JPH09501055A - 初代リンパ球への効率的遺伝子転移 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は薬剤による選択なしに、初代リンパ球細胞に外来遺伝子を効率的に導入する方法に関し、（ａ）ウイルス産生レベル５×１０⁶〜５×１０⁷単位／mlが得られるであろうレトロウイルスベクターおよびヘルパー細胞の組合わせを、ベクターをヘルパー細胞に感染移入し、次いで選択、細胞クローンの単離、ならびにウイルス産生細胞系がウイルス力価を５×１０⁶〜５×１０⁷単位／mlの範囲で産生するよう同定してウイルス力価を決定することにより、誘導し、（b）特定のリンパ系を再集団化できるかまたは濃縮リンパ系分集団を得るように望ましくないリンパ球細胞を除去したモノクローナル抗体でリンパ球細胞の懸濁液を処理することによる長寿命集団である、リンパ球細胞分集団を単離し、（c）工程（b）よりの濃縮リンパ系分集団をリンパ系分集団に特異的な生長因子と共に培養し、（d）工程（c）からのリンパ系分集団を、工程（ａ）からのウイルス産生細胞系を照射して得たウイルス産生細胞叢と共生培養して感染リンパ系分集団を産生し、そして（ｅ）感染リンパ系分集団を収穫する、工程からなる。本発明は、更にリンパ球細胞の約９０％以上がプロウイルスを含んでいる感染リンパ球細胞の集団に関するものである。

Description

【発明の詳細な説明】 初代リンパ球への効率的遺伝子転移 本発明の導く研究は、部分的に米国立衛生院(Ｎational Ｉnstitute of Ｈeal th)助成金５Ｒ２９ＣＡ５０７７７−０、および米国立衛生院(Ｎational Ｉnsti tute of Ｈealth)研究助成賞(Ｒcsearch Ｓervice Ａward)ＩＴ32Ａ107043-01に よって補助されている。合衆国政府は本発明にある種の権利を有している。本件 は、１９９３年７月３０日出願の米国特願Ｎｏ.０８／100,546の部分継続出願で あり、35Ｕ.Ｓ.Ｃ.§§120および365により出願日の利益を請求している。 発明の分野 本発明はレトロウイルスベクターおよびヘルパー細胞を使用した外部遺伝子を リンパ球に転移する方法に関する。本発明の遺伝子転移方法は薬剤選択をしなく ても達成でき、体細胞治療およびリンパ球生物学にとって潜在的に重要である。 発明の背景 本発明の背景を説明し、そしてその実施に関して更に詳細を提供するためにこ こに参照する開示はここに引例文献として取り入れられている。便宜上、本開示 は以下の本文において言及され、各々付属する引用文献において分類されている 。 レトロウイルスベクターは脊椎動物細胞に遺伝子を安定的に導入するための最 も効率的な道具である。臨床実験が、ヒトの遺伝子病を治療するためにレトロウ イルスを使用して行われている （アデノシンデアミナーゼ(ＡＤＡ)欠損症）。先天性代謝異常を治す他に、遺伝 子治療はガンおよび種々のその他の疾病の治療に臨床的な試みがなされている( Ｓcience,1992,Ｖol.258,744-746)。 レトロウイルスベクターは、基本的には対象とする遺伝子で置換された全ての ウイルスタンパク質をコードする配列を含む損なわれたウイルスゲノムを含むレ トロウイルス粒子である。その結果、そのようなウイルスはヘルパーウイルスの 助けなしには感染の１回転後もはや複製することができない。レトロウイルスベ クター粒子はヘルパー細胞により生産される。そのようなヘルパー細胞はレトロ ウイルス粒子生産や複製に必要なレトロウイルスタンパク質を発現するプラスミ ド構造を含んでいる。レトロウイルスゲノムのそのようなヘルパー細胞への導入 （移入、トランスフェクション）の後、ベクターゲノム（ＲＮＡゲノム）はウイ ルス粒子に（特異的な被包配列が存在するので）被包される。ウイルス粒子は、 対象とする遺伝子のみを含むゲノムを運搬しているヘルパー細胞から放出される 。新鮮な標的細胞に感染した後に、ＲＮＡゲノムはＤＮＡに逆転写されそしてＤ ＮＡコピーは宿主ゲノムに組み込まれる。組み込まれたウイルスＤＮＡはプロウ イルスと称されている。最近１０年間に、ニワトリあるいはネズミレトロウイル スから誘導されたいくつかのトロウイルスベクター系が、種々の遺伝子の発現の ために開発されている（総説としてＴemin,1987;Ｇilboa1990を参照）。 ネズミ一次リンパ球への効率的な遺伝子転換 レトロウイルスベクターを使用した造血幹細胞への外来遺伝子 の効率的な導入を目指した実験動物モデルが多く注目されている(Ｗilliams et al., 1984, Ｎature 310:476; Ｄzicrzak et al., 1989, Nature331:35; Ｂende r et al., 1989, Ｍol. Ｃewll. Ｂiol. 9:1426)。多能性幹細胞が全ての造血細 胞系列に再増殖する能力、および自己再生能力(Ｗilliams et al., 1984, Natur e 310:476; Lemischka et al., 1986, Cell45:917)は、造血細胞に影響を及ぼす 遺伝子欠損を正しくするための標的細胞として好ましいものであるとされた（Pa rkman, 1986,Science 232:1373)。しかしながら、技術的には、これは幾分困難 であることが証明された。第一に全骨髄はほんの少ししか多能性幹細胞を含んで いないので、未だにこれらの細胞上にユニークな細胞表面マーカーが同定されて おらず、従って詳細な分析のために十分な量を精製することが困難なことである 。かくして、これらの細胞への遺伝子転移は不十分であった(Ｓzilvassy et al. , 1989,Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. Ｕ.Ｓ.Ａ. 86:8798)、そして転移が達成さ れたとしても、転移された遺伝子の適切な発現はしばしば問題であった、それは 多分、多能性幹細胞は成熟に達するまでに多くの分化過程を経るので、導入され た遺伝子の適切な発現が妨げられるからであろう。それゆえに、リンパ球系の区 画に影響するか、あうりは増強性免疫応答により治療されるようなある種の疾病 に対して、一次リンパ球への遺伝子転移は多分効果的であろうし、ある場合には より適していることが示唆されたのである(Ｃulver et al.,Ｐroc. Ｎatl. Ａca d. Ｓci. Ｕ.Ｓ.Ａ. 88:3155; Ｃulver et al., 1991, Ｈuman Ｇene Ｔherapy 2:107)。一次リンパ球は容易に得られる；それらの多くは長寿命であり；そして 、それらはレトロウイルスベクター を使用して感染に必要な段階に容易に増殖を誘導することができる(Ｒichter et al., 1984, Ｍol. Ｃell Ｂiol., 4:151)。このような進歩は、近年、一次リン パ球への遺伝子転移に関する研究を動機付けることになった。 Ｂ細胞系列体細胞遺伝子治療のためのネズミモデル 一次Ｂリンパ球への外来遺伝子の効率的な転移は、Ｘ-染色体性無ガンマグロ ブリン血症(Ｖetrie et al .,1993, Ｎature 361:226；Ｔsukuda et al., 1993, Ｃell 72:279)およぶＡＤＡ欠損症(Ａnderson, 1992,Ｓcicnce 256:808)のよう な、Ｂ細胞区画に影響するような疾病の治療に直接的な治療効果を有している。 また、それは血友病（第ＶIII因子および第ＩＸ因子欠損症）（Ｍiller, 1990, Ｂlood 76:271；Ｈoeben et al., 1992, Ｔhromb. Ｈaeost.67:341；Ｈoeben et al., 1993，Ｈum. Ｇene Ｔher. 4:179)およびリポプロテインリパーゼ欠損症( Ｈaydcn and Ｍa, 1992, Ｍol. Ｃell. Ｂiochem. 113:171; Ａuwerx et al.,19 92, Ｃritical Ｒeview in Ｃlinical Ｌaboratory Ｓciences29:243)のような 、正常な遺伝子産物が血流中に分配されることが役立つような遺伝子病に治療効 果を有する。更に、Ｂ細胞は抗原提示細胞として機能するので、ガンあるいはウ イルス抗原を発現して、抗ガン性あるいは抗ウイルス免疫応答を開始したり増強 したりするよう操作することができる。標的としてＢ細胞を使用する、更に付加 的な進歩は、イムノグロブリン重鎖および軽鎖遺伝子の発現を制御することにつ いて多く知られるという事実である。この情報は、B細胞中の外来遺伝子の組織 特異的発現を至適化するために使用できる。更に、イムノグロブリン分泌経路を 外来遺伝子産物の多 量分泌に利用することができる。 外来遺伝子をリンパ球にレトロウイルスベクターを介して転移させることを含 むいくつかの遺伝子治療計画が臨床試験中である。これらには、アデノシンデア ミナーゼ(ＡＤＡ)遺伝子をＡＤＡ欠損症の末梢血Ｔ細胞に導入する、重症複合型 免疫不全症(ＳＣＩＤ)患者(Ｓprent, 1973, Ｃell. Ｉmmunol. 7:10; Ｓtevens et al., 1982, Ｊ. Ｉmmunol.128:844)、およびマーカー遺伝子あるいはリンホ カイン遺伝子を腫瘍浸潤(ＴＩＬ)Ｔ細胞に導入する(Ｋasis et al.,1990,Ｐroc. Ｎatl. Ａcad.Ｓci. Ｕ.Ｓ.Ａ. 87:473; Ｃulver et al.,1991,同上、88:3155) ことが含まれる。これらの計画では、安定して感染した細胞を増やすための標的 細胞のin vitroでの増殖および/または薬剤選択に長期間を必要とせねばならな い。Ｂ細胞はin vitroでは効率的に増殖できないので、これらの方法は遺伝子を Ｂ細胞に導入するには不適当である。更にまた、長期間培養した細胞は通常変わ ったホーミングパターン(homing patterns)を示し、養子免疫細胞移入に際しリ ンパ系器官へ適切に移行しない（Ｄauket et al., 1985, Ｊ. Ｍol. Ｃell. Ｉm munol.2:27; Ｔedder et al., 1990, Ｊ. Ｉmmunol. 144:532; Ｋishimoto et a l., 1990,Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci. Ｕ.Ｓ.Ａ. 87:2244)。 多発性硬化症 多発性硬化症(ＭＳ)は白質中に主に血管周囲における脱髄した「斑様」領域を 伴う中枢神経系の慢性的炎症の病気である。小分子ならびに細胞に対する血液脳 関門の透過性がＭＳでは亢進しており、脱髄斑は白血球、著しくリンパ球マクロ ファージで浸潤されている。非常に組織的ならびに臨床症状は実験的疾病ＥＡＥ に特 徴付けられている(Ｓobel et al., 1984, Ｊ. Ｉmmunol.132:2393; Ｓedgwick e t al., 1987, Ｊ. Ｅxp.Ｍed.165:1058)、そしてそれはＭＳに示も類似している 実験モデルであると考えられている。しかしながら、ある種の重要な相違がＭＳ とＥＡＥの間、特に臨床経過において存在している。ＭＳは明らかな再発症状発 現が重症で進行する神経機能障害の再発、寛解により特徴付けられる。一方、Ｅ ＡＥは通常一相性症状であり、完全な回復と次の攻撃に対する免疫を伴う急性症 状である。しかしながら最近、より慢性的なＥＡＥの再発型を誘導する実験系が マウスで開発された。慢性病は通常、宿主の免疫系を変えることにより、および 常法のＭＢＰ/ＣＦＡ投与を使った誘導方法により、前感作Ｔ細胞を投与した動 物に実質的な割合でつくりあげることができる(Ｆallis and ＭcＦarland, 1989 , Ｊ.Ｉmmunol. 143:2160; Ｌassmann and Ｗisniewski, 1979,Ａcta Ｎeuropat hol. 47:111; Ｂrawn and ＮcＦarlin, 1981, Ｊ. lab. Ｉnvest. 45:278; Ｂen -Ｎun et al., 1980, Ｎature 283:389; Ｌublin et al., 1981, Ｊ.Ｉmmunol. 126:819; Ｆritz et al., 1983, Ｊ. Ｉmmunol. 139:1024; Ｍokhtarian et al. , 1983 Ｎature 309:356; Ｆallis et al., 1989,Ｊ. Ｎeuroimmunol. 22:93)。 その他のＭＳのモデルとしてＥＡを使用したしばしば批評される問題点は、Ｍ Ｓ患者の末梢血および脳脊髄液(ＣＳＦ)からＭＢＰ反応性Ｔ細胞を単離する困難 さであった。事実、多くの最近の報告は、これがそうではないことを示している 。ＭＢＰ特異的でクラスII限定ＣＦ4+Ｔ細胞が限定的Ｔ細胞レセプターを使用し て、脳脊髄液および末梢血から分離され増殖されている。多分、ＭＳに対する ＥＡＥ研究に関連する最適の実例は、いくつかは人間で現在臨床試験が行われて いる、マウスで始まった実験から導かれる治療指針である。ＥＡＥの誘発および ／または再発を防止するために開発された戦略はＭＳの治療を開発するために重 要である。 本明細書に引用されているいかなる文献も、本発明の先行技術として使用し得 るものであって、容認されたものと解釈されてはならない。 