KR20240108421A - 라만 분광법을 사용한 샘플 내 바이러스 역가 결정 방법 - Google Patents
라만 분광법을 사용한 샘플 내 바이러스 역가 결정 방법 Download PDFInfo
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Abstract
라만 분광법을 사용하여 샘플에서 바이러스 역가를 정량화하는 방법이 개시된다. 이 방법은 샘플을 제공하는 단계; 샘플에서 바이러스 역가를 결정하기 위한 모델을 제공하는 단계; 샘플을 광원으로 조사하는 단계; 및 샘플의 라만 스펙트럼을 획득하는 단계를 포함한다. 방법은 바이러스 역가를 결정하기 위한 모델에 라만 스펙트럼의 바이러스 성분을 적용하여 샘플의 바이러스 역가를 정량화하는 단계를 추가로 포함한다. 본 개시의 다른 측면은 샘플에서 바이러스 역가를 정량화하기에 적합한 모델을 생성하기 위한 방법에 관한 것이다.
Description
본 출원은 2021년 11월 19일에 출원된 미국 특허 가출원 제63/281,441호의 우선권을 주장하며, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
본 발명은 국립보건원에 의해 수여된 R01 GM109988 하의 정부 지원으로 만들어졌다. 정부는 본 발명에 대한 소정의 권리를 갖는다.
기술분야
본 개시는 라만 분광법을 사용하여 샘플에서 바이러스 역가를 결정하는 방법에 관한 것이다.
렌티바이러스 역가를 신속하게 식별하고 결정하는 능력은 유전자 편집부터 제약 및 백신 개발에 이르기까지, 다수의 생물의학적 도전 과제에 중요하다. 렌티바이러스는 유전자 정보를 재프로그램 세포에 효율적으로 전달하는 것으로 나타난 외피형 바이러스이며, 이는 면역 요법에서 특히 유용하게 만든다(Kalos 등, "T Cells with Chimeric Antigen Receptors Have Potent Antitumor Effects and Can Establish Memory in Patients with Advanced Leukemia" Science Translational Medicine 3(95):95ra73 (2011); Brentjens 등, "Eradication of Systemic B-Cell Tumors by Genetically Targeted Human T Lymphocytes Co-Stimulated by CD80 and Interleukin-15," Nature Medicine 9(3):279-286 (2003); Zuffere 등, "Multiply Attenuated Lentiviral Vector Achieves Efficient Gene Delivery In Vivo" Nat. Biotechnol. 15(9):871-875 (1997)). 치료를 위해 이들 바이러스를 생산할 때, 렌티바이러스는 세포를 변형시키고 또한 의도하지 않은 감염을 방지하기 위해 바이러스의 복제를 방지하는 데 필요한 정보를 포함하도록 변형된다(Zuffere 등, "Multiply Attenuated Lentiviral Vector Achieves Efficient Gene Delivery In Vivo," Nat. Biotechnol. 15(9):871-875 (1997); Wang 등, "Clinical Manufacturing of CAR T Cells: Foundation of a Promising Therapy," Molecular Therapy - Oncolytics 3:16015 (2016)). 이는 각각의 형질전환된 바이러스가 하나의 세포만을 형질전환할 수 있음을 의미한다. 따라서, 형질전환된 바이러스의 유효 역가를 아는 것은 치료에 대한 투여량 및 기대치를 아는 데 중요하다.
바이러스를 특성화하고 바이러스 역가를 결정하는 현재의 방법은 ELISA(Wu 등, "Digital Single Virus Electrochemical Enzyme-Linked Immunoassay for Ultrasensitive H7N9 Avian Influenza Virus Counting," Analytical Chemistry 90(3):1683-1690 (2018)), PCR (Carr 등, "Development of a Real-Time RT-PCR for the Detection of Swine-lineage Influenza A (H1N1) Virus Infections," Journal of Clinical Virology 45(3):196-199 (2009); Pivert 등, "A First Experience of Transduction for Differentiated HepaRG Cells using Lentiviral Technology" Scientific Reports 9(1):12910 (2019)), 및 세포 배양(Gueret 등, "Rapid Titration of Adenoviral Infectivity by Flow Cytometry in Batch Culture of Infected HEK293 Cells," Cytotechnology 38(1-3):87-97 (2002))을 포함한다. 이들 방법은 바이러스를 검출하고 정량화하는 데 신뢰성이 있지만, 일부 단점이 있다. 이들 방법은 종종 공지된 수의 세포를 감염시킨 다음 PCR과 같은 분석을 수행하여 성공적인 재프로그래밍을 결정하는 단계를 포함한다. 검정 및 세포 배양은 인큐베이션 시간을 고려할 때 시간이 많이 걸릴 수 있고 상당한 샘플 제조를 필요로 한다. 이는 이러한 방법이 결과를 제공하는 데 수일 내지 수주가 걸릴 수 있음을 의미한다. 이들 바이러스를 신속하게 특성화하는 능력은 약제학적 및 백신 개발에 중요하다.
SERS는 분석물의 라만 신호를 향상시키기 위해 플라스모닉 금속 나노구조를 이용하며, 따라서 분석물의 진동 모드에 기초한 분자 지문을 제공한다(Kneipp 등, "Ultrasensitive Chemical Analysis by Raman Spectroscopy," Chemical Reviews 99(10):2957-2976 (1999); Moskovits, M., "Surface-Enhanced Spectroscopy," Reviews of Modern Physics 57(3):783-826 (1985); Stiles 등, "Surface-Enhanced Raman Spectroscopy," Annual Review of Analytical Chemistry 1(1):601-626 (2008)). SERS는 바이러스 입자를 검출하고 바이러스의 조성에 기초하여 분자 지문을 제공하는 능력을 이전에 보여주었다(Shanmukh 등, "Rapid and Sensitive Detection of Respiratory Virus Molecular Signatures Using a Silver Nanorod Array SERS Substrate," Nano Letters 6(11):2630-2636 (2006); Lim 등, "Identification of Newly Emerging Influenza Viruses by Surface-Enhanced Raman Spectroscopy," Analytical Chemistry 87(23):11652-11659 (2015); Dardir 등, "SERS Nanoprobe for Intracellular Monitoring of Viral Mutations," Journal of Physical Chemistry C 124(5):3211-3217 (2020); Paul 등, "Bioconjugated Gold Nanoparticle Based SERS Probe for Ultrasensitive Identification of Mosquito-Borne Viruses Using Raman Fingerprinting," Journal of Physical Chemistry C 119(41):23669-23675 (2015); Verduin 등, "RNA-Protein Interactions and Secondary Structures of Cowpea Chlorotic Mottle Virus for In Vitro Assembly," Biochemistry 23(19):4301-4308 (1984)). 인플루엔자의 상이한 균주는 바이러스의 외피 상의 상이한 표면 단백질로부터 발생하는 SERS 스펙트럼의 차이로 인해 구별되었다(Lim 등, "Identification of Newly Emerging Influenza Viruses by Surface-Enhanced Raman Spectroscopy," Analytical Chemistry 87(23):11652-11659 (2015)). SERS는 또한 각각의 바이러스를 구성하는 상이한 핵산 및 아미노산으로부터 발생하는 신호 변화에 기초하여 아데노바이러스, HIV, 및 리노바이러스 입자를 구별할 수 있다(Shanmukh 등, "Rapid and Sensitive Detection of Respiratory Virus Molecular Signatures Using a Silver Nanorod Array SERS Substrate," Nano Letters 6(11):2630-2636 (2006)). 바이러스에 대한 많은 SERS 연구는 나노구조를 바이러스를 표적으로 하는 앱타머(Dardir 등, "SERS Nanoprobe for Intracellular Monitoring of Viral Mutations," Journal of Physical Chemistry C 124(5):3211-3217 (2020); Negri 등, "Identification of Virulence Determinants in Influenza Viruses," Analytical Chemistry 86(14):6911-6917 (2014)) 또는 항체(Paul 등, "Bioconjugated Gold Nanoparticle Based SERS Probe for Ultrasensitive Identification of Mosquito-Borne Viruses Using Raman Fingerprinting," Journal of Physical Chemistry C 119(41):23669-23675 (2015); Driskell 등, "Low-Level Detection of Viral Pathogens by a Surface-Enhanced Raman Scattering Based Immunoassay," Analytical Chemistry 77(19):6147-6154 (2005))로 관능화함으로써 SERS 기반 검정을 개발하는 것을 포함한다.
본 개시는 바이러스 역가의 결정에서 현재의 결함을 극복하는 것에 관한 것이다.
본 개시의 제1 측면은 라만 분광법을 사용하여 샘플에서 바이러스 역가를 정량화하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 샘플을 제공하는 단계; 샘플에서 바이러스 역가를 결정하기 위한 모델을 제공하는 단계; 샘플을 광원으로 조사하는 단계; 및 샘플의 라만 스펙트럼을 획득하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 바이러스 역가를 결정하기 위한 모델에 라만 스펙트럼의 바이러스 성분을 적용하여 샘플의 바이러스 역가를 정량화하는 단계를 추가로 포함한다.
본 개시의 다른 측면은 샘플에서 바이러스 역가를 정량화하기에 적합한 모델을 생성하기 위한 방법에 관한 것이다. 이 방법은 2개 이상의 샘플을 제공하는 단계로서, 각각의 샘플은 공지된 바이러스 유형 및 대응하는 역가를 함유하는 단계; 각각의 샘플을 라만 분광법으로 처리하여 각각의 공지된 바이러스 유형 및 역가에 대한 기준 스펙트럼을 생성하는 단계; 기준 스펙트럼으로부터 바이러스 유형-특이적 성분을 식별하는 단계; 및 공지된 바이러스 유형 및 공지된 역가의 각각의 샘플에 대해 상기 성분에 대한 점수를 결정하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 상기 점수에 기초하여 바이러스 역가를 정량화하기 위한 모델을 생성하는 단계를 추가로 포함한다.
바이러스 역가를 결정하는 보다 간단하고 신속한 접근법을 제공하기 위해, SERS의 사용을 탐색하였다. SERS를 사용하여 제형화 배지에서 바이러스 입자를 검출하고 구별하였다. 삽입된 유전자를 함유하는 바이러스 입자와 그 유전자가 없는 바이러스 입자의 2가지 유형을 다양한 농도로 분석하였다. 그런 다음, 다변량 곡선 해상도(MCR)를 사용하여 스펙트럼을 구별하고 삽입된 유전자를 갖는 입자의 바이러스 역가를 결정하였다. 이는 상이한 여기 파장에서 은 및 금 기판 둘 다를 사용하여 용액에서 수행하였다. 상이한 기판 및 여기 파장을 사용함으로써 발생하는 스펙트럼 차이도 탐색하였다.
첨부된 예에서 입증된 바와 같이, SERS는 현재의 방법보다 적은 샘플 제조로 바이러스 역가를 결정하는 신속한 접근법을 제공한다. SERS는 바이러스 유형과 균주를 구별하는 것으로 이미 나타났지만, 본원에 기술된 방법론은 직접 SERS 측정을 사용하여 바이러스 역가를 결정할 수 있게 한다. 렌티바이러스 입자를 사용하여 결과를 제시하지만, 이러한 동일한 방법론이 다른 바이러스 유형에 적용될 수 있다. 이 기술은 바이러스 게놈에 대한 변형을 정량화하는 데에도 사용될 수 있다.
도 1은 실험 설정에 대한 개략도이다. 2가지 유형의 바이러스 입자를 SERS로 분석하였다. 하나의 입자는 녹색 형광 단백질(GFP)을 암호화하는 벡터를 함유하고, 하나는 함유하지 않는다. GFP 벡터로부터 발생하는 성분 스펙트럼을 결정하기 위해 다변량 곡선 해상도(MCR)를 사용하여 SERS 스펙트럼을 분석하였다. 그런 다음, 이 성분을 사용하여 GFP 암호화 입자의 바이러스 역가를 결정하였다.
도 2a-2b는 금 기판 상에서 50,000 TU/mL의 GFP 함유(회색) 및 GFP 미함유(검은색) LentiArray CRISPR 음성 대조군 렌티바이러스에 대해 획득된 SERS 스펙트럼(도 2a) 및 상이한 농도의 GFP 함유 LentiArray CRISPR 음성 대조군 렌티바이러스(도 2b)를 보여준다. 음영 영역은 각 농도에서 수득된 모든 스펙트럼에 걸친 표준 편차를 나타낸다.
도 3은 다양한 농도에서 GFP 미함유 LentiArray CRISPR 음성 대조군 렌티바이러스의 SERS 스펙트럼을 보여주는 그래프이다. 음영 영역은 금 기판 상에서 획득된 모든 스펙트럼에 걸친 표준 편차를 나타낸다.
도 4는 표준 편차가 개략된 금 기판 상에서 획득된 LV-MAX 배지의 평균 SERS 스펙트럼을 보여주는 그래프이다.
도 5a-5d는 500 TU/ml, 5,000 TU/mL, 및 50,000 TU/mL에서 획득된 스펙트럼을 사용하여 개발된 GFP 함유 LentiArray CRISPR 음성 대조군 렌티바이러스에 대한 MCR 모델을 보여준다. 모델은 10,000 TU/mL의 스펙트럼을 사용하여 검증하였다. MCR 분석 전에 각 농도로부터 물 스펙트럼을 뺀다. 도 5a는 모델의 3개 성분 로딩의 스펙트럼을 보여주는 그래프이다. 도 5b는 성분 3에 대해 도표화된 성분 2 상의 각 스펙트럼의 점수를 보여주는 그래프이다. 성분 2의 점수는 바이러스 역가와의 관계를 나타낸다. 도 5c는 바이러스 역가에 대해 도표화된 각 농도에 대한 평균 점수를 보여주는 그래프이다. 도 5d는 GFP 미함유 렌티바이러스 입자(50,000 TU/mL)의 성분 2에 대한 평균 점수 및 GFP함유 입자(50,000 TU/mL)의 평균 점수와 비교하여 도표화된 입자의 저장 배지에 대한 막대 그래프이다.
도 6은 GFP 함유(검은색) 렌티바이러스 입자의 최고 농도의 평균 SERS 스펙트럼 및 GFP 함유(회색) 입자를 정량화하는데 사용된 MCR 모델의 성분 스펙트럼을 보여주는 그래프이다.
도 7은 세포 형광에 의한 바이러스 역가의 결정을 보여주는 그래프이다. 삽입된 그림들은 분석된 각 농도에서 명시야 이미지 상에 중첩된 형광 이미지를 나타낸다.
도 8a-8d는 은 SERS 기판 및 532 nm 레이저 여기를 사용하여 GFP 함유 및 미함유 LentiArray CRISPR 음성 대조군 렌티바이러스의 분석을 보여준다. 도 8a는 50,000 TU/mL의 GFP함유(회색) 및 미함유(검은색) 렌티바이러스의 평균 SERS 스펙트럼을 보여주는 그래프이다. 이 농도에서 획득된 모든 스펙트럼을 사용하여 3 성분 MCR 모델을 개발하였다. 도 8b는 이러한 MCR 모델의 성분 로딩을 보여주는 그래프이다. 도 8c는 3개의 성분 각각에 대한 점수의 3차원 플롯이다. 성분 3에 대해 높은 GFP 점수를 함유하는 입자의 스펙트럼만. 도 8d는 은(검은색) 및 금(회색) 기판을 사용하여 획득된 GFP 벡터로부터 발생하는 성분 스펙트럼의 비교를 보여주는 그래프이다.
