BRPI0721707A2 - estruturas de cristal de fragmentos de neuropilina e complexos de neuropilina-anticorpo - Google Patents

Abstract

ESTRUTURAS DE CRISTAL DE FRAGMENTOS DE NEUROPILINA E COMPLEXOS DE NEUROPILINA-ANTICORPO. A presente invenção proporciona estruturas de cristal de fragmentos de neuropilina 1 (Nrpl) e neuropilina 2 (Nrp2) apenas e em complexo com anticorpos anti-neuropilina e um método para seu uso. A presente invenção ainda proporciona anticorpos anti-Nrp e métodos para suas aplicações terapêuticas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ESTRUTU- RAS DE CRISTAL DE FRAGMENTOS DE NEUROPILINA E COMPLEXOS DE NEUROPILINA-ANTICORPO".

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção proporciona estruturas de cristal de frag- mentos de neuropilina 1 (NrpI) e neuropilina 2 (Nrp2) sozinhos e em com- plexo com anticorpos anti-neuropilina e seus usos. A invenção ainda propor- ciona anticorpos que se ligam a Nrpl e/ou Nrp2 e métodos para seu uso. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

O desenvolvimento de um sistema vascular é um requisito fun- damental para muitos processos fisiológicos e patológicos. Tecidos em cres- cimento ativo, tais como embriões e tumores, requerem um suprimento san- güíneo adequado. Eles satisfazem essa necessidade através da produção de fatores pró-angiogênicos, os quais promovem a formação e manutenção de novos vasos sangüíneos via um processo geralmente referido como an- giogênese. A formação vascular é um evento biológico complexo, mas orde- nado, que envolve todas ou muitas das seguintes etapas: a) Células endote- Iiais (ECs) proliferam a partir de ECs existentes ou diferenciam a partir de células progenitoras; b) ECs migram e coalescem para formar estruturas semelhantes a cordões; c) cordões vasculares, então, sofrem tubulogênese para formar vasos com um lúmen central; d) os cordões ou vasos existentes enviam ramificações para formar vasos secundários; e) o plexo vascular primitivo sofre remodelamento e re-formatação adicionais; e f) células peri- endoteliais são recrutadas para encapsular os tubos endoteliais, proporcio- nando manutenção e funções modulatórias aos vasos; tais células incluindo perócitos para pequenos capilares, células do músculo liso para vasos maio- res e células miocárdicas no coração. Hanahan1 D. Science 277: 48-50 (1997); Hogan, B. L. & Kolodziej, P. A. Nature Reviews Genetics. 3: 513-23 (2002); Lubarsky, B. & Krasnow, M. A. Cell. 112: 19-28 (2003).

Agora, foi bem estabelecido que a angiogênese está envolvida na patogênese de uma variedade de distúrbios. Esses incluem tumores sóli- dos e metástases, aterosclerose, fibroplasia retrolental, hemangiomas, in- flamação crônica, doenças neovasculares intraoculares, tais como retinopa- tias proliferativas, por exemplo, retinopatia diabética, degeneração macular idade-relacionada (AMD), glaucoma neovascular, rejeição imune de tecido corneal transplantado e outros tecidos, artrite reumatoide e psoríase. Folk- man e outros, J. Biol. Chem., 267: 10931-10934 (1992); Klagsbrun e outros, Annu. Rev. Physiol. 53: 217-239 (1991); e Garner A., "Vascular Diseases", Em: Pathobiology of Ocular Disease. A Dynamic Approach, GarnerA., Klint- worth GK, eds., 2a Edição (Mareei Dekker, NY, 1994), páginas 1625-1710.

No caso de crescimento de tumor, a angiogênese parece ser crucial para a transição de hiperplasia para neoplasia e para proporcionar nutrição para crescimento e metástase do tumor. Folkman e outros, Nature 339: 58 (1989). A neovascularização permite que as células tumorais adqui- ram uma vantagem de crescimento e autonomia proliferativa comparado com células normais. Um tumor usualmente começa como uma única célula anormal a qual pode proliferar apenas para um tamanho de uns poucos mi- límetros cúbicos em virtude da distância dos leitos capilares disponíveis e pode permanecer "dormente" sem crescimento adicional e disseminação durante um longo período de tempo. Algumas células tumorais, então, tro- cam para o fenótipo angiogênico para ativar células endoteliais, as quais proliferam e amadurecem em novos vasos sangüíneos capilares. Esses va- sos sangüíneos recentemente formados não apenas permitem crescimento contínuo do tumor primário, mas também a disseminação e recolonização de células tumorais metastáticas. Consequentemente, foi observada uma corre- lação entre a densidade dos microvasos em seções tumorais e a sobrevi- vência do paciente em câncer de mama, bem como em vários outros tumo- res. Weidner e outros, N. EngL J. Med 324: 1-6 (1991); Horak e outros, Lan- cet 340: 1120-1124 (1992); Macchiarini e outros, Lancet 340: 145-146 (1992). Os mecanismos precisos que controlam a troca angiogênica não são bem entendidos, mas acredita-se que a neovascularização da massa tumo- ral resulta do equilíbrio líquido de uma multiplicidade de estimuladores e ini- bidores de angiogênese (Folkman, 1995, NatMed 1(1 ): 27-31).

O processo de desenvolvimento vascular é rigorosamente regu- lado. Até o momento, foi mostrado que um número significativo de molécu- las, principalmente fatores secretados produzidos pelas células adjacentes regulam a diferenciação, proliferação, migração e coalescência de ECs em estruturas semelhantes a cordão. Por exemplo, o fator de crescimento endo- telial vascular (VEGF) foi identificado como um fator chave envolvido em es- timulação de angiogênese e na indução de permeabilidade vascular Ferrara e outros, Endocr. Rev. 18: 4-25 (1997). A descoberta de que a perda de mesmo um único alelo de VEGF resulta em Ietalidade embriônica aponta para um papel especial desse fator no desenvolvimento e diferenciação do sistema vascular. Além disso, foi mostrado que o VEGF é um mediador cha- ve de neovascularização associada a tumores e distúrbios intraoculares Fer- rara e outros, Endocr. Rev. supra. O mRNA de VEGF é superexpresso pela maioria dos tumores humanos examinados. Berkman e outros, J. Clin. In- vest. 91: 153-159 (1993); Brown e outros, Human Pathol 26: 86-91 (1995); Brown e outros, Câncer Res. 53: 4727-4735 (1993); Mattern e outros, Brit. J. Câncer 73: 931-934 (1996); Dvorak e outros, Am. J. Pathol 146: 1029-1039 (1995).

Também, os níveis de concentração de VEGF em fluidos ocula- res estão altamente correlacionados com a presença de proliferação ativa de vasos sangüíneos em pacientes com retinopatia diabética e outras relacio- nadas à isquemia Aiello e outros, N. Engl. J. Med. 331: 1480-1487 (1994). Além disso, estudos demonstraram a localização de VEGF em membranas neovasculares coroidais em pacientes afetados com AMD Lopez e outros, Invest. Ophthalmol Vis. Sei. 37: 855-868 (1996). Anticorpos de neutralização anti-VEGF suprimem o crescimento

de uma variedade de linhagens de células tumorais humanas em camun- dongos nus (Kim e outros, Nature 362: 841-844 (1993); Warren e outros, J. Clln. Invest. 95: 1789-1797 (1995); Borgstrõm e outros, Câncer Res. 56: 4032-4039 (1996); Melnyk e outros, CancerRes. 56: 921-924 (1996)) e tam- bém inibem a angiogênese intraocular em modelos de distúrbios retinais is- quêmicos Adamis e outros, Arch Ophthalmol. 114: 66-71(1996). Portanto, anticorpos monoclonais anti-VEGF ou outros inibidores de ação de VEGF são candidatos promissores para o tratamento de tumores e vários distúrbios neovasculares intraoculares. Tais anticorpos são descritos, por exemplo, no EP 817.648 publicado em 14 de Janeiro de 1998; e no W098/45331 e W098/45332, ambos publicados em 15 de Outubro de 1998. Um dos anti- corpos anti-VEGF, bevacizumab, foi aprovado pelo FDA para uso em combi- nação com um regime de quimioterapia para tratar câncer cólon-retal (CRC) metastático e câncer de pulmão de células não-pequenas (NSCLC). O beva- cizumab está sendo investigado em muitos ensaios clínicos em andamento para o tratamento de várias indicações de câncer. Durante o desenvolvimento do sistema nervoso, neurônios envi-

am axônios semelhantes a cabo que migram sobre longas distâncias de forma a atingir seus alvos. Veja revisão por Carmeliet e Tessier-Lavigne (2005) Nature 436: 193-200. Na ponta condutora de um axônio em cresci- mento, está uma estrutura sensória altamente móvel denominada cone de crescimento, através de ciclos dinâmicos de extensão e retração de exten- sões filopodiais, o cone de crescimento capta e avalia continuamente uma miríade de indícios de orientação em seu ambiente espacial e seleciona pre- cisamente um trajeto correto para extensão em direção a seu alvo final.

Durante a última década, progresso considerável foi feito na compreensão dos mecanismos de orientação axonal. Veja revisão por Dick- son (2002) Science 298: 1959-64. Indícios de orientação se originam de qua- tro variedades: atraentes e repelentes; os quais podem atuar seja em uma curta faixa (isto é, célula- ou matriz-associada) ou em uma faixa mais longa (isto é, passível de difusão). Até o momento, quatro famílias principais de moléculas de orientação axonal foram identificadas: as netrinas, semafori- nas, efrinas e slits. Veja revisão por Huber e outros (2003) Annu Rev Neu- rosci 26: 509-63.

As semaforinas (Sema), também denominadas colapsinas, per- tencem a uma grande família de proteínas membrana-associadas e secreta- das filogeneticamente conservadas. Membros da família semaforina são ca- pazes de mediar eventos de orientação axonal repulsivos e atrativos durante desenvolvimento neural, Raper (2000) Curr Opin Neurobiol 10: 88-94. As mais de trinta semaforinas identificadas até o momento compartilham todas um domínio Sema N-terminal conservado de cerca de 500 aminoácidos. Membros da semaforina são classificados em oito subfamílias, dependendo de suas similaridades estruturais e espécies de origem. Para maiores deta- lhes sobre a nomenclatura unificada de semaforinas veja Semaphorin No- menclatura Committee (1999) Cell 97: 551-552.

A família das neurofilinas (NRP) é compreendida de duas proteí- nas homólogas, neuropilina-1 (NRP1) e neuropilina-2 (NRP2). A NRP1 foi primeiro identificada como uma glicoproteína transmembrana de 130 kDa do tipo 1 expressa em cones de crescimento axonais em crescimento. A NRP2 foi subseqüentemente identificada através de clonagem por expressão, Fuji- sawa e Kitsukawa (1998) Curr Opin Neurobiol 8: 587-592. Descobriu-se que NRPs são receptores para um subconjunto de semaforinas, as semaforinas da classe 3. Foi sugerido que as NRPs funcionam como co-receptores de não-sinalização junto com outra família de receptores de semaforina, plexi- nas.

Embora inicialmente descritas como um mediador de orientação axonal, também descobriu-se que as NRPs exercem papéis críticos em de- senvolvimento vascular, Carmeliet e Tessier-Lavigne (2005). Elas são identi- ficadas como um receptor de VEGF isoforma-específico expresso sobre células tumorais e endoteliais, promovendo esforços consideráveis para compreender o papel das NRPs em biologia vascular e tumoral, Soker e ou- tros (1998) Cell 92: 735-745; Klagsbrun e outros (2002) Adv Exp Med Biol 515: 33-48. Estudos genéticos forneceram forte evidência de que Nrpl é requerido para morfogênese vascular. Perda de função de Nrp 1 resulta em remodelamento vascular e defeitos de ramificação, um fenótipo que pode ser ainda intensificado pela perda de função de Nrp2, Kawasaki e outros (1999) Development 126: 4895-4902; Takashima e outros (2002) Proc Natl Acad Sci USA 99: 3657-3662. Esses resultados sugerem que, prematuramente no desenvolvimento, Nrpl e Nrp2 podem ter funções sobrepostas. Contudo, a expressão de cada Nrp é dividida posteriormente no desenvolvimento, com a Nrpi sendo expressa primariamente em artérias e a Nrp2 em veias e vasos linfáticos, Yuan e outros (2002) Development 129: 4797-4806; Herzog e ou- tros (2001) Mech Dev 109: 115-119. Notavelmente, a perda de função de Nrp2 apenas prejudica especificamente o desenvolvimento linfático.

Uma vez que a Nrpi é expressa em muitos outros tipos de célula durante o desenvolvimento, o papel da Nrpi vascular foi considerado através da geração de um knockout EC-específico, o qual resultou em defei- tos vasculares similares àqueles observados no alelo nulo, Gu e outros (2003) Dev Cell 5: 45-57. De modo interessante, esse estudo também mos- trou que a ligação de Sema3A a Nrpl não é requerida para desenvolvimento vascular. Em outro estudo, defeitos foram observados na orientação de células endoteliais no metencéfalo em desenvolvimento em embriões KO para Nrp?, Gerhardt e outros (2004) Dev Dyn 231: 503-509.

A despeito dos estudos extensivos sobre o papel de NRP1 em desenvolvimento vascular, não se sabe se a Nrpl exerce sua função vascu- lar exclusivamente através da via do Receptor 2 de VEGF-VEGF (VEGFR2), como um intensificador para ligação de VEGF ao VEGFR2 e, desse modo, para sinalização ao VEGFR2 ou através de uma via de sinalização indepen- dente de VEGFR2 ou uma combinação de ambos.

Anticorpos monoclonais podem ser fabricados usando a tecno- Iogia de DNA recombinante. Uso difundido tem sido feito de anticorpos mo- noclonais, particularmente aqueles derivados de roedores, contudo, anticor- pos não-humanos são freqüentemente antigênicos em seres humanos. A técnica tem tentado superar esse problema construindo anticorpos "quiméri- cos" nos quais um domínio de ligação a antígeno não-humano é acoplado a um domínio constante humano (Cabilly e outros, Patente U.S. No. 4.816.567). O isotipo do domínio constante humano pode ser selecionado para configurar o anticorpo quimérico para participação em citotoxicidade celular anticorpo-dependente (ADCC) e citotoxicidade complemento- dependente. Em um outro esforço para resolver as funções de ligação a an- tígeno de anticorpos e minimizar o uso de seqüências heterólogas em anti- corpos humanos, anticorpos humanizados foram gerados para vários antí- genos nos quais substancialmente menos do que um domínio variável hu- mano intacto foi substituído nas regiões pela seqüência correspondente de uma espécie não-humana. Por exemplo, resíduos de roedor foram substituí- dos pelos segmentos correspondentes de um anticorpo humano. Na prática, anticorpos humanizados são, tipicamente, anticorpos humanos nos quais alguns resíduos da região de determinação de complementaridade (CDR) e possivelmente alguns resíduos da região de estrutura "framework" (FR) são substituídos por resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedor, Jones e outros (1986) Nature 321: 522-525; Riechmann e outros (1988) Nature 332: 323-327; Verhoeyen e outros (1988) Science 239: 1534-1536.

Antes de administração de um anticorpo terapêutico a um ser humano, estudos pré-clínicos em mamíferos não-humanos são geralmente desejados para avaliar a eficácia e/ou toxicidade do anticorpo, idealmente, os anticorpos submetidos a esses estudos são capazes de reconhecer e reagir com alta potência com um antígeno-alvo endógeno ao animal hospe- deiro, tal como camundongo ou primata não-humano.

A tecnologia de phage display tem proporcionado uma ferramen- ta poderosa para a geração e seleção de novas proteínas que se ligam a um ligante, tal como um antígeno. Usando a técnica de phage display, grandes bibliotecas de variantes de proteína podem ser geradas e rapidamente sele- cionadas com relação àquelas seqüências que se ligam a um antígeno-alvo com alta afinidade. Ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos variantes são fundidos a uma seqüência de ácido nucleico que codifica uma proteína do envoltório viral, tal como a proteína do gene Ill ou a proteína do gene VIII. Sistemas de phage display monovalentes, onde a seqüência de ácido nucle- ico que codifica a proteína ou polipeptídeo é fundida a uma seqüência de ácido nucleico que codifica uma porção da proteína do gene Ill foram desen- volvidos (Bass, S. (1990) Proteins 8: 309; Lowman e Wells (1991) Methods: A Companion to Methods in Enzymology 3: 205). Em um sistema de phage display monovalente, a fusão gênica é expressa em baixos níveis e proteí- nas do gene Ill do tipo silvestre também são expressas, de modo que a in- fectividade das partículas é retida. Métodos de geração de bibliotecas peptí- dicas e seleção dessas bibliotecas foram divulgados em muitas patentes (e.g., Patente U.S. No. 5.723.286, Patente U.S. No. 5.432. 018, Patente U.S. No. 5.580.717, Patente U.S. No. 5.427.908 and Patente U.S. No. 5.498.530). (por exemplo, Patente U.S. No. 5.723.286, Patente U.S. No. 5.432.018, Pa- tente U.S. No. 5.580.717, Patente U.S. No. 5.427.908 e Patente U.S. No. 5.498.530).

A demonstração de expressão de peptídeos sobre a superfície de fagos filamentosos e a expressão de fragmentos funcionais de anticorpo no periplasma de E. coli foi importante no desenvolvimento de bibliotecas de phage display de anticorpo (Smith e outros (1985) Science 228: 1315; Skerra e Pluckthun (1988) Science 240: 1038). Bibliotecas de anticorpo ou polipeptídeos de ligação a antígeno foram preparadas através de uma série de formas, incluindo alterando um único gene através de inserção de se- qüências de DNA aleatórias ou através de clonagem de uma família de ge- nes relacionados. Métodos para visualização de anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno usando phage display foram descritos nas Patentes U.S. Nos. 5.750.373, 5.733.743, 5.837.242, 5.969.108, 6.172.197, 5.580.717 e 5.658.727. A biblioteca é, então, selecionada com relação à expressão de anticorpos ou proteínas de ligação a antígeno com características deseja- das.

A tecnologia de phage display tem diversas vantagens com rela- ção aos métodos convencionais recombinantes e de hibridoma para preparo de anticorpos com as características desejadas. Essa tecnologia permite o desenvolvimento de grandes bibliotecas de anticorpos com diversas se- qüências em menos tempo e sem o uso de animais. Preparo de hibridomas ou preparo de anticorpos humanizados pode requerer facilmente vários me- ses de preparo. Além disso, uma vez que nenhuma imunização é requerida, bibliotecas de anticorpo de fago podem ser geradas para antígenos os quais são tóxicos ou têm baixa antigenicidade (Hogenboom (1988) Immunotechni- ques 4: 1-20). Bibliotecas de anticorpo de fago podem também ser usadas para gerar e identificar novos anticorpos terapêuticos.

Bibliotecas de phage display têm sido usadas para gerar anti- corpos humanos a partir de seqüências de linhagem germinativa ou repertó- rios de Ig de células B "naive" de seres humanos não imunizados ou imuni- zados (Barbas & Burton (1996) Trends Biotech 14: 230; Griffiths e outros (1994) EMBO J. 13: 3245; Vaughan e outros (1996) Nat. Biotech. 14: 309; Winter EP 0368 684 B1). Bibliotecas de ligação a antígeno "naive" ou não imunes têm sido geradas usando uma variedade de tecidos linfoides. Algu- mas dessas bibliotecas estão comercialmente disponíveis, tais como aque- las desenvolvidas pela Cambridge Antibody Technology and Morphosys (Vaughan e outros (1996) Nature Blotech 14: 309; Knappik e outros (1999) J. Mol. Biol. 296: 57). Contudo, muitas dessas bibliotecas têm diversidade Iimi- tada.

A capacidade de identificar e isolar anticorpos de alta afinidade a partir de uma biblioteca de phage display é importante no isolamento de no- vos anticorpos para uso terapêutico, isolamento de anticorpos de alta afini- dade a partir de uma biblioteca é dependente do tamanho da biblioteca, da eficiência de produção em células bacterianas e da diversidade da bibliote- ca. Veja, por exemplo, Knappik e outros (1999) J. Mol. Biol. 296: 57. O ta- manho da biblioteca é diminuído pela ineficácia de produção em virtude de duplicação inapropriada do anticorpo ou proteína de ligação a antígeno e da presença de códons terminais. A expressão em células bacterianas pode ser inibida se o anticorpo ou domínio de ligação a antígeno não for apropriada- mente duplicado. A expressão pode ser aprimorada através de mutação de resíduos em torno da superfície da interface variável/constante ou em resí- duos de CDR selecionados (Deng e outros (1994) J. Biol. Chem. 269: 9533, Ulrich e outros (1995) PNAS1 92: 11907-11911; Forsberg e outros (1997) J. Biol. Chem. 272: 12430). A seqüência da região de estrutura "framework" é um fator para proporcionar duplicação adequada quando bibliotecas de fago de anticorpo são produzidas em células bacterianas.

A geração de uma biblioteca diversa de anticorpos ou proteínas de ligação a antígeno também é importante para isolamento de anticorpos de alta afinidade. Bibliotecas com diversificação em CDRs limitadas têm sido geradas usando uma variedade de abordagens. Veja, por exemplo, Tomlin- son (2000) Nature Biotech. 18: 989-994. Regiões CDR3 são de interesse, em parte porque descobriu-se que elas freqüentemente participam na liga- ção a antígeno. regiões CDR3 sobre a cadeia pesada variam grandemente de tamanho, seqüência e conformação estrutural.

Outros também geraram diversidade através de distribuição ale- atória de regiões CDR das cadeias variáveis pesada e leve usando todos os aminoácidos em cada posição. Acredita-se que uso de todos os 20 ami- noácidos resultará em uma grande diversidade de seqüências de anticorpos variáveis e aumentará a chance de identificação de novos anticorpos (Bar- bas (1994) PNAS 91: 3809; Yelton1 DE (1995)7. Immunology 155: 1994; Jackson, J.R. (1995) J. Immunology 154: 3310 e Hawkins1 RE (1992) J. MoL Biology 226: 889). SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção proporciona estruturas de cristal de frag- mentos de neuropilina-1 e neuropilina-2 (Nrp1 e Nrp2) isoladamente e em complexo com anticorpos que bloqueiam seletivamente a ligação à semafo- rina - ou VEGF. Nrps adotam uma disposição de domínio inesperada na qual os domínios a2, b1 e b2 formam um núcleo hermeticamente acondicionado. As localizações dos epitopos de anticorpo, junto com experimentos in vitro, mostram que o VEGF e semaforinas não competem diretamente pela liga- ção a Nrp. Baseado em um dímero de Nrp cristalográfico mediado pelo do- mínio A1, a presente invenção proporciona, adicionalmente, modelos para dimerização de receptor e ligação a ligante.

Baseado nesses resultados, em um aspecto, a presente inven- ção proporciona um cristal formado por um fragmento Nrp1bib2 que sofre di- fração, através de radiação por raios X, para produzir um padrão de difração que representa a estrutura tridimensional do referido fragmento, tendo apro- ximadamente as seguintes constantes celulares: a = 65,9 A, b = 66,7 A, c = 74,7 A e um grupo espacial de P2i2-|2-|.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a um cristal formado por um fragmento Nrp132bib2 que sofre difração, através de radiação por raios X, para produzir um padrão de difração que representa a estrutura tridimensio- nal do referido fragmento, tendo aproximadamente as seguintes constantes celulares: a = 53,2 A, b = 68,2 Â, c = 66,6 A e um grupo espacial de P2-i.

Em ainda outro aspecto, a invenção refere-se a um cristal de um complexo formado entre um fragmento Nrp1bi e um fragmento Fab de um anticorpo anti-NrpB (YW107.4.87) que inibe a ligação de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) a Nrp1, em que o referido cristal sofre difração, através de radiação por raios X, para produzir um padrão de difração que representa a estrutura tridimensional do referido complexo, tendo aproxima- damente as seguintes constantes celulares: a = 213 A, b = 213 A, c = 45,3 A e um grupo espacial de H3.

Em um outro aspecto, a invenção refere-se a um cristal formado por um fragmento Nrp2b-ib2 que sofre difração, através de radiação por raios X, para produzir um padrão de difração que representa a estrutura tridimen- sional do referido fragmento, tendo aproximadamente as seguintes constan- tes celulares a = 36,5 A, b = 70,5 A, c = 122 A e um grupo espacial de P2-|2-|2i.

Em ainda um outro aspecto, a invenção refere-se a um cristal formado por um fragmento Nrp2a2bib2 que sofre difração, através de radiação por raios X, para produzir um padrão de difração que representa a estrutura tridimensional do referido fragmento, tendo aproximadamente as seguintes constantes celulares: a = 50,1 A, b = 193 A, c = 66,2 A e um grupo espacial de P21.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a um cristal de um com- plexo formado entre um fragmento Nrp2aia2bib2 e um fragmento Fab de um anticorpo anti-panNrpA que inibe a ligação de semaforina a Nrp2, em que o referido cristal sofre difração, através de radiação por raios X1 para produzir um padrão de difração que representa a estrutura tridimensional do referido complexo, tendo aproximadamente as seguintes constantes celulares: a = 148 A, b = 106 A, c = 92,4 A e um grupo espacial de C2.

A invenção ainda refere-se a um cristal de um complexo formado entre um fragmento Nrp1a-ia2bib2 e um fragmento Fab de um anticorpo anti- panNrpA que inibe a ligação de semaforina a Nrp2, em que o referido cristal sofre difração, através de radiação por raios X, para produzir um padrão de difração que representa a estrutura tridimensional do referido complexo, ten- do aproximadamente as seguintes constantes celulares: a = 121 Â, b = 121 A, c = 203 Aeum grupo espacial de P3221.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a um anticorpo anti- panNrpA compreendendo uma seqüência de domínio variável de cadeia leve mostrada na Figura 7 e/ou uma seqüência de domínio variável de cadeia pesada mostrada na Figura 8 ou um fragmento das mesmas.

Em ainda outro aspecto, a invenção refere-se a um fragmento Fab de anticorpo anti-panNrpA YW68.11 compreendendo a seqüência mos- trada na Figura 9A.

Em um outro aspecto, a invenção refere-se a um fragmento Fab de anticorpo anti-panNrpA YW68.11.26 compreendendo a seqüência mos- trada na Figura 9B.

Em ainda um outro aspecto, a invenção refere-se a um anticorpo anti-Nrp que compete pela ligação a Nrp com o anticorpo anti-panNrpA.

Em uma modalidade, o anticorpo anti-Nrp se liga essencialmente ao mesmo epitopo que o anticorpo anti-panNrpA.

Em outra modalidade, o anticorpo anti-Nrp se liga a um epitopo compreendendo pelo menos parte de uma interface definida pelos resíduos de aminoácido Y39, Y45, P46, Q47, F72, N73 P74, H75, F76, A133 e R138 da seqüência de aminoácido de Nrp1aia2bib2-

Em ainda outra modalidade, o anticorpo anti-Nrp se liga a Nrpl e

Nrp2.

