CN105683214B - 触发针对多种肿瘤的抗体依赖细胞毒性的嵌合受体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及结合人免疫球蛋白Fc部分并递送活化信号的嵌合受体。本发明的嵌合受体可包含F158 FCGR3A或高亲和V158 FCGR3A变体的胞外配体－结合区，CD8α的铰链区和跨膜区，和CD3ζ和4‑1BB的信号传导区。本发明的嵌合受体对利妥昔单抗、曲妥珠单抗、hu14.18K322A和其它治疗抗体具有高亲和力，使其可用于增强针对各种癌症的抗体治疗效果。

Description

触发针对多种肿瘤的抗体依赖细胞毒性的嵌合受体
相关申请的交叉引用
基于35U.S.C.§119，本PCT申请要求2013年10月17日提交的美国临时申请61/892,218，2014年7月18日提交的美国临时申请62/026,243，和2014年9月9日提交的美国临时申请62/047,916的优先权。所有优先权申请的全部内容通过引用纳入本文。
发明领域
本发明涉及结合人类免疫球蛋白Fc部分并递送活化信号的嵌合受体。本发明的嵌合受体包括高亲和性V158FCGR3A变体、CD8α的铰链区和跨膜区、CD3ζ和4-1BB的信号传导区。本发明的嵌合受体对利妥昔单抗、曲妥珠单抗、hu14.18K322A和其他治疗性抗体具有高亲和力，使其可用于增强针对多种癌症的抗体疗法的疗效。
发明背景技术
免疫治疗具备规避耐药性的基因和细胞机制，靶向肿瘤细胞的同时能保留正常组织的潜能，因此是癌症治疗的有前途的选择。对血液恶性肿瘤的异体造血干细胞移植(HSCT)的结果证明T-淋巴细胞可以起到主要的抗肿瘤作用，其中T-细胞介导的移植物抗宿主病(GvHD)与疾病复发呈负相关，并且免疫抑制停药或输注供体淋巴细胞可以包括疾病复发。Weiden等，N.Engl.J.Med.,1979；1979(19):1068-1073；Porter等，N.Engl.J.Med.,1994；330(2):100-106；Kolb等，Blood 1995；86(5):2041-2050；Slavin等，Blood 1996；87(6):2195-2204；Appelbaum，Nature,2001；411(6835):385-389。可以通过表达具有抗体识别属性的嵌合信号传导受体使得T淋巴细胞的反应性偏向癌细胞：连接同源靶标导致T-细胞活化并触发细胞毒性。Eshhar等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1993；90(2):720-724；Geiger等，J.Immunol.1999；162(10):5931-5939；Brentjens等，Nat.Med.2003；9(3):279-286；Cooper等，Blood 2003；101(4):1637-1644；Imai等，Leukemia 2004；18:676-684。输注表达嵌合受体的自体T淋巴细胞的最近临床试验结果为其临床潜力给出了令人信服的证据。Pule等，Nat.Med.2008；14(11):1264-1270；Porter等，OncLive 2011；25；365(8):725-733；Brenjens等，Blood 2011；118(18):4817-4828；Ti ll等，Blood 2012；119(17):3940-3950；Kochenderfer等，Blood 2012；119(12):2709-2720；Brentjens等，Sci.Transl.Med.2013；5(177):177ra138。
癌症免疫治疗的另一个方法是施用单克隆抗体，其可以通过多种机制发挥细胞毒性，包括促细胞凋亡信号、补体结合和抗体依赖细胞毒性(ADCC)。Yu等，N.Engl.J.Med.2010；363(14):1324-1334；Ferris等，J.Clin.Oncol.2010；28(28):4390-4399；Maloney,N.Engl.J.Med.2012；366(21):2008-2016；Scott等，Nat.Rev.Cancer 2012；12(4):278-287；Weiner等，Cell 2012；148(6):1081-1084；Galluzzi等，Oncoimmunology2012；1(1):28-37.后一种机制发挥主要作用，是源自于通过抗体Fc部分与表达于天然杀伤细胞(NK细胞)和其他细胞(如中性粒细胞和巨噬细胞)表面的Fc受体(FcγR)的衔接。Nimmerjahn等，Nat.Rev.Immunol.2008；8(1):34-47。FcγR基因的多态性可以具有明显的功能性结果，进而影响对抗体治疗的反应。为此，NK细胞表达的编码FcγRIIIa(FCRG3A或CD16)的基因的同种型可导致受体在158位具有苯丙氨酸(F)或缬氨酸(V)残基；在少数个体上，CD16158V/V具有更高的Fc结合力并与肿瘤细胞杀伤增加和优越的患者反应相关。Ferris等，J.Clin.Oncol.2010；28(28):4390-4399；Koene等，Blood1997；90(3):1109-1114；Cartron等，Blood 2002；99(3):754-758；Weng等，J.Clin.Oncol.2003；21(21):3940-3947；Dall'Ozzo等，Cancer Res.2004；64(13):4664-4669；Hatjiharissi等,Blood 2007；110(7):2561-2564；Musolino等，J.Clin.Oncol.2008；26(11):1789-1796；Bibeau等，J.Clin.Oncol.2009；27(7):1122-1129；Ahlgrimm等，Blood 2011；118(17):4657-4662；Veeramani等，Blood 2011；118(12):3347-3349。
本领域迫切需要研发癌症治疗的新方法和新试剂。
发明概要
本发明，至少部分发明，是基于对用于例如癌症治疗的新型嵌合受体的开发。因此，本文提供了嵌合受体，编码它的核酸，包含该编码核酸的载体，表达该嵌合受体的宿主细胞，和该宿主细胞在增强个体(如癌症患者)中基于抗体的癌症疗法和/或ADCC效果中的应用。
一方面，本发明提供了一种嵌合受体，其包含：(a)CD16分子的细胞外配体结合区；(b)CD8α的铰链区和跨膜区；和(c)包括4-1BB信号传导区和CD3ζ信号传导区的胞浆区。在一些实施方式中，CD16分子为F158FCGR3A，其胞外配体-结合区可包含(例如，由以下组成)SEQID NO:16所示的氨基酸序列。在其他实施方式中，CD16分子为V158FCGR3A变体，其胞外配体-结合区可包含(例如，由以下组成)SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
本文公开的任一嵌合受体中，CD8α的铰链区和跨膜区可包含(例如，由以下组成)SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；4-1BB信号传导区可包含(例如，由以下组成)SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，和/或CD3ζ信号传导区可包含(例如，由以下组成)SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
本文公开的任一嵌合受体可进一步包含CD8α的信号肽，其位于该嵌合受体的N端。在一实施例中，该CD8α的信号肽可包含(例如，由以下组成)SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述嵌合受体可包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:15的残基22-436所示的氨基酸序列。在一实施例中，所述嵌合受体包含(例如，由以下组成)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。
在另一方面，本发明提供了一种分离的多核苷酸，其包含编码本文公开的任一嵌合受体的核苷酸序列。在一些实施方式中，编码所述嵌合受体的多核苷酸可包含SEQ IDNO:10或SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列，SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列，SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列，SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列，或它们的组合。在一具体实施方式中，编码所述嵌合受体的多核苷酸包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列。
在另一方面，本发明提供了一种载体，其包含编码本文所公开的任一嵌合受体的多核苷酸，其中，所述多核苷酸可操作性地与至少一个调控元件连接以便表达嵌合受体。在一实施例中，所述载体是病毒载体(例如，逆转录病毒载体或慢病毒载体)。
进一步地，本发明提供了一种分离的宿主细胞，其包含本文公开的任一嵌合受体。在一具体实施方式中，所述宿主细胞是T淋巴细胞或NK细胞。在一具体实施方式中，所述宿主细胞是离体活化和/或扩增的T淋巴细胞或NK细胞，(例如，T淋巴细胞可在有一种或多种选自下组的试剂存在下被活化：抗-CD3/CD28，IL-2，和植物凝集素(phytohemoagglutinin)；例如，NK细胞可在有一种或多种选自下组的试剂存在下被活化：CD137配体蛋白，CD137抗体，IL-15蛋白，IL-15受体抗体，IL-2蛋白，IL-12蛋白，IL-21蛋白和K562细胞系)。在一具体实施方式中，所述宿主细胞是分离自癌症患者的自体T淋巴细胞或自体NK细胞。在一具体实施方式中，所述宿主细胞是同种异体T淋巴细胞或同种异体NK细胞。在一具体实施方式中，所述宿主细胞是抑制了或消除了内源性T细胞受体表达的同种异体T淋巴细胞。
在另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含(i)编码本文公开的任一嵌合受体的多核苷酸或包含该多核苷酸的载体，或表达该嵌合受体的宿主细胞；和(ii)药学上可接受的载体或赋形剂。所述药物组合物进一步可包含对癌细胞产生毒性的抗体(如与肿瘤细胞结合并具有与人CD16结合的人或人源化Fc部分的抗体，或利妥昔单抗，或曲妥珠单抗，或者hu14.18K322A，或依帕珠单抗，西妥昔单抗，或拉贝珠单抗)。
在另一方面，本发明提供了一种增强有此需要的个体中基于抗体的癌症免疫治疗的疗效的方法。所述个体可用与癌细胞结合的抗体治疗。该方法可包括将治疗有效量的T淋巴细胞或NK细胞引入该个体，该T淋巴细胞或NK细胞表达本文描述的任一嵌合受体。
此外，本发明提供了一种增强个体中T淋巴细胞或NK细胞抗体－依赖细胞毒性(ADCC)的方法，所述方法包括将治疗有效量的T淋巴细胞或NK细胞引入该个体，该T淋巴细胞或NK细胞表达本文描述的嵌合受体。在一具体实施方式中，所述个体正在接受与癌细胞结合的抗体治疗。
