JPH06503719A - Ｔ↓ｈ依存性細胞障害性Ｔリンパ球の産生方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 り二 Ｔ）Ｉ依存性細胞障害性Ｔリンパ球の産生方法及囲旦宣ｌ 哺乳類造血系には種々の細胞型が関与しており、それには骨髄細胞およびリンパ 球が含まれる。これらの細胞は免疫応答のエフェクターとして作用し、感染や疾 患に対抗する役割を有する。リンパ球は成熟ＢおよびＴリンパ球よりなり、各々 は異なる抗原に対して特異的なレセプターを有している。リンパ球の集団は外来 抗原に対する体液性および細胞媒介性の応答をもたらす際に重要な役割を果たす 。

全ての成熟１９７８球はＣＤ３細胞表面分子を発現しているが、細胞表面分子Ｃ Ｄ４およびＣＤ８の何れか１方の発現に基づく２種類の基本的なサブタイプより なる。ＣＤ４４Ｔ細胞は一般的に免疫応答における「ヘルパー」機能に関与し、 サイトカイン分子、特にＩＬ−２、ＩＬ−４またはＩＬ−７を分泌する。この機 能に細胞障害性ＣＤ８　′″丁細胞が依存している。ＣＤ４’″はしばしばＴヘ ルパー（Ｔ）Ｉ　）細胞と称される。ＣＤ８　”細胞は免疫応答における「エフ ェクター」機能、例えば外来抗原を有する標的細胞の直接の細胞障害性破壊に関 与しており、ウィルス感染および膿瘍への抵抗性のための重要な機構を示す。Ｃ Ｄ４“とＣＤ８”Ｔ細胞との間の機能的相違は、ＣＤ４’が■類のＭＨＣ分子と ともに存在する抗原を認識する能力を有し、ＣＤ８”細胞は工類ＭＨＣ分子とと もに存在する抗原をｔ？２識する能力を有するという点に基づく。この融解機能 を媒介するＣＤ８”細胞は細胞障害性ＴＩＪンバ球（ＣＴＬ）と称される。

殆どのＣＴＬがＣＤ８”表現型であるが、ＣＤ４’″表現型であるＣＴＬも報告 されている。一般に、個々のＣＴＬ　（ＣＤ８°またはＣＤ４“）は抗原特異性 である。

ＣＴＬは、外来抗原に応答して成長および増殖するために、ＩＬ−２、ＩＬ−４ およびＩＬ−７のようなヘルパーＴ　（Ｔ＋　）細胞由来サイトカインに依存し ている（　ＺｉｎｋｅｒｎａｇｅｌおよびＤｏｈｅｒｔｙ、　Ａｄｖ、ＩｍＬＬ Ｉ！；ＬＬ　２７：５１，１９７９；Ｍａｌｅら、　ｄｂｖａｎｃｅｄ　Ｉｍｍ ｕｎｏｌｏ　、Ｃｈａｐ、７゜Ｇｏｖｅｒ　Ｐｕｂｌ、　、　Ｌｏｎｄｏｎ、　 １９８７；Ｊａｃｏｂｓｏｎら、Ｌユｍｍｕｏ１．　ｌｐニア５４゜１９８４） 。例えばＩＬ−２は、細胞障害性１９７８球の強力なマイトジェンであり（Ｇｉ ｌｌｉｓおよびＳｍ１ｔｈ、　■阻■、　２６８：１５４，１９７７＞、そして 抗原とＩＬ−２の組合せにより初期ＣＤ８２Ｔ細胞インビトロ増殖が起こる。Ｃ Ｄ８　”　ＣＴＬのインビボの増殖および維持のためのＩＬ−２の重要性は養子 免疫療法のモデルで示されており、このモデルでは移入した抗レトロウィルスＣ Ｄ８”細胞の治療効果は、その後のＩＬ−２の投与で増強される（Ｃｈｅｅｖｅ ｒら、Ｌ」Ｌし且０−１５５：９６８．１９８２；Ｒｅｄｄｅｈａｓｅら、Ｌｊ 上り日、ｊ２１：３１０２，１９８７）。　ＩＬ−４およびＩＬ−７もまた、成 熟ＣＤ８’　ＣＴＬの増殖を促進することができる（　Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｌ ユ４　ＬＩｉ：　５７７　、１９９０）。

外来抗原に対するＴ細胞の特異性のために、多くの研究がウィルス感染および悪 性腫瘍の治療におけるＴ細胞の使用に向けられてきた。特定の型の腫瘍抗原に対 して特異的な細胞障害性Ｔ細胞を単離して腫瘍を有する患者に投与し得、ＣＴＬ が腫瘍を改善するという作用が得られる。例えば、マウスにおける実験的腫瘍に 対して腫瘍特異性Ｔ細胞を発生させ得るばかりでなく、見かけの腫瘍特異性を有 するＴ細胞をガン患者がら単離し得ることも解っている。このようなヒト腫瘍浸 潤リンパ球（ＴＩＬ）はインビトロで増殖されガン患者の治療に用いられており 、膿瘍特異性Ｔ細胞を用いたヒト養子免疫療法に関する多大な関心を呼んでいる 。（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、ＬユＪロエＬ且ｏ工３１９：１７６７、１９８８） 。

ウィルス抗原に対して特異的な細胞障害性Ｔ細胞を用いる同様の試験また、実験 動物モデルにおいて行われている。ヒトＣＤ８”　ＣＷａｌｋｅｒら、Ｎａｔｕ ｒｅ　３２８：３４５．１９８７；Ｐｌａｔａら、Ｎａｔｕｒｅ　３２８：３４ ８．１９＋１７）およびＣＤ４’　（Ｓ　ｉ　ｌ　１ｃｉａｎｏら、Ｃｅ１ｌ　 ５４：５６１，１９８８）の両方の表現型のヒトＨＩＶ特異的ＣＴＬが単離され 特徴づけされている。ＨＩＶ特異的ＣＴＬはその増殖と細胞障害性応答が抗原特 異的でありＭＢＣ＝制限性である点で古典的ＣＴＬであり（Ｗａｌｋｅｒら、前 記ＨＰｌａｔａら、前記；Ｃｈｅｎｉｃｉｎｅｒら、ニ亘、　１９：１５３７． １９８９：（Ｗａｌｋｅｒら、、ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ 　８６：９５１４，１９８９）、ウィルス、膿瘍またはアロ特異的抗原に対して 特異的な、既に特徴づけされている多くのマウスおよびヒトのＣＴＬクローンと 共通である。

多（の抗原特異的Ｔ細胞クローンが単離されているが、インビトロで生成された 腫瘍特異的子細胞クローンの使用は腫瘍治療においては限界があることが解って いる。いくつかの治療モデルにおいて、細胞溶解性ＣＤ８’Ｔ細胞の薬効は外因 性ＩＬ−２（ＴＨ細胞が生産する）に対する依存性により制限されることが解っ ている。この所見は、外因性ＩＬ−２の投与が最適な治療効果を得るために必須 である、ヒト養子療法において実証されている（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら　、Ｎ、 Ｅｎ　ｌｉ、Ｍｅｄ、３１９：１７６７．１９８８：Ｋｌａｒｎｅｔ役割）、Ｌ ｏｔｚｏｖａおよびＨｅｒｂｅｒｍａｎ版、ＣＲＣＰｒｅｓ、Ｆｌｏｒｉｄａ、 第１４章ｐｐ、　１９９−２１８．１９９０）。従って、インビトロのＴ細胞ク ローニング技術はＪ腫瘍またはウィルスに対する特異性を示すことができるよう な多くのＴ細胞を発生させるための手段を提供するものの、このような抗原特異 的Ｔ細胞を治療に用いることの最大の可能性は、そのＴ。細胞依存性により制限 されると考えられる。

限られた例において、ＴＨ依存症の問題点は、Ｔ、細胞から独立して機能するこ とが知られている特定の種類の細胞を使用することにより克服し得る。これらの 細胞は、ヘルパー非依存性細胞溶解性ＣＤ８”Ｔ細胞（）Ｉ　ＩＴｃ）として知 られており（Ｋｌａｒｎｅｔら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１４２＋２１８７． １９８９）　、−次ぐ即ちインビボの材料から新たに単離された）　ＣＤ８”Ｃ ＴＬの集団中に同定されている（Ｓｔ）ｒｅｎｔおよび５ｃｈａｅｆｅｒ、　Ｊ 、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１６２　：２１０６ｇ、１９８５；Ａｎｄｒｕｓら、 ムシＬ上蜂、　１５９：６４７．１９８４）　、　ＨＩＴＣ細胞は、ＣＤ４”細 胞およびそれらが生産するサイトカインには非依存的に生育するのに十分なＩＬ −２を生産する。ＨＩＴｏ細胞はまた、細胞膜ＩＬ−ルセプター（ＩＬ−ＩＲ） を発現し、そのＩＬ−２−非依存性増殖のためにはＩＬ−１を必要とすることが 知られている（Ｋｌａｒｎｅｔら、１９８９゜前記）。これは表面に検出可能な ＩＬ−ＩＲを発現しない従来のＣＤ８’ＣＴＬとは対照的である（　Ｌｏｖｅｎ 　ｔｈａ　ｌおよびＭａｃＤｏｎａｌｄ、　１９Ｂ？）。

腫瘍、ウィルスおよびアロ抗原を含む一定範囲の抗原に対して特異的な旧Ｔｃ細 胞が作成されている（ｖｏｎ　Ｂｏｅｈｍｅｒら、二ｍｍｕｎｏ１．１３３：５ ９，１９８４＋Ｋｌａｒｎｅｔら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３８：４０１２，１ ９８７；およびＡｎｄｒｕｓら、Ｌシ且１包、　１５９：６４７．１９８４；Ｍ ｉｚｕｏｃｈｉら、↓、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１４２　：２７０．１９８９）。

レトロウィルスで形質転換された腫瘍に対して特異的なＨＩＴｃは、接種後、膿 瘍細胞を死滅させ、長期間インビボで常在することが報告されている（Ｋｌａｒ ｎｅｔら、４９８９年、前記）。残念なことに、■ＩＶのような重要な抗原の多 くに対して特異性を有する■ＩＴｃ細胞はいまだ単離されていない。

治療における抗原特異的Ｔ細胞の最大の可能性を実現するためには、ＴＨ非依存 性細胞融解性Ｔ細胞のより完成されたレパートリ−を開発する必要がある。

木及囲五１互 本発明はＴヘルパー（ＴＨ）細胞非依存性細胞障害性Ｔ’Ｊンパ球（ＣＴＬ）を ＴＨ依存性ＣＴＬから生産するための方法を提供する。

得られたＴＨ非依存性ＣＴＬは、ＴＨ細胞とは無関係に、増強された成長または 増殖が可能である。

特に本発明は、組み換え体発現ベクターを、Ｔ＋依存性ＣＴＬに導入することに よる、ＴＨ非依存性ＣＴＬの製造方法を提供する。

この発現ベクターは、例えば感染性組み換え体レトロウィルスベクターであり、 ７Ｍ細胞とは無関係にＣＴＬを成長または増殖させることのできる例えば外因性 ＩＬ−ルセプターのようなサイトカインレセプターをコードする。好ましい実施 態様においては、ＣＴＬは抗原特異的であり、サイトカインレセプターの発現に より、抗原特異的ＣＴＬはＴＨ細胞に非依存的に増強された成長または増殖が可 能である。

本発明はまた、上記方法により生産されたＴＨ非依存性ＣＴＬを提供する。この ＣＴＬはレセプター、例えば遺伝子の伝達により導入される外因性発現ベクター によりコードされるＩＬ−ルセプターのようなレセプターを発現する。ＣＴＬは 、レセプターの発現により、ＴＨ細胞に非依存的に増強された成長または増殖が 可能である。好ましい実施態様においては、このＣＴＬは抗原特異的であり、サ イトカインレセブターの発現により、抗原特異的ＣＴＬはＴＨ細胞に非依存的に 増強された増殖が可能である。

本発明はまた、哺乳類において、例えば腫瘍またはウィルス抗原のような外来抗 原を発現する細胞を殺す方法を提供する。抗原を発現する細胞に対して細胞溶解 特異性を有するＣＴＬは、抗原にさらされたドナーから単離する。次に、ＣＴＬ の成長または増殖を増強することのできる外因性サイトカインレセブター、例え ばＩＬ−ＩＲをコードする組み換え発現ベクターをＣＴＬに導入する。次に、得 られたＴＨ非依存性ＣＴＩ、を、抗原を発現する細胞を殺すのに十分な量で、哺 乳類に導入する。

図面の簡単な説明 図１は、レトロウィルスパッケージング細胞系ＰＡ３１？およびＷ２に導入した レトロウィルスベクターＬ、　ＩＬ（ＲＳＮのプラスミド形態を示す模式図であ る。矢印は転写開始部位および転写方向を示す。ＬＴＲと記された白い四角はレ トロウィルスのロングターミナルリピートである。ＳＤはスプライスドナーであ り、ＳＡはスプライスアクセプターであり、点描の施された四角はＳＶ４０初期 領域プロモーターである。

図２は感染されたＷ２産生細胞内のり、　ＩＬ−ＩＲＳＮプロウィルスのサザン 分析結果を示す。Ｌ、　ＩＬ−ＩＲＳＮ　Ｗ２ｔ６ウイルス産生クローンから得 たゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩ　（レーン１）またはＥｃｏＲＶ　（レーン２）で 消化した。ｐＬ、　ＩＬ−ＩＲＳＮプラスミドＤＮＡは組込まれたプロウィルス の予想されるサイズに対する陽性対照としてＥｃｏＲＶ　（レーン３）で消化し た。全ての消化物をゲル上で泳動し、ニトロセルロースにブロッティングした。

次にプロットを放射標識ネオ特異性プローブとハイブリダイズした。レーン１の 単一バンドは、ウィルス産生クローンは組み込まれたベクタープロウィルスの単 一のコピーを有していることを示している（なぜならば各プロウィルス組込み体 が独特で異なるサイズのＢａｍＨＩフラグメントを有するからである）。Ｅｃｏ ＲＩ消化の後に、Ｌ、　ＩＬ−ＩＲＳＮＷ　２ｔ６ウイルス産生クローン（レー ン２）およびｐＬ、　ＩＬ−ＩＲＳＮプラスミド（レーン３）から切り出した同 様のサイズのバンドは、Ｌ、ＩＬ−ＩＲＳＮプロウィルスはウィルス産生クロー ン中に非転位形態で組み込まれたことを示している。

図３は、ＬＸＳＮウィルスまたはＩＬ−ＩＲ発現ウィルスを感染させた細胞のオ ートラジオグラムおよび染色コロニーの比較を示す。レトロウィルスベクターＬ 、　ＩＬ−ＩＲＳＮを感染させたコロニー（ネズミ■型ＩＬ−ＩＲを発現）およ びコントロールベク９−ＬＸＳＮを感染させたコロニー（ＩＬ−ＩＲを発現しな い）をメチレンブルーで染色し、全ての生息する細胞コロニーを可視化した。

染色したコロニーにより、ＬＸＳＮプレートおよびり、　ＩＬ（ＲＳＮプレート 上の細胞の数はおおむね等しいことが示される。オートラジオグラムは抗ＩＬ− ＩＲ’　２５１−Ｍ５抗体に結合させフィルムにさらしたコロニーを示す。フィ ルム上の暗い斑点は、抗ＩＬ−ＩＲ’２５１−Ｍ５抗体がＩＬ−ＩＨに結合する ことを示している。Ｌ、　ＩＬ−ＩＲＳＮを感染させた後に誘導したコロニーの オートラジオグラムの上の暗い点は、抗ＩＬ−ＩＲ′２５１−Ｍ５抗体が細胞表 面上に発現されたＩＬ−ＩＨに結合していることを示している。一方、ＬＸＳＮ コントロールベクターのオートラジオグラム上に暗い点が全く無いことは、細胞 表面ＩＬ−ＩＲが無いことを示している。

