JP2020505438A - インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合タンパク質および免疫調節物質を用いる併用がん治療法 - Google Patents

インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合タンパク質および免疫調節物質を用いる併用がん治療法 Download PDF

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Abstract

本発明は、インテグリン結合Ｆｃ融合タンパク質を単独に使用すること、もしくはＩＬ−２および／または免疫刺激剤（つまり、免疫チェックポイント刺激物質）、および／または免疫チェックポイント阻害物質と併用することにより、がんを治療する方法を提供する。本発明はさらに、当該方法に用いられる組成物を提供する。

Description

関連出願の交差引用
本願は、本願に援用されている、米国仮出願第６２／４４４，６６０号（出願日：２０１７年１月１０日）、米国仮出願第６２／４６６，２９８号（出願日：２０１７年３月２日）、米国仮出願第６２／５００，２０３号（出願日：２０１７年５月２日）、米国仮出願第６２／５２３，１９１号（出願日：２０１７年６月２１日）、米国仮出願第６２／５２３，２００号（出願日：２０１７年６月２１日）、米国仮出願第６２／５７３，０７９号（出願日：２０１７年１０月１６日）、米国仮出願第６２／５８０，７８３号（出願日：２０１７年１１月２日）に対して優先権を主張する。
インターロイキン−２（ＩＬ−２）は、Ｔ細胞およびＮＫ細胞の増殖を活性化および誘導する多面性サイトカインである。ＩＬ−２はＦＤＡ承認の両方ではあるが、ＩＬ−２を用いる全身療法は著しい毒性を有し、患者の奏効率も２５％未満に過ぎない。ＩＬ−２および／または半減期を延長したＩＬ−２、並びに、腫瘍特異的抗原に対する抗体を組み合わせて、獲得免疫系と自然免疫系の両方を発動させる療法からは、かなり有望な治療効果が期待できる。しかしながら、抗体を応用する療法は、ほとんどの腫瘍には既知の腫瘍関連抗原を持たないという弱点を抱えている。
インテグリンは、充実性腫瘍の発生、進行、転移に重要な役割を担う各種の細胞機能を調節する細胞買いマトリックス接着受容体のファミリーである。腫瘍の進行においてあまりも重要であるため、インテグリンはがん療法の有効な目標として見なされ、様々な種類のがんの治療が可能となった。がん細胞に存在するインテグリンとしては、ανβ３、ανβ５、α５β１が挙げられる。現在、抗体、線状ペプチド、環状ペプチド、ペプチド模倣薬など、がんに関連する各インテグリンを標的とする治療法が開発されている。しかしながら、小型の構造化ペプチド足場を利用する療法や、３種以上のインテグリンを同時に標的にする療法はない。また、現在のインテグリン標的薬は単剤療法として投与されている。様々ながんをより効率的に治療するためには、新規の単剤療法は勿論、併用療法も必要である。
本発明は、上記のニーズに応え、がん治療に用いられる新規の単剤療法、並びに併用療法を提供する。
本発明は、本明細書に記載のインテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体の投与が、がんの治療に有用であるという知見に基づいたものである。
本発明は、対象のがんを治療する方法であって、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体の有効量を前記対象に投与するステップを含み、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体は、治療有効量が投与され、配列番号１３０（ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＳＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧ）と配列番号１３１（ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＫＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧ）からなる群から選択される配列を含み、インテグリン結合性ポリペプチドはＦｃドメインと共役させている、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒトＦｃドメインである。
いくつかの実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチドはＦｃドメインと直接共役されている。
いくつかの実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチドは、リンカーポリペプチドを介してＦｃドメインと共役されている。
いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドは、ＧＧＧＧＳ（配列番号１３６）とＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１３７）からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、当該方法は、免疫チェックポイント阻害物質を投与するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、当該方法は、免疫チェックポイント刺激物質を投与するステップをさらに含む。
いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害物質はＰＤ−１阻害物質である。
いくつかの実施形態では、ＰＤ−１阻害物質は抗ＰＤ−１抗体である。
いくつかの実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体は、リンカーの存在下、または非存在下でインテグリン結合性ポリペプチド配列を含み、配列は、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＳＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧ（配列番号１３０）、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＫＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧ（配列番号１３１）、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＳＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧＧＧＧＧＳ（配列番号１３２）、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＫＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧＧＧＧＧＳ（配列番号１３３）、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＳＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１３４）、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＫＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１３５）からなる群から選ばれ、インテグリン結合性ポリペプチド配列はＦｃドメインに直接連結され、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、当該方法は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）を投与するステップをさらに含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２はプロロイキンである。
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２は、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体の投与より先、もしくはその後、もしくは同時に投与される。
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２は、前記インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体の投与より後に投与される。
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２の一日投与量は、１２ＭＩＵ／ｍ２である。
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２は皮下投与により投与される。
いくつかの実施形態では、当該方法は、ＩＬ−２、もしくは、免疫チェックポイント阻害物質のいずれかを投与するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、当該方法は、ＩＬ−２、もしくは、免疫チェックポイント刺激物質のいずれかを投与するステップをさらに含む。
いくつかの実施形態では、当該方法は、ＩＬ−２、および、免疫チェックポイント阻害物質を投与するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、当該方法は、ＩＬ−２、および、免疫チェックポイント刺激物質を投与するステップをさらに含む。
いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害物質は、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント刺激物質は、抗４−１ＢＢ／ＣＤ１３７抗体、抗ＩＦＮα抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、ＯＸ４０抗体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害物質は抗ＰＤ−１抗体である。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害物質は抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害物質は抗ＣＴＬＡ−４抗体である。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント刺激物質は抗４−１ＢＢ／ＣＤ１３７抗体である。
いくつかの実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体は、少なくとも２つのインテグリンと結合（ｂｉｎｄ）する。
いくつかの実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体は、少なくとも３つのインテグリンと結合（ｂｉｎｄ）する。
いくつかの実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体は、αｖβ１、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６、α５β１からなる群から選択される少なくとも２つのインテグリンと結合（ｂｉｎｄ）する。
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２、もしくは、免疫チェックポイント阻害物質の追加投与は、未投与の場合より、ＣＤ８＋Ｔ細胞の腫瘍浸潤を引き起こす。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２、もしくは、免疫チェックポイント刺激物質の追加投与は、未投与の場合より、ＣＤ８＋Ｔ細胞の腫瘍浸潤を引き起こす。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２、もしくは、抗ＰＤ−１抗体の追加投与は、未投与の場合より、ＣＤ８＋Ｔ細胞の腫瘍浸潤を引き起こす。
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２、もしくは、免疫チェックポイント阻害物質の追加投与は、未投与の場合より、骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）の減少を引き起こす。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２、もしくは、免疫チェックポイント刺激物質の追加投与は、未投与の場合より、骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）の減少を引き起こす。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２、もしくは、抗ＰＤ−１抗体の追加投与は、未投与の場合より、骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）の減少を引き起こす。
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２、および、免疫チェックポイント阻害物質の両方の追加投与は、ＩＬ−２、および／または免疫チェックポイント阻害物質の個別投与に比べて、ＣＤ８＋Ｔ細胞の腫瘍浸潤をより増加させる。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２、および、免疫チェックポイント刺激物質の両方の追加投与は、ＩＬ−２、および／または免疫チェックポイント阻害物質の個別投与に比べて、ＣＤ８＋Ｔ細胞の腫瘍浸潤をより増加させる。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２、および、抗ＰＤ−１抗体の両方の追加投与は、ＩＬ−２、および／または抗ＰＤ−１抗体の個別投与に比べて、ＣＤ８＋Ｔ細胞の腫瘍浸潤をより増加させる。
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２、および、免疫チェックポイント阻害物質の両方の追加投与は、ＩＬ−２、および／または免疫チェックポイント阻害物質の個別投与に比べて、骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）をより減少させる。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２、および、免疫チェックポイント刺激物質の両方の追加投与は、ＩＬ−２、および／または免疫チェックポイント刺激物質の個別投与に比べて、骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）をより減少させる。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２、および、抗ＰＤ−１抗体の両方の追加投与は、ＩＬ−２、および／または抗ＰＤ−１抗体の個別投与に比べて、骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）をより減少させる。
本発明は、リンカーの存在下、または非存在下でインテグリン結合性ポリペプチド配列を含むポリペプチドであって、配列は、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＳＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧ（配列番号１３０）、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＫＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧ（配列番号１３１）、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＳＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧＧＧＧＧＳ（配列番号１３２）、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＫＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧＧＧＧＧＳ（配列番号１３３）、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＳＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１３４）、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＫＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１３５）からなる群から選ばれ、インテグリン結合性ポリペプチド配列はＦｃドメインに直接連結され、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４からなる群から選択されるポリペプチドを、さらに提供する。
本発明はまた、リンカーの存在下、または非存在下でインテグリン結合性ポリペプチド配列を含む組成物であって、配列は、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＳＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧ（配列番号１３０）、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＫＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧ（配列番号１３１）、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＳＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧＧＧＧＧＳ（配列番号１３２）、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＫＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧＧＧＧＧＳ（配列番号１３３）、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＳＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１３４）、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＫＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１３５）からなる群から選ばれ、インテグリン結合性ポリペプチド配列はＦｃドメインに直接連結され、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４からなる群から選択される組成物を、さらに提供する。
本発明はまた、リンカーの存在下、または非存在下でインテグリン結合性ポリペプチド配列を含む医薬組成物であって、配列は、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＳＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧ（配列番号１３０）、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＫＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧ（配列番号１３１）、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＳＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧＧＧＧＧＳ（配列番号１３２）、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＫＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧＧＧＧＧＳ（配列番号１３３）、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＳＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１３４）、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＫＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１３５）からなる群から選ばれ、インテグリン結合性ポリペプチド配列はＦｃドメインに直接連結され、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４からなる群から選択される医薬組成物を、さらに提供する。
本発明はまた、前述のインテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体をコード化する核酸を、さらに提供する。
本発明はまた、前述のインテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体をコード化する核酸を含む発現ベクターを、さらに提供する。
本発明はまた、請求項３１に記載の発現ベクターを含む宿主細胞を、さらに提供する。
本発明はさらに、前述のインテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体の作製方法であって、
ａ）インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体が発現する条件下で、請求項３２に記載の宿主細胞を培養するステップと、
ｂ）前記インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体を回収するステップと、を含む、方法を、提供する。
本発明は、対象のがんを治療するために免疫系を活性化する方法であって、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体の有効量を前記対象に投与するステップを含み、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体は、治療有効量が投与され、配列番号１３０（ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＳＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧ）と配列番号１３１（ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＫＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧ）からなる群から選択される配列を含み、インテグリン結合性ポリペプチドはＦｃドメインと共役させている方法を提供する。
いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒトＦｃドメインである。
いくつかの実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチドはＦｃドメインと直接共役されている。
いくつかの実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチドは、リンカーポリペプチドを介してＦｃドメインと共役されている。
いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドは、ＧＧＧＧＳ（配列番号１３６）とＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１３７）からなる群から選択される。
以下の説明および添付図面を参照として、本発明の特徴、態様、効果をより詳しく理解することができる。
ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４配列の例示。
Ｆｃドメインに改変シスチンノット（ノッチン）ペプチドを融合して作製された「疑似ｍＡｂ」のＮＯＤ２０１。当該構築体は、αｖβ１、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６、α５β１インテグリンに対する自然のエフェクター機能（ＡＤＣＣおよびＣＤＣ）を標的とする。
ＮＯＤ２０１Ｍは、単剤療法としての効能は弱い。左：腫瘍体積曲線。右：Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線。接種した腫瘍が平均サイズ６０〜１８０ｍｍ３に達した後、１日、７日、１３日、１９日目（すなわち、週に１回）に２５０μｇ、５００μｇ、または１０００μｇの用量でＮＯＤ２０１Ｍを静脈内投与した。ビヒクル：リン酸緩衝生理食塩水。ＭＣ３８結腸腫瘍モデル。
ＮＯＤ２０１Ｍは、低用量のＩＬ−２（４μｇ、プロロイキン）の効能を高める。左：腫瘍体積曲線。右：Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線。接種腫瘍が平均サイズ６０〜１８０ｍｍ３に達した後、１日、７日、１３日、１９日目に５００μｇ、または１０００μｇの用量でＮＯＤ２０１Ｍを静脈内投与した。ＩＬ−２（４μｇ、プロロイキン）を、２〜４日目、８〜１０日目、１４〜１６日目、２０〜２２日目（＋１日目、＋２日目、＋３日目）に皮下投与した。ビヒクル：リン酸緩衝生理食塩水。ＭＣ３８結腸腫瘍モデル。
ＮＯＤ２０１Ｍは、抗ＰＤ−１の効能を高める。左：腫瘍体積曲線。右：Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線。接種した腫瘍が平均サイズ６０〜１８０ｍｍ３に達した後、１日、７日、１３日、１９日目に２５０μｇ、５００μｇ、または１０００μｇの用量でＮＯＤ２０１Ｍを静脈内投与した。抗ＰＤ−１（２００μｇ、クローンＲＭＰ１−１４）を、１日目、７日目、１３日目、１９日目に静脈内投与した。ビヒクル：リン酸緩衝生理食塩水。ＭＣ３８結腸腫瘍モデル。
ＮＯＤ２０１Ｍ併用療法後に測定した腫瘍細胞浸潤。左：ＮＯＤ２０１Ｍ併用療法において、抗ＰＤ、低用量ＩＬ−２、またはその両方との併用治療後、腫瘍内のＣＤ８＋Ｔ細胞が大幅に増加した。右：治療後の腫瘍で測定した骨髄由来免疫抑制細胞。ＮＯＤ２０１Ｍ、抗ＰＤ−１、低用量ＩＬ−２を、図１１に説明されている方法で投与した。９日目に、プロロイキン投与から２４時間が経過した後、腫瘍を染色し、フローサイトメトリーにより細胞表面マーカーについて分析した。投与サイクル２回目の２日後に測定を行っている。ＭＣ３８腫瘍モデル。
図７Ａ−図７Ｈ、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマモデルにおけるＮＯＤ２０１Ｍの効能。ＮＯＤ２０１Ｍ±ＩＬ−２±抗ＰＤ−１併用療法における腫瘍体積曲線。Ａ）ＮＯＤ２０１Ｍ。Ｂ）抗ＰＤ−１抗体。Ｃ）ＩＬ−２。Ｄ）ＮＯＤ２０１Ｍ＋抗ＰＤ−１抗体。Ｅ）ＮＯＤ２０１Ｍ＋ＩＬ−２。Ｆ）ＮＯＤ２０１Ｍ＋抗ＰＤ−１抗体＋ＩＬ−２。Ｇ／Ｈ）データのグラフ当該実験では、研究開始日は腫瘍移植の日（１日目）であり、ＭＣ３８研究のように最初の日に定着腫瘍を投与しなかった。ＮＯＤ２０１Ｍは、４日目、１０日目、１６日目、２２日目に５００μｇまたは１０００μｇ（図のように）の用量で静脈内投与した。ＩＬ−２（４μｇ、プロロイキン）を、５〜７日目、１１〜１３日目、１７〜１９日目、２３〜２５日目に皮下投与した。抗ＰＤ−１（２００μｇ、クローンＲＭＰ１−１４）を、４日目、１０日目、１６日目、２２日目に静脈内投与した。Ｂ１６Ｆ１０腫瘍モデル。
一過性ＨＥＫ発現システムから生成されたＮＯＤ２０１の分析的特性評価。発現および精製したＮＯＤ２０１のＳＤＳ−ＰＡＧＥは、期待分子量の帯を示す。減少サンプルと未減少サンプルを分析した。ＮＯＤ２０１をｍＡｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ樹脂により精製した後、サイズ排除クロマトグラフィーを行った。Ｃ８カラムを用いて、ｐＨ ７．４のＰＢＳで製剤化した精製ＮＯＤ２０１に対してＲＰ−ＨＰＬＣを行った。熱安定性：ＤＳＦによる測定したｐＨ ７．４のＰＢＳで６８°Ｃ。
ＮＯＤ２０１は、ヒトおよびサルのインテグリンを発現する細胞と高い親和性で結合する。ＮＯＤ２０１Ｘはスクランブル結合エピトープを含み、陰性対照群として機能する。Ｕ８７ＭＧ（ヒト腫瘍細胞）、ＣＶ−１（サル）、ＲＦ／６Ａ（サル）。フローサイトメトリーと、ＮＯＤ２０１またはＮＯＤ２０１Ｘ Ｆｃドメインに対する抗体を使用して結合を測定した。ＮＯＤ２０１ＭのＵ８７ＭＧ細胞への結合も比較のために測定したが、ＮＯＤ２０１と同様の結合親和性を示していた。
ＮＯＤ２０１は、ラットおよびウサギのインテグリンを発現する細胞と高い親和性で結合する。ＮＯＤ２０１Ｘはスクランブル結合エピトープを含み、陰性対照群として機能する。Ｒａｔ２（ラット線維芽細胞）、ＳＩＲＣ（ウサギ角膜細胞）。フローサイトメトリーと、ＮＯＤ２０１またはＮＯＤ２０１Ｘ Ｆｃドメインに対する抗体を使用して結合を測定した。
図１１ＡおよびＢ、ＮＯＤ２０１Ｍ＋ＩＬ−２＋抗ＰＤ−１併用療法に対する腫瘍体積曲線（左）およびＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線（右）。ＭＣ３８結腸腫瘍モデル（１１Ａおよび１１Ｂ）。接種した腫瘍が平均サイズ６０〜１８０ｍｍ３に達した後、１日、７日、１３日、１９日目に２５０μｇ、５００μｇ、または１０００μｇの用量でＮＯＤ２０１Ｍを静脈内投与した。ＩＬ−２（４μｇ、プロロイキン）を、２〜４日目、８〜１０日目、１４〜１６日目、２０〜２２日目に皮下投与した。抗ＰＤ−１（２００μｇ、クローンＲＭＰ１−１４）を、１日目、７日目、１３日目、１９日目に静脈内投与した。
ＩＬ−２をＮＯＤ２０１Ｍ＋抗ＰＤ−１併用療法に追加したが、３０日間の生存率に向上無し。ＭＣ３８結腸腫瘍モデル。
雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを用いたＭＣ３８−ＮＯＤＵ同系結腸モデルにおいて、ＮＯＤ２０１Ｍ単剤療法、高用量または低用量のプロロイキンおよび抗ＰＤ−１との併用療法の効能を判定するための研究設計。「日」は接種腫瘍が平均サイズ６０−１８０ｍｍ３に達した時点からその日数だけ経過した日に投与していることを意味する。
ＮＯＤ２０１は、複数のマウスおよびヒトＲＧＤ結合インテグリンヘテロダイマーと高い親和性で結合する。
図１３に概説されている研究設計におけるマウスのエンドポイントまでの個々の時間。ＮＯＤ２０１Ｍ、プロロイキン、または抗ＰＤ−１を図のように投与した。
図１３に概説されている研究設計におけるマウスの腫瘍成長の中央値、およびＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロット。ＮＯＤ２０１Ｍ、プロロイキン、または抗ＰＤ−１を図のように投与した。
図１３に概説されている研究設計におけるマウスの平均腫瘍体積曲線。ＮＯＤ２０１Ｍ、プロロイキン、または抗ＰＤ−１を図のように投与した。
図１３に概説されている研究設計におけるマウスの個別腫瘍体積増殖曲線。
図１３に概説されている研究設計におけるマウスの個別腫瘍体積増殖曲線。
図１３に概説されている研究設計におけるマウスの個別腫瘍体積増殖曲線。
図１３に概説されている研究デザインにおけるマウスの群平均体重（％）。
ＮＯＤ２０１の投与原理。１）急速な全身クリアランス（〜６０ｋＤａ）、２）急速なエンドサイトーシスクリアランス（半減期〜１．５時間）、３）ＴＭＤＤ（ＰＢＭＣ）を克服するために、マウスの場合２５ｍｇ／ｋｇ、ヒトの場合＞１０ｍｇ／ｋｇが求められる。Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２０１３；２４（２）：３２９−３６を参照、 Ｊ Ｔｈｅｏｒ． Ｂｉｏｌ． ３１４：５７−６８ （２０１２）によるモデル計算法を適用。
各種の治療、または併用治療に対する腫瘍体積曲線。Ａ）生理食塩水（対照群）。Ｂ）ＮＯＤ２０１Ｍ。Ｃ）ＮＯＤ２０１Ｍ＋抗ＰＤ−１抗体。Ｄ）ＮＯＤ２０１Ｍ＋抗ＰＤ−Ｌ１抗体。Ｅ）ＮＯＤ２０１Ｍ＋抗ＣＴＬＡ−４抗体。Ｆ）ＮＯＤ２０１Ｍ＋抗ＬＡＧ−３抗体。Ｇ）ＮＯＤ２０１Ｍ＋抗ＴＩＭ−３抗体。Ｈ）ＮＯＤ２０１Ｍ＋抗ＴＩＧＩＴ抗体。Ｉ）ＮＯＤ２０１Ｍ＋抗４−１ＢＢ／ＣＤ１３７抗体。ＮＯＤ２０１Ｍ＋抗ＰＤ−１抗体、ＮＯＤ２０１Ｍ＋抗ＰＤ−Ｌ１抗体、ＮＯＤ２０１Ｍ＋抗ＣＴＬＡ−４抗体、ＮＯＤ２０１Ｍ＋抗−４−１ＢＢ／ＣＤ１３７抗体の場合、ＮＯＤ２０１Ｍ単独に対して、腫瘍体積の減少効果の増加が観察された。ＮＯＤ２０１Ｍ＋抗ＬＡＧ−３抗体、ＮＯＤ２０１Ｍ＋抗ＴＩＭ−３抗体、ＮＯＤ２０１Ｍ＋抗ＴＩＧＩＴ抗体の場合、ＮＯＤ２０１Ｍ単独に対して、腫瘍体積の減少効果の増加が観察されなかった。
ＮＯＤ２０１Ｍ±様々なチェックポイント阻害物質（抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗４−１ＢＢ／ＣＤ１３７抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＬＡＧ−３抗体、抗ＴＩＭ−３抗体、または抗ＴＩＧＩＴ抗体）の併用治療における生存率曲線。ＮＯＤ２０１Ｍ＋抗ＣＴＬＡ−４抗体、ＮＯＤ２０１Ｍ＋抗ＰＤ−Ｌ１抗体、ＮＯＤ２０１Ｍ＋抗−４−１ＢＢ／ＣＤ１３７抗体、ＮＯＤ２０１Ｍ＋抗ＰＤ−１抗体の場合、ＮＯＤ２０１Ｍ単独に対して、生存率の増加が観察された。ＮＯＤ２０１Ｍ＋抗ＬＡＧ−３抗体、ＮＯＤ２０１Ｍ＋抗ＴＩＭ３抗体、ＮＯＤ２０１Ｍ＋抗−ＴＩＧＩＴ抗体場合、ＮＯＤ２０１Ｍ単独に対して、生存率の増加が観察されなかった。
ＮＯＤ２０１Ｍ併用療法による腫瘍細胞浸潤。投与サイクル２回目の２日後（９日目）に測定。Ａ）ＣＤ８、Ｂ）ＣＤ４（ｎｓ）、Ｃ）Ｔｒｅｇ（ｎｓ）、Ｄ）マクロファージ、Ｅ）Ｍ１マクロファージ、Ｆ）Ｍ２マクロファージ、Ｇ）ＮＫ（ｎｓ）、Ｈ）樹状細胞（ｎｓ）、Ｉ）ＭＨＣＩＩ−、Ｊ）ＭＨＣＩＩ＋（ｎｓ）、Ｋ）ＭＤＳＣ（ｎｓ）、Ｌ）ｇＭＤＳＣ（ｎｓ）、Ｍ）ｍＭＤＳＣ（ｎｓ）。Ａ）ＣＤ８、Ｄ）ＭＨＣＩＩ−、Ｅ）Ｍ１マクロファージは併用治療に対して、Ｉ）Ｍ２マクロファージはαＰＤ−１に対して、統計的有意性を示した。ＣＤ８ Ｔ細胞およびマクロファージは、ＮＯＤ２０１ＭおよびαＰＤ−１の治療効果に関与している。しかし、単剤のＮＯＤ２０１ＭまたはαＰＤ−１では、腫瘍内のＣＤ８ Ｔ細胞またはマクロファージの数に統計的に有意な変化をもたらさかった。単剤または併用治療で有意に変化しなかった細胞は、ＣＤ４ Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ、ＮＫ細胞、ＭＤＳＣ、ｇＭＤＳＣ、ｍＭＤＳＣ、樹状細胞、およびＭＨＣＩＩである。Ｍ２マクロファージ：寛容化または免疫抑制マクロファージは、αＰＤ−１の単剤治療で増加していた。Ｍ２における併用治療の場合、生理食塩水で処理したレベルまで落ちた。Ｍ１マクロファージ：高刺激腫瘍殺傷性マクロファージ種は、単剤ではほぼ差がなかったが、併用では増加した。ＭＨＣＩＩ−（樹状細胞の可能性が高い）は併用治療では変化したが、単剤治療では変化しなかった。
ＮＯＤ２０１Ｍと、αＰＤ−１およびＬＤ ＩＬ−２の併用療法による腫瘍細胞浸潤。Ａ）ＣＤ８。Ｂ）ＭＤＳＣ。投与サイクル２回目の２日後に測定。ＭＣ３８結腸腫瘍モデル。
ＮＯＤ２０１は、αＰＤ−１、αＰＤ−Ｌ１、αＣＴＬＡ−４、α４−１ＢＢ／ＣＤ１３７と効果的に結合する。対応する単剤療法は効果無し。＋αＴＩＭ３、＋αＴＩＧＩＴ、＋αＬＡＧ３：増分効果なし。
併用療法は、自然免疫系および獲得免疫系を発動させる。ＮＯＤ２０１−Ｄ２６５Ａ：Ｆｃドメイン（Ｄ２６５Ａ）の点突然変異は、抗ＰＤ１併用療法でＦｃＲｙの結合と治療効果を低下させるため、エフェクター機能が必要となる。Ｆｃエフェクター機能は、Ｔ細胞応答のクロスプライミング（ワクチン効果）を促進する。この場合、マクロファージ、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋樹状細胞を利用する。Ｆｃエフェクター機能は炎症性腫瘍微小環境（腫瘍内ケモカインの増加）を作り出す。
ヒト結腸腫瘍１の組織染色。ＮＯＤ２０１、α５インテグリン、ＮＯＤ２０１Ｘ（ネガティブコントロール）、αｖインテグリン。組織反応性の研究が進行中（インテグリンのプロファイリング、並びに健康な組織のＮＯＤ２０１染色）。
ヒト結腸腫瘍２の組織染色。ＮＯＤ２０１、α５インテグリン、ＮＯＤ２０１Ｘ（ネガティブコントロール）、αｖインテグリン。
ヒト前立腺腫瘍１の組織染色。ＮＯＤ２０１、α５インテグリン、ＮＯＤ２０１Ｘ（ネガティブコントロール）、αｖインテグリン。
ヒト膵臓腫瘍１の組織染色。ＮＯＤ２０１、α５インテグリン、ＮＯＤ２０１Ｘ（ネガティブコントロール）、αｖインテグリン。
ヒト膠芽腫腫瘍１の組織染色。ＮＯＤ２０１、α５インテグリン、ＮＯＤ２０１Ｘ（ネガティブコントロール）、αｖインテグリン。
ＮＯＤ２０１＋αＰＤ１併用療法は、Ｔ細胞を腫瘍に補充し、ＭＤＳＣを減らす。ＭＣ３８結腸腫瘍モデルのＮＯＤ２０１＋αＰＤ１を、治療後の様々な時点で分析した。
患者の「レスポンダー」における遺伝子特徴は、最良のレスポンダーであるマウス腫瘍と相関関係を持つ。α−ＰＤ１で治療を受けた患者における非レスポンダー（ＮＲ）とレスポンダー（Ｒ）の対遺伝子分析。腫瘍アレイ分析を実施した（腫瘍パネルに対するインテグリンプロファイリングおよびＮＯＤ２０１染色。図２９−３３を参照）。Ａ）対遺伝子分析により、抗ＰＤ１による治療に反応した患者（Ｒ）において発現上昇した遺伝子のパネルを、非レスポンダーと比べて同定した。Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ２０１６， ６：８２．から得たデータを使用。Ｂ）実施例７に記載されているように、生理食塩水対照群、抗ＰＤ１単剤、ＮＯＤ２０１単剤、または抗ＰＤ１とＮＯＤ２０１の併用で治療を受けたＭＣ３８同系腫瘍からのＲＮＡｓｅｑにより、類似の遺伝子を分析した。腫瘍体積の変化を５日目から９日目まで測定し、最も大きい腫瘍は非レスポンダーと、最も小さい腫瘍をレスポンダーと称した。データを腫瘍体積に応じてグループ化し、腫瘍内のバルク遺伝子発現を示すヒートマップとしてプロットした。レスポンダーであるマウス腫瘍は、Ｃｈｅｎ ２０１６の研究で患者レスポンダーとして同定されたものと同様の免疫遺伝子特徴を示した。
免疫応答遺伝子の遺伝子特徴は、最良のレスポンダーである腫瘍と相関関係を持つ。Ｔ細胞活性化遺伝子はレスポンダーにより発現上昇となり、非レスポンダーにより発現減少となる。Ｃｈｅｎチェックポイントの特徴は、腫瘍体積の変化と相関関係を持つ。治療群に応じて、５日目から９日目までの腫瘍体積変化に対して遺伝子セットスコアをプロットした。
Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．では、αＰＤ１がＮＯＤ２０１に付加された場合にのみ、免疫応答遺伝子の特徴を明確に表れる。
Ｔ細胞活性化に関与する遺伝子はＮＯＤ２０１＋αＰＤ１による治療に応じて発現上昇となる一方、一部のＴ細胞活性化遺伝子はαＰＤ１単剤治療に応じて発現減少となることを示すＲＮＡｓｅｑ分析データ。Ｔ細胞活性化遺伝子はレスポンダーにより発現上昇となり、非レスポンダーにより発現減少となる。遺伝子に応じてクラスター化した。
Ｔ細胞活性化に関与する遺伝子はＮＯＤ２０１＋αＰＤ１による治療に応じて発現上昇となる一方、一部のＴ細胞活性化遺伝子はαＰＤ１単剤治療に応じて発現減少となることを示すＲＮＡｓｅｑ分析データ（データは体積順に並らべた）。Ｔ細胞活性化遺伝子はレスポンダーにより発現上昇となり、非レスポンダーにより発現減少となる。サンプルを、５日目から９日目までの腫瘍体積の変化に応じてグループ化した。レスポンダーは体積の経時的変化が最も小さい腫瘍に対応する。
抗体の様々な鎖と末端に融合した２．５Ｆノッチンペプチド。
抗ＣＴＬＡ−４抗体の様々な鎖と末端に融合した２．５Ｆノッチンペプチド。
ＮＯＤ２０１Ｍ±様々なチェックポイント阻害物質（抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗４−１ＢＢ／ＣＤ１３７抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＬＡＧ−３抗体、抗ＴＩＭ−３抗体、または抗ＴＩＧＩＴ抗体）、およびＩＦＮ−αの併用治療における生存率曲線。ＮＯＤ２０１Ｍ＋抗ＣＴＬＡ−４抗体、ＮＯＤ２０１Ｍ＋抗ＰＤ−Ｌ１抗体、ＮＯＤ２０１Ｍ＋抗−４−１ＢＢ／ＣＤ１３７抗体、ＮＯＤ２０１Ｍ＋抗ＰＤ−１抗体ＮＯＤ２０１Ｍ＋抗ＩＦＮ−α抗体の場合、ＮＯＤ２０１Ｍ単独に対して、生存率の増加が観察された。ＮＯＤ２０１Ｍ＋抗ＬＡＧ−３抗体、ＮＯＤ２０１Ｍ＋抗ＴＩＭ３抗体、ＮＯＤ２０１Ｍ＋抗−ＴＩＧＩＴ抗体場合、ＮＯＤ２０１Ｍ単独に対して、生存率の増加が観察されなかった。
α５およびαｖインテグリン：患者の腫瘍染色プロファイル。ａ５またはａｖインテグリンを陽性染色した患者腫瘍サンプルの割合（％）。乳がん、頭頸部がん、非小細胞肺がん、膵臓がん、膠芽腫ではｎ＝２０。メラノーマの場合はｎ＝１６、結腸がんの場合はｎ＝２４。ａ５染色は乳がんでは示されなかった。Ａ）まとめ。Ｂ）乳がん。Ｃ）頭頸部がん。Ｄ）メラノーマ。Ｅ）非小細胞肺がん。Ｆ）結腸がん。Ｇ）膵臓がん。Ｈ）膠芽腫。
α５およびαｖインテグリンの腫瘍および線維血管染色に関する患者の集計データ。図４３のデータから集計した。
発明を詳細な説明
Ｉ．前書き
インターロイキン−２（ＩＬ−２）は、Ｔ細胞およびＮＫ細胞の増殖を活性化および誘導する多面性サイトカインである。ＩＬ−２はＦＤＡ承認の両方ではあるが、ＩＬ−２を用いる全身療法は著しい毒性を有し、患者の奏効率も２５％未満に過ぎない。半減期を延長したＩＬ−２と、腫瘍特異的抗原に対する抗体を組み合わせると、かなり有望な治療効果が期待できる。しかしながら、抗体を応用する療法は、ほとんどの腫瘍には既知の腫瘍関連抗原を持たないという弱点を抱えている。
インテグリンは、充実性腫瘍の発生、進行、転移に重要な役割を担う各種の細胞機能を調節する細胞買いマトリックス接着受容体のファミリーである。腫瘍の進行においてあまりも重要であるため、インテグリンはがん療法の有効な目標として見なされ、様々な種類のがんの治療が可能となった。がん細胞に存在するインテグリンとしては、ανβ３、ανβ５、α５β１が挙げられる。現在、抗体、線状ペプチド、環状ペプチド、ペプチド模倣薬など、がんに関連する各インテグリンを標的とする治療法が開発されている。しかしながら、小型の構造化ペプチド足場を利用する療法や、３種以上のインテグリンを同時に標的にする療法はない。また、現在のインテグリン標的薬は単剤療法として投与されている。様々ながんをより効率的に治療するためには、新規の併用療法が必要である。
ＩＩ．定義
請求の範囲および明細書で用いられる用語は、別途の明記がない限り、次のように定義される。原出願の仮出願書で用いられる用語と矛盾する場合は、本明細書の用語が優先するものとする。
「アミノ酸」とは、天然アミノ酸および合成アミノ酸、並びに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物を指す。天然アミノ酸とは、遺伝情報によりコード化されるアミノ酸や修飾アミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、Ｏ−ホスホセリンを意味する。アミノ酸類似体とは、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を有する化合物、つまり、水素、カルボキシル基、アミノ基、Ｒ基と結合したα炭素、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを意味する。類似体は、修飾Ｒ基（例えば、ノルロイシン）または修飾ペプチド骨格を有するが、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を保持しているものである。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を持つが、天然アミノ酸と同様に機能する化合物を指す。本明細書では、アミノ酸を、周知の３文字記号、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会が勧める１文字記号で表記するものとする。同様に、ヌクレオチドは、周知の１文字コードで表記するものとする。
「アミノ酸置換」とは、所定のアミノ酸配列（出発ポリペプチドのアミノ酸配列）における少なくとも１つの既存アミノ酸残基を、第２の異なる「置換用」アミノ酸残基で置換することを指す。「アミノ酸挿入」とは、少なくとも１つの追加アミノ酸を所定のアミノ酸配列に組み込むことを指す。挿入は通常、１つまたは２つのアミノ酸残基を挿入することであるが、現在はより大規模の「ペプチド挿入」として、例えば約３つ〜約５つ、もしくは最大約１０個、１５個、２０個のアミノ酸残基を挿入することができる。挿入した残基は、前述した天然アミノ酸でもよく、天然アミノ酸でなくてもよい。「アミノ酸欠失」とは、少なくとも１つのアミノ酸残基を所定のアミノ酸配列から取り除くことを指す。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを意味し、本明細書では相互代替可能である。当該用語は、１または複数のアミノ酸残基が、対応する天然アミノ酸の人工化学模倣物であるアミノ酸ポリマー、並びに天然アミノ酸ポリマーや非天然アミノ酸ポリマーに適用される。
「核酸」とは、一本鎖または二本鎖のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、並びにそれらのポリマーを指す。特に限定されない限り、当該用語は、基準核酸と同様の結合特性を有し、天然ヌクレオチドと同様の方法で代謝される、既知の天然ヌクレオチド類似体を含む核酸を網羅する用語である。別途の明記がない限り、特定の核酸配列は、明示された配列は勿論、その保存的に修飾されたバリアント（例えば、縮重コドン置換）や相補配列も暗黙的に網羅するものと見なされる。具体的には、縮重コドン置換は、選択された１または複数の（もしくは全ての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することである（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１， １９９１； Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８， １９８５； ａｎｄ Ｃａｓｓｏｌ ｅｔ ａｌ， １９９２； Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１−９８， １９９４）。アルギニンとロイシンの場合、２番目の塩基の修飾も保存的になる。「核酸」という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、また、遺伝子によってコード可されるｍＲＮＡと総合代替可能である。本明細書で用いられるポリヌクレオチドは、任意のポリリボヌクレオチド、またはポリデオキシリボヌクレオチドから構成されてもよく、これらは非修飾ＲＮＡまたはＤＮＡ、もしくは修飾ＲＮＡまたはＤＮＡであってもよい。例えば、ポリヌクレオチドは、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖、より通常的には、二本鎖、または一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であるＤＮＡとＲＮＡを含むハイブリッド分子から構成されてもよい。さらに、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡ、もしくはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域から構成されてもよいポリヌクレオチドは、１または複数の修飾塩基、もしくは、安定性や他の理由により修飾されたＤＮＡまたはＲＮＡ骨格を含むこともできる。「修飾」塩基には、例えば、トリチル化塩基や、イノシンなどの独特な塩基が含まれる。ＤＮＡやＲＮＡに様々な修飾を加えることもできるため、「ポリヌクレオチド」には、化学的、酵素的、代謝的に修飾されたものも含まれる。
本明細書において、インターロイキン−２（ＩＬ−２）は、Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の増殖を活性化および誘導する多面性サイトカインである。ＩＬ−２は、アルファ、ベータ、ガンマサブユニットで構成されるＩＬ−２の受容体であるＩＬ−２Ｒを結合することで、シグナルを伝達する。ＩＬ−２のシグナル伝達は、抗原活性化Ｔ細胞の増殖を刺激する。
本明細書において、「ＰＫ」とは「薬物動態」の頭字語であり、例として対象による吸収、分布、代謝、排泄を含む、化合物の特性を網羅する用語である。本明細書において、「拡張ＰＫ基」とは、生物活性分子と融合した場合、または一緒に投与した場合に、生物活性分子の循環半減期を延長するタンパク質、ペプチド、または部分を指す。拡張ＰＫ基の例としては、ＰＥＧ、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）結合剤（米国公開第２００５／０２８７１５３号、米国公開第２００７／０００３５４９号、国際公開第ＷＯ ２００９／０８３８０４号、国際公開第ＷＯ ２００９／１３３２０８号お参照。さらに、米国公開第２０１２／０９４９０９に記載されているＳＡＢＡ分子）、ヒト血清アルブミン、ＦｃまたはＦｃ断片、そのバリアント、並びに糖（例えば、シアル酸）が挙げられる。拡張ＰＫ基の他の例示は、本願に援用されているＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１１；２２：８６８−８７６に開示されている。本明細書において、「拡張ＰＫ・ＩＬ−２」とは、拡張ＰＫ基と組み合わせたＩＬ−２部分を指す。一実施形態では、拡張ＰＫ・ＩＬ−２は、ＩＬ−２部分が拡張ＰＫ基に連結、または融合されている融合タンパク質である。融合タンパク質の例としては、１または複数のＩＬ−２部分がＨＳＡに連結されているＨＳＡ／ＩＬ−２融合体が挙げられる。
「拡張ＰＫ・ＩＬ−２」という用語には、その受容体、例えばＣＤ２５の１または複数に対するＩＬ−２の親和性を高める、１または複数のアミノ酸残基に突然変異が生じているＩＬ−２変異体も含まれる。一実施形態では、拡張ＰＫ・ＩＬ−２のＩＬ−２部分は野生型ＩＬ−２である。別の実施形態では、ＩＬ−２部分は、野生型ＩＬ−２よりもＣＤ２５に対して高い親和性を示すＩＬ−２変異体である。ＨＳＡ−ＩＬ−２など、特定の拡張ＰＫ基を提示する場合、これには、野生型ＩＬ−２部分に融合したＨＳＡまたはＭＳＡ、または変異ＩＬ−２部分に融合したＨＳＡまたはＭＳＡが全て含まれる。
ある態様において、拡張ＰＫ・ＩＬ−２、またはノッチン（ｋｎｏｔｔｉｎ）Ｆｃは、ポリペプチドリンカーなど、１または複数の「リンカードメイン」を採用してもよい。本明細書において、「リンカー」または「リンカードメイン」とは、直線配列において２つ以上のドメイン（例えば、ＰＫ部分とＩＬ−２）を接続する配列を指す。本明細書において「ポリペプチドリンカー」とは、ポリペプチド鎖の直鎖アミノ酸配列内の２つ以上のドメインを接続するペプチドまたはポリペプチド配列（例えば、合成ペプチドやポリペプチド配列）を指す。例えば、ポリペプチドリンカーを用いて、ＩＬ−２部分またはインテグリン結合性ポリペプチドをＦｃドメイン、またはＨＳＡなどその他のＰＫ延長物質に接続してもよい。いくつかの実施形態では、該ポリペプチドリンカーにより、ポリペプチド分子に柔軟性を与えることもできる。リンカーの例としては、４つのグリシンとそれに続く１つのセリンを含む［Ｇｌｙ４Ｓｅｒ］や、４つのグリシンとそれに続く３つのセリンを含む［Ｇｌｙ４Ｓｅｒ３］などのグリシン−セリンリンカーが挙げられるが、これらに限定はされない。
本明細書において、「連結」や「融合」は相互代替可能である。当該用語は、化学的共役または組換え手段を含む何かしらの手段により、２つ以上の要素、構成要素、ドメインを結合することを意味する。化学的結合の方法（例えば、ヘテロ二官能性架橋剤を使用するなど）は、当技術分野で既知のものである。
「インテグリン」とは、細胞接着に重要な役割を担う、膜貫通ヘテロ二量体タンパク質である。インテグリンは、αサブユニットとβサブユニットを含む。これらのタンパク質は、細胞外マトリックス成分（フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニンなど）と結合し、シグナル伝達カスケードを誘導することで反応を示す。インテグリンは、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）モチーフの認識により、細胞外マトリックス成分と結合する。特定のインテグリンは腫瘍細胞の表面に存在するので、治療標的として有用である。ある実施形態では、個別的に、または組み合わせて標的となるインテグリンは、ανβ３、ανβ５、α５β１である。
「インテグリン結合性ポリペプチド」とは、ノッチンポリペプチド足場内にインテグリン結合ドメインまたはループを含むポリペプチドを指す。インテグリン結合ドメインまたはループは、少なくとも１つのＲＧＤペプチドを含む。ある実施形態では、ＲＧＤペプチドは、ανβ１、ανβ３、ανβ５、ανβ６、α５β１インテグリンにより認識される。ある実施形態では、ＲＧＤペプチドは、ανβ１、ανβ３、ανβ５、ανβ６、α５β１インテグリンの組み合わせと結合する。これらの特定のインテグリンは、腫瘍細胞や細胞の血管系に存在するため、恰好の標的となる。
インテグリンは、細胞外マトリックス接着タンパク質のファミリーであり、独自の細胞特異性と接着特異性を有し、αおよびβヘテロダイマーに非共有結合的に結合する（Ｈｙｎｅｓ， １９９２； Ｌｕｓｃｉｎｓｋａｓ ａｎｄ Ｌａｗｌｅｒ， １９９４）。インテグリンとタンパク質の相互作用により媒介される細胞接着は、細胞の運動性、寿命、分化に関与する。インテグリン受容体におけるαサブユニットおよびβサブユニットのそれぞれは、配位子の結合や特異性に寄与する。
様々な細胞表面インテグリンに対するタンパク質結合は、短ペプチドモチーフＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）を介して媒介される（Ｐｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒ ａｎｄ Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ、１９８４）。これらのペプチドは２つの機能を有する。まずは、表面に固定されると細胞接着を促進し、溶液中の細胞に対しては細胞接着を阻害する。ＲＧＤ配列を含有する接着タンパク質には、フィブロネクチン、ビトロネクチン、オステオポンチン、フィブリノゲン、フォンウィルブランド因子、トロンボスポンジン、ラミニン、エンタクチン、テネイシン、骨シアロタンパク質が含まれる（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ， １９９６）。ＲＧＤ配列は、α５β１、α８β１、ανβ１、ανβ３、ανβ５、ανβ６、ανβ８、αｖβ３インテグリンを含む既知のインテグリン２０種類の約半分に対して特異性を示し、α２β１、α３β１、α４β１、α７β１インテグリンに対してはそれより弱い特異性を示す（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ， １９９６）。特にανβ３インテグリンは、フィブロネクチン、フィブリノゲン、ビトロネクチン、オステオポンチン、フォンウィルブランド因子、トロンボスポンジンなどのタンパク質を含む様々なＲＧＤに結合できる（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ， １９９６； Ｈａｕｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９７）反面、α５β１インテグリンはより特異的であり、フィブロネクチンにのみ結合することができる（Ｄ’Ｓｏｕｚａ ｅｔ ａｌ．， １９９１）。
線形ペプチド配列ＲＧＤは、インテグリンに対して、インテグリンが由来するタンパク質よりはるかに低い親和性を持つ（Ｈａｕｔａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９８９）。これは、線形ペプチドには存在しない折り畳みタンパク質ドメインがもたらす立体配座特異性によるものである。環状ＲＧＤモチーフの調製、ＲＧＤ配列に隣接する残基の変更、小分子模倣物の合成などにより、機能的インテグリン活性が増加することになる（（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ， １９９６； Ｈａｕｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９７）で概説）。
「ループドメイン」とは、規則的な二次構造を持たず、一般にペプチドの表面に存在するペプチド鎖内のアミノ酸部分配列を指す。「ループ」とは、当技術分野では、αヘリックス、βシートなどのように順番が付けられていない二次構造を指すものとして見なされる。
「インテグリン結合性ループ」とは、通常、分子進化などの実験的方法により最初からインテグリンと結合するように作製された、約９〜１３個のアミノ酸の一次配列を指す。ある実施形態では、インテグリン結合性ループは、所望の足場と結合特異性を有するアミノ酸の間に配置されたＲＧＤペプチド配列などを含む。ＲＧＤ含有ペプチドまたは同様のペプチド（ＲＹＤなど）は、一般に、既知のタンパク質の天然結合配列から簡単に得られるものではない。インテグリン結合性ループは、好ましくはシステイン残基間のノッチンポリペプチド足場内に挿入され、ループ長はシステイン残基間の三次元間隔に応じて最適なインテグリン結合が得られるように調整される。例えば、ノッチン足場のシステイン隣接残基が相互連結している場合は、システイン隣接残基が一次配列で分離されたシステイン残基に連結している場合より最適ループが短くなる可能性がある。或いは、特定のアミノ酸置換を導入して、より長い含ＲＧＤループを、高親和性インテグリン結合の最適な立体構造に拘束することができる。本明細書におけるノッチンポリペプチド足場は、天然ノッチンをトランケートするか、またはループ、不要なシステイン残基、またはジスルフィド結合を取り除く、特定の修飾を含んでもよい。
インテグリン結合性配列を分子（例えば、ノッチンポリペプチド）足場へ組み込むと、線形または環状ペプチドループよりも強固で安定な配位子のフレームワークを得ることができる。さらに、溶液中の低分子ペプチドの立体構造は高い柔軟性を有しており、その結果、結合するとエントロピーが大きくなってしまう。上記のような構築体は、本願に援用されている国際公開第ＷＯ ２０１６／０２５６４２号にも詳細に記載されている。
インテグリン結合性配列をノッチンポリペプチド足場に組み込むと、高親和性インテグリン結合に必要な立体構造上の拘束が得られる。さらに、足場は、親和性や安定性に関するタンパク質工学研究を実行できるプラットフォームとして機能できる。
本明細書において「ノッチンタンパク質」とは、タンパク質、糖、脂質などの一連の分子標的に結合する、通常２５〜４０個のアミノ酸の低分子タンパク質の構造ファミリーを指す。それらの三次元構造は、３〜５個のジスルフィド結合の特異な配置により定義される。同じシスチンネットワークを持つマイクロタンパク質の数種から発見した、２つの鎖内ジスルフィド結合より制限された大員環を横断するジスルフィド架橋を持つノットトポロジーにより、この類の生体分子の名前が決められた。一般的に二次構造の含有量は高くないが、ノッチンは、ジスルフィド結合性骨格（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）により安定化されている、低分子の三本鎖逆平行βシートを共有する。シスチンノットタンパク質とも呼ばれるノッチンファミリーの生化学的メンバーには、Ｅｃｂａｌｌｉｕｍ ｅｌａｔｅｒｉｕｍ種子のトリプシン阻害剤ＥＥＴＩ−ＩＩ、捕食性イモガイのＣｏｎｕｓ ｇｅｏｇｒａｐｈｕｓの毒液から抽出したニューロンＮ型Ｃａ２＋通路遮断物質、アグーチ関連タンパク質（ＡｇＲＰ， Ｓｅｅ Ｍｉｌｌｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．， “Ｌｏｏｐｓ ａｎｄ Ｌｉｎｋｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｒｅｍａｒｋａｂｌｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｇｏｕｔｉ−Ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ，” Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． ＳｃＬ， Ｊｕｎ． １， ２００３； ９９４（１）： ２７−３５）、オメガアガトキシンファミリーなどが含まれる。適切なアガトキシン配列［配列番号４１］は、本出願と同じ発明者により米国特許第８，５３６，３０１号に記載されている。本明細書に開示される方法に使用できる他のアガトキシン配列としては、オメガアガトキシン−Ａａ４ｂ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ３７０４５）、およびオメガアガトキシン−Ａａ３ｂ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ８１７４４）が挙げられるが、これらに限定はされない。本明細書に開示される方法に使用できる他のノッチン配列には、ノッチン［Ｂｅｍｉｓｉａ ｔａｂａｃｉ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＦＪ６０１２１８．１）、オメガリコトキシン（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｐ８５０７９）、ｍｕ−ＯコノトキシンＭｒＶＩＡ 電圧依存性ナトリウム通路遮断物質（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＢ３４９１７）、Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｏｃｈｉｎｃｈｉｎｅｎｓｉｓトリプシン阻害剤Ｉ（ＭＣｏＴＩ−Ｉ）またはＩＩ（ＭＣｏＴＩ−ＩＩ）（それぞれ、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ８２４０８およびＰ８２４０９）が含まれる。
ノッチンタンパク質は、特徴的なジスルフィド結合構造を有する。当該構造は、Ｇｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．， “Ｔｈｅ ＫＮＯＴＴＩＮ ｗｅｂｓｉｔｅ ａｎｄ ｄａｔａｂａｓｅ： ａ ｎｅｗ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｄｅｄｉｃａｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｋｎｏｔｔｉｎ ｓｃａｆｆｏｌｄ，” Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２００４， Ｖｏｌ．３２， Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ Ｄ１５６−Ｄ１５９にも解説されている。三本鎖βシートは多数のノッチンに存在する。インテグリン結合性ループの分子トポロジーおよび立体構造と同様に、システイン残基間の間隔も重要である。
「分子足場」とは、本明細書に記載されているように、ＲＧＤペプチド配列などのインテグリン結合性ループが組み込まれた、所定の三次元構造を有するポリマーを意味する。「分子足場」という用語は、他の文脈では当該技術分野で周知の意味を有し、本明細書でもこれを意図している。例えば、Ｓｋｅｒｒａ， “Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，” Ｊ． Ｍｏｌ． Ｒｅｃｏｇｎｉｔ． ２０００； １３： １６７−１８７は、免疫グロブリンスーパーファミリーの抗体の単一ドメイン、プロテアーゼ阻害物質、ヘリックス束タンパク質、ジスルフィド結合性ペプチド、リポカリンなどの分子足場を説明している。適切な分子足場を選択できる指針として活用できる。
「ノッチンポリペプチド足場」とは、本明細書に記載されているように、分子足場として適切に使用できるノッチンタンパク質を指す。操作用として望ましいノッチンポリペプチド足場の特徴としては、１）インビトロおよびインビボにおける高安定性、２）全体の折り畳みを乱すことなく足場のアミノ酸領域を他の配列に置き換える能力、３）分子の別々の領域を設計し、多機能性または二重特異性に標的をターゲットする能力、４）必要に応じて非天然アミノ酸の化学合成と取り込みを可能にする小さなサイズが挙げられる。ヒトタンパク質由来の足場は、毒性または免疫原性の問題を軽減する治療に好ましく用いられるが、必ずしも含まれるべき要件ではない。タンパク質設計に用いられるその他の足場には、フィブロネクチン（Ｋｏｉｄｅ ｅｔ ａｌ．， １９９８）、リポカリン（Ｂｅｓｔｅ ｅｔ ａｌ．， １９９９）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ−４）（Ｈｕｆｔｏｎ ｅｔ ａｌ， ２０００）、テンダミスタット（ＭＭｃＣｏｎｎｅｌｌ ａｎｄ Ｈｏｅｓｓ， １９９５； Ｌｉ ｅｔ ａｌ， ２００３）が含まれます。これらの足場はタンパク質工学に有用な骨格（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）であることが証明されているが、ノッチンなどの分子足場には、小さいサイズと高い安定性という明確な利点がある。
本明細書において「ＮＯＤ２０１」とは、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＳＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧ（配列番号１３０、２．５Ｆペプチド）の配列を含み、２．５ＦペプチドとＦｃドメインとの間にリンカーを持たない、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体を指す。いくつかの実施形態では、ＦｃドメインはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４に由来し、マウスやヒト由来であってもよい。
本明細書において「ＮＯＤ２０１ｍｏｄＫ」とは、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＫＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧ（配列番号１３１、２．５Ｆｍｏｄｋペプチド）の配列を含み、２．５ＦｍｏｄｋペプチドとＦｃドメインとの間にリンカーを持たない、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体を指す。いくつかの実施形態では、ＦｃドメインはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４に由来し、マウスやヒト由来であってもよい。
本明細書において「ＮＯＤ２０３」とは、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＳＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧＧＧＧＧＳ（配列番号１３２、２．５Ｆペプチド）の配列を含み、２．５ＦペプチドとＦｃドメインとの間にＧｌｙ４Ｓｅｒリンカーを有する、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体を指す。いくつかの実施形態では、ＦｃドメインはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４に由来し、マウスやヒト由来であってもよい。
本明細書において「ＮＯＤ２０３ｍｏｄＫ」とは、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＫＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧＧＧＧＧＳ（配列番号１３３、２．５ＦｍｏｄＫペプチド）の配列を含み、２．５ＦｍｏｄＫペプチドとＦｃドメインとの間にＧｌｙ４Ｓｅｒリンカーを有する、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体を指す。いくつかの実施形態では、ＦｃドメインはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４に由来し、マウスやヒト由来であってもよい。
本明細書において「ＮＯＤ２０４」とは、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＳＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１３４、２．５Ｆペプチド）の配列を含み、２．５ＦペプチドとＦｃドメインとの間にＧｌｙ４Ｓｅｒ３リンカーを有する、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体を指す。いくつかの実施形態では、ＦｃドメインはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４に由来し、マウスやヒト由来であってもよい。
本明細書において「ＮＯＤ２０４ｍｏｄＫ」とは、ＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＫＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１３５、２．５ＦｍｏｄＫペプチド）の配列を含み、２．５ＦｍｏｄＫペプチドとＦｃドメインとの間にＧｌｙ４Ｓｅｒ３リンカーを有する、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体を指す。いくつかの実施形態では、ＦｃドメインはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４に由来し、マウスやヒト由来であってもよい。
本明細書において「ＡｇＲＰ」とは、ＰＤＢエントリー１ＨＹＫを意味する。Ｋｎｏｔｔｉｎデータベースのエントリーは、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ＡＧＲＰ＿ＨＵＭＡＮで、１２９個のアミノ酸を有する全長配列である。これには、アミノ酸８７から始まる配列が含まれる。さらなるＧがこの構築体に追加される。また、Ｊａｃｋｓｏｎ， ｅｔ ａｌ．２００２ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ４１， ７５６５や、本願に援用されている国際公開第ＷＯ ２０１６／０２５６４２にも記載されるＣＩ ０５ Ａ突然変異が含まれている。ループ４の太字下線付きの部分は、本明細書に記載のＲＧＤ配列に置き換えられる。括弧の中はループ１および３である。
本明細書において「インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体」は、「ノッチン−Ｆｃ」に書き換えてもよく、ノッチンポリペプチド足場内にインテグリン結合性アミノ酸配列を含み、Ｆｃドメインに作用可能に連結されるインテグリン結合ポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、インテグリン結合性ポリペプチドのＮ末端に融合している。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、インテグリン結合性ポリペプチドのＣ末端に融合している。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、リンカーを介してインテグリン結合性ポリペプチドと作用可能に連結されている。
本明細書において「Ｆｃ領域」とは、２つの重鎖のそれぞれのＦｃドメイン（またはＦｃ部分）により形成される天然免疫グロブリンの部分を指す。本明細書において「Ｆｃドメイン」とは、ＦｃドメインがＦｖドメインを含まない単一の免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖の一部を指す。そのため、Ｆｃドメインを「Ｉｇ」または「ＩｇＧ」とも呼ぶ。ある実施形態では、Ｆｃドメインは、パパイン切断部位のすぐ上流側のヒンジ領域で始まり、抗体のＣ末端で終わる。従って、完全Ｆｃドメインは、少なくともヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインを含む。ある実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒンジ（例えば、上側、中間、および／または下側ヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、またはそのバリアント、部分、断片のうち少なくとも１つを含む。他の実施形態では、Ｆｃドメインは、完全Ｆｃドメイン（つまり、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン）を含む。一実施形態では、Ｆｃドメインは、ＣＨ３ドメイン（もしくはその一部）に融合されたヒンジドメイン（もしくはその一部）を含む。別の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＣＨ３ドメイン（もしくはその一部）に融合されたＣＨ２ドメイン（もしくはその一部）を含む。別の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＣＨ３ドメイン、もしくはその一部から構成される。別の実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒンジドメイン（もしくはその一部）およびＣＨ３ドメイン（もしくはその一部）から構成される。別の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＣＨ２ドメイン（もしくはその一部）およびＣＨ３ドメインから構成される。別の実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒンジドメイン（もしくはその一部）およびＣＨ２ドメイン（もしくはその一部）から構成される。一実施形態では、Ｆｃドメインは、ＣＨ２ドメインの少なくとも一部（例えば、ＣＨ２ドメインの全部または一部）を欠失している。本明細書におけるＦｃドメインは、一般敵に、免疫グロブリン重鎖のＦｃドメインの全部または一部を含むポリペプチドを指す。これとしては、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、および／またはＣＨ３ドメイン全体を含むポリペプチド、並びに、例えばヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３ドメインのみを含むペプチドの断片が挙げられるが、これらに限定はされない。Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ抗体を含むがこれらに限定はされない、あらゆる種および／またはサブタイプの免疫グロブリンに由来してもよい。ヒトＩｇＧ１の定常領域については、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１８５７および図１を参照されたい。上側ヒンジ領域が欠失したヒトＩｇＧ１のＦｃドメインについては、国際公開第ＷＯ ２０１６／０２５６４２号の表２、配列番号３を参照されたい。Ｆｃドメインは、天然Ｆｃ分子およびＦｃバリアント分子を網羅する。Ｆｃバリアントや天然Ｆｃと同様に、Ｆｃドメインの定義には、抗体全体から消化されたものか他の手段により生成されたものであるかを問わず、単量体または多量体（例えば、二量体）形態の分子が含まれる。アミノ酸残基の番号は、Ｋａｂａｔの定義に従ってＦｃドメインに割り当てた。例えば、本願にもそれぞれ援用されている、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ （Ｔａｂｌｅ ｏｆ Ｃｏｎｔｅｎｔｓ， Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｒｅｇｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｓｅｃｔｉｏｎｓ）， ５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ：ＮＩＨ ｖｏｌ．１：６４７−７２３ （１９９１）； Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， “Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ” Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ＵＳ Ｄｅｐｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， ＮＩＨ， ５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ ｖｏｌ．１ ：ｘｉｉｉ−ｘｃｖｉ （１９９１）； Ｃｈｏｔｈｉａ ＆ Ｌｅｓｋ， Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７ （１９８７）； Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８−８８３ （１９８９）を参照されたい。本明細書に記載のインテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体について、本明細書に記載されている、または既知の任意のＩｇＧから得られる任意のＦｃドメインは、マウス、ヒト、およびそのバリアント、例えばヒンジ欠失（ＥＰＫＳＣ欠失など；国際公開第ＷＯ２０１６／０２５６４２号の配列番号３を参照）を含むＦｃ融合体の一部として採用することができる。
本明細書に記載されているように、任意のＦｃドメインを修飾して天然免疫グロブリン分子の天然Ｆｃドメインにおいてアミノ酸配列を変化させてもよいことは、当業者によって自明であろう。ある例示的実施形態では、Ｆｃドメインにおいて、エフェクター機能が増加している（例えば、ＦｃγＲ結合）。
本発明のポリペプチドのＦｃドメインは、異なる免疫グロブリン分子に由来してもよい。例えば、ポリペプチドのＦｃドメインは、ＩｇＧ１分子に由来するＣＨ２ドメインおよび／またはＣＨ３ドメインと、ＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域を含んでもよい。別の例では、Ｆｃドメインは、一部はＩｇＧ１分子に由来し、一部はＩｇＧ３に由来するキメラヒンジ領域を含むことができる。別の例では、Ｆｃドメインは、一部はＩｇＧ１分子に由来し、一部はＩｇＧ４に由来するキメラヒンジ領域を含むことができる。
指定のポリペプチドまたはタンパク質に「由来する」ポリペプチドまたはアミノ酸配列は、ポリペプチドの起点となる。好ましくは、特定の配列に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、その配列または部分と本質的に同一のアミノ酸配列を有し、当該部分は少なくとも１０〜２０個のアミノ酸、好ましくは少なくとも２０〜３０個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも３０〜５０個のアミノ酸からなり、もしくは、配列に起点があると当業者が特定できるものであればよい。別のペプチドに由来するポリペプチドは、出発ポリペプチド、例えば、他のアミノ酸残基で置換された１または複数のアミノ酸残基、或いは、アミノ酸の挿入又は欠失を１または複数含む１または複数のアミノ酸残基に対して１または複数の突然変異を含んでもよい。
ポリペプチドは、非天然のアミノ酸配列を含むこともできる。上記のバリアントは、ＩＬ−２またはノッチンタンパク質において、必然的に出発ＩＬ−２またはノッチンタンパク質に対し、１００％未満の配列同一性または類似性を有する。いくつかの実施形態では、バリアントは、出発ポリペプチドのアミノ酸配列と約７５％〜１００％未満、より好ましくは約８０％〜１００％未満、より好ましくは約８５％〜１００％未満、さらに好ましくは約９０％〜１００％未満（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）のアミノ酸配列同一性または類似性を持つアミノ酸配列を有することになる。いくつかの実施形態では、約９５％〜１００％未満の、例えば、バリアント分子の長さに渡るアミノ酸配列同一性または類似性を持つ。
一実施形態では、出発ポリペプチド配列とそれに由来する配列は、アミノ酸が１個のみ異なる。本明細書において、最大比率の配列同一性を成し遂げるべく配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後、当該配列に対する同一性または類似性は、出発アミノ酸残基と同一（つまり、同じ残基）である候補配列中のアミノ酸残基の割合として定義される。
一実施形態では、拡張ＰＫ・ＩＬ−２で用いられるＩＬ−２またはそのバリアントを含むポリペプチドは、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５（国際公開第ＷＯ２０１６／０２５６４２号（以下に写しを記載））から選択されるアミノ酸配列により構成されるか、本質的に構成されるか、もしくは含む。一実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５から選択されるアミノ酸配列（国際公開第ＷＯ ２０１６／０２５６４２号（以下に写しを記載））に対して、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５から選択される連続アミノ酸配列（国際公開第ＷＯ ２０１６／０２５６４２号（以下に写しを記載））に対して、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する連続アミノ酸配列を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５から選択される連続アミノ酸配列（国際公開第ＷＯ ２０１６／０２５６４２号（以下に写しを記載））の連続するアミノ酸を少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、２００個、３００個、４００個、または５００個（または、この数字範囲内の任意の整数）有するアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、ペプチドはヌクレオチド配列によりコード化される。ヌクレオチド配列は、クローニング、遺伝子治療、タンパク質発現および精製、変異導入、接種を必要とする宿主のＤＮＡワクチン接種を含み、その他にも、例えば受動免疫、ＰＣＲ、プライマー、プローブ生成に用いられる抗体生成なども含む、多くの用途に有用に用いられる。一実施形態では、本発明のヌクレオチド配列は、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４（国際公開第ＷＯ ２０１６／０２５６４２号（以下に写しを記載））から選択されるＩＬ−２またはそのバリアントのヌクレオチド配列から構成されるか、本質的に構成されるか、もしくは含む。一実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４（国際公開第ＷＯ ２０１６／０２５６４２号（以下に写しを記載））のヌクレオチド配列に対して、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４（国際公開第ＷＯ ２０１６／０２５６４２号（以下に写しを記載））の連続ヌクレオチド配列に対して、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する連続ヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４（国際公開第ＷＯ ２０１６／０２５６４２号（以下に写しを記載））に記載のヌクレオチド配列の連続するヌクレオチドを少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、２００個、３００個、４００個、または５００個（または、この数字範囲内の任意の整数）有するヌクレオチド配列を含む。
表１：配列の概要










