BR112021001694A2 - polipeptídeos do receptor de antígeno quimérico em combinação com moléculas de metabolismo trans que modulam o ciclo de krebs e seus usos terapêuticos - Google Patents

polipeptídeos do receptor de antígeno quimérico em combinação com moléculas de metabolismo trans que modulam o ciclo de krebs e seus usos terapêuticos Download PDF

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BR112021001694A2
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Seth Ettenberg
Luke Barron
Michael Fray
Charles Wilson
Gregory Motz
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Abstract

a presente invenção refere-se a células hematopoiéticas geneticamente manipuladas, que expressam um ou mais polipeptídeos moduladores do ciclo de krebs e, opcionalmente, um polipeptídeo do receptor quimérico (por exemplo, um polipeptídeo do receptor de célula t acoplado ao anticorpo (actr) ou um polipeptídeo do receptor de antígeno quimérico (car) capaz de se ligar a um antígeno alvo de interesse. também são divulgados neste documento os usos das células hematopoiéticas manipuladas para inibir células que expressam um antígeno alvo em um indivíduo em necessidade.

Description

Relatório Descritivo de Patente de Invenção para "POLIPEPTÍDEOS DO RECEPTOR DE ANTÍGENO QUIMÉRICO EM
COMBINAÇÃO COM MOLÉCULAS DE METABOLISMO TRANS QUE MODULAM O CICLO DE KREBS E SEUS USOS TERAPÊUTICOS". REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este pedido reivindica o benefício das datas de depósito do pedido provisório US n° 62/718.491, depositado em 14 de agosto de 2018, e do pedido provisório US n° 62/718.579, depositado em 14 de agosto de 2018. Todo o conteúdo de cada um dos pedidos precedentes é incorporado neste documento por referência.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] A imunoterapia contra o câncer, incluindo a terapia baseada em células, é usada para provocar respostas imunes que atacam as células tumorais enquanto poupam os tecidos normais. É uma opção promissora para o tratamento de vários tipos de câncer por causa de seu potencial de evasão dos mecanismos genéticos e celulares de resistência aos medicamentos e de direcionar células tumorais enquanto preserva os tecidos normais.
[003] Terapia baseada em células pode envolver células T citotóxicas com reatividade tendendo para o câncer. Eshhar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.; 1993; 90(2):720-724; Geiger et al., J Immunol. 1999; 162(10):5931-5939; Brentjens et al., Nat. Med. 2003; 9(3):279- 286; Cooper et al., Blood. 2003; 101(4):1637-1644; e Imai et al., Leukemia. 2004; 18:676-684. Uma abordagem é expressar um receptor quimérico com um domínio de ligação ao antígeno fundido a um ou mais domínios de sinalização de ativação de células T. A ligação de um antígeno de câncer através do domínio de ligação ao antígeno resulta na ativação de células T e desencadeia a citotoxicidade. Resultados recentes de ensaios clínicos com infusões de linfócitos T autólogos que expressam receptores quiméricos forneceram evidências convincentes de seu potencial clínico. Pule et al., Nat. Med. 2008;14(11):1264-1270; Porter et al., N Engl J Med; 2011; 25;365(8):725-733; Brentjens et al., Blood. 2011;118(18):4817-4828; Till et al., Blood. 2012;119(17):3940- 3950; Kochenderfer et al., Blood. 2012;119(12):2709-2720; and Brentjens et al., Sci Transl Med. 2013;5(177):177ra138.
[004] Outra abordagem é expressar uma proteína do receptor de células T acopladas a anticorpo (ACTR) em uma célula hematopoiética (por exemplo, uma célula-tronco hematopoiética, uma célula imune, como uma célula NK ou uma célula T), a proteína ACTR contendo um domínio de ligação a Fc extracelular. Quando as células hematopoiéticas que expressam ACTR (por exemplo, células T que expressam ACTR, também chamadas de "células T de ACTR") são administradas a um indivíduo junto com um anticorpo anticâncer, elas podem aumentar a toxicidade contra células cancerosas direcionadas pelo anticorpo por meio de sua ligação ao domínio Fc do anticorpo. Kudo et al., Cancer Research (2014) 74:93-103.