図面の簡単な説明 第１図は本発明のレトロウイルスベクターを概略的に図示する。Ｎ2とＡsＡＤ Ａはモロニーネズミ白血病ウイルスを基にしたベクターである。Ｎ2はウイルス 長末端反復(ＬＴＲ)プロモーターから発現したネオマイシンホスホトランスフェ ラーゼII遺伝子(neo)を含んでいる。ＡsＡＤＡはウイルスＬＴＲプロモーターか ら発現したneoとＡＤＡ内在性プロモーター(Ａs)から発現したヒトアデノシンデ アミナーゼ遺伝子(ＡＤＡ)を含んでいる。 第２(Ａ)図と第２(Ｂ)図はＤＮ胸腺細胞中における遺伝子転移と発現を示すサ ザンブロットである。第２(Ａ)図はＮ2感染細胞のサザンブロットであり、第２( Ｂ)図はＡsＡＤＡ感染細胞のサザンブロットである。第２(Ｃ)図はＡsＡＤＡで 感染したネズミＤＮ胸腺細胞におけるヒ卜ＡＤＡ遺伝子ノ発現を示す。 第３図はリンパ節Ｔ細胞における遺伝子転移と発現を示す。第３(Ａ)図におい て、ゲノムＤＮＡは感染後４８時間に抽出された、次いで第２図の凡例に記した ようにサザンブロッティングを行った。第３(Ｂ)図はＡsＡＤＡで感染したネズ ミリンパ節Ｔリンパ球にお けるヒトＡＤＡ遺伝子発現を示す。 第４図はリンパ節Ｂ細胞における遺伝子転移と発現を示す。第４(Ａ)図におい て、ゲノムＤＮＡは感染後４８時間に抽出された、次いで第２図の凡例に記した ようにサザンブロッティングを行った。第４(Ｂ)図はＡsＡＤＡで感染したネズ ミリンパ節Ｂリンパ球におけるヒトＡＤＡ遺伝子発現を示す。 第５(Ａ)図はレトロウイルスベクターＡsＡＤＡを概略的に図示する。ＡsＡＤ Ａは、ＭＬＶＬＴＲプロモーターから発現した細菌のneo遺伝子を含むＧ1Ｎaベ クター(Ｍiller et al., 1992, Ｈum. Ｇen. Ｔher.3:619)およびその内在性プ ロモーターから発現したヒトＡＤＡ遺伝子である。第５(Ｂ)図はＡsＡＤＡで感 染した脾およびＬＮＢ細胞のサザンブロット解析である。第５(Ｃ)図はネズミＢ 細胞中のヒトＡＤＡ分析を示す。 第６図はＡsＡＤＡ感染ＬＮおよび脾Ｂ細胞で再構成したＳＣＩＤマウスから 得た脾のフローサイトメトリー分析を示す。脾細胞を、ＬＮＢ細胞を投与した代 表的なマウスから転移後４週間、第６(Ａ,Ｂ)図、および脾Ｂ細胞投与マウスか ら転移後３ヵ月、第６(Ｃ,Ｄ)図、フローサイトメトリーにより分析した。 第７(Ａ)図は、標的Ｂ細胞に養子移入されたＳＣＩＤマウスの脾からえたゲノ ムＤＮＡのサザンブロット分析を示す。第７(Ｂ)図はＳＣＩＤマウスにおけるヒ トＡＤＡ活性を示す。 第８図は、自己抗原に対する不応答性を誘導するために、実験的自己免疫性脳 脊髄炎(ＥＡＥ)、多発性硬化症(ＭＳ)の動物モデル、に関連した自己抗原の発現 のためのネズミ白血病ウイルスベクタ ーの概略図を示すものである。 発明の要約 本発明は、薬剤選択なしに一次リンパ球細胞に外来遺伝子を効率的に導入する ための方法に関する。本発明は、リンパ系分集団の増殖を誘導するに十分な時間 リンパ系分集団の増殖を誘導する成長因子で、選択したリンパ系分集団を刺激す る段階、およびウイルス生産ヘルパー細胞系で刺激されたリンパ系分集団を共生 培養(co-culturing)する段階よりなる、ここにおいてヘルパー細胞系のウイルス 生産のレベルは１ml当り５×１０⁶から５×１０⁷コロニー形成単位(colony form ing uits/ml)の範囲である。 そのようなレトロウイルスベクターは公知の手段で入手可能であり、また以下 の標準的な方法で調製される。例えば、そのようなヘルパー（またはプロデュサ ー）細胞系は、ヘルパー細胞にベクターを移入し、次いで選択、細胞コロニーの 単離、およびウイルス生成細胞系がウイルスタイター５×１０⁶から５×１０⁷コ ロニー単位/mlの範囲に生成するように同定されたウイルスタイターを決める、 ことにより生産することができる。 好ましくは、選択されたリンパ系分集団は、例えは集団から望ましくない細胞 を除去することによって、単離される。望ましくない細胞の除去は、リンパ細胞 の懸濁液をポリクローナルまたはモノクローナル抗体および補体で処理すること により、パンニングにより、ナイロンウール選択により、分別勾配遠心法、また は豊富なリンパ系分集団を得るように好ましくないリンパ細胞を分離する他のい かなる技術によっても、達成することができる。そ のょうなリンパ系分集団は特定のリンパ系列に再集団化することができ、あるい は長寿命の集団となり得るのである。 共生培養が完了した後、感染リンパ球細胞は培養することができる。 発明の詳細な説明 本発明は、レトロウイスルベクターを使用して、リンパ球細胞、例えば一次、 成熟ネズミリンパ節ＴおよびＢ細胞、および一次、未成熟ネズミＣＤ4,ＣＤ8ダ ブルネガティブ(ＤＮ)胸腺細胞、に外来遺伝子を効率的に導入する方法に関する 。この新規遺伝子転移方法は、(a)外来遺伝子を運搬するレトロウイスルベクタ ーの非常に高い力価を生産するヘルパー細胞の産生、(b)始原細胞の場合、特異 的なリンパ系列を再増殖するかあるいは、成熟リンパ球の場合、長寿命集団にす ることができるかいずれかのリンパ系分集団の単離、および(c)標的細胞集団に 外来遺伝子を効率よく迅速に導入する、ことを提供するものである。 本発明の効率的な選択方法おw達成するために、ベクター生産ヘルパー細胞系 列が５×１０⁶から５×１０⁷単位/mlのウイルス力価を産生するようクローン化 され得る。本発明の方法は、また、ＳＣＩＤに導入した場合、あるいは致死量の 放射線照射を受けた宿主がＢ細胞またはＴ細胞系列を再増殖するような、リンパ 系始原細胞についての精製手段をも包含する。精製手段は、また、ＳＣＩＤまた は正常宿主への養子免疫細胞移入に際し、長期間生存するような成熟Ｂ細胞また はＴ細胞分集団びついて開発されたものである。本方法によると、２４ないし４ ０時間以内に、１から５、好ましく は１から３のプロウイルスで標的細胞の９０％以上が非常に急速に、かつ効率的 に感染に成功する。これらの進歩生は、遺伝子治療に著しく有利である、なぜな ら目的とする望ましい遺伝子を発現する標的細胞を豊富にするために、現行の方 法で使用されている選択段階を排除できるからであり、それゆえに標的細胞がin vitroで操作される時間を短縮でき、その結果宿主に一度戻し導入される細胞の 適切なホーミングが大きく改善されるのである。本新規遺伝子転移方法は、リン パ球における遺伝子欠損から生起する遺伝子障害を強力に修正するものであり、 そして失われた遺伝子産物がリンパ球により組織的に供給されるような別の遺伝 子障害を修正するものである。 本方法の一つの観点によれば、レトロウイルスベクターおよびヘルパー細胞の 組み合わせがウイルス産生の高いレベル、即ち５×１０⁶から５×１０⁷単位/ml 、をもたらすことを決定することを含む。このベクター産生ヘルパー細胞系選択 方法においては、ベクターはヘルパー細胞に移入され、次いで選択、細胞クロー ンの単離、そして５×１０⁶から５×１０⁷単位/mlの範囲ひウイルス力価が産生 されるようにウイルス産生細胞系を同定するためにウイルス力価が決定される。 本発明によれば、公知の多くの産生細胞系ベクターの組み合わせが、本発明の 実施のために使用することができる。一般的に、ベクターはヘルパー細胞系に移 入される。約５×１０⁵c.f.u./mlを産生する細胞系が選択される。これらの細胞 のサブクローニングにより、ウイルスの１０⁷c.f.u./mlまで産生することができ る系を とることができる。 以下に記すようなネズミリンパ球細胞に遺伝子転移するための特定の例におい ては、細胞系はＧＰ+Ｅ-86細胞系である(Ｅlwood et al., 1994, Ｌeukemia 8:1 06-114; Ｍatsushita et al., 1993,Ｔhombosis Ｒes.69:387-393; Ｗilson et al., 1993 Ｈuman Ｇene Ｔherapy 4:25-34; Ｍarkowitz et al., 1990, Ａnn. Ｎ.Ｙ. Ａcad. Ｓci. 612:407-414; Ｍoore et al., 1990, Ｂlood 75:2085-92) 、これはＮＩＨ 3Ｔ3を基にした細胞系であり、ベクターはpＮ2(Ｍoore et al., 1991, Ｈuman Ｇene Ｔherapy 2:307-315; Ａlford and Ｂelmont, 1990, Ｈum an Ｇene Ｔherapy 1:269-276; Ｓtoeckert et al., 1990, Ｅxperimental Ｈem atology 18:1164-1170)およびpＡsＡＤＡからなる群から選択されたものであり 、これらはＭＬＶ長末端反復プロモーターの制御に下にneo遺伝子を含むモロニ ーネズミ白血病ウイルスを基にしたレトロウイルスベクターである。特別な例に おいては、ベクターは内因生プロモーターの制御下でヒトアデノシンデアミナー ゼ(ＡＤＡ)遺伝子をコードしている。 ヒトリンパ球細胞に遺伝子転移を行う別の特別な例においては、ベクターはp ＭＦＧ-ＮＢ(Ｆerry et al., Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. Ｕ.Ｓ.Ａ.88:8377-8 1)であり、そしてヘルパー細胞はイヌ骨肉種細胞から調製され得る。これはアメ リカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ＡＴＣＣ)から、受け入れ番号ＣＣ Ｌ183で入手可能である。このイヌ細胞系は公知の方法によりヘルパー系として 調製することができる（例えば、Ｐear et al., 1993, Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. Ｕ.Ｓ.Ａ.90:8392-96; Ｍiller et al., 1991,Ｊ. Ｖirol. 65:2220-2224 ; Ｍarkowitz et al., 1988, Ｖirol. 167:400-406; Ｍarkowitz et al., 1988, Ｖirol. 167:112 0-24; Ｄanos and Ｍulligan, 1988, Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. Ｕ.Ｓ.Ａ.85 :6460-64; Ｄougherty et al., 1989,Ｊ. Ｖirol. 63:3209, およびＴemin and Ｄougherty米国特許Ｎo.4,980,289およびaＮo.5,124,263）。 別の本発明方法の観点によれば、本方法は特定のリンパ系列を再増殖できるよ うな、あるいは豊富なリンパ球細胞分集団を得るために望ましくないリンパ球細 胞を除去するようなモノクローナル抗体でリンパ球細胞の懸濁液を処理すること による長寿命集団であるような、リンパ球細胞分集団を分離することを含む。 更に別の本発明方法は、感染方法も含む。適当な生長因子を細胞が増殖性を保 つために被感染リンパ球の特定の型に加える。成熟Ｂ細胞に対しては、リポポリ サッカライド(ＬＰＳ)が使用される。成熟Ｔ細胞に対しては、コンカナバリンＡ およびインターロイキン２の連続処理が利用される。 好ましくは、一次リンパ球細胞は増殖を誘導するに必要な時間、例えば約２４ 時間、の長さに刺激される。刺激されたリンパ球は、生長因子の存在下で非常に 高いウイルス力価を有するヘルパー(pろデューサー）細胞の叢と共に共生培養さ れる。好ましくは、ヘルパー細胞は放射線照射される。照射はヘルパー／プロデ ューサー細胞の生長を止めるが細胞はウイルスを産生する能力を有している。こ のようにして、プロデューサー細胞の密集叢はプレートから生育しすぎることな くもちあがることもない。プロデューサー細胞はプレートに接着し、リンパ球は 接着しない。リンパ球がウイルス組み込みに必要な段階に増殖すると、リンパ球 は形質転 換ウイルスで感染させられる。感染した（あるいはトランスフェクトした）細胞 は培養され、そして動物に返される。 本発明で使われるベクターは、ゲノムに共有結合しなければならないが、しか しウイルスタンパク質生産に必要な配列を有していないで、ウイルスの複製のた めのゲノムに必要な配列を有している。ベクターは、複製に必要なシス作用配列 を有するが、しかしトランス作用配列は有していない。プロデューサー細胞はウ イルスタンパク質を発現するが、しかしウイルス（ウイルスに挿入することがで きるゲノムを有しない）を産生しない、そして、従って、中空の粒子のみを生産 する。直鎖ＬＴＲを有するベクターは高いウイルス力価を与える。 一次リンパ球への効率的な遺伝子転移 本発明は、一次、成熟リンパ節ＴおよびＢ細胞、および完全なＴ細胞系列(Ｎi kolic-Ｚugic, 1991, Ｉmmunol. Ｔoday)を再構築することのできる前駆細胞を 含む一次、未成熟ＣＤ4ＣＤ8ダブルネガティブ(double-negative, ＤＮ)胸腺細 胞に、外来遺伝子（約ゲノム当り１ないし５コピー）を効率的に導入するための レトルウイルスベクターの使用に関する。一次細胞の効率的な感染は、標的細胞 をレトロウイルスベクターの高力価を生産する致死量を照射したヘルパー細胞と 共生培養することによって達成される。 