【発明の詳細な説明】
初代リンパ球への効率的遺伝子転移
本発明の導く研究は、部分的に米国立衛生院(National Institute of Heal
th)助成金5R29CA50777−0、および米国立衛生院(National Insti
tute of Health)研究助成賞(Rcsearch Service Award)IT32A107043-01に
よって補助されている。合衆国政府は本発明にある種の権利を有している。本件
は、1993年7月30日出願の米国特願No.08/100,546の部分継続出願で
あり、35U.S.C.§§120および365により出願日の利益を請求している。
発明の分野
本発明はレトロウイルスベクターおよびヘルパー細胞を使用した外部遺伝子を
リンパ球に転移する方法に関する。本発明の遺伝子転移方法は薬剤選択をしなく
ても達成でき、体細胞治療およびリンパ球生物学にとって潜在的に重要である。
発明の背景
本発明の背景を説明し、そしてその実施に関して更に詳細を提供するためにこ
こに参照する開示はここに引例文献として取り入れられている。便宜上、本開示
は以下の本文において言及され、各々付属する引用文献において分類されている
。
レトロウイルスベクターは脊椎動物細胞に遺伝子を安定的に導入するための最
も効率的な道具である。臨床実験が、ヒトの遺伝子病を治療するためにレトロウ
イルスを使用して行われている
(アデノシンデアミナーゼ(ADA)欠損症)。先天性代謝異常を治す他に、遺伝
子治療はガンおよび種々のその他の疾病の治療に臨床的な試みがなされている(
Science,1992,Vol.258,744-746)。
レトロウイルスベクターは、基本的には対象とする遺伝子で置換された全ての
ウイルスタンパク質をコードする配列を含む損なわれたウイルスゲノムを含むレ
トロウイルス粒子である。その結果、そのようなウイルスはヘルパーウイルスの
助けなしには感染の1回転後もはや複製することができない。レトロウイルスベ
クター粒子はヘルパー細胞により生産される。そのようなヘルパー細胞はレトロ
ウイルス粒子生産や複製に必要なレトロウイルスタンパク質を発現するプラスミ
ド構造を含んでいる。レトロウイルスゲノムのそのようなヘルパー細胞への導入
(移入、トランスフェクション)の後、ベクターゲノム(RNAゲノム)はウイ
ルス粒子に(特異的な被包配列が存在するので)被包される。ウイルス粒子は、
対象とする遺伝子のみを含むゲノムを運搬しているヘルパー細胞から放出される
。新鮮な標的細胞に感染した後に、RNAゲノムはDNAに逆転写されそしてD
NAコピーは宿主ゲノムに組み込まれる。組み込まれたウイルスDNAはプロウ
イルスと称されている。最近10年間に、ニワトリあるいはネズミレトロウイル
スから誘導されたいくつかのトロウイルスベクター系が、種々の遺伝子の発現の
ために開発されている(総説としてTemin,1987;Gilboa1990を参照)。
ネズミ一次リンパ球への効率的な遺伝子転換
レトロウイルスベクターを使用した造血幹細胞への外来遺伝子
の効率的な導入を目指した実験動物モデルが多く注目されている(Williams et
al., 1984, Nature 310:476; Dzicrzak et al., 1989, Nature331:35; Bende
r et al., 1989, Mol. Cewll. Biol. 9:1426)。多能性幹細胞が全ての造血細
胞系列に再増殖する能力、および自己再生能力(Williams et al., 1984, Natur
e 310:476; Lemischka et al., 1986, Cell45:917)は、造血細胞に影響を及ぼす
遺伝子欠損を正しくするための標的細胞として好ましいものであるとされた(Pa
rkman, 1986,Science 232:1373)。しかしながら、技術的には、これは幾分困難
であることが証明された。第一に全骨髄はほんの少ししか多能性幹細胞を含んで
いないので、未だにこれらの細胞上にユニークな細胞表面マーカーが同定されて
おらず、従って詳細な分析のために十分な量を精製することが困難なことである
。かくして、これらの細胞への遺伝子転移は不十分であった(Szilvassy et al.
, 1989,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:8798)、そして転移が達成さ
れたとしても、転移された遺伝子の適切な発現はしばしば問題であった、それは
多分、多能性幹細胞は成熟に達するまでに多くの分化過程を経るので、導入され
た遺伝子の適切な発現が妨げられるからであろう。それゆえに、リンパ球系の区
画に影響するか、あうりは増強性免疫応答により治療されるようなある種の疾病
に対して、一次リンパ球への遺伝子転移は多分効果的であろうし、ある場合には
より適していることが示唆されたのである(Culver et al.,Proc. Natl. Aca
d. Sci. U.S.A. 88:3155; Culver et al., 1991, Human Gene Therapy
2:107)。一次リンパ球は容易に得られる;それらの多くは長寿命であり;そして
、それらはレトロウイルスベクター
を使用して感染に必要な段階に容易に増殖を誘導することができる(Richter et
al., 1984, Mol. Cell Biol., 4:151)。このような進歩は、近年、一次リン
パ球への遺伝子転移に関する研究を動機付けることになった。
B細胞系列体細胞遺伝子治療のためのネズミモデル
一次Bリンパ球への外来遺伝子の効率的な転移は、X-染色体性無ガンマグロ
ブリン血症(Vetrie et al .,1993, Nature 361:226;Tsukuda et al., 1993,
Cell 72:279)およぶADA欠損症(Anderson, 1992,Scicnce 256:808)のよう
な、B細胞区画に影響するような疾病の治療に直接的な治療効果を有している。
また、それは血友病(第VIII因子および第IX因子欠損症)(Miller, 1990,
Blood 76:271;Hoeben et al., 1992, Thromb. Haeost.67:341;Hoeben et
al., 1993,Hum. Gene Ther. 4:179)およびリポプロテインリパーゼ欠損症(
Haydcn and Ma, 1992, Mol. Cell. Biochem. 113:171; Auwerx et al.,19
92, Critical Review in Clinical Laboratory Sciences29:243)のような
、正常な遺伝子産物が血流中に分配されることが役立つような遺伝子病に治療効
果を有する。更に、B細胞は抗原提示細胞として機能するので、ガンあるいはウ
イルス抗原を発現して、抗ガン性あるいは抗ウイルス免疫応答を開始したり増強
したりするよう操作することができる。標的としてB細胞を使用する、更に付加
的な進歩は、イムノグロブリン重鎖および軽鎖遺伝子の発現を制御することにつ
いて多く知られるという事実である。この情報は、B細胞中の外来遺伝子の組織
特異的発現を至適化するために使用できる。更に、イムノグロブリン分泌経路を
外来遺伝子産物の多
量分泌に利用することができる。
外来遺伝子をリンパ球にレトロウイルスベクターを介して転移させることを含
むいくつかの遺伝子治療計画が臨床試験中である。これらには、アデノシンデア
ミナーゼ(ADA)遺伝子をADA欠損症の末梢血T細胞に導入する、重症複合型
免疫不全症(SCID)患者(Sprent, 1973, Cell. Immunol. 7:10; Stevens
et al., 1982, J. Immunol.128:844)、およびマーカー遺伝子あるいはリンホ
カイン遺伝子を腫瘍浸潤(TIL)T細胞に導入する(Kasis et al.,1990,Proc.
Natl. Acad.Sci. U.S.A. 87:473; Culver et al.,1991,同上、88:3155)
ことが含まれる。これらの計画では、安定して感染した細胞を増やすための標的
細胞のin vitroでの増殖および/または薬剤選択に長期間を必要とせねばならな
い。B細胞はin vitroでは効率的に増殖できないので、これらの方法は遺伝子を
B細胞に導入するには不適当である。更にまた、長期間培養した細胞は通常変わ
ったホーミングパターン(homing patterns)を示し、養子免疫細胞移入に際しリ
ンパ系器官へ適切に移行しない(Dauket et al., 1985, J. Mol. Cell. Im
munol.2:27; Tedder et al., 1990, J. Immunol. 144:532; Kishimoto et a
l., 1990,Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 87:2244)。
多発性硬化症
多発性硬化症(MS)は白質中に主に血管周囲における脱髄した「斑様」領域を
伴う中枢神経系の慢性的炎症の病気である。小分子ならびに細胞に対する血液脳
関門の透過性がMSでは亢進しており、脱髄斑は白血球、著しくリンパ球マクロ
ファージで浸潤されている。非常に組織的ならびに臨床症状は実験的疾病EAE
に特
徴付けられている(Sobel et al., 1984, J. Immunol.132:2393; Sedgwick e
t al., 1987, J. Exp.Med.165:1058)、そしてそれはMSに示も類似している
実験モデルであると考えられている。しかしながら、ある種の重要な相違がMS
とEAEの間、特に臨床経過において存在している。MSは明らかな再発症状発
現が重症で進行する神経機能障害の再発、寛解により特徴付けられる。一方、E
AEは通常一相性症状であり、完全な回復と次の攻撃に対する免疫を伴う急性症
状である。しかしながら最近、より慢性的なEAEの再発型を誘導する実験系が
マウスで開発された。慢性病は通常、宿主の免疫系を変えることにより、および
常法のMBP/CFA投与を使った誘導方法により、前感作T細胞を投与した動
物に実質的な割合でつくりあげることができる(Fallis and McFarland, 1989
, J.Immunol. 143:2160; Lassmann and Wisniewski, 1979,Acta Neuropat
hol. 47:111; Brawn and NcFarlin, 1981, J. lab. Invest. 45:278; Ben
-Nun et al., 1980, Nature 283:389; Lublin et al., 1981, J.Immunol.
126:819; Fritz et al., 1983, J. Immunol. 139:1024; Mokhtarian et al.