도 9는 GFP를 암호화하는 렌티바이러스 입자(위), 동일하거나 GFP 유전자가 없는 렌티바이러스 입자(중간), 및 캡시드 내에 RNA가 없는 렌티바이러스 입자(빈 캡시드, 아래)로부터 수집된 SERS 스펙트럼을 보여주는 그래프이다. 바이러스에 존재하는 유전자 함량과 상관될 수 있는 분광 차이가 관찰된다. 모든 스펙트럼은 금 SERS 기판으로 785 nm를 사용하여 수집하였다.
도 10a-10h는 JLV1로 지정된 변형된 렌티바이러스 입자의 평가를 위한 MCR 모델을 보여준다. 도 10a는 JLV1의 차이 농도에 대한 평균 SERS 스펙트럼을 보여주는 그래프이다. 도 10b는 JLV1 샘플의 3개의 성분 각각에 대한 점수의 3차원 플롯이고, 도 10c는 이러한 MCR 모델의 성분 로딩을 보여주는 그래프이다. 도 10d는 성분 1 상의 각 샘플(103 내지 106 TU/mL)에 대한 평균 점수를 보여준다. 도 10e는 103 내지 105 TU/mL의 범위에 걸쳐 JLV1의 바이러스 역가를 결정하기 위한 교정 곡선이다. 도 10f-h는 서로에 대해 도표화된 2개의 성분, 즉 성분 1 대 성분 2 (도 10f), 성분 1 대 성분 3(도 10g), 및 성분 2 대 성분 3(도 10h)을 갖는 JLV1 샘플에 대한 스펙트럼 성분 점수의 비교를 보여주는 그래프이다.
도 2a-2b는 금 기판 상에서 50,000 TU/mL의 GFP 함유(회색) 및 GFP 미함유(검은색) LentiArray CRISPR 음성 대조군 렌티바이러스에 대해 획득된 SERS 스펙트럼(도 2a) 및 상이한 농도의 GFP 함유 LentiArray CRISPR 음성 대조군 렌티바이러스(도 2b)를 보여준다. 음영 영역은 각 농도에서 수득된 모든 스펙트럼에 걸친 표준 편차를 나타낸다.
도 3은 다양한 농도에서 GFP 미함유 LentiArray CRISPR 음성 대조군 렌티바이러스의 SERS 스펙트럼을 보여주는 그래프이다. 음영 영역은 금 기판 상에서 획득된 모든 스펙트럼에 걸친 표준 편차를 나타낸다.
도 4는 표준 편차가 개략된 금 기판 상에서 획득된 LV-MAX 배지의 평균 SERS 스펙트럼을 보여주는 그래프이다.
도 5a-5d는 500 TU/ml, 5,000 TU/mL, 및 50,000 TU/mL에서 획득된 스펙트럼을 사용하여 개발된 GFP 함유 LentiArray CRISPR 음성 대조군 렌티바이러스에 대한 MCR 모델을 보여준다. 모델은 10,000 TU/mL의 스펙트럼을 사용하여 검증하였다. MCR 분석 전에 각 농도로부터 물 스펙트럼을 뺀다. 도 5a는 모델의 3개 성분 로딩의 스펙트럼을 보여주는 그래프이다. 도 5b는 성분 3에 대해 도표화된 성분 2 상의 각 스펙트럼의 점수를 보여주는 그래프이다. 성분 2의 점수는 바이러스 역가와의 관계를 나타낸다. 도 5c는 바이러스 역가에 대해 도표화된 각 농도에 대한 평균 점수를 보여주는 그래프이다. 도 5d는 GFP 미함유 렌티바이러스 입자(50,000 TU/mL)의 성분 2에 대한 평균 점수 및 GFP함유 입자(50,000 TU/mL)의 평균 점수와 비교하여 도표화된 입자의 저장 배지에 대한 막대 그래프이다.
도 6은 GFP 함유(검은색) 렌티바이러스 입자의 최고 농도의 평균 SERS 스펙트럼 및 GFP 함유(회색) 입자를 정량화하는데 사용된 MCR 모델의 성분 스펙트럼을 보여주는 그래프이다.
도 7은 세포 형광에 의한 바이러스 역가의 결정을 보여주는 그래프이다. 삽입된 그림들은 분석된 각 농도에서 명시야 이미지 상에 중첩된 형광 이미지를 나타낸다.
도 8a-8d는 은 SERS 기판 및 532 nm 레이저 여기를 사용하여 GFP 함유 및 미함유 LentiArray CRISPR 음성 대조군 렌티바이러스의 분석을 보여준다. 도 8a는 50,000 TU/mL의 GFP함유(회색) 및 미함유(검은색) 렌티바이러스의 평균 SERS 스펙트럼을 보여주는 그래프이다. 이 농도에서 획득된 모든 스펙트럼을 사용하여 3 성분 MCR 모델을 개발하였다. 도 8b는 이러한 MCR 모델의 성분 로딩을 보여주는 그래프이다. 도 8c는 3개의 성분 각각에 대한 점수의 3차원 플롯이다. 성분 3에 대해 높은 GFP 점수를 함유하는 입자의 스펙트럼만. 도 8d는 은(검은색) 및 금(회색) 기판을 사용하여 획득된 GFP 벡터로부터 발생하는 성분 스펙트럼의 비교를 보여주는 그래프이다.
도 9는 GFP를 암호화하는 렌티바이러스 입자(위), 동일하거나 GFP 유전자가 없는 렌티바이러스 입자(중간), 및 캡시드 내에 RNA가 없는 렌티바이러스 입자(빈 캡시드, 아래)로부터 수집된 SERS 스펙트럼을 보여주는 그래프이다. 바이러스에 존재하는 유전자 함량과 상관될 수 있는 분광 차이가 관찰된다. 모든 스펙트럼은 금 SERS 기판으로 785 nm를 사용하여 수집하였다.
도 10a-10h는 JLV1로 지정된 변형된 렌티바이러스 입자의 평가를 위한 MCR 모델을 보여준다. 도 10a는 JLV1의 차이 농도에 대한 평균 SERS 스펙트럼을 보여주는 그래프이다. 도 10b는 JLV1 샘플의 3개의 성분 각각에 대한 점수의 3차원 플롯이고, 도 10c는 이러한 MCR 모델의 성분 로딩을 보여주는 그래프이다. 도 10d는 성분 1 상의 각 샘플(103 내지 106 TU/mL)에 대한 평균 점수를 보여준다. 도 10e는 103 내지 105 TU/mL의 범위에 걸쳐 JLV1의 바이러스 역가를 결정하기 위한 교정 곡선이다. 도 10f-h는 서로에 대해 도표화된 2개의 성분, 즉 성분 1 대 성분 2 (도 10f), 성분 1 대 성분 3(도 10g), 및 성분 2 대 성분 3(도 10h)을 갖는 JLV1 샘플에 대한 스펙트럼 성분 점수의 비교를 보여주는 그래프이다.
정의
본 방법을 설명하기 전에, 본 발명이 설명된 특정 방법론에 한정되지 않는 것으로 이해해야 하는데, 이는 이들이 다양할 수 있기 때문이다. 또한, 본 설명에 사용된 용어는 단지 특정 버전 또는 실시예를 설명하기 위한 목적을 위한 것이며, 첨부된 청구범위에 의해서만 제한되는 본원의 실시예의 범위를 제한하려는 것이 아님을 이해해야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당 분야의 숙련자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본원의 실시예의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법, 장치 및 재료를 이제 설명하기로 한다. 본원에 언급된 모든 간행물은 그 전체가 참조로서 통합된다. 본원에서의 어느 것도 본원의 실시예가 종래 발명으로 인해 그러한 개시를 선행할 자격이 없다고 인정하는 것으로 해석되어선 안된다.
본원에서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태("a," "an," "the")는 문맥이 달리 명확하게 언급하지 않는 한 복수 참조를 포함한다는 것을 주목해야 한다.
달리 언급되지 않는 한, 본원에서 설명되는 농도 또는 농도 범위와 같은 임의의 수치 값은 모든 경우에 용어 "약"에 의해 변형된 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 수치 값은 일반적으로 인용된 값의 ± 10%, 보다 구체적으로는 인용된 값의 ± 5%, 또는 인용된 값의 ± 3%, ± 2%, 또는 ± 1%를 포함한다. 예를 들어, 1 mg/mL의 농도는 0.9 mg/mL 내지 1.1 mg/mL를 포함한다. 마찬가지로, 1% 내지 10%(w/v)의 농도 범위는 0.9%(w/v) 내지 11%(w/v)를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 수치 범위의 사용은 모든 가능한 하위범위를 명시적으로 포함하며, 문맥이 달리 명시하지 않는 한, 이러한 범위 내의 정수 및 값의 분율을 포함하여, 그 범위 내의 모든 개별 수치 값을 포함한다.
달리 명시되지 않는 한, 일련의 요소 앞에 있는 용어 "적어도"는 일련의 모든 요소를 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 당 분야의 숙련자는, 본원에서 설명되는 본 발명의 특정 실시예에 대한 많은 균등물을, 통상적인 실험 정도로 사용하여 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등물은 본 발명에 포함되도록 의도된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "포함하다(comprises)", "포함하는(comprising)", "포함한다(includes)", "포함하는(including)", "가진다(has)", "갖는(having)", "함유한다(contains)" 또는 "함유하는(containing)", 또는 이들의 임의의 다른 변형은, 언급된 정수 또는 정수들의 군을 포함하지만, 임의의 다른 정수 또는 정수들의 군을 배제하지 않고 비-배타적이거나 개방적인 것으로 의도되는 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 요소들의 목록을 포함하는 조성물, 혼합물, 공정, 방법, 물품, 또는 장치는 반드시 이들 요소에만 한정되지는 않지만, 이러한 조성물, 혼합물, 공정, 방법, 물품, 또는 장치에 명시적으로 열거되거나 내재되지 않은 다른 요소를 포함할 수 있다. 또한, 반대로 명시적으로 언급되지 않는 한, "또는"은 포괄적인 또는 을 지칭하며 배타적인 또는 을 지칭하지 않는다. 예를 들어, 조건 A 또는 B는 다음 중 어느 하나에 의해 충족된다: A는 참(또는 존재)이고 B는 거짓(또는 존재하지 않음)이고, A는 거짓(또는 존재하지 않음)이고 B는 참(또는 존재)이고, A 및 B 모두가 참(또는 존재)이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 다수의 인용된 요소 사이의 접속어 "및/또는"은 개별 및 조합된 옵션 모두를 포함하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 2개의 요소가 "및/또는"에 의해 결합되는 경우, 첫번째 옵션은 제2 요소가 없는 제1 요소의 적용 가능성을 지칭한다. 두번째 옵션은 제1 요소가 없는 제2 요소의 적용 가능성을 지칭한다. 세번째 옵션은 제1 및 제2 요소의 적용 가능성을 함께 지칭한다. 이들 옵션 중 어느 하나가 의미 내에 속하는 것으로 이해되며, 따라서 본원에서 사용되는 용어 "및/또는"의 요건을 충족시킨다. 하나 이상의 옵션의 동시 적용 가능성 또한 의미 내에 속하는 것으로 이해되며, 따라서 용어 "및/또는"의 요건을 충족시킨다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 명세서 및 청구범위 전체에 걸쳐 사용되는 바와 같은, 용어 "~으로 이루어진다", 또는 "~으로 이루어진다" 또는 "~으로 이루어지는"과 같은 변형은, 임의의 인용된 정수 또는 정수의 군을 포함하지만, 특정 방법, 구조 또는 조성물에 추가 정수 또는 정수의 군을 추가할 수 없음을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 명세서 및 청구범위 전체에 걸쳐 사용되는 바와 같은, 용어 "필수적으로 "~으로 이루어진다", 또는 "필수적으로 "~으로 이루어진다" "필수적으로 "~으로 이루어지는"과 같은 변형은 임의의 인용된 정수 또는 정수들의 군을 포함하는 것과, 특정 방법, 구조 또는 조성물의 기본 또는 신규한 특성을 실질적으로 변화시키지 않는 임의의 인용된 정수 또는 정수들의 군을 선택적으로 포함하는 것을 나타낸다.
또한, 본 발명의 바람직한 구성요소의 치수 또는 특징을 지칭할 때 본원에서 사용되는, 용어 "약", "대략", "대체로", "실질적으로" 및 유사한 용어는 설명된 치수/특징이 엄격한 경계 또는 파라미터가 아니며, 당 분야의 숙련자에 의해 이해될 수 있는 바와 같이, 기능적으로 동일하거나 유사한 작은 변형을 배제하지 않음을 나타내는 것으로 이해되어야 한다. 최소한, 수치 파라미터를 포함하는 이러한 참조는 당 기술분야에서 용인되는 수학적 및 산업적 원리(예를 들어, 반올림, 측정 또는 기타 체계적인 오차, 제조 허용 오차 등)를 사용하는 변형을 포함할 것이고, 이는 최소한의 유효 숫자를 변화시키지 않을 것이다.
샘플에서 바이러스 역가 정량화 방법
본 개시의 제1 측면은 라만 분광법을 사용하여 샘플에서 바이러스 역가를 정량화하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 샘플을 제공하는 단계 및 샘플에서 바이러스 역가를 결정하기 위한 모델을 제공하는 단계를 포함한다. 샘플을 광원으로 조사하고, 샘플의 라만 스펙트럼을 획득한다. 상기 방법은 바이러스 역가를 결정하기 위한 모델에 라만 스펙트럼의 바이러스 성분을 적용하여 샘플의 바이러스 역가를 정량화하는 단계를 추가로 포함한다.
바이러스는 다른 유기체의 살아있는 세포 내부에서만 복제할 수 있는 초현미경적 감염체(일반적으로 박테리아보다 작은)이다. 바이러스는 RNA 또는 DNA 기반 게놈을 가질 수 있다. 본원에 기술된 방법에 따르면, 바이러스는 임의의 자연 발생 바이러스, 변형된 바이러스, 또는 바이러스 벡터를 포함한다. 따라서 임의의 야생형 바이러스의 바이러스 역가가 본 개시에 따라 평가될 수 있지만, 본원에 개시된 방법의 유용성은 돌연변이체 또는 변형된 바이러스(예를 들어, 하나 이상의 핵산 치환을 포함하는 바이러스, 삽입, 야생형 또는 자연 발생 바이러스와 비교하여 결실 또는 전위, 또는 바이러스 단백질을 암호화하는 유전 물질의 큰 부분이 없음) 또는 바이러스 벡터까지 확장된다는 것이 이해될 것이다.