一実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチドまたはそのバリアントは、配列番号５９〜１３５から選択されるアミノ酸配列により構成されるか、本質的に構成されるか、もしくは含む。一実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５９〜１３５から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５９〜１３５から選択される連続アミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する連続アミノ酸配列を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５９〜１３５から選択されるアミノ酸配列の連続するアミノ酸を少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、２００個、３００個、４００個、または５００個（または、この数字範囲内の任意の整数）有するアミノ酸配列を含む。
表２：インテグリン結合性ノッチン配列


表３：インテグリン結合性ポリペプチド配列、シグナル配列、リンカー、Ｆｃ融合体


表４：ＩｇＧ配列の例示
本明細書で用いられるＩＬ−２、拡張ＰＫ・ＩＬ−２またはインテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体を変更させ、天然配列の望ましい活性を保持しながら、それらが由来する天然配列における配列を変化してもよいことは、当業者には自明であろう。例えば、保存的置換または「非必須」アミノ酸残基の変化をもたらすヌクレオチドまたはアミノ酸置換が行われてもよい。突然変異は、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発などの標準技術により導入されてもよい。
本明細書に記載のポリペプチド（例えば、ＩＬ−２、拡張ＰＫ・ＩＬ−２、ＰＫ部分、ノッチン、Ｆｃ、ノッチン−Ｆｃ、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体など）は、１または複数のアミノ酸残基、例えば必須または非必須のアミノ酸残基において、保存的アミノ酸置換を含んでもよい。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されたものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で既に定義されており、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。従って、結合ポリペプチドの非必須アミノ酸残基は、好ましくは同じ側鎖ファミリーに属する別のアミノ酸残基で置換される。別の実施形態では、アミノ酸の鎖を、側鎖ファミリーメンバーの順序および｀／または組成が異なるが構造的に類似する鎖で置き換えることができる。或いは、別の実施形態では、飽和突然変異誘発などによりコード化配列の全部または一部に沿って突然変異をランダムに導入してもよく、また、その結果として得た突然変異体を本発明の結合性ポリペプチドに組み込み、所望の標的に結合する能力についてスクリーニングすることができる。
「プログラム細胞死−１（ＰＤ−１）」受容体とは、ＣＤ２８ファミリーに属する免疫抑制受容体である。ＰＤ−１は、主に活性化したＴ細胞においてインビボで発現し、２つの配位子ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２と結合する。本明細書において「ＰＤ−１」とは、ヒトＰＤ−１（ｈＰＤ−１）、ｈＰＤ−１のバリアント、アイソフォーム、種相同体、ｈＰＤ−１と少なくとも１つの共通エピトープを有する類似体を含むものである。完全ｈＰＤ−１配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ５１７７３（国際公開第ＷＯ２０１６／０２５６４２号に記載の配列番号５２）から探し出すことができる。
「プログラム細胞死配位子−１（ＰＤ−Ｌ１）」は、ＰＤ−１に２つある細胞表面糖タンパク質配位子のうち１つ（もう１つはＰＤ−Ｌ２となる）で、ＰＤ−１と結合するとＴ細胞の活性化とサイトカイン分泌を発現減少する。本明細書において「ＰＤ−Ｌ１」とは、ヒトＰＤ−Ｌ１（ｈＰＤ−Ｌ１）、ｈＰＤ−１のバリアント、アイソフォーム、種相同体、ｈＰＤ−Ｌ１と少なくとも１つの共通エピトープを有する類似体を含むものである。完全ｈＰＤ−Ｌ１配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｑ９ＮＺＱ７（国際公開第ＷＯ２０１６／０２５６４２号に記載の配列番号５３）から探し出すことができる。
「細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原−４（ＣＴＬＡ−４）」は、Ｔ細胞表面分子であり、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する。このタンパク質は、ＣＤ８０およびＣＤ８６と結合して、免疫系の発現減少を引き起こす。本明細書において「ＣＴＬＡ−４」とは、ヒトＣＴＬＡ−４（ｈＣＴＬＡ−４）、ｈＣＴＬＡ−４のバリアント、アイソフォーム、種相同体、ｈＣＴＬＡ−４と少なくとも１つの共通エピトープを有する類似体を含むものである。完全ｈＣＴＬＡ−４配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ１６４１０（国際公開第ＷＯ２０１６／０２５６４２号に記載の配列番号５４）から探し出すことができる。
「リンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ−３）」は、ＭＨＣクラスＩＩ分子と結合することでリンパ球活性の阻害に関与する阻害性受容体である。この受容体は、Ｔｒｅｇ細胞の機能を強化し、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の機能を阻害する。本明細書において「ＬＡＧ−３」とは、ヒトＬＡＧ−３（ｈＬＡＧ−３）、ｈＬＡＧ−３のバリアント、アイソフォーム、種相同体、ｈＬＡＧ−３と少なくとも１つの共通エピトープを有する類似体を含むものである。完全ｈＬＡＧ−３配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ１８６２７（国際公開第ＷＯ２０１６／０２５６４２号に記載の配列番号５５）から探し出すことができる。
「Ｔ細胞膜タンパク質−３（ＴＩＭ−３）」は、Ｔ細胞およびＢ細胞の応答性の阻害することでリンパ球活性の阻害に関与する阻害性受容体である。その配位子はガレクチン９であり、様々な種類のがんにおいて発現上昇を引き起こす。本明細書において「ＴＩＭ−３」とは、ヒトＴＩＭ−３（ｈＴＩＭ−３）、ｈＴＩＭ−３のバリアント、アイソフォーム、種相同体、ｈＴＩＭ−３と少なくとも１つの共通エピトープを有する類似体を含むものである。完全ｈＴＩＭ−３配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｑ８ＴＤＱ０（国際公開第ＷＯ２０１６／０２５６４２号に記載の配列番号５６）から探し出すことができる。
「Ｂ７ファミリー」とは、未定義の受容体を持つ阻害性配位子である。Ｂ７ファミリーにはＢ７−Ｈ３およびＢ７−Ｈ４が含まれ、両方とも腫瘍細胞および腫瘍浸潤細胞において発現上昇を引き起こす。完全ｈＢ７−Ｈ３配列および完全ｈＢ７−Ｈ４配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｑ５ＺＰＲ３およびＡＡＺ１７４０６（国際公開第ＷＯ２０１６／０２５６４２号に記載の配列番号５７および５８）から探し出すことができる。
「血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）」は、内皮細胞を選択的に刺激してマトリックス分解酵素の増殖、移動、産生を行う分泌型ジスルフィド結合性ホモダイマーであり、これらはす全て、新しい血管の形成に必要なプロセスです。内皮細胞特異的マイトジェンとして唯一知られている上、ＶＥＧＦは、血管新生成長因子の中でも独特であり、巨大分子に対する血管透過性の一時的な増加を誘導する能力がある。「ＶＥＧＦ」または「ＶＥＧＦ−Ａ」とは、１６５個のアミノ酸を持つヒト血管内皮細胞成長因子、並びに関連のある１２１個のアミノ酸、１４５個のアミノ酸、１８９個のアミノ酸、２０６個のアミノ酸を持つヒト血管内皮細胞成長因子を意味する用語であり、例えば、Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４６： １３０６ （１９８９）， ａｎｄ Ｈｏｕｃｋ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．， ５： １８０６ （１９９１）に、天然対立遺伝子および加工形態と共に言及されている。ＶＥＧＦ−Ａは、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ、ＶＥＧＦ−Ｆ、Ｐ１ＧＦを含む遺伝子ファミリーに属している。ＶＥＧＦ−Ａは、２つの高親和性受容体チロシンキナーゼであるＶＥＧＦＲ−１（Ｆｉｔ−１）およびＶＥＧＦＲ−２（Ｆｌｋ−１ ＫＤＲ）と主に結合する。後者は、ＶＥＧＦ−Ａの血管内皮細胞分裂促進シグナルの伝達に主要な役割を担う伝達物質である。
「ＩｇおよびＩＴＩＭドメインを備えたＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）」は、Ｙｕ Ｘ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０ （１）： ４８-５７ （２００９）に説明されているように、Ｔ細胞とナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）に存在する免疫受容体である。ＷＵＣＡＭおよびＶｓｔｍ３とも呼ばれる。ＴＩＧＩＴは、例えば樹状細胞（ＤＣ）やマクロファージなどに対して高い親和性を有しながら、ＣＤ１５５（ＰＶＲ）と結合する。ＴＩＧＩＴはＣＤ１１２（ＰＶＲＬ２）とも結合するが、親和性は低くなる。さらに、Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ， ４４（５）：９８９−１００４ （２０１６）を参照できる。ヒトＴＩＧＩＴ配列は、アクセッション番号Ｑ４９５Ａ１でＵｎｉＰｒｏｔＫＢに登録されている。
ＣＤ１３７や「腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー９（ＴＮＦＲＳＦ９またはＴＮＲ９）」とも呼ばれる「４−１ ＢＢ」は、Ｔ細胞のクローン性増殖、生存、成長に寄与する受容体である。当該受容体は、末梢単球の増殖の誘導、ＴＣＲ／ＣＤ３トリガー活性化によるＴ細胞アポトーシスの増強、ＣＤ２８共刺激の調節に関与するものであり、Ｔｈ１細胞応答を促進する。この受容体の発現は、リンパ球の活性化により誘導される。ＴＲＡＦアダプタータンパク質は、この受容体と結合し、ＮＦ−κＢの活性化を誘導するシグナルを伝達する。例えば、Ｚｈｏｕ， Ｚ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．， ４５（１−２）：６７−７３ （１９９５）およびＡｌｄｅｒｓｏｎ Ｍ．Ｒ．， ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２４（９）：２２１９−２７ （１９９４）を参照されたい。ヒト４−１ＢＢ（ＴＮＲ）配列は、アクセッション番号Ｑ０７０１１でＵｎｉＰｒｏｔＫＢに登録されている。
「インターフェロンα」とも呼ばれる「ＩＦＮα」または「ＩＦＮ−α」は、プロテインキナーゼおよびオリゴアデニル酸合成酵素（ＯＡＳ）の産生するサイトカインである。このサイトカインは、マクロファージなどの免疫細胞により産生され、抗ウイルス、抗増殖、および免疫調節の特性を持つ。ＩＦＮαはインターフェロンα受容体と結合し、２つの細胞質チロシンキナーゼである、ヤヌスキナーゼ１（ＪＡＫ１）およびチロシンキナーゼ２（ＴＹＫ２）を介して下流側のシグナル伝達を活性化する。チロシンキナーゼはＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路を活性化して、ＩＦＮαの抗ウイルス効果および炎症効果を媒介する。例えば、Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ２８５ （５７６６）， ５４７−５４９ （１９８０）およびＺｏｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６７：１５２１０−１５２１６， （１９９２）を参照されたい。ヒトＩＦＮα配列は、アクセッション番号Ｐ０１５６２またはＰ０１５６３でＵｎｉＰｒｏｔＫＢに登録されている。
「ＧＩＴＲ」は「グルココルチコイド誘発ＴＮＦＲ関連タンパク質」、「腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１８」、「ＴＮＦＲＳＦ１８」、「活性化誘導ＴＮＦＲファミリー受容体」、「ＡＩＴＲ」とも呼ばれ、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーの受容体であり、さらに、共刺激免疫チェックポイント分子でもある。ＧＩＴＲは、制御性Ｔ細胞の抑制活性の阻害とＴエフェクター細胞の寿命の延長に関与する受容体である。ＧＩＴＲは、活性化Ｔ細胞において発現上昇（誘導）できる。例えば、Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ３（２）：１３５−１４２ （２００２）およびＧｕｒｎｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．， ９（４）：２１５−２１８ （１９９９）を参照されたい。ヒトＧＩＴＲ配列は、アクセッション番号Ｑ９Ｙ５Ｕ５でＵｎｉＰｒｏｔＫＢに登録されている。
「ＯＸ４０」は「ＣＤ１３４」、「腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー４」、「ＴＮＦＲＳＦ４」、「ＯＸ４０受容体」とも呼ばれ、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーと受容体であり、二次共刺激免疫チェックポイント分子でもある。ＯＸ４０の発現は、Ｔ細胞の活性化に左右される。その配位子に当たるＯＸ４０ＬはＴ細胞上のＯＸ４０受容体と結合し、Ｔ細胞の死を防ぎ、サイトカインの産生を増強させる。ＯＸ４０がＴｈ１およびＴｈ２を媒介する免疫応答の一因であることは、既に知られている。例えば、Ａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８ （１）：５５８-６５ （１９９８）、Ｂａｕｍ ｅｔ ａｌ．， Ｃｉｒｃ．Ｓｈｏｃｋ， ４４：３０−３４ （１９９４）、Ｌａｔｓａ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ．Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２４（３）：６７７−６８３ （１９９４）を参照されたい。ヒトＯＸ４０配列は、アクセッション番号Ｐ４３４８９でＵｎｉＰｒｏｔＫＢに登録されている。
「ＣＤ４０」は、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーの受容体であり、抗原提示細胞（樹状細胞、Ｂ細胞、マクロファージなど）などの免疫細胞に存在する共刺激タンパク質である。その配位子であるＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４またはＴＮＦＳＦ５）はヘルパーＴ細胞に発現し、ＣＤ４０と結合して抗原提示細胞を活性化する。ＣＤ４０は、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、上皮細胞、腫瘍細胞でも発現する。例えば、Ｇｒｅｗａｌ ａｎｄ Ｆｌａｖｅｌｌ， Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １６：１１１-３５ （１９９８）及びＣｈａｔｚｉｇｅｏｒｇｉｏｕ ｅｔ ａｌ．， ＢｉｏＦａｃｔｏｒｓ （Ｏｘｆｏｒｄ， Ｅｎｇｌａｎｄ）， ３５（６）：４７４-８３ （２００９）を参照されたい。ヒトＣＤ４０配列は、アクセッション番号Ｐ２５９４２でＵｎｉＰｒｏｔＫＢに登録されている。
「誘導性Ｔ細胞共刺激」または「ＣＤ２７８」とも呼ばれる「ＩＣＯＳ」は、ＣＤ２８スーパーファミリーメンバーの共刺激分子であり、活性化Ｔ細胞に発現する。ＩＣＯＳは、Ｔ細胞の増殖とサイトカインの分泌を促進するなど、獲得免疫応答の調節の一因である。例えば、Ｈｕｔｌｏｆｆ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３９７（６７１６）：２６３−６ （１９９９）およびＢｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ．Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ３０：３７０７−３７１７ （２０００）を参照されたい。ヒトＩＣＯＳ配列は、アクセッション番号Ｑ９Ｙ６Ｗ８でＵｎｉＰｒｏｔＫＢに登録されている。
「ＣＤ２８」は、抗原提示細胞に発現するＣＤ８０（Ｂ７．１）およびＣＤ８６（Ｂ７．２）の受容体である。未感作Ｔ細胞に発現するＣＤ２８は、Ｔ細胞の活性化と寿命、サイトカインの産生に関与している。例えば、Ｌｉｎｓｌｅｙ ａｎｄ Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ， Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：１９１-２１２ （１９９３）、Ｎｕｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（３）：１５９１-８ （１９９６）、Ｂｏｕｒ−Ｊｏｒｄａｎ ａｎｄ Ｂｌｕｅｓｔｏｎ， Ｊ． Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２（１）：１-７ （２００２）を参照されたい。ヒトＣＤ２８配列は、アクセッション番号Ｐ１０７４７でＵｎｉＰｒｏｔＫＢに登録されている。
本明細書において「免疫チェックポイント」とは、抗原のＴ細胞受容体認識の振幅および質を調節する刺激シグナルおよび阻害シグナルを指す。ある実施形態では、免疫チェックポイントは阻害シグナルである。ある実施形態では、阻害シグナルは、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の相互作用である。ある実施形態では、阻害シグナルは、ＣＴＬＡ−４と、ＣＤ８０またはＣＤ８６の間の相互作用であり、ＣＤ２８結合を置換する。ある実施形態では、阻害シグナルは、ＬＡＧ−３分子とＭＨＣクラスＩＩ分子の相互作用である。ある実施形態では、阻害シグナルは、ＴＩＭ−３とガレクチン９の相互作用である。ある実施形態では、阻害シグナルは、ＴＩＧＩＴとＣＤ１５５の相互作用である。ある実施形態では、免疫チェックポイントは刺激シグナルであり、例えば、免疫抑制を低減および／または排除するシグナルが含まれる。ある実施形態では、刺激シグナルは、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７とその配位子（例えばＣＤ１３７Ｌ）の間で作用する。ある実施形態では、刺激シグナルは、ＩＦＮαとその配位子の間で作用する。ある実施形態では、刺激シグナルは、ＧＩＴＲとその配位子（例えば、ＧＩＴＲＬ）の相互作用の調節により生じる。ある実施形態では、刺激シグナルは、ＯＸ４０とその配位子（例えば、ＯＸ４０Ｌ）の相互作用の調節により生じる。ある実施形態では、刺激シグナルは、ＩＣＯＳとその配位子の相互作用の調節により生じる。ある実施形態では、刺激シグナルは、ＩＦＮαとその受容体（例えば、ＩＦＮαＲ）の相互作用の調節により生じる。ある実施形態では、刺激シグナルは、ＣＤ２８とその配位子（例えば、ＣＤ８０またはＣＤ８６）の相互作用の調節により生じる。ある実施形態では、刺激シグナルは、ＣＤ４０とその配位子（例えば、ＣＤ４０Ｌ）の相互作用の調節により生じる。
本明細書において「免疫チェックポイント遮断物質」、「免疫チェックポイント阻害物質」または「免疫チェックポイント調節物質」とは、免疫系経路内の１または複数のチェックポイントタンパク質または他のタンパク質の減少、阻害、干渉または調節を誘発する分子を指す。ある実施形態では、免疫チェックポイント阻害物質は、免疫チェックポイントに関連する阻害シグナルを防止する。ある実施形態では、免疫チェックポイント阻害物質は、免疫チェックポイントに関連する阻害シグナルを妨害する抗体、またはその断片である。ある実施形態では、免疫チェックポイント阻害物質は、阻害シグナル伝達を妨害する小分子である。ある実施形態では、免疫チェックポイント阻害物質は、チェックポイント遮断タンパク質の相互作用を防止する抗体、その断片、または抗体模倣物であり、例えばＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の相互作用を防止する抗体またはその断片である。ある実施形態では、免疫チェックポイント阻害物質は、ＣＴＬＡ−４と、ＣＤ８０またはＣＤ８６の相互作用を防止する抗体またはその断片である。ある実施形態では、免疫チェックポイント阻害物質は、ＬＡＧ−３分子とＭＨＣクラスＩＩ分子の相互作用を防止する抗体またはその断片である。ある実施形態では、免疫チェックポイント阻害物質は、ＴＩＭ−３とガレクチン９の相互作用を防止する抗体またはその断片である。チェックポイント遮断物質は、可溶性分子（またはその突然変異）そのもの、例えば可溶性ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ１融合体、並びに可溶性ＴＩＧＩＴまたはＴＩＧＩＴ融合体の形であってもよい。
本明細書において「免疫チェックポイントエンハンサー」、「免疫チェックポイント刺激物質」または「免疫チェックポイント調節物質」とは、免疫系経路内の１または複数のチェックポイントタンパク質または他のタンパク質の増強、増加、または調節を誘発する分子を指す。ある実施形態では、免疫チェックポイント刺激物質は、免疫チェックポイントに関連する阻害シグナルを誘発する。ある実施形態では、免疫チェックポイント刺激物質は、免疫チェックポイント抑制に関連するシグナルを減少させる。ある実施形態では、免疫チェックポイント刺激物質は、免疫チェックポイントに関連する阻害シグナルを増加させる抗体、またはその断片である。ある実施形態では、免疫チェックポイント刺激物質は、免疫チェックポイント抑制に関連するシグナルを減少させる抗体、またはその断片である。ある実施形態では、免疫チェックポイント刺激物質は、阻害シグナル伝達の抑制を妨害する小分子である。ある実施形態では、免疫チェックポイント刺激物質は、チェックポイント阻害タンパク質の相互作用を防止する抗体、その断片、または抗体模倣物であり、例えば、抗体またはその断片である。ある実施形態では、免疫チェックポイント刺激物質は、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＦＮα、ＧＩＴＲ、およびＯＸ４０と、それぞれの関連結合パートナーとの相互作用を妨害する抗体またはその断片である。免疫チェックポイント刺激物質は、可溶性分子（またはその突然変異）そのもの、例えば可溶性ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ１融合体、並びに可溶性ＴＩＧＩＴまたはＴＩＧＩＴ融合体の形であってもよい。
「改善」とは、予防、重症度または進行の緩和、寛解、または治癒を含む、疾患状態、例えばがんの治療における有益な結果を指す。
「インビボ」とは、生体内で生じるプロセスを指す。
本明細書において「哺乳動物」、「対象」または「患者」とは、ヒトおよび非ヒトの両方を含み、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ネズミ、ウシ、ウマ、ブタが挙げられるが、これらに限定はされない。
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列に関する「同一性（％）」という用語は、後述する配列比較アルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮ、または当業者に利用可能な他のアルゴリズム）の１つ、または目視検査により測定される、最大一致度を見るために比較／整列したときにおける、ヌクレオチド残基またはアミノ酸残基が特定の割合で同一である２つ以上の配列または部分配列を指す。「同一性（％）」は、配列における比較対象の領域、例えば機能的ドメイン、或いは、比較対象の配列２つの全長において適用できる。
配列比較につき、通常、１つの配列が、テスト配列を比較する基準となる基準配列として機能する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、テスト配列と基準配列をコンピューターに入力し、必要に応じて部分配列の座標を指定して、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、基準配列に対するテスト配列の配列同一性（％）を計算する。
比較において配列を最適に整列するために、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ， Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２：４８２ （１９８１）の局所ホモロジーアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３ （１９７０）のホモロジー整列アルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：２４４４ （１９８８）の類似法に基づく検索、（ＧＡＰ， ＢＥＳＴＦＩＴ， ＦＡＳＴ Ａ， ａｎｄ ＴＦＡＳＴＡ ｉｎ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓ．）による上記方法のコンピュータ実装、または目視検査（一般的にはＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．、下記を参照）を用いることができる。
配列同一性（％）および配列類似性の決定に適するアルゴリズムの一例としては、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０ （１９９０）に記載のＢＬＡＳＴアルゴリズムが挙げられる。ＢＬＡＳＴ分析を実行するソフトウェアは、国立生物工学情報センターのＷｅｂサイトに公開されている。
本明細書において、「グリシン−セリンポリペプチドリンカー」とはグリシンおよびセリン残基で構成されるペプチドである。グリシン−セリンポリペプチドリンカーの例としては、アミノ酸配列Ｓｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎが挙げられる。一実施形態では、ｎは１である。一実施形態では、ｎは２である。別の実施形態では、ｎは３であり、つまりＳｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３となる。別の実施形態では、ｎは４であり、つまりＳｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４となる。別の実施形態では、ｎは５である。さらに別の実施形態では、ｎは６である。別の実施形態では、ｎは７である。さらに別の実施形態では、ｎは８である。別の実施形態では、ｎは９である。さらに別の実施形態では、ｎは１０である。グリシン−セリンポリペプチドリンカーの別の例としては、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎが挙げられる。一実施形態では、ｎは１である。一実施形態では、ｎは２である。好ましい実施形態では、ｎは３である。別の実施形態では、ｎは４である。別の実施形態では、ｎは５である。さらに別の実施形態では、ｎは６である。グリシン−セリンポリペプチドリンカーの別の例としては、アミノ酸配列（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）ｎが挙げられる。一実施形態では、ｎは１である。一実施形態では、ｎは２である。好ましい実施形態では、ｎは３である。別の実施形態では、ｎは４である。別の実施形態では、ｎは５である。さらに別の実施形態では、ｎは６である。
本明細書において「半減期」とは、例えば、天然のメカニズムによる分解および／またはクリアランス、または隔離により、ポリペプチドの血清または血漿濃度がインビボで５０％減少するまでかかる時間である。本明細書で用いられる拡張ＰＫ・ＩＬ−２は、インビボで安定性を維持し、例えば、ＰＥＧ化によりＨＳＡ、ＭＳＡまたはＦｃに融合することで、もしくは分解および／またはクリアランス、または隔離に対して耐性のある血清アルブミン分子（例えば、ヒト血清アルブミン）と結合することで、半減期が増加する。半減期は、薬物動態分析など、既知の任意の方法で判定することができる。適切な分析法は当業者にとって周知のものであり、例えば一般的に、本発明のアミノ酸配列または化合物の適量を対象に投与するステップ、定期的に対象から血液サンプルまたはその他のサンプルを採取するステップ、該血液サンプルにおける本発明のアミノ酸配列または化合物のレベル、もしくは濃度を判定するステップ、その結果として得たデータ（のプロット）から、投与時の最初のレベルに対してアミノ酸配列または化合物のレベルまたは濃度が５０％減少するまでかかる時間を算出する。さらなる詳細事項は、例えば、Ｋｅｎｎｅｔｈ， Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ： Ａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｆｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｉｓｔｓ、Ｐｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９６）などの標準ハンドブックに記載されている。Ｇｉｂａｌｄｉ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ， ２ｎｄ Ｒｅｖ． Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ （１９８２）も参照することができる。
本明細書において「小分子」とは、分子量が約５００ダルトン未満の分子である。
本明細書において「治療用タンパク質」とは、薬剤として対象に投与することができるポリペプチド、タンパク質、タンパク質バリアント、融合タンパク質および／またはその断片を指す。治療用タンパク質の例としては、インターロイキン、例えばＩＬ−７が挙げられる。
本明細書において、個々の成分２種以上によって生じる効果に関する「相乗効果」とは、併用したとき、これらの成分により生じる総合効果が、各成分が単独に機能して得られる個別効果の和より大きい現象を指す。
本明細書において「十分な量」またはその類似の表現は、所望の効果を生成するのに十分な量、例えば、腫瘍の大きさを小さくするのに十分な量を意味する。
「治療有効量」とは、疾患の症状の改善に有効である量を指す。予防も治療の一種に見なされるので、治療有効量を「予防有効量」と言ってもよい。
本明細書において「併用療法」は、投薬計画における各薬剤の投与または療法の適用を逐次的に行って併用療法の効果を得ること、並びに、略同時に上記の薬剤の同時投与または療法の同時適用を行うことを含む。さらに併用療法には、個々の要素を異なる時間および／または異なる経路で投与したものの、組み合わせで作用し、各薬剤または腫瘍治療の相互作用、もしくは、薬物動態および薬物力学的効果による有益な効果が、併用療法の効果に近接しているものも含まれる。
本明細書において「約（ａｂｏｕｔ）」とは、当業者にとって理解の範疇であり、当該表現が用いられる状況によってある程度変化する。当該表現の意味が文脈からみて当業者にも明確でない場合、「約」は、特定値の±１０％と見なす。
また、本明細書および請求の範囲において、別途の明記がない限り、単数形の「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」は、複数形を網羅するものとして見なす。
本明細書で説明される様々な態様を、以下でさらに詳細に説明する。
ＩＩＩ．ＩＬ−２および拡張ＰＫ・ＩＬ−２
本発明のインテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体は、ＩＬ−２および／または延長ＩＬ−２の非存在下で用いることができる。いくつかの実施形態では、本発明のインテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体はＩＬ−２と組み合わせて用いることができ、半減期延長ＩＬ−２の使用を必要としない。いくつかの実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体は、半減期延長ＩＬ−２と組み合わせて用いてもよい。
インターロイキン−２（ＩＬ−２）は、抗原活性化Ｔ細胞の増殖を誘導し、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を刺激するサイトカインである。ＩＬ−２の生物学的活性は、細胞膜を貫通する３種のポリペプチドサブユニット、つまり、ｐ５５（ＩＬ−２Ｒａ：αサブユニット、ヒトではＣＤ２５とも呼ばれる）、ｐ７５（ＩＬ−２ＲＰ：βサブユニット、ヒトではＣＤ１２２とも呼ばれる）、ｐ６４（ＩＬ−２Ｒｙ：γサブユニット、ヒトではＣＤ１３２とも呼ばれる）を有する、マルチサブユニット型ＩＬ−２受容体複合体（ＩＬ−２Ｒ）により媒介される。ＩＬ−２に対するＴ細胞の応答は、（１）ＩＬ−２の濃度、（２）細胞表面のＩＬ−２Ｒ分子の数、（３）ＩＬ−２により占められるＩＬ−２Ｒの数（すなわち、ＩＬ−２とＩＬ−２Ｒの相互作用の親和性（Ｓｍｉｔｈ， “Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｓ Ｑｕａｎｔａｌ” Ｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ Ａｎｔｉｇｅｎｓ， Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ， Ｈｏｒｍｏｎｅｓ， ａｎｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ７６６：２６３−２７１， １９９５）など、様々な要因に左右される。ＩＬ−２ＴＬ−２Ｒ複合体は、配位子が結合すると内部に取り込まれ、様々な成分が差分選別を受ける。ＩＬ−２Ｒａは細胞表面に再循環されるが、ＩＬ−２ＴＬ−２Ｒｐγ複合体と結合したＩＬ−２はリソソームに送られ分解される。急速静注（ｉｖ）により投与する場合、ＩＬ−２は急速な全身クリアランス（半減期１２．９分の初期クリアランス相に続き、半減期８５分の遅いクリアランス相）を有する（Ｋｏｎｒａｄ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０：２００９−２０１７， １９９０）。
従って、いくつかの実施形態では、ＩＬ−２全身投与などのＩＬ−２療法は、インテグリン結合性Ｆｃ融合タンパク質の有効量を、必要によって免疫チェックポイント阻害物質と組み合わせて、対象に投与する。
しかしながら、がん患者にＩＬ−２全身投与を行っても、その結果はあまり理想的とは言えない。客観的に見て、患者の１５〜２０％は高用量のＩＬ−２に反応するが、大多数は反応せず、多くは吐き気、混乱、低血圧、敗血性ショックを含む、命にかかわるほどの重大な副作用に苦しむことになる。ＩＬ−２治療に伴う重度の毒性は、主にナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性に起因する。ＮＫ細胞は中間親和性受容体のＩＬ−２Ｒβｙｃを発現するため、ナノモル濃度のＩＬ−２で刺激され、実際に高用量ＩＬ−２療法中に患者の血清に影響を及ぼす。用量を減らし、投薬計画を調整して、血清の濃度を低下させ、ＩＬ−２Ｒａβｙｃ保有細胞を選択的に刺激する方法を試みたが、低毒性の代わり、治療効果も低かった。高用量のＩＬ−２がん治療における毒性の問題を考慮し、多くの研究者が、治療用抗体を同時に投与してＩＬ−２の抗がん効果を改善する方策を試してきた。しかしながら、ほとんどは成功せず、ＩＬ−２療法のみを行った場合に比べて、臨床的効果は一切得られなかった。よって、様々ながんをより効率的に治療するためには、新規のＩＬ−２療法が必要である。
近年、出願人は、ＩＬ−２を薬物動態修飾基と結合すれば、様々ながんモデルにおける腫瘍を制御するＩＬ−２の能力を実質的に増加させることができるとの知見を得た。その結果として得られた分子を以下で「拡張薬物動態（ＰＫ）ＩＬ−２」と呼ぶ。遊離ＩＬ−２と比べ、循環半減期が延長されたものである。拡張ＰＫ・ＩＬ−２の長い循環半減期のため、インビボの血清ＩＬ−２濃度を治療範囲内に維持でき、Ｔ細胞を含む各種の免疫細胞の活性化が促進される。非修飾ＩＬ−２と比較してみると、好ましい薬物動態プロファイルにより、拡張ＰＫ・ＩＬ−２の投与頻度は低くなり、より長時間に渡って投与することができる。拡張ＰＫ・ＩＬ−２は、２０１３年５月２１日に出願され、２０１２年５月２２日に出願された米国仮出願第６１／６５０２７７号に対して優先権を主張する国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０４２０５７号により詳細に記載される。上記の出願は本願にも援用されている。
１．ＩＬ−２およびその突然変異体
ある実施形態では、有効量のヒトＩＬ−２を全身投与する。いくつかの実施形態では、有効量の拡張ＰＫ・ＩＬ−２を全身投与する。一実施形態では、ＩＬ−２は、プロロイキン（登録商標）（アルデスロイキン）などのヒト組換えＩＬ−２である。プロロイキンは、大腸菌で産生されたヒト組換えインターロイキン−２製品である。プロロイキンは、（ａ）グリコシル化されていない、（ｂ）Ｎ末端アラニンがない、（ｃ）アミノ酸１２５位のシステインがセリンに置換されているという点で、天然インターロイキン−２とは異なる。プロロイキンは、生物学的活性を有し、非共有結合した微小凝集体として存在し、平均サイズは組換えインターロイキン−２分子２７個に相当する。プロロイキン（アルデスロイキン）は、静脈内注入によって投与される。いくつかの態様では、拡張ＰＫ・ＩＬ−２のＩＬ−２部分は野生型ＩＬ−２である（例えば、前駆体形のヒトＩＬ−２（国際公開第ＷＯ２０１６／０２５６４２号に記載の配列番号３３、本願に援用されている）、または成熟ＩＬ−２（国際公開第ＷＯ２０１６／０２５６４２号に記載の配列番号３５、本願に援用されている）など）。
ある実施形態では、拡張ＰＫ・ＩＬ−２は、突然変異により、非修飾ＩＬ−２に対してＩＬ−２Ｒα受容体に対する親和性が変化している（例えば、より高い親和性を有する）。
部位特異的突然変異誘発を用いて、野生型ＩＬ−２と比べて、ＣＤ２５、すなわちＩＬ−２Ｒａに高い親和性結合を示すＩＬ−２変異体を単離することができる。細胞表面におけるＩＬ−２Ｒａに対するＩＬ−２の親和性を増加させると、限定的な範囲内のＩＬ−２濃度で受容体占有率が増加し、細胞表面におけるＩＬ−２の局所濃度は上昇する。
ある実施形態では、本発明の特徴であるＩＬ−２変異体は、実質的に精製され、高親和性ＣＤ２５結合物質として機能してもよいが、必ずそのようにする必要はない。ＩＬ−２は、抗原活性化Ｔ細胞の増殖を誘導し、ＮＫ細胞を刺激するＴ細胞成長因子である。高親和性結合物質であるＩＬ−２変異体の例としては、配列番号７、２３、２５、２７、２９、３１のアミノ酸配列を有するものなど、国際公開第ＷＯ２０１３／１７７１８７Ａ２号（本願にも援用されている）に記載されるものが挙げられる。ＣＤ２５に対する親和性が増大したＩＬ−２変異体のさらなる例としては、本願に援用されている米国特許第７，５６９，２１５号に開示されている。一実施形態では、ＩＬ−２変異体はＣＤ２５、例えば配列番号９および１１に示されるアミノ酸配列を有するものとは結合しない。
ＩＬ−２変異体は、ＣＤ２５を結合する配列番号３３（本願に援用されている国際公開第ＷＯ ２０１６／０２５６４２号を参照）に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、ＩＬ−２変異体には、野生型ＩＬ−２と比べてＩＬ−２受容体のαサブユニットに対する親和性を増加させる、少なくとも１つの変異（例えば、アミノ酸残基１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上の欠失、付加、置換）が生じていてもよい。マウスＩＬ−２で同定された突然変異は、配列番号３２（本願に援用されている国際公開第ＷＯ２０１６／０２５６４２号を参照）の全長ヒトＩＬ−２（核酸配列（アクセッション番号：ＮＭ０００５８６））、アミノ酸配列（本願に援用されている国際公開第ＷＯ２０１６／０２５６４２号に記載の配列番号３３のアクセッション番号Ｐ６０５６８）、シグナルペプチドを含まないヒトＩＬ−２（配列番号３４の核酸配列（本願に援用されている国際公開第ＷＯ２０１６／０２５６４２号を参照）、または配列番号３５のアミノ酸配列（本願に援用されている国際公開第ＷＯ２０１６／０２５６４２号を参照）の、対応残基で行われてもよい。従って、ある実施形態では、拡張ＰＫ・ＩＬ−２のＩＬ−２部分はヒトＩＬ−２である。他の実施形態では、拡張ＰＫ・ＩＬ−２のＩＬ−２部分はヒトＩＬ−２変異体である。
ＩＬ−２変異体のアミノ酸配列は、野生型ＩＬ−２（前駆体または成熟型）に対して、少なくとも、または約５０％、少なくとも、または約６５％、少なくとも、または約７０％、少なくとも、または約８０％、少なくとも、または約８５％、少なくとも、または約８７％、少なくとも、または約９０％、少なくとも、または約９５％、少なくとも、または約９７％、少なくとも、または約９８％、少なくとも、または約９９％の同一性を有する。突然変異は、アミノ酸残基の数、または含有量の変化により生じてもよい。例えば、ＩＬ−２変異体は、野生型ＩＬ−２よりも多い、または少ない数のアミノ酸残基を有してもよい。或いは、またはさらに、ＩＬ−２変異体において、野生型ＩＬ−２に存在する１または複数のアミノ酸残基が置換されていてもよい。
例として、配列番号３３の基準アミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドは、配列番号３３の基準アミノ酸のうち最大５個までが変更されていることを除けば、基準配列を同じである（本願に援用されている国際公開第ＷＯ２０１６／０２５６４２号を参照）。例えば、参照配列におけるアミノ酸残基を最大５％まで欠失するか別のアミノ酸で置換してもよく、基準配列における総アミノ酸残基の最大５％までアミノ酸を挿入してもよい。基準配列における上記の変化は、基準アミノ酸配列のアミノ（Ｎ−）またはカルボキシ（Ｃ−）末端位置、または末端位置間の任意の場所で生じ、基準配列内の残基間また１または複数の連続基に個々散在する。
置換されたアミノ酸残基は、通常、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、リジン、アルギニン、フェニルアラニン、チロシンを置換する、保存的置換であってもよいが、必ずそうである必要はない。突然変異は、ＩＬ−２Ｒａと接触するアミノ酸残基で生じることがある。
一般的に、本発明の実施に用いられるポリペプチドは合成であるか、或いは、組換え核酸分子の発現により産生されるものである。ポリペプチドが拡張ＰＫ・ＩＬ−２である場合（例えば、少なくともＩＬ−２と、ヘキサヒスチジンタグ、血球凝集素タグ、Ｆｃ領域、またはヒト血清アルブミンなどの異種ポリペプチドと、を含む融合タンパク質）、ＩＬ−２をコード化する１つの配列と異種ポリペプチドの全部または一部をコード化する第２の配列と、を含むハイブリッド核酸分子によりコード化される。
ＩＬ−２変異体の作製に必要な技術は、当技術分野では周知のものであり、当業者であれば、過度な実験を行わずとも実施することができる。例えば、ＩＬ−２の１または複数のアミノ酸残基の置換による突然変異は、ＰＣＲ支援突然変異誘発技術を用いて作製することができる（例えば、当技術分野で周知であるか、および／または本明細書に記載のＩＬ−２変異体）。ＩＬ−２ポリペプチドに対するアミノ酸残基の欠失または付加を含む突然変異は、標準的な組換え技術により行うことができる。欠失または付加を行う場合、ＩＬ−２をコード化する核酸分子は適切な制限エンドヌクレアーゼで簡単に消化される。結果として得た断片は、直接発現させてもよく、２番目の断片に連結（ｌｉｇａｔｉｏｎ）させるなど、さらに操作してもよい。核酸分子の２つの末端が重なり合う相補的ヌクレオチドを含む場合、連結が促進されるが、平滑末端断片も連結されることになる。ＰＣＲにより生成された核酸を用いて、様々な変異配列を生成することもできる。
分子生物学における組換え手法により変更された核酸分子の発現を介してＩＬ−２変異体を生成するが、ＩＬ−２変異体を化学的に合成することができる。当業者にとって、化学合成ポリペプチドの生成は周知の手法である。
上述の通り、ＩＬ−２は、ＩＬ−２および異種ポリペプチド（つまり、ＩＬ−２ではないポリペプチド）を含む融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドとして調製することもできる。異種ポリペプチドは、インビボでキメラポリペプチドの循環半減期を延長することができ、従って、ＩＬ−２の特性のさらなる増強が期待される。詳細は後述するが、循環半減期を増加させるポリペプチドは、ヒトまたはマウス血清アルブミンなどの血清アルブミンであってもよい。
他の実施形態では、キメラポリペプチドは、ＩＬ−２、並びに、ＦＬＡＧ配列など、抗原タグとして機能するポリペプチドを含むことができる。ＦＬＡＧ配列は、本明細書に記載されているように、高特異的ビオチン化抗ＦＬＡＧ抗体により認識される（Ｂｌａｎａｒ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６： １０１４， １９９２； ＬｅＣｌａｉｒ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：８１４５， １９９２も参照されたい）。ある実施形態では、キメラポリペプチドは、Ｃ末端ｃ−ｍｙｃエピトープタグをさらに含む。
キメラポリペプチドは、従来の分子生物学的技術のみを用いて構築することが可能であるが、当業者であれば、格別な困難なく実施できる。
２．ＩＬ−２をコード化する核酸分子
ＩＬ−２は、単独で、または本明細書に記載されるものなどのキメラポリペプチドの一部として、核酸分子の発現により得ることができる。従って、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４の核酸配列を有するものなど、ＩＬ−２またはＩＬ−２変異体を含むポリペプチドをコード化する核酸分子は、本発明の請求の範囲に属するものとして見なされる。野生型ＩＬ−２との同一性を以ってＩＬ−２変異体を記述しているので、ＩＬ−２変異体をコードかする核酸分子も、必然的に野生型ＩＬ−２をコード化する核酸分子とある程度の同一性を有することになる。例えば、例えば、ＩＬ−２変異体をコード化する核酸分子は、全長の野生型ＩＬ−２（例えば、本願に援用されている国際公開第ＷＯ２０１６／０２５６４２号の配列番号３２）、またはシグナルペプチドを含まない野生型ＩＬ−２（例えば、本願に援用されている国際公開第ＷＯ２０１６／０２５６４２号の配列番号３４）をコード化する核酸に対して、少なくとも５０％、少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９５％（例えば９９％）の同一性を有する。
本発明の核酸分子には、天然配列、または天然配列とは異なるが遺伝情報の縮重により同じポリペプチドをコード化する配列が含まれる。これらの核酸分子は、ＲＮＡ、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはホスホアミダイト系の合成により生成されるものなどの合成ＤＮＡ）、または当該核酸内のヌクレオチドを組み合わせたもの、または修飾したもので構成される。さらに、核酸分子は、二本鎖、または一本鎖（つまり、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれか）であってもよい。
核酸分子は、ポリペプチドをコード化する配列に限定されない。コード化配列（例えば、ＩＬ−２のコード化配列）の上流側または下流側にある非コード化配列の一部または全部を含めてもよい。分子生物分野の当業者にとって、核酸分子を単離する手法は、既に周知のものである。例えば、制限エンドヌクレアーゼによるゲノムＤＮＡの処理により、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により生成することができる。核酸分子がリボ核酸（ＲＮＡ）である場合、分子は、例えば、インビトロ転写により生成されることになる。
単離された核酸分子は、自然状態では見出されない断片を含むこともある。従って、本発明には、核酸配列（例えば、ＩＬ−２変異体をコード化する配列）を、異種細胞（または、天然の染色体位置以外の位置にある相同細胞のゲノム）のゲノム、またはベクター（例えば、プラスミドまたはウイルスベクター）に組み込んだものなど、組換え分子の使用も含まれる。
上述の通り、本発明のＩＬ−２変異体は、キメラポリペプチドの一部として存在してもよい。上記の異種ポリペプチドに加えて、またはその代わりに、本発明の核酸分子は「マーカー」または「レポーター」をコード化する配列を含んでもよい。マーカーまたはレポーター遺伝子の例としては、β−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ、Ｇ４１８ｒ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ヒグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ｌａｃｚ（β−ガラクトシダーゼをコードする）、キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）が挙げられる。本発明の実施に係る多くの標準手順と同じく、当業者にとって、例えばマーカーまたはレポーターとして機能できる追加配列など、有用な追加試薬は、既に周知のものであろう。
本発明の核酸分子は、哺乳類の細胞など、任意の生物細胞から得られたＩＬ−２をコード化するＤＮＡに突然変異を導入することで、得ることができる。よって、本明細書で使用される核酸（並びに、核酸がコード化するポリペプチド）は、マウス、ラット、モルモット、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ウサギ、サル、ヒヒ、イヌ、またはネコのものであってもよい。通常、核酸分子はヒトのものである。
３．拡張ＰＫ基
上記のように、ＩＬ−２または変異体ＩＬ−２は拡張ＰＫ基と融合して、循環半減期を延長することができる。拡張ＰＫ基の例としては以下のものが挙げられるが、これらに限定はされない。ＩＬ−２またはそのバリアントの循環半減期を延長する他のＰＫ基も、拡張ＰＫ・ＩＬ−２に適用することができる。
ある実施形態では、拡張ＰＫ・ＩＬ−２の血清半減期は、ＩＬ−２単独（つまり、拡張ＰＫ基と融合していないＩＬ−２）より増加している。ある実施形態では、拡張ＰＫ・ＩＬ−２の血清半減期は、ＩＬ−２単独の血清半減期に対して、少なくとも２０％、４０％、６０％、８０％、１００％、１２０％、１５０％、１８０％、２００％、４００％、６００％、８００％、または１０００％長い。他の実施形態では、拡張ＰＫ・ＩＬ−２の血清半減期は、ＩＬ−２単独の血清半減期の、少なくとも１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、１０倍、１２倍、１３倍、１５倍、１７倍、２０倍、２２倍、２５倍、２７倍、３０倍、３５倍、４０倍、または５０倍である。ある実施形態では、拡張ＰＫ・ＩＬ−２の血清半減期は、少なくとも１０時間、１５時間、２０時間、２５時間、３０時間、３５時間、４０時間、５０時間、６０時間、７０時間であり、８０時間、９０時間、１００時間、１１０時間、１２０時間、１３０時間、１３５時間、１４０時間、１５０時間、１６０時間、または２００時間である。
４．血清アルブミンおよび血清アルブミン結合性タンパク質
ある実施形態では、拡張ＰＫ基は、血清アルブミンまたはその断片である。血清アルブミンをタンパク質に融合する方法は、例えば、本願にも援用されている米国公開第２０１０／０１４４５９９号、米国公開第ＵＳ２００７／００４８２８２号、米国公開第２０１１／００２０３４５号に開示されている。ある実施形態では、拡張ＰＫ基は、米国特許第５，８７６，９６９号、国際公開第２０１１／１２４７１８号、国際公開第ＷＯ２０１３／０７５０６６号、国際公開第ＷＯ２０１１／０５１４７８９号に記載されている、ＨＳＡ、またはそのバリアントまたは断片である。