図４は交叉結合試験の結果を示している。この試験ではり。

ＩＬ−ＩＲＳＮを感染すｆりＷＩ２６−ｖＡ４細胞（ネズミ■型ＩＬ−ＩＲを発 現する）をネズミ１２５１−ＩＬ−１に結合させ、次にこれをスペリン酸ジスク シンイミジル（ＤＳＳ）を用いてＩＬ−ＩＨに交叉結合させた。次に交叉結合物 質を、アフィゲルに結合させた抗ＩＬ−ＩＲモノクローナル抗体を用いて沈澱さ せ、次いで、５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィで分析した。レーン ２の９７ｋＤのバンドは■型ネズミＩＬ−ＩＲ／ＩＬ−１複合体と合致している 。約１８ｋＤのバンドは遊離の１２５１−ＩＬ−１を示している。陰性コントロ ールベクターＬＸＳＮを感染させた細胞の場合の結果を示すレーン１は交叉結合 物質を示さない。

図５は抗生物質０４１８中でのＩＬ−ＩＲレトロウィルス感染後のＣＴＬ細胞の 成長と、Ｇ４１８の存在下および非存在下の親細胞系の成長を比較したグラフで ある。ＣＤ１ｌ”ＣＴＬクローンＴ８１ヲＬ、ＬＩ−１１？ｓＮレトロウイルス を産生ずるり、　ＩＬ−ＩＲＳＮＩＦ　２ｔ６細胞から得た上澄みで感染させ、 ０４１８上で選択した。グラフから、Ｇ４１８が親細胞に対して毒性を示し、細 胞数を減少させたことが示される。０４１８中で選択されなかった細胞は安定し て数が増大した。

Ｌ、　ＩＬ−ＩＲＳＮを感染させた細胞は、初期に細胞数が減少し、その後選択 薬剤非存在下では親クローンと平行して成長した。

図６はフローサイトメトリーによる形質導入Ｔ８１ＣＴＬ上のＩＬ−ルセブター の細胞表面発現の分析を示す（フィコエリスリン−ＭＳモノクローナル抗体ココ ンジュゲート染色）。パネル（ａ）、（ｃ）および（ｅ）は、親Ｔ８１細胞を用 いた実験結果を示し、パネル（ｂ）、（ｄ）および（ｆ）はＩＬ−ルセブターを 形質導入したＴ８１細胞（Ｔａ２−ＩＬ−ＩＲ）を用いた実験結果を示している 。パネル（ａ）および（ｂ）は細胞のみであり、パネル（Ｃ）および（ｄ）は抗 ＩＬ−ＩＲ％ツクローナル抗体Ｍ５に結合したフィコエリスリン（ＰＥ−ＭＳ） で染色した細胞であり、パネル（ｅ）および（ｆ）は競合物質としてコンジュゲ ートしていないＭＳの５０倍過剰量の存在下でＰＥ−ＭＳで染色した細胞を示す 。パネル（ａ）と比較してパネル（Ｃ）では、蛍光シフトが無いことは、親Ｔ８ １細胞が検出可能な細胞表面ＩＬ−ルセブターを有さないことを示している。一 方パネル（ｄ）に蛍光のソフトが有ることは、表面ＩＬ−ルセプターがＴａ２− ＩＬ−ＩＲ細胞に存在することを示している。

図７および図８は、放射様ｍ１Ｌ−１（７）Ｔａ２−ＩＬ−ＩＲ細胞ヘノ結合を 示している。パネルＡは１２５Ｉ標識組み換え体ＩＬ−１αのＴａ２−ＩＬ−Ｉ Ｒ細胞への直接の結合を示している。パネルＢはスキャッチャード座標系に再プ ロットされたパネルＡに対応するデータを示している。この分析によれば、クロ ーンＴ８１−ＩＬ−ＩＲ上で１つの細胞当たり約１０００の高親和性！し一１受 容の存在が示されている。

図９は、ネズミＴ８１親細胞およびレトロウィルスベクターＬ、　ＩＬ−ＩＲＳ Ｎを感染させたその誘導体（細胞表面ＩＬ−ＩＲを発現する）の種々の刺激物質 の存在下での増殖能力をアッセイした結果を示している。親細胞および感染細胞 （ＩＬ−ＩＲを発現する）は両方とも腫瘍抗原（Ａｇ）およびＩＬ−２の組み合 わせに応答して増殖した。親細胞とは対照的に、Ｌ、　ＩＬ−ＩＲＳＮを感染し た細胞は、Ａｇおよび抗原提示細胞（ＡＰＣ）の組合わせ、またはＡｇおよびＩ Ｌ−１の組合わせに応答して増殖することが可能であった。このデータから、Ｉ Ｌ−ＩＲを形質導入したＣＴＬはルー１および抗原提示に応答して、Ｔｓ細胞ま たはそれが生産するサイトカインに非依存的に増殖する。

図１０はフローサイトメトリーによる、形質導入されたヒトＣＴＬ細胞上のＩＬ −ルセプターの細胞表面発現の結果を示している（フィコエリスリン−Ｍ５　モ ノクローナル抗体コンジュゲートＰＥ−ＭＳで染色した）。パネル（ａ）、（ｃ ）および（ｅ）は、親３Ｇ５細胞を用いた実験結果を示し、パネル（ｂ）、（ｄ ）および（ｆ）はＩＬ−ルセプターを形質導入した３Ｇ５細胞（３Ｇ５−１１． −ＩＲ）を用いた実験結果を示している。パネル（ａ）および（ｂ）は細胞のみ であり、パネル（Ｃ）および（ｄ）はＰＥ−ＭＳで染色した細胞であり、パネル （ｅ）および（ｆ）は競合物質としてコンジュゲートしていないＭＳの５０倍過 剰量の存在下でＰＥ−ＭＳで染色した細胞を示す。パネル（ａ）と比較してパネ ル（ｅ）では、蛍光シフトが無いことは、この細胞が細胞表面ＩＬ−ルセブター を発現していないことを示している。一方パネル（ｄ）に蛍光のシフトがあるこ とは、マウスＩＬ−ルセブターが３Ｇ５−ＩＬ−ＩＲ細胞上に存在することを示 している。

図１１はヒｌ−３Ｇ５親細胞および形質導入３Ｇ５−ＩＬ−ＩＲ細胞が種々の刺 激物質存在下での増殖する能力を示している。ＩＬ−ＩＲレトロウィルスに感染 した細胞は抗原提示細胞（Ａ２’ＬＣＬ）の存在下で増殖可能であった。親細胞 は同じ条件下で同等に増殖することができなかった。このデータによれば、ＩＬ −ＩＲを形質転換されたヒトＣＴＬ細胞は、ＴＨ細胞に非依存的に抗原提示に応 答して増殖する。

図１２および１３は、クロム放出アッセイにおけるクローン３Ｇ５および３Ｇ５ −ＩＬ−ＩＨの細胞溶解応答性を示す。標的細胞はオートロガス（・）およびＨ ＬＡ　Ａ２陽性同橿ＥＢＩ／−［、ＣＬ　（０）　テある。エフェクター細胞３ Ｇ５および３Ｇ５−ＩＬ−ＩＲを添加して種々のエフェクター二標的細胞の比を 得たくＸ軸上）。データによれば、ＩＬ−ＩＨの導入および発現の後に、アロ反 応性ＨＬＡ　Ａ２特異ＣＤ８＋Ｔ細胞クローン３Ｇ５は抗原特異的細胞溶解応答 性を維持していることが解る。

灸里９」１１瓦炎哩 区五 「細胞障害性１９７８球」またはｒＣＴＬＪとは、ＣＤ３細胞表面抗原決定基を 担持し、同族抗原を担持する標的細胞の溶解を媒介するようなＴ細胞である。Ｃ ＴＬはＣＤ８′″またはＣＤ４”の表現型の何れかである。ＣＴＬは一般的に抗 原特異的であり、そして、標的細胞上の主要組織適合性複合体（ＭＢＣ）と共存 してのみ抗原ペプチドを認職できるという点でＭＩＩＣ−制限性である。ＣＴＬ はＨＩＶ、　ＥＢＶ、　ＣＭＶおよび広範囲の腫瘍抗原を含む、種々のウィルス 、腫瘍またはアロ特異性抗原に対して特異的であり得る。しかしながらＣＴＬの 一部は、抗原特異的ではない。例えば、あるクローン化されたＣＴＬは、異常に 高濃度のＩＬ−２中で培養することによりその同族抗原に対する特異性を一部失 うように誘導され得る（　Ｂｒｏｏｋｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｒｅｖ、７２：４ ３．　１９８３）　ａ「組み換え体発現ベクター」とは、トランスフェクション 、形質導入またはレトロウィルス感染により標的細胞に導入されることができる 形態の、ＤＮＡまたはＲＮＡの複製可能な単位を指す。そしてこれは、プロモー ターまたはエンハンサ−のような遺伝子発現における調節作用を有する遺伝子エ レメント（単数または複数）の制御下でｍＲＮＡに転写されタンパク質に翻訳さ れる例えばサイトカンレセプターのような異種構造コード配列の発現をコードす る。このようなベクターは、好ましくは適切な転写および翻訳の開始配列および 終止配列も含んでいる。本発明の組み換え体発現ベクターは、例えば、すン酸カ ル／ウム沈澱、エレクトロポレーションまたはその他の物理的移入方法により、 菌体内で複製し直接線的細胞にトランスフェクトされるＤＮＡ構造物の形態を取 り得る。または、レトロウィルスベクターを生産する適当な「バフケージング」 細胞系によりパッケージされた感染性レトロウィルスの形態のＲＮＡ構造物の形 態を取り得る。直接のトランスフェクションのために用いるベクターは、細菌の 宿主細胞中でベクターの複製が可能なりＮＡ配列を含む。本発明で使用するのに 適切な種々の組み換え体発現ベクターは後に記載する。

本明細書の用語「組み換え体」とは、特定のＤＮＡ配列が、天然に存在する同種 配列とは異なる構造コード配列を有する構築体を与えるような、クローニング、 制限酵素処理および連結の工程の種々の組合せの生産物であるような場合を指す 。

一般的に、例えばサイトカインレセブタータンパク質のような構造フード配列を コードするＤＮＡ配列は、ｃＤＮＡフラグメントおよび短いオリゴヌクレオチド リンカーがら、または、一連のオリゴヌクレオチド類から組み立てることができ 、これにより組み換え体転写単位内で発現されることのできる合成遺伝子が得ら れる。このような配列は、好ましくは、内部未翻訳配列で中断されていない、オ ーブンリーディングフレーム、または真核生物遺伝子内に典型的に存在するイン トロンで中断されないオーブンリーディングフレームの形態で提供され得る。関 連する配列を含有するゲノムＤＮＡも使用できる。未翻訳ＤＮＡの配列はオーブ ンリーディングフレームから５°または３゛に存在し、この部位では、このよう な配列はコード領域の操作や発現を妨げない。

「Ｔ１．Ｉ非依存性Ｊ　ＣＴＬは、ＣＤ４”Ｔヘルパー　（ＴＨ）　１ｍｍ由来 （Ｄサイトカインまたはその等傷物の制限された量の存在下または非存在下で増 強された成長または増殖が可能であるか、または、目的のＣＴＬの由来源の親Ｃ ＴＬと比較して増強された成長または増殖が可能である。成長または増殖は例え ば何らかのインビトロ増殖または成長のアッセイにより、または、ｃＴＬのイン ビボでの常在能力を測定する何らがのアッセイにょ１１）測定され得る。適当な アッセイの特定の例は以下の実施例３および４に開示する。増強された成長また は生存能力を有するＣＴＬは、外来抗原を担持した標的細胞を破壊したり、また は長期の免疫学的メモリーを提供する高い能力を有し得る。

「サイトカインレセプター」とは、サイトカイン分子を結合し、サイトカイン分 子により提供されるシグナルを形質導入する際に役割を果たすことのできる細胞 表面タンパク質を指す。上記したように、ＴＨ非依存的にＣＴＬの成長または増 殖を増強することの可能なサイトカインレセブターは、例えば■型および［１型 のインターロイキン〜Ｉレセプターを包含する。その他の等価なレセプターには 、インターロイキン−６レセプター　（ＩＬ−６Ｒ）および膿瘍壊死因子レセプ ター（ＴＮＦ−Ｒ）が包含される。本発明のサイトカインレセプターは好ましく はＣＴＬに対し外因性のものである。

ＣＴＬは、ＣＴＬが腫瘍抗原またはウィルス抗原を担持する細胞を選択的に２ｍ して溶解することが可能な場合に、腫瘍抗原またはウィルス抗原を発現する細胞 に対して「細胞溶解特異的」である。ＣＴＬは、ＣＴＬが腫瘍抗原またはウィル ス抗原を担持する細胞を、このような細胞を選択的に認識する能力に関わらず溶 解することが可能な場合、腫瘍抗原またはウィルス抗原を発現する細胞に対し「 細胞溶解応答性」である。

ｌｉ五旦止立座 トランスフェクションや感染のように、哺乳類細胞に外因性遺伝子を導入するた めの多くの方法が開発されている。このような形質導入方法は性質として物理的 であるか、または、ＲＮＡに転写することができ、感染性ウィルス粒子にパ・２ ケージされ、標的細胞を感染させるために使用し、これにより所望の遺伝物質を 供給するようなりＮＡをコードする組み換え体レトロウィルスベクターの使用に 依存し得る。多くの異なる型の哺乳類遺伝子伝達ベクターおよび発現ベクターが 開発されている（ＭｉｌｌｅｒおよびＣａｌｏＳ編、−Ｇｅｎｅ　Ｔｒａｎｓｆ ｅｒ　Ｖｅｃｔｏｒｓ　ｆｏｒＭａｍｍａｌｉａｎ　Ｃｅ１ｌｓ　（哺乳類細胞 のための遺伝子伝達ベクター）Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｃｏｍｍ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏ ｌ、、　（Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅ ｖ　Ｙｏｒｋ、１９８７）参照）。むき出しのＤＮＡを、これらに限定はされな いが、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション（Ｂｅｒｍａｎら、Ｐｒ ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８４８１ニア１７５．　１９８４ ）　、ＤＥＡＥデキストラントランスフェクション、プロトプラスト融合（Ｄｅ ａｎｓら、Ｐｒｏｃ、’１ａｔ１．　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８４８１：１ ２９２、　１９８４）　、−Ｃレクトロボレー７：アン（Ｐｏｔ　ｔｅｒら、Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８４８１ニア１６１． １９８４）　、’Ｊホ７　エ’ｙ　シ＊　７（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ、Ｎ ａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｅｔ、ＬＩＳＡ　８４ニア４１３．　１９８７）、ポリブ レントランスフェクション（ＫａｗａｉおよヒＮ１５ｈｉｚａｖａ。

Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ　ｉ：１１７２．１９８４）および細胞膜のレ ーザーミクロン穿孔による直接遺伝子伝達（Ｔａｏら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、 　Ａｃａ虹」」エユ銃■８４：４１８０．１９８７）のような多（の方法の内の 一つを用いたトランスフェクションにより哺乳類細胞に物理的に導入できる。遺 伝子送達のための組み換え体感染ウィルス粒子を用いた種々の感染方法が開発さ れている。これは本発明の好ましい実施方法である。このようにして使用されて いるウィルスベクターは、シミアンウィルス４ｏ由来のウィルスベクター（５Ｖ ４０ＨＫａｒ１ｓｓｏｎら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　 ＵＳＡ−８４８２：１５ｇ、　１９８５）　、アゾ／ウィルス（Ｋａｒｌｓｓｏ ｎら、ＥＭＢＯＪ、ｓ：ｏ７７、１９８６）　、アゾ／関連ウィルス（ｆ、ａＦ ａｃｅら、■皿１６２：４８３．１９８８）およびレトロウィルス（Ｃｏｆｆｉ ｎ、　１９８５、　ｐｌ？−７１，ＷｅｉｓｓＲ（編）　、　ＲＮＡ４ｕ＋ｌｏ ｒ　Ｖｉｒｕｓｅｓ、第２版、第２巻％　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏ ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）を包含する。

従って、遺伝子伝達および発現方法は多数あるが、本質的には、哺乳類細胞に遺 伝物質を導入し、そこで発現させるための機能を有する。上記した方法のいくつ かは造血細胞またはリンパ様細胞の形質導入に使用されており、その例は、リン 酸カルシウムトランスフェクンヨン（Ｂｅｒｍａｎら、前記、１９８４）、プロ トプラスト融合ＣＤｅａｎｓら、前記、１９８４）　、工し／クトロポレー／ゴ ン（Ｃａｎｎら、匣匹■坦ｉ：１２３．　１９！ｌ１ｌ）および組み換え体アデ ノウィルスによる感染（Ｋａｒｌｓｓｏｎら、前記：Ｒｕｅｔｈｅｒら、Ｍｏ１ ．　Ｃｅ１１．　ＢｉｏｌＦＬ：１２３．１９８６）　、アデノ関連ウィルス（ ＬａＦａｃｅら、前記）およびレトロウィルスベクター（Ｏｖｅｒｅｌｌら、旺 並■…４：１４２５．１９８９）である。−次Ｔリンパ球は、エレクトロボレー ンヨン（Ｃａｎｎら、前記、１９８８）により、そして、レトロウィルス感染（ Ｎ　ｉｓｈ　ｊｈａｒａら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４゜８：４７３０．１９ ８８；　Ｋａｓｉｄら、前記、１９９０）により形質導入に成功レトロウィルス ベクターは真核細胞への遺伝子伝達のための極めて効果的な方法を提供し、−次 細胞への遺伝子の供給のための好ましい方法である。更にレトロウィルス組込み は制御された方法で行われ、これにより、新しい遺伝ｔｌｌ！報のコピーを細胞 当り１つないしは数個、安定して組込むことができる。

レトロウィルスはウィルスがコードするＲＮＡ向けＤＮＡポリメラーゼまたは逆 転写酵素を用いて、ウィルスＲＮＡゲノムを複製し、二本鎖ＤＮＡ中間体を与え るような種類のウィルスであり、この二本鎖ＤＮＡは鳥類または哺乳類の宿主細 胞の染色体ＤＮＡに組込まれる。はとんどのレトロウィルスベクターはネズミレ トロウィルス由来のものである。しかしながら本発明で使用するのに適している レトロウィルスは鳥類または哺乳類の細胞材料から誘導され得る。これらのレト ロウィルスは好ましくはアンフォトロビックである。これはヒトを含む数種の宿 主細胞を感染させることが可能であることを意味する。レトロウィルスゲノム（ および本明細書において使用する場合レトロウィルスベクター）の特徴はレトロ ウィルス長末端反復即ちＬＴＲであり、これは約６００塩基対の未翻訳領域であ り、レトロウィルスゲノムの５゛末端および３゛末端において僅かに変動のある 形態で認められる。プロウィルスとしてＤＮＡに組み込まれる場合、レトロウィ ルスＬＴＲは各末端に短いダイレクト繰り返しく５ｈｏｒｔ　ｄｅｒｅｃｔ　ｒ ｅｐｅａｔ）配列を含み、モしてＲＮＡポリメラーゼＩ＋による転写およびＲＮ Ａ転写産物の３゛切断およびポリアデニル化を開始するためのシグナルを含む。

ＬＴＲはウィルス複製に必要な他のすべてのシス作用配列を含む。

「プロウィルス」とは、適当な宿主細胞内で染色体ＤＮＡに安定して組込まれる ようなレトロウィルスのＤＮＡ逆転写物またはそのクローンコピー、またはレト ロウィルスＤＮＡの未組込み中間体のクローンコピーを指す。その後のプロウィ ルスの転写および感染ウィルスへの組立は、適切なヘルパーウィルスの存在下、 または汚染ヘルパーウィルスの生産を伴わない粗膜を可能にする適切な配列を含 む細胞系内で起こる。Ｍａｎｎら（Ｃｅｌｌ　３３：１５３．１９８３）は組み 換えレトロウィルスのヘルパー非含有保存株を生産するために用いることのでき る細胞系（例えばｔＦ２）の開発を記載している。これらの細胞系は粗膜のため にｉｎ　ｃｉｓで必要とされる配列を有さないが、完全なウィルス粒子を産生ず るために必要なすべての遺伝産物をｉｎ　ｔｒａｎｓで与える。組み込まれた突 然変異プロウィルスから転写されたＲＮＡはそれ自体パッケージできないが、こ れらの細胞は、同じ細胞に導入された組み換え体レトロウィルスから転写された ＲＮＡを粗膜することができる。得られるウィルス粒子は感染性であるが、複製 欠損性であり、従って粗膜を可能にする相補的遺伝情報を持たない細胞に導入さ れた後には、感染ウィルスを生産することのできない有用なベクターが得られる のである。外生の（ｅｃｏｔｒｏｐｉｃ）ウィルスエンベロープをコードするト ランス作用性エレメントを有する細胞系内（例えばＷ２）で粗膜することにより 、外生（制限された宿主範囲）の後代ウィルスを得ることができる。あるいは、 アンフォトロビソクのパッケージ遺伝子を含有する細胞系内での組立（例えばＰ Ａ３１７．　ＡＴＣＣＣＲＬ　９０７８；　ＭｉｌｌｅｒおよびＢｕｔｔｉｍｏ ｒｅ、　Ｍｏｌ。

Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　ｉ：２８９５．　１９８６）により、アンフォトロピ ソク（広範な種類の宿主）の後代ウィルスを得ることができる。このようなパッ ケージ細胞系を用いることにより、必要なレトロウィルスのｇａｇ、　ｐｏｌお よびｅｎＶタンパク質をｉｎ　ｔｒａｎｓで得ることができる。この方法により 、哺乳類細胞に対しては高い感染性を有するが、標的細胞のゲノムに組み込まれ た後にはそれ以上複製することが不可能なレトロウィルス粒子を生産できる。ｍ 遺伝子の産物は標的細胞上のウィルスレセプターへのレトロウィルスの結合に必 要であり、従って、レトロウィルスの宿主範囲を決定する。ＰＡ３１７細胞はア ンホトロビックエンベローブタンパク質を有するレトロウィルス粒子を生産し、 このタンパク質はヒトまたはその他の細胞に形質導入できる。その他のパッケー ジ細胞系は、マウスおよびう１トの細胞のみを形質導入できる外生のエンベロー プタンパク質を有する粒子を生産できる。

多くのレトロウィルスベクター構築物は多くの外来性遺伝子を発現するために用 いられ成功している（Ｃｏｆｆｉｎ、　Ｗｅｉｓｓら、（ｇ）　、ＲＮＡ　Ｔｕ ｍｏｒ　Ｖｉｒｕｓｅｓ　（ＲＮＡ腫瘍ウィルス）、第２版、第２巻、Ｃｏ１ｄ 　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、 　１９８５．　ｐ９、１７−７１．）。挿入配列を有するレトロウィルスベクタ ーは一般的に機能性であり、レトロウィルス感染に対して一貫して抑制的である ような配列は殆ど同定されていない。機能的ポリアデニル化モチーフは、レトロ ウィルスＲＮＡ合成をブロックすることによりレトロウィルスの複製を抑制し、 レトロウィルス粒子にパッケージされ得る配列の大きさには約１１ｋｂの上限が ある（Ｃｏｆｆｉｎ、前記、１９８５）。しかしながら、始めは問題とされてい た（　Ｃｏｆｆ　ｉｎ、前記、１９８５）複数の内部プロモーターの存在に対し ては、いくつかのレトロウィルス構築物では十分な耐性が得られることが解った （Ｏｖｅｒｅｌｌら、Ｍｏ１．　Ｃｅｌ１．　Ｂｉｏｌ、　ｊ４＋１８０３．１ ９８３）。

レトロウィルスベクターは、レトロウィルスベクターでインビトロ形質導入され 、レシピエンドマウスに移植されるネズミ造血幹細胞の発生を追跡するためにい くつかのグループにより遺伝的ダグとして使用されている（Ｗｉｌｌｉａｍｓら 、■匹ｒｅ　３１０＋４７６、　１９８４ＨＤｉｃｋら、二４２ニア１．　１９ ８５；　Ｋｅｌｌａｒら、Ｎａｔｕｒｅ　３１８：１４９．１９８５）。これら の研究によれば、感染した造血細胞は、レシピエンドの動物の造血組繊およびリ ンパ様組織を再生し、そしてその細胞は正常なインビボ発生能力を示した。標識 された細胞は、レトロウィルスベクター配列の存在を示すことができる多くの分 子生物学的方法の何れか、特にサザン分析およびＰＣＲ（ポリメラーゼチェーン リアクション）を用いて可視化され得る。レトロウィルスベクターを用いて、遺 伝子的に細胞を標識する能力はまた、この方法を用いてオートロガスの細胞の移 植片を追跡するような臨床例において有用である。この方法はまたＲｏｓｅｎｂ ｅｒｇらにより、末期ガン治療のためＴＩＬ　（腫瘍浸潤リンパ球）療法を受け ている患者においてＴＩＬを追跡するために用いられている（Ｌ」」出−Ｊ、　 Ｍｅｄ、　３２３：５７０．１９９０）　。これらの細胞へのマーカー遺伝子の 形質導入にはインビトロの細胞機能不全を伴わない（Ｋａｓｔｄら、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８７：４７３．　１９９０’）。

多くの遺伝子産物がレトロウィルスベクター内で発現されている。これはレトロ ウィルスＬＴＲ内に組み込まれたプロモーターの転写制御下に、発現させるべき 配列を置くか、またはＬＴＲ間に挿入された異種プロモーターの制御下にこれら を置くかして、達成することができる。後者の方法によれば、ベクター内に優勢 選択可能マーカー遺伝子を同時発現する方法が得られ、これにより、特定のベク ター配列を発現する細胞を選択することができる。本発明のレトロウィルスベク ターは好ましくは、感染細胞に対する優勢選択可能マーカー、例えばネオ（ｎｅ ｏ＞およびａｐｈ　（Ｇ４１ｇ耐性を与える）　（ＳｏｕｔｈｅｒｎおよびＢｅ ｒｇ、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ａ　１．　Ｇｅｎｅｔ　、ｊ：３２７．　１９８２） 　、ｈｐｈ　（／＼イグ０フィシン耐性）　（Ｓｕｇｄｅｎら、Ｍｏ１．　Ｃｅ １１．　Ｂｉｏｌ、　５：４１０．１９８５）またはｇｐｔ（マイコフェノール 酸耐性）のような抗生物質耐性表現型を含む。あるいは、ベクターは特殊化され た宿主菌株における代謝不全、例えばｔｋ−細胞におけるチミジンキナーゼ活性 またはヒポキサンチンホスホリシル転移酵素（ＨＰＲＴ）−細胞におけるＨＰ　 ＲＴ活性を補う遺伝子産物を含有する。このような選択可能なマーカーは多種の ものが入手できる。

本発明で使用するのに適するレトロウィルスは多くの鳥類または哺乳類の宿主か ら誘導され得る。しかしながら、使用の条件として、レトロウィルスベクターを 用いて形質導入すべき新しい遺伝物質のレシピエンドとなるべき細胞を感染させ る能力をウィルスが有することが必要である。本発明で使用するのに適するベク ターを誘導するために用い得るレトロウィルスの例は、トリレトロウィルス、例 えばトリ赤芽球ウィルス（ＡＥｖ）、トリ白血病ウィルス（ＡＬＶ）、トリ骨髄 芽球症ウィルス（ＡＭＶ）、トリ肉層ウィルス（ＡＳＶ）　、Ｆｕｊｉｎａｍｉ 肉腫ウィルス（ＦｕＳＶ）　、牌壊死ウィルス（ＳＮＶ）　、およびＲｏｕｓ肉 腫ウィルス（ＲＳＶ）　；ウシ白血病ウィルス（ＢＬ’／）　；ネコレトロウィ ルス、例えばネコ白血病ウィルス（ＦｅＬＶ）またはネコ肉腫ウィルス（ＦｅＳ Ｖ）　；ネコレトロウィルス、例えばネコ白血病ウィルス（ＭｕＬＶ）　；マウ ス乳腫瘍ウィルス（ＭＭＴＶ）およびネズミ肉腫ウィルス（ＭＳＶ）　；および 霊長類レトロウィルス、例えばヒトＴ細胞リンパ栄養性ウィルス１および２　（ ＨＴＬＶ−１および−２）およびサル肉腫ウィルス（５Ｓｖ）である。その他の 多くの適当なレトロウィルスは当業者に知られている。

レトロウィルスの分類はＴｅ１ｃｈらが行っている（Ｗｅｉｓｓら（編）、ＲＮ Ａ　Ｔｕｍｏｒ　Ｖｉｒｕｓｅｓ（ＲＮＡ腫瘍ウィルス）、第２版、第２巻、Ｃ ｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏ ｒｋ、１９８５．　ｐｐ、ｌ−１６０）。本発明で使用するのに適する好ましい レトロウィルスは、Ｍｏ１ｏｎｅｙ不ズミ白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）　、　 Ｍｏ１ｏｎｅｙ不ズミ肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）　、Ｈａｒｖｅｙネズミ肉腫 ネズルス（ＨａＭＳＶ）およびＫｉｒｓｔｅｎ不ズミ肉腫ウネズス（Ｋ　ｉＳ’ ／）として知られている種々のネコレトロウィルスである。

特に好ましいレトロウィルスはＭｉｌｌｅｒおよびＲｏｓｍａｎがＢｉｏｔｅｃ ｈｎｉｑｕｅｓ　７：９８０，１９８９に記載したレトロウィルスベクターｐＬ ＸＳＮである。このレトロウィルスベクターはレトロウィルスＬＴＨの転写制御 下に異種ＤＮＡを発現し、ＳＶ４０初期領域プロモーターの制御下にネオ遺伝子 を発現することができる。有用な複製欠損レトロウィルスベクターの構築は当業 者の知るとおりである。得られた組み換え体レトロウィルスは、感染宿主細胞の 染色体ＤＮＡへの組み込みが可能であるが、組み込まれた後は、導入先の細胞が 機能的に活性なトランス作用ウィルスタンパク質をフードする別のプロウィルス インサートを有さない限り、複製して感染ウィルスをもたらすことはできない。