以下の特定の例においては、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼII(nco) 遺伝子あるいはneoおよびヒトアデノシンデアミナーゼ(ＡＤＡ)遺伝子の両者を 含むレトロウイルスベクターを保持しているヘルパープロデューサー細胞をリン ホカインおよび／また はマイトジェンの存在下で単離リンパ球と共生培養した。ネオマイシン選択なし に、感染後２日で、１細胞当り１から５コピーの外来遺伝子がサザンブロット分 析で検出された。ヒトＡＤＡタンパク質の発現は、成熟ＴおよびＢリンパ球にお ける内因性ネズミＡＤＡタンパク質に比較しうるレベルで検出された、そして未 成熟ＤＮ胸腺細胞よりは幾分低かった。ここに記載した感染方法は２４時間以内 に完成することができ、従ってin vivo動物再構築実験に有利である。 Ｂ細胞系列体細胞遺伝子治療 一次、成熟Ｂリンパ球は体細胞遺伝子治療の強力で重要な細胞標的である。そ れらの抗原提示細胞として働く能力は、免疫応答の引き金および／または増強に 利用することができる。 別に、自己抗原を発現するB細胞は、自己免疫疾患の治療に抗原特異的不応答 を誘導するように操作することができた。例えば、自己抗原を発現する休止Ｂ細 胞の養子免疫細胞移入は、他の実験系で示したように、抗原特異的不応答を付与 するために使用することができた。例えば、Ｍls^aのＭls^bへの転移は、宿主のＭ ls^a特異的Ｔ細胞のクローンアネルギーおよび／またはクローン消失を誘導する ことが示された(Ｒammensee et al., 1989, Ｎature 339:541-544; Ｗebb et al ., 1990, Ｃell 63:1249-56）。この不応答の型は末梢性免疫寛容と呼ばれてい る。下記の実施例に開示されているように、末梢性免疫寛容は自己免疫疾患、例 えば多発性硬化症、およびＭＳ、ＥＡＥの動物モデル、同様にリウマチ性関節炎 、狼瘡(lupus)、シェーグレン症候群、およびその他の自己免疫疾患、に対して 、 特に強力であろう。本発明は、従って、末梢性免疫寛容の誘導はＴ細胞介在自己 免疫疾患の処理に有益な手段であることを証明することができた。 下記する実施例において論じたように、Ｂ細胞において自己抗原の移入のため のベクターが調製できるので。従って自己抗原は、ＭＨＣクラスII分子に関連し た提示をするための内在性細胞機構を経て転移するために、細胞質内で発現され る(例えば、Ｂraciale and Ｂraciale, 1991, Ｉmmunol. Today 12:124; Ｂrods ky and Ｇuagliardi, 1991, Ａnn. Ｒev. Ｉmmunol. 9:707)。より好ましくは、 自己抗原は、シグナル配列を含むことによって分泌タンパク質または細胞表面タ ンパク質として発現することができ、そして、後者の場合には、膜結合配列であ る。別の好ましい例においては、自己抗原は、細胞質末端において、エンドソー ムまたはリソソーム標的配列と共に、キメラ構造として発現される(Ｂraciale a nd Ｂraciale, 同上; Ｂrodsky and Ｇuagliardi, 同上；Ｐeters et al.,1990, ＥＭＢＯ Ｊ.9:3497; Ｂakke and Ｄobherstein, 1990, Ｃell63:707)。 別の観点において、自己抗原特異的不応答を誘発するためのベクターは抗原提 示細胞接着分子に対するアンチセンスコーディング配列、即ちＴ細胞への結合お よび刺激を促進する分子、を含み得る。より好ましくは、ベクターは、そのよう な細胞表面分子に特異的なリボザイムの発現を提供する。アンチセンスＲＮＡま たはリボザイムの共発現、更に、Ｔ細胞を刺激するのに重要である細胞表面補助 分子の発現、および一般的には免疫応答を減少することによってＴ細胞アネルギ ーを増加させ得る。 更に別の観点において、ベクターは、Ｔ細胞活性化を阻害するリンホカインま たはサイトカイン、例えばインターロイキン−１０(ＩＬ-10)、これに限らない が、を含み得る。 長寿命Ｂリンパ球細胞は正常化した遺伝子産物を血流中に放出するのに有益で ある。 本発明に合わせて、動物モデル系が、薬剤選択なしに外来遺伝子を導入するた めの効率的かつ迅速な方法がとられている、Ｂリンパ球細胞遺伝子治療について 、記述されている。 このモデルにおいては、脾とリンパ節(ＬＮ)Ｂ細胞は、それ自体のプロモータ ーから発現されたヒトＤＮＡ遺伝子を含むレトロウイルスベクターで４０時間以 内に、再現的に感染させられ得る。標的細胞は１細胞当り平均１−３コピーのプ ロウイルスを含み、ヒトＡＤＡタンパクを高レベルで発現することができ、そし てＳＣＩＤ宿主に養子免疫細胞移入するとき、リンパ系器官に適切に定着(home) することができ、誘導遺伝子の発現レベルで検出し得るいかなる損失もなしに、 少なくとも３ヵ月は生き残ることができる。 本発明で使用される略号は以下の通りである： pro:プロモーター；enh:エンハンサー；ＰＢＳ:ＤＮＡ合成のプライマー結合部 位；ＰＰＴ:ＤＮＡ合成のためのポリプリントラック；Ｅ:ＲＮＡパッケージング のための包膜配列；attＲ+:組み込みに関連した接着部位の右側を形成する配列 ；attＬ+: 組み込みに関連した接着部位の左側を形成する配列；attＬ+: 原プロ ウイルスの左側接着部位の除去；およびattＲ+: 原プロウイルスの右側接着部位 の除去。 本発明は、目的の真核遺伝子を選択し、本発明にしたがってデ ザインされたベクターに遺伝子を挿入し、そのベクターでヘルパー細胞をトラン スフェクトし、ヘルパー細胞からウイルス株を培養し、培養した子孫ウイルスを 標的細胞に感染するために使用し、そして標的細胞に生成したプロウイルスがい かなるレトロウイルスタンパク質も発現することなしに挿入した真核遺伝子を発 現させることである。プロウイルスで活性のあるレトロウイルスプロモーターは ないので、内在性ヘルパータンパク質はプロウイルスからウイルス産生の引金と はなり得ない。プロウイルス中にはレトロウイルスプロモーターが存在しないの で、プロウイルスは、宿主細胞が意図しなかったように作用する引金となるよう なレトロウイルスをもたらすことはできない。 本発明は以下の実施例を参照してよりよく理解されるであろう。実施例は例示 の形で示されるが、限定的なものではない。実施例１：リンパ球細胞へ効率的な遺伝子転移 材料と方法 一次ネズミリンパ球細胞への効率的な遺伝子転移 マウス Ｂalb/cＢy、雌雄、マウスはＪackson Ｌaboratory, Ｂar Ｈarbor,Ｍaineから 購入した。 プラスミド pＮ2はＥ.Ｇilboaから供与された。pＮ2とpＡsＡＤＡは、モロニーネズミ白血病 ウイルス(ＭＬＶ)に基づく、ＭＬＶ長末端反復(ＬＴＲ)プロモーターから発現さ れたネイマイシンホスホトランスフェラーゼII(neo)遺伝子を含む、レトロウイ ルスベクターである。 pＡsＡＤＡは、内在性プロモーターから発現されたヒトアデノシンデアミナーゼ (ＡＤＡ)遺伝子を含む。このベクターはＧene Ｔherapy Ｉnc.から供与された。 ウイルス産生細胞系 ＧＰ+Ｅ-86細胞系はＮＩＨ 3Ｔ3に基づくエコトロピックネズミパッケージング 細胞系(Ｍarkowitz et al., 1988, J. Ｖirol.62:1120)である。ＧＰ+Ｅ-86細胞 はポリグレン／ＤＭＳＯショック法(Ｋawai and Ｎishizawa, 1984, Ｍol. Ｃel l Ｂiol.4:1172)を用いてベクタープラスミドＤＮＡ5/gでトランスフェクトした 、次いでＧ418(0.35mg/ml)およびＧＰＴ(キサンチン0.25mg/ml、マイコフェノー ル酸25/g/mlおよびヒポキサンチン１５/g/ml)で選択した。Ｎ2でトランスフェク トしたＧＰ+Ｅ-86細胞は、ＮＩＨ3Ｔ3細胞をヘルパー細胞上清の連続希釈で接種 して定量し、次いでＧ418(0.35mg/ml)の存在下２週間選択し、コロニーを計数し て、ウイルス株2.0×10⁷コロニー形成単位(ＣＦＵ)/mlを得た。ＡsＡＤＡトＲＮ ンスフェクト細胞はウイルス株1.5×10⁷ＣＦＵ/mlを得た。 ダブルネガティブ(ＤＮ)胸腺細胞の調製 ３ないし５週令のマウスから得た胸腺細胞を、モノクローナル抗体ＧＫ1.5(ラ ット抗マウスＣＤ4)（Ｗilde et al., 1983, J. Ｉmmunol. 131:2178; Ｄialyna s et al., 1983, Ｊ. Ｉmmunol. 131:1445)、3.168（ラット抗マウスＣＤ８）( Ｓarimiento et al., 1980, Ｊ. Ｉmmunol.125:1665)およびモルモットとウサギ の補体混合物の反応混液で処理してＣＤ4＋およびＣＤ８＋細胞を除去した。こ の方法では、常法で、フローサイトメトリーによる分析で、２％以下のＣＤ4+お よび０.５％ 以下のＣＤ８＋細胞を含むＤＮ細胞集団を得ることができる。ＤＮ細胞はゲンタ マイシン(50mg/ml)(ＧＩＢＣＯ,Ｇrand Ｉsland,ＮＹ)および２−メルカプトエ タノール(50/Ｍ)(Ｓigma,Ｓt.Ｌuisi,ＭＯ)加ＲＰＭＩ培地で培養し、感染前２ ４時間組換えヒトインターロイキン７(rＩＬ-7、50ng/ml)(Ｐepro Ｔech, Ｒock y Ｈill, ＮＪ)で刺激した。 末梢リンパ節リンパ球細胞の調製 リンパ節(ＬＮ)は親マウスから得た。Ｔリンパ球細胞は、ＬＮ細胞懸濁液をモ ノクローナル抗体J11d、ラット抗ネズミ熱安定性抗原(ＨＳＡ)抗体、で処理して 単離した。この抗体により補体も加えて、ＬＮ１９から実際的にすべてのＢ細胞 を除去できる。Ｂリンパ球細胞は、ラット抗マウスＴhy-1.2抗体(Ｓymington,19 81,Ｊ.Ｉmmunol.127:2496)であるモノクローナル抗体J1j ち補体で処理して単離 した。これらの処理方法は常法により、フローサイトメトリーで分析すると、各 々＞９７％のＴまたはＢ細胞を含む濃縮ＴおよびＢ細胞集団が得られる。Ｔ細胞 濃縮集団中にＢ細胞０.５％以下が検出された（データは示さない）。Ｔ細胞を ゲンタマイシン(50/g/ml)、２−メルカプトエタノール(50/Ｍ)を加えたＲＰＭＩ 培地で培養し、コンカナバリンＡ(4/g/ml)で刺激した。２４時間後、細胞を２回 洗浄し、組換えネズミインターロイキン２(Ｐepro Ｔech)10ng/mlを沸組む培地 に再懸濁した。Ｂ細胞をリポポリサッカライド(50/g/ml)で刺激した。 ウイルス感染 初代リンパ球細胞への遺伝子転移をウイルス産生細胞との共生培養により、お よびウイルス産生細胞から培養の上清に接種する ことにより試みた。共生培養による感染は、１×１０⁶細胞／ml−ＲＰＭＩの密 度で刺激したリンパ球標的を、１００mm組織培養プレート中の照射（１６００ラ ド）ウイルス産生細胞の集密的細胞叢に１×１０⁶に播種することにより行った 。ＤＮ胸腺細胞にポリブレン(6/g/ml)およびrＩＬ-7(50ng/ml)を、Ｔリンパ球細 胞用にはrＩＬ-2(10ng/ml)を、あるいはＢリンパ球細胞用にはリポポリサッカラ イド(50/g/ml)を培地に加えた。２４時間後、初代標的細胞を収穫し、刺激剤リ ンホカイン／マイトジェンを含む新鮮培地で培養した。７２時間後、標的細胞ゲ ノムＤＮＡをサザンブロット分析用に抽出した、そしてタンパク抽出をＡＤＡ活 性を測定するために行った。接種による感染はrＩＬ-7(50ng/ml)およびポリブレ ン(8/g/ml)の存在下、ウイルス上清５.０ml中２０×１０⁶ＤＮ胸腺細胞を、２時 間３７℃にてインキュベートすることにより行った。細胞を遠心し、rＩＬ-7(50 ng/ml)を加えた新鮮培地に再懸濁し、収穫まで組織培養プレートで培養した。初 代リンパ球細胞の接種に使った感染ベクター上清が感染ベクターウイルスを含ん でいることを保証するために、ＮＩＨ3Ｔ3細胞を、感染ベクターウイルスが上清 中に含まれていることの確信を得るために平行して感染させ、そしてＮＩＨ3Ｔ3 細胞の感染を常に観察した。 ＤＮＡの単離をサザンブロット分析 ＳacI消化ゲノムＤＮＡ29/g/レーンのサザンブロッティングは、３２Ｐラベル neo特異的プローブ、pＮ2からの1.3kbＥcoＲＩ-Ｘho-Ｉ断片、を用いて常法(Ｓa mbrook et al., 1989, Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory Ｐress)に従い行っ た。プローブは任意にラベルした。コピー数の 対照はＳacIでpＮ2およびpＡsＡＤＡを消化して行いゲル上１ないし１０プロウ イルスコピー／ゲノムに相当する量を負荷した。 ＡＤＡアッセイ 感染２日後凍結／融解法により１×１０⁶標的細胞を融解し、ライゼートをセ ルローズアセテートプレート(Ｈelena Ｌaboratories, Ｂlaumont, Ｔexas)にか けた。ヒトおよびネズミＡＤＡアイソザイムをセルローズアセテートプレート上 で電気泳動により分離した(Ｌim et al.,1989, Ｐroc. Ｎatl.Ａcad. Ｓci. Ｕ. Ｓ.Ａ.86:8892)。酵素活性は、プレート上で分離されたＡＤＡアイソザイムをリ ン酸緩衝液中アデノシン(2mg/ml)(Ｓigma)、ヌクレオシドホスホリラーゼ(15/g/ ml)(Ｂochringer Ｍannheim, Ｉndianapolis, ＩＮ)、キサンチンオキシダーゼ( 0.06Ｕ/ml)(Ｂoehringer Ｍannheim, Ｉndianapolis, ＩＮ)、フェナジンメトサ ルフェイト(0.01mg/ml)(Ｓigma)、およびジメチルチアゾールジフェニルテトラ ゾリウムブロミド(0.1mg/ml)(Ｓigma)を含む寒天重層を暗室中２０分３７℃反応 により検出した。 