PT973804E

PT973804E - Anticorpos anti-vegf

Info

Publication number: PT973804E
Application number: PT98917991T
Authority: PT
Inventors: Henry B Lowman; Yvonne Man-Yee Chen; James A Wells; Leonard G Presta; Manuel Baca
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 1997-04-07
Filing date: 1998-04-03
Publication date: 2007-03-30
Also published as: LTPA2007004I1; HK1114621A1; CN1191276C; DE69842174D1; NO2017039I2; CN101838328A; SI2301580T1; PT1787999E; EP2301580B1; JP2001502922A; NO2017039I1; DK0971959T3; DK1787999T3; WO1998045332A3; IL175906A; ATE501170T1; SI0973804T1; PT971959E; CN101210051A; AU740738B2

Description

ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ DESCRIÇÃO "Anticorpos anti-VEGF"

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Campo da Invenção A presente invenção refere-se genericamente a anticorpos anti-VEGF e, em particular, a anticorpos anti-VEGF humanizados variantes.

Descrição da Arte Relacionada

Está actualmente bem estabelecido que a angiogénese está implicada na patogénese de uma variedade de desordens. Estas incluem tumores sólidos, síndromas neovasculares intra-oculares tais como retinopatias proliferativas ou degeneração macular relacionada com a idade (AMD), artrite reumatóide e psoríase (Folkman et al. J. Biol. Chem. 267:10931-10934 (1992); Klagsbrun et al. Annu. Rev. Physiol. 53:217-239 (1991); e Garner A, Vascular diseases. Em: Pathobiology of ocular disease. A dynamic approach. Garner A, Klintworth GK, Eds. 2nd Edition Mareei Dekker, NY, p. 1625-1710 (1994)). No caso de tumores sólidos, a neovascularização permite que as células tumorais adquiram uma vantagem de crescimento e autonomia proliferativa em comparação com as células normais. Assim, foi observada uma correlação entre a densidade de microvasos em secções de tumores e a sobrevivências de pacientes no cancro da mama bem como em vários outros tumores (Weidner et al. N Engl J Med 324:1-6 (1991); Horak et al. Lancet 340:1120-1124 (1992); e Macchiarini et al. Lancet 340:145-146 (1992)). A procura de reguladores positivos da angiogénese deu origem a muitos candidatos, incluindo aFGF, bFGF, TGF-a, TGF-β, HGF, TNF-a, angiogenina, IL-8, etc. (Folkman et al. e Klagsbrun et al). Os reguladores negativos até agora identificados incluem trombospondina (Good et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 87:6624-6628 (1990)), o fragmento N-terminal de 16 quilodalton da prolactina (Clapp et al. Endocrinology, 133:1292-1299 (1993)), angiostatina (0'Reilly et al. Cell, 2 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ 79:315-328 (1994)) e endostatina (0'Reilly et al. Cell, 88:277-285 (1996)) . O trabalho realizado ao longo dos últimos anos estabeleceu o papel chave do factor do crescimento endotelial vascular (VEGF) na regulação da angiogénese normal e anormal (Ferrara et al. Endocr. Rev. 18:4-25 (1997)). A verificação de que a perda mesmo de um só alelo de VEGF resulta em letalidade embrionária aponta para um papel insubstituível desempenhado por este factor no desenvolvimento e diferenciação do sistema vascular (Ferrara et al.). Adicionalmente, mostrou-se que o VEGF é um mediador chave da neovascularização associada a tumores e desordens intra-oculares (Ferrara et al.). O ARNm de VEGF é super-expresso pela maioria dos tumores humanos examinados (Berkman et al. J Clin Invest 91:153-159 (1993);

Brown et al. Human Pathol., 26:86-91 (1995); Brown et al. Câncer Res. 53:4727-4735 (1993); Mattern et al. Brlt. J. Câncer. 73:931-934 (1996); e Dvorak et al. Am J. Pathol. 146:1029-1039 (1995)). Do mesmo modo, a concentração de VEGF nos fluidos do olho está altamente correlacionada com a presença de proliferação activa de vasos sanguíneos em pacientes com retinopatias diabéticas e outras retinopatias relacionadas com isquemia (Aiello et al. N. Engl. J. Med. 331:1480-1487 (1994)). Adicionalmente, estudos recentes demonstraram a localização de VEGF em membranas coróides neovasculares em pacientes afectados por AMD (Lopez et al. Invest. Ophtalmo. Vis. Sei. 37:855-868 (1996)). Os anticorpos neutralizantes anti-VEGF suprimem o crescimento de uma variedade de linhas de células tumorais humanas em ratinhos nus (Kim et al. Nature 362:841-844 (1993); Warren et al. J.

Clin. Invest. 95:1789-1797 (1995); Borgstrõm et al. Câncer

Res. 56:4032-4039 (1996); e Melnyk et al. Câncer Res. 56 :921-924 (1996)) e também inibem a angiogénese intra-ocular em modelos de desordens retinais isquémicas (Adamis et al. Arch. Ophthalmol. 114:66-71 (1996)). Há uma revisão sobre anticorpos humanizantes em Bending, Methods: Comp. Meth. Enzy., 8:83-93 (1995) . W092/22653 refere-se também à humanização de anticorpos. Portanto, os anticorpos monoclonais anti-VEGF ou outros inibidores da acção do VEGF são candidatos promissores para o tratamento de tumores sólidos e várias desordens neovasculares intra-oculares. 3 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Baca et al., J. Biol. Chem. 272(16), 10678-10684, descrevem um método de exibição em fagos para a humanização de anticorpos anti-VEGF por mutagénese aleatória de certos resíduos de esqueleto (framework). O presente pedido de patente descreve variantes de anticorpos anti-VEGF humanizados conforme definidos nas reivindicações, com propriedades desejáveis de uma perspectiva terapêutica, incluindo forte afinidade de ligação para com o VEGF; a capacidade de inibir a proliferação de células endoteliais induzida por VEGF in vitrcr, e a capacidade de inibir a angiogénese induzida por VEGF in vivo. O anticorpo anti-VEGF humanizado variante aqui preferido liga-se a VEGF humano com um valor de Kd não superior a cerca de 1 x 1CT8 M e preferivelmente não superior a cerca de 5 x IO”9 M. Em adição, o anticorpo anti-VEGF humanizado variante pode ter um valor de ED50 não superior a cerca de 5 nM para a inibição da proliferação de células endoteliais induzida por VEGF in vitro. Os anticorpos anti-VEGF humanizados variantes com interesse particular são aqueles que inibem pelo menos cerca de 50% do crescimento tumoral num modelo de tumor A6 73 in vivo, com uma dose de anticorpo de 5 mg/kg.

Como definido nas reivindicações, a invenção proporciona uma variante de um anticorpo anti-VEGF progenitor (anticorpo progenitor este que é o anticorpo anti-VEGF humanizado F(ab)-12), em que a variante se liga a VEGF humano e compreende uma substituição de um aminoácido pelo menos em CDRHl e/ou em CDRH3 do domínio variável de cadeia pesada ou leve do anticorpo anti-VEGF progenitor. A variante possui preferivelmente uma ou mais substituições numa ou mais regiões hipervariáveis do anticorpo anti-VEGF. Preferivelmente, há substituições em ambas estas regiões hipervariáveis.

Demonstra-se aqui que estas variantes "maduras em afinidade" se ligam ao VEGF humano mais fortemente do que o anticorpo anti-VEGF progenitor a partir do qual foram geradas, i.e., possuem um valor de Kd que é significativamente inferior ao do anticorpo anti-VEGF progenitor. Preferivelmente, a variante 4 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ possui um valor de ED50 para a inibição da proliferação de células endoteliais induzida por VEGF in vitro que é pelo menos cerca de 10 vezes inferior, preferivelmente pelo menos cerca de 20 vezes inferior, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 50 vezes inferior, ao do anticorpo anti-VEGF progenitor. Uma variante particularmente preferida é a variante Y0317 do Exemplo 3, que possui uma CDRHl compreendendo a sequência de aminoácidos: GYDFTHYGMN (SEQ ID NO:126) e uma CDRH3 compreendendo a sequência de aminoácidos: YPYYYGTSHWYFDV (SEQ ID NO:127). Estas regiões hipervariáveis e CDRH2 são geralmente proporcionadas sobre uma região de esqueleto (framework) humana, e.g., resultando um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:116. Estas sequências de domínio variável de cadeia pesada são opcionalmente combinadas com um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:124, e preferivelmente a sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO:115.

Estão aqui contempladas várias formas do anticorpo. Por exemplo, o anticorpo anti-VEGF pode ser um anticorpo de comprimento completo (e.g. possuindo uma região Fc intacta humana) ou um fragmento de anticorpo (e.g. um Fab, Fab' ou F(ab')2). Adicionalmente, o anticorpo pode ser marcado com um marcador detectável, imobilizado numa fase sólida e/ou conjugado com um composto heterólogo (tal como um agente citotóxico).

Estão contempladas utilizações em diagnóstico e terapêuticas para o anticorpo. Numa aplicação em diagnóstico, a invenção proporciona um método para a determinação da presença de proteína VEGF compreendendo a exposição de uma amostra que se suspeita conter a proteína VEGF, ao anticorpo anti-VEGF, e a determinação da ligação do anticorpo à amostra. Para esta utilização, a invenção proporciona um kit compreendendo o anticorpo e instruções para utilização do anticorpo para detectar a proteína VEGF. A invenção proporciona ainda: ácido nucleico isolado codificando o anticorpo; um vector compreendendo esse ácido nucleico, opcionalmente ligado operativamente a sequências de 5 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ controlo reconhecidas por uma célula hospedeira transformada com o vector; uma célula hospedeira compreendendo esse vector; um processo para a produção do anticorpo compreendendo a cultura da célula hospedeira de modo a que o ácido nucleico seja expresso e, opcionalmente, a recuperação do anticorpo a partir da cultura de células hospedeiras (e.g. a partir do meio de cultura das células hospedeiras). A invenção proporciona também uma composição compreendendo o anticorpo anti-VEGF e um transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável. A composição para utilização terapêutica é estéril e pode ser liofilizada. A invenção proporciona ainda um método para o tratamento de um mamífero que sofre de uma desordem tumoral ou retinal, compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo anti-VEGF ao mamífero.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

As Fig. 1a e 1B apresentam as sequências de aminoácidos do domínio pesado (SEQ ID NO:9) e domínio leve (SEQ ID NO:10) variáveis do muMAbVEGF A.4.6.1, domínio pesado (SEQ ID NO:7) e domínio leve (SEQ ID NO:8) variáveis de F(ab) humanizado (F(ab)-12) e esqueletos de consenso humanos (hum III para o subgrupo III pesado (SEQ ID NO:ll); humKl para o subgrupo I leve K (SEQ ID NO:12)). A Fig. IA alinha sequências de domínio pesado variável e a Fig. 1B alinha sequências de domínio leve variável. Os asteriscos indicam diferenças entre F(ab)-12 humanizado e o MAb murino ou entre F(ab)-12 e a região esqueleto. As Regiões Determinantes de Complementaridade (CDR) estão sublinhadas. A Fig. 2 é um diagrama de fitas do modelo de domínios VL e VH de F(ab)-12 humanizado. O domínio VL é apresentado a castanho com as CDR a bronzeado. A cadeia lateral do resíduo L46 é mostrada a amarelo. O domínio VH é apresentado a púrpura com as CDR a cor-de-rosa. As cadeias laterais de resíduos VH com a alteração de humano para murino estão mostradas a amarelo. A Fig. 3 apresenta a inibição da mitogénese induzida pelo VEGF por F(ab)-12 humanizado anti-VEGF do Exemplo 1. Células endoteliais capilares derivadas do córtex supra-renal bovino 6 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ foram semeadas com uma densidade de 6 x 103 células/poço em placas de seis poços, como descrito no Exemplo 1. Adicionou-se muMAb VEGF A.4.6.1 ou rhuMAb VEGF (IgGl; F(ab)-12) nas concentrações indicadas. Após 2-3 horas, adicionou-se rhVEGFl65 numa concentração final de 3 ng/ml. Após cinco ou seis dias, as células foram tratadas com tripsina e contadas. Os valores mostrados são as médias de determinações em duplicado. A variação relativamente à media não excedeu 10%. A Fig. 4 mostra a inibição do crescimento tumoral in vivo pelo F(ab)-12 humanizado anti-VEGF do Exemplo 1. Células de rabdomiossarcoma A673 foram injectadas em ratinhos nus BALB/c a uma densidade de 2 x 106 por ratinho. A partir de 24 horas após a inoculação das células tumorais, os animais foram injectados com um MAb de controlo, muMAb VEGF A4.6.1 ou rhuMAb VEGF (IgGl; F(ab)-12) duas vezes por semana, intraperitonealmente. A dose do MAb de controlo foi de 5 mg/kg; os MAb anti-VEGF foram dados a 0,5 ou 5 mg/kg, conforme indicado (n= 10). Quatro semanas após a injecção das células tumorais, os animais foram eutanizados e os tumores foram removidos e pesados. *: diferença significativa quando comparado com o grupo de controlo por ANOVA (p < 0,05).

As Fig. 5A e 5B mostram as sequências de aminoácidos dos domínios variáveis leve e pesado respectivamente do anticorpo murino A4.6.1 (SEQ ID NO:10 para a VL e SEQ ID NO:9 para a VH) e das variantes de A4.6.1 humanizado hu2.0 (SEQ ID NO:13 para a VL e SEQ ID NO: 14 para a VH) e hu2.10 (SEQ ID NO: 15 para a VL e SEQ ID NO: 16 para a VH) do Exemplo 2. A numeração das sequências é de acordo com Kabat et al.r Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) e as falhas de correspondência estão indicadas com asteriscos (A4.6.1 murino vs hu2.0) ou pontos (hu2.0 vs hu2.10). A variante hu2.0 contém apenas as sequências das CDR (negrito) do anticorpo murino enxertadas num esqueleto de consenso do subgrupo I de cadeias leves K humanas (SEQ ID NO: 12) e num esqueleto de consenso do subgrupo III de cadeias pesadas (SEQ ID NO:11). hu2.10 foi o clone de consenso humanizado obtido de experiências de selecção em fagos aqui descritas. 7 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ A Fig. 6 apresenta resíduos de esqueleto escolhidos para serem tornados aleatórios no Exemplo 2. A Fig. 7 apresenta a construção de fagemídeo para exibição em superfície de fusões Fab-pIII sobre fagos. O fagemídeo codifica uma versão humanizada do fragmento Fab para o anticorpo A4.6.1 fundido com uma porção da proteína de revestimento do gene III de M13. A proteína de fusão consiste no Fab unido pelo terminal carboxilo da cadeia pesada a um único resíduo glutamina (por supressão de um codão âmbar em E. colí supE), e depois a região C-terminal da proteína do gene III (resíduos 249-406). A transformação em E. coli F+, seguida por super-infecção com fago auxiliar M13K07, produz partículas fagemídicas em que uma pequena proporção destas apresenta uma única cópia da proteína de fusão.

As Fig. 8A-E apresentam a sequência nucleotídica (SEQ ID NO:99) para o vector do anticorpo de exibição em fagos, phMB4-19-1.6, no Exemplo 3, e as sequências de aminoácidos por elas codificadas (SEQ ID NO:130 e 100).

As Fig. 9A e 9B apresentam um alinhamento das sequências de aminoácidos para os domínios variáveis leve e pesado, respectivamente, de variantes anti-VEGF maduras em afinidade no Exemplo 3, em comparação com F(ab)-12 do Exemplo 1 (SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 7 para os domínios variáveis leve e pesado, respectivamente). As CDR estão sublinhadas e são designadas por L, cadeia leve, ou H, cadeia pesada, e pelos números 1-3. Os resíduos são numerados sequencialmente nos domínios VL e VH, em oposição ao esquema de numeração de Kabat. É mostrada a molécula molde, MB1.6 (SEQ ID NO: 101 e 102 para os domínios variáveis leve e pesado, respectivamente), juntamente com as variantes: H2305.6 (SEQ ID NO: 103 e 104 para os domínios variáveis leve e pesado, respectivamente), Y0101 (SEQ ID NO: 105 e 106 para os domínios variáveis leve e pesado, respectivamente), e Y0192 (SEQ ID NO: 107 e 108 para os domínios variáveis leve e pesado, respectivamente). As diferenças em relação ao F(ab)-12 estão apresentadas em caixas sombreadas.

As Fig. 10A e 10B apresentam um alinhamento das sequências de aminoácidos para os domínios variáveis leve e 8 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ pesado respectivamente de variantes anti-VEGF maduras em afinidade do Exemplo 3 em comparação com F(ab)-12 do Exemplo 1 (SEQ ID NO: 8 e 7 para os dominios variáveis leve e pesado, respectivamente). As CDR estão sublinhadas e são designadas por L, cadeia leve, ou H, cadeia pesada, e pelos números 1-3. As variantes são designadas Y0243-1 (SEQ ID NO: 109 e 110 para os dominios variáveis leve e pesado, respectivamente), Y0238-3 (SEQ ID NO: 111 e 112 para os dominios variáveis leve e pesado, respectivamente), Y0313-1 (SEQ ID NO:113 e 114 para os dominios variáveis leve e pesado, respectivamente) e Y0317 (SEQ ID NO:115 e 116 para os dominios variáveis leve e pesado, respectivamente). As diferenças relativamente ao F(ab)-12 estão apresentadas em caixas sombreadas. A Fig. 11 apresenta os resultados do ensaio de actividade de HuVEC no Exemplo 3 para as variantes Y0238-3, Y0192 e Y0313-1 bem como para o F(ab)-12 de comprimento completo do Exemplo 1. A Fig. 12 apresenta a inibição da mitogénese induzida por VEGF pelo F(ab)-12 de comprimento completo do Exemplo 1 (rhuMAb VEGF), um fragmento Fab de F(ab)-12 do Exemplo 1 (rhuFab VEGF), e um fragmento Fab da variante maduras em afinidade Y0317 do Exemplo 3 (rhuFab VEGF (maduras em afinidade)).

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS CONCRETIZAÇÕES PREFERIDAS I. Definições A expressão "VEGF humano", como aqui se utiliza, refere-se ao factor de crescimento de células endoteliais vasculares humano de 165 aminoácidos, e factores de crescimento de células endoteliais vasculares relacionados, de 121, 189 e 206 aminoácidos, como descrito por Leung et al., Science 246:1306 (1989), e Houck et al., Mol. Endocrin. 5:1806 (1991) juntamente com as formas alélicas de ocorrência natural e processadas destes factores de crescimento. A presente invenção proporciona anticorpos antagonistas anti-VEGF que são capazes de inibir uma ou mais das actividades biológicas de VEGF, por exemplo, a sua actividade 9 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ mitogénica ou angiogénica. Os antagonistas de VEGF actuam interferindo na ligação de VEGF a um receptor celular, incapacitando ou matando as células que foram activadas pelo VEGF, ou interferindo na activação de células endoteliais vasculares após ligação de VEGF a um receptor celular. Todos estes pontos de intervenção por um antagonista de VEGF deverão ser considerados equivalentes para os fins da presente invenção. A expressão "receptor de VEGF" ou o termo "VEGFr", como aqui se utilizam, referem-se a um receptor celular para VEGF, vulgarmente um receptor da superfície celular encontrado em células endoteliais vasculares, bem como suas variantes que retêm a capacidade de ligar hVEGF. Um exemplo de um receptor de VEGF é a tirosina-quinase do tipo fms (flt), um receptor transmembranar na familia das tirosina-quinases. DeVries et al., Science 255:989 (1992); Shibuya et al., Oncogene 5:519 (1990). O receptor flt compreende um domínio extracelular, um dominio transmembranar e um dominio intracelular com actividade de tirosina-quinase. O dominio extracelular está envolvido na ligação de VEGF, enquanto o dominio intracelular está envolvido na transdução de sinal. Outro exemplo de um receptor de VEGF é o receptor flk-1 (também referido como KDR). Matthews et ai., Proc. Nat. Acad. Sei. 88:9026 (1991); Terman et al., Oncogene 6:1677 (1991); Terman et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 187:1579 (1992). A ligação de VEGF ao receptor flt resulta na formação de pelo menos dois complexos de elevado peso molecular, possuindo um peso molecular aparente de 205 000 e 300 000 Dalton. O complexo de 300 000 Dalton crê-se ser um dimero compreendendo duas moléculas de receptor ligadas a uma única molécula de VEGF. A expressão "epítopo A4.6.1", quando aqui utilizada, a menos que indicado de outro modo, refere-se à região do VEGF humano à qual se liga o anticorpo A4.6.1 descrito em Kim et al., Growth Factors 7:53 (1992) e Kim et al. Nature 362:841 (1993) . "Tratamento" refere-se tanto ao tratamento terapêutico como a medidas profiláticas ou preventivas. Aqueles que necessitam de tratamento incluem os que já têm a desordem assim como aqueles em que a desordem deve ser prevenida. 10 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ "Mamífero", para fins de tratamento, refere-se a qualquer animal classificado como um mamífero, incluindo seres humanos, animais domésticos e de quinta, e animais de zoológico, desporto ou de estimação, tais como cães, cavalos, gatos, vacas, etc. Preferivelmente, o mamífero é um ser humano. "Anticorpos" (Ab) e "imunoglobulinas" (Ig) são glicoproteínas possuindo as mesmas características estruturais. Enquanto os anticorpos exibem especificidades de ligação para com um antigénio específico, as imunoglobulinas incluem tanto os anticorpos como outras moléculas semelhantes a anticorpos que não têm especificidades antigénica. Os polipéptidos deste ultimo tipo são, por exemplo, produzidos em baixos níveis pelo sistema linfático e em níveis aumentados por mielomas. "Anticorpos nativos" e "imunoglobulinas nativas" são usualmente glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de 150 000 daltons, compostas por duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Cada cadeia leve está ligada a uma cadeia pesada através de uma ligação dissulfureto covalente, embora o número de ligações dissulfureto varie entre as cadeias pesadas de diferentes isotipos de imunoglobulinas. Cada cadeia pesada e leve tem também, regularmente espaçadas, pontes de dissulfureto intracadeias. Cada cadeia pesada possui numa extremidade um domínio variável (vH) seguido por um número de domínios constantes. Cada cadeia leve possui um domínio variável numa extremidade (Vl) e um domínio constante na sua outra extremidade; o domínio constante da cadeia leve está alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada, e o domínio variável da cadeia leve está alinhado com o domínio variável da cadeia pesada. Crê-se que resíduos de aminoácido particulares formam uma interface entre os domínios variáveis de cadeia leve e pesada. O termo "variável" refere-se ao facto de certas porções dos domínios variáveis diferirem extensamente em sequência entre os anticorpos e serem utilizadas na ligação e especificidade de cada anticorpo particular para o seu antigénio particular. Contudo, a variabilidade não está homogeneamente distribuída por todos os domínios variáveis dos 11 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ anticorpos. Está concentrada em três segmentos denominados regiões hipervariáveis tanto no domínio variável de cadeia leve como no de cadeia pesada. As porções mais altamente conservadas dos domínios variáveis são denominadas a região de esqueleto (FR - "framework region")) . Os domínios variáveis das cadeias nativas pesadas e leves compreendem, cada um, quatro FR (FRl, FR2, FR3 e FR4, respectivamente), adoptando largamente uma configuração de folha β, ligadas por três regiões hipervariáveis, que formam ansas ligando, e em alguns casos fazendo parte, do esqueleto em folha β. As regiões hipervariáveis em cada cadeia são mantidas juntas em estreita proximidade pelas FR e, com as regiões hipervariáveis da outra cadeia, contribuem para a formação do local de ligação ao antigénio dos anticorpos (veja-se Kabat et al., Sequences of Proteínas of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991), páginas 647-669). Os domínios constantes não estão envolvidos directamente na ligação de um anticorpo a um antigénio, mas exibem várias funções efectoras, tais como a participação do anticorpo em toxicidades celular dependente de anticorpos. A expressão "região hipervariável", quando aqui utilizada, refere-se aos resíduos de aminoácido de um anticorpo que são responsáveis pela ligação ao antigénio. A região hipervariável compreende resíduos de aminoácido de uma "região determinante de complementaridade" ou "CDR" (i.e. os resíduos 24-34 (L1), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 31-35 (Hl), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) e/ou os resíduos de uma "ansa hipervariável" (i.e. resíduos 26-32 (Ll), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 26-32 (Hl), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Chothia e Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Os resíduos de "esqueleto" ou "FR" são os resíduos do domínio variável que não os resíduos das regiões hipervariáveis como aqui definidos. A digestão com papaína de anticorpos produz dois fragmentos idênticos de ligação ao antigénio, denominados fragmentos "Fab", cada um com um único local de ligação ao 12 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ antigénio, e um fragmento "Fc" residual, cujo nome reflecte a sua capacidade para cristalizar rapidamente. O tratamento com pepsina origina um fragmento F(ab')2 que possui dois locais de combinação com o antigénio e é ainda capaz de ligação cruzada ao antigénio. "Fv" é o fragmento de anticorpo mínimo que contém um local completo de reconhecimento e ligação do antigénio. Esta região consiste num dímero de um domínio variável de cadeia leve e um de cadeia pesada em associação não covalente forte. É nesta configuração que as três regiões hipervariáveis de cada domínio variável interactuam para definir um local de ligação ao antigénio na superfície do dímero VH-VL. Colectivamente, as seis regiões hipervariáveis conferem ao anticorpo especificidade de ligação ao antigénio. Contudo, mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv compreendendo apenas três regiões hipervariáveis específicas para um antigénio) tem a capacidade de reconhecer e ligar o antigénio, embora com uma menor afinidade do que o local de ligação completo. O fragmento Fab contém também o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CHI) da cadeia pesada. Os fragmentos Fab' diferem dos fragmentos Fab pela adição de alguns resíduos no terminal carboxilo do domínio CHI de cadeia pesada incluindo uma ou mais cisteínas da região charneira do anticorpo. Fab'-SH é a designação que aqui se utiliza para Fab' em que os(s) resíduo(s) cisteína dos domínios constantes possuem um grupo tiol livre. Os fragmentos de anticorpo F(ab')2 originalmente eram produzidos na forma de pares de fragmentos Fab' que possuem cisteínas de charneira entre si. São também conhecidos outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpos.

As "cadeias leves" de anticorpos (imunoglobulinas) de quaisquer espécies de vertebrados podem ser atribuídas a um de dois tipos claramente distintos, denominados capa (K) e lambda (λ), com base nas sequências de aminoácidos dos seus domínios constantes.

Dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constante das suas cadeias pesadas, as imunoglobulinas podem 13 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ ser atribuídas a diferentes classes. Existem cinco classes principais de imunoglobulinas: igA, igD, IgE, igG e igM, e várias destas podem ser adicionalmente divididas em subclasses (isotipos), e.g., igGl, igG2, igG3, lgG4, IgA e lgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são denominados a, δ, ε, γ e μ, respectivamente. As estruturas subunitárias e configurações tridimensionais de diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas. O termo "anticorpo" é aqui utilizado no seu sentido mais amplo e cobre especificamente anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais de comprimento completo), anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (e.g., anticorpos biespecíficos), e fragmentos de anticorpos desde que exibam a actividade biológica desejada. "Fragmentos de anticorpo" compreendem uma porção de um anticorpo de comprimento completo, geralmente o seu domínio variável ou de ligação ao antigénio. Os exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e Fv; diacorpos; anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia única; e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos. A expressão "anticorpo monoclonal", como aqui se utiliza, refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogéneos, í.e., os anticorpos individuais que constituem a população são idênticos excepto quanto a possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em menores quantidades. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único local antigénico. Adicionalmente, em contraste com as preparações convencionais de anticorpos (policlonais) que incluem tipicamente diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante no antigénio. O adjectivo "monoclonal" indica o carácter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população substancialmente homogénea de anticorpos, e não deve ser entendido como requerendo a produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a utilizar 14 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ de acordo com a presente invenção podem ser preparados pelo método do hibridoma descrito pela primeira vez por Kohler et al., Nature 256:495 (1975), ou podem ser preparados por métodos de adn recombinante (veja-se, e.g., Patente U.S. 4 816 567). Os "anticorpos monoclonais" podem também ser isolados a partir de bibliotecas de anticorpos em fagos utilizando as técnicas descritas em Clackson et ai., Nature 352:624-628 (1991) e Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), por exemplo.

Os anticorpos monoclonais incluem aqui especificamente anticorpos (imunoglobulinas) "quiméricos" em que uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencentes a uma classe ou subclasse particular de anticorpos, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo às sequências correspondentes em anticorpos derivados de outra espécie ou pertencente a outra classe ou subclasse de anticorpos, bem como fragmentos destes anticorpos, desde que exibam a actividade biológica desejada (Patente U.S. 4 816 567; e Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:6851-6855 (1984)).

As formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (e.g., murinos) são anticorpos quiméricos que contêm uma sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Na sua maior parte, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) em que resíduos da região hipervariável do receptor estão substituídos por resíduos da região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo dador) tal como de ratinho, rato, coelho ou um primata não humano, possuindo a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, resíduos da região de esqueleto (FR) da imunoglobulina humana estão substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Adicionalmente, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não se encontram no anticorpo receptor ou no anticorpo dador. Estas modificações são feitas para adicionalmente refinar o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as regiões hipervariáveis correspondem às de uma imunoglobulina 15 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ não humana e todas ou substancialmente todas as FR são as de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado opcionalmente também compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulina humana. Para mais detalhes, veja-se Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature 332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).

Os fragmentos de anticorpo "Fv de cadeia única" ou "sFv" compreendem os domínios VH e VL de anticorpo, em que estes domínios estão presentes numa única cadeia polipeptídica. Geralmente, o polipéptido Fv compreende ainda um ligante polipeptídico entre os domínios VH e VL que permite que o sFv forme a estrutura desejada para ligação ao antigénio. Para uma revisão de sFv veja-se Pluckthun em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994) . O termo "diacorpos" ("diabodies") refere-se a pequenos fragmentos de anticorpo com dois locais de ligação a antigénios, fragmentos estes que compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) ligado a um domínio variável de cadeia leve (VL) na mesma cadeia polipeptídica (VH - VL) . Utilizando um ligante que é demasiado curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a emparelhar com os domínios complementares de outra cadeia e criar dois locais de ligação a antigénios. São descritos diacorpos mais completamente em, por exemplo, EP 404 097; WO 93/11161; e Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:6444-6448 (1993). A expressão "anticorpos lineares", quando utilizada ao longo do presente pedido, refere-se aos anticorpos descritos em Zapata et al. Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995).

Resumidamente, estes anticorpos compreendem um par de segmentos Fd em tandem (vh-Ch1-Vh-Ch1) que formam um par de regiões de ligação a antigénios. Os anticorpos lineares podem ser biespecíficos ou monoespecíficos.