, 1983 Nature 309:356; Fallis et al., 1989,J. Neuroimmunol. 22:93)。
その他のMSのモデルとしてEAを使用したしばしば批評される問題点は、M
S患者の末梢血および脳脊髄液(CSF)からMBP反応性T細胞を単離する困難
さであった。事実、多くの最近の報告は、これがそうではないことを示している
。MBP特異的でクラスII限定CF4+T細胞が限定的T細胞レセプターを使用し
て、脳脊髄液および末梢血から分離され増殖されている。多分、MSに対する
EAE研究に関連する最適の実例は、いくつかは人間で現在臨床試験が行われて
いる、マウスで始まった実験から導かれる治療指針である。EAEの誘発および
/または再発を防止するために開発された戦略はMSの治療を開発するために重
要である。
本明細書に引用されているいかなる文献も、本発明の先行技術として使用し得
るものであって、容認されたものと解釈されてはならない。
図面の簡単な説明
第1図は本発明のレトロウイルスベクターを概略的に図示する。N2とAsAD
Aはモロニーネズミ白血病ウイルスを基にしたベクターである。N2はウイルス
長末端反復(LTR)プロモーターから発現したネオマイシンホスホトランスフェ
ラーゼII遺伝子(neo)を含んでいる。AsADAはウイルスLTRプロモーターか
ら発現したneoとADA内在性プロモーター(As)から発現したヒトアデノシンデ
アミナーゼ遺伝子(ADA)を含んでいる。
第2(A)図と第2(B)図はDN胸腺細胞中における遺伝子転移と発現を示すサ
ザンブロットである。第2(A)図はN2感染細胞のサザンブロットであり、第2(
B)図はAsADA感染細胞のサザンブロットである。第2(C)図はAsADAで
感染したネズミDN胸腺細胞におけるヒ卜ADA遺伝子ノ発現を示す。
第3図はリンパ節T細胞における遺伝子転移と発現を示す。第3(A)図におい
て、ゲノムDNAは感染後48時間に抽出された、次いで第2図の凡例に記した
ようにサザンブロッティングを行った。第3(B)図はAsADAで感染したネズ
ミリンパ節Tリンパ球にお
けるヒトADA遺伝子発現を示す。
第4図はリンパ節B細胞における遺伝子転移と発現を示す。第4(A)図におい
て、ゲノムDNAは感染後48時間に抽出された、次いで第2図の凡例に記した
ようにサザンブロッティングを行った。第4(B)図はAsADAで感染したネズ
ミリンパ節Bリンパ球におけるヒトADA遺伝子発現を示す。
第5(A)図はレトロウイルスベクターAsADAを概略的に図示する。AsAD
Aは、MLVLTRプロモーターから発現した細菌のneo遺伝子を含むG1Naベ
クター(Miller et al., 1992, Hum. Gen. Ther.3:619)およびその内在性プ
ロモーターから発現したヒトADA遺伝子である。第5(B)図はAsADAで感
染した脾およびLNB細胞のサザンブロット解析である。第5(C)図はネズミB
細胞中のヒトADA分析を示す。
第6図はAsADA感染LNおよび脾B細胞で再構成したSCIDマウスから
得た脾のフローサイトメトリー分析を示す。脾細胞を、LNB細胞を投与した代
表的なマウスから転移後4週間、第6(A,B)図、および脾B細胞投与マウスか
ら転移後3ヵ月、第6(C,D)図、フローサイトメトリーにより分析した。
第7(A)図は、標的B細胞に養子移入されたSCIDマウスの脾からえたゲノ
ムDNAのサザンブロット分析を示す。第7(B)図はSCIDマウスにおけるヒ
トADA活性を示す。
第8図は、自己抗原に対する不応答性を誘導するために、実験的自己免疫性脳
脊髄炎(EAE)、多発性硬化症(MS)の動物モデル、に関連した自己抗原の発現
のためのネズミ白血病ウイルスベクタ
ーの概略図を示すものである。
発明の要約
本発明は、薬剤選択なしに一次リンパ球細胞に外来遺伝子を効率的に導入する
ための方法に関する。本発明は、リンパ系分集団の増殖を誘導するに十分な時間
リンパ系分集団の増殖を誘導する成長因子で、選択したリンパ系分集団を刺激す
る段階、およびウイルス生産ヘルパー細胞系で刺激されたリンパ系分集団を共生
培養(co-culturing)する段階よりなる、ここにおいてヘルパー細胞系のウイルス
生産のレベルは1ml当り5×106から5×107コロニー形成単位(colony form
ing uits/ml)の範囲である。
そのようなレトロウイルスベクターは公知の手段で入手可能であり、また以下
の標準的な方法で調製される。例えば、そのようなヘルパー(またはプロデュサ
ー)細胞系は、ヘルパー細胞にベクターを移入し、次いで選択、細胞コロニーの
単離、およびウイルス生成細胞系がウイルスタイター5×106から5×107コ
ロニー単位/mlの範囲に生成するように同定されたウイルスタイターを決める、
ことにより生産することができる。
好ましくは、選択されたリンパ系分集団は、例えは集団から望ましくない細胞
を除去することによって、単離される。望ましくない細胞の除去は、リンパ細胞
の懸濁液をポリクローナルまたはモノクローナル抗体および補体で処理すること
により、パンニングにより、ナイロンウール選択により、分別勾配遠心法、また
は豊富なリンパ系分集団を得るように好ましくないリンパ細胞を分離する他のい
かなる技術によっても、達成することができる。そ
のょうなリンパ系分集団は特定のリンパ系列に再集団化することができ、あるい
は長寿命の集団となり得るのである。
共生培養が完了した後、感染リンパ球細胞は培養することができる。
発明の詳細な説明
本発明は、レトロウイスルベクターを使用して、リンパ球細胞、例えば一次、
成熟ネズミリンパ節TおよびB細胞、および一次、未成熟ネズミCD4,CD8ダ
ブルネガティブ(DN)胸腺細胞、に外来遺伝子を効率的に導入する方法に関する
。この新規遺伝子転移方法は、(a)外来遺伝子を運搬するレトロウイスルベクタ
ーの非常に高い力価を生産するヘルパー細胞の産生、(b)始原細胞の場合、特異
的なリンパ系列を再増殖するかあるいは、成熟リンパ球の場合、長寿命集団にす
ることができるかいずれかのリンパ系分集団の単離、および(c)標的細胞集団に
外来遺伝子を効率よく迅速に導入する、ことを提供するものである。
本発明の効率的な選択方法おw達成するために、ベクター生産ヘルパー細胞系
列が5×106から5×107単位/mlのウイルス力価を産生するようクローン化
され得る。本発明の方法は、また、SCIDに導入した場合、あるいは致死量の
放射線照射を受けた宿主がB細胞またはT細胞系列を再増殖するような、リンパ
系始原細胞についての精製手段をも包含する。精製手段は、また、SCIDまた
は正常宿主への養子免疫細胞移入に際し、長期間生存するような成熟B細胞また
はT細胞分集団びついて開発されたものである。本方法によると、24ないし4
0時間以内に、1から5、好ましく
は1から3のプロウイルスで標的細胞の90%以上が非常に急速に、かつ効率的
に感染に成功する。これらの進歩生は、遺伝子治療に著しく有利である、なぜな
ら目的とする望ましい遺伝子を発現する標的細胞を豊富にするために、現行の方
法で使用されている選択段階を排除できるからであり、それゆえに標的細胞がin
vitroで操作される時間を短縮でき、その結果宿主に一度戻し導入される細胞の
適切なホーミングが大きく改善されるのである。本新規遺伝子転移方法は、リン
パ球における遺伝子欠損から生起する遺伝子障害を強力に修正するものであり、
そして失われた遺伝子産物がリンパ球により組織的に供給されるような別の遺伝
子障害を修正するものである。
本方法の一つの観点によれば、レトロウイルスベクターおよびヘルパー細胞の
組み合わせがウイルス産生の高いレベル、即ち5×106から5×107単位/ml
、をもたらすことを決定することを含む。このベクター産生ヘルパー細胞系選択
方法においては、ベクターはヘルパー細胞に移入され、次いで選択、細胞クロー
ンの単離、そして5×106から5×107単位/mlの範囲ひウイルス力価が産生
されるようにウイルス産生細胞系を同定するためにウイルス力価が決定される。
本発明によれば、公知の多くの産生細胞系ベクターの組み合わせが、本発明の
実施のために使用することができる。一般的に、ベクターはヘルパー細胞系に移
入される。約5×105c.f.u./mlを産生する細胞系が選択される。これらの細胞
のサブクローニングにより、ウイルスの107c.f.u./mlまで産生することができ
る系を
とることができる。
以下に記すようなネズミリンパ球細胞に遺伝子転移するための特定の例におい
ては、細胞系はGP+E-86細胞系である(Elwood et al., 1994, Leukemia 8:1
06-114; Matsushita et al., 1993,Thombosis Res.69:387-393; Wilson et
al., 1993 Human Gene Therapy 4:25-34; Markowitz et al., 1990, Ann.
N.Y. Acad. Sci. 612:407-414; Moore et al., 1990, Blood 75:2085-92)
、これはNIH 3T3を基にした細胞系であり、ベクターはpN2(Moore et al.,
1991, Human Gene Therapy 2:307-315; Alford and Belmont, 1990, Hum
an Gene Therapy 1:269-276; Stoeckert et al., 1990, Experimental Hem
atology 18:1164-1170)およびpAsADAからなる群から選択されたものであり
、これらはMLV長末端反復プロモーターの制御に下にneo遺伝子を含むモロニ
ーネズミ白血病ウイルスを基にしたレトロウイルスベクターである。特別な例に
おいては、ベクターは内因生プロモーターの制御下でヒトアデノシンデアミナー
ゼ(ADA)遺伝子をコードしている。
ヒトリンパ球細胞に遺伝子転移を行う別の特別な例においては、ベクターはp
MFG-NB(Ferry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.88:8377-8
1)であり、そしてヘルパー細胞はイヌ骨肉種細胞から調製され得る。これはアメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)から、受け入れ番号CC
L183で入手可能である。このイヌ細胞系は公知の方法によりヘルパー系として
調製することができる(例えば、Pear et al., 1993, Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A.90:8392-96; Miller et al., 1991,J. Virol. 65:2220-2224
; Markowitz et
al., 1988, Virol. 167:400-406; Markowitz et al., 1988, Virol. 167:112
0-24; Danos and Mulligan, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.85
:6460-64; Dougherty et al., 1989,J. Virol. 63:3209, およびTemin and
Dougherty米国特許No.4,980,289およびaNo.5,124,263)。
別の本発明方法の観点によれば、本方法は特定のリンパ系列を再増殖できるよ
うな、あるいは豊富なリンパ球細胞分集団を得るために望ましくないリンパ球細
胞を除去するようなモノクローナル抗体でリンパ球細胞の懸濁液を処理すること
による長寿命集団であるような、リンパ球細胞分集団を分離することを含む。
更に別の本発明方法は、感染方法も含む。適当な生長因子を細胞が増殖性を保
つために被感染リンパ球の特定の型に加える。成熟B細胞に対しては、リポポリ
サッカライド(LPS)が使用される。成熟T細胞に対しては、コンカナバリンA
およびインターロイキン2の連続処理が利用される。
好ましくは、一次リンパ球細胞は増殖を誘導するに必要な時間、例えば約24
時間、の長さに刺激される。刺激されたリンパ球は、生長因子の存在下で非常に
高いウイルス力価を有するヘルパー(pろデューサー)細胞の叢と共に共生培養さ
れる。好ましくは、ヘルパー細胞は放射線照射される。照射はヘルパー/プロデ
ューサー細胞の生長を止めるが細胞はウイルスを産生する能力を有している。こ
のようにして、プロデューサー細胞の密集叢はプレートから生育しすぎることな
くもちあがることもない。プロデューサー細胞はプレートに接着し、リンパ球は
接着しない。リンパ球がウイルス組み込みに必要な段階に増殖すると、リンパ球
は形質転
換ウイルスで感染させられる。感染した(あるいはトランスフェクトした)細胞
は培養され、そして動物に返される。
本発明で使われるベクターは、ゲノムに共有結合しなければならないが、しか
しウイルスタンパク質生産に必要な配列を有していないで、ウイルスの複製のた
めのゲノムに必要な配列を有している。ベクターは、複製に必要なシス作用配列
を有するが、しかしトランス作用配列は有していない。プロデューサー細胞はウ
イルスタンパク質を発現するが、しかしウイルス(ウイルスに挿入することがで
きるゲノムを有しない)を産生しない、そして、従って、中空の粒子のみを生産
する。直鎖LTRを有するベクターは高いウイルス力価を与える。
一次リンパ球への効率的な遺伝子転移
本発明は、一次、成熟リンパ節TおよびB細胞、および完全なT細胞系列(Ni
