KR102308597B1 - 다중 종양에 대항하여 항체-의존성 세포 세포독성을 촉발시키는 키메라 수용체 - Google Patents

Abstract

본 개시내용은 인간 면역글로불린의 Fc 부분과 결합되고 활성화 신호를 전달하는 키메라 수용체에 관한 것이다. 본 개시내용의 키메라 수용체는 F158 FCGR3A 또는 고 친화성 V158 FCGR3A 변이체의 세포외 리간드-결합성 도메인; CD8α의 힌지 및 막관통 도메인; 및 CD3ζ 및 4-1BB의 신호 전달 도메인을 포함할 수 있다. 본 개시내용의 키메라 수용체는 리툭시맙, 트라스투주맙, hu14.18K322A, 및 기타 치료 항체에 대한 고 친화성을 가지므로, 각종 암에 대항한 항체 요법의 효능을 증대시키는 데 유용하다.

Description

다중 종양에 대항하여 항체-의존성 세포 세포독성을 촉발시키는 키메라 수용체 {CHIMERIC RECEPTOR THAT TRIGGERS ANTIBODY-DEPENDENT CELL CYTOTOXICITY AGAINST MULTIPLE TUMORS}

관련 출원에 대한 상호 참조

본 PCT 출원은 35 U.S.C. §119 하에, 2013년 10월 17일에 출원된 미국 가출원 번호 61/892,218, 2014년 7월 18일에 출원된 미국 가출원 번호 62/026,243, 및 2014년 9월 9일에 출원된 미국 가출원 번호 62/047,916을 우선권 주장한다. 모든 우선권 출원의 전문이 본원에 참조로 포함된다.

본 개시내용은 인간 면역글로불린의 Fc 부분과 결합하고 활성화 신호를 전달하는 키메라 수용체에 관한 것이다. 본 개시내용의 키메라 수용체는 고 친화성 V158 FCGR3A 변이체, CD8α의 힌지 및 막관통 도메인, 및 CD3ζ 및 4-1BB의 신호 전달 도메인을 포함한다. 본 개시내용의 키메라 수용체는 리툭시맙(Rituximab), 트라스투주맙(Trastuzumab), hu14.18K322A, 및 기타 치료 항체에 대한 고 친화성을 가지므로, 각종 암에 대항한 항체 요법의 효능을 증대시키는 데 유용하다.

면역요법은 약물 내성의 유전적 기전과 세포성 기전을 피할 수 있는 잠재력과, 정상 조직은 기피하면서 종양 세포를 표적으로 할 수 있는 잠재력을 지니고 있기 때문에, 암 치료를 위한 전도유망한 옵션이다. T-림프구는, T-세포-매개된 이식편 대 숙주 질환 (GvHD)과 질환 재발이 반대되는 관계에 있고 면역억제 철회 또는 공여자 림프구의 주입은 재발을 방지할 수 있는, 혈액 악성 종양에 대한 동종 조혈 줄기 세포 이식 (HSCT)의 결과로써 입증된 바와 같이 주요 항-종양 효과를 발휘할 수 있다 ([Weiden et al., N. Engl. J. Med. 1979; 300(19):1068-1073]; [Porter et al., N. Engl. J. Med. 1994; 330(2):100-106]; [Kolb et al., Blood 1995; 86(5):2041-2050]; [Slavin et al., Blood 1996; 87(6):2195-2204]; [Appelbaum, Nature 2001; 411(6835):385-389]). T 림프구의 반응성은 항체 인식 특성 (동족 표적의 라이게이션으로 인해, T-세포의 활성화가 초래되고 세포독성이 촉발된다)을 수반한 키메라 신호 전달 수용체의 발현에 의해 암 세포 쪽으로 편향될 수 있다 ([Eshhar et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA. 1993; 90(2):720-724]; [Geiger et al., J. Immunol. 1999; 162(10):5931-5939]; [Brentjens et al., Nat. Med. 2003; 9(3):279-286]; [Cooper et al., Blood 2003; 101(4):1637-1644]; [Imai et al., Leukemia 2004; 18:676-684]). 키메라 수용체-발현성 자가 T 림프구를 주입하는 최근의 임상 시험 결과는 그들의 임상 잠재력의 설득력있는 명백한 증거를 제공하였다 ([Pule et al., Nat. Med. 2008; 14(11):1264-1270]; [Porter et al., OncLive 2011; 25;365(8):725-733]; [Brenjens et al., Blood 2011; 118(18):4817-4828]; [Till et al., Blood 2012; 119(17):3940-3950]; [Kochenderfer et al., Blood 2012; 119(12):2709-2720]; [Brentjens et al., Sci . Transl . Med. 2013; 5(177):177ra138]).

암 면역요법에 대한 또 다른 접근 방식은 아폽토시스 유발성(pro-apoptotic) 신호의 도입, 보체 고정화 및 항체-의존성 세포 세포독성 (ADCC)을 포함한 각종 기전을 통하여 세포독성을 발휘할 수 있는 모노클로날 항체를 투여하는 것이다 ([Yu et al., N. Engl. J. Med . 2010; 363(14):1324-1334]; [Ferris et al., J. Clin . Oncol. 2010; 28(28):4390-4399]; [Maloney, N. Engl . J. Med. 2012; 366(21):2008-2016]; [Scott et al., Nat. Rev. Cancer 2012; 12(4):278-287]; [Weiner et al., Cell 2012; 148(6):1081-1084]; [Galluzzi et al., Oncoimmunology 2012; 1(1):28-37]). 주요 역할은 후자 기전에 의해 수행되는데, 이는 항체의 Fc 부분에 의해, 자연 킬러 (NK 세포) 및 기타 세포, 예컨대 호중구 및 대식 세포의 표면 상에 발현된 Fc 수용체 (FcγR)의 개입으로부터 비롯된다 (Nimmerjahn et al., Nat. Rev. Immunol. 2008; 8(1):34-47). FcγR 유전자의 다형성은 현저한 기능적 결과를 초래할 수 있는데, 이는 결국 항체 치료에 대한 반응에 영향을 미친다. 이 목적을 달성하기 위하여, NK 세포에 의해 발현된, FcγRIIIa를 코딩하는 유전자 (FCRG3A 또는 CD16)의 동종이형은 위치 158에 페닐알라닌 (F) 또는 발린 (V) 잔기를 갖는 수용체를 생성시킬 수 있고; 대다수의 개체에게서 발생되는 CD16 158 V/V는 보다 높은 Fc 결합성을 갖고 있고, 환자에게서 증가된 종양 세포 사멸 및 탁월한 반응과 연관이 있다 ([Ferris et al., J. Clin . Oncol. 2010; 28(28):4390-4399]; [Koene et al., Blood 1997; 90(3):1109-1114]; [Cartron et al., Blood 2002; 99(3):754-758]; [Weng et al., J. Clin . Oncol. 2003; 21(21):3940-3947]; [Dall'Ozzo et al., Cancer Res. 2004; 64(13):4664-4669]; [Hatjiharissi et al., Blood 2007; 110(7):2561-2564]; [Musolino et al., J. Clin . Oncol. 2008; 26(11):1789-1796]; [Bibeau et al., J. Clin . Oncol. 2009; 27(7):1122-1129]; [Ahlgrimm et al., Blood 2011; 118(17):4657-4662]; [Veeramani et al., Blood 2011; 118(12):3347-3349]).

암을 치료하기 위한 새로운 접근 방식과 새로운 제제를 개발할 필요성이 커지고 있다.

본 개시내용은 적어도 부분적으로, 예를 들어 암 요법에 사용하기 위한 신규 키메라 수용체의 개발에 근거한다. 따라서, 키메라 수용체, 이를 코딩하는 핵산, 이러한 코딩 핵산을 포함하는 벡터, 상기 키메라 수용체를 발현하는 숙주 세포, 및 특정 대상체, 예를 들어 암 환자에게서 항체-기반 암 요법 및/또는 ADCC 효과를 증강시키기 위한 상기 숙주 세포의 용도가 본원에 제공된다.

한 측면에서, 본 개시내용은 (a) CD16 분자의 세포외 리간드-결합성 도메인; (b) CD8α의 힌지 및 막관통(transmembrane) 도메인; 및 (c) 4-1BB 신호 전달 도메인 및 CD3ζ 신호 전달 도메인을 포함하는 세포질 도메인을 포함하는 키메라 수용체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 CD16 분자는 F158 FCGR3A이고 그의 세포외 리간드-결합성 도메인은 서열 16의 아미노산 서열을 포함할 수 있다 (예를 들어, 이로 이루어질 수 있다). 다른 실시양태에서, 상기 CD16 분자는 V158 FCGR3A 변이체이고 그의 세포외 리간드-결합성 도메인은 서열 2의 아미노산 서열을 포함할 수 있다 (예를 들어, 이로 이루어질 수 있다).

본원에 개시된 키메라 수용체 중 어느 것에서, CD8α의 힌지 및 막관통 도메인은 서열 3의 아미노산 서열을 포함할 수 있고 (예를 들어, 이로 이루어질 수 있고)/있거나; 4-1BB 신호 전달 도메인은 서열 4의 아미노산 서열을 포함할 수 있고 (예를 들어, 이로 이루어질 수 있고)/있거나; CD3ζ 신호 전달 도메인은 서열 5의 아미노산 서열을 포함할 수 있다 (예를 들어, 이로 이루어질 수 있다).

본원에 개시된 키메라 수용체 중 어느 것은 키메라 수용체의 N-말단에 위치하는, CD8α의 신호 펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 한 예에서, 이러한 CD8α의 신호 펩티드는 서열 6의 아미노산 서열을 포함할 수 있다 (예를 들어, 이로 이루어질 수 있다).

일부 예에서, 상기 키메라 수용체는 서열 1의 잔기 22 내지 436 또는 서열 15의 잔기 22 내지 436의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 한 예에서, 상기 키메라 수용체는 서열 1 또는 서열 15의 아미노산 서열을 포함한다 (예를 들어, 이로 이루어진다).

또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 키메라 수용체 중 어느 것을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 일부 예에서, 상기 키메라 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열 10 또는 서열 18의 뉴클레오티드 서열, 서열 11의 뉴클레오티드 서열, 서열 12의 뉴클레오티드 서열, 서열 14의 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 한 구체적 실시양태에서, 상기 키메라 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열 9 또는 서열 17의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

추가 측면에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 키메라 수용체 중 어느 것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공하는데, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 키메라 수용체의 발현을 위하여 하나 이상의 조절 요소에 작동가능하게 연결될 수 있다. 한 예에서, 상기 벡터는 바이러스 벡터 (예를 들어, 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터)이다.

추가로, 본 개시내용은 본원에 개시된 키메라 수용체 중 어느 것을 포함하는 단리된 숙주 세포를 제공한다. 한 구체적 실시양태에서, 이러한 숙주 세포는 T 림프구 또는 NK 세포이다. 한 구체적 실시양태에서, 상기 숙주 세포는 생체 외에서 활성화되고/되거나 확장되는 T 림프구 또는 NK 세포이다 (예를 들어, T 림프구는 항-CD3/CD28, IL-2, 및 식물성 적혈구 응집소로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 작용제의 존재 하에 활성화될 수 있고; 예를 들어, NK 세포는 CD137 리간드 단백질, CD137 항체, IL-15 단백질, IL-15 수용체 항체, IL-2 단백질, IL-12 단백질, IL-21 단백질, 및 K562 세포주로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 작용제의 존재 하에 활성화될 수 있다). 한 구체적 실시양태에서, 상기 숙주 세포는 암 환자로부터 단리된 자가 T 림프구 또는 자가 NK 세포이다. 한 구체적 실시양태에서, 숙주 세포는 동종 T 림프구 또는 동종 NK 세포이다. 한 구체적 실시양태에서, 숙주 세포는 내인성 T 세포 수용체의 발현을 억제 또는 제거시킨 동종 T 림프구이다.

또한 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 (i) 본원에 개시된 키메라 수용체 중 어느 것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 또는 상기 키메라 수용체를 발현하는 숙주 세포; 및 (ii) 제약상 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 이러한 제약 조성물은 암 세포에 대한 세포독성을 발휘하는 항체 [예를 들어, 암 세포와 결합되고; 인간 CD16, 또는 리툭시맙, 또는 트라스투주맙, 또는 hu14.18K322A, 또는 에프라투주맙(Epratuzumab), 또는 세툭시맙(Cetuximab), 또는 라베투주맙(Labetuzumab)과 결합되는 인간 또는 인간화 Fc 부분을 갖는 항체]를 추가로 포함할 수 있다.

또한 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 암의 항체-기반 면역요법의 효능의 증강을 필요로 하는 대상체에게서 이러한 면역요법의 효능을 증강시키는 방법을 제공한다. 상기 대상체는 암 세포와 결합되는 항체를 이용하여 치료할 수 있다. 이러한 방법은 본원에 기재된 바와 같은 키메라 수용체 중 어느 것을 발현하는 T 림프구 또는 NK 세포의 치료상 유효량을 상기 대상체 내로 도입하는 것을 포함할 수 있다.

더욱이, 본 개시내용은 본원에 개시된 바와 같은 키메라 수용체를 발현하는 T 림프구 또는 NK 세포의 치료상 유효량을 특정 대상체 내로 도입하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에게서 T 림프구 또는 NK 세포 항체-의존성 세포 세포독성 (ADCC)을 증강시키는 방법을 제공한다. 한 구체적 실시양태에서, 상기 대상체는 암 세포와 결합될 수 있는 항체를 이용하여 치료받고 있다.

본원에 기재된 방법 중 어느 것에서, 상기 대상체는 인간 CD16과 결합될 수 있는 인간 또는 인간화 Fc 부분을 가질 수 있는 항체를 이용하여 치료할 수 있다. 한 구체적 실시양태에서, 상기 대상체는 리툭시맙, 트라스투주맙, hu14.18K322A, 에프라투주맙, 세툭시맙, 및 라베투주맙으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체를 이용하여 치료받고 있다. 한 구체적 실시양태에서, 암은 암종, 림프종, 육종, 모세포종 및 백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 구체적 실시양태에서, 암은 B-세포 기원의 암 [예를 들어, B-계통 급성 림프모구성 백혈병, B-세포 만성 림프구성 백혈병 및 B-세포 비-호지킨(non-Hodgkin) 림프종], 유방암, 위암, 신경모세포종, 골육종, 폐암, 흑색종, 전립선암, 결장암, 신 세포 암종, 난소암, 횡문근육종, 백혈병, 및 호지킨 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 구체적 실시양태에서, T 림프구 또는 NK 세포는 상기 대상체로부터 단리된 자가 T 림프구 또는 자가 NK 세포이다. 한 구체적 실시양태에서, 대상체 내로 재도입하기에 앞서, 상기 자가 T 림프구 또는 자가 NK 세포는 생체 외에서 활성화되고/되거나 확장된다. 한 구체적 실시양태에서, T 림프구 또는 NK 세포는 동종 T 림프구 또는 동종 NK 세포이다. 한 구체적 실시양태에서, 동종 T 림프구는 내인성 T 세포 수용체의 발현을 억제 또는 제거시킨 T 림프구이다. 한 구체적 실시양태에서, 대상체 내로 도입하기에 앞서, 상기 동종 T 림프구 또는 동종 NK 세포는 생체 외에서 활성화되고/되거나 확장된다. 한 구체적 실시양태에서, 상기 키메라 수용체는 레트로바이러스 형질도입, 렌티바이러스 형질도입, DNA 전기천공, 및 RNA 전기천공으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의해 T 림프구 또는 NK 세포 내로 도입된다.

T 림프구 활성화를 포함하는 본원에 개시된 방법 중 어느 것에서, 이러한 T 림프구는 항-CD3/CD28, IL-2, 및 식물성 적혈구 응집소로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 작용제의 존재 하에 활성화될 수 있다. NK 세포 활성화를 포함하는 본원에 개시된 방법 중 어느 것에서, 이러한 NK 세포는 CD137 리간드 단백질, CD137 항체, IL-15 단백질, IL-15 수용체 항체, IL-2 단백질, IL-12 단백질, IL-21 단백질, 및 K562 세포주로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 작용제의 존재 하에 활성화될 수 있다.

본원에 개시된 방법 중 어느 것은 대상체에게 IL-2의 치료상 유효량을 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

또한, (i) 암 환자에게서 ADCC 효과를 증강시키기 위하여 또는 암을 치료하기 위하여 사용하기 위한 제약 조성물 (이러한 제약 조성물은 본원에 개시된 바와 같은 키메라 수용체를 코딩하는, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드 중 어느 것, 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 또는 상기 키메라 수용체를 발현하는 숙주 세포; 및 제약상 허용되는 담체 또는 부형제를 포함한다); 및 (ii) 암 질환을 치료하기 위한 의약을 제조하기 위한, 상기 제약 조성물의 용도가 본 개시내용의 범위 내에 있다. 상기 제약 조성물은 항암 항체, 예컨대 관련 기술분야에 공지되어 있거나 또는 본원에 개시된 것을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 하나 이상의 실시양태의 세부 사항은 다음 설명에 제시되어 있다. 본 발명의 다른 특징 또는 이점은 다음 도면 및 몇 가지 실시양태의 구체적인 내용으로부터, 및 또한 첨부된 청구범위로부터 명백할 것이다.