在本文所述的任一方法中，所述个体可用抗体治疗，该抗体具有与人CD16结合的人或人源化Fc部分。在一具体实施方式中，所述个体用选自下组的抗体治疗：利妥昔单抗、曲妥珠单抗、hu14.18K322A、依帕珠单抗、西妥昔单抗和拉贝珠单抗。在一具体实施方式中，所述癌症选自下组：上皮癌、淋巴瘤、肉瘤、母细胞瘤和白血病。在一具体实施方式中，所述癌症选自下组：B-细胞来源的癌症(例如，B细胞急性淋巴细胞白血病、B细胞慢性淋巴细胞白血病、B细胞非霍奇金淋巴瘤)，乳腺癌，胃癌，神经母细胞瘤，骨肉瘤，肺癌，黑色素瘤，前列腺癌，结肠癌，肾细胞癌，卵巢癌，横纹肌肉瘤，白血病，和霍奇金氏淋巴瘤。在一具体实施方式中，所述T淋巴细胞或NK细胞为从所述个体分离的自体T淋巴细胞或自体NK细胞。在一具体实施方式中，在引入个体之前，所述自体T淋巴细胞或自体NK细胞经离体活化或扩增。在一具体实施方式中，所述T淋巴细胞或NK细胞为同种异体T淋巴细胞或同种异体NK细胞。在一具体实施方式中，所述同种异体T淋巴细胞为抑制或消除了内源性T细胞受体表达的T淋巴细胞。在一具体实施方式中，所述同种异体T淋巴细胞或同种异体NK细胞先经离体活化和/或扩增，再引入个体。在一具体实施方式中，用选自下组的方法将所述嵌合受体引入T淋巴细胞或NK细胞：逆转录病毒转导，慢病毒转导，DNA电穿孔和RNA电穿孔。
在本文所公开的任一涉及T淋巴细胞活化的方法中，所述T淋巴细胞可在有选自下组的一种或多种试剂存在下被活化：抗-CD3/CD28，IL-2，和植物凝集素。在本文所公开的任一涉及NK细胞活化的方法中，所述NK细胞可在有选自下组的一种或多种试剂存在下被活化：CD137配体蛋白质、CD137抗体、IL-15蛋白、IL-15受体抗体、IL-2蛋白、IL-12蛋白、IL-21蛋白和K562细胞系。
本文所公开的任一方法可进一步包括给个体施用治疗有效量的IL-2。
以下方面也在本发明的范围内：(i)用于增强癌症患者的ADCC效果或用于治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包含本文公开的编码本文所公开嵌合受体的任一多核苷酸，包含该多核苷酸的载体，或表达所述嵌合受体的宿主细胞，和药学上可接受的载体或赋形剂；和(ii)所述药物组合物在用于生产用于癌症治疗的药物中的应用。所述药物组合物可进一步包含抗癌症抗体，例如本领域已知的或本文公开的。
本发明的一个或多个实施方式在下文中详述。从如下附图和几个实施方式的具体描述以及所附权利要求中可以明显看出本发明的其他特征或优点。
附图简述
本专利申请文件包含至少一幅彩色附图。只要提出请求和缴纳必要的费用，专利局可提供附有彩色附图的本发明申请文件的副本。
图1显示了T细胞中CD16V-BB-ζ受体的表达。A.CD16V-BB-ζ受体构建物的示意图。B.外周血T淋巴细胞中CD16V-BB-ζ受体的表达。流式细胞散点图说明在用单独包含GFP(模拟)或包含GFP和CD16V-BB-ζ的载体转导的活化的T淋巴细胞中CD16(B73.1抗体)与GFP或CD3ζ的组合表达。在每个象限示出了阳性细胞百分比。C.用GFP单独或CD16V-BB-ζ转导的T淋巴细胞的细胞裂解物的蛋白质印迹。膜用抗CD3ζ抗体探测。
图2显示了T细胞亚群中CD16V-BB-ζ受体的表达。A.活化的CD3+T淋巴细胞用单独包含GFP的载体(模拟)和用包含CD16V-BB-ζ构建物的载体转导。用流式细胞仪检测CD4+和CD8+细胞中CD16的表达。散点图显示了典型试验的结果。B.三个献血者的T淋巴细胞获得的结果概要(平均值±SD)(P＝N.S.)。
图3显示了CD16V-BB-ζ受体的抗体结合力。A.用包含GFP(模拟)或GFP和CD16V-BB-ζ的载体转导的T淋巴细胞与利妥昔单抗温育30分钟；用与藻红蛋白偶联的羊抗人IgG抗体(GAH IgG)和流式细胞术目测观察结合于细胞表面的抗体量。B.用CD16V-BB-ζ(V158)或CD16F-BB-ζ(F158)转导的Jurkat细胞与利妥昔单抗温育30分钟。该图比较了从表达这两个受体的细胞获得的GFP平均荧光强度(MFI)和GAH IgG MFI之间的关系。C.在利妥昔单抗存在下，将经模拟转导或用CD16V-BB-ζ转导的Jurkat细胞与经钙黄绿素AM橙红(calcein AMorange-red)标记的Daudi细胞共同培养。定量测定各散点图的右上象限中的细胞聚集物。D.C.栏所示聚集实验的概要显示了三个实验的平均值±SD。在利妥昔单抗(“Ab”)存在下，用CD16V-BB-ζ转导的Jurkat细胞测得的聚集明显更高于其他三种培养条件下测得的聚集(P<0.001，采用t检测)。
图4显示了CD16V-BB-ζ和CD16F-BB-ζ受体对曲妥珠单抗和人IgG的相对结合力。经CD16V-BB-ζ(V158，黑色符号)或CD16F-BB-ζ(F158，白色符号)转导的Jurkat细胞与曲妥珠单抗或人IgG温育30分钟。该图比较了从表达任一受体的细胞中获得的GFP平均荧光强度(MFI)和与藻红蛋白(PE)偶联的羊抗人(GAH)IgG MFI之间的关系(曲妥珠单抗和IgG，P<0.0001)。
图5显示了结合于CD16V-BB-ζ受体的免疫球蛋白引起T细胞活化，裂解颗粒的胞吐和细胞增殖。A.经包含GFP(模拟)或包含GFP和CD16V-BB-ζ的载体转导的T淋巴细胞在包被利妥昔单抗的微量滴定板中培养48小时，无IL-2；用流式细胞术检测CD25的表达。B.A栏所示测试结果的概要显示了GFP+细胞中的CD25表达(来自三个献血者的T细胞实验的平均值±SD)；在利妥昔单抗(“Ab”)存在下，经CD16V-BB-ζ转导的T淋巴细胞中CD25的表达显著高于其他实验条件(P≤0.003)。C.经包含GFP的载体(模拟)和包含GFP和CD16V-BB-ζ的载体转导的来自四个献血者的T淋巴细胞用A的条件(n＝3)培养4小时或与Daudi细胞(n＝3)培养4小时；用流式细胞术检测CD107a染色。各栏显示了6个实验的平均值±SD；在利妥昔单抗(“Ab”)存在下，经CD16V-BB-ζ转导的T淋巴细胞中CD107a的表达明显更高于其他实验条件(P<0.0001)。D.在有或没有Daudi细胞存在下，单独培养或用利妥昔单抗培养模拟-或CD16V-BB-ζ-转染的T淋巴细胞最多四周。符号显示了与输入细胞的数量相比的细胞恢复百分比(来自三个献血者的T细胞实验的平均值±SD)。
图6显示了体外CD16V-BB-ζT淋巴细胞介导的抗体－依赖细胞毒性。A.在对应抗体存在下，模拟－或CD16V-BB-ζ-转导的T淋巴细胞介导的针对癌细胞系的细胞毒性的典型实施例。每个符号显示了一式三份培养物的平均值(P<0.01，配对t检测法检测所有三组比对)。完整的数据示于图7。B.在有或没有利妥昔单抗(“Ab”)存在下，模拟-或CD16V-BB-ζ转导的T淋巴细胞针对来自慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者原代细胞的细胞毒性。每栏(每个患者用不同的阴影)对应于2:1E:T比的一式三份4小时实验检测到的平均(±SD)细胞毒性。CD16V-BB-ζT细胞和抗体的细胞毒性明显更高于其他3个条件下测得的细胞毒性(P<0.0001，t测试)；用模拟转导T细胞，添加抗体提高细胞毒性(P＝0.016)；所有其它比对：P>0.05。C.在间充质基质细胞(MSC)存在下，24小时后以1:2E:T的比例针对B中测试的相同CLL样本的细胞毒性。每栏对应于两个测试的平均值。CD16V-BB-ζ和抗体的细胞毒性明显更高于单独使用抗体(P＝0.0002)或单独使用细胞的(P<0.0001)，单独使用抗体的细胞毒性明显更高于单独使用细胞的(P＝0.0045)。
图7显示了4小时体外细胞毒性试验的总体结果。模拟-或CD16V-BB-ζT淋巴细胞与所示的细胞系和非反应性人免疫球蛋白("无Ab")或和相应抗体("Ab")一起培养。Daudi和Ramos用利妥昔单抗，MCF-7、SKBR-3和MKN-7用曲妥珠单抗，以及CHLA-255，NB1691，SK-N-SH和U-2OS用hu14.18K322A。与没有T细胞和/或抗体培养的肿瘤细胞相比，显示了2:1比例(CHLA-255为4:1)下的细胞毒性。NB1691和SK-BR-3的结果对应于用3个献血者的T淋巴细胞进行的一式三份试验的均值(±SD)细胞毒性，其余细胞系的结果对应于1个献血者的试验；Daudi的结果是2个献血者的一式三份试验的均值(+SD)细胞毒性以及来自另外4个献血者的T淋巴细胞的单独试验。在不存在T细胞时添加利妥昔单抗、曲妥珠单抗或hul4.18K322A时的均值细胞毒性<10。
图8显示了CD16V-BB-ζT淋巴细胞的细胞毒性是强的、特异性的，并且不受未结合IgG的影响。A.CD16V-BB-ζT淋巴细胞与神经母细胞瘤细胞系NB1691和非反应性人免疫球蛋白("无Ab")或hul4.18K322A抗体("Ab")共培养24小时。结果对应于一式三份实验的平均(±SD)细胞毒性。即便在1:8E:T(P＝0.0002)下，CD16V-BB-ζ细胞加hul4.18K322A抗体的细胞毒性仍显著高于单独使用CD16V-BB-ζT细胞的。B.在利妥昔单抗或非反应性抗体曲妥珠单抗或hul4.18K322A存在下，模拟-或CD16V-BB-ζ转导的T淋巴细胞以2:1E:T与B细胞淋巴瘤细胞系Daudi共培养4小时。结果对应于一式三份实验的平均(±SD)细胞毒性。("模拟"结果是每个抗体的一式三份实验的总和)。利用利妥昔单抗的细胞毒性明显更高于所有其他实验条件(P<0.0001与所有比较)。C.在各种浓度的免疫治疗抗体和竞争性的未结合IgG(同时加入到抗体)存在下，8:1E:T下，表达CD16V-BB-ζ的T淋巴细胞针对肿瘤细胞系的细胞毒性。符号对应于对每个抗体浓度下至少一式三份测量的平均值(±SD)。不论未结合IgG的存在量，对于每种细胞系，细胞毒性在统计学上并非不同。
图9显示了表达CD16V-BB-ζ受体的T淋巴细胞具有体内抗肿瘤活性。对NOD-SCID-IL2RGnull小鼠腹膜内注射3×105标记荧光素酶的Daudi细胞。第四天起每周一次腹膜内注射利妥昔单抗(150μg)，四周。在4只小鼠中，不施加其他治疗方法，而在其他5只小鼠中，在第5和第6天第一次注射利妥昔单抗后再注射表达CD16V-BB-ζ受体的T淋巴细胞(1×107腹膜内；n＝5)；其它两组的4只小鼠每只在接受CD16V-BB-ζT淋巴细胞之前，腹膜内注射RPMI-1640而非利妥昔单抗，或仅腹膜内注射RPMI-1640介质("对照")。A.肿瘤生长的体内成像结果。每个符号对应一种生物发光测量值；线条连接一只小鼠中的所有测量值。B.每个实验条件下的代表性小鼠(2只每组)。第3天的腹部影像用增强的灵敏度进行了处理，以显示CD16V-BB-ζ+利妥昔单抗组小鼠中肿瘤的存在。当生物发光达5x1010光子/秒时对小鼠进行安乐死。C.不同治疗组小鼠的总生存率的比较。
图10证实了表达CD16V-BB-ζ受体的T淋巴细胞在体内具有抗肿瘤活性。对NOD-SCID-IL2RGnull小鼠腹膜内注射3×105的标记荧光素酶的NB1691细胞。第5天起每周一次地腹膜内注射Hul4.18K322A抗体(25μg)，四周。在4只小鼠中不施加其他治疗方法，而在其他4只小鼠中，在第6和第7天第一次注射抗体后再注射表达CD16V-BB-ζ受体的T淋巴细胞(1×107腹腔；n＝4)；其它两组的4只小鼠每只在接受CD16V-BB-ζT淋巴细胞之前，腹膜内注射RPMI-1640而非抗体，或仅腹膜内注射RPMI-1640介质("对照")。A.肿瘤生长的体内成像结果。每个符号对应一种生物发光测量值；线条连接一只小鼠中的所有测量值。B.每个实验条件下所有小鼠的成像。当生物发光达1x1010光子/秒时对小鼠进行安乐死。C.不同治疗组小鼠的总生存率的比较。