kolic-Zugic, 1991, Immunol. Today)を再構築することのできる前駆細胞を
含む一次、未成熟CD4CD8ダブルネガティブ(double-negative, DN)胸腺細
胞に、外来遺伝子(約ゲノム当り1ないし5コピー)を効率的に導入するための
レトルウイルスベクターの使用に関する。一次細胞の効率的な感染は、標的細胞
をレトロウイルスベクターの高力価を生産する致死量を照射したヘルパー細胞と
共生培養することによって達成される。
以下の特定の例においては、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼII(nco)
遺伝子あるいはneoおよびヒトアデノシンデアミナーゼ(ADA)遺伝子の両者を
含むレトロウイルスベクターを保持しているヘルパープロデューサー細胞をリン
ホカインおよび/また
はマイトジェンの存在下で単離リンパ球と共生培養した。ネオマイシン選択なし
に、感染後2日で、1細胞当り1から5コピーの外来遺伝子がサザンブロット分
析で検出された。ヒトADAタンパク質の発現は、成熟TおよびBリンパ球にお
ける内因性ネズミADAタンパク質に比較しうるレベルで検出された、そして未
成熟DN胸腺細胞よりは幾分低かった。ここに記載した感染方法は24時間以内
に完成することができ、従ってin vivo動物再構築実験に有利である。
B細胞系列体細胞遺伝子治療
一次、成熟Bリンパ球は体細胞遺伝子治療の強力で重要な細胞標的である。そ
れらの抗原提示細胞として働く能力は、免疫応答の引き金および/または増強に
利用することができる。
別に、自己抗原を発現するB細胞は、自己免疫疾患の治療に抗原特異的不応答
を誘導するように操作することができた。例えば、自己抗原を発現する休止B細
胞の養子免疫細胞移入は、他の実験系で示したように、抗原特異的不応答を付与
するために使用することができた。例えば、MlsaのMlsbへの転移は、宿主のM
lsa特異的T細胞のクローンアネルギーおよび/またはクローン消失を誘導する
ことが示された(Rammensee et al., 1989, Nature 339:541-544; Webb et al
., 1990, Cell 63:1249-56)。この不応答の型は末梢性免疫寛容と呼ばれてい
る。下記の実施例に開示されているように、末梢性免疫寛容は自己免疫疾患、例
えば多発性硬化症、およびMS、EAEの動物モデル、同様にリウマチ性関節炎
、狼瘡(lupus)、シェーグレン症候群、およびその他の自己免疫疾患、に対して
、
特に強力であろう。本発明は、従って、末梢性免疫寛容の誘導はT細胞介在自己
免疫疾患の処理に有益な手段であることを証明することができた。
下記する実施例において論じたように、B細胞において自己抗原の移入のため
のベクターが調製できるので。従って自己抗原は、MHCクラスII分子に関連し
た提示をするための内在性細胞機構を経て転移するために、細胞質内で発現され
る(例えば、Braciale and Braciale, 1991, Immunol. Today 12:124; Brods
ky and Guagliardi, 1991, Ann. Rev. Immunol. 9:707)。より好ましくは、
自己抗原は、シグナル配列を含むことによって分泌タンパク質または細胞表面タ
ンパク質として発現することができ、そして、後者の場合には、膜結合配列であ
る。別の好ましい例においては、自己抗原は、細胞質末端において、エンドソー
ムまたはリソソーム標的配列と共に、キメラ構造として発現される(Braciale a
nd Braciale, 同上; Brodsky and Guagliardi, 同上;Peters et al.,1990,
EMBO J.9:3497; Bakke and Dobherstein, 1990, Cell63:707)。
別の観点において、自己抗原特異的不応答を誘発するためのベクターは抗原提
示細胞接着分子に対するアンチセンスコーディング配列、即ちT細胞への結合お
よび刺激を促進する分子、を含み得る。より好ましくは、ベクターは、そのよう
な細胞表面分子に特異的なリボザイムの発現を提供する。アンチセンスRNAま
たはリボザイムの共発現、更に、T細胞を刺激するのに重要である細胞表面補助
分子の発現、および一般的には免疫応答を減少することによってT細胞アネルギ
ーを増加させ得る。
更に別の観点において、ベクターは、T細胞活性化を阻害するリンホカインま
たはサイトカイン、例えばインターロイキン−10(IL-10)、これに限らない
が、を含み得る。
長寿命Bリンパ球細胞は正常化した遺伝子産物を血流中に放出するのに有益で
ある。
本発明に合わせて、動物モデル系が、薬剤選択なしに外来遺伝子を導入するた
めの効率的かつ迅速な方法がとられている、Bリンパ球細胞遺伝子治療について
、記述されている。
このモデルにおいては、脾とリンパ節(LN)B細胞は、それ自体のプロモータ
ーから発現されたヒトDNA遺伝子を含むレトロウイルスベクターで40時間以
内に、再現的に感染させられ得る。標的細胞は1細胞当り平均1−3コピーのプ
ロウイルスを含み、ヒトADAタンパクを高レベルで発現することができ、そし
てSCID宿主に養子免疫細胞移入するとき、リンパ系器官に適切に定着(home)
することができ、誘導遺伝子の発現レベルで検出し得るいかなる損失もなしに、
少なくとも3ヵ月は生き残ることができる。
本発明で使用される略号は以下の通りである:
pro:プロモーター;enh:エンハンサー;PBS:DNA合成のプライマー結合部
位;PPT:DNA合成のためのポリプリントラック;E:RNAパッケージング
のための包膜配列;attR+:組み込みに関連した接着部位の右側を形成する配列
;attL+: 組み込みに関連した接着部位の左側を形成する配列;attL+: 原プロ
ウイルスの左側接着部位の除去;およびattR+: 原プロウイルスの右側接着部位
の除去。
本発明は、目的の真核遺伝子を選択し、本発明にしたがってデ
ザインされたベクターに遺伝子を挿入し、そのベクターでヘルパー細胞をトラン
スフェクトし、ヘルパー細胞からウイルス株を培養し、培養した子孫ウイルスを
標的細胞に感染するために使用し、そして標的細胞に生成したプロウイルスがい
かなるレトロウイルスタンパク質も発現することなしに挿入した真核遺伝子を発
現させることである。プロウイルスで活性のあるレトロウイルスプロモーターは
ないので、内在性ヘルパータンパク質はプロウイルスからウイルス産生の引金と
はなり得ない。プロウイルス中にはレトロウイルスプロモーターが存在しないの
で、プロウイルスは、宿主細胞が意図しなかったように作用する引金となるよう
なレトロウイルスをもたらすことはできない。
本発明は以下の実施例を参照してよりよく理解されるであろう。実施例は例示
の形で示されるが、限定的なものではない。実施例1:リンパ球細胞へ効率的な遺伝子転移
材料と方法
一次ネズミリンパ球細胞への効率的な遺伝子転移
マウス
Balb/cBy、雌雄、マウスはJackson Laboratory, Bar Harbor,Maineから
購入した。
プラスミド
pN2はE.Gilboaから供与された。pN2とpAsADAは、モロニーネズミ白血病
ウイルス(MLV)に基づく、MLV長末端反復(LTR)プロモーターから発現さ
れたネイマイシンホスホトランスフェラーゼII(neo)遺伝子を含む、レトロウイ
ルスベクターである。
pAsADAは、内在性プロモーターから発現されたヒトアデノシンデアミナーゼ
(ADA)遺伝子を含む。このベクターはGene Therapy Inc.から供与された。
ウイルス産生細胞系
GP+E-86細胞系はNIH 3T3に基づくエコトロピックネズミパッケージング
細胞系(Markowitz et al., 1988, J. Virol.62:1120)である。GP+E-86細胞
はポリグレン/DMSOショック法(Kawai and Nishizawa, 1984, Mol. Cel
l Biol.4:1172)を用いてベクタープラスミドDNA5/gでトランスフェクトした
、次いでG418(0.35mg/ml)およびGPT(キサンチン0.25mg/ml、マイコフェノー
ル酸25/g/mlおよびヒポキサンチン15/g/ml)で選択した。N2でトランスフェク
トしたGP+E-86細胞は、NIH3T3細胞をヘルパー細胞上清の連続希釈で接種
して定量し、次いでG418(0.35mg/ml)の存在下2週間選択し、コロニーを計数し
て、ウイルス株2.0×107コロニー形成単位(CFU)/mlを得た。AsADAトRN
ンスフェクト細胞はウイルス株1.5×107CFU/mlを得た。
ダブルネガティブ(DN)胸腺細胞の調製
3ないし5週令のマウスから得た胸腺細胞を、モノクローナル抗体GK1.5(ラ
ット抗マウスCD4)(Wilde et al., 1983, J. Immunol. 131:2178; Dialyna
s et al., 1983, J. Immunol. 131:1445)、3.168(ラット抗マウスCD8)(
Sarimiento et al., 1980, J. Immunol.125:1665)およびモルモットとウサギ
の補体混合物の反応混液で処理してCD4+およびCD8+細胞を除去した。こ
の方法では、常法で、フローサイトメトリーによる分析で、2%以下のCD4+お
よび0.5%
以下のCD8+細胞を含むDN細胞集団を得ることができる。DN細胞はゲンタ
マイシン(50mg/ml)(GIBCO,Grand Island,NY)および2−メルカプトエ
タノール(50/M)(Sigma,St.Luisi,MO)加RPMI培地で培養し、感染前2
4時間組換えヒトインターロイキン7(rIL-7、50ng/ml)(Pepro Tech, Rock
y Hill, NJ)で刺激した。
末梢リンパ節リンパ球細胞の調製
リンパ節(LN)は親マウスから得た。Tリンパ球細胞は、LN細胞懸濁液をモ
ノクローナル抗体J11d、ラット抗ネズミ熱安定性抗原(HSA)抗体、で処理して
単離した。この抗体により補体も加えて、LN19から実際的にすべてのB細胞
を除去できる。Bリンパ球細胞は、ラット抗マウスThy-1.2抗体(Symington,19
81,J.Immunol.127:2496)であるモノクローナル抗体J1j ち補体で処理して単離
した。これらの処理方法は常法により、フローサイトメトリーで分析すると、各
々>97%のTまたはB細胞を含む濃縮TおよびB細胞集団が得られる。T細胞
濃縮集団中にB細胞0.5%以下が検出された(データは示さない)。T細胞を
ゲンタマイシン(50/g/ml)、2−メルカプトエタノール(50/M)を加えたRPMI
培地で培養し、コンカナバリンA(4/g/ml)で刺激した。24時間後、細胞を2回
洗浄し、組換えネズミインターロイキン2(Pepro Tech)10ng/mlを沸組む培地
に再懸濁した。B細胞をリポポリサッカライド(50/g/ml)で刺激した。
ウイルス感染
初代リンパ球細胞への遺伝子転移をウイルス産生細胞との共生培養により、お
よびウイルス産生細胞から培養の上清に接種する
ことにより試みた。共生培養による感染は、1×106細胞/ml−RPMIの密
度で刺激したリンパ球標的を、100mm組織培養プレート中の照射(1600ラ
ド)ウイルス産生細胞の集密的細胞叢に1×106に播種することにより行った
。DN胸腺細胞にポリブレン(6/g/ml)およびrIL-7(50ng/ml)を、Tリンパ球細
胞用にはrIL-2(10ng/ml)を、あるいはBリンパ球細胞用にはリポポリサッカラ
イド(50/g/ml)を培地に加えた。24時間後、初代標的細胞を収穫し、刺激剤リ
ンホカイン/マイトジェンを含む新鮮培地で培養した。72時間後、標的細胞ゲ
ノムDNAをサザンブロット分析用に抽出した、そしてタンパク抽出をADA活
性を測定するために行った。接種による感染はrIL-7(50ng/ml)およびポリブレ
ン(8/g/ml)の存在下、ウイルス上清5.0ml中20×106DN胸腺細胞を、2時
間37℃にてインキュベートすることにより行った。細胞を遠心し、rIL-7(50
ng/ml)を加えた新鮮培地に再懸濁し、収穫まで組織培養プレートで培養した。初
代リンパ球細胞の接種に使った感染ベクター上清が感染ベクターウイルスを含ん
でいることを保証するために、NIH3T3細胞を、感染ベクターウイルスが上清
中に含まれていることの確信を得るために平行して感染させ、そしてNIH3T3
細胞の感染を常に観察した。
DNAの単離をサザンブロット分析
SacI消化ゲノムDNA29/g/レーンのサザンブロッティングは、32Pラベル
neo特異的プローブ、pN2からの1.3kbEcoRI-Xho-I断片、を用いて常法(Sa
mbrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press)に従い行っ
た。プローブは任意にラベルした。コピー数の
対照はSacIでpN2およびpAsADAを消化して行いゲル上1ないし10プロウ
イルスコピー/ゲノムに相当する量を負荷した。
ADAアッセイ
感染2日後凍結/融解法により1×106標的細胞を融解し、ライゼートをセ
ルローズアセテートプレート(Helena Laboratories, Blaumont, Texas)にか
けた。ヒトおよびネズミADAアイソザイムをセルローズアセテートプレート上
で電気泳動により分離した(Lim et al.,1989, Proc. Natl.Acad. Sci. U.
