KR101523788B1 - 뉴로필린 단편 및 뉴로필린-항체 복합체의 결정 구조 - Google Patents

뉴로필린 단편 및 뉴로필린-항체 복합체의 결정 구조 Download PDF

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Abstract

본 발명은 뉴로필린 1 (Nrp1) 및 뉴로필린 2 (Nrp2) 단편 단독의 결정 구조 및 항-뉴로필린 항체와 복합체를 형성한 상기 단편들의 결정 구조, 및 이들의 사용 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 항-Nrp 항체 및 이들의 치료적 적용 방법을 제공한다.
뉴로필린, 뉴로필린-항체 복합체, 결정 구조, 암 치료

Description

뉴로필린 단편 및 뉴로필린-항체 복합체의 결정 구조{CRYSTAL STRUCTURES OF NEUROPILIN FRAGMENTS AND NEUROPILIN-ANTIBODY COMPLEXES}
본 발명은 뉴로필린 1 (Nrp1) 및 뉴로필린 2 (Nrp2) 단편 단독의 결정 구조 및 항-뉴로필린 항체와 복합체를 형성한 상기 단편들의 결정 구조, 및 이들의 용도를 제공한다. 본 발명은 또한 Nrp1 및/또는 Nrp2에 결합하는 항체 및 이들의 사용 방법을 제공한다.
수 많은 생리적 과정과 병리적 과정을 위해 기본적으로 요구되는 것은 혈관계의 발생이다. 활동적으로 성장하는 조직, 예컨대 배아 및 종양에는 적절하게 혈액이 공급되어야 한다. 이들 조직은 일반적으로 혈관신생으로서 지칭되는 과정을 통하여 새로운 혈관 형성과 유지를 증진시켜 주는 전-혈관신생 인자를 생성시킴으로써 이러한 요구를 충족시키고 있다. 혈관 형성은 복잡하지만, 다음 단계들을 전부 또는 많이 포함하는 규칙적인 생물학적 사건이다: a) 내피 세포 (EC)가 기존의 EC로부터 증식되거나 기원 세포로부터 분화되는 단계; b) EC가 이동하고 유착하여 코드 (cord)-유사 구조를 형성시키는 단계; c) 이어서, 혈관 코드가 세관형성을 진행하여 중앙에 내강이 있는 혈관을 형성시키는 단계; d) 기존의 코드나 혈관에 싹이 나기 시작하여 이차 혈관을 형성시키는 단계; e) 원시 혈관총이 추가의 재형성 과 재생을 진행하는 단계; 및 f) 내피 주변 세포를 동원하여 내피 관에 넣어, 혈관에 대한 유지 및 조정 기능을 제공하는 단계 (이러한 세포에는, 작은 모세혈관의 경우에는 혈관주위세포, 큰 혈관의 경우에는 평활근 세포, 및 심장 내의 심근 세포가 포함된다) (참고: 문헌 [Hanahan, D. Science 277:48-50 (1997)]; [Hogan, B. L. ＆ Kolodziej, P. A. Nature Reviews Genetics. 3:513-23 (2002)]; [Lubarsky, B. ＆ Krasnow, M. A. Cell. 112:19-28 (2003)]).
혈관신생이 각종 장애의 발병 기전에 밀접한 영향을 끼치는 것으로 현재 널리 정립되었다. 이러한 장애로는 고형 종양 및 전이, 아테롬성 동맥경화증, 후수정체 섬유증식증, 혈관종, 만성 염증, 안내 신생혈관 질환, 예컨대 증식성 망막병증, 예를 들어 당뇨병성 망막병증, 연령 관련 황반 변성 (AMD), 신생혈관 녹내장, 이식된 각막 조직 및 기타 조직의 면역 거부반응, 류마티스성 관절염, 및 건선이 있다 (참고: 문헌 [Folkman et al., J. Biol. Chem., 267:10931-10934 (1992)]; [Klagsbrun et al., Annu. Rev. Physiol. 53:217-239 (1991)]; 및 [Garner A., "Vascular diseases", In: Pathobiology of Ocular Disease. A Dynamic Approach, Garner A., Klintworth GK, eds., 2nd Edition (Marcel Dekker, NY, 1994), pp 1625-1710]).
종양 성장의 경우, 혈관신생은 과형성물에서 신생물로 전이되는데 있어 결정적이고, 종양의 성장과 전이에 대한 영양을 제공하는데 있어서도 결정적인 것으로 여겨진다 (참고: 문헌 [Folkman et al., Nature 339:58 (1989)]). 신생혈관형성으로 인해 종양 세포는 정상 세포와 비교해서 성장 이점과 증식 자율성을 획득할 수 있게 된다. 종양은 통상적으로, 이용 가능한 모세혈관 층으로부터의 거리 때문에 수 입방 밀리미터 크기로만 증식할 수 있는 단일 비정상 세포로서 시작하고, 추가의 성장과 전염없이 장 기간 동안 '잠복' 상태로 정체될 수 있다. 이어서, 몇몇 종양 세포는 혈관신생 표현형으로 전환되어 내피 세포를 활성화시켜, 새로운 모세혈관으로 증식 및 성숙된다. 이와 같이 새로이 형성된 혈관은 원발성 종양을 지속적으로 성장시킬 수 있게 해줄 뿐만 아니라 전이성 종양 세포를 전파하고 재집락화시킬 수 있다. 따라서, 종양 절편 중의 미소혈관 밀도와, 유방암 뿐만 아니라 기타 몇 가지 종양 환자 생존률 간에는 상관 관계가 있는 것으로 관찰되었다 (참고: 문헌 [Weidner et al., N. Engl. J. Med 324:1-6 (1991)]; [Horak et al., Lancet 340:1120-1124 (1992)]; [Macchiarini et al., Lancet 340:145-146 (1992)]). 혈관신생 전환을 제어하는 정확한 기전은 충분히 밝혀지지 않았지만, 종양 덩어리의 신생혈관형성은 다수의 혈관신생 자극인자와 억제인자의 전체적인 밸런스로부터 비롯되는 것으로 여겨진다 (참고: 문헌 [Folkman, 1995, Nat Med 1(1):27-31]).
혈관 발생 과정은 치밀하게 조절되고 있다. 현재, 상당 수의 분자, 대개는 주변 세포에 의해 생성되고 분비된 인자가 코드-유사 구조로의 EC 분화, 증식, 이동 및 유착을 조절하는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)가 혈관신생을 자극하고 혈관 투과성을 유도시키는데 관여하는 중요한 인자로서 확인되었다 (참고: 문헌 [Ferrara et al., Endocr. Rev. 18:4-25 (1997)]). 심지어 단일 VEGF 대립 유전자의 상실로 인해서도 배아 치사가 일어난다는 발견은 혈관계 발생과 분화에 있어 상기 인자에 의해 수행되는 대체할 수 없는 역할을 지적하고 있다. 더우기, VEGF는 종양 및 안내 장애와 연관된 신생혈관형성의 중요한 매개인자인 것으로 밝혀졌다 (참고: Ferrara et al., Endocr. Rev. 상기 문헌). VEGF mRNA는 조사된 대다수의 인간 종양에 의해 과발현된다 (참고: 문헌 [Berkman et al., J. Clin. Invest. 91:153-159 (1993)]; [Brown et al., Human Pathol. 26:86-91 (1995)]; [Brown et al., Cancer Res. 53:4727-4735 (1993)]; [Mattern et al., Brit. J. Cancer 73:931-934 (1996)]; [Dvorak et al., Am. J. Pathol. 146:1029-1039 (1995)]).
또한, 안액 중의 VEGF의 농도 수준은 당뇨병 환자와 기타 허혈증 관련 망막병증 환자에게서 혈관의 적극적 증식 존재와 고도로 상관이 있다 (참고: 문헌 [Aiello et al., N. Engl. J. Med. 331:1480-1487 (1994)]). 더우기, 연구 결과, AMD에 걸린 환자의 맥락막성 신생혈관 막에 VEGF가 국재하는 것으로 입증되었다 (참고: 문헌 [Lopez et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 37:855-868 (1996)]).
항-VEGF 중화 항체는 누드 마우스에서 각종 인간 종양 세포주의 성장을 저해하고 (참고: 문헌 [Kim et al., Nature 362:841-844 (1993)]; [Warren et al., J. Clin. Invest. 95:1789-1797 (1995)]; [Borgstroem et al., Cancer Res. 56:4032-4039 (1996)]; [Melnyk et al., Cancer Res. 56:921-924 (1996)]), 또한 허혈성 망막 장애 모델에서 안내 혈관형성을 억제시킨다 (참고: 문헌 [Adamis et al., Arch. Ophthalmol. 114:66-71 (1996)]). 따라서, 항-VEGF 모노클로날 항체 또는 VEGF 작용의 기타 억제제가 종양 및 각종 안내 신생혈관 장애를 치료하기 위한 장래성 있는 후보이다. 이러한 항체는, 예를 들어 EP 817,648 (1998년 1월 14일자로 공개 됨); 및 WO 98/45331 및 WO 98/45332 (둘 다 1998년 10월 15일자로 공개됨)에 기재되어 있다. 항-VEGF 항체 중의 하나인 베바시주맵 (bevacizumab)은 전이성 결장직장암 (CRD)과 비소세포 폐암 (NSCLC)을 치료하기 위해 화학요법 처방과 병용해서 사용하도록 FDA에 의해 승인되었다. 그리고, 베바시주맵은 현재 각종 암 징후를 치료하기 위해 진행되고 있는 많은 임상 시험으로 연구 중에 있다.
신경계 발생 동안, 뉴런에서 케이블-유사 액손 (cable-like axon)이 나오기 시작하고 이는 그들의 표적에 도달하기 위해 장 거리에 걸쳐 이동한다 (참고: 문헌 [Carmeliet and Tessier-Lavigne (2005) Nature 436:193-200]). 성장하고 있는 액손의 선두 끝은 성장 원뿔로 불리우는 고도로 운동성인 감각 구조이다. 필로포디아성 (filopodial) 신장물의 신장과 수축의 동적 주기를 통하여, 성장 원뿔은 지속적으로 그의 공간적 환경에서 무수한 안내 신호로부터 감지하고 평가하며, 그의 최종 표적을 향한 신장을 위해 정확한 경로를 정밀하게 선택한다.
지난 십 여년 동안, 액손 안내 기전을 이해하는데 있어서 상당한 수준의 진보가 이루어졌다 (참고: 문헌 [Dickson (2002) Science 298:1959-64]). 안내 신호는 4가지 다양체, 즉 유인물질과 기피제에 오는데, 이들은 짧은 범위 (즉, 세포- 또는 매트릭스-연합됨) 또는 보다 긴 범위 (즉, 확산성)에서 작용할 수 있다. 지금까지, 4가지 주요 부류의 액손 안내 분자가 확인되었다: 네트린 (netrin), 세마포린 (semaphorin), 에프린 (ephrin) 및 슬리트 (slit) (참고: 문헌 [Huber et al (2003) Annu Rev Neurosci 26:509-63]).
콜랩신 (collapsin)으로 지칭되기도 하는 세마포린 (세마)은 큰 부류의 계통 발생적으로 보존되고 분비된 막 관련 단백질에 속한다. 세마포린 부류의 구성원은 신경 세포 발생 동안 반발성 및 유인성 액손 안내 사건 둘 다를 매개할 수 있다 (참고: 문헌 [Raper (2000) Curr Opin Neurobiol 10:88-94]). 지금까지 확인된 30개 이상의 세마포린은 모두 약 500개 아미노산의 보존된 N-말단 세마 도메인을 공유하고 있다. 세마포린 구성원은 그들의 구조적 유사성과 기원 종에 따라서 8개의 하위부류로 분류된다. 세마포린에 대한 통일된 명칭에 관한 보다 상세한 설명은 다음 문헌을 참고할 수 있다 (참고: 문헌 [Semaphorin Nomenclature Committee (1999) Cell 97:551-552]).
뉴로필린 (NRP) 부류은 2개의 상동성 단백질, 즉 뉴로필린-1 (NRP1) 및 뉴로필린-2 (NRP2)로 구성된다. NRP1은 성장하는 액손의 성장 원뿔에서 발현된 유형 I 130-kDa 막횡단 당단백질로서 처음 확인되었다. NRP2는 발현 클로닝에 의해 후속 확인되었다 (참고: 문헌 [Fujisawa and Kitsukawa (1998) Curr Opin Neurobiol 8:587-592]). NRP는 세마포린의 일부인 클래스 3 세마포린에 대한 수용체인 것으로 밝혀졌다. NRP는 또 다른 세마포린 수용체 부류인 플렉신 (plexin)과 함께 비-신호전달 공동-수용체로서 기능하는 것으로 제안되었다.
NRP가 초기에는 액손 안내의 매개인자로서 보고되긴 하였지만, 혈관 발생에 있어서 결정적인 역할을 하는 것으로 또한 밝혀졌다 (참고: 문헌 [Carmeliet and Tessier-Lavigne (2005)]). 이는 종양 및 내피 세포 상에서 발현된 이소형-특이적 VEGF 수용체로서 확인되어, 혈관 및 종양 생물학에 있어서의 NRP의 역할을 밝히는데 상당한 노력을 기울이게 하였다 (참고: 문헌 [Soker et al (1998) Cell 92:735- 745]; [Klagsbrun et al (2002) Adv Exp Med Biol 515:33-48]). 유전적 연구 결과는 Nrp1이 혈관 형태발생에 요구된다는 강력한 증거를 제공하였다. Nrp1 기능이 상실되면 혈관 재형성과 분지형성 결함이 생겨, Nrp2 기능 상실에 의해 추가로 증강될 수 있는 표현형이 된다 (참고: 문헌 [Kawasaki et al. (1999) Development 126:4895-4902]; [Takashima et al. (2002) Proc Natl Acad Sci USA 99:3657-3662]). 이들 결과는 Nrp1과 Nrp2 발생 초기에는 중복 기능을 가질 수도 있다고 제안한다. 그러나, 각 Nrp의 발현이 발생 후기에 분할되는데, Nrp1은 주로 동맥에서 발현되고 Nrp2는 정맥과 림프관에서 발현된다 (참고: 문헌 [Yuan et al (2002) Development 129:4797-4806]; [Herzog et al. (2001) Mech Dev 109: 115-119]). 특히, Nrp2 기능 상실 만이 림프관 발생에 특이적으로 손상을 입힌다.
Nrp1은 발생 동안 기타 많은 세포 유형에서 발현되기 때문에, 혈관 Nrp1 의 역할은 EC-특이적 녹아웃 (knock-out)의 생성을 통하여 다루어졌고, 그 결과로 기능없는 (null) 대립 유전자에서 관찰된 것과 유사한 혈관 결함이 생겨났다 (참고: 문헌 [Gu et al. (2003) Dev Cell 5:45-57]). 흥미롭게도, 이러한 연구 결과 또한, NRP1에 대한 세마3A 결합이 혈관 발생에는 요구되지 않는 것으로 밝혀졌다. 또 다른 연구에서는 Nrp1 KO 배아에서 발생하는 후뇌의 내피 끝 세포 안내에서 결함이 관찰되었다 (참고: 문헌 [Gerhardt et al. (2004) Dev Dyn 231:503-509]).
혈관 발생에 있어서의 NRP1의 역할에 관한 광범위한 연구에도 불구하고, NRP1이 VEGF 수용체 2 (VEGFR2)에 대한 VEGF 결합을 위한 인헨서로서 그리고 이로 인해 VEGFR2 신호전달을 위한 인헨서로서 VEGF-VEGFR2 경로를 통하여, 또는 VEGFR2 와 독립적인 신호전달 경로를 통해서, 또는 이 둘 다의 조합을 통하여 그의 혈관 기능을 발휘하는지에 관해서는 아직 명확하지 않다.
재조합 DNA 기술을 이용하여 모노클로날 항체를 제작할 수 있다. 모노클로날 항체, 특히 설치류로부터 유래된 모노클로날 항체에 관한 광범위한 이용이 이루어질 수 있지만, 비-인간 항체는 종종 인간에게서 항원성이다. 당해 분야에서는 비-인간 항원 결합 도메인을 인간 불변 도메인과 커플링시킨 "키메라" 항체를 구축함으로써 이러한 문제점을 극복하고자 하였다 (참고: 카빌리(Cabilly) 등의 미국 특허 제4,816,567호). 인간 불변 도메인의 이소형은 키메라 항체가 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC) 및 보체 의존성 세포독성에 참여하기에 적합하도록 선택할 수 있다. 항체의 항원 결합 기능을 해결하고 인간 항체에서 이종 서열의 사용을 최소화하기 위한 추가의 노력으로, 무손상 인간 가변 도메인의 실질적으로 일부를 해당 영역에서 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열에 의해 치환시킨 인간화 항체를 각종 항원에 대해 생성시켰다. 예를 들어, 인간 항체의 상응하는 절편을 설치류 잔기로 치환시켰다. 실제적으로, 인간화 항체는 전형적으로, 몇몇 상보성 결정 영역 (CDR) 잔기 및 가능하게는 몇몇 프레임워크 영역 (FR) 잔기를 설치류 항체 중의 유사한 부위로부터의 잔기로 치환시킨 인간 항체이다 (참고: 문헌 [Jones et al. (1986) Nature 321:522-525]; [Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327]; [Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536]).
치료적 항체를 인간에게 투여하기에 앞서, 비-인간 포유동물에서의 전임상 연구는 일반적으로 상기 항체의 효능 및/또는 독성을 평가하려고 한다. 이상적으 로는, 이들 연구에 참여한 항체는 숙주 동물 (예컨대, 마우스 또는 비-인간 영장류)에 대해 내인성인 표적 항원과 높은 효력으로 인식 및 반응할 수 있다.
파지 디스플레이 (phage display) 기술은 특정 리간드 (예컨대 항원)와 결합하는 신규 단백질을 생성 및 선별하기 위한 강력한 도구를 제공하였다. 파지 디스플레이 기술을 사용하여, 단백질 변이체의 큰 라이브러리를 생성시키고, 표적 항원과 고친화도로 결합하는 서열을 신속하게 분류할 수 있다. 변이체 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 바이러스성 외피 단백질, 예컨대 유전자 III 단백질 또는 유전자 VIII 단백질을 코딩하는 핵산 서열과 융합시킨다. 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 유전자 III 단백질의 일부를 코딩하는 핵산 서열과 융합시킨 1가 파지 디스플레이 시스템을 개발하였다 (참고: 문헌 [Bass, S. (1990) Proteins 8:309]; [Lowman and Wells (1991) Methods: A Companion to Methods in Enzymology 3:205]). 1가 파지 디스플레이 시스템에서는, 유전자 융합물이 낮은 수준으로 발현되고 야생형 유전자 III 단백질이 또한 발현되어 입자 감염성이 유지된다. 펩티드 라이브러리를 생성시키는 방법과 이들 라이브러리를 스크리닝하는 방법이 수 많은 특허에 개시되었다 (참고: 문헌 [예를 들어, 미국 특허 제5,723,286호, 미국 특허 제5,432,018호, 미국 특허 제5,580,717호, 미국 특허 제5,427,908호 및 미국 특허 제5,498,530호]).
섬유상 파지 표면 상에서의 펩티드의 발현과, 이. 콜라이 (E. coli)의 주변세포질에서의 기능성 항체 단편의 발현을 입증하는 것이 항체 파지 디스플레이 라이브러리를 개발하는 데에 있어 중요하였다 (참고: 문헌 [Smith et al. (1985) Science 228:1315]; [Skerra and Pluckthun (1988) Science 240:1038]). 항체 또는 항원 결합 폴리펩티드의 라이브러리는 수 많은 방식, 예컨대 무작위적인 DNA 서열을 삽입함으로써 단일 유전자를 변경시키는 방법 또는 관련 유전자 부류를 클로닝하는 방법으로 제조하였다. 파지 디스플레이를 이용하여 항체 또는 항원 결합 단편을 디스플레이하는 방법이 미국 특허 제5,750,373호, 제5,733,743호, 제5,837,242호, 제5,969,108호, 제6,172,197호, 제5,580,717호, 및 제5,658,727호에 기재되었다. 이어서, 라이브러리를 대상으로 하여, 목적하는 특징을 수반한 항체 또는 항원 결합 단백질의 발현에 관하여 스크리닝하였다.
파지 디스플레이 기술은 목적하는 특징을 지닌 항체를 제조하기 위한 통상적인 하이브리도마 및 재조합 방법에 비해 몇 가지 이점을 지니고 있다. 이러한 기술은 동물을 사용하지 않고서도 짧은 시간에 다양한 서열을 지닌 큰 항체 라이브러리를 개발할 수 있게 해준다. 하이브리도마의 제조나 인간화 항체의 제조는 수 개월의 제조 기간을 필요로 할 수 있다. 또한, 면역화가 전혀 요구되지 않기 때문에, 파지 항체 라이브러리는 독성이거나 항원성이 낮은 항원에 대해서도 생성시킬 수 있다 (참고: 문헌 [Hogenboom (1988) Immunotechniques 4:1-20]). 파지 항체 라이브러리를 또한 사용하여 신규한 치료적 항체를 생성 및 확인할 수 있다.
파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 면역화, 비-면역화 인간, 생식세포계 서열, 또는 본래 그대로의 B 세포 Ig 레퍼토리 (repertory)로부터 인간 항체를 생성시켰다 (참고: 문헌 [Barbas ＆ Burton(1996) Trends Biotech 14:230]; [Griffiths et al. (1994) EMBO J. 13:3245]; [Vaughan et al. (1996) Nat. Biotech. 14:309]; Winter EP 0368 684 B1). 각종 림프계 조직을 사용하여, 본래 그대로의, 또는 비면역 항원 결합 라이브러리를 생성시켰다. 이들 라이브러리 중의 몇몇이 시판되고 있다 (예컨대, 'Cambridge Antibody Technology and Morphosys'에서 개발됨) (참고: 문헌 [Vaughan et al.(1996) Nature Biotech 14:309]; [Knappik et al. (1999) J. Mol. Biol. 296:57]). 그러나, 이들 라이브러리 중의 많은 것이 제한된 다양성을 지닌다.
파지 디스플레이 라이브러리로부터 고친화도 항체를 확인 및 분리할 수 있는 능력은 치료용의 신규 항체를 단리하는 데에 있어 중요하다. 라이브러리로부터 고친화도 항체를 분리하는 것은 라이브러리의 크기, 세균성 세포 중에서의 생산 효율 및 라이브러리의 다양성에 좌우된다 (참고: 예를 들어 문헌 [Knappik et al. (1999) J. Mol. Biol. 296:57]). 라이브러리의 크기는 항체 또는 항원 결합 단백질의 부적절한 폴딩과 정지 코돈의 존재로 인한 비효율적 생산에 의해 감소된다. 세균성 세포에서의 발현은 항체 또는 항원 결합 도메인이 적절하게 폴딩되지 않는 경우에는 억제될 수 있다. 발현은 가변/불변 계면의 표면이나 선별된 CDR 잔기에서의 잔기를 교대로 돌연변이시킴으로써 개선시킬 수 있다 (참고: 문헌 [Deng et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9533], [Ulrich et al. (1995) PNAS, 92:11907-11911]; [Forsberg et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:12430]). 프레임워크 영역의 서열은 항체 파지 라이브러리를 세균성 세포에서 생성시키는 경우에 적절한 폴딩을 제공하는데 있어서의 한 인자이다.
항체 또는 항원 결합 단백질의 다양한 라이브러리를 생성시키는 것이 또한, 고친화도 항체를 단리하는데 중요하다. 제한된 CDR에서 다양화를 나타내는 라이브러리는 각종 접근 방식을 이용하여 생성시켰다 (참고: 예를 들어 문헌 [Tomlinson (2000) Nature Biotech. 18:989-994]). CDR3 영역은 이들이 종종 항원 결합에 참여하는 것으로 밝혀졌기 때문에 부분적으로 관심이 있다. 중쇄 상의 CDR3 영역은 크기, 서열 및 구조적 입체 형태 면에서 상당히 다양하다.
또한, 각 위치에서 20개 아미노산 모두를 사용하여 가변 중쇄 및 경쇄의 CDR 영역을 무작위화함으로써 다양성을 발생시켰다. 20개의 모든 아미노산을 사용하면 다양성이 큰 변이체 항체 서열이 생성되고 신규한 항체를 확인할 기회가 증가하는 것으로 여겨졌다 (참고: 문헌 [Barbas (1994) PNAS 91:3809]; [Yelton, DE (1995) J. Immunology 155:1994]; [Jackson, J.R. (1995) J. Immunology 154:3310] 및 [Hawkins, RE (1992) J. Mol. Biology 226:889]).
<발명의 개요>
본 발명은 뉴로필린-1 및 뉴로필린-2 (Nrp1 및 Nrp2) 단편 단독의 결정 구조 및 세마포린-결합 또는 VEGF-결합을 선택적으로 차단하는 항체와 복합체를 형성한 상기 단편들의 결정 구조를 제공한다. Nrp는 a2, b1 및 b2 도메인이 단단하게 패킹된 코어를 형성하는 예상치못한 도메인 배열을 채택한다. 항체 에피토프의 위치는 시험관내 실험 결과와 함께 VEGF 및 세마포린이 Nrp 결합에 대해 직접 경쟁하지 않는다는 것을 보여준다. a1 도메인에 의해 매개되는 Nrp 이량체 결정학에 기초하여, 본 발명은 또한 수용체 이량체화 및 리간드 결합을 위한 모델을 제공한다.
이러한 결과에 기초하여, 한 측면에서, 본 발명은 x-선 방사선을 회절시켜 Nrp1b1b2 단편의 3-차원 구조를 나타내는 회절 패턴을 생성하며, 이는 대략 a = 65.9 Å, b = 66.7 Å, c = 74.7 Å의 격자 상수 및 P212121의 공간군을 갖는 것인, 상기 단편에 의해 형성된 결정을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 x-선 방사선을 회절시켜 Nrp1a2b1b2 단편의 3-차원 구조를 나타내는 회절 패턴을 생성하며, 이는 대략 a = 53.2 Å, b = 68.2 Å, c = 66.6 Å의 격자 상수 및 P21의 공간군을 갖는 것인, 상기 단편에 의해 형성된 결정에 관한 것이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 x-선 방사선을 회절시켜 Nrp1에 대한 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)의 결합을 억제하는 항-Nrp1B 항체 (YW107.4.87)의 Fab 단편과 Nrp1b1 단편 사이에 형성된 복합체의 3-차원 구조를 나타내는 회절 패턴을 생성하며, 이는 대략 a = 213 Å, b = 213 Å, c = 45.3 Å의 격자 상수 및 H3의 공간군을 갖는 것인, 상기 복합체의 결정에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 x-선 방사선을 회절시켜 Nrp2b1b2 단편의 3-차원 구조를 나타내는 회절 패턴을 생성하며, 이는 대략 a = 36.5 Å, b = 70.5 Å, c = 122 Å의 격자 상수 및 P212121의 공간군을 갖는 것인, 상기 단편에 의해 형성된 결정에 관한 것이다.
또다른 측면에서 본 발명은 x-선 방사선을 회절시켜 Nrp2a2b1b2 단편의 3-차원 구조를 나타내는 회절 패턴을 생성하며, 이는 대략 a = 50.1 Å, b = 193 Å, c = 66.2 Å의 격자 상수 및 P21의 공간군을 갖는 것인, 상기 단편에 의해 형성된 결정에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 x-선 방사선을 회절시켜 Nrp2에 대한 세마포린 결합을 억제하는 항-panNrpA 항체의 Fab 단편과 Nrp2a1a2b1b2 단편 사이에 형성된 복합체의 3-차원 구조를 나타내는 회절 패턴을 생성하며, 이는 대략 a = 148 Å, b = 106 Å, c = 92.4 Å의 격자 상수 및 C2의 공간군을 갖는 것인, 상기 복합체의 결정에 관한 것이다.
