KR20210045418A - 크렙스 사이클을 조정하는 트랜스 대사 분자와 조합된 키메라 항원 수용체 폴리펩타이드 및 이의 치료적 용도 - Google Patents

크렙스 사이클을 조정하는 트랜스 대사 분자와 조합된 키메라 항원 수용체 폴리펩타이드 및 이의 치료적 용도 Download PDF

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카트린 맥기네스
세스 에텐버그
루크 바론
마이클 프레이
찰스 윌슨
그레고리 모츠
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소티오, 엘엘씨
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Abstract

하나 이상의 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드, 및 선택적으로 관심 표적 항원에 결합할 수 있는 키메라 수용체 폴리펩타이드(예를 들어, 항체 커플링된 T 세포 수용체(ACTR) 폴리펩타이드 또는 키메라 항원 수용체(CAR) 폴리펩타이드)를 발현하는 유전자 조작된 조혈 세포가 본원에 개시된다. 또한, 필요로 하는 대상체에서 표적 항원을 발현하는 세포를 억제하는데 사용되는 상기 유전자 조작된 조혈 세포의 용도가 본원에 개시된다.

Description

크렙스 사이클을 조정하는 트랜스 대사 분자와 조합된 키메라 항원 수용체 폴리펩타이드 및 이의 치료적 용도
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 8월 14일에 출원된 미국 임시 출원번호 제62/718,491호 및 2018년 8월 14일에 출원된 미국 임시 출원번호 제62/718,579호의 출원일 혜택을 주장한다. 이전 출원의 전체 내용은 각각 본원에 참조로 포함된다.
개시내용의 배경
세포 기반 요법을 포함한 암 면역요법은 정상 조직을 피하면서 종양 세포를 공격하는 면역 반응을 유발하기 위해 사용된다. 이것은 약물 내성의 유전자적 및 세포적 메커니즘을 회피하고 정상 조직을 피하면서 종양 세포를 표적으로 삼는 잠재성으로 인해 다양한 유형의 암을 치료하기에 촉망받는 옵션이다.
세포 기반 요법은 암세포쪽으로 치우친 반응성을 갖는 세포독성 T 세포를 수반할 수 있다. Eshhar 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.; 1993; 90(2):720-724; Geiger 등, J Immunol. 1999; 162(10): 5931-5939; Brentjens 등, Nat. Med. 2003; 9(3): 279-286; Cooper 등, Blood. 2003; 101(4): 1637-1644; 및 Imai 등, Leukemia. 2004; 18:676-684. 하나의 접근법은 하나 이상의 T 세포 활성화 신호전달 도메인에 융합된 항원 결합 도메인을 갖는 키메라 수용체를 발현하는 것이다. 상기 항원 결합 도메인을 통한 암 항원의 결합은 T 세포 활성화를 초래하고 세포독성을 촉발한다. 키메라 수용체 발현성 자가유래 T 림프구의 주입에 의한 임상 시험의 최근 결과는 그들의 임상적 잠재력에 대한 강력한 증거를 제공하였다. Pule 등, Nat. Med. 2008; 14(11): 1264-1270; Porter 등, N Engl J Med; 2011; 25; 365(8): 725-733; Brentjens 등, Blood. 2011; 118(18): 4817-4828; Till 등, Blood. 2012; 119(17): 3940-3950; Kochenderfer 등, Blood. 2012; 119(12): 2709-2720; 및 Brentjens 등, Sci Transl Med. 2013; 5(177): 177ra138.
다른 접근법은 조혈 세포(예컨대, 조혈 줄기 세포, 면역 세포, 예컨대, NK 세포 또는 T 세포)에서 항체-커플링된 T 세포 수용체(ACTR) 단백질을 발현하는 것이며, 상기 ACTR 단백질은 세포외 Fc 결합 도메인을 함유한다. 상기 ACTR-발현성 조혈 세포(예컨대, "ACTR T 세포"라고도 불리는 ACTR 발현성 T 세포)가 항암 항체와 함께 대상체에게 투여되는 경우, 그들은 상기 항체의 Fc 도메인에 대한 결합을 통해, 상기 항체에 의해 표적화된 암 세포에 대한 독성을 향상시킬 수 있다. Kudo 등, Cancer Research (2014) 74:93-103.
세포 기반 면역요법은 촉망받지만, 악성 종양 세포와 형질전환되지 않은 세포 사이의 상호작용을 통해 생성되는 세포 환경인 종양 미세환경(tumor microenvironment, TME)의 특정 특성으로 인해 일어나는 문제에 직면해 있다. 따라서, TME의 측면에서 세포 기반 면역요법의 효능을 개선하는 전략을 개발하는 것이 매우 중요하다.
개시내용의 요약
본 개시내용은 세포 기반 면역요법에 사용하기 위해, 항체 커플링된 T-세포 수용체(antibody-coupled T-cells receptor, ACTR) 폴리펩타이드 또는 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR) 폴리펩타이드와 같은 키메라 수용체 폴리펩타이드를 발현하는 것을 포함하는, 면역 세포와 같은 조혈 세포에서 크렙스 사이클(Krebs cycle)을 조정(modulation)하기 위한 전략의 개발을 기반으로 한다. 크렙스 사이클의 조정은 조혈 세포(예컨대, 조혈 줄기 세포(HSC) 또는 면역 세포, 예컨대 T 세포 또는 자연 살해 세포)에서 본원에 기재된 것과 같은 하나 이상의 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드를 발현(예컨대, 과발현)시킴으로써 달성될 수 있다. 상기 유전자 조작된 면역 세포는, 예를 들어, 낮은 글루코스 환경, 낮은 아미노산 환경, 낮은 pH 환경 및/또는 저산소 환경(예를 들어, 종양 미세환경)에서, 조정된(예를 들어, 향상된) 크렙스 사이클 반응을 가질 것으로 예측된다. 상기 유전자 조작된 면역 세포는 또한 조정된 후성유전 상태(예를 들어, 아세틸화 상태) 및/또는 조정된 수준의 면역억제 대사산물(예를 들어, 키누레닌)을 가질 수 있다. 이와 같이, 하나 이상의 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및 키메라 수용체 폴리펩타이드를 공동발현하는 HSC 또는 면역 세포와 같은 조혈 세포는 우수한 생물활성(예를 들어, 낮은 글루코스, 낮은 아미노산, 낮은 pH 및/또는 저산소 상태 하에서, 선택적으로 치료 항체의 존재 하에서), 예를 들어, 세포 증식, 활성화(예컨대, 증가된 사이토카인 생산, 예를 들어 IL-2 또는 IFNγ 생산), 세포독성 및/또는 생체내 항종양 활성을 나타낼 것이다.
따라서, 본원에는 특히, 예를 들어 낮은 글루코스, 낮은 아미노산, 낮은 pH, 및/또는 저산소 조건에서, 동일한 유형의 천연 면역 세포에 비해 조정된 크렙스 사이클을 갖는 변형된(예를 들어, 유전자 변형된) 조혈 세포(예를 들어, 조혈 줄기 세포, 면역 세포, 예컨대 T 세포 또는 자연 살해 세포)가 제공된다. 상기 변형된 면역 세포는 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드를 발현하거나 과발현할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드는 크렙스 사이클의 반응을 촉매하는 효소일 수 있다. 예로는 IDH1 또는 IDH2와 같은 이소시트레이트 탈수소효소(IDH), MDH1 또는 MDH2와 같은 말레이트 탈수소효소(MDH), 또는 포스포글리세레이트 탈수소효소(PHGDH)를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 다른 구현예에서, 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드는 기질로서 크렙스 사이클 대사산물을 사용하는 효소이다. 예에는 GOT1 또는 GOT2와 같은 글루탐산-옥살로아세트산 트랜스아미나제(GOT)(아스파테이트 트랜스아미나제 또는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제라고도 알려져 있음) 또는 포스포에놀피루베이트 카복시키나제 1(PCK1)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 또 다른 구현예에서, 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드는 전구체를 크렙스 사이클 대사산물로 전환하는 효소이다. 예에는 포스포세린 아미노트랜스퍼라제(PSAT1), 글루타메이트 탈수소효소(GDH1), 글루탐산-피루베이트 트랜스아미나제 1(GPT1) 또는 글루타미나제(GLS)를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
상기 변형된 면역 세포는 (a) 세포외 표적 결합 도메인; (b) 막관통 도메인(transmembrane domain); 및 (c) 세포질 신호전달 도메인 (예를 들어, 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(immunereceptor tyrosin-based activation motif, ITAM)를 포함하는 세포질 도메인)을 포함할 수 있는 키메라 수용체 폴리펩타이드를 추가로 발현할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드는 세포외 Fc-결합 도메인(a)을 포함하는, 항체-커플링된 T 세포 수용체(ACTR)이다. 다른 구현예에서, 상기 키메라 수용체는 세포외 항원 결합 도메인(a)을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)이다. 일부 예에서, (c)는 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드의 C-말단에 위치한다. 일부 예에서, 상기 키메라 폴리펩타이드는 적어도 하나의 공동자극성 신호전달 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 다른 경우에, 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드에는 공동자극성 신호전달 도메인이 없을 수 있다.
본원에 기재된 임의의 키메라 수용체 폴리펩타이드(예를 들어, ACTR 폴리펩타이드 또는 CAR 폴리펩타이드)는 (a)의 C-말단 및 (b)의 N-말단에 위치하는 힌지 도메인(hinge domain)을 추가로 포함할 수 있다. 다른 예에서, 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드에는 임의의 힌지 도메인이 없을 수 있다. 그러나, 다른 예에서 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드, 예를 들어 ACTR 폴리펩타이드는 임의의 비-CD16A 수용체 유래의 힌지 도메인을 갖지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드는 이의 N-말단에 신호 펩타이드를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 키메라 수용체 폴리펩타이드는 Fc 결합 도메인(a)을 포함하는 ACTR 폴리펩타이드일 수 있다. 일부 예에서, (a)의 Fc 결합 도메인은 Fc-수용체의 세포외 리간드-결합 도메인, 예를 들어 Fc-감마 수용체, Fc-알파 수용체, 또는 Fc-엡실론 수용체의 세포외 리간드-결합 도메인일 수 있다. 특별한 예에서, 상기 Fc 결합 도메인은 CD16A(예를 들어, F158 CD16A 또는 V158 CD16A), CD32A 또는 CD64A의 세포외 리간드-결합 도메인이다. 다른 예에서, (a)의 Fc 결합 도메인은 면역글로불린의 Fc 부분에 결합하는 항체 단편일 수 있다. 예를 들어, 상기 항체 단편은 단일 사슬 가변 단편(ScFv), 단일 도메인 항체 (예를 들어, 나노바디(nanobody))일 수 있다. 부가적으로, (a)의 Fc 결합 도메인은 면역글로불린의 Fc 부분에 결합하는 자연 발생 단백질 또는 이의 Fc 결합 단편일 수 있다. 예를 들어, 상기 Fc 결합 도메인은 단백질(Protein) A 또는 단백질 G, 또는 이의 Fc 결합 단편일 수 있다. 추가 예에서, (a)의 Fc 결합 도메인은 면역글로불린의 Fc 부분에 결합하는 합성 폴리펩타이드일 수 있다. 예로는 Kunitz 펩타이드, SMIP, 아비머(avimer), 아피바디(affibody), DARPin 또는 안티칼린(anticalin)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 키메라 수용체 폴리펩타이드는 세포외 항원 결합 도메인 (a)을 포함하는 CAR 폴리펩타이드일 수 있다. 일부 예에서, (a)의 세포외 항원 결합 도메인은 종양 항원, 병원성 항원, 또는 자가항원에 특이적인 면역 세포에 결합하는 단일 사슬 항체 단편이다. 특정 예에서, 상기 종양 항원은 혈액 종양과 관련이 있다. 예는 CD19, CD20, CD22, 카파-사슬(Kappa-chain), CD30, CD123, CD33, LeY, CD138, CD5, BCMA, CD7, CD40 및 IL-1RAP를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 특정 예에서, 상기 종양 항원은 고형 종양과 관련이 있다. 예는 GD2, GPC3, FOLR(예컨대, FOLR1 또는 FOLR2), HER2, EphA2, EFGRVIII, IL13RA2, VEGFR2, ROR1, NKG2D, EpCAM, CEA, 메소텔린(Mesothelin), MUC1, CLDN18.2, CD171, CD133, PSCA, cMET, EGFR, PSMA, FAP, CD70, MUC16, L1-CAM, B7H3 및 CAIX를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 특정 예에서, 상기 병원성 항원은 박테리아 항원, 바이러스 항원, 또는 진균 항원, 예를 들어 본원에 기재된 것들이다.
일부 구현예에서, 임의의 키메라 수용체 폴리펩타이드(예를 들어, ACTR 또는 CAR 폴리펩타이드)에서 (b)의 막관통 도메인은 싱글-패스(single-pass) 막 단백질, 예를 들어 CD8α, CD8β, 4-1BB, CD28, CD34, CD4, FcεRIγ, CD16A, OX40, CD3ζ, CD3ε, CD3γ, CD3δ, TCRα, CD32, CD64, VEGFR2, FAS, 및 FGFR2B의 것일 수 있다. 대안적으로, (b)의 막관통 도메인은 비-자연발생의 소수성 단백질 분절일 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 키메라 수용체 폴리펩타이드(예를 들어, ACTR 또는 CAR 폴리펩타이드)의 적어도 하나의 공동자극성 신호전달 도메인은, 적용되는 경우, 4-1BB, CD28, CD28LL→GG 변이체, OX40, ICOS, CD27, GITR, ICOS, HVEM, TIM1, LFA1 및 CD2일 수 있는 공동자극 분자일 수 있다. 일부 예에서, 상기 적어도 하나의 공동자극성 신호전달 도메인은 CD28 공동자극성 신호전달 도메인 또는 4-1BB 공동자극성 신호전달 도메인이다. 일부 경우에, 상기 ACTR 폴리펩타이드는 2개의 공동자극성 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 상기 공동자극성 신호전달 도메인 중 하나는 CD28 공동자극성 신호전달 도메인이고; 다른 공동자극성 도메인은 4-1BB 공동자극성 신호전달 도메인, OX40 공동자극성 신호전달 도메인, CD27 공동자극성 신호전달 도메인, 또는 ICOS 공동자극성 신호전달 도메인일 수 있다. 구체적인 예는 CD28 및 4-1BB; 또는 CD28LL→GG 변이체 및 4-1BB를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 대안적으로, 임의의 키메라 수용체 폴리펩타이드는 임의의 공동자극성 신호전달 도메인이 없을 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 키메라 수용체 폴리펩타이드(예를 들어, ACTR 또는 CAR 폴리펩타이드)에서 (c)의 세포질 신호전달 도메인은 CD3ζ 또는 FcεR1γ의 세포질 도메인일 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 키메라 폴리펩타이드(예를 들어, ACTR 또는 CAR 폴리펩타이드)의 힌지 도메인은, 적용되는 경우, CD28, CD16A, CD8α 또는 IgG일 수 있다. 다른 예에서, 상기 힌지 도메인은 비-천연 발생 펩타이드이다. 예를 들어, 상기 비-천연 발생 펩타이드는 연장된(extended) 재조합 폴리펩타이드(XTEN) 또는(Gly4Ser)n 폴리펩타이드일 수 있으며, 여기서 n은 3-12의 정수이다. 일부 예에서, 상기 힌지 도메인은 최대 60개의 아미노산 잔기를 함유할 수 있는 짧은 분절이다.
구체적인 예에서, 본원에 기재된 ACTR 폴리펩타이드는 (i) CD28 공동자극성 도메인; 및 (ii) CD28 막관통 도메인, CD28 힌지 도메인, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 ACTR 폴리펩타이드는 표 3에 나타낸 바와 같은 성분 (a)-(e)를 포함한다. 특별한 예에서, 상기 ACTR 폴리펩타이드는 서열번호 1-80으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
구체적인 예에서, 본원에 기재된 CAR 폴리펩타이드는 (i) CD28 공동자극성 도메인 또는 4-1BB 공동자극성 도메인; 및 (ii) CD28 막관통 도메인, CD28 힌지 도메인, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 더욱 구체적인 예에서, 본원에 기재된 CAR 폴리펩타이드는 (i) CD28 공동자극성 도메인 또는 4-1BB 공동자극성 도메인, (ii) CD8 막관통 도메인, CD8 힌지 도메인, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 CAR 폴리펩타이드는 서열번호 104 및 105로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및 선택적으로 키메라 수용체 폴리펩타이드를 발현하는 본원에 기재된 조혈 세포는 조혈 줄기 세포 또는 이의 자손일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 조혈 세포는 면역 세포, 예컨대 자연 살해 세포, 단핵구/대식세포, 호중구, 호산구 또는 T 세포일 수 있다. 상기 면역 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 조혈 줄기 세포(HSC) 또는 유도 만능 줄기 세포(iPSC)에서 유래될 수 있다. 일부 예에서, 상기 면역 세포는 T 세포이되, 내인성 T 세포 수용체, 내인성 주요 조직적합성 복합체, 내인성 베타-2-마이크로글로불린 또는 이들의 조합의 발현이 억제 또는 제거된 세포이다.
본원에 기재된 임의의 조혈 세포(예를 들어, HSC 또는 면역 세포)는 (a) 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열; 및 선택적으로 (b) 키메라 항원 수용체(CAR) 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 종합적으로 포함하는, 핵산 또는 핵산 세트를 포함할 수 있다. 상기 핵산 또는 핵산 세트는 RNA 분자 또는 RNA 분자 세트이다. 일부 경우에, 상기 면역 세포는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 제2 뉴클레오타이드 서열을 모두 포함하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드의 암호 서열은 상기 CAR 폴리펩타이드의 암호 서열의 상류에 있다. 일부 구현예에서, 상기 CAR 폴리펩타이드의 암호 서열은 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드의 암호 서열의 상류에 있다. 이러한 핵산은 상기 제1 뉴클레오타이드 서열과 상기 제2 뉴클레오타이드 서열 사이에 위치하는 제3 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 상기 제3 뉴클레오타이드 서열은 리보솜 스키핑 부위(예를 들어, P2A 펩타이드), 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 또는 제2 프로모터를 암호화한다.
일부 예에서, 상기 핵산 또는 핵산 세트는 발현 벡터 또는 발현 벡터 세트(예를 들어, 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터)일 수 있는, 벡터 또는 벡터 세트 내에 포함된다. 핵산 세트 또는 벡터 세트는 2개 이상의 핵산 분자 또는 2개 이상의 벡터의 그룹을 지칭하는 것으로서, 각각 관심 있는 폴리펩타이드 중 하나(즉, 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및 상기 CAR 폴리펩타이드)를 암호화한다. 본원에 기재된 임의의 핵산은 또한 본 개시내용의 범위 내에 있다.
다른 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 임의의 면역 세포 및 약제학적 허용성 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
더욱이, 본원에는 대상체에서 표적 항원을 발현하는 세포를 억제하는(예를 들어, 상기 세포의 수를 감소시키는, 세포 증식을 차단하는, 및/또는 세포 활성을 억제하는) 방법이 제공되며, 상기 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및 상기 CAR 폴리펩타이드를 공동발현할 수 있는, 본원에 기재된 면역 세포의 집단을 투여하는 것을 포함한다. 상기 대상체(예를 들어, 인간 환자, 예컨대 암을 앓고 있는 인간 환자)는 항암 요법(예컨대, 항암제)에 의해 치료를 받았을 수 있거나, 또는 치료 중이다. 일부 예에서, 상기 표적 항원을 발현하는 상기 세포의 적어도 일부는 낮은 글루코스 환경, 낮은 아미노산(예컨대, 낮은 글루타민) 환경, 낮은 pH 환경 및/또는 저산소 환경, 예컨대, 종양 미세환경에 위치한다.
일부 예에서, 상기 면역 세포는 자가유래이다. 다른 예에서, 상기 면역 세포는 동종이계이다. 본원에 기재된 임의의 방법에서, 상기 면역 세포는 생체외에서 활성화되거나, 확대되거나, 또는 둘 모두일 수 있다. 일부 경우에, 상기 면역 세포는 항-CD3 항체, 항-CD28 항체, IL-2, 식물성적혈구응집소 및 조작된 인공 자극 세포 또는 입자 중 하나 이상의 존재하에 활성화되는 T 세포를 포함한다. 다른 경우에, 상기 면역 세포는 4-1BB 리간드, 항-4-1BB 항체, IL-15, 항-IL-15 수용체 항체, IL-2, IL-12, IL-21 및 K562 세포, 조작된 인공 자극 세포 또는 입자 중 하나 이상의 존재 하에 활성화되는 자연 살해 세포를 포함한다.
일부 예에서, 본원에 기재된 방법에 의해 치료되는 대상체는 암, 예를 들어 암종, 림프종, 육종, 아세포종 및 백혈병을 앓고 있는 인간 환자일 수 있다. 또 다른 예시적인 표적 암은 B-세포 기원의 암, 유방암, 위암, 신경아세포종, 골육종, 폐암, 피부암, 전립선 암, 결장암, 신장 세포 암종, 난소 암, 횡문근육종, 백혈병, 중피종, 췌장암, 두경부암, 망막아세포종, 신경교종, 교모세포종, 간암 및 갑상선암을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. B-세포 기원의 예시적인 암은 B-계통 급성 림프아구성 백혈병, B-세포 만성 림프구성 백혈병 및 B-세포 비-호지킨 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또한, 본 개시내용의 범위 내에는 암 또는 감염성 장애와 같은 표적 질환 또는 장애를 치료하기 위해 사용되는, 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및 CAR 폴리펩타이드를 공동발현하는 본원에 기재된 유전자 조작된 면역 세포의 용도, 및 상기 의도된 의학적 치료를 위한 약제의 제조에 대한 그의 용도가 포함된다.
본 개시내용의 하나 이상의 구현예의 세부사항은 이하의 상세한 설명에 제시된다. 본 개시내용의 다른 특징 또는 이점은 여러 구현예의 상세한 설명 및 또한 첨부된 청구범위로부터 명백해질 것이다.
이하의 도면은 본 명세서의 일부를 형성하며, 본원에 제시된 특정 구현예의 상세한 설명과 함께 이들 도면 중 하나 이상을 참조함으로써 더 잘 이해될 수 있는 본 개시내용의 특정 측면을 추가 입증하기 위해 포함된 것이다.
도 1은 GPC3-발현성 JHH7 또는 Hep3B 표적 세포 및 다양한 농도의 글루코스의 존재 하에 GPC3-표적화 CAR(서열번호 104)을 발현하는 T 세포 또는 "모의" 비형질도입된 T 세포의 증식을 보여주는 다이어그램이다. CAR-T 세포의 증식은 글루코스 농도의 함수로서 변동한다.
도 2a 및 도 2b는 GPC3-발현성 JHH7 표적 세포의 존재 하에 GPC3-표적화 CAR(서열번호 104)을 발현하거나 또는 GPC3-표적화 CAR 및 GOT1(서열번호 87)을 공동발현하는 T 세포의 증식을 보여주는 다이어그램이다. 도 2a: 1.25 mM 글루코스. 도 2b: 10mM 글루코스. GOT1을 공동발현하는 CAR-T 세포의 증식은 1.25mM 및 10mM 글루코스 둘 모두에서 CAR-T를 단독으로 발현하는 세포에 비해 향상된다.
도 3a 및 도 3b는 GPC3-발현성 JHH7 표적 세포의 존재 하에 GPC3-표적화 CAR(서열번호 104)을 발현하거나 또는 GPC3-표적화 CAR 및 GOT2(서열번호 88)를 공동발현하는 T 세포의 증식을 보여주는 다이어그램이다. 도 3a: 1.25 mM 글루코스. 도 3b: 10mM 글루코스. GOT2를 공동발현하는 CAR-T 세포의 증식은 1.25mM 및 10mM 글루코스 둘 모두에서 CAR-T를 단독으로 발현하는 세포에 비해 향상된다.
도 4는 GPC3-표적화 CAR을 발현하는 T 세포 및 GPC3-표적화 CAR(서열번호 104) 및 GOT2(서열번호 88)를 공동발현하는 T 세포의 JHH7 이종이식편 종양 억제 활성을 보여주는 차트이다.
도 5는 GPC3-표적화 CAR을 발현하는 T 세포 및 GPC3-표적화 CAR(서열번호 104) 및 GOT2(서열번호 88)를 공동발현하는 T 세포의 NCI-H446 이종이식편 종양 억제 활성을 보여주는 차트이다.
도 6은 GPC3-표적화 CAR을 발현하는 T 세포 및 GPC3-표적화 CAR(서열번호 104) 및 GOT2(서열번호 88)를 공동발현하는 T 세포의 Hep3B 이종이식편 종양 억제 활성을 보여주는 차트이다.
도 7은 GPC3-표적화 CAR을 발현하는 T 세포 및 GPC3-표적화 CAR(서열번호 104) 및 GOT2(서열번호 88)를 공동발현하는 T 세포에 의해 치료된 Hep3B 이종이식편 종양을 보유하는 마우스로부터의 말초혈액 T 세포 수를 보여주는 차트이다.
도 8a 및 도 8b는 항-GPC3 CAR 및 GOT2를 공동발현하는 T 세포에서의 단백질 발현 및 아미노트랜스퍼라제 활성을 보여준다. 도 8a: CAR을 단독 발현하는 T 세포에 비해 항-GPC3 CAR(서열번호 104) 및 GOT2(서열번호 88)를 공동발현하는 T 세포에서 GOT2의 증가된 발현을 입증하는 웨스턴 블롯. T 세포는 Hep3B GPC3 발현성 종양 세포를 이용하여 4일 동안 활성화시켰다. 블롯은 각각 로딩 대조군을 위해 항-인간 GAPDH 또는 항-인간 GOT2 항체로 염색하였다. 도 8b: 항-GPC3 CAR 및 GOT2를 공동발현하는 T 세포는 CAR을 단독 발현하는 T 세포에 비해 증가된 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제(AST) 효소 활성을 나타낸다. T 세포는 Hep3B GPC3 발현성 종양 세포를 이용하여 8일 동안 활성화시켰고, 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제 효소 활성은 시판되는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제 활성 검정(Abcam)을 사용하여 측정하였다.
도 9a 및 도 9b는 GOT2(서열번호 88) 및 항-GPC3 CAR(서열번호 104) 또는 ACTR(서열번호 1)을 공동발현하는 T 세포가 CAR 또는 ACTR을 단독 발현하는 T 세포에 비해 향상된 증식을 나타냄을 보여주는 다이어그램이다. 도 9a: CAR T 세포는 Hep3B GPC3-발현성 종양 세포를 이용하여 6일 동안 활성화시켰다. 증식은 CD3+ T 세포에 대한 세포 분열의 척도로서 세포내 세포 추적 바이올렛 희석(cell trace violet dilution)을 사용하여 유세포분석에 의해 평가하였다; 도 9b: ACTR T 세포는 HepG2 GPC3 발현성 종양 세포와 항-GPC3 항체(GC33, 1 μg/ml)를 이용하여 3일 동안 활성화시켰다. 증식은 CD3+ T 세포의 유세포분석 세포 수에 의해 평가하였다. 결과는 모체 작제물 대비 GOT2 공동발현성 작제물에서 나타난 것이다.
도 10a-10c는 GOT2(서열번호 88) 및 항-GPC3 CAR(서열번호 104) 또는 ACTR(서열번호 1 및 서열번호 57)을 공동발현하는 T 세포가 CAR 또는 ACTR을 단독 발현하는 T 세포에 비해 향상된 IL-17A 생산을 나타낸다는 것을 보여주는 다이어그램이다. 도 10a: GPC3-CAR(서열번호 104). 도 10b: ACTR(서열번호 1). 도 10c: ACTR(서열번호 57). T 세포는 ACTR 공동배양물에 대해 항-GPC3 항체의 첨가 하에, GPC3-발현성 HepG2 세포를 이용하여 24 시간 동안 활성화시켰고, IL-17A는 상청액에서 MSD 검정을 이용하여 측정하였다. CAR 또는 ACTR을 단독 발현하는 T 세포 대비 향상된 IL-17A 생산은 작제물의 유형(CAR 또는 ACTR) 및 1차 공동자극성 도메인(4-1BB 또는 CD28)에 상관없이, GOT2를 공동발현하는 작제물에서 관찰되었다.
도 11a-11c는 GOT2(서열번호 88) 및 항-GPC3 CAR(서열번호 104) 또는 ACTR(서열번호 1 및 서열번호 57)을 공동발현하는 T 세포가 CAR 또는 ACTR을 단독 발현하는 T 세포에 비해 향상된 CD4+ 다기능성(polyfunctionality)을 나타낸다는 것을 보여주는 다이어그램이다. 도 11a: GPC3-CAR(서열번호 104). 도 11b: ACTR(서열번호 1). 도 11c: ACTR(서열번호 57). T 세포는 ACTR 공동배양물에 항-GPC3 항체의 첨가와 함께, 단백질 수송 억제제 Brefeldin A 및 Monensin의 존재 하에, GPC3-발현성 HepG2 세포와 37℃, 5% CO2에서 6 시간 동안 항온배양하였다. 세포를 고정시켰고, IFNγ, IL-2, TNFα, 및 IL-17A에 대한 세포내 염색을 유세포분석으로 평가하였다. 1, 2, 또는 3개 초과의 사이토카인을 동시에 생성하는 CD4+ T 세포의 더 높은 빈도는 키메라 수용체 유형(CAR 또는 ACTR) 및 1차 공동자극성 도메인(4-1BB 또는 CD28)에 상관없이 CAR 또는 ACTR을 단독 발현하는 세포에 비해 GOT2 및 ACTR 또는 CAR을 공동발현하는 T 세포에서 관찰되었다.
도 12a-12c는 GOT2(서열번호 88) 및 항-GPC3 CAR(서열번호 104) 또는 ACTR(서열번호 1 및 서열번호 57)을 공동발현하는 T 세포가 CAR 또는 ACTR을 단독으로 발현하는 T 세포에 비해, 덜 분화된 나이브(naive) 유사 CD8+ T 세포의 더 큰 집단을 나타내었음을 보여주는 다이어그램이다. 도 12a: GPC3-CAR(서열번호 104). 도 12b: ACTR(서열번호 1). 도 12c: ACTR(서열번호 57). 11명의 건강한 공여체로부터 생성된 CAR(서열번호 104) T 세포 및 2명의 건강한 공여체로부터 생성된 ACTR T 세포(4-1BB 1차 공동자극성 도메인, 서열번호 1; CD28 1차 공동자극성 도메인, 서열번호 57)는 표면 마커 패널에 대해 염색하였고 나이브 유사 표현형 마커에 대해 유세포분석으로 분석하였다. 세포는 CD8+/CAR+(CAR) 또는 CD8+/CD16+(ACTR+)에 대해 게이트(gate)하였다. 마커 CD27, CD45RO 및 CD62L에 대해 양성으로 염색되고 CD45RA에 대해 음성으로 염색되는 상기 집단의 하위세트(subset)는 키메라 수용체 유형(CAR 또는 ACTR) 및 1차 공동자극성 도메인(4-1BB 또는 CD28)에 상관없이, CAR 또는 ACTR을 단독으로 발현하는 세포에 비해 GOT2 및 ACTR 또는 CAR을 공동발현하는 T 세포에서 농축되었다.
도 13은 GOT2(서열번호 88) 및 항-GPC3 CAR(서열번호 104)을 공동발현하는 T 세포가 CAR을 단독으로 발현하는 T 세포에 비해 덜 분화된(더 젊은) CD8+ T 세포 표현형을 입증하였음을 보여주는 다이어그램이다. 11명의 건강한 공여체로부터 생성된 CAR T 세포는 표면 마커 패널에 대해 염색하고 유세포분석으로 분석하였다. 세포는 CD8+/CAR+에 대해 게이트하였다. CD27+CD45RO+, CD27+RO-, CD27+CD45RA+ 또는 CD27+CD45RA- 염색 집단은 덜 분화된 표현형을 나타낸다. 이들 하위세트는 CAR을 단독으로 발현하는 T 세포에 비해 GOT2를 공동발현하는 CAR T 세포에서 농축되었다.
도 14는 GOT2(서열번호 88) 및 항-GPC3 CAR(서열번호 104)을 공동발현하는 T 세포가 만성 항원 자극 및 저산소 상태 하에서 CAR을 단독으로 발현하는 T 세포에 비해 증식 이점을 입증하였음을 보여주는 다이어그램이다. CAR T 세포는 Hep3B GPC3-발현성 종양 세포를 이용하여 3일 동안 활성화하였고; 그 다음 정상 산소(20% 산소) 또는 저산소(1.5%) 조건에서 새로운 표적 세포를 이용하여 3일 동안 재자극하여, 저산소증의 추가 스트레스 있거나 없이 만성 항원 자극의 종양 미세환경 스트레스를 모의실험하였다. 그 다음, 증식은 세포 분열의 척도로서 세포내 세포 추적 바이올렛 희석을 사용하여 CD3+ T 세포의 유세포분석에 의해 평가하였고 평균 형광의 역수를 플로팅하였다.
도 15는 GOT2(서열번호 88) 및 항-GPC3 CAR(서열번호 104)을 공동발현하는 T 세포가 제한 글루코스 하에서 CAR만을 발현하는 T 세포에 비해 증식 이점을 입증하였음을 보여주는 다이어그램이다. CAR T 세포는 10mM 또는 1.25mM 글루코스의 존재하에 HepG2 GPC3 발현성 종양 세포를 이용하여 7일 동안 활성화시켰다. 그 다음, 증식은 세포 분열의 척도로서 세포내 세포 추적 바이올렛 희석을 사용하여 유세포분석에 의해 평가하고 평균 형광의 역수를 플로팅하였다. GOT2를 발현하는 CAR은 두 글루코스 조건 하에서 증식 이점을 나타내었다.
도 16은 GOT2(서열번호 88) 및 ACTR(서열번호 57)을 공동발현하는 T 세포가 ACTR을 단독 발현하는 T 세포에 비해, T 세포 억제제 키누레닌의 존재 하에 향상된 증식을 입증하였음을 보여주는 다이어그램이다.
도 17a-17c는 GOT2(서열번호 88) 및 항-GPC3 CAR(서열번호 104)을 공동발현하는 T 세포가 CAR을 단독 발현하는 T 세포에 비해 종양에서 향상된 활성화를 입증하였음을 보여주는 다이어그램이다. 도 17a: CD69. 도 17b: CD25. 도 17c: ICOS. CAR 및 GOT2를 공동발현하는 T 세포는 CAR을 단독 발현하는 T 세포에 비해 활성화 마커의 증가된 발현을 입증하였다.
도 18a 및 도 18b는 GOT2(서열번호 88) 및 항-GPC3 CAR(서열번호 104)을 공동발현하는 T 세포가 CAR을 단독 발현하는 T 세포에 비해 종양내 고갈에 대한 더 큰 내성을 입증하였음을 보여주는 다이어그램이다. 도 18a: CD4+ T 세포 하위세트. 도 18b: CD8+ T 세포 하위세트.
도 19a-19d는 GOT2를 공동발현하는 CAR이 GPC3-발현성 종양에서 고갈에 내성적임을 보여주는 다이어그램이다; CAR의 활성화는 항원 음성 비장 대비 종양에 특이적이다. 도 19a: 6일, CD4+ T 세포 하위세트. 도 19b: 6일, CD8+ T 세포 하위세트. 도 19c: 13일, CD4+ T 세포 하위세트. 도 19d: 13일, CD8+ T 세포 하위세트.
도 20a 및 도 20b는 GOT2(서열번호 88) 및 항-GPC3 CAR(서열번호 104)을 공동발현하는 T 세포가 CAR을 단독 발현하는 T 세포에 비해 생체내에서 종양에 노출 후 더 큰 기능을 입증한다는 것을 보여주는 다이어그램이다. 도 20a: IL-17A. 도 20b: IFNγ.
종양 미세환경은 낮은 글루코스, 낮은 아미노산, 낮은 pH 및/또는 저산소 상태와 같은 특이적인 특성을 가지며, 이들 중 일부는 이펙터 T 세포와 같은 이펙터 면역 세포의 활성을 제한할 수 있다. 본 개시내용은 적어도 부분적으로, 이펙터 면역 세포에 의해 크렙스 사이클 반응을 조정함(예를 들어, 향상시킴)을 통해 종양 미세환경에서 이펙터 면역 세포 활성을 향상시킴으로써, 그들의 성장 및 생물활성을 향상시키는 다양한 접근법의 개발을 기반으로 한다. 상기 크렙스 사이클은 크렙스 사이클 효소(예를 들어, 자연 발생 효소 또는 이의 기능적 등가물)의 발현 수준, 이러한 효소의 활성화 상태, 크렙스 사이클 대사산물을 기질로서 사용하는 효소의 발현 수준 및 활성, 및/또는 전구체를 크렙스 사이클 대사산물로 전환하는 효소의 발현 수준 및 활성을 포함하는 다양한 요인에 의해 조정될 수 있다.
본원에 개시된 연구는 예기치 않게, T 세포와 같은 면역 세포에서 GOT1 또는 GOT2와 같은 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및 CAR(예를 들어, 4-1BB 공동자극성 도메인을 가짐) 또는 ACTR(예를 들어, 4-1BB 또는 CD28 공동자극성 도메인을 가짐)과 같은 키메라 수용체 폴리펩타이드의 공동-발현이, 상기 CAR 또는 상기 ACTR만을 발현하는 면역 세포에 비해 시험관내 및 생체내 모두에서 우수한 특징을 나타냈음을 입증한다. 예를 들어, CAR 또는 ACTR과 함께 GOT1 또는 GOT2의 공동발현은 특히 고형 종양 미세환경 조건(예를 들어, 저산소증, 낮은 글루코스 조건 및 TME 억제제의 존재) 하에서 T 세포 증식/확대 및 T 세포 기능을 향상시켰다. 예를 들어, GOT2의 공동발현은 억제 수용체(예를 들어, PD1)의 장기 발현의 내성에 기여하였고 종양 미세환경에서 T 세포 기능을 유지하였다. 또한, GOT1 또는 GOT2와 CAR 또는 ACTR의 공동발현은 항종양 효과를 향상시켰다.