S.A.86:8892)。酵素活性は、プレート上で分離されたADAアイソザイムをリ
ン酸緩衝液中アデノシン(2mg/ml)(Sigma)、ヌクレオシドホスホリラーゼ(15/g/
ml)(Bochringer Mannheim, Indianapolis, IN)、キサンチンオキシダーゼ(
0.06U/ml)(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)、フェナジンメトサ
ルフェイト(0.01mg/ml)(Sigma)、およびジメチルチアゾールジフェニルテトラ
ゾリウムブロミド(0.1mg/ml)(Sigma)を含む寒天重層を暗室中20分37℃反応
により検出した。
第1図は本発明のレトロウイルスベクターを概略的に図示する。N2とAsAD
Aはモロニーネズミ白血病ウイルスを基にしたベクターである。N213はウイ
ルス長末端反復(LTR)プロモーターから発現したネオマイシンホスホトランス
フェラーゼII遺伝子(neo)を含んでいる。AsADAはウイルスLTRプロモータ
ーから発現したneoとADA内在性プロモーター(As)から発現したヒトアデノシ
ンデアミナーゼ遺伝子(ADA)を含んでいる。
第2(A)図と第2(B)図はDN胸腺細胞中における遺伝子転移と発現を示すサ
ザンブロットである。第2(A)図はN2感染細胞のサザ
ンブロットであり、第2(B)図はAsADA感染細胞のサザンブロットである。
ゲノムDNAは感染2日目にSacIで消化し抽出した、次いでneo特異的プローブ
を用いてサザンブロティングを行った。10/gDNAを各レーンにつけた。第2(
A)図および第2(B)図のレーン:1(レーン1)あるいは10(レーン2)プ
ロウイルス/細胞に相当するプラスミドコピー数の対照群;非トランスフェクト
GP+E-86細胞(レーン3);N2-(A、レーン4)またはAsADA(B、レー
ン4)産生GP+E-86細胞;非感染DN胸腺(レーン5);rIL-7存在下で感
染させたDN胸腺細胞、ウイルス含有プロデューサー細胞上清と共に2時間イン
キュベーション(レーン6)によるもの、または照射プロデューサー細胞の集密
的細胞叢上で24時間共生培養(レーン7)によるもの;「非接着細胞」(もち
上がった、lifting)対照;共生培養のために播種したゲノムDNA単離直前に
得た新鮮なDN胸腺細胞と混ぜた、照射プロデューサー細胞からの上清(レーン
8)。
第2(C)図はAsADAで感染したネズミDN胸腺細胞におけるヒトADA遺
伝子ノ発現を示す。感染48時間後、標的細胞リゼート(1×106細胞/レーン
に相当)をセルローズアセテートプレート上で電気泳動し、ネズミADAアイソ
ザイムからヒトのを分離した。ADAタンパクは比色酵素測定法により検出した
。レーン:非感染DN胸腺細胞(レーン1);AsADAウイルス株を接種した
DN胸腺細胞(レーン2);AsADAウイルス産生細胞と共生培養したDN胸
腺細胞(レーン3);「非接着細胞」対照(レーン4);ヒト標準品:H9細胞
(希釈1:2、レーン5);ヒトT細胞系:
AsADAプロデューサー細胞(希釈1:10、レーン6)。
第3図はリンパ節T細胞における遺伝子転移と発現を示す。Tリンパ球細胞は
、補体の存在下、J11Dに特異的なモノクローナル抗体でリンパ節細胞を処理し
て単離した。T細胞はコンカナバリンAで一夜刺激し培養、次いで照射AsAD
A産生細胞と共生培養中にインターロイキン-2を加えた。
第3(A)図において、ゲノムDNAは感染後48時間に抽出された、次いで第
2図の凡例に記したようにサザンブロッティングを行った。レーン:1(レーン
1)および10(レーン2)プロウイルス/細胞に相当するプラスミドコピー数
の対照群;非トランスフェクトGP+E-86細胞(レーン3);AsADAトラン
スフェクトGP+E-86細胞(レーン4);非感染リンパ節Tリンパ球細胞(レー
ン5);AsADAウイルス産生細胞と共生培養したリンパ節T細胞(レーン6
);「非接着細胞対照」DNA抽出の直前新しく得たリンパ節Tリンパ球細胞と
混ぜた照射AsADAウイルス産生細胞からの上清(レーン7)。
第3(B)図はAsADAで感染したネズミリンパ節Tリンパ球におけるヒトA
DA遺伝子発現を示す。感染後48時間にADA測定を第2図に説明したと同様
に行った。レーン:「非接着」対照(レーン1);AsADAウイルス産生細胞
と共生培養したリンパ節T細胞(レーン2);非感染リンパ節T細胞(レーン3
);AsADA産生細胞(希釈1:10、レーン4);ヒト標準品:H9細胞(
希釈1:2、レーン5)。
第4図はリンパ節B細胞における遺伝子転移と発現を示す。Bリ
ンパ球細胞は、補体の存在下、pan-T細胞マーカーThy-1.2に特異的なモノクロ
ーナル抗体と共にリンパ節細胞と培養して増強させた。B細胞は感染1日前およ
び感染中リポポリサッカライドで培養して刺激した。
第4(A)図において、ゲノムDNAは感染後48時間に抽出された、次いで第
2図の凡例に記したようにサザンブロッティングを行った。レーン:1(レーン
1)および10(レーン2)プロウイルス/細胞に相当するプラスミドコピー数
の対照群;非トランスフェクトGP+E-86細胞(レーン3);AsADAトラン
スフェクトGP+E-86細胞(レーン4);非感染リンパ節Bリンパ球細胞(レー
ン5);AsADAウイルス産生細胞と共生培養したリンパ節B細胞(レーン6
);「非接着細胞対照」DNA抽出の直前新しく得たリンパ節Bリンパ球細胞と
混ぜた照射AsADAウイルス産生細胞からの上清(レーン7)。
第4(B)図はAsADAで感染したネズミリンパ節Bリンパ球におけるヒトA
DA遺伝子発現を示す。感染後48時間にADA測定を第2図に説明したと同様
に行った。レーン:ヒト標準品:H9細胞(希釈1:2、レーン1);AsADA
産生細胞(希釈1:10)レーン2);非感染リンパ節B細胞(レーン3);A
sADAウイルス産生細胞と共生培養したリンパ節B細胞(レーン4);「非接
着」対照(レーン5):上記の細胞のベクターゲノムコピーの対照。
B細胞系列体細胞遺伝子治療のネズミモデル
ネズミ白血病ウィルス(MLV)に基づいた、エコトロピックパッケージ細胞系
GP+E-86により産生されるヒトADAおよび細菌性ネ
オマイシン耐性(neo)遺伝子(第4A図)を含むレトロウイルスベクターAsAD
Aを用いた。(Braakman et al., 1992, Eur. J. Immunol. 22:63)。増殖し
たBリンパ球細胞を親C.B-17脾またはリンパ節からT細胞を除去して行った。
効率的にプロウイルスがぢきるように、B細胞をマイトジェンリポポリサッカラ
イド(LPS)で16時間増殖誘導した、そして24時間致死量照射したヘルパー
細胞を共生培養した。この方法により、脾およびLNB細胞の両者において標的
細胞ゲノム当り1ないし3プロウイルスコピーの感染効率が普通に得られた(第
4B図、レーン4、5)。これを、プロウイルスにあるneo配列に特異的なプロ
ーブを用いて、感染40時間後に標的細胞ゲノムDNAのサザンブロティングに
より評価した、そして5、1または0.5プロウイルス/ゲノムに相当するAsA
DAプラスミドコピー数対照と比較した(第4B図、レーン1−3)。第4B図
、レーン6は観察されるシグナルの一部が細胞が共生培養中に盛り上がったため
ヘルパー細胞のコンタミおこったためであるという可能性を除くためにデザイン
された対照を示す。この対照ではシグナルは検出されなかった。
ヒトADAタンパク発現は、内在性ネズミADA酵素からの外来ヒトADAを
分離するために電気泳動した標的細胞リゼートを用いて比色酵素測定を平行して
行って、測定した(Hayden and Ma, 1992, Mol. Cell. Biochem. 113;171;
Auwerx et al., 1992, Critical Reviews in Clinical Laboratory Scien
ces)。第4C、レーン3および4にみられるように脾およびLNB細胞両者のヒ
トADA酵素活性はネズミADA活性より高い。強く持ち上げられたヘルパー細
胞に起因するシグ
ナルは検出されなかった(第4C図、レーン5)。
サザンブロッティングが、感染細胞を増強するためにin vitro薬剤選択段階を
必要とせずに、非常に効率のよい遺伝子転移を40時間以内に完了することがで
きた、ということを示したので、初代B細胞はin vivoでの生存性と正常なホー
ミングパターンを保持していることが仮定された。これを試験するために、As
ADAレトロウイルスベクターで感染させたC.B-17脾細胞のホーミングパタ
ーンを新しい脾B細胞と比較した。51Cr標識B細胞をIgh-コンジェニックBalb
/cBy・SCIDマウスの群にi.v.投与した。レシピエントを18時間後に屠殺
し、種々の器官を取り出し、放射能レベルを測定した。第1表に示すように、A
sADA感染脾B細胞は新しい脾B細胞に類似したホーミングパターンを示した
。両群とも、細胞はレシピエントの脾に主として定着した。これは公表された報
告と一致する(Sprent, 1973, Cell Immunol. 7:10; Stevens et al., 1982,
J.Immunol. 128:844)、しかし脾に達した感染細胞の割合は7.14%であり
これは対照細胞に比べ減少している。肝は損傷したリンパ球を処理するので、両
群とも放射能は肝で最も高かった。肝に比較して脾の放射能比は転移した細胞の
生存数の程度を示している。感染細胞では、肝に対する脾の割合は新しいB細胞
(抗Thy-1.2および補体処理のみ)では0.28対0.65であって、これは40
時間の共生培養で脾に定着した生存細胞数は約半分に減少していることを示して
いる。
AsADA感染B細胞がin vivoで長期間生存するかを評価するため、C.B-1
7マウスからの脾およびLNB細胞をAsADAベクターウイルスで、記したよ
うに感染させた。そして10匹のIgh-コンジェニックBalb/cBySCIDマウス
(5-25×106細胞/マウス、i.v.)に養子免疫細胞移入を行った。
第5(A)図はレトロウイルスベクターAsADAを概略的に図示する。AsAD
Aは、MLVLTRプロモーターから発現した細菌のneo遺伝子を含むGlNaベ
クター(Miller et al., 1992, Hum. Gen. Ther. 3:619)およびその内在性プ
ロモーターから発現したヒトADA遺伝
子である。エコトロピックGP+E-86ヘルパーさしぼう(Braakman et al., 199
2, Eur, J. Immunol.22:63)はヘルパー細胞上清の連続希釈でNIH3T3を接
種して測った結果2×107CFU/mlでAsADAを産生する。AsADA産生細胞
を常に試験して、いつも接種したNIH3T3細胞での逆転写酵素活性の測定によ
って複製感応ウイルスの産生がないことが見い出された。
第5(B)図はAsADAで感染した脾およびLNB細胞のサザンブロット解析
である。初代C.B-17B細胞は抗Thy-1.2mAb JIjおよび補体で脾またはLN細
胞を処理して得た(Braakmann et al.,1992,Eur.J.Immunol.22:63)。B細胞
は、前に記したように、LPSの存在下24時間、致死量照射ヘルパー細胞の密
叢と共生培養することによりAsADAに感染する前に、LPS(50/g/ml)で一夜
培養した。(Kuo et al., Blood, 投稿中)。ゲノムDNAは48時間後に標的細
胞から抽出した、そしてサザンブロッティングを制限酵素SacI、これはneo特異
的配列でハイブリダイゼーションにより3.7kbプロウイルス断片を与えるが、
を用いて行った。レーン:1-3、5.1および0.5プロウイルスコピー/細胞に相
当するSacI消化pAsADAプラスミドDNA;4、AsADA感染脾B細胞;5
、AsADA感染LNB細胞;6、共生培養で持ち上がった(非接着)ヘルパー
細胞が標的細胞から得られたシグナルに影響するかどうかを測るための上清対照
。非感染LN細胞(持ち上がるかもしれないわずかのヘルパー細胞のためのキャ
リアーとして使用)を、ゲノムDNA抽出の直前に共生培養のために接種した照
射ヘルパーからの上清に加えた。;7、非感染LN細胞。
第5(C)図はネズミB細胞中のヒトADA分析を示す。平行実験で、感染48
時間後、1×106標的細胞からのリゼートをネズミADA酵素からヒトのを分離
するためにセルロースアセテートプレートで電気泳動し、そしてADA活性を比
色酵素測定法で検出した(Kuo et al., Blood, 投稿中)。レーン:1、AsA
DA産生細胞;2、ヒト標品:H-9T細胞系;3、ネズミ標品:非感染LN細
胞;4、AsADA感染脾B細胞;5、AsADA感染LNB細胞;6、上清対照
(B細胞の)。
第6図はAsADA感染LNおよび脾B細胞で再構成したSCIDマウスから
得た脾のフローサイトメトリー分析を示す。C.B-17マウスからのLNおよび
脾B細胞を、第4B図に記載したようにAsADAで感染し、軽く照射した(2