본 발명은 또한 x-선 방사선을 회절시켜 Nrp2에 대한 세마포린 결합을 억제하는 항-panNrpA 항체의 Fab 단편과 Nrp2a1a2b1b2 단편 사이에 형성된 복합체의 3-차원 구조를 나타내는 회절 패턴을 생성하며, 이는 대략 a = 121 Å, b = 121 Å, c = 203 Å의 격자 상수 및 P3221의 공간군을 갖는 것인, 상기 복합체의 결정에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 도 7에 나타낸 경쇄 가변 도메인 서열 및/또는 도 8에 나타낸 중쇄 가변 도메인 서열을 포함하는 항-panNrpA 항체, 또는 그의 단편에 관한 것이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 도 9A에 나타낸 서열을 포함하는 항-panNrpA YW68.11 항체 Fab 단편에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 도 9B에 나타낸 서열을 포함하는 항-panNrpA YW68.11.26 항체 Fab 단편에 관한 것이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 항-panNrpA 항체와 Nrp 결합에 대해 경쟁하는 항-Nrp 항체에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 항-Nrp 항체는 본질적으로 항-panNrpA 항체와 동일한 에피토프에 결합한다.
다른 실시양태에서, 항-Nrp 항체는 Nrp2a1a2b1b2 아미노산 서열의 아미노산 잔기 Y39, Y45, P46, Q47, F72, N73, P74, H75, F76, A133 및 R138에 의해 규정된 계면의 적어도 일부를 포함하는 에피토프에 결합한다.
또다른 실시양태에서, 항-Nrp 항체는 Nrp1 및 Nrp2 둘다에 결합한다.
다른 실시양태에서, 항-Nrp 항체는 Nrp1 및 Nrp2 둘다에 대해 약 0.10 nM 이상, Nrp1 및 Nrp2 둘다에 대해 약 0.15 nM 이상, Nrp1 및 Nrp2 둘다에 대해 약 0.20 nM 이상, Nrp1 및 Nrp2 둘다에 대해 약 0.25 nM 이상, 또는 Nrp1 및 Nrp2 둘다에 대해 약 0.30 nM 이상의 결합 친화도를 갖는다.
다른 실시양태에서, 항-Nrp 항체는 Nrp1 및 Nrp2 둘다에 대한 Sema3 결합을 차단한다.
또다른 실시양태에서, 항-Nrp 항체는 Nrp1 또는 Nrp2에 대한 VEGF 결합을 차 단하지 않는다.
다른 실시양태에서, 항-Nrp 항체는 시험관내에서 세마포린의 생물학적 활성을 억제한다.
다른 실시양태에서, 항-Nrp 항체는 생체내에서 세마포린의 생물학적 활성을 억제한다.
다른 측면에서, 본 발명은 Nrp2a1a2b1b2 아미노산 서열의 아미노산 잔기 Y39, Y45, P46, Q47, F72, N73, P74, H75, F76, A133 및 R138에 의해 규정된 계면의 적어도 일부를 포함하는 부위에 대한 분자 결합을 고안하는 단계, 화합물을 합성하는 단계, 및 상기 화합물이 Nrp1 및 Nrp2에 대한 세마포린 결합을 차단하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 세마포린 길항제의 제조 방법에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 길항제는 Nrp1 또는 Nrp2에 대한 VEGF의 결합을 방해하지 않고, 상기 방법은 상기 길항제가 Nrp1 또는 Nrp2에 대한 VEGF의 결합을 방해하지 않는지 여부를 확인하는 추가의 단계를 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 방법은 길항제가 VEGF의 생물학적 활성을 방해하지 않는지 여부를 확인하는 단계를 더 포함한다.
길항제는 예를 들면 항체, 항체 단편, 결합 폴리펩티드, 펩티드 및 비-펩티드 소분자로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 바람직하게는 항체 또는 항체 단편이며, 여기서 항체 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, scFv, (scFv)2, dAb, 선형 항체, 단일-쇄 항체 분자, 미니바디, 디아바디 및 항체 단편으로부터의 다중특이적 항체를 포함하나 이들로 한정되지는 않는다.
다른 측면에서, 본 발명은 항-Nrp1B 항체 (YW107.4.87)의 Fab 단편과 Nrp1b1 단편 사이에 형성된 복합체의 결정으로부터 유래된 3-차원 구조를 이용하여 상기 Nrp1B 항체에 의해 결합된 에피토프의 적어도 일부를 포함하는 부위에 대한 분자 결합을 고안하는 단계 (여기서, 상기 결정은 x-선 방사선을 회절시켜 상기 복합체의 3-차원 구조를 나타내는 회절 패턴을 생성하고, 이는 a = 213 Å, b = 213 Å, c = 45.3 Å의 격자 상수 및 H3의 공간군을 가짐), 화합물을 합성하는 단계, 및 상기 화합물이 Nrp1에 대한 VEGF 결합을 억제하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는, VEGF 길항제의 제조 방법에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 길항제는 Nrp1에 대한 세마포린 결합을 방해하지 않고, 방법은 이를 확인하는 단계를 더 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 길항제는 VEGF의 생물학적 활성을 억제한다.
또다른 실시양태에서, 방법은 길항제가 VEGF의 생물학적 활성을 억제하는지 여부를 확인하는 단계를 더 포함한다.
다른 실시양태에서, 길항제는 혈관 재형성을 억제한다.
또다른 실시양태에서, 길항제는 항체, 항체 단편, 결합 폴리펩티드, 펩티드 및 비-펩티드 소분자로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 항체 또는 항체 단편이며, 여기서 항체 단편은 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, scFv, (scFv)2, dAb, 선형 항체, 단일-쇄 항체 분자, 미니바디, 디아바디, 또는 항체 단편으로부터의 다중특이적 항체일 수 있다.
본 발명은 또한 암의 치료가 필요한 포유동물 대상체에게 상기 본 발명의 방법에 의해 제조된 VEGF 길항제를 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 암 치료 방법에 관한 것이다. 암은, 예를 들어 유방암, 결장직장암, 비-소세포 폐암, 비-호지킨 림프종 (NHL), 신장암, 전립선암, 간암, 두경부암, 흑색종, 난소암, 중피종 및 다발성 골수종으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
다른 실시양태에서, 치료가 제2 요법제를 더 포함하며, 여기서 제2 요법제는 항-혈관신생제, 항-신생물 조성물, 화학요법제 및 세포독성제, 예컨대 다른 VEGF 길항제로 이루어진 군으로부터 선택된 제제일 수 있으나, 이들로 한정되지는 않는다.
다른 실시양태에서, 다른 VEGF 길항제는 항-hVEGF 항체 또는 그의 단편이다.
항-hVEGF 항체는, 예를 들어 항체 A4.6.1과 동일한 VEGF 에피토프에 결합할 수 있고, 구체적으로는 베바시주맵 또는 라니비주맵이 있다.
다른 실시양태에서, 제2 요법제는 바탈라닙 (PTK787), 에를로티닙 (타르세바(TARCEVA; 등록상표)), OSI-7904, ZD6474 (자크티마(ZACTIMA; 등록상표)), ZD6126 (ANG453), ZD1839, 수니티닙 (수텐트(SUTENT; 등록상표)), 세막사닙 (SU5416), AMG706, AG013736, 이마티닙 (글리벡(GLEEVEC; 등록상표)), MLN-518, CEP-701, PKC-412, 라파티닙 (GSK572016), 벨카데(VELCADE; 등록상표), AZD2171, 소라페닙 (넥사바르(NEXAVAR; 등록상표)), XL880 및 CHIR-265로 이루어진 군으로부 터 선택된 수용체 티로신 키나제 억제제이다.
표 1 - 데이타 수집 및 정밀화 통계
도 1 - VEGF 는 DRG 뉴론의 Sema3A -유도된 성장 원뿔 붕괴를 차단하지 않는다 A) 액손 성장 원뿔 영상. 처리되지 않은 DRG는 Sema3A의 첨가시 유의하게 감소되는 큰 액틴-풍부 성장 원뿔 (화살촉)을 갖는다. 항-Nrp 항체가 50 μg/ml 첨가되었다. B) Sema3A-유도된 성장 원뿔 붕괴의 정량화. 붕괴된 성장 원뿔의 백분율을 붕괴된 성장 원뿔과 붕괴되지 않은 성장 원뿔을 계수하여 산출하였다 (한 가지 조건당 외식편수 N = 4). 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 2 - 뉴로필린 결정 구조 요약. A) Nrp 엑토도메인은 직렬 CUB (a1a2), 직렬 응고 인자 V/VIII (b1b2) 및 하나의 MAM (c1) 도메인으로 구성된다. 상기 보고에 제시된 7개 결정 구조의 카툰 표현이 해상도 한계와 함께 아래 열거되어 있다. 주황색 구는 a2 도메인 내의 결합된 칼슘 이온을 나타낸다. B) 인간 Nrp1 및 Nrp2의 a1a2b1b2 도메인의 서열 정렬. 2차 구조 요소는 Nrp2-a1a2b1b2 구조 (청색, a1; 녹색, a2; 황색, b1; 적색 b2)를 나타내고, 스펌어드헤신 CUB 도메인 (문헌 [Romero, A. et al., Nat Struct Biol 4, 783-8 (1997)]) 및 응고 인자 V C2 도메인 (문헌 [Macedo-Ribeiro, S. et al., Nature 402, 434-9 (1999)])에 대해 채택된 관례에 따라 명명한다. 청색 및 황색 박스로 표시한 잔기는 각각 항-panNrpA 및 항-Nrp1B에 대한 항체 에피토프를 나타낸다. 주황색으로 강조된 아미노산은 a2 도 메인 내의 Ca2 + 결합 부위를 나타내는 한편, 적색으로 강조된 잔기는 a1 도메인 내의 추정되는 Ca2 + 결합 부위를 나타낸다. 녹색 배경의 잔기는 Sema3A와 Nrp1 사이의 상호작용을 파괴하는 아미노산 치환의 위치를 강조한다 (문헌 [Gu, C. et al., J Biol Chem 277, 18069-76 (2002)]). 이러한 정렬은 EsPript로 생성되었다 (문헌 [Gouet, P. et al., Nuclei Acids Res 31, 3320-3 (2003)]).
도 3 - 뉴로필린의 전반적인 도메인 골격구조. A) 항-panNrpA의 Fab 단편 (밝은 주황색, 중쇄; 회색, 경쇄)와 복합체를 형성한 Nrp2의 도메인 구성 (청색, a1; 녹색, a2; 황색, b1; 적색, b2). N-글리코실화된 잔기를 자홍색으로 표시하였다. B) Nrp1 및 Nrp2 a2b1b2 구조의 리본 표현; 주황색 구는 결합된 칼슘 이온을 강조한다. C) a2b1b2 도메인에 기초한 2개의 상이한 결정 형태로부터의 Nrp2/Fab 복합체의 중첩. a2b1b2 영역에 비해 양호하지 못한 a1 도메인의 중첩에 유의한다. 모든 구조 도면은 PyMol (http://www.pymol.org)로 생성되었다.
도 4 - 뉴로필린 CUB 도메인의 분자적 세부사항. A) a2b1b2 구조에서, a2 도메인은 결합된 칼슘 이온 (주황색)을 포함한다. Nrp a1 (패널 C 참조) 및 a2 도메인에는 스펌어드헤신에서 발견되는 b1 가닥이 없다 ([Romero et al, 상기문헌]). B) Nrp1 a2 도메인의 칼슘 이온은 3개의 음하전된 아미노산, 2개의 주쇄 카르보닐 산소 및 물 분자와 배위결합되어 있다. 이들 상호작용은 Nrp 사이에 고도로 보존된다 (도 S2 및 S3 참조). C) (왼쪽 패널) 아미노산을 Nrp2/Fab 계면에 함입된 용매-접근가능한 표면의 백분율에 따라 해당 색으로 표시하였다 (적색, 75 내지 100 ％; 주황색, 50 내지 74％; 황색, 25 내지 49％). 항-panNrpA를 Nrp1 및 Nrp2에 대해 교차반응시키고, 구조 에피토프에서 14개 잔기 중 11개가 동일하다 (흑색 텍스트, 동일; 백색 텍스트, 보존되지 않음; 별표는 측쇄가 a1 단백질 코어를 향하고 있는 잔기를 표시함). 녹색으로 밑줄 친 잔기는 Nrp1과 Sema3A23 사이의 상호작용에 필수적인 아미노산 치환의 위치를 나타낸다. (오른쪽 패널) 이들 아미노산 치환의 Cα 원자는 녹색 구로 표시되어 있다. 보라색 배경 Cα 원자는 추정되는 칼슘-결합 위치를 나타낸다. D) 항-panNrpA/Nrp2 계면. Nrp2를 정전위에 따른 분자 표면으로 도시하였다 (적색, 산성; 청색, 염기성). 항체 접촉 잔기는 CDR H2, H3 및 L3으로부터의 방향족 잔기에 의해 좌우된다.
도 5 - Nrp VEGF -결합 및 헤파린-결합 도메인의 특징. A) Nrp b1b2 결정 구조의 중첩 (Nrp1, 황색 (b1) 및 적색 (b2); Nrp2, 회색). 청색 (Nrp1) 및 녹색 (Nrp2) 잔기는 b2의 "스파이크"의 형태 차이를 강조하나, b1에서는 아니다. B) 래트 (PDB 승인 번호 2ORZ) (문헌 [Vancer Kooi, C. W., et al., Proc Natl Acad Sci USA (2007)]) 및 인간 b1b2 결정 구조의 분자 표면은 정전위에 따라 해당 색으로 표시하였다. 황색 화살표는 b1 도메인에서 "스파이크"에 의해 형성되며 래트 구조에서 투프신(Tuftsin)-결합 부위를 나타내는 산성 홈을 나타낸다 ([Vander Kooi et al., 상기문헌]). 녹색 화살표는 헤파린-결합 패치의 대략적인 위치를 나타낸다. C) 12개 Nrp (도 S3) 사이에서의 b1b2 도메인의 상대적 서열 보존율 (녹색, 100％; 황색, ≥75％)을 인간 Nrp1 b1b2 구조의 표면에 맵핑하였다. 2개의 고도로 보존된 패치를 주황색으로 나타냈다. 청록색으로 밑줄 친 잔기는 항-Nrp1B-Fab/b1 복합체에서 Fab와 접촉하는 잔기를 나타낸다. a2 도메인 (밀색)은 Nrp1로부터 b1b2 및 a2b1b2 구조의 중첩을 이용하여 나타냈다. D) 항-Nrp1B-Fab/b1 복합체의 리본 표현 (황색, b1; 주황색, 중쇄; 회색, 경쇄). E) 항-Nrp1B/bl 계면. b1 도메인은 정전위에 따른 분자 표면의 카툰으로 표시하였다; 황색 화살표는 VEGF 꼬리 결합 홈을 나타낸다. CDR H3 및 L1 만이 b1과 접촉한다.
도 6 - Nrp2 결정학상 이량체는 VEGF 및 세마포린 결합을 위한 모델을 제안한다 A) Nrp2는 Nrp2/Fab 복합체의 두 결정 형태에서 안장-모양 이량체를 형성한다. 본 도면은 Fab 복합체의 단사정계 형태로부터의 Nrp2 a1a2b1b2 도메인을 강조하고 있다. 추정되는 VEGF 꼬리-결합, 헤파린-결합 및 세마포린-결합 부위가 표시되어 있다. B) 결정 구조에서 Nrp a1-매개된 이량체에 기초한, EGF/Nrp 및 세마포린/Nrp 복합체의 가능한 모델.
도 7 - 항- panNrp A 클론 YW68 .11 및 YW68 .11.26의 경쇄 가변 도메인 서열 정렬.
도 8 - 항- panNrp A 클론 YW68 .11 및 YW68 .11.26의 중쇄 가변 도메인 서열 정렬.
도 9A - 인간 항- panNrp A IgG1 항체 YW68 .11의 완전한 서열.
도 9B - 인간 항- panNrp A IgG1 항체 YW68 .11.26의 완전한 서열.
표 S1 - 결정화 및 동결방지에 사용되는 조건.
도 S1 - 항- Nrp 항체 결합 역학 분석. 항-panNrpA 항체의 BIAcore 역학 분석. 25 ℃에서 IgG 고정된 BIAcore 센서칩 상의 50O nM 각 인간 NRP 단백질의 주사에 대한 세소그램은 결합 특이성을 입증한다. 항-panNrpA는 Nrp1 및 Nrp2 a1a2b1b2에 결합하지만, Nrp2 b1b2 도메인에는 결합하지 않는다.
도 S2 - Nrp CUB 도메인은 보존된 칼슘-결합 부위를 포함한다. A) Nrp1 a2b1b2 구조 (1.5σ에서 윤곽을 따라 그린 최종 2Fo-Fc 맵) 내의 칼슘 이온 주위의 전자 밀도. B) Nrp2 a2 도메인의 칼슘 이온. C) 칼슘-결합 부위를 나타내는 3개의 음하전된 아미노산 (주황색 바탕)은 Nrp1 및 Nrp2로부터의 CUB 도메인에 보존되어 있다.
도 S3 - 뉴로필린의 서열 정렬. 인간, 마우스, 래트, 제브라피쉬 (BRARE), 개구리 (XENLA) 및 닭 Nrp1 및 Nrp2로부터의 a1a2b1b2 도메인의 전장 서열 정렬. 본 도면은 도 2B와 동일한 계획을 이용하여 해당 색으로 표시하였으며, 이는 EsPript로 생성되었다 ([Gouet P. et al., 상기문헌]).
도 S4 - Nrp1 / 투프신 및 b1 / Fab 구조 사이의 비교. A) Nrp1-b1/항-Nrp1B-Fab 복합체에서, 대칭-관련 분자로부터의 중쇄의 C-말단 꼬리 (보라색)는 투프신-결합 부위 (Nrp2, 정전위에 따른 분자 표면; 주황색, 항체 중쇄; 회색, 항체 경쇄) 를 차지한다. B) 래트 Nrp1 b1b2와 복합체를 형성한 투프신 (녹색)의 위치 (PDB 승인 번호 2ORZ) ([Vander Kooi, et al., 상기문헌]). C) 패널 A에 강조된 2개의 구조의 중첩. 항체 및 투프신 펩티드는 인간 Nrp1 b1을 황색으로 표시하고, 래트 Nrp1 b1b2를 청록색으로 표시한 이전 패널에서와 같이 해당 색으로 표시하였다.
도 S5 - Nrp2 이량체 계면. A) 단사정계 형태의 구조로 나타난 Nrp2-a1a2b1b2/Fab 이량체의 리본 표현. B) Nrp2/Fab 결정 구조에 대한 Nrp1-b1/항-Nrp1B-Fab 구조의 중첩. C) a1/a1 계면에 함입된 아미노산을 이량체화시 함입되는 용매 접근가능한 표면의 백분율에 따라 해당 색으로 표시하였다 (적색, 75 내지 100％; 주황색, 50 내지 74％; 황색, 25 내지 49％).
본 발명은 신규한 결정 구조, 조성물, NRP-매개된 생물학적 활성을 조절하는 방법, 및 NRP-매개된 생물학적 활성을 조절할 수 있는 후보물질을 확인하기 위한 스크리닝 분석에 관한 것이다.
정의
"뉴로필린" 또는 NRP는, 문헌 [Rossignol et al. (2000) Genomics 70:211-222]에 기재된 바와 같이, 집합적으로 뉴로필린-1 (NRP1), 뉴로필린-2 (NRP2) 및 그들의 이소형 및 변이체를 지칭한다. 뉴로필린은 120 내지 130 kDa 비-티로신 키나제 수용체이다. 다수의 NRP-1 및 NRP-2 스플라이스 변이체 및 가용성 이소형이 있다. 뉴로필린의 기본 구조는 5개 도메인을 포함한다: 3개의 세포외 도메인 (a1a2, b1b2 및 c), 막횡단 도메인 및 세포질성 도메인. a1a2 도메인은 2개의 디술피드 브릿지를 형성하는 4개의 시스테인 잔기를 일반적으로 함유하는 보체 성분 C1r 및 C1s (CUB)와 상동성이다. b1b2 도메인은 응고 인자 V 및 VIII와 상동성이다. c 도메인의 중앙부는 메프린 (meprin), A5 및 수용체 티로신 포스파타제 μ 단백질과의 상동성 때문에 MAM으로서 명명된다. a1a2 및 b1b2 도메인은 리간드 결합에 책임이 있는 반면, c 도메인은 동종-이량체화 또는 이종-이량체화에 있어 결정적이다 (참고: 문헌 [Gu et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:18069-76]; [He and Tessier-Lavigne (1997) Cell 90:739-51]).
"뉴로필린 매개된 생물학적 활성"은 일반적으로, 뉴로필린-1 및/또는 뉴로필린-2가 실질적 역할을 하는 생리적 또는 병리학적 사건을 지칭한다. 이러한 활성의 비제한적 예는 배아 신경계 발생 또는 뉴런 재생 동안의 액손 안내, 혈관신생 (혈관 재형성 포함), 종양생성 및 종양 전이이다.
용어 "항체"는 가장 광범위한 의미로 사용되고, 구체적으로는 모노클로날 항체 (전장 모노클로날 항체 포함), 폴리클로날 항체, 다중-특이적 항체 (예를 들면, 이중-특이적 항체), 및 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 항체 단편이 포함된다.
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동질적 항체 집단으로부터 수득한 항체, 즉 집단을 구성하고 있는 개개의 항체가 미량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생적 돌연변이를 제외하고는 동일한 것을 지칭한다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이어서, 단일 항원 부위에 대해 유도된다. 더우기, 상이한 결정기 (에피토프)에 대해 유도된 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 통상적인 (폴리클로날) 항체 제제와는 달리, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해 유도된다. 수식어 "모노클로날"은 실질적으로 동질한 항체 집단으로부터 수득되는 바와 같은 항체의 형질을 표시하고, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생성을 요구하는 것으로 추론되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라서 사용될 모노클로날 항체는 문헌 (참고: 문헌 [Kohler et al. (1975) Nature, 256:495])에 최초로 기재된 하이브리도마 방법에 의해 만들 수 있거나 또는 재조합 DNA 방법 (예를 들면, 미국 특허 제4,816,567호 참고)에 의해 만들 수 있다. "모노클로날 항체"는 또한, 예를 들어 문헌 [Clackson et al. (1991) Nature, 352: 624-628] 및 [Marks et al. (1991) J. Mol.Biol., 222: 581-597]에 기재된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리할 수 있다.
본원에서의 모노클로날 항체에는 구체적으로, 중쇄 및/또는 경쇄 일부가 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 반면, 나머지 쇄(들)은 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 "키메라" 항체 (이뮤노글로불린) 뿐만 아니라 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 상기 항체의 단편이 포함된다 (참고: 미국 특허 제4,816,567호; 문헌 [Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855]).
"인간화" 형태의 비-인간 (예를 들면, 뮤린) 항체는 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는, 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기를 목적하는 특이성, 친화도 및 능력을 보유하고 있는 비-인간 종 (공여자 항체), 예컨대 마우스, 래트, 토끼 또는 비-인간 영장류의 초가변 영역로부터의 잔기로 대체시킨 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)이다. 몇몇 경우에는, 인간 이뮤노글로불린의 Fv 프레임워크 영역 (FR) 잔기를 상응하는 비-인간 잔기로 대체시킨다. 더우기, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 추가로 정밀화시키기 위해 만들어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 1개 이상, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 이뮤노글로불린에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 이뮤노글로불린 서열의 것이다. 인간화 항체는 임의로, 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc), 전형적으로는 인간 이뮤노글로불린의 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 추가의 상세 내역에 대해서는 다음 문헌을 참고할 수 있다 (참고: 문헌 [Jones et al. (1986) Nature 321: 522-525]; [Reichmann et al. (1988) Nature 332: 323-329] 및 [Presta (1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596]).
"종-의존성 항체"는 제2 포유동물 종으로부터의 항원의 상동체에 대한 것 보다, 제1 포유동물 종으로부터의 항원에 대한 결합 친화도가 더 강력한 항체이다. 정상적으로, 종-의존성 항체는 인간 항체와 "특이적으로 결합"하지만 [즉, 결합 친화도 (Kd) 값이 약 1 x 10-7 M 이하, 바람직하게 약 1 x 10-8 M 이하, 가장 바람직하게 약 1 x 10-9 M 이하이다], 제2 비-인간 포유동물 종으로부터의 항원의 상동체에 대한 결합 친화도는 인간 항원에 대한 그의 결합 친화도 보다 약 50배 이상, 또는 약 500배 이상, 또는 약 1000배 이상 더 약하다. 종-의존성 항체는 상기 정의된 바와 같은 각종 유형의 항체일 수 있지만, 바람직하게 인간화 또는 인간 항체이다.
본원에 사용된 바와 같은 "항체 돌연변이체" 또는 "항체 변이체"는 종-의존성 항체의 하나 이상의 아미노산 잔기를 변형시킨 종-의존성 항체의 아미노산 서열 변이체를 지칭한다. 이러한 돌연변이체는 필수적으로, 종-의존성 항체와의 서열 동일성 또는 유사성이 100％ 미만이다. 바람직한 실시양태에서, 항체 돌연변이체는 종-의존성 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열과의 아미노산 서열 동일성 또는 유사성이 75％ 이상, 보다 바람직하게 80％ 이상, 보다 바람직하게 85％ 이상, 보다 바람직하게 90％ 이상, 가장 바람직하게 95％ 이상인 아미노산 서열을 가질 것이다. 이러한 서열에 대한 동일성 또는 유사성은 서열들을 정렬시키고, 필요한 경우 갭을 도입하여 최대 서열 동일성을 달성한 후, 종-의존성 항체 잔기와 동일하거나 (즉, 동일한 잔기) 유사한 (즉, 공통의 측쇄 특성을 기준으로 하여 동일한 군으로부터의 아미노산 잔기, 하기 참고), 후보 서열 중의 아미노산 잔기의 비율로서 본원에 정의된다. 어떠한 N-말단, C-말단 또는 내부 연장물, 결실물, 또는 가변 도메인 외부에 있는 항체 서열 내로의 삽입물도 서열 동일성 또는 유사성에 영향을 미치는 것으로 간주되지 말아야 한다.
"단리된" 항체는 그의 자연 환경의 성분으로부터 동정되고 분리 및/또는 회수된 것이다. 자연 환경의 오염물 성분은 항체를 위한 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬, 및 기타 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수도 있다. 하나의 실시양태에서, (1) 로우리 방법에 의해 결정될 때 항체의 95 중량％ 초과, 가장 바람직하게는 99 중량％ 초과까지, (2) 회전 컵 서열분석기의 사용에 의해 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개 잔기를 얻기 위해 충분한 정도까지, 또는 (3) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건 하에서 SDS-PAGE에 의해 균질할 때까지, 항체를 정제할 것이다. 항체의 자연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않기 때문에, 단리된 항체는 재조합 세포 내에서 원위치의 항체를 포함한다. 그러나, 통상, 단리된 항체는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 "항체 가변 도메인"은 상보성 결정 영역 (CDR; 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3), 및 프레임워크 영역 (FR)의 아미노산 서열을 포함하는 항체 분자의 경쇄 및 중쇄 부분을 지칭한다. VH는 중쇄의 가변 도메인을 지칭한다. VL은 경쇄의 가변 도메인을 지칭한다. 본 발명에 사용된 방법에 따르면, CDR 및 FR에 할당된 아미노산 위치는 카바트에 따라서 규정될 수 있다 (참고: 문헌 [Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 and 1991)]). 항체 또는 항원 결합 단편의 아미노산 넘버링도 카바트에 따른다.