Em outras modalidades, o anticorpo anti-Nrp tem uma afinidade de ligação de pelo menos cerca de 0,10 nM pela Nrpl e Nrp2 ou pelo menos cerca de 0,15 nM pela Nrpl e Nrp2 ou pelo menos cerca de 0,20 nM pela Nrpl e Nrp2 ou pelo menos cerca de 0,25 nM pela Nrpl e Nrp2 ou pelo me- nos cerca de 0,30 nM pela Nrpl e Nrp2.

Em outra modalidade, o anticorpo anti-Nrp bloqueia a ligação de Sema3 a Nrpl e Nrp2.

Em ainda outra modalidade, o anticorpo anti-Nrp não bloqueia a ligação de VEGF a Nrpl ou Nrp2. Em uma modalidade diferente, o anticorpo anti-Nrp inibe a ativi- dade biológica de semaforina in vitro.

Em uma modalidade adicional, o anticorpo anti-Nrp inibe a ativi- dade biológica de semaforina in vivo.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método de preparo de um antagonista de semaforina compreendendo criação de uma molécula de ligação a um sítio compreendendo pelo menos parte de uma interface definida pelos resíduos de aminoácido Y39, Y45, P46, Q47, F72, N73 P74, H75, F76, A133 e R138 da seqüência de aminoácido de Nrp1a-ia2t>ib2> síntese do composto e confirmação se o composto bloqueia a ligação de semaforina a Nrpl e Nrp2.

Em uma modalidade, o antagonista não interfere com a ligação de VEGF a Nrpl ou Nrp2 e o método pode compreender uma etapa adicio- nal de confirmação se o referido antagonista não interfere com a ligação de VEGF a Nrpl ou Nrp2.

Em outra modalidade, o método ainda compreende a etapa de confirmação se o antagonista não interferir com a atividade biológica de VEGF.

O antagonista pode, por exemplo, ser selecionado do grupo consistindo em anticorpos, fragmentos de anticorpo, polipeptídeos de liga- ção, peptídeos e pequenas moléculas não-peptídicas e, de preferência, é um anticorpo ou um fragmento de anticorpo, onde os fragmentos de anticorpo incluem, sem limitação, Fab, Fab', F(ab')2, scFv, (ScFv)2, dAb, anticorpos lineares, moléculas de anticorpo com uma única cadeia, minicorpos, diacor- pos e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anti- corpo.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método de preparo de um antagonista de VEGF compreendendo uso de uma estrutura tridimen- sional derivada de um cristal de um complexo formado entre um fragmento de Nrp1bi e um fragmento Fab de um anticorpo anti-Nrp1B (YW107.4.87), em que o cristal sofre difração, através de radiação por raios X, para produzir um padrão de difração que representa a estrutura tridimensional do referido complexo, tendo aproximadamente as seguintes constantes celulares: a = 213 A, b = 213 A, c = 45,3 A e um grupo espacial de H3, para criar uma mo- lécula que se liga a um sítio compreendendo pelo menos parte do epitopo ligado pelo referido anticorpo anti-Nrp1B, síntese do composto e confirmação se o composto inibe a ligação de VEGF a Nrpl.

Em uma modalidade, o antagonista não interfere com a ligação de semaforina a Nrpl e o método pode, adicionalmente, incluir a etapa de confirmação disso.

Em outra modalidade, o antagonista inibe a atividade biológica

do VEGF.

Em ainda outra modalidade, o método ainda compreende a eta- pa de confirmação se o antagonista inibe uma atividade biológica do VEGF.

Em uma outra modalidade, o antagonista inibe o remodelamento

vascular.

Em ainda uma outra modalidade, o antagonista é selecionado do grupo consistindo em anticorpos, fragmentos de anticorpo, polipeptídeos de ligação, peptídeos e pequenas moléculas não-peptídicas e, de preferência, é um anticorpo ou um fragmento de anticorpo, onde os fragmentos de anticor- po incluem, sem limitação, Fab, Fab', F(ab')2, scFv, (ScFv)2, dAb, anticorpos lineares, moléculas de anticorpo com uma única cadeia, minicorpos, diacor- pos e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anti- corpo.

A invenção ainda refere-se a um método para o tratamento de câncer compreendendo administração, a um mamífero que precisa, de uma quantidade eficaz de um antagonista de VEGF preparado através do método precedente da presente invenção. O câncer pode ser, por exemplo, selecio- nado do grupo consistindo em câncer de mama, câncer cólon-retal, câncer de pulmão de células não-pequenas, Iinfoma não-Hodgkin (NHL), câncer renal, câncer de próstata, câncer de fígado, câncer de cabeça e pescoço, melanoma, câncer ovariano, mesotelioma e mieloma múltiplo.

Em uma modalidade, o tratamento ainda compreende um se- gundo agente terapêutico, onde o segundo agente terapêutico pode ser, sem limitação, um agente selecionado do grupo consistindo em um agente anti- angiogênico, uma composição antineoplásica, um agente quimioterapêutico e um agente citotóxico, tal como um outro antagonista de VEGF.

Em uma outra modalidade, o outro antagonista de VEGF é um anticorpo anti-hVEGF ou um fragmento do mesmo.

O anticorpo anti-hVEGF pode, por exemplo, ser capaz de liga- ção ao mesmo epitopo de VEGF que o anticorpo A4.6.1 e, especialmente, bevacizumab ou ranibizumab.

Em outras modalidades, o segundo agente terapêutico é um ini- bidor de quinase de tirosina de receptor selecionado do grupo consistindo em vatalanib (PTK787), erlotinib (TARCEVA®), OSI-7904, ZD6474 (ZACTI- MA®), ZD6126 (ANG453), ZD1839, sunitinib (SUTENT®), semaxanib (SU5416), AMG706, AG013736, Imatinib (GLEEVEC®), MLN-518, CEP-701, PKC- 412, Lapatinib (GSK572016), VELCADE®, AZD2171, sorafenib (NE- XAVAR®), XL880 e CHIR-265. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Tabela 1 - Coleta de Dados e Refino Estatístico Figura 1 - VEGF Não Bloqueia o Colapso de Cone de Cresci- mento Induzido Por Sema3A de Neurônios de DRG. A) Imagens de cones de crescimento axonal. DRG's não tratados têm grandes cones de cresci- mento ricos em actina (triângulo) que são significativamente reduzidos quando da adição de Sema3A. Anticorpos anti-Nrp foram adicionados a 50 μg/ml. B) Quantificação de colapso de cone de crescimento induzido por Sema3A. O percentual de cones de crescimento em colapso foi calculado através de contagem de cones de crescimento em colapso e não em colap- so (N = 4 explantes por condição). As barras de erro representam o erro pa- drão da média.

Figura 2 - Sumário das Estruturas de Cristal de Neuropilina. A) O ectodomínio de Nrp é compreendido, um depois do outro, de CUB (a1a2), fator de coagulação V/VIII (b1b2) e um domínio MAM (c1). Representação gráfica das sete estruturas de cristal apresentadas nesse relato com os limi- tes de resolução listados abaixo. Esferas laranjas indicam um íon de cálcio ligado no domínio a2. B) Alinhamento de seqüência dos domínios a1a2b1b2 de Nrpl e Nrp2 humanas. Elementos de estrutura secundária refere-sem à estrutura Nrp2-a1a2b1b2 (azul, a1; verde, a2; amarelo, b1; vermelho, b2) e são denominados de acordo com as convenções adotadas para o domínio CUB de espermadesina (Romero, A. e outros, Nat Struct Biol 4, 783-8 (1997)) e o domínio C2 de fator de coagulação V (Macedo-Ribeiro, S. e ou- tros, Nature 402, 434-9 (1999)). Os resíduos entre o retângulo em azul e amarelo delineiam os epitopos de anticorpo para anti-NrpAe anti-Nrp1B, res- pectivamente. Aminoácidos realçados em laranja indicam o sítio de ligação de Ca2+ em a2, enquanto que resíduos em vermelho representam um sítio de ligação de Ca2+ putativo no domínio a1. Resíduos sombreados em verde destacam as posições de substituições de aminoácido que rompem intera- ções entre Sema3A e Nrpl (Gu, C. e outros, J Biol Chem 277, 18069-76 (2002)). Esse alinhamento foi produzido com EsPript (Gouet, P. e outros, Nucleic Aeids Res 31, 3320-3 (2003)).

Figura 3 - Arquitetura de Domínio Global de Neurofilinas. A) Or- ganização de domínio de Nrp2 (azul, a1; verde, a2; amarelo, b1; vermelho, b2) em complexo com o fragmento Fab de anti-panNrpA (laranja claro, ca- deia pesada; cinza, cadeia leve). Resíduos N-glicosilados são indicados em magenta. B) Representação de fita das estruturas a2b1b2 de Nrpl e Nrp2; as esferas laranja destacam um íon de cálcio ligado. C) Superposição do complexo Nrp2/Fab a partir de duas formas de cristal diferentes baseado nos domínios a2b1b2. Note a pobre superposição dos domínios 1 em compara- ção com a região a2b1b2. Todas as figuras de estrutura foram produzidas com o PyMoI (http://www.pvmol.org)·

Figura 4 - Detalhes Moleculares dos Domínios CUB de Neuropi- lina. A) Nas estruturas a2b1b2, o domínio a2 inclui um íon de cálcio ligado (laranja). Os domínios a1 (veja painel C) e a2 de Nrp carecem da fita b1 en- contrada em espermadesina (Romero e outros, supra). Β) O íon de cálcio do domínio a2 de Nrpl é coordenado por três aminoácidos negativamente car- regados, dois oxigênios de carbonila da cadeia principal e uma molécula de água. Essas interações são altamente conservadas entre Nrps (veja Fig. S2- S3). C) (Painel esquerdo) Aminoácidos são coloridos de acordo com o per- centual de superfície acessível a solvente que está incrustado na interface Nrp2/Fab (vermelho, 75-100%; laranja, 50-74%; amarelo, 25-49%). Anti- panNrpA reage cruzadamente com Nrpl e Nrp2 e onze dos catorze resíduos no epitopo estrutural são idênticos (texto em preto, idêntico; texto em branco, não conservados; o asterisco indica resíduos nos quais a cadeia lateral a- ponta para o núcleo de proteína a1). Resíduos esboçados em verde repre- sentam as posições de substituição de aminoácido que são necessárias pa- ra interações entre Nrpl e Sema3A23. (Painel direito) Os átomos de Ca des- sas substituições de aminoácido são indicados como esferas verdes. Áto- mos de Ca sombreados em púrpura representam um sítio de ligação de cál- cio putativo. D) A interface anti-panNrpA/Nrp2. Nrps é mostrada como uma superfície molecular, de acordo com o potencial eletrostático (vermelho, áci- do; azul, básico). Os resíduos de contato de anticorpo são dominados por resíduos aromáticos de CDRs H2, H3 e L3.

Figura 5 - Características dos Domínios de Ligação a VEGF e Heparina da Nrp. A) Superposição das estruturas de cristal b1b2 de Nrp (N- rp1, amarelo (b1) e vermelho (b2); Nrp2, cinza). Resíduos em azul (NrpI) e verde (Nrp2) destacam diferenças conformacionais nos "estacas" de b2, mas não b1. Β) A superfície molecular das estruturas de cristal b1 b2 de rato (no. de acesso PDB 20RZ) (Vancer Kooi, C.W. e outros, Proc Natl Acad Sci USA (2007)) e humana são coloridas pelo potencial eletrostático. Setas em ama- relo indicam uma ranhura ácida que é formada pelos "estacas" no domínio b1 e que representam o sítio de ligação de Tuftsina na estrutura de rato (Vander Kooi e outros, supra). Setas verdes indicam a localização aproxima- da do adesivo de ligação de heparina. C) A conservação relativa de seqüên- cia (verde, 100%; amarelo, >75%) dos domínios b1b2 entre doze Nrps (Fig. S3) foi mapeada sobre a superfície da estrutura b1b2 de Nrpl humana. Dois patches altamente conservados são delineados em laranja. Os resíduos es- boçados em ciano indicam aqueles resíduos que contatam o Fab no com- plexo anti-Nrp1B-Fab/b1. O domínio a2 (trigo) é mostrado usando uma su- perposição das estruturas b1b2 e a2b1b2 de Nrp1. D) Representação de fita do complexo anti-Nrp1B-Fab/b1 (amarelo, b1; laranja, cadeia pesada; cinza, cadeia leve). Ε) A interface anti-Nrp1B/b1. O domínio b1 é representado co- mo uma superfície molecular de acordo com o potencial eletrostático; a seta em amarelo indica a ranhura de ligação à cauda de VEGF. Apenas CDRs H3 e L1 contatam b1.

Figura 6 - Dímero Cristalográfico de Nrp2 Sugere Modelos para Ligação ao VEGF e Semaforina. A) Nrp2 forma um dímero em formato de sela em ambas as formas de cristal do complexo Nrp2/Fab. Essa figura des- taca os domínios a1a2b1b2 de Nrp2 da forma monoclínica do complexo Fab. Os sítios de ligação à cauda de VEGF, heparina e semaforina putativos são indicados. B) Modelos potenciais de complexos de VEGF/Nrp e semafori- na/Nrp baseado no dímero a1-mediado de Nrp nas estruturas de cristal.

Figura 7 - Alinhamento de Seqüência de Domínio Variável de Cadeia Leve de Clones anti-panNrpA YW68.11 e YW68.11.26.

Figura 8 - Alinhamento de Seqüência de Domínio Variável de Cadeia Pesada de Clones anti-panNrpA YW68.11 e YW68.11.26.

Figura 9A - Seqüência Completa do Anticorpo de IgGI anti- panNrpA YW68.11.

Figura 9B - Seqüência Completa Anticorpo de IgGI anti-panNrpA YW68.11.26.

Tabela S1 - Condições Usadas para Cristalização e Crioprote-

ção.

Figura S1 - Análise da Cinética de Ligação de Anticorpo Anti- Nrp. Análise de cinética BIAcore de anticorpo anti-panNrpA. Os sensogramas para injeção de cada proteína Nrp humana a 500 nM a 25°C sobre uma las- ca sensora BIAcore imobilizada com IgG demonstram a especificidade de ligação. O anti-panNrpA se liga ao domínio a1a2b1b2 de Nrpl e Nrp2, mas não ao b1b2 de Nrp2.

Figura S2 - Domínios CUB de Nrp Incluem um Sítio de Ligação de Cálcio Conservado. A) Densidade de elétrons em torno do íon de cálcio na estrutura a2b1b2 de Nrpl (mapa 2F0-FC final contornado a 1,5q. Β) O íon de cálcio do domínio a2 de Nrp2. C) Três aminoácidos negativamente carre- gados (sombreados em laranja), os quais delineiam o sítio de ligação de cál- cio, são conservados nos domínios CUB de Nrpl e Nrp2.

Figura S3 - Alinhamento de Seqüência das Neurofilinas. Alinha- mento de seqüência de comprimento total dos domínios a1a2b1b2 de Nrpl e Nrp2 humana, de camundongo, rato, zebrafish (BRARE), rã (XENLA) e gali- nha. Essa figura é colorida usando o mesmo esquema conforme a Fig. 2B e foi produzida com o EsPript (Gouet P. e outros, supra).

Figura S4 - Comparação Entre as Estruturas Nrp1/Tuftsina e b1/Fab. A) No complexo Nrp1-b1/anti-Nrp1B-Fab, a cauda C-terminal (púrpu- ra) da cadeia pesada de uma molécula com simetria relacionada ocupa o sítio de ligação de Tuftsina (Nrp2, superfície molecular através do potencial eletrostático; laranja, cadeia pesada de anticorpo; cinza, cadeia leve de anti- corpo). B) Localização de Tuftsina (verde) em complexo com b1b2 de Nrpl de rato (no. de acesso PDB 20RZ)(Vander Kooi e outros, supra). C) Super- posição das duas estruturas destacadas no painel A. O anticorpo e peptídeo Tuftsina são coloridos conforme nos painéis anteriores com b1 de Nrpl hu- mana colorido em amarelo e b1b2 de Nrpl de rato colorido em ciano.

Figura S5 - A Interface do Dímero de Nrp2. A) Representação de fita do dímero Nrp2-a1a2b1b2/Fab conforme observado na forma monoclíni- ca da estrutura. B) Superposição da estrutura Nrp1-b1/anti-Nrp1B-Fab sobre a estrutura de cristal de Nrp2/Fab. C) Aminoácidos incrustados na interface a1/a1 são coloridos de acordo com o percentual de superfície acessível a solvente que é incrustado quando de dimerização (vermelho, 75-100%; la- ranja, 50-74%; amarelo, 25-49%). DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a novas estruturas de cristal, composições, métodos para modulação de atividades biológicas mediadas por NRP e ensaios de seleção para identificar candidatos capazes de modu- lação de atividades biológicas mediadas por NRP. Definições

"Neuropilina" ou NRP refere-se coletivamente à neuropilina-1 (NRP1), neuropilina-2 (NRP2) e suas isoformas e variantes, conforme des- crito em Rossignol e outros (2000) Genomics 70: 211-222. Neurofilinas são receptores de quinase de não-tirosina de 120 a 130 kDa. Existem múltiplas variantes com splicing e isoformas solúveis de NRP-1 e NRP-2. A estrutura básica das neurofilinas compreende cinco domínios: três domínios extracelu- Iares (a1a2, b1b2 e c), um domínio transmembrana e um domínio citoplás- mico. O domínio a1a2 é homólogo aos componentes de complemento C1r e C1s (CUB)1 os quais geralmente contêm quatro resíduos de cisteína que formam duas ligações em ponte de dissulfeto. O domínio b1b2 é homólogo aos fatores de coagulação V e VIII. A porção central do domínio c é desig- nada como MAM em virtude de sua homologia à meprina, A5 e proteínas μ de fosfatase de tirosina de receptor. Os domínios a1a2 e b1b2 são respon- sáveis pela ligação de Iigante1 enquanto que o domínio c é crítico para ho- modimerização ou heterodimerização. Gu e outros (2002) J. Biol. Chem, 277: 18069-76; He e Tessier-Lavigne (1997) Cell 90: 739-51.

"Atividade biológica mediada por neuropilina" refere-se, em ge- ral, a eventos fisiológicos ou patológicos nos quais neuropilina-1 e/ou neuro- pilina-2 exerce um papel substancial. Exemplos não Iimitativos de tais ativi- dades são orientação de axônio durante desenvolvimento do sistema nervo- so embriônico ou regeneração neuronal, angiogênese (incluindo modela- mento vascular), tumorigênese e metástase de tumor;

O termo "anticorpo" é usado no sentido mais amplo e abrange especificamente anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais de comprimento total), anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos bi-específicos) e fragmentos de anticorpo, na me- dida em que eles exibam a atividade biológica desejada.

O termo "anticorpo monoclonal", conforme usado aqui, refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancial- mente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos, exceto quanto a possíveis mutações que ocorrem naturalmente que podem estar presentes em quantidades mínimas. Anticor- pos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único sítio antigênico. Além disso, em contraste a preparados de anticorpo con- vencionais (policlonais) os quais, tipicamente, incluem diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes (epitopos), cada anticorpo mono- clonal é dirigido contra um único determinante sobre o antígeno. O modifica- dor "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpo e não deve ser cons- truído como requerendo a produção do anticorpo através de qualquer méto- do em particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados de acordo com a presente invenção podem ser feitos através do método de hibridoma primeiro descrito por Kohler e outros (1975) Nature 256: 495 ou podem ser feitos através de métodos de DNA recombinante (veja, por e- xemplo, Patente U.S. No. 4.816.567). Os "anticorpos monoclonais" podem também ser isolados de bibliotecas de anticorpo de fago usando as técnicas descritas em Clackson e outros (1991) Nature 352: 624-628 e Marks e ou- tros (1991) J. Mol. BioL 222: 581-597, por exemplo.

Os anticorpos monoclonais aqui incluem especificamente anti- corpos "quiméricos" (imunoglobulinas) nos quais uma porção da cadeia pe- sada e/ou leve é idêntica à ou homóloga a seqüências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie em particular ou pertencendo a uma classe ou subclasse de anticorpo em particular, enquanto que o restante da(s) cadeia(s) é idêntico à ou homólogo à seqüências correspondentes em anticorpos derivados de outra espécie ou pertencendo à outra classe ou subclasse de anticorpo, bem como fragmentos de tais anticorpos, na medida em que eles exibam a atividade biológica desejada (Patente U.S. No. 4.816.567; e Morrison e outros (1984) Proc. Nati Acad. Sei. USA 81: 6851- 6855).

Formas "humanizadas" de anticorpos não-humanos (por exem- plo, de murino) são anticorpos quiméricos os quais contêm a seqüência mí- nima derivada de uma imunoglobulina não-humana. Em sua maioria, anti- corpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo recipiente) nas quais resíduos de uma região hipervariável do recipiente são substituí- dos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não-humana (anticorpo doador), tal como camundongo, rato, coelho ou primata não- humano tendo a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em al- guns casos, resíduos da região de estrutura "framework" Fv (FR) da imuno- globulina humana são substituídos pelos resíduos não-humanos correspon- dentes. Além disso, anticorpos humanizados podem compreender resíduos os quais não são encontrados no anticorpo recipiente ou no anticorpo doa- dor. Essas modificações são feitas para refinar adicionalmente o desempe- nho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substan- cialmente todos ou pelo menos um e, tipicamente, dois domínios variáveis, nos quais todos ou substancialmente todos os Ioops hipervariáveis corres- pondem àqueles de uma imunoglobulina não-humana e todas ou substanci- almente todas as regiões FR são aquelas de uma seqüência de imunoglobu- lina humana. O anticorpo humanizado também compreenderá, opcionalmen- te, pelo menos uma porção de uma região constante (Fc) de imunoglobulina, tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Para outros detalhes veja Jones e outros (1986) Nature 321: 522-525; Riechmann e outros (1988) Nature 332: 323-329; e Presta (1992) Curr. Op. Struct. Bioi 2: 593-596.

Um "anticorpo espécie-dependente" é um o qual tem uma afini- dade de ligação mais forte por um antígeno de uma primeira espécie de mamífero do que por um homólogo desse antígeno de uma segunda espécie de mamífero. Normalmente, o anticorpo espécie-dependente "se liga especi- ficamente" a um antígeno humano (isto é, tem um valor de afinidade de liga- ção (Κ,) de não mais do que cerca de 1 χ 10"7 Μ, de preferência não mais do que cerca de 1 χ 10"8 M e, ainda mais preferivelmente, não mais do que cer- ca de 1 χ 10~9 Μ), mas tem uma afinidade de ligação por um homólogo do antígeno de uma segunda espécie de mamífero a qual é pelo menos cerca de 50 vezes ou pelo menos cerca de 500 vezes ou pelo menos cerca de 1000 vezes mais fraca do que sua afinidade de ligação pelo antígeno huma- no. O anticorpo espécie-dependente pode ser de qualquer um dos vários· tipos de anticorpos conforme definido acima mas, de preferência, é um anti- corpo humanizado ou humano.

Conforme usado aqui, "mutante de anticorpo" ou "variante de anticorpo" refere-se a uma variante de seqüência de aminoácido do anticor- po espécie-dependente em que um ou mais dos resíduos de aminoácido do anticorpo espécie-dependente foram modificados. Tais mutantes têm, ne- cessariamente, menos de 100% de identidade ou similaridade de seqüência com o anticorpo espécie-dependente. Em uma modalidade preferida, o mu- tante de anticorpo terá uma seqüência de aminoácido tendo pelo menos 75% de identidade ou similaridade de seqüência de aminoácido com a se- qüência de aminoácido do domínio variável de cadeia pesada ou leve do anticorpo espécie-dependente, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90% e, ainda mais preferivelmente, pelo menos 95%. A identidade ou similaridade, com relação a essa seqüência, é definida aqui como o percentual de resí- duos de aminoácido na seqüência candidata que são idênticos (isto é, mes- mo resíduo) ou similares (isto é, resíduo de aminoácido do mesmo grupo baseado nas propriedades em comum da cadeia lateral, veja abaixo) com resíduos do anticorpo espécie-dependente, após alinhamento das seqüên- cias e introdução de gaps, se necessário, para obter a identidade de se- qüência percentual máxima. Nenhuma das extensões, deleções ou inser- ções N-terminais, C-terminais ou internas na seqüência do anticorpo fora do domínio variável deverá ser construída como afetando a identidade ou simi- laridade de seqüência.

Um anticorpo "isolado" é um o qual foi identificado e separado e/ou recuperado de um componente de seu ambiente natural. Componentes contaminantes de seu ambiente natural são materiais os quais interfeririam com usos diagnósticos ou terapêuticos para o anticorpo e podem incluir en- zimas, hormônios e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em modalidades preferidas, o anticorpo será purificado (1) para mais de 95% em peso de anticorpo, conforme determinado através do método de Lowry e, mais preferivelmente, mais de 99% em peso, (2) até um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos de seqüência de aminoácido N-terminal ou interna através do uso de um Spinning Cup Sequenator ou (3) até homoge- neidade através de SDS-PAGE sob condições de redução ou não-redução usando azul Coomassie ou, de preferência, coloração com prata. Anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ dentro de células recombinantes, uma vez que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não esta- rá presente. Comumente, contudo, o anticorpo isolado será preparado atra- vés de pelo menos uma etapa de purificação.

Conforme usado aqui, "domínio variável de anticorpo" refere-se às porções das cadeias pesada e leve de moléculas de anticorpo que inclu- em seqüências de aminoácido de Regiões de Determinação de Complemen- taridade (CDRs; isto é, CDR1, CDR2 e CDR3) e Regiões de Estrutura "fra- mework" (FR). Vh refere-se ao domínio variável da cadeia pesada. Vl refere- se ao domínio variável da cadeia leve. De acordo com os métodos usados na presente invenção, as posições de aminoácido atribuídas as CDRs e FRs podem ser definidas de acordo com Kabat (Sequences of Proteins of Immu- nological Interest (National Institutes of Health, Bethesda1 Md., 1987 e 1991)). A numeração de aminoácido de anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno é também de acordo com aquela de Kabat.

Conforme usado aqui, o termo " Regiões de Determinação de Complementaridade" (CDRs; isto é, CDR1, CDR2 e CDR3) refere-se aos resíduos de aminoácido de um domínio variável de anticorpo, a presença das quais é necessária para ligação de antígeno. Cada domínio variável tem, tipicamente, três regiões CDR identificadas como CDR1, CDR2 e CDR3. Cada região de determinação de complementaridade pode compreender resíduos de aminoácido de uma "região de determinação de complementari- dade" conforme definido por Kabat (isto é, cerca dos resíduos 24-34 (L1), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 31-35 (H1), 50- 65 (H2) e 95-102 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Kabat e outros, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Servi- ce, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) e/ou aqueles resí- duos de um "loop hipervariável" (isto é, cerca dos resíduos 26-32 (L1), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Chothia e Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917). Em alguns casos, uma região de determi- nação de complementaridade inclui aminoácidos de uma região CDR defini- da de acordo com Kabat e um Ioop hipervariável. Por exemplo, a CDRH1 da cadeia pesada do anticorpo 4D5 inclui os aminoácidos 26 a 35.