ある実施形態では、拡張ＰＫ基は、本願にも援用されている米国公開第２００５／０２８７１５３号、米国公開第２００７／０００３５４９号、米国公開第２００７／０１７８０８２号、米国公開第２００７／０２６９４２２号、米国公開第２０１０／０１１３３３９号、国際公開第ＷＯ２００９／０８３８０４号、国際公開第ＷＯ２００９／１３３２０８号に記載されている、血清アルブミン結合性タンパク質である。
１．ＰＥＧ化
ある実施形態では、本明細書で用いられる拡張ＰＫ・ＩＬ−２は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ドメインを含む。ＰＥＧ化がタンパク質の循環半減期を増加させることは、当技術分野で周知の事実である。ＰＥＧ化の方法については、例えば、本願に援用されている米国特許第７，６１０，１５６号、米国特許第７，８４７，０６２号に開示されている。
ＰＥＧは周知の水溶性ポリマーであり、市販のものを入手してもよく、当技術分野で周知の方法に従ってエチレングリコールの開環重合により調製してもよい（Ｓａｎｄｌｅｒ ａｎｄ Ｋａｒｏ， Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｖｏｌ． ３， ｐａｇｅｓ １３８−１６１）。「ＰＥＧ」という用語は、サイズを問わず、またはＰＥＧ末端の修飾の有無を問わず、あらゆるポリエチレングリコール分子を幅広く含む概念であり、式Ｘ−０（ＣＨ２ＣＨ２０）ｎ−ｉＣＨ２ＣＨ２ＯＨで表される。ｎは２０〜２３００であり、ＸはＨまたは末端修飾、例えばＣ１．４アルキルである。一実施形態では、本発明のＰＥＧは、一端がヒドロキシまたはメトキシで終わる。つまり、ＸはＨ、またはＣＨ３である（「メトキシＰＥＧ」）。ＰＥＧは、結合反応に必要な化学基、例えば分子の化学合成から生じるもの、または分子部分間の距離を最適に保つためのスペーサなどを、さらに含むことができる。なお、該ＰＥＧは、互いに連結されている１または複数のＰＥＧ側鎖で構成される。複数のＰＥＧ鎖を有するＰＥＧは、マルチアームまたは分岐ＰＥＧと呼ばれる。分岐ＰＥＧは、例えば、グリセロール、ペンタエリスリオール、ソルビトールなど、様々なポリオールにポリエチレンオキシドを付加して調製することができる。例えば、四腕分岐ＰＥＧはペンタエリスリオールとエチレンオキシドから調製できる。分岐ＰＥＧについては、例えば、本願に援用されている欧州公開第０４７３０８４号および米国特許第５９３２４６２号に記載されている。ＰＥＧの一例は、リジンの一級アミノ基を介して結合した２つのＰＥＧ側鎖（ＰＥＧ２）を含むものである（Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ １９９５；６：６２−９）。
一実施形態では、ＰＥＧ化ＩＬ−２は、部位特異的ＰＥＧ化により、特にＰＥＧのＮ末端またはＣ末端のシステイン部分への結合により生成される。ＰＥＧ部分はまた他の化学的性質により付着されてもよく、アミンへの結合によるものを含む。
ペプチドまたはタンパク質に対するＰＥＧ共役には、一般的に、ＰＥＧの活性化と、活性化ＰＥＧ中間体と標的タンパク質／ペプチドの直接カップリング、または、標的タンパク質／ペプチドの活性化や結合に繋がるリンカーへのカップリングが含まれる（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ， ＪＢＣ １９７７； ２５２：３５７１ ａｎｄ ＪＢＣ １９７７； ２５２：３５８２、Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ． ａｌ， ｉｎ：Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ） Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ： Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ； （Ｊ． Ｍ． Ｈａｒｒｉｓ ｅｄ．） Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ： Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９２； Ｃｈａｐ． ２１ ａｎｄ ２２を参照）。
ＰＥＧの分子量は、例えば、ＩＬ−２への結合のために、約１０００ダルトン（Ｄａ）から１０００００Ｄａ（ｎは２０〜２３００）の範囲で選択することができる。ＰＥＧの繰り返し単位の数「ｎ」は、ダルトンで表される分子量に近似している。活性化リンカー上のＰＥＧの結合分子量は、医薬用途に適する量であることが好ましい。従って、一実施形態では、ＰＥＧ分子の分子量は１０００００Ｄａを超えない。例えば、３つのＰＥＧ分子がリンカーに結合し、各ＰＥＧ分子の分子量が同じ１２０００Ｄａ（各ｎは約２７０）である場合、リンカー上のＰＥＧの総分子量は約３６０００Ｄａ（合計ｎ約８２０）になる。リンカーに付着したＰＥＧの分子量が異なっていてもよい。例えば、リンカー上の３つの分子のうち、２つのＰＥＧ分子は、それぞれ５，０００Ｄａ（各ｎは約１１０）であり、残り１つのＰＥＧ分子は１２０００Ｄａ（ｎは約２７０）である。
当業者は、例えば、ＰＥＧ化ＩＬ−２を利用する治療の種類、所望の用量、循環時間、タンパク質分解に対する耐性、免疫原性、および他の条件に基づいて、ＰＥＧに適した分子量を選択できる。ＰＥＧおよびタンパク質の特性を向上させるＰＥＧの使用については、Ｎ． Ｖ． Ｋａｔｒｅ， Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ １９９３；１０：９１−１１４を参照されたい。
本発明の一実施形態では、ＰＥＧ分子は、活性化され、リジンなどのＩＬ−２上のアミノ基と反応してもよい（Ｂｅｎｃｈａｍ Ｃ． Ｏ． ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １３１， ２５ （１９８３）； Ｖｅｒｏｎｅｓｅ， Ｆ． Ｍ． ｅｔ ａｌ， Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １１， １４１ （１９８５）； Ｚａｌｉｐｓｋｙ， Ｓ． ｅｔ ａｌ， Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， ａｄｒｓ ９−１１０ ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ４６９ （１９９９）； Ｚａｌｉｐｓｋｙ， Ｓ． ｅｔ ａｌ， Ｅｕｒｏｐ． Ｐｏｌｙｍ． Ｊ．， １９， １１７７−１１８３ （１９８３）； Ｄｅｌｇａｄｏ， Ｃ． ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １２， １１９−１２８ （１９９０））。
一実施形態では、ＰＥＧの炭酸エステルを用いて、ＰＥＧ−ＩＬ−２共役体を形成する。Ν，Ν’−ジスクシンイミジルカーボネート（ＤＳＣ）を用いてＰＥＧと反応させ、活性混合ＰＥＧ−スクシンイミジルカーボネートを形成し、続いてリンカーの求核基またはＩＬ−２のアミノ基と反応させてもよい（米国特許第５２８１６９８号および米国特許第５９３２４６２号を参照）。同様の反応として１，１’−（ジベンゾトリアゾリル）カーボネートおよびジ−（２−ピリジル）カーボネートをＰＥＧと反応させ、それぞれ、ＰＥＧ−ベンゾトリアゾリルおよびＰＥＧ−ピリジル混合カーボネートを形成してもよい（米国特許第５３８２６５７号）。
ＩＬ−２のＰＥＧ化は、例えばＩＬ−２と求電子活性ＰＥＧ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｃｏｒｐ．， ＵＳＡ， ｗｗｗ．ｓｈｅａｒｗａｔｅｒｃｏｒｐ．ｃｏｍ）との反応など、最新技術に従って実施することができる。好ましいＰＥＧ試薬としては、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルプロピオネート（ＰＥＧ−ＳＰＡ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルブタノエート（ＰＥＧ−ＳＢＡ）、ＰＥＧ−スクシンイミジルプロピオネート、またはｍＰＥＧ２−ＮＨＳなどの分岐Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉ， Ｃ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ６ （１９９５） ６２−６９）が挙げられる。
別の実施形態では、ＰＥＧ分子をＩＬ−２上のスルフヒドリル基にカップリングしてもよい（Ｓａｒｔｏｒｅ， Ｌ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ２７， ４５ （１９９１）、Ｍｏｒｐｕｒｇｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎ． Ｃｈｅｍ．， ７， ３６３−３６８ （１９９６）、Ｇｏｏｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （１９９０） ８， ３４３、米国特許第５７６６８９７号）。米国特許第６６１０２８１号および米国特許第５７６６８９７号は、スルフヒドリル基とカップリングできる反応性ＰＥＧ種の例示を記載している。
ある実施形態では、ＰＥＧ分子がＩＬ−２上のシステイン残基に共役させる。システイン残基はＩＬ−２に由来する。一方、他の実施形態では、１または複数のシステイン残基がＩＬ−２に組み込まれる。突然変異をＩＬ−２のコード化配列に導入して、システイン残基を生成してもよい。これは、例えば、１または複数のアミノ酸残基をシステインに変異させることにより成し遂げると思われる。システイン残基への変異にアミノ酸の例として、好ましくは、セリン、スレオニン、アラニン、その他の親水性残基が挙げられる。好ましくは、システインに変異する残基は、表面曝露残基である。一次配列またはタンパク質に基づいて残基の表面接近可能度を予測するアルゴリズムは、当技術分野で周知のものである。
別の実施形態では、ＰＥＧ化ＩＬ−２は、リンカーに共有結合した１または複数のＰＥＧ分子を含む。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化ＩＬ−２はＮＫＴＲ−２１４である。ＮＫＴＲ−１２は、６つの放出性ポリエチレングリコールＰＥＧ鎖と共役させたＩＬ−２である。インビボでは、Ｃｈａｒｙｃｈ， Ｄ．Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．； ２２（３）： ６８０−６９０ （２０１６）に記載されているように、ＰＥＧ鎖は徐々に放出され、活性ＩＬ−２共役体を生成する。
一実施形態では、ＩＬ−２はＣ末端でＰＥＧ化されている。特定の実施形態では、タンパク質は、Ｃ末端アジドメチオニンの導入、並びに、シュタウディンガー反応を介したメチル−ＰＥＧ−トリアリールホスフィン化合物の共役により、Ｃ末端でＰＥＧ化される。上記のＣ末端共役法については、Ｃａｚａｌｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃ−Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｔｒｕｎｃａｔｅｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ Ｍｕｔａｎｔ ｗｉｔｈ Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｕｌｌ Ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ． ２００４； １５（５）： １００５− １００９を参照されたい。
ＩＬ−２のモノＰＥＧ化は、国際公開第ＷＯ９４／０１４５１号に記載されている一般的な方法に従って行われてもよい。国際公開第ＷＯ９４／０１４５１号は、修飾末端アミノ酸α炭素反応基を有する組換えポリペプチドを調製する方法を記載している。この方法には、組換えポリペプチドを形成し、Ｎ末端アルファアミンおよびＣ末端アルファカルボキシルで１または複数の生物学的に付加された保護基により保護するステップが含まれる。次いで、ポリペプチドを化学的保護剤と反応させ、反応性側鎖基を選択的に保護し、側鎖基の修飾を防止する。次いで、ポリペプチドを、生物学的保護基に特異的な開裂剤で開裂し、未保護の末端アミノ酸α炭素反応性基を形成する。未保護の末端アミノ酸α炭素反応性基を、化学修飾剤で修飾する。次に、側鎖保護末端修飾単一コピーポリペプチドを、側鎖基で脱保護して、末端修飾組換え単一コピーポリペプチドを形成する。当該方法におけるステップの数や順序は、ポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端アミノ酸での選択的修飾のために変更してもよい。
共役反応におけるＩＬ−２と活性化ＰＥＧの比は、約１：０．５〜１：５０、約１：１〜１：３０、または約１：５〜１：１５であってもよい。様々な水性緩衝液を触媒として利用し、ＩＬ−２またはそのバリアントに対するＰＥＧの共有結合的付加を促進してもよい。一実施形態では、用いられる緩衝液のｐＨは約７．０〜９．０である。別の実施形態では、ｐＨはわずかに塩基性の範囲、例えば約７．５〜８．５である。中性ｐＨ範囲に近いｐＫａを有する緩衝液、例えばリン酸緩衝液を用いてもよい。
サイズ排除（例えば、ゲル濾過）クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーなど、当技術分野で公知の従来の分離および精製技術を用いて、ＰＥＧ化ＩＬ−２を精製することができる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて生成物を分離してもよい。分離してもよい生成物には、モノＰＥＧ化、ジＰＥＧ化、トリＰＥＧ化、ポリＰＥＧ化、未ＰＥＧ化ＩＬ−２、および遊離ＰＥＧが含まれる。溶出ピークの周りにより広い画分をプールして、組成物中のモノＰＥＧの割合を増加することにより、モノＰＥＧ共役体の割合を制御できる。
一実施形態では、本発明のＰＥＧ化ＩＬ−２は、１つ、２つ、またはそれ以上のＰＥＧ部分を含む。一実施形態では、ＰＥＧ部分は、タンパク質の表面上および／またはＣＤ２５と接触する表面から離れているアミノ酸残基と結合している。一実施形態では、ＰＥＧ−ＩＬ−２中のＰＥＧの結合分子量または総分子量は、約３０００Ｄａ〜６００００Ｄａであり、場合によっては約１００００Ｄａ〜３６０００Ｄａである。一実施形態では、ＰＥＧ化ＩＬ−２中のＰＥＧは、略直線状の直鎖ＰＥＧである。
一実施形態では、本発明のＰＥＧ化ＩＬ−２は、好ましくは、非修飾タンパク質に対して少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の生物活性を保持する。一実施形態では、生物活性とは、ＣＤ２５と結合する能力を指す。ＰＥＧ修飾ＩＬ−２の血清クリアランス率は、未修飾ＩＬ−２のクリアランス率に対して、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％まで低下する。ＰＥＧ修飾ＩＬ−２の循環半減期は、非修飾ＩＬ−２の半減期より向上する。ＰＥＧ−ＩＬ−２またはそのバリアントの半減期は、未修飾のＩＬ−２の半減期に対して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、４００％、５００％、または１０００％向上される。ある実施形態では、タンパク質の半減期は、緩衝食塩水または血清などを用いて、インビトロで判定される。他の実施形態では、タンパク質半減期は、動物の血清または他の体液中のタンパク質の半減期など、インビボの循環半減期である。
ＩＶ．他の拡張ＰＫ基
ある実施形態では、拡張ＰＫ基は、本願に援用されている米国特許第７１７６２７８号および米国特許第８１５８５７９号に開示されているように、トランスフェリンである。
ある実施形態では、拡張ＰＫ基は、本願に援用されている米国公開第２００７／０１７８０８２号に開示されているものなど、血清免疫グロブリン結合性タンパク質である。
ある実施形態では、拡張ＰＫ基は、本願に援用されている米国公開第２０１２／００９４９０９号に開示されているものなど、血清アルブミンと結合する、フィブロネクチン（Ｆｎ）系足場ドメインタンパク質である。フィブロネクチン系足場ドメインタンパク質を作製する方法も、米国公開第２０１２／００９４９０９号に開示されている。Ｆｎ３系拡張ＰＫ群の例としては、Ｆｎ３（ＨＳＡ）、つまりヒト血清アルブミンと結合するＦｎ３タンパク質が挙げられるが、これに限定はされない。
Ｖ．Ｆｃドメイン
ある実施形態では、国際公開第ＷＯ２０１３／１７７１８７号に記載されているように、拡張ＰＫ・ＩＬ−２はＦｃドメインを含む。Ｆｃドメインには、抗原に結合する可変領域は含まれていない。本明細書に記載の拡張ＰＫ・ＩＬ−２の産生に有用に用いられるＦｃドメインは、様々な供給源から入手することができる。ある実施形態では、拡張ＰＫ・ＩＬ−２のＦｃドメインは、ヒト免疫グロブリンに由来する。ある実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１定常領域に由来する（例えば、配列番号１２６）。ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインは、配列番号１２６に記載されている。ある実施形態では、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインは、上側ヒンジ領域を有しない（本願に援用されている国際公開第ＷＯ２０１６／０２５６４２号の配列番号３）。しかしながら、Ｆｃドメインは、例えばげっ歯類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット）または非ヒト霊長類（例えば、チンパンジー、マカク）を含む、その他の哺乳類の免疫グロブリンに由来してもよい。さらに、Ｆｃドメインまたはその一部は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥを含む免疫グロブリンクラス、並びに、ＩｇＧ１（例えば、配列番号１２６）、ＩｇＧ２（例えば、配列番号１２７）、ＩｇＧ３（例えば、配列番号１２８）、ＩｇＧ４（例えば、配列番号１２９）を含む免疫グロブリンアイソタイプに由来してもよい。
いくつかの態様では、拡張ＰＫ・ＩＬ−２には、変異体Ｆｃドメインが含まれる。いくつかの態様では、拡張ＰＫ・ＩＬ−２には、変異体ＩｇＧ１ Ｆｃドメインが含まれる。いくつかの態様では、変異体Ｆｃドメインは、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、および／またはＣＨ３ドメインに１または複数の変異を含む。いくつかの態様では、変異体ＦｃドメインにはＤ２６５Ａ変異が含まれる。
一実施形態では、本発明の拡張ＰＫ・ＩＬ−２は、完全Ｆｃ領域の１または複数の定常領域ドメインを欠失している。つまり、部分的または完全に欠失している。ある実施形態では、本発明の拡張ＰＫ・ＩＬ−２は、ＣＨ２ドメイン全体を欠失している。ある実施形態では、本発明の拡張ＰＫ・ＩＬ−２は、ＩｇＧ１ヒト定常領域ドメインをコード化するベクター（例えば、ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）から由来するＣＨ２ドメイン欠失Ｆｃ領域を含む（例えば、国際公開第ＷＯ０２／０６０９５５Ａ２号および国際公開第ＷＯ０２／０９６９４８Ａ２号を参照）。
このベクターは、ＣＨ２ドメインを欠失させ、ドメインを欠失したＩｇＧ１定常領域を発現する合成ベクターを提供するために設計したものである。上記の構築体は、好ましくは、それぞれのＦｃドメインのヒンジ領域に、結合ＣＨ３ドメインを直接融合するために設計されていることに留意されたい。
ＶＩ．ＩＦＮα
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２をインターフェロン−α（ＩＮＦα）で置き換えることができる。いくつかの実施形態では、ＩＮＦαは天然ヒトＩＮＦαである。いくつかの実施形態では、ＩＮＦαは、ヒト血清アルブミンと融合した米国公開第２００６／００５１８５９号に記載されているものなど、長時間作用型ＩＮＦαである。いくつかの実施形態では、ＩＦＮαはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ参照番号Ｐ０１５６２またはＰ０１５６３の配列を有する。いくつかの実施形態では、ＩＦＮαはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ参照番号Ｐ０１５６２またはＰ０１５６３の配列の機能的バリアントを有する。いくつかの実施形態では、ＩＦＮαは、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ参照番号Ｐ０１５６２またはＰ０１５６３（配列番号１４８または１５４）の配列に対して８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＦＮαは、メルク社から市販されるイントロン−Ａである（例えば、米国特許第６６１０８３０号およびｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｅｒｃｋ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｕｓａ／ｐｉ＿ｃｉｒｃｕｌａｒｓ／ｉ／ｉｎｔｒｏｎ＿ａ／ｉｎｔｒｏｎ＿ａ＿ｐｉ．ｐｄｆを参照）。いくつかの実施形態では、ＩＦＮαはＰＥＧ−ＩＦＮαである。いくつかの実施形態では、ＩＦＮαはペギントロンである（例えば、米国特許第６６１０８３０号および第６１８００９６号を参照）。いくつかの実施形態では、ＩＦＮαはシラトロンである（例えば、米国特許第６６１０８３０号および第６１８００９６号を参照）。
ＶＩＩ．インテグリン、ノッチンポリペプチド、およびＦｃ融合体
インテグリンは、充実性腫瘍の発生、進行、転移に重要な役割を担う各種の細胞機能を調節する細胞買いマトリックス接着受容体のファミリーである。腫瘍の進行においてあまりも重要であるため、インテグリンはがん療法の有効な目標として見なされ、様々な種類のがんの治療が可能となった。がん細胞に存在するインテグリンとしては、ανβ１、ανβ３、ανβ５、ανβ６、α５β１が挙げられる。
ノッチンタンパク質は、低分子のコンパクトペプチドであり、熱安定性およびタンパク質分解安定性が高く、突然変異誘発に耐性があるので、分子足場として優れた性質を有する。上記のペプチドには、「ノット」コアを形成する、少なくとも３つのジスルフィド結合が含まれている。また、表面に曝露し、標的を結合するループが含まれる。ループは、特定の標的を高い親和性で結合するように設計できるので、治療に非常に有用である。
本発明には、Ｆｃドナーと融合したインテグリンを結合するＲＧＤ配列を備え、有益な治療効果をもたらすノッチンポリペプチド足場（「ノッチン−Ｆｃ」と呼ばれる）、本明細書ではインテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体と総称されるものの使用が含まれる。上述の通り、半減期を延ばすために、Ｆｃ断片をタンパク質および／または治療薬に添加している。本明細書で用いられるインテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体において、Ｆｃのエフェクター機能は、様々ながんの治療に寄与する。いくつかの実施形態では、プロロイキンおよび／または拡張ＰＫ・ＩＬ−２を含むＩＬ−２と共に使用すると、当該効果をさらなる用途を見出すこともでき、および／または効果を増強することもできる。いくつかの実施形態では、同時に３つのインテグリンを結合するインテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体（「ノッチン−Ｆｃ」とも呼ばれる）は、例えば、ＮＯＤ２０１（配列番号１３９）、ＮＯＤ２０３（配列番号１４２）、およびＮＯＤ２０４（配列番号１４３）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体は、ＮＯＤ２０１（配列番号１３９）である。いくつかの実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体は、ＮＯＤ２０３（配列番号１４２）である。いくつかの実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体は、ＮＯＤ２０４（配列番号１４３）である。いくつかの実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体は、Ｆｃドメインに作用可能に連結されている、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＳＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧ（２．５Ｆ、配列番号１３０）、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＫＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧ（２．５ＦｍｏｄＫ、配列番号１３１）、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＳＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧＧＧＧＧＳ（配列番号１３２）、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＫＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧＧＧＧＧＳ（配列番号１３３）、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＳＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１３４）、またはＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＫＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１３５）を含む。いくつかの実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体は、Ｆｃドメインに作用可能に連結されている、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＳＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧ（２．５Ｆ、配列番号１３０）、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＫＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧ（２．５ＦｍｏｄＫ、配列番号１３１）、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＳＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧＧＧＧＧＳ（配列番号１３２）、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＫＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧＧＧＧＧＳ（配列番号１３３）、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＳＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１３４）、またはＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＫＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１３５）を含み、該Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４（マウスまたはヒト）に由来する。ＩｇＧ配列の例示は当技術分野では周知のものであり、上記の図１および表１を参照されたい。
いくつかの実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体は、ανβ１、ανβ３、ανβ５、ανβ６、α５β１から選択される１または複数のインテグリンと、高い親和性を以って結合する。いくつかの実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体は、ανβ１、ανβ３、ανβ５、ανβ６、α５β１から選択される２つのインテグリンと、高い親和性を以って結合する。いくつかの実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体は、ανβ１、ανβ３、ανβ５、ανβ６、α５β１から選択される３つのインテグリンと、高い親和性を以って結合する。いくつかの実施形態では、結合親和性は、約１００ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約４０ｎＭ未満、約３０ｎＭ未満、約２０ｎＭ未満、約２０ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約４ｎＭ未満、約３ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、または約１ｎＭ未満である。いくつかの実施形態では、結合親和性は５ｎＭ未満である。いくつかの実施形態では、結合親和性は約４ｎＭ未満である。いくつかの実施形態では、結合親和性は約３ｎＭ未満である。いくつかの実施形態では、結合親和性は約２ｎＭ未満である。いくつかの実施形態では、結合親和性は約１ｎＭ未満である。いくつかの実施形態では、結合親和性は約１．６ｎＭである。いくつかの実施形態では、結合親和性は約１．５ｎＭである。いくつかの実施形態では、結合親和性は約１ｎＭである。いくつかの実施形態では、結合親和性は約０．７ｎＭである。
いくつかの実施形態では、ＮＯＤ２０１は血清および熱負荷に対して非常に安定している。いくつかの実施形態では、当該安定性は、ジスルフィド結合性ペプチドではなく、Ｆｃドメインによりもたらされる。いくつかの実施形態では、４０℃における延長培養、または凍結融解サイクル×５の後、ＮＯＤ２０１の凝集、または分解は生じない。
ＮＯＤ２０１ペプチド（Ａｎｔｉｔｏｐｅ）のインシリコ免疫原性分析を行い、ｉＴｏｐｅ（登録商標）およびＴＣＥＤ（登録商標）分析を配列に適用して、ヒトＭＨＣクラスＩＩと結合する、および／または既知のＴ細胞エピトープとの相同性を共有すると予測されるペプチドを同定する。この分析では、ＴＣＥＤ（登録商標）において、既知のＴ細胞エピトープと一致するものを同定することはできなかった。いくつかの実施形態では、ＮＯＤ２０１は、非生殖細胞系の無差別ＭＨＣクラスＩＩ結合性ペプチドを含まない。従って、いくつかの実施形態では、ＮＯＤ２０１免疫原性のリスクは低い。いくつかの実施形態では、ＮＯＤ２０１は低い免疫原性を有する。
１．ＦＣドメイン
Ｆｃドメインには、抗原に結合する可変領域は含まれていない。本明細書に記載のインテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体有用に用いられるＦｃドメインは、様々な供給源から入手することができる。ある実施形態では、拡張ＰＫ・ＩＬ−２のＦｃドメインは、ヒト免疫グロブリンに由来する。ある実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１定常領域に由来する（図１、配列番号１２６）。ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインの例は、配列番号１２６に記載されている（図１）。ある実施形態では、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインは上側ヒンジ領域を有しない（図１および表１）。しかしながら、Ｆｃドメインは、例えばげっ歯類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット）または非ヒト霊長類（例えば、チンパンジー、マカク）を含む、その他の哺乳類の免疫グロブリンに由来してもよい。さらに、Ｆｃドメインまたはその一部は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＥを含む免疫グロブリンクラス、およびＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む免疫グロブリンアイソタイプに由来してもよい。Ｆｃドメインはマウスであってもよく、ヒトであってもよい。
いくつかの実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体は、変異体Ｆｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体は、変異体ＩｇＧ１ドメインを含む。いくつかの実施形態では、変異体Ｆｃドメインは、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、および／またはＣＨ３ドメインに１または複数の変異を含む。いくつかの実施形態では、変異体ＦｃドメインにはＤ２６５Ａ変異が含まれる。
いくつかの実施形態では、本発明のインテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体は、完全Ｆｃ領域の１または複数の定常領域ドメインを欠失している。つまり、部分的または完全に欠失している。ある実施形態では、本発明のインテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体は、ＣＨ２ドメイン全体を欠失している。いくつかの実施形態では、本発明のインテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体は、ＩｇＧ１ヒト定常領域ドメインをコード化するベクター（例えば、ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）から由来するＣＨ２ドメイン欠失Ｆｃ領域を含む（例えば、国際公開第ＷＯ０２／０６０９５５Ａ２号および国際公開第ＷＯ０２／０９６９４８Ａ２号を参照）。
いくつかの実施形態では、当該ベクターは、ＣＨ２ドメインを欠失させ、ドメインを欠失したＩｇＧ１定常領域を発現する合成ベクターを提供するために設計したものである。上記の構築体は、好ましくは、それぞれのＦｃドメインのヒンジ領域に、結合ＣＨ３ドメインを直接融合するために設計されていることに留意されたい。
２．ノッチンポリペプチド足場の操作方法
ノッチンポリペプチド足場は、好ましくはループの形でインテグリン結合性配列を挿入して、特定のインテグリン結合をもたらすために用いられる。インテグリン結合は、好ましくは、ＲＧＤペプチドなどのインテグリン結合ペプチド配列を挿入することにより、ノッチンポリペプチド足場に設計される。いくつかの実施形態では、インテグリン結合性ペプチド配列の挿入により、天然ノッチンタンパク質の一部が置換される。例えば、一実施形態では、ループの全部または一部を、１または複数のインテグリンと結合するために選択された含ＲＧＤペプチド配列（例えば、５〜１２個のアミノ酸配列）で置換することにより、ＲＧＤペプチド配列を天然溶媒曝露ループに挿入する。溶媒曝露ループ（つまり、表面上）は一般的に、天然ノッチンタンパク質配列におけるジスルフィド連結システイン残基によって固定される。インテグリン結合性置換アミノ酸配列は、ループ部分のコドンをランダム化し、改変ペプチドを発現させ、所定の配位子との結合度が最も高い変異体を選択することにより取得できる。上記の選択ステップを数回繰り返し、前のステップで最も強く結合したタンパク質を取り、ループを再ランダム化する。
インテグリン結合性ポリペプチドは、様々な方法で修飾されてもよい。例えば、ポリペプチドは内部でさらに架橋されてもよく、互いに架橋されてもよく、もしくは、ＲＧＤループが他の架橋分子足場にグラフトされてもよい。タンパク質またはペプチドの生物共役体を調製できる架橋試薬は、数多く市販されている。そのほとんどは、タンパク質側鎖の遊離アミンまたはスルフヒドリル基を介した生体分子の二量体ホモ共役またはヘテロ共役を可能にする。さらに最近は、炭水化物基を介したヒドラジド部分とのカップリングを含む別の架橋方法も開発されている。これらの試薬を使用すれば、生物共役体の調製において化学実験の経験がほとんど、またはまったくない研究者でも、便利且つ簡単に架橋ができるようになる。
ＥＥＴＩ−ＩＩノッチンタンパク質（本願に援用されている米国特許第８５３６３０１号の配列番号３９）は、ジスルフィドノットトポロジーを含み、突然変異誘発の影響を受けやすい複数の溶媒曝露ループを有する。いくつかの実施形態では、分子足場としてＥＥＴＩ−ＩＩを使用する。
分子足場として使用できるノッチンタンパク質の別の例としては、ＡｇＲＰまたはアガトキシンが挙げられる。ＡｇＲＰ（米国特許第８５３６３０１号の配列番号４０）とアガトキシン（米国特許第８５３６３０１号の配列番号４１）において、アミノ酸配列は異なるが、構造は同じである。ＡｇＲＰノッチンの例については、米国特許第８５３６３０１号の表１を参照されたい。
追加のＡｇＲＰ改変ノッチンを、本願に援用されているＣｏｃｈｒａｎ ｅｔ ａｌの米国公開第２００９／０２５７９５２号に記載されている方法で作製することもできる。ＡｇＲＰノッチン融合体は、ＡｇＲＰループ１、２、３、４を用いて調製できる。
本発明のポリペプチドは、本明細書に記載の３つの足場全てのペプチドに対して行われているように、組換えＤＮＡにより産生されてもよく、ペプチド合成装置を用いて固相で合成されてもよい。このポリペプチドは、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）または他の標識との反応により、さらにＮ末端でキャップされてもよく、また、追加の架橋反応のために選択されたアミノ酸残基で合成されてもよい。ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ ＲＡＭ Ｆｍｏｃ樹脂（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ）を用いて、開裂時にＣ末端アミドを与えてもよい。Ｂ−アラニンは、ペプチドの脱保護中のチアゾリドンの形成、およびフルオレセインの放出を防ぐために、Ｎ−末端アミノ酸として使用される（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、１９９６）。ペプチドを樹脂から切断し、側鎖を８％トリフルオロ酢酸、２％トリイソプロピルシラン、５％ジチオトレイトールで脱保護し、エーテル沈殿により最終生成物を回収します。ペプチドは、０．１％トリフルオロ酢酸のアセトニトリル勾配、およびＣ４またはＣ１８カラム（Ｖｙｄａｃ）を用いる逆相ＨＰＬＣで精製し、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）またはエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）を用いて検証する。
本ペプチドが組換えＤＮＡにより産生される場合、選択されたペプチドをコード化する発現ベクターは、適切な宿主に形質転換される。上述の通り、適切なペプチドの折り畳みとジスルフィド結合の形成を確保するために、ホストを選択する必要がある。ＥＥＴＩ−ＩＩなどの特定のペプチドは、細菌などの原核生物の宿主で発現する場合、適切に折り畳むことができる。
本ペプチドの二量体複合体、三量体複合体、四量体複合体は、上記の配列の遺伝子操作により、もしくは合成架橋剤と、例えばペプチドのＣ末端に導入されたシステイン残基を有する改変ペプチドとの反応により形成することもできる。これらのオリゴマーペプチド複合体は、ゲル濾過により精製できる。本ペプチドのオリゴマーは、複数のペプチド配列をエンドツーエンドでコード化するベクターを調製することで、調製することもできる。また、マルチマーは、例えば、米国特許第６２６５５３９号に記載されているように、ペプチドを複合化して調製することができる。そこで、活性ＨＪＶペプチドは、ペプチドのアミノ末端残基を変更することにより、マルチマー型で調製され、それにより、グリシル残基など、アミノ末端リシル残基および１個〜約５個のアミノ酸残基を含むスペーサーペプチドとペプチド結合され、複合ポリペプチドを形成する。或いは、各ペプチドは、そのアミノ末端およびカルボキシ末端のそれぞれにシステイン（Ｃｙｓ）残基を含むように合成される。次に、結果として得たジシステイン末端（ジ−Ｃｙｓ）ペプチドを酸化してジ−Ｃｙｓペプチドモノマーを重合させ、ポリマーまたは環状ペプチドマルチマーにする。マルチマーは、リジンコアマトリックスを利用した固相ペプチド合成により調製することもできる。本ペプチドは、ナノ粒子として調製してもよい。“Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＲＧＤ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｄｉｓｐｌａｙ，” Ｍｏｎｔｅｔ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．； ２００６； ４９（２０） ｐｐ ６０８７−６０９３を参照されたい。ＥＥＴＩ−ＩＩ二量体化論文の“Ｇｒａｆｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ−ｍｉｍｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎｔｏ ｃｙｓｔｉｎｅ ｋｎｏｔ ｍｉｎｉｐｒｏｔｅｉｎｓ ｙｉｅｌｄｓ ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ ｆｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ ａｎｄ ａｇｏｎｉｓｔｓ，” Ｋｒａｕｓｅ， ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｊｏｕｒｎａｌ； ２００６； ２７４ ｐｐ ８６−９５に従い、ＥＥＴＩ−ＩＩペプチドを用いてＥＥＴＩＩ二量体化を行ってもよい。これについては、本願に援用されている国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０６５６１０号により詳しく記載されている。
フィブロネクチンおよび他の接着タンパク質の相乗作用部位における、インテグリン結合の増強が確認されている（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ， １９９６； Ｋｏｉｖｕｎｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９４； Ａｏｔａ ｅｔ ａｌ．， １９９４； Ｈｅａｌｙ ｅｔ ａｌ．， １９９５）。異なるインテグリン特異的モチーフを１つの可溶性分子に組み込む能力は、治療の開発に重要な役割を担う。ヘテロ機能的特異性を有する架橋剤は、相乗結合効果を持つインテグリン結合性タンパク質の作製に使用できる。さらに、同じ架橋剤を、二重特異性標的分子の作製に使用することもでき、放射性核種または治療用途の毒性物質を送達するビヒクルとして使用することもできる。
３．インテグリン結合性ポリペプチド
Ｆｃ融合体に用いられるインテグリン結合性ポリペプチドには、インテグリン結合性ループ（例えば、ＲＧＤペプチド配列）およびノッチンポリペプチド足場が含まれる。上記のインテグリン結合性ポリペプチドは、本願に援用されている米国特許第８５３６３０１号に記載されている。米国特許第８５３６３０１号に記載されているように、インテグリン結合性ポリペプチドは、結合特異性および効力に影響を与えない範囲で、非ＲＧＤ残基がある程度変化していてもよい。たとえば、１１個の残基のうち３つが変化した場合、２．５Ｄに対して約７０％の同一性を有することになる。表１は、本発明の範囲内のインテグリン結合性ポリペプチドの例、およびそれらの特定のノッチンポリペプチド足場（例えば、ＥＥＴＩ−ＩＩまたはＡｇＲＰ）を示す。いくつかの実施形態では、Ｆｃ融合体に用いられるインテグリン結合性ポリペプチドは、本明細書に記載のＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＳＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧ（２．５Ｆ、配列番号１３０）およびＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＫＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧ（２．５ＦｍｏｄＫ、配列番号１３１）、並びにＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＳＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧＧＧＧＧＳ（配列番号１３２）、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＫＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧＧＧＧＧＳ（配列番号１３３）、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＳＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１３４）、および／またはＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＫＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１３５）である、ペプチド２．５Ｆおよび２．５ＦｍｏｄＫである。
ある実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチドは、νβ３，ανβ５またはα５β１と別々に結合する。
ある実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチドは、νβ３およびνβ５と同時に結合する。
ある実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチドは、νβ３、ανβ５、α５β１と同時に結合する。
ある実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチドは、本明細書に記載のＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＳＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧ（２．５Ｆ、配列番号１３０）およびＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＫＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧ（２．５ＦｍｏｄＫ、配列番号１３１）、並びに、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＳＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧＧＧＧＧＳ（配列番号１３２）、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＫＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧＧＧＧＧＳ（配列番号１３３）、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＳＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１３４）、および／またはＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＫＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１３５）である、２．５Ｆまたは２．５ｍｏｄＫである。いくつかの実施形態では、米国特許第８５３６３０１号の表１に列挙されるインテグリン結合性ポリペプチドを、本明細書に記載のＦｃ融合体に用いてもよい。
本ポリペプチドは、αｖβ１、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６、α５β１インテグリン受容体を標的とする。αｉｉｂβ３など、他のインテグリンに対しても試験を行ったが、ポリペプチドは、親和性がほとんど、またはまったくない他のインテグリンとは結合しなかった（米国参照）。従って、これらの改変インテグリン結合性ポリペプチドは、上述のインテグリンを特異的に過剰発現する様々なヒトのがんにおいて、診断および治療に幅広く用いられる。後述するように、これらのポリペプチドは、界面活性剤可溶化および腫瘍細胞表面インテグリン受容体の両方と高い親和性を以って結合する。
ανβ３（およびανβ５）インテグリンは、骨肉腫、神経芽細胞腫、肺・乳・前立腺・膀胱の癌、膠芽腫、浸潤性メラノーマを含む、様々な腫瘍細胞でも高度に発現する。ανβ３インテグリンは、腫瘍細胞および／または乳癌、卵巣癌、前立腺癌、結腸癌の血管系で発現するが、正常な成人組織または血管では発現しない。α５β１インテグリンも同じく、腫瘍細胞および／または乳癌、卵巣癌、前立腺癌、結腸癌の血管系で発現するが、正常な成人組織または血管では発現しない。該立体構造規制低分子ポリペプチド（アミノ酸約３３個）は、分子内結合により規制されている。例えば、ＥＥＴＩ−ＩＩには３つのジスルフィド結合がある。これにより、インビボでより安定することになる。
現在まで、ανβ３、ανβ５、α５β１インテグリンと高い親和性および特異性で結合できる単一の薬剤は開発されていないと見なされていた。上記の３つのインテグリンは全て腫瘍に発現しており、血管新生と転移の媒介に関与しているため、広範囲の標的化剤（つまり、ανβ３、ανβ５、α５β１）の方が、診断および治療により効果的である。
改変ノッチン−ＦＣ融合体は、既存のインテグリン標的化合物に対して利点を有する。つまり、タンパク質分解耐性と、並外れたインビボ安定性を付与するコンパクトなジスルフィド結合コアを有している。
本発明者の研究によると、マウス血清中のインテグリン結合性Ｆｃ融合タンパク質の半減期が９０時間を超えている。ＲＧＤ系の環状ペプチドと比べて、サイズが大きく（約３〜４ｋＤａ）、親和性が高いため、分子撮像と治療に適する薬物動態や体内分布が向上する。これらのインテグリン結合性Ｆｃ融合タンパク質は、低分子であるため、撮像プローブ、放射性同位元素、または化学療法剤の化学合成および部位特異的結合が可能となる。さらに、必要に応じて、インビボ特性をさらに改善するための化学修飾を行うことも簡単である。
４．インテグリン結合性ポリペプチド−ＦＣ融合体
本明細書、並びに本願に援用されている米国公開第２０１４／００７３５１８号に記載されたインテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体（ノッチン−Ｆｃ融合体）は、改変インテグリン結合性ポリペプチド（ノッチン足場内）と、ＦｃｙＲと結合してＡＤＣＣを誘導することのできる、Ｆｃドメインまたは抗体様構築体と、を組み合わせる。
抗体のＦｃ部分は、免疫グロブリン分子を構成する２つの重鎖における、２つのカルボキシ末端ドメインによって形成される。ＩｇＧ分子には、２つの重鎖（それぞれ〜５０ｋＤａ）と２つの軽鎖（それぞれ〜２５ｋＤａ）が含まれている。全ての抗体の一般的な構造は非常に類似するが、タンパク質の先端の小領域は多様である。よって、先端構造のみが僅かに異なる数百万の抗体が存在することになる。この領域は、超可変領域（Ｆａｂ）と呼ばれる。もう一方の断片は抗原結合活性を持たないが、元々は容易に結晶化する部分であり、結晶化断片（Ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ）という意味でＦｃ断片と名付けられている。この断片は、対となったＣ３／４およびＣ３／４ドメインに対応し、エフェクター分子および細胞と相互作用する抗体分子の一部である。重鎖アイソタイプは、主にＦｃ断片において機能的な差を示す。抗体分子のＦｃ部分とＦａｂ部分をつなぐヒンジ領域は、実際には可撓性のテザーであり、剛性ヒンジより、Ｆａｂ腕２つが独自的に動けるようにする。これは、ハプテンと結合した抗体の電子顕微鏡検査により実証されている。従って、本融合タンパク質は、抗体断片の各腕に１つずつ、２つのノッチンペプチドを含むように作製することができる。
