtiretina, la glicoprotefna acida-a1, la transferrina, el fibrinogeno y la albumina, o cualquiera de sus fragmentos.
Tal como se emplea en la presente, una 'molecula de inmunoglobulina de la circulacion' incluye IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, sIgA, IgM e IgD, o cualquiera de sus fragmentos.
CD35/CR1 es una protefna presente sobre eritrocitos que presenta una semivida de 36 dfas (intervalo normal de 28 a 47 dfas; Lanaro et al., 1971, Cancer, 28(3):658-661).
En una realizacion preferida, la segunda protefna por la cual el dAb presenta especificidad es una protefna portadora serica, siendo particularmente preferida una protefna portadora serica humana. En una realizacion mas preferida, la protefna portadora serica es la albumina del suero humana.
Por consiguiente, se proporciona una protefna de fusion de anticuerpo con especificidad dual que comprende un fragmento de anticuerpo Fab o Fab' con especificidad por un antfgeno de interes, y dicho fragmento esta condensado con al menos un anticuerpo de dominio unico que presenta especificidad por la albumina del suero humana.
En una realizacion, la presente invencion proporciona una protefna de fusion de anticuerpo con especificidad dual aislada que comprende un fragmento de anticuerpo Fab o Fab' con especificidad por un antfgeno de interes, y dicho fragmento esta condensado con al menos un anticuerpo de dominio unico que presenta especificidad por la albumina del suero humana.
En una realizacion, el fragmento de anticuerpo con especificidad por un antfgeno de interes es un fragmento Fab. En otra realizacion, el fragmento de anticuerpo con especificidad por un antfgeno de interes es un fragmento Fab'.
Asf, en una realizacion mas preferida, las protefnas de fusion de anticuerpos de la invencion son protefnas de fusion de traduccion, es decir, fusiones geneticas, siendo codificadas cada una de sus secuencias por un vector de expresion.
En un ejemplo, los fragmentos de anticuerpo son fragmentos Fab' que poseen una region bisagra nativa o modificada. Cuando el fragmento de anticuerpo que se va a emplear para preparar la protefna de fusion de anticuerpo de especificidad dual de la invencion es un fragmento Fab', dicho fragmento se extiende, en general, en el extremo C-terminal de la cadena pesada por medio de uno o mas aminoacidos. Por tanto, una fusion de anticuerpo de la invencion puede comprender un fragmento Fab' condensado por traduccion (o qufmicamente condensado) con un dAb, directamente o a traves de un conector. Ademas, los ejemplos de fragmentos de anticuerpo Fab' adecuados incluyen los descritos en los documento W02005003170 y WO2005003171.
En otro ejemplo, los fragmentos de anticuerpos son fragmentos Fab. Asf, una fusion de anticuerpo de la invencion puede comprender un fragmento Fab condensado por traduccion (o qufmicamente condensada) con una secuencia
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de conector que, a su vez, esta condensada por traduccion (o qufmicamente condensado) a un dAb. Preferiblemente, el fragmento Fab es un fragmento Fab que termina en las cistefnas intercatenarias, tal como se describe en el documento WO2005/003169.
Los fragmentos de anticuerpo Fab o Fab' para su uso en la presente invencion pueden proceder de cualquier especie, pero preferiblemente se derivan de un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humano, o son fragmentos humanizados. Un fragmento de anticuerpo para su uso usado en la presente invencion puede proceder de cualquier clase (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD o IgA) o subclase de molecula de inmunoglobulina, y puede obtenerse de cualquier especie, que incluye, por ejemplo, raton, rata, tiburon, conejo, cerdo, hamster, camello, llama, cabra o ser humano.
En una realizacion, el fragmento de anticuerpo Fab o Fab' es un fragmento de anticuerpo monoclonal, totalmente humano, humanizado o quimerico. En una realizacion, los fragmentos de anticuerpo Fab o Fab' son totalmente humanos o estan humanizados.
Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar mediante cualquier metodo conocido en la tecnica, tal como la tecnica del hibridoma (Kohler y Milstein, Nature, 1975, 256, 495-497), la tecnica del trioma, la tecnica del hibridoma de celulas B humanas (Kozbor et al., Immunology Today, 1983, 4, 72) y la tecnica del EBV-hibridoma (Cole et al., "Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy", pags. 77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985).
Los anticuerpos para su uso en la invencion tambien pueden ser generados utilizando metodos de anticuerpos de linfocitos mediante la clonacion y expresion de ADNc de la region variable de inmunoglobulina generados a partir de linfocitos individuales seleccionados para la produccion de anticuerpos especfficos, por ejemplo, mediante los metodos descritos por Babcook, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93(15), 7843-7848, el documento WO 92/02551, el documento WO2004/051268 y el documento WO2004/106377.
Los anticuerpos humanizados son moleculas de anticuerpo procedentes de una especie no humana que tienen una o mas regiones determinantes de la complementariedad (CDR) procedentes de una especie no humana, y una region de marco procedente de una molecula de inmunoglobulina humana (vease, por ejemplo, el documento US 5.585.089).
Los anticuerpos para su utilizacion en la presente invencion tambien pueden ser generados utilizando diversos metodos de presentacion en fagos conocidos en la tecnica e incluyen los descritos por Brinkman et al., J. Immunol. Methods, 1995, 182, 41-50; Ames et al., J. Immunol. Methods, 1995, 184, 177-186; Kettleborough et al. Eur. J. Immunol., 1994, 24, 952-958; Persic et al., Gene, 1997 187, 9-18; y Burton et al., Advances in Immunology, 1994, 57, 191-280; documento WO 90/02809; documento WO 91/10737; documento WO 92/01047; documento WO 92/18619; documento WO 93/11236; documento WO 95/15982; y documento WO 95/20401; y documentos US 5.698.426; 5.223.409; 5.403.484; 5.580.717; 5.427.908; 5.750.753; 5,821,047; 5.571.698; 5.427.908; 5.516.637; 5.780.225; 5.658.727; 5.733.743; y 5.969.108. Ademas, se pueden utilizar ratones transgenicos u otros organismos, incluyendo otros mamfferos, para generar anticuerpos humanizados.
Los anticuerpos totalmente humanos son aquellos anticuerpos en los que las regiones variables y las regiones constantes (cuando estan presentes) de las cadenas pesadas y ligeras son en su totalidad de origen humano, o sustancialmente identicas a secuencias de origen humano, no necesariamente del mismo anticuerpo. Los ejemplos de anticuerpos completamente humanos pueden incluir anticuerpos producidos, por ejemplo, mediante los metodos de presentacion en fagos descritos anteriormente y anticuerpos producidos por ratones en los que los genes de las regiones variables y/o constantes de la inmunoglobulina murina han sido remplazados por sus homologos humanos, por ejemplo, tal como se describe en terminos generales en los documentos EP0546073 B1,US 5.545.806, US 5.569.825, US 5.625.126, US 5.633.425, US 5.661.016, US 5.770.429, EP 0438474 B1 y EP0463151 B1.
El material de partida del fragmento de anticuerpo Fab o Fab' para su uso en la presente invencion puede obtenerse a partir de cualquier anticuerpo completo, en especial un anticuerpo monoclonal completo, empleando cualquier tecnica de ruptura y/o digestion enzimatica adecuada, por ejemplo, por medio de un tratamiento con pepsina. Como alternativa, o ademas, el material de partida de anticuerpo puede prepararse mediante el uso de tecnicas de ADN recombinante que implican la manipulacion y la reexpresion del ADN que codifica las regiones variables y/o constantes del anticuerpo. Se pueden utilizar las tecnicas convencionales de la biologfa molecular para modificar, anadir o suprimir aminoacidos o dominios segun se desee. Cualquier alteracion de las regiones variables o constantes aun estara incluida en los terminos region 'variable' y 'constante' segun se utilizan en la presente memoria.
El material de partida del fragmento de anticuerpo puede ser obtenido a partir de cualquier especie incluyendo, por ejemplo, raton, rata, conejo, hamster, camello, Ilama, cabra o ser humano. Las partes del fragmento de anticuerpo se pueden obtener de mas de una especie, por ejemplo los fragmentos de anticuerpo pueden ser quimericos. En un ejemplo, las regiones constantes son de una especie y las regiones variables de otra. El material de partida del fragmento de anticuerpo tambien se puede modificar. En otro ejemplo, la region variable del fragmento de anticuerpo ha sido creada utilizando tecnicas de modificacion de ADN recombinante. Estas versiones modificadas incluyen aquellas creadas, por ejemplo, a partir de regiones variables de anticuerpos naturales por medio de inserciones,
deleciones o cambios en las secuencias de aminoacidos de los anticuerpos naturales. Los ejemplos concretos de este tipo incluyen aquellos dominios de la region variable modificados geneticamente que contienen al menos una CDR y, opcionalmente, uno o mas aminoacidos del marco de un anticuerpo y el resto del dominio de la region variable de un segundo anticuerpo. Los metodos para crear y fabricar estos fragmentos de anticuerpos son bien 5 conocidos en la tecnica (veanse por ejemplo, Boss et al., documento US 4.816.397; Cabilly et al., documento US 6.331.415; Shrader et al., documento WO 92/02551; Ward et al., 1989, Nature, 341, 544; Orlandi et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 3833; Riechmann et al., 1988, Nature, 322, 323; Bird et al., 1988, Science, 242, 423; Queen et al., documento US 5.585.089; Adair, documento WO91/09967; Mountain y Adair, 1992, Biotechnol. Genet. Eng. Rev, 10, 1-142; Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181).
10 En la presente invencion, cada anticuerpo de dominio unico condensado con el fragmento Fab o Fab' puede estar unido directamente o a traves de un conector.
Unido directamente, tal como se emplea en la presente, significa que el "ultimo" aminoacido del Fab o Fab' esta unido a traves de un enlace peptfdico al "primer" aminoacido del anticuerpo de dominio unico (o viceversa)
Los ejemplos de regiones de conectores adecuadas para unir un dAb a un Fab o Fab' incluyen, pero no se limitan a 15 secuencias de conectores flexibles y secuencias de conectores rfgidas. Las secuencias de conectores flexibles incluyen las descritas en Huston et al.,1988, PNAS, 85:5879-5883; Wright y Deonarain, Mol. Immunol., 2007, 44(11 ):2860-2869; Alfthan et al., Prot. Eng., 1995, 8(7):725-731; Luo et al., J. Biochem., 1995, 118(4):825-831; Tang et al., 1996, J. Biol. Chem., 271(26):15682-15686; y Turner et al., 1997, JIMM 205, 42-54 (vease la tabla 1 para los ejemplos representativos).
20 Tabla 1. Secuencias de conectores flexibles
SEQ ID NO:
SECUENCIA
1
SGGGGSE
2
DKTHTS
3
(S)GGGGS
45
(S)GGGGSGGGGS
46
(S)GGGGSGGGGSGGGGS
47
(S)GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
48
(S)GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
4
AAAGSG-GASAS
5
AAAGSG-XGGGS-GASAS
49
AAAGSG-XGGGSXGGGS -GASAS
50
AAAGSG- XGGGSXGGGSXGGGS -GASAS
51
AAAGSG- XGGGSXGGGSXGGGSXGGGS-GASAS
6
AAAGSG-XS-GASAS
7
PGGNRGTTTTRRPATTTGSSPGPTQSHY
8
ATTTGSSPGPT
9
ATTTGS
SEQ ID NO:
SECUENCIA
-
GS
10
EPSGPISTINSPPSKESHKSP
11
GTVAAPSVFIFPPSD
12
GGGGIAPSMVGGGGS
13
GGGGKVEGAGGGGGS
14
GGGGSMKSHDGGGGS
15
GGGGNLITIVGGGGS
16
GGGGVVPSLPGGGGS
17
GGEKSIPGGGGS
18
RPLSYRPPFPFGFPSVRP
19
YPRSIYIRRHPSPSLTT
20
TPSHLSHILPSFGLPTFN
21
RPVSPFTFPRLSNSWLPA
22
SPAAHFPRSIPRPGPIRT
23
APGPSAPSHRSLPSRAFG
24
PRNSIHFLHPLLVAPLGA
25
MPSLSGV LQVRYLSPPDL
26
SPQYPSPLTLTLPPHPSL
27
NPSLNPPSYLHRAPSRIS
28
LPWRTSLLPSLPLRRRP
29
PPLFAKGPVGLLSRSFPP
30
VPPAPVVSLRSAHARPPY
31
LRPTPPRVRSYTCCPTP-
32
PNVAHVLPLLTVPWDNLR
33
CNPLLPLCARSPAVRTFP
5
10
15
20
25
S) es opcional en la secuencia 3 y 45 a 48.
Los ejemplos de conectores ligidos incluyen las secuencias peptfdicas GAPAPAAPAPA (SEQ ID NO:34), PPPP (SEQ ID NO:35) y PPP.
En una realizacion, el conector peptfdico es un peptido de union a la albumina. Los ejemplos de los peptidos de union a la albumina se proporcionan en el documento WO 2007/106120 e incluyen:
Tabla 2
SEQ ID NO:
SECUENCIA
208
dlclrdwgclw
209
diclprwgclw
210
mediclprwgclwgd
211
qrlmediclprwgclwedde
212
qgligdiclprwgclwgrsv
213
qgligdiclprwgclwgrsvk
214
ediclprwgclwedd
215
rlmediclprwgclwedd
216
medtclprwgclwedd
217
mediclprwgclwed
218
rlmediclarwgclwedd
219
evrsfctrwpaeksckplrg
220
rapesfvcyweticferseq
221
emcyfpgicwm
En una realizacion, se emplea una secuencia bisagra de anticuerpo, o una de sus partes, como conector, por ejemplo, la secuencia bisagra superior. Generalmente, los fragmentos de anticuerpo Fab' para su uso en la presente invencion poseen una region bisagra nativa o modificada. Estas regiones bisagra se emplean como conector natural con el resto dAb. La region bisagra nativa es la region bisagra asociada normalmente al dominio Ch1 de la molecula de anticuerpo. Una region bisagra modificada es cualquier bisagra que difiera en longitud y/o composicion de la region bisagra nativa. Estas bisagras pueden incluir regiones bisagra de otras especies, tales como regiones bisagra de ser humano, raton, rata, conejo, hamster, camello, llama o cabra. Otras regiones bisagra modificadas pueden comprender una region bisagra completa procedente de un anticuerpo de una clase o subclase diferente a la del dominio Ch1. Asf pues, por ejemplo, un dominio Ch1 de clase y1 podna estar conectado a una region bisagra de clase y4. Como alternativa, la region bisagra modificada puede comprender parte de una bisagra natural o una unidad de repeticion en la que cada unidad de la repeticion procede de una region bisagra natural. En otra alternativa, se puede alterar la region bisagra natural al convertir una o varias cistemas u otros restos en restos neutros, tales como alanina, o al convertir los restos colocados idoneamente en restos cistema. Mediante tales medios, se puede incrementar o disminuir el numero de restos cistema de la region bisagra. Ademas se pueden controlar otras caractensticas de la bisagra, tales como la distancia de las cistemas de la bisagra desde la cistema intercatenaria de la cadena ligera, la distancia entre las cistemas de la bisagra y la composicion de otros aminoacidos de la bisagra que pueden afectar a las propiedades de la bisagra tales como la flexibilidad, por ejemplo, se pueden incorporar glicinas a la bisagra para aumentar la flexibilidad rotacional o se pueden incorporar prolinas para reducir la flexibilidad. Como alternativa, pueden incorporarse restos cargados o hidrofobos en la bisagra para
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conferir propiedades de multimerizacion; vease, por ejemplo, Richter et al., 2001, Prot. Eng., 14(10):775-783, para el uso de colas cargadas o ionicas, por ejemplo, colas acidas como conectores, y Kostelny et al., 1992, J. Immunol., 5(1):1547-1553 para secuencias de cremallera de leucina. Otras regiones bisagra modificadas pueden ser completamente sinteticas y se pueden disenar para que posean propiedades deseadas tales como longitud, composicion y flexibilidad.
Se han descrito una serie de regiones bisagra modificadas, por ejemplo, en los documentos US5.677.425, US6642356, WO9915549, W02005003170, WO2005003169, W02005003170, WO9825971 y WO2005003171.
Estas bisagras en general surgen de la region CH1, pero tambien pueden incorporarse en el extremo de la region constante de un fragmento kappa o lambda de cadena ligera; vease la tabla 3 para ejemplos.
Tabla 3. Secuencias conectoras bisagra
SEQ ID NO:
SECUENCIA
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DKTHTCAA
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DKTHTCPPCPA
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DKTHTCPPCPATCPPCPA
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DKTHTCPPCPATCPPCPATCPPCPA
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DKTHTCPPCPAGKPTLYNSLVMSDTAGTCY
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DKTHTCPPCPAGKPTHVNVSVVMAEVDGTCY
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DKTHTCCVECPPCPA
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DKTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPA
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DKTHTCPSCPA
Los dominios variables unicos, tambien denominados anticuerpos de dominio unico o dAb, para su uso en la presente invencion, pueden generarse empleando metodos conocidos en la tecnica, que incluyen los descritos en el documento WO2005118642, Ward et al., 1989, Nature, 341, 544-546, y Holt et al., 2003, Trends in Biotechnology, 21, 484-490. En una realizacion, un anticuerpo de dominio unico para su uso en la presente invencion es un dominio variable de cadena pesada (VH) o un dominio de cadena ligera (VL). Cada dominio de cadena ligera puede pertenecer al subgrupo kappa o lambda. En la tecnica se han descrito metodos para aislar los dominios VH y VL; vease, por ejemplo, el documento EP0368684, y Ward et al., supra. Estos dominios pueden proceder de cualquier especie adecuada o material de partida de anticuerpo. En una realizacion, el anticuerpo de dominio unico puede derivarse de un roedor, un ser humano u otra especie. En una realizacion, el anticuerpo de dominio unico esta humanizado.
En una realizacion, el anticuerpo de dominio unico se deriva de un banco de presentacion en fagos, empleando los metodos descritos, por ejemplo, en el documento WO2005/118642, Jespers et al., 2004, Nature Biotechnology, 22, 1161-1165, y Holt et al., 2003, Trends in Biotechnology, 21, 484-490. Preferiblemente, estos anticuerpos de dominio unico son totalmente humanos, pero tambien pueden proceder de otras especies. En una realizacion, el dominio variable unico es quimerico, puesto que el marco es de origen humano o sustancialmente humano, y la CDR o las CDR son de origen no humano. Se apreciara que la secuencia del anticuerpo de dominio unico, despues de ser aislada, puede modificarse para mejorar las caracterfsticas del anticuerpo de dominio unico, por ejemplo, la solubilidad, tal como se describe en Holt et al., supra.
Sustancialmente humano, tal como se emplea en la presente, significa que se conserva el caracter humano del material original, que puede ser importante para la inmunogenicidad. Un material sustancialmente humano incluirfa un material en el que un aminoacido en la secuencia de marco se anade, se deleciona o se sustituye por otro aminoacido.
En una realizacion, el dAb es una secuencia humana obtenida de una presentacion en fagos de scFv o de un raton transgenico Humouse™ o Velocimouse™ o de un roedor humanizado.