본원에 사용된 용어 "상보성 결정 영역 (CDR; 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3)은 항원 결합을 위해 필요한 존재인, 항체 가변 도메인의 아미노산 잔기를 지칭한다. 각 가변 도메인은 전형적으로, CDR1, CDR2 및 CDR3으로서 확인된 3개의 CDR 영역을 갖는다. 각 상보성 결정 영역은 카바트에 의해 정의된 바와 같은 "상보성 결정 영역"으로부터의 아미노산 잔기 [즉, 경쇄 가변 도메인 내의 잔기 약 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3); 및 중쇄 가변 도메인 내의 잔기 31-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3) (참고: 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]) 및/또는 "초가변 루프"로부터의 잔기 [즉, 경쇄 가변 도메인 내의 잔기 약 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3); 및 중쇄 가변 도메인 내의 잔기 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3) (참고: 문헌 [Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917)])를 포함할 수 있다. 몇몇 경우에는, 상보성 결정 영역이 카바트에 따라서 정의된 CDR 영역과 초가변 루프 둘 다로부터의 아미노산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체 4D5의 중쇄의 CDRH1에는 아미노산 26 내지 35가 포함된다.
"프레임워크 영역" (FR로 후술됨)은 CDR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다. 각 가변 도메인은 전형적으로, FR1, FR2, FR3 및 FR4로서 확인된 4개의 FR을 갖는다. CDR이 카바트에 따라서 정의되는 경우, 경쇄 FR 잔기는 잔기 약 1-23 (LCFR1), 35-49 (LCFR2), 57-88 (LCFR3), 및 98-107 (LCFR4)에 위치하고, 중쇄 FR 잔기는 중쇄 잔기 내의 잔기 약 1-30 (HCFR1), 36-49 (HCFR2), 66-94 (HCFR3), 및 103-113 (HCFR4)에 위치한다. CDR이 초가변 루프로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 경우, 경쇄 FR 잔기는 경쇄 내의 잔기 약 1-25 (LCFR1), 33-49 (LCFR2), 53-90 (LCFR3), 및 97-107 (LCFR4)에 위치하고, 중쇄 FR 잔기는 중쇄 잔기 내의 잔기 약 1-25 (HCFR1), 33-52 (HCFR2), 56-95 (HCFR3), 및 102-113 (HCFR4)에 위치한다. 몇몇 경우에, CDR이 카바트에 의해 정의된 바와 같은 CDR과 초가변 루프 둘 다로부터의 아미노산을 포함하는 경우, FR 잔기는 이에 따라서 조정될 것이다. 예를 들어, CDRH1이 아미노산 H26-H35를 포함하는 경우, 중쇄 FR1 잔기는 위치 1-25에 존재하고, FR2 잔기는 위치 36-49에 존재한다.
본원에 사용된 바와 같은 "코돈 세트"는 목적하는 변이체 아미노산을 코딩하기 위해 사용되는 상이한 뉴클레오티드 삼중자 서열 세트를 지칭한다. 올리고뉴클레오티드 세트는 코돈 세트에 의해 제공된 뉴클레오티드 삼중자의 가능한 모든 조합을 나타내고 목적하는 아미노산 군을 코딩할 서열을 포함하여, 예를 들어 고체 상 합성에 의해 합성할 수 있다. 표준 형태의 코돈 명칭은 당해 분야에 공지되어 있고 본원에 기재된 IUB 코드에 따른다. 코돈 세트는 전형적으로, 3개의 대문자를 이탤릭체로써 나타낸 것인데, 예를 들면 NNK , NNS , XYZ , DVK 등이다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같은 "비-무작위 코돈 세트"는 본원에 기재된 바와 같은 아미노산 선별 기준을 부분적으로, 바람직하게 완전히 충족시키는 선별 아미노산을 코딩하는 코돈 세트를 지칭한다. 특정 위치에서 선별된 뉴클레오티드 "축퇴 (degeneracy)"를 나타내는 올리고뉴클레오티드의 합성은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들면 TRIM 접근 방식이다 (참고: 문헌 [Knappek et al. (1999) J. Mol. Biol. 296:57-86]; [Garrard ＆ Henner (1993) Gene 128:103]). 특정한 코돈 세트를 갖는 올리고뉴클레오티드 세트는 시판용 핵산 합성기 [공급처: 예를 들어, Applied Biosystems, Foster City, CA]를 사용하여 합성할 수 있거나, 또는 상업적으로 구입할 수 있다 [공급처; 예를 들어, Life Technologies, Rockville, MD]). 따라서, 특정 코돈 세트를 갖는 합성된 올리고뉴클레오티드 세트는 전형적으로, 상이한 서열을 수반한 복수 개의 올리고뉴클레오티드를 포함할 것인데, 이러한 상이성은 전반적인 서열 내의 코돈 세트에 의해 확립된다. 본 발명에 따라서 사용된 바와 같은 올리고뉴클레오티드는 가변 도메인 핵산 주형과 혼성화할 수 있는 서열을 갖고, 또한 반드시는 아니지만, 예를 들어 클로닝 목적에 유용한 제한 효소 부위를 포함할 수 있다.
"Fv" 단편은 완전한 항체 인식 및 결합 부위를 함유하는 항체 단편이다. 이러한 영역은 1개의 중쇄 가변 도메인과 1개의 경쇄 가변 도메인이, 예를 들어 scFv로 단단하게 사실상 공유적으로 연합된 이량체로 이루어진다. 이러한 입체 배치에서는, 각 가변 도메인의 3개 CDR이 VH-VL 이량체 표면 상에 항원 결합 부위를 명백히 규정하도록 상호 작용한다. 집합적으로, 6개 CDR 또는 그의 일부가 항체에 항원 결합 특이성을 부여해 준다. 그러나, 통상적으로 전체 결합 부위 보다는 낮은 친화도이긴 하지만, 심지어 단일 가변 도메인 (또는 특정 항원에 대해 특이적인 3개의 CDR 만을 포함하는 Fv의 절반)도 항원을 인식하고 결합할 수 있는 능력을 지니고 있다.
"Fab" 단편은 경쇄의 가변 및 불변 도메인과, 중쇄의 가변 및 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. F(ab')2 항체 단편은 일반적으로 그들 사이에 힌지 시스테인에 의해 그들의 카복시 말단 근처에 공유적으로 연결되는 한 쌍의 Fab 단편을 포함한다. 항체 단편의 기타 화학적 커플링물이 또한 공지되어 있다.
"단일 쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는데, 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄 내에 존재한다. 일반적으로, Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위해 목적하는 구조를 형성할 수 있게 해주는, VH 도메인과 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv 검토에 대해서는 다음 문헌을 참고할 수 있다 (참고: 문헌 [Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]).
용어 "디아바디"는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 지칭하는데, 이들 단편은 동일한 폴리펩티드 쇄 내에 경쇄 가변 도메인 (VL)과 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다 (VH 및 VL). 동일한 쇄 상에서 두 도메인 간에 짝짓기를 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 이들 도메인을 또 다른 쇄의 상보적 도메인와 짝짓기하여, 2개의 항원-결합 부위를 창출시킨다. 디아바디는, 예를 들어 다음 문헌에 보다 상세히 기재되었다 (참고: 문헌 [EP 404,097; WO 1993/11161] 및 [Hollinger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448]).
"선형 항체"란 표현은 문헌 (참고: 문헌 [Zapata et al. (1995 Protein Eng, 8(10):1057-1062)])에 기재된 항체를 지칭한다. 간단하게 설명하면, 이들 항체는 상보성 경쇄 폴리펩티드와 함께, 한 쌍의 항원 결합 영역을 형성하는 한 쌍의 직렬 Fd 절편 (VH-CH1-VH-CH1)을 포함한다. 선형 항체는 이중-특이적 또는 단일-특이적일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "라이브러리"는 복수 개의 항체 또는 항체 단편 서열 (예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드), 또는 이들 서열을 코딩하는 핵산을 지칭하는데, 이 서열은 본 발명의 방법에 따라서 이들 서열 내로 도입되는 변이체 아미노산의 조합에 있어서 상이하다.
"파지 디스플레이"는 변이체 폴리펩티드를 파지, 예를 들어 섬유상 파지 입자의 표면 상에 외피 단백질의 적어도 일부와의 융합 단백질로서 디스플레이하는 기술이다. 파지 디스플레이의 유용성은 무작위화 단백질 변이체의 큰 라이브러리를 대상으로 하여, 표적 항원과 고 친화도로 결합하는 서열을 신속하고도 효율적으로 분류할 수 있다는 사실에 있다. 펩티드 및 단백질 라이브러리를 파지 상에 디스플레이하는 것은 특이적 결합 특성을 지닌 폴리펩티드를 알아보기 위해 수 백만개의 폴리펩티드를 스크리닝하는데 사용되어 왔다. 다가 파지 디스플레이 방법은 섬유상 파지의 유전자 III 또는 유전자 VIII과의 융합을 통하여 소형 무작위 펩티드 및 소형 단백질을 디스플레이하기 위해 사용되어 왔다 (참고: 문헌 [Wells and Lowman (1992) Curr. Opin. Struct. Biol. 3:355-362] 및 이에 인용된 참고 문헌들). 1가 파지 디스플레이에서는, 단백질 또는 펩티드 라이브러리를 유전자 III 또는 그의 일부와 융합시키고, 야생형 유전자 III 단백질의 존재 하에 저 수준으로 발현시켜 파지 입자가 상기 융합 단백질의 1개 카피를 디스플레이하거나 전혀 디스플레이하지 않도록 한다. 결합 활성도 효과는 다가 파지에 비해 저하되므로, 분류는 내재된 리간드 친화도를 기준으로 하였고 DNA 조작을 단순화시켜 주는 파지미드 (phagemid) 벡터를 사용하였다 (참고: 문헌 [Lowman and Wells (1991) Methods: A companion to Methods in Enzymology 3:205-0216]).
"파지미드"는 세균성 복제 기점, 예를 들어 Co1El, 및 박테리오파지의 유전자간 영역의 카피를 갖는 플라스미드 벡터이다. 파지미드는 섬유상 박테리오파지 및 람다 박테리오파지를 포함한 공지된 모든 박테리오파지 상에서 사용할 수 있다. 이러한 플라스미드는 또한 일반적으로, 항생제 내성을 위한 선별성 마커를 함유할 것이다. 이들 벡터 내로 클로닝된 DNA 절편은 플라스미드로서 증식될 수 있다. 이들 벡터를 정착시킨 세포에 파지 입자의 생성에 필요한 모든 유전자가 제공되는 경우에는, 플라스미드의 복제 방식이 롤링 서클 복제 방식으로 변화되어 플라스미드 DNA 및 패키지 파지 입자의 1개 가닥 카피를 생성시킨다. 파지미드는 감염성 또는 비-감염성 파지 입자를 형성할 수 있다. 이 용어에는 융합 단백질로서 이종 폴리펩티드 유전자와 연결된 파지 외피 단백질 유전자 또는 그의 단편을 함유하므로 상기 이종 폴리펩티드가 파지 입자의 표면 상에서 디스플레이 되도록 하는 파지미드가 포함된다.
용어 "파지 벡터"는 이종 유전자를 함유하고 복제할 수 있는 이중 가닥 복제 형태의 박테리오파지를 의미한다. 파지 벡터는 파지 복제와 파지 입자 형성을 허용해 주는 파지 복제 기점을 갖는다. 파지는 바람직하게, 섬유상 박테리오파지, 예를 들어 M13, f1, fd, Pf3 파지 또는 그의 유도체, 또는 람다 파지, 예를 들어 람다 21, 파이 (phi)80, 파이81, 82, 424, 434 등 또는 그의 유도체이다.
본원에 사용된 바와 같은 "용매 접근가능한 위치"는 용매 접근 및/또는 분자 (예를 들어, 항체-특이적 항원)와의 접촉에 잠재적으로 이용 가능한 바와 같이, 구조에 기초하여 항체 또는 항원 결합 단편의 구조 및/또는 모델화 구조의 앙상블을 결정하는 원시 항체 또는 항원 결합 단편의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 내의 아미노산 잔기 위치를 지칭한다. 이들 위치는 전형적으로, CDR 내에 그리고 단백질의 외부 상에서 발견된다. 본원에 정의된 바와 같은, 항체 또는 항원 결합 단편의 용매 접근가능한 위치는 당해 분야에 공지된 수 많은 알고리즘을 사용하여 결정할 수 있다. 바람직하게, 용매 접근가능한 위치는 항체의 3차원적 모델로부터의 좌표를 사용하여, 바람직하게는 인사이트II 프로그램 (공급처: Accelrys, San Diego, CA)과 같은 컴퓨터 프로그램을 사용하여 결정한다. 용매 접근가능한 위치는 당해 분야에 공지된 알고리즘을 사용하여 결정할 수도 있다 (참고: 문헌 [예를 들어, Lee and Richards (1971) J. Mol. Biol. 55, 379] 및 [Connolly (1983) J. Appl. Cryst. 16, 548]). 용매 접근가능한 위치의 결정은 항체로부터 수득한 3차원적 구조 정보 및 단백질 모델링에 적합한 소프트웨어를 사용하여 수행할 수 있다. 이들 목적에 활용될 수 있는 소프트웨어에는 SYBYL 바이오폴리머 모듈 (Biopolymer Module) 소프트웨어 (공급처: Tripos Associates)가 포함된다. 일반적으로, 그리고 바람직하게, 알고리즘 (프로그램)에 사용자 입력 크기 파라미터가 요구되는 경우, 계산에 사용되는 프로브의 "크기"는 직경이 약 1.4 이하 옹스트롬으로 설정된다. 또한, 개인용 컴퓨터용 소프트웨어를 사용하여 용매 접근가능한 영역과 구역 공법을 결정하는 것이 다음 문헌에 보고되었다 (참고: 문헌 [Pacios (1994) Comput. Chem. 18(4): 377-386]).
"혈관신생 인자 또는 혈관신생제"는 혈관 발생을 자극하는, 예를 들어 혈관신생, 내피 세포 성장, 혈관 안정성, 및/또는 혈관생성 등을 증진시키는 성장 인자이다. 예를 들어, 혈관신생 인자에는 VEGF 및 VEGF 부류 구성원, PlGF, PDGF 부류, 섬유아세포 성장 인자 부류 (FGF), TIE 리간드 (안지오포이에틴: Angiopoietin), 에프린, Del-1, 섬유아세포 성장 인자: 산성 (aFGF) 및 염기성 (bFGF), 폴리스타틴 (Follistatin), 과립구 집락 자극 인자 (G-CSF), 간세포 성장 인자 (HGF)/스캐터 인자 (SF), 인터루킨-8 (IL-8), 렙틴 (Leptin), 미드카인 (Midkine), 뉴로필린, 태반 성장 인자, 혈소판 유래된 내피 세포 성장 인자 (PD-ECGF), 혈소판 유래된 성장 인자, 특히 PDGF-BB 또는 PDGFR-베타, 플레이오트로핀 (Pleiotrophin) (PTN), 프로그라눌린, 프롤리페린, 전환 성장 인자-알파 (TGF-알파), 전환 성장 인자-베타 (TGF-베타), 종양 괴사 인자-알파 (TNF-알파) 등이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다. 이에는 또한, 상처 치유를 촉진시켜 주는 인자, 예를 들어 성장 호르몬, 인슐린 유사 성장 인자-I (IGF-I), VIGF, 표피 성장 인자 (EGF), CTGF 및 그의 부류 구성원, 및 TGF-알파 및 TGF-베타가 포함될 수 있다 (참고: 예를 들어 문헌 [Klagsbrun and D'Amore (1991) Annu. Rev. Physiol. 53:217-39]; [Streit and Detmar (2003) Oncogene 22:3172-3179]; [Ferrara ＆ Alitalo (1999) Nature Medicine 5(12):1359-1364]; [Tonini et al. (2003) Oncogene 22:6549-6556 (e.g., Table 1 listing known angiogenic factors)] 및 [Sato (2003) Int. J. Clin. Oncol. 8:200-206]).
"항혈관신생제" 또는 "혈관신생 억제제"는 혈관신생, 혈관형성 또는 바람직하지 못한 혈관 투과성을 직접 또는 간접적으로 억제시키는 소 분자량 물질, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 단리된 단백질, 재조합 단백질, 항체, 또는 그의 접합체 또는 융합 단백질을 지칭한다. 항혈관신생제에는 혈관형성 인자 또는 그의 수용체와 결합하여 이들의 혈관형성 활성을 차단시키는 제제가 포함된다는 것을 인지해야 한다. 예를 들어, 항혈관신생제는 상기 정의된 바와 같은 혈관신생제에 대한 항체 또는 기타 길항제, 예를 들어 VEGF-A 또는 VEGF-A 수용체 (예를 들어, KDR 수용체 또는 Flt-1 수용체)에 대한 항체, 항-PDGFR 억제제, 예를 들어 글리벡 (Gleevec™) (이마티닙 메실레이트: Imatinib Mesylate)이다. 항혈관신생제에는 또한, 본래의 혈관신생 억제제, 예를 들어 안지오스타틴, 엔도스타틴 등이 포함된다 (참고: 예를 들어, 문헌 [Klagsbrun and D'Amore (1991) Annu. Rev. Physiol. 53:217-39]; [Streit and Detmar (2003) Oncogene 22:3172-3179 (e.g., Table 3 listing anti-angiogenic therapy in malignant melanoma)]; [Ferrara ＆ Alitalo (1999) Nature Medicine 5(12):1359-1364]; [Tonini et al. (2003) Oncogene 22:6549-6556 (e.g., Table 2 listing known antiangiogenic factors)] 및 [Sato (2003) Int. J. Clin. Oncol. 8:200-206 (e.g., Table 1 listing anti- angiogenic agents used in clinical trials)]).
본원에 사용된 용어 "VEGF" 또는 "VEGF-A"는 문헌 (참고: 문헌 [Leung et al. (1989) Science 246:1306] 및 [Houck et al. (1991) Mol. Endocrin, 5:1806])에 기재된 바와 같은, 165-아미노산 인간 혈관 내피 세포 성장 인자 및 관련된 121-, 189- 및 206-아미노산 인간 혈관 내피 세포 성장 인자, 및 그의 천연 발생적 대립 유전자성 및 프로세싱된 형태를 지칭한다. 용어 "VEGF"는 또한, 비-인간 종, 예를 들어 마우스, 래트 또는 영장류로부터의 VEGF를 지칭한다. 종종 특이적 종으로부터의 VEGF는 인간 VEGF의 경우에는 hVEGF란 용어로써 표시되고, 뮤린 VEGF의 경우에는 mVEGF란 용어로써 표시된다. 용어 "VEGF"는 또한, 165-아미노산 인간 혈관 내피 세포 성장 인자의 아미노산 8 내지 109 또는 1 내지 109를 포함하는 폴리펩티드의 절단된 형태를 지칭하기 위해 사용된다. 이러한 형태의 VEGF에 대한 참고는 본 출원에서, 예를 들어 "VEGF (8-109)," "VEGF (1-109)" 또는 "VEGF165"로써 확인할 수 있다. "말단절단된" 본래의 VEGF에 대한 아미노산 위치는 본래의 VEGF 서열에서 표시된 바와 같이 넘버링된다. 예를 들어, 말단절단된 본래의 VEGF 내의 아미노산 위치 17 (메티오닌)은 또한, 본래의 VEGF 내의 위치 17 (메티오닌)이다. 말단절단된 본래의 VEGF는 본래의 VEGF와 거의 동등한 수준으로 KDR 및 Flt-1 수용체에 대한 결합 친화도를 갖는다.
"항-VEGF 항체"는 VEGF와 충분한 친화도와 특이성으로 결합하는 항체이다. 바람직하게, 본 발명의 항-VEGF 항체는 VEGF 활성과 관련된 질병이나 질환을 표적으로 하여 이를 방해하는데 있어서 치료제로서 사용할 수 있다. 항-VEGF 항체는 통상적으로, 기타 VEGF 상동체, 예를 들어 VEGF-B 또는 VEGF-C와는 결합하지 않을 뿐만 아니라 기타 성장 인자, 예를 들어 PIGF, PDGF 또는 bFGF와도 결합하지 않을 것이다. 바람직한 항-VEGF 항체는 하이브리도마 ATCC HB 10709에 의해 생산된 모노클로날 항-VEGF 항체 A4.6.1과 동일한 에피토프와 결합하는 모노클로날 항체이다. 보다 바람직하게, 항-VEGF 항체는 문헌 (참고: 문헌 [Presta et al. (1997) Cancer Res. 57:4593-4599])에 따라서 생성된 재조합 인간화 항-VEGF 모노클로날 항체인데, 이에는 베바시주맵 (BV; 아바스틴(Avastin; 상표명))로서 공지된 항체가 포함되지만, 그에 제한되지 않는다.
"rhuMAb VEGF" 또는 "아바스틴(등록상표)"로서 공지되기도 한 항-VEGF 항체 "베바시주맵 (BV)"는 문헌 (참고: 문헌 [Presta et al. (1997) Cancer Res. 57:4593-4599])에 따라서 생성된 재조합 인간화 항-VEGF 모노클로날 항체이다. 이는 인간 VEGF가 그의 수용체와 결합하는 것을 차단시키는 뮤린 항-hVEGF 모노클로날 항체 A.4.6.1로부터의 항원 결합 상보성 결정 영역과 돌연변이된 인간 IgG1 프레임워크 영역을 포함한다. 대부분의 프레임워크 영역을 포함한, 베바시주맵의 아미노산 서열의 대략 93％가 인간 IgG1로부터 유래되고, 이 서열의 약 7％는 뮤린 항체 A4.6.1로부터 유래된다. 베바시주맵은 분자량이 약 149,000 달톤이고 글리코실화된다.
"VEGF 길항제"는 VEGF 활성 (이에는 하나 이상의 VEGF 수용체와의 결합성 등이 포함된다)을 중화, 차단, 억제, 폐기, 저하 또는 방해할 수 있는 분자를 지칭한다. VEGF 길항제에는 항-VEGF 항체 및 그의 항원 결합 단편; VEGF와 특이적으로 결합함으로써 하나 이상의 수용체에 대한 그의 결합을 격리시키는 수용체 분자 및 유도체; 항-VEGF 수용체 항체; 및 VEGF 수용체 길항제, 예를 들어 VEGF 티로신 키나제의 소분자 억제제 등이 포함된다. 본원에 사용된 용어 "VEGF 길항제"는 특히 뉴로필린-1 및/또는 뉴로필린-2 (Nrp-1 및/또는 Nrp-2)에 결합하며, VEGF 활성을 중화, 차단, 억제, 폐기, 저하 또는 방해할 수 있는 분자 (항체, 항체 단편, 기타 결합 폴리펩티드, 펩티드 및 비-펩티드 소분자 포함), 예컨대 항-Nrp1 및 항-Nrp2 항체, 및 Nrp1 및 Nrp2와 교차-반응하는 항체 (단, 이들은 VEGF 활성을 중화, 차단, 억제, 폐기, 저하 또는 방해할 수 있음) 등을 포함한다. 따라서, 용어 "VEGF 활성"은 특히 VEGF의 (상기 정의된 바와 같은) 뉴로필린 매개된 생물학적 활성을 포함한다.
"세마포린 길항제"는 세마포린 활성 (이에는 하나 이상의 세마포린 수용체에 대한 결합성 등이 포함된다)을 중화, 차단, 억제, 폐기, 저하 또는 방해할 수 있는 분자를 지칭한다. 세마포린 길항제는 그의 항-세마포린 항체 및 항원-결합 단편, 세마포린에 특이적으로 결합하여 하나 이상의 수용체에 대한 결합을 격리시키는 수용체 분자 및 유도체, 항-세마포린 수용체 항체 및 세마포린 수용체 길항제, 예컨대 세마포린의 소분자 억제제 등을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "세마포린 길항제"는 특히 뉴로필린-1 및/또는 뉴로필린-2 (Nrp-1 및/또는 Nrp-2)에 결합하며 세마포린 활성을 중화, 차단, 억제, 폐기, 저하 또는 방해할 수 있는 분자 (항체, 항체 단편, 기타 결합 폴리펩티드, 펩티드, 및 비-펩티드 소분자 포함), 예컨대 항-Nrp1 및 항-Nrp2 항체, 및 Nrp1 및 Nrp2와 교차-반응하는 항체 (단, 이들은 세마포린 활성을 중화, 차단, 억제, 폐기, 저하 또는 방해할 수 있음) 등을 포함한다. 따라서, 용어 "세마포린 활성"은 특히 클래스 3 세마포린의 (상기 정의된 바와 같은) 뉴로필린 매개된 생물학적 활성을 포함한다. 이러한 생물학적 활성은, 예를 들면 배아 신경계 발생 및 뉴런-재생 동안 신경돌기 성장 억제 효과를 포함한다.
"치료 (처치)"는 치료 처치와 예방 또는 방지 조치 둘 다를 지칭한다. 치료가 필요한 대상체에는 이미 장애가 있는 대상체 뿐만 아니라 해당 장애를 예방하기 위한 대상체가 포함된다.
"장애"는 치료로부터 이득을 얻는 임의의 증상이다. 예를 들면, 비정상적인 혈관신생 (과도한, 부적절한, 또는 제어되지 않은 혈관신생) 또는 혈관 투과성으로 인해 고통받고 있거나 이러한 비정상적인 혈관형성 또는 혈관 투과성에 대항한 예방을 필요로 하는 포유동물이다. 이에는 포유동물이 문제의 장애에 걸리기 쉬운 병리적 상태를 포함한, 만성 및 급성 장애 또는 질병이 포함된다. 본원에서 치료하고자 하는 장애의 비제한적 예에는 악성 및 양성 종양; 비-백혈병 및 림프계 악성 종양; 뉴런, 신경교, 성상 세포, 시상 하부 및 기타 과립상, 대식 세포성, 표피성, 간질성 및 포배강 장애; 및 염증성, 혈관신생 및 면역학적 장애가 포함된다.
비정상적인 혈관형성은 새로운 혈관이 질병 상태에서 과도하게, 불충분하게 또는 부적절하게 (예를 들어, 혈관신생 부위, 시기 또는 발병이 의학적 관점에서 볼 때 바람직하지 못하다) 성장하는 경우, 또는 이로 인해 질병 상태가 유발되는 경우에 일어난다. 과도한, 부적절한 또는 제어되지 않은 혈관형성은 암, 특히 혈관화 고형 종양 및 전이성 종양 [결장, 폐암 (특히 소세포 폐암), 또는 전립선 암 포함], 안구 신생혈관 생성에 의해 유발된 질환, 특히 당뇨병성 실명, 망막병증, 주로 당뇨병성 망막병증 또는 연령 관련 황반 변성 (AMD), 건선, 건선성 관절염, 혈관모세포종, 예를 들어 혈관종; 염증성 신 질환, 예를 들어 사구체신염, 특히 메산지움 증식성 사구체신염, 용혈성 요독 증후군, 당뇨병성 신병증 또는 고혈압성 신경화증; 각종 염증 질환, 예를 들어 관절염, 특히 류마티스성 관절염, 염증성 장 질환, 건선, 사르코이드증, 동맥성 동맥경화증 및 이식 후 발생하는 질환, 자궁내막증 또는 만성 천식 및 기타 70가지 이상 질환에서와 같이 병든 상태를 유발시키거나 병든 상태를 악화시키는데 일조하는 새로운 혈관 성장이 있는 경우에 일어난다. 새로운 혈관은 병든 조직에 영양을 공급하고, 정상 조직을 파괴시키며, 암의 경우에는 새로운 혈관이 종양 세포를 순환계 내로 도피시켜 다른 기관에 머무르게 할 수 있다 (종양 전이). 예를 들어, 관상 동맥 질환, 발작 및 지연된 상처 치유와 같은 질병에서 병든 상태 악화에 일조하는 부적절한 혈관 성장이 있는 경우에 불충분한 혈관혈성이 일어난다. 추가로, 궤양, 발작 및 심장 마비는 자연 치유를 위해 통상적으로 요구되는 혈관형성의 부재로부터 비롯될 수 있다. 본 발명은 상기 언급된 질병이 발생할 위험이 있는 환자를 치료하는 것을 고려한다.