본 특허 출원 파일은 컬러로 작성된 하나 이상의 도면을 함유한다. 컬러 도면(들)을 수반한 본 특허 출원의 카피는 요청 및 필요한 수수료의 지불시 특허청에 의해 제공될 것이다.
도 1은 T 세포에서의 CD16V-BB-ζ 수용체의 발현을 보여준다. A . CD16V-BB-ζ 수용체 구조물을 도식적으로 나타냄. B . 말초혈 T 림프구에서의 CD16V-BB-ζ 수용체의 발현. 유동 세포 계수 도트 플롯은 GFP 단독 (모의)을 함유하거나 또는 GFP와 CD16V-BB-ζ를 함유하는 벡터로 형질도입된 활성화 T 림프구에서 GFP 또는 CD3ζ와 조합된 CD16 (B73.1 항체)의 발현을 예시한다. 각 사분면 내에 양성 세포의 비율이 제시되어 있다. C . GFP 단독 또는 CD16V-BB-ζ으로 형질도입된 T 림프구로부터의 세포 용해물의 웨스턴 블롯팅(Western blotting). 막을 항-CD3ζ 항체로 프로빙하였다.
도 2는 T-세포 서브세트에서의 CD16V-BB-ζ 수용체의 발현을 나타낸 것이다. A. 활성화 CD3+ T 림프구를, GFP 단독 (모의)을 함유하는 벡터 및 CD16V-BB-ζ 구조물을 함유하는 벡터로 형질도입하였다. CD16의 발현을 유동 세포계수법에 의하여 CD4+ 및 CD8+ 세포에서 시험하였다. 도트 플롯은 하나의 대표적인 실험의 결과를 보여준다. B . 3명의 공여자로부터의 T 림프구를 이용하여 수득된 결과 (평균 ± SD)의 요약 (P = N.S.).
도 3은 CD16V-BB-ζ 수용체의 항체-결합 능력을 명확하게 보여준다. A . GFP (모의)를 함유하거나 또는 GFP와 CD16V-BB-ζ를 함유하는 벡터로 형질도입된 T 림프구를 30분 동안 리툭시맙과 함께 인큐베이션하였고; 세포 표면과 결합된 항체의 양을, 피코에리트린과 접합된 염소-항 인간 IgG 항체 (GAH IgG) 및 유동 세포계수법을 이용하여 가시화하였다. B . CD16V-BB-ζ (V158) 또는 CD16F-BB-ζ (F158)으로 형질도입된 저캣(Jurkat) 세포를 30분 동안 리툭시맙과 함께 인큐베이션하였다. 플롯은 상기 두 수용체를 발현하는 세포를 이용하여 수득된 GAH IgG의 평균 형광 세기 (MFI)와 GFP의 MFI 간의 관계를 비교한 것이다. C . 모의-형질도입되거나 또는 CD16V-BB-ζ로 형질도입된 저캣 세포를, 리툭시맙의 존재 하에 칼세인(calcein) AM 오렌지-레드로 표지된 다우디(Daudi) 세포와 함께 공동-배양하였다. 세포 집합체를 각 도트 플롯의 상부 우측 사분면에 정량화한다. D . C에서 예시된 집합 검정의 요약. 막대는 3가지 실험의 평균 ± SD를 나타낸다. 리툭시맙 ("Ab")의 존재 하에 CD16V-BB-ζ로 형질도입된 저캣 세포를 이용하여 측정된 집합은 3가지 다른 배양 조건에서 측정된 것보다 상당히 더 높았다 (t 시험에 의한 P<0.001).
도 4는 트라스투주맙 및 인간 IgG와 결합할 수 있는 CD16V-BB-ζ 및 CD16F-BB-ζ 수용체의 상대적 능력을 나타낸 것이다. CD16V-BB-ζ (V158; 흑색 부호) 또는 CD16F-BB-ζ (F158; 백색 부호)로 형질도입된 저캣 세포를 30분 동안 트라스투주맙 또는 인간 IgG와 함께 인큐베이션하였다. 플롯은 어느 하나의 수용체를 발현하는 세포를 이용하여 수득된, PE와 접합된 염소-항 인간 (GAH) IgG의 평균 형광 세기 (MFI)와 GFP의 MFI 간의 관계를 비교한 것이다 (트라스투주맙과 IgG 둘 다에 대해 P <0.0001).
도 5는 CD16V-BB-ζ 수용체와 결합하는 면역글로불린이 T 세포 활성화, 용해 과립의 세포외 유출, 및 세포 증식을 유도시킨다는 것을 명확하게 보여준다. A . GFP (모의)를 함유하거나 또는 GFP와 CD16V-BB-ζ를 함유하는 벡터로 형질도입된 T 림프구를, IL-2를 수반하지 않으면서 48시간 동안 리툭시맙으로 코팅된 미세역가 판에서 배양하였고; CD25의 발현을 유동 세포계수법에 의해 측정하였다. B . A에서 예시된 시험의 결과 요약: 막대는 GFP+ 세포에서의 CD25 발현을 나타내고 (3명의 공여자로부터의 T 세포를 이용한 실험의 평균 ± SD); CD25 발현은 다른 실험 조건 하에서보다도 리툭시맙 ("Ab")의 존재 하에 CD16V-BB-ζ으로 형질도입된 T 림프구에서 상당히 더 높았다 (P ≤0.003). C . 4명의 공여자로부터의 T 림프구를, GFP (모의)를 함유하거나 또는 GFP와 CD16V-BB-ζ를 함유하는 벡터로 형질도입하였고, 4시간 동안 A에서와 같이 (n=3) 배양하거나 또는 다우디 세포 (n=3)와 함께 배양하였으며; CD107a 염색을 유동 세포계수법에 의해 측정하였다. 막대는 6가지 실험의 평균 ± SD를 나타내고; CD107a 발현은 다른 실험 조건 하에서보다도 리툭시맙 ("Ab")의 존재 하에 CD16V-BB-ζ으로 형질도입된 T 림프구에서 상당히 더 높았다 (P <0.0001). D . 모의-형질도입되거나 또는 CD16V-BB-ζ-형질도입된 T 림프구를 4주 이하 동안 단독으로 배양하였거나, 또는 다우디 세포를 수반하거나 수반하지 않으면서 리툭시맙과 함께 배양하였다. 부호는 유입 세포의 수와 비교한 세포 회수 비율 (%)을 표시한다 (3명의 공여자로부터의 T 세포를 이용한 실험의 평균 ± SD).
도 6은 시험관 내에서 CD16V-BB-ζ T 림프구에 의해 매개된 항체-의존성 세포 세포독성을 명확하게 보여준다. A . 상응하는 항체의 존재 하에 모의-형질도입되거나 또는 CD16V-BB-ζ-형질도입된 T 림프구에 의해 매개된 암 세포주에 대항한 세포독성의 대표적인 예. 각 부호는 삼중 배양물의 평균을 표시한다 (3가지 비교물 모두에 대한 대응표본 t 시험에 의한 P<0.01). 전체 데이터 세트가 도 7에 제시되어 있다. B. 만성 림프구성 백혈병 (CLL) 환자로부터의 일차 세포에 대항한, 리툭시맙 ("Ab")을 수반하거나 수반하지 않은 모의-형질도입되거나 또는 CD16V-BB-ζ-형질도입된 T 림프구의 세포독성. 각 막대 (각 환자에 대해 상이한 색조를 수반함)는 2:1 E:T 비에서 삼중 4-시간 검정에서 결정된 바와 같은 평균 (± SD) 세포독성에 상응한다. CD16V-BB-ζ T 세포 및 항체를 이용한 세포독성은 다른 3가지 조건 중 어느 것에서 측정된 것보다 상당히 더 높았고 (t 시험에 의한 P <0.0001); 모의-형질도입된 T 세포를 이용하는 경우에는, 항체의 부가가 세포독성을 증가시켰다 (P = 0.016); 다른 모든 비교물: P >0.05. C . 중간엽 기질 세포 (MSC)의 존재 하에 1:2 E:T에서 24시간 후 B에서 시험된 동일한 CLL 샘플에 대항한 세포독성. 각 막대는 두 시험의 평균에 상응한다. CD16V-BB-ζ T 세포 + 항체를 이용한 경우의 세포독성은 항체 단독을 이용한 경우 (P = 0.0002) 또는 세포 단독을 이용한 경우 (P <0.0001)보다 상당히 더 높았고; 항체 단독을 이용한 경우의 세포독성은 세포 단독을 이용한 경우 (P = 0.0045)보다 상당히 더 높았다.
도 7은 시험관내 세포독성 검정에서 4시간의 집합적 결과를 나타낸 것이다. 모의- 또는 CD16V-BB-ζ T 림프구를, 제시된 세포주, 및 비-반응성 인간 면역글로불린 ("Ab 없음") 또는 상응하는 항체 ("Ab")와 함께 공동 배양하였다. 이는 다우디 및 라모스(Ramos)의 대해서는 리툭시맙이었고, MCF-7, SKBR-3, 및 MKN-7에 대해서는 트라스투주맙이었으며, CHLA-255, NB1691, SK-N-SH 및 U-2 OS에 대해서는 hu14.18K322A였다. T 세포 및/또는 항체를 수반하지 않고 배양된 종양 세포와 비교해서 2:1 비 (CHLA-255의 경우에는 4:1)에서의 세포독성이 제시되어 있다. 결과는 NB1691 및 SK-BR-3에 대해서는 3명의 공여자 및 나머지 세포주에 대해서는 1명의 공여자의 T 림프구를 이용하여 수행된 삼중 실험의 평균 (± SD) 세포독성에 상응하고; 다우디의 결과는 2명의 공여자로부터의 삼중 측정치 및 4명의 부가 공여자로부터의 T 림프구를 이용한 단일 측정치의 평균 (± SD) 세포독성이다. T 세포의 부재 하에 배양물에 부가된 경우의 리툭시맙, 트라스투주맙 또는 hu14.18K322A의 평균 세포독성은 <10%였다.
도 8은 CD16V-BB-ζ T 림프구의 세포독성이 강력하고, 특이적이며 결합되지 않은 IgG에 의해 영향을 받지 않는다는 것을 명확하게 보여준다. A . CD16V-BB-ζ T 림프구를 24시간 동안 비-반응성 인간 면역글로불린 ("Ab 없음") 또는 hu14.18K322A 항체 ("Ab")를 수반하면서 신경모세포종 세포주 NB1691과 함께 공동 배양하였다. 결과는 삼중 실험의 평균 (± SD) 세포독성에 상응한다. 세포독성은 심지어 1:8 E:T에서도 CD16V-BB-ζ T 세포 단독과 비교해서 CD16V-BB-ζ 세포 + hu14.18K322A 항체를 이용한 경우에 여전히 상당히 더 높았다 (P = 0.0002). B . 모의-형질도입되거나 또는 CD16V-BB-ζ-형질도입된 T 림프구를 리툭시맙 또는 비-반응성 항체 트라스투주맙 또는 hu14.18K322A의 존재 하에 2:1 E:T에서 4시간 동안 B-세포 림프종 세포주 다우디와 함께 공동 배양하였다. 결과는 삼중 실험의 평균 (± SD) 세포독성에 상응한다 ("모의" 결과는 각 항체를 이용한 삼중 실험의 집합체이다). 리툭시맙을 이용한 경우의 세포독성은 다른 모든 실험 조건에서의 세포독성보다 상당히 더 높았다 (모든 비교물에 대해 P <0.0001). C . 각종 농도의 면역요법 항체 및 경쟁하는 결합되지 않은 IgG (상기 항체에 동시에 부가됨)의 존재 하에 8:1 E:T에서 종양 세포주에 대항하여 CD16V-BB-ζ를 발현하는 T 림프구의 세포독성. 부호는 각 항체 농도에 대한 적어도 삼중 측정치의 평균 (± SD)에 상응한다. 각 세포주에 대해, 존재하는 결합되지 않은 IgG의 양에 상관없이, 세포독성은 통계상 상이하지 않았다.
도 9는 CD16V-BB-ζ 수용체를 발현하는 T 림프구가 생체 내에서 항-종양 활성을 발휘한다는 것을 명확하게 보여준다. NOD-SCID-IL2RGnull 마우스에게 루시페라제로 표지된 3 x 10⁵개의 다우디 세포를 복강내 주사하였다. 리툭시맙 (150 ㎍)을 4일째에 시작하여 4주 동안 매주 1회 복강내 주사하였다. 4마리 마우스에게는, 다른 치료를 제공하지 않았지만, 5마리 다른 마우스에게는 리툭시맙을 처음 주사한 다음, 5일 및 6일째에 CD16V-BB-ζ 수용체를 발현하는 T 림프구 (1 x 10⁷개 복강내; n = 5)를 주사하였고; 4마리 마우스의 다른 2개 군에게는 각각, 리툭시맙 대신에 RPMI-1640을 복강내 주사하기에 앞서 CD16V-BB-ζ T 림프구를 투여하거나, 또는 RPMI-1640 배지만을 복강내 주사하였다 ("대조군"). A . 종양 성장의 생체내 영상화의 결과. 각 부호는 하나의 생물발광 측정치에 상응하고; 라인은 하나의 마우스 내에서의 모든 측정치를 연결시켜 준다. B . 각 실험 조건에 대한 대표적인 마우스 (군당 2마리). 3일째의 복부 영상을 증강된 감도로 처리하여, CD16V-BB-ζ + 리툭시맙 군의 마우스에 종양이 존재하는 것을 명확하게 보여주었다. 생물발광이 5 x 10¹⁰ 광자/초에 도달하게 되면 마우스를 안락사시켰다. C . 상이한 치료 군에서의 마우스의 전반적인 생존 비교.
도 10은 CD16V-BB-ζ 수용체를 발현하는 T 림프구가 생체 내에서 항-종양 활성을 발휘한다는 것을 확증시켜 준다. NOD-SCID-IL2RGnull 마우스에게 루시페라제로 표지된 3 x 10⁵개의 NB1691 세포를 복강내 주사하였다. Hu14.18K322A 항체 (25 ㎍)을 5일째에 시작하여 4주 동안 매주 1회 복강내 주사하였다. 4마리 마우스에게는, 다른 치료를 제공하지 않았지만, 4마리 다른 마우스에게는 항체를 처음 주사한 다음, 6일 및 7일째에 CD16V-BB-ζ 수용체를 발현하는 T 림프구 (1 x 10⁷개 복강내; n = 4)를 주사하였고; 4마리 마우스의 다른 2개 군에게는 각각, 항체 대신에 RPMI-1640을 복강내 주사하기에 앞서 CD16V-BB-ζ T 림프구를 투여하거나, 또는 RPMI-1640 배지만을 복강내 주사하였다 ("대조군"). A . 종양 성장의 생체내 영상화의 결과. 각 부호는 하나의 생물발광 측정치에 상응하고; 라인은 하나의 마우스 내에서의 모든 측정치를 연결시켜 준다. B . 각 실험 조건에 대한 모든 마우스의 영상. 생물발광이 1 x 10¹⁰ 광자/초에 도달하게 되면 마우스를 안락사시켰다. C . 상이한 치료 군에서의 마우스의 전반적인 생존 비교.
도 11은 CD16V-BB-ζ 수용체를 발현하는 T 림프구와 CD16F-BB-ζ 수용체를 발현하는 T 림프구 간의 기능적 차이를 명확하게 보여준다. A . 유동 세포계수 도트 플롯은 CD16V-BB-ζ 또는 CD16F-BB-ζ로 형질도입된 T 림프구에서의 CD16 (B73.1 항체를 이용하여 탐지됨) 및 그린 형광성 단백질 (GFP)의 발현을 나타낸다. 각 사분면 내에 양성 세포의 비율이 제시되어 있다. B . CD16V 또는 CD16F 수용체로 형질도입된 T 림프구를 리툭시맙, 트라스투주맙 및 hu14.18K322A 각각의 존재 하에 다우디, SK-BR-3 또는 NB1691 세포와 함께 배양하였다. 모든 항체를 0.1 ㎍/mL로 사용하였다. 부호는 유입 세포의 수와 비교한 세포 회수 비율 (%)을 표시하고 (3가지 실험의 평균 ± SD); 배양 1주 내지 3주 동안의 세포 계수치는 3가지 배양물 모두에 대한 대응표본 t 시험에 의해 상당히 상이하였다 (다우디, P = 0.0007; SK-BR-3, P = 0.0164; NB1691, P = 0.022). C . 각종 농도의 리툭시맙의 존재 하에 다우디 세포에 대항하여 CD16V-BB-ζ 또는 CD16F-BB-ζ 수용체를 발현하는 T 림프구에 의해 매개된 항체-의존성 세포 세포독성. 각 부호는 8:1 (좌측) 또는 2:1 (우측) E:T에서 삼중 배양물의 평균 ± SD를 표시한다. CD16V-BB-ζ를 이용한 경우의 T 세포의 세포독성은 CD16F-BB-ζ를 이용한 경우의 T 세포의 세포독성보다 상당히 더 높았다 (어느 하나의 E:T에 대하여 P<0.001).
도 12는 본 연구에서 사용된 CD16 키메라 수용체를 도식적으로 나타낸 것이다.
도 13은 상이한 신호 전달 도메인을 수반한 CD16V 수용체의 발현을 나타낸 것이다. 유동 세포계수 도트 플롯은 그린 형광성 단백질 (GFP) 단독 (모의)을 함유하거나 또는 상이한 CD16V 구조물을 함유하는 벡터로 형질도입된 활성화 T 림프구에서 GFP와 조합된 CD16 (3G8 항체를 이용하여 탐지됨)의 발현을 예시한다. 각 사분면 내에 양성 세포의 비율이 제시되어 있다.
도 14는 CD16V-BB-ζ가 상이한 신호 전달 특성을 지닌 CD16V 수용체보다 더 높은 T 세포 활성화, 증식 및 세포독성을 유도시킨다는 것을 명확하게 보여준다. A . 다우디 세포 및 리툭시맙 (0.1 ㎍/mL)과 48시간 공동-배양한 후 상이한 키메라 수용체를 발현하는 T 림프구에서 그린 형광성 단백질 (GFP) 평균 형광 세기 (MFI)에 대항하여 플롯된 유동 세포계수법에 의한 CD25 MFI. CD16V-BB-ζ를 이용한 경우의 CD25 발현은 CD16V-ζ, CD16V-FcεRIγ, 또는 신호 전달 능력을 전혀 수반하지 않은 CD16V ("CD16V-끝을 잘라냄")에 의해 촉발된 것보다 상당히 더 높았다 (선형 회귀 분석에 의한 P<0.0001). B . 각종 CD16V 수용체로 형질도입된 T 림프구를 리툭시맙, 트라스투주맙 및 hu14.18K322A 각각의 존재 하에 다우디, SK-BR-3 또는 NB1691 세포와 함께 배양하였다. 모든 항체를 0.1 ㎍/mL로 사용하였다. 부호는 유입 세포의 수와 비교한 세포 회수 비율 (%)을 표시하고 (3가지 실험의 평균 ± SD); 배양 1주 내지 3주 동안의 세포 계수치는 3가지 배양물 모두에 대한 대응표본 t 시험에 의해 다른 모든 수용체를 이용한 경우보다 CD16V-BB-ζ 수용체를 이용한 경우에 상당히 더 높았다 (P<0.0001). C . 리툭시맙, 트라스투주맙 및 hu14.18K322A 각각의 존재 하에 다우디, SK-BR-3 및 NB1691에 대항하여 각종 CD16V 수용체를 발현하는 T 림프구 또는 모의-형질도입된 T 세포의 ADCC. 부호는 제시된 E:T에서 삼중 배양물의 평균 ± SD이다. CD16V-BB-ζ 수용체를 이용한 경우의 세포독성은 다른 모든 수용체를 이용한 경우의 세포독성보다 상당히 더 높은 반면 (모든 비교물에서의 t 시험에 의한 P<0.0001), 모의-형질도입되거나 또는 CD16V-끝을 잘라낸 수용체로 형질도입된 림프구의 세포독성은 서로 유의적으로 상이하지 않았고 (P>0.05); CD16V-FcεRIγ를 이용한 경우의 세포독성은 다우디 (P = 0.006) 및 SK-BR-3 (P = 0.019)에 대항하여 CD3-ζ를 이용한 경우의 세포독성보다 상당히 더 높았으며; 어느 하나의 수용체를 발현하는 림프구는 모의-형질도입되거나 또는 CD16V-끝을 잘라낸 것으로 형질도입된 것보다 더 높은 세포독성을 가졌다 (모든 비교물에 대해 P<0.01).
도 15는 mRNA 전기천공에 의한 CD16V-BB-ζ 수용체의 발현을 명확하게 보여준다. A . 활성화 T 림프구를 CD16V-BB-ζ mRNA로 전기천공하거나 또는 mRNA를 수반하지 않으면서 (모의) 전기천공하였고; 24시간 후에 CD16의 발현을 유동 세포계수법에 의해 시험하였다. B . 모의 또는 CD16V-BB-ζ 전기천공된 T 세포의 세포독성을 리툭시맙의 존재 하에 라모스 세포주에 대항하여 시험하였다. 부호는 평균 ± SD % 세포독성을 나타낸다 (n =3; 모든 E:T 비에서의 비교물에 대한 P <0.01).