본원에 개시된 방법에 따라 결정된 바이러스 역가는 바이러스 입자를 검출하는 맥락에서 기술된다. 바이러스 입자 또는 비리온은 바이러스의 숙주와 독립적이지만(즉, 세포에서 발견되지 않음), 바이러스 게놈 및 바이러스 캡시드(또는 바이러스의 외피)를 포함하는 바이러스이다. 본원에 기술된 방법은 또한 바이러스 유사 입자의 역가를 결정하는 데 적합하다. 바이러스-유사 입자는 바이러스의 외피로부터의 특정 단백질을 함유하지만, 바이러스로부터의 유전 물질의 일부 또는 전부를 함유하지 않고 감염을 야기할 수 없는 작은 입자이다. 바이러스 유사 입자(VLP)는 바이러스 유사 구조로 자가 조립되는 바이러스 구조 단백질의 개별 발현에 의해 자연적으로 발생되거나 합성될 수 있다. 합성 바이러스 유사 입자는 또한 바이러스 단백질, 예를 들어, 바이러스 구조 단백질을 디스플레이 및/또는 함유하도록 변형된 리포좀 또는 중합체 입자를 포함할 수 있다. 본 개시의 목적을 위해, 비리온의 역가를 결정하는 것을 참조할 때, 이는 비리온 및 모든 형태의 바이러스 유사 입자, 즉, 자연 발생 VLP, 합성 VLP, 리포좀 기반 VLP, 중합체 입자 VLP 등의 역가를 결정하는 것을 포함한다는 것을 이해해야 한다.
일부 실시예에서, 샘플의 바이러스 역가는 하나 이상의 바이러스 입자 유형을 포함하는 샘플에서 결정된다. 일부 실시예에서, 샘플은 2개 이상의 바이러스 입자 유형, 예를 들어, 2개 이상의 바이러스 입자 유형, 3개 이상의 바이러스 입자 유형, 4개 이상의 바이러스 입자 유형, 5개 이상의 바이러스 입자 유형, 또는 5개 초과의 바이러스 입자 유형을 함유한다.
임의의 실시예에서, 2개 이상의 바이러스 입자 유형은 하나 이상의 유전자 요소 만큼 상이하다. 예를 들어, 샘플 내의 2개 이상의 바이러스 입자 유형은 바이러스 입자 게놈 내의 하나 이상의 유전자 삽입, 치환, 전위, 또는 결실에 의해 상이할 수 있다. 일부 실시예에서, 2개 이상의 바이러스 입자는 유전자 삽입, 예를 들어, 외인성 유전자 또는 이의 일부를 바이러스 입자 게놈에 삽입하는 것에 의해 상이하다. 바이러스 입자 유형 간에 하나 이상의 단백질 차이를 야기할 수도 있는 하나 이상의 유전자 차이는 본원에 기술된 바이러스 역가를 정량화하는 데 유용한 바이러스 유형 특이적 성분을 식별하기 위한 기초를 제공한다.
본원에 개시된 방법은 또한 샘플에서 바이러스 벡터의 역가를 결정하는데 적합하다. 바이러스 벡터는 유전 물질을 표적 세포(예를 들어, 치료적 용도의 유전자) 내로 도입하는 데 일반적으로 사용되는 바이러스의 변형된 비감염성 버전이다. 따라서, 바이러스 벡터는, 예를 들어, 유전자 요법, 세포 요법 또는 다른 분자 응용을 위한 특정 유용성을 가지며, 이들의 생산은 유전자 요법 및 세포 요법 산업의 중심이다. 일부 실시예에서, 샘플의 바이러스 역가는 하나 이상의 바이러스 벡터를 포함하는 샘플에서 결정된다. 일부 실시예에서, 샘플은 2개 이상의 바이러스 벡터, 예를 들어, 2개의 바이러스 벡터, 3개의 바이러스 벡터, 4개의 바이러스 벡터, 5개의 바이러스 벡터, 또는 5개 초과의 바이러스 벡터를 함유한다.
임의의 실시예에서, 포장 세포주에 의해 생산되는 바이러스 벡터의 역가는 본원에 개시된 방법에 의해 모니터링되거나 평가될 수 있다. 유전자 요법 및 세포 요법 분야에서는, 예를 들어, 생산자 세포주로부터의 생산과 같은 생산 공정이 정확하게 모니터링되고 관리될 수 있도록 민감한 방식으로 생산된 역가를 측정할 수 있는 것이 특히 중요하다. 따라서, 바이러스는 본원에 개시된 방법에 의해 모니터링되거나 평가되기 위해 완전히 기능적이거나 야생형일 필요는 없다.
용어 "바이러스 역가"는 정해진 부피로 존재하는 바이러스(즉, 바이러스 입자, VLP, 및/또는 바이러스 벡터)의 양을 지칭한다. 임의의 유형의 바이러스 역가가 본 발명으로 평가될 수 있는데, 예를 들어, 물리적 바이러스 역가, 기능적 바이러스 역가(감염성 바이러스 역가로도 지칭됨) 또는 형질도입 바이러스 역가가 평가될 수 있다.
특정 실시예에서, 물리적 바이러스 역가가 평가될 수 있다. 물리적 바이러스 역가는 샘플 내 비리온 농도의 척도이며, 일반적으로 바이러스 단백질 또는 바이러스 핵산, 즉 바이러스 성분의 존재에 기초한다. 물리적 역가는 mL 당 비리온(VP/mL), mL 당 바이러스 게놈(vg/mL), mL 당 바이러스 사본, 또는 mL 당 RNA 사본으로서 표현될 수 있고, 본원에 기술된 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 물리적 역가 측정은 빈 비리온 또는 결함이 있는 비리온과 세포를 감염시킬 수 있는 입자를 항상 구별하지는 않는다. 따라서, 물리적 바이러스 역가는 생산된 입자 중 얼마나 많은 입자가 세포를 감염시킬 수 있는지 결정하는 기능적 역가 또는 감염성 역가, 및 (예를 들어, 바이러스 벡터의 생산을 위해, 형질도입 바이러스 역가가 관련될 수 있는) 얼마나 많은 기능적 바이러스 입자가 관심 유전자를 함유하지를 결정하는 형질도입 바이러스 역가와 구별될 수 있다. 따라서, 샘플 내의 모든 입자가 기능하지 않는 한, 물리적 역가의 결정은 기능적 역가의 결정과 동등하지 않다. 실제로, 기능적 역가는 종종 물리적 역가보다 100 내지 1000배 작다.
대안적으로, 기능적 또는 감염성 역가는 본 발명으로 측정되거나 평가될 수 있으며, 여기서 기능적 또는 감염성 역가는 표적 세포를 감염시킬 수 있는 특정 부피에 존재하는 바이러스 입자의 양의 척도이다. 기능적 역가는 mL 당 플라크 형성 단위(pfu/mL), mL 당 감염성 단위(ifu/mL), 또는 mL 당 형질감염 단위(TU/mL)로서 표현될 수 있다.
형질도입 역가는 표적 세포를 감염시킬 수 있고 관심 유전자를 포함하는 특정 부피에 존재하는 바이러스 입자의 양의 척도이다. 형질도입 역가는 형질도입 단위/mL로서 표현될 수 있고, 본원에 기술된 검정을 사용하여 평가될 수 있다. 당업자는 기능적 역가 또는 형질도입 역가가 물리적 역가에 대해 수득된 임의의 값을 스케일 다운함으로써 결정될 수 있음을 이해할 것이다. 전술한 바와 같이, 물리적 역가와 기능적 역가 또는 형질도입 역가 사이의 배수 차이는 당업계에서 잘 이해된다. 따라서, 본 발명의 일 측면에서, 기능적 또는 형질도입 역가는 본 발명의 방법에 의해 간접적으로 결정될 수 있다(예를 들어, 물리적 역가에 대해 수득된 값을 낮춤으로써). 따라서, 본 발명의 방법은 물리적 역가의 결정을 낮추어 기능적 또는 형질도입 역가를 결정하는 추가 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법은 바이러스 역가를 모니터링하거나 평가할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 바이러스 역가, 예를 들어 샘플에 존재하는 비리온의 수준, 양 또는 농도를 결정할 수 있다. 따라서, 특히, 상기 방법은 (예를 들어, 상이한 시점에 샘플을 분석함으로써) 바이러스의 수준, 양 또는 농도가 시간 경과에 따라 증가 또는 평탄화되는지, 또는 (예를 들어, 동일하거나 동등한 시점에 분석된) 상이한 샘플과 비교하여 변화되는지(예를 들어, 증가, 감소 또는 등가인지) 여부를 결정할 수 있다. 이러한 방식으로, 본원에 개시된 방법은, 예를 들어, 상기 바이러스의 생산 방법의 효율을 평가하고, 예를 들어, 높은 수준의 바이러스의 검출 또는 결정은 효율적인 방법을 나타낼 수 있고, 낮은 수준의 바이러스는 준최적 생산 방법을 나타낼 수 있고, 또는 바이러스의 생산 방법에서 특정 인자의 중요성을 결정하는 데 사용될 수 있고, 예를 들어, (동일하거나 상이한 바이러스에 대해) 다른 변형된 생산 방법 동안 측정된 바이러스 역가와 비교함으로써 사용될 수 있다.
본 발명의 방법은 바이러스 생산 공정의 하류에 있는 임의의 공정을 평가하는 데, 예를 들어, 임의의 이러한 공정이 바이러스 역가에 영향을 미쳤는지 여부를 결정하는 데 사용될 수도 있다. 임의의 실시예에서, 본원에 개시된 방법은, 이러한 정제 방법이 역가에 임의의 영향을 미쳤는지, 예를 들어, 정제 전에 샘플에 존재했던 바이러스 역가와 비교하여 이러한 정제 후에 역가가 증가, 감소 또는 등가로 유지되었는지 여부를 결정하기 위해 사용될 수 있는 정제 방법을 평가하는 데 적합하다. 본원에 개시된 방법은 유전자 요법을 위한 비리온 또는 벡터의 제조에 특히 중요할 수 있는, 바이러스, 예를 들어, 바이러스 입자, VLP, 또는 바이러스 벡터의 대규모 제조를 평가하는 데 추가로 사용될 수 있다.
본원에 개시된 방법은 다른 샘플에 비해 샘플의 바이러스 역가의 증가 또는 감소를 결정할 수 있다. 임의의 실시예에서, 본원에 개시된 방법은 측정이 비교되는 바이러스 역가의 약 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%의 증가, 및 측정이 비교되는 바이러스 역가의 약 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%의 바이러스 역가의 감소를 결정하는 데 적합하다. 동등한 바이러스 역가는 측정이 비교되는 바이러스 역가의 5% 이내일 수 있다.
이와 관련하여, 일부 목적을 위해, 바이러스 역가의 임의의 변화 또는 변화가 발생했는지 여부를 결정하기 위해, 방법을 수행하기 전 및 후 및/또는 방법을 수행 동안 바이러스 역가를 평가하는 것이 바람직할 수 있음을 이해할 것이다. 본원에 개시된 방법은 바이러스 역가, 예를 들어 상이한 샘플 내(동등하거나 상이한 시점에), 또는 상이한 시점에 동일한 샘플 내 바이러스 역가와 비교하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 방법은 대상체에서 바이러스 감염의 정도를 결정하는 데, 예를 들어 감염이 성공적으로 치료되고 있는지 또는 감소되고 있는지 여부를 결정하는 데 사용될 수 있다. 이러한 방법에서, 바이러스 역가가 시간 경과에 따라 증가, 감소 또는 등가로 유지되는지 여부를 결정하기 위해, 샘플, 예를 들어, 상이한 시점에 대상체로부터 유래된 동일한 유형의 샘플에서 바이러스 역가를 비교하는 것이 바람직할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 개체로부터의 샘플에서의 바이러스 역가를, 병태에 대해 이전에 수득된 바이러스 역가 측정치와 비교하는 것이 바람직할 수 있으며, 이는 예를 들어 감염 단계 및/또는 예후를 나타낼 수 있다.
대안적으로, 본원에 개시된 방법은 샘플에서 바이러스의 실제 양, 수준 또는 농도를 결정하지 않을 수 있지만, 양, 수준 또는 농도가 허용 가능한 임계값을 초과하거나 미만인지 여부를 결정할 수 있는데, 예를 들어, 생산 방법의 경우, 임계값은 샘플 내에 허용 가능한 수준의 바이러스 입자가 존재하는지 여부를 결정할 수 있다. 본원에 개시된 방법은 바이러스 역가의 수준이 이전에 검정된 샘플의 수준과 증가, 감소, 또는 필적하는지 여부를 결정할 수 있고, 따라서 특정 응용의 경우, 실제 바이러스 역가(예를 들어, 존재하는 바이러스의 양 또는 농도)를 결정할 필요가 없을 수 있음을 이해할 것이다.
본원에 기술된 바와 같은 샘플에서 바이러스 역가를 결정하는 방법에 따르면, 적합한 샘플은 하나 이상의 바이러스 입자, VLP 또는 바이러스 벡터를 함유하거나 함유할 것으로 예상되는 임의의 샘플을 포함한다. 샘플 내의 바이러스 역가는 실시간, in situ로 라만 분광법에 의해 측정될 수 있거나 ex situ로 샘플에 대해 수행될 수 있다.
"in situ"는 바이러스 입자를 생산할 수 있는 배양물에서 라만 산란 광의 강도를 얻기 위한 측정이 바이러스 입자가 생산되는 일차 배양 환경으로부터 취해지고, 일차 배양 환경으로부터 추출된 샘플로부터 취해지지 않는 것을 의미한다. 따라서, "in situ" 측정을 수행함으로써, 액체 취급 단계에 대한 요건은 없다. 따라서, 그 환경으로부터 샘플을 제거하는 것은 본 발명의 특정 응용에 필요하지 않을 수 있고, 샘플의 in situ 측정이 바람직할 수 있다. 샘플의 in situ 측정은 샘플의 일부가 제거되는 실제 샘플링 단계를 필요로 하지 않고 샘플에서 바이러스 역가의 정기적인 평가를 허용할 수 있다. 이와 관련하여 바이러스 역가 평가는 비용 및 오류를 초래할 수 있는 추가 단계를 필요로 하지 않고 실시간으로 정확하고 민감하게 측정될 수 있다.
대안적으로, 본원에 개시된 방법은 ex situ 샘플에 대해 수행될 수 있다. "ex situ"는 바이러스 입자를 생산할 수 있는 배양물에서 라만 산란 광의 강도를 얻기 위한 측정이 하나 이상의 액체 취급 단계에 따라 바이러스 입자가 생산되는 일차 배양 환경으로부터 추출된 샘플로부터 취해지는 것을 의미한다. 특정 실시예에서, 본원에 개시된 방법은 샘플링 단계를 포함할 수 있다.