第１図は本発明のレトロウイルスベクターを概略的に図示する。Ｎ2とＡsＡＤ Ａはモロニーネズミ白血病ウイルスを基にしたベクターである。Ｎ２１３はウイ ルス長末端反復(ＬＴＲ)プロモーターから発現したネオマイシンホスホトランス フェラーゼII遺伝子(neo)を含んでいる。ＡsＡＤＡはウイルスＬＴＲプロモータ ーから発現したneoとＡＤＡ内在性プロモーター(Ａs)から発現したヒトアデノシ ンデアミナーゼ遺伝子(ＡＤＡ)を含んでいる。 第２(Ａ)図と第２(Ｂ)図はＤＮ胸腺細胞中における遺伝子転移と発現を示すサ ザンブロットである。第２(Ａ)図はＮ2感染細胞のサザ ンブロットであり、第２(Ｂ)図はＡsＡＤＡ感染細胞のサザンブロットである。 ゲノムＤＮＡは感染２日目にＳacIで消化し抽出した、次いでneo特異的プローブ を用いてサザンブロティングを行った。10/gＤＮＡを各レーンにつけた。第２( Ａ)図および第２(Ｂ)図のレーン：１（レーン１）あるいは１０（レーン２）プ ロウイルス／細胞に相当するプラスミドコピー数の対照群；非トランスフェクト ＧＰ+Ｅ-86細胞（レーン３）；Ｎ２-(Ａ、レーン４)またはＡsＡＤＡ(Ｂ、レー ン４）産生ＧＰ+Ｅ-86細胞；非感染ＤＮ胸腺（レーン５）；rＩＬ-7存在下で感 染させたＤＮ胸腺細胞、ウイルス含有プロデューサー細胞上清と共に２時間イン キュベーション（レーン６）によるもの、または照射プロデューサー細胞の集密 的細胞叢上で２４時間共生培養（レーン７）によるもの；「非接着細胞」（もち 上がった、lifting）対照；共生培養のために播種したゲノムＤＮＡ単離直前に 得た新鮮なＤＮ胸腺細胞と混ぜた、照射プロデューサー細胞からの上清（レーン ８）。 第２(Ｃ)図はＡsＡＤＡで感染したネズミＤＮ胸腺細胞におけるヒトＡＤＡ遺 伝子ノ発現を示す。感染４８時間後、標的細胞リゼート(１×１０⁶細胞／レーン に相当）をセルローズアセテートプレート上で電気泳動し、ネズミＡＤＡアイソ ザイムからヒトのを分離した。ＡＤＡタンパクは比色酵素測定法により検出した 。レーン：非感染ＤＮ胸腺細胞（レーン１）；ＡsＡＤＡウイルス株を接種した ＤＮ胸腺細胞（レーン２）；ＡsＡＤＡウイルス産生細胞と共生培養したＤＮ胸 腺細胞（レーン３）；「非接着細胞」対照（レーン４）；ヒト標準品：Ｈ９細胞 （希釈１：２、レーン５）；ヒトＴ細胞系： ＡsＡＤＡプロデューサー細胞（希釈１：１０、レーン６）。 第３図はリンパ節Ｔ細胞における遺伝子転移と発現を示す。Ｔリンパ球細胞は 、補体の存在下、Ｊ11Ｄに特異的なモノクローナル抗体でリンパ節細胞を処理し て単離した。Ｔ細胞はコンカナバリンＡで一夜刺激し培養、次いで照射ＡsＡＤ Ａ産生細胞と共生培養中にインターロイキン-２を加えた。 第３(Ａ)図において、ゲノムＤＮＡは感染後４８時間に抽出された、次いで第 ２図の凡例に記したようにサザンブロッティングを行った。レーン：１（レーン １）および１０（レーン２）プロウイルス／細胞に相当するプラスミドコピー数 の対照群；非トランスフェクトＧＰ+Ｅ-86細胞（レーン３）；ＡsＡＤＡトラン スフェクトＧＰ+Ｅ-86細胞（レーン４）；非感染リンパ節Ｔリンパ球細胞（レー ン５）；ＡsＡＤＡウイルス産生細胞と共生培養したリンパ節Ｔ細胞（レーン６ ）；「非接着細胞対照」ＤＮＡ抽出の直前新しく得たリンパ節Ｔリンパ球細胞と 混ぜた照射ＡsＡＤＡウイルス産生細胞からの上清（レーン７）。 第３(Ｂ)図はＡsＡＤＡで感染したネズミリンパ節Ｔリンパ球におけるヒトＡ ＤＡ遺伝子発現を示す。感染後４８時間にＡＤＡ測定を第２図に説明したと同様 に行った。レーン：「非接着」対照（レーン１）；ＡsＡＤＡウイルス産生細胞 と共生培養したリンパ節Ｔ細胞（レーン２）；非感染リンパ節Ｔ細胞（レーン３ ）；ＡsＡＤＡ産生細胞（希釈１：１０、レーン４）；ヒト標準品：Ｈ９細胞（ 希釈１：２、レーン５）。 第４図はリンパ節Ｂ細胞における遺伝子転移と発現を示す。Ｂリ ンパ球細胞は、補体の存在下、pan-Ｔ細胞マーカーＴhy-1.2に特異的なモノクロ ーナル抗体と共にリンパ節細胞と培養して増強させた。Ｂ細胞は感染１日前およ び感染中リポポリサッカライドで培養して刺激した。 第４(Ａ)図において、ゲノムＤＮＡは感染後４８時間に抽出された、次いで第 ２図の凡例に記したようにサザンブロッティングを行った。レーン：１（レーン １）および１０（レーン２）プロウイルス／細胞に相当するプラスミドコピー数 の対照群；非トランスフェクトＧＰ+Ｅ-86細胞（レーン３）；ＡsＡＤＡトラン スフェクトＧＰ+Ｅ-86細胞（レーン４）；非感染リンパ節Ｂリンパ球細胞（レー ン５）；ＡsＡＤＡウイルス産生細胞と共生培養したリンパ節Ｂ細胞（レーン６ ）；「非接着細胞対照」ＤＮＡ抽出の直前新しく得たリンパ節Ｂリンパ球細胞と 混ぜた照射ＡsＡＤＡウイルス産生細胞からの上清（レーン７）。 第４(Ｂ)図はＡsＡＤＡで感染したネズミリンパ節Ｂリンパ球におけるヒトＡ ＤＡ遺伝子発現を示す。感染後４８時間にＡＤＡ測定を第２図に説明したと同様 に行った。レーン：ヒト標準品：Ｈ９細胞（希釈１：２、レーン１）;ＡsＡＤＡ 産生細胞（希釈１：１０）レーン２）；非感染リンパ節Ｂ細胞（レーン３）；Ａ sＡＤＡウイルス産生細胞と共生培養したリンパ節Ｂ細胞（レーン４）；「非接 着」対照（レーン５）：上記の細胞のベクターゲノムコピーの対照。 Ｂ細胞系列体細胞遺伝子治療のネズミモデル ネズミ白血病ウィルス(ＭＬＶ)に基づいた、エコトロピックパッケージ細胞系 ＧＰ+Ｅ-86により産生されるヒトＡＤＡおよび細菌性ネ オマイシン耐性(neo)遺伝子（第４Ａ図）を含むレトロウイルスベクターＡsＡＤ Ａを用いた。(Ｂraakman et al., 1992, Ｅur. Ｊ. Ｉmmunol. 22:63)。増殖し たＢリンパ球細胞を親Ｃ.Ｂ-17脾またはリンパ節からＴ細胞を除去して行った。 効率的にプロウイルスがぢきるように、Ｂ細胞をマイトジェンリポポリサッカラ イド(ＬＰＳ)で１６時間増殖誘導した、そして２４時間致死量照射したヘルパー 細胞を共生培養した。この方法により、脾およびＬＮＢ細胞の両者において標的 細胞ゲノム当り１ないし３プロウイルスコピーの感染効率が普通に得られた（第 ４Ｂ図、レーン４、５）。これを、プロウイルスにあるneo配列に特異的なプロ ーブを用いて、感染４０時間後に標的細胞ゲノムＤＮＡのサザンブロティングに より評価した、そして５、１または０.５プロウイルス／ゲノムに相当するＡsＡ ＤＡプラスミドコピー数対照と比較した（第４Ｂ図、レーン１−３）。第４Ｂ図 、レーン６は観察されるシグナルの一部が細胞が共生培養中に盛り上がったため ヘルパー細胞のコンタミおこったためであるという可能性を除くためにデザイン された対照を示す。この対照ではシグナルは検出されなかった。 ヒトＡＤＡタンパク発現は、内在性ネズミＡＤＡ酵素からの外来ヒトＡＤＡを 分離するために電気泳動した標的細胞リゼートを用いて比色酵素測定を平行して 行って、測定した(Ｈayden and Ｍa, 1992, Ｍol. Ｃell. Ｂiochem. 113;171; Ａuwerx et al., 1992, Ｃritical Ｒeviews in Ｃlinical Ｌaboratory Ｓcien ces)。第４Ｃ、レーン３および４にみられるように脾およびＬＮＢ細胞両者のヒ トＡＤＡ酵素活性はネズミＡＤＡ活性より高い。強く持ち上げられたヘルパー細 胞に起因するシグ ナルは検出されなかった（第４Ｃ図、レーン５）。 サザンブロッティングが、感染細胞を増強するためにin vitro薬剤選択段階を 必要とせずに、非常に効率のよい遺伝子転移を４０時間以内に完了することがで きた、ということを示したので、初代Ｂ細胞はin vivoでの生存性と正常なホー ミングパターンを保持していることが仮定された。これを試験するために、Ａs ＡＤＡレトロウイルスベクターで感染させたＣ.Ｂ-１７脾細胞のホーミングパタ ーンを新しい脾Ｂ細胞と比較した。⁵¹Ｃr標識Ｂ細胞をIgh-コンジェニックＢalb /cＢy・ＳＣＩＤマウスの群にi.v.投与した。レシピエントを１８時間後に屠殺 し、種々の器官を取り出し、放射能レベルを測定した。第１表に示すように、Ａ sＡＤＡ感染脾Ｂ細胞は新しい脾Ｂ細胞に類似したホーミングパターンを示した 。両群とも、細胞はレシピエントの脾に主として定着した。これは公表された報 告と一致する(Ｓprent, 1973, Ｃell Ｉmmunol. 7:10; Ｓtevens et al., 1982, Ｊ.Ｉmmunol. 128:844)、しかし脾に達した感染細胞の割合は７.１４％であり これは対照細胞に比べ減少している。肝は損傷したリンパ球を処理するので、両 群とも放射能は肝で最も高かった。肝に比較して脾の放射能比は転移した細胞の 生存数の程度を示している。感染細胞では、肝に対する脾の割合は新しいＢ細胞 （抗Ｔhy-1.2および補体処理のみ）では０.２８対０.６５であって、これは４０ 時間の共生培養で脾に定着した生存細胞数は約半分に減少していることを示して いる。 ＡsＡＤＡ感染Ｂ細胞がin vivoで長期間生存するかを評価するため、Ｃ.Ｂ-１ ７マウスからの脾およびＬＮＢ細胞をＡsＡＤＡベクターウイルスで、記したよ うに感染させた。そして１０匹のIgh-コンジェニックＢalb/cＢyＳＣＩＤマウス （5-25×10⁶細胞／マウス、i.v.）に養子免疫細胞移入を行った。 第５(Ａ)図はレトロウイルスベクターＡsＡＤＡを概略的に図示する。ＡsＡＤ Ａは、ＭＬＶＬＴＲプロモーターから発現した細菌のneo遺伝子を含むＧlＮaベ クター(Ｍiller et al., 1992, Ｈum. Ｇen. Ｔher. 3:619)およびその内在性プ ロモーターから発現したヒトＡＤＡ遺伝 子である。エコトロピックＧＰ+Ｅ-86ヘルパーさしぼう(Ｂraakman et al., 199 2, Ｅur, Ｊ. Ｉmmunol.22:63)はヘルパー細胞上清の連続希釈でＮＩＨ3Ｔ3を接 種して測った結果2×10⁷ＣＦＵ/mlでＡsＡＤＡを産生する。ＡsＡＤＡ産生細胞 を常に試験して、いつも接種したＮＩＨ3Ｔ3細胞での逆転写酵素活性の測定によ って複製感応ウイルスの産生がないことが見い出された。 第５(Ｂ)図はＡsＡＤＡで感染した脾およびＬＮＢ細胞のサザンブロット解析 である。初代Ｃ.Ｂ-17Ｂ細胞は抗Ｔhy-1.2mＡb JIjおよび補体で脾またはＬＮ細 胞を処理して得た(Ｂraakmann et al.,1992,Ｅur.Ｊ.Ｉmmunol.22:63)。Ｂ細胞 は、前に記したように、ＬＰＳの存在下２４時間、致死量照射ヘルパー細胞の密 叢と共生培養することによりＡsＡＤＡに感染する前に、ＬＰＳ(50/g/ml)で一夜 培養した。(Kuo et al., Blood, 投稿中）。ゲノムＤＮＡは４８時間後に標的細 胞から抽出した、そしてサザンブロッティングを制限酵素ＳacI、これはneo特異 的配列でハイブリダイゼーションにより３.７kbプロウイルス断片を与えるが、 を用いて行った。レーン：１-３、5.1および0.5プロウイルスコピー／細胞に相 当するＳacI消化pＡsＡＤＡプラスミドＤＮＡ；４、ＡsＡＤＡ感染脾Ｂ細胞；５ 、ＡsＡＤＡ感染ＬＮＢ細胞；６、共生培養で持ち上がった（非接着）ヘルパー 細胞が標的細胞から得られたシグナルに影響するかどうかを測るための上清対照 。非感染ＬＮ細胞（持ち上がるかもしれないわずかのヘルパー細胞のためのキャ リアーとして使用）を、ゲノムＤＮＡ抽出の直前に共生培養のために接種した照 射ヘルパーからの上清に加えた。；７、非感染ＬＮ細胞。 第５(Ｃ)図はネズミＢ細胞中のヒトＡＤＡ分析を示す。平行実験で、感染４８ 時間後、１×10⁶標的細胞からのリゼートをネズミＡＤＡ酵素からヒトのを分離 するためにセルロースアセテートプレートで電気泳動し、そしてＡＤＡ活性を比 色酵素測定法で検出した（Ｋuo et al., Ｂlood, 投稿中）。レーン：１、ＡsＡ ＤＡ産生細胞；２、ヒト標品：Ｈ-９Ｔ細胞系；３、ネズミ標品：非感染ＬＮ細 胞；４、ＡsＡＤＡ感染脾Ｂ細胞；５、ＡsＡＤＡ感染ＬＮＢ細胞；６、上清対照 (Ｂ細胞の）。 第６図はＡsＡＤＡ感染ＬＮおよび脾Ｂ細胞で再構成したＳＣＩＤマウスから 得た脾のフローサイトメトリー分析を示す。Ｃ.Ｂ-１７マウスからのＬＮおよび 脾Ｂ細胞を、第４Ｂ図に記載したようにＡsＡＤＡで感染し、軽く照射した（２ ００ラド）Igh-コンジェニックＢＡＬＢ/cＢy ＳＣＩＤマウス（５×10⁶ＬＮＢ 細胞、１７×10⁶脾Ｂ細胞i.v.)に投与した。脾細胞を、ＬＮＢ細胞を投与した代 表的なマウスから転移後４週間、第６(Ａ,Ｂ)図、および脾Ｂ細胞投与マウスか ら転移後３ヵ月、第６(Ｃ,Ｄ)図、フローサイトメトリーにより分析した。10⁶細 胞をドナーＣ.Ｂ-１７Ighアロタイプ／^b、およびレシピエントＢＡＬＢ/cＢy Ig hアロタイプ／^aに特異的なモノクローナル抗体で染色した(Ｏi et al., 1978, Ｃurr. Ｔop. Ｍicro. Ｉmmunol. 81:115)。５０００細胞をエピックスプロファ イルで分析した。 第７(Ａ)図は、標的Ｂ細胞に養子移入されたＳＣＩＤマウスの脾からえたゲノ ムＤＮＡのサザンブロット分析を示す。