본 발명의 항체 또는 폴리펩티드를 투여하기 위한 후보인 기타 환자는 섬유혈관 조직의 비정상적 증식, 딸기코, 후천성 면역 결핍증, 동맥 폐색, 아토피성 각막염, 세균성 궤양, 베체트병 (Bechets disease), 혈행성 종양, 경동맥 폐색 질환, 맥락막 신생혈관 증식, 만성 염증, 만성 망막 박리, 만성 포도막염, 만성 유리체염, 콘택트 렌즈 과도착용, 각막 이식편 거부, 각막 신생혈관 증식, 각막 이식편 신생혈관 증식, 크론병 (Crohn's disease), 일스병 (Eales disease), 유행성 각결막염, 진균성 궤양, 단순 포진 감염증, 대상 포진 감염증, 과점성 증후군, 카포시 (Kaposi) 육종, 백혈병, 지질 변성, 라임병 (Lyme's disease), 말단 표피 박리, 무렌 (Mooren) 궤양, 나병 이외의 미코박테리아 감염증, 근시, 안구 신생혈관병, 안와, 오슬러-웨버 (Osler-Weber) 증후군 [오슬러-웨버-렌두 (Osler-Weber-Rendu)], 골관절염, 파제트병 (Pagets disease), 주변 포도막염, 유사천포창, 필렉테눌로시스 (phylectenulosis), 다발성 동맥염, 레이저 후 합병증, 원충 감염증, 탄성섬유성 가성황색종, 건성 익상편 각막염, 방사상 각막절개술, 망막 신생혈관 증식, 미숙아 망막병증, 후수정체 섬유증식증, 사르코이드, 공막염, 겸상 적혈구 빈혈, 쇼그렌 (Sogrens) 증후군, 고형 종양, 슈타르가르츠 (Stargarts) 질환, 스티븐 존슨 (Steven's Johnson) 질환, 상부연 각막염, 매독, 전신성 루푸스, 테리엔 (Terrien) 말단 변성, 독성 플라시모시스, 외상, 유윙 (Ewing) 육종의 종양, 신경모세포종의 종양, 골육종의 종양, 망막모세포종의 종양, 횡문근육종의 종양, 궤양성 결장염, 정맥 폐색, 비타민 A 결핍증 및 베게너 (Wegener) 사르코이드증, 당뇨병과 연관된 바람직하지 못한 혈관형성, 기생충 질병, 비정상적 상처 치유, 수술 후 비대증, 손상 또는 외상, 모발 성장 억제, 배란 및 황체 형성의 억제, 착상 억제 및 자궁 내에서의 배아 발생 억제가 있거나 이러한 질병에 걸릴 위험이 있다.
항혈관신생 요법은 이식편 거부, 폐 염증, 신 증후군, 자간전증, 심낭 삼출, 예를 들어 심막염과 연관된 심낭 삼출, 및 흉막 삼출, 바람직하지 못한 혈관 투과성을 특징으로 하는 질병 및 장애, 예를 들어 뇌 종양과 연관된 부종, 악성 종양과 연관된 복수, 메이그스 (Meigs) 증후군, 폐 염증, 신 증후군, 심낭 삼출, 흉막 삼출, 심혈관계 질환과 연관된 투과성, 예를 들어 심근 경색 및 발작 후의 질환 등의 일반적인 치료에 유용하다.
본 발명에 따르는 기타 혈관신생 의존성 질환에는 혈관섬유종 (출혈을 일으키기 쉬운 비정상적인 혈관), 신생혈관 녹내장 (안구에서의 혈관 성장), 동정맥 기형 (동맥과 정맥 간의 비정상적인 소통), 유착 결여 골절 (치유되지 않을 골절), 아테롬성 경화성 플라크 (동맥의 경화), 화농성 육아종 (혈관으로 구성된 통상의 피부 병변), 피부 경화증 (결합 조직 질병 형태), 혈관종 (혈관으로 구성된 종양), 트라코마 (제3 세계에서 실명의 주요 원인), 혈우병성 관절, 혈관 유착 및 비대성 반흔 (비정상적인 반흔 형성)이 포함된다.
용어 "암" 및 "암성"은 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물에게서의 생리적 질환을 지칭하거나 기재한다. 암의 예에는 암종, 림프종, 모세포종, 육종, 및 백혈병이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 암의 보다 특정한 예에는 편평 세포 암, 폐암 (소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암종 및 폐의 편평세포 암종 포함), 복막암, 간세포암, 위암 (위장암 포함), 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암 또는 신암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종 및 각종 유형의 두경부암 뿐만 아니라; B-세포 림프종 [저 악성도/소포 비호지킨 림프종 (NHL); 소 림프구성 (SL) NHL; 중간 악성도/소포 NHL; 중간 악성도 확산성 NHL; 고 악성도 면역모세포성 NHL; 고 악성도 림프아구성 NHL; 고 악성도 소 비-절단 세포 NHL; 거대 질환 NHL; 외투 세포 림프종; AIDS-관련 림프종 및 발덴스트롬 (Waldenstrom) 마크로글로불린혈증 포함]; 만성 림프구성 백혈병 (CLL); 급성 림프아구성 백혈병 (ALL); 모양 세포성 백혈병; 만성 골수아구성 백혈병; 및 이식 후 림프증식성 장애 (PTLD) 뿐만 아니라 모반증, 부종 (예를 들어, 뇌 종양과 연관된 부종) 및 메이그스 증후군과 연관된 비정상적인 혈관 증식이 포함된다.
용어 "항-신생물 조성물"은 한 가지 이상의 활성 치료제, 예를 들어 "항암제"를 포함하는, 암을 치료하는데 유용한 조성물을 지칭한다. 치료제 (항암제)의 예에는, 예를 들어 화학요법제, 성장 억제제, 세포독성제, 방사선 요법에 사용된 제제, 항혈관신생제, 세포자멸제, 항투불린제, 및 암을 치료하기 위한 기타 제제, 예를 들어 항-HER-2 항체, 항-CD20 항체, 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 길항제 (예를 들어, 티로신 키나제 억제제), HER1/EGFR 억제제 [예: 에를로티닙 (erlotinib) (타르세바(Tarceva; 상표명))], 혈소판 유래된 성장 인자 억제제 [예: 글리벡(Gleevec; 상표명) (이마티닙 메실레이트)], COX-2 억제제 [예: 셀레콕시브 (celecoxib)], 인터페론, 사이토킨, 다음 표적, 즉 ErbB2, ErbB3, ErbB4, PDGFR-베타, BlyS, APRIL, BCMA 또는 VEGF 수용체(들), TRAIL/Apo2 중의 하나 이상과 결합하는 길항제 (즉, 중화 항체), 및 기타 생체 활성 및 유기 화학제 등이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다. 이들 조합물이 또한 본 발명에 포함된다.
본원에 사용된 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제 또는 방지하고/하거나 세포의 파괴를 유발시키는 물질을 지칭한다. 이 용어에는 방사성 동위원소 (예를 들어, I131, I125, Y90 및 Re186), 화학요법제, 및 독소, 예를 들어 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소 또는 그의 단편이 포함된다.
"화학요법제"는 암을 치료하는데 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예에는 알킬화제, 예를 들어 티오테파 및 시톡산(CYTOXAN; 등록상표) 시클로포스파미드; 알킬 설포네이트, 예를 들어 부설판, 임프로설판 및 피포설판; 아지리딘, 예를 들어 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파, 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸라멜라민, 예를 들어 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸롤로멜라민; 아세토게닌 (특히, 불라타신 및 불라타시논); 캄프토테신 (합성적으로 유사한 토포테칸 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (그의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 크립토피신 (특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 두오카르마이신 (합성 유사체 KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드, 예를 들어 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로르에타민, 메클로르에타민 옥사이드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예를 들어 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라님무스틴; 항생제, 예를 들어 엔디인 (enediyne) 항생제 [예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감마1I 및 칼리케아미신 오메가I1 (참고: 문헌 [Agnew (1994) Chem Intl. Ed. Engl. 33: 183-186]); 디네미신 (디네미신 A 포함); 비스포스포네이트, 예를 들어 클로드로네이트, 에스페라미신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 색단백질 엔디인 항생제 발색단], 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 아드리아마이신(ADRIAMYCIN; 등록상표) 독소루비신 [모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신 포함], 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신 (예를 들어, 미토마이신 C), 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사제, 예를 들어 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예를 들어 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예를 들어 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들어 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘; 안드로겐, 예를 들어 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항부신제, 예를 들어 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충물, 예를 들어 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 마이탄시노이드, 예를 들어 마이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK(등록상표) 다당류 복합체 (공급처: JHS Natural Products, Eugene, OR); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히, T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들어 탁솔(TAXOL; 등록상표) 파클리탁셀 (공급처: Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), 아브락산(ABRAXANE; 상표명) 크레모포르-무함유, 파클리탁셀의 알부민-공학 처리시킨 나노입자 제형 (공급처: Americal Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois), 및 탁소테레(TAXOTERE; 등록상표) 독세탁셀 (공급처; Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); 클로란부실; 겜자르(GEMZAR; 등록상표) 젬시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예를 들어 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴; 나벨빈(NAVELBINE; 등록상표) 비노렐빈; 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 크셀로다; 이반드로네이트; 이리노테칸 (캄프토사르, CPT-11) (이리노테칸과 5-FU 및 류코보린의 치료 섭생 포함); 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드 (예를 들어, 레티노산); 카페시타빈; 콤브레타스타틴; 류코보린 (LV); 옥살리플라틴 [옥살리플라틴 치료 섭생 (FOLFOX) 포함]; 세포 증식을 저하시키는 PKC-알파, Raf, H-Ras, EGFR [예: 에를로티닙 (타르세바; 상표명)] 및 VEGF-A의 억제제; 및 상기 언급된 제제의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체가 포함된다.
상기 정의에는 또한, 종양에 대한 호르몬 작용을 조절 또는 억제시키는 작용을 하는 항호르몬제, 예를 들어 항에스트로겐제 및 선택적 에스트로겐 수용제 조정제 (SERM)가 포함되는데, 예를 들어 타목시펜 (놀바덱스 (NOLVADEX; 등록상표) 타목시펜 포함), 랄록시펜, 드롤록시펜, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 파레스톤(FARESTON; 등록상표) 토레미펜; 부신에서의 에스트로겐 생성을 조절하는 효소 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제, 예를 들어 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, 메가세(MEGASE; 등록상표) 메게스트롤 아세테이트, 아로마신(AROMASIN; 등록상표) 엑세메스탄, 포르메스타니에, 파드로졸, 리비조르(RIVISOR; 등록상표) 보로졸, 페마라(FEMARA; 등록상표) 레트로졸 및 아리미덱스 (ARIMIDEX; 등록상표) 아나스트로졸; 및 항안드로겐제, 예를 들어 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드 및 고세렐린; 뿐만 아니라 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 이상한 세포 증식에 밀접한 영향을 미치는 신호전달 경로에 있어 유전자, 예를 들어 PKC-알파, Raf 및 H-Ras의 발현을 억제시키는 안티센스 올리고뉴클레오티드; 리보자임, 예를 들어 VEGF 발현 억제제 (예를 들어, 안지오자임(ANGIOZYME; 등록상표) 리보자임) 및 HER2 발현 억제제; 백신, 예를 들어 유전자 요법 백신, 예를 들면 알로벡틴(ALLOVECTIN; 등록상표) 백신, 류벡틴(LEUVECTIN; 등록상표) 백신 및 백시드 (VAXID; 등록상표) 백신; 프로류킨(PROLEUKIN; 등록상표) rIL-2; 루르토테칸(LURTOTECAN; 등록상표) 토포이소머라제 1 억제제; 아바렐릭스(ABARELIX; 등록상표) rmRH; 비노렐빈 및 에스페라미신 (참고: 미국 특허 제4,675,187호); 및 이들의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체가 포함된다.
본 출원에 사용된 바와 같은 용어 "전구약물"은 모 약물과 비교해서 종양 세포에 대해 덜 세포독성이고 효소적으로 활성화되거나 보다 더 활성인 모 형태로 전환될 수 있는, 제약상 활성 물질의 전구체 또는 유도체 형태를 지칭한다 (참고: 예를 들어, 문헌 [Wilman (1986), "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast and Stella et al. (1985), "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press]). 본 발명의 전구약물에는 보다 활성인 세포독성 자유 약물로 전환될 수 있는, 포스페이트 함유 전구약물, 티오포스페이트 함유 전구약물, 설페이트 함유 전구약물, 펩티드 함유 전구약물, D-아미노산 변형된 전구약물, 글리코실화 전구약물, β-락탐 함유 전구약물, 임의로 치환된 페녹시아세트아미드 함유 전구약물 또는 임의로 치환된 페닐아세트아미드 함유 전구약물, 5-플루오로시토신, 및 기타 5-플루오로우리딘 전구약물이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다. 본 발명에 사용하기 위한 전구약물 형태로 유도체화할 수 있는 세포독성 약물의 예에는 상기 언급된 화학요법제가 포함되지만, 그에 제한되지 않는다.
세마포린 길항제로 치료할 수 있는 질환 및 증상은 신경 질환 및 신경-재생을 필요로 하거나 또는 신경-재생이 이로운 질환 등을 포함한다.
"소분자"는 본원에서 약 500 달톤 미단의 분자량을 갖는 것으로 정의한다.
"단리된" 핵산 분자는 항체 핵산의 천연 공급원 내에서 통상 연합되는 하나 이상의 오염성 핵산 분자로부터 확인되어 이로부터 격리시킨 핵산 분자이다. 단리된 핵산 분자는 천연에서 발견되는 형태 또는 환경 이외의 것이다. 따라서, 단리된 핵산 분자는 천연 세포에 존재하는 바와 같은 핵산 분자와는 구별된다. 그러나, 단리된 핵산 분자에는, 예를 들어 핵산 분자가 천연 세포와는 상이한 염색체 위치 내에 존재하는 경우에 항체를 통상적으로 발현하는 세포 내에 함유된 핵산 분자가 포함된다.
"제어 서열"이란 표현은 특정 숙주 유기체에서 작동적으로 연결된 코딩 서열을 발현시키는데 필요한 DNA 서열을 지칭한다. 원핵생물에 적합한 제어 서열에는, 예를 들어 프로모터, 임의의 작동인자 서열, 및 리보솜 결합 부위가 포함된다. 진핵 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인헨서를 활용하는 것으로 공지되어 있다.
핵산은 이것이 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 놓여있을 때 "작동적으로 연결된"다. 예를 들어, 프리-서열 또는 분비성 리더에 대한 DNA는 이것이 해당 폴리펩티드의 분비에 참여하는 프리-단백질로서 발현되는 경우에 이러한 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동적으로 연결되어 있거나; 프로모터 또는 인헨서는 이것이 코딩 서열의 전사에 영향을 미치는 경우에 이러한 서열과 작동적으로 연결되어 있거나; 또는 리보솜-결합 부위는 이것이 해독을 촉진시키도록 위치 설정된 경우에 코딩 서열과 작동적으로 연결되어 있다. 일반적으로, "작동적으로 연결된"이란 연결되는 DNA 서열이 연속된 것이고, 분비성 리더인 경우에는 연속된 판독 기에 있다는 것을 의미한다. 그러나, 인헨서는 연속적이지 않다. 편리한 제한 부위에서 연결시킴으로써 연결을 수행한다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우에는, 합성 올리고뉴클레오티드 적응인자 또는 링커를 통상적인 실시에 따라서 사용할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 표현 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"은 상호 교환적으로 사용되고, 이러한 명칭 모두는 자손을 포함한다. 따라서, 단어 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"에는 1차 대상 세포와, 전이 횟수에 상관없이 이로부터 유래된 배양물이 포함된다. 의도하였거나 의도하지 않은 돌연변이로 인해, 모든 자손이 DNA 함량에 있어 정확하게 동일할 수는 없다는 것을 인지해야 한다. 최초로 형질전환된 세포에 대해 스크리닝한 바와 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 지닌 돌연변이체 자손이 포함된다. 별개의 명칭을 고려하는 경우에도, 이는 본문 내용으로부터 명백할 것이다.
본 발명의 수행 방식
도메인 골격구조 및 기능적 특성에 기초하여, Nrp의 세포외 도메인은 전형적으로 3가지 기능적 단위로 분류되는데, 이들은 각각 일차 세마포린-결합, VEGF-결합 및 이량체화 영역을 나타내는 a1a2, b1b2 및 c이다 (문헌 [Ellis, L.M., Mol. Cencer Ther 5, 1099-107 (2006)]). 구조-기능 연구에서 뉴로필린 기능에 대한 전체 도메인 요구를 설명하였으나, 아직까지 이들 수용체/리간드 복합체의 분자에 대한 상세한 내용은 잘 이해되지 않고 있으며, Nrp의 구조 정보는 Nrp1의 b1b2 도메인으로만 제한된다 ([Vander Kooi et al., 상기문헌]; [Lee, C. et al., J Biol Chem 281, 5702-10 (2006)]). 투프신과 복합체를 형성한 Nrp1 b1b2의 결정 구조 (VEGF165의 C-말단에 상동성인 테트라펩티드)는 Nrp와 그의 결합 파트너 VEGF의 상호작용에 대한 첫번재 구조 정보를 제공하였다 ([Vander Kooi, et al., 상기문헌]; [von Wronski, M.A., et al, J. Biol Chem 281, 5702-10 (2006)]).
본 발명은 시험관내에서 Nrp1 및 Nrp2 둘다에 대한 Sema3 결합을 차단할 수 있는, 항체의 Fab 단편과 복합체를 형성한 Nrp2 a1a2b1b2의 결정 구조를 제공한다. 2개 Nrp 이소형의 a2b1b2 및 b1b2 단편의 구조를 또한 비교 및 대조하였다. 또한, 생체내에서 특이적으로 Nrp1에 대한 VEGF165 결합을 억제하는 최근 밝혀진 파지-유래 항체의 Fab 단편과 합한 Nrp1의 b1 도메인의 구조 (문헌 [Liang, W.C., et al., J Mol. Biol 366, 815-29 (2007)]; [Pan, Q et al., Cancer Cell 11, 53-67 (2007)])가 또한 제공 및 평가되었다. 이와 함께, 이들 구조는 Nrp 세포외 도메인의 큰 부분에 대한 상세한 사진을 제시하고, VEGF 및 세마포린 결합에 대한 모델을 제안한다. 2가지 상이한 결정 형태로 존재하는 Nrp2 이량체에 기초하여, Nrp 이량체화 및 리간드 결합에 대한 신규한 메카니즘이 제안되었다.
결정학적 연구에 대한 자세한 내용은 아래 실시예에 기재하였다. 일반적인 항-NRP 항체 생성 방법이 본원 및 실시예 1에 기재되어 있다.
항- NRP 항체의 생성
본 발명은 항-NRP 항체의 제법 및 용도를 포함한다. 항체를 생성시키기 위한 예시 방법이 다음 섹션에 보다 상세히 기재되어 있다.
항-NRP 항체는 포유동물 종으로부터 유래된 NRP (예를 들면, NRP1 및/또는 NRP2) 항원을 사용하여 선별한다. 바람직하게, 상기 항원은 인간 NRP (hNRP)이다. 그러나, 기타 종으로부터의 NRP, 예를 들어 뮤린 NRP (mNRP)을 표적 항원으로서 사용할 수 있다. 각종 포유동물 종으로부터의 NRP 항원은 천연 공급원으로부터 분리할 수 있다. 기타 실시양태에서, 항원은 재조합적으로 생성시키거나, 또는 당해 분야에 공지된 기타 합성 방법을 사용하여 만든다.
선별된 항체는 통상적으로, NRP 항원에 대한 충분히 강력한 결합 친화도를 가질 것이다. 예를 들어, 항체는 hNRP과 약 5 nM 이하, 바람직하게 약 2 nM 이하, 보다 바람직하게 약 500 pM 이하의 Kd 값으로 결합할 수 있다. 항체 친화도는, 예를 들어 표면 플라스몬 공명에 의거한 분석 (예를 들어, 본 실시예에 기재된 바와 같은 BIAcore 분석); 효소 결합 면역 흡착 분석 (ELISA); 및 경쟁 분석 (예를 들어, RIA)에 의해 결정할 수 있다.
또한, 항체를 대상으로 하여, 예를 들면 그의 치료제로서의 유효성을 평가하기 위해 기타 생물학적 활성 분석을 수행할 수 있다. 이러한 분석은 당해 분야에 공지되어 있고 표적 항원과 의도한 항체 용도에 좌우된다. 이의 예에는 HUVEC 억제 분석 (다음 실시예에 기재된 바와 같음); 종양 세포 성장 억제 분석 (예를 들어, WO 89/06692에 기재된 바와 같음); 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC) 및 보체-매개된 세포독성 (CDC) 분석 (참고: 미국 특허 제5,500,362호); 및 작동 활성 또는 조혈 분석 (참고: WO 95/27062)이 포함된다.
관심있는 항원 상의 특정 에피토프와 결합하는 항체를 스크리닝하기 위해, 예를 들어 문헌 (참고: 문헌 [Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)])에 기재된 바와 같은 통상적인 교차-차단성 분석을 수행할 수 있다. 또 다른 한편, 예를 들어 문헌 (참고: 문헌 [Champe et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:1388-1394])에 기재된 바와 같은 에피토프 맵핑을 수행하여 항체가 관심있는 에피토프와 결합하는지를 결정할 수 있다.
합성 항체 파지 라이브러리로부터 신규한 항- NRP 항체의 생성
바람직한 실시양태에서, 독특한 파지 디스플레이 접근 방식을 사용하여 항-NRP 항체를 선별한다. 이러한 접근 방식은 단일 골격 주형에 기초하여 합성 항체 파지 라이브러리를 생성시키고, 가변 도메인 내에 충분한 다양성을 고안하며, 다양화된 가변 도메인을 갖는 폴리펩티드를 디스플레이하고, 표적 NRP 항원에 대한 고친화도를 지닌 후보 항체를 선별하며, 이와 같이 선별된 항체를 단리하는 것을 포함한다.
파지 디스플레이 방법에 관한 상세 내역은, 예를 들어 WO 03/102157 (2003년 12월 11일자로 공개됨)를 참고할 수 있다.
한 측면에서, 본 발명에 사용된 항체 라이브러리는 항체 가변 도메인의 하나 이상의 CDR 내의 용매 접근가능한 위치 및/또는 고도로 다양한 위치를 돌연변이시킴으로써 생성시킬 수 있다. 몇몇 CDR 또는 모든 CDR은 본원에 제공된 방법을 사용하여 돌연변이시킬 수 있다. 몇몇 실시양태에서, CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 내의 위치를 돌연변이시켜 단일 라이브러리를 형성시키거나, CDRL3 및 CDRH3 내의 위치를 돌연변이시켜 단일 라이브러리를 형성시키거나, 또는 CDRL3 및 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 내의 위치를 돌연변이시켜 단일 라이브러리를 형성시킴으로써 다양한 항체 라이브러리를 생성시키는 것이 바람직할 수 있다.
예를 들어, CDRH1, CDRH2 및 CDRH3의 용매 접근가능한 위치 및/또는 고도로 다양한 위치에서 돌연변이가 이루어진 항체 가변 도메인의 라이브러리를 생성시킬 수 있다. CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 내에서 돌연변이가 이루어진 또 다른 라이브러리를 생성시킬 수 있다. 이들 라이브러리는 서로 연계해서 사용하여 목적하는 친화도의 결합제를 생성시킬 수도 있다. 예를 들어, 표적 항원과 결합하는 것을 알아보기 위해 중쇄 라이브러리를 1회전 이상 선별한 후, 결합제의 친화도를 증가시키기 위한 추가 선별 회전 동안 경쇄 라이브러리를 중쇄 집단으로 대체시킬 수 있다.
바람직하게, 라이브러리는 본래 아미노산을 중쇄 서열의 가변 영역의 CDRH3 영역 내의 변이체 아미노산으로 치환시킴으로써 창출된다. 이로써 생성되는 라이브러리는 복수 개의 항체 서열을 함유할 수 있는데, 서열 다양성은 주로 중쇄 서열의 CDRH3 영역 내에 있다.
한 측면에서, 라이브러리는 인간화 항체 4D5 서열, 또는 인간화 항체 4D5 서열의 골격 아미노산 서열 맥락에서 창출된다. 바람직하게, 라이브러리는 적어도 중쇄 잔기 95-100a를 DVK 코돈 세트에 의해 코딩된 아미노산으로 치환시킴으로써 창출되는데, DVK 코돈 세트는 이들 위치 1개마다 변이체 아미노산 세트를 코딩하기 위해 사용된다. 이들 치환을 창출시키는데 유용한 올리고뉴클레오티드 세트의 한 예는 서열 (DVK)7을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 특정 라이브러리는 잔기 95-100a를 DVK 코돈 세트와 NNK 코든 세트 둘 다에 의해 코딩된 아미노산으로 치환시킴으로써 창출시킨다. 이들 치환을 창출시키는데 유용한 올리고뉴클레오티드 세트의 한 예는 서열 (DVK)6(NNK)을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 특정 라이브러리는 적어도 잔기 95-100a를 DVK 코돈 세트와 NNK 코든 세트 둘 다에 의해 코딩된 아미노산으로 치환시킴으로써 창출시킨다. 이들 치환을 창출시키는데 유용한 올리고뉴클레오티드 세트의 한 예는 서열 (DVK)5(NNK)을 포함한다. 이들 치환을 창출시키는데 유용한 올리고뉴클레오티드 세트의 또 다른 예는 서열 (NNK)6을 포함한다. 적합한 올리고뉴클레오티드 서열의 기타 예는 본원에 기재된 기준에 따라서 당업자에 의해 결정할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 상이한 CDRH3 고안을 활용하여 고친화도 결합제를 분리하고 각종 에피토프에 대한 결합제를 분리한다. 이러한 라이브러리에서 생성된 CDRH3의 길이 범위는 11 내지 13개 아미노산이지만, 이와 상이한 길이가 생성될 수도 있다. NNK, DVK 및 NVK 코든 세트를 사용함으로써 H3 다양성을 확장시킬 수 있을 뿐만 아니라 N 및/또는 C 말단에서 보다 제한된 다양성을 만들 수 있다.
다양성은 CDRH1 및 CDRH2에서도 생성될 수 있다. CDR-H1 및 H2 다양성의 고안은 기존의 고안 보다는 천연 다양성에 보다 근접하게 부합된 다양성에 초점을 맞춘 변형을 수반하여 기재된 바와 같은 모의 천연 항체 레퍼토리를 표적으로 하는 전략에 따른다.