본 개시내용은 암 치료에 있어서 항암 항체 효능을 증강시키는 신규 키메라 수용체의 구축에 근거한다. αβ T-세포 수용체를 발현하는 T 림프구 (대부분의 T 세포)는 FcγR을 활성화시키는 것이 결여되고 항체-의존성 세포 세포독성 (ADCC)을 매개하지 않는다 (Nimmerjahn et al., Nat Rev Immunol . 2008;8(1):34-47). 본 개시내용은 FcγR 및 T-세포 신호 전달 분자로 구성된 키메라 수용체의 발현이 이들 세포에 대해 ADCC 능력을 부여해야 하므로, 표적화된 종양-항원에 상관없이, 모노클로날 항체 [뿐만 아니라 Fc 부분을 포함하는 기타 항-종양 분자, 예컨대 예를 들어, 면역글로불린의 Fc-부분 또는 Fc-함유 DNA 또는 RNA와 조합된 종양 표면 수용체와 결합하는 리간드 (예를 들어, 시토카인, 면역 세포 수용체)에 의해 구성된 복합 분자]의 항-종양 잠재력을 상당히 증대시켜야 한다는 것을 보여준다. 본원에는 상기 키메라 수용체를 발현하는 T 림프구의 항체-유도된 항-종양 활성이 기재되어 있다.

본 개시내용은 (i) F158 FCGR3A 또는 고 친화성 V158 FCGR3A 변이체일 수 있는, CD16 분자의 세포외 리간드-결합성 도메인, (ii) CD8α의 힌지 및 막관통 도메인, 및 (iii) CD3ζ 및 4-1BB의 신호 전달 도메인을 포함하는 키메라 수용체를 제공한다. 본 개시내용의 키메라 수용체는 다중 종양에 대항한 항체 요법의 효능을 상당히 증대시키기 위한 잠재력을 지닌 만능 키메라 수용체이다. 다음 실시예 섹션에 논의된 바와 같이, 레트로바이러스 형질도입에 의해 인간 T 세포에서 발현되는 경우, 본 개시내용의 수용체는 통상의 F158 변이체를 함유하는 또 다른 수용체와 비교해서 인간화 항체, 예컨대 항-CD20 항체 리툭시맙을 포함한 인간 IgG에 대하여 상당히 더 높은 친화성을 지니고 있다. 이러한 키메라 수용체의 개입으로 인해, T-세포 활성화, 용해 과립의 세포외 유출, 및 증식이 유발된다. CD16V-BB-ζ 발현성 T 세포는 심지어 만성 림프구성 백혈병 (CLL) 배양물을 골수 유래 중간엽 세포 상에서 수행하는 경우에도, 낮은 이펙터(effector):표적 비에서 리툭시맙의 존재하에 림프종 세포주 및 원발성 CLL 세포를 특이적으로 사멸시킨다. 항-HER2 항체 트라스투주맙은 유방암 및 위암 세포에 대항하여 키메라 수용체-매개된 항체-의존성 세포 세포독성 (ADCC)을 촉발시키고, 항-GD2 항체 hu14.18K322A는 신경모세포종 및 골육종 세포에 대항하여 촉발시킨다. 실시예 섹션에서 추가로 개시된 바와 같이, 키메라 수용체와 리툭시맙을 조합하여 발현하는 T 세포는 면역결핍성 마우스에서 인간 림프종 세포를 박멸시켰지만, T 세포 또는 항체 단독은 그렇지 못하였다. 이러한 기술의 임상적 번역을 촉진하기 위하여, 키메라 수용체 mRNA의 전기천공에 근거한 방법이 본원에 개시된 바와 같이 개발되었는데, 이로써 바이러스 벡터를 사용하지 않고서도 효율적이면서 일시적인 수용체 발현이 야기되었다.

정의

본원에 사용된 바와 같은 용어 "키메라 수용체"는 단일 단백질 상에서는 자연적으로 함께 발견되지 않는, 세포외 리간드 결합성 도메인, 막관통 도메인 및 세포질 신호 전달 도메인을 조합하여 포함하는 세포-표면 수용체로서 정의된다. 본 개시내용의 키메라 수용체는 주로, T 세포와 함께 사용하기 위한 것이지만, 자연 킬러 (NK) 세포에 대해서도 사용될 수 있었다.

용어 "약" 또는 "대략"은 부분적으로는 특별한 값을 측정하거나 결정하는 방식, 즉 측정 시스템의 한계에 좌우될, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 측정되는 바와 같은 특별한 값에 대하여 허용되는 오차 범위 이내를 의미한다. 예를 들어, "약"은 관련 기술분야의 실시에 따라서, 허용되는 표준 편차 이내를 의미할 수 있다. 또 다른 한편으론, "약"은 소정의 값의 ±20% 이하, 바람직하게 ±10% 이하, 보다 바람직하게 ±5% 이하, 또한 보다 바람직하게 ±1% 이하의 범위를 의미할 수 있다. 또 다른 한편으론, 특히 생물학적 시스템 또는 공정과 관련해서, 상기 용어는 특정 값의 한 자릿수 이내, 바람직하게 2배 이내를 의미할 수 있다. 특별한 값이 본 명세서 및 청구범위에 기재되는 경우에는, 달리 언급되지 않는 한, 용어 "약"은 암시적이고, 이러한 맥락에서 상기 용어는 특별한 값에 대하여 허용되는 오차 범위 이내를 의미한다.

본 개시내용이 본원에 인용된 질환 병태 중 어느 것과 관련이 있는 한에서는 이러한 맥락에서, 용어 "치료하다", "치료" 등은 상기 병태와 연관된 한 가지 이상의 증상을 경감 또는 완화시키거나, 또는 상기 병태의 진행을 느리게 하거나 역전시키는 것을 의미한다. 본 개시내용의 의미 내에서, 용어 "치료하다"는 또한, 질환을 저지하고/하거나, 질환의 발병 (즉, 질환의 임상적 징후 이전의 기간)을 지연시키고/시키거나 질환의 발생 위험 또는 질환이 악화될 위험을 저하시키는 것을 의미한다. 예를 들어, 암과 연계해서 용어 "치료하다"는 환자의 종양 존재량을 제거 또는 감소시키거나, 또는 전이 등을 방지, 지연 또는 억제시키는 것을 의미할 수 있다.

용량 또는 양에 적용된, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료상 유효한"은 목적 활성을 필요로 하는 대상체에게 투여시 목적하는 활성을 초래하는 데 충분한 화합물 또는 제약 조성물 [예를 들어, 본 개시내용의 키메라 수용체를 포함하는 T 림프구 (및/또는 NK 세포)를 포함하고, 종양-특이적 세포독성 모노클로날 항체, 또는 Fc 부분을 포함하는 또 다른 항-종양 분자 (예를 들어, 면역글로불린 또는 Fc-함유 DNA 또는 RNA의 Fc-부분과 조합된 종양 표면 수용체와 결합하는 리간드 (예를 들어, 시토카인, 면역 세포 수용체)에 의해 구성된 복합 분자)를 임의로 추가로 포함하는 조성물]의 양을 지칭한다. 본 개시내용의 맥락 내에서, 용어 "치료상 유효한"은 본 개시내용의 방법에 의해 치료된 장애의 한 가지 이상의 증상 징후를 지연시키거나, 그 진행을 저지시키거나, 그 증상을 경감 또는 완화시키기에 충분한 화합물 또는 제약 조성물의 양을 지칭한다. 활성 성분의 조합물을 투여하는 경우에는, 이러한 조합물의 유효량이, 개별적으로 투여되는 경우에 유효하였을 것인 각 성분의 양을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다는 것에 주목해야 한다.

본 개시내용의 조성물과 연계해서 사용되는 바와 같은 "제약상 허용되는"은 생리학상 관용되고 포유류 (예를 들어, 인간)에게 투여된 경우에 전형적으로 부적당한 반응을 야기시키지 않는, 상기 조성물의 분자 실체 및 기타 성분을 지칭한다. 바람직하게, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "제약상 허용되는"은 연방 또는 주 정부의 규제 기간에 의해 승인되었거나, 또는 미국 약전 또는 포유류, 보다 특히 인간에게 사용하는 것으로 일반적으로 인식된 기타 약전에 열거된 것을 의미한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "대상체"는 모든 포유류를 지칭한다. 바람직한 실시양태에서, 대상체는 인간이다.

본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같은, 단수 형태는 달리 명백하게 지시하지 않는 한은 복수의 언급 대상을 포함한다.

본 개시내용에 따라서, 관련 기술분야 내의 통상적인 분자 생물학, 미생물학 및 재조합 DNA 기술이 이용될 수 있다. 이러한 기술은 다음 문헌에 상세히 설명되어 있다 (예를 들어, 특히 문헌 [Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (본원에서 "Sambrook et al., 1989")]; [DNA Cloning: A practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985)]; [Oligonucleotide Synthesis (MJ. Gait ed. 1984)]; [Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds.(1985)]; [Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)]; [Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1986)]; [Immobilized Cell and Enzymes (lRL Press, (1986)]; [B. Perbal, A practical Guide To Molecular Cloning (1984)]; [F.M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)] 참조).

본 개시내용의 키메라 수용체

본 개시내용은 (a) F158 FCGR3A 또는 V158 FCGR3A 변이체의 세포외 리간드-결합성 도메인 (예를 들어, 각각 서열 16 또는 서열 2); (b) CD8α의 힌지 및 막관통 도메인 (예를 들어, 서열 3); 및 (c) 4-1BB 신호 전달 도메인 (예를 들어, 서열 4) 및 CD3ζ 신호 전달 도메인 (예를 들어, 서열 5)을 포함하는 세포질 도메인을 포함하는 키메라 수용체를 제공한다. 이러한 키메라 수용체는 CD8α의 신호 펩티드, 예를 들어 서열 6을 추가로 포함할 수 있다. 한 구체적 실시양태에서, 상기 키메라 수용체는 서열 1 또는 서열 15의 아미노산 서열을 포함한다. 한 예에서, 상기 키메라 수용체는 서열 1의 아미노산 서열로 이루어진 CD16V-BB-ζ이다. 또 다른 예에서, 상기 키메라 수용체는 서열 15의 아미노산 서열로 이루어진 CD16F-BB-ζ이다.

한 실시양태에서, 본 개시내용의 키메라 수용체는 본원에 기재된 2개의 신호 전달 도메인, 즉 CD3ζ 및 4-1BB/CD137 이외에 하나 이상의 신호 전달 도메인을 함유한다. 한 구체적 실시양태에서, 몇 가지 신호 전달 도메인이 부가적 효과 또는 상승적 효과를 위해 함께 융합된다. 유용한 부가의 신호 전달 도메인의 비-제한적 예는 TCR 제타 쇄, CD28, OX40/CD134, 4-1BB/CD137, FcεRIγ, ICOS/CD278, ILRB/CD122, IL-2RG/CD132, 및 CD40 중 하나 이상의 일부 또는 전부를 포함한다.

본 개시내용은 또한, 상기 개시된 키메라 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 한 구체적 실시양태에서, V158 FCGR3A 변이체의 세포외 리간드-결합성 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열 10의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 한편으론, F158 FCGR3A 세포외 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열 18의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 한 구체적 실시양태에서, CD8α의 힌지 및 막관통 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열 11의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 한 구체적 실시양태에서, 4-1BB 신호 전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열 12의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 한 구체적 실시양태에서, CD3ζ 신호 전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열 13의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 한 구체적 실시양태에서, CD8α의 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열 14의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

한 예에서, CD16V-BB-ζ의 키메라 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열 9의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, CD16F-BB-ζ의 키메라 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열 17의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

이들 폴리뉴클레오티드와 연계해서, 본 개시내용은 또한, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 (이러한 폴리뉴클레오티드가 상기 키메라 수용체의 발현을 위하여 하나 이상의 조절 요소에 작동가능하게 연결되는 벡터 포함)를 제공한다. 본 개시내용의 유용한 벡터의 비-제한적 예는 바이러스 벡터, 예컨대 예를 들어, 레트로바이러스 벡터 및 렌티바이러스 벡터를 포함한다.