脾Ｂ細胞を第４Ｂ図に記したようにＡs ＡＤＡで感染した、そして直ちに１０匹のＳＣＩＤマウス（5-25×10⁶細胞／マ ウスi.v.）に投与した。レシピエ ントマウスを１および３ヵ月後に屠殺し、脾からゲノムＤＮＡを抽出した。第４ 図に記したと同様にサザンブロッティングを行った。レーン：１-４、転移後１ ヵ月目に屠殺したレシピエントマウス；または５-１９、屠殺後３ヵ月；１１、 再構成しないマウスからの対照；１２-１４、夫々0.5、1、および5プロウイルス コピー／細胞、に相当するsacI消化pＡsＡＤＡプラスミドＤＮＡ。 第７(Ｂ)図はＳＣＩＤマウスにおけるヒトＡＤＡ活性を示す。１×10⁶リンパ 球細胞に相当する脾細胞リゼートで第４図に記したと同様に、ヒトＡＤＡ活性を 測定した。レーン：１、ＡsＡＤＡヘルパー細胞；２、ヒトＨ-９Ｔ細胞系；３- ６、転移後１ヵ月のレシピエントの脾；7-12、転移後３ヵ月。 結果 初代ネズミリンパ球への効率的な遺伝子転移 ＤＮ胸腺への効率的な遺伝子転移 ＣＤ４-ＣＤ８-（ＤＮ）胸腺は補体の存在下抗ＣＤ４および抗ＣＤ８モノクロ ーナル抗体で胸腺を培養して３ないし５週令マウスから誘導された。これにはベ クターＮ２およびＡsＡＤＡを使用した。Ｎ２およびＡsＡＤＡはモロニーネズミ 白血病ウイルス（ＭＬＶ）に基づいたベクターである。エコトロピックパッケー ジング細胞系、ＧＰ+Ｅ-86,14をウイルス生産に使用した。これらの細胞は複製 受容能力を有するＭＬＶがなくてもＭＬＶに基づくベクターウイルスを産生する ように設計されている。Ｎ２はネオマイシントランスフェラーゼII遺伝子(neo) を含み、ＡsＡＤＡはneoとヒトアデノシンデアミナーゼ遺伝子(ＡＤＡ)を含む（ 第１図）。 ＤＮ胸腺細胞を、照射した、Ｎ２またはＡsＡＤＡベクターウイルス産生細胞 のいずれかの密集培養と共生培養により、あるいは組換えヒトインターロイキン -7（rＩＬ-7).21の存在下にウイルス含有上清とインキュベートするかによって 、感染させた。rＩＬ-7はＭＬＶに基づくベクターウイルスによる感染に必要な 工程であるＤＮ胸腺細胞の増殖を刺激するのに必要である(Ｒichter et al., 19 84, Ｍol. Ｃell. Ｂiol. 4:151)。共生培養の２４時間後に、標的細胞を新鮮な プレート移し、もち上がった産生細胞が再び接着するように２日間培養した。こ の培養期間は転移した遺伝子を発現するための時間を細胞に与える。サザンブロ ット分析によりウイルスＤＮＡの蓄積、および酵素測定法によりヒトＡＤＡタン パクの存在のため細胞を分析した。 ゲノムＤＮＡはＳacIで消化した。うまくプロウイルスが生成していると、3.3 kbのneo特異的配列とハイブリダイゼーションをするとＮ２感染細胞では3.7kbの バンドが得られる（第１図）。第２図に示したように、１細胞当り約１-５プロ ウイルスに相当するシグナル（走査ゲルデンシトメトリーで定量および１または １０コピーに相当するプラスミド対照と比較）が、ＤＮ胸腺細胞と照射Ｎ２産生 細胞（第２Ａ図レーン７）またはＡsＡＤＡ産生細胞（第２Ｂ図レーン７）の共 生培養の後に得られた。対照的に、接種により感染させた細胞は、Ｎ２接種（第 ２Ａ図レーン６）、ＡsＡＤＡ接種（第２Ｂ図レーン６）のように２週間の露出 でやっと検出できる（データは示さない）、非常に弱いシグナルを与える。一細 胞当り約０.１プロウイルスに相当するシグナルは、接種による感染は 約５０倍も、共生培養による感染に比べて効率が悪いことを示している。初代リ ンパ球細胞の感染は６時間ないし一夜の長時間の培養が必要である。更に、これ はウイルス力価が約８倍（ＮＩＨ3Ｔ3細胞で１×10⁸力価／ml）に増えた濃厚ウ イルス液で行われたのである。濃厚ウイルス株と長時間の培養にもかかわらず、 効率的な遺伝子は、共生培養のようには、得られなかった。非感染対照リンパ球 細胞（第２ＡおよびＢ図、レーン５）およびＧＰ+Ｅ-86細胞（第２ＡおよびＢ図 、レーン３）はneoについて陰性であった。Ｎ２産生細胞（第２Ａ図、レーン４ ）およびＡsＡＤＡ産生細胞（第２Ｂ図、レーン４）は陽性対照のような結果で あった。 共生培養で感染した胸腺細胞を、共生培養中に持ち上がった産生細胞が再び接 着するように新しい組織培養プレートに加えたが、この工程の後にもヘルパー細 胞が初代細胞培養に混入するかもしれないのを制御するのに、それは有用である と信じられた。これを制御するため、リンパ球細胞なしに培養した照射ＡsＡＤ ＡおよびＮ２ヘルパー細胞からの上清を測定した。リンパ球細胞と共に共生培養 した培地と同様に操作した。これらの上清は新しく得られたＤＮ胸腺細胞に加え られ、すぐ後にゲノムＤＮＡの抽出が行われた(ＡsＡＤＡ上清の一定量を後のＡ ＤＡ測定に使用した）。非接着細胞の数は全体に比べ少しであるので、ＤＮ胸腺 細胞をキャリアーとして作用するために加えた。第２図（ＡおよびＢ、レーン８ ）にみられるように、この対照からばシグナルは見られなかった。このことは感 染させたダブルネガティブ胸腺細胞で得られた陽性シグナルは（第２ＡおよびＢ 図、レーン７）混入したヘルパー細 胞によるものではなかった。 ネズミＤＮ胸腺細胞でのヒトＡＤＡ遺伝子の発現 先に記したように、共生培養によりまたは接種かによりレトロウイルスベクタ ーＡsＡＤＡで感染したＤＮ胸腺細胞を収穫し、新しいプレートに移し、ヒトＡ ＤＡ遺伝子が十分に発現するように２日間培養した、そして共生培養した標的細 胞の場合には、非接着細胞が再接着するようにした。標的ＤＮ胸腺細胞のヒトＡ ＤＡタンパク発現を測定した。第２Ｃ図は標的ＤＮ胸腺細胞のＡＤＡ測定を示す 。ヒトＡＤＡタンパクはセルロースアセテートプレートで標的細胞リゼートを電 気泳動しネズミＡＤＡアイソザイムから分離した。タンパクの検出は比色酵素測 定法で行った（材料と方法）。結果は外来ヒトＡＤＡ遺伝子は共生培養胸腺細胞 中に発現されたことを自召している。発現レベルは、内在性ネズミＡＤＡ遺伝子 の発現よりいくぶん低い（第２Ｃ図、レーン３）。ＡsＡＤＡベクターのないウ イルス株と接種したＤＮ胸腺細胞中にはヒトＡＤＡの発現はみられなかった（第 ２Ｃ図、レーン２）。この結果は、ＤＮ胸腺細胞の接種により得られたプロウイ ルスコピー数が極端に低いことと一致する（第２Ｂ図、レーン６）。ネズミＤＮ 胸腺細胞とヒトＨ-９細胞(Ｔ細胞系）をネズミおよびヒトアイソザイムの標品と して使用した（第２Ｃ図、レーン１および５）。第２Ｃ図、レーン４は、ＡＤＡ 測定の直前に新しく得たＤＮ胸腺細胞と混ぜた、胸腺細胞と共生培養胸しなかっ た照射ＡsＡＤＡヘルパー細胞からの上清を用いた「非接着」対照を示す。ヒト ＡＤＡ発現は検出されず、このことはＤＮ胸腺細胞から得られたＡＤＡシグナル はヘルパー細胞の混入に よるものではないことを示している。 ネズミリンパ節ＴおよびＢリンパ球細胞での ヒトＡＤＡ遺伝子の効率的な転移および発現 リンパ節ＴおよびＢ細胞を材料と方法の記載に基づいて調製した。細胞はＴ細 胞ではＣonＡ、Ｂ細胞ではＬＰＳで２４時間刺激した。次いで洗浄し、そしてポ リブレン、rＩＬ-2(Ｔ細胞)またはＬＢＳ（Ｂ細胞）の存在下ＡsＡＤＡ産生細胞 の密集照射細胞と共生培養した。２４時間後、標的細胞を新鮮なプレートに移し 、更に４８時間非接着のヘルパー細胞が再接着するように、培養した。細胞は収 穫し、ゲノムＤＮＡを抽出し、あるいは一定量をタンパク発現のＡＤＡ測定に用 いた。 標的細胞ＤＮＡのサザンブロッティングは、１細胞当り１ないし１０コピーに 等しいプラスミドコピー数対照と比較するとき（第３Ａおよび４Ａ図、レーン１ および２）、１細胞当り平均約１ベクタープロウイルスがとよびＢ細胞に転移さ れていることを示した（第３Ａおよび４Ａ図、レーン６）。ＤＮＡ抽出またはＡ ＤＡ測定の直前に新しく得られたリンパ節細胞と共に標的細胞と共生培養しなか った照射ヘルパー細胞プレートから得られた混合上清からなる「非接着」対照は シグナルを与えない（第３Ａおよび４Ａ図、レーン７）。よってこのことは、共 生培養した標的細胞で得られたシグナルは非接着ヘルパー細胞の混入によるもの ではない。 標的細胞リゼートのＡＤＡ測定は、ＡsＡＤＡ産生細胞と共生培養したリンパ 節とよびＢリンパ球細胞は内在性ネズミアイソザイムに比較し得るレベルで外来 ヒトＡＤＡタンパクを発現した（第３Ｂ 図、レーン２；４Ｂ図、レーン４）。混入したヘルパー細胞の「非接着」対照は 、前に記したように、ＡＤＡシグナルを与えない（第３Ｂ図、レーン１；４Ｂ図 、レーン５）。これらの結果は感染効率は高く、約１細胞当り１コピーであり、 そして外来ＡＤＡ遺伝子の発現レベルは内在性遺伝子の発現レベルに比較しうる ことを示している。 Ｂ細胞系列体細胞遺伝子治療のネズミモデル 第６図に示したように、感染Ｂ細胞は、主にレシピエントマウスの脾に定着す る、そこではドナータイプIgh(/)アロマタイプマーカーに特異的なモノクローナ ル抗体を用いたフローサイトメトリー(ＦＡＣＳ)分析によって、少なくとも３ヵ 月は検出された（Ｏi et al., 1978, Ｃur. Ｔop. Ｍicro. Ｉmmunol. 81:115) 。脾Ｂ細胞は、ＬＮＢ細胞よりはレシピエントネズミのＢ細胞区画に再構成され やすいが、しかしドナータイプＬＮＢ細胞は、ＳＣＩＤ脾でたやすく検出される 。第６Ａ,Ｂ図はＬＮＢ細胞と養子免疫細胞移入を行ったＳＣＩＤマウスの脾の フローサイトメトリー分析を示す。脾のリンパ球細胞の２４.３％がドナーIgh-5 アロタイプを発現し、１６.８％が宿主Igh-5アロタイプを発現した。宿主型細胞 は「漏出」型細胞であり、多くはＣ.Ｂ-１７ＳＣＩＤマウスに見い出される(Ｂo sma et al., 1988, Ｊ. Ｅxp. Ｍed. 167:1016）。第６Ｃ、Ｄ図は脾Ｂ細胞と養 子免疫細胞移入を行ったＳＣＩＤマウスの脾のフローサイトメトリー分析を示す 。転移後３ヵ月において脾のリンパ球細胞の４４.８％がドナー由来であり、ほ んの６.８％が宿主由来であった。ドナー型のリンパ球細胞がＬＮ中に検出され たが、少数であった（データは示さない）。こ れは、Ｂ細胞はマウスに養子免疫細胞移入の後に脾に優先的に定着するという報 告と一致する(Ｏi et al., 1978, Ｃur. Ｔop. Ｍicro. Ｉmmunol. 81:115)。Ｓ ＣＩＤマウスのＬＮは萎縮であるから、リンパ系の再構築に続いてＬＮが正常な 大きさになるのに長期間を要する。完全にＬＮを再構成するには、細胞移入でな されるよりももっと大量のリンパ球細胞の流入が必要であると考えられる。感染 細胞と外来遺伝子発現の持続性をレシピエント動物の脾および胸腺で少なくとも ３ヵ月しらべた。転移後１ヵ月および３ヵ月の全脾から単離された全ゲノムＤＮ Ａのサザンブロッティングは、シグナルを検出するのにＰＣＲ増幅を必要とせず 、しらべた全１０匹のマウスで、プロウイルス陽性であった。第７Ａ図、レーン １０、において、養子免疫細胞移入後１おおび３ヵ月で１０匹のマウスでのプロ ウイルスシグナルを示す。0.5、1および5プロウイルス／細胞に等しいＡsＡＤＡ プラスミドコピー数対照に比較して（第７Ａ図、レーン１２-１４）、プロウイ ルスは、各脾に０.１ないし０.５コピー／細胞の範囲で、非リンパ系細胞の数に 比例して、存在している、そして漏出細胞も各脾に存在している。再構成ＳＣＩ Ｄマウスの脾細胞の少しの割合がリンパ球細胞であり、それゆえに分析されたＤ ＮＡのほとんどが、無関係の非リンパ系細胞から由来していることに注目するこ とが重要である。それゆえ、これらの結果は、遺伝子転移効率は非常に高く、感 染細胞（またはそれらの子孫）は少なくとも３ヵ月は著しい数が持続することを 証明する、第４図のデータを確証している。いくつかのマウスの腎および肝から 抽出されたゲノムＤＮＡは、いつも、プロウイルス配列について陰 性の結果を与えた（データは示さない）。 討論 初代ネズミリンパ球細胞への効率的遺伝子転移 in vitroで比較的短時間の間に初代リンパ球細胞に遺伝子を導入する能力は特 に重要である、なぜなら、in vivoで不適当な定着をもたらす細胞損傷や細胞表 面の変化を最小にできるからである。Ｔ細胞にレトロウイルス介在遺伝子転移の 報告はいくつかある。しかし、これらの報告は、殆ど転移したＴ細胞系(Ｋrauss et al.,1991, Ｈuman Ｇene Ｔherapy 2:221)、長期間のＴ細胞クローン(Ｃulv er et al., 1991, Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ; Ｕchida et al., 1986 , Ｊ. Ｉmmunol. 136:1876）、あるいはＩＬ-2存在下で長期間の展開(Ｃulver e t al., 1991, Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ 88:3155)などに限られてい た、しかもほとんどの例で感染集団を増やすのに薬剤による選択が必要であった 。１つの報告では、初代Ｔ細胞の移植して数日以内の遺伝子転移が報告されてい るが、これは初代Ｔ細胞のたったの５％の平均遺伝子転移であり、そしてこれは 細胞障害性Ｔ細胞分集団についてしらべられたものであった(Ｒemann et al., 1 981, Ｊ. Ｉmmunol, Ｍethods 89:93）。