CDRH3에서의 다양성을 위해, 다중 라이브러리를 상이한 길이의 H3과 별개로 구축한 다음, 합하여 표적 항원에 대한 결합제에 대해 선별할 수 있다. 다중 라이브러리를 모은 다음, 앞서 기재되고 다음에 기재되는 바와 같은 고체 지지체 선별 및 용액 분류 방법을 사용하여 분류할 수 있다. 다중 분류 전략을 이용할 수 있다. 예를 들어, 한 가지 전략은 고체와 결합된 표적 상에서 분류한 다음, 융합 폴리펩티드 상에 존재할 수 있는 태그 (예를 들어, 항-gD 태그)에 관하여 분류하고, 이어서 고체와 결합된 표적 상에서 또 다르게 분류하는 것을 포함한다. 또 다른 한편, 라이브러리를 먼저, 고체 표면과 결합된 표적 상에서 분류한 다음, 표적 항원의 농도를 감소시키면서 용액 상 결합을 이용하여, 상기 용출된 결합제를 분류한다. 상이한 분류 방법을 조합하여 활용하는 것은 단지 고도로 발현된 서열 선별을 최소화시켜 주고 수 많은 상이한 고친화도 클론을 선별시켜 준다.
표적 NRP 항원에 대한 고친화도 결합제를 상기 라이브러리로부터 분리할 수 있다. H1/H2 영역에서의 다양성을 제한하면 축퇴가 약 104 내지 약 105배 저하되고, 보다 많은 H3 다양성을 허용하면 보다 고친화도 결합제가 제공된다. CDRH3에서 상이한 유형의 다양성을 지닌 라이브러리를 활용하면 (예를 들어, DVK 또는 NVT를 활용함) 표적 항원의 상이한 에피토프와 결합할 수 있는 결합제를 분리할 수 있다.
상기 언급된 바와 같이 풀링된 라이브러리로부터 분리된 결합제 중에서, 경쇄에서의 다양성을 제한함으로써 친화도를 추가로 개선시킬 수 있다는 사실이 밝혀졌다. 이러한 실시양태에서는 경쇄 다양성이 다음과 같이 생성될 수 있다: CDRL1에서: 아미노산 위치 28은 RDT에 의해 코딩되고; 아미노산 위치 29는 RKT에 의해 코딩되며; 아미노산 위치 30은 RVW에 의해 코딩되고; 아미노산 위치 31은 ANW에 의해 코딩되며; 아미노산 위치 32는 THT에 의해 코딩되고; 임의로, 아미노산 위치 33은 CTG에 의해 코딩되며; CDRL2에서: 아미노산 위치 50은 KBG에 의해 코딩되고; 아미노산 위치 53은 AVC에 의해 코딩되며; 임의로, 아미노산 위치 55는 GMA에 의해 코딩되고; CDRL3에서: 아미노산 위치 91은 TMT 또는 SRT, 또는 둘 다에 의해 코딩되며; 아미노산 위치 92는 DMC에 의해 코딩되고; 아미노산 위치 93은 RVT에 의해 코딩되며; 아미노산 위치 94는 NHT에 의해 코딩되고; 아미노산 위치 96은 TWT 또는 YKG, 또는 둘 다에 의해 코딩된다.
또 다른 실시양태에서, CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 영역에서의 다양성을 지닌 라이브러리(들)이 생성된다. 이러한 실시양태에서, CDRH3에서의 다양성은 각종 길이의 H3 영역을 사용하고 주로 코돈 세트 XYZ 및 NNK 또는 NNS를 사용하여 생성시킨다. 라이브러리는 개개의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 형성시킨 다음 모으거나, 또는 올리고뉴클레오티드를 모아 라이브러리의 일부를 형성시킬 수 있다. 이러한 실시양태의 라이브러리를 고체와 결합된 표적에 대항하여 분류할 수 있다. 다중 분류로부터 분리한 클론을 대상으로 하여, ELISA 분석을 사용하여 특이성과 친화도에 관하여 스크리닝할 수 있다. 특이성의 경우, 목적하는 표적 항원 뿐만 아니라 기타 비표적 항원에 대항하는 클론을 스크리닝할 수 있다. 이어서, 표적 NRP1 항원에 대한 결합제를 대상으로 하여 용액 결합 경쟁 ELISA 분석 또는 스폿 경쟁 분석에서 친화도에 관하여 스크리닝할 수 있다. 상기 언급된 바와 같이 제조된 XYZ 코돈 세트를 활용하는 라이브러리로부터 고친화도 결합제를 분리할 수 있다. 이들 결합제는 세포 배양액 중에서 항체 또는 항원 결합 단편으로서 고 수율로 용이하게 생성될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, CDRH3 영역의 길이 측면에서 다양성이 보다 큰 라이브러리를 생성시키는 것이 요망될 수 있다. 예를 들어, 약 7 내지 19개 아미노산 범위의 CDRH3 영역을 지닌 라이브러리를 생성시키는 것이 요망될 수 있다.
이들 실시양태의 라이브러리로부터 분리된 고친화도 결합제는 세균성 및 진핵성 세포 배양물 중에서 고 수율로 용이하게 생성된다. gD 태그, 바이러스성 외피 단백질 성분 등의 서열을 용이하게 제거시키고/시키거나 불변 영역 서열에 부가하여 완전한 길이의 항체 또는 항원 결합 단편을 고 수율로 생성시켜 주는 벡터를 고안할 수 있다.
CDRH3에서의 돌연변이를 수반한 라이브러리를, 기타 CDR의 변이체 버젼, 예를 들어 CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1 및/또는 CDRH2를 함유하는 라이브러리와 합할 수 있다. 따라서, 예를 들어 한 실시양태에서, CDRH3 라이브러리를 예정된 코돈 세트를 사용하여 위치 28, 29, 30, 31 및/또는 32에서의 변이체 아미노산을 수반한 인간화 4D5 항체 서열 맥락에서 창출된 CDRL3 라이브러리와 합한다. 또 다른 실시양태에서는, CDRH3에 대한 돌연변이를 수반한 라이브러리를, 변이체 CDRH1 및/또는 CDRH2 중쇄 가변 도메인을 포함하는 라이브러리와 합할 수 있다. 한 실시양태에서, CDRH1 라이브러리는 위치 28, 30, 31, 32 및 32에서의 변이체 아미노산을 수반한 인간화 4D5 항체 서열을 이용하여 창출시킨다. CDRH2 라이브러리는 예정된 코돈 세트를 사용하여 50, 52, 53, 54, 56 및 58에서의 변이체 아미노산을 수반한 인간화 항체 4D5 서열을 이용하여 창출시킨다.
항- NRP 항체 돌연변이체
파지 디스플레이로부터 생성된 신규한 항-NRP 항체를 추가로 변형시켜 모 항체에 비해 개선된 물리적, 화학적 및/또는 생물학적 특성을 지닌 항체 돌연변이체를 생성시킬 수 있다. 사용된 분석이 생물학적 활성 분석인 경우, 항체 돌연변이체는 선택 분석에서의 생물학적 활성이, 이러한 분석에서의 모 항체의 생물학적 활성 보다 약 10배 이상, 바람직하게 약 20배 이상, 보다 바람직하게 약 50배 이상, 종종 약 100배 이상 또는 200배 이상 더 우수하다. 예를 들어, 항-NRP1 항체 돌연변이체는 바람직하게, NRP에 대한 결합 친화도가 모 항-NRP 항체의 결합 친화도 보다 약 10배 이상, 바람직하게 약 20배 이상, 보다 바람직하게 약 50배 이상, 종종 약 100배 이상 또는 200배 이상 더 강력하다.
이러한 항체 돌연변이체를 생성시키기 위해, 하나 이상의 아미노산 변경 (예를 들어, 치환)을 모 항체의 하나 이상의 초가변 영역에 도입한다. 또 다른 한편, 또는 또한, 프레임워크 영역 잔기의 하나 이상의 변경 (예를 들어, 치환)을 모 항체에 도입할 수 있는데, 이로써 제2 포유동물 종으로부터의 항원에 대한 항체 돌연변이체의 결합 친화도가 개선된다. 변형시키기 위한 프레임워크 영역 잔기의 예에는 항체와 직접 비공유적으로 결합하고/하거나 (참고: 문헌 [Amit et al. (1986) Science 233:747-753]); CDR의 입체 형태 효과와 상호 작용하고/하거나 (참고: 문헌 [Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917]) VL - VH 계면에 참여하는 잔기가 포함된다 (참고: 문헌 [EP 239 400B1]). 특정 실시양태에서, 이러한 프레임워크 영역 잔기 하나 이상의 변형으로 인해, 제2 포유동물 종으로부터의 항원에 대한 항체의 결합 친화도가 증강된다. 예를 들어, 이러한 본 발명의 실시양태에서는 약 1개 내지 약 5개 골격 잔기를 변경시킬 수 있다. 종종 초가변 영역 잔기 중의 어느 것도 변경시키지 않은 경우일지라도, 전임상 시험에 사용하기 적합한 항체 돌연변이체를 산출시키기에는 상기와 같은 변경이면 충분할 수 있다. 그러나, 통상적으로 항체 돌연변이체는 부가의 초가변 영역 변경(들)을 포함할 것이다.
변경되는 초가변 영역 잔기는, 특히 모 항체의 출발 결합 친화도가 무작위로 생성된 항체 돌연변이체를 용이하게 스크리닝할 수 있도록 하는 수준인 경우에 무작위로 변화시킬 수 있다.
이러한 항체 돌연변이체를 생성시키기 위한 한 가지 유용한 과정은 "알라닌 스캐닝 돌연변이 유발"로 지칭된다 (참고: 문헌 [Cunningham and Wells (1989) Science 244:1081-1085]). 여기서는, 초가변 영역 잔기(들) 중의 하나 이상을 알라닌 또는 폴리알라닌 잔기로 대체시켜 아미노산과 제2 포유동물 종으로부터의 항원과의 상호 작용에 영향을 미친다. 이때, 치환에 대한 기능적 민감성을 나타내는 초가변 영역 잔기는 치환 부위에 추가의 또는 기타 변형을 도입함으로써 정밀화시킨다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입하기 위한 부위가 예정되긴 하였지만, 돌연변이 자체의 특성이 예정될 필요는 없다. 이러한 방식으로 생성된 ala-돌연변이체를 대상으로 하여 본원에 기재된 바와 같은 그들의 생물학적 활성에 관하여 스크리닝한다.
통상적으로, 보존적 치환이 "바람직한 치환"이란 표제 하에 다음에 나타나 있다. 이러한 치환으로 인해 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화도) 상의 변화가 이루어진다면, 다음 표에서 "예시 치환"로 명명되거나 아미노산 부류와 관련하여 다음에 추가로 기재되는 바와 같은 보다 실재적인 변화를 도입하고 생성물을 스크리닝한다.
바람직한 치환:
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항체의 생물학적 특성 면에 있어서 보다 더 실질적인 변형은 (a) 치환 부위에서 폴리펩티드 주쇄의 구조를, 예를 들어 시트 또는 나선 입체 형태로서 유지시키는 데에 대한 그의 효과, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성을 유지시키는 데에 대한 그의 효과, 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지시키는 데에 대한 그의 효과 측면에서 상당히 상이한 치환을 선택함으로써 달성한다. 천연 발생 잔기는 공통의 측쇄 특성을 기초로 하여 다음 군으로 나눌 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, met, ala, val, leu, ile;
(2) 중성 친수성: cys, ser, thr, asn, gln;
(3) 산성: asp, glu;
(4) 염기성: his, lys, arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro; 및
(6) 방향족: trp, tyr, phe.
비-보존적 치환은 이들 부류 중의 하나의 구성원을 또 다른 부류의 구성원으로 교환시키는 것을 수반할 것이다.
또 다른 실시양태에서, 변형을 위해 선택된 부위는 파지 디스플레이 (상기 참고)를 이용하여 친화도 성숙시킨다.
아미노산 서열 변이체를 코딩하는 핵산 분자는 당해 분야에 공지된 각종 방법에 의해 제조한다. 이들 방법에는 앞서 제조된 돌연변이체 또는 모 항체의 비-돌연변이체 버젼을 올리고뉴클레오티드-매개된 (또는 부위-지시된) 돌연변이 유발, PCR 돌연변이 유발 및 카세트 돌연변이 유발시키는 방법이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 돌연변이체를 제조하는 바람직한 방법은 부위 지시된 돌연변이 유발이다 (참고: 문헌 [예를 들어, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488]).
특정 실시양태에서, 항체 돌연변이체는 치환된 단일 초가변 영역 잔기 만을 가질 것이다. 기타 실시양태에서, 모 항체의 초가변 영역 잔기의 2개 이상, 예를 들어 약 2개 내지 약 10개 초가변 영역이 치환될 것이다.
통상적으로, 개선된 생물학적 특성을 지닌 항체 돌연변이체는 모 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열과의 아미노산 서열 동일성 또는 유사성이 75％ 이상, 보다 바람직하게 80％ 이상, 보다 바람직하게 85％ 이상, 보다 바람직하게 90％ 이상, 가장 바람직하게 95％ 이상인 아미노산 서열을 가질 것이다. 이러한 서열과 관련한 동일성 또는 유사성은 서열들을 정렬시키고, 필요한 경우 갭을 도입하여 최대 서열 동일성을 달성한 후, 모 항체 잔기와 동일하거나 (즉, 동일한 잔기) 유사한 (즉, 공통의 측쇄 특성을 기준으로 하여 동일한 군으로부터의 아미노산 잔기, 상기 참고), 후보 서열 중의 아미노산 잔기의 비율로서 본원에 정의된다. 어떠한 N-말단, C-말단 또는 내부 연장물, 결실물, 또는 가변 도메인 외부에 있는 항체 서열 내로의 삽입물도 서열 동일성 또는 유사성에 영향을 미치는 것으로 간주되지 말아야 한다.
항체 돌연변이체를 생성시킨 후, 모 항체와 비교하여 해당 분자의 생물학적 활성을 결정한다. 상기 언급된 바와 같이, 이는 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 활성을 결정하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 항체 돌연변이체 패널을 준비하고, 이를 대상으로 하여 NRP1과 같은 항원 또는 그의 단편에 대한 결합 친화도에 관하여 스크리닝한다. 이러한 초기 스크린으로부터 선별된 하나 이상의 항체 돌연변이체를 대상으로 하여, 임의로 한 가지 이상의 추가 생물학적 활성 분석을 수행하여 결합 친화도가 증강된 항체 돌연변이체가 실제로, 예를 들어 전임상 연구에 유용한지를 확인한다.
이와 같이 선별된 항체 돌연변이체를 대상으로 하여, 종종 의도한 항체 용도에 따라서 추가의 변형을 수행할 수 있다. 이러한 변형에는 아미노산 서열의 추가 변경, 이종 폴리펩티드(들)과의 융합 및/또는 다음에 상세히 설명되는 바와 같은 공유 변형이 포함될 수 있다. 아미노산 서열 변경과 관련하여, 예시 변형이 다음에 상세히 설명된다. 예를 들어, 항체 돌연변이체의 적당한 입체 형태를 유지시키는 데에 관여하지 않은 어떠한 시스테인 잔기도, 일반적으로 세린으로 치환시켜 분자의 산화적 안정성을 개선시키고 이상한 가교 결합을 방지할 수 있다. 역으로 말하면, 시스테인 결합(들)을 항체에 가하여 그의 안정성을 개선시킬 수 있다 (특히, 항체가 Fv 단편과 같은 항체 단편인 경우). 또 다른 유형의 항체 돌연변이체는 변경된 글리코실화 패턴을 갖고 있다. 이는 항체에서 발견된 하나 이상의 탄수화물 부분을 결실시키고/시키거나 항체에는 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위를 부가함으로써 달성할 수 있다. 항체의 글리코실화는 전형적으로, N-연결 또는 O-연결된다. N-연결된이란 탄수화물 부분을 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착시킨 것을 지칭한다. 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서, X는 프롤린을 제외한 모든 아미노산이다)은 탄수화물 부분을 아스파라긴 측쇄에 효소적 부착시키기 위한 인식 서열이다. 따라서, 이들 트리펩티드 서열 중의 어느 하나가 폴리펩티드에 존재하는 것은 잠재적 글리코실화 부위를 창출시켜 준다. O-연결된 글리코실화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 크실로스 중의 하나를 히드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 부착시키는 것을 지칭하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신을 사용할 수도 있다. 글리코실화 부위를 항체에 부가하는 것은 (N-연결된 글리코실화 부위의 경우에는) 상기 언급된 트리펩티드 서열 중의 하나 이상를 함유하도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 편리하게 수행된다. 이러한 변경은 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 본래의 항체 서열에 부가하거나, 또는 이들 잔기에 의해 치환시킴으로써 만들 수도 있다 (O-연결된 글리코실화 부위의 경우).
벡터, 숙주 세포 및 재조합 방법
본 발명의 항-NRP 항체는 용이하게 수득 가능한 물질 및 기술을 사용하여 재조합적으로 생성시킬 수 있다.
항-NRP 항체를 재조합 생성하기 위해, 이를 코딩하는 핵산을 분리하고, 이를 복제 가능한 벡터 내로 삽입하여 추가로 클로닝하거나 (DNA의 증폭) 또는 추가로 발현시킨다. 상기 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 과정을 사용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄와 경쇄를 코딩하는 DNA와 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 분리 또는 합성한다. 많은 벡터가 입수 가능하다. 벡터 성분에는 일반적으로, 다음 중의 하나 이상이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인헨서 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열.
(i) 신호 서열 성분
본 발명의 항체는 직접적으로 뿐만 아니라 이종 폴리펩티드, 바람직하게는 신호 서열, 또는 성숙한 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특이적 절단 부위를 갖는 기타 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로서 재조합적으로 생성될 수 있다. 선별된 이종 신호 서열은 바람직하게는, 숙주 세포에 의해 인식되고 프로세싱되는 (즉, 신호 펩티다제에 의해 절단되는) 것이다. 본래의 항체 신호 서열을 인식 및 프로세싱하지 못하는 원핵성 숙주 세포의 경우에는, 신호 서열을, 예를 들어 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, lpp 또는 열-안정한 엔테로톡신 II 리더로 이루어진 군 중에서 선택된 원핵성 신호 서열로 대체시킨다. 효모 분비의 경우에는, 본래의 신호 서열을, 예를 들어 효모 전화효소 리더, α-인자 리더 [사카로마이세스 (Saccharomyces) 및 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) α-인자 리더 포함], 산-포스파타제 리더, 씨. 알비칸스 (C. albicans) 글루코아밀라제 리더, 또는 문헌 (참고: 문헌 [WO 90/13646])에 기재된 신호로 대체시킬 수 있다. 포유동물 세포 발현에서는, 포유동물 신호 서열 뿐만 아니라 바이러스성 분비 리더, 예를 들어 단순 포진 gD 신호를 이용할 수 있다.
이러한 전구체 영역에 대한 DNA가 동일 리딩 프레임 내에서, 상기 항체를 코딩하는 DNA에 연결된다.
(ii) 복제 기점 성분
발현 벡터와 클로닝 벡터 둘 다는 이러한 벡터가 하나 이상의 선별된 숙주 세포에서 복제될 수 있게 해주는 핵산 서열을 함유한다. 일반적으로, 클로닝 벡터에서는 상기 서열이 벡터가 숙주 염색체성 DNA와는 독립적으로 복제할 수 있게 해주는 것이고, 이에는 복제 기점 또는 자기 복제 서열이 포함된다. 이러한 서열은 각종 세균, 효모 및 바이러스에 대해 널리 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기점은 대부분의 그람-음성 세균에 적합하고, 2 μ 플라스미드 기점은 효모에 적합하며, 각종 바이러스성 기점 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)는 포유동물 세포에서의 클로닝 벡터에 유용하다. 일반적으로, 복제 기점 성분은 포유동물 발현 벡터에 필요치 않다 (SV40 기점이 전형적으로 사용될 수 있는데, 이는 단지 이것이 초기 프로모터를 함유하기 때문이다).
(iii) 선별 유전자 성분
발현 및 클로닝 벡터는 선별성 마커로 명명되기도 하는 선별 유전자를 함유할 수 있다. 전형적인 선별 유전자는 (a) 항생제 또는 기타 독소, 예를 들어 앰피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여해주는 단백질; (b) 영양요구성 결핍증을 보충해주는 단백질; 또는 (c) 복합 배지로부터 입수 가능하지 않은 중요한 영양분, 예를 들어 바실루스 (Bacillus)에 대한 D-알라닌 라세마제를 코딩하는 유전자를 공급해 주는 단백질을 코딩한다.
선별 도식의 한 가지 예는 숙주 세포의 성장을 중지시키기 위한 약물을 활용한다. 이종 유전자를 이용하여 성공적으로 형질전환시킨 세포는 약물 내성을 부여해 주는 단백질을 생산하므로, 선별 섭생에서 살아 남는다. 이러한 우성 선별의 예들은 약물 네오마이신, 미코페놀산 및 히그로마이신을 이용한다.
포유동물 세포에 적합한 선별성 마커의 또 다른 예는 항체 핵산을 흡수하기에 적격한 세포를 확인시켜 줄 수 있는 것인데, 예를 들면 DHFR, 티미딘 키나제, 메탈로티오네인-I 및 -II, 바람직하게는 영장류 메탈로티오네인 유전자, 아데노신 데아미나제, 오르니틴 데카복실라제 등이 있다.
예를 들어, DHFR 선별 유전자로 형질전환시킨 세포는 먼저, 형질전환체 모두를 DHFR의 경쟁적 길항제인 메토트렉세이트 (Mtx)를 함유하는 배양 배지에서 배양함으로써 확인한다. 야생형 DHFR이 이용되는 경우에 적당한 숙주 세포는, DHFR 활성이 결핍된 중국산 햄스터 난소 (CHO) 세포주이다.
또 다른 한편, 항체, 야생형 DHFR 단백질 및 또 다른 선별성 마커, 예를 들어 아미노글리코시드 3'-포스포트랜스퍼라제 (APH)를 코딩하는 DNA 서열로 형질전환시켰거나 공동-형질전환시킨 숙주 세포 (특히, 내인성 DHFR을 함유하는 야생형 숙주)는, 선별성 마커, 예를 들어 아미노글리코시드성 항생제 (예를 들어, 카나마이신, 네오마이신 또는 G418)에 대한 선별제를 함유하는 배지에서 세포 성장시킴으로써 선별할 수 있다 (참고: 미국 특허 제4,965,199호).
효모에 사용하기 적합한 선별 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다 (참고: 문헌 [Stinchcomb et al. (1979) Nature, 282:39]). 이러한 trp1 유전자는 트립토판에서 성장할 수 있는 능력이 결여된 효모의 돌연변이체 균주, 예를 들어 ATCC No. 44076 또는 PEP4-1에 대한 선별 마커를 제공한다 (참고: 문헌 [Jones (1977) Genetics, 85:12]). 이때, 효모 숙주 세포 게놈 내에 trp1 병변이 존재한다는 것은 트립토판 부재 하의 성장에 의한 형질전환을 검출하는데 유효한 환경을 제공해준다. 유사하게, Leu2-결핍성 효모 균주 (ATCC 20,622 또는 38,626)가 Leu2 유전자를 보유하고 있는 공지된 플라스미드로써 고려된다.
또한, 1.6 ㎛ 환상 플라스미드 pKD1로부터 유래된 벡터를 클루이베로마이세스 효모의 형질전환을 위해 사용할 수 있다. 또 다른 한편, 재조합 송아지 카이모신 (chymosin)을 대규모로 생성하기 위한 발현 시스템이 케이. 락티스 (K. lactis)에 대해 보고되었다 (참고: 문헌 [Van den Berg (1990) Bio/Technology 8:135]). 클루이베로마이세스의 산업용 균주에 의해 성숙한 재조합 인간 혈청 알부민을 분비시키는데 적합한 다중-복사 발현 벡터가 또한 보고되었다 (참고: 문헌 [Fleer et al. (1991) Bio/Technology 9: 968-975]).
(iv) 프로모터 성분
발현 및 클로닝 벡터는 통상적으로, 숙주 유기체에 의해 인식되고 항체 핵산에 작동적으로 연결되는 프로모터를 함유한다. 원핵성 숙주를 이용한 경우에 사용하기 적합한 프로모터에는 phoA 프로모터, β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 알칼리성 포스파타제, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템, 및 하이브리드 프로모터, 예를 들어 tac 프로모터가 포함된다. 그러나, 기타 공지된 세균성 프로모터도 적합하다. 세균성 시스템에 사용하기 위한 프로모터는 또한, 항체를 코딩하는 DNA에 작동적으로 연결된 샤인-달가르노 (S.D.) 서열을 함유할 것이다.
진핵생물에 대한 프로모터 서열이 공지되어 있다. 사실상 모든 진핵성 유전자가, 전사가 개시되는 부위로부터의 대략 25 내지 30개 염기 상류에 위치한 AT-풍부 영역을 갖는다. 많은 유전자의 전사 개시 부위로부터 70 내지 80개 염기 상류에서 발견된 또 다른 서열은 CNCAAT 영역인데, 여기서 N은 모든 뉴클레오티드일 수 있다. 대부분의 진핵성 유전자의 3' 말단에는 AATAAA 서열이 존재하는데, 이는 폴리 A 미부를 코딩 서열의 3' 말단에 부가하기 위한 신호일 수 있다. 이들 서열 모두는 진핵성 발현 벡터 내로 적합하게 삽입된다.
효모 숙주를 이용한 경우에 사용하기 적합한 프로모터 서열의 예에는 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 기타 당분해 효소, 예를 들어 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 무타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제, 및 글루코키나제에 대한 프로모터가 포함된다.
성장 조건에 의해 제어된 전사의 부가 이점을 지니고 있는 유도성 프로모터인 기타 효모 프로모터는 알코올 데히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사와 연관된 분해성 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 및 말토스 및 갈락토스 활용에 책임이 있는 효소에 대한 프로모터 영역이다. 효모 발현에 있어 사용하기 적합한 벡터 및 프로모터가 EP 73,657에 추가로 기재되어 있다. 효모 인헨서가 또한 효모 프로모터와 함께 유리하게 사용된다.
포유동물 숙주 세포에서 벡터로부터의 항체 전사는, 예를 들어 폴리오마 바이러스, 조류폭스 (fowlpox) 바이러스, 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 시토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 가장 바람직하게는 원숭이 바이러스 40 (SV40) 등의 바이러스 게놈으로부터 수득한 프로모터, 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어 액틴 프로모터 또는 이뮤노글로불린 프로모터, 및 열-충격 프로모터에 의해 제어되는데, 단 이들 프로모터는 숙주 세포 시스템과 상용성이어야 한다.
SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 SV40 바이러스성 복제 기점을 함유하기도 하는 SV40 제한 단편으로서 편리하게 수득된다. 인간 시토메갈로바이러스의 즉발형 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로서 편리하게 수득된다. 벡터로서 소 유두종 바이러스를 사용하여 포유동물 숙주에서 DNA를 발현하기 위한 시스템이 미국 특허 제4,419,446호에 기재되어 있다. 이러한 시스템의 변형이 미국 특허 제4,601,978에 기재되어 있다. 단순 포진 바이러스로부터의 티미딘 키나제 프로모터의 제어 하에 마우스 세포에서 인간 β-인터페론 cDNA를 발현하는 것에 관해서는 다음 문헌을 참고할 수 있다 (참고: 문헌 [Reyes et al. (1982) Nature 297:598-601]). 또 다른 한편, 라우스 (rous) 육종 바이러스 장-말단 반복 서열을 프로모터로서 사용할 수 있다.