따라서, 본 개시내용은 상승된 크렙스 사이클 조정 활성을 보유하는 변형된(예를 들어, 유전자 조작된) 조혈 세포(예를 들어, HSC 또는 면역 세포)를 제공한다. 면역 세포에서 크렙스 사이클의 변형은 임의의 적절한 접근법에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 변형된 면역 세포는 하나 이상의 크렙스 사이클 조정 인자를 발현할 수 있으며, 이때 인자는 크렙스 사이클에 직접 관여하거나(예를 들어, 크렙스 사이클의 하나 이상의 반응을 촉매하는 효소) 또는 하나 이상의 크렙스 사이클 효소의 발현 수준, 활성 및/또는 분해에 영향을 미침을 통해 크렙스 사이클을 간접적으로 조정하는 임의의 유형의 분자일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 크렙스 사이클 조정 인자는, 예컨대, 천연 대응물에 비해 발현하는 면역 세포에서 크렙스 사이클 조정을 향상시키는 본원에 기재된 바와 같은 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드일 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 크렙스 사이클 조정 인자는 크렙스 사이클의 하나 이상의 반응을 촉매하는 하나 이상의 효소의 발현을 조절하는 핵산(예를 들어, 마이크로RNA, 간섭 RNA, 예컨대 siRNA 또는 shRNA, 또는 안티센스 핵산)일 수 있다. 추가 구현예에서, 상기 크렙스 사이클 조정 인자는 하나 이상의 크렙스 사이클 효소의 발현을 조절하는 전사 인자일 수 있다.
이러한 유전자 조작된 면역 세포는 키메라 수용체 폴리펩타이드, 예를 들어 항체 커플링된 T 세포 수용체(ACTR) 폴리펩타이드 또는 키메라 항원 수용체(CAR) 폴리펩타이드를 추가로 발현할 수 있다. 또한, 본원에는 대상체(예를 들어, 인간 암 환자)에서, 예를 들어 ADCC를 통해, 표적 세포(예를 들어, 표적 암 세포)를 억제 또는 감소시키고, 및/또는 면역 세포 증식을 개선하기 위해 사용되는, 선택적으로 필요한 경우(예를 들어, 면역 세포가 ACTR 폴리펩타이드를 발현하는 경우) Fc 함유 제제와 조합되는, 유전자 조작된 면역 세포의 용도가 제공된다. 본 개시내용은 또한 상기 기재된 유전자 조작된 면역 세포를 포함하는 약제학적 조성물 및 키트도 제공한다.
크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드를 발현(예를 들어, 과발현)하는, 본원에 기재된 상기 유전자 조작된 면역 세포는 적어도 다음과 같은 이점을 부여할 수 있다. 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드의 발현은 T 세포의 대사 활성을 향상시킬 것이다. 이와 같이, 상기 유전자 조작된 면역 세포는 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드를 발현(또는 과발현)하지 않는 면역 세포에 비해, 종양 환경(예를 들어, 낮은 글루코스, 낮은 아미노산, 낮은 pH, 및/또는 저산소 환경)에서 더 잘 증식하고, 더 많은 사이토카인을 생산하고, 더 큰 항종양 세포독성을 나타내고, 더 적은 면역억제 대사산물을 나타내며, 및/또는 더 큰 T 세포 생존율을 나타낼 수 있어, 향상된 사이토카인 생산, 생존율, 세포독성 및/또는 항종양 활성을 야기한다.
I. 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드
본원에 사용된 바와 같이, 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드는 글루코스, 아미노산 및/또는 지방산을 처리하기 위한 대사 경로와 같은 다양한 대사 경로를 연결하는 크렙스 사이클을 조정하는 임의의 폴리펩타이드를 의미한다. 구연산 사이클 및 트리카복실산(TCA) 사이클이라고도 알려진 크렙스 사이클은 해당작용에서 생성된 아세틸-CoA를 옥살로아세테이트에 첨가하여 시트레이트를 형성하는 것으로 시작되는 대사 경로이다. 상기 폴리펩타이드는 다른 방향에 비해 한 방향을 위해 크렙스 사이클의 하나 이상의 가역성 효소 반응을 조절하여, 그로부터 생성된 대사산물을 조절할 수 있다. 하나의 대사 급원으로부터 크렙스 사이클로의 증가된 투입은 다른 경로의 상류 대사 산물을 재유도할 수 있다. 예를 들어, 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드는 알라닌을 해당경로로 재유도하고, TCA 및/또는 세린 합성 경로를 위한 α-케토-글루타레이트(αKG)를, 예를 들어 PSAT1을 통해, 증가시키고, 미토콘드리아 및/또는 세포질에서 TCA 사이클을 용이하게 할 수 있고; TCA 사이클로부터 글루코스를 이동시켜 PSAT1 또는 PSPH를 통해 세린을 생성한다.
부가적으로, 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드는 미토콘드리아 및/또는 세포질에서 크렙스 사이클 활성을 증가시킬 수 있다. 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드는 또한 락테이트와 같은 억제 대사산물을 피루베이트로 변환시켜 크렙스 사이클 활성을 촉진할 수 있다. 임의의 적합한 종(예를 들어, 인간과 같은 포유류)의 것일 수 있는 임의의 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드는 본원에 기재된 조성물 및 방법과 함께 사용하기 위해 고려될 수 있다.
대안적으로, 상기 크렙스 사이클 대사산물 폴리펩타이드는 활성화된 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드를 모방하도록 돌연변이된 분자(예를 들어, 인산화 모방체) 또는 상기 크렙스 사이클의 활성이 조정되도록 그의 세포내 트래피킹(예를 들어, 미토콘드리아로의 트래픽)에 영향을 주기 위해 돌연변이된 분자일 수 있다. 대안적으로, 내인성 크렙스 사이클 폴리펩타이드의 발현은, 예를 들어, 전사 인자 또는 마이크로RNA의 발현에 의해, 또는 상기 폴리펩타이드의 안정성 또는 분해를 조정함에 의해, 예를 들어 그의 분해를 매개하는 인자, 예를 들어 유비퀴틴/프로테아좀 경로의 일부인 E3 리가아제를 조정함에 의해, 조정될 수 있다. 부가적으로, 내인성 크렙스 사이클 폴리펩타이드의 트래피킹은, 예를 들어, 원하는 하위세포 구획, 예를 들어 미토콘드리아로 그의 트래피킹을 증가시키는 폴리펩타이드를 발현시킴으로써 조정될 수 있다. 또한, 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드는 면역 세포의 활성을 억제하거나 제한하는, 종양 미세환경에서 높은 수준으로 발견되는, 기질을 더 이상 억제 효과가 없는 분자로 효소적으로 전환시켜, 면역 세포 기능을 개선하는 폴리펩타이드일 수 있다.
크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드는 크렙스 사이클에서 반응을 촉매하는 효소 활성을 갖는 폴리펩타이드, 예를 들어 크렙스 사이클 반응을 촉매하는 자연 발생 효소, 또는 동일한 크렙스 사이클 반응을 촉매하는 그의 기능적 변이체/동족체(homolog)일 수 있다. 예에는 이소시트레이트 탈수소효소(IDH1 또는 IDH2를 포함하는 IDH), 말레이트 탈수소효소(MDH1 또는 MDH2를 포함하는 MDH) 또는 포스포글리세레이트 탈수소효소(PHGDH)를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
이소시트레이트 탈수소효소(isocitrate dehydrogenase, IDH)는 이소시트레이트의 산화적 탈카복시화를 촉매하여 α-케토글루타레이트와 CO2의 생성을 야기하는 임의의 폴리펩타이드(효소)를 지칭한다. 말레이트 탈수소효소(malate dehydrogenase, MDH)는 NAD+에서 NADH로의 환원을 사용하여 말레이트에서 옥살로아세테이트로의 산화를 촉매하는 임의의 폴리펩타이드(효소)를 지칭한다. 포스포글리세레이트 탈수소효소(phosphoglycerate dehydrogenase, PHGDH)는 NAD+의 NADH로의 환원을 이용하여 3-포스포-D-글리세레이트를 3-포스포노옥시피루베이트로 전환하고 2-하이드록시글루타레이트를 2-옥소글루타레이트로 전환하는 반응을 촉매하는 임의의 폴리펩타이드(효소)를 지칭한다. 예시적인 IDH, MDH, 및 PHGDH의 아미노산 서열이 이하에 제공된다:
IDH1(서열번호 81)
Figure pct00001
IDH2(서열번호 82)
Figure pct00002
MDH1(서열번호 83)
Figure pct00003
MDH2(서열번호 84)
Figure pct00004
PHGDH(서열번호 85)
Figure pct00005
크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드는 또한 크렙스 사이클 대사산물을 기질로서 사용하는 폴리펩타이드, 예를 들어 글루탐산-옥살로아세트산 트랜스아미나제(GOT1 및 GOT2를 포함하는 GOT) 또는 포스포에놀피루베이트 카복시키나제 1(PCK1)일 수 있다. 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제(AST)라고도 알려진 글루탐산-옥살로아세트산 트랜스아미나제(GOT)는 아스파테이트와 글루타메이트 간에 α-아미노 기를 전이시키는 가역 반응을 촉매하는 임의의 피리독살 포스페이트(PLP)-의존적 효소를 지칭한다. 일부 경우에, GOT는 세포질형 및 내막 미토콘드리아 형태, 각각 GOT1 및 GOT2로 존재한다. 또한, GOT는 라고도 알려져 있다. GOT1 및 GOT2 외에도 다양한 PLP 의존 효소도 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드일 수 있으며, 예를 들어 아미노트랜스퍼라제, 트립토판 합성효소, 알라닌 라세미화효소, D-아미노산 아미노트랜스퍼라제 및 글리코겐 포스포릴라제일 수 있다. 이들 효소 모두는 본 개시내용의 범위 내에 있다. 포스포에놀피루베이트 카복시키나제 1(phosphoenolpyruvate carboxykinase 1, PCK1)은 옥살로아세테이트를 포스포에놀피루베이트와 이산화탄소로 전환하는 임의의 폴리펩타이드(효소)를 지칭한다. 예시적인 GOT 및 PCK1의 아미노산 서열은 이하에 제공된다:
PCK1(서열번호 86)
Figure pct00006
GOT1(서열번호 87)
Figure pct00007
GOT2(서열번호 88)
Figure pct00008
또한, 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드는 전구체를 크렙스 사이클 대사산물로 전환하는 효소, 예를 들어 포스포세린 아미노트랜스퍼라제(PSAT1), 글루타메이트 탈수소효소(GDH1; GLUD1이라고도 알려짐), 글루타메이트-피루베이트 트랜스아미나제 1(GPT1), 또는 글루타미나제(GLS)일 수 있다. 포스포세린 아미노트랜스퍼라제(PSAT1)는 3-포스포하이드록시피루베이트를 포스포세린으로, 3-하이드록시-2-옥소-4-포스포노옥시부타노에이트를 포스포하이드록시트레오닌으로 가역적 전환하는 것을 촉매하는 임의의 폴리펩타이드(효소)를 지칭한다. PSAT1은 2-옥소글루타레이트와 O-포스포-L-세린을 만든다. 글루타메이트 탈수소효소(GDH1)는 글루타메이트를 α-케토글루타레이트로, 및 그 반대로 전환시키는 임의의 폴리펩타이드(효소)를 지칭한다. GDH1은 글루타메이트를 2-옥소글루타레이트(알파-케토글루타레이트)로 전환시킨다. 글루타메이트-피루베이트 트랜스아미나제 1(GPT1)은 알라닌과 2-옥소글루타레이트 사이의 가역적 아미노기전이를 촉매하여 피루베이트와 글루타메이트를 형성하는 임의의 폴리펩타이드(효소)를 지칭한다. 글루타미나제(GLS)는 글루타민으로부터 글루타메이트를 생성하는 임의의 폴리펩타이드(효소)를 지칭한다. 예시적인 PSAT1, GDH1, GPT1 및 GLS의 아미노산 서열은 이하에 제공된다:
GPT1(서열번호 89)
Figure pct00009
GLS(서열번호 90)
Figure pct00010
PSAT1(서열번호 91)
Figure pct00011
GDH1(서열번호 92)
Figure pct00012
상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드는 적절한 종 유래의 자연 발생의 폴리펩타이드, 예를 들어 인간 또는 비-인간 영장류로부터 유래된 것과 같은 포유류 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드일 수 있다. 이러한 자연 발생의 폴리펩타이드는 본 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, GenBank와 같은 공개적으로 이용가능한 유전자 데이터베이스를 검색하기 위한 검색어로서 상기 언급된 아미노산 서열 중 임의의 것을 사용하여 얻을 수 있다. 본 개시내용에 사용하기 위한 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드는 상기 언급된 예시적인 단백질 중 임의의 것과 적어도 85%(예를 들어, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상)의 서열 동일성을 공유할 수 있다.
두 아미노산 서열의 "동일성%"은 Karlin 및 Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-77, 1993에서와 같이 변형된, Karlin 및 Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-68, 1990의 알고리즘을 사용하여 결정한다. 이러한 알고리즘은 Altschul, 등 J. Mol. Biol. 215: 403-10, 1990의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램(버전 2.0)에 통합되어 있다. BLAST 단백질 검색은 본 발명의 단백질 분자에 상동성인 아미노산 서열을 수득하기 위해 XBLAST 프로그램, 점수=50, 단어길이=3을 이용하여 수행할 수 있다. 두 서열 사이에 갭이 존재하는 경우에는, Altschul 등, Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402, 1997에 기재된 바와 같은 Gapped BLAST를 이용할 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 사용할 때, 각 프로그램(예컨대, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드는 상기 폴리펩타이드를 원하는 하위세포 구획으로 트래피킹하기 위해 하위세포 구획-국재화 신호전달 펩타이드(예를 들어, 미토콘드리아-국재화 신호전달 펩타이드)에 접합될 수 있다. 예를 들어, GOT2 폴리펩타이드는 숙주 면역 세포에서 미토콘드리아로 트래피킹될 수 있도록 미토콘드리아-국재화 신호전달 펩타이드를 포함할 수 있다.
대안적으로, 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드는 천연 대응물의 기능적 변이체일 수 있다. 이러한 기능적 변이체는 천연 대응물의 기능적 도메인(들) 외부에 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 천연 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드의 기능적 도메인은 본 기술분야에 공지되어 있을 수 있고, 또는 그의 아미노산 서열을 기반으로 하여 예측될 수 있다. 상기 기능적 도메인(들) 외부의 돌연변이는 상기 단백질의 생물학적 활성에 실질적으로 영향을 미칠 것으로 예상되지 않을 것이다. 일부 경우에, 상기 기능적 변이체는 천연 대응물에 비해 증가된 크렙스 사이클 조정을 나타낼 수 있다. 대안적으로, 상기 기능적 변이체는 천연 대응물에 비해 감소된 크렙스 사이클 조정을 나타낼 수 있다.
크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드의 기능적 변이체는 천연 대응물에 비해 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있고 천연 대응물과 동일한 생물학적 활성을 실질적으로 보유할 수 있는, 야생형 폴리펩타이드의 기능적 변이체일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드의 기능적 변이체는 상기 천연 대응물에 비해 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개 또는 그 이상의 돌연변이를 포함한다.
예를 들어, GOT의 기능적 변이체는 천연 대응물에 비해 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개 또는 그 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, GOT의 기능적 변이체는 서열번호 88의 위치 159에서 라이신 잔기의 돌연변이(예를 들어, K159Q)를 포함한다. 일부 구현예에서, GOT의 기능적 변이체는 서열번호 88의 위치 185에서 라이신 잔기의 돌연변이(예를 들어, K185Q)를 포함한다. 일부 구현예에서, GOT의 기능적 변이체는 서열번호 88의 위치 404에서 라이신 잔기의 돌연변이(예를 들어, K404Q)를 포함한다. 일부 구현예에서, GOT의 기능적 변이체는 서열번호 88의 위치 159(예를 들어, K159Q) 및 위치 185(예를 들어, K185Q)에서 라이신 잔기의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, GOT의 기능적 변이체는 서열번호 88의 위치 185(예를 들어, K185Q) 및 위치 404(예를 들어, K404Q)에서 라이신 잔기의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, GOT의 기능적 변이체는 서열번호 88의 위치 159(예를 들어, K159Q) 및 위치 404(예를 들어, K404Q)에서 라이신 잔기의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, GOT의 기능적 변이체는 서열번호 88의 위치 159(예를 들어, K159Q), 위치 185(예를 들어, K185Q), 및 위치 404(예를 들어, K404Q)에서 라이신 잔기의 돌연변이를 포함한다. 또한 Yang 등, The EMBO Journal (2015) 34: 1100-1125를 참조하고, 이의 관련 개시내용은 본원의 목적 및 주제 참조를 위해 본원에 참고로 포함된다.
일부 구현예에서, 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드의 상기 기능적 변이체는 천연 대응물에 비해 변경될 수 있는 하나 이상의 생물학적 특성(예를 들어, 변형 상태, 촉매 활성, 세포 위치 및/또는 결합 파트너)을 나타낼 수 있다. 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드의 기능적 변이체의 비제한적인 예는 크렙스 사이클에서 반응을 촉진하는 효소의 기능적 변이체(예를 들어, IDH, MDH 또는 PHGDH의 기능적 변이체), 크렙스 사이클 대사산물을 기질로서 사용하는 효소의 기능적 변이체(예를 들어, GOT 또는 PCK1의 기능적 변이체), 및 전구체를 크렙스 사이클 대사산물로 전환시키는 효소의 기능적 변이체(예를 들어, PSAT1, GDH1, GPT1, 또는 GLS의 기능적 변이체)를 포함한다.
대안적으로 또는 부가적으로, 상기 기능적 변이체는 천연 대응물의 하나 이상의 위치 (예를 들어, 최대 20개 위치, 최대 15개 위치, 최대 10개 위치, 최대 5, 4, 3, 2, 1개 위치(들))에 보존적 돌연변이(들)를 함유할 수 있다. 본원에 사용된, "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 치환이 이루어지는 단백질의 상대적 전하 또는 크기 특성을 변경하지 않는 아미노산 치환을 의미한다. 변이체는 본 기술분야의 기술자에게 공지된 폴리펩타이드 서열을 변경시키는 방법, 예컨대 이러한 방법을 편집한 문헌, 예를 들어, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, 등, eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, 또는 Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, 등, eds., John Wiley & Sons, Inc., New York에서 발견되는 방법에 따라 제조될 수 있다. 아미노산의 보존적 치환은 하기 그룹 내의 아미노산 간에 이루어지는 치환을 포함한다: (a) M, I, L, V; (b) F, Y, W; (c) K, R, H; (d) A, G; (e) S, T; (f) Q, N; 및 (g) E, D.
II. 키메라 수용체 폴리펩타이드
본원에 사용된, 키메라 수용체 폴리펩타이드는 숙주 세포의 표면에서 발현될 수 있는 비-천연 발생 분자를 의미한다. 키메라 수용체 폴리펩타이드는 관심 항원(예를 들어, 암과 같은 질병과 관련된 항원 또는 병원체와 관련된 항원; 본원의 고찰 참조)을 표적으로 할 수 있는 세포외 표적 결합 도메인을 포함한다. 세포외 표적 결합 도메인은 관심 항원(예를 들어, 본원에 개시된 CAR 폴리펩타이드 중의 세포외 항원 결합 도메인)에 직접 결합할 수 있다. 대안적으로, 세포외 표적 결합 도메인은 중간체, 예를 들어 항체와 같은 Fc 함유 제제를 통해 상기 관심 항원에 결합할 수 있다. 키메라 수용체 폴리펩타이드는 막관통 도메인, 힌지 도메인, 세포질 신호전달 도메인, 하나 이상의 공동자극성 도메인, 세포질 신호전달 도메인, 또는 이들의 조합을 추가로 포함할 수 있다. 일부 경우에, 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드는 공동자극성 도메인이 없을 수 있다. 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드는 숙주 세포에서 발현될 때 상기 세포외 표적 결합 도메인이 표적 항원에 직접 또는 간접적으로 결합하기 위해 세포외에 위치하도록 구성된다. 상기 선택적인 공동자극성 신호전달 도메인은 활성화 및/또는 이펙터 신호전달을 촉발하기 위해 세포질 내에 위치할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 키메라 수용체 폴리펩타이드는 상기 세포외 표적 결합 도메인의 C-말단 및 상기 막관통 도메인의 N-말단에 위치할 수 있는 힌지 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 상기 힌지는 임의의 적합한 길이일 수 있다. 다른 구현예에서, 본원에 기재된 키메라 수용체 폴리펩타이드에는 힌지 도메인이 전혀 없을 수 있다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드는 단축된 힌지 도메인(예를 들어, 최대 25개의 아미노산 잔기를 포함함)을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 키메라 수용체 폴리펩타이드는 N-말단에서부터 C-말단쪽으로, 상기 세포외 표적 결합 도메인, 상기 막관통 도메인, 및 상기 세포질 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 키메라 수용체 폴리펩타이드는 N-말단에서부터 C-말단쪽으로, 상기 세포외 표적 결합 도메인, 상기 막관통 도메인, 적어도 하나의 공동자극성 신호전달 도메인, 및 상기 세포질 신호전달 도메인을 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 기재된 키메라 수용체 폴리펩타이드는 N-말단에서부터 C-말단쪽으로, 상기 세포외 표적 결합 도메인, 상기 막관통 도메인, 상기 세포질 신호전달 도메인, 및 적어도 하나의 공동자극성 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드는 항체-커플링된 T 세포 수용체(ACTR) 폴리펩타이드일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, ACTR 폴리펩타이드(일명, ACTR 작제물)는 숙주 세포의 표면에서 발현될 수 있고 면역글로불린의 Fc 부분에 대해 결합 친화성 및 특이성을 갖는 세포외 도메인("Fc 결합제" 또는 "Fc 결합 도메인"), 막관통 도메인 및 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 비-천연 발생 분자를 의미한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 ACTR 폴리펩타이드는 적어도 하나의 공동자극성 신호전달 도메인을 추가로 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 본원에 개시된 키메라 수용체 폴리펩타이드는 키메라 항원 수용체(CAR) 폴리펩타이드일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, CAR 폴리펩타이드(일명, CAR 작제물)는 숙주 세포의 표면에서 발현될 수 있고 세포외 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 비-천연 발생 분자를 의미한다. 본원에 기재된 CAR 폴리펩타이드는 적어도 하나의 공동자극성 신호전달 도메인을 추가로 포함할 수 있다.
상기 세포외 항원 결합 도메인은 의학적 상태(예컨대, 질병)와 관련이 있는 자연 발생 항원을 포함하는 표적 항원에 특이적으로 결합하는 임의의 펩타이드 또는 폴리펩타이드, 또는 질병-관련 항원을 표적으로 하는 치료제에 접합된 항원 모이어티일 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 CAR 폴리펩타이드는 적어도 하나의 공동자극성 신호전달 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 상기 CAR 폴리펩타이드는 숙주 세포에서 발현될 때, 상기 세포외 항원 결합 도메인이 표적 분자 및 상기 세포질 신호전달 도메인에 결합하기 위해 세포외에 위치하도록 구성된다. 상기 선택적인 공동자극성 신호전달 도메인은 활성화 및/또는 이펙터 신호전달을 촉발하기 위해 세포질 내에 위치할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "단백질 X 막관통 도메인"(예를 들어, CD8 막관통 도메인)이라는 어구는 막에서 열역학적으로 안정한, 주어진 단백질, 즉 막관통-스패닝 단백질 X의 임의의 부분을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 어구 "단백질 X 세포질 신호전달 도메인", 예를 들어 CD3ζ 세포질 신호전달 도메인은 세포 또는 세포 소기관의 내부와 상호작용하고 본 기술분야에 공지된 바와 같은 1차 신호를 중계할 수 있어 면역 세포 증식 및/또는 활성화를 야기하는 단백질(단백질 X)의 임의의 부분을 지칭한다. 본원에 기재된 상기 세포질 신호전달 도메인은 면역 세포를 완전히 활성화하기 위해 2차 신호를 중계하는 공동자극성 신호전달 도메인과 상이하다.
본원에 사용된, 어구 "단백질 X 공동자극성 신호전달 도메인", 예를 들어 CD28 공동자극성 신호전달 도메인은 공동자극성 신호(2차 신호)를 면역 세포(예컨대, T 세포)로 형질도입시킬 수 있어 면역 세포의 완전한 활성화를 야기하는 주어진 공동자극성 단백질(단백질 X, 예컨대 CD28, 4-1BB, OX40, CD27, 또는 ICOS)의 부분을 의미한다.
A. 세포외 표적 결합 도메인
본원에 개시된 키메라 수용체 폴리펩타이드는 직접 결합 또는 간접 결합(항체와 같은 중간체를 통해)을 통해 관심 항원(예를 들어, 본원에 기재된 것)을 표적으로 하는 세포외 도메인을 포함한다. 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드는 Fc 결합 도메인을 포함하는 ACTR 폴리펩타이드일 수 있다. 대안적으로, 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드는 세포외 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR 폴리펩타이드일 수 있다.
Fc 결합 도메인
본원에 기재된 ACTR 폴리펩타이드는 세포외 도메인, 즉 적합한 포유류(예컨대, 인간, 마우스, 래트, 염소, 양, 또는 원숭이)의 면역글로불린(예컨대, IgG, IgA, IgM 또는 IgE)의 Fc 부분에 결합할 수 있는, Fc 결합 도메인을 포함한다. 적합한 Fc 결합 도메인은 포유류 Fc 수용체 또는 특정 박테리아 단백질(예컨대, 단백질 A, 단백질 G)과 같은 자연 발생 단백질로부터 유래될 수 있다. 추가로, Fc 결합 도메인은 높은 친화성 및 특이성을 가지면서 본원에 기재된 임의의 항체의 Fc 부분에 결합하도록 특이적으로 조작된 합성 폴리펩타이드일 수 있다. 예를 들어, 이러한 Fc 결합 도메인은 면역글로불린의 Fc 부분에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다. 예로는 단일 사슬 가변 단편(scFv), 도메인 항체 또는 단일 도메인 항체(예를 들어, 나노바디)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 대안적으로, Fc 결합 도메인은 Fc 부분에 특이적으로 결합하는 합성 펩타이드, 예를 들어 Kunitz 도메인, SMIP(small modular immunopharmaceutical), 애드넥틴(adnectin), 아비머(avimer), 아피바디(affibody), DARPin 또는 안티칼린(anticalin)일 수 있고, 이것은 Fc에 대한 결합 활성에 대해 펩타이드 조합 라이브러리를 스크리닝함으로써 식별될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 Fc 결합 도메인은 포유류 Fc 수용체의 세포외 리간드-결합 도메인이다. 본원에 사용된, "Fc 수용체"는 많은 면역 세포(B 세포, 수지상 세포, 자연 살해(NK) 세포, 대식세포, 호중구, 비만 세포 및 호산구를 포함함)의 표면에서 발현되고 항체의 Fc 도메인에 대해 결합 특이성을 나타내는 세포 표면 결합 수용체이다. Fc 수용체는 전형적으로 항체의 Fc(결정화할 수 있는 단편) 부분에 대해 결합 특이성을 갖는 2개 이상의 면역글로불린(Ig)-유사 도메인으로 구성된다. 일부 경우에, 상기 항체의 Fc 부분에 대한 Fc 수용체의 결합은 항체 의존성 세포 매개의 세포독성(antibody dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC) 효과를 촉발할 수 있다. 본원에 기재된 ACTR 폴리펩타이드를 작제하는데 사용되는 Fc 수용체는 자연 발생의 다형성 변이체(예를 들어, CD16 V158 변이체)일 수 있으며, 이는 야생형 대응물에 비해 Fc에 대해 증가 또는 감소된 친화성을 가질 수 있다. 대안적으로, 상기 Fc 수용체는 Ig 분자의 Fc 부분에 대한 결합 친화성을 변경시키는 하나 이상의 돌연변이(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 돌연변이를 포함하는 최대 10개의 아미노산 잔기 치환)를 운반하는 야생형 대응물의 기능적 변이체일 수 있다. 일부 경우에, 상기 돌연변이는 Fc 수용체의 글리코실화 패턴 및 이에 따라 Fc에 대한 결합 친화성을 변경시킬 수 있다.
하기의 표는 본원에 기재된 임의의 방법 또는 작제물에 사용될 수 있는 Fc 수용체 세포외 도메인의 많은 예시적인 다형성(예컨대, Kim 등, J. Mol. Evol. 53: 1-9, 2001 참조)을 나열한 것이다:
Figure pct00013
Fc 수용체는 결합할 수 있는 항체의 아이소타입(isotype)을 기반으로 하여 분류된다. 예를 들어, Fc-감마 수용체(FcγR)는 일반적으로 IgG 항체, 예컨대, 이의 하나 이상의 아형(즉, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4)에 결합하고; Fc-알파 수용체(FcαR)는 일반적으로 IgA 항체에 결합하며; Fc-엡실론 수용체(FcεR)는 일반적으로 IgE 항체에 결합한다. 일부 구현예에서, 상기 Fc 수용체는 Fc-감마 수용체, Fc-알파 수용체 또는 Fc-엡실론 수용체이다. Fc-감마 수용체의 예는 CD64A, CD64B, CD64C, CD32A, CD32B, CD16A 및 CD16B를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. Fc-알파 수용체의 예는 FcαR1/CD89이다. Fc-엡실론 수용체의 예는 FcεRI 및 FcεRII/CD23을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 하기 표는 본원에 기재된 ACTR 폴리펩타이드를 작제하는데 사용되는 예시적인 Fc 수용체 및 상응하는 Fc 도메인에 대한 결합 활성을 나열한 것이다:
Figure pct00014
본원에 기재된 ACTR 폴리펩타이드에 사용하기 위한 Fc 수용체의 리간드-결합 도메인의 선택은 본 기술분야의 기술자에게 명백할 것이다. 예를 들어, Fc 수용체의 결합이 필요한 항체의 아이소타입 및 상기 결합 상호작용의 바람직한 친화성과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다.
상기 CAR 폴리펩타이드 중 임의의 것의 세포외 항원 결합 도메인 일부 예에서, 상기 Fc 결합 도메인은 Fc에 대한 친화성을 조절할 수 있는 자연 발생의 다형성을 통합시킬 수 있는 CD16의 세포외 리간드-결합 도메인이다. 일부 예에서, 상기 Fc 결합 도메인은 위치 158(예를 들어, 발린 또는 페닐알라닌)에서 다형성을 통합시킨 CD16의 세포외 리간드-결합 도메인이다. 일부 구현예에서, 상기 Fc 결합 도메인은 이의 글리코실화 상태 및 Fc에 대한 친화성을 변경시키는 조건 하에 생성된다.
인간 CD16A F158 및 CD16A V158 변이체의 아미노산 서열은 하기에 제공되며, F158 및 V158 잔기가 굵게 및 밑줄로 강조되어 있다(신호 펩타이드는 이탤릭체):
CD16A F158(서열번호 93)
Figure pct00015
CD16A V158 (서열번호: 94):
Figure pct00016
일부 구현예에서, 상기 Fc 결합 도메인은 ACTR 폴리펩타이드를 IgG 항체의 하위세트에 특이적으로 만드는 변형을 통합시킨 CD16의 세포외 리간드-결합 도메인이다. 예를 들어, IgG 아형(예를 들어, IgG1)에 대한 친화성을 증가 또는 감소시키는 돌연변이가 통합될 수 있다.
본원에 기재된 임의의 상기 Fc 결합 도메인은 치료 항체의 Fc 부분에 대해 적합한 결합 친화성을 가질 수 있다. 본원에 사용된 "결합 친화성"은 겉보기 결합 상수 또는 KA를 지칭한다. 상기 KA는 해리 상수 KD의 역수이다. 본원에 기재된 ACTR 폴리펩타이드의 Fc 수용체 도메인의 세포외 리간드-결합 도메인은 항체의 Fc 부분에 대해 적어도 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10M 또는 그 이하의 결합 친화성 Kd를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 Fc 결합 도메인은 다른 항체, 항체의 아이소타입(들) 또는 이의 아형에 대한 상기 Fc 결합 도메인의 결합 친화성에 비해, 항체, 항체의 아이소타입(들) 또는 이의 아형(들)에 대해 높은 결합 친화성을 갖는다. 일부 구현예에서, Fc 수용체의 세포외 리간드-결합 도메인은 다른 항체, 항체의 아이소타입(들), 또는 이의 아형(들)에 대한 Fc 수용체의 세포외 리간드-결합 도메인의 결합에 비해, 항체, 항체의 아이소타입(들), 또는 이의 아형(들)에 대한 특이성을 갖는다.
본 기술분야에 공지된 기타 Fc 결합 도메인은, 예컨대, WO2015058018A1 및 PCT 출원 번호 PCT/US2018/015999에 기재된 것을 포함하여 본원에 기재된 ACTR 작제물에 사용될 수 있으며, 상기 문헌 각각의 관련 개시내용은 본원에 언급된 목적 및 주제에 대하여 참조적으로 포함된다.
세포외 항원 결합 도메인
본원에 기재된 CAR 폴리펩타이드는 CAR 폴리펩타이드를 발현하는 면역 세포의 특이성을 재유도하는 세포외 항원 결합 도메인을 포함한다. 본원에 사용된, "세포외 항원 결합 도메인"은 의학적 상태(예컨대, 질병)과 관련이 있는 자연 발생의 항원일 수 있는 관심 있는 표적 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 펩타이드 또는 폴리펩타이드, 또는 질병-관련 항원을 표적으로 하는 치료제에 접합되는 항원 모이어티를 지칭한다. 본원에 기재된 상기 세포외 항원 결합 도메인은 Fc 수용체의 세포외 도메인을 포함하지 않고, 면역글로불린의 Fc 부분에 결합하지 않을 수 있다. Fc 단편에 결합하지 않는 세포외 도메인은 둘 간의 결합 활성이 통상적인 검정법을 사용하여 검출할 수 없거나, 또는 단지 배경 또는 생물학적으로 무의미한 결합 활성만이 통상적인 검정법에 의해 검출된다는 것을 의미한다.
일부 경우에, 본원에 기재된 임의의 CAR 폴리펩타이드의 세포외 항원 결합 도메인은 세포 표면 항원(예를 들어, 종양 항원), 또는 주요 조직적합성 복합체와 복합체를 이루고 항원-제시 세포의 세포 표면 상에 제시되는 항원(또는 이의 단편)에 결합할 수 있는 펩타이드 또는 폴리펩타이드이다. 상기 세포외 항원 결합 도메인은 높은 결합 친화성으로 상기 표적 세포 표면 항원에 결합하는 항체에서 유래될 수 있는 단일 사슬 항체 단편(scFv)일 수 있다. 하기의 표 3은 예시적인 세포 표면 표적 항원 및 이에 결합하는 예시적인 항체를 나열한 것이다.
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
상기 세포외 항원 결합 도메인은 관심 있는 표적 항원에 따라 표 1에 나열된 임의의 항체로부터 유래된 항원 결합 단편(예를 들어, scFv)을 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 CAR 폴리펩타이드의 세포외 항원 결합 도메인은 박테리아 항원, 바이러스 항원 또는 진균 항원과 같은 병원성 항원에 특이적일 수 있다. 일부 예가 이하에 제공된다: 인플루엔자 바이러스 뉴라미니다제, 헤마글루티닌 또는 M2 단백질, 인간 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) F 당단백질 또는 G 당단백질, 단순 포진 바이러스 당단백질 gB, gC, gD 또는 gE, 클라미디아 MOMP 또는 PorB 단백질, 뎅기 바이러스 코어 단백질, 기질 단백질 또는 당단백질 E, 홍역 바이러스 헤마글루티닌, 단순 헤르페스 바이러스 2형 당단백질 gB, 폴리오바이러스 I VP1, HIV 1의 외피 당단백질, B형 간염 코어 항원 또는 표면 항원, 디프테리아 독소, 스트렙토코커스(Streptococcus) 24M 에피토프, 임균 필린, 가성광견병 바이러스 g50(gpD), 가성광견병 바이러스 II(gpB), 가성광견병 바이러스 III(gpC), 가성광견병 바이러스 당단백질 H, 가성광견병 바이러스 당단백질 E, 전염성 위장염 당단백질 195, 전염성 위장염 기질 단백질 또는 인간 C형 간염 바이러스 당단백질 E1 또는 E2.
