CN101665536B - 抗-血管内皮生长因子的抗体 - Google Patents

抗-血管内皮生长因子的抗体 Download PDF

Info

Publication number
CN101665536B
CN101665536B CN2009101470179A CN200910147017A CN101665536B CN 101665536 B CN101665536 B CN 101665536B CN 2009101470179 A CN2009101470179 A CN 2009101470179A CN 200910147017 A CN200910147017 A CN 200910147017A CN 101665536 B CN101665536 B CN 101665536B
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
vegf
seq
sequence
variable region
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
CN2009101470179A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101665536A (zh
Inventor
M·巴卡
J·A·韦尔斯
L·G·普雷塔
H·B·洛曼
Y·M·Y·陈
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Genentech Inc
Original Assignee
Genentech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=25264594&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN101665536(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from US08/908,469 external-priority patent/US6884879B1/en
Application filed by Genentech Inc filed Critical Genentech Inc
Publication of CN101665536A publication Critical patent/CN101665536A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101665536B publication Critical patent/CN101665536B/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/005—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies constructed by phage libraries
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Abstract

本发明涉及抗-血管内皮生长因子的抗体。公开了人源化和变异的抗-VEGF抗体及其各种不同用途。抗-VEGF抗体对VEGF有很强的结合亲和力，可在体外抑制VEGF诱导的内皮细胞增殖，并且可在体内抑制肿瘤生长。