(v) 인헨서 요소 성분
고등 진핵생물에 의해 본 발명의 항체를 코딩하는 DNA를 전사하는 것은 종종, 인헨서 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 증가된다. 많은 인헨서 서열이 현재 포유동물 유전자로부터 공지되어 있다 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-태아단백질 및 인슐린). 그러나, 전형적으로는, 진핵성 세포 바이러스로부터의 인헨서가 사용될 것이다. 이의 예에는 복제 기점의 후기 측면 (bp 100-270) 상의 SV40 인헨서, 시토메갈로바이러스 초기-프로모터 인헨서, 복제 기점의 후기 측면 상의 폴리오마 인헨서, 및 아데노바이러스 인헨서가 포함된다. 진핵성 프로모터 활성화를 위한 증강 요소에 관해서는 다음 문헌을 참고할 수 있다 (참고: 문헌 [Yaniv (1982) Nature 297:17-18]). 인헨서는 항체 코딩 서열에 대한 5' 또는 3' 위치에서 벡터 내로 분할될 수 있지만, 바람직하게는 프로모터로부터의 5' 부위에 위치한다.
(vi) 전사 종결 요소
진핵성 숙주 세포 (예를 들어, 효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간, 또는 기타 다세포 유기체로부터의 핵형성 세포)에 사용된 발현 벡터는 또한, 전사를 종결시키고 mRNA를 안정화시키는데 필요한 서열을 함유할 것이다. 이러한 서열은 진핵성 또는 바이러스성 DNA 또는 cDNA의 비해독 영역의 5' 말단, 종종 3' 말단으로부터 통상 이용 가능하다. 이들 영역은 항체를 코딩하는 mRNA의 비해독 부분에서 폴리아데닐화 단편으로서 전사된 뉴클레오티드 절편을 함유한다. 한 가지 유용한 전사 종결 요소는 소의 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다 (참고: 문헌 [WO 1994/11026; 및 이에 기재된 발현 벡터]).
(vii) 숙주 세포의 선별 및 형질전환
본원 내의 벡터에서 DNA를 클로닝 또는 발현하는데 적합한 숙주 세포는 상기 언급된 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포이다. 이러한 목적에 적합한 원핵생물에는 유박테리아 (eubacteria), 예를 들어, 그람-음성 또는 그람-양성 유기체, 예를 들면, 엔테로박테리아세애 (Enterobacteriaceae), 예를 들어 에스케리챠 (Escherichia), 예를 들면, 이. 콜라이 (E. coli), 엔테로박터 (Enterobacter), 에르위니아 (Erwinia), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 살모넬라 (Salmonella), 예를 들면, 살모넬라 티피무륨 (Salmonella typhimurium), 세라티아 (Serratia), 예를 들면, 세라티아 마르세스칸스 (Serratia marcescans), 및 쉬겔라 (Shigella) 뿐만 아니라 바실루스 (Bacillus), 예를 들어 비. 서브틸리스 (B. subtilis) 및 비. 리케니포르미스 (B. licheniformis) (예를 들어, 1989년 4월 12일자로 공개된 DD 266,710에 기재된 비. 리케니포르미스 41P), 슈도모나스 (Pseudomonas), 예를 들면, 피. 애루기노사 (P. aeruginosa), 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces)가 포함된다. 한 가지 바람직한 이. 콜라이 클로닝 숙주는 이. 콜라이 294 (ATCC 31,446)이지만, 기타 균주, 예를 들어 이. 콜라이 B, 이. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537), 및 이. 콜라이 W3110 (ATCC 27,325)도 적합하다. 이들 예는 제한적이기 보다는 예시적이다.
원핵생물 이외에도, 진핵성 미생물, 예를 들면, 섬유상 진균 또는 효모가 항체-코딩 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae), 또는 통상의 빵 효모가 하등 진핵성 숙주 미생물 중에 가장 흔히 사용되는 것이다. 그러나, 수 많은 기타 속, 종 및 균주가 통상적으로 입수 가능하고 본원에 유용한데, 예를 들면 시조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe); 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 숙주, 예를 들어 케이. 락티스 (K. lactis), 케이. 프라질리스 (K. fragilis) (ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스 (K. bulgaricus) (ATCC 16,045), 케이. 위케라미이 (K. wickeramii) (ATCC 24,178), 케이. 왈티이 (K. waltii) (ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸 (K. drosophilarum) (ATCC 36,906), 케이. 더모톨레란스 (K. thermotolerans), 및 케이. 마륵시아누스 (K. marxianus); 야로위아 (yarrowia) (EP 402,226); 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) (EP 183,070); 칸디다 (Candida); 트리코데르마 레에시아 (Trichoderma reesia) (EP 244,234); 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa); 쉬와니오마이세스 (Schwanniomyces), 예를 들어 쉬와니오마이세스 옥시덴탈리스 (Schwanniomyces occidentalis); 및 섬유상 진균, 예를 들어 뉴로스포라 (Neurospora), 페니실륨 (Penicillium), 톨리포클라듐 (Tolypocladium), 및 아스페르길루스 (Aspergillus) 숙주, 예를 들어 에이. 니둘란스 (A. nidulans) 및 에이. 니거 (A. niger)가 있다.
글리코실화 항체를 발현하기에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유래된다. 무척추 동물 세포의 예에는 식물 및 곤충 세포가 포함된다. 수 많은 바쿨로바이러스성 균주 및 변이체, 및 숙주, 예를 들어 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) (모충: caterpillar), 애데스 애깁티 (Aedes aegypti) (모기: mosquito), 애데스 알보픽투스 (Aedes albopictus) (모기), 드로소필라 멜라노가스테르 (Drosophila melanogaster) (초파리: fruitfly), 및 봄빅스 모리 (Bombyx mori)로부터의 상응하는 증식 허용 곤충 숙주 세포가 확인되었다. 형질감염시키기 위한 각종 바이러스성 균주, 예를 들어, 아우토그라파 칼리포르니카 (Autographa californica) NPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주가 공개적으로 입수 가능하고, 이러한 바이러스는 특히 스포도프테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위해 본 발명에 따르는 바이러스로서 사용할 수 있다. 면, 옥수수, 감자, 대두, 페튜니아 (petunia), 토마토 및 담배의 식물 세포 배양물을 숙주로서 활용할 수도 있다.
그러나, 척추동물 세포에 대한 관심이 가장 크며, 척추동물 세포를 배양하여 증식시키는 것이 (조직 배양) 통상적인 과정이 되었다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 현탁 배양 하에 성장하도록 아클로닝된 인간 배아 신장주 293 세포 (참고: 문헌 [Graham et al. (1977) J. Gen Virol. 36:59]); 유아 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR [CHO (참고: 문헌 [Urlaub et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77:4216]); 마우스 세르톨리 (sertoli) 세포 [TM4; 참고 문헌 [Mather (1980) Biol. Reprod. 23:243-251]; 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카산 그린 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개의 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (참고: 문헌 [Mather et al. (1982) Annals N. Y. Acad. Sci. 383:44-68]); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간세포암 주 (Hep G2)이다.
숙주 세포를 항체 생성을 위해 상기 언급된 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환시키고; 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선별하거나 또는 목적하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키기에 적당한 바 대로 변형시킨 통상적인 영양 배지에서 배양한다.
(viii) 숙주 세포 배양
본 발명의 항체를 생성시키기 위해 사용된 숙주 세포는 각종 배지에서 배양할 수 있다. 시판용 배지, 예를 들면 햄스 (Ham's) F10 (공급처: Sigma), 최소 필수 배지 [(MEM); 공급처: Sigma], RPMI-1640 (공급처: Sigma), 및 둘베코 변형 이글 배지 [(DMEM); 공급처: Sigma]가 상기 숙주 세포를 배양하는데 적합하다. 또한, 다음 문헌에 기재된 배지 중의 어떠한 것도 숙주 세포에 대한 배양 배지로서 사용할 수 있다 (참고: 문헌 [Ham et al. (1979) Meth. Enz. 58:44]; [Barnes et al. (1980) Anal. Biochem. 102:255]; 미국 특허 제4,767,704호; 제4,657,866호; 제4,927,762호; 제4,560,655호; 또는 제5,122,469호; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 제(재)30,985호). 이들 배지 모두는 필요에 따라, 호르몬 및/또는 기타 성장 인자 (예를 들어, 인슐린, 트랜스페린, 또는 표피 성장 인자), 염 (예를 들어, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 인산염), 완충제 (예를 들어, HEPES), 뉴클레오티드 (예를 들어, 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예를 들어, GENTAMYCIN™ 약물), 미량 원소 (마이크로몰 범위의 최종 농도로 통상 존재하는 무기 화합물로서 정의됨), 및 글루코스 또는 등가 에너지원으로 보충시킬 수 있다. 당업자에게 공지되어 있는 기타 모든 필수 보충물이 적당한 농도로 포함될 수도 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등이 발현을 위해 선별된 숙주 세포와 함께 이미 사용되고 있고, 이는 당업자에게 명백할 것이다.
(ix) 항체 정제
재조합 기술을 사용하는 경우, 항체를 주변세포질 공간에서 세포내적으로 생성시킬 수 있거나, 또는 배지 내로 직접 분비할 수 있다. 항체가 세포내적으로 생성되는 경우에는, 제1 단계로서 숙주 세포 또는 용해된 단편의 미세 부스러기를, 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거한다. 문헌 (참고: 문헌 [Carter et al. (1992) Bio/Technology 10:163-167])에는 이. 콜라이의 주변세포질 공간 내로 분비되는 항체를 분리하는 과정이 기재되어 있다. 간략하게 언급하면, 세포 페이스트를 약 30분에 걸쳐 나트륨 아세테이트 (pH 3.5), EDTA, 및 페닐메틸설포닐플루오라이드 (PMSF)의 존재 하에 해동시킨다. 세포 부스러기를 원심분리에 의해 제거할 수 있다. 항체가 배지 내로 분비되는 경우에는, 이러한 발현 시스템으로부터의 상등액을 먼저 일반적으로, 시판용 단백질 농축 필터, 예를 들어 아미콘 (Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘 (Millipore Pellicon) 한외여과 장치를 사용하여 농축시킨다. 프로테아제 억제제, 예를 들어 PMSF를 전술된 단계들 중의 어느 단계에 포함시켜 단백질 분해를 억제시킬 수 있고, 항생제를 포함시켜 우발적 오염물의 성장을 방지시킬 수 있다.
세포로부터 제조된 항체 조성물은, 예를 들어 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 및 친화 크로마토그래피를 이용하여 정제할 수 있는데, 친화 크로마토그래피가 바람직한 정제 기술이다. 단백질 A가 친화도 리간드로서 적합한지의 여부는 항체에 존재하는 모든 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소형에 좌우된다. 단백질 A를 사용하여 인간 γ1, γ2, 또는 γ4 중쇄에 의거하여 항체를 정제할 수 있다 (참고: 문헌 [Lindmark et al. (1983) J. Immunol. Meth. 62: 1-13]). 단백질 G는 모든 마우스 이소형과 인간 γ3에 권장된다 (참고: 문헌 [Guss et al. (1986) EMBO J. 5: 15671575]). 친화도 리간드가 부착되는 매트릭스는 가장 흔히는 아가로스지만, 기타 매트릭스도 이용 가능하다. 기계적으로 안정적인 매트릭스, 예를 들어 제어 공극 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은 아가로스를 이용하여 달성된 것 보다 더 신속한 유속 및 보다 짧은 처리 시간을 허용해 준다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, 베이커본드 (Bakerbond) ABX™ 수지 (공급처: J. T. Baker, Phillipsburg, NJ)가 정제에 유용하다. 단백질을 정제하기 위한 기타 기술, 예를 들어 이온 교환 칼럼 상에서의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상에서의 크로마토그래피, 헤파린 SEPHAROSE™ 상에서의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예를 들어, 폴리아스파르트산 칼럼) 상에서의 크로마토그래피, 크로마토분획 (chromatofocusing), SDS-PAGE, 및 황산암모늄 침전을, 회수하고자 하는 항체에 따라서 이용하기도 한다.
예비 정제 단계(들) 후, 관심있는 항체와 오염물을 포함하는 혼합물을 대상으로 하여 pH 약 2.5 내지 4.5, 바람직하게는 저염 농도 (예를 들어, 약 0 내지 0.25 M 염)에서 용출 완충제를 사용하여 저 pH 소수성 상호 작용 크로마토그래피할 수 있다.
제약 제형 (제제)
본 발명의 항체의 치료적 제형은, 목적하는 순도를 지닌 항체를 임의의 생리적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제 (참고: 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)])와 혼합하여, 동결건조된 제형 또는 수성 용제 형태로 저장하기 위해 제조한다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 이용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 이에는 완충제, 예를 들어 인산염, 시트레이트 및 기타 유기 산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산 및 메티오닌; 방부제 (예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레솔); 저분자량 (약 10개 미만 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린; 킬레이트제, 예를 들어 EDTA; 당, 예를 들어 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨; 염 형성 반대-이온, 예를 들어 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예를 들어 TWEEN™, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이 포함된다.
본원의 제형은 치료하고자 하는 특정 적응증에 대해 필요한 만큼의 한 가지 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로에게 불리한 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 지닌 한 가지 이상의 활성 화합물을 함유할 수도 있다. 예를 들어, 면역억제제를 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 분자는 의도한 목적에 유효한 양으로 병용해서 존재하는 것이 적합하다.
활성 성분을, 예를 들어 액적형성 (coacervation) 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 미소캡슐, 예를 들면, 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴 미소캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 미소캡슐; 콜로이드상 약물 전달 시스템 (예를 들면, 리포솜, 알부민 미소구, 마이크로에멀션, 나노-입자 및 나노-캡슐); 또는 매크로에멀션 내에 포착시킬 수도 있다. 이러한 기술은 문헌 (참고: 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)])에 기재되어 있다.
생체내 투여에 사용하고자 하는 제형은 멸균성이어야만 한다. 이는 멸균성 여과 막을 통하여 여과시킴으로써 용이하게 달성된다.
서방형 제제를 제조할 수 있다. 서방형 제제의 적합한 예에는 본 발명의 항체를 함유하는 고형 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되는데, 이러한 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 미소캡슐 형태이다. 서방형 매트릭스의 예에는 폴리에스테르, 히드로겔 [예를 들면, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알코올)], 폴리락티드 (참고: 미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 γ에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어 LUPRON DEPOT™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사용 미소구), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산이 포함된다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산 등의 중합체가 분자를 100일에 걸쳐 방출시킬 수 있긴 하지만, 특정 히드로겔은 보다 짧은 기간 동안 단백질을 방출시킨다. 피막화 항체가 체내에 장기간 동안 잔존하는 경우, 이들은 37℃하 수분에 대한 노출에 따른 결과로서 변성되거나 응집되어 생물학적 활성을 상실하고 면역원성이 변할 수 있다. 관련된 기전에 따라서 안정화시키기 위한 합리적 전략을 고안할 수 있다. 예를 들어, 응집 기전이 티오-디술피드 교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀진 경우에는, 술프히드릴 잔기를 변형시키고, 산성 용액으로부터 동결건조시키며, 적당한 부가제를 사용하여 수분 함량을 제어하며 특이적 중합체 매트릭스 조성물을 개발함으로써 안정화를 달성시킬 수 있다.
치료적 용도
본 발명의 항체를 사용하여 포유동물을 치료할 수 있는 것으로 고려된다. 한 실시양태에서는, 항체를, 예를 들어 전임상 데이터를 수득하기 위해 비-인간 포유동물에게 투여한다. 처치하고자 하는 비-인간 포유동물의 예에는 비-인간 영장류, 개, 고양이, 설치류 및 전임상 연구가 수행되는 기타 포유동물이 포함된다. 이러한 포유동물은 본 발명의 항체를 사용하여 치료하고자 하는 질병에 대한 확립된 동물 모델일 수 있거나, 또는 상기 포유동물을 사용하여 관심있는 항체의 독성을 연구할 수 있다. 이들 실시양태 각각에서는, 용량의 단계적 상승 연구를 포유동물에서 수행할 수 있다. 항체가 항-NRP1 항체인 경우, 이는 예를 들어 고형 종양 모델에서 숙주 설치류에게 투여할 수 있다.
또한, 또는 또 다른 한편, 항체를 사용하여 인간, 예를 들어 이러한 항체 투여로부터 이득을 얻을 수 있는 특정 질병이나 장애로 인해 고통받고 있는 환자를 치료한다.
본 발명은 종양 성장을 뒷받침해주는 영양분 공급을 요구하는 종양 혈관 발생을 억제시키고자 하는 새로운 암 치료 전략인 혈관형성성 암 요법을 포괄한다. 혈관형성은 원발성 종양 성장과 전이 둘 다에 관여하기 때문에, 본 발명에 의해 제공된 혈관형성성 치료법은 일차 부위에서의 종양의 신생 성장을 억제시킬 수 있을 뿐만 아니라 이차 부위에서의 종양 전이를 예방할 수 있으므로, 기타 치료제가 종양을 공격할 수 있게 해준다. 본원에서 치료하고자 하는 암의 예에는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다. 이러한 암의 보다 특정한 예에는 편평 세포 암, 폐암 (소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암종 및 폐의 편평세포 암종 포함), 복막암, 간세포암, 위암 (위장암 포함), 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암 또는 신암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종 및 각종 유형의 두경부암 뿐만 아니라 B-세포 림프종 [저 악성도/소포 비호지킨 림프종 (NHL); 소 림프구성 (SL) NHL; 중간 악성도/소포 NHL; 중간 악성도 확산성 NHL; 고 악성도 면역모세포성 NHL; 고 악성도 림프아구성 NHL; 고 악성도 소 비-절단 세포 NHL; 거대 질환 NHL; 외투 세포 림프종; AIDS-관련 림프종 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증 포함]; 만성 림프구성 백혈병 (CLL); 급성 림프아구성 백혈병 (ALL); 모양 세포성 백혈병; 만성 골수아구성 백혈병; 및 이식 후 림프 증식성 장애 (PTLD) 뿐만 아니라 모반증, 부종 (예를 들어, 뇌 종양과 연관된 부종) 및 메이그스 증후군과 연관된 비정상적인 혈관 증식이 포함된다. 보다 특히, 본 발명의 항체에 의해 치료되기 쉬운 암에는 유방암, 결장직장암, 직장암, 비소세포 폐암, 비호지킨 림프종 (NHL), 신세포암, 전립선암, 간암, 췌장암, 연질 조직 육종, 카포시 육종, 경동맥 암종, 두경부암, 흑색종, 난소암, 중피종 및 다발성 골수종이 포함된다.
종양과 같은 각종 질환을 치료하기 위해 사용하는 경우, 본 발명의 항체를 동일하거나 유사한 질환에 적합한 기타 치료제와 병용할 수 있는 것으로 고려된다. 암을 치료하기 위해 사용하는 경우, 본 발명의 항체를 통상적인 암 요법, 예를 들어 수술, 방사선요법, 화학요법 또는 이의 조합과 병용해서 사용할 수 있다.
특정 측면에서, 본 발명의 항체와의 병용 암 요법에 유용한 기타 치료제에는 기타 항혈관신생제가 포함된다. 많은 항혈관신생제가 당해 분야에서 확인되었고 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 (참고: 문헌 [Carmeliet and Jain (2000)])에 열거되어 있다.
한 측면에서, 본 발명의 항체를 VEGF 길항제 또는 VEGF 수용체 길항제, 예를 들어 항-VEGF 항체, VEGF 변이체, 가용성 VEGF 수용체 단편, VEGF 또는 VEGFR을 차단시킬 수 있는 압타머 (aptamer), 중화 항-VEGFR 항체, VEGFR 티로신 키나제의 억제제 및 그의 모든 조합과 병용해서 사용한다. 또 다른 한편, 또는 또한, 2가지 이상의 항-NRP1 항체를 환자에게 공동 투여할 수 있다. 보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항-NRP1A 또는 항-NRP1B 항체를 항-VEGF 항체와 병용해서 사용하여 부가 또는 상승적 효과를 발생시킨다. 바람직한 항-VEGF 항체에는 항-hVEGF 항체 A4.6.1과 동일한 에피토프와 결합하는 항체가 포함된다. 보다 바람직하게, 항-VEGF 항체는 베바시주맵 또는 라니비주맵이다.
몇몇 기타 측면에서, 본 발명의 항체와의 병용 종양 요법에 유용한 기타 치료제에는 종양 성장에 관여하는 기타 인자, 예를 들어 EGFR, ErbB2 (Her2로서 공지되기도 함), ErbB3, ErbB4, 또는 TNF의 길항제가 포함된다. 바람직하게, 본 발명의 항-NRP1 항체를 하나 이상의 티로신 키나제 수용체, 예를 들어 VEGF 수용체, FGF 수용체, EGF 수용체 및 PDGF 수용체를 표적으로 하는 소분자 수용체 티로신 키나제 억제제 (RTKI)와 병용해서 사용할 수 있다. 많은 치료적 소분자 RTKI가 당해 분야에 공지되어 있는데, 이에는 바탈라닙 (PTK787), 에를로티닙 (타르세바; 등록상표), OSI-7904, ZD6474 (자크티마(ZACTIMA; 등록상표)), ZD6126 (ANG453), ZD1839, 수니티닙 (수텐트(SUTENT; 등록상표)), 세막사닙 (SU5416), AMG706, AG013736, 이마티닙 (글리벡; 등록상표), MLN-518, CEP-701, PKC-412, 라파티닙 (GSK572016), 벨카데(등록상표), AZD2171, 소라페닙 (넥사바르(NEXAVAR; 등록상표)), XL880, 및 CHIR-265가 포함되지만, 그에 제한되지 않는다.
본 발명의 항-NRP1 항체를 단독으로 또는 제2의 치료제 (예를 들어, 항-VEGF 항체)와 병용해서, 한 가지 이상의 화학요법제와 병용해서 추가로 사용할 수 있다. 각종 화학요법제를 본 발명의 병용 치료 방법에 사용할 수 있다. 고려된 화학요법제의 비제한적 예시 목록이 본원에 "정의" 항목에 제공되어 있다.
항-Nrp 항체를 제2의 치료제와 함께 공동 투여하는 경우, 이러한 제2 치료제를 먼저 투여한 다음, 항-Nrp 항체를 투여할 수 있다. 그러나, 동시 투여하거나 항-Nrp 항체를 먼저 투여하는 것이 또한 고려된다. 제2 치료제에 대한 적합한 투여량은 현재 사용되고 있는 양이고, 이러한 제제와 항-NRP1 항체의 조합 작용 (상승 작용)으로 인해 낮출 수도 있다.
질병을 예방 또는 치료하는데 적당한 항체 투여량은 치료하고자 하는 질병의 유형, 질병의 중증도 및 과정, 항체가 예방적 용도로 투여되는지 아니면 치료적 용도로 투여되는지의 여부, 기존의 요법, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응, 및 담당 의사의 판단에 좌우될 것이다. 항체는 환자에게 1회 투여하거나 일련의 치료 기간 내내 투여하는 것이 적합하다.
질병의 유형과 중증도에 따라서, 1회 이상의 별도 투여이든지 아니면 연속적인 주입이든지 간에, 항체 약 1 ㎍/kg 내지 약 50 mg/kg (예를 들어, 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg)이 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량이다. 전형적인 1일 투여량은 상기 언급된 요인들에 따라서 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 이상의 범위일 수 있다. 수 일에 걸쳐 반복 투여하는 경우에는, 질환에 따라서 목적하는 질병 증상 억제가 나타날 때까지 치료를 지속한다. 그러나, 기타 투여량 섭생도 유용할 수 있다. 바람직한 측면에서, 본 발명의 항체를 2주 내지 3주 마다 약 5 mg/kg 내지 약 15 mg/kg의 범위 용량으로 투여한다. 보다 바람직하게, 이러한 투여 섭생을 전이성 결장직장암을 치료하기 위한 1차 치료로서 화학요법 섭생과 병용해서 사용한다. 몇몇 측면에서는, 화학요법 섭생이 전통적인 고 용량 간헐적 투여를 포함한다. 몇몇 기타 측면에서는, 예정된 중단 없이 화학요법제를 보다 적은 용량으로 보다 자주 투여한다 ["메트로노믹 (metronomic) 화학요법"]). 본 발명의 요법의 진행 과정은 통상적인 기술 및 분석에 의해 용이하게 모니터링할 수 있다.
항체 조성물은 우수한 의료 행위에 일관되는 방식으로 제형화, 투약 및 투여될 것이다. 이러한 맥락에서 고려해야 하는 요인에는 치료하고자 하는 특정 장애, 치료하고자 하는 특정 포유동물, 개개 환자의 임상 상태, 장애의 원인, 제제 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케쥴, 및 의사에게 공지된 기타 요인들이 포함된다. 투여하고자 하는 항체의 "치료상 유효량"은 이러한 고려 사항에 의해 좌우될 것이며, 이는 특정 질병이나 장애를 예방, 완화 또는 치료하는데 필요한 최소량이다. 본 발명의 항체를, 문제의 장애를 예방 또는 치료하기 위해 현재 사용되고 있는 한 가지 이상의 제제와 함께 반드시 제형화할 필요는 없지만, 임의로 제형화한다. 이러한 기타 제제의 유효량은 제형 내에 존재하는 항체의 양, 장애 또는 치료 유형, 및 상기 논의된 기타 요인들에 의해 좌우된다. 이들은 일반적으로, 지금까지 사용된 바와 동일한 투여량과 투여 경로로 사용되거나, 또는 지금까지 이용된 투여량의 약 1 내지 99％이다. 일반적으로, 특징 질병이나 장애의 완화 또는 치료는 이러한 질병이나 장애와 연관된 한 가지 이상 증상 또는 의학적 문제를 경감시키는 것을 포함한다. 암의 경우, 약물의 치료상 유효량은 다음 중의 한 가지 또는 조합을 달성할 수 있다: 암 세포 수를 감소시키고/시키거나; 종양 크기를 감소시키고/시키거나; 암 세포가 말초 기관 내로 침윤되는 것을 억제 (즉, 어느 정도 저하시키고/시키거나 중지시킨다)시키고/시키거나; 종양 전이를 억제시키고/시키거나; 종양 성장을 어느 정도 억제시키고/시키거나; 암과 연관된 한 가지 이상의 증상을 어느 정도 경감시킨다. 약물이 기존의 암 세포의 성장을 방지시키고/시키거나 암 세포를 사멸시킬 수 있는 정도까지는 이러한 약물이 세포증식 억제성 및/또는 세포독성일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 조성물을 사용하여 특정 대상체 또는 포유동물에게서 해당 질병이나 장애의 발병 또는 재발을 예방할 수 있다.
비- 치료적 용도
본 발명의 항체를 친화도 정제 제제로서 사용할 수 있다. 이러한 공정에서는, 당해 분야에 널리 공지된 방법을 사용하여, 항체를 고체 상, 예를 들어 세파덱스 수지 또는 여과지 상에 고정화시킨다. 이와 같이 고정화시킨 항체를, 정제시키고자 하는 항원을 함유하는 샘플과 접촉시킨 후, 고정화 항체와 결합되는, 정제시키고자 하는 항원을 제외하고는 샘플 내의 실질적으로 모든 물질을 제거시키는데 적합한 용매를 이용하여 지지체를 세척한다. 최종적으로, 항체로부터 상기 항원을 방출시키는데 적합한 또 다른 용매, 예를 들어 글리신 완충액 (pH 5.0)으로 지지체를 세척한다.
본 발명의 항체는, 예를 들어 관심있는 항원이 특이적 세포, 조직 또는 혈청 내에서 발현되는지를 검출하기 위한 진단 분석에 유용할 수도 있다.
