ES2256935T3 - Anticuerpos humanizadores y procedimiento para producirlos. - Google Patents

Anticuerpos humanizadores y procedimiento para producirlos.

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ES2256935T3 ES98918013T ES98918013T ES2256935T3 ES 2256935 T3 ES2256935 T3 ES 2256935T3 ES 98918013 T ES98918013 T ES 98918013T ES 98918013 T ES98918013 T ES 98918013T ES 2256935 T3 ES2256935 T3 ES 2256935T3
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Abstract

Se describe un anticuerpo humanizado para el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). También se describe un procedimiento para producir e identificar rápidamente mutaciones estructurales que mejoran la unión de anticuerpos humanizados a sus antígenos emparentados. En una realización preferida, CDR no humanos se injertan sobre una estructura V{sub,1k}l-V{sub,H}III humano. También se realiza una mutagénesis aleatoria de un pequeño conjunto de residuos de estructuras críticas siguiendo con una representación monovalente de la biblioteca resultante de moléculas de anticuerpos sobre la superficie del fago filamentoso. Las secuencias de estructuras óptimas se identifican entonces por selección basada en la afinidad. Opcionalmente, los anticuerpos seleccionados pueden mutarse adicionalmente de forma que sustituyan los residuos vernier que se sitúan en la interfaz V{sub,L}- V{sub, H} por residuos que concuerden con el anticuerpo padre no humano. Los procedimientos aquí descritos pueden aplicarse a cualquier anticuerpo no humano. Concordantemente, se suministran anticuerpos humanizados.

Description

Anticuerpos humanizadores y procedimiento para producirlos.
Campo de la invención
La presente invención está dirigida a anticuerpos humanos y procedimientos para preparar anticuerpos humanos. En particular, la presente invención está dirigida a procedimientos para preparar anticuerpos humanizados usando un sistema de presentación en fagos monovalente y de mutantes de anticuerpos producidos por mutagénesis aleatoria de un pequeño grupo de residuos estructurales críticos realizados en una sola región estructural humana. Más particularmente, esta invención está dirigida a la humanización de un anticuerpo murino que se une al factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF).
Antecedentes de la invención
Los anticuerpos monoclonales (mAbs) tienen un potencial enorme como agentes terapéuticos, particularmente cuando se usan para regular sistemas definidos. Por ejemplo, en algunas circunstancias se podría desear regular un sistema, como por ejemplo la angiogénesis, en la que se forman vasos capilares nuevos a partir de las paredes de los vasos pequeños existentes. La angiogénesis generalmente es importante después de la aparición de una herida o de una infección ya que en los tejidos adyacentes a la lesión se puede estimular la inducción de crecimiento capilar. Sin embargo, la angiogénesis también es importante en el crecimiento tumoral, ya que, para un crecimiento continuado, un tumor debe inducir la formación de una red capilar que invada la masa tumoral.
Se han identificado determinados factores de crecimiento que regulan la angiogénesis. De particular interés es el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF), que parece ser el agente por el cual algunos tumores adquieren su gran irrigación sanguínea. Molecular Biology of the Cell, 3rd Ed., Alberts et al., Garland Publishing, págs. 1154 (1994). Por lo tanto, los mAbs anti VEGF, por ejemplo, pueden ser útiles por un variedad de razones, incluyendo su uso en la regulación de la angiogénesis y más particularmente, como un agente antitumoral. Previamente se ha descrito un mAB A4.6.1 murino anti VEGF que bloquea la unión al receptor de VEGF. Se ha demostrado que este anticuerpo inhibe la señalización mitogénica. Kim y col., Growth Factors 7, 53 (1992); Kim y col., Nature 362, 841 (1993).
La mayoría de mABs incluyendo el anti VEGF descrito anteriormente tienen un origen murino y otras fuentes no humanas, lo que limita la eficacia clínica. En particular, el cuerpo a menudo reacciona con una respuesta inmunogénica frente a los anticuerpos no humanos, en la que se elimina rápidamente el anticuerpo del sistema antes de que se produzca su efecto terapéutico. Además de la inmunogenicidad de los mAbs no humanos, que aparece cuando se administran a humanos, existen limitaciones adicionales debidas a la débil incorporación de función efectora.
Para sortear estas deficiencias, se pueden conferir las propiedades de unión antigénica de los mAbs no humanos a los anticuerpos humanos a través de un procedimiento conocido como "humanización" del anticuerpo. Un anticuerpo humanizado contiene la secuencia aminoacídica de seis regiones determinantes de complementariedad (CDR) (el centro de unión al antígeno de la molécula de anticuerpo) del mAb no humano parental o correspondiente, injertado en la región estructural de un anticuerpo humano. Por lo tanto, la humanización de anticuerpos no humanos se conoce generalmente como injertos de CDR. El bajo contenido de secuencia no humana en tales anticuerpos humanizados (\sim5%) tiene una eficacia demostrada en la reducción de la inmunogenicidad y en la prolongación de la vida media sérica de los anticuerpos administrados a los humanos. Entre otros, los anticuerpos monoclonales humanizados ("inmunoglobulinas quiméricas") se describen en la patente de EE.UU. Nº 4.816.567.
Desafortunadamente, la simple inserción de secuencias de CDR a menudo produce anticuerpos humanizados que se unen al antígeno de modo mucho más débil que el mAb parental no humano. Para restaurar la alta afinidad de unión, el anticuerpo debe atravesar procesos adicionales para ajustar la estructura de las hélices de unión al antígeno. Esto se logra reemplazando residuos clave en las regiones estructurales del los dominios variables del anticuerpo con la secuencia que encaje con la del anticuerpo murino parental. Estos residuos estructurales normalmente están implicados en el mantenimiento de la conformación de las hélices de CDR, aunque algunos residuos estructurales pueden contactar directamente con el antígeno. Se han realizado estudios que han evidenciado la importancia de determinados residuos estructurales para la conformación de las CDR y se ha recopilado una exhaustiva lista de todos los residuos estructurales que puedan afectar a la unión al antígeno. Chothia et al., J. Mol. Biol. 224, 487 (1992); Foote et al., J. Mol. Biol. 224, 489 (1992). La lista exhaustiva incluye unos treinta residuos "vernier" que pueden potencialmente contribuir a la estructura de las CDR. Aunque probablemente se produciría una mayor afinidad de unión al antígeno al cambiar todo el conjunto de residuos vernier de un anticuerpo humanizado de modo que encajara con la secuencia no humana parental correspondiente, esto no sería generalmente deseable debido a un aumento del riesgo de inmunogenicidad impuesta al añadir elementos adicionales de secuencia no humana. Así, desde un punto de vista terapéutico, es preferible limitar los cambios estructurales a un conjunto mínimo para obtener un anticuerpo humanizado de alta afinidad.
Por lo tanto, es deseable identificar un pequeño grupo de cambios que sean suficientes para optimizar la unión, sin embargo, se espera que los cambios requeridos difieran de un anticuerpo humanizado a otro. Para lograr el resultado deseado, un enfoque ha sido identificar la combinación adecuada de mutaciones construyendo un panel de mutaciones que tengan residuos estructurales "candidatos" reemplazados por sus homólogos murinos. Estas variantes se forman individualmente y se prueban con antígenos y después se combinan con otras variantes que tienen afinidades de unión favorables. Sin embargo, este procedimiento implica ciclos de mutagénesis dirigida individual, aislamiento y análisis y por lo tanto no es deseable ya que es una labor muy costosa y tediosa.
Para simplificar la humanización de anticuerpos, se han desarrollado varios enfoques diferentes. Véase, por ejemplo, Queen y col., PNASUSA 86, 10029(1989); Kettleborough et al., Protein Eng. 4,773(1991); Tempest et al., Biotechnology 9, 266 (1991); Padlan, Mol. Immunol. 28, 489 (1991); Roguska et al., PNAS USA 91, 969 (1994); Studnicka et al., Protein Eng. 7, 805 (1994); Allen et al., J. Immunol. 135, 368 (1985); Carter et al., PNAS USA 89,4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151, 2623 (1993); Eigenbrot et al., Proteins 18, 49 (1994); Shalaby et al., J.Exp. Med. 175, 217 (1992); Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th), Public Health Service,NIH, Bethesda, MD (1991); Rosok et al., J. Biol. Chem. 271, 22611 (1996); WO-A-92/22653, GB-A-2 268 744, y WO 94/04679. El documento WO-A-92/22653 incluye una lista de sitios de mutación preferentes.
Es un objeto de la presente invención el proporcionar medios generales para seleccionar rápidamente mutaciones estructurales que mejoren la unión de anticuerpos humanizados a sus antígenos cognados en donde se eliminan los procedimientos actuales de optimización estructural basados en ciclos de mutagénesis dirigida individual y análisis.
Es además un objeto el proporcionar procedimientos rápidos de anticuerpos humanizantes que proporcionen anticuerpos con una baja inmunogenicidad y que utilicen una sola región estructural como respaldo.
Es un objeto adicional de la presente invención el proporcionar anticuerpos humanizados con mutaciones que les confieran una afinidad potenciada por el antígeno en relación con el anticuerpo humanizado sin cambios estructurales.
Es además un objeto adicional de la presente invención el proporcionar anticuerpos humanizados que tengan una tas de eliminación reducida y por lo tanto una mayor retención en el cuerpo después de la administración sistémica de modo que se haya dosis de material menores disponibles para la administración sistémica con efecto terapéutico.
Es también un objeto adicional de la presente invención el proporcionar anticuerpos monoclonales humanizados contra VEGF.