Um anticorpo anti-VEGF "variante", refere-se aqui a uma molécula que difere na sequência de aminoácidos de uma 16 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ sequência de aminoácidos de um anticorpo anti-VEGF "progenitor" em virtude de adição, deleção e/ou substituição de um ou mais resíduos de aminoácido na sequência do anticorpo progenitor. Conforme definido na reivindicação 1, a variante compreende uma ou mais substituições de aminoácidos numa ou mais regiões hipervariáveis do anticorpo progenitor. Por exemplo, a variante pode compreender pelo menos uma, e.g. de cerca de uma a cerca de dez, e preferivelmente de cerca de duas a cerca de cinco substituições, numa ou mais regiões hipervariáveis do anticorpo progenitor. A variante terá uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácidos com as sequências do domínio variável de cadeia pesada ou leve do anticorpo progenitor de SEQ ID NO: 7 ou 8), mais preferivelmente pelo menos 95%. A identidade ou homologia em relação a esta sequência define-se aqui como a percentagem de resíduos de aminoácido na sequência candidata que são idênticos aos resíduos do anticorpo progenitor, após alinhamento das sequências, e introdução de hiatos se necessário, para se conseguir a máxima percentagem de identidade de sequência. Nenhuma das extensões, deleções ou inserções N-terminais, C-terminais ou internas, na sequência do anticorpo deverão ser consideradas como afectando a identidade ou homologia das sequências. A variante retém a capacidade de ligar VEGF humano e possui uma mais forte afinidade de ligação do que o anticorpo progenitor. A variante pode ter uma capacidade melhorada para inibir a proliferação de células endoteliais induzida por VEGF e/ou uma capacidade aumentada para inibir a angiogénese induzida por VEGF in vivo. Para analisar estas propriedades, dever-se-á comparar uma forma Fab da variante com uma forma Fab do anticorpo progenitor ou uma forma de comprimento completo da variante com uma forma de comprimento completo do anticorpo progenitor, por exemplo, uma vez que se verificou que o formato do anticorpo anti-VEGF tem impacto sobre a sua actividade nos ensaios de actividade biológica aqui descritos. O anticorpo variante aqui com interesse particular é um que apresente pelo menos cerca de 10 vezes, preferivelmente pelo menos cerca de 20 vezes, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 50 vezes, de aumento de actividade biológica quando comparado com o anticorpo progenitor. 17 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ Ο anticorpo "progenitor" aqui compreende as sequências de aminoácidos do domínio variável da cadeia pesada e leve de SEQ ID NO: 7 e 8 e, preferivelmente, se presente, possui região(s) constante(s) de anticorpo humano.

Um anticorpo "isolado" é um anticorpo que foi identificado e separado e/ou recuperado a partir de um componente do seu ambiente natural. Os componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que interfeririam com as utilizações em diagnóstico ou terapêuticas do anticorpo, e podem incluir enzimas, hormonas, e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em concretizações preferidas, o anticorpo será purificado (1) até mais de 95% em peso de anticorpo, como determinada pelo método de Lowry, e mais preferivelmente mais de 99% em peso, (2) até um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos da sequência de aminoácidos N-terminal ou interna utilizando um sequenciador de taça rotativa, ou (3) até à homogeneidade através de SDS-PAGE sob condições redutoras ou não redutoras utilizando coloração com azul de Coomassie ou, preferivelmente, com prata. O anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ no interior de células recombinantes uma vez que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não estará presente. Vulgarmente, contudo, o anticorpo isolado será preparado através de pelo menos um passo de purificação. A expressão "marcado com epítopo", quando aqui utilizada, refere-se ao anticorpo anti-VEGF fundido com um "epítopo marcador". O polipéptido epítopo marcador possui resíduos suficientes para proporcionar um epítopo contra o qual pode ser criado um anticorpo, sendo ainda suficientemente curto para que não interfira com a actividade do anticorpo contra VEGF. O epítopo marcador preferivelmente é suficientemente único para que o anticorpo contra ele não reaja substancialmente de modo cruzado com outros epítopos. Os polipéptidos marcadores adequados possuem geralmente pelo menos 6 resíduos de aminoácido e usualmente entre cerca de 8-50 resíduos de aminoácido (preferivelmente entre cerca de 9-30 resíduos). Os exemplos incluem o polipéptido marcador flu HA e o seu anticorpo 12CA5 (Field et al. Mol. Cell. Biol. 8:2159-2165 (1988)); o marcador c-myc e os seus anticorpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 e 9E10 (Evan et al., Mol. Cell. Biol. 5(12):3610- 18 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ 3616 (1985)); e ο marcador glicoproteína D (gD) do vírus Herpes Simplex e o seu anticorpo (Paborsky et al., Protein Engíneeríng 3(6):547-553 (1990)). Em certas concretizações, o epítopo marcador é um "epítopo de ligação ao receptor selvagem". Como aqui se utiliza, a expressão "epítopo de ligação ao receptor selvagem" refere-se a um epítopo da região Fc de uma molécula de IgG (e.g., igGi, IgG2, IgG3 ou lgG4) que é responsável pelo aumento da semivida sérica in vivo da molécula de IgG. A expressão "agente citotóxico", como aqui se utiliza, refere-se a uma substância que inibe ou previne a função de células e/ou causa a destruição de células. A expressão pretende incluir isótopos radioactivos (e.g., I131, I125, Y90 e Re186), agentes quimioterapêuticos, e toxinas tais como toxinas enzimaticamente activas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, ou seus fragmentos.

Um "agente quimioterapêutico" é um composto químico útil no tratamento de cancro. Os exemplos de agentes quimioterapêuticos incluem Adriamicina, Doxorubicina, 5-Fluorouracilo, Citosina-arabinósido ("Ara-C"), Ciclofosfamida, Tiotepa, Taxotere (docetaxel), Busulfan, Citoxina, Taxol, Metotrexato, Cisplatina, Melfalan, Vinblastina, Bleomicina, Etoposido, Ifosfamida, Mitomicina C, Mitoxantrona, Vincristina, Vinorelbina, Carboplatina, Teniposido, Daunomicina, Carminomicina, Aminopterina, Dactinomicina, Mitomicinas, Esperamicinas (veja-se Pat. U.S. 4 675 187), Melfalan e outras mostardas de azoto relacionadas. O termo "profármaco", como utilizado no presente pedido, refere-se a uma forma precursora ou derivada de uma substância farmaceuticamente activa que é menos citotóxica para células tumorais em comparação com o fármaco progenitor e é capaz de ser enzimaticamente activada ou convertida na forma progenitora, mais activa. Veja-se, e.g., Wilman, "Prodrugs in Câncer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) e Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985). Os profármacos da presente invenção incluem, mas não se limitam a, profármacos contendo fosfato, 19 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ profármacos contendo tiofosfato, profármacos contendo sulfato, profármacos contendo péptidos, profármacos modificados por D-aminoácidos, profármacos glicosilados, profármacos contendo β-lactama, profármacos contendo fenoxiacetamida opcionalmente substituída ou profármacos contendo fenilacetamida opcionalmente substituída, 5-fluorocitosina e outros profármacos de 5-fluorouridina, que podem ser convertidos no fármaco citotóxico livre, mais activo. Os exemplos de fármacos citotóxicos que podem ser derivatizados numa forma de profármaco para utilização na presente invenção incluem, mas não lhes estão limitados, os agentes quimioterapêuticos acima descritos . A palavra "marcador", quando aqui utilizada, refere-se a um composto ou composição detectável que é conjugado directamente ou indirectamente com o anticorpo. O marcador pode, ele próprio, ser detectável por si só (e.g., marcadores radioisótopos ou marcadores fluorescentes) ou, no caso de um marcador enzimático, podem catalisar uma alteração química de um composto ou composição substrato que é detectável. "Fase sólida" significa uma matriz não aquosa à qual o anticorpo da presente invenção pode aderir. Os exemplos de fases sólidas aqui abrangidas incluem as que são formadas parcial ou totalmente de vidro (e.g. vidro de poros controlados), polissacáridos (e.g., agarose), poliacrilamidas, poliestireno, poli(ácido vinilico) e silicones. Em certas concretizações, dependendo do contexto, a fase sólida pode compreender o poço de uma placa de ensaio; em outras, é uma coluna de purificação (e.g. uma coluna de cromatografia de afinidade). Esta expressão inclui também uma fase sólida descontínua de partículas discretas, tal como descrito na Patente U.S. 4 275 149.

Um "lipossoma" é uma pequena vesícula composta por vários tipos de lípidos, fosfolípidos e/ou tensioactivos, que é útil para a entrega de um fármaco (tal como os anticorpos anti-VEGF aqui descritos e, opcionalmente, um agente quimioterapêutico) a um mamífero. Os componentes do lipossoma estão normalmente dispostos numa formação em bicamada, similar ao arranjo lipídico de membranas biológicas. Uma molécula de ácido nucleico "isolada" é uma molécula de ácido nucleico que é 20 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ identificada e separada de pelo menos uma molécula de ácido nucleico contaminante com a qual está normalmente associada na fonte natural do ácido nucleico do anticorpo. Uma molécula de ácido nucleico isolada é outra que não na forma ou disposição em que se encontra na natureza. As moléculas de ácido nucleico isoladas distinguem-se portanto da molécula de ácido nucleico conforme existe nas células naturais. Contudo, uma molécula de ácido nucleico isolada inclui uma molécula de ácido nucleico contida em células que vulgarmente expressam o anticorpo onde, por exemplo, a molécula de ácido nucleico está numa localização cromossómica diferente da de células naturais. A expressão "sequências de controlo" refere-se a sequências de ADN necessárias para a expressão de uma sequência de codificação ligada operativamente num organismo hospedeiro particular. As sequências de controlo que são adequadas para procariotas, por exemplo, incluem um promotor, opcionalmente uma sequência operadora, e um local de ligação ao ribossoma. Sabe-se que as células eucariotas utilizam promotores, sinais de poliadenilação e potenciadores. O ácido nucleico está "ligado operativamente" quando está colocado numa relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, o ADN para uma pré-sequência ou comando de secreção está ligado operativamente a ADN para um polipéptido se for expresso na forma de uma pré-proteina que participa na secreção do polipéptido; um promotor ou potenciador está ligado operativamente a uma sequência de codificação se afecta a transcrição da sequência; ou um local de ligação ao ribossoma está ligado operativamente a uma sequência de codificação se está posicionado de modo a facilitar a tradução. Geralmente, "ligado operativamente" significa que as sequências de ADN ligadas são contíguas, e, no caso de um comando de secreção, contíguas e em fase de leitura. Contudo, os potenciadores não têm que ser contíguos. A ligação é conseguida por ligação em locais de restrição convenientes. Se estes locais não existirem, são utilizados adaptadores ou ligantes oligonucleotídicos sintéticos de acordo com a prática convencional.

Como aqui se utilizam, os termos e expressões "célula", "linha celular", "linha de células", "cultura de células" e 21 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ "cultura celular", são utilizados indiferentemente e todas estas designações incluem progénie. Assim, as palavras "transformantes" e "células transformadas" incluem as células primárias em questão e culturas delas derivadas independentemente do número de transferências. Entende-se também que toda a progénie pode não ser exactamente idêntica em teor de ADN, devido a mutações deliberadas ou inadvertidas. Está incluida a progénie mutante que possui a mesma função ou actividade biológica tal como rastreado na células originalmente transformada. Quando se pretenderem dar designações distintas, isso será claro a partir do contexto. II. Modos de Realização da invenção

Os exemplos que se seguem descrevem a produção de anticorpos anti-VEGF humanizados variantes com propriedades desejáveis de uma perspectiva terapêutica incluindo: (a) forte afinidade de ligação para com o antigénio VEGF; (b) uma capacidade para inibir a proliferação de células endoteliais induzida por VEGF in vitro; e (c) a capacidade para inibir a angiogénese induzida por VEGF in vivo.

As afinidades dos anticorpos podem ser determinadas como descrito nos exemplos que se seguem. Os anticorpos humanizados variantes preferidos são aqueles que se ligam a VEGF humano com um valor de Kd não superior a cerca de 1 x 1CT7 M; preferivelmente não superior a cerca de 1 x 1CT8 M; e mais preferivelmente não superior a cerca de 5 x 1CT9 M.

Para além de anticorpos com forte afinidade de ligação para com o VEGF humano, é também desejável seleccionar anticorpos humanizados variantes que possuam outras propriedades benéficas de uma perspectiva terapêutica. Por exemplo, o anticorpo pode ser um anticorpo que inibe o crescimento de células endoteliais em resposta ao VEGF. Numa concretização, o anticorpo pode ser capaz de inibir a proliferação de células endoteliais capilares bovinas em resposta a uma concentração próxima do máximo de eficácia de VEGF (3 ng/ml). Preferivelmente, o anticorpo possui um valor de dose eficaz 50 (ED50) não superior a cerca de 5 nM, preferivelmente não superior a cerca de 1 nM, e mais preferivelmente não superior a cerca de 0,5 nM, para a 22 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ inibição da proliferação de células endoteliais induzida por VEGF neste "ensaio de crescimento de células endoteliais", í.e., nestas concentrações o anticorpo é capaz de inibir o crescimento induzido por VEGF de células endoteliais in vitro em 50%. Um "ensaio de crescimento de células endoteliais" preferido envolve a cultura de células endoteliais capilares derivadas do córtex supra-renal bovino, na presença de meio de Eagle modificado por Dulbecco de baixo teor de glucose (DMEM) (GIBCO) suplementado com 10% de soro de vitelo, glutamina 2 mM e antibióticos (meio de crescimento), essencialmente como descrito no Exemplo 1 adiante. Estas células endoteliais são semeadas a uma densidade de 6 x 103 células por poço, em placas de 6 poços em meio de crescimento. O anticorpo anti-VEGF progenitor (controlo), ou o anticorpo anti-VEGF humanizado ou variante, é então adicionado em concentrações que variam entre 1 e 5000 ng/ml. Após 2-3 h, adicionou-se o VEGF purificado até uma concentração final de 3 ng/ml. Para o controlo da especificidade, cada anticorpo pode ser adicionado a células endoteliais na concentração de 5000 ng/ml, sozinho ou na presença de 2 ng/ml de bFGF. Após cinco ou seis dias, as células são dissociadas por exposição a tripsina e contadas num contador Coulter (Coulter Electronics, Hialeah, FL) . Os resultados podem ser analisados através de um programa de ajuste de curves de quatro parâmetros (KaleidaGraph). O anticorpo anti-VEGF humanizado variante preferido pode também ser um anticorpo que possui actividade de supressão tumoral in vivo. Por exemplo, o anticorpo pode suprimir o crescimento de células humanas de rabdomiossarcoma A673 ou células de carcinoma da mama MDA-MB-435, em ratinhos nus. Para estudos de tumores in vivo, células humanas de rabdomiossarcoma A673 (ATCC; CRL 1598) ou células MDA-MB-435 (disponíveis na ATCC) são cultivadas em DMEM/F12 suplementado com 10% de soro fetal bovino, glutamina 2 mM e antibióticos como descrito no Exemplo 1 adiante. Ratinhos nus fêmea BALB/c, de 6-10 semanas de idade, são injectados subcutaneamente com 2 x 106 células tumorais na área dorsal num volume de 200 μΐ. Os animais são então tratados com o anticorpo humanizado ou variante e um anticorpo de controlo sem actividade neste ensaio. O MAb anti-VEGF humanizado ou variante é administrado numa dose de 0,5 e/ou 5 mg/kg. Cada MAb é administrado duas vezes por semana intraperitonealmente num volume de 100 μΐ, 23 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ começando 24 h após a inoculação das células tumorais. A dimensão do tumor é determinada a intervalos semanais. Quatro semanas após a inoculação das células tumorais, os animais são eutanizados e os tumores são removidos e pesados. A análise estatística pode ser realizada por ANOVA. Preferivelmente, o anticorpo neste "ensaio tumoral in vivo" inibe cerca de 50-100%, preferivelmente cerca de 70-100% e mais preferivelmente cerca de 80-100% do crescimento das células tumorais humanas A673 numa dose de 5 mg/kg.

Na concretização preferida, o anticorpo humanizado variante não consegue eliciar uma resposta imunogénica por administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo a um paciente humano. Se for eliciada uma resposta imunogénica, preferivelmente a resposta será tal que o anticorpo ainda proporcione um benefício terapêutico ao paciente com ele tratado. O anticorpo humanizado variante é também preferivelmente um anticorpo que é capaz de inibir a angiogénese induzida por VEGF num ser humano, e.g. de inibir o crescimento de tumores humanos e/ou inibir a angiogénese intra-ocular em desordens retinais.

Os anticorpos preferidos ligam-se ao "epítopo A4.6.1" como aqui definido. Para o rastreio de anticorpos que se ligam ao epítopo no vegf humano ligado por um anticorpo de interesse (e.g., aqueles que bloqueiam a ligação do anticorpo A4.6.1 a um VEGF humano), pode ser realizado um ensaio de bloqueio cruzado de rotina tal como descrito em Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow e David Lane (1988). Alternativamente, pode-se realizar o mapeamento do epítopo, e.g. como descrito em Champe et al., J. Biol. Chem. 270:1388-1394 (1995), para determinar se o anticorpo se liga a um epítopo de interesse.

Os anticorpos da concretização aqui preferida possuem um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pela fórmula: FR1-CDRH1-FR2-CDRH2-FR3-CDRH3-FR4, em que "FRl-4" representam as quatro regiões de esqueleto e "CDRHl-3" representam as três regiões hipervariáveis de um domínio variável pesado de um anticorpo 24 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ anti-VEGF. FR1-4 podem ser derivadas de uma "sequência de consenso" (i.e. os aminoácidos mais comuns de uma classe, subclasse ou subgrupo de cadeias pesadas ou leves de imunoglobulinas humanas) como nos exemplos adiante, ou podem ser derivadas de uma região de esqueleto de um anticorpo humano individual ou de uma combinação de diferentes sequências de regiões de esqueleto diferentes. Muitas sequências de regiões de esqueleto de anticorpos humanos estão compiladas em Kabat et al., supra, por exemplo. Numa concretização preferida, a FR variável pesada é proporcionada por uma sequência de consenso de um subgrupo de imunoglobulinas humanas conforme compilado por Kabat et ai., supra. Preferivelmente, o subgrupo de imunoglobulinas humanas é o subgrupo III de cadeias pesadas humanas (e.g. como em SEQ ID NO:11). A sequência de FR variável pesada humana preferivelmente possui substituições, e.g. em que o resíduo de FR humana é substituído por um resíduo não humano correspondente ("resíduo não humano correspondente" significa o resíduo não humano com a mesma numeração posicionai de Kabat que o resíduo humano de interesse quando as sequências humana e não humana são alinhadas), mas a substituição pelo resíduo não humano não é necessária. Por exemplo, um resíduo de substituição de FR outro que não o resíduo não humano correspondente pode ser seleccionado por exibição em fagos (veja-se o Exemplo 2 adiante). Os resíduos de FR variável pesada exemplificativos, que podem ser substituídos, incluem qualquer um ou mais dos números de resíduos de FR: 37H, 49H, 67H, 69H, 71H, 73H, 75H, 76H, 78η, 94H (empregue aqui a numeração de resíduos de Kabat). Preferivelmente pelo menos dois, ou pelo menos três, ou pelo menos quatro destes resíduos são substituídos. Uma combinação particularmente preferida de substituições de FR é: 49H, 69H, 71H, 73H, 76H, 78H e 94H.

Em relação às regiões hipervariáveis de cadeia pesada, estas possuem preferivelmente sequências de aminoácidos como se seguem: CDRHl GYXiX2X3X4YGX5N (SEQ ID NO:117), em que Xi é D, T ou E, mas preferivelmente é D ou T; X2 é F, W ou Y, mas preferivelmente 25 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ é F; Χ3 é Τ, Q, G ou S, mas preferivelmente é T; X4 é H ou N; e X5 é M ou I, mas preferivelmente é M. CDRH2 WINTXiTGEPTYAADFKR (SEQ ID NO: 118), em que Xi é Y ou W, mas preferivelmente é Y. CDRH3 YPX1YX2X3X4X5HWYFDV (SEQ ID NO:119), em que Xi é H ou Y; X2 é Y, R, K, I, T, E ou W, mas preferivelmente é Y; X3 é G, N, A, D, Q, E, T, K ou S, mas preferivelmente é G; X4 é S, T, K, Q, N, R, A, E ou G, mas preferivelmente é S ou T; e X5 é S ou G, mas preferivelmente é S. O dominio variável de cadeia pesada opcionalmente compreende o que foi aqui designado "CDR7" no interior de (í.e. fazendo parte de) FR3 (veja-se as Fig. 9B e 10B), em que CDR7 pode ter a sequência de aminoácidos seguinte: CDR7 X1SX2DX3X4X5X6TX7 (SEQ ID NO: 120), em que Xi é F, I, V, L ou A, mas preferivelmente é F; X2 é A, L, V ou I, mas preferivelmente é L; X3 é Τ, V ou K, mas preferivelmente é T; X4 é S ou W, mas preferivelmente é S; X5 é S; ou K, mas preferivelmente é K; X6 é N, ou S, mas preferivelmente é S; e X7 é V, A, L ou I, mas preferivelmente é A.

Os anticorpos da concretização aqui preferida possuem um dominio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pela fórmula: FR1-CDRL1-FR2-CDRL2-FR3-CDRL3-FR4, em que "FRl-4" representam as quatro regiões de esqueleto e "CDRLl-3" representam as três regiões hipervariáveis de um dominio leve variável de um anticorpo anti-VEGF. FRl-4 podem ser derivados de uma "sequência de consenso" (i.e. os aminoácidos mais comuns de uma classe, subclasse ou subgrupo de cadeias pesadas ou leves de imunoglobulinas humanas) como nos exemplos adiante, ou podem ser derivados de uma região de esqueleto de um anticorpo humano individual ou de uma combinação de sequências de regiões de esqueleto diferentes. Numa concretização preferida, a FR variável leve é proporcionada por uma sequência de consenso de um subgrupo de imunoglobulinas humanas como 26 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ compilado por Kabat et al., supra. Preferivelmente, o subgrupo de imunoglobulinas humanas é o subgrupo I de cadeias leves capa humanas (e.g. como em SEQ ID NO:12). A sequência de FR variável leve humana preferivelmente possui substituições, e.g. em que o resíduo de FR humana é substituído por um resíduo correspondente de ratinho, mas a substituição por um resíduo não humano não é necessária. Por exemplo, um resíduo de substituição outro que não o resíduo não humano correspondente pode ser seleccionado por exibição em fagos (veja-se o Exemplo 2 adiante) . Os resíduos de FR variáveis leves exemplificativos que podem ser substituídos incluem qualquer um ou mais dos resíduos de FR números: 4L, 46l e 71L (emprega-se aqui a numeração de resíduos de Kabat). Preferivelmente, apenas é substituído o 46L. Noutra concretização, são substituídos tanto 4L como 46L.

Em relação às CDR, estas preferivelmente possuem sequências de aminoácidos como se segue: CDRLl X1AX2X3X4X5SNYLN (SEQ ID NO :121), em que Xx é R ou S, mas preferivelmente é S; X2 é S ou N, mas preferivelmente é S; X3 é Q ou E, mas preferivelmente é Q; X4 é Q ou D, mas preferivelmente é D; e X5 é I ou L, mas preferivelmente é I. CDRL2 FTSSLHS (SEQ ID NO:122). CDRL3 QQYSXiX2PWT (SEQ ID NO :123), em que Xx é T, A ou N, mas preferivelmente é T; e X2 é V ou T, mas preferivelmente é V.

Os anticorpos anti-VEGF variantes são variantes de F(ab)-12 no Exemplo 1, tais como formas maduras em afinidade incluindo as variantes Y0317, Y0313-1 e Y0238-3 no Exemplo 3, sendo Y0317 a variante preferida. Métodos para qerar anticorpos anti-VEGF humanizados de interesse são aqui elaborados com mais detalhes adiante. 27 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ A. Preparação de Anticorpos Métodos para a humanização de anticorpos não humanos contra vegf e para gerar variantes de anticorpos anti-VEGF são descritos nos exemplos adiante. De modo a humanizar um anticorpo anti-VEGF, é preparado o material de partida de anticorpo não humano. Quando se pretende gerar uma variante, prepara-se o anticorpo progenitor. Exemplos de técnicas para gerar este material de partida de anticorpo não humano e anticorpos progenitores serão descritos nas secções seguintes. (i) Preparação de antigénios O antigénio VEGF a utilizar para a produção de anticorpos pode ser, e.g., VEGF intacto ou um fragmento de VEGF (e.g. um fragmento de VEGF compreendendo o "epitopo A4.6.1"). Outras formas de VEGF úteis para gerar anticorpos serão evidentes para os peritos na especialidade. O antigénio VEGF utilizado para gerar o anticorpo, é preferivelmente VEGF humano, e.g. como descrito em Leung et al., Science 246:1306 (1989), e Houck et al., Mol. Endocrin. 5:1806 (1991). (ii) Anticorpos policlonais

Os anticorpos policlonais são preferivelmente criados em animais através de múltiplas injecções subcutâneas (sc) ou intraperitoneais (ip) do antigénio relevante e um adjuvante. Pode ser útil conjugar o antigénio relevante com uma proteína que seja imunogénica na espécie a imunizar, e.g., hemocianina de lapa Fissurella, albumina sérica, tiroglobulina bovina, ou inibidor de tripsina de soja utilizando um agente bifuncional ou de derivatização, por exemplo, éster maleimidobenzoílo de sulfossuccinimida (conjugação através de resíduos cisteína), N-hidroxissuccinimida (através de resíduos lisina), glutaraldeído, anidrido succínico, S0C12, ou R1N=C=NR, onde R e R1 são diferentes grupos alquilo.

Os animais são imunizados contra o antigénio, conjugados imunogénicos, ou derivados, através da combinação de, e.g., 100 μρ ou 5 μρ da proteína ou conjugado (para coelhos ou ratinhos, respectivamente) com 3 volumes de adjuvante completo de Freund, e injecção da solução intradermicamente em 28 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ múltiplos locais. Um mês mais tarde os animais recebem um reforço com 1/5 a 1/10 da quantidade original de péptido ou conjugado em adjuvante completo de Freund por injecção subcutânea em múltiplos locais. Sete a 14 dias mais tarde os animais são sangrados e o soro é ensaiado quanto ao titulo de anticorpos. Os animais recebem reforços até se atingirem patamares de titulo. Preferivelmente, o animal recebe o reforço com o conjugado do mesmo antigénio, mas conjugado com uma proteína diferente e/ou através de um diferente reagente de reacção cruzada. Os conjugados também podem ser preparados em cultura de células recombinantes na forma de fusões de proteínas. Também, agentes de agregação tais como alúmen são adequadamente utilizados para aumentar a resposta imunitária. (iii) Anticorpos monoclonais

Os anticorpos monoclonais podem ser preparados utilizando o método do hibridoma, descrito pela primeira vez por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), ou podem ser preparados por métodos de ADN recombinante (Patente U.S. 4 816 567).

No método do hibridoma, um ratinho ou outro animal hospedeiro apropriado, tal como um hamster ou um macaco Macaque, é imunizado como descrito atrás para eliciar linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que se ligarão especificamente à proteína utilizada para a imunização. Alternativamente, os linfócitos podem ser imunizados ín vitro. Os linfócitos são então fundidos com células de mieloma utilizando um agente de fusão adequado, tal como polietilenoglicol, para formar uma célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)).

As células de hibridoma assim preparadas são semeadas e crescidas num meio de cultura adequado que preferivelmente contém uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou a sobrevivência das células de mieloma progenitoras não fundidas. Por exemplo, se as células de mieloma progenitoras não têm a enzima hipoxantina-guanina-fosforibosil-transferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura para os hibridomas incluirá tipicamente hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT), 29 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ substâncias estas que evitam o crescimento de células deficientes em HGPRT.

As células de mieloma preferidas são aquelas que se fundem eficientemente, suportam a produção estável em nível elevado de anticorpo pelas células produtoras do anticorpo seleccionadas, e são sensíveis a um meio como o meio HAT. Entre estas, as linhas de células de mieloma preferidas são linhas de mieloma de murino, tais como as derivadas de tumores de ratinho MOP-21 e M.C.-ll disponíveis no Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Califórnia EUA, e as células SP-2 ou x63-Ag8-653 disponíveis em American Type Culture Collection, Rockville, Maryland EUA. Linhas de células de mieloma humano e heteromieloma ratinho-humano também foram descritas para a produção de anticorpos monoclonais humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al.,

Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Mareei Dekker, Inc., New York, 1987)). O meio de cultura em que as células de hibridoma crescem é ensaiado para a produção de anticorpos monoclonais dirigidos contra o antigénio. Preferivelmente, a especificidade de ligação dos anticorpos monoclonais produzidos por células de hibridoma é determinada por imunoprecipitação ou por um ensaio de ligação in vitro, tal como um radioimunoensaio (RIA) ou um ensaio imunoabsorvente com enzimas ligadas (ELISA). A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode, por exemplo, ser determinada pela análise Scatchard de Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980).

Depois de serem identificadas as células de hibridoma que produzem anticorpos com a especificidade, afinidade e/ou actividade desejadas, os clones podem ser subclonados através de procedimentos de diluição limitante e crescidos através de métodos Standard (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Os meios de cultura adequados para este fim incluem, por exemplo, meio D-MEM ou RPMI-1640. Em adição, as células de hibridoma podem ser crescidas in vivo na forma de tumores ascíticos num animal. 30 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ

Os anticorpos monoclonais segregados pelos subclones são adequadamente separados do meio de cultura, do fluido ascitico ou do soro, através de procedimentos convencionais de purificação de imunoglobulinas tais como, por exemplo, cromatografia em proteína A-Sepharose, hidroxilapatite, electroforese em gel, diálise ou cromatografia de afinidade. O ADN que codifica os anticorpos monoclonais é prontamente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais (e.g., utilizando sondas oligonucleotídicas que são capazes de se ligar especificamente a genes que codificam as cadeias pesada e leve dos anticorpos monoclonais). As células de hibridoma servem como uma fonte preferida deste ADN. Uma vez isolado, o ADN pode ser colocado em vectores de expressão, que são depois transfectados para células hospedeiras tais como células E. coli, células COS de símio, células de ovário de hamster chinês (CHO) ou células de mieloma, que não produzem de outro modo a proteína imunoglobulina, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. A produção recombinante de anticorpos será descrita com mais detalhes adiante. (iv) Humanização e variantes de sequência de aminoácidos

Os exemplos 1-2 adiante descrevem procedimentos para a humanização de um anticorpo anti-VEGF. Em certas concretizações, pode ser desejável gerar variantes de sequência de aminoácidos destes anticorpos humanizados, particularmente quando estas melhoram a afinidade de ligação ou outras propriedades biológicas do anticorpo humanizado. O Exemplo 3 descreve metodologias para gerar variantes de sequência de aminoácidos de um anticorpo anti-VEGF com afinidade melhorada relativamente ao anticorpo progenitor.

As variantes de sequência de aminoácidos do anticorpo anti-VEGF são preparadas introduzindo alterações de nucleótidos apropriadas no ADN do anticorpo anti-VEGF, ou por síntese peptídica. Estas variantes incluem, por exemplo, deleções e/ou inserções e/ou substituições de resíduos nas sequências de aminoácidos dos anticorpos anti-VEGF do presentes exemplos. É feita qualquer combinação de deleção, inserção e substituição para chegar à construção final, desde 31 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ que a construção final possua as características desejadas. As alterações de aminoácidos também podem alterar processos pós-tradução do anticorpo anti-VEGF humanizado ou variante, tal como alteração do número ou posição de locais de glicosilação.

Um método útil para a identificação de certos resíduos ou regiões do anticorpo anti-VEGF que são localizações preferidas para mutagénese é denominado "mutagénese por varrimento de alanina" (alanine scanning), como descrito por Cunningham e Wells, Science, 244:1081-1085 (1989). Aqui, é identificado um residuo ou grupo de resíduos alvo (e.g., resíduos carregados tais como arg, asp, his, lys e glu) e substituiu-se por um aminoácido neutro ou carregado negativamente (mais preferivelmente alanina ou polialanina) para afectar a interacção dos aminoácidos com o antigénio VEGF. As localizações de aminoácidos que demonstram sensibilidade funcional às substituições são então refinadas através da introdução de mais variantes ou outras variantes nos, ou para os, locais de substituição. Assim, embora o local para a introdução de uma variação de sequência de aminoácidos seja predeterminado, a natureza da mutação per se não precisa de ser predeterminada. Por exemplo, para analisar o desempenho de uma mutação num dado local, é conduzida mutagénese por varrimento de ala ou aleatória no codão ou região alvo e as variantes do anticorpo anti-VEGF expressas são rastreadas quanto à actividade desejada. A mutagénese por varrimento de alanina é descrita no Exemplo 3.