Description

抗-血管内皮生长因子的抗体
此案是申请日为1998年4月3日、中国申请号为98805914.2、发明名称为“抗-血管内皮生长因子的抗体”的发明申请的分案申请。
交叉引用
本申请是未审定的美国申请No.08/833,504(1 997年4月7日申请)的部分续展申请，美国申请No.08/833,504在此在被引用作为参考并且根据35U.S.C.§120要求其申请优先权。
发明领域
本发明一般涉及抗-VEGF的抗体，具体地，涉及人源化的抗-VEGF抗体和变异的抗-VEGF抗体。
相关技术的描述
目前已充分确定，在多种疾病的发病机理中涉及血管生成。这包括实体瘤、眼内新血管综合症如增生性视网膜病或年龄相关性黄斑变性(AMD)、类风湿性关节炎、和牛皮癣(Folkman等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)267：10931-10934；Klagsbrun等人，Annu.Rev.Physiol.53：217-239(1991)；和Garner A，Vascular Diseases In：Pathobiology of ocular disease.A dynamic approach.Garner A，Klintworth GK编，2版，Macel Dekker，NY，pp1625-1710(1994))。在实体瘤情况下，新血管生成使得与正常细胞相比肿瘤细胞能够获得生长优势和增殖自主性。因此，观察到肿瘤切片的微血管密度和乳腺癌及数种其他肿瘤的病人存活率之间的相关性(Weidner等人，新英格兰医学杂志(N.Engl.J.Med.)324：1-6(1991)；Horak等人，柳叶刀(Lancet)340：1120-1124(1992)；和Macchiarini等人，柳叶刀(Lancet)340：145-146(1992))。
对血管生成的正调节物的研究已得到了许多候选物质，其中包括：aFGF、bFGF、TGF-α、TNF-β、HGF、TNF-α、血管生成素、IL-8等(Folkman等人和Klagsbrun等人)。目前为止被鉴别出的负调节物包括：血小板反应蛋白(Good等人，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)87：6624-6628(1990))、16千道尔顿的促乳素N末端片段(Clapp等人，Endocrinology，133：1292-1299(1993))、血管抑制素(angiostatin)(O′Reilly等人，细胞(Cell)79：315-328(1994))和内皮抑制素(endostatin)(O′Reilly等人，细胞(Cell)88，277-285(1996))。
在过去数年中所做的工作已确立了血管内皮生长因子(VEGF)在调节正常和异常血管生成方面的关键地位(Ferrara等人，Endocr.Rev.18：4-25(1997))。丢失甚至一个VEGF等位基因会导致胚胎死亡，这一发现指明了该因子在血管系统发育和分化过程中所起的不可替代的作用(Ferrara等人)。此外，还表明VEGF是与肿瘤和眼内疾病相关的新血管生成的关键介质(Ferrara等人)。在受检查的大多数人肿瘤中，VEGF mRNA是过度表达的(Berkman等人，临床研究杂志(J.Clin.Invest.)91：153-159(1993)；Brown等人，Human Pathol.26：86-91(1995)；Brown等人，癌症研究(Cancer Res.)53：4727-4735(1993)；Mattern等人，Brit.J.Cancer.73：931-934(1996)；hDvorak等人，Am.J.Pathol.146：1029-1039(1995))。而且，在眼睛液体中VEGF浓度，与患糖尿病和其他局部缺血有关的视网膜疾病的病人中存在的血管活跃增殖现象是高度相关的(Aiello等人，新英格兰医学杂志(N.Engl.J.Med.)331：1480-1487(1994))。此外，最近的研究已表明，在患AMD的病人中脉络膜的新血管膜中存在VEGF(Lopez等人，Invest.Ophtalmo.Vis.Sci.37：855-868(1996))。抗-VEGF中和抗体可抑制裸鼠中各种不同人肿瘤细胞系的生长(Kim等人，自然(Nature)362：841-844(1993)；Warren等人，临床研究杂志(J.Clin.Invest.)95：1789-1797(1995)；Borgstrom等人，癌症研究(Cancer Res.)56：4032-4039(1996)和Melnyk等人，癌症研究(Cancer Res.)56：921-924(1996))，并且在缺血性视网膜疾病模型中也抑制眼内的血管生成(Adamis等人，Arch.Ophthalmol.114：66-71(1996))。因此，对于治疗实体瘤和各种眼内新血管疾病，抗-VEGF的单克隆抗体或其他抑制VEGF作用的抑制剂是有前途的候选物质。
发明概述
本发明描述了具有治疗前景的有利特性的人源化抗-VEGF抗体和变异的抗-VEGF抗体，这些特性包括：与VEGF的强结合亲和力；在体外抑制VEGF-诱导型内皮细胞增殖的能力；和在体内抑制VEGF-诱导型血管生成的能力。
此处优选的人源化抗-VEGF抗体或变异的抗-VEGF抗体结合于人VEGF时的Kd值不超过约1×10-8M，更佳地不超过约5×10-9M。此外，对于在体外抑制VEGF诱导型内皮细胞增殖，人源化或变异的抗-VEGF抗体的ED50值不超过约5nM。此处特别感兴趣的人源化或变异抗-VEGF抗体，是那些在抗体剂量为5毫克/千克下在A673体内肿瘤模型中能抑制至少50％肿瘤生长的种类。
在一实例中，抗-VEGF抗体具有重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包括具有如下氨基酸序列的高变区：CDRH1(GYX1FTX2YGMN，其中X1是T或D，而X2是N或H；SEQ ID NO：128)，CDRH2(WINTYTGEPTYAADFKR；SEQ ID NO：2)和CDRH3(YPX1YYGX2SHWYFDV，其中X1是Y或H，而X2是S或T；SEQ IDNO：129)。例如，重链可变区可包含CDRH1(GYTFTNYGMN；SEQ ID NO：1)、CDRH2(WINTYTGEPTYAADFKR；SEQ ID NO：2)和CDRH3(YPHYYGSSHWYFDV；SEQ ID NO：3)的氨基酸序列。较佳地，3个重链高变区在人构架区域中，例如作为由下式表示的连续序列：FR1-CDRH1-FR2-CDRH2-FR3-CDRH3-FR4。
本发明还提供了抗-VEGF抗体重链可变区，它具有氨基酸序列：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYX1FT X2YGMNWVRQAPGKGLEWVGW INTYTGEPTY AADFKRRFTF SLDTSKSTAYLQMNSLRAED TAVYYCAKYP X3YYGX4SHWYF DVWGQGTLVT VSS(SEQID NO：125)，其中X1是T或D；X2是N或H；X3是Y或H以及X4是S或T。一种特别有用的重链可变区序列是实施例1的F(ab)-12人源化抗体的重链可变区，它包含SEQ ID NO：7的重链可变区序列。这种优选的重链可变区序列可与下面优选的轻链可变区序列或其他轻链可变区序列组合，只要这样产生的抗体能结合于人VEGF。
本发明还提供了优选的轻链可变区序列，它可与上述重链可变区序列或其他重链可变区序列组合，只要这样产生的抗体能结合于人VEGF。例如，轻链可变区可包含具有下列氨基酸序列的高变区：CDRL1(SASQDISNYLN；SEQ ID NO：4)，CDRL2(FTSSLHS；SEQ ID NO：5)和CDRL3(QQYSTVPWT；SEQ ID NO：6)。较佳地，3个轻链高变区在人构架区域中，例如作为由下式表示的连续序列：FR1-CDRL1-FR2-CDRL2-FR3-CDRL3-FR4。
在一实例中，本发明提供了人源化的抗-VEGF抗体轻链可变区，它具有氨基酸序列：DIQX1TQSPSS LSASVGDRVT ITCSASQDIS NYLNWYQQKPGKAPKVLIYF TSSLHSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQYSTVPWTFGQ GTKVEIKR(SEQ ID NO：124)，其中X1是M或L。一种特别有用的轻链可变区序列是实施例1的F(ab)-12人源化抗体的轻链可变区，它包含SEQ ID NO：8的轻链可变区序列。
本发明还提供了亲代抗-VEGF抗体的变异抗体(该亲代抗体宜为人源化或人的抗-VEGF抗体)，其中变异抗体结合于人VEGF并且在亲代抗-VEGF抗体的重链或轻链可变区的高变区中包含了氨基酸取代。变异抗体较佳地在抗-VEGF抗体的一个或多个高变区中具有一个或多个取代。较佳地，取代位于亲代抗体的重链可变区中。例如，氨基酸取代可以位于重链可变区的CDRH1和/或CDRH3。较佳地，在这两种高变区中都有取代。这种“亲和力成熟”变异抗体在本文中已表明可比产生它们的亲代抗-VEGF抗体更有力地结合于人VEGF，即它们的Kd值明显低于亲代抗-VEGF抗体。较佳地，与亲代抗-VEGF抗体相比，变异抗体的在体外抑制VEGF-诱导型内皮细胞增殖的ED50值低至少约10倍，较佳地低至少约20倍，最佳地低至少约50倍。一种特别优选的变异抗体是实施例3的Y0317变异抗体，它具有氨基酸序列为GYDFTHYGMN(SEQ ID NO：126)的CDRH1以及具有氨基酸序列为YPYYYGTSHWYFDV(SEQ ID NO：127)的CDRH3。这些高变区和CDRH2通常位于人构架区，例如导致重链可变区具有SEQ ID NO：116的氨基酸序列。这种重链可变区序列可任选地与具有SEQ ID NO：124氨基酸序列的轻链可变区组合，更佳地与具有SEQ ID NO：11氨基酸序列的轻链可变区组合。
各种形式的抗体被包括在本发明之中。例如，抗-VEGF抗体可以是全长的抗体(例如具有完整的人Fc区)，或是抗体片段(如Fab、Fab′或F(ab′)2)。此外，抗体可以用可检测的标记物进行标记，固定在固相载体上，和/或偶联于异源化合物(如细胞毒性物质)。
抗体的诊断和治疗用途被包括在内。在一种诊断应用中，本发明提供了一种确定VEGF蛋白是否存在的方法，它包括：将怀疑含有VEGF蛋白的样品暴露于抗-VEGF抗体，然后测定抗体与样品的结合。对于该应用，本发明提供了一试剂盒，它含有抗体和使用抗体来检测VEGF蛋白的说明书。
本发明还提供了：分离的编码该抗体的核酸；含有该核酸的载体，其中该核酸可任选地操作性连接于被载体所转化的宿主细胞所识别的控制序列；含该载体的宿主细胞；产生该抗体的方法，它包括培养该宿主细胞从而表达核酸，以及任选地从宿主细胞培养物(如从宿主细胞培养液中)中回收抗体。本发明还提供了一种组合物，它含抗-VEGF抗体和药学上可接受的载体或稀释剂。用于治疗的组合物是灭菌的并且可以是冻干的。本发明还提供了治疗患肿瘤或视网膜疾病的哺乳动物的方法，它包括将治疗有效量的抗-VEGF抗体施用于哺乳动物。
本发明涉及：
1.一种人源化抗-VEGF抗体，它与人VEGF结合的Kd值不超过约1×10- 8M。
2.一种人源化抗-VEGF抗体，它与人VEGF结合的Kd值不超过约5×10- 9M。
3.一种人源化抗-VEGF抗体，它在体外抑制VEGF诱导型内皮细胞增殖的ED50值不超过约5nM。
4.一种人源化抗-VEGF抗体，它在体内抑制VEGF-诱导型血管生成。
5.如4所述的人源化抗-VEGF抗体，5毫克/千克的该抗体在A673体内肿瘤模型中抑制至少50％肿瘤生长。
6.如1所述的人源化抗-VEGF抗体，它具有重链可变区，该重链可变区包括具有如下氨基酸序列的高变区：CDRH1(GYX1FTX2YGMN，其中X1是T或D，而X2是N或H；SEQ ID NO：128)，CDRH2(WINTYTGEPTYAADFKR；SEQ ID NO：2)和CDRH3(YPX1YYGX2SHWYFDV，其中X1是Y或H，而X2是S或T；SEQ IDNO：129)。
7.如6所述的人源化抗-VEGF抗体，它包含SEQ ID NO：7所述的氨基酸序列。
8.如6所述的人源化抗-VEGF抗体，它具有重链可变区，该重链可变区包括具有如下氨基酸序列的高变区：CDRH1(GYTFTNYGMN；SEQ IDNO：1)、CDRH2(WINTYTGEPTYAADFKR；SEQ ID NO：2)和CDRH3(YPHYYGSSHWYFDV；SEQ ID NO：3)。
9.如1所述的人源化抗-VEGF抗体，它具有轻链可变区，轻链可变区可包含具有下列氨基酸序列的高变区：CDRL1(SASQDISNYLN；SEQ ID NO：4)，CDRL2(FTSSLHS；SEQ ID NO：5)和CDRL3(QQYSTVPWT；SEQ IDNO：6)。
10.如9所述的人源化抗-VEGF抗体，它包含SEQ ID NO：8所述的氨基酸序列。
11.如1所述的人源化抗-VEGF抗体，它具有的重链可变区包括SEQ IDNO：7的氨基酸序列，而且它具有的轻链可变区包括SEQ ID NO：8的氨基酸序列。
12.一种抗-VEGF抗体轻链可变区，它包括氨基酸序列：
DIQX1TQSPSS LSASVGDRVT ITCSASQDIS NYLNWYQQKPGKAPKVLIYF TSSLHSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQYSTVPWTFGQ GTKVEIKR(SEQ ID NO：124)，其中X1是M或L。
13.一种抗-VEGF抗体重链可变区，它包括氨基酸序列：
EVQLVESGGG  LVQPGGSLRL SCAASGYX1FT X2YGMNWVRQAPGKGLEWVGW INTYTGEPTY AADFKRRFTF SLDTSKSTAYLQMNSLRAED TAVYYCAKYP X3YYGX4SHWYF DVWGQGTLVT VSS(SEQID NO：125)，其中X1是T或D；X2是N或H；X3是Y或H以及X4是S或T。
14.一种亲代抗-VEGF抗体的变异抗体，该变异抗体结合于人VEGF，而且在该亲代抗体的重链可变区的高变区中有氨基酸取代。
15.如14所述的变异抗体，该亲代抗体是人抗体或人源化抗体。
16.如14所述的变异抗体，它与人VEGF结合的Kd值不超过约1×10- 8M。
17.如14所述的变异抗体，它与人VEGF结合的Kd值不超过约5×10- 9M。
18.如14所述的变异抗体，该取代位于重链可变区的CDRH1中。
19.如14所述的变异抗体，该取代位于重链可变区的CDRH3中。
20.如14所述的变异抗体，该氨基酸取代位于CDRH1和CDRH3两者中。
21.如14所述的变异抗体，它与人VEGF结合的Kd值小于该亲代抗体的Kd值。
22.如14所述的变异抗体，它在体外抑制VEGF诱导型内皮细胞增殖的ED50值比该亲代抗体的ED50值低至少10倍。
23.如18所述的变异抗体，该CDRH1具有氨基酸序列GYDFTHYGMN(SEQ ID NO：126)。
24.如19所述的变异抗体，该CDRH3具有氨基酸序列YPYYYGTSHWYFDV(SEQ ID NO：127)。
25.如14所述的变异抗体，该重链可变区具有SEQ ID NO：116的氨基酸序列。
26.如25所述的变异抗体，该轻链可变区具有SEQ ID NO：124的氨基酸序列。
27.如26所述的变异抗体，该轻链可变区具有SEQ ID NO：115的氨基酸序列。
28.如1所述的人源化抗-VEGF抗体，它是全长的抗体。
29.如28所述的人源化抗-VEGF抗体，它是人IgG。
30.如1所述的人源化抗-VEGF抗体，它是抗体片段。
31.如30所述的抗体片段，它是Fab。
32.一种组合物，它含有1所述的人源化抗-VEGF抗体和药学上可接受的载体。
33.一种组合物，它含有14所述的变异的人源化抗-VEGF抗体和药学上可接受的载体。
34.分离的编码1所述抗体的核酸。
35.含有34所述核酸的载体。
36.含有35所述载体的宿主细胞。
37.一种产生人源化抗-VEGF抗体的方法，它包括培养36所述的宿主细胞，从而使核酸被表达出。
38.如37所述的方法，还包括从宿主细胞培养物中回收人源化的抗-VEGF抗体。
39.一种在哺乳动物中抑制VEGF诱导型血管生成的方法，它包括将治疗有效量的1所述的人源化抗-VEGF抗体施用于该哺乳动物。
40.如39所述的方法，该哺乳动物是人。
41.如39所述的方法，该哺乳动物有肿瘤。
42.如39所述的方法，该哺乳动物有视网膜疾病。
附图简述
图1A和1B显示了muMAb VEGF A4.6.1的重链可变区(SEQ ID NO：9)和轻链可变区(SEQ ID NO：10)，人源化的F(ab)(F(ab)-12)的重链可变区(SEQ IDNO：7)和轻链可变区(SEQ ID NO：8)，以及人共有构架(重链亚组III，humIII(SEQ ID NO：11)；轻链κ亚组I，humκI(SEQ ID NO：12))。图1A排列了可变的重链区序列，而图1B排列的可变的轻链区序列。星号表示在人源化F(ab)-12和鼠单克隆抗体之间，或F(ab)-12和人构架之间的差别。互补决定区(CDR)用下划线标出。
图2是人源化F(ab)-12VL和VH区模型的带状图。VL区用棕色表示，而CDR用黄褐色表示。残基L46的侧链用黄色表示。VH区用紫色表示，而CDR用粉红色表示。从人的变为鼠的VH残基的侧链用黄色表示。
图3显示了实施例1的人源化抗-VEGF F(ab)-12对VEGF诱导型有丝分裂的抑制作用。将衍生自牛肾上腺皮质的毛细血管内皮细胞，以6×103细胞/孔的密度接种于6孔板中，如实施例1所述。按所示浓度加入muMAb VEGF A4.6.1或rhuMAb VEGF(IgG1；F(ab)-12)。在2-3小时后，加入rhVEGF165至终浓度为3ng/ml。在5或6天之后，用胰蛋白酶处理细胞并计数。所示的数值是两次测量的平均值。与平均值的变差不超过10％。
图4显示了实施例1的人源化抗-VEGF F(ab)-12在体内对肿瘤生长的抑制作用。将A673成横纹肌细胞瘤细胞以2×106/鼠的密度注入BLAB/c裸鼠。在肿瘤细胞接种开始后24小时，动物每周两次腹膜内注射对照单克隆抗体、muMAbVEGF A4.6.1或rhuMAb VEGF(IgG1；F(ab)-12)。对照单克隆抗体的剂量是5mg/kg；抗-VEGF单克隆抗体的剂量按指示是0.5或5mg/kg(n＝10)。在注射肿瘤细胞4周后，动物被安乐死亡，然后取出肿瘤并称量。*：用ANOVA比较，与对照组相比有显著区别(p＜0.05)。
图5A和5B分别显示了实施例2的下列抗体的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列：鼠抗体A4.6.1(SEQ ID NO：10是VL而SEQ ID NO：9是VH)、人源化的A4.6.1变异抗体hu2.0(SEQ ID NO：13是VL而SEQ ID NO：14是VH)和人源化的鼠A4.6.1变异抗体hu2.10(SEQ ID NO：15是VL而SEQ ID NO：16是VH)。序列编号根据Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，(5th)，Public Health Service，NIH，Bethesda，MD(1991)，并且错配用星号(A4.6.1vs hu2.0)或点(hu2.0vs hu2.10)表示。变异抗体hu2.0仅含有鼠抗体的CDR序列(粗体)，它被移植于人轻链κ亚组I共有构架(SEQ ID NO：12)和重链亚组III共有构架(SEQ ID NO：11)上。hu2.10是用本文所述的噬菌体挑选试验而获得的共有人源化克隆。
图6显示了实施例2中随机诱变所针对的构架残基。
图7显示了用于在噬菌体上表面展示Fab-pIII融合蛋白的噬菌粒构建物。噬菌粒编码融合于一部分M13基因III外被蛋白的人源化的A4.6.1抗体Fab片段。该融合蛋白包括Fab，该Fab在重链的羧基端处连于单个谷氨酰胺残基(受到SupE E.coli的琥珀密码子的抑制)，然后连于基因III蛋白的C末端区域(残基249-406)。转入F+大肠杆菌，然后用M13KO7辅助噬菌体进行超感染，这样产生了噬菌粒颗粒，其中一部分展示出单拷贝的融合蛋白。
图8A-8F显示了实施例3中噬菌体展示抗体在载体phMB4-19-1.6的双链核苷酸序列(SEQ ID NO：99)和编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：100)。
图9A和9B显示了轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列排列图，被比较的分别是实施例3的亲和力成熟的抗-VEGF抗体和实施例1的F(ab)-12(SEQ IDNO：8和7分别为轻链和重链可变区)。CDR用下划线标出，用L表示轻链，用H表示重链，并且用1-3编号。残基在VL和VH区中被依次标号，这与Kabat的编号方法相反。显示了模板分子MB1.6(SEQ ID NO：101和102分别是轻链和重链可变区)以及下列变异抗体：H2305.6(SEQ ID NO：103和104分别是轻链和重链可变区)、Y0101(SEQ ID NO：105和106分别是轻链和重链可变区)以及Y0192(SEQ ID NO：107和108分别是轻链和重链可变区)。与F(ab)-12的区别用阴影框标出。
图10A和10B显示了轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列排列图，被比较的分别是实施例3的亲和力成熟的抗-VEGF抗体和实施例1的F(ab)-12(SEQID NO：8和7分别为轻链和重链可变区)。CDR用下划线标出，用L表示轻链，用H表示重链，并且用1-3编号。变异抗体被命名为：Y0243-1(SEQ ID NO：109和110分别是轻链和重链可变区)、Y0238-3(SEQ ID NO：111和112分别是轻链和重链可变区)、Y0313-1(SEQ ID NO：113和114分别是轻链和重链可变区)以及Y0317(SEQ ID NO：115和116分别是轻链和重链可变区)。与F(ab)-12的区别用阴影框标出。
图11显示了实施例3中对变异抗体Y0238-3、Y0192和Y0313-1以及实施例1的全长F(ab)-12进行HuVEC活性测定的结果。
图12显示了实施例1的全长F(ab)-12(rhuMAb VEGF)、实施例1的F(ab)-12的Fab片段(rhuFab VEGF)和实施例3的亲和力成熟变异抗体Y0317的Fab片段(rhuFab VEGF(亲和力成熟型))对VEGF诱导型有丝分裂的抑制作用。
优选例的详细描述
I.定义
如本文所用，术语“人VEGF”指如Leung等人，科学(Science)246：1306(1989)和Houck等人，Mol.Endocrin.5：1806(1991)所述的165个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子，以及相关的121、189和206个氨基酸的血管内皮细胞生长因子，以及这些生长因子的天然存在的等位基因的或加工的形式。
本发明提供了抗-VEGF的拮抗性抗体，它能够抑制VEGF的一种或多种生物活性，例如其促分裂或血管生成活性。VEGF的拮抗剂通过干扰VEGF与细胞受体的结合、通过使被VEGF激活的细胞失去功能或被杀灭、或通过干扰VEGF结合于细胞受体后血管内皮细胞的激活过程而起作用。出于本发明目的，VEGF拮抗剂的所有这些干扰应被认为是等价的。
如本文所用，术语“VEGF受体”或“VEGFr”指VEGF的细胞受体，通常是在血管内皮细胞上的细胞表面受体，以及保留与hVEGF结合能力的变异受体。VEGF受体的一个例子是fms样酪氨酸激酶(flt)，它是酪氨酸激酶家族的一种跨膜受体(DeVries等人，科学(Science)255：989(1992)；Shibuya等人，Oncogene 5：519(1990))。flt受体包括一个胞外结构域、一个跨膜结构域和一个具有酪氨酸激酶活性的胞内结构域。胞外结构域涉及与VEGF的结合，而胞内结构域涉及信号传导。VEGF受体的另一例子是flk-1受体(也被称为KDR)(Matthews等人，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)88：9026(1991)；Terman等人，Oncogene 6：1677(1991)；Terman等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.187：1579(1992))。VEGF与flt受体的结合导致形成至少2种高分子量的复合物，表观分子量为205,000和300,000道尔顿。据信，300,000道尔顿的复合物是包含结合于一个VEGF分子的2个受体分子的二聚体。
除非另外说明，术语“表位A4.6.1”在本文指可与Kim等人，GrowthFactors 7：53(1992)和Kim等人，自然(Nature)362：841(1993)所公开的A4.6.1抗体结合的，人VEGF的区域。
“治疗”指治疗性处理和预防性或防御性措施。需要治疗者包括已经患病以及要预防疾病的生物。
出于治疗目的，“哺乳动物”指任何划为哺乳动物的动物，包括人、家畜和农场动物，以及动物园动物、运动动物和宠物，如狗、马、猫、牛等。较佳地，此处的哺乳动物为人。
“抗体(Ab)”和“免疫球蛋白(Ig)”是有相同结构特征的糖蛋白。抗体表现出对特异抗原的结合特异性，而免疫球蛋白包括抗体和缺少抗原特异性的抗体样分子。后一类多肽可由例如淋巴系统低水平地产生，而由骨髓瘤高水平地产生。
“天然抗体”和“天然免疫球蛋白”是约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。据信特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中被称为高变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区(分别是FR1、FR2、FR3和FR4)，它们大致上呈β-折叠构型，由三个高变区相连。这些高变区形成连接β折叠结构的环并且在某些情况下是β折叠结构的一部分。每条链中的高变区通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的高变区一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，(5th版)，PublicHealth Service，National Instistutes of Health，Bethesda，MD(1991)，第647-669页)。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应子功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
如本文所用，术语“高变区”指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包括来自“互补决定区”即“CDR”的氨基酸残基(即轻链可变区的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)以及重链可变区的残基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，(5th版)，Public Health Service，National Instistutes of Health，Bethesda，MD(1991))和/或来自“高变环”的残基(即轻链可变区的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)以及重链可变区的残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk等人，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)196，901(1987))。“构架”或“FR”残基是除了此处所定义的高变区残基之外的那些可变区残基。
木瓜蛋白酶消化抗体产生了两个相同的抗原结合片段(称为“Fab”片段，每个片段有单个抗原结合位点)以及一个残余的“Fc”片段(该名称反映了其容易结晶的能力)。用胃蛋白酶处理产生了一个F(ab′)2片段，该片段有两个抗原结合位点，并仍能与抗原交联。
“Fv”是最小的抗体片段，它含有全部抗原识别和结合位点。该区域由非共价地紧密结合的一个重链和一个轻链可变区的二聚物组成。在该构型中，各可变区中的三个高变区相互作用，在VH-VL二聚物表面上界定了抗原结合位点。6个高变区共同地赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使是单个可变区(或Fv的一半，它只包含对抗原有特异性的三个高变区)也能识别并结合抗原，只是其亲和力比完整的结合位点低。
Fab片段还含有轻链的恒定区和重链的第一个恒定区(CH1)。Fab′片段与Fab片段的不同之处在于，在重链CH1区的羧基端多几个残基(包括来自铰链区的一个或多个半胱氨酸)。Fab′-SH在本文表示恒定区的半胱氨酸残基携带了游离巯基的Fab′。F(ab′)2抗体片段最初是以Fab′片段对的形式产生的，在其间有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联方式也是已知的。
脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”，可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为kappa(κ)和lambda(λ))中的一类。
根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG-1、IgG-2、IgG-3、IgG4、IgA-1和IgA-2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。
术语“抗体”被最广义地使用，并且具体地包括：单克隆抗体(包括全长的单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、以及抗体片段，只要它们表现出所需的生物活性即可。
“抗体片段”包括完整抗体的一部分，通常是完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；二体(diabody)；线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
本文所用的术语“单克隆抗体”指从一类基本均一抗体获得的抗体，即该群体中包含的各抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变之外。单克隆抗体是高特异性的，针对单个抗原位点。而且，与常规的(多克隆)抗体制剂(它通常是包括针对不同的决定簇(表位)的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性-即从基本均一的抗体群中获得的，而不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。例如，用于本发明的单克隆抗体可用杂交瘤方法(由Kohler等，Nature，256：495(1975)首先提出)制得，或可用重组DNA方法(例如参见美国专利No.4,816,567)制得。“单克隆抗体”还可利用例如Clackson等人，自然(Nature)352：624-628(1991)和Marks等人，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)222：581-597(1991)所述的技术从噬菌体抗体文库中分离得到的。
单克隆抗体在此特别包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与某一特定物种的抗体对应序列相同或同源，或是属于特定的抗体类别或亚类，而链的其余部分则与另一物种的抗体对应序列相同或同源、或是属于另一种抗体类别或亚类，以及这种抗体的片段，只要该片段具有所需的生物活性即可(美国专利No.4,816,567和Morrison等人，美国科学院院报81：6851-6855(1984))。
“人源化”形式的非人(如鼠)抗体是嵌合的抗体，它们含有非人免疫球蛋白的最小序列。对于大多数情况，人源化抗体是这样的人免疫球蛋白(受者抗体)，其中受者高变区残基被非人源(供者抗体)(例如有所需特异性、亲和力和活性的小鼠、大鼠、兔或非人灵长动物抗体)的高变区残基所代替。在一些情况下，人免疫球蛋白的构架区(FR)残基可被对应的非人残基代替。另外，人源化的抗体可包括既不存在于受者抗体、又不存在于供体抗体的残基。这些修饰能进一步提高抗体的性能。通常，人源化抗体包含了基本上所有的(至少一个、通常两个)可变区，其中所有或基本上所有的高变区区对应于非人免疫球蛋白的高变区区，而所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白序列的FR区。人源化抗体最好还包括免疫球蛋白(通常是人免疫球蛋白)恒定区(Fc)的至少一部分。更详细的情况可参见Jones等人，Nature，321：522-525(1986)；Reichmann等人，Nature，332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2：593-596(1992)。
“单链Fv”或“sFv”抗体片段包含存在于单条多肽链内的抗体VH和VL区。一般说来，Fv多肽还包含位于VH和VL区之间的多肽接头，使得sFv形成适合抗原结合所需的结构。有关sFv的综述，可参见Pluckthum的“单克隆抗体的的药物学”(Pharmacology of Monoclonal Antibodies)第113卷，Rosenburg和Moore编，Spring-Verlag，New York，pp.269-315(1994)。
“二体(diabody)”指有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段包含在同一多肽链(VH-VL)内与轻链可变区(VL)连接的重链可变区(VH)。通过使用短至使同一链内两功能区无法配对的接头，功能区被迫与另一链的互补区配对，由此形成两个抗体结合位点。例如欧洲专利404,097；WO93/11161；和Hollinger等在美国科学院院报90：6444-6448(1993)中对二体有更为全面的论述。
术语“线性抗体”在本申请中指Zapata等人，蛋白质工程(Protein Eng.)8(10)：1057-1062(1995)中所述的抗体。简而言之，这些抗体包括一对串联的Fd片段(VH-CH1-VH-CH1)，它们构成了一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性或单特异性的。
“变异的”抗-VEGF抗体指与因在亲代抗体序列中插入、缺失和/或取代一个或多个氨基酸残基而在氨基酸序列上与“亲代”抗-VEGF抗体氨基酸序列有所不同的分子。在优选例中，变异抗体包含位于亲代抗体的一个或多个高变区中的一个或多个氨基酸取代。例如，变异抗体在亲代抗体的一个或多个高变区中可含有至少一个(例如1-10个，较佳地2-5个)取代。通常，变异抗体的氨基酸序列与亲代抗体的重链或轻链可变区序列(如SEQ IDNO：7或8)有至少75％，较佳地至少80％，更佳地至少85％，更好地至少90％，最佳地至少95％的氨基酸序列相同。关于序列的相同性或同源度，在本文是将序列排列对齐并引入空隙(如果需要)从而达到最大的序列相同百分比之后，用候选序列中与亲代抗体残基相同的氨基酸残基百分比表示。抗体序列的N末端、C末端、或内部延伸区、缺失或插入都不认为会影响序列相同性或同源度。变异抗体保留结合人VEGF的能力，并且较佳地具有优于亲代抗体的特性。例如，变异抗体具有更强的结合亲和力，更强的抑制VEGF诱导型内皮细胞增殖的能力和/或更高的在体内抑制VEGF诱导型血管生成的能力。为了分析这些特性，人们可例如将Fab形式的变异抗体与Fab形式的亲代抗体比较，或将全长形式的变异抗体与全长形式的亲代抗体比较，因为已发现抗-VEGF抗体的形式影响其在此处公开的生物活性测定中的活性。此处特别感兴趣的变异抗体是与亲代抗体相比生物活性高至少约10倍，较佳地至少约20倍，更佳地至少约50倍的抗体。
“亲代”抗体在此是具有用于制备变异抗体的氨基酸序列的抗体。较佳地，亲代抗体具有人构架区，而且具有人抗体恒定区(如果存在)。例如，亲代抗体可以是人源化抗体或人抗体。
“分离的”抗体是经鉴定的和分离和/或回收自其天然环境组份的抗体。其天然环境中的污染组份是指会干扰所述抗体的诊断或治疗性用途的物质，可包括酶、激素和其它蛋白质类或非蛋白质类溶质。在优选实施方案中，抗体纯化至(1)经Lowry法测定，按重量计抗体纯度高于95％，最好高于99％，(2)其纯度足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个N末端残基或内部氨基酸序列，或者(3)用Coomassie蓝或最好用银染色法，经还原或非还原条件下SDS-PAGE测定时达到均质。分离的抗体包括存在于重组细胞内的原位抗体，因为该抗体天然环境的至少一种组份是不存在的。但是，通常，分离的抗体是经至少一步纯化步骤制备的。
术语“表位标记的”在此表示抗-VEGF抗体被融合于“表位标记”。表位标记(epitope tag)应具有足够的残基来形成可产生其对应抗体所需的表位，但又短到不至于影响VEGF抗体的活性。表位标记宜具有相当的独特性，以致针对其的抗体基本上不与其它表位交叉反应。适宜的标记多肽一般具有至少6个氨基酸残基，一般介于约8至50个氨基酸残基(以约9至30个残基为宜)。例子包括flu HA标记多肽及其抗体12CA5(Field等人，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)8：2159-2165(1988))；c-myc标记及其抗体8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10(Evan等人，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)5(12)：3610-3616(1985)；和单纯性疱疹病毒糖蛋白D(gD)标记及其抗体(Paborsky等，Protein Engineering 3(6)：547-553(1990))。在某些例子中，表位标记是“补救受体结合表位”。如本文所用，术语“补救受体结合表位”指IgG分子(如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc区的表位，它负责提高IgG分子在体内血清半衰期。
术语“细胞毒剂”在此指抑制或阻止细胞功能和/或导致细胞破坏的物质。该术语包括放射性同位素(例如I131、I125、Y90、和Re186)、化疗剂和毒素(例如来自细菌、真菌、植物或动物的酶活毒素或其片段)。
“化疗剂”是用于治疗癌症的化合物。化疗剂包括例如阿霉素(Adriamycin)、阿霉素(Doxorubicin)、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷(“Ara-C”)、环磷酰胺、塞替派、白消胺、Taxotere(docetaxel)、细胞毒素、红豆杉醇、甲氨蝶呤、顺氯铵铂、美法仑、长春碱、博来霉素、依托泊甙、异环磷酰胺、丝裂霉素C、米托蒽醌、长春新碱、长春瑞宾、卡铂、替尼泊甙、道诺霉素、洋红霉素、氨基蝶呤、放线菌素D、丝裂霉素、Esperamicins(参见美国专利4,675,187)、美法仑以及其它相关的氮芥。
术语“前药(prodrug)”在此指药学活性物质的前体或衍生形式，其对肿瘤细胞的细胞毒性低于亲代药物，并且能够被酶激活或转化成较高活性的亲代形式。参见Wilman，“癌症化疗中的前药”(“Prodrugs in CancerChemotherapy”)，生物化学协会学报(Biochemical SocietyTransaction)14，pp.375-382，第615次会议，Belfast(1986)和Stella等人，“前药：定靶药物释放的化学方法”(“Prodrug：A Chemical Approach to TargetedDrug Delivery”)，受控药物释放(Directed Drug Delivery)，Borchardt等编，pp.247-267，Humana Press(1985)。本发明的前药包括(但不限于)：含磷酸盐的前药、含硫代磷酸盐的前药、含硫酸盐的前药、含肽的前药、经D-氨基酸修饰的前药、糖基化的前药、含β内酰胺的前药、任选地取代的苯氧基乙酰胺的前药或任选地取代的苯乙酰胺的前药、5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿嘧啶前药，它们可以被转化为细胞毒性更高的游离药物。可以衍生成为本发明所用前药形式的细胞毒性药物的例子，包括(但不限于)前文所述的化疗剂。
词语“标记”在此指直接或间接与抗体偶联的可检测化合物或组合物。标记自身可以被检测到(例如放射性同位素标记或荧光标记)，或者，如果是酶标记，它们可催化化合物或组合物底物发生可检测的化学转变。
“固相”指本发明抗体可吸附于其上的非液态基质。固相的例子在此包括：部分或完全由玻璃(例如可控多孔玻璃)、多糖(例如琼脂糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和硅氧烷构成的固相。在某些实施方案中，根据上下文，固相可能包括测试板的孔；而在其它实施方案中，可能是纯化柱(例如亲和色谱柱)。该术语还包括分散的颗粒构成的不连续固相，如美国专利No.4,275,149中所述的。
“脂质体”是由各种脂类、磷脂和/或表面活性剂构成的，通常被用来向哺乳动物传递药物(例如本文所述的抗VEGF抗体和任选的化疗剂)的小囊泡。脂质体的组份通常排列成双层结构，与生物膜的脂排列类似。
“分离的”核酸分子是经鉴定的，并且与通常与之相伴存在于该抗体核酸天然来源中的至少一种污染核酸分子分离的核酸分子。分离的核酸分子不是其天然形式或处于其天然环境中。所以，分离的核酸分子与存在于天然细胞内的核酸分子在形式上是不同的。但是，分离的核酸分子包括正常表达抗体的细胞内所含的核酸分子，例如，该核酸分子可以位于不同于天然细胞内的某个染色体位置上。
术语“调控序列”指在特定的宿主微生物内表达与之可操作性连接的编码序列所必需的DNA序列。例如，适合原核细胞的调控序列包括启动子、任选的操纵子序列和核糖体结合位点。已知，真核细胞利用启动子、聚腺苷酸化信号和加强子。