图11显示了表达CD16V-BB-ζ受体T淋巴细胞和表达CD16F-BB-ζ受体的T淋巴细胞之间的功能差异。A.流式细胞散点图显示了用CD16V-BB-ζ或CD16F-BB-ζ转导的T淋巴细胞中CD 16(用B73.1抗体检测)和绿色荧光蛋白(GFP)的表达。显示了每个象限中的阳性细胞百分比。B.在利妥昔单抗、曲妥珠单抗和hul4.18K322A的存在下，CD 16V或CD16F受体转导的T淋巴细胞分别与Daudi、SK-BR-3或NB1691细胞培养。所有抗体以0.1μg/mL使用。符号表示相比于输入细胞量的细胞恢复百分比(3个实验的平均值±SD)；对于所有3种培养物，配对t测试显示1-3周培养的细胞计数显著不同(Daudi，P＝0.0007；SK-BR-3，P＝0.0164；NB1691，P＝0.022)。C.在不同浓度的利妥昔单抗存在下，表达CD16V-BB-ζ或CD16F-BB-ζ受体的T淋巴细胞介导的针对Daudi细胞的抗体依赖型细胞毒性。每个符号表示在8:1(左)或2:1(右)E:T下的三种培养物的平均值±SD。含有CD16V-BB-ζ的T细胞的细胞毒性明显更高于那些含有CD16F-BB-ζ的T细胞的细胞毒性(P<0.001，任一个E:T)。
图12显示了用于本研究的CD 16嵌合受体的示意图。
图13显示了具有不同信号传导域的CD 16V受体的表达。流式细胞散点图显示了活化的T淋巴细胞中，绿色荧光蛋白与CD 16组合的表达(用3G8抗体检测)，该T淋巴细胞用单独含有绿色荧光蛋白(GFP)(模拟)或不同CD 16V构建物的载体转导。显示了每个象限中的阳性细胞百分比。
图14显示了与具有不同信号传导特性的CD 16V受体相比，CD16V-BB-ζ诱导更高的T细胞活化，增殖和细胞毒性。A.与Daudi细胞和利妥昔单抗(0.1μg/m l)共培养48小时后，表达不同嵌合受体的T淋巴细胞中通过流式细胞术检测的CD25平均荧光强度(MFI)对绿色荧光蛋白(GFP)MFI的图谱。利用CD16V-BB-ζ的CD25表达明显更高于那些没有信号传导能力("CD16V-截短")的CD16V-ζ、CD16V-FcεRIγ或CD 16V所触发的CD25表达。(P<0.0001通过线性回归分析)。B.在利妥昔单抗、曲妥珠单抗和hul4.18K322A存在下，各种CD16V受体转导的T淋巴细胞分别与Daudi、SK-BR-3或NB1691细胞培养。所有抗体以0.1μg/ml使用。符号表示相比于输入细胞量的细胞恢复百分比(3个实验的平均值±SD)；对于所有3种培养物，配对t测试显示利用CD16V-BB-ζ受体的1-3周培养的细胞计数显著高于利用其它受体的细胞计数(P<0.0001)。C.分别在利妥昔单抗、曲妥珠单抗和hu14.18K322A存在下，表达各种CD16V受体的T淋巴细胞或模拟转导的T细胞对Daudi、SK-BR-3和NB1691的ADCC。符号为在所示E:T下，一式三份培养物的平均值±SD。利用CD16V-BB-ζ受体的细胞毒性明显高于利用所有其它受体的细胞毒性(所有对比通过t测试，P<0.0001)，然而模拟转导或经CD16V-截短受体转导的淋巴细胞的细胞毒性彼此并非显著不同(P>0.05)；针对Daudi(P＝0.006)和SK-BR-3(P＝0.019)，利用CD16V-FcεRIγ的细胞毒性明显更高于利用CD3-ζ的细胞毒性；表达任一受体的淋巴细胞比模拟转导或经CD16V-截短(P<0.01，所有比较)转导的淋巴细胞具有更高的细胞毒性。
图15显示了mRNA电穿孔测得的CD16V-BB-ζ受体的表达。A.用CD16V-BB-ζmRNA或无mRNA(模拟)电穿孔活化T淋巴细胞；24小时后用流式细胞术检测CD16的表达。B.在利妥昔单抗存在下，测试模拟或CD16V-BB-ζ电穿孔的T细胞对Ramos细胞系的细胞毒性。符号显示了平均值±SD百分比细胞毒性(n＝3；P<0.01所有E:T比例下的比较)。
发明详述
本发明基于构建新型嵌合受体，该受体增强抗癌抗体在癌症治疗中的功效。表达αβT细胞受体的T淋巴细胞(T细胞的绝大多数)缺乏活化FcγR且不介导抗体依赖细胞毒性。Nimmerjahn等，Nat Rev Immunol.2008；8(1):34-47。本发明显示了表达由FcγR和T细胞信号传导分子组成的嵌合受体应赋予这些细胞ADCC能力，因此，应该显著增加单克隆抗体的抗肿瘤潜力(以及其他包含Fc部的抗肿瘤分子，例如，一复合分子，由结合肿瘤表面受体的配体(例如，细胞因子，免疫细胞受体)与免疫球蛋白的Fc-部或包含Fc的DNA或RNA构成)，而无论靶向的肿瘤抗原。本文所描述的是表达此类嵌合受体的T淋巴细胞的抗体导向抗肿瘤活性。
本发明提供了一种嵌合受体，其包含：(i)CD16分子的胞外配体结合区，可以是F158 FCGR3A或高亲和力的V158 FCGR3A变体；(ii)CD8α的铰链区和跨膜区；和(ii)包括CD3ζ和4-1BB信号传导区。本发明的嵌合受体是具有显著增强对多种肿瘤的抗体治疗功效潜能的通用嵌合受体。如在下述实施例部分讨论的，当通过逆转录病毒转导在人T细胞中表达时，与另一种含有常见的F158变体的受体相比，本发明的受体对人IgG(包括人源化抗体如抗-CD20抗体利妥昔单抗)的亲和力显著更高。嵌合受体的接合引起T细胞活化，裂解性颗粒的胞吐和增殖。在利妥昔单抗存在下，表达CD16V-BB-ζ的T细胞在较低的效靶比下特异性杀伤淋巴瘤细胞系和原发性慢性淋巴细胞白血病(CLL)细胞，即便在骨髓间充质干细胞上进行CLL培养时。抗HER2抗体曲妥珠单抗触发嵌合受体介导的抗乳腺癌和胃癌细胞的抗体依赖细胞毒性(ADCC)，抗GD2抗体hu14.18K322A触发嵌合受体介导的抗神经母细胞瘤和骨肉瘤细胞的抗体依赖细胞毒性。在实施例部分进一步揭示了，组合表达嵌合受体和利妥昔单抗的T细胞根除免疫缺陷小鼠体内的人淋巴瘤细胞，而单独用T细胞或抗体无法做到。为了加速这项技术的临床转化，本文研发了一种基于嵌合受体mRNA电穿孔的方法，使得受体有效和瞬时地表达，而不使用病毒载体。
定义
本文所使用的术语“嵌合受体”被定义为细胞表面受体，包括胞外配体结合区，跨膜区和细胞质信号传导区的组合，其不是单个蛋白质上天然发现的。本发明的嵌合受体主要目的是用于T细胞，但也可用于天然杀伤(NK)细胞。
术语“约”或“大约”是指本领域普通技术人员测定的特定值在可接受的错误范围内，这将部分取决于如何测量或确定该值，即，测量系统的局限性。例如，就本领域的惯例而言，“约”可指在可接受的标准偏差内。或者，“约”可指给定值的最高±20％，较佳地，最高±10％，更佳地，最高±5％，更佳地，最高±1％的范围。或者，特别是对于生物体系或工艺，这个术语可指在某值的一个数量级内，较佳地，在2倍内。在申请文本和权利要求中描述特定值之处，除非另有说明，否则术语“约”是隐含的，且在这种情况下意味着该特定值在可接受的错误范围内。
在本发明的上下文中，在其涉及任一本文所引用病症的范围内，术语“治疗”、“疗法”等意味着缓解或减轻与此类病症相关的至少一种症状，或减缓或逆转这种病症的进展。在本发明的含义中，术语“治疗”还表示抑制、延缓其发作(即，疾病临床表现之前的时期)和/或降低疾病发展或恶化的风险。例如，与癌症相关的术语“治疗”可以指消除或减少病人的肿瘤负荷，或预防、延迟或抑制转移等。
如本文所用，应用于剂量或用量的术语“治疗有效的”是指给予有此需要的个体后，化合物或药物组合物(例如，包含含有本发明嵌合受体的T淋巴细胞(和/或NK细胞)的组合物，和任选还包含肿瘤特异性细胞毒性单克隆抗体或含有Fc部分的另一种抗肿瘤分子(例如，由结合肿瘤表面受体的配体(例如，细胞因子，免疫细胞受体)与免疫球蛋白的Fc部分或含有Fc的DNA或RNA构成的复合分子))的数量足以导致所需活性。在本发明上下文中，术语“治疗有效的”是指化合物或药物组合物的数量足以延缓表现，抑制进展，缓解或减轻由本发明方法治疗的疾病的至少一种症状。注意，当施用活性成分的组合时，该组合的有效量可以包括或不包括各个成分被单独施用时有效的量。
与本发明的组合物结合使用的短语“药学上可接受的”是指分子实体和组合物中的其他成分在生理上是可耐受的且通常当施用给哺乳动物(例如，人)时不会产生不良反应。优选地，如本文所用，术语“药学上可接受的”是指由联邦管理机构或州政府批准或在美国药典或其它通常公认的药典中列出的，用于哺乳动物的，并且更特别地是人。
如本文所用，术语“个体”是指任何哺乳动物。在一优选实施方案中，所述个体是人。
如本说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一”，“一个”和“该”包括复数引用，除非上下文另有明确说明。
按照本发明，可采用本领域常规的分子生物学，微生物学，和重组DNA技术。这些技术在文献中有充分解释。参见，例如，Sambrook,Fritsch&Maniatis,分子克隆：实验室手册，第二版(1989)，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，冷泉港，纽约(本文中，"Sambrook等，1989")；DNA克隆：一种实用方法，卷I和II(D.N.Glover编1985)；寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)(MJ.Gait编1984)；核酸杂交(NucleicAcid Hybridization)(B.D.Hames&S.J.Higgins编(1985>>；转录和翻译(Transcriptionand Translation)(B.D.Hames&S.J.Higgins,编(1984>>；动物细胞培养(Animal CellCulture)(R.I.Freshney,编(1986>>；固定化细胞和酶(Immobilized Cells and Enzymes)(lRL出版社，(1986>>；B.Perbal,分子克隆实践指南(A practical Guide To MolecularCloning)(1984)；F.M.Ausubel等编,分子生物学最新方案(Current Protocols inMolecular Biology),,约翰韦利父子股份有限公司(John Wi ley&Son,Inc s)(1994)等。
本发明的嵌合受体
本发明提供了一种嵌合受体，其包含(a)F158 FCGR3A或V158 FCGR3A变体的胞外配体结合区(例如，SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:2，各自地)；(b)CD8α的铰链区和跨膜区(例如，SEQ ID NO:3)；和(c)包含4-1BB信号传导区(例如，SEQ ID NO:4)和CD3ζ信号传导区(例如，SEQ ID NO:5)的胞浆区。所述嵌合受体可进一步包含CD8α的信号肽，例如，SEQ ID NO:6。在一具体实施方式中，所述嵌合受体包含如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。在一实施例中，所述嵌合受体为由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列组成的CD16V-BB-ζ。在另一实施例中，所述嵌合受体为由SEQ ID NO:15所示氨基酸序列组成的CD16F-BB-ζ。