진단 적용하는 경우에는, 항체를 전형적으로, 검출가능한 부분으로 표지시킬 것이다. 일반적으로 다음 범주로 나눌 수 있는 수 많은 표지가 이용 가능하다:
(a) 방사성 동위원소, 예를 들어 35S, 14C, 125I, 3H, 및 131I. 항체를, 예를 들어 문헌 (참고: 문헌 [Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, Coligen et al. (1991) Ed. Wiley-Interscience, New York, New York, Pubs.])에 기재된 기술을 사용하여 방사성 동위원소로 표지시킬 수 있고, 신틸레이션 계수를 이용하여 방사능을 측정할 수 있다.
(b) 형광성 표지, 예를 들어 희토류 킬레이트 (에우로퓸 킬레이트) 또는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 리사민 (Lissamine), 피코에리트린 및 텍사스 레드 (Texas Red)가 이용 가능하다. 형광성 표지는 예를 들어 문헌 [Current Protocols in Immunology, 상기문헌]에 기재된 기술을 사용하여 항체에 접합시킬 수 있다. 형광계를 사용하여 형광을 정량화할 수 있다.
(c) 각종 효소-기질 표지가 이용 가능하고, 미국 특허 제4,275,149호에는 이들 중의 몇 가지에 관한 검토이 제공된다. 효소는 일반적으로, 각종 기술을 사용하여 측정할 수 있는 발색 기질의 화학적 변경을 촉매한다. 예를 들어, 효소는 기질에서의 색상 변화를 촉매할 수 있는데, 이는 분광광도계를 이용하여 측정할 수 있다. 또 다른 한편, 효소는 기질의 형광 또는 화학발광을 변경시킬 수 있다. 형광 상의 변화를 정량화하는 기술이 상기 언급되어 있다. 화학발광성 기질은 화학적 반응에 의해 전자적으로 여기된 다음, (예를 들어 화학발광계를 사용하여) 측정할 수 있는 빛을 방출하거나 에너지를 형광 수용체에 기증할 수 있다. 효소적 표지의 예에는 루시퍼라제 (예를 들어, 개똥벌레 루시퍼라제 및 세균성 루시퍼라제; 미국 특허 제4,737,456호), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 말레이트 데히드로게나제, 우레아제, 퍼옥시다제, 예를 들어 서양고추냉이 퍼옥시다제 (HRPO), 알킬리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 당류 옥시다제 (예를 들어, 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제), 헤테로사이클릭 옥시다제 (예를 들어, 우리카제 및 크산틴 옥시다제), 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제 등이 포함된다. 효소를 항체에 접합시키는 기술은 다음 문헌에 기재되어 있다 (참고: 문헌 [O'Sullivan et al. (1981) Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (Ed., J. Langone ＆ H. Van Vunakis), Academic Press, New York, 73:147-166]).
효소-기질 조합물의 예에는, 예를 들어 다음이 포함된다:
(i) 서양고추냉이 퍼옥시다제 (HRPO)와 기질로서의 수소 퍼옥시다제의 조합물 [여기서는, 수소 퍼옥시다제가 염료 전구체 (예를 들어, 오르토페닐렌 디아민 (OPD) 또는 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 히드로클로라이드 (TMB))를 산화시킨다];
(ii) 알칼리성 포스파타제 (AP)와 발색 기질로서의 파라-니트로페닐 포스페이트의 조합물; 및
(iii) β-D-갈락토시다제 (β-D-Gal)와 발색 기질 (예를 들어, p-니트로페닐-β-D-갈락토시다제) 또는 형광발생 기질 4-메틸움벨리페릴-β-D-갈락토시다제의 조합물.
당업자는 수 많은 기타 효소-기질 조합물을 입수할 수 있다. 이들에 관한 일반적인 검토을 위해, 미국 특허 제4,275,149호 및 제4,318,980호를 참고할 수 있다.
종종, 표지를 항체와 간접적으로 접합시킨다. 당업자는 이를 달성하기 위한 각종 기술을 알고 있을 것이다. 예를 들어, 항체를 비오틴과 접합시키고, 상기 언급된 3 가지 광범위한 범주의 표지 중의 어느 하나를 아비딘과 접합시킬 수 있는데, 그 반대의 경우도 가능하다. 비오틴은 아비딘과 선택적으로 결합하므로, 표지를 이러한 간접 방식으로 항체와 접합시킬 수 있다. 또 다른 한편, 표지를 항체와 간접적으로 접합시키기 위해, 항체를 작은 합텐 [예: 디곡신 (digoxin)]과 접합시키고, 상기 언급된 상이한 유형의 표지 중의 하나를 항-합텐 항체 (예를 들어, 항-디곡신 항체)와 접합시킨다. 이로써, 표지와 항체와의 간접적 접합이 달성될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서는, 항체를 표지시킬 필요가 없는데, 그의 존재는 항체와 결합하는 표지된 항체를 사용하여 검출할 수 있다.
본 발명의 항체는 공지된 모든 분석 방법, 예를 들어 경쟁적 결합 분석, 직접 및 간접 샌드위치 분석, 및 면역침전 분석에 이용할 수 있다 (참고: 문헌 [Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc. 1987)]).
경쟁적 결합 분석은 제한된 양의 항체와의 결합을 놓고 시험 샘플 분석물과 경쟁할 수 있는 표지된 표준물의 능력에 좌우된다. 시험 샘플 중의 항원의 양은 항체와 결합되는 표준물의 양에 반비례한다. 결합되는 표준물의 양을 결정하는 것을 촉진시키기 위해, 항체를 일반적으로 경쟁 전 또는 후에 가용화시키므로, 항체와 결합되는 표준물 및 분석물은 결합되지 않은 채로 남아 있는 표준물 및 분석물로부터 편리하게 격리시킬 수 있다.
샌드위치 분석은 각각 검출하고자 하는 단백질의 상이한 면역원성 부분 또는 에피토프와 결합할 수 있는 2개의 항체를 사용하는 것을 포함한다. 샌드위치 분석에서는, 시험 샘플 분석물이 고체 지지체 상에서 고정화되는 제1 항체에 의해 결합된 후, 제2 항체가 분석물과 결합하므로, 불용성 3-부분 복합체가 형성된다 (참고: 문헌 [예를 들어, 미국 특허 제4,376,110호]). 제2 항체 자체를 검출가능한 부분으로 표지시킬 수 있거나 (직접 샌드위치 분석) 또는 검출가능한 부분으로 표지시킨 항-이뮤노글로불린 항체를 사용하여 측정할 수 있다 (간접 샌드위치 분석). 예를 들어, 샌드위치 분석의 한 가지 유형이 ELISA 분석이고, 여기서는 검출가능한 부분이 효소이다.
면역조직화학의 경우에는, 종양 샘플이 신선하거나 동결될 수 있거나, 또는 파라핀에 포매시키고, 예를 들면 포르말린 등의 방부제로 고정시킬 수 있다.
본 발명의 항체를 생체내 진단 분석에 사용할 수도 있다. 일반적으로, 항체를 방사성 핵종 (예를 들어, 111In, 99Tc, 14C, 131I, 125I, 3H, 32P 또는 35S) 또는 염료로 표지시켜 면역섬광조영술을 이용하여 종양을 국재시킬 수 있다.
한 실시양태에서, 특정 생물학적 샘플 (예를 들어, 조직, 혈액, 혈청, 척수액) 또는 준비된 생물학적 샘플 중에서 NRP1을 검출하는 방법은 본 발명의 항체를 상기 샘플과 접촉시키는 단계; 및 이러한 샘플 중에서 NRP1과 결합된 항-NRP1 항체를 관찰하거나 또는 상기 샘플 중에서 NRP1과 결합된 항-NRP1 항체의 양을 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 특정 대상체에게서 NRP1을 검출하는 방법은 본 발명의 항체를 상기 대상체에게 투여하는 단계; 및 이러한 대상체에게서 NRP1과 결합된 항-NRP1 항체를 관찰하거나 또는 상기 대상체 (예를 들어, 인간, 마우스, 토끼, 래트 등)에게서 NRP1과 결합된 항-NRP1 항체의 양을 결정하는 단계를 포함한다.
진단용 키트
편의상, 본 발명의 항체를 키트 내에 제공할 수 있는데, 즉 진단 분석을 수행하기 위한 지시사항과 함께 예정량으로 패키지된 시약 조합물로 제공될 수 있다. 항체를 효소로 표지시킨 경우에는, 키트가 이러한 효소에 의해 요구되는 기질 및 조인자 (예를 들어, 검출가능한 발색단 또는 형광단을 제공하는 기질 전구체)를 포함할 것이다. 또한, 기타 부가제, 예를 들어 안정화제, 완충제 (예를 들어, 차단 완충제 또는 용해 완충제) 등을 포함할 수 있다. 각종 시약의 상대량은 해당 분석의 민감도를 실질적으로 최적화시키는 시약 용액 중의 농도를 제공하기 위해 광범위하게 다양할 수 있다. 특히, 시약은 통상적으로 동결건조된 무수 분말로서 제공될 수 있는데, 이에는 용해시 적당한 농도를 지닌 시약 용액을 제공해주는 부형제가 포함된다.
제조품
본 발명의 또 다른 실시양태에서는, 상기 언급된 장애를 치료하는데 유용한 물질을 함유하는 제조품이 제공된다. 본 발명의 제조품은 용기, 및 표지를 포함한다. 적합한 용기에는, 예를 들어 병, 바이알, 주사기 및 시험용 튜브가 포함된다. 용기는 각종 재료, 예를 들어 유리 또는 플라스틱으로부터 형성할 수 있다. 용기는 상기 질환을 치료하는데 유효한 조성물을 보유하고 있고 멸균성 유입 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 상기 용기는 피하 주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용제 봉지 또는 바이알일 수 있다). 조성물 내의 활성제는 상기 항체이다. 용기 상에 있거나 이와 연합된 표지는 해당 조성물이 선택 증상을 치료하는데 사용된다는 것을 표시한다. 본 발명의 제조품은 또한 제약상 허용되는 완충제, 예를 들어 인산염 완충 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 상업적 및 사용자 측면에서 바람직한 기타 재료, 예를 들어 기타 완충제, 희석제, 충진제, 바늘, 주사기 및 사용에 관한 지시사항을 수반한 패키지된 삽입물을 추가로 포함할 수 있다.
다음 실시예는 본 발명의 실시를 단지 예시하기 위한 것이며, 이로써 본 발명의 범위가 제한되지 않는다. 본원에 인용된 모든 특허 및 과학지의 기재 내용은 그의 전문이 본원에 참고로 도입된다.
실시예 1
항- Nrp1 B 및 항- panNrp A 항체 구축 및 이들의 기능
세마포린 또는 VEGF의 Nrp1에 대한 결합을 선택적으로 차단하는 파지-유래 항체의 개발 전략은 문헌 [Liang et al., J MoI Biol 366, 815-29 (2007)] 및 [Pan et al., Cancer Cell 11, 53-67 (2007)]에 보고되어 있다. 이들 모노클로날 항체는 어느 한 리간드에 대한 Nrp1-매개된 반응들을 서로 구별하고, 뮤린 종양 모델에서 이들의 요법제로서의 잠재성을 평가하기 위한 도구로 고안되었다.
요컨대, VH/VL 다양성을 갖는 단일 컨센서스 스캐폴드 상에 구축된 인간 합성 항체 파지 라이브러리를 고안하였다. 상기 항체 라이브러리의 고안 및 선별에 대한 상세한 내용은 [Liang et al., 상기 문헌]에 기재되어 있으며, 2003년 12월 11일에 공개된 WO 03/102157 (그의 전체 개시내용이 본원에 참고로 포함됨)에서 찾아볼 수도 있다. 상기 라이브러리로부터, 인간 및 뮤린 NRP1에 대한 기능적 차단 항체를 제조하였다. NRP1의 b1b2 도메인에 대한 항체 맵핑으로 VEGF 및 NRP1의 결합 및 VEGF-유도 HUVEC 세포 이동을 차단할 수 있었다. 확인된 항체는 0.2 nM의 친화도로 Nrp1에 결합하는 VEGF-차단 항체 (클론YW107.4.87; 항-Nrp1B)를 포함한다 ([Liang et al., 상기문헌]; [Pan et al., 상기문헌]). 이 항체는 VEGF와 Nrp1 사이의 상호작용을 차단하지만, Sema3A 기능을 길항하지는 않는다. 생체내에서, 항-Nrp1B는 마우스 망막에서의 혈관 재형성을 감소시킬 뿐만 아니라, 종양 성장을 지연시키는 항-VEGF 요법에 부가적으로 작용한다 ([Liang et al., 상기문헌] 및 [Pan et al., 상기문헌]).
동일한 접근법에 따라, 단일 컨센서스 프레임워크 상에 구축된 인간 합성 항체 파지 라이브러리를 사용하여, 각각 0.21 및 0.15 nM의 친화도로 Nrp1 및 Nrp2 둘다와 교차-반응하는 항체 (클론 YW68.11.26, 항-panNrpA)를 개발하였다 (도 S1). YW68.11.26 및 관련 YW68.11의 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 서열은 각각 도 7 및 8에 도시되어 있다. 항-panNrpA IgG1 항체 YW68.11 및 YW68.11.26의 Fab 단편의 아미노산 서열은 각각 도 9A 및 9B에 도시되어 있다.
항-Nrp1B와는 달리, 항-panNrpA는 VEGF165 또는 VEGF-C의 결합에 영향을 미치지 않는다 (데이타는 나타내지 않음). 상기 두 항체가 뮤린 후근 신경절 (DRG)로부터의 액손 성장 원뿔의 Sema3A-매개된 붕괴를 억제하는 능력을 평가하였다 (도 1). Sema3A를 첨가한 결과 DRG 성장 원뿔이 있는 액틴 프로세스가 축소되었으며, 이러한 작용은 항-panNrpA에 의해 완전하게 길항되었으나, 항-Nrp1B에 의해서는 길항되지 않았다.
실시예 2
뉴로필린 /항체 복합체의 구조 연구
재료 및 방법
기능 분석 및 항체 결합 친화도
붕괴 분석 및 항-Nrp 항체 결합 친화도 결정은 앞서 기재된 바와 같이 수행하였다 (문헌 [He, Z and Tessier-Lavigne, M., Cell 90, 739-51 (1997)]; [Liang et al., 상기문헌] 및 [Pan et al., 상기문헌]).
단백질 발현 및 결정학 연구를 위한 정제
Nrp1-b1, Nrp1-b1b2 및 Nrp2-b1b2 (도메인 경계에 대해 표 S1 참조)를 pET15b (노바젠; Novagen)에 클로닝하고, 이. 콜라이에서 발현시킨 후에 37 ℃ (Nrp1-b1 및 -b1b2) 또는 16 ℃ (Nrp2-b1b2)에서 유도하였다. 모든 뉴로필린 유형 b 단편은 재폴딩 프로토콜이 필요없는 가용성 단백질로 발현되었다. 세포를 용해시킨 후에, 단백질을 50 mM Tris (pH 8.0), 300-500 mM NaCl 및 20 mM 이미다졸 중 니켈-니트릴로트리아세트산 (Ni-NTA) 수지를 사용하여 정제하고, 250 mM 이미다졸이 포함된 동일한 완충액에서 용출하였다. 트롬빈으로 his6-태그를 제거하고, 샘플을 25 mM Tris (pH 8.0) 및 150 mM NaCl 중에 평형화된 Superdex-75 컬럼을 사용하는 겔 여과 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하였다.
Hi5 세포로부터 Nrp1-a2b1b2, Nrp2-a2b1b2, Nrp2-a1a2b1b2 및 전장 Nrp2-ECD (표 S1)의 분비를 용이하게 하는 재조합 배큘로바이러스를 제조하였다. Nrp2-a1a2b1b2 및 전장 Nrp2-ECD를 Nrp2 자연 분비 신호 및 C-말단 His6-태그와 pENTR/D-TOPO (인비트로젠; Invitrogen)에 서브클로닝하고, pDEST8 (인비트로젠)에 재조합시켜 바이러스 배크미드(bacmid)를 제조하였다. Nrp1-a2b1b2 및 Nrp2-a2b1b2를 pAcGP67B (클론텍; Clonetech)에 클로닝하였다. 감염 후에, 배양 배지를 수집하고, 50 mM Tris (pH 8.0), 5 mM CaCl2 및 1 mM NiCl2를 보충하였으며; 단백질을 박테리아-발현 뉴로필린 구축물에 대해 기재된 바와 같이 겔 여과 크로마토그래피 및 Ni-NTA를 사용하여 정제하였다.
항-Nrp1B (YW107.4.87) 및 항-panNrpA (YW68.11.26)에 대한 Fab 단편을 이. 콜라이에서 발현시키고, PBS 중에 평형화된 단백질 G 컬럼 상에 포획하고, 0.58％ 아세트산으로 용출하였다. 단백질 분획을 20 mM MES (pH 5.5) 중에서 이온 교환 크로마토그래피 (SP-세파로스)로 추가로 정제하고, 0 → 250 mM NaCl의 구배로 용출하였다. Fab/Nrp 복합체를 통상적으로는 1:1 몰비로 혼합하고, 25 mM Tris-HCl (pH 7.5) 및 200 mM NaCl 중에 평형화된 Superdex-200 컬럼을 사용하여 추가로 정제하였다. 결정화를 위해, 모든 결합되지 않은 뉴로필린 및 Nrp/Fab 복합체 샘플을 표 S1에 상세히 기재된 바와 같이 농축시켰다 .
결정화, 구조 결정 및 정밀화
모든 결정은 동일한 부피의 웰 포함 단백질 용액을 혼합하여 19 ℃에서 증기 확산 방법에 의해 수득하였다 (보다 상세한 내용은 보충 표 1 참조). 동결 방지를 위해, 일반적으로 결정을 20％ 글리세롤 또는 에틸렌 글리콜이 포함된 모액의 용액으로 옮긴다 (표 S1). Nrp1-b1/Fab 복합체 결정을 10 mM Hepes (pH 7.2), 25％ PEG 1,500 및 10％ 에틸렌 글리콜로 옮기고; 10 mM Hepes (pH 7.2), 25％ PEG 1,500 및 20％ 에틸렌 글리콜에 대해 밤새 탈수시키고; 액체 질소에 신속하게 냉동시켰다. 데이타 세트를 어드밴스드 라이트 소스(Advanced Light Source) (빔-라인 5.0.1 또는 5.0.2) 또는 스탠포드 싱크로트론 방사 실험실(Stanford Synchrotron Radiation Laboratory) (빔-라인 9-2 또는 11-1)에서 수집하였다. 데이타를 HKL 쉬트(HKL Suite)로부터 Denzo 및 Scalepack을 사용하여 처리하였다 (문헌 [Otwinowski, Z ＆ Minor, W., Methods in Enzymology 276,307-326 (1997)]). 세포 파라미터 및 데이타 통계를 표 1에 요약하였다.
모든 결정 구조를 페이저(Phaser)를 이용하여 분자 재배치에 의해 해석하였다 (문헌 [McCoy et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 61, 458-64 (2005)]). Nrp1-b1b2 구조는 각각의 응고 인자 도메인에 대한 검색 모델로서 Nrp1-b1 결정 구조 (pdb 승인 번호 1KEX) (문헌 [Lee, et al., Structure 11, 99-108 (2003)])를 사용하여 해석하였다. Nrp1-b1b2 구조의 정밀화 좌표는 Nrp2-b1b2 구조에 대한 검색 조사로 해석하였다. Nrp2 a1a2b1b2/항-panNrpA-Fab 복합체의 단사정계 형태를 Nrp2-b1b2 구조 및 B20-4/VEGF 복합체 (pdb 승인 번호 2FJH)로부터의 가변 도메인 (VH/VL) 또는 불변 도메인 (CH1/CL)을 함유하는 Fab 단편을 사용하여 해석하였다. a2 도메인을 MASP-2로부터의 N-말단 CUB 도메인을 사용하여 분자 재배치에 의해 확인하였으며; a1 도메인은 분자 재배치로 배치할 수 없어, 전자 밀도 내에서 수동 배치하였다. Nrp1-b1/Fab 복합체는 Nrp1-b1 결정 구조 및 상기 기재된 B20-4 Fab 단편을 사용하여 해석하였다. 나머지 구조는 모두 b1b2 구조 및 Nrp2-a1a2b1b2/Fab 복합체로부터의 a2 CUB 도메인의 정밀화 배위를 사용하여 해석하였다. 쿠트(Coot)를 이용하여 원자 모델을 구축하고 (문헌 [Emsley, P. ＆ Cowtan, K. Coot, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 60, 2126-32 (2004)]), Refmac으로 정밀화하였다 (문헌 [Murshudov, et al., Acta Crystallographica D53, 240-255 (1997)]).
Nrp1 , Nrp2 및 뉴로필린 / Fab 복합체의 결정화
2 가지 다른 전략을 이용하여 구조 연구를 위한 단백질을 생산하였다. b형 도메인 만을 포함하는 보다 작은 뉴로필린 단편을 이. 콜라이에서 발현시키는 한편, 보다 큰 Nrp 구축물은 배큘로바이러스-감염된 곤충 세포로부터 분비된 단백질로 생산될 필요가 있었다. 7개 구조의 개략도를 도 2에 제시하였다. 요컨대, Nrp1 및 Nrp2의 VEGF 결합 부분 (b1b2)의 결정을 각각 1.8 및 1.95 Å의 최대 해상도로 회절시켰다. Nrp1 및 Nrp2의 a2b1b2 도메인의 결정을 각각 2.0 및 2.3 Å의 해상도로 정밀화시키고, VEGF-차단 Fab, 항-Nrp1B와 복합체를 형성한 Nrp1의 b1 도메인을 2.2 Å 해상도로 회절시켰다. 마지막으로, 항-panNrpA 세마포린-차단 Fab와 복합체 형성한 Nrp2 a1a2b1b2 도메인의 결정 구조를 해석하였으며; 상기 복합체의 2개의 결정 형태를 2.75 및 3.1 Å로 회절시켜 확인하였다. 모든 구조를 분자 재배치에 의해 해석하고, 고급 입체화학을 이용하여 20/25％ 미만의 최종 Rwork/Rfree 값으로 기록하였다 (표 1). Nrp1 a2b1b2 구조는 a2 도메인의 반대 측면 상의 2개의 N-연결된 글리코실화 부위를 갖는다 (도 3B). Nrp2/Fab 복합체의 단사정계 형태는 또한 a2 도메인 내에 2개의 글리코실화 부위를 갖지만 (도 3A); 이들 당 잔기는 Nrp2-a2b1b2 구조의 전자 밀도 내에서 잘 규명되지 않아 모델링하지 않았다 (도 3B).
뉴로필린 엑토도메인의 전반적인 도메인 골격구조
뉴로필린 세포외 영역은 종종 각각 1차 세마포린-결합 (a1a2), VEGF-결합 (b1b2) 및 이량체화 도메인 (c)을 나타내는 3개의 유닛으로 나누어진다 (문헌 [Ellis, L.M., Mol Cancer Ther 5, 1099-107 (2006)]). 또한, 최근 래트 Nrp1 b1b2의 결정 구조 (문헌 [Vander Kooi, C. W., et al., Proc Natl Acad Sci USA 104, 6152- 6157 (2007)])에서 b1 도메인과 b2 도메인 사이에 큰 계면이 확인되었으며, 도메인 사이에 함입된 잔기의 서열이 보존되어 있으므로, 이 b1b2 도메인 배열은 Nrp 부류의 일반적 특징으로 인지된다. 여기서, a2, b1 및 b2 도메인을 포함하는 Nrp의 4개의 결정 구조가 다양한 결정화 조건 (표 S1)으로부터 해석되었다 (도 2, 3). 2가지 모델은 Fab 단편에 결합된 a1 도메인을 포함하는 반면, 2가지 다른 모델은 a2 도메인에 칼슘 이온을 포함한다. 이러한 차이에도 불구하고, 3가지 도메인 (a2, b1 및 b2)은 모든 결정 구조에서 동일한 배열을 공유하고, 슈도 3- 폴드 축을 둘러싸고 단단히 패킹되어 있다 (도 3). Nrp1 및 Nrp2 a2b1b2 구조는 매우 유사하며, 317 Cα 원자 상에서 1.2 Å의 r.m.s.d. (평균 제곱근 편차)로 중첩된다. b1 및 b2 사이의 계면은 두 뉴로필린 사이에 보존되어 있고, 여기에 용매 접근가능한 표면의 약 1200-1500 Å2가 함입되어 있다. 흥미롭게도, a2 도메인과 b1b2 사이의 계면은 모든 구조에서 보존되어 있을 뿐 아니라, 용매 접근가능한 표면의 2000 Å2가 넘게 함입되어 있으며, 이는 3가지 도메인이 모두 단단한 구조 단위를 형성한다 (도 3).
반면, a1 및 a2b1b2 사이의 도메인 배열은 Nrp2/항-panNrpA-Fab 복합체의 2가지 결정 형태 사이에서 유지되지 않는다. 수용체의 a2b1b2 코어가 중첩되는 경우, a1 도메인은 서로에 대해 약 7 Å 옮겨진다. a1 및 a2b1b2 사이의 계면은 작고 (표면 영역의 약 800 Å2가 함입되어 있음), 보존되지 있지 않다. 강한 상호작용의 결핍은 a1 도메인의 가요성을 확인해주며, 이는 용액 중에서 또는 수용체 결합시 나머지 Nrp에 대해 형태 변화가 진행될 수 있음을 시사한다 (도 3C).
Nrp CUB 도메인은 칼슘-결합 부위 및 세마포린 -결합 부위를 포함한다
Nrp1 및 Nrp2의 a1 및 a2 도메인은 CUB 도메인이다 (문헌 [Ellis, L.M, Mol, Cencer Ther 5, 1099-107 (2006)]). CUB 도메인 원형, 스펌어드헤신에서 (문헌 [Romero, A., et al., Nat Struct Biol 4, 783-8 (1997)]), 폴드는 β-샌드위치를 형성하는 2개의 5-가닥 β-시트를 포함한다. 가닥 β2, β4, β9, β6 및 β7은 가닥 β1, β3, β10, β5 및 β8을 함유하는 다른 시트와 하나의 β-시트를 형성하지만, 가닥 β1 및 β2는 여러 상보체 부류 단백질로부터의 CUB 도메인에 없는 경우가 많다 (문헌 [Feinberg, H. et al., EMBO J 22, 2348-59 (2003)]; [Gregory, L.A. et al., J Biol Chem 278, 32157-64 (2003)]; [Gregory, L.A. et al., J Bol. Chem 279, 29391-7 (2004)]). 이들 단백질과 유사하게, Nrp의 a1 및 a2 도메인은 β1 가닥이 결여되어 있다 (도 4). 전반적으로, CUB 도메인은 고도의 유사성을 나타낸다. 예를 들어, Nrp a2 도메인은 구조적으로 Nrp1 a2 도메인 (r.m.s.d. 0.9 Å), Nrp2 a1 도메인 (r.m.s.d. 0.9 Å) 및 CUB 도메인 (스펌어드헤신 유래, [Romero, A. et al., 상기문헌]) (r.m.s.d. 1.4 Å)과 유사하다.
