ES2597228T3

ES2597228T3 - Procedimiento para la selección y la producción de entidades de objetivación, como dianas, altamente selectivas y multiespecíficas, personalizadas, las cuales contienen por lo menos dos entidades de unión diferentes, y utilización de éstas

Info

Publication number: ES2597228T3
Application number: ES13730906.8T
Authority: ES
Inventors: Sebastian Fenn; Erhard Kopetzki; Georg Tiefenthaler
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2012-06-27
Filing date: 2013-06-25
Publication date: 2017-01-17
Anticipated expiration: 2033-06-25
Also published as: EP2867253A1; CN104395339A; MX354862B; CA2871880A1; US11407836B2; JP6203838B2; KR20150023889A; RU2015100230A; BR112014032193A2; RU2639287C2; US10106612B2; US20230220110A1; WO2014001324A9; HK1207864A1; US20150232561A1; CN110256567A; CN110256567B; WO2014001324A1; MX2014014801A; EP2867253B1

Abstract

Un procedimiento para producir un anticuerpo biespecífico, el cual comprende la etapa de incubar (i) un fragmento de anticuerpo Fab, o un anticuerpo scFv, el cual comprende, en el ámbito de los residuos de los 20 aminoácidos C-terminales, la secuencia de aminoácidos GnSLPX1TG (SEQ ID NO: 02), en donde, X1, puede ser cualquier residuo de aminoácidos, con n >= 1, 2 ó 3, (ii) un fragmento de anticuerpo de una sola ramificación, el cual comprende una cadena pesada de anticuerpo, de longitud total, una cadena ligera de anticuerpo, de longitud total, y un polipéptido de la región Fc, de cadena pesada, de anticuerpo, en donde, la cadena pesada de anticuerpo, de longitud total, y la cadena ligera de anticuerpo, de longitud total, son cadenas de anticuerpo, cognadas, las cuales son complementarias, la una con respecto a la otra, y el par de dominios variables (VH y VL) de éstas, forman un sitio de unión al antígeno en donde, la cadena pesada de anticuerpo, de longitud total, y el polipéptido de la región Fc, de cadena pesada, de anticuerpo, se encuentran enlazados, de una forma covalente, el uno con el otro, vía uno o más enlaces de disulfuro, formando una región bisagra de anticuerpo, y en donde, el polipéptido de la región Fc, de cadena pesada, de anticuerpo, tiene una secuencia de aminoácidos GGCPX4C (SEQ ID NO: 08), en donde, X4, es S ó P, en su extremo N-terminal, y (iii) una enzima Sortasa A, y, mediante ello, producir el anticuerpo biespecífico.

Description

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encuentran enlazados, de una forma covalente, el uno con el otro, vía uno o más enlaces de disulfuro, formando una región bisagra de anticuerpo, y el polipéptido de la región Fc, de cadena pesada, de anticuerpo, tiene una secuencia de aminoácidos de la oligo-glicina Gm (m = 2, ó 3, ó 4, ó 5), en su extremo terminal N.

5 El fragmento de anticuerpo Fab, o el anticuerpo scFv, comprende, en el ámbito de los residuos de los 20 aminoácidos C-terminales, la secuencia de aminoácidos GnSLPX1TG (SEQ ID NO: 02), en donde, X1, puede ser cualquier residuo de aminoácidos, con n = 1, 2 ó 3).

En una forma de presentación de todos los aspectos, en concordancia con la presente invención, el fragmento de anticuerpo Fab, o el anticuerpo scFv, comprende, en el ámbito de los residuos de los 20 aminoácidos C-terminales, la secuencia de aminoácidos GSLPX1TGGSGS (SEQ ID NO: 03, en donde, X1, puede ser cualquier residuo de aminoácidos).

En una forma de presentación de todos los aspectos, en concordancia con la presente invención, el fragmento de

15 anticuerpo Fab, o el anticuerpo scFv, comprende, en el ámbito de los residuos de los 20 aminoácidos C-terminales, la secuencia de aminoácidos GGGSLPX1TGGSGS (SEQ ID NO: 04, en donde, X1, puede ser cualquier residuo de aminoácidos).

En una forma de presentación de todos los aspectos, en concordancia con la presente invención, el fragmento de anticuerpo Fab, o el anticuerpo scFv, comprende la secuencia de aminoácidos X2GSLPX1TGGSGS (SEQ ID NO: 05, en donde, X1, puede ser cualquier residuo de aminoácidos), en el ámbito de los residuos de los 20 aminoácidos C-terminales, en donde, X2, puede ser cualquier residuo de aminoácidos, excepto G.

25 anticuerpo Fab, o el anticuerpo scFv, comprende la secuencia de aminoácidos GnSLPX1TGGSGSX3 (SEQ ID NO: 06, en donde, X1, puede ser cualquier residuo de aminoácidos, con n = 1, 2 ó 3), en el ámbito de los residuos de los 20 aminoácidos C-terminales, en donde, X3, es una secuencia de aminoácidos tag.

En una forma de presentación de todos los aspectos, en concordancia con la presente invención, el fragmento de anticuerpo Fab, o el anticuerpo scFv, comprende la secuencia de aminoácidos X2GSLPX1TGGSGSX3 (SEQ ID NO: 07, en donde, X1, puede ser cualquier residuo de aminoácidos), en el ámbito de los residuos de los 20 aminoácidos C-terminales, excepto G, y en donde, X3, es una secuencia de aminoácidos tag.

En una forma de presentación de todos los aspectos, en concordancia con la presente invención, el polipéptido de la 35 región Fc de cadena pesada de anticuerpo, comprende dos residuos de glicina en su extremo terminal N.

El fragmento de anticuerpo de una sola ramificación, comprende la secuencia de aminoácidos GGCPX4C (SEQ ID NO: 08), en el extremo N-terminal de su cadena pesada, en donde, X4, es S ó P.

En una forma de presentación, en concordancia con la presente invención, X1 es E.

Aquí, en este documento de solicitud de patente, se reporta sobre una molécula de unión, multiespecífica, obtenida mediante un procedimiento el cual se da a conocer aquí.

45 Aquí, en este documento de solicitud de patente, se reporta sobre una molécula de unión, multiespecífica, la cual comprende la secuencia de aminoácidos LPX1TG (SEQ ID NO: 01, en donde, X1, puede ser cualquier residuo de aminoácidos), en una de sus cadenas pesadas.

En una forma de presentación, en concordancia con la presente invención, la molécula de unión, multiespecífica, comprende la secuencia de aminoácidos GnSLPX1TG (SEQ ID NO: 02, en donde, X1, puede ser cualquier residuo de aminoácidos, en donde, n = 1, 2 ó 3), en una de sus cadenas pesadas.

En una forma de presentación, en concordancia con la presente invención, la molécula de unión, multiespecífica, comprende la secuencia de aminoácidos GnSLPX1TGGCPX4C (SEQ ID NO: 09, en donde, X1, puede ser cualquier

55 residuo de aminoácidos, en donde, X4, puede ser S ó P, con n = 1, 2, ó 3), en una de sus cadenas pesadas.

En una forma de presentación, en concordancia con la presente invención, la molécula de unión, multiespecífica, comprende la secuencia de aminoácidos X2GSLPX1TGGCPX4C (SEQ ID NO: 10, en donde, X1, puede ser cualquier residuo de aminoácidos, en donde, X4, puede ser S ó P), en una de sus cadenas pesadas, en donde, X2, puede ser cualquier residuo de aminoácidos, excepto G.

Aquí, en este documento de solicitud de patente, se reporta sobre un anticuerpo biespecífico, obtenido mediante un procedimiento el cual se da a conocer aquí.

65 Aquí, en este documento de solicitud de patente, se reporta sobre un anticuerpo biespecífico, el cual comprende la

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anticuerpos multiespecíficos, formados a partir de fragmentos de anticuerpos.

Los fragmentos de anticuerpos, incluyen, si bien no de una forma limitativa en cuanto a éstos, a los fragmentos Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2, Fv, y scFv, y otros fragmentos, los cuales se describen posteriormente, más abajo, a 5 continuación. Para una revisión de determinados fragmentos de anticuerpos, véase el trabajo de Hudson, P.J., et al., en Nat. Med. 9 (2003) 129 -134. Para una revisión de los fragmentos scFv, véase, por ejemplo, Plueckthun, A., en: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, -La farmacología de los anticuerpos monoclonales -, volumen 113, Rosenburg and Moore (eds.), Springer-Verlag, New York (1994), páginas 269 -315; véase así mismo, también, la patente internacional WO 93 / 16 185; la patente estadounidense US 5. 571. 894 y la patente estadounidense US 5.

587. 458. Para una discusión de los fragmentos Fab y F(ab’)2, los cuales comprenden los residuos de epítopos de unión al receptor salvaje, y que tienen una vida media in vivo incrementada, véase la patente estadounidense US 5.

869. 046.