Descripción de la invención
La presente invención proporciona un anticuerpo humanizado contra el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF), como se define en las reivindicaciones. El anticuerpo humanizado inicial anti VEGF tiene una región estructural que deriva de secuencias de consenso para las subclases humanas más abundantes, a saber, V_{L}\kappa subgrupo I (V_{I}\kappaI) y V_{H} subgrupo III (V_{H}III) en las que se injertan CDR de anticuerpos no humanos anti VEGF. La mutagénesis aleatoria de los residuos estructurales críticos en la construcción inicial produjo el anticuerpo humanizado anti VEGF descrito en la presente memoria descriptiva que tiene una afinidad por el antígeno 125 veces mayor en relación con el anticuerpo humanizado inicial sin cambios estructurales. Una sola mutación adicional produjo una mejora de seis veces en la unión. Este anticuerpo anti VEGF humanizado se puede reproducir por el procedimiento descrito en la presente memoria descriptiva o con técnicas recombinantes tradicionales dad la información de la secuencia ofrecida en la presente memoria descriptiva.
En la presente memoria descriptiva también se desvela un procedimiento para producir e identificar rápidamente mutaciones estructurales que mejoren la capacidad de unión de los anticuerpos humanizados a sus antígenos cognados. Preferentemente, se injertan CDR no humanas en una región estructural V_{I}\kappaI-V_{H}III humana. También se realiza mutagénesis aleatoria de un pequeño grupo de residuos estructurales críticos seguida de una presentación monovalente de la genoteca resultante, de moléculas de anticuerpo en la superficie de un fago filamentoso. Las secuencias estructurales óptimas se identifican por selección basada en la afinidad. Opcionalmente, los anticuerpos seleccionados pueden sufrir mutaciones adicionales para reemplazar los residuos vernier situados en el interfaz V_{L}-V_{H} por residuos que encajen con el anticuerpo no humano.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 representa las secuencias aminoacídicas del A4.6.1 murino (Identificador de secuencia nº: 6 y 9 para los dominios V_{L} y V_{H}, respectivamente), A4.6.1 humanizado variante hu2.0 (Identificador de secuencia Nº: 7 y 10 para los dominios V_{L} y V_{H}, respectivamente), y A4.6.1 humanizado variante hu2.10 (Identificador de secuencia Nº: 8 y 11 para los dominios V_{L} y V_{H}, respectivamente). La numeración de las secuencias está según Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th), Public Health Service, NIH, Bethesda, MD (1991) y los errores se indican con asteriscos (A4.6.1 murino frente hu2.0) o flechas (hu2.0 frente hu2.10). La variante hu2.0 sólo contiene las secuencias CDR (negrita) del anticuerpo murino injertado en la cadena K ligera humana subgrupo I, región estructural de la cadena pesada subgrupo III. La variante hu2.10 es el clon humanizado consenso obtenido a partir de los experimentos de clasificación de fagos descritos en la presente memoria descriptiva.
La figura 2 representa los residuos estructurales objetivo de la aleatorización.
La figura 3 representa la construcción del fagómido para la presentación en superficie de las fusiones Fab-pIII en el fago. La construcción del fagómido codifica una versión humanizada del fragmento Fab para el anticuerpo A4.6.1 fusionado con una porción de la proteína de revestimiento del gen III del M13. La proteína de fusión está compuesta por la Fab unida al extremo carboxi terminal de la cadena pesada de un solo residuo de glutamina (a partir de la supresión de un codón ámbar en supE E. coli), y después la región C terminal de la proteína del gen III (residuos 249-406). La transformación en F^{+} E.coli, seguida de una superinfección con el fago adyuvante M13KO7, produce partículas de fagómidos en las que una pequeña proporción de éstas contienen una sola copia de la proteína de
fusión.
Descripción detallada de la invención A. Definiciones
Los "anticuerpos" (ABs) y las "inmunoglobulinas" (Igs) son glicoproteínas con las mismas características estructurales. Mientras que los anticuerpos presenten una especificidad de unión a un antígeno específico, las inmunoglobulinas incluyen tanto a los anticuerpos como otras moléculas similares a los anticuerpos que carecen de especificidad antigénica. Los polipéptidos de la última clase, por ejemplo, se producen a bajos niveles en el sistema linfático y a mayores niveles en los mielomas.
Los "anticuerpos nativos" y las "inmunoglobulinas nativas" son por lo general glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 daltons, compuestas por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera se enlaza a una pesada mediante un enlace covalente disulfuro, mientras que la cantidad de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas con distintos isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera tiene también puentes disulfuro separados regularmente dentro de la cadena. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (V_{H}) seguido de una cantidad de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable (V_{L}) en un extremo y uno constante en el otro, el dominio constante de la cadena ligera se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera se alinea con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que ciertos residuos particulares de aminoácidos forman una interfaz entre los dominios variables de la cadena ligera y la pesada. Chothia y col., J. Mol. Biol. 186, 651 (1985); Foote y col., J. Mol. Biol. 82, 4592 (1985).
El término "variable" se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren ampliamente en sus secuencias de un anticuerpo a otro y se utilizan para la unión y especificidad de cada anticuerpo en particular con relación a su antígeno particular. De todos modos, la variabilidad no se distribuye uniformemente a través de los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en tres segmentos, denominados "regiones determinantes de complementariedad" (CDR) o "regiones hipervariables", de los dominios variables tanto de la cadena ligera como la pesada. Las porciones más conservadas de los dominios variables se llaman regiones estructurales (FR). Cada dominio variable de las cadenas pesada y ligera nativas comprende cuatro FR que, en gran parte, adoptan una configuración de hoja-\beta. Dichas FR están conectadas por tres CDR que crean hélices que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de la hoja-\beta. Las CDR de cada cadena están ancladas juntas y muy próximas a las regiones FR y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del centro de unión al antígeno de los anticuerpos. Kabat y col., citado con anterioridad. Los dominios constantes no participan directamente en el proceso de unión al antígeno de un anticuerpo, pero desarrollan diversas funciones efectoras, como la participación del anticuerpo en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo.
La digestión con papaína de anticuerpos produce dos fragmentos idénticos de unión a antígeno, llamados fragmentos Fab, cada uno de ellos con un solo punto de unión a antígeno, y un fragmento "Fc" residual, cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizarse fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab^{1})_{2} que tiene dos puntos de unión a antígeno y todavía es capaz de establecer un enlace cruzado con el antígeno.
"Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un punto completo de reconocimiento y unión a antígeno. Esta región está compuesta por un dímero de un dominio variable de cadena pesada y otro de cadena ligera en una estrecha asociación no covalente. En esta configuración, las tres CDR de cada dominio variable interactúan para definir un punto de unión a antígeno en la superficie del dímero V_{H}-V_{L}. Colectivamente, las seis CDR confieren al anticuerpo una especificidad de unión a antígeno. No obstante, incluso un dominio variable simple (o la mitad de un Fv que comprenda únicamente tres regiones CDR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer un antígeno y unirse a él, aunque con una afinidad inferior que el punto de unión completo.
Un fragmento Fab contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab’ se diferencian de los Fab por la adición de algunos residuos en el extremo carboxi terminal del dominio CH1 de la cadena pesada, incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra de un anticuerpo. Fab'-SH es la designación que se da en la presente memoria descriptiva a los Fab' en que el(los) residuo(s)
de cisteína de los dominios constantes presenta(n) un grupo tiol libre. Los fragmentos F(ab')_{2} de anticuerpos se produjeron originalmente como pares de fragmentos Fab^{1} con cisteínas bisagra entre ellos. También se conocen otros emparejamientos químicos de fragmentos de anticuerpos.
Las cadenas ligeras de anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier vertebrado pueden asignarse a uno de dos tipos claramente distintos, denominados kappa (\kappa) y lambda (\lambda), sobre la base de las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.
Según la secuencia aminoacídica del dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas pueden asignarse a "clases" diferentes. Existen cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de éstas pueden seguir dividiéndose en "subclases" (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA-1 e IgA-2. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las distintas clases de inmunoglobulinas se denominan \alpha, \delta, \varepsilon, \gamma y \mu, respectivamente. Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de las distintas clases de inmunoglobulinas son muy conocidas.
El término "anticuerpo" se emplea en su sentido más amplio y cubre específicamente los anticuerpos monoclonales individuales (incluyendo anticuerpos agonistas y antagonistas), composiciones de anticuerpos con especificidad poliepitópica, así como fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, Fab, F(ab^{1})_{2}, y Fv), mientras muestren la actividad biológica deseada.
El término "anticuerpo monoclonal", en el contexto de la presente memoria descriptiva, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales que comprende la población son idénticos salvo por posibles mutaciones espontáneas que puedan aparecer minoritariamente. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, ya que están dirigidos contra un solo sitio antigénico. Además, en contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales convencionales (policlonales) que típicamente incluyen distintos anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un solo determinante del antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales tienen la ventaja de estar sintetizados en un cultivo de hibridoma y no están contaminados por otras inmunoglobulinas. El modificador "monoclonal" revela la característica del anticuerpo que se ha obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, y no debe interpretarse como una indicación de que sea necesario producir el anticuerpo por algún procedimiento en particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que deben usarse de acuerdo con la presente invención pueden conseguirse por el método del hibridoma, descrito por primera vez en Kohler y col., Nature, 256:495 (1975), o con ADN recombinante (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. Nº 4.816.567).
Los anticuerpos (inmunoglobulinas) "quiméricos" son anticuerpos en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes de anticuerpos obtenidos de una especie en particular o pertenecientes a una clase o subclase de anticuerpos en particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es idéntico u homólogo a las secuencias correspondientes de anticuerpos obtenidos de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que muestren la actividad biológica deseada. Patente de EE.UU. Nº 4.816.567.