00ラド)Igh-コンジェニックBALB/cBy SCIDマウス(5×106LNB
細胞、17×106脾B細胞i.v.)に投与した。脾細胞を、LNB細胞を投与した代
表的なマウスから転移後4週間、第6(A,B)図、および脾B細胞投与マウスか
ら転移後3ヵ月、第6(C,D)図、フローサイトメトリーにより分析した。106細
胞をドナーC.B-17Ighアロタイプ/b、およびレシピエントBALB/cBy Ig
hアロタイプ/aに特異的なモノクローナル抗体で染色した(Oi et al., 1978,
Curr. Top. Micro. Immunol. 81:115)。5000細胞をエピックスプロファ
イルで分析した。
第7(A)図は、標的B細胞に養子移入されたSCIDマウスの脾からえたゲノ
ムDNAのサザンブロット分析を示す。脾B細胞を第4B図に記したようにAs
ADAで感染した、そして直ちに10匹のSCIDマウス(5-25×106細胞/マ
ウスi.v.)に投与した。レシピエ
ントマウスを1および3ヵ月後に屠殺し、脾からゲノムDNAを抽出した。第4
図に記したと同様にサザンブロッティングを行った。レーン:1-4、転移後1
ヵ月目に屠殺したレシピエントマウス;または5-19、屠殺後3ヵ月;11、
再構成しないマウスからの対照;12-14、夫々0.5、1、および5プロウイルス
コピー/細胞、に相当するsacI消化pAsADAプラスミドDNA。
第7(B)図はSCIDマウスにおけるヒトADA活性を示す。1×106リンパ
球細胞に相当する脾細胞リゼートで第4図に記したと同様に、ヒトADA活性を
測定した。レーン:1、AsADAヘルパー細胞;2、ヒトH-9T細胞系;3-
6、転移後1ヵ月のレシピエントの脾;7-12、転移後3ヵ月。
結果
初代ネズミリンパ球への効率的な遺伝子転移
DN胸腺への効率的な遺伝子転移
CD4-CD8-(DN)胸腺は補体の存在下抗CD4および抗CD8モノクロ
ーナル抗体で胸腺を培養して3ないし5週令マウスから誘導された。これにはベ
クターN2およびAsADAを使用した。N2およびAsADAはモロニーネズミ
白血病ウイルス(MLV)に基づいたベクターである。エコトロピックパッケー
ジング細胞系、GP+E-86,14をウイルス生産に使用した。これらの細胞は複製
受容能力を有するMLVがなくてもMLVに基づくベクターウイルスを産生する
ように設計されている。N2はネオマイシントランスフェラーゼII遺伝子(neo)
を含み、AsADAはneoとヒトアデノシンデアミナーゼ遺伝子(ADA)を含む(
第1図)。
DN胸腺細胞を、照射した、N2またはAsADAベクターウイルス産生細胞
のいずれかの密集培養と共生培養により、あるいは組換えヒトインターロイキン
-7(rIL-7).21の存在下にウイルス含有上清とインキュベートするかによって
、感染させた。rIL-7はMLVに基づくベクターウイルスによる感染に必要な
工程であるDN胸腺細胞の増殖を刺激するのに必要である(Richter et al., 19
84, Mol. Cell. Biol. 4:151)。共生培養の24時間後に、標的細胞を新鮮な
プレート移し、もち上がった産生細胞が再び接着するように2日間培養した。こ
の培養期間は転移した遺伝子を発現するための時間を細胞に与える。サザンブロ
ット分析によりウイルスDNAの蓄積、および酵素測定法によりヒトADAタン
パクの存在のため細胞を分析した。
ゲノムDNAはSacIで消化した。うまくプロウイルスが生成していると、3.3
kbのneo特異的配列とハイブリダイゼーションをするとN2感染細胞では3.7kbの
バンドが得られる(第1図)。第2図に示したように、1細胞当り約1-5プロ
ウイルスに相当するシグナル(走査ゲルデンシトメトリーで定量および1または
10コピーに相当するプラスミド対照と比較)が、DN胸腺細胞と照射N2産生
細胞(第2A図レーン7)またはAsADA産生細胞(第2B図レーン7)の共
生培養の後に得られた。対照的に、接種により感染させた細胞は、N2接種(第
2A図レーン6)、AsADA接種(第2B図レーン6)のように2週間の露出
でやっと検出できる(データは示さない)、非常に弱いシグナルを与える。一細
胞当り約0.1プロウイルスに相当するシグナルは、接種による感染は
約50倍も、共生培養による感染に比べて効率が悪いことを示している。初代リ
ンパ球細胞の感染は6時間ないし一夜の長時間の培養が必要である。更に、これ
はウイルス力価が約8倍(NIH3T3細胞で1×108力価/ml)に増えた濃厚ウ
イルス液で行われたのである。濃厚ウイルス株と長時間の培養にもかかわらず、
効率的な遺伝子は、共生培養のようには、得られなかった。非感染対照リンパ球
細胞(第2AおよびB図、レーン5)およびGP+E-86細胞(第2AおよびB図
、レーン3)はneoについて陰性であった。N2産生細胞(第2A図、レーン4
)およびAsADA産生細胞(第2B図、レーン4)は陽性対照のような結果で
あった。
共生培養で感染した胸腺細胞を、共生培養中に持ち上がった産生細胞が再び接
着するように新しい組織培養プレートに加えたが、この工程の後にもヘルパー細
胞が初代細胞培養に混入するかもしれないのを制御するのに、それは有用である
と信じられた。これを制御するため、リンパ球細胞なしに培養した照射AsAD
AおよびN2ヘルパー細胞からの上清を測定した。リンパ球細胞と共に共生培養
した培地と同様に操作した。これらの上清は新しく得られたDN胸腺細胞に加え
られ、すぐ後にゲノムDNAの抽出が行われた(AsADA上清の一定量を後のA
DA測定に使用した)。非接着細胞の数は全体に比べ少しであるので、DN胸腺
細胞をキャリアーとして作用するために加えた。第2図(AおよびB、レーン8
)にみられるように、この対照からばシグナルは見られなかった。このことは感
染させたダブルネガティブ胸腺細胞で得られた陽性シグナルは(第2AおよびB
図、レーン7)混入したヘルパー細
胞によるものではなかった。
ネズミDN胸腺細胞でのヒトADA遺伝子の発現
先に記したように、共生培養によりまたは接種かによりレトロウイルスベクタ
ーAsADAで感染したDN胸腺細胞を収穫し、新しいプレートに移し、ヒトA
DA遺伝子が十分に発現するように2日間培養した、そして共生培養した標的細
胞の場合には、非接着細胞が再接着するようにした。標的DN胸腺細胞のヒトA
DAタンパク発現を測定した。第2C図は標的DN胸腺細胞のADA測定を示す
。ヒトADAタンパクはセルロースアセテートプレートで標的細胞リゼートを電
気泳動しネズミADAアイソザイムから分離した。タンパクの検出は比色酵素測
定法で行った(材料と方法)。結果は外来ヒトADA遺伝子は共生培養胸腺細胞
中に発現されたことを自召している。発現レベルは、内在性ネズミADA遺伝子
の発現よりいくぶん低い(第2C図、レーン3)。AsADAベクターのないウ
イルス株と接種したDN胸腺細胞中にはヒトADAの発現はみられなかった(第
2C図、レーン2)。この結果は、DN胸腺細胞の接種により得られたプロウイ
ルスコピー数が極端に低いことと一致する(第2B図、レーン6)。ネズミDN
胸腺細胞とヒトH-9細胞(T細胞系)をネズミおよびヒトアイソザイムの標品と
して使用した(第2C図、レーン1および5)。第2C図、レーン4は、ADA
測定の直前に新しく得たDN胸腺細胞と混ぜた、胸腺細胞と共生培養胸しなかっ
た照射AsADAヘルパー細胞からの上清を用いた「非接着」対照を示す。ヒト
ADA発現は検出されず、このことはDN胸腺細胞から得られたADAシグナル
はヘルパー細胞の混入に
よるものではないことを示している。
ネズミリンパ節TおよびBリンパ球細胞での
ヒトADA遺伝子の効率的な転移および発現
リンパ節TおよびB細胞を材料と方法の記載に基づいて調製した。細胞はT細
胞ではConA、B細胞ではLPSで24時間刺激した。次いで洗浄し、そしてポ
リブレン、rIL-2(T細胞)またはLBS(B細胞)の存在下AsADA産生細胞
の密集照射細胞と共生培養した。24時間後、標的細胞を新鮮なプレートに移し
、更に48時間非接着のヘルパー細胞が再接着するように、培養した。細胞は収
穫し、ゲノムDNAを抽出し、あるいは一定量をタンパク発現のADA測定に用
いた。
標的細胞DNAのサザンブロッティングは、1細胞当り1ないし10コピーに
等しいプラスミドコピー数対照と比較するとき(第3Aおよび4A図、レーン1
および2)、1細胞当り平均約1ベクタープロウイルスがとよびB細胞に転移さ
れていることを示した(第3Aおよび4A図、レーン6)。DNA抽出またはA
DA測定の直前に新しく得られたリンパ節細胞と共に標的細胞と共生培養しなか
った照射ヘルパー細胞プレートから得られた混合上清からなる「非接着」対照は
シグナルを与えない(第3Aおよび4A図、レーン7)。よってこのことは、共
生培養した標的細胞で得られたシグナルは非接着ヘルパー細胞の混入によるもの
ではない。
標的細胞リゼートのADA測定は、AsADA産生細胞と共生培養したリンパ
節とよびBリンパ球細胞は内在性ネズミアイソザイムに比較し得るレベルで外来
ヒトADAタンパクを発現した(第3B
図、レーン2;4B図、レーン4)。混入したヘルパー細胞の「非接着」対照は
、前に記したように、ADAシグナルを与えない(第3B図、レーン1;4B図
、レーン5)。これらの結果は感染効率は高く、約1細胞当り1コピーであり、
そして外来ADA遺伝子の発現レベルは内在性遺伝子の発現レベルに比較しうる
ことを示している。
B細胞系列体細胞遺伝子治療のネズミモデル
第6図に示したように、感染B細胞は、主にレシピエントマウスの脾に定着す
る、そこではドナータイプIgh(/)アロマタイプマーカーに特異的なモノクローナ
ル抗体を用いたフローサイトメトリー(FACS)分析によって、少なくとも3ヵ
月は検出された(Oi et al., 1978, Cur. Top. Micro. Immunol. 81:115)
。脾B細胞は、LNB細胞よりはレシピエントネズミのB細胞区画に再構成され
やすいが、しかしドナータイプLNB細胞は、SCID脾でたやすく検出される
。第6A,B図はLNB細胞と養子免疫細胞移入を行ったSCIDマウスの脾の
フローサイトメトリー分析を示す。脾のリンパ球細胞の24.3%がドナーIgh-5
アロタイプを発現し、16.8%が宿主Igh-5アロタイプを発現した。宿主型細胞
は「漏出」型細胞であり、多くはC.B-17SCIDマウスに見い出される(Bo
sma et al., 1988, J. Exp. Med. 167:1016)。第6C、D図は脾B細胞と養
子免疫細胞移入を行ったSCIDマウスの脾のフローサイトメトリー分析を示す
。転移後3ヵ月において脾のリンパ球細胞の44.8%がドナー由来であり、ほ
んの6.8%が宿主由来であった。ドナー型のリンパ球細胞がLN中に検出され
たが、少数であった(データは示さない)。こ
れは、B細胞はマウスに養子免疫細胞移入の後に脾に優先的に定着するという報
告と一致する(Oi et al., 1978, Cur. Top. Micro. Immunol. 81:115)。S
CIDマウスのLNは萎縮であるから、リンパ系の再構築に続いてLNが正常な
大きさになるのに長期間を要する。完全にLNを再構成するには、細胞移入でな
されるよりももっと大量のリンパ球細胞の流入が必要であると考えられる。感染
細胞と外来遺伝子発現の持続性をレシピエント動物の脾および胸腺で少なくとも
3ヵ月しらべた。転移後1ヵ月および3ヵ月の全脾から単離された全ゲノムDN
Aのサザンブロッティングは、シグナルを検出するのにPCR増幅を必要とせず
、しらべた全10匹のマウスで、プロウイルス陽性であった。第7A図、レーン
10、において、養子免疫細胞移入後1おおび3ヵ月で10匹のマウスでのプロ
ウイルスシグナルを示す。0.5、1および5プロウイルス/細胞に等しいAsADA
プラスミドコピー数対照に比較して(第7A図、レーン12-14)、プロウイ
ルスは、各脾に0.1ないし0.5コピー/細胞の範囲で、非リンパ系細胞の数に
比例して、存在している、そして漏出細胞も各脾に存在している。再構成SCI
Dマウスの脾細胞の少しの割合がリンパ球細胞であり、それゆえに分析されたD
NAのほとんどが、無関係の非リンパ系細胞から由来していることに注目するこ
とが重要である。それゆえ、これらの結果は、遺伝子転移効率は非常に高く、感
染細胞(またはそれらの子孫)は少なくとも3ヵ月は著しい数が持続することを
証明する、第4図のデータを確証している。いくつかのマウスの腎および肝から
抽出されたゲノムDNAは、いつも、プロウイルス配列について陰
性の結果を与えた(データは示さない)。
討論
初代ネズミリンパ球細胞への効率的遺伝子転移
in vitroで比較的短時間の間に初代リンパ球細胞に遺伝子を導入する能力は特
に重要である、なぜなら、in vivoで不適当な定着をもたらす細胞損傷や細胞表
面の変化を最小にできるからである。T細胞にレトロウイルス介在遺伝子転移の