Los diacuerpos, son fragmentos de anticuerpos, con dos sitios de unión al antígeno, los cuales pueden ser

15 bivalentes o específicos. Véase, a dicho efecto, por ejemplo, la patente europea EP 0 404 097; la patente internacional WO 1993 / 01 161; Hudson, P.J., et al., Nat. Med. 9 (2003) 129 -134; y Holliger, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444 -6448. Los triacuerpos y tetratacuerpos, se describen así mismo, también, en Hudson, P.J., et al., Nat. Med. 9 (2003) 129 -134).

Los anticuerpos de dominio individual, son fragmentos de anticuerpos, los cuales comprenden la totalidad o una porción de un dominio variable de cadena pesada, o la totalidad o una porción de un dominio variable de cadena ligera. En ciertas formas de presentación, en concordancia con la presente invención, un anticuerpo de dominio individual, es un anticuerpo de dominio individual, humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; véase, a dicho efecto, por ejemplo, la patente estadounidense U.S. No. 6. 248. 516 B1).

25 Los fragmentos de anticuerpos, pueden producirse mediante varias técnicas, incluyendo, si bien no de una forma limitativa en cuanto a éstas, a la digestión proteolítica de un anticuerpo intacto, así como también la producción mediante células huésped recombinantes (tal como, por ejemplo, E. coli ó fago), de la forma la cual se describe aquí, en este documento de solicitud de patente.

El término “anticuerpo biespecífico”, tal y como éste se utiliza aquí, en este documento de solicitud de patente, significa una molécula de unión a un antígeno, la cual puede unirse, de una forma específica, a un primer antígeno o epítopo, y a un segundo antígeno o epítopo, en donde, el primer antígeno o epítopo, es distinto del segundo antígeno o epítopo.

35 Los formatos de anticuerpos biespecíficos, se describen, por ejemplo, en las patentes internacionales WO 2009 / 08 0251, WO 2009 / 080 252, WO 2009 / 080 253, WO 2009 / 080 254, WO 2010 /112 193, WO 2010 / 115 589, WO 2010 / 136 172, WO 2010 / 145 792, y WO 2010 / 145 793.

El término “citoxicidad mediatizada por células dependiente de anticuerpos”, abreviado, “ADCC” (de sus siglas en idioma inglés, correspondientes a "antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity"), tal y como éste se utiliza aquí, en este documento de solicitud de patente, significa una reacción mediatizada por células, en la cual, las células citotóxicas no dependientes del antígeno, las cuales expresan los FcRs (tales como, por ejemplo, las células asesinas naturales, (células NK – de sus iniciales en idioma ingles correspondientes a natural killer cells). Los

45 neutrófilos, y los macrófagos), reconocen a una célula objetivizada como diana, mediante una unión a la región Fc de la inmunoglobulina, y subsiguientemente, provocan la lisis de la célula objetivizada como diana. Las células primarias para mediatizar la ADDC, las células NK, expresan únicamente el FcγRIII, mientras que, los monocitos, expresan los FcγRI, FcγRII, y FcγRIII. La expresión del FcR, en células hematopoyéticas, se resume en la Tabla 3, en la página 464, de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457 -492.

El término “fagocitosis celular dependiente de anticuerpos”, abreviado, “ADCP”, significa un proceso, mediante el cual, las células recubiertas con un anticuerpo, se mediatizan, bien ya sea en su totalidad, o bien ya sea en parte, mediante células inmunes fagocíticas (tales como, por ejemplo, los macrófagos, los neutrófilos, o las células dendríticas), las cuales se unen a una región Fc de la inmunoglobulina.

55 El término “unión a un receptor Fc), tal y como éste se utiliza aquí, en este documento de solicitud de patente, significa la unión de una región Fc, a un receptor Fc, en por ejemplo el ensayo del tipo “BIAcore® assay” (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia).

En el ensayo del tipo “BIAcore(R) assay”, se procede a unir el receptor Fc, a una superficie, y la unión del analito, tal como por ejemplo, la consistente en una región Fc, la cual comprenda un polipéptido de fusión o un analito, y se procede a su medición, mediante resonancia de plasmón superficial (SRP – de sus siglas en idioma inglés, correspondientes a “surface plasmon resonance“) (SPR). La afinidad de la unión, se define mediante los términos Ka (constante de asociación: constante de proporción, para la asociación del polipéptido o conjugado de fusión de la

65 región Fc, para formar un complejo región Fc / receptor Fc), kd (constante de disociación, constante de proporción,

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El término “función efectora reducida”, tal y como éste se utiliza aquí, en este documento de solicitud de patente, significa una reducción de una función efectora específica, la cual se encuentra asociada con una molécula, tal como por ejemplo, la ADCC ó la CDC, en comparación con una molécula de control, (tal como, por ejemplo, un polipéptido

5 con una región Fc del tipo salvaje, en un porcentaje de por lo menos un 20%. El término “función efectora fuertemente reducida”, significa una reducción de una función efectora específica, asociada con una molécula, tal como, por ejemplo la ADCC ó la CDC, en comparación con una molécula de control, en un porcentaje de por lo menos un 50 %.

El término “región Fc”, significa una región C-terminal de una inmunoglobulina. La región Fc, es una molécula dimérica, la cal comprende dos fragmentos de cadena pesada de un anticuerpo ligado a disulfuro (cadenas de polipéptido de la región Fc de cadena pesada). Una región Fc, puede generarse mediante la digestión de papaína, o mediante la digestión de IdeS, ó mediante la digestión de tripsina, de un anticuerpo intacto (de longitud total), o bien, ésta puede producirse de una forma recombinante.

15 La región Fc, obtenible de un anticuerpo de longitud total, o la inmunoglobulina, de longitud total, comprende, por lo menos por lo menos dos residuos 226 (Cys), en el término C, de la cadena pesada de longitud total, y así, de este modo, ésta comprende un parte de la región bisagra y dos o tres dominios constantes, a saber, un dominio CH2, un domino CH3, y un dominio adicional / extra CH4, en los anticuerpos de la clase IgE e IgM. Se conoce, a raíz de las patentes estadounidenses U S 5. 648. 260, y U S 5. 624. 821, el hecho consistente en que, la modificación de residuos de aminoácidos conocidos, en la región Fc, tiene como resultado unos efectos fenotípicos.

La formación de la región Fc dimérica, la cual comprende dos fragmentos de cadena pesada de un anticuerpo, idénticas o no idénticas, se encuentra mediatizada por la dimerización no covalente de los dominios CH3

25 comprendidos (para los residuos de aminoácidos los cuales se encuentran involucrados, véase, por ejemplo, Dall’Acqua, Biochem. 37 (1998) 9266 -9273). La región Fc, se estabiliza, de una forma covalente, mediante la formación de enlaces de disulfuro, en la región bisagra (véase, a dicho efecto, por ejemplo, el trabajo de Huber, et al., publicado en Nature 264 (1976) 415 -420; y el trabajo de Thies, et al., publicado en J. Mol. Biol. 293 (1999) 67 79). La introducción de cambios en los residuos de aminoácidos, en el ámbito del dominio CH3, con objeto de interrumpir la dimerización de las interacciones del dominio CH3 – CH3, o afectan, de una forma adversa, a la unión al receptor Fc neonatal (FCRn), debido al hecho de la localización de los residuos involucrados en la dimerización del dominio CH3 – CH3, se encuentran localizados sobre la interfaz interior del dominio CH3 – CH3, mientras que, la interacción de los residuos involucrados en la interacción región Fc – FCRn, se encuentran localizados sobre el exterior del dominio CH2 – CH3.

35 Los residuos asociados con las funciones efectoras de una región Fc, se encuentran localizados en la región bisagra, el dominio CH2, y / o el dominio CH3, según se determina para una molécula de anticuerpo de longitud total. Las funciones asociadas / mediatizadas de la región Fc, son las siguientes:

(i): la citoxicidad celular dependiente de un anticuerpo (ADCC),

(ii): la unión a un complemento (C1q), activación, y citoxicidad dependiente de un complemento (CDC),

(iii) la fagocitosis / despeje de los complejos antígenos – anticuerpo,

(iv): la liberación citocinas, en algunos casos, y

(v): vida media / tasa de despeje de complejos anticuerpos y de antígenos – anticuerpos.

45 La región Fc asociada con las funciones efectoras, se inician mediante la interacción de la región Fc, con moléculas

o receptores específicos de la función efectora. En la mayoría de los casos, los anticuerpos de la subclase IgG1, pueden efectuar la activación de los receptores, mientras que, los anticuerpos de las clases IgG2 e IgG4, no tienen una función efectora, o éstos tienen una función efectora limitada.

Los receptores los cuales producen la función efectora, son los tipos (y los substipos) de receptores Fc, consistentes en los del tipo FcγRI, FcγRII y FcγRIII. Las funciones efectoras asociadas con una subclase de IgG1, pueden reducirse mediante la introducción de cambios de aminoácidos, específicos, en la región bisagra inferior, tales como los consistentes en los L234A y / ó L235A, los cuales se encuentran involucrados en la unión de los FcγR y C1q. Así

55 mismo, también, determinados residuos de aminoácidos, los cuales se encuentren especialmente localizados en el dominio CH2 y / o CH3, se encuentran asociados con la vida media circulante de una molécula de anticuerpo, o un polipéptido de fusión de la región Fc, en la corriente sanguínea. La vida media circulatoria, se determina mediante la unión de la región Fc a un receptor Fc neonatal (FcRn).