As inserções na sequência de aminoácidos incluem fusões amino- e/ou carboxilo-terminais variando em comprimento desde um resíduo até polipéptidos contendo uma centena ou mais de resíduos, bem como inserções intra-sequência de resíduos de aminoácido únicos ou múltiplos. Os exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo anti-VEGF com um resíduo metionilo N-terminal ou o anticorpo fundido com um epítopo marcador. Outras variantes de inserção da molécula de anticorpo anti-VEGF incluem a fusão com o terminal N ou C do anticorpo anti-VEGF de uma enzima ou um polipéptido que aumente a semivida sérica do anticorpo (veja-se adiante) . 32 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ

Outro tipo de variante é uma variante de substituição de aminoácidos. Estas variantes têm removido pelo menos um residuo de aminoácido na molécula de anticorpo anti-VEGF e um residuo diferente inserido no seu lugar. Os locais de maior interesse para a mutagénese de substituição incluem as regiões hipervariáveis, mas estão também contempladas alterações em FR. Mostram-se na Tabela 1 substituições conservativas na coluna intitulada "substituições preferidas". Se estas substituições resultam numa alteração na actividade biológica, então podem ser introduzidas alterações mais substanciais, denominadas "substituições exemplificativas" na Tabela 1, ou como adicionalmente se descreve adiante por referência às classes de aminoácidos, e os produtos são rastreados.

Tabela 1

Resíduo Original Substituições Exemplificat ivas Substituições Preferidas Ala (A) vai; leu; ile vai Arg (R) lys; gin; asn lys Asn (N) gin; his; asp, lys; arg gin Asp (D) glu; asn glu Cys (C) ser; ala ser Gin (Q) asn; glu asn Glu (E) asp; gin asp Gly (G) ala ala His (H) asn; gin; lys; arg arg He (I) leu; vai; met; ala; phe; norleucina leu Leu (L) norleucina; ile; vai; met; ala; phe ile Lys (K) arg; gin; asn arg Met (M) leu; phe; ile leu Phe (F) leu; vai; ile; ala; tyr tyr Pro (P) ala ala Ser (S) thr thr Thr (T) ser ser Trp (W) tyr; phe tyr Tyr (Y) trp; phe; thr; ser phe Vai (V) ile; leu; met; phe; ala; norleucina leu 33 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ São conseguidas modificações substanciais nas propriedades biológicas do anticorpo através da selecção de substituições que diferem significativamente no seu efeito sobre a manutenção (a) da estrutura do esqueleto polipeptidico na área da substituição, por exemplo, na forma de uma conformação em folha ou helicoidal, (b) da carga ou hidrofobicidade da molécula no local alvo, ou (c) do volume da cadeia lateral. Os residuos de ocorrência natural dividem-se em grupos com base em propriedades comuns da cadeia lateral: (1) hidrófobos: norleucina, met, ala, vai, leu, ile; (2) hidrófilos neutros: cys, ser, thr; (3) ácidos: asp, glu; (4) básicos: asn, gin, his, lys, arg; (5) residuos que influenciam a orientação da cadeia: gly, pro; e (6) aromáticos: trp, tyr, phe.

As substituições não conservativas implicarão a troca de um membro de uma destas classes por outra classe.

Qualquer resíduo cisteína não envolvido na manutenção da correcta conformação do anticorpo anti-VEGF humanizado ou variante também pode ser substituído, geralmente por serina, para melhorar a estabilidade oxidativa da molécula e prevenir ligação cruzada aberrante. Inversamente, podem ser adicionadas ao anticorpo ligações de cisteína para melhorar a sua estabilidade (particularmente quando o anticorpo é um fragmento de anticorpo tal como um fragmento Fv).

Um tipo particularmente preferido de variante de substituição envolve a substituição de um ou mais resíduos da região hipervariável de um anticorpo progenitor (e.g. um anticorpo humanizado ou humano). Geralmente, a(s) variante(s) resultante(s) seleccionada(s) para posterior desenvolvimento terão propriedades biológicas melhoradas relativamente ao anticorpo progenitor a partir do qual é(são) gerada(s). Uma maneira conveniente de gerar estas variantes de substituição consiste na maturação da afinidade utilizando exibição em fagos (veja-se o Exemplo 3) . Resumidamente, vários locais da região hipervariável (e.g. 6-7 locais) são mutados para gerar todas as possíveis substituições de aminoácidos em cada local. 34 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ

As variantes de anticorpo assim geradas são exibidas de uma maneira monovalente a partir de partículas de fagos filamentosos na forma de fusões com o produto do gene III de Ml3 empacotado em cada partícula. As variantes exibidas nos fagos são então rastreadas quanto à sua actividade biológica (e.g. afinidade de ligação) conforme aqui descrito. De modo a identificar locais da região hipervariável candidatos para modificação, pode-se realizar a mutagénese por varrimento de alanina (veja-se o Exemplo 3) para identificar resíduos da região hipervariável que contribuem significativamente para a ligação ao antigénio. Alternativamente, ou em adição, pode ser benéfico analisar uma estrutura cristalina do complexo antigénio-anticorpo para identificar pontos de contacto entre o anticorpo e o VEGF humano. Estes resíduos de contacto e resíduos vizinhos são candidatos para substituição de acordo com as técnicas aqui elaboradas. Uma vez geradas estas variantes, o painel de variantes é submetido a rastreio como aqui descrito e os anticorpos com superiores propriedades num ou mais ensaios relevantes podem ser seleccionados para posterior desenvolvimento.

Outro tipo de variante de aminoácidos do anticorpo altera o padrão de glicosilação original do anticorpo. Alterar significa eliminar uma ou mais porções hidrato de carbono encontradas no anticorpo, e/ou adicionar um ou mais locais de glicosilação que não estão presentes no anticorpo. A glicosilação de anticorpos é tipicamente ligada a N ou ligada a 0. Ligada a N refere-se à ligação da porção hidrato de carbono à cadeia lateral de um resíduo asparagina. As sequências tripeptídicas asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido excepto prolina, são as sequências de reconhecimento para ligação enzimática da porção hidrato de carbono à cadeia lateral de asparagina. Assim, a presença de uma destas sequências tripeptídicas num polipéptido cria um potencial local de glicosilação. A glicosilação ligada a 0 refere-se à ligação de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose ou xilose a um hidroxiaminoácido, mais vulgarmente serina ou treonina, embora também se possam utilizar 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina. 35 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ A adição de locais de glicosilação ao anticorpo é convenientemente conseguida alterando a sequência de aminoácidos de modo a que esta contenha uma ou mais das sequências tripeptidicas atrás descritas (para locais de glicosilação ligada a N) . A alteração pode também ser realizada através da adição ou substituição de um ou mais resíduos serina ou treonina, na sequência do anticorpo original (para locais de glicosilação ligada a O).

As moléculas de ácido nucleico que codificam variantes de sequência de aminoácidos do anticorpo anti-VEGF são preparadas através de uma variedade de métodos conhecidos na arte. Estes métodos incluem, mas não se lhes limitam, isolamento a partir de uma fonte natural (no caso de variantes de sequência de aminoácidos de ocorrência natural) ou preparação por mutagénese mediada por oligonucleótidos (ou dirigida ao local), mutagénese por PCR e mutagénese por cassetes, de uma variante anteriormente preparada ou de uma versão não variante do anticorpo anti-VEGF. (v) Anticorpos humanos

Em alternativa à humanização, podem-se gerar anticorpos humanos. Por exemplo, é agora possível produzir animais transgénicos (e.g., ratinhos) que são capazes, por imunização, de produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulinas endógenas. Por exemplo, foi descrito que a deleção homozigótica do gene da região de junção (Jh) da cadeia pesada do anticorpo nos ratinhos mutantes de linha germinal e quiméricos resulta na inibição completa da produção de anticorpos endógenos. A transferência do arranjo dos genes de imunoglobulina da linha germinal humana nestes ratinhos mutantes da linha germinal resultará na produção de anticorpos humanos por provocação com o antigénio. Veja-se, e.g., Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); e Patentes US 5 591 669, 5 589 369 e 5 545 807. Os anticorpos humanos podem também ser derivados de bibliotecas de exibição em fagos (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991); e Patentes US 5 565 332 e 5 573 905). Tal como 36 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ discutido atrás, os anticorpos humanos podem também ser gerados por células B activadas in vitro (vejam-se as Patentes US 5 567 610 e 5 229 275) (vi) Fragmentos de anticorpo

Em certas concretizações, o anticorpo anti-VEGF humanizado ou variante é um fragmento de anticorpo. Foram desenvolvidas várias técnicas para a produção de fragmentos de anticorpo. Tradicionalmente, estes fragmentos eram derivados por digestão proteolitica de anticorpos intactos (veja-se, e.g., Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) e Brennan et al., Science 229:81 (1985)). Contudo, estes fragmentos podem agora ser produzidos directamente por células hospedeiras recombinantes. Por exemplo, os fragmentos Fab'-SH podem ser recuperados directamente a partir de E. coli e acoplados quimicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Cárter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). Noutra concretização, o F(ab')2 é formado utilizando o "fecho" de leucinas GCN4 para promover a montagem da molécula de F(ab')2· De acordo com outra abordagem, podem-se isolar fragmentos Fv, Fab ou F(ab')2 directamente a partir da cultura das células hospedeiras recombinantes. Outras técnicas para a produção de fragmentos de anticorpo serão evidentes para os peritos na especialidade. (vii) Anticorpos multiespecíficos

Em algumas concretizações, pode ser desejável gerar anticorpos anti-VEGF humanizados ou variantes multiespecíficos (e.g. biespecíficos) possuindo especificidades de ligação para com, pelo menos, dois epítopos diferentes. Os anticorpos biespecíficos exemplificativos podem-se ligar a dois epítopos diferentes da proteína VEGF. Alternativamente, pode-se combinar um braço anti-VEGF com um braço que se liga a uma molécula desencadeadora num leucócito tal como uma molécula de um receptor de células τ (e.g., CD2 ou CD3), ou receptores de Fc para IgG (FcyR), tais como FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) e FcyRlll (CD16) de modo a focar os mecanismos de defesa celular na célula que expressa o VEGF. Os anticorpos biespecíficos podem também ser utilizados para localizar agentes citotóxicos para células que expressam VEGF. Estes anticorpos possuem um 37 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ braço de ligação a VEGF e um braço que se liga ao agente citotóxico (e.g., saporina, anti-interferão a, alcaloide de vinca, cadeia A de ricina, metotrexato ou hapteno de isótopo radioactivo). Os anticorpos biespecificos podem ser preparados na forma de anticorpos de comprimento completo ou fragmentos de anticorpo (e.g., anticorpos biespecificos F(ab')2).

De acordo com outra abordagem para a preparação de anticorpos biespecificos, a interface entre um par de moléculas de anticorpo pode ser manipulada para maximizar a percentagem de heterodimeros que são recuperados a partir da cultura de células recombinantes. A interface preferida compreende pelo menos uma parte do dominio CH3 de um dominio constante de um anticorpo. Neste método, uma ou mais cadeias laterais pequenas de aminoácidos da interface da primeira molécula de anticorpo são substituídas por cadeias laterais maiores (e.g., tirosina ou triptofano). São criadas "cavidades" compensatórias de dimensões idênticas ou similares à(s) cadeia(s) lateral(ais) grande(s), na interface da segunda molécula de anticorpo substituindo cadeias laterais grandes de aminoácidos por mais pequenas (e.g., alanina ou treonina). Isto proporciona um mecanismo para aumentar o rendimento do heterodímero relativamente a outros produtos finais não desejados tais como homodímeros. Veja-se WO96/27011 publicado a 6 Setembro, 1996.

Os anticorpos biespecificos incluem anticorpos ligados de modo cruzado ou "heteroconjugados". Por exemplo, um dos anticorpos no heteroconjugado pode ser acoplado a avidina, o outro a biotina. Os anticorpos heteroconjugados podem ser preparados utilizando quaisquer métodos convenientes de ligação cruzada. Os agentes de ligação cruzada adequados são bem conhecidos na arte, e são descritos na Patente US 4 676 980, juntamente com um número de técnicas de ligação cruzada.

Foram também descritas na literatura técnicas para gerar anticorpos biespecificos a partir de fragmentos de anticorpo. Por exemplo, podem-se preparar anticorpos biespecificos utilizando ligação química. Brennan et al., Science 229:81(1985) descreve um procedimento em que anticorpos intactos são proteoliticamente clivados para gerar fragmentos 38 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ F(ab')2· Estes fragmentos são reduzidos na presença do agente complexante de ditiol arseneto de sódio para estabilizar ditióis vicinais e prevenir a formação de dissulfureto intermolecular. Os fragmentos Fab' gerados são então convertidos em derivados tionitrobenzoato (TNB). Um dos derivados Fab'-TNB é então reconvertido no Fab'-tiol por redução com mercaptoetilamina e é misturado com uma quantidade equimolar do outro derivado Fab'-TNB para formar o anticorpo biespecifico. Os anticorpos biespecificos produzidos podem ser utilizados como agentes para a imobilização selectiva de enzimas. Ainda numa outra concretização, fragmentos Fab'-SH recuperados directamente de E. coli podem ser quimicamente acoplados in vitro para formar anticorpos biespecificos. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992).

Foram igualmente descritas várias técnicas para preparar e isolar fragmentos de anticorpos biespecificos directamente da cultura de células recombinantes. Por exemplo, foram produzidos anticorpos biespecificos utilizando "fechos" de leucinas. Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992) . Os péptidos "fecho" de leucinas das proteínas Fos e Jun foram ligados às porções Fab' de dois anticorpos diferentes por fusão génica. Os homodímeros de anticorpos foram reduzidos na região charneira para formar monómeros e depois foram re-oxididados para formar os heterodímeros de anticorpos. Este método pode também ser utilizado para a produção de homodímeros de anticorpos. A tecnologia dos "diacorpos" descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:6444-6448 (1993) proporcionou um mecanismo alternativo para a preparação de fragmentos de anticorpos biespecificos. Os fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) ligado a um domínio variável de cadeia leve (VL) através de um ligante que é demasiado curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia. Assim, os domínios VH e VL de um fragmento são forçados a emparelhar com os domínios VL e VH complementares de outro fragmento, formando assim dois locais de ligação ao antigénio. Foi também relatada outra estratégia para a preparação de fragmentos de anticorpos biespecificos através da utilização de dímeros de Fv de cadeia única (sFv). Veja-se Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994). Alternativamente, o anticorpo biespecífico pode ser um "anticorpo linear" 39 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ produzido como descrito em Zapata et al. Protein Eng. 8(10) :1057-1062 (1995).

Os anticorpos com mais do que duas valências estão contemplados. Por exemplo, podem-se preparar anticorpos triespecificos. Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991). (viii) Outras modificações

Estão contempladas outras modificações do anticorpo anti-VEGF humanizado ou variante. Por exemplo, pode ser desejável modificar o anticorpo da invenção em relação à função efectora, de modo a aumentar a eficácia do anticorpo no tratamento do cancro, por exemplo. Por exemplo podem-se introduzir resíduo(s) cisteína na região Fc, permitindo assim a formação de ligações dissulfureto inter-cadeias nesta região. O anticorpo homodimérico assim gerado pode ter uma capacidade de internalização melhorada e/ou aumentada capacidade de morte celular mediada pelo complemento e citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC). Veja-se Caron et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) e Shopes, B.J. Immunol. 148:2918-2922 (1992). Anticorpos homodiméricos com actividade antitumoral melhorada podem também ser preparados utilizando ligantes para ligação cruzada heterobifuncionais como descrito em Wolff et al., Câncer Research 53:2560-2565 (1993). Alternativamente, pode ser manipulado um anticorpo que possui regiões Fc duplas e pode assim ter capacidade de lise pelo complemento e ADCC melhoradas. Veja-se Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989). A invenção também se refere a imunoconjugados compreendendo o anticorpo aqui descrito conjugado com um agente citotóxico tal como um agente quimioterapêutico, uma toxina (e.g., uma toxina enzimaticamente activa de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, ou seus fragmentos), ou um isótopo radioactivo (i.e., um radioconjugado).

Os agentes quimioterapêuticos úteis para gerar estes imunoconjugados foram descritos atrás. As toxinas enzimaticamente activas e seus fragmentos que podem ser utilizados incluem a cadeia A da difteria, fragmentos não 40 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ activos para ligação da toxina da difteria, cadeia A da exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia A da ricina, cadeia A da abrina, cadeia A da modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos. Estão disponíveis uma variedade de radionuclidos para a produção de anticorpos anti-VEGF radioconjugados. Os exemplos incluem 212Bi, 131I, 131In, 90Y e 186Re.

Os conjugados do anticorpo e do agente citotóxico são preparados utilizando uma variedade de agentes de acoplamento de proteínas bifuncionais tais como N-succinimidil-3-(2-piridilditiol)propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como adipimidato de dimetilo - HC1), ésteres activos (tais como suberato de di-succinimidilo), aldeídos (tais como glutaraldeído), compostos bis-azido (tais como bis(p-azidobenzoíl)-hexanodiamina), derivados bis-diazónio (tais como bis-(p-diazóniobenzoíl)etilenodiamina), diisocianatos (tais como 2,6-diisocianato de tolueno) e compostos activos de bis-flúor (tais como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Por exemplo, pode-se preparar uma imunotoxina de ricina como descrito em Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). O ácido 1-isotiocianatobenzil-3-metildietilenotriaminopenta-acético (MX-DTPA) marcado com Carbono-14 constitui um exemplo de agente quelante para conjugação do radionucleótido com o anticorpo. Veja-se WO94/11026.

Noutra concretização, o anticorpo pode ser conjugado com um "receptor" (tal como estreptavidina) para utilização no pré-direccionamento a tumores, em que o conjugado anticorpo-receptor é administrado ao paciente, seguindo-se a remoção do conjugado não ligado da circulação utilizando um agente de depuração e depois administração de um "ligando" (e.g., avidina) que está conjugado com um agente citotóxico (e.g., um radionuclido).

Os anticorpos anti-VEGF aqui descritos pode também ser formulados na forma de imunolipossomas. Os lipossomas contendo 41 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ ο anticorpo são preparados através de métodos conhecidos na arte, tais como os descritos em Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sei. USA 77:4030 (1980); e Pat. U.S. 4 485 045 e 4 544 545. Lipossomas com tempo em circulação melhorado são descritos na Patente U.S. 5 013 556.

Os lipossomas particularmente úteis podem ser gerados através do método de evaporação em fase inversa com uma composição lipidica compreendendo fosfatidileolina, colesterol e fosfatidiletanolamina derivatizada com PEG (PEG-PE) . Os lipossomas são extrudidos através de filtros de tamanho de poros definido para originar lipossomas com o diâmetro desejado. Os fragmentos Fab' do anticorpo da presente invenção podem ser conjugados com os lipossomas conforme descrito em Martin et al., J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982) através de uma reacção de inter-permuta de dissulfureto. Um agente quimioterapêutico (tal como Doxorubicina) está opcionalmente contido no lipossoma. Veja-se Gabizon et al., J. National Câncer Inst. 81(19):1484 (1989) O anticorpo da presente invenção pode também ser utilizado em ADEPT por conjugação do anticorpo com uma enzima activante de profármaco que converte um profármaco (e.g., um agente quimioterapêutico de peptidilo, veja-se WO81/01145) num fármaco anticanceroso activo. Veja-se, por exemplo, WO 88/07378 e Patente U.S. 4 975 278. A componente enzima do imunoconjugado útil para ADEPT inclui qualquer enzima capaz de actuar sobre um profármaco de maneira a convertê-lo na sua forma citotóxica, mais activa.

As enzimas que são úteis no método da presente invenção incluem, mas não se lhes limitam, fosfatase alcalina útil para converter profármacos contendo fosfato nos fármacos livres; arilsulfatase útil para converter profármacos contendo sulfato em fármacos livres; citosina-desaminase útil para converter 5-fluorocitosina não tóxica no fármaco anticanceroso, 5-fluorouracilo; proteases, tais como protease de Serratia, termolisina, subtilisina, carboxipeptidases e catepsinas (tais como as catepsinas Be L), que são úteis para converter profármacos contendo péptidos em fármacos livres; 42 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ D-alanilcarboxipeptidases, úteis para converter profármacos que contêm substituintes D-aminoácido; enzimas que clivam hidratos de carbono tais como β-galactosidase e neuraminidase úteis para converter profármacos glicosilados em fármacos livres; β-lactamase útil para converter fármacos derivatizados com β-lactamas em fármacos livres; e penicilina-amidases, tais como penicilina V-amidase ou penicilina G-amidase, úteis para converter fármacos derivatizados nos seus azotos de aminas com grupos fenoxiacetilo ou fenilacetilo, respectivamente, em fármacos livres. Alternativamente, podem ser utilizados anticorpos com actividade enzimática, também conhecidos na arte como "aczimas" ("abzymes"), para converter os profármacos da invenção em fármacos activos livres (veja-se, e.g., Massey, Nature 328:457-458 (1987)). Os conjugados anticorpo-aczima podem ser preparados como aqui descrito para entrega da aczima a uma população de células tumorais.

As enzimas da presente invenção podem ser covalentemente ligadas aos anticorpos anti-VEGF por técnicas bem conhecidas na arte tais como utilizando os reagentes de ligação cruzada heterobifuncionais atrás discutidos. Alternativamente, podem-se construir proteínas de fusão compreendendo pelo menos a região de ligação ao antigénio de um anticorpo da invenção ligado a pelo menos uma porção funcionalmente activa de uma enzima da invenção, utilizando técnicas de ADN recombinante bem conhecidas na arte (veja-se, e.g., Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984)).

Em certas concretizações da invenção, pode ser desejável a utilização de um fragmento de anticorpo, em vez de um anticorpo intacto, para aumentar a penetração tumoral, por exemplo. Neste caso, pode ser desejável modificar o fragmento de anticorpo de modo a aumentar a sua semivida sérica. Isto pode ser conseguido, por exemplo, por incorporação de um epítopo de ligação ao receptor selvagem no fragmento de anticorpo (e.g., por mutação da região apropriada no fragmento de anticorpo ou por incorporação do epítopo num marcador peptídico que é então fundido ao fragmento de anticorpo em qualquer das suas extremidades ou no meio, e.g., por síntese de ADN ou de péptidos). Veja-se W096/32478 publicado a 17 de Outubro, 1996. 43 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ Ο epítopo de ligação ao receptor selvagem constitui geralmente uma região em que qualquer um ou mais resíduos de aminoácido de uma ou duas ansas de um domínio Fc são transferidos para uma posição análoga do fragmento de anticorpo. Ainda mais preferivelmente, são transferidos três ou mais resíduos de uma ou duas ansas do domínio Fc. É ainda mais preferido tomar o epítopo do domínio CH2 da região Fc (e.g., de uma IgG) e transferi-lo para a região CHI, CH3 ou VH, ou mais do que uma destas regiões, do anticorpo. Alternativamente, o epítopo é tomado do domínio CH2 da região Fc e transferido para a região CL ou a região VL, ou ambas, do fragmento de anticorpo.

Numa concretização mais preferida, o epítopo de ligação ao receptor selvagem compreende a sequência: PKNSSMISNTP (SEQ ID NO:17), e opcionalmente compreende ainda uma sequência seleccionada do grupo que consiste em HQSLGTQ (SEQ ID NO:18), HQNLSDGK (SEQ ID NO:19), HQNISDGK (SEQ ID NO:20) ou VISSHLGQ (SEQ ID NO:21), particularmente quando o fragmento de anticorpo é um Fab ou F(ab')2. Noutra concretização mais preferida, o epitopo de ligação ao receptor selvagem é um polipéptido contendo a(s) sequência(s) : HQNLSDGK (SEQ ID NO:19), HQNISDGK (SEQ ID NO:20) OU VISSHLGQ (SEQ ID N0:21) e a sequência: PKNSSMISNTP (SEQ ID NO:17).

Modificações covalentes do anticorpo anti-VEGF humanizado ou variante estão também incluídas no âmbito da presente invenção. Podem ser preparadas por síntese química ou por clivagem enzimática ou química do anticorpo, se aplicável. Outros tipos de modificações covalentes do anticorpo são introduzidos na molécula através da reacção de resíduos de aminoácido alvo do anticorpo com um agente de derivatização orgânico que é capaz de reagir com cadeias laterais seleccionadas ou com os resíduos N- ou C-terminais. Modificações covalentes de polipéptidos exemplificativas são descritas na Patente US 5 534 615. Um tipo preferido de modificação covalente do anticorpo compreende a ligação do anticorpo a um de uma variedade de polímeros não proteináceos, e.g., polietilenoglicol, polipropilenoglicol ou polioxialquilenos, da maneira apresentada nas Patentes U.S. 4 640 835; 4 496 689; 4 301 144; 4 670 417; 4 791 192 ou 4 179 337. 44 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ Β. Vectores, Células Hospedeiras e Métodos Recombinantes A invenção também proporciona ácido nucleico isolado codificando o anticorpo anti-VEGF humanizado ou variante, vectores e células hospedeiras compreendendo o ácido nucleico, e técnicas recombinantes para a produção do anticorpo.

Para a produção recombinante do anticorpo, o ácido nucleico que o codifica pode ser isolado e inserido num vector replicável para posterior clonagem (amplificação do ADN) ou para expressão. Noutra concretização, o anticorpo pode ser produzido por recombinação homóloga, e.g. como descrito na Patente US 5 204 244. O ADN que codifica o anticorpo monoclonal é prontamente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais (e.g., utilizando sondas oligonucleotídicas que são capazes de se ligar especificamente a genes que codificam as cadeias pesada e leve do anticorpo). Estão disponíveis muitos vectores. Os componentes do vector incluem geralmente, mas não se lhes limitam, um ou mais dos seguintes: uma sequência de sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento potenciador, um promotor e uma sequência de terminação da transcrição, e.g., como descrito na Patente US 5 534 615 concedida em 9 de Julho, 1996 .

As células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão do ADN nos vectores são aqui as células procariotas, de levedura ou eucariotas superiores descritas atrás. Os procariotas adequados para este fim incluem eubactérias, tais como organismos Gram-negativos ou Gram-positivos, por exemplo, Enterobacteriaceae tais como Escherichia, e.g., E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, e.g., Salmonella typhimurium, Serratia, e.g., Serratia marcescans, e Shigella, bem como Bacilli tais como B. subtilis e B. licheniformis (e.g., B. licheniformis 41P descrito em DD 266710 publicado em 12 Abril, 1989), Pseudomonas tais como P. aeruginosa e Streptomyces. Um hospedeiro de clonagem E. coli preferido é E. coli 294 (ATCC 31, 446), embora sejam adequadas outras estirpes tais como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31,537) e E. coli W3110 (ATCC 27,325). Estes exemplos são ilustrativos e não limitantes. 45 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ

Em adição aos procariotas, micróbios eucariota tais como fungos filamentosos ou leveduras são hospedeiros de clonagem ou expressão adequados para vectores que codificam anticorpo anti-VEGF. Saccharomyces cerevisiae, ou a comum levedura de padeiro, é o mais vulgarmente utilizado entre os microorganismos hospedeiros eucariotas inferiores. Contudo, um número de outros géneros, espécies e estirpes estão vulgarmente disponíveis e são aqui úteis, tais como Schizosaccharomyces pombe; hospedeiros Kluyveromyces tais como, e.g., K. lactis, K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. wallii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906), K. thermotolerans e K. marxianus; Yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244234); Neurospora crassa; Schwanniomyces tais como Schwanniomyces occidentalis; e fungos filamentosos tais como, e.g., Neurospora, Penicillium, Tolypocladium e Aspergillus tais como hospedeiros A. nidulans e A. niger.

As células hospedeiras adequadas para a expressão de anticorpo anti-VEGF glicosilado são derivadas de organismos pluricelulares. Os exemplos de células de invertebrado incluem células de plantas e de insectos. Foram identificadas numerosas estirpes e variantes de baculovírus e correspondentes células de insecto hospedeiras permissivas de hospedeiros tais como Spodoptera frugiperda (lagarta), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melangaster (mosca da fruta) e Bombyx mori. Uma variedade de estirpes virais para transfecção estão disponíveis ao público, e.g., a variante L-l de Autographa californica NPV e a estirpe Bm-5 de Bombyx mori NPV, e estes vírus podem ser utilizados como o vírus de acordo com a presente invenção, particularmente para transfecção de células de Spodoptera frugiperda. Culturas de células vegetais de algodão, milho, batata, soja, petúnia, tomate e tabaco, podem também ser utilizadas como hospedeiros.

Contudo, o interesse tem sido maior em células de vertebrado, e a propagação de células de vertebrado em cultura (cultura de tecidos) tornou-se um procedimento rotineiro. São exemplos de linhas de células hospedeiras de mamífero úteis a linha CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7, 46 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ ATCC CRL 1651); a linha de rim embrionário humano (células 293 ou 293 subclonadas para crescimento em cultura em suspensão, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de rim de hamster bebé (BHK, ATCC CCL 10); células de ovário de hamster chinês/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:4216 (1980)); células de Sertoli de ratinho (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato-búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de ratinho (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRl (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sei. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; e uma linha de hepatoma humano (Hep G2).

As células hospedeiras são transformadas com os vectores de expressão ou de clonagem atrás descritos para a produção do anticorpo anti-VEGF e cultivadas em meios nutrientes convencionais modificados conforme apropriado para indução de promotores, selecção de transformantes ou amplificação dos genes que codificam as sequências desejadas.

As células hospedeiras utilizadas para produzir o anticorpo anti-VEGF da presente invenção podem ser cultivadas numa variedade de meios. Os meios comercialmente disponíveis tais como F10 de Ham (Sigma), Meio Mínimo Essencial ( (MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) e Meio de Eagle Modificado por Dulbecco ((DMEM), Sigma) são adequados para a cultura das células hospedeiras. Em adição, qualquer dos meios descritos em Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Bíochem. 102:255 (1980), Pat. U.S. 4 767 704; 4 657 866; 4 927 762; 4 560 655; ou 5 122 469; WO 90/03430; WO 87/00195; ou Patente U.S. Re. 30 985, pode ser utilizado como meio de cultura para as células hospedeiras. Qualquer destes meios pode ser suplementado conforme necessário com hormonas e/ou outros factores de crescimento (tais como insulina, transferrina ou factor de crescimento epidérmico), sais (tais como cloreto de sódio, cálcio, magnésio e fosfato), tampões (tais como HEPES), nucleótidos (tais como adenosina e timidina), antibióticos (tais como o fármaco GENTAMYCIN™), 47 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ elementos vestigiários (definidos como compostos inorgânicos usualmente presentes em concentrações finais na gama micromolar) e glucose ou uma fonte de energia equivalente. Quaisquer outros suplementos necessários podem também ser incluídos nas concentrações apropriadas que serão conhecidas dos peritos na especialidade. As condições de cultura, tais como temperatura, pH, e similares, são as anteriormente utilizadas com a célula hospedeira seleccionada para a expressão e serão evidentes para uma pessoa competente na matéria.