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En una realizacion, el dAb se obtiene a partir de un ser humano o roedor humanizado, un camelido o un tiburon. Este dAb preferiblemente estara humanizado. En un ejemplo, el anticuerpo de dominio unico es un dominio VHH basado en inmunoglobulinas de camelido, tal como se describe en el documento EP0656946. En un ejemplo, un camello o una llama se inmuniza con un antfgeno de interes y se recoge sangre cuando la titulacion sea la apropiada. El gen que codifica el dAb puede clonarse mediante PCR de una sola celula, o la celula o celulas B que codifican el dAb pueden inmortalizarse por medio de una transformacion con EBV, o mediante fusion con una lfnea de celulas inmortales.
Tal como se describio anteriormente en la presente, la presente realizacion proporciona protefnas de fusion de anticuerpos de especificidad dual que comprenden un fragmento de anticuerpo Fab o Fab' con especificidad por un antfgeno de interes, y dicho fragmento esta condensado con al menos un anticuerpo de dominio unico, directamente o a traves de un conector, que presenta especificidad por un segundo antfgeno de interes.
Por consiguiente, en una realizacion, el fragmento de anticuerpo, por ejemplo, un fragmento Fab o Fab', se condensa en el extremo N-terminal de la region variable de cadena pesada o ligera a un dAb, directamente o a traves de un conector. Como alternativa, el fragmento de anticuerpo Fab o Fab' se condensa en el extremo C- terminal de la cadena pesada o ligera a un dAb, directamente o a traves de un conector. En otra realizacion, las cadenas pesada y ligera del fragmento de anticuerpo Fab o Fab' se condensan cada una en el extremo C-terminal a un dAb, directamente o a traves de un conector. El enlace puede ser una conjugacion qufmica, pero, lo mas preferiblemente, es una fusion de traduccion, es decir, una fusion genetica en la que la secuencia de cada uno esta codificada en secuencia por un vector de expresion.
Generalmente, el extremo N-terminal del anticuerpo de dominio unico estara condensado con el extremo C-terminal de la cadena pesada o ligera del fragmento Fab o Fab', directamente o a traves de un conector, y cuando el anticuerpo de dominio unico esta condensado al extremo N-terminal del Fab o Fab', se condensara a traves de su extremo C-terminal, opcionalmente a traves de un conector.
En una realizacion, la presente invencion proporciona una protefna de fusion de anticuerpo de especificidad dual que comprende o que consiste en un fragmento de anticuerpo Fab o Fab' con especificidad por un antfgeno de interes, y dicho fragmento esta condensado con un anticuerpo de dominio unico en el extremo N-terminal de la cadena pesada o ligera que presenta especificidad por un segundo antfgeno de interes.
En una realizacion, la descripcion proporciona una protefna de fusion de anticuerpo de especificidad dual que comprende o que consiste en un fragmento de anticuerpo Fab o Fab' con especificidad por un antfgeno de interes, y dicho fragmento esta condensado con un anticuerpo de dominio unico en el extremo C-terminal de la cadena pesada o ligera que presenta especificidad por un segundo antfgeno de interes.
En una realizacion, la presente invencion proporciona una protefna de fusion de anticuerpo de especificidad dual que comprende o que consiste en un fragmento de anticuerpo Fab o Fab' con especificidad por un antfgeno de interes, y dicho fragmento esta condensado con al menos un anticuerpo de dominio unico en el extremo C-terminal de la cadena pesada o ligera que presenta especificidad por un segundo antfgeno de interes.
En una realizacion, la presente invencion proporciona una protefna de fusion de anticuerpo de especificidad dual que comprende o que consiste en un fragmento de anticuerpo Fab o Fab' con especificidad por un antfgeno de interes, y dicho fragmento esta condensado con dos anticuerpos de dominio unico, en la que cada anticuerpo de dominio unico esta condensado en secuencia lineal con respecto al otro, opcionalmente a traves de un conector, y la fusion de anticuerpo de dominio unico resultante esta condensada con el extremo C-terminal de la cadena ligera o la cadena pesada del fragmento Fab o Fab'.
En una realizacion, la presente invencion proporciona una protefna de fusion de anticuerpo de especificidad dual que comprende o que consiste en un fragmento de anticuerpo Fab o Fab' con especificidad por un antfgeno de interes, y dicho fragmento esta condensado con dos anticuerpos de dominio unico, en la que un anticuerpo de dominio unico esta condensado con el extremo C-terminal de la cadena ligera del fragmento Fab o Fab', y el otro anticuerpo de dominio unico esta condensado con el extremo C-terminal de la cadena pesada del fragmento Fab o Fab', y dichos anticuerpos de dominio unico presentan especificidad por un segundo antfgeno de interes.
En una realizacion en la que las cadenas pesada y ligera del fragmento Fab o Fab' comprenden, cada una, un anticuerpo de dominio unico en el extremo C-terminal, los dos anticuerpos de dominio unico son identicos, es decir, presentan la misma especificidad de union por el mismo antfgeno. En un ejemplo, se unen al mismo epitopo sobre el mismo antfgeno. Por ejemplo, los anticuerpos de dominio unico pueden ser ambos la misma VH de dAb, la misma VHH de dAb o la misma VL de dAb.
Preferiblemente, cuando las cadenas pesada y ligera del fragmento Fab o Fab' comprenden, cada una, un anticuerpo de dominio unico en el extremo C-terminal, los dos anticuerpos de dominio unico son una pareja VH/VL complementaria que se une al antfgeno de forma cooperativa, es decir, son una pareja VHNL complementaria que tiene la misma especificidad de union. Generalmente, seran una pareja VH/VL derivada del mismo anticuerpo.
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En una realizacion, cuando la protefna de fusion de anticuerpo de especificidad dual de la presente invencion comprende dos anticuerpos de dominio unico que son una pareja VH/VL complementaria, el anticuerpo de dominio unico de VH esta condensado con el extremo C-terminal de la region constante de cadena pesada (CH1), y el anticuerpo de dominio unico de VL esta condensado con el extremo C-terminal de la region constante de cadena ligera (C kappa o C lambda). En una realizacion, cuando la protefna de fusion de anticuerpo de especificidad dual de la presente invencion comprende dos anticuerpos de dominio unico que son una pareja VH/VL complementaria, el anticuerpo de dominio unico de VL esta condensado con el extremo C-terminal de la region constante de cadena pesada (CH1), y el anticuerpo de dominio unico de VH esta condensado con el extremo C-terminal de la region constante de cadena ligera (C kappa o C lambda).
En una realizacion, cuando la protefna de fusion de anticuerpo de especificidad dual de la presente invencion comprende dos anticuerpos de dominio unico que estan unidos por uno o mas enlaces disulfuro, por ejemplo, dos anticuerpos de dominio unico que son una pareja VHNL complementaria unida por uno o mas (tal como 1 o 2) enlaces disulfuro, el anticuerpo de dominio unico de VH esta condensado con el extremo C-terminal de la region constante de cadena pesada (CH1), y el anticuerpo de dominio unico de VL esta condensado con el extremo C- terminal de la region constante de cadena ligera (C kappa o C lambda). Como alternativa, el anticuerpo de dominio unico de VL esta condensado con el extremo C-terminal de la region constante de cadena pesada (CH1), y el anticuerpo de dominio unico de VH esta condensado con el extremo C-terminal de la region constante de cadena ligera (C kappa o C lambda).
Se cree que el enlace disulfuro proporciona mas estabilizacion a la construccion, lo cual puede resultar ventajoso.
En una o mas realizaciones, el enlace disulfuro entre la cadena pesada y ligera, tal como entre el dominio CH y el dominio CL o CK, no esta presente, por ejemplo debido a que una o mas cistefnas que forman el enlace han sido reemplazadas. Dichas una o mas cistefnas pueden ser reemplazadas, por ejemplo, por serina.
En una o mas realizaciones, esta presente un enlace disulfuro intercatenario entre la cadena pesada y ligera entre el dominio CH y el dominio CL o CK.
En una realizacion, se proporciona un fragmento F(ab)2 que comprende uno, dos, tres o cuatro anticuerpos de dominio unico, por ejemplo, dos parejas de VH/VL separadas que pueden dirigirse al mismo antfgeno o a antfgenos diferentes.
En las protefnas de fusion de especificidad dual de la presente invencion, el anticuerpo o anticuerpos de dominio unico se unen a un segundo antfgeno, diferente del antfgeno al que se une el componente de fragmento Fab o Fab'.
En un ejemplo, los dAb para su uso en la presente invencion muestran especificidad por una protefna de la via del complemento, una protefna marcadora de CD o un FcyR. En este caso, el dAb es preferiblemente especffico para una molecula de CD. Lo mas preferiblemente, el dAb muestra especificidad por una molecula de CD seleccionada del grupo que consiste en CD68, CD80, CD86, CD64, CD3, CD4, CD8 CD45, CD16 y CD35.
En un ejemplo preferido, los dAb para su uso en la presente invencion muestran especificidad por una protefna portadora serica, una molecula de inmunoglobulina de la circulacion, o CD35/CR1, y la protefna portadora serica preferiblemente es una protefna portadora serica humana, tal como la protefna de union a tiroxina, la transtiretina, la glicoprotefna acida-a1, la transferrina, el fibrinogeno o la albumina del suero. Lo mas preferiblemente, el dAb muestra especificidad por la albumina del suero humana. Asf, en un ejemplo, un conejo, un raton, una rata, un camello o una llama se inmuniza con una protefna portadora serica, una molecula de inmunoglobulina de la circulacion, o CD35/CR1 (por ejemplo, albumina del suero humana) y se recoge sangre cuando la titulacion sea la apropiada. El gen que codifica el dAb puede clonarse mediante PCR de una sola celula, o la celula o celulas B que codifican el dAb pueden inmortalizarse por medio de una transformacion con EBV, o mediante fusion con una lfnea de celulas inmortales. Como alternativa, el anticuerpo de dominio unico puede obtenerse mediante presentacion en fagos, tal como se describio anteriormente en la presente.
En una realizacion, el anticuerpo o anticuerpos de dominio unico se unen a la albumina del suero humana. En una realizacion, el anticuerpo o anticuerpos de dominio unico se unen a la albumina del suero humana, a la albumina del suero murina y a la albumina del suero de rata.
En una realizacion, el anticuerpo de dominio unico que se une a la albumina del suero es un dAb proporcionado en el documento WO2005/118642 (veanse, por ejemplo, las figuras 1c y 1d) o una VHH proporcionada en el documento WO2004/041862, o un nanocuerpo humanizado descrito, por ejemplo, en la tabla III del documento WO2006/122787.
En una realizacion, un anticuerpo de dominio unico que se une a la albumina del suero humana para su uso en la presente invencion es un anticuerpo de dominio unico de VH de cadena pesada, que comprende al menos una de una CDR que tiene la secuencia indicada en la figura 5 (e) SEQ ID NO:56 o la figura 5 (k) SEQ ID NO:62 para CDR- H1, una CDR que tiene la secuencia indicada en la figura 5 (f) SEQ ID NO:57 o la figura 5 (l) SEQ ID NO:63 para CDR-H2, y una CDR que tiene la secuencia indicada en la figura 5 (g) SEQ ID NO:58 o la figura 5 (m) SEQ ID NO:64 para CDR-H3.
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En otra realizacion, un anticuerpo de dominio unico que se une a la albumina del suero humana para su uso en la presente invencion es un anticuerpo de VH de cadena pesada, en el que al menos dos de CDR-H1, CDR-H2 y CDR- H3 del dominio VH se seleccionan de lo siguiente: la secuencia proporcionada en SEQ ID NO:56 o 62 para CDR-H1, la secuencia proporcionada en SEQ ID NO:57 o SEQ ID NO:63 para CDR-H2 y la secuencia proporcionada en SEQ ID NO:58 o SEQ ID NO:64 para CDR-H3. Por ejemplo, el anticuerpo de dominio unico puede comprender un dominio VH en el que CDR-H1 tiene la secuencia indicada en SEQ ID NO:56, y CDR-H2 tiene la secuencia indicada en SEQ ID NO:57. Como alternativa, el anticuerpo de dominio unico puede comprender un dominio VH en el que CDR-H1 tiene la secuencia indicada en SEQ ID NO:56, y CDR-H3 tiene la secuencia indicada en SEQ ID NO:58. Con el fin de evitar dudas, se entiende que estan incluidas todas las permutaciones.
En otra realizacion, un anticuerpo de dominio unico que se une a la albumina del suero humana para su uso en la presente invencion es un anticuerpo de dominio unico de VH cadena pesada, en el que el dominio VH comprende la secuencia indicada en SEQ ID NO:56 para CDR-H1, la secuencia indicada en SEQ ID NO:57 para CDR-H2 y la secuencia indicada en SEQ ID NO:58 para CDR-H3.
En otra realizacion, un anticuerpo de dominio unico que se une a la albumina del suero humana para su uso en la presente invencion es un anticuerpo de dominio unico de VH cadena pesada, en el que el dominio VH comprende la secuencia indicada en SEQ ID NO:62 para CDR-H1, la secuencia indicada en SEQ ID NO:63 para CdR-H2 y la secuencia indicada en SEQ ID NO:64 para CDR-H3.

En una realizacion, un anticuerpo de dominio unico que se une a la albumina del suero humana para su uso en la

presente invencion es un anticuerpo de dominio unico de VH cadena pesada humanizado, dAbH1, que tiene la
secuencia indicada en la figura 5 (a) (SEQ ID NO:52). Un ejemplo de una fusion CH1-dAbH1 adecuada que comprende un conector G4S se indica en la figura 6 (SEQ ID NO:68).

En una realizacion, un anticuerpo de dominio unico que se une a la albumina del suero humana para su uso en la

presente invencion es un anticuerpo de dominio unico de VH cadena pesada humanizado, dAbH2, que tiene la
secuencia indicada en la figura 5 (c) (SEQ ID NO:54). Un ejemplo de una fusion CH1-dAbH2 adecuada que comprende un conector G4S se indica en la figura 6 (SEQ ID NO:69).
Los restos en los dominios variables de un anticuerpo se numeran convenientemente segun un sistema disenado por Kabat et al. Este sistema se establece en Kabat et al., 1987, en Sequences of Proteins of Immunological Interest, Departamento de Salud y Servicios Sociales de EE.UU., NIH, EE.UU. (a partir de ahora, "Kabat et al. (anteriormente mencionado)"). En la presente especificacion se usa dicho sistema de numeracion, a menos que se indique lo contrario.
Las denominaciones de los restos de Kabat no siempre se corresponden directamente con la numeracion lineal de los restos aminoacidos. La secuencia lineal de aminoacidos real puede contener menos o mas aminoacidos que la numeracion de Kabat estricta correspondiente a un acortamiento o a una insercion en un componente estructural, region de marco o region determinante de la complementariedad (CDR), de la estructura del dominio variable basico. La numeracion de Kabat correcta de los restos se puede determinar para un anticuerpo dado por medio de un alineamiento de restos de homologfa en la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada de Kabat "convencional".
Las CDR del dominio variable de cadena pesada estan localizadas en los restos 31-35 (CDR-H1), los restos 50-65 (CDR-H2) y los restos 95-102 (CDR-H3) segun el sistema de numeracion Kabat. Sin embargo, segun Chothia (Chothia, C. y Lesk, A. M. J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987)), el bucle equivalente a CDR-H1 se extiende desde el resto 26 al resto 32. Por tanto, 'CDR-H1', tal como se usa en la presente, comprende los restos 26 a 35, descritos mediante una combinacion del sistema de numeracion Kabat y la definicion topologica de bucle de Chothia.
Las CDR del dominio de cadena ligera estan localizadas en los restos 24-34 (CDR-L1), los restos 50-56 (CDR-L2) y los restos 89-97 (CDR-L3) segun el sistema de numeracion Kabat.
En una realizacion, un anticuerpo de dominio unico que se une a la albumina del suero humana para su uso en la presente invencion es un anticuerpo de dominio unico de VL de cadena ligera, que comprende al menos una de una CDR que tiene la secuencia indicada en la figura 5 (h) SEQ ID NO:59 o la figura 5 (m) SeQ ID NO:65 para CDR-L1, una CDR que tiene la secuencia indicada en la figura 5 (i) SEQ ID NO:60 o la figura 5 (o) SEQ ID NO:66 para CDR- L2, y una CDR que tiene la secuencia indicada en la figura 5 (j) SEQ ID NO:61 o la figura 5 (p) SEQ ID NO:67 para CDR-L3.
En otra realizacion, un anticuerpo de dominio unico que se une a la albumina del suero humana para su uso en la presente invencion es un anticuerpo de VL de cadena ligera, en el que al menos dos de CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 del dominio VL se seleccionan de lo siguiente: la secuencia proporcionada en SEQ ID NO:59 o SEQ ID NO:65 para CDR-L1, la secuencia proporcionada en SEQ ID NO:60 o SEQ ID NO:66 para CDR-L2 y la secuencia proporcionada en SEQ ID NO:61 o SeQ ID NO:67 para CDR-L3. Por ejemplo, el anticuerpo de dominio puede comprender un dominio VL, en el que la CDR-L1 tiene la secuencia indicada en SEQ ID nO:59, y la CDR-L2 tiene la secuencia indicada en SEQ ID NO:60. Como alternativa, el anticuerpo de dominio puede comprender un dominio VL, en el que
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la CDR-L1 tiene la secuencia indicada en SEQ ID NO:59, y la CDR-L3 tiene la secuencia indicada en SEQ ID NO:61. Con el fin de evitar dudas, se entiende que estan incluidas todas las permutaciones.
En otra realizacion, un anticuerpo de dominio unico que se une a la albumina del suero humana para su uso en la presente invencion es un anticuerpo de dominio de VL cadena ligera, en el que el dominio VL comprende la
secuencia indicada en SEQ ID NO:59 para CDR-L1, la secuencia indicada en SeQ ID NO:60 para CDR-L2 y la
secuencia indicada en SEQ ID NO:61 para CDR-L3.
En otra realizacion, un anticuerpo de dominio unico que se une a la albumina del suero humana para su uso en la presente invencion es un anticuerpo de dominio de VL cadena ligera, en el que el dominio Vl comprende la
secuencia indicada en SEQ ID NO:65 para CDR-L1, la secuencia indicada en SeQ ID NO:66 para CDR-L2 y la
secuencia indicada en SEQ ID NO:67 para CDR-L3.
En una realizacion, un anticuerpo de dominio unico que se une a la albumina del suero humana para su uso en la presente invencion es un anticuerpo de dominio unico de VL cadena ligera humanizado, dAbL1, que tiene la secuencia indicada en la figura 5 (b) (SEQ ID NO:53). Un ejemplo de una fusion CH1-dAbL1 y una fusion Ck1-dAbL1 adecuadas, en las que ambas comprenden un conector G4S, se indica en la figura 6 (SEQ ID NO:70 y SEQ ID NO:72).
En una realizacion, un anticuerpo de dominio unico que se une a la albumina del suero humana para su uso en la presente invencion es un anticuerpo de dominio unico de VL cadena ligera humanizado, dAbL2, que tiene la secuencia indicada en la figura 5 (d) (SEQ ID NO:55). Un ejemplo de una fusion CH1-dAbL2 y una fusion Ck1-dAbL2 adecuadas, en las que ambas comprenden un conector G4S, se indica en la figura 6 (SEQ ID NO:71 y SEQ ID NO:73).
En una realizacion, cuando las cadenas pesada y ligera del fragmento Fab o Fab' comprenden, cada una, un anticuerpo de dominio unico en el extremo C-terminal, y los dos anticuerpos de dominio unico son una pareja VH/VL complementaria que se une al antfgeno cooperativamente, tal como se describio anteriormente en la presente, el dAb de VH es dAbH1 (SEQ ID NO:52) y el dAb de VL es dAbL1 (SEQ ID NO:53).