"Regiões de estrutura "framework"' (aqui depois FR) são aque- les outros resíduos de domínio variável que não os resíduos de CDR. Cada domínio variável tem, tipicamente, quatro FRs identificadas como FR1, FR2, FR3 e FR4. Se as CDRs são definidas de acordo com Kabat, os resíduos de FR de cadeia leve estão posicionados em torno dos resíduos 1-23 (LCFR1), 35-49 (LCFR2), 57-88 (LCFR3) e 98-107 (LCFR4) e os resíduos de FR de cadeia pesada estão posicionados em torno dos resíduos 1-30 (HCFR1), 36- 49 (HCFR2), 66-94 (HCFR3) e 103-113 (HCFR4) nos resíduos de cadeia pesada. Se as CDRs compreende resíduos de aminoácido de Ioops hiperva- riáveis, os resíduos de FR de cadeia leve estão posicionados em torno dos resíduos 1-25 (LCFR1), 33-49 (LCFR2), 53-90 (LCFR3) e 97-107 (LCFR4) na cadeia leve e os resíduos de FR de cadeia pesada estão posicionados em torno dos resíduos 1-25 (HCFR1), 33-52 (HCFR2), 56-95 (HCFR3) e 102-113 (HCFR4) nos resíduos de cadeia pesada. Em alguns casos, quando a CDR compreende aminoácidos de uma CDR conforme definido por Kabat e aqueles de um Ioop hipervariável, os resíduos de FR serão corresponden- temente ajustados. Por exemplo, quando CDRH1 inclui os ácido nucleicos H26-H35, os resíduos de FR1 de cadeia pesada estão nas posições 1-25 e os resíduos de FR2 estão nas posições 36-49.

Conforme usado aqui, "conjunto de códon" refere-se a um con- junto de diferentes seqüências nucleotídicas triplas usadas para codificar aminoácidos variantes desejados. Um conjunto de oligonucleotídeos pode ser sintetizado, por exemplo, através de síntese em fase sólida, incluindo seqüências que representam todas as possíveis combinações de triplas de nucleotídeo fornecidas pelo conjunto de códon e que codificarão o grupo de aminoácidos desejado. Uma forma padrão de designação de códon é aquela do código IUB1 o qual é conhecido na técnica e descrito aqui. Um conjunto de códon é, tipicamente, representado por 3 letras maiúsculas em itálico, por exemplo, NNK, NNS, XYZ, DVK e semelhantes. Um "conjunto de códon não- aleatório", conforme usado aqui, assim, refere-se a um conjunto de códon que codifica aminoácidos selecionados que preenchem parcialmente, de preferência completamente, os critérios para seleção de aminoácido confor- me descrito aqui. Síntese de oligonucleotídeos com "degenerância" de nu- cleotídeo selecionada em determinadas posições é bem-conhecida nessa técnica, por exemplo, a abordagem TRIM (Knappek e outros (1999) J. Mol. BioL 296: 57-86); Garrard & Henner (1993) Gene 128: 103). Tais conjuntos de oligonucleotídeos tendo determinados conjuntos de códon podem ser sintetizados usando sintetizadores de ácido nucleico comerciais (disponíveis, por exemplo, da Applied Biosystems, Foster City, CA) ou podem ser obtidos comercialmente (por exemplo, da Life Technologies, Rockville, MD). Portan- to, um conjunto de oligonucleotídeos sintetizado tendo um conjunto de códon em particular incluirá, tipicamente, uma pluralidade de oligonucleotídeos com diferentes seqüências, as diferenças estabelecidas pelo conjunto de códon dentro da seqüência global. Oligonucleotídeos, conforme usado de acordo com a invenção, têm seqüências que permitem hibridização a um padrão de ácido nucleico com domínio variável e também podem incluir, mas não ne- cessariamente, sítios de enzima de restrição úteis, por exemplo, para fins de clonagem.

Um fragmento "Fv" é um fragmento de anticorpo o qual contém um sítio de ligação e reconhecimento de antígeno completo. Essa região consiste em um dímero de um domínio variável de cadeia pesada e um de cadeia leve em associação hermética, a qual pode ser de natureza covalen- te, por exemplo, em scFv. É nessa configuração que as três CDRs de cada domínio variável interagem para definir um sítio de ligação de antígeno sobre a superfície do dímero Vh-Vl. Coletivamente, as seis CDRs ou um subcon- junto das mesmas conferem especificidade de ligação a antígeno ao anticor- po. contudo, mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv com- preendendo apenas três CDRs específicas para um antígeno) tem a capaci-. dade de reconhecer e se ligar a antígeno, embora usualmente em uma me- nor afinidade do que o sítio de ligação inteiro.

O fragmento "Fab" contém um domínio variável e constante da cadeia leve e um domínio variável e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada. Fragmentos de anticorpo F(ab')2 compreendem um par de fragmentos Fab os quais são, em geral, covalentemente ligados próximos de seu carbóxi término através de cisteínas de dobradiça entre os mesmos. Ou- tros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpo também são conhe- cidos na técnica.

Fragmentos de anticorpo "Fv com uma única cadeia" ou "scFv" compreendem os domínios Vh e Vl de anticorpo, em que esses domínios estão presentes em uma única cadeia polipeptídica. Geralmente, o polipeptídeo Fv ainda compreende um Iigante polipeptídico entre os domínios Vh e VL, o que permite que o scFv forme a estrutura desejada para ligação a antígeno. Para uma revisão de scFv, veja Pluckthun em The Phar- macology of Monoclonal Antibodies, Vol 113, Rosenburg e Moore eds. S- pringer-Verlag, New York, páginas 269-315 (1994).

O termo "diacorpos" refere-se a pequenos fragmentos de anti- corpo com dois sítios de ligação a antígeno, fragmentos os quais compreen- dem um domínio variável de cadeia pesada (Vh) conectado a um domínio variável de cadeia leve (Vl) na mesma cadeia polipeptídica (VH e VL). Usan- do um Iigante que é muito curto para permitir emparelhamento entre os dois domínios sobre a mesma cadeia, os domínios são forçados a emparelhar com os domínios complementares de outra cadeia e criar dois sítios de liga- ção a antígeno. Diacorpos são descritos mais completamente, por exemplo, no EP 404,097; WO 93/11161; e Hollinger e outros (1993) Proc. Nati Acad. Sei. USA 90: 6444-6448.

A expressão "anticorpos lineares" refere-se aos anticorpos des- critos em Zapata e outros (1995 Protein Eng1 8( 10): 1057-1062). Resumi- damente, esses anticorpos compreendem um par de segmentos Fd um após o outro (VH-CH1-Vh-ChI ) o qual, junto com polipeptídeos da cadeia leve com- plementar, forma um par de regiões de ligação a antígeno. Anticorpos linea- res são bi-específicos ou mono-específicos.

Conforme usado aqui, "biblioteca" refere-se a uma pluralidade de seqüências de anticorpo ou fragmentos de anticorpo (por exemplo, polipeptídeos da invenção) ou aos ácidos nucleicos que codificam essas se- quências, as seqüências sendo diferentes na combinação de aminoácidos variantes que são introduzidos nessas seqüências de acordo com os méto- dos da invenção.

"Phage display" é uma técnica pela qual polipeptídeos variantes são visualizados como proteínas de fusão a pelo menos uma porção da pro- teína do envoltório sobre a superfície de fago, por exemplo, partículas de fago filamentoso. Uma utilidade de phage display repousa no fato de que grandes bibliotecas de variantes de proteína aleatórias pode ser rápida e eficientemente selecionada com relação àquelas seqüências que se ligam a um antígeno-alvo com alta afinidade. Visualização de bibliotecas de peptídeo e proteína sobre fago tem sido usada para seleção de milhões de polipeptídeos com relação àqueles com propriedades de ligação específicas. Métodos de phage display polivalentes têm sido usados para visualização de pequenos peptídeos aleatórios e pequenas proteínas através de fusões ao gene Ill ou gene Vlll do fago filamentosos. Wells e Lowman (1992) Curr. O- pin. Struct. Biol. 3: 355-362 e referências citadas no mesmo. Em um phage display monovalente, uma biblioteca de proteína ou peptídeo é fundida a um gene Ill ou uma porção do mesmo e expressa em baixos níveis na presença de proteína do gene Ill do tipo selvagem, de modo que partículas de fago mostram uma cópia ou nenhuma das proteínas de fusão. Efeitos de avidez são reduzidos com relação ao fago polivalente, de modo que a seleção é com base na afinidade intrínseca pelo Iigante e vetores de fagemídeo são usados, os quais simplificam manipulações de DNA, Lowman e Wells (1991) Methods: A companion to Methods in Enzymology 3: 205-0216.

Um "fagemídeo" é um vetor de plasmídeo tendo uma origem de replicação bacteriana, por exemplo, CoIEI e uma cópia de uma região inter- gênica de um bacteriófago. O fagemídeo pode ser usado sobre qualquer bacteriófago conhecido, incluindo bacteriófagos filamentosos e bacteriófagos lambdoides. O plasmídeo também conterá, em geral, um marcador selecio- nável para resistência a antibiótico. Segmentos de DNA clonados nesses vetores podem ser propagados como plasmídeos. Quando células abrigando esses vetores são fornecidas com todos os genes necessários para a produ- ção de partículas de fago, o modo de replicação do plasmídeo muda para replicação "rolling circle" para gerar cópias de uma fita do DNA de plasmídeo e engolfar partículas de fago. O fagemídeo pode formar partículas de fago infecciosas ou não-infecciosas. Esse termo inclui fagemídeos os quais con- têm um gene de proteína do envoltório de fago ou fragmento do mesmo li- gado a um gene de polipeptídeo heterólogo como uma fusão gênica, de mo- do que o polipeptídeo heterólogo é visualizado sobre a superfície da partícu- la de fago.

O termo "vetor de fago" significa uma forma replicativa de fita dupla de um bacteriófago contendo um gene homólogo e capaz de replica- ção. O vetor de fago tem uma origem de replicação de fago que permite re- plicação de fago e formação de partícula de fago. O fago é, de preferência, um bacteriófago filamentoso, tal como um fago M13, fl, fd, Pf3 ou um deriva- do do mesmo ou um fago lambdoide, tal como lambda, 21, phi80, phi81, 82, 424, 434, etc. ou um derivado do mesmo.

Conforme usado aqui, "posição acessível a solvente" refere-se a uma posição de um resíduo de aminoácido nas regiões variáveis das cadei- as pesada e leve de um anticorpo fonte ou fragmento de ligação a antígeno que é determinada, baseado na estrutura, montagem de estruturas e/ou es- trutura modelada do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, como potencialmente disponível para acesso por solvente e/ou contato com uma molécula, tal como um antígeno anticorpo-específico. Essas posições são, tipicamente, encontradas nas CDRs e sobre o exterior da proteína. As posi- ções acessíveis a solvente de um anticorpo ou fragmento de ligação a antí- geno, conforme definido aqui, podem ser determinadas usando qualquer um de uma série de algoritmos conhecidos na técnica. De preferência, as posi- ções acessíveis a solvente são determinadas usando coordenadas de um modelo tridimensional de um anticorpo, de preferência usando um programa de computador, tal como o programa InsightH (Accelrys, San Diego1 CA). Posições acessíveis a solvente também podem ser determinadas usando algoritmos conhecidos na técnica (por exemplo, Lee e Richards (1971) J. MoL Biol. 55, 379 e Connolly (1983) J. AppL Cryst. 16, 548). Determinação de posições acessíveis a solvente pode ser realizada usando software ade- quado para modelamento de proteína e informação estrutural tridimensional obtida de um anticorpo, um softwares que pode ser utilizado para essas fina- lidades inclui o software SYBYL Biopolymer Module (Tripos Associates). Em geral e de preferência, onde um algoritmo (programa) requer um parâmetro de tamanho de entrada do usuário, o "tamanho" de uma sonda a qual é usa- da no cálculo é configurado como cerca de 1,4 Angstrom ou de raio menor. Além disso, métodos de determinação da área e regiões acessíveis a sol- vente usando software para computadores pessoais foram descritos por Pa- dos (1994) Comput. Chem. 18(4): 377-386.

Um "fator ou agente angiogênico" é um fator de crescimento que estimula o desenvolvimento de vasos sangüíneos, por exemplo, promove a angiogênese, crescimento de células endoteliais, estabilidade de vasos san- güíneos e/ou vasculogênese, etc. Por exemplo, fatores angiogênicos inclu- em, mas não estão limitados a, por exemplo, VEGF e membros da família VEGF, P1GF, a família PDGF, a família de fator de crescimento de fibroblas- to (FGFs), Iigantes TIE (Angiopoietinas), efrinas, Del-1, fatores de cresci- mento de fibroblasto: ácido (aFGF) e básico (bFGF), Folistatina, fator de es- timulação de colônia de granulócito (G-CSF), fator de crescimento de hepa- tócito (HGF)/fator de dispersão (SF), lnterleucina-8 (IL-8), Leptina, Midquina, neurofilinas, fator de crescimento placentário, fator de crescimento de célu- las endoteliais derivado de plaquetas (PD-ECGF), fator de crescimento deri- vado de plaquetas, especialmente PDGF-BB ou PDGFR-beta, Pleiotrofina (PTN), Progranulina, Proliferina, fator-alfa de crescimento de transformação (TGF-alfa), fator-beta de crescimento de transformação (TGF-beta), fator- alfa de necrose de tumor (TNF-alfa), etc. Ele também deverá incluir fatores que aceleram a cicatrização de ferimentos, tais como hormônio de cresci- mento, fator-1 de crescimento semelhante à insulina (IGF-1), VIGF, fator de crescimento epidérmico (EGF), CTGF e membros de sua família e TGF-alfa e TGF-beta. Veja, por exemplo, Klagsbrun e D1Amore (1991; Annu. Rev. Physiol. 53: 217-39; Streit e Detmar (2003) Oncogene 22: 3172-3179; Ferra- ra & Alitalo (1999) Nature Medicine 5(12): 1359-1364; Tonini e outros (2003) Oncogene 22: 6549-6556 (por exemplo, Tabela 1 listando fatores angiogêni- cos conhecidos); e Sato (2003) Int. J. Clin. Oncoi 8: 200-206.

Um "agente antiangiogênese" ou "inibidor de angiogênese" refe- re-se a uma substância de pequeno peso molecular, um polinucleotídeo, um polipeptídeo, uma proteína isolada, uma proteína recombinante, um anticor- po ou conjugados ou proteínas de fusão dos mesmos, que inibe a angiogê- nese, vasculogênese ou permeabilidade vascular indesejável, seja direta ou indiretamente. Deve ser entendido que o agente antiangiogênese inclui a - queles agentes que se ligam ou bloqueiam a atividade angiogênica do fator angiogênico ou seu receptor. Por exemplo, um agente antiangiogênese é um anticorpo ou outro antagonista a um agente angiogênico conforme definido acima, por exemplo, anticorpos ao VEGF-A ou ao receptor de VEGF-A (por exemplo, receptor KDR ou receptor Fit-1), inibidores anti-PDGFR, tal como Gleevec® (Imatinib Mesilato). Agentes antiangiogênese também incluem inibidores de angiogênese nativos, por exemplo, angiostatina, endostatina, etc. Veja, por exemplo, Klagsbrun e D1Amore (1991) Annu. Rev. Physiol. 53: 217-39; Streit e Detmar (2003) Oncogene 22: 3172-3179 (por exemplo, Ta- bela 3 listando terapia antiangiogênica em melanoma maligno); Ferrara & Alitalo (1999) Nature Medicine 5(12): 1359-1364; Tonini e outros (2003) On- cogene 22: 6549-6556 (por exemplo, Tabela 2 listando fatores antiangiogê- nicos conhecidos); e Sato (2003) Int. J. Clin. Oncoi 8: 200-206 (por exemplo, Tabela 1 listando agentes antiangiogênicos usados em ensaios clínicos).

O termo "VEGF" ou "VEGF-A", conforme usado aqui, refere-se ao fator de crescimento de células endoteliais vasculares humanas de 165 aminoácidos e fatores de crescimento de células endoteliais vasculares hu- manas de 121, 189 e 206 aminoácidos relacionados, conforme descrito por Leung e outros (1989) Science 246: 1306 e Houck e outros (1991) Moi. En- docrin, 5: 1806, junto com as formas alélicas que ocorrem naturalmente e processadas dos mesmos. O termo "VEGF" também refere-se a VEGFs de espécies não-humanas, tais como camundongo, rato ou primata. Algumas vezes, VEGFs de uma espécie específica são indicados através de termos tais como hVEGF para VEGF humano, mVEGF para VEGF de murino, etc. O termo "VEGF" é também usado para se referir a formas truncadas do polipeptídeo compreendendo os aminoácidos 8 a 109 ou 1 a 109 do fator de crescimento de células endoteliais vasculares humanas de 165 aminoácidos. Referência à quaisquer formas de VEGF pode ser identificada no presente pedido, por exemplo, por "VEGF (8-109)," "VEGF (1-109)" ou "VEGF165." As posições de aminoácido para um VEGF nativo "truncado" são numeradas conforme indicado na seqüência do VEGF nativo. Por exemplo, a posição de aminoácido 17 (metionina) no VEGF nativo truncado é também a posição 17 (metionina) no VEGF nativo. O VEGF nativo truncado tem afinidade de Iiga- ção por receptores KDR e Fit-1 comparável ao VEGF nativo.

Um "anticorpo anti-VEGF" é um anticorpo que se liga ao VEGF com afinidade e especificidade suficientes. De preferência, o anticorpo anti- VEGF da invenção pode ser usado como um agente terapêutico em objeti- vação e interferência com doenças ou condições em que a atividade de VEGF está envolvida. Um anticorpo anti-VEGF usualmente não se ligará a outros homólogos de VEGF, tais como VEGF-B ou VEGF-C, nem outros fa- tores de crescimento, tais como PIGF, PDGF ou bFGF. Um anticorpo anti- VEGF preferido é um anticorpo monoclonal que se liga ao mesmo epitopo que o anticorpo monoclonal anti-VEGF A4.6.1 produzido pelo hibridoma ATCC HB 10709. Mais preferivelmente, o anticorpo anti-VEGF é um anticor- po monoclonal anti-VEGF humanizado recombinante gerado de acordo com Presta e outros (1997) Câncer Res. 57: 4593-4599 incluindo, mas não- Iimitado a, o anticorpo conhecido como bevacizumab (BV; Avastin™).

O anticorpo anti-VEGF "Bevacizumab (BV)", também conhecido como "rhuMAb VEGF" ou "Avastin®, é um anticorpo monoclonal anti-VEGF humanizado recombinante gerado de acordo com Presta e outros (1997) Câncer Res. 57: 4593-4599. Ele compreende regiões de estrutura "frame- work" de IgGI humana com mutação e regiões de determinação de com- plementaridade de ligação a antígeno do anticorpo monoclonal anti-VEGF de murino A.4.6.1 que bloqueia a ligação de VEGF humano a seus receptores. Aproximadamente 93% da seqüência de aminoácido do Bevacizumab, inclu- indo a maioria das regiões de estrutura "framework", são derivados de IgGI humana e cerca de 7% da seqüência são derivados do anticorpo A4.6.1 de murino. O bevacizumab tem uma massa molecular de cerca de 149.000 dál- tons e é glicosilado.

Um "antagonista de VEGF" refere-se a uma molécula capaz de neutralizar, bloquear, inibir, eliminar, reduzir ou interferir com as atividades de VEGF incluindo, mas não-limitado a, sua ligação a um ou mais receptores de VEGF. Antagonistas de VEGF incluem, sem limitação, anticorpos anti- VEGF e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos, moléculas recepto- ras e derivados os quais se ligam especificamente ao VEGF, desse modo, impedindo sua ligação a um ou mais receptores, anticorpos antirreceptor de VEGF e antagonistas do receptor de VEGF, tais como inibidores de pequena molécula das quinases de tirosina de VEGF. O termo "antagonista de VEGF", conforme usado aqui, inclui especificamente moléculas, incluindo anticorpos, fragmentos de anticorpo, outros polipeptídeos de ligação, peptí- deos e pequenas moléculas não-peptídicas, que se ligam à neuropilina-1 e/ou neuropilina-2 (Nrp-1 e/ou Nrp-2) e são capazes de neutralizar, bloquear, inibir, eliminar, reduzir ou interferir com as atividades de VEGF incluindo, mas não-limitado a, anticorpos anti-Nrpl e anti-Nrp2 e anticorpos que rea- gem cruzadamente com Nrpl e Nrp2, contanto que eles sejam capazes de neutralizar, bloquear, inibir, eliminar, reduzir ou interferir com as atividades de VEGF. Assim, o termo "atividades de VEGF" inclui especificamente ativi- dades biológicas mediadas por neuropilina (conforme aqui acima definido) de VEGF.

Um "antagonista de semaforina" refere-se a uma molécula capaz de neutralizar, bloquear, inibir, eliminar, reduzir ou interferir com as ativida- des de semaforina incluindo, mas não-limitado a, sua ligação a um ou mais receptores de semaforina. Antagonistas de semaforina incluem, sem limita- ção, anticorpos antissemaforina e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos, moléculas receptoras e derivados os quais se ligam especifica- mente à semaforina, desse modo, impedindo sua ligação a um ou mais re- ceptores, anticorpos antirreceptor de semaforina e antagonistas do receptor de semaforina, tais como inibidores de pequena molécula de semaforinas. O termo "antagonista de semaforina", conforme usado aqui, inclui especifica- mente moléculas, incluindo anticorpos, fragmentos de anticorpo, outros polipeptídeos de ligação, peptídeos e pequenas moléculas não-peptídicas, que se ligam à neuropilina-1 e/ou neuropilina-2 (Nrp-1 e/ou Nrp-2) e são ca- pazes de neutralizar, bloquear, inibir, eliminar, reduzir ou interferir com as atividades de semaforina incluindo, mas não-limitado a, anticorpos anti-Nrpl e anti-Nrp2 e anticorpos que reagem cruzadamente com Nrpl e Nrp2, con- tanto que eles sejam capazes de neutralizar, bloquear, inibir, eliminar, redu- zir ou interferir com as atividades de semaforina. Assim, o termo "atividades de semaforina" inclui especificamente atividades biológicas mediadas por neuropilina (conforme aqui acima definido) de semaforinas da classe 3. Tais atividades biológicas incluem, por exemplo, efeito inibitório de crescimento de neurito durante desenvolvimento do sistema nervoso embriônico e neuro- regeneração.

"Tratamento" refere-se a tratamento terapêutico e medidas profi- láticas ou preventivas. Aqueles que precisam de tratamento incluem aqueles que já têm o distúrbio, bem como aqueles nos quais o distúrbio tem de ser prevenido.

Um "distúrbio" é qualquer condição que se beneficiaria de trata- mento. Por exemplo, mamíferos que sofrem de ou precisam de profilaxia contra angiogênese (angiogênese excessiva, inapropriada ou descontrolada) ou permeabilidade vascular anormal. Isso inclui distúrbios ou doenças agu- das e crônicas, incluindo aquelas condições patologias as quais predispõem o mamífero ao distúrbio em questão. Exemplos não Iimitativos de distúrbios a serem tratados aqui incluem tumores malignos e benignos; malignidades Iinfoides e não-leucemia; distúrbios neuronais, gliais, astrocitais, hipotalâmi- cos e outros glandulares, macrofagais, epiteliais, estromais e blastocelíacos; e distúrbios inflamatórios, angiogênicos e imunológicos.

Angiogênese anormal ocorre quando novos vasos sangüíneos crescem excessiva, insuficiente ou inapropriadamente (por exemplo, a loca- lização, momento ou início da angiogênese sendo indesejada do ponto de vista médico) em um estado doentio ou de modo que ela causa um estado doentio. Angiogênese excessiva, inapropriada ou descontrolada ocorre quando há o crescimento de um novo vaso sangüíneo que contribui para a piora do estado doentio ou causa um estado doentio, tal como em câncer, especialmente tumores sólidos vascularizados e tumores metastáticos (inclu- indo câncer de cólon, pulmão (especialmente câncer de pulmão de células pequenas) ou câncer de próstata), doenças causadas por neovascularização ocular, especialmente cegueira por diabetes, retinopatias, retinopatia diabé- tica primária ou degeneração macular idade-relacionada (AMD), psoríase, artrite psoriática, hemangioblastoma, tal como hemangioma; doenças renais inflamatórias, tal como glomerulonefrite, especialmente glomerulonefrite me- sangioproliferativa, síndrome urêmica hemolítica, nefropatia diabética ou ne- froesclerose hipertensiva; várias doenças inflamatórias, tais como artrite, especialmente artrite reumatoide, doença inflamatória do intestino, psoríase, sarcoidose, arteriosclerose arterial e doenças que ocorrem após transplan- tes, endometriose ou asma crônica e mais de outras 70 condições. Os novos vasos sangüíneos podem alimentar os tecidos doentes, destruir tecidos normais e, no caso de câncer, os novos vasos sangüíneos podem permitir que células tumorais escapem para a circulação e se alojem em outros ór- gãos (metástases de tumor). Angiogênese insuficiente ocorre quando há vasos sangüíneos inadequados que contribuem para a piora de um estado doentio, por exemplo, em doenças tais como doença da artéria coronária, derrame e cicatrização retardada de ferimentos. Ainda, úlceras, derrames e ataques cardíacos podem resultar da ausência de angiogênese que nor- malmente é requerida para cicatrização natural. A presente invenção consi- dera o tratamento daqueles pacientes que estão em risco de desenvolver as enfermidades mencionadas acima.