当与另外的核酸序列形成功能关联的时，核酸是“操作性相连的”。例如，前序列(presequense)或分泌性前导序列的DNA是与多肽的DNA操作性相连的，如果它被表达成参与多肽分泌的前蛋白原(preprotein)；启动子或增强子是与编码序列操作性相连的，如果它影响序列的转录；或者，核糖体结合位点是与编码序列操作性相连的，如果它的位置能够促进翻译。通常，“操作性相连”指相连的DNA序列是毗邻的，而在分泌性前导序列情况下，是毗邻的并处于同一阅读框下。然而，增强子不必毗邻。可通过方便的限制性位点处的连接来实现相连。如果这样的位点不存在，则可按常规实践采用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
在本文中，“细胞”“细胞系”和“细胞培养物”是互换使用的，而且所有这些名称都包括子代。所以，词语“转化体”和“转化细胞”包括原代细胞及其衍生的培养物(不论传代多少次)。还应理解，由于有意或无意的突变，所有子代也许在DNA内容上并不精确相同。它包括了筛选出的，具有与原始转化细胞相同功能或生物活性的突变型子代。当采用不同的命名时，可以从上下文中明显看出。
II.发明的实施方式
下面的实施例描述了人源化和变异的抗-VEGF抗体的产生方法，这些抗体从治疗角度看具有有益的特性，其中包括：(a)与VEGF的强结合亲和力；(b)在体外抑制VEGF-诱导型内皮细胞增殖的能力；和(c)在体内抑制VEGF-诱导型血管生成的能力。
抗体的亲和力如下面的实施例所述进行测定。优选的人源化或变异的抗体是那些与人VEGF结合时Kd值不超过约1×10-7M，较佳地不超过1×10- 8M，最佳地不超过约5×10-9M的抗体。
除了与人VEGF具有强结合亲和力的抗体之外，还需要选择具有其他有利的治疗特性的人源化或变异的抗体。例如，抗体可以是能抑制对VEGF应答而导致的内皮细胞生长的抗体。在一个实施例中，抗体能够抑制牛毛细血管内皮细胞对几乎最大有效浓度的VEGF(3ng/ml)应答时的增殖。较佳地，对于在该“内皮细胞生长测定”中抑制VEGF诱导型的内皮细胞生长，抗体的有效剂量50(ED50)不超过约5nM，较佳地不超过1nM，最佳地不超过0.5nM，即在这些浓度下抗体能够在体外抑制50％VEGF诱导型内皮细胞生长。一种优选的“内皮细胞生长测定”包括：基本上如实施例1所述，将衍生自牛肾上腺皮质的毛细血管内皮细胞，在补充有10％牛血清、2mM谷氨酰胺和抗生素的低葡萄糖Dulbecco氏改良的Eagle培养基(DMEM)(GIBCO)(生长培养基)中培养。这些内皮细胞，以6×103细胞/孔的密度接种于6孔板中的生长培养基中。以1-5000ng/ml之间的浓度加入亲代抗-VEGF抗体(对照)、人源化的或变异的抗-VEGF抗体。在2-3小时后，加入纯化的VEGF至终浓度为3ng/ml。对于特异性对照，将每种抗体以5000ng/ml的浓度加至内皮细胞，或者单独加入，或者在有2ng/ml bFGF下加入。在5或6天之后，通过暴露于胰蛋白酶而使细胞解离，并在Coulter计数器(CoulterElectronics，Hialeah，FL)上计数。用四参数曲线拟合程序(KaleidaGraph)分析数据。
优选的人源化或变异的抗-VEGF抗体还可以是具有体内抑制肿瘤活性的抗体。例如，该抗体可抑制人A673成横纹肌细胞瘤细胞或乳房癌MDA-MB-435细胞在裸鼠中的生长。对于体内肿瘤研究，如实施例1所述将A673成横纹肌细胞瘤细胞(ATCC；CRL1598)或MDA-MB-435细胞(可从ATCC获得)在补充有10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺和抗生素的DMEM/F12培养基中培养。将2×106肿瘤细胞(体积200微升)皮下注入6-10周龄雌性BLAB/c裸鼠的背部。然后，在该测试中用人源化或变异的抗体以及无活性的对照抗体来处理动物。人源化或变异的抗-VEGF单克隆抗体的剂量是0.5或5mg/kg。在肿瘤细胞接种开始后24小时，将每种单克隆抗体以100微升体积进行腹膜内注射，每周两次。每周确定肿瘤大小。在注射肿瘤细胞4周后，动物被安乐死亡，然后取出肿瘤并称量。用ANOVA进行统计分析。较佳地，在这种“体内肿瘤测定”中5mg/kg剂量的抗体可抑制约50-100％，较佳地约70-100％，最佳地约80-100％人A673肿瘤细胞的生长。
在优选例中，在将治疗有效量的抗体施用于病人时，人源化或变异的抗体不会引发免疫应答。如果引发了免疫应答，则该应答较佳地仍使抗体能够给被治疗的病人带来治疗好处。
人源化的或变异的抗体还宜能够抑制人体中VEGF诱导型血管生成，例如，抑制人肿瘤生长和/或抑制视网膜疾病中眼内的血管生成。
优选的抗体与本文所述的“表位A4.6.1”结合。为了筛选能结合于被感兴趣抗体结合的人VEGF表位的抗体(如阻断A4.6.1抗体与人VEGF结合的抗体)，可以进行常规的交叉阻断测定，例如在Antibodies，A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，Ed Harlow和David Lane(1988)中所述的方法。或者，可进行表位定位(例如用Champe等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)270：1388-1394(1995)中所述的方法)，以确定抗体是否结合于有关的表位。
本文优选例的抗体具有一重链可变区，它包括由下式表示的氨基酸序列：FR1-CDRH1-FR2-CDRH2-FR3-CDRH3-FR4，其中，“FR1-4”表示4个构架区，而“CDRH1-3”表示抗-VEGF抗体重链可变区的3个高变区。FR1-4可如下面实施例那样衍生自“共有序列”(即一类、亚类或亚组人免疫球蛋白的重链或轻链中最常见的氨基酸)，或者可来自某个人抗体构架区或来自组合的不同构架区序列。许多人抗体构架区序列被收集在例如Kabat等人(同上)的文献中。在一个优选例中，可变的重链FR是由如Kabat等人(同上)编纂的人免疫球蛋白的共有序列所提供。较佳地，人免疫球蛋白亚组是人重链亚组III(如SEQ ID NO：11)。
人可变的重链FR序列宜在其中具有取代，例如人FR残基被相应的非人残基取代(非人残基指当人和非人的序列被排列对齐时，与有关的残基具有相同Kabat位置编号的非人残基)，但是不一定必须用非人残基进行取代。例如，除了相应的非人残基之外的FR残基替换，可以用噬菌体展示法进行选择(参见下面的实施例2)。可以被取代的代表性可变重链FR残基包括任何一个或多个下列编号的FR残基：37H、49H、67H、69H、71H、73H、75H、76H、78H、94H(此处采用Kabat的残基编号法)。较佳地，这些残基中有至少2个，或至少3个或至少4个被取代。一种优选的FR取代组合是：49H、69H、71H、73H、76H、78H和94H。
对于重链高变区，较佳地具有如下氨基酸序列：
CDRH1
GYX1X2X3X4YGX5N(SEQ ID NO：117)，其中X1是D、T或E，但较佳地是D或T；X2是F、W、或Y，但较佳地是F；X3是T、Q、G或S，但较佳地是T；X4是H或N；而且X5是M或I，但较佳地是M。
CDRH2
WINTX1TGEPTYAADFKR(SEQ ID NO：118)，其中X1是Y或W，但较佳地是Y。
CDRH3
YPX1YX2X3X4X5HWYFDV(SEQ ID NO：119)，其中X1是H或Y；X2是Y、R、K、I、T、E、或W，但较佳地是Y；X3是G、N、A、D、Q、E、T、K、或S，但较佳地是G；X4是S、T、K、Q、N、R、A、E、或G，但较佳地是S或T；而且X5是S或G，但较佳地是S。
重链可变区可任选地包括FR3中的、在此处被命名为“CDR7”的序列(参见图9B和10B)，其中CDR7可具有如下氨基酸序列：
CDR7
X1SX2DX3X4X5X6TX7(SEQ ID NO：120)，其中X1是F、I、V、L或A，但较佳地是F；X2是A、L、V或I，但较佳地是L；X3是T、V或K，但较佳地是T；X4是S或W，但较佳地是S；X5是S或K，但较佳地是K；X6是N或S，但较佳地是S；而X7是V、A、L或I，但较佳地是A。
本文优选例的抗体具有一轻链可变区，它包括由下式表示的氨基酸序列：FR1-CDRL1-FR2-CDRL2-FR3-CDRL3-FR4，其中，“FR1-4”表示4个构架区，而“CDRL 1-3”表示抗-VEGF抗体轻链可变区的3个高变区。FR 1-4可如下面实施例那样衍生自“共有序列”(即一类、亚类或亚组人免疫球蛋白的重链或轻链中最常见的氨基酸)，或者可来自某个人抗体构架区或来自组合的不同构架区序列。在一个优选例中，可变的轻链FR是由如Kabat等人(同上)编纂的人免疫球蛋白的共有序列所提供。较佳地，人免疫球蛋白亚组是人κ轻链亚组I(如SEQ ID NO：12)。
人可变的轻链FR序列宜在其中具有取代，例如人FR残基被相应的小鼠残基取代，但是不一定必须用非人残基进行取代。例如，除了相应的非人残基之外的FR残基替换，可以用噬菌体展示法进行选择(参见下面的实施例2)。可以被取代的代表性可变轻链FR残基包括任何一个或多个下列编号的FR残基：4L、46L和71L(此处采用Kabat的残基编号法)。较佳地，仅46L被取代。在另一实例中，4L和46L被取代。
对于CDR，较佳地具有如下氨基酸序列：
CDRL1
X1AX2X3X4X5SNYLN(SEQ ID NO：121)，其中X1是R或S，但较佳地是S；X2是S或N，但较佳地是S；X3是Q或E，但较佳地是Q；X4是Q或D，但较佳地是D；而且X5是I或L，但较佳地是I。
CDRL2
FTSSLHS(SEQ ID NO：122)
CDRL3
QQYSX1X2PWT(SEQ ID NO：123)，其中X1是T、A或N，但较佳地是T；而且X2是V或T，但较佳地是V。
优选的人源化抗-VEGF抗体是那些具有实施例1中F(ab)-12的重链和/或轻链可变区序列的抗体及其变异体，例如亲和性成熟形式的变异抗体，其中包括实施例3中的变异抗体Y0317、Y0313-1和Y0238-3，并且Y0317是优选的变异抗体。产生感兴趣的人源化抗-VEGF抗体的方法，将在下面详细描述。
A.制备抗体
在下面实施例中描述了使非人VEGF抗体人源化以及产生抗-VEGF抗体变异体的方法。为了使抗-VEGF抗体抗体人源化，制备非人的抗体原料。当需要产生变异抗体时，可制备亲代抗体。在下一节中将描述产生这种非人的抗体原料和亲代抗体的代表性技术。
(i)制备抗原
用于产生抗体的VEGF抗原可以是例如完整的VEGF或VEGF片段(如含“A4.6.1表位”的VEGF片段)。可用于产生抗体的其他形式的VEGF，对于本领域技术人员而言是显而易见的。用于产生抗体的VEGF抗原宜是人VEGF，例如在Leung等人，科学(Science)246：1306(1989)和Houck等人，Mol.Endocrin.5：1806(1991)所述的。
(ii)多克隆抗体
多克隆抗体宜通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂在动物体内生成的。可以用例如马来酰亚氨苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基偶联)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R1N＝C＝NR(其中的R和R1是不同的烷基)的双官能剂或衍生剂，将有关抗原与在待免疫物种中具有免疫原性的蛋白质进行偶联，后者包括例如：匙孔虫戚血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制物。
用抗原、免疫偶联物或衍生物免疫动物，例如将100微克或5微克(分别适合兔或小鼠)蛋白质或偶联物与3倍体积Freund完全佐剂混合后，在多处皮内注射该溶液。一个月后，通过多处皮下注射1/5至1/10最初剂量的肽或偶联物和Freund完全佐剂，对动物进行加强免疫。7至14天后，对动物放血，分析血清的抗体效价。对动物的加强免疫进行至效价稳定为止。较好的是，用相同抗原但与不同蛋白和/或通过不同的交联剂偶联而成的偶联物进行加强免疫。偶联物还可以在重组细胞内以融合蛋白的形式制备。而且，凝聚剂(例如明矾)适合用来加强免疫应答。
(iii)单克隆抗体
单克隆抗体可以用Kohler等人，自然256：495(1975)首次公开的杂交瘤方法制得，或者利用重组DNA方法制得(美国专利4,816,567)。
在杂交瘤方法中，鼠或其它合适的宿主动物，例如仓鼠或猕猴，如前文所述接受免疫，以引发产生或能够产生特异性结合免疫所用蛋白的抗体的淋巴细胞。或者，可以体外免疫淋巴细胞。然后使用合适的融合剂(例如聚乙二醇)将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞(Goding，单克隆抗体：理论与实践(Monoclonal Antibodies：Principles and Practic)，pp.59-103(Academic Press，1986))。
将如此制得的杂交瘤细胞接种并培养在合适的培养基中，培养基中最好含有一种或多种抑制非融合亲代骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，如果亲代骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，杂交瘤培养基中一般含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷这些抑制HGPRT缺陷型细胞生长的物质(HAT培养基)。
优选的骨髓瘤细胞是那些融合效率高、支持选定的抗体生产细胞稳定且高水平地生产抗体、而且对诸如HAT培养基敏感的细胞。其中，优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤细胞系，例如来自MOPC-21和M.C.-11鼠肿瘤的(可以从Salk Institute Cell Distribution Center，San Diego，California USA获得)，和SP-2或X63-Ag8-653细胞(可由美国典型培养物保藏中心，Rockville，Maryland USA获得)。也有用人骨髓瘤细胞和人-鼠异源骨髓瘤细胞系来生产人单克隆抗体的(Kozbor，免疫杂志(J.Immunol.)133：3001(1984)；Brodeur等，单克隆抗体的生产技术和应用(Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications)，pp.51-63(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)。
对生长有杂交瘤细胞的培养液进行分析，检测是否产生针对抗原的单克隆抗体。较好的是，用免疫沉淀法或例如放射免疫分析(RIA)或酶联免疫吸附分析(ELISA)的体外结合分析法，来测定由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。
例如，单克隆抗体的结合亲和性可以利用Scatchard分析(Munson等，生物化学年刊(Anal.Biochem.)107：220(1980))来测定。
在杂交瘤细胞经鉴定生产了具有所要求的特异性、亲和性和/或活性的抗体后，可以利用有限稀释程序将克隆亚克隆化，并利用标准方法培养(Goding，单克隆抗体：理论与实践(Monoclonal Antibodies：Principles andPractice)pp.59-103(Academic Press，1986))。就此目的而言，合适的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养液。此外，杂交瘤细胞可以以腹水瘤的形式在动物体内生长。
利用常规免疫球蛋白纯化技术，例如A蛋白-琼脂糖柱(protein A-Sepharose)、羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析或亲和性色谱，可从培养液、腹水液或血清中合适地分离出由亚克隆分泌的单克隆抗体。
使用常规方法，可以方便地分离出编码单克隆抗体的DNA并进行测序(例如，利用能与编码单克隆抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞是所述DNA的优选来源。一旦被分离，可以将DNA置于表达载体中，表达载体然后被转染到例如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或杂交瘤细胞等原本并不产生免疫球蛋白的宿主细胞内，从而在重组宿主细胞内获得生成的单克隆抗体。下面更详细地描述抗体的重组产生法。
(iv)人源化和氨基酸序列变异体
下面的实施例1-2描述了使抗-VEGF抗体人源化的程序。在某些例子中，可能需要产生这些人源化抗体的氨基酸序列变异体，尤其是在需要提高人源化抗体的结合亲和力或其他生物特性的场合。实施例3描述了产生具有比亲代抗体更高亲和力的抗-VEGF抗体的氨基酸序列变异体的方法。
抗-VEGF抗体的氨基酸序列变异体可这样制备：将合适的核苷酸变化引入抗-VEGF抗体的DNA，或通过肽合成。这样的变异抗体包括例如，在此处实施例的抗-VEGF抗体的氨基酸序列中有氨基酸残基缺失、和/或插入和/或取代。可进行缺失、插入和取代的任何组合，以制备最终的构建物，只要该最终构建物具有所需的特性。氨基酸改变也可改变人源化或变异的抗-VEGF抗体的翻译后加工过程，例如改变糖基化位点的数目或位置。
一种有用的、确定抗-VEGF抗体中那些残基或区域是适合诱变的优选位置的方法，是Cunningham和Wells，科学(Science)，244：1081-1085(1989)中描述的“丙氨酸扫描诱变”。在该方法中，确定一个或一组靶残基(如带电荷的残基如arg、asp、his、lys和glu)，并用中性或带负电荷的氨基酸(最佳的是丙氨酸或聚丙氨酸)加以替换，以影响氨基酸与VEGF的相互作用。那些在功能上表现出对替换敏感的氨基酸位置，再通过在置换位点处引入进一步的或其他的突变而进行结构的精细研究。这样，尽管引入氨基酸序列变异的位点被预先确定，但是突变本身的性质不必被预先确定。例如，为了优化给定位点处突变的性能，可以对靶密码子或区域进行丙氨酸扫描或随机诱变，然后筛选表达的抗-VEGF抗体变异体是否有所需活性。丙氨酸扫描诱变在实施例3中描述。
氨基酸序列插入包括氨基端和/或羧基端的融合，长度为一个残基至含100个或更多残基的多肽，还包括在序列内插入单个或多个氨基酸残基。末端插入的例子包括：具有N端甲硫氨酸残基的抗-VEGF抗体，或融合于表位标记的抗体。抗-VEGF抗体分子的其他插入变异体包括：将抗-VEGF抗体的N端或C端融合于会导致抗体血清半衰期更长的酶或多肽(见下面)。
另一种变异体是氨基酸置换变异体。这些变异体在抗-VEGF抗体分子中至少有一个氨基酸残基被除去并在其位置上插入不同的残基。置换诱变最感兴趣的位置包括高变区，但FR改变也在范围之中。保守性置换示于表1，标题是“优选的置换”。如果这种置换导致生物活性的改变，那么可引入更接近的变化即表1中指出的“代表性置换”、或进一步按下面氨基酸类型引入置换，然后筛选产物。
表1
  最初的残基   代表性的置换   优选的置换
  Ala(A)   val；leu；ile   val
  Arg(R)   lys；gln；asn   lys
  Asn(N)   gln；his；lys；arg；asp   gln
  Asp(D)   glu；asn   glu
  Cys(C)   ser；ala   ser
  Gln(Q)   asn；glu   asn
  Glu(E)   asp；gln   asp
  Gly(G)   ala   ala
  His(H)   asn；gln；lys；arg   arg
  Ile(I)   leu；val；met；ala；phe；正亮氨酸   leu
  Leu(L)   正亮氨酸；ile；val；met；ala；phe   ile
  Lys(K)   arg；gln；asn   arg
  Met(M)   leu；phe；ile   leu
  Phe(F)   leu；val；ile；ala；tyr   leu
  Pro(P)   ala   ala
  Ser(S)   thr   thr
  Thr(T)   ser   ser
  Trp(W)   tyr；phe   tyr
  Tyr(Y)   trp；phe；thr；ser   phe
  Val(V)   ile；leu；met；phe；ala；正亮氨酸   leu
对抗体生物性能的基本修饰，可以通过选择在下列方面的效应上差别明显的置换而实现：(a)维持取代区域中多肽骨架的结构，例如折叠或螺旋构象，(b)维持靶位置处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链体积。根据共同的侧链特性，天然存在的残基被分成下列几类：
(1)疏水的：正亮氨酸，met，ala，val，leu，ile；
(2)中性亲水的：cys，ser，thr；
(3)酸性的：asp，glu；
(4)碱性的：asn，gln，his，lys，arg；
(5)影响链取向的残基：gly，pro；和
(6)芳香类的：trp，tyr，phe
非保守性取代需要用这些类别中一类的某种氨基酸替换另一类的某种氨基酸。
在维持人源化或变异的抗-VEGF抗体的正常构象中不涉及的任何半胱氨酸残基也可被取代，一般是用丝氨酸取代，以改善分子的氧化稳定性并防止异常交联。相反地，可以在抗体中添加半胱氨酸键以提高稳定性(尤其是在抗体是抗体片段(如Fv片段)的情况下)。
一种特别优选的置换变异体涉及替换亲代抗体(如人源化抗体或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，形成的并选出用于进一步开发的变异抗体应与产生它们的亲代抗体相比具有更高的生物活性。一种方便的产生这种置换变异体的方法，是用噬菌体展示法(见实施例3)进行亲和力成熟化。简而言之，对数个高变区位点(如6-7个位点)进行突变，从而在每个位点上产生所有可能的氨基酸置换。这样产生的变异抗体以单价形式在丝状噬菌体颗粒上展示，即作为在每个颗粒中包装且融合于M13基因III产物的融合蛋白。然后按此处所述的那样，筛选噬菌体展示的变异抗体的生物活性(如结合亲和力)。为了鉴别用于修饰的候选高变区位点，可进行丙氨酸扫描诱变(见实施例3)以鉴别出对抗原结合有重大贡献的高变区残基。另外或额外的，分析抗原-抗体复合物的晶体结构可能是有利的，以鉴别出抗体和人VEGF之间的接触点。根据此处所述的技术，这些接触残基和相邻残基是置换的候选残基。一旦得到了这些变异体，那么可如本文所述的那样对一组变异体进行筛选，并选出在一个或多个相关测试中有优异性能的抗体作进一步开发。
另一种抗体的氨基酸变异体是是改变抗体的原来的糖基化方式。“改变”指删去一个或多个在抗体中发现的碳水化合物分子(部分)，和/或增加一个或多个在抗体中不存在的糖基化位点。
抗体的糖基化通常是N-连接的或O-连接的。“N-连接”指碳水化合物部分连在天冬酰胺残基的侧链上。天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸这样的三肽序列，是将碳水化合物酶连于天冬酰胺侧链的识别序列，其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸。因此，在多肽中存在任何一种这样的三肽便会形成一个潜在的糖基化位点。“O-连接的”糖基化指N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、或木糖等糖中的一种被连于羟基氨基酸上，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，尽管也可使用5-羟基脯氨酸或5-羟基丝氨酸。
在抗体中添加糖基化位点，通常可通过改变氨基酸序列从而使其含有一个或多个上述的三肽序列(对于N-连接的糖基化位点而言)而实现。还可以通过在原来的抗体中添加或取代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基而实现改变(对于N-连接的糖基化位点而言)。
编码抗-VEGF抗体氨基酸序列变异体的核酸分子，可用本领域中已知的各种方法制备。这些方法包括(但并不限于)：从天然来源中分离出(在天然存在的氨基酸序列变异体的情况下)，或通过对早先制备的变异或非变异的抗-VEGF抗体进行寡核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变、和盒式诱变而制备。
(v)人抗体
作为人源化的替换形式，可产生人抗体。现在可以产生转基因动物(如小鼠)，一旦免疫，它们能够在没有内源免疫球蛋白产生的情况下产生所有种类的人抗体。例如，已有报道，在嵌合的种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失，会导致完全抑制内源抗体的产生。将人种系免疫球蛋白基因阵列(gene array)转入这种种系突变的小鼠中，会导致在抗原攻击时产生人抗体。参见例如Jakobovits等人，美国科学院院报，90：2551-255(1993)和Jakobovits等人，自然：362：255-258(1993)；Bruggermann等人，Year.InImmuno.，7：33(1993)；和美国专利5,591,669、5,589,369和5,545,807。还可从噬菌体展示文库中产生人抗体(Hoogenboom等人，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)，227：381[1991]；Marks等人，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)，222：581[1991]；和美国专利5,565,332和5,573,905)。如上所述，人抗体还可在体外用激活的B细胞来产生(参见美国专利5,567,610和5,229,275)。
(vi)抗体片段
在某些例子中，人源化或变异的抗-VEGF抗体是抗体片段。已经有了各种方法生产抗体片段。通常，所述片段是通过用蛋白酶消化完整的抗体而得到的(参见Morimoto等人，生物化学和生物物理学方法杂志(Journal ofBiochemical and Biophysical Methods)24：107-117(1992)和Brennan等，科学229：81(1985))。但是，现在，抗体片段可以直接由重组宿主细胞产生。例如，可以直接从大肠杆菌回收Fab′-SH片段，然后化学偶合而形成F(ab′)2片段(Carter等，生物技术10：163-167(1992))。在另一例子中，F(ab′)2的形成，可通过用亮氨酸拉链GCN4来促进F(ab′)2分子的装配。根据另一方法，Fv、Fab或F(ab′)2片段可以从重组宿主细胞培养物中直接分离得到。生产抗体片段的其它方法是本领域一般技术人员众所周知的。
(vii)多特异性抗体
在某些例子中，产生多特异性(如双特异性)的人源化或变异的抗-VEGF抗体是有利的，它们具有针对至少两个不同表位的结合特异性。代表性的双特异性抗体可与VEGF蛋白的两个不同表位结合。或者，抗VEGF臂可与能结合于白细胞触发分子的臂组合，后者例如T细胞受体分子(例如CD2或CD3)，或IgG的Fc受体(FcγR)例如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)，从而使细胞防御机制主要针对VEGF表达细胞。双特异性抗体还可以用于将细胞毒剂定位于表达VEGF的细胞。所述抗体具有结合VEGF的臂和结合细胞毒剂(例如皂草素、抗α干扰素、长春花生物碱、蓖麻毒蛋白A链、氨甲蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。双特异性抗体可以制备成全长抗体或抗体片段(例如F(ab′)2双特异性抗体)。
根据另一种制备双特异性抗体的方法，可对一对抗体分子之间的界面进行工程化，以便使从重组细胞培养物中回收的异二聚体的百分比最大化。优选的界面含有抗体恒定区的至少一部分CH3区。在该方法中，第一抗体分子界面上的一个或多个小氨基酸侧链被用更大的侧链(如酪氨酸或色氨酸)加以替换。与大侧链大小相同或相似的、补偿性的“空穴”可在第二抗体分子的界面上形成，即将大的氨基酸侧链用更小的侧链(如丙氨酸或苏氨酸)加以替换。这样提供了一种使异二聚体比不需要的终产物(如同二聚体)的产率更高的机理。参见1996年9月6日出版的WO96/27011。
双特异性抗体包括交联的或“异偶联(heteroconjugate)”抗体。例如，异偶联体中的一个抗体可被偶联于亲和素，而另一抗体被偶联于生物素。这种异偶联抗体可用任何方便的交联方法制备。合适交联剂在本领域中是已知的，并与多种交联技术一起公开于美国专利No.4,676,980中。
文献中也记载了从抗体片段产生双特异性抗体的技术。例如，双特异性抗体可用化学连接方法制备。Brennan等，Science 229：81(1985)描述了一种方法，其中完整的抗体被蛋白酶解切断，产生F(ab′)2片段。这些片段在二硫酚复合剂亚砷酸钠存在下被还原，从而稳定了连位的二硫酚并防止形成分子间的二硫键。产生的Fab′片段接着被转变成硫代硝基苯甲酸(thionitrobenzoate，TNB)衍生物。Fab′-TNB衍生物中的一种然后通过用巯基乙胺还原而被再转变成Fab′-巯基，再与等摩尔量的另一种Fab′-TNB衍生物相混合，从而形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作选择性地固定酶的试剂。在另一例子中，从大肠杆菌中直接回收的Fab′-SH片段，被体外化学偶联形成双特异性抗体。Shalaby等人，实验医学杂志(J.Exp.Med.)，175：217-225(1992)
各种直接从重组细胞培养物制备和分离双特异性抗体片段的技术已有描述。例如，已用亮氨酸拉链生成了双特异性抗体。Kostelny等，免疫学杂志148(5)：1547-1553(1992)。来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两个不同抗体的Fab′部分连接。该抗体同二聚体在铰链区被还原成单体，然后重新氧化成抗体异二聚体。该方法还可以被用来产生抗体同二聚体。Hollinger等人在美国科学院院报90：6444-6448(1993)中所述的“二体”技术，提供了另一种制造双特异性抗体片段的机制。所述片段包含通过接头而连接在一起的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)，接头很短以致于同一链上的两个功能区之间无法配对。所以，同一片段上的VH和VL功能区被迫与其它片段上的互补性VL和VH功能区配对，由此形成两个抗原结合位点。利用单链Fv(sFv)二聚体制备双特异性抗体片段的其它方法也已有所报道。参见Gruber等，免疫学杂志(J.Immunol.)152：5368(1994)。或者，双特异性抗体可以是按Zapata等人，蛋白质工程(Protein Eng.)8(10)：1057-1062(1995)中所述方法制备的“线性抗体”。
可考虑使用二价以上的抗体。例如可以制备三特异性抗体。Tutt等人，免疫学杂志147：60(1991)。
(viii)其他修饰形式
人源化或变异的抗-VEGF抗体的其他修饰形式也在范围之中。例如，可能需要就效应子功能对本发明抗体进行修饰，从而加强抗体在例如治疗癌症中的效果。例如，可在Fc区内引入半胱氨酸残基，由此允许在该区形成链间二硫键。由此形成的同源二聚体抗体可以具有改善的内在能力和/或提高的补体介导的细胞杀伤性和抗体依赖性细胞毒性(ADDC)。参见Caron等，实验医学杂志176：1191-1195(1992)和Shopes，B.，免疫学杂志148：2918-2922(1992)。抗癌活性增强的同源二聚体抗体，还可以如Wolff等在癌症研究(Cancer Research)53：2560-2565(1993)中所述利用异源双功能(heterobifunctional)交联剂来制备。或者，抗体可以经改造后具有两个Fc区，并由此加强其补体裂解性和ADDC能力。参见Stevenson等，抗癌药的设计(Anti-Cancer Drug Design)3：219-230(1989)。
本发明还涉及包含与细胞毒剂偶联的所述抗体的免疫偶联物，细胞毒剂例如化疗剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射性偶联物)。
用于产生所述免疫偶联物的化疗剂已在前文论述过。可以使用的酶活性毒素或其片段包括：白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自绿脓杆菌)、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、modeccin A链、α八叠球菌素(α-sarcin)、油桐蛋白、dianthin蛋白、美商路(Phytolacaamericana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制物、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草抑制物、gelonin、mitogellin、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢菌素(tricothecenes)。有多种放射性核素可用于生成放射性偶联的抗VEGF抗体。例如212Bi、131I、131In、90Y和186Re。
抗体与细胞毒剂的偶联物可用各种不同双官能蛋白偶合剂制备的，例如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫代戊环(iminothiolane)(IT)、亚胺酯的双官能衍生物(例如己二亚氨酸二甲酯盐酸盐)、活泼酯(例如二琥珀酰亚胺辛二酸酯)、醛(例如戊二醛)、二叠氮基化合物(例如二(对叠氮基苯甲酰)己二胺)、二重氮衍生物(例如二-(对重氮苯甲酰)-乙二胺)、二异氰酸酯(例如甲苯2，6-二异氰酸酯)和二活性氟化合物(例如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可以如Vitetta等在科学(Science)238：1098(1987)中所述的方法来制备。碳14标记的1-异硫氰酸根合苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是一种代表性的用于将放射性核素与抗体偶联的螯合剂。参见WO94/11026。
在另一实施方案中，为了用于肿瘤导向，抗体可以与“受体”(例如链霉亲和素)偶联，并给患者使用抗体-受体偶联物，接着用清除剂去除循环系统中的未被结合的偶联物，然后施用与细胞毒剂(例如放射性核素)偶联的“配体”(例如亲和素)。
本处所述的抗VEGF抗体还可以制成免疫脂质体。含有抗体的脂质体是利用本领域已知方法制备的，例如以下所述：Epstein等，美国科学院院报82：3688(1985)；Hwang等，美国科学院院报77：4030(1980)；和美国专利4,485,045和4,544,545。美国专利5,013,556公开了具有更长循环时间的脂质体。
特别有用的脂质体可以通过含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物，用反相蒸发法生成。将脂质体挤压通过一定孔径的滤器形成具有所需直径的脂质体。如Martin等在生物化学杂志257：286-288(1982)中所述，可通过二硫键互换反应将本发明中抗体的Fab′片段与脂质体偶联。脂质体中可以任选的包含化疗剂(例如阿霉素)。参见Gabizon等人，国立癌症研究所杂志(J.National CancerInst.)81(19)1481(1989)。
通过将抗体与可将前药(例如肽基化疗剂，参见WO81/01145)转化成活性抗癌药物的前药激活酶偶联，本发明的抗体还可以用于抗体依赖性酶介导的前药疗法(ADEPT)。例如，可参见WO 88/07378和美国专利No.4,975,278。
用于ADEPT的免疫偶联物的酶组份，包括任何能以此途径作用于前药使之转化为更具活性、更有细胞毒性的形式的酶。
可用于本发明的该方法的酶组份包括(但不限于)：用于将含磷酸根的前药转化成游离药的碱性磷酸酶；将含硫酸根的前药转化成游离药的芳基硫酸酯酶；将无毒的5-氟胞嘧啶转化成抗癌药5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脱氨酶；用于将含肽前药转化成游离药的蛋白酶，例如沙雷氏菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧基肽酶和组织蛋白酶(例如组织蛋白酶B和L)；用于转化含D-氨基酸取代基的前药的D-丙胺酰基羧基肽酶；用于将糖基化前药转化成游离药的糖切割酶，例如β-半乳糖苷酶和神经氨酸酶；用于将β-内酰胺衍生的药物转化成游离药的β-内酰胺酶；和用于分别将在其胺氮原子上带有苯氧基乙酰基或苯基乙酰基基团的药物转化成游离药的青霉素酰胺酶，诸如青霉素V酰胺酶和青霉素G酰胺酶。或者，可以用具有酶活性的抗体(在本领域中又称“抗体酶”)将本发明的前药转化成游离的活性药(参见Massey，自然328：457-458(1987))。可以如本文所述制备抗体-抗体酶偶联物，用于向肿瘤细胞群输送抗体酶。
本发明的酶可以利用本领域的公知技术与抗VEGF抗体共价结合，例如利用前文所述的异源双官能交联剂。或者，利用本领域公知的重组DNA技术构建这样的融合蛋白，它包含与本发明酶的至少一个功能活性部分连接的本发明抗体的至少一个抗原结合区(参见Neuberger等，自然312：604-608(1984))。
在本发明某些例子中，可能需要采用抗体片段而不是完整的抗体来加强对肿瘤的穿透。此时，为了延长它的血清半衰期可能需要对抗体片段加以修饰。这可以通过例如在抗体片段中加入补救受体结合表位来做到(例如，通过对抗体片段对应区的突变，或通过将表位引入肽标记中，然后通过例如DNA或肽合成将肽标记融合在抗体片段的两端或中部)。参见1996年10月17日出版的WO 96/32478。
补救受体结合表位通常构成这样一个区域，在其中，Fc区一个或两个环的一个或多个氨基酸残基被转移到抗体片段的类似位置上。较佳地，Fc区一个或两个环的三个或更多个残基被转移。更佳地，表位来自(例如IgG的)Fc区的CH2区，并被转移到抗体的CH1、CH3或VH区，或一个以上的此类区域。或者，表位来自Fc区的CH2区，并被转移到抗体片段的CL区或VL区，或转移到CL和VL两个区。
在一个最佳例子中，补救受体结合表位含有序列PKNSSMISNTP(SEQID NO：17)，而且可任选地含有选自下组的序列：HQSLGTQ(SEQ IDNO：18)、HQNLSDGK(SEQ ID NO：19)、HQNISDGK(SEQ ID NO：20)、或VISSHLGQ(SEQ ID NO：21)，尤其当抗体片段是Fab或(Fab′)2时。在另一最佳例子中，补救受体结合表位是这样的多肽，该多肽是含有以下序列的多肽：HQNLSDGK(SEQ ID NO：19)、HQNISDGK(SEQ ID NO：20)、或VISSHLGQ(SEQ ID NO：21)，以及序列PKNSSMISNTP(SEQ ID NO：17)。
人源化或变异的抗-VEGF抗体的共价修饰形式也在本发明范围之内。它们的制备可以通过化学合成，或用化学法或酶法来切割抗体(如果可行)。抗体的其他类型共价修饰形式，可以通过将抗体的靶残基与能和所选侧链或N-端或C-端残基反应的有机衍生剂反应，而被引入到分子中。代表性的多肽共价修饰形式在美国专利5,534,615中有描述，该专利在此引用作为参考。一种优选抗体共价修饰包括，将抗体连于各种非蛋白质的聚合物如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯，其方法描述于美国专利No.4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192；或4,179,337中。
B.载体、宿主细胞和重组方法
本发明还提供了分离的编码人源化或变异的抗-VEGF抗体的核酸、包含该核酸的载体和宿主细胞，以及用于产生该抗体的重组技术。
为了重组产生抗体，其编码核酸被分离出来并插入到用于进一步克隆(扩增DNA)或表达的复制载体中。在另一例子中，抗体是用例如美国专利5,204,244中所述的同源重组法产生的(该专利在此引用作为参考)。利用常规技术可方便地分离出编码单克隆抗体的DNA并测序(例如使用能够特异性结合编码抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。有许多载体可以使用。载体的组成通常包括(但不限于)以下之一或几个：信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列，例如在1996年7月9日授权的美国专利5,534,615(该专利在此引用作为参考)中所描述。
适于在本发明载体中克隆或表达DNA的宿主细胞是所述的原核、酵母或高等真核相比。适于此目的的原核生物包括真细菌，如革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌。例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)如埃希氏杆菌属(Escheriachia)(比如大肠杆菌)、肠杆菌属、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏杆菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门氏菌属如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌属如粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescans)、志贺氏菌属(Shigella)，以及芽胞杆菌属如枯草杆菌和藓样芽胞杆菌(B.licheniformis)(如1989年4月12日出版的DD 266,710中所公开的藓样芽胞杆菌41P)、假单胞菌属如绿脓假单胞菌(P.aeruginosa)和链霉菌属。一种优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC 31，446)，尽管其他的菌株如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC 31，537)、和大肠杆菌W3110(ATCC27，325)也是合适的。这些例子仅仅是阐述性的，并不起限制作用。