Las formas "humanizadas" de anticuerpo no humanas (por ejemplo, murino) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulinas o sus fragmentos (como Fv, Fab, Fab^{1}, F(ab^{1})_{2} u otras subsecuencias de unión a antígenos) que contienen secuencias mínimas derivadas de una inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en que los residuos de una región determinante de complementariedad (CDR) del receptor están sustituidos por los residuos de la CDR de una especie no humana (anticuerpo donante), como el ratón, la rata o el conejo, que tenga la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los estructurales Fv de la inmunoglobulina humana se sustituyen por sus correspondientes residuos no humanos. Además, el anticuerpo humanizado puede comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en las secuencias CDR o estructurales importadas. Estas modificaciones se llevan a cabo para refinar y optimizar el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos los dominios variables de al menos uno, y típicamente dos, en que todos, o sustancialmente todos, las regiones CDR correspondan a los de una inmunoglobulina no humana y todas, o sustancialmente todas, las regiones FR sean las de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. Óptimamente, el anticuerpo humanizado también comprenderá al menos una porción de una región constante (Fc) de inmunoglobulina, típicamente humana. Para más detalle véase: Jones y col., Nature 321, 522 (1986); Reichmann y col., Nature 332,323(1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593 (1992).
"No inmunogénico en un humano" significa que después de entrar en contacto el anticuerpo humanizado en una cantidad terapéuticamente eficaz con el tejido apropiado de un humano, no se demuestra sustancialmente un estado de sensibilidad o resistencia frente al anticuerpo humanizado después de la administración.
Como se emplea en la presente memoria descriptiva, "factor de crecimiento celular del endotelio vascular" o "VEGF" se refiere a un factor de crecimiento en mamíferos como se define en la patente de EE.UU. 5.332.671, incluyendo la secuencia aminoacídica humana de la figura 1. La actividad biológica del VEGF nativo es compartida por cualquier análogo o variante suya que sea capaz de promover el crecimiento selectivo de las células endoteliales vasculares pero no de las células endoteliales corneales bovinas, células endoteliales del cristalino, células corticoadrenales, fibroblastos BHK-21 o queratinocitos, o que posee un inmunoepítopo que sufre reacciones inmunológicamente cruzadas con el anticuerpo producido contra al menos un epítopo del VEGF nativo correspondiente.
La "mutagénesis dirigida" es una técnica habitual en la materia, y se realiza usando cebadores de oligonucleótidos sintéticos complementarios con la molécula de ADN fágico monocatenario que se va a mutar, pero que mantenga la complementariedad, que presente la mutación deseada. Brevemente, el oligonucleótido sintético se usa como cebador para dirigir la síntesis de una cadena complementaria a la del fago, y la molécula de DNA bicatenario se usa para transformar un bacteria hospedadora con un soporte fágico. Los cultivos de las bacterias transformadas se siembran en agar de calidad superior, permitiendo la formación de colonias a partir de células únicas que lleven el fago. Teóricamente, el 50% de las colonias nuevas contendrá el fago la forma mutada, monocatenaria; y el otro 50% tendrá la secuencia original. El ADN de las colonias se hibrida con el cebador sintético fosforilado a una temperatura que permita la hibridación de un aparejamiento exacto, pero a la cual, las diferencias con la cadena original sean suficientes como para evitar la hibridación. Las colonias cuyo ADN hibride con la sonda, después se seleccionan y se cultivan, y se recupera el ADN.
"Sistema de expresión" se refiere a secuencias de ADN con una secuencia codificadora deseada y secuencias de control enlazadas operativamente, de modo que los hospedadores transformados con estas secuencias sean capaces de producir las proteínas codificadas. Para efectuar la transformación, se puede incluir el sistema de expresión en un vector; sin embargo, el ADN pertinente también se puede integrar en el cromosoma del hospedador.
Como se usa en la presente memoria descriptiva, "célula", "línea celular" y "cultivo celular" se usan indistintamente y todas las denominaciones que incluyan progenie. Así, "transformantes" o "células transformadas" incluyen la célula sujeto primaria y los cultivos derivados de ésta independientemente del número de transferencias. Se entiende además que puede que no toda la progenie sea precisamente idéntica en su contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o involuntarias. Se incluye la progenie mutante que tenga la misma funcionalidad que la analizada en la célula originalmente transformada. Cuando se empleen denominaciones distintas, se hará claramente fuera de contexto.
Los "plásmidos" se nombran con una p minúscula precedida y/o seguida de letras en mayúsculas y números. Los plásmidos de inicio en la presente memoria descriptiva están disponibles comercialmente si ningún tipo de restricción, o se pueden construir a partir de plásmidos disponibles según los procedimientos publicados. Adicionalmente, en la técnica se conocen otros plásmidos equivalentes que son aparentes para cualquier experto en la materia.
"Afinidad de unión" se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un único centro de unión de un anticuerpo y un solo epítopo. Los anticuerpos de baja afinidad se unen débilmente al antígeno y tienden a disociarse con facilidad, mientras que los anticuerpos de gran afinidad se unen más estrechamente al antígeno y permanecen unidos más tiempo.
"Transformación" significa introducir ADN en un organismo de modo que el ADN se pueda replicar, ya sea como un elemento extracromosómico como por integración cromosómica. Dependiendo de la célula hospedadora empleada, la transformación se realiza usando técnicas habituales apropiadas para tales células. El tratamiento con calcio que emplea cloruro de calcio, como se describe en Cohen, Proc. Natl. Acad Sci. USA 69, 2110 (1972) y Mandel y col., J. Mol. Biol. 53, 154 (1970), se usa generalmente con procariotas u otras células que contienen una pared celular considerable. Para las células de mamífero sin dichas paredes celulares, se prefiere el método Graham y van der Eb de precipitación con fosfato de calcio Virology 52, 456 (1978). Axel describió los aspectos generales de las transformaciones en sistemas hospedadores de células de mamífero en la patente de EE.UU. Nº 4.399.216, concedida el 16 de agosto de 1983. Las transformaciones en levadura se llevan a cabo generalmente siguiendo el método de Van Solingen y col., J. Bact. 130, 946 (1977) y Hsiao y col., Proc. Natl. Acad Sci. USA 76, 3829 (1979). Sin embargo, se pueden usar otros procedimientos para introducir el ADN en las células, como por ejemplo la inyección nuclear, la electroporación o la fusión con protoplastos.
La "recuperación" o el "aislamiento" de un fragmento de ADN a partir de la digestión de ADN, significa la separación de la digestión por electroforesis en un gel de poliacrilamida o de agarosa, la identificación del fragmento de interés comparando su movilidad electroforética en relación a los fragmentos de ADN de los marcadores de peso molecular conocido, el aislamiento de la sección del gel que contiene el fragmento deseado y la extracción del ADN del gel. Este procedimiento se conoce generalmente. Véase por ejemplo, Lawn y col., Nucleic Acids Res. 9, 6103 (1981) y Goeddel y col., Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980).
"Ligación" se refiere al procedimiento por el cual se forman enlaces fosfodiester entre dos fragmentos de ácido nucleico de cadena doble. A menos que se indique lo contrario, la ligación se puede realizar usando tampones y condiciones conocidas con 10 unidades de la ADN ligasa del T4 ("ligasa") por cada 0,5 mg de cantidades aproximadamente equimolares de los fragmentos de ADN que se van a ligar.
El término "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificadora enlazada operativamente en un organismo hospedador particular. Las secuencias de control adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, un centro de unión a ribosomas, y posiblemente, otras secuencias aún menos conocidas. Se sabe que las células eucariotas usan promotores, señales de poliadenilazción y potenciadores.
Un ácido nucleico está "enlazado operativamente" o "enlazado funcionalmente" cuando se coloca funcionalmente a continuación de otra secuencia nucleotídica. Por ejemplo, se enlaza operativamente el ADN de una presecuencia de una secuencia líder de secreción al ADN de un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o un potenciador están enlazados operativamente a una secuencia codificadora si afectan a la transcripción de la secuencia; o se enlaza operativamente un centro de unión a ribosomas a una secuencia codificadora si se coloca de modo que facilita la traducción. Generalmente, "enlazado operativamente" o "enlazado funcionalmente" significa que las secuencias de ADN que se están enlazando son contiguas y, en el caso de una secuencia líder se secreción, contigua y en pauta de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que ser contiguos. El enlace está acompañado de una ligación en los sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existen, se usan adaptadores oligonucleotídicos sintéticos o ligadores según la práctica habitual.
Como se emplea en la presente memoria descriptiva "enumerado representativamente" se refiere al número de la posición de un residuo en una secuencia particular y los números de posición correspondientes en diferentes secuencias. Los números de posición correspondientes son aquellas posiciones dentro de una secuencia, generalmente secuencias estructurales de anticuerpos humanos, que son funcionalmente equivalentes a la posición enumerada representativamente cuando se usan en la construcción de un anticuerpo humanizado.
Normalmente, los términos "aminoácido" y "aminoácidos" se refieren a todos los L-\alpha-aminoácidos naturales. En algunas formas de realización, sin embargo, puede haber presentes D-aminoácidos en los polipéptidos o péptidos de la presente invención para facilitar la restricción conformacional. Los aminoácidos se identifican con una sola letra o con denominaciones de tres letras.
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Asp D ácido aspártico Ile I isoleucina
Thr T treonina Leu L leucina
Ser S Serina Tyr Y tirosina
Glu E Ácido glutámico Phe F fenilalanina
Pro P Prolina His H histidina
Gly G Glicina Lys K lisina
Ala A Alanina Arg R arginina
Cys C cisteína Trp W triptófano
Val V Valina Gln Q glutamina
Met M metionina Asn N asparragina
El término "variante de secuencia aminoacídica" se refiere a moléculas con diferencias en sus secuencias aminoacídicas en comparación con una secuencia aminoacídica nativa.