Quando se utilizam técnicas recombinantes, o anticorpo pode ser produzido intracelularmente, no espaço periplasmático, ou directamente segregado para o meio. Se o anticorpo é produzido intracelularmente, como primeiro passo, removem-se os detritos em partículas, sejam células hospedeiras ou fragmentos lisados, por exemplo, por centrifugação ou ultrafiltração. Cárter et al., Bío/Technology 10:163-167 (1992) descrevem um procedimento para o isolamento de anticorpos que são segregados para o espaço periplasmático de E. coli. Resumidamente, a pasta de células é descongelada na presença de acetato de sódio (pH 3,5), EDTA e fenilmetilsulfonilfluoreto (PMSF) ao longo de cerca de 30 min. Os detritos celulares podem ser removidos por centrifugação. Quando o anticorpo é segregado para o meio, os sobrenadantes destes sistemas de expressão são geralmente primeiro concentrados utilizando um filtro de concentração de proteínas disponível comercialmente, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração Amicon ou Millipore Pellicon. Pode ser incluído um inibidor de proteases tal como PMSF em qualquer dos passos seguintes para inibir a proteólise e podem-se incluir antibióticos para evitar o crescimento de contaminantes adventícios. A composição de anticorpos preparada a partir das células pode ser purificada utilizando, por exemplo, cromatografia em hidroxilapatite, electroforese em gel, diálise e cromatografia de afinidade, sendo a cromatografia de afinidade a técnica de purificação preferida. A adequabilidade da proteína A como ligando de afinidade depende das espécies e do isotipo de qualquer domínio Fc de imunoglobulina que esteja presente no anticorpo. A Proteína A pode ser utilizada para purificar 48 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ

anticorpos que são baseados em cadeias pesadas humanas γΐ, γ2 ou γ4 (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). A Proteína G é recomendada para todos os isotipos de ratinho e para γ3 humana (Guss et al., EMBO J. 5:1567-1575 (1986)). A matriz à qual o ligando de afinidade é ligado é muito frequentemente agarose, mas estão disponíveis outras matrizes. Matrizes mecanicamente estáveis tais como vidro de poros controlados ou poli(estirenodivinil)benzeno permitem caudais mais rápidos e menores tempos de processamento do que pode ser conseguido com agarose. Quando o anticorpo compreende um domínio CH3, a resina Bakerbond ABX™ (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ) é útil para a purificação. Outras técnicas para a purificação de proteínas tais como fraccionamento numa coluna de permuta iónica, precipitação com etanol, HPLC de fase inversa, cromatografia em sílica, cromatografia em heparina SEPHAROSE™ cromatografia numa resina de permuta aniónica ou catiónica (tal como uma coluna de poli(ácido aspártico), cromatofocagem, SDS-PAGE e precipitação com sulfato de amónio, estão também disponíveis dependendo do anticorpo a recuperar.

Após quaisquer passo ou passos de purificação preliminar, a mistura compreendendo o anticorpo de interesse e contaminantes pode ser submetida a cromatografia de interacção hidrófoba a baixo pH utilizando um tampão de eluição a um pH entre cerca de 2,5-4,5, preferivelmente realizada com baixas concentrações de sais (e.g., de cerca de 0-0,25 M de sal). C. Formulações farmacêuticas

As formulações terapêuticas do anticorpo são preparadas para armazenagem misturando o anticorpo possuindo o grau de pureza desejado com transportadores, excipientes ou estabilizantes opcionais fisiologicamente aceitáveis, (Remíngton's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Os transportadores, excipientes ou estabilizantes aceitáveis não são tóxicos para os beneficiários nas dosagens e concentrações empregues, e incluem tampões tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzilamónio; cloreto de hexametónio; cloreto de benzalcónio, cloreto de benzetónio; 49 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ fenol, álcool butílico ou benzílico; alquilparabenos tais como metilparabeno ou propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipéptidos de baixo peso molecular (inferior a cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrófilos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacáridos, dissacáridos e outros hidratos de carbono incluindo glucose, manose ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; açúcares tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contra-iões formadores de sais tais como sódio; complexos de metais (e.g., complexos Zn-proteína); e/ou tensioactivos não iónicos tais como TWEEN™, PLURONICS™ ou polietilenoglicol (PEG). A presente formulação também pode conter mais do que um composto activo, conforme necessário para a indicação particular a tratar, preferivelmente aqueles com actividades complementares que não afectam adversamente cada um dos outros (veja-se a Secção F adiante). Estas moléculas estão adequadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para o fim pretendido.

Os ingredientes activos podem também ser aprisionados em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, microcápsula de hidroximetilcelulose ou gelatina e microcápsula de poli(metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas de entrega de fármacos coloidais (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Estas técnicas estão descritas em Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).

As formulações a utilizar para administração in vivo têm que ser estéreis. Isto é prontamente realizado por filtração através de membranas de filtração para esterilização.

Podem ser preparadas preparações de libertação sustentada. Os exemplos de preparações de libertação sustentada adequadas incluem matrizes semi-permeáveis de polímeros hidrófobos sólidos contendo o anticorpo, matrizes 50 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ estas que estão na forma de artigos conformados, e.g., filmes ou microcápsulas. Os exemplos de matrizes de libertação sustentada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietilmetacrilato) ou poli(álcool vinílico)), polilactidos (Pat. U.S. 3 773 919), copolimeros de ácido L-glutâmico e γ-etil-L-glutamato, copolimeros de etileno-acetato de vinilo, não degradáveis, e de ácido láctico-ácido glicólico, degradáveis, tais como Lupron Depot™ (microesferas injectáveis compostas por copolimero de ácido láctico-ácido glicólico e acetato de leuprolida), e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Enquanto polímeros tais como etileno-acetato de vinilo e ácido láctico-ácido glicólico permitam a libertação de moléculas ao longo de mais de 100 dias, certos hidrogéis libertam proteínas durante períodos de tempo mais curtos. Quando os anticorpos encapsulados permanecem no corpo durante um longo período de tempo, podem desnaturar ou agregar-se em resultado da exposição à humidade a 37°C, resultando numa perda de actividade biológica e possíveis alterações na imunogenicidade. Podem-se deduzir estratégias racionais para a estabilização dependendo do mecanismo envolvido. Por exemplo, se se verifica que o mecanismo de agregação é a formação de ligações S-S intermoleculares através de interpermuta de tio-dissulfureto, a estabilização pode ser conseguida através da modificação de resíduos sulfidrilo, liofilização em soluções ácidas, controlo do teor de humidade, utilização de aditivos apropriados e desenvolvimento de composições de matriz de polímeros específicos. D. Utilizações Não Terapêuticas para o Anticorpo

Os anticorpos da invenção podem ser utilizados como agentes de purificação por afinidade. Neste processo, os anticorpos são imobilizados numa fase sólida tal como resina Sephadex ou papel de filtro, utilizando métodos bem conhecidos na arte. O anticorpo imobilizado é colocado em contacto com uma amostra contendo a proteína VEGF (ou um seu fragmento) a purificar, e depois o suporte é lavado com um solvente adequado que irá remover substancialmente todo o material na amostra excepto a proteína VEGF, que fica ligada ao anticorpo imobilizado. Finalmente, o suporte é lavado com outro solvente adequado, tal como tampão de glicina, pH 5,0, que irá libertar a proteína VEGF do anticorpo. 51 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ

Os anticorpos anti-VEGF podem também ser úteis em ensaios de diagnóstico para a proteína VEGF, e.g., na detecção da sua expressão em células, tecidos ou soro específicos. Estes métodos de diagnóstico podem ser úteis no diagnóstico do cancro.

Para aplicação em diagnósticos, o anticorpo tipicamente será marcado com uma porção detectável. Estão disponíveis numerosos marcadores que podem ser genericamente agrupados nas seguintes categorias: (a) Radioisótopos, tais como 35S, 14C, 125l, 3H e 131l. O anticorpo pode ser marcado com o radioisótopo utilizando as técnicas descritas em Current Protocols in Immunology, Volumes 1 e 2, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, New York, Pubs. (1991), por exemplo, e a radioactividade pode ser medida utilizando contagem de cintilação. (b) Estão disponíveis marcadores fluorescentes tais como quelatos de terras-raras (quelatos de európio) ou

fluoresceína e seus derivados, rodamina e seus derivados, dansilo, Lissamina, ficoeritrina e vermelho Texas. Os marcadores fluorescentes podem ser conjugados com o anticorpo utilizando as técnicas reveladas em Current Protocols in Immunology, supra, por exemplo. A fluorescência pode ser quantificada utilizando um fluorímetro. (c) Estão disponíveis vários marcadores enzima-substrato e a Patente U.S. 4 275 149 proporciona uma revisão de alguns deles. A enzima geralmente catalisa uma alteração química do substrato cromogénico que pode ser medida utilizando várias técnicas. Por exemplo, a enzima pode catalisar uma alteração de cor num substrato, que pode ser medida espectrofotometricamente. Alternativamente, a enzima pode alterar a fluorescência ou a quimioluminescência do substrato. Técnicas para a quantificação de uma alteração na fluorescência estão descritas acima. O substrato quimioluminescente fica electronicamente excitado através de uma reacção química e pode então emitir luz que pode ser medida (utilizando um quimioluminómetro, por exemplo) 52 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ ou doa energia a um aceitador fluorescente. Os exemplos de marcadores enzimáticos incluem luciferases (e.g., luciferase de pirilampo e luciferase bacteriana; Patente U.S. 4 737 456), luciferina, 2,3-di-hidroftalazinodionas, malato-desidrogenase, urease, peroxidase tal como peroxidase de rábano (HRPO), fosfatase alcalina, β-galactosidase, glucoamilase, lisozima, sacárido-oxidases (e.g., glucose-oxidase, galactose-oxidase e glucose-6-fosfato-desidrogenase), oxidases heterocíclicas (tais como uricase e xantina-oxidase), lactoperoxidase, microperoxidase e similares. Técnicas para a conjugação de enzimas a anticorpos estão descritas em 0'Sullivan et al., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, em Methods in Enzym. (ed J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, New York, 73:147-166 (1981).

Os exemplos de combinações enzima-substrato incluem, por exemplo: (i) Peroxidase de rábano (HRPO) com hidrogénio-peroxidase como substrato, em que a hidrogénio-peroxidase oxida um precursor de corante (e.g., ortofenilenodiamina (OPD) ou cloridrato de 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB)); (ii) fosfatase alcalina (AP) com fosfato de para-nitrofenilo como substrato cromogénico; e (iii) β-D-galactosidase (β-D-Gal) com um substrato cromogénico (e.g., p-nitrofenil^-D-galactosidase) ou o substrato fluorogénico da 4-metilumbeliferil^-D-galactosidase

Estão disponíveis aos peritos na especialidade numerosas outras combinações enzima-substrato. Para uma revisão geral veja-se Patente U.S. 4 275 149 e 4 318 980.

Por vezes, o marcador é indirectamente conjugado com o anticorpo. O perito na especialidade estará ao corrente de várias técnicas para o conseguir. Por exemplo, o anticorpo pode ser conjugado com biotina e qualquer um das três amplas categorias de marcadores atrás mencionadas pode ser conjugado com avidina, ou vice versa. A biotina liga-se selectivamente a 53 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ avidina e assim, ο marcador pode ser conjugado com o anticorpo desta maneira indirecta. Alternativamente, para se conseguir a conjugação indirecta do marcador com o anticorpo, o anticorpo é conjugado com um hapteno pequeno (e.g., digoxina) e um dos diferentes tipos de marcadores atrás mencionados é conjugado com um anticorpo anti-hapteno (e.g., anticorpo anti-digoxina). Assim, pode ser conseguida a conjugação indirecta do marcador com o anticorpo.

Noutra concretização da invenção, o anticorpo anti-VEGF não precisa de ser marcado, e a sua presença pode ser detectada utilizando um anticorpo marcado que se liga ao anticorpo contra VEGF.

Os anticorpos da presente invenção podem ser empregues em qualquer método de ensaio conhecido, tal como ensaios de ligação competitiva, ensaios em sanduíche directos e indirectos e ensaios de imunoprecipitação. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc. 1987) .

Os ensaios de ligação competitiva assentam na capacidade de um padrão marcado para competir com o analito da amostra de teste, pela ligação com uma quantidade limitada de anticorpo. A quantidade de proteína VEGF na amostra de teste é inversamente proporcional à quantidade de padrão que fica ligado aos anticorpos. Para facilitar a determinação da quantidade de padrão que fica ligado, os anticorpos são geralmente insolubilizados antes ou depois da competição, de modo a que o padrão e o analito que estão ligados aos anticorpos possam ser convenientemente separados do padrão e do analito que permanecem não ligados.

Os ensaios em sanduíche envolvem a utilização de dois anticorpos, cada um capaz de se ligar a uma diferente porção imunogénica, ou epítopo, da proteína a detectar. Num ensaio em sanduíche, um analito da amostra de teste é ligado através de um primeiro anticorpo que está imobilizado num suporte sólido, e depois um segundo anticorpo liga-se ao analito, formando assim um complexo tripartido insolúvel. Veja-se, e.g., Pat US 4 376 110. O segundo anticorpo pode, ele próprio, estar marcado com uma porção detectável (ensaios em sanduíche 54 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ directos) ou pode ser medido utilizando um anticorpo anti-imunoglobulina que está marcado com uma porção detectável (ensaio em sanduíche indirecto). Por exemplo, um tipo de ensaio em sanduíche é um ensaio ELISA, caso em que a porção detectável é uma enzima.

Para imuno-histoquimica, a amostra de tumor pode ser fresca ou congelada ou pode estar embebida em parafina e fixada com um conservante tal como formalina, por exemplo.

Os anticorpos podem também ser utilizados para ensaios de diagnóstico in vivo. Geralmente, o anticorpo é marcado com um radionuclido (tal como inIn, 99Tc, 14C, 131I, 125I, 3H, 32P ou 35S) de modo a que o tumor possa ser localizado utilizando imunocintigrafia. E. Kits de Diagnóstico

Por conveniência, o anticorpo da presente invenção pode ser proporcionado num kit, i.e., uma combinação embalada de reagentes em quantidades predeterminadas com instruções para a realização do ensaio de diagnóstico. Quando o anticorpo é marcado com uma enzima, o kit incluirá substratos e cofactores requeridos pela enzima (e.g., um precursor de substrato que proporciona o cromóforo ou fluoróforo detectável). Em adição, podem ser incluídos outros aditivos tais como estabilizantes, tampões (e.g., um tampão de bloqueio ou um tampão de lise) e similares. As quantidades relativas dos vários reagentes podem variar amplamente para proporcionar as concentrações em solução dos reagentes que substancialmente optimizam a sensibilidade do ensaio. Particularmente, os reagentes podem ser proporcionados na forma de pós secos, usualmente liofilizados, incluindo excipientes que por dissolução proporcionarão uma solução reagente possuindo a concentração apropriada. F. Utilizações Terapêuticas para o Anticorpo

Para aplicações terapêuticas, os anticorpos anti-VEGF da invenção são administrados a um mamífero, preferivelmente um ser humano, numa forma de dosagem farmaceuticamente aceitável tal como as discutidas atrás, incluindo as que podem ser administradas a um ser humano intravenosamente como bolus ou 55 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ por infusão contínua ao longo de um período de tempo, pelas vias intramuscular, intraperitoneal, intra-cerebrospinal, subcutânea, intra-articular, intra-sinovial, intratecal, oral, tópica ou de inalação. Os anticorpos também são adequadamente administrados pelas vias intratumoral, peritumoral, intralesional ou perilesional, para exercer efeitos terapêuticos locais bem como sistémicos. A via intraperitoneal espera-se particularmente útil, por exemplo, no tratamento de tumores nos ovários.

Para a prevenção ou tratamento de doenças, a dosagem apropriada de anticorpo dependerá do tipo de doença a tratar, como definido atrás, da gravidade e do curso da doença, de se o anticorpo é administrado para fins preventivos ou terapêuticos, da terapia prévia, da história clínica do paciente e da resposta ao anticorpo, e da discrição do médico assistente. O anticorpo é adequadamente administrado ao paciente de uma só vez ou ao longo de uma série de tratamentos.

Os anticorpos anti-VEGF são úteis no tratamento de várias doenças e desordens neoplásicas e não neoplásicas. Os neoplasmas e condições relacionadas que são susceptíveis de tratamento incluem carcinomas da mama, carcinomas pulmonares, carcinomas gástricos, carcinomas esofágicos, carcinomas colorrectais, carcinomas hepáticos, carcinomas ovarianos, tecomas, arrenoblastomas, carcinomas cervicais, carcinoma endometrial, hiperplasia endometrial, endometriose, fibrossarcomas, coriocarcinoma, cancro da cabeça e pescoço, carcinoma nasofaríngico, carcinomas laríngicos, hepatoblastoma, sarcoma de Kaposi, melanoma, carcinomas cutâneos, hemangioma, hemangioma cavernoso, hemangioblastoma, carcinomas pancreáticos, retinoblastoma, astrocitoma, glioblastoma, Schwannoma, oligodendroglioma, meduloblastoma, neuroblastomas, rabdomiossarcoma, sarcoma osteogénico, leiomiossarcomas, carcinomas do tracto urinário, carcinomas da tiróide, tumor de wilm, carcinoma de células renais, carcinoma da próstata, proliferação vascular anómala associada a facomatoses, edema (tal como o associado a tumores cerebrais), e síndroma de Meigs. 56 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ

As condições não neoplásicas que são susceptíveis de tratamento incluem artrite reumatóide, psoríase, aterosclerose, retinopatias diabéticas e outras retinopatias proliferativas incluindo retinopatia da prematuridade, fibroplasia retrolental, glaucoma neovascular, degeneração macular relacionada com a idade, hiperplasias da tiróide (incluindo doença de Grave), transplantação da córnea e de outros tecidos, inflamação crónica, inflamação pulmonar, síndroma nefrótico, pré-eclampsia, ascites, efusão pericardial (tal como a associada a pericardite) e efusão pleural. A degeneração macular relacionada com a idade (AMD) é uma causa principal da perda visual grave na população mais idosa. A forma exudativa de AMD é caracterizada por neovascularização coróide e deslocamento de células epiteliais do pigmento retinal. Como a neovascularização coróide está associada a um drástico agravamento no prognóstico, os anticorpos contra VEGF da presente invenção esperam-se especialmente úteis na redução da gravidade da AMD.

Dependendo do tipo e da gravidade da doença, cerca de 1 μg/kg a cerca de 50 mg/kg (e.g., 0,1-20 mg/kg) de anticorpo constituem um dosagem inicial candidata para administração ao paciente, quer, por exemplo, numa ou mais administrações separadas, quer por infusão contínua. Uma dosagem diária ou semanal típica pode variar de cerca de 1 μρ/kg a cerca de 20 mg/kg ou mais, dependendo dos factores atrás mencionados. Para administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento é repetido até que ocorra uma supressão desejada dos sintomas da doença. Contudo, podem ser úteis outros regimes de dosagem. O progresso desta terapia é facilmente monitorado por técnicas e ensaios convencionais, incluindo, por exemplo, imageologia radiográfica de tumores.

De acordo com outra concretização da invenção, a eficácia do anticorpo na prevenção ou tratamento da doença pode ser melhorada através da administração do anticorpo em série ou em combinação com outro agente que é eficaz para estes fins, tal como factor de necrose tumoral (TNF), um anticorpo capaz de inibição ou neutralização da actividade angiogénica de factor do crescimento de fibroblastos ácido ou básico (FGF) ou factor de crescimento de hepatócitos (HGF), um anticorpo capaz de 57 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ inibição ou neutralização das actividades coagulantes de factores tissulares, proteína C ou proteína S (veja-se Esmon et al., Publicação de pedido de Patente PCT N°. WO 91/01753, publicado em 21 Fevereiro de 1991), um anticorpo capaz de ligação ao receptor HER2 (veja-se Hudziak et al., Publicação de pedido de Patente PCT N°. WO 89/06692, publicado em 27 Julho de 1989), ou um ou mais agentes terapêuticos convencionais tais como, por exemplo, agentes alquilantes, antagonistas do ácido fólico, antimetabolitos do metabolismo de ácido nucleico, antibióticos, análogos de pirimidina, 5-fluorouracilo, cisplatina, nucleósidos de purina, aminas, aminoácidos, nucleósidos de triazol ou corticosteróides. Estes outros agentes podem estar presentes na composição que está a ser administrada ou podem ser administrados separadamente. Também, o anticorpo é adequadamente administrado em série ou em combinação com tratamentos radiológicos, envolvendo quer irradiação quer administração de substâncias radioactivas.

Numa concretização, a vascularização de tumores é atacada em terapia de combinação. O anticorpo e um ou mais outros antagonistas anti-VEGF são administrados a pacientes com tumores em doses terapeuticamente eficazes como determinado por exemplo por observação da necrose do tumor ou seus focos metastáticos, se existirem. Esta terapia é continuada até que não se observe mais nenhum efeito benéfico adicional ou que o exame clínico não mostre vestígios do tumor ou qualquer foco metastático. Depois é administrado tnf, sozinho ou em combinação com um agente auxiliar tal como alfa -, beta- ou gama-interferão, anticorpo anti-HER2, heregulina, anticorpo anti-heregulina, factor D, interleucina-1 (IL-1), interleucina-2 (IL-2), factor estimulante de colónias de macrófagos-granulócitos (GM-CSF), ou agentes que promovem a coagulação microvascular em tumores, tais como anticorpo anti-proteína C, anticorpo anti-proteína S, ou proteína de ligação a C4b (veja-se Esmon et al., Publicação de pedido de Patente PCT N°. WO 91/01753, publicado em 21 de Fevereiro, 1991), ou calor ou radiação.

Como os agentes auxiliares vão variar em eficácia, é desejável comparar o seu impacto no tumor por rastreio de matriz da maneira convencional. A administração de anticorpo anti-VEGF e TNF é repetida até que seja conseguido o efeito 58 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ clínico desejado. Alternativamente, ο anticorpo anti-VEGF é administrado juntamente com TNF e, opcionalmente, agente(s) auxiliar(es). Em casos em que os tumores sólidos se encontram nos membros ou em outras localizações susceptíveis de isolamento da circulação geral, os agentes terapêuticos aqui descritos são administrados ao tumor ou órgão isolado. Noutras concretizações, um antagonista de FGF ou de factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), tal como um anticorpo neutralizante anti-FGF ou anti-PDGF, é administrado ao paciente em conjunto com o anticorpo anti-VEGF. O tratamento com anticorpos anti-VEGF pode ser suspenso, optimamente, durante períodos de cura de feridas ou neovascularização desejável. G. Artigos de Fabrico

Noutra concretização da invenção, é proporcionado um artigo de fabrico contendo materiais úteis para o tratamento das desordens atrás descritas. O artigo de fabrico compreende um recipiente e um rótulo. Os recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas e tubos de ensaio. Os recipientes podem ser formados de uma variedade de materiais tais como vidro ou plástico. O recipiente contém uma composição que é eficaz para o tratamento da condição e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo o recipiente pode ser um saco de solução intravenosa ou um frasco possuindo uma tampa perfurável por uma agulha de injecção hipodérmica). O agente activo na composição é o anticorpo anti-VEGF. O rótulo no, ou associado ao, recipiente, indica que a composição é utilizada para o tratamento da condição de eleição. O artigo de fabrico pode ainda compreender um segundo recipiente compreendendo um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Pode ainda incluir outros materiais desejáveis do ponto de vista do utilizador e comercial, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas e bulas de embalagem com instruções de utilização. EXEMPLO 1

Este exemplo descreve a produção de anticorpos anti-VEGF humanizados com propriedades desejáveis de um ponto de vista terapêutico. 59 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ

MATERIAIS Ε MÉTODOS

Clonagem do MAb Murino A4.6.1 e Construção de Fab Quimérico Ratinho-Humano: O MAb anti-VEGF murino A4.6.1 foi previamente descrito por Kim et al.r Growth Factors 7:53 (1992) e Kim et al. Nature 362:841 (1993). Isolou-se ARN total das células de hibridoma que produzem o MAb anti-VEGF A.4.6.1 utilizando ARNsol (TEL-TEST) e efectuou-se a transcrição inversa em ADNc utilizando iniciadores Oligo-dT e o sistema SuperScript II (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) . Sintetizaram-se conjuntos de iniciadores oligonucleotídicos degenerados, com base nas sequências de aminoácidos N-terminais das cadeias leve e pesada do anticorpo, e utilizaram-se como iniciadores directos. Os iniciadores inversos foram baseados em sequências de esqueleto 4 obtidas do subgrupo V de cadeias leves k e do subgrupo II de cadeia pesada de murino (Kabat et al. Sequences of Protelns of Immunological Interest. 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Depois de amplificação através da reacção em cadeia com polimerase (PCR), ligaram-se os fragmentos de ADN a um vector de clonagem de TA (Invitrogen, San Diego, CA) . Sequenciaram-se oito clones de cada uma das cadeias leve e pesada. Um clone com a sequência de consenso para o domínio VL de cadeia leve e um com uma sequência de consenso para o domínio VH de cadeia pesada, foram subclonados respectivamente no vector pEMXl contendo os domínios CL e CH1 humanos (Werther et al. J.

Immunol. 157:4986-4995 (1996)), gerando assim uma quimera

ratinho-humano. Este F(ab) quimérico consistia no domínio VH de A4.6.1 murino completo fundido com um domínio CH1 humano no aminoácido SerHll3 e no domínio VL de A4.6.1 murino completo fundido com um domínio CL humano no aminoácido LysL107. A expressão e a purificação do F(ab) quimérico foram idênticas às dos F(ab) humanizados. O F(ab) quimérico foi utilizado como padrão nos ensaios de ligação.

Modelos Gráficos em Computador de F(ab) Murino e

Humanizado: Sequências dos domínios VL e VH (Fig. IA e 1B) foram utilizadas para construir um modelo gráfico em computador dos domínios VL-VH de A4.6.1 murino. Este modelo foi utilizado para determinar que resíduos de esqueleto deveriam ser incorporados no anticorpo humanizado. Foi também construído um modelo do F(ab) humanizado para verificar a 60 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ correcta selecção de resíduos de esqueleto de murino. A construção de modelos foi realizada como descrito previamente (Cárter et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:4285-4289 (1992) e Eigenbrot et al. J. Mol. Biol. 229:969-995 (1993)).

Construção de F(ab) Humanizados: O plasmídeo pEMXl utilizado para mutagénese e expressão de F(ab) em E. coli foi descrito anteriormente (Werther et al., supra). Resumidamente, o plasmídeo contém um fragmento de ADN que codifica uma cadeia leve k do subgrupo I humana de consenso (VLkl-CL) e uma cadeia pesada do subgrupo III humana de consenso (VHIII-CH1) e um promotor da fosfatase alcalina. A utilização das sequências de consenso para VL e VH foi descrita anteriormente (Cárter et al., supra).

Para construir a primeira variante F(ab) de A4.6.1 humanizado, F(ab)-1, realizou-se mutagénese dirigida ao local (Kunkel et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:488-492 (1985)) sobre um molde de pEMXl contendo desoxiuridina. As seis CDR de acordo com Kabat et al., supra, foram alteradas para a sequência de A4.6.1 murino. O F(ab)-1 consistia portanto numa região de esqueleto humana completa (VL k do subgrupo I e VH do subgrupo III) com as seis sequências de CDR de murino completas. Os plasmídeos para todas as outras variantes F(ab) foram construídas a partir do plasmídeo molde de F(ab)-1. Os plasmídeos foram transformados em E. coli, estirpe XL-1 Blue (Stratagene, San Diego, CA) para a preparação de adn de cadeia dupla e simples. Para cada variante, o ADN que codifica para as cadeias leve e pesada foi completamente sequenciado utilizando o método dos didesoxinucleótidos (Sequenase, U.S. Biochemical Corp., Cleveland, OH). Os plasmídeos foram transformados em E. coli, estirpe 16C9, um derivado de MM294, plaqueou-se, em placas de caldo Luria contendo 50 μρ/ιηΐ carbenicilina, e seleccionou-se uma única colónia para expressão da proteína. A colónia única foi crescida em 5 ml de caldo Luria com 100 mg/ml de carbenicilina durante 5-8 h a 37°C. Os 5 ml de cultura foram adicionados a 500 ml de AP5 com 50 μρ/ηιΐ de carbenicilina e deixou-se crescer durante 20 h num balão de agitação de 4 L com chicanas a 30°C. O meio AP5 consiste em 1,5 g de glucose, 11,0 g de Hycase SF, 0,6 g de extracto de levedura (certificado), 0,19 g de MgS04 (anidro), 1,07 g de NH4C1, 3,73 g de KOI, 1,2 g de NaCl, 120 ml de 61 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ trietanolamina 1 Μ, ρΗ 7,4, até 1 L de água e depois esterilizou-se por filtração através de um filtro Sealkeen de 0,1 mm. Recolheram-se as células por centrifugação num frasco de centrífuga de 1 L centrífuga a 3000xg e removeu-se o sobrenadante. Após congelação durante 1 h, ressuspendeu-se a pelete em 25 ml de Tris 10 mM-EDTA 1 mM-sacarose a 20% frio, pH 8,0. Adicionaram-se 250 ml de benzamidina 0,1 M (Sigma, St. Louis, MO) para inibir a proteólise. Após agitação suave em gelo durante 3 h, centrifugou-se a amostra a 40 OOOxg durante 15 min. Aplicou-se então o sobrenadante numa coluna de proteína G-Sepharose CL-4B (Pharmacia, Uppsala, Suécia) (0,5 ml de volume de leito) equilibrada com Tris 10 mM-EDTA 1 mM, pH 7,5. Lavou-se a coluna com 10 ml de Tris 10 mM-EDTA 1 mM, pH 7,5, e eluiu-se com 3 ml de glicina 0,3 M, pH 3,0, para 1,25 ml de Tris 1 M, pH 8,0. O F(ab) foi então mudado de tampão para PBS utilizando um Centricon-30 (Amicon, Beverly, MA) e concentrado para um volume final de 0,5 ml. Correram-se géis de SDS-PAGE de todos os F(ab) para avaliar a pureza e verificou-se o peso molecular de cada variante por espectrometria de massa de electropulverização.

Construção e Expressão de IgG Quimérica e Humanizada:

Para gerar variantes de IgGl humana de A4.6.1 quimérico (chlgGl) e humanizado (huIgGl), subclonaram-se os domínios VL e VH murinos ou humanizados apropriados (F(ab)-12, Tabela 2) em vectores pRK separados, previamente descritos, (Eaton et al., Biochemistry 25:8343-8347 (1986)). O ADN que codifica para a cadeia leve completa e a cadeia pesada completa de cada variante foi verificado por sequenciação de didesoxinucleótidos.

Para expressão transiente de variantes, plasmídeos da cadeia pesada e leve foram co-transfectados em células 293 humanas (Graham et al., j. Gen. Virol. 36:59-74 (1977)), utilizando um procedimento de alta eficiência (Gorman et al., DNA Prot. Eng. Tech. 2:3-10 (1990)). Trocou-se o meio para meio isento de soro e recolheu-se diariamente durante até cinco dias. Os anticorpos foram purificados a partir dos sobrenadantes reunidos utilizando proteína A-Sepharose CL-4B (Pharmacia). O anticorpo eluído foi mudado de tampão para PBS utilizando um Centricon-30 (Amicon), concentrado para 0,5 ml, 62 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ esterilizado por filtração utilizando um Millex-GV (Millipore, Bedford, MA) e armazenado a 4°C.