Ｆｃ部分は抗体クラス（およびサブクラス）によって異なるが、そのクラス内では同じである。重鎖のＣ末端はＦｃ領域を形成する。Ｆｃ領域は、受容体結合部分として重要な役割を果たす。抗体のＦｃ部分は、２つの異なる方法でＦｃ受容体と結合する。例えば、ＩｇＧおよびＩｇＭがＦａｂ部分により病原体と結合した後、Ｆｃ部分は食作用細胞（マクロファージなど）の受容体と結合して、食作用を引き起こす。
本インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体において、Ｆｃ部分は、二重結合能力を与え、および／または半減期を延長し、発現レベルを向上することができる。インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体のＦｃ断片は、例えば、マウスＩｇＧ２ａまたはヒトＩｇＧ１に由来する。いくつかの実施形態では、Ｆｃ断片は、マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはマウスＩｇＧ４、並びにそれらのバリアントに由来する。いくつかの実施形態では、Ｆｃ断片は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはマウスＩｇＧ４、並びにそれらのバリアントに由来する。例えば、図１を参照されたい。必要に応じて、リンカーを用いてインテグリン結合性部分（ノッチン）をＦｃ部分に繋ぐこともできる。
いくつかの実施形態では、リンカーは、インテグリンまたはＦｃ受容体に対するインテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体の結合親和性に影響を及ぼさない。様々なＦｃドメイン遺伝子配列（例えば、マウスおよびヒト定常領域遺伝子配列）は、公的保存機関に寄託された資源として入手することができる。
５．Ｆｃドメイン
様々なＦｃドメイン遺伝子配列（例えば、マウスおよびヒト定常領域遺伝子配列）は、公的保存機関に寄託された資源として入手することができる。Ｆｃドメイン配列を含む定常領域ドメインは、特定のエフェクター機能を欠くもの、および／または免疫原性を低下させる特定の修飾を有するものを選択することができる。抗体および抗体をコード化する遺伝子における多くの配列は既に公開されており、よって、当技術分野で認定されている技術を用いてこれらの配列から適切なＦｃドメイン配列（例えば、ヒンジ、ＣＨ２、および／またはＣＨ３配列、またはその一部）を得ることができる。次いで、前述の方法のいずれかを用いて取得した遺伝物質を変更または合成すると、本明細書で用いられるポリペプチドが得られる。さらに、定常領域ＤＮＡ配列の対立遺伝子、バリアント、突然変異を、本明細書に開示の方法に適用することもできる。
本明細書に開示の方法での使用に適するインテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体は、１または複数のＦｃドメイン（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれ以上のＦｃドメイン）を含んでもよい。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは異なる種のものであってもよい。いくつかの実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体に存在する少なくとも１つのＦｃドメインは、ヒンジドメインまたはその一部を含む。別の実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体は、少なくとも１つのＣＨ２ドメインまたはその一部を含む少なくとも１つのＦｃドメインを含む。別の実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体は、少なくとも１つのＣＨ３ドメインまたはその一部を含む少なくとも１つのＦｃドメインを含む。別の実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体は、少なくとも１つのＣＨ４ドメインまたはその一部を含む少なくとも１つのＦｃドメインを含む。別の実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体は、少なくとも１つのヒンジドメインまたはその一部、並びに少なくとも１つのＣＨ２ドメインまたはその一部を含む、少なくとも１つのＦｃドメインを含む（例えば、ヒンジ−ＣＨ２配向）。別の実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体は、少なくとも１つのＣＨ２ドメインまたはその一部、並びに少なくとも１つのＣＨ３ドメインまたはその一部を含む、少なくとも１つのＦｃドメインを含む（例えば、ＣＨ２−ＣＨ３配向）。別の実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体は、少なくとも１つのヒンジドメインまたはその一部、少なくとも１つのＣＨ２ドメインまたはその一部、並びに、少なくとも１つのＣＨ３ドメインまたはその一部を含む、少なくとも１つのＦｃドメインを含む。例えば、ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３配向、ヒンジ−ＣＨ３−ＣＨ２配向、またはＣＨ３−ＣＨ２−ヒンジ配向となる。
いくつかの実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体は、１または複数の免疫グロブリン重鎖に由来する少なくとも１つの完全Ｆｃ領域（例えば、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインを含むＦｃドメインであるが、当該ドメインが同じ抗体に由来する必要はない）。他の実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体は、１または複数の免疫グロブリン重鎖に由来する少なくとも２つの完全Ｆｃドメインを含む。ある実施形態では、完全Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ免疫グロブリン重鎖（例えば、ヒトＩｇＧ１）に由来する。
別の実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体は、完全ＣＨ３ドメインを含む少なくとも１つのＦｃドメインを含む。別の実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体は、完全ＣＨ２ドメインを含む少なくとも１つのＦｃドメインを含む。別の実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体は、少なくともＣＨ３ドメイン、並びに、ヒンジ領域とＣＨ２ドメインの少なくとも１つを含む少なくとも１つのＦｃドメインを含む。一実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体は、ヒンジとＣＨ３ドメインを含む少なくとも１つのＦｃドメインを含む。別の実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体は、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３ドメインを含む少なくとも１つのＦｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ免疫グロブリン重鎖（例えば、ヒトＩｇＧ１）に由来する。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインは、１または複数のヒンジ領域システイン残基を除去または置換する、ヒンジ領域の突然変異、置換、または欠失を含む。
インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体のＦｃドメインを構成する定常領域ドメインまたはその一部は、異なる免疫グロブリン分子に由来してもよい。例えば、本発明で用いられるポリペプチドは、ＩｇＧ１分子に由来するＣＨ２ドメインまたはその一部、およびＩｇＧ３分子に由来するＣＨ３領域またはその一部を含んでもよい。いくつかの実施形態では、インテグリン結合ポリペプチド−Ｆｃ融合体は、一部がＩｇＧ１分子に由来し、一部がＩｇＧ３分子に由来するヒンジドメインを含むＦｃドメインを含むことができる。本明細書に記載されているように、任意のＦｃドメインを変更して天然抗体分子からのアミノ酸配列を変化させてもよいことは、当業者によって自明であろう。
他の構築体では、１または複数の構成要素のＦｃドメイン間にペプチドスペーサーを設けることが望ましい場合がある。例えば、いくつかの実施形態では、ペプチドスペーサーを、ヒンジ領域とＣＨ２ドメインの間、および／または、ＣＨ２とＣＨ３ドメインの間に設けてもよい。例えば、ＣＨ２ドメインは欠失し、残りのＣＨ３ドメイン（合成または非合成を問わない）は１〜２０個、１〜１０個、または１〜５個のアミノ酸ペプチドスペーサーによりヒンジ領域に接合（ｊｏｉｎ）されている、適合構築体を発現することができる。上記のペプチドスペーサーは、例えば、定常領域ドメインの調節要素が事由且つ接近可能状態を維持する、またはヒンジ領域が可撓性を維持するように、追加してもよい。本発明に適合するリンカーペプチドは、比較的に非免疫原性であり、Ｆｃの適切な折り畳みを妨げないのが好ましい。
６．Ｆｃアミノ酸の変更
いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、例えば、アミノ酸の突然変異（例えば、付加、欠失、または置換）により変更、または修飾される。本明細書における「Ｆｃドメインバリアント」とは、Ｆｃドメインが由来する野生型Ｆｃと比べて、アミノ酸置換など、少なくとも１つのアミノ酸修飾を有するＦｃドメインを指す。例えば、ＦｃドメインがヒトＩｇＧ１抗体に由来する場合、バリアントは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域の対応する位置の野生型アミノ酸と比べ、少なくとも１つのアミノ酸変異（例えば、置換）を含む。
いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインのヒンジ領域は、アミノ酸置換または欠失により変更されている。つまり、３つのヒンジ領域システイン残基（ＥＵ番号によると残基２２０位、２２６位、２２９位）の１または複数が変異または除去している。いくつかの態様では、上側ヒンジ領域を欠失させ、軽鎖と対になるシステインを取り除く。例えば、いくつかの実施形態では、米国特許第８５３６３０１号の配列番号３に記載されているように、上側ヒンジ領域のアミノ酸「ＥＰＫＳＣ」が欠失されている。他の態様では、３つのヒンジ領域システインのうち、１または複数が変異している（例えば、セリンに変異）。ある実施形態では、システイン２２０がセリンに変異している。
いくつかの実施形態では、Ｆｃバリアントは、ヒンジドメインまたはその一部に位置するアミノ酸位置に置換を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃバリアントは、ＣＨ２ドメインまたはその一部に位置するアミノ酸位置に置換を含む。別の実施形態では、Ｆｃバリアントは、ＣＨ３ドメインまたはその一部に位置するアミノ酸位置に置換を含む。別の実施形態では、Ｆｃバリアントは、ＣＨ４ドメインまたはその一部に位置するアミノ酸位置に置換を含む。
いくつかの実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体は、２つ以上のアミノ酸置換を含むＦｃバリアントを含む。本明細書に記載の方法で用いられるインテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体は、例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれ以上のアミノ酸置換を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、アミノ酸位置の少なくとも１位以上、例えば、少なくとも２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、またはそれ以上の間隔を互いに置いて位置してもよい。いくつかの実施形態では、改変アミノ酸は、アミノ酸位置の少なくとも５位、１０位、１５位、２０位、２５位、またはそれ以上の間隔を互いに置いて位置してもよい。
いくつかの実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体は、ポリペプチドの抗原非依存性エフェクター機能、特にポリペプチドの循環半減期を変更するＦｃドメインへのアミノ酸置換を含む。
一実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体は、活性化ＦｃγＲ（例えば、ＦｃγＩ、Ｆｃγ１α、またはＦｃγＲＩＩＩα）に対して、より強固に結合している。ＦｃＲまたは相補結合活性を変更されたアミノ酸置換の例については、本願に援用されている国際公開第ＷＯ２００５／０６３８１５号に開示されている。ある実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２３９Ｅ、Ｌ２６１Ａ、Ｈ２６８Ｄ、Ｓ２９８Ａ、Ａ３３０Ｈ、Ａ３３０Ｌ、Ｉ３３２Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ｉ３３２Ｑ、Ｋ３３４Ｖ、Ａ３７８Ｆ、Ａ３７８Ｋ、Ａ３７８Ｗ、Ａ３７８Ｙ、Ｈ４３５Ｓ、またはＨ４３５Ｇの突然変異の少なくとも１つを含む。ある実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２３９Ｅ、Ｉ３３２Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、またはＨ２６８Ｄの突然変異の少なくとも１つを含む。ある実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｉ３３２Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、またはＨ２６８Ｄの突然変異の少なくとも１つを含む。
本明細書で用いられるインテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体はさらに、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体のグリコシル化を変更するアミノ酸置換を含んでもよい。例えば、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体のＦｃドメインは、グリコシル化の低下（例えば、Ｎ−またはＯ−結合型グリコシル化）をもたらす突然変異を有するＦｃドメインを含んでもよく、野生型Ｆｃドメインの改変グリコフォーム（例えば、低フコースまたはフコースを含有しないグリカン）を含んでもよい。別の実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体は、グリコシル化モチーフ、例えばアミノ酸配列ＮＸＴまたはＮＸＳを含むＮ結合型グリコシル化モチーフの近く、または内部にアミノ酸置換を有する。グリコシル化の低減または変更をもたらすアミノ酸置換の例については、本願に援用されている国際公開第ＷＯ０５／０１８５７２号および米国公開第２００７／０１１１２８１号に開示されている。他の実施形態では、本明細書で用いられるインテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体は、溶媒曝露表面に位置する改変システイン残基またはその類似体を有する少なくとも１つのＦｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で用いられるインテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体は、第２のシステイン残基とのジスルフィド結合を実質的に含まない少なくとも１つの改変遊離システイン残基またはその類似体を含むＦｃドメインを含む。上記の改変システイン残基またはその類似体のいずれかは、その後、当技術分野で既知の技術を用いて機能的ドメインと共役させてもよい（例えば、チオール反応性ヘテロ二機能性リンカーと共役させる）。
一実施形態では、本明細書で用いられるインテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体は、本明細書に記載のＦｃドメインと独立して選択される構成要素のＦｃドメインを２つ以上有する、遺伝子融合Ｆｃドメインを含んでもよい。一実施形態では、Ｆｃドメインは同じである。別の実施形態では、異なるＦｃドメインが少なくとも２つある。例えば、本明細書で用いられるインテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体のＦｃドメインは、同じ数のアミノ酸残基を含むが、もしくは、１または複数のアミノ酸残基（例えば、約５個（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ）、約１０個、約１５個、約２０個、約３０個、約４０個、または約５０個）の分だけ長さが異なってもよい。いくつかの実施形態では、本明細書で用いられるインテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体のＦｃドメインは、１または複数のアミノ酸位置で配列が異なっていてもよい。例えば、少なくとも２つのＦｃドメインは、約５位（例えば、１位、２位、３位、４位、または５位）、約１０位、約１５位、約２０位、約３０位、約４０位、または約５０位のアミノ酸位置が異なっていてもよい。
ＶＩＩＩ．核酸組成物
本発明のインテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体をコード化する核酸組成物、並びに、核酸を含む発現ベクターと、核酸および／または発現ベクター組成物で形質転換された宿主細胞を、さらに提供する。
インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃをコード化する核酸組成物は、一般的に、当技術分野で公知の単一発現ベクターに入れられ、本発明のインテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃを形成するために発現される宿主細胞に形質転換される。核酸は、シグナルおよび分泌配列、調節配列、プロモーター、複製起点、選択遺伝子などを含むがこれらに限定はされない、適切な転写および翻訳制御配列を含む発現ベクターに入れることができる。
例えば、タンパク質ＤＮＡを発現させるために、標準分子生物工学技術（例えば、ＰＣＲ増幅または遺伝子合成）によりＤＮＡを取得し、遺伝子が転写および翻訳制御配列に作用可能に連結されるように、ＤＮＡを発現ベクターに挿入する。この場合、「作用可能に連結される」とは、抗体遺伝子をベクターに連結（ｌｉｇａｔｉｏｎ）し、ベクター内の転写および翻訳制御配列が、抗体遺伝子の転写および翻訳を調節する本来の機能を果たすようにすることを意味する。発現ベクターおよび発現制御配列としては、用いられる発現宿主細胞と適合するものが選択される。タンパク質遺伝子は、標準法（例えば、遺伝子断片とベクターの相補的制限部位の連結（ｌｉｇａｔｉｏｎ）、または制限部位が存在しない場合の平滑末端の連結）により発現ベクターに挿入される。それに加えて、またはその代わりに、組換え発現ベクターは、宿主細胞からのタンパク質（融合タンパク質を含む）の分泌を促進するシグナルペプチドをコード化することができる。遺伝子を、シグナルペプチドが遺伝子のアミノ末端にインフレームで連結されるように、ベクターにクローン化することもできる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド（つまり、非免疫グロブリンタンパク質からのシグナルペプチド）であってもよい。シグナルペプチドの例としては、ＭＴＲＬＴＶＬＡＬＬＡＧＬＬＡＳＳＲＡ（配列番号１３８）が挙げられるが、これらに限定はされない。
タンパク質遺伝子に加えて、本発明の少なくともいくつかの実施形態による組換え発現ベクターは、宿主細胞における遺伝子の発現を制御する調節配列を保有する。「調節配列」とは、プロモーター、エンハンサー、および遺伝子の転写または翻訳を制御する他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含む用語である。上記の調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（“Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ． （１９９０））に記載されている。調節配列の選択を含む発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの要因に左右されることは、当業者にとって周知に事実であろう。哺乳類宿主細胞の発現における好ましい調節配列には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））、ポリオーマ由来のプロモーターおよび／またはエンハンサーなど、哺乳類細胞における高レベルのタンパク質発現を誘導するウイルス要素が含まれる。或いは、ユビキチンプロモーターまたはβ−グロビンプロモーターなどの非ウイルス性調節配列を用いてもよい。さらに、調節要素は、ＳＶ４０初期プロモーターおよびヒトＴ細胞白血病ウイルス１型の長末端反復配列を含むＳＲαプロモーター系など、異なる供給源から取得した配列で構成されてもよい（Ｔａｋｅｂｅ， Ｙ． ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ８：４６６−４７２）。
タンパク質遺伝子および調節配列に加えて、本発明の少なくともいくつかの実施形態による組換え発現ベクターは、追加の配列、例えば、宿主細胞内のベクター複製を調節する配列（例えば、複製起点）および選択性標識遺伝子などを、保有していてもよい。選択性標識遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする（例えば、Ａｘｅｌ ｅｔ ａｌ．による、米国特許第４３９９２１６号、第４６３４６６５号および第５１７９０１７号を参照）。例えば、通常、選択性標識遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞に、Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートなどの薬剤に対する耐性を付与する。好ましい選択性標識遺伝子には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅を伴うｄｈｆｒ宿主細胞で用いられる）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択に用いられる）が含まれる。
本発明のタンパク質の発現のために、タンパク質をコード化する発現ベクターは、標準技術により宿主細胞にトランスフェクトされる。「トランスフェクション」、およびそれに準じる用語は、外因性ＤＮＡを原核生物または真核生物宿主細胞に導入するために一般的に使用される様々な技術、例えば電気穿孔法、リン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなどを網羅する概念である。原核または真核宿主細胞のいずれかで本発明の少なくともいくつかの実施形態によるタンパク質を発現することは理論的に可能であるが、真核細胞、最も好ましくは哺乳動物宿主細胞での抗体の発現が最も好ましい。
いくつかの実施形態では、組換えタンパク質を発現するための哺乳類宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ， （１９８０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：４２１６−４２２０に記載のｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞が含まれる。該細胞は、さらに、Ｒ． Ｊ． Ｋａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｐ． Ａ． Ｓｈａｒｐ （１９８２） Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５９：６０１−６２１に記載のＤＨＦＲ選択性標識と共に使用される）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞が含まれる。特に、ＮＳＯ骨髄腫細胞で使用できる、別の好ましい発現系としては、国際公開第ＷＯ８７／０４４６２号、国際公開第ＷＯ８９／０１０３６号、欧州公開第３３８８４１号に開示されているＧＳ遺伝子発現系が挙げられる。タンパク質遺伝子をコード化する組換え発現ベクターが哺乳類宿主細胞に導入されると、宿主細胞でのタンパク質の発現、より好ましくはタンパク質の分泌を可能にするのに十分な期間、宿主細胞が成長する培地に、宿主細胞を培養することによって、タンパク質が産生される。
ＩＸ．免疫チェックポイント調節物質
ある実施形態では、免疫チェックポイント調節物質（阻害物質または刺激物質）は、本明細書に記載の他の治療薬（例えば、ＩＬ−２、拡張ＰＫ・ＩＬ−２、ＩＮＦα、および／またはインテグリン結合性Ｆｃ融合タンパク質）と組み合わせて用いられる。Ｔ細胞の活性化とエフェクター機能は、「免疫チェックポイント」と呼ばれる共刺激および阻害シグナルによりバランスが取れている。Ｔ細胞エフェクター機能を調節する阻害性配位子および受容体は、腫瘍細胞で過剰に発現する。次いで、共刺激受容体のアゴニストまたは阻害シグナルのアンタゴニストにより、抗原特異的Ｔ細胞応答が増幅される。
１．免疫チェックポイント阻害物質
ある実施形態では、免疫チェックポイント調節物質は免疫チェックポイント阻害物質である。腫瘍細胞を直接標的とする治療用抗体とは異なり、免疫チェックポイント阻害物質は内因性の抗腫瘍活性を高める。ある実施形態では、本明細書に開示の方法での使用に適する免疫チェックポイント阻害物質は、阻害シグナルのアンタゴニスト、例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４を標的とする抗体である。これらの配位子と受容体については、Ｐａｒｄｏｌｌ， Ｄ．， Ｎａｔｕｒｅ． １２： ２５２−２６４， ２０１２で検討されている。
いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害物質は、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害物質は抗ＰＤ−１抗体である。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害物質は抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害物質は抗ＣＴＬＡ−４抗体である。いくつかの実施形態では、ＮＯＤ２０１は、抗ＰＤ−１抗体およびＩＬ−２と組み合わせて用いられる。いくつかの実施形態では、ＮＯＤ２０１は、抗ＰＤ−１抗体および低用量ＩＬ−２と組み合わせて用いられる。いくつかの実施形態では、ＮＯＤ２０１は、チェックポイント刺激物質およびＩＮＦαと組み合わせて用いられる。いくつかの実施形態では、ＮＯＤ２０１は、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＬＡＧ−３抗体、または抗ＴＩＭ−３抗体と組み合わせて使用されない。いくつかの実施形態では、ＮＯＤ２０１は、抗ＴＩＧＩＴ抗体と組み合わせて使用されない。いくつかの実施形態では、ＮＯＤ２０１は、抗ＬＡＧ−３抗体と組み合わせて使用されない。いくつかの実施形態では、ＮＯＤ２０１は、抗ＴＩＭ−３抗体と組み合わせて使用されない。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害物質は、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＬＡＧ−３抗体、または抗ＴＩＭ−３抗体ではない。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害物質は抗ＴＩＧＩＴ抗体ではない。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害物質は抗ＬＡＧ−３抗体ではない。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害物質は抗ＴＩＭ−３抗体ではない。
本明細書に開示されるのは、がんなどの疾患を持つ対象を治療する方法であり、当該方法は、本明細書に記載のインテグリン結合性Ｆｃ融合タンパク質の治療有効量を含む組成物を対象に投与するステップを含む。いくつかの実施形態では、当該方法は、ＮＯＤ２０１、ＮＯＤ２０３、および／またはＮＯＤ２０４などのインテグリン結合性Ｆｃ融合タンパク質、並びに、それらの組み合わせを投与するステップを含む。いくつかの実施形態では、インテグリン結合性Ｆｃ融合タンパク質は、免疫チェックポイントを遮断する分子、およびインテグリン結合性Ｆｃ融合タンパク質と組み合わされる。いくつかの実施形態では、がんなどの疾患を持つ対象を治療する方法は、免疫チェックポイントをブロックする分子の治療有効量と、インテグリン結合性Ｆｃ融合タンパク質と、ＩＬ−２（例えば、野生型ＩＬ−２、プロロイキン、および／または拡張ＰＫ・ＩＬ−２）と、を含む組成物を対象に投与するステップを含む。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害物質は、阻害性免疫調節因子からのシグナルを妨害または阻害する抗体、またはその抗原結合部分である。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害物質は、阻害性免疫調節因子からのシグナルを妨害または阻害する小分子である。
いくつかの実施形態では、阻害性免疫調節因子（免疫チェックポイント阻害物質）は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１のシグナル経路の構成要素である。従って、いくつかの実施形態は、がんを持つ対象の免疫療法に用いられる方法を提供し、当該方法は、ＰＤ−１受容体とその配位子の相互作用を妨害する抗体またはその抗原結合部分の治療有効量を対象に投与するステップを含む。ＰＤ−１と結合し、ＰＤ−１とその配位子のＰＤ−Ｌ１の相互作用を妨害し、抗腫瘍性免疫応答を刺激する当技術分野で公知の抗体は、本明細書に開示の方法において、適合に用いられることができる。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、ＰＤ−１と特異的に結合する。例えば、ＰＤ−１を標的として、本発明の方法で使用できる抗体には、ニボルマブ（ＢＭＳ−９３６５５８、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、ペンブロリズマブ（ランブロリズマブ、ＭＫ０３４７５またはＭＫ− ３４７５、Ｍｅｒｃｋ）、ヒト化抗ＰＤ−１抗体ＪＳ００１（ＳｈａｎｇＨａｉ ＪｕｎＳｈｉ）、モノクローナル抗ＰＤ−１抗体ＴＳＲ−０４２（Ｔｅｓａｒｏ， Ｉｎｃ．）、Ｐｉｄｉｌｉｚｕｍａｂ（抗ＰＤ−１ ｍＡｂ ＣＴ−０１１、Ｍｅｄｉｖｉａｔｉｏｎ）、抗ＰＤ−１モノクローナル抗体ＢＧＢ−Ａ３１７（ＢｅｉＧｅｎｅ）、および／または抗ＰＤ−１抗体ＳＨＲ−１２１０（ＳｈａｎｇＨａｉ ＨｅｎｇＲｕｉ）、ヒトモノクローナル抗体ＲＥＧＮ２８１０（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）、ヒトモノクローナル抗体ＭＤＸ−１１０６（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、および／またはヒト化抗ＰＤ−１ ＩｇＧ４抗体ＰＤＲ００１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）が含まれる。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１抗体は、ＲＭＰ１−１４（ラットＩｇＧ）−ＢｉｏＸｃｅｌｌ ｃａｔ＃ＢＰ０１４６クローンからのものである。本明細書に開示の方法での使用に適する他の抗体としては、本願に援用されている米国特許第８００８４４９号に開示されている抗ＰＤ−１抗体が挙げられる。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、ＰＤ−Ｌ１と特異的に結合し、ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１の相互作用を阻害し、それにより免疫活性を増加させる。ＰＤ−Ｌ１と結合し、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の相互作用を妨害し、抗腫瘍性免疫応答を刺激する当技術分野で公知の抗体は、本明細書に開示の方法において、適合に用いられることができる。例えば、ＰＤ−Ｌ１を標的とする、臨床試験中の抗体には、ＢＭＳ−９３６５５９（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）およびＭＰＤＬ３２８０Ａ（Ｇｅｎｅｔｅｃｈ）が含まれる。ＰＤ−Ｌ１を標的とするその他の適切な抗体については、本願に援用されている米国特許第７９４３７４３号に開示されている。ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１と結合し、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用を妨害し、抗腫瘍性免疫応答を刺激する抗体であれば、本明細書に開示の方法に相応するということは、当業者であれば理解できるだろう。
いくつかの実施形態では、阻害性免疫調節因子は、ＣＴＬＡ−４のシグナル経路の構成要素である。従って、いくつかの実施形態は、がんを持つ対象の免疫療法に用いられる方法を提供し、当該方法は、ＣＴＬＡ−４を標的として、ＣＤ８０およびＣＤ８６との相互作用を妨害する抗体またはその抗原結合部分の治療有効量を対象に投与するステップを含む。ＣＴＬＡ−４を標的とする抗体の例としては、ＦＤＡ承認済みのイピリムマブ（ＭＤＸ−０１０、ＭＤＸ−１０１、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、並びに、現在ヒト試験中のトレメリムマブ（チシリムマブ、ＣＰ−６７５、２０６、Ｐｆｉｚｅｒ）が挙げられる。ＣＴＬＡ−４を標的とするその他の適切な抗体については、本願に援用されているＷＯ２０１２／１２０１２５米国特許第６９８４７２０号、米国特許第６６８２７３６８号、米国公開第２００２／００３９５８１号、米国公開第２００２／００８６０１４号、米国公開第２００５／０２０１９９４号に開示されている。ＣＴＬ−４と結合し、ＣＴＬ−４とＣＤ８０およびＣＤ８６の相互作用を妨害し、抗腫瘍性免疫応答を刺激する抗体であれば、本明細書に開示の方法に相応するということは、当業者であれば理解できるだろう。
ある実施形態では、阻害性免疫調節因子は、ＬＡＧ−３（リンパ球活性化遺伝子３）のシグナル経路の構成要素である。従って、ある実施形態は、がんを持つ対象の免疫療法に用いられる方法を提供し、当該方法は、ＬＡＧ−３を標的として、ＭＨＣクラスＩＩ分子との相互作用を妨害する抗体またはその抗原結合部分の治療有効量を対象に投与するステップを含む。ＬＡＧ−３を標的とする抗体の例としては、現在ヒト試験中のＩＭＰ３２１（Ｉｍｍｕｔｅｐ）が挙げられる。ＬＡＧ−３を標的とするその他の適切な抗体については、本願に援用されている米国公開第２０１１／０１５０８９２号に開示されている。ＬＡＧ−３と結合し、ＬＡＧ−３とＭＨＣクラスＩＩ分子の相互作用を妨害し、抗腫瘍性免疫応答を刺激する抗体であれば、本明細書に開示の方法に相応するということは、当業者であれば理解できるだろう。
いくつかの実施形態では、阻害性免疫調節因子は、Ｂ７ファミリーのシグナル経路の構成要素である。いくつかの実施形態では、Ｂ７ファミリーメンバーはＢ７−Ｈ３およびＢ７−Ｈ４である。従って、いくつかの実施形態は、がんを持つ対象の免疫療法に用いられる方法を提供し、当該方法は、Ｂ７−Ｈ３またはＢ７−Ｈ４を標的とする抗体またはその抗原結合部分の治療有効量を対象に投与するステップを含む。Ｂ７ファミリーには明確な受容体はないが、これらの配位子は腫瘍細胞または腫瘍浸潤細胞で発現上昇される。前臨床マウスモデルによると、これらの配位子を遮断すると、抗腫瘍免疫を増強することができる。Ｂ７−Ｈ３を標的とする抗体の例としては、現在ヒト試験中のＭＧＡ２７１（Ｍａｃｒｏｇｅｎｉｃｓ）が挙げられる。Ｂ７ファミリーメンバーを標的とするその他の適切な抗体については、本願に援用されている米国公開第２０１３／０１４９２３６号に開示されている。Ｂ７−Ｈ３またはＢ７−Ｈ４と結合し、抗腫瘍性免疫応答を刺激する抗体であれば、本明細書に開示の方法に相応するということは、当業者であれば理解できるだろう。
ある実施形態では、阻害性免疫調節因子は、ＴＩＭ−３（Ｔ細胞膜タンパク質３）のシグナル経路の構成要素である。従って、ある実施形態は、がんを持つ対象の免疫療法に用いられる方法を提供し、当該方法は、ＴＩＭ−３を標的として、ガレクチン９との相互作用を妨害する抗体またはその抗原結合部分の治療有効量を対象に投与するステップを含む。ＴＩＭ−３を標的とするその他の適切な抗体については、本願に援用されている米国公開第２０１３／００２２６２３号に開示されている。ＴＩＭ−３と結合し、ＴＩＭ−３とガレクチン９の相互作用を妨害し、抗腫瘍性免疫応答を刺激する抗体であれば、本明細書に開示の方法に相応するということは、当業者であれば理解できるだろう。
本明細書に開示の方法に使用に適する免疫チェックポイントを標的とする抗体は、しかしながら、本明細書に記載されるものに限定はされない。さらに、当業者であれば、本明細書に記載の方法において、他の免疫チェックポイント標的を、アンタゴニストまたは抗体により標的化できることを理解するであろう（例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２）。但し、標的化は、例えば、Ｔ細胞増殖の増加、Ｔ細胞活性化の増強、および／またはサイトカイン産生の増加に反映され、抗腫瘍性免疫応答の刺激をもたらすことになる。
２．免疫チェックポイント刺激物質
ある実施形態では、免疫チェックポイント調節物質は免疫チェックポイント刺激物質である。腫瘍細胞を直接標的とする抗体医薬とは異なり、免疫チェックポイント刺激物質は、内在性免疫系の活性化増進および／または内在性免疫系の抑制活性の低減を行う。ある実施形態では、本明細書で開示される方法において好適に用いられる免疫チェックポイント刺激物質は、刺激性シグナルのアゴニストまたは抑制性シグナルのアンタゴニストであり、例えば、抗４−１ＢＢ／ＣＤ１３７抗体、抗ＩＦＮα抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、および抗ＯＸ４０抗体などである。これらのリガンドおよび受容体については、Peggs, K.S., et al., Clin Exp Immunol., 157(1): 9-19 (2009)にて概説されている。
いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント刺激物質は、抗４−１ＢＢ／ＣＤ１３７抗体、抗ＩＦＮα抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、および抗ＯＸ４０抗体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント刺激物質は抗４−１ＢＢ／ＣＤ１３７抗体である。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント刺激物質は抗ＩＦＮα抗体である。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント刺激物質は抗ＧＩＴＲ抗体である。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント刺激物質は抗ＯＸ４０抗体である。いくつかの実施形態では、ＮＯＤ２０１が、チェックポイント刺激物質およびＩＬ−２と併用される。いくつかの実施形態では、ＮＯＤ２０１が、チェックポイント刺激物質および低用量のＩＬ−２と併用される。いくつかの実施形態では、ＮＯＤ２０１が、チェックポイント刺激物質およびＩＮＦαと併用される。いくつかの実施形態では、ＮＯＤ２０１が、ＩＦＮαと併用される。
本明細書に開示する方法は、がんなどの疾患を患う対象を治療するための方法であって、本明細書に記載されるような、治療有効量のインテグリン結合性Ｆｃ融合タンパク質を含んでなる組成物を該対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、前記方法は、ＮＯＤ２０１、ＮＯＤ２０３、および／またはＮＯＤ２０４、並びにこれらの組み合わせなどのインテグリン結合性Ｆｃ融合タンパク質の投与を含む。いくつかの実施形態では、前記インテグリン結合性Ｆｃ融合タンパク質は、免疫チェックポイントをブロックする分子、および、あるインテグリン結合性Ｆｃ融合タンパク質と併用される。いくつかの実施形態では、前記方法は、がんなどの疾患を患う対象を治療するための方法であって、免疫チェックポイントを増強する、免疫系を増強する、および／または、免疫系抑制を低減する治療有効量の分子と、インテグリン結合性Ｆｃ融合タンパク質と、ＩＬ−２（例えば、野生型ＩＬ−２、プロロイキン（Proleukin）、および／または長期ＰＫ性ＩＬ−２）と、を含んでなる組成物を該対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント刺激物質は、刺激性免疫調節因子からのシグナル伝達を増強する抗体、またはその抗原結合性タンパク質である。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント刺激物質は、抑制性免疫調節因子からのシグナル伝達を減弱する抗体、またはその抗原結合性タンパク質である。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害物質は、刺激性免疫調節因子からのシグナル伝達を増強する小分子である。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害物質は、抑制性免疫調節因子からのシグナル伝達を減弱する小分子である。
いくつかの実施形態では、阻害性免疫調節因子は、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７シグナル経路の構成成分である。従って、いくつかの実施形態では、がんを患う対象の免疫療法のための方法であって、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７を標的として、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７のＣＤ１３７Ｌとのその相互作用を妨げる治療有効量の抗体、またはその抗原結合性タンパク質を該対象に投与することを含む方法が提供される。４−１ＢＢ／ＣＤ１３７に結合し、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７のＣＤ１３７Ｌとの相互作用または別のリガンドとの相互作用を妨げ、抗腫瘍性免疫応答または免疫刺激応答を刺激することにより全体的な抗腫瘍活性をもたらすものであれば、いかなる抗体も、本明細書で開示される方法において好適に使用できることは、当業者には理解されよう。
いくつかの実施形態では、阻害性免疫調節因子は、ＩＦＮαシグナル経路の構成成分である。従って、いくつかの実施形態では、がんを患う対象の免疫療法のための方法であって、ＩＦＮαを標的とし、ＩＦＮαのリガンドとの相互作用を妨げる治療有効量の抗体またはその抗原結合性タンパク質を該対象に投与することを含む方法が提供される。ＩＦＮαに結合し、ＩＦＮαのリガンドとの相互作用を妨げ、抗腫瘍性免疫応答または免疫刺激応答を刺激することにより全体的な抗腫瘍活性をもたらすものであれば、いかなる抗体も、本明細書で開示される方法において好適に使用できることは、当業者には理解されよう。
いくつかの実施形態では、阻害性免疫調節因子はＧＩＴＲシグナル経路の構成成分である。従って、いくつかの実施形態では、がんを患う対象の免疫療法のための方法であって、ＧＩＴＲを標的とし、ＧＩＴＲのリガンドとの相互作用を妨げる治療有効量の抗体またはその抗原結合性タンパク質を該対象に投与することを含む方法が提供される。ＧＩＴＲに結合し、ＧＩＴＲのＧＩＴＲＬとの相互作用または別のリガンドとの相互作用を妨げ、抗腫瘍性免疫応答または免疫刺激応答を刺激することにより全体的な抗腫瘍活性をもたらすものであれば、いかなる抗体も、本明細書で開示される方法において好適に使用できることは、当業者には理解されよう。
いくつかの実施形態では、阻害性免疫調節因子は、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）シグナル経路の構成成分である。従って、いくつかの実施形態では、がんを患う対象の免疫療法のための方法であって、ＯＸ４０を標的とし、ＯＸ４０のリガンドとの相互作用を妨げる治療有効量の抗体またはその抗原結合性タンパク質を該対象に投与することを含む方法が提供される。ＯＸ４０に結合し、ＯＸ４０のＯＸ４０Ｌとの相互作用または別のリガンドとの相互作用を妨げ、抗腫瘍性免疫応答または免疫刺激応答を刺激することにより全体的な抗腫瘍活性をもたらすものであれば、いかなる抗体も、本明細書で開示される方法において好適に使用できることは、当業者には理解されよう。
いくつかの実施形態では、阻害性免疫調節因子はＣＤ４０シグナル経路の構成成分である。従って、いくつかの実施形態では、がんを患う対象の免疫療法のための方法であって、ＣＤ４０を標的とし、ＯＸ４０のリガンドとの相互作用を妨げる治療有効量の抗体またはその抗原結合性タンパク質を該対象に投与することを含む方法が提供される。ＣＤ４０に結合し、ＣＤ４０のリガンドとの相互作用を妨げ、抗腫瘍性免疫応答または免疫刺激応答を刺激することにより全体的な抗腫瘍活性をもたらすものであれば、いかなる抗体も、本明細書で開示される方法において好適に使用できることは、当業者には理解されよう。
いくつかの実施形態では、阻害性免疫調節因子はＩＣＯＳシグナル経路の構成成分である。従って、いくつかの実施形態では、がんを患う対象の免疫療法のための方法であって、ＩＣＯＳを標的とし、ＩＣＯＳのリガンドとの相互作用を妨げる治療有効量の抗体またはその抗原結合性タンパク質を該対象に投与することを含む方法が提供される。ＩＣＯＳに結合し、ＩＣＯＳのリガンドとの相互作用を妨げ、抗腫瘍性免疫応答または免疫刺激応答を刺激することにより全体的な抗腫瘍活性をもたらすものであれば、いかなる抗体も、本明細書で開示される方法において好適に使用できることは、当業者には理解されよう。
いくつかの実施形態では、阻害性免疫調節因子はＣＤ２８シグナル経路の構成成分である。従って、いくつかの実施形態では、がんを患う対象の免疫療法のための方法であって、ＣＤ２８を標的とし、ＣＤ２８のリガンドとの相互作用を妨げる治療有効量の抗体またはその抗原結合性タンパク質を該対象に投与することを含む方法が提供される。ＣＤ２８に結合し、ＣＤ２８のリガンドとの相互作用を妨げ、抗腫瘍性免疫応答または免疫刺激応答を刺激することにより全体的な抗腫瘍活性をもたらすものであれば、いかなる抗体も、本明細書で開示される方法において好適に使用できることは、当業者には理解されよう。
本明細書で開示される方法において好適に使用される免疫チェックポイントを標的とする抗体が、本明細書に記載されたものに限定されないことは理解されよう。さらに、本明細書に記載の方法において、他の免疫チェックポイント標的も、その標的化によって、例えばＴ細胞増殖の増加、Ｔ細胞活性化の強化、および／またはサイトカイン産生の増加（例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２）に反映されるような、免疫応答の刺激がもたらされるのであれば、アンタゴニストまたは抗体の標的となり得ることは、当業者には理解されよう。
Ｘ．免疫チェックポイント調節物質の代替物
ある実施形態では、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のアンタゴニストが、免疫チェックポイント阻害物質の代わりに使用される。最近、ＶＥＧＦは免疫抑制に関与することが示されている（Liang, W.-C. et al. J. Biol. Chem. (2006) Vol 281: 951-961; Voron, T. et al. Front Oncol (2014) Vol. 4: Article 70; Terme, M. et al, Clin Dev Immunol (2012) Vol. 2012: Article ID 492920; Kandalaft, E. et &\.,Curr Top Microbiol Immunol (201 1) Vol 344: 129-48）。そのため、ＶＥＧＦの活性を遮断することによって、免疫チェックポイント阻害物質の場合と同様に、免疫応答が増強されると考えられる。「ＶＥＧＦアンタゴニスト」とは、１または複数のＶＥＧＦ受容体への結合性を包含するＶＥＧＦ活性を、中和、遮断、阻害、抑制、低減または干渉可能な分子を指す。ＶＥＧＦアンタゴニストの非限定的な例としては、抗ＶＥＧＦ抗体およびその抗原結合性断片、ＶＥＧＦに特異的に結合することで１もしくは複数の受容体（例えば、ＶＥＧＦ受容体）に対するＶＥＧＦの結合性を封鎖する受容体分子および誘導体、抗ＶＥＧＦ受容体抗体、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼの小分子阻害剤などのＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト、並びにドミナントネガティブＶＥＧＦが挙げられる。
ある実施形態では、ＶＥＧＦアンタゴニストは抗体である。「抗ＶＥＧＦ抗体」は、十分な親和性および特異性でＶＥＧＦに結合する抗体である。抗ＶＥＧＦ抗体の非限定的な例が、米国特許第６，８８４，８７９号、同第７，０６０，２６９号、同第６，５８２，９５９号、同第６，７０３，０３０号、同第６，０５４，２９７号、米国特許出願公開第２００６００９３６０号、同第２００５０１８６２０８号、同第２００３０２０６８９９号、同第２００３０１９０３１７号、同第２００３０２０３４０９号、同第２００５０１１２１２６号、および、国際公開第９８／４５３３２号、同第９６／３００４６号、同第９４／１０２０２号、同第０５／０４４８５３号、同第１３／１８１４５２号に記載されている。上記の特許および特許出願公開の内容は参照により本明細書に援用されたものとする。ある実施形態では、ＶＥＧＦ抗体はベバシズマブ（アバスチン（Avastin）（登録商標）、ジェネンテック／ロシュ社製）またはラニビズマブ（ルセンティス（Lucentis）（登録商標）ジェネンテック／ロシュ社製）である。
ＶＥＧＦに特異的に結合するＶＥＧＦ受容体、またはその断片を用いた場合、ＶＥＧＦタンパク質に結合し、それを封鎖することで、ＶＥＧＦによる下流シグナル伝達の活性化を妨げることができる。ある実施形態では、ＶＥＧＦ受容体またはそのＶＥＧＦ結合性断片は、可溶性のＶＥＧＦ受容体であり、例えばｓＦｌｔ−１である。前記受容体の可溶型は、ＶＥＧＦに結合することで、標的細胞表面に存在する本来の受容体へのＶＥＧＦの結合を阻止することによって、ＶＥＧＦの生物活性に対する阻害効果を発揮する。ＶＥＧＦ受容体と結合するＶＥＧＦアンタゴニストの非限定的な例が、国際出願第９７／４４４５３号、同第０５／０００８９５号および米国特許出願公開第２０１４００５７８５１号に開示されている。ある実施形態では、ＶＥＧＦアンタゴニストは、参照により本明細書に援用される米国特許第８，７４１，８３９号に記載されているような、インテグリン認識ＲＧＤ配列を有するループを含有する改変ＶＥＧＦを含んでなる、二機能性の、一本鎖の、拮抗性ヒトＶＥＧＦバリアントを有するポリペプチドである。
ある実施形態では、ＶＥＧＦアンタゴニストはＶＥＧＦ受容体に結合するものであり、抗体またはＶＥＧＦ断片を挙げることができる。
ＸＩ．リンカー
ある実施形態では、前記長期ＰＫ基は、所望によりリンカーを介して、ＩＬ−２に融合されていてもよい。ある実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチドは、リンカーを介してＦｃ断片に融合されている。好適なリンカーが当該技術分野においては周知であり、例えば、その全体が参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１０／０２１０５１１号、同第２０１０／０１７９０９４号、および同第２０１２／００９４９０９号に開示されているリンカーなどがある。代表的なリンカーとして、グリシン―セリンポリペプチドリンカー、グリシン−プロリンポリペプチドリンカー、およびプロリン−アラニンポリペプチドリンカーが挙げられる。ある実施形態では、リンカーはグリシン―セリンポリペプチドリンカー、すなわち、グリシン残基とセリン残基とからなるペプチドである。