ｌ旦玉久里 本発明で使用されるレトロウィルスベクターは、適切な開始シグナル、エンハン サ−およびプロモーターを有する転写制御配列を含有しており、これらは、作動 可能に結合している下流の構造配列の転写を誘導または制御する。このようなエ ンハンサ−およびまたはプロモーターは哺乳類ゲノムを含むウィルスまたは細胞 から誘導でき、好ましくは構成的である。多くの種類のプロモーターがレトロウ ィルスベクター内で遺伝子を発現するために用いられている。ヒト第１ｘ因子ｃ ＤＮＡを発現するベクターのパネルの比較において、Ｐａｌｍｅｒら（Ｂｌｏｏ ｄ　７３：４３８．１９８９）は、ｃＤＮＡがＬ／　ｌ−０ウイ／Ｉ／スＬＴＲ （’）制御下で発現されるか、または内部ヒトサイトメガロウィルス極初期（Ｈ ＣＭＶ−ＩＥ）プロモーターであるかどうかに関わらず、感染宿主細胞内で同レ ベルの因子ＩＸの発現があることを発見している。そして内部ＳＶ４０初期領域 プロモーターは何倍か低い発現レベルをもたらすことが発見されている。同様の 研究において、Ｈｏｃｋら（Ｂｌｏｏｄ　７４：８７６、１９８９）は、感染造 血細胞系内で、種々のエンハンサ−およびプロモーターの制御下でＡＤＡ遺伝子 を発現した。これらにはリンパ栄養性パボバウイルスエンハンサーおよびベータ グロビンプロモーターが含まれる。

そして感染細胞内のＡＤＡ発現には、最高２０倍の差があることを観察している 。

形質導入された細胞内で発現されるためには、上記遺“伝子伝達方法のいずれか で導入されたＤＮＡ配列は、通常ＲＮＡポリメラーゼＩｔプロモーターの制御下 で発現される。レトロウィルスベクター内で使用され得る転写制御配列には、ヒ ストンＨ４プロモーター（Ｇｕｉｌｄら、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６２：３７９５ ．　１９８ｇ）　、マウスメタロチオ不インプロモーターＣＭｅ　ｌ　ｖｏｒら 、Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、　７：８３８．　１９８７）、ラット成長ホルモンプロモーター（Ｍ ｉｌｌｅｒら、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　５：４３１．１９８５）、 ヒトアデノシンデアミナーゼプロモーター（ｔｆａｎ　ｔｚａｐｏｕｌｏｓら、 Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８６：３５１９．　１９８９　）　、）ＩＳＶ ｔｋＳＶｔ−ター（Ｔａｂｉｎら、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、２：４２ ６．　１９８２）　、アルファー１抗トリプンンエンハンサ−（Ｐｅｎｇら、Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８５：８１４６．１９１ １８）および免疫グロブリンエンハンサー／プロモーター（Ｂｌａｎｋｅｎｓｔ ｅｊｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、１６：１０９３９゜１９８８） 　、ＳＶ４０初期または後期プロモーター、アデノウィルス２主要後期プロモー ター、またはポリオーマウィルス、ウシ乳頭腫ウィルスまたは他のレトロウィル スまたはアデノウィルス由来のウィルスプロモーターが包含される。完全なアゾ ／ウィルス２ゲノムはＢＲＬから入手可能である（＃５２７０５Ａ）。

同様に、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓのような販売会社を含め、Ｓ Ｖ４０　ＤＮＡの入手光は多数ある。よく知られた制限酵素処理および連結手法 を用いることにより、適切な転写制御配列を種々のＤＮＡ源から単離し、本発明 のレトロウィルス構築物を用いて、発現すべき完全な構造遺伝子を調節可能な関 係において組込むことができる。即ち、感染細胞内の挿入遺伝子の発現を目的と して、多くの転写制御配列をレトロウィルスベクター内で用い得る。

リンフ才力インレセプター インターロイ牛ン−１にはαとβという２種類の形態があり、これらは生物学的 に活性な形態で１７．５ｋＤの同じサイズを有する。２種類の型のＩＬ−ルセプ ター、すなわちＩ型およびＩＩ型が同定されている。Ｉ型のＩ　Ｌ−Ｉ　Ｒは充 分に特性化されており（Ｄ。

ｖｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ　３２４：２６６、　１９８６；　Ｄｏｗｅｒら、Ｊ、 Ｅｘ　、Ｍｅｄ、１６２：５０１．　１９８５）　、Ｉ型のＩＬ−ＩＲをフード するｃＤＮＡは分子クローニングされている（Ｓｉｍら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４ ユニ５８５．１９８８；　５ｉＩｌｓら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、 　Ｓｃｉ、　ｔｌｓＡ　８６：８９４６．１９８９）　、　ＩＩ型のＩＬ−ＩＲ は最近同定され特性化されており（Ｂｅｎｊａｍｉｎら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ劫ａｍ 、２６５：９９４３．　１９９０；　Ｂｏｍｓｚｔｙｋら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ 、Ａｃ１ｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８６：８０３４．　１９８９）　、そしてＩ！ 型のＩＬ−ＩＲをコードするＣＤＮＡは分子クローニングされている（　ＭｃＭ ａｈｏｎら、ＥＭＢＯＪ、　１０：　、　１９９１：　ＰＣＴ／ＵＳ９１１０３ ４９８．１９９１　）。１型またはＩＩ型のＩＬ−ＩＨの何れも本発明に関して 使用できるが、ｌ型のＩＬ−ＩＲが好ましい。

Ｔ細胞上に認められるレセプター（Ｉ型）はＩＬ−１に対して特異的であり、レ セプターへの結合性について放射標識したＩＬ−１と競合する能力を試験した、 多くの種類の他の成長因子の何れとも結合しない。ＩＬ−ＩＲは広範に示されて おり、多くの細胞型上に、一般的に少ない数／ｍ体（スカ／チャード分析で測定 した場合数千未満；　Ｄｏｗｅｒら、前記、１９８５）で存在しているが、ＣＴ Ｌ上には存在しない。ＩＬ−１のレセプターとの結合は一般的には細胞増殖応答 を直接引き起こすことはないが、トランスフェクトされたレセプターで認められ たように、むしろ標的細胞によるその他のサイトカインの産生を誘発する（下記 Ｃｕｒｔｉｓら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８ ６：３０４５．１９８９参照）。

Ｔ細胞に認められるＩ型ＩＬ−ＩＲの特性化は、マウスＥＬ４Ｔ細胞系統由来の レセプターをコードするｃＤＮＡのクローニングで最終段階になる（Ｓｉｎｓら 、５ｃｉｅｎｃｅ　２４１：５８５．１９８８）。その後のヒトＴ細胞由来のＩ Ｌ−ＩＲをコードするｃＤＮＡのクローニング（Ｓｉｍｓら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａ ｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ　８６：８９４６．　１９１ｆ９）によれ ば、これはネズミタンパク質と構造的に類似していることがわかつた。ヒトＩＬ −ルセブターは単一のｍＲＮＡ種によりコードされ、典型的な疎水性のリーダー 配列、３１９アミノ酸よりなる細胞外部分、単一の内部疎水性膜架橋ドメインお よび２１３アミノ酸の細胞間ドメインを有する。リーダー配列を取り除くと成熟 細胞表面レセプターが得られ、これは見かけのＭ、は〜８０ｋＤであり、そのう ち約１５ｋＤは添加された炭水化物部分よりなる。細胞外では、レセプターは３ 種類の免疫グロブリン様のドメインよりなり、免疫グロブリンのスーパーファミ リーの一員である。細胞質配列はデータベース内の他のタンパク質のいずれとも 存意な相同性を有さず、例えばチロシンキナーゼ内に認められるモチーフとも相 同性が無い。クローニングされたレセプターはトランスフェクトされたチャイニ ーズノ＼ムスター線維芽細胞内の［Ｌ−１シグナルを生物学的に伝達することが でき、トランスフェクトされた細胞によるプロスタグランジンＥ２およびＧ−Ｃ ３ＦのＩＬ−１依存性刺激をもたらす（Ｃｕｒｔｉｓら、旦ｔｏｅ、　Ｎａｔｌ 、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８６：３０４５．　１９８９）　６インター ロイキンー６はＩＬ−１およびＴＮＦと多くの生物学的性質を共有している（Ｄ ｉｎａｒｅｌｌｏ、　Ａｄｖ、１ｍｍｕｎｏ１．４４：ｌＳ３．１９８９）。

ＩＬ−６およびその相当するレセプターもまた、Ｔ細胞を含む種々の組織の成長 と分化を調節し、ＴＨ依存性ＣＴＬをＴＨ非依存性に変換する際にＩＬ−ルセブ ターと同じ様式で機能する。ＩＬ−１と同様、ＩＬ−６はミトゲン刺激Ｔ細胞お よび胸腺細胞内のＩＬ−２産生を誘発することが示されている（　Ｇｅｒｍａｎ ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　ＡｃａｄＳｅｔ、（ＵＳＡ）　８４ニア６２９． 　１９８７）。ヒトＩＬ−６−レセプターをフードする相捕的ＤＮＡが単離され ている（　Ｙａｍａｓａｋｉら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４１：８２５．１９８８） 。

腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）および相当するレセプターもまた、炎症および免疫応答 において広範囲の生物学的活性を有しており、そして、主として他のサイトカイ ンの産生を刺激することにより機能する。ＴＮＦの生物学的活性はそれぞれｐ５ ５およびｐ７５と称される５５ｋＤａおよび７５ｋＤａの分子量を有する２つの 異なる細胞表面レセプターにより媒介される。ＴＮＦレセプターのｐ５５および ｐ７５の形態は両方とも分子クローニングされており、発現されている（　Ｓｍ ｉ　ｔｈら、５ｃｉｅｎｃｅ　Ｗａｓｈ、Ｄ、Ｃ，２４８：１０１９゜１９９０ 　；Ｌｏｅｔｓｈｅｒら、Ｃｅ１ｌ　６１：３５１．　１９９０：　５ｃｈａｌ Ｌら、Ｃｅｌユ■・３６１．１９９０）。

１五灸及血広 養子免疫療法は単離および患者由来の免疫学的に活性な細胞ツインビトロでのク ローニングおよび増殖を含む治療方法である。増殖された治療上活性な細胞は、 治療効果を得るために、徹者に再度導入される。本発明によれば、ＣＴＬを例え ばＩＬ−ＩＲのようなサイトカインレセプターをコードする組み換え体発現ベク ターで形質導入し、ＴＨ細胞とは独立にトランスフェクトされたＣＴＬを成長さ せることが可能である。このようなＣＴ１．は、免疫応答を得るためにＣＴＬの 成長またはインビボ機能が必要であるような場合、特に、ＴＨ依存性の成長また はインビボ機能が、例えば旧■感染の結果として、ＴＨの介助が完全または部分 的に損なわれることにより弱められているような場合に、養子免疫療法において 有用であることが予測される。

Ｔ、依存性ＣＴＬをＴＨ非依存性に変換することにより、ＣＴＬはＴＨの介助と は独立して機能し得る。ＣＴＬは抗原非特異性であってよいが、好ましくは抗原 特異性である。本発明の特に好ましい実施態様においては、外来抗原の存在によ って一部特徴付けられる疾患について、ヒトを治療する。この方法に従って、異 なる抗原に対して特異性を有するＣＴＬを被験体から単離する。

適切な抗原特異的ＣＴＬはウィルス抗原または腫瘍抗原に対する特異性を有し得 る。ＩＬ−ルセブターをフードする組み換え体発現ベクターをＣＴＬに導入し、 これによりＣＴＬをＴ。非存在性表現型に変換し、Ｔ細胞の介助に依存しないＣ ＴＬの成長またはインビボ機能を可能にする。次に、得られたＴ８非依存性抗原 特異的ＣＴＬを、ＣＴＬが特異性を有するような抗原の存在を特徴とする疾患を 有するヒトに導入する。

ヒトがかかるウィルス感染症の多くは宿主の免疫応答により急速に制御される。

特にＭＨＣ−制限ウィルス特異性ＣＤ８”ＣＴＬおよびＣＤ４″″ヘルパー（Ｔ ）Ｉ）　Ｔ細胞の応答の発生は急性ウィルス感染症の解決策と関連する（　Ａｄ ａおよびＪｏｎｅｓ、　Ｃｕｒｒ、　Ｔｏ　、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｉｍｍｕ ｎｏｌ、１２８°１．　１９８６ＨＨｏｗｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ　２７７：６７ ．１９７９）。ＨＩＶのように潜伏期または存続期を有するＣＭＶまたはＥＢＶ のようなヒトウィルスに対しては、潜伏性を維持し、再活性後のウィルスの蔓延 を制限するためにはクラスＩ　ＭＨＣ制限ＣＤ８”Ｔ０メモリ一応答が必要であ る。（Ｈｏｗｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ　２７７：６７、　１９７９ＨＲｏｏｋら、 Ｔｒａｎｓ　Ｉａｎｔａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎ　ｓ　１６：１４６６． １９８４）。同様に、Ｉ（ＩＶ惑染個体においては、ＣＤ８”７９２８球は、感 染細胞の直接的な溶解およびウィルス複製の抑制により、１１１Ｖ複製の制御に 寄与する（Ｗａｌｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ　３２８：３４５．１９８７ＨＷａｌ ｋｅｒら、５ｃｉｅｎｃｅ　２３４：１５６３．１９８６）　ｏ　ＣＤ８”ＭＨ Ｃ制限旧Ｖ特異的Ｔ０応答は、末梢血液リンパ球の分析で示されているように健 康な旧Ｖ血清陽性個体において認められるが、このような応答はＡＩＤＳ患者で は減退しているか全く無い（Ｐａｌｔａｌｅｏら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１４ ４：１６９６．１９９０）。このようにＣＤ８”ＨＩＶ特異的Ｔ。応答性の減退 は、ＨｌｖのＣＤ４”ＴＨ細胞向性が原因であると考えられる。その理由は、機 能的インビボＣＤ８”Ｔ、応答はＣＤ４°Ｔ、によりもたらされるサイトカイン 放出（例えば！Ｌ−２およびＩＬ−４）を介した十分なヘルパー機能の存在に依 存しているからである。従って、！Ｉ［Ｖ感染の結果として徐々にＣＤ４”ＴＨ 種機能失うことにより、宿主は、感染を制御するために十分な旧Ｖ特異的ＣＤ８ ”Ｔ、を発生させ維持することができなくなるのである。

ウィルス感染のネズミモデルで行った実験によれば、養子免疫学的に伝達された 同系の免疫Ｔ細胞はウィルス性疾患を予防したり治療することができることを示 しており、ヒトウィルス感染症におけるＴ細胞療法の利用の可能性を例示してい る。