Para expressão estável da variante final de igGl humanizada (rhuMAb VEGF), transfectaram-se células de ovário de hamster chinês (CHO) com vectores dicistrónicos desenhados para co-expressar ambas as cadeias pesada e leve (Lucas et al., Nucleic Acid Res. 24:1774-79 (1996)). Os plasmídeos foram introduzidos em células DP12, um derivado patenteado da linha celular CHO-Kl'DUX Bll desenvolvido por L. Chasin (Columbia University), por via de lipofecção e seleccionou-se por crescimento em meio isento de GHT (Chisholm, V. High efficiency gene transfer in mammalian cells. Em: Glover, DM, Hames, BD. DNA Cloning 4. Mammalian systems. Oxford Univ. Press, Oxford pp 1-41 (1996)). Aproximadamente 20 clones não amplificados foram escolhidos aleatoriamente e novamente semeados em placas de 96 poços. A produtividade específica relativa de cada colónia foi monitorada utilizando um ELISA para quantificar a IgG humana de comprimento completo acumulada em cada poço após 3 dias e um corante fluorescente, Calcien AM, como marcador substituto do número de células viáveis por poço. Com base nestes resultados, escolheram-se vários clones não amplificados para amplificação adicional na presença de concentrações crescentes de metotrexato. Os clones individuais que sobrevivem a 10, 50 e 100 nM de metotrexato foram escolhidos e transferidos para placas de 96 poços para rastreio de produtividade. Um clone, que exibiu reprodutivelmente elevada produtividade específica, foi expandido em balões T e utilizado para inocular uma cultura rotativa. Após várias passagens, as células adaptadas em suspensão foram utilizadas para inocular culturas de produção em meio isento de soro contendo GHT, suplementado com várias hormonas e hidrolisados de proteínas. O fluido da cultura das células recolhido, contendo rhuMAb VEGF, foi purificado utilizando proteína A-Sepharose CL-4B. A pureza após este passo foi -99%. A subsequente purificação até à homogeneidade foi realizada utilizando um passo de cromatografia de permuta iónica. O teor de endotoxina do anticorpo final purificado era <0,10 eu/mg.

Quantificação de F(ab) e IgG: Para a quantificação das moléculas de F(ab), revestiram-se placas de ELISA com 2 μρ/ιηΐ de Fab de IgG de cabra anti-humana (Organon Teknika, Durham, NC) em tampão carbonato 50 mM, pH 9,6, a 4°C durante a noite e bloqueou-se com PBS-albumina sérica bovina a 0,5% (tampão de 63 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ bloqueio) à temperatura ambiente durante 1 h. Adquiriram-se os padrões (F(ab) humano a 0,78-50 ng/ml) a Chemicon (Temecula, CA) . Incubaram-se diluições em série de amostras em PBS-albumina sérica bovina a 0,5%-polisorbato 20 a 0,05% (tampão de ensaio), nas placas, durante 2 h. O F(ab) ligado foi detectado utilizando F(ab) de igG de cabra anti-humana marcada com peroxidase de rábano (Organon Teknika), seguido por 3,3', 5,5'-tetrametilbenzidina (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) como substrato. Lavaram-se as placas entre os passos. Leu-se a absorvância a 450 nm num leitor de placas Vmax (Molecular Devices, Menlo Park, CA) . A curva padrão foi ajustada utilizando um programa de ajustamento de curvas por regressão não linear de quatro parâmetros. Os pontos de dados que caem na gama da curva padrão foram utilizados para o cálculo das concentrações de F(ab) das amostras. A concentração de anticorpo de comprimento completo foi determinada utilizando Fc de IgG de cabra anti-humana (Cappel, Westchester, PA) para a captura e Fc de cabra anti-humano marcado com peroxidase de rábano (Cappel) para a detecção. Utilizou-se IgGl humana (Chemicon) como padrão.

Ensaio de Ligação a VEGF: Para medir a actividade de ligação a VEGF dos F(ab), revestiram-se placas de ELISA com 2 μρ/ιηΐ de F(ab')2 de coelho para Fc de IgG humana (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) e bloqueou-se com tampão de bloqueio (descrito atrás). Incubaram-se na placa meios condicionados diluidos contendo 3 ng/ml de KDR-lgG (Park et al., J. Biol. Chem. 269:25646-25645 (1994)) em tampão de bloqueio, durante 1 h. Incubaram-se os padrões (F(ab) quimérico a 6,9 - 440 ng/ml) e diluições duplas em série de amostras com VEGF biotinilado 2 nM durante 1 h em tubos. As soluções dos tubos foram então transferidas para as placas de ELISA e incubadas durante 1 h. Após lavagem, detectou-se o VEGF biotinilado ligado a KDR utilizando estreptavidina marcada com peroxidase de rábano (Zymed, South San Francisco, CA ou Sigma, St. Louis, MO) seguida por 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina como substrato. As curvas de titulação foram ajustadas com programa de ajustamento de curvas por regressão não linear de quatro parâmetros (KaleidaGraph, Synergy Software, Reading PA). As concentrações das variantes de F(ab) correspondentes ao ponto médio de absorvância da curva de titulação do padrão foram calculadas e depois 64 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ divididas pela concentração do padrão correspondente ao ponto médio de absorvância da curva de titulação do padrão. Os ensaios para a IgG de comprimento completo foram os mesmos que para os F(ab) excepto que o tampão de ensaio continha 10% de soro humano.

Ensaio Biossensor BIAcore™: A ligação a VEGF dos F(ab) humanizados e quiméricos foi comparada utilizando um biossensor BIAcore™ (Karlsson et al. Methods: A Comparison to Methods in Enzymology 6:97-108 (1994)). As concentrações dos F(ab) foram determinadas por análise quantitativa dos aminoácidos. O VEGF foi acoplado a um chip biossensor CM-5 através de grupos amina primária de acordo com as instruções do fabricante (Pharmacia). As cinéticas de dissociação ("off-rate”) foram medidas por saturação do chip com F(ab) (35 μΐ de F(ab) 2 μΜ a um caudal de 20 μΐ/min) e depois troca para tampão (PBS-polisorbato 20 a 0,05%). Os pontos de dados de 0 - 4500 s foram utilizados para a análise cinética da dissociação. A constante de velocidade de dissociação (koff) foi obtida a partir do declive da representação gráfica de ln(R0/R) versus tempo, onde Ro é o sinal a t=0 e R é o sinal em cada ponto de tempo.

As cinéticas de associação ("on-rate") foram medidas utilizando diluições duplas em sérias de F(ab) (0,0625 -2 mM). O declive, Ks, foi obtido a partir da representação gráfica de ln(-dR/dt) versus tempo para cada concentração de F(ab) utilizando o software de avaliação da cinética BIAcore™ como descrito no manual do Biossensor da Pharmacia. R é o sinal no tempo t. Os resultados entre 80 e 168, 148, 128, 114, 102 e 92 s foram utilizados para F(ab) 0,0625, 0,125, 0,25, 0,5, 1 e 2 mM, respectivamente. A constante de velocidade de associação (kon) foi obtida a partir do declive da representação gráfica de Ks versus concentração de F(ab). No final de cada ciclo, o F(ab) ligado foi removido por injecção de 5 μΐ de HC1 50 mM a um caudal de 20 μΐ/min para regenerar o chip.

Ensaio de Crescimento de Células Endoteliais: Células endoteliais capilares derivadas de córtex supra-renal bovino foram cultivadas na presença de meio de Eagle modificado por Dulbecco com baixo teor de glucose (DMEM) (GIBCO) suplementado 65 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ com 10% de soro de vitelo, glutamina 2 mM e antibióticos (meio de crescimento), essencialmente como descrito anteriormente (Leung et al. Science 246:1306-1309 (1989)). Para os ensaios mitogénicos, semearam-se células endoteliais a uma densidade de 6 x 103 células por poço, em placas de 6 poços em meio de crescimento. Adicionou-se então muMAb VEGF A.4.6.1 ou rhuMAb VEGF em concentrações entre 1 e 5000 ng/ml. Após 2-3 h, adicionou-se rhVEGFl65 expresso em E.coli, purificado, até uma concentração final de 3 ng/ml. Para o controlo da especificidade, cada anticorpo foi adicionado a células endoteliais na concentração de 5000 ng/ml, sozinho ou na presença de 2 ng/ml de bFGF. Após cinco ou seis dias, as células foram dissociadas por exposição a tripsina e contadas num contador Coulter (Coulter Electronics, Hialeah, FL) . A variação relativamente à média não excedeu 10%. Os resultados foram analisados por um programa de ajustamento de curvas de quatro parâmetros (KaleidaGraph).

Estudos de Tumores In Vivo: Células de rabdomiossarcoma humano A673 (ATCC; CRL 1598) foram cultivadas como anteriormente descrito em DMEM/F12 suplementado com 10% de soro fetal bovino, glutamina 2 mM e antibióticos (Kim et al. Nature 362:841-844 (1993) e Borgstrõm et al. Câncer Res. 56:4032-4039 (1996)). Ratinhos nus BALB/c fêmea, de 6-10 semanas de idade, foram injectados subcutaneamente com 2 x 106 células tumorais na área dorsal num volume de 200 μι. Os animais foram então tratados com muMAb VEGF A.4.6.1, rhuMAb VEGF ou um MAb de controlo dirigido contra a proteína gpl20 (Kim et al. Nature 362:841-844 (1993)). Ambos os MAb anti-VEGF foram administrados nas doses de 0,5 e 5 mg/kg; o MAb de controlo foi dado na dose de 5 mg/kg. Cada MAb foi administrado duas vezes por semana intraperitonealmente num volume de 100 μΐ, começando 24 h depois da inoculação das células tumorais. Cada grupo consistia em 10 ratinhos. A dimensão dos tumores foi determinada com intervalos semanais. Quatro semanas após a inoculação das células tumorais, os animais foram eutanizados e os tumores foram removidos e pesados. A análise estatística foi realizada por anova. 66 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ

RESULTADOS

Humanização: As sequências de consenso para o subgrupo iii de cadeias pesadas humanas e para o subgrupo I de cadeias leves k foram utilizadas como esqueleto para a humanização (Kabat et al., supra) (Fig. IA e 1B) . Este esqueleto foi utilizado com sucesso na humanização de outros anticorpos murinos (Werther et al., supra; Cárter et al., supra; Presta et al. J. Immunol. 151:2623-2632 (1993); e Eigenbrot et al. Proteins 18:49-62 (1994)). CDR-H1 incluía os resíduos H26-H35. As outras CDR eram de acordo com Kabat et al., supra. Todas as variantes humanizadas foram inicialmente preparadas e rastreadas quanto à ligação na forma de F(ab) expressos em E. coli. Os rendimentos típicos de balões de agitação de 500 ml foram de 0,1-0,4 mg de F(ab).

Utilizou-se o F(ab) quimérico como padrão nos ensaios de ligação. Na variante inicial, F(ab)-1, os resíduos de CDR foram transferidos do anticorpo murino para o esqueleto humano e, com base nos modelos dos F(ab) murinos e humanizados, o resíduo na posição H49 (Ala em humano) foi alterado para o Gly murino. Em adição, os F(ab) que consistiam na cadeia pesada quimérica/cadeia leve de F(ab)-1 (F(ab)-2) e cadeia pesada de F(ab)-1/cadeia leve quimérica (F(ab)-3) foram gerados e testados quanto à ligação. O F(ab)-1 exibiu uma afinidade de ligação mais de 1000 vezes reduzida relativamente ao F(ab) quimérico (Tabela 2). A comparação das afinidades de ligação de F(ab)-2 e F(ab)-3 sugeriu que os resíduos de esqueleto no domínio VH de F(ab)-1 não precisavam de ser alterados para aumentar a ligação. 67 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ

Tabela 2: Ligação a VEGF de Variantes F(ab) Anti-VEGF Humanizadasa

Variante Molde Alterações15 Finalidade EC50 F(ab)—X EC50 F(ab)c quimérico Média D.P. N F (ab) quim. F (ab) quimérico 1,0 F(ab)-1 FR Humana Troca de CDR directa AlaH49Gly >1350 2 F(ab)-2 Cadeia leve da quimera Cadeia pesada de F(ab)-1 >145 3 F(ab)-3 Cadeia leve de F(ab)-l Cadeia pesada da quimera 2,6 0,1 2 F(ab)-4 F(ab)-1 ArgH71Leu AsnH73Thr Conformação CDR-H2 Esqueleto >295 3 F(ab)-5 F(ab)-4 LeuL46Val Interface VL-VH 80,9 6,5 2 F(ab)-6 F(ab)-5 LeuH78Ala Conformação CDR-H1 36,4 4,2 2 F(ab)-7 F(ab)-5 IleH69Phe Conformação CDR-H2 45,2 2,3 2 F(ab)-8 F(ab)-5 IleH69Phe LeuH78Ala Conformação CDR-H2 Conformação CDR-H1 9,6 0,9 4 F(ab)-9 F(ab)-8 GlyH49Ala Conformação CDR-H2 >150 2 F(ab)-10 F(ab)-8 AsnH76Ser Esqueleto 6,4 1,2 4 F(ab)-11 F(ab)-10 LysH75Ala Esqueleto 3,3 0,4 2 F(ab)-12 F(ab)-10 ArgH94Lys Conformação CDR-H3 1,6 0,6 4 a As variantes de F(ab) anti-VEGF foram incubadas com VEGF biotinilado e depois transferidas para placas de ELISA revestidas com KDR-IgG (Park et al., supra). b Os resíduos de murino estão sublinhados; os números dos resíduos são de acordo com Kabat et al., supra. c A média e o desvio padrão são a média das razões calculadas para cada um dos ensaios independentes; o EC50 para o F(ab) quimérico foi de 0,049 +/-0,013 mg/ml (1,0 nM).

A alteração dos resíduos humanos H71 e H73 para as suas contrapartidas murinas em F(ab)-4 melhorou a ligação em 4 vezes (Tabela 2). A inspecção dos modelos dos F(ab) murinos e humanizados sugeriu que o resíduo L46, enterrado na interface VL-VH e interactuando com CDR-H3 (Fig. 2), pode também desempenhar um papel quer na determinação da conformação de CDR-H3 e/ou afectando a relação dos domínios VL e VH. Quando o Vai murino foi alterado para o Leu humano em L46 (F(ab)-5), a afinidade de ligação aumentou quase 4 vezes (Tabela 2) . Três outros resíduos de esqueleto enterrados foram avaliados com base nos modelos moleculares: H49, H69 e H78. A 68 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ posição Η69 pode afectar a conformação de CDR-H2 enquanto a posição H78 pode afectar a conformação de CDR-Hl (Figura 2). Quando cada um foi individualmente alterado de humano para a contrapartida de murino, a ligação melhorou 2 vezes em cada caso (F(ab)-6 e F(ab)-7, Tabela 2). Quando ambos foram simultaneamente alterados, o melhoramento na ligação foi de 8 vezes (F(ab)-8, Tabela 2). O residuo H49 foi originalmente como Gly murino; quando alterado para a contrapartida de consenso humana Ala, a ligação foi reduzida 15 vezes (F(ab)-9, Tabela 2).

Em F(ab)-10 e F(ab)-ll, dois resíduos na ansa 3 de esqueleto, FR-3, foram alterados para as suas contrapartidas de murino: AsnH76 para Ser murina (F(ab)-10) e LysH75 para Ala murina (F(ab)-ll). Ambos efectuaram um melhoramento relativamente pequeno na ligação (Tabela 2). Finalmente, na posição H94 as sequências humana e murina muito frequentemente possuem uma Arg (Kabat et al.r supra). Em F(ab)-12, esta Arg foi substituída pela rara Lys encontrada no anticorpo murino (Fig.lA) e isto resultou numa ligação que foi menos de 2 vezes a do F(ab) quimérico (Tabela 2). O F(ab)-12 foi também comparado com o F(ab) quimérico utilizando o sistema BIAcore™ (Pharmacia). Utilizando esta técnica a Kd do F(ab)-12 humanizado foi 2 vezes mais fraca do que a do F(ab) quimérico devido tanto a uma mais lenta kon como a uma mais rápida koff (Tabela 3).

Tabela 3: Ligação de Variantes de F(ab) Anti-VEGF a VEGF Utilizando o Sistema BIAcorem

Variante Quantidade de koff kon Kd (Fab) ligado (UR) (s-1) (M-V1) (nM) F(ab) quimb 4250 5,9xl0~b 6,5xl04 0,91 F(ab)-12 3740 6,3xl0_b 3,5xl04 1,8 a A quantidade de F(ab) ligado, em unidades de ressonância (UR), foi medida utilizando um sistema BIAcore™ quando se injectaram 2 μg de F(ab) num chip contendo 2480 UR de VEGF imobilizado. A cinética da dissociação (k0ff) foi medida por saturação do chip com F(ab) e depois monitoração da dissociação após troca para tampão. A cinética da associação (kon) foi medida utilizando diluições duplas em série de F(ab). A Kd, a constante de equilíbrio de dissociação, foi calculada como koff/kon. b F(ab) quim é um F(ab) quimérico com domínios VL e VH de murino fundidos com os domínios pesado CH1 e CL humanos.

Os MAb de comprimento completo foram construídos fundindo os domínios VL e VH do F(ab) quimérico e F(ab)-12 variante com os domínios constantes da cadeia leve k humana e cadeia pesada 69 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ de igGl humana. Ο 12-lgGl de comprimento completo (F(ab)-12 fundido com igGl humana) exibiu ligação que foi 1,7 vezes mais fraca do que a da IgGl quimérica (Tabela 4) . Tanto 12-lgGl como a IgGl quimérica ligaram-se ligeiramente menos bem do que o MAb murino original A4.6.1 (Tabela 4).

Tabela 4: Ligação de Variantes de IgG Anti-VEGF a VEGFa

IgGl/chlgGl13 Variante Média D.P. N chlgGl 1,0 2 murlgGl0 0, 759 0,001 2 12-IgGld 1, 71 0,03 2 a As variantes de IgG anti-VEGF foram incubadas com VEGF biotinilado e depois transferidas para placas de ELISA revestidas com KDR-IgG (Park et al., (1994), supra) . b chlgGl é IgGl quimérica com domínios VL e VH de murino fundidos com CL e cadeias pesadas de IgGl humanas; a EC50 para chlgGl foi de 0,113 + /- 0,013 μρ/ml (0,75 nM). 0 murlgGl é muMAbVEGF A461 purificado de ascites. d 12-lgGl é domínios VL e VH de F(ab)-12 fundidos com CL e cadeias pesadas de IgGl humanas.

Estudos Biológicos: Compararam-se rhuMAb VEGF e muMAb VEGF A.4.6.1. quanto à sua capacidade para inibir a proliferação de células endoteliais capilares bovinas em resposta a uma concentração próxima do máximo de eficácia de VEGF (3 ng/ml). Como ilustrado na Figura 3, os dois MAb foram essencialmente equivalentes, tanto em potência como em eficácia. Os valores de ED50 foram respectivamente de 50 +/-5 ng/ml e 48 +/- 8 ng/ml (~0,3 nM) . Em ambos os casos conseguiu-se 90% de inibição na concentração de 500 ng/ml (~3 nM). Nem muMAb VEGF A.4.6.1 nem rhuMAb VEGF tiveram qualquer efeito sobre a proliferação basal ou estimulada por bFGF de células endoteliais capilares, confirmando que a inibição é especifica para VEGF.

Para determinar se esta equivalência se aplica também a um sistema in vivo, os dois anticorpos foram comparados quanto à sua capacidade para suprimir o crescimento de células de rabdomiossarcoma humano A673 em ratinhos nus. Estudos anteriores mostraram que o muMAb VEGF A.4.6.1 possui um drástico efeito inibidor neste modelo de tumor (Kim et al. Nature 362:841-844 (1993) e Borgstrõm et al. Câncer Res 70 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ 56:4032-4039 (1996)). Como mostrado na Figura 4, em ambas as doses testadas (0,5 e 5 mg/kg), os dois anticorpos suprimiram marcadamente o crescimento tumoral conforme avaliado por medições do peso dos tumores quatro semanas após a inoculação das células. As diminuições no peso do tumor comparadas com o grupo de controlo foram, respectivamente, de 85% e 93% para cada dose nos animais tratados com muMAb VEGF A.4.6. 1. versus 90% e 95% nos animais tratados com rhuMAb VEGF. Obtiveram-se resultados similares com a linha de células de carcinoma da mama MDA-MB 435. EXEMPLO 2 (Arte Anterior)

Neste exemplo, o anticorpo murino anti-VEGF A4.6.1 atrás discutido foi humanizado tornando aleatórios um pequeno conjunto de resíduos de esqueleto e por exibição monovalente da biblioteca resultante de moléculas de anticorpo na superfície de fagos filamentosos para identificar as sequências de esqueleto de elevada afinidade através de selecção à base da afinidade.

MATERIAIS E MÉTODOS

Construção de Vector Fagemídico Anti-VEGF, pMB4-19: O MAb anti-VEGF murino A4.6.1 está discutido atrás no Exemplo 1. A primeira variante Fab de A4.6.1 humanizado, hu2.0, foi construída por mutagénese dirigida ao local utilizando um molde de plasmídeo pAK2 contendo desoxiuridina (Cárter et al. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 89:4285-4289 (1992)) que codifica para um fragmento Fd de cadeia leve VLKl-CKi humana e cadeia pesada VHIII-CHlyi humana. As sequências de CDR de A4.6.1 transplantadas foram escolhidas de acordo com a definição de sequências de Kabat et al., supra, excepto para CDR-Hl que incluía os resíduos 26-35. A sequência de codificação de Fab foi subclonada no vector fagemídico phGHamg3 (Bass et al. Proteins 8:309-314 (1990) e Lowman et al. Biochemistry 30:10832-10838 (1991)). Esta construção, pMB4-19, codifica o Fab de A4.6.1 humanizado inicial, hu2.0, com o terminal C da cadeia pesada fundido precisamente com a porção carboxilo da proteína de revestimento do gene III de M13. pMB4-19 é similar em construção ao pDHl88, um plasmídeo previamente descrito para exibição monovalente de fragmentos 71 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ

Fab (Garrard et al. Biotechnology 9:1373-1377 (1991)). As diferenças notáveis entre pMB4-19 e pDHl88 incluem um segmento do gene III de Ml3 mais curto (codões 249-406) e a utilização de um codão de stop âmbar imediatamente após o fragmento Fd de cadeia pesada do anticorpo. Isto permite a expressão tanto de cadeia pesada segregada como de fusões cadeia pesada-gene iii em estirpes supressoras supE de E. coli.

Expressão e Purificação de Fragmento Fab de A4.6.1 Humanizado: A estirpe 34B8 de E. coli, um não supressor, foi transformada com fagemideo pMB4-19, ou suas variantes. Cresceram-se colónias individuais durante a noite a 37°C em 5 mL de 2YT contendo 50 μg/mL de carbenicilina. Estas culturas foram diluídas em 200 mL de meio AP5 (Chang et al. Gene 55:189-196 (1987)) contendo 20 μg/mL de carbenicilina e incubadas durante 26 h a 30°C. Formou-se uma pelete das células a 4000 x g e congelou-se a -20°C durante pelo menos 2 h. As peletes de células foram então ressuspensas em 5 mL de Tris-HCl 10 mM (pH 7,6) contendo EDTA 1 mM, agitadas a 4°C durante 90 min e centrifugadas a 10 000 x g durante 15 min. O sobrenadante foi aplicado numa coluna de 1 mL de proteína G de estreptococos-Sepharose (Pharmacia) e lavou-se com 10 mL de MES 10 mM (pH 5,5). O fragmento Fab ligado foi eluído com 2,5 mL de ácido acético 100 mM e imediatamente neutralizado com 0,75 mL de Tris-HCl 1M, pH 8,0. As preparações de Fab foram trocadas de tampão para PBS e concentradas utilizando concentradores Centricon-30 (Amicon). Os rendimentos típicos de Fab eram de ~1 mg/L de cultura, após purificação em proteína G. As amostras de Fab purificado foram caracterizadas por espectrometria de massa de electropulverização, e as concentrações foram determinadas por análise dos aminoácidos.

Construção da Biblioteca em Fagemídeos de Fab Anti-VEGF: A biblioteca em fagemídeos de A4.6.1 humanizado foi construída por mutagénese dirigida ao local de acordo com os método de Kunkel et al. Methods Enzymol. 204:125-139 (1991)). Um derivado de pMB4-19 contendo tripletos de stop TAA nos codões de VH 24, 37, 67 e 93 foi preparado para utilização como molde de mutagénese (toda a numeração de sequências de acordo com Kabat et al., supra). Esta modificação foi para evitar subsequente contaminação de fundo por sequências de tipo selvagem. Os codões alvo para se tornarem aleatórios eram 4 e 72 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ 71 (cadeia leve) e 24, 37, 67, 69, 71, 73, 75, 76, 78, 93 e 94 (cadeia pesada).

De modo a tornar aleatórios os codões de cadeia pesada 67, 69, 71, 73, 75, 76, 78, 93 e 94 com um único oligonucleótido mutagénico, pré-montaram-se primeiro dois oligonucleótidos 126-mero a partir de fragmentos 60-mero e 66-mero por ligação enzimática assistida por molde.

Especificamente, 1,5 nmol de oligonucleótido fosforilado em 5' 503- 1 (5'-GAT TTC AAA CGT CGT NYT ACT WTT TCT AGA GAC AAC TCC AAA AAC ACA BYT TAC CTG CAG ATG AAC-3' (SEQ ID NO :22)) ou 503-2 (5'-GAT TTC AAA CGT CGT NYT ACT WTT TCT TTA GAC ACC TCC GCA AGC ACA BYT TAC CTG CAG ATG AAC-3' (SEQ ID NO:23)) foram combinados com 1,5 nmol de 503-3 (5'-AGC CTG CGC GCT GAG GAC ACT GCC GTC TAT TAC TGT DYA ARG TAC CCC CAC TAT TAT GGG-3' (SEQ ID NO:24)) (codões tornados aleatórios sublinhados; N=A/G/T/C; W=A/T; B=G/t/C; D=G/A/T; R=A/G; y=C/T). Depois, adicionaram-se 1,5 nmol de oligonucleótido molde (5'-CTC AGC GCG CAG GCT GTT CAT CTG CAG GTA-3 ' (SEQ ID NO:25)), com sequência complementar às extremidades 5' de 503-1/2 e à extremidade 3' de 503-3, para hibridar com cada extremidade da junção de ligação. Adicionaram-se ligase Taq (ligase termostável de New England Biolabs) e tampão, e submeteu-se a mistura reaccional a 40 operações de ciclos térmicos, (95°C 1,25 min; 50 °C durante 5 min) de modo a submeter o oligonucleótido molde a ciclos entre junções ligadas e não ligadas. Os oligonucleótidos produto 126-mero foram purificados num gel de ureia a 6%/poliacrilamida TBE e extraídos da poliacrilamida em tampão. Os dois produtos 126-mero foram combinados em igual proporção, precipitados com etanol e finalmente solubilizados em Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM. O produto oligonucleótido 126-mero misto foi denominado 504- 01. A operação de tornar aleatórios os codões de esqueleto seleccionados (VL 4, 71; VH 24, 37, 67, 69, 71, 73, 75, 76,

93, 94) foi efectuada em dois passos. Primeiro, conseguiu-se tornar aleatória a VL preparando três derivados adicionais do molde pMB4-19 modificado. Os codões de esqueleto 4 e 71 na cadeia leve foram substituídos individualmente ou em pares utilizando os dois oligonucleótidos mutagénicos 5'-GCT GAT ATC CAG TTG ACC CAG TCC CCG-3' (SEQ ID NO:26) e 5'-TCT GGG ACG GAT 73 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ TAC ACT CTG ACC ATC-3' (SEQ ID ΝΟ:27). Preparou-se Ο molde contendo desoxiuridina a partir de cada um destes novos derivados. Juntamente com o molde original, estas quatro construções codificavam para cada uma das quatro possíveis combinações de sequências de esqueleto de cadeia leve (Tabela 5).

Os oligonucleótidos 504-1, uma mistura de dois oligonucleótidos 126-mero (veja-se atrás), e 5'-CGT TTG TCC TGT GCA RYT TCT GGC TAT ACC TTC ACC AAC TAT GGT ATG AAC TGG RTC CGT CAG GCC CCG GGT AAG-3' (SEQ ID NO:28) foram utilizados para tornar aleatórios os codões de esqueleto da cadeia pesada utilizando cada um dos quatro moldes acabados de descrever. As quatro bibliotecas foram electroporadas em células de E. coli XL-1 Blue (Stratagene) e combinadas. O número total de transformantes independentes foi estimado em >1,2 x 108, aproximadamente 1 500 vezes maior do que o número máximo de sequências de ADN na biblioteca.

Foram desenvolvidos uma variedade de sistemas para a exibição funcional de fragmentos de anticorpo na superfície de fagos filamentosos. Winter et al., Ann. Rev. immunol. 12,433 (1994). Estes incluem a exibição de fragmentos Fab ou Fv de cadeia única (scFv) na forma de fusões com proteínas de revestimento do gene VIII ou o gene III de bacteriófago M13. O sistema aqui seleccionado é similar ao descrito por Garrard et al., Biotechn, 9, 1373 (1991) em que um fragmento Fab é exibido de modo monovalente na forma de uma fusão do gene III (Figura 7). Este sistema possui duas características notáveis. Em particular, ao contrário de scFv, os fragmentos Fab não têm tendência para formar espécies diméricas, cuja presença pode impedir a selecção dos ligantes mais fortes devido a efeitos de avidez. Adicionalmente, a monovalência da proteína exibida elimina uma segunda fonte potencial de efeitos de avidez que de outro modo resultaria da presença de múltiplas cópias de uma proteína em cada partícula fagemídica. Bass e Wells, Proteins 8:309 (1990) e Lowman et al., Biochemistry 30:10832 (1991) .

As partículas fagemídicas que exibem os fragmentos Fab do A4.6.1 humanizado foram propagadas em células de E. coli XL-1 Blue. Resumidamente, as células portadoras da construção pMB4-19 tornada aleatória foram crescidas durante a noite a 74 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ 37°C em 25 mL de meio 2YT contendo 50 μρ/ηιΒ de carbenicilina e aproximadamente IO10 de fago auxiliar M13K07 (Vieira & Messing Methods Enzymol. 153:3-11 (1987)). Purificaram-se reservas de fagemideo a partir dos sobrenadantes da cultura por precipitação com uma solução salina de polietilenoglicol, e ressuspenderam-se em 100 μΒ de PBS (~ 1014 fagemídeo/mL)

Selecção de Variantes Fab de A4.6.1 Humanizado:

Revestiu-se um poço de uma placa de microtitulo com VEGF121 purificado (100 μ]-, a 10 μρ/ιηΒ em PBS) durante a noite a 4°C. Rejeitou-se a solução de revestimento e este poço, em adição a um poço não revestido, foram bloqueados com leite desnatado a 6% durante lhe lavados com PBS contendo 0,05% de TWEEN 20™ (detergente). Depois, adicionaram-se a cada poço 10 μΒ de reserva de fagemideo, diluida para 100 μΒ com Tris 20 mM (pH 7,5) contendo 0,1% de BSA e 0,05% de TWEEN 20™. Após 2 horas lavaram-se os poços e eluiu-se o fago ligado com 100 μΒ de glicina 0,1 M (pH 2,0), e neutralizou-se com 25 μΒ de Tris 1M pH 8,0. Utilizou-se uma alíquota deste material para titular o número de fagos eluídos. Os restantes fagos que eluiram do poço revestido com VEGF foram propagados para utilização no ciclo de selecção seguinte. Realizaram-se um total de 8 operações de selecção após as quais foram seleccionados e sequenciados 20 clones individuais (Sanger et al. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 74:5463-5467 (1977)).