한 구체적 실시양태에서, 상기 벡터는 또한, 자살 유전자를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "자살 유전자"는 자살 유전자를 발현하는 세포의 사멸을 초래하는 유전자를 지칭한다. 자살 유전자는 특정 유전자가 발현되는 세포에 대해, 특정 제제, 예를 들어 약물에 대한 감수성을 부여해 주고, 이러한 세포가 상기 제제와 접촉하거나 이에 노출되는 경우에 상기 세포의 사멸을 초래하는 유전자일 수 있다. 자살 유전자는 관련 기술분야에 공지되어 있고 (예를 들어, 문헌 [Suicide Gene Therapy: Methods and Reviews, Springer, Caroline J. (Cancer Research UK Centre for Cancer Therapeutics at the Institute of Cancer Research, Sutton, Surrey, UK), Humana Press, 2004] 참조), 이는 예를 들어, 단순 포진 바이러스 (HSV) 티미딘 키나제 (TK) 유전자, 시토신 데아미나제, 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제, 니트로리덕타제 및 카스파제, 예컨대 카스파제 8을 포함한다.

본 개시내용은 또한, 상기 개시된 키메라 수용체를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 유용한 숙주 세포의 비-제한적 예는 자가 또는 동종일 수 있는 T 림프구 및 NK 세포 (내인성 T-세포 수용체가 제거되거나 보유된다)를 포함한다. 한 구체적 실시양태에서, 상기 숙주 세포는 암 환자로부터 단리된 자가 T 림프구이다. 한 구체적 실시양태에서, 이러한 자가 T 림프구는 생체 외에서 활성화되고 확장된다.

본 개시내용의 키메라 수용체는 관련 기술분야에서 공지된 어떠한 방법에 의해서도 상기 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 특히 유용한 방법의 비-제한적 예는 레트로바이러스 형질도입, 렌티바이러스 형질도입, 및 DNA 및 mRNA 전기천공을 포함한다. 다음 실시예에서 입증된 바와 같이, mRNA 전기천공으로 인해, 본 개시내용의 키메라 수용체가 T 림프구에서 효과적으로 발현된다. 레트로바이러스 형질도입을 설명하는 참고문헌의 예는 앤더슨(Anderson) 등의 미국 특허 번호 5,399,346; 문헌 ([Mann et al., Cell 33:153 (1983)]); 테민(Temin) 등의 미국 특허 번호 4,650,764; 테민 등의 미국 특허 번호 4,980,289; 문헌 ([Markowitz et al., J. Virol. 62:1120 (1988)]); 테민 등의 미국 특허 번호 5,124,263; 도허티(Dougherty) 등에 의해 1995년 3월 16일에 공개된 국제 특허 공개 번호 WO 95/07358; 및 문헌 ([Kuo et al., Blood 82:845 (1993)])을 포함한다. 국제 특허 공개 번호 WO 95/07358에는 일차 B 림프구의 고 효율 형질도입이 기재되어 있다. 예를 들어, 사용될 수 있는 레트로바이러스 형질도입 및 mRNA 전기천공에 대한 구체적인 기술은 하기 실시예 섹션을 참고할 수 있다.

숙주 세포 활성화 및 확장을 통상적으로 이용하여, 바이러스 벡터를 게놈 내로 통합시킬 수 있고 본 개시내용의 키메라 수용체를 코딩하는 유전자를 발현시킬 수 있다. 그러나, mRNA 전기천공이 사용되는 경우에는, (활성화된 세포 상에서 수행되는 경우에 전기천공이 보다 유효하긴 하지만) 활성화 및 확장이 요구되지 않는다. 바이러스 형질도입에 따른 결과로서, 숙주 세포 (T 림프구 또는 NKT 세포)는 본 개시내용의 키메라 수용체가 일시적으로 발현되는 경우의 (전형적으로 3 내지 5일 동안) mRNA 전기천공에 대한 효과 보다 잠재적으로 더 강력한 효과를 야기시키는 장 시간 동안 상기 키메라 수용체를 발현한다. 그러나, 바이러스 형질도입은 복잡하고, 비용이 많이 들며 실행하기가 어려운 반면, mRNA 전기천공은 훨씬 더 간단하고 보다 용이하게 실행 가능하다. 또한, 잠재적 독성이 존재하고 가능한 부작용을 알아보기 위한 임상 시험의 초기 단계에 도움을 주어야만 하는 경우에는 일시적 발현이 유용하다.

본 개시내용의 제약 조성물

본 개시내용의 추가 측면은 제약 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 개시내용은 (i) 본 개시내용의 키메라 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 (ii) 제약상 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 (i) 본 개시내용의 키메라 수용체를 포함하는 숙주 세포 및 (ii) 제약상 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 한 구체적 실시양태에서, 이러한 제약 조성물은 암 세포에 대한 세포독성을 발휘할 수 있는 모노클로날 항체 (예를 들어, 리툭시맙, 트라스투주맙, hu14.18K322A 등) 또는 Fc 부분을 포함하는 또 다른 항-종양 분자 (예를 들어, 면역글로불린 또는 Fc-함유 DNA 또는 RNA의 Fc-부분과 조합된 종양 표면 수용체와 결합하는 리간드 (예를 들어, 시토카인, 면역 세포 수용체)에 의해 구성된 복합 분자)를 추가로 포함한다.

본 개시내용의 제약 조성물에 사용하기 적합한 부형제는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있을 것이고, 이는 예를 들어, 조직 배양 배지 (예를 들어, 세포를 생체 외에서 생존시키기 위함) 또는 식염수 용액 (예를 들어, 세포가 환자에게 주사되는 경우)을 포함할 수 있다. 제약상 허용되는 부형제의 철저한 토의의 내용은 문헌 ([Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991)])에서 입수 가능하다.

본 개시내용의 제약 조성물은 또한, 치료하고자 하는 특별한 적응증에 대해 필요한 바와 같은 한 가지 이상의 부가 활성 화합물, 바람직하게 서로에게 불리한 효과를 나타내지 않는 상보적 활성을 지닌 화합물을 함유할 수 있다. 가능한 부가의 활성 화합물의 비-제한적 예는, 예를 들어 IL2 뿐만 아니라 다음 조합 치료의 토의에 열거된 각종 제제를 포함한다.

본 개시내용의 치료 방법

본 개시내용의 키메라 수용체는 T 림프구에 항체-의존성 세포 세포독성 (ADCC) 능력을 부여해 주고 NK 세포에서 ADCC를 증강시켜 준다. 이러한 수용체가 종양 세포와 결합된 항체 (또는 Fc 부분을 포함하는 또 다른 항-종양 분자)에 의해 개입되는 경우, 이는 T-세포 활성화, 지속적인 증식, 및 상기 항체 (또는 Fc 부분을 포함하는 상기 다른 항-종양 분자)에 의해 표적화된 암 세포에 대항하여 특이적 세포독성을 촉발시킨다. 다음 실시예 섹션에 개시된 바와 같이, 본 개시내용의 수용체를 포함하는 T 림프구는 B-세포 림프종, 유방암 및 위암, 신경모세포종 및 골육종 뿐만 아니라 원발성 만성 림프구성 백혈병 (CLL)을 포함한 광범위한 종양 세포 유형에 대항하여 고도로 세포독성이었다. 세포독성은 표적 세포와 결합된 특이적 항체의 존재에 전적으로 의존성이었고; 가용성 항체는 세포용해 과립의 세포외 유출을 유도시키지 못하였으며 비-특이적 세포독성을 유발시키지 못하였다. Ig의 Fc 부분에 대한 CD16의 친화도가 ADCC의 중요한 결정 요인이므로, 항체 면역요법에 대한 임상 반응에 영향을 미친다. 158V 다형성을 동반한 CD16이 한 예로서 선택되었는데; 이러한 변이체는 Ig에 대한 높은 결합 친화성을 가지고 있고 탁월한 ADCC를 매개한다.

본 개시내용의 키메라 수용체는 하나의 단일 수용체가 다중 암 세포 유형에 사용될 수 있도록 함으로써 T-세포 요법을 촉진시켜 준다. 이는 또한, 다중 항원을 동시에 표적화시켜 줄 수 있는데, 이는 종양에 의해 악용된 면역탈출 기전을 고려해 볼때 궁극적으로 유리할 수 있는 전략이다 (Grupp et al., N. Engl . J. Med. 2013; 368(16):1509-1518). 항체 투여의 간단히 철회가 요구될 때마다 언제든지 항체-유도된 세포독성이 중단될 수 있었다. 본 개시내용의 키메라 수용체를 발현하는 T 세포는 표적 세포와 결합된 항체에 의해서만 활성화되기 때문에, 결합되지 않은 면역글로불린은 주입된 T 세포에 대하여 어떠한 자극도 발휘하지 못하여야 한다. 키메라 수용체를 일시적으로 발현하기 위하여 mRNA 전기천공을 이용함으로써 임상 안전성을 추가로 증강시켜, 잠재적인 어떠한 자가면역 반응성도 제한할 수 있다.

다음 실시예 섹션에 개시된 결과는 생체 외에서 활성화 및 확장되고 본 개시내용의 키메라 수용체를 이용하여 유전적으로 변형시킨 후 재주입되는 자가 T 세포의 주입이 ADCC를 상당히 신장시켜야 한다는 것을 제안하고 있다. 조합된 CD3ζ/4-1BB 신호 전달이 T-세포 증식을 또한 유발시키기 때문에, 종양 부위에 활성화 T 세포가 축적되어야 하고, 이는 그들의 활성을 추가로 증강시킬 수 있다.

따라서, 한 실시양태에서, 본 개시내용은 암의 항체-기반 면역요법의 효능의 증강을 필요로 하는 대상체 내로 치료상 유효량의 T 림프구 또는 NK 세포 (이러한 T 림프구 또는 NK 세포는 본 개시내용의 키메라 수용체를 포함한다)를 도입하는 단계를 포함하는, 암 세포와 결합될 수 있고, 인간 CD16과 결합할 수 있는 인간화 Fc 부분을 갖는 항체를 이용하여 치료받고 있는 대상체에게서 암의 항체-기반 면역요법의 효능을 증강시키는 방법을 제공한다.

또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 특정 대상체에게 T 림프구 또는 NK 세포 (이러한 T 림프구 또는 NK 세포는 본 개시내용의 키메라 수용체를 포함한다)를 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에게서 T 림프구 또는 NK 세포 ADCC 활성을 증강시키는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 대상체는 암을 갖고 있다. 한 구체적 실시양태에서, 상기 대상체는 암 세포와 결합될 수 있는 항체를 이용하여 치료받고 있다.

상기 방법의 한 실시양태에서, 상기 T 림프구 또는 NK 세포는 상기 대상체로부터 단리된 자가 T 림프구 또는 NK 세포이다. 한 구체적 실시양태에서, 대상체 내로 재도입하기에 앞서, 자가 T 림프구 또는 NK 세포는 생체 외에서 활성화되고/되거나 확장된다. 또 다른 실시양태에서, T 림프구 또는 NK 세포는 동종 T 림프구 또는 NK 세포이다. 한 구체적 실시양태에서, T 림프구는 내인성 T 세포 수용체의 발현을 억제 또는 제거시킨 동종 T 림프구이다. 한 구체적 실시양태에서, 대상체 내로 도입하기에 앞서, 동종 T 림프구는 생체 외에서 활성화되고/되거나 확장된다. T 림프구는, 예를 들어 항-CD3/CD28, IL-2, 및/또는 식물성 적혈구 응집소의 존재 하에 관련 기술분야에 공지된 어떠한 방법에 의해서도 활성화시킬 수 있다. NK 세포는, 예를 들어 CD137 리간드 단백질, CD137 항체, IL-15 단백질, IL-15 수용체 항체, IL-2 단백질, IL-12 단백질, IL-21 단백질, 및 K562 세포주로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 작용제의 존재 하에 관련 기술분야에 공지된 어떠한 방법에 의해서도 활성화될 수 있다. NK 세포를 확장시키는 데 유용한 방법에 관한 설명은, 예를 들어 미국 특허 번호 7,435,596 및 8,026,097을 참조할 수 있다.

상기 방법의 한 실시양태에서, 상기 키메라 수용체는 레트로바이러스 형질도입, 렌티바이러스 형질도입, 또는 DNA 또는 RNA 전기천공에 의해 T 림프구 또는 NK 세포 내로 (예를 들어, 생체외 활성화 및/또는 확장 후에) 도입한다.

상기 방법의 한 실시양태에서, T 림프구 또는 NK 세포를 대상체 내로 도입 (또는 재도입)한 다음, 이러한 대상체에게 치료상 유효량의 IL-2를 투여한다.

본 개시내용의 키메라 수용체는 암종, 림프종, 육종, 모세포종 및 백혈병을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 모든 암 (그에 대하여 CD16과 결합되는 Fc 부분을 수반한 특이적 항체가 존재하거나 또는 생성될 수 있다)의 치료에 사용될 수 있다. 본 개시내용의 키메라 수용체에 의해 치료될 수 있는 암의 구체적인 비-제한적 예는, 예를 들어 B-세포 기원의 암 (예를 들어, B-계통 급성 림프모구성 백혈병, B-세포 만성 림프구성 백혈병 및 B-세포 비-호지킨 림프종), 유방암, 위암, 신경모세포종, 및 골육종을 포함한다.

인간 CD16과 결합될 수 있는 Fc 부분을 함유하는 항암 항체 (그의 효능은 본 개시내용의 방법에 의해 증강될 수 있다)의 비-제한적 예는, 예를 들어 리툭시맙, 트라스투주맙, hu14.18K322A, 에프라투주맙, 세툭시맙, 및 라베투주맙을 포함한다.

사용된 항체의 적당한 투여량은 치료하고자 하는 암의 유형, 질환의 중증도 및 과정, 기존의 요법, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응, 및 담당의의 재량에 좌우될 것이다. 상기 항체는 환자에게 1회 투여되거나 또는 일련의 치료 전반에 걸쳐 투여될 수 있다. 본 개시내용의 요법의 진행은 통상적인 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링할 수 있다.

항체의 투여는 전신 투여 뿐만 아니라 질환 부위 (예를 들어, 원발성 종양)에 직접적으로 투여하는 것을 포함한, 적합한 모든 경로에 의해 수행될 수 있다.

본 개시내용의 방법에 사용된 T 림프구는 앞서 혈액 샘플로부터 단리하였고 바람직하게는 표준 방법, 예컨대 예를 들어, 항-CD3/CD28 비드, IL-2, 또는 식물성 적혈구 응집소를 이용하여 생체 외에서 활성화 및 확장시켰던 (예를 들어, 3 내지 5일 동안) 환자 자신의 세포 (즉, 자가 세포)가 가장 바람직하다. 또 다른 한편으론, 동종 T 림프구 (바람직하게, 내인성 T 세포 수용체의 발현을 억제 또는 제거시킨 동종 T 림프구)를 사용할 수 있다 (문헌 [Torikai et al., Blood, 2012 119: 5697-5705] 참조). 단리 (및 임의로 활성화 및/또는 확장)시킨 후, 환자로부터의 T 림프구 및 NK 세포를 본 개시내용의 키메라 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (또는 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터)로 형질도입 (또는 전기천공)하여, 상기 키메라 수용체가 T 세포 또는 NK 세포의 세포 표면 상에서 발현되도록 한다. 이어서, 이와 같이 변형된 세포를 환자 내로 투여할 수 있다 (예를 들어, 치료 항체를 주입한지 1일 후에 투여할 수 있다).

본 개시내용에 따라서, 약 10⁵ 내지 10¹⁰개 또는 그 초과 세포/체중 킬로그램 (세포/Kg)의 범위의 본 개시내용의 키메라 수용체를 포함하는 치료상 유효 용량의 T 림프구 또는 NK 세포를 주입함으로써 환자를 치료할 수 있다. 이러한 주입은 목적하는 반응이 달성될 때까지 환자가 관용할 수 있을 만큼 자주 수회 반복할 수 있다. 적당한 주입 용량 및 스케줄은 환자마다 다양할 것이지만, 특별한 환자를 치료하는 의사에 의해 결정될 수 있다. 전형적으로, 대략 10⁶개 세포/Kg의 초기 용량을 주입하고, 그 용량을 10⁸개 또는 그 초과 세포/Kg이 되도록 단계적으로 상승시킬 것이다. IL-2를 공동-투여하여, 주입 후 주입된 세포를 확장시킬 수 있다. IL-2의 양은 체표면 평방 미터당 약 1 내지 5 x 10⁶ 국제 단위일 수 있다.