본원에 기술된 방법에 사용된 샘플의 기원은 바이러스가 생산되고 있는 세포 배양물일 수 있다. 따라서, 샘플은 배양 배지(예를 들어, DMEM, MEM, SFII, LVMAX, Texmacs, 또는 선택적으로 혈청, L-글루타민 및/또는 다른 성분을 포함하는 PBS) 중 하나일 수 있으며, 예를 들어, 바이러스 생산 공정 동안 취해지는 경우, 패키징 세포를 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로, 샘플은 바이러스 회수 동안 수득된 부분 정제된 또는 무세포 샘플일 수 있다. 샘플은, 예를 들어, 판매 또는 사용 전에 품질 시험을 필요로 하는, 의료용 샘플 바이러스일 수 있다. 샘플은 바이러스에 감염되었다고 의심되는 대상체(예를 들어, 인간 또는 포유류 대상체)로부터의 샘플일 수 있다. 따라서, 샘플은 혈액, 타액, 가래, 혈장, 혈청, 뇌척수액, 소변 또는 대변 샘플과 같은 생물학적으로 동일할 수 있다. 샘플의 다른 공급원은 개방 수역 또는 공공 수역 공급부를 포함한다.
본원에 기술된 바와 같은 샘플에서 바이러스 역가를 결정하는 방법은 샘플을 광원으로 조사하고 샘플의 라만 스펙트럼을 획득하는 단계를 포함한다. 라만 분광법은 샘플에 의해 산란된 단색 광의 파수의 변화를 측정하여 이들의 화학적 조성, 물리적 상태 및 환경에 대한 정보를 제공한다. 이는 입사광 양자가 샘플을 포함하는 분자에 존재하는 진동 모드와 상호 작용하는 방식으로 인해 가능하다. 이들 모드는 주어진 물리적 조건의 세트 하에서 특정 진동 주파수 및 산란 강도를 가지며, 이는 주어진 관심 분석물의 양을 정량화할 수 있게 한다. 광대역 광원으로부터 상이한 에너지의 광 흡수가 측정되는 적외선 흡수 분광법과 달리, 라만 분광법에서, 산란된 광에 대한 단색 입사 광의 에너지의 차이가 측정되며; 이는 라만 이동으로 알려져 있다.
라만 스펙트럼은 분자의 진동 상태에 대한 정보를 제공함으로써 샘플의 정성적 및 정량적 분석을 가능하게 하는 "분자 지문"을 제공한다. 많은 분자는 다수의 진동 상태에 존재할 수 있는 원자 결합을 갖는다. 이러한 분자는 그의 허용된 진동 상태 중 2개 사이의 전이와 일치하는 입사 복사선을 흡수하고 후속하여 복사선을 방출할 수 있다. 가장 자주, 흡수된 방사선은 동일한 파장, 레일리 또는 탄성 산란으로 지정된 공정으로 재방사된다. 일부 경우에, 재방사된 방사선은 (분자의 허용 가능한 진동 상태 및 초기 및 최종 진동 상태에 따라) 흡수된 방사선보다 약간 더 많거나 약간 더 적은 에너지를 함유할 수 있다. 입사 방사선과 재방사 방사선 사이의 에너지 차이의 결과는 입사 방사선과 재방사 방사선 사이의 파장의 이동으로 나타나며, 차이의 정도는 파수(역 길이(inverse length)) 단위로 측정된 라만 이동(RS)으로 지정된다. 입사광이 레이저 공급원을 사용할 때와 같이 실질적으로 단색(단일 파장)인 경우, 주파수가 상이한 산란광은 레일리 산란광과 더 쉽게 구별될 수 있다.
임의의 실시예에서, 본원에 개시된 방법에 따라 사용되는 라만 분광법은 표면 강화 라만 분광법(SERS)이다. SERS는 거친 금속 표면(예를 들어, 거친 은 또는 금 표면) 상에 흡착된 분자에 의해 또는 기판 상의 플라스몬-자성 실리카 나노튜브와 같은 나노구조에 의해 라만 산란을 향상시키는 표면 감응성 기술이다.
임의의 실시예에서, 본원에 기술된 바와 같은 바이러스 역가를 결정하는 방법에서 SERS의 적용은 실리콘, 석영 또는 유리 기판과 같은 평면(또는 평평한) 기판을 사용하여 수행된다. 평면 기판은 또 반도체(예를 들어, Si, GaAs, GaAsP, 및 Ge), 산화물(예, SiO2, Al2O3), 및 중합체(예를 들어, 폴리스티렌, 폴리아세틸렌, 폴리에틸렌 등)를 포함하지만 이에 한정되지 않는 재료로 제조될 수도 있다. 다른 실시예에서, 기판은 원통형 또는 원뿔형 기판(예를 들어, 광섬유 또는 피펫 팁)과 같은 비평면 기판이다. 기판은 마이크로패턴의 규칙적인 어레이, 예컨대 도트 어레이, 라인 어레이, 또는 웰 어레이, 또는 유사한 나노패턴을 갖는 기판과 같은 마이크로패브리케이트 또는 나노패브리케이트 기판일 수 있다. 일 실시예에서, 본원에 설명된 방법에 따른 SERS는 금속 기판을 사용하여 수행되며, 여기서 금속은 금, 은, 구리, 및 백금, 및 이들의 합금으로부터 선택된다. 일 실시예에서, 바이러스 역가를 결정하기 위한 SERS는 금 기판 상에서 수행된다. 다른 실시예에서, 바이러스 역가를 결정하기 위한 SERS는 은 기판을 사용하여 수행된다.
임의의 실시예에서, 본원에 개시된 방법에서 SERS의 적용은 나노구조를 함유하도록 변형된 기판을 사용하여 수행된다. 적절한 나노구조는 나노로드, 나노와이어, 나노튜브, 나노나선형, 나노구, 나노삼각형, 나노스타, 이들의 조합 등, 및 각각의 균일한 어레이를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. (전술한 유형의) 나노구조는 금속, 금속 산화물, 금속 질화물, 금속 산질화물, 금속 탄화물, 도프된 재료, 중합체, 다성분 화합물, 화합물(예를 들어, 화합물 또는 전구체 화합물, 또는 유기 또는 무기 화합물), 및 이들의 조합과 같은 하나 이상의 재료로 제조될 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 금속은 은, 니켈, 알루미늄, 실리콘, 금, 백금, 팔라듐, 티타늄, 구리, 코발트, 아연, 다른 전이금속, 이의 복합체, 이의 산화물, 이의 질화물, 이의 규화물, 이의 인화물, 이의 산질화물, 이의 탄화물, 및 이들의 조합을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 임의의 실시예에서, 재료는 은 또는 금이다. 임의의 실시예에서, 나노구조의 조성은 기판 물질의 조성과 동일하다. 임의의 실시예에서, 나노구조의 조성은 기판 물질과 상이하다.
Silmeco ApS(덴마크 코펜하겐), Horiba Scientific(피스카타웨이, 뉴저지), Ocean Optics(올랜도, 플로리다), Ato ID(빌뉴스, 리투아니아), Enhanced Spectrometry(산호세, 캘리포니아), 및 SERSitive(바르샤바, 폴란드)에서 구입할 수 있는 다양한 SERS 기판을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 다수의 시판 SERS 기판이 개시된 방법을 수행하는 데 사용될 수 있다. 대안적으로, 당업자는 물론, 맞춤형 SERS 기판을 대안적으로 사용할 수 있고, 이들은 나노구조화 재료뿐만 아니라 바이러스 입자 결합/배향을 촉진하기 위한 임의의 표면-결합 시약에 대해 맞춤화될 수 있음을 이해할 것이다.
본 개시의 방법은 바이러스 역가에 관한 정보가 필요한 샘플을 제공하는 단계, 및 샘플을 기판 또는 기판 상의 나노구조 상에 도입하는 단계, 샘플을 광원으로 조사하는 단계, 및 샘플 내의 바이러스 역가를 결정하는 데 사용될 샘플의 라만 스펙트럼을 획득하는 단계를 포함한다. 전술한 바와 같이 그리고 실시예에서 언급한 바와 같이, 샘플은 하나 이상의 희석물(10배, 100배 등과 같은 연속 희석물 포함), 또는 둘 다를 사용하여 희석되지 않은 형태로 평가될 것이다.
임의의 실시예에서, 샘플을 조사하기 위해 이용되는 광원은 좁은 대역폭 레이저이다. 적절한 파장은 제한 없이, 300-1200 nm, 350-1100 nm, 400-1100 nm, 400-1064 nm, 450-1064 nm, 500-1064 nm, 550-1064 nm, 600-1064 nm, 650-1064 nm, 700-1064 nm, 450-1100 nm, 또는 500-1100 nm의 파장을 포함한다. 일 실시예에서, 광원은 550-1064 nm의 파장을 갖는 좁은 대역폭 레이저이다. 일 실시예에서, 광원은 400-1064 nm의 파장을 갖는 좁은 대역폭 레이저이다.
임의의 실시예에서, 광원은 약 800 nm, 약 785 nm, 약 750 nm, 약 725 nm, 약 700 nm, 약 675 nm, 약 650 nm, 약 625 nm, 약 600 nm, 약 575 nm, 약 550 nm, 약 532 nm, 약 525 nm, 또는 약 500 nm의 파장을 갖는 좁은 대역폭 레이저이다. 바람직하게는, 광원은 약 785 nm, 약 640 nm(예를 들어, 638 nm), 또는 약 532 nm의 파장을 갖는 좁은 대역폭 레이저이다.
임의의 실시예에서, 본원에 기술된 방법에 따라 샘플로부터 라만 스펙트럼을 획득하는 단계는 약 100 ms, 150 ms, 200 ms, 250 ms, 300 ms, 350 ms, 400 ms, 450 ms, 500 ms, 550 ms, 600 ms, 650 ms, 700 ms, 750 ms, 800 ms, 850 ms, 900 ms, 950 ms, 1000 ms, 또는 >1000 ms의 노출 시간을 갖는 스펙트럼을 획득하는 단계를 포함한다. 임의의 실시예에서, 라만 스펙트럼은 약 250 ms의 노출 시간을 사용하여 획득된다.
라만 신호 강도는 샘플을 여기시키는데 사용되는 라만 레이저의 출력에 정비례한다. 사용되는 레이저 파워가 클수록 라만 신호가 커질 것이고, 사용되는 특정 레이저 파워는 특정 샘플에 대해 최적화될 수 있다. 그러나, 임의의 실시예에서, 바이러스를 함유하는 샘플의 스펙트럼은 약 1.9 mW, 약 1.8 mW, 약 1.7 mW, 약 1.6 mW, 약 1.50 mW, 약 1.4 mW, 약 1.3 mW, 약 1.2 mW, 약 1.1 mW, 약 1mW, 약 0.9 mW, 약 0.8 mW, 약 0.7 mW, 0.6 mW, 또는 0.5 약 mW의 전력을 갖는 라만 레이저를 사용하여 획득될 수 있다. 임의의 실시예에서, 스펙트럼은 약 1.50 mW의 전력을 갖는 라만 레이저로 획득된다. 임의의 실시예에서, 스펙트럼은 0.6 mW의 전력을 갖는 라만 레이저로 획득된다.
이어서, 광원으로 샘플을 조사하여 수득된 라만 스펙트럼을 분석하고, 라만 스펙트럼으로부터 바이러스 성분에 대한 점수를 추출한다. 특정 라만 스펙트럼, 특정 파장에 대해 수득된 피크는 바이러스 입자 특이적 아미노산(예를 들어, 캡시드 단백질 등에 존재함) 또는 핵산(예를 들어, 바이러스 입자에 의해 캡슐화된 RNA 또는 DNA)에 상응할 수 있거나, 비-바이러스성(예를 들어, 배양물 중의 대사산물)이지만 바이러스의 존재로부터 발생하는 분자/화합물에 상응할 수 있다. 이러한 방식으로, 라만 분광법은 샘플에서 바이러스의 존재를 직접 또는 간접적으로 검출하는 데 사용될 수 있으며, 이는 후속하여 점수를 매기고 샘플에서 바이러스 역가를 결정하는 데 사용되는 상응하는 모델에 적용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이, 본원에 기술된 방법에 따라 바이러스 역가를 결정하기에 적합한 모델은 바이러스 입자-특이적 교정 곡선을 포함한다. 따라서, 모델을 생성하는데 사용되는 바이러스 입자-특이적 성분은 실험 샘플(즉, 알려지지 않은 바이러스 역가를 함유하는 샘플)로부터 수득된 라만 스펙트럼으로부터 분석되고 점수를 매긴 바이러스 성분이다. 바이러스 입자 특이적 성분에 대한 점수를 라만 스펙트럼으로부터 추출하면, 바이러스 입자 특이적 역가를 정량화하기 위해 모델에 적용한다.
본 개시의 다른 측면은 샘플에서 바이러스 역가를 정량화하기에 적합한 모델을 생성하기 위한 방법에 관한 것이다. 이 방법은 2개 이상의 샘플을 제공하는 단계를 포함하며, 각각의 샘플은 공지된 바이러스 유형 및 상응하는 역가를 함유하고, 각각의 샘플을 라만 분광법으로 처리하여 각각의 공지된 바이러스 유형 및 역가에 대한 기준 스펙트럼을 생성하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 기준 스펙트럼으로부터 바이러스 유형-특이적 성분을 식별하는 단계, 및 공지된 바이러스 유형 및 공지된 역가의 각 샘플에 대해 상기 성분에 대한 점수를 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 방법은 결정된 점수에 기초하여 바이러스 역가를 정량화하기 위한 모델을 생성하는 단계를 추가로 포함한다.
샘플에서 바이러스 역가를 정량화하기에 적합한 모델을 생성하기 위해, 알려진 바이러스 유형 및 알려진 양의 상응하는 바이러스 역가를 함유하는 여러 샘플을 라만 분광법, 특히 SERS를 사용하여 분석한다. 일부 모델의 경우, 라만 분광법을 사용하여 2개 이상의 샘플을 분석한다. 다른 모델을 생성하기 위해, 3개 이상의 샘플, 4개 이상의 샘플, 5개 이상의 샘플, 6개 이상의 샘플, 7개 이상의 샘플, 8개 이상의 샘플, 9개 이상의 샘플, 10개 이상의 샘플, 15개 이상의 샘플, 또는 20개 이상의 샘플이 요구된다.
공지된 바이러스 유형 및 공지된 양의 상응하는 바이러스 역가를 함유하는 각 샘플에 대한 하나 이상의 라만 스펙트럼이 수집된다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 스펙트럼은 이들 샘플 각각에 대해 수집된다. 예를 들어, 이들 샘플 각각에 대해 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 10개 이상, 20개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 50개 이상, 60개 이상, 70개 이상, 80개 이상, 90개 이상, 100개 이상, 200개 이상, 300개 이상, 400개 이상, 또는 500개 이상의 스펙트럼이 수집된다.
본 개시의 이러한 측면에 따라, 샘플은 전술한. 바와 같이 라만 분광법을 거친다 임의의 실시예에서, 라만 분광법은 전술한 바와 같은 표면 강화 라만 분광법이며, 여기서 스펙트럼은 전술한 바와 같은 금속 기판(예를 들어, 금 또는 은) 및/또는 나노구조 상의 샘플로부터 수득된다.