代表的なグリシン―セリンポリペプチドリンカーは、Ｓｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ、並びに（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎおよび／または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ３）ｎのアミノ酸配列から構成される。いくつかの実施形態では、ｎ＝１である。いくつかの実施形態では、ｎ＝２である。いくつかの実施形態では、ｎ＝３、すなわち、Ｓｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３である。いくつかの実施形態では、ｎ＝４、すなわち、Ｓｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４である。いくつかの実施形態では、ｎ＝５である。いくつかの実施形態では、ｎ＝６である。いくつかの実施形態では、ｎ＝７である。いくつかの実施形態では、ｎ＝８である。いくつかの実施形態では、ｎ＝９である。いくつかの実施形態では、ｎ＝１０である。別の代表的なグリシン―セリンポリペプチドリンカーは、Ｓｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎのアミノ酸配列から構成される。いくつかの実施形態では、ｎ＝ｌである。いくつかの実施形態では、ｎ＝２である。いくつかの実施形態では、ｎ＝３である。別の実施形態では、ｎ＝４である。いくつかの実施形態では、ｎ＝５である。いくつかの実施形態では、ｎ＝６である。別の代表的なグリシン―セリンポリペプチドリンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎから構成される。いくつかの実施形態では、ｎ＝１である。いくつかの実施形態では、ｎ＝２である。いくつかの実施形態では、ｎ＝３である。いくつかの実施形態では、ｎ＝４である。いくつかの実施形態では、ｎ＝５である。いくつかの実施形態では、ｎ＝６である。別の代表的なグリシン―セリンポリペプチドリンカーは、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）ｎから構成される。いくつかの実施形態では、ｎ＝１である。いくつかの実施形態では、ｎ＝２である。いくつかの実施形態では、ｎ＝３である。いくつかの実施形態では、ｎ＝４である。別の実施形態では、ｎ＝５である。さらに別の実施形態では、ｎ＝６である。別の代表的なグリシン―セリンポリペプチドリンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ３）ｎから構成される。いくつかの実施形態では、ｎ＝１である。いくつかの実施形態では、ｎ＝２である。いくつかの実施形態では、ｎ＝３である。いくつかの実施形態では、ｎ＝４である。いくつかの実施形態では、ｎ＝５である。いくつかの実施形態では、ｎ＝６である。別の代表的なグリシン―セリンポリペプチドリンカーは、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）ｎから構成される。いくつかの実施形態では、ｎ＝１である。いくつかの実施形態では、ｎ＝２である。いくつかの実施形態では、ｎ＝３である。いくつかの実施形態では、ｎ＝４である。別の実施形態では、ｎ＝５である。さらに別の実施形態では、ｎ＝６である。
いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドは、ＧＧＧＧＳ（配列番号１３６）およびＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１３７）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドは、ＧＧＧＧＳ（配列番号１３６）である。いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１３７）である。
ＸＩＩ．他の治療薬
本明細書で開示される方法において好適に使用されるインテグリン結合性Ｆｃ融合タンパク質は、１または複数の治療薬と併用することができる。一実施形態では、治療薬は抗体医薬である。別の実施形態では、治療薬は治療用タンパク質である。別の実施形態では、治療薬は小分子である。別の実施形態では、治療薬は抗原である。別の実施形態では、治療薬は細胞集団である。
ＸＩＩＩ．改変融合分子
また、本発明は、２つ以上のＩＬ−２と、本明細書に記載の抗体（例えば、抗体医薬、免疫チェックポイント阻害物質、またはＶＥＧＦと拮抗する抗体）または抗体断片とを含んでなる、改変分子を提供する。そのような改変分子は、本明細書に記載の方法において対象（例えば、がん患者）に投与されることとなる成分の数を、効果的に減らすことができる。いくつかの実施形態では、前記抗体または抗体断片は、他の構成成分（例えば、ＩＬ−２）と結合する際の足場として機能する。
従って、ある実施形態では、前記改変分子は、ＩＬ−２と、抗体または抗体断片とを含んでなる。特定の実施形態では、前記改変タンパク質に用いられる抗体は二重特異性抗体であり、該二重特異性抗体において、一方の構成成分は抗体医薬であり、他方の構成成分は免疫チェックポイント阻害物質に結合する抗体またはＶＥＧＦ活性と拮抗する抗体である。二重特異性抗体の作製法は当該技術分野において公知である。
従って、ある実施形態では、前記改変分子は、ＩＬ−２と、治療標的および免疫チェックポイント阻害物質に結合する二重特異性抗体またはＶＥＧＦと拮抗する抗体とを含んでなる。
ある実施形態では、改変タンパク質に用いられるＩＬ−２成分は、薬物動態に関連する部分が欠失したＩＬ−２（すなわち、非長期ＰＫ性ＩＬ−２）である。他の実施形態では、前記ＩＬ−２は薬物動態に関連する部分を含む（長期ＰＫ性ＩＬ−２）。
ある実施形態では、前記改変分子の各構成成分は、リンカーを用いて、またはリンカーを用いずに、前記抗体または二重特異性抗体に結合される。結合に適したリンカーは、本明細書に記載されており、さらには、当該技術分野において広く報告されている。
抗体に対して、リンカー有りまたは無しで、前記改変分子のポリペプチド系成分（例えば、ＩＬ−２）が融合可能な領域は、当該技術分野において公知であり、例えば、抗体重鎖のＣ末端および抗体軽鎖のＣ末端が挙げられる。
ある実施形態では、前記改変分子の各構成成分は、他の構成成分の機能に干渉しない。例として、前記改変タンパク質が抗体医薬とＩＬ−２とを含んでなる場合、抗体がその抗原結合機能を保持するように、且つ、ＩＬ−２のその受容体との相互作用能が保持されるように、該ＩＬ−２は該抗体医薬に融合される。本明細書に記載の方法を用いることで、例えば実施例にて、改変タンパク質の各構成成分が機能を保持しているかどうかを判定することができる。ＸＩＶ．インテグリン結合性ポリペプチドと抗体の融合体
本発明のいくつかの実施形態では、本発明のインテグリン結合性ポリペプチドは、Ｆｃに融合しているのではなく、抗体、または一本鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）およびＦａｂ断片を包含するその結合性断片に結合していてもよい。いくつかの実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチドに融合するための抗体またはその結合性断片は、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＬＡＧ−３抗体、抗ＴＩＭ−３抗体、抗４−１−ＢＢ／ＣＤ１３７抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＤ２７抗体、抗ＩＣＯＳ抗体、および抗ＰＤ−Ｌ１抗体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチド２．５Ｆ（配列番号１３０；ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＳＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧ）が抗体またはその結合性断片に融合されている。いくつかの実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチド２．５ＦｍｏｄＫ（配列番号１３１；ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＫＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧ）が抗体またはその結合性断片に融合されている。いくつかの実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチドは、本明細書に記載されるようなリンカーを介して抗体またはその結合性断片に融合されている。いくつかの実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチドは抗体軽鎖のＮ末端側に融合されている。いくつかの実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチドは抗体軽鎖のＣ末端側に融合されている。いくつかの実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチドは抗体重鎖のＮ末端側に融合されている。いくつかの実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチドは抗体軽鎖のＣ末端側に融合されている。
特に、本発明のインテグリン結合性ポリペプチドに融合させるための抗体としては、以下が挙げられるが、これらに限定はされない：抗ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体（イピリムマブ、トレメリムマブなど）；抗ＰＤ−１抗体（ニボルマブＢＭＳ−９３６５５８／ＭＤＸ−１１０６／ＯＮＯ−４５３８、ＡＭＰ２２４、ＣＴ−０１１、ＭＫ−３４７５、抗ＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト抗体（ＢＭＳ−９３６５５９／ＭＤＸ−１１０５、ＭＥＤＩ４７３６、ＲＧ−７４４６／ＭＰＤＬ３２８０Ａなど）；抗ＬＡＧ−３（ＩＭＰ−３２１など）；抗ＣＤ４０モノクローナル抗体をはじめとする免疫刺激性タンパク質を標的とするアゴニスト抗体（ＣＰ−８７０，８９３、ルカツムマブ、ダセツズマブなど）；抗ＣＤ１３７モノクローナル抗体（抗４−１−ＢＢ抗体）、例えば、ＢＭＳ−６６３５１３ ウレルマブ（抗４−１ＢＢ抗体；その全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第７，２８８，６３８号、同第８，９６２，８０４号などを参照）、およびＰＦ−０５０８２５６６（ウトミルマブ；その全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第８，８２１，８６７号；同第８，３３７，８５０号；同第９，４６８，６７８号、国際公開第２０１２／０３２４３３号などを参照）；抗ＯＸ４０モノクローナル抗体（その全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２００６／０２９８７９号、同第２０１０／０９６４１８号などを参照）；抗ＧＩＴＲモノクローナル抗体（ＴＲＸ５１８など）（その全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第７，８１２，１３５号などを参照）；抗ＣＤ２７モノクローナル抗体（バリルマブ ＣＤＸ−１１２７など）（その全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１６／１４５０８５号、米国特許出願公開第２０１１／０２７４６８５、同第２０１２／０２１３７７１号などを参照）、抗ＩＣＯＳモノクローナル抗体（例えば、ＭＥＤＩ−５７０、ＪＴＸ−２０１１、並びに、抗ＴＩＭ−３抗体（その全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１３／００６４９０号、米国特許出願公開第２０１６／０２５７７５８号などを参照）。他の抗体としては、前立腺がん、卵巣がん、乳がん、子宮内膜がん、多発性骨髄腫、メラノーマ、リンパ腫、小細胞肺がんを包含する肺がん、腎がん、結腸直腸がん、膵がん、胃がん、および脳がんに対するモノクローナル抗体を挙げることができる（通常、www.clinicaltrials.govを参照）。
ＸＶ．ポリペプチドの作製法
いくつかの態様において、本明細書に記載のポリペプチド（例えば、長期ＰＫ性ＩＬ−２などのＩＬ−２、ノッチンＦｃ、インテグリン結合性タンパク質Ｆｃ融合体）は、組換えＤＮＡ技術を用いて、形質転換した宿主細胞において作製される。そのために、前記ペプチドをコードする組換えＤＮＡ分子が作製される。そのようなＤＮＡ分子の作製法は当該技術分野において周知である。例えば、好適な制限酵素を用いて、前記ペプチドをコードする配列をＤＮＡから切り出してもよい。あるいは、前記ＤＮＡ分子を、ホスホルアミダート法などの化学合成手法を用いて合成してもよい。また、これら手法を組み合わせたものを用いてもよい。
ポリペプチドの作製法としては、適切な宿主内で前記ペプチドを発現可能なベクターも挙げられる。前記ベクターは、適切な発現制御配列に機能的に連結されたペプチドをコードするＤＮＡ分子を含む。前記ＤＮＡ分子をベクターに挿入する前または挿入した後に、この機能的な結合に影響を与える方法は周知である。発現制御配列としては、プロモーター、アクティベーター、エンハンサー、オペレーター、リボソーマルヌクレアーゼドメイン、開始シグナル、終止シグナル、キャップシグナル、ポリアデニル化シグナル、および転写または翻訳の制御に関与する他のシグナルが挙げられる。
このようにして得られた、前記ＤＮＡ分子を有するベクターを用いることで、適切な宿主を形質転換させることができる。この形質転換は、当該技術分野において周知の方法を用いて行ってよい。
多数の利用可能な周知の宿主細胞のいずれも、本発明の実施に用いてよい。特定の宿主の選択は、当該技術分野で認められる多くの要素に基づく。これらの要素としては、例えば、選択された発現ベクターとの適合性、ＤＮＡ分子にコードされるペプチドの毒性、形質転換速度、ペプチド回収の容易さ、発現特性、バイオセイフティ、およびコストが挙げられる。これらの要素のバランスのためには、全ての宿主が特定のＤＮＡ配列の発現に同等の効果を有しているわけでないことを理解していなければならない。これらの一般的な指針の範囲内で、有用な微生物宿主としては、細菌（大腸菌種など）、酵母（サッカロマイセス属菌種など）、および他の真菌培養細胞、昆虫培養細胞、植物培養細胞、哺乳類（ヒトを含む）培養細胞、または当該技術分野において公知の他の宿主が挙げられる。
次に、形質転換した宿主の培養および精製を行う。宿主細胞は、目的の化合物が発現されるような従来の発酵条件下で培養すればよい。そのような発酵条件は当該技術分野において周知である。その後、当該技術分野において周知の方法によって、培養物からペプチドが精製される。
前記化合物は合成法で作製されてもよい。例えば、固相合成法を用いてもよい。好適な手法が当該技術分野において周知であり、例えば、以下に記載の手法が挙げられる：Merrifield (1973), Chem. Polypeptides, pp. 335-61 (Katsoyannis and Panayotis eds.); Merrifield (1963), J. Am. Chem. Soc. 85: 2149; Davis et al. (1985), Biochem. Intl. 10: 394-414; Stewart and Young (1969), Solid Phase Peptide Synthesis；米国特許第３，９４１，７６３号；Finn et al. (1976), The Proteins (3rd ed.) 2: 105-253;およびErickson et al. (1976), The Proteins (3rd ed.) 2: 257-527。固相合成は、小ペプチドを作製するのに最も対費用効果が高い方法であるため、ペプチドを個々に作製する手法として好ましい。誘導体化したペプチドを含有する化合物または非ペプチド基を含有する化合物は、周知の有機化学的手法で合成できる。
他の分子発現／合成法が当該技術分野においては当業者に公知である。
１．ポリペプチドの発現
上記の核酸分子を、例えばベクターを導入された細胞内で自身の発現を指示できるベクター内に、含有させることができる。従って、長期ＰＫ性ＩＬ−２変異体およびノッチン−Ｆｃ変異体に加えて、長期ＰＫ性ＩＬ−２変異体またはノッチン−Ｆｃ変異体をコードする核酸分子を含有する発現ベクター、およびこれらのベクターをトランスフェクトした細胞も、実施形態に含まれる。
好適に使用できるベクターとしては、細菌用のＴ７系ベクター（例えば、Rosenberg et al., Gene 56: 125, 1987を参照）、哺乳類細胞用のｐＭＳＸＮＤ発現ベクター（Lee and Nathans, J. Biol. Chem. 263:3521, 1988）、および昆虫細胞用のバキュロウイルス由来ベクター（例えば、クロンテック社（カリフォルニア州パロアルト）製の発現ベクター、ｐＢａｃＰＡＫＳ）が挙げられる。そのようなベクター内の目的ポリペプチドをコードする核酸インサートを、プロモーターに機能的に連結させることができ、このプロモーターは、例えば、発現が求められる細胞型に基づいて選択される。例えば、細菌においてはＴ７プロモーターが使用可能であり、昆虫細胞においてはポリヘドリンプロモーターが使用可能であり、哺乳類細胞においてはサイトメガロウイルスプロモーターまたはメタロチオネインプロモーターが使用可能である。また、高等真核生物の場合では、組織特異的プロモーターや細胞型特異的プロモーターが広範に利用可能である。これらのプロモーターの名称は、核酸分子の発現を指示できる、体内の所与の組織または細胞型に由来している。多くのプロモーターおよび他の調節エレメントが核酸の発現指示に使用可能であることは、当業者には十分に理解される。
挿入された核酸分子の転写を促進する配列に加えて、ベクターは、複製開始点、および選択マーカーをコードする他の遺伝子を含有することができる。例えば、ネオマイシン抵抗性（ｎｅｏｒ）遺伝子は、それが発現された細胞にＧ４１８抵抗性を付与するが、これによりトランスフェクト細胞の表現型選択が可能となる。所与の調節エレメントまたは選択マーカーが特定の実験背景で好適に使用できるかどうかは、当業者であれば容易に判定できる。
本発明に使用できるウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）ベクター、およびウシパピローマウイルスベクターが挙げられる（例えば、Gluzman (Ed.), Eukaryotic Viral Vectors, CSH Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.を参照）。
本発明はまた、長期ＰＫ性ＩＬ−２変異体またはインテグリン結合性タンパク質Ｆｃ融合体変異体をコードする核酸分子を含有し発現する原核細胞または真核細胞に関する。本発明の細胞は、トランスフェクト細胞、すなわち、核酸分子、例えば長期ＰＫ性ＩＬ−２変異体またはインテグリン結合性タンパク質Ｆｃ融合体をコードする核酸分子、を組換えＤＮＡ技術により導入した細胞、である。そのような細胞の子孫も本発明の範囲内とみなされる。
発現系の厳密な成分に重要な意味はない。例えば、大腸菌などの原核生物宿主においても、あるいは、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ２１細胞）や哺乳類細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞）などの真核生物宿主においても、長期ＰＫ性ＩＬ−２変異体またはインテグリン結合性タンパク質Ｆｃ融合体変異体は産生可能である。これらの細胞は多くの供給源から入手可能であり、例えば、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（バーモント州マナッサス）が挙げられる。発現系を選択する際、重要なことは、その構成成分が互いに適合性があるか否かだけである。当業者であれば、そのような判断は可能である。さらに、発現系を選択する際に指針が要るのであれば、当業者は、Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, N.Y., 1993)およびPouwels et al.（Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985 Suppl. 1987）を参考にするとよい。
発現されたポリペプチドは、通例の生化学的方法を用いて発現系から精製でき、さらに、例えば本明細書に記載されるような治療薬として、使用できる。
ＸＶＩ．医薬組成物および投与様式
いくつかの実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体は単独で投与される。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２が、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体と共に（同時でも別々にでもよい）投与される。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２は、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体の投与の前に投与される。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２は、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体の投与の間に投与される。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２は、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体の投与の後に投与される。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２およびインテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体は同時投与される。他の実施形態では、ＩＬ−２およびインテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体は逐次投与される。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２およびインテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体は、その他の投与の１日、２日、または３日以内に投与される。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２は、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体の投与前２日目、３日目、および／または４日目に投与される。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２は、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体の投与後２日目、３日目、および／または４日目に投与される。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２は、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体の投与後２日目に投与される。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２は、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体の投与後３日目に投与される。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２は、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体の投与後４日目に投与される。
理論に束縛されるものではないが、抗体またはインテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体などのＦｃ含有腫瘍標的部分と組み合わされたＩＬ−２の治療機序の仮説としては、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体による治療後のＣＤ８＋Ｔ細胞応答の活性化および増幅というものがある（Cancer Cell. 2015 Apr 13;27(4):489-501.）。ＩＬ−２は多くの重大な臨床毒性例を引き起こしたことが周知であり、そのため、ＩＬ−２投与の用量および頻度は最小限にすることが望ましい。従って、低用量ＩＬ−２の皮下投与を含む臨床プロトコルを試験したところ、効能はいくらか低減したが、はるかに良い耐用性が示されるという知見を得た（Journal of Clinical Oncology, Vol 21, No 16 (August 15), 2003: pp 3127-3132）。この低用量を、プロロイキン投与用の好適なアロトメリースケーリングアルゴリズムを用いることによりマウスで試験してもよく（http://www.fda.gov/downloads/Drugs/.../Guidances/UCM078932.pdf）、約４μｇの皮下投与という用量が得られる。長期ＰＫ性ＩＬ−２の代わりに、より良い耐用性を示すスケジュールで、低用量ＩＬ−２を、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体の投与の翌日から開始して毎日、皮下投与できることが示される。低用量ＩＬ−２は、高親和性ＩＬ−２受容体サブユニットα（別名ＣＤ２５）を発現している細胞を優先的に刺激する。免疫抑制性調節性ＣＤ４陽性Ｔ細胞（調節性Ｔ細胞）は、高レベルのＣＤ２５を発現することが知られており、活性化型細胞傷害性ＣＤ８陽性Ｔ細胞（ＣＴＬ）もＣＤ２５を一過性に発現する。調節性Ｔ細胞を優先的に刺激させる目的で、低用量ＩＬ−２の長期に亘る皮下投与を試験したところ、移植片対宿主病患者において成功した（Science Translational Medicine Vol 5 Issue 179 179ra43）。調節性Ｔ細胞によってもたらされるこの免疫抑制効果が、皮下ＩＬ−２に対する目的の活性化ＣＴＬ応答を妨害するのではと予測する当業者がいるかもしれない。しかし、実際には、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体と、低用量ＩＬ−２の毎日皮下投与の組み合わせを３日間行うことにより、がん動物モデルにおいて有意な治療効果がもたらされるという知見が得られた（図４および図７参照）。
いくつかの実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体およびＩＬ−２は、免疫チェックポイント阻害物質と共に投与される。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害物質は抗ＰＤ−１抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体としては、以下を挙げることができるが、これらに限定はされない：ニボルマブ（ＢＭＳ−９３６５５８、ブリストル・マイヤーズスクイブ社）、ペンブロリズマブ（ランブロリズマブ、ＭＫ０３４７５またはＭＫ−３４７５、メルク社）、ヒト型化抗ＰＤ−１抗体ＪＳ００１（君実生物医薬社）、モノクローナル抗ＰＤ−１抗体ＴＳＲ−０４２（テサロ社）、ピジリズマブ（抗ＰＤ−１モノクローナル抗体ＣＴ−０１１、メディベーション社）、抗ＰＤ−１モノクローナル抗体ＢＧＢ−Ａ３１７（ベイジーン社）、および／または抗ＰＤ−１抗体ＳＨＲ−１２１０（上海ハンルイ医薬社）、ヒトモノクローナル抗体ＲＥＧＮ２８１０（リジェネロン社）、ヒトモノクローナル抗体ＭＤＸ−１１０６（ブリストル・マイヤーズスクイブ社）、および／またはヒト型化抗ＰＤ−１ＩｇＧ４抗体ＰＤＲ００１（ノバルティス社）。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１抗体は、ＲＭＰ１−１４（ラットＩｇＧ）（バイオＸセル社、カタログ番号ＢＰ０１４６）クローン由来である。
いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害物質は抗ＣＴＬＡ−４抗体であり、例えば、イピリムマブ（ヤーボイ、ブリストル・マイヤーズスクイブ社）などである。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害物質の代わりに、ＶＥＧＦのアンタゴニストが使用される。
本発明の医薬組成物は、併用療法で、すなわち、他の薬剤と組み合わせて、投与することができる。薬剤としては、インビトロ合成により調製された化学成分、抗体、抗原結合領域、並びにそれらの組み合わせおよびコンジュゲートが挙げられるが、これらに限定はされない。ある実施形態では、薬剤はアゴニスト、アンタゴニスト、アロステリックモジュレーター、または毒素として作用し得る。
いくつかの実施形態では、本発明は、長期ＰＫ性ＩＬ−２と、薬剤的に許容できる賦形剤、担体、溶解補助剤、乳化剤、保存剤および／またはアジュバントとを、含んでなる別個の医薬組成物、並びに、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体と、薬剤的に許容できる賦形剤、担体、溶解補助剤、乳化剤、保存剤および／またはアジュバントとを含んでなる別の医薬組成物を提供する。ある実施形態では、本発明はさらに、免疫チェックポイント阻害物質（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）と、薬剤的に許容できる賦形剤、担体、溶解補助剤、乳化剤、保存剤および／またはアジュバントとを含んでなる別個の医薬組成物を提供する。ある実施形態では、前記医薬組成物は、ＩＬ−２または長期ＰＫ性ＩＬ−２およびインテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体の両方と、薬剤的に許容できる賦形剤、担体、溶解補助剤、乳化剤、保存剤および／またはアジュバントとを含んでなる。ある実施形態では、前記医薬組成物は、ＩＬ−２または長期ＰＫ性ＩＬ−２、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体、並びに免疫チェックポイント調節物質（阻害物質および／または刺激物質を含む）（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）と、薬剤的に許容できる賦形剤、担体、溶解補助剤、乳化剤、保存剤および／またはアジュバントとを含んでなる。
いくつかの実施形態では、本発明は、ＩＬ−２または長期ＰＫ性ＩＬ−２と、薬剤的に許容できる賦形剤、担体、溶解補助剤、乳化剤、保存剤および／またはアジュバントとを含んでなる医薬組成物、並びに、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体と、薬剤的に許容できる賦形剤、担体、溶解補助剤、乳化剤、保存剤および／またはアジュバントとを含んでなる別の医薬組成物を提供する。ある実施形態では、本発明は、免疫チェックポイント阻害物質と、薬剤的に許容できる賦形剤、担体、溶解補助剤、乳化剤、保存剤および／またはアジュバントとを含んでなる医薬組成物を提供する。ある実施形態では、前記薬剤の各々、例えば、ＩＬ−２、長期ＰＫ性ＩＬ−２、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体、および所望による免疫チェックポイント阻害物質（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）は、別個の組成物として製剤化され得る。いくつかの実施形態では、許容できる製剤化材は、使用された用量および濃度において、受容者に無毒であることが好ましい。ある実施形態では、前記製剤化材は皮下投与用、且つ／または静脈内投与用である。ある実施形態では、前記医薬組成物は、例えば、前記組成物のｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色、等張性、匂い、無菌性、安定性、溶解率、遊離率、吸着性、または浸透性を変化、維持または保存するための製剤化材を含有することができる。ある実施形態では、好適な製剤化材としては、以下が挙げられるが、これらに限定はされない：アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジンなど）；抗菌剤；抗酸化剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、または亜硫酸水素ナトリウムなど）；緩衝液（ホウ酸、炭酸水素、トリス塩酸、クエン酸、リン酸、または他の有機酸など）；増量剤（マンニトールまたはグリシンなど）；キレート化剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）；錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンなど）；充填剤；単糖類；二糖類；および他の炭水化物（グルコース、マンノースまたはデキストリンなど）；タンパク（血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなど）；着色剤、着香剤および希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）；低分子量ポリペプチド；塩形成対イオン（ナトリウムなど）；保存剤（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素など）；溶剤（グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなど）；糖アルコール（マンニトールまたはソルビトールなど）；懸濁化剤；界面活性剤または湿潤剤（プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート、例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサポール（tyloxapal）など）；安定性増強剤（スクロースまたはソルビトールなど）；張度増強剤（tonicity enhancing agent）（アルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、マンニトールソルビトールなど）；送達基剤；賦形剤；医薬品添加物、並びに／または医薬品アジュバント(Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, A. R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company（1995）。ある実施形態では、前記製剤は、ＰＢＳ；２０ｍＭ ＮａＯＡＣ、ｐＨ５．２、５０ｍＭ ＮａＣｌ；および／または１０ｍＭ ＮＡＯＡＣ、ｐＨ５．２、９％スクロースを含む。ある実施形態では、最適な医薬組成物は、例えば、意図する投与経路、送達様式および目的の用量に基づいて、当業者によって決定される。例えば、上記のRemington’s Pharmaceutical Sciencesを参照されたい。ある実施形態では、このような組成物は、長期ＰＫ性ＩＬ−２、ノッチン−Ｆｃ、および所望による免疫チェックポイント阻害物質（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）の、物理的状態、安定性、生体内放出速度および生体内クリアランス速度に影響し得る。
いくつかの実施形態では、医薬組成物中の主要な基剤または担体は、実際には水性でも非水性でもあり得る。例えば、ある実施形態では、好適な基剤または担体は、非経口投与用の組成物に通常含まれる他の物質を添加されていてもよい、注射用蒸留水、生理的食塩水または人工脳脊髄液であり得る。ある実施形態では、前記食塩水は等張リン酸緩衝食塩水を含む。ある実施形態では、血清アルブミンを混合した中性緩衝食塩水または食塩水が、さらなる代表的な基剤である。ある実施形態では、医薬組成物は、約ｐＨ７．０〜８．５のトリス緩衝液または約ｐＨ４．０〜５．５の酢酸緩衝溶液を含み、該緩衝液はソルビトールまたはその好適な代用物をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２または長期ＰＫ性ＩＬ−２、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体、および所望による免疫チェックポイント阻害物質（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）を含んでなる組成物は、所望の純度を有する選択された組成物を、任意の製剤化剤（上記Remington's Pharmaceutical Sciences）と混合して凍結乾燥塊または水溶液の形態にすることによって、保存用に調製することができる。さらに、ある実施形態では、ＩＬ−２または長期ＰＫ性ＩＬ−２、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体、および所望による免疫チェックポイント阻害物質（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）を含んでなる組成物は、スクロースなどの適切な医薬品添加物を用いて、凍結乾燥物として製剤化できる。
いくつかの実施形態では、前記医薬組成物は、非経口送達用に選択できる。いくつかの実施形態では、前記組成物は、吸入用に、または消化管を経た（例えば、経口的な）送達用に、選択できる。そのような薬剤的に許容できる組成物の調製は、当業者の能力の範囲内である。
いくつかの実施形態では、前記製剤成分は投与部位に許容される濃度で含まれる。いくつかの実施形態では、前記組成物を生理的ｐＨに、またはそれよりもわずかに低いｐＨに、通常は約ｐＨ５〜約ｐＨ８の範囲内に維持するために、緩衝液が使用される。
ある実施形態では、非経口投与が企図される場合、治療用組成物は、目的の長期ＰＫ性ＩＬ−２、ノッチン−Ｆｃ、および所望による免疫チェックポイント阻害物質（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）を含んでなる、薬剤的に許容できる基剤中の、発熱物質を含有しない、非経口的に許容できる水溶液の形態とすることができる。ある実施形態では、非経口注射用の基剤は滅菌蒸留水であり、滅菌蒸留水中で、ＩＬ−２または長期ＰＫ性ＩＬ−２、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体および所望による免疫チェックポイント阻害物質（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）は、無菌等張液として製剤化され、適宜保存される。いくつかの実施形態では、前記調製は、前記目的の分子の、注射用ミクロスフェア、生体内分解性粒子、高分子化合物（ポリ乳酸またはポリグリコール酸など）、ビーズまたはリポソームなどの剤との、製剤化を含むことができ、これにより、後に蓄積注射により送達され得る生成物の制御放出または持続放出が可能となり得る。いくつかの実施形態では、ヒアルロン酸を使用することもでき、ヒアルロン酸は血流滞留期間を持続促進する効果を有し得る。ある実施形態では、植え込み式の薬物送達デバイスを用いて、目的の分子が導入され得る。
いくつかの実施形態では、医薬組成物が吸入用に製剤化され得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２または長期ＰＫ性ＩＬ−２、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体、および所望による免疫チェックポイント阻害物質（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）が、吸入用に乾燥粉末として製剤化され得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２または長期ＰＫ性ＩＬ−２、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体、および所望による免疫チェックポイント阻害物質（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）を含んでなる吸入液が、エーロゾル送達用に、噴射剤と製剤化され得る。ある実施形態では、水剤が噴霧投与され得る。肺内投与については、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／００１８７５号でさらに説明されており、該ＰＣＴ出願には、化学修飾タンパク質の肺送達が記載されている。
ある実施形態では、経口投与可能な製剤が企図される。ある実施形態では、この様式で投与されるＩＬ−２または長期ＰＫ性ＩＬ−２、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体、および所望による免疫チェックポイント阻害物質（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）が、錠剤およびカプセル剤などの固体剤形の配合で通例使用される担体を含んで、または含まずに、製剤化され得る。いくつかの実施形態では、胃腸管内の、生物学的利用能が最大となり、全身循環前の分解が最小となる時点で、製剤の有効成分を放出するように、カプセルが設計され得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２または長期ＰＫ性ＩＬ−２、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体、および所望による免疫チェックポイント阻害物質（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）の吸収を促進するために、少なくとも１種の追加の剤が含有され得る。いくつかの実施形態では、賦形剤、着香剤、低融点ワックス、植物油、滑沢剤、懸濁化剤、錠剤崩壊剤、および結合剤も使用され得る。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、有効量のＩＬ−２ 長期ＰＫ性ＩＬ−２、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体、および所望による免疫チェックポイント阻害物質（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）の混合物を、錠剤の製造に好適な無毒の医薬品添加物と一緒に含み得る。いくつかの実施形態では、滅菌水、または別の適切な基剤中に、錠剤を溶解することにより、単位用量形態の水剤が調製され得る。いくつかの実施形態では、好適な医薬品添加物としては、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムなどの不活性な賦形剤；あるいは、デンプン、ゼラチン、アカシアなどの結合剤；あるいは、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、タルクなどの滑沢剤が挙げられるが、これらに限定はされない。
持続送達製剤または制御送達製剤として、ＩＬ−２または長期ＰＫ性ＩＬ−２、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体、および所望による免疫チェックポイント阻害物質（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）を含む製剤をはじめとするさらなる医薬組成物が、当業者には明らかである。いくつかの実施形態では、種々の他の持続送達手段または制御送達手段、例えば、リポソーム担体、生体内分解性微小粒子または多孔質ビーズおよびデポ剤、を製剤化するための手法も、当業者に公知のものである。例えば、医薬組成物を送達するための多孔性ポリマー微粒子の制御放出を記載している、参照により本明細書に援用される、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９号を参照されたい。いくつかの実施形態では、持続放出製剤としては、成型品（例えばフィルム、またはマイクロカプセル）形態の半透性ポリマーマトリックスを挙げることができる。持続放出マトリックスとしては、以下を挙げることができる：ポリエステル、ヒドロゲル、ポリ乳酸（参照により本明細書に援用される、米国特許第３，７７３，９１９号および欧州特許第０５８，４８１号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタミン酸（gamma efhyl-L-glutamate）とのコポリマー（Sidman et al., Biopolymers, 22:547-556 (1983)）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（poly (2-hydroxyefhyl-mefhacrylate)）（Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277（1981）およびLanger, Chem. Tech., 12:98- 105 (1982)）、エチレン酢酸ビニル（上記Langer et al.）、またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１３３，９８８号）。ある実施形態では、持続放出組成物はリポソームを含むこともでき、当該技術分野において公知のいくつかの方法のうちのいずれかにより調製できる。例えば、Eppstein et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688-3692（1985）；欧州特許第０３６，６７６号；同第０８８，０４６号および同第１４３，９４９号を参照されたい。
生体内投与に用いられる医薬組成物は通常は無菌である。ある実施形態では、これは無菌ろ過膜を通じた濾過により達成され得る。前記組成物が凍結乾燥されるいくつかの実施形態では、この方法を用いた滅菌は、凍結乾燥および再構成の前または後に行われ得る。ある実施形態では、非経口投与用の前記組成物は、凍結乾燥形態で、または溶液として、保存され得る。いくつかの実施形態では、非経口用組成物は、通常、無菌のアクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射用針で貫通可能な栓を有する静脈注射用溶液バッグまたはバイアル、の中に入っている。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、製剤化された後、無菌バイアル中で、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体、脱水粉末または凍結乾燥粉末として、保存され得る。いくつかの実施形態では、このような製剤は、そのまま使用できる形態で、または、投与前に再構成される形態（例えば、凍結乾燥形態）で、保存され得る。
いくつかの実施形態では、単回投与ユニットをつくるためのキットが提供される。ある実施形態では、前記キットは、乾燥タンパク質を含む第一容器および水性製剤を含む第二容器の両方を含み得る。いくつかの実施形態では、シングルチャンバ式充填済み注射器を含むキットおよびマルチチャンバ式充填済み注射器を含むキットも包含される（例えば、液体用注射器および凍結乾燥製剤用注射器（lyosyringe））。
いくつかの実施形態では、治療用に使用される、長期ＰＫ性ＩＬ−２を含んでなる医薬組成物、並びに／または、ノッチン−Ｆｃを含んでなる医薬組成物、および所望による免疫チェックポイント阻害物質（もしくはＶＥＧＦのアンタゴニスト）を含んでなる医薬組成物のうちの１もしくは複数、の有効量は、例えば治療の背景と目的とに依存する。それ故、ある実施形態において、治療のための適切な用量レベルが、以下のものに部分的に依存して変動することは、当業者には理解される：送達される分子、ＩＬ−２または長期ＰＫ性ＩＬ−２、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体、および所望による免疫チェックポイント阻害物質（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）が使用される適応症、投与経路、並びに、サイズ（体重、体表または臓器サイズ）、並びに／または、患者の状態（年齢および全体的な健康）。いくつかの実施形態では、臨床医は、最適な治療効果を得るために、用量滴定し、投与経路を変更することができる。ある実施形態では、ＩＬ−２または長期ＰＫ性ＩＬ−２およびインテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体の典型的な用量は、それぞれ、上記要素に依存して、約０．１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、またはそれ以上の範囲を取り得る。ある実施形態では、前記用量は、０．１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ；または１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ；または５μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの範囲を取り得る。いくつかの実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体の前記用量は、約５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの範囲を取り得る。いくつかの実施形態では、前記用量は、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇ、または約５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲を取り得る。いくつかの実施形態では、前記用量は約１０ｍｇ／ｋｇである。
ＩＬ−２の用量としては、高用量（ＨＤ）：０．７２ＭＩＵ／ｋｇ、毎８時間、１５回（８０ＭＩＵ／ｍ２／日）；低用量（ＬＤ）：８ＭＩＵ／ｍ２／日；および皮下用量（ＳＣ）：２５０，０００Ｕ／ｋｇ／投与（９．２５ＭＩＵ／ｍ２／日、週５日間、２〜６週目は用量半分）を挙げることができるが、これらに限定はされない。ＭＩＵは百万国際単位を指す。皮下ＩＬ−２は、耐用性が良好であり、１０％の皮下ＩＬ−２奏功率を示すことが示されている（例えば、J Clin Oncol 21:3127-3132, 2003参照）。従って、他の皮下ＩＬ−２用量としては、１ＭＩＵ／ｍ２を、２〜７日目、１２〜２１日目；その後、１２ＭＩＵ／ｍ２を、９〜１１日目に、１〜３サイクル（例えば、Mani et al., Breast Cancer Research and Treatment, 117(1), 83-89. 2009を参照）、並びに、８．８ＭＩＵ／ｍ２／日、６．２５ＭＩＵ／ｍ２／日（２〜５週目は１４ＭＩＵ、皮下を週３回、６〜９週目は１０ＭＩＵ、皮下を週３回；例えば、Clinical Cancer Research 12(23), 7046-7053, 2006を参照；下記の表３〜５を参照）を挙げることができる。本明細書に記載の実施例はマウスでの研究を対象としているが、そのような研究は、ＩＬ−２投薬をはじめとして、ヒト患者に置き換え可能である。例えば、ヒトでの９ＭＩＵ／ｍ２はマウスでの３．６μｇと等価である。ＦＤＡヒト等価用量（ＨＥＤ）は体面積に基づいたものである（例えば、参照により本明細書に援用される、http://www.fda.gov/downloads/drugs/guidances/ucm078932.pdfを参照；下記の表１および表３を参照）。例えば、９ＭＩＵ／ｍ２／（３７ｋｇ／ｍ２）＝０．２４ＭＩＵ／ｋｇ×１２．３（表３）＝２．９５ＭＩＵ／ｋｇ（マウス）および２．９５ＭＩＵ／ｋｇ／（１６．４ＭＩＵ／ｍｇ）＊０．０２ｋｇ／マウス＝３．６μｇ（マウス）。