２子免疫療法の抗ウィルス作用は、インフルエンザ、リン／　＜球脈絡髄膜炎ウ ィルス（ＬＣＭＶ）　、呼吸性シンシチウムウイノ！・ス（ＲＳＶ）　、および 不ス゛ミサイトメガロウイルス（ＭＣＭＶ）感染不ス゛ミモデルにおいて示され ている（　１ｕｋａｃｈｅｒら、ム」■工Ｍｅｄ、１６０：８１４．　１９８４ ；　Ｌａｒｓｅｎら、ムーヱ江」旦肛５０：５６．　１９８４；　Ｂｙｒｎｅお よび０１ｄｓｔｏｎｅ、　Ｊ、　Ｖｉｒ立ｌ■５１：６８２．１９８４＋　Ｃａ ｎｎａｎら、釦１組配旦江６２：１３３．　１９８７；　Ｒｅｄｄｅｈａｓｅら 、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　５ｑ１２６４、１９８５）。ＣＤ８”Ｔ、またはＣＤ４“ ＴＨｏ）サブセットの治療効果への寄与を調べる研究は、ＭＣＭＶモデルで最も 厳密に評価されている。これらの研究は、養子Ｔ細胞伝達の保護的なおよび治療 的な抗ウィルス作用は、ＭＣＭＶ特異的ＣＤ８”Ｔ。サブセ・、ｌ−単独で媒介 し得ることを示している（　Ｒｅｄｄｅｈａｓｅら、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　Ｓ５ ：２６４．　１９８５；　Ｒｅｄｄｅｈａｓｅら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６１＋３１ ０２．１９８７）　ｃ、　ＭＣＭＶ免疫ＣＤ４”ＴＨ細胞単独の養子伝達は、評 価された細胞の用量においては、測定可能な直接の抗つィルス作用は有さな力） つた。しかしながら、ＣＤ４’Ｔ、子細胞はＩＬ−２，ＩＬ−４，ＩＬ−５，Ｇ Ｍ−ＣＳＦおよびγインターフェロンを含むリンフ才力イン類を生産し、そして γインターフェロンの抗つィルス作用を介して、またはウィルス特異的ＣＤ８０ Ｔ０に対するＩＬ−２およびＩＬ−４の成長促進作用を介して、治療効果に寄与 する（Ｓｍｉｔｈ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｒυ−１９８７）。従って、リンフ才 力イン産生ＣＤ４″″ＴＨの同時伝達は伝達されたＣＤ８”細胞のインビボでの 増殖および生存可能性を促進することにより、ＣＤ８″″Ｔｏの効力を増強する ことができる。

あるいは、ＭＣＭＶモデルにおいて示されるように、ＣＤ８”Ｔｃサブセットの 効力は同時にＩＬ−２を全身投与することにより改善でき、低用量のＣＤ８“細 胞の伝達後に同等の抗ウィルス作用を達成することができる（　Ｒｅｄｄｅｈａ ｓｅら、Ｊ、　ＥＸ　、　Ｍｅｄ、　１６５：６５０゜１９８７）。同様の研究 により、インフルエンザウィルス性および呼吸性シンシチウムウイルス性肺炎の 治療のための、ウィルス特異的ＣＤ１ｌ”Ｔｏの使用が行われている。ＣＤ８” インフルエンザ特異的Ｔ。クローンを投与された慢性インフルエンザウィルス肺 炎を有するマウスにおける研究によれば、副作用はなく、肺の組織学的異常は急 速に改善され、これは細胞伝達後速くも６日で明らかとなり、病理学的には１０ 日までに肺の完全な正常化を示していた（　ＭａｃＫｅｎｚｉｅら、組肚匣圏肛 ６７：３７５．１９８９）。同様に、低用量のＣＤ８”ＲＳＶ−特異的Ｔ。を用 いたＲＳ”／肺実質炎を有するマウスの治療により、肺におけるウィルス力価が 減少し、肺機能を悪化させることなく感染症が解消された（Ｃａｎｎｏｎら、Ｊ 、Ｅｘ　、Ｍｅｄ、１６８：１１６３．　１９８８）。

ＦＢＬに対して特異的な伝達Ｔ細胞の存続性を分析するために、ネズミレトロウ ィルス誘導腫瘍、すなわち、ドナーＴ細胞が宿主のｒｈｙ−を抗原に対して類遺 伝子性であるようなモデルを用いたところ、ドナー腫瘍応答性子細胞は腫瘍根絶 に必要とされた時間の後も、長時間存続し、宿主におけるメモリーＴ細胞として 作用し得た（　Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４０：４４２ ８．１９８０）。

免疫Ｔ細胞が膿瘍を排除する機構を検討したところ、非細胞障害性ＣＤ４”ＴＨ 細胞は炎症遅延型高感受性応答を誘導することにより養子免疫療法において治療 性の抗腫瘍作用を媒介し、一方、Ｔ、４の枯渇した精製された免疫ＣＤ８”Ｔ、 は、証明可能であるが制限された抗腫瘍作用を示したＣ　Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら 、ム」工二」ｅｄ、１５４：９５２．　１９８１：Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら、Ｊ、 ＥＸ　、Ｍｅｄ、１６１：１１２２゜１９８５：　Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ、　Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３６：１９１７．　１９８６）。しかしながら、Ｔｃの効力 は、Ｔ、４の同時伝達または組み換え体ＩＬ−２のインビボ投与のいずれかによ り明らかに増強され得、これらはＴｏのインビボでの生存および増殖を支持する のに必要である（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３６：１９ １７．１９８６）。

最近の研究では、治療におけるヘルパー非依存性ＣＤ８°Ｔｃクローン（ＨＩＴ ｏ）の効力が調べられている。これらのＣＤ８”Ｔｃクローンは抗原活性化後に ＩＬ−２を産生じ、抗原を用いた刺激の反復により生成し得、そしてＩＬ−２ま たは抗原刺激の非存在下で長期間存続できる（Ｍａ　ｔ　ｉ　ｓら、Ｊ、　Ｉｍ ｍｕｎｏｌ、　１３６：３４９０．１９８６；Ｋｌａｒｎｅｔら、Ｊ、Ｉｍｍｕ ｎｏｌ、　１３８：４０１２．１９８７）。ＨＩＴ、単独の養子免疫伝達により 、散在性のＦＢＬは根絶され、長期にわたるインビボでの免疫学的メモリーを有 する宿主を提供する（Ｋｌａｒｎｅｔら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３８：４０１ ２．　１９８７）。従って、このネズミレトロウイルス腫瘍モデルにおける研究 は、インビトロで増殖された抗原特異的Ｔ細胞を養子免疫療法のために使用する ことにより治療効果を媒介し存続性免疫をもたらす可能性を示唆している。更に ＣＤ８　”Ｔ。（ＨＩＴ０）クローンを生産するＩＬ−２を用いた研究は、ＣＤ ８”クラスｌ　ＭＨＣ制限細胞溶解エフェクター細胞のみで効果的な治療法と長 期間持続する免疫が提供される可能性を示している。

ＡＩＤＳ治療は現時点では単に症状軽減を行うものであり、大部分は旧Ｖの複製 を妨害するためにＡＺＴのようなヌクレオシドアナログの使用に関するものであ る。養子免疫療法はＡＩＤＳ治療において新しいウィルス特異的な形態を提供す る可能性を与える。養子免疫治療法の１つの方法は、オートロガス抗原特異的Ｃ Ｄ１ｌ”ＣＴＬをインビトロで増殖させ、その後これらを宿主に戻すことにより 宿主の旧Ｖ特異的ＣＴＬ活性を増強することである。ＣＤ８”すなわちＨＩＶ− 特異的ＣＴＬは健康な旧Ｖ血清陽性患者で検出され、これらの細胞はインビボで 旧ソー抗原発現標的細胞を殺すために用い得ることは十分に認められている（Ｃ ｈｅｎｃｉｎｅｒら、１９８９）。さらに旧Ｖ特異的ＣＴＬは、培養のヒトリン パ球■Ｌ」恒り長ユ・１４２１．　１９８９）、モしてＣＴＬがインビボでＡＩ ＤＳの発症を遅延させるという状況的証拠がある（Ｈｏｆｆｅｎｂａｃｈら、■ 、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１４２：４５２．１９８９＞。上記したマウスのモデルか ら得たデータと組み合わせると、これらの所見は）ＩＩ’／感染個体のＣＤ８” ＣＴＬ機能は抗ウィルス作用を有さなければならないことを主張するものである 。

ＨＩＶ感染の効果的な養子免疫療法には宿主に存在する少数の旧■特異的エフェ クターＴ細胞を同定し、そして次に治療効果を媒介するのに十分な数までインビ トロで増殖させることが必要である。ネズミＦＢＬモデルによる研究では、養子 免疫療法における培養Ｔ細胞とＴ細胞クローンの効果が調べられている。

抗原を用いてインビトロの特異的活性化を行い、次に、抗原、単核支持細胞およ び＋Ｌ−２を用いて再刺激の反復を行うことにより、免疫Ｔ細胞を多数まで増殖 させる方法が開発されている（Ｃｈｅｅｖｅｒら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１２６ ：１３１８．　１９８１ＨＣｈｅｅｖｅｒら、止一旦■工ＪμＬ１５５：９６８ ．１９ｇ２；　Ｃｈｅｅｖｅｒら、Ｌ−■ニー茎蚤１６３　：１１００、１９８ ６）。上記条件下で長期間培養されたＴ細胞は増殖後にインビトロの特異性を維 持しており、散在性腫瘍の養子免疫療法における特定の用量依存性の作用を媒介 する（Ｃｈｅｅｖｅｒら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１２６＋１３１８．　１９８１ ：　Ｃｈｅｅｖｅｒら、Ｌ−阻り、±蚤＝　１５５：９６８．　１９８２；　Ｃ ｈｅｅｖｅｒら、Ｊ、ＥＸ　、Ｍｅｄ、１６３：１１００．　１９８６）。さら に急速なインビトロ増殖を促進するＩＬ−２は、細胞伝達後に宿主に投与された 場合、培養Ｔ細胞の治療効果を増強する（Ｃｈｅｅｖｅｒら、ムーム２工上仰工 １５５：９６８．１９８２）。Ｔ細胞プラスＩＬ−２のこの組み合わせ方法によ れば、比較的少数のドナーＴ細胞の注入により散在性白血病の治療が可能になり 、これにより多数のエフェクター細胞をインビボで生成させる必要がなくなる。

さらに腫瘍担持マウスに投与された長期間培養Ｔ細胞は宿主のリンパ様器官に広 範に分布し、ＩＬ−２投与中止後も１００日間以上存続し、そして宿主に抗原特 異的免疫メモＩＪ−を与える（Ｃｈｅｅｖｅｒら、Ｊ、　ＥＸ　、　Ｍｅｄ、　 １５５：９６８．１９８２＞。

細胞免疫療法はウィルス感染症患者についてはまだ評価されていないが、免疫エ フェクターＴ細胞は進行した悪性の患者を治療するために用いられている。腫瘍 治療の主な目標はＭＨＣ制限旧Ｖ特異的Ｔ細胞に類似の腫瘍特異的ＭＨＣ制限Ｔ 細胞を伝達することであるが、これまで行われている臨床試験では細胞溶解エフ ェクター細胞の非Ｍｌ（Ｃ制限群が頻繁に使用されており、その理由は部分的に は、ＭＨＣ制限Ｔ細胞応答を効果的に誘導するヒト腫瘍抗原を同定することが困 難なためである。これらの相違にも関わらず、ガン患者における研究は、多数の 活性化細胞溶解エフェクター細胞の注入の安全性と毒性に関し、いくらかの洞察 を与える（Ｍａｚｕｍｄｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ　５３：８９６゜１９８４：　Ｒ ｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｎ、Ｅｎ　１．　Ｊ、Ｍｅｄ、３１３：１４８５．　１９ ８５＞。

ガン患者における細胞免疫治療法の研究では２種類のエフェクタ一群が評価され ている。高濃度のＩＬ−２の存在下ＰＢＭＣの短期間の培養により生成するリン フ才力イン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞は形質転換された標的細胞を溶解し、は とんどの正常組織に対しては最小限の溶解活性しか示さない（Ｇｒ　ｉｔｎ＋ら 、ム」狂−」μＬ１５５＋１８２３．　１９８２：　５ｏｎｄｅｌら、Ｊ、Ｉｍ ｍｕｎｏｌ、１３７：５０２、１９８６）。インビトロ生成ＬＡＫ細胞の養子免 疫伝達は多数のインビトロ活性化リンパ球の全身投与の安全性を示している。

ガン患者に１回の経静脈的注入で最高１０１１のＬＡＫ細胞を投与したところ、 全身毒性は重要でなく、肺脈管構造内の滞留による肺への悪影響は認められかっ た（ＭａｚｕＩＩ＋ｄｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ　５３：８９６、　１９８４：　Ｒ ｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｎ、Ｅｎ　１．　Ｊ、Ｍｅｄ、３１３：１４８５．　１９ ８５）。治療的な試みもまた短期間の高用量の全身的なＩＬ−２投与とＬＡＫ細 胞伝達を組み合わせてＬＡＫ機能と生存可能性を助長しており、明らかに増強さ れた効果が認められた（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｎ、Ｅｎ　１．　Ｊ、Ｍｅｄ、 ３１３：１４８５．　１９８５；　Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、し−随創工Ｊ、　Ｍ ｅｄ、　３１６：１３１０．１９８６）。

腫瘍浸潤から誘導されたインビトロ増殖リンパ球を用いた療法もまた開発されて いる。このような腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を用いることの根拠は、これらの リンパ球では腫瘍応答性Ｔ細胞が豊富になっており、このようなＴＩＬ細胞は、 ネズミ肉腫モデルにおいて、ＬＡＮ細胞よりも５０〜１００倍効果的に腫瘍の微 小転移を消滅させたことが示されていることである（Ｓｏｎｄｅｌら、Ｊ、Ｉｍ ｍｕｎｏｌ、　１３７：５０２．１９８６）。ヒトにおいては、ＴＩＬ細胞細胞 腫瘍標本を粉砕し、溶出したリンパ球を高濃度のＩＬ−２とともに培養すること により発生されている。ＴＩＬ系は培養３〜８週間にわたり１０８〜１０目にま で増殖され得、一部の系はオートロガス腫瘍標的に対しては溶解特異性を有する Ｔ細胞として機能するが、同種異型の腫瘍標的に対してはそうではなく１、一方 、その他の系はＬＡＷ細胞として機能し、オートロガス膿瘍標的と同種異型の腫 瘍標的の両方を溶解する（Ｔｏｐａｌｉａｎら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈ ｏｄｓ　１０２；１２７；　Ｉｔｏｈら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、４６：３０１ １、１９８６）。５ｘｌＯ１ｉｌのＴＩＬ単独の養子免疫伝達には重要な毒性は 無＜　（Ｋｒａｄｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅ ｒ、２４ニア６、　１９８７）、そして、ＩＬ−２の全身投与とともに５Ｘ１０ ”のＴＩＬ細胞を投与しても、ＩＬ−２に起因する毒性が認められたのみであっ た（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｎ、Ｅｎ　１．　Ｊ、Ｍｅｄ、３１９：１６７６． １９８８ＨＴｏｐａｌｉａｎら、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　０ｎｃｏｌ　ｉ＋８３９． １９８８）。インジウム−１１１標職細胞の注入による伝達されたＴＩＬ細胞の 移行パターンを評価したところ、経静脈的注入後２時間で肺、肝臓および牌臓に ＴＩＬ細胞が先ず局在化し、その後移行して、２４時間以内に転移腫瘍部位に選 択的に局在化した（Ｆｉｓｈｅｒら、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　０ｎｃｏ１．７：２５ ０．１９８９）。単回ＴＩＬ細胞注入後、患者には部分的および完全な腫瘍後退 が見られ、これらの長期培養免疫エフェクター細胞がインビボの生物学的作用を 媒介し得ることが示された。

最近、数人の異なる個体から得られたＴＩＬが、ネオマイシンホスホトランスフ ァラーゼ遺伝子の導入とレトロウィルス媒介遺伝子伝達により、毒性用量の０４ １８に耐性を示すように形質導入された（Ｋａｓｉｄら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ 、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８７：４７３、１９９０）。これらのＴＩ Ｌをガン患者に投与し、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードするマ ーカー遺伝子の発現を用いてインビボでの存続性と分布を調べた。これらの研究 から得られた予備的なデータは、移行後長期間にわたる腫瘍部位へのＴＩＬ細胞 の局在化を実証し、ヒトＴ細胞を標職するためのレトロウィルス媒介遺伝子伝達 を用いることが可能であり安全であることを示している（Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｈｕ ｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅ工１：５．　１９９０：　Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｎ 、Ｅｎ　、Ｊ、Ｍｅｄ、３２３＋５７０゜１９９０）。