Los residuos de sialilo los cuales se encuentran presentes en la glicoestructura de la región Fc, se encuentran involucrados en la actividad mediatizada antiinflamatoria de la región Fc (véase, a dicho efecto, por ejemplo, el trabajo de Anthony, R.M., et al., en Science 320 (2008) 373 -376).

La enumeración o numeración de los residuos de aminoácidos, en la región constante de un anticuerpo, se realiza 65 en concordancia con el índice EU de Kabat (véase, a dicho efecto, Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of

Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, -Secuencias de proteínas de interés inmunológico, 5ª Edición, Servicios de la Salud Pública, Instituto Nacional de la Salud, Bethesda. Nº de publicación del NHI, 91 342).

5 El término “región Fc humana”, tal y como ésta se utiliza aquí, en este documento de solicitud de patente, significa una región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina de origen humano, la cual contiene por lo menos una parte de la región bisagra, el dominio CH2 y el dominio CH3. En una forma de presentación, en concordancia con la presente invención, la región Fc de cadena pesada de un anticuerpo de IgG humana, se extiende desde aproximadamente Glu215, ó desde aproximadamente Cys226, ó desde aproximadamente Pro230, hasta el extremo terminal carboxilo de la cadena pesada. Sin embargo, no obstante, la lisina C-terminal (Lys447) de la región Fc del anticuerpo, puede encontrarse presente, o bien ésta puede no encontrarse presente

El término “región Fc variante”, significa una secuencia de aminoácidos, la cual difiere de una secuencia de aminoácidos de la región Fc, “nativa” o “del tipo salvaje, en virtud de por lo menos una “modificación / mutación de 15 aminoácidos”. En una forma de presentación, en concordancia con la presente invención, la región Fc variante, tiene por lo menos una mutación de aminoácidos, en comparación de la región Fc nativa, o en comparación de una región Fc del polipéptido progenitor, tal como, por ejemplo, de aproximadamente una a aproximadamente diez mutaciones de aminoácidos y, en una forma de presentación, en concordancia con la presente invención, desde aproximadamente una hasta aproximadamente cinco mutaciones de una región Fc nativa, o en la región Fc del polipéptido progenitor. En una forma de presentación, en concordancia con la presente invención, la región Fc (variante), tiene un porcentaje de homología de aproximadamente un 80%, con una región Fc del tipo salvaje y / o con una región Fc de un polipéptido progenitor, y en una forma de presentación, en concordancia con la presente invención, la región Fc variante, tiene un porcentaje de homología, de aproximadamente un 90%, y en una forma de presentación, en concordancia con la presente invención, la región Fc variante, tiene un porcentaje de homología de

25 aproximadamente un 95%.

Las regiones Fc variantes, tal y como éstas se reportan aquí, en este documento de solicitud de patente, se definen mediante las modificaciones de aminoácidos las cuales éstas contienen. Así, por ejemplo, el término P329G, significa una región Fc variante, con la mutación de prolina a glicina, en la posición del aminoácido 329, con relación a la región progenitora (del tipo salvaje). La identidad del aminoácido del tipo salvaje, puede no estar especificada, en cuyo caso, la variante anteriormente mencionada, arriba, se refiere a 239G. Para todas las posiciones las cuales de discuten en la presente invención, la enumeración o numeración, se lleva a cabo en concordancia con el índice EU. El índice EU índice EU como en Kabat, o el esquema de enumeración EU, se refiere a la enumeración o numeración del anticuerpo EU (véase, a dicho efecto, el trabajo publicado por Edelman, et al., en Proc. Natl. Acad.

35 Sci. USA 63 (1969) 78 -85, el cual se incorpora aquí, en su totalidad, a título de referencia). La modificación, puede tratarse de una adición, de una supresión, o de una mutación. El término “mutación”, significa un cambio en los aminoácidos de origen natural, así como, también, un cambio en aminoácidos que no son de origen natural, véase, a dicho efecto, por ejemplo, la patente estadounidense U S 6. 586. 207, la patente internacional WO 98 / 48 032, la patente internacional WO 03 / 073 238, la patente estadounidense U S 2004 / 0 214 988, la patente internacional WO 2005 / 35 727, la patente internacional WO 2005 / 74 524, Chin, J.W., et al., J. Am. Chem. Soc. 124 (2002) 9026 -9027; Chin, J.W. y Schultz, P.G., ChemBioChem 11 (2002) 1135 -1137; Chin, J.W., et al., PICAS United States of America 99 (2002) 11020 -11024; y, Wang, L. y Schultz, P.G., Chem. (2002) 1 -10 (trabajos éstos, los cuales se incluyen aquí, en su totalidad, en este documento de solicitud de patente, a título de referencia).

45 Una cadena de polipéptido de una región Fc humana, del tipo salvaje, de la subclase IgG1, tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

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Una cadena de polipéptido de una región Fc humana variante, de la subclase IgG1, con las mutaciones L234A, L235 A; tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

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Una cadena de polipéptido de una región Fc humana variante, de la subclase IgG1, con una mutación T366S, 368A, e Y407V, tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

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Una cadena de polipéptido de una región Fc humana variante, de la subclase IgG1, con una mutación T366W, tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

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Una cadena de polipéptido de una región Fc humana variante, de la subclase IgG1, con una mutación L234A, L235A 25 y T366S, 368A, 368A, e Y407V, tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

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Una cadena de polipéptido de una región Fc humana variante, de la subclase IgG1, con una mutación L234A, L235A 35 y T366W, tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

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Una cadena de polipéptido de una región Fc humana variante, de la subclase IgG1, con una mutación P329G, tiene 45 la siguiente secuencia de aminoácidos:

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Una cadena de polipéptido de una región Fc humana variante, de la subclase IgG1, con una mutación L234A, L235A 55 y P329G, tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

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Una cadena de polipéptido de una región Fc humana variante, de la subclase IgG1, con una mutación P239G y 65 T366S, 368A, e Y407V, tiene la siguiente secuencia de aminoácidos: 15

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Una cadena de polipéptido de una región Fc humana variante, de la subclase IgG1, con una mutación P329G y T366W tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

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Una cadena de polipéptido de una región Fc humana variante, de la subclase IgG1, con una mutación L234A, L235A, P329G y T366S, 368A, y Y407V, tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

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Una cadena de polipéptido de una región Fc humana variante, de la subclase IgG1, con una mutación L234A, L235A, P329G y T366W , tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

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Una cadena de polipéptido de una región Fc humana, del tipo salvaje, de la subclase IgG4, tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

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Una cadena de polipéptido de una región Fc humana variante, de la subclase IgG4, con una mutación S228P y L235E, tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

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Una cadena de polipéptido de una región Fc humana variante, de la subclase IgG4, con una mutación S228P y L235E, y P329G, tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

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El término “receptor Fc”, de una forma abreviada, “FcR”, tal y como éste se utiliza aquí, en este documento de solicitud de patente, significa un receptor, el cual se une a una región Fc. En una forma de presentación, en concordancia con la presente invención, el FcR, es una FcR humana, de secuencia nativa. De una forma adicional, en una forma de presentación, en concordancia con la presente invención, el FcR, es un FcR, el cual se une a un anticuerpo FcR (un receptor Fc gamma) y éste incluye a los receptores de las subclases FcγRI, FcγRII, y FcγRIII, incluyendo a las variantes alélicas y, de una forma alternativa, a las formas empalmadas de éstas. Los receptores 15 FcγRII, incluyen a los receptores FcγRIIA (un “ receptor de activación”), y a los receptores FcγRIIB (un “ receptor de inhibición”), los cuales tienen, ambos, unas secuencias de aminoácidos similares, las cuales difieren, principalmente, en los dominios citoplásticos de éstos. El receptor de activación, FcγRIIA, contiene un motivo de activación de inmunoreceptores, basado en tirosina (ITAM – [de sus iniciales en idioma inglés, “immunoreceptor tyrosine-based activation motif”] -), en su dominio citoplásmico. El receptor de inhibición FcγRIIB, contiene un motivo de inhibición de inmunoreceptores, basado en tirosina (ITIM – [de sus iniciales en idioma inglés, “immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif”] -), en su dominio citoplásmico (véase, a dicho efecto, por ejemplo, el trabajo de Daëron, publicado en M., Annu. Rev. Immunol. 15 (1997) 203 -234). Los FcRs, se han revisado, por parte de Ravetch y Kinet, en un trabajo publicado en Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457 -492, también, por parte de Capel, et al., en un trabajo publicado en Immunomethods 4 (1994) 25 -34, y por parte, también, de, de Haas, et al., en un trabajo publicado en

25 J. Lab. Clin. Med. 126 (1995) 330 -341. Otros FcRs, incluyendo a aquéllos los cuales se identificarán en el futuro, se incorporan aquí, en este documento de solicitud de patente, mediante el térmico, "FcR". El término en cuestión, incluye así mismo, también, al receptor neonatal, FcRn, el cual es responsable para la transferencia de IgGs maternos, al feto (véase, a dicho efecto, por ejemplo, el trabajo publicado por parte de Guyer, et al., en J. Immunol. 117 (1976) 587; y el trabajo publicado por Kim, et al., en J. Immunol. 24 (1994) 249).