또한, 본원에 기재된 CAR 폴리펩타이드의 세포외 항원 결합 도메인은 질환 또는 장애와 관련이 있는 항원(예를 들어, 본원에 기재된 종양 항원 또는 병원성 항원)을 표적으로 하는 치료제에 접합된 태그에 특이적일 수 있다. 일부 예에서, 상기 치료제에 접합된 태그는 항원성일 수 있고 상기 CAR 폴리펩타이드의 세포외 항원 결합 도메인은 상기 항원성 태그에 높은 결합 친화성 및/또는 특이성을 갖는 항체의 항원 결합 단편(예컨대, scFv)일 수 있다. 예시적인 항원성 태그는 비오틴, 아비딘, 형광 분자(예를 들어, GFP, YRP, 루시퍼라제 또는 RFP), Myc, Flag, His(예를 들어, 6xHis와 같은 폴리 His), HA(헤마글루티닌), GST, MBP(말토스 결합 단백질), KLH(키홀 림펫 헤모시아닌), trx, T7, HSV, VSV(예컨대, VSV-G), Glu-Glu, V5, e-태그, S-태그, KT3, E2, Au1, Au5 및/또는 티오레독신을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
다른 경우에, 상기 치료제에 접합된 태그는 리간드-수용체 쌍의 구성원이고 상기 세포외 항원 결합 도메인은 상기 리간드-수용체 쌍의 다른 구성원 또는 상기 태그에 결합하는 그 단편을 포함한다. 예를 들어, 상기 치료제에 접합된 태그는 비오틴일 수 있고 상기 CAR 폴리펩타이드의 세포외 항원 결합 도메인은 아비딘의 비오틴 결합 단편을 포함할 수 있다. 예를 들어, Urbanska 등, 2012, Lohmueller 등, 2018을 참조한다. 다른 예는 상기 세포외 항원 결합 도메인이 단백질 태그, 예컨대 FITC(Tamada 등, 2012, Kim 등, 2015; Cao 등, 2016; 및 Ma 등, 2016), PNE(Rodgers 등, 2016), La-SS-B(Cartellieri 등, 2016), 비오틴(Lohmullular 등, 2017) 및 류신-지퍼(Leucine-Zipper)(Cho 등, 2018)에 특이적인 scFv 단편인 항-Tag CAR을 포함한다. 본원에 기재된 CAR 폴리펩타이드에 사용하기 위한 항원 결합 도메인의 선택은 본 기술분야의 기술자에게 명백할 것이다. 예를 들어, 이것은 표적 항원의 유형 및 결합 상호작용의 바람직한 친화성과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다.
본원에 기재된 임의의 CAR 폴리펩타이드의 세포외 항원 결합 도메인은 표적 항원(예를 들어, 본원에 기재된 표적 중 임의의 하나) 또는 이의 항원성 에피토프에 대해 적합한 결합 친화성을 가질 수 있다. 본원에 사용된 "결합 친화성"은 겉보기 결합 상수 또는 KA를 지칭한다. 상기 KA는 해리 상수 KD의 역수이다. 본원에 기재된 CAR 폴리펩타이드에 사용하기 위한 세포외 항원 결합 도메인은 상기 표적 활성 또는 항원성 에피토프에 대해 적어도 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10M 또는 그 이하의 결합 친화성(KD)을 가질 수 있다. 증가된 결합 친화성은 감소된 KD에 상응한다. 제2 항원에 비해, 제1 항원에 대한 세포외 항원 결합 도메인의 더 높은 친화성 결합은 제2 항원 결합에 대한 KA(또는 수치 값 KD)보다 제1 항원 결합에 대한 더 높은 KA(또는 더 작은 수치 값 KD)에 의해 표시될 수 있다. 이러한 경우에, 상기 세포외 항원 결합 도메인은 상기 제2 항원(예컨대, 제2 입체 형태의 동일한 제1 단백질 또는 이의 모방체; 또는 제2 단백질)에 비해 제1 항원(예를 들어, 제1 입체 형태의 제1 단백질 또는 이의 모방체)에 대한 특이성을 갖는다. 결합 친화성(예를 들어, 특이성 또는 다른 비교에 대해)의 차이는 적어도 1.5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 37.5, 50, 70, 80, 91, 100, 500, 1000, 10,000, 또는 105 배일 수 있다.
결합 친화성(또는 결합 특이성)은 평형 투석, 평형 결합, 겔 여과, ELISA, 표면 플라즈몬 공명 또는 분광법(예컨대, 형광 검정법을 사용함)을 포함한 다양한 방법에 의해 결정될 수 있다. 결합 친화성을 평가하기 위한 예시적인 조건은 HBS-P 완충액(10mM HEPES pH7.4, 150mM NaCl, 0.005 %(v/v) 계면활성제 P20) 중이다. 이러한 기술은 표적 단백질 농도의 함수로서 결합된 결합 단백질의 농도를 측정하는데 사용될 수 있다. 결합된 결합 단백질의 농도([결합])는 일반적으로 하기 식에 의해 유리의 표적 단백질([유리])의 농도와 관련이 있다:
[결합] = [유리]/(Kd+[유리])
때로는 예를 들어 ELISA 또는 FACS 분석과 같은 방법을 사용하여 결정되는 것처럼 친화성의 정량적 측정을 수득하는 것이 충분하고, KA에 비례하여, 예컨대, 더 높은 친화성, 예를 들어 2배 더 높은 친화성이 있는지 여부를 결정하는 것과 같이 비교용으로 사용하여 친화성의 정성적 측정을 수득하거나, 또는 예를 들어 시험관내 또는 생체내 검정과 같은 기능적 검정에서 활성에 의한 것과 같이, 친화성의 추론을 수득할 수 있으므로, KA를 정확히 결정하는 것이 항상 필요한 것은 아니다.
B. 막관통 도메인
본원에 기재된 키메라 수용체 폴리펩타이드(예를 들어, ACTR 폴리펩타이드 또는 CAR 폴리펩타이드)의 막관통 도메인은 본 기술분야에 공지된 임의의 형태일 수 있다. 본원에 사용된, "막관통 도메인"은 세포막, 바람직하게는 진핵 세포막에서 열역학적으로 안정한 임의의 단백질 구조를 지칭한다. 본원에 사용된 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드에 사용하기에 적합한 막관통 도메인은 자연 발생의 단백질로부터 수득할 수 있다. 대안적으로는, 세포막에서 열역학적으로 안정한 소수성 단백질 분절과 같이 비-자연 발생의 합성 단백질 분절일 수 있다.
막관통 도메인은 막관통 도메인의 3차원 구조를 기반으로 하여 분류된다. 예를 들어, 막관통 도메인은 알파 나선, 하나보다 많은 알파 나선의 복합체, 베타 배럴(barrel) 또는 세포의 인지질 이중층에 걸쳐 있을 수 있는 임의의 다른 안정한 구조를 형성할 수 있다. 더욱이, 막관통 도메인은 또한 막관통 도메인이 막을 가로 지르는 통과 횟수 및 단백질의 배향을 포함한 막관통 도메인 토폴로지를 기반으로 하여 분류될 수 있다. 예를 들어, 싱글-패스 막 단백질은 세포막을 한번 통과하고 멀티-패스 막 단백질은 세포막을 적어도 2회(예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7회 이상) 통과한다.
막 단백질은 세포의 내부 및 외부에 비해 상기 단백질의 말단 및 막 통과 분절(들)의 토폴로지에 따라 유형 I, 유형 II 또는 유형 III으로 정의될 수 있다. 유형 I 막 단백질은 싱글 막-스패닝 영역을 가지며 상기 단백질의 N-말단이 세포의 지질 이중층의 세포외 측에 존재하고 상기 단백질의 C-말단이 세포질 측에 존재하도록 배향된다. 유형 II 막 단백질은 또한 싱글 막-스패닝 영역을 갖지만, 상기 단백질의 C-말단이 세포의 지질 이중층의 세포외 측에 존재하고 상기 단백질의 N-말단이 세포질 측에 존재하도록 배향된다. 유형 III 막 단백질은 멀티 막-스패닝 분절을 가지며 막관통 분절의 수 및 N-말단과 C-말단의 위치를 기반으로 하여 추가로 하위분류될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 키메라 수용체 폴리펩타이드의 막관통 도메인은 유형 I 싱글-패스 막 단백질로부터 유래된다. 싱글-패스 막 단백질은 CD8α, CD8β, 4-1BB/CD137, CD27, CD28, CD34, CD4, FcεRIγ, CD16, OX40/CD134, CD3ζ, CD3ε, CD3γ, CD3δ, TCRα, TCRβ, TCRζ, CD32, CD64, CD64, CD45, CD5, CD9, CD22, CD37, CD80, CD86, CD40, CD40L/CD154, VEGFR2, FAS 및 FGFR2B를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 상기 막관통 도메인은 하기 중에서 선택되는 막 단백질에서 유래된다: CD8α, CD8β, 4-1BB/CD137, CD28, CD34, CD4, FcεRIγ, CD16, OX40/CD134, CD3ζ, CD3ε, CD3γ, CD3δ, TCRα, CD32, CD64, VEGFR2, FAS 및 FGFR2B. 일부 예에서, 상기 막관통 도메인은 CD8의 것이다(예를 들어, 상기 막관통 도메인은 CD8α의 것이다). 일부 예에서, 상기 막관통 도메인은 4-1BB/CD137의 것이다. 다른 예에서, 상기 막관통 도메인은 CD28의 것이다. 일부 경우에, 본원에 기재된 키메라 수용체 폴리펩타이드는 임의의 비-CD16A 수용체로부터의 힌지 도메인이 없는 것일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드는 본원에 기재된 바와 같은 2개 이상의 공동자극성 영역을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드는 임의의 힌지 도메인이 없을 수 있다. 다른 예에서, 상기 막관통 도메인은 CD34의 것이다. 또 다른 예에서, 상기 막관통 도메인은 인간 CD8α에서 유래된 것이 아니다. 일부 구현예에서, 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드의 막관통 도메인은 싱글-패스 알파 나선이다.
멀티-패스(multi-pass) 막 단백질로부터의 막관통 도메인은 또한 본원에 기재된 키메라 수용체 폴리펩타이드에 사용하기에 적합할 수 있다. 멀티-패스 막 단백질은 복잡한 알파 나선 구조(예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7개 이상의 알파 나선) 또는 베타 시트 구조를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 멀티-패스 막 단백질의 N-말단 및 C-말단은 지질 이중층의 반대 측에 존재하며, 예를 들어 상기 단백질의 N-말단은 지질 이중층의 세포질 측에 존재하고 상기 단백질의 C-말단은 세포외 측에 존재한다. 멀티-패스 막 단백질로부터의 하나 또는 복수의 나선 통과는 본원에 기재된 키메라 수용체 폴리펩타이드를 작제하는데 사용될 수 있다.
본원에 기재된 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드에 사용하기 위한 막관통 도메인은 또한 비-천연 발생의 합성 단백질 분절의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 막관통 도메인은 비-천연 발생의 합성 알파 나선 또는 베타 시트이다. 일부 구현예에서, 상기 단백질 분절은 적어도 대략 20개의 아미노산, 예를 들어 적어도 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개 이상의 아미노산이다. 합성 막관통 도메인의 예는 본 기술분야, 예를 들어 미국 특허 번호 7,052,906 B1 및 PCT 공개 번호 WO 2000/032776 A2에 공지되어 있고, 이들 각각의 관련 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 상기 막관통 도메인의 아미노산 서열은 시스테인 잔기를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 막관통 도메인의 아미노산 서열은 하나의 시스테인 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 막관통 도메인의 아미노산 서열은 2개의 시스테인 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 막관통 도메인의 아미노산 서열은 2개보다 많은 시스테인 잔기(예를 들어, 3, 4, 5개 이상)를 포함한다.
상기 막관통 도메인은 막관통 영역 및 상기 막관통 도메인의 C-말단 측에 위치한 세포질 영역을 포함할 수 있다. 상기 막관통 도메인의 세포질 영역은 3개 이상의 아미노산을 포함할 수 있고, 일부 구현예에서는 지질 이중층에서 상기 막관통 도메인의 배향을 돕는다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 시스테인 잔기는 상기 막관통 도메인의 막관통 영역에 존재한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 시스테인 잔기는 상기 막관통 도메인의 세포질 영역에 존재한다. 일부 구현예에서, 상기 막관통 도메인의 세포질 영역은 양으로 하전된 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 막관통 도메인의 세포질 영역은 아미노산 아르기닌, 세린 및 라이신을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 막관통 도메인의 막관통 영역은 소수성 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 막관통 영역은 대부분 소수성 아미노산 잔기, 예컨대 알라닌, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 또는 발린을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 막관통 영역은 소수성이다. 일부 구현예에서, 상기 막관통 영역은 폴리-류신-알라닌 서열을 포함한다.
단백질 또는 단백질 분절의 수치법(hydropathy)인, 소수성(hydrophobic) 또는 친수성(hydrophilic) 특성은, 예를 들어, Kyte 및 Doolittle 수치 분석을 포함하는 본 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 평가될 수 있다.
C. 공동자극성 신호전달 도메인
많은 면역 세포는 항원 특이적 신호의 자극 외에도 세포 증식, 분화 및 생존을 촉진할 뿐만 아니라, 상기 세포의 이펙터 기능을 활성화하기 위해 공동자극을 필요로 한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 키메라 수용체 폴리펩타이드, 예컨대 ACTR 또는 CAR 폴리펩타이드는 적어도 하나의 공동자극성 신호전달 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드는 CD28 공동자극성 신호전달 도메인 또는 4-1BB(CD137) 공동자극성 신호전달 도메인을 함유할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "공동자극성 신호전달 도메인"은 이펙터 기능(2차 신호)과 같은 면역 반응을 유도하기 위해 세포 내에 신호 변환을 매개하는 공동자극성 신호전달 단백질의 최소 단편을 지칭한다. 본 기술분야에 알려진 바와 같이, T 세포와 같은 면역 세포의 활성화는 종종 두 가지 신호를 필요로 한다: (1) T 세포 수용체(TCR) 복합체의 성분으로서 CD3ζ에 의해 전형적으로 유도되는 항원 제시 세포에 의해 제시되는 항원 펩타이드/MHC 복합체와 T 세포 수용체(TCR)의 체결에 의해 촉발되는 항원 특이적 신호(1차 신호) 및 (ii) 공동자극성 수용체와 이의 리간드 사이의 상호작용에 의해 촉발되는 공동자극성 신호(2차 신호). 공동자극성 수용체는 상기 TCR-촉발성 신호전달에 부가적으로 공동자극성 신호(2차 신호)를 변환시키고 T 세포, NK 세포, 대식세포, 호중구 또는 호산구와 같은 면역 세포에 의해 매개되는 반응을 조절한다.
숙주 세포(예를 들어, 면역 세포)에서 공동자극성 신호전달 도메인의 활성화는 사이토카인의 생산 및 분비, 식세포 특성, 증식, 분화, 생존 및/또는 세포독성을 증가 또는 감소시키도록 상기 세포를 유도할 수 있다. 임의의 공동자극성 분자의 공동자극성 신호전달 도메인은 본원에 기재된 키메라 수용체 폴리펩타이드에 사용하기에 적합할 수 있다. 공동자극성 신호전달 도메인의 유형(들)은 키메라 수용체 폴리펩타이드가 발현될 수 있는 면역 세포(예컨대, T 세포, NK 세포, 대식세포, 호중구 또는 호산구)의 유형 및 원하는 면역 이펙터 기능(예컨대, ADCC)과 같은 요인을 기반으로 하여 선택한다. 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드에 사용하기 위한 공동자극성 신호전달 도메인의 예는 B7/CD28 패밀리의 구성원(예를 들어, B7-1/CD80, B7-2/CD86, B7-H1/PD-L1, B7-H2, B7-H3, B7-H4, B7-H6, B7-H7, BTLA/CD272, CD28, CTLA-4, Gi24/VISTA/B7-H5, ICOS/CD278, PD-1, PD-L2/B7-DC 및 PDCD6); TNF 수퍼패밀리의 구성원(예컨대, 4-1BB/TNFRSF9/CD137, 4-1BB 리간드/TNFSF9, BAFF/BLyS/TNFSF13B, BAFFR/TNFRSF13C, CD27/TNFRSF7, CD27 리간드/TNFSF7, CD30/TNFRSF8, CD30 리간드/TNFSF8, CD40/TNFRSF5, CD40/TNFSF5, CD40 리간드/TNFSF5, DR3/TNFRSF25, GITR/TNFRSF18, GITR 리간드/TNFSF18, HVEM/TNFRSF14, LIGHT/TNFSF14, 림프독소-알파/TNF-베타, OX40 리간드/TNFRSF4, RELT/TNFRSF19L, TACI/TNFRSF13B, TL1A/TNFSF15, TNF-알파 및 TNF RII/TNFRSF1B); SLAM 패밀리의 구성원(예컨대, 2B4/CD244/SLAMF4, BLAME/SLAMF8, CD2, CD2F-10/SLAMF9, CD48/SLAMF2, CD58/LFA-3, CD84/SLAMF5, CD229/SLAMF3, CRACC/SLAMF7, NTB-A/SLAMF6 및 SLAM/CD150); 및 임의의 다른 공동자극성 분자, 예컨대 CD2, CD7, CD53, CD82/Kai-1, CD90/Thy1, CD96, CD160, CD200, CD300a/LMIR1, HLA Class I, HLA-DR, 이카로스, 인테그린 알파 4/CD49d, 인테그린 알파 4 베타 1, 인테그린 알파 4 베타 7/LPAM-1, LAG-3, TCL1A, TCL1B, CRTAM, DAP12, Dectin-1/CLEC7A, DPPIV/CD26, EphB6, TIM-1/KIM-1/HAVCR, TIM-4, TSLP, TSLP R, 림프구 기능 관련 항원-1(LFA-1), 및 NKG2C를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는 공동자극성 단백질의 세포질 신호전달 도메인일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 공동자극성 신호전달 도메인은 4-1BB, CD28, OX40, ICOS, CD27, GITR, HVEM, TIM1, LFA1(CD11a) 또는 CD2, 또는 이의 임의의 변이체의 것이다.
또한, 본 개시내용의 범위 내에는 공동자극성 신호전달 도메인이 면역 세포의 면역 반응을 조절할 수 있도록 한, 본원에 기재된 임의의 공동자극성 신호전달 도메인의 변이체가 있다. 일부 구현예에서, 상기 공동자극성 신호전달 도메인은 야생형 대응물에 비해 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 최대 10개의 아미노산 잔기 돌연변이(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 8개)를 포함한다. 하나 이상의 아미노산 변이(예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가)를 포함하는 상기 공동자극성 신호전달 도메인은 변이체라고 지칭될 수 있다.
상기 공동자극성 신호전달 도메인의 아미노산 잔기의 돌연변이는 상기 돌연변이를 포함하지 않는 공동자극성 신호전달 도메인에 비해 신호전달 도입의 증가 및 면역 반응의 향상된 자극을 초래할 수 있다. 상기 공동자극성 신호전달 도메인의 아미노산 잔기의 돌연변이는 상기 돌연변이를 포함하지 않는 공동자극성 신호전달 도메인에 비해 신호전달 도입의 감소 및 면역 반응의 저하된 자극을 초래할 수 있다. 예를 들어, 천연 CD28 아미노산 서열의 잔기 186 및 187의 돌연변이는 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드의 공동자극성 도메인에 의한 공동자극성 활성의 증가 및 면역 반응의 유도를 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 돌연변이는 위치 186 및 187 각각에서 라이신이 상기 CD28 공동자극성 도메인의 글리신 잔기로 치환된 것이며, CD28LL→GG 변이체라고 지칭된다. 상기 도메인의 공동자극 활성을 향상 또는 저하시킬 수 있는 공동자극성 신호전달 도메인에 이루어질 수 있는 부가적인 돌연변이는 본 기술분야의 기술자에게 명백할 것이다. 일부 구현예에서, 상기 공동자극성 신호전달 도메인은 4-1BB, CD28, OX40, 또는 CD28LL→GG 변이체의 것이다.
일부 구현예에서, 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드는, 예를 들어, CD27 공동자극성 도메인, CD28 공동자극성 도메인, 4-1BB 공동자극성 도메인, ICOS 공동자극성 도메인, 또는 OX40 공동자극성 도메인과 같은 단일 공동자극성 도메인을 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드는 하나보다 많은 공동자극성 신호전달 도메인(예를 들어, 2, 3개 또는 그 이상)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드는 2개 이상의 동일한 공동자극성 신호전달 도메인, 예를 들어 CD28의 공동자극성 신호전달 도메인의 2 카피를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드는 본원에 기재된 임의의 2개 이상의 공동자극성 단백질과 같이 상이한 공동자극성 단백질로부터의 2개 이상의 공동자극성 신호전달 도메인을 포함한다. 공동자극성 신호전달 도메인의 유형(들)의 선택은 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드(예를 들어, T 세포 또는 NK 세포)와 함께 사용될 숙주 세포의 유형 및 원하는 면역 이펙터 기능과 같은 요인을 기반으로 할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드는 2개의 공동자극성 신호전달 도메인, 예를 들어 CD28의 공동자극성 신호전달 도메인의 2 카피를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드는 본원에 기재된 임의의 2개 이상의 공동자극성 수용체, 예를 들어 CD28 및 4-1BB, CD28 및 CD27, CD28 및 ICOS, CD28LL→GG 변이체 및 4-1BB, CD28 및 OX40, 또는 CD28LL→GG 변이체 및 OX40과 같은 상이한 공동자극성 수용체로부터의 2개 이상의 공동자극성 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 2개의 공동자극성 신호전달 도메인은 CD28 및 4-1BB이다. 일부 구현예에서, 상기 2개의 공동자극성 신호전달 도메인은 CD28LL→GG 변이체 및 4-1BB이다. 일부 구현예에서, 상기 2개의 공동자극성 신호전달 도메인은 CD28 및 OX40이다. 일부 구현예에서, 상기 2개의 공동자극성 신호전달 도메인은 CD28LL→GG 변이체 및 OX40이다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 키메라 수용체 폴리펩타이드는 CD28 및 ICOSL의 조합을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 키메라 수용체 폴리펩타이드는 CD28 및 CD27의 조합을 함유할 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 4-1BB 공동자극성 도메인은 CD28 또는 CD28LL→GG 변이체 공동자극성 신호전달 도메인에 대해 N-말단에 위치한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 키메라 수용체 폴리펩타이드는 공동자극성 신호전달 도메인을 포함하지 않는다.
D. 세포질 신호전달 도메인
임의의 세포질 신호전달 도메인은 본원에 기재된 키메라 수용체 폴리펩타이드(예를 들어, ACTR 폴리펩타이드 또는 CAR 폴리펩타이드)를 생성하는데 사용될 수 있다. 이러한 세포질 도메인은 면역 세포 증식 및/또는 활성화를 야기하는 세포 신호전달(1차 신호전달)을 촉발하는 데 관여하는 임의의 신호전달 도메인일 수 있다. 본원에 기재된 세포질 신호전달 도메인은 본 기술분야에 공지된 바와 같이, 면역 세포를 완전히 활성화하기 위한 공동자극성 또는 2차 신호를 중계하는 공동자극성 신호전달 도메인이 아니다.
본원에 기재된 세포질 도메인은 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM) 도메인(예를 들어, 적어도 하나의 ITAM 도메인, 적어도 2개의 ITAM 도메인, 또는 적어도 3개의 ITAM 도메인)을 포함할 수 있거나, 또는 ITAM이 없을 수 있다. 본원에 사용된 "ITAM"은 많은 면역 세포에서 발현되는 신호전달 분자의 꼬리 부분에 일반적으로 존재하는 보존적 단백질 모티프이다. 상기 모티프는 6 내지 8개의 아미노산에 의해 분리된 아미노산 서열 YxxL/I의 2개의 반복체를 포함할 수 있어, 보존적 모티프 YxxL/Ix(6-8)YxxL/I를 생성하며, 여기서 각 x는 독립적으로 임의의 아미노산이다. 신호전달 분자 내의 ITAM은 상기 세포 내에 신호 도입에 중요하며, 이는 상기 신호전달 분자의 활성화 후에 상기 ITAM 내의 티로신 잔기의 인산화에 의해 적어도 부분적으로 매개된다. ITAM은 또한 신호전달 경로에 관여하는 다른 단백질의 도킹 부위(docking site)로도 기능할 수 있다.
일부 예에서, 상기 세포질 신호전달 도메인은 CD3ζ 또는 FcεR1γ의 것이다. 다른 예에서, 세포질 신호전달 도메인은 인간 CD3ζ로부터 유래되지 않는다. 또 다른 예에서, 상기 세포질 신호전달 도메인은, 동일한 키메라 수용체 폴리펩타이드의 세포외 Fc 결합 도메인이 CD16A로부터 유래되는 경우, Fc 수용체로부터 유래되지 않는다.
하나의 특정 구현예에서, 여러 신호전달 도메인은 부가 또는 상승 효과를 위해 함께 융합될 수 있다. 유용한 부가 신호전달 도메인의 비제한적인 예는 TCR 제타 사슬, CD28, OX40/CD134, 4-1BB/CD137, FcεRIy, ICOS/CD278, IL2R-베타/CD122, IL-2R-감마/CD132, 및 CD40 중 하나 이상의 일부 또는 전부를 포함한다.
다른 구현예에서, 본원에 기재된 세포질 신호전달 도메인에는 ITAM 모티프가 없다. 예로는 Jak/STAT의 세포질 신호전달 도메인, Toll-인터루킨 수용체(TIR), 및 티로신 키나제를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
E. 힌지 도메인
일부 구현예에서, 본원에 기재된 ACTR 폴리펩타이드 또는 CAR 폴리펩타이드와 같은 키메라 수용체 폴리펩타이드는 상기 세포외 리간드-결합 도메인과 상기 막관통 도메인 사이에 위치하는 힌지 도메인을 추가로 포함한다. 힌지 도메인은 단백질의 두 도메인 사이에서 일반적으로 발견되고 상기 단백질의 유연성 및 상기 도메인 중 하나 또는 둘 모두의 서로 상대적인 이동을 허용할 수 있는 아미노산 분절이다. 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드의 막관통 도메인에 상대적인 세포외 리간드-결합 도메인의 상기 유연성 및 이동을 제공하는 임의의 아미노산 서열이 사용될 수 있다.
힌지 도메인을 포함하는 것으로 본 기술분야에 공지된 임의의 단백질의 힌지 도메인은 본원에 기재된 키메라 수용체 폴리펩타이드에 사용하기에 적합하다. 일부 구현예에서, 상기 힌지 도메인은 자연 발생의 단백질의 힌지 도메인의 적어도 일부이고 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드에 유연성을 부여한다. 일부 구현예에서, 상기 힌지 도메인은 CD8의 것이다. 일부 구현예에서, 상기 힌지 도메인은 CD8의 힌지 도메인의 일부, 예를 들어 CD8의 힌지 도메인의 적어도 15개(예를 들어, 20, 25, 30, 35 또는 40개) 연속 아미노산을 함유하는 단편이다. 일부 구현예에서, 상기 힌지 도메인은 CD28의 것이다. 일부 구현예에서, 상기 힌지 도메인은 CD28의 힌지 도메인의 일부, 예를 들어 CD28의 힌지 도메인의 적어도 15개(예를 들어, 20, 25, 30, 35, 또는 40개) 연속 아미노산을 함유하는 단편이다. 상기 힌지 도메인 및/또는 상기 막관통 도메인은 N-말단 부분, C-말단 부분, 또는 둘 모두에 부가적인 아미노산(예를 들어, 15개 aa, 10개 aa, 8개 aa, 6개 aa 또는 4개 aa)에 연결될 수 있다. 예는, 예를 들어 Ying 등, Nature Medicine, 25(6): 947-953(2019)에서 찾아볼 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 힌지 도메인은 CD16A 수용체의 것, 예를 들어 CD16A 수용체의 전체 힌지 도메인 또는 이의 일부이며, 이는 CD16A 수용체의 최대 40개의 연속 아미노산 잔기(예를 들어, 20, 25, 30, 35 또는 40개)로 구성될 수 있다. 이러한 키메라 수용체 폴리펩타이드(예를 들어, ACTR 폴리펩타이드)는 다른 수용체(비-CD16A 수용체)로부터의 힌지 도메인을 함유하지 않을 수 있다.
IgG, IgA, IgM, IgE 또는 IgD 항체와 같은 항체의 힌지 도메인은 또한 본원에 기재된 키메라 수용체 폴리펩타이드에 사용하기에 적합하다. 일부 구현예에서, 상기 힌지 도메인은 항체의 불변 도메인 CH1 및 CH2를 연결하는 힌지 도메인이다. 일부 구현예에서, 상기 힌지 도메인은 항체의 것이고 항체의 힌지 도메인 및 항체의 하나 이상의 불변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 힌지 도메인은 항체의 힌지 도메인 및 항체의 CH3 불변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 힌지 도메인은 항체의 힌지 도메인 및 항체의 CH2 및 CH3 불변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 항체는 IgG, IgA, IgM, IgE 또는 IgD 항체이다. 일부 구현예에서, 상기 항체는 IgG 항체이다. 일부 구현예에서, 상기 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 항체이다. 일부 구현예에서, 상기 힌지 영역은 IgG1 항체의 CH2 및 CH3 불변 영역 및 힌지 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 힌지 영역은 IgG1 항체의 CH3 불변 영역 및 힌지 영역을 포함한다.
비-천연 발생의 펩타이드는 또한 본원에 기재된 키메라 수용체 폴리펩타이드에 대한 힌지 도메인으로서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 세포외 표적 결합 도메인의 C-말단과 상기 막관통 도메인의 N-말단 사이의 힌지 도메인은 (GlyxSer)n 링커와 같은 펩타이드 링커이며, 여기서 x 및 n은 독립적으로 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 이상을 포함하는 3과 12 사이의 정수일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 힌지 도메인은 (Gly4Ser)n(서열번호 95)이고, 여기서 n은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 또는 60을 포함하는, 3과 60 사이의 정수일 수 있다. 특정 구현예에서, n은 60보다 큰 정수일 수 있다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 (Gly4Ser)3(서열번호 96)이다. 일부 구현예에서, 상기 힌지 도메인은 (Gly4Ser)6(서열번호 97)이다. 일부 구현예에서, 상기 힌지 도메인은 (Gly4Ser)9(서열번호 98)이다. 일부 구현예에서, 상기 힌지 도메인은 (Gly4Ser)12(서열번호 99)이다. 일부 구현예에서, 상기 힌지 도메인은 (Gly4Ser)15(서열번호 100)이다. 일부 구현예에서, 상기 힌지 도메인은 (Gly4Ser)30(서열번호 101)이다. 일부 구현예에서, 상기 힌지 도메인은 (Gly4Ser)45(서열번호 102)이다. 일부 구현예에서, 상기 힌지 도메인은 (Gly4Ser)60(서열번호 103)이다.
다른 구현예에서, 상기 힌지 도메인은 다양한 길이의 친수성 잔기(예를 들어, 10-80 아미노산 잔기)로 이루어진 비구조화된 폴리펩타이드인 연장된 재조합 폴리펩타이드(XTEN)이다. XTEN 펩타이드의 아미노산 서열은 본 기술분야의 기술자에게 명백할 것이며, 예를 들어 관련 개시내용이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 8,673,860에서 찾아볼 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 힌지 도메인은 XTEN 펩타이드이고 60개의 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 힌지 도메인은 XTEN 펩타이드이고 30개의 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 힌지 도메인은 XTEN 펩타이드이고 45개의 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 힌지 도메인은 XTEN 펩타이드이고 15개의 아미노산을 포함한다.
본원에 기재된 키메라 수용체 폴리펩타이드를 제조하기 위해 사용되는 임의의 힌지 도메인은 최대 250개의 아미노산 잔기를 함유할 수 있다. 일부 경우에, 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드는 비교적 긴 힌지 도메인, 예를 들어 150-250개 아미노산 잔기(예컨대, 150-180개 아미노산 잔기, 180-200개 아미노산 잔기, 또는 200-250개 아미노산 잔기)를 함유할 수 있다. 다른 경우에, 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드는 60-150개의 아미노산 잔기(예를 들어, 60-80, 80-100, 100-120 또는 120-150개의 아미노산 잔기)를 함유할 수 있는 중간 크기의 힌지 도메인을 함유할 수 있다. 대안적으로, 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드는 60개 미만의 아미노산 잔기(예를 들어, 1-30개 아미노산 또는 31-60개 아미노산)를 함유할 수 있는, 짧은 힌지 도메인을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 키메라 수용체 폴리펩타이드(예를 들어, ACTR 폴리펩타이드)는 힌지 도메인, 또는 비-CD16A 수용체로부터의 힌지 도메인을 함유하지 않는다.
F. 신호 펩타이드
일부 구현예에서, 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드(예를 들어, ACTR 폴리펩타이드 또는 CAR 폴리펩타이드)는 상기 폴리펩타이드의 N-말단에 신호 펩타이드(신호 서열이라고도 알려짐)를 추가로 포함할 수 있다. 일반적으로, 신호 서열은 세포 내의 원하는 부위로 폴리펩타이드를 표적화하는 펩타이드 서열이다. 일부 구현예에서, 상기 신호 서열은 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드를 상기 세포의 분비 경로로 표적화하여, 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드를 지질 이중층 내로 통합 및 고착시킬 것이다. 본원에 기재된 키메라 수용체 폴리펩타이드에 사용하기에 적합한 천연 발생의 단백질의 신호 서열 또는 비-천연 발생의 합성 신호 서열을 포함하는 신호 서열은 본 기술분야의 기술자에게 명백할 것이다. 일부 구현예에서, 상기 신호 서열은 CD8α로부터의 것이다. 일부 구현예에서, 상기 신호 서열은 CD28로부터의 것이다. 다른 구현예에서, 상기 신호 서열은 뮤린 카파 사슬로부터의 것이다. 또 다른 구현예에서, 상기 신호 서열은 CD16로부터의 것이다.
G. ACTR 폴리펩타이드의 예
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물과 함께 사용하기 위한 예시적인 ACTR 작제물은, 예를 들어, 본 명세서 및 도면에서 찾아볼 수 있거나, 또는 PCT 특허 공개 번호 WO2016040441A1, WO2017/161333 및 PCT 출원 번호 PCT/US2018/015999에서 찾아볼 수 있고, 이들 각각은 본 목적을 위해 본원에 참조로 포함된다. 본원에 기재된 ACTR 폴리펩타이드는 IgG 분자의 Fc 부분에 대한 결합 친화성 및 특이성을 가진 CD16A 세포외 도메인, 막관통 도메인 및 CD3ζ 세포질 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 ACTR 폴리펩타이드는 하나 이상의 공동자극성 신호전달 도메인을 추가로 포함할 수 있고, 이들 중 하나는 CD28 공동자극성 신호전달 도메인 또는 4-1BB 공동자극성 신호전달 도메인일 수 있다. 상기 ACTR 폴리펩타이드는 숙주 세포에서 발현될 때, 상기 세포외 리간드-결합 도메인이 표적 분자 및 CD3ζ 세포질 신호전달 도메인에 결합하기 위해 세포외에 위치하도록 구성된다. 상기 공동자극성 신호전달 도메인은 활성화 및/또는 이펙터 신호전달을 촉발하기 위해 세포질에 위치할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 ACTR 폴리펩타이드는 N-말단에서부터 C-말단쪽으로, CD16A 세포외 도메인과 같은 상기 Fc 결합 도메인, 상기 막관통 도메인, 상기 선택적인 하나 이상의 공동자극성 도메인(예를 들어, CD28 공동자극성 도메인, 4-1BB 공동자극성 신호전달 도메인, OX40 공동자극성 신호전달 도메인, CD27 공동자극성 신호전달 도메인, 또는 ICOS 공동자극성 신호전달 도메인), 및 상기 CD3ζ 세포질 신호전달 도메인을 포함할 수 있다.
대안적으로 또는 부가적으로, 본원에 기재된 ACTR 폴리펩타이드는 서로 연결되거나 상기 세포질 신호전달 도메인에 의해 분리될 수 있는 2 이상의 공동자극성 신호전달 도메인을 함유할 수 있다. ACTR 폴리펩타이드 내의 상기 세포외 Fc 결합제, 막관통 도메인, 선택적인 공동자극성 신호전달 도메인(들) 및 세포질 신호전달 도메인은 직접 또는 펩타이드 링커를 통해 서로 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 ACTR 폴리펩타이드는 N-말단에 신호 서열을 포함할 수 있다.
표 4는 본원에 기재된 예시적인 ACTR 폴리펩타이드를 제공한다. 이러한 예시 적 작제물은 N-말단에서부터 C-말단쪽 순서로, 상기 신호 서열, 상기 Fc 결합 도메인(예를 들어, Fc 수용체의 세포외 도메인), 상기 힌지 도메인 및 상기 막관통을 갖는 한편, 상기 선택적인 공동자극성 도메인과 상기 세포질 신호전달 도메인의 위치는 교환될 수 있다.
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
상기 ACTR 폴리펩타이드 예의 아미노산 서열은 이하에 제공된다(신호 서열은 이탤릭체임).