在一实施方式中，本发明所述嵌合受体除了包含本文所描述的两个信号传导区，即，CD3ζ和4-1BB/CD137，还包含一个或多个信号传导区。在一具体实施方式中，一些信号传导区融合在一起以达到加和或协同作用。有用的其他信号传导区的非限制性实施例包括来自于以下的部分或全部：选自TCRζ链、CD28、OX40/CD134、4-1BB/CD137、FcεRIy、ICOS/CD278、ILRB/CD122、IL-2RG/CD132和CD40的一个或多个。
本发明还提供了编码以上公开的嵌合受体的多核苷酸。在一具体实施方式中，所述编码V158FCGR3A变体胞外配体结合区的多核苷酸包含SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列。或者，所述编码F158FCGR3A胞外区的多核苷酸包含SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列。在一具体实施方式中，所述编码CD8α铰链区和跨膜区的多核苷酸包含SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列。在一具体实施方式中，所述编码4-1BB信号传导区的多核苷酸包含SEQ ID NO:12所示核苷酸序列。在一具体实施方式中，所述编码CD3ζ信号传导区的多核苷酸包含SEQ IDNO:13所示的核苷酸序列。在一具体实施方式中，所述编码CD8α信号肽的多核苷酸包含SEQID NO:14所示的核苷酸。
在一实施例中，所述编码CD16V-BB-ζ嵌合受体的多核苷酸包含SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。在另一实施例中，所述编码CD16F-BB-ζ嵌合受体的多核苷酸包含SEQ IDNO:17所示的核苷酸序列。
结合所述多核苷酸，本发明还提供了包含此类多核苷酸的载体(包括这样的载体，其中，此类多核苷酸可操作地连接于至少一个调控元件，用于表达该嵌合受体)。本发明有用载体的非限制性实施例包括病毒载体，如逆转录病毒载体和慢病毒载体。
在一具体实施方式中，此类载体还包括自杀基因。如本文所用，术语“自杀基因”是指引起表达该自杀基因的细胞死亡的基因。所述自杀基因可以是一种基因，其赋予给予表达该基因的细胞对某种试剂(例如，药物)的敏感性，当细胞与该试剂接触或暴露于该试剂中时其引起细胞死亡。自杀基因为本领域已知的(参见，例如，自杀基因治疗：方法和综述(Suicide Gene Therapy:Methods and Reviews),Springer,Carol ine J.(癌症研究所-癌症治疗的癌症研究英国中心-Cancer Research UK Centre for Cancer Therapeuticsat the Institute of Cancer Research,萨顿,萨里郡,英国),Humana出版社，2004)，包括，例如单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)基因、胞嘧啶脱氨酶(cytosine daminase)、嘌呤核苷磷酸化酶、硝基还原酶和胱冬酶，如胱冬酶8。
本发明还提供了包含如上公开的嵌合受体的宿主细胞。有用的宿主细胞的非限制性实施例包括T淋巴细胞和NK细胞，它们可以是自体的或异体的(移除了或保留了内源性T细胞受体).在一具体实施方式中，所述宿主细胞是分离自癌症患者的自体T淋巴细胞。在一具体实施方式中，此类自体T淋巴细胞经离体活化或扩增。
本发明的嵌合受体可通过本领域已知的任何方法引入该宿主细胞。特别有用的方法的非限制性实施例包括逆转录病毒转导、慢病毒转导以及DNA和mRNA电穿孔。如下实施例所证实的，mRNA电穿孔导致本发明嵌合受体在T淋巴细胞中有效表达。描述逆转录病毒转导的文献示例包括：Anderson等，美国专利号5,399,346；Mann等，Cell 33:153(1983)；Temin等，美国专利号4,650,764；Temin等，美国专利号4,980,289；Markowitz等，J.Virol.62:1120(1988)；Temin等，美国专利号5,124,263；国际专利公布号WO 95/07358，公布于1995年3月16日，Dougherty等；以及Kuo等，Blood 82:845(1993)。国际专利公布号WO 95/07358描述了原代B淋巴细胞的高效转导。可采用的逆转录病毒转导和mRNA电穿孔的具体技术的实例还可参见以下实施例部分。
宿主细胞活化和扩增通常用于将病毒载体整合进基因组并表达编码本发明嵌合受体的基因。然而，如果使用了mRNA电穿孔，不需要活化或扩增(虽然电穿孔在活化细胞中更有效)。作为病毒转导的结果，宿主细胞(T淋巴细胞或NKT细胞)长时间表达本发明的嵌合受体，从而可能提供比mRNA电穿孔更强的效果，mRNA电穿孔时受体是瞬间表达的(通常3-5天)。然而，病毒转导复杂、昂贵且难以实施，而mRNA电穿孔简单很多且更容易实施。另外，如果存在潜在的毒性，那瞬间表达是有利的且因可能的副作用其应该在临床检测初期有用。
本发明的药物组合物
本发明的另一方面提供了药物组合物。在一实施方式中，本发明提供了药物组合物，其包含(i)编码本发明的嵌合受体的多核苷酸或包含此类多核苷酸的载体，和(ii)药学上可接受的载体或赋形剂。
在另一实施方式中，本发明提供了一种药物组合物，其包含(i)包含本发明嵌合受体的宿主细胞和(ii)药学上可接受的载体或赋形剂。在一具体实施方式中，该药物组合物进一步包含能对癌症细胞产生细胞毒性的单克隆抗体(如，利妥昔单抗、曲妥珠单抗、hul4.18K322A等)或另一种包含Fc部分的抗肿瘤分子(例如，由结合肿瘤表面受体的配体(如细胞因子、免疫细胞受体)与免疫球蛋白的Fc-部分或包含Fc的DNA或RNA构成的复合分子)。
用于本发明药物组合物的适宜赋形剂可以是本领域技术人员所熟知的，可，例如，包括组织培养基(例如用于细胞离体存活)或生理盐水溶液(例如，当将细胞注射给患者时)。药学上可接受的赋形剂的透彻讨论可在《雷明顿药学科学》(Remington'sPharmaceutical Sciences)(马克出版社，新泽西州1991)中获得。
必要时，本发明药物组合物还可包含一种或多种额外的活性化合物，用于正在接受治疗的适应症，较佳地，是具有互补作用且不负面影响彼此的活性化合物。可能的额外活性化合物的非限制例子包括，例如，IL2以及在组合疗法的讨论中列出的各种试剂。
本发明的治疗方法
本发明的嵌合受体赋予T淋巴细胞抗体依赖性细胞毒性(ADCC)性能并增强NK细胞中的抗体依赖性细胞毒性。当所述受体与结合于肿瘤细胞的抗体(或另一包含Fc部分的抗肿瘤分子)接合，它会触发T细胞活化、持续扩增和该抗体(或包含Fc部分的此外其它抗肿瘤分子)所靶向的癌细胞的特异性细胞毒性。如下面实施例部分公开的，包含本发明的受体的T淋巴细胞对广泛的肿瘤细胞类型具有高细胞毒性，包括B细胞淋巴瘤、乳腺癌、胃癌、神经母细胞瘤和骨肉瘤，以及原发性慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。细胞毒性完全依赖于结合于靶细胞的特异性抗体的存在：可溶性抗体不引起裂解颗粒的胞吐并不引起非特异性细胞毒性。CD 16与Ig的Fc部分的亲和力是ADCC进而对抗体免疫治疗的临床反应的关键决定因素。具有158V多态性的CD 16选为例子；该变体对Ig具有高亲和力且介导优越的ADCC。
由于一种受体能够用于多种癌症细胞类型，本发明的嵌合体受体促进T细胞疗法。它还允许同时靶向多种抗原，考虑到肿瘤利用的免疫逃脱机制，该策略最终可能有利(Grupp等，N.Engl.J.Med.2013；368(16):1509-1518)。无论何时需要，通过简单停止施用抗体，可停止抗体导向的细胞毒性。因为表达本发明嵌合受体的T细胞只被结合于靶细胞的抗体激活，未结合的免疫球蛋白对注入的T细胞不应有任何刺激。通过使用mRNA电穿孔以瞬时表达嵌合受体以限制任何潜在的自体免疫反应性，可以进一步提高临床安全性。
下面在实施例部分中披露的结果表明自体T细胞的注入(用本发明嵌合受体作基因修饰后经离体活化和扩增以及重新注入)应该显著促进ADCC。因为组合的CD3ζ/4-lBB信号传导也引起T细胞增殖，在肿瘤部位应该有活化T细胞的积累，可能进一步增强它们的活性。
因此，在一实施方式中，本发明提供用于提高有此需要的个体中癌症的基于抗体免疫疗法的疗效的方法，所述个体正在接受抗体的治疗，该抗体可以结合于癌细胞并具有可结合于人CD16的人源化Fc部分，所述方法包括往所述个体中引入治疗有效量的T淋巴细胞或NK细胞，该T淋巴细胞或NK细胞包含本发明的嵌合受体。
在另一实施方式中，本发明提供了提高个体中T淋巴细胞或NK细胞ADCC活性的方法，包括给所述个体施用T淋巴细胞或NK细胞，该T淋巴细胞或NK细胞包含本发明的嵌合受体。在一实施方式中，所述个体患有癌症。在一具体实施方式中，该个体正在接受能结合癌细胞的抗体治疗。
在上述方法的一实施方式中，所述T淋巴细胞或NK细胞是分离自个体的自体T淋巴细胞或NK细胞。在一特定实施方式中，在重新引入个体之前，所述自体的T淋巴细胞或NK细胞离体活化和/或扩增。在另一实施方式中，T淋巴细胞或NK细胞是同种异体T淋巴细胞或NK细胞。在一具体实施方式中，T淋巴细胞是同种异体T淋巴细胞，其中内源性T细胞受体的表达被抑制或消除。在一具体实施方式中，在引入个体之前，同种异体T淋巴细胞离体活化和/或扩增。T淋巴细胞可以用本领域任何已知的方法活化，例如，在抗-CD3/CD28、IL-2和/或植物凝集素存在下。NK细胞可以用本领域任何已知的方法活化，例如，在一个或多个选自下组的试剂存在下：CD 137配体蛋白、CD 137抗体、IL-15蛋白、IL-15受体抗体、IL-2蛋白、IL-12蛋白、IL-21蛋白和K562细胞系。参见，例如，美国专利号7,435,596和8,026,097中描述的扩增NK细胞的有用方法。
在上述方法的一实施方式中，通过逆转录病毒转导、慢病毒转导或DNA或RNA电穿孔将所述嵌合受体引入T淋巴细胞或NK细胞(例如，在离体活化和/或扩增后)。
在上述方法的一实施方式中，将T淋巴细胞或NK细胞引入(或重新引入)个体中，然后给个体施用治疗有效量的IL-2。
本发明的嵌合受体可用于治疗任何癌症，包括但不限于，腺癌、淋巴瘤、肉瘤、母细胞瘤和白血病，对于这些疾病，存在或能产生具有与CD16结合的Fc部分的特异性抗体。可以用本发明的嵌合受体治疗的癌症的具体非限制性例子包括，例如，B细胞来源的癌症(例如，B系急性淋巴细胞性白血病、B细胞慢性淋巴细胞性白血病和B细胞非霍奇金淋巴瘤)、乳腺癌、胃癌、神经母细胞瘤、骨肉瘤。
可通过本发明方法提高其疗效并包含可结合人CD16的抗癌抗体的非限制性例子包括，例如，利妥昔单抗、曲妥珠单抗、hul4.18K322A、依帕珠单抗、西妥昔单抗和拉贝珠单抗(Labetuzumab)。
所用抗体的适当剂量将取决于要治疗的癌症类型、疾病的严重程度和病程、之前的治疗方法、病人的临床病史及对抗体的反应和主治医生的判断。可以一次性或通过一系列的治疗向病人施用所述抗体。可以简单地通过传统的技术及试验监测本发明所述治疗的进展。
可以用任何合适的路线施用抗体，包括，全身用药以及向疾病部位(例如，对原发性肿瘤)直接施用。