El término “receptor Fc gamma”, y en su forma abreviada ”FcγR”, tal y como éste se utiliza aquí, en este documento de solicitud de patente, significa cualquier familia de proteínas, las cuales se unen a la región Fc del anticuerpo IgG, y que se encuentran codificadas por un gen FcγR. En los humanos, esta familia, incluye, si bien no de una forma limitativa en cuanto a ésta, al FcγRII (CD64), incluyendo a las isoformas FcγRIA, FcγRIB, y FcγRIC, FcγRII (CD32), 35 incluyendo a las isoformas FcγRIIA, (incluyendo a los alotipos H131 y R131), FcγRIIB (incluyendo a los FcγRII-B-1 y FcγRIIB-2) y FcγRIIC, y FcγRRIII (CD16), incluyendo a las isoformas FcγRIIIA (incluyendo a los alotipos V158 y F158), y FcγRIII (incluyendo a los alotipos FcγRIIB-NA1 y FcγRII-NA2), (véase, a dicho efecto, por ejemplo, el trabajo de Jefferis, et al., publicado en Immunol. Lett. 82 (2002) 57 -65, el cual se incorpora aquí, en este documento de solicitud de patente, a título de referencia), así como también, cualesquiera FcγRs humanos, o isoformas o alotipos de FcγRs, los cuales no se hayan descubierto todavía. Una forma de FcγR, puede ser la procedente de un organismo, incluyendo éste, si bien no de una forma limitativa en cuanto a éstos, a los humanos, a los ratones, a las ratas, a los conejos, y a los monos. Los FcγRs de los ratones, incluyen, si bien no de una forma limitativa en cuanto a éstos, a los FcγRI (CD64), FcγRII (CD32), FcγRIII (CD16), y FcγRIII-C (CD16-2), así como también, cualesquiera FcγRs o isoformas o alotipos de FcγRs, del ratón, los cuales no se hayan descubierto todavía. 45 Los residuos de aminoácidos involucrados en la interacción región Fc – FcγR, son los 234 – 239 (región bisagra inferior), 265 – 269 (bucle B / C), 297 – 299 (bucle D / E), y 327 – 332 (bucle F / G), (véase, a dicho efecto, el trabajo de Sondermann, et al., publicado en Nature 406 (2000) 267 -273). Las mutaciones de aminoácidos las cuales tienen como resultado una unión / afinidad disminuidas para los FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB y / o FcγRIII, incluyen a la N297 (de una forma concomitante una disminución inmunogénica y una prolongada unión / afinidad, en cuanto a lo referente a la vida media), (véase, a dicho efecto, el trabajo de Routledge, et al., publicado en Transplantation 60 (1995) 847; el trabajo de Friend, et al., publicado en Transplantation 68 (1999) 1632; el trabajo de Shields, et al., publicado en J. Biol. Chem. 276 (2001) 659 1-6604), a los residuos 233 -236 (véase, a dicho efecto, el trabajo de Ward y Ghetie, publicado en Ther. Immunol. 2 (1995) 77; y el trabajo de Armour, et al., publicado en Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2613 -2624). Algunas sustituciones ejemplares de aminoácidos, se encentran descritas en la patente

55 estadounidense U S 7. 355. 008, y en la patente estadounidense U S 7. 381. 408.

El término “receptor Fc neonatal”, y de una forma abreviada, "FcRn", tal y como éste se utiliza aquí, en este documento de solicitud de patente, significa una proteína, la cual se une a la región Fc del anticuerpo IgG, y éste se encuentra codificado, por lo menos en parte, mediante un gen FcRn. El FcRn, puede ser de procedencia de cualquier organismo, incluyendo, si bien no de una forma limitativa en cuanto a éstos, a los humanos, a los ratones, a las ratas, a los conejos y a los monos. Tal y como es conocido, en arte especializado de la técnica, la proteína FcRn funcional, comprende dos polipéptidos, a los cuales se les hace referencia, a menudo, como la cadena pesada y la cadena ligera. La cadena ligera, es la beta-2-microglobulina, y la cadena pesada, se encuentra codificada por el gen Fcn. A menos que se notifique de una forma distinta, en este documento de solicitud de patente, FcRn y una 65 proteína FCRn, se refiere a un complejo de FcRn, de cadena pesada, con beta-2-microglobulina. Los residuos de

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El término “posición”, tal y como éste se utiliza aquí, en este documento de solicitud de patente, se refiere a la localización de residuo de aminoácidos, en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido. La posiciones, puede numerarse o enumerarse, de una forma secuencial, o en concordancia con un formato preestablecido, tal como, por ejemplo, un índice UE de Kabat, para una numeración (enumeración) de anticuerpos.

5 El término afinidad de unión a un FcR, “modificada”, ó actividad ADCC, “modificada”, significa un polipéptido, el cual tenga, bien ya sea una actividad de unión a un FcR, y / o actividad ADCC, enriquecida, o bien ya sea una actividad de unión a un FcR, y / o actividad ADDC, disminuida, a un polipéptido progenitor (tal como, por ejemplo, un polipéptido, el cual comprenda una región Fc del tipo salvaje). El polipéptido variante, el cual “tiene una unión incrementada”, a un FcR, se una por lo menos a un FcR, con una constante de disociación más baja (es decir, una mejor / más alta afinidad), que la correspondiente al polipéptido progenitor del tipo salvaje. La variante del polipéptido, la cual “tiene una unión disminuida”, a un FcR, se une a por lo menos un FcR, con una mayor constante de disociación (a saber, una afinidad peor / más baja), que la correspondiente a su polipéptido del tipo salvaje. Tales tipos de variantes, las cuales exhiben una unión disminuida a un FcR, pueden poseer una unión reducida, o no

15 apreciable, a un FcR, al como, por ejemplo, un porcentaje de unión del 0 – 20 %, para el FcR, en comparación con el de una región Fc de la IgG, del tipo salvaje o progenitora.

El polipéptido el cual se une a un FcR, con una “afinidad reducida”, en comparación con un polipéptido progenitor o del tipo salvaje, es un polipéptido, el cual se une a cualquiera de entre uno o más, de los FcRs anteriormente identificados, arriba, con una afinidad de unión (substancialmente) reducida, en comparación con la correspondiente al polipéptido progenitor, cuando las cantidades de la variante del polipéptido, y del polipéptido progenitor, en el ensayo de unión, son (esencialmente) las mismas. Así, por ejemplo, la variante del polipéptido, con una reducida afinidad de unión al FcR, puede exhibir una reducción en la afinidad de unión al FcR, en comparación con la correspondiente al polipéptido progenitor, en un valor comprendido dentro de unos márgenes, los cuales van desde

25 aproximadamente 1,15 veces hasta aproximadamente 100 veces, tal como, por ejemplo, una reducción correspondiente a un valor comprendido dentro de unos márgenes que van desde aproximadamente 1,2 veces, hasta aproximadamente 50 veces, en donde se determina la afinidad para de unión al FcR.

El polipéptido el cual comprende una región Fc variante, la cual “mediatiza la citotoxicidad mediatizada por células dependiente de un anticuerpo (ADCC), en presencia de células efectoras humanas, de una forma menos efectiva, que la correspondiente a un polipéptido progenitor, se trata de uno, el cual, in vitro o in vivo, es (substancialmente menos efectivo”, en la mediatización de la ADCC, cuando las cantidades del polipéptido variante y del polipéptido progenitor, utilizadas en el ensayo, son (esencialmente) aproximadamente las mismas. Generalmente, tales tipos de variables, se identificarán, mediante la utilización de un ensayo de ADCC, in vitro, tal y como se discute aquí, en este

35 documento de solicitud de patente, pero se contemplan así mismo, también, otros ensayos y procedimientos para determinar la actividad de la ADCC, tal como, por ejemplo, en un modelo animal, etc. En una forma de presentación, en concordancia con la presente invención, la variante es menos efectiva, en la mediatización de la ADCC, que el progenitor, en un valor comprendido dentro de unos márgenes, los cuales van desde aproximadamente 1,5 veces hasta aproximadamente 100 veces, tal como, por ejemplo, en un valor correspondiente a un valor comprendido dentro de unos márgenes los cuales van desde aproximadamente dos veces, hasta aproximadamente cincuenta, en por ejemplo, en el ensayo in vitro el cual se da a conocer aquí, en este documento de solicitud de patente.

El término “receptor”, tal y como éste se utiliza aquí, en este documento de solicitud de patente, significa un polipéptido, el cual es capaz de unirse a por lo menos un ligando. En una forma de presentación, en concordancia

45 con la presente invención, el receptor, es un receptor de superficie celular, el cual tiene un dominio extracelular de unión a un ligando y, de una forma opcional, otros dominios (tales como, por ejemplo, un dominio transmembrana, u dominio intracelular y / o anclaje de membrana). El receptor a ser evaluado, en el ensayo el cual se describe aquí, en este documento de solicitud de patente, puede ser el consistente en un receptor intacto, o un fragmento, o un derivado de éste (tal como, por ejemplo, una proteína de fusión, la cual comprende el dominio de unión del receptor, Fusionado a uno o más polipéptidos homólogos). De una forma adicional, el receptor a ser evaluado para sus propiedades de unión, puede encontrarse presente en una célula o aislamiento y, de una forma opcional, éste puede aplicarse, a modo de recubrimiento, sobre una placa de ensayo, o sobre cualquier otra fase sólida.