用于克隆和表达载体内的DNA的合适宿主细胞是上述的原核、酵母或其他更高级的真核细胞。用于该目的的合适原核生物包括：真细菌如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)如埃希氏杆菌属(Escheriachia)(比如大肠杆菌)、肠杆菌属、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏杆菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门氏菌属如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌属如粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescans)、志贺氏菌属(Shigella)，以及芽胞杆菌属如枯草杆菌和藓样芽胞杆菌(B.licheniformis)(如1989年4月12日出版的DD 266,710中所公开的藓样芽胞杆菌41P)、假单胞菌属如绿脓假单胞菌(P.aeruginosa)和链霉菌属。一种优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC 31，446)，尽管其他的菌株如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC 31，537)、和大肠杆菌W3110(ATCC27，325)也是合适的。这些例子仅仅是阐述性的，并不起限制作用。
除了原核生物，真核微生物如丝状真菌或酵母也是适用于抗-VEGF抗体编码载体的克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，即常见的发面酵母，是低级真核宿主微生物中最常用的。然而，大量其他属、种或株通常是可得到并可用于此处的，如裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属宿主，如乳克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12，424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16，045)、威克曼氏克鲁维酵母(K.wicheramii)(ATCC24，178)、K.waltii(ATCC 56，500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36，906)、K.thermotolerans和马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)；yarrowia[EP 402,226]；巴士德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)(EP 183,070)；念珠菌属；Trichoderma reesia[EP 244,234]；粗糙链孢霉(Neurosporacrassa)；许旺氏酵母属(Schwanniomyces)如西方许旺氏酵母(Schwanniomyces occidentalis)；和丝状真菌如链孢霉属(Neurospora)、青霉菌属(penicillium)、Tolypocladium和曲霉属(Aspergillus)如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。
适用于表达糖基化抗-VEGF抗体的宿主细胞可衍生自多细胞生物体。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫的细胞。已经鉴别出许多杆状病毒株和变异株，以及相应的来自宿主[如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(虫蜀)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyx mori)]的允许性昆虫宿主细胞。用于转染的各种不同的病毒株是公众可以获得的，如苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)NPV的L-1变异体和家蚕NPV的Bm-5株，而且这类病毒可根据本发明在此处用作病毒，尤其是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。棉花、玉米、土豆、大豆、矮牵牛花、番茄和烟草的植物细胞培养物也可以被用作宿主。
然而，脊椎动物细胞是最感兴趣的，而通过培养繁殖脊椎动物细胞(组织培养)已经成为一种常规的程序。有用的哺乳动物宿主细胞系的例子是，被SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾细胞系(293细胞或亚克隆的悬浮培养生长的293细胞，Graham等人，J.Gen Virol.36：59[1977])；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人，美国科学院院报，77：4216[1980])；小鼠Sertoli细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251[1980])；猴肾细胞(CV1ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL34)；水牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCCCCL75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳房肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人，Annal s N.Y.Acad.Sci.383：44-68[1982])；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝癌细胞系(Hep G2)。
宿主细胞用本发明上述的用于产生抗-VEGF抗体的表达或克隆载体进行转化，然后在常规的营养培养基上培养，其中培养基可被加以改进以便诱导启动子、选择转化子或扩增编码所需序列的基因。
用于产生本发明的抗-VEGF抗体的宿主细胞可在各种不同培养基中培养。市售的培养基如Ham′s F10(Sigma)、极限必需培养基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM，Sigma)都适合培养这些宿主细胞。此外，任何在例如下列文献中描述的培养基也可用作宿主细胞的培养基：Ham和Wallace，Meth.Enz.58：44(1979)，Barnes等人，分析化学(Anal.Biochem)102：255(1980)，美国专利No.4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO87/00195；或美国专利RE No.30,985。所有这些培养基都可按需要添加激素和/或其他的生长因子(如胰岛素、运铁蛋白、或表皮生长因子[EGF])、盐类(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(如HEPES)、核苷(如腺苷和胸苷)、抗生素(如庆大霉素(GentamycinTM)药物)、痕量元素(定义为以微摩尔级的终浓度存在的无机化合物)、和葡萄糖或等价的能量源。任何其他必要的补充物也可以合适的浓度加入，这是本领域技术人员知晓的。培养条件如温度、pH等是以往用于培养所选的表达宿主细胞的条件，这是一般技术人员所熟知的。
在使用重组技术时，抗体可以产生在细胞内、周质间隙内或直接分泌在培养基中。如果抗体产生在细胞内，第一步是通过例如离心或超滤去除颗粒状碎片(或者是宿主细胞或者是裂解片段)。Cater等人在生物技术(Bio/Technology)10：163-167(1992)中，叙述了分离分泌在大肠杆菌周质间隙内的抗体的方法。简而言之，在乙酸钠(pH3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)存在下融解细胞糊约30分钟。细胞碎片可以通过离心去除。如果抗体分泌在培养基中，通常，首先用市售的蛋白质浓缩滤膜(例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元)将得自此类表达系统的上清液浓缩。可以在任何前述步骤中加入诸如PMSF这样的蛋白酶抑制剂以抑制蛋白酶解，并加入抗生素以阻止外来污染菌的生长。
由细胞制得的抗体组合物可以利用例如羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析和亲和色谱来纯化，其中亲和色谱是最好的纯化技术。A蛋白是否适合用作亲和性配体取决于抗体中的免疫球蛋白Fc区的种类和同种型。A蛋白可以用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等，免疫学方法杂志(J.Immunol.Meth.)62：1-13(1983))。G蛋白可推荐用于所有的鼠同种型和人γ3(Guss等，欧洲生物学杂志(EMBO)5：1567-1575(1986))。对于固定亲和性配体的基质，最常用的是琼脂糖，但是也可以用其它基质。机械性能稳定的基质例如可控多孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯可以获得比琼脂糖更快的流率和较短的处理时间。如果抗体包含CH3区，可以使用BakerbondABXTM树脂(J.T.Baker，Philipshburg，NJ)来纯化。根据待回收的抗体，也可以使用其它蛋白质纯化技术，例如离子交换柱分级、乙醇沉淀、反相HPLC、硅胶柱色谱、肝素SepharoseTM上的色谱、阴离子或阳离子交换树脂上的色谱(例如聚天冬氨酸色谱柱)、层析聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。
在任何初步纯化步骤之后，可以对包含感兴趣抗体和污染物的混合物进行低pH疏水性色谱，用pH在约2.5-4.5的洗脱缓冲液进行，最好在低盐浓度(例如约0-0.25M的盐)下进行。
C.药物制剂
为了便于保存，可以通过将具有要求纯度的抗体与任选的生理上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合，制成冻干制剂或水溶液形式的抗体治疗用制剂(《雷明顿药物科学》(Remington′s Pharmaceutical Sciences)第16版，Osol，A.编(1980))。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在使用剂量和浓度对接受者是无毒的，它们包括例如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸的缓冲液；包括维生素C和甲硫氨酸在内的抗氧化剂；防腐剂(例如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；氯化苯甲烃铵；氯化苄乙氧铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟苯甲酸甲酯或丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲苯酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷胺酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖或其它糖，其中包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子，例如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，例如吐温TM Pluronics TM或聚乙二醇(PEG)。
本发明制剂还可以包含一种以上治疗特殊状况所需的活性混合物，它们最好具有互补的活性但是不相互产生负影响(见下面的章节F)。所述分子，以适合各自预定目的所需的有效含量相互组合。
活性成份还可以包裹在分别通过凝聚法或界面聚合法制备的例如羟甲基纤维素或明胶胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊中。亦可在胶态药物释放系统(例如脂质体、白蛋白微珠、微乳液、毫微颗粒和毫微胶囊)或粗滴乳液(macroemulsion)。(《雷明顿药物科学》(Remington′s PharmaceuticalSciences)第16版，Osol，A.编(1980))中叙述了此类技术。
用于体内使用的制剂必须是无菌的。通过灭菌滤膜过滤可以方便地做到这一点。
可以制备缓释制剂。合适的缓释制剂包括例如包含所述抗体的固体疏水聚合物的半渗透基质体，所述的基质体是有形的物体，例如膜或微胶囊。合适的缓释基质体包括例如聚酯、水凝胶(例如聚(甲基丙烯酸2-羟基乙酯)或聚乙烯醇)、聚交酯(美国专利3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸γ乙酯的共聚物、非降解性乙烯乙酸乙烯酯、诸如Lupron DepotTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和leuprolide acetate组成的可注射微球)之类可降解乳酸-乙醇酸共聚物和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。诸如乙烯乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸之类聚合物能够使分子释放持续100天以上，有些水凝胶可在较短的时间内释放蛋白质。当胶囊化的抗体在体内保留较长时间时，它们可能会因为在37℃接触水分而变性或凝聚，结果造成生物活性降低并可能造成免疫原性改变。根据有关的机制可以设计出合理的稳定化策略。例如，如果发现凝聚机制是通过硫-二硫键互换反应而形成了分子间的S-S键，稳定化可以是通过修饰巯基残基、冻干酸性溶液、控制含水量、使用合适的添加剂和设计特殊的聚合基质组合物而达到。
D.抗体的非治疗性用途
本发明的抗体可以用作亲和纯化试剂。在这种方法中，抗体利用本领域公知的方法固定在例如Sephadex树脂或滤纸的固相上。被固定的抗体与待纯化的含VEGF蛋白(或其片段)的样品接触，然后用合适的溶剂洗涤载体，所述的溶剂能够基本上去除样品中除了与固定化抗体结合的VEGF蛋白之外所有其它物质。最后，用另一种能将VEGF蛋白从抗体上释放的溶剂洗涤载体，例如pH5.0的甘氨酸缓冲液。
抗VEGF抗体还可以用于VEGF蛋白的诊断性分析中，例如检测其在特定细胞、组织或血清中的表达。这种诊断方法可用于诊断癌症。
用于诊断时，抗体通常用可检测分子进行标记。有许多标记可以使用，它们可以大致如下分类：
(a)放射性同位素，例如35S、14C、125I、3H和131I。可以利用例如《现代免疫学方法》(Current Protocols in Immunology)第1和第2卷，Coligen等编，Wiley-Interscience，New York，New York，Pubs.(1991)中所述的方法以放射性同位素来标记抗体，放射性可以利用闪烁计数法来测定。
(b)荧光标记，例如稀土螯合剂(铕螯合剂)或萤光素及其衍生物，罗丹明及其衍生物，丹酰，丽丝胺，藻红素和德克萨斯红(Texas red)。荧光标记可以利用例如上文《现代免疫学方法》中所述的方法与抗体偶联。荧光可以利用荧光计来定量。
(c)有各种酶底物标记可供使用，而美国专利4,275,149公开了其中部分。所述的酶通常催化可以用各种技术测定的生色底物的化学改变。例如，酶催化底物的颜色变化，这种变化可以用分光光度计来测定。或者，酶改变底物的荧光性或化学发光性。前文已经说明了定量测定荧光变化的技术。化学发光底物因化学反应而被电激发，并由此发光，发出的光可以被测定(例如利用化学光度计)或向荧光受体供能。酶标记包括例如萤光素酶(例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶；美国专利4,737,456)，萤光素，2，3-二氢二氮杂萘二酮(2，3-dihydrophthalazinediones)，苹果酸脱氢酶，脲酶，过氧化物酶如辣根过氧化物酶(HRPO)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)，杂环氧化酶(例如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)，乳过氧化物酶，微过氧化物酶等。O′Sullivan等在“制备用于酶免疫分析的酶-抗体偶联物的方法”，《酶学方法》(“Methods for the Preparation ofEnzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay”(Methods inEnzym.)(J.Langone和H.Van Vunakis编)，Academic press，New York，73：147-166(1981)中描述了酶与抗体偶联的技术。
酶-底物的组合包括，例如：
(i)辣根过氧化物酶(HRPO)和作为底物的氢过氧化物酶，其中的氢过氧化物酶使染料前体(例如邻苯二胺(OPD)或盐酸3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB))氧化；
(ii)碱性磷酸酶(AP)和作为生色底物的对硝基苯磷酸；
(iii)β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)和生色底物(例如对硝基苯-β-D-半乳糖苷酶)或荧光底物4-methylumbelliferyl-β-D-半乳糖苷酶。
对本领域技术人员来说还有许多其它酶-底物组合。对这些组合的综述可参见美国专利4275149和4318980。有时，标记物与抗体间接偶联。技术人员也知道各种获得所述组合的方法。例如，抗体可以与生物素偶联，上述三大类标记中的任何一种都可以与亲和素偶联，或者正相反。生物素选择性地结合亲和素，标记可以间接方式与抗体偶联。或者，为了将标记与抗体间接偶联，抗体可以与小的半抗原(例如地高辛)偶联，而上述不同类型的标记之一与抗半抗原抗体(例如抗地高辛抗体)偶联。这样就获得的标记与抗体的间接偶联。
在本发明另一实施方案中，抗VEGF抗体不必被标记，其存在可以利用标记过的结合该VEGF抗体的抗体来检测。
本发明抗体可以用在任一种已知的分析方法中，例如竞争性结合分析，直接或间接夹心分析和免疫沉淀分析。Zola，《单克隆抗体：技术手册》(Monoclone Antibodies：A Manual of Techniques)，pp.147-158(CRC Press，Inc.，1987)。
竞争性结合分析依赖于标记过的标准物与被测样品中分析物竞争结合有限量抗体的能力。被测样品中VEGF蛋白的量与与抗体结合的标准物的量成反比。为了方便测定被结合标准物的量，通常令抗体在竞争前或竞争后不溶解，这样就可以方便地将与抗体结合的标准物和分析物与未结合的标准物和分析物分离。
夹心分析法涉及使用两种抗体，各自结合待测蛋白不同的免疫原性部位或表位。在夹心分析中，被测样品分析物与固定在固相载体上的第一抗体结合，然后第二抗体与分析物结合，由此形成不溶性三部分复合物。参见美国专利4,376,110。第二抗体本身可以是用可检测部分标记过的(直接夹心分析法)，或者利用被可检测部分标记的抗免疫球蛋白抗体来测定(间接夹心分析法)。例如，夹心分析法之一是ELISA，其中的可检测部分是酶。
对于免疫组织化学来说，肿瘤样品可以是新鲜的或者冷冻的或者包在石蜡和以福尔马林之类防腐剂固定的。
抗体还可以用于体内诊断分析。通常，以放射性核素(例如111In、99Tc、14C、131I、125I、3H、32P或35S)标记抗体，使得可以利用免疫闪烁照相术来定位肿瘤。
E.诊断试剂盒
为了方便，本发明抗体可以试剂盒的形式提供，即将预定量的试剂与进行诊断分析的说明书的包装组合在一起。如果抗体是用酶标记的，试剂盒将包含酶所需的底物和辅因子(例如提供可测定的生色团和荧光团的底物前体)。此外，还可能包括其它添加剂，例如稳定剂、缓冲剂(例如封闭缓冲剂或裂解缓冲剂)等。为了使所提供的试剂浓度能使得分析的灵敏度最高，各种试剂的相对量变化很大。具体地说，试剂可以是干粉，通常是冻干粉末形式的，可包括赋形剂在内，它们一经溶解将形成具有合适浓度的试剂溶液。
F.抗体的治疗用途
对于治疗用途，可将上述的在药学上可接受的剂型中的本发明抗-VEGF抗体，用已知方法施用于哺乳动物，最好是人。所述方法包括在静脉内(例如静脉注射浓缩药团(bolus)或在一段时间内连续输注)、肌内、腹膜内、脑脊髓腔内、皮下、动脉内、滑膜腔内、鞘内注射、口服、局部或吸入途径使用。抗体还可合适地通过瘤内、瘤周围、损伤部位内、损伤部位周围的途径给药，以发挥局部和全身的治疗效果。腹膜内途径预计特别有用，例如对于治疗卵巢癌。
为了预防或治疗疾病来说，抗体的合适剂量将取决于上述定义的待治疾病的类型、疾病的严重程度和病程、抗体给予是用来预防还是用来治疗、以前的治疗情况、患者病史和对抗体的应答性，以及主治医师的独立判断。抗体适合一次性或系列地给患者使用。
抗-VEGF抗体可用于治疗各种肿瘤和非肿瘤的疾病。可被治疗的肿瘤和相关病症包括：乳房癌、肺癌、胃癌、食管癌、结肠直肠癌、肝癌、卵巢癌、泡膜细胞瘤、卵巢男胚瘤、宫颈癌、子宫内膜癌、子宫内膜增生、子宫内膜异位、纤维肉瘤、绒毛膜上皮癌、脑癌和颈癌、鼻咽癌、喉癌、肝母细胞瘤、Kaposi氏肉瘤、黑色素瘤、皮肤癌、血管癌、海绵状血管瘤、成血管细胞瘤、胰腺癌、成视网膜细胞瘤、星形细胞瘤、成胶质细胞瘤、神经鞘瘤、少突神经胶质瘤、成神经管细胞瘤、成神经细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、平滑肌肉瘤、泌尿道癌、甲状腺癌、Wilm氏瘤、肾细胞瘤、前列腺瘤、与斑痣性错构瘤病相关的血管异常增生、水肿(如与脑瘤相关的水肿)以及Meigs氏综合症。
可被治疗的非肿瘤性病症包括：类风湿性关节炎、牛皮癣、动脉粥样硬化、糖尿病，和其他增生性视网膜疾病包括早熟性视网膜疾病、晶状体后纤维增生症、新生血管性青光眼、年龄相关性黄斑变性、甲状腺增生(包括Grave氏病)、角膜和其他组织的移植、慢性炎症、肺炎、肾病综合症、先兆子痫、腹水、心包积液(如与心包炎相关的)和胸膜腔积液。
年龄相关性黄斑变性(AMD)是在老年人群中导致严重丧失视力的主要原因。渗出性AMD的特征是脉络膜的新血管生成和视网膜色素上皮细胞的脱落。因为脉络膜的新血管生成与预后剧烈恶化相关，因此，本发明的抗-VEGF抗体预期在降低AMD严重性方面特别有用。
根据疾病的类型和严重程度，不论是一次或多次分开给药，还是连续输注，1微克/公斤至50毫克/公斤(例如0.1-20毫克/公斤)的抗体是给患者使用的最初候选剂量。典型的日剂量或周剂量可在约1微克/公斤-20毫克/公斤或以上，这取决于上述提到的因素。对于几天或更长时间内的重复给药(这取决于病况)来说，治疗需持续直至疾病症状发生所期望的抑制。但是，也可以使用其它给药方案。所述治疗的进展可以方便地利用常规技术和分析方法(例如放射性肿瘤成像技术)来监测。
根据本发明的另一例子，抗体的预防或治疗疾病有效性可以通过连续地施用，或者通过与其他对该目的有效物质联用而提高。这些有效物质有例如肿瘤坏死因子TNF，能够抑制或中和酸性或碱性成纤维细胞生长因子(FGF)或肝细胞生长因子(HGF)的血管生成活性的抗体，能够抑制或中和组织因子、C蛋白或S蛋白的促凝活性的抗体(见Esmon等人，PCT专利申请出版物No.WO 91/01753，1991年2月21日出版)，能结合于HER2受体的抗体(参见Hudziak等人，PCT专利申请出版物No.WO89/06692，1989年7月27日出版)，或一种或多种常规的治疗剂例如烷基化试剂、叶酸拮抗剂、抗-核酸代谢的代谢产物、抗生素、嘧啶类似物、5-氟尿嘧啶、顺铂、嘌呤核苷、胺、氨基酸、三唑核苷、或皮质类固醇。这些其他物质可以存在于被施用的组合物中，或者被分开施用。此外，抗体可合适地连续施用或与放射性治疗(无论是用放射性物质进行辐射还是给药)联用。
在一个例子中，用联合疗法攻击肿瘤的血管生成。将抗体和一种或多种抗-VEGF拮抗剂施用于肿瘤病人，用量为通过例如观察肿瘤或转移性病灶(如果有的话)的坏死而确定的治疗有效量。这种疗法被继续，直至观察不到进一步的有利效果或者临床检测显示没有肿瘤或转移性病灶的迹象。然后，施用TNF，或者单独施用，或者与下列的辅助性试剂联用：例如α-、β-或γ-干扰素，抗-HER2抗体、heregulin、抗-heregulin抗体、D-因子、白细胞介素1(IL-1)、白细胞介素2(IL-2)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，或者促进肿瘤微血管凝结的物质如抗-C蛋白抗体、抗-S蛋白抗体、或C4b结合蛋白(见Esmon等人，PCT专利申请出版物No.WO91/01753，1991年2月21日出版)，或者热，或者辐射。
因为辅助性试剂的有效性有所不同，因此需要按常规的矩阵筛选法比较其对肿瘤的影响。施用抗-VEGF抗体和TNF可重复进行，直至达到所需的临床效果。或者，将抗-VEGF抗体和TNF以及任选地的辅助性试剂一起施用。当在实体瘤位于四肢或其他怀疑与全身循环系统隔开的部位时，此处公开的治疗剂可被施用于隔开的肿瘤或器官。在其他例子中，可将FGF或血小板衍生生长因子(PDGF)拮抗剂(例如抗-FGF或抗-PDGF中和抗体)与抗-VEGF抗体一起施用于病人。在伤口愈合或需要新血管生成的期间，最好宜停止抗-VEGF抗体治疗。
G.产品
本发明另一实施方案提供了一种含有用于治疗上述疾病的材料的产品。该产品包括容器和标签。合适的容器包括例如普通瓶、药瓶、注射器和试管。容器可以用各种材料制成，例如玻璃或塑料。容器中含有治疗疾病的有效组合物，并具有一个无菌的出入口(例如容器可以是一个有塞子的静脉输液袋或药瓶，该塞子可用皮下注射针头穿透)。该组合物中的有效成份是抗VEGF抗体。容器上或与容器相联的标签说明组合物所治疗的特定病症。产品还可以含有另一个容器，其中包含药学上可接受的缓冲液，例如磷酸盐缓冲液、林格氏(Ringer)溶液和葡萄糖溶液。根据商业上的需要或使用者的需要，它还可以包括其它材料，例如其它缓冲液、稀释剂、滤器、针头、注射器、以及附有使用说明的包装说明书。
实施例1
该实施例描述了具有有利的治疗特性的人源化抗-VEGF抗体的产生。
材料和方法
鼠A4.6.1单克隆抗体的克隆和小鼠-人嵌合Fab的构建：鼠抗-VEGF单克隆抗体A4.6.1已被描述过(Kim等人，生长因子(Growth Factors)7，53(1992)；Kim等人，自然(Nature)362，841(1993))。从产生抗-VEGF单克隆抗体A4.6.1的杂交瘤细胞中用RNAsol(TEL-TEST)分离出总RNA，然后用oligo-dT引物和SuperScript II系统(GIBCO BRL，Gaithersburg，MD)反向转录成cDNA。根据抗体轻链和重链的N端氨基酸序列，合成简并的寡核苷酸引物混合物，然后用作正向引物。反向引物根据从鼠轻链亚组kV和重链亚组II(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，(5th)，Public Health Service，National Instistutes of Health，Bethesda，MD(1991))获得的构架4序列制备。在聚合酶链反应(PCR)扩增之后，将DNA片段连于TA克隆载体(Invitrogen，SanDiego，CA)。对8个克隆的轻链和重链都进行测序。一个具有轻链VL区共有序列的克隆和一个具有重链VH区共有序列的克隆，被分别亚克隆入含人CL和CH1区的pEMX1载体(Werther等人，免疫学杂志(J.Immunol.)157：4986-4995(1996))，从而产生鼠-人嵌合抗体。这种嵌合的F(ab)由在氨基酸SerH113处融合于人CH1区完整的鼠A4.6.1VH区以及在氨基酸LysL107处融合于人CL区的完整的鼠A4.6.1VL区构成。嵌合F(ab)的表达和纯化与人源化F(ab)相同。嵌合F(ab)被用作结合测试中的标准物。
鼠的和人源化F(ab)的计算机立体图模型：VL和VH区的序列(图1A和1B)被用来构建鼠A4.6.1VL-VH区的计算机立体图模型。该模型被用来确定哪些构架残基应被引入人源化抗体。人源化F(ab)模型的构建还被用来证实正确选择了鼠构架残基。模型的构建按早先描述的方法进行(Carter等人，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89：4285-4289(1992)和Eigenbrot等人，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)229：969-995(1993))。
构建人源化的F(ab)：用于诱变和在大肠杆菌中表达的质粒pEMX1早已被描述过(Werther等人，同上)。简而言之，该质粒含有编码共有的人κ亚组I轻链(VLκI-CL)和共有的人亚组III重链(VHIII-CH1)的DNA片段以及碱性磷酸酶启动子。VL和VH共有序列的使用，早已被描述过(Carter等人，同上)。
为了构建人源化A4.6.1的第一个F(ab)变异体F(ab)-1，在pEMX1的含脱氧尿苷的模板上进行定点诱变(Kunkel等人，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)82：488-492(1985))。将根据Kabat等人(同上)的6个CDR变为鼠A4.6.1序列。因此，F(ab)-1由完整的人构建(VLκ亚组I和VH亚组III)和6个完整的鼠CDR序列构成。所有其他F(ab)变异体的质粒是用F(ab)-1的质粒模板构建的。将质粒转入大肠杆菌XL-1Blue株(Stratagene，San Diego，CA)中，以制备双链和单链DNA。对于每种变异体，用双脱氧核苷酸法(Sequenase，U.S.Biochemical Corp.，Cleveland，OH)对编码轻链和重链的DNA进行全部测序。质粒被转入大肠杆菌16C9株(这是MM294的一种衍生菌株)，接种在Luria肉汤平板(含50微克/毫升羧苄青霉素)，然后选择有蛋白质表达的单一克隆。单一克隆在5毫升Luria肉汤-100毫克/毫升羧苄青霉素中37℃生长5-8小时。将5毫升培养物加至500毫升AP5-50微克/毫升羧苄青霉素中，在4升带挡板的摇瓶中于30℃生长20小时。AP5培养液是在1升水中含有1.5克葡萄糖，11.0克Hycase SF、0.6克酵母提取物(已检验合格)、0.19克MgSO4(无水)、1.07克NH4Cl、3.73克氯化钾、1.2克氯化钠、120毫升1M三乙醇胺，pH 7.4，然后通过0.1mm Sealkeen过滤器灭菌过滤。细胞通过在1升离心瓶中于3000×g离心而收获，上清液被弃去。在冰冻1小时后，将沉淀再悬浮于25毫升冷的10mM Tris-1mM EDTA-20％蔗糖，pH 8.0中。加入250毫升0.1M苯甲脒(Sigma，St.Louis，MO)以抑制蛋白水解。在冰上轻柔搅拌3小时后，样品在40000×g离心15分钟。然后将上清液上样于用10mM Tris-1MM EDTA(pH 7.5)平衡过的G蛋白-Sepharose CL-4B(Pharmacia，Uppsala，Sweden)柱(0.5毫升床体积)。柱用10毫升10mM Tris-1MM EDTA(pH 7.5)洗涤，然后用3毫升0.3M甘氨酸(pH 3.0)洗脱入1.25毫升1M Tris(pH 8.0)中。用Centricon-30(Amicon，Beverly，MA)将F(ab)的缓冲液换成PBS，并浓缩至终体积为0.5毫升。对所有F(ab)进行SDS-PAGE凝胶电泳，以确定纯度，每种变异体的分子量用电喷质谱法验证。
嵌合的和人源化IgG的构建和表达：为了产生嵌合的(chIgG1)和人源化(huIgG1)A4.6.1的人IgG1变异抗体，将合适的鼠或人源化VL和VH区(F(ab)-12，表2)亚克隆入早已描述过的各个pRK载体(Eaton等人，Biochemistry25：8343-8347(1986))。编码每种变异体的完整轻链和完整重链的DNA，用双脱氧核苷酸测序法进行验证。
为了瞬时表达变异抗体，用高效程序(Gorman等人，DNA Prot.Eng.Tech.2：3-10(1990))将重链和轻链质粒共转入人293细胞(Graham等人，J.Gen.Virol.36：59-74(1977))。培养基被换成无血清型，并在5天之内每天收获。从合并的上清液中用A蛋白-Sepharose CL-4B(Pharmacia)纯化抗体。洗脱抗体的缓冲液用Centricon-30(Amicon)交换成PBS，浓缩至0.5毫升，用Millex-GV(Millipore，Bedford，MA)灭菌过滤，并在4℃贮存。
为了稳定地表达最终的人源化IgG1变异抗体(rhuMAb VEGF)，用设计的共表达重链和轻链的双顺反子型(dicistronic)载体(Lucas等人，《核酸研究》(Nucl.Acids Res.)24：1774-79(1996))转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。将质粒通过脂质转染法引入DP12细胞(这是由L.Chasin(Columbia University)开发的CHO-K1DUX B11细胞系的一种专有衍生株)，然后根据在无GHT的培养基上的生长情况而选择(Chisholm，V.High efficiency gene transfer in mammaliancells.In：Glover，D.M.，Hames，BD.DNA Cloning 4 Mammalian systems.OxfordUniv.Press.Oxford pp 1-41(1996))。随机挑选出约20个未扩增的克隆，并再接种于96孔板。用ELISA监测各菌落的相对特异性产量，以定量每个孔中在3天后所积累起的全长人IgG数量，一种荧光染料Calcien AM被用作每个孔中存活细胞的代用标记物。根据这些数据，选择了数种未扩增的克隆用于在氨甲蝶呤浓度逐渐增加下进一步扩增。在10、50和100nM氨甲蝶呤下存活的各克隆被选出，转移至96孔板以便进行产量筛选。一个重复性地表现出高特异性产量的克隆在T-烧瓶中繁殖并用于接种旋转培养基。在数次传代后，适应悬浮的细胞被用于接种生产培养基，该培养物位于含GHT、无血清并添加有各种激素和蛋白质水解酶的培养基中。收获的含rhuMAb VEGF的细胞培养液，用A蛋白-Sepharose CL-4B纯化。该步骤后的纯度约为99％。用离子交换色谱步骤进行随后的纯化至均质。最终的纯化抗体的内毒素含量小于0.10eu/mg。
F(ab)和IgG的定量：为了定量F(ab)分子，ELISA板用50mM碳酸盐缓冲液(pH 9.6)中的2微克/毫升羊抗-人IgG Fab(Organon Teknika，Durham，NC)在4℃进行包被，然后用PBS-0.5％牛血清白蛋白(封闭缓冲液)在室温下封闭1小时。标准物(0.78-50ng/ml人F(ab))购自Chemicon(Temecula，CA)。样品在PBS-0.5％牛血清白蛋白(封闭缓冲液)-0.05％聚山梨醇酯20(分析缓冲液)作一系列稀释，在板上孵育2小时。被结合的F(ab)的检测，是用辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgGF(ab)(Organon Teknika)，再用3，3，5′，5′-四甲基联苯胺(Kirkegaard & PerryLaboratories，Gaitherburg，MD)作为底物。在各步骤之间板被洗涤。吸光度是在Vmax板阅读器(Molecular Devices，Menlo Park，CA)上于450纳米处读取。标准曲线用四参数非线性回归曲线拟合程序进行拟合。在标准曲线范围内的数据点被用来计算样品的F(ab)浓度。全长抗体浓度的确定，是用羊抗-人IgGFc(Cappel，Westchester，PA)进行捕获并用辣根过氧化物酶标记的羊抗-人Fc(Cappel)进行检测。人的IgG1(Chemicon)被用作标准物。
VEGF结合分析：为了测量F(ab)的VEGF结合活性，ELISA板用2微克/毫升针对人IgG Fc的羊抗-人IgG F(ab′)2(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)进行包被，然后用上述的封闭缓冲液封闭。加入用封闭缓冲液配的含3ng/mlKDR-IgG(Park等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)269：25646-25645(1994))的稀释条件培养液，在板上孵育1小时。将标准物(6.9-440ng/ml嵌合的F(ab))和2倍系列稀释的样品与2nM生物素化的VEGF在管中一起孵育1小时。然后将管中的溶液转移至ELISA板并孵育1小时。洗涤后，检测结合于KDR的生物素化VEGF，其中用辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(Zymed，South San Francisco，CA或Sigma，St.Louis，MO)，再用3，3，5′，5′-四甲基联苯胺作为底物。效价曲线用四参数非线性回归曲线拟合程序(KaleidaGraph，Synergy Software，ReadingPA)进行拟合。计算对应于标准效价曲线中点吸光度的F(ab)变异抗体的浓度，然后除以对应于标准效价曲线中点吸光度的标准物浓度。对全长IgG的分析与F(ab)相同，不同点在于分析缓冲液含有10％人血清。
BIAcoreTM生物传感器分析：用BIAcoreTM生物传感器(Karlsson等人，Methods：A Comparison to Methods in Enzymology 6：97-108(1994))比较人源化的和嵌合的F(ab)的VEGF结合性。F(ab)的浓度用定量氨基酸分析加以确定。按制造商的说明(Pharmacia)，通过伯胺基团将VEGF偶联于CM-5生物传感器芯片。解离速率(off-rate)动力学的测量是通过用F(ab)(35微升2μM F(ab)，流速为20微升/分钟)饱和芯片然后切换至缓冲液(PBS-0.05％聚山梨醇酯20)。0-4500秒的数据点被用作解离动力学分析。通过ln(R0/R)-时间曲线的斜率，获得解离速率常数(koff)，其中R0是在t＝0时的信号，而R是各时间点时的信号。
结合速率(on-rate)动力学是用F(ab)的2倍系列稀释液(0.0625-2mM)进行测量的。对于每种F(ab)浓度，用BIAcoreTM动力学评估软件按Pharmacia生物传感器手册中所述的方法，从ln(-dR/dt)-时间曲线得出斜率Ks。R是在时间t时的信号。在80与168、148、128、114、102和92秒之间的数据分别用于0.0625、0.125、0.25、0.5、1和2mM F(ab)。结合速率常数(Kon)是通过Ks-F(ab)浓度曲线的斜率而得出。在每轮循环结束时，通过注入5微升50mM盐酸(流速20微升/分钟)去除结合的F(ab)，从而使芯片再生。
内皮细胞生长分析：基本上按以前所述的方法(Leung等人，科学(Science)246：1306-1309(1989))，在补充有10％牛血清、2mM谷氨酰胺和抗生素的低葡萄糖Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)(GIBCO)(生长培养基)中，培养牛肾上腺皮质衍生毛细血管内皮细胞。对于促有丝分裂分析，将内皮细胞以6×103细胞/孔的密度接种于6孔板的生长培养基中。muMAb VEGF A4.6.1或rhuMAb VEGF的加入浓度为1-5000ng/ml。在2-3小时后，加入纯化的大肠杆菌表达的rhVEGF165至终浓度为3ng/ml。对于特异性对照，以每种抗体以5000ng/ml的浓度加至内皮细胞，或者单独加入，或者在2ng/ml bFGF存在下加入。在5或6天之后，通过暴露于胰蛋白酶而使细胞解离，并在Coulter计数器(Coulter Electronics，Hialeah，FL)上计数。用四常数曲线拟合程序(KaleidaGraph)分析数据。
体内肿瘤研究：按以前所述的方法，在补充有10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺和抗生素的DMEM/F12中培养人A673成横纹肌细胞瘤细胞(ATCC；CRL1598)(Kim等人，自然(Nature)362：841-844(1993)和Borgstrom等人，癌症研究(Cancer Res.)56：4032-4039(1996))。将6-10周龄的雌性BLAB/c裸鼠，在背部区域皮下注射200微升体积、2×106个肿瘤细胞。然后用muMAb VEGFA4.6.1、rhuMAb VEGF或针对gp120蛋白的对照单克隆抗体处理动物(Kim等人，自然(Nature)362：841-844(1993))。两种抗-VEGF单克隆抗体的施用剂量是0.5和5mg/kg；而对照单克隆抗体的给药剂量是5mg/kg。在肿瘤细胞接种开始后24小时，每种单克隆抗体在腹膜内一周施用2次，体积各为100微升。每组由10只小鼠构成。每周测定肿瘤大小。在肿瘤细胞接种4周后，动物被安乐死亡，然后取出肿瘤并称量。用ANOVA进行统计分析。
结果
人源化：人重链亚组III和轻链亚组κI的共有序列被用作人源化构架(Kabat等人，同上)(图1A和1B)。该构架已经被成功地用于使其他鼠抗体人源化(Werther等人，同上；Carter等人，同上；Presta等人，免疫学杂志(J.Immunol.)151：2623-2632(1993)；和Eigenbrot等人，Proteins，18：49-62(1994))。CDR-H1包括残基H26-H25。其他CDR根据Kabat等人(同上)。所有的人源化变异抗体最初以大肠杆菌中表达的F(ab)形式制备，然后根据结合性进行筛选。500毫升摇瓶的典型产量是0.1-0.4毫克F(ab)。
嵌合的F(ab)被用作结合分析中的标准物。在最初的变异抗体F(ab)-1中，CDR残基被从鼠抗体转移到人构架上，并且根据鼠和人源化F(ab)模型将H49位残基(在人中为Ala)改为鼠的Gly。此外，产生了由嵌合重链/F(ab)-1轻链构成的F(ab)(F(ab)-2)和由F(ab)-1重链/嵌合轻链构成的F(ab)(F(ab)-3)，并测试其结合性。F(ab)-1的结合亲和力比嵌合F(ab)高100倍(表2)。F(ab)-2和F(ab)-3之间结合亲和力的比较提示，在F(ab)-1VH区中的构架残基需要被改变以提高结合力。
表2：人源化抗-VEGF F(ab)变异抗体对VEGFa的结合