Determinação das Afinidades de Ligação a VEGF: As constantes de velocidade de associação (kon) e de dissociação (k0ff) para a ligação das variantes Fab de A4.6.1 humanizado a VEGF121 foram medidas por ressonância plasmónica de superfície (Karlsson et al. J. Immun. Methods 145:229-240 (1991)) num instrumento BIAcore da Pharmacia. O VEGF121 foi covalentemente imobilizado no chip biossensor através dos grupos amina primária. A ligação de variantes Fab de A4.6.1 humanizado foi medida por escoamento de soluções de Fab em PBS/TWEEN 20™ a 0,05% sobre o chip com um caudal de 20 μΒ/min. Após cada medição da ligação, separou-se o Fab residual do ligando imobilizado por lavagem com 5 μΒ de HC1 aquoso 50 mM a 3 μΒ/min. Os perfis de ligação foram analisados por regressão não linear utilizando um modelo de ligação monovalente simples (software BIAevaluation v2.0; Pharmacia). 75 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ

RESULTADOS

Construção do Α4.6.1 Humanizado: Construiu-se um fragmento Fab de A4.6.1 humanizado inicial (hu2.0, Fig. 5A e 5B), em que as CDR de A4.6.1 foram enxertadas num esqueleto VlKI-VhIII humano. Todos os outros residuos no hu2.0 foram mantidos na forma da sequência humana. A ligação desta variante a VEGF foi tão fraca que não foi detectável. Com base na afinidade relativa de outras variantes de A4.6.1 humanizado com ligação fraca, a KD para a ligação de hu2.0 foi estimada em >7 μΜ. Isto contrasta com uma afinidade de 1,6 nM para a construção de Fab quimérico que consiste nos domínios VL e VH intactos de A4.6.1 murino e domínios constantes humanos. Assim, a ligação de hu2.0 a VEGF foi reduzida pelo menos 4000 vezes relativamente à quimera.

Desenho da Biblioteca de Anticorpos: O grupo de alterações no esqueleto na sequência de esqueleto humana é aqui apresentada na Tabela 5 e na Fig. 6.

Tabela 5: Resíduos de Esqueleto Chave Importantes para a Ligação ao Antigénio e que são Alvo para serem Tornados Aleatórios

Resíduo de esqueleto Resíduo de consenso VHIII, vkli humano Resíduo de A4.6.1 murino Tornados aleatórios* vL 4 Met Met Met, Leu 71 Phe Tyr Phe, Tyr VH 24 Ala Ala Ala, Vai, Thr 37 Vai Vai Vai, Ile 67 Phe Phe Phe, Vai, Thr, Leu, Ile, Ala 69 Ile Phe Ile, Phe 71 Arg Leu Argb, Leub 73 Asp Thr Aspb, Thrb 75 Lys Ala Lysb, Alab 76 Asn Ser Asnb, Serb 78 Leu Ala Leu, Ala, Vai, Phe 93 Ala Ala Ala, Vai, Leu, Ser, Thr 94 Arg Lys Arg, Lys a diversidade de aminoácidos na biblioteca em fagemideos b Vh71, 73, 75, 76 tornados aleatórios para obter a tétrada todo murino (L71/T73/A75/S76) ou todo humano (R71/D73/K75/N76)

Uma preocupação no desenho da biblioteca de A4.6.1 humanizado em fagemideos foi de que os residuos alvo para se 76 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ tornarem aleatórios estavam amplamente distribuídos pelas sequências VL e VH. As limitações no comprimento de oligonucleótidos sintéticos implicam que tornar aleatória em simultâneo cada uma destas posições de esqueleto apenas possa ser conseguido através da utilização de múltiplos oligonucleótidos. Contudo, como o número total de oligonucleótidos aumenta, a eficiência da mutagénese diminui (i.e. a proporção de mutantes obtidos que incorporam a sequência derivada de todos os oligonucleótidos mutagénicos). Para ultrapassar este problema, foram incorporadas duas características na construção da biblioteca. A primeira consistiu em preparar quatro moldes de mutagénese diferentes codificando para cada uma das possíveis combinações de esqueleto de VL. Isto foi simples de efectuar dada a limitada diversidade do esqueleto da cadeia leve (apenas 4 sequências diferentes), mas foi benéfico na medida em que eliminou a necessidade de dois oligonucleótidos da estratégia da mutagénese. Em segundo lugar, pré-montaram-se dois oligonucleótidos de 126 bases a partir de fragmentos sintéticos mais pequenos. Isto tornou possível tornar aleatórios os codões de VH 67, 69, 71, 73, 75, 76, 93 e 94 com um único oligonucleótido longo, em vez de dois mais pequenos. A estratégia final de mutagénese aleatória empregou portanto apenas dois oligonucleótidos simultaneamente em quatro moldes diferentes.

Selecção de Fab de A4.6.1 Humanizado com Ligação Forte:

Variantes da biblioteca de Fab de A4.6.1 humanizado em fagemídeos foram seleccionadas com base na ligação a VEGF. 0 enriquecimento de fagemídeo funcional, como medido por comparação dos títulos para fago eluído de um poço de placa de microtítulo revestido com VEGF versus um não revestido, aumentou até à sétima operação de selecção ("panning”) por afinidade. Após uma operação adicional de selecção, foram sequenciados 20 clones para identificar os resíduos de esqueleto preferidos seleccionados em cada posição tornada aleatória. Estes resultados, resumidos na Tabela 6, revelaram forte consenso entre os clones seleccionados. Dez dos vinte clones tinham a sequência de ADN idêntica, e designaram-se hu2.10. Das treze posições de esqueleto tornadas aleatórias, seleccionaram-se oito substituições em hu2.10 (VL 71; VH 37, 71, 73, 75, 76, 78 e 94) . É interessante que os resíduos de VH 77 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ 37 (Ile) e 78 (Vai) não foram seleccionados nem como sequência de VHIII humana nem de A4.6.1 murino. Este resultado sugere que algumas das posições de esqueleto podem beneficiar da extensão da diversidade para além das sequências de esqueleto alvo humana e murina progenitora.

Tabela 6: Sequências Seleccionadas da Biblioteca de Fab de A4.6.1 Humanizado em Fagemídeos

Variante Substituições de Resíduos VL VH 4 71 24 37 67 69 71 73 75 76 78 93 94 A4.6 .1 murino M Y A V F F L T A S A A K hu2.0 (enxerto de CDR) M F A V F I R N K N L A R Clones seleccionados dos fagos: hu2.1(2) - Y - I - - - - - - V - K hu2.2(2) L Y - I - - - - - - V - K hu2.6(1) L - - I T - L T A S V - K hu2.7(1) L - - I - - - - - - V - K hu2.10(10) - Y - I - - L T A s V - K

As diferenças entre hu2.0 e os anticorpos A4.6.1 murinos estão sublinhadas. O número de clones idênticos identificados para cada sequência seleccionada no fago está indicado entre parêntesis. Os travessões nas sequências de clones seleccionados nos fagos indicam a selecção da sequência de esqueleto VLKI-VHIII humana (i.e. como em hu2.0).

Haviam quatro outras sequências de aminoácidos únicas entre os restantes dez clones analisados: hu2.1, hu2.2, hu2.6 e hu2.7. Todos estes clones, em adição a hu2.10, continham idênticas substituições no esqueleto nas posições VH 37 (Ile), 78 (Vai) e 94 (Lys), mas retinham a sequência de consenso VHIII humana nas posições 24 e 93. Quatro clones tinham perdido a sequência de codificação da cadeia leve e não se ligaram a VEGF quando testados num ensaio ELISA dos fagos (Cunningham et al. EMBO J. 13:2508-251 (1994)). Estes artefactos podem frequentemente ser minimizados reduzindo o número de ciclos de selecção ou propagando as bibliotecas em meios sólidos.

Expressão e Afinidade de Ligação de Variantes de A4.6.1 Humanizado: As variantes seleccionadas em fagos hu2.1, hu2.2, hu2.6, hu2.7 e hu2.10 foram expressas em E. coli utilizando balões de agitação e os fragmentos Fab foram purificados a 78 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ

partir de extractos periplasmáticos por cromatografia de afinidade em proteína G. Os rendimentos recuperados de Fab para estes cinco clones variaram de 0,2 (hu2.6) a 1,7 mg/L (hu2.1). A afinidade de cada uma destas variantes para com o antigénio (VEGF) foi medida por ressonância plasmónica de superfície num instrumento BIAcore (Tabela 7). A análise destes resultados de ligação revelou que o clone de consenso hu2.10 possuia a maior afinidade para com VEGF das cinco variantes testadas. Assim, a biblioteca de Fab em fagemídeos foi selectivamente enriquecida no clone com ligação mais forte. A KD calculada para hu2.10 foi de 55 nM, pelo menos 125 vezes mais forte do que para hu2.0 que não contém alterações no esqueleto (KD >7 μΜ). As outras quatro variantes seleccionadas exibiram todas ligação mais fraca a VEGF, variando de forma decrescente até uma KD de 360 nM para a mais fraca (hu2.7). É interessante que a KD para hu2.6, 67 nM, foi apenas marginalmente mais fraca do que a de hu2.10 e no entanto apenas se encontrou uma cópia deste clone entre os 20 clones sequenciados. isto pode dever-se a um menor nível de expressão e exibição, como foi o caso quando se expressou o Fab solúvel desta variante. Contudo, apesar da menor taxa de expressão, esta variante é útil como anticorpo humanizado.

Tabela 7: Afinidade de Ligação a VEGF de Variantes Fab de A4. 6.1 Humanizado

Variante kon koff KD Kd(A4.6.1) m"VVio4 íoV1 nM KD(mut) Quimera de A4.6.1 5,4 0, 85 1,6 >4000 hu2.0 ND ND > 7000** Clones seleccionados em fagos: hu2.1 0, 70 18 260 170 hu2.2 0,47 16 340 210 hu2.6 0,67 4,5 67 40 hu2.7 0,67 24 360 230 hu2.10 0,63 3,5 55 35 *hu2.10V 2,0 1,8 9,3 5, 8 *hu2.10V = hu2.10 com a mutação VL Leu-> Vai

Os erros estimados nas medições de ligação em Biacore são de +/-25%. **Demasiado fraca para ser medida; estimativa de ligação mais fraca

Melhoramento Adicional da Variante Humanizada hu2.1:

Apesar do grande melhoramento na afinidade para com o antigénio sobre a variante humanizada inicial, a ligação de 79 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ hu2.10 a VEGF era ainda 35 vezes mais fraca do que um fragmento Fab quimérico contendo os domínios VL e VH de A4.6.1 murino. Esta diferença considerável sugere que possa ser possível uma optimização adicional do esqueleto humanizado através de mutações adicionais. Dos resíduos de Vernier identificados por Foote & Winter J. Mol. Biol. 224:487-499 (1992), apenas os resíduos VL 46, VH 2 e VH 48 diferiam no esqueleto de A4.6.1 versus VLKI-VHIII humana (Fig. 5A e 5B) mas não foram tornados aleatórios na nossa biblioteca em fagemídeos. Um modelo molecular do fragmento Fv de A4.6.1 humanizado mostrou que o VL 46 está na interface VL-VH e podia influenciar a conformação de CDR-H3. Adicionalmente, este aminoácido é quase sempre leucina na maior parte dos esqueletos VLK (Kabat et al., supra), mas é valina em A4.6.1. Assim, fez-se uma substituição Leu -> Vai nesta posição sobre o fundo de hu2.10. A análise da cinética da ligação para esta nova variante, hu2.10v, indicou um melhoramento adicional de 6 vezes na KD para a ligação a VEGF, demonstrando a importância da valina na posição VL 46 no anticorpo A4.6.1. A KD para hu2.10v (9,3 nM) estava assim dentro de 6 vezes relativamente à da quimera. Em contraste com VL 46, não se observou qualquer melhoramento na afinidade de ligação de hu2.10 para a substituição de Vh 2 ou VH 48 pelo correspondente resíduo de A4.6.1 murino. EXEMPLO 3

Neste exemplo, tornar aleatórias as CDR, a maturação de afinidade por exibição monovalente de Fab em fagos e a combinação cumulativa de mutações, foram as técnicas utilizadas para melhorar a afinidade de um anticorpo anti-VEGF humanizado.

Construção do Anticorpo Humanizado pYOlOl: Utilizou-se o vector de anticorpo exibido em fagos phMB4-19-1.6 (veja-se Fig. 8A-E) como progenitor. Nesta construção, o anti-VEGF é expresso na forma de um fragmento Fab com a sua cadeia pesada fundida com o terminal N de g3p truncado. Ambas cadeias, leve e pesada, estão sob o controlo do promotor de phoA com uma sequência de sinal stll a montante para a secreção no periplasma. Realizaram-se mutações pontuais fora das regiões CDR por mutagénese dirigida ao local para melhorar a afinidade para com VEGF com os oligonucleótidos HL-242, HL-243, HL-245, HL-246, HL-254, HL-256 e HL-257 tal como mostrado na Tabela 8 adiante: 80 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ

Tabela 8: Oligos para Mutações Dirigidas Número do oligo Região Substituições/ Comentários Sequência HL-242 VL M4L 5'-GATATCCAGTTGACCCAGTCCCCG-3 ' (SEQ ID NO:29) HL-243 VL L46V 5'-GCTCCGAAAGTACTGATTTAC-3' (SEQ ID NO:30) HL-245 VH CDR-7 5'-CGTCGTTTCACTTTTTCTGCAGACACCT CCAGCAACACAGTATACCTGCAGATG-3’ (SEG ID NO:31) HL-246 VH R98K 5'-C T ATT ACT GTGC A AAGT ACCCCC AC-31 (SEQ ID NO:32) HL-254 VL Y71F 5'-GGG ACGGATTT C ACT CTG ACC AT C-3' (SEQ ID NO:33) HL-256 VH I37V 5'-GGTATGAACTGGGTCCGTCAGGCCCC-3' (SEQ ID NO:34) HL-257 VH CDR-7 A72L S76K N77S 5'-CGTCGTTTCACTTTTTCTTTAGACACCT CC AAAAGCACAGCAT ACCTGCAGATGAA C-3’ (SEQ ID NO:35) A variante resultante foi denominada Y0101 (Fig.9A e 9B).

Construção da Primeira Geração de Bibliotecas de Anticorpos em Fagos: Para evitar contaminação pela sequência de tipo selvagem, prepararam-se moldes com o codão de stop TAA nos locais alvo para serem tornados aleatórios e utilizaram-se para a construção de bibliotecas por mutagénese dirigida ao local com oligonucleótidos utilizando o codão degenerado NNS (onde N é uma mistura igual de A, G, C e T enquanto S é uma mistura igual de G e C) para mutagénese de saturação. Escolheram-se VL1 e VH3 como potenciais candidatos para melhoramento da afinidade (Fig. 9A e B) . No interior das CDR, construiram-se duas bibliotecas a partir do molde pYOlOl. VL1 foi mutada utilizando os oligonucleótidos molde com stop HL-248 e HL-249 (Tabela 9) e os oligonucleótidos da biblioteca HL-258 e HL-259 (Tabela 10). De modo semelhante, construiram-se três bibliotecas para VH3 utilizando os oligonucleótidos molde com stop HL-250, HL-251 e HL-252 (Tabela 9), e os oligonucleótidos da biblioteca hl-260, FIL-261 e HL-262 (Tabela 10). A construção da biblioteca está resumida nas Tabelas 9 e 10 adiante. 81 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ

Tabela 9: Oligos Molde para Mutagénese Número do oligo Região Comentário Sequência HL-248 VL1 5-GGGTCACCATCACCTGCTAAGCATAATAATAA TAAAGCAACTATTTAAACTGG-3' (SEQID NO:36) HL-249 VL1 5’-GCGCAAGTCAGGATATTTAATAATAATAATAA TGGTATCAACAGAAACCAGG-3' (SEQ ID NO:37) HL-250 VH3 5‘- GTCT ATTACTGTGCAAAGT AATAACACTAATA AGGGAGCAGCCACTGG-3' (SEQ ID NO:38) HL-251 VH3 5'- GGTACCCCC ACT ATT ATT AATAAT AATAATGG TATTTCGACGTCTGGGG-3' (SEQ ID NO:39) HL-252 VH3 5-CACT ATTATGGGAGCAGCCACTAATAATAATA AGTCTGGGTCAAGGAACCCTG-3' (SEQ ID NO:40) HL-263 VH1 5'-TCCTGTGCAGCTTCTGGCTAATAATTCTAATA AT AAGGT ATGAACTGGGTCCG-3' (SEQ ID NO:41) HL-264 VH2 5'- GAAT GGGTTGG ATGGATT AACTAAT AAT AAG GTT AACCGACCT ATGCTGCGG-3' (SEQ ID NO:42) YC-80 VH3 5'- CTGTGC AAAGTACCCGT AAT ATTAAT AATAAT AACACTGGT ATTTCGAC-3' (SEQ ID NO:43) YC-100 CDR7 5’- CGTTTC ACTTTTTCTT AAGACTAATCC AAATA AACAGC AT ACCTGC AG-3' (SEQ ID NO:44) YC-102 VH2 5'- GAATGGGTTGG ATGG ATTTAATAAT AATAAG GTGAACCGACCTATG-3' (SEQ ID NO:45) Tabela 10: Oligos Aleatórios para a Construção da Biblioteca Numero do oligo Região Comentário Sequência HL-258 VLl 5-GGGTCACC AT C ACCT GCNNSGCANNSNNSNNSNN SAGC AACTATTTAAACTGG-3* (SEQ ID NO:46) HL-259 VLl 5'-GCGCAAGTCAGGATATTNNSNNSNNSNNSNNSTG GTATCAACAGAAACCAGG-3' (SEQ ID NO:47) HL-260 VH3 5'-GTCTATTACTGTGCAAAGNNSNNSCACNNSNNSG GGAGCAGCCACTGG-3' (SEQ ID NO:48) HL-261 VH3 5’-T ACCCCCACTATT ATNNSNNSNNSNNSTGGTATTT CGACGTCTGGGG-3' (SEQ ID NO:49) HL-262 VH3 5-CACTATTATGGGAGCAGCCACNNSNNSNNSNNSG TCTGGGGTCAAGGAACCCTG-3' (SEQ ID N0:50) HL-265 VH1 5'-TCCTGTGCAGCTTCTGGCNNSNNSTTCNNSNNSN NSGGTATGAACTGGGTCCG-3* (SEQ ID NO:51) 82 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ Número do oligo Região Comentário Sequência HL-266 VH2 5'-GAATGGGTTGGATGGATTAACNNSNNSNNSGGTN NSCCGACCTATGCTGCGG-3' (SEQID NO:52) YC-81 VH3 5'-CTGTGCAAAGT ACCCGNNSTATNNSNNSNNSNNS CACTGGTATTTCGAC-3' (SEQ ID NO:53) YC-101 CDR7 5’-CGTTTCACTTTTTCTNNSGACNNSTCCAAANNSA CAGCATACCTGC AG-3* (SEQ ID NO:54) YC-103 VH2 5'-GAATGGGTTGGATGGATTNNSNNSNNSNNSGGTG AACCGACCTATG-3' (SEQ ID NO:55)

Os produtos de reacções de mutagénese aleatória foram electroporados em células de E. coli XLl-Blue (Stratagene) e amplificados por crescimento durante 15-16 h com fago auxiliar M13K07. A complexidade de cada biblioteca, variando de 2 x 107 a 1,5 x 108, foi estimada com base no plaqueamento da transformação inicial em placas de carbenicilina.

Selecções Iniciais por Afinidade: Para cada operação de selecção, efectuou-se o rastreio de aproximadamente 109-1010 fagos quanto a ligação a placas (Nunc Maxisorp 96-poços) revestidas com 2 μρ/ηϋΐ, de VEGF (recombinante; versão dos residuos 9-109) em tampão de carbonato 50 mM, pH 9,6 e bloqueadas com leite instantâneo a 5% em tampão de carbonato 50 mM, pH 9,6. Após 1-2 horas de ligação à temperatura ambiente, na presença de albumina sérica bovina a 0,5% e TWEEN 20™ a 0,05% em PBS, removeu-se a solução de fagos, e lavou-se a placa dez vezes com PBS/TWEEN™ (TWEEN 20™ a 0,05% em tampão PBS). Tipicamente, para seleccionar relativamente a variantes com afinidade melhorada com menores velocidades de dissociação, as placas foram incubadas com tampão PBS/TWEEN™ durante um período de tempo que aumentou progressivamente para cada operação de selecção (de 0 minutos para a primeira operação, até 3 h para a nona operação de selecção) . Após a remoção do tampão PBS/TWEEN™, eluiram-se os restantes fagos com HC1 0,1 M e neutralizou-se imediatamente com 1/3 volume de Tris 1 M, pH 8,0. Os fagos eluidos foram propagados por infecção de células E. coli XLl-Blue (Stratagene) para o ciclo de selecção seguinte. 83 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ

Os resultados da sequenciação revelaram que ambas as bibliotecas de VL1, mesmo após oito/nove operações de selecção, permaneciam diversas, tolerando vários tipos de residuos nos locais que se tornaram aleatórios. Em contraste, as bibliotecas de VH3 retinham apenas residuos de tipo selvagem ou tinham substituições muito conservativas. Isto sugere que a VL1 estava mais exposta ao solvente e estava fora da interface de ligação. Em contraste, a VH3 não apresentou substituições de cadeias laterais drasticamente diferentes, e portanto poderia estar mais intimamente envolvida na ligação ao antigénio.

Ensaio ELISA-fago de Afinidades de Ligação: De cada uma destas bibliotecas, ensaiaram-se clones representativos (aqueles que eram representados por sequências abundantes) quanto às suas afinidades relativamente à do clone progenitor pYOlOl num ensaio ELISA-fago. Neste tipo de ensaio, os fagos são primeiro diluídos em série para determinar um título de saturação fraccional que foi depois mantido constante e utilizado para incubar com várias concentrações de VEGF (partindo de 200 nM até 0 nM) em solução. A mistura foi depois transferida para uma placa pré-revestida com VEGF (2 μρ/ιηύ) e bloqueada com leite instantâneo a 5%, e deixou-se equilibrar durante 1 hora à temperatura ambiente. Posteriormente, removeu-se a solução de fagos e detectaram-se os restantes fagos ligados com uma solução de anticorpo de coelho anti-fago misturado com anticorpo de cabra anti-coelho conjugado com peroxidase de rábano. Após uma hora de incubação à temperatura ambiente, a placa foi desenvolvida com um substrato cromogénico, o-fenilenodiamina (Sigma). A reacção foi parada com adição de 1/2 volume de H2S04 2,5 M. Mediu-se a densidade óptica a 492 nm num leitor espectrofotométrico de placas.

Embora todos os clones seleccionados a partir destas cinco bibliotecas apresentassem afinidades mais fracas ou similares relativamente às do pYOlOl de tipo selvagem no ensaio ELISA-fago, uma variante particular (pY0192) da biblioteca HL-258 apresentou uma vantagem aparente (cerca de 10 vezes) no nível de expressão ou exibição nos fagos relativamente a pYOlOl. Este clone continha mutações S24R, S26N, Q27E, D28Q e 129L na região VL (Fig. 9A) . Em adição, verificou-se que esta variante tinha uma mutação espúria, 84 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ Μ34Ι, em Vh. Esta variante não apresentou qualquer diferença significativa na afinidade de ligação ao VEGF em comparação com a variante pYOlOl. Para melhorar o nível de exibição de Fab nos fagos, e a razão sinal-para-ruído nos ensaios ELISA-fago, incorporaram-se as substituições correspondentes em pY0192 em VL1 no molde de fundo para a construção tanto de mutantes Ala em CDR como da segunda geração de bibliotecas anti-VEGF.

Varrimento de Ala das CDR de Anti-VEGF: Para determinar as energias contribuídas por cada um dos aminoácidos nas regiões CDR e assim melhor seleccionar resíduos alvo para serem tornados aleatórios, as regiões CDR foram rastreadas substituindo por alanina cada resíduo. Cada mutante Ala foi construído utilizando mutagénese dirigida ao local com um oligonucleótido sintético codificando para a substituição específica por alanina. Quando Ala era o resíduo de tipo selvagem, substituiu-se por Ser para testar o efeito de uma substituição de cadeia lateral. Os clones de fagos possuindo uma única mutação de Ala foram purificados e ensaiados em ELISA-fago como atrás descrito. Os resultados do varrimento de Ala demonstraram que a substituição por Ala em várias posições pode ter um efeito, variando em reduções de 2 a >150 vezes, na afinidade de ligação ao antigénio em comparação com pY0192. Em adição, confirmou uma observação prévia de que VH3, mas não VL1, estava envolvida na ligação ao antigénio. Os resultados do varrimento de Ala das CDR estão resumidos na Tabela 11 adiante.

Tabela 11: Afinidades Relativas para com VEGF de Variantes Fab por Varrimento de Ala

Resíduo VL IC50 (mut) IC50 (wt) Resíduo VH IC50 (mut) IC50 (wt) R2 4A 1 G26A 2 A25S 1 Y27A 34 N26A 1 T28A 1 E2 7A 1 F29A 16 Q2 8A 1 T30A 1 L2 9A 1 N31 A >150 S30A 2 Y32A >150 N31A 2 G33A 6 Y32A 2 I34A 6 L33A 2 N35A 66 N3 4A 4 W50A >150 85 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ

Resíduo VL IC50 (mut) IC50 (wt) Resíduo VH IC50 (mut) IC50 (wt) F50A 1 151A 4 T51A 1 N52A >150 S52A 1 T53A 9 S53A 1 Y54A 9 L54A 1 T55A 4 H55A 1 G56A 1 S56A 1 E57A 2 P58A 1 Q89A 4 T59A 3 Q90A 3 Y60A 2 Y91A 14 A61 S 1 S92A 1 A62S 1 T93A 1 D63A 1 V94A 2 F64A 1 P95A 3 K65A 1 W96A >150 R66A 1 T97A 1 Y99A > 150 P100A 38 H101A 4 Y102A 4 Y103A 5 G104A 2 S105A 1 S106A >150 H107A 2 W108A >150 Y109A 19 F110A 25 D111A 2

Todas as variantes são sobre o fundo de pY0192 ("wt"; veja-se Fig. 9A-B). As IC50 foram determinadas num ensaio ELISA-fago competitivo.

Os maiores efeitos das substituições por Ala são observados nas CDR Hl, H2 e H3, incluindo Y27A (redução de 34 vezes na afinidade), N31A, Y32A, W50A, N52A, Y99A, S106A e W108A (cada uma com redução >150 vezes); N35A (redução de 66 vezes), P100A (redução de 38 vezes) e F110A (redução de 25 vezes) . Em contraste, apenas uma substituição em VL tinha um grande impacto na afinidade de ligação, W96A (redução >150 vezes). Estes resultados apontam para as três CDR de VH como as principais determinantes energéticas da ligação de Fab a VEGF, com alguma contribuição de VL3.

Desenho de Bibliotecas de Mutação CDR de Segunda Geração:

Desenharam-se duas bibliotecas adicionais em que se tornaram aleatórios resíduos existentes na versão Y0192 anti-VEGF, com 86 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ base na inspecção da estrutura cristalina. Em VH2, tornaram-se aleatórios os resíduos 52-55 porque estão no interior da interface de ligação a VEGF. Uma região adicional do Fab, denominada "CDR7" (veja-se Fig. 10B), foi também alvo para ser tornada aleatória porque vários resíduos nesta ansa, embora não estando em contacto com o VEGF, têm contactos com as ansas de VH do anticorpo. Estes representavam locais potenciais para melhoramento da afinidade através de efeitos secundários nos resíduos da interface. Os resíduos L72, T74 e S77 foram tornados aleatórios nesta biblioteca de CDR7.

Também com base na estrutura cristalina, uma das bibliotecas de CDR originais foi reconstruída para voltar a testar o potencial para maturação da afinidade na CDR de VH1. Os resíduos 27, 28 e 30-32 foram tornados aleatórios utilizando o novo fundo de Y0192.

Selecções de Segunda Geração de Bibliotecas Anti-VEGF:

Com base nos resultados do varrimento de Ala bem como na estrutura cristalina do complexo antigénio-anticorpo (F(ab)-12), construíram-se um total de dezassete bibliotecas utilizando o molde pY0192 e oligonucleótidos molde com stop (que codificam para um codão de stop nos locais alvo para serem tornados aleatórios) YC-80, YC-100, YC-102, HL-263 e HL-264 (Tabela 9 atrás). Os correspondentes oligonucleótidos aleatórios (que empregam NNS nos locais alvo para serem tornados aleatórios) foram YC81, YC-101, YC-103, HL-265 e HL-266 (Tabela 10 atrás). Os resultantes transformantes originaram bibliotecas com complexidades variando de 6 χ 107 a 5 χ 108 que sugerem que as bibliotecas eram compreensivas cobrindo todas as possíveis variantes. As bibliotecas em fagos foram seleccionadas em 7-8 operações utilizando as condições descritas na Tabela 12 atrás. 87 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ

Tabela 12: Condições para Selecções Secundárias de variantes Fab

Operação de Selecção Tempo de Incubação (h) Solução de Incubação Temp. de Incubação (2C) 1 0 0 temp. amb. 2 1 Tampão de ELISA temp. amb. 3 2 VEGF 1 μΜ/ELISA temp. amb. 4 18 VEGF 1 μΜ/ELISA temp. amb. 5 37 VEGF 1 μΜ/ELISA temp. amb. 6 17 h @ temp. amb./ 30h @ 37°C VEGF 1 μΜ/ELISA temp. amb./37°C 7 63 VEGF 1 μΜ/ELISA 37°C 8 121 VEGF 1 μΜ/ELISA O o Γ ΟΟ O tampão de ELISA continha 0,5% de albumina sérica bovina e 0,05% de TWEEN 20™ em PBS. O VEGF foi incluído no tampão de incubação para minimizar a nova ligação de fagos ao VEGF que reveste a superfície da placa. A selecção destas bibliotecas originou enriquecimentos em fagos ao longo de 7 a 8 operações de selecção.