El término “tratamiento” (y las variaciones gramaticales de éste, tal como las consistentes en “tratar” o “tratando”),

55 tal y como éste se utiliza aquí, en este documento de solicitud de patente, se refiere a intervenciones clínicas, en una tentativa o esfuerzo para modificar el curso natural de un individuo el cual se esté tratando, y éste puede llevarse a cabo, bien ya sea para la profilaxis, o bien, durante el curso de la patología clínica. Los efectos deseables del tratamiento, incluyen, si bien no de una forma limitativa en cuanto a éstos, a la prevención o evitar que acontezca una enfermedad, o que reaparezca ésta, al alivio o mitigación de los síntomas, a la disminución de cualesquiera consecuencias patológicas directas o indirectas de la enfermedad, a la prevención o evitar la metástasis, a la disminución de la tasa progresión de la enfermedad, a la mejora o paliación del estado de la enfermedad, y a la remisión o prognosis mejorada. En algunas formas de presentación, en concordancia con la presente invención, los anticuerpos los cuales se reportan aquí, en este documento de solicitud de patente, pueden utilizarse para retardar el desarrollo de una enfermedad, o bien, para enlentecer la progresión de una enfermedad.

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Aquí, en este documento de solicitud de patente, se da a conocer un procedimiento para producir un cuerpo biespecífico, el cual comprende las siguientes etapas:

5 (i) determinar los marcadores de superficie, los cuales se encuentran presentes en la superficie de una célula, en una muestra, y seleccionar, de entre éstos, un primer marcador de superficie y un segundo marcador de superficie,

(ii) incubar (a) una primera entidad de unión, un fragmento Fab de anticuerpo, o un fragmento scFv de anticuerpo, el cual comprende, en los residuos de los 20 aminoácidos C-terminales, la secuencia de aminoácidos LPX1TG (SEQ ID NO: 01) , en donde, X1, puede ser cualquier residuo de aminoácidos, (b) un fragmento de anticuerpo, el cual comprende una cadena pesada de anticuerpo, de longitud total, una cadena ligera de anticuerpo, de longitud total, y un polipéptido de la región Fc, de cadena pesada, de anticuerpo, en donde, la cadena pesada de anticuerpo, de longitud total, y la cadena ligera de anticuerpo, de longitud total, son cadenas de anticuerpo, cognadas, y el par de dominios variables (VH y VL) de éstas, forman un sitio de unión al antígeno, el cual se une, de una forma específica,

15 al segundo marcador específico de superficie, en donde, la cadena pesada de anticuerpo, de longitud total, y el polipéptido de la región Fc, de cadena pesada, de anticuerpo, se encuentran enlazados, de una forma covalente, el uno con el otro, vía uno o más enlaces de disulfuro, formando una región bisagra de anticuerpo, y en donde, el polipéptido de la región Fc, de cadena pesada, de anticuerpo, tiene una secuencia de aminoácidos de la oligoglicina, en su extremo N-terminal, y (c) una enzima Sortasa A,

y, así, de este modo, producir la molécula de unión multiespecífica.

Aquí, en este documento de solicitud de patente, se da a conocer un procedimiento para determinar una combinación de entidades de unión a un antígeno, la cual comprende las siguientes etapas:

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(i) determinar la especificidad y / o selectividad y / o afinidad y / o función efectora, de unión, y / o vida media in vivo, de una multitud de anticuerpos biespecíficos, preparados mediante la combinación de cada uno de los miembros, a una primer multitud de los fragmentos Fab de anticuerpo, o los fragmentos de anticuerpo scFv, con cada miembro, de una segunda multitud de fragmentos de anticuerpos, comprendiendo una cadena pesada de anticuerpo, de longitud total, una cadena ligera de anticuerpo, de longitud total, y un polipéptido de la región Fc, de cadena pesada, de anticuerpo,

en donde, la primer multitud, se une, de una forma específica, a una primera molécula de superficie celular, y la segunda multitud, se une, de una forma específica, a una segunda superficie celular,

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(ii) elegir el anticuerpo biespecífico, con una apropiada especificidad y / o selectividad y / o afinidad y / o función efectora, de unión, y / o vida media, in vivo, y determinando, con ello, una combinación de sitios de unión al antígeno.

En una forma de presentación, en concordancia con la presente invención, la combinación, se caracteriza por la incubación del fragmento de anticuerpo Fab o fragmento de anticuerpo scFv, y el fragmento de anticuerpo, el cual comprende una cadena pesada de anticuerpo, de longitud total, una cadena ligera de anticuerpo, de longitud total, y

45 un polipéptido de la región Fc, de cadena pesada, de anticuerpo, con una enzima Sortasa A.

En una forma de presentación, en concordancia con la presente invención, el fragmento de anticuerpo Fab, o el anticuerpo scFv, comprende, en el ámbito de los residuos de los 20 aminoácidos C-terminales, la secuencia de aminoácidos LPX1TG (SEQ ID NO: 01, en donde, X1, puede ser cualquier residuo de aminoácidos)

En una forma de presentación, en concordancia con la presente invención, la cadena pesada de anticuerpo, de longitud total, y la cadena ligera de anticuerpo, de longitud total, de un fragmento de anticuerpo de una sola ramificación, son cadenas de anticuerpo, cognadas, y el par de dominios variables (VH y VL) de éstas, forman un sitio de unión al antígeno, el cual se une, de una forma específica, al segundo marcador de superficie, en donde, la

55 cadena pesada de anticuerpo, de longitud total, y el polipéptido de la región Fc, de cadena pesada, de anticuerpo, se encuentran enlazados, de una forma covalente, el uno con el otro, vía uno o más enlaces de disulfuro, formando una región bisagra de anticuerpo, y el polipéptido de la región Fc, de cadena pesada, de anticuerpo, tiene una secuencia de aminoácidos de la oligo-glicina, en su extremo terminal N.

El fragmento de anticuerpo Fab, o el anticuerpo scFv, comprende, en el ámbito de los residuos de los 20 aminoácidos C-terminales, la secuencia de aminoácidos GnSLPX1TG (SEQ ID NO: 02), en donde, X1, puede ser cualquier residuo de aminoácidos, con n = 1, 2 ó 3).

En una forma de presentación de todos los aspectos, en concordancia con la presente invención, el fragmento de 65 anticuerpo Fab, o el anticuerpo scFv, comprende, en el ámbito de los residuos de los 20 aminoácidos C-terminales,

la secuencia de aminoácidos GSLPX1TGGSGS (SEQ ID NO: 03, en donde, X1, puede ser cualquier residuo de aminoácidos).

5 anticuerpo Fab, o el anticuerpo scFv, comprende la secuencia de aminoácidos X2GSLPX1TGGSGS (SEQ ID NO: 05, en donde, X1, puede ser cualquier residuo de aminoácidos), en el ámbito de los residuos de los 20 aminoácidos C-terminales, en donde, X2, puede ser cualquier residuo de aminoácidos, excepto G.

En una forma de presentación de todos los aspectos, en concordancia con la presente invención, el fragmento de anticuerpo Fab, o el anticuerpo scFv, comprende la secuencia de aminoácidos GnSLPX1TGGSGSX3 (SEQ ID NO: 06, en donde, X1, puede ser cualquier residuo de aminoácidos, con n = 1, 2 ó 3), en el ámbito de los residuos de los 20 aminoácidos C-terminales, en donde, X3, es una secuencia de aminoácidos tag.

15 anticuerpo Fab, o el anticuerpo scFv, comprende la secuencia de aminoácidos X2GSLPX1TGGSGSX3 (SEQ ID NO: 07, en donde, X1, puede ser cualquier residuo de aminoácidos), en el ámbito de los residuos de los 20 aminoácidos C-terminales, excepto G, y en donde, X3, es una secuencia de aminoácidos tag.

En una forma de presentación de todos los aspectos, en concordancia con la presente invención, el polipéptido de la región Fc de cadena pesada de anticuerpo, comprende dos residuos de glicina en su extremo terminal N.

El fragmento de anticuerpo Fc, de una sola ramificación, comprende la secuencia de aminoácidos GGCPX4C (SEQ ID NO: 08), en el extremo N-terminal de su cadena pesada, en donde, X4, es S ó P.

25 En una forma de presentación, en concordancia con la presente invención, X1 es E.

Aquí, en este documento de solicitud de patente, se reporta sobre una molécula de unión multiespecífica / un anticuerpo de unión biespecifico, obtenido mediante un procedimiento el cual se da a conocer aquí.

Aquí, en este documento de solicitud de patente, se reporta sobre una molécula de unión, multiespecífica / un anticuerpo de unión, biespecífico, los cuales comprenden la secuencia de aminoácidos LPX1TG (SEQ ID NO: 01, en donde, X1, puede ser cualquier residuo de aminoácidos), en una de sus cadenas pesadas.