MASP-236'37 및 상보체 부류 단백질 C1로부터의 CUB 도메인의 결정 구조는 샌드위치의 한쪽 말단에서 칼슘-결합 부위를 함유한다. Nrp1 및 Nrp2 a2b1b2 구조는 또한 도메인 a2 내의 상기 위치에서 결합된 이온을 함유한다 (도 3B, 4A). Nrp1 구조에서, 결정화 동안 2가의 양이온이 포함되지 않더라도 (표 S1), 이온은 전자 밀도에서 명확하게 관찰된다 (도 S2). Nrp1에서, 칼슘 이온은 3개의 음하전된 측쇄 (Glu195, Asp209 및 Asp250), 2개의 카르보닐 산소 (Ala252 및 Ile253) 및 물 분자에 의해 배위결합된다 (도 4B). 마찬가지로, 칼슘 배위는 Nrp2에서 3개의 음하전되 아미노산 (Glu197, Asp211 및 Asp252; 도 S2 참조)과 연관되어 있으며; 이들 3개의 잔기는 12가지 관계가 먼 종으로부터 a2 도메인에서 완전히 보존되어 있다 (도 S3)
Nrp의 a1 및 a2 도메인 사이의 서열 정렬 (도 S2)은 이러한 하전된 잔기 3개 의 집합체가 Nrp의 a1 도메인 내에서도 엄격하게 보존되어 있음을 보여준다. 그러나, Nrp2/항-NrpA-Fab 복합체에는, a1 도메인에 결합된 이온의 표시가 없다. 추정되는 a1 Ca2 + 결합 부위를 규정하는 잔기가 기여하는 루프는 잘 정렬되어 있지 않으며, 이는 Ca2 +가 도메인의 폴드를 안정화시키는데 소정의 역할을 수행함을 시사한다. 고도의 서열 보존성에 기초하여, 칼슘 결합은 Nrp CUB 도메인의 공유 특성을 나타낼 수도 있다.
뉴로필린은 세마포린의 클래스 3 부류의 구성원을 선별하기 위한 공동-수용체로 기능한다. N-말단은 기호 "Sema" 도메인 (7개 날개가 있는 β-프로펠러)을 함유하고 (문헌 [Antipenko, A., et al., Neuron 39, 589-98 (2003)]), 이는 뉴로필린의 a1a2 도메인에 대한 결합에 필요하다. 항-panNrpA는 Nrp1 및 Nrp2 둘다에 대한 Sema3의 결합을 차단하지만 (도 1), VEGF 결합에는 영향을 미치지 않는다 (데이타는 나타내지 않음). Nrp2/항-panNrpA-Fab 복합체의 구조에서 (도 4C), Fab 단편은 오직 용매 접근가능한 표면의 대략 1400 Å2가 함입되어 있는 샌드위치 β8-5-10-3 면에서 Nrp2의 a1 도메인과 접촉한다. 상기 항체가 인식하는 계면은 Nrp1 및 Nrp2 사이에 잘 보존되어 있는데, 즉 계면에 함입된 접근가능한 표면의 25％를 넘게 갖는 14개의 Nrp2 잔기들 중 11개가 두 수용체 사이에서 동일하다 (도 4C). Nrp1 및 Nrp2 사이에 보존된 에피토프의 인식은 항체가 나노몰 아래의 범위의 친화 도로 두 수용체와 결합하는 능력을 설명한다 (도 S1).
항체 측면에서, 11개의 측쇄 (이들 중 7개는 방향족 특성을 가짐)가 CDR L3, H2 및 H3으로부터의 Nrp2와 접촉한다 (도 4D). 이전의 연구는 부위 지정 돌연변이 유발을 이용하여 Nrp1의 세마포린 결합 부위를 요약하였다 (문헌 [Gu, C. et al., J Biol Chem 111, 18069-76 (2002)]). 스펌어드헤신의 모델에 근거하여, 추정상 a1 도메인의 표면에서 용매 노출된 잔기를 아미노산 치환을 위해 선별하였다. 이러한 접근법을 이용하여, Sema3A와 Nrp1 사이의 상호작용을 붕괴시키는 다수의 돌연변이를 확인하였고 ([Gu et al., 상기문헌]), 이들은 Npr1 a1의 모델에 대해 맵핑되었을 때 a1 β-샌드위치의 한쪽 극에 있는 루프에 위치하였다 (도 4C). 도메인의 다른 한쪽 말단에서의 치환은 Sema3A 결합에 영향을 미치지 않는다 ([Gu et al., 상기문헌]). Sema3A 결합을 붕괴시키는 돌연변이는 Sema3A-차단 Fab에 의해 인식되는 에피토프에 인접하여 있으며 (도 4C), 이는 sema 도메인이 Nrp2 a1 도메인 내의 샌드위치의 8-5-10-3 면 및 루프에 결합함을 강력하게 시사한다. 세마포린-결합 부위의 위치는 또한 a1 도메인의 칼슘-결합 부위에 인접하여 있는데 (도 4C), 이는 칼슘 결합이 리간드와 수용체 사이의 상호작용에 소정의 역할을 수행할 수 있음을 시사한다.
Nrp b형 도메인은 헤어핀-결합 부위 및 VEGF -결합 부위를 함유한다
인간 뉴로필린 b1b2 구조에서의 b 도메인 (도 5A 및 [Vander Koo et al., 상기문헌], [Lee et al., 상기문헌])은 응고 인자 V 및 VIII (F5/8)로부터의 인지질-결합 (C2형) 모듈 (문헌 [Macedo-Ribeiro et al., Nature 402, 434-9 (1999)]; [Pratt, K.P., et al., Nature 402, 439-42 (1999)])와, 그리고 박테리아 시알리다제의 갈락토스-결합 도메인 (문헌 [Gaskell, A. et al., Structure 3, 1197-205 (1995)])에 대해 유의한 상동성을 공유한다. 결론적으로, 이들 도메인은 위상적으로 8개의 코어 β-가닥으로 구성된 비틀린 젤리-롤 β-원통으로 분류된 디스코이딘(discoidin) 폴드를 규정한다. 도메인의 한쪽 극은 통상적으로 디스코이딘 부류 구성원을 위한 리간드-결합 부위를 구성하는 3개의 확장된 "스파이크" 또는 루프를 함유한다 ([Macedo-Ribeiro et al., 상기문헌]; [Pratt et al., 상기문헌]; [Gaskell et al., 상기문헌]). Nrp1 및 Nrp2의 b1b2 단편은 50％ 서열 동일성을 공유하고, 307 Cα 원자 상에서 2.3 Å의 r.m.s.d.로 중첩된다 (도 5A). Nrp1 및 Nrp2의 b1 도메인은 거의 구별불가능한 반면 (r.m.s.d = 0.6 Å), b2 도메인은 상이한 형태의 "스파이크"를 크게 저지하는 차이로 보다 덜 중첩된다 (r.m.s.d. = 2.7 Å) (도 5A). 이들 스파이크는 디스코이딘 부류 내의 결합 부위를 규정하기도 하므로 ([Vander Kooi et al., 상기문헌]; [Lee et al., 상기문헌]; [Macedo-Ribeiro et al., 상기문헌]; [Pratt et al., 상기문헌]; [Gaskell et al., 상기문헌]), Nrp1 및 Nrp2의 차이는 Nrp가 별개의 결합 파트너를 인식하는 한 가지 방식을 나타낼 수 있다.
Nrp1 및 Nrp2의 b2 도메인 사이의 차이에도 불구하고, b 도메인은 단단하게 패킹되어 있으며, 단단한 스캐폴드를 형성한다 (도 5). 인터도메인 연결부는 2개의 b 도메인의 장축에 대해 대략 수직 방향으로 진행되는 깊은 홈을 형성한다 (도 5). b1의 β4:β5 루프 및 b2의 β5:β6 루프에 의해 생성되는 상기 홈은 다수의 양하전된 잔기들로 둘러싸여 있는데, 이는 래트 Nrp1에 대한 돌연변이유발 실험에 기초하여 ([Vander Koo et al., 상기문헌]) Nrp의 헤어핀-결합 부위를 나타낸다. 양전성 패치는 인간 Nrp 둘다의 구조에도 존재한다 (도 5B). VEGF165 (VEGF55로도 알려져 있음) (문헌 [Fairbrother et al., Structure 6, 637-48 (1998)])의 C-말단 도메인은 또한 헤어핀 결합 부위를 함유한다. 헤어핀이 VEGF165에 대한 b1b2의 친화도를 100-배까지 증가시키므로 (문헌 [Mamluk, R. et al., J Biol Chem 277, 24818-25 (2002)]; [Fuh, G. et al., J Biol Chem 275, 26690-5 (2000)]), Nrp는 상기 영역으로 VEGF165를 동원하는데 헤어핀을 사용할 가능성이 있다.
VEGF165의 엑손 7 사이에서의 상기 헤어핀-매개된 상호작용 이외에도, 엑손 8에 의해 코딩되는 VEGF의 C-말단 꼬리 (CDKPRRCOOH)는 Nrp에 직접 결합할 수 있다. 투프신와 복합체를 형성한 래트 Nrp1-b1b2의 결정 구조에서 ([Vander Kooi et al., 상기문헌]), VEGF 꼬리의 테트라펩티드 모방체 (TKPRCOOH) (문헌 [von Wronski, M.A. et al., J Biol Chem 281, 5702-10 (2006)]), C-말단 아르기닌은 b1 도메인의 보존된 "스파이크"로부터 잔기에 의해 생성된 산성 홈에 팽팽하게 채워진다. 3가지 Fab 복합체 모두를 비롯하여 본 발명의 구조 중 몇몇에서, 대칭-관련 분자로부터의 C-말단 잔기 (히스티딘)는 투프신 펩티드의 동일한 산성 포켓을 차지한다 (도 S4).
VEGF 결합에 연관된 잠재적 잔기를 더 상세하게 하기 위해, b1b2 표면 상의 Nrp 잔기의 표면 보존성을 조사하였다 (도 5C). 2개의 인접한 패치가 12가지 Nrp1 및 Nrp2 단백질 사이에 보존되어 있다 (도 S3). 이러한 부위 중 하나는 투프신-결합 부위에 직접 맵핑하는 반면, 2번째 부위는 헤어핀-결합 패치의 가장자리 상에 잔기를 포함하는데, 이는 Nrp 및 VEGF 사이의 상호작용을 위한 추가의 구역을 시사한다.
Nrp1-b1/항-Nrp1B-Fab 복합체의 결정 구조에서 (도 5D), Fab는 상기 2개의 추정되는 VEGF 결합 부위 사이에 위치한 에피토프와 접촉하고, 투프신 결합 틈과 부분적으로 중복된다. 상기 VEGF 차단 항체의 에피토프는 드문 것으로, CDR L1 및 H3으로부터의 잔기들과만 연관이 있다. 평균적으로, Fab/항원 계면에는 용매 노출된 표면의 1680 Å2가 함입되어 있으나 (문헌 [Lo Conte et al., JMol. Biol 285, 2177-98 (1999)]), 900 Å2 만이 Nrp1-b1/Fab 계면에서 가리워져 있다. 계면이 작음에도 불구하고, 항-Nrp1B는 Nrp1에 0.2 nM의 친화도로 단단하게 결합한다 ([Liang et al., 상기문헌]; [Pan et al., 상기문헌]).
VEGF 및 Sema3A 는 Nrp 결합에 대해 경쟁하지 않는다
본 발명의 Nrp/Fab 결정 구조에서, VEGF 및 세마포린 결합을 차단하는 결합 에피토프는 65 Å 떨어져 있으며, Nrp의 반대 부위에 위치한다 (도 S5). 여러 연구에서 VEGF 및 세마포린은 세포 표면에서의 결합에 대해 경쟁하고, 이러한 경쟁이 b1 도메인 상의 부분적으로 중복되는 결합 부위와 관련이 있다고 보고하고 있다 ([Gu et al., 상기문헌]; 문헌 [Miao, H.Q. et al., J Cell Biol 146, 2177-98 (1999)]; [Narazaki, M. ＆ Tosato, G., Blood 107, 3892-901 (2006)]). 클래스 3 세마포린 및 VEGF165의 카르복시 꼬리는 둘다 염기성 잔기가 풍부한데, 이는 이들 꼬리가 b1 도메인에서 "스파이크"에 의해 생성되는 음전성 홈에 대해 경쟁할 수 있음을 시사한다 ([Vander Kooi et al., 상기문헌]; [Lee et al., 상기문헌]). 최근 밝혀진 b1b2/투프신 결정 구조에서 VEGF165 꼬리가 상기 결합 부위를 차지할 수도 있음을 확인하였다. 본원 발명자들은 이전에 항-NRP1B가 후근 신경절 (DRG)로부터의 액손의 Sema3A-매개된 붕괴를 길항하지 않음을 발견하였으며 ([Liang et al., 상기문헌]; [Pan et al., 상기문헌]), 이는 Sema3의 C-말단 꼬리가 동일한 홈에 결합하지 않음을 시사한다.
이전의 경쟁 실험 ([Gu et al., 상기문헌]; [Miao et al., 상기문헌]; [Narazaki et al., 상기문헌])은 단백질의 C-말단에 이종성 태그 (예컨대, 알칼리성 포스파타제)를 함유하는 VEGF 및 세마포린을 사용하였다. 관찰된 경쟁은 VEGF 및 Sema3 꼬리 사이의 직접적인 경쟁 보다는 태그로부터의 입체적 붕괴의 결과일 수 있다. 본원 발명자들은 VEGF165가 DRG로부터의 액손 성장의 Sema3-매개된 붕괴를 길항하는 능력에 대해 조사하였다. 100 mM의 농도에서도, VEGF165는 Sema3A가 액틴 프로세스의 축소를 유발하는 능력에 영향을 미치지 않았다 (도 1). 이러한 데이타는 Sema3이 b1 도메인에 대한 결합에 대해 VEGF와 경쟁하지 않으며, 세마포린의 꼬리가 상기 도메인 내의 상이한 부위와 접촉하고 있음을 입증한다.
뉴로필린 이량체화를 위한 모델
Nrp1 및 Nrp2는 리간드의 부재하에서도 동종-다량체 또는 이종-다량체를 형성할 수 있고 (문헌 [Takahashi, L. et al., Cell 99, 59-69 (1999)]; [Chen, H. et a!., Neuron 21, 1283-90 (1998)]; [Giger, R.J. et al., Neuron 21, 1079-92 (1998)]; [Takahashi et al., Nat Neurosci 1, 487-93 (1998)]), 뉴로필린 복합체의 정확한 화학량론이 아직 확립되지 않았으나, Nrp는 리간드 결합시 동종이량체를 형성하는 것으로 널리 추정되고 있다. 최근의 데이타는 c 도메인이 Nrp 올리고머화에 필수적이지만 충분하지는 않음을 보여주고 있는데, 이는 상기 도메인이 결여된 말단절단 돌연변이체가 전장 ECD에 대해 감소된 다량체화를 나타냈기 때문이다 (문헌 [Takahashi et al., Cell 99, 59-69 (1999)]; [Chen et al., 상기문헌]; [Giger et al., 상기문헌]; [Nakamura et al, Neuron 21, 1093-100 (1998)]). a1a2 도메인이 VEGF에 결합하지 않음에도 a1a2 및 b1b2 도메인을 포함하는 뉴로필린 구축물은 몇몇 VEGF 이소형에 대해 b1b2 도메인 만을 포함하는 구축물보다 높은 친화도를 갖는다 (문헌 [Mamluk, R. et al., J. Biol. Chem. 277, 24818-25 (2002)]; [Karpanen, T. et al., FASEB J20, 1462-72 (2006)]; [Giger, Rj. et al., Neuron 25, 29-41 (2000)]). 이에 따라, a1a2 도메인이 Nrp 이량체화에 직접 기여하여 2:2 복합체를 안정화시킴으로써 Nrp 및 VEGF 이량체 사이의 상호작용을 강화시킬 가능성이 있다. 흥미롭게도, 2가지 상이한 결정 형태로부터의 Nrp2-a1a2b1b2의 결정 구조 (표 1)는 a1에 의해 매개되는 보존된 결정학상 계면을 함유한다. 상기 이량체에서, a1 도메인은 β7 및 β8 가닥과 대략 반대로 평행한 배열 로 정렬된다. 계면에는 용매 접근가능한 표면 영역의 대략 1200 Å2가 함입되어 있고, 소수성 상호작용에 의해 좌우된다 (도 S5). 흥미롭게도, 다른 CUB 도메인 부류 구성원에서 유사한 이량체가 관찰되었다 (Romero et al., 상기문헌). 그러나, 다각도 광산란에 의한 3가지 Nrp2 구축물 (a2b1b2, a1a2b1b2 및 a1a2b1b2c)의 분자량 조사에서 상기 3가지 Nrp2 구축물은 모두 용액 중에서 단량체인 것으로 밝혀졌다 (데이타는 나타내지 않음). 이들 데이타는 Nrp의 동종-이량체화가 MAM 도메인의 부재하에서도 용액 중에서는 매우 약하며, 수용체 이량체화는 리간드 결합시에만 일어날 수 있음을 의미한다. 결정학상 Nrp2 이량체의 배향은 VEGF 결합에 대한 모델을 제안한다. a1 계면은 폭이 대략 70 Å인 안장-모양 이량체를 생성하며 (도 6), 이는 크기가 약 35×60 Å인 VEGF109-이량체를 수용하기에 충분히 크다. 중요하게는, 투프신 결합 부위 및 헤어핀 결합 패치가 안장의 내부 표면 상에서 발견되었다. 헤어핀은 VEGF와 Nrp의 헤어핀 결합 부위 사이의 상호작용을 안정화시킬 수 있으며, 또한 VEGF 꼬리와 b1의 "스파이크(spike)"의 연결을 용이하게 한다. 이러한 배열은 또한 하류 신호전달을 위한 VEGF 수용체-결합 도메인을 통해 VEGFR 결합을 수용할 수 있을 것이다. 이와 같이, a1 도메인은 VEGF에 직접 관여되지는 않으나 Nrp의 VEGF 결합을 향상시켜 Nrp 이량체화를 용이하게 할 수 있을 것이다. 이 이량체는 또한 Sema3 결합을 수용할 수 있다 (도 6). Sema3A 결정 구조에서 (문헌 [Antipenko, A. et al., Neuron 39, 589-98 (2003)]), 2개의 "세마" 도메인은 계면에서 서로 단단하게 패킹되어 있다. Nrp 결합시, Sema3A의 sema 도메인은 분리되 어 a1a2의 첫번째 결합 부위와 상호작용한다 (Antipenko, et al., 상기문헌). 본원에 제시된 a1-매개된 Nrp 이량체의 모델에서, 2개의 추정되는 Sema3A 결합 부위는 반대 측면에 위치하고, 2개의 결합된 Sema3 분자의 큰 β-프로펠러를 수용하기에 충분한 거리로 떨어져 있다 (도 6 및 S5).
본 발명의 구조 분석은 Nrp ECD의 VEGF (b1b2) 및 세마포린-결합 (a1a2) 부위 모두에 대한 첫번째 상세 사진을 제공한다. 항체 복합체 (도 3 내지 5)는 이전의 돌연변이유발 연구 ([Gu et al., 상기문헌]; [Vander Kooi et al., 상기문헌])에 따라 VEGF의 헤어핀 결합 도메인 및 세마포린의 Sema 도메인에 대한 Nrp 결합 부위를 묘사하였다. 이들 구조는 앞으로의 돌연변이유발 실험을 위한 기반을 제공하고, 리간드 및 신호전달 수용체 VEGF, VEGFR, 세마포린 및 플렉신과 복합체를 형성한 Nrp 구조를 명확하게 하는 전략을 제공한다. 또한, 본 발명에서 제공된 결정 구조 및 다른 정보는 VEGF 및/또는 세마포린 길항제 및 효능제의 고안을 가능하게 하며, 상기 길항제 또는 효능제를 확인하기 위한 스크리닝 분석에 사용될 수 있다.
앞서 본 발명을 특정 실시양태를 언급하며 예를 들어 설명하였으나, 본 발명이 이들로 한정되지는 않는다. 또한, 본원에서 나타내고 설명한 것 이외에 다양한 본 발명의 변형이 상기 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이며, 첨부된 특허청구범 내에 포함될 것이다.
본 명세서 전반에 걸쳐 인용된 모든 참고문헌 및 이들에서 인용된 참고문헌은 그 전체가 상기 거명을 통해 본원에 참고로 포함된다.
Figure 112009077730546-pct00002
Figure 112009077730546-pct00003
SEQUENCE LISTING <110> APPLETON, BRENT A. WIESMANN, CHRISTIAN WU, YAN <120> CRYSTAL STRUCTURES OF NEUROPILIN FRAGMENTS AND NEUROPILIN-ANTIBODY COMPLEXES <130> GNE-0241 US <140> 12/598,625 <141> 2010-02-25 <150> PCT/US07/69185 <151> 2007-05-17 <160> 39 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 568 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Cys Gly Gly Arg Leu Asn Ser Lys Asp Ala Gly Tyr Ile Thr Ser Pro 1 5 10 15 Gly Tyr Pro Gln Asp Tyr Pro Ser His Gln Asn Cys Glu Trp Ile Val 20 25 30 Tyr Ala Pro Glu Pro Asn Gln Lys Ile Val Leu Asn Phe Asn Pro His 35 40 45 Phe Glu Ile Glu Lys His Asp Cys Lys Tyr Asp Phe Ile Glu Ile Arg 50 55 60 Asp Gly Asp Ser Glu Ser Ala Asp Leu Leu Gly Lys His Cys Gly Asn 65 70 75 80 Ile Ala Pro Pro Thr Ile Ile Ser Ser Gly Ser Met Leu Tyr Ile Lys 85 90 95 Phe Thr Ser Asp Tyr Ala Arg Gln Gly Ala Gly Phe Ser Leu Arg Tyr 100 105 110 Glu Ile Phe Lys Thr Gly Ser Glu Asp Cys Ser Lys Asn Phe Thr Ser 115 120 125 Pro Asn Gly Thr Ile Glu Ser Pro Gly Phe Pro Glu Lys Tyr Pro His 130 135 140 Asn Leu Asp Cys Thr Phe Thr Ile Leu 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Asn Ser Trp Ser Ala Glu Arg Ser Arg Leu Asn Asn Pro Glu Asn Gly 275 280 285 Trp Thr Pro Leu Lys Asp Thr Asn Lys Glu Trp Ile Gln Val Asp Leu 290 295 300 Gly Phe Leu Arg Phe Val Ser Ala Ile Gly Thr Gln Gly Ala Ile Ser 305 310 315 320 Gln Glu Thr Lys Lys Lys Tyr Tyr Val Lys Glu Tyr Lys Val Asp Val 325 330 335 Ser Ser Asn Gly Glu Asp Trp Ile Thr Ile Lys Ser Gly Pro Lys Gln 340 345 350 Lys Leu Phe Gln Gly Asn Thr Asn Ala Thr Asp Val Val Lys Ala Lys 355 360 365 Phe Pro Lys Pro Thr Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile Arg Pro Ile Asn 370 375 380 Trp Glu Thr Gly Ile Ala Leu Arg Phe Glu Val Tyr Gly Cys Lys Ile 385 390 395 400 Ser Glu Tyr Pro Cys Ser Gly Met Leu Gly Met Val Ser Gly Leu Ile 405 410 415 Thr Asp Ser Gln Ile Thr Val Ser Ser His Ile Glu Arg Thr Trp Val 420 425 430 Ser Glu Asn Ala Arg Leu Leu Thr Ser Arg Ser Gly Trp Met Leu Leu 435 440 445 Pro Gln Ser Gln Pro Tyr Ala Asp Glu Trp Leu Gln Ile Asp Leu Ala 450 455 460 Glu Glu Lys Leu Val Lys Gly Leu Ile Ile Gln Gly Gly Lys His Arg 465 470 475 480 Asp Asn Lys Val Phe Met Lys Lys Phe Arg Leu Gly Tyr Ser Asn Asn 485 490 495 Gly Ser Asp Trp Lys Leu Val Met Asp Ala Thr Gly Asn Lys Pro Lys 500 505 510 Ile Phe Glu Gly Asn Leu Asn Tyr Asp Thr Pro Ala Leu Arg Thr Met 515 520 525 Glu Pro Val Leu Thr Arg Phe Val Arg Ile Tyr Pro Glu Arg Gly Thr 530 535 540 Pro Ala Gly Met Gly Leu Arg Leu Glu Leu Leu Gly Cys Glu Met Glu 545 550 555 560 <210> 27 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 28 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser 1 5 <210> 30 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser 1 5 <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Gln Gln Tyr Asn Ser Leu Pro Trp Thr 1 5 <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Thr Thr 1 5 <210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Gln Gln Ala Trp Ala Tyr Leu Thr Thr 1 5 <210> 34 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser 1 5 10 <210> 35 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Gly Phe Thr Ile Ser Gly Tyr Gly Ile His 1 5 10 <210> 36 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Val Ile Ser Gly Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 37 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Ala Tyr Ile Tyr Pro Asp Ser Gly Tyr Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val 1 5 10 15 Lys Gly <210> 38 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Gly Phe Asp Tyr 1 <210> 39 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Glu Asp Phe Arg Asn Arg Arg Arg Leu Trp Tyr Val Met Asp Tyr 1 5 10 15

Claims (66)

  1. (a) 서열 4 또는 5의 경쇄 가변 도메인 서열 및 서열 7의 중쇄 가변 도메인 서열을 포함하거나,
    (b) 서열 28의 CDRL1 서열, 서열 30의 CDRL2 서열, 및 서열 32 또는 33의 CDRL3 서열 및 서열 35의 CDRH1 서열, 서열 37의 CDRH2 서열, 및 서열 39의 CDRH3 서열을 포함하는
    항-panNrp(뉴로필린)A 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 서열 28의 CDRL1 서열, 서열 30의 CDRL2 서열, 및 서열 32의 CDRL3 서열 및 서열 35의 CDRH1 서열, 서열 37의 CDRH2 서열, 및 서열 39의 CDRH3 서열을 포함하는 항-panNrpA 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  3. 제1항에 있어서, 서열 28의 CDRL1 서열, 서열 30의 CDRL2 서열, 및 서열 33의 CDRL3 서열 및 서열 35의 CDRH1 서열, 서열 37의 CDRH2 서열, 및 서열 39의 CDRH3 서열을 포함하는 항-panNrpA 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  4. 제1항에 있어서, 서열 9에 나타낸 서열을 포함하는 YW68.11 항체인 항-panNrpA 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  5. 제1항에 있어서, 서열 10에 나타낸 서열을 포함하는 YW68.11.26 항체인 항-panNrpA 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 단편이 Fab, Fab', F(ab')2, scFv, (scFv)2, dAb, 선형 항체, 단일-쇄 항체 분자, 미니바디, 디아바디, 및 다중특이적 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 항-panNrpA 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 단편이 Fab 단편인 항-panNrpA 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
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  11. 제1항에 있어서, Nrp1 및 Nrp2 둘다에 결합하는 항-panNrpA 항체.
  12. 제11항에 있어서, Nrp1 및 Nrp2 둘다에 대해 0.10 nM 이상의 결합 친화도를 갖는 항-panNrpA 항체.
  13. 제11항에 있어서, Nrp1 및 Nrp2 둘다에 대해 0.15 nM 이상의 결합 친화도를 갖는 항-panNrpA 항체.
  14. 제11항에 있어서, Nrp1 및 Nrp2 둘다에 대해 0.20 nM 이상의 결합 친화도를 갖는 항-panNrpA 항체.
  15. 제11항에 있어서, Nrp1 및 Nrp2 둘다에 대해 0.25 nM 이상의 결합 친화도를 갖는 항-panNrpA 항체.
  16. 제11항에 있어서, Nrp1 및 Nrp2 둘다에 대해 0.30 nM 이상의 결합 친화도를 갖는 항-panNrpA 항체.
  17. 제11항에 있어서, Nrp1 및 Nrp2 둘다에 대한 Sema3 결합을 차단하는 항-panNrpA 항체.
  18. 제17항에 있어서, Nrp1 또는 Nrp2에 대한 VEGF 결합을 차단하지 않는 항-panNrpA 항체.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 시험관내에서 또는 생체내에서 세마포린의 생물학적 활성을 억제할 수 있는 항-panNrpA 항체.
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