Outros pacientes que são candidatos para recebimentos dos anticorpos ou outras moléculas da presente invenção têm ou estão em risco de desenvolver proliferação anormal de tecido fibrovascular, acne rosácea, síndrome de imuno deficiência adquirida, oclusão arterial, queratite atópica, úlceras bacterianas, doença de Bechet, tumores abrigados no sangue, do- ença obstrutiva da carótida, neovascularização coroidal, inflamação crônica, descolamento retinal crônico, uveíte crônica, vitrite crônica, uso excessivo de lentes de contato, rejeição a enxerto corneal, neovascularização corneal, neovascularização de enxerto corneal, doença de Crohn, doença de Eale, queratoconjuntivite crônica, úlceras fúngicas, infecções pelo Herpes simplex, infecções pelo Herpes zoster, síndromes de hiperviscosidade, sarcoma de Kaposi, leucemia, degeneração lipídica, doença de Lyme, queratólise margi- nal, úlcera de Mooren, outras infecções por Micobactérias que não lepra, miopia, doença neovascular ocular, buracos ópticos, síndrome de Osler- Weber (Osier-Weber-Rendu), osteoartrite, doença de Paget, pars planitis, penfigoide, filectenulose, poliarterite, complicações pós-laser, infecções por protozoários, pseudoxantoma elasticum, pterygium queratite sicca, querato- tomia radial, neovascularização retinal, retinopatia de prematuridade, fibro- plasias retrolentais, sarcoide, esclerite, anemia de células falsiformes, sín- drome de Sogren, tumores sólidos, doença de Stargart, doença de Steven's Johnson, queratite límbica superior, Iupus eritematoso sistêmico, degenera- ção marginal de Terrien, toxoplasmose, tumores de sarcoma de Ewing, tu- mores de neuroblastoma, tumores de osteosarcoma, tumores de retinoblas- toma, tumores de rhabdomiossarcoma, colite ulcerativa, oclusão venosa, deficiência de Vitamina A e sarcoidose de Wegener, angiogênese indeseja- da associada ao diabetes, doenças parasíticas, cicatrização anormal de fe- rimentos, hipertrofia após cirurgia, lesão ou trauma, inibição de crescimento de pêlos, inibição de ovulação e formação de corpus luteum, inibição de im- plante e inibição de desenvolvimento de embrião no útero.

Terapias antiangiogênese são úteis no tratamento geral de rejei- ção a enxerto, inflamação pulmonar, síndrome nefrótica, pré-eclampsia, efu- são pericárdica, tal como aquela associada à endocardite e efusão pleural, doenças e distúrbios caracterizados por permeabilidade vascular indesejá- vel, por exemplo, edema associado a tumores cerebrais, ascite associada à malignidades, síndrome de Meig, inflamação pulmonar, síndrome nefrótica, efusão pericárdica, efusão pleural, permeabilidade associada à doenças cardiovasculares, tal como a condição após enfartes do miocárdio e derra- mes e semelhantes. Outras doenças angiogênese-dependentes de acordo com a presente invenção incluem angiofibroma (vasos sangüíneos anormais os quais são propensos à hemorragia), glaucoma neovascular (crescimento de vasos sangüíneos nos olhos), má formações arteriovenosas (comunicação anormal entre artérias e veias), fraturas sem união (fraturar que não cicatri- zam), placas ateroscleróticas (endurecimento das artérias), granuloma pio- gênico (lesão comum da pele composta de vasos sangüíneos), escleroder- ma (uma forma de doença do tecido conectivo), hemangioma (tumor com- posto de vasos sangüíneos), tracoma (causa que leva à cegueira no terceiro mundo), articulações hemofílicas, adesões vasculares e cicatrizes hipertrófi- cas (formação anormal de cicatriz).

Os termos "câncer" e "cancerígeno" refere-sem a ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que é, tipicamente, caracterizada por crescimento celular desregulado. Exemplos de câncer incluem, mas não es- tão limitados a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma e leucemia. Exem- plos mais particulares de tais cânceres incluem câncer de células escamo- sas, câncer de pulmão (incluindo câncer de pulmão de células não peque- nas, câncer de pulmão de células pequenas, adenocarcinoma do pulmão e carcinoma escamoso do pulmão), câncer do peritônio, câncer hepatocelular, câncer gástrico ou de estômago (incluindo câncer gastrointestinal), câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer ovariano, câncer de fíga- do, câncer de bexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer de cólon, câncer cólon-retal, carcinoma endometrial ou uterino, carcinoma da glândula salivar, câncer renal ou de rim, câncer de fígado, câncer de próstata, câncer vulval, câncer da tiroide, carcinoma hepático e vários tipos de câncer de cabeça e pescoço, bem como linfoma de células B (incluindo linfoma não-Hodgkin foli- cular/de baixo grau (NHL); NHL linfocítico de células pequenas (SL); NHL folicular/de grau intermediário; NHL difuso de grau intermediário; NHL imu- noblástico de alto grau; NHL linfoblástico de alto grau; NHL de células pe- quenas não clivadas de alto grau; NHL por doença difusa; linfoma de células do manto; linfoma AIDS-relacionado; e Macroglobulinemia de Waldenstrom); leucemia linfocítica crônica (CLL); leucemia linfoblástica aguda (ALL); leu- cernia de células pilosas; leucemia mieloblástica crônica; e distúrbio Iinfopro- Iiferativo pós-transplante (PTLD), bem como proliferação vascular anormal associada à facomatoses, edema (tal como aquele associado a tumores ce- rebrais) e síndrome de Meig.

O termo "composição antineoplásica" refere-se a uma composi- ção útil no tratamento de câncer compreendendo pelo menos um agente terapêutico ativo, por exemplo, um "agente anticâncer". Exemplos de agen- tes terapêuticos (agentes anticâncer) incluem, mas não estão limitados a, agentes quimioterapêuticos, agentes inibitórios de crescimento, agentes cito- tóxicos, agentes usados em terapia de radiação, agentes antiangiogênese, agentes apoptóticos, agentes antitubulina e outros agentes para tratar cân- cer, tais como anticorpos anti-HER-2, anticorpos anti-CD20, um antagonista do receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR) (por exemplo, um inibidor de quinase de tirosina), inibidor de HER1/EGFR (por exemplo, erloti- nib (Tarceva®), inibidores do fator de crescimento derivado de plaqueta (por exemplo, Gleevec® (lmatinib Mesilato)), um inibidor de COX-2 (por exemplo, celecoxib), interferons, citocinas, antagonistas (por exemplo, anticorpos de neutralização) que se ligam a um ou mais dos seguintes alvos ErbB2, ErbB3, ErbB4, PDGFR-beta, BIyS, APRIL, BCMA ou receptor(es) de VEGF, TRA- IL/Apo2 e outros agentes químicos orgânicos e bioativos, etc. Combinações dos mesmos também são incluídas na invenção.

O termo "agente citotóxico", conforme usado aqui, refere-se a uma substância que inibe ou impede a função de células e/ou causa destrui- ção de células. O termo se destina a incluir isótopos radioativos (por exem- plo, I1311 1125, Y90 e Re186), agentes quimioterapêuticos e toxinas, tais como toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, de planta ou animal ou fragmentos das mesmas.

Um "agente quimioterapêutico" é um composto químico útil no tratamento de câncer. Exemplos de agentes quimioterapêuticos incluem a- gentes de alquilação, tais como tiotepa e ciclofosfamida CYTOXAN®; sulfo- natos de alquila, tais como bussulfan, improssulfan e pipossulfan; aziridinas, tais como benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etileniminas e metilamelaminas, incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosfora- mida, trietilenotiofosforamida e trimetilolomelamina; acetogeninas (especial- mente bulatacina e bulatacinona); uma camptotecina (incluindo o análogo sintético topotecan); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluindo seus análo- gos sintéticos adozeiesina, carzelesina e bizelesina); criptoficinas (particu- larmente criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluindo os análogos sintéticos, KW-2189 e CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; uma sarcodictina; espongistatina; mostardas de nitrogênio, tais como clo- rambucila, clornafazina, clorofosfamida, estramustina, ifosfamida, meclore- tamina, cloridrato de oxido de mecloretamina, melphalan, novembichina, fe- nesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracila; nitrosureias, tais como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina e ranim- nustina; antibióticos, tais como os antibióticos de enodiina (por exemplo, ca- licheamicina, especialmente calicheamicina gamall e calicheamicina ômegall (veja, por exemplo, Agnew (1994) Chem Intl. Ed. Engl. 33: 183-186); dinemi- cina, incluindo dinemicina A; bisfosfonatos, tal como clodronato; uma espe- ramicina; bem como o cromóforo de neocarzinostatina e cromóforos de anti- biótico de enodiina de cromoproteína relacionados), aclacinomisinas, acti- nomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina ADRIAMYCIN® (in- cluindo morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino- doxorrubicina e deóxidoxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, tal como mitomicina C, ácido micofenólico, no- galamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamici- na, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; anti-metabólitos, tais como metotrexato e 5- fluorouracila (5-FU); análogos de ácido fólico, tais como denopterina, meto- trexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina, tais como fludarrabi- na, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina, tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarrabina, dideoxiuri- dina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; androgênios, tais como caluste- rona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenais, tais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; repositor de ácido fólico, tal como ácido frolínico; aceglatona; glicosídeo aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracila; amsacrina; bestrabucila; bisantreno; eda- traxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptínio; uma epotilona; etoglucid; nitrato de gálio; hidroxiureia; lentinano; lonidainina; maytansinoides, tais como maytansina e ansamitocinas; mitoguazona; mito- xantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; phenamet; pirarrubicina; Io- soxantrona; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; complexo de polissacarídeo PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxano; rizoxi- na; sizofirano; espirogermânio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2,2',2"- triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A e anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mi- tobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosinea arabinosídeo ("Ara-C"); ciclo- fosfamida; tiotepa; taxoides, por exemplo, paclitaxel TAXOL® (Bristol-Myers Squibb Oncoiogy, Princeton, N.J.), ABRAXANE® Cremophor-free, fórmula em nanopartícula albumina-manipulada de paclitaxel (American Pharmaceu- tical Partners1 Schaumberg, Illinois) e doxetaxel TAXOTERE® (Rhone- Poulenc Rorer, Antony, França); clorambucila; gemcitabina GEMZAR®; 6- tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platina, tais como cis- platina e carboplatina; vinblastina; platina; etoposídeo (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina NAVELBINE®; novantrona; teniposí- deo; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; irinotecan (Camptosar, CPT-11) (incluindo o regime de tratamento de irinotecan com 5- FU e leucovorina); inibidor de topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides, tal como ácido retinoico; capecitabina; combretastatina; leucovorina (LV); oxaliplatina, incluindo o regime de tratamento com oxalipla- tina (FOLFOX); inibidores de PKC-alfa, Raf, H-Ras1 EGFR (por exemplo, erlotinib (Tarceva®)) e VEGF-A que reduzem a proliferação celular e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos aci- ma.

Também incluídos nessa definição estão agente anti-hormonais que atuam para regular ou inibir a ação de hormônios sobre tumores, tais como antiestrogênios e moduladores seletivos do receptor de estrogênio (SERMs) incluindo, por exemplo, tamoxifeno (incluindo tamoxifeno NOLVA- DEX®), raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, cetoxifeno, LY117018, onapristona e FARESTON-toremifeno; inibidores de aromatase que inibem a enzima aromatase, a qual regula a produção de estrogênio nas glândulas adrenais tais como, por exemplo, 4(5)-imidazóis, aminoglutetimida, acetato de megestrol MEGASE®, exemestano AROMASIN®, formestanina, fadrozol, vorozol RIVISOR®, Ietrozol FEMARA® e anastrozol ARIMIDEX®; e antiandrogênios, tais como flutamida, nilutamida, bicalutamida, Ieuprolida e goserelina; bem como troxacitabina (um análogo de citosina de nucleosídeo de 1,3-dioxolano); oligonucleotídeos antissenso, particularmente aqueles os quais inibem a expressão de genes em vias de sinalização envolvidas em proliferação celular anormal tais como, por exemplo, PKC-alfa, Raf e H-Ras; ribozimas, tais como inibidores de expressão de VEGF (por exemplo, ribozi- ma ANGIOZYME®) e um inibidor de expressão de HER2; vacinas, tais como vacinas de terapia gênica, por exemplo, a vacina ALLOVECTIN®, vacina LEUVECTIN® e vacina VAXID®; rlL-2 PROLEUKIN®; inibidor de topoisome- rase I LURTOTECAN®; rtnRH ABARELIX®; Vinorelbina e Esperamicinas (veja Pat. U.S. No. 4.675.187) e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamen- te aceitáveis de qualquer um dos acima.

O termo "pró-fármaco", conforme usado no presente pedido, re- fere-se a um precursor ou forma derivada de uma substância farmaceutica- mente ativa que é menos citotóxico para células tumorais comparado com o fármaco precursor e é capaz de ser enzimaticamente clivado ou convertido na forma precursora mais ativa. Veja, por exemplo, Wilman (1986) "Prodrugs in Câncer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, páginas 375-382, 615° Meeting Belfast e Stella e outros (1985). "Prodrugs: A Chemi- - cal Approach to Targeted Drug Delivery," Direeted Drug Delivery, Borchardt e outros (ed.), páginas 247-267, Humana Press. Os pró-fármacos da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, pró-fármacos contendo fósfo- ro, pró-fármacos contendo tiofosfato, pró-fármacos contendo sulfato, pró- fármacos contendo peptídeo, pró-fármacos de D-aminoácido, pró-fármacos glicosilados, pró-fármacos contendo β-lactam, pró-fármacos contendo feno- xiacetamida opcionalmente substituída ou pró-fármacos contendo fenilace- tamida opcionalmente substituída, 5-fluorocitosina e outros pró-fármacos de 5-fluorouridina os quais podem ser convertidos ao fármaco livre citotóxico mais ativo. Exemplos de fármacos citotóxicos que podem ser derivatizados em uma forma de pró-fármaco para uso na presente invenção incluem, mas não estão limitados a, aqueles agentes quimioterapêuticos descritos acima.

Doenças e condições que podem ser tratada com antagonistas de semaforina incluem, sem limitação, doenças neurológicas e doenças que requerem ou se beneficia, de neuro-regeneração.

Uma "pequena molécula" é definida aqui como tendo um peso molecular abaixo de cerca de 500 Dáltons.

Uma molécula de ácido nucleico isolada é uma molécula de áci- do nucleico que é identificada e separada de pelo menos uma molécula de ácido nucieico contaminante com a qual ela está comumente associada na fonte natural do ácido nucleico do anticorpo. Uma molécula de ácido nuclei- co isolada está em outra que não na forma ou configuração na qual ela é encontrada na natureza. Moléculas de ácido nucleico isoladas, portanto, se distinguem da molécula de ácido nucleico conforme ele existe em células naturais. Contudo, uma molécula de ácido nucleico inclui uma molécula de ácido nucleico contida em células que expressam comumente o anticorpo onde, por exemplo, a molécula de ácido nucleico está em uma localização cromossômica diferente daquela de células naturais.

A expressão "seqüências de controle" refere-se à seqüências de DNA necessárias para a expressão de uma seqüência de codificação opera- velmente ligada em um organismo hospedeiro particular. As seqüências de controle que são adequadas para procariotas, por exemplo, incluem um promotor, opcionalmente uma seqüência operadora e um sítio de ligação ribossômica. Células eucariotas são conhecidas por utilizar promotores, si- nais de poliadenilação e intensificadores.

Ácido nucleico é "operavelmente ligado" quando ele está colo- cado em uma relação funcional com outra seqüência de ácido nucleico. Por exemplo, DNA para uma pré-sequência ou líder secretório é operavelmente ligado ao DNA para um polipeptídeo se ele é expresso como uma pré- proteína que participa na secreção do polipeptídeo; um promotor ou intensi- ficador é operavelmente ligado a uma região de codificação se ele está ope- ravelmente ligado a uma seqüência de codificação se ele afeta a transcrição da seqüência; ou um sítio de ligação ribossômica se ele está operavelmente ligado a uma seqüência de codificação se ele está posicionado de modo a facilitar a tradução. Geralmente, "operavelmente ligado" significa que as se- qüências de DNA que estão sendo ligadas são contínuas e, no caso de um líder secretório, contínuas e em fase de leitura. Contudo, intensificadores não têm de ser contíguos. Ligação é realizada através de ligação em sítios de restrição convenientes. Se tais sítios não existem, os adaptadores ou Ii- gantes de oligonucleotídeo sintéticos são usados de acordo com a prática convencional.

Conforme usado aqui, as expressões "célula", "linhagem de célula" e "cultura de célula" são usadas permutavelmente e todas de tais designações incluem prole. Assim, as palavras "transformantes" e "células transformadas" incluem a célula em questão primária e culturas derivadas da mesma sem considerar o número de transferências. Também deve ser en- tendido que tal prole pode não ser precisamente idêntica quanto ao teor de DNA, em virtude de mutações deliberadas ou inadvertidas. A prole mutante, que tem a mesma função ou atividade biológica conforme selecionado para a célula originalmente transformada, está incluída. Onde designações distin- tas são consideradas, estará claro a partir do contexto. Modos para Realização da Invenção

Baseado na arquitetura de domínio e propriedades funcionais, os domínios extraceIulares de Nrps são, tipicamente, divididos em três uni- dades funcionais: ala2, b1b2 e c, representando suas regiões de ligação à semaforina primária, ligação ao VEGF e dimerização, respectivamente (Ellis, L.M., Mol Cencer Ther 5, 1099-107 (2006)). Embora estudos de estrutura- função tenham delineado os requisitos de domínio global para função de neuropilina, os detalhes moleculares desses complexos de receptor/ligante permanecem pobremente entendidos. Até o momento, informação estrutural de Nrps está limitada ao domínio b1b2 da Nrpl (Vander Kooi e outros, su- pra; Lee, C. e outros, J Biol Chem 281, 5702-10 (2006)). A estrutura de cris- tal do b1b2 de Nrpl em complexo com a Tuftusina, um tetrapeptídeo homó- logo ao C-término de VEGF165, forneceu a primeira informação sobre a inte- ração de Nrp com seu parceiro de ligação, VEGF (Vander Kooi e outros, su- pra; von Wronski, M.A. e outros, J. Biol Chem 281, 5702-10 (2006)).

A presente invenção proporciona a estrutura de cristal de a- Ia2b1b2 de Nrp2 em complexo com um fragmento Fab de um anticorpo que pode bloquear a ligação de Sema3 a Nrpl e Nrp2 in vitro. Estruturas dos fragmentos a2b1b2 e b1b2 de ambas as isoformas de Nrp também são con- sideradas e têm contrastes. Além disso, a estrutura do domínio b1 de Nrp1, combinada com o fragmento Fab de uma anticorpo fago-derivado recente- mente descrito que inibe especificamente a ligação de VEGFi6S a Nrpl in vivo (Liang, W.C e outros, J Moi Biol 366, 815-29 (2007); Pan, Q. e outros, Câncer Cell 11, 53-67 (2007) é também proporcionada e avaliada. Juntas, essas estruturas apresentam um quadro detalhado de uma grande porção do domínio extracelular de Nrp e sugere modelos para ligação ao VEGF e semaforina. Baseado em um dímero de Nrp2 presente em duas formas de cristal diferentes, um novo mecanismo é proposto para dimerização de Nrp e ligação a ligante.

Detalhes dos estudos cristaIográficos são proporcionados nos Exemplos abaixo. Métodos gerais para produção de anticorpos anti-NRP são descritos aqui e no Exemplo 1. Produção de anticorpos anti-NRP

A invenção aqui inclui a produção e uso de anticorpos anti-NRP. Métodos exemplificativos para a geração de anticorpos são descritos em maiores detalhes nas seções a seguir.

Anticorpos anti-NPR são selecionados usando um antígeno NRP (por exemplo, NRP1 e/ou NRP2) derivado de uma espécie de mamífero. De preferência, o antígeno é NRP humano (hNRP). Contudo, NRPs de outras espécies, tal como NRP de murino (mNRP) também podem ser usadas co- mo o antígeno-alvo. Os antígenos NRP de várias espécies de mamífero po- dem ser isolados de fontes naturais. Em outras modalidades, o antígeno é produzido recombinantemente ou feito usando outros métodos sintéticos conhecidos na técnica.

O anticorpo selecionado normalmente terá uma afinidade de li- gação suficientemente forte pelo antígeno NRP. Por exemplo, o anticorpo pode se ligar à hNRP com um valor de Kd de não mais do que cerca de 5 nM, de preferência não mais do que cerca de 2 nM e, de preferência, não mais do que cerca de 500 pM. As afinidades do anticorpo podem ser deter- minadas através de um ensaio baseado em ressonância de plasmônio em superfície (tal como o ensaio BIAcore, conforme descrito nos Exemplos); ensaio imunoabsorvente enzima-ligado (ELISA); e ensaios de competição (por exemplo, RIA's), por exemplo.

Também, o anticorpo pode ser submetido a outros ensaios de atividade biológica, por exemplo, de forma a avaliar sua eficácia como um produto terapêutico. Tais ensaios são conhecidos na técnica e dependem do antígeno-alvo e uso pretendido para o anticorpo. Exemplos incluem o ensaio de inibição de HUVEC (conforme descrito nos Exemplos abaixo); ensaios de inibição de crescimento de células tumorais (conforme descrito no WO 89/06692, por exemplo); ensaios de citotoxicidade complemento-mediada (CDC) e citotoxicidade celular anticorpo-dependente (ADCC) (Patente US 5.500.362); e ensaios de atividade agonística ou hematopoiese (veja WO 95/27062).

Para selecionar anticorpos os quais se ligam a um epitopo parti- cular sobre o antígeno de interesse, um ensaio de bloqueio cruzado de roti- na, tal como aquele descrito em Antibodies, A Laboratory Manual, Cold S- pring Harbor Laboratory1 Ed Harlow and David Lane (1988), pode ser reali- zado. Alternativamente, mapeamento de epitopo, por exemplo, conforme descrito em Champe e outros (1995) J. Biol. Chem. 270: 1388-1394, pode ser realizado para determinar se o anticorpo se liga a um epitopo de interes- se. Geração de anticorpos anti-NRP a partir de bibliotecas de fago sintéticas

Em uma modalidade preferida, os anticorpos anti-NRP são sele- cionados usando uma abordagem de phage display única. A abordagem en- volve a geração de bibliotecas de fago de anticorpo sintéticas baseada em um único padrão de estrutura "framework", criação de diversidades suficien- tes dentro de domínios variáveis, visualização de polipeptídeos tendo os domínios variáveis diversificados, seleção de anticorpos candidatos com alta afinidade pelo antígeno-alvo NRP e isolamento dos anticorpos selecionados.

Detalhes dos métodos de phage display podem ser encontrados, por exemplo, no W003/102157, publicado em 11 de Dezembro de 2003.

Em um aspecto, as bibliotecas de anticorpo podem ser geradas através de mutação das posições acessíveis a solvente e/ou altamente di- versas em pelo menos uma CDR de um domínio variável de anticorpo. Al- gumas ou todas as CDRs podem sofrer mutação usando os métodos forne- cidos aqui. Em algumas modalidades, pode ser preferível gerar bibliotecas de anticorpo diversas através de mutação de posições em CDRH1, CDRH2 e CDRH3 para formar uma única biblioteca ou através de mutação de posi- ções em CDRL3 e CDRH3 para formar uma única biblioteca ou através de mutação de posições em CDRL3 e CDRH1, CDRH2 e CDRH3 para formar uma única biblioteca.

Uma biblioteca de domínios variáveis de anticorpo pode ser ge- rada, por exemplo, tendo mutações nas posições altamente diversas e/ou acessíveis a solvente de CDRH1, CDRH2 e CDRH3. Outra biblioteca pode ser gerada tendo mutações em CDRL1, CDRL2 e CDRL3. Essas bibliotecas também podem ser usadas em conjunto umas com as outras para gerar Ii- gantes de afinidades desejadas. Por exemplo, após um ou mais ciclos de seleção de bibliotecas de cadeia pesada para ligação a um antígeno-alvo, uma biblioteca de cadeia leve pode ser substituída na população de Iigantes de cadeia pesada para outros ciclos de seleção a fim de aumentar a afinida- de dos ligantes.

De preferência, uma biblioteca é criada através de substituição de aminoácidos originais por aminoácidos variantes na região CDRH3 da região variável da seqüência de cadeia pesada. A biblioteca resultante pode conter uma pluralidade de seqüências de anticorpo, em que a diversidade de seqüência está primariamente na região CDRH3 da seqüência de cadeia pesada.

Em um aspecto, a biblioteca é criada no contexto da seqüência do anticorpo humanizado 4D5 ou da seqüência dos aminoácidos de estrutu- ra "framework" da seqüência do anticorpo humanizado 4D5. De preferência, a biblioteca é criada através de substituição de pelo menos os resíduos 95- 100a da cadeia pesada pelos aminoácidos codificados pelo conjunto de có- don DVK, em que o conjunto de códon DVK é usado para codificar um con- junto de aminoácidos variantes para cada uma dessas posições. Um exem- plo de um conjunto de oligonucleotídeo que é útil para criação dessas substi- tuições compreende a seqüência (DVK)7. Em algumas modalidades, uma biblioteca é criada através de substituição dos resíduos 95-1 OOa pelos ami- noácidos codificados pelos conjuntos de códon DVK e NNK Um exemplo de um conjunto de oligonucleotídeo que é útil para criação dessas substituições compreende a seqüência (DVK)6 (NNK). Em outra modalidade, uma bibliote- ca é criada através de substituição de pelo menos os resíduos 95-1 OOa pe- los aminoácidos codificados pelos conjuntos de códon DVK e NNK. Um e- xemplo de um conjunto de oligonucleotídeo que é útil para criação dessas substituições compreende a seqüência (DVK)5 (NNK). Outro exemplo de um conjunto de oligonucleotídeo que é útil para criação dessas substituições compreende a seqüência (NNK)e. Outros exemplos de seqüências de oligo- nucleotídeo adequadas podem ser determinadas por aqueles versados na técnica de acordo com os critérios descritos aqui.

Em outra modalidade, diferentes designs de CDRH3 são utiliza- dos para isolar Iigantes de alta afinidade e isolar Iigantes para uma varieda- de de epitopos. A faixa de comprimentos de CDRH3 gerada nessa biblioteca é de 11 a 13 aminoácidos, embora comprimentos diferentes desse também possam ser gerados. A diversidade em H3 pode ser expandida usando os conjuntos de códon NNK, DVK e NVK, bem como diversidade mais limitada no N e/ou C-término. Diversidade também pode ser gerada em CDRH1 e CDRH2. Os designs de diversidades em CDR-H1 e H2 seguem a estratégia de objetiva- ção para imitar o repertório de anticorpos naturais, conforme descrito, com modificação que focaliza a diversidade mais intimamente relacionada à di- versidade natural do que o design anterior.

Para diversidade em CDRH3, múltiplas bibliotecas podem ser construídas separadamente com diferentes comprimentos de H3 e, então, combinadas para selecionar Iigantes aos antígenos-alvo. As múltiplas biblio- tecas podem ser empoçadas e escolhidas usando métodos de seleção em suporte sólido e seleção em solução conforme descrito previamente e aqui abaixo. Múltiplas estratégias de seleção podem ser empregadas. Por exem- plo, uma variação envolve seleção sobre um alvo ligado a um sólido, segui- do por seleção de uma tag que pode estar presente sobre o polipeptídeo de fusão (por exemplo, tag anti-gD) e seguido por outra seleção sobre o alvo ligado ao sólido. Alternativamente, as bibliotecas podem ser escolhidas pri- meiro sobre o aivo ligado a uma superfície sólida, os Iigantes eluídos são, então, escolhidos usando ligação em fase em solução com concentrações decrescentes de antígeno-alvo. Utilização de combinações de diferentes mé- todos de seleção proporciona minimização de seleção apenas de seqüên- cias altamente expressas e proporciona seleção de uma série de diferentes clones de alta afinidade.