본 개시내용의 방법에 사용된 NK 세포는 주요 조직적합성 복합체 I 및/또는 II 분자가 결여되거나 또는 이를 불충분하게 발현하는 세포, 및 막 결합된 IL-15 및 4-1BB 리간드 (CDI37L)를 발현시키기 위해 유전적으로 변형시켰던 세포에 노출시킴으로써 우선적으로 확장될 수 있다. 이러한 세포주는 K562 (ATCC, CCL 243; 문헌 [Lozzio et al., Blood 45(3):321-334 (1975)]; [Klein et al., Int. J. Cancer 18:421-431 (1976)]), 및 빌름스(Wilms) 종양 세포주 HFWT (문헌 [Fehniger T A, Caligiuri M A. Int Rev Immunol 20(3-4):503-534 (2001)]; [Harada H, et al., Exp Hematol 32(7):614-621 (2004)]), 자궁 내막 종양 세포주 HHUA, 흑색종 세포주 HMV-II, 간모세포종 세포주 HuH-6, 폐 소 세포 암종 세포주 Lu-130 및 Lu-134-A, 신경모세포종 세포주 NB 19 및 N1369, 고환 NEC 14로부터의 배아 암종 세포주, 자궁경부 암종 세포주 TCO-2, 및 골수-전이된 신경모세포종 세포주 TNB 1 (문헌 [Harada H., et al., Jpn. J. Cancer Res 93: 313-319 (2002)])을 포함하지만, 이에 반드시 제한되지 않는다. 바람직하게, 사용된 세포주는 MHC I 분자와 II 분자 둘 다가 결여되거나 또는 이를 불충분하게 발현하는데, 예컨대 K562 및 HFWT 세포주이다. 세포주 대신 고형 지지체를 사용할 수 있다. 이러한 지지체는 바람직하게 그의 표면 상에, NK 세포와 결합할 수 있고 일차 활성화 현상 및/또는 증식성 반응을 유도할 수 있거나 또는 상기 효과를 지닌 분자와 결합할 수 있음으로써, 스캐폴드(scaffold)로서 작용할 수 있는 하나 이상의 분자가 부착되어야 한다. 상기 지지체는 그의 표면에 CD137 리간드 단백질, CD137 항체, IL-15 단백질 또는 IL-15 수용체 항체를 부착시킬 수 있다. 바람직하게, 상기 지지체는 그의 표면 상에 결합된 CD137 항체 및 IL-15 수용체 항체를 가질 것이다.

본 개시내용의 조합 치료

본 개시내용에 기재된 조성물 및 방법은 다른 유형의 암 요법, 예컨대 화학요법, 수술, 방사선, 유전자 요법 등과 연계해서 활용될 수 있다. 이러한 요법은 본 개시내용에 따르는 면역요법과 동시에 또는 순차적으로 (어떠한 순서로든지) 투여될 수 있다.

부가의 치료제와 공동-투여되는 경우, 각 제제에 적합한 치료상 유효 투여량은 부가적 작용 또는 상승 작용으로 인해 낮출 수 있다.

본 개시내용의 치료는 기타 면역조정 치료, 예컨대 예를 들어, 치료용 백신 (GVAX, DC-기반 백신 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다), 체크포인트(checkpoint) 억제제 (CTLA4, PD1, LAG3, TIM3 등을 차단시키는 제제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다) 또는 활성화제 (41BB, OX40 등을 증강시키는 제제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다)와 조합될 수 있다.

본 개시내용의 면역요법과 조합하는 데 유용한 기타 치료제의 비-제한적 예는 다음을 포함한다:

(i) 항-혈관형성제 [예를 들어, TNP-470, 혈소판 인자 4, 트롬보스폰딘-1, 메탈로프로테아제의 조직 억제제 (TIMP1 및 TIMP2), 프롤락틴(prolactin) (16-Kd 단편), 안지오스타틴(angiostatin) (플라스미노겐의 38-Kd 단편), 엔도스타틴(endostatin), bFGF 가용성 수용체, 전환 성장 인자 베타, 인터페론 알파, 가용성 KDR 및 FLT-1 수용체, 태반 프로리페린-관련 단백질 뿐만 아니라 문헌 (Carmeliet and Jain (2000))에 열거된 것];

(ii) VEGF 길항제 또는 VEGF 수용체 길항제, 예컨대 항-VEGF 항체, VEGF 변이체, 가용성 VEGF 수용체 단편, VEGF 또는 VEGFR을 차단할 수 있는 앱타머, 중화성 항-VEGFR 항체, VEGFR 티로신 키나제의 억제제 및 그의 모든 조합물;

(iii) 화학요법 화합물, 예컨대 예를 들어, 피리미딘 유사체 (5-플루오로우라실, 플록수리딘, 카페시타빈, 젬시타빈 및 시타라빈), 퓨린 유사체, 엽산 길항제 및 관련 억제제 (머캅토퓨린, 티오구아닌, 펜토스타틴 및 2-클로로데옥시아데노신 (클라드리빈)); 항증식제/항유사분열제, 예를 들어 자연 생성물, 예컨대 빈카 알카로이드 (빈블라스틴, 빈크리스틴 및 비노렐빈), 미세소관 교란제, 예컨대 탁산 (파클리탁셀, 도세탁셀), 빈크리스틴, 빈블라스틴, 노코다졸, 에포틸론 및 나벨빈, 에피디포도필로톡신 (에토포시드, 테니포시드), DNA 손상제 (악티노마이신, 암사크린, 안트라시클린, 블레오마이신, 부술판, 캄프토테신, 카르보플라틴, 클로람부실, 시스플라틴, 시클로포스파미드, 시톡산, 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 헥사메틸멜라민옥살리플라틴, 이포스파미드, 멜팔란, 메르클로르에타민, 미토마이신, 미톡산트론, 니트로소우레아, 플리카마이신, 프로카르바진, 탁솔, 탁소테레, 테니포시드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 에토포시드 (VP16)); 항생체, 예컨대 닥티노마이신 (악티노마이신 D), 다우노루비신, 독소루비신 (아드리아마이신), 이다루비신, 안트라시클린, 미톡산트론, 블레오마이신, 플리카마이신 (미트라마이신) 및 미토마이신; 효소 (자신의 아스파라긴을 합성할 수 있는 능력을 갖고 있지 않은 세포를 박탈시키고 L-아스파라긴을 체계적으로 대사시키는 L-아스파라기나제); 항혈소판제; 항증식성/항유사분열성 알킬화제, 예컨대 질소 머스타드 (메클로르에타민, 시클로포스파미드 및 유사체, 멜팔란, 클로람부실), 에틸렌이민 및 메틸멜라민 (헥사메틸멜라민 및 티오테파), 알킬 술포네이트-부술판, 니트로소우레아 (카르무스틴 (BCNU) 및 유사체, 스트렙토조신), 트라젠-다카르바지닌 (DTIC); 항증식성/항유사분열성 항대사제, 예컨대 엽산 유사체 (메토트렉세이트); 백금 배위 착물 (시스플라틴, 카르보플라틴), 프로카르바진, 히드록시우레아, 미토탄, 아미노글루테티미드; 호르몬, 호르몬 유사체 (에스트로겐, 타목시펜, 고세렐린, 비칼루타미드, 닐루타미드) 및 아로마타제 억제제 (레트로졸, 아나스트로졸); 항응고제 (헤파린, 합성 헤파린 염 및 트롬빈의 기타 억제제); 섬유소 용해제 (예컨대, 조직 플라스미노겐 활성화제, 스트렙토키나제 및 우로키나제), 아스피린, 디피리다몰, 티클로피딘, 클로피도그렐, 압시키맙; 항유주제; 항분비제 (브레벨딘); 면역억제제 (시클로스포린, 타크롤리무스 (FK-506), 시롤리무스 (라파마이신), 아자티오프린, 미코페놀레이트 모페틸); 항-혈관형성 화합물 (예를 들어, TNP-470, 제니스테인, 베바시주맙) 및 성장 인자 억제제 (예를 들어, 섬유모세포 성장 인자 (FGF) 억제제); 안지오텐신 수용체 차단제; 산화질소 공여자; 안티센스 올리고뉴클레오티드; 항체 (트라스투주맙); 세포 주기 억제제 및 분화 유도제 (트레티노인); mTOR 억제제, 토포이소메라제 억제제 (독소루비신 (아드리아마이신), 암사크린, 캄프토테신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 에니포시드, 에피루비신, 에토포시드 이다루비신 및 미톡산트론, 토포테칸, 이리노테칸), 코르티코스테로이드 (코르티손, 덱사메타손, 히드로코르티손, 메틸페드니솔론, 프레드니손 및 프레니솔론); 성장 인자 신호 변환 키나제 억제제; 미토콘드리아 기능 장애 유도제 및 카스파제 활성화제; 및 염색질 교란제.

부가의 유용한 제제의 예에 관해서는 다음 문헌을 참조할 수 있다 ([Physician's Desk Reference, 59.sup.th edition, (2005), Thomson P D R, Montvale N.J.]; [Gennaro et al., Eds. Remington's The Science and Practice of Pharmacy 20.sup.th edition, (2000), Lippincott Williams and Wilkins, Baltimore Md.]; [Braunwald et al., Eds. Harrison's Principles of Internal Medicine, 15.sup.th edition, (2001), McGraw Hill, NY]; [Berkow et al., Eds. The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, (1992), Merck Research Laboratories, Rahway N.J]).

추가의 동화 없이도, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 상기 설명에 근거하여, 본 발명을 충분히 이용할 수 있는 것으로 여겨진다. 따라서, 다음의 구체적 실시양태는 단지 예시적인 것이고, 어떠한 방식으로든지 나머지 개시내용을 제한하지 않는 것으로 간주되어야 한다. 본원에 인용된 모든 공개문헌은 본원에 언급된 목적 또는 주제를 위해 참조로 포함된다.

실시예

본 개시내용은 또한, 다음 실시예를 통하여 기재되고 입증된다. 그러나, 본 명세서 내의 어느 곳에서 이들 및 기타 실시예를 사용하는 것은 단지 예시적이고 어떠한 방식으로든지 본 개시내용 또는 예시된 모든 항목의 범위 및 의미를 제한하지 않는다. 마찬가지로, 본 개시내용은 실시예에 기재된 특별한 어떠한 바람직한 실시양태로 제한되지 않는다. 실제로, 본 개시내용의 많은 변형 및 변이는 본 명세서 판독시 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 수 있고, 이러한 변이는 본 개시내용을 벗어나지 않고서도 본 발명의 요지 또는 범위 내에서 만들어질 수 있다.

재료 및 방법

세포

인간 B-계통 림프종 세포주 다우디 및 라모스, T-세포 급성 림프모구성 백혈병 세포주 저캣, 및 신경모세포종 세포주 CHLA-255, NB1691 및 SK-N-SH는 세인트 주드 아동 연구 병원(St. Jude Children’s Research Hospital)에서 입수 가능하였다. 유방 암종 세포주 MCF-7 (ATCC HTB-22) 및 SK-BR-3 (ATCC HTB-30), 및 골육종 세포주 U-2 OS (ATCC HTB-96)는 아메리칸 타입 컬처 컬렉션 (ATCC; 미국 메릴랜드주 록빌)으로부터 입수하였고; 위 암종 세포주 MKN7은 국립 바이오의학 혁신 연구소 (일본 오사카)로부터 입수하였다. 다우디, CHLA-255, NB1691, SK-N-SH, SK-BR-3, MCF-7, U-2 OS 및 MKN7은 또한, 반딧불이 루시페라제 유전자를 함유하는 뮤린 줄기 세포 바이러스 (MSCV)-내부 리보솜 진입 부위 (IRES)-그린 형광성 단백질 (GFP) 레트로바이러스 벡터로 형질도입하였다 (Fujisaki et al., Cancer Res. 2009; 69(9):4010-4017). 형질도입된 세포를 대상으로 하여, FACSAria 세포 분류기 [BD 바이오사이언스(BD Biosciences; 미국 캘리포니아주 산호세)]를 이용하여 그들의 GFP의 발현에 관하여 선별하였다. B-만성 림프구성 백혈병 (CLL)이 있는 것으로 새롭게 진단되었고 아직 치료받지 못한 환자로부터의 말초혈 또는 골수 샘플을, 싱가포르 국립 대학 병원을 관리하는 지역 특화 윤리 위원회로부터의 승인과 고지에 입각한 동의서에 따라서 수득하였다.

말초혈 샘플은 건강한 성인 공여자로부터의 혈소판 기증의 비특정화된 부산물로부터 수득하였다. 단핵 세포는 Accu-Prep 인간 림프구 세포 분리 배지 [정밀 화학 & 과학 코포레이션 (Accurate Chemical & Scientific Corp.; 미국 뉴욕주 웨스트베리)] 상에서 원심분리함으로써 강화시켰고, 이를 3일 동안 10% 태아 소 혈청 (FBS), 항생제, 100 IU 인터루킨 (IL)-2 [로슈 (Roche; 독일 만하임)]를 수반하는 RPMI-1640에서 항-CD3/CD28 비드 [인비트로젠 (Invitrogen; 미국 캘리포니아주 칼즈배드)]와 함께 배양하였다. 4일째에, CD14, CD16, CD19, CD36, CD56, CD123 및 CD235a 항체의 혼합물 및 자기 비드 [범 T 세포 단리 키트 II; 밀테니 바이오텍 (Miltenyi Biotec; 독일 베르기슈 글라트바흐)]를 이용하여 음성 선별함으로써 T 세포를 정제하였다 (순도 >98%). 정제된 T 세포를 상기 배지에서 유지시키는데, 100 IU IL-2를 격일로 부가하였다.

플라스미드, 바이러스 생성 및 유전자 형질도입

pMSCV-IRES-GFP, pEQ-PAM3(-E), 및 pRDF는 세인트 주드 어린이 연구 병원 벡터 개발 및 생산 공용 자원 (미국 테네시주 멤피스)으로부터 입수하였다¹⁰. FCRG3A cDNA는 오리진 (Origene; 미국 메릴랜드주 록빌)으로부터 입수하였고, 그의 V158F 변이체는 프라이머 "F" CTTCTGCAGGGGGCTTGTTGGGAGTAAAAATGTGTC (서열 7) 및 "R" GACACATTTTTACTCCCAACAAGCCCCCTGCAGAAG (서열 8)를 사용하여 PCR함으로써 부위-유도 돌연변이유발을 이용하여 생성시켰다. CD8α 힌지 및 막관통 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (서열 11), 4-1BB의 신호 전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (서열 12) 및 CD3ζ의 신호 전달 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (서열 13)를, 미리 제조된 항-CD19-41BB-CD3ζ cDNA로부터 서브클로닝하였다 (문헌 [Imai et al., Leukemia 2004; 18:676-684] 참조). 이들 분자를, PCR에 의해 중복 연장시킴으로써 스플라이싱을 이용하여 어셈블리하였다. 구조물 ("CD16F-BB-ζ" 및 "CD16V-BB-ζ") 및 발현 카세트를 MSCV-IRES-GFP 벡터의 EcoRI 및 MLu1 부위 내로 서브클로닝하였다.

RD114-슈도타입 레트로바이러스를 생성하기 위하여, fuGENE 6 또는 X-tremeGENE 9 (로슈; 미국 인디애나주 인디애나폴리스)를 이용하여, CD16V-BB-ζ를 코딩하는 3.5 ㎍의 cDNA, 3.5 ㎍의 pEQ-PAM3(-E), 및 3 ㎍의 pRDF로 3 x 10⁶개 293T 세포를 형질감염시켰다 (Imai et al., Leukemia 2004; 18:676-684). 24시간째에 상기 배지를, 10% FBS를 수반한 RPMI-1640으로 대체한 후, 48 내지 96시간 후에 레트로바이러스를 함유하는 배지를 수거하고, 이를 레트로넥틴 (RetroNectin; 일본 오쓰 다카라)-코팅된 폴리프로필렌 튜브에 가한 다음, 10분 동안 1400 g으로 원심분리시키고 37℃ 하에 6시간 동안 인큐베이션하였다. 원심분리를 더 수행하고 상등액을 제거한 후, T 세포 (1 x 10⁵개)를 상기 튜브에 가하고 37℃ 하에 24시간 동안 정치시켜 두었다. 이어서, 형질도입 7 내지 21일 후 실험할 때까지, FBS, 항생제 및 100 IU/mL IL-2를 수반한 RPMI-1640에서 세포를 유지시켰다.