Figure G2009101470179D00451
a抗-VEGF F(ab)变异抗体与生物素化的VEGF一起孵育，然后转移至包被有KDR-IgG(Park等人，同上)的ELISA板
b鼠残基带下划线；残基编号根据Kabat等人(同上)。
C平均值和标准差是各独立分析中计算出的比率的平均值；嵌合F(ab)的EC50是0.049±0.013mg/ml(1.0nM)
在F(ab)-4中将人残基H71和H73改为其鼠中对应的残基，使结合力提高了4倍(表2)。对鼠和人源化F(ab)模型的研究揭示，包埋在VL-VH界面中并且与CDR-H3作用的残基L46(图2)，可能在确定CDR-H3的构型和/或影响VL和VH区相互关系方面起作用。在L46中当鼠的Val与人的Leu交换(F(ab)-5)，结合亲和力增加了近4倍(表2)。3个其他的包埋构架残基也根据分子模型进行了评估：H49、H69和H78。H69位可影响CDR-H2构型，而H78位可影响CDR-H1构型(图2)。当各残基从人的变为鼠的对应残基时，在每种情况下都使结合力增加了2倍(F(ab)-6和F(ab)-7，表2)。当两者同时改变时，结合力增加了8倍(F(ab)-8，表2)。最初包含的H49残基是鼠的Gly；当变为人共有的对应残基Ala时，结合力下降了15倍(F(ab)-9，表2)。
在F(ab)-10和F(ab)-11中，构架环3(FR-3)中的两个残基被变为鼠的对应残基：AsnH76被变为鼠Ser(F(ab)-10)和LysH75被变为鼠Ala(F(ab)-11)。两种变化都使结合力有小幅提高(表2)。最后，在H94位，人和鼠序列最常见的是Arg(Kabat等人，同上)。在F(ab)-12中，该精氨酸被鼠抗体(图1)中罕见的Lys所替换，而这导致结合力比嵌合F(ab)小2倍(表2)。还用BIAcoreTM系统(Pharmacia)将F(ab)-12与嵌合F(ab)作比较。用该技术，人源化F(ab)-12的Kd因为更慢的kon和更快的koff而比嵌合F(ab)弱2倍(表3)。
表3：用BIAcoreTM系统测得的抗-VEGF F(ab)变异抗体与VEGF的结合
  变异抗体  F(ab)结合(RU)的数量   Koff(s-1)   Kon(M-1s-1)   Kd(nM)
  Chim-F(ab)b   4250   5.9×10-5   6.5×104   0.91
  F(ab)-12   3740   6.3×10-5   3.5×104   1.8
a以共振单位(RU)表示的F(ab)结合量，是将2微克F(ab)注射到含2480RU固定化VEGF的芯片上，用BIAcoreTM系统进行测量。解离速率动力学(koff)的测量是通过用F(ab)来饱和芯片，然后在切换缓冲液之后检测解离情况。结合速率动力学(kon)的测量是用F(ab)的2倍系列稀释液。平衡解离常数Kd按koff/kon进行计算。
bchim-F(ab)是嵌合的F(ab)，其中鼠VL和VH区被融合于人的CL和CH1重链区。
全长单克隆抗体的构建是通过将嵌合F(ab)和变异抗体F(ab)-12的VL区和VH区融合于人κ轻链和人IgG1重链的恒定区。全长的12-IgG1(F(ab)-12融合于人IgG1)表现出的结合力比嵌合IgG1弱1.7倍(表4)。12-IgG1和嵌合IgG1两者的结合力都稍弱于原始的鼠单克隆抗体A4.6.1(表4)。
表4抗-VEGF IgG变异抗体与VEGF的结合情况
Figure G2009101470179D00471
a抗-VEGF IgG变异抗体与生物素化的VEGF一起孵育，然后转移至包被有KDR-IgG(Park等人(1994)，同上)的ELISA板。
bchIgG1是嵌合的IgG1，其中鼠的VL和VH区被融合于人CL和IgG1重链；chIgG1的EC50是0.113±0.013微克/毫升(0.75nM)。
cmurIgG1是从腹水中纯化出的muMAb VEGF A4.6.1。
d 12-IgG1是将F(ab)-12的VL和VH区融合于人CL和IgG1重链。
生物学研究：比较rhuMAb VEGF和muMAb VEGF A4.6.1在接近VEGF最大有效浓度(3ng/ml)下对牛毛细血管内皮细胞增殖的抑制能力。如图3所示，这两种单克隆抗体在效能和效力方面基本上相近。ED50值分别为50±5ng/ml和48±8ng/ml(约3nM)。在两种情况下，在约500ng/ml(约3nM)的浓度下达到了90％抑制。rhuMAb VEGF A4.6.1和muMAb VEGF A4.6.1两者对基底或bFGF-刺激的毛细血管内皮细胞的增殖都没有效力，这证实了这种抑制作用是对VEGF特异的。
为了确定这种等价性是否适用于体内系统，比较了两种抗体在裸鼠中抑制人A673成横纹肌细胞瘤细胞生长的能力。早先的研究已表明，muMAbVEGF A4.6.1对这种肿瘤模型有强抑制效应(Kim等人，自然(Nature)362：841-844(1993)和Borgstrom等人，癌症研究(Cancer Res.)56：4032-4039(1996))。如图4所示，在两种测试剂量(0.5和5毫克/千克)下，通过在细胞接种后4周测量肿瘤重量加以评估，两种抗体都显著抑制了肿瘤生长。与对照组相比，用muMAbVEGF A4.6.1在各剂量下处理的动物其肿瘤重量分别下降85％和93％，用rhuMAb VEGF处理的动物其肿瘤重量各下降90％和95％。用乳房癌细胞系MDA-MB 435，也获得了类似的结果。
实施例2
在该实施例中，对上述的鼠抗-VEGF抗体A4.6.1如下进行人源化：通过使一小组构架残基随机变化以及通过将形成的抗体分子文库在丝状噬菌体表面上单价展示出来，以便用基于亲和力的选择法鉴别出高亲和力的构架序列。
材料和方法
构建抗-VEGF抗体的噬菌粒载体pMB4-19：
鼠抗-VEGF单克隆抗体A4.6.1如实施例1中所述。A4.6.1的第一个人源化Fab变异体hu2.0是这样构建的：对编码人VLκI-Cκ1轻链和人VHIII-CH1γ1重链Fd片段的质粒pAK2的含脱氧尿苷的模板进行定点诱变(Carter等人，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89，4285-4289(1992))。根据Kabat等人(同上)中的序列定义，选择被移植的A4.6.1的CDR序列，除了CDR-H1之外(CDR-H1包括残基26-35)。Fab编码序列被亚克隆入噬菌粒载体phGHamg3(Bass等人，Proteins，8，309-314(1990)；Lowman等人，Biochemistry.30：10832-10838(1991))。该构建物pMB4-19编码最初的人源化A4.6.1的Fab(即hu2.0)，其中重链的C末端被精确地融合于M13基因III外被蛋白的羧基部分。pMB4-19这个构建物的构建与pDH188(一种早已描述过的用于单价展示Fab片段的质粒(Garrard等人，Biotechnology.9：1373-1377(1991)))相似。pMB4-19与pDH188之间的明显区别包括更短的M13基因III片段(密码子249-406)以及使用紧跟在抗体重链Fd片段之后的琥珀终止密码子。这样可以在大肠杆菌的supE抑制型菌株中表达分泌的重链或重链-基因III融合蛋白两种物质。
人源化A4.6.1Fab片段的表达和纯化：用噬菌粒pMB419或其变异噬菌粒来转化大肠杆菌34B8菌株(一种非抑制型菌株)。单菌落在5毫升含50微克/毫升羧苄青霉素的2YT培养基中37℃生长过夜。将这些培养物稀释于200毫升含20微克/毫升羧苄青霉素的AP5培养液(Chang等人，Gene，55，189-196(1987))，然后在30℃孵育26小时。细胞在4000×g下离心，在-20℃下冷冻至少2小时。然后将细胞沉淀再悬浮于5毫升含1mM EDTA的10mM Tris-HCl(pH7.6)中，在4℃振荡90分钟，然后在10,000×g下离心15分钟。上清液被加至1毫升链球菌G蛋白-Sepharose柱(Pharmacia)上，用10毫升10mM MES(pH 5.5)洗涤。结合的Fab片段用2.5毫升100mM乙酸洗脱并立刻用0.75毫升1M Tris-HCl，pH 8.0中和。Fab制剂的缓冲液被换成PBS，然后用CENTRICON-30浓缩器(Amicon)浓缩。在G蛋白纯化之后，典型的Fab产量约为1毫克/升培养物。纯化的Fab样品用电喷射质谱法加以确定，而浓度用氨基酸分析确定。
构建抗-VEGF Fab噬菌粒文库：按照Kunkel等人，Methods Enzymol.204，125-139(1991)的方法，通过定点诱变而构建人源化A4.6.1噬菌粒文库。制备用作诱变模板的pMB4-19的衍生质粒，它在VH的密码子24、37、67和93处含有TAA终止三联体密码(所有的序列编号按照Kabat等人，同上)。这种修饰可防止以后野生型序列所造成的背景污染。定点随机变化的密码子是4和71(轻链)，以及24、37、67、69、71、73、75、76、78、93和94(重链)。
为了用一个诱变寡核苷酸来使重链密码子67、69、71、73、75、76、93和94随机化，2个126-聚物的寡核苷酸先通过模板协助式酶连接法用60-聚物和66-聚物的片段预组装成。具体地讲，将1.5nmol 5′磷酸化的寡核苷酸503-1(5′-GAT TTC AAA CGT CGT NYT ACT WTT TCT AGA GAC AACTCC AAA AAC ACA BYT TAC CTG CAG ATG AAC-3′(SEQ ID NO：22))或503-2(5′-GAT TTC AAA CGT CGT NYT ACT WTT TCT TTA GAC ACC TCCGCA AGC ACA BYT TAC CTG CAG ATG AAC-3′(SEQ ID NO：23))与1.5nmol 503-3(5′-AGC CTG CGC GCT GAG GAC ACT GCC GTC TAT TACTGT DYA ARG TAC CCC CAC TAT TAT GGG-3′(SEQ ID NO：24))混合。随机化的密码子带下划线，而N表示A/G/T/C；W表示A/T；B表示G/T/C；D表示G/A/T；R表示A/G；而Y表示C/T。然后，加入1.5nmol模板寡核苷酸(5′-CTC AGC GCG CAG GCT GTT CAT CTG CAG GTA-3′(SEQ ID NO：25))(具有与503-1/2的5′端以及503-3的3′端互补的序列)，使其与连接接头处的各末端杂交。向该混合物中，加入Taq连接酶(New England Biolabs的耐热连接酶)和缓冲液，反应混合物经过40轮热循环(95℃1.25分钟和50℃5分钟)，从而使模板寡核苷酸在连接的和未连接的接头之间循环。产物126-聚物寡核苷酸在6％尿素/TBE聚丙烯酰胺凝胶上纯化，然后以缓冲液从聚丙烯酰胺胶上提取出来。将两个126-聚物产物等比例地混合，乙醇沉淀，最后溶解在10mM Tris-HCl，1mM EDTA中。将混合的126-聚物寡核苷酸产物标记为504-01。
在两个步骤中实现对选定构架密码子(VL的4、71；VH的24、37、67、69、71、73、75、76、93和94)的随机诱变。首先，通过制备修饰的pMB4-19模板的另外3个衍生模板而实现VL的随机化。轻链的构架密码子4和71，用两个诱变寡核苷酸5′-GCT GAT ATC CAG TTG ACC CAG TCCCCG-3′(SEQ ID NO：26)和5′-TCT GGG ACG GAT TAC ACT CTG ACC ATC-3′(SEQ ID NO：27)单个地或成对地予以替换。从每个新的衍生模板制备含脱氧尿苷的模板。与最初的模板一起，这4个构建物编码轻链构架序列4种可能组合中的每一种组合(见表5)。
用寡核苷酸504-1(2种126-聚物寡核苷酸的混合物(见上面))以及5-′CGT TTG TCC TGT GCA RYT TCT GGC TAT ACC TTC ACC AAC TAT GGTATG AAC TGG RTC CGT CAG GCC CCG GGT AAG-3′(SEQ ID NO：28)，在用刚才所述的4种模板中的一种模板时使重链构架密码子随机诱变。将4种文库电穿孔导入大肠杆菌XL-1BLUE细胞(Stratagene)并合并。各种转化子的总数估计＞1.2×108，比文库中的DNA序列最大数约大1500倍。
已开发了各种不同的系统用于在丝状噬菌体表面上功能性地展示抗体片段(Winter等人，Ann.Rev.Immunol.12，433(1994))。它们包括以融合于M13噬菌体基因III或基因VIII包被蛋白的融合蛋白形式，来展示Fab或单链Fv(scFv)片段。本文所选的系统与Garrard等人，Biotechn.9：1373-1377(1991)所述的系统相似，其中Fab片段以基因III融合物形式被单价地展示(图7)。该系统有两个显著特征。具体地讲，与scFv不同，Fab片段没有形成二聚体物质的倾向，而二聚体的存在会因亲合效应而阻碍选出最强的结合物。此外，被展示蛋白质的单价性消除了第二种亲合效应的潜在来源，而原本在每个噬菌粒颗粒上存在一个蛋白的多个拷贝会产生这种亲合效应(Bass and Wells，Proteins，8，309(1990)；Lowman等人，Biochem.30，10832(1991))。
使展示人源化A4.6.1Fab片段的噬菌粒颗粒，在大肠杆菌XL-1Blue细胞中繁殖。简而言之，使携带随机化pMB4-19构建物的细胞，在25毫升含50微克/毫升羧苄青霉素和约1010M13KO7辅助噬菌体的2YT培养基中，37℃生长过夜(Vieira and Messing，Methods Enzymol.153，3[1987])。用聚乙二醇盐水溶液沉淀培养上清液纯化噬菌粒原液，然后重悬于100微升PBS中(约1014噬菌粒/毫升)。
选择人源化的A4.6.1Fab变异体：将纯化的VEGF121(100微升，10微克/毫升PBS)包被微量滴定板孔，4℃过夜。弃去包被溶液，用6％脱脂奶封闭这个孔以及未包被的孔1小时，并用含0.05％吐温20(洗涤剂)的PBS洗孔，然后每孔加入噬菌粒原液10微升(用含1％BSA和0.05％吐温20的20mM Tris，pH7.5稀释至100微升)。2小时后洗涤各孔，然后用100微升0.1M甘氨酸(pH2.0)洗脱结合的噬菌体并用25微升1M Tris pH8.0液中和，取其等份用于洗脱噬菌体数目的滴定。从VEGF包被孔上洗脱下的留存噬菌体被繁殖，以用于下一轮选择循环。总计进行了8轮选择，之后20个克隆可以被选出并测序(Sanger等人，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，74，5463(1977))。
测定VEGF的结合亲和力：通过表面胞质团共振法(surface plasmonresonance)(Karlsson等人，J.Immun.Methods 145，229-240(1991))，在Pharmacia BIAcore仪器上测定了人源化A4.6.1Fab变异体与VEGF121结合的结合速率常数(kon)和解离速率常数(koff)。VEGF121通过伯氨基而共价固定于生物传感器芯片上。人源化A4.6.1Fab变异体的结合性的测定，是通过将Fab(以PBS/0.05％TWEEN-20(去污剂)配)溶液以20微升/分钟的流速流过芯片。在每次结合测量之后，用5微升50mM盐酸水溶液以3微升/分钟速度洗涤，从而将残留的Fab从固相化的配体上脱下。用简单的单价结合模式(BIAevaluation软件2.0版；Pharmacia)，通过非线性回归法分析结合曲线。
结果
构建人源化A4.6.1抗体：构建最初的人源化A4.6.1Fab片段(hu2.0，图5A和5B)，其中A4.6.1的CDR被移植于人的VLκI-VHIII构架上。hu2.0中所有其他的残基都保留与人序列相同。该最初的人源化抗体与VEGF的结合力如此之弱，以致于无法检测。根据其他弱结合的人源化A4.6.1变异体的相对亲和力，hu2.0的结合KD估计大于7μM。这与嵌合Fab构建物(由鼠A4.6.1的完整VL和VH区和人的恒定区所构成)的1.6nM亲和力形成了反差。因此，hu2.0与VEGF的结合比嵌合抗体下降了至少4000倍。
设计抗体文库：在本发明中对人构架序列进行构架改变的一组残基列于表5和图6。
表5：对于抗原结合至关重要以及作为定点随机变化目标的关键性构架残基
Figure G2009101470179D00511
a在噬菌粒文库中的氨基酸多样性
bVH 71、73、75、76被随机化以产生全鼠(L71/T73/A75/S76)或全人(R71/D73/K75/N76)的VHIII四联体(tetrad)
在设计人源化A4.6.1噬菌粒文库时的一个着眼点是，定点随机化的目标残基是广泛分布于VL和VH序列中的。合成的寡核苷酸长度方面的限制，要求这些构架部位各点同时进行随机化只能通过使用多个寡核苷酸而实现。然而，随着寡核苷酸总数的增加，诱变的效率(即获掺入了所有诱变寡核苷酸序列的突变体的比例)会下降。为了巧妙地克服这一问题，在文库构建中引入两个特征。第一个特征是制备4个不同的、编码每种可能的VL构架组合的诱变模板。由于轻链构架的多样性很有限(仅4种不同序列)，这是简单可行的，但是其优点是不再需要使用诱变策略的两种寡核苷酸。第二，两个126碱基的寡核苷酸用更小的合成片段预组装成。这样可以用一个长寡核苷酸而不是用两个较短的寡核苷酸随机诱变VH密码子67、69、71、73、75、76、93和94。因此，最终的随机诱变策略是在4种不同模板上同时采用仅两种寡核苷酸。
选择牢固结合的人源化A4.6.1Fab′：根据与VEGF的结合性选出人源化的A4.6.1Fab噬菌粒文库的变异体。通过比较VEGF包被的和未包被的微量滴定板孔中所洗脱出的噬菌体效价，确定功能性噬菌粒的富集程度，在7轮亲和力淘选之内富集程度是增加的。在又一轮挑选之后，对20个克隆进行测序以鉴定在每个随机化位点处选出的优选构架残基。这些结果总结于表6，揭示出在所选的克隆之间有强共有序列。20个克隆中的10个有相同的DNA序列，命名为h2.10。在13个被随机化的构架位置中，在hu2.10中选出了8个取代(VL 71；VH 37、71、73、75、76、78和94)。有趣的是，选出的残基VH 37(Ile)和78(Val)既不是人VHIII的也不是鼠A4.6.1序列的。这个结果提示，通过将多样性扩展至靶定的人和亲代鼠构架序列之外，可以使某些构架位置受益。
表6从人源化A4.6.1噬菌粒Fab文库中选出的序列
Figure G2009101470179D00531
Hu2.0和鼠A4.6.1抗体之间的区别用下划线标出。对于每种噬菌体选出序列相同的克隆数目在括号中标出。在噬菌体选出的克隆序列中的破折号表示选出的是人V1κI-VHIII构架序列(即与hu2.0中相同)。
在被分析的其余10种克隆中，有另外4种独特的氨基酸序列：hu2.1、hu2.2、hu2.6和hu2.7。除了hu2.10之外，所有这些克隆在位置VH 37(Ile)、78(Val)和94(Lys)处含有相同的构架取代，但是在位置24和93保留了人VHIII共有序列。4个克隆丢失了轻链编码序列，在噬菌体ELISA试验(Cunningham等人，EMBO J.13，2508-251(1994))中测试时不结合于VEGF。通过减少选择循环次数或者通过在固相培养基上繁殖文库，常可最大程度减少这种人为现象。
人源化A4.6.1变异抗体的表达和结合亲和力：用摇瓶在大肠杆菌中表达噬菌体选出的变异体hu2.1、hu2.2、hu2.6、hu2.7和hu2.10，然后用G蛋白亲和层析从周质提取物中纯化得到Fab片段。这5种克隆的Fab回收产率在0.2(hu2.6)-1.7毫克/升(hu2.1)之间。这些变异体对抗原(VEGF)的亲和力用表面胞质团共振法在BIAcore仪器上测定(表7)。对这些结合数据的分析揭示，在5种被测试的变异体中，共有序列的克隆hu2.10对VEGF具有最高亲和力。因此，Fab噬菌粒文库选择性富集了结合最牢的克隆。计算出的hu2.10的KD是55nM，至少比没有构架变化的hu2.0(KD＞7μM)结合牢固125倍。其他4种选出的变异体都表现出与VEGF的弱结合，最弱的(hu2.7)低至KD为360nM。有趣的是，hu2.6的KD是67nM，只比hu2.10略低，但是在20个被测序克隆中发现此克隆只有一个拷贝。这可能是因为表达和展示的水平较低，正如表达该变异体的可溶性Fab时一样。然而，尽管表达率较低，该变异体仍可用作人源化抗体。
表7人源化A4.6.1Fab变异体的VEGF结合亲和力
Figure G2009101470179D00541
*Hu2.10V＝具有VL Leu46→Val突变的Hu2.10；估计在Biacore结合测量值中的误差为±25％；
**太弱以致于无法测量，更低结合的估计值
人源化变异抗体hu2.1的进一步改进：尽管抗原亲和性已比最初的人源化变异体有了大幅提高，hu2.10与VEGF的结合仍比含有鼠A4.6.1VL和VH区的嵌合Fab片段弱35倍。这种相当大的差别提示，可通过额外的突变使人源化构架进一步优化。在Foote & Winter等人，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)224，487-499(1992)所鉴别的游标残基中，仅残基VL 46、VH2和VH48在A4.6.1和人V1κI-VHIII构架之间是不同的(图5A和5B)但在我们的噬菌粒文库中没有被随机变化。人源化A4.6.1Fv片段的分子模型显示，VL 46位于VL-VH界面处而且可能影响CDR-H3的构型。此外，该氨基酸在大多数V1κ构架中几乎总是亮氨酸(Kabat等人，同上)，但是在A4.6.1中是缬氨酸。因此，在hu2.10的基础上在该位置进行了Leu→Val取代。对该新变异体hu2.10V的结合动力学分析表明，与VEGF结合的KD又提高了6倍。这表明在抗体A4.6.1的VL46位上缬氨酸的重要性。这样，hu2.10V的KD(9.3nM)就在嵌合体KD的6倍之内。与VL 46相反，将VH 2或VH 48残基用鼠A4.6.1的相应残基进行替换时，未见hu2.10结合亲和力的提高。
实施例3
在该实施例中，通过使用以下手段来提高人源化抗-VEGF抗体的亲和力：CDR随机变化、通过单价Fab噬菌体展示进行的亲和力突变、以及将突变累积组合起来。
构建人源化抗体pY0101：将噬菌体展示的抗体载体phMB4-19-1.6(见图8A-8F)用作亲代载体。在该构建物中，抗-VEGF是以Fab片段形式表达，其中它的重链被融合于截断的g3p的N端。轻链和重链两者都在phoA启动子和上游stII周质分泌信号序列的控制之下。在CDR区之外的点突变是用下表8所示寡核苷酸通过定点诱变法进行，以改善VEGF的亲和力：寡核苷酸HL-242、HL-243、HL-244、HL-245、HL-246、和HL-242。
表8：用于定点诱变的寡核苷酸
  寡核苷酸编号   区域   取代/注解   序列
  HL-242   VL   M4L   5′-GATATCCAGT TGACCCAGTC CCCG-3′(SEQID NO：29)
  HL-243   VL   L46V   5′-GCTCCGAAAG TACTGATTTA C-3′(SEQ IDNO：30)
  HL-245   VH   CDR-7   5′-CGTCGTTTCA CTTTTTCTGC AGACACCTCCAGCAACACAG TATACCTGCA GATG-3′(SEQ IDNO：31)
  HL-246   VH   R98K   5′-CTATTACTGT GCAAAGTACC CCCAC-3′(SEQID NO：32)
  HL-254   VL   Y71F   5′-GGGACGGATT TCACTCTGAC CATC-3′(SEQID NO：33)
  HL-256   VH   I37V   5′-GGTATGAACT GGGTCCGTCA GGCCCC-3′(SEQ ID NO：34)
  HL-257   VH   CDR-7A72L   5′-CGTCGTTTCA CTTTTTCTTT AGACACCTCCAAAAGCACAG CATACCTGCA GATGAAC-3′
  S76KN77S  (SEQ ID NO：35)
形成的变异体被命名为Y0101(图9A和9B)。
构建第一代抗体-噬菌体文库：为了防止野生型序列的污染，制备在靶定随机化位点处具有TAA终止密码子的模板，并通过定点诱变构建文库，其中具有简并NNS密码子(N是A、G、C和T的等量混合物，而S是G和C的等量混合物)寡核苷酸进行饱和诱变。将VL1和VH3选作潜在的候选者用于提高亲和力(图9A和9B)。在CDR中，用pY0101模板构建了2个文库。VL1用终止模板寡核苷酸HL-248和HL249(表9)和文库寡核苷酸HL-258和HL259(表10)进行突变。类似地，用终止模板寡核苷酸HL-250、HL-251、和HL-252(表9)以及文库寡核苷酸HL-260、HL-261和HL262(表10)构建了3个VH3的文库。文库的构建总结于下表9和和10中。
表9：用于诱变的模板寡核苷酸
  寡核苷酸编号   区域注解   序列
  HL-248   VL1   5′-GGGTCACCAT CACCTGCTAA GCATAATAATAATAAAGCAA CTATTTAAAC TGG-3′(SEQ ID NO：36)
  HL-249   VL1   5′-GCGCAAGTCA GGATATTTAA TAATAATAATAATGGTATCA ACAGAAACCA GG-3′(SEQ ID NO：37)
  HL-250   VH3   5′-GTCTATTACT GTGCAAAGTA ATAACACTAATAAGGGAGCAGCCACTGG-3′(SEQ ID NO：38)
  HL-251   VH3   5′-GGTACCCCCA CTATTATTAA TAATAATAATGGTATTTCGA CGTCTGGGG-3′(SEQ ID NO：39)
  HL-252   VH3   5′-CACTATTATG GGAGCAGCCA CTAATAATAATAAGTCTGGG TCAAGGAACC CTG-3′(SEQ ID NO：40)
  HL-263   VH1   5′-TCCTGTGCAG CTTCTGGCTA ATAATTCTAATAATAAGGTA TGAACTGGGT CCG-3′(SEQ ID NO：41)
  HL-264   VH2   5′-GAATGGGTTG GATGGATTAA CTAATAATAAGGTTAACCGA CCTATGCTGC GG-3′(SEQ ID NO：42)
  YV-80   VH3   5′-CTGTGCAAAG TACCCGTAAT ATTAATAATA
  ATAACACTGG TATTTCGAC-3′(SEQ ID NO：43)
  YC-100   CDR7   5′-CGTTTCACTT TTTCTTAAGA CTAATCCAAATAAACAGCAT ACCTGCAG-3′(SEQ ID NO：44)
  YC-102   VH2   5′-GAATGGGTTG GATGGATTTA ATAATAATAAGGTGAACCGA CCTATG-3′(SEQ ID NO：45)
表10：用于文库构建的随机寡核苷酸
  寡核苷酸编号   区域注解   序列
  HL-258   VL1   5′-GGGTCACCAT CACCTGCNNS GCANNSNNSNNSNNSAGCAA CTATTTAAAC TGG-3′(SEQ ID NO：46)
  HL-259   VL1   5′-GCGCAAGTCA GGATATTNNS NNSNNSNNSNNSTGGTATCA ACAGAAACCA GG-3′(SEQ ID NO：47)
  HL-260   VH3   5′-GTCTATTACT GTGCAAAGNN SNNSCACNNSNNSGGGAGCAGCCACTGG-3′(SEQ ID NO：48)
  HL-261   VH3   5′-TACCCCCA CTATTATNNS NNSNNSNNSTGGTATTTCGACGTCTGGGG-3′(SEQ ID NO：49)
  HL-262   VH3   5′-CACTATTATG GGAGCAGCCA CNNSNNSNNSNNSGTCTGGG GTCAAGGAAC CCTG-3′(SEQ ID NO：50)
  HL-265   VH1   5′-TCCTGTGCAG CTTCTGGCNN SNNSTTCNNSNNSNNSGGTA TGAACTGGGT CCG-3′(SEQ ID NO：51)
  HL-266   VH2   5′-GAATGGGTTG GATGGATTAA CNNSNNSNNSGGTNNSCCGA CCTATGCTGC GG-3′(SEQ ID NO：52)
  YC-81   VH3   5′-CTGTGCAAAG TACCCGNNST ATNNSNNSNNSNNSCACTGG TATTTCGAC-3′(SEQ ID NO：53)
  YC-101   CDR7   5′-CGTTTCACTT TTTCTNNSGA CNNSTCCAAANNSACAGCAT ACCTGCAG-3′(SEQ ID NO：54)
  YC-103   VH2   5′-GAATGGGTTG GATGGATTNN SNNSNNSNNSGGTGAACCGACCTATG-3′(SEQ ID NO：55)
将随机诱变反应产物电穿孔导入大肠杆菌XL-1BLUE细胞(Stratagene)，然后通过与M13KO7辅助噬菌体一起生长15-16小时而得以扩增。通过将最初转化物接种于含羧苄青霉素的平板而加以评估，每个文库的复杂度为2×107-1.5×108。
最初的亲和力选择：对于每轮选择，根据与包被有2微克/毫升VEGF(重组的，残基为9-109个)(在50mM碳酸盐缓冲液，pH 9.6中)并用5％速溶牛奶(在50mM碳酸盐缓冲液，pH 9.6中)封闭的板(Nunc Maxsorp 96孔)的结合情况，筛选109-1010个噬菌体。在存在0.5％牛血清白蛋白和0.05％TWEEN 20TM的PBS溶液下，室温下结合1-2小时之后，用PBS/TWEENTM(含0.05％TWEEN20TM的PBS缓冲液)洗涤板。典型地，为了选择解离速度更慢的亲和力提高的变异体，将板与PBS/TWEENTM缓冲液孵育一段时间，孵育时间在每轮选择中逐渐延长(第一轮为0分钟，然后逐渐增加至第9轮选择中为3小时)。在去除PBS/TWEENTM缓冲液之后，将剩余的噬菌体用0.1M盐酸洗脱，然后立刻用1/3体积的1M Tris-HCl，pH 8.0中和。洗脱下的噬菌体通过感染XL1-BLUE细胞(Stratagene)而进行繁殖，以用于下一轮选择。
测序数据揭示，两种VL文库，即使在挑选了8和9轮之后，仍然保留了多样性，在随机化位点处能容忍各种不同残基。与之相反，VH3文库仅保留了野生型残基和非常保守的取代。这表明，VL1更暴露于溶剂并且位于结合界面外侧。与之相反，VH3没有明显不同的侧链取代，因此可能更密切地在抗原结合中被涉及。
结合亲和力的噬菌体-ELISA测定：从每种这些文库中，在噬菌体-ELISA测定中分析代表性克隆(由丰富序列所代表的克隆)相比亲代克隆pY0101而言的亲和力。在该测定中，先将噬菌体系列稀释，以确定保持稳定的组份饱和效价，然后将其用于与不同浓度的VEGF(200nM-0nM)溶液一起孵育。接着将混合物转移至包被有VEGF(2微克/毫升)并用5％速溶牛奶封闭的板，在室温下平衡1小时。之后，除去噬菌体溶液，对残留的结合噬菌体用兔抗-噬菌体抗体和山羊抗-兔抗体和辣根过氧化物酶的偶联物的混合溶液检测。在室温下孵育1小时后，用生色底物邻-苯二胺(Sigma)使板显色。通过加入1/2体积2.5MH2SO4而终止反应。用分光光度计板阅读器测量在492纳米处的光密度。
尽管在噬菌体-ELISA测定中，从这5个文库中选出的所有克隆都表现出比野生型pY0101更弱或类似的亲和力，但是来自文库HL-258的一个特殊的变异体(pY0192)却在表达水平或噬菌体展示方面表现出优于pY0101的明显优势(高约10倍)。该克隆在VL区含有突变S24R、S26N、Q27E、D28Q和I29L(图9A)。此外，发现该变异抗体在VH区有乱真的突变M34I。这个变异抗体与pY0101相比，对VEGF的结合亲和力没有明显差异。为了提高Fab在噬菌体上的展示水平以及噬菌体-ELISA测定的信号-噪音比，将pY0192中的相应取代引入背景模板，以构建两种CDR的Ala突变体和第二代抗-VEGF文库。
对抗-VEGF的CDR进行丙氨酸扫描：为了确定CDR区中各氨基酸对结合力的贡献并更好地选择用于随机变化的靶定残基，通过用丙氨酸替换每个残基而对CDR区进行筛选。每个丙氨酸变异体的构建是通过定点诱变法并使用编码各具体丙氨酸取代的合成寡核苷酸。当丙氨酸是野生型残基时，用丝氨酸加以替换以测试侧链取代的效应。如上所述，对具有单个丙氨酸突变的噬菌体克隆进行纯化和用噬菌体-ELISA分析。丙氨酸扫描的结果表明，在不同位置上的丙氨酸替换可能有效，与pY0192相比抗原结合亲和力下降了2-150倍。此外，证实了早先的观察结果，即在抗原结合中涉及的是VH3而不是VL1。CDR丙氨酸扫描的结果总结于下表11。
表11：丙氨酸扫描的Fab变异抗体的相对VEGF亲和力
Figure G2009101470179D00591
Figure G2009101470179D00601
所有变异抗体都以pY0192(“野生型(wt)”；见图9A-B)为基础。IC50通过竞争性噬菌体-ELISA分析加以测定。
在CDR H1、H2和H3中观察到了丙氨酸替换的最大效应，其中包括Y27A(亲和力下降34倍)、N31A、Y32A、W50A、N52A、Y99A、S106A和W108A(各下降了＞150倍)；N35A(下降66倍)、P100A(下降38倍)和F110A(下降25倍)。与之相反，仅有一个VL替换对结合亲和力有大影响，即W96A(下降＞150倍)。这些结果表明，3个VH CDR是Fab与VEGF结合的主要力能决定因素，而VL3有部分贡献。
设计第二代CDR突变文库：根据对晶体结构的研究，设计了另2种对抗-VEGF抗体Y0192中现有残基进行随机变化的文库。在VH2中，对残基52-55随机变化，因为它们位于与VEGF的结合界面中。称为“CDR7”的一个Fab额外区域，也被选定进行随机化，因为在该环中有数个残基尽管不与VEGF接触但是却与抗体的VH环接触。这些是通过界面残基的二级效应来提高亲和力的潜在位点。在该CDR7文库中，残基L72、T74和S77被随机变化。
还根据晶体结构，再构建了一个原始CDR文库来再次测试VH1CDR中亲和力成熟的潜力。用新的Y0192为背景，对残基27、28和30-32进行随机变化。
抗-VEGF文库的第二代选择：根据丙氨酸扫描结果和抗原-抗体(F(ab)-12)复合物的晶体结构，用pY0192模板和终止模板寡核苷酸(在靶定的随机化位点具有终止密码子的寡核苷酸)YC-80、YC-100、YC-102、HL-263、和HL-264(上表9)构建总计17个文库。对应的随机化寡核苷酸(在靶定的随机化位点为NNS)是YC81、YC-101、YC-103、HL-265、和HL-266(上表10)。形成的转化子产生了复杂度为6×107-5×108的文库，这表明文库是全面的且覆盖了所有可能的变异体。用下表12所述的条件，对噬菌体文库挑选7-8轮。
表12Fab变异抗体的第二代选择的条件
  选择轮次   孵育时间(小时)   孵育溶液   孵育温度(℃)
  1   0   0   室温
  2   1   ELISA缓冲液   室温
  3   2   1μM VEGF/ELISA   室温
  4   18   1μM VEGF/ELISA   室温
  5   37   1μM VEGF/ELISA   室温
  6   17小时，室温/30小时，37℃   1μM VEGF/ELISA   室温/37℃
  7   63   1μM VEGF/ELISA   37℃
  8   121   1μM VEGF/ELISA   37℃
ELISA缓冲液在PBS中含有0.5％牛血清白蛋白和0.05％TWEEN 20TM。将VEGF包含在孵育缓冲液中以减少噬菌体与包被在板表面上的VEGF之间的再结合。对这些文库的挑选导致噬菌体在7-8轮选择后富集。
第二代克隆的噬菌体-ELISA测定：在8轮选择之后，从携带大肠杆菌(XL1)菌落(已用洗脱的噬菌体混合物感染)的含羧苄青霉素的平板上，分离出各文库的10-20个克隆。菌落被分离并与辅助噬菌体一起生长，以获得单链DNA用于测序。选出的与VEGF结合更好CDR取代，是通过噬菌粒克隆的DNA推导出的。选定克隆的采样结果示于下表13。
表13：第二代Fab-噬菌体文库的抗-VEGF变异抗体的蛋白质序列
仅示出了根据DNA测序推导出的随机变化区域的序列。
当大量克隆与亲代克隆pY0192一起用噬菌体-ELISA法测试时，没有一个克隆表现出比亲代克隆明显改善。这可能是因为测试进行的时间(＜3小时)所限。
为了定量分析与亲代克隆相比在抗原结合性方面的改善，将数种抗-VEGF变异体的DNA转入大肠杆菌34B8菌株，以Fab形式表达，然后将周质破碎物(periplasmic shockate)如上面实施例2所述通过G蛋白柱(Pharmacia)进行纯化。
CDR组合型变异抗体：为了进一步改善VEGF结合亲和力，将噬菌体展示中所发现的突变与不同的CDR组合，以产生多种CDR变异体。具体地，将VH1、VH2和VH3文库中亲和力提高程度最大的噬菌体变异体中所鉴别出的突变合并(表14)，以测试它们对结合亲和力的增加程度。
表14：抗-VEGF变异抗体的CDR组合
  名称   亲代克隆   诱变寡核苷酸/注解   序列
  Y0313-1   Y0243-1   YC-115(VH3：H101Y和S105T)   5′-GCAAAGTACC CGTACTATTATGGGACGAGC CACTGGTATT TC-3′(SEQ ID NO：96)
  Y0317   Y0313-1   YC-108(将VL1逆转回野生型)   5′-GTCACCATCA CCTGCAGCGCAAGTCAGGAT ATTAGCAACTATTTAAAC-3′(SEQ ID NO：97)
  Y0313-3   Y0238-3   YC-116(VH3：T105S)   5′-CCGTACTATT ATGGGAGCAGCCACTGGTAT TTC-3′(SEQ IDNO：98)
将所示的亲代载体中的突变与所示寡核苷酸中的突变，通过定点诱变进行组合(合并)，以产生所示的组合型变异抗体。
Y0317与Y0313-1是相同的，不同点仅在于在VL1中的背景突变被去除并将其序列逆转回pY0101中的序列。突变H101Y和S105T的效应是通过用Y0238-3构建回复突变体而加以测试的。
BIAcore分析：Fab片段的VEGF-结合亲和力是根据用BIAcore-2000TM表面胞质团共振系统(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)测得的结合速率常数和解离速率常数计算出的。根据供应商(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)的说明，用盐酸N-乙基-N′(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺将生物传感器芯片活化，以便与VEGF共价偶联。将VEGF的缓冲液换为20mM乙酸钠(pH 4.8)，然后稀释至约50微克/毫升。将一等份样品(35微升)以2微升/分钟的流速注入，以达到约700-1400共振单位(RU)的偶联蛋白。最后，注入1M乙醇胺作为封闭剂。
对于动力学测量，将25℃的、Fab在PBS/TWEENTM缓冲液(含0.05％TWEEN 20TM的磷酸盐缓冲液)中的的2倍系列稀释液，以10微升/分钟的速度注入。结合和解离速率用标准方法(Karlsson等人，免疫学方法杂志(J.Immun.Methods)145：229-240(1991))计算。平衡解离常数Kd(表面胞质团共振(SPR)测量值的Kd)是按koff/kon进行计算。数据列于下表15。
Figure G2009101470179D00651
*观察到的解离速率可能反映了在这些试验中真实解离速率的上限，因为解离速率接近BIAcore的测量极限。
在表15中所示的BIAcoreTM数据表明，数种变异抗体具有高于Y0192的亲和力。例如，CDRH1变异抗体Y0243-1(具有突变T28D和N31H)的亲和力高4.1倍。变异抗体Y0238-3的结合亲和力比Y0192高至少14倍。两种CDRH3突变都使Y0238-3的亲和力上升，因为将T105回复至S(变异抗体Y0313-3)将Y0238-3的亲和力从0.15nM降至0.65nM(见表15)。相对于Y0192而言更大的亲和力提高见于Y0313-1，它含有CDRH3突变和CDRH1突变。
基于细胞的VEGF抑制分析：测试了数种A4.6.1抗-VEGF抗体拮抗VEGF(重组型，种类1-165)诱导HuVEC(人脐静脉内皮细胞)生长的能力。以1000个HuVEC/孔接种96孔板，然后在分析培养液(F12∶DMEM(50∶50)，并补充有1.5％渗滤处理过的胎牛血清)中禁食24小时。用于诱导细胞的VEGF浓度，通过测定能刺激80％最大DNA合成所需的VEGF量而加以确定。然后，加入含固定量VEGF(0.2nM终浓度)以及抗-VEGF Fab或MAb浓度逐渐增加的新鲜分析培养基。在孵育40小时后，通过含氚胸苷的掺入量来测量DNA合成情况。将0.5μCi[3H]-胸苷/每孔加入细胞培育24小时，然后收获，用TopCount伽马计数器计数。
结果(图11)表明，在抑制VEGF活性方面，全长IgG形式的F(ab)-12明显强于Fab形式(此处使用的是Y0192)。然而，两种变异抗体Y0238-3和Y0313-1甚至表现出强于Y0192Fab或F(ab)-12单克隆抗体的对VEGF活性的抑制作用。通过比较Fab形式，变异体Y0313-1表现出比野生型Fab强＞30倍。应注意，用于此分析中的VEGF量(0.2nM)，可能潜在地限制了对变异体IC50的精确测量。例如，如果变异体的结合亲和力(Kd)事实上小于0.2nM，那么在该试验中IC50会明显高于在更低VEGF浓度下所测得的IC50。因此，这个结果支持这样的结论：亲和力提高的变异体与VEGF的亲和力至少提高了30倍，而且它可在体外有效地阻断VEGF活性。因为变异抗体Y0317与Y0313-1的差别仅在于VL1序列回复至野生型(图10)，因此可预计Y0317具有与Y0313类似的活性。
将变异抗体Y0317(Fab)与实施例1的人源化F(ab)-12(全长及Fab)进行比较，即用实施例1所述的分析方法比较它们对响应近最大有效浓度VEGF时牛毛细血管内皮细胞增殖的抑制能力。如图12所示，在该分析中，在抑制牛毛细血管内皮细胞增殖方面，Y0317明显比全长或Fab形式的F(ab)-12更有效。在该分析中，Y0317亲和力成熟形式的Fab表现出的ED50值比F(ab)-12的Fab低至少20倍。