本发明所述方法中使用的T淋巴细胞最好是病人自己的细胞(即，自体细胞)，这些细胞早先用标准方法从血液样本中分离且优选经离体活化和扩增(例如，3-5天)，例如，抗-CD3/CD28珠、IL-2或植物凝集素等。或者，可以使用同种异体T淋巴细胞(较佳地，其中内源性T细胞受体的表达被抑制或消除的同种异体T淋巴细胞)。See Torikai等，Blood,2012119:5697-5705。分离后(和任选的活化和/或扩增)，来自病人的T淋巴细胞及NK细胞用编码本发明嵌合受体的多核苷酸(或包含此类多核苷酸的载体)转导，从而所述嵌合受体在T细胞或NK细胞的细胞表面表达。然后被修饰的细胞可施用于患者(例如，治疗性抗体注入后1天)。
根据本发明，患者可以通过输注治疗有效剂量(在每公斤体重约105至1010的范围内或更多的细胞(细胞/千克))的包含本发明嵌合受体的T淋巴细胞或NK细胞来治疗。只要患者可以耐受，可以经常或多次重复输注直至达到所需的反应。病人不同，适宜的输注剂量和安排也不同，但可以由主治医生为特定病人决定。通常情况下，会输注大约106细胞/Kg的初始剂量，逐步上升到108或更多细胞/Kg。输注后可以共同施用IL-2来扩增输注的细胞。IL-2的量可为约1-5x 106国际单位每平方米身体表面积。
本发明所述方法中使用的NK细胞可通过暴露于细胞优先扩增，该细胞缺乏主要组织相容性复合物I和/或II分子或表达不佳以及已经被基因修饰以表达结合于膜的IL-15和4-IBB配体(CDI37L)。此类细胞系包括，但不是必须限于K562[ATCC、CCL 243；Lozzio等，Blood 45(3):321-334(1975)；Klein等，Int.J.Cancer 18:421-431(1976)]，和Wi lms肿瘤细胞系HFWT，[Fehniger T A,Cal igiuri M A.Int Rev Immunol 20(3-4):503-534(2001)；Harada H,等，Exp Hematol 32(7):614-621(2004)]，子宫内膜肿瘤细胞系HHUA、黑色素瘤细胞系HMV-II型、肝母细胞瘤细胞系HuH-6、肺小细胞癌细胞株Lu-130和Lu-134-A、神经母细胞瘤细胞系NB 19和N1369，来自睾丸NEC 14的胚胎性癌细胞，宫颈癌细胞系TCO-2以及骨髓转移神经母细胞瘤细胞系TNB 1[Harada H.,等，Jpn.J.Cancer Res 93:313-319(2002)]。较佳地，所用的细胞系缺乏MHC I和II分子或表达不佳，如K562和HFWT细胞株。可采用固体支持物来代替细胞系。较佳地，此类支持物应在其表面附有至少一种分子，该分子能结合NK细胞和诱导初级活化事件和/或增殖反应或能够结合具有此类作用的分子，藉此用作支架。该支持物可在其表面附有CD 137配体蛋白、CD 137抗体、IL-15蛋白或IL-15受体抗体。较佳地，该支持物在其表面结合有IL-15受体抗体和CD 137抗体。
本发明的组合疗法
本发明描述的组合物和方法可与其他种类的癌症治疗方法，如化疗、手术、辐射、基因治疗等联用。此类疗法可与本发明的免疫疗法同时或按顺序(按任何顺序)实施。
当与额外的治疗剂联合给药，因其相加作用或协同作用可降低各试剂的适宜的有效治疗剂量。
本发明的治疗可以结合其它免疫调节治疗，例如治疗性疫苗(包括但不限于GVAX、DC疫苗等)、检查点抑制剂(包括但不限于阻断CTLA4、PD1、LAG3、TIM3等的试剂)或活化剂(包括但不限于增强41BB、OX40等试剂)。
可与本发明免疫疗法联用的其它治疗剂的非限制性例子包括：
(i)抗血管生成试剂(例如，TNP-470，血小板因子4、血小板反应蛋白-1、金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP1和TIMP2)、催乳素(16-Kd片段)、血管抑素(血纤维蛋白溶酶原38-Kd片段)、内皮抑素、bFGF可溶性受体、转化生长因子β、干扰素α、可溶性KDR和FTL-1受体、胎盘增殖蛋白相关的蛋白，以及Carmeliet and Jain(2000)中所列举的那些)；
(ii)VEGF拮抗剂或VEGF受体拮抗剂，如抗VEGF抗体、VEGF变体、可溶性VEGF受体片段、能够阻断VEGF或VEGFR的适体、中和性抗VEGFR抗体、VEGFR酪氨酸激酶抑制剂、及其任何组合；
(iii)化疗化合物，例如，嘧啶类似物(5-氟尿嘧啶、氟尿苷、卡培他滨、吉西他滨和阿糖胞苷)、嘌呤类似物、叶酸拮抗剂和相关抑制剂(巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、喷妥司汀和2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨))；抗增殖/抗有丝分裂剂，包括天然产物，如长春花生物碱(长春花碱、长春新碱、长春瑞滨)，微管干扰素，如紫杉烷(紫杉醇、多西紫杉醇)、长春新碱、长春花碱、诺考达唑、埃坡霉素和长春瑞滨，表鬼臼毒素(epidipodophyllotoxins)(足叶乙甙，替尼泊甙)、DNA损伤剂(放线菌素、胺苯吖啶、蒽环霉素、博莱霉素、白消安、喜树碱、卡铂、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺，环磷酰胺(Cytoxan)，放线菌素D，柔红霉素、阿霉素、表阿霉素、六亚甲基二胺、奥沙利铂、异环磷酰胺、马法兰、氮芥(merchlorehtamine)、丝裂霉素、米托蒽醌、亚硝基脲、普卡霉素(plicamycin)、甲基苄肼、紫杉醇、泰索帝、替尼泊甙、三亚乙基硫代磷酰胺和依托泊苷(vp16))；抗生素，如更生霉素(放线菌素D)、柔红霉素、阿霉素(亚德里亚霉素)，去甲氧柔红霉素、蒽环霉素、米托蒽醌、博来霉素、普卡霉素(光神霉素)和丝裂霉素；酶(L-天冬酰胺酶，其系统性代谢L-天冬酰胺和剥夺没有能力合成自身的天冬酰胺的细胞)；抗血小板药物；抗增殖/抗有丝分裂烷基化剂，如氮芥(二氯甲基二乙胺、环磷酰胺和类似物，马法兰，苯丁酸氮芥)、乙烯亚胺和甲基三聚氰胺(六甲基三聚氰胺、噻替哌)、烷基磺酸盐-白消安(卡氮芥(BCNU)和类似物，链脲菌素)，三嗪－达卡巴嗪(trazenes-dacarbazinine)(DTIC)；抗增殖/抗有丝分裂代谢物，如叶酸类似物(甲氨蝶呤)；铂配合物(顺铂、卡铂)、甲基苄肼、羟基脲、米托坦、氨鲁米特；激素、激素类似物(雌激素、三苯氧胺、戈舍瑞林、比卡鲁胺、尼鲁米特)和芳香化酶抑制剂(来曲唑，阿那曲唑)；抗凝剂(肝素、合成肝素盐和其他凝血酶抑制剂)；纤维蛋白酶溶解剂(如组织纤溶酶原激活剂、链激酶和尿激酶)、阿司匹林、双嘧达莫、噻氯匹定、氯吡格雷、阿昔单抗；抗迁移剂；抗分泌剂(布雷菲德菌素-breveldin)；免疫抑制剂(环孢霉素、他克莫司(FK 506)、西罗莫司(雷帕霉素)、硫唑嘌呤、霉酚酸酯)；抗血管生成化合物(如TNP-470、金雀异黄素、贝伐单抗)和生长因子抑制剂(如，成纤维细胞生长因子(FGF)抑制剂)；血管紧张素受体阻滞剂；一氧化氮供体；反义寡核苷酸；抗体(曲妥珠单抗)；细胞周期抑制剂和分化诱导剂(维甲酸)；mTOP抑制剂，拓扑异构酶抑制剂(多柔比星(阿霉素)、胺苯吖啶、喜树碱、柔红霉素、更生霉素、替尼泊苷(eniposide)、表阿霉素、足叶乙甙、去甲氧柔红霉素和米托蒽醌，拓扑替康，伊立替康)，糖皮质激素(可的松、地塞米松，氢化可的松、甲基强的松龙(methylpednisolone)、泼尼松和氢化波尼松(prenisolone))；生长因子信号转导激酶抑制剂；线粒体功能障碍诱导剂和半胱天冬酶活化剂；和染色质干扰素。
其它的有用试剂示例也可参见《医师案头参考》(Physician's Desk Reference),第59.版,(2005),Thomson P D R,蒙特威尔，N.J.；Gennaro等编，《雷明顿药学科学和实践》(Remington's The Science and Practice of Pharmacy)第20版,(2000),利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司，巴尔的摩，马里兰州；Braunwald等编.《哈里森内科原理》(Harrison's Principles of Internal Medicine),第15版,(2001),麦格劳-希尔集团，纽约；Berkow等编，默克诊断和治疗手册(The Merck Manual of Diagnosis and Therapy)，(1992)，默克研究实验室，拉威，新泽西州。
不作进一步阐述，应相信，基于上述描述，本领域技术人员可在完整的范围内利用本发明。因此，以下具体实施方式应视为仅仅是说明性的，而非以任何方式限制本发明的其余部分。出于本文引用的目的或主题，本文所引的所有出版物通过引用纳入。
实施例
也借助下列实施例描述和说明本发明。然而，利用这些实施例和说明书任意地方的其他实施例只是说明性的，绝非要限制本发明或任何示例性术语的范围和意义。同样地，本发明不限于任何在此描述的特定优选实施方案。事实上，在阅读本说明书后，本发明的多种修饰和变化对本领域技术人员是明显的，并且可不脱离本发明的实质或范围来作出此种变化。
材料和方法
细胞
人B系淋巴瘤细胞系Daudi和Ramos，T细胞急性淋巴细胞白血病细胞系Jurkat，和神经母细胞瘤细胞系CHLA-255、NB1691和SK N SH获自圣朱迪儿童研究医院(St.Jude Children's Research Hospital)。乳腺癌细胞系MCF-7(ATCC HTB-22)，SK-BR-3(ATCC HTB-30)和骨肉瘤细胞系U-2OS(ATCC HTB-96)获自美国典型培养物保藏中心(ATCC；罗克维尔，MD)；胃癌细胞系MKN7来自国家生物医学创新研究所(大阪，日本)。Daudi、CHLA-255、NB1691、SK-N-SH、SK-BR-3、MCF-7、U-2OS和MKN7也用含荧火虫荧光素酶基因的小鼠干细胞病毒(MSCV)-内部核糖体进入位点(IRES)-绿色荧光蛋白(GFP)逆转录病毒载体转导(藤崎等，Cancer Res.，2009；69(9)：4010-4017)。通过FACSAria细胞分选仪(BD生物科学公司-BDBiosciences，圣何塞，加利福尼亚州)选择转导细胞的绿色荧光蛋白表达情况。来自新诊断的并未治疗的B慢性淋巴细胞性白血病(CLL)患者的外周血或骨髓样本经知情同意和经管理新加坡国立大学医院的特定领域伦理委员会批准获得。
外周血样品来自健康成年献血者血小板捐献物的去识别化副产品。单核细胞通过离心富集在Accu-Prep人淋巴细胞细胞分离介质上(ACS公司-Accurate Chemical&Scientific Corp.,韦斯特伯里，纽约)，并用抗-CD3/CD28珠(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)在含10％胎牛血清(FBS)、抗生素、100 IU白细胞介素(IL)-2(罗氏，曼海姆，德国)的RPMI-1640中培养3天。在第4天，用CD14、CD16、CD19、CD36、CD56、CD123和CD235a抗体和磁珠的混合物作阴性选择来纯化T细胞(全T细胞分离试剂盒II；MB公司-MiltenyiBiotec，贝尔吉施格拉德巴赫，德国)(纯度>98％)。纯化的T细胞保存在上述介质中，每隔一天加入100IU的IL-2。
质粒、病毒产生和基因转导