Ligantes de alta afinidade pelo antígeno-alvo NRP podem ser isolados das bibliotecas. Diversidade limitada na região H1/H2 diminui a de- generância cerca de 104 a 105 vezes e permitir mais diversidade em H3 pro- porciona mais Iigantes de alta afinidade. Utilização de bibliotecas com dife- rentes tipos de diversidade em CDRH3 (por exemplo, utilizando DVK ou NVT) proporciona isolamento de Iigantes que podem se ligar a diferentes epitopos de um antígeno-alvo.

Dos Iigantes isolados das bibliotecas empoçadas conforme des- crito acima, descobriu-se que a afinidade pode ser adicionalmente aprimora- da proporcionando diversidade limitada na cadeia leve. A diversidade na ca- deia leve é gerada, nessa modalidade, como segue em CDRL1: a posição de aminoácido 28 é codificada por RDT; a posição de aminoácido 29 é codi- ficada por RKT; a posição de aminoácido 30 é codificada por RVW; a posi- ção de aminoácido 31 é codificada por ANW; a posição de aminoácido 32 é codificada por THT; opcionalmente, a posição de aminoácido 33 é codificada por CTG; em CDRL2: a posição de aminoácido 50 é codificada por KBG; a posição de aminoácido 53 é codificada por AVC; e a posição de aminoácido 55 é codificada por GMA; em CDRL3: a posição de aminoácido 91 é codifi- cada por TMT ou SRT ou ambos; a posição de aminoácido 92 é codificada por DMC; a posição de aminoácido 93 é codificada por RVT; a posição de aminoácido 94 é codificada por NHT; e a posição de aminoácido 96 é codifi- cada por TWT ou YKG ou ambos.

Em outra modalidade, uma biblioteca ou bibliotecas com diversi- dade nas regiões CDRH1, CDRH2 e CDRH3 é gerada. Nessa modalidade, a diversidade em CDRH3 é gerada usando uma variedade de comprimentos de regiões H3 e usando primariamente os conjuntos de códon XYZ e NNK ou NNS. Bibliotecas podem ser formadas usando oligonucleotídeos individu- ais e empoçados ou oligonucleotídeos podem ser empoçados para formar um conjunto de bibliotecas. As bibliotecas dessa modalidade podem ser es- colhidas contra um alvo ligado ao sólido. Clones isolados de múltiplas sele- ções podem ser selecionados com relação à especificidade e afinidade u- sando ensaios ELISA. Para especificidade, os clones podem ser seleciona- dos contra os antígenos-alvo desejados, bem como outros antígenos não- alvo. Aqueles Iigantes ao antígeno NRP1 alvo podem, então, ser seleciona- dos com relação à afinidade em um ensaio ELISA por competição de ligação em solução ou ensaio de competição por ponto. Ligantes de alta afinidade podem ser isolados da biblioteca utilizando conjuntos de códon XYZ prepa- rados conforme descrito acima. Esses Iigantes podem ser prontamente pro- duzidos como anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno em alto ren- dimento em cultura de célula.

Em algumas modalidades, pode ser desejável gerar bibliotecas com uma maior diversidade em trechos da região CDRH3. Por exemplo, po- de ser desejável gerar bibliotecas com regiões CDRH3 oscilando de cerca de 7 a 19 aminoácidos.

Ligantes de alta afinidade isolados das bibliotecas dessas moda- lidades são prontamente produzidos em cultura de células bacterianas e eu- cariotas em alto rendimento. Os vetores podem ser criados para remover prontamente seqüências, tais como tags gD, seqüência de componente da proteína do envoltório viral e/ou adicionar seqüências na região constante para proporcionar a produção de anticorpos de comprimento total ou frag- mentos de ligação a antígeno em alto rendimento.

Uma biblioteca com mutações na CDRH3 pode ser combinada com uma biblioteca contendo versões variantes de outras CDRs1 por exem- plo, CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1 e/ou CDRH2. Assim, por exemplo, em uma modalidade, uma biblioteca de CDRH3 é combinada com uma bibliote- ca de CDRL3 criada no contexto da seqüência do anticorpo humanizado 4D5 com aminoácidos variantes nas posições 28, 29, 30, 31 e/ou 32 usando conjuntos de códon predeterminados. Em outra modalidade, uma biblioteca com mutações na CDRH3 pode ser combinada com uma biblioteca compre- endendo domínios variáveis de cadeia pesada CDRH1 e/ou CDRH2 varian- tes. Em uma modalidade, a biblioteca de CDRH1 é criada com a seqüência do anticorpo humanizado 4D5 com aminoácidos variantes nas posições 28, 30, 31, 32 e 33. Uma biblioteca de CDRH2 pode ser criada com as seqüên- cias do anticorpo humanizado 4D5 com aminoácidos variantes nas posições 50, 52, 53, 54, 56 e 58 usando os conjuntos de códon predeterminados. Mutantes de anticorpo anti-NRP

O anticorpo anti-NRP gerado a partir das bibliotecas de fago po- de ser ainda modificado para gerar mutantes de anticorpo com propriedades físicas, químicas e/ou biológicas aprimoradas com relação ao anticorpo pre- cursor. Onde o ensaio usado é um ensaio de atividade biológica, o mutante de anticorpo tem, de preferência, uma atividade biológica no ensaio de esco- lha a qual é pelo menos cerca de 10 vezes melhor, de preferência pelo me- nos cerca de 20 vezes melhor, mais preferivelmente pelo menos cerca de 50 vezes melhor e, algumas vezes, cerca de 100 vezes ou 200 vezes melhor, do que a atividade biológica do anticorpo precursor nesse ensaio. Por exem- pio, um mutante de anticorpo anti-NRP 1 tem, de preferência, uma afinidade de ligação pela Nrp a qual é pelo menos cerca de 10 vezes mais forte, de preferência pelo menos cerca de 20 vezes mais forte, mais preferivelmente pelo menos cerca de 50 vezes mais forte e, algumas vezes, pelo menos cer- ca de 100 vezes ou 200 vezes mais forte, do que a afinidade de ligação do anticorpo anti-NRP precursor.

Para gerar o mutante de anticorpo, uma ou mais alterações de aminoácido (por exemplo, substituições) são introduzidas em uma ou mais das regiões hipervariáveis do anticorpo precursor. Alternativamente ou além disso, uma ou mais alterações (por exemplo, substituições) de resíduos da região de estrutura "framework" podem ser introduzidas no anticorpo precur- sor onde essas resultam em um aprimoramento na afinidade de ligação do mutante de anticorpo pelo antígeno da segunda espécie de mamífero. E- xemplos de resíduos da região de estrutura "framework" a modificar incluem aqueles os quais se ligam não covalentemente ao antígeno diretamente (A- mit e outros (1986) Science 233: 747-753); interagem com/afetam a confor- mação de uma CDR (Chothia e outros (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917); e/ou participam na interface Vl - Vh (EP 239 400B1). Em determinadas mo- dalidades, modificação de um ou mais de tais resíduos da região de estrutu- ra "framework" resulta em uma intensificação da afinidade de ligação do an- ticorpo pelo anticorpo da segunda espécie de mamífero. Por exemplo, de cerca de um a cerca de cinco resíduos de estrutura "framework" podem ser alterados nessa modalidade da invenção. Algumas vezes, isso pode ser su- ficiente para proporcionar um mutante de anticorpo adequado para uso em ensaios pré-clínicos, mesmo onde nenhum dos resíduos da região hipervari- ável foi alterado. Normalmente, contudo, o mutante de anticorpo compreen- derá alteração(ões) adicional(is) da região hipervariável.

Os resíduos da região hipervariável os quais são alterados po- dem ser trocados aleatoriamente, especialmente onde a afinidade de ligação inicial do anticorpo precursor é tal que esses mutantes de anticorpo aleatori- amente produzidos podem ser prontamente selecionados.

Um procedimento útil para a geração de tais mutantes de anti- corpo é denominado "mutagênese por exploração de alanina" (Cunningham e Wells (1989) Science 244: 1081-1085). Aqui, um ou mais dos resíduos da região hipervariável são substituídos por resíduo(s) de alanina ou polialanina para afetar a interação dos aminoácidos com o antígeno da segunda espécie de mamífero. Aquele(s) resíduo(s) da região hipervariável que demonstra(m) sensibilidade funcional às substituições é(são), então, refinado(s) introduzin- do mutações adicionais ou outras em ou nos sítios de substituição. Assim, embora o sítio para introdução de uma variação de seqüência de aminoácido seja predeterminado, a natureza da mutação per se não precisa ser prede- terminada. Os mutantes-ala produzidos dessa forma são selecionados com relação à sua atividade biológica conforme descrito aqui.

Normalmente, se começará com uma substituição conservativa, tal como aquelas mostradas abaixo sob o cabeçalho de "substituições prefe- ridas". Se tais substituições resultam em uma alteração na atividade biológi- ca (por exemplo, afinidade de ligação, então, alterações mais substanciais, denominadas "substituições exemplificativas" na tabela a seguir ou conforme ainda descrito abaixo com referência às classes de aminoácido, são introdu- zidas e os produtos selecionados. Substituições preferidas

Resíduo origi- nal Substituições exemplificativas Substituições preferidas Ala (A) vai; leu; ile vai Arg (R) lys; gln; asn Iys Asn (N) gln; his; lys; arg gln Asp (D) glu glu Cys (C) ser ser Gln (Q) asn asn Glu (E) asp asp Gly (G) pro; ala ala His(H) asn; gln; lys; arg arg IIe(I) leu: vai; met; ala; phe; norleucina leu Leu (L) norleucina; ile; vai; met; ala; phe ile Lys (K) arg; gln; asn arg Met (M) leu; phe; ile leu Phe (F) leu; vai; ile; ala; tyr leu Pro (P) ala ala Ser (S) thr thr Thr (T) ser ser Trp (W) tyr; phe tyr Tyr (Y) trp; phe; thr; ser phe Val (V) ile; leu; met; phe; ala; norleucina leu

Mesmo modificações mais substanciais nas propriedades bioló-

gicas dos anticorpos são obtidas selecionando substituições que diferem significativamente quanto a seu efeito sobre a manutenção de (a) a estrutura da parte principal polipeptídica na área da substituição, por exemplo, como uma conformação em folha ou helicoidal, (b) a carga ou hidrofobicidade da molécula no local alvo ou (c) o grosso da cadeia lateral. Resíduos que ocorrem naturalmente são divididos em grupos baseado em propriedades em comum da cadeia lateral:

(1) hidrofóbicos: norleucina, met, ala, vai, leu, ile;

(2) hidrofílicos neutros: cys, ser, thr, asn, gln;

(3) ácidos: asp, glu;

(4) básicos: his, lys, arg;

(5) resíduos que influenciam a orientação de cadeia: gly, pro; e

(6) aromáticos: trp, tyr, phe.

Substituições não conservativas requererão troca de um mem- bro de uma dessas classes por outra classe.

Em outra modalidade, os sítios selecionados para modificação são maturados por afinidade usando phage display (veja acima).

Moléculas de ácido nucleico que codificam mutantes de seqüên- cia de aminoácido são preparadas através de uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Esses métodos incluem, mas não estão limitados a, mutagênese oligonucleotídeo-mediada (ou sítio-dirigida), mutagênese por PCR e mutagênese por cassete de um mutante anteriormente preparado ou uma versão sem mutação do anticorpo precursor. O método preferido para fazer mutantes é mutagênese sítio-dirigida (veja, por exemplo, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82: 488).

Em determinadas modalidades, o mutante de anticorpo terá a- penas um único resíduo de região hipervariável substituído. Em outras mo- dalidades, dois ou mais resíduos da região hipervariável do anticorpo pre- cursor foram substituídos, por exemplo, de cerca de dois a cerca de dez substituições na região hipervariável.

Comumente, o mutante de anticorpo com propriedades biológi- cas aprimoradas terá uma seqüência de aminoácido tendo pelo menos 75% de identidade ou similaridade de seqüência de aminoácido com a seqüência de aminoácido do domínio variável de cadeia pesada ou leve do anticorpo precursor, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90% e, ainda mais preferi- velmente, pelo menos 95%. Identidade ou similaridade, com relação a essa seqüência, é definida aqui como o percentual de resíduos de aminoácido na seqüência candidata que são idênticos (isto é, mesmo resíduo) ou similares (isto é, resíduo de aminoácido do mesmo grupo baseado em propriedades em comum da cadeia lateral, veja acima) aos resíduos do anticorpo precur- sor, após alinhamento das seqüências e introdução de gaps, se necessário, para obter a identidade de seqüência percentual máxima. Nenhuma das ex- tensões, deleções ou inserções N-terminais, C-terminais ou internas na se- qüência do anticorpo fora do domínio variável serão construídas como afe- tando a identidade ou similaridade de seqüência.

Após produção do mutante de anticorpo, a atividade biológica dessa molécula com relação ao anticorpo precursor é determinada. Confor- me notado acima, isso pode envolver determinação da afinidade de ligação e/ou outras atividades biológicas do anticorpo. Em uma modalidade preferida da invenção, um painel de mutantes de anticorpo é preparado e selecionado com relação à afinidade de ligação pelo invenção, tal como NRP1 ou um fragmento da mesma. Um ou mais dos mutantes de anticorpo selecionados a partir dessa triagem inicial são opcionalmente submetidos a um ou mais de outros ensaios de atividade biológica para confirmar se o(s) mutante(s) de anticorpo com afinidade de ligação intensificada é(são), na verdade, útil(eis), por exemplo, para estudos pré-clínicos.

O(s) mutante(s) de anticorpo assim selecionado(s) pode(m) ser submetido(s) a outras modificações, freqüentemente dependendo do uso pretendido do anticorpo. Tais modificações podem envolver alteração adi- cional da seqüência de aminoácido, fusão a polipeptídeo(s) heterólogo(s) e/ou modificações covalentes, tais como aquelas elaboradas abaixo. Com relação a alterações da seqüência de aminoácido, modificações exemplifica- tivas são elaboradas acima. Por exemplo, qualquer resíduo de cisteína não envolvido em manutenção da conformação apropriada do mutante de anti- corpo pode também ser substituído, geralmente por serina, para aprimorar a estabilidade oxidativa da molécula e impedir ligação cruzada anormal. Inver- samente, ligação(ões) de cisteína pode(m) ser adicionada(s) ao anticorpo para aprimorar sua estabilidade (particularmente onde o anticorpo é um fragmento de anticorpo, tal como um fragmento Fv). Outro tipo de mutante de aminoácido tem um padrão de glicosilação alterado. Isso pode ser obtido deletando uma ou mais porções carboidrato encontradas no anticorpo e/ou adicionando um ou mais sítios de glicosilação que não estão presentes no anticorpo, glicosilação de anticorpo é, tipicamente, N-Iigada ou O-ligada. N- Iigada refere-se à fixação da porção carboidrato à cadeia lateral de um resí- duo de asparagina. As seqüências tripeptídicas asparagina-X-serina e aspa- ragina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido exceto prolina, são as se- qüências de reconhecimento para fixação enzimática da porção carboidrato à cadeia lateral de asparagina. Assim, a presença de qualquer uma dessas seqüências tripeptídicas em um polipeptídeo cria um sítio de glicosilação em potencial. Glicosilação O-Iigada refere-se à fixação de um dos açúcares N- acetilgalactosamina, galactose ou xilose a um hidróxi aminoácido, mais co- mumente serina ou treonina, embora 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina tam- bém possam ser usadas. A adição de sítios de glicosilação ao anticorpo é, convenientemente, realizada alterando a seqüência de aminoácido, de modo que ela contenha uma ou mais das seqüências tripeptidicas acima descritas (para sítios de glicosilação N-ligada). A alteração pode também ser feita a- través da adição de ou substituição por um ou mais resíduos de serina ou treonina à seqüência do anticorpo original (para sítios de glicosilação O- ligada).

Vetores, células hospedeiras e métodos recombinantes

Os anticorpos anti-Nrp da invenção podem ser produzidos re- combinantemente, usando técnicas e materiais prontamente obteníveis.

Para a produção recombinante de um anticorpo anti-NRP, o áci- do nucleico que o codifica é isolado e inserido em um vetor replicável para clonagem adicional (amplificação do DNA) ou para expressão. O DNA que codifica o anticorpo é prontamente isolado ou sintetizado usando procedi- mentos convencionais (por exemplo, usando sondas de oligonucleotídeo que são capazes de se ligar especificamente a DNAs que codificam as cadeias pesada e leve do anticorpo). Muitos vetores estão disponíveis. Os compo- nentes do vetor geralmente incluem, mas não estão limitados a, um ou mais dos seguintes: uma seqüência sinalizadora, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento intensificador, um promotor e uma seqüência de término de transcrição, (i) Componente seqüência sinalizadora

O anticorpo da presente invenção pode ser produzido recombi- nantemente não apenas diretamente, mas também como um polipeptídeo de fusão com um polipeptídeo heterólogo o qual, de preferência, é uma se- qüência sinalizadora ou outro polipeptídeo tendo um sítio de clivagem espe- cífico no N-terminal da proteína madura ou polipeptídeo. A seqüência sinali- zadora heteróloga selecionada é, de preferência, uma que é reconhecida e processada (isto é, clivada por uma peptidase sinalizadora) pela célula- hospedeira. Para células hospedeiras procariotas que não reconhecem e processam a seqüência sinalizadora de anticorpo nativa, a seqüência sinali- zadora é substituída por uma seqüência sinalizadora procariota selecionada, por exemplo, do grupo da fosfatase alcalina, penicilinase, Ipp ou líderes de enterotoxina Il estáveis ao calor. Para secreção em levedo, a seqüência si- nalizadora nativa pode ser substituída, por exemplo, pelo líder de invertase de levedo, um líder de fator (incluindo líderes de α-fator de Saccharomyces and Kluyveromyces) ou o líder de fosfatase ácida, o líder de glicoamilase de C. albicans ou o sinal descrito no WO 90/13646. Em expressão em células de mamífero, seqüências sinalizadoras de mamífero, bem como líderes se- cretórios virais, por exemplo, o sinal gD do herpes simplex, estão disponí- veis.

O DNA para tal região precursora é ligado em rede de leitura ao DNA que codifica o anticorpo.

(ii) Componente origem de replicação

Vetores de expressão e clonagem contêm uma seqüência de ácido nucleico que permite que o vetor se reproduza em uma ou mais célu- las hospedeiras selecionadas. Geralmente, em vetores de clonagem, essa seqüência é uma que permite que o vetor se reproduza independentemente do DNA cromossômico do hospedeiro e inclui origens de replicação ou se- qüências de replicação autônoma. Tais seqüências são bem-conhecidas para uma variedade de bactérias, levedo e vírus. A origem de replicação do plasmídeo pBR322 é adequada para a maioria das bactérias Gram- negativas, a origem de replicação do plasmídeo 2u é adequada para levedo e várias origens virais (SV40, polioma, adenovírus, VSV ou BPV) são úteis para vetores de clonagem em células de mamífero. Geralmente, o compo- nente origem de replicação não é necessário para vetores de expressão de mamífero (a origem do SV40 pode, tipicamente, ser usada isoladamente porque ela contém o promotor precoce).

(iii) Componente gene de seleção

Vetores de expressão e clonagem podem conter um gene de seleção, também denominado um marcador selecionável. Genes de seleção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, por exemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetracicli- na, (b) complementam deficiências auxotróficas ou (c) fornecem nutrientes críticos não disponíveis a partir de meios complexos, por exemplo, o gene que codifica a racemase de D-alanina para Bacilos. Um exemplo de um esquema de seleção utiliza um fármaco para interromper o crescimento de uma célula-hospedeira. Aquelas células que são transformadas com sucesso com um gene heterólogo produzem uma proteína que confere resistência ao fármaco e, assim, sobrevivem ao regime de seleção. Exemplos de tal seleção dominante usa o fármaco neomicina, ácido micofenólico e higromicina.

Outro exemplo de marcadores adequados para células de mamí- fero são aqueles que permitem a identificação de células competentes para captar o ácido nucleico do anticorpo, tais como DHFR, quinase de timidina, metalotioneína-l e -II, de preferência genes de metalotioneína de primata, deaminase de adenosina, decarboxilase de ornitina, etc.

Por exemplo, células transformadas com o gene de seleção DH- FR são primeiro identificadas através de cultura de todos os transformantes em um meio de cultura que contém metotrexato (Mtx), um antagonista com- petitivo de DHFR. Uma célula-hospedeira apropriada quando DHFR do tipo silvestre é empregado é a linhagem de células de ovário de hâmster Chinês (CHO) deficiente em atividade de DHFR.

Alternativamente, células hospedeiras (particularmente hospe- deiros do tipo silvestre que contêm DHFR endógeno) transformadas ou co- transformadas com seqüências de DNA que codificam anticorpo, proteína DHFR do tipo silvestre e outro marcador selecionável, tal como 3'- fosfotransferase de aminoglicosídeo (APH) podem ser selecionadas através de crescimento das células em meio contendo um agente de seleção para o marcador selecionável, tal como um antibiótico aminoglicosídico, por exem- plo, canamicina, neomicina ou G418. Veja Patente U.S. No. 4.965.199.

Um gene de seleção adequado para uso em Ievedo é o gene trpl presente no plasmídeo de Ievedo YRp7 (Stinchcomb e outros (1979) Nature 282: 39). O gene trpl proporciona um marcador de seleção para uma cepa mutante de Ievedo carecendo da capacidade de crescer em triptofano, por exemplo, ATCC No. 44076 ou PEP4-1 (Jones (1977) Genetics 85: 12). A presença da lesão pelo trpl no genoma da célula-hospedeira de levedo, en- tão, proporciona um ambiente eficaz para detectar a transformação através de crescimento na ausência de triptofano. Similarmente, cepas de Ievedo iew2-deficientes (ATCC 20.622 ou 38.626) são complementadas por plasmí- deos conhecidos trazendo o gene Leu2.

Além disso, vetores derivados do plasmídeo circular de 1,6 μηη pKDI podem ser usados para transformação de Ievedos Kluyveromyces. Al- ternativamente, um sistema de expressão para a produção em larga escala de quimiosina recombinante de bezerro foi reportada para K. Iactis. Van den Berg (1990) Bio/Technology 8: 135. Vetores de expressão com múltiplas có- pias estáveis para secreção de albumina de soro humano recombinante ma- dura por cepas industriais de Kluyveromyces também foram divulgados (Fle- er e outros (1991) Bio/Technology 9: 968-975). (iv) Componente promotor

Vetores de expressão e clonagem usualmente contêm um pro- motor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e é operavelmente li- gado ao ácido nucleico de anticorpo. Promotores adequados para uso com hospedeiros procariotas incluem o promotor phoA, os sistemas do promotor de β-lactamase e lactose, fosfatase alcalina, o sistema de promotor de tripto- fano (trp) e promotores híbridos, tal como o promotor tac. Contudo, outros promotores bacterianos são adequados. Promotores para uso em sistemas bacterianos também conterão uma seqüência de Shine-Dalgarno (S.D.) ope- ravelmente ligada ao DNA que codifica o anticorpo.

Seqüências promotoras são conhecidas para eucariotas. Virtu- almente, todos os genes eucariotas têm uma região rica em AT localizada aproximadamente 25 a 30 bases a montante do sítio onde transcrição é ini- ciada. Outra seqüência encontrada 70 a 80 bases a montante do início de transcrição de muitos genes é uma região CNCAAT, onde N pode ser qual- quer nucleotídeo. Na extremidade 3' da maioria dos genes eucariotas, está uma seqüência AATAAA que pode ser o sinal para adição da cauda poliA à extremidade 3' da seqüência de codificação. Todas essas seqüências são, adequadamente, inseridas em vetores de expressão eucariotas.

Exemplos de seqüências promotoras para uso com hospedeiros de Ievedo incluem os promotores para quinase de 3-fosfoglicerato ou outras enzimas giicolíticas, tais como enolase, de-hidrogenase de gliceraldeído-3- fosfato, hexoquinase, decarboxilase de piruvato, fosfo-frutoquinase, isome- rase de glicose-6-fosfato, mutase de 3-fosfoglicerato, quinase de piruvato, isomerase de triosefosfato, isomerase de fosfoglicose e glicoquinase.

Outros promotores de Ievedo os quais são promotores induzíveis tendo a vantagem adicional de transcrição controlada por condições de crescimento são as regiões promotoras para de-hidrogenase 2 de álcool, isocitocroma C, fosfatase ácida, enzimas degradativas associadas ao meta- bolismo de nitrogênio, metalotioneína, de-hidrogenase de gliceraldeído-3- fosfato e enzimas responsáveis pela utilização de maltose e galactose. Veto- res e promotores adequados para uso em expressão de Ievedo são ainda descritos no EP 73.657. Intensificadores de Ievedo também são, vantajosa- mente, usados com promotores de levedo.

Transcrição de anticorpo a partir de vetores em células hospe- deiras é controlada, por exemplo, por promotores obtidos dos genomas de vírus tais como polioma vírus, vírus da rubéola, adenovírus (tal como Adeno- vírus 2), papiloma vírus bovino, sarcoma vírus aviário, citomegalovírus, um retrovírus, vírus da hepatite B e, mais preferivelmente, vírus Simian 40 (SV40), de promotores de mamífero heterólogos, por exemplo, o promotor de actina ou um promotor de imunoglobulina, de promotores de choque tér- mico, contanto que tais promotores sejam compatíveis com os sistemas da célula-hospedeira.

Os promotores tardio e precoce do vírus SV40 são convenien- temente obtidos como um fragmento de restrição de SV40 que também con- tém a origem de replicação viral do SV40. O promotor precoce imediato do citomegalovírus humano é, convenientemente, obtido como um fragmento de restrição Hindlll E. Um sistema para expressão de DNA em hospedeiros mamíferos usando o papiloma vírus bovino como um vetor é divulgado na Patente U.S. No. 4.419.446. Uma modificação desse sistema é descrita na Patente U.S. No. 4.601.978. Veja também Reyes e outros (1982) Nature 297: 598-601 sobre a expressão de cDNA de β-interferon humano em célu- las de camundongo sob o controle de um promotor de quinase de timidina do vírus do herpes simplex. Alternativamente, a repetição terminal longa do vírus do sarcoma de Rous pode ser usada como o promotor.