[005] As imunoterapias baseadas em células, embora promissoras, têm enfrentado desafios causados por características específicas do microambiente tumoral (TME), que é o ambiente celular criado por meio da interação entre células tumorais malignas e células não transformadas. Portanto, é de grande importância desenvolver estratégias para melhorar a eficácia das imunoterapias baseadas em células à luz da TME.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[006] A presente invenção é baseada no desenvolvimento de estratégias para modular o ciclo de Krebs em células hematopoiéticas, como células imunes, incluindo aquelas que expressam um polipeptídeo do receptor quimérico, tal como um polipeptídeo do receptor de células T acopladas a anticorpo (ACTR) ou um polipeptídeo do receptor de antígeno quimérico (CAR), para uso em imunoterapia baseada em células. A modulação do ciclo de Krebs pode ser alcançada pela expressão (por exemplo, superexpressão) em células hematopoiéticas (por exemplo, células-tronco hematopoiéticas (HSCs) ou células imunes, como células T ou células killer naturais) um ou mais polipeptídeos moduladores do ciclo de Krebs, como aqueles descritos neste documento. Espera-se que tais células imunes geneticamente manipuladas (por exemplo, aumentadas) tenham reações do ciclo de Krebs, por exemplo, em um ambiente de baixo teor de glicose, um ambiente de baixo teor de aminoácidos, um ambiente de baixo pH e/ou um ambiente hipóxico (por exemplo, em um microambiente tumoral). Essas células imunes geneticamente manipuladas também podem ter estados epigenéticos modulados (por exemplo, estados de acetilação) e/ou níveis modulados de metabólitos imunossupressores (por exemplo, quinurenina). Assim, as células hematopoiéticas, como HSCs ou células imunes que coexpressam um ou mais polipeptídeos moduladores do ciclo de Krebs e um polipeptídeo do receptor quimérico exibiriam bioatividades superiores (por exemplo, sob o microambiente tumoral, como baixo teor de glicose, baixo teor de aminoácidos, baixo pH e/ou condições hipóxicas, opcionalmente na presença de um anticorpo terapêutico), por exemplo, proliferação celular, ativação (por exemplo, produção aumentada de citocinas, por exemplo, produção de IL-2 ou IFN), citotoxicidade e/ou atividade antitumoral in vivo.
[007] Consequentemente, são fornecidas, neste documento, células hematopoiéticas modificadas (por exemplo, geneticamente modificadas) (por exemplo, células-tronco hematopoiéticas, células imunes, como células T ou células killer naturais) que têm um ciclo de Krebs modulado em relação a uma célula imune nativa do mesmo tipo, particularmente, por exemplo, em baixo teor de glicose, baixo teor de aminoácidos, baixo pH e/ou condições de hipóxia. As células imunes modificadas podem expressar ou expressar excessivamente um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs.
[008] Em algumas modalidades, o polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs pode ser uma enzima que catalisa uma reação do ciclo de Krebs. Os exemplos incluem, mas não estão limitados a isocitrato desidrogenase (IDH), como IDH1 ou IDH2, malato desidrogenase (MDH), como MDH1 ou MDH2, ou fosfoglicerato desidrogenase (PHGDH). Em outras modalidades, o polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs é uma enzima que usa um metabólito do ciclo de Krebs como substrato. Os exemplos incluem, mas não estão limitados a uma transaminase glutâmico-oxaloacética (GOT), como GOT1 ou GOT2 (também conhecido como aspartato transaminase ou aspartato aminotransferase) ou fosfoenolpiruvato carboxicinase 1 (PCK1). Em ainda outras modalidades, o polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs é uma enzima que converte um precursor em um metabólito do ciclo de Krebs. Exemplos incluem, mas não estão limitados a uma fosfoserina aminotransferase (PSAT1), uma glutamato desidrogenase (GDH1), uma glutamato-piruvato transaminase 1 (GPT1) ou uma glutaminase (GLS).