それゆえに、初代Ｂ細胞およびＤＮ胸 腺細胞への効率的な遺伝子転移についてはいめての記述とは別に、本発明は、in vitroでは長い間展開がなかった初代成熟Ｔ細胞に、初めて詳細に描写した、効 率的な遺伝子転移を記載するものである。 ここに記したデータは、１細胞当り平均１ないし５プロウイルスに達する遺伝 子転移、および外来ＡＤＡ遺伝子の発現レベルが標 的細胞の内在性ＡＤＡ遺伝子のそれと比較し得るものであることを示している。 全ての細胞が標的となることは記載された実験からは確かではないが、大きな割 合で細胞が感染していることはいえる。もし、例えば、ほんの１％の細胞が効率 的に感染されれば、１細胞当り１００から５００のプロウイルスが侵入したこと になり、これは大きな変異負担をもたらし、正常な機能や生存に有害な作用を及 ぼすようなものである。レシピエントとしてＳＣＩＤマウスを使ったホーミング 実験は、感染した細胞は適切に定着する能力を保持しており、ヒトＡＤＡ遺伝子 の発現が転移後動物中で少なくとも２ヵ月は検出されることを示している（論文 準備中）。したがって、ほんの少しの割合の細胞が標的となっていることはあり そうもない。しかし、感染細胞の割合をより精密に評価するために、組織化学的 に検出し得るタンパク（例えばβ-ガラクトシダーゼおよびヒト胎盤アルカリ性 ホスファターゼ）(Ｆields-Ｂerryet al., 1992, Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ 89:693)をコードしたベクターが将来の研究のために構築されつつある。 初代ネズミリンパ球に効率的に遺伝子転移を行うのに重要と思われているいく つかのパラメーターがある：１）ＮＩＨ3Ｔ3細胞で約10⁷ＣＦＵ/mlの力価を与え るウイルス株を産生するに必要なプロデューサー細胞系。初代ＤＮ胸腺細胞に遺 伝子転移が、ＮＩＨ3Ｔ3細胞で１×１０⁶から２×１０⁷／mlの範囲でベクターウ イルス力価を産生する別々のヘルパー細胞クローンを使って試験された、ことに 注目すべきである。共生培養で初代細胞への遺伝子転移は、ＮＩＨ3Ｔ3細胞で相 当する力価が１０⁷／mlに近いときに、１細胞当 り１プロウイルスという値に近づきはじめたのである。それゆえに、このことが 一度観察されると、初代細胞への遺伝子転移は１０⁷／mlの範囲の力価を与える プロデューサー細胞で試みられただけであった；２）別の記載で示されているよ うに、致死量照射ウイルス産生細胞との共生培養(Ｃulver et al., 1991, Ｐroc . Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ 88:3155; Ｂeusechem et al., 1992,, Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ 89:7640)はフリーウイルス株に感染するよりもも っと効率的であった。成熟およびＢ細胞への転換について上清接種対共生培養が 試験された。ＤＮ胸腺細胞でのように、上清接種は効果的な遺伝子転移について 共生培養と同じくらい効率的に近いとはいえない（データは示さない）。３）予 想した通り適切なマイトジェンおよび／または生長因子の存在不存在は効果的な 遺伝子転移に重要である、なぜなら使用したレトロウイルスベクターはプロウイ ルス生成に細胞の複製が必要であるＭoＭＬＶガンレトロウイルスから誘導され たものであるからである(Ｒichter et al., 1984, Ｍol, Ｃell. Ｂiol. 4:151) 。 ＡsＡＤＡベクターで、初代細胞標的に導入したヒトＡＤＡ遺伝子の良好な発 現が、内在性ＡＤＡ遺伝子の発現レベルに比較しうる位に得られた。しかし、他 のベクターの発現と同様のレベルは得られなかった。別のネズミ白血病ウイルス に基ずくベクターが種々のプロモーターを利用して使われたが初代細胞では一定 でない発現結果であった（共生培養方法により使用した全てのベクターでは良好 な転移効率が一貫して得られたにもかかわらず）。他の方法にはヘルペスシンプ レックスウイルスtkプロモーター、ＳＶ４０ 初期遺伝子プロモーター、およびサイトメガロウイルス即時型遺伝子プロモータ ーを含む。しかし、これらのプロモーターは関連ある別のベクターで初代リンパ 球細胞における受け入れられ得る発現レベルを与えた。ほとんど全てのベクター が、種々の確立された細胞系、例えばＮＩＨ 3Ｔ3やＢＶ５４１７において、よ く発現することが見い出された。しかし、不死化したあるいはガン細胞系におい て発現するベクターの能力は、初代リンパ球細胞で発現する能力は貧しいもので あった。 初代リンパ球細胞への遺伝子転移による治療に適した病気が多くある。既に、 アデノシンデアミナーゼ(ＡＤＡ)遺伝子欠損による重症複合免疫不全(ＳＣＩＤ) の患者の初代ヒトリンパ球細胞が、正常ヒトＡＤＡ遺伝子のレトロウイルス介在 転移のレシピエントとして使われている(Ｃulver et al., 1991, Ｈuman Ｇene Ｔherapy)。体細胞遺伝子治療に使われるはじめての治療にこのＳＣＩＤを選ぶ 重要な因子は、正常ＡＤＡ遺伝子の転移は、感染が成功し外来ＡＤＡ遺伝子が発 現した患者のリンパ球細胞に選択的に生育進歩をもたらすことである。従って、 誰でも、１細胞当り１外来遺伝子に達する非常に効率的な遺伝子転移を必要とす ることとせずに治療効果を得ることが期待できた。しかしより効率的な初代Ｂお よびＴ細胞への遺伝子転移が、この病気でさえも治療を増強することができるの である。これらの実験は初代ＬＮＢに効果的な遺伝子転移を示した。そしてＴ細 胞は、リンパ節と末梢血は非常に少ない割合でＴおよびＢ細胞サブセットを含む ので末梢血リンパ球細胞に効率的に遺伝子転移を行う適切なモデルである。ＬＮ ＴとＢ細胞が使用された理由 は、末梢血の代わりにマウスのリンパ節から記載された実験を行うのに必要な細 胞数を得るのが容易なことである。 他の疾病については初代リンパ球細胞に外来遺伝子を効率よく導入する重要性 はより決定的である。例えは、細胞内免疫方法がＨＩＶ感染患者の治療に提案さ れている(Ｂaltimore, 1988, Nature 335:395)。これらの方法は、ＨＩＶ免疫調 節タンパクに結合して拮抗するようＨＩＶのシス作用配列を効果的に転移する( Ｚimmerman et al., 1992, human Ｇene Ｔherapy 3:155)、および／またはＨＩ Ｖ複製を阻害するためにトランス優勢変異ＨＩＶ調節タンパクをコードした遺伝 子(Ｐearson et al., 1990, Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ 87:5079; Ｍa lim et al., 1989, Ｃell 58:205; Ｈope et al., 1992, Ｊ. irol. 66:1849） 。最近Ｍalim等(Ｍalim et al., 1989, Ｃell 58:205)は、ＨＩＶ revタンパク のトランス優勢変異株をコードするレトロウイルスベクターを導入したＴ細胞系 はＨＩＶ複製ができなかった、ことを報告している。この結果は末梢ＣＤ4+Ｔ細 胞またはリンパ系幹細胞にトランス優勢変異遺伝子の効果的導入はＡＩＤＳにつ いて治療の重要性があることを示している。 養子免疫治療(Ｈowes et al., 1979, Ｎature 277:67; Ｂyrne and Ｏldstone , 1984 Ｊ. Ｖirol. 51:682; Ｇreenberg, 1991, Ａdv. Ｉmmunol 49:281)は初 代リンパ球細胞に効率的に遺伝子導入を行う別の方法である。最近多くの方法が 提案されている。それにはガンとの戦いを助けるために患者に、移植用に自己Ｔ 細胞をin vitroで増殖する(Ｇreeberg, 1991, Ａdv. Ｉmmunol, 49:281)、免疫 易感染性宿主における感染(Ｒiddell et al., 1992, Ｓcience 257:238)、およ びＡＩＤＳ(Ｍiller, 1992, Ｎature 357:455)がある。これら細胞の遺伝子操作は、より強力な作用や 、安全性を含む進歩が要請される。この目的に強力に有益な遺伝子の型は免疫応 答を増強することができる免疫調節分子をコードした遺伝子、あるいは患者に再 導入した後リンパ球細胞のオートクリン増強を導入することができる生長促進作 用である。これは治療効果のある細胞を十分に蓄積するために当面必要な長期間 の細胞増加の必要性を除くことができるであろう(Ｒiddell et al., 1992, Ｓci ence 257:238; Ｍiller, 1992, Ｎature 357:455)。更に重要なことは、移植細 胞が発ガん性を帯びたり、他の異常をきたしたときや、必要性がなくなってしま ったときなどに移植細胞を破壊するのに使う「自殺」遺伝子の効率的な導入、で ある(Ｌupton et al., 1991, Ｍol. Ｃell. Ｂiol. 11:3374）。 体細胞遺伝子治療に予言される価値に加えて、初代リンパ球細胞の遺伝子操作 はリンパ球生物学の基本的な疑問を研究する有用性を証明するであろう。例えば 、免疫ＤＮ胸腺細胞および他のリンパ球前駆体に免疫調節遺伝子を効率よく転移 することはＴ細胞の展開の研究に重要である。またレトロウイルスベクターで始 原リンパ系細胞を遺伝子マークすることはリンパ球の分化とホーミングの研究の 道具となる。 まとめると、レトルウイルスベクターは外来遺伝子を初代ネズミリンパ球細胞 に効率的に導入するのに使うことができ、安定して感染した細胞を増やすために 薬剤選択を必要とせず、平均１細胞当り１ないし５コピーが得られることが実証 された。更に、転移したヒトＡＤＡ遺伝子は、細胞、特に成熟ＴおよびＢ細胞で 高レ ベルに発現されることが示された。このことはネズミの系はリンパ系の初代細胞 に効率的に遺伝子転移を行うに必要な遺伝子治療の適切なモデルであることを示 している。 Ｂ細胞系体細胞遺伝子治療のためのネズミモデル 外来遺伝子発現が、転移後１ヵ月および３ヵ月のレシピエントマウスの全てに おいて、全脾組織からつくった細胞リゼートでのヒトＡＤＡ活性を酵素測定する ことにより実証された。第７Ｂ図、レーン３-１２は、第７Ａ図示されるマウス でのヒトＡＤＡ活性を示したものである。ＳＣＩＤ脾では、ヒトＡＤＡ活性は、 内在性ＡＤＡ遺伝子（骨髄系および赤血球細胞）を発現する脾に存在する別の型 の細胞が存在するので、ネズミＡＤＡ活性と同じ位の強さには、現われない。こ れを考慮すると、外来遺伝子の発現レベルは、第６図と同様にＦＡＣＳ分析によ り定量した、マウスにおけるドナーリンパ球細胞の割合によく相関している（デ ータは示さない）。第７Ｂ図で証明したように、ヒトＡＤＡの発現レベルは転移 後１ヵ月と３ヵ月の間に低下しなかった、そして実際６ヵ月、９ヵ月でも同じレ ベルを保っていた。各マウスのヒトＡＤＡレベルはプロウイルスコピー数で精密 には相関していないが、これは誤解されるもとである、なぜなら結果は測定手順 に固有の相違を反映しているからである。ＡＤＡ測定は１×１０⁶の測ったリン パ球細胞に相当する各マウスからの脾組織量で行っている。宿主細胞は、外来ヒ トＡＤＡのシグナルを出すために希釈していない、しかし代わりにネズミＡＤＡ シグナルがより大きくなる。これに反して、関係のない宿主の細胞は外来ＤＮＡ からのシグナルが希釈されてしまう、 なぜならゲノムＤＮＡは全脾から抽出されたものであり、各レーンに一定のゲノ ムＤＮＡを使っているからである。従ってＡＤＡ活性測定は宿主細胞の数とは独 立しているが、しかし、サザンブロティングは影響される；このことは第７Ａと ７Ｂ図の間の変化で証明できる。ヒトＡＤＡ遺伝子を発現するＡＤＡ遺伝子はＬ Ｎにも見い出されるしかし、ＳＣＩＤＬＮは常に小さくそして少量の細胞しか含 まれていない（データは示さない）。 以上の結果は、成熟初代Ｂ細胞で外来遺伝子の導入と発現の再現性のある動物 モデル系を提供する。このモデルはＢ細胞の形質導入は血液あるいはリンパ系区 画で外来遺伝子の長期発現に実行可能な手段を提示する。この容易で比較的安価 な動物モデルはb細胞を標的として使用する別の体細胞遺伝子の最初のスクリー ニング手段として使うのに適当であることを立証している。実施例２．自己免疫疾患における誘導不応答性 プラスミド構築 一般的にＤＮＡ組換え体はオリゴヌクレオチドプライマーとPCRを用いてつく られる。プライマーはクローニングを行うための特徴ある制限部位を含む。この 方法は断片を容易に単離やクローニングを正確に行えるようになっている。ＰＣ Ｒには、Ｐfポリメラーゼや３’から５’への校正エキソヌクレアーゼ活性を有 しているために、ＴagおよびＶentポリメラーゼより１２倍から５倍大きな忠実 度を有すると報告されているのでＰfuＤＮＡポリメラーゼが使用される(Ｓrateg eneカタログ１９９２、p.１２６）。ＰＣＲはＰfuＤＮＡポリメラーゼと共に行 われるが、挿入配列がＰＣＲ中に導 入される変異を含まないことを確認するために、付加工程が行われる。そのため に、増幅されたＤＮＡは先ずpＵＣ18のようなプラスミドにクローンされる。５ ００bpまたはそれ以下を挿入するために、全断片を標準のジデオキシ配列決定法 を使用して配列決定される。