Las variantes por sustitución son en las que al menos se elimina un residuo aminoacídico de una secuencia nativa y se inserta un aminoácido diferente su lugar y en la misma posición. Las sustituciones pueden ser únicas, en las que sólo se sustituye un aminoácido en la molécula, o pueden ser múltiples, en las que se sustituyen dos o más aminoácidos en la misma molécula.
La hibridación se realiza preferentemente bajo "condiciones restrictivas" que significa (1) emplear durante los lavados una concentración iónica baja y una alta temperatura, por ejemplo, cloruro de sodio 0,015 M / citrato de sodio 0,0015 / dodecilsulfato de sodio al 0,1% a 50ºC, o (2) emplear durante la hibridación un agente desnaturalizante, como por ejemplo formamida, por ejemplo, 50% (v/v) de formamida con 0,1% de polivinilpirrolidona / tampón de fosfato de sodio 50 nM a pH 6,5 con cloruro de sodio 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42ºC. Otro ejemplo es usar 50% de formamida, SSC X5 (NaCl 0,75 M, citrato de sodio 0,075 M), fosfato de sodio 50 mM (pH 6/8), pirofosfato de sodio al 0,1%, solución de Denhardt X5, ADN de esperma de salmón sometido a ultrasonidos (50 \mug/ml), 0,1% de SDS y 10% de sulfato de dextrano a 42ºC, con lavados a 42ºC en SSC X0,2 y 0,1% de SDS. Otro ejemplo diferente es la hibridación usando un tampón de sulfato de dextrano al 10%, SSC X2 (cloruro de sodio / citrato de Sodio) y 50% de formamida a 55ºC, seguida de lavados en condiciones altamente restrictivas compuestos por SSC X0,1 con EDTA a 55ºC. Cuando se proporciona una secuencia nucleotídica de una molécula de ácido nucleico, dentro del alcance de la secuencia se consideran otras moléculas de ácido nucleico que también hibriden bajo las mismas condiciones descritas anteriormente.
Cuando se describen secuencias aminoacídicas, se sobreentiende que esas mismas secuencias pueden ser reproducidas reconstruyendo la secuencia aminoacídica sintéticamente o por mutación. Alternativamente, se entiende que se pueden usar técnicas recombinantes mientras se recupere la molécula de ADN que codifica las secuencias aminoacídicas. El ADN se recupera formando una genoteca con el ADN que codifica las secuencias aminoacídicas deseadas. Las sondas se generan después basándose en las secuencias aminoacídicas. Después se aísla el ADN que hibrida con la sonda y se analiza para determinar si el producto codificado por el ADN es el producto deseado. Generalmente, las células se transforman con el ADN (o el ARN) y se realizan estudios de expresión.
B. Metodología general para humanizar anticuerpos
Los procedimientos descritos en la presente memoria descriptiva se pueden usar para humanizar cualquier anticuerpo. Similarmente, se entiende que el anticuerpo humanizado específicamente descrito en la presente memoria descriptiva, anti VEGF humanizado, se puede reproducir mediante los procedimientos descritos en la presente memoria descriptiva o con técnicas de ADN recombinante tradicionales. Específicamente, ya que las mutaciones en residuos estructurales críticos están descritas en la presente memoria descriptiva, el anticuerpo humanizado se puede reproducir para que tenga las mismas mutaciones sin ser reproducido usando el sistema de presentación en fagos monovalentes. Más bien, el ADN que codifica las secuencias aminoacídicas descritas se puede sintetizar o reproducir con técnicas de ADN recombinante tradicionales. Después se expresa el producto del ADN, se identifica y se recupera. Alternativamente, se puede realizar mutagénesis dirigida sobre el anticuerpo por procedimientos conocidos en la técnica, o se puede sintetizar el anticuerpo de modo que tengas las mutaciones descritas en la presente memoria
descriptiva.
Un procedimiento particularmente preferente para producir los anticuerpos humanizados descritos en la presente memoria descriptiva implica los siguiente: preparando un vector fagómido con el anticuerpo para la presentación monovalente de fragmentos Fab que tengan transplantadas secuencias CDR por mutagénesis dirigida en un vector que codifica la Fd de la cadena ligera humana y de la cadena pesada humana V_{H}III-C_{H}l\gamma; construyendo una genoteca de fagómidos con el Fab del anticuerpo para mutagénesis aleatoria de un pequeño grupo de residuos estructurales críticos; expresando y purificando los fragmentos Fab humanizados; seleccionando las variantes Fab humanizadas y determinando las afinidades de unión. Estos pasos no tienen porqué realizarse en un orden particular. Estos pasos se describen específicamente a continuación en el "ejemplo específico" pero generalmente se realizan del siguiente modo:
Preparación de un vector fagómido con el anticuerpo para presentación monovalente de fragmentos Fab
Primero se selecciona un anticuerpo que se vaya a humanizar y se identifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR). Las secuencias CDR del anticuerpo se pueden identificar según la definición de secuencia de Kabat y col., citado con anterioridad. Las secuencias de las CDR se transplantan por mutagénesis dirigida a un vector que codifica las Fd de la cadena ligera V_{L}\kappaI-C\kappa_{I} humana y de la cadena pesada V_{H}III-C_{H}l\gamma_{I} humana. La secuencia que codifica el fragmento Fab se puede subclonar en un vector fagómido. Esta construcción codifica un anticuerpo humanizado inicial en el que el extremo C terminal de la cadena pesada se fusiona precisamente con el extremo carboxilo de la proteína de revestimiento de un fago. Preferentemente, se selecciona un vector fagómido que proporcione la expresión de ambas cadenas, la pesada y la ligera, fusionadas con el gen III en cepas supresoras supE de
E. coli.
Construcción de una genoteca de fagómidos con el Fab del anticuerpo
Basándose en los resultados acumulados para humanizar varios anticuerpos no humanos en una región estructural V_{L}\kappaI-V_{H}III humana, se consideró que los cambios estructurales requeridos para optimizar la capacidad de unión al antígeno estaban limitados a un subgrupo de los residuos. Véase, Carter et al., PNAS USA 89, 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151, 2623 (1993); Eigenbrot et al., Proteins 18, 49-62 (1994); Shalaby et al., J. Exp. Med. 175, 217 (1992). Por consiguiente, se seleccionó un novedoso grupo de residuos para la aleatorización. La aleatorización de estos residuos estructurales clave identificados proporciona la genoteca deseada de variantes Fab que se van a presentar en la superficie del fago filamentoso. Específicamente, se seleccionaron los residuos V_{L } 4 y 71 y los residuos V_{H} 24, 37, 67, 69, 71, 73, 75, 76, 78, 93 y 94 como residuos estructurales clave importantes para la capacidad de unión al antígeno y fueron el objetivo de la aleatorización.
Expresión y purificación de los fragmentos Fab humanizados
Se conocen varios procedimientos en la técnica para expresar y purificar fragmentos. Como se ha descrito en la presente memoria descriptiva, se transformó una cepa 34B8 de E. coli no supresora, con el fagómido pMB419, o con sus variantes. Las bacterias individuales crecieron durante la noche a 37ºC en 5 ml de 2YT con 50 \mug/ml de carbenicilina. Estos cultivos se diluyeron en 200 ml de medio AP5 descrito en Chang y col., con 20 \mug/ml de carbenicilina y se incubaron durante 26 horas a 30ºC. Las células se centrifugaron a 4000 x g, se tiró el sobrenadante, y el sedimento se congeló a -20ºC durante al menos 2 horas. Los sedimentos celulares se resuspendieron después en 5 ml de Tris-HCl 10 mM (pH 7.6) con EDTA 1 mM, se agitaron a 4ºC durante 90 minutos y se centrifugaron a 10.000 xg durante 15 minutos. Se añadió el sobrenadante a 1 ml de columna de proteína G-SEFAROSA (una columna producida por Pharmacia) y se lavó con 10 ml de MES 10 mM (pH 5,5). El fragmento Fab unido se eluyó con 2,5 ml de ácido acético 100 mM y se neutralizó inmediatamente con 0,75 ml de Tris HCl 1 M, pH 8,0. Se cambió el tampón de las preparaciones de Fab por PBS y se concentraron usando concentradores CENTRICON-30 (producidos por Amicon). Las producciones típicas de Fab fuero de aproximadamente 1 mg/l de cultivo, después de la purificación con la proteína G. Las muestras de Fab purificadas se caracterizaron con espectrometría de masas con electronebulizacion, y las concentraciones se determinaron por análisis aminoacídico.
Selección de las variantes Fab humanizadas
Se reviste una placa de microvaloración con el antígeno etiquetado y purificado. Se desecha la solución de revestimiento, se bloquean los pocillos y se añade la solución madre del fagómido. Después de un periodo de tiempo, se lavan los pocillos y se eluye y titula el fago que se ha unido. Los fagos restantes eluídos del pocillo recubierto con VEGF se propagan para el uso en el siguiente ciclo de selección. Este procedimiento se puede repetir varias veces para obtener el número de clones deseado. Por ejemplo, se pueden seleccionar y secuencias unas pocas docenas de clones individuales.
Determinación de las afinidades de unión a VEGF
Se miden las constantes de asociación y disociación de la unión de las variantes humanizadas al VEGF. Se analizan los perfiles de unión y se seleccionan las variantes que muestran las mayores afinidades.
Administración del anticuerpo anti VEGF humanizado
La administración del anticuerpo anti VEGF humanizado se puede extrapolar a partir de los datos presentados en el anticuerpo anti VEGF murino descrito en Kim y col., Growth Factors 7, 53 (1992); Kim et al., Nature 362, 841 (1993). En particular, Kim y col., demuestran que la administración de una cantidad tan pequeña como 10 \mug dos veces a la semana de un anticuerpo anti VEGF tuvo como resultado una inhibición significativa del crecimiento tumoral. Los efectos máximos se lograron con dosis de anticuerpo de 50-100 \mug.