報告はいくつかある。しかし、これらの報告は、殆ど転移したT細胞系(Krauss
et al.,1991, Human Gene Therapy 2:221)、長期間のT細胞クローン(Culv
er et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA; Uchida et al., 1986
, J. Immunol. 136:1876)、あるいはIL-2存在下で長期間の展開(Culver e
t al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3155)などに限られてい
た、しかもほとんどの例で感染集団を増やすのに薬剤による選択が必要であった
。1つの報告では、初代T細胞の移植して数日以内の遺伝子転移が報告されてい
るが、これは初代T細胞のたったの5%の平均遺伝子転移であり、そしてこれは
細胞障害性T細胞分集団についてしらべられたものであった(Remann et al., 1
981, J. Immunol, Methods 89:93)。それゆえに、初代B細胞およびDN胸
腺細胞への効率的な遺伝子転移についてはいめての記述とは別に、本発明は、in
vitroでは長い間展開がなかった初代成熟T細胞に、初めて詳細に描写した、効
率的な遺伝子転移を記載するものである。
ここに記したデータは、1細胞当り平均1ないし5プロウイルスに達する遺伝
子転移、および外来ADA遺伝子の発現レベルが標
的細胞の内在性ADA遺伝子のそれと比較し得るものであることを示している。
全ての細胞が標的となることは記載された実験からは確かではないが、大きな割
合で細胞が感染していることはいえる。もし、例えば、ほんの1%の細胞が効率
的に感染されれば、1細胞当り100から500のプロウイルスが侵入したこと
になり、これは大きな変異負担をもたらし、正常な機能や生存に有害な作用を及
ぼすようなものである。レシピエントとしてSCIDマウスを使ったホーミング
実験は、感染した細胞は適切に定着する能力を保持しており、ヒトADA遺伝子
の発現が転移後動物中で少なくとも2ヵ月は検出されることを示している(論文
準備中)。したがって、ほんの少しの割合の細胞が標的となっていることはあり
そうもない。しかし、感染細胞の割合をより精密に評価するために、組織化学的
に検出し得るタンパク(例えばβ-ガラクトシダーゼおよびヒト胎盤アルカリ性
ホスファターゼ)(Fields-Berryet al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 89:693)をコードしたベクターが将来の研究のために構築されつつある。
初代ネズミリンパ球に効率的に遺伝子転移を行うのに重要と思われているいく
つかのパラメーターがある:1)NIH3T3細胞で約107CFU/mlの力価を与え
るウイルス株を産生するに必要なプロデューサー細胞系。初代DN胸腺細胞に遺
伝子転移が、NIH3T3細胞で1×106から2×107/mlの範囲でベクターウ
イルス力価を産生する別々のヘルパー細胞クローンを使って試験された、ことに
注目すべきである。共生培養で初代細胞への遺伝子転移は、NIH3T3細胞で相
当する力価が107/mlに近いときに、1細胞当
り1プロウイルスという値に近づきはじめたのである。それゆえに、このことが
一度観察されると、初代細胞への遺伝子転移は107/mlの範囲の力価を与える
プロデューサー細胞で試みられただけであった;2)別の記載で示されているよ
うに、致死量照射ウイルス産生細胞との共生培養(Culver et al., 1991, Proc
. Natl. Acad. Sci. USA 88:3155; Beusechem et al., 1992,, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 89:7640)はフリーウイルス株に感染するよりもも
っと効率的であった。成熟およびB細胞への転換について上清接種対共生培養が
試験された。DN胸腺細胞でのように、上清接種は効果的な遺伝子転移について
共生培養と同じくらい効率的に近いとはいえない(データは示さない)。3)予
想した通り適切なマイトジェンおよび/または生長因子の存在不存在は効果的な
遺伝子転移に重要である、なぜなら使用したレトロウイルスベクターはプロウイ
ルス生成に細胞の複製が必要であるMoMLVガンレトロウイルスから誘導され
たものであるからである(Richter et al., 1984, Mol, Cell. Biol. 4:151)
。
AsADAベクターで、初代細胞標的に導入したヒトADA遺伝子の良好な発
現が、内在性ADA遺伝子の発現レベルに比較しうる位に得られた。しかし、他
のベクターの発現と同様のレベルは得られなかった。別のネズミ白血病ウイルス
に基ずくベクターが種々のプロモーターを利用して使われたが初代細胞では一定
でない発現結果であった(共生培養方法により使用した全てのベクターでは良好
な転移効率が一貫して得られたにもかかわらず)。他の方法にはヘルペスシンプ
レックスウイルスtkプロモーター、SV40
初期遺伝子プロモーター、およびサイトメガロウイルス即時型遺伝子プロモータ
ーを含む。しかし、これらのプロモーターは関連ある別のベクターで初代リンパ
球細胞における受け入れられ得る発現レベルを与えた。ほとんど全てのベクター
が、種々の確立された細胞系、例えばNIH 3T3やBV5417において、よ
く発現することが見い出された。しかし、不死化したあるいはガン細胞系におい
て発現するベクターの能力は、初代リンパ球細胞で発現する能力は貧しいもので
あった。
初代リンパ球細胞への遺伝子転移による治療に適した病気が多くある。既に、
アデノシンデアミナーゼ(ADA)遺伝子欠損による重症複合免疫不全(SCID)
の患者の初代ヒトリンパ球細胞が、正常ヒトADA遺伝子のレトロウイルス介在
転移のレシピエントとして使われている(Culver et al., 1991, Human Gene
Therapy)。体細胞遺伝子治療に使われるはじめての治療にこのSCIDを選ぶ
重要な因子は、正常ADA遺伝子の転移は、感染が成功し外来ADA遺伝子が発
現した患者のリンパ球細胞に選択的に生育進歩をもたらすことである。従って、
誰でも、1細胞当り1外来遺伝子に達する非常に効率的な遺伝子転移を必要とす
ることとせずに治療効果を得ることが期待できた。しかしより効率的な初代Bお
よびT細胞への遺伝子転移が、この病気でさえも治療を増強することができるの
である。これらの実験は初代LNBに効果的な遺伝子転移を示した。そしてT細
胞は、リンパ節と末梢血は非常に少ない割合でTおよびB細胞サブセットを含む
ので末梢血リンパ球細胞に効率的に遺伝子転移を行う適切なモデルである。LN
TとB細胞が使用された理由
は、末梢血の代わりにマウスのリンパ節から記載された実験を行うのに必要な細
胞数を得るのが容易なことである。
他の疾病については初代リンパ球細胞に外来遺伝子を効率よく導入する重要性
はより決定的である。例えは、細胞内免疫方法がHIV感染患者の治療に提案さ
れている(Baltimore, 1988, Nature 335:395)。これらの方法は、HIV免疫調
節タンパクに結合して拮抗するようHIVのシス作用配列を効果的に転移する(
Zimmerman et al., 1992, human Gene Therapy 3:155)、および/またはHI
V複製を阻害するためにトランス優勢変異HIV調節タンパクをコードした遺伝
子(Pearson et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:5079; Ma
lim et al., 1989, Cell 58:205; Hope et al., 1992, J. irol. 66:1849)
。最近Malim等(Malim et al., 1989, Cell 58:205)は、HIV revタンパク
のトランス優勢変異株をコードするレトロウイルスベクターを導入したT細胞系
はHIV複製ができなかった、ことを報告している。この結果は末梢CD4+T細
胞またはリンパ系幹細胞にトランス優勢変異遺伝子の効果的導入はAIDSにつ
いて治療の重要性があることを示している。
養子免疫治療(Howes et al., 1979, Nature 277:67; Byrne and Oldstone
, 1984 J. Virol. 51:682; Greenberg, 1991, Adv. Immunol 49:281)は初
代リンパ球細胞に効率的に遺伝子導入を行う別の方法である。最近多くの方法が
提案されている。それにはガンとの戦いを助けるために患者に、移植用に自己T
細胞をin vitroで増殖する(Greeberg, 1991, Adv. Immunol, 49:281)、免疫
易感染性宿主における感染(Riddell et al., 1992, Science 257:238)、およ
びAIDS(Miller,
1992, Nature 357:455)がある。これら細胞の遺伝子操作は、より強力な作用や
、安全性を含む進歩が要請される。この目的に強力に有益な遺伝子の型は免疫応
答を増強することができる免疫調節分子をコードした遺伝子、あるいは患者に再
導入した後リンパ球細胞のオートクリン増強を導入することができる生長促進作
用である。これは治療効果のある細胞を十分に蓄積するために当面必要な長期間
の細胞増加の必要性を除くことができるであろう(Riddell et al., 1992, Sci
ence 257:238; Miller, 1992, Nature 357:455)。更に重要なことは、移植細
胞が発ガん性を帯びたり、他の異常をきたしたときや、必要性がなくなってしま
ったときなどに移植細胞を破壊するのに使う「自殺」遺伝子の効率的な導入、で
ある(Lupton et al., 1991, Mol. Cell. Biol. 11:3374)。
体細胞遺伝子治療に予言される価値に加えて、初代リンパ球細胞の遺伝子操作
はリンパ球生物学の基本的な疑問を研究する有用性を証明するであろう。例えば
、免疫DN胸腺細胞および他のリンパ球前駆体に免疫調節遺伝子を効率よく転移
することはT細胞の展開の研究に重要である。またレトロウイルスベクターで始
原リンパ系細胞を遺伝子マークすることはリンパ球の分化とホーミングの研究の
道具となる。
まとめると、レトルウイルスベクターは外来遺伝子を初代ネズミリンパ球細胞
に効率的に導入するのに使うことができ、安定して感染した細胞を増やすために
薬剤選択を必要とせず、平均1細胞当り1ないし5コピーが得られることが実証
された。更に、転移したヒトADA遺伝子は、細胞、特に成熟TおよびB細胞で
高レ
ベルに発現されることが示された。このことはネズミの系はリンパ系の初代細胞
に効率的に遺伝子転移を行うに必要な遺伝子治療の適切なモデルであることを示
している。
B細胞系体細胞遺伝子治療のためのネズミモデル
外来遺伝子発現が、転移後1ヵ月および3ヵ月のレシピエントマウスの全てに
おいて、全脾組織からつくった細胞リゼートでのヒトADA活性を酵素測定する
ことにより実証された。第7B図、レーン3-12は、第7A図示されるマウス
でのヒトADA活性を示したものである。SCID脾では、ヒトADA活性は、
内在性ADA遺伝子(骨髄系および赤血球細胞)を発現する脾に存在する別の型
の細胞が存在するので、ネズミADA活性と同じ位の強さには、現われない。こ
れを考慮すると、外来遺伝子の発現レベルは、第6図と同様にFACS分析によ
り定量した、マウスにおけるドナーリンパ球細胞の割合によく相関している(デ
ータは示さない)。第7B図で証明したように、ヒトADAの発現レベルは転移
後1ヵ月と3ヵ月の間に低下しなかった、そして実際6ヵ月、9ヵ月でも同じレ
ベルを保っていた。各マウスのヒトADAレベルはプロウイルスコピー数で精密
には相関していないが、これは誤解されるもとである、なぜなら結果は測定手順
に固有の相違を反映しているからである。ADA測定は1×106の測ったリン
パ球細胞に相当する各マウスからの脾組織量で行っている。宿主細胞は、外来ヒ
トADAのシグナルを出すために希釈していない、しかし代わりにネズミADA
シグナルがより大きくなる。これに反して、関係のない宿主の細胞は外来DNA
からのシグナルが希釈されてしまう、
なぜならゲノムDNAは全脾から抽出されたものであり、各レーンに一定のゲノ
ムDNAを使っているからである。従ってADA活性測定は宿主細胞の数とは独
立しているが、しかし、サザンブロティングは影響される;このことは第7Aと
7B図の間の変化で証明できる。ヒトADA遺伝子を発現するADA遺伝子はL
Nにも見い出されるしかし、SCIDLNは常に小さくそして少量の細胞しか含
まれていない(データは示さない)。
以上の結果は、成熟初代B細胞で外来遺伝子の導入と発現の再現性のある動物
モデル系を提供する。このモデルはB細胞の形質導入は血液あるいはリンパ系区