Claims (47)

1.一种人源化抗-VEGF抗体，它具有重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含如下高变区氨基酸序列：由序列GYX1FTX2YGMN(SEQ IDNO：128)所示的CDRH1，其中X1是T或D，而X2是N或H；由序列WINTYTGEPTYAADFKR(SEQ ID NO：2)所示的CDRH2；和由序列YPX1YYGX2SHWYFDV(SEQ ID NO：129)所示的CDRH3，其中X1是Y或H，而X2是S或T，该轻链可变区包含如下高变区氨基酸序列：由序列SASQDISNYLN(SEQ ID NO：4)所示的CDRL1；由序列FTSSLHS(SEQID NO：5)所示的CDRL2；和由序列QQYSTVPWT(SEQ ID NO：6)所示的CDRL3。
2.如权利要求1所述的人源化抗-VEGF抗体，它包含SEQ ID NO：7所示的重链可变区氨基酸序列。
3.如权利要求1所述的人源化抗-VEGF抗体，它具有重链可变区，该重链可变区包括如下高变区氨基酸序列：由序列GYTFTNYGMN(SEQ IDNO：1)所示的CDRH1；由序列WINTYTGEPTYAADFKR(SEQ ID NO：2)所示的CDRH2；和由序列YPHYYGSSHWYFDV(SEQ ID NO：3)所示的CDRH3，该人源化抗-VEGF抗体是全长的抗体或是选自下组的抗体片段：Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双抗体(diabody)；线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
4.如权利要求1所述的人源化抗-VEGF抗体，它包含SEQ ID NO：8所示的轻链可变区氨基酸序列。
5.一种人源化抗-VEGF抗体，它具有重链可变区氨基酸序列SEQ IDNO：7和轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO：8，该人源化抗-VEGF抗体是全长的抗体或是选自下组的抗体片段：Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双抗体(diabody)；线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
6.一种抗-VEGF抗体，它具有轻链可变区氨基酸序列：
DIQX1TQSPSS LSASVGDRVT ITCSASQDIS NYLNWYQQKPGKAPKVLIYF TSSLHSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQYSTVPWTFGQ GTKVEIKR(SEQ ID NO：124)，其中X1是M或L。
和重链可变区氨基酸序列：
EVQLVESGGG LVQpGGSLRL SCAASGYX1FT X2YGMNWVRQAPGKGLEWVGW INTYTGEPTY AADFKRRFTF SIDTSKSTAYLQMNSLRAED TAVYYCAKYP X3YYGX4SHWYF DVWGQGTLVT VSS(SEQID NO：125)，其中X1是T或D；X2是N或H；X3是Y或H以及X4是S或T。
7.一种亲代抗-VEGF抗体的变异抗体，其中该亲代抗体是权利要求5的人源化抗-VEGF抗体，该变异抗体结合于人VEGF，而且在该亲代抗体的重链可变区的高变区中有氨基酸取代，该氨基酸取代位于重链可变区的CDRH1和/或CDRH3中，该变异抗体包含下述高变区氨基酸序列之一或二者：由序列GYDFTHYGMN(SEQ ID NO：126)所示的CDRH1和由序列YPYYYGTSHWYFDV(SEQ ID NO：127)所示的CDRH3。
8.如权利要求7所述的变异抗体，该取代位于重链可变区的CDRH1中，该变异抗体包含由序列GYDFTHYGMN(SEQ ID NO：126)所示的CDRH1。
9.如权利要求7所述的变异抗体，该取代位于重链可变区的CDRH3中，该变异抗体包含由序列YPYYYGTSHWYFDV(SEQ ID NO：127)所示的CDRH3。
10.如权利要求7所述的变异抗体，该氨基酸取代位于CDRH1和CDRH3两者中，该变异抗体包含由序列GYDFTHYGMN(SEQ ID NO：126)所示的CDRH1和由序列YPYYYGTSHWYFDV(SEQ ID NO：127)所示的CDRH3。
11.如权利要求8所述的变异抗体，该变异抗体包含重链可变区氨基酸序列SEQ ID NO：116。
12.如权利要求11所述的变异抗体，该变异抗体进一步包含轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO：124。
13.如权利要求12所述的变异抗体，该变异抗体包含轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO：115，该变异抗体是全长的抗体或是选自下组的抗体片段：Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双抗体(diabody)；线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
14.如权利要求1-13任一项所述的抗体，它是全长的抗体。
15.如权利要求14所述的抗体，它是人IgG。
16.如权利要求1-13任一项所述的抗体，它是抗体片段，选自Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双抗体(diabody)；线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
17.如权利要求16所述的抗体，它是Fab。
18.分离的编码权利要求1-17任一项所述抗体的核酸。
19.含有权利要求18所述核酸的载体。
20.含有权利要求19所述载体的宿主细胞。
21.一种产生人源化抗-VEGF抗体的方法，它包括培养权利要求20所述的宿主细胞，从而使核酸被表达出。
22.如权利要求21所述的方法，还包括从宿主细胞培养物中回收人源化的抗-VEGF抗体。
23.一种药物制剂，它含有权利要求1-17任一项所述的抗体。
24.如权利要求23所述的药物制剂，它含有缓冲液。
25.如权利要求24所述的药物制剂，其中所述缓冲液是磷酸盐。
26.如权利要求23-25任一项所述的药物制剂，它还含有糖。
27.如权利要求26所述的药物制剂，其中所述糖是海藻糖。
28.如权利要求23-27任一项所述的药物制剂，它还含有非离子表面活性剂。
29.如权利要求28所述的药物制剂，其中所述非离子表面活性剂是聚山梨酯(即吐温)。
30.一种亲和纯化试剂，它包含如权利要求1-17任一项所述的抗VEGF抗体。
31.如权利要求30所述的亲和纯化试剂，其中所述抗体固定在固相上。
32.权利要求1-17任一项所述抗体在制备可用于VEGF蛋白的诊断性分析的试剂中的用途。
33.如权利要求32所述的用途，其中所述抗体用可检测分子进行标记。
34.如权利要求33所述的用途，其中所述抗体用放射性同位素、荧光标志、或酶进行标记。
35.如权利要求32所述的用途，其中所述抗体进行间接标记。
36.如权利要求35所述的用途，其中所述抗体用生物素、亲合素、半抗原或抗半抗原抗体进行间接标记。
37.如权利要求32所述的用途，其中所述抗体用标记过的结合该抗VEGF抗体的抗体来检测。
38.如权利要求32所述的用途，其中所述试剂用于竞争性结合分析、直接或间接夹心分析、或免疫沉淀分析。
39.一种用于进行VEGF蛋白的诊断性分析的试剂盒，它包括权利要求1-17任一项所述的抗体。
40.如权利要求39所述的试剂盒，其中所述抗体用可检测分子进行标记。
41.如权利要求40所述的试剂盒，其中所述抗体用放射性同位素、荧光标志、或酶进行标记。
42.如权利要求39所述的试剂盒，其中所述抗体进行间接标记。
43.如权利要求42所述的试剂盒，其中所述抗体用生物素、亲合素、半抗原或抗半抗原抗体进行间接标记。
44.如权利要求39所述的试剂盒，其中所述抗体用标记过的结合该抗VEGF抗体的抗体来检测。
45.如权利要求39所述的试剂盒，其用于竞争性结合分析、直接或间接夹心分析、或免疫沉淀分析。
46.一种药物用途的产品，它包括容器和标签，其中所述容器中含有权利要求23-29任一项的药物制剂。
47.如权利要求46所述的药物用途的产品，其中所述容器是普通瓶、药瓶、注射器或试管。
CN2009101470179A 1997-04-07 1998-04-03 抗-血管内皮生长因子的抗体 Expired - Lifetime CN101665536B (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US83350497A 1997-04-07 1997-04-07
US08/833,504 1997-04-07
US08/908,469 US6884879B1 (en) 1997-04-07 1997-08-06 Anti-VEGF antibodies
US08/908,469 1997-08-06