R-피코에리트린 접합된 항-인간 CD16 [클론 B73.1, BD 바이오사이언스 파르밍겐(Pharmingen); 미국 캘리포니아주 샌디에이고]을 이용하여 유동 세포계수함으로써 CD16의 표면 발현을 분석하였다. 웨스턴 블롯팅을 위하여, 2 x 10⁷개 T 세포를, 1% 프로테아제 억제제 칵테일 [시그마(Sigma)] 및 1% 포스파타제 억제제 칵테일 2 (시그마)를 함유하는 셀리틱(Cellytic) M 용해 완충액 (시그마; 미국 미주리주 세인트 루이스)에 용해시켰다. 원심분리시킨 후, 용해물 상등액을, 환원성 완충제 (인비트로젠)를 수반하거나 수반하지 않는 등용적의 LDS 완충제 (인비트로젠; 미국 캘리포니아주 칼즈배드)와 함께 비등시킨 다음, NuPAGE 노벡스(Novex) 12% 비스-트리스(Bis-Tris) 겔 (인비트로젠)에 의해 분리시켰다. 단백질을 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF) 막으로 옮기고, 이를 마우스 항-인간 CD3ζ (클론 8D3; BD 이바이오사이언스 파르밍겐)와 함께 인큐베이션한 다음, 염소 항-마우스 IgG 서양고추냉이 퍼옥시다제-접합된 2차 항체 [셀 시그날링 테크놀로지 (Cell Signaling Technology; 미국 매사추세츠주 댄버스)]와 함께 인큐베이션하였다. 애머샴(Amersham) ECL 프라임 탐지 시약 [GE 헬스케어(Healthcare)]을 이용함으로써 항체 결합성을 밝혀내었다.

mRNA 전기천공

pVAX1 벡터 (인비트로젠; 미국 캘리포니아주 칼즈배드)를 시험관내 mRNA 전사를 위한 주형으로서 사용하였다. CD16V-BB-ζ cDNA를 pVAX1의 EcoRI 및 XbaI 부위 내로 서브클로닝하였다. 상응하는 mRNA를 시험관 내에서 T7 mScript mRNA 생성 시스템 [셀스크립트(CellScript; 미국 위스콘신주 매디슨)]으로 전사하였다 (예를 들어, 문헌 [Shimasaki et al., Cytotherapy. 2012;14(7):830-40] 참조).

전기천공하기 위하여, 아막사 뉴클레오펙터(Amaxa Nucleofector) [론자 (Lonza; 미국 메릴랜드주 워커스빌)]를 사용하였고; 200 IU/mL IL-2로 밤새 활성화시킨 정제된 T 세포 1 x 10⁷개를 셀 라인(Cell Line) 뉴클레오펙터 키트 V (론자)에서 200 ㎍/mL mRNA와 혼합하고, 프로세싱 챔버 내로 옮긴 다음, 프로그램 X-001을 이용하여 형질감염시켰다. 전기천공 직후, 세포를 프로세싱 챔버로부터 24-웰 판으로 옮긴 다음, FBS, 항생제 및 100 IU/mL IL-2를 수반하는 RPMI-1640 (로슈; 독일 만하임)에서 배양하였다 (또한, 문헌 [Shimasaki et al., Cytotherapy, 2012, 1-11] 참조).

항체 결합성, 세포 접합 및 세포 증식 검정

키메라 수용체의 항체-결합 능력을 측정하기 위하여, 키메라 수용체로 형질도입시켰거나 또는 GFP 만을 함유하는 벡터로 형질도입시킨 T 림프구 (5 x 10⁵개)를 4℃ 하에 30분 동안 리툭시맙 [리툭산 (Rituxan; 로슈; 0.1 내지 1 ㎍/mL)], 트라스투주맙 [헤르셉틴 (Herceptin; 로슈; 0.1 내지 1 ㎍/mL)] 및/또는 정제된 인간 IgG (R&D 시스템즈; 미국 미네소타주 미네아폴리스; 0.1 내지 1 ㎍/mL)와 함께 인큐베이션하였다. 인산염 완충 식염수 (PBS)로 2회 세척한 후, 세포를 실온 하에 10분 동안 염소 항-인간 IgG-PE [서던 바이오테크놀로지 어소시에이트 (Southern Biotechnology Associates; 미국 앨라배마주 버밍햄)]와 함께 인큐베이션하고, 아쿠리(Accuri) C6 유동 세포계수기 (BD 바이오사이언스)를 이용하여 세포 염색을 측정하였다.

수용체에 대한 항체 결합이 세포 집합을 증진시켰는지를 결정하기 위하여, CD20-양성 다우디 세포를 셀트레이스(CellTrace) 칼세인 레드-오렌지 AM (인비트로젠)으로 표지시킨 다음, 4℃ 하에 30분 동안 리툭시맙 (0.1 ㎍/mL)과 함께 인큐베이션하였다. PBS에서 2회 세척한 후, 상기 세포를, 37℃ 하에 60분 동안 96 환저 판 [코스타르 (Costar; 미국 뉴욕주 코닝)]에서 1:1 E:T 비 하에 상기 키메라 수용체로 형질도입되었거나 또는 모의 형질도입된 저캣 세포로 대체하였다. 이종 세포 집합체 (칼세인 AM-GFP 이중 양성)를 형성하는 세포의 비율을 유동 세포계수법에 의해 결정하였다.

세포 증식을 측정하기 위하여, 키메라 수용체로 형질도입되었거나 또는 모의-형질도입된 1 x 10⁶개의 T 세포를, FBS, 항생제 및 50 IU/mL IL-2를 수반한 RPMI-1640에서 24-웰 판 (코스타르; 미국 뉴욕주 코닝)의 웰에 놓아두었다. 다우디 세포를 스트렉크(Streck) 세포 보존제 [스트렉크 라보라토리즈 (Streck Laboratories; 미국 네브래스카주 오마하)]로 처리하여 증식을 중단시키고, 4℃ 하에 30분 동안 리툭시맙 (0.1 ㎍/mL)으로 표지시켰다. 이들을 0, 7, 14 및 21일째에 T 세포와 1:1 비로 상기 웰에 가하였다. 배양 후 살아있는 T 세포의 n 수를 유동 세포계수법에 의해 측정하였다.

CD107 탈과립 및 세포독성 검정

CD16 교차 결합이 용해 과립의 세포외 유출을 유발시켰는지를 결정하기 위하여, 키메라 수용체-형질도입된 및 모의 형질도입된 T 세포 (1 x 10⁵개)를 리툭시맙-코팅된 96-웰 평저 판의 각 웰 내로 놓아두고 37℃ 하에 4시간 동안 배양하였다. 다른 실험에서는, T 세포를 리툭시맙과 미리-인큐베이션된 다우디 세포와 공동-배양하였다. 피코에리트린과 접합된 항-인간 CD107a 항체 (BD 바이오사이언스)를 배양 시작시 가하였고, 1시간 후에 골지스톱(GolgiStop) (0.15 ㎕; BD 바이오사이언스)을 가하였다. CD107a 양성 T 세포를 유동 세포계수법에 의해 분석하였다.

세포독성을 시험하기 위하여, 표적 세포를, 10% FBS를 수반한 RPMI-1640에 현탁시키고, 칼세인 AM (인비트로젠)으로 표지시키며, 96-웰 환저 판 (코스타르) 내로 도말하였다. T 세포를 결과에 표시된 바와 같이 각종 E:T 비로 가하였고, 항체 리툭시맙 (리툭산; 로슈), 트라스투주맙 (헤르셉틴; 로슈), 또는 hu14.18K322A [세인트 주드 어린이 GMP의 닥터 제임스 알레이 (Dr. James Allay, St Jude Children's GMP (미국 테네시주 멤피스)로부터 입수함; 1 ㎍/mL]를 수반하거나 수반하지 않으면서, 4시간 동안 표적 세포와 함께 공동 배양하였다. 배양이 끝날 무렵, 세포를 수집하고, 동일한 용적의 PBS에 재현탁시키며, 프로피듐 요오다이드를 가하였다. 아쿠리 C6 유동 세포계수기를 이용하여 살아있는 표적 세포 (칼세인 AM-양성, 프로피듐-요오다이드 음성)의 수를 계수하였다 (Fujisaki et al., Cancer Res. 2009; 69(9):4010-4017). 부착성 세포주에 대해서는, 루시페라제-표지된 표적 세포를 이용하여 세포독성을 시험하였다. 부착성 세포주 NB1691, CHLA-255, SK-BR-3, MCF-7, U-2 OS 및 MKN7에 대항한 세포독성을 측정하기 위하여, 그들의 루시페라제-표지된 유도체를 사용하였다. 4시간 이상 동안 도말한 후, T 세포를 상기 언급된 바와 같이 가하였다. 4시간 공동-배양한 후, 프로메가 브라이트-글로(Promega Bright-Glo) 루시페라제 시약 (프로메가; 미국 위스콘신주 매디슨)을 각 웰에 가하고; 5분 후에, 판 판독기 바이오텍 FLx800 (바이오텍; 미국 애리조나주 투손)을 이용하여 발광을 측정하며, Gen5 2.0 데이터 분석 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.

이종이식편 실험

루시페라제를 발현하는 다우디 세포를 NOD.Cg-Prkdc^scid IL2rg^tm1Wjl/SzJ (NOD/scid IL2RGnull) 마우스 [잭슨 라보라토리 (Jackson Laboratory; 미국 바 하버)]에 복강내 (i.p.; 마우스당 0.3 x 10⁶개 세포) 주사하였다. 일부 마우스에게는 다우디 접종 후 4일째에 리툭시맙 (100 ㎍)을 복강내 투여하였고, 5일 및 6일째에는 인간 일차 T 세포를 복강내 주사하거나 주사하지 않았다. T 세포를 3일 동안 항-CD3/CD28 비드로 활성화시켰고, CD16V-BB-ζ 수용체로 형질도입시켰으며, 10% FBS가 부가된 RPMI-1640에 재현탁시킨 다음, 마우스당 1x 10⁷개 세포로 주사하였다. 추가의 T 림프구 주사를 수반하지 않으면서, 리툭시맙 주사를 4주 동안 매주 반복하였다. 모든 마우스에게 4주 동안 1주에 2회씩 1,000 내지 2,000 IU의 IL-2를 복강내 주사하였다. 일군의 마우스에게 리툭시맙 또는 T 세포 대신 조직 배양 배지를 투여하였다.

제노겐(Xenogen) IVIS-200 시스템 [캘리퍼 라이프 사이언스 (Caliper Life Sciences; 미국 매사추세츠주 홉킨턴)]을 이용하여 종양 생착과 성장을 측정하였다. D-루시페린 칼륨 염 (3 mg/마우스)의 수성 용액을 복강내 주사한지 5분 후에 영상화를 시작하였고, 리빙 이미지(Living Image) 3.0 소프트웨어를 이용하여, 루시페라제-발현성 세포로부터 방출된 광자를 정량화하였다.

결과

CD16V -BB-ζ 수용체의 발현

개체의 약 1/4에게서 발현되는 FCRG3A (CD16)의 V158 다형성은 고 친화성 면역글로불린 Fc 수용체를 코딩하고, 항체 요법에 대해 유리한 반응과 연관이 있다 (25, 26, 29-31). FCGR3A 유전자의 V158 변이체가 생성되었다. 이를 CD8α의 힌지 및 막관통 도메인, T-세포 자극성 분자 CD3ζ, 및 상호 자극성 분자 4-1BB와 조합하였다 (도 1A) (Imai et al., Leukemia 2004; 18:676-684). CD16V-BB-ζ 구조물과 GFP를 함유하는 MCSV 레트로바이러스 벡터를 사용하여, 12명의 공여자로부터의 말초혈 T 림프구를 형질도입하였는데: CD3+ 세포에서의 평균 GFP 발현은 89.9% (범위, 75.3% 내지 97.1%)였고; 동일한 세포 내에서, 항-CD16 염색에 의해 평가된 바와 같은 평균 키메라 수용체 표면 발현은 83.0% (67.5% 내지 91.8%)였다 (도 1B). GFP 만을 함유하는 벡터로 형질도입시킨 동일한 공여자로부터의 T 림프구는 90.3% (67.8% 내지 98.7%)의 평균 GFP 발현을 나타냈지만, 1.0% (0.1% 내지 2.7%) 만이 CD16을 발현하였다 (도 1B). 상기 수용체의 발현은 CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포 간에 유의적으로 상이하지 않았는데: 77.6% ± 9.2% CD8+ 세포와 비교해서 69.8% ± 10.8% CD4+ 세포가, CD16V-BB-ζ로의 형질도입 후 CD16+였다 (도 2).

키메라 수용체의 다른 성분이 발현되었다는 것을 보장하기 위하여, CD3ζ의 발현 수준을 유동 세포계수법에 의해 측정하였다. 도 1B에 제시된 바와 같이, CD16V-BB-ζ-형질도입된 T 림프구는 모의-형질도입된 세포에 의해 발현된 것 보다 훨씬 더 높은 수준으로 CD3ζ를 발현하였는데: 평균 형광 세기의 평균 (± SD)은 전자에서는 45,985 ± 16,365인 반면, 후자에서는 12,547 ± 4,296였다 (t 시험에 의한 P = 0.027; n = 3; 도 1B). 키메라 단백질의 존재는 항-CD3ζ 항체로 프로빙된 웨스턴 블롯팅에 의해 결정하였다. 도 1C에 제시된 바와 같이, CD16V-BB-ζ-형질도입된 T 림프구는 16 kDa의 내인성 CD3ζ 이외에도, 환원성 조건 하에 대략 25 kDa의 키메라 단백질을 발현하였다. 비-환원성 조건 하에서는, CD16V-BB-ζ 단백질이 50 kDa의 이량체 또는 단량체로서 발현된 것으로 밝혀졌다.

V158 대 F158 CD16 수용체의 항체-결합 능력

면역글로불린 (Ig)과 결합할 수 있는 CD16V-BB-ζ 키메라 수용체의 능력을 시험하기 위하여, 3명의 공여자로부터의 말초혈 T 림프구를 형질도입하였다. 도 3A에 제시된 바와 같이, CD16V-BB-ζ-발현성 T 림프구를, 리툭시맙과 인큐베이션한 후에 상기 항체로 코팅하였다. 트라스투주맙 및 인간 IgG를 이용하여 유사한 결과를 수득하였다.

그 다음, FCRG3A (CD16)의 고 친화성 V158 다형성을 함유한 CD16V-BB-ζ 수용체의 Ig-결합 능력을, 대신 F158 변이체를 함유하는 동일한 수용체 ("CD16F-BB-ζ")의 결합 능력과 비교하였다. 저캣 세포를 어느 하나의 수용체로 형질도입한 후, 이들을 리툭시맙 및 항-인간 Ig PE 항체 (리툭시맙과 결합함)와 함께 인큐베이션하였고, PE 형광 세기는 GFP의 것과 관계가 있었다. 도 3B에 제시된 바와 같이, GFP의 어떠한 소정의 수준에서도, CD16V-BB-ζ 수용체로 형질도입된 세포는 CD16F-BB-ζ 수용체로 형질도입된 세포 보다 더 높은 PE 형광 세기를 갖고 있었는데, 이는 전자가 상당히 더 높은 항체-결합 친화성을 갖고 있었다는 것을 표시한다. 트라스투주맙과 인간 IgG는 또한, CD16V-BB-ζ 수용체에 의해 보다 높은 친화성으로 결합되었다 (도 4).

CD16V-BB-ζ 수용체와 결합하는 항체가 이펙터 및 표적 세포의 집합을 증진시킬 수 있었는지를 결정하기 위하여, CD16V-BB-ζ (및 GFP)를 발현하는 저캣 세포를 60분 동안 CD20+ 다우디 세포주 (칼세인 AM 적색-오렌지로 표지됨)와 1:1 비로 혼합하였고, 리툭시맙을 부가하거나 또는 부가하지 않으면서 GFP-칼세인 이중선의 형성을 측정하였다. 3가지 실험에서, CD16V-BB-ζ 수용체 및 리툭시맙을 발현한 저캣 세포가 존재하는 경우에는, 공동 배양물 중에서의 현상(event)의 39.0% ± 1.9%가 이중선이었다 (도 3C 및 D). 이와는 달리, 리툭시맙 대신 인간 IgG이 존재하거나, 또는 리툭시맙이 존재하는지에 상관없이 모의-형질도입된 저캣 세포의 경우에는 <5% 이중선이 있었다.