En una realizacion, cuando las cadenas pesada y ligera del fragmento Fab o Fab' comprenden, cada una, un anticuerpo de dominio unico en el extremo C-terminal, y los dos anticuerpos de dominio unico son una pareja VHNL complementaria que se une al antfgeno cooperativamente, tal como se describio anteriormente en la presente, el dAb de VH es dAbH2 (SEQ ID NO:54) y el dAb de VL es dAbL2 (SEQ ID NO:55).
En otro aspecto, la presente invencion proporciona anticuerpos de union a la albumina, o sus fragmentos, que contiene una o mas de las CDR proporcionadas en la presente anteriormente y en la figura 5 (e-p), y en particular comprenden una CDRH1 con la secuencia indicada en SED ID NO:56, una CDRH2 con la secuencia indicada en SED ID NO:57, una CDRH3 con la secuencia indicada en SED ID NO:58, una CDRL1 con la secuencia indicada en SED ID NO:59, una CDRL2 con la secuencia indicada en SED ID NO:60 y /o una CDRL3 con la secuencia indicada en SED ID NO:61. En una realizacion, los anticuerpos de union a la albumina, o sus fragmentos, comprenden una CDRH1 con la secuencia indicada en SED ID NO:62, una CDRH2 con la secuencia indicada en SED ID NO:63, una CDRH3 con la secuencia indicada en SED ID NO:64, una CDRL1 con la secuencia indicada en SED ID NO:65, una CDRL2 con la secuencia indicada en SED ID NO:66 y /o una CDRL3 con la secuencia indicada en SED ID NO:67. Dichas CDR pueden incorporarse en cualquier marco de anticuerpo adecuado y en cualquier formato de anticuerpo adecuado. Estos anticuerpos incluyen anticuerpos completos y sus fragmentos o derivados funcionalmente activos, y pueden ser, pero no se limitan a anticuerpos monoclonales, humanizados, totalmente humanos o quimericos. Por consiguiente, dichos anticuerpos de union a la albumina pueden comprender una molecula de anticuerpo completa que presenta las cadenas pesadas y ligeras de longitud completa, o uno de sus fragmentos, y pueden ser, pero no se limitan a Fab, Fab modificado, Fab', F(ab')2, Fv, anticuerpos de dominio unico, scFv, anticuerpos bi-, tri o tetravalentes, Bis-scFv, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y los fragmentos de union a epitopos de cualquiera de los mencionados (vease, por ejemplo, Holliger y Hudson, 2005, Nature Biotech., 23(9):1126-1136; Adair y Lawson, 2005, Drug Design Reviews - en lfnea 2(3), 209-217). Los metodos para crear y fabricar estos fragmentos de anticuerpo son muy conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181). Los anticuerpos multivalentes pueden comprender multiples especificidades o pueden ser monoespecfficos (veanse, por ejemplo, los documentos WO 92/22853 y WO05/113605). Se apreciara que este aspecto de la invencion tambien se extiende a los variantes de estos anticuerpos de union a la albumina.
Se apreciara que estos anticuerpos de union a la albumina, en particular los anticuerpos de dominio unico, pueden conjugarse con cualquier otro anticuerpo o protefna u otra molecula, segun se desee, o utilizarse en cualquier otro contexto adecuado. En un ejemplo, los anticuerpos de dominio unico dAbH1, dAbL1, dAbH2, dAbL2, segun se describieron anteriormente y tal como se muestran en la figura 5 (a-d), pueden incorporarse en cualquier formato de anticuerpo adecuado o pueden usarse como anticuerpos de dominio unico en cualquier contexto adecuado, tal como una fusion o un conjugado.
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En una realizacion, los anticuerpos de este aspecto de la invencion comprenden la secuencia indicada en la figura 5(e) para CDR-H1, la secuencia indicada en la figura 5(f) para CDR-H2 y la secuencia indicada en la figura 5(g) para CDR-H3.
En una realizacion, los anticuerpos de este aspecto de la invencion comprenden la secuencia indicada en la figura 5(k) para CDR-H1, la secuencia indicada en la figura 5(l) para CDR-H2 y la secuencia indicada en la figura 5(m) para CDR-H3.
En una realizacion, los anticuerpos de este aspecto de la invencion comprenden la secuencia indicada en la figura 5(h) para CDR-L1, la secuencia indicada en la figura 5(i) para CDR-L2 y la secuencia indicada en la figura 5(j) para CDR-L3.
En una realizacion, los anticuerpos de este aspecto de la invencion comprenden la secuencia indicada en la figura 5(n) para CDR-L1, la secuencia indicada en la figura 5(o) para CDR-L2 y la secuencia indicada en la figura 5(p) para CDR-L3.
En los siguientes formatos de anticuerpos, cada una de las secuencias del listado de secuencias en la presente puede localizarse en la posicion correspondiente a la posicion natural o a una posicion no natural. La posicion natural sera, para la posicion pertinente en el listado indicada como CDRH1, la posicion H1, para la posicion pertinente en el listado indicada como CDRH2, la posicion H2, para la posicion pertinente en el listado indicada como CDRH3, la posicion H3, para la posicion pertinente en el listado indicada como CDRL1, la posicion L1, para la posicion pertinente en el listado indicada como CDRL2, la posicion L2, y para la posicion pertinente en el listado indicada como CDRL3, la posicion L3. Tambien se contemplan sus combinaciones, tales como H1 y H2, H1 y H3, H1 y L1, H1 y L2, H1 y L3, H2 y L1, H2 y L2, H2 y L3, H2 y H3, H3 y L1, H3 y L2, H3 y L3, H1 y H2 y H3, H1 y H2 y L1, H1 y H2 y L2, H1 y H2 y L3, H2 y H3 y L1, H2 y H3 y L2, H2 y H3 y L3, H3 y L1 y L2, H3 y L1 y L3, H3 y L2 y L3, L1 y L2 y L3, H1 y H2 y H3 y L1, H1 y H2 y H3 y L2, H1 y H2 y H3 y L3, H2 y H3 y L1 y L2, H2 y H3 y L1 y L3, y H2 y H3 y L2 y L3, H3 y L1 y L2 y L3, H1 y H2 y H3 y L1 y L2, H1 y H2 y H3 y L2 y L3, H1 y H2 y H3 y L1 y L3, L1 y L2 y L3 y H1 y H2, L1 y L2 y L3 y H1 y H3, L1 y L2 y L3 y H2 y H3, H1 y H2 y H3 y L1 y L2 y L3.
En una realizacion, la protefna de fusion de anticuerpo de la descripcion comprende una secuencia, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5 o 6 secuencias seleccionadas de SEQ ID NO:88 a 93.
En una realizacion, la protefna de fusion de anticuerpo de la descripcion comprende una secuencia, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5 o 6 secuencias seleccionadas de SEQ ID NO:94 a 99.
En una realizacion, la protefna de fusion de anticuerpo de la descripcion comprende una secuencia, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5 o 6 secuencias seleccionadas de SEQ ID NO:100 a 105.
En una realizacion, la protefna de fusion de anticuerpo de la descripcion comprende una secuencia, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5 o 6 secuencias seleccionadas de SEQ ID NO:106 a 111.
En una realizacion, la protefna de fusion de anticuerpo de la descripcion comprende una secuencia, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5 o 6 secuencias seleccionadas de SEQ ID NO:112 a 117.
En una realizacion, la protefna de fusion de anticuerpo de la descripcion comprende una secuencia, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5 o 6 secuencias seleccionadas de SEQ ID NO:118 a 123.
En una realizacion, la protefna de fusion de anticuerpo de la descripcion comprende una secuencia, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5 o 6 secuencias seleccionadas de SEQ ID NO:124 a 129.
En una realizacion, la protefna de fusion de anticuerpo de la descripcion comprende una secuencia, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5 o 6 secuencias seleccionadas de SEQ ID NO:130 a 135.
En una realizacion, la protefna de fusion de anticuerpo de la descripcion comprende una secuencia, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5 o 6 secuencias seleccionadas de SEQ ID NO:136 a 141.
En una realizacion, la protefna de fusion de anticuerpo de la descripcion comprende una secuencia, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5 o 6 secuencias seleccionadas de SEQ ID NO:142 a 147.
En una realizacion, la protefna de fusion de anticuerpo de la descripcion comprende una secuencia, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5 o 6 secuencias seleccionadas de SEQ ID NO:148 a 153.
En una realizacion, la protefna de fusion de anticuerpo de la descripcion comprende una secuencia, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5 o 6 secuencias seleccionadas de SEQ ID NO:154 a 159.
En una realizacion, la protefna de fusion de anticuerpo de la descripcion comprende una secuencia, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5 o 6 secuencias seleccionadas de SEQ ID NO:160 a 165.
En una realizacion, la protefna de fusion de anticuerpo de la descripcion comprende una secuencia, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5 o 6 secuencias seleccionadas de SEQ ID NO:166 a 171.
En una realizacion, la protefna de fusion de anticuerpo de la descripcion comprende una secuencia, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5 o 6 secuencias seleccionadas de SEQ ID NO:172 a 177.
5 En una realizacion, la protefna de fusion de anticuerpo de la descripcion comprende una secuencia, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5 o 6 secuencias seleccionadas de SEQ ID NO:178 a 183.
En una realizacion, la protefna de fusion de anticuerpo de la descripcion comprende una secuencia, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5 o 6 secuencias seleccionadas de SEQ ID NO:184 a 189.
En una realizacion, la protefna de fusion de anticuerpo de la descripcion comprende una secuencia, por ejemplo 1, 10 2, 3, 4, 5 o 6 secuencias seleccionadas de SEQ ID NO:190 a 195.
En una realizacion, la protefna de fusion de anticuerpo de la descripcion comprende una secuencia, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5 o 6 secuencias seleccionadas de SEQ ID NO:196 a 201.
En una realizacion, la protefna de fusion de anticuerpo de la descripcion comprende SEQ ID CM O CM O Z
En una realizacion, la protefna de fusion de anticuerpo de la descripcion comprende SEQ ID NO:203.
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En una realizacion, la protefna de fusion de anticuerpo de la descripcion comprende SEQ ID NO:202 y 203
En una realizacion, la protefna de fusion de anticuerpo de la descripcion comprende SEQ ID NO:204.
En una realizacion, la protefna de fusion de anticuerpo de la descripcion comprende SEQ ID NO:205.
En una realizacion, la protefna de fusion de anticuerpo de la descripcion comprende SEQ ID LO o CM "3- o CM 6 z
En una realizacion, la protefna de fusion de anticuerpo de la descripcion comprende SEQ ID NO:206.
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En una realizacion, la protefna de fusion de anticuerpo de la descripcion comprende SEQ ID NO:207.
En una realizacion, la protefna de fusion de anticuerpo de la descripcion comprende SEQ ID NO:206 y 207.
Cuando el anticuerpo o anticuerpos de dominio unico de la protefna de fusion de especificidad dual de la presente invencion se unen a la albumina, la afinidad de union del anticuerpo de dominio unico por la albumina sera suficiente para extender la semivida del Fab o Fab' in vivo. Se ha indicado que una afinidad por la albumina menor o igual a 25 2,5 pM extendera la semivida in vivo (Nguyen, A. et al. (2006), Protein Engineering, Design & Selection, 19(7), 291
297). Las moleculas de anticuerpos de dominio unico de la presente invencion preferiblemente tendran una afinidad de union adecuada a su proposito y al antfgeno al cual se unen. En un ejemplo, los anticuerpos de dominio unico presentan una alta afinidad de union, por ejemplo, picomolar. En un ejemplo, los anticuerpos de dominio unico presentan una afinidad de union por el antfgeno que es nanomolar o micromolar. La afinidad se puede medir usando 30 cualquier metodo adecuado conocido en la tecnica, incluyendo BIAcore como se describe en los ejemplos de la presente, empleando un antfgeno natural o recombinante.
Preferiblemente, las moleculas de anticuerpos de dominio unico de la presente invencion que se unen a la albumina presentan una afinidad de union de aproximadamente 2 pM o mejor. En una realizacion, la molecula de anticuerpo de dominio unico la presente invencion presenta una afinidad de union de aproximadamente 1 pM o mejor. En una 35 realizacion, la molecula de anticuerpo de dominio unico la presente invencion presenta una afinidad de union de aproximadamente 500 nM o mejor. En una realizacion, la molecula de anticuerpo de dominio unico la presente invencion presenta una afinidad de union de aproximadamente 200 nM o mejor. En una realizacion, la molecula de anticuerpo de dominio unico la presente invencion presenta una afinidad de union de aproximadamente 1 nM o mejor. Se apreciara que la afinidad de anticuerpos de dominio unico proporcionados por la presente invencion y 40 conocidos en la tecnica puede alterarse usando cualquier metodo adecuado conocido en la tecnica. Por lo tanto, la presente invencion tambien se refiere a variantes de las moleculas de anticuerpo de dominio de la presente invencion, que presentan una afinidad mejorada por la albumina. Dichos variantes se pueden obtener a traves de una serie de protocolos de maduracion por afinidad que incluyen la mutacion de las CDR (Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), el reordenamiento de cadenas (Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), el uso de 45 cepas mutadoras de E. coli (Low et al., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996), el reordenamiento de ADN (Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), la presentacion en fagos (Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996) y la PCR sexual (Crameri et al., Nature, 391, 288-291, 1998). Vaughan et al. (supra) analiza estos metodos de maduracion por afinidad.
El anticuerpo o anticuerpos de dominio unico de la protefna de fusion de especificidad dual pueden proporcionarse 50 como monomeros, dfmeros o trfmeros, segun sea necesario. El producto deseado puede obtenerse ajustando las etapas de procesamiento corriente abajo a las cuales se somete el material. En una realizacion, el material procesado se proporciona como un monomero sustancialmente homogeneo. En una realizacion, el material
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procesado se proporciona como un dfmero sustancialmente homogeneo. En una realizacion, el material procesado se proporciona como un trfmero sustancialmente homogeneo.
La presente invencion tambien proporciona una secuencia de ADN aislada que codifica una protefna de fusion de anticuerpo de especificidad dual de la presente invencion. Las secuencias de ADN de la presente invencion pueden comprender ADN sintetico, por ejemplo producido por un proceso qufmico, ADNc, ADN genomico o cualquiera de sus combinaciones.
Las secuencias de ADN que codifican la protefna de fusion de anticuerpo de especificidad dual de la presente invencion pueden obtenerse mediante metodos muy conocidos por los expertos en la tecnica. Por ejemplo, las secuencias de ADN que codifican una parte o todos los fragmentos de anticuerpo, conectores y/o dAb pueden sintetizarse segun se desee a partir de las secuencias de ADN determinadas, o basandose en las correspondientes secuencias de aminoacidos.
Se pueden usar tecnicas convencionales de biologfa molecular para preparar secuencias de ADN que codifican la protefna de fusion de anticuerpo de especificidad dual de la presente invencion. Las secuencias de ADN deseadas pueden sintetizarse completa o parcialmente mediante el uso de tecnicas de sfntesis de oligonucleotidos. Se pueden usar tecnicas de mutagenesis dirigida especffica de sitio y de reaccion en cadena de la polimerasa (PCR, por su nombre en ingles), segun sea apropiado.
La presente invencion se refiere ademas a un vector de clonacion o de expresion que comprende una o mas secuencias de ADN de la presente invencion. Por consiguiente, se proporciona un vector de clonacion o expresion que comprende una o mas secuencias de ADN que codifican una protefna de fusion de anticuerpo de especificidad dual de la presente invencion. En una realizacion preferida, el vector de clonacion o de expresion comprende una unica secuencia de ADN que codifica la protefna de fusion de anticuerpo de especificidad dual completa. Por tanto, el vector de clonacion o de expresion comprende unidades de transcripcion codificadas en el ADN en secuencia, de modo que se produce la protefna de fusion de traduccion.
En efecto, los expertos en la tecnica entenderan que una protefna de fusion de la invencion puede presentar el dAb en el extremo N-terminal o C-terminal y, por tanto, la unidad de transcripcion codificada en el ADN del dAb estara en primer lugar o en ultimo lugar, respectivamente, dentro de la secuencia de ADN que codifica la fusion de traduccion. Asf, una fusion de traduccion puede comprender un dAb N-terminal y un Fab o Fab' C-terminal. Ademas, una fusion de traduccion puede comprender un Fab o Fab' N-terminal y un dAb C-terminal.
Se apreciara que la cadena pesada y la cadena ligera del Fab o Fab' pueden incorporarse al mismo vector o a vectores diferentes. En una realizacion, un vector puede comprender una fusion de traduccion que comprende una cadena pesada de Fab o Fab' y un dAb C-terminal, y otro vector puede comprender una fusion de traduccion que comprende una cadena ligera de Fab o Fab' y un dAb C-terminal.
Por ejemplo, cuando se desee producir una protefna de fusion de anticuerpo de especificidad dual con el resto dAb en el extremo N-terminal del fragmento de anticuerpo, el vector comprendera las unidades de trascripcion de ADN en el orden de secuencia: una unidad de transcripcion de ADN que codifica el resto dAb, opcionalmente una unidad de transcripcion de ADN que codifica una secuencia de conector, y una unidad de transcripcion de ADN que codifica un fragmento de anticuerpo. Cuando se desee producir una protefna de fusion de anticuerpo de especificidad dual con el resto dAb en el extremo C-terminal del fragmento de anticuerpo, el vector comprendera las unidades de trascripcion de ADN en el orden de secuencia: una unidad de transcripcion de ADN que codifica un fragmento de anticuerpo, opcionalmente una unidad de transcripcion de ADN que codifica una secuencia de conector, y una unidad de transcripcion de ADN que codifica un resto dAb con especificidad para una protefna portadora serica, una molecula de inmunoglobulina de la circulacion, o CD35/CR1, por ejemplo, la albumina del suero humana. Asf, una fusion de traduccion de la invencion puede estar en diferentes configuraciones que incluyen, por ejemplo, pero sin limitacion, dAb-conector-Fab, Fab-conector-dAb, dAb-Fab, Fab-dAb, Fab'-dAb, dAb-Fab', dAb-conector-Fab', Fab'- conector-dAb. Por ejemplo, cuando se emplean dos vectores, el primero puede comprender la cadena pesada de un Fab o Fab' condensada con un dAb, y el segundo puede comprender la cadena ligera de un Fab o Fab' condensado con un dAb.
El ADN que codifica un fragmento de anticuerpo comprendido dentro de una fusion de traduccion de la invencion puede incorporarse en un vector como una unidad de transcripcion en configuraciones conocidas por los expertos en la tecnica, por ejemplo, una unidad de transcripcion puede comprender la codificacion de la cadena ligera, seguido de la codificacion de la cadena pesada o viceversa; vease, en concreto, Humphreys et al., 2002, Protein Expression and Purification, 26:309-320.
Preferiblemente, un vector segun la presente invencion comprende una secuencia conductora apropiada, tal como una secuencia conductora de anticuerpo. Estas secuencias conductoras son muy conocidas en la tecnica.
Los metodos generales mediante los cuales se pueden construir los vectores, los metodos de transfeccion y transformacion y los metodos de cultivo son muy conocidos por los expertos en la tecnica. A este respecto, se hace referencia a Current Protocols in Molecular Biology, 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, Nueva York y al manual de Maniatis producido por Cold Spring Harbor Publishing.