[009] As células imunes modificadas podem ainda expressar um polipeptídeo do receptor quimérico, que pode compreender (a) um domínio de ligação ao alvo extracelular; (b) um domínio transmembrana; e (c) um domínio de sinalização citoplasmático (por exemplo, um domínio citoplasmático que compreende um motivo de ativação baseado em tirosina imunorreceptor (ITAM). Em algumas modalidades, o polipeptídeo do receptor quimérico é um receptor de células T acopladas a anticorpo (ACTR), que compreende um domínio de ligação ao Fc extracelular (a). Em outras modalidades, o receptor quimérico é um receptor de antígeno quimérico (CAR), que compreende um domínio de ligação ao antígeno extracelular (a). Em alguns exemplos, (c) está localizado no terminal C do polipeptídeo do receptor quimérico. Em alguns casos, o polipeptídeo quimérico pode compreender ainda pelo menos um domínio de sinalização coestimulador. Em outros casos, o polipeptídeo do receptor quimérico pode estar livre de domínios de sinalização coestimuladores.
[0010] Qualquer um dos polipeptídeos receptores quiméricos descritos neste documento (por exemplo, um polipeptídeo de ACTR ou um polipeptídeo de CAR) pode ainda compreender um domínio de dobradiça, que está localizado no terminal C de (a) e no terminal N de (b). Em outros exemplos, o polipeptídeo do receptor quimérico pode estar livre de qualquer domínio de dobradiça. Em ainda outros exemplos, o polipeptídeo receptor quimérico, por exemplo, um polipeptídeo de ACTR, pode estar livre de um domínio de dobradiça de qualquer receptor não CD16A. Alternativamente ou adicionalmente, o polipeptídeo do receptor quimérico compreende ainda um peptídeo sinal em seu terminal N.
[0011] Em algumas modalidades, o polipeptídeo do receptor quimérico descrito neste documento pode ser um polipeptídeo de ACTR compreendendo um domínio de ligação a Fc (a). Em alguns exemplos, o domínio de ligação a Fc de (a) pode ser um domínio de ligação ao ligante extracelular de um receptor Fc, por exemplo, um domínio de ligação ao ligante extracelular de um receptor Fc-gama, um receptor Fc- alfa ou um receptor Fc-epsilon. Em exemplos particulares, o domínio de ligação a Fc é um domínio de ligação ao ligante extracelular de CD16A (por exemplo, F158 CD16A ou V158 CD16A), CD32A ou CD64A. Em outros exemplos, o domínio de ligação a Fc de (a) pode ser um fragmento de anticorpo que se liga à porção Fc de uma imunoglobulina. Por exemplo, o fragmento de anticorpo pode ser um fragmento variável de cadeia única (ScFv), um anticorpo de domínio único (por exemplo, um nanocorpo). Além disso, o domínio de ligação a Fc de (a) pode ser uma proteína de ocorrência natural que se liga à porção Fc de uma imunoglobulina ou um fragmento de ligação a Fc desta. Por exemplo, o domínio de ligação a Fc pode ser Proteína A ou Proteína G ou um fragmento de ligação a Fc desta. Em outros exemplos, o domínio de ligação a Fc de (a) pode ser um polipeptídeo sintético que se liga à porção Fc de uma imunoglobulina. Os exemplos incluem, mas não estão limitados a um peptídeo Kunitz, um SMIP, um avimer, um affibody, um DARPin ou um anticalin.
[0012] Em algumas modalidades, o polipeptídeo do receptor quimérico descrito neste documento pode ser um polipeptídeo de CAR compreendendo um domínio de ligação ao antígeno extracelular (a). Em alguns exemplos, o domínio de ligação ao antígeno extracelular de