ａヒトは６０ｋｇとする。列挙されていない種や標準範囲外の体重については、ＨＥＤは次式から算出できる：ＨＥＤ＝動物用量（ｍｇ／ｋｇ）×（動物体重（ｋｇ） ヒト体重（ｋｇ））０．３３。
ｂ健全な小児が第１相臨床試験の志願者となることは稀であるため、このｋｍ値はただの参考である。
ｃ例えば、カニクイザル、アカゲザル、およびベニガオザル（stumptail）。


ａ特定の範囲内の動物体重について、標準的なｋｍ値を用いて算出された６０ｋｇのヒトのＨＥＤは、正確な動物体重に基づいたｋｍ値を用いて算出されたＨＥＤから±２０パーセントを超えて異なることはない。
bヒトは６０ｋｇとする。列挙されていない種や標準範囲外の体重については、ＨＥＤは次式から算出できる：ＨＥＤ＝動物用量（ｍｇ／ｋｇ）×（動物体重（ｋｇ） ヒト体重（ｋｇ））０．３３。
ｃ健全な小児が第１相臨床試験の志願者となることは稀であるため、このｋｍ値はただの参考である。
ｄ例えば、カニクイザル、アカゲザル、およびベニガオザル（stumptail）。
１ＭＩＵ／ｍ２当たり０．７ｎＭが皮下投与される場合、皮下ＩＬ−２には血漿ピークがある。計算は以下の通りである。
１ＭＣＵ／ｍ２当たり１０．６ＣＵ／ｍＬ；
１０．６ＣＵ／ｍＬ／（４×１０６ＣＵ／ｍｇ）＊１０００ｍＬ／Ｌ／（１５，３００ｍｇ／ｍｍｏｌ）×１０６ｎｍｏｌ／ｍｍｏｌ＝０．１７ｎＭ
１６．４ＭＩＵ／ｍｇ／（４ＭＣＵ／ｍｇ）＝４．１ＭＩＵ／ＭＣＵ
これは、例えばCancer Research 50. 2009-2017, ’90に記載されており、その表４が以下に記載される。