画で外来遺伝子の長期発現に実行可能な手段を提示する。この容易で比較的安価
な動物モデルはb細胞を標的として使用する別の体細胞遺伝子の最初のスクリー
ニング手段として使うのに適当であることを立証している。実施例2.自己免疫疾患における誘導不応答性
プラスミド構築
一般的にDNA組換え体はオリゴヌクレオチドプライマーとPCRを用いてつく
られる。プライマーはクローニングを行うための特徴ある制限部位を含む。この
方法は断片を容易に単離やクローニングを正確に行えるようになっている。PC
Rには、Pfポリメラーゼや3’から5’への校正エキソヌクレアーゼ活性を有
しているために、TagおよびVentポリメラーゼより12倍から5倍大きな忠実
度を有すると報告されているのでPfuDNAポリメラーゼが使用される(Srateg
eneカタログ1992、p.126)。PCRはPfuDNAポリメラーゼと共に行
われるが、挿入配列がPCR中に導
入される変異を含まないことを確認するために、付加工程が行われる。そのため
に、増幅されたDNAは先ずpUC18のようなプラスミドにクローンされる。5
00bpまたはそれ以下を挿入するために、全断片を標準のジデオキシ配列決定法
を使用して配列決定される。500bp以上の挿入には、PCR増幅挿入の中心部
分を独特の使用可能な制限部位を使用してプラスミドから相当する断片に変更す
る;それでPCRの生成物となるためには5’と3’末端が必要なだけである。
レトロウイルスベクター
ネズミ白血病ウイルス(MLV)に基づいたレトロウイルスベクターが標的細
胞に望みの遺伝子を導入するのに全ての実験において使用される。この研究にお
いて使用される全てのベクターの概要は第8図に示される。ベクターはエコトロ
ピックパッケージ細胞系GP+E-86を用いてつくられる(実施例1参照)。力
価5×106-2×107コロニー形成単位(CF)/ml(NIH 3T3細胞で測定
)のベクターウイルスを産生するパッケージング(ヘルパー)細胞系を単離する
。neo遺伝子を含むベクターにつき、力価を測定し、継代の後ベクターの安定性
をサザンブロティングで分析する。neo遺伝子を含まないベクターには、サザン
ブロティングで継代後に得られるシグナルと1×107の範囲の力価の対照ウイ
ルス株で得られるシグナルとを比較して相対力価を決める。
第8図記載のベクターにおいて、脾壊死ウイルスプロモーターを第2の遺伝子
の発現を提出するために使用する。このプロモーターはネズミ細胞を含め多くの
細胞の中で特別強力なプロモータ
ーである。その他のプロモーター、例えばネズミBおよびT細胞でヒトADAを
効率よく発現するのに使用しているヒトADAプロモーターも使用しうる。
細胞の調製と感染方法
全ての実験において、成熟B細胞とpre-B細胞をミエリン起脳炎決定基の発現
に使用する。成熟B細胞の濃縮集団は、Thy-1、CD4およびCD8に特異的な
mABの反応混液を用いて全脾およびLN細胞からT細胞を除去して調製される
。このような濃縮方法ではLNからは>95%B細胞を、脾から85%を与える
。感染には、B細胞LPSで16時間刺激する、そして致死量照射ヘルパー細胞
で24時間共生培養する。標的細胞のLPS誘導増殖のはプロウイルスの効果的
な集積が必要である。この方法で、脾、LNB細胞の両者で標的細胞ゲノム当り
1ないし3プロウイルスコピーの感染効率を得ている(前述)。
Pre-B細胞は長期間whitlockおよびWitte培養で得られる(1982, Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 79:3608)。細胞は開始から4-8週培養後に収穫する
。そして10%FCSおよび50μM2-メルカプトエタノール加PRMI培地
で50ng/ml rIL-7とともに2週間in vitro増殖を行う。rIL-7はpre-B細
胞のレトロウイルス感染に必要な工程である増殖を誘導するが、分化は誘導しな
い。これら培養によるPre-B細胞はSCIDマウスでB細胞を再構成しないが
、成熟μ+およびδ+B細胞に分化する。B細胞の両型はSCIDマウスに養子
免疫移入後長期間生存する。既報(Ron and Sprent, 1958, J. Exp. Med. 1
61:1518; Sprent et al., 1991, J. Exp. Med. 174:717)によると、正常、
成熟B細胞は正常またはSCIDレシピエントに転移したと数ヵ月生存すること
が報告されている。
感染および増殖の評価
導入遺伝子のコピー数を、ベクター-DR1-9には非特異性プローブを、ベクタ
ーDR8とDR10にはSNV特異性プローブを用いてサザンブロッティングに
より評価した。例えば、DR1ベクターの増殖について、MBP特異性プローブ
を用いる。PLJ、SJLおよびPLB由来基脳炎ペプチド特異的なmABを含
むMBP特異性mABを調製した。これらのmABを使用して、タンパク産生を
全細胞リゼートからの免疫沈降により評価した。融合タンパクはこれらmABを
用いて検出できる。MHCクラスII分子で複合体となった時に処理したタンパク
が認めることができた場合、増殖はまたフローサイトメトリーで評価する。
免疫機能の評価
成熟B細胞の全てを、外来抗原が存在しない状態で生成抗原感作LNT細胞の
増殖誘導能をin vitroで測定する。感作T細胞を得るため、マウスをCFAと関
連する抗原で足踵に免疫する。LNCD4+T細胞を抗CD8および抗HSAm
ABで処理して9日後に調製する(抗HSAmABJIIdおよび補体による処
理でLN調製物から全てのB細胞が実質的に除去される)。次いで細胞をナイロ
ンウールカラムを通過させ、関連抗原パルス感染B細胞でin vitroで刺激した。
感染B細胞は外来抗原を加えた同様の測定法でアネルギー誘導を測定する。これ
ら測定は感染B細胞が免疫原性か寛容原性の抗原を示す能力をざっと評価するの
に使用される。
はじめのin vitro測定に続いて、成熟B細胞をEAE-感受性マウスの適当な
ストレインに20-40×106細胞を4−10回、隔週間隔で投与して転移する
。レシピエントマウスは既報の方法で調製された関連起脳炎性物質の起脳炎量あ
るいは起脳炎性T細胞系を起脳炎量を投与してチャレンジする(Meyers et al.,
1993, J. Immunol.)。感染B細胞は、T細胞が増殖してから非応答性が誘導
されているかどうかをテストするためEAE誘導後、異なった時間でマウスに転
移される。
モノクローナル抗ネズミIL-2抗体で処理した平行実験も行われる。抗IL-2
抗体はT細胞活性化を防止し、特異的非応答性を誘導することが知られている(
Dallman et al., 1991, J. Exp. Med. 173:79; Andreu-Sanchez et al.,
1991, J. Exp. Med. 173:1323)。抗CD4抗体でCD4細胞を除去したレシ
ピエントが使用される。そのような除去により抗原特異的寛容性誘導の感度が上
昇することが示された(Vandervegt et al., 1993, J. Exp. Med. 177:1587)
。
完全MBPおよびPLP遺伝子の発現あるいは成熟およびpre-B細胞における
起脳炎性の決定
通常、エンドサイトーシスを経て外部から細胞内に入るタンパクは最後はリソ
ソーム区画に入り、そこで処理され、MHCクラスII分子に結合する。他方、細
胞内で発現したペプチドは、多くはERでMHCクラスIに結合する。しかしペ
プチドはMHCクラスII抗原提示経路に「クロス」することができると報告され
ている(Braciale and Braciale, 1991, Immunol. Today 12:124; Brodsky
et al.,1991,Ann. Rev. Immunol. 9:707)。更に、最近ヒトクラスII表面分
子から精製されたタンパクの85%は内在性自己タンパクであることが示された
(Newcomb and Crosswell, 1993, J. Immunol. 150:499; Chiczetal, 1993
J. Exp. Med. 178:27)。それゆえに、リソソーム標的配列ないしB細胞にお
けるMBPおよびPLPまたはそれらの相当する起脳炎ペプチドの発現は表面ク
ラスII分子での提示であるかもしれない。このことをテストするために、ベクタ
ーを、完全な真正MBP遺伝子およびPLP遺伝子、あるいは起脳炎決定基およ
びペプチドのプロセッシングを助けるであろうフランキング配列をコードするミ
ニ遺伝子を発現するように構築することができよう。
完全MBPおよびPLP遺伝子をコードするベクターは夫々DR1およびDR
2である。コード配列のみがベクターにクローンされている。MBPおよびPL
P両遺伝子の非解釈5’および3’配列はそれらが組織特異性発現の場合には含
まれない。代わりにベクター配列が5’および3’非翻訳配列を提示する。MB
P遺伝子は改変スプライシングにより得られる5イソ型タンパクをコードする。
PLPをコードする配列(30kD)はベクターDR2に使われる(第8図)。
起脳炎決定基およびフランキング配列の小伸長を含むこれらのタンパクの小部
分をコードするミニ遺伝子は、完全長のタンパクは非常に疎水性であるのでレト
ロウイルスベクター(DR3およびDR4、第8図)中に構築され配置されている。
ATG出発コドンはKozak(1989, J. Cell. Biol. 108:229)により決定され
たのに相当する強力な翻訳開始シグナルに関して配置されており、そして適当な
停止コドンは全ての3つの読み枠内に配置されよう。種々のミニ遺伝子は、H-
2S(aa87-114)またはH2U(as1-9)について2つの主要なMBP起脳炎決定基や
PLPについての起脳炎決定基(aa139-151、システインに代わりセリン置換)を
含む。
リソソーム標的タンパクとの融合タンパクとしての起脳炎ペプチドの発現
標的B細胞において、MBP、PLPまたは起脳炎ペプチドの発現が一度おこ
ると、エンドソーム区画におこるクラスII提示の適当なプロッセッシングが促進
される。リソゾームの局在はプロッセッシングやMHCクラスII分子への結合が
促進するであろう。それゆえに、自然型に加えて、起脳炎ペプチドはリソソーム
区画に局在する子とが知られているタンパクの枠組みに融合される。3つの特異
的タンパクがリソソームに対し起脳炎タンパクの直接発現に使われる:a) リソ
ソームの酸性ホスファターゼ(LAP)の細胞質末端。自然のLAPは細胞表面に
移される前にリソソームによるプロセッシングを必要とする。リソソーム区画へ
の標的は短い(19aa)細胞質末端により行われる(Peters et al., 1990 EMBO
J. 9:34397)。LAP細胞質末端と起脳炎ペプチドからなる融合タンパクをコ
ードするミニ遺伝子が構築される(第8図、DR5)。b) リソソーム膜糖タン
パク lamp-1の細胞質末端。LAPについては、lamp-1の細胞質末端はリソソー
ムに特異的なこの内在性膜糖タンパクの直接の標的であることが判った(Willi
ams and Fukuda, 1990, J. Cell. Biol. 111:955)。LAP細胞質末端と起
脳炎ペプチドからなる融合タンパクをコードするミニ遺伝子が構築される(第8
図、DR5)。c)エンドソーム分画に対するMHCクラスII分子の標的である
ことが示されているクラスII関連非変異鎖(II)(第8図、DR6:Braciale
and Braciale, 既出;Brodsky et al., 既出;Bakke and Dobberstein, 199
0 Cell 63:707)。起脳炎ペプチドをコードする配列はこれらの遺伝子の3’コ
ーディング配列に融合される。カルボキシ末端への配置は起脳炎ペプチドがリソ
ソーム内にできあがることを確証している。
実施例3:自己抗原およびリボザイムの共発現
B-7特異的リボザイムと起脳炎ペプチドの共発現。
ここでは、B7-1およびB7-2の発現の阻害の方法について記述する。B7-1お
よびB7-2は活性化b細胞を含む専用のAPCを発現する細胞表面分子である。そ
れらはT細胞の表面に発現されるCD28に結合する。これら2つの分子の相互
作用により生産的なT細胞活性化に必要な共刺激性シグナルの伝達を引き起こす
(Linsley et al., 1991, J. Exp. Med. 173:721; Freeman et al., 1991,
J. Exp. Med. 174:625; Reiser et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci
. USA 89:271;Azuma et al., 1992, nature 366:76; Feeman et al., 1993
, J. Exp.Med. 178:2185, Freman et al. 1993, Science 262:907)。B7分
子を発現しないAPCはクローン活性化よりもむしろ長永続性クローンアネルギ