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Tambien se proporciona una celula hospedante que comprende uno o mas vectores de clonacion o expresion que comprenden una o mas secuencias de ADN que codifican una protema de fusion de anticuerpo de especificidad dual de la presente invencion. Se puede utilizar cualquier sistema adecuado de celula hospedante/vector para la expresion de las secuencias de ADN que codifican la protema de fusion de anticuerpo de especificidad dual. Se pueden utilizar sistemas bacterianos, por ejemplo E. coli, y otros sistemas microbianos, o tambien se pueden utilizar sistemas de expresion de celulas hospedantes eucariotas, por ejemplo de mairnfero. Las celulas hospedantes de mairnfero idoneas incluyen NSO, CHO, mieloma o hibridoma. Por consiguiente, en una realizacion, la protema de fusion de la presente invencion se expresa en E. coli. En otra realizacion, la protema de fusion de la presente invencion se expresa en celulas de mairnfero.
La presente invencion tambien proporciona un proceso para la produccion de una protema de fusion de anticuerpo de especificidad dual, que comprende cultivar una celula hospedante que comprende un vector de la presente invencion bajo condiciones adecuadas para la expresion de la protema a partir de la secuencia de ADN que codifica dicha protema de fusion de anticuerpo de especificidad dual. La invencion proporciona ademas metodos para aislar la protema de fusion de anticuerpo de especificidad dual.
Tras su produccion, una protema de fusion de anticuerpo de especificidad dual de la presente invencion puede purificarse, cuando sea necesario, empleando cualquier metodo adecuado conocido en la tecnica. Por ejemplo, pero sin limitacion, pueden emplearse tecnicas cromatograficas, tales como cromatograffa de intercambio ionico, de exclusion molecular, de protema G o de interaccion hidrofoba.
El tamano de la protema de fusion de anticuerpo de especificidad dual se puede confirmar mediante metodos convencionales conocidos en la tecnica, tales como la cromatograffa de exclusion molecular y SDS-PAGE no reductor. Estas tecnicas pueden emplearse, por ejemplo, para confirmar que la protema no ha dimerizado y/o no le falta una porcion, por ejemplo, la porcion de dAb. Si se detectan dfmeros y es necesario un producto monomerico homogeneo, entonces la protema de fusion de anticuerpo de especificidad dual monomerica puede purificarse de las especies dimericas empleando tecnicas de cromatograffa convencionales, segun se describio anteriormente.
Las protemas de fusion de anticuerpo de especificidad dual de la invencion son utiles en el tratamiento de enfermedades o trastornos, que incluyen enfermedades y trastornos inflamatorios, enfermedades y trastornos inmunologicos, trastornos fibroticos y canceres.
Las expresiones "enfermedad o trastorno inflamatorio" y "enfermedad o trastorno inmunologico" incluyen artritis reumatoide, artritis psoriatica, enfermedad de Still, enfermedad de Muckle Wells, psoriasis, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, SLE (lupus eritematoso sistemico), asma, rinitis alergica, dermatitis atopica, esclerosis multiple, vasculitis, diabetes mellitus de tipo I, transplantes y enfermedad injerto frente al receptor.
La expresion "trastorno fibrotico" incluye fibrosis pulmonar idiopatica (IPF), esclerosis sistemica (o escleroderma), fibrosis renal, nefropaffa diabetica, nefropaffa por IgA, hipertension, enfermedad renal en fase terminal, fibrosis peritoneal (dialisis peritoneal ambulatoria continua), cirrosis hepatica, degeneracion macula asociada con la edad (ARMD), retinopaffa, fibrosis reactiva cardfaca, cicatrizacion, queloides, quemaduras, ulceras de la piel, angioplastia, cirugfa de bypass coronario, artroplastia y cirugfa de cataratas.
El termino "cancer" incluye un nuevo crecimiento maligno que surge del epitelio, se encuentra en la piel, o de modo mas habitual, en el revestimiento de los organos corporales, por ejemplo: mama, ovario, prostata, pulmon, rinon, pancreas, estomago, vejiga o intestino. Los canceres tienden a infiltrarse en el tejido adyacente y a propagarse (metastatizar) hacia organos distantes, por ejemplo: a hueso, Iffgado, pulmon o el cerebro.
Asf, segun otro aspecto de la invencion, se proporciona una composicion farmaceutica que comprende una fusion de anticuerpo de la invencion en asociacion con uno o mas vehuculo, excipientes o diluyentes farmaceuticamente aceptables. Tambien se proporciona el uso de una protema de fusion de anticuerpo de la invencion para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o un trastorno. Lo mas preferiblemente, la enfermedad o el trastorno es una enfermedad o un trastorno inflamatorio.
Las composiciones farmaceuticas segun la invencion pueden tener una forma adecuada para la administracion oral, bucal, parenteral, nasal, topica, oftalmica o rectal, o una forma adecuada para administracion por inhalacion o insuflacion.
Cuando resulte apropiado, por ejemplo, si el anticuerpo o anticuerpos de dominio unico de la protema de fusion de anticuerpo se unen a la albumina, puede resultar deseable preformular la protema de fusion de especificidad dual con albumina del suero humana o recombinante, empleando cualquier metodo adecuado conocido en la tecnica.
Cuando la formulacion farmaceutica es un ffquido, por ejemplo, una disolucion o una suspension, entonces la formulacion puede comprender ademas albumina, por ejemplo, albumina del suero humana, en particular albumina recombinante, tal como albumina del suero humana recombinante. Las cantidad adecuadas pueden encontrarse en la gama de menos del 2% en p/p de la formulacion total, en particular menos del 1, 0,5, o 0,1% en p/p. Esto puede ayudar a la estabilizacion del componente de anticuerpo en la formulacion. La composicion farmaceutica puede liofilizarse para su posterior reconstitucion con un disolvente acuoso.
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En una realizacion, se proporciona un recipiente de dosis unitaria, tal como un vial, que comprende un "anticuerpo" liofilizado segun la invencion.
Para la administracion oral, las composiciones farmaceuticas pueden tomar la forma de, por ejemplo, comprimidos, pastillas o capsulas preparadas por medios convencionales con excipientes farmaceuticamente aceptables, tales como agentes ligantes (por ejemplo, almidon de mafz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa); cargas (por ejemplo, lactosa, celulosa microcristalina o bifosfato de calcio); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco o sflice); disgregantes (por ejemplo, almidon de patata o glicolato de sodio); o agentes humectantes (por ejemplo, laurilsulfato de sodio). Los comprimidos pueden recubrirse por medio de metodos muy conocidos en la tecnica. Las preparaciones lfquidas para la administracion oral pueden tomar la forma, por ejemplo, de disoluciones, jarabes o suspensiones, o se pueden presentar como un producto seco para su reconstitucion con agua u otro vehfculo adecuado antes del uso. Tales preparaciones lfquidas pueden prepararse por medios convencionales con aditivos farmaceuticamente aceptables, tales como agentes de suspension, agentes emulgentes, vehfculos no acuosos o conservantes. Las preparaciones tambien pueden contener sales tampon, agentes aromatizantes, agentes colorantes o agentes edulcorantes, segun sea apropiado.
Las preparaciones para la administracion oral se pueden formular de modo adecuado para obtener una liberacion controlada del compuesto activo.
Para la administracion bucal, las composiciones pueden tomar la forma de comprimidos o pastillas formuladas de manera convencional.
Los anticuerpos biespecfficos de la invencion pueden formularse para la administracion parenteral mediante inyeccion, por ejemplo, mediante una inyeccion en embolada o infusion. Las formulaciones para inyeccion pueden presentarse en una forma de dosificacion unitaria, por ejemplo en ampollas de vidrio o recipientes de dosis multiples, por ejemplo viales de vidrio. Las composiciones para inyeccion pueden tomar formas tales como suspensiones, disoluciones o emulsiones en vehfculos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulacion tales como agentes de suspension, estabilizantes, conservantes y/o dispersantes. Como alternativa, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para su constitucion con un vehfculo adecuado, por ejemplo, agua libre apirogena, antes del uso.
Ademas de las formulaciones descritas anteriormente, los anticuerpos biespecfficos de la invencion tambien se pueden formular como una preparacion de liberacion lenta (depot). Estas formulaciones de accion prolongada pueden administrarse por implantacion o por inyeccion intramuscular.
Para la administracion nasal o la administracion mediante inhalacion, los compuestos segun la presente invencion pueden administrarse de forma conveniente en forma de una presentacion en pulverizado de aerosol para envases presurizados o un nebulizador, con el uso de un propelente adecuado, por ejemplo diclorodifluorometano, fluorotriclorometano, diclorotetrafluoroetano, dioxido de carbono u otro gas o mezcla de gases adecuados.
Las composiciones pueden, si se desea, presentarse en un envase o dispositivo dispensador que puede contener una o mas formas de dosificacion unitarias que contienen el ingrediente activo. El envase o dispositivo dispensador puede acompanarse de instrucciones para su administracion.
Para la administracion topica, los compuestos segun la presente invencion pueden formularse, de modo conveniente, en un unguento adecuado que contenga el componente activo suspendido o disuelto en uno o mas vehfculos farmaceuticamente aceptables. Los vehfculos concretos incluyen, por ejemplo, aceite mineral, petroleo lfquido, propilenglicol, polioxietileno, polioxipropileno, cera emulgente y agua. Como alternativa, los compuestos segun la presente invencion pueden formularse en una locion adecuada que contenga el componente activo suspendido o disuelto en uno o mas vehfculos farmaceuticamente aceptables. Los vehfculos concretos incluyen, por ejemplo, aceite mineral, monoestearato de sorbitan, polisorbato 60, cera de esteres de cetilo, alcohol cetearflico, alcohol bencflico, 2-octildodecanol y agua.
En una realizacion se proporciona la formulacion en forma de una formulacion para administraciones topicas, que incluyen la inhalacion.
Las preparaciones inhalables adecuadas incluyen polvos inhalables, aerosoles dosimetricos que contienen gases propelentes o disoluciones inhalables sin gases propelentes. Los polvos inhalables segun la descripcion que contienen la sustancia activa pueden consistir solamente en las sustancias activas anteriormente mencionadas o en una mezcla de las sustancias activas anteriormente mencionadas con un excipiente fisiologicamente aceptable.
Estos polvos inhalables pueden incluir monosacaridos (por ejemplo, glucosa o arabinosa), disacaridos (por ejemplo, lactosa, sacarosa, maltosa), oligo- y polisacaridos (por ejemplo, dextranos), polialcoholes (por ejemplo, sorbitol, manitol, xilitol), sales (por ejemplo, cloruro de sodio, carbonato de calcio) o mezclas de estos entre sf. Se utilizan de modo adecuado mono- o disacaridos, y la lactosa o la glucosa, en particular, pero no exclusivamente, se utilizan en forma de sus hidratos.
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Las partfculas para el deposito en el pulmon requieren un tamano de partfcula menor de 10 micrometros, tal como 19 micrometros, por ejemplo de 0,1 a 5 pm, en particular de 1 a 5 pm. El tamano de partfcula del ingrediente activo (tal como el anticuerpo o fragmento) tiene una gran importancia.
Los gases propelentes que se pueden utilizar para preparar los aerosoles inhalables son conocidos en la tecnica. Los gases propelentes adecuados se seleccionan entre hidrocarburos tales como n-propano, n-butano o isobutano e hidrocarburos halogenados, tales como derivados clorados y/o fluorados de metano, etano, propano, butano, ciclopropano o ciclobutano. Los gases propelentes anteriormente mencionados se pueden utilizar como tales o en mezclas de los mismos.
Los gases propelentes particularmente adecuados son derivados de alcano halogenados seleccionados entre TG 11, TG 12, tG 134a y TG227. De los hidrocarburos halogenados mencionados anteriormente, TG134a (1,1,1,2- tetrafluoroetano) y TG227 (1,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropano) y sus mezclas son particularmente adecuados.
Los aerosoles inhalables que contienen gas propelente tambien pueden contener otros ingredientes, tales como codisolventes, estabilizantes, agentes tensioactivos, antioxidantes, lubricantes y medios para ajustar el pH. Todos estos ingredientes son conocidos en la tecnica.
Los aerosoles inhalables que contienen un gas propelente segun la invencion pueden contener hasta 5% en peso de sustancia activa. Los aerosoles segun la invencion contienen, por ejemplo, de 0,002 a 5% en peso, de 0,01 a 3% en peso, de 0,015 a 2% en peso, de 0,1 a 2% en peso, de 0,5 a 2% en peso o de 0,5 a 1% en peso de ingrediente activo.
Como alternativa, las administraciones topicas en el pulmon tambien pueden ser mediante la administracion de una disolucion lfquida o una formulacion en suspension, por ejemplo empleando un dispositivo tal como un nebulizador, por ejemplo, un nebulizador conectado a un compresor (por ejemplo, el nebulizador Pari LC-Jet Plus(R) conectado a un compresor Pari Master(R) fabricado por Pari Respiratory Equipment, Inc., Richmond, Va.).
Los formatos de anticuerpo de la invencion se pueden suministrar en un disolvente, por ejemplo, en forma de una disolucion o una suspension. Pueden suspenderse en una disolucion fisiologica apropiada, por ejemplo, disolucion salina u otro disolvente o disolucion tamponada farmacologicamente aceptable. Las disoluciones tamponadas conocidas en la tecnica pueden contener de 0,05 mg a 0,15 mg de edetato de disodio, de 8,0 mg a 9,0 mg de NaCl, de 0,15 mg a 0,25 mg de polisorbato, de 0,25 mg a 0,30 mg de acido cftrico anhidro, y de 0,45 mg a 0,55 mg de citrato de sodio por 1 ml de agua de manera que se logre un pH de aproximadamente 4,0 a 5,0. Una suspension puede contener, por ejemplo, el anticuerpo liofilizado.
Las formulaciones en suspension o en disolucion terapeuticas tambien pueden contener uno o mas excipientes. Los excipientes son muy conocidos en la tecnica e incluyen tampones (por ejemplo, tampon citrato, tampon fosfato, tampon acetato y tampon bicarbonato), aminoacidos, urea, alcoholes, acido ascorbico, fosfolfpidos, protefnas (por ejemplo, albumina del suero), EDTA, cloruro de sodio, liposomas, manitol, sorbitol, y glicerol. Las disoluciones o suspensiones se pueden encapsular en liposomas o microesferas biodegradables. La formulacion se proporcionara generalmente en una forma sustancialmente esteril empleando procedimientos de fabricacion esteriles.
Estos pueden incluir la produccion y la esterilizacion mediante filtracion del disolvente/disolucion tamponada utilizada para la formulacion, la suspension aseptica del anticuerpo en la disolucion disolvente tamponada esteril, y la dispensacion de la formulacion hacia receptaculos esteriles mediante metodos conocidos por los expertos en la tecnica.
La formulacion nebulizable segun la presente descripcion puede ser proporcionada, por ejemplo, en forma de unidades de dosis unitaria (por ejemplo, recipientes de plastico o viales sellados) envasados en sobres de aluminio. Cada vial contiene una dosis unitaria en un volumen, por ejemplo, de 2 ml de disolvente/disolucion tampon.
Se cree que los formatos de anticuerpo de la presente descripcion son adecuados para la administracion a traves de nebulizacion.
Para la administracion oftalmica, los compuestos segun la presente invencion pueden formularse de forma conveniente como suspensiones micronizadas en disolucion salina isotonica esteril con pH ajustado, con o sin un conservante, tal como un agente bactericida o fungicida, por ejemplo, nitrato fenilmercurico, cloruro de benzalconio o acetato de clorhexidina. Como alternativa, para la administracion oftalmica, los compuestos pueden formularse en una unguento, tal como vaselina.
Para la administracion rectal, los compuestos segun la presente invencion pueden formularse de modo conveniente como supositorios. Estos pueden prepararse mezclando el componente activo con un excipiente no irritante adecuado que es solido a temperatura ambiente, pero lfquido a temperatura rectal y, por lo tanto, se fundira en el recto para liberar el componente activo. Tales materiales incluyen, por ejemplo, manteca de cacao, cera de abejas y polietilenglicoles.
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La cantidad de un compuesto de la invencion requerido para la profilaxis o el tratamiento de un trastorno concreto variara dependiendo del compuesto elegido y de la afeccion del paciente que se esta tratando. Sin embargo, en general las dosificaciones diarias pueden variar de aproximadamente 10 ng/kg a 1000 mg/kg, generalmente de 100 ng/kg a 100 mg/kg, por ejemplo de aproximadamente 0,01 mg/kg a 40 mg/kg de peso corporal para la administracion oral o bucal, de aproximadamente 10 ng/kg a 50 mg/kg de peso corporal para la administracion parenteral, y de aproximadamente 0,05 mg a aproximadamente 1000 mg, por ejemplo de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 1000 mg para la administracion nasal o para la administracion mediante inhalacion o insuflacion.
Las caracterfsticas preferidas de cada realizacion de la invencion son las mismas que las de cada una de las otras realizaciones mutatis mutandis.
Se pretende que "lo que comprende" en el contexto de la presente memoria descriptiva signifique "que incluye". Cuando sea tecnicamente apropiado, se pueden combinar las realizaciones de la invencion.
Las realizaciones descritas en la presente comprenden ciertas caracterfsticas/elementos. La descripcion tambien se extiende a realizaciones diferentes que consistan o que consistan fundamentalmente en dichas caracterfsticas/elementos.
La invencion se describira a continuacion remitiendose a los siguientes ejemplos, que son solo ilustrativos y no deben considerarse, de ninguna manera, limitantes del alcance de la presente invencion, que se define por las reivindicaciones.
Lista de figuras:
Figura 1: Representacion esquematica de Fab-dAb, en los que el dAb esta en el extremo C-terminal Figura 2A: Representacion esquematica de Fab-didAb
Figura 2B: Representacion esquematica de Fab-didAb con una estabilizacion por disulfuro adicional entre los dAb Figura 3: Analisis de SDS-PAGE de FabA-dAbL3 (CK-SG4SE) (1) y FabA-dAbL3 (CK-G[APAPA]2) (2)
Figura 4: Analisis de la transferencia Western de FabA-dAbL3 (CK-SG4SE) (1) y FabA-dAbL3 (CK-G[APAPA]2) (2)
Figura 4a: SDS-PAGE de FabB-didAb
Carril M = marcadores SeeBlue
Carriles 1 y 2 = control de IgG
Carril 3 = FabB
Carril 4 = FabB-didAb, -dAbL1 (CK-G4Sx2) y dAbH1 (CH1-G4Sx2)
Carril 5 = FabB-didAb, -dAbL2 (CK-G4Sx2) y dAbH2 (CH1-G4Sx2)
Figura 5: Secuencias de los anticuerpos de dominio dAbH1, dAbH2, dAbL1 y dAbL2, y las CDR derivadas de cada uno de estos anticuerpos
Figura 6: Construcciones de FabB-dAb que comprenden el dominio variable de cadena pesada o ligera de FabB condensado con un anticuerpo de dominio
Figura 7: Secuencias de la cadena pesada y ligera de Fab'A y secuencia de la cadena pesada de FabA
Figuras 8a, 8b y 8c: Secuencias de aminoacidos de Fab-didAb murinizado
La figura 8a muestra la secuencia de aminoacidos de las CDR en diversos dAb murinos.