En una forma de presentación, en concordancia con la presente invención, la molécula de unión, multiespecífica / el

35 anticuerpo de unión, biespecífico, comprende la secuencia de aminoácidos GnSLPX1TG (SEQ ID NO: 02, en donde, X1, puede ser cualquier residuo de aminoácidos, en donde, n = 1, 2 ó 3), en una de sus cadenas pesadas.

En una forma de presentación, en concordancia con la presente invención, la molécula de unión, multiespecífica / el anticuerpo de unión, biespecífico, comprende la secuencia de aminoácidos GnSLPX1TGGCPX4C (SEQ ID NO: 09, en donde, X1, puede ser cualquier residuo de aminoácidos, en donde, X4, puede ser S ó P, con n = 1, 2, ó 3), en una de sus cadenas pesadas.

En una forma de presentación, en concordancia con la presente invención, la molécula de unión, multiespecífica / el anticuerpo de unión, biespecífico, comprende la secuencia de aminoácidos X2GSLPX1TGGCPX4C (SEQ ID NO: 10,

45 en donde, X1, puede ser cualquier residuo de aminoácidos, en donde, X4, puede ser S ó P), en una de sus cadenas pesadas, en donde, X2, puede ser cualquier residuo de aminoácidos, excepto G.

En una forma de presentación, en concordancia con la presente invención, X1, es E.

Aquí, en este documento de solicitud de patente, se reporta sobre una formulación farmacéutica, la cual comprende una molécula de unión, multiespecífica / un anticuerpo de unión, biespecífico, de la forma la cual se da a conocer aquí.

Aquí, en este documento de solicitud de patente, se reporta sobre el uso de una molécula de unión, multiespecífica / 55 un anticuerpo de unión, biespecífico, de la forma la cual se da a conocer aquí, en la fabricación de un medicamento.

En una forma de presentación, en concordancia con la presente invención, el medicamento, es para el tratamiento del cáncer.

Aquí, en este documento de solicitud de patente, se reporta sobre un procedimiento para tratar a un individuo, el cual está afectado de cáncer, procedimiento éste, el cual comprende la administración, al individuo en cuestión, de una cantidad efectiva de una molécula de unión, multiespecífica / un anticuerpo de unión, biespecífico, de la forma la cual se da a conocer aquí, en este documento de solicitud de patente.

65 Aquí, en este documento de solicitud de patente, se reporta sobre un procedimiento para la destrucción de células

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en concordancia con la presente invención, la afinidad a los FcγRI y FcγRIIIA, se encuentra reducida. En una forma de presentación, en concordancia con la presente invención, la afinidad a los FcγRI, FcγRII, y FcγRIIIA, se encuentra reducida.

5 En una forma de presentación, en concordancia con la presente invención, la afinidad a los FcγRI, FcγRIIIA, y a la C1q, se encuentra reducida.

En una forma de presentación, en concordancia con la presente invención, la afinidad a los FcγRI, FcγRII, FcγRIIIA, y a la C1, se encuentra reducida.

En una forma de presentación, en concordancia con la presente invención, el conjugado de la región Fc de un anticuerpo (según se produce mediante el procedimiento el cual se reporta aquí, en este documento de solicitud de patente), tiene una ADCC reducida, en comparación con una anticuerpo o conjugado Fc de un anticuerpo, en comparación con una región Fc del tipo salvaje. En una forma de presentación, en concordancia con la presente

15 invención, la ADDC, se encuentra reducida, en un porcentaje de por lo menos un 20%, en comparación con la ADDC inducida mediante un polipéptido de fusión, o conjugado, de la región Fc, el cual comprenda una región Fc del tipo salvaje.

En una forma de presentación, en concordancia con la presente invención, el conjugado de la región Fc de un anticuerpo (según se produce mediante el procedimiento el cual se reporta aquí, en este documento de solicitud de patente), tiene una ADCC y CDC, inducida mediante la región Fc, la cual se encuentra reducida o eliminada, en comparación con un conjugado de la región Fc de un anticuerpo, el cual comprenda una región Fc del tipo salvaje.

En una forma de presentación, en concordancia con la presente invención, el conjugado de la región Fc de un

25 anticuerpo (según se produce mediante el procedimiento el cual se reporta aquí, en este documento de solicitud de patente), tiene una ADCC, una CDC y una ADCP reducidas, en comparación con un conjugado de la región Fc de un anticuerpo, el cual comprenda una región Fc del tipo salvaje.

En una forma de presentación, en concordancia con la presente invención, el conjugado de la región Fc de un anticuerpo, comprende por lo menos una sustitución de aminoácido, en la región Fc, el cual se encuentra seleccionado de entre el grupo que comprende a los S228P, E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D, P329G, y P331S.

En una forma de presentación, en concordancia con la presente invención, la región Fc del tipo salvaje, es una 35 región Fc de la IgG1, humana, o una región Fc de la IgG4, humana.

En una forma de presentación, en concordancia con la presente invención, la región Fc de un anticuerpo, comprende, además de una mutación del residuo de aminoácido prolina, en la posición 239, por lo menos una adición, mutación, o supresión de un residuo de aminoácidos, en la región Fc, la cual se encentra correlacionada con una estabilidad incrementad de un conjugado de la región Fc de un anticuerpo.

En una forma de presentación, en concordancia con la presente invención, la adición, mutación o supresión adicional de un residuo de aminoácidos, en la región Fc, es en la posición 228 y / o 235 de la región Fc, si la región Fc, es de la subclase IgG4. En una forma de presentación, en concordancia con la presente invención, el residuo de

45 aminoácidos, serina, en la posición 228 y / o el resido de aminoácidos, leucina, en la posición 235, se encuentra / se encuentran sustituidos por otro aminoácido. En una forma de presentación, en concordancia con la presente invención, el conjugado de la región Fc de un anticuerpo, comprende un residuo de prolina, en la posición 228 (mutación del residuo de serina a un residuo de prolina). En una forma de presentación, en concordancia con la presente invención, el conjugado de la región Fc del anticuerpo, comprende un residuo de ácido glutámico, en la posición 235 (mutación del residuo de leucina, a un resido de ácido glutámico).

En una forma de presentación, en concordancia con la presente invención, la región Fc, comprende tres mutaciones de aminoácidos. En una forma de presentación, en concordancia con la presente invención, las tres mutaciones de aminoácidos, son una mutación de los P329G, S228P y L235E (P329G / SPLE).

55 En una forma de presentación, en concordancia con la presente invención, la adición, mutación o supresión de un residuo de aminoácidos, en la región Fc, es en la posición 234 y / o 235 de la región Fc, si la región Fc, es de la subclase IgG1. En una forma de presentación, en concordancia con la presente invención, el residuo de aminoácidos leucina, en la posición 234 y / o el residuo de aminoácidos, en la posición 235, se encuentra / se encuentran mutados a otro aminoácido.

En una forma de presentación, en concordancia con la presente invención, la región Fc, comprende una mutación de aminoácidos, en la posición 234, en donde, el residuo de aminoácidos leucina, se encuentra mutado a un residuo aminoácido de alanina.

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del segundo polipéptido del substrato con contenido de oligoglicina (correspondiente a la unidad de pentaglicina de peptidoglicano en la S. aureus), conduciendo a una proteína de la pared celular unida de una forma covalente, y a la regeneración de la sortasa A. En la ausencia de nucleófilos de oliglicina, el intermediario de acil-enzima, se hidroliza mediante una molécula de agua.

5 La ligación / conjugación mediatizada por la sortasa, se ha empezado a aplicar para el diseño de una variedad de proteínas, y propósitos de bioconjugación. Esta nueva técnica, posibilita la introducción de funcionalidades naturales e innaturales, en los polipéptidos LPX1TLPX-etiquetado, recombinantes, o químicamente sintetizados. Los ejemplos, incluyen a la unión covalente de polímeros derivatizados de la oligoglicina (tal como, por ejemplo, PEG), los

10 fluoróforos, las vitaminas, (tal como, por ejemplo, biotina y folato), los lípidos, los hidratos de carbono, los ácidos nucleicos, los péptidos sintéticos y las proteínas sintéticas (tal como, por ejemplo, GEP) (véase, a dicho efecto, el trabajo de Tsukiji, S. y Nagamune, T., publicado en ChemBioChem 10 (2009) 787 -798; y el trabajo de Popp, M.W.-

L. y Ploegh, H.L., publicado en Angew. Chem. Int. Ed. 50 (2011) 5024 -5032).

15 Se ha mostrado el hecho de que, una triglicina e, incluso un motivo de diglicina, del componente aminoácido, es suficiente, para la etapa de ligadura mediatizada por SrtA (véase, a dicho efecto, el trabajo de Clancy, K.W., et al., publicado en Peptide Science 94 (2010) 385 -396).