서열번호 1:
Figure pct00028
서열번호 2:
Figure pct00029
서열번호 3:
Figure pct00030
서열번호 4:
Figure pct00031
서열번호 5:
Figure pct00032
서열번호 6:
Figure pct00033
서열번호 7:
Figure pct00034
서열번호 8:
Figure pct00035
서열번호 9:
Figure pct00036
서열번호 10:
Figure pct00037
서열번호 11:
Figure pct00038
서열번호 12:
Figure pct00039
서열번호 13:
Figure pct00040
서열번호 14:
Figure pct00041
서열번호 15:
Figure pct00042
서열번호 16:
Figure pct00043
서열번호 17:
Figure pct00044
서열번호 18:
Figure pct00045
서열번호 19:
Figure pct00046
서열번호 20:
Figure pct00047
서열번호 21:
Figure pct00048
서열번호 22:
Figure pct00049
서열번호 23:
Figure pct00050
서열번호 24:
Figure pct00051
서열번호 25:
Figure pct00052
서열번호 26:
Figure pct00053
서열번호 27:
Figure pct00054
서열번호 28:
Figure pct00055
서열번호 29:
Figure pct00056
서열번호 30:
Figure pct00057
서열번호 31:
Figure pct00058
서열번호 32:
Figure pct00059
서열번호 33:
Figure pct00060
서열번호 34:
Figure pct00061
서열번호 35:
Figure pct00062
서열번호 36:
Figure pct00063
서열번호 37:
Figure pct00064
서열번호 38:
Figure pct00065
서열번호 39:
Figure pct00066
서열번호 40:
Figure pct00067
서열번호 41:
Figure pct00068
서열번호 42:
Figure pct00069
서열번호 43:
Figure pct00070
서열번호 44:
Figure pct00071
서열번호 45:
Figure pct00072
서열번호 46:
Figure pct00073
서열번호 47:
Figure pct00074
서열번호 48:
Figure pct00075
서열번호 49:
Figure pct00076
서열번호 50:
Figure pct00077
서열번호 51:
Figure pct00078
서열번호 52:
Figure pct00079
서열번호 53:
Figure pct00080
서열번호 54:
Figure pct00081
서열번호 55:
Figure pct00082
서열번호 56:
Figure pct00083
서열번호 57:
Figure pct00084
서열번호 58:
Figure pct00085
서열번호 59:
Figure pct00086
서열번호 60:
Figure pct00087
서열번호 61:
Figure pct00088
서열 번호 62:
Figure pct00089
서열번호 63:
Figure pct00090
서열번호 64:
Figure pct00091
서열번호 65:
Figure pct00092
서열번호 66:
Figure pct00093
서열번호 67:
Figure pct00094
서열번호 68:
Figure pct00095
서열번호 69:
Figure pct00096
서열번호 70:
Figure pct00097
서열번호 71:
Figure pct00098
서열번호 72:
Figure pct00099
서열번호 73:
Figure pct00100
서열번호 74:
Figure pct00101
서열번호 75:
Figure pct00102
서열번호 76:
Figure pct00103
서열번호 77:
Figure pct00104
서열번호 78:
Figure pct00105
서열번호 79:
Figure pct00106
서열번호 80:
Figure pct00107
H. CAR 폴리펩타이드의 예
본원에 기재된 방법 및 조성물과 함께 사용하기 위한 예시적인 CAR 폴리펩타이드는 예를 들어, 본 명세서 및 도면에서 또는 본 기술분야에 공지된 바와 같이 찾을 수 있다. 본원에 기재된 CAR 폴리펩타이드는 관심 항원(예를 들어, 상기 표 3에 나열된 것들)에 대해 결합 친화성 및 특이성을 갖는 단일 사슬 항체 단편(scFv)을 포함하는 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 CD3ζ 세포질 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 CAR 폴리펩타이드는 하나 이상의 공동자극성 신호전달 도메인을 추가로 포함할 수 있고, 이 중 하나는 CD28 공동자극성 신호전달 도메인 또는 4-1BB 공동자극성 신호전달 도메인일 수 있다. 상기 CAR 폴리펩타이드는 숙주 세포에서 발현되는 경우, 상기 세포외 항원 결합 도메인이 표적 분자 및 상기 CD3ζ 세포질 신호전달 도메인에 결합하기 위해 세포외에 위치하도록 구성된다. 상기 공동자극성 신호전달 도메인은 활성화 및/또는 이펙터 신호전달을 촉발하기 위해 세포질에 위치할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 CAR 폴리펩타이드는 N-말단에서부터 C-말단쪽으로, 상기 세포외 항원 결합 도메인, 상기 막관통 도메인, 상기 선택적인 하나 이상의 공동자극성 도메인(예를 들어, CD28 공동자극성 도메인, 4-1BB 공동자극성 신호전달 도메인, OX40 공동자극성 신호전달 도메인, CD27 공동자극성 신호전달 도메인, 또는 ICOS 공동자극성 신호전달 도메인) 및 CD3ζ 세포질 신호전달 도메인을 포함할 수 있다.
대안적으로 또는 부가적으로, 본원에 기재된 CAR 폴리펩타이드는 서로 연결되거나 상기 세포질 신호전달 도메인에 의해 분리될 수 있는 2개 이상의 공동자극성 신호전달 도메인을 함유할 수 있다. CAR 폴리펩타이드의 상기 세포외 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 선택적인 공동자극성 신호전달 도메인(들) 및 세포질 신호전달 도메인은 서로 직접적으로 또는 펩타이드 링커를 통해 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 CAR 폴리펩타이드는 N-말단에 신호 서열을 포함할 수 있다.
표 5는 본원에 기재된 예시적인 CAR 폴리펩타이드를 제공한다. 이들 예시적 작제물은 N-말단에서부터 C-말단쪽 순서로, 상기 신호 서열, 상기 항원 결합 도메인(예를 들어, 종양 항원 또는 병원성 항원과 같은 항원을 표적으로 하는 scFv 단편), 상기 힌지 도메인 및 상기 막관통을 갖는 한편, 상기 선택적인 공동자극성 도메인 및 세포질 신호전달 도메인의 위치는 교환될 수 있다.
Figure pct00108
CAR 폴리펩타이드 예의 아미노산 서열은 이하에 제공된다(신호 서열은 이탤릭체임).
서열번호 104:
Figure pct00109
서열번호 105:
Figure pct00110
III. 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및 선택적으로 키메라 수용체 폴리펩타이드를 발현하는 조혈 세포
본원에는 본원에 기재된 하나 이상의 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드를 발현하는 유전자 조작된 숙주 세포(예를 들어, 조혈 세포, 예컨대 HSC 및 면역 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포)가 제공된다. 상기 유전자 조작된 숙주 세포는 또한 본원에 기재된 키메라 수용체 폴리펩타이드(예를 들어, ACTR-발현 세포, 예를 들어, ACTR T 세포, 또는 CAR-발현 세포, 예를 들어, CAR T 세포)를 추가로 발현할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 숙주 세포는 조혈 세포 또는 이의 자손이다. 일부 구현예에서, 상기 조혈 세포는 조혈 줄기 세포일 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 숙주 세포는 T 세포 또는 NK 세포와 같은 면역 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 면역 세포는 T 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 면역 세포는 NK 세포이다. 다른 구현예에서, 상기 면역 세포는 확립된 세포주, 예를 들어, NK-92 세포일 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 유전자 조작된 조혈 세포, 예컨대 HSC 또는 면역 세포(예를 들어, T 세포 또는 NK 세포)는 본원에 개시된 바와 같은 임의의 CAR 작제물을 임의의 크렙스 사이클 조정제, 예컨대 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드(예를 들어, GOT1 또는 GOT2)와 공동발현할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 CAR 작제물은 4-1BB 또는 CD28로부터의 공동자극성 도메인을 포함할 수 있고, 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드는 GOT1 또는 GOT2이다. 상기 CAR 작제물은 CD8 또는 CD28로부터의 힌지 및 막관통 도메인을 추가로 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 유전자 조작된 조혈 세포, 예컨대 HSC 또는 면역 세포(예를 들어, T 세포 또는 NK 세포)는 본원에 개시된 것과 같은 임의의 ACTR 작제물을 임의의 크렙스 사이클 조정제, 예컨대 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드(예를 들어, GOT1 또는 GOT2)와 함께 공동발현할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 ACTR 작제물은 4-1BB 또는 CD28로부터의 공동자극성 도메인을 포함할 수 있고, 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드는 GOT1 또는 GOT2이다. 상기 ACTR 작제물은 CD8 또는 CD28로부터의 힌지 및 막관통 도메인을 추가로 포함할 수 있다.
대안적으로, 본원에 개시된 유전자 조작된 숙주 세포는 임의의 키메라 수용체 폴리펩타이드를 발현할 수는 없다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 하나 이상의 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드를 과하게 발현할 수 있는 상기 유전자 조작된 면역 세포는 종양 침윤 림프구(tumor-infiltrating lymphocyte, TIL)로부터 유래될 수 있다. 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드의 과발현은 종양 미세환경에서 항종양 활성 또는 TIL을 향상시킬 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 상기 유전자 조작된 면역 세포는 유전자 조작된 T 세포 수용체를 추가로 가질 수 있는 T 세포일 수 있다. 상기 TIL 및/또는 유전자 변형된 TCR은 펩타이드-MHC 복합체를 표적화할 수 있으며, 여기서 펩타이드는 병원체, 종양 항원 또는 자가항원으로부터 유래될 수 있다. 일부 예는 하기 표 6에 제공된다.
본원에 개시된 임의의 CAR 작제물 또는 ACTR T 세포와 함께 공동사용될 항체는 또한 상기 펩타이드/MHC 복합체 중의 임의의 펩타이드를 표적화할 수 있다.
Figure pct00111
일부 구현예에서, 상기 숙주 세포는 T 세포 또는 NK 세포와 같은 면역 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 면역 세포는 T 세포이다. 예를 들어, 상기 T 세포는 CD4+ 헬퍼 세포 또는 CD8+ 세포독성 세포, 또는 이들의 조합일 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 상기 T 세포는 Treg 세포와 같은 억제 T 세포일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 면역 세포는 NK 세포이다. 다른 구현예에서, 상기 면역 세포는 확립된 세포주, 예를 들어 NK-92 세포일 수 있다. 일부 예에서, 상기 면역 세포는 본 기술분야에 공지된 바와 같이 상이한 유형의 T 세포 및/또는 NK 세포의 혼합물일 수 있다. 예를 들어, 상기 면역 세포는 적합한 공여체(예를 들어, 인간 환자)로부터 분리된 면역 세포 집단일 수 있다. 하기 개시내용을 참조한다.
일부 경우에, 숙주 세포로 도입될 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드는 숙주 세포의 내인성 단백질과 동일하다. 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드의 암호 서열의 추가 카피를 숙주 세포 내로 도입하는 것은 천연 대응물에 비해 상기 폴리펩타이드의 발현 수준을 향상(즉, 과발현)시킬 것이다. 일부 경우에, 상기 숙주 세포 내로 도입될 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드는 숙주 세포에 대해 이종성이며, 즉 상기 숙주 세포에는 존재하지 않거나 발현되지 않는다. 이러한 이종 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드는 숙주 세포에서 조금도 발현되지 않는 자연 발생의 단백질일 수 있다(예를 들어, 상이한 종 유래인 것). 대안적으로, 상기 이종 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드는 본원에 기재된 것과 같이 천연 단백질의 변이체일 수 있다. 일부 예에서, 상기 암호 핵산의 외인성(즉, 상기 숙주 세포 태생이 아닌) 카피는 염색체외에 존재할 수 있다. 다른 예에서, 상기 암호 서열의 외인성 카피는 상기 숙주 세포의 염색체에 통합될 수 있고, 내인성 유전자의 천연 유전자좌와 다른 부위에 위치할 수 있다.
상기 유전자 조작된 숙주 세포는 해당작용의 속도를 향상시키는 능력을 가지며, 예를 들어 환경으로부터 글루코스를 취하는 향상된 능력을 가질 수 있다. 따라서, 이러한 유전자 조작된 숙주 세포는 낮은 글루코스, 낮은 아미노산, 낮은 pH 및/또는 저산소 상태, 예를 들어 종양 미세환경에서 우수한 성장 및/또는 생물활성을 나타낼 수 있다. 상기 유전자 조작된 세포는 본원에 개시된 키메라 수용체 폴리펩타이드를 발현할 때, 표적 세포를 직접(예를 들어, CAR-발현성 면역 세포에 의해) 또는 항-종양 항체와 같은 Fc 함유 치료제를 통해(예를 들어, ACTR-발현성 면역 세포에 의해) 인식하고 억제할 수 있다. 낮은 글루코스, 낮은 아미노산, 낮은 pH 및/또는 저산소 환경(예를 들어, 종양 미세환경)에서 그들의 예상되는 높은 증식 속도, 생물활성 및/또는 생존율을 감안하면, T 세포 및 NK 세포와 같은 상기 유전자 조작된 세포는 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드의 더 낮은 수준 또는 덜 활성인 형태를 발현하거나 발현하지 않는 키메라 수용체 폴리펩타이드 T 세포에 비해 더 높은 치료 효능을 가질 것으로 예상될 것이다.
면역 세포 집단은, 예컨대 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 골수, 또는 비장, 림프절, 흉선, 줄기 세포 또는 종양 조직과 같은 조직과 같이, 모든 출처에서 수득될 수 있다. 대안적으로, 상기 면역 세포 집단은 줄기 세포, 예를 들어 조혈 줄기 세포 및 유도 만능 줄기 세포(iPSC)로부터 유래될 수 있다. 원하는 숙주 세포 유형을 수득하기에 적합한 출처는 본 기술분야의 기술자에게 명백할 것이다. 일부 구현예에서, 면역 세포의 집단은 본원에 기재된 치료를 필요로 하는 환자(예를 들어, 인간 환자)로부터 수득할 수 있는 PBMC에서 유래된다. 바람직한 숙주 세포의 유형(예를 들어, T 세포, NK 세포, 또는 T 세포 및 NK 세포)은 세포를 자극성 분자와 함께 공동배양함으로써 수득되는 세포 집단 내에서 확대될 수 있다. 비제한적인 예로서, 항-CD3 및 항-CD28 항체는 T 세포의 확대에 사용될 수 있다.
임의의 상기크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및 선택적으로 본원에 기재된 키메라 수용체 폴리펩타이드를 발현하는 면역 세포를 작제하기 위해, 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및/또는 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드의 안정적 또는 일시적 발현을 위한 발현 벡터는 본원에 기재된 바와 같은 통상적인 방법을 통해 생성할 수 있고, 면역 숙주 세포 내로 도입시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및/또는 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 적합한 프로모터에 작동가능한 연결로, 바이러스 벡터 또는 비-바이러스 벡터와 같은 하나 또는 두 개의 적합한 발현 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 일부 경우에, 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드 및 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드에 대한 각각의 암호 서열은 2개의 개별 핵산 분자 상에 있고 2개의 개별 벡터에 클로닝될 수 있으며, 이는 동시에 또는 순차적으로 적합한 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 대안적으로, 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드 및 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드에 대한 암호 서열은 하나의 핵산 분자 상에 있고 하나의 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드 및 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드의 암호 서열은 2개의 폴리펩타이드의 발현이 상이한 프로모터에 의해 제어되도록 2개의 별개의 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 대안적으로, 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드 및 상기 글루코스 이입 폴리펩타이드의 암호 서열은 두 폴리펩타이드의 발현이 단일 프로모터에 의해 제어되도록 하나의 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 2개의 개별 폴리펩타이드가 단일 mRNA 분자로부터 해독될 수 있도록 2개의 폴리펩타이드의 암호 서열 사이에는 적절한 서열이 삽입될 수 있다. 이러한 서열, 예를 들어 IRES 또는 리보솜 스키핑 부위는 본 기술분야에 잘 알려져 있다. 부가 설명은 이하에 제공된다.
상기 핵산 및 벡터(들)는 적합한 조건 하에서 제한 효소와 접촉하여, 각 분자에 상보적 말단을 생성하여 서로 쌍을 이루고 리가제에 의해 결합될 수 있다. 대안적으로, 합성 핵산 링커는 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및/또는 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 말단에 결찰될 수 있다. 상기 합성 링커는 상기 벡터 내의 특정 제한 부위에 상응하는 핵산 서열을 함유할 수 있다. 발현 벡터/플라스미드/바이러스 벡터의 선택은 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및/또는 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드의 발현을 위한 숙주 세포의 유형에 따라 달라질 수 있지만 진핵 세포에서 통합 및 복제에 적합해야 한다.
본원에 기재된 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및/또는 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드의 발현에는 사이토메갈로바이러스(CMV) 중간 초기 프로모터, 라우스 육종(Rous sarcoma) 바이러스 LTR, HIV-LTR, HTLV-1 LTR과 같은 바이러스 LTR, 유인원 바이러스 40(SV40) 초기 프로모터, 인간 EF1-알파 프로모터 또는 단순 헤르페스 tk 바이러스 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지 않는 다양한 프로모터가 사용될 수 있다. 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및/또는 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드의 발현을 위한 추가 프로모터는 면역 세포 중의 임의의 구성적 활성 프로모터를 포함한다. 대안적으로, 면역 세포 내에서 발현이 조절될 수 있도록 임의의 조절가능한 프로모터가 사용될 수 있다.
부가적으로, 상기 벡터는, 예를 들어, 다음 중 일부 또는 전부를 함유할 수 있다: 적합한 마커 유전자, 예컨대 숙주 세포에서 안정적 또는 일시적 형질감염체의 선택을 위한 네오마이신 유전자 또는 카나마이신 유전자; 높은 수준의 전사를 위한 인간 CMV의 즉시 초기 유전자로부터의 인핸서/프로모터 서열; 인간 EF1-알파 유전자으로부터의 인트론 서열, mRNA 안정성을 위한 SV40의 전사 종결 및 RNA 프로세싱 신호; SV40 폴리오마바이러스 복제 기원 및 적절한 에피솜 복제를 위한 ColE1; 내부 리보솜 결합 부위(IRESes), 다목적 다중 클로닝 부위; 센스 및 안티센스 RNA의 시험관내 전사를 위한 T7 및 SP6 RNA 프로모터; 촉발될 때 벡터를 운반하는 세포를 죽게하는 "자살 스위치" 또는 "자살 유전자"(예컨대, HSV 티미딘 키나제 또는 iCasp9와 같은 유도성 카스파제), 및 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및/또는 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드의 발현을 평가하기 위한 리포터 유전자.
일 특정 구현예에서, 상기 벡터는 또한 자살 유전자를 포함한다. 본원에 사용된, 용어 "자살 유전자"는 상기 자살 유전자를 발현하는 세포를 죽게 하는 유전자를 지칭한다. 상기 자살 유전자는 이 유전자가 발현되는 세포 상에 제제, 예컨대 약물에 대한 민감성을 부여하고, 상기 세포가 상기 제제와 접촉하거나 상기 제제에 노출될 때 상기 세포를 죽게 하는 유전자일 수 있다. 자살 유전자는 본 기술분야에 알려져 있고(예를 들어, Suicide Gene Therapy: Methods and Reviews, Springer, Caroline J.(Cancer Research UK Centre for Cancer Therapeutics at the Institute of Cancer Research, Sutton, Surrey, UK), Humana Press, 2004를 참고한다), 예를 들어 헤르페스 단순 바이러스(HSV) 티미딘 키나제(TK) 유전자, 사이토신 데아미나제, 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제, 니트로리덕타제 및 카스파제 8과 같은 카스파제를 포함한다.
전이유전자(transgene)를 함유하는 벡터를 생산하기에 적합한 벡터 및 방법은 본 기술분야에 잘 알려져 있고 이용가능하다. 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및/또는 키메라 수용체 폴리펩타이드의 발현을 위한 벡터의 제조 예는, 예를 들어, US2014/0106449에서 찾을 수 있으며, 이의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본원에 기재된 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및/또는 키메라 수용체 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 임의의 벡터는 또한 본 개시내용의 범위 내에 있다. 이러한 벡터 또는 여기에 함유된 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및/또는 키메라 수용체 폴리펩타이드를 암호화하는 서열은 임의의 적절한 방법에 의해 숙주 면역 세포와 같은 숙주 세포로 전달될 수 있다. 벡터를 면역 세포로 전달하는 방법은 본 기술분야에 잘 알려져 있으며 DNA 전기천공, RNA 전기천공, 리포솜과 같은 시약을 사용한 형질감염 또는 바이러스 형질도입(예를 들어, 렌티바이러스 형질도입과 같은 레트로바이러스 형질도입)을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및/또는 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드의 발현을 위한 벡터는 바이러스 형질도입(예를 들어, 렌티바이러스 또는 감마-레트로바이러스 형질도입과 같은 레트로바이러스 형질도입)에 의해 숙주 세포로 전달된다. 전달을 위한 예시적인 바이러스 방법은 재조합 레트로바이러스(예를 들어, PCT 공개 번호 WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; WO 93/11230; WO 93/10218; 및 WO 91/02805; 미국 특허 번호 5,219,740 및 4,777,127; GB 특허 번호 2,200,651; 및 EP 특허 번호 0 345 242 참조), 알파바이러스 기반 벡터, 및 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터(예를 들어, PCT 공개 번호 WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984; 및 WO 95/00655 참조)를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및/또는 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드의 발현을 위한 벡터는 레트로바이러스이다. 일부 구현예에서, 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및/또는 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드의 발현을 위한 벡터는 렌티바이러스이다.
레트로바이러스 형질도입을 설명하는 참고문헌의 예는 Anderson 등, 미국 특허 번호 5,399,346; Mann 등, Cell 33: 153(1983); Temin 등, 미국 특허 번호 4,650,764; Temin 등, 미국 특허 번호 4,980,289; Markowitz 등, J. Virol. 62: 1120(1988); Temin 등, 미국 특허 번호 5,124,263; Dougherty 등에 의해 1995년 3월 16일에 공개된 국제 특허 공개 번호 WO 95/07358; 및 Kuo 등, Blood 82: 845(1993)을 포함한다. 국제 특허 공개 번호 WO 95/07358은 원발성 B 림프구의 고효율 형질도입을 기술하고 있다. 또한, 본원에서 언급된 목적 및 주제에 대하여 본원에 참조로 포함되는 WO 2016/040441 A1을 참조한다.
크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및/또는 키메라 수용체 폴리펩타이드를 암호화하는 벡터가 바이러스 벡터를 사용하여 숙주 세포로 도입되는 예에서, 상기 면역 세포를 감염시킬 수 있고 상기 벡터를 운반하는 바이러스 입자가 본 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 생성될 수 있고, 예를 들어 PCT 출원 번호 WO 1991/002805 A2, WO 1998/009271 A1 및 미국 특허 6,194,191에서 찾을 수 있다. 상기 바이러스 입자는 상기 세포 배양 상청액으로부터 수확되고 상기 바이러스 입자를 상기 면역 세포와 접촉시키기 전에 분리 및/또는 정제될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 임의의 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및/또는 키메라 수용체 폴리펩타이드를 암호화하는 RNA 분자는 통상적인 방법(예를 들어, 시험관내 전사)에 의해 제조된 다음, 적합한 숙주 세포, 예를 들어 본원에 기재된 세포로 공지된 방법, 예를 들어 Rabinovich 등, Human Gene Therapy 17: 1027-1035에 기재된 방법을 통해 도입될 수 있다.
일부 경우에, 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 적합한 키메라 수용체 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 개별 발현 벡터로 클로닝될 수 있으며, 이는 동시에 또는 순차적으로 적합한 숙주 세포로 도입될 수 있다. 예를 들어, 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드를 발현하기 위한 발현 벡터(또는 RNA 분자)가 먼저 숙주 세포에 도입될 수 있고, 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드를 발현하는 형질감염된 숙주 세포가 단리되어 시험관내에서 배양될 수 있다. 적합한 키메라 수용체 폴리펩타이드를 발현하기 위한 발현 벡터(또는 RNA 분자)는 그 다음, 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드를 발현하는 숙주 세포에 도입될 수 있고 두 폴리펩타이드를 모두 발현하는 형질감염된 세포가 단리될 수 있다. 다른 예로서, 상기 글루코스 이입 폴리펩타이드 및 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드를 발현하기 위한 각 발현 벡터(또는 RNA 분자)는 숙주 세포에 동시에 도입될 수 있고, 두 폴리펩타이드를 모두 발현하는 형질감염된 숙주 세포는 일상적인 방법을 통해 단리될 수 있다.
다른 경우에, 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 동일한 발현 벡터에 클로닝될 수 있다. 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드 및 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드의 발현을위한 폴리뉴클레오타이드(이러한 폴리뉴클레오타이드가 적어도 하나의 조절 인자에 작동가능하게 연결된 벡터를 포함함)는 또한 본 개시내용의 범위 내에 있다. 본 개시내용의 유용한 벡터의 비제한적인 예는 바이러스 벡터, 예를 들어 감마 레트로바이러스 벡터, 및 렌티바이러스 벡터, 및 아데노-관련 바이러스 벡터(AAV 벡터) 및 렌티바이러스 벡터를 포함하는 레트로바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다.
일부 경우에, 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및/또는 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산(들)은 트랜스포존(transposon)을 통해 숙주 세포 내로 전달될 수 있다. 일부 경우에, 상기 암호화 핵산(들)은 유전자 편집을 통해, 예를 들어 CRISPR, TALEN, 아연-핑거 뉴클레아제(ZFN), 또는 메가뉴클레아제에 의해 숙주 세포 내로 전달될 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기재된 핵산은 본원에 기재된 바와 같은 키메라 수용체 폴리펩타이드를 암호화하는 서열 및 크렙스 사이클을 조정할 수 있는 폴리펩타이드(즉, 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 폴리펩타이드)를 암호화하는 서열인 2개의 암호 서열을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 2개의 암호 서열을 포함하는 핵산은 2 개의 암호 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드가 독립된(및 물리적으로 분리된) 폴리펩타이드로서 발현될 수 있도록 구성될 수 있다. 이러한 목표를 달성하기 위해, 본원에 기재된 핵산은 제1 및 제2 암호 서열 사이에 위치한 제3 뉴클레오타이드 서열을 함유할 수 있다. 이 제3 뉴클레오타이드 서열은 예를 들어 리보솜 스키핑 부위를 암호화할 수 있다. 리보솜 스키핑 부위는 정상적인 펩타이드 결합 형성을 손상시키는 서열이다. 이 메커니즘은 하나의 메신저 RNA로부터 부가적인 오픈 리딩 프레임의 해독을 초래한다. 이 제3 뉴클레오타이드 서열은 예를 들어 P2A, T2A 또는 F2A 펩타이드를 암호화할 수 있다(예를 들어, Kim 등, PLoS One. 2011; 6(4):e18556 참조). 비제한적인 예로서, 예시적인 P2A 펩타이드는 ATNFSLLKQAGDVEENPGP(서열번호 106)의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
다른 구현예에서, 제3 뉴클레오타이드 서열은 내부 리보솜 진입 부위(internal ribosome entry site, IRES)를 암호화할 수 있다. IRES는 말단-독립적 방식으로 해독 개시를 허용하고, 또한 하나의 메신저 RNA로부터 부가적인 오픈 리딩 프레임의 해독을 허용하는 RNA 요소이다. 대안적으로, 상기 제3 뉴클레오타이드 서열은 상기 제2 폴리펩타이드의 발현을 제어하는 제2 프로모터를 암호화할 수 있다. 상기 제3 뉴클레오타이드 서열은 또한 하나보다 많은 리보솜 스키핑 서열, IRES 서열, 부가적인 프로모터 서열, 또는 이들의 조합을 암호화할 수 있다.
상기 핵산은 또한 부가적인 암호 서열(제4 및 제5 암호 서열을 포함하지만, 이에 제한되지 않음)을 추가로 포함할 수 있고, 상기 부가적인 암호 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드가 또 다른 독립적이고 물리적으로 별개의 폴리펩타이드로서 발현되도록 구성될 수 있다. 이를 위해, 상기 부가적인 암호 서열은 하나 이상의 리보솜 스키핑 서열, IRES 서열, 또는 부가적인 프로모터 서열을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열에 의해 다른 암호 서열로부터 분리될 수 있다.
일부 예에서, 상기 핵산(예를 들어, 본원에 기재된 발현 벡터 또는 RNA 분자)은 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드(예를 들어, 본원에 기재된 것들) 및 적합한 키메라 수용체 폴리펩타이드 둘 모두에 대한 암호 서열을 포함할 수 있고, 상기 두 암호 서열은 임의의 순서로, P2A 펩타이드(예를 들어, ATNFSLLKQAGDVEENPGP; 서열번호 106)를 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열에 의해 분리된다. 그 결과, 두 개의 분리된 폴리펩타이드인 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및 상기 키메라 수용체는 상기 핵산으로부터 생산될 수 있으며, 여기서 P2A 부분 ATNFSLLKQAGDVEENPG(서열번호 107)는 상류 폴리펩타이드(상류 암호 서열에 의해 암호화됨)에 연결되고, 상기 P2A 펩타이드로부터의 잔기 P는 하류 폴리펩타이드(하류 암호 서열에 의해 암호화됨)에 연결된다. 일부 예에서, 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드는 상류 폴리펩타이드이고 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드는 하류 폴리펩타이드이다. 다른 예에서, 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드는 상류 폴리펩타이드이고 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드는 하류 폴리펩타이드이다.
일부 예에서, 상기 핵산(예를 들어, 본원에 기재된 발현 벡터 또는 RNA 분자)은 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드(예를 들어, 본원에 기재된 것) 및 적합한 ACTR 폴리펩타이드 모두에 대한 암호 서열을 포함할 수 있고, 상기 두 암호 서열은 임의의 순서로, P2A 펩타이드(예를 들어, ATNFSLLKQAGDVEENPGP; 서열번호 106)를 암호화하는 제3 뉴클레오타이드 서열에 의해 분리된다. 그 결과, 두 개의 분리된 폴리펩타이드인, 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및 상기 ACTR은 상기 핵산으로부터 생산될 수 있으며, 여기서 상기 P2A 부분 ATNFSLLKQAGDVEENPG(서열번호 107)는 상류 폴리펩타이드(상류 암호 서열에 의해 암호화됨)에 연결되고, 상기 P2A 펩타이드로부터의 잔기 P는 하류 폴리펩타이드(하류 암호 서열에 의해 암호화됨)에 연결된다. 일부 예에서, 상기 ACTR 폴리펩타이드는 상류 폴리펩타이드이고, 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드는 하류 폴리펩타이드이다. 다른 예에서, 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드는 상류 폴리펩타이드이고 상기 ACTR 폴리펩타이드는 하류 폴리펩타이드이다.
일부 예에서, 상기 기재된 핵산은 상기 암호화된 서열의 두 분절, 예를 들어, 상기 상류 폴리펩타이드 및 상기 P2A 펩타이드 사이에 링커(예를 들어, GSG 링커)를 추가로 암호화할 수 있다.
구체적인 예에서, 본원에 기재된 핵산은 상기 핵산이 형질감염된 숙주 세포에서 2개의 개별 폴리펩타이드를 발현하도록 구성된다: (i) N-말단에서부터 C-말단쪽으로, 적합한 CAR(예를 들어, 서열번호 104 또는 서열번호 105), 펩타이드 링커(예를 들어, GSG 링커) 및 상기 P2A 펩타이드에서 유래되는 ATNFSLLKQAGDVEENPG(서열번호 107) 분절을 함유하는 제1 폴리펩타이드; 및 (ii) N-말단에서부터 C-말단쪽으로, 상기 P2A 펩타이드에서 유래되는 P 잔기 및 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드(예를 들어, 서열번호 81-92 중 임의의 것)를 함유하는 제2 폴리펩타이드.
구체적인 예에서, 본원에 기재된 상기 핵산은 상기 핵산이 형질감염된 숙주 세포에서 2개의 개별 폴리펩타이드를 발현하도록 구성된다: (i) N-말단에서부터 C-말단쪽으로, 적합한 ACTR(예를 들어, 본원에 기재된 서열번호 1 내지 80 중 임의의 것, 예를 들어 서열번호 1 또는 서열번호 57), 펩타이드 링커(예컨대, GSG 링커), 및 상기 P2A 펩타이드에서 유래되는 ATNFSLLKQAGDVEENPG(서열번호 107) 분절을 함유하는 제1 폴리펩타이드; 및 (ii) N-말단에서부터 C-말단쪽으로, 상기 P2A 펩타이드에서 유래되는 P 잔기 및 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드(예를 들어, 서열번호 81-92 중 임의의 것)를 함유하는 제2 폴리펩타이드.
일부 경우, 관심 있는 부가적인 폴리펩타이드가 상기 숙주 면역 세포에 도입 될 수도 있다.
본원에 제공된 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및/또는 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드 중 임의의 것을 암호화하는 벡터 또는 상기 키메라 수용체 및/또는 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드(예를 들어, RNA 분자)를 암호화하는 핵산을 숙주 세포에 도입한 후, 상기 세포는 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및/또는 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양될 수 있다. 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및/또는 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산이 조절가능한 프로모터에 의해 조절되는 예에서, 상기 숙주 세포는 상기 조절가능한 프로모터가 활성화되는 조건에서 배양될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 프로모터는 유도성 프로모터이고 상기 면역 세포는 유도 분자의 존재 하에 또는 상기 유도 분자가 생성되는 조건에서 배양된다. 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및/또는 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드가 발현되는지 여부를 결정하는 것은 본 기술분야의 기술자에게 명백할 것이며, 임의의 공지된 방법, 예를 들어, 정량적 역전사효소 PCR(qRT-PCR)에 의한 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및/또는 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드-암호화 mRNA의 검출, 또는 웨스턴 블롯팅, 형광 현미경법 및 유세포 분석을 포함하는 방법에 의한 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및/또는 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드 단백질의 검출에 의해 평가될 수 있다.
대안적으로, 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드의 발현은 상기 면역 세포가 대상체에게 투여된 후 생체내에서 일어날 수 있다. 본원에 사용된 용어 "대상체"는 인간, 원숭이, 마우스, 토끼 또는 가축용 포유류와 같은 임의의 포유류를 지칭한다. 예를 들어, 상기 대상체는 영장류일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 대상체는 인간이다.
대안적으로, 본원에 개시된 임의의 면역 세포에서 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및/또는 키메라 수용체 폴리펩타이드의 발현은 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및/또는 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드를 암호화하는 RNA 분자를 도입시킴으로써 달성될 수 있다. 이러한 RNA 분자는 시험관내 전사 또는 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다. 상기 RNA 분자는 그 다음 면역 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포 또는 T 세포 및 NK 세포 둘 다)와 같은 적합한 숙주 세포에, 예를 들어 전기천공에 의해 도입될 수 있다. 예를 들어, RNA 분자는 Rabinovich 등, Human Gene Therapy, 17: 1027-1035 및 WO2013/040557에 기재된 방법에 따라 합성되고 숙주 면역 세포 내로 도입될 수 있다.
특정 구현예에서, 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및/또는 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드를 포함하는 벡터(들) 또는 RNA 분자(들)는 생체내에서 상기 숙주 세포 또는 면역 세포로 도입될 수 있다. 비제한적인 예로서, 이것은 본원에 기재된 하나 이상의 키메라 수용체 폴리펩타이드 및/또는 하나 이상의 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드를 암호화하는 벡터 또는 RNA 분자를 상기 대상체에게 직접 투여하여(예를 들어, 정맥내 투여를 통해), 생체내에서 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및/또는 키메라 수용체 폴리펩타이드를 포함하는 숙주 세포를 생성함으로써 달성될 수 있다.
본원에 기재된 임의의 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및/또는 키메라 수용체 폴리펩타이드를 발현하는 숙주 세포를 제조하는 방법은 또한 생체외에서 상기 숙주 세포를 활성화하는 것을 포함할 수 있다. 숙주 세포를 활성화하는 것은 상기 세포가 이펙터 기능을 수행할 수 있는 활성화 상태로 숙주 세포를 자극하는 것을 의미한다. 숙주 세포를 활성화하는 방법은 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및/또는 키메라 수용체 폴리펩타이드의 발현에 사용되는 숙주 세포의 유형에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, T 세포는 항-CD3 항체, 항-CD28 항체, IL-2, 식물성적혈구응집소, 조작된 인공 자극 세포 또는 입자, 또는 이의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는 하나 이상의 분자의 존재 하에 생체외에서 활성화될 수 있다. 상기 조작된 인공 자극 세포는 본 기술분야에 공지된 인공 항원 제시 세포일 수 있다. 예를 들어, Neal 등, J. Immunol. Res. Ther. 2017, 2(1): 68-79 및 Turtle 등, Cancer J. 2010, 16(4): 374-381을 참조하고, 각각의 관련 개시내용은 본원에 언급된 목적 및 주제를 위해 본 명세서에 참고로 포함된다.
다른 예에서, NK 세포는 4-1BB 리간드, 항-4-1BB 항체, IL-15, 항-IL-15 수용체 항체, IL-2, IL12, IL-21, K562 세포, 및/또는 조작된 인공 자극 세포 또는 입자와 같은 하나 이상의 분자의 존재 하에 생체외에서 활성화될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및/또는 키메라 수용체 폴리펩타이드를 발현하는 숙주 세포(ACTR-/CAR- 및/또는 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드-발현 세포)는 대상체에게 투여하기 전에 생체외에서 활성화된다. 숙주 세포가 활성화되는지 여부를 결정하는 것은 본 기술분야의 기술자에게 명백한 것일 것이며 세포 활성화와 관련된 하나 이상의 세포 표면 마커의 발현, 사이토카인의 발현 또는 분비, 및 세포 형태학을 평가하는 것을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 임의의 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및/또는 키메라 수용체 폴리펩타이드를 발현하는 숙주 세포를 제조하는 방법은 상기 숙주 세포를 생체외에서 확대시키는 것을 포함할 수 있다. 숙주 세포 확대는 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및/또는 키메라 수용체 폴리펩타이드를 발현하는 세포 수의 증가를 초래하여, 예를 들어 상기 숙주 세포가 증식하도록 하거나, 또는 상기 숙주 세포가 증식하도록 자극하는 임의의 방법을 수반할 수 있다. 숙주 세포의 확대를 자극하는 방법은 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및/또는 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드의 발현에 사용되는 숙주 세포의 유형에 따라 달라질 것이며 본 기술분야의 기술자에게 명백할 것이다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및/또는 키메라 수용체 폴리펩타이드를 발현하는 숙주 세포는 대상체에게 투여하기 전에 생체외에서 확대된다.