El siguiente ejemplo pretende solamente ilustrar el mejor modo conocido actualmente para practicar la invención pero no se considera que la invención esté limitada a los detalles de este ejemplo.
Ejemplo específico I
Construcción de un vector fagómido y el anticuerpo anti VEGF humanizado inicial
El mAb murino anti VEGF A4.6.1 ha sido previamente descrito por Kim y col., Growth Factors, 7, 53 (1992); Kim y col., Nature, 362, 841 (1993). La primera variante Fab del A4.6.1 humanizado, hu2.0, se construyó por mutagénesis dirigida usando un molde con desoxiuridina del plásmido pAK2 que codifica el fragmento Fd de una cadena ligera V_{L}\kappaI-C\kappa_{I} humana_{ }y una cadena pesada V_{H}III-C_{H}l\gamma_{I} humana_{.} Carter y col., PNAS USA 89, 4285 (1992). Las secuencias CDR A4.6.1 transplantadas se escogieron según la definición de secuencia de Kabat y col., Sequences of Proteins of Immuno-logical Interest (5th), Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991), salvo para la CDR-H1 que se amplió para que incluyera tanto la definición de secuencia como de estructural, a saber, V_{H} residuos 26-3 5, Chothia y col., J. Mol. BioL 196, 901 (1987). La secuencia que codifica el fragmento Fab se subclonó en el vector fagómido phGHamg3. Bass and Wells, Proteins, 8, 309 (1990); Lowman y col., Biochem. 30, 10832 (1991). Esta construcción, pMB4-19, codifica el Fab A4.6.1 humanizado inicial, hu2.0, con el extremo C terminal de la cadena pesada fusionada precisamente al el extremo carboxilo de la proteína de revestimiento del gen III de M13. pMB4-19 es una construcción similar a pDH188, un plásmido previamente descrito para la presentación monovalente de fragmentos Fab. Garrard y col., Biotechn. 9: 1373-1377 (1991). Existen notables diferencias entre el pMB4-19 y el pDH188 que incluyen un segmento del gen III de M13 más corto (codones 249-406) y el uso de un codón de parada ámbar justo detrás del fragmento Fd de la cadena pesada del anticuerpo. Esto permite la expresión de la cadena pesada secretada y de las fusiones cadena pesada-gen III en cepas de supresoras supE de E. coli.
En la figura 1 se muestra el fragmento Fab A4.6.1 humanizado (hu2.0) en el que se injertaron las CDR del A4.6.1 en una región estructural V_{L\kappa}I-V_{H}III humana. El dominio V_{L} de hu2.0 está expuesto en el Identificador de secuencia Nº: 7 y el dominio V_{H} de hu2.0 está expuesto en el Identificador de secuencia Nº: 10.
El resto de residuos que no sean las CDR injertadas se mantuvieron como en la secuencia humana. La capacidad de unión de este anticuerpo humanizado inicial a VEGF fue tan débil que no se pudo detectar. Basándose en la afinidad relativa de otras variantes A4.6.1 humanizadas con una débil capacidad de unión (datos no mostrados), la K_{D} para la capacidad de unión de hu2.0 se estimó en >7 \muM. Esto contrasta con una afinidad de 1,6 nM para una construcción de Fab quimérica compuesta por los dominios V_{L} y V_{H} intactos de un A4.6.1 murino y de dominios constantes humanos. De este modo, la capacidad de unión de hu2.0 a VEGF fue de al menos 4000 veces menos que la de la
quimera.
Diseño de una genoteca de fagómidos con Fab anti VEGF
El grupo de cambios estructurales necesarios para optimizar la capacidad de unión al antígeno usando una región estructural humana V_{L}\kappaI-V_{H}III se seleccionó como se muestra en la tabla 1 y en la figura 2. La genoteca de fagómidos del A4.6.1 humanizado se construyó por mutagénesis dirigida según el método de Kunkel y col., Methods Enzymol. 204, 125 (1991). Se preparó un derivado del pMB4-19 con tripletes de parada TAA en los codones de V_{H} 24, 37, 67 y 93 para usar como molde de la mutagénesis (todas las numeraciones de secuencia están según Kabat y col., citado con anterioridad). Esta modificación se realizó para evitar una posterior contaminación de fondo por secuencias silvestres. Los codones diana para la aleatorización fueron el 4 y el 71 (cadena ligera) y 24, 37, 67, 69, 71, 73, 75, 76, 78, 93 y 94 (cadena pesada).
TABLA 1
Residuos estructurales clave importantes para la unión al antígeno y dianas de la aleatorización
Residuo Residuo humano Residuo A4.6.1m Randomización^{a}
Estructura consenso murino
Vk_{L}I, V_{H}III
V_{L} 4 Met Met Met, Leu
71 Phe Tyr Phe, Tyr
V_{H} 24 Ala Ala Ala, Val, Thr
37 Val Val Val, Ile
67 Phe Phe Phe, Val, Thr, Leu,
Ile, Ala
69 Ile Phe Ile, Phe
71 Arg Leu Arg^{b}, Leu^{b}
73 Asp Thr Asp^{b}, Thr^{b}
75 Lys Ala Lys^{b}, Ala^{b}
76 Asn Ser Asn^{b}, Ser^{b}
78 Leu Ala Leu, Ala, Val, Phe
93 Ala Ala Ala, Val, Leu, Ser, Thr
94 Arg Lys Arg, Lys
^{a} Diversidad aminoacídica en la genoteca de fagómidos
^{b} \begin{minipage}[t]{155mm}V_{H} 71, 73, 75, 76 aleatorizados para producir todos los tetrámeros V_{H}III murinos (L71/T73/A75/S76) o todos los humanos (R71/D73/K75/N76).\end{minipage}
Una preocupación en el diseño de la genoteca de fagómidos del A4.6.1 humanizado fue que los residuos diana para la aleatorización estaban muy distribuidos por las secuencias V_{L} y V_{H.} Las limitaciones en la longitud de los oligonucleótidos sintéticos hacen que la aleatorización simultánea de cada una de estas posiciones estructurales se pueda lograr solamente mediante el uso de múltiples oligonucleótidos. Sin embargo, como el número total de oligonucleótidos aumenta, la eficacia de la mutagénesis disminuye (es decir, la proporción de los mutantes obtenidos que incorporan la secuencia derivada de todos los oligonucleótidos mutagénicos). Para sortear este problema, se incorporaron dos características en la construcción de la genoteca. Lo primero fue preparar cuatro moldes distintos para la mutagénesis que codificaran cada una de las posibles combinaciones estructurales V_{L}. Esto fue sencillo de hacer dada la limitada diversidad de la región estructural de la cadena ligera (sólo 4 secuencias diferentes), pero fue muy beneficioso porque eliminó la necesidad de dos oligonucleótidos de la estrategia de mutagénesis. En segundo lugar, se prepararon dos oligonucleótidos de 126 bases a partir de fragmentos sintéticos más pequeños. Esto posibilitó la aleatorización de los codones de V_{H} 67, 69, 71, 73, 75, 76, 93 y 94 con un solo pero largo oligonucleótido en lugar de con dos más pequeños. Por lo tanto, en la estrategia de mutagénesis por aleatorización final se emplearon sólo dos oligonucleótidos simultáneamente sobre los cuatro moldes diferentes.
Más específicamente, para aleatorizar los codones de la cadena pesada 67, 69, 71, 73, 75, 76, 78, 93 y 94 con un solo oligonucleótido mutagénicos primero se prepararon dos oligonucleótidos de 126 mer a partir de fragmentos de 60 y 66 mer por ligación enzimático sobre el molde. Específicamente, se combinaron 1,5 nmol del oligonucleótido fosforilado 5' GAT TTC AAA CGT CGT NYT ACT WTT TCT AGA GAC AAC TCC AAA AAC ACA BYT TAC CTG CAG ATG AAC (Identificador de secuencia Nº: 12) o GAT TTC AAA CGT CGT NYT ACT WTT TCT TTA GAC ACC TCC GCA AGC ACA BYT TAC CTG CAG ATG AAC (Identificador de secuencia Nº: 1) con 1,5 nmol de AGC CTG CGC GCT GAG GAC ACT GCC GTC TAT TAC TGT DYA ARG TAC CCC CAC TAT TAT GGG (Identificador de secuencia Nº: 2). Los codones aleatorizados están subrayados y N representa A/G/ T/C; W representa A/T; B representa G/T/C;D representa G/A/T; R representa A/G; e Y representa C/T ("/" representa "o"). Después, 1,5 nmol del oligonucleótido molde CTC AGC GCG CAG GCT GTT CAT CTG CAG GTA (Identificador de secuencia Nº: 3), con una secuencia complementaria a los extremos 5’ de los Identificadores de secuencia Nº: 12 y 1 y se añadió el extremo 3’ del Identificador de secuencia Nº: 3 para hibridar con cada extremo de la ligación. A esta mezcla, se añadió Taq ligasa (ligasa termoestable de New England Biolabs) y tampón, y la reacción se sometió a 40 ciclos térmicos (95ºC durante 1,25 minutos y 50ºC durante 5 minutos) para establecer ciclos del oligonucleótido molde entre las uniones ligadas y las no ligadas. Los productos de oligonucleótidos de 126 mer se purificaron en un gel de poliacrilamida con 6% de urea/TBE y se extrajeron de la poliacrilamida a tampón. Los dos productos de 126 mer se combinaron en una proporción igual con etanol, se precipitaron y se solubilizaron en Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM. El producto mezcla de oligonucleótido de 126 mer se etiquetó 504-01.