ＩＬ−２は、皮下注射により０．５または１．０ＭＵ／ｍ２の用量で投与した。活性は、注射の０．５、１、２、３、４、６、８、および２４時間後に採取した血清において測定したものである。中央値用量の正規化されたピークレベル（１０．７ユニット／ｍｌ）およびピーク時間（１８０分）は、筋肉内投与後に観察された対応するそれぞれの値（１４．０ユニット／ｍｌおよび１５０分）と類似している（表４）。筋肉内での試験と比較して、この試験では服用レベルが低くなり、意味のあるＡＵＣ値が得られなかった。
プロロイキンに関して、プロロイキンは１５．３ｋＤの分子量を有し、１６．４ＭＩＵ／ｍｇで投与することができる。「シータスユニット（Cetus Units）」および「ロシュユニット（Roche Units）」をはじめとして、他の用量単位が記載されたが、１シータスユニット＝３−６ＩＵである（例えば、http://cancerguide.org/rcc_il2.html Cancer Research 50. 2009-2017, ’90を参照）。
ＩＬ−２投与における体表面積用量換算係数に関しては、以下を本明細書に記載の方法に適用できる。成人において、１００ｍｇ／ｋｇは、１００ｍｇ／ｋｇ×３７ｋｇ／ｍ２＝３７００ｍｇ／ｍ２、に相当する。マウスにおける所与の用量ｍｇ／ｋｇを１２で割ることで、ヒトにおける等価用量（単位ｍｇ／ｍ２）を得ることができる。例えば、６０ｋｇのヒトは１．６ｍ２の表面積を有する。例えば、https://ncifrederick.cancer.gov/Lasp/Acuc/Frederick/Media/Documents/ACUC42.pdfを参照されたい。
いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害物質の典型的な用量は、上記要素に依存して、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約３００ｍｇ／ｋｇの範囲を取り得る。いくつかの実施形態では、前記用量は、１ｍｇ／ｋｇ〜約３００ｍｇ／ｋｇ；または５ｍｇ／ｋｇ〜約３００ｍｇ／ｋｇ；または１０ｍｇ／ｋｇ〜約３００ｍｇ／ｋｇの範囲を取り得る。
いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント刺激物質の典型的な用量は、上記要素に依存して、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約３００ｍｇ／ｋｇの範囲を取り得る。いくつかの実施形態では、前記用量は、１ｍｇ／ｋｇ〜約３００ｍｇ／ｋｇ；または５ｍｇ／ｋｇ〜約３００ｍｇ／ｋｇ；または１０ｍｇ／ｋｇ〜約３００ｍｇ／ｋｇの範囲を取り得る。
いくつかの実施形態では、ＩＦＮαの典型的な用量は、上記要素に依存して、約１，０００，０００〜３０，０００，０００ユニット／ｍ２の範囲を取り得る。いくつかの実施形態では、前記用量は、約２，０００，０００〜２５，０００，０００ユニット／ｍ２の範囲を取り得る。いくつかの実施形態では、前記用量は、約２，０００，０００〜２０，０００，０００ユニット／ｍ２の範囲を取り得る。いくつかの実施形態では、前記用量は、約５，０００，０００〜２０，０００，０００ユニット／ｍ２の範囲を取り得る。いくつかの実施形態では、前記用量は、約１０，０００，０００〜２０，０００，０００ユニット／ｍ２の範囲を取り得る。いくつかの実施形態では、前記用量は、約５，０００，０００〜１５，０００，０００ユニット／ｍ２の範囲を取り得る。いくつかの実施形態では、前記用量は、約１５，０００，０００〜２０，０００，０００ユニット／ｍ２の範囲を取り得る。いくつかの実施形態では、前記用量は、約５，０００，０００〜１０，０００，０００ユニット／ｍ２の範囲を取り得る。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ−αはメルク社から市販されているイントロンＡである（例えば、米国特許第６，６１０，８３０号およびhttps://www.merck.com/product/usa/pi_circulars/i/intron_a/intron_a_pi.pdfを参照）。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ−αはＰＥＧ−ＩＦＮ−αである。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ−αはペグイントロンである（例えば、米国特許第６，６１０，８３０号および同第６，１８０，０９６号参照）。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ−αはＳＹＬＡＴＲＯＮである（例えば、米国特許第６，６１０，８３０号および同第６，１８０，０９６号参照）。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ−ＩＦＮαは約０．２５〜２．５μｇ／ｋｇ、または約０．５〜１．５μｇ／ｋｇで投与され得る（例えば、米国特許第６，５２４，５７０号参照）。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ−ＩＦＮαは約０．２５〜２．５μｇ／ｋｇで投与され得る。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ−ＩＦＮαは、約０．５〜２．５μｇ／ｋｇで投与され得る。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ−ＩＦＮαは、約１〜２．５μｇ／ｋｇで投与され得る。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ−ＩＦＮαは、約１．５〜２．５μｇ／ｋｇで投与され得る。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ−ＩＦＮαは、約０．５〜１．５μｇ／ｋｇで投与され得る。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ−ＩＦＮαは、約０．５〜１μｇ／ｋｇで投与され得る。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ−ＩＦＮαは、約１〜１．５μｇ／ｋｇで投与され得る。
いくつかの実施形態では、投与頻度は、使用される製剤中のＩＬ−２または長期ＰＫ性ＩＬ−２、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体、および所望による免疫チェックポイント阻害物質（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）の薬物動態パラメーターを考慮に入れる。いくつかの実施形態では、臨床医は、目的の効果を達成する用量に達するまで、組成物を投与することとなる。従って、いくつかの実施形態では、前記組成物は、単回投与として、または長期的に２回以上の投与（目的の分子を同量ずつ含有してもよいし、していなくてもよい）として、または植え込み式デバイスもしくはカテーテルを介した持続点滴として、投与され得る。さらに、適切な用量の改善が当業者により行われてもよく、これは当業者が行う通例の業務の範囲内である。いくつかの実施形態では、適切な用量反応データを用いて、適切な用量が確認され得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２は、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体の前、後、および／またはそれと同時に、投与される。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２は、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体の投与の１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、またはそれ以上の日数後に、投与される。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２は、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体の投与の２日後に投与される。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２は、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体の投与の３日後に投与される。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２は、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体の投与の４日後に投与される。
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２は１２ＭＩＵ／ｍ２以下の一日量で投与される。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２用量は、１日当たり、１４ＭＩＵ／ｍ２未満、１２ＭＩＵ／ｍ２未満、１０ＭＩＵ／ｍ２未満、８ＭＩＵ／ｍ２未満、６ＭＩＵ／ｍ２未満、４ＭＩＵ／ｍ２未満、２ＭＩＵ／ｍ２未満である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２用量は、１日当たり、約１４ＭＩＵ／ｍ２〜約６ＭＩＵ／ｍ２である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２用量は、１日当たり、約１２ＭＩＵ／ｍ２〜約８ＭＩＵ／ｍ２である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２用量は、１日当たり、約１２ＭＩＵ／ｍ２〜約１０ＭＩＵ／ｍ２である。
いくつかの実施形態では、医薬組成物の投与経路は、公知の方法に従い、例えば、経口的な投与経路、静脈内経路、腹腔内経路、脳内経路（脳実質内経路）、脳室内経路、筋肉内経路、皮下経路、眼内経路、動脈内経路、門脈内経路、または病巣内経路による注射を介した投与経路；持続放出系による投与経路、または植え込み式デバイスによる投与経路である。いくつかの実施形態では、前記組成物は、ボーラス投与で投与することもできるし、点滴で持続的に投与することもできるし、または、植え込み式デバイスで投与することもできる。ある実施形態では、前記併用療法の個々の成分が異なる経路で投与されてもよい。
いくつかの実施形態では、前記組成物は、目的分子が吸着または封入されている膜、スポンジまたは他の適切な材料の植え込みによって、局所的に投与できる。植え込み式デバイスが使用されるいくつかの実施形態では、デバイスはあらゆる好適な組織または臓器に植え込むことができ、目的の分子の送達は、拡散、徐放性ボーラス（timed-release bolus）、または連続投与を介してもよい。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２または長期ＰＫ性ＩＬ−２、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体、および所望による免疫チェックポイント阻害物質（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）を含んでなる医薬組成物を、生体外で用いることが望ましい場合がある。そのような場合、患者から摘出された細胞、組織および／または臓器が、ＩＬ−２または長期ＰＫ性ＩＬ−２、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体、および所望による免疫チェックポイント阻害物質（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）を含んでなる医薬組成物に暴露され、その後、該細胞、組織および／または臓器が該患者に移植により戻される。
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２または長期ＰＫ性ＩＬ−２、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体、および所望による免疫刺激物質または免疫チェックポイント阻害物質（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）は、本明細書に記載の方法などを用いて、これらのポリペプチドを発現し分泌するように遺伝子改変されたとある細胞を移植することによって、送達されてもよい。ある実施形態では、そのような細胞は、動物細胞であってもヒト細胞であってもよく、自家性であっても、異種であっても、異種間であってもよい。いくつかの実施形態では、前記細胞は不死化されていてもよい。いくつかの実施形態では、免疫応答のリスクを減らすために、前記細胞を封入することによって、周辺組織の浸潤を回避してもよい。いくつかの実施形態では、封入材は、典型的には、タンパク質産物の放出は可能とするが、患者の免疫系による、または周辺組織由来の他の有害要素による、細胞の破壊を妨げる、生体適合性の、半透性の、ポリマー性の封入物または膜である。
ＸＶＩＩ．治療法および治療効果の読み出し
本明細書に記載されるような、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体および／またはそれを発現する核酸は、異常なアポトーシスまたは分化過程と関連した障害（例えば、がんなどの細胞増殖障害または細胞分化障害）の治療に有用である。さらに、本明細書に記載されるような、ＩＬ−２または長期ＰＫ性ＩＬ−２、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体、および所望による、阻害物質または刺激物質を含む免疫チェックポイント調節物質（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）、および／またはそれらを発現する核酸も、異常なアポトーシスまたは分化過程と関連した障害（例えば、がんなどの細胞増殖障害または細胞分化障害）の治療に有用である。本発明の方法で治療可能ながんの非限定的な例を以下に記載する。
細胞増殖性且つ／または細胞分化性の障害としては、がん（例えば、癌腫、肉腫、転移性障害または造血系腫瘍性障害、例えば白血病）が挙げられる。転移性腫瘍は多数の原発腫瘍種から生じる可能性があり、例えば、前立腺、結腸、肺、乳房および肝臓の腫瘍が挙げられるが、これらに限定はされない。従って、例えば、長期ＰＫ性ＩＬ−２、ノッチン−Ｆｃ、および所望による免疫チェックポイント阻害物質（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）を含んでなる、本発明で使用される組成物は、がん患者に投与され得る。
本明細書で使用される場合、用語「がん」（または「癌」）、「過剰増殖性の」、および「新生物の」は、自律増殖能を有する細胞を指して使用され得る（すなわち、急速な増殖性細胞成長を特徴とする異常な状態または状況）。
過剰増殖性であり且つ腫瘍形成性である疾病状態は、病的（すなわち、疾病状態を特徴付ける、または構成する）として分類される場合もあるし、非病的（すなわち、正常から逸脱しているが疾病状態を伴わない）として分類される場合もある。前記用語は、組織病理学的な種類や浸潤性のステージにかかわらず、全ての種類の、がん性増殖もしくは発がん過程、転移性組織または悪性形質転換した細胞、組織、もしくは臓器、を包含することが意図される。「病的過剰増殖性」の細胞は、悪性腫瘍成長を特徴とする疾病状態で発生する。非病的過剰増殖性細胞の例としては、傷の修復に関連する細胞の増殖が挙げられる。
増殖性疾患のさらなる例として、造血系腫瘍性障害が挙げられる。本明細書で使用される場合、用語「造血系腫瘍性障害」は、例えば、骨髄系、リンパ系もしくは赤血球系、またはその前駆細胞から生じる、造血器の過形成性／腫瘍性細胞が関与する疾患を包含する。いくつかの実施形態では、前記疾患は低分化急性白血病（例えば、赤芽球性白血病および急性巨核芽球性白血病）から生じる。さらなる代表的な骨髄性障害としては、急性前骨髄性白血病（ＡＰＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）（Vaickus, L. (1991) Crit. Rev. In Oncol./Hemotol. 11 :267-97で概説されている）が挙げられるが、これらに限定はされない。リンパ系腫瘍としては、急性リンパ芽球白血病（ＡＬＬ）（Ｂ細胞系ＡＬＬおよびＴ細胞系ＡＬＬを含む）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）、毛様細胞性白血病（ＨＬＬ）およびワルデンシュトレームマクログロブリン血症（ＷＭ）が挙げられるが、これらに限定はされない。悪性リンパ腫のさらなる形態として、非ホジキンリンパ腫およびその異型、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＦ）、ホジキン病並びにリード・シュテルンベルク病（Reed-Sternberg disease）が挙げられるが、これらに限定はされない。
用語「癌腫」は、当該技術分野において認知されており、上皮系または内分泌系の組織の悪性腫瘍を指し、例えば、呼吸器系癌、胃腸管系癌、尿生殖器系癌、精巣癌、乳癌、前立腺癌、内分泌系癌、およびメラノーマが挙げられる。ＩＬ−２ポリペプチド変異体を用いることで、腎癌もしくはメラノーマを包含するあらゆる種類のがん、もしくはあらゆるウイルス性疾患を患う患者、それを患っていることが疑われる患者、または、それを発症するリスクが高いおそれがある患者を治療することができる。代表的な癌腫としては、子宮頸部、肺、前立腺、乳房、頭頸部、結腸および卵巣の組織から形成される癌腫が挙げられる。前記用語には癌肉腫も包含され、癌肉腫には癌性組織から構成される悪性腫瘍および肉腫性組織から構成される悪性腫瘍が包含される。「腺癌」とは、腺組織由来の癌腫、または腫瘍細胞が認識できる腺構造を形成している癌腫を指す。
「がん」とは、本明細書で使用される場合、悪性増殖または腫瘍を生じるす異常で無制御な細胞分裂（例えば、無秩序な細胞増殖）を特徴とする、あらゆる腫瘍性疾患（浸潤性か、非浸潤性か、転移性かを問わない）を広く指す。がんの例としては本明細書に記載されるものが挙げられるが、これらに限定はされない。がんには、無秩序な細胞増殖を典型的な特徴とする哺乳類におけるあらゆる生理的状態が包含される。がんの例を実施例に例示したが、本明細書にも記載されている。用語「がん」または「新生物」は、肺、乳房、甲状腺、リンパ腺、リンパ組織、胃腸管系、および尿生殖路に発症したものを含む、各種臓器系の悪性腫瘍、並びに、大部分の結腸がん、腎細胞癌、前立腺がんおよび／または精巣腫瘍、非小細胞肺癌、小腸がん、並びに食道がんなどの悪性腫瘍を包含すると一般に考えられている腺癌、を指して用いられる。
本発明のインテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体を用いて治療できるがんの例としては、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、および白血病が挙げられるが、これらに限定はされない。そのようながんのより具体的な例としては、以下が挙げられる：扁平上皮がん、肺がん（小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺癌、および扁平上皮肺癌を含む）、腹膜がん、肝細胞がん、胃がん（胃腸がんを含む）、膵がん、グリア芽腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、肝細胞腫、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜癌、子宮癌、唾液腺癌、腎がん、肝臓がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、肝癌、および各種頭頚部がん、並びに、Ｂ細胞リンパ腫（例えば、低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ；巨大病変ＮＨＬ（bulky disease NHL）；マントル細胞リンパ腫；エイズ関連リンパ腫；並びに、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症）；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球白血病（ＡＬＬ）；毛様細胞性白血病；慢性骨髄芽球性白血病；多発性骨髄腫、並びに移植後リンパ球増加症（ＰＴＬＤ）。いくつかの実施形態では、本発明により治療可能な他のがんとしては、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、および白血病またはリンパ系腫瘍が挙げられるが、これらに限定はされない。そのようながんのより具体的な例としては、以下が挙げられる：結腸直腸がん、膀胱がん、卵巣がん、メラノーマ、扁平上皮がん、肺がん（小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺癌、および扁平上皮肺癌を含む）、腹膜がん、肝細胞がん、胃がん（胃腸がんを含む）、膵がん、グリア芽腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、肝細胞腫、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜癌、子宮癌、唾液腺癌、腎がん、肝臓がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、肝癌、および各種頭頚部がん、並びに、Ｂ細胞リンパ腫（例えば、低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ；巨大病変ＮＨＬ（bulky disease NHL）；マントル細胞リンパ腫；エイズ関連リンパ腫；並びに、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症）；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球白血病（ＡＬＬ）；毛様細胞性白血病；慢性骨髄芽球性白血病；並びに移植後リンパ球増加症（ＰＴＬＤ）、並びに、母斑症（phakomatoses）と関連した異常血管増殖、浮腫と関連した異常血管増殖（脳腫瘍と関連した異常血管増殖など）、並びに、メイグス症候群と関連した異常血管増殖。がんは、結腸直腸がん、乳がん、直腸がん、非小細胞肺がん、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、腎細胞がん、前立腺がん、肝臓がん、膵がん、軟部組織肉腫、カポジ肉腫、カルチノイド性癌腫（carcinoid carcinoma）、頭頚部がん、メラノーマ、卵巣がん、中皮腫、および多発性骨髄腫からなる群から選択されることが好ましい。代表的な実施形態では、がんは、早期または進行性（転移性を含む）の膀胱がん、卵巣がんまたはメラノーマである。別の実施形態では、がんは結腸直腸がんである。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、血管新生化腫瘍の治療に有用である。
腫瘍の成長およびサイズを低減するのに十分な、ＩＬ−２、長期ＰＫ性ＩＬ−２、ＩＦＮα、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体、および所望による阻害物質または刺激物質を含む免疫チェックポイント調節物質（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）の各々の量、すなわち治療有効量は、選択された特定の化合物または組成物によって変化するだけでなく、投与経路、治療されている病状の性質、並びに患者の年齢および状態によっても変化するため、最終的には患者の医師または薬剤師の自由裁量となることは、当業者に理解される。本方法で使用される化合物が与えられる期間は個人レベルで異なる。本明細書に記載されているように、免疫チェックポイント阻害物質には抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体が包含され、免疫刺激物質には抗４−１ＢＢ／ＣＤ１３７抗体が包含される。
本明細書の実施例で使用される結腸癌モデル（結腸癌ＭＣ３８マウス）が一般化された（generalized）固形腫瘍モデルであることは、当業者には理解される。すなわち、このモデルにおける治療効率によって、他の非メラノーマ固形腫瘍における治療効率も予測される。例えば、Baird et al. (J Immunology 2013; 190:469-78; Epub Dec 7, 2012)に記載されているように、適応免疫応答を誘導する寄生虫株であるｃｐｓの、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍に対する抗腫瘍免疫を媒介する際の有効性は、肺癌モデルおよび卵巣がんモデルをはじめとする他の固形腫瘍に一般化可能であることが分かった。別の例では、ＶＥＧＦ標的リンパ球の一連の研究から得られた結果も、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍における結果がその他の研究対象の腫瘍型に一般化可能であったことを示している（Chinnasamy et al., JCI 2010; 120:3953-68; Chinnasamy et al, Clin Cancer Res 2012; 18: 1672-83）。さらに別の例では、ＬＡＧ−３およびＰＤ−１を伴う免疫療法が腫瘍量の減少をもたらし、その結果は、線維肉腫細胞株および結腸腺癌細胞株において一般化可能であった（Woo et al., Cancer Res 2012;72:917-27）。
いくつかの実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体を用いて、がんが治療される。いくつかの実施形態では、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体、および所望による免疫チェックポイント刺激物質または免疫チェックポイント阻害物質（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）を用いて、がんが治療される。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２または長期ＰＫ性ＩＬ−２、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体、および所望による免疫刺激物質（immune stimultator）または免疫チェックポイント阻害物質（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）を用いて、がんが治療される。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体、および所望による免疫刺激物質または免疫チェックポイント阻害物質（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）を用いて、がんが治療される。いくつかの実施形態では、長期ＰＫ性ＩＬ−２、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体、および所望による免疫刺激物質または免疫チェックポイント阻害物質（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）を用いて、がんが治療される。
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２または長期ＰＫ性ＩＬ−２、ＩＦＮα、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体、および所望による免疫刺激物質または免疫チェックポイント阻害物質（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）を用いて、メラノーマ、白血病、肺がん、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、結腸がん、腎癌、および脳がんが治療される。
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２または長期ＰＫ性ＩＬ−２、ＩＦＮα、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体、および所望による免疫刺激物質または免疫チェックポイント阻害物質（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）により、腫瘍細胞の成長および／または増殖が阻害される。
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２または長期ＰＫ性ＩＬ−２、ＩＦＮα、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体、および所望による免疫刺激物質または免疫チェックポイント阻害物質（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）により、腫瘍サイズが減少する。
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２ 長期ＰＫ性ＩＬ−２、ＩＦＮα、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体、および所望による免疫刺激物質または免疫チェックポイント阻害物質（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）によって、原発腫瘍の転移が阻害される。
いくつかの実施形態では、ＩＬ−２を含むかまたは含まない、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体および免疫刺激物質または免疫チェックポイント阻害物質（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）によって、腫瘍細胞の成長および／または増殖が阻害される。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２を含むかまたは含まない、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体および免疫刺激物質または免疫チェックポイント阻害物質（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）によって、腫瘍サイズが減少する。ある実施形態では、ＩＬ−２を含むかまたは含まない、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体および免疫刺激物質または免疫チェックポイント阻害物質によって、原発腫瘍の転移が阻害される。
いくつかの実施形態では、ＩＦＮαを含むかまたは含まない、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体および免疫刺激物質または免疫チェックポイント阻害物質（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）によって、腫瘍細胞の成長および／または増殖が阻害される。いくつかの実施形態では、ＩＦＮαを含むかまたは含まない、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体および免疫刺激物質または免疫チェックポイント阻害物質（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）によって、腫瘍サイズが減少する。ある実施形態では、ＩＦＮαを含むかまたは含まない、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体および免疫刺激物質または免疫チェックポイント阻害物質によって、原発腫瘍の転移が阻害される。
本明細書における治療への言及が、予防にまで及び、さらには、有名ながんおよび症状の治療にも及ぶことは、当業者には理解される。
本明細書における「がん治療」とは、がんを予防もしくは治療する、または、がんの症状のうちの１もしくは複数を改善する、あらゆる方法を指す。通常、そのような治療法は、単独、または、その活性を増強するための、化学療法もしくは放射線療法もしくは他の生物学的製剤と組み合わせた、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体の投与を含む。いくつかの実施形態では、がん治療は、生存率の増加を伴うか、またはそれによって測られ得る。いくつかの実施形態では、がん治療は腫瘍体積の減少をもたらす。
いくつかの実施形態では、ＮＯＤ２０１単独と比較した場合、ＮＯＤ２０１＋抗ＣＴＬＡ−４を含む組み合わせ、ＮＯＤ２０１＋抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む組み合わせ、ＮＯＤ２０１＋抗４−１ＢＢ／ＣＤ１３７抗体を含む組み合わせ、およびＮＯＤ２０１＋抗ＰＤ−１抗体を含む組み合わせにより、生存率効果の上昇が見られる。いくつかの実施形態では、前記組み合わせはＩＬ−２をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記組み合わせはＩＦＮαをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＮＯＤ２０１を、抗ＰＤ−１抗体およびＩＬ−２と併用した場合に、生存率効果の上昇が見られる。いくつかの実施形態では、ＮＯＤ２０１を、抗ＰＤ−１抗体および低用量ＩＬ−２と併用した場合に、生存率効果の上昇が見られる。
いくつかの実施形態では、ＮＯＤ２０１単独と比較した場合、ＮＯＤ２０１＋抗ＬＡＧ−３抗体を含む組み合わせ、ＮＯＤ２０１＋抗ＴＩＭ−３抗体を含む組み合わせ、またはＮＯＤ２０１＋抗ＴＩＧＩＴ抗体を含む組み合わせによる、生存率効果の上昇は見られない。
いくつかの実施形態では、ＮＯＤ２０１単独と比較した場合、ＮＯＤ２０１＋抗ＣＴＬＡ−４を含む組み合わせ、ＮＯＤ２０１＋抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む組み合わせ、ＮＯＤ２０１＋抗４−１ＢＢ／ＣＤ１３７抗体を含む組み合わせ、およびＮＯＤ２０１＋抗ＰＤ−１抗体を含む組み合わせにより、腫瘍体積の減少が見られる。いくつかの実施形態では、前記組み合わせはＩＬ−２をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記組み合わせはＩＦＮαをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＮＯＤ２０１を、抗ＰＤ−１抗体およびＩＬ−２と併用した場合に、腫瘍体積の減少が見られる。いくつかの実施形態では、ＮＯＤ２０１を、抗ＰＤ−１抗体および低用量ＩＬ−２と併用した場合に、腫瘍体積の減少が見られる。
いくつかの実施形態では、ＮＯＤ２０１単独と比較した場合、ＮＯＤ２０１＋抗ＬＡＧ−３抗体を含む組み合わせ、ＮＯＤ２０１＋抗ＴＩＭ−３抗体を含む組み合わせ、またはＮＯＤ２０１＋抗ＴＩＧＩＴ抗体を含む組み合わせによる、腫瘍体積の減少は見られない。
ＮＯＤ２０１および抗ＰＤ−１抗体を用いた治療について、いくつかの実施形態では、治療効率の決定に関連するマーカーについて患者を検査してもよい。いくつかの実施形態では、これらのマーカーはＴ細胞遺伝子サブセットであり、例えば、Ｔ細胞活性化遺伝子が挙げられる（例えば図３５、図３６、図３７、図３８、および図３９を参照）。いくつかの実施形態では、治療法の応答者と非応答者とを比較した場合、Ｔ細胞活性化遺伝子の発現には有意差がある（例えば、図３９参照）。ＮＯＤ２０１および抗ＰＤ−１抗体を用いた治療においては、いくつかの実施形態では、治療法の応答者と非応答者とを比較した場合、Ｔ細胞活性化遺伝子の発現には有意差がある。いくつかの実施形態では、治療法の応答者と非応答者とを比較した場合、Ｌａｔ、Ｐａｋ１、Ｖａｖ３、Ｇｒａｐ３、Ｇｒｂ２、Ｗａｓ、Ｒａｃ２、Ｌｃｐ２、Ｖａｖ１、Ｒａｃ１、Ｐｌｃｇ１、Ｐａｋ２、Ｓｏｓ１、Ｓｏｓ２、Ｖａｖ２、Ｃｄｃ４２、Ｎｃｋ１、Ｒａｃ３、Ｎｃｋ２、および／またはＰＡＫ３の発現に有意差がある。ＮＯＤ２０１および抗ＰＤ−１抗体を用いた治療においては、いくつかの実施形態では、治療法の応答者と非応答者とを比較した場合、Ｌａｔ、Ｐａｋ１、Ｖａｖ３、Ｇｒａｐ３、Ｇｒｂ２、Ｗａｓ、Ｒａｃ２、Ｌｃｐ２、Ｖａｖ１、Ｒａｃ１、Ｐｌｃｇ１、Ｐａｋ２、Ｓｏｓ１、Ｓｏｓ２、Ｖａｖ２、Ｃｄｃ４２、Ｎｃｋ１、Ｒａｃ３、Ｎｃｋ２、および／またはＰＡＫ３の発現に有意差がある。いくつかの実施形態では、治療法の応答者と非応答者とを比較した場合、Ｌａｔ、Ｐａｋ１、Ｖａｖ３、Ｇｒａｐ３、Ｇｒｂ２、Ｗａｓ、Ｒａｃ２、Ｌｃｐ２、Ｖａｖ１、Ｒａｃ１、Ｐｌｃｇ１、Ｐａｋ２、Ｓｏｓ１、Ｓｏｓ２、Ｖａｖ２、Ｃｄｃ４２、Ｒａｃ３、および／またはＰａｋ３の発現に有意差がある。ＮＯＤ２０１および抗ＰＤ−１抗体を用いた治療においては、いくつかの実施形態では、治療法の応答者と非応答者とを比較した場合、Ｌａｔ、Ｐａｋ１、Ｖａｖ３、Ｇｒａｐ３、Ｇｒｂ２、Ｗａｓ、Ｒａｃ２、Ｌｃｐ２、Ｖａｖ１、Ｒａｃ１、Ｐｌｃｇ１、Ｐａｋ２、Ｓｏｓ１、Ｓｏｓ２、Ｖａｖ２、Ｃｄｃ４２、Ｒａｃ３、および／またはＰａｋ３の発現に有意差がある。いくつかの実施形態では、治療法の応答者と非応答者とを比較した場合、Ｌａｔ、Ｐａｋ１、Ｖａｖ３、Ｇｒａｐ３、Ｇｒｂ２、Ｗａｓ、Ｒａｃ２、Ｌｃｐ２、Ｖａｖ１、Ｒａｃ１、Ｐｌｃｇ１、Ｐａｋ２、Ｓｏｓ１、Ｓｏｓ２、Ｖａｖ２、Ｃｄｃ４２、Ｒａｃ３、および／またはＰａｋ３の発現に有意差がある。ＮＯＤ２０１および抗ＰＤ−１抗体を用いた治療においては、いくつかの実施形態では、治療法の応答者と非応答者とを比較した場合、Ｌａｔ、Ｐａｋ１、Ｖａｖ３、Ｇｒａｐ３、Ｇｒｂ２、Ｗａｓ、Ｒａｃ２、Ｌｃｐ２、Ｖａｖ１、Ｒａｃ１、Ｐｌｃｇ１、Ｐａｋ２、Ｓｏｓ１、Ｓｏｓ２、Ｖａｖ２、Ｃｄｃ４２、Ｒａｃ３、および／またはＰａｋ３の発現に有意差がある。いくつかの実施形態では、治療法の非応答者と比較した場合に、応答者において、Ｌａｔ、Ｐａｋ１、Ｖａｖ３、Ｇｒａｐ３、Ｇｒｂ２、Ｗａｓ、Ｒａｃ２、Ｌｃｐ２、Ｖａｖ１、Ｒａｃ１、Ｐｌｃｇ１、Ｐａｋ２、Ｓｏｓ１、Ｓｏｓ２、Ｖａｖ２、Ｃｄｃ４２、Ｒａｃ３、および／またはＰａｋ３が発現上昇している。ＮＯＤ２０１および抗ＰＤ−１抗体を用いた治療においては、いくつかの実施形態では、治療法の非応答者と比較した場合に、応答者において、Ｌａｔ、Ｐａｋ１、Ｖａｖ３、Ｇｒａｐ３、Ｇｒｂ２、Ｗａｓ、Ｒａｃ２、Ｌｃｐ２、Ｖａｖ１、Ｒａｃ１、Ｐｌｃｇ１、Ｐａｋ２、Ｓｏｓ１、Ｓｏｓ２、Ｖａｖ２、Ｃｄｃ４２、Ｒａｃ３、および／またはＰａｋ３が発現上昇している。いくつかの実施形態では、治療法の応答者と比較した場合に、非応答者において、Ｌａｔ、Ｐａｋ１、Ｖａｖ３、Ｇｒａｐ３、Ｇｒｂ２、Ｗａｓ、Ｒａｃ２、Ｌｃｐ２、Ｖａｖ１、Ｒａｃ１、Ｐｌｃｇ１、Ｐａｋ２、Ｓｏｓ１、Ｓｏｓ２、Ｖａｖ２、Ｃｄｃ４２、Ｒａｃ３、および／またはＰａｋ３が発現減少している。ＮＯＤ２０１および抗ＰＤ−１抗体を用いた治療においては、いくつかの実施形態では、治療法の応答者と比較した場合に、非応答者において、Ｌａｔ、Ｐａｋ１、Ｖａｖ３、Ｇｒａｐ３、Ｇｒｂ２、Ｗａｓ、Ｒａｃ２、Ｌｃｐ２、Ｖａｖ１、Ｒａｃ１、Ｐｌｃｇ１、Ｐａｋ２、Ｓｏｓ１、Ｓｏｓ２、Ｖａｖ２、Ｃｄｃ４２、Ｒａｃ３、および／またはＰａｋ３が発現減少している。いくつかの実施形態では、治療法の非応答者と比較した場合に、応答者において、Ｌａｔ、Ｐａｋ１、Ｖａｖ３、Ｇｒａｐ３、Ｇｒｂ２、Ｗａｓ、Ｒａｃ２、Ｌｃｐ２、Ｖａｖ１、Ｒａｃ１、Ｐｌｃｇ１、Ｐａｋ２、Ｓｏｓ１、Ｓｏｓ２、および／またはＶａｖ２が発現上昇している。ＮＯＤ２０１および抗ＰＤ−１抗体を用いた治療においては、いくつかの実施形態では、治療法の非応答者と比較した場合に、応答者において、Ｌａｔ、Ｐａｋ１、Ｖａｖ３、Ｇｒａｐ３、Ｇｒｂ２、Ｗａｓ、Ｒａｃ２、Ｌｃｐ２、Ｖａｖ１、Ｒａｃ１、Ｐｌｃｇ１、Ｐａｋ２、Ｓｏｓ１、Ｓｏｓ２、および／またはＶａｖ２が発現上昇している。いくつかの実施形態では、治療法の応答者と比較した場合に、非応答者において、Ｌａｔ、Ｐａｋ１、Ｖａｖ３、Ｇｒａｐ３、Ｇｒｂ２、Ｗａｓ、Ｒａｃ２、Ｌｃｐ２、Ｖａｖ１、Ｒａｃ１、Ｐｌｃｇ１、Ｐａｋ２、Ｓｏｓ１、Ｓｏｓ２、および／またはＶａｖ２が発現減少している。ＮＯＤ２０１および抗ＰＤ−１抗体を用いた治療においては、いくつかの実施形態では、治療法の応答者と比較した場合に、非応答者において、Ｌａｔ、Ｐａｋ１、Ｖａｖ３、Ｇｒａｐ３、Ｇｒｂ２、Ｗａｓ、Ｒａｃ２、Ｌｃｐ２、Ｖａｖ１、Ｒａｃ１、Ｐｌｃｇ１、Ｐａｋ２、Ｓｏｓ１、Ｓｏｓ２、および／またはＶａｖ２が発現減少している。いくつかの実施形態では、治療法の応答者と非応答者とを比較した場合、Ｌａｔ、Ｐａｋ１、Ｖａｖ３、Ｇｒａｐ３、Ｇｒｂ２、Ｗａｓ、Ｒａｃ２、Ｌｃｐ２、Ｖａｖ１、Ｒａｃ１、Ｐｌｃｇ１、Ｐａｋ２、Ｓｏｓ１、Ｓｏｓ２、および／またはＶａｖ２の発現に有意差がある。ＮＯＤ２０１および抗ＰＤ−１抗体を用いた治療においては、いくつかの実施形態では、治療法の応答者と非応答者とを比較した場合、Ｌａｔ、Ｐａｋ１、Ｖａｖ３、Ｇｒａｐ３、Ｇｒｂ２、Ｗａｓ、Ｒａｃ２、Ｌｃｐ２、Ｖａｖ１、Ｒａｃ１、Ｐｌｃｇ１、Ｐａｋ２、Ｓｏｓ１、Ｓｏｓ２、および／またはＶａｖ２の発現に有意差がある。いくつかの実施形態では、Ｌａｔ、Ｐａｋ１、Ｖａｖ３、Ｇｒａｐ３、Ｇｒｂ２、Ｗａｓ、Ｒａｃ２、Ｌｃｐ２、Ｖａｖ１、Ｒａｃ１、Ｐｌｃｇ１、Ｐａｋ２、Ｓｏｓ１、Ｓｏｓ２、Ｖａｖ２、Ｃｄｃ４２、Ｎｃｋ１、Ｒａｃ３、Ｎｃｋ２、および／またはＰａｋ３のうちの１または複数の発現上昇は、対象が治療に応答性であることを示している。いくつかの実施形態では、Ｌａｔ、Ｐａｋ１、Ｖａｖ３、Ｇｒａｐ３、Ｇｒｂ２、Ｗａｓ、Ｒａｃ２、Ｌｃｐ２、Ｖａｖ１、Ｒａｃ１、Ｐｌｃｇ１、Ｐａｋ２、Ｓｏｓ１、Ｓｏｓ２、Ｖａｖ２、Ｃｄｃ４２、Ｎｃｋ１、Ｒａｃ３、Ｎｃｋ２、および／またはＰａｋ３のうちの１または複数の発現上昇は、対象がＮＯＤ２０１および抗ＰＤ−１抗体を用いた治療に応答性であることを示している。いくつかの実施形態では、Ｌａｔ、Ｐａｋ１、Ｖａｖ３、Ｇｒａｐ３、Ｇｒｂ２、Ｗａｓ、Ｒａｃ２、Ｌｃｐ２、Ｖａｖ１、Ｒａｃ１、Ｐｌｃｇ１、Ｐａｋ２、Ｓｏｓ１、Ｓｏｓ２、Ｖａｖ２、Ｃｄｃ４２、Ｎｃｋ１、Ｒａｃ３、Ｎｃｋ２、および／またはＰＡＫ３の発現に有意差があることは、対象が治療に応答性であることを示している。いくつかの実施形態では、Ｌａｔ、Ｐａｋ１、Ｖａｖ３、Ｇｒａｐ３、Ｇｒｂ２、Ｗａｓ、Ｒａｃ２、Ｌｃｐ２、Ｖａｖ１、Ｒａｃ１、Ｐｌｃｇ１、Ｐａｋ２、Ｓｏｓ１、Ｓｏｓ２、Ｖａｖ２、Ｃｄｃ４２、Ｎｃｋ１、Ｒａｃ３、Ｎｃｋ２、および／またはＰＡＫ３の発現に有意差があることは、対象がＮＯＤ２０１および抗ＰＤ−１抗体を用いた治療に応答性であることを示している。いくつかの実施形態では、Ｌａｔ、Ｐａｋ１、Ｖａｖ３、Ｇｒａｐ３、Ｇｒｂ２、Ｗａｓ、Ｒａｃ２、Ｌｃｐ２、Ｖａｖ１、Ｒａｃ１、Ｐｌｃｇ１、Ｐａｋ２、Ｓｏｓ１、Ｓｏｓ２、Ｖａｖ２、Ｃｄｃ４２、Ｒａｃ３、および／またはＰａｋ３のうちの１または複数の発現上昇は、対象が治療に応答性であることを示している。いくつかの実施形態では、Ｌａｔ、Ｐａｋ１、Ｖａｖ３、Ｇｒａｐ３、Ｇｒｂ２、Ｗａｓ、Ｒａｃ２、Ｌｃｐ２、Ｖａｖ１、Ｒａｃ１、Ｐｌｃｇ１、Ｐａｋ２、Ｓｏｓ１、Ｓｏｓ２、Ｖａｖ２、Ｃｄｃ４２、Ｒａｃ３、および／またはＰａｋ３のうちの１または複数の発現上昇は、対象がＮＯＤ２０１および抗ＰＤ−１抗体を用いた治療に応答性であることを示している。いくつかの実施形態では、Ｌａｔ、Ｐａｋ１、Ｖａｖ３、Ｇｒａｐ３、Ｇｒｂ２、Ｗａｓ、Ｒａｃ２、Ｌｃｐ２、Ｖａｖ１、Ｒａｃ１、Ｐｌｃｇ１、Ｐａｋ２、Ｓｏｓ１、Ｓｏｓ２、Ｖａｖ２、Ｃｄｃ４２、Ｎｃｋ１、Ｒａｃ３、Ｎｃｋ２、および／またはＰａｋ３のうちの１または複数の発現減少は、対象が治療に非応答性であることを示している。いくつかの実施形態では、Ｌａｔ、Ｐａｋ１、Ｖａｖ３、Ｇｒａｐ３、Ｇｒｂ２、Ｗａｓ、Ｒａｃ２、Ｌｃｐ２、Ｖａｖ１、Ｒａｃ１、Ｐｌｃｇ１、Ｐａｋ２、Ｓｏｓ１、Ｓｏｓ２、Ｖａｖ２、Ｃｄｃ４２、Ｎｃｋ１、Ｒａｃ３、Ｎｃｋ２、および／またはＰａｋ３のうちの１または複数の発現減少は、対象がＮＯＤ２０１および抗ＰＤ−１抗体を用いた治療に非応答性であることを示している。いくつかの実施形態では、Ｌａｔ、Ｐａｋ１、Ｖａｖ３、Ｇｒａｐ３、Ｇｒｂ２、Ｗａｓ、Ｒａｃ２、Ｌｃｐ２、Ｖａｖ１、Ｒａｃ１、Ｐｌｃｇ１、Ｐａｋ２、Ｓｏｓ１、Ｓｏｓ２、Ｖａｖ２、Ｃｄｃ４２、Ｎｃｋ１、Ｒａｃ３、Ｎｃｋ２、および／またはＰＡＫ３の発現に有意差があることは、対象が治療に非応答性であることを示している。いくつかの実施形態では、Ｌａｔ、Ｐａｋ１、Ｖａｖ３、Ｇｒａｐ３、Ｇｒｂ２、Ｗａｓ、Ｒａｃ２、Ｌｃｐ２、Ｖａｖ１、Ｒａｃ１、Ｐｌｃｇ１、Ｐａｋ２、Ｓｏｓ１、Ｓｏｓ２、Ｖａｖ２、Ｃｄｃ４２、Ｎｃｋ１、Ｒａｃ３、Ｎｃｋ２、および／またはＰＡＫ３の発現に有意差があることは、対象がＮＯＤ２０１および抗ＰＤ−１抗体を用いた治療に非応答性であることを示している。いくつかの実施形態では、Ｌａｔ、Ｐａｋ１、Ｖａｖ３、Ｇｒａｐ３、Ｇｒｂ２、Ｗａｓ、Ｒａｃ２、Ｌｃｐ２、Ｖａｖ１、Ｒａｃ１、Ｐｌｃｇ１、Ｐａｋ２、Ｓｏｓ１、Ｓｏｓ２、Ｖａｖ２、Ｃｄｃ４２、Ｒａｃ３、および／またはＰａｋ３のうちの１または複数の発現減少は、対象が治療に非応答性であることを示している。いくつかの実施形態では、Ｌａｔ、Ｐａｋ１、Ｖａｖ３、Ｇｒａｐ３、Ｇｒｂ２、Ｗａｓ、Ｒａｃ２、Ｌｃｐ２、Ｖａｖ１、Ｒａｃ１、Ｐｌｃｇ１、Ｐａｋ２、Ｓｏｓ１、Ｓｏｓ２、Ｖａｖ２、Ｃｄｃ４２、Ｒａｃ３、および／またはＰａｋ３のうちの１または複数の発現減少は、対象がＮＯＤ２０１および抗ＰＤ−１抗体を用いた治療に非応答性であることを示している。
効能の読み取りとしては、以下のモニタリングを挙げることができる：αβＴ細胞および／またはγδＴ細胞の変化、細胞傷害性Ｔ細胞活性、ＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａなどのマーカーの変化、ＮＫ活性および／またはＮＫ／Ｔ活性の変化、インターフェロン−γ産生、調節性Ｔ細胞の変化（調節性Ｔ細胞の数の変化を含む）、マクロファージ数の変化、好中球の腫瘍形成促進活性の変化、Ｔ細胞活性化、ＣＴＬ活性化、ＣＤ４５ＲＡまたはＣＣＲ７などの活性化マーカーの変化、並びにがん細胞毒性試験。効能の読み取りとしては、図３５、図３６、図３７、図３８、および図３９に示される、並びに上述のような、遺伝子の発現の検査も挙げることができる。効能の読み取りとしては、腫瘍サイズ減少、腫瘍数減少、転移数減少、および病状の低減（または平均余命の延長）も挙げることができる。いくつかの実施形態では、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％の腫瘍サイズ減少が、治療効果を示すものである。いくつかの実施形態では、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％の腫瘍数減少が、治療効果を示すものである。いくつかの実施形態では、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％の腫瘍量減少が、治療効果を示すものである。いくつかの実施形態では、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％の転移数減少が、治療効果を示すものである。
ＸＶＩＩＩ．キット
キットは、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体と、所望により、本明細書にて開示されるような、免疫刺激物質または免疫チェックポイント阻害物質（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）と、取扱説明書とを含むことができる。さらに、キットは、ＩＬ−２または長期ＰＫ性ＩＬ−２と、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体と、所望により、本明細書にて開示されるような、免疫刺激物質または免疫チェックポイント阻害物質（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）と、取扱説明書とを含むことができる。キットは、好適な容器の中に、ＩＬ−２または長期ＰＫ性ＩＬ−２、ＩＦＮα、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体、所望による免疫刺激物質または免疫チェックポイント阻害物質（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）、１または複数の対照、および種々の緩衝液、試薬、酵素、並びに当該技術分野において周知の他の標準的な成分を含んでいてよい。いくつかの実施形態では、キットは、長期ＰＫ性ＩＬ−２、ＩＦＮα、ノッチン−Ｆｃ、および所望による免疫刺激物質または免疫チェックポイント阻害物質（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）を同一のバイアル内に含む。ある実施形態では、キットは、長期ＰＫ性ＩＬ−２、ＩＦＮα、ノッチン−Ｆｃ、および所望による免疫刺激物質または免疫チェックポイント阻害物質（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）を、別々のバイアル内に含む。
容器は、少なくとも１つのバイアル、ウェル、試験管、フラスコ、ビン、注射器、または他の収容手段を含むことができ、その中に、ＩＬ−２または長期ＰＫ性ＩＬ−２、ＩＦＮα、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体、および所望による免疫刺激物質または免疫チェックポイント阻害物質（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）が入っていてよく、場合によっては、適宜分注されている。追加の成分がある場合、キットは追加の容器を含むことができ、その中に、この成分を入れてよい。キットはまた、ＩＬ−２または長期ＰＫ性ＩＬ−２、ＩＦＮα、インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体、および所望による免疫刺激物質または免疫チェックポイント阻害物質（またはＶＥＧＦのアンタゴニスト）を収容するための手段と、市販用として厳重な制限内のあらゆる他の試薬容器とを含むことができる。そのような容器は、射出成形または吹出し成形されたプラスチック容器を含んでもよく、その中に、所望のバイアルが保定される。容器および／またはキットは、指示および／または警告を含んだ標識を含むことができる。
本開示を下記の実施例によりさらに詳細に説明するが、下記の実施例は本開示を限定するものと見なされるべきではない。本願を通じて引用された全ての図および全ての参考文献、Ｇｅｎｂａｎｋ配列、特許および特許出願公開の内容は、参照により本明細書に明確に援用されたものとする。特に、国際公開第２０１３／１７７１８７号、米国特許第８，５３６，３０１号、および米国特許出願公開第２０１４／００７３５１８号の開示は、全ての目的において、それらの全体が参照により本明細書に明確に援用されたものとする。
以下は、本明細書に記載される方法を実施するための具体的な実施形態の例示である。本実施例は例示のみを目的として提示されるものであり、本発明の範囲を限定する意図は全くない。使用される数値（例えば量、温度など）に関し、正確性を期す努力はされているが、いくらかの実験誤差および偏差はもちろん許容されるものとする。本発明の実施は別段の示唆が無い限り当分野の技術範囲内のタンパク質化学、生化学、組み換えＤＮＡ技術、および薬理学の従来的な方法を採用するものとする。そのような技術は文献中に完全に解説されている。例えばT.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition); Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第2版、1989); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry 3rd Ed. (Plenum Press) Vols A and B（1992）を参照のこと。
さらに、以下の実施例はマウス起源のＩＬ−２、およびインテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体の一部として融合されたマウスＦｃを採用しているが、当分野の当業者であれば、対応するヒトＩＬ−２または伸長ＰＫ ＩＬ−２（すなわちヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）およびヒトＩＬ−２、ならびにそのバリアント）、およびヒトＦｃ（すなわちインテグリン結合性ポリペプチドに融合されたヒトＩｇＧ１由来のＦｃ）を含むインテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体を、上記の方法を使用して容易に作製し得ること、およびそれらを本明細書に開示される方法において使用し得ることを理解されたい。
実施例１
ＭＣ３８− ＮＯＤＵ−Ｅ２０２ 材料および方法
３つの有望な治療候補物質を設計し、検証した。これらバリアントは抗体Ｆｃドメイン（ヒトＩｇＧ１）に融合された腫瘍標的化ペプチド（２．５Ｆ）を含有した。ＮＯＤ２０１：リンカー無し、ＮＯＤ２０３：短い［Ｇｌｙ４Ｓｅｒ］リンカー、そしてＮＯＤ２０４：長い［Ｇｌｙ４Ｓｅｒ３］リンカー。これら３つの構築体は、アズロシジン（Ａｚｕｒｏｃｉｄｉｎ）プレプロタンパク質由来のシグナルペプチドとともに発現された（注記：このシグナルペプチドは、細胞内でのタンパク質発現を誘導する配列である）。これら構築体のオープンリーディングフレームをコードする遺伝子は、哺乳類細胞発現にコドン最適化された。タンパク質構築体は、ヒト胎児腎細胞において一過性発現により産生された。１００ｍＬの培養液をＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ樹脂により精製し、ＵＶ／Ｖｉｓ吸光度により定量して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびサイズ排除クロマトグラフィーにより解析した。サイズ排除クロマトグラフィーで解析したところ、タンパク質の９８％超が単量体であった（すなわち凝集していない）。
タンパク質の血清安定性は、４８時間、３７℃でマウス血清においてインキュベートされた後、未処置サンプルと比較して測定された。タンパク質の完全性はバイオレイヤー干渉法（Ｂｉｏｌａｙｅｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ）法でαｖβ３インテグリンへの結合により測定された。マウス血清中でのインキュベート後でもすべてのＮＯＤ融合タンパク質が損なわれなかった。
融点（Ｔｍ）は、ＰＢＳとクエン酸塩の２種の異なる緩衝液中で測定された。すべてのタンパク質のＴｍが、ＰＢＳ中では６８℃、クエン酸塩中では６６℃であった。
ＮＯＤ２０１Ｘは、寄せ集めのインテグリン結合性配列を含んだものであり、これも陰性対照としてクローニングされ、ＨＥＫ細胞で産生された。
ＮＯＤ２０１ＭはマウスＦｃドメインに融合された２．５Ｆペプチドを含有する。この構築体は同系マウス実験（本来の免疫系を有するマウス）における実験に必要である。ＮＯＤ２０１Ｍは、動物実験用にＨＥＫ細胞中で産生された。
ＮＯＤ２０１は、「ユニバーサル」な腫瘍標的化物質であることが見出され、Ｔ細胞誘導型癌免疫療法（例えばチェックポイント阻害、ＩＬ−２）を強化することができ、ならびに自然免疫のエフェクター機能をインテグリンへと標的化させることにより、腫瘍へのＴ細胞浸潤を誘導することができる。
学説に拘束されないが、提唱されているＮＯＤ２０１の作用機序は、ＡＤＣＣがＴ細胞応答のクロスプライミングを誘導するというものである。これは以下を必要とすると考えられている：Ｆｃエフェクター機能、マクロファージ、ＣＤ８＋Ｔ細胞、そしてＣＤ８＋樹状細胞。Ｆｃエフェクター機能は炎症性ＴＭＥ（ｔｕｍｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ：腫瘍微小環境）を生じさせ、腫瘍内ケモカインが増加する。
実施例２
ＭＣ３８−ＮＯＤ−Ｅ２０２材料および方法
マウス
試験１日目、メスのＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｃ５７ＢＬ／６／ＮＣｒｌ、チャールズリバー社）は７週齢であり、１５．５〜２１．８ｇの範囲のＢＷであった。動物は水（逆浸透、１ｐｐｍ Ｃｌ）ならびに、１８．０％の粗タンパク質、５．０％の粗脂肪、および５．０％の粗繊維からなるＮＩＨ ３１ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｎｄ Ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ Ｌａｂ Ｄｉｅｔ（登録商標）を不断給餌された。マウスは照射済みのＥｎｒｉｃｈ−ｏ’ｃｏｂｓ（商標）で飼育され、２０〜２２℃（６８〜７２°Ｆ）および４０〜６０％の湿度、１２時間の明暗サイクルで、据え付けのマイクロアイソレーター中で眠った。ＣＲ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓは、拘束、管理、外科的手順、給餌および給水管理ならびに獣医師によるケアに関し、実験動物の管理と使用に関する指針の推奨を特に遵守している。ＣＲ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓでの動物の世話および使用のプログラムは、国際実験動物管理公認協会により認定されており、実験動物の管理と使用に関し承認された標準を遵守していることを保証する。
腫瘍細胞の培養
Ｎｏｄｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．から提供されたＭＣ３８齧歯類大腸癌細胞を、１０％ウシ胎仔血清ならびに２ｍＭグルタミン、１００単位／ｍＬペニシリンＧナトリウム、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン硫酸塩、および２５μｇ／ｍＬゲンタマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させた。細胞培養は、３７℃の加湿インキュベーター中、５％ＣＯ２と９５％空気の雰囲気下、組織培養フラスコ中で維持された。
腫瘍移植および測定
移植に使用されたＭＣ３８齧歯類大腸細胞は対数増殖期に回収され、冷却されたＲＰＭＩ培地中に再懸濁された。マウスはイソフルランで麻酔され、その後移植された。各マウスは右わき腹に１ｘ１０６個の腫瘍細胞（０．１ｍＬの細胞懸濁液）を皮下注射され、腫瘍体積が６０〜１８０ｍｍ３の標的範囲に達するまで腫瘍を監視した。腫瘍移植７日後、試験の１日目で、６３〜１７２ｍｍ３の範囲の個体腫瘍体積を有する動物を１１群（ｎ＝１０）に分けた。群の平均腫瘍体積は１０９〜１１２ｍｍ３の範囲であった。ノギスを使用して週に２回、二次元で腫瘍を測定した。腫瘍サイズは以下の式を使用して算出された：
腫瘍体積（ｍｍ３）＝ｗ２ｘｌ／２
式中、ｗは腫瘍の幅、ｌは長さであり、単位はｍｍである。腫瘍の重量は、腫瘍体積１ｍｍ３は１ｍｇに等しいという仮定で推定され得る。
被験物質
インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体のＮＯＤ２０１Ｍ（コード名称 ＫＷ２、ロット番号 ＢＰ−０４６−０１６−２）、プロロイキン（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）（ロット番号 ５０２５１９ＡＡ）および抗ＰＤ−１（ロット番号 ６１４６１６Ｊ２）。ＮＯＤ２０１Ｍ、プロロイキンおよび抗ＰＤ−１は遮光され、４℃で保存された。すべての剤は、説明書に従い調製された。
投与が行われる各日に、ＮＯＤ２０１Ｍをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に希釈して、２．０８ｍｇ／ｍＬの投与用溶液を作製した。投与用溶液は４℃に保存された。
投与が行われる各日に、プロロイキンを滅菌水中に溶解し、０．０４ｍｇ／ｍＬの投与用溶液を作製した。投与用溶液は４℃に保存された。
投与が行われる各日に、抗ＰＤ−１をＰＢＳ中に希釈して、２ｍｇ／ｍＬの投与用溶液を作製した。投与用溶液は４℃に保存された。
治療
１１群のＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝１０）に、図１３のＭＣ３８−ＮＯＤＵ−ｅ２０２プロトコールに従いＤ１に投与を開始した。ビヒクル（ＰＢＳ）およびＮＯＤ２０１Ｍ（５００または１０００μｇ／動物で投与された）を、０．２４ｍＬ／マウスの投与量で静脈内（ｉ．ｖ．）投与した。プロロイキン（４または４０μｇ／動物で投与された）は、０．１ｍＬ／マウスの投与量で静脈内投与または皮下（ｓ．ｃ．）投与した。抗ＰＤ−１（２００μｇ／動物で投与された）は、０．１ｍＬ／マウスの投与量で静脈内投与された。全投与量とも、個々の動物の体重に対して調製されず投与された。
１群の動物は対照とされ、１、７、１３、１９日目にビヒクルを静脈内投与された。
２群の動物は１、７、１３、１９日目に５００μｇ／動物のＮＯＤ２０１Ｍを静脈内投与された。
３群の動物は２〜４、８〜１０、１４〜１６、２０〜２２日目に４０μｇ／動物のプロロイキンを静脈内投与された。
４群の動物は２〜４、８〜１０、１４〜１６、２０〜２２日目に４μｇ／動物のプロロイキンを皮下投与された。
５群の動物は、１、７、１３、１９日目に５００μｇ／動物のＮＯＤ２０１Ｍを、２〜４、８〜１０、１４〜１６、２０〜２２日目の４０μｇ／動物のプロロイキンの静脈内投与と併用して静脈内投与された。
６群の動物は、１、７、１３、１９日目に５００μｇ／動物のＮＯＤ２０１Ｍを、２〜４、８〜１０、１４〜１６、２０〜２２日目の４μｇ／動物のプロロイキンの皮下投与と併用して静脈内投与された。
７群の動物は１、７、１３、１９日目に２００μｇ／動物の抗ＰＤ−１を静脈内投与された。
８群の動物は、１、７、１３、１９日目に５００μｇ／動物のＮＯＤ２０１Ｍを、１、７、１３、１９日目の２００μｇ／動物の抗ＰＤ−１の静脈内投与と併用して静脈内投与された。
９群の動物は、１、７、１３、１９日目に５００μｇ／動物のＮＯＤ２０１Ｍを、１、７、１３、１９日目の２００μｇ／動物の抗ＰＤ−１の静脈内投与と、２〜４、８〜１０、１４〜１６、２０〜２２日目の４μｇ／動物のプロロイキンの皮下投与を併用して静脈内投与された。
１０群の動物は、１、７、１３、１９日目に１０００μｇ／動物のＮＯＤ２０１Ｍを、１、７、１３、１９日目の２００μｇ／動物の抗ＰＤ−１の静脈内投与と、２〜４、８〜１０、１４〜１６、２０〜２２日目の４μｇ／動物のプロロイキンの皮下投与を併用して静脈内投与された。
１１群の動物は、１、７、１３、１９日目に１０００μｇ／動物のＮＯＤ２０１Ｍを、２〜４、８〜１０、１４〜１６、２０〜２２日目の４μｇ／動物のプロロイキンの皮下投与と併用して静脈内投与された。
エンドポイントおよび腫瘍増殖遅延（ＴＧＤ：Ｔｕｍｏｒ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｅｌａｙ）解析
腫瘍は、週に２回、ノギスを使用して測定された。各動物は、その腫瘍が１０００ｍ３のエンドポイント体積に達したとき、または試験が終了したとき（８５日目）のいずれか早いときに安楽死処理された。腫瘍体積エンドポイントで本試験を離脱した動物は、安楽死の日付とともに腫瘍進行（ＴＰ：ｔｕｍｏｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）のために安楽死されたと記録された。解析用のエンドポイントまでの時間（ＴＴＥ：Ｔｈｅ ｔｉｍｅ ｔｏ ｅｎｄｐｏｉｎｔ）は、各マウスに対し、以下の式により算出された：
ＴＴＥ＝ｌｏｇ１０（エンドポイント体積）−ｂ／ｍ
式中、ＴＴＥは日数で表され、エンドポイント体積はｍｍ３で表され、ｂは切片（ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ）であり、そしてｍは対数変換された腫瘍増殖データセットの直線回帰により得られた線の傾きである。
データセットは、解析に使用されたエンドポイント体積を上回った第一の観察結果、およびこのエンドポイント体積への到達直前に先行する３つの連続的な観察結果からなった。算出されたＴＴＥは通常、ＴＰの日付未満であり、ＴＰの当日に動物は腫瘍サイズのために安楽死された。エンドポイント体積に達しなかった腫瘍を有する動物は、本試験の最終日（８５日目）と等しいＴＴＥ値を割り当てられた。対数変換され算出されたＴＴＥがエンドポイントに達する前の日に先行するか、または腫瘍体積エンドポイントに達する日を越える場合、線形補間を実施して、ＴＴＥの近似値を求めた。ＮＴＲ（非治療関連、ｎｏｎ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔ−ｒｅｌａｔｅｄ）により死亡したとして分類されたすべての動物は、アクシデント（ＮＴＲａ）または未知の病因（ＮＴＲｕ）によるものであり、ＴＴＥの算出（およびすべてのその後の解析）から除外された。ＴＲ（治療関連、ｔｒｅａｔｍｅｎｔ−ｒｅｌａｔｅｄ）死またはＮＴＲｍ（転移による非治療関連死）として分類された動物は、死亡日と同じＴＴＥ値を割り当てられた。
治療転帰は、腫瘍増殖遅延（ＴＧＤ：ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｄｅｌａｙ）から評価された。ＴＧＤは対照群と比較した治療群におけるエンドポイントまでの時間（ＴＴＥ）のメジアンにおける増加として規定される：
ＴＧＤ＝Ｔ−Ｃ
日数で表されるか、または対照群のメジアンＴＴＥの百分率として表される：
％ＴＧＤ＝Ｔ−Ｃ／Ｃｘ１００
式中、
Ｔ＝治療群のメジアンＴＴＥ、および
Ｃ＝指定される対照群のメジアンＴＴＥ。
ＭＴＶ、および退縮反応（ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）に対する基準
治療有効性は、最終日に本試験に残った動物の腫瘍体積から決定され得る。ＭＴＶ（ｎ）は、腫瘍がエンドポイント体積に達しなかった残留動物数（ｎ）における、本試験の最終日のメジアン腫瘍体積として規定された。
治療有効性は、本試験の間に観察された退縮反応の発生率と程度から決定されてもよい。治療は、動物における腫瘍の部分退縮（ＰＲ：ｐａｒｔｉａｌ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）または完全退縮（ＣＲ：ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）をもたらし得る。ＰＲ反応において、腫瘍体積は、本試験経過中の３回の連続的な測定で、１日目の体積の５０％未満であり、かつこれら３回の測定のうちの１回または複数回で、１３．５ｍｍ３以上であった。ＣＲ反応において、腫瘍体積は本試験経過中の３回の連続的な測定で、１３．５ｍｍ３未満であった。試験終了時にＣＲ反応であった動物はさらに無腫瘍生存個体（ＴＦＳ：ｔｕｍｏｒ−ｆｒｅｅ ｓｕｒｖｉｖｏｒ）として分類された。動物は退縮反応を監視された。
毒性
動物は本試験の最初の５日間は毎日、そしてその後は週に２回体重を測定された。マウスは健康状態を頻繁に観察され、すべての有害な治療関連（ＴＲ）副作用の明白な兆候が観察された。注目すべき臨床観察結果は記録された。個々の体重の減少はプロトコールに沿って監視され、１回の測定で３０％を越える体重の減少があった動物、または３回の測定で２５％を越える体重減少があった動物はすべてＴＲ死として健康状態を理由に安楽死されるものとした。群の平均体重が回復した場合、当該群の投与は再開されたが、投与量を少なく、または投与スケジュールの頻度を少なくした。受容可能な毒性は、本試験期間中、２０％未満の群平均ＢＷ減少、かつ１０匹の治療動物で１匹以下、または１０％以下のＴＲ死として規定された。高い毒性を生じさせた投与レジメンはすべて、最大耐用量（ＭＴＤ：ｍａｘｉｍｕｍ ｔｏｌｅｒａｔｅｄ ｄｏｓｅ）を上回るとみなされる。死は、臨床兆候により明らかな、および／または解剖により明らかな治療副作用に起因した場合、ＴＲとして分類されるものとした。または投与期間中もしくは最後の投与から１４日以内の未知の原因に起因した場合も、ＴＲとして分類され得る。死亡が治療関連ではなくその腫瘍モデルに関連したことが明白であった場合、その死亡はＮＴＲと分類された。ＮＴＲ死はさらにＮＴＲａ（アクシデントまたはヒューマンエラーが原因）、ＮＴＲｍ（解剖により確認される浸潤または転移による腫瘍播種が原因）、およびＮＴＲｕ（未知の原因）としてカテゴライズされる。
最小中毒量が１００ｍｇ／ｋｇまで達しなかったことが判明し、完全血球計算値（ＣＢＣ：ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｏｕｎｔ）および化学パネルに対し、有意な影響は無く、または最小限の影響であった。
ＮＯＤ２０１は、血清および温度変化に対して非常に安定的である（ジスルフィド結合ペプチドではなく、Ｆｃドメインに由来する安定性）。４０℃で長時間インキュベートした後、または５回の凍結融解サイクル後にＮＯＤ２０１の凝集または分解は認められなかった。
ＮＯＤ２０１ペプチドのインシリコ免疫原性解析（アンチトープ：Ａｎｔｉｔｏｐｅ）：“ｉＴｏｐｅ（商標）およびＴＣＥＤ（商標）解析をこの配列に施し、ヒトＭＨＣクラスＩＩに結合すると予測された、および／または公知のＴ細胞エピトープとの相同性を共有すると予測されたペプチドを特定した。この解析において、ＴＣＥＤ（商標）で公知のＴ細胞エピトープとの合致は特定されなかった。”非生殖細胞系列の異所的（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドは特定されなかった。ゆえに、ＮＯＤ２０１に関し、免疫原性のリスクは低い。
統計解析および図形解析
ウィンドウズ７．０１用のＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）を図形提示および統計解析に使用した。生存率はカプランマイヤー法により解析した。ログランク検定（マンテル−コックス）およびゲーハン−ブレスロウ−ウィルコクソン検定が、ＴＴＥ値に基づき、２群の全生存経験（生存曲線）の間の差異の有意性を決定した。すべての検定結果を添付のＢに示す。両側統計解析をＰ＝０．０５の有意レベルで実施した。解析は、多重比較に対し補正されなかった。Ｐｒｉｓｍは検定結果を、Ｐ＞０．０５で有意ではない（ｎｓ）、０．０１＜Ｐ≦０．０５で有意（＊の記号）、０．００１＜Ｐ≦０．０１でとても有意（＊＊）、およびＰ≦０．００１で非常に有意として要約する。統計的有意性の検定は、群間の差異の程度の推定を提供しないため、有意性のすべてのレベルを、本報告書の文章内では有意か有意でないかのいずれかとして記載した。受容可能な毒性の限界を超えたレジメンの群は、統計的評価を受けなかった。
散布図は、群を単位とした個々のマウスに対するＴＴＥ値を示すために作製された（図１）。群のメジアン腫瘍体積は、時間の関数としてプロットされた（図２、上のパネル）。腫瘍サイズを理由として動物が本試験から離脱した場合、その動物に対して記録された最終腫瘍体積は、その後の時点でのメジアン体積を算出するために使用されるデータとともに含められた。カプランマイヤープロットは、時間に対する、試験に残留した各群中の動物の百分率を示すために作製された（図１７、下のパネル）。
群のメジアン腫瘍体積は、時間関数としてプロットされ、群中の２回目のＴＲ死の後に切り捨てられた。本試験の平均プロットも含められた（図３）。本試験経過中の群の平均ＢＷ変化は、１日目から、パーセント変化±ＳＥＭとして図形化された（図１９）。腫瘍増殖およびＢＷ変化の曲線は、ＮＴＲ死と評価された動物のデータを除外し、群中の半分を越えるマウスが試験を離脱した後、切り捨てられた。
実施例３
Ｂ１６Ｆ１０実験の説明
メスのＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｃ５７ＢＬ／６／ＮＣｒｌ、チャールズリバー）は、試験開始時、８〜１２週齢であった。試験開始は、腫瘍移植の日である（１日目）。動物（１群当たりｎ＝１０）は、１日目の体重に基づき治療群に無作為化された。移植に使用されたＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞はチャールズリバーラボラトリーから提供され、対数増殖期の間に回収され、培地中に再懸濁された。マウスは移植前にイソフルランで麻酔された。
各マウスに、０％Ｍａｇｒｉｇｅｌを用いて１ｘ１０６個の腫瘍細胞（０．１ｍＬの細胞懸濁液）を、右脇腹に皮下注射した。移植４日後、治療を開始した。動物の体重は試験期間中、少なくとも週に２回測定された。腫瘍は、週に少なくとも２回、ノギスで二次元測定された。腫瘍サイズは以下の式を使用して算出された：
腫瘍体積（ｍｍ３）＝ｗ２ ｘｌ／２
式中、ｗは腫瘍の幅、ｌは長さであり、単位はｍｍである。腫瘍の重量は、腫瘍体積１ｍｍ３は１ｍｇに等しいという仮定で推定され得る。
１群の動物は対照とされ、４、１０、１６、２２日目にビヒクル（リン酸緩衝生理食塩水）を静脈内投与された。
２群の動物は４、１０、１６、２２日目に１０００μｇ／動物のＮＯＤ２０１Ｍを静脈内投与された。
３群の動物は４、１０、１６、２２日目に２００μｇ／動物の抗ＰＤ−１抗体を静脈内投与された。抗ＰＤ−１は、クローンＲＭＰ１−１４（ラットＩｇＧ）−ＢｉｏＸｃｅｌｌ カタログ番号ＢＰ０１４６であった。
４群の動物は５〜７、１１〜１３、１７〜１９、２３〜２５日目に４μｇ／動物のプロロイキンを皮下投与された。
５群の動物は、４、１０、１６、２２日目に１０００μｇ／動物のＮＯＤ２０１Ｍを、４、１０、１６、２２日目の２００μｇ／動物の抗ＰＤ−１抗体の静脈内投与と併用して静脈内投与された。
６群の動物は、４、１０、１６、２２日目に１０００μｇ／動物のＮＯＤ２０１Ｍを、５〜７、１１〜１３、１７〜１９、２３〜２５日目の４μｇ／動物のプロロイキンの皮下投与と併用して静脈内投与された。
７群の動物は、４、１０、１６、２２日目に５００μｇ／動物のＮＯＤ２０１Ｍを、４、１０、１６、２２日目の２００μｇ／動物の抗ＰＤ−１抗体の静脈内投与と、５〜７、１１〜１３、１７〜１９、２３〜２５日目の４μｇ／動物のプロロイキンの皮下投与と併用して静脈内投与された。
治療後の腫瘍細胞浸潤の測定
１、７日目に１０００μｇ／動物のＮＯＤ２０１Ｍを単独静脈内投与された動物、または１、７日目に２００μｇ／動物の抗ＰＤ−１の静脈内投与、および／または２〜４、８〜９日目に４μｇ／動物のプロロイキンの皮下投与を併用された動物。９日目、プロロイキン注射の２４時間後、腫瘍を採取し、保存し、単一細胞懸濁液に処理した。細胞懸濁液は、以下に記載される抗体を使用して細胞表面マーカーに対して染色し、フローサイトメトリーにより解析した。データは、腫瘍中のＣＤ４５＋細胞の％として表される。