Ig가 CD16V -BB-ζ와 결합하면, T 세포 활성화, 탈과립 및 세포 증식이 유도된다

고정화 항체에 의한 CD16V-BB-ζ 수용체 교차 결합이 T 림프구에서의 활성화 신호를 유도시킬 수 있었는지를 평가하였다. 실제로, CD16V-BB-ζ로 형질도입된 T 림프구는 리툭시맙으로 코팅된 판 상에서 배양된 경우에는 IL-2 수용체 발현 (CD25)을 현저하게 증가시킨 반면, 항체의 부재 하에서는 또는 이러한 항제가 존재하는지에 상관없이 모의-형질도입된 세포에서는 변화가 전혀 탐지되지 않았다 (도 5A 및 B).

IL-2 수용체의 발현 이외에도, CD16V-BB-ζ 수용체 교차 결합은 CD107a 염색에 의해 탐지된 바와 같이, T 림프구에서 용해 과립의 세포외 유출을 촉발시켰다. 따라서, 4명의 공여자로부터의 T 림프구를, 리툭시맙으로 코팅된 미세역가 판 상으로 시딩하였거나 (n = 3) 또는 리툭시맙의 존재 하에 다우디 세포와 공동-배양한 (n = 3) 6가지 실험에서는, CD16V-BB-ζ를 발현하는 T 림프구가 CD107a 양성이 되었다 (도 5C).

최종적으로, 수용체 교차 결합이 세포 증식을 유도할 수 있었는지를 결정하였다. 도 5D에 제시된 바와 같이, CD16V-BB-ζ를 발현하는 T 림프구는 리툭시맙 및 다우디 세포 (T 림프구와 1:1 에서)의 존재 하에 확장되었는데: 3가지 실험에서, 배양 7일 후 평균 T 세포 회수율은 유입 세포의 632% (± 97%)였고; 배양 4주 후에는 6,877% (± 1,399%)였다. 주목해야 할 것은, 극히 높은 농도 (1 내지 10 ㎍/mL) 하에서도, 결합되지 않은 리툭시맙은 표적 세포의 부재 하에서 세포 증식에 대하여 유의적 효과를 나타내지 않았고, 리툭시맙을 수반하지 않거나 또는 이러한 항체 및/또는 표적 세포의 존재와 상관없이 모의-형질도입된 T 세포에서는 세포 성장이 전혀 일어나지 않았다 (도 5D). 따라서, CD16V-BB-ζ 수용체 교차 결합은 지속적인 증식을 초래하는 신호를 유도시켜 준다.

CD16V -BB-ζ를 발현하는 T 림프구는 시험관내 및 생체 내에서 ADCC를 매개한다

CD16V-BB-ζ 교차 결합이 용해 과립의 세포외 유출을 유발시켰다는 관찰 결과는 CD16V-BB-ζ T 림프구가 특이적 항체의 존재 하에 표적 세포를 사멸시킬 수 있어야 한다는 것을 암시하였다. 실제로, 4시간의 시험관내 세포독성 검정에서는, CD16V-BB-ζ T 림프구가 리툭시맙의 존재 하에 B-세포 림프종 세포주 다우디 및 라모스에 대항하여 고도로 세포독성이었는데: 50% 초과의 표적 세포가 2:1 E:T 비에서 공동-배양 4시간 후에 전형적으로 용해되었다 (도 6 및 도 7). 이와는 달리, 표적 세포 사멸은 상기 항체의 부재 하에 또는 모의-형질도입된 T 세포의 경우에 낮았다 (도 6 및 도 7). 특히, 이들 실험에 사용된 이펙터 세포는 CD3+ T 림프구로 고도로 강화되었고 (>98%), 탐지 가능한 CD3- CD56+ NK 세포를 함유하지 않았다. CD16V-BB-ζ T 림프구의 리툭시맙-매개된 세포독성은 또한, CD20+ 일차 CLL 세포의 경우에 명백하였는데 (n = 5); 도 6B에 제시된 바와 같이, 세포독성은 전형적으로, 2:1 E:T 비로 공동-배양한지 4시간 후에 70%를 초과하였다. 골수 중간엽 기질 세포가 면역억제 효과를 발휘하는 것으로 밝혀졌다 ([Jefferis, Nat. Rev. Drug Discov. 2009; 8(3):226-234]; [Clemenceau et al., Blood 2006; 107(12):4669-4677]). 이것이 CD16V-BB-ζ T 림프구의 세포독성 능력에 영향을 미칠 수 있을 것인지를 시험하기 위하여, 이들을 1:2 E:T에서 24시간 동안 골수-유래된 중간엽 기질 세포의 존재 하에 CLL 세포와 공동-배양하였다. 도 6C에 제시된 바와 같이, 중간엽 세포는 ADCC-매개성 림프구의 사멸 능력을 저하시키지 않았다.

그 다음, 상이한 면역치료 항체가 상응하는 항원을 발현하는 종양 세포에 대항하여 유사한 세포독성을 촉발시킬 수 있었는지를 결정하였다. 따라서, HER2 (유방암 세포주 MCF-7 및 SK-BR-3 및 위암 세포주 MKN7) 또는 GD2 (신경모세포종 세포주 CHLA-255, NB1691 및 SK-N-SH, 및 골육종 세포주 U2-OS)를 발현하는 고형 종양 세포에 대항하는, CD16V-BB-ζ T 림프구의 세포독성을 시험하였다. 항체 트라스투주맙을 사용하여 HER2를 표적으로 하였고, hu14.18K322A를 사용하여 GD2를 표적으로 하였다. CD16V-BB-ζ T 림프구는 상응하는 항체의 존재 하에 이들 세포에 대항하여 고도로 세포독성이었다 (도 6 및 도 7). NB1691을 이용한 실험에서는, 배양을 24시간으로 연장함으로써 심지어 더 낮은 E:T 비에서도 세포독성을 달성할 수 있었는지를 또한 시험하였다. 도 8에 제시된 바와 같이, 세포독성은 hu14.18K322A의 존재 하에 1:8 비에서 50%를 초과하였다. CD16V-BB-ζ-매개된 세포 사멸의 특이성을 추가로 시험하기 위하여, CD20+ 다우디 세포를 상이한 특이성의 항체 및 CD16V-BB-ζ T 림프구와 함께 배양하였는데: 리툭시맙 만이 세포독성을 매개한 반면, 트라스투주맙 또는 hu14.18K322A의 존재 하에서는 세포독성 상의 증가가 전혀 없었다 (도 8). 최종적으로, 면역치료 항체의 존재 하에서 CD16V-BB-ζ-매개된 세포 사멸이 결합되지 않은 단량체성 IgG에 의해 억제될 수 있었는지를 결정하였다. 도 8에 제시된 바와 같이, IgG가 세포-결합된 면역치료 항체 보다 1,000배까지 더 높은 농도로 존재하는 경우에도, T 세포 세포독성은 전혀 영향을 받지 않았다.

생체 내에서 CD16V-BB-ζ T 림프구의 항-종양 능력을 판단하기 위하여, 루시페라제-표지된 다우디 세포가 생착된 NOD/scid IL2RGnull 마우스를 이용한 실험을 수행하였다. CD16V-BB-ζ T 림프구 + 리툭시맙이 투여된 마우스에서의 라이브 영상화에 의해 종양 성장을 측정하였고, 그들의 성과를 리툭시맙 또는 T 림프구 단독이 투여되었거나 또는 전혀 치료받지 못한 마우스와 비교하였다. 도 9에 제시된 바와 같이, 종양 세포는 리툭시맙에 이어 CD16V-BB-ζ T 림프구를 투여한 마우스를 제외한 모든 마우스에서 확장되었다. 상기 조합물로 처리된 5마리 마우스 모두는 종양 주사 후 >120일 동안 지속적으로 차도를 보여준 반면, 상기와 같이 처리되지 않았거나 또는 항체 또는 세포 단독이 투여된 12마리 마우스 중 어느 것도 차도를 보이지 않았다. 신경모세포종 세포주 NB1691이 생착되었고 hu14.18K322A 및 CD16V-BB-ζ T 림프구로 처리된 마우스에서는 또한, 강력한 항-종양 활성이 관찰되었다 (도 10).

CD16V -BB-ζ와 다른 수용체의 비교

CD16V-BB-ζ 수용체를 보유하고 있는 T 세포 또는 CD16F-BB-ζ 수용체를 보유하고 있는 T 세포의 기능을 비교하였다. Ig에 대한 CD16V-BB-ζ 수용체의 보다 높은 친화성과 일치하여, 상기 수용체는 저 친화성 CD16F-BB-ζ 수용체에 의해 촉발된 것 보다 상당히 더 높은 T 세포 증식 및 ADCC를 유도시켰다 (도 11).

이어서, CD16V-BB-ζ를 보유하고 있는 T 세포의 기능을, 상이한 신호 전달 특성을 지닌 다른 수용체를 발현하는 T 세포의 기능과 비교하였다. 이들은 신호 전달 능력이 전혀 없는 수용체 ("CD16V-끝을 잘라냄"), CD3ζ는 수반하지만 4-1BB는 수반하지 않는 수용체 ("CD16V-ζ"), 및 CD16V을 FcεRIγ의 막관통 및 세포질 도메인과 조합시킨, 앞서 기재된 수용체 ("CD16V-FcεRIγ")를 포함하였다 ([Jefferis, Nat. Rev. Drug Discov . 2009; 8(3):226-234]; [Clemenceau et al., Blood 2006; 107(12):4669-4677]) (도 12). 활성화된 T 세포에서의 레트로바이러스 형질도입 후, 모든 수용체는 고도로 발현되었다 (도 13). 도 14에 제시된 바와 같이, CD16V-BB-ζ는 다른 모든 구조물 보다 상당히 더 높은 활성화, 증식 및 특이적 세포독성을 유도시켰다.

mRNA 전기천공에 의한 CD16V -BB-ζ 수용체의 발현

상기 실험 모두에서, CD16V-BB-ζ 발현은 레트로바이러스 형질도입에 의해 시행되었다. 대체 방법인 mRNA의 전기천공이 또한, T 림프구에 ADCC 능력을 부여할 수 있었는지를 시험하였다. 2명의 공여자로부터의 활성화 T 림프구를 전기천공하였고, 고 발현 효율을 수득하였는데: T 림프구의 55% 및 82%가 전기천공 후 24시간에 CD16+가 되었다 (도 15A). 두 번째 공여자에서는, 수용체 발현을 또한 3일째에 시험하였는데, 이때 43%가 되었고, 이는 발현이 72시간 내지 96시간 동안 지속되었던 또 다른 수용체를 이용한 앞서 실험의 결과와 유사하였다 (Fujisaki et al., Cancer Res. 2009; 69(9):4010-4017). ADCC는 CD16V-BB-ζ mRNA로 전기천공된 T 림프구에서 활성화되었는데: 리툭시맙의 존재 하에서는, 2:1 E:T 비에서 4시간 후에 80% 라모스 세포가 사멸되었지만, mRNA를 이용하지 않고 전기천공된 세포는 효과가 없었다 (도 15B).

토의

본원에는 T 림프구에 ADCC를 발휘할 수 있는 능력을 부여해 주는 키메라 수용체의 개발이 기재되어 있다. CD16V-BB-ζ 수용체가 종양 세포와 결합된 항체에 의해 개입되는 경우, 이는 T-세포 활성화, 지속적인 증식, 및 항체에 의해 표적화된 암 세포에 대항하여 특이적 세포독성을 촉발시킨다. CD16V-BB-ζ T 림프구는 B-세포 림프종, 유방 및 위암, 신경모세포종 및 골육종 뿐만 아니라 일차 CLL 세포를 포함한 광범위한 종양 세포 유형에 대항하여 고도로 세포독성이었다. 세포독성은 표적 세포와 결합된 특이적 항체의 존재에 전적으로 의존적이었는데; 결합되지 않은 항체는 비-특이적 세포독성을 유발시키지 못하였거나, 또는 세포-결합된 항체의 경우의 세포독성에 전혀 영향을 미치지 못하였다. CD16V-BB-ζ T 세포는 또한, 미소환경의 공지된 면역억제 효과에 상관없이, 이들을 중간엽 세포층 상에서 배양한 경우에 CLL 세포를 사멸시켰다 ([Jefferis, Nat. Rev. Drug Discov. 2009; 8(3):226-234]; [Clemenceau et al., Blood 2006; 107(12):4669-4677]). 더욱이, 리툭시맙 다음에 주입된 CD16V-BB-ζ T 림프구는 면역결핍성 마우스에 생착된 B-세포 림프종 세포를 박멸시켰고, 항-GD2 항체의 존재 하에 신경모세포종 세포가 생착된 마우스에서 상당한 항-종양 활성을 나타내었다. 요약하면, CD16V-BB-ζ를 발현하는 T 세포는 시험관내 및 생체 내에서 강력한 ADCC를 나타내었다.

Ig의 Fc 부분에 대한 CD16의 친화성이 ADCC의 중요한 결정 요인이므로, 항체 면역요법에 대한 임상 반응에 영향을 미친다. 따라서, 예를 들어 당조작(glycoengineering)에 의해, FcγR에 대한 Fc 단편의 친화성을 추가로 증강시키기 위한 상당히 노력들이 수행되고 있다 ([Nimmerjahn et al., Nat. Rev. Immunol. 2008; 8(1):34-47], [Kohrt et al., Immunotherapy 2012; 4(5):511-527]). 본 개시내용의 키메라 수용체를 구축하기 위하여, 158V 다형성 (서열 10)을 수반한 FCRG3A (CD16) 유전자가 한 예로서 사용되었다. 이러한 변이체는 Ig에 대한 보다 높은 결합 친화성을 지닌 수용체를 코딩하고, 탁월한 ADCC를 매개하는 것으로 밝혀졌다 ([Ferris et al., J. Clin . Oncol. 2010; 28(28):4390-4399]; [Koene et al., Blood 1997; 90(3):1109-1114]; [Cartron et al., Blood 2002; 99(3):754-758]; [Weng et al., J. Clin . Oncol. 2003; 21(21):3940-3947]; [Dall'Ozzo et al., Cancer Res. 2004; 64(13):4664-4669]; [Hatjiharissi et al., Blood 2007; 110(7):2561-2564]; [Musolino et al., J. Clin. Oncol. 2008; 26(11):1789-1796]; [Bibeau et al., J. Clin . Oncol. 2009; 27(7):1122-1129]; [Ahlgrimm et al., Blood 2011; 118(17):4657-4662]; [Veeramani et al., Blood 2011; 118(12):3347-3349]). 실제로, 보다 통상적인 F158 변이체를 함유하는 키메라 수용체와의 좌우 비교에서는, CD16V-BB-ζ가 인간 Ig Fc와 결합할 수 있는 상당히 더 높은 능력을 갖고 있었고, 보다 강력한 증식 및 세포독성을 유도시켜, 키메라 항원 수용체 기능에 있어서의 친화성의 역할에 역점을 둔 최근의 연구 결과를 유발시켰다 ([Kono et al., Cancer Res. 2002; 62(20):5813-5817]; [Delgado et al., Cancer Res. 2010; 70(23):9554-956]). 현재의 "차세대" 키메라 수용체는 자극성 분자를 상호 자극성 분자와 조합하여, 신호 전달을 증대시키고 활성화-유도된 아폽토시스를 방지시킨다. 따라서, CD16 V158을 CD3ζ 및 4-1BB (CD137)에 의해 구성된 자극성 분자 탠덤(tandem)과 조합하였다. 실제로, CD16V-BB-ζ 수용체는 CD3ζ 단독을 통하여 작용하는 수용체, 또는 FcεRIγ 보다 현저하게 탁월한 T 세포 활성화, 증식 및 세포독성을 유도시켰다.