La figura 8b muestra la secuencia de aminoacidos de mFabD-mdidAb:
dAbL1(CK-G4Sx2)
dAbH1(CH1-G4Sx2)
dAbL2(CK-G4Sx2) y
dAbH2(CH1-G4Sx2)
La figura 8c muestra la secuencia de aminoacidos de mFabD-mdidAb:
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dAbLI (CK-G4Sx2) y dAbH1(CH1-G4Sx2)mFabC-mdAbH1 dAbL2(CK-G4Sx2) y dAbH2(CH1-G4Sx2
La figura 9 muestra una SDS-PAGE de FabB-didAb.
Los carriles 1 y 4 son Fab'B.
Los carriles 2 y 5 son FabB-didAb, -dAbL1 (CK-G4Sx2) y -dAbH1(CH1-G4Sx2).
Los carriles 3 y 6 son FabB-didAb, -dAbL2(CK-G4Sx2) y -dAbH2(CH1-G4Sx2).
La figura 10 muestra una representacion esquematica de un ensayo de estabilidad termica Thermofluor.
La figura 11 muestra un diagrama de la senal de HAS-FITC/mezclas de HAS-FITC unidas a celulas T de raton activadas.
La figura 12 muestra un diagrama de un ensayo de estabilidad de agregacion.
La figura 13 muestra los perfiles de concentracion in vivo a lo largo del tiempo despues de una dosificacion subcutanea e intravenosa.
Las figuras 14A, B y C muestran ciertas lecturas de celulas CD4+ y celulas CD8+.
La figura 15 muestra un analisis de SDS-PAGE para FabB-645Fv.
La figura 16 muestra un analisis de exclusion molecular de FabB-645Fv.
La figura 17 muestra termogramas de FabB-645Fv con diversas longitudes del conector.
La figura 18 muestra un analisis de SDS-PAGE de ciertas construcciones de FabB.
La figura 19 muestra un analisis de exclusion molecular de diversas construcciones de FabB-645Fv.
Las figuras 20 a 24 muestran secuencias para ciertos formatos.
Leyenda
-645Fv: es igual a didAbL1 y H1 (el conector utilizado para cada dAB sera el mismo, a menos que se indique lo contrario).
648Fv: es igual a didAbL2 y H2 (el conector utilizado para cada dAB sera el mismo, a menos que se indique lo contrario).
-645dsFv: es igual a didAbL1 y H1 (el conector utilizado para cada dAB sera el mismo, a menos que se indique lo contrario), en los que L1 y H1 estan estabilizados mediante un enlace disulfuro.
-648dsFv: es igual a didAbL2 y H2 (el conector utilizado para cada dAB sera el mismo, a menos que se indique lo contrario), en los que L2 y H3 estan estabilizados mediante un enlace disulfuro.
FabA: son Fab que carecen del enlace cistefna intercatenario (es decir, entre CH y CL o CK).
Parte experimental:
Abreviaturas: A menos que el contexto indique lo contrario, "m", como prefijo, indica murino.
A menos que el contexto indique lo contrario, "h", como prefijo, indica humano. Los componentes de Fab A, Fab B, Fab C y Fab D pueden proporcionarse en diferentes formatos.
Ejemplo 1. Produccion de un dAb especffico para la albumina del suero humana
Se produjo una unidad de transcripcion codificada en el ADN dentro de marco que codifica un dAb con especificidad por la albumina del suero humana, empleando la tecnologfa del ADN recombinante.
Cuando se desee, puede producirse una unidad de transcripcion codificada en el ADN dentro de marco que codifique un dAb con especificidad por una protefna de reclutamiento, empleando la tecnologfa del ADN recombinante.
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Ejemplo 2. Produccion de un fragmento de anticuerpo
Para la fusion de un dAb con el extremo C-terminal de la cadena ligera, se sintetizo un ADN que codifica una region constante de cadena ligera kappa humana (con el alotipo Km3 de la region constante kappa), un conector peptfdico y un dAb, y se clona como un fragmento de restriccion Sacl-Pvull en el vector de expresion del laboratorio de los inventores UCB-Celltech pTTOD(Fab) (un derivado de pTTO-1, descrito en Popplewell et al., Methods Mol. Biol., 2005, 308:17-30), que contiene el ADN que codifica la region constante gamma-1 CH1 humana. Esto produjo una disposicion de gen dicistronico que consiste en el gen para la cadena ligera humanizada condensado, a traves de un conector, con un dAb, seguido del gen para el fragmento Fab de cadena pesada humanizada, ambos bajo el control del promotor tac. Tambien esta codificado un sitio BspE1 exclusivo cadena arriba del conector Gly4Ser, o un sitio Ascl cadena arriba del conector rico en Ala-Pro.
Para la fusion de un dAb al extremo C-terminal de la cadena pesada, se sintetizo un ADN que codifica un fragmento CH1 humano (del isotipo y1), seguido de una secuencia codificadora de conector y un dAb. Esto se subclono como un fragmento de restriccion Apal-EcoRI en el vector de expresion del laboratorio de los inventores UCB-Celltech pTTOD(Fab) (un derivado de pTTO-1, descrito en Popplewell et al., arriba), que contiene el ADN que codifica la region constante gamma-1 CH1 humana. Esto produjo una disposicion de gen dicistronico que consiste en el gen para la cadena ligera humanizada, una secuencia intergenica no codificadora, seguido de una cadena pesada condensada a traves de un conector a un dAb, ambos bajo el control del promotor tac. El plasmido de expresion recombinante se transformo en la cepa de E. coli W3110, en donde la expresion es inducida por la adicion de lPTG. Se realizaron experimentos de expresion, en un principio a pequena escala (volumenes de cultivo de 5 ml) con la adicion de lPTG 200 uM a una oD(600 nm) de aproximadamente 0,5, las celulas se recolectaron 2 horas despues de la induccion y se extrajeron durante la noche a 30 °C en Tris/EDTA. Los extractos aclarados se emplearon para un analisis de afinidad mediante Biacore. Se seleccionaron las construcciones que mostraron unos rendimientos de expresion prometedores para la fermentacion.
Metodos aplicables a los siguientes ejemplos
En los siguientes ejemplos, la cadena de anticuerpo a la cual esta condensada el dAb se denomina CK o LC para la cadena ligera cKappa, y CH1 o HC para el dominio constante de cadena pesada, CH1.
Construccion de plasmidos de fusion de FabA-dAb para la expresion en E. coli
Se construyeron protefnas de fusion de Fab-dAb condensando dAbL3 o dAbH4 al extremo C-terminal de la region constante de la cadena ligera o pesada de FabA. Se empleo un conector flexible (SGGGGSE (SEQ lD NO:1)) o rfgido (G(APAPA)2 (SEQ lD NO:34)) para unir el dAb a la region cKappa (SEQ lD NO:75), mientras que se empleo el conector DKTHTS (SEQ lD NO:2) para unir el dAb a la region CH1 (SEQ lD NO:76). La secuencia de ADN que codifica la fusion de region constante-dAb se fabrico de modo sintetico en forma de fragmentos, para permitir la subclonacion en la secuencia FabA del vector del laboratorio de los inventores pTTOD.
Se construyeron fusiones de cadena ligera-dAb mediante la subclonacion del fragmento Sacl-Apal de los genes sintetizados, que codifica una cKappa C-terminal condensada a dAbL3 o dAbH4 a traves de un conector (SGGGGSE (SEQ lD NO:1)) o un conector rfgido (G(APAPA)2 (SEQ lD NO:34)), en los correspondientes sitios de un plasmido capaz de expresar FabA. Se construyeron fusiones de cadena pesada-dAb mediante la subclonacion del fragmento Apal-EcoRl de los genes sintetizados, que codifica un CH1 C-terminal condensado con dAbL3 o dAbH4 a traves de un conector DKTHTS, en los correspondientes sitios de un plasmido capaz de expresar FabA.
Fab' A se deriva de un anticuerpo de union a lL-1 beta, cuyas secuencias de cadena pesada y ligera se proporcionan en SEQ lD NO:74 y 75, respectivamente, tal como se muestra en la figura 7. En Fab'A, cuando la cadena ligera presenta un dAb unido, la bisagra de la cadena pesada se altera a DKTHTS aunque no exista ningun dAb unido a la cadena pesada (SEQ lD NO:76).
FabA comprende la misma secuencia de cadena ligera (SEQ lD NO:75) y una secuencia de cadena pesada truncada que termina en la cistefna intercatenaria (SEQ lD NO:77). dAbL3 y dAbH4 son anticuerpos de dominio de cadena ligera y pesada, respectivamente, que se unen a la albumina del suero humana.
Construccion de plasmidos de fusion de FabA-didAb para la expresion en E. coli
Se construyo FabA-didAb con dAbL3 o dAbH4 en ambas cadenas ligera y pesada mediante la subclonacion del fragmento Apal-EcoRl, que codifica las fusiones de CH1-dAb, en los plasmidos de Fab-dAb existentes, en los que el dAb esta condensado con la cadena ligera a traves de un conector flexible.
Construccion de plasmidos de fusion de FabB-dAb para la expresion en celulas de mamffero
Los FabB-dAb FabB-dAbH1 (CH1-G4Sx2), FabB-dAbH2 (CH1-G4Sx2), FabB-dAbL1 (CH1-G4Sx2), FabB-dAbL2 (CH1-G4Sx2) fueron todos ensamblados mediante PCR y despues clonados en un vector de expresion de mamffero bajo el control del promotor HCMV-MlE y una secuencia de poliA de SV40E. Se aparearon con un vector similar que contenfa la cadena ligera de FabB para la expresion en celulas de mamffero (vease a continuacion).
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Expresion en mamfferos de FabB-dAb y didAb
Se transfectaron celulas HEK293 con plasmidos de cadena pesada y ligera utilizando el reactivo de transfeccion 293fectin de Invitrogen segun las instrucciones del fabricante. Brevemente, se incubaron 2 pg del plasmido de cadena pesada + 2 pg del plasmido de cadena ligera con 10 pl de 293fectin + 340 pl de medio Optimem durante 20 min a temperatura ambiente. La mezcla despues se anadio a 5 x 106 celulas HEK293 en suspension y se incubo durante 4 dfas con agitacion a 37 °C.
Biacore
Se determinaron las afinidades de union y los parametros cineticos para las interacciones de las construcciones de Fab-dAb mediante resonancia de plasmon de superficie (SPR) realizado en un Biacore T100 empleando chips detectores CM5 y tampon de ensayo HBS-EP (HEPES 10 mM (pH 7,4), NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,05% en v/v). Las muestras de Fab-dAb se capturaron sobre la superficie del chip detector empleando Fab de cabra especffico de F(ab')2 humano (Jackson ImmunoResearch, 109-006-097) o un anticuerpo monoclonal anti- CH1 humano generado en el laboratorio de los inventores. La inmovilizacion covalente del anticuerpo de captura se logro mediante la qufmica de acoplamiento de amina convencional.
Cada ciclo de ensayo consistio en capturar, en primer lugar, el Fab-dAb empleando una inyeccion durante 1 min, antes de una fase de asociacion que consiste en una inyeccion del antfgeno durante 3 min, tras lo cual se controlo la disociacion durante 5 min. Despues de cada ciclo, la superficie de captura se regenero con 2 x inyecciones durante 1 min de HCl 40 mM, seguido de 30 s de NaOH 5 mM. Los caudales utilizados fueron de 10 pl/min para la captura, 30 pl/min para las fases de asociacion y disociacion, y 10 pl/min para la regeneracion.
Para los ensayos cineticos, se realizo una titulacion del antfgeno (para la albumina del suero humana, generalmente 62,5 nM-2 pM, para IL-1p, 1,25-40 nM), se empleo una celula de flujo de blanco para restar la referencia, y se incluyeron inyecciones de tampon-blanco para restar la deriva y el ruido del instrumento.
Se determinaron los parametros cineticos mediante un ajuste global simultaneo de los sensogramas resultantes a un modelo de union 1:1 convencional utilizando el software de Biacore T100 Evaluation. Para ensayar la union simultanea, se realizaron inyecciones de 3 min de HSA 5 pM o IL-1p 100 nm por separado, o una disolucion mixta de HSA 5 pM y IL-1 p 100 nm, sobre el Fab-dAb capturado.
Purificacion de Fab-dAb de E. coli
Extraction periplasmica
Se resuspendieron sedimentos de E. coli que contenfan los Fab-dAb dentro del periplasma, en el volumen de cultivo original con Tris/HCl 100 mM, EDTA 10 mM, pH 7,4. Estas suspensiones entonces se incubaron a 4 °C durante 16 horas a 250 rpm. Los sedimentos resuspendidos se centrifugaron a 10000 x g durante 1 hora a 4 °C. Los sobrenadantes se retiraron y se filtraron a 0,45 pm.
Captura de la proteina-G
Los Fab-dAb se capturaron a partir del sobrenadante filtrado mediante una cromatograffa de protefna G. Brevemente, los sobrenadantes se aplicaron, con un tiempo de residencia de 20 minutos, a una columna Gammabind Plus Sepharose (GE Healthcare) equilibrada en fosfato 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,1. La columna se lavo con fosfato 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,1, y el material unido se eluyo con glicina/HCl 0,1 M, pH 2,8. El pico de elucion se recogio y el pH se ajusto a aproximadamente pH 5 con acetato de sodio 1 M. Las eluciones con el pH ajustado se concentraron y se diafiltraron en acetato de sodio 50 mM, pH 4,5, empleando una membrana con un corte de peso molecular de 10 k.
Intercambio ionico
Los Fab-dAb se purificaron aun mas mediante una cromatograffa de intercambio cationico a pH 4,5 con un gradiente de elucion de NaCl. Brevemente, los eluatos de protefna-G diafiltrados se aplicaron a una columna Source15S (GE Healthcare) equilibrada en acetato de sodio 50 mM, pH 4,5. La columna se lavo con acetato de sodio 50 mM, pH 4,5, y el material unido se eluyo con un gradiente lineal de 20 volumenes de columna desde NaCl 0 a 1 M en acetato de sodio 50 mM, pH 4,5. Las fracciones del tercer volumen de columna se recogieron a lo largo del gradiente. Las fracciones se analizaron mediante A280 y SDS-PAGE y se reunieron las fracciones pertinentes.
Filtration en gel
Si es necesario, los Fab-dAb se purifican aun mas mediante filtracion en gel. Brevemente, las fracciones de la elucion del intercambio ionico reunidas FabA-dAbL3 (CK-SG4SE) se aplicaron a una columna Superdex200 (GE Healthcare) equilibrada en acetato de sodio 50 mM, NaCl 125 mM, pH 5,0, y se eluyeron con un gradiente isocratico
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de acetato de sodio 50 mM, NaCI 125 mM, pH 5,0. Se recogieron las fracciones de 1/120 del volumen de columna a lo largo del gradiente. Las fracciones se analizaron mediante A280 y SDS-PAGE y se reunieron las fracciones pertinentes. Para los Fab-dAb que no se sometieron a la filtracion en gel, las fracciones de elucion del intercambio ionico reunidas se concentraron y se diafiltraron en acetato de sodio 50 mM, NaCl 125 mM, pH 5,0, empleando una membrana de corte de peso molecular 10 k.
SDS-PAGE
Las muestras se diluyeron con agua cuando fue necesario y despues se anadieron, a 10 pl, 10 pl de 2X tampon de ensayo de muestras. Para las muestras no reducidas, se anadieron 2 pl de NEM 100 mM en este momento, y para las muestras reducidas se anadieron 2 pl de 10X de agente reductor. Las muestras se agitaron en vortice, se incubaron a 85 °C durante 5 mins, se enfriaron y se centrifugaron a 12500 rpm durante 30 seg. Las muestras preparadas se cargaron en un gel de SDS tris/glicina acrilamina al 4-20% y se ensayaron durante 100 min a 125 V. Los geles se trasladaron a membranas de PVDF para un analisis de la transferencia Western o se tineron con tinte de protefnas azul de Coomassie.
Analisis de la transferencia Western
Los geles se trasladaron a membranas de PVDF en Tris 12 mM, glicina 96 mM, pH 8,3, durante 16 horas a 150 mA. La membrana de PVDF se bloqueo durante 1 hr con Marvel™ al 2% en PBS + Tween20 al 0,1% (tampon de bloqueo).
Anti-cadena ligera: HRP-anti-cadenas ligeras kappa humanas de conejo, dilucion 1/5000 en tampon de bloqueo durante 1 hr; anti-cadena pesada: anti-cadena pesada humana de raton, dilucion 1/7000 en tampon de bloqueo durante 1 hr, seguido de HRP-anti-raton de cabra, dilucion 1/2000 en tampon de bloqueo durante 1 hr; anti-marcador His: anti-His6 de conejo, dilucion 1/1000 en tampon de bloqueo durante 1 hr, seguido de HRP-anti-IgG de raton de cabra, dilucion 1/1000 en tampon de bloqueo durante 1 hr.
Todas las transferencias se lavaron 6 veces con 100 ml de PBS + Tween20 al 0,1% durante 10 minutos por lavado. Las transferencias se revelaron con reactivo ECL durante 1 min antes de ser expuestas a Amersham Hyperfilm, o reactivo DAB potenciado en metales durante 20-30 minutos, seguido de agua.
HPLC de fase inversa a alta temperatura
Se analizaron muestras (2 pg) en una columna C8 Poroshell de 2,1 mm a 80 °C, con un caudal de 2 ml/min y un gradiente de B al 18-38% a lo largo de 4 min. A = TFA al 0,1% en H2O, B = TFA al 0,065% en IPA:MeOH 80:20. La deteccion se realiza mediante absorcion a 214 nm.
ELISA
Los rendimientos de Fab-dAb se midieron empleando un ELISA de "sandwich". Brevemente, el Fab-dAb se capturo con un anticuerpo anti-CH1 y despues se revelo con un anti-kappa-HRP.
FACS
Se incubaron muestras (mFabD-didAb) con HSA marcado con FITC 5 pg/ml (isotiocianato de fluorescefna) durante 45 min. Las incubaciones de muestra/HSA-FITC despues se anadieron a celulas T CD4+ de raton activadas y se incubaron durante 45 min mas. Las celulas se lavaron con PBS y la fluorescencia asociada a las celulas se midio mediante FACS (clasificacion de celulas activada por fluorescencia).
Ejemplo 3
Generacion de anticuerpos anti-albumina
Se inmunizaron conejos 1X lop con albumina del suero humana Chromapure recombinante (adquirida en Jackson). Los conejos recibieron 3 inmunizaciones de 100 ug de protefna HSA por via subcutanea, la primera inmunizacion en adyuvante de Freund completo y las posteriores inmunizaciones en Freund incompleto. Los anticuerpos 1 y 2, 646, 647, y 649 que se unen a la albumina del suero humana, de raton y de rata se aislaron empleando los metodos descritos en el documento WO04/051268. Los genes para el dominio variable de cadena pesada (VH) y para el dominio variable de cadena ligera (VL) de los anticuerpos 1 y 2 se aislaron y se secuenciaron despues de una clonacion por medio de una PCR de transcripcion inversa.
Las secuencias injertadas en la cadena ligera fueron subclonadas en el vector de expresion de cadena ligera de conejo pVRbcK que contiene el ADN que codifica la region constante C-Kappa de conejo. Las secuencias injertadas en la cadena pesada fueron subclonadas en el vector de expresion de cadena pesada de conejo pVRbHFab que contiene el ADN que codifica la region constante de cadena pesada de Fab' de conejo. Los plasmidos se cotransfectaron en celulas CHO y los anticuerpos producidos se seleccionaron para la afinidad y la union a la albumina (tabla 1). Las transfecciones de celulas CHO se llevaron a cabo usando el procedimiento de Lipofectamine™ 2000 siguiendo las instrucciones del fabricante (InVitrogen, n° de catalogo 11668).