ヒトウィルス特異性ＣＤ８”ＣＴＬをクローニングしインビトロ増殖させ得るよ うな培養系が現在開発中である（ＲｉｄｄｅｌおよびＧｒｅｅｎｂｅｒｇ、　Ｊ 、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈ、１２８＋１８９．　１９９０）　ｏ　これらの ＣＴＬは培養において１年以上の後もウィルス抗原に対する特異性を維持してお り、ウィルス感染細胞またはＴ細胞レセプターＣＤ３複合体に対する抗原のいず れかを用いて刺激することにより増殖し得る。そしてフィラー細胞上に置かれる と刺激しなくても長期間インビトロで生存できる。このようなウィルス抗原また は腫瘍抗原に対して特異的なインビトロ生成細胞は養子免疫療法に用いることが できる。

以下の実施例は本発明の特定の実施態様を示すものであり、請求の範囲で定義さ れる本発明の範囲を限定するものではない。

（以下余白） 案Ｊ１舛 実施例Ｉ ＩＬ−ＩＲレトロウィルスの　築および　生Ａ、二’７　−１簗　クローン７８ 由来のネズミＩ型！Ｌ−１受容体をコードする全長ｃＤＮＡ　（Ｓｉｍｓら、５ ｃｉｅｎｃｅ　２４ユニ５８５，１９８８）を、レトロウィルスベクターｐＬＸ ＳＮのＥｃｏＲ１部位と迦１部位との間のＥｃｏＲＩ−Ｓａｉｌフラグメントと して挿入した（ＭｉｌｌｅｒおよびＲＯｓＩｌｌａｎＳＢｉｏｔｅｃｈｎｉ　ｕ ｅｓ　７：９８０．１９８９）　ｏ　ｐＬＸＳＮレトロウィルスベクターをネズ ミＩＬ−ルセブターｃＤＮＡ挿入断片と共に図１に示す。ｐＬＸＳＮレトロウィ ルスベクターは、５°ＬＴＲおよびＭｏＭＳＶ由来の塩基５４１を介した配列、 ＭｏＭＬｖ由来の５６６から１０３８までの塩基、非レトロウィルス配列、およ びＭｏＭＬＶ由来の３’　ＬＴＲを介しての塩基７７７４から成る。点描の施さ れた四角は、初期プロモーターを含むＳＶ４０由来のＰｖｕ　ＩＩからＨｉｎｄ 　ＩｌｌフラグメントまでのＳＶ４０配列を表す（Ｆｉｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ 　２７３：１１３．１９７Ｌ　Ｒｅｄｄｙら、５ｃｉｅｎｃｅ　２００：４９４ ．１９７８）。ネオ配列はトランスポゾンＴｎ５由来である（　１３ｅｃｋら、 Ｇｅｎｅ　１９：３２７．１９８２）　ｏ得られたベクターをｐＬ、　ＩＬ−Ｉ ＲｓＮと称し図１に示す。このベクターは、レトロウィルスＬＴＲの転写制御下 、ネズミＩＬ−ＩＲｃＤＮＡを、そして、ＳＶ４０初期領域プロモーターの制御 下、ネオ遺伝子を発現する。

ネオ遺伝子は陽性選択マーカーとして用いられる。

Ｂ、ウィルスを生　るクローンの生　Ｌ、　ＩＬ−ＩＲｓＮレトロウィルスを、 感染した？２細胞の単一クローンにより生産したが、それは以下のようにして誘 導された。前に記載のように（Ｏｖｅｒｅｌｌら、Ｍｏ１ｅｃ、Ｃｅ１１．　Ｂ ｉｏｌ、ヱ：３３９４．　１９８７）　リン酸カルシウム処理によって、ｐｔ、 、　ＩＬ−ＩＲＳＮプラスミドＤＮＡをｖ２細胞にトランスフェクトし、ウィル ス上清をトランスフェクションから２４時間後に回収した。生存可能なウィルス を産生ずる細胞を取り除くために、ウィルス上清を通常通り遠心分離した（　ｂ ｅｎｃｈｔｏｌ）遠心分離機により２５００ｒｐｍで１０分間）。次にこの上清 を４μｇ／ｍ　ｌのポリブレンおよび５μｇ／ａｌのツニカマイシンの存在下で 新鮮なＷ２細胞を３時間感染するために用いた。エコトロピックウィルスによる 感染を行うため、受容体マ２細胞をツニカマイシンを用いて４時間前処理した。

これらの感染した細胞をさらに２４時間成長させ、Ｇ４１８を含有する培地（５ ００μｇ／ｅｌ）にワブレートした。０４１８−抵抗性細胞のクローンをクロー ニングリングを用いて単離し、数を増幅し、前に記載のように（Ｏｖｅｒｅｌｌ ら、Ｍｏ１ｅｃ、　Ｃｅ１１．　Ｂｆｏｌ、ヱ：３３９４．　１９８７）力価を 調べた（ｔｉｔｅｒｅｄ）。クローンをまたＸＣ／１１’／プラークアツセイ（ Ｗｅｉｓｓら（ｍ）　、ＲＮＡ　Ｔｕｍｏｒ　Ｖｉｒｕｓｅｓ、第２版、Ｍｏｌ 。

１　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎｅ ｗ　Ｙｏｒｋ、１９８５．　ｐｐ。

２０９−２６０に記載）を用いてヘルパーウィルスの存在に関してアッセイした 。得られたい（つかの高い力価のクローンのうちから、Ｌ、　ＩＬ−ＬＲＳＮ− ＩＦ　Ｚｔ６と命名された１つのクローンを、さらに用いるために選択した。こ のクローンは、５ｘｌＯ’Ｇ４１１１”ＣＦＵ／Ｉｌｌのウィルス力価を有して おり、そしてＸＣ／ＵＶプラークアッセイで測定されたように検出可能なヘルパ ーを有していなかった。

実施例２ Ｌ、　ＩＬ−ＩＲｓＮレトロウィルスのＡ、生　マ２細　でのプロウィルス　° ６の　感染したＷ２生産細胞中でのり、　ＩＬ−ＩＲｓＮプロウィルスの構造を サザン分析により決定した。■旧を用いてのゲノムＤＮＡの消化、および放射標 識されたネオ特異的プローブとのハイブリダイゼーションは単一のハイブリダイ ジングバンドを現した（図２、レーン１）。このフラグメントはプロウィルスに 隣接する接合フラグメントを表しており（図１参照）、またそれは各プロウィル スごとに異なるため、これはウィルスを生産するクローンが統合されたベクター プロウィルスの単一コピーを含有していることを示した。ＥｃｏＲＶによるり、 　ＩＬ−ＩＲＳＮ−１Ｆ　２細胞由来のゲノムＤＮＡの消化は、予測されたサイ ズのベクターフラグメントを放出したが（図１）、それはネオ遺伝子に特異的な プローブとハイブリダイズしく図２、レーン２）、またＥｃｏＲＶ消化によるｐ Ｌ、　ＩＬ−ＩＲＳＮプラスミドＤＮＡから放出されたフラグメントと同じサイ ズであった（図２、レーン３）。このことは、Ｌ、ＩＬ−ＩＲＳＮ統合プロウィ ルスが生産クローン中で再配置されていない形態で存在したことを示している。

Ｂ、　Ｌ、Ｉｔ、−ＬＲＳＮレトロウィルスによ　発　したＩｔ、−ＬＲタンパ ム！立五二　ベクターによりコードされたｍ１Ｌ−ＩＲタンパク質の発現を、感 染したＷ１２６−１／Ａ４　ヒト繊維芽細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ９５．１ン中でネ ズミｌ型ＩＬ−ＩＲに特異的なモノクローナル抗体であるＭ５を用いて分析した （Ｂｏｍｓｚｔｙｋら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

７８６：８０３４．１９１１９）。ネズミ細胞系は、導入されたレセプターの分 析を不確かなものとする内因性のＩＬ−ＩＲを発現するため、ネズミｌ型ＩＬ− ＩＲをヒト細胞中で発現させた。陰性の対照として、Ｗ１２６−ＶＡ４細胞を、 Ｇ４１８耐性の発現は付与するが、ＩＬ−ＩＲｃＤＮＡを含有しないＬＸＳＮウ ィルスを用いて感染させた。

両種性ＰＡ３１７ハンゲージング細胞系（ＭｉｌｌｅｒおよびＢｕｔｔｉｍ。

ｒｅＳＭｏｌ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　ｉ：２８９５．１９８６；　ＡＴＣ ＣＣＲＬ　９０７８；米国特許第４．８６１．７１９号）をり、　ＩＬ−ＩＲ− Ｗ　２ｔ６細胞系からの上清を用いて感染させることにより、Ｌ、　ＩＬ−ＩＲ ｓＮの両種性ウィルスストックを得た。上述のように、トランスフェクションに 続いてＬＸＳＮベクターを一時的に発現するｖ２細胞からの上溝を用いてＰＡ３ １７細胞を感染させることにより、ＬＸＳＮの両種性ストックを得た。ＰＡ３１ ７細胞を５Ｘ１０５／１００１１１１１１培養皿の濃度でシードし、２４時間後 にエコトロピックウィルス上清を４μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下で添加した 。これらのウィルス上清を新鮮な培地と取り替え、ウィルス上清を３日間のイン キュベーション後に回収した。多数の１００ｍｍ培養皿中に１０５細胞の濃度で ２４４時間前二シードたＷ１２６−’／Ａ４細胞を、ＰＡ３１７細胞由来ノＬＸ ＳＮまたはり、　ＩＬ−ＩＲＳＮウィルス上清の段階希釈物を用いて感染させた 。これらの細胞をｉｎ　５ｉｔｕでＧ４１ｇ　（ｌｏｇ／ｒａｌ）を用いて選択 し、１４日間の増殖後、オートラジオグラフィーでマウスＩＬ−ＩＨの発現を可 視化するために、得られたコロニーを１２５１−Ｍ５とインキユベートし、そし て全ての生存可能な細胞コロニーを可視化するためにメチレンブルーで染色した 。

オートラジオグラムと染色されたコロニーとを比較すると（図３　）　、ＩＬ− ＩＲウィルスを用いた感染により誘導されたコロニーはＭ５抗体と結合し、ＬＸ ＳＮウィルスを用いた感染により誘導されたものは結合しなかったことが示され た。Ｌ、　ＩＬ−ＩＲＳＮを用いた感染に続いて誘導されたＧ４１８Ｒコロニー の全てはＩＬ−１と結合したので、この実験はまた０４１８中での選択がＩＬ− ＩＨの同時発現を導くことを示した。

形質導入されたＩＬ−１ｉｔのサイズを分析するために、上記の実験による感染 した１ｒ１２６−ＶＡ４細胞の平行プレートからの０４１８”コロニーをプール し、Ｇ４１８中で成長させ、得られた細胞を１２５！−ＩＬ−１αと結合させ、 次にそれを１　ｏ＋ｇ／＋１のスペリン酸ジスクシンイミジルを用いてレセプタ ーに架橋した（ＤＳＳＨＤｏｗｅｒら、Ｊ、　Ｅｘ　、　Ｍｅｄ、　１６２：５ ０１．１９８５）　ｏ次に細胞を１％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を用いて抽出 し、ａｆｆｉｇｅｌに結合したＭ５抗体とインキュベートした。結合した物質を 溶離し、５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにより分析した。この 実験の結果を図４に示すが、これはネズミｌ型ネズミＩＬ−ＩＲ／ＩＬ−１複合 体と一致した分子量で移動する架橋バンドを示すオートラジオグラムである（９ ７ｋＤ：　Ｄｏｗｅｒら、Ｊ、　ＥＸ　、　Ｍｅｄ、　１６２：５０１．１９８ ５）。このバンドはり、　ＩＬ−ＬＲＳＮで感染させた細胞からの精製抽出物、 Ｍ５抗体を含むレーン中に存在したが（レーン２）、陰性対照しＸＳＮベクター で感染させた細胞からの精製抽出物を含むレーン中には存在しなかった（レーン １）。このデータは、Ｌ、　ＩＬ−ＩＲＳＮベクターが、レトロウィルス感染に よる真正のネズミＩＬ−ＩＨの発現を伝達したことを示している。

実施例３ ＩＬ−ルセプターｃＤＩＪＡの　人によるヘルパー　型へのＴリンパ　の１　・ Ａ、ネズミＩＬ−ＩＲをコードするレトロウィルスベクターＬ、ＩＬ−ＩＲＳＮ を　いてヅ　したＣＤ８”Ｔ　クローンＴ８１のネズミＩＬ−ルセブターをコー ドするレトロウィルスベクターＬ、　ＩＬ−ｉＲｓＮを、腫瘍特異的ＣＤ３ゝ、 ＣＤ８　”　Ｔ細胞クローンＴ８１に以下のようにして導入した。Ｔｉ１ｌはに １７３５マウスメラノーマ細胞系上で発現する抗原に特異的である。Ｔａ２は、 膿瘍抗原および支持細胞として照射同系肺細胞を用いての８−１０日ごとの刺激 により増殖させた。刺激して−から４８時間後に組み換え体！Ｌ−２（５００／ ｍｌ）を培養に添加した。Ｔ細胞クローンに形質導入するために、Ｌ、　ＩＬ− ＩＲＳＮＷ　２ｔｌ細胞系からのレトロウィルス粒子を含む上清を刺激から４８ 時間後に１＝１の希釈で添加し、薬剤選択（０４１Ｂ）を２日後に開始した。次 に、Ｇ４１８ＩｌｉｙＩ性を安定して発現したＴ細胞を選択するために、各刺激 から２日後に０４１８を添加した。図５に示すグラフは、用いられる０４１８の 用量が親細胞に対して毒性であること、および最初に細胞数が減少してから後の 、薬剤選択を行った形質導入された細胞（Ｔａ２−ＩＬ−ＩＲ）の成長を、薬剤 選択を行わなかった親クローンの成長と比較して示している。

Ｂ、ＣＤ８”Ｔ　クローンＴ８１　の　み　え　ネズミ　ＩＩＩＬ−止Δｍ皿且 ユ　形質導入された、親細胞であるＴａ２のＴ細胞を１０６細胞／ｖＡｌに懸濁 し、そして１０μｇ／ｍｌのフィコエリトリンに直接的に結合したＭ５モノクロ ーナル抗体（ネズミ１ｍｎ−ＩＨに特異的である）の複合体（ＰＥ−ＭＳ）を用 いて染色した。

細胞を、Ｂｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　ＦＡＣスキャン分析器で、Ｍ５ 結合に関して分析した。図６に示す結果は、ｍ１Ｌ−ＩＲレトロウィルスに感染 したＴ８１細胞が容易に検出可能なＭＳ結合を発現し、一方親の感染していない Ｔ８１細胞は発現しなかったことを示している（図６、ａ−ｄ）。ＭＳの結合は ５０倍過剰量の標識されていないＭ５抗体との競合により完全に可逆的であった が、このことは結合が特異的であることを示している（図６、ｅおよびｆ）。