Para la conjugación enzimática, puede utilizarse una sortasa A truncada, soluble, exenta de la región que abarca a

20 la membrana (SrtA; residuos de aminoácidos 60 -206 de Staphylococcus aureus SrtA) (véase, a dicho efecto, el trabajo de Ton-That, H., et al., publicado en Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (1999) 12424 -12429; y el trabajo de Ilangovan, H., et al., publicado en Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 (2001) 6056 -6061). La variante de sortasa A, truncada, soluble, pueden producirse en E. coli.

25 Una región Fc de un anticuerpo, la cual comprende una oligoglicina, en por lo menos uno de sus extremos Nterminales (Gm, m = 2, ó 3, ó 4, ó 5), puede expresarse y purificase, a partir del sobrenadante de células eucariotas (tal como, por ejemplo, células HEK293, células CHO).

Una entidad de unión (tal como, por ejemplo, un polipéptido de unión a un antígeno, de cadena individual, tal como

30 un scFv, un scFab, o una darpina, o polipéptido de unión a un antígeno, de cadena múltiple, tal como un dsFv ó un Fab), la cual comprenda un motivo de reconocimiento SrtA, en el extremo C-terminal de una cadena de polipéptido, puede expresarse y purificarse, a partir del sobrenadante de células eucariotas (tal como, por ejemplo, la células HEK293, las células CHO).

35 Aquí, en este documento de solicitud de patente, se reporta sobre un anticuerpo biespecífico, el cual se obtiene mediante la conjugación de un polipéptido / dominio de unión a un antígeno (tal como, por ejemplo, scFv, scFab), a una variante de anticuerpo de una sola ramificación (OA-Fc) mediante la utilización de la Sortasa A, en donde, la secuencia de reconocimiento de la sortasa, se encuentra localizada en el extremo C-terminal del polipéptido de unión al antígeno, de cadena individual (tal como, por ejemplo, scFv, scFab, ó darpina), o el extremo C-terminal de

40 una cadena de polipéptido de un complejo de unión al antígeno, de cadena múltiple ( tal como, por ejemplo, dsFv ó Fab), y en donde, un motivo de glicina, doble o triple, se encuentra localizado en el extremo N-terminal de la cadena Fc, de una variante de anticuerpo de una sola ramificación ((OA-Fc-Gm; m = 2 ó 3). Un conjugado Fab ó scFv del anticuerpo de una sola ramificación el cual comprende un fragmento Fab de anticuerpo (OA-Fc∼Fab) o un fragmento de anticuerpo, scFv (OA-Fc∼scFv) y un anticuerpo de una sola ramificación (OA-Fc), puede obtenerse, mediante un

45 alto rendimiento productivo, en una conjugación enzimática, mediante la utilización de (i) un polipéptido, el cual comprende una secuencia de aminoácidos GnSLPX1TG (SEQ ID NO:02, en donde, X1, puede ser cualquier residuo de aminoácidos, con n = 1, 2, ó 3), en su región del extremo C-terminal, (ii) un polipéptido de la región Fc, de cadena pesada, el cual comprende una oligoglicina, en su extremo N-terminal, y (iii) la enzima Sortasa A.

50 Mediante esta combinación de reactivos

i) la reacción inversa la cual reconoce a la secuencia de aminoácidos LPX1TG, en el producto conjugado como substrato, y / o

55 ii ) la generación de un fragmento de polipéptido de hidrólisis de punto muerto (polipéptido sin una secuencia de reconocimiento LPX1TG, o bien con secuencia de LPX1TG segmentada o escindida, generada a través de la segmentación o escisión de la entidad de unión al tioacilo, Sortasa A, inmediatamente, mediante agua, en lugar del nucleófilo de la región Fc del anticuerpo Gm)

60 que acontecen, de una forma normal, en tiempos de reacción incrementados, puede reducirse o incluso eliminarse.

Se ha procedido a someter, a test de ensayo, diferentes combinaciones de secuencias de aminoácidos C-terminales y N-terminales.

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a las células de los insectos. Se han identificado numerosas cepas vaculovirales, las cuales se han utilizado en conjunción con las células de insectos, de una forma particular, para la transfección de las células Spodoptera frugiperda.

5 Los cultivos de las células de plantas, pueden también utilizarse como huéspedes (véase, por ejemplo, a dicho efecto, las patentes estadounidenses U S 5. 959. 177, U S 6. 040. 498, U S 6. 420. 548, U S 7. 125. 978, y U S 6.

417. 429 (en donde se describe la tecnología PLANTIBODIES™, para producir anticuerpos en plantas transgénicas).

Las células de vertebrados, pueden ser utilizadas como huéspedes. Así, por ejemplo, pueden ser de utilidad, a dicho efecto, líneas celulares de mamíferos, las cuales se encuentren adaptadas para crecer en suspensión. Otros ejemplos de líneas celulares huésped de mamíferos, son las consistentes en la línea celular COS-7 (la célula del riñón de mono, CV1, transformada mediante (el virus) SV40; la línea celular HEK293 (riñón embrionario humano); la línea celular BHK (de la cría de hámster), la línea celular sertoli del ratón, TM4 (células TM4, según se describen éstas, por ejemplo, mediante el trabajo de Mather, publicado en Biol. Reprod. 23 (1980) 243 -251); la línea celular 15 CV1 (célula del riñón del mono); la línea celular VERO-76 (célula del riñón del mono verde africano); la línea celular HELA (célula del carcinoma cervical humano); la línea celular MDCK (célula del riñón canino), la línea celular BRL3A (célula del hígado de la rata búfalo); la línea celular W138 (célula del pulmón humano), la línea celular HepG2 (célula del hígado humano); la línea celular MMT 060562 (célula del tumor mamario del ratón); la línea celular TRI (según se describe ésta, por ejemplo, en el trabajo de Mather, et al., publicado en Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44 -68; la línea celular MRC5; y las líneas celulares FS4. Otras líneas celulares huéspedes, de mamíferos, las cuales con de utilidad, incluyen a la línea celular CHO (célula del ovario del hámster chino), incluyendo a las líneas celulares DHFR, y CHO negativas (véase, a dicho efecto, el trabajo de Urlaub, et al., publicado en Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216), y las líneas celulares del mieloma, tales como las consistentes en la línea celular Y0, en la línea celular NS0 y en la línea celular Sp2/0. Para una revisión de determinadas líneas celulares huéspedes, de

25 mamíferos, las cuales son apropiadas para la producción de polipéptidos, véase, por ejemplo, del trabajo de Yazaki, y Wu, publicado en Methods in Molecular Biology, Antibody Engineering, -Procedimientos en biología molecular, diseño de anticuerpos -, 248 (2004) 255 -268 (B.K.C. Lo, (ed.), Humana Press, Totowa, NJ).

IV. Procedimientos y composiciones para la diagnosis y para la detección

En ciertas formas de presentación, en concordancia con la presente invención, cualesquiera de los anticuerpos biespecíficos, los cuales se proporcionan aquí, en este documento de solicitud de patente, son de utilidad para detectar la presencia de uno o de ambos antígenos, en una muestra biológica. El término “detectar”, tal y como éste se utiliza aquí, en este documento de solicitud de patente, abarca a la detección cuantitativa o la detección

35 cualitativa. En ciertas formas de presentación, en concordancia con la presente invención, una muestra biológica, comprende una célula o un tejido, tales como las biopsias o células cancerosas.

En una forma de presentación, en concordancia con la presente invención, se proporciona un anticuerpo biespecífico, para su uso en un procedimiento de diagnosis o de detección. Aquí, en este documento de solicitud de patente, se proporciona un procedimiento para la detección de la presencia de células cancerosas, en una muestra biológica. En ciertas formas de presentación, en concordancia con la presente invención, la procedimiento, comprende el proceder a poner en contacto la muestra biológica, con una anticuerpo biespecífico, de la forma la cual se describe aquí, en este documento de solicitud de patente, bajo unas condiciones permisivas para la unión del anticuerpo específico a su anticuerpo biespecífico, a su antígeno o antígenos, y detectar el hecho de si se forma un

45 complejo, entre el anticuerpo biespecífico y su antígeno o antígenos. Tal tipo de procedimiento, puede ser un procedimiento in vitro, o puede ser un procedimiento in vivo.

Los trastornos o desórdenes ejemplares los cuales pueden ser diagnosticado, mediante la utilización de un anticuerpo, de la forma la cual se reporta aquí, en este documento de solicitud de patente, incluyen al cáncer.