Se disenaron regiones VL y VH humanizadas empleando marcos de aceptores de region V humanos y restos donadores en las regiones de marco. Se diseno una region VL injertada (L1 (SEQ ID NO:53) y L2 (SEQ ID NO:55)) y una region VH (H1 (SEQ ID NO:52) y H2 (SEQ ID NO:54)) para cada uno de los anticuerpos 1 y 2, respectivamente, 5 y se introdujeron genes mediante ensamblaje de oligonucleotidos y mutagenesis de PCR. Los anticuerpos de dominio injertados y sus CDR se muestran en la figura 5.
Tabla 1: Afinidades de anticuerpos anti-albumina
como Fab de conejo como IgG humanizada
HSA
SA murina SA humana SA murina SA de rata
nM
nM
nM
nM
nM
Anticuerpo 1 (Anticuerpo 645)
0,31 2,6 0,82 2,9 7,9
Anticuerpo 2 (Anticuerpo 648)
0,33 12 0,13 23 54
Anticuerpo 646
0,14 1,6 0,57 1,7 4,5
Anticuerpo 647
0,60 3,6 1,3 26 10
Anticuerpo 649
0,54 13 0,32 17 44
Ejemplo 4: Analisis de FabB-dAb expresados en celulas de mamffero
10 Se produjeron construcciones de FabB-dAb segun se describio en los metodos y se ensayaron los sobrenadantes procedentes de celulas HEK293 transfectadas que contenfan los FabB-dAb directamente en BIAcore.
Se realizaron analisis cineticos para evaluar la interaccion de HSA con las construcciones FabB-dAb. Estos consistieron en dAbL1, dAbH2 o dAbL3 condensado con el extremo C-terminal de CH1 de FabB (vease la figura 6). El FabB-dAbL1 tiene mayor afinidad por HSA , Kd = 170 nM, que el FabB-dAbL3, Kd = 392 nM. Se demostro que 15 FabB-dAbH2 posee la peor afinidad hacia HSA, Kd = 1074 nM, vease la tabla 2.
Tabla 2
Construccion
ka (x 104 M-1s-1) kd (x 10-3 s-1) Kd (x 10-9 M)
FabB-dAbL1 (CH1-G4Sx2)
1,91 ± 0,74 2,18 ± 1,21 170 ± 78
FabB-dAbH2 (CH1-G4Sx2)
2,66 ± 0,39 29 ± 4,76 1074±42
FabB-dAbL3 (CH1-G4Sx2)
2,63 ± 0,39 9,87 ± 1,63 392±119
La afinidad y los parametros cineticos se determinaron para la union de HSA a FabB condensados con dAbL1, dAbH2 o dAbL3. Los datos muestran el valores promedio ± PEE (para FabB-dAbL1 y FabB-dAbH2, n = 4; para 20 FabB-dAbL3, n = 2).
Una SDS-PAGE y una analisis de la transferencia Western de las protefnas FabB-dAb confirmaron que los FabB- dAb producidos tenfan el tamano esperado.
Ejemplo 5: Analisis de FabB-didAb expresados en celulas de mamffero
Se produjeron construcciones de FabB-didAb segun se describio en los metodos y se ensayaron los sobrenadantes 25 procedentes de celulas HEK293 transfectadas que contenfan los didAb directamente en BIAcore.
Se realizaron mas analisis empleando construcciones de didAb, en las que dAb individuales se condensan con los extremos C-terminales pesado y ligero de Fab. Las construcciones en las que el didAb procede de un apareamiento de dominios variables pesado y ligero naturales mostraron una notable mejorfa en la afinidad, comparado con el unico dAb por si solo (tabla 2 y 3). La fusion de didAb que consistfa en dos dAbLI no mostro mejorfa en la afinidad 5 frente a la observada para el dAbLI individual (los datos no se muestran).
Tabla 3
Construccion
ka (x 104 mV) kd (x 10-3 s-1) Kd (x 10-9 M)
FabB-didAb, -dAbLI (CK-G4Sx2) y dAbHI (CH1-G4Sx2)
1,78 0,16 9
FabB-didAb, -dAbL2 (CK-G4Sx2) y dAbH2 (CH1-G4Sx2)
0,54 0,21 39
La afinidad y los parametros cineticos se determinaron para la union de HSA a FabB condensados con dAbLI y dAbHI o dAbL2 y dAbH2.
10 Una SDS-PAGE de las protefnas de FabB-didAb confirmo que los FabB-didAb se expresaban bien y que tenfan el tamano esperado (vease la figura 4a). Notese que este gel de SDS-PAGE es de las protefnas totales expresadas por la celula.
Ejemplo 6
Analisis de FabA-dAb purificados
15 Se construyeron plasmidos para la expresion de los Fab-dAb, Fab'A-dAbL3 (CK-SG4SE) Fab'A-dAbL3 (CK- G[APAPA]2) en E. coli como se describe en los metodos. Los Fab-dAb se expresaron hacia el periplasma de E. coli y se purificaron hasta la homogeneidad segun se describe en los metodos. La pureza de los Fab-dAb se evaluo mediante HPLC en fase inversa de alta temperatura, SDS-PAGE y analisis de la transferencia Western. Los Fab- dAb tambien se evaluaron para la union al antfgeno mediante Biacore.
20 HPLC de fase inversa a alta temperatura
Una HPLC de fase inversa realizada como se describe en los metodos produjo un analisis cuantitativo de todas las especies contenidas en FabA-dAbL3 (CK-SG4SE) y FabA-dAbL3 (CK-G[ApApA]2). El porcentaje de cada especie presente se indica en la tabla 4.
Tabla 4: Cuantificacion de las especies presentes en lotes de Fab-dAb
Especies
Fab'A-dAbL3 (CK-SG4SE) Fab'A-dAbL3 (CK-G[APAPA]2)
Pico 1
0,6% 1,8%
Pico 2
0,6% 0,0%
Pico 3
1,0% 0,3%
Pico 4
0,9% 0,8%
Pico de Fab-dAb
85,5% 92,9%
Pico de di-Fab-dAb
11,5% 4,2%
25
SDS-PAGE
Se prepararon muestras de Fab-dAb bajo condiciones reducidas y no reducidas y se ensayaron en un gel como se describe en los metodos. El gel se tino con Coomassie. El perfil de bandas de ambas muestras de Fab-dAb, Fab'A- dAbL3 (CK-SG4SE) y Fab'A-dAbL3 (CK-G[APAPA]2), se corresponde bien con el perfil observado mediante una 30 HPLC de fase inversa a alta temperatura (figura 3).
5
10
15
20
25
Analisis de la transferencia Western
Muestras de Fab-dAb se sometieron a una SDS-PAGE no reducida, seguida de un analisis de la transferencia Western con anticuerpos anti-cadena ligera y anti-cadena pesada, segun se describe en los metodos. Esto confirmo que el dAb se encontraba en la cadena ligera del Fab y que la cadena pesada no estaba modificada en ambas muestras (figura 4). Tambien demostro que todas las bandas detectadas mediante la SDS-PAGE no reducida tenida con Coomassie son productos relacionados con Fab-dAb.
Biacore
Se empleo un analisis cinetico mediante SPR, segun se describe en los metodos, para evaluar la union de la albumina del suero humana a Fab'A-dAbL3 (CK-SG4SE) y Fab'A-dAbL3 (CK-G[APAPA]2). Los resultados en la tabla 5 demuestran que ambas construcciones son capaces de unirse a la albumina del suero humana con una afinidad similar (Kd) de aproximadamente 1 pM.
Tabla 5
Construccion
ka (x 104 mV) kd (x 10-2 s-1) Kd (x 10-9 M)
Fab'A-dAbL3 (CK- SG4SE)
3,44 1,42 411
Fab'A-dAbL3 (CK- G[APAPA]2)
9,61 2,85 296
Otros analisis cineticos demostraron que todas las construcciones de fusion conservaban las caracterfsticas de interaccion del FabA original hacia IL-1p, tabla 6, observandose solo pequenas diferencias en los parametros cineticos y de afinidad.
Tabla 6
Construccion
ka (x 105 mV) kd (x 10-5 s-1) Kd (x 10-12 M)
Fab'A-dAbL3 (CK- SG4SE)
1,90 4,21 221
Fab'A-dAbL3 (CK- G[APAPA]2)
2,17 3,99 184
Fab'A
2,02 6,46 320
El potencial para cada construccion para unirse simultaneamente con la albumina del suero human y el antfgeno de IL-1p se evaluo capturando cada construccion sobre la superficie del chip detector antes de llevar a cabo 3 inyecciones distintas de 3 min con albumina del suero humana 5 pM o IL-1 p 100 nM, o una disolucion mixta de albumina del suero humana 5 pM y IL-1 p 100 nM. Para cada construccion de Fab-dAb, la respuesta observada para la disolucion de HSA/IL-1p combinada fue casi identica a la suma de las respuestas de las inyecciones independientes (vease la tabla 7). Esto demuestra que los Fab-dAb son capaces de una union simultanea de ambas IL-1 p y albumina del suero humana, y que la union de IL-1 p o de la albumina del suero humana no inhibe la interaccion de la otra sustancia. El FabA original solo se une a IL-1 p, con una union desdenable a la albumina del suero humana.
Tabla 7
Construccion
Analito Union (RU)
Fab'A-dAbL3 (CK- SG4SE)
HSA + IL-1 p 37,6
HSA 13,2 (37,9)
IL-1 p 24,7
Fab'A-dAbL3 (CK- G[APAPA]2)
HSA + IL-1 p 61,9
5
10
15
20
25
Construccion
Analito Union (RU)
HSA 30,7 (63,6)
IL-1 p 32,9
Fab'A
HSA + IL-1 p 30,3
HSA 1,3 (30,0)
IL-1 p 28,7
La anterior tabla muestra la respuesta de union (RU) observada para cada construccion despues de inyecciones distintas de HSA o IL-1p, o una inyeccion de HSA y IL-1p premezclados. En cada caso, la concentracion final fue de 5 pM para el HSA y de 100 nM para la IL-1 p. La suma de las respuestas individuales de HSA e IL-1 p se muestra entre parentesis.
Ejemplo 7. FabA-didAb
Expresion de FabA-didAb en E. coli
Se expresaron fusiones FabA-dAb y FabA-didAb que terminan con un marcador de histidina C-terminal (marcador HIS6) en Escherichia coli. Despues de una extraccion periplasmica, las protefnas de fusion de dAb se purificaron por medio del marcador His6 C-terminal. La expresion del Fab se analizo mediante analisis de la transferencia Western de un gel no reducido con anticuerpos anti-CH1 y anti-cKappa. Los FabA-dAb y FabA-didAb se expresaron como protefnas de longitud completa y se demostro que reaccionaban con ambos reactivos de deteccion de anticuerpos.
Analisis de FabA-didAb expresados en E. coli
Se realizaron mas analisis para caracterizar la union de HSA a las construcciones de FabA con los que estaban condensados uno o mas dAb. Se realizaron ensayos de union con una diversidad de construcciones, en las que dAbL3 o dAbH4 estan condensados a la cadena ligera o pesada del FabA (vease la tabla 8 para detalles de las construcciones y un resumen de los datos de union). Mientras que se observo que las construcciones que portan solo dAbH4, tanto sobre la cadena ligera como sobre la cadena pesada, se unen a HSA con una afinidad comparativamente mala (aproximadamente 9 pM y 3 pM, respectivamente), se observo una afinidad de union mayor para las construcciones que portan dAbL3, como una fusion unica (en la cadena ligera o pesada) o en companfa de un segundo dAb (dAbL3 o dAbH4) en la cadena opuesta.
Tabla 8
Construccion
ka (x 104 M-1s-1) kd (x 10-3 s-1) Kd (x 10-9 M)
FabA
- - no
FabA-dAbL3 (LC-SG4SE)
4,46 16,2 363
FabA-dAbH4 (LC SG4SE)
- - 9142
FabA-dAbL3 (HC-DKTHTS)
8,24 15,4 187
FabA-dAbH4 (HC-DKTHTS)
- - 2866
FabA-didAb, -dAbL3 (LC-SG4SE) y -dAbL3 (HC-DKTHTS)
3,00 15,1 502
FabA-didAb, -dAbL3 (LC-SG4SE) y -dAbH4 (HC-DKTHTS)
4,36 16,3 373
Se determino la afinidad y los parametros cineticos para la union de HSA a FabA que portan dAbL3 o dAbH4 sobre la cadena ligera (LC) o sobre la cadena pesada (HC) o sobre ambas, segun se indica. No se detecto union (no) de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
HSA al FabA original. La cinetica de interaccion para la union de HSA al FabA con (dAbH4 sobre HC) o (dAbH4 sobre LC) fue demasiado rapida para poder determinarse y, por tanto, se determino la afinidad (KD) a partir de la union en estado estacionario.
Ejemplo 8
Expresion y purificacion de FabB-didAb Expresion en mamfferos
Antes de la transfeccion, se lavaron celulas CHO-XE en disolucion salina equilibrada de Earle (EBSS), se sedimentaron y se resuspendieron en EBSS a 2 x 108 celulas/ml. Se anadieron los plasmidos de cadena pesada y ligera a las celulas a una concentracion total de 400 ug. Se emplearon los parametros electricos optimizados para 800 pl de mezcla de celulas/ADN en el electroporador del laboratorio de los inventores para la transfeccion. Las celulas transfectadas se trasladaron directamente a 1 l de medio CD-CHO suplementado con Glutamax, HT y disolucion antibiotica y antimicotica. Las celulas se incubaron con agitacion a 37 °C durante 24 horas y despues se cambiaron a 32 °C. Se anadio butirato de sodio 3 mM en el dfa 4. Los sobrenadantes se recolectaron en el dfa 14 mediante centrifugacion a 1500 x g para eliminar las celulas. Los niveles de expresion se determinaron mediante ELISA.
Concentracion en el sobrenadante de la expresion en mamfferos
Los sobrenadantes de mamffero que contenfan aproximadamente 55 pg/ml de FabB-didAb, segun se evalua mediante ELISA, se concentraron desde 1,8 l a 200 ml empleando un concentrador Minisette equipado con una membrana de polietersulfona (PES) con un lfmite de exclusion molecular de 10 kDa.
Purificacion en protefna G
Los sobrenadantes concentrados se aplicaron a una columna Gammabind Plus Sepharose (GE Healthcare) equilibrada en fosfato 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,1. La columna se lavo con fosfato 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,1, y el material unido se eluyo con glicina/HCl 0,1 M, pH 2,7. El pico de elucion se recogio y el pH se ajusto a aproximadamente pH 7 con Tris/HCl 2 M, pH 8,8. Las eluciones con pH ajustado se concentraron hasta 1 mg/ml y se diafiltraron hacia fosfato 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,1, empleando una membrana PES de lfmite de exclusion molecular de 10 kD.
SDS-PAGE
Las muestras se diluyeron con agua cuando fue necesario y despues se anadieron, a 26 pl, 10 pl de 4X tampon de ensayo de muestras LDS. Para las muestras no reducidas, se anadieron 4 pl de NEM 100 mM, y para las muestras reducidas se anadieron 4 pl de 10X de agente reductor. Las muestras se agitaron en vortice, se incubaron a 85 °C durante 5 mins, se enfriaron y se centrifugaron a 12500 rpm durante 30 seg. Las muestras preparadas se cargaron en un gel de SDS tris/glicina acrilamina al 4-20% y se ensayaron durante 110 min a 125 V. Los geles se tineron con tincion de protefnas de azul de Coomassie.
ELISA
Los rendimientos de Fab-didAb se midieron empleando un ELISA de "sandwich". Brevemente, el Fab-didAb se capturo con un anticuerpo anti-CH1 y despues se revelo con un anti-kappa-HRP.
SDS-PAGE
Se prepararon muestras de FabB y FabB-didAb bajo condiciones reducidas y no reducidas, se separaron en un gel y se tineron como se describe en los metodos. Vease la figura 9.
Ejemplo 9
Ensayo de estabilidad termica Thermofluor con FabB-Fv
Se ensayaron muestras (1 pl de muestra a aproximadamente 1 mg/ml, 8 pl de PBS y 1 pl de 30x disolucion madre de tinte fluorescente naranja Sypro) por cuadruplicado en placas de 384 pocillos. La placa se calienta desde 20-99°C empleando un sistema de PCR a tiempo real rapido 7900HT y se midio la fluorescencia (excitacion a 490 nm, emision a 530 nm). Los resultados se muestran en la tabla D y en la figura 10.
5
10
15
20
25
30
35
Tm °C (Fab) Tm °C (Fv)
FabB-didAb, -dAbL1 (CK-G4SX2) y -dAbL1(CH1 -G4SX2)
81,9 ± 0,6 68,5 ± 0,5
FabB-didAb, -dAbL2(CK-G4SX2) y -dAbL2(CH1 -G4SX2)
82,4 ± 0,2 70,6 ± 0,8
Ejemplo 10
Ensayo de estabilidad de agregacion de FabB-Fv
Se incubaron muestras a 1 mg/ml en PBS a 25 °C con agitacion en vortice a 1400 rpm. La absorbancia se mide a 595 nm. Esta absorbancia es debida a la luz dispersada por partfculas y puede correlacionarse con la agregacion de la muestra. Ambos FabB-645Fv (G4SX2) y FabB-648Fv (G4SX2) son tan resistentes a la agregacion como FabB por si solo. Todos son mas resistentes a la agregacion que el control de IgG (figura 12).
Ejemplo 11
Dependencia del pH de la union de Fab-Fv a HSA
Se determinaron las afinidades de union para las interacciones de las construcciones de Fab-Fv con HSA segun se describe en los metodos, excepto que los tampones de ensayo a pH 5,0, 5,5, 6,0 y 7,0 se crearon mezclando acido cftrico 40 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,05% en v/v, y bifosfato de disodio 80 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,05% en v/v para producir el pH deseado.
La afinidad de FabB-645Fv (G4SX2) por HSA no se vio afectada por el pH desde 7,4 (pH patron del ensayo) a 5,0. La afinidad del FabB-648Fv (G4SX2) por HSA si se ve afectada por el pH y se produce una perdida en aproximadamente 10 veces de la afinidad entre pH 7,4 y pH 5,0.