実施例４
目的：ＮＯＤ２０１Ｍ単独の有効性と、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＣＴＬＡ−４、抗ＬＡＧ３、抗ＴＩＭ３、抗ＴＩＧＩＴ、および抗ＣＤ１３７との併用の有効性を、メスＣ５７ＢＬ／６マウスを使用してＭＣ３８同系大腸モデルにおいて決定する。データを図２３〜２４に示す。
手順：
〇 細胞移植のためにイソフルランでマウスを麻酔し、潰瘍を低減させる。
〇 ２４０匹のＣＲメスＣ５７ＢＬ／６マウスを設定し、０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ中、１ｘ１０６個のＭＣ３８腫瘍細胞を用いてわき腹に皮下注射する。
〇 細胞注射体積は、０．１ｍＬ／マウスであった。
〇 開始日の齢：８〜１２週齢。
〇 腫瘍が６０〜１８０ｍｍ３の平均サイズに達したとき、ペアマッチを実施し、治療を開始する。
・約１００ｍｍ３（細胞移植後約６〜７日）を標的とする。
〇 体重：５／２、その後、週に２回で最後まで。
〇 ノギス測定：週に２回で最後まで。
〇 ３０％を越える体重減少が１回観察された個々の動物、または２５％を越える体重減少が３回連続的に測定された個々の動物はすべて安楽死された。
〇 ２０％を越える平均体重減少、または１０％を越える死亡率があった群はすべて投与を停止する。
・ 群は安楽死されず、回復が許可される。２０％を超える体重減少のあった群内で、個体体重減少エンドポイントに合致した個体は安楽死される。
・ 群の治療関連体重減少が、元の体重の１０％以内に回復した場合、投与は投与量を減少させて、または投与スケジュールの頻度を低くして再開され得る。
・ 非治療体重％回復に対する除外は、個別的に許可され得る。
〇 エンドポイントＴＧＤ。動物は個々に監視された。実験のエンドポイントは、１０００ｍｍ３の腫瘍体積か、５５日のいずれか早い方であった。反応個体はより長く追跡され得る。エンドポイントに達したとき、動物はＳＯＰに準じて安楽死されるものとした。
マウス投与の説明：
〇 調製された投与用溶液：
・抗ＣＴＬＡ−４、抗ＬＡＧ−３、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＴＩＧＩＴ、抗ＴＩＭ−３、抗ＣＤ１３７、およびＮＯＤ２０１Ｍ（４℃で保存。遮光）
〇 ビヒクル＝ＰＢＳ
〇 全抗体に対する投与量＝０．１ｍＬ／マウス。体重に対して調整しない。
〇 投与量 ＫＷ２＝０．２５ｍＬ／マウス。体重に対して調整しない。
〇 投与レジメン2を最初に、次いでレジメン1。
抗体：すべてＢｉｏＸｃｅｌｌ社より。インビボＭＡｂ抗マウスＬＡＧ−３（ＳＫＵ：ＢＥ０１７４−Ｒ０２５ｍｇ）。インビボＭａｂ抗マウスＴＩＭ−３（ＣＤ３６６）（ＳＫＵ：ＢＥ０１１５−Ｒ０２５ｍｇ）。インビボＭａｂ抗マウスＴＩＧＩＴ（ＳＫＵ：ＢＥ０２７４−Ｒ０５０ｍｇ）。インビボＭａｂ抗マウスＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）（ＳＫＵ：ＢＥ０１３１−Ｒ０２５ｍｇ）。インビボＭａｂ抗マウスＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１）（ＳＫＵ：ＢＥ０１０１−Ｒ０２５ｍｇ）。インビボＭａｂ抗マウス４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）（ＳＫＵ：ＢＥ０１６９−Ｒ０５０ｍｇ）。
実施例５
ＭＣ３８−ＮＯＤＵ−ｐ０１０
目的：ＮＯＤ２０１Ｍ単独で治療され、および抗ＰＤ−１で併用治療され、ＭＣ３８同系大腸腫瘍を担持するメスＣ５７ＢＬ／６マウスからフローサイトメトリー用のサンプルを採取する。データを図２５に示す。

手順：
〇 細胞移植のためにイソフルランでマウスを麻酔し、潰瘍を低減させる。
〇 ＣＲメスＣ５７ＢＬ／６マウスを設定し、０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ中、１ｘ１０６個のＭＣ３８−ＮＯＤＵ腫瘍細胞を用いてわき腹に皮下注射する。
・９日目のサンプリングが、当該週の前半に当たるように細胞移植を予定する。
〇 細胞注射体積は、０．１ｍＬ／マウスである。
〇 開始日の齢：８〜１２週齢。
〇 腫瘍が６０〜１８０ｍｍ３の平均サイズに達したとき、ペアマッチを実施し、治療を開始する。
・約１００ｍｍ３（細胞移植後約６〜７日）を標的とする。
〇 体重：ｑｄで最後まで。
〇 ノギス測定：１、３、５、７、９日目。
〇 ３０％を越える体重減少が１回観察された個々の動物、または２５％を越える体重減少が３回連続的に測定された個々の動物はすべて安楽死された。
〇 ２０％を越える平均体重減少、または１０％を越える死亡率があった群はすべて投与を停止した。群は安楽死されず、回復が許可された。
・ ２０％を超える体重減少のあった群内で、個体体重減少エンドポイントに合致した個体は安楽死される。群の治療関連体重減少が、元の体重の１０％以内に回復した場合、投与は投与量を減少させて、または投与スケジュールの頻度を低くして再開され得た。
・ 非治療体重％回復に対する除外は、個別的に許可され得た。
〇 エンドポイントＴＧＩ。動物は群として監視されるものとする。
・ 実験のエンドポイントは、対照群における１０００ｍｍ３の平均腫瘍体積か、９日のいずれか早い方であった。
・ エンドポイントに達したとき、全ての動物は安楽死されるものとした。
投与の説明：
〇 塩型の化合物：なし
〇 投与用溶液の調製：
・抗ＰＤ−１−ＮＯＤＵ、ＫＷ２、プロロイキン−ＮＯＤＵ、４℃で保存。遮光
・抗ＰＤ−１−ＮＯＤＵ＝抗ＰＤ−１−ＮＯＤＵのＰＢＳ溶液
・ＮＯＤ２０１ＭのＰＢＳ溶液（内部でＫＷ２と呼称された）
・凍結禁止。前もって製剤化されて提供され、すぐに使用できた。
〇 ビヒクル＝ＰＢＳ
〇 投与量 ０．１ｍＬ／マウス。体重に対して調整しない。
サンプリングの説明：
〇 サンプリング１
・時点：９日目
・動物：
・１〜４群：１０匹／群
・臓器採取
・腫瘍（サンプルの重量測定−ｍｇ）：単一細胞懸濁液に処理、輸送条件−室温。フローサイトメトリーのためにＣＲＬ−ＮＣに送付。インビトロ実験室と予定。以下のパネルを参照。


フローデータは２つの方法で解析された：１）％ＣＤ４５細胞、および２）細胞数／腫瘍グラム。総ＭＤＳＣおよび総マクロファージ群が、このサブセットに加えて報告された。ｇＭＤＳＣ群は、好中球群でもあり得る／好中球群も含み得る。
実施例６
併用療法
ＮＯＤ２０１と、ＩＦＮα、抗ＴＩＭ３、抗ＬＡＧ３、抗ＴＩＧＩＴ、抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１および抗ＣＴＬＡ４の併用療法。図２４および４０のデータを参照のこと。注記：ＮＯＤ２０１Ｍとは、同系モデルに必要とされる齧歯類Ｆｃドメインを指す。
メスのＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｃ５７ＢＬ／６／ＮＣｒｌ、チャールズリバー社）は試験１日目で８週齢であり、１４．５〜２１．４ｇの範囲の体重（ＢＷ）であった。動物は水（逆浸透、１ｐｐｍ Ｃｌ）ならびに、１８．０％の粗タンパク質、５．０％の粗脂肪、および５．０％の粗繊維からなるＮＩＨ ３１ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｎｄ Ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ Ｌａｂ Ｄｉｅｔ（登録商標）を不断給餌された。マウスは照射済みのＥｎｒｉｃｈ−ｏ’ｃｏｂｓ（商標）で飼育され、２０〜２２℃（６８〜７２°Ｆ）および４０〜６０％の湿度、１２時間の明暗サイクルで、据え付けのマイクロアイソレーター中で眠った。
ＭＣ３８齧歯類大腸癌細胞を、１０％ウシ胎仔血清ならびに２ｍＭグルタミン、１００単位／ｍＬペニシリンＧナトリウム、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン硫酸塩、および２５μｇ／ｍＬゲンタマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させた。細胞培養は、３７℃の加湿インキュベーター中、５％ＣＯ２と９５％空気の雰囲気下、組織培養フラスコ中で維持された。
移植に使用されたＭＣ３８大腸細胞は対数増殖期に回収され、冷却されたＲＰＭＩ培地中に再懸濁された。マウスはイソフルランで麻酔され、その後移植された。各マウスは右わき腹に１ｘ１０６個の腫瘍細胞（０．１ｍＬの細胞懸濁液）を皮下注射され、腫瘍体積が６０〜１８０ｍｍ３の標的範囲に達するまで腫瘍を監視した。腫瘍移植６日後、試験の１日目で、７５〜１４４ｍｍ３の範囲の個体腫瘍体積を有する動物を１０群（ｎ＝１２）に分けた。群の平均腫瘍体積は９７〜１０３ｍｍ３の範囲であった。
ノギスを使用して週に２回、二次元で腫瘍を測定した。腫瘍サイズは以下の式を使用して算出された：
腫瘍体積（ｍｍ３）＝（ｗ２ ｘｌ）／２
式中、ｗは腫瘍の幅、ｌは長さであり、単位はｍｍである。
腫瘍の重量は、腫瘍体積１ｍｍ３は１ｍｇに等しいという仮定で推定され得る。
被験物質：ＮＯＤ２０１Ｍ（ロット番号ＢＰ−０４６−０１６−５ａ）およびＩＦＮ−ａ（大腸菌で産生）。すべての抗体は、ＢｉｏＸＣｅｌｌ社からであった。抗ＣＤ１３７（ＬＯＢ１２．３、カタログ番号 ＢＥ０１６９；ロット番号５９８９１６Ｄ１）、抗ＣＴＬＡ−４（クローン ９Ｈ１０；カタログ番号 ＢＥ０１３１；ロット番号６２４３１６Ｄ１Ｂ）、抗ＬＡＧ−３（クローン Ｃ９Ｂ７Ｗ；カタログ番号 ＢＥ０１７４；ロット番号６３５１１６Ｄ１）、抗ＰＤ−１（クローン ＲＭＰ１−１４；カタログ番号 ＢＥ０１４６；ロット番号６１４６１６Ｏ１）、抗ＰＤ−Ｌ１（クローン １０Ｆ．９Ｇ２；カタログ番号 ＢＥ０１０１；ロット番号６１５４１６Ｄ１）、抗ＴＩＧＩＴ（クローン １Ｇ９；カタログ番号 ＢＥ０２７４；ロット番号６４００１７Ｊ１）、抗ＴＩＭ−３（クローン ＲＭＴ３−２３；カタログ番号 ＢＥ０１１５；ロット番号５９５６１６Ａ２）。ＩＦＮ−ａを除くすべての剤は遮光され、４℃で保存された。ＩＦＮ−αの剤は、遮光され、−２０℃で保存された。すべての剤は、プロトコールの指示に従い調製された。
投与：
試験１日目、確立されたＭＣ３８腫瘍を担持するＣ５７ＢＬ／６マウスを１０群、ｎ＝１２／群に分けた。すべての剤は静脈内（ｉ．ｖ．）投与された。すべての抗体およびＩＦＮ−α治療剤が最初に投与され、次いでＮＯＤ２０１Ｍ治療が行われた。
〇 １群マウスは対照とされ、１、７、および１３日目にビヒクル（ＰＢＳ）を静脈内投与された。
〇 ２群は１、７、１３、および１９日目に５００μｇ／動物のＮＯＤ２０１Ｍを静脈内投与された。
〇 ３群は２群の投与量およびスケジュールでＮＯＤ２０１Ｍを静脈内投与され、１、７、１３、および１９日目に２００μｇ／動物の抗ＰＤ−１の静脈内投与を併用された。
〇 ４群は１および７日目に５００μｇ／動物のＮＯＤ２０１Ｍを静脈内投与され、１、７および１３日目に２００μｇ／動物の抗ＰＤ−Ｌ１の静脈内投与を併用された。
〇 ５群は１、７および１３日目に５００μｇ／動物のＮＯＤ２０１Ｍを静脈内投与され、１、７、および１３日目に２００μｇ／動物の抗ＣＴＬＡ−４の静脈内投与を併用された。
〇 ６群は１、７、１３、および１９日目に５００μｇ／動物のＮＯＤ２０１Ｍを静脈内投与され、１、７、１３、および１９日目に２００μｇ／動物の抗ＬＡＧ−３の静脈内投与を併用された。
〇 ７群は１、７、１３、および１９日目に５００μｇ／動物のＮＯＤ２０１Ｍを静脈内投与され、１、７、１３、および１９日目に２００μｇ／動物の抗ＴＩＭ−３の静脈内投与を併用された。
〇 ８群は１、７、１３、および１９日目に５００μｇ／動物のＮＯＤ２０１Ｍを静脈内投与され、１、７、１３、および１９日目に５００μｇ／動物の抗ＴＩＧＩＴの静脈内投与を併用された。
〇 ９群は１、７、および１３日目に５００μｇ／動物のＮＯＤ２０１Ｍを静脈内投与され、３および９日目に５０μｇ／動物のＩＦＮ−αの静脈内投与を併用された。
〇 １０群は１、７、および１３日目に５００μｇ／動物のＮＯＤ２０１Ｍを静脈内投与され、３および９日目に２５０μｇ／動物の抗ＣＤ１３７の静脈内投与を併用された。
解析：
腫瘍は週に２回ノギスを使用して測定された。各動物は、その腫瘍が１０００ｍ３のエンドポイント体積に達したとき、または試験終了時（５４日目）のいずれか早いときに安楽死処理された。腫瘍体積エンドポイントで本試験を離脱した動物は、安楽死の日付とともに腫瘍進行（ＴＰ）のために安楽死されたと記録された。
データ：
腫瘍サイズを理由として動物が本試験から離脱した場合、その動物に対して記録された最終腫瘍体積は、その後の時点でのメジアン体積を算出するために使用されるデータとともに含められた。カプランマイヤープロットは、時間に対する、試験に残留した各群中の動物の百分率を示すために作製された（図２４および４０を参照のこと）。群のメジアン腫瘍体積は、時間関数としてプロットされ、群中の２回目のＴＲ死の後に切り捨てられた。平均腫瘍体積プロットも本試験に含められた（提示される図）。
これらの実験から、ＮＯＤ２０１ＭがＰＤ１（抗ＰＤ１抗体）、ＰＤＬ１（抗ＰＤ−Ｌ１抗体）、ＣＴＬＡ４（抗ＣＴＬＡ４抗体）、ＣＤ１３７、およびＩＦＮ−αと有効に併用されることが示される。これらの結果は図２７にも示されており、対応する単剤療法対照は有効性が無いことを示している（ＩＦＮａを除く。ＩＦＮａは図２７において反復されなかった）。ＮＯＤ２０１Ｍは検証されたモデルにおいて抗ＴＩＭ３抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、および抗ＬＡＧ３抗体とは併用されていない。
実施例７
ＲＮＡ配列およびＴＩＬデータの作製のための実験デザイン
メスのＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｃ５７ＢＬ／６／ＮＣｒｌ、チャールズリバー社）は試験１日目で９週齢であり、１６．４〜２３．８ｇの範囲の体重（ＢＷ）であった。動物は水（逆浸透、１ｐｐｍ Ｃｌ）ならびに、１８．０％の粗タンパク質、５．０％の粗脂肪、および５．０％の粗繊維からなるＮＩＨ ３１ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｎｄ Ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ Ｌａｂ Ｄｉｅｔ（登録商標）を不断給餌された。マウスは照射済みのＥｎｒｉｃｈ−ｏ’ｃｏｂｓ（商標）で飼育され、２０〜２２℃（６８〜７２°Ｆ）および４０〜６０％の湿度、１２時間の明暗サイクルで、据え付けのマイクロアイソレーター中で眠った。
ＭＣ３８齧歯類大腸癌細胞を、１０％ウシ胎仔血清ならびに２ｍＭグルタミン、１００単位／ｍＬペニシリンＧナトリウム、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン硫酸塩、および２５μｇ／ｍＬゲンタマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させた。細胞培養は、３７℃の加湿インキュベーター中、５％ＣＯ２と９５％空気の雰囲気下、組織培養フラスコ中で維持された。
移植に使用されたＭＣ３８大腸細胞は対数増殖期に回収され、冷却されたＲＰＭＩ培地中に再懸濁された。マウスはイソフルランで麻酔され、その後移植された。各マウスは右わき腹に１ｘ１０６個の腫瘍細胞（０．１ｍＬの細胞懸濁液）を皮下注射され、腫瘍体積が６０〜１８０ｍｍ３の標的範囲に達するまで腫瘍を監視した。腫瘍移植７日後、試験の１日目で、７５〜１７２ｍｍ３の範囲の個体腫瘍体積を有する動物を４群（ｎ＝３０）に分けた。群の平均腫瘍体積は１２０〜１２２ｍｍ３の範囲であった。
ノギスを使用して週に２回、二次元で腫瘍を測定した。腫瘍サイズは以下の式を使用して算出された：
腫瘍体積（ｍｍ３）＝（ｗ２ｘｌ）／２
式中、ｗは腫瘍の幅、ｌは長さであり、単位はｍｍである。腫瘍の重量は、腫瘍体積１ｍｍ３は１ｍｇに等しいという仮定で推定され得る。
ＮＯＤ２０１Ｍ（ロット番号 ＢＰ−０４６−０１６−５ｂ）、および抗ＰＤ−１クローン ＲＭＰ１−１４（ＢｉｏＸｃｅｌｌ社 ロット番号 ６１４６１６Ｏ１）。
治療：ＭＣ３８腫瘍を担持するＣ５７ＢＬ／６マウスの４群（ｎ＝３０）に、図１３のＭＣ３８−ＮＯＤＵ−ｅ２０８プロトコールに従い１日目に投与を開始した。ビヒクル（ＰＢＳ）およびＮＯＤ２０１Ｍ（５００μｇ／動物で投与される）は、２５０μＬ／動物の投与体積で静脈内（ｉ．ｖ．）投与された。抗ＰＤ−１（２００μｇ／動物で投与される）も、１００μＬ／マウスの投与体積で静脈内投与された。すべての投与は１日目および７日目に行われた。１群の動物は対照とされ、ビヒクルを投与された。２群の動物は２００μｇ／動物の抗ＰＤ−１を投与された。３群は５００μｇ／動物のＮＯＤ２０１Ｍを投与された。４群の動物は５００μｇ／動物のＮＯＤ２０１Ｍと、２００μｇ／動物の抗ＰＤ−１が併用されて投与された。
サンプリング：９日目、１〜４群のすべての動物を安楽死させ、腫瘍を直ちに無菌的に取り出し、重量測定した。１０個の腫瘍／群がＲＮＡ−ｌａｔｅｒ中に保存され、４℃でＧｅｎｅｗｉｚへと輸送された。別の１０個の腫瘍サンプルは、ＣＲ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓでのフローサイトメトリー解析用に単一細胞懸濁液に処理された。
フローサイトメトリー用のサンプル調製：マウス腫瘍サンプルは、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（商標）プロトコール「Ｔｕｍｏｒ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ」を使用しメーカーの指示に従って解離させた。簡潔に述べると、腫瘍を摘出し、小片（２〜４ｍｍ）へとカットした。腫瘍サンプルを酵素緩衝液中に置き、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ上で処理した。サンプルを２０分間、３７℃で連続回転させながらインキュベートした。
サンプルをＰＢＳ中で２回洗浄し、酵素緩衝液を取り除いた。最終単一細胞懸濁液を、染色緩衝液（２．５％ ＦＢＳ、０．０９％ ＮａＮ３のＰＢＳ溶液 ｐＨ ７．４）中に約２ｘ１０７個細胞／ｍＬで調製した。次いで細胞を生／死解析用に染色し、Ｆｃ受容体はＴｒｕＳｔａｉｎ Ｆｃを使用してブロッキングした。細胞を細胞表面マーカーに対する所望の抗体で染色した。アイソタイプ対照抗体は、必要と思われる場合に陰性染色対照として使用した。すべてのデータはＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩ（ＢＤ）で集められ、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）で解析された。データはＣＤ４５＋細胞の％、および腫瘍１グラム当たりの細胞数として報告された。このサブセットに加えて総ＭＤＳＣおよび総マクロファージ群が報告された。ｇＭＤＳＣ群は好中球群でもあり得る／好中球群も含み得ることに注意されたい。


ＲＮＡ発現解析
１）ＲＮＡライブラリ調製およびＨｉＳｅｑ配列解析
総ＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用して抽出された。ＲＮＡサンプルは、Ｑｕｂｉｔ ２．０ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国カリフォルニア州カールスバッド）を使用して定量され、２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国カリフォルニア州パロアルト）でＲＮＡの完全性をチェックした。ＲＮＡライブラリの調製、配列解析反応、および初期バイオインフォマティクス解析は、ＧＥＮＥＷＩＺ，ＬＬＣ．（米国ニュージャージー州サウスプレインフィールド）で実施された。
ＲＮＡ配列解析ライブラリ調製は、メーカーの推奨に従いＩｌｌｕｍｉｎａ社用のＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔを使用した（ＮＥＢ社、米国マサチューセッツ州イプスウィッチ）。簡潔に述べると、ｍＲＮＡは最初にＯｌｉｇｏｄ（Ｔ）ビーズを用いて富化された。富化されたｍＲＮＡは９４℃で１５分間断片化された。その後に第一ストランドと第二ストランドのｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡ断片は末端修復され、３’末端でアデニル化された。ユニバーサルアダプターをｃＤＮＡ断片にライゲートし、次いで限定されたサイクル数のＰＣＲを行ってインデックス付加とライブラリ富化を行った。配列解析ライブラリは、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国カリフォルニア州パロアルト）上でＤＮＡチップを使用して確認し、Ｑｕｂｉｔ ２．０ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国カリフォルニア州カールスバッド）ならびに定量的ＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、米国カリフォルニア州カールスバッド）を使用して定量した。
配列解析ライブラリをマルチプレックス化して、フローセルの１レーン上でクラスター化させた。クラスター化後、フローセルをメーカーの指示に従いＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ装置上にロードした。サンプルは２ｘ１５０のペア形成末端（ＰＥ）配置を使用して配列解析された。画像解析と塩基呼び出しはＨｉＳｅｑ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＨＣＳ社）により行われた。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑから生成された生配列データ（．ｂｃｌファイル）はｆａｓｔｑファイルへと転換され、Ｉｌｌｕｍｉｎａのｂｃｌ２ｆａｓｔｑ ２．１７ソフトウェアを使用して脱マルチプレックス化された。インデックス配列特定に対し、１つのミスマッチが許可された。
２）データ解析
すべての解析の前に、配列リードはトリミングされ、Ｑｉａｇｅｎ ＣＬＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｓｅｒｖｅｒ ９．０を使用して３’末端のアダプターの可能性のある配列、および低品質（エラー率＜０．０５）のヌクレオチドを除去した。３０塩基よりも短いリードは、その後の解析から取り除かれた。トリミングされたリードはマウス参照ゲノムＧＲＣｍ３８（ｆｔｐ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／ｐｕｂ／ｃｕｒｒｅｎｔ＿ｆａｓｔａ／ｍｕｓ＿ｍｕｓｃｕｌｕｓ／ｄｎａ）へと割り当てられた。総リード数とＲＰＫＭ値が算出された。
２群のサンプル間の遺伝子発現を比較するために、Ｗａｌｄ検定を実施して、各遺伝子または転写物に対するＰ値、ＦＤＲ Ｐ値を生成した。そのＦＤＲ Ｐ値が＜０．０５であり、倍数変化が＞１．５であれば、有意に発現された遺伝子または転写物として選択された。
遺伝子オントロジー解析に関して、有意に発現された遺伝子は、遺伝子オントロジーの生物学的プロセスカテゴリー（Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓ ｃａｔｅｇｏｒｉｅｓ）を用いてアノテーションされた。次いで超幾何検定を各比較に対して行った。ＦＤＲ＜０．０５を有したカテゴリーのリストは、有意に発現された遺伝子における過剰表出（ｏｖｅｒ−ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ）生物学的プロセスとして取得された。
ＲＮＡ配列解析（ワークフロー／要約）：
１．ＲＮＡ配列ライブラリ調製のワークフロー
ポリＡ選択を用いた全トランスクリプトーム配列解析
１．ｍＲＮＡ富化、ｍＲＮＡ断片化、およびランダムプライミング
２．第一および第二ストランドｃＤＮＡの合成
３．末端修復、５’リン酸化、およびｄＡテーリング（Ｔａｉｌｉｎｇ）
４．アダプターのライゲーション、ＰＣＲ富化、および配列解析。
２．バイオインフォマティクス解析のワークフロー：
１．配列のＱＣ、２．低品質塩基のトリミング、アダプター配列の切り出し、３．ゲノムおよびスプライスジャンクションへリードをマッピング、４．遺伝子／エクソン上のリード密度、およびアノテーション、５．スプライスアイソフォームＩＤ、６．転写物／遺伝子に対する総ヒット数およびＲＰＫＭ値の算出、７．転写物発現の比較、７．ＧＯアノテーション、Ｕｎｉｐｒｏｔアノテーション。
３．遺伝子発現解析
３．１ 参照ゲノムへの配列リードのマッピング、および遺伝子ヒット数の抽出：配列リードはトリミングされ、末端のアダプターの可能性のある配列および低品質ヌクレオチド（エラー率＜０．０５）が除去された。トリミング後、３０ヌクレオチドよりも短い配列リードは廃棄された。残りの配列リードをマウスの参照ゲノム（ＧＲＣｍ３８、ｆｔｐ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／ｐｕｂ／ｃｕｒｒｅｎｔ＿ｆａｓｔａ／ｍｕｓ＿ｍｕｓｃｕｌｕｓ／ｄｎａ）に対して割り当てた。総遺伝子ヒット数が測定され、ＲＰＫＭ値が算出された。
３．２ 遺伝子発現の解析
ＣＬＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓを使用したマッピングおよび総遺伝子ヒット数算出の後、総遺伝子ヒット数を使用して、遺伝子差次的発現を比較した。
３．２．１ 階層的クラスター解析
教師無し階層的クラスター化は、全てのサンプル、および標準化後のすべての遺伝子を用いて行われた。
３．２．２ 主成分分析（ＰＣＡ）は、全ての遺伝子を用いて行われ、サンプル間の類似性が明らかとなった。
４．遺伝子発現の比較
以下のサンプル群間の遺伝子発現値の以下の比較が実施された（注記：１群＝ＰＢＳ、２群＝抗ＰＤ１、３群＝ＮＯＤ２０１、４群＝抗ＰＤ１／ＮＯＤ２０１の組み合わせ
２群対１群
３群対１群
４群対１群
４群対２群
４群対３群
Ｗａｌｄ検定を使用して、Ｐ値および倍数変化が生成された。偽発見率（ＦＤＲ：Ｆａｌｓｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｒａｔｅ）＜０．０５、および絶対倍数変化＞１．５の遺伝子は、各比較に対し、差次的発現遺伝子と呼称された。
５．遺伝子オントロジー解析
遺伝子オントロジー解析（ＧＯ：Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ ａｎａｌｙｓｉｓ）は、各比較に関し、有意に発現された遺伝子に対して行われた。ＦＤＲ＜０．０５のＧＯ生物学的プロセスのリストが取得された。
６．スプライスバリアント発現解析
スプライスバリアントに関し、その発現レベルが測定され、遺伝子発現比較と同じように発現比較が行われた。差次的発現転写物のリストが各比較に対して取得された（ＦＤＲ＜０．０５、倍数変化＞１．５）。
実施例８
抗体融合体：
Ａｂ融合体の様々なアプリケーション／用途；１）Ａｂ融合体は、サイズの増加またはＦｃＲｎリサイクルの増加を介したノッチン（ｋｎｏｔｔｉｎｓ）の半減期延長に使用することができる。２）ノッチンを、癌標的に特異的な抗体に結合させて、インテグリンおよび別の標的に結合する多重特異的タンパク質を生成し、両標的を調節する、または相乗効果をもたらすことができる（例としては、抗ＥＧＦＲ、抗ＶＥＧＦ、または抗ＣＴＬＡ−４および他のチェックポイントなどがありえる）。３）これに基づき、ノッチンを抗体に結合させ、より効率的に抗体を腫瘍に送達させ、さらなる有効性を得ることができる。４）より効率的に送達することで、Ａｂの副作用を軽減し得る。
半減期延長と、多重特異的タンパク質の生成を行うために、２．５Ｆノッチンペプチドと一般的な抗体の融合を行った。図Ｘに示されるように、抗体の重鎖または軽鎖の上にノッチンの結合点が複数存在する。提示される例は解説を目的として提供されており、包括的または総合的であることは意図されていない。
１．齧歯類抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ）抗体（クローンｓｍ３Ｅ）の軽鎖のＮ末端と２．５Ｆの融合
２．異なる結合点での２．５Ｆと抗ＣＴＬＡ４抗体（クローン９Ｄ９）の融合。重鎖のＮ末端への融合、重鎖のＣ末端への融合、または軽鎖のＮ末端への融合。比較用に野生型９Ｄ９抗体も含まれている。
ノッチン２．５Ｆに対応するＤＮＡを特定の位置で対象抗体の重鎖または軽鎖に遺伝的に融合させた。オープンリーディングフレームを、ＣＨＯ細胞またはＨＥＫ細胞での哺乳類細胞発現に適したベクター内にクローニングした。一過性発現系が示されているが、これらタンパク質を発現する安定的細胞株を作製することもできる。
一過性発現のために、充分な量のトランスフェクション品質のＤＮＡを調製してトランスフェクションを実施した。ＣＨＯ−Ｓ細胞またはＨＥＫ２９３細胞の安定的な培養が確立された。パイロット（ミリリットル）または大規模（リットル規模）なトランスフェクションは、適切な宿主細胞株（ＣＨＯ−ＳまたはＨＥＫ２９３）と、生成されたプラスミドＤＮＡを利用する脂質系トランスフェクション試薬を使用して実施された。これら構築体に関し、非改変の重鎖または軽鎖が、ノッチンペプチドと融合された重鎖または軽鎖と組み合わされた。細胞の活性が８０％よりも落ちが時点で、馴化培地を回収し、清浄化して、タンパク質の力価をバイオレイヤー干渉法（ｂｉｏｌａｙｅｒ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ）により決定した。シングルパスプロテインＡクロマトグラフィーを使用して上清から抗体融合体を精製した。精製されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元条件および非還元条件）およびサイズ排除クロマトグラフィーにより解析した。
すべての抗体融合体がＨＥＫ細胞およびＣＨＯ細胞において良好に発現された。図に示されるように、プロテインＡ精製の後、抗体融合体の９８〜９９％超が単量体であり、非還元条件下、および還元条件下で予測分子量を示した。
４つのノッチン融合タンパク質をこれら構築体から作製した。９Ｄ９ ＷＴと呼称されるタンパク質１は、非改変ＬＣ ９Ｄ９とＨＣ ９Ｄ９を含んでいる（構築体１と２を組み合わせている）。ＮＯＤ２０１Ｇ４Ｓ３−ＬＣ−ＨＣと呼称されるタンパク質２は、ＨＣ ９Ｄ９とペア形成した２．５Ｆ−Ｇｌｙ４Ｓｅｒ３−ＬＣ ９Ｄ９を含んでいる（構築体３と２を組み合わせている）。ＮＯＤ２０１Ｇ４Ｓ３−ＨＣ−ＬＣと呼称されるタンパク質３は、非改変ＬＣ ９Ｄ９とペア形成した２．５Ｆ−Ｇｌｙ４Ｓｅｒ３−ＨＣ ９Ｄ９を含んでいる（構築体４と１を組み合わせている）。ＨＣ−Ｇ４Ｓ３−ＮＯＤ２０１−ＬＣと呼称されるタンパク質４は、非改変ＬＣ ９Ｄ９とペア形成されたＨＣ−Ｇｌｙ４Ｓｅｒ３−２．５Ｆ ９Ｄ９を含んでいる（構築体５と１を組み合わせている）。２．５Ｆノッチンペプチドは、以下にアノテーションされて例示されるように、抗ＣＴＬＡ−４抗体の異なる鎖および末端に融合された：

上記に解説される実施例は、当分野の当業者に、本発明の組成物、システムおよび方法の実施形態をどのように作製および使用するかについての完全な開示および説明を提供するために提示されており、本発明者らが本発明とみなす範囲を限定する意図はない。当分野の当業者に明らかな、本発明を実施するための上述の形式の改変は、以下の請求の範囲内にあることが意図される。本明細書において言及される全ての特許および公表文献は、本発明が関する分野の当業者の技術レベルを示すものである。本開示に引用されるすべての参照文献は、各参照文献が個々にその全体で参照により組み込まれたのと同程度に参照により組み込まれる。
全ての表題および節の指定は、明白性および参照の目的にのみ使用されており、限定とは決してみなされないものとする。例えば当分野の当業者であれば、本明細書に記載される本発明の主旨および範囲に従い、異なる表題および節からの様々な態様を組み合わせることの有用性を適切であると認識するであろう。
本明細書に引用される全ての参照文献は、各個々の公表文献または特許または特許出願が具体的および個別に全ての目的に対しその全体で参照により組み込まれると示唆されるのと同程度に、その全体で、およびすべての目的に対して、本明細書に参照により組み込まれる。
本出願の様々な改変および変動が、その主旨および範囲から逸脱することなく実施され得、当分野の当業者には明白であろう。本明細書に記載される具体的な実施形態および実施例は、例示の目的でのみ提示される。本出願は、添付の請求項の条件と、その請求項が権利付与される均等の全範囲によってのみ、限定されるものとする。

Claims (40)

  1. 対象のがんを治療する方法であって、
    インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体の有効量を前記対象に投与するステップを含み、
    前記インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体は、治療有効量が投与され、配列番号１３０（ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＳＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧ）と配列番号１３１（ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＫＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧ）からなる群から選択される配列を含み、
    前記インテグリン結合性ポリペプチドはＦｃドメインと共役させている、方法。
  2. 前記Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記Ｆｃドメインは、ヒトＦｃドメインである、請求項２に記載の方法。
  4. 前記インテグリン結合性ポリペプチドは、前記Ｆｃドメインと直接共役されている、前項のうちいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記インテグリン結合性ポリペプチドは、リンカーポリペプチドを介して前記Ｆｃドメインと共役されている、前項のうちいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記リンカーポリペプチドは、ＧＧＧＧＳ（配列番号１３６）とＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１３７）からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
  7. 免疫チェックポイント阻害物質、または免疫チェックポイントを投与するステップをさらに含む、前項のうちいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記免疫チェックポイント阻害物質はＰＤ−１阻害物質である、請求項７に記載の方法。
  9. ＰＤ−１阻害物質は抗ＰＤ−１抗体である、請求項８に記載の方法。
  10. 前記インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体は、リンカーの存在下、または非存在下でインテグリン結合性ポリペプチド配列を含み、
    前記配列は、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＳＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧ（配列番号１３０）、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＫＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧ（配列番号１３１）、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＳＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧＧＧＧＧＳ（配列番号１３２）、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＫＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧＧＧＧＧＳ（配列番号１３３）、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＳＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１３４）、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＫＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１３５）からなる群から選ばれ、
    前記インテグリン結合性ポリペプチド配列はＦｃドメインに直接連結され、
    前記Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４からなる群から選択される、前項のうちいずれか１項に記載の方法。
  11. インターロイキン−２（ＩＬ−２）を投与するステップをさらに含む、前項のうちいずれか１項に記載の方法。
  12. 前記ＩＬ−２はプロロイキンである、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記ＩＬ−２は、前記インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体の投与より先、もしくはその後、もしくは同時に投与される、請求項１１に記載の方法。
  14. 前記ＩＬ−２は、前記インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体の投与より後に投与される、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記ＩＬ−２の一日投与量は、１２ ＭＩＵ／ｍ２である、請求項１１〜１４のうちいずれか１項に記載の方法。
  16. 前記ＩＬ−２は皮下投与により投与される、請求項１１〜１５のうちいずれか１項に記載の方法。
  17. （ｉ）ＩＬ−２、もしくは、（ｉｉ）免疫チェックポイント阻害物質または免疫チェックポイント刺激物質のいずれかを投与するステップをさらに含む、前項のうちいずれか１項に記載の方法。
  18. （ｉ）ＩＬ−２、および（ｉｉ）免疫チェックポイント阻害物質または免疫チェックポイント刺激物質の両方を投与するステップをさらに含む、前項のうちいずれか１項に記載の方法。
  19. 前記免疫チェックポイント阻害物質は、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体からなる群から選択される、請求項１７または１８に記載の方法。
  20. 前記免疫チェックポイント刺激物質は、抗４−１ＢＢ／ＣＤ１３７抗体、抗ＩＦＮα抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、ＯＸ４０抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗ＩＣＯＳ抗体、抗ＣＤ２８抗体からなる群から選択される、請求項１７または１８に記載の方法。
  21. 前記インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体は、少なくとも２つのインテグリンと結合（ｂｉｎｄ）する、前項のうちいずれか１項に記載の方法。
  22. 前記インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体は、少なくとも３つのインテグリンと結合（ｂｉｎｄ）する、前項のうちいずれか１項に記載の方法。
  23. 前記インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体は、αｖβ１、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６、α５β１からなる群から選択される少なくとも２つのインテグリンと結合（ｂｉｎｄ）する、前項のうちいずれか１項に記載の方法。
  24. （ｉ）ＩＬ−２、もしくは、（ｉｉ）免疫チェックポイント阻害物質または免疫チェックポイント刺激物質の追加投与は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の腫瘍浸潤を引き起こす、請求項１７に記載の方法。
  25. （ｉ）ＩＬ−２、もしくは、（ｉｉ）免疫チェックポイント阻害物質または免疫チェックポイント刺激物質の追加投与は、骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）の減少を引き起こす、請求項１７に記載の方法。
  26. （ｉ）ＩＬ−２、および（ｉｉ）免疫チェックポイント阻害物質または免疫チェックポイント刺激物質の両方の追加投与は、（ｉ）ＩＬ−２、および／または（ｉｉ）免疫チェックポイント阻害物質または免疫チェックポイント刺激物質の個別投与に比べて、ＣＤ８＋Ｔ細胞の腫瘍浸潤をより増加させる、請求項１８に記載の方法。
  27. （ｉ）ＩＬ−２、および（ｉｉ）免疫チェックポイント阻害物質または免疫チェックポイント刺激物質の両方の追加投与は、（ｉ）ＩＬ−２、および／または（ｉｉ）免疫チェックポイント阻害物質または免疫チェックポイント刺激物質の個別投与に比べて、骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）をより減少させる、請求項１８に記載の方法。
  28. リンカーの存在下、または非存在下でインテグリン結合性ポリペプチド配列を含むポリペプチドであって、
    前記配列は、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＳＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧ（配列番号１３０）、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＫＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧ（配列番号１３１）、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＳＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧＧＧＧＧＳ（配列番号１３２）、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＫＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧＧＧＧＧＳ（配列番号１３３）、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＳＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１３４）、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＫＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１３５）からなる群から選ばれ、
    前記インテグリン結合性ポリペプチド配列はＦｃドメインに直接連結され、
    前記Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４からなる群から選択される、ポリペプチド。
  29. リンカーの存在下、または非存在下でインテグリン結合性ポリペプチド配列を含む組成物であって、
    前記配列は、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＳＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧ（配列番号１３０）、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＫＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧ（配列番号１３１）、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＳＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧＧＧＧＧＳ（配列番号１３２）、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＫＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧＧＧＧＧＳ（配列番号１３３）、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＳＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１３４）、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＫＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１３５）からなる群から選ばれ、
    前記インテグリン結合性ポリペプチド配列はＦｃドメインに直接連結され、
    前記Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４からなる群から選択される、組成物。
  30. リンカーの存在下、または非存在下でインテグリン結合性ポリペプチド配列を含む医薬組成物であって、
    前記配列は、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＳＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧ（配列番号１３０）、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＫＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧ（配列番号１３１）、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＳＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧＧＧＧＧＳ（配列番号１３２）、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＫＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧＧＧＧＧＳ（配列番号１３３）、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＳＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１３４）、ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＫＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１３５）からなる群から選ばれ、
    前記インテグリン結合性ポリペプチド配列はＦｃドメインに直接連結され、
    前記Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４からなる群から選択される、医薬組成物。
  31. 前項に記載のインテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体をコード化する核酸。
  32. 前項に記載のインテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体をコード化する核酸を含む発現ベクター。
  33. 請求項３１に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
  34. 前項に記載のインテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体の作製方法であって、
    ａ）前記インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体が発現する条件下で、請求項３３に記載の宿主細胞を培養するステップと、
    ｂ）前記インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体を回収するステップと、を含む、方法。
  35. 対象のがんを治療するために免疫系を活性化する方法であって、
    インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体の有効量を前記対象に投与するステップを含み、
    前記インテグリン結合性ポリペプチド−Ｆｃ融合体は、治療有効量が投与され、配列番号１３０（ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＳＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧ）と配列番号１３１（ＧＣＰＲＰＲＧＤＮＰＰＬＴＣＫＱＤＳＤＣＬＡＧＣＶＣＧＰＮＧＦＣＧ）からなる群から選択される配列を含み、
    前記インテグリン結合性ポリペプチドはＦｃドメインと共役させている、方法。
  36. 前記Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４からなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記Ｆｃドメインは、ヒトＦｃドメインである、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記インテグリン結合性ポリペプチドは、前記Ｆｃドメインと直接共役されている、請求項３４〜３６のいずれか１項に記載の方法。
  39. 前記インテグリン結合性ポリペプチドは、リンカーポリペプチドを介して前記Ｆｃドメインと共役されている、請求項３５〜３８のいずれか１項に記載の方法。
  40. 前記リンカーポリペプチドは、ＧＧＧＧＳ（配列番号１３６）とＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１３７）からなる群から選択される、請求項３８に記載の方法。
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