종양 세포 표면의 항원을 인식하고 자극 신호를 전달할 수 있는 수용체를 발현하는 유전적으로 변형된 T 세포의 임상 잠재력이, 임상 시험의 결과에 의해 점점 더 입증되고 있다 ([Pule et al., Nat. Med . 2008; 14(11):1264-1270]; [Porter et al., OncLive 2011; 25;365(8):725-733]; [Brenjens et al., Blood 2011; 118(18):4817-4828]; [Till et al., Blood 2012; 119(17):3940-3950]; [Kochenderfer et al., Blood 2012; 119(12):2709-2720]; [Brentjens et al., Sci . Transl. Med. 2013; 5(177):177ra138]). 그 중에서도 특히, 바이러스 형질도입에 의해 CD19 또는 CD20에 대항하여 키메라 항원 수용체를 발현하는 자가 T 림프구가 투여된 B-세포 악성 종양 환자에게서 상당한 종양 감소 및/또는 완전한 관해가 보고되었다 ([Porter et al., OncLive 2011; 25;365(8):725-733]; [Brenjens et al., Blood 2011; 118(18):4817-4828]; [Till et al., Blood 2012; 119(17):3940-3950]; [Kochenderfer et al., Blood 2012; 119(12):2709-2720]; [Brentjens et al., Sci . Transl. Med . 2013; 5(177):177ra138]). 이러한 전략을 다른 종양으로 확장하는 것은 상당한 노력을 수반하는데, 이는 또 다른 키메라 항원 수용체 구조물을 개발하고, 조절 요건에 맞는 대규모 형질도입 조건을 최적화하는 것을 포함한다. 이와 관련하여, 본원에 기재된 CD16V-BB-ζ 수용체는 하나의 단일 수용체가 다중 암 세포 유형에 사용될 수 있도록 함으로써 T-세포 요법의 실행을 촉진시킬 것이다. 또한, 다중 항원을 동시에 표적화시킬 수 있어야 하는데, 이는 단일 특이성을 지닌 키메라 수용체에 의해 표적화된 마커가 결여된 서브클론에 의해 구동된 백혈병 재발에 관한 최근의 보고서에 예시된 바와 같이, 종양에 의해 악용된 면역탈출 기전을 고려해볼 때 궁극적으로 유리할 수 있는 전략이다. 항체 투여의 간단한 철회가 요구될 때마다 언제든지 항체-유도된 세포독성이 중단될 수 있었다. CD16V-BB-ζ를 발현하는 T 세포는 표적 세포와 결합된 항체에 의해서만 활성화되기 때문에, 가용성 면역글로불린은 주입된 T 세포에 대하여 어떠한 자극도 발휘하지 못할 것이다. 그럼에도 불구하고, CD16V-BB-ζ 수용체를 일시적으로 발현하기 위하여 mRNA 전기천공을 이용하고, 이에 따라 잠재적인 어떠한 자가면역 반응성도 제한함으로써, 상기 전략의 임상 안전성을 시험하는 것이 중요할 것이다. 본원에 입증된 바와 같이, mRNA 전기천공은 상기 수용체를 매우 효과적으로 발현할 수 있다.

항체 요법은 많은 암 서브타입에 대한 표준 치료가 되었는데; 그의 임상 효능은 Fc 수용체의 개입을 통하여 ADCC를 촉발시킬 수 있는 그의 능력에 의해 대부분 결정된다 (Ferris et al., J. Clin . Oncol . 2010; 28(28):4390-4399). ADCC의 주요 이펙터는 NK 세포이지만, 그들의 기능은 암 환자에게서 손상될 수 있다. 예를 들어, HER2를 과발현하는 위암 세포의 트라스투주맙-매개된 ADCC는 초기 질환 환자 또는 건강한 공여자로부터의 샘플을 이용하여 수득된 것과 비교해서 중증 질환 및 위암 환자로부터의 말초혈 단핵 세포를 이용한 경우에 상당히 더 낮은 것으로 보고되었다. 더욱이, 반응은 NK-세포 억제성 수용체 및 그들의 리간드의 유전자형을 비롯한 다른 요인에 의해 영향을 받는 것으로 예상된다. 본원에 제시된 결과는 CD16V-BB-ζ 수용체를 이용하여 유전적으로 조작된 자가 T 세포를 주입하는 것이 ADCC를 상당히 증강시킬 것임을 제안하고 있다. 상기 조합된 CD3ζ/4-1BB 신호 전달이 또한, T-세포 증식을 유발시키기 때문에, 종양 부위에 활성화 T 세포가 축적될 것이고, 이는 그들의 활성을 더욱 강화시킬 수 있다. CD16V-BB-ζ 수용체는 활성화 T 림프구에서 뿐만 아니라 휴지기 말초혈 단핵 세포에서도 mRNA 전기천공에 의해 발현될 수 있는데, 이는 혈액 수집에서부터 CD16V-BB-ζ-발현 세포의 주입까지 단지 수 시간이 소요될 것이므로, 임상 적용에 매우 적합한 과정이다.

본 개시내용은 본원에 기재된 구체적 실시양태로써 그 범위가 제한되지 않아야 한다. 실제로, 본원에 기재된 것 이외의 본 개시내용의 각종 변형이 앞서의 설명으로부터 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구범위의 범위 내에 속한다.

본원에 인용된 모든 특허, 출원, 공보, 시험 방법, 문헌 및 기타 물질은 마치 물리적으로 본 명세서에 제시되는 바와 같이 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

서열 목록

SEQUENCE LISTING <110> National University of Singapore <120> CHIMERIC RECEPTOR THAT TRIGGERS ANTIBODY-DEPENDENT CELL CYTOTOXICITY AGAINST MULTIPLE TUMORS <130> N0565.70000WO00 <150> US 62/026,243 <151> 2014-07-18 <150> US 61/892,218 <151> 2013-10-17 <160> 18 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 436 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 1 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val 20 25 30 Val Phe Leu Glu Pro Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val 35 40 45 Thr Leu Lys Cys Gln Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln 50 55 60 Trp Phe His Asn Glu Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe 65 70 75 80 Ile Asp Ala Ala Thr Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr 85 90 95 Asn Leu Ser Thr Leu Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly 100 105 110 Trp Leu Leu Leu Gln Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro 115 120 125 Ile His Leu Arg Cys His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val 130 135 140 Thr Tyr Leu Gln Asn Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser 145 150 155 160 Asp Phe Tyr Ile Pro Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe 165 170 175 Cys Arg Gly Leu Val Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn 180 185 190 Ile Thr Ile Thr Gln Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe 195 200 205 Pro Pro Gly Tyr Gln Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro 210 215 220 Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys 225 230 235 240 Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala 245 250 255 Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu 260 265 270 Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys 275 280 285 Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr 290 295 300 Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly 305 310 315 320 Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala 325 330 335 Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg 340 345 350 Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu 355 360 365 Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn 370 375 380 Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met 385 390 395 400 Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly 405 410 415 Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala 420 425 430 Leu Pro Pro Arg 435 <210> 2 <211> 192 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 2 Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro 1 5 10 15 Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln 20 25 30 Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu 35 40 45 Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr 50 55 60 Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu 65 70 75 80 Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln 85 90 95 Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys 100 105 110 His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn 115 120 125 Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro 130 135 140 Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val 145 150 155 160 Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln 165 170 175 Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln 180 185 190 <210> 3 <211> 69 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 3 Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala 1 5 10 15 Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly 20 25 30 Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile 35 40 45 Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val 50 55 60 Ile Thr Leu Tyr Cys 65 <210> 4 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 4 Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 1 5 10 15 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 20 25 30 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 35 40 <210> 5 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 5 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 50 55 60 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 65 70 75 80 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 85 90 95 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 100 105 110 <210> 6 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 6 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro 20 <210> 7 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 7 cttctgcagg gggcttgttg ggagtaaaaa tgtgtc 36 <210> 8 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 8 gacacatttt tactcccaac aagccccctg cagaag 36 <210> 9 <211> 1311 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 9 atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60 ccgggcatgc ggactgaaga tctcccaaag gctgtggtgt tcctggagcc tcaatggtac 120 agggtgctcg agaaggacag tgtgactctg aagtgccagg gagcctactc ccctgaggac 180 aattccacac agtggtttca caatgagagc ctcatctcaa gccaggcctc gagctacttc 240 attgacgctg ccacagtcga cgacagtgga gagtacaggt gccagacaaa cctctccacc 300 ctcagtgacc cggtgcagct agaagtccat atcggctggc tgttgctcca ggcccctcgg 360 tgggtgttca aggaggaaga ccctattcac ctgaggtgtc acagctggaa gaacactgct 420 ctgcataagg tcacatattt acagaatggc aaaggcagga agtattttca tcataattct 480 gacttctaca ttccaaaagc cacactcaaa gacagcggct cctacttctg cagggggctt 540 gttgggagta aaaatgtgtc ttcagagact gtgaacatca ccatcactca aggtttggca 600 gtgtcaacca tctcatcatt ctttccacct gggtaccaaa ccacgacgcc agcgccgcga 660 ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc 720 cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg agggggctgg acttcgcctg tgatatctac 780 atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt 840 tactgcaaac ggggcagaaa gaaactcctg tatatattca aacaaccatt tatgagacca 900 gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt agctgccgat ttccagaaga agaagaagga 960 ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc 1020 cagaaccagc tctataacga gctcaatcta ggacgaagag aggagtacga tgttttggac 1080 aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa 1140 ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag atggcggagg cctacagtga gattgggatg 1200 aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac gatggccttt accagggtct cagtacagcc 1260 accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg caggccctgc cccctcgcta a 1311 <210> 10 <211> 576 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 10 ggcatgcgga ctgaagatct cccaaaggct gtggtgttcc tggagcctca atggtacagg 60 gtgctcgaga aggacagtgt gactctgaag tgccagggag cctactcccc tgaggacaat 120 tccacacagt ggtttcacaa tgagagcctc atctcaagcc aggcctcgag ctacttcatt 180 gacgctgcca cagtcgacga cagtggagag tacaggtgcc agacaaacct ctccaccctc 240 agtgacccgg tgcagctaga agtccatatc ggctggctgt tgctccaggc ccctcggtgg 300 gtgttcaagg aggaagaccc tattcacctg aggtgtcaca gctggaagaa cactgctctg 360 cataaggtca catatttaca gaatggcaaa ggcaggaagt attttcatca taattctgac 420 ttctacattc caaaagccac actcaaagac agcggctcct acttctgcag ggggcttgtt 480 gggagtaaaa atgtgtcttc agagactgtg aacatcacca tcactcaagg tttggcagtg 540 tcaaccatct catcattctt tccacctggg taccaa 576 <210> 11 <211> 207 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 11 accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60 tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120 gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc 180 ctgtcactgg ttatcaccct ttactgc 207 <210> 12 <211> 126 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 12 aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60 actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120 gaactg 126 <210> 13 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 13 agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60 tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120 cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180 gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240 cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300 tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctaa 339 <210> 14 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 14 atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60 ccg 63 <210> 15 <211> 436 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> 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Phe 195 200 205 Pro Pro Gly Tyr Gln Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro 210 215 220 Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys 225 230 235 240 Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala 245 250 255 Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu 260 265 270 Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys 275 280 285 Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr 290 295 300 Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly 305 310 315 320 Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala 325 330 335 Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg 340 345 350 Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu 355 360 365 Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn 370 375 380 Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met 385 390 395 400 Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly 405 410 415 Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala 420 425 430 Leu Pro Pro Arg 435 <210> 16 <211> 192 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 16 Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro 1 5 10 15 Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln 20 25 30 Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu 35 40 45 Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr 50 55 60 Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu 65 70 75 80 Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln 85 90 95 Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys 100 105 110 His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn 115 120 125 Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro 130 135 140 Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Phe 145 150 155 160 Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln 165 170 175 Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln 180 185 190 <210> 17 <211> 1311 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 17 atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60 ccgggcatgc ggactgaaga tctcccaaag gctgtggtgt tcctggagcc tcaatggtac 120 agggtgctcg agaaggacag tgtgactctg aagtgccagg gagcctactc ccctgaggac 180 aattccacac agtggtttca caatgagagc ctcatctcaa gccaggcctc gagctacttc 240 attgacgctg ccacagtcga cgacagtgga gagtacaggt gccagacaaa cctctccacc 300 ctcagtgacc cggtgcagct agaagtccat atcggctggc tgttgctcca ggcccctcgg 360 tgggtgttca aggaggaaga ccctattcac ctgaggtgtc acagctggaa gaacactgct 420 ctgcataagg tcacatattt acagaatggc aaaggcagga agtattttca tcataattct 480 gacttctaca ttccaaaagc cacactcaaa gacagcggct cctacttctg cagggggctt 540 tttgggagta aaaatgtgtc ttcagagact gtgaacatca ccatcactca aggtttggca 600 gtgtcaacca tctcatcatt ctttccacct gggtaccaaa ccacgacgcc agcgccgcga 660 ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc 720 cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg agggggctgg acttcgcctg tgatatctac 780 atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt 840 tactgcaaac ggggcagaaa gaaactcctg tatatattca aacaaccatt tatgagacca 900 gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt agctgccgat ttccagaaga agaagaagga 960 ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc 1020 cagaaccagc tctataacga gctcaatcta ggacgaagag aggagtacga tgttttggac 1080 aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa 1140 ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag atggcggagg cctacagtga gattgggatg 1200 aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac gatggccttt accagggtct cagtacagcc 1260 accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg caggccctgc cccctcgcta a 1311 <210> 18 <211> 576 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 18 ggcatgcgga ctgaagatct cccaaaggct gtggtgttcc tggagcctca atggtacagg 60 gtgctcgaga aggacagtgt gactctgaag tgccagggag cctactcccc tgaggacaat 120 tccacacagt ggtttcacaa tgagagcctc atctcaagcc aggcctcgag ctacttcatt 180 gacgctgcca cagtcgacga cagtggagag tacaggtgcc agacaaacct ctccaccctc 240 agtgacccgg tgcagctaga agtccatatc ggctggctgt tgctccaggc ccctcggtgg 300 gtgttcaagg aggaagaccc tattcacctg aggtgtcaca gctggaagaa cactgctctg 360 cataaggtca catatttaca gaatggcaaa ggcaggaagt attttcatca taattctgac 420 ttctacattc caaaagccac actcaaagac agcggctcct acttctgcag ggggcttttt 480 gggagtaaaa atgtgtcttc agagactgtg aacatcacca tcactcaagg tttggcagtg 540 tcaaccatct catcattctt tccacctggg taccaa 576

Claims (62)

1. (a) F158 FCGR3A 또는 V158 FCGR3A 변이체의 세포외 리간드-결합성 도메인; (b) CD8α의 힌지 및 막관통 도메인; 및 (c) 4-1BB 신호 전달 도메인 및 CD3ζ 신호 전달 도메인을 포함하는 세포질 도메인을 포함하는 키메라 수용체.
2. 제1항에 있어서, (i) F158 FCGR3A 및 V158 FCGR3A 변이체의 세포외 리간드-결합성 도메인이 서열 16 및 서열 2의 아미노산 서열로 각각 이루어진 것이고/이거나, (ii) CD8α의 힌지 및 막관통 도메인이 서열 3의 아미노산 서열로 이루어진 것이고/이거나, (iii) 4-1BB 신호 전달 도메인이 서열 4의 아미노산 서열로 이루어진 것이고/이거나, (iv) CD3ζ 신호 전달 도메인이 서열 5의 아미노산 서열로 이루어진 것인 키메라 수용체.
3. 제1항에 있어서, 서열 1 또는 서열 15의 잔기 22 내지 436의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열 1 또는 서열 15의 아미노산 서열을 포함하는 키메라 수용체.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 키메라 수용체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
5. 제4항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
6. 제5항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가, 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 키메라 수용체의 발현을 위하여 하나 이상의 조절 요소에 작동가능하게 연결된 것이고/이거나, 벡터가 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 렌티바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 벡터.
7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 키메라 수용체를 포함하는, 단리된 숙주 세포.
8. 제7항에 있어서, T 림프구 또는 NK 세포인 단리된 숙주 세포.
9. 제8항에 있어서, T 림프구 또는 NK 세포가 생체 외에서 활성화되고/되거나 확장되며, 여기서 T 림프구는 항-CD3/CD28, IL-2, 및 식물성 적혈구 응집소로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 작용제의 존재 하에 활성화되는 것이고/이거나, NK 세포는 CD137 리간드 단백질, CD137 항체, IL-15 단백질, IL-15 수용체 항체, IL-2 단백질, IL-12 단백질, IL-21 단백질, 및 K562 세포주로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 작용제의 존재 하에 활성화되는 것인 단리된 숙주 세포.
10. 제8항에 있어서, 암 환자로부터 단리된 T 림프구 또는 NK 세포인 단리된 숙주 세포.
11. 제8항에 있어서, 암의 항체-기반 면역요법의 효능의 증강을 필요로 하는 대상체에게서 암의 항체-기반 면역요법의 효능의 증강에 사용하기 위한 것이며, 여기서 대상체는 암 세포와 결합되는 항체를 이용하여 치료받고 있는 대상체이며, 항체는 인간 CD16과 결합되는 것인 단리된 숙주 세포.
12. 제11항에 있어서, 암이 암종, 림프종, 육종, 모세포종, 및 백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 또는 암이 B-세포 기원의 암, 유방암, 위암, 신경모세포종, 골육종, 폐암, 흑색종, 전립선암, 결장암, 신 세포 암종, 난소암, 횡문근육종, 백혈병, 및 호지킨 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단리된 숙주 세포.
13. 제11항에 있어서, 항체가 리툭시맙, 트라스투주맙, hu14.18K322A, 에프라투주맙, 세툭시맙, 및 라베투주맙으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단리된 숙주 세포.
14. 제11항에 있어서, T 림프구 또는 NK 세포가 대상체로부터 단리된 자가 T 림프구 또는 자가 NK 세포이거나, 또는 T 림프구 또는 NK 세포가 동종 T 림프구 또는 동종 NK 세포인 단리된 숙주 세포.
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