Tabla 10
Kd (x 10-9 M)
pH 7,0
pH 6,0 pH 5,5 pH 5,0
FabB-645Fv(G4SX2)
13,3 12,5 10,7 7,1
FabB-648Fv(G4SX2)
3,3 11,1 24,1 47,8
Ejemplo 12
PK murino in vivo de FabB-Fv
Se determino la farmacocinetica de FabB-645Fv (G4SX2) y FabB-648Fv (G4SX2) en ratones BALB/c macho tras una unica administracion a 10 mg/kg por via subcutanea (sc) o intravenosa (iv). Se dosificaron seis ratones para cada construccion y via de administracion. Se recogieron muestras de sangre en serie (30 pl) de la vena de la cola en los siguientes momentos: 1, 4, 8, 24, 48, 72, 102 y 168 horas despues de la administracion subcutanea, y 30 minutos, 1, 8, 24, 48, 72, 96 y 168 horas despues de la administracion intravenosa. La sangre recogida se dispenso en una microcubeta Sarstedt CB300Z con activador de la coagulacion para la separacion del suero, y se dejo a temperatura ambiente durante al menos 20 minutos. La microcubeta despues se centrifugo a 20 °C a 10.000 rpm durante 5 minutos. Se retiro el suero y se conservo congelado antes del analisis. Se evaluo la concentracion de FabB-645Fv (G4SX2) o FabB-648Fv (G4SX2) en las muestras de suero mediante ELISA. Brevemente, placas Nunc MaXisorb Immunomodule Plates se revistieron con hOX40-Fc en PBS y se bloquearon con BSA al 1% en PBS. Las muestras de suero y los patrones se diluyeron en BSA al 1% en PBS y se aplicaron a la placa durante 1 hora. La placa se lavo con PBS y se aplico el anticuerpo revelador de conjugado de HRP anti-kappa humano de cabra en BSA al 1% en PBS durante 1 hora. La placa se lavo y despues se revelo con sustrato TMB, seguido de la detencion con acido sulfurico 2,5 M. Se midio la absorbancia a 630 nm y se determinaron las concentraciones a partir de la curva patron.
Ambos FabB-645Fv (G4SX2) y FabB-648Fv (G4SX2) presentan una semivida larga en plasma (figura 13). Las semividas de FabB-645Fv (G4SX2) son de 71 h sc y 62 h iv, y de FabB-648Fv (G4SX2) son de 25 h sc y 30 h iv.
Estudio de la eficacia in vivo de FabB-Fv
Se realizo un estudio para investigar si FabB-645Fv y FabB-648Fv son eficaces in vivo. Brevemente, esto implied la dosificacion en estado estacionario de ratones HuSCID y la lectura consistio en la prevencion del injerto de celulas 5 T.
Ratones CB 17 SCID fueron dosificados con una dosis de carga por via subcutanea en el dfa -2 de 2,475 mg/kg de FabB-645Fv o FabB-648Fv o FabB-PEG40k o PBS. En cada dfa posterior e incluyendo el dfa 10, fueron dosificados con una dosis de mantenimiento por via subcutanea de 0,75 mg/kg de FabB-645Fv o FabB-648Fv o FabB-PEG40k o PBS. Cada grupo de dosificacion consistio en 9-10 ratones. En el dfa -1, todos los ratones fueron tratados con 0,87 10 mg/raton de anticuerpo anti-TM-p1 murino de rata para abrogar la actividad de las celulas asesinas naturales. En el dfa 0, todos los ratones recibieron una inyeccion interperitoneal de 8 x 106 celulas mononucleares de sangre periferica humanas. En el dfa 14, los ratones se sacrificaron y se extrajeron la sangre, el bazo y un lavado peritoneal. Las muestras se analizaron mediante FACS para celulas T CD4+ y CD8+. Los conjuntos de datos se analizaron mediante un Anova de una sola via con una comparacion posensayo de Dunnett. Todas las construcciones de 15 ensayo FabB-645Fv, FabB-648Fv y FabB-PEG40k fueron igualmente eficaces en todos los compartimentos ensayados, es decir, sangre, peritoneo y bazo (figuras 14A, B y C).
Ejemplo 14
Mutaciones de FabB-645Fv para cambiar la afinidad de 645Fv por la albumina
Se introdujeron mutaciones puntuales en restos seleccionados en las CDR de la cadena pesada de la porcion 645Fv 20 de FabB-645dsFv (S3xG4S) mediante PCR mutagenica. Por ejemplo, I50A es una sustitucion de Ile 50 por Ala. Las diversas mutaciones se indican en la siguiente tabla 11. Se evaluo la afinidad de los mutantes de Fab-645Fv por la albumina humana mediante BIAcore, segun se describe en los metodos. Todas las mutaciones dieron como resultado una afinidad reducida o no alterada para la albumina humana.
Tabla 11
Mutacion cadena pesada de Fv
Albumina ka (1/Ms) kd (1/s) KD (nM)
I50A
HSA 3,12E+04 1,90E-03 60,9
T56A
HSA 4,65E+04 3,78E-04 8,12
T95A
HSA 2,81 E+04 2,64E-03 94,0
V96A
HSA 2,81 E+04 6,42E-04 22,9
P97A
HSA 4,60E+04 1,26E-02 275
G98A
HSA 4,73E+04 2,71E-04 5,73
Y99A
HSA 4,71E+04 4,79E-04 10,2
S100A
HSA 3,94E+04 1,44E-03 36,6
T100aA
HSA 3,60E+05 1,86E-02 51,6
Y100cA
HSA 1,23E+04 1,07E-03 87,0
I50A y T95A
HSA 2,12E+04 9,94E-03 468
I50A y G98A
HSA 1,79E+04 6,96E-03 389
I50A y Y99A
HSA >3500
5
10
15
20
25
30
Mutacion cadena pesada de Fv
Albumina ka (1/Ms) kd (1/s) KD (nM)
T56A y T95A
HSA 2,84E+04 8,57E-04 30,1
T56A y G98A
HSA 2,40E+04 3,68E-03 153
T56A y Y99A
HSA 2,24E+04 1,49E-02 664
Ejemplo 15
Longitud del conector 1-5 Gly4Ser entre Fab y Fv
Construction de plasmidos de fusion de FabB-645Fv para la expresion en celulas de mamffero
Se ensamblaron FabB-645Fv con un conector SGGGGS, SGGGGSGGGGS, SGGGGSGGGGSGGGGS, SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS o SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS entre los extremos C-terminales del Fab y los extremos N-terminales del Fv mediante PCR y despues se clonaron en vectores de expresion en mamfferos bajo el control del promotor HCMV-MIE y una secuencia poliA de SV40E. Los plasmidos de cadena pesada y ligera pertinentes se aparearon para la expresion en celulas de mamffero.
Expresion en mamfferos de FabB-645Fv (1-5xG4S)
Se transfectaron celulas HEK293 con plasmidos de cadena pesada y ligera utilizando el reactivo de transfeccion 293fectin de Invitrogen segun las instrucciones del fabricante. Brevemente, se incubaron 24 pg del plasmido de cadena pesada + 24 pg del plasmido de cadena ligera con 120 pl de 293fectin + 4080 pl de medio Optimem durante 20 mins a temperatura ambiente. Despues se anadio la mezcla a 60 x 106 celulas HEK293 en 60 ml de suspension y se incubaron durante 4 dfas con agitacion a 37 °C. Todas las construcciones fueron igualmente bien expresadas.
Purification en protefna G
Las suspensiones de expresion en mamfferos se aclararon mediante centrifugacion, y los sobrenadantes se concentraron hasta aproximadamente 1,8 ml empleando concentradores de centrifugacion de lfmite de exclusion molecular de 10 kDa. Los sobrenadantes concentrados se centrifugaron a 16000 x g durante 10 min para eliminar cualquier precipitado y despues se cargaron 1,5 ml en columnas HiTrap Protein-G de 1 ml (GE Healthcare) a 1 ml/min. Las columnas se lavaron con fosfato 20 mM, NaCl 40 mM, pH 7,4, y el material unido se eluyo con glicina 0,1 M/HCl, pH 2,7. El pico de elucion (2 ml) se recogio y el pH se ajusto a aproximadamente pH 5 con 250 pl de acetato de sodio 1 M. Las eluciones con pH ajustado se diafiltraron hacia fosfato 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,1, empleando concentradores de centrifugacion de lfmite de exclusion molecular de 10 kDa y se concentraron hasta aproximadamente 250 pl. Todas las construcciones presentaron unos perfiles de purificacion similares y las concentraciones finales fueron de 0,5-1,1 mg/ml.
Afinidad de FabB-645Fv (1-5xG4S) por la albumina
Se determinaron las afinidades de las construcciones de FabB-645Fv (1-5xG4S) purificadas por la albumina humana y de raton segun se describe en los metodos. Las diferentes longitudes de conector del Fv de 1 a 5 xGly4Ser entre los extremos C-terminales del Fab y los extremos N-terminales del Fv no afectaron a la afinidad del 645Fv por la albumina humana o de raton.
Tabla 12
Albumina KD (nM) Albumina KD (nM)
FabB-645Fv (1xG4S)
Humana 8,77 Raton 2,18
FabB-645Fv (2xG4S)
Humana 6,72 Raton 8,01
FabB-645Fv (3xG4S)
Humana 9,87 Raton 8,92
FabB-645Fv(4xG4S)
Humana 7,90 Raton 7,24
FabB-645Fv (5xG4S)
Humana 3,90 Raton 6,09
5
10
15
20
25
Se prepararon muestras de FabB-645Fv (1-5xG4S) bajo condiciones reducidas y no reducidas, se separaron en un gel y se tineron como se describe en los metodos. Vease la figura 15.
Analisis de exclusion molecular de FabB-645Fv (1-5xG4S) purificado
Se analizaron muestras de FabB-645Fv (1-5xG4S) para el tamano en una columna Superdex200 10/300GL Tricorn (GE Healthcare) ensayado con un gradiente isocratico de fosfato 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4, a 1 ml/min.
Una longitud del conector entre los extremos C-terminales del Fab y los extremos N-terminales del Fv de 1XG4S o 2XG4S reduce la cantidad de monomero de FabB-645Fv, al mismo tiempo que aumenta la cantidad de dfmero y multfmeros superiores. La cantidad de monomero es menor para la longitud del conector de 1xG4S. Una longitud del conector entre los extremos C-terminales del Fab y los extremos N-terminales del Fv de 3xG4S, 4xG4S o 5xG4S aumenta la cantidad de monomero de FabB-645Fv, al mismo tiempo que disminuye la cantidad de dfmero y multfmeros superiores, siendo los niveles similares para las tres longitudes de conector (figura 16).
Tabla 13
Monomero Dfmero Multfmeros superiores
FabB-645Fv (1xG4S)
5% 47% 48%
FabB-645Fv (2xG4S)
27% 38% 36%
FabB-645Fv (3xG4S)
51% 32% 17%
FabB-645Fv (4xG4S)
55% 30% 15%
FabB-645Fv (5xG4S)
51% 31% 18%
Analisis de estabilidad termica de Thermofluor de FabB-645Fv (1-5xG4S) purificado
Se ensayaron muestras (1 pl de muestra a aproximadamente 1 mg/ml, 8 pl de PBS y 1 pl de 30x disolucion madre de tinte fluorescente naranja Sypro) por cuadruplicado en placas de 384 pocillos. La placa se calienta desde 20-99°C empleando un sistema de PCR a tiempo real rapido 7900HT y se midio la fluorescencia (excitacion a 490 nm, emision a 530 nm). Los resultados se muestran en la tabla 14 y en la figura 17.
Tabla 14
Tm °C (Fab) Tm °C (Fv)
FabB-645Fv (1xG4S)
82,8 ± 0,6 67,4 ± 0,4
FabB-645Fv (2xG4S)
83,4 ± 0,3 68,7 ± 0,3
FabB-645Fv (3xG4S)
83,4 ± 0,3 69,5 ± 0,6
FabB-645Fv (4xG4S)
83,8 ± 0,3 71,3 ± 1,0
FabB-645Fv (5xG4S)
83,8 ± 0,4 72,0 ± 0,7
Ejemplo 16
Estabilizacion por disulfuro del Fv en un Fab-Fv
Plasmidos de fusion de FabB-645dsFv (2xG4S), FabB-648dsFv (2xG4S), FabAB-645dsFv (2xG4S) y FabAB-648dsFv (2xG4S) para la expresion en celulas de mamffero
5
10
15
20
25
30
35
Se introdujeron mutaciones puntuales en las secuencias de ADN de FabB-645Fv (2XG4S) y FabB-648Fv (2XG4S) en restos seleccionados en la region de marco de la cadena pesada y la cadena ligera del Fv mediante PCR mutagenica. Las mutaciones introducidas para crear un enlace disulfuro intercatenario entre las cadenas pesada y ligera del Fv fueron G44C en la cadena pesada y G100C en la cadena ligera. Ademas de anadir las cistefnas para crear el enlace disulfuro intercatenario en el Fv, se elimino el disulfuro intercatenario natural entre la cadena pesada y la cadena ligera del Fab mediante PCR mutagenica cambiando las cistefnas a serinas. Los Fv que contenfan un enlace disulfuro intercatenario se denominaron dsFv, y Fab que carecfan de un enlace disulfuro intercatenario se denominaron FabA. Despues, el ADN de todas estas construcciones se clono en vectores de expresion en mamfferos bajo el control del promotor HCMV-MIE y la secuencia poliA de SV40E. Los plasmidos de cadena pesada y ligera pertinentes se aparearon para la expresion en celulas de mamffero.
Expresion en mamfferos de FabB-645dsFv (2XG4S), FabB-648dsFv (2XG4S), FabAB-645dsFv (2XG4S) y bAB- 648dsFv (2xG4S)
Se transfectaron celulas HEK293 con plasmidos de cadena pesada y ligera utilizando el reactivo de transfeccion 293fectin de Invitrogen segun las instrucciones del fabricante. Brevemente, se incubaron 24 pg del plasmido de cadena pesada + 24 pg del plasmido de cadena ligera con 120 pl de 293fectin + 4080 pl de medio Optimem durante 20 min a temperatura ambiente. La mezcla despues se anadio a 60 x 106 celulas HEK293 en 60 ml de suspension y se incubo durante 4 dfas con agitacion a 37 °C. Todas las construcciones fueron igualmente bien expresadas.
Purificacion con protefna G de FabB-645dsFv (2XG4S), FabB-648dsFv (2XG4S), FabAB-645dsFv (2XG4S) y bAB- 648dsFv (2XG4S)
Las suspensiones de expresion en mamfferos se aclararon mediante centrifugacion, y los sobrenadantes se concentraron hasta aproximadamente 1,8 ml empleando concentradores de centrifugacion de lfmite de exclusion molecular de 10 kDa. Los sobrenadantes concentrados se centrifugaron a 16000 x g durante 10 min para eliminar cualquier precipitado y despues se cargaron 1,5 ml en columnas HiTrap Protein-G de 1 ml (GE Healthcare) a 1 ml/min. Las columnas se lavaron con fosfato 20 mM, NaCl 40 mM, pH 7,4, y el material unido se eluyo con glicina 0,1 M/HCl, pH 2,7. El pico de elucion (2 ml) se recogio y el pH se ajusto a aproximadamente pH 5 con 250 pl de acetato de sodio 1 M. Las eluciones con pH ajustado se diafiltraron hacia fosfato 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,1, empleando concentradores de centrifugacion de lfmite de exclusion molecular de 10 kDa y se concentraron hasta aproximadamente 250 pl. Todas las construcciones presentaron unos perfiles de purificacion similares y las concentraciones finales fueron de 0,5-0,8 mg/ml.
Afinidad de FabB-645dsFv (2XG4S), FabB-648dsFv (2XG4S), FabAB-645dsFv (2XG4S) y bAB-648dsFv (2XG4S) por la album: na
Se determinaron las afinidades de las construcciones FabB-645dsFv (2xG4S), FabB-648dsFv (2xG4S) FabAB- 645dsFv (2xG4S), FabAB-648dsFv (2xG4S) purificadas para la albumina humana y de raton segun se describe en los metodos. La estabilizacion con disulfuro del Fv no produjo ningun efecto o aumento ligeramente la afinidad del Fv para la albumina humana o de raton.
Tabla 15
Albumina KD (nM) Albumina KD (nM)
FabB-645Fv (2xG4S)
Humana 17,5 Raton 24,7
FabB-645dsFv (2xG4S)
Humana 12,6 Raton 14,0
FabAB-645dsFv (2xG4S)
Humana 8,3 Raton 12,2
FabB-648Fv (2xG4S)
Humana 9,4 Raton 42,4
FabB-648dsFv (2xG4S)
Humana 3,1 Raton 59,6
FabAB-648dsFv (2xG4S)
Humana 8,3 Raton 59,8
5
10
15
20
25
Se prepararon muestras de FabB-645dsFv (2XG4S), FabB-648dsFv (2XG4S) FabAB-645dsFv (2XG4S), FabAB- 648dsFv (2xG4S) purificados bajo condiciones reducidas y no reducidas, se separaron sobre un gel y se tineron segun se describe en los metodos. Vease la figura 18.
Analisis de exclusion molecular de FabB-645dsFv (2XG4S), FabB-648dsFv (2XG4S), FabAB-645dsFv (2XG4S) y bAB- 648dsFv (2XG4S) purificados
Se analizaron muestras de FabB-645dsFv (2XG4S), FabB-648dsFv (2XG4S) FabAB-645dsFv (2XG4S), FabAB- 648dsFv (2XG4S) purificados para determinar el tamano en una columna Superdex200 10/300GL Tricorn (GE Healthcare) revelada con un gradiente isocratico de fosfato 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4, a 1 ml/min.
La introduccion de un enlace disulfuro intercatenario en el Fv de un 645Fv o 648Fv aumento la cantidad de especies monomericas de Fab-Fv, comparado con el Fab-Fv en el que el Fv no presenta un disulfuro intercatenario. La eliminacion del enlace disulfuro intercatenario natural de la parte Fab de un Fab-Fv solo produjo un efecto pequeno sobre la cantidad de especies monomericas presentes (figura 19).
Tabla 16
Monomero Dfmero Multfmeros superiores
FabB-645Fv (2XG4S)
26% 38% 35%
FabB-645dsFv (2XG4S)
43% 21% 37%
FabAB-645dsFv (2XG4S)
40% 25% 34%
FabB-648dsFv (2XG4S)
50% 26% 24%
FabAB-648dsFv (2XG4S)
55% 24% 20%
Analisis de estabilidad termica de Thermofluor de FabB-645dsFv (2XG4S), FabB-648dsFv (2XG4S), FabAB-645dsFv (2XG4S) y bAB-648dsFv (2XG4S) purificados
Se ensayaron muestras (1 pl de muestra a aproximadamente 1 mg/ml, 8 pl de PBS y 1 pl de 30x disolucion madre de tinte fluorescente naranja Sypro) por cuadruplicado en placas de 384 pocillos. La placa se calienta desde 20-99°C empleando un sistema de PCR a tiempo real rapido 7900HT y se midio la fluorescencia (excitacion a 490 nm, emision a 530 nm).
La introduccion de un enlace disulfuro intercatenario en la parte Fv de un Fab-Fv de un 645Fv o 648Fv aumento la estabilidad termica del Fv, comparado con el Fab-Fv en el que el Fv no presenta un disulfuro intercatenario. La eliminacion del enlace disulfuro intercatenario natural de la parte Fab de un a Fab-Fv disminuyo la estabilidad termica de la parte Fab del Fab-Fv.
Tabla 17
Tm °C (Fab) Tm °C (Fv)
FabB-645Fv(2XG4S)
81,9 ± 0,6 68,5 ± 0,5
FabB-645dsFv (2XG4S)
83,6 ± 0,3 71,6 ± 0,3
FabAB-645dsFv (2XG4S)
79,5 ± 0,1 70,8 ± 0,6
FabB-648Fv (2XG4S)
82,4 ± 0,2 70,6 ± 0,8
FabB-648dsFv (2XG4S)
82,8 ± 0,3 75,0 ± 0,6
5
10
15
20
25
30
35
Tm °C (Fab) Tm °C (Fv)
FabAB-648dsFv (2xG4S)
n.d. 73,6 ± 0,8
n.d. = no determinado. El software de analisis no pudo resolver este punto de inflexion.