De este modo, la aleatorización de los codones estructurales (V_{L} 4, 71; V_{H} 24, 37, 67, 69, 71, 73, 75, 76, 93, 94) se efectuó en dos etapas. La primera, la aleatorización V_{L} se logró preparando tres derivados adicionales del molde pMB4-19 modificado. Los codones estructurales 4 y 71 de la cadena ligera se reemplazaron individualmente o por pares usando dos oligonucleótidos mutagénicos GCT GAT ATC CAG TTG ACC CAG TCC CCG (Identificador de secuencia Nº: 13) y TCT GGG ACG GAT TAC ACT CTG ACC ATC (Identificador de secuencia Nº: 4). Se preparó un molde que contiene desoxiuridina para cada uno de estos nuevos derivados. Junto con el molde original, estas cuatro construcciones codificaron cada una de las cuatro posibles combinaciones de secuencias estructurales de la cadena ligera (véase la tabla 1).
Los oligonucleótidos 504-01, la mezcla de dos oligonucleótidos de 126 mer, y CGT TTG TCC TGT GCA RYT TCT GGC TAT ACC TTC ACC AAC TAT GGT ATG AAC TGG RTC CGT CAG GCC CCG GGT AAG (Identificador de secuencia Nº: 5) se usaron para aleatorizar los codones estructurales de la cadena pesada usando cada uno de los cuatro moldes como se describe. Se electroporaron las cuatro genotecas en células de E. coli XL-1 BLUE (células marcadoras producidas por Stratagene) y se combinaron. El número total de transformantes independientes fue aproximadamente de >1,2 x 10^{8}, aproximadamente 1.500 veces superior al número máximo de secuencias de ADN de la genoteca.
A partir de esta estrategia, cada uno de los residuos 4 y 71 de la cadena ligera y los 24, 37, 67, 78 y 93 de la cadena pesada se aleatorizaron parcialmente para permitir la selección de la secuencia del A4.6.1 murino de la secuencia V_{L}\kappaI-V_{H}III humana, u otras secuencias frecuentemente encontradas en otras regiones estructurales humanas y murinas (tabla I). Nótese que la aleatorización de estos residuos no se limitó a la elección entre las secuencias estructurales consenso V_{L}\kappaI-V_{H}III humana o A4.6.1. Más bien, la inclusión de aminoácidos adicionales comúnmente presentes en otras secuencias estructurales humanas y murinas ofrece la posibilidad de que una diversidad adicional pueda conducir a la selección de u número mayor de variantes funcionales.
Alguno de los residuos estructurales de la cadena pesada fueron aleatorizados de modo binario según las secuencias estructurales V_{H}III humana y A4.6.1 murina. Los residuos de V_{H} 71, 73, 75 y 76 se colocan en una horquilla junto al centro de unión al antígeno. Las cadenas laterales de V_{H} 71 y 73 están ampliamente ocultas por las estructuras canónicas del anticuerpo y su papel potencial en el mantenimiento de la conformación de las CDR-H2 y CDR-H3 es muy conocido. Kettleborough y col., Protein Eng. 4, 773 (1991); Carter y col., PNAS USA 89, 4285 (1992); Shalaby y col., J. Exp. Med. 175, 217 (1992). Por otro lado, aunque las cadenas laterales de V_{H} 75 y 76 están muy expuestas (figura 2), sin embargo, no se ha comprobado que estos dos residuos puedan influir además en la capacidad de unión al antígeno (Eigenbrot, Proteins 18, 49 [1994]), presumiblemente debido al contacto directo con el antígeno en algunos complejos anticuerpo-antígeno. Debido a su proximidad en la secuencia y a la posible interdependencia, se aleatorizaron V_{H}, 71, 73, 75 y 76 en bloque de modo que sólo se podrían seleccionar dos combinaciones posibles de estos tetrámeros; todos secuencias V_{H}III humanas o A4.6.1 murinas. Finalmente, se aleatorizaron los residuos de V_{H} 69 y 94, pero sólo para representar las secuencias V_{H}III y A4.6.1. Los residuos de V_{H} 69 y 94 no se reemplazaron en previas humanizaciones de anticuerpos, pero porque diferían entre las secuencias consenso V_{H}III y A4.6.1 (figura 1) y como se observó que eran potencialmente importantes para la conformación de la región CDR (Foote y col., J. Mol. Biol. 224, 487 [1992]), se incluyeron en esta estrategia de aleatorización.
Genoteca del Fab A4.6.1 humanizados presentado en la superficie del fagómido
Se ha desarrollado una variedad de sistemas para la presentación funcional de fragmentos de anticuerpos en la superficie del fago filamentoso. Winter y col., Ann. Rev. Immunol. 12, 433 (1994). Estos incluyen la presentación de fragmentos Fab o de una sola cadena Fv (scFv) como fusiones con las proteínas de revestimiento del gen III o del gen VIII del bacteriófago M13. El sistema seleccionado en la presente memoria descriptiva es similar al descrito en Garrard y col., Biotechn. 9, 13 73 (1991) en el que se presenta monovalentemente un fragmento Fab como una fusión con el gen III (figura 3). Este sistema tiene dos características destacables. En particular, a diferencia de los scFvs, los fragmentos Fab no tienen tendencia a formar especies diméricas, la presencia de las cuales puede impedir la selección de los anticuerpo con mayor fuerza de unión a debido a efectos de la avidez. Adicionalmente, la monovalencia de la proteína presentada elimina una segunda fuente potencial de efectos de avidez que de otro modo podrían resultar de la presencia de copias múltiples de una proteína en cada partícula de fagómido. Bass y Wells, Proteins 8, 309 (1990); Lowman y col., Biochemistry 30, 10832 (1991).
Las partículas de fagómidos que presentan los fragmentos Fab A4.6.1 humanizados se propagaron en células E. coli XL-1 Blue. Brevemente, las células que llevan la construcción pMB4-19 aleatorizada crecieron durante la noche a 37ºC en 25 ml de medio 2YT con carbenicilina 50 \mug/ml y aproximadamente 10^{10} fagos adyuvantes M13KO7 (Viera y Messing, Methods Enry-mol. 153,3[1987]). La solución madre de fagómidos se purificarón a partir de los sobrenadantes del cultivo precipitando con una solución salina de polietilenglicol, y se resuspendió en 100 \mul de PBS (aproximadamente 10^{14} fagómido/ml)
Selección de las variantes Fab A4.6.1 humanizadas
Se revistieron el pocillo de una placa de microtitulación con VEGF_{121} purificado durante toda la noche a 4ºC. La solución de revestimiento se desechó y este pocillo y uno sin recubrir se bloquearon con un 6% de leche desnatada durante 1 hora y se lavó con PBS que contenía un 0,05% de TWEEN-20^{TM} (detergente). Entonces, se añadieron a cada pocillo 10 \mul de la solución madre de fagómidos, diluidos hasta 100 \mul con Tris 20 mM (pH 7,5) con 0,1% de BSA (seroalbúmina bovina) y 0,05% de TWEEN-20^{TM}. Después de 2 horas, se lavaron los pocillos y se eluyó el fago unido con 100 \mul de glicina 0,1 M (pH 2,0) y se neutralizó con 25 \mul de Tris 1 M pH 8,0. Se usó una alícuota para valorar el número de fagos eluídos. Los fagos restantes eluídos del pocillo recubierto con VEGF se propagan para el uso en el siguiente ciclo de selección. Se realizaron un total de 8 ciclos de selección después de los cuales se seleccionaros 20 clones individuales y se secuenciaron (Sanger y col., PNAS USA 74, 5463 [1977]).
Se seleccionaron de este modo las variantes de la genoteca de fagómidos con el Fab A4.6.1 humanizado basándose en la capacidad de unión a VEGF. El enriquecimiento de fagómidos funcionales, medido comparando las valoraciones de fagos eluídos del pocillo recubierto con VEGF de la placa de microtitulación en comparación con el pocillo sin recubrir, se aumentó hasta el séptimo ciclo de cribado de afinidad. Después de u ciclo adicional de clasificación, se secuenciaron 20 clones para identificar los residuos estructurales preferentes seleccionados en casa posición aleatorizada. Estos resultados, resumidos en la tabla 2, revelaron un fuerte consenso entre los clones seleccionados. Diez de los veinte clones tenían una secuencia de ADN idéntica, denominada hu2.10. De las trece posiciones estructurales aleatorizadas, se seleccionaron ocho sustituciones en el hu2.10 (V_{L} 71; V_{H} 37, 71, 73, 75, 76, 78 y 94). De modo interesante, los residuos V_{H} 37 (Ile) y 78 (Val) no como la secuencia V_{H}III humana o la A4.6.1 murina. Este resultado sugiere que algunas posiciones estructurales se pueden beneficiar de ampliar la diversidad de secuencias estructurales más allá de la humana diana y la murina parental.
TABLA 2 Secuencias seleccionadas de la genoteca Fab de fagómidos con A4.6.1 humanizado
1
\begin{minipage}[t]{145mm}Las diferencias entre los anticuerpos hu2.0 y el A4.6.1 murino están subrayadas. El número de clones idénticos identificados para cada secuencia de fago seleccionada se indica entre paréntesis. Los guiones en las secuencias de los clones seleccionados indican la selección de la región estructural V_{L}\kappa I-V_{H}III humana (es decir, como en hu2.0).\end{minipage}
Hubo otras cuatro secuencias aminoacídicas únicas entre los diez clones restantes analizados: hu2.1, hu2.2, hu2.6 y hu2.7. Todos estos clones, además del hu2.10, contenían sustituciones estructurales idénticas en las posiciones V_{H} 37 (Ile), 78 (Val) y 94 (Lys), pero conservaban la secuencia de consenso V_{H}III humana en las posiciones 24 y 93. Cuatro clones habían perdido la secuencia codificadora de la cadena ligera y no se unían a VEGF cuando se analizaron en un ensayo ELISA con fagos (Cunningham y col., EMBO J. 13, 2508 [1994]). Ocasionalmente, apreciamos la pérdida de la secuencia de la cadena ligera o de la cadena pesada en otras genotecas de fagómidos con Fab (datos no publicados), y estos clones se seleccionan presumiblemente basándose a la expresión aumentada Tales artefactos a menudo se pueden minimizar reduciendo el número de ciclos de clasificación o propagando las genotecas en medios sólidos.