임의의 실시예에서, 기준 스펙트럼을 얻기 위해 샘플을 조사하는 데 사용되는 광원은 좁은 대역폭 레이저이다. 적절한 파장은 제한 없이, 300-1200 nm, 350-1100 nm, 400-1100 nm, 400-1064 nm, 450-1064 nm, 500-1064 nm, 550-1064 nm, 600-1064 nm, 650-1064 nm, 700-1064 nm, 450-1100 nm, 또는 500-1100 nm의 파장을 포함한다. 일 실시예에서, 광원은 550-1064 nm의 파장을 갖는 좁은 대역폭 레이저이다. 일 실시예에서, 광원은 400-1064 nm의 파장을 갖는 좁은 대역폭 레이저이다.
임의의 실시예에서, 각각의 공지된 바이러스 유형 및 역가에 대한 기준 스펙트럼을 생성하기 위해 각각의 샘플을 라만 분광법으로 처리하는 단계는 약 250 ms의 노출 시간을 갖는 스펙트럼을 획득하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 스펙트럼은 약 1.9 mW, 약 1.8 mW, 약 1.7 mW, 약 1.6 mW, 약 1.5 mW, 약 1.4 mW, 약 1.3 mW, 약 1.2 mW, 약 1.1 mW, 약 1 mW, 약 0.9 mW, 약 0.8 mW, 약 0.7 mW, 약 0.6 mW, 약 0.5 mW, 약 0.4 mW, 약 0.3 mW, 약 0.2 mW, 또는 약 0.1 mW에서 획득된다.
임의의 실시예에서, 각각의 공지된 바이러스 유형 및 역가에 대한 기준 스펙트럼을 생성하기 위해 각각의 샘플을 라만 분광법으로 처리하는 단계는 약 100 ms, 150 ms, 200 ms, 250 ms, 300 ms, 350 ms, 400 ms, 450 ms, 500 ms, 550 ms, 600 ms, 650 ms, 700 ms, 750 ms, 800 ms, 850 ms, 900 ms, 950 ms, 1000 ms, 또는 >1000 ms의 노출 시간을 갖는 스펙트럼을 획득하는 단계를 포함한다. 임의의 실시예에서, 라만 스펙트럼은 약 250 ms의 노출 시간을 사용하여 획득된다.
임의의 실시예에서, 각각의 공지된 바이러스 유형 및 역가에 대한 기준 스펙트럼을 생성하기 위해 각각의 샘플을 라만 분광분석에 거치게 하는 단계는 약 1.9 mW, 약 1.8 mW, 약 1.7 mW, 약 1.6 mW, 약 1.50 mW, 약 1.4 mW, 약 1.3 mW, 약 1.2 mW, 약 1.1 mW, 약 1mW, 약 0.9 mW, 약 0.8 mW, 약 0.7 mW, 약 0.6 mW, 약 0.5 mW, 약 0.4 mW, 약 0.3 mW, 약 0.2 mW 또는 약 0.1 mW의 전력을 갖는 라만 레이저를 사용하여 스펙트럼을 획득하는 단계를 포함한다. 임의의 실시예에서, 스펙트럼은 약 1.50 mW 이하의 전력을 갖는 라만 레이저로 획득된다. 임의의 실시예에서, 스펙트럼은 0.6 mW 이하의 전력을 갖는 라만 레이저로 획득된다.
그런 다음, 공지된 바이러스 유형 및 공지된 양의 상응하는 바이러스 역가를 함유하는 샘플로부터 수집된 라만 스펙트럼을 분석하여 기준 스펙트럼으로부터 바이러스 유형 특이적 성분을 식별한다. 일부 실시예에서, 각각의 샘플에 대한 기준 스펙트럼은 상기 샘플의 2개 이상의 스펙트럼을 분석함으로써 생성된다. 대안적으로, 각각의 샘플에 대한 기준 스펙트럼은 상기 샘플의 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 10개 이상, 20개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 50개 이상, 60개 이상, 70개 이상, 80개 이상, 90개 이상, 100개 이상의 스펙트럼, 200개 이상, 300개 이상, 400개 이상, 또는 500개 이상의 스펙트럼을 분석함으로써 생성된다.
일부 실시예에서, 하나 이상의 배경 라만 스펙트럼이 수집된다. 이러한 배경 스펙트럼은 대조군 샘플, 즉, 조성물 중의 바이러스 샘플에 대응하지만 바이러스를 함유하지 않는 샘플로부터 수집될 수 있다. 예를 들어, 적합한 배경 스펙트럼은 조성물 중의 바이러스 함유 샘플과 일치하지만 바이러스가 없는 물, 배양 배지, 또는 다른 완충액의 샘플로부터 수득될 수 있다. 일부 실시예에서, 배경으로부터의 2개 이상의 스펙트럼은 배경 라만 스펙트럼을 생성하기 위해 평균화된다. 일부 실시예에서, 배경 스펙트럼은 바이러스 함유 샘플로부터의 스펙트럼이 분석되기 전에 기준 스펙트럼 각각으로부터 뺐다.
일부 실시예에서, 샘플로부터 수집된 스펙트럼은 분석되기 전에 절단된다. 바람직하게는, 스펙트럼은, 예를 들어, 300 cm-1 내지 2000 cm-1, 300 cm-1 내지 1900 cm-1, 300 cm-1 내지 1800 cm-1, 300 cm-1 내지 1700 cm-1, 300 cm-1 내지 1600 cm -1 , 300 cm-1 내지 1500 cm-1, 350 cm-1 내지 1700 cm-1, 350 cm-1 내지 1600 cm-1, 400 cm-1 내지 1700 cm-1, 400 cm-1 내지 1600 cm -1 , 450cm-1 내지 1700 cm-1, 450 cm-1 내지 1600 cm-1, 500 cm-1 내지 1700 cm-1, 500 cm-1 내지 1600 cm-1, 550 cm-1 내지 1700 cm-1, 550 cm-1 내지 1600 cm-1, 600 cm-1 내지 1700 cm-1, 또는 600 cm-1 내지 1600 cm-1의 스펙트럼 범위로 절단된다. 보다 바람직하게는, 스펙트럼은 500 cm-1 내지 1600 cm-1의 스펙트럼 범위로 절단된다.
기준 스펙트럼(즉, 공지된 바이러스 유형 및 공지된 역가의 샘플로부터의 스펙트럼)으로부터 바이러스 유형-특이적 성분을 식별하기 위해, 화학측정 분석을 사용하여 2개 이상의 샘플 각각으로부터 생성된 2개 이상의 기준 스펙트럼을 분석(분해)한다. 이러한 화학측정 분석을 사용하여, 기준 스펙트럼 간의 하나 이상의 변동 성분을 식별하고 각 성분에 대한 점수를 평가한다. 샘플로부터 생성된 기준 스펙트럼을 분석하는 데 사용될 수 있는 적절한 화학측정 분석은 당업계에 공지되어 있으며, 제한 없이 다음을 포함한다: 다변량 곡선 해상도, 주요 성분 분석, 차별 분석(예를 들어, 선형 구별 분석, 부분 최소 제곱 구별 분석), K 평균 군집 분석, 신경망 분석, 회귀 분석(예를 들어, 주요 성분 회귀 분석, 부분 최소 제곱 회귀 분석) 및 클래스 모델링 방법(예를 들어, 클래스 유사점의 소프트 독립 모델링)(예 참조, Biancolillo 및 Marini, "Chemometric Methods for Spectroscopy-Based Pharmaceutical Analysis", Front. Chem. 6:576 (2018), 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨). 이들 분석에 기초하여, 특정 바이러스 유형(즉, 바이러스 유형 특이적 성분)과 상관되는 하나 이상의 스펙트럼 성분이 식별되고 점수를 매긴다.
공지된 바이러스 유형 및 공지된 양의 상응하는 바이러스 역가를 함유하는 각 샘플에 대한 바이러스 유형-특이적 성분의 점수를 사용하여 시험 또는 실험 샘플에서 알려지지 않은 바이러스 역가의 바이러스 역가를 정량화하기에 적합한 모델을 제조한다. 임의의 실시예에서, 생성된 모델은 바이러스 유형-특이적 교정 곡선 또는 표준 곡선이다. 따라서, 다른 바이러스 입자 특이적 성분보다 하나의 바이러스 입자 특이적 성분을 선택하기 위한 기준은, 바이러스 입자가 상주하는 배지뿐만 아니라, 관심 대상과 관심 대상이 아닌 바이러스 입자 또는 빈 캡시드를 구별하는 성분의 능력에 따라 달라질 것이다. 또한, 관심 바이러스 입자, 빈 캡시드, 또는 유전 물질의 특성(즉, 이에 대한 특이성)인 특징에 대해 성분을 조사하여, 수득된 스펙트럼이 관심 바이러스 입자 또는 빈 캡시드의 기준 스펙트럼과 유사하게 보이거나, 예상되는 특징을 갖는지 확인하는 것이 중요하다.
샘플에서 바이러스 역가를 정량화하기에 적합한 모델을 개발하는데 이용되는 기준 스펙트럼은 바람직하게는 공지된 관심 바이러스 유형을 포함하는 2개 이상의 샘플로부터 생성된다. 일부 실시예에서, 2개 이상의 샘플은 2개 이상의 상이한 바이러스 유형, 예를 들어, 하나 이상의 유전자 요소(예를 들어, 유전자 삽입, 결실, 치환 또는 전위) 만큼 상이한 바이러스 유형을 포함한다. 예를 들어, 샘플에서 바이러스 역가를 정량화하기에 적합한 모델이 외인성 유전자 삽입을 포함하는 렌티바이러스를 식별하는 데 적합한 경우, 모델을 개발하는데 사용되는 기준 스펙트럼은 관심 변형된 렌티바이러스의 공지된 양을 포함하는 샘플, 및 선택적으로 야생형 렌티바이러스의 공지된 양을 포함하는 샘플로부터 수집된다. 이는 야생형 렌티바이러스와 비교하여 변형된 렌티바이러스에 특이적인 스펙트럼 성분의 식별, 및 샘플에서 변형된 렌티바이러스의 역가를 결정하기 위한 특이적인 교정 곡선의 생성을 가능하게 한다.
전술한 바와 같이, 샘플에서 바이러스 역가를 정량화하기에 적합한 모델을 생성하는 방법은 임의의 바이러스 유형의 공지된 유형 및 양을 포함하는 샘플을 사용하여 수행된다. 예를 들어, 적합한 샘플은, 제한 없이, 레트로바이러스 입자, 레트로바이러스-유사 입자, 아데노바이러스 입자, 아데노바이러스-유사 입자, 아데노-연관 바이러스 입자, 아데노-연관 바이러스-유사 입자, 단순 포진 바이러스 입자, 및 단순 포진 바이러스-유사 입자를 함유하는 샘플을 포함한다. 일부 실시예에서, 바이러스는 렌티바이러스 입자와 같은 레트로바이러스 입자이다.
예
하기 예는 본 개시의 실시예의 실시를 예시하기 위한 것이지만, 그 범위를 제한하기 위한 것은 아니다.
예 1 및 2를 위한 재료 및 방법
재료 및 시약: 금 및 은 SERS 기판을 Silmeco(SERStrate)로부터 구입하였다. 초순수(18.2 MΩ cm)를 Milli-Q 시스템으로부터 수득하였다. 75.9 μm i.d. 및 150.0 μm o.d.를 갖는 용융 실리카 모세관을 Polymicro Technologies로부터 구입하였다. 염산, LV-MAX 생산 배지, 소태아 혈청(FBS), 인산염 완충 식염수(PBS), 이글 최소 필수 배지(EMEM), 및 녹색 형광 단백질(GFP)이 있고 GFP 미함유 인간 비표적화 LentiArray CRISPR 음성 대조군 렌티바이러스를 ThermoFisher Scientific으로부터 구입하였다. 인간 HT-1080 섬유육종 세포(ATCC CCL-121)를 American Type Culture Collection(ATCC)으로부터 수득하였다. 폴리브렌 및 이소프로판올을 Sigma Aldrich로부터 구입하였다. 오렌지 터프 수지는 Prusa Research로부터 구입하였다.
샘플 제조: 모든 바이러스 용액을 LV-MAX 생산 배지에서 제조하였다. SERS 교정을 위해, 용액은 각각 500 TU/mL 내지 50,000 TU/mL 범위의 농도를 갖는 GFP 함유 및 GFP 미함유 인간 비표적화 LentiArray CRISPR 음성 대조군 렌티바이러스로 제조하였다.
3D 인쇄: 금 기판과 함께 사용하기 위해 Original Prusa SL1을 사용하여 3D 인쇄된 SERS 기판 홀더를 제조하였다. 은 기판의 경우, 3D 인쇄된 유동 셀을 개발하고 사용하였다. CAD 디자인은 Autodesk Fusion 360에서 생성한 다음 PrusaSlicer 소프트웨어를 사용하여 슬라이스했다. 오렌지 터프 수지를 모든 인쇄된 물체에 사용하였다. 그런 다음, 물체를 이소프로판올에서 10분 동안 세척하고, 2분 동안 건조시키고, Original Prusa CW1 경화 및 세척기에서 2분 동안 경화시켰다. 그런 다음, 물체를 Milli-Q 물로 헹구었다.
SERS 유동 세포 제조: 은 및 금 기판을 핫플레이트 상에서 175°C로 10분 동안 가열하였다. 금 Silmeco 기판을 용융 실리카 모세관이 상부에 부착된 3D 인쇄된 SERS 기판 홀더 내에 배치하였다. 그런 다음, 이러한 기판 홀더를 유리 슬라이드 대신에 이전에 기술된 외피 유동 SERS 세포 내에 배치하였다(Negri 등, "Ultrasensitive Surface-Enhanced Raman Scattering Flow Detector Using Hydrodynamic Focusing," Analytical Chemistry 85(21):10159-10166 (2003), 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨). 은 Silmeco 기판을 3D 인쇄된 유동 셀 내에 배치한 다음, 투명한 Gorilla 접착제를 사용하여 접착하였다. 라만 검출 전에, 0.1 M HCl을 은 기판 위로 흘려 표면 상에 남아 있는 임의의 오염물을 씻어냈다. 라만 측정 전에, 물을 유동 셀을 통해 통과시켜 은 및 금 표면 모두를 헹구었다.
라만 측정: 라만 분광법은 자작 기기를 사용하여 수행하였다. 785 nm 또는 532 nm 레이저(Oxxius)를 40x 수침 대물렌즈(NA=0.8)를 사용하여 SERS 기판 상에 집속시켰다. 라만 산란을 동일한 대물렌즈를 통해 수집하고, ProEM: 16002 eXcelon 3 CCD 검출기(Princeton Instruments)가 구비된 Isoplane SCT-320 스펙트로그래프로 유도하였다. 샘플에서 250 ms 및 1.50 mW(785 nm) 또는 0.60 mW(532 nm)의 레이저 파워의 노출 시간으로 스펙트럼을 획득하였다. 획득 당 240개의 스펙트럼을 직렬로 획득하였다. 바이러스 샘플을 융합된 실리카 모세관을 통해 금 기판을 사용하는 실험을 위해 수성 외피 액(water sheath fluid)과 함께 주입하였다. SERS 스펙트럼 획득 전 및 도중에, 외피 및 샘플 유동을 정지시켰다. 스펙트럼 획득 후, 외피 유동을 재개하고, 샘플 유동을 물로 전환하여 다음 샘플을 주입하기 전에 표면을 세정하였다.