일부 구현예에서, 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및/또는 키메라 수용체 폴리펩타이드를 발현하는 숙주 세포는 상기 세포를 대상체에게 투여하기 전에 생체외에서 확대되고 활성화된다. 숙주 세포 활성화 및 확대는 바이러스 벡터를 게놈 내로 통합시키고 본원에 기재된 바와 같은 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및/또는 키메라 수용체 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자를 발현시키는데 사용될 수 있다. mRNA 전기천공이 사용되는 경우, 상기 전기천공이 활성화된 세포에서 수행될 때 더욱 효과적일 수 있을 지라도, 활성화 및/또는 확대가 필요하지 않을 수 있다. 일부 경우에, 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및/또는 키메라 수용체 폴리펩타이드는 적합한 숙주 세포에서 일시적으로 발현된다(예를 들어, 3-5일 동안). 일시적인 발현은 잠재적인 독성이 있는 경우 유리할 수 있으며, 가능한 부작용에 대한 임상 시험의 초기 단계에 도움이 될 것이다.
상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및/또는 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드를 발현하는 임의의 숙주 세포는 약제학적 허용성 담체와 혼합되어 약제학적 조성물을 형성 할 수 있으며, 이 또한 본 개시내용의 범위 내에 있다.
본 개시내용의 조성물과 관련하여 사용되는, "약제학적 허용성"이라는 어구는 생리학적으로 견딜수 있고 전형적으로 포유류(예를 들어, 인간)에게 투여했을 때 바람직하지 않은 반응을 일으키지 않는 상기 조성물의 분자적 실체 및 기타 성분을 지칭한다. 바람직하게는, 본원에 사용되는 용어 "약제학적 허용성"은 연방 또는 주정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 미국 약전 또는 기타 일반적으로 인정되는 약전에 포유류, 보다 특히 인간에 사용하기 위한 것으로 나열된 것을 의미한다. "허용성"은 상기 담체가 상기 조성물의 활성 성분(예를 들어, 핵산, 벡터, 세포 또는 치료 항체)에 적합하고, 조성물(들)이 투여되는 대상체에게 부정적인 영향을 미치지 않음을 의미한다. 본 방법에서 사용되는 임의의 약제학적 조성물은 동결건조된 형성물 또는 수용액 형태의 약제학적 허용성 담체, 부형제 또는 안정제를 포함할 수 있다.
완충액을 포함하는 약제학적 허용성 담체는 본 기술분야에 잘 알려져 있으며, 인산염, 구연산염 및 기타 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 산화방지제; 보존제; 저분자량 폴리펩타이드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 아미노산; 소수성 중합체; 단당류; 이당류; 및 기타 탄수화물; 금속 착물; 및/또는 비이온성 계면활성제를 포함할 수 있다. 예를 들어, Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed.(2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover을 참조한다.
본 개시내용의 약제학적 조성물은 또한 치료되는 특정 적응증을 위해 필요한 경우, 하나 이상의 부가적인 활성 화합물, 바람직하게는 서로 불리하게 영향을 미치지 않는 보완적 활성을 갖는 화합물을 함유할 수 있다. 가능한 부가적인 활성 화합물의 비제한적인 예는, 예를 들어, IL-2 뿐만 아니라 본 기술분야에 공지되고 하기 조합 치료의 논의에 나열된 다양한 제제를 포함한다.
IV. 본원에 기재된 유전자 조작된 조혈 세포를 사용한 면역요법
본원에 개시된 유전자 조작된 조혈 세포(예를 들어, 조혈 줄기 세포, 면역 세포, 예컨대 NK 세포 또는 T 세포)는 다양한 장애, 예를 들어 암, 감염성 질환, 및 자가면역 질환에 대한 면역요법에 사용될 수 있다.
(a) ACTR 폴리펩타이드 및 Fc-함유 치료제를 발현하는 유전자 조작된 조혈 세포의 조합된 면역요법
본 개시내용의 예시적인 ACTR 폴리펩타이드는 T 림프구에 대한 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC) 능력을 부여하고 NK 세포에서 ADCC를 향상시킨다. 상기 수용체가 세포에 결합된 항체에 의해 체결될 때, 이것은 T 세포 활성화, 지속적인 증식 및 상기 결합된 세포에 대한 특정 세포독성을 촉발한다.
Ig의 Fc 부분에 대한 CD16의 친화성 정도는 ADCC의 중요한 결정인자이며 따라서 항체 면역요법에 대한 임상 반응에 중요하다. F158 다형성을 갖는 CD16에 대비하여, Ig에 대해 더 높은 결합 친화성을 갖고 우수한 ADCC를 매개하는 V158 다형성을 갖는 CD16을 일 예로서 선택하였다. 상기 F158 수용체는 T 세포 증식 및 ADCC의 유도에 있어서 상기 V158 수용체보다 낮은 효력을 갖지만, 상기 F158 수용체는 상기 V158 수용체보다 생체내 독성이 낮아서 일부 임상 상황에서 유용할 수 있다.
면역 세포에서 ACTR 폴리펩타이드와 함께 공동발현되는 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드를 조정하는 크렙스 사이클은 낮은 글루코스, 낮은 아미노산, 낮은 pH, 및/또는 혈중산소감소 환경에서 세포가 효과적으로 성장 및/또는 기능하도록 함으로써 T 세포 요법 또는 NK 세포 요법과 같은 세포 기반 면역요법을 촉진할 것이다. 항체 유도 세포독성은 항체 투여를 간단히 철회하여 필요할 때마다 중단될 수 있다. 임의의 잠재적인 자가면역 반응성을 제한하기 위해, 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및/또는 ACTR 폴리펩타이드를 일시적으로 발현시키는 mRNA 전기천공을 사용함으로써 임상 안전성을 더욱 향상시킬 수 있다.
따라서, 일 구현예에서, 본 개시내용은 암의 항체-기반 면역요법의 효능을 이를 필요로 하는 대상체에서 향상시키는 방법을 제공하며, 이때 대상체는 항원 발현 세포에 결합할 수 있는 치료 항체와 같은 Fc-함유 치료제에 의해 치료 중인 것이다. 상기 Fc-함유 치료제는 상기 조작된 면역 세포에서 발현되는 상기 ACTR의 Fc 결합 부분(예컨대, 인간 CD16A의 세포외 도메인)에 의해 인식 및 결합될 수 있는, 인간 또는 인간화된 Fc 부분과 같은 Fc 부분을 함유한다.
본원에 기재된 방법은 본 개시내용의 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및 ACTR 폴리펩타이드를 조정하는 크렙스 사이클을 공동발현하는 조혈세포, 예컨대 면역 세포(예컨대, T 림프구 또는 NK 세포)와 같은 유전자 조작된 숙주 세포의 치료적 유효량 및 항체의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 도입하는 것을 포함할 수 있다. 상기 대상체(예를 들어, 인간 암 환자와 같은 인간 환자)는 표적 항원에 특이적인 Fc-함유 치료제에 의해 치료를 받았거나 치료 중인 것이다. 표적 항원은 종양 항원, 병원성 항원(예를 들어, 박테리아 또는 바이러스), 또는 본원에 기재된 것과 같은 질병 세포에 존재하는 항원을 포함하나, 이에 제한되지 않는 질환 또는 상태와 관련이 있는 임의의 분자일 수 있다.
본원에 언급된 임의의 질병 상태에 관한 한, 본 개시내용의 상황에서, 용어 "치료하다", "치료" 및 이의 유사어는 상기 상태와 관련된 적어도 하나의 증상을 경감 또는 완화시키거나, 또는 상기 상태의 진행을 늦추거나 또는 반전시키는 것을 의미한다. 본 개시내용의 의미 내에서, 용어 "치료하다"는 또한 개시(즉, 질병의 임상 발현 전의 기간)를 저지, 지연시키고, 및/또는 질병의 발달 또는 악화 위험을 감소시키는 것을 의미한다. 예를 들어, 암과 관련하여 용어 "치료하다"는 환자의 종양 부담(burden)을 제거 또는 감소시키거나, 또는 전이를 예방, 지연 또는 억제하는 것 등을 의미할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용량 또는 양에 적용되는 용어 "치료적 유효"는 필요로 하는 대상체에게 투여 시 원하는 활성을 초래하기에 충분한 화합물 또는 약제학적 조성물의 양을 지칭한다. 특히, 활성 성분의 조합이 투여되는 경우(예를 들어, 항체를 포함하는 제1 약제학적 조성물, 및 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및/또는 항체 커플링된 T-세포 수용체(ACTR) 작제물을 발현하는 T 림프구 또는 NK 세포의 집단을 포함하는 제2 약제학적 조성물), 상기 조합의 유효량은 개별적으로 투여하면 효과적이었을 각 성분의 양을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 본 개시내용의 상황에서, 용어 "치료적 유효"는 본 개시내용의 방법에 의해 치료되는 장애의 적어도 하나의 증상을 경감 또는 완화시키거나, 발현을 지연시키거나, 진행을 저지하기에 충분한 화합물 또는 약제학적 조성물의 양을 지칭한다.
본원에 기재된 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및 ACTR 폴리펩타이드를 발현하는 숙주 세포(예를 들어, 조혈 세포, 예를 들어 T 세포 및 NK 세포와 같은 면역 세포)는 대상체에서 ADCC를 향상시키는데, 및/또는 항체 기반 면역요법의 효능을 향상시키는데, 및/또는 낮은 글루코스 환경에서 면역 세포의 성장 및/또는 증식을 향상시키는데 유용하다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 인간, 원숭이, 마우스, 토끼 또는 가축 포유류와 같은 포유류이다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 인간이다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 인간 암 환자이다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 본원에 기재된 임의의 치료 항체에 의해 치료를 받았거나 치료 중이다.
본원에 기재된 방법을 실행하기 위해, 유효량의 숙주 세포, 예를 들어, 본원에 기재된 임의의 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및 상기 ACTR 폴리펩타이드를 발현하는 면역 세포(예를 들어, NK 세포 및/또는 T 림프구) 및 유효량의 항체, 또는 이의 조성물은 치료를 필요로 하는 대상체에게 정맥내 투여와 같은 적절한 경로를 통해 투여될 수 있다. 본원에 사용된, 유효량은 투여 시 대상체에게 치료 효과를 부여하는 각각의 제제(예를 들어, 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드, ACTR 폴리펩타이드, 항체 또는 이의 조성물을 발현하는 NK 세포 및/또는 T 림프구)의 양을 지칭한다. 본원에 기재된 세포 또는 조성물의 양이 치료 효과를 달성했는지 여부의 결정은 본 기술분야의 기술자에게 명백할 것이다. 유효량은 본 기술분야의 기술자에 의해 인식되는 것처럼, 치료 중인 특별한 상태, 그 상태의 중증도, 연령, 신체 상태, 크기, 성별, 성 및 체중을 포함한 개별 환자의 매개 변수, 치료 기간, 동시 요법(존재하는 경우)의 성질, 특정 투여 경로, 및 의사의 지식과 전문 지식 내의 유사 요인에 따라 달라진다. 일부 구현예에서, 상기 유효량은 증상을 완화, 경감, 개량, 개선, 감소시키거나, 대상체의 임의의 질환 또는 장애의 진행을 지연시킨다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간이다. 일부 구현예에서, 치료를 필요로 하는 대상체는 인간 암 환자이다. 일부 구현예에서, 치료를 필요로 하는 대상체는 하나 이상의 병원성 감염(예를 들어, 바이러스, 박테리아 및/또는 진균 감염)을 앓고 있다.
본 개시내용의 방법은 임의의 암 또는 임의의 병원체의 치료에 사용될 수 있다. 본 개시내용의 방법에 의해 치료될 수 있는 암의 구체적인 비제한적 예는 예를 들어 림프종, 유방암, 위암, 신경아세포종, 골육종, 폐암, 피부암, 전립선 암, 결장직장암, 신장 세포 암종, 난소 암, 횡문근육종, 백혈병, 중피종, 췌장암, 두경부암, 망막아세포종, 신경교종, 교모세포종, 갑상선암, 간세포암, 식도암 및 자궁경부암을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 암은 고형 종양일 수 있다.
본 개시내용의 방법은 또한 박테리아 감염, 바이러스 감염 또는 진균 감염에 의해 유발될 수 있는 감염성 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 이러한 경우, 상기 유전자 조작된 면역 세포는 병원성 항원(예컨대, 감염을 유발하는 박테리아, 바이러스 또는 진균과 관련이 있는 항원)을 표적으로 하는 Fc-함유 치료제(예컨대, 항체)와 함께 공동사용될 수 있다. 병원성 항원의 구체적인 비제한적인 예는 박테리아, 바이러스 및/또는 진균 항원을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 예가 이하에 제공된다: 인플루엔자 바이러스 뉴라미니다제, 혈구응집소 또는 M2 단백질, 인간 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) F 당단백질 또는 G 당단백질, 단순 헤르페스 바이러스 당단백질 gB, gC, gD 또는 gE, 클라미디아(Chlamydia) MOMP 또는 PorB 단백질, 뎅기 바이러스 코어 단백질, 기질 단백질 또는 당단백질 E, 홍역 바이러스 혈구응집소, 단순 헤르페스 바이러스 2형 당단백질 gB, 폴리오바이러스 I VP1, HIV 1의 외피 당단백질, B형 간염 코어 항원 또는 표면 항원, 디프테리아 독소, 스트렙토코커스(Streptococcus) 24M 에피토프, 임균 필린, 가성광견병 바이러스 g50(gpD), 가성광견병 바이러스 II(gpB), 가성광견병 바이러스 III(gpC), 가성광견병 바이러스 당단백질 H, 가성광견병 바이러스 당단백질 E, 전염성 위장염 당단백질 195, 전염성 위장염 기질 단백질 또는 인간 C형 간염 바이러스 당단백질 E1 또는 E2.
일부 구현예에서, 상기 면역 세포는 ADCC 활성을 적어도 20% 및/또는 적어도 2배 향상, 예를 들어 ADCC를 50%, 80%, 100%, 2배, 5배, 10배, 20배, 50배, 100배 이상 향상시키는데 효과적인 양으로 대상체에게 투여된다.
상기 면역 세포는 Fc-함유 치료제가 결합하는 항원을 발현하는 세포를 표적화하기 위해 치료 항체와 같은 Fc-함유 치료제와 공동투여된다. 일부 구현예에서, 하나보다 많은 Fc-함유 치료제, 예컨대 하나보다 많은 항체가 상기 면역 세포와 공동사용될 수 있다. 항체 기반의 면역요법은 상기 면역요법이 대상체에서 유용한 것으로 간주되는 임의의 질환 또는 장애의 증상을 치료하거나, 완화하거나 또는 감소시키는데 사용될 수 있다.
항체(복수 형태가 호환적으로 사용됨)는 상기 면역글로불린 분자의 가변 영역에 위치한, 적어도 하나의 항원 인식 부위를 통해 탄수화물, 폴리뉴클레오타이드, 지질, 폴리펩타이드 등과 같은 표적에 대해 특이적 결합을 할 수 있는 면역글로불린 분자이다. 본원에 사용된, 용어 "항체"는 온전한(즉, 전체 길이) 다클론 또는 단일클론 항체 뿐만 아니라 Fc 영역을 포함하는 이의 항원 결합 단편, 이의 돌연변이체, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 인간화 항체, 키메라 항체, 디아바디, 단일 도메인 항체(예를 들어, 나노바디), 선형 항체, 다중특이성 항체(예컨대, 이중특이성 항체) 및 필요한 특이성의 항원 인식 부위 및 Fc 영역을 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형 형상, 예컨대 항체의 글리코실화 변이체, 항체의 아미노산 서열 변이체, 및 공유 변형된 항체를 포괄한다. 항체는 IgD, IgE, IgG, IgA 또는 IgM(또는 이의 하위부류)과 같은 임의의 부류의 항체를 포함하며, 상기 항체는 임의의 특정 부류일 필요는 없다. 중쇄의 불변 도메인의 항체 아미노산 서열에 따라 면역글로불린은 다른 부류로 지정될 수 있다. 면역글로불린에는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5가지 주요 부류가 있으며, 이들 중 몇몇은 하위부류(아이소타입), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 더 분류될 수 있다. 상기 상이한 부류의 면역글로불린에 해당하는 중쇄 불변 도메인은 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤라 불린다. 상이한 부류의 면역글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 형상은 잘 알려져 있다. 본 개시내용에 사용하기 위한 항체는 상기 공동사용되는 ACTR- 및/또는 크렙스 사이클 조정 향상 폴리펩타이드-발현 면역 세포에 의해 인식될 수 있는 Fc 영역을 함유한다. 상기 Fc 영역은 인간 또는 인간화된 Fc 영역일 수 있다.
본원에 기재된 임의의 항체는 단일클론 또는 다클론일 수 있다. "단일클론 항체"는 균일 항체 집단을 의미하고, "다클론 항체"는 불균일 항체 집단을 의미한다. 이 두 용어는 항체의 출처 또는 항체가 제조되는 방식을 제한하지 않는다.
일 예에서, 본원에 기재된 방법에 사용되는 항체는 인간화 항체이다. 인간화 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래되는 최소 서열을 함유하는 특정 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 사슬 또는 이의 항원 결합 단편인 비-인간(예컨대, 뮤린) 항체의 형태를 지칭한다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수용체의 상보적 결정 영역(CDR)으로부터의 잔기가 바람직한 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 마우스, 래트, 또는 토끼와 같은 비-인간 종(공여체 항체)의 CDR로부터의 잔기에 의해 대체된 인간 면역글로불린(수용체 항체)이다. 일부 경우에, 상기 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 대체된다. 또한, 상기 인간화 항체는 수용체 항체 또는 이입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서는 발견되지 않지만, 항체 성능을 추가로 개량하고 최적화하기 위해 포함되는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 상기 인간화 항체는 적어도 하나, 전형적으로 두 개의 가변 도메인의 거의 전부를 포함할 것이며, 여기서 상기 CDR 영역의 전부 또는 거의 전부는 비-인간 면역글로불린의 것에 상응하고, 상기 FR 영역의 전부 또는 거의 전부는 인간 면역글로불린 콘센서스(consensus) 서열의 것이다. 상기 인간화 항체는 최적으로는, 면역글로불린 불변 영역 또는 도메인(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 것을 추가로 포함할 것이다. 항체는 WO 99/58572에 기재된 바와 같이 변형된 Fc 영역을 가질 수 있다. 본원에 사용된 상기 항체는 글리코실화(예컨대, 푸코실화)되거나, 또는 비-푸코실화될 수 있다. 다른 형태의 인간화 항체는 원래(original) 항체와 관련하여 변경된 하나 이상의 CDR(1, 2, 3, 4, 5, 6개)을 가지며, 이는 또한 상기 원래 항체의 하나 이상의 CDR"로부터 유래된" 하나 이상의 CDR로 지칭된다. 인간화 항체는 또한 친화성 성숙을 수반할 수 있다.
다른 예에서, 본원에 기재된 항체는 인간 항체로부터의 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역을 포함할 수 있는 키메라 항체이다. 키메라 항체는 제1 종으로부터의 가변 영역 또는 가변 영역의 일부 및 제2 종으로부터의 불변 영역을 갖는 항체를 지칭한다. 전형적으로, 이러한 키메라 항체에서, 경쇄 및 중쇄 모두의 가변 영역은 1종의 포유류(예를 들어, 마우스, 토끼 및 래트와 같은 비인간 포유류)에서 유래되는 항체의 가변 영역을 모방하는 반면, 상기 불변 부분은 인간과 같은 다른 포유류로부터 유래되는 항체의 서열과 상동성이다. 일부 구현예에서, 상기 가변 영역 및/또는 상기 불변 영역에는 아미노산 변형이 만들어질 수 있다.
본 명세서에 개시된 임의의 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및/또는 상기 ACTR 폴리펩타이드를 발현하는 상기 조혈 세포, 예를 들어. 면역 세포(예를 들어, T 림프구 및/또는 NK 세포) 또는 HSC는 Fc 함유 항체에 의해 치료를 받았거나 치료 중인 대상체에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 상기 면역 세포는 항체와 동시에 인간 대상체에게 투여될 수 있다. 대안적으로, 상기 면역 세포는 항체-기반 면역요법 과정 동안 인간 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 예에서, 상기 면역 세포 및 항체는 적어도 4 시간 간격, 예를 들어 적어도 12 시간 간격, 적어도 1일 간격, 적어도 3일 간격, 적어도 1주 간격, 적어도 2주 간격 또는 적어도 1개월 간격으로 인간 대상체에게 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 항체는 상응하는 표적 항원 또는 이의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 항원 또는 에피토프에 "특이적으로 결합하는" 항체는 본 기술분야에서 잘 알려진 용어이다. 분자는 대체 표적보다 특별한 표적 항원과 더 자주, 더 빠르게, 더 긴 기간 및/또는 더 큰 친화성으로 반응하는 경우, "특이 적 결합"을 나타낸다고 한다. 항체는 다른 물질에 결합하는 것보다 더 큰 친화성, 결합력(avidity), 더 쉽게 및/또는 더 긴 기간으로 결합하는 경우, 표적 항원 또는 에피토프에 "특이적으로 결합"한다. 예를 들어, 본원에서 항원 또는 항원성 에피토프에 특이적으로(또는 우선적으로) 결합하는 항체는, 다른 항원 또는 동일 항원의 다른 에피토프에 결합하는 것보다, 더 큰 친화성, 결합력, 더 쉽게, 및/또는 더 긴 기간으로 상기 표적 항원에 결합하는 항체이다. 또한, 이 정의에 의하면, 예컨대 제1 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 제2 표적 항원에 특이적 또는 우선적으로 결합하거나, 또는 결합하지 않을 수 있는 것으로도 이해된다. 이와 같이, "특이적 결합" 또는 "우선적 결합"은 반드시 배타적 결합을 필요로 하지는 않는다(포함할 수는 있음). 일부 예에서, 표적 항원 또는 이의 에피토프에 "특이적으로 결합하는 항체는 다른 항원 또는 동일한 항원의 다른 에피토프에 결합하지 않을 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 항체는 표적 항원(예를 들어, 본원에 기재된 표적 중 임의의 하나) 또는 이의 항원성 에피토프에 대해 적합한 결합 친화성을 갖는다. 본원에 기재된 면역요법 방법에 사용하기 위한 항체는 관심 표적 항원, 또는 그 안의 특정 영역 또는 항원성 에피토프에 결합(예를 들어, 특이적으로 결합)할 수 있다. 상기 표 3은 예시적인 관심 표적 항원 및 이에 특이적인 예시적인 항체를 열거한다.
(b) CAR 폴리펩타이드를 발현하는 유전자 조작된 조혈 세포의 면역요법
크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및 CAR 폴리펩타이드를 공동발현하는, 본원에 기재된 유전자 조작된 조혈 세포(예를 들어, 조혈 줄기 세포, 면역 세포, 예컨대 T 세포 또는 자연 살해 세포)는 상기 CAR 폴리펩타이드가 직접 또는 간접적으로(예를 들어, 상기 CAR 폴리펩타이드가 결합하는 태그에 접합된 치료제를 통해) 표적으로 삼는 항원을 발현하는 병든 세포를 억제하기 위한 T 세포 요법 또는 NK 세포 요법과 같은 면역 요법에 사용될 수 있다. 면역 세포에서 CAR 폴리펩타이드와 공동발현되는 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드는 상기 세포가 낮은 글루코스, 낮은 아미노산, 낮은 pH 및/또는 저산소 환경, 예를 들어 종양 미세환경에서 효과적으로 성장 및/또는 기능하게 하여, 상기 세포 기반 면역 요법을 용이하게 할 것이다. 임의의 잠재적인 비-종양 특이적 반응성을 제한하기 위하여, mRNA 전기천공을 사용하여 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및/또는 상기 CAR 폴리펩타이드를 일시적으로 발현하도록 하여 임상적 안전성을 추가로 향상시킬 수 있다.
본원에 기재된 방법은 본 개시내용의 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및 CAR 폴리펩타이드를 공동발현하는, 유전자 조작된 숙주 세포, 예컨대 조혈 세포, 예를 들어 면역 세포(예를 들어, T 림프구 또는 NK 세포)의 치료적 유효량을 상기 대상체 내로 도입하는 것을 포함할 수 있다. 상기 대상체(예를 들어, 인간 암 환자와 같은 인간 환자)는 항암 치료제 또는 항감염제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 항암 또는 항감염 요법에 의해 부가적으로 치료를 받았거나 또는 치료 중일 수 있다. 상기 CAR은 임의의 표적 항원에 결합할 수 있는 항원 결합 도메인을 갖는다. 이러한 표적 항원은 질환 또는 상태와 관련이 있는 임의의 분자일 수 있고, 예컨대 종양 항원, 병원성 항원(예를 들어, 박테리아, 진균, 또는 바이러스의 항원), 또는 병든 세포 상에 존재하는 항원, 예컨대 본원에 개시된 것을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 기재된 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및 CAR 폴리펩타이드를 발현하는 숙주 세포(예를 들어, 조혈 세포, 예를 들어 T 세포 및 NK 세포와 같은 면역 세포)는 표적 항원을 발현하는 세포를 억제하고 및/또는 낮은 글루코스 환경, 낮은 아미노산 환경, 낮은 pH 환경, 및/또는 저산소 환경, 예를 들어 종양 미세환경에서 면역 세포의 성장 및/또는 증식을 향상시키는 데 유용하다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 인간, 원숭이, 마우스, 토끼 또는 가축 포유류와 같은 포유류이다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 인간이다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 인간 암 환자이다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 본원에 기재된 임의의 치료 항체에 의해 부가적으로 치료를 받았거나 치료 중이다.
본원에 기재된 방법을 실행하기 위해, 본원에 기재된 임의의 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및 CAR 폴리펩타이드를 발현하는 면역 세포(NK 세포 및/또는 T 림프구)와 같은 조혈 세포, 또는 그의 조성물의 유효량은 정맥내 투여와 같은 적절한 경로를 통해 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. 본원에 사용된 유효량은 투여시 대상체에게 치료 효과를 부여하는 각 제제(예를 들어, 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드, CAR 폴리펩타이드, 또는 이의 조성물을 발현하는 NK 세포 및/또는 T 림프구)의 양을 지칭한다. 본원에 기재된 세포 또는 조성물의 양이 치료 효과를 달성했는지의 결정은 본 기술분야의 기술자에게 명백한 것일 것이다. 유효량은 치료 중인 특별한 상태, 상기 상태의 중증도, 연령, 신체 상태, 체격, 성별(gender), 성(sex) 및 체중을 포함한 개별 환자의 매개 변수, 치료 기간, 병행 요법의 특성(존재하는 경우), 구체적인 투여 경로 및 의료 종사자의 지식과 전문지식에 속하는 유사 요인에 따라, 본 기술분야의 기술자라면 인식하는 것처럼, 다양하다. 일부 구현예에서, 상기 유효량은 대상체의 임의의 질환 또는 장애의 진행을 지연시키거나, 또는 증상을 완화, 경감, 개선, 향상, 감소시킨다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간이다. 일부 구현예에서, 치료가 필요한 대상체는 인간 암 환자이다. 일부 구현예에서, 치료가 필요한 대상체는 하나 이상의 병원성 감염(예를 들어, 바이러스, 박테리아 및/또는 진균 감염)을 앓고 있다.
본 개시내용의 방법은 임의의 암 또는 임의의 병원체의 치료에 사용될 수 있다. 본 개시내용의 방법에 의해 치료될 수 있는 암의 구체적인 비제한적 예는, 예를 들어, 림프종, 유방암, 위암, 신경아세포종, 골육종, 폐암, 피부암, 전립선 암, 결장직장암, 신장 세포 암종, 난소 암, 횡문근육종, 백혈병, 중피종, 췌장암, 두 경부암, 망막아세포종, 신경교종, 교모세포종, 갑상선암, 간세포 암, 식도암 및 자궁경부암을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 암은 고형 종양일 수 있다.
본 개시내용의 방법은 또한 박테리아 감염, 바이러스 감염, 또는 진균 감염에 의해 유발될 수 있는 감염성 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 이러한 경우, 병원성 항원(예를 들어, 감염을 유발하는 박테리아, 바이러스 또는 진균과 관련된 항원)에 특이적인 CAR 폴리펩타이드를 발현하는 유전자 조작된 면역 세포는 감염된 세포를 제거하는 데 사용될 수 있다. 병원성 항원의 구체적인 비제한적인 예는 박테리아, 바이러스 및/또는 진균 항원을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
일부 구현예에서, 상기 면역 세포는 상기 표적 항원을 발현하는 세포를 적어도 20% 및/또는 적어도 2배 억제하는데, 예를 들어 상기 표적 항원을 발현하는 세포를 50%, 80%, 100%, 2배, 5배, 10배, 20배, 50배, 100배, 또는 그 이상 억제하는데 효과적인 양으로 대상체에게 투여된다.
부가적인 치료제(예를 들어, 항체 기반 면역요법제)는 이 치료제가 대상체에서 유용하다고 간주된 임의의 질환 또는 장애의 증상을 치료, 완화 또는 감소시키는데 사용될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 세포 기반 면역요법의 효능은 본 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 평가될 수 있고 숙련된 의료 전문가에게 명백한 것일 것이다. 예를 들어, 상기 세포 기반 면역요법의 효능은 대상체의 생존율 또는 대상체 또는 이의 조직 또는 샘플에서의 종양 또는 암 부담에 의해 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 면역 세포는 세포 기반 면역요법의 효능을, 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및/또는 상기 CAR 폴리펩타이드를 발현하는 면역 세포의 부재 시의 효능에 비해, 적어도 20% 및/또는 적어도 2배 향상시키는데, 예를 들어 항체 기반 면역요법의 효능을 50%, 80%, 100%, 2배, 5배, 10배, 20배, 50배, 100배, 또는 그 이상으로 향상시키는데 효과적인 양으로 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여된다.
본원에 기재된 임의의 조성물 또는 방법에서, 상기 면역 세포(예를 들어, NK 및/또는 T 세포)는 대상체에게 자가유래인 것일 수 있고, 즉, 상기 면역 세포는 치료를 필요로 하는 대상체로부터 수득될 수 있고, 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및/또는 상기 CAR 폴리펩타이드의 발현을 위해 유전자 조작될 수 있고, 그 다음 동일한 대상체에게 투여될 수 있다. 구체적인 일 구현예에서, 상기 대상체로 재도입하기 전에, 상기 자가유래 면역 세포(예를 들어, T 림프구 또는 NK 세포)는 생체외에서 활성화 및/또는 확대된다. 대상체에게 자가유래 세포의 투여는 비-자가유래 세포의 투여에 비해 숙주 세포의 감소된 거부 반응을 초래할 수 있다.
대안적으로, 상기 숙주 세포는 동종이계 세포이며, 즉, 상기 세포는 제1 대상체로부터 수득되고, 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및/또는 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드(예를 들어, ACTR 폴리펩타이드 또는 CAR 폴리펩타이드)의 발현을 위해 유전자 조작되고, 상기 제1 대상체와 다르지만 동일한 종인 제2 대상체에게 투여된다. 예를 들어, 동종이계 면역 세포는 인간 공여체로부터 유래되고, 상기 공여체와 다른 인간 수용체에게 투여될 수 있다. 구체적인 구현예에서, 상기 T 림프구는 내인성 T 세포 수용체의 발현이 억제되거나 제거된 동종이계 T 림프구이다. 구체적인 일 구현예에서, 상기 대상체로의 도입 전에, 상기 동종이계 T 림프구는 생체외에서 활성화 및/또는 확대된다. T 림프구는 본 기술분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 항-CD3/CD28, IL-2, 식물혈구응집소, 조작된 인공 자극 세포 또는 입자, 또는 이들의 조합의 존재하에 활성화될 수 있다.
NK 세포는 본 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해, 예를 들어 CD137 리간드 단백질, CD137 항체, IL-15 단백질, IL-15 수용체 항체, IL-2 단백질, IL-12 단백질, IL-21 단백질, K562 세포주 및/또는 조작된 인공 자극 세포 또는 입자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 제제의 존재하에 활성화될 수 있다. 예를 들어, NK 세포를 확대하기에 유용한 방법에 대한 설명은 미국 특허 번호 7,435,596 및 8,026,097을 참조하라. 예를 들어, 본 개시내용의 조성물 또는 방법에 사용된 NK 세포는 주요 조직적합성 복합체 I 및/또는 II 분자가 없거나 빈약하게 발현되고 막 결합된 IL-15 및 4-1BB 리간드(CDI37L)를 발현하도록 유전자 변형된 세포에 노출시킴으로써 우선적으로 확대될 수 있다. 이러한 세포주는 K562 [ATCC, CCL 243; Lozzio 등, Blood 45(3): 321-334(1975); Klein 등, Int. J. Cancer 18: 421-431(1976)] 및 Wilms 종양 세포주 HFWT (Fehniger 등, Int Rev Immunol 20(3-4): 503-534(2001); Harada H, 등, Exp Hematol 32(7): 614-621(2004)), 자궁 자궁내막 종양 세포주 HHUA, 흑색종 세포주 HMV-II, 간모세포종 세포주 HuH-6, 폐 소세포 암종 세포주 Lu-130 및 Lu-134-A, 신경아세포종 세포주 NB 19 및 N1369, 고환 NEC 14의 배아 암종 세포주, 자궁경부 암종 세포주 TCO-2, 및 골수 전이된 신경아세포종 세포주 TNB 1 [Harada, 등, Jpn. J. Cancer Res 93: 313-319(2002)]를 포함하나, 이에 반드시 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 상기 사용된 세포주는 K562 및 HFWT 세포주와 같이, MHC I 및 II 분자 둘 모두가 없거나 빈약하게 발현한다. 세포주 대신 고체 지지체가 사용될 수 있다. 이러한 지지체는 바람직하게는 NK 세포에 결합할 수 있고 1차 활성화 이벤트 및/또는 증식 반응을 유도할 수 있거나, 또는 그러한 효과를 갖는 분자에 결합할 수 있어 스캐폴드로서 작용할 수 있는 적어도 하나의 분자가 표면에 부착되어 있어야 한다. 상기 지지체는 CD137 리간드 단백질, CD137 항체, IL-15 단백질 또는 IL-15 수용체 항체가 표면에 부착되어 있을 수 있다. 바람직하게는, 상기 지지체는 표면에 결합된 IL-15 수용체 항체 및 CD137 항체를 가질 것이다.
상기 기재된 조성물 또는 방법의 일 구현예에서, 상기 대상체에 T 림프구, NK 세포, 또는 T 림프구 및 NK 세포의 도입(또는 재도입) 후에는, 치료적 유효량의 IL-2가 대상체에게 투여된다.
본 개시내용에 따르면, 환자는 본 개시내용의 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및/또는 CAR 폴리펩타이드를 포함하는 T 림프구 또는 NK 세포와 같은 면역 세포의 치료적 유효 용량을 체중 킬로그램당 약 105 내지 1010 또는 그 이상의 범위의 세포(세포/Kg)로 주입함으로써 치료될 수 있다. 상기 주입은 원하는 반응이 달성될 때까지 환자가 견딜 수 있는 한, 자주 수 회 반복될 수 있다. 적절한 주입 용량과 일정은 환자마다 다를 것이지만, 특정 환자에 대해서는 치료 의사가 결정할 수 있다. 전형적으로, 약 106개 세포/Kg의 초기 용량이 주입되고, 108 이상의 세포/Kg로 상승할 것이다. IL-2는 주입된 세포의 확대를 위해 공동투여될 수 있다. IL-2의 양은 체표면 평방 미터당 약 1-5 x 106 국제 단위일 수 있다.
용어 "약" 또는 "대략"은 본 기술분야의 기술자에 의해 결정된 특정 값에 대해 허용가능한 오차 범위 내를 의미하며, 이는 값이 측정 또는 결정되는 방법, 즉 측정 시스템의 한계에 따라 부분적으로 달라질 것이다. 예를 들어, "약"은 본 기술분야의 관습에 따라 허용가능한 표준 편차 이내를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 주어진 값의 최대 ±20%, 바람직하게는 최대 ±10%, 더 바람직하게는 최대 ±5%, 더 바람직하게는 여전히 최대 ±1%의 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 공정과 관련하여, 상기 용어는 값의 배 이내, 바람직하게는 2배 이내를 의미할 수 있다. 특정 값이 본 출원 및 청구범위에 기재된 경우, 달리 언급되지 않는 한, 용어 "약"은 암시적이며, 본 상황에서 특정 값에 대해 허용가능한 오차 범위 내를 의미한다.
본원에 기재된 조성물 또는 방법의 효능은 본 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 평가될 수 있으며 숙련된 의료 전문가에게 명백할 것이다. 예를 들어, 항체-기반 면역요법의 효능은 대상체의 생존 또는 대상체 또는 이의 조직 또는 샘플에서의 암 부담에 의해 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체 기반의 면역요법은 예를 들어, 대상체에서 치료법(예를 들어, 항체 및 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및/또는 CAR 폴리펩타이드를 발현하는 면역 세포의 투여)의 안전성 또는 독성에 기초하여, 예컨대 대상체의 전반적인 건강 및/또는 부작용 또는 심각한 부작용의 존재에 의해 평가된다.
(c) 기타 면역요법
일부 구현예에서, 하나 이상의 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드(예를 들어, GOT1 또는 GOT2와 같은 GOT)를 발현하는 유전자 조작된 면역 세포는 병든 세포(예를 들어, 암 세포 또는 병원체 감염 세포)에 특이적인 자연 면역 세포로부터 유래될 수 있다. 이와 같이 유전자 조작된 면역 세포(예를 들어, 종양 침윤 림프구 또는 TIL)는 임의의 키메라 수용체 폴리펩타이드를 공동발현하지 않을 수 있고 표적 질환 세포, 예를 들어 암 세포를 파괴하는 데 사용될 수 있다. 하나 이상의 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드를 발현하지만, 키메라 수용체는 발현하지 않는 상기 유전자 조작된 TIL은 표적 종양 세포 및 TIL(BiTE)에 결합할 수 있는 이중특이적 항체와 함께 공동사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드(예를 들어, GOT1 또는 GOT2와 같은 GOT)를 발현하는 유전자 조작된 면역 세포는 Treg 세포일 수 있다. 이러한 Treg 세포는 본원에 개시된 키메라 수용체 폴리펩타이드를 공동발현할 수 있다. 대안적으로, 상기 Treg 세포는 임의의 키메라 수용체 폴리펩타이드를 공동발현하지 않을 수 있고 의도된 요법에 사용될 수 있다.