パネルｄは、複合していないＭＳによって阻害される、形質導入されたＴｉ１ｌ 細胞の、ＰＥ−ＭＳ複合体での陽性の染色を示している（　ハネ／Ｉ／　ｆ）。

結果は、Ｌ−ＩＬ−ＩＲＳＮを用いて形質導入されたＣＤ８”Ｔ細胞クローンＴ ８１が細胞表面ＩＬ−ＩＲを発現したことを示している。

Ｃ，スキャッチャード　Ｌ、　ＩＬ−ＩＲＳＮベクターに感染したＴ８１細胞上 の１１．−ルセブターを前に記載のように１２５１−ＩＬ−１α結合に関して分 析した（　Ｄｏｗｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｌａｎｄ　３２４；２６６゜１９１！ ６）。図７は１２５Ｉ標識された組み換え体ＩＬ−１αのＴ８１細胞を有するＩ Ｌ−ＩＲへの直接的な結合を示すものである。Ｔ細胞を種々の濃度の”’Ｉ−Ｉ Ｌ−１αの存在下で２４時間８°Ｃで振動台（ロッカープラットフォーム）でイ ンキュベートした。＋２’ｌ−１ｔ−４の非特異的結合を過剰量の標識していな いＩＬ−１の存在下でインキュベージシンすることにより測定した。インキユベ ーシヨンの終わりに、結合した、および遊離の１２５１−ＩＬ−１をフタル酸油 混合物上の遠心分離により分離し、各画分の放射標識量を測定した。データを非 特異的結合に対して補正して、次にＩＬ−１１？／細胞の数を評定するために非 線形最小２乗法により分析した。図８は図７のデータをス牛ヤノチャードコーデ ィネートンステム中で再プロ、トシたものを示している。このデータは細胞が、 Ｋ１が５ｎＭ−’である単一の親和性クラスを有する平均９８０のレセプターを 発現したことを示している。この親和性はクローニングされたネズミＩ型ＩＬ− ＩＲに典型的なものである（ＳｉＩｌｌｓら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４１：５８５ ．　１９６８）　。

Ｄ、ＩＬ−ＩＲを　るＴａ２　の　「Ｔ８１親細胞、およびり、　ＩＬ−ＩＲＳ Ｎに感染し、細胞表面ＩＬ−ＩＲを発現するそれらの誘導体を、借地、抗原提示 細胞（ＡＰＣ）　、ＩＬ−１、腫瘍抗原（Ａｇ）、およびＡｇとＡＰＣｌＩＬ− １とＩＬ−２の組み合わせを含む種々の刺激に反応して増殖する能力に関してア ッセイした。親クローンＴ８１、およびレトロウィルスベクターＬ、　ＩＩ、− ＩＲＳＮで形質導入された（またネズミＩＬ−ＩＲを発現する）Ｔ８Ｌクローン を、９６ウエルプレート中の３倍培養中（ＳｘｌＯ’Ｔ細胞／ウェル）　、ｔ＋ Ｖ照射抗原保持騰瘍細胞（２Ｘ１０’細胞／ウエル）　、　ＡＰＣとしての照射 同系肺細胞（５ｘｌＯ５細胞／ウエル）　、ＩＬ−１（Ｌｏｎｇ／＋１）　、ま たはＩＬ−２（Ｓｏｕ／ｍｌ）を様々に組み合わせて刺激した。ウェルを、７２ 時間アッセイのうちの最終の１８時間の間、１μＣｉの３Ｈチミジンを用いてパ ルスして、次いでβ計数のために回収した。

このデータは（図９にグラフで示す）、親子８１細胞が腫瘍抗原およびＡＰＣま たはＩＬ−１の存在下で有意に増殖しないが、外因性ＩＬ−２が提供されると腫 瘍抗原に反応して増殖することを示している。対照的にＩＬ−ＩＲレトロウィル スに感染した（また１Ｌ−ＩＲを発現する）Ｔ８１細胞は、腫瘍抗原の存在下で ＩＬ−２が存在しなくても、ＩＬ−１またはＡＰＣが提供されるとで増殖し得た 。

実施例４ ＩＬ−ルセブターのヒトＣＴＬへの　”Ａ、ヒ）ＣＴＬ　３Ｇ５および３Ｇ５− ＩＬ−ＩＲノ　殖応Ｘ上記のように得られる結果の他のＣＴＬクローンに対する 普遍性を評価するために、および特に伝達されたＩＬ−ＩＲを発現するヒ）　Ｃ ＴＬが同様の表現型を示し得るかどうを確認するために、さらなる実験を行った 。ＣＤ３°、　ＣＤ８＋ヒトアロ応答性ＣＴＬクローンである３Ｇ５は、［１Ｌ Ａ−Ａ２に対してアロ応答性で、同種異系のＨＬＡ−Ａ２　（＋）リンパ芽球細 胞系（ＬＣＬｓ）は、抗原源として作用する。

３Ｇ５クローンは、上記実施例２に記載のように誘導されたり、ＩＬ−ＩＲＳＮ の両種性のプソイドタイプで形質導入し、細胞をＧ４１ａ中で選択した。得られ たＧ４１Ｂ’細胞（３Ｇ５−ＩＬ−ＩＲ）は、フローサイトメトリーで、　ＭＳ 抗体の特異的な結合を示しく図１０．パネルｄ）　、　５０倍過剰の複合体化し ていないＭＳと競合した（図１０、パネルｆ）。処理していない細胞（パネルａ およびｂ）、またはＭＳ−ＰＥ処理された形質導入していない親３Ｇ５細胞（パ ネルＣ）に対しては、いかなるＭ５結合も観察されなかった。Ｍ５抗体はマウス ＩＬ−ＩＨに特異的であるため、この実験は、それが発現されつつあった伝達さ れたレセプターであることを示した。

３Ｇ５および３Ｇ５−ＩＬ−ＩＲ細胞は、５Ｘ１０’（７）　３Ｇ５または形質 導入された３Ｇ５−ＩＬ−ＩＲ細胞を９６ウエルの丸底トレイに様々な刺激条件 下でシードすることによって種々の刺激に対する応答に対し増殖する能力につぃ てアッセイした。オートロガスＬＣＬ（Ａ２（−）　ＬＣＬ）細胞は、オートロ ガス刺激物質として機能し、他方Ａ２（＋）ＬＣＬは、同種異系刺激物質として 機能し、これらの細胞は応答細胞に１：１の比率で加えた。ヒＩ−ＩＬ−１およ びルー２を、それぞれＬｏｎｇ／１ｍｌおよび２０　Ｕ／ｍｌで加えた。細胞を ９６時間成長させ、アッセイの最終の１８時間、’Ｉ（−ＴｄＲでパルスした。

次にウェルを回収し、チミジン取り込みについてβシンチレーシ１ン計数で評価 した。

上記のマウス系で得られたデータと一致して、感染細胞は、ＣＤ４”Ｔ細胞由来 のサイトカイン源とは独立に増殖したく図１１）。

この系では、ＩＬ−ＩＲ”Ｉｇ胞の増殖は抗原提示細胞（Ａ２＋ＬＣＬ）単独で 達成され得、これは多分、これらの細胞が抗原と共働して応答を起こすためにＩ Ｌ−ルベルを適切にするためである。親細胞は、同じアッセイ条件下では同程度 には増殖し得なかった。３Ｇ５−ＩＬ−ＩＨの増殖は、オートロガスＡ２（−） ＬＣＬが増殖応答を誘導しなかったため、抗原依存性であった（図１１）。

ヒトクローン３Ｇ５および３Ｇ５−ＩＬ−ＩＲの細胞溶解性応答もまた、実質的 にＢｒｕｎｎｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１４：１８１．１９６８に記載のよう に４時間のクロム放出アッセイで評価された。標的細胞はオートロガス（・）お よびＨＬＡ−Ａ２−陽性同種異系（ＤＥＢＶ−ＬＣＬ　（０）　テあった。これ らの細胞を２００μＣｉの５１（ｒで９０分間標議し、洗浄し、９６セルの丸底 プレート中に５ｘｌＯ’細胞／ウエルでプレートした。エフェクター細胞３Ｇ５ および３Ｇ５−ＩＬ−ＩＲを、種々のエフェクタ一対標的細胞比（Ｘ軸）になる ように添加し、プレートを４時間インキュベートした。実験ウェルならびに標的 細胞および培地のみを含むウェルからの、Ｓ　ｔ　Ｃｒの自然的放出、あるいは ＮＰ−４０での正常の放出を測定するために、上清を回収した。

このデータは、アロ応答性のＨＬＡ　Ａ２−特異的ＣＤ８”Ｔ細胞のクローンで ある３Ｇ５が、ＩＬ−ＩＨの導入と発現の後に、抗原特異的細胞溶解性応答を維 持していることを示す。これらの細胞は、オートロガスの非抗原保持細胞のいか なる有意な溶解も、エフェクター：標的細胞比の範囲内では観察されなかったと いう点で、適切な標的細胞を溶解する能力を保持し、かつ抗原特異性を保持して いた（図１２および１３）。

上述の実施例１−４に記載された結果は、ＩＬ−ＩＨの挿入が、ＣＴＬを、ＣＤ ４３Ｔ細胞により産生されるサイトカインからの介助の要求に対して非依存性に することを示している。この結果は、マウスおよびヒトの両方の系で得られたも ので、これらのインビトロでの結果に基づくと、ＩＬ−ＩＲで形質誘導された細 胞は、インビボでＴ細胞の介助に非依存的に増殖する能力を示すことが予測され る。しかし、上記の結果に基づ（と、それらはなお、増殖のために抗原およびＩ Ｌ−１を必要とする。ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の欠損が、インビボで合体された ＣＤ８”ＣＴＬの存続性を妨害することが予測され得たので、これらの結果はＡ ＩＤＳに関連して特に意味深い。

実施例５ ＨＩｖ−１的ＣＴＬの生　および　、ならびににおける　のためのＩＬ−ＩＲで の２ Ａ、■ １、培　培地および培地　足物　使用された培養培地は、Ｔ細胞培養のためのＲ ＰＭＩ　１６４０、ならびにＥＳＣ−４０細胞上でワクシニア−ｇａｇおよびワ クシニア−ＲＴウィルスを増殖させ、レトロウィルスベクターをパッケージする ために用いられるＰＡ３１７細胞を増殖するためのＤｕｌｂｅｃｃｏ培地である 。全ての培地はＷｈｉｔｔａｋａｒ　ＭＡ　Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓから１リツ トルボトルで購入し、ヒトの養子免疫療法の研究に使用するための現行のアメリ カ食品医薬品局（ＦＤＡ）のガイドラインを満たすものである。培養培地への補 足物は、グルタミン（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ　ＭＡ　Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）、 Ｔ細胞培養のためのヒトＡＢ血清、および繊維芽細胞培養のためのウシ胎児血清 を包含する。培地補足物の添加の後、全培養培地ヲ、０．２ミクロンの酢酸セル ロースフィル９−　（Ｎａｌｇｅｎｅ）で濾過し、細胞培養に使用する前に、細 菌、真菌およびマイコプラズマの汚染についてスクリーニングした。

２、旦上旦ＩＬ　ヒトＡＢ血清は、長期にわたるインビトロでのＴ細胞の最適な 成長を持続させるために、培養培地への補足物として必要とされる。ヒトＡＢ血 清は、ＡＢ”型のボランティアのドナーから調製される。各供血ごとに、個々の ドナーからの血清部分を旧Ｖ血清学、ＨＴＬＶ　Ｉ血清学、肝炎血清学、アラニ ンアミ／トランスフェラーゼおよびＳＴＳについてスクリーニングした。輸血用 血液の評価に使用されるのと同じ必要条件を満たさないドナーからの血清は、捨 てられる。全血清を、培養培地に使用する前に、細菌、真菌およびマイコプラズ マの汚染についてスクリーニングし、プールした。プールされた血清を、５６℃ で３０分間熱処理して血清の補体および潜在的なウィルス汚染を不活性化し、Ｏ ，Ｚミクロンの酢酸セルロースフィルターに通した。万一、）ＩＩＶ−特異的Ｔ 細胞で免疫治療したレシピエンドが肝炎、単核細胞症または他のウィルス疾患を 発症した場合、その血清が源として調べられ得るように、培養培地中に使用され るプールされた血清の一部は、少な（とも１年間保存される。

３、ウシ　＆　ＦＳＣは、ＥＳＣ−４０細胞系、ＰＡ３１７バツケージング細胞 系、およびオートロガスＥＢＶ−誘導Ｂ細胞系を成長させるために使用される培 養培地への補足物して添加される。すべてのＦＳＣはＨｙｃｌｏｎｅから購入さ れ、培養培地に使用される前に、細菌、真菌およびマイコプラズマの汚染１こつ いてスクリーニングし、５６°Ｃで３０分間熱による不活性化を行い、０．２ミ クロンの酢酸セルロースフィルターで濾過する。ウシ胎児血清は、免疫治療のた めのヒトＴ細胞を成長させるための培地中では使用されない。

４、イン　−ロイキン２　ヒト組み換えインターロイキン２（ＩＬ−２＞は、Ｈ ｏｆｆ＋＊ａｎｎ−Ｌａ　Ｒｏｃｈｅから得られる。ＩＬ−２は、１．５ｘ１０ ６ユニツ）７ｍｇタンパク質の比活性を有する凍結乾燥されたＩＬ−２の０．６ ７ｍｇを含有するバイアルで供給される。Ｌｉｍｕｌｕｓアメ−バ様細胞アッセ イで測定すると、各バイアルあたり０．０４ｎｇ未満のエンドトキシンが存在す る。この組み換えＩＬ−２は、ヒト癌治療に用いるためにインビトロでヒトＬＡ Ｋ細胞を生成するために使用され、フェイズＩおよびフェイズ■の免疫療法研究 において、ヒト癌患者に全身的に投与された。

凍結乾燥された組み換えＩＬ−２は、滅菌水で再構築され、５ｘ１０５単位／＋ １の濃度まで希釈される。ＩＬ−２は、滅菌バイアルに分注され、２０℃で保存 される。ＩＬ−２は、下記の０項に記載されるように、Ｔ細胞培養で使用される 。

Ｂ、　療法のためのヒト旧Ｖ−特　的Ｔ細胞の立１、１　リンパ・−′　および 　抹消血リンパ球（ＰＢＬ）を旧Ｖ血清陽性ドナーか・ら静脈穿刺により得て、 フィコールハイパツク密度勾配遠心分離により単離した。ＰＢＬを滅菌リン酸緩 衝化生理食塩水中で２回洗浄し、ＲＰＭＩ　１６４０、ｌＯ％ヒトＡＢ血清、お よび４ｍＭ　Ｌグルタミンからなる培養培地中に懸濁する。単核細胞をＴ細胞培 養の開始のために使用し、充填細胞として使用するために照射し、ＬＣＬを支持 細胞系として供給するためにＥＢＶで形質転換し、または将来の使用のために、 ２０％ヒトＡＢ血清および１０％ＤＭＳＯを含むＲＰＭＩ中に懸濁した後、液体 窒素中で細胞を凍結することによって保存する。

２６　■辷１」１虹血系　ＥＢＶ−誘導オートロガスＢ細胞系を旧■血清陽性ド ナーから得て、インビトロでのＴ細胞成長を支持するために支持細胞として使用 する。ＥＢＶを８９５−８細胞系（Ａｎｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒ ｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ａｃＲＬ　１６１２）の濾過された上清から得る。

Ｂ−リンパ芽球細胞系＜８−１．ＣＬ）は、ＰＢＬを７クロスポリンＡの存在下 にこの上清とともに培養することによって誘導し、続いて１０％ＦＳＣを含むＲ ＰＭＩ　１６４０中で増殖させる。全Ｂ−ＬＣＬを、γ照射された支持細胞とし て、およびＴ細胞培養のための刺激細胞として使用する前に、マイコプラズマ、 細菌および真菌の汚染についてスクリーニングする。