pMSCV-IRES-GFP、pEQ-PAM3(-E)和pRDF获自圣朱迪儿童研究医院载体开发和生产共享资源(孟菲斯，田纳西州)。FCRG3A CDNA获自Origene公司(罗克维尔，马里兰州)，其V158F变体使用引物"F"CTTCTGCAGGGGGCTTGTTGGGAGTAAAAATGTGTC(SEQ ID NO.:7)和"R"GACACATTTTTACTCCCAACAAGCCCCCTGCAGAAG(SEQ ID NO.:8)，通过PCR定点诱变生成。编码CD8α铰链区和跨膜区的多核苷酸(SEQ ID NO.:11)，4-1BB(SEQ ID NO.:12)和CD3ζ(SEQ IDNO︰13)胞内区从先前制备的抗-CD19-41BB-CD3ζCDNA亚克隆得到。参见Imai等，Leukemia2004；18:676-684。这些分子通过PCR重叠延伸而剪接组装。将构建体("CD16F-BB-ζ"和"CD16V-BB-ζ")和表达盒亚克隆入MSCV-IRES-GFP载体的EcoRI和MLul位点。
为了生成RD114-假逆转录病毒，利用fuGENE 6或X-tremeGENE 9(罗氏，印第安纳波利斯，印第安纳州)，用3.5μg编码CD16V-BB-ζ的CDNA、3.5μg pEQ-PAM3(-E)和3μg pRDF转染3x106 293T细胞(Imai等，Leukemia 2004；18:676-684)。在24小时时用含10％FBS的RPMI-1640替换培养基，在48-96小时后得到含有逆转录病毒的培养物，并将其加到包被有RetroNectin(TakaRa，大津，日本)的聚丙烯试管中，在1400g下离心10分钟，在37℃温育6小时。在离心分离并除去上清液后，将T细胞(1×105)加到试管中，在37℃下放置24小时。细胞在含有FBS、抗生素和100IU/mL IL-2的RPMI-1640中保存直到试验时间(转导后7-21天)。
通过使用R-藻红蛋白偶联的抗人CD16(克隆B73.1，BDBP公司-BD BiosciencesPharmingen，圣地亚哥，加利福尼亚州)的流式细胞仪分析CD16的表面表达。将2x107T细胞在含有1％蛋白酶抑制剂混合物(西格玛公司-Sigma)和1％磷酸酶抑制剂混合物2(西格玛公司)的Cellytic M裂解缓冲液(西格玛公司，圣路易斯，密苏里州)中裂解，以用于蛋白质免疫印迹。离心后，在有或没有还原缓冲液(英杰公司)存在下，裂解上清液用等体积的LDS缓冲液(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)煮沸，然后用NuPAGE Novex 12％Bis-Tris凝胶(英杰公司)分离。蛋白质被转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，然后用小鼠抗人CD3ζ(克隆8D3；BDBP公司-BD eBioscience Pharmingen)温育，然后用山羊抗小鼠IgG辣根过氧化物酶偶联的二抗(细胞信号传导技术公司Cell Signal ing Technology，丹弗斯，马萨诸塞州)温育。通过使用Amersham ECL Prime检测试剂(GE医疗集团)揭示抗体结合。
mRNA电穿孔
pVAX1载体(英杰公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)被用作体外mRNA转录的模板。将CD16V-BB-ζCDNA亚克隆到pVAX1的EcoRI和Xbal位点。利用T7 mScript mRNA生产系统(CS公司-CellScript，麦迪逊，威斯康星州)在体外转录相应的mRNA。参见，例如Shimasaki等，Cytotherapy，2012；14(7)︰830-40。
电穿孔法使用了Amaxa Nucleofector(隆萨公司-Lonza，沃克斯维尔，马里兰州)。用细胞系核转染试剂盒V(Cell Line Nucleofector Kit V，隆萨公司)混合用200IU/mLIL-2过夜活化的1x 107纯化的T细胞与200μg/mL mRNA，转入处理室，并采用程序X-001转染。电穿孔后立即将细胞从处理室转入24孔板、然后在含有FBS、抗生素和100IU/mL IL-2(罗氏，曼海姆，德国)的RPMI-1640中培养。也参见Shimasaki等，Cytotherapy，2012，1-11。
抗体结合、细胞接合和细胞增殖试验
为了测量嵌合受体的抗体结合能力，4℃下，将经嵌合受体或只含GFP的载体转导的T淋巴细胞(5×105)与利妥昔单抗(美罗华，罗氏；0.1-1μg/mL)、曲妥珠单抗(赫赛汀；罗氏；0.1-1μg/mL)和/或纯化的人IgG(研发系统公司-R&D Systems，明尼阿波利斯，明尼苏达州；0.1-1μg/mL)温育30分钟。磷酸盐缓冲盐(PBS)洗涤两次后，将细胞与山羊抗人IgG-PE(SBA公司-Southern Biotechnology Assoc iates，伯明翰，阿拉巴马州)在室温下温育10分钟，使用Accuri C6流式细胞仪(BD生物科学公司-BD Biosciences)检测细胞染色。
为了确定与受体结合的抗体是否促进细胞聚集，用CellTrace钙黄绿素红－橙AM(英杰公司)标记CD20阳性Daudi细胞，然后与利妥昔单抗(0.1μg/mL)在4℃下温育30分钟。PBS洗涤两次后，细胞与用嵌合受体转导或模拟转导的Jurkat细胞在37℃下在96圆底平板(Costar，康宁，NY)中以1:1E:T比例温育60分钟。用流式细胞仪检测形成异源细胞聚集体(钙黄绿素AM-GFP双阳性)的细胞比例。
为了检测细胞增殖，将经嵌合受体转导或模拟转导的1×106T细胞置于24孔板(Costar，康宁，纽约)的含FBS、抗生素和50IU/mL IL-2的RPMI 1640中的孔中。Daudi细胞用Streck细胞防腐剂(斯特雷克实验室-Streck Laboratories，奥马哈，内布拉斯加州)处理来结束增殖，并用利妥昔单抗(0.1 g/mL)在4℃下标记30分钟。将它们在0、7、14和21天以与T细胞呈1：1的比例加入各孔。培养后存活的T细胞数目n用流式细胞仪检测。
CD107脱粒和细胞毒性试验
为了测定CD 16交联是否引起裂解颗粒胞吐作用，嵌合受体转导和模拟转导的T细胞(1×105)置于利妥昔单抗包被的96孔平底板的每一个孔中并在37℃下培养4小时。在其他实验中，T细胞与经利妥昔单抗预培养的Daudi细胞共同培养。在开始培养时添加藻红蛋白偶联的抗人CD107a抗体(BD生物科学公司)，一个小时后加入GolgiStop(0.15μl；BD生物科学公司)。通过流式细胞仪分析CD 107a阳性T细胞。
为了测试细胞毒性，将靶细胞悬浮在含10％FBS的RPMI 1640中，用钙黄绿素AM(英杰公司)标记并置于96孔圆底板(Costar)。T细胞以结果中显示的不同E:T比例添加，并在有或没有抗体利妥昔单抗(美罗华，罗氏公司)，曲妥珠单抗(赫赛汀，罗氏公司)或hul4.18K322A(获自James Allay博士，圣朱迪儿童研究医院GMP，孟斐斯，田纳西州；1μg/mL)存在下与靶细胞共同培养4小时。培养结束时，收集细胞，重悬于相同体积的PBS中，加入碘化丙啶。存活的靶细胞数目(钙黄绿素AM-阳性，碘化丙啶阴性)用Accuri C6流式细胞仪计算(藤崎等，Cancer Res.2009；69(9):4010-4017)。对贴壁细胞系，细胞毒性用荧光素酶标记的靶细胞测试。为了检测对贴壁细胞系NB1691、CHLA-255、SK-BR-3、MCF-7、U-2OS和MKN7的细胞毒性，采用它们的荧光素酶标记衍生物。涂布至少4小时后，如上述描述的，加入T细胞。共同培养4小时后，将Promega Bright-Glo荧光素酶试剂(普洛迈格公司-Promega，麦迪逊，威斯康星州)添加到每个孔中；5分钟后，用板阅读器Biotek FLx800(BioTek，图森，亚利桑那州)检测荧光并用Gen5 2.0数据分析软件进行分析。
异种移植实验
给NOD.Cg-Prkdcscid IL2rgtmlWjl/SzJ(NOD/scid IL2RGnull)小鼠(杰克逊实验室-Jackson Laboratory，巴尔港)腹膜内注射表达荧光素酶的Daudi细胞(i.p.；0.3x 106细胞每小鼠)。一些小鼠在Daudi接种后通过腹膜内接受利妥昔单抗(100μg)四天，在第5天和第6天腹膜内注射或不注射人原代T细胞。T细胞用抗-CD3/CD28珠活化3天，经CD16V-BB-ζ受体转导，重悬于RPMI1640+10％FBS并随后以每小鼠lx 107细胞注射。每周重复注射利妥昔单抗，4周，不进一步注射T淋巴细胞。所有的小鼠接受腹膜内注射1000-2000IU的IL-2，每周两次，共四周。一组小鼠接受组织培养介质，而非利妥昔单抗或T细胞。
利用Xenogen IVIS-200系统(CLS公司-Caliper Life Sciences，霍普金顿，马萨诸塞州)测量肿瘤植入和增长。腹膜内注射D-荧光素钾盐(3毫克/小鼠)水溶液5分钟后开始成像，表达荧光素酶的细胞发出的光子用Living Image 3.0软件定量测定。
结果
CD16V-BB-ζ受体的表达
FCRG3A(CD16)的V158多态性，在约四分之一的个体中表达，编码高亲和免疫球蛋白Fc受体并与对抗体疗法的良好反应相关(25，26，29-31)。生成FCGR3A基因的V158变体。其与CD8α的铰链区和跨膜区、T细胞刺激分子CD3ζ和共刺激分子4-1BB组合(图1A)。Imai等，Leukemia 2004；18:676-684。用含CD16V-BB-ζ构建物和GFP的MCSV逆转录病毒载体转导来自12个献血者的外周血T淋巴细胞：CD3+细胞的中值GFP表达为89.9％(75.3％-97.1％的范围)；在相同细胞中，由抗-CD16染色评估的中值嵌合受体表面表达是83.0％(67.5％-91.8％)(图1B)。经只含GFP的载体转导的来自相同献血者的T淋巴细胞的中值GFP表达为90.3％(67.8％-98.7％)，表达的CD 16却只有1.0％(0.1％-2.7％)(图1B)。CD4+和CD8+T细胞之间受体的表达无显著差异：69.8％±10.8％CD4+细胞为经CD16V-BB-ζ转导后的CD 16+，相比之下CD8+细胞为77.6％±9.2％(图2)。
为了保证表达嵌合受体的其他成分，CD3ζ的表达水平用流式细胞术进行测定。如图1B所示，CD16V-BB-ζ转导的T淋巴细胞中CD3ζ表达水平远高于模拟转导细胞：前者的平均荧光强度的平均值(±SD)为45,985±16,365，后者为12,547±4,296(P＝0.027，经t检测；n＝3；图1B)。也通过蛋白印迹法，用抗CD3ζ抗体探测测定嵌合蛋白的存在。如图1C所示，除了16kDa的内源性CD3ζ，CD16V-BB-ζ-转导的T淋巴细胞在还原条件下还表达约25kDa的嵌合蛋白。在非还原条件下，CD16V-BB-ζ蛋白被证明以单体或50kDa的二聚体形式表达。
V158与F158 CD16受体的抗体结合能力比对
为了测试CD16V-BB-ζ嵌合受体对免疫球蛋白(Ig)的结合力，转导来自3个献血者的外周血T淋巴细胞。如图3A所示，用利妥昔单抗温育后，用抗体包被表达CD16V-BB-ζ的T淋巴细胞。用曲妥珠单抗和人IgG得到类似的结果。
随后比较包含FCRG3A(CD16)的高亲和V158多态性的CD16V-BB-ζ受体的Ig-结合能力与包含F158变体代替("CD16F-BB-ζ")的相同受体相比。用任一受体转导Jurkat细胞后，它们用利妥昔单抗和抗人Ig PE抗体(结合利妥昔单抗)温育，PE荧光强度与GFP的荧光强度相关。如图3B所示，在任何给定的GFP水平，经CD16V-BB-ζ受体转导的细胞与经CD16F-BB-ζ受体转导的细胞相比具有较高的PE荧光强度，表明前者有明显更高的抗体亲和力。曲妥珠单抗和人IgG也与CD16V-BB-ζ受体以较高的亲和力结合(图4)。