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB988059142A Division CN100480269C (zh) 1997-04-07 1998-04-03 抗-血管内皮生长因子的抗体

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101665536A CN101665536A (zh) 2010-03-10
CN101665536B true CN101665536B (zh) 2013-07-03

Family

ID=25264594

Family Applications (6)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2009101470179A Expired - Lifetime CN101665536B (zh) 1997-04-07 1998-04-03 抗-血管内皮生长因子的抗体
CN2007101971417A Expired - Lifetime CN101210051B (zh) 1997-04-07 1998-04-03 抗-血管内皮生长因子的抗体
CN2007101971402A Expired - Lifetime CN101210050B (zh) 1997-04-07 1998-04-03 抗-血管内皮生长因子的抗体
CN200910147016A Pending CN101838328A (zh) 1997-04-07 1998-04-03 抗-血管内皮生长因子的抗体
CNB98805910XA Expired - Lifetime CN1191276C (zh) 1997-04-07 1998-04-03 人源化抗体和制备人源化抗体的方法
CN201410411945.2A Pending CN104231078A (zh) 1997-04-07 1998-04-03 抗-血管内皮生长因子的抗体

Family Applications After (5)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2007101971417A Expired - Lifetime CN101210051B (zh) 1997-04-07 1998-04-03 抗-血管内皮生长因子的抗体
CN2007101971402A Expired - Lifetime CN101210050B (zh) 1997-04-07 1998-04-03 抗-血管内皮生长因子的抗体
CN200910147016A Pending CN101838328A (zh) 1997-04-07 1998-04-03 抗-血管内皮生长因子的抗体
CNB98805910XA Expired - Lifetime CN1191276C (zh) 1997-04-07 1998-04-03 人源化抗体和制备人源化抗体的方法
CN201410411945.2A Pending CN104231078A (zh) 1997-04-07 1998-04-03 抗-血管内皮生长因子的抗体

Country Status (22)

Country Link
EP (6) EP1695985B1 (zh)
JP (1) JP4191258B2 (zh)
KR (2) KR100794454B1 (zh)
CN (6) CN101665536B (zh)
AT (4) ATE501170T1 (zh)
AU (1) AU740738B2 (zh)
BR (1) BRPI9809388B8 (zh)
CA (1) CA2286397C (zh)
CY (3) CY1111345T1 (zh)
DE (3) DE69841815D1 (zh)
DK (4) DK0971959T3 (zh)
ES (4) ES2361267T3 (zh)
HK (7) HK1025338A1 (zh)
IL (3) IL132239A0 (zh)
LT (1) LTC0973804I2 (zh)
NO (3) NO325823B1 (zh)
NZ (1) NZ500077A (zh)
PT (5) PT1787999E (zh)
SI (5) SI2301580T1 (zh)
TR (1) TR199902818T2 (zh)
WO (1) WO1998045332A2 (zh)
ZA (2) ZA982907B (zh)