V. 조합 치료
본 개시내용에 기재된 조성물 및 방법은 화학 요법, 수술, 방사선, 유전자 요법 등과 같은 암에 대한 다른 유형의 치료법 또는 항감염 요법과 함께 이용될 수 있다. 이러한 요법은 본 개시내용에 따른 면역요법과 동시에 또는 순차적으로(임의의 순서로) 투여될 수 있다. 부가적인 치료제와 공동투여되는 경우, 각 제제의 적합한 치료적 유효 투여량은 부가 작용 또는 상승작용으로 인해 낮아질 수 있다.
일부 경우에, 본원에 개시된 임의의 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및/또는 키메라 수용체 폴리펩타이드를 발현하는 면역 세포(예를 들어, T 림프구 및/또는 NK 세포)는 부가적인 치료제(예를 들어, 부가적인 항암 치료제)에 의해 치료를 받았거나 치료 중인 대상체에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 상기 면역 세포는 부가적인 치료제와 동시에 인간 대상체에게 투여될 수 있다. 대안적으로, 상기 면역 세포는 부가적인 치료제 전에 인간 대상체에게 투여될 수 있다. 대안적으로, 상기 면역 세포는 부가적인 치료제 후에 인간 대상체에게 투여될 수 있다.
크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및 태그에 특이적인 CAR 폴리펩타이드를 공동발현하는 유전자 조작된 면역 세포(예를 들어, T 세포 또는 NK 세포)는 상기 태그에 접합된 치료제와 공동사용될 수 있다. 종양 세포와 같은 병든 세포와 관련된 항원에 결합할 수 있는 치료제를 통해, 상기 유전자 조작된 면역 세포는 병든 세포와 결합하여 그의 성장을 억제할 수 있다. 상기 표 1에 나열된 임의의 항체 또는 표 1에 또한 나열된 동일한 표적 항원에 특이적인 다른 항체는 적합한 태그(예를 들어, 본원에 기재된 것들)에 접합될 수 있고 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및 상기 태그에 특이적인 CAR 폴리펩타이드를 공동발현하는 면역 세포와 공동사용될 수 있다.
본 개시내용의 치료는 다른 면역조절 치료, 예컨대 치료 백신(GVAX, DC 기반 백신 등을 포함하나, 이에 제한되지 않음), 관문(ckeckpoint) 억제제(CTLA4, PD1, LAG3, TIM3 등을 차단하는 제제를 포함하나, 이에 제한되지 않음) 또는 활성화제(41BB, OX40 등을 향상시키는 제제를 포함하나, 이에 제한되지 않음)와 조합될 수 있다.
본 개시내용의 면역요법과 조합하기에 유용한 다른 치료제의 비제한적인 예는 하기를 포함한다: (i) 항혈관형성제 (예를 들어, TNP-470, 혈소판 인자 4, 트롬보스폰딘-1, 금속단백분해효소의 조직 억제제(TIMP1 및 TIMP2), 프로락틴(16-Kd 단편), 안지오스타틴(플라스미노겐의 38-Kd 단편), 엔도스타틴, bFGF 가용성 수용체, 형질전환 성장 인자 베타, 인터페론 알파, 가용성 KDR 및 FLT-1 수용체, 태반 프롤리페린-관련 단백질, 뿐만 아니라 Carmeliet 및 Jain(2000)에 의해 나열된 것); (ii) VEGF 길항제 또는 VEGF 수용체 길항제, 예컨대 항-VEGF 항체, VEGF 변이체, 가용성 VEGF 수용체 단편, VEGF 또는 VEGFR을 차단할 수 있는 압타머, 중화 항-VEGFR 항체, VEGFR 티로신 키나제의 억제제 및 이들의 임의의 조합; 및 (iii) 화학 요법 화합물, 예를 들어 피리미딘 유사체(5-플루오로우라실, 플록수리딘, 카페시타빈, 젬시타빈 및 시타라빈), 퓨린 유사체, 엽산 길항제 및 관련 억제제 (머캅토퓨린, 티오구아닌, 펜토스타틴 및 2-클로로데옥시아데노신(클라드리빈)); 항증식/항유사분열제, 예컨대 빈카 알칼로이드(빈블라스틴, 빈크리스틴 및 비노렐빈)와 같은 천연물, 탁산(파클리탁셀, 도세탁셀), 빈크리스틴, 빈블라스틴, 노코다졸, 에포틸론 및 나벨빈과 같은 미세소관 교란인자, 에피디포도필로톡신(에토포시드 및 테니포시드), DNA 손상제 (악티노마이신, 암사크린, 안트라사이클린, 블레오마이신, 부설판, 캄프토테신, 카보플라틴, 클로람부실, 시스플라틴, 사이클로포스파미드, 사이톡산, 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 헥사메틸멜라민 옥살리플라틴, 이포스파미드, 멜팔란, 머클로레타민, 미토마이신, 미톡산트론, 니트로소우레아, 플리카마이신, 프로카바진, 탁솔, 탁소테레, 테니포사이드, 트리에틸렌티오포스포아미드 및 에토포사이드(VP16)); 항생제, 예컨대 닥티노마이신(악티노마이신 D), 다우노루비신, 독소루비신(아드리아마이신), 이다루비신, 안트라사이클린, 미톡산트론, 블레오마이신, 플리카마이신(미트라마이신) 및 미토마이신; 효소(L-아스파라긴을 전신적으로 대사하고 자체 아스파라긴을 합성할 능력이 없는 세포를 박탈하는 L-아스파라기나제); 항혈소판제; 항증식/항유사분열 알킬화제, 예컨대 질소 머스타드(메클로레타민, 사이클로포스파미드 및 유사체, 멜팔란, 클로람부실), 에틸렌이민 및 메틸멜라민(헥사메틸멜라민 및 티오테파), 알킬 설포네이트-부설판, 니트로소우레아 (카무스틴(BCNU) 및 유사체, 스트렙토조신), 트라젠-다카바지닌(DTIC); 엽산 유사체(메토트렉세이트)와 같은 항증식/항유사분열성 항대사물질; 백금 배위 복합체(시스플라틴, 카보플라틴), 프로카바진, 하이드록시우레아, 미토탄, 아미노글루테티미드; 호르몬, 호르몬 유사체(에스트로겐, 타목시펜, 고세렐린, 비칼루타미드, 닐루타미드) 및 아로마타제 억제제(레트로졸, 아나스트로졸); 항응고제(헤파린, 합성 헤파린 염 및 기타 트롬빈 억제제); 섬유소용해제(예컨대, 조직 플라스미노겐 활성화제, 스트렙토키나제 및 유로키나제), 아스피린, 다이피리다몰, 티클로피딘, 클로피도그렐, 압식시맙; 이동방지제; 항분비제(브레펠딘); 면역억제제 (사이클로스포린, 타크로리무스(FK-506), 시롤리무스(라파마이신), 아자티오프린, 마이코페놀레이트 모페틸); 항-혈관형성 화합물(예컨대, TNP-470, 제니스테인, 베바시주맙) 및 성장 인자 억제제 (예컨대, 섬유아세포 성장 인자(FGF) 억제제); 안지오텐신 수용체 차단제; 산화질소 공여체; 안티센스 올리고뉴클레오타이드; 항체(트라스투주맙); 세포주기 억제제 및 분화 유도제(트레티노인); AKT 억제제 (예컨대, MK-2206 2HCl, 페리포신(KRX-0401), GSK690693, 이파타서팁(GDC-0068), AZD5363, 업로서팁, 아푸레서팁 또는 트리시리빈); mTOR 억제제, 토포이소머라제 억제제 (독소루비신(아드리아마이신), 암사크린, 캄토테신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 에니포사이드, 에피루비신, 에토포사이드, 이다루비신, 미톡산트론, 토포테칸 및 이리노테칸), 코르티코스테로이드(코르티손, 덱사메타손, 하이드로코르티손, 메틸프레드니솔론, 프레드니손, 및 프레드니솔론); 성장 인자 신호 전달 키나제 억제제; 미토콘드리아 기능장애 유도제 및 카스파제 활성화제; 및 염색질 교란제.
부가적인 유용한 제제의 예는 하기 문헌을 참조한다: Physician's Desk Reference, 59.sup.th edition,(2005), Thomson P D R, Montvale N.J.; Gennaro 등, Eds. Remington's The Science and Practice of Pharmacy 20th edition,(2000), Lippincott Williams and Wilkins, Baltimore Md.; Braunwald 등, Eds. Harrison's Principles of Internal Medicine, 15.sup.th edition,(2001), McGraw Hill, NY; Berkow 등, Eds. The Merck Manual of Diagnosis and Therapy,(1992), Merck Research Laboratories, Rahway N.J.
부가적인 치료제의 투여는 전신 투여뿐만 아니라 질병 부위(예를 들어, 종양)로의 직접 투여를 포함하는 임의의 적절한 경로에 의해 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 부가적인 치료제(예를 들어, 항체)를 대상체에게 1회 용량으로 투여하는 것을 수반한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 상기 부가적인 치료제(예를 들어, 항체)를 다회 용량(예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8회 용량)으로 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 부가적인 치료제(예를 들어, 항체)는 대상체에게 다회 용량으로 투여되고, 상기 부가적인 치료제(예를 들어, 항체)의 1차 용량은 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및/또는 상기 CAR 폴리펩타이드를 발현하는 면역 세포를 투여하기 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7일 전에 상기 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 부가적인 치료제(예를 들어, 항체)의 1차 용량은 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및/또는 상기 CAR 폴리펩타이드를 발현하는 면역 세포를 투여하기 약 24-48 시간 전에 상기 대상체에게 투여된다. 일부 경우에, 상기 부가적인 치료제는 관심 있는 표적 항원에 특이적인 항체, 예를 들어 표 1에 나열된 것 및 동일한 표적에 특이적인 다른 항체일 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 부가적인 치료제(예를 들어, 항체)는 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및/또는 상기 CAR 폴리펩타이드를 발현하는 면역 세포의 투여 전 및 그 다음 후속적으로 약 2주마다 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 상기 부가적인 치료제(예를 들어, 항체)의 처음 2회 용량은 약 1주(예를 들어, 약 6, 7, 8 또는 9일) 간격으로 투여된다. 특정 구현예에서, 3차 및 그 이후의 용량은 약 2주마다 투여된다.
본원에 기재된 임의의 구현예에서, 상기 부가적인 치료제(예를 들어, 항체)의 투여 시기는 대략적이며, 표시된 날보다 3일 전 및 3일 후를 포함한다(예를 들어, 3주마다 투여는 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일 또는 24일째의 투여를 포괄한다).
본원에 기재된 방법의 효능은 본 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 평가될 수 있으며 숙련된 의료 전문가 및/또는 본원에 기재된 것들에게 명백할 것이다. 예를 들어, 항체-기반 면역요법의 효능은 대상체의 생존 또는 대상체 또는 이의 조직 또는 샘플 중의 암 부담에 의해 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 항체-기반 면역요법은 대상체에서 치료법의 안전성 또는 독성에 기초하여, 예를 들어 대상체의 전반적인 건강 및/또는 부작용 또는 심각한 부작용의 존재에 의해 평가된다.
VI. 치료용 키트
본 개시내용은 또한 본원에 기재된 조성물의 사용을 위한 키트를 제공한다. 예를 들어, 본 개시내용은 또한 낮은 글루코스 환경, 낮은 아미노산 환경, 낮은 pH 환경, 및/또는 저산소 환경, 예를 들어 종양 미세환경에서 면역 세포 성장 및/또는 증식을 향상시키고 및/또는 병든 세포, 예컨대 종양 세포의 성장을 억제하는데 사용하기 위한 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및 선택적으로 키메라 수용체 폴리펩타이드를 발현하는 면역 세포(예를 들어, 시험관내 또는 생체내에서 작제된 T 림프구 또는 NK 세포)의 집단을 포함하는 키트를 제공한다. 상기 키트는 치료제 또는 상기 면역 세포 상에서 발현되는 키메라 수용체 폴리펩타이드가 결합하는 태그(예를 들어, 본원에 기재된 것)에 접합된 치료제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 키트는 본원에 기재된 것과 같은 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 및 키메라 수용체 폴리펩타이드를 공동발현하는, 본원에 기재된 것과 같은 유전자 조작된 면역 세포(예를 들어, T 림프구 및/또는 NK 세포)의 집단, 및 선택적으로 치료제 또는 태그에 접합된 치료제를 포함하는 하나 이상의 용기를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 키트는 시험관내에서 확대되는, 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드-발현성 및 키메라 수용체 폴리펩타이드-발현성 면역 세포, 및 활성화된 T 세포에 존재하는 세포 표면 항체에 특이적인 항체, 예를 들어 항-CD5 항체, 항-CD38 항체 또는 항-CD7 항체를 포함한다. 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드-발현성 및 키메라 수용체 폴리펩타이드-발현성 면역 세포는 본 기술분야에 공지되거나 본원에 개시된 임의의 키메라 수용체 폴리펩타이드 작제물을 발현할 수 있다.
대안적으로, 본원에 개시된 키트는 본원에 기재된 핵산 또는 핵산 세트를 포함할 수 있고, 이는 역시 본원에 기재된 임의의 키메라 수용체 폴리펩타이드 및 임의의 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드를 종합적으로 암호화한다.
일부 구현예에서, 상기 키트는 본원에 기재된 임의의 방법에 사용하기 위한 지침을 추가로 포함할 수 있다. 포함된 지침은 의도된 활성을 달성하기 위해, 예를 들어, 대상체에서 표적 세포 성장을 억제하고, 및/또는 낮은 글루코스 환경, 낮은 아미노산(예를 들어, 낮은 글루타민 환경) 환경, 낮은 pH 환경, 및/또는 저산소 환경(예를 들어, 낮은 글루코스, 낮은 아미노산, 낮은 pH 또는 저산소 종양 미세환경)에서 면역 세포의 성장 및/또는 증식을 향상시키기 위해 대상체에게 상기 제1 및 제2 약제학적 조성물을 투여하는 설명을 포함할 수 있다. 상기 키트는 대상체가 치료를 필요로 하는지를 확인하는 것을 기반으로 하는 치료에 적합한 대상체를 선택하는 것에 대한 설명을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 지침은 유전자 조작된 면역 세포 집단을 투여하는 것에 대한 설명 및 선택적으로 태그-접합된 치료제를 투여하는 것에 대한 설명을 포함한다.
본원에 기재된 바와 같은 면역 세포 및 선택적으로 태그-접합된 치료제의 사용에 관한 지침은 일반적으로 의도된 치료를 위한 투여량, 투여 일정 및 투여 경로에 관한 정보를 포함한다. 용기는 단위 용량, 벌크 패키지(예를 들어, 다회용량 패키지) 또는 하위단위 용량일 수 있다. 본 개시내용의 키트에 공급된 지침은 일반적으로 라벨 또는 패키지 인서트에 쓰여진 지침이다. 상기 라벨 또는 패키지 인서트는 약제학적 조성물이 대상체의 질병 또는 장애를 치료, 발병 지연 및/또는 완화시키는데 사용됨을 나타낸다.
본원에 제공된 키트는 적합한 포장재에 존재한다. 적합한 포장재는 바이알, 보틀, 병(jar), 유연한 포장재, 및 이의 유사물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 특정 장치, 예컨대 흡입기, 비측 투여 장치, 또는 주입 장치와 조합으로 사용하기 위한 패키지도 고려된다. 키트는 멸균 접근 포트일 수 있다(예컨대, 상기 용기는 피하 주사 바늘이 꽂힐 수 있는 스토퍼를 갖는 정맥내 용액 백(bag) 또는 바이알일 수 있다). 상기 용기도 멸균 접근 포트를 가질 수 있다. 상기 제2 약제학적 조성물 중의 적어도 하나의 활성제는 본원에 기재된 항체이다. 상기 제1 약제학적 조성물 중의 적어도 하나의 활성제는 본원에 기재된 키메라 수용체 폴리펩타이드 및 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드를 발현하는 면역 세포(예컨대, T 림프구 또는 NK 세포)의 집단이다.
키트는 선택적으로 완충액과 같은 부가적인 성분 및 설명 정보를 제공할 수 있다. 보통, 상기 키트는 용기 및 상기 용기 상의 또는 용기에 결합된 라벨 또는 패키지 인서트(들)를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용은 전술한 키트의 내용물을 포함하는 제조 물품을 제공한다.
일반 기술
본 개시내용의 실행은 달리 지시되지 않는 한, 본 기술분야의 기술 내에 있는 분자생물학(재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기술을 사용할 것이다. 이러한 기술은 문헌, 예컨대 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition(Sambrook, 등, 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis(M.J. Gait, ed. 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook(J. E. Cellis, ed., 1989) Academic Press; Animal Cell Culture(R. I. Freshney, ed. 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture(J. P. Mather 및 P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures(A. Doyle, J. B. Griffiths 및 D. G. Newell, eds. 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology(Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology(D. M. Weir 및 C.C. Blackwell, eds.): Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J. M. Miller 및 M. P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology(F. M. Ausubel, 등 eds. 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction,(Mullis, 등, eds. 1994); Current Protocols in Immunology(J. E. Coligan 등, eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology(Wiley and Sons, 1999); Immunobiology(C. A. Janeway 및 P. Travers, 1997); Antibodies(P. Finch, 1997); Antibodies: a practice approach(D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach(P. Shepherd 및 C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual(E. Harlow 및 D. Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies(M. Zanetti 및 J.D. Capra, eds. Harwood Academic Publishers, 1995); DNA Cloning: A practical Approach, Volumes I and II(DN Glover ed. 1985); Nucleic Acid Hybridization(BD Hames & S.J. Higgins eds.1985≫; Transcription and Translation(BD Hames & SJ Higgins, eds.(1984≫; Animal Cell Culture(R.I. Freshney, ed.(1986≫; Immobilized Cells and Enzymes(lRL Press,(1986)); 및 B. Perbal, A practical Guide To Molecular Cloning(1984); FM Ausubel 등(eds.)을 참조한다.
추가 상세한 설명 없이, 본 기술분야의 기술자는 상기 설명에 기초하여 본 개시내용을 최대한 활용할 수 있다고 생각한다. 따라서, 다음의 구체적인 구현예는 단지 예시적인 것으로 해석되어야 하며, 어떤 식으로든지 본 개시내용의 나머지를 제한하지 않는다. 본 명세서에 인용된 모든 간행물은 본 명세서에서 언급된 목적 또는 주제를 위해 참조로 포함된다.
실시예
실시예 1: 낮은 글루코스 환경에서 T 세포 기능에 대한 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 발현의 영향.
크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 전이유전자는 ACTR 폴리펩타이드와 함께 동일한 T 세포에서 공동발현된다. 상기 전이유전자는, 예를 들어, PHGDG, PCK1, IDH1, IDH1, MDH1, MDH2, GOT1, GOT2, PSAT1, GDH1, GPT1 또는 GLS(예를 들어, 서열번호 81-92)이다. 상기 T 세포는, 예를 들어 P2A 리보솜 스킵 서열에 의해 분리 된, 상기 ACTR 폴리펩타이드 및 글루코스 이입 폴리펩타이드를 암호화하는 바이러스에 의해 형질도입된다. 상기 T 세포는 IGROV-1 세포와 같은 종양 표적 세포 및 항-FOLR1 항체와 같은 종양 표적화 항체와 함께 주어진 이펙터 대 표적(E:T) 비율로 혼합된다. 반응물은 그 다음 상이한 출발 농도의 글루코스(예컨대, 0-20mM)에서 5% CO2 항온배양기에서 일정 기간(예컨대, 6-8일) 동안 37℃에서 항온배양된다. T 세포 기능은 그 다음, 예를 들어, 사이토카인 생산 또는 T 세포 증식 검정을 사용하여 평가하거나, 또는 만성 자극에 대한 내성에 대해 평가된다. 사이토카인 생산(예컨대, IL-2 및/또는 IFN-감마)은 반응 상청액에서 측정된다. 증식 실험을 위해, 공동배양물을 수확하고 항-CD3 항체 및 생-사세포(live-dead cell) 염색으로 염색한다. CD3 양성 생세포의 수는 T 세포 증식의 척도로서 유세포분석에 의해 평가한다. 상기 ACTR 폴리펩타이드 외에도 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드를 발현하는 T 세포는 ACTR을 단독 발현하는 T 세포에 비해, 예를 들어, 향상된 사이토카인 생산 또는 향상된 증식을 포함하는 향상된 T 세포 기능을 나타낸다. 상기 향상된 기능은 더 낮은 글루코스 농도에서 더욱 현저해질 수 있다. 본 실험은 T 세포에서 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드를 발현하는 것이 T 세포 활성에 긍정적인 영향을 미친다는 것을 입증한다.
실시예 2: 더 높은 가용성 억제제 농도를 갖는 환경에서 T 세포 기능에 대한 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 유전자 발현의 영향.
크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 전이유전자는 ACTR 폴리펩타이드와 함께 동일한 T 세포에서 공동발현된다. 상기 전이유전자는, 예를 들어, PHGDG, PCK1, IDH1, IDH1, MDH1, MDH2, GOT1, GOT2, PSAT1, GDH1, GPT1 또는 GLS(예를 들어, 서열번호 81-92)이다. 상기 T 세포는, 예를 들어, P2A 리보솜 스킵 서열에 의해 분리된, 상기 ACTR 폴리펩타이드와 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드를 암호화하는 바이러스에 의해 형질도입된다. 형질도입된 T 세포는 종양 미세환경에 존재하는 상이한 농도의 가용성 억제제(예컨대, TGF-베타, PGE2, 키누레닌, 및/또는 아데노신)를 함유하는 배지에서, IGROV-1 세포와 같은 종양 표적 세포 및 항-FOLR1 항체와 같은 종양 표적화 항체와 함께 주어진 이펙터 대 표적(E:T) 비율로 혼합된다. 반응물은 그 다음 5% CO2 항온배양기에서 일정 기간(예컨대, 6-8일) 동안 37℃에서 항온배양된다. T 세포 기능은 그 다음, 예를 들어, 사이토카인 생산 또는 T 세포 증식 검정을 사용하여 평가하거나, 또는 만성 자극에 대한 내성에 대해 평가한다. 사이토카인 생산(예컨대, IL-2 및/또는 IFN-감마)은 반응 상청액에서 측정한다. 증식 실험을 위해, 공동배양물을 수확하고 항-CD3 항체 및 생-사세포 염색으로 염색한다. CD3 양성 생세포의 수는 T 세포 증식의 척도로서 유세포분석에 의해 평가한다. ACTR 폴리펩타이드 외에도 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드를 발현하는 T 세포는 ACTR을 단독 발현하는 T 세포에 비해, 예를 들어, 향상된 사이토카인 생산 또는 향상된 증식을 포함하는 향상된 T 세포 기능을 나타낸다. 상기 향상된 기능은 더 높은 가용성 억제제 농도에서 달성될 수 있다. 본 실험은 T 세포에서 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드를 발현하는 것이 T 세포 활성에 긍정적인 영향을 미친다는 것을 입증한다.
실시예 3: 더 많은 면역억제 세포 존재를 가진 환경에서 T 세포 기능에 대한 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 발현의 영향.
크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 전이유전자는 ACTR 폴리펩타이드와 함께 동일한 T 세포에서 공동발현된다. 상기 전이유전자는, 예를 들어, PHGDG, PCK1, IDH1, IDH1, MDH1, MDH2, GOT1, GOT2, PSAT1, GDH1, GPT1 또는 GLS(예를 들어, 서열번호 81-92)이다. 상기 T 세포는, 예를 들어 P2A 리보솜 스킵 서열에 의해 분리된, 상기 ACTR 폴리펩타이드 및 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드를 암호화하는 바이러스에 의해 형질도입된다. 형질도입된 T 세포는 면역억제성 세포(예컨대, 골수-유래 억제인자 세포 및/또는 조절성 T 세포)의 존재 하에, IGROV-1 세포와 같은 종양 표적 세포 및 항-FOLR1 항체와 같은 종양 표적화 항체와 함께 주어진 이펙터 대 표적(E:T) 비율로 혼합된다. 반응물은 그 다음 5% CO2 항온배양기에서 일정 시간(예컨대, 3-10일) 동안 37℃에서 항온배양된다. T 세포 기능은 그 다음, 예를 들어, 사이토카인 생산 또는 T 세포 증식 검정을 사용하여 평가하거나, 또는 만성 자극에 대한 내성에 대해 평가한다. 사이토카인 생산(예컨대, IL-2 및/또는 IFN-감마)은 반응 상청액에서 측정한다. 증식 실험을 위해 공동배양물을 수확하고 항-CD3 항체 및 생-사세포 염색으로 염색한다. CD3 양성 생세포의 수는 T 세포 증식의 척도로서 유세포분석에 의해 평가한다. ACTR 폴리펩타이드 외에도 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드를 발현하는 T 세포는 ACTR을 단독 발현하는 T 세포에 비해, 예를 들어, 향상된 사이토카인 생산 또는 향상된 증식을 포함하는 향상된 T 세포 기능을 나타낸다. 이러한 향상된 기능은 면역억제 세포의 증가된 양(예를 들어, 더 많은 수 또는 백분율)의 존재 하에 달성될 수 있다. 본 실험은 T 세포에서 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드를 발현하는 것이 T 세포 활성에 긍정적인 영향을 미친다는 것을 입증한다.
실시예 4: 종양 모델에서 T 세포 기능에 미치는 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 발현의 영향.
크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 전이유전자는 ACTR 폴리펩타이드와 함께 동일한 T 세포에서 공동발현된다. 전이유전자는, 예를 들어, PHGDG, PCK1, IDH1, IDH1, MDH1, MDH2, GOT1, GOT2, PSAT1, GDH1, GPT1 또는 GLS(예를 들어, 서열번호 81-92)이다. 상기 T 세포는, 예를 들어 P2A 리보솜 스킵 서열에 의해 분리된, 상기 ACTR 폴리펩타이드 및 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드를 암호화하는 바이러스에 의해 형질도입된다. 형질도입된 T 세포는 마우스 종양 모델에서 항종양 활성에 대해 평가된다. 이 실험을 위해, 종양 세포주, 예를 들어 IGROV-1을 NSG™(NOD scid 감마, NOD.Cg-Prkdc scid IL2rgtm1Wjl/SzJ, 계통 005557) 마우스에 접종한다. 종양-보유 마우스에게 후속적으로 종양 표적화 항체 및 ACTR 단독 또는 ACTR 및 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드를 발현하는 T 세포를 투여한다. 종양 성장은 실험 과정 내내 모니터한다. 종양 표적화 항체와 조합되는, ACTR 폴리펩타이드 외에도 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드를 발현하는 T 세포는 ACTR 폴리펩타이드를 단독으로 발현하는 T 세포에 비해 향상된 항종양 활성을 나타낸다. 또한, 종양-표적화 항체와 조합되는, ACTR 폴리펩타이드에 더하여 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드를 발현하는 T 세포는 ACTR 폴리펩타이드를 단독으로 발현하는 T 세포에 비해, 예를 들어, 향상된 증식, 향상된 T 세포 지속성 및/또는 향상된 사이토카인 생산을 포함하는 향상된 T 세포 활성을 나타낼 수 있다. 본 실험은 ACTR 발현 T 세포에서 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드를 발현하는 것이 생체내에서 T 세포 기능에 긍정적인 영향을 미친다는 것을 입증한다.
실시예 5: T 세포 기능에 대한 감소된 글루코스 농도의 영향
서열번호 104의 예시적인 GPC3-표적화 CAR 발현 작제물을 암호화하는 감마-레트로바이러스는 재조합 기술을 통해 생성하였고 원발성 인간 T-세포를 감염시키는데 사용하여, 세포 표면에서 GPC3-표적화 CAR 폴리펩타이드를 발현하는 세포를 생성하였다. 그 다음, 6일간 유동 기반의 증식 검정을 사용하여 상기 GPC3 표적화 CAR 발현 세포의 기능성을 시험하였다. 구체적으로, 200,000개의 형질도입되지 않은 모의 T 세포 또는 상기 GPC3-표적화 CAR 작제물을 발현하는 T-세포를 50,000개의 GPC3+ 간세포 암종 JHH7 또는 Hep3B 종양 세포와 4:1(이펙터 세포/CAR-발현 T 세포 대 표적 세포)의 비율로 함께 항온배양하였다. 상기 공동배양물은 상이한 농도의 글루코스의 존재 하에 5% CO2 항온배양기에서 6일 동안 37℃에서 항온배양하였다. 6일째 마지막에, 공동배양물을 수확하고 항-CD3 항체로 염색하였다. CD3-양성 세포의 수를 T 세포 증식의 척도로서 유세포분석에 의해 평가하였다. 더 낮은 글루코스 농도에서, 더 적은 CAR-T 증식이 관찰되었다(도 1). 본 실험은 낮은 글루코스 환경이 CAR-T 세포 증식 활성에 부정적인 영향을 미칠 수 있음을 입증한다.
실시예 6: GPC3-표적화 CAR-T 발현 작제물을 사용한 T 세포 기능에 대한 크렙스 사이클 조정 유전자 발현의 영향
예시적인 GPC3-표적화 CAR 폴리펩타이드 발현 작제물(서열번호 104)을 암호화하는 감마-레트로바이러스는 재조합 기술을 통해 생성하였고, 원발성 인간 T 세포를 감염시키는데 사용하여 그 세포 표면에 GPC3-표적화 CAR 폴리펩타이드를 발현하는 세포를 생성하였다. 부가적으로, 예시적인 GPC3-표적화 CAR 폴리펩타이드 및 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드(GOT1 및 GOT2)(각각 서열번호 87 및 88)를 암호화하는 감마-레트로바이러스를 재조합 기술을 통해 생성하고 원발성 인간 T-세포를 감염시키는데 사용하여 GPC3-표적화 폴리펩타이드 및 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드를 발현하는 세포를 생성하였다. 상기 CAR 폴리펩타이드 및 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드를 모두 암호화하는 작제물에서, 두 폴리펩타이는 P2A 리보솜 스킵 서열에 의해 분리되었다. 발현된 변이체는 항-GPC3 CAR + GOT1 및 항-GPC3 CAR + GOT2였다. 그 다음, 6일간 유동 기반의 증식 검정을 사용하여 상기 GPC3-표적화 CAR 발현 세포의 기능성을 시험하였다. 구체적으로, 200,000개의 형질도입되지 않은 모의 T-세포, GPC3-표적화 CAR 폴리펩타이드를 발현하는 T-세포 또는 GPC3-표적화 CAR 폴리펩타이드 및 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드를 발현하는 T-세포를 50,000개의 GPC3+ 간세포 암종 JHH7 종양 세포와 4:1(이펙터 CAR 발현성 T 세포 대 표적 세포)의 비율로 함께 항온배양하였다. 상기 공동배양물은 1.25mM 글루코스(종양 관련) 및 10mM 글루코스(대략적인 말초 혈액 수준)의 존재 하에 5% CO2에서 37℃에서 6일 동안 항온배양하였다. 6일째 마지막에, 공동배양물을 수확하고 항-CD3 항체로 염색하였다.
CD3-양성 세포의 수는 T 세포 증식의 척도로서 유세포분석에 의해 평가하였다. CAR 폴리펩타이드 외에도 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드를 발현하는 T 세포는 CAR 작제물을 단독으로 발현하는 T 세포에 비해 향상된 T 세포 증식을 입증하였다(도 2a, 2b, 3a, 및 3b). 이러한 향상된 증식은 또한 종양 관련된 낮은 글루코스 농도에서도 발생하였다. 본 실험은 T 세포에서 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드를 발현시키는 것이 CAR-T 세포 증식 활성에 긍정적인 영향을 미친다는 것을 입증하였다.
실시예 7: 더 낮은 글루코스 환경에서 T 세포 기능에 대한 크렙스 사이클 조정 유전자 발현의 영향
크렙스 사이클 조정 전이유전자는 키메라 항원 수용체(CAR) 폴리펩타이드와 함께 동일한 T 세포에서 공동발현된다. 상기 전이유전자는, 예를 들어, GPT1, GLS, PCK1, GOT1, GOT2, IDH1, IDH2, MDH1, MDH2, PHGDH, PSAT1, 또는 GDH1(예를 들어, 서열번호 81-92)이다. 상기 T 세포는, 예를 들어, P2A 리보솜 스킵 서열에 의해 분리된, 상기 CAR 폴리펩타이드 및 상기 크렙스 사이클 대사산물 폴리펩타이드를 암호화하는 바이러스에 의해 형질도입된다. 상기 T 세포는 HepG2 세포와 같은 종양 표적 세포와 주어진 이펙터 대 표적(E:T) 비율로 혼합된다. 반응물은 그 다음, 5% CO2 항온배양기에서 일정 기간(예컨대, 6-8일) 동안, 상이한 출발 농도의 글루코스(예컨대, 0-20mM)에서 37℃에서 항온배양한다. 그 다음, T 세포 기능은, 예를 들어, 사이토카인 생산 또는 T 세포 증식 검정을 사용하여 평가한다. 사이토카인 생산(예컨대, IL-2 및/또는 IFN-감마)은 반응 상청액에서 측정한다. 증식 실험을 위해, 공동배양물을 수확하고 항-CD3 항체 및 생-사세포 염색으로 염색한다. CD3 양성 생세포의 수는 T 세포 증식의 척도로서 유세포분석에 의해 평가한다.
상기 CAR 폴리펩타이드 외에도 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드를 발현하는 T 세포는 CAR을 단독으로 발현하는 T 세포에 비해, 예를 들어, 향상된 사이토카인 생산 또는 향상된 증식을 포함하는 향상된 T 세포 기능을 나타낼 것으로 예측된다. 이 향상된 기능은 더 낮은 글루코스 농도에서 더욱 현저해질 수 있다.
실시예 8: 더 높은 가용성 억제제 농도를 갖는 환경에서 T 세포 기능에 대한 크렙스 사이클 조정 유전자 발현의 영향
크렙스 사이클 조정 전이유전자는 키메라 항원 수용체(CAR) 폴리펩타이드와 함께 동일한 T 세포에서 공동발현된다. 상기 전이유전자는, 예를 들어, GPT1, GLS, PCK1, GOT1, GOT2, IDH1, IDH2, MDH1, MDH2, PHGDH, PSAT1, 또는 GDH1(예를 들어, 서열번호 81-92)이다. 상기 T 세포는, 예를 들어, P2A 리보솜 스킵 서열에 의해 분리된, 상기 CAR 폴리펩타이드 및 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드를 암호화하는 바이러스에 의해 형질도입된다. 형질도입된 T 세포는 종양 미세환경에 존재하는 상이한 농도의 가용성 억제제(예컨대, TGF-베타, PGE2, 및/또는 아데노신)를 함유하는 배지에서 HepG2 세포와 같은 종양 표적 세포와 주어진 이펙터 대 표적(E:T) 비율로 혼합된다. 반응물은 그 다음 5% CO2 항온배양기에서 일정 기간(예컨대, 6-8일) 동안 37℃에서 항온배양된다. T 세포 기능은 그 다음, 예를 들어, 사이토카인 생산 또는 T 세포 증식 검정을 사용하여 평가한다. 사이토카인 생산(예컨대, IL-2 및/또는 IFN-감마)은 반응 상청액에서 측정한다. 증식 실험을 위해, 공동배양물을 수확하고 항-CD3 항체 및 생-사세포 염색으로 염색한다. CD3 양성 생세포의 수는 T 세포 증식의 척도로서 유세포분석에 의해 평가한다.
상기 CAR 폴리펩타이드 외에도 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드를 발현하는 T 세포는 CAR를 단독으로 발현하는 T 세포에 비해, 예를 들어, 향상된 사이토카인 생산 또는 향상된 증식을 포함하는 향상된 T 세포 기능을 나타낼 것으로 예측된다. 이러한 향상된 기능은 더 높은 가용성 억제제 농도에서 달성될 수 있다.
실시예 9: 더 많은 면역억제 세포 존재를 갖는 환경에서 T 세포 기능에 대한 크렙스 사이클 조정 유전자 발현의 영향
크렙스 사이클 대사산물 분로 전이유전자는 키메라 항원 수용체(CAR) 폴리펩타이드와 함께 동일한 T 세포에서 공동발현된다. 상기 전이유전자는, 예를 들어, GPT1, GLS, PCK1, GOT1, GOT2, IDH1, IDH2, MDH1, MDH2, PHGDH, PSAT1, 또는 GDH1 (예를 들어, 서열번호 81-92)이다. 상기 T 세포는, 예를 들어, P2A 리보솜 스킵 서열에 의해 분리된, 상기 CAR 폴리펩타이드와 상기 크렙스 사이클 대사산물 분로 폴리펩타이드를 암호화하는 바이러스에 의해 형질도입된다. 형질도입된 T 세포는 형광 라벨로 표지된 면역억제성 세포(예컨대, 골수-유래 억제인자 세포 및/또는 조절성 T 세포)의 존재 하에, HepG2 세포와 같은 종양 표적 세포와 주어진 이펙터 대 표적(E:T) 비율로 혼합한다. 반응물은 5% CO2 항온배양기에서 일정 시간(예컨대, 3-10일) 동안 37℃에서 항온배양된다. T 세포 기능은 그 다음, 예를 들어, 사이토카인 생산 또는 T 세포 증식 검정을 사용하여 평가한다. 사이토카인 생산(예컨대, IL-2 및/또는 IFN-감마)은 반응 상청액에서 측정한다. 증식 실험을 위해, 공동 배양물을 수확하고 항-CD3 항체 및 생-사세포 염색으로 염색한다. CD3 양성의 미표지된 생세포의 수는 T 세포 증식의 척도로서 유세포분석에 의해 평가한다.