En ciertas formas de presentación, en concordancia con la presente invención, se proporcionan anticuerpos biespecíficos, marcados (etiquetados). Los marcajes o etiquetas, incluyen, si bien no de una forma limitativa en cuanto a éstos, a marcadores o etiquetas, o porciones, las cuales se detectan de una forma directa (tales como los consistentes en los marcajes o etiquetajes fluorescentes, cromofóricos, electrones densos, y radioactivos), así como 55 a las porciones, tales como las consistentes en las enzimas o en los ligandos, los cuales de detectan de una forma indirecta, tal como, por ejemplo, mediante una reacción enzimática, o mediante una interacción molecular. Los marcadores o etiquetas ejemplares, incluyen, si bien no de una forma limitativa en cuanto a éstos, a los radioisótopos 32P, 14C, 125I, 3H, y 131I, a los fluoróforos, tales como los quelatos de tierras raras, o la fluoresceína y sus derivados, al dansilo, a la umbeliferona, a las luceriferasas, tales como, por ejemplo, la luciferasa de la luciérnaga y la luciferasa bacteriana (véase, a dicho efecto, la patente estadounidense U S 4. 737. 456), a la luciferina, a las 2,3-dihidroftalazindionas, a la perosidaxada del rábano picante (HRP – [de sus iniciales, en idioma inglés, correspondientes a horseradish peroxidase] -), a la fosfatasa alcalina, a la β-galactosidasa, a la glucoamilasa, a la lisozima, a las oxidasas sacarídicas, tales como, por ejemplo, la glucosa oxidasa, la galactosa oxidasa y la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, a las oxidasas heterocíclicas, tales como la uricasa y la xantina oxidasa, 65 acopladas con un enzima, la cual emplea peróxido de hidrógeno, para oxidar un precursor de colorante, tal como la

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de la forma la cual se reporta aquí, en este documento de solicitud de patente, puede coadministrarse con por lo menos un agente terapéutico adicional. En determinadas formas de presentación, en concordancia con la presente invención, un agente terapéutico adicional, es un agente citotóxico, o un agente quimioterapéutico.

5 Tales tipos de terapias de combinación las cuales se han anotado anteriormente, arriba, en este documento de solicitud de patente, abarcan a la administración separada (en donde, dos o más agentes terapéuticos, se encuentran incluidos en la misma formulación, o en formulaciones separadas), y a la administración separada, en cuyo caso, la administración del anticuerpo, de la forma la cual se reporta aquí, en este documento de solicitud de patente, puede acontecer previamente, o simultáneamente y / o a continuación de la administración del agente terapéutico y / o adyuvante adicional. Los anticuerpos, de la forma la cual éstos se reportan aquí, en este documento de solicitud de patente, pueden también utilizarse en combinaciones, con una terapia de radiación.

Un anticuerpo, de la forma la cual se reporta aquí, en este documento de solicitud de patente (y cualquier agente terapéutico adicional), puede administrarse mediante cualquier medio el cual sea apropiado, incluyendo a la

15 administración parenteral, a la administración intrapulmonar, y a la administración intranasal y, en caso deseado, para la el tratamiento local, la administración intralesional. Las infusiones parenterales, incluyen a la administración intramuscular, a la administración intravenosa, a la administración intraarterial, a la administración intraperitoneal, y a la administración subcutánea. La dosificación, puede llevarse a cabo mediante cualquier tipo de vía o ruta la cual sea apropiada, tal como, por ejemplo, mediante inyecciones, tales como las consistentes en las inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo, en parte, del hecho consistente en si, la administración, es breve, o ésta es crónica. Aquí, en este documento de solicitud de patente, se contemplan varios tipos de programas de dosificación, incluyendo, si bien no de una forma limitativa en cuanto a éstas, a las administraciones individuales o a las administraciones múltiples, en varios puntos de tiempo, en la administración de bolos, y la infusión por pulsos.

25 Los anticuerpos, de la forma la cual éstos se reportan aquí, en este documento de solicitud de patente, se formularán y se administrarán, de una forma consistente, con una buena práctica médica. Los factores a ser considerados en este contexto, incluyen al desorden o trastorno particular el cual se esté tratando, al mamífero particular el cual se esté tratando, a la condición clínica del paciente individual, a la causa del trastorno o desorden, al sitio de suministro del agente, al procedimiento de administración, al programa de administración, y a otros factores, los cuales son conocidos por parte de los médicos practicantes especialistas. El anticuerpo, no necesita ser formulado con uno o más agentes usualmente utilizados para prevenir o evitar, o tratar, el desorden o trastorno en cuestión, pero sin embargo, no obstante, de una forma opcional, se formula con éstos. La cantidad efectiva de tales otros agentes, depende de la cantidad de anticuerpo la cual se encuentre presente en la formulación, del tipo de trastorno o desorden o de tratamiento, y de oros factores, los cuales se han discutido anteriormente, arriba, en este

35 documento de solicitud de patente. Éstos se utilizan, de una forma general, en las mismas dosificaciones y mediante las mismas vías o rutas de administración, la cuales se encuentran descritas aquí, en este documento de solicitud de patente, o bien, a una tasa correspondiente a un porcentaje comprendido dentro de unos márgenes, los cuales van desde aproximadamente el 1 % hasta aproximadamente el 99 %, de las dosificaciones las cuales se encuentran descritas aquí, en este documento de solicitud de patente, o bien, en cualquier dosificación o mediante cualquier tipo de vía o ruta , la cual se determine, de una forma clínica, como siendo apropiada.

Para la prevención o tratamiento de una enfermedad, la dosificación apropiada de un medicamento, tal y como se reporta aquí, en este documento de solicitud de patente (cuando éste se utiliza solo, o en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales, distintos), dependerá del tipo de enfermedad a ser tratada, del tipo de 45 anticuerpo, de la gravedad y del curso de la enfermedad, del hecho consistente en si, el anticuerpo, se administra para los propósitos de prevención, o para los propósitos terapéuticos, de la terapia previa, de la historia clínica del paciente, y de la respuesta al anticuerpo, y de la discreción del médico practicante especialista que esté tratando al paciente. De una forma apropiada, el anticuerpo, se administra, al paciente, de una sola vez, o mediante una serie de tratamientos. En dependencia del tipo y de la gravedad de la enfermedad, una dosificación de un anticuerpo, correspondiente a una tasa comprendido dentro de unos márgenes, los cuales van desde aproximadamente 1 μg / kg, hasta aproximadamente 15 mg / kg (tal como, por ejemplo, una tasas correspondiente a un valor de 0,5 mg / kg

– 10 mg /kg), puede considerarse como siendo una dosificación inicial candidata, para la administración, al paciente, mediante, bien ya sea por ejemplo, en una sola administración, o bien ya sea mediante administraciones separadas,

o bien ya sea mediante una infusión continua. Una dosificación diaria típica, podría ser la correspondiente a una tasa

55 comprendida dentro de unos márgenes, los cuales van desde los aproximadamente 1 μg / kg, hasta los aproximadamente 100 mg / kg, o más, en dependencia de los factores anteriormente mencionados, arriba, aquí, en este documento de solicitud de patente. Para las administraciones repetidas, durante un transcurso de tiempo de varios, días, o más prolongadas, y en dependencia de la condición, el tratamiento, de una forma general, sería sostenido, hasta que acontezca la supresión de los síntomas de la enfermedad. Una dosificación ejemplar del anticuerpo, sería la correspondiente a una tasa comprendida dentro de unos márgenes, los cuales van desde los aproximadamente 0,05 mg / kg, hasta los aproximadamente 10 mg / kg. Así, de este modo, pueden administrarse, al paciente, una o más dosis correspondientes a aproximadamente 0,5 mg / kg, a aproximadamente 2,0 mg / kg, a aproximadamente 4,0 mg / kg, o a aproximadamente 10 mg / kg (o cualquier combinación de éstas). Tales dosis, pueden administrarse de una forma intermitente, tal como, por ejemplo, cada semana, o bien, cada tres semanas

65 (por ejemplo, de tal forma que, el paciente, reciba desde aproximadamente dos dosis, hasta aproximadamente 20

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-Dominio variable de una cadena ligera de Pertuzumab, combinado con una región constante de cadena ligera kappa, humana.

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-Dominio variable de una cadena pesada de Trastuzumab, combinado con una región constante de cadena pesada, humana, de la región de la subclase IgG1, que contiene una mutación T366S, L368A, y Y407V:

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-Dominio variable de una cadena ligera de Trastuzumab, combinado con una región constante de cadena ligera 45 kappa, humana.

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-Fragmento Fab de un anticuerpo, el cual comprende el dominio variable de cadena pesada de Pertuzumab, y una 55 región 1, constante, de cadena pesada, humana (CH1), de la subclase IgG1, que contiene una secuencia de aminoácidos C-terminal GGGSLPETGGSGSHHHHHH:

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-Polipéptido de la región Fc, de cadena pesada (IgG1 humana (CH2-CH3)), con una mutación T366S, L368A, y Y407V , que contiene una secuencia N-terminal GGGDKTHTCPPC:

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-Polipéptido de la región Fc, de cadena pesada (IgG1 humana (CH2-CH3)), con una mutación T366S, L368A, y Y407V, que contiene una secuencia N-terminal GGHTCPPC:

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-Polipéptido de la región Fc, de cadena pesada (IgG1 humana (CH2-CH3)), con una mutación T366S, L368A, y Y407V, que contiene una secuencia N-terminal GGCPPC:

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-Polipéptido de la región Fc, de cadena pesada (IgG1 humana (CH2-CH3)), con una mutación T366W, que contiene una secuencia N-terminal GGGDKTHTCPPC:

-Polipéptido de la región Fc, de cadena pesada (IgG1 humana (CH2-CH3)), con una mutaciónT366W, que contiene 45 una secuencia N-terminal GGHTCPPC:

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55 -Polipéptido de la región Fc, de cadena pesada (IgG1 humana (CH2-CH3)), con una mutación T366C, que contiene una secuencia N-terminal GGCPPC:

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Claims

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