Metodo Biacore para FabD
Se determinaron las afinidades de union y los parametros cineticos para las interacciones de las construcciones de Fab-dAb y Fab-didAb mediante resonancia de plasmon de superficie (SPR) realizado en un Biacore T100 empleando chips detectores CM5 y tampon de ensayo HBS-EP (HEPES l0 mM (pH 7,4), NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,05% en v/v). Las muestras de Fab humano se capturaron sobre la superficie del chip detector empleando Fab de cabra especffico de F(ab')2 humano (Jackson ImmunoResearch, 109-006-097) o un anticuerpo monoclonal anti-CH1 humano generado en el laboratorio de los inventores. Las muestras de Fab murino se capturaron empleando un Fab de cabra especffico de F(ab')2 murino (Jackson ImmunoResearch, 115-006-072). La inmovilizacion covalente del anticuerpo de captura se logro mediante la qufmica de acoplamiento de amina convencional.
Cada ciclo de ensayo consistio en capturar, en primer lugar, la construccion Fab-dAb o Fab-didAb empleando una inyeccion durante 1 min, antes de una fase de asociacion que consiste en una inyeccion del antfgeno durante 3 min, tras lo cual se controlo la disociacion durante 5 min. Despues de cada ciclo, la superficie de captura se regenero con 2 x inyecciones durante 1 min de HCl 40 mM, seguido de 30 s de NaOH 5 mM. Los caudales utilizados fueron 10 pl/min para la captura, 30 pl/min para las fases de asociacion y disociacion, y 10 pl/min para la regeneracion.
Para los ensayos cineticos, se realizo una titulacion del antfgeno (para la albumina del suero humana o de raton, generalmente 62,5 nM-2 pM, para IL-1p, 1,25-40 nM, para el receptor de la superficie celular D, 20-1,25 nM), se empleo una celula de flujo de blanco para restar la referencia, y se incluyeron inyecciones de tampon-blanco para restar la deriva y el ruido del instrumento.
Se determinaron los parametros cineticos mediante ajuste global simultaneo de los sensogramas resultantes a un modelo de union 1:1 convencional utilizando el software de Biacore T100 Evaluation. Para ensayar la union simultanea, se realizaron inyecciones de 3 min de HSA 5 pM o IL-1p 100 nm por separado, o una disolucion mixta de HSA 5 pM y IL-1p 100 nm, sobre el Fab-dAb capturado. Se evaluo la union simultanea de la albumina y el receptor de la superficie celular D de la misma manera, utilizando concentraciones finales de HSA o MSA 2 pM y receptor de la superficie celular D murino 20 nM.
Ejemplo 17
Expresion en mamfferos de mFabC-mdidAb y mFabD-mdidAb
Se transfectaron celulas HEK293 con plasmidos de cadena pesada y ligera utilizando el reactivo de transfeccion 293fectin de Invitrogen segun las instrucciones del fabricante. Brevemente, se incubaron 2 pg del plasmido de cadena pesada + 2 pg del plasmido de cadena ligera con 10 pl de 293fectin + 340 pl de medio Optimem durante 20 min a temperatura ambiente. La mezcla despues se anadio a 5 x 106 celulas HEK293 en suspension y se incubo durante 6 dfas con agitacion a 37 °C.
ELISA
Los rendimientos de mFab-mdidAb se midieron empleando un ELISA de "sandwich". Brevemente, el mFab-mdidAb se capturo con un anticuerpo anti-CH1 y despues se revelo con un anti-kappa-HRP.
Tabla 18
Expresion en ELISA (ug/ml)
mFabD-mdidAb, -dAbL1 (CK-G4Sx2) y -dAbH1(CH1 -G4Sx2)
44
mFabD-mdidAb, -dAbL2(CK-G4Sx2) y -dAbH2(CH1-G4Sx2)
35
mFabC-mdidAb, -dAbL1 (CK-G4Sx2) y -dAbH1(CH1 -G4Sx2)
11
mFabC-mdidAb, -dAbL2(CK-G4Sx2) y -dAbH2(CH1-G4Sx2)
14
Se realizaron otros analisis cineticos para evaluar las interacciones de la albumina del suero y OX40 humano con las fusiones FabB-didAb, -dAbL1 (CK-G4Sx2) y -dAbH1(CH1-G4Sx2) y FabB-didAb, -dAbL2(CK-G4Sx2) y -dAbH2(CH1- G4Sx2) purificadas (tabla 19). Ambos FabB-didAb, -dAbL1 (CK-G4Sx2) y -dAbH1(CH1-G4Sx2) y FabB-didAb, - 5 dAbL2(CK-G4Sx2) y -dAbH2(CH1-G4Sx2) conservaron la afinidad por OX40 humano del FabB original (tabla 20).
El potencial de las construcciones de FabB-didAb, -dAbL1(CK-G4Sx2) y -dAbH1(CH1-G4Sx2) y FabB-didAb, - dAbL2(CK-G4Sx2) y -dAbH2(CH1-G4Sx2) para unirse simultaneamente a la albumina del suero human o de raton y OX40 humano se evaluo capturando cada construccion de Fab-didAb sobre la superficie del chip detector, antes de realizar inyecciones distintas de 3 min con albumina 2 pM (humana o de raton) o OX40 humano 50 nM, o una 10 disolucion mixta de ambos albumina 2 pM y OX40 50 nM. Se observo union a HSA en ambas construcciones de Fab-didAb. Para cada construccion de Fab-didAb, la respuesta observada para la disolucion de albumina/OX40 combinada fue casi identica a la suma de las respuestas de las inyecciones independientes (resumido en la tabla 21). Esto demuestra que los Fab-didAb son capaces de una union simultanea a OX40 y la albumina del suero. El FabB original se une solo a OX40, sin presentar union significativa con la albumina humana o de raton.
15 Tabla 19
Construccion
Albumina ka (x 104 mV) kd (x 10'5 s'1) Kd (x 10'9 M)
FabB-didAb, -dAbL1(CK-G4Sx2) y -dAbH1(CH1-G4Sx2
HSA 1,65 2,06 12,5
FabB-didAb, -dAbL2(CK-G4Sx2) y -dAbH2(CH 1-G4Sx2
HSA 1,80 1,24 6,92
FabB-didAb, -dAbL1(CK-G4Sx2) y -dAbH1(CH1-G4Sx2
MSA 1,83 1,82 9,94
FabB-didAb, - dAbL2(CK-G4Sx2) y -dAbH2(CH1-G4Sx2
MSA ND ND -
La afinidad y los parametros cineticos se determinaron para la union de HSA y MSA a las fusiones de Fab-didAb. Tabla 20
Construccion
ka (x 105 mV) kd (x 10'5 s'1) Kd (x 10'12 M)
FabB
2,92 22,6 775
FabB-didAb, -dAbL1(CK-G4Sx2) y -dAbH1(CH1-G4Sx2
3,58 8,54 238
FabB-didAb, - dAbL2(CK-G4Sx2) y -dAbH2(CH1-G4Sx2
3,27 13,6 415
20 Afinidad y parametros cineticos para la union de hOX40-Fc a las fusiones de FabB y FabB-didAb. Tabla 21
Construccion
Analito Union (RU)
FabB
HSA 2,5
MSA -2,5
OX40 89,5
HSA + OX40 90,1 (92)
MSA + OX40 86,5 (87)
5
10
15
20
25
Construccion
Analito Union (RU)
FabB-didAb, -dAbL1 (CK-G4Sx2) y -dAbH1(CH1 -G4Sx2
HSA 109,1
MSA 93,3
OX40 73,7
HSA + OX40 186,1 (182,8)
MSA + OX40 170,3 (167)
FabB-didAb, - dAbL2(CK-G4Sx2) y -dAbH2(CH1-G4Sx2
HSA 50,9
MSA 2,4
OX40 52,9
HSA + OX40 104,2 (103,8)
MSA + OX40 54,9 (55,3)
La anterior tabla muestra la respuesta de union (RU) observada para cada construccion despues de inyecciones distintas de HSA o MSA o hOX40-Fc, o una inyeccion de albumina y hOX40-Fc premezclados. En cada caso, la concentracion final fue de 2 pM de albumina HSA y 50 nM de hOX40-Fc. La suma de las respuestas individuales de albumina y hOX40-Fc se muestra entre parentesis.
Ejemplo 19
Se realizaron otros analisis cineticos para evaluar las interacciones de la albumina del suero y el receptor de la superficie celular D murino a mFabD-mdidAb, -mdAbL1(CK-G4Sx2) y mdAbH1(CH1-G4Sx2) y mFabD-mdidAb, - mdAbL2(CK-G4Sx2) y mdAbH2(CH1-G4Sx2) (tabla 22). Ambos mFabD-mdidAb mostraron una union de afinidad relativamente alta a HsA (Kd = 2,78 nM y 8,97 nM, respectivamente). Los mFabD-mdidAb, -mdAbL2(CK-G4Sx2) y mdAbH2(CH1-G4Sx2) tambien se unieron a MSA con una afinidad similar (Kd = 22 nM), aunque no se observo union a MSA para mFabD-mdidAb, -mdAbL1(CK-G4Sx2) y mdAbH1(CH1-G4Sx2). Ambos mFabD-mdidAb conservaron la afinidad por el receptor de la superficie celular D murino del mFabD original (tabla 23).
Se evaluo el potencial de mFabD-mdidAb, -mdAbL1(CK-G4Sx2) y mdAbH1(CH1-G4Sx2) y mFabD-mdidAb, - mdAbL2(CK-G4Sx2) y mdAbH2(CH1-G4Sx2) para unirse simultaneamente a la albumina del suero humana o de raton y al receptor de la superficie celular D murino capturando cada construccion de mFab-mdidAb sobre la superficie del chip detector, antes de realizar inyecciones distintas de 3 min con albumina 2 pM (humana o de raton) o receptor de la superficie celular D 20 nM, o una disolucion mixta de ambos albumina 2 pM y receptor de la superficie celular D 20 nM. De nuevo, se observo union de HSA para ambas construcciones de mFab-mdidAb, mientras que solo mFabD-mdidAb, -mdAbL2(CK-G4Sx2) y mdAbH2(CH1-G4Sx2) se unio a MSA. Para cada construccion de mFab-mdidAb, la respuesta observada para la disolucion de albumina/receptor de la superficie celular D combinada fue casi identica a la suma de las respuestas de las inyecciones independientes (resumido en la tabla 24). Esto demuestra que los mFab-mdidAb son capaces de una union simultanea al receptor de la superficie celular D y la albumina del suero. El mFabD original solo se une al receptor de la superficie celular D, sin union significativa con la albumina humana o de raton.
Tabla 22
Construccion
Albumina ka (x 104 mV) kd (x 10-5 s-1) Kd (x 10-9 M)
mFabD-mdidAb, -mdAbL1 (CK-G4Sx2) y mdAbH1(CH1- G4Sx2)
HSA 1,01 2,82 2,78
mFabD-mdidAb, -mdAbL2(CK-G4Sx2) y mdAbH2(CH1-
HSA 1,19 10,69 8,97
Construccion
Albumina ka (x 104 M'1s'1) kd (x 10-5 s-1) Kd (x 10-9 M)
G4Sx2)
mFabD-mdidAb, -mdAbL1 (CK-G4Sx2) y mdAbH1(CH1- G4Sx2)
MSA - - -
mFabD-mdidAb, -mdAbL2(CK-G4Sx2) y mdAbH2(CH1- G4Sx2)
MSA 1,03 22,73 22,06
La afinidad y los parametros cineticos se determinaron para la union de HSA y MSA a mFabD-mdidAb, -mdAbLI (CK-G4Sx2) y mdAbH1(CH1 -G4Sx2) y mFabD-mdidAb, -mdAbL2(CK-G4Sx2) y mdAbH2(CH1-G4Sx2).
Tabla 23
Construccion
ka (x 105 M-1s-1) kd (x 10-5 s-1) Kd (x 10-12 M)
mFabD
1,98 2,50 126
mFabD-mdidAb, -mdAbL1 (CK-G4Sx2) y mdAbH1(CH1-G4Sx2)
2,01 4,67 233
mFabD-mdidAb, -mdAbL2(CK-G4Sx2) y mdAbH2(CH1-G4Sx2)
3,62 6,36 176
5
Afinidad y parametros cineticos para la union del receptor de la superficie celular D murino-Fc a mFabD, mFabD- mdidAb, -mdAbL1(CK-G4Sx2) y mdAbH1(CH1 -G4Sx2) y mFabD-mdidAb, -mdAbL2(CK-G4Sx2) y mdAbH2(CH1- G4Sx2).
Tabla 24
Construccion
Analito Union (RU)
mFabD
receptor D 61,3
HSA 0,9
MSA -1,1
receptor D + HSA 62,9 (62,2)
receptor D + MSA 59,2 (60,2)
mFabD-mdidAb, -mdAbL1 (CK-G4Sx2) y mdAbH1(CH1-G4Sx2)
receptor D 39,8
HSA
59,9
MSA -0,6
receptor D + HSA 101,2 (99,7)
receptor D + MSA 39,9 (39,2)
mFabD-mdidAb, -mdAbL2(CK-G4Sx2) y mdAbH2(CH1-G4Sx2)
receptor D 42,6
Construccion
Analito Union (RU)
HSA
61,9
MSA 43,5
receptor D + HSA 105,3 (104,5)
receptor D + MSA 86,3 (86,1)
La anterior tabla muestra la respuesta de union (RU) observada para cada construccion despues de inyecciones distintas de HSA o MSA o receptor de la superficie celular D murino-Fc, o una inyeccion de albumina y receptor de la superficie celular D murino-Fc premezclados. En cada caso, la concentracion final fue de 2 pM de albumina HSA y 5 de 20 nM de receptor de la superficie celular D murino-Fc. La suma de las respuestas individuales de la albumina y el receptor de la superficie celular D murino-Fc se muestra entre parentesis.
Ejemplo 20
Se realizaron otros analisis para evaluar la interaccion simultanea de mFabD-mdidAb, -mdAbL1(CK-G4Sx2) y mdAbH1(CH1-G4Sx2) o mFabD-mdidAb, -mdAbL2(CK-G4Sx2) y mdAbH2(CH1-G4Sx2) con albumina del suero y 10 receptor de la superficie celular D murino expresado sobre la superficie celular. Ambos mFabD-mdidAb fueron capaces de unirse a HSA marcado con FITC y el receptor de la superficie celular X expresado sobre la superficie celular de celulas T murinas activadas simultaneamente (figura 11). El mFabD fue capaz de unirse al receptor de la superficie celular X expresado sobre la superficie celular de celulas T murinas activadas (los datos no se muestran), pero no se unio al HSA marcado con FITC.
15

Claims (9)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    REIVINDICACIONES
    1. - Una protefna de fusion de anticuerpo multivalente que comprende un fragmento Fab o Fab', con una primera especificidad por un antfgeno de interes, y que comprende ademas dos anticuerpos de dominio unico (dAb) con especificidad por un segundo antfgeno de interes, en la que los dos anticuerpos de dominio unico estan conectados por un enlace disulfuro y en la que los dos anticuerpos de dominio unico son una pareja Vh/Vl y el Vh de dAb esta geneticamente condensado, directamente o a traves de un conector, con el extremo C-terminal de la cadena pesada de Fab o Fab', y el Vl de dAb esta geneticamente condensado, directamente o a traves de un conector, con el extremo C-terminal de la cadena ligera de Fab o Fab'.
  2. 2. - Una protefna de fusion de anticuerpo multivalente segun la reivindicacion 1, en la que el primer antfgeno y el segundo antfgeno son entidades diferentes.
  3. 3. - Una protefna de fusion de anticuerpo multivalente segun la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en la que el segundo antfgeno es la albumina.
  4. 4. - Una protefna de fusion de anticuerpo multivalente segun la reivindicacion 3, en la que la albumina es la albumina del suero humana.
  5. 5. - Una protefna de fusion de anticuerpo de especificidad dual segun la reivindicacion 1, que comprende un fragmento Fab o Fab', con una primera especificidad por un antfgeno de interes, y que comprende ademas dos anticuerpos de dominio unico (dAb) con especificidad por un segundo antfgeno de interes, que se une a la albumina del suero humana, y en la que los dos anticuerpos de dominio unico estan conectados por un enlace disulfuro y uno de dichos anticuerpos de dominio unico es un anticuerpo de dominio unico de VH de cadena pesada que comprende al menos una CDR que tiene la secuencia que se indica en la figura 5 (e) SEQ ID NO:56 o la figura 5 (k) SEQ ID NO:62 para CDR-H1, una CDR que tiene la secuencia que se indica en la figura 5 (f) SEQ ID NO:57 o la figura 5 (l) SEQ ID NO:63 para CDR-H2, y una CDR que tiene la secuencia que se indica en la figura 5 (g) SEQ ID NO:58 o la figura 5 (m) SeQ ID NO:64 para CDR-H3.
  6. 6. - Una protefna de fusion de anticuerpo de especificidad dual segun la reivindicacion 1, que comprende un fragmento Fab o Fab', con una primera especificidad por un antfgeno de interes, y que comprende ademas dos anticuerpos de dominio unico (dAb) con especificidad por un segundo antfgeno de interes, que se une a la albumina del suero humana, y en la que los dos anticuerpos de dominio unico estan conectados por un enlace disulfuro y uno de dichos anticuerpos de dominio unico es un anticuerpo de dominio unico de VL de cadena ligera que comprende al menos una CDR que tiene la secuencia que se indica en la figura 5 (h) SEQ ID NO:59 o la figura 5 (n) SEQ ID NO:65 para CDR-L1, una CDR que tiene la secuencia que se indica en la figura 5 (i) SEQ ID NO:60 o la figura 5 (o) SEQ ID NO:66 para CDR-L2, y una CDR que tiene la secuencia que se indica en la figura 5 (j) SEQ ID NO:61 o la figura 5 (p) SEQ ID NO:67 para CDR-L3.
  7. 7. - Una protefna de fusion de anticuerpo de especificidad dual segun la reivindicacion 1, que comprende un fragmento Fab o Fab', con una primera especificidad por un antfgeno de interes, y que comprende ademas dos anticuerpos de dominio unico (dAb) con especificidad por un segundo antfgeno de interes, que se une a la albumina del suero humana, y en la que los dos anticuerpos de dominio unico estan conectados por un enlace disulfuro y uno de dichos anticuerpos de dominio unico es un anticuerpo de dominio unico de VH de cadena pesada que comprende la secuencia que se indica en SEQ ID NO:56 para CDRH1, la secuencia que se indica en SEQ ID NO:57 para CDRH2, y la secuencia que se indica en SEQ ID NO:58 para CDRH3, y el otro anticuerpo de dominio unico es un anticuerpo de dominio unico de VL de cadena ligera que comprende la secuencia que se indica en SEQ ID NO:59 para CDRL1, la secuencia que se indica en SEQ ID NO:60 para CDRL2, y la secuencia que se indica en SEQ ID NO:61 para CDRL3.
  8. 8. - Una composicion farmaceutica que comprende una protefna de fusion de anticuerpo de especificidad dual o multivalente segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en asociacion con uno o mas vehfculos, excipientes o diluyentes farmaceuticamente aceptables.
  9. 9. - Una protefna de fusion de anticuerpo de especificidad dual o multivalente segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para su uso en terapia.
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