Families Citing this family (205)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6582959B2 (en) 1991-03-29 2003-06-24 Genentech, Inc. Antibodies to vascular endothelial cell growth factor
US20020032315A1 (en) 1997-08-06 2002-03-14 Manuel Baca Anti-vegf antibodies
US6884879B1 (en) 1997-04-07 2005-04-26 Genentech, Inc. Anti-VEGF antibodies
ES2361267T3 (es) * 1997-04-07 2011-06-15 Genentech Inc. Procedimiento para la produccion de anticuerpos humanizados mediante mutagénesis aleatoria.
JP3957765B2 (ja) 1997-04-07 2007-08-15 ジェネンテク・インコーポレイテッド 抗ｖｅｇｆ抗体
US20070059302A1 (en) 1997-04-07 2007-03-15 Genentech, Inc. Anti-vegf antibodies
ES2389387T3 (es) 1998-03-17 2012-10-25 Genentech, Inc. Polipéptidos homólogos de VEGF y de BMP1
US6632926B1 (en) 1998-11-18 2003-10-14 Genentech, Inc. Antibody variants
US20030035798A1 (en) * 2000-08-16 2003-02-20 Fang Fang Humanized antibodies
US6342221B1 (en) 1999-04-28 2002-01-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Antibody conjugate compositions for selectively inhibiting VEGF
US6703020B1 (en) 1999-04-28 2004-03-09 Board Of Regents, The University Of Texas System Antibody conjugate methods for selectively inhibiting VEGF
US6346249B1 (en) * 1999-10-22 2002-02-12 Ludwig Institute For Cancer Research Methods for reducing the effects of cancers that express A33 antigen using A33 antigen specific immunoglobulin products
EP1881004B1 (en) 2000-04-21 2012-07-25 Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd. Novel collectin
EP2275549A1 (en) 2000-06-23 2011-01-19 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of disorders involving angiogenesis
CA2648046A1 (en) 2000-06-23 2002-01-03 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of disorders involving angiogenesis
US20050123925A1 (en) 2002-11-15 2005-06-09 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
AU2003216250A1 (en) * 2002-02-11 2003-09-04 Genentech, Inc. Antibody variants with faster antigen association rates
EP1551453A4 (en) 2002-06-17 2007-04-25 Us Gov Health & Human Serv SPECIFICITY GRAFTING OF A MICE RESPONSE TO A HUMAN FRAME
AU2004205684A1 (en) 2003-01-23 2004-08-05 Genentech, Inc. Methods for producing humanized antibodies and improving yield of antibodies or antigen binding fragments in cell culture
RS20181002A1 (sr) 2003-05-30 2018-12-31 Genentech Inc Tretman sa anti-vegf antitelima
WO2005035575A2 (en) * 2003-08-22 2005-04-21 Medimmune, Inc. Humanization of antibodies
EP2361974A1 (fr) 2003-12-02 2011-08-31 Institut Pasteur Utilisation des proteines et des peptides codés par le genome d'une nouvelle souche de coronavirus associé au SRAS
AU2005214382B2 (en) 2004-02-19 2011-08-04 Genentech, Inc. CDR-repaired antibodies
US8604185B2 (en) 2004-07-20 2013-12-10 Genentech, Inc. Inhibitors of angiopoietin-like 4 protein, combinations, and their use
AU2005269716B2 (en) 2004-07-20 2011-01-27 Genentech, Inc. Inhibitors of angiopoietin-like 4 protein, combinations, and their use
ES2390676T3 (es) 2004-10-21 2012-11-15 Genentech, Inc. Método para el tratamiento de enfermedades neovasculares intraoculares
UA96139C2 (uk) 2005-11-08 2011-10-10 Дженентек, Інк. Антитіло до нейропіліну-1 (nrp1)
US8101365B2 (en) 2006-01-05 2012-01-24 Genentech, Inc. Anti-EphB4 antibodies and methods using same
WO2007127506A2 (en) 2006-01-20 2007-11-08 Genentech, Inc. Anti-ephrinb2 antibodies and methods using same
AR059851A1 (es) 2006-03-16 2008-04-30 Genentech Inc Anticuerpos de la egfl7 y metodos de uso
TW200812615A (en) 2006-03-22 2008-03-16 Hoffmann La Roche Tumor therapy with an antibody for vascular endothelial growth factor and an antibody for human epithelial growth factor receptor type 2
BRPI0711908B8 (pt) * 2006-05-25 2021-05-25 Glaxo Group Ltd anticorpo anti-interleucina-18 humanizado, composição farmacêutica, uso de um anticorpo anti-interleucina 18, e, método de produção de um anticorpo.
AU2007319672B2 (en) 2006-06-06 2011-06-30 Genentech, Inc. Anti-DLL4 antibodies and methods using same
CN1903880B (zh) * 2006-08-02 2010-05-12 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 抗肿瘤血管内皮生长因子vegf-e抗原及其编码基因与应用
EP2056874B1 (en) 2006-08-21 2012-09-19 F. Hoffmann-La Roche AG Tumor therapy with an anti-vegf antibody
CN101148474B (zh) * 2006-09-21 2014-06-11 上海杰隆生物工程股份有限公司 人源人血管内皮生长因子单克隆抗体及其制备方法
MX2009006779A (es) 2006-12-19 2009-08-27 Genentech Inc Antagonistas especificos para terapia con adyuvantes y neo-adyuvantes y el tratamiento de tumores en etapa temprana.
WO2008143666A2 (en) 2007-05-17 2008-11-27 Genentech, Inc. Crystal structures of neuropilin fragments and neuropilin-antibody complexes
EP2152307B1 (en) 2007-05-17 2014-04-16 Genentech, Inc. Inhibition of tumor metastasis by anti neuropilin 2 antibodies
PE20090321A1 (es) 2007-06-04 2009-04-20 Genentech Inc Anticuerpos anti-notch1 nrr, metodo de preparacion y composicion farmaceutica
PL2565206T3 (pl) 2007-10-30 2017-08-31 Genentech, Inc. Oczyszczanie przeciwciał za pomocą chromatografii kationowymiennej
EP2217261B1 (en) 2007-11-09 2015-10-07 Genentech, Inc. Activin receptor-like kinase-1 antagonist compositions and methods of use
TWI468417B (zh) * 2007-11-30 2015-01-11 Genentech Inc 抗－ｖｅｇｆ抗體
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
HUE032894T2 (hu) * 2008-06-25 2017-11-28 Esbatech Alcon Biomed Res Unit VEGF-gátló, stabilis és oldható antitestek
US8268314B2 (en) 2008-10-08 2012-09-18 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific anti-VEGF/anti-ANG-2 antibodies
JP5913980B2 (ja) 2008-10-14 2016-05-11 ジェネンテック， インコーポレイテッド 免疫グロブリン変異体及びその用途
CN107011425B (zh) 2008-11-03 2021-01-01 分子组合公司 抑制vegf-a受体相互作用的结合蛋白
KR101807319B1 (ko) 2008-11-22 2017-12-11 제넨테크, 인크. 유방암의 치료를 위한, 화학요법과 조합된 항-ｖｅｇｆ 항체의 용도
SG172355A1 (en) 2008-12-23 2011-07-28 Genentech Inc Methods and compositions for diagnostic use in cancer patients
EP2414391B1 (en) 2009-04-02 2018-11-28 Roche Glycart AG Multispecific antibodies comprising full length antibodies and single chain fab fragments
US20120093811A1 (en) * 2009-04-03 2012-04-19 Simmonds Jason W Anti-vegf-d antibodies
WO2010115589A1 (en) 2009-04-07 2010-10-14 Roche Glycart Ag Trivalent, bispecific antibodies
CA2761310C (en) 2009-05-07 2017-02-28 Charles S. Craik Antibodies and methods of use thereof
PE20120902A1 (es) 2009-05-08 2012-08-08 Genentech Inc Anticuerpos anti-egfl7 humanizados
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
EP2443150B1 (en) 2009-06-17 2015-01-21 AbbVie Biotherapeutics Inc. Anti-vegf antibodies and their uses
KR20120106935A (ko) 2009-07-13 2012-09-27 제넨테크, 인크. 암의 치료를 위한 진단 방법 및 조성물
TW201106972A (en) 2009-07-27 2011-03-01 Genentech Inc Combination treatments
US20110027275A1 (en) 2009-07-31 2011-02-03 Napoleone Ferrara Inhibition of tumor metastasis
JP6088246B2 (ja) 2009-08-15 2017-03-01 ジェネンテック， インコーポレイテッド 以前に治療された乳癌の治療のための抗血管新生療法
WO2011032013A1 (en) 2009-09-11 2011-03-17 Genentech, Inc. Method to identify a patient with an increased likelihood of responding to an anti-cancer agent
RU2573915C2 (ru) 2009-09-16 2016-01-27 Дженентек, Инк. Содержащие суперспираль и/или привязку белковые комплексы и их применение
ES2530732T3 (es) 2009-09-17 2015-03-05 Hoffmann La Roche Procedimientos de diagnóstico para el cáncer de pulmón
WO2011056497A1 (en) 2009-10-26 2011-05-12 Genentech, Inc. Activin receptor type iib compositions and methods of use
WO2011056502A1 (en) 2009-10-26 2011-05-12 Genentech, Inc. Bone morphogenetic protein receptor type ii compositions and methods of use
CN102051396B (zh) * 2009-11-04 2014-07-16 无锡天演生物技术有限公司 雁阵式定域随机突变方法及其在单抗分子进化技术中的应用
EP2509626B1 (en) 2009-12-11 2016-02-10 F.Hoffmann-La Roche Ag Anti-vegf-c antibodies and methods using same
RU2017102553A (ru) 2009-12-21 2018-12-19 Дженентек, Инк. Состав, содержащий антитело
ES2585350T3 (es) 2009-12-23 2016-10-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Anticuerpos anti Bv8 y usos de los mismos
FR2955773B1 (fr) 2010-02-01 2017-05-26 Commissariat A L'energie Atomique Complexe moleculaire de ciblage des antigenes vers les cellules presentatrices d'antigene et ses applications pour la vaccination
EP2539367A2 (en) 2010-02-23 2013-01-02 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-angiogenesis therapy for the treatment of ovarian cancer
AR080793A1 (es) 2010-03-26 2012-05-09 Roche Glycart Ag Anticuerpos biespecificos
AR080794A1 (es) 2010-03-26 2012-05-09 Hoffmann La Roche Anticuerpos bivalentes biespecificos anti- vegf/ anti-ang-2
AR081361A1 (es) 2010-04-30 2012-08-29 Molecular Partners Ag Proteinas de union modificadas que inhiben la interaccion de receptor del factor de crecimiento endotelial vascular de glicoproteina a vegf-a
WO2011153224A2 (en) 2010-06-02 2011-12-08 Genentech, Inc. Diagnostic methods and compositions for treatment of cancer
WO2011153243A2 (en) 2010-06-02 2011-12-08 Genentech, Inc. Anti-angiogenesis therapy for treating gastric cancer
CN102863533B (zh) * 2010-06-21 2013-12-11 中国科学技术大学 抗体人源化改造方法
MX2013000083A (es) 2010-07-09 2013-02-26 Genentech Inc Anticuerpos de anti-neuropilina y metodos de uso.
BR112013001431A2 (pt) 2010-07-19 2016-05-31 Hoffmann La Roche método de identificação de pacientes com maior probabilidade de reação a terapia anticâncer
KR20130126576A (ko) 2010-07-19 2013-11-20 에프. 호프만-라 로슈 아게 항암요법에 반응할 가능성이 증가된 환자를 확인하는 방법
AR082693A1 (es) 2010-08-17 2012-12-26 Roche Glycart Ag Terapia de combinacion de un anticuerpo anti-cd20 afucosilado con un anticuerpo anti-vegf
WO2012025530A1 (en) 2010-08-24 2012-03-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies comprising a disulfide stabilized - fv fragment
EA201390722A1 (ru) 2010-11-15 2013-11-29 Файв Прайм Терапьютикс, Инк. Лечение рака повышенными дозами растворимых белков слияния fgfr1
WO2012085111A1 (en) 2010-12-23 2012-06-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Polypeptide-polynucleotide-complex and its use in targeted effector moiety delivery
WO2012092539A2 (en) 2010-12-31 2012-07-05 Takeda Pharmaceutical Company Limited Antibodies to dll4 and uses thereof
CA2823044C (en) * 2010-12-31 2022-08-16 Jay M. Short Express humanization of antibodies
KR101638224B1 (ko) 2011-02-28 2016-07-08 에프. 호프만-라 로슈 아게 항원 결합 단백질
JP5768147B2 (ja) 2011-02-28 2015-08-26 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 一価抗原結合タンパク質
MX336740B (es) 2011-03-29 2016-01-29 Roche Glycart Ag Variantes de fragmento cristalizable (fc) de los anticuerpos.
RS56759B1 (sr) 2011-04-01 2018-04-30 Genentech Inc Kombinacija akt inhibitor jedinjenja i abiraterona za upotrebu pri terapeutskim tretiranjima
CN108341863A (zh) 2011-04-20 2018-07-31 阿塞勒隆制药公司 内皮糖蛋白多肽及其用途
WO2012151317A1 (en) 2011-05-03 2012-11-08 Genentech, Inc. Vascular disruption agents and uses thereof
WO2012172054A1 (en) 2011-06-16 2012-12-20 Scil Proteins Gmbh Modified multimeric ubiquitin proteins binding vegf-a
EP2732269B1 (en) 2011-07-12 2017-10-18 Epitomics, Inc. Facs-based method for obtaining an antibody sequence
WO2013025944A1 (en) 2011-08-17 2013-02-21 Genentech, Inc. Inhibition of angiogenesis in refractory tumors
WO2013082511A1 (en) 2011-12-02 2013-06-06 Genentech, Inc. Methods for overcoming tumor resistance to vegf antagonists
BR112014019579A2 (pt) 2012-02-10 2019-10-15 Genentech, Inc Anticorpo de cadeia única, polinucleotídeo, vetor, célula hospedeira, método de produção de um anticorpo de cadeia única, heteromultímero e método de produção do heteromultímero
PL2825558T3 (pl) 2012-03-13 2019-11-29 Hoffmann La Roche Terapia skojarzona w leczeniu raka jajnika
WO2013181452A1 (en) 2012-05-31 2013-12-05 Genentech, Inc. Methods of treating cancer using pd-l1 axis binding antagonists and vegf antagonists
BR112014032193A2 (pt) 2012-06-27 2017-06-27 Hoffmann La Roche métodos de produção de anticorpos biespecíficos e de determinação de combinação, anticorpo biespecífico, formulação e uso de anticorpo biespecífico
CA2871882A1 (en) 2012-06-27 2014-01-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for making antibody fc-region conjugates comprising at least one binding entity that specifically binds to a target and uses thereof
HRP20211641T1 (hr) 2012-07-13 2022-02-04 Roche Glycart Ag Bispecifična protutijela anti-vegf/anti-ang-2 i njihova primjena u liječenju vaskularnih očnih bolesti
KR20190088571A (ko) 2012-08-07 2019-07-26 제넨테크, 인크. 교모세포종의 치료를 위한 조합 요법
EP2916835A4 (en) 2012-11-12 2016-07-27 Redwood Bioscience Inc COMPOUNDS AND METHOD FOR PRODUCING A CONJUGATE
US9310374B2 (en) 2012-11-16 2016-04-12 Redwood Bioscience, Inc. Hydrazinyl-indole compounds and methods for producing a conjugate
KR20150085064A (ko) 2012-11-16 2015-07-22 더 리젠트스 오브 더 유니이버시티 오브 캘리포니아 단백질 화학적 변형을 위한 피크테 스펭글러 결합
FR2998579B1 (fr) 2012-11-27 2015-06-19 Commissariat Energie Atomique Methode pour obtenir des anticorps humains specifiques d'un antigene par immunisation in vitro
US20140154255A1 (en) 2012-11-30 2014-06-05 Abbvie Biotherapeutics Inc. Anti-vegf antibodies and their uses
US20140271462A1 (en) * 2013-03-13 2014-09-18 Imaginab, Inc. Antigen binding constructs to cd8
SG11201507475UA (en) 2013-03-13 2015-10-29 Genentech Inc Antibody formulations
WO2014190147A2 (en) 2013-05-23 2014-11-27 Five Prime Therapeutics, Inc. Methods of treating cancer
CN104341504B (zh) 2013-08-06 2017-10-24 百奥泰生物科技(广州)有限公司 双特异性抗体
US10617755B2 (en) 2013-08-30 2020-04-14 Genentech, Inc. Combination therapy for the treatment of glioblastoma
US10456470B2 (en) 2013-08-30 2019-10-29 Genentech, Inc. Diagnostic methods and compositions for treatment of glioblastoma
MX2016003593A (es) 2013-10-11 2016-06-02 Hoffmann La Roche Anticuerpos de cadena ligera variable comun intercambiada de dominio multiespecifico.
CA2928708A1 (en) 2013-10-25 2015-04-30 Acceleron Pharma, Inc. Endoglin peptides to treat fibrotic diseases
WO2015071348A1 (en) 2013-11-18 2015-05-21 Formycon Ag Pharmaceutical composition of an anti-vegf antibody
CA2927806C (en) 2013-11-27 2023-01-10 Redwood Bioscience, Inc. Hydrazinyl-pyrrolo compounds and methods for producing a conjugate
DK3081576T3 (da) 2013-12-12 2019-10-21 Shanghai hengrui pharmaceutical co ltd Pd-1-antistof, antigenbindende fragment deraf og medicinsk anvendelse deraf
EP3083680B1 (en) 2013-12-20 2020-01-15 F. Hoffmann-La Roche AG Humanized anti-tau(ps422) antibodies and methods of use
JOP20200094A1 (ar) 2014-01-24 2017-06-16 Dana Farber Cancer Inst Inc جزيئات جسم مضاد لـ pd-1 واستخداماتها
JOP20200096A1 (ar) 2014-01-31 2017-06-16 Children’S Medical Center Corp جزيئات جسم مضاد لـ tim-3 واستخداماتها
KR102442436B1 (ko) 2014-03-14 2022-09-15 노파르티스 아게 Lag-3에 대한 항체 분자 및 그의 용도
BR112016021383A2 (pt) 2014-03-24 2017-10-03 Genentech Inc Método para identificar um paciente com câncer que é susceptível ou menos susceptível a responder ao tratamento com um antagonista de cmet, método para identificar um paciente apresentando câncer previamente tratado, método para determinar a expressão do biomarcador hgf, antagonista anti-c-met e seu uso, kit de diagnóstico e seu método de preparo
JP6588461B2 (ja) 2014-03-31 2019-10-09 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗血管新生剤及びｏｘ４０結合アゴニストを含む併用療法
CN106456757A (zh) 2014-05-12 2017-02-22 福尔密孔股份公司 含有vegf拮抗剂的预填充塑料注射器
EP3151830A4 (en) 2014-06-06 2018-02-07 Redwood Bioscience, Inc. Anti-her2 antibody-maytansine conjugates and methods of use thereof
US9840553B2 (en) 2014-06-28 2017-12-12 Kodiak Sciences Inc. Dual PDGF/VEGF antagonists
EP3169801A1 (en) 2014-07-14 2017-05-24 F. Hoffmann-La Roche AG Diagnostic methods and compositions for treatment of glioblastoma
JP6800141B2 (ja) 2014-08-12 2020-12-16 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー Ｉｌ−２およびインテグリン結合性ｆｃ融合タンパク質による相乗的な腫瘍処置
WO2016025647A1 (en) 2014-08-12 2016-02-18 Massachusetts Institute Of Technology Synergistic tumor treatment with il-2, a therapeutic antibody, and a cancer vaccine
US11344620B2 (en) 2014-09-13 2022-05-31 Novartis Ag Combination therapies
ES2949173T3 (es) 2014-09-15 2023-09-26 Hoffmann La Roche Formulaciones de anticuerpo
WO2016054555A2 (en) 2014-10-03 2016-04-07 Novartis Ag Combination therapies
MA41044A (fr) 2014-10-08 2017-08-15 Novartis Ag Compositions et procédés d'utilisation pour une réponse immunitaire accrue et traitement contre le cancer
AU2015333687B2 (en) 2014-10-14 2021-03-18 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Antibody molecules to PD-L1 and uses thereof
CA2959821A1 (en) 2014-10-24 2016-04-28 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Compositions and methods for inducing phagocytosis of mhc class i positive cells and countering anti-cd47/sirpa resistance
CN107172879B (zh) 2014-11-10 2021-11-05 豪夫迈·罗氏有限公司 抗白细胞介素-33抗体及其用途
WO2016087416A1 (en) 2014-12-03 2016-06-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Multispecific antibodies
EP3233918A1 (en) 2014-12-19 2017-10-25 Novartis AG Combination therapies
JP2018508183A (ja) 2014-12-23 2018-03-29 ジェネンテック， インコーポレイテッド 化学療法耐性癌を治療及び診断する組成物及び方法
EP3303397A1 (en) 2015-06-08 2018-04-11 H. Hoffnabb-La Roche Ag Methods of treating cancer using anti-ox40 antibodies and pd-1 axis binding antagonists
US9862763B2 (en) * 2015-06-24 2018-01-09 Hoffmann-La Roche Inc. Humanized anti-tau(pS422) antibodies and methods of use
PT3317301T (pt) 2015-07-29 2021-07-09 Novartis Ag Terapias de associação compreendendo moléculas de anticorpo contra lag-3
WO2017019897A1 (en) 2015-07-29 2017-02-02 Novartis Ag Combination therapies comprising antibody molecules to tim-3
KR20180050321A (ko) 2015-08-07 2018-05-14 이미지냅 인코포레이티드 분자를 표적화하기 위한 항원 결합 구조체
IL295097A (en) 2015-10-30 2022-09-01 Genentech Inc Anti-htra1 antibodies and methods of using them
CN108697791B (zh) 2015-11-03 2022-08-23 詹森生物科技公司 特异性结合pd-1的抗体及其用途
WO2017079419A1 (en) 2015-11-05 2017-05-11 The Regents Of The University Of California Cells labelled with lipid conjugates and methods of use thereof
KR102354198B1 (ko) 2015-11-18 2022-01-20 에스아이오2 메디컬 프로덕츠, 인크. Vegf-길항제의 액체 제제를 포함하는 사전-충전된 제약 패키지
AU2016356717B2 (en) 2015-11-18 2022-09-29 Sio2 Medical Products, Inc. Pharmaceutical package for ophthalmic formulations
AU2016356047B2 (en) 2015-11-18 2021-10-21 Formycon Ag Pre-filled plastic syringe containing a VEGF antagonist
CN108495651A (zh) 2015-12-17 2018-09-04 诺华股份有限公司 抗pd-1的抗体分子及其用途
BR112018013407A2 (pt) 2015-12-30 2018-12-18 Kodiak Sciences Inc anticorpos e conjugados dos mesmos
WO2017129685A1 (en) 2016-01-26 2017-08-03 Formycon Ag Liquid formulation of a vegf antagonist
CN105481981B (zh) * 2016-01-27 2019-03-19 中国人民解放军第二军医大学 靶向vegf双特异性抗体及其用途
ES2850428T3 (es) 2016-04-15 2021-08-30 Hoffmann La Roche Procedimientos de monitorización y tratamiento del cáncer
WO2017181079A2 (en) 2016-04-15 2017-10-19 Genentech, Inc. Methods for monitoring and treating cancer
CN109690315A (zh) 2016-07-08 2019-04-26 豪夫迈·罗氏有限公司 人附睾蛋白4(he4)用于评估muc16阳性癌症治疗的响应性的用途
EP3481963A1 (en) 2016-07-08 2019-05-15 Genentech, Inc. Methods for diagnosing and treating cancer by means of the expression status and mutational status of nrf2 and downstream target genes of said gene.
MX2019001635A (es) 2016-08-12 2019-06-10 Genentech Inc Terapia de combinacion con un inhibidor de mek, un inhibidor del eje de pd-1, y un inhibidor de vegf.
KR102538827B1 (ko) * 2016-08-23 2023-05-31 메디뮨 리미티드 항-ｖｅｇｆ-ａ 항체 및 이의 용도
US10350266B2 (en) 2017-01-10 2019-07-16 Nodus Therapeutics, Inc. Method of treating cancer with a multiple integrin binding Fc fusion protein
JP2020505438A (ja) 2017-01-10 2020-02-20 ノダス・セラピューティクスＮｏｄｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合タンパク質および免疫調節物質を用いる併用がん治療法
MX2019010295A (es) 2017-03-01 2019-11-21 Genentech Inc Métodos de diagnóstico y terapéuticos para el cáncer.
EP3630062A2 (en) 2017-05-24 2020-04-08 SiO2 Medical Products, Inc. Sterilizable pharmaceutical package for ophthalmic formulations
US20200237997A1 (en) 2017-05-24 2020-07-30 Formycon Ag Sterilizable pre-filled pharmaceutical packages comprising a liquid formulation of a vegf-antagonist
WO2018215580A1 (en) 2017-05-24 2018-11-29 Formycon Ag Method for sterilizing prefilled plastic syringes containing a vegf antagonist
EP3642240A1 (en) 2017-06-22 2020-04-29 Novartis AG Antibody molecules to cd73 and uses thereof
WO2018237157A1 (en) 2017-06-22 2018-12-27 Novartis Ag CD73 BINDING ANTIBODY MOLECULES AND USES THEREOF
WO2019020777A1 (en) 2017-07-26 2019-01-31 Formycon Ag LIQUID FORMULATION OF A VEGF ANTAGONIST
JP7436365B2 (ja) 2017-12-29 2024-02-21 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 抗ｖｅｇｆ抗体及び使用の方法
CA3093468A1 (en) 2018-03-09 2019-09-12 Agenus Inc. Anti-cd73 antibodies and methods of use thereof
AU2019254237A1 (en) 2018-04-16 2020-12-03 Onquality Pharmaceuticals China Ltd. Method for preventing or treating side effects of cancer therapy
EP3802609A2 (en) 2018-05-24 2021-04-14 Janssen Biotech, Inc. Psma binding agents and uses thereof
UY38247A (es) 2018-05-30 2019-12-31 Novartis Ag Anticuerpos frente a entpd2, terapias de combinación y métodos de uso de los anticuerpos y las terapias de combinación
US20210214459A1 (en) 2018-05-31 2021-07-15 Novartis Ag Antibody molecules to cd73 and uses thereof
MX2021004348A (es) 2018-10-18 2021-05-28 Genentech Inc Procedimientos de diagnóstico y terapéuticos para el cáncer de riñón sarcomatoide.
WO2020109343A1 (en) 2018-11-29 2020-06-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy for treatment of macular degeneration
US20220185875A1 (en) 2019-03-18 2022-06-16 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. Bispecific antibody specifically bound to vegf and ang2
AR118720A1 (es) 2019-04-19 2021-10-27 Janssen Biotech Inc Métodos para tratar el cáncer de próstata con un anticuerpo anti-psma / cd3
CN114269376A (zh) 2019-05-03 2022-04-01 豪夫迈·罗氏有限公司 用抗pd-l1抗体治疗癌症的方法
AR122263A1 (es) * 2019-05-09 2022-08-31 Genentech Inc Métodos para producir anticuerpos
DE112019005626T5 (de) 2019-08-09 2021-08-05 Anhui Biox Vision Biological Technology Co., Ltd. Anti-VEGF-Anti-PD1 bispezifischer Antikörper mit einer neuen Struktur
JP2022548881A (ja) 2019-09-18 2022-11-22 ノバルティス アーゲー Ｅｎｔｐｄ２抗体、組合せ療法並びに抗体及び組合せ療法を使用する方法
EP4041312A4 (en) 2019-10-10 2023-12-20 Kodiak Sciences Inc. METHOD FOR TREATING AN EYE DISORDER
CN115605507A (zh) 2020-03-13 2023-01-13 基因泰克公司（Us） 抗白介素-33抗体及其用途
CN113461824A (zh) 2020-03-31 2021-10-01 普米斯生物技术(珠海)有限公司 一种构建多特异性抗体的平台
CN115698717A (zh) 2020-04-03 2023-02-03 基因泰克公司 癌症的治疗和诊断方法
FR3110838B1 (fr) 2020-05-28 2022-06-24 Commissariat Energie Atomique Complexe immunomodulateur et ses applications pour la thérapie
CN116133679A (zh) 2020-06-30 2023-05-16 门德斯有限公司 白血病衍生细胞在卵巢癌疫苗中的用途
CN114106190A (zh) 2020-08-31 2022-03-01 普米斯生物技术(珠海)有限公司 一种抗vegf/pd-l1双特异性抗体及其用途
AU2021377810A1 (en) 2020-11-13 2023-05-11 Genentech, Inc. Methods and compositions comprising a krasg12c inhibitor and a vegf inhibitor for treating solid tumors
WO2022157715A1 (en) 2021-01-22 2022-07-28 Dcprime B.V. Methods of tumor vaccination
US20240059789A1 (en) 2021-01-28 2024-02-22 Janssen Biotech, Inc. Psma binding proteins and uses thereof
EP4304633A1 (en) 2021-03-12 2024-01-17 Mendus B.V. Methods of vaccination and use of cd47 blockade
JP2024516230A (ja) 2021-04-30 2024-04-12 ジェネンテック， インコーポレイテッド がんのための治療及び診断方法並びに組成物
AU2022302170A1 (en) 2021-07-02 2023-12-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods and compositions for treating cancer
CA3224180A1 (en) 2021-07-28 2023-02-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods and compositions for treating cancer
WO2023080900A1 (en) 2021-11-05 2023-05-11 Genentech, Inc. Methods and compositions for classifying and treating kidney cancer
WO2024062076A1 (en) 2022-09-21 2024-03-28 Domain Therapeutics Anti-ccr8 monoclonal antibodies and their therapeutic use
WO2024062072A2 (en) 2022-09-21 2024-03-28 Domain Therapeutics Anti-ccr8 monoclonal antibodies and their therapeutic use
WO2024062082A1 (en) 2022-09-21 2024-03-28 Domain Therapeutics Anti-ccr8 monoclonal antibodies and their therapeutic use

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994010202A1 (en) * 1992-10-28 1994-05-11 Genentech, Inc. Vascular endothelial cell growth factor antagonists
EP0741748A1 (en) * 1994-02-10 1996-11-13 Imclone Systems, Inc. Monoclonal antibodies specific to vegf receptors and uses thereof
CN1145636A (zh) * 1994-03-08 1997-03-19 人体基因组科学有限公司 血管内皮生长因子2

Family Cites Families (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
USRE30985E (en) 1978-01-01 1982-06-29 Serum-free cell culture media
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4318980A (en) 1978-04-10 1982-03-09 Miles Laboratories, Inc. Heterogenous specific binding assay employing a cycling reactant as label
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
WO1981001145A1 (en) 1979-10-18 1981-04-30 Univ Illinois Hydrolytic enzyme-activatible pro-drugs
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4675187A (en) 1983-05-16 1987-06-23 Bristol-Myers Company BBM-1675, a new antibiotic complex
DD266710A3 (de) 1983-06-06 1989-04-12 Ve Forschungszentrum Biotechnologie Verfahren zur biotechnischen Herstellung van alkalischer Phosphatase
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
US4879231A (en) 1984-10-30 1989-11-07 Phillips Petroleum Company Transformation of yeasts of the genus pichia
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
DE3675588D1 (de) 1985-06-19 1990-12-20 Ajinomoto Kk Haemoglobin, das an ein poly(alkenylenoxid) gebunden ist.
GB8516415D0 (en) 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
GB8610600D0 (en) 1986-04-30 1986-06-04 Novo Industri As Transformation of trichoderma
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
US5567610A (en) 1986-09-04 1996-10-22 Bioinvent International Ab Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor
GB8705477D0 (en) 1987-03-09 1987-04-15 Carlton Med Prod Drug delivery systems
US4975278A (en) 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
US5204244A (en) 1987-10-27 1993-04-20 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
WO1989006692A1 (en) 1988-01-12 1989-07-27 Genentech, Inc. Method of treating tumor cells by inhibiting growth factor receptor function
EP0435911B1 (en) 1988-09-23 1996-03-13 Cetus Oncology Corporation Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity and product expression
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
WO1990004788A1 (en) * 1988-10-28 1990-05-03 Genentech, Inc. Method for identifying active domains and amino acid residues in polypeptides and hormone variants
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5147638A (en) 1988-12-30 1992-09-15 Oklahoma Medical Research Foundation Inhibition of tumor growth by blockade of the protein C system
US5332671A (en) 1989-05-12 1994-07-26 Genetech, Inc. Production of vascular endothelial cell growth factor and DNA encoding same
EP0402226A1 (en) 1989-06-06 1990-12-12 Institut National De La Recherche Agronomique Transformation vectors for yeast yarrowia
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
GB8928874D0 (en) * 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5229275A (en) 1990-04-26 1993-07-20 Akzo N.V. In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
DK1471142T3 (da) * 1991-04-10 2009-03-09 Scripps Research Inst Heterodimere receptor-biblioteker under anvendelse af fagemider
DE122004000008I1 (de) * 1991-06-14 2005-06-09 Genentech Inc Humanisierter Heregulin Antikörper.
WO1994004679A1 (en) * 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
EP0617706B1 (en) 1991-11-25 2001-10-17 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
DE69333082T2 (de) 1992-02-11 2004-05-06 Cell Genesys, Inc., Foster City Erzielen von homozygotem durch zielgerichtete genetische ereignisse
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
PT752248E (pt) 1992-11-13 2001-01-31 Idec Pharma Corp Aplicacao terapeutica de anticorpos quimericos e marcados radioactivamente contra antigenios de diferenciacao restrita de linfocitos b humanos para o tratamento do linfoma de celulas b
US5534615A (en) 1994-04-25 1996-07-09 Genentech, Inc. Cardiac hypertrophy factor and uses therefor
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
ES2361267T3 (es) * 1997-04-07 2011-06-15 Genentech Inc. Procedimiento para la produccion de anticuerpos humanizados mediante mutagénesis aleatoria.

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994010202A1 (en) * 1992-10-28 1994-05-11 Genentech, Inc. Vascular endothelial cell growth factor antagonists
EP0741748A1 (en) * 1994-02-10 1996-11-13 Imclone Systems, Inc. Monoclonal antibodies specific to vegf receptors and uses thereof
CN1145636A (zh) * 1994-03-08 1997-03-19 人体基因组科学有限公司 血管内皮生长因子2

Also Published As

Publication number Publication date
CN101210051B (zh) 2012-12-26
CN101838328A (zh) 2010-09-22
ES2380575T3 (es) 2012-05-16
EP0971959A1 (en) 2000-01-19
EP3260468A1 (en) 2017-12-27
HK1114622A1 (en) 2008-11-07
DK1695985T3 (da) 2011-06-14
DE69832970D1 (de) 2006-02-02
ES2361267T3 (es) 2011-06-15
BR9809388A (pt) 2000-06-13
CN1191276C (zh) 2005-03-02
DE69842174D1 (de) 2011-04-21
ZA982907B (en) 1998-10-09
EP1695985B1 (en) 2011-03-09
NO325823B1 (no) 2008-07-21
IL132239A0 (en) 2001-03-19
DE69841815D1 (de) 2010-09-16
SI0971959T1 (sl) 2006-06-30
LTPA2007004I1 (lt) 2019-12-27
DK2301580T3 (da) 2012-05-14
IL175906A (en) 2010-05-31
HK1025338A1 (en) 2000-11-10
EP2338915A3 (en) 2011-10-12
KR100856995B1 (ko) 2008-09-04
SI1695985T1 (sl) 2011-06-30
EP0971959B1 (en) 2005-12-28
BR9809388B1 (pt) 2013-06-04
NZ500077A (en) 2001-10-26
PT1787999E (pt) 2010-11-11
KR20010006116A (ko) 2001-01-26
CY1111345T1 (el) 2015-08-05
ATE314395T1 (de) 2006-01-15
CA2286397C (en) 2011-02-15
PT1695985E (pt) 2011-06-06
NO2017039I2 (no) 2018-08-28
ES2349559T3 (es) 2011-01-05
CN101210051A (zh) 2008-07-02
DE69832970T2 (de) 2006-08-10
EP2301580A1 (en) 2011-03-30
JP4191258B2 (ja) 2008-12-03
ES2256935T3 (es) 2006-07-16
SI0973804T1 (sl) 2007-06-30
KR20010006115A (ko) 2001-01-26
WO1998045332A2 (en) 1998-10-15
HK1139425A1 (en) 2010-09-17
JP2001502922A (ja) 2001-03-06
NO994870L (no) 1999-12-06
IL175906A0 (en) 2006-10-05
AU7102398A (en) 1998-10-30
ZA982908B (en) 1999-01-21
EP2301580B1 (en) 2012-01-18
CN1259961A (zh) 2000-07-12
CY1112757T1 (el) 2016-02-10
IL132240A (en) 2006-09-05
ATE501170T1 (de) 2011-03-15
EP2338915A2 (en) 2011-06-29
WO1998045332A3 (en) 1998-12-03
ATE476664T1 (de) 2010-08-15
SI2301580T1 (sl) 2012-05-31
EP1695985A3 (en) 2006-11-22
KR100794454B1 (ko) 2008-01-16
DK1787999T3 (da) 2010-11-15
NO994870D0 (no) 1999-10-06
HK1114621A1 (en) 2008-11-07
BRPI9809388B8 (pt) 2021-05-25
EP1695985A2 (en) 2006-08-30
SI1787999T1 (sl) 2010-12-31
PT973804E (pt) 2007-03-30
PT971959E (pt) 2006-05-31
HK1204329A1 (zh) 2015-11-13
PT2301580E (pt) 2012-05-02
NO2019045I1 (no) 2019-12-11
DK0971959T3 (da) 2006-05-15
CN101210050A (zh) 2008-07-02
NO2017039I1 (no) 2017-08-01
EP2336190A2 (en) 2011-06-22
CN104231078A (zh) 2014-12-24
CA2286397A1 (en) 1998-10-15
EP2301580A9 (en) 2011-09-14
CN101210050B (zh) 2010-12-08
AU740738B2 (en) 2001-11-15
LTC0973804I2 (lt) 2020-04-27
CN101665536A (zh) 2010-03-10
TR199902818T2 (xx) 2000-05-22
ATE541586T1 (de) 2012-02-15
CY1111520T1 (el) 2015-08-05
EP2336190A3 (en) 2011-10-05
HK1149501A1 (en) 2011-10-07
HK1095334A1 (en) 2007-05-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101665536B (zh) 抗-血管内皮生长因子的抗体
CN100480269C (zh) 抗-血管内皮生长因子的抗体
US7365166B2 (en) Anti-VEGF antibodies
US20030190317A1 (en) Anti-VEGF antibodies
US20170369564A1 (en) Anti-vegf antibodies

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1139425

Country of ref document: HK

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CX01 Expiry of patent term
CX01 Expiry of patent term

Granted publication date: 20130703