(v) Componente elemento intensificador

A transcrição de um DNA que codifica o anticorpo da presente invenção por eucariotas superiores é freqüentemente aumentada através de inserção de uma seqüência intensificadora no vetor. Muitas seqüências in- tensificadoras são agora conhecidas de genes de mamífero (globina, elasta- se, albumina, α-fetoproteína e insulina). Tipicamente, contudo, se usará um intensificador de um vírus de célula eucariota. Exemplos incluem o intensifi- cador de SV40 sobre o lado posterior da origem de replicação (bp 100-270), o intensificador do promotor precoce de citomegalovírus, o intensificador de polioma sobre o lado posterior da origem de replicação e intensificadores de adenovírus. Veja também Yaniv (1982) Nature 297: 17-18 sobre elementos de intensificação para ativação de promotores eucariotas. O intensificador pode ser unido ao vetor em uma posição 5' ou 3' à seqüência de codificação do anticorpo mas, de preferência, está localizado em um lado 5' a partir do promotor.

(vi) Componente término de transcrição

Vetores de expressão usados em células hospedeiras eucariotas (células de levedo, fungo, inseto, planta, animal, humana ou nucleadas de outros organismos multicelulares) também conterão seqüências necessárias para o término de transcrição e para estabilização do mRNA. Tais seqüên- cias estão comumente disponíveis a partir das regiões não traduzidas 5' e, ocasionalmente, 3' dos DNAs ou cDNAs virais ou eucariotas. Essas regiões contêm segmentos nucleotídicos transcritos como fragmentos poliadenilados na porção não traduzida do mRNA que codifica o anticorpo. Um componente de término de transcrição útil é a região de poliadenilação de hormônio de crescimento bovino. Veja W094/11026 e o vetor de expressão divulgado no mesmo.

(vii) Seleção e transformação de células hospedeiras

Células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão do DNA nos vetores aqui são as células procariotas, de levedo ou eucariotas superiores descritas acima. Procariotas adequados para essa finalidade in- cluem eubactérias, tais como organismos Gram-negativos ou Gram- positivos, por exemplo, Enterobacteriaceae1 tal como Escherichia, por exem- plo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por e- xemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por exemplo, Serratia marces- cans e Shigella, bem como Bacillil tais como B. subtilis e B. Iicheniformis (por exemplo, B. Iieheniformis 4IP divulgado no DD 266.710 publicado em 12 de Abril de 1989), Pseudomonas, tal como P. aeruginosa e Streptomyees. Um hospedeiro de clonagem de E. coli preferido é E. coli 294 (ATCC 31.446), embora outras cepas, tais como E. coli Β, E. coli X1776 (ATCC 31.537) e E. coli W3110 (ATCC 27.325) sejam adequadas. Esses exemplos são ilustrati- vos ao invés de limitativos.

Além de procariotas, micróbios eucariotas, tais como fungos fi- Iamentosos ou levedos, são hospedeiros de clonagem ou expressão ade- quados para vetores de codificação de anticorpo. Saccharomyces cerevisiae ou Ievedo de padaria, é o mais comumente usado dentre micro-organismos hospedeiros eucariotas inferiores. Contudo, uma série de outros gêneros, espécies e cepas estão comumente disponíveis e são úteis aqui, tais como Schizosaccharomyces pombe; hospedeiros Kluyveromyces, tais como, por exemplo, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906), K. thermotolerans e K. marxianus; yarrowia (EP 402.226); Pichia pastor (EP 183.070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244.234); Neurospora crassa; Schwanniomyces, tal como Schwanniomyces occidenta- lis; e fungos filamentosos tais como, por exemplo, hospedeiros Neurospora, Penicillium, Tolypocladium e Aspergillus, tais como A. nidulans e A. niger.

Células hospedeiras adequadas para a expressão de anticorpo glicosilado são derivadas de organismos multicelulares. Exemplos de células de invertebrado incluem células de planta e inseto. Numerosas cepas bacu- Iovirais e variantes e células hospedeiras de inseto permissivas correspon- dentes de hospedeiros, tais como Spodoptera frugiperda (lagarta), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca da fruta) e Bombyx mori foram identificadas. Uma variedade de ce- pas virais para transfecção estão publicamente disponíveis, por exemplo, a variante L-1 de Autographa californica NPV e a cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV e tais vírus podem ser usados como o vírus aqui de acordo com a pre- sente invenção, particularmente para a transfecção de células de Spodopte- ra frugiperda. Culturas de células de planta de algodão, milho, batata, soja, petúnia, tomate e tabaco podem também ser utilizadas como hospedeiros.

Contudo, tem havido grande interesse em células de vertebrado e propagação de células de vertebrado em cultura (cultura tecidual) se tor- nou um procedimento de rotina. Exemplos de linhagens de células hospedei- ras de mamífero úteis são a linhagem CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); a linhagem de rim embriônico humano (células 293 ou 293 subclonadas para crescimento em cultura em suspen- são, Graham e outros (1977) J. Gen Viroi 36: 59); células de rim de hâmster bebê (BHK, ATCC CCL 10); células de ovário de hâmster Chinês/-DHFR (CHO, Urlaub e outros (1980) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77: 4216); células de Sertoli de camundongo (TM4, Mather (1980) Biol. Reprod. 23: 243-251 ); células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); célula de rim de macaco African green (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pul- mão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather e outros (1982) Armais Ν. Υ. A cad. Sei. 383: 44-68); células MRC5; células FS4; e uma linhagem de hepatoma humano (Hep G2).

Células hospedeiras são transformadas com os vetores de ex- pressão ou clonagem acima descritos para produção de anticorpo e cultiva- das em meios nutrientes convencionais modificados conforme apropriado para indução de promotores, seleção de transformantes ou amplificação dos genes que codificam as seqüências desejadas, (viii) Cultura de células hospedeiras As células hospedeiras usadas para produzir o anticorpo da pre- sente invenção podem ser cultivadas em uma variedade de meios. Meios comercialmente disponíveis, tais como HarrTs F10 (Sigma), Meio Mínimo Essencial ((MEM)1 (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) e Meio de Eagle Modificado de Dulbecco ((DMEM), Sigma) são adequados para cultura das células hos- pedeiras. Além disso, qualquer um dos meios descritos em Ham e outros (1979) Meth. Enz. 58: 44, Barnes e outros (1980) Anal. Biochem. 102: 255, Pats. U.S. Nos. 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; ou 5.122.469; WO 90/03430; WO 87/00195; ou Patente U.S. Re. 30.985 podem ser usadas como meio de cultura para as células hospedeiras. Qualquer um desses meios pode ser suplementado conforme necessário com hormônios e/ou outros fatores de crescimento (tais como insulina, transferrina ou fator de crescimento epidérmico), sais (tais como cloreto de sódio, cálcio, magnésio e fosfato), tampões (tal como HEPES), nucleotídeos (tais como adenosina e timidina), antibióticos (tal como o fármaco GENTAMYCIN™), elementos ves- tigiais (definidos como compostos inorgânicos usualmente presentes em concentrações finais na faixa micromolar) e glicose ou uma fonte de energia equivalente. Quaisquer outros suplementos necessários podem também ser incluídos em concentrações apropriadas que serão conhecidos por aqueles versados na técnica. As condições de cultura, tais como temperatura, pH e semelhantes, são aquelas previamente usadas com a célula-hospedeira se- lecionada para expressão e serão evidentes para aqueles versados, (ix) Purificação de anticorpo

Quando de uso de técnicas recombinantes, o anticorpo pode ser produzido intracelularmente, no espaço periplásmico ou diretamente secre- tado no meio. Se o anticorpo é produzido intracelularmente, como uma pri- meira etapa, os resíduos em partícula, sejam células hospedeiras ou frag- mentos submetidos à lise, são removidos, por exemplo, através de centrifu- gação ou ultrafiltração. Carter e outros (1992) Bio/Technology 10: 163-167 descrevem um procedimento para isolamento de anticorpos os quais são secretados no espaço periplásmico de E. coli. Resumidamente, a pasta de células é descongelada na presença de acetato de sódio (pH de 3,5), EDTA e fluoreto de fenilmetil-sulfonila (PMSF) durante cerca de 30 min. Os resí- duos de célula podem ser removidos através de centrifugação. Onde o anti- corpo é secretado no meio, sobrenadantes de tais sistemas de expressão são, geralmente, primeiro concentrados usando um filtro de concentração de proteína comercialmente disponível, por exemplo, uma unidade de ultrafiltra- ção Amicon ou Millipore Pellicon. Um inibidor de protease, tal como PMSF, pode ser incluído em qualquer uma das etapas precedentes para inibir a pro- teólise e antibióticos podem ser incluídos para impedir crescimento de con- taminantes adventícios.

A composição de anticorpo preparada a partir das células pode ser purificada usando, por exemplo, cromatografia em hidroxiapatita, eletro- forese em gel, diálise e cromatografia por afinidade, com cromatografia por afinidade sendo a técnica de purificação preferida. A adequabilidade da pro- teína A como um Iigante de afinidade depende da espécie e isotipo de qual- quer domínio Fc de imunoglobulina que esteja presente no anticorpo, proteí- na A pode ser usada para purificar anticorpos que são baseados em cadeias pesadas γ1, γ2 ou γ4 humanas (Lindmark e outros (1983) J. Immunol. Meth. 62: 1-13). Proteína G é recomendada para todos os isotipos de camundongo e para γ3 humana (Guss e outros (1996) EMBO J. 5: 1567-1575). A matriz à qual o Iigante de afinidade é preso é, mais freqüentemente, agarose, mas outras matrizes estão disponíveis. Matrizes mecanicamente estáveis, tais como vidro com poro controlado ou (poli)estirenodivinil benzeno, permitem taxas de fluxo mais rápidas e tempos de processamento mais curtos do que pode ser obtido com agarose. Onde o anticorpo compreende um domínio Ch3, a resina Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) é útil para pu- rificação. Outras técnicas para purificação de proteína, tais como fraciona- mento sobre uma coluna de troca de íons, precipitação de etanol, HPLC de fase reversa, cromatografia sobre sílica, cromatografia sobre heparina, cro- matografia em SEPHAROSE™, cromatografia sobre uma resina de troca de ânions ou cátions (tal como uma coluna de ácido poliaspártico), cromatofo- calização, SDS-PAGE e precipitação com sulfato de amônio, também estão disponíveis, dependendo do anticorpo a ser recuperado. Após qualquer etapa de purificação preliminar, a mistura com- preendendo o anticorpo de interesse e contaminantes pode ser submetida à cromatografia por interação hidrofóbica em baixo pH usando um tampão de eluição em um pH entre cerca de 2,5-4,5, de preferência realizada em baixas concentrações de sal (por exemplo, de cerca de 0-0,25M de sal). Formulações farmacêuticas

Formulações farmacêuticas do anticorpo são preparadas para armazenamento através de mistura do anticorpo tendo o grau desejado de pureza com veículos, excipientes ou estabilizantes fisiologicamente aceitá- veis opcionais (Remingtorís Pharmaceutical Sciences, 16a edição, Osol, A. Ed. (1980)), na forma de formulações Iiofilizadas ou soluções aquosas. Veí- culos, excipientes ou estabilizantes aceitáveis são não tóxicos para os reci- pientes nas dosagens e concentrações empregadas e incluem tampões, tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes, incluindo áci- do ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecil dime- tilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio; cloreto de benzetônio; fenol; álcool butílico ou benzílico; alquil parabenos, tais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m- cresol); polipeptídeo de baixo peso molecular (menos do que cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina de soro, gelatina ou imunoglobuli- nas; polímeros hidrofílicos, tal como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossaca- rídeos, dissacarídeos e outros carboidratos, incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes de quelação, tal como EDTA; açúcares, tais como saca- rose, manitol, trealose ou sorbitol; contra-íons de formação de sal, tal como sódio; complexos de metal (por exemplo, complexos de Zn-proteína); e/ou tensoativos não-iônicos, tais como TWEEN™, PLURONICS™ ou polietileno glicol (PEG).

A formulação aqui pode também conter mais de um composto ativo, conforme necessário, para a indicação que está sendo tratada em par- ticular, de preferência aqueles com atividades complementares que não afe- tam adversamente uns aos outros. Por exemplo, pode ser desejável propor- cionar ainda um agente imunossupressor. Tais moléculas estão, adequada- mente, presentes em combinação em quantidades que são eficazes para a finalidade pretendida.

Os ingredientes ativos podem também estar encerrados em uma microcápsula preparada, por exemplo, através de técnicas de coacervação ou através de polimerização interfacial, por exemplo, microcápsula de hidró- ximetil celulose ou microcápsula de gelatina e metacrilato de (poli)metila, respectivamente, em sistemas de distribuição de fármaco coloidais (por e- xemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartícu- Ias e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são divulgadas em Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A. Ed. (1980).

As formulações a serem usadas para administração in vivo de- vem ser estéreis. Isso é prontamente obtido por meio de filtração através de membranas de filtração estéreis.

Preparados com liberação sustentada podem ser feitos. Exem- plos adequados de preparados com liberação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o anticorpo, matrizes as quais estão na forma de artigos formatados, por exemplo, filmes ou microcápsula. Exemplos de matrizes com liberação sustentada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, (poli)2 metacrilato de hidroxietila ou ál- cool (poli)vinílico, polilactídeos (Pat. U.S. No. 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e etil-L-glutamato, acetato de etileno vinila não degradá- vel, copolímeros degradáveis de ácido láctico-ácido glicólico, tal como o LU- PRON DEPOT® (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico e acetato de leuprolida) e ácido poli-D-(-)-3- hidroxibutírico. Embora polímeros, tais como acetato de etileno vinila e ácido láctico-ácido glicólico permitam a liberação de moléculas durante mais de 100 dias, determinados hidrogéis liberam proteínas durante períodos de tempo mais curtos. Quando anticorpos encapsulados permanecem no corpo durante longo tempo, eles podem desnaturar ou agregar como um resultado de exposição à umidade a 37°C, resultando em uma perda de atividade bio- lógica e possíveis alterações na imunogenicidade. Estratégias racionais po- dem ser criadas para estabilização, dependendo do mecanismo envolvido. Por exemplo, se descobriu-se que o mecanismo de agregação é formação de ligação S-S intermolecular através de intertroca de tiodissulfeto, estabili- zação pode ser obtida através de modificação de resíduos de sulfidrila, Iiofili- zação a partir de soluções ácidas, controle do teor de umidade, uso de aditi- vos apropriados e desenvolvimento de composições de matriz polimérica específicas. Usos terapêuticos

Considera-se que o anticorpo da presente invenção pode ser usado para tratar um mamífero. Em uma modalidade, o anticorpo é adminis- trado a um mamífero não humano para fins de obtenção de dados pré- clínicos, por exemplo. Mamíferos não humanos exemplificativos a serem tratados incluem primatas não humanos, cães, gatos, roedores e outros mamíferos nos quais estudos pré-clínicos são realizados. Tais mamíferos podem ser modelos animais estabelecidos para uma doença a ser tratada com o anticorpo ou podem ser usados para estudar a toxicidade do anticor- po de interesse. Em cada uma dessas modalidades, estudos de escalona- mento de dose podem ser realizados no mamífero. Onde o anticorpo é um anticorpo anti-NRP1, ele pode ser administrado a um roedor hospedeiro em um modelo de tumor sólido, por exemplo.

Além disso ou alternativamente, o anticorpo é usado para tratar um ser humano, por exemplo, um paciente sofrendo de uma doença ou dis- túrbio que poderia se beneficiar de administração do anticorpo.

A presente invenção abrange terapia antiangiogênica de câncer, uma nova estratégia de tratamento para o câncer objetivando inibir o desen- volvimento de vasos sangüíneos tumorais requeridos para fornecer nutrien- tes para suportar o crescimento do tumor. Em virtude do fato de a angiogê- nese estar envolvida em crescimento de tumor primário e metástase, o tra- tamento antiangiogênico proporcionado pela invenção é capaz de inibir o crescimento neoplásico do tumor no local primário, bem como prevenir me- tástase de tumores para locais secundários, portanto, permitindo ataque dos tumores por outros produtos terapêuticos. Exemplos de cânceres a serem tratados aqui incluem, mas não estão limitados a, carcinoma, linfoma, blas- toma, sarcoma e leucemia. Exemplos mais particulares de tais cânceres in- cluem câncer de células escamosas, câncer de pulmão (incluindo câncer de pulmão de células pequenas, câncer de pulmão de células não-pequenas, adenocarcinoma do pulmão e carcinoma escamoso do pulmão), câncer do peritônio, câncer hepatocelular, câncer gástrico ou de estômago (incluindo câncer gastrointestinal), câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer ovariano, câncer de fígado, câncer de bexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer de cólon, câncer cólon-retal, carcinoma endometrial ou uteri- no, carcinoma de glândula salivar, câncer de rim ou renal, câncer de prósta- ta, câncer vulval, câncer da tiroide, carcinoma hepático e vários tipos de câncer de cabeça e pescoço, bem como linfoma de células B (incluindo lin- foma não-Hodgkin folicular/de baixo grau (NHL); NHL linfocítico pequeno (SL); NHL folicular/de grau intermediário; NHL difuso de grau intermediário; NHL imunoblástico de alto grau; NHL linfoblástico de alto grau; NHL de pe- quenas células não clivadas de alto grau; NHL por célula volumosa; linfoma de células do manto; linfoma relacionado à AIDS; e Macroglobulinemia de Waldenstrom); leucemia linfocítica crônica (CLL); leucemia linfoblástica agu- da (ALL); leucemia de células pilosas; leucemia mieloblástica crônica; e dis- túrbio Iinfoproliferativo pós-transplante (PTLD), bem como proliferação vas- cular anormal associada à facomatoses, edema (tal como aquele associado a tumores cerebrais) e síndrome de Meig. Mais particularmente, cânceres que são passíveis de tratamento com os anticorpos da invenção incluem câncer de mama, câncer cólon-retal, câncer retal, câncer de pulmão de células não-pequenas, linfoma não-Hodgkin (NHL), câncer de células renais, câncer de próstata, câncer de fígado, câncer pancreático, sarcoma de teci- dos moles, sarcoma de Kaposi, carcinoma carcinoide, câncer de cabeça e pescoço, melanoma, câncer ovariano, mesotelioma e mieloma múltiplo.

Considera-se que, quando usados para tratar várias doenças, tais como tumores, os anticorpos da invenção podem ser combinados com outros agentes terapêuticos adequados para as mesmas ou doenças simila- res. Quando usados para o tratamento de câncer, os anticorpos da presente invenção podem ser usados em combinação com terapias convencionais para o câncer, tais como cirurgia, radioterapia, quimioterapia ou combina- ções das mesmas.

Em determinados aspectos, outros agentes terapêuticos úteis para terapia combinada de câncer com o anticorpo da invenção incluem ou- tros agentes antiangiogênicos. Muitos agentes antiangiogênicos foram identi- ficados e são conhecidos na técnica, incluindo aqueles listados por Carmeli- et and Jain (2000).

Em um aspecto, o anticorpo da invenção é usado em combinação com um antagonista de VEGF ou um antagonista do receptor de VEGF, tal como anticorpos anti-VEGF, variantes de VEGF, fragmentos do receptor de VEGF solúveis, aptâmeros capazes de bloquear o VEGF ou VEGFR, anti- corpos anti-VEGF de neutralização, inibidores de quinases de tirosina de VEGF e quaisquer combinações dos mesmos. Alternativamente ou além disso, dois ou mais anticorpos anti-NRP1 podem ser co-administrados ao paciente. Em uma modalidade mais preferida, o anticorpo anti-NRP1A ou anti-NRPB da invenção é usado em combinação com um anticorpo anti- VEGF para gerar efeitos aditivos ou sinergísticos. Anticorpos anti-VEGF pre- feridos incluem aqueles que se ligam ao mesmo epitopo que o anticorpo an- ti-hVEGF A4.6.1. Mais preferivelmente, o anticorpo anti-VEGF é bevacizu- mab ou ranibizumab.

Em alguns outros aspectos, outros agentes terapêuticos úteis para terapia combinada de tumor com o anticorpo da invenção incluem ago- nistas de outros fatores que estão envolvidos em crescimento de tumor, tais como EGFR, ErbB2 (também conhecido como Her2) ErbB3, ErbB4 ou TNF. De preferência, o anticorpo anti-NRP1 da invenção pode ser usado em com- binação com inibidores de quinase de tirosina de pequena molécula (RTKIs) que objetivam um ou mais receptores de quinase de tirosina, tais como re- ceptores de VEGF, receptores de FGF, receptores de EGF e receptores de PDGF. Muitos RTKIs de pequena molécula terapêuticos são conhecidos na técnica incluindo, mas não-limitado a, vatalanib (PTK787), erlotinib (TARCE- VA®), OSI-7904, ZD6474 (ZACTIMA®), ZD6126 (ANG453), ZD1839, suniti- nib (SUTENT®), semaxanib (SU5416), AMG706, AG013736, Imatinib (GLE- EVEC®), MLN-518, CEP-701, PKC- 412, Lapatinib (GSK572016), VELCA- DE®, AZD2171, sorafenib (NEXAVAR®), XL880 e CHIR-265.

O anticorpo anti-Nrp da invenção, seja isoladamente ou em combinação com um segundo agente terapêutico (tal como um anticorpo anti-VEGF), pode ser ainda usado em combinação com um ou mais agentes quimioterapêuticos. Uma variedade de agentes quimioterapêuticos podem ser usados nos métodos de tratamento combinado da invenção. Uma lista exemplificativa e não Iimitativa de agentes quimioterapêuticos é fornecida aqui sob "Definição".

Quando o anticorpo anti-Nrp é co-administrado com um segundo agente terapêutico, o segundo agente terapêutico pode ser administrado primeiro, seguido pelo anticorpo anti-Nrp. Contudo, administração simultâ- nea ou administração do anticorpo anti-Nrp primeiro também é considerada. Dosagens adequadas para o segundo agente terapêutico são aquelas pre- sentemente usadas e podem ser diminuídas em virtude da ação combinada (sinergia) do agente e anticorpo anti-Nrp.

Para a prevenção ou tratamento de doenças, a dosagem apro- priada do anticorpo dependerá do tipo de doença a ser tratada, da gravidade e curso da doença, se o anticorpo é administrado para fins preventivos ou terapêuticos, terapia anterior, a história clínica do paciente e resposta ao anticorpo e o critério do médico que faz o atendimento. O anticorpo é, ade- quadamente, administrado ao paciente uma vez ou durante uma série de tratamentos.

Dependendo do tipo e gravidade da doença, cerca de 1 μg/kg a 50 mg/kg (por exemplo, 0,1-20 mg/kg) de anticorpo é uma dosagem inicial candidata para administração ao paciente seja, por exemplo, através de uma ou mais administrações distintas ou através de infusão contínua. Uma dosa- gem diária típica poderia oscilar de cerca de 1 μg/kg a cerca de 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Para administrações repetidas durante vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamen- to é sustentado até que uma supressão desejada dos sintomas da doença ocorra. Contudo, outros regimes de dosagem podem ser úteis. Em um as- pecto preferido, o anticorpo da invenção é administrado a cada duas a três semanas, em uma dose oscilando de cerca de 5 mg/kg a cerca de 15 mg/kg. Mais preferivelmente, tal regime de dosagem é usado em combinação com um regime quimioterapêutico como a terapia de primeira linha para trata- mento de câncer de cólon metastático. Em alguns aspectos, o regime quimi- oterapêutico envolve a administração intermitente em alta dose tradicional. Em alguns outros aspectos, os agentes quimioterapêuticos são administra- dos usando doses menores e mais freqüentes sem interrupções esquemati- zadas ("quimioterapia metronômica"). O progresso da terapia da invenção é facilmente monitorado através de técnicas e ensaios convencionais.

A composição de anticorpo será formulada, dosada e adminis- trada de um modo consistente com a boa prática médica. Fatores a conside- rar nesse contexto incluem o distúrbio que está sendo tratado em particular, o mamífero que está sendo tratado em particular, a condição clínica do paci- ente individual, a causa do distúrbio, o local de distribuição do agente, o mé- todo de administração, o esquema de administração e outros fatores conhe- cidos pelos médicos. A "quantidade terapeuticamente eficaz" do anticorpo a ser administrada será orientada por tais considerações e é a quantidade mí- nima necessária para prevenir, aliviar ou tratar uma doença ou distúrbio. O anticorpo não precisa ser, mas é opcionalmente, formulado com um ou mais agentes atualmente usados para prevenir ou tratar o distúrbio em questão. A quantidade eficaz desses outros agentes depende da quantidade de anticor- po presente na formulação, do tipo de distúrbio ou tratamento e outros fato- res discutidos acima. Esses são geralmente usados nas mesmas dosagens e com vias de administração conforme usado aqui antes ou de cerca de 1 a 99% das dosagens empregadas até agora. Geralmente, alívio ou tratamento de uma doença ou distúrbio envolve a redução de um ou mais sintomas ou problemas médicos associados à doença ou distúrbio. No caso de câncer, a quantidade terapeuticamente eficaz do fármaco pode obter um ou uma com- binação do seguinte: reduzir o número de células cancerígenas; reduzir o tamanho do tumor; inibir (isto é, diminuir até algum grau e/ou cessar) a infil- tração de células cancerígenas nos órgãos periféricos; inibir a metástase de tumor; inibir, até algum grau, o crescimento de tumor; e/ou aliviar, até algum grau, um ou mais sintomas associados ao câncer. Até o ponto em que o fármaco pode prevenir o crescimento e/ou matar células cancerígenas exis- tentes, ele pode ser citostático e/ou citotóxico. Em algumas modalidades, uma composição da presente invenção pode ser usada para prevenir o início ou re-ocorrência da doença ou distúrbio em um indivíduo ou mamífero. Usos não terapêuticos

Os anticorpos da invenção podem ser usados como agentes de purificação por afinidade. Nesse processo, os anticorpos são imobilizados sobre uma fase sólida, tal como uma resina Sephadex ou papel filtro, usando métodos bem conhecidos na técnica. O anticorpo imobilizado é contatado com uma amostra contendo o antígeno a ser purificado e, após o que, o su- porte é lavado com um solvente adequado que removerá substancialmente todo o material na amostra, exceto o antígeno a ser purificado, o qual está ligado ao anticorpo imobilizado. Finalmente, o suporte é lavado com outro solvente adequado, tal como tampão de glicerina, pH de 5,0, que liberará o antígeno do anticorpo.

Os anticorpos da presente invenção podem também ser úteis em ensaios diagnósticos, por exemplo, para detecção de expressão de um antígeno de interesse em células, tecidos ou soro específico.

Para aplicações diagnosticas, o anticorpo será, tipicamente, ro- tulado com uma porção detectável. Numerosos rótulos estão disponíveis, os quais podem ser geralmente agrupados nas seguintes categorias:

(a) Radioisótopos, tais como 35S, 14C, 125I1 3H e 131I. O anticorpo pode ser rotulado com o radioisótopo correspondente usando as técnicas descritas em Current Protocols in Immunology, Volumes 1 e 2, Coligen e outros (1991) Ed. Wiley-lnterscience, New York, New York, Pubs, por exem- plo e a radioatividade medida usando contagem de cintilação.