Ensaios ELISA-Fago de Clones de Segunda Geração: Após oito operações de selecção, isolaram-se dez a vinte clones de cada biblioteca a partir de placas contendo carbenicilina portadoras de colónias de E. coli (XL1) que tinham sido infectadas com um conjunto de fagos eluído. As colónias foram isoladas e crescidas com fago auxiliar para obter ADN de cadeia simples para sequenciação. As substituições nas CDR seleccionadas pela ligação mais favorável ao VEGF foram deduzidas a partir das sequências de ADN de clones de fagemídeos. Uma amostragem de clones seleccionados é apresentada na Tabela 13 adiante. 88 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ

Tabela 13: Sequências Proteínicas de Variantes Anti-VEGF de Bibliotecas de Fab em Fagos de Segunda Geração

Variantes da biblioteca YC-81 Nome Sequência de VH3 (resíduos 99-111) Y0238-1 YPYYRGTSHWYFD (SEQ ID NO:56) Y0238-2 YPYYINKSHWYFD (SEQ ID NO:57) Y0238-3 YPYYYGTSHWYFD (SEQ ID NO:58) Y0238-4 YPYYYNQSHWYFD (SEQ ID NO:59) Y0238-5 YPYYIAKSHWYFD (SEQ ID NO:60) Y0238-6 YPYYRDNSHWYFD (SEQ ID NO:61) Y0238-7 YPYYWGTSHWYFD (SEQ ID NO:62) Y0238-8 YPYYRQNSHWYFD (SEQ ID NO:63) Y0238-9 YPYYRQSSHWYFD (SEQ ID NO:64) Y0238-10 YPYYRNTSHWYFD (SEQ ID NO:65) Y0238-11 YPYYKNTSHWYFD (SEQ ID NO:66) Y0238-12 YPYYIERSHWYFD (SEQ ID NO:67) Y0228-21 YPYYRNASHWYFD (SEQ ID NO:68) Y0228-22 YPYYTTRSHWYFD (SEQ ID NO:69) Y0228-23 YPYYEGSSHWYFD (SEQ ID NO:70) Y0228-24 YPYYRQRGHWYFD (SEQ ID NO:71) Y0228-26 YPYYTGRSHWYFD (SEQ ID NO:72) Y0228-27 YPYYTNTSHWYFD (SEQ ID NO:73) Y0228-28 YPYYRKGSHWYFD (SEQ ID NO:74) Y0228-29 YPYYTGSSHWYFD (SEQ ID NO:75) Y0228-30 YPYYRSGSHWYFD (SEQ ID NO:76) Y0229-20 YPYYTNRSHWYFD (SEQ ID NO:77) Y0229-21 YPYYRNSSHWYFD (SEQ ID NO:78) Y0229-22 YPYYKESSHWYFD (SEQ ID NO:79) Y0229-23 YPYYRDASHWYFD (SEQ ID NO:80) Y0229-24 YPYYRQRGHWYFD (SEQ ID NO:81) Y0229-25 YPYYKGGSHWYFD (SEQ ID NO:82) Y0229-26 YPYYYGASHWYFD (SEQ ID NO:83) Y0229-27 YPYYRGESHWYFD (SEQ ID NO:84) Y0229-28 YPYYRSTSHWYFD (SEQ ID NO:85) Variantes da biblioteca HL-265 Nome Sequência de VH1 (resíduos 26-35) Y0243-1 GYDFTHYGMN (5/10 clones) (SEQ ID NO:86) Y0243-2 GYEFQHYGMN (SEQ ID NO:87) Y0243-3 GYEFTHYGMN (SEQ ID NO:88) Y0243-4 GYDFGHYGMN (SEQ ID NO:89) Y0243-5 GYDFSHYGMN (SEQ ID NO:90) Y0243-6 GYEFSHYGMN (SEQ ID NO:91) Variantes da biblioteca YC-101 Nome Sequência de "CDR7" de VH (resíduos 70-79) Y0244-1 FSVDVSKSTA (SEQ ID NO:92) Y0244-2 FSLDKSKSTA (SEQ ID NO:93) Y0244-3 FSLDVWKSTA (SEQ ID NO:94) Y0244-4 FSIDKSKSTA (:95) 89 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ A sequência da região tornada aleatória apenas é apresentada conforme deduzida a partir da sequenciação do ADN.

Quando se testaram vários clones juntamente com o clone progenitor pY0192 no ensaio ELISA-fago, nenhum apresentou um melhoramento distintivo sobre o clone progenitor. Isto pode ser explicado pela escala temporal na qual o ensaio foi realizado (< 3 horas).

De modo a quantificar o melhoramento na ligação ao antigénio relativamente ao clone progenitor, ADN de várias variantes anti-VEGF foi transformado em E. coli, estirpe 34B8, expresso como Fab, e purificou-se por passagem do conjunto periplasmático através de uma coluna de proteína G (Pharmacia) como descrito no Exemplo 2 atrás.

Variantes de Combinação de CDR: para melhorar ainda mais a afinidade de ligação para com o VEGF, as mutações encontradas por exibição em fagos foram combinadas com diferentes CDR para criar mutantes de CDR múltiplos. Em particular, as mutações identificadas nas variantes em fagos com a afinidade mais melhorada de bibliotecas de VHl, VH2 e VH3 foram combinadas (Tabela 14) de modo a testar a aditividade das suas contribuições para a afinidade de ligação.

Tabela 14: Variantes de Combinação de CDR Anti-VEGF

Nome Clone progenitor oligo de mutagénese/ comentários Sequência Y0313-1 Y0243-1 YC-115 (VH3: H101Y e S105T) 5'- GCAAAGTACCCGT ACTATTA TGGGACGAGCCACTGGTATTT C-3' (SEQID NO:96) Y0317 Y0313-1 YC-108 (reverte VLl ao tipo selvagem 5'- GTCACCATC ACCTGCAGCGC AAGTCAGGATATTAGCAACT A TTTAAAC-3' (SEQ ID NO:97) Y0313-3 Y0238-3 YC-116 (VH3: T105S) 5'-CCGT ACT ATT ATGGGAGC A GCCACTGGTATTTC-31 (SEQ ID NO:98)

As mutações dos vectores progenitores indicados foram combinadas com as do oligonucleótido indicado por mutagénese dirigida ao local para obter as variantes de combinação enumeradas. 90 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ A versão Υ0317 é equivalente a Y0313-1 excepto por a mutação de fundo em VL1 ter sido removida e a sua sequência ter revertido de novo para a de pYOlOl. Os efeitos da mutação H101Y e S105T foram testados construindo um mutante de reversão a partir de Y0238-3.

Análise BIAcore: As afinidades de ligação a VEGF dos fragmentos Fab foram calculadas a partir das constantes de velocidade de associação e de dissociação medidas utilizando um sistema de ressonância plasmónica de superfície BlAcore-2000™ (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) . Activou-se um chip biossensor para acoplamento covalente de VEGF utilizando cloridrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) e N-hidroxissuccinimida (NHS) de acordo com as instruções do fornecedor (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ). Trocou-se o tampão do VEGF para acetato de sódio 20 mM, pH 4,8 e diluiu-se para aproximadamente 50 μρ/ηΛ. Injectou-se uma alí quota (35 μΐΟ a um caudal de 2 μυ/ιηίη para conseguir aproximadamente 700-1400 unidades de resposta (UR) de proteína acoplada. Finalmente, injectou-se etanolamina 1 M como agente de bloqueio.

Para as medições da cinética, injectaram-se diluições duplas em série de Fab em tampão PBS/TWEEN™ (TWEEN 20™ a 0,05% em solução salina tamponada com fosfato) a 25°C a um caudal de 10 μΕ/ιηίη. Calcularam-se as velocidades de associação e as velocidades de dissociação utilizando protocolos Standard (Karlsson et al. J. Immun. Methods 145:229-240 (1991)). Calcularam-se as constantes de equilíbrio de dissociação, Kd, a partir das medições de ressonância plasmónica de superfície (SPR) como koff/kon· Os resultados estão apresentados na Tabela 15 adiante. 91 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ

Tabela 15: Cinética da Ligação Fab-VEGF a partir de medições no BIAcore™

Variante kon uoVm/s) koff (10"7s) K„ (nM) K„ (wt)/Kd (mut) Y0244-1 3,4 2,7 8 0,36 Y0244-4 5,2 1,7 3,3 0,9 Y0243 -1 6,7 0,45 0,7 4,1 Y0238-3 1,7 <0,04* <0,2* > 14* Y0238-7 1,5 <0,06* <0, 4* >7,3* Y0238-10 1,6 0, 09 0,6 4,8 Y0238-5 0, 8 0, 08 0,9 3,2 Y0238-1 2,6 0, 09 0,4 7,3 Y0313-1 3,5 <0,054* <0,15* >20* Y0313-3 1,2 0,081 0,65 4,5 * A velocidade de dissociação observada reflecte provavelmente um limite superior para a verdadeira velocidade de dissociação nestas experiências, uma vez que a velocidade de dissociação (off-rate) se aproxima do limite de detecção por BIAcore.

Os resultados do BIAcore™ na Tabela 15 mostram que várias variantes tinham afinidade melhorada relativamente ao Y0192. Por exemplo, uma variante de CDRHl, Y0243-1, apresentou uma afinidade melhorada 4,1 vezes, proveniente de mutações T28D e N31H. A variante Y0238-3 apresentou um melhoramento de pelo menos 14 vezes na afinidade de ligação relativamente ao Y0192. Ambas as mutações de CDRH3 contribuem para a afinidade melhorada de Y0238-3 porque a reversão de T105 para S (variante Y0313-3) reduz a afinidade de Y0238-3 de 0,15 nM para 0,65 nM (veja-se a Tabela 15). O maior melhoramento de afinidade relativamente a Y0192 foi observado para Y0313-1, que continha mutações de CDRH3 combinadas com mutações de CDRHl.

Ensaio à Base de Células da Inibição de VEGF: Testaram-se várias versões do anticorpo anti-VEGF A4.6.1 quanto à sua capacidade para antagonizar o VEGF (recombinante; versão 1-165) na indução do crescimento de HuVEC (células endoteliais da veia umbilical humana). As placas de 96 poços foram semeadas com 1000 HuVEC por poço que foram mantidas apenas em meio de ensaio (F12:DMEM 50:50 suplementado com 1,5% de soro fetal bovino diafiltrado) durante 24 h. A concentração de VEGF utilizada para indução das células foi determinada titulando primeiro a quantidade de VEGF que pode estimular 80% 92 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ da síntese máxima de ADN. Foram então adicionados meio de ensaio fresco contendo quantidades fixadas de VEGF (concentração final de 0,2 nM), e concentrações crescentes de Fab ou MAb anti-VEGF. Após 40 h de incubação, mediu-se a síntese de ADN por incorporação de timidina tritiada. Aplicaram-se às células pulsos de 0,5 μϋί por poço de [3H]-timidina durante 24 h e recolheram-se as células para contagem utilizando um contador gama TopCount.

Os resultados (Fig. 11) mostram que a forma de IgG de comprimento completo de F(ab)-12 foi significativamente mais potente na inibição da actividade de VEGF do que a forma Fab (aqui utilizou-se Y0192). Contudo, ambas as variantes, Y0238-3 e Y0313-1, apresentaram uma inibição ainda mais potente da actividade de VEGF do que o Fab Y0192 ou o MAb F(ab)-12. Comparando as formas Fab, a variante Y0313-1 parecia >30 vezes mais potente do que o Fab de tipo selvagem. Deve notar-se que a quantidade de VEGF (0,2 nM) utilizada neste ensaio é potencialmente limitante para determinação de uma IC50 com precisão para o mutante. Por exemplo, se a afinidade de ligação (Kd) do mutante é de facto <0,2 nM, a IC50 nesta experiência surgirá maior do que em condições de menor concentração de VEGF. O resultado suporta portanto a conclusão de que a variante com afinidade melhorada é pelo menos 30 vezes melhorada em afinidade para com VEGF, e que bloqueia eficazmente a actividade de VEGF in vitro. Como a variante Y0317 difere de Y0313-1 apenas na reversão da sequência de VLl para o tipo selvagem (Fig. 10A), prevê-se que Y0317 terá uma actividade similar a Y0313-1. A variante Y0317 (Fab) e a variante humanizada F(ab)-12 do Exemplo 1 (comprimento completo e Fab) foram comparadas quanto à sua capacidade para inibir a proliferação de células endoteliais capilares bovinas em resposta a uma concentração próxima do máximo de eficácia de VEGF utilizando o ensaio descrito no Exemplo 1. Como ilustrado na Figura 12, Y0317 foi marcadamente mais eficaz na inibição da proliferação de células endoteliais capilares bovinas do que as formas de comprimento completo e Fab de F(ab)-12 neste ensaio. O Fab com afinidade maturada Y0317 apresentou um valor de ED50 neste ensaio que era pelo menos cerca de 20 vezes inferior ao do Fab de F(ab)-12. 93 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: Genentech, Inc.

(ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: Anticorpos Anti-VEGF (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 130 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA:

(A) DESTINATÁRIO: FLEHR HOHBACH TEST ALBRITTON & HERBERT LLP (B) RUA: Four Embarcadero Center, Ste. 3400 (C) CIDADE: San Francisco

(D) ESTADO: CA

(E) PAÍS: EUA (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): 94111 (v) FORMA LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: disquete

(B) COMPUTADOR: PC compatível com IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Versão #1.30 (vi) DADOS DO PRESENTE PEDIDO: (A) NÚMERO DO PEDIDO: PCT/US98/06604 (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 03-Abril-1998 (C) CLASSIFICAÇÃO: (vii) DADOS DO PEDIDO ANTERIOR: (A) NÚMERO DO PEDIDO: US 08/833 504 (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 07-Abril-1997 (vii) DADOS DO PEDIDO ANTERIOR: (A) NÚMERO DO PEDIDO: US 08/908 469 (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 06-Agosto-1997 (viii) INFORMAÇÃO SOBRE REPRESENTANTE/AGENTE: (A) NOME: Dolly A Vance (B) NÚMERO DE REGISTRO: 39054

(C) NÚMERO DE REFERÊNCIA/PROCESSO: FP-65358/WHD/DAV (ix) INFORMAÇÃO SOBRE TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: (415)781-1989 (B) TELEFAX: (415)398-3249 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida 94 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:1:

Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:2:

Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe Lys 15 10 15 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 14 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:3:

Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Vai 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 11 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:4:

Ser Ala Ser Gin Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn 15 10 95 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID Ν0:5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 7 aminoácidos (Β) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:5:

Phe Thr Ser Ser Leu His Ser 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:6:

Gin Gin Tyr Ser Thr Vai Pro Trp Thr 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 123 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:7:

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe 50 55 60 Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Vai 100 105 110 Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 96 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 108 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:8:

Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai >1 0 1 5 10 15 Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gin Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Vai Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly 65 Ser Gly Thr Asp 70 Phe Thr Leu Thr Ile Ser 75 Ser Leu Gin Pro 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 85 Tyr Cys Gin Gin 90 Tyr Ser Thr Vai Pro 95 Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr 100 Lys Vai Glu 105 Ile Lys Arg INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: ; 9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 123 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteina (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:9:

Glu Ile Gin Leu Vai Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Gin Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Vai Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Vai Lys Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe 50 55 60 Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Ile Ser Asn Leu Lys Asn Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Lys Tyr Pro Hls Tyr Tyr Gly Ser Ser Hls Trp Tyr Phe Asp Vai 100 105 110

Ttp Gly Ala Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 97 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 108 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:10:

Asp Ile Gin Met Thr Gin Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Vai Ile Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gin Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Asp Gly Thr Vai Lys Vai Leu Ile 35 40 45

Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Ser Thr Vai Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 113 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:11:

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45 Ser Vai Ile Ser Gly Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser 100 105 110

Ser 98 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:12: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 108 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:12:

Asp Xle 1 Gin Met Thr 5 Gin Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Ala Ser Vai Gly 15 Asp Arg Vai Thr 20 Ile Thr Cys Arg Ala 25 Ser Gin Ser Ile ser 30 Asn Tyr

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr cys Gin Gin Tyr Asn Ser Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys Arg 100 105 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:13: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 107 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:13:

Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gin Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Ser Thr Val Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 99 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:14: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 123 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:14:

GlU Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30

Gly Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe 50 55 60 Lys Arg Arg Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu 65 70 75 80 Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr'Phe Asp 100 105 110 Vai Trp Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:15: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 107 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:15:

Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 1 5 10 15 Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gin Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Ser Thr Vai Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys 100 105 100 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID Ν0:1β: (ί) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 123 aminoácidos (Β) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:16:

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30

Gly Met Asn Trp Ile Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe 50 55 60

Lys Arg Arg Phe Thr Ile Ser Leu Asp Thr ser Ala ser Thr Vai Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Vai 100 105 110

Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:17: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 11 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:17:

Pro Lys Asn Ser Ser Met Ile Ser Asn Thr Pro 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:18: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 8 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida 101 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:18

His Gin Ser Leu Thr Gly Thr Gin 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:19: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 8 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:19

His Gin Asn Leu Ser Asp Gly Lys 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:20: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 8 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:20

His Gin Asn Ile Ser Asp Gly Lys 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:21: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 8 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:21

Vai Ile Ser Ser His Leu Gly Gin 1 5 102 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:22: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 67 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:22: GATTTCAAAC GTCGTNYTAC TWTTTCTAGA GACAACTCCA AAAACACABY TTACCTGCAG 60 ATGAAAC 67 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:23: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 66 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:23: GATTTCAAAC GTCGTNYTAC TWTTTCTTTA GACACCTCCG CAAGCACABY TTACCTGCAG 60 ATGAAC 66 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:24: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 60 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:24: AGCCTGCGCG CTGAGGACAC TGCCGTCTAT TACTGTDYAA RGTACCCCCA CTATTATGGG 60 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:25: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida 103 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:25: CTCAGCGCGC AGGCTGTTCA TCTGCAGGTA 30 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:26: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:26: GCTGATATCC AGTTGACCCA GTCCCCG 27 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:27: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:27: TCTGGGACGG ATTACACTCT GACCATC 27 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:28: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 75 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:28: CGTTTGTCCT GTGCARYTTC TGGCTAlACC TTCACCAACT ATGGTATGAA CTGGRTCCGT 60 75

CAGGCCCCGG GTAAG 104 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID ΝΟ:29: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:29: GATATCCAGT TGACCCAGTC CCCG 24 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:30: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:30: GCTCCGAAAG TACTGATTTA C 21 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:31: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 54 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:31: CGTCGTTTCA CTTTTTCTGC AGACACCTCC AGCAACACAG TATACCTGCA GATG 54 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:32: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 25 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:32: CTATTACTGT GCAAAGTACC CCCAC 25 105 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID ΝΟ:33: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:33: GGGACGGATT TCACTCTGAC CATC 24 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:34: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 26 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:34: GGTATGAACT GGGTCCGTCA GGCCCC 26 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:35: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 57 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:35: CGTCGTTTCA CTTTTTCTTT AGACACCTCC AAAAGCACAG CATACCTGCA GATGAAC 57 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:36: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 53 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:36: GGGTCACCAT CACCTGCTAA GCATAATAAT AATAAAGCAA CTATTTAAAC TGG 53 106 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID ΝΟ:37: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 52 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:37: GCGCAAGTCA GGATATTTAA TAATAATAAT AATGGTATCA ACAGAAACCA GG 52 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:38: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 48 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:38: GTCTATTACT GTGCAAAGTA ATAACACTAA TAAGGGAGCA GCCACTGG 48 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:39: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 49 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:39: GGTACCCCCA CTATTATTAA TAATAATAAT GGTATTTCGA CGTCTGGGG 49 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:40: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 53 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:40: CACTATTATG GGAGCAGCCA CTAATAATAA TAAGTCTGGG TCAAGGAACC CTG 53 107 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID Ν0:41: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 53 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:41: TCCTGTGCAG CTTCTGGCTA ATAATTCTAA TAATAAGGTA TGAACTGGGT CCG 53 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:42: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 52 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:42: GAATGGGTTG GATGGATTAA CTAATAATAA GGTTAACCGA CCTATCGTGC GG 52 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:43: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 49 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:43: CTGTGCAAAG TACCCGTAAT ATTAATAATA ATAACACTGG TATTTCGAC 49 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:44: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 48 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:44: CGTTTCACTT TTTCTTAAGA CTAATCCAAA TAAACAGCAT ACCTGCAG 48 108 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID ΝΟ:45: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 46 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:45: GAATGGGTTG GATGGATTTA ATAATAATAA GGTGAACCGA CCTATG 46 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:46: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 53 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:46: GGGTCACCAT CACCTGCNNS GCANNSNNSN NSNNSAGCAA CTATTTAAAC TGG 53 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:47: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 52 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:47: GCGCAAGTCA GGATATTNNS NNSNNSNNSN NSTGGTATCA ACAGAAACCA GG 52 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:48: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 48 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:48: GTCTATTACT GTGCAAAGNN SNNSCACNNS NNSGGGAGCA GCCACTGG 48 109 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:49: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 49 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:49: GGTACCCCCA CTATTATNNS NNSNNSNNST GGTATTTCGA CGTCTGGGG 49 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:50: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 54 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:50: CACTATTATG GGAGCAGCCA CNNSNNSNNS NNSGTCTGGG GTCAAGGAAC CCTG 54 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:51: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 53 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:51: TCCTGTGCAG CTTCTGGCNN SNNSTTCNNS NNSNNSGGTA TGAACTGGGT CCG 53 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:52: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 52 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:52: GAATGGGTTG GATGGATTAA CNNSNNSNNS GGTNNSCCGA CCTATGCTGC GG 52 110 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID ΝΟ:53: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 49 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:53: CTGTGCAAAG TACCCGNNST ATNNSNNSNN SNNSCACTGG TATTTCGAC 49 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:54: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 48 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:54: CGTTTCACTT TTTCTNNSGA CNNSTCCAAA NNSACAGCAT ACCTGCAG 48 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:55: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 47 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:55: GAATGGGTTG GATGGATTNN NSNNSNNSNN SGGTGAACCG ACCTATG 47 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:56: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteina 111 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:56

Tyr Pro Tyt Tyr Arg Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:57: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:57

Tyr Pro Tyr Tyr Ile Asn Lys Ser His Trp Tyr Phe Asp 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:58: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:58

Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp 1 . 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:59: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:59

Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Asn Gin Ser His Trp Tyr Phe Asp 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:60: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida 112 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:60

Tyr Pro Tyr Tyr Ile Ala Lys Ser His Trp Tyr Phe Asp 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:61: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:61

Tyr Pro Tyr Tyr Arg Asp Asn Ser His Trp Tyr Phe Asp 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:62: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:62

Tyr Pro Tyr Tyr Trp Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:63: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:63

Tyr Pro Tyr Tyr Arg Gin Asn Ser His Trp Tyr Phe Asp 15 10 113 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID ΝΟ:64: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (Β) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:64

Tyr Pro Tyr Tyr Arg Gin Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:65: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:65

Tyr Pro Tyr Tyr Arg Asn Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:66: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:66

Tyr Pro Tyr Tyr Lys Asn Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:67: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína 114 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:67

Tyr Pro Tyr Tyr Ile Glu Arg Ser His Trp Tyr Phe Asp 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:68: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:68

Tyr Pro Tyr Tyr Arg Asn Ala Ser His Trp Tyr Phe Asp 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:69: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:69

Tyr Pro Tyr Tyr Thr Thr Arg Ser His Trp Tyr Phe Asp 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:70: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:70

Tyr Pro Tyr Tyr Glu Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:71: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida 115 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:71

Tyr Pro Tyr Tyr Arg Gin Arg Gly His Trp Tyr Phe Asp 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:72: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:72

Tyr Pro Tyr Tyr Thr Gly Arg Ser His Trp Tyr Phe Asp 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:73: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:73

Tyr Pro Tyr Tyr Thr Asn Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:74: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:74

Tyr Pro Tyr Tyr Arg Lys Gly Ser His Trp Tyr Phe Asp 15 10 116 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID ΝΟ:75: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (Β) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:75:

Tyr Pro Tyr Tyr Thr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:76: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:76:

Tyr Pro Tyr Tyr Arg Ser Gly Ser His Trp Tyr Phe Asp 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:77: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:77: Tyr Pro Tyr Tyr Thr Asn Arg Ser His Trp Tyr Phe Asp 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:78: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína 117 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:78:

Tyr Pro Tyr Tyr Arg Asn Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:79: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:79:

Tyr Pro Tyr Tyr Lys Glu Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:80: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:80:

Tyr Pro Tyr Tyr Arg Asp Ala Ser His Trp Tyr Phe Asp 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:81: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:81:

Tyr Pro Tyr Tyr Arg Gin Lys Gly His Trp Tyr Phe Asp 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:82: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida 118 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:82:

Tyr Pro Tyr Tyr Lys Gly Gly Ser His Trp Tyr Phe Asp 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:83: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 12 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:83:

Tyr Pro Tyr Tyr Gly Ala Ser His Trp Tyr Phe Asp 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:84: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:84:

Tyr Pro Tyr Tyr Arg Gly Glu Ser His Trp Tyr Phe Asp 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:85: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:85:

Tyr Pro Tyr Tyr Arg Ser Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp 15 10 119 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID Ν0:8β: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 aminoácidos (Β) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:86

Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr Gly Met Asn 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:87: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:87

Gly Tyr Glu Phe Gin His Tyr Gly Met Asn 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:88: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:88

Gly Tyr Glu Phe Thr His Tyr Gly Met Asn 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:89: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína 120 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:89

Gly Tyr Asp Phe Gly His Tyr Gly Met Asn 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:90: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:90

Gly Tyr Asp Phe Ser His Tyr Gly Met Asn 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:91: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:91

Gly Tyr Glu Phe Ser His Tyr Gly Met Asn 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:92: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:92

Phe Ser Vai Asp Vai Ser Lys Ser Thr Ala 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:93: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida 121 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:93

Phe Ser Leu Asp Lys Ser Lys Ser Thr Ala 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:94: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:94

Phe Ser Leu Asp Vai Trp Lys Ser Thr Ala 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:95: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:95

Phe Ser Ile Asp Lys Ser Lys Ser Thr Ala 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:96: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 42 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:96 GCAAAGTACC CGTACTATTA TGGGACGAGC CACTGGTATT TC 42 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:97: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 48 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida 122 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:97: GTCACCATCA CCTGCAGCGC AAGTCAGGAT ATTAGCAACT ATTTAAAC 48 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:98: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 33 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:98: CCGTACTATT ATGGGAGCAG CCACTGGTAT TTC 33 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:99: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 6072 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 390..1101 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: mat_peptide (B) LOCALIZAÇÃO: 459 (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1185..2423 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: mat_peptide (B) LOCALIZAÇÃO: 1254 123 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:99: GAATTCAACT TCTCCATACT TTGGATAAGG AAATACAGAC ATGAAAAATC TCATTGCTGA 60 GTTGTTATTT AAGCTTTGGA GATTATCGTC ACTGCAATGC TTCGCAATAT GGCGCAAAAT 120 GACCAACAGC GGTTGATTGA TCAGGTAGAG GGGGCGCTGT ACGAGGTAAA GCCCGATGCC 180 AGCATTCCTG ACGACGATAC GGAGCTGCTG CGCGATTACG TAAAGAAGTT ATTGAAGCAT 240 CCTCGTCAGT AAAAAGTTAA TCTTTTCAAC AGCTGTCATA AAGTTGTCAC GGCCGAGACT 300 TATAGTCGCT TTGTTTTTAT TTTTTAATGT ATTTGTAACT AGAATTCGAG CTCGGTACCC 360 GGGGATCCTC TAGAGGTTGA GGTGATTTT ATG AAA AAG AAT ATC GCA TTT CTT 413 Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe Leu -23 -20 CTT GCA TCT ATG TTC GTT TTT TCT ATT GCT ACA AAC GCG TAC GCT GAT 461 Leu Ala Ser Met Phe Val Phe Ser Ile Ala Thr Asn Ala Tyr Ala Asp -15 -10 -5 1 ATC CAG TTG ACC CAG TCC CCG AGC TCC CTG TCC GCC TCT GTG GGC GAT 509 Ile Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp C J 10 15 AGG GTC ACC ATC ACC TGC AGC GCA AGT CAG GAT ATT AGC AAC TAT TTA 557 Arg Vai Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gin Asp Ile Ser Asn Tyr Leu 20 25 30 AAC TGG TAT CAA CAG AAA CCA GGA AAA GCT CCG AAA CTA CTG ATT TAC 605 Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 TTC ACC TCC TCT CTC CAC TCT GGA GTC CCT TCT CGC TTC TCT GGA TCC 653 Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 65 GGT TCT GGG ACG GAT TAC ACT CTG ACC ATC AGC AGT CTG CAG CCA GAA 701 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu 70 75 80 GAC TTC GCA ACT TAT TAC TGT CAA CAG TAT AGC ACC GTG CCG TGG ACG 749 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr 85 90 95 TTT GGA CAG GGT ACC AAG GTG GAG ATC AAA CGA ACT GTG GCT GCA CCA 797 Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile (0 Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 TCT GTC TTC ATC TTC CCG CCA TCT GAT GAG CAG TTG AAA TCT GGA ACT 845 Ser Vai Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 GCT TCT GTT GTG TGC CTG CTG AAT AAC TTC TAT ccc AGA GAG GCC AAA 893 Ala ser Vai val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 145 124 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ GTA CAG TGG AAG GTG GAT AAC GCC CTC CAA TCG GGT AAC TCC CAG GAG 941 Vai Gin Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gin ser Gly Asn Ser Gin Glu 150 155 160 AGT GTC ACA GAG CAG GAC AGC AAG GAC AGC ACC TAC AGC CTC AGC AGC 989 Ser Vai Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 ACC CTG ACG CTG AGC AAA GCA GAC TAC GAG AAA CAC AAA GTC TAC GCC 1037 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Vai Tyr Ala 180 185 190 TGC GAA GTC ACC CAT CAG GGC CTG AGC TCG ccc GTC ACA AAG AGC TTC 1085 Cys Glu Vai Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Vai Thr Lys Ser Phe 195 200 205 AAC AGG GGA GAG TGT Τ AAGCTGATCC TCTACGCCGG ACGCATCGTG 1131