３、　ＣＤ８”）ＩＩＶ−１・Ｔクローンの　血清陽性ドナーが旧Ｖ遺伝子産物 に特異的なＣＴＬを有するかどうかを決定するために、ＰＢＬをｖａｃ／ｇａｇ 、　ｖａｃ／ｅｎｖ、　ｖａｃ／逆転写酵素（ＲＴ）およびＶａＣに感染したオ ートロガスでクラスＩＭＨｃミスマツチのＬＣＬに対する溶解活性について、記 載のようにしてアッセイする（Ｗａｌｋｅｒら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ 、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８６：９Ｓ１４．　１９１１９；　Ｌａｎｇ　ｌａｄｓ−Ｌ ｅｍｏｙｅｎら、Ｊ、Ｉ＋＋ｕａｕｎｏ１．　１４１：１９４９．　１９８８Ｈ Ｒｉｖｉｅｒｅら、ムーＬ工凶工６３：２２７０．　１９８９：　ｔａｌｋｅｒ ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４０＋５４．　１９８８）。ＣＤ８”ＨＩＶ７ｇａｇお よびＲＴ特異的ＣＴＬクローンを生成するために、ワタシニアーｇａｇおよびワ クシニア−ＲＴを用いて、それぞれ１０の感染多重度で１６時間感染させた５ｘ ｌＯ５オートロガスＢ−ＬＣＬによって、ＨＩＶ血清陽性ドナーから得た５ｘｌ Ｏ’のＰＢＬを滅菌６ウエルプレート中で刺激し、続いて殺ｍＵＶ光で不活性化 する。

これらの培養を３７℃、５．５％ＣＯ２で７日間インキュベートすると、ＥＢＶ 　ｇａｇ−ならびにＨ［Ｖ　ｇａｇ−の両方、およびＲＴ−特異的Ｔ細胞を活性 化し、増殖させることが予測された。次にこれらの細胞を、Ｔ細胞クローニング によって単離する。クローニングのために、ＣＤ８”Ｔ細胞を、ＯＫＴ４ｍＡｂ およびウサギ補体でＣＤ４”Ｔ細胞培養体を除くことによって豊富にする。この 豊富になったＣＤ８４Ｔ細胞を、支持細胞としての５ＸＩＯ’のオートロガスγ 照射（３３Ｇｙ）ＰＢＬ／ウェル、刺激のための抗−ＣＤ３　ｍＡｂ、および５ ０　Ｕ／ｎ＋１組み換えＩＬ−２を用いて、０．３７細胞／ウエルで、９６ウエ ルの丸底プレート中でクローニングする。成長が陽性のウェルを、培養７−１０ 　Ｅｌ後に同定し、オートロガスｖａｃ／ｇａｇまたはｖａｃ／ＲＴ惑染ＬＣＬ に対して溶解特異性を有するがｖａｃ−感染ＬＣＬまたは非感染しＣＬに対して は溶解特異性を有しないクローンを同定するために、プレートしてから１２−１ ４日後に、微量細胞毒アッセイでスクリーニングする。これらの旧Ｖ−特異的Ｔ 細胞クローンをより大きなウェルに移し、抗−ＣＤ３　＋ｍＡｂ、オートロガス γ照射ＰＢＬで７−１０日ごとに再刺激し、各々の再刺激の４８−９６時間後、 ４０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２でフィードする。インビトロでの成長が速い２０のクロ ーンを、特性化、増殖、Ｌ、ｈｌＬ−ＩＲＳＮによる形質導入（下記）および治 療への使用のために選択する。ＣＤ８　’″ＨＩＶ−特異的Ｔ。クローンを、１ 週間ごとの刺激により、細胞数で５−１０倍に増殖する。従って、養子療法研究 を始めるために充分な細胞数が、クローニング後８−１２週間使用可能である。

４、ＨＩＴ／−的Ｔの、性 ａ）　Ｍｌ艮【艮里里　クラスＩのＭｌ（Ｃ−制限Ｔ。はＣＤ３°、ＣＤ８”、 αβＴｃＲ“、ＣＤ４−１Ｃ１６−細胞表面表現型を有しているべきであり、全 クローンの部分は、予測される表現型を確認するために、モノクローナル抗体Ｏ ＫＴ、（ＣＤ３）、Ｌｅｕ２ａ（ＣＤ８）、ＷＴ／３１（αβＴｃＲ）、０ＫＴ Ａ　（ＣＤ４）、およびＬｅｕｌｌｂ（ＣＤ１６）を使用して間接的な免疫蛍光 法により分析される。

ｂ）旧■　ａまたはＲＴに・する、およびクラスＩ　ＭＨＣ！エレメントＣＤ８ ＋Ｔｏは、抗原特異的Ｔ細胞レセプターと感染細胞のクラスＩのＭＢＣ分子によ って提供された処理されたウィルス抗原との相互作用の後、ウィルス感染細胞を 認議し、溶解する。ｇａｇまたはＲＴｍ示およびクラスＩ　Ｍ）ＩＣ制限の要求 は、オートロガスでクラスＩ　ＭＨＣミスマツチのｖａｃ／ｇａｇまたはｙａｃ ／ＲＴ感染および非感染ＬＣＬに対して、各クローンをアッセイすることにより 確認される。阻害実験は、クラスＩ　Ｍｉｌｅ制限をさらに確認するものとして 、抗−クラスｌ　ｍＡｂ　Ｗ６／３２を用いて行われる。

１、レトロウィルスベクター　本研究で使用されるレトロウィルスベクターＬ、 　ｈｌＬ−ＩＲＳＮは、ネズミＩＬ−ＩＲｃＤＮＡの代わりにヒトｌ型ＩＬ〜Ｉ ＲｃＤＮＡ遺伝子を発現することを除いて、Ｌ、ＩＬ−ＩＲＳＮベクター（図１ ）と同様である。Ｌ、　ｈｌＬ−ＩＲｓＮベクターは、５ｉＩｌｓら、Ｐｒｏｃ 、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｅｔ、ＵＳＡ　８６：８９４６．　１９８９に８ヱｌ −風１１７ラグメントとして記載されているヒトＩＬ−ＩＲをコードする全長の ｃＤＮＡをＬＸＳＮのＨＰ！３．１部位に挿入することによって構築される。Ｌ 、　ｈｌＬ−ＩＲＳＮレトロウィルスベクターは、実施例１および２に記載のよ うに、ＰＡ３１７バツーケージング細胞系（ＭｉｌｌｅｒおよびＢｕｔｔｉｍｏ ｒｅ、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　６Ｌ：２８９５．１９８６；　ＡＴ ＣＣＣＲＬ　９０７８．米国特許第４，８６１．７１９号）の感染クローンを使 用して、高力価に、そしてヘルパーウィルスを含まずに産生される。

２、レトロウィルス鵬　によるヒトＣＤ８　”Ｔ　クローンのＬＬ！ＬＡＣＤ８ ”ＨＩＶ−特異的Ｔ細胞クローンは、５ｘｌＯ’／ｍｌで６ウエルプレートまた は７５　ｃ＋ａ２フラスコ内で、抗−ＣＤ３　ｍＡｂおよび照射された支持細胞 によって刺激される。活性化から２４時間後、Ｔ細胞増殖を誘導するために、Ｉ Ｌ−２（５０Ｃ１／ｍｌ）を培養に添加する。ＩＬ−２添加の２４時間後、活性 化Ｔ細胞を遠心し、Ｌ：１（Ｖｏｌ：ｖｏｌ）の比率の、５０　Ｕ／＋ＬのＩＬ −２を含む細胞培養培地と、ポリブレン６μｇ／ｍｌを含む、５ｘｌＯ’　ｃｆ ｕ／ｍｌの力価でレトロウィルス粒子を含有する培養上清中に再懸濁する。Ｔ細 胞クローンを、培養中で５日間増殖させ、抗−ＣＤ３　ｍＡｂで再刺激し、刺激 から４８時間後、ＩＬ−２（５０Ｕ／ｍｌ）および２　ｍｇ／ｍｌのＧ４１ｇを 含む培地でフィードする。次にこれらの細胞を、上述の実施例４に記載のように Ｔ、４機能の非存在下で増殖する能力についてアッセイする。

形質導入されたＩＬ−ＩＲを含むオートロガスＣＴＬの注入は、Ｔｍ胞培養の開 始から８−１２週間後に始まり、その構成は、オートロガスなＣＤ８”ＨＩＶ− 特異的Ｔ細胞クローンを、その用量を段階的に増大させながら、３週間ずつの期 間をあけて、３回の注入を行う。　゛ 各患者は、表１に概略される用量ニスカレーシランスケールに従って、３週間の 間隔をあけて、細胞数を増加させていく用量で、３回のＴ細胞経静脈注入を受け る。

表１ １　、　０　３ｘｌＯ７／ｍ２ ２　２１　３ｘｌＯ８／ｍ２ ３　４２　３ｘｌＯ９／ｍ２ 投与されるべきＴ細胞クローンを培養から回収し、０．９％生理食塩水で３回洗 浄し、プールし、そして２％ヒトＡＢＩｍ清を含む０．９％ＮａＣ１１００−２ ５０＋＊１中に再懸濁する。Ｔ細胞を、内径の大きな針を使用して経静脈的に、 ３０−６０分間かけて投与する。

実施例６ Ｔｒｏの　を　るためのＩＬ−ＩＲ≦　のＴＩＬは、養子腫瘍免疫療法のために 、マウスおよびヒトの両方で使用される。これらの細胞を、Ｔｏｐａｌａｉｎら （Ｊ、１ｍｍｕｎｏｌ。

Ｍｅｔｈ、　１０２：１２７．１９８７）が記載する方法に従って単離し、培養 中成長させる。次にこれらの細胞を、ヒト［Ｌ−ルセブターを発現するり、　ｔ ｔｆＬ−ＩＲＳＮレトロウィルスベクターで感染させる。

効率的な、形質導入およびＧ４１８中のＴＩＬの選択の方法は、既に記載されて いる（Ｋａｓｉｄら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ 　８７：４７３．１９９０）。次にこれらの形質導入された細胞を、培養中で増 殖し、ｎｏｓｅｎｂｅｒｇら、（Ｎ、　Ｅｎ　１．　Ｊ、　Ｍｅｄ、　３２３： ５７０．１９９０）が既に記載のように、患者に注入する。

−一 ＦＩＧ、　３ ）１色し丁くコロ＝、−不−トラシ゛°オグ°ヲへＦＩＧ、　４ ・−１８ ＦＩＧ、５ 拷友糧秋、ｅ”（Ｐｓ’）　（ａ） ＦＩＧ、　６ ＦＩＧ、７ ＦＩＧ、　８ ＦＩＧ、９ 剰潴Ｘ掬噴 ＦＩＧ、１０ ＦＩＧ、１１ ＦＩｏ、１２ エフシフタ−二　不訃９／ｌ　１ｊｋ ＦＩＧ、１３ ’３Ｇ５−工Ｌ−ＩＲ 補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．ヘルパーＴ細胞（ＴＨ）に非依存的に増殖し得る細胞障害性Ｔリンパ球（Ｃ ＴＬ）を産生する方法であって、ＴＨ依存性ＣＴＬの中に、ＴＨ細胞に非依存性 の該ＣＴＬの成長あるいは増殖を高め得るサイトカインレセプターをコードする 組み換え発現ベクターを導入する工程を包含する、方法。
2. ２．前記サイトカインレセプターが、インターロイキン−１Ｉ型レセプターおよ びインターロイキン−１ＩＩ型レセプターからなる群から選択される、請求項１ に記載の方法。
3. ３．前記サイトカインレセプターがインターロイキン−１Ｉ型レセプターである 、請求項１に記載の方法。
4. ４．前記ＣＴＬがヒトＣＤ８＋ＣＴＬである、請求項２に記載の方法。
5. ５．前記ＣＴＬが、腫瘍抗原またはウイルス抗原を発現する細胞に対して、細胞 溶解性応答あるいは特異性を有する、請求項４に記載の方法。
6. ６．前記ウイルス抗原が、ＨＩＶに感染した細胞で発現される、請求項５に記載 の方法。
7. ７．ヘルパーＴ細胞（ＴＨ）に非依存的に増殖し得る細胞障害性Ｔリンパ球（Ｃ ＴＬ）を産生する方法であって、（ａ）抗原にさらされたドナーから、該抗原を 有する細胞に対して、細胞溶解性応答を有するＣＴＬ細胞の標本集団を単離する 工程； （ｂ）該細胞溶解性応答を有するＣＴＬ細胞の部分集団の中に、ＴＨ細胞に非依 存性の該ＣＴＬの成長あるいは増殖を高め得るサイトカインレセプターをコード するＤＮＡまたはＲＮＡを含有する組み換え発現ベクターを導入する工程；を包 含する、方法。
8. ８．ヘルパーＴ細胞（ＴＨ）に非依存的に増殖し得る細胞障害性Ｔリンパ球（Ｃ ＴＬ）を産生するための請求項７に記載の方法であって、 さらに、前記組み換え発現ベクターを含有する前記部分集団から、ＴＨに非依存 的に機能するＣＴＬであるクローンを選択する工程を包含する、方法。
9. ９．前記サイトカインレセプターが、インターロイキン−１Ｉ型レセプターおよ びインターロイキン−１ＩＩ型レセプターからなる群から選択される、請求項７ に記載の方法。
10. １０．前記サイトカインレセプターが、インターロイキン−１Ｉ型レセプターで ある、請求項７に記載の方法。
11. １１．前記ＣＴＬが、ヒトＣＤ８＋ＣＴＬである、請求項１０に記載の方法。
12. １２．前記ＣＴＬが、腫瘍抗原またはウイルス抗原を発現する細胞に対して、細 胞溶解性応答あるいは特異性を有する、請求項１１に記載の方法。
13. １３．前記ウイルス抗原が、ＨＩＶに感染した細胞で発現される、請求項１２に 記載の方法。
14. １４．請求項１から１３のいずれかに記載の方法によって産生されるＴＨ非依存 性ＣＴＬ。
15. １５．哺乳類動物中で、腫瘍抗原またはウイルス抗原を発現する細胞を選択的に 殺す方法であって、（ａ）腫瘍抗原またはウイルス抗原にさらされたドナーから 、該腫瘍抗原または該ウイルス抗原を発現する細胞に対して、細胞溶解性応答あ るいは特異性を有する、細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬｓ）を単離する工程； （ｂ）該ＣＴＬｓの中に、該ＣＴＬｓの成長あるいは増殖を高め得るサイトカイ ンレセプターをコードする組み換え発現ベクターを導入する工程； （ｃ）哺乳類動物の中に、該腫瘍抗原または該ウイルス抗原を発現する細胞を殺 すのに充分な数の細胞溶解性応答または特異性を有するＴＨ非依存性ＣＴＬｓを 導入する工程；を包含する、方法。
16. １６．前記サイトカインレセプターが、インターロイキン−１Ｉ型レセプターお よびインターロイキン−１ＩＩ型レセプターからなる群から選択される、請求項 １５に記載の方法。
17. １７．前記サイトカインレセプターが、インターロイキン−１Ｉ型レセプターで ある、請求項１５に記載の方法。
18. １８．前記ＣＴＬｓが、腫瘍抗原を発現する細胞に対して細胞溶解性応答なたは 特異性を有する腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬｓ）である、請求項１７に記載の方 法。
19. １９．前記ＣＴＬｓが、ウイルス抗原を発現する細胞に対して細胞溶解性応答ま たは特異性を有する、請求項１７に記載の方法。
20. ２０．前記ＣＴＬｓが、ＨＩＶに感染した細胞に対して細胞溶解性応答または特 異性を有する、請求項１９に記載の方法。