为了测定结合于CD16V-BB-ζ受体的抗体是否可以促进效应子和靶细胞的聚集，将表达CD16V-BB-ζ(和GFP)的Jurkat细胞与CD20+Daudi细胞(钙黄绿素AM红-橙标记)以1：1的比例混合60分钟，添加或不添加利妥昔单抗来检测GFP-钙黄绿素双联体的形成。在3个实验中，如果Jurkat细胞表达CD16V-BB-ζ受体且存在利妥昔单抗，共同培养结果39.0％±1.9％为双联体(图3C和D)。相比之下，用人IgG而非利妥昔单抗，或用模拟转导Jurkat细胞(不论利妥昔单抗是否存在)，有<5％双联体。
将IgG结合于CD16V-BB-ζ诱导T细胞活化、脱粒和细胞增殖
评估了固定化抗体交联的CD16V-BB-ζ受体是否能够诱导T淋巴细胞的活化信号。事实上，当在包被有利妥昔单抗的板上培养时，CD16V-BB-ζ转导的T淋巴细胞显著提高了IL-2受体的表达(CD25)，而不存在抗体时或模拟转导细胞(不论抗体是否存在)中没有检测到变化(图5A和B)。
除了表达IL-2受体，用CD 107a染色法还检测到交联CD16V-BB-ζ受体触发T淋巴细胞中裂解颗粒的胞吐。因此，在6个试验中，其中来自4个献血者的T淋巴细胞要么接种于包被有利妥昔单抗(n＝3)的微量滴定板上要么在利妥昔单抗(n＝3)存在下与Daudi细胞共同培养，表达CD16V-BB-ζ的T淋巴细胞成为CD107a阳性(图5C)。
最后，确定了是否受体交联能诱导细胞增殖。如图5D所示，表达CD16V-BB-ζ的T淋巴细胞在利妥昔单抗和Daudi细胞(以与T淋巴细胞1：1的比例)存在下扩增：在3个实验中，培养7天后平均T细胞恢复为输入细胞的632％(±97％)；培养4周后，为6877％(±1399％)。值得注意的是，在没有靶细胞存在下，未结合的利妥昔单抗即使在很高的浓度(1-10μg/ml)下，对细胞增殖无显著影响，且若没有利妥昔单抗或在模拟转导T细胞中，不论是否存在抗体和/或靶细胞，均不发生细胞生长(图5D)。因此，CD16V-BB-ζ受体交联诱导导致持续增殖的信号。
表达CD16V-BB-ζ的T淋巴细胞介导体外和体内的ADCC
观察到CD16V-BB-ζ交联引起裂解颗粒的胞吐暗示了CD16V-BB-ζT淋巴细胞在特异性抗体存在时应可以杀伤靶细胞。事实上，在4小时的体外细胞毒性试验中，CD16V-BB-ζT淋巴细胞在利妥昔单抗存在下对B细胞淋巴瘤细胞系Daudi和Ramos具有高细胞毒性：超过50％的靶细胞通常在以2:1E:T比例下共同培养4小时后裂解(图6和图7)。相比之下，不存在抗体时或在模拟转导的T细胞中，靶细胞杀伤是低的(图6和图7)。值得注意的是，这些实验使用的效应细胞富含CD3+T淋巴细胞(>98％)且和没有检出的CD3-CD56+NK细胞。利妥昔单抗介导的CD16V-BB-ζT淋巴细胞也明显对CD20+原发性CLL细胞(n＝5)有细胞毒性；如图6B所示，在以2:1E:T比例下共同培养4小时后细胞毒性通常超过70％。骨髓间充质基质细胞已被证明发挥免疫抑制作用(Jefferis,Nat.Rev.Drug Discov.2009；8(3):226-234；Clemenceau等，Blood 2006；107(12):4669-4677)。为了测试是否这会影响CD16V-BB-ζT淋巴细胞的细胞毒能力，将它们与CLL细胞在有骨髓源性间充质基质细胞存在下以1:2E:T的比例共同培养24小时。如图6C所示，间充质细胞并不能减少ADCC介导淋巴细胞的杀伤能力。
接下来，测定了是否不同的免疫治疗抗体可触发对表达相应抗原的肿瘤细胞的类似细胞毒性。因此，CD16V-BB-ζT淋巴细胞对表达HER2(乳腺癌细胞系MCF-7和SK-BR-3以及胃癌细胞系MKN7)或GD2(神经母细胞瘤细胞株CHLA-255、NB1691和SK-N-SH，和骨肉瘤细胞系U2-OS)的实体瘤细胞的细胞毒性进行了测试。曲妥珠单抗被用来靶向HER2和hul4.18K322A被用来靶向GD2。CD16V-BB-ζT淋巴细胞在有相应抗体存在下对这些细胞是高细胞毒性的(图6和图7)。在NB1691实验中，也测试了通过延长培养至24小时是否能以甚至更低的E:T比例获得细胞毒性。如图8所示，在hul4.18K322A存在下以1:8的比例，细胞毒性超过50％。为进一步测试CD16V-BB-ζ介导的细胞杀伤的特异性，培养CD20+Daudi细胞与CD16V-BB-ζT淋巴细胞和不同特异性的抗体：只有利妥昔单抗介导细胞毒作用，而在曲妥珠单抗或hul4.18K322A存在时细胞毒性没有提高(图8)。最后，检测了在免疫治疗抗体存在下，CD16V-BB-ζ介导的细胞杀伤是否可以被未结合的单体IgG抑制。如图8所示，即使IgG以比细胞结合的免疫治疗抗体浓度高最多1000倍的浓度存在，T细胞细胞毒性是不会受影响。
为了测量CD16V-BB-ζT淋巴细胞体内的抗肿瘤能力，利用移植有荧光素酶标记的Daudi细胞的NOD/scid IL2RGnull小鼠进行实验。用接受CD16V-BB-ζT淋巴细胞和利妥昔单抗的小鼠活体成像来检测肿瘤的生长，将它们的结果与单独接受利妥昔单抗或T淋巴细胞的或不治疗的结果比较。如图9所示，所有小鼠中肿瘤细胞扩增，除了那些先后接受利妥昔单抗和CD16V-BB-ζT淋巴细胞的小鼠。接受该组合的全部5只小鼠在肿瘤注射后大于120天仍然处于消退期，相比之下，未接受治疗或单独接受抗体或细胞治疗的12只小鼠中无一处于消退期。在移植了神经母细胞瘤细胞系NB1691并用hul4.18K322A与CD16V-BB-ζT淋巴细胞治疗的小鼠中观察到了很强的抗肿瘤活性(图10)。
比较CD16V-BB-ζ和其它受体
比较了含有CD16V-BB-ζ或CD16F-BB-ζ受体的T细胞的功能。与低亲和力的CD16F-BB-ζ受体相比，CD16V-BB-ζ受体诱导明显更高的T细胞增殖和ADCC，与它们对IgG更高的亲和力一致(图11)。
接下来，比较了含有CD16V-BB-ζ的T细胞与表达具有不同信号传导特性的其它受体的T细胞的功能。这些包括没有信号传导能力的受体(“CD16V-截短”)，含有CD3ζ但没有4-1BB(“CD16V-ζ”)的，以及先前描述的CD16V与FcεRIγ跨膜区和胞浆区结合的受体(“CD16V-FcεRIγ”)(Jefferis,Nat.Rev.Drug Discov.2009；8(3):226-234；Clemenceau等，Blood2006；107(12):4669-4677)(图12)。逆转录病毒转导后，在活化T细胞中所有受体被高表达(图13)。如图14所示，与所有其它构建体相比，CD 16V-ΒΒ-ζ诱导明显更高的活化、增殖和特定的细胞毒性。
用mRNA电穿孔表达CD16V-BB-ζ受体
在所有上述实验中，CD16V-BB-ζ表达通过逆转录病毒转导实施。测试了备选方法，mRNA电穿孔，是否也能赋予T淋巴细胞ADCC能力。来自2个献血者的活化T淋巴细胞进行了电穿孔并获得了高表达效率：穿孔后24小时，55％和82％的T淋巴细胞成为CD16+(图15A)。在第二献血者中，也在第三天测试了受体的表达，为43％，结果与先前的用另一个受体的实验结果类似，其中，表达持续72到96小时(藤崎等，Cancer Res.2009；69(9):4010-4017)。用CD16V-BB-ζmRNA作电穿孔的T淋巴细胞中ADCC被激活：在利妥昔单抗存在下，以2:1E:T的比例，4小时后80％的Ramos细胞被杀死，而没用mRNA作电穿孔的细胞则没有效果(图15B)。
讨论
本文描述了开发一嵌合受体，其赋予T淋巴细胞发挥ADCC的能力。当CD16V-BB-ζ受体与结合肿瘤细胞的抗体接合时，它触发T细胞的活化、持续的增殖以及对抗体靶向的癌细胞的特异性细胞毒性。CD16V-BB-ζT淋巴细胞对广泛的肿瘤细胞类型具有高度的细胞毒性，包括B细胞淋巴瘤细胞、乳腺癌细胞、胃癌细胞、神经母细胞瘤细胞和骨肉瘤细胞，以及原发性CLL细胞。细胞毒性完全依赖于和靶细胞结合的特异性抗体的存在，未结合的抗体既不激发非特异性细胞毒性，也不影响细胞结合抗体的细胞毒性。当CD16V-BB-ζT细胞在间充质细胞层培养时，它们也杀伤CLL细胞，而不管这些微环境的已知的免疫抑制的影响(Jefferis,Nat.Rev.Drug Discov.2009；8(3):226-234；Clemenceau等,Blood 2006；107(12):4669-4677)。此外，在利妥昔单抗后注入CD16V-BB-ζT淋巴细胞根除移植到免疫缺陷小鼠的B细胞淋巴瘤细胞，并在有抗GD2抗体存在下，在移植神经母细胞瘤细胞的小鼠体内具有相当大的抗肿瘤活性。总之，表达CD16V-BB-ζ的T细胞在体外和体内实现强烈的ADCC。
CD 16对免疫球蛋白Fc部分的亲和力是ADCC的关键决定因素，因此，影响抗体免疫治疗的临床反应。所以，正在做相当多的努力以进一步提高Fc片段对FcγR的亲和力，例如通过糖工程(Nimmerjahn等.,Nat.Rev.Immunol.2008；8(l):34-47,Kohrt等.,Immunotherapy 2012；4(5):511-527)。具有158V多态性的FCRG3A(CD16)基因(SEQ ID NO.:10)被用作示例来构建本发明的嵌合受体。这种变体编码对Ig具有更高亲和力的受体，并已显示介导优越的ADCC(Ferris等，J.Clin.Oncol.2010；28(28):4390-4399；Koene等，Blood1997；90(3):1109-1114；Cartron等，Blood 2002；99(3):754-758；Weng等，J.Clin.Oncol.2003；21(21):3940-3947；Dall'Ozzo等，Cancer Res.2004；64(13):4664-4669；Hatjiharissi等，Blood 2007；110(7):2561-2564；Musolino等，J.Clin.Oncol.2008；26(11):1789-1796；Bibeau等，J.Clin.Oncol.2009；27(7):1122-1129；Ahlgrimm等，Blood2011；118(17):4657-4662；Veeramani等，Blood 2011；118(12):3347-3349)。事实上，与含有更普遍F158变体的嵌合受体作边到边的比较(side-to-side comparison)，CD16V-BB-ζ对人Ig Fc具有显著更高的结合能力，诱导更强烈的增殖和细胞毒性，产生最近的研究结果，从而定位亲和力在嵌合抗原受体功能中的作用(Kono等，Cancer Res.2002；62(20):5813-5817；Delgado等，Cancer Res.2010；70(23):9554-956)。当前"第二代"嵌合受体将刺激分子与共刺激分子结合以增强信号传导和防止活化诱导的凋亡。因此，CD16V158与由CD3ζ和4-1BB(CD137)串联组成的刺激分子结合。事实上，与通过单独CD3ζ或FcεRIγ起作用的受体相比，CD16V-BB-ζ受体诱导明显更优越的T细胞活化，增殖和细胞毒性。