상기 CAR 폴리펩타이드 외에도 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드를 발현하는 T 세포는 CAR을 단독으로 발현하는 T 세포에 비해, 예를 들어 향상된 사이토카인 생산 또는 향상된 증식을 포함하는 향상된 T 세포 기능을 나타낼 것으로 예측된다. 이러한 향상된 기능은 면역억제 세포의 증가된 양(예를 들어, 더 많은 수 또는 백분율)의 존재 하에 달성될 수 있다.
실시예 10: GPC3-표적화 CAR-T 발현 작제물을 사용한 마우스 종양 모델에서 T 세포 기능에 대한 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 발현의 영향
크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드(GOT2)(서열번호 88)를 GPC3-표적화 CAR-T 폴리펩타이드(서열번호 104)와 함께 동일한 T 세포에서 공동발현시켰다. GPC3-표적화 CAR-T 발현 작제물을 암호화하는 감마-레트로바이러스를 생성하였고, 원발성 인간 T 세포를 감염시키는데 사용하여 세포 표면에서 GPC3-표적화 CAR-T를 발현한 세포를 생성하였다. 상기 T 세포를 또한 P2A 리보솜 스킵 서열에 의해 분리된 항-GPC3 CAR 폴리펩타이드 및 GOT2를 암호화하는 바이러스를 이용하여 형질도입시켰다.
상기 CAR 형질도입된 T 세포는 마우스 종양 모델에서 항종양 활성에 대해 평가하였다. 이 실험을 위해, 간세포 암종 종양 세포주, JHH7을 NSG™(NOD scid 감마, NOD.Cg-Prkdc scid IL2rgtmWjl/SzJ, 계통 005557) 마우스에게 접종하였다. 종양 부피가 약 50 mm3(접종 후 8일)에 도달했을 때 항-GPC3 CAR-발현 T 세포를 사용한 치료를 개시하였다. 마우스를 종양 부피를 기준으로 각각 5 마리 마우스의 치료 그룹으로 무작위로 선발하고, GPC3-표적화 CAR을 발현하는 T 세포를 사용하여 접종 후 8일 및 15일째 5x106 CAR+ T 세포의 용량으로 치료하였다. 총 T 세포 용량은 각 작제물의 CAR 형질도입 효율을 기반으로 하여 변동되었다.
종양 부피와 체중은 실험 기간 동안 매주 2 내지 3회 측정하였다. GOT2를 공동발현하는 CAR-T 세포는 GPC3 CAR 작제물만을 발현하는 T 세포에 비해 향상된 항종양 효능을 입증하였다(도 4). 본 실험은 CAR-T 세포에서 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드를 발현하는 것이 간세포 암종의 마우스 이종이식편 모델에서 CAR-T 세포 항종양 효능에 긍정적인 영향을 미친다는 것을 입증하였다.
상기 CAR 형질도입된 T 세포는 마우스 종양 모델에서 항종양 활성에 대해 평가하였다. 이 실험을 위해, 간세포 암종 종양 세포주, Hep3B를 NSG™(NOD scid 감마, NOD.Cg-Prkdc scid IL2rgtmWjl/SzJ, 계통 005557) 마우스에게 접종하였다. 종양 부피가 약 100 mm3(접종 후 20일)에 도달했을 때 항-GPC3 CAR-발현 T 세포를 사용한 치료를 개시하였다. 마우스를 종양 부피를 기준으로 각각 5 마리 마우스의 치료 그룹으로 무작위로 선발하고, GPC3-표적화 CAR을 발현하는 T 세포를 사용하여 접종 후 20일 및 27일째에 1x106 CAR+ T 세포의 용량으로 치료하였다. 총 T 세포 용량은 각 작제물의 CAR 형질도입 효율을 기반으로 하여 변동되었다.
종양 부피와 체중은 실험 기간 동안 매주 2 내지 3회 측정하였다. GOT2를 공동발현하는 CAR-T 세포는 GPC3 CAR 작제물만을 발현하는 T 세포에 비해 향상된 항종양 효능을 입증하였다(도 6). 본 실험은 CAR-T 세포에서 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드를 발현하는 것이 간세포 암종의 마우스 이종이식편 모델에서 CAR-T 세포 항종양 효능에 긍정적인 영향을 미친다는 것을 입증하였다.
상기 CAR 형질도입된 T 세포는 마우스 종양 모델에서 항 종양 활성에 대해 평가하였다. 이 실험을 위해, 소세포 폐암 종양 세포주, NCI-H446을 NSG™(NOD scid 감마, NOD.Cg-Prkdc scid IL2rgtmWjl/SzJ, 계통 005557) 마우스에게 접종하였다. 종양 부피가 약 100 mm3(접종 후 18일)에 도달했을 때 항-GPC3 CAR-발현 T 세포를 사용한 치료를 개시하였다. 마우스를 종양 부피를 기준으로 각각 5 마리 마우스의 치료 그룹으로 무작위로 선발하고, GPC3-표적화 CAR을 발현하는 T 세포를 사용하여 접종 후 18일 및 25일째 5x106 CAR+ T 세포의 용량으로 치료하였다. 총 T 세포 용량은 각 작제물의 CAR 형질도입 효율을 기반으로 하여 변동되었다.
종양 부피와 체중은 실험 기간 동안 매주 2 내지 3회 측정하였다. GOT2를 공동발현하는 CAR-T 세포는 GPC3 CAR 작제물만을 발현하는 T 세포에 비해 향상된 항종양 효능을 입증하였다(도 5). 본 실험은 CAR-T 세포에서 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드를 발현하는 것이 소세포 폐암의 마우스 이종이식편 모델에서 CAR-T 세포 항종양 효능에 긍정적인 영향을 미친다는 것을 입증하였다.
실시예 11: GPC3-표적화 CAR-T 발현 작제물을 사용한 마우스 종양 모델에서 T 세포 확대에 대한 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 발현의 영향
크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드(GOT2)(서열번호 88)를 GPC3-표적화 CAR-T 폴리펩타이드(서열번호 104)와 함께 동일한 T 세포에서 공동발현시켰다. GPC3-표적화 CAR-T 발현 작제물을 암호화하는 감마-레트로바이러스를 생성하였고, 원발성 인간 T 세포를 감염시키는데 사용하여 세포 표면에서 GPC3-표적화 CAR-T를 발현한 세포를 생성하였다. 상기 T 세포를 또한 P2A 리보솜 스킵 서열에 의해 분리된 항-GPC3 CAR 폴리펩타이드 및 GOT2를 암호화하는 바이러스를 이용하여 형질도입시켰다.
상기 CAR 형질도입된 T 세포는 마우스 종양 모델에서 확대에 대해 평가하였다. 이 실험을 위해, 간세포 암종 종양 세포주, Hep3B를 NSG™(NOD scid 감마, NOD.Cg-Prkdc scid IL2rgtmWjl/SzJ, 계통 005557) 마우스에게 접종하였다. 종양 부피가 약 100 mm3(접종 20일 후)에 도달했을 때 항-GPC3 CAR-발현 T 세포를 사용한 치료를 개시하였다. 마우스를 종양 부피를 기준으로 각각 5 마리 마우스의 치료 그룹으로 무작위로 선발하고, GPC3-표적화 CAR을 발현하는 T 세포를 사용하여 접종 후 20일 및 27일째 1x106 CAR+ T 세포의 용량으로 치료하였다. 총 T 세포 용량은 각 작제물의 CAR 형질도입 효율을 기반으로 하여 변동되었다.
말초혈액을 수집하였고, 항-CD3 및 항-CAR 항체로 염색하였다. CD3 양성 및 CAR 양성 세포의 수는 T 세포 확대 및 CAR 활성의 척도로서 유세포분석에 의해 평가하였다. GOT2를 공동발현하는 CAR-T 세포는 GPC3 CAR 작제물만을 발현하는 T 세포에 비해 향상된 T 세포 확대를 입증하였다(도 7). 본 실험은 CAR-T 세포에서 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드를 발현하는 것이 간세포 암종의 마우스 이종이식편 모델에서 CAR-T 세포 확대에 긍정적인 영향을 미친다는 것을 입증하였다.
실시예 12: T 세포에서 크렙스 사이클 조정 유전자(GOT2) 및 GPC3-표적화 CAR의 공동발현은 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제 효소 활성을 증가시킨다
예시적인 GPC3-표적화 CAR 폴리펩타이드 발현 작제물(서열번호 104)을 암호화하는 감마-레트로바이러스는 재조합 기술을 통해 생성하였고, 원발성 인간 T 세포를 감염시키는데 사용하여 그 세포 표면에 GPC3-표적화 CAR 폴리펩타이드를 발현하는 세포를 생성하였다. 부가적으로, 예시적인 GPC3-표적화 CAR 폴리펩타이드 및 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드(GOT2)(서열번호 88)를 암호화하는 감마-레트로바이러스를 재조합 기술을 통해 생성하고 원발성 인간 T-세포를 감염시키는데 사용하여 P2A 리보솜 스킵 서열에 의해 분리된 두 폴리펩타이드인 GPC3-표적화 폴리펩타이드 및 GOT2를 발현하는 세포를 생성하였다. GOT2의 발현은 웨스턴 블롯을 사용하여 확인하였다. CAR 형질도입된 T 세포를 GPC3+ 간세포 암종 Hep3B 종양 세포와 4:1 이펙터 대 표적 비율로 혼합하고, 37℃, 5% CO2에서 4일 동안 항온배양하였다. 항온배양 후, 세포 용해물을 1x106 세포로부터 제조하였고, 세포 용해물을 Bolt LDS 샘플 완충액(Invitrogen) 및 100nM DTT와 배합하였고, 2개의 개별 겔 상에서 진행시켰다. 그 다음, 상기 겔로부터 단백질을 니트로셀룰로스 막(BioRad의 Transblot turbo transfer pack) 위로 전이시켰다. 블롯은 토끼 항-인간 GOT2 항체(Origene)를사용하여 GOT2 발현에 대해 밤새 탐침하였고, 그 다음 HRP-접합된 항-토끼 항체로 탐침하거나, 또는 GAPDH 발현에 대해 마우스 항-인간 GAPDH(Biolegend)를 사용하여 탐침한 다음, HRP-접합된 항-마우스 IgG 2차 항체로 탐침하였다. GOT2 발현은 모체 CAR에 비해 CAR + GOT2 작제물에 의해 형질도입된 T 세포에서 더 컸다(도 8a).
형질도입된 T 세포를 GPC3+ 간세포 암종 Hep3B 종양 세포와 4:1 이펙터 대 표적 비율로 혼합하고 37℃, 5% CO2에서 8일 동안 항온배양하였다. 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제(AST) 효소 활성은 제조업체의 프로토콜에 따라 Aspartate Aminotransferase Activity Assay Kit(Abcam)를 사용하여 측정하였다. AST 활성은 37℃에서 1분당 생성되는 글루타메이트의 양을 측정하여 계산한다. 본 실시예에서 AST 활성은 기질 첨가 후 50분째에 계산하였다. CAR 폴리펩타이드 외에도 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드 GOT2를 발현하는 T 세포는 종양 세포에 의해 활성화 후에 증가된 AST 활성을 입증하였다(도 8b). 이 실험은 T 세포에서 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드를 발현하는 것이 T 세포 기능에 긍정적인 영향을 미친다는 것을 입증한다.
실시예 13: T 세포에서 크렙스 사이클 조정 유전자(GOT2) 및 GPC3-표적화 CAR 또는 ACTR의 공동발현은 증식을 향상시킨다
크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드(GOT2)(서열번호 10)를 GPC3-표적화 CAR-T 폴리펩타이드(서열번호 1)와 동일한 T 세포에서 공동발현시켰다. 상기 T 세포를 상기 CAR 폴리펩타이드 단독 또는 P2A 리보솜 스킵 서열에 의해 분리된 CAR 및 GOT2를 암호화하는 바이러스를 이용하여 형질도입시켰다. GPC3-표적화 CAR을 발현하는 T 세포 및 GPC3-CAR 및 GOT2를 공동발현하는 T 세포를 세포 추적 바이올렛, 형광 표지 세포 단백질에 의해 표지한 다음, GPC3+ 간세포 암종 Hep3B 종양 세포와 2:1 이펙터 대 표적 비율로 혼합하였다. 활성화 후 6일째에, 세포를 항-CD3으로 염색하고, 증식을 측정하기 위해 활성화 후 6일째에 유세포분석에 의해 세포 추적 바이올렛 희석을 측정하였다. CAR 및 GOT2를 공동발현하는 T 세포의 CD3+ 세포의 세포 추적 바이올렛 평균 형광 강도의 역수를 CAR만을 발현하는 T 세포의 평균 형광 강도의 역수에 상대적으로 나타내었다. 상기 CAR 폴리펩타이드와 조합된 GOT2를 발현하는 T 세포는 CAR만을 발현하는 T 세포에 비해 증가된 세포 분열을 입증하였다. 도 9a.
크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드(GOT2)(서열번호 10)를 ACTR 폴리펩타이드(서열번호 1)와 동일한 T 세포에서 공동발현시켰다. 상기 T 세포는 ACTR 폴리펩타이드 단독 또는 P2A 리보솜 스킵 서열에 의해 분리된 ACTR 및 GOT2를 암호화하는 바이러스를 이용하여 형질도입시켰다. ACTR을 발현하는 T 세포 및 ACTR 및 GOT2를 공동발현하는 T 세포를 GPC3+ 간세포 암종 HepG2 종양 세포 및 1 μg/mL 항-GPC3 항체 GC33[Nakano, K 등. Anticancer 2010 Nov; 21(10):907-16 참조]과 2:1 이펙터 대 표적 비율로 혼합하였다. 활성화 후 3일째에, 항-CD3 항체로 염색한 후 유세포분석으로 T 세포 수를 측정하였다. ACTR 및 GOT2를 공동발현하는 T 세포의 CD3+ 세포의 총 수는 ACTR을 단독으로 발현하는 T 세포의 총 CD3+ T 세포 수에 상대적으로 나타내었다. 상기 ACTR 폴리펩타이드 외에도 상기 GOT2를 발현하는 T 세포는 증가된 T 세포 수를 입증하였다. 도 9b.
이 실험은 T 세포에서 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드를 발현하는 것이 T 세포 증식에 긍정적인 영향을 미친다는 것을 입증한다.
실시예 14: T 세포에서 크렙스 사이클 조정 유전자(GOT2) 및 GPC3-표적화 CAR 또는 ACTR의 공동발현은 IL-17A 사이토카인 생산을 향상시킨다
크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드(GOT2)(서열번호 88)를 GPC3-표적화 CAR-T 폴리펩타이드(서열번호 104)와 함께 T 세포에서 공동발현시키거나, 또는 ACTR-4-1BB 폴리펩타이드(서열번호 1) 또는 ACTR-CD28 폴리펩타이드(서열번호 57)와 함께 T 세포에서 공동발현시켰다. 상기 T 세포를 CAR 또는 ACTR 폴리펩타이드 단독, 또는 P2A 리보솜 스킵 서열에 의해 분리된 CAR 또는 ACTR 및 GOT2를 암호화하는 바이러스를 이용하여 형질도입시켰다. 형질도입된 T 세포를 GPC3+ 간세포 암종 HepG2 종양 세포와 2:1 이펙터 대 표적 비율로 혼합하였다; ACTR T 세포를 이용한 실험에서는 상기 항-GPC3 항체 GC33(1 μg/mL)을 첨가하였다. 상기 세포는 5% CO2 항온배양기에서 37℃에서 24시간 동안 항온배양하였다. 항온배양 후, 100μL의 세포 배양 상청액을 수집하고 MSD ELISA(Meso Scale Discovery, Pacific BioLabs)를 제조업체의 지침에 따라 사용하여 IL-17A를 측정하였다. IL-17A 생산은 발현 작제물의 함수로서 플로팅된다(도 10a-10c). GOT2 및 CAR(도 10a) 또는 ACTR 폴리펩타이드(도 10b-10c)를 공동발현하는 T 세포는 CAR 또는 ACTR을 단독으로 발현하는 T 세포에 비해 향상된 IL-17A 생산 능력을 입증하였다. 이 실험은 T 세포에서 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드를 발현하는 것이 IL-17A 사이토카인 생산에 긍정적인 영향을 미친다는 것을 입증한다.
실시예 15: 크렙스 사이클 조정 유전자(GOT2)와 GPC3-표적화 CAR 또는 ACTR의 공동발현은 CD4+ T 세포 다기능성을 향상시킨다
크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드(GOT2)(서열번호 88)를 GPC3-표적화 CAR-T 폴리펩타이드(서열번호 104)와 함께 동일한 T 세포에서 공동발현시키거나, 또는 4-1BB(서열번호 1) 또는 CD28(서열번호 57) 1차 공동자극성 도메인을 함유하는 ACTR 폴리펩타이드와 함께 동일한 T 세포에서 공동발현시켰다. 상기 T 세포를 상기 CAR 또는 ACTR 폴리펩타이드 단독, 또는 P2A 리보솜 스킵 서열에 의해 분리된 CAR 또는 ACTR 및 GOT2를 암호화하는 바이러스를 이용하여 형질도입시켰다. 형질도입된 T 세포를 GPC3+ 간세포 암종 HepG2 종양 세포와 1:1 이펙터 대 표적 비율로 혼합하였다; ACTR T 세포를 이용한 실험에 항-GPC3 항체 GC33(1 μg/mL)을 첨가하였다. 상기 세포를 단백질 수송 억제제인 Brefeldin A(5 μg/mL) 및 Monensin(2μM)의 존재하에 5% CO2 항온배양기에서 37℃에서 6시간 동안 항온배양하였다. 항온배양 후, 공동배양물을 CAR 및 ACTR T 세포 둘 모두에 대해 항-CD4 및 항-CD8 항체로 염색하였다; ACTR T 세포는 또한 항 CD16 항체로도 염색하였다. 이어서, 상기 세포를 고정하고, 투과화시키고, 항-IFNγ, 항-IL-2, 항-TNFα 및 항-IL-17A 항체로 염색하여 세포내 사이토카인 생산을 정량하였다.
복수의 사이토카인을 생산하는 CD4+ T 세포의 빈도는 유세포분석으로 정량하였다. 상기 CAR 또는 ACTR 폴리펩타이드 외에도 GOT2를 발현하는 T 세포는 CAR 또는 ACTR을 단독으로 발현하는 T 세포에 비해 동시에 1, 2 또는 3개보다 많은 사이토 카인을 생산하는 CD4+ T 세포의 빈도가 더 높았고, 이는 상기 GOT2 발현 세포의 더 큰 다기능성을 입증하였다(도 11a-11c). 이 실험은 T 세포에서 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드를 발현하는 것이 CD4 T 세포 다기능성에 긍정적인 영향을 미친다는 것을 입증한다.
실시예 16: 크렙스 사이클 조정 유전자(GOT2) 및 GPC3-표적화 CAR 또는 ACTR의 공동발현은 덜 분화된 나이브 유사 표현형을 가진 CD8+ 세포의 빈도를 증가시킨다
크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드(GOT2)(서열번호 88)를 GPC3-표적화 CAR-T 폴리펩타이드(서열번호 104)와 함께 동일한 T 세포에서 공동발현시키거나, 4-1BB(서열번호 1) 또는 CD28(서열번호 57) 1차 공동자극성 도메인을 함유하는 ACTR 폴리펩타이드와 함께 동일한 T 세포에서 공동발현시켰다. 상기 T 세포는 상기 CAR 또는 ACTR 폴리펩타이드 단독 또는 P2A 리보솜 스킵 서열에 의해 분리된 CAR 또는 ACTR 및 GOT2를 암호화하는 바이러스를 이용하여 형질도입시켰다. 11명의 건강한 공여체로부터의 CAR 작제물 및 2명의 건강한 공여체에 대한 ACTR 작제물의 T 세포 표현형을 유세포분석에 의해 평가하였다. 이 실험을 위해, 세포를 해동하고 CAR- 및 ACTR-발현성 T 세포 모두에 대해 항-CD3, 항-CD4, 항-CD8, 항-CD45RA, 항-CD45RO, 항-CD27 및 항-CD62L 항체를 이용하여 염색하였다. CAR T 세포는 또한 CAR 폴리펩타이드를 검출하기 위해 재조합 GPC3 단백질을 이용하여 염색하였고 ACTR T 세포는 또한 ACTR 폴리펩타이드를 검출하기 위해 항-CD16 항체를 이용하여 염색하였다. CD27, CD45RA, CD62L에 대해 양성으로, CD45RO에 대해 음성으로 염색된 CD8+ CAR+ 또는 ACTR+ T 세포의 빈도는 GOT2도 공동발현한 T 세포에서 동족 모체에 비해 서 더 높았으며, 이는 GOT2-발현성 세포가 더욱 나이브-유사 CD8+ 집단을 갖고 있음을 입증한다(도 12a-12c). 전반적으로, GOT2를 공동발현하는 CD8+ CAR 또는 ACTR T 세포의 표현형은 덜 분화된(더 젊은) 표현형의 표현형적 마커(CD27+/CD45RO+, CD27+/CD45RO-, CD27+/CD45RA+, CD27+/CD45RA-)를 가진 세포의 비율이 CAR 모체에 비해 더 높다는 것을 보여준다(도 13). 본 실험은 T 세포에서 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드를 발현하는 것이 CD8 표현형에 긍정적인 영향을 미친다는 것을 입증한다.
실시예 17: T 세포에서 크렙스 사이클 조정 유전자(GOT2) 및 GPC3 표적화 CAR의 공동발현은 만성 항원 자극 및 저산소증 하에서 증식을 개선한다
크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드(GOT2)(서열번호 88)를 GPC3-표적화 CAR-T 폴리펩타이드(서열번호 104)와 함께 동일한 T 세포에서 공동발현시켰다. 상기 T 세포를 상기 CAR 폴리펩타이드 단독 또는 P2A 리보솜 스킵 서열에 의해 분리된 CAR 및 GOT2를 암호화하는 바이러스를 이용하여 형질도입시켰다. GPC3-표적화 CAR을 발현하는 T 세포 및 GPC3-CAR 및 GOT2 세포를 공동발현하는 T 세포를 세포 추적 바이올렛, 형광 표지 세포 단백질로 표지한 다음, GPC3+ 간세포 암종 Hep3B 종양 세포와 2:1 이펙터 대 표적 비율로 혼합하였다. 활성화 후 3 일째에 세포를 세척하였고, 그 다음 제2 항원 자극으로서 신선한 GPC3+ 간세포 암종 Hep3B 종양 세포와 2:1 이펙터 대 표적 비율로 혼합하였다. 세포를 추가 3일 동안 정상산소(20% 산소) 또는 저산소(1.5% 산소) 조건 하에 항온배양하였고, 그 다음 항-CD3로 염색하였고, 증식을 측정하기 위해 세포 추적 바이올렛 희석을 유세포분석으로 측정하였고, 세포 추적 바이올렛 평균 형광 강도의 역수(MFI-1)로서 나타내었다. 상기 CAR 폴리펩타이드 외에도 GOT2를 발현하는 T 세포는 종양 미세환경의 복수의 스트레스를 모의실험하는 정상산소 및 저산소 조건 모두에서 만성 항원 자극 하에 증가된 증식을 입증하였다(도 14). 본 실험은 T 세포에서 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드를 발현하는 것이 고형 종양 미세환경에 존재하는 좋지 않은 조건 하에서 증식 이점을 제공한다는 것을 입증한다.
실시예 18: T 세포에서 크렙스 사이클 조정 유전자(GOT2) 및 GPC3-표적화 CAR의 공동발현은 제한적 글루코스 조건에서 증식을 개선한다
크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드(GOT2)(서열번호 88)를 4-1BB(서열번호 104) 또는 CD28(서열번호 105) 공동자극성 도메인을 함유하는 GPC3-표적화 CAR-T 폴리펩타이드와 동일한 T 세포에서 공동발현시켰다. 상기 T 세포를 상기 CAR 폴리펩타이드 단독 또는 P2A 리보솜 스킵 서열에 의해 분리된 CAR 및 GOT2를 암호화하는 바이러스를 이용하여 형질도입시켰다. GPC3-표적화 CAR-T 폴리펩타이드에 의해 형질도입된 T 세포를 AlexaFluor 647-접합된 GPC3 재조합 단백질 및 항-AlexaFluor647 마이크로비드(Miltenyi Biotec)로 분리하였고 RPMI + 10% FBS에서 밤새 정치시켰다. 형질도입된 T 세포를 그 다음 세포 추적 바이올렛으로 표지하고 GPC3+ 간세포 암종 HepG2 종양 세포와 2:1 이펙터 대 표적 비율로 혼합하였다. 공동배양물은 종양 미세환경에서 제한적 영양소 이용성을 모방하기 위해 높은(10mM) 또는 낮은(1.25mM) 글루코스의 존재 하에서 항온배양하였다. 5% CO2 항온배양기에서 37℃에서 7일 후, 세포를 항-CD3 항체로 염색하고 세포 분열을 세포 추적 바이올렛 희석에 의해 유세포 분석을 통해 평가하였다.
GOT2 및 CAR 폴리펩타이드를 공동발현하는 T 세포는 감소된 세포 추적 바이올렛 형광 강도에 의해 나타나는 것과 같이, CAR 단독 발현 T 세포에 비해 10mM 및 1.25mM 글루코스 모두에서 더 큰 증식을 입증하였다. 세포 추적 바이올렛 형광 강도의 역수를 글루코스 조건 및 T 세포 유형의 함수로서 플로팅하였다(도 15). 본 실험은 T 세포에서 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드를 발현하는 것이 4-1BB 또는 CD28 공동자극성 도메인을 함유하는 CAR-T 세포에서 높고 낮은 글루코스 조건에서 T 세포 증식에 긍정적인 영향을 미친다는 것을 입증한다.
실시예 19: T 세포에서 크렙스 사이클 조정 유전자(GOT2) 및 GPC3-표적화 CAR의 공동발현은 T 세포 억제제 키누레닌의 존재 하에 증식을 개선한다
크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드(GOT2)(서열번호 88)를 CD28 1차 공동자극성 도메인을 함유하는 ACTR 폴리펩타이드(서열번호 57)와 함께 동일한 T 세포에서 공동발현시켰고, 기능 검정에서 ACTR 폴리펩타이드만을 발현하는 T 세포와 비교하였다. 상기 T 세포를 상기 ACTR 폴리펩타이드 단독 또는 P2A 리보솜 스킵 서열에 의해 분리된 ACTR 및 GOT2를 암호화하는 바이러스를 이용하여 형질도입시켰다. T 세포를 항-FOLR 항체(5 μg/mL)의 첨가 하에 엽산 수용체 알파 발현성(FOLR+) 난소 암종 IGROV-1 종양 세포(파라포름알데히드에 고정됨)와 함께 4:1 이펙터 대 표적 비율로 혼합하였다. 공동배양물은 5% CO2 항온배양기에서 37℃에서 6일 동안 항온배양하였다. 항온배양 후, 세포의 절반을 새 평판으로 옮기고 BrdU(Millipore Sigma)로 펄스화하고 5% CO2 항온배양기에서 37℃에서 약 16시간 동안 항온배양하였고 화학발광을 검출하기 위해 EnVision 평판 판독기(Perkin Elmer)를 사용하여 제조업체의 지시에 따라 BrdU 흡수에 대해 분석하였다. GOT2 및 ACTR을 공동발현하는 T 세포는 ACTR을 단독으로 발현하는 T 세포에 비해 키누레닌의 부재 및 존재 모두에서 증가된 BrdU 흡수에 의해 나타나는 바와 같이 개선된 증식을 입증하였다. 본 실험은 T 세포에서 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드를 발현하는 것이 고형 종양 미세환경에서 발견되는 억제 분자의 존재에서 증식 이점을 제공한다는 것을 입증한다. 도 16.
실시예 20: T 세포에서 크렙스 사이클 조정 유전자(GOT2) 및 GPC3-표적화 CAR의 공동발현은 GPC3+ 고형 종양 이종이식편에서 분리된 T 세포에 대한 지속적인 억제 수용체 발현을 감소시킨다
크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드(GOT2)(서열번호 88)를 GPC3-표적화 CAR-T 폴리펩타이드(서열번호 104)와 함께 동일한 T 세포에서 공동발현시켰다. 상기 T 세포는 CAR 폴리펩타이드 단독 또는 P2A 리보솜 스킵 서열에 의해 분리된 CAR 및 GOT2를 암호화하는 바이러스를 이용하여 형질도입시켰다.
CAR T 세포의 생체외 표현형은 마우스 종양 모델에 주입한 후 평가하였다. 이 실험을 위해, GPC3+ 간세포 암종 종양 세포주 JHH7을 NSG™(NOD scid 감마, NOD.Cg-Prkdc scid IL2rgtmWjl/SzJ, 계통 005557) 마우스에게 접종하였다. 종양 부피가 약 100 mm3(접종 11일 후)에 도달했을 때 T 세포를 사용한 치료를 개시하였다. 마우스를 종양 부피를 기준으로 각각 5 마리 마우스의 치료 그룹으로 무작위로 선발하고, GPC3-표적화 CAR을 발현하는 T 세포 또는 GPC3-표적화 CAR 및 GOT2를 공동발현하는 T 세포를 사용하여 접종 후 11일째에 5x106 CAR+ T 세포의 용량으로 치료하였다.
T 세포 투여 후, 2일, 7일 및 14일에 JHH7 종양 보유 마우스로부터 피하 종양을 수확하였다. 종양을 레이저 블레이드를 이용하여 갈고 인간 종양 분리 키트(Miltenyi Biotec)를 사용하여 37℃에서 1시간 동안 효소 분해하였다. 분해된 종양은 세포 염색을 위해 96웰 평판에 파종하기 전에 70μm 세포 스트레이너(cell strainer)를 통해 통과시켰다.
확립된 JHH7 GPC3-발현성 피하 종양을 보유하는 면역결핍 마우스에게 CAR 및 GOT2를 공동발현하는 T 세포 또는 CAR만을 발현하는 T 세포 5 x 106을 단일 정맥내 주사하여 치료하였다. 동물 코호트를 2일, 7일 및 14일에 안락사시켰고, 종양으로부터 T 세포를 수작업 및 효소 분해를 통해 분리하였다. 유세포분석을 수행하였고, CD4+ 및 CD8+ T 세포 하위세트에서 CD69, CD25, 및 ICOS 활성화 분자의 평균 형광 강도를 정량하였다. T 세포 표현형은 적혈구 용해 및 세포 염색 후 유세포분석에 의해 평가하였다. 이 실험을 위해 종양에서 분리한 세포를 항-CD3, 항-CD4, 항-CD8, 항-PD-1, 항-TIM-3, 항-CD69, 항-CD25, 및 항-ICOS 항체로 염색하였다. CD69, CD25 및 ICOS 활성화 분자의 평균 형광 강도는 2일(CD69) 또는 7일(CD25, ICOS)째에 종양에서 분리된 CD4+ 및 CD8+ T 세포 하위세트에서 정량하였고, 각 T 세포 유형에 대해 플로팅하였다. 도 17a-17c에 나타낸 바와 같이, GOT2 및 CAR 폴리펩타이드를 공동발현하는 T 세포는 CAR만을 발현하는 T 세포에 비해 CD69, CD25 및 ICOS 활성화 마커의 증가된 발현을 입증하였다.
확립된 JHH7 GPC3-발현성 피하 종양을 보유하는 면역결핍 마우스에게 CAR 및 GOT2를 발현하는 T 세포 또는 CAR만을 발현하는 T 세포 5x106을 단일 정맥내 주사하여 치료하였다. 동물 코호트를 2일, 7일 및 14일에 안락사시켰고 수작업 및 효소 분해를 통해 종양 및 비장으로부터 T 세포를 분리하였다. 유세포분석을 수행하였고, PD-1 및 TIM-3 억제 분자를 공동발현하는 T 세포의 빈도를 CD4+ 및 CD8+ T 세포 하위세트에서 정량하였다. PD-1 및 TIM-3 억제 분자를 공동발현하는 T 세포의 빈도를 상기 종양으로부터 분리된 CD4+ 및 CD8+ T 세포 하위세트에서 정량하였고 각 T 세포 유형마다 시점의 함수로서 플로팅하였다. CAR 및 GOT2를 공동발현하는 T 세포는 CAR만을 발현하는 T 세포와 비교하여, 7일째에 비슷하거나 더 높은 빈도의 PD-1+ TIM-3+ T 세포를 보여주었지만, 14일째에는 더 낮은 빈도의 PD-1+ TIM-3+ T 세포를 보여주었다. 도 18a-18b. 이 결과는 CAR 및 GOT2를 공동발현하는 T 세포가 CAR만을 발현하는 T 세포에 비해 억제 수용체의 지속적인 발현에 대해 더욱 내성적임을 보여준다. 이 실험은 T 세포에서 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드를 발현하는 것이 고형 종양 미세환경에서 T 세포의 활성화를 향상시키고 T 세포의 지속적인 억제 수용체 발현을 제한한다는 것을 입증한다.
실시예 21: T 세포에서 크렙스 사이클 조정 유전자(GOT2) 및 GPC3-표적화 CAR의 공동발현은 GPC3+ 고형 종양 이종이식편으로부터 분리된 T 세포에 대해 지속적인 억제 수용체 발현에 대한 내성을 초래한다
크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드(GOT2)(서열번호 88)를 GPC3-표적화 CAR-T 폴리펩타이드(서열번호 104)와 함께 동일한 T 세포에서 공동발현시켰다. 상기 T 세포를 CAR 폴리펩타이드 단독 또는 P2A 리보솜 스킵 서열에 의해 분리된 CAR 및 GOT2를 암호화하는 바이러스를 이용하여 형질도입시켰다.
CAR T 세포의 생체외 표현형은 마우스 종양 모델에 주입한 후 평가하였다. 이 실험을 위해 GPC3+ 간세포 암종 종양 세포주 JHH7을 NSG™(NOD scid 감마, NOD.Cg-Prkdc scid IL2rgtmWjl/SzJ, 계통 005557) 마우스에게 접종하였다. 종양 부피가 약 80 mm3(접종 10일 후)에 도달했을 때 T 세포를 사용한 치료를 개시하였다. 마우스를 종양 부피를 기준으로 각각 3 마리 마우스의 치료 그룹으로 무작위로 선발하고, GPC3-표적화 CAR을 발현하는 T 세포 또는 GPC3-표적화 CAR 및 GOT2를 공동발현하는 T 세포를 사용하여 접종 후 11일째에 5x106 CAR+ T 세포의 용량으로 치료하였다.
피하 종양 및 비장 조직을 T 세포 투여 후 1일, 6일 및 13일째에 JHH7 종양 보유 마우스로부터 수확하였다. 종양을 레이저 블레이드로 갈고, 인간 종양 분리 키트(Miltenyi Biotec)를 사용하여 37℃에서 1시간 동안 효소 분해하였다. 비장은 주사기 플런저의 끝을 사용하여 기계적으로 분리하였다. 분해된 종양과 비장은 세포 염색을 위해 96웰 평판에 파종하기 전에 70 μm 세포 스트레이너를 통해 통과시켰다.
확립된 JHH7 GPC3-발현성 피하 종양을 보유하는 면역결핍 마우스에게 CAR 및 GOT2를 공동발현하는 T 세포 또는 CAR만을 발현하는 T 세포 5x106을 단일 정맥내 주사하여 치료하였다. 동물 코호트를 6일 및 13일째에 안락사시켰고, T 세포를 종양 및 비장으로부터 수작업 및 효소 분해를 통해 분리하였다. 유세포분석을 수행하고, PD-1 및 TIM-3 억제 분자를 공동발현하는 T 세포의 빈도를 CD4+ 및 CD8+ T 세포 하위세트에서 정량하였다.
T 세포 표현형은 적혈구 용해 및 세포 염색 후 유세포분석에 의해 평가하였다. 이 실험을 위해 세포는 항-CD3, 항-CD4, 항-CD8, 항-PD-1, 및 항-TIM-3 항체를 이용하여 염색하였다. PD-1 및 TIM-3을 공동발현하는 T 세포의 빈도를 CD4+ 및 CD8+ T 세포 하위세트에서 정량하였다. CAR 및 GOT2를 공동발현하는 CD4+ 및 CD8+ 하위세트의 T 세포는 CAR을 단독으로 발현하는 T 세포에 비해 6일째, PD-1+ TIM-3+ T 세포의 빈도가 비슷하거나 더 높은 것을 입증하여 활성화를 나타내었지만, 종양 미세환경에 대한 장기간 노출(13일) 후에는, CAR만을 발현하는 T 세포에 비해, 발현 빈도가 감소하였고, 이는 지속적인 억제 수용체 발현에 대한 내성을 나타낸다. 비장에서 분리된 T 세포는 6일 또는 13일째에 PD-1+ TIM-3+ 발현을 나타내지 않았으며, 이는 GPC3-발현성 종양만에 대한 활성화의 특이성을 입증하였다. 도 19a-19d. CAR 및 GOT2를 공동발현하는 T 세포는 CAR만을 발현하는 T 세포에 비해 6일째에 PD-1+ TIM-3+ T 세포의 더 높은 빈도를 보여주었다. 도 19a 및 19b. 반면에, CAR 및 GOT2를 공동발현하는 T 세포는 종양 미세환경에 장기간 노출된 후 13일째에 PD-1+ TIM-3+ T 세포의 더 낮은 빈도를 보여주었고, 이는 CAR만을 발현하는 T 세포에 비해, 지속적인 억제 수용체 발현에 대한 내성을 나타낸다. 도 19c 및 19d. 비장에서 분리된 T 세포는 6일 또는 13일째에 PD-1+ TIM-3+ 발현을 보이지 않았고, 이는 GPC3-발현성 종양에서만의 T 세포 활성화의 특이성을 입증하는 것이다. 도 19a-19d.