데이터 분석: 모든 스펙트럼은 Matlab R2018b(Mathworks)를 사용하여 처리하였다. 다변량 곡선 해상도(MCR)는 Matlab의 PLS Toolbox(Eigenvector Research Inc.)를 사용하여 수행하였다. MCR 분석 전에, SERS 기판 상의 물의 배경 스펙트럼을 각각의 렌티바이러스 스펙트럼으로부터 뺀 다음 스펙트럼을 500 cm-1 내지 1600 cm-1의 스펙트럼 범위로 절단하였다. 성분 2에 대한 평균 점수를 농도에 대해 도표화하여 교정 곡선을 생성하였다.
렌티바이러스 형질도입: HT-1080 세포를 10% FBS가 보충된 EMEM에서 배양하였다. 10,000개의 세포를 96-웰 플레이트에서 웰 당 100μL 배양 배지에 시딩하고, 5% CO2의 가습된 분위기 및 37°C의 온도에서 밤새 인큐베이션하였다. GFP 함유 인간 비표적화 LentiArray™ CRISPR 음성 대조군 렌티바이러스를 형질도입 전 1시간 동안 얼음 위에서 해동하였다. 형질도입 배지는 FBS가 보충된 EMEM에 폴리브렌을 첨가하여 8 μg/mL의 최종 농도로 제조하였다. 바이러스 용액을 형질도입 배지 내로 순차적으로 희석함으로써 4-로그 연속 희석물을 3회 제조하였다. 배지를 세포로부터 제거하고, 100μL의 각 희석물을 웰에 첨가하였다. 플레이트를 5분 동안 볼텍싱하여 바이러스를 분포시켰다. 그런 다음, 세포를 24시간 동안 인큐베이션하였다. 다음으로, 렌티바이러스 형질도입 배지를 10% FBS가 보충된 EMEM으로 교체한 다음, 세포를 24시간 동안 추가로 인큐베이션하였다. 그런 다음, 배지를 세포로부터 제거하고 이미징 전에 PBS로 교체하였다.
형광 이미징: 세포를 GFP 필터 큐브 및 여기용 청색 LED(Thorlabs)를 사용하여 직립 Olympus 현미경으로 영상화하였다. 명시야 및 형광 이미지의 데이터 분석은 ImageJ를 사용하여 수행하였고, 세포 계수 플러그인을 사용하여 세포를 계수하였다. 그런 다음, 아래의 식 1을 사용하여 렌티바이러스 역가를 계산하였다.
(식 1)
예 1: 금 SERS 기판을 사용한 렌티바이러스 입자 검출 및 구별
실험 설계는 도 1에 도시하였다. GFP 유전자를 암호화하거나 암호화하지 않은 렌티바이러스 입자로부터의 SERS 스펙트럼을 LV-MAX 바이러스 생산 배지에서 획득하였다. 각각의 바이러스 유형을 배지에 SERS 기판 상에 주입하고 유동 없이 측정하였다. 배지에서 측정함으로써, 최소 샘플 전처리가 필요하다. 또한, 수성 환경은 여기된 나노구조로부터의 열 소산을 개선하는데, 이는 샘플 또는 기판에 대한 열 손상 없이 개선된 신호 생성을 가능하게 하는 것으로 나타났다(Zeng 등, "Photothermal Microscopy of Coupled Nanostructures and the Impact of Nanoscale Heating in Surface Enhanced Raman Spectroscopy," J. Phys. Chem. C 121(21):11623-11631 (2017), 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨).
입자의 SERS 측정으로부터 생성된 스펙트럼을 사용하여 GFP 유전자를 함유하는 입자의 수를 나타내는 다변량 곡선 해상도(MCR) 모델을 생성하였다. SERS 획득 전에, 유동 세포를 물로 헹구어 표면 및 모세관을 세정한 다음, 바이러스 샘플을 모세관을 통해 주입하고, 외피 및 샘플 유동, 둘 모두를 정지시켰다. SERS 획득 후, 기판의 표면을 물을 사용하여 세정하였다. 각 농도를 분석하기 전에 기판 상의 물 스펙트럼을 수득한 다음, 기판의 배경 신호를 설명하기 위해 분석 전에 SERS 스펙트럼에서 뺐다.
렌티바이러스 샘플을 금 기판을 갖는 외피 유동 SERS 세포 내로 주입함으로써 수득된 바이러스 입자의 SERS 스펙트럼이 도 2a-2b에 도시되었다. 도 2a는 분석된 최고 농도에서 GFP 유전자 함유 및 미함유 바이러스로부터 얻은 평균 SERS 스펙트럼을 비교한다. 바이러스 입자의 각 유형에 대한 스펙트럼은 아미노산 및 핵산과 연관된 라만 대역을 보여준다. 2가지 유형의 입자 사이에서 공유되는 공통 피크는 RNA에서의 인산염 골격 신장과 연관된 813 cm-1 (Shanmukh 등, "Rapid and Sensitive Detection of Respiratory Virus Molecular Signatures Using a Silver Nanorod Array SERS Substrate" Nano Letters 6(11):2630-2636 (2006), 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨), 티로신에 할당된 851 cm-1(Shanmukh 등, "Rapid and Sensitive Detection of Respiratory Virus Molecular Signatures Using a Silver Nanorod Array SERS Substrate" Nano Letters 6(11):2630-2636 (2006), 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨), 페닐알라닌에 할당된 1007 cm-1(Ashton 등, "pH-Induced Conformational Transitions in α-Lactalbumin Investigated with Two-Dimensional Raman Correlation Variance Plots and Moving Windows" Journal of Molecular Structure 974(1-3):132-138 (2010), 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨), 사이토신에 할당된 1046 cm-1(Shanmukh 등, "Rapid and Sensitive Detection of Respiratory Virus Molecular Signatures Using a Silver Nanorod Array SERS Substrate" Nano Letters 6(11):2630-2636 (2006); Negri 등, "Detection of Genetic Markers Related to High Pathogenicity in Influenza by SERS," The Analyst 138(17):4877-4884 (2013), 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨), 아미드 III 스트레치에서 발생하는 1242 cm-1을 포함하는 (Ashton 등, "pH-Induced Conformational Transitions in α-Lactalbumin Investigated with Two-Dimensional Raman Correlation Variance Plots and Moving Windows" Journal of Molecular Structure 974(1-3):132-138 (2010), 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨), 및 글루타메이트 및 아스파르테이트의 CH2 시서링(scissoring)과 연관된 1475 cm-1(Negri 등, "Online SERS Detection of the 20 Proteinogenic l-Amino Acids Separated by Capillary Zone Electrophoresis," The Analyst 139(22):5989-5998 (2014), 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨)의 대역을 포함한다. 두 개의 상이한 바이러스 입자의 유사한 구조에도 불구하고, 도 2a는 또한 SERS 신호에 차이가 있음을 보여준다. 스펙트럼에서 주목할 만한 차이는 인산염 골격 (Shanmukh 등, "Rapid and Sensitive Detection of Respiratory Virus Molecular Signatures Using a Silver Nanorod Array SERS Substrate" Nano Letters 6(11):2630-2636 (2006), 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨) 및 아데닌(Suh 등, "Surface-Enhanced Raman Spectroscopy of Amino Acids and Nucleotide Bases Adsorbed on Silver" J. Am. Chem. Soc. 108(16):4711-4718 (1986), 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨)으로부터 발생하는 812 및 921 cm-1에서의 강한 피크를 포함한다. 이들 추가 대역은 GFP 미함유 입자와 비교하여 이들 입자에서의 추가 RNA로 인해 발생할 수 있다. 또한, 1164 cm-1에서 숄더를 갖는 1141 cm-1에서의 강한 대역이 페닐알라닌 및 트립토판으로부터 각각 발생하는 GFP 함유입자의 스펙트럼에서 관찰된다(Negri 등, "Online SERS Detection of the 20 Proteinogenic l-Amino Acids Separateed by Capillary Zone Electrophoresis," The Analyst 139(22):5989-5998 (2014), 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨). 또한, 아르기닌, 히스티딘, 및 페닐알라닌/티로신으로부터 각각 발생하는 1280, 1410, 및 1567 cm-1에서의 대역은 GFP를 함유하는 입자의 스펙트럼에서 강력하게 보인다(Negri 등, "Online SERS Detection of the 20 Proteinogenic l-Amino Acids Separated by Capillary Zone Electrophoresis," The Analyst 139(22):5989-5998 (2014), 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨). 이들 차이는 SERS가 50,000 TU/mL의 농도로 바이러스 입자 내에서 유전 물질의 변형을 검출할 수 있음을 보여준다.
다양한 농도의 GFP 함유 바이러스 입자의 스펙트럼을 그 주위에 음영 처리된 표준 편차와 함께 도 2b에 도시하였다. 바이러스 입자 구조의 복잡성으로 인해, 동일한 입자 유형에 대해 수득된 평균 신호에 변화가 있다. 1164 및 1259 cm-1에서의 피크, 트립토판(Negri 등, "Online SERS Detection of the 20 Proteinogenic l-Amino Acids Separated by Capillary Zone Electrophoresis," The Analyst 139(22):5989-5998 (2014), 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨) 및 아미드 III 스트레치(Ashton 등, "pH-Induced Conformational Transitions in α-Lactalbumin Investigated with Two-Dimensional Raman Correlation Variance Plots and Moving Windows" Journal of Molecular Structure 974(1-3):132-138 (2010), 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨), 4가지 농도 모두에서 검출되었다. 813 cm-1(인산염 골격)에서의 피크(Shanmukh 등, "Rapid and Sensitive Detection of Respiratory Virus Molecular Signatures Using a Silver Nanorod Array SERS Substrate" Nano Letters 6(11):2630-2636 (2006), 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨), 923 cm-1 (아데닌) (Suh 등, "Surface-Enhanced Raman Spectroscopy of Amino Acids and Nucleotide Bases Adsorbed on Silver" J. Am. Chem. Soc. 108(16):4711-4718 (1986), 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨), 1095 cm-1 (인산염 골격) (Negri 등, "Detection of Genetic Markers Related to High Pathogenicity in Influenza by SERS," The Analyst 138(17):4877-4884 (2013), 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨), 1475 cm-1 (글루타메이트/아스파르테이트) (Negri 등, "Online SERS Detection of the 20 Proteinogenic l-Amino Acids Separated by Capillary Zone Electrophoresis," The Analyst 139(22):5989-5998 (2014), 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨), 및 1575 cm-1(트립토판)(Shanmukh 등, "Rapid and Sensitive Detection of Respiratory Virus Molecular Signatures Using a Silver Nanorod Array SERS Substrate" Nano Letters 6(11):2630-2636 (2006), 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨)은 최고 농도에서 강도의 가장 큰 증가를 나타냈다. 평균으로 일관되게 보이는 피크는 바이러스 입자의 표면 또는 캡시드에서 발견되는 단백질로부터 발생할 가능성이 있다. 반면, 강도 증가를 나타내는 피크의 대부분은 캡시드 내의 유전 물질의 핵산 및 인산염 골격으로부터 발생한다. 바이러스 입자는 유전 물질을 함유하는 캡시드를 둘러싸는 표면 상에 단백질 및 지질을 함유한다. 예상대로, 캡시드 내의 분자보다 바이러스 표면 상의 분자로부터 발생하는 더 많은 모드가 관찰되었다. 이는 바이러스의 표면이 SERS 기판과 직접 상호작용하기 때문이다. 그러나, 방향족 핵산은 SERS에 의해 검출될 기판에 충분히 가까울 것으로 예상된다. 상이한 농도의 바이러스 입자에 대한 평균 신호의 차이는 SERS 활성 표면 상의 입자의 상이한 배향, 또는 핫스팟에 있는 바이러스의 상이한 분자 성분으로부터 발생할 수 있으며, 이는 관찰된 진동 모드의 상이한 향상을 유도한다. 분석된 바이러스 입자는 구형 내지 장방형으로 직경이 80 내지 100 nm였고, SERS 기판 상의 핫스팟과 연관된 대략 1 nm3 부피보다 크기가 훨씬 더 컸으며, 따라서 바이러스 입자의 일부분만이 주어진 핫스팟에 있을 것이다. 각 농도에 대한 평균 스펙트럼은 관찰된 밴드의 차이를 보여주며, 농도 의존성을 결정하기 위한 단변량 분석의 사용을 복잡하게 한다. GFP 미함유 렌티바이러스 입자의 각 농도에 대한 평균 SERS 스펙트럼은 도 3에 도시되어 있고 유사한 경향을 보여준다.
렌티바이러스 입자를 희석하고 LV-MAX 생산 배지에 보관하였다. 순수 LV-MAX 배지를 유동 셀 내에 주입하였고, 획득된 스펙트럼은 도 4에 도시하였다. 배지는 653 cm-1 및 1030 cm-1에서 피크를 나타내므로, 렌티바이러스 입자에 대해 수득된 신호는 배지가 아닌 바이러스 입자 자체로부터 발생한다.
바이러스 역가를 결정하기 위해, 다변량 곡선 해상도(MCR)를 수행하여 GFP 벡터와 상관되는 성분을 추출하였다. 도 5a-5d는 500 TU/mL, 5,000 TU/mL, 및 50,000 TU/mL의 농도로 GFP 함유 렌티바이러스 입자로부터 얻은 스펙트럼을 사용하여 개발된 3가지 성분 모델을 보여준다. 이 모델은 데이터 분산의 95.47%를 포착하였다. 10,000 TU/mL GFP 입자 스펙트럼을 사용하여 이 모델을 검증하였다. 모델은 성분 2 상의 점수와 GFP 함유 렌티바이러스의 농도 사이의 선형 관계를 보여준다(도 5b). 그런 다음, 각 농도에 대한 성분 2의 평균 점수를 바이러스 역가에 대해 도표화하여 바이러스 역가를 결정하기 위한 교정을 생성하였다(도 5c 참조). 이 곡선 상의 오차 막대는 측정의 표준 편차를 나타낸다.