(b) Rótulos fluorescentes, tais como quelatos de terras raras (quelatos de európio) ou fluoresceína e seus derivados, rodamina e seus derivados, dansila, Lissamina, ficoetritina e Texas Red estão disponíveis. Os rótulos fluorescentes podem ser conjugados ao anticorpo usando as técnicas divulgadas em Current Protocols in Immunology, supra, por exemplo. A fluo- rescência pode ser quantificada usando um fluorímetro. (c) Vários rótulos de enzima-substrato estão disponíveis e a Patente U.S. No. 4.275.149 pro- porciona uma revisão de alguns deles. A enzima geralmente catalisa uma alteração química do substrato cromogênico, a qual pode ser medida usando várias técnicas. Por exemplo, a enzima pode catalisar uma alteração de cor em um substrato, a qual pode ser medida espectrofotometricamente. Alter- nativamente, a enzima pode alterar a fluorescência ou quimioluminescência do substrato. Técnicas para quantificação de uma alteração na fluorescência são descritas acima. O substrato quimioluminescente se torna eletronica- mente excitado por uma reação química e pode, então, emitir luz, a qual po- de ser medida (usando um quimioluminômetro, por exemplo) ou doar ener- gia a um aceitador de fluorescência. Exemplos de rótulos enzimáticos inclu- em Iuciferases (por exemplo, Iuciferase de vaga-lume e Iuciferase bacteria- na; Patente U.S. No. 4,737,456), luciferina, 2,3-di-hidroftalazina dionas, de- hidrogenase de malato, uréase, peroxidase, tal como peroxidase de armorá- cia (HRPO), fosfatase alcalina, β-galactosidase, glicoamilase, lisozima, oxi- dases de sacarídeo (por exemplo, oxidase de glicose, oxidase de galactose e de-hidrogenase de glicose-6-fosfato), oxidases heterocíclicas (tais como uricase e oxidase de xantina), lactoperoxidase, microperoxidase e semelhan- tes. Técnicas para conjugação de enzimas a anticorpos são descritas em O1SuIIivan e outros (1981) Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, em Methods in Enzym. (ed J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, New York 73: 147-166.

Exemplos de combinações de enzima-substrato incluem, por

exemplo:

(i) Peroxidase de armorácia (HRPO) com peroxidase de hidro- gênio como um substrato, em que a peroxidase de hidrogênio oxida um pre- cursor de corante (por exemplo, ortofenileno diamina (OPD) ou cloridrato de 3,3',5,5'-tetrametil benzidina (TMB));

(ii) fosfatase alcalina (AP) com fosfato de para-nitrofenila como substrato cromogênico; e

(iii) β-D-galactosidase (β-D-Gal) com um substrato cromogênico (por exemplo, p-nitrofenil-p-D-galactosidase) ou o substrato fluorogênico A- metilumbeliferil-p-D-galactosidase.

Numerosas outras combinações de enzima-substrato estão dis- poníveis para aqueles versados na técnica. Para uma revisão geral das mes- mas veja Patentes U.S. Nos. 4.275.149 e 4.318.980.

Algumas vezes, o rótulo é indiretamente conjugado com o anti- corpo. Aqueles versados na técnica estarão cientes de várias técnicas para obtenção disso. Por exemplo, o anticorpo pode ser conjugado com biotina e qualquer uma das três amplas categorias de rótulos mencionados acima po- de ser conjugada com avidina ou vice-versa. A biotina se liga seletivamente à avidina e, assim, o rótulo pode ser conjugado com o anticorpo dessa ma- neira indireta. Alternativamente, para obter conjugação indireta do rótulo com o anticorpo, o anticorpo é conjugado com um pequeno hapteno (por exem- plo, digoxina) e um dos diferentes tipos de rótulos mencionados acima é conjugado com um anticorpo anti-hapteno (por exemplo, anticorpo antidigo- xina). Assim, conjugação indireta do rótulo com o anticorpo pode ser obtida.

Em outra modalidade da invenção, o anticorpo não precisa ser rotulado e a presença do mesmo pode ser detectada usando um anticorpo rotulado o qual se liga ao anticorpo.

Os anticorpos da presente invenção podem ser empregados em qualquer método de ensaio conhecido, tais como ensaios de ligação compe- titiva, ensaios em sanduíche diretos e indiretos e ensaios de imunoprecipita- ção. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, páginas 147-158 (CRC Press, Inc. 1987).

Ensaios de ligação competitiva contam com a capacidade de um padrão rotulado de competir com um analito na amostra de teste pela liga- ção com uma quantidade limitada de anticorpo. A quantidade de antígeno na amostra de teste é inversamente proporcional à quantidade de padrão que se torna ligado aos anticorpos. Para facilitar a determinação da quantidade de padrão que se toma ligado, os anticorpos são, em geral, insolubilizados antes ou após a competição, de modo que o padrão e o analito que estão ligados aos anticorpos podem, convenientemente, ser separados do padrão e analito os quais permanecem não ligados.

Ensaios em sanduíche envolvem o uso de dois anticorpos, cada um capaz de ligação a uma porção imunogênica diferente, ou epitopo, da proteína a ser detectada. Em um ensaio em sanduíche, o analito na amostra de teste é ligado por um primeiro anticorpo o qual é imobilizado sobre um suporte sólido e, após o que, um segundo anticorpo se liga ao analito, assim, formando um complexo insolúvel com três partes. Veja, por exemplo, Pat. U.S. No. 4.376.110. O segundo anticorpo pode, em si, ser rotulado com uma porção detectável (ensaios em sanduíche diretos) ou pode ser medido usan- do um anticorpo anti-imunoglobulina que é rotulado com uma porção detec- tável (ensaio em sanduíche indireto). Por exemplo, um tipo de ensaio em sanduíche é um ensaio ELISA, caso no qual a porção detectável é uma en- zima.

Para imunohistoquímica, a amostra de tumor pode ser fresca ou congelada ou pode estar incrustada em parafina e fixada com um conser- vante, tal como formalina, por exemplo.

Os anticorpos também podem ser usados para ensaios diagnós- ticos in vivo. Geralmente, o anticorpo é rotulado com um radionuclídeo (tal como mIn, 99Tc, 14C1 131I1 125I13H, 32P ou 35S) ou um corante, de modo que o tumor possa ser localizado usando imunocintiografia.

Em uma modalidade, um método de detecção de NRP1 em uma amostra biológica (por exemplo, tecido, sangue, soro, fluido espinhal) ou uma amostra biológica preparada pode compreender a etapa de contato de um anticorpo da presente invenção com a amostra e observando o anticorpo anti-NRP1 ligado a Nrpl na amostra ou determinando-se a quantidade do anticorpo anti-NRPI ligado a Nrpl na amostra. Em outra modalidade, um método de detecção de NRP1 em um indivíduo compreende a etapa de ad- ministração de um anticorpo da presente invenção ao indivíduo e observa- ção do anticorpo anti-NRP1 ligado à NPR1 no indivíduo ou determinação da quantidade do anticorpo anti-NRP1 ligado a Nrpl no indivíduo (por exemplo, ser humano, camundongo, coelho, rato, etc.). Kits Diagnósticos

Como uma questão de conveniência, o anticorpo da presente invenção pode ser proporcionado em um kit, isto é, uma combinação emba- lada de reagentes em quantidades predeterminadas com instruções para realização do ensaio diagnóstico. Onde o anticorpo é rotulado com uma en- zima, o kit incluirá substratos e co-fatores requeridos pela enzima (por e- xemplo, um precursor de substrato o qual proporciona o cromóforo ou fluoró- foro detectável). Além disso, outros aditivos podem ser incluídos, tais como estabilizantes, tampões (por exemplo, um tampão de bloqueio ou tampão de lise) e semelhantes. As quantidades relativas dos vários reagentes podem ser variadas amplamente para proporcionar as concentrações em solução dos reagentes as quais otimizam substancialmente a sensibilidade do ensai- o. Particularmente, os reagentes podem ser fornecidos como pós secos, u- sualmente liofilizados, incluindo excipientes os quais, quando de dissolução, proporcionarão uma solução reagente tendo a concentração apropriada. Artigos de Fabricação

Em outra modalidade da invenção, um artigo de fabricação con- tendo materiais úteis para o tratamento dos distúrbios descritos acima é pro- porcionado. O artigo de fabricação compreende um recipiente e um rótulo. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas e tubos de ensaio. Os recipientes podem ser formados de uma variedade de materiais, tais como plástico ou vidro. O recipiente contém uma composição a qual é eficaz para tratamento da condição e pode ter um orifício de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser um saco de solução intravenosa ou um frasco tendo uma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipo- dérmica). O agente ativo na composição é o anticorpo. O rótulo sobre ou associado ao recipiente indica que a composição é usada para tratamento da condição de escolha. O artigo de fabricação pode compreender ainda um segundo recipiente compreendendo um tampão farmaceuticamente aceitá- vel, tal como solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Ele pode ainda incluir outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas e bulas com instruções para uso.

Os exemplos a seguir se destinam meramente a ilustrar a prática da presente invenção e não são proporcionados como forma de limitação. As divulgações de todas as patentes e literaturas científicas citadas aqui são expressamente incorporadas em sua totalidade por referência. EXEMPLOS Exemplo 1

Construções e Função de anticorpos anti-Nrp1B e anti-panNrpA

Uma estratégia para desenvolver anticorpos derivados de fago que bloqueiam seletivamente a ligação de semaforina ou VEGF a Nrpl foi reportada por Liang e outros, J Mol Biol 366, 815-29 (2007) e Pan e outros, Câncer Cell 11, 53-67 (2007). Esses anticorpos monoclonais foram criados como ferramentas para discriminar entre repostas Nrpl-mediadas ao Iigante e para avaliar seu potencial como produtos terapêuticos em modelos de tu- mor em murino.

Em resumo, uma biblioteca de fago de anticorpo sintético huma- no foi criada que foi construída sobre uma única base de consenso com di- versidade VH/VL. Detalhes do projeto e seleção dessa biblioteca de anticor- po são escritos em Liang e outros, supra e também podem ser encontrados no WO 03/102157, publicado em 11 de Dezembro de 2003, a descrição toda do qual é incorporada aqui por referência. A partir dessa biblioteca, anticor- pos de bloqueio funcionais a Nrpl humana e de murino foram gerados. Ma- peamento de anticorpo ao domínio b1b2 de NRP1 poderia bloquear a liga- ção de VEGF e NRP1 e a migração de células HUVEC VEGF-induzida. Os anticorpos identificados incluem um anticorpo de bloqueio de VEGF (clone YW107.4.87; anti-Nrp1B) que se liga a Nrpl com uma afinidade de 0,2 nM (Liang e outros, supra; Pan e outros, supra). Embora esse anticorpo bloqueia a interação entre VEGF e Nrpl, ele não antagoniza a função de Sema3A. In vivo, o anti-Nrp1B não apenas reduz o remodelamento vascular na retina de camundongo, mas também funciona aditivamente com terapia anti-VEGF para diminuir o crescimento de tumor (Liang e outros, supra e Pan e outros, supra).

Seguindo a mesma abordagem, usando uma biblioteca de fago de anticorpo sintético humano construída sobre uma única estrutura "frame- work" de consenso, um anticorpo (clone YW68.11.26, anti-panNrpA) foi de- senvolvido, o qual reage cruzadamente com a Nrpl e Nrp2 com afinidades de 0,21 e 0,15 nM, respectivamente (Fig. S1). As seqüências de domínio variável de cadeias leve e pesada do YW68.11.26 e YW68.11 relacionado são mostradas nas Figuras 7 e 8, respectivamente. As seqüências de ami- noácido dos fragmentos Fab de anticorpos de IgGI anti-panNrpA YW68.11 e YW68.11.26 são mostradas nas Figuras 9A e 9B, respectivamente.

Em contraste ao anti-Nrp1B, o anti-panNrpA não afeta a ligação de VEGF165 ou VEGF-C (dados não mostrados). Avaliação da capacidade de ambos os anticorpos de inibir o colapso Sema3A-mediado de cones de crescimento axonal de gânglios da raiz dorsal de murino (DRG) (Fig. 1). A adição de Sema3A resulta na retração dos processos de actina com os co- nes de crescimento de DRG; essa ação é completamente antagonizada pelo anti-panNrpA, mas não pelo anti-Nrp1B. Exemplo 2

Estudos Estruturais de Complexos de Neuropilina/Anticorpo Materiais e Métodos

Ensaios funcionais e afinidades de ligação de anticorpo

Ensaios de colapso e determinação de afinidades de ligação de anticorpo anti-Nrp foram realizados conforme previamente descrito (He, Z. e Tessier-Lavigne, M., Ceil 90, 739-51 (1997); Liang e outros, supra e Pan e outros, supra.

Expressão de proteína e purificação para estudos cristalográficos

Nrp1-b1, Nrp1-b1b2 e Nrp2-b1b2 (veja Tabela S1 para limites de domínio) foram clonados no pET15b (Novagen) e expressos em E. coli após indução a 37°C (Nrp1-b1 e -b1b2) ou 16°C (Nrp2-b1b2). Todos os fragmen- tos de neuropilina do tipo b são expressos como proteínas solúveis sem a necessidade de um protocolo de reduplicação. Após Iise celular, proteínas foram purificadas usando resina de níquel-ácido nitrilotriacético (Ni-NTA) em Tris a 50 mM (pH de 8,0), NaCI a 300-500 mM e imidazol a 20 mM e eluídas no mesmo tampão mais imidazol a 250 mM. As his6-tags foram removidas com trombina e as amostras foram ainda purificadas através de cromatogra- fia por filtração em gel usando uma coluna Superdex-75 equilibrada em Tris a 25 mM (pH de 8,0) e NaCI a 150 mM.

Baculovírus recombinantes foram gerados para facilitar a secre- ção de Nrp1-a2b1b2, Nrp2-a2b1b2, Nrp2-a1a2b1b2 e a Nrp2-ECD de comprimento total (Tabela SI) de células Hi5. Nrp2-a1a2b1b2 e a Nrp2-ECD de comprimento total foram subclonados com o sinal de secreção nativo de Nrp2 e uma His6-tag C-terminal no pENTR/D-TOPO (Invitrogen) e recombi- nados em pDEST8 (Invitrogen) para gerar um bacmídeo viral. Nrp1-a2b1b2 e Nrp2-a2b1b2 foram clonados no pAcGP67B (Clonetech). Após injeção, o meio de cultura foi coletado e suplementado com Tris a 50 mM (pH de 8,0), CaCI2 a 5 mM e NiCI2 a 1 mM; as proteínas foram purificadas com Ni-NTA e uma cromatografia de filtração em gel, conforme descrito para construtos de neuropilina expressos em bactérias.

Os fragmentos Fab para anti-Nrp1B (YW107.4.87) e anti-panNrpA (YW68.11.26) foram expressos em E. coli, capturados sobre uma coluna de Proteína G equilibrada em PBS e eluídos com ácido acético a 0,58%. Fra- ções de proteína foram ainda purificadas através de cromatografia de troca (SP-sepharose) em MES a 20 mM (pH de 5,5) e eluída com um gradiente de NaCI a 0 a 250 mM. Complexos de Fab/Nrp foram, tipicamente, misturados em uma proporção molar de 1:1 e ainda purificados usando uma coluna Su- perdex-200 equilibrada em Tris-HCI a 25 mM (pH de 7,5) e NaCI a 200 mM. Para cristalização, todas as amostras de neuropilina não ligada e complexo de Nrp/Fab foram concentradas, conforme detalhado na Tabela S1. Cristalização, determinação de estrutura e refino

Todos os cristais foram obtidos através do método de difusão a vapor a 19°C através de mistura de volumes iguais de proteína mais solução (veja Tabela 1 Suplementar para detalhes). Para crioproteção, cristais foram geralmente transferidos para uma solução de líquido de origem mais glicerol a 20% ou etileno glicol (Tabela S1). Os cristais de complexo de Nrp1-b1/Fab foram transferidos para Hepes a 10 mM (pH de 7,2), PEG 1.500 a 25% e etileno glicol a 10%; deixados desidratar durante a noite contra Hepes a 10 mM (pH de 7,2), PEG 1.500 a 25% e etileno glicol a 20%; e congelados rapi- damente em nitrogênio líquido. Conjuntos de dados foram coletados no Ad- vanced Light Source (linhas de feixe de 5.0.1 ou 5.0.2) ou Stanford Synchro- tron Radiation Laboratory (linhas de feixe 9-2 ou 11-1). Os dados foram pro- cessados usando Denzo e Scalepack do HKL Suite (Otwinowski, Z & Minor, W., Methods in Enzymology 276, 307-326 (1997). Parâmetros celulares e dados estatísticos são resumidos na Tabela 1. Todas as estruturas de cristal foram decompostas através de

substituição molecular usando Phaser (McCoy e outros, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 61, 458-64 (2005). A estrutura Nrp1-b1b2 foi decomposta usando a estrutura de cristal de Nrp1-b1 (no. de acesso PDB 1KEX) (Lee e outros, Structure 11, 99-108 (2003)) como modelo de busca para cada do- mínio de fator de coagulação. As coordenadas refinadas da estrutura Nrpl- b1b2 serviram como a sonda de busca para a estrutura Nrp2-b1b2. A forma monoclínica do complexo a1a2b1b2 de Nrp2/anti-panNrpA-Fab foi decom- posta usando a estrutura Nrp2-b1b2 e fragmentos Fab contendo os domínios variáveis (VH/VL) ou os domínios constantes (Chi/Cl) do complexo B20- 4/VEGF (acesso PDB no. 2FJH). O domínio a2 foi identificado através de substituição molecular usando o domínio CUB N-terminal do MASP-2; o do- mínio a1 não pôde ser localizado através de substituição molecular e foi co- locado manualmente dentro da densidade de elétrons. O complexo Nrpl- bl/Fab foi decomposto usando a estrutura de cristal de Nrp1-b1 e os frag- mentos Fab B20-4 descritos acima. Todas as estruturas restantes foram de- compostas usando as coordenadas refinadas das estruturas e b1b2 e o do- mínio CUB de a2 do complexo Nrp2-a1a2b1b2/Fab. Modelos atômicos foram construídos usando Coot (Emsley, P. & Cowtan, K. Coot, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 60, 2126-32 (2004)) e refinados com o Refmac (Murshudov e outros, Acta Crystallographica D53, 240-255 (1997)).

Cristalização de Nrp 1. Nrp2 e complexos de Neuropilina/Fab

Duas estratégias diferentes foram usadas para produzir proteína para estudos estruturais. Os fragmentos menores de neuropilina, que inclu- em apenas os domínios do tipo b foram expressos em E. coli, enquanto que os construtos de Nrp maiores requereram a produção como proteínas secre- tadas de células de inseto infectadas com baculovírus. Uma visão geral das sete estruturas é apresentada na Fig. 2. Resumidamente, cristais da porção de ligação a VEGF (b1b2) de Nrpl e Nrp2 sofreram difração em uma resolu- ção máxima de 1,8 e 1,95 A, respectivamente. Cristais dos domínios a2b1b2 de Nrpl e Nrp2 foram refinados para a resolução de 2,0 e 2,3 A, respectiva- mente e o domínio b1 de Nrpl em complexo com o Fab de bloqueio de VEGF, anti-Nrp1B, sofreu difração para a resolução de 2,2 A. Finalmente, a estrutura de cristal dos domínios a1a2b1b2 de Nrp2 foi decomposta em complexo com o Fab de bloqueio de semaforina, anti-panNrpA; duas formas de cristal desse complexo foram identificadas, as quais sofreram difração para 2,75 e 3,1 A. Todas as estruturas foram decompostas através de subs- tituição molecular e são reportadas com valores finais de Rtrabaiho/Rnvre abaixo de 20/25% com boa estereoquímica (Tabela 1). As estruturas a2b1b2 de Nrpl têm dois sítios de glicosilação N-Iigados sobre lados opostos do domí- nio a2 (Fig. 3B). A forma monoclínica do complexo Nrp2/Fab também mostra dois sítios de glicosilação dentro do domínio a2 (Fig. 3A); contudo, essas porções de açúcar não são bem definidas na densidade de elétrons da es- trutura Nrp2-a2b1b2 e, portanto, não são modeladas (Fig. 3B). A Arquitetura de Domínio Global do Ectodomínio de Neuropilina

A região extracelular de neuropilina é, freqüentemente, dividida em três unidades que descrevem os domínios primários (a1a2), ligação a VEGF (b1b2) e dimerização (c), respectivamente (Ellis, L.M., Mol Câncer Ther 5, 1099-107 (2006)). Na verdade, a estrutura de cristal recente de b1b2 de Nrpl de rato (Vander Kooi, C.W. e outros, Proc Natl Acad Sci USA 104, 6152-6157 (2007)), identificou uma grande interface entre os domínios b1 e b2 e, como os resíduos incrustados entre domínios são conservados na se- quência, essa disposição de domínio b1b2 foi reconhecida como uma carac- terística geral da família Nrp. Aqui, quatro estruturas de cristal de Nrp que incluem os domínios a2, b1 e b2 foram decompostas (Fig. 2, 3) a partir de uma variedade de condições de cristalização (Tabela SI). Dois modelos in- cluem os domínios a1 ligados a fragmentos Fab, enquanto que dois outros incluem íons de cálcio nos domínios a2. A despeito dessas diferenças, os três domínios (a2, b1 e b2) compartilham a mesma disposição em todas as estruturas de cristal e são hermeticamente acondicionados em torno de um pseudo eixo com tridimensional (Fig. 3). As estruturas de a2b1b2 de Nrpl e Nrp2 são muitos similares e são superpostas com um r.m.s.d. (desvio médio da raiz quadrada) de 1,2 A sobre 317 átomos de Ca. A interface entre b1 e b2 é conservada entre ambas as neurofilinas, se incrustando cerca de 1200- 1500 A2 da superfície acessível a solvente. De modo interessante, a interfa- ce entre o domínio a2 e o b1b2 é conservada em todas as estruturas tam- bém e se incrusta mais de 2000 A2 da superfície acessível a solvente, indi- cando que todos os três domínios formam uma unidade estrutural rígida (Fig. 3).

Em contraste, a disposição de domínio entre a1 e a2b1b2 não é preservada entre as duas formas de cristal do complexo Nrp2/antí-panNrpA- Fab. Quando de superimposição dos núcleos de a2b1 b2 dos receptores, os domínios a1 são deslocados em torno de 7 A uns com relação aos outros. A interface entre a1 e a2b1b2 é pequena (área de superfície incrustada de - 800 A2) e não conservada. A falta de interações fortes identifica a flexibilida- de do domínio a1, sugerindo que ele pode sofrer alterações conformacionais com relação ao restante da Nrp em solução ou quando de ligação ao recep- tor (Fig 3C).

Domínios CUB de Nrp Incluem Sítios de Ligação de Cálcio e Semaforina

Os domínios a1 e a2 de Nrpl e Nrp2 são domínios CUB (Ellis, L.M, Mol Câncer Ther 5, 1099-107 (2006)). No protótipo do domínio CUB, espermadesina (Romero, A. e outros, Nat Struct Biol 4, 783-8 (1997), a du- plicação compreende duas β-folhas com 5-fitas que formam um β- sanduíche. As fitas β2, β4, β9, β6 e β7 formam uma β-folha, com a outra fo- lha contendo as fitas β1, β3, β10, β5 e β8; contudo, as fitas β1 e β2 freqüen- temente estão ausentes em domínios CUB de várias proteínas da família de complemento (Feinberg, H. e outros, EMBO J 22, 2348-59 (2003); Gregory, L.A. e outros, J Biol Chem 278, 32157-64 (2003); Gregory, L.A. e outros, J Biol Chem 279, 29391-7 (2004)). Similar a essas proteínas, os domínios a1 e a2 de Nrps carecem da fita β1 (Fig. 4). Em geral, domínios CUB mostram um alto grau de similaridade. Por exemplo, o domínio a2 de Nrp é estruturalmen- te similar ao domínio a2 de Nrpl (r.m.s.d. de 0,9 A), o domínio a1 de Nrp2 (r.m.s.d. de 0,9 Â) e o domínio CUB de espermadesina (Romero, A. e outros, supra) (r.m.s.d. de 1,4 Â).

As estruturas de cristal de domínios CUB das proteínas da famí- lia de complemento C1s e MASP-236,37 contêm um sítio de ligação de cálcio em uma extremidade do sanduíche. As estruturas a2b1b2 de Nrpl e Nrp2 também contêm um íon ligado nesse local dentro do domínio a2 (Fig. 3B, 4A). Na estrutura da Nrp1, o íon é claramente observado na densidade de elétrons (Fig. S2), mesmo embora nenhum cátion divalente seja incluído du- rante cristalização (Tabela S1). Em Nrp1, o íon de cálcio é coordenado por três cadeias laterais negativamente carregadas (Glu195, Asp209 e Asp250), dois oxigênios de carbonila (Ala252 e Ile253) e uma molécula de água (Fig. 4B). Similarmente, a coordenação de cálcio envolve três aminoácidos nega- tivamente carregados em Nrp2 (Glu197, Asp211 e Asp252; veja Fig. S2); esses três tratamentos são absolutamente conservados nos domínios a2 de doze espécies distantemente relacionadas (Fig. S3).

Um alinhamento de seqüência entre os domínios a1 e a2 de N- rps (Fig. S2) mostra que essa tríade de resíduos carregados é também estri- tamente conservada dentro do domínio a1 das Nrps. Contudo, no complexo Nrp2/anti-NrpA-Fab, não há indicação de um íon ligado no domínio a1. Os Ioops que contribuem para os resíduos que definem o sítio de ligação de Ca2+ putativo de a1 são pobremente ordenados, sugerindo que o Ca2+ exer- ce um papel na estabilização da duplicação do domínio. Baseado no alto grau de conservação de seqüência, é provável que a ligação de cálcio re- presente uma característica compartilhada de domínios CUB de Nrp.

Neurofilinas funcionam como co-receptores para membros sele- cionados da família de semaforinas da classe 3. O N-término contém o do- mínio de assinatura "Sema", um β-propulsor com 7-lâminas (Antipenko, A. e outros, Neuron 39, 589-98 (2003)), o qual é requerido para ligação dos do- mínios a1a2 de neurofilinas. Anti-panNrpA bloqueia a ligação de Sema3 a Nrpl e Nrp2 (Figura 1), mas não afeta a ligação de VEGF (dados não mos- trados). Na estrutura do complexo Nrp2/anti-panNrpA-Fab (Fig. 4C), o frag- mento Fab contata apenas o domínio a1 de Nrp2 sobre a face β8-5-10-3 do sanduíche incrustado aproximadamente 1400 A2 da superfície acessível a solvente. A interface reconhecida por esse anticorpo é bem conservada en- tre Nrpl e Nrp2, uma vez que 11 dos 14 resíduos de Nrp2 que têm mais de 25% de sua superfície acessível incrustada na interface são idênticos entre os dois receptores (Fig. 4C). O reconhecimento de um epitopo que é conser- vado entre Nrpl e Nrp2 explica a capacidade do anticorpo de se ligar a am- bos os receptores com afinidades na faixa sub-nanomolar (Fig. S1).