Determinación de las afinidades de unión a VEGF
Se midieron las constantes de asociación (k_{on}) y de disociación (k_{off}) para la capacidad de unión de variantes Fab humanizadas a VEGF_{121} mediante resonancia de plasmón superficial (Karlsson et al, J. Immun. Methods 145, 229 [1991]) en un instrumento (Karlsson y col, J. Immun. Methods 145, 229 [1991]) on a Pharmacia de Pharmacia. Se inmovilizó covalentemente el VEGF_{121} al chip del biodetector a través de los grupos amino principales.
La capacidad de unión de las variantes Fab A4.6.1 humanizadas se midió usando soluciones de flujo de Fab en PBS/0,05% TWEEN-20^{TM} (detergente) sobre el chip a una velocidad de flujo de 20 \mul/m. Después de cada medición de unión, se eliminó el Fab residual del ligando lavando con 5 \mul de una solución acuosa de HCl 50 mM a una velocidad de flujo de 3 \mul/m. Los perfiles de unión se analizaron con un regresión no lineal usando un modelo de unión monovalente sencillo (BIAevaluation software v2.0; Pharmacia).
Se expresaron las variantes seleccionadas de los fagos hu2.1, hu2.2, hu2.6, hu2.7 y hu2.10 en E. coli usando matraces en agitación y se purificaron los fragmentos Fab a partir de los extractos periplásmicos por cromatografía de afinidad con proteína G. Las producciones recuperadas de Fab para estos cinco clones oscilaron entre 0,2 (hu2.6) y 1,7 mg/l (hu2.1). La afinidad de cada una de estas variantes por el antígeno (VEGF) se midió por resonancia de plasmón superficial en un instrumento BIAcore como se muestra en la tabla 3.
TABLA 3
Afinidad de unión a VEGF de las variantes A4.6.1 humanizadas
Variante k_{on} k_{off} K_{D} K_{D}(mut)
M^{-1}s^{-1}/10^{4} 104s-1 nM K_{D}(A4.6.1)
Quimera A4.6.1 5,4 0,85 1,6
hu2.0 ND ND >7000** >4000
Clones de fagos seleccionados:
\hskip0,2cm hu2.1 0,70 18 260 170
\hskip0,2cm hu2.2 0,47 16 340 210
\hskip0,2cm hu2.6 0,67 4,5 67 40
\hskip0,2cm hu2.7 0,67 24 360 230
\hskip0,2cm hu2.10 0,63 3,5 55 35
\hskip0,2cm *hu2.10V 2,0 1,8 9,3 5,8
* \hskip0,1cm \begin{minipage}[t]{150mm}hu2.10V = hu2.10 con la mutación V_{L} Leu46 -> Val; los errores estimados en las mediciones de unión del Biacore son +/- 25%;\end{minipage}
** Demasiado baja para poder medirla, estimación de unión menor.
El análisis de estos datos de unión, revelaron que el clon consenso hu2.10 poseía la mayor afinidad por VEGF entre las cinco variantes analizadas. Así, nuestra genoteca de fagómidos con Fab, se enriqueció selectivamente con el clon con una capacidad de unión más fuerte. La K_{D} calculada para hu2.10 fue 55 nM, al menos 125 veces más fuerte que la de hu.20 que no contenía cambios estructurales (K_{D} >7 \muM). Las otras cuatro variantes seleccionadas mostraron una capacidad de unión a VEGF más débil, que no superó una K_{D} de 360 nM en el caso de la más débil (hu2.7). Curiosamente, la K_{D} para hu2.6, 67 nM, fue sólo ligeramente más débil que la de hu2.10 y sólo se descubrió una copia de este clon entre los 20 clones secuenciados. Esto puede deberse a los menores niveles de expresión y presentación, como fue el caso cuando se expresó el fragmento Fab soluble de esta variante. Sin embargo, a pesar de la menos tasa de expresión, esta variante es útil como anticuerpo humanizado.
Mejora adicional de la variante hu2.10 humanizada
A pesar de la enorme mejora en la afinidad por el antígeno con la variante humanizada inicial, la capacidad de unión de hu2.10 a VEGF aún fue 35 veces más débil que la del fragmento Fab quimérico con los dominios V_{L} y V_{H} del A4.6.1 murino. Esta diferencia considerable sugirió que aún podría ser posible otra optimización de la región estructural humanizada mediante mutaciones adicionales. De los residuos vernier identificados por Foote y col., J. Mol. Biol. 196, 901 (1992), sólo los residuos V_{L} 46, V_{H} 2 y V_{H} 48 diferían en el A4.6.1 en comparación con la región estructural V_{l}\kappaI-V_{H} III (figura 1) pero no se aleatorizó en nuestra genoteca de fagómidos. Un modelo molecular del fragmento Fv de A4.6.1 humanizado mostró que el sitio V_{L} 46 se asienta en el interfaz V_{L}-V_{H} y que podría influir en la conformación de CDRH3. Además este aminoácido es casi siempre leucina en la mayoría de las regiones estructurales V_{L}\kappa (Kabat y col., citado con anterioridad), pero es valina en el A4.6.1. Por consiguiente, se realizó una sustitución Leu -> Val en esta posición del hu2.10 como base. Los análisis de la cinética de unión para esta nueva variante, hu2.10V, indicó una mejora de 6 veces en la K_{D} para la unión a VEGF. La K_{D} para hu2.10V (9,3 nM) fue de este modo 6 veces la de la quimera. En contraste con V_{L} 46, no se observó ninguna mejora en la afinidad de unión de hu2.10 con el reemplazamiento de V_{H} 2 o V_{H} 48 con el residuo correspondiente del A4.6.1 murino.
Curiosamente, parte de la mejora antes del último cambio en la afinidad se debió a un incremento en la constante de asociación (k_{on}), que sugiere que V_{L} 46 puede desempeñar un papel en la preorganización de la estructura del anticuerpo en una conformación más adecuada para al unión al antígeno. Otras mutaciones con una afinidad por el antígeno afectada se debieron principalmente a cambios en la constante de disociación (k_{off}) para la unión. La comparación de hu2.1 y hu2.10 revela una mejora de 5 veces la afinidad para la sustitución de los residuos V_{H} 1, 73, 75, 76 con la secuencia A4.6.1. La conversión de V_{L}-71 a la secuencia (Phe -> Tyr) de A4.6.1 tuvo un efecto inapreciable en la capacidad de unión (hu2.2 frente a hu2.7), mientras que las variantes con leucina en V_{L} 4 se unieron ligeramente peor (<2 veces) que las que tenían metionina, el residuo natural tanto en las regiones estructurales A4.6.1 y V_{KL}I humana (hu2.2 frente a hu2.1). La comparación de otras variantes A4.6.1 humanizadas no mostradas en la presente memoria descriptiva, revelaron que el cambio V_{H} 94 Arg -> Lys producía una mejora de 5 veces en la K_{D}, debido al contacto directo con el antígeno por este residuo, o a un papel estructural en el mantenimiento de una conformación adecuada de CDR-H3. La variante hu2.6 tiene tres diferencias en la secuencia en relación al clon consenso hu2.10, pero sin embargo tiene una K_{D} similar, lo que sugiere que estas tres sustituciones tiene un escaso efecto en la capacidad de unión al antígeno. El efecto inapreciable de los cambios conservativos en V_{L} 4 y 71 coinciden con los datos de unión para otras variantes, incluso el cambio en V_{H} 67 (Phe -> Thr) tuvo un escaso efecto en la capacidad de unión.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
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(i)
SOLICITANTE: Genentech, Inc.
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: ANTICUEROS HUMANIZADOS Y PROCEDIMIENTOS PARA SINTETIZAR ANTICUERPOS HUMANIZADOS
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 14
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN DE CONTACTO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DIRECCIÓN: Flehr, Hohbach, Test, Albritton Herbert
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: Four Embarcadero Center, Suite 3400
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: San Francisco
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: California
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: Estados Unidos
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CP: 94111
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
FORMULARIO LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE EMDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.30
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS DE SOLICITUD ACTUALES:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: PCT HEREWITH
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(B)
FECHA DE DEPÓSITO 02/04/1998
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS DE SOLICITUD ANTERIORES:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: 08/833,504
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE DEPÓSITO: 07/04/1997
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Dreger, Walter H.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 24,190
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: A-64254
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFOMRACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: (415) 781-1989
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TELEFAX: (415) 398-3249
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia Nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 66 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocido
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
2 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia Nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 60 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocido
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGCCTGCGCG CTGAGGACAC TGCCGTCTAT TACTGTDYAA TGTACCCCCA CTATTATGGG 
\hfill
60 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia Nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocido
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTCAGCGCGC AGGCTGTTCA TCTGCAGGTA 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia Nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocido
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCTGGGACGG ATTACACTCT GACCATC 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia Nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 75 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocido
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
3 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia Nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 107 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocido
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 6:
\vskip1.000000\baselineskip
4
5 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia Nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 107 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocido
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
6 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia Nº 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 107 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocido
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 8:
\vskip1.000000\baselineskip
7 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia Nº 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 123 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocido
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 9:
8 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia Nº 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 123 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocido
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 10:
\vskip1.000000\baselineskip
9
10 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia Nº 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 123 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocido
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 11:
\vskip1.000000\baselineskip
11
12 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia Nº 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 66 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocido
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 12:
13 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia Nº 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocido
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCTGATATCC AGTTGACCCA GTCCCCG 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia Nº 14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 6072 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocido
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 459..460
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= "La cadena ligera comienza en la base número 459."