ーを誘導する(Linsley and Ledbetter, 1993, Ann.Rev. Immunol.,11:191;
Schwarz, 1992, Cell 71:1065; Ding et al., 1993, J. Immunol.,151:12
44; Azuma et al.,既出、Freeman et al., 1993, J. Exp. Med. 既出、Fr
eeman et al., 1993, Science,既出)。B細胞は、ミエリン決定基とB7特異
的リボザイムを発現することができるレトロウイルスベ
クターで感染される。
アンチセンスRNA技術の改良は自己分解的開裂をおこすことができる天然の
RNA分子の発見に進展した(Tanner and Vasseur, 1993,Antisense researc
h and applications, S. Crooke and B. Leblen編、CRC Press Inc.,
Boca Taton, Florida, 415-26頁)。自己触媒的RNA開裂は最初テトラヒメ
ナTetrahymena thermophilaで証明された、そしてそれ以来、細菌、植物、動物
で多くの分子が証明された。いくつかの触媒的RNAの配列の比較により、これ
らRNA酵素の共通構造が導かれた。少なくともいくつかのリボザイムはそれら
が触媒活性を有するために1つの隣接鎖上に位置する必要がない;それらは触媒
刺激を形成するためにハイブリダイズする2つの別々のRNA鎖から調製するこ
とができる。したがってそれらはトランスで作用することができる。報告されて
いる3つのトランス開裂リボザイムの型はハンマーの頭型、ヘアピン型と肝炎デ
ルタウイルス(HDV)リボザイムである。これらのリボザイムによるRNA開
裂は2、3’サイクリックホスフェイトと5’-ヒドロキシからなる末端を与え
る。ヘアピン型とハンマーの頭型リボザイムの先端を切った実験では、触媒活性
には少なくとも15ヌクレオチドが必要であること、これに対しHDVリボザイ
ムでは85ヌクレオチドが必要であることが実証された。目下のところ、HDV
リボザイムの基質の要求性についてはよく決定されていないが、ハンマーの頭型
とヘアピン型リボザイムでは知られている。ハンマーの頭型とヘアピン型リボザ
イムについては、基質要求性は最小である。ハンマーの頭型リボザイムでは、開
裂部位はGUX5'、
ここでXはGではありえない、によってのみ行われ、ヘアピン型リボザイムにつ
いては、開裂部位はGUC3'によって行われる。これらの観察で、触媒部位から
5’および3’方向で標的RNAにハイブリダイズするアンチセンスRNA伸長
を含むことによってデザインされる高特異性リボザイムの可能性が示される。リ
ボザイムのアンチセンス部分は典型的には12ないし20ヌクレオチドの範囲で
ある。さらにリボザイムは触媒作用を有しているから、消耗されることなく、こ
れが高有用性にとって重要な点であるが、複数の基質RNAを開裂することがで
きなければならない。
2つの特に重要な技術上の考慮がリボザイムの使用に関して考えられる。それ
らは標的RNAへの接近しやすさとリボザイムの細胞内濃度である。構築され試
験されるベクターはこれら重要問題を直視している。DR7、DR8およびDR
9はB7タンパクの発現を阻害するベクターを含んだリボザイムの能力を利用す
るよう設計された。
DR7(第8図)はB7-1およびB7ー2に対する多価リボザイムを含んでい
る。1つはB7-1(509から528に配位結合している)に対するハンマー型
リボザイムである。リボザイムのアンチセンス部は開裂部位に対し12ヌクレオ
チドの5’および8ヌクレオチドの3’に融合している。第2のものはヘアピン
型リボザイムでB7-2(362から381に配位結合している)に特異的であり
、そのアンチセンス部は20ヌクレオチドの長さである。ノナリボザイムを含む
多価リボザイムについては既に報告されている。(Chen et al., 1992, Nucl.
Acid Res. 20:4581-9)。ハンマー
の頭型およびヘアピン型リボザイムの両方とも既に使われているので、我々はレ
トロウイルスベクターに直接反復を導入することは避けたい、多くの他の研究機
関がレトロウイルス中の直接反復により、レトロウイルス複製の1回転の後でさ
えも欠失変異が起り得ることを注意している。
ベクターDR7において、リボザイムは少なくとも2転写配列があることが見
い出されている。1つはLTプロモーターから開始される完全長転写配列であり
、他はSNVプロモーターから開始されるサブゲノム転写配列である。LTプロ
モーターから開始される長い方の転写配列はネオマイシンホスホトランスフェラ
ーゼをコードする。高濃度のリボザイムを得るための潜在的な問題は非コーディ
ングmRNAを分解する細胞中に展開する機構であるから、リボザイムをコード
されたRNAに含ませる戦略は重要であると信じられている(Leedsetal,1991,
Genes and Develop., 58:2304-14)。非コーディングmRNAに等しいナンセ
ンス変異を含む転写配列は細胞中のmRNAレベルを劇的に減少させたことが証
明された(Pellts and Jacobson, 1993, Control of messenger RNA stabi
lity, Academic Press, Inc., 291-328頁)。ナンセンスあるいはフレームシ
フト突然変異による翻訳の未成熟終結は種々のmRNAの急速な分解を促進する
。非コーディングRNAであるアンチセンスRNAは遺伝子産物をコードするこ
とを意味しないから、アンチセンスRNAに翻訳開始が起るときはいつでも、コ
ーディングmRNAの3’非コーディング領域に局在しない限り、急速な翻訳の
停止と分解が起りうるのであろう。
DR7は初代B細胞のベクターを使用する前に2つの試験をおこなった。
(a)第1はリボザイムは無細胞系で基質RNAを分解するかどうかを確かめる
ことである。組み換え体を、2価リボザイムと基質V7-1およびB7-2RNAの
両者をin vitro転写物を産生しうるT7プロモーターで構築した。標準的なin v
itro開裂反応を実行し、基質を、既に報告されている方法に従いゲル電気泳動お
よびオートラジオグラフィで分析した(Chen et al., 既出、Dropulic et al.,
1992, J. Virol. 66: 1432-41; Weerasinge et al., 1991, J. Virol. 65
:5531-4)。B7-1およびB7-2の異なる部分を指向するリボザイムをつくり試験
できる。
(b)リボザイムは、ベクター感染細胞においてB7-1およびB7-2RNAレベル
を著しく減少させるので、ノーザンブロッティングで分析可能となる。B7-1お
よびB7-2(細胞系はB17-B7と称する)の両者を発現する発現ベクターでトラ
ンスフェクトしたB16ネズミメラノーマ細胞系を使用した。B17-B7細胞をD
R7で感染し、G418を含む培地で選択を行った後に、RNAを単離しノーザ
ンブロッティングで分析した。空の感染を行ったB17-B7細胞からのRNAを
対照とした。リボザイムの効果的な発現と作用にB7RNAsの定常状態レベル
は著しく減少しなければならない。
第2の型のベクター(DR8、第8図)において、翻訳を阻害する分子内二重
鎖を形成するRN配列が2価リボザイムの5’位に挿入される。このアイディア
の背景は、mRNAの分解を止め定常状態レベルを増加させるために非コーディ
ングリボザイム
mRNAの翻訳を阻害する、というものである。加える配列はKozakにより報告
されており(1989, Mol. Cell. Bio. 9:5134-42)、転写配列の5’末端に存在
するとき、翻訳開始複合体の生成を阻害するステム.ループ構造を形成する。初
代B細胞で使用する前に、上述したベクターの試験を行えばよい。加えるに、D
R8のSNNプロモーター空発現されるサブゲノムRNAの定常状態レベルを、
リボザイムRNAがステム・ループ構造を含むことによってより安定化されてい
るかどうかを決定するために、DR9で得られた結果と比較することができる。
第3のタイプのベクター(DR9、第8図)において、クローンアネルギーを
増加させるタンパクとB7RNAを分解する能力のあるリボザイムの両者をコー
ドできる二重機能mRNAをつくるように、遺伝子を構成する。より詳細にはB
7RNAに特異的な2価リボザイムをIL-10遺伝子の3’非コーディング部分
に挿入する。IL-10がこのようにしてクローンアネルギーの増大した誘導が起
るのかは次節で論じる。本実験には3つの目的がある:a)リボザイムは、リボザ
イムを安定化しその定常状態レベルを上昇させるコーディング配列に結合される
。b) リボザイムを含むこのRNAは、丁度B7RNAのように粗小胞体のリボ
ソームにより当然翻訳される、それで、これにより、リボソームの効果的な作用
を上昇させるような同一の細胞下分画に、両RNAが局在していることが確認さ
れる。そしてc) 2つの異なったレベルでクローンアネルギーの誘導を増強する
ことができるような物質を発現させる大きな能力を有する単一遺伝子を創製する
。初代B細胞で実施する前
に、ベクターDR8について記載したようにDR9の効率をテストする。更に感
染B16-B細胞はIL-10発現でアッセイできる。これいついては次節で詳述する
。実施例4:IL-10と起脳炎ペプチドの共発現
IL-10はマクロファージ、B細胞および主としてTH2細胞により産生され
るサイトカインである(Howard and O'Garra, 1992, Immunol. Today, 13:1
98; Moore et al.m, 1993, Ann. Rev. Immunol.,11:165)。それはTH1細
胞の阻害剤として最初報告された、そして後にAPCによるサイトカイン産生を
ブロックする作用を有することが見い出された。IL-10は種々の造血細胞に効
果を有する。例えば、B細胞の生存数を上げる、クラスII抗原の発現を誘導する
、そしてIL-4と相乗的にB細胞増殖をする。そのマクロファージの阻害機構は
、APC活性化中にB7発現の上方制御を選択的に阻害するためであることが、
最近示された(Ding et al., 1993, Immunol. 15:1224)。それゆえに、同じベ
クターからの起脳炎決定基とIL-10の機構的共発現はTH1細胞の活性を阻害
し、従ってB7特異的リボザイムの使用なしにクローンアネルギーの誘導を導く
ことになる。IL-10を発現するために、ベクターDR10(はじめはリボザイ
ムを含まない)を構築する。IL-10の全コーディング配列(18kD、N結合糖
鎖形成を除く)をこのベクターに挿入し、MLVLTRプロモーターで発現させ
る。基脳炎決定基をコードする遺伝子はSNVプロモーターから発現される。B
7特異的リボザイムは、IL-10遺伝子の3’非翻訳部位中のDRI0に含まれる
。両戦略(リボザイムおよびIL−10)が働けば、DR10は初代B細胞
で使用されるより好ましいベクターである。IL10の選択は、EKISAを用い
たラットモノクローナル抗体SXCIで検出され、指示系MC-9の増殖の誘導に
よっても検出される。この細胞系はネズミIL-4の亜至適量(25ng/ml)で促
進するとき、IL-10に応答する。
本発明を通じて、種々の文献を参照した。これら文献の開示は、本件技術分野
をより十分に記述するために引用文献として取り入れられる。
ここに記載した発明は、同じ内容が多くの面で変形することは明らかである。
このような変形は本発明の精神と範囲からの新発展と考えられ、そのような変形
・修飾は以下の特許請求の範囲に含まれるものとされる。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FR,GB,GR,IE,IT,LU,M
C,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF,CG
,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,SN,
TD,TG),AP(KE,MW,SD),AM,AU,
BB,BG,BR,BY,CA,CN,CZ,FI,G
E,HU,JP,KG,KR,KZ,LK,LV,MD
,MG,MN,NO,NZ,PL,RO,RU,SI,
SK,TJ,TT,UA,US,UZ,VN
(72)発明者 コー,ミン−リン
台湾、タイペイ、アン―ハー ロード、セ
クション 2、レーン 23 ナンバー11
4エフ
(72)発明者 シュトコウスキ,ナタリー
アメリカ合衆国、08817 ニュージャージ
ー、エジソン、リベンデル ウェイ 2316
(72)発明者 ヤコブ,ロン
アメリカ合衆国、08816 ニュージャージ
ー、イースト ブランズウィック、スリー
ローリー ドライブ
【要約の続き】
約90%以上がプロウイルスを含んでいる感染リンパ球
細胞の集団に関するものである。