Sobre o lado do anticorpo, 11 cadeias laterais contatam a Nrp2 das CDRs L3, H2 e H3, 7 das quais são de caráter aromático (Fig. 4D). Es- tudos anteriores esboçaram o sítio de ligação de semaforina de Nrpl usando mutagênese sítio-dirigida (Gu, C. e outros, J Biol Chem 277, 18069-76 (2002). Baseado em um modelo de espermadesina, resíduos putativamente expostos a solvente sobre a superfície do domínio a1 foram selecionados para substituições de aminoácido. Usando essa abordagem, uma série de mutantes foram identificados que rompem as interações entre Sema3A e Nrpl (Gu e outros, supra) e, quando mapeados sobre um modelo de a1 de Nprl, eles estão localizados sobre os Ioops em um pólo do β-sanduíche de a1 (Fig. 4C). Substituições na outra extremidade do domínio não tiveram efeito sobre a ligação de Sema3A (Gu e outros, supra). As mutações que romperam a ligação de Sema3A são adjacentes ao epitopo reconhecido pelo Fab de bloqueio de Sema3A (Fig. 4C), sugerindo fortemente que o domínio Sema se liga aos Ioops e à face 8-5-10-3 do sanduíche dentro do domínio a1 de Nrp2. A localização do sítio de ligação de semaforina também é adjacen- te ao sítio de ligação de cálcio putativo do domínio a1 (Fig. 4C), sugerindo que a ligação de cálcio pode exercer um papel nas interações entre o Iigante e receptor.

Domínios de Nrp do Tipo b Contêm os Sítios de Ligação de Heparina e VEGF

Os domínios b das estruturas b1b2 de neuropilina humana (Fig. 5A e Vander Koo e outros, supra, Lee e outros, supra) compartilham homo- Iogia significativa com os módulos de ligação de fosfolipídio (tipo C2) dos fatores de coagulação V e Vlll (F5/8) (Macedo-Ribeiro e outros, Nature 402, 434-9 (1999); Pratt, K.P. e outros, Nature 402, 439-42 (1999)) e o domínio de ligação de galactose de sialidase bacteriana (Gaskell, A. e outros, Struc- ture 3, 1197-205 (1995)). Coletivamente, esses domínios definem a duplica- ção de discoidina que é topologicamente classificada como um β-barril "jelly- roll" distorcido composto de oito β-fitas centrais. Um pólo do domínio contém três "estacas" ("spikes") estendidos ou Ioops que, tipicamente, constituem o sítio de ligação de Iigante para membros da família discoidina (Macedo- Ribeiro e outros, supra; Pratt e outros, supra; Gaskell e outros, supra). O fragmento b1 b2 de Nrpl e Nrp2 compartilha 50% de identidade de sequên- cia e se superimpõe com um r.m.s.d. de 2,3 A sobre 307 átomos de Ca (Fig. 5A). Embora os domínios b1 de Nrpl e Nrp2 sejam quase indistinguíveis (r.m.s.d = 0,6 A), os domínios b2 se superimpõem bem menos (r.m.s.d. = 2,7 A) com as diferenças se originando grandemente de diferentes conforma- ções dos "estacas" (Fig. 5A). Uma vez que esses "estacas" freqüentemente definem sítios de ligação dentro da família discoidina (Vander Koo e outros, supra; Lee e outros, supra; Macedo-Ribeiro e outros, supra; Pratt e outros, supra; Gaskell e outros, supra), a dissimilaridade entre Nrpl e Nrp2 pode representar uma forma pela qual as Nrps reconhecem parceiros de ligação distintos.

A despeito das diferenças entre os domínios b2 de Nrpl e Nrp2,

os domínios b são hermeticamente acondicionados e formam uma base rígi- da (Fig. 5). A junção interdomínio forma um agrupamento profundo que corre aproximadamente perpendicular ao eixo longo dos dois domínios b (Fig. 5). Esse agrupamento, criado pelo Ioop β4:β5 de b1 e o Ioop β5:β6 de b2, é en- volvido por uma série de resíduos positivamente carregados os quais, base- ado em experimentos de mutagênese sobre Nrpl de rato (Vander Koo e ou- tros, supra), representam o sítio de ligação de heparina de Nrps. O adesivo eletropositivo está presente na estrutura de ambas as Nrps humanas tam- bém (Fig. 5B). O domínio C-terminal de VEGF165 (também conhecido como VEGF55) (Fairbrother e outros, Structure 6, 637-48 (1998)) também contém um sítio de ligação de heparina. Uma vez que a heparina aumenta a afinida- de de b1b2 pelo VEGF165 até 100 vezes (Mamluk, R. e outros, J Biol Chem 277, 24818-25 (2002); Fuh1 G. e outros, J Biol Chem 275, 26690-5 (2000)), é possível que as Nrps usem a heparina para recrutar VEGF165 para essa re- gião.

Além dessa interação mediada por heparina entre o éxon 7 do VEGF165, a cauda C-terminal do VEGF (CDKPRRCOOh) codificada pelo éxon 8 pode se ligar diretamente às Nrps. Na estrutura de cristal de Nrp1-b1b2 de rato em complexo com Tuftsina (Vander Kooi e outros, supra), um mimético tetrapeptídico (TKPRcooh) da cauda de VEGF (von Wronski, M.A. e outros, J Biol Chem 281, 5702-10 (2006)), a arginina C-terminal é dobrada hermeti- camente em uma ranhura ácida criada pelos resíduos dos "estacas" conser- vados do domínio b1. Em várias de nossas estruturas, incluindo todos os três complexos de Fab, o resíduo C-terminal (uma histidina) de uma molécu- la de simetria relacionada ocupa a mesma bolsa ácida do peptídeo Tuftsina (Fig. S4).

Para outros detalhes de resíduos potenciais envolvidos em liga- ção de VEGF, a conservação em superfície de resíduos de Nrp sobre a su- perfície b1b2 foi examinada (Fig. 5C). Dois patches contíguos são conserva- dos entre doze proteínas de Nrpl e Nrp2 (Fig. S3). Um desses sítios se ma- peia diretamente ao sítio de ligação de Tuftsina, enquanto que o segundo sítio inclui resíduos sobre a borda do adesivo de ligação de heparina, suge- rindo uma área adicional para interações entre Nrp e VEGF.

Na estrutura de cristal do complexo Nrp1-b1/anti-Nrp1B-Fab (Fig. 5D), o Fab contata um epitopo localizado entre esses dois sítios de ligação de VEGF putativos e se sobrepõe parcialmente com o agrupamento de liga- ção de Tuftsina. O epitopo desse anticorpo de bloqueio de VEGF é inco- mum, envolvendo apenas resíduos das CDRs L1 e H3. Em média, interfaces Fab/antígeno se incrustam 1680 A2 da superfície exposta a solvente (Lo Conte e outros, J Mol Biol 285, 2177-98 (1999)), contudo, apenas 900 A2 são protegidos na interface Nrp1-b1/Fab. A despeito da pequena interface, o an- ti-Nrp1B se liga hermeticamente a Nrpl com uma afinidade de 0,2 nM (Liang e outros, supra; Pan e outros, supra).

VEGF e Sema3A Não Competem pela Ligação a Nrp

Nas estruturas de Nrp/Fab da presente invenção, os epitopo de ligação que bloqueiam a ligação de VEGF e semaforina são separados por 65 A e estão localizados sobre lados opostos da Nrp (Fig. S5). Vários estu- dos reportaram que VEGFs e semaforinas competem pela ligação sobre a superfície celular e que essa competição envolve um sítio de ligação parci- almente sobreposto sobre o domínio b1 (Gu e outros, supra; Miao, H.Q. e outros, J Cell Biol 146, 2177-98 (1999); Narazaki, M. & Tosato, G., Blood 107, 3892-901 (2006)). Uma vez que a cauda de carboxila do VEGFi65 e semaforinas da classe 3 são ambas ricas em resíduos básicos, foi sugerido que essas caudas poderiam competir pela ranhura eletronegativa criada pe- los "estacas" no domínio b1 (Vander Kooi e outros, supra; Lee e outros, su- pra). A estrutura de cristal recente de b1b2/Tuftsina identificou que a cauda do VEGF165 provavelmente ocupa esse sítio de ligação. Nós mostramos pre- viamente que o anti-Nrp1B não antagoniza o colapso Sema3A-mediado de axônios de gânglios da raiz dorsal (DRG) (Liang e outros, supra; Pan e ou- tros, supra), sugerindo que caudas C-terminais de Sema3 não se ligam à mesma ranhura.

Experimentos anteriores de competição (Gu e outros, supra; Mi- ao e outros, supra; Narazaki e outros, supra) empregaram VEGFs e semafo- rinas que continham tag heteróloga (tal como fosfatase alcalina) no C- término da proteína. É possível que a competição observada seja um resul- tado de conflitos estéricos das tags ao invés de competição direta entre a cauda de VEGF e Sema3. Examinou-se a capacidade do VEGFi65 de anta- gonizar o colapso Sema3-mediado de crescimento axonal de DRG. Mesmo em concentrações de 100 mM, o VEGF165 não afeta a capacidade da Se- ma3A de causar a retração de processos de actina (Fig. 1). Esses dados demonstram que a Sema3 não compete com o VEGF pela ligação ao domí- nio b1 e que a cauda de semaforinas contata um sítio diferente dentro desse domínio.

Modelos para Dimerização de Neuropilina

Nrpl e Nrp2 podem formar homo- ou hetero-multímeros mesmo na ausência de Iigante (Takahashi, L. e outros, Cell 99, 59-69 (1999); Chen, H. e outros, Neuron 21, 1283-90 (1998); Giger, R.J. e outros, Neuron 21, 1079-92 (1998); Takahashi e outros, Nat Neurosci λ, 487-93 (1998))) e, em- bora a estequiometria exata de complexos de neuropilina não seja ainda es- tabelecida, presume-se amplamente que Nrps formem homodímeros quando de ligação de ligante. Dados atuais mostram que o domínio c é necessário, mas não suficiente para oligomerização de Nrp, uma vez que mutantes com truncamento carecendo desse domínio mostram multimerização reduzida com relação ao ECD de comprimento total (Takahashi e outros, Cell 99, 59- 69 (1999); Chen e outros, supra; Giger e outros, supra; Nakamura e outros, Neuron 21, 1093-100 (1998)). Construtos de neuropilina que incluem os do- mínios a1a2 e b1b2 têm maior afinidade por algumas isoformas de VEGF do que construtos que abrangem apenas o domínios b1b2 (Mamluk, R. e ou- tros, J. Biol. Chem. 277, 24818-25 (2002); Karpanen, T. e outros, FASEB J 20, 1462-72 (2006); Giger, R.J. e outros, Neuron 25, 29-41 (2000), mesmo embora os domínios a1a2 não se liguem ao VEGF. Portanto, é possível que os domínios a1a2 contribuam diretamente para a dimerização de Nrp e, as- sim, fortaleçam as interações entre Nrp e o dímero de VEGF através de es- tabilização do complexo 2:2. De modo interessante, as estruturas de cristal de Nrp2-a1a2b1b2 de duas formas de cristal diferentes (Tabela 1) contêm uma interface cristalográfica conservada que é mediada por a1. Nesse díme- ro, os domínios a1 se alinham em uma disposição aproximadamente antipa- ralela ao longo das fitas β7 e β8. A interface se incrusta aproximadamente 1200 A2 da área de superfície acessível a solvente e é dominada por intera- ções hidrofóbicas (Fig. S5). De modo interessante, dímeros similares foram observados para outros membros da família de domínio CUB (Romero e ou- tros, supra). Contudo, exame das massas moleculares de três construtos de Nrp2 (a2b1b2, a1a2b1b2 e a1a2b1b2c) através de dispersão de luz em múl- tiplos ângulos, revelou que todos os três construtos de Nrp2 são monoméri- cos em solução (dados não mostrados). Esses dados implicam que a homo- dimerização de Nrps é muito fraca em solução, mesmo na presença do do- mínio MAM e que a dimerização de receptor pode ocorrer apenas quando de ligação de ligante. A orientação cristalográfica do dímero de Nrp2 sugere um modelo para ligação de VEGF. A interface a1 cria um dímero em formato de sela com uma largura de aproximadamente 70 A (Fig. 6), grande o bastante para acomodar um dímero de VEGF109 com dimensões de cerca de 35 χ 60 A. De modo importante, os sítios de ligação de Tuftsina e os patches de Iiga- ção de heparina são encontrados sobre a superfície interna da sela. Hepari- na poderia estabilizar interações entre os sítios de ligação de heparina de Nrp e VEGF e ainda facilitar a associação da cauda de VEGF com os "esta- cas" de b1. Essa disposição também seria capaz de acomodar a ligação de VEGFR via o domínio de ligação do receptor de VEGF para sinalização a jusante. Portanto, embora os domínios a1 não se encaixem diretamente ao VEGF, eles poderiam intensificar a ligação ao VEGF de Nrps, uma vez que eles facilitam a dimerização de Nrp. Esse dímero poderia ainda acomodar a ligação de Sema3 (Fig. 6). Na estrutura de cristal de Sema3A (Antipenko, A. e outros, Neuron 39, 589-98 (2003)), dois domínios "sema" se acondicionam hermeticamente juntos em uma interface. Quando de ligação a Nrp, os do- mínios sema de Sema3A se dissociam para permitir interações com o sítio de ligação primária sobre a1a2 (Antipenko e outros, supra). No modelo do dímero de Nrp a1-mediado apresentado aqui, os dois sítios de ligação de Sema3A putativos estão localizados sobre lados opostos e distantes o bas- tante para acomodar os grandes β-propulsores de duas moléculas de Se- ma3 ligadas (Figs. 6 e S5).

A presente análise estrutural proporciona o primeiro quadro de- talhado de porções de ligação de VEGF (b1b2) e semaforina (a1a2) do ECD de Nrp. Os complexos de anticorpo (Figs. 3-5), junto com estudos de muta- gênese anteriores (Gu e outros, supra; Vander Kooi e outros, supra) delinei- am os sítios de ligação de Nrp para o domínio Sema de Semaforinas e o domínio de ligação de Heparina para VEGF. Essas estruturas proporcionam uma base para futuros experimentos de mutagênese e proporcionam estra- tégias para elucidar as estruturas de Nrps em complexo com seus Iigantes de receptores de sinalização de VEGF1 VEGFR, semaforinas e plexinas. A- lém disso, as estruturas de cristal e outra informação fornecida pela presente invenção permitem o design de antagonistas e agonistas de VEGF e/ou se- maforina e podem ser usadas em ensaios de seleção para identificar tais antagonistas ou agonistas.

Embora na descrição precedente a invenção seja ilustrada com referência à determinadas modalidades, ela não está assim limitada. Na ver- dade, várias modificações da invenção, além daquelas mostradas e descri- tas aqui, se tornarão evidentes para aqueles versados na técnica a partir da descrição detalhada e caem dentro do escopo das reivindicações em anexo.

Todas as referências citadas por todo o relatório descritivo e as referências citadas na mesma são aqui incorporadas por referência em sua totalidade.

Claims (48)

1. Cristal formado por um fragmento de Nrp1bib2 que sofre difra- ção, através de radiação por raios X, para produzir um padrão de difração que apresenta a estrutura tridimensional do referido fragmento, tendo apro- ximadamente as seguintes constantes celulares: a = 65,9 Â, b = 66,7 A, c =74,7 A e um grupo espacial de P212i21.

2. Cristal formado por um fragmento de Nrp1a2t>ib2 que sofre di- fração, através de radiação por raios X, para produzir um padrão de difração que representa a estrutura tridimensional do referido fragmento, tendo apro- ximadamente as seguintes constantes celulares: a = 53,2 A, 6 = 68,2 A, c = 66,6 A e um grupo espacial de P2.

3. Cristal de um complexo formado entre um fragmento de N- rp1bi e um fragmento Fab de um anticorpo anti-Nrp1B (YW107.4.87) que ini- be a ligação de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) a Nrpl, em que o referido cristal sofre difração, através de radiação por raios X, para produzir um padrão de difração que representa a estrutura tridimensional do referido complexo, tendo aproximadamente as seguintes constantes celula- res: a = 213 A, b = 213 A, c = 45,3 A e um grupo espacial de H3.

4. Cristal formado por um fragmento de Nrp2bib2 que sofre difra- ção, através de radiação por raios X, para produzir um padrão de difração que representa a estrutura tridimensional do referido fragmento, tendo apro- ximadamente as seguintes constantes celulares: a = 36,5 A, b = 70,5 A, c =122 A e um grupo espacial de P2i2-|2-|.

5. Cristal formado por um fragmento de Nrp2a2bib2 que sofre di- fração, através de radiação por raios X, para produzir um padrão de difração que representa a estrutura tridimensional do referido fragmento, tendo apro- ximadamente as seguintes constantes celulares: a = 50,1 A, b = 193 A, c =62,2 A e um grupo espacial de P2i.

6. Cristal de um complexo formado entre um fragmento de N- rp2aia2bib2 e um fragmento Fab de um anticorpo anti-Nrp1A que inibe a liga- ção de semaforina a Nrp2, em que o referido cristal sofre difração, através de radiação por raios X, para produzir um padrão de difração que representa a estrutura tridimensional do referido complexo, tendo aproximadamente as seguintes constantes celulares: a = 148 Λ, b = 106 A1 c = 92,4 A e um grupo espacial de C2.

7. Cristal de um complexo formado entre um fragmento de N- rp2aia2bib2 e um fragmento Fab de um anticorpo anti-panNrpl que inibe a ligação de semaforina a Nrp2, em que o referido cristal sofre difração, atra- vés de radiação por raios X, para produzir um padrão de difração que repre- senta a estrutura tridimensional do referido complexo, tendo aproximada- mente as seguintes constantes celulares: a = 121 A, b = 121 A, c = 203 A e um grupo espacial de P3221.

8. Anticorpo anti-panNrpA compreendendo uma seqüência de domínio variável de cadeia leve mostrada na Figura 7 e/ou uma seqüência de domínio variável de cadeia pesada mostrada na Figura 8 ou um fragmen- to do mesmo.

9. Fragmento Fab de anticorpo anti-panNrpA YW68.11 compre- endendo a seqüência mostrada na Figura 9A.

10. Fragmento Fab de anticorpo anti-panNrpA YW68.11.26 com- preendendo a seqüência mostrada na Figura 9B.

11. Anticorpo anti-Nrp que compete pela ligação a Nrp com anti- corpo anti-panNrpA.

12. Anticorpo anti-Nrp de acordo com a reivindicação 11, que se liga essencialmente ao mesmo epitopo que o anticorpo anti-panNrpA.

13. Anticorpo anti-Nrp de acordo com a reivindicação 11, que se liga a um epitopo compreendendo pelo menos parte de uma interface defini- da pelos resíduos de aminoácido Y39, Y45, P46, Q47, F72, N73 P74, H75, F76, A133 e R138 da seqüência de aminoácido de Nrp2aia2bib2·

14. Anticorpo anti-Nrp de acordo com a reivindicação 11, que se liga a Nrpl e Nrp2.

15. Anticorpo anti-Nrp de acordo com a reivindicação 14, tendo uma afinidade de ligação de pelo menos cerca de 0,10 nM pela Nrpl e Nrp2.

16. Anticorpo anti-Nrp de acordo com a reivindicação 14, tendo uma afinidade de ligação de pelo menos cerca de 0,15 nM pela Nrpl e Nrp2.

17. Anticorpo anti-Nrp de acordo com a reivindicação 14, tendo uma afinidade de ligação de pelo menos cerca de 0,20 nM pela Nrpl e Nrp2.

18. Anticorpo anti-Nrp de acordo com a reivindicação 14, tendo uma afinidade de ligação de pelo menos cerca de 0,25 nM pela Nrpl e Nrp2.

19. Anticorpo anti-Nrp de acordo com a reivindicação 14, tendo uma afinidade de ligação de pelo menos cerca de 0,30 nM pela Nrpl e Nrp2.

20. Anticorpo anti-Nrp de acordo com a reivindicação 14, que bloqueia a ligação de Sema3 a Nrpl e Nrp2.

21. Anticorpo anti-Nrp de acordo com a reivindicação 20, que não bloqueia a ligação de VEGF a Nrpl ou Nrp2.

22. Anticorpo anti-Nrp de acordo com a reivindicação 20 ou a reivindicação 21 que inibe a atividade biológica de semaforina in vitro.

23. Anticorpo anti-Nrp de acordo com a reivindicação 20 ou a reivindicação 21 que inibe a atividade biológica de semaforina in vivo.

24. Método de preparo de um antagonista de semaforina com- preendendo criação de uma molécula que se liga a um sítio compreendendo pelo menos parte de uma interface definida pelos resíduos de aminoácido Y39, Y45, P46, Q47, F72, N73 P74, H75, F76, A133 e R138 da seqüência de aminoácido de Nrp2a1a2bib2, síntese do referido composto e confirmação de que o referido composto bloqueia a ligação de semaforina a Nrpl e Nrp2.

25. Método de acordo com 24, em que o referido antagonista não interfere com a ligação de VEGF a Nrpl ou Nrp2.

26. Método de acordo com a reivindicação 25, ainda compreen- dendo a etapa de confirmação se o referido antagonista não interfere com a ligação de VEGF a Nrpl ou Nrp2.

27. Método de acordo com a reivindicação 25, ainda compreen- dendo a etapa de confirmação se o referido antagonista não interfere com a atividade biológica do VEGF.

28. Método de acordo com a reivindicação 24 em que o referido antagonista é selecionado do grupo consistindo em anticorpos, fragmentos de anticorpo, polipeptídeos de ligação, peptídeos e pequenas moléculas não-peptídicas.

29. Método de acordo com a reivindicação 28 em que o referido antagonista é um anticorpo ou um fragmento de anticorpo.

30. Método de acordo com a reivindicação 29 em que o referido fragmento de anticorpo é selecionado do grupo consistindo em Fab1 Fab', 5 F(ab')2, scFv, (ScFv)2, dAb, anticorpo linear, molécula de anticorpo com uma única cadeia, diacorpo, minicorpo e anticorpo multi-específico formado de fragmentos de anticorpo.

31. Método para preparo de um antagonista de VEGF compre- endendo uso de uma estrutura tridimensional derivada de um cristal de um complexo formado entre um fragmento de Nrplbi e um fragmento Fab de um anticorpo anti-Nrp1B (YW107-4.87), em que o referido cristal sofre difração, através de radiação por raios X, para produzir um padrão de difração que representa a estrutura tridimensional do referido complexo, tendo aproxima- damente as seguintes constantes celulares: a = 213 A, b = 213 A, c = 45,3 A e um grupo espacial de H3, para criar uma molécula que se liga a um sítio compreendendo pelo menos parte do epitopo ligado pelo referido anticorpo anti-Nrp1B, síntese do referido composto e confirmação se o referido com- posto inibe a ligação de VEGF a Nrpl.

32. Método de acordo com a reivindicação 31, em que o referido antagonista não interfere com a ligação de semaforina a Nrp1.

33. Método de acordo com a reivindicação 32, ainda compreen- dendo a etapa de confirmação se o referido antagonista não interfere com a ligação de semaforina a Nrp1.

34. Método de acordo com a reivindicação 31, em que o referido antagonista inibe a atividade biológica de VEGF.

35. Método de acordo com a reivindicação 34, ainda compreen- dendo a etapa de confirmação se o referido antagonista inibe uma atividade biológica de VEGF.

36. Método de acordo com a reivindicação 35, em que o referido antagonista inibe o remodelamento vascular.

37. Método de acordo com a reivindicação 35, em que o referido antagonista é selecionado do grupo consistindo em anticorpos, fragmentos de anticorpo, polipeptídeos de ligação, peptídeos e pequenas moléculas não-peptídicas.

38. Método de acordo com a reivindicação 37 em que o referido antagonista é um anticorpo ou fragmento de anticorpo.

39. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 38, em que o referido fragmento de anticorpo é selecionado do grupo consistindo em Fab, Fab', F(ab')2, scFv, (ScFv)2, dAb, anticorpo linear, molé- cula de anticorpo com uma única cadeia, diacorpo, minicorpo e anticorpo multi-específico formado de fragmentos de anticorpo.

40. Método para o tratamento de câncer compreendendo admi- nistração, a um mamífero que precisa, de uma quantidade eficaz de um an- tagonista de VEGF preparado através do método de acordo com a reivindi- cação 31.

41. Método de acordo com a reivindicação 40 em que o câncer é selecionado do grupo consistindo em câncer de mama, câncer cólon-retal, câncer de pulmão de células não-pequenas, Iinfoma não-Hodgkin (NHL), câncer renal, câncer de próstata, câncer de fígado, câncer de cabeça e pes- coço, melanoma, câncer ovariano, mesotelioma e mieloma múltiplo.

42. Método de acordo com a reivindicação 41, em que o trata- mento ainda compreende um segundo agente terapêutico.

43. Método de acordo com a reivindicação 42, em que o segun- do agente terapêutico é um agente selecionado do grupo consistindo em um agente antiangiogênico, uma composição antineoplásica, um agente quimio- terapêutico e um agente citotóxico.

44. Método de acordo com a reivindicação 43, em que o agente antiangiogênico é um outro antagonista de VEGF.

45. Método de acordo com a reivindicação 44, em que o outro antagonista de VEGF é um anticorpo anti-hVEGF ou um fragmento do mes- mo.

46. Método de acordo com a reivindicação 45, em que o anticor- po anti-hVEGF é capaz de ligação ao mesmo epitopo de VEGF que o anti- corpo A4.6.1.

47. Método de acordo com a reivindicação 45, em que o anticor- po anti-hVEGF é bevacizumab ou ranibizumab.

48. Método de acordo com a reivindicação 42, em que o segun- do agente terapêutico é um inibidor de quinase de tirosina de receptor sele- cionado do grupo consistindo em vatalanib (PTK787), erlotinib (TARCEVA®), OSI-7904, ZD6474 (ZACTIMA®), ZD6126 (ANG453), ZD1839, sunitinib (SU- TENT®), semaxanib (SU5416), AMG706, AG013736, Imatinib (GLEEVEC®), MLN-518, CEP-701, PKC- 412, Lapatinib (GSK572016), VELCADE®, AZD2171, sorafenib (NEXAVAR®), XL880 e CHIR-265.