성분 2에 대한 로딩은 분석된 최고 농도에서 GFP 벡터를 함유하는 렌티바이러스 입자의 스펙트럼과 유사한 스펙트럼을 나타낸다(도 6 참조). 성분 2에서 관찰된 SERS 밴드에 대한 피크 할당은 표 1에 나타나 있다. 이러한 성분 스펙트럼이 GFP 함유 입자로부터 발생하는 것을 추가로 확인하기 위해, 50,000 TU/mL의 농도로 GFP 미함유 입자의 스펙트럼을 모델로 시험하였다. 이들 스펙트럼 점수는 동일한 농도에서 GFP 함유 입자의 스펙트럼 점수보다 성분 2에서 더 낮으며, 그 차이는 통계적으로 유의하다. 이는 이 성분이 GFP 벡터와 연관되어 있음을 추가로 시사한다. 도 4에 도시된 LV-MAX 배지의 스펙트럼을 또한 모델로 시험하였고, 성분 2에 대한 이들 스펙트럼에 대한 점수는 두 유형의 렌티바이러스 입자보다 훨씬 낮다. 도 5d에 도시된 막대 그래프는 이들 샘플 각각에 대한 점수를 비교하고, SERS가 삽입된 유전자가 있는 것과 없는 바이러스 입자를 구별할 수 있음을 나타낸다. GFP 함유 입자의 점수는 성분 2에서 평균 2500을 가지며, 이는 5,000 및 10,000 TU/mL의 농도에서 GFP 함유 입자에 대한 점수와 유사하다. 이는 정량화를 방해할 수 있는 GFP 유전자가 없는 입자로부터의 높은 수준의 산란으로 인한 것이다. 그러나 일반적으로 사용되는 바이러스 역가는 105 TU/mL 이상이고, 이는 본 연구에 도시된 역가보다 크다(Pivert 등, "A First Experience of Transduction for Differentiated HepaRG Cells using Lentiviral Technology" Scientific Reports 9(1):12910 (2019); Lim 등, "Identification of Newly Emerging Influenza Viruses by Surface-Enhanced Raman Spectroscopy," Analytical Chemistry87(23):11652-11659 (2015); Bagnall 등, "Quantitative Dynamic Imaging of Immune Cell Signalling Using Lentiviral Gene Transfer," Integrative Biology 7(6):713-725 (2015); Guerreiro 등, "Detection and Quantification of Label-Free Infectious Adenovirus Using a Switch-On Cell-Based Fluorescent Biosensor", ACS Sensors 4(6):1654-1661 (2019), 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨).
| SERS 밴드 (cm -1 ) | 피크 할당 |
| 649 | 구아닌 |
| 681 | 아데닌 |
| 812 | 인산염 골격 |
| 851 | 티로신 |
| 921 | 아데닌 |
| 985 | 알라닌 |
| 1006 | 페닐알라닌 |
| 1046 | 사이토신 |
| 1095 | 인산염 골격 |
| 1141 | 페닐알라닌 |
| 1195 | 사이토신 |
| 1241 | 아미드 III |
| 1259 | 아미드 III |
| 1280 | 아르기닌 |
| 1338 | 아데닌 |
| 1354 | 트립토판 |
| 1410 | 히스티딘 |
| 1476 | 글루탐산염/아스파르테이트 |
| 1540 | 아데닌 |
| 1567 | 페닐알라닌/티로신 |
형광 이미징을 사용하여 SERS에 의해 결정된 바이러스 역가를 검증하였다. HT-1080 섬유육종 세포를 GFP를 암호화하는 렌티바이러스로 형질도입하였다. 형광인 세포의 분획 및 형질도입에 사용된 렌티바이러스 입자의 양의 로그를 사용하여 투여량-반응 곡선(도 7)을 생성하였다. 이들 결과는 SERS 실험에 사용된 바이러스 역가를 확인한다. 또한, 이들 이미지는 사용된 렌티바이러스가 104 TU/mL 초과 농도에서 매우 감염성이며, 이는 두 입자 유형을 구별하기 위해 SERS를 사용한 농도와 유사함을 보여준다.
예 2: 은 SERS 기판을 사용하여 렌티바이러스 입자를 검출하고 구별
렌티바이러스 입자를 검출하고 구별하는 SERS 방법은 또한 은 SERS 기판 및 532 nm 여기법을 사용하여 수행하였다. 이전에 연구된 것과 동일한 렌티바이러스를 사용하여, 50,000 TU/mL의 농도로 각 유형의 입자에 대한 기준 스펙트럼을 수집하였다. GFP 유전자가 있거나 없는 렌티바이러스 입자의 수집된 원시 스펙트럼은 도 8a에 도시하였다. 각 입자에 대해 수집된 모든 스펙트럼, 각 유형에 대해 총 740개의 스펙트럼을 사용하여 3성분 MCR 모델을 구축하였다. 이 모델에 대한 로딩 스펙트럼은 도 8b에 도시하였고, 각 구성요소에 대한 점수는 도 8c에 도시하였다. 이 모델에서, 성분 1, 2, 및 3은 각각 데이터의 총 분산의 53.67%, 44.74%, 및 1.29%를 차지하였다. 성분 3에서 높은 점수를 받는 유일한 스펙트럼은 GFP 함유 렌티바이러스 입자로부터의 스펙트럼이다. 이들 스펙트럼은 GFP 미함유 렌티바이러스 입자의 스펙트럼으로부터 분리될 수 있기 때문에, 이 성분은 GFP 벡터와 연관될 수 있다. 대부분의 스펙트럼은 성분 1 및 2에 대해 유사한 점수를 가지므로, 삽입된 유전자의 검출은 렌티바이러스 자체로부터의 배경 신호에 의해 복잡해질 수 있음을 나타낸다. 바이러스 입자의 크고 복잡한 분자 구조는 많은 광을 산란시키고 복잡한 SERS 신호를 생성할 수 있다. 따라서, 이들 신호는 삽입된 유전자를 보여주고 이 유전자의 검출 및 정량화를 더욱 어렵게 하는 스펙트럼을 복잡하게 할 수 있다. 두 렌티바이러스에 대한 스펙트럼의 대부분은 성분 1 및 2에 대해 유사한 점수를 갖지만, 성분 3은 삽입된 유전자를 검출하는 데 사용될 수 있다.
은 및 금 기판 상의 GFP 유전자와 연관된 성분 스펙트럼은 도 8d에 도시되었다. 이들 성분 스펙트럼은 많은 스펙트럼 차이를 나타내며, 동일한 주파수를 갖지만 강도가 상이한 3개의 피크만을 공유한다. 피크는 아미드 III 스트레치(Ashton 등, "pH-Induced Conformational Transitions in α-Lactalbumin Investigated with Two-Dimensional Raman Correlation Variance Plots and Moving Windows" Journal of Molecular Structure 974(1-3):132-138 (2010), 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨), 아르기닌 (Negri 등, "Online SERS Detection of the 20 Proteinogenic l-Amino Acids Separated by Capillary Zone Electrophoresis," The Analyst 139(22):5989-5998 (2014), 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨), 및 트립토판(Ashton 등, "pH-Induced Conformational Transitions in α-Lactalbumin Investigated with Two-Dimensional Raman Correlation Variance Plots and Moving Windows" Journal of Molecular Structure 974(1-3):132-138 (2010), 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨)에 상응하는 1260, 1281, 및 1354 cm-1이다. 피크 할당의 전체 목록은 표 1 및 표 2에 나타나 있다. 은 기판 상의 스펙트럼은 금 기판에 비해 아미노산보다 핵산과 연관된 더 많은 밴드을 나타낸다.
| SERS 밴드 (cm -1 ) | 피크 할당 |
| 623 | 구아닌 |
| 632 | 티로신 |
| 687 | 아데닌 |
| 709 | 사이토신 |
| 777 | 사이토신/우라실 |
| 794 | 사이토신 |
| 830 | 티로신 |
| 862 | 티로신 |
| 907 | 우라실 |
| 1012 | 트립토판 |
| 1077 | 트레오닌 |
| 1128 | 아데닌 |
| 1155 | 구아닌 |
| 1178 | 리보오스 인산염 |
| 1217 | 우라실 |
| 1260 | 아미드 III |
| 1281 | 아르기닌 |
| 1298 | 우라실 |
| 1354 | 트립토판 |
| 1427 | 사이토신 |
| 1447 | 단백질의 CH2 변형 |
예 1및 2 논의:
결과는 SERS가 GFP 유전자의 삽입에 의해서만 상이한 단일 유형의 바이러스 입자를 검출하고 정량화할 수 있음을 보여준다. 이들 결과는 기존의 기술보다 적은 샘플 제조로 특정 유전자를 암호화하도록 성공적으로 형질전환된 바이러스 입자를 정량화하는 상당히 더 신속한 방법을 제공한다. 이들 입자의 정량화는 SERS 활성 기판의 표면 상의 핫스팟과 상호작용하는 바이러스 입자에 의존한다. 관찰된 스펙트럼은 핫스팟과 상호작용하는 바이러스의 배향 및 특정 부분에 의존하기 때문에, 단일 피크를 사용하여 정량화를 달성하기 어려울 수 있다. MCR은 SERS 스펙트럼을 성분으로 분해함으로써 이들 복합 신호의 정량화에 유용한 것으로 나타나, 점수는 존재하는 바이러스의 양을 결정하는 데 사용될 수 있다. 또한, 신호의 균일성을 개선하기 위해 바이러스의 특정 배향을 강제하기 위해 기판 표면을 기능화하는 것을 탐색할 수 있다.
GFP 유전자를 함유하는 입자와 연관된 신호는 SERS 기판에 사용된 여기 파장 및 금속에 따라 상이하다. 532 nm 여기 레이저 및 은 기판을 사용할 때, 785 nm 여기 및 금 기판을 사용하는 스펙트럼에 비해 더 많은 피크가 핵산과 연관된다. 바이러스 입자에 대한 SERS의 이전 연구는 785nm 여기의 은 기판을 사용하여 핵산 및 아미노산 둘 모두가 검출될 수 있음을 보여준다(Shanmukh 등, "Rapid and Sensitive Detection of Respiratory Virus Molecular Signatures Using a Silver Nanorod Array SERS Substrate," Nano Letters 6(11):2630-2636 (2006), 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨). 그러나, 785 nm 여기의 금 기판을 사용하는 연구는 대부분의 SERS 신호가 바이러스 외피의 아미노산 및 지질 성분으로부터 발생함을 보여준다(Lim 등, "Identification of Newly Emerging Influenza Viruses by Surface-Enhanced Raman Spectroscopy," Analytical Chemistry 87(23):11652-11659 (2015), 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨). 은 기판 상의 GFP 함유 바이러스의 성분 스펙트럼은 금 기판 상의 것들보다 더 많은 핵산 신호를 나타낸다. 그러나, 핵산 및 아미노산 신호는 두 유형의 기판 모두에서 관찰된다.
금속과 분석물 사이의 상호작용은 또한 분자가 표면에 흡착되는 방법에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 따라서 관찰된 SERS 신호에 영향을 미칠 것이다. 이는 표면 상의 분석물의 바람직한 배향으로 인한 것일 수 있으며, 이는 표면에 가장 가까운 밴드가 기판으로부터 더 멀리 있는 밴드보다 더 향상되게 할 것이다. 적혈구의 SERS 스펙트럼은 금 대신에 은 나노입자가 사용될 때 상이한 것으로 보이며, 이는 분석물과 각 금속 간의 상이한 상호작용에 의해 설명된다(Drescher 등, "SERS Reveals the Specific Interaction of Silver and Gold Nanoparticles with Hemoglobin and Red Blood Cell Components," Physical Chemistry Chemical Physics 15:5364-5373 (2013), 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨). 유사한 효과가 은 및 금 기판 상에 GFP를 함유하는 바이러스 입자의 상이한 신호의 원인일 가능성이 있다.
SERS는 현재의 방법보다 적은 샘플 제조로 바이러스 역가를 결정하는 보다 신속한 접근법을 제공한다. SERS는 바이러스 유형과 균주를 구별하고(Shanmukh 등, "Rapid and Sensitive Detection of Respiratory Virus Molecular Signatures Using a Silver Nanorod Array SERS Substrate," Nano Letters 6(11):2630-2636 (2006); Lim 등, "Identification of Newly Emerging Influenza Viruses by Surface-Enhanced Raman Spectroscopy," Analytical Chemistry 87(23):11652-11659 (2015), 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨) 바이러스 돌연변이를 검출하기 위한 DNA 헤어핀을 사용하는 (Dardir 등, "SERS Nanoprobe for Intracellular Monitoring of Viral Mutations," The Journal of Physical Chemistry C 124(5):3211-3217 (2020), 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨)것으로 이미 나타났다. 직접 SERS 측정을 사용하여 바이러스 역가를 결정하기 위한 본 출원에 기술된 방법은 다른 바이러스 유형에 적용될 수 있다. 이는 또한 바이러스 게놈에 대한 변형을 정량화하는 데 사용될 수 있다.
결론
이전 예에서 입증된 바와 같이, 바이러스 역가는 SERS 기판에 대한 변형 없이 결정될 수 있으므로, 시판 SERS 기판을 사용하는 신속하고 간단한 방법을 제공한다. 바이러스 입자 구조의 복잡성으로 인해, 화학측정 분석, 예를 들어, MCR은 바이러스-특이적 성분이 결정되고 정량화에 사용될 수 있도록 스펙트럼을 분해하는 데 유용하다. 선행하는 예에 사용된 바이러스 역가는 생물의학 응용에 일반적으로 사용되는 것보다 한 자리수 이상 낮다. 이들 입자를 분석하기 위한 상이한 금속 및 여기 파장의 사용도 연구하였으며, 532 nm 여기의 은 기판이 785 nm 여기의 금 기판보다 더 많은 핵산 특징을 갖는 스펙트럼을 생성하였음을 보여주었다. SERS는 최소한의 샘플 제조로 바이러스 역가를 결정하는 신속한 방법을 제공하며, 이들 결과는 이 방법이 다양한 유형의 바이러스에 적용될 수 있음을 확인한다.