临床试验结果不断证实，表达识别肿瘤细胞表面抗原并可传导刺激信号的受体的遗传学改造T细胞的临床潜力(Pule等，Nat.Med.2008；14(11):1264-1270；Porter等，OncLive 2011；25；365(8):725-733；Brenjens等，Blood 2011；118(18):4817-4828；Till等，Blood 2012；119(17):3940-3950；Kochenderfer等，Blood 2012；119(12):2709-2720；Brentjens等，Sci.Transl.Med.2013；5(177):177ra138)。最值得注意的是，显著的肿瘤减少和/或完全消退在B细胞恶性肿瘤患者中有报道，这些患者接受了通过病毒转导表达针对CD19或CD20的嵌合抗原受体的自体T淋巴细胞(Porter等，OncLive 2011；25；365(8):725-733；Brenjens等，Blood 2011；118(18):4817-4828；Till等，Blood 2012；119(17):3940-3950；Kochenderfer等，Blood 2012；119(12):2709-2720；Brentjens等，Sci.Transl.Med.2013；5(177):177ra138)。将这种策略扩展至其它肿瘤需要相当大的努力，包括开发另一种嵌合抗原受体构建物，优化大规模转导条件以符合规范要求。在这方面，本文描述的CD16V-BB-ζ受体通过允许一种受体用于多种癌症细胞类型来促进T细胞疗法的实施。它还允许同时靶向多种抗原，该策略对于肿瘤利用的免疫逃逸机制最终可能是有利的，如最近的报道所揭示的，缺乏单一特异性的嵌合受体所靶向的标记物的亚克隆导致白血病复发。无论何时需要，通过简单的停止抗体施用可结束抗体导向的细胞毒性。由于表达CD 16V-ΒΒ-ζ的T细胞仅被结合于靶细胞的抗体所激活，可溶性免疫球蛋白对输注的T细胞不发挥任何刺激作用。然而，通过使用mRNA电穿孔以瞬时表达CD 16V-ΒΒ-ζ受体从而限制任何潜在的自体免疫反应性来测试该策略的临床安全性是重要的。如本文所揭示，mRNA电穿孔能非常有效地表达该受体。
抗体疗法已成为许多癌症亚型的标准疗法；其临床疗效主要取决于其通过Fc受体接合触发ADCC的能力(Ferris等.,J.Clin.Oncol.2010；28(28):4390-4399)。ADCC的主要效应子是NK细胞，但它们的功能可在癌症患者中受损。例如，据报道，与来自早期疾病患者或健康献血者样品中所得到外周血单核细胞相比，来自胃癌患者和晚期患者的外周血单核细胞的过表达HER2的胃癌细胞的曲妥珠单抗介导的ADCC显著降低。此外，反应可能受到其他因素的影响，包括NK细胞抑制受体及其配体的基因型。本发明所呈现的结果表明，输注由CD16V-ΒΒ-ζ受体作遗传学工程改造的自体T细胞应该显著提高ADCC。因为组合CD3ζ/4-lBB信号也导致T细胞增殖，在肿瘤部位应有活化T细胞的累积，这可能会进一步增强它们的活性。CD16V-ΒΒ-ζ受体不仅可在活化的T淋巴细胞中还可在休眠的外周血单核细胞中通过mRNA电穿孔表达，该过程从血液采集到CD 16V-ΒΒ-ζ表达细胞注入仅需几个小时，因此非常适合临床应用。
本发明不限于本文所述的具体实施方式的范围。事实上，前述描述中，除那些本文所描述的之外，本发明的各种修改对于那些本领域人员是显而易见的。这种修改也将落入所附权利要求的范围内。
所有专利、申请、出版物、试验方法、文献和本文所列其他材料，其全部通过引用并入本文，如同实际存在于本说明书中一样。
序列表
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Figure IDA0000967931140000021
Figure IDA0000967931140000031
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Claims (51)

1.一种嵌合受体，其包含：(a) F158 FCGR3A或V158 FCGR3A变体的胞外配体－结合区；(b) CD8α的铰链区和跨膜区；和(c) 包括4-1BB信号传导区和CD3ζ信号传导区的胞浆区，其中所述F158 FCGR3A和V158 FCGR3A变体的胞外配体－结合区分别由SEQ ID NO: 16和SEQID NO: 2所示的氨基酸序列组成。
2.权利要求1所述的嵌合受体，其中所述嵌合受体还包含CD8α的信号肽。
3.权利要求1-2任一项所述的嵌合受体，其中所述CD8α的铰链区和跨膜区由SEQ IDNO: 3所示的氨基酸序列组成。
4.权利要求1-2任一项所述的嵌合受体，其中所述4-1BB信号传导区由SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列组成。
5.权利要求1-2任一项所述的嵌合受体，其中所述CD3ζ信号传导区由SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列组成。
6.权利要求2所述的嵌合受体，其中所述CD8α的信号肽由SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列组成。
7.权利要求1所述的嵌合受体，其包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 15的所示的氨基酸序列的第22-436残基。
8.权利要求1所述的嵌合受体，其包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。
9.一种分离的多核苷酸，其包含编码权利要求1-2或6-8任一项所述的嵌合受体的核苷酸序列。
10.权利要求9所述的分离的多核苷酸，其包含 SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列。
11.权利要求9所述的分离的多核苷酸，其包含SEQ ID NO: 10 或SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列。
12.权利要求9所述的分离的多核苷酸，其包含SEQ ID NO: 11所示的核苷酸序列。
13.权利要求9所述的分离的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列。
14.权利要求9所述的分离的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列。
15.权利要求9所述的分离的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列。
16.一种载体，其包含权利要求9-15任一项所述的多核苷酸。
17.权利要求16所述的载体，其中所述多核苷酸操作性地与至少一个调控元件连接，以便表达所述多核苷酸编码的嵌合受体。
18.权利要求16或17所述的载体，其为病毒载体。
19.权利要求18所述的载体，其中所述病毒载体为逆转录病毒载体或慢病毒载体。
20.一种分离的宿主细胞，其包含权利要求1-8任一项所述的嵌合受体。
21.权利要求20所述的宿主细胞，其为T淋巴细胞 或 NK细胞。
22.权利要求21所述的宿主细胞，其中所述T淋巴细胞 或 NK细胞经离体活化和/或扩增。
23.权利要求22所述的宿主细胞，其中所述T淋巴细胞在有一种或多种选自下组的试剂存在下被活化：抗-CD3/CD28，IL-2，和植物凝集素。
24.权利要求22所述的宿主细胞，其中所述NK细胞在有一种或多种选自下组的试剂存在下被活化：CD137配体蛋白，CD137抗体，IL-15蛋白，IL-15受体抗体，IL-2蛋白，IL-12蛋白，IL-21蛋白，和K562细胞系。
25.权利要求23或24所述宿主细胞，其为分离自癌症患者的自体T淋巴细胞或自体NK细胞。
26.权利要求23或24所述宿主细胞，其为同种异体T淋巴细胞或同种异体 NK细胞。
27.权利要求26所述的宿主细胞，其中，所述同种异体T淋巴细胞中的内源性T细胞受体得到抑制或消除。
28.一种T淋巴细胞在制备增强有此需要的个体中基于抗体的癌症免疫治疗疗效的药物中的用途，所述细胞表达权利要求1－8任一项所述的嵌合受体，其中所述个体正在接受结合于癌细胞的抗体治疗，其中所述抗体具有与人CD16结合的人的或人源化的Fc部分。
29.权利要求28所述的用途，其中所述癌症选自下组：腺癌、淋巴瘤、肉瘤、母细胞瘤和白血病。
30.权利要求28所述的用途，其中所述癌症选自下组：B-细胞来源的癌症，乳腺癌，胃癌，神经母细胞瘤，骨肉瘤，肺癌，黑色素瘤，前列腺癌，结肠癌，肾细胞癌，卵巢癌，横纹肌肉瘤，白血病和霍奇金氏淋巴瘤。
31.权利要求30所述的用途，其中所述B-细胞来源的癌症选自下组：B细胞急性淋巴细胞白血病，B细胞慢性淋巴细胞白血病和B细胞非霍奇金淋巴瘤。
32.权利要求28所述的用途，其中所述抗体选自下组：利妥昔单抗，曲妥珠单抗，hu14.18K322A。
33.权利要求28-32任一项所述的用途，其中所述T淋巴细胞为分离自所述个体的自体T淋巴细胞。
34.权利要求33所述的用途，其中，在施用于个体之前，所述自体T淋巴细胞经离体活化或扩增。
35.权利要求28-32任一项所述的用途，其中所述T淋巴细胞为同种异体T淋巴细胞。
36.权利要求35所述的用途，其中所述同种异体T淋巴细胞为抑制了或消除了内源性T细胞受体表达的T淋巴细胞。
37.权利要求35所述的用途，其中，所述在施用于个体之前，所述同种异体T淋巴细胞经离体活化和/或扩增。
38.权利要求28-32任一项所述的用途，其中，用选自下组的方法将所述嵌合受体引入所述T淋巴细胞：逆转录病毒转导，慢病毒转导，DNA电穿孔和RNA电穿孔。
39.一种T淋巴细胞在制备增强个体中T淋巴细胞抗体－依赖细胞毒性(ADCC)的药物中的用途，所述细胞表达权利要求1-8任一项所述的嵌合受体，其中所述个体正在接受与癌细胞结合的抗体治疗，其中所述抗体具有与人CD16结合的人的或人源化的Fc部分, 其中所述个体为具有癌症的人患者。
40.权利要求39所述的用途，其中所述抗体选自下组：利妥昔单抗，曲妥珠单抗，hu14.18K322A。
41.权利要求39所述的用途，其中所述癌症选自下组：腺癌、淋巴瘤、肉瘤、母细胞瘤和白血病。
42.权利要求39所述的用途，其中所述癌症选自下组：B-细胞来源的癌症，乳腺癌，胃癌，神经母细胞瘤，骨肉瘤，肺癌，黑色素瘤，前列腺癌，结肠癌，肾细胞癌，卵巢癌，横纹肌肉瘤，白血病和霍奇金氏淋巴瘤。
43.权利要求42所述的用途，其中所述B-细胞来源的癌症选自下组：B细胞急性淋巴细胞白血病，B细胞慢性淋巴细胞白血病，和B细胞非霍奇金淋巴瘤。
44.权利要求39或40所述的用途，其中所述T淋巴细胞为分离自个体的自体T淋巴细胞。
45.权利要求44所述的用途，在施用给个体之前，所述自体T淋巴细胞经离体活化或扩增。
46.权利要求39或40所述的用途，其中所述T淋巴细胞为同种异体T淋巴细胞。
47.权利要求46所述的用途，其中所述同种异体T淋巴细胞为抑制了或消除了内源性T细胞受体表达的T淋巴细胞。
48.权利要求46所述的用途，其中在施用给个体之前，所述同种异体T淋巴细胞经离体活化和/或扩增。
49.权利要求39或40所述的用途，其中用选自下组的方法将所述嵌合受体引入所述T淋巴细胞：逆转录病毒转导，慢病毒转导，DNA电穿孔和RNA电穿孔。
50.权利要求28-32或39-40任一项所述的用途，其中所述T淋巴细胞可在选自下组的一种或多种试剂存在下被活化：抗-CD3/CD28，IL-2，和植物凝集素。
51.权利要求28-32或39-40任一项所述的用途，进一步包括给所述个体施用治疗有效量的IL-2。
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