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1101..1102
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= "La cadena ligera termina en la base número 1101."
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1254..1255
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= "La cadena pesada comienza en la base número 1254."
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 2424..2425
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /nota= "La cadena pesada termina en la base número 2424."
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 14:
\vskip1.000000\baselineskip
14
15
16
17

Claims (30)

1. Anticuerpo anti factor de crecimiento del endotelio vascular humanizado, en el que las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de un anticuerpo no humano se injertan en una región estructural humana que comprende la región estructural VL\kappa subgrupo I (VL\kappaI) con Identificador de secuencia Nº 7 y la región estructural VH subgrupo III (VHIII) con Identificador de secuencia Nº 10, en el que al menos uno de los residuos representativamente enumerados 4 y 71 del dominio V_{L} se sustituye por un aminoácido diferente, y al menos tres de los residuos representativamente enumerados 37, 67, 69, 71, 73, 75, 76, 78 and 94 del dominio V_{H} se sustituyen con un aminoácido diferente, y en el que el residuo 46 del domino V_{L} se sustituye opcionalmente por el aminoácido valina, y en el que la numeración de los residuos está según el sistema de numeración de Kabat y col., como se muestra en la figura 1.
2. Anticuerpo humanizado según la reivindicación 1, con al menos una de las siguientes sustituciones: en VL4, leucina y en VL71, tirosina y al menos tres de las siguientes sustituciones: en VH37, isoleucina; en VH67, treonina; en VH69, fenilalanina; en VH71, leucina; en VH73, treonina; VH75, alanina; VH76, serina; en VH78, valina; y en VH94, lisina.
3. Anticuerpo humanizado según la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, en el que los residuos 37, 78 y 94 del dominio VH se sustituyen con los aminoácidos isoleucina, valina y lisina, respectivamente.
4. Anticuerpo humanizado según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que los residuos 71, 73, 75 y 76 del dominio VH se sustituyen con los aminoácidos leucina, treonina, alanina y serina, respectivamente.
5. Anticuerpo humanizado según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el residuo 46 del domino VL se sustituye con el aminoácido valina.
6. Anticuerpo humanizado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el dominio VL tiene la secuencia expuesta con Identificador de secuencia Nº 8 y el domino VH tiene la secuencia expuesta con Identificador de secuencia Nº 11.
7. Anticuerpo humanizado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que: el domino VL tiene la secuencia expuesta con Identificador de secuencia Nº 8 en la que el residuo 46, leucina, se sustituye con valina y el domino VH tiene la secuencia expuesta con Identificador de secuencia Nº 11.
8. Anticuerpo humanizado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que: el domino VL tiene la secuencia expuesta con Identificador de secuencia Nº 8, en la que los residuos 4, metionina y 71, tirosina, se sustituyen con leucina y fenilalanina, respectivamente; y el dominio VH tiene la secuencia expuesta con Identificador de secuencia Nº 11, en la que el residuo 67, fenilalanina, se sustituye con treonina.
9. Anticuerpo humanizado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que: el domino VL tiene la secuencia expuesta con Identificador de secuencia Nº 7, en la que el residuo 71, fenilalanina, se sustituye con tirosina y el domino VH tiene la secuencia expuesta con Identificador de secuencia Nº 10, en la que los residuos 37, valina; 78, leucina y 94, arginina, se sustituyen con isoleucina, valina y lisina, respectivamente.
10. Anticuerpo humanizado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que: el domino VL tiene la secuencia expuesta con Identificador de secuencia Nº 7, en la que los residuos 4, metionina y 71, fenilalanina, se sustituyen con leucina y tirosina, respectivamente; y el dominio VH tiene la secuencia expuesta con Identificador de secuencia Nº 10, en la que los residuos 37, valina; 78, leucina y 94, arginina, se sustituyen con isoleucina, valina y lisina, respectivamente.
11. Anticuerpo humanizado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que: el domino VL tiene la secuencia expuesta con Identificador de secuencia Nº 7, en la que el residuo 4, metionina, se sustituye con leucina y el domino VH tiene la secuencia expuesta con Identificador de secuencia Nº 10, en la que los residuos 37, valina; 67, fenilalanina, 78, leucina, 94 arginina, se sustituyen con isoleucina, treonina, valina y lisina, respectivamente.
12. Procedimiento para humanizar un anticuerpo anti factor de crecimiento del endotelio vascular no humano que comprende los pasos de:
injertar regiones determinantes de complementariedad (CDR) de un anticuerpo no humano en una región estructural humana que comprende los dominios VL\kappa subgrupo I (VL\kappaI) y VH subgrupo III (VHIII);
sustituir al menos uno de los residuos 4 y 71 en el dominio VL con un aminoácido diferente; y
sustituir al menos tres de los residuos 37, 67, 69, 71, 73, 75, 76, 78 y 94 en el dominio VH con un aminoácido diferente,
en el que la numeración de los residuos está según el sistema de numeración de Kabat y col., como se muestra en la figura 1.
13. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que la región estructural humana comprende, antes de la sustitución, la región estructural del dominio VL\kappa subgrupo I (VL\kappaI) con Identificador de secuencia Nº 7 y VH subgrupo III (VHIII) con Identificador de secuencia Nº 10.
14. Procedimiento según la reivindicación 12 o la reivindicación 13, que comprende al menos una de las siguientes sustituciones: en VL4, leucina y en VL71, tirosina y al menos tres de las siguientes sustituciones: en VH37, isoleucina; en VH67, treonina; en VH69, fenilalanina; en VH71, leucina; en VH73, treonina; en VH75, alanina; en VH76, serina; en VH78, valina; y en VH94, lisina.
15. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en el que los residuos 37, 78 y 94 del dominio VH se sustituyen con los aminoácidos isoleucina, valina y lisina, respectivamente.
16. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, en el que los residuos 71, 73, 75 y 76 se sustituyen con los aminoácidos leucina, treonina, alanina y serina, respectivamente.
17. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, en el que el residuo 46 del domino VL se sustituye con el aminoácido valina.
18. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, en el que el dominio VL tiene la secuencia expuesta con Identificador de secuencia Nº 8 y el domino VH tiene la secuencia expuesta con Identificador de secuencia Nº 11.
19. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 17, en el que:
el domino VL tiene la secuencia expuesta con Identificador de secuencia Nº 8 en la que el residuo 46, leucina, se sustituye con valina y el domino VH tiene la secuencia expuesta con Identificador de secuencia Nº 11.
20. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, en el que:
el domino VL tiene la secuencia expuesta con Identificador de secuencia Nº 8, en la que los residuos 4, metionina y 71, tirosina, se sustituyen con leucina y fenilalanina, respectivamente; y el dominio VH tiene la secuencia expuesta con Identificador de secuencia Nº 11, en la que el residuo 67, fenilalanina, se sustituye con treonina.
21. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, en el que:
el domino VL tiene la secuencia expuesta con Identificador de secuencia Nº 7, en la que el residuo 71, fenilalanina, se sustituye con tirosina y el domino VH tiene la secuencia expuesta con Identificador de secuencia Nº 10, en la que los residuos 37, valina; 78, leucina y 94, arginina, se sustituyen con isoleucina, valina y lisina, respectivamente.
22. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, en el que:
el domino VL tiene la secuencia expuesta con Identificador de secuencia Nº 7, en la que los residuos 4, metionina y 71, fenilalanina, se sustituyen con leucina y tirosina, respectivamente; y el dominio VH tiene la secuencia expuesta con Identificador de secuencia Nº 10, en la que los residuos 37, valina; 78, leucina y 94, arginina, se sustituyen con isoleucina, valina y lisina, respectivamente.
23. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, en el que:
el domino VL tiene la secuencia expuesta con Identificador de secuencia Nº 7, en la que el residuo 4, metionina, se sustituye con leucina y el domino VH tiene la secuencia expuesta con Identificador de secuencia Nº 10, en la que los residuos 37, valina; 67, fenilalanina, 78, leucina, 94 arginina, se sustituyen con isoleucina, treonina, valina y lisina, respectivamente.
24. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 17 que además comprende los pasos de:
presentar los dominios VL y VH con sustituciones en un fagómido; determinar si VEGF se unirá a los dominios VL y VH con sustituciones; seleccionar anticuerpos humanizados que se unan a VEGF.
25. Anticuerpo humanizado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que es un fragmento de anticuerpo.
26. Fragmento de anticuerpo según la reivindicación 25, que es un fragmento Fab, Fab^{1}, F(ab^{1})_{2} o Fv.
27. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 24, en el que el anticuerpo humanizado es un fragmento de anticuerpo.
28. Procedimiento según la reivindicación 27, en el que el fragmento es un fragmento Fab, Fab^{1}, F(ab^{1})_{2} o Fv.
29. Anticuerpo humanizado según la reivindicación 1 codificado por una molécula de ácido nucleico con la secuencia expuesta con Identificador de secuencia Nº 14.
30. Uso del anticuerpo humanizado según cualquiera de las reivindicaciones 1, 11, 25, 26 y 29, en la fabricación de un medicamento para inhibir el crecimiento tumoral inhibiendo la señalización mitogénica.
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