５００bp以上の挿入には、ＰＣＲ増幅挿入の中心部 分を独特の使用可能な制限部位を使用してプラスミドから相当する断片に変更す る；それでＰＣＲの生成物となるためには５’と３’末端が必要なだけである。 レトロウイルスベクター ネズミ白血病ウイルス（ＭＬＶ）に基づいたレトロウイルスベクターが標的細 胞に望みの遺伝子を導入するのに全ての実験において使用される。この研究にお いて使用される全てのベクターの概要は第８図に示される。ベクターはエコトロ ピックパッケージ細胞系ＧＰ+Ｅ-８６を用いてつくられる（実施例１参照）。力 価５×１０⁶-２×１０⁷コロニー形成単位（ＣＦ）／ml（ＮＩＨ 3Ｔ3細胞で測定 ）のベクターウイルスを産生するパッケージング（ヘルパー）細胞系を単離する 。neo遺伝子を含むベクターにつき、力価を測定し、継代の後ベクターの安定性 をサザンブロティングで分析する。neo遺伝子を含まないベクターには、サザン ブロティングで継代後に得られるシグナルと１×１０⁷の範囲の力価の対照ウイ ルス株で得られるシグナルとを比較して相対力価を決める。 第８図記載のベクターにおいて、脾壊死ウイルスプロモーターを第２の遺伝子 の発現を提出するために使用する。このプロモーターはネズミ細胞を含め多くの 細胞の中で特別強力なプロモータ ーである。その他のプロモーター、例えばネズミＢおよびＴ細胞でヒトＡＤＡを 効率よく発現するのに使用しているヒトＡＤＡプロモーターも使用しうる。 細胞の調製と感染方法 全ての実験において、成熟Ｂ細胞とpre-Ｂ細胞をミエリン起脳炎決定基の発現 に使用する。成熟Ｂ細胞の濃縮集団は、Ｔhy-1、ＣＤ4およびＣＤ８に特異的な ｍＡＢの反応混液を用いて全脾およびＬＮ細胞からＴ細胞を除去して調製される 。このような濃縮方法ではＬＮからは＞９５％Ｂ細胞を、脾から８５％を与える 。感染には、Ｂ細胞ＬＰＳで１６時間刺激する、そして致死量照射ヘルパー細胞 で２４時間共生培養する。標的細胞のＬＰＳ誘導増殖のはプロウイルスの効果的 な集積が必要である。この方法で、脾、ＬＮＢ細胞の両者で標的細胞ゲノム当り １ないし３プロウイルスコピーの感染効率を得ている（前述）。 Ｐre-Ｂ細胞は長期間whitlockおよびＷitte培養で得られる(1982, Ｐroc. Ｎa tl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ 79:3608)。細胞は開始から４-８週培養後に収穫する 。そして１０％ＦＣＳおよび５０μＭ２-メルカプトエタノール加ＰＲＭＩ培地 で５０ng／ml rＩＬ-7とともに２週間in vitro増殖を行う。rＩＬ-7はpre-Ｂ細 胞のレトロウイルス感染に必要な工程である増殖を誘導するが、分化は誘導しな い。これら培養によるＰre-Ｂ細胞はＳＣＩＤマウスでＢ細胞を再構成しないが 、成熟μ＋およびδ＋Ｂ細胞に分化する。Ｂ細胞の両型はＳＣＩＤマウスに養子 免疫移入後長期間生存する。既報(Ｒon and Ｓprent, 1958, Ｊ. Ｅxp. Ｍed. 1 61:1518; Ｓprent et al., 1991, Ｊ. Ｅxp. Ｍed. 174:717)によると、正常、 成熟Ｂ細胞は正常またはＳＣＩＤレシピエントに転移したと数ヵ月生存すること が報告されている。 感染および増殖の評価 導入遺伝子のコピー数を、ベクター-ＤＲ1-9には非特異性プローブを、ベクタ ーＤＲ８とＤＲ１０にはＳＮＶ特異性プローブを用いてサザンブロッティングに より評価した。例えば、ＤＲ１ベクターの増殖について、ＭＢＰ特異性プローブ を用いる。ＰＬＪ、ＳＪＬおよびＰＬＢ由来基脳炎ペプチド特異的なｍＡＢを含 むＭＢＰ特異性ｍＡＢを調製した。これらのｍＡＢを使用して、タンパク産生を 全細胞リゼートからの免疫沈降により評価した。融合タンパクはこれらｍＡＢを 用いて検出できる。ＭＨＣクラスII分子で複合体となった時に処理したタンパク が認めることができた場合、増殖はまたフローサイトメトリーで評価する。 免疫機能の評価 成熟Ｂ細胞の全てを、外来抗原が存在しない状態で生成抗原感作ＬＮＴ細胞の 増殖誘導能をin vitroで測定する。感作Ｔ細胞を得るため、マウスをＣＦＡと関 連する抗原で足踵に免疫する。ＬＮＣＤ４＋Ｔ細胞を抗ＣＤ８および抗ＨＳＡｍ ＡＢで処理して９日後に調製する（抗ＨＳＡｍＡＢＪＩＩｄおよび補体による処 理でＬＮ調製物から全てのＢ細胞が実質的に除去される）。次いで細胞をナイロ ンウールカラムを通過させ、関連抗原パルス感染Ｂ細胞でin vitroで刺激した。 感染Ｂ細胞は外来抗原を加えた同様の測定法でアネルギー誘導を測定する。これ ら測定は感染Ｂ細胞が免疫原性か寛容原性の抗原を示す能力をざっと評価するの に使用される。 はじめのin vitro測定に続いて、成熟Ｂ細胞をＥＡＥ-感受性マウスの適当な ストレインに２０-４０×１０⁶細胞を４−１０回、隔週間隔で投与して転移する 。レシピエントマウスは既報の方法で調製された関連起脳炎性物質の起脳炎量あ るいは起脳炎性Ｔ細胞系を起脳炎量を投与してチャレンジする(Ｍeyers et al., 1993, Ｊ. Ｉmmunol.)。感染Ｂ細胞は、Ｔ細胞が増殖してから非応答性が誘導 されているかどうかをテストするためＥＡＥ誘導後、異なった時間でマウスに転 移される。 モノクローナル抗ネズミＩＬ-2抗体で処理した平行実験も行われる。抗ＩＬ-2 抗体はＴ細胞活性化を防止し、特異的非応答性を誘導することが知られている( Ｄallman et al., 1991, Ｊ. Ｅxp. Ｍed. 173:79; Ａndreu-Ｓanchez et al., 1991, Ｊ. Ｅxp. Ｍed. 173:1323)。抗ＣＤ４抗体でＣＤ４細胞を除去したレシ ピエントが使用される。そのような除去により抗原特異的寛容性誘導の感度が上 昇することが示された(Ｖandervegt et al., 1993, Ｊ. Ｅxp. Ｍed. 177:1587) 。 完全ＭＢＰおよびＰＬＰ遺伝子の発現あるいは成熟およびpre-Ｂ細胞における 起脳炎性の決定 通常、エンドサイトーシスを経て外部から細胞内に入るタンパクは最後はリソ ソーム区画に入り、そこで処理され、ＭＨＣクラスII分子に結合する。他方、細 胞内で発現したペプチドは、多くはＥＲでＭＨＣクラスIに結合する。しかしペ プチドはＭＨＣクラスII抗原提示経路に「クロス」することができると報告され ている(Ｂraciale and Ｂraciale, 1991, Ｉmmunol. Ｔoday 12:124; Ｂrodsky et al.,1991,Ａnn. Ｒev. Ｉmmunol. 9:707)。更に、最近ヒトクラスII表面分 子から精製されたタンパクの８５％は内在性自己タンパクであることが示された (Ｎewcomb and Crosswell, 1993, Ｊ. Ｉmmunol. 150:499; Ｃhiczetal, 1993 Ｊ. Ｅxp. Ｍed. 178:27）。それゆえに、リソソーム標的配列ないしＢ細胞にお けるＭＢＰおよびＰＬＰまたはそれらの相当する起脳炎ペプチドの発現は表面ク ラスII分子での提示であるかもしれない。このことをテストするために、ベクタ ーを、完全な真正ＭＢＰ遺伝子およびＰＬＰ遺伝子、あるいは起脳炎決定基およ びペプチドのプロセッシングを助けるであろうフランキング配列をコードするミ ニ遺伝子を発現するように構築することができよう。 完全ＭＢＰおよびＰＬＰ遺伝子をコードするベクターは夫々ＤＲ１およびＤＲ ２である。コード配列のみがベクターにクローンされている。ＭＢＰおよびＰＬ Ｐ両遺伝子の非解釈５’および３’配列はそれらが組織特異性発現の場合には含 まれない。代わりにベクター配列が５’および３’非翻訳配列を提示する。ＭＢ Ｐ遺伝子は改変スプライシングにより得られる５イソ型タンパクをコードする。 ＰＬＰをコードする配列（３０kＤ）はベクターＤＲ２に使われる（第８図）。 起脳炎決定基およびフランキング配列の小伸長を含むこれらのタンパクの小部 分をコードするミニ遺伝子は、完全長のタンパクは非常に疎水性であるのでレト ロウイルスベクター(ＤＲ3およびＤＲ4、第８図)中に構築され配置されている。 ＡＴＧ出発コドンはＫozak(1989, Ｊ. Ｃell. Ｂiol. 108:229)により決定され たのに相当する強力な翻訳開始シグナルに関して配置されており、そして適当な 停止コドンは全ての３つの読み枠内に配置されよう。種々のミニ遺伝子は、Ｈ- ２^S(aa87-114)またはＨ２^U(as1-9)について２つの主要なＭＢＰ起脳炎決定基や ＰＬＰについての起脳炎決定基(aa139-151、システインに代わりセリン置換）を 含む。 リソソーム標的タンパクとの融合タンパクとしての起脳炎ペプチドの発現 標的Ｂ細胞において、ＭＢＰ、ＰＬＰまたは起脳炎ペプチドの発現が一度おこ ると、エンドソーム区画におこるクラスII提示の適当なプロッセッシングが促進 される。リソゾームの局在はプロッセッシングやＭＨＣクラスII分子への結合が 促進するであろう。それゆえに、自然型に加えて、起脳炎ペプチドはリソソーム 区画に局在する子とが知られているタンパクの枠組みに融合される。３つの特異 的タンパクがリソソームに対し起脳炎タンパクの直接発現に使われる：a) リソ ソームの酸性ホスファターゼ(ＬＡＰ)の細胞質末端。自然のＬＡＰは細胞表面に 移される前にリソソームによるプロセッシングを必要とする。リソソーム区画へ の標的は短い(19aa)細胞質末端により行われる(Ｐeters et al., 1990 ＥＭＢＯ Ｊ. 9:34397)。ＬＡＰ細胞質末端と起脳炎ペプチドからなる融合タンパクをコ ードするミニ遺伝子が構築される（第８図、ＤＲ５）。b) リソソーム膜糖タン パク lamp-1の細胞質末端。ＬＡＰについては、lamp-1の細胞質末端はリソソー ムに特異的なこの内在性膜糖タンパクの直接の標的であることが判った（Ｗilli ams and Ｆukuda, 1990, Ｊ. Ｃell. Ｂiol. 111:955)。ＬＡＰ細胞質末端と起 脳炎ペプチドからなる融合タンパクをコードするミニ遺伝子が構築される（第８ 図、ＤＲ５）。c）エンドソーム分画に対するＭＨＣクラスII分子の標的である ことが示されているクラスII関連非変異鎖（II）（第８図、ＤＲ６：Ｂraciale and Ｂraciale, 既出；Ｂrodsky et al., 既出；Ｂakke and Ｄobberstein, 199 0 Ｃell 63:707)。起脳炎ペプチドをコードする配列はこれらの遺伝子の３’コ ーディング配列に融合される。カルボキシ末端への配置は起脳炎ペプチドがリソ ソーム内にできあがることを確証している。 実施例３：自己抗原およびリボザイムの共発現 Ｂ-７特異的リボザイムと起脳炎ペプチドの共発現。 ここでは、Ｂ7-1およびＢ7-2の発現の阻害の方法について記述する。Ｂ7-1お よびＢ7-2は活性化b細胞を含む専用のＡＰＣを発現する細胞表面分子である。そ れらはＴ細胞の表面に発現されるＣＤ２８に結合する。これら２つの分子の相互 作用により生産的なＴ細胞活性化に必要な共刺激性シグナルの伝達を引き起こす (Ｌinsley et al., 1991, Ｊ. Ｅxp. Ｍed. 173:721; Ｆreeman et al., 1991, Ｊ. Ｅxp. Ｍed. 174:625; Ｒeiser et al., 1992, Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci . ＵＳＡ 89:271;Ａzuma et al., 1992, nature 366:76; Ｆeeman et al., 1993 , Ｊ. Ｅxp.Ｍed. 178:2185, Ｆreman et al. 1993, Ｓcience 262:907)。Ｂ7分 子を発現しないＡＰＣはクローン活性化よりもむしろ長永続性クローンアネルギ ーを誘導する(Ｌinsley and Ｌedbetter, 1993, Ａnn.Ｒev. Ｉmmunol.,11:191; Ｓchwarz, 1992, Ｃell 71:1065; Ｄing et al., 1993, Ｊ. Ｉmmunol.,151:12 44; Ａzuma et al.,既出、Ｆreeman et al., 1993, Ｊ. Ｅxp. Ｍed. 既出、Ｆr eeman et al., 1993, Ｓcience,既出）。Ｂ細胞は、ミエリン決定基とＢ７特異 的リボザイムを発現することができるレトロウイルスベ クターで感染される。 アンチセンスＲＮＡ技術の改良は自己分解的開裂をおこすことができる天然の ＲＮＡ分子の発見に進展した(Ｔanner and Ｖasseur, 1993,Ａntisense researc h and applications, Ｓ. Ｃrooke and Ｂ. Ｌeblen編、ＣＲＣ Ｐress Ｉnc., Ｂoca Ｔaton, Ｆlorida, 415-26頁）。自己触媒的ＲＮＡ開裂は最初テトラヒメ ナＴetrahymena thermophilaで証明された、そしてそれ以来、細菌、植物、動物 で多くの分子が証明された。いくつかの触媒的ＲＮＡの配列の比較により、これ らＲＮＡ酵素の共通構造が導かれた。少なくともいくつかのリボザイムはそれら が触媒活性を有するために１つの隣接鎖上に位置する必要がない；それらは触媒 刺激を形成するためにハイブリダイズする２つの別々のＲＮＡ鎖から調製するこ とができる。したがってそれらはトランスで作用することができる。