Asn Arg Gly Glu Cys 210 GCCCTAGTAC GCAACTAGTC GTAAAAAGGG TATCTAGAGG TTGAGGTGAT TTT ATG 1187

Met -23 AAA AAG AAT ATC GCA TTT CTT CTT GCA TCT ATG TTC GTT TTT TCT ATT 1235 Lys Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Ala Ser Met Phe Vai Phe ser Ile -20 -15 -10 GCT ACA AAC GCG TAC GCT GAG GTT CAG CTG GTG GAG TCT GGC GGT GGC 1283 Ala Thr Asn Ala Tyr Ala Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly -5 1 5 10 CTG GTG CAG CCA GGG GGC TCA CTC CGT TTG TCC TGT GCA GCT TCT GGC 1331 Leu Vai Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 15 20 25 TAT ACC TTC ACC AAC TAT GGT ATG AAC TGG ATC CGT CAG GCC CCG GGT 1379 Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Ile Arg Gin Ala Pro Gly 30 35 40 AAG GGC CTG GAA TGG GTT GGA TGG ATT AAC ACC TAT ACC GGT GAA CCG 1427 Lys Gly Leu Glu Trp Vai Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro 45 50 55 ACC TAT GCT GCG GAT TTC AAA CGT CGT TTT ACT ATA TCT GCA GAC ACC 1475 Thr Tyr Ala Ala Asp Phe Lys Arg Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr 60 65 70 TCC AGC AAC ACA GTT TAC CTG CAG ATG AAC AGC CTG CGC GCT GAG GAC 1523 Ser Ser Asn Thr Vai Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 75 80 85 90 ACT GCC GTC TAT TAC TGT GCA AAG TAC CCG CAC TAT TAT GGG AGC AGC 1571 Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser 35 100 105 CAC TGG TAT TTC GAC GTC TGG GGT CAA GGA ACC CTG GTC ACC GTC TCC 1619 His Trp Tyr Phe Asp Vai Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser 110 115 120 TCG GCC TCC ACC AAG GGC CCA TCG GTC TTC CCC CTG GCA CCC TCC TCC 1667 Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro ser Ser 125 130 135 125 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ AAG AGC ACC TCT GGG GGC ACA GCG GCC CTG GGC TGC CTG GTC AAG GAC 1715 Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp 140 145 150 TAC TTC ccc GAA CCG GTG ACG GTG TCG TGG AAC TCA GGC GCC CTG ACC 1763 Tyr Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr 155 160 165 170 AGC GGC GTG CAC ACC TTC CCG GCT GTC CTA CAG TCC TCA GGA CTC TAC 1811 Ser Gly Vai His Thr Phe Pro Ala val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr 175 180 185 TCC CTC AGC AGC GTG GTG ACC GTG ccc TCC AGC AGC TTG GGC ACC CAG 1859 Ser Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin 190 195 200 ACC TAC ATC TGC AAC GTG AAT CAC AAG CCC AGC AAC ACC AAG GTC GAC 1907 Thr Tyr Ile Cys Asn Vai Asn Kls Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp 205 210 215 AAG AAA GTT GAG CCC AAA TCT TGT GAC AAA ACT CAC CTC TAG AGT GGC 1955 Lys Lys Vai Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Leu ★ Ser Gly 220 225 230 GGT GGC TCT GGT TCC GGT GAT TTT GAT TAT GAA AAG ATG GCA AAC GCT 2003 Gly Gly Ser Gly Ser Gly Asp Phe Asp Tyr Glu Lys Met Ala Asn Ala 235 240 245 250 AAT AAG GGG GCT ATG ACC GAA AAT GCC GAT GAA AAC GCG CTA CAG TCT 2051 Asn Lys Gly Ala Met Thr Glu Asn Ala Asp Glu Asn Ala Leu Gin Ser 255 260 265 GAC GCT AAA GGC AAA CTT GAT TCT GTC GCT ACT GAT TAC GGT GCT GCT 2099 Asp Ala Lys Gly Lys Leu Asp Ser Val Ala Thr Asp Tyr Gly Ala Ala 270 275 280 ATC GAT GGT TTC ATT GGT GAC GTT TCC GGC CTT GCT AAT GGT AAT GGT 2147 Ile Asp Gly Phe Ile Gly Asp Vai Ser Gly Leu Ala Asn Gly Asn Gly 285 290 295 GCT ACT GGT GAT TTT GCT GGC TCT AAT TCC CAA ATG GCT CAA GTC GGT 2195 Ala Thr Gly Asp Phe Ala Gly Ser Asn Ser Gin Met Ala Gin Val Gly 300 305 310 GAC GGT GAT AAT TCA CCT TTA ATG AAT AAT TTC CGT CAA TAT TTA CCT 2243 Asp Gly Asp Asn Ser Pro Leu Met Asn Asn Phe Arg Gin Tyr Leu Pro 315 320 325 330 TCC CTC CCT CAA TCG GTT GAA TGT CGC CCT TTT GTC TTT AGC GCT GGT 2291 Ser Leu Pro Gin Ser Vai Glu Cys Arg Pro Phe Val Phe Ser Ala Gly 335 340 345 AAA CCA TAT GAA TTT TCT ATT GAT TGT GAC AAA ATA AAC TTA TTC CGT 2339 Lys Pro Tyr Glu Phe Ser Ile Asp Cys Asp Lys Ile Asn Leu Phe Arg 350 355 360 GGT GTC TTT GCG TTT CTT TTA TAT GTT GCC ACC TTT ATG TAT GTA TTT 2387 Gly Vai Phe Ala phe Leu Leu Tyr Val Ala Thr Phe Met Tyr Val Phe 365 370 375 TCT ACG TTT GCT AAC ATA CTG CGT AAT AAG GAG TCT TAATCATGCC 2433 Ser Thr Phe Ala Asn Ile Leu Arg Asn Lys Glu Ser 380 385 390 126 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ AGTTCTTTTG GCTAGCGCCG CCCTATACCT TGTCTGCCTC CCCGCGTTGC GTCGCGGTGC 2493 ATGGAGCCGG GCCACCTCGA CCTGAATGGA AGCCGGCGGC ACCTCGCTAA CGGATTCACC 2553 ACTCCAAGAA TTGGAGCCAA TCAATTCTTG CGGAGAACTG TGAATGCGCA AACCAACCCT 2613 TGGCAGAACA TATCCATCGC GTCCGCCATC TCCAGCAGCC GCACGCGGCG CATCTCGGGC 2673 AGCGTTGGGT CCTGGCCACG GGTGCGCATG ATCGTGCTCC TGTCGTTGAG GACCCGGCTA 2733 GGCTGGCGGG GTTGCCTTAC TGGTTAGCAG AATGAATCAC CGATACGCGA GCGAACGTGA 2793 AGCGACTGCT GCTGCAAAAC GTCTGCGACC TGAGCAACAA CATGAATGGT CTTCGGTTTC 2853 CGTGTTTCGT AAAGTCTGGA AACGCGGAAG TCAGCGCCCT GCACCATTAT GTTCCGGATC 2913 TGCATCGCAG GATGCTGCTG GCTACCCTGT GGAACACCTA CATCTGTATT AACGAAGCGC 2973 rGGCATTGAC CCTGAGTGAT TTTTCTCTGG TCCCGCCGCA TCCATACCGC CAGTTGTTTA 3033 CCCTCACAAC GTTCCAGTAA CCGGGCATGT TCATCATCAG TAACCCGTAT CGTGAGCATC 3093 CTCTCTCGTT TCATCGGTAT CATTACCCCC ATGAACAGAA ATTCCCCCTT ACACGGAGGC 3153 ATCAAGTGAC CAAACAGGAA AAAACCGCCC TTAACATGGC CCGCTTTATC AGAAGCCAGA 3213 CATTAACGCT TCTGGAGAAA CTCAACGAGC TGGACGCGGA TGAACAGGCA GACATCTGTG 3273 AATCGCTTCA CGACCACGCT GATGAGCTTT ACCGCAGGAT CCGGAAATTG TAAACGTTAA 3333 TATTTTGTTA AAATTCGCGT TAAATTTTTG TTAAATCAGC TCATTTTTTA ACCAATAGGC 3393 CGAAATCGGC AAAATCCCTT ATAAATCAAA AGAATAGACC GAGATAGGGT TGAGTGTTGT 3453 TCCAGTTTGG AACAAGAGTC CACTATTAAA GAACGTGGAC TCCAACGTCA AAGGGCGAAA 3513 AACCGTCTAT CAGGGCTATG GCCCACTACG TGAACCATCA CCCTAATCAA GTTTTTTGGG 3573 GTCGAGGTGC CGTAAAGCAC TAAATCGGAA CCCTAAAGGG AGCCCCCGAT TTAGAGCTTG 3633 ACGGGGAAAG CCGGCGAACG TGGCGAGAAA GGAAGGGAAG AAAGCGAAAG GAGCGGGCGC 3693 TAGGGCGCTG GCAAGTGTAG CGGTCACGCT GCGCGTAACC ACCACACCCG CCGCGCTTAA 3753 TGCGCCGCTA CAGGGCGCGT CCGGATCCTG CCTCGCGCGT TTCGGTGATG ACGGTGAAAA 3813 CCTCTGACAC ATGCAGCTCC CGGAGACGGT CACAGCTTGT CTGTAAGCGG ATGCCGGGAG 3873 CAGACAAGCC CGTGAGGGCG CGTCAGCGGG TGTTGGCGGG TGTCGGGGCG CAGCCATGAC 3933 CCAGTCACGT AGCGATAGCG GAGTGTATAC TGGCTTAACT ATGCGGCATC AGAGCAGATT 3993 GTACTGAGAG TGCACCATAr GCGGTGTGAA ATACCGCACA GATGCGTAAG GAGAAAATAC 4053 CGCATCAGGC GCTCTTCCGC TTCCTCGCTC ACTGACTCGC TGCGCTCGGT CGTTCGGCTG 4113 CGGCGAGCGG TATCAGCTCA CTCAAAGGCG GTAATACGGT TATCCACAGA ATCAGGGGAT 4173 AACGCAGGAA AGAACATGTG AGCAAAAGGC CAGCAAAAGG CCAGGAACCG TAAAAAGGCC 4233 GCGTTGCTGG CGTTTTTCCA TAGGCTCCGC CCCCCTGACG AGCATCACAA AAATCGACGC 4293 TCAAGTCAGA GGTGGCGAAA CCCGACAGGA CTATAAAGAT ACCAGGCGTT TCCCCCTGGA 4353 AGCTCCCTCG TGCGCTCTCC TGTTCCGACC CTGCCGCTTA CCGGATACCT GTCCGCCTTT 4413 127 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ CTCCCTTCGG GAAGCGTGGC GCTTTCTCAT AGCTCACGCT GTAGGTATCT cagttcggtg 4473 TAGGTCGTTC GCTCCAAGCT GGGCTGTGTG CACGAACCCC CCGTTCAGCC CGACCGCTGC 4533 GCCTTATCCG GTAACTATCG TCTTGAGTCC AACCCGGTAA GACACGACTT ATCGCCACTG 4593 gcagcagcca CTGGTAACAG GATTAGCAGA GCGAGGTATG TAGGCGGTGC TACAGAGTTC 4653 TTGAAGTGGT GGCCTAACTA CGGCTACACT AGAAGGACAG TATTTGGTAT CTGCGCTCTG 4713 CTGAAGCCAG TTACCTTCGG AAAAAGAGTT GGTAGCTCTT GATCCGGCAA ACAAACCACC 4773 GCTGGTAGCG GTGGTTTTTT TGTTTGCAAG CAGCAGATTA CGCGCAGAAA AAAAGGATCT 4833 CAAGAAGATC CTTTGATCTT TTCTACGGGG TCTGACGCTC AGTGGAACGA AAACTCACGT 4893 TAAGGGATTT TGGTCATGAG ATTATCAAAA AGGATCTTCA CCTAGATCCT TTTAAATTAA 4953 AAATGAAGTT TTAAATCAAT CTAAAGTATA TATGAGTAAA CTTGGTCTGA CAGTTACCAA 5013 TGCTTAATCA GTGAGGCACC TATCTCAGCG ATCTGTCTAT TTCGTTCATC CATAGTTGCC 5073 TGACTCCCCG TCGTGTAGAT AACTACGATA CGGGAGGGCT TACCATCTGG CCCCAGTGCT 5133 GCAATGATAC CGCGAGACCC ACGCTCACCG GCTCCAGATT TATCAGCAAT AAACCAGCCA 5193 GCCGGAAGGG CCGAGCGCAG AAGTGGTCCT GCAACTTTAT CCGCCTCCAT CCAGTCTATT 5253 AATTGTTGCC GGGAAGCTAG AGTAAGTAGT TCGCCAGTTA ATAGTTTGCG CAACGTTGTT 5313 GCCATTGCTG CAGGCATCGT GGTGTCACGC TCGTCGTTTG GTATGGCTTC ATTCAGCTCC 5373 GGTTCCCAAC GATCAAGGCG AGTTACATGA TCCCCCATGT TGTGCAAAAA AGCGGTTAGC 5433 TCCTTCGGTC CTCCGATCGT TGTCAGAAGT AAGTTGGCCG CAGTGTTATC ACTCATGGTT 5493 AT GGCAGCAC TGCATAATTC TCTTACTGTC ATGCCATCCG TAAGATGCTT TTCTGTGACT 5553 GGTGAGTACT CAACCAAGTC ATTCTGAGAA TAGTGTATGC GGCGACCGAG TTGCTCTTGC 5613 CCGGCGTCAA CACGGGATAA TACCGCGCCA CATAGCAGAA CTTTAAAAGT GCTCATCATT 5673 GGAAAACGTT CTTCGGGGCG AAAACTCTCA AGGATCTTAC CGCTGTTGAG ATCCAGTTCG 5733 ATGTAACCCA CTCGTGCACC CAACTGATCT TCAGCATCTT TTACTTTCAC CAGCGTTTCT 5793 GGGTGAGCAA AAACAGGAAG GCAAAATGCC GCAAAAAAGG GAATAAGGGC GACACGGAAA 5853 TGTTGAATAC TCATACTCTT CCTTTTTCAA TATTATTGAA GCATTTATCA GGGTTATTGT 5913 CTCATGAGCG GATACATATT TGAATGTATT TAGAAAAATA AACAAATAGG ggttccgcgc 5973 ACATTTCCCC GAAAAGTGCC AC.CTGACGTC TAAGAAACCA TTATTATCAT GACATTAACC 6033 ΤΑΤΑΑΑΑΑΓΑ GGCGTATCAC GAGGCCCTTT CGTCTTCAA 6072 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID ΝΟ:100: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 413 aminoácidos (Β) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína 128ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA : SEQ ID NO:100: • Met -23 Lys Lys Asn -20 Ile Ala Phe Leu Leu -15 Ala Ser Met Phe Val Phe Ser -10 Ile Ala Thr -5 Asn Ala Tyr Ala Glu 1 Val Gin Leu Val Glu 5 Ser Gly Gly Gly 10 Leu Vai Gin Pro Gly Gly Ser 15 Leu Arg Leu Ser Cys 20 Ala Ala Ser 25 Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met 30 Asn Trp Ile Arg 35 Gin Ala Pro 40 Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Vai Gly Trp 50 Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu 55 Pro Thr Tyr 60 Ala Ala Asp Phe Lys 65 Arg Arg Phe Thr Ile 70 Ser Ala Asp Thr Ser 75 Ser Asn Thr vai Tyr Leu 80 Gin Met Asn Ser Leu 85 Arg Ala Glu Asp 90 Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala 95 Lys Tyr Pro His Tyr 100 Tyr Gly Ser 105 ser His Trp Tyr Phe Asp Val Trp 110 Gly Gin Gly Thr Leu 115 Val Thr Val 120 Ser Ser Ala Ser 125 Thr Lys Gly Pro Ser 130 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser 135 Ser Lys Ser 140 Thr Ser Gly Gly Thr 145 Ala Ala Leu Gly Cys 150 Leu Val Lys Asp Tyr 155 Phe Pro Glu Pro Val Thr 160 Val Ser Trp Asn Ser 165 Gly Ala Leu Thr 170 Ser Gly Vai His Thr Phe Pro 175 Ala Val Leu Gin Ser 180 Ser Gly Leu 185 Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 190 Val Pro Ser Ser Ser 195 Leu Gly Thr 200 Gin Thr Tyr Ile 205 Cys Asn Val Asn His 210 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val 215 Asp Lys Lys 220 Vai Glu Pro Lys Ser 225 Cys Asp Lys Thr His 230 Leu * Ser Gly Gly 235 Gly Ser Gly Ser Gly Asp 240 Phe Asp Tyr Glu Lys 245 Met Ala Asn Ala 250 Asn Lys Gly Ala Met Thr Glu 255 Asn Ala Asp Glu Asn 260 Ala Leu Gin 265 Ser Asp Ala Lys Gly Lys Leu Asp 270 Ser Val Ala Thr Asp 275 Tyr Gly Ala 280 Ala Ile Asp Gly 285 Phe Ile Gly Asp Val 290 Ser Gly Leu Ala Asn Gly Asn 295 Gly Ala Thr 300 Gly Asp Phe Ala Gly 305 Ser Asn Ser Gin Met 310 Ala Gin Val 129 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ

Gly Asp Gly Asp Asn Ser Pro Leu Met Asn Asn Phe Arg Gin Tyr Leu 315 320 325 Pro Ser Leu Pro Gin Ser Vai Glu Cys Arg Pro Phe Vai Phe Ser Ala 330 335 340 345 Gly Lys Pro Tyr Glu Phe Ser Ile Asp Cys Asp Lys Ile Asn Leu Phe 350 355 360 Arg Gly Vai Phe Ala Phe Leu Leu Tyr Vai Ala Thr Phe Met Tyr Vai 365 370 375 Phe Ser Thr Phe Ala Asn Ile Leu Arg Asn Lys Glu ser 380 385 390 INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: ; 101 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 110 aminoácidos (Β) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:101: Asp Ile Gin Leu Thr Gin Ser Pro ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 1 5 10 15 Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gin Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Thr Ser Ser Leu Hls Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Ser Thr Vai Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys Arg Thr Vai 100 105 110 INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 102 . (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 119 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína 130 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:102:

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30

Gly Met Asn Trp Ile Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe 50 55 60

Lys Arg Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Ser Ser Asn Thr vai 65 70 75 80

Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr 85 90 95

Cys Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp 100 105 110

Vai Trp Gly Gin Gly Thr Leu 115 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:103: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 110 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:103:

Asp Ile Gin Leu Thr Gin ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 1 5 10 15 Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gin Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Vai Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr ,Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Ser Thr Vai Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys Arg Thr Vai 100 105 110 131 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:104: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 118 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:104:

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Ile Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe 50 55 60 Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Vai Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 do 95 Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser Hls Trp Tyr Phe Asp Vai 100 105 110 Trp Gly Gin Gly Thr Leu 115 INFORMAÇÃC l PARA SEQ ID NO: 105: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 110 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:105:

Asp Ile Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 1 5 10 15 Asp Arg vai Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gin Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Vai Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Ser Thr Vai Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys vai Glu Ile Lys Arg Thr Vai 100 105 110 132 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID ΝΟ:106: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 118 aminoácidos (Β) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:106:

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe 50 55 60 Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Tyr Pro Hls Tyr Tyr Gly Ser Ser Hls Trp Tyr Phe Asp Vai 100 105 110 Trp Gly Gin Gly Thr Leu 115 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:107: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 110 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:107:

Asp Ile Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 1 5 10 15 Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Asn Glu Gin Leu Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Vai Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Ser Thr Vai Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys Arg Thr Vai 100 105 110 133 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:108: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 118 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteina (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:108:

GlU vai Gin Leu Vai GlU Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Ile Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe 50 55 60 Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala vai Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Vai 100 105 110 Trp Gly Gin Gly Thr Leu 115 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:109: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 110 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteina (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:109:

Asp Ile Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Asn Glu Gin Leu Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Ser Thr Val Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys Arg Thr Val 100 105 110 134 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:110: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 118 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína :xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA : SEQ ID NO:110: GlU Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe 50 55 60 Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Tyr Pro Hls Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp val 100 105 110 Trp Gly Gin Gly Thr Leu 115 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:111: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 110 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:111:

Asp Ile Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Asn Glu Gin Leu Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys val Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Ser Thr Val Pro Trp 85 90 95 135 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys Arg Thr Vai 100 105 110 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:112: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 118 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:112:

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Ile Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe 50 55 60 Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp Vai 100 105 110 Trp Gly Gin Gly Thr Leu 115 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:113: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 110 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:113:

Asp Ile Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Asn Glu Gin Leu Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Thr Ser Ser Leu Hls Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 136 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Ser Thr Vai Pro Trp 85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys Arg Thr Vai 100 105 110 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:114: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 118 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:114:

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe 50 55 60 Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr ser Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr ser His Trp Tyr Phe Asp Vai 100 105 110 Trp Gly Gin Gly Thr Leu 115 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:115: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 110 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:115:

Asp Ile Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 1 5 10 15 Asp Arg vai Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gin Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Vai Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 137 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ

Ser Gly ser Gly Thr Asp Phe Thr 65 70

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 85

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai 100

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 75 80

Gin Gin Tyr Ser Thr Vai Pro Trp 90 95

Glu Ile Lys Arg Thr Vai 105 110 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:116: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 118 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:116:

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe 50 55 60 Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp Val 100 105 110 Trp Gly Gin Gly Thr Leu 115 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:117: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Modified_site (B) LOCALIZAÇÃO: 3 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /note: "Quando ο X na posição 3 representa ácido aspártico, treonina ou ácido glutâmico." 138 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ (ix) CARACTERISTICA: (Α) ΝΟΜΕ/CHAVE: Modified_site (Β) LOCALIZAÇÃO: 4 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /note: "Quando ο X na posição 4 representa Fenilalanina, Triptofano ou Tirosina." (ix) CARACTERISTICA: (A) NOME/CHAVE: Modified_site (B) LOCALIZAÇÃO: 5 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /note: "Quando ο X na posição 5 representa Treonina, Glutamina, Glicina ou Serina." (ix) CARACTERISTICA: (A) NOME/CHAVE: Modified_site (B) LOCALIZAÇÃO: 6 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /note: "Quando ο X na posição 6 representa Histidina ou Asparagina." (ix) CARACTERISTICA: (A) NOME/CHAVE: Modified_site (B) LOCALIZAÇÃO: 9 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /note: "Quando ο X na posição 9 representa Metionina ou Isoleucina." (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:117:

Gly Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Asn 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:118: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (ix) CARACTERISTICA: (A) NOME/CHAVE: Modified_site (B) LOCALIZAÇÃO: 5 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /note: "Quando ο X na posição 5 representa Tirosina ou Triptofano." (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:118:

Trp Ile Asn Thr Xaa Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe Lys 15 10 15

Arg 139 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:119: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 14 aminoácidOS (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Modified_site (B) LOCALIZAÇÃO: 3 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /note: "Quando ο X na posição 3 representa Histidina ou Tirosina." (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Modified_site (B) LOCALIZAÇÃO: 5 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /note: "Quando ο X na posição 5 representa Tirosina, Arginina, Lisina, Isoleucina,

Treonina, Ácido glutâmico ou Triptofano." (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Modified_site (B) LOCALIZAÇÃO: 6 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /note: "Quando ο X na posição 6 representa Glicina, Arginina, Alanina, Ácido aspártico,

Glutamina, Ácido glutâmico, Treonina, Leucina ou Serina." (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Modified_site (B) LOCALIZAÇÃO: 7 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /note: "Quando ο X na posição 7 representa Serina, Treonina, Lisina, Glutamina,

Asparagina, Arginina, Alanina, Ácido glutâmico ou Glicina." (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Modified_site (B) LOCALIZAÇÃO: 8 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /note: "Quando ο X na posição 8 representa Serina ou Glicina." (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:119:

Tyr Pro Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa His Trp Tyr Phe Asp Vai 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:120: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida 140 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Modified_site (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /note: "Quando ο X na posição 1 representa Fenilalanina, Isoleucina, Valina, Leucina ou Alanina." (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Modified_site (B) LOCALIZAÇÃO: 3 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /note: "Quando ο X na posição 3 representa Alanina, Leucina, Valina ou Isoleucina." (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Modified_site (B) LOCALIZAÇÃO: 5 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /note: "Quando ο X na posição 5 representa Treonina, Valina ou Lisina." (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Modified_site (B) LOCALIZAÇÃO: 6 (D) outra INFORMAÇÃO: /note: "Quando ο X na posição 6 representa Serina ou Triptofano." (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Modified_site (B) LOCALIZAÇÃO: 7 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /note: "Quando ο X na posição 7 representa Serina ou Lisina." (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Modified_site (B) LOCALIZAÇÃO: 8 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /note: "Quando ο X na posição 8 representa Asparagina ou Serina." (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Modified_site (B) LOCALIZAÇÃO: 10 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /note: "Quando ο X na posição 10 representa Valina, Alanina, Leucina ou Isoleucina." (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:120:

Xaa Ser Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa 15 10 141 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:121: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 11 aminoácidOS (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Modified_site (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /note: "Quando ο X na posição 1 representa Arginina ou Serina." (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Modified_site (B) LOCALIZAÇÃO: 3 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /note: "Quando ο X na posição 3 representa Serina ou Asparagina." (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Modified_site (B) LOCALIZAÇÃO: 4 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /note: "Quando ο X na posição 4 representa Glutamina ou Ácido glutâmico." (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Modified_site (B) LOCALIZAÇÃO: 5 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /note: "Quando ο X na posição 5 representa Glutamina ou Ácido aspártico." (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Modified_site (B) LOCALIZAÇÃO: 6 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /note: "Quando ο X na posição 6 representa Isoleucina ou Leucina." (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:121:

Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Asn Tvr Leu Asn 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:122: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 7 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína 142 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:122:

Phe Thr Ser Ser Leu His Ser 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:123: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteina (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Modified_site (B) LOCALIZAÇÃO: 5 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /note: "Quando ο X na posição 5 representa Treonina, Alanina ou Asparagina." (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Modified_site (B) LOCALIZAÇÃO: 6 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /note: "Quando ο X na posição 6 representa Valina ou Treonina." (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:123:

Gin Gin Tyr Ser Xaa Xaa Pro Trp Thr 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:124: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 108 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteina (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Modified_site (B) LOCALIZAÇÃO: 4 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /note: "Quando ο X na posição 4 representa Metionina ou Leucina." (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:124:

Asp Ile Gin Xaa Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 15 10 15

Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gin Asp Ile Ser Asn Tyr 143 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Vai Leu Ile 35 40 45

Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Ser Thr Vai Pro Trp 85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys Arg 100 105 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:125: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 123 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteina (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Modified_site (B) LOCALIZAÇÃO: 28 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /note: "Quando ο X na posição 28 representa Treonina ou Ácido aspártico." (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Modified_site (B) LOCALIZAÇÃO: 31 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /note: "Quando ο X na posição 31 representa Asparagina ou Histidina." (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Modified_site (B) LOCALIZAÇÃO: 101 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /note: "Quando ο X na posição 101 representa Tirosina ou Histidina." (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Modified_site (B) LOCALIZAÇÃO: 105 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /note: "Quando ο X na posição 105 representa Serina ou Treonina." 144 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:125:

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Xaa Phe Thr Xaa Tyr 20 25 30

Gly Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe 50 55 60

Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Lys Tyr Pro Xaa Tyr Tyr Gly Xaa Ser His Trp Tyr Phe Asp Vai 100 105 110

Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:126: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:126:

Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr Gly Met Asn 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:127: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 14 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:127:

Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp Vai 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:128: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida 145 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Modified_site (B) LOCALIZAÇÃO: 3 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /note: "Quando ο x na posição 3 representa Treonina ou Ácido aspártico." (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Modified_site (B) LOCALIZAÇÃO: 6 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /note: "Quando ο X na posição 6 representa Asparagina ou Histidina." (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:128:

Gly Tyr Xaa Phe Thr Xaa Tyr Gly Met Asn 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:129: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 14 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Modified_site (B) LOCALIZAÇÃO: 3 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /note: "Quando ο X na posição 3 representa Tirosina ou Histidina." (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Modified_site (B) LOCALIZAÇÃO: 7 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /note: "Quando ο X na posição 7 representa Serina ou Treonina." (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:129:

Tyr Pro Xaa Tyr Tyr Gly Xaa Ser His Trp Tyr Phe Asp Vai 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:130: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 237 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína 146 ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:130:

Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Ala Ser Met Phe Val Phe Ser -23 -20 -15 -10 Ile Ala Thr Asn Ala Tyr Ala Asp Ile Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser -5 1 5 Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala 10 15 20 25 Ser Gin Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly 30 35 40 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly 45 50 55 Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu 60 65 70 Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin 75 80 85 Gin Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu 90 95 100 105 Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser 110 115 120 Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn 125 130 135 Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala 140 145 150 Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp ser Lys 155 160 165 Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp 170 175 180 185 Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr HiS Gin Gly Leu 190 195 200 Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu cys 205 210

Lisboa,

Claims

ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ 1/4 REIVINDICAÇÕES 1. Variante de um anticorpo anti-factor do crescimento endotelial vascular (VEGF) progenitor, sendo que o referido anticorpo anti-VEGF progenitor possui um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, em que: (i) a referida variante se liga a VEGF humano com maior afinidade de ligação do que o progenitor e compreende uma substituição de aminoácidos pelo menos na região hipervariável CDRHl e/ou na região hipervariável CDRH3 do domínio variável de cadeia pesada do referido anticorpo progenitor, (ii) a variante possui um domínio variável de cadeia pesada compreendendo as seguintes sequências de aminoácidos da região hipervariável: CDRHl: GYX1X2X3X4YGX5N (SEQ ID NO: 117), em que Xi é D, T ou E, X2 é F, W ou Y, X3 é T, Q, G ou S, X4 é H ou N e X5 é M ou I; CDRH3: YPXiYX2X3X4X5HWYFDV (SEQ ID NO: 119), em que Xi é H ou Y, X2 é Y, R, K, I, T, E ou W, X3 é G, N, A, D, Q, E, T, K OU S, X4 é S, T, K, Q, N, R, A, E ou G e X5 é S ou G; e (iii) a variante possui uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90% de identidade de aminoácidos com o domínio variável de cadeia pesada ou leve do anticorpo progenitor de SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8.
2. Anticorpo variante de acordo com a reivindicação 1, compreendendo substituições tanto na CDRHl como na CDRH3 do domínio variável da cadeia pesada.
3. Anticorpo variante de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2, que se liga a VEGF humano com um valor de Kd não superior a cerca de 1 x 1CT8 M.
4. Anticorpo variante de acordo com a reivindicação 3 que se liga a VEGF humano com um valor de Kd não superior a cerca de 5 x IO”9 M. ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ 2/4
5. Anticorpo variante de acordo com quaisquer das reivindicações anteriores que possui um valor de ED50 para a inibição de proliferação de células endoteliais induzida por VEGF in vitro que é pelo menos 10 vezes menor do que o do anticorpo progenitor.
6. Anticorpo variante de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o nivel de identidade é de pelo menos 95%.
7. Anticorpo variante de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores possuindo um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da região hipervariável CDRH2: WINTXiTGEPTYAADFKR (SEQ ID NO: 118), em que Xi é Y ou W.
8. Anticorpo variante de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, possuindo um domínio variável de cadeia pesada compreendendo as seguintes sequências de aminoácidos da região hipervariável: CDRHl: GYXiFTX2YGMN (SEQ ID NO: 128), em que Xj é T ou D e X2 é N ou H; CDRH2: WINTYTGEPTYAADFKR (SEQ ID NO: 2); e CDRH3: YPX1YYGX2SHWYFDV (SEQ ID NO: 129), em que Χχ é Y ou H e X2 é S ou T.
9. Anticorpo variante de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que CDRHl possui a sequência de aminoácidos GYDFTHYGMN (SEQ ID NO: 126).
10. Anticorpo variante de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que CDRH3 possui a sequência de aminoácidos YPYYYGTSHWYFDV (SEQ ID NO: 127).
11. Anticorpo variante de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, possuindo um domínio variável de cadeia leve compreendendo as seguintes sequências de aminoácidos da região hipervariável: ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ 3/4 CDRL1: X1AX2X3X4X5SNYLN (SEQ ID ΝΟ: 121), em que Χι é R ou S, X2 é S ou N, X3 é Q ou E, X4 é Q ou D e X5 é I ou L; CDRL2: FTSSLHS (SEQ ID NO: 122); CDRL3: QQYSX1X2PWT (SEQ ID NO: 123), em que X2 é T, A ou N e X2 é V ou T.
12. Anticorpo variante de acordo com a reivindicação 11, em que: em CDRLl, X2 é S, X2 é S, X3 é Q, X4 é D e X5 é I; e em CDRL3, Xi é T e X2 é V.
13. Anticorpo variante de acordo com qualquer das reivindicações anteriores em que o domínio variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 116.
14. Anticorpo variante de acordo com a reivindicação 13, em que o domínio variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos: DIQXiTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRF SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 124), em que Xi é M ou L.
15. Anticorpo variante de acordo com a reivindicação 14, em que o domínio variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 115.
16. Anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, que é um anticorpo de comprimento completo.
17. Anticorpo de acordo com a reivindicação 16, que é uma IgG humana.
18. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, que é um fragmento de anticorpo.
19. Anticorpo de acordo com a reivindicação 18, que é um Fab ou Fab'. ΕΡ Ο 973 804 /ΡΤ 4/4
20. Anticorpo de acordo com a reivindicação 18, que é um F(ab')2·
21. Composição compreendendo o anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores e um transportador farmaceuticamente aceitável.
22. Ácido nucleico isolado que codifica o anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20.
23. Vector compreendendo o ácido nucleico de acordo com a reivindicação 22.
24. Célula hospedeira compreendendo o vector de acordo com a reivindicação 23.
25. Processo para produção de um anticorpo anti-VEGF humanizado compreendendo a cultura da célula hospedeira de acordo com a reivindicação 24 de modo a que o ácido nucleico seja expresso.
26. Processo de acordo com a reivindicação 25 compreendendo ainda a recuperação do anticorpo anti-VEGF humanizado a partir da cultura de células hospedeiras.
27. Medicamento compreendendo um anticorpo anti-VEGF humanizado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20 para utilização na inibição da angiogénese induzida por VEGF num mamífero, em que o referido medicamento pode ser administrado numa quantidade terapeuticamente eficaz ao mamífero.
28. Medicamento de acordo com a reivindicação 27, em que o mamífero é o ser humano.
29. Medicamento de acordo com a reivindicação 27 ou a reivindicação 28, em que o mamífero tem um tumor.
30. Medicamento de acordo com a reivindicação 27 ou a reivindicação 28, em que o mamífero tem uma desordem retinal. Lisboa,