이 실험은 T 세포에서 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드를 발현하는 것이 고형 종양 미세환경에서 지속적인 억제 수용체 발현 내성을 제공한다는 것을 입증한다.
실시예 22: T 세포에서 크렙스 사이클 조정 유전자(GOT2) 및 GPC3-표적화 CAR의 공동발현은 생체내 종양 미세환경에 노출된 후 지속적인 T 세포 기능성을 초래한다
크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드(GOT2)(서열번호 88)를 GPC3-표적화 CAR-T 폴리펩타이드(서열번호 104)와 함께 동일한 T 세포에서 공동발현시켰다. 상기 T 세포를 CAR 폴리펩타이드 단독 또는 P2A 리보솜 스킵 서열에 의해 분리된 CAR 및 GOT2를 암호화하는 바이러스를 이용하여 형질도입시켰다.
CAR 형질도입된 세포의 기능은 마우스 종양 모델에서 평가하였다. 이 실험을 위해, 상기 GPC3+ 간세포 암종 종양 세포주 JHH7을 NSG™(NOD scid 감마, NOD.Cg-Prkdc scid IL2rgtmWjl/SzJ, 계통 005557) 마우스에게 접종하였다. 종양 부피가 약 80 mm3(접종 10일 후)에 도달했을 때 T 세포를 사용한 치료를 개시하였다. 마우스를 종양 부피를 기준으로 각각 3 마리 마우스의 치료 그룹으로 무작위로 선발하고, GPC3-표적화 CAR을 발현하는 T 세포를 사용하여 접종 후 11일째에 5x106 CAR+ T 세포의 용량으로 치료하였다.
피하 종양을 CAR 투여 후 3일째에 JHH7 종양 보유 마우스로부터 수확하였다. 종양을 레이저 블레이드로 갈고, 인간 종양 분리 키트(Miltenyi Biotec)를 사용하여 37℃에서 1시간 동안 효소 분해하였다. 분해된 종양을 24웰 평판에 파종(1x106 세포/1mL 부피)하기 전에 70 μm 세포 스트레이너를 통해 통과시켰다. 5% CO2 항온배양기에서 37℃에서 18시간 동안 항온배양 후, 사이토카인 분석을 위해 세포 상층 액을 수집하였다. 세포 상층액에서 IFNγ 및 IL-17A의 농도를 각각 균일 시간 분해 형광 검정(Cisbio) 및 Meso Scale Discovery V-Plex 검정 기술을 사용하여 결정하였다. 두 검정 모두 제조업체의 프로토콜에 따라 수행하였다.
GOT2 및 CAR을 공동발현하는 T 세포를 투여한 마우스의 종양내 T 세포는 CAR만을 발현하는 T 세포를 투여한 마우스의 종양내 T 세포에 비해 증가된 IFNγ 및 IL-17A 생산을 입증하였다. 도 20a-20b. 이 실험은 T 세포에서 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드를 발현하는 것이 종양 미세환경에서 T 세포 기능에 긍정적인 영향을 미친다는 것을 입증한다.
다른 구현예
본 명세서에 개시된 모든 특징은 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 각 특징은 동일하거나, 동등하거나, 또는 유사한 목적을 제공하는 대안적인 특징으로 대체될 수 있다. 따라서, 달리 명시적으로 언급되지 않는 한, 개시된 각 특징은 일반적인 일련의 동등하거나 유사한 특징의 예일 뿐이다.
이상의 설명으로부터 본 기술분야의 기술자는 본 개시내용의 본질적인 특징을 용이하게 확인할 수 있고, 그 사상 및 범위를 벗어남이 없이 본 개시내용의 다양한 변화 및 수정을 만들어 다양한 용도 및 조건에 맞출 수 있다. 따라서, 다른 구현예도 청구범위 내에 있다.
등가물
몇몇 본 발명의 구현예가 본원에 설명되고 예시되었지만, 본 기술분야의 기술자는 기능을 수행하고, 및/또는 본원에 기재된 결과 및/또는 하나 이상의 이점을 수득하기 위한 다양한 다른 수단 및/또는 구조를 쉽게 구상할 것이며, 이러한 변경 및/또는 수정은 각각 본원에 기재된 본 발명의 구현예의 범위 내에 있는 것으로 간주된다. 보다 일반적으로, 본 기술분야의 기술자는 본원에 기재된 모든 매개 변수, 치수, 재료 및 구성이 예시적인 것이며 실제 매개 변수, 치수, 재료 및/또는 구성은 본 발명의 교시가 사용되는 특정 응용 또는 응용들에 따라 달라질 것이라는 것을 쉽게 인식할 것이다. 본 기술분야의 기술자는 본원에 기재된 본 발명의 특정 구현예들에 대한 많은 동등물을 단지 일상적인 실험을 사용하여 인식하거나, 또는 확인할 수 있을 것이다. 따라서, 전술한 구현예는 단지 예로서 제시된 것이며, 첨부 된 청구범위 및 그 동등물의 범위 내에서 본 발명의 구현예는 구체적으로 기재되고 청구된 것과 달리 수행될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 본 개시내용의 발명적 구현예는 본원에 기재된 각각의 개별적인 특징, 시스템, 물품, 재료, 키트 및/또는 방법에 관한 것이다. 또한, 상기 특징, 시스템, 물품, 재료, 키트 및/또는 방법이 서로 불일치하지 않는다면, 2 이상의 상기 특징, 시스템, 물품, 재료, 키트 및/또는 방법의 임의의 조합은 본 발명의 범위 내에 포함된다.
본원에서 정의되고 사용된 모든 정의는 사전적 정의, 참조로 포함된 문서의 정의 및/또는 정의된 용어의 일반적인 의미를 관리하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에 개시된 모든 참고문헌, 특허 및 특허 출원은 각각 인용되는 주제와 관련하여 참조로 포함되며, 일부 경우에는 문서 전체를 포괄할 수 있다.
본 명세서 및 청구범위에서 본원에 사용된 부정 관사 "일(a)" 및 "일(an)"은 명확하게 반대로 표시되지 않는 한, "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서 및 청구범위에서 본원에 사용된 "및/또는"이라는 문구는 그렇게 결합된 요소들, 즉 일부 경우에는 결합적으로 존재하고 다른 경우에는 분리적으로 존재하는 요소의 "어느 하나 또는 둘 모두"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. "및/또는"과 함께 나열된 복수의 요소는 동일한 방식, 즉, 그렇게 결합된 요소의 "하나 이상"으로 해석되어야 한다. 구체적으로 식별된 요소와 관련이 있는지 여부에 관계없이, "및/또는" 절에 의해 구체적으로 식별된 요소 외에, 다른 요소가 선택적으로 존재할 수 있다. 따라서, 비제한적인 예로서, "A 및/또는 B"에 대한 언급은 "포함하는"과 같은 개방형 언어와 함께 사용될 때, 일 구현예에서는, A만을 지칭할 수 있고(선택적으로, B 외에 다른 요소를 포함함); 다른 구현예에서는, B만을 지칭할 수 있고(선택적으로, A 외에 다른 요소를 포함함); 또 다른 구현예에서는, A 및 B를 둘 모두 지칭할 수 있고(선택적으로, 다른 요소를 포함함), 이에 제한되지 않는다.
본 명세서 및 청구범위에서 본원에 사용된 "또는"은 상기 정의된 "및/또는"과 동일한 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 목록에서 항목을 구분할 때 "또는" 또는 "및/또는"은 다른 것을 포함하는 것, 즉, 적어도 하나 뿐만 아니라 하나보다 많은 수 또는 목록의 요소들, 및 선택적으로 나열되지 않은 추가 항목을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. "하나만" 또는 "정확히 하나", 또는 청구범위에 사용된 경우 "로 이루어진"과 같이 정반대로 명확하게 표시된 용어만이 다수의 또는 일련의 요소들 중 정확히 하나의 요소의 포함을 지칭할 것이다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 용어 "또는"은 "어느 하나", "중 하나", "하나만" 또는 "정확히 하나"와 같이 배타적 용어가 선행될 때에는 배타적 대안예(즉, "하나 또는 둘이지만, 둘 모두는 아닌 것")를 나타내는 것으로 해석되어야만 할 것이다. 청구범위에 사용될 때, "본질적으로 이루어진"은 특허법 분야에서 사용되는 일상적인 의미를 가질 것이다.
본 명세서 및 청구범위에서 본원에 사용된 바와 같이, 하나 이상의 요소의 목록과 관련하여 "적어도 하나"라는 문구는 상기 요소 목록 중의 어느 하나 이상의 요소들로부터 선택되는 적어도 하나의 요소를 의미하는 것으로 이해되어야 하지만, 상기 요소들의 목록에 구체적으로 나열된 각 요소 및 모든 요소 중 적어도 하나를 반드시 포함해야 하는 것은 아니고 상기 요소 목록 중의 요소들의 임의의 조합을 배제하는 것은 아니다. 이 정의는 또한 구체적으로 식별된 요소들과 관련이 있는지 여부에 상관없이, "적어도 하나"라는 문구가 지칭하는 요소들의 목록 내에서 구체적으로 식별되는 요소들 외에 다른 요소가 선택적으로 존재할 수 있음을 허용한다. 따라서, 비제한적 예로서, "A 및 B 중 적어도 하나"(또는, 동등하게, "A 또는 B 중 적어도 하나", 또는 동등하게, "A 및/또는 B 중 적어도 하나")는 일 구현예에서는 선택적으로 하나보다 많은 것을 포함하는, 적어도 하나의 A를 지칭하고 B는 존재하지 않음(선택적으로, B 외에 다른 요소를 포함함)을 지칭할 수 있고; 다른 구현예에서는 선택적으로 하나보다 많은 것을 포함하는, 적어도 하나의 B를 지칭하고, A는 존재하지 않음(선택적으로, A 외에 다른 요소를 포함함)을 지칭할 수 있고; 또 다른 구현예에서, 선택적으로 하나보다 많은 A를 포함하는, 적어도 하나의 A 및 선택적으로 하나보다 많은 B를 포함하는 적어도 하나의 B(및 선택적으로 다른 요소를 포함함)를 지칭할 수 있으며; 이에 제한되지 않는다.
또한, 정반대로 명확하게 표시되지 않는 한, 하나보다 많은 단계 또는 행위를 포함하는 본원에 청구된 임의의 방법에서, 상기 방법의 단계 또는 행위의 순서는 상기 방법의 단계 또는 행위가 언급된 순서에 반드시 제한되는 것은 아니라는 것을 이해해야 한다.
<110> UNUM THERAPEUTICS INC. <120> CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR POLYPEPTIDES IN COMBINATION WITH TRANS METABOLISM MOLECULES MODULATING KREBS CYCLE AND THERAPEUTIC USES THEREOF <130> 103068-627891-70015W000 <140> PCT/US2019/046550 <141> 2019-08-30 <150> 62/718,491 <151> 2018-08-14 <150> 62/718,579 <151> 2018-08-14 <160> 107 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 436 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 1 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val 20 25 30 Val Phe Leu Glu Pro Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val 35 40 45 Thr Leu Lys Cys Gln Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln 50 55 60 Trp Phe His Asn Glu Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe 65 70 75 80 Ile Asp Ala Ala Thr Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr 85 90 95 Asn Leu Ser Thr Leu Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly 100 105 110 Trp Leu Leu Leu Gln Ala Pro Arg Trp 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Gln Gly Leu 450 455 460 Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu 465 470 475 480 Pro Pro Arg <210> 106 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 106 Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn 1 5 10 15 Pro Gly Pro <210> 107 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 107 Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn 1 5 10 15 Pro Gly

Claims (103)

  1. 동일한 유형의 천연 조혈 세포와 비교했을 때, 조정된 크렙스 사이클(modulated Krebs cycle)을 갖는 유전자 조작된 조혈 세포.
  2. 제1항에 있어서, (i) 크렙스 사이클 조정 인자를 발현하거나 과발현하는 유전자 조작된 조혈 세포.
  3. 제2항에 있어서, 상기 크렙스 사이클 조정 인자가 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드인 유전자 조작된 조혈 세포.
  4. 제3항에 있어서, 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드가 (a) 상기 크렙스 사이클에서 반응을 촉매하는 효소, (b) 크렙스 사이클 대사산물을 기질로서 사용하는 효소, 또는 (c) 전구체를 크렙스 사이클 대사산물로 전환시키는 효소인 유전자 조작된 조혈 세포.
  5. 제4항에 있어서, 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드가 (a)이고, 이는 이소시트레이트 탈수소효소(IDH), 말레이트 탈수소효소(MDH) 또는 포스포글리세레이트 탈수소효소(PHGDH)인 유전자 조작된 조혈 세포.
  6. 제5항에 있어서, 상기 IDH가 IDH1 또는 IDH2이고/이거나 상기 MDH가 MDH1 또는 MDH2인 유전자 조작된 조혈 세포.
  7. 제4항에 있어서, 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드가 (b)이고, 이는 글루탐산-옥살로아세트산 트랜스아미나제(GOT) 또는 포스포에놀피루베이트 카복시키나제 1(PCK1)인 유전자 조작된 조혈 세포.
  8. 제7항에 있어서, 상기 GOT가 GOT1 또는 GOT2인 유전자 조작된 조혈 세포.
  9. 제4항에 있어서, 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드가 (c)이고, 이는 포스포세린 아미노트랜스퍼라제(PSAT1), 글루타메이트 탈수소효소(GDH1), 글루타메이트-피루베이트 트랜스아미나제 1(GPT1) 또는 글루타미나제(GLS)인 유전자 조작된 조혈 세포.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 추가로 발현하는 유전자 조작된 조혈 세포:
    (ii) 하기를 포함하는 키메라 수용체 폴리펩타이드;
    (a) 세포외 표적 결합 도메인;
    (b) 막관통 도메인; 및
    (c) 세포질 신호전달 도메인.
  11. 제10항에 있어서, 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드는 항체 커플링된 T 세포 수용체(ACTR) 폴리펩타이드이되, 여기서 (a)는 세포외 Fc 결합 도메인인 유전자 조작된 조혈 세포.
  12. 제10항에 있어서, 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드는 키메라 수용체 항원(CAR) 폴리펩타이드이되, 여기서 (a)는 세포외 항원 결합 도메인인 유전자 조작된 조혈 세포.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드가 적어도 하나의 공동자극성 신호전달 도메인을 추가로 포함하는 유전자 조작된 조혈 세포.
  14. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 선택적으로 ACTR 폴리펩타이드 인 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드에 공동자극성 신호전달 도메인이 없는 유전자 조작된 조혈 세포.
  15. 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포질 신호전달 도메인이 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM)를 포함하는 유전자 조작된 조혈 세포.
  16. 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, (c)가 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드의 C-말단에 위치하는 유전자 조작된 조혈 세포.
  17. 제10항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드가 (a)의 C-말단 및 (b)의 N-말단에 위치하는 힌지 도메인을 추가로 포함하는 유전자 조작된 조혈 세포.
  18. 제10항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드가 N-말단에 신호 펩타이드를 추가로 포함하는 유전자 조작된 조혈 세포.
  19. 제10항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드가 ACTR 폴리펩타이드이되, 여기서 상기 세포외 표적 결합 도메인 (a)는 세포외 Fc 결합 도메인이고, 상기 Fc 결합 도메인은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 유전자 조작된 조혈 세포:
    (A) Fc 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인,
    (B) 면역글로불린의 Fc 부분에 결합하는 항체 단편,
    (C) 면역글로불린의 Fc 부분에 결합하는 천연 발생 단백질 또는 이의 Fc 결합 단편, 및
    (D) 면역글로불린의 Fc 부분에 결합하는 합성 폴리펩타이드.
  20. 제19항에 있어서, 상기 Fc 결합 도메인이 (A)이고, 이는 Fc-감마 수용체, Fc-알파 수용체 또는 Fc-엡실론 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인인 유전자 조작된 조혈 세포.
  21. 제20항에 있어서, 상기 Fc 결합 도메인이 CD16A, CD32A 또는 CD64A의 세포외 리간드-결합 도메인인 유전자 조작된 조혈 세포.
  22. 제20항에 있어서, 상기 Fc 결합 도메인이 F158 CD16A 또는 V158 CD16A의 세포외 리간드-결합 도메인인 유전자 조작된 조혈 세포.
  23. 제19항에 있어서, 상기 Fc 결합 도메인이 (B)이고, 이는 단일 사슬 가변 단편(scFv) 또는 단일 도메인 항체인 유전자 조작된 조혈 세포.
  24. 제19항에 있어서, 상기 Fc 결합 도메인이 (C)이고, 이는 단백질(Protein) A 또는 단백질 G, 또는 이의 Fc-결합 단편인 유전자 조작된 조혈 세포.
  25. 제19항에 있어서, 상기 Fc 결합 도메인이 (D)이고, 이는 Kunitz 펩타이드, SMIP, 아비머(avimer), 아피바디(affibody), DARPin, 또는 안티칼린(anticalin)인 유전자 조작된 조혈 세포.
  26. 제10항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드가 CAR 폴리펩타이드이고, 여기서 (a)의 상기 세포외 표적 결합 도메인은 항원 결합 도메인이고, 상기 항원 결합 도메인은 종양 항원, 병원성 항원 또는 자가항원에 특이적인 면역 세포에 결합하는 단일 사슬 항체 단편인 유전자 조작된 조혈 세포.
  27. 제26항에 있어서, 상기 종양 항원이 혈액 종양과 관련된 것인 유전자 조작된 조혈 세포.
  28. 제27항에 있어서, 상기 종양 항원이 CD19, CD20, CD22, 카파 사슬, CD30, CD123, CD33, LeY, CD138, CD5, BCMA, CD7, CD40, 및 IL-1RAP로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자 조작된 조혈 세포.
  29. 제26항에 있어서, 상기 종양 항원이 고형 종양과 관련된 것인 유전자 조작된 조혈 세포.
  30. 제29항에 있어서, 상기 종양 항원이 GD2, GPC3, FOLR, HER2, EphA2, EFGRVIII, IL13RA2, VEGFR2, ROR1, NKG2D, EpCAM, CEA, 메소텔린, MUC1, CLDN18.2, CD171, CD133, PSCA, cMET, EGFR, PSMA, FAP, CD70, MUC16, L1-CAM 및 CAIX로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 유전자 조작된 조혈 세포.
  31. 제26항에 있어서, 상기 병원성 항원이 박테리아 항원, 바이러스 항원 또는 진균 항원인 유전자 조작된 조혈 세포.
  32. 제10항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, (b)의 막관통 도메인이 싱글 패스 막 단백질의 것인 유전자 조작된 조혈 세포.
  33. 제32항에 있어서, 상기 막관통 도메인이 CD8α, CD8β, 4-1BB, CD28, CD34, CD4, FcεRIγ, CD16A, OX40, CD3ζ, CD3ε, CD3γ, CD3δ, TCRα, CD32, CD64, VEGFR2, FAS, 및 FGFR2B로 이루어진 군으로부터 선택되는 막 단백질의 것인 유전자 조작된 조혈 세포.
  34. 제10항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, (b)의 막관통 도메인이 비천연 발생의 소수성 단백질 분절인 유전자 조작된 조혈 세포.
  35. 제10항 내지 제13항 및 제15항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 공동자극성 신호전달 도메인이 4-1BB, CD28, CD28LL→GG 변이체, OX40, ICOS, CD27, GITR, ICOS, HVEM, TIM1, LFA1 및 CD2로 이루어진 군으로부터 선택되는 공동자극성 분자의 것인 유전자 조작된 조혈 세포.
  36. 제35항에 있어서, 상기 적어도 하나의 공동자극성 신호전달 도메인이 CD28 공동자극성 신호전달 도메인 또는 4-1BB 공동자극성 신호전달 도메인인 유전자 조작된 조혈 세포.
  37. 제10항 내지 제13항 및 제15항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드가 2개의 공동자극성 신호전달 도메인을 포함하는 유전자 조작된 조혈 세포.
  38. 제37항에 있어서, 상기 2개의 공동자극성 도메인이 하기인 유전자 조작된 조혈 세포:
    (i) CD28 및 4-1BB; 또는
    (ii) CD28LL→GG 변이체 및 4-1BB.
  39. 제37항에 있어서, 상기 공동자극성 신호전달 도메인 중 하나가 CD28 공동자극성 신호전달 도메인이고; 다른 공동자극성 도메인은 4-1BB 공동자극성 신호전달 도메인, OX40 공동자극성 신호전달 도메인, CD27 공동자극성 신호전달 도메인, 및 ICOS 공동자극성 신호전달 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자 조작된 조혈 세포.
  40. 제10항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, (c)의 세포질 신호전달 도메인이 CD3ζ 또는 FcεR1γ의 세포질 도메인인 유전자 조작된 조혈 세포.
  41. 제17항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 힌지 도메인이 1 내지 60개의 아미노산 길이인 유전자 조작된 조혈 세포.
  42. 제17항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 힌지 도메인이 CD28, CD16A, CD8α 또는 IgG의 것인 유전자 조작된 조혈 세포.
  43. 제17항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 힌지 도메인이 비천연 발생 펩타이드인 유전자 조작된 조혈 세포.
  44. 제43항에 있어서, 상기 힌지 도메인이 연장된 재조합 폴리펩타이드(XTEN) 또는 (Gly4Ser)n 폴리펩타이드이고, 여기서 n은 3-12의 정수인 유전자 조작된 조혈 세포.
  45. 제10항 내지 제16항 및 제18항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 선택적으로 ACTR 폴리펩타이드인 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드에 임의의 힌지 도메인이 없는 것인, 유전자 조작된 조혈 세포.
  46. 제10항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 선택적으로 ACTR 폴리펩타이드인 상기 키메라 수용체에 임의의 비-CD16A 수용체 유래의 힌지 도메인이 없는 것인, 유전자 조작된 조혈 세포.
  47. 제19항에 있어서, 상기 ACTR 폴리펩타이드가 (i) CD28 공동자극성 도메인; 및 (ii) CD28 막관통 도메인, CD28 힌지 도메인, 또는 이들의 조합을 포함하는 유전자 조작된 조혈 세포.
  48. 제19항에 있어서, 상기 ACTR 폴리펩타이드가 표 3에 제시된 성분 (a)-(e)를 포함하는 유전자 조작된 조혈 세포.
  49. 제19항에 있어서, 상기 ACTR 폴리펩타이드가 서열번호 1-80으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 유전자 조작된 조혈 세포.
  50. 제26항에 있어서, 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드가 (i) CD28 막관통 도메인, CD28 힌지 도메인, 또는 이들의 조합과 조합된 CD28 공동자극성 도메인, 또는 (ii) CD8 막관통 도메인, CD8 힌지 도메인, 또는 이들의 조합과 조합된 4-1BB 공동자극성 도메인을 포함하는 CAR 폴리펩타이드인 유전자 조작된 조혈 세포.
  51. 제26항에 있어서, 상기 CAR 폴리펩타이드가 서열번호 104 또는 105의 아미노산 서열을 포함하는 유전자 조작된 조혈 세포.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조혈 세포가 조혈 줄기 세포 또는 면역 세포이고, 선택적으로 상기 면역 세포는 자연 살해 세포, 대식세포, 호중구, 호산구 또는 T 세포인 유전자 조작된 조혈 세포.
  53. 제52항에 있어서, 상기 면역 세포가 내인성 T 세포 수용체, 내인성 주요 조직적합성 복합체, 내인성 베타-2-마이크로글로불린 또는 이들의 조합의 발현이 억제 또는 제거된 T 세포인 유전자 조작된 조혈 세포.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조혈 세포가 면역 세포이고, 이는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 조혈 줄기 세포(HSC) 또는 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC)로부터 유래된 것인 유전자 조작된 조혈 세포.
  55. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조혈 세포가 하기를 종합적으로 포함하는 핵산 또는 핵산 세트를 포함하는, 유전자 조작된 조혈 세포:
    (A) 상기 크렙스 사이클 대사산물 조정 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열; 및 선택적으로
    (B) 상기 키메라 수용체 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열.
  56. 제55항에 있어서, 상기 핵산 또는 상기 핵산 세트가 RNA 분자 또는 RNA 분자 세트인 유전자 조작된 조혈 세포.
  57. 제55항 또는 제56항에 있어서, 상기 조혈 세포가 상기 제1 뉴클레오타이드 서열 및 상기 제2 뉴클레오타이드 서열을 둘 모두 포함하는 핵산을 포함하는, 유전자 조작된 조혈 세포.
  58. 제57항에 있어서, 상기 핵산이 상기 제1 뉴클레오타이드 서열과 상기 제2 뉴클레오타이드 서열 사이에 위치한 제3 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하되, 상기 제3 뉴클레오타이드 서열은 리보솜 스키핑(skipping) 부위, 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 또는 제2 프로모터를 암호화하는 것인 유전자 조작된 조혈 세포.
  59. 제57항에 있어서, 상기 제3 뉴클레오타이드 서열이 P2A 펩타이드인 리보솜 스키핑 부위를 암호화하는 것인 유전자 조작된 조혈 세포.
  60. 제55항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 또는 상기 핵산 세트가 벡터 또는 벡터 세트 내에 포함되어 있는 것인 유전자 조작된 조혈 세포.
  61. 제60항에 있어서, 상기 벡터 또는 벡터 세트가 발현 벡터 또는 발현 벡터 세트인 유전자 조작된 조혈 세포.
  62. 제60항 또는 제61항에 있어서, 상기 벡터 또는 벡터 세트가 하나 이상의 바이러스 벡터를 포함하는 유전자 조작된 조혈 세포.
  63. 제62항에 있어서, 상기 하나 이상의 바이러스 벡터가 레트로바이러스 벡터이고, 이는 선택적으로 렌티바이러스 벡터 또는 감마레트로바이러스 벡터인 유전자 조작된 조혈 세포.
  64. 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항의 유전자 조작된 조혈 세포, 및 약제학적 허용성 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  65. 제64항에 있어서, 상기 유전자 조작된 조혈 세포가 ACTR 폴리펩타이드를 발현하고, 상기 조성물이 Fc 함유 치료제를 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
  66. 제65항에 있어서, 상기 Fc 함유 치료제가 치료 항체 또는 Fc 융합 단백질인 약제학적 조성물.
  67. 제65항 또는 제66항에 있어서, 상기 Fc 함유 치료제가 표적 항원에 결합하고, 이 표적 항원은 선택적으로 종양 항원, 병원성 항원, 또는 자가항원에 특이적인 면역 세포인, 약제학적 조성물.
  68. 제67항에 있어서, 상기 병원성 항원이 박테리아 항원, 바이러스 항원 또는 진균 항원인 약제학적 조성물.
  69. 제68항에 있어서, 상기 Fc 함유 치료제가 아달리무맙(Adalimumab), 아도-트라스투주맙 엠탄신(Ado-Trastuzumab emtansine), 알렘투주맙(Alemtuzumab), 바실릭시맙(Basiliximab), 베바시주맙(Bevacizumab), 벨리무맙(Belimumab), 브렌툭시맙(Brentuximab), 카나키누맙(Canakinumab), 세툭시맙(Cetuximab), 세르톨리주맙(Certolizumab), 다클리주맙(Daclizumab), 데노수맙(Denosumab), 다이누툭시맙(Dinutuximab), 에큘리주맙(Eculizumab), 에팔리주맙(Efalizumab), 에프라투주맙(Epratuzumab), 젬투주맙(Gemtuzumab), 골리무맙(Golimumab), hu14.18K322A, 이브리투모맙(Ibritumomab), 인플릭시맙(Infliximab), 이필리무맙(Ipilimumab), 라베투주맙(Labetuzumab), 뮤로모납(Muromonab), 나탈리주맙(Natalizumab), 오비누투주맙(Obinutuzumab), 오파투무맙(Ofatumumab), 오말리주맙(Omalizumab), 팔리비주맙(Palivizumab), 파니투무맙(Panitumumab), 퍼투주맙(Pertuzumab), 라무시루맙(Ramucirumab), 라니비주맙(Ranibizumab), 리툭시맙(Rituximab), 토실리주맙(Tocilizumab), 트라스투주맙(Trastuzumab), 토시투모맙(Tositumomab), 어스테키누맙(Ustekinumab), 및 베돌리주맙(Vedolizumab)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료 항체인 약제학적 조성물.
  70. 하기를 포함하는 키트:
    제10항 내지 제63항 중 어느 한 항의 유전자 조작된 조혈 세포, 및 약제학적 허용성 담체를 포함하는 제1 약제학적 조성물; 및
    Fc 함유 치료제 및 약제학적 허용성 담체를 포함하는 제2 약제학적 조성물.
  71. 제70항에 있어서, 상기 Fc 함유 치료제가 Fc 융합 단백질 또는 치료 항체인 키트.
  72. 제70항 또는 제71항에 있어서, 상기 Fc 함유 치료제가 표적 항원에 결합하고, 이 표적 항원은 선택적으로 종양 항원, 병원성 항원, 또는 자가항원에 특이적인 면역 세포인, 키트.
  73. 제72항에 있어서, 상기 치료 항체가 아달리무맙, 아도-트라스투주맙 엠탄신, 알렘투주맙, 바실릭시맙, 베바시주맙, 벨리무맙, 브렌툭시맙, 카나키누맙, 세툭시맙, 세르톨리주맙, 다클리주맙, 데노수맙, 다이누툭시맙, 에큘리주맙, 에팔리주맙, 에프라투주맙, 젬투주맙, 골리무맙, hu14.18K322A, 이브리투모맙, 인플릭시맙, 이필리무맙, 라베투주맙, 뮤로모납, 나탈리주맙, 오비누투주맙, 오파투무맙, 오말리주맙, 팔리비주맙, 파니투무맙, 퍼투주맙, 라무시루맙, 라니비주맙, 리툭시맙, 토실리주맙, 트라스투주맙, 토시투모맙, 어스테키누맙, 및 베돌리주맙으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 키트.
  74. 제10항 내지 제63항 중 어느 한 항에 기재된 유전자 조작된 조혈 세포의 집단을, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 표적 항원을 발현하는 세포를 억제하는 방법.
  75. 제74항에 있어서, 상기 유전자 조작된 조혈 세포가 ACTR 폴리펩타이드를 발현하고, 상기 대상체는 표적 항원에 특이적인 Fc 함유 치료제에 의해 치료를 받았거나 치료 중인 것인, 방법.
  76. 제74항에 있어서, 상기 유전자 조작된 조혈 세포가 CAR 폴리펩타이드를 발현하고, 이 폴리펩타이드는 표적 항원에 특이적인 세포외 항원 결합 도메인을 포함하는 것인, 방법.
  77. 제75항 또는 제76항에 있어서, 상기 표적 항원이 종양 항원, 병원성 항원, 또는 자가항원에 특이적인 면역 세포인 방법.
  78. 제77항에 있어서, 상기 병원성 항원이 박테리아 항원, 바이러스 항원 또는 진균 항원인 방법.
  79. 제75항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 항원을 발현하는 세포의 적어도 일부가 낮은 글루코스 환경에 위치한 것인 방법.
  80. 제74항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 조작된 조혈 세포가 자가유래인 방법.
  81. 제74항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 조작된 조혈 세포가 동종이계인 방법.
  82. 제74항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 조작된 조혈 세포가 생체외에서 활성화되거나, 확대되거나, 또는 둘 모두인 방법.
  83. 제75항 및 제77항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 함유 치료제가 치료 항체 또는 Fc 융합 단백질인 방법.
  84. 제83항에 있어서, 상기 Fc-함유 치료제가 아달리무맙, 아도-트라스투주맙 엠탄신, 알렘투주맙, 바실릭시맙, 베바시주맙, 벨리무맙, 브렌툭시맙, 카나키누맙, 세툭시맙, 세르톨리주맙, 다클리주맙, 데노수맙, 다이누툭시맙, 에큘리주맙, 에팔리주맙, 에프라투주맙, 젬투주맙, 골리무맙, hu14.18K322A, 이브리투모맙, 인플릭시맙, 이필리무맙, 라베투주맙, 뮤로모납, 나탈리주맙, 오비누투주맙, 오파투무맙, 오비누투주맙, 오말리주맙, 팔리비주맙, 파니투무맙, 퍼투주맙, 라무시루맙, 라니비주맙, 리툭시맙, 토실리주맙, 토시투모맙, 트라스투주맙, 어스테키누맙, 및 베돌리주맙으로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료 항체인 방법.
  85. 제74항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 암을 앓고 있는 인간 환자이고 상기 표적 항원이 종양 항원인 방법.
  86. 제85항에 있어서, 상기 암이 암종, 림프종, 육종, 아세포종 및 백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  87. 제85항 또는 제86항에 있어서, 상기 암이 B-세포 기원의 암, 유방암, 위암, 신경아세포종, 골육종, 폐암, 피부암, 전립선암, 결장암, 신장세포 암종, 난소암, 횡문근육종, 백혈병, 중피종, 췌장암, 두경부암, 망막아세포종, 신경교종, 교모세포종, 간암 및 갑상선암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  88. 제87항에 있어서, 상기 B-세포 기원의 암이 B-계통 급성 림프아세포성 백혈병, B-세포 만성 림프구성 백혈병, 및 B-세포 비호지킨 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  89. 제74항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 조작된 조혈 세포가 항-CD3 항체, 항-CD28 항체, IL-2, 식물성혈구응집소, 및 조작된 인공 자극 세포 또는 입자 중 하나 이상의 존재하에 활성화되는 T 세포를 포함하는 방법.
  90. 제74항에 있어서, 상기 유전자 조작된 조혈 세포가 4-1BB 리간드, 항-4-1BB 항체, IL-15, 항-IL-15 수용체 항체, IL-2, IL-12, IL-21, K562 세포, 및 조작된 인공 자극 세포 또는 입자 중 하나 이상의 존재 하에 활성화되는 자연 살해 세포를 포함하는 방법.
  91. 하기를 종합적으로 포함하는, 핵산 또는 핵산 세트:
    (A) 제10항 내지 제51항 중 어느 한 항에 기재된 항체 커플링된 T 세포 수용체(ACTR) 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 뉴클레오타이드 서열; 및
    (B) 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 뉴클레오타이드 서열.
  92. 제91항에 있어서, 상기 크렙스 사이클 조정 폴리펩타이드가 포스포에놀피루베이트 카복시키나제 1(PCK1), 글루탐산-옥살로아세트산 트랜스아미나제(GOT), 이소시트레이트 탈수소효소(IDH), 말레이트 탈수소효소(MDH), 포스포글리세레이트 탈수소효소(PHGDH), 포스포세린 아미노트랜스퍼라제(PSAT1), 글루타메이트 탈수소효소(GDH1), 글루타메이트-피루베이트 트랜스아미나제 1(GPT1) 및 글루타미나제(GLS)로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 또는 핵산 세트.
  93. 제92항에 있어서, 상기 GOT가 GOT1 또는 GOT2인 핵산 또는 핵산 세트.
  94. 제92항에 있어서, 상기 IDH가 IDH1 또는 IDH2이고/이거나 상기 MDH가 MDH1 또는 MDH2인 핵산 또는 핵산 세트.
  95. 제89항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 또는 핵산 세트가 RNA 분자 또는 RNA 분자 세트인 핵산 또는 핵산 세트.
  96. 제89항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산은 상기 제1 뉴클레오타이드 서열 및 상기 제2 뉴클레오타이드 서열을 모두 포함하고, 상기 핵산은 상기 제1 뉴클레오타이드 서열과 상기 제2 뉴클레오타이드 서열 사이에 위치한 제3 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하고, 상기 제3 뉴클레오타이드 서열은 리보솜 스키핑 부위, 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 또는 제2 프로모터를 암호화하는 것인, 핵산 또는 핵산 세트.
  97. 제96항에 있어서, 상기 리보솜 스키핑 부위가 P2A 펩타이드인 핵산 또는 핵산 세트.
  98. 제91항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 또는 핵산 세트가 벡터 또는 벡터 세트 내에 포함되어 있는 것인, 핵산 또는 핵산 세트.
  99. 제98항에 있어서, 상기 벡터 또는 벡터 세트가 발현 벡터 또는 발현 벡터 세트인 핵산 또는 핵산 세트.
  100. 제98항 또는 제99항에 있어서, 상기 벡터 또는 벡터 세트가 하나 이상의 바이러스 벡터를 포함하는 핵산 또는 핵산 세트.
  101. 제100항에 있어서, 상기 하나 이상의 바이러스 벡터가 레트로바이러스 벡터이고, 이는 선택적으로 렌티바이러스 벡터 또는 감마레트로바이러스 벡터인 핵산 또는 핵산 세트.
  102. 제91항 내지 제101항 중 어느 한 항의 핵산 또는 핵산 세트를, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 변형된 조혈 세포를 생체내에서 생성하는 방법.
  103. 제101항에 있어서, 상기 표적 항원에 특이적인 Fc 함유 치료제를 상기 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
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