報告されて いる３つのトランス開裂リボザイムの型はハンマーの頭型、ヘアピン型と肝炎デ ルタウイルス（ＨＤＶ）リボザイムである。これらのリボザイムによるＲＮＡ開 裂は２、３’サイクリックホスフェイトと５’-ヒドロキシからなる末端を与え る。ヘアピン型とハンマーの頭型リボザイムの先端を切った実験では、触媒活性 には少なくとも１５ヌクレオチドが必要であること、これに対しＨＤＶリボザイ ムでは８５ヌクレオチドが必要であることが実証された。目下のところ、ＨＤＶ リボザイムの基質の要求性についてはよく決定されていないが、ハンマーの頭型 とヘアピン型リボザイムでは知られている。ハンマーの頭型とヘアピン型リボザ イムについては、基質要求性は最小である。ハンマーの頭型リボザイムでは、開 裂部位はＧＵＸ5'、 ここでＸはＧではありえない、によってのみ行われ、ヘアピン型リボザイムにつ いては、開裂部位はＧＵＣ3'によって行われる。これらの観察で、触媒部位から ５’および３’方向で標的ＲＮＡにハイブリダイズするアンチセンスＲＮＡ伸長 を含むことによってデザインされる高特異性リボザイムの可能性が示される。リ ボザイムのアンチセンス部分は典型的には１２ないし２０ヌクレオチドの範囲で ある。さらにリボザイムは触媒作用を有しているから、消耗されることなく、こ れが高有用性にとって重要な点であるが、複数の基質ＲＮＡを開裂することがで きなければならない。 ２つの特に重要な技術上の考慮がリボザイムの使用に関して考えられる。それ らは標的ＲＮＡへの接近しやすさとリボザイムの細胞内濃度である。構築され試 験されるベクターはこれら重要問題を直視している。ＤＲ７、ＤＲ８およびＤＲ ９はＢ７タンパクの発現を阻害するベクターを含んだリボザイムの能力を利用す るよう設計された。 ＤＲ７（第８図）はＢ７-1およびＢ７ー２に対する多価リボザイムを含んでい る。１つはＢ７-1（５０９から５２８に配位結合している）に対するハンマー型 リボザイムである。リボザイムのアンチセンス部は開裂部位に対し１２ヌクレオ チドの５’および８ヌクレオチドの３’に融合している。第２のものはヘアピン 型リボザイムでＢ７-2（３６２から３８１に配位結合している）に特異的であり 、そのアンチセンス部は２０ヌクレオチドの長さである。ノナリボザイムを含む 多価リボザイムについては既に報告されている。(Ｃhen et al., 1992, Ｎucl. Ａcid Ｒes. 20:4581-9)。ハンマー の頭型およびヘアピン型リボザイムの両方とも既に使われているので、我々はレ トロウイルスベクターに直接反復を導入することは避けたい、多くの他の研究機 関がレトロウイルス中の直接反復により、レトロウイルス複製の１回転の後でさ えも欠失変異が起り得ることを注意している。 ベクターＤＲ７において、リボザイムは少なくとも２転写配列があることが見 い出されている。１つはＬＴプロモーターから開始される完全長転写配列であり 、他はＳＮＶプロモーターから開始されるサブゲノム転写配列である。ＬＴプロ モーターから開始される長い方の転写配列はネオマイシンホスホトランスフェラ ーゼをコードする。高濃度のリボザイムを得るための潜在的な問題は非コーディ ングｍＲＮＡを分解する細胞中に展開する機構であるから、リボザイムをコード されたＲＮＡに含ませる戦略は重要であると信じられている(Ｌeedsetal,1991, Ｇenes and Ｄevelop., 58:2304-14)。非コーディングｍＲＮＡに等しいナンセ ンス変異を含む転写配列は細胞中のｍＲＮＡレベルを劇的に減少させたことが証 明された(Ｐellts and Ｊacobson, 1993, Ｃontrol of messenger ＲＮＡ stabi lity, Ａcademic Ｐress, Ｉnc., 291-328頁）。ナンセンスあるいはフレームシ フト突然変異による翻訳の未成熟終結は種々のｍＲＮＡの急速な分解を促進する 。非コーディングＲＮＡであるアンチセンスＲＮＡは遺伝子産物をコードするこ とを意味しないから、アンチセンスＲＮＡに翻訳開始が起るときはいつでも、コ ーディングｍＲＮＡの３’非コーディング領域に局在しない限り、急速な翻訳の 停止と分解が起りうるのであろう。 ＤＲ７は初代Ｂ細胞のベクターを使用する前に２つの試験をおこなった。 (a)第１はリボザイムは無細胞系で基質ＲＮＡを分解するかどうかを確かめる ことである。組み換え体を、２価リボザイムと基質Ｖ７-1およびＢ７-2ＲＮＡの 両者をin vitro転写物を産生しうるＴ７プロモーターで構築した。標準的なin v itro開裂反応を実行し、基質を、既に報告されている方法に従いゲル電気泳動お よびオートラジオグラフィで分析した(Ｃhen et al., 既出、Ｄropulic et al., 1992, Ｊ. Ｖirol. 66: 1432-41; Ｗeerasinge et al., 1991, Ｊ. Ｖirol. 65 :5531-4)。Ｂ７-1およびＢ７-2の異なる部分を指向するリボザイムをつくり試験 できる。 (b)リボザイムは、ベクター感染細胞においてＢ７-１およびＢ７-2ＲＮＡレベル を著しく減少させるので、ノーザンブロッティングで分析可能となる。Ｂ7-1お よびＢ7-2（細胞系はＢ17-Ｂ7と称する）の両者を発現する発現ベクターでトラ ンスフェクトしたＢ１６ネズミメラノーマ細胞系を使用した。Ｂ17-Ｂ7細胞をＤ Ｒ７で感染し、Ｇ４１８を含む培地で選択を行った後に、ＲＮＡを単離しノーザ ンブロッティングで分析した。空の感染を行ったＢ１７-Ｂ7細胞からのＲＮＡを 対照とした。リボザイムの効果的な発現と作用にＢ７ＲＮＡsの定常状態レベル は著しく減少しなければならない。 第２の型のベクター（ＤＲ８、第８図）において、翻訳を阻害する分子内二重 鎖を形成するＲＮ配列が２価リボザイムの５’位に挿入される。このアイディア の背景は、ｍＲＮＡの分解を止め定常状態レベルを増加させるために非コーディ ングリボザイム ｍＲＮＡの翻訳を阻害する、というものである。加える配列はＫozakにより報告 されており(1989, Ｍol. Ｃell. Ｂio. 9:5134-42)、転写配列の５’末端に存在 するとき、翻訳開始複合体の生成を阻害するステム．ループ構造を形成する。初 代Ｂ細胞で使用する前に、上述したベクターの試験を行えばよい。加えるに、Ｄ Ｒ８のＳＮＮプロモーター空発現されるサブゲノムＲＮＡの定常状態レベルを、 リボザイムＲＮＡがステム・ループ構造を含むことによってより安定化されてい るかどうかを決定するために、ＤＲ９で得られた結果と比較することができる。 第３のタイプのベクター（ＤＲ９、第８図）において、クローンアネルギーを 増加させるタンパクとＢ７ＲＮＡを分解する能力のあるリボザイムの両者をコー ドできる二重機能ｍＲＮＡをつくるように、遺伝子を構成する。より詳細にはＢ ７ＲＮＡに特異的な２価リボザイムをＩＬ-10遺伝子の３’非コーディング部分 に挿入する。ＩＬ-10がこのようにしてクローンアネルギーの増大した誘導が起 るのかは次節で論じる。本実験には３つの目的がある：a)リボザイムは、リボザ イムを安定化しその定常状態レベルを上昇させるコーディング配列に結合される 。b) リボザイムを含むこのＲＮＡは、丁度Ｂ７ＲＮＡのように粗小胞体のリボ ソームにより当然翻訳される、それで、これにより、リボソームの効果的な作用 を上昇させるような同一の細胞下分画に、両ＲＮＡが局在していることが確認さ れる。そしてc) ２つの異なったレベルでクローンアネルギーの誘導を増強する ことができるような物質を発現させる大きな能力を有する単一遺伝子を創製する 。初代Ｂ細胞で実施する前 に、ベクターＤＲ８について記載したようにＤＲ９の効率をテストする。更に感 染Ｂ16-Ｂ細胞はＩＬ-10発現でアッセイできる。これいついては次節で詳述する 。実施例４：ＩＬ-１０と起脳炎ペプチドの共発現 ＩＬ-10はマクロファージ、Ｂ細胞および主としてＴＨ２細胞により産生され るサイトカインである(Ｈoward and Ｏ'Ｇarra, 1992, Ｉmmunol. Ｔoday, 13:1 98; Ｍoore et al.m, 1993, Ａnn. Ｒev. Ｉmmunol.,11:165）。それはＴＨ１細 胞の阻害剤として最初報告された、そして後にＡＰＣによるサイトカイン産生を ブロックする作用を有することが見い出された。ＩＬ-10は種々の造血細胞に効 果を有する。例えば、Ｂ細胞の生存数を上げる、クラスII抗原の発現を誘導する 、そしてＩＬ-4と相乗的にＢ細胞増殖をする。そのマクロファージの阻害機構は 、ＡＰＣ活性化中にＢ７発現の上方制御を選択的に阻害するためであることが、 最近示された(Ｄing et al., 1993, Ｉmmunol. 15:1224)。それゆえに、同じベ クターからの起脳炎決定基とＩＬ-10の機構的共発現はＴＨ１細胞の活性を阻害 し、従ってＢ７特異的リボザイムの使用なしにクローンアネルギーの誘導を導く ことになる。ＩＬ-10を発現するために、ベクターＤＲ１０（はじめはリボザイ ムを含まない）を構築する。ＩＬ-10の全コーディング配列（１８kＤ、Ｎ結合糖 鎖形成を除く）をこのベクターに挿入し、ＭＬＶＬＴＲプロモーターで発現させ る。基脳炎決定基をコードする遺伝子はＳＮＶプロモーターから発現される。Ｂ ７特異的リボザイムは、ＩＬ-10遺伝子の３’非翻訳部位中のＤＲI0に含まれる 。両戦略（リボザイムおよびＩＬ−10）が働けば、ＤＲ10は初代Ｂ細胞 で使用されるより好ましいベクターである。ＩＬ10の選択は、ＥＫＩＳＡを用い たラットモノクローナル抗体ＳＸＣＩで検出され、指示系ＭＣ-9の増殖の誘導に よっても検出される。この細胞系はネズミＩＬ-4の亜至適量（２５ng/ml）で促 進するとき、ＩＬ-10に応答する。 本発明を通じて、種々の文献を参照した。これら文献の開示は、本件技術分野 をより十分に記述するために引用文献として取り入れられる。 ここに記載した発明は、同じ内容が多くの面で変形することは明らかである。 このような変形は本発明の精神と範囲からの新発展と考えられ、そのような変形 ・修飾は以下の特許請求の範囲に含まれるものとされる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ)，ＡＭ，ＡＵ， ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＶ，ＭＤ ，ＭＧ，ＭＮ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＩ， ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 コー，ミン−リン 台湾、タイペイ、アン―ハー ロード、セ クション ２、レーン 23 ナンバー11 ４エフ (72)発明者 シュトコウスキ，ナタリー アメリカ合衆国、08817 ニュージャージ ー、エジソン、リベンデル ウェイ 2316 (72)発明者 ヤコブ，ロン アメリカ合衆国、08816 ニュージャージ ー、イースト ブランズウィック、スリー ローリー ドライブ 【要約の続き】 約９０％以上がプロウイルスを含んでいる感染リンパ球 細胞の集団に関するものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．薬剤による選択なしに初代リンパ球細胞に外来遺伝子を効率的に導入する方 法であって、 a) 選択したリンパ系分集団を、リンパ系分集団の増殖を誘導するために十分な 時間リンパ系分集団の増殖誘導を行う生長因子で刺激し； そして b) 刺激したリンパ系分集団を、レトロウイルスベクターが潜在するウイルス産 生ヘルパー細胞（ここにおいてヘルパー細胞系のウイルス産生レベルは５×１０⁶ から５×１０⁷コロニー形成単位／mlの範囲である）を共生培養(co-culturing) する工程からなる方法。 ２．ベクターをプロデューサー細胞にトランスフェクトし、次いで選択、細胞コ ロニーの単離、および、ウイルス産生細胞系が５×１０⁶から５×１０⁷単位／ml の範囲のウイルス力価を生じるようにウイルス力価を同定決定することによりウ イルス産生細胞系が調製されることよりなる請求項１記載の方法。 ３．選択したリンパ系分集団が望ましくない細胞を除去したものである請求項１ 記載の方法。 ４．望ましくない細胞の除去が、リンパ球細胞の懸濁液をポリクローナルまたは モノクローナル抗体での処理により、パンニング法により、ナイロンウール選別 により、または分別勾配遠心法により、達成される請求項３記載の方法。 ５．リンパ系分集団が特異的リンパ系を再集団化する能力か、あ るいは長寿命の集団の能力を有するものである請求項１記載の方法。 ６．リンパ球細胞が初代、成熟リンパ節ＴおよびＢ細胞であるか、または一次、 未成熟ＣＤ４・ＣＤ８ダブルネガティブ（ＤＮ）胸腺細胞である請求項１記載の 方法。 ７．レトロウイルスベクターがpＮ２またはpＡｓＡＤＡモロニーネズミ白血病ウ イルス（ＬＴＶ）を基礎としたレトロウイルスベクターである請求項１記載の方 法。 ８．プロデューサー細胞がＧＰ＋Ｅ-８６細胞系である請求項１記載の方法。 ９．リンパ球細胞の９０％以上に１ないしそれ以上のプロウイルスが存在してい るリンパ球細胞集団。 １０．リンパ球細胞が、成熟Ｂ細胞、成熟Ｔ細胞、未成熟Ｂ細胞、および未成熟 Ｔ細胞からなる群より選ばれたものである、請求項９記載のリンパ球細胞集団。