예 3: 전체 및 빈 렌티바이러스 캡시드 사이의 검출 및 구별
SERS 스펙트럼은 전체 또는 빈 렌티바이러스 캡시드를 함유하는 렌티바이러스의 분석을 위해 금 SERS 기판과 함께 785 nm 여기를 이용하여 수득하였다. 시판 렌티바이러스(LentiArray CRISPR 음성 대조군 렌티바이러스, 녹색 형광 단백질(GFP)이 있고 GFP 미함유 인간 비표적화)를 ThermoFisher Scientific으로부터 구매하였고, 완전한 렌티바이러스 측정을 위해 Silmeco로부터 금 SERS 기판을 구매하였다. 빈 캡시드 렌티바이러스를 SignaGen으로부터 구매하였다. 열 증착 금 기판을 전술한 절차를 사용하여 생산하고 빈 캡시드 실험에 사용하였다(Asiala 등, "Characterization of Hotspots in a Highly Enhancing SERS Substrate," Analyst 136(21):4472-4479 (2011), 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨). 자작 라만 기기를 사용하여 40x 수침 대물렌즈(NA=0.8)를 통해 레이저를 SERS 기판 상에 집속함으로써 라만 분광법을 수행하였다. 라만 산란은 ProEM: 16002 eXcelon 3 CCD 검출기(Princeton Instruments)가 구비된 Isoplane SCT-320 스펙트로그래프로 유도되었다. 바이러스 용액을 SERS 기판 상에 주입하고, 스펙트럼을 250 ms의 노출 시간 및 전체 렌티바이러스에 대해 1.50 mW의 레이저 파워 및 빈 렌티바이러스에 대해 0.50 mW의 레이저 파워로 500 ms의 노출 시간으로 획득하였다. 도 9에 도시된 스펙트럼은 720 스펙트럼의 평균이다. 전체 바이러스 입자와 빈 바이러스 입자 사이의 SERS 신호의 차이는 캡시드 내의 유전 물질의 부재와 연관될 수 있다. 회색 상자에 의해 강조된 피크는 3개의 바이러스 입자 모두에 걸쳐 보여지고(표 3), 티로신(853 cm-1), 페닐알라닌(1004 cm-1), 트립토판(1127 cm-1), 및 아미드 III 스트레치(1240 cm-1)(Shanmukh 등, "Rapid and Sensitive Detection of Respiratory Virus Molecular Signatures Using a Silver Nanorod Array SERS Substrate," Nano Letters 6(11):2630-2636 (2006); Ashton 등, "pH-Induced Conformational Transitions in α-Lactalbumin Investigated with Two-Dimensional Raman Correlation Variance Plots and Moving Windows" Journal of Molecular Structure 974(1-3):132-138 (2010); Verduin 등, "RNA-Protein Interactions and Secondary Structures of Cowpea Chlorotic Mottle Virus for in Vitro Assembly," Biochemistry 23(19):4301-4308 (1984), 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨)에 상응한다. 빈 캡시드 스펙트럼(표 4)에서 관찰된 추가 밴드는 719 cm-1(ν (C-S), 트립토판), 1362 cm-1(트립토판), 1454 cm-1 (단백질의 CH2 변형, 트립토판), 및 1565 cm-1(페닐알라닌/트립토판, 아미드 II) (Shanmukh 등, "Rapid and Sensitive Detection of Respiratory Virus Molecular Signatures Using a Silver Nanorod Array SERS Substrate," Nano Letters 6(11):2630-2636 (2006); Ashton 등, "pH-Induced Conformational Transitions in α-Lactalbumin Investigated with Two-Dimensional Raman Correlation Variance Plots and Moving Windows" Journal of Molecular Structure 974(1-3):132-138 (2010); Verduin 등, "RNA-Protein Interactions and Secondary Structures of Cowpea Chlorotic Mottle Virus for in Vitro Assembly," Biochemistry 23(19):4301-4308 (1984); Negri 등, "Online SERS Detection of the 20 Proteinogenic L-Amino Acids Separated by Capillary Zone Electrophoresis" The Analyst 139(22):5989-5998 (2014); Szekeres 등, "SERS Probing of Proteins in Gold Nanoparticle Agglomerates," Front. Chem. 7:30 (2019), 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨)을 포함한다. 전체 캡시드 스펙트럼과 빈 캡시드 스펙트럼 사이의 차이는 예컨대 RNA의 인산염 골격 스트레치로부터 발생하는 812 cm-1, 아데닌으로부터 발생하는 921 cm-1, 및 사이토신으로부터 발생하는 1046 cm-1에서의 밴드와 같은 바이러스 내의 유전 물질의 존재와 연관될 수 있다(Shanmukh 등, "Rapid and Sensitive Detection of Respiratory Virus Molecular Signatures Using a Silver Nanorod Array SERS Substrate," Nano Letters 6(11):2630-2636 (2006); Negri 등, "Detection of Genetic Markers Related to High Pathogenicity in Influenza by SERS," The Analyst 138(17):4877-4884 (2013); Suh 등, "Surface-Enhanced Raman Spectroscopy of Amino Acids and Nucleotide Bases Adsorbed on Silver," Journal of the American Chemical Society 108(16):4711-4718 (1986), 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨).
| SERS 밴드 (cm -1 ) | 할당 |
| 853 | 티로신 |
| 1004 | 페닐알라닌 |
| 1127 | 트립토판 |
| 1240 | 아미드 III |
| SERS 밴드 (cm -1 ) | 할당 |
| 719 | v(C-S), 트립토판 |
| 853 | 티로신 |
| 1004 | 페닐알라닌 |
| 1127 | 트립토판 |
| 1240 | 아미드 III |
| 1362 | 트립토판 |
| 1454 | 단백질의 CH2 변형, 트립토판 |
| 1565 | 페닐알라닌/트립토판, 아미드 II |
예 4:
변형된 렌티바이러스 입자에 대한 교정 곡선 개발
638 nm 여기 및 통상의 금 SERS 기판(Silmeco)을 갖는 Snowy Range Sierra Raman 분광계를 사용하여 JLV1로 지정된, 변형된 렌티바이러스 입자의 SERS 스펙트럼을 수득하였다. 바이러스 용액을 3D 인쇄된 유동 셀을 통해 SERS 기판 상에 주입하고, 스펙트럼을 250 ms의 노출 시간과 0.50 mW의 레이저 파워로 수득하였다. 도 10a에 도시된 스펙트럼은 200개의 스펙트럼의 평균이다. 모든 스펙트럼은 분석 전에 SERS 기판의 실리콘 배킹으로부터 발생하는 520 cm-1 피크로 정규화하였다. 도 10b 및 10bc및 도 10f-h(성분 1, 2 및 3에 대한 점수 비교)에 도시된 바와 같이 바이러스 역가를 결정하기 위한 교정 모델을 만드는데 MCR을 이용하였다. 도 10c는 바이러스를 구성하는 구아닌(658 및 1380 cm-1), RNA의 인산염 골격(811 및 1173 cm-1), 우라실(1059 및 1296 cm-1), 아데닌(1328 cm-1), 및 트립토판(1115, 1380, 및 1524 cm-1)과 같은 아미노산 및 핵산으로부터 발생하는 피크를 갖는 이 모델의 성분 1 로딩 스펙트럼을 도시하였다(Shanmukh 등, "Rapid and Sensitive Detection of Respiratory Virus Molecular Signatures Using a Silver Nanorod Array SERS Substrate" Nano Letters 6(11):2630-2636 (2006); Otto 등, "Surface-Enhanced Raman Spectroscopy of DNA Bases," Journal of Raman Spectroscopy 17(3):289-298 (1986); Suh 등, "Surface-Enhanced Raman Spectroscopy of Amino Acids and Nucleotide Bases Adsorbed on Silver," Journal of the American Chemical Society 108(16):4711-4718 (1986); Sloan-Dennison 등, "Surface Enhanced Raman Scattering Selectivity in Proteins Arises from Electron Capture and Resonant Enhancement of Radical Species" The Journal of Physical Chemistry C 124(17):9548-9558 (2020); Verduin 등, "RNA-Protein Interactions and Secondary Structures of Cowpea Chlorotic Mottle Virus for in Vitro Assembly," Biochemistry 23(19):4301-4308 (1984), 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨). 로딩 스펙트럼에서 강하게 나타나는 피크는 또한 각 역가에 대한 평균 스펙트럼에서 강하게 나타나, 이 성분이 렌티바이러스 입자와 연관됨을 확인한다. 그런 다음, 성분 1 상의 각 샘플에 대한 평균 점수를 바이러스 역가에 대해 도표화하여(도 10d-e 참조 ) 교정 곡선을 개발한다. 분석된 최고 역가인 106 TU/mL에서, SERS 신호가 감소한다(도 10d). 이는 표면이 샘플로 포화되어, 추가적인 렌티바이러스 입자가 핫스팟을 점유하는 것을 차단하고 SERS 신호의 일부가 관찰되기 때문일 수 있다. 그러나, 그 역가 수준 아래에는 성분 1에 대한 점수와 바이러스 역가 사이에 선형 경향이 있으며, 이는 도 10e에 도시된 JLV1의 바이러스 역가를 결정하기 위한 교정을 개발하는데 사용된다(R2= 0.974). 오차 막대는 SERS 측정의 표준 편차를 나타낸다.
전술한 것에 기초하여, 교정 곡선은 샘플 희석 없이 105 TU/mL 미만의 바이러스 역가를 평가하기 위해, 그리고 선택적으로 소정 샘플 희석(예를 들어, 10배, 100배, 또는 그 이상)으로 더 높은 바이러스 역가에서 동일한 설정으로 사용될 수 있다. 희석된 샘플과 희석되지 않은 샘플 둘 모두는 임의로 병렬로 평가될 수 있다.
바람직한 실시예가 본원에서 상세히 도시되고 설명되었지만, 본 발명의 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정, 첨가, 치환 등이 이루어질 수 있고, 따라서 이들은 이어지는 청구범위에서 정의된 바와 같은 본 개시의 범위 내에 있는 것으로 간주된다는 것이 당 분야의 숙련자에게 자명할 것이다.
Claims (38)
- 라만 분광법을 사용하여 샘플에서 바이러스 역가를 정량화하는 방법으로서, 상기 방법은:
샘플을 제공하는 단계;
상기 샘플에서 바이러스 역가를 결정하기 위한 모델을 제공하는 단계;
상기 샘플을 광원으로 조사하는 단계;
상기 샘플의 라만 스펙트럼을 획득하는 단계; 및
바이러스 역가를 결정하기 위해 라만 스펙트럼의 바이러스 성분을 상기 모델에 적용함으로써 상기 샘플의 바이러스 역가를 정량화하는 단계를 포함하는, 방법. - 제1항에 있어서, 상기 샘플은 하나 이상의 바이러스 입자 유형을 포함하는, 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 샘플은 2개 이상의 바이러스 입자 유형을 함유하는 유체 샘플이고, 상기 유형은 하나 이상의 유전 요소 만큼 상이한, 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자 요소는 상기 바이러스 입자 게놈에 대한 유전자 삽입, 치환, 또는 결실을 포함하는, 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자 요소는 상기 바이러스 입자 게놈 내로의 외인성 유전자 삽입을 포함하는, 방법.
- 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 입자는 레트로바이러스 입자, 레트로바이러스 유사 입자, 아데노바이러스 입자, 아데노바이러스 유사 입자, 아데노-연관 바이러스 입자, 아데노-연관 바이러스 유사 입자, 단순 포진 바이러스 입자, 및 단순 포진 바이러스 유사 입자로부터 선택되는, 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 바이러스 입자는 레트로바이러스 입자인, 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 레트로바이러스 입자는 렌티바이러스 입자인, 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 라만 분광법은 표면 강화 라만(SER) 분광법인, 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 SER 분광법은 금속 기판을 사용하여 수행되고, 상기 금속은 금, 은, 구리, 및 백금, 및 이들의 합금으로부터 선택되는, 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 SER 분광법은 금 기판 상에서 수행되는, 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 광원은 550 내지 1064 nm의 파장을 갖는 좁은 대역폭 레이저인, 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 SER 분광법은 은 기판을 사용하여 수행되는, 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 광원은 400 내지 1064 nm의 파장을 갖는 좁은 대역폭 레이저인, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 라만 스펙트럼으로부터 상기 바이러스 성분에 대한 점수를 추출하는 단계; 및
상기 샘플의 라만 스펙트럼으로부터 추출된 점수를 상기 모델에 적용하여 상기 샘플 내의 바이러스 역가를 정량화하는 단계를 추가로 포함하는, 방법. - 제15항에 있어서, 상기 모델은 바이러스 입자 유형-특이적 교정 곡선이고, 바이러스 입자 유형-특이적 성분에 대한 점수를 추출하여 상기 모델에 적용하여 상기 샘플에서 바이러스 입자 유형-특이적 역가를 정량화하는, 방법.
- 샘플에서 바이러스 역가를 정량화하기에 적합한 모델을 생성하는 방법으로서, 상기 방법은:
각각의 샘플이 공지된 바이러스 유형 및 공지된 역가를 함유하는 2개 이상의 샘플을 제공하는 단계;
각각의 샘플을 라만 분광법으로 처리하여 각각의 공지된 바이러스 유형 및 역가에 대한 기준 스펙트럼을 생성하는 단계;
상기 기준 스펙트럼으로부터 바이러스 유형-특이적 성분을 식별하는 단계;
공지된 바이러스 유형 및 공지된 역가의 각 샘플에 대해 상기 성분에 대한 점수를 결정하는 단계; 및
상기 점수에 기초하여 바이러스 역가를 정량화하기 위한 모델을 생성하는 단계를 포함하는, 방법. - 제17항에 있어서, 각각의 샘플에 대한 상기 기준 스펙트럼은 상기 샘플의 2개 이상의 스펙트럼을 분석함으로써 생성되는, 방법.
- 제17항에 있어서,
상기 식별 전에 기준 스펙트럼으로부터 배경 스펙트럼을 차감하는 단계를 추가로 포함하는, 방법. - 제17항에 있어서, 상기 식별 단계는,
상기 2개 이상의 샘플로부터 생성된 기준 스펙트럼에 화학측정 분석을 적용하여 상기 기준 스펙트럼 사이의 하나 이상의 변동 성분을 식별하는 단계;
상이한 공지된 역가를 갖는 각각의 공지된 바이러스 유형의 2개 이상의 샘플로부터 스펙트럼에서 식별된 하나 이상의 성분의 점수를 평가하는 단계; 및
상기 평가에 기초하여, 바이러스 유형-특이적 성분으로서 공지된 바이러스 역가와 상관되는 성분을 선택하는 단계를 포함하는, 방법. - 제20항에 있어서, 상기 화학측정 분석은 다변량 곡선 분석인, 방법.
- 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생성된 모델은 바이러스 유형-특이적 교정 곡선인, 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 2개 이상의 샘플은 적어도 2개의 상이한 바이러스 유형을 포함하되, 상기 바이러스 유형은 하나 이상의 유전자 요소 만큼 상이한, 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자 요소는 상기 바이러스 게놈에 대한 유전자 삽입, 치환, 또는 결실을 포함하는, 방법.
- 제24항에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자 요소는 상기 바이러스 게놈 내로의 외인성 유전자 삽입을 포함하는, 방법.
- 제17항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스는 레트로바이러스 입자, 레트로바이러스 유사 입자, 아데노바이러스 입자, 아데노바이러스 유사 입자, 아데노-연관 바이러스 입자, 아데노-연관 바이러스 유사 입자, 단순 포진 바이러스 입자, 및 단순 포진 바이러스 유사 입자로부터 선택되는, 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 바이러스는 레트로바이러스 입자인, 방법.
- 제27항에 있어서, 상기 레트로바이러스 입자는 렌티바이러스 입자인, 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 라만 분광법은 표면 강화 라만(SER) 분광법인, 방법.
- 제29항에 있어서, 상기 SER 분광법은 금속 기판을 사용하여 수행되고, 상기 금속은 금, 은, 구리, 및 백금, 및 이들의 합금으로부터 선택되는, 방법.
- 제30항에 있어서, 상기 SER 분광법은 금 기판을 사용하여 수행되는, 방법.
- 제31항에 있어서, 상기 처리는 550 내지 1064 nm의 파장을 갖는 좁은 대역폭 레이저로 각각의 샘플을 조사하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제32항에 있어서, 상기 파장은 약 785 nm인, 방법.
- 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 처리는 약 250 ms의 노출 시간 및 약 1.50 mW으로 스펙트럼을 획득하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제30항에 있어서, 상기 SER 분광법은 은 기판을 사용하여 수행되는, 방법.
- 제35항에 있어서, 상기 처리는 400 내지 1064 nm의 파장을 갖는 좁은 대역폭 레이저로 각각의 샘플을 조사하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제36항에 있어서, 상기 파장은 약 532 nm인, 방법.
- 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 처리는 약 250 ms의 노출 시간 및 약 0.6 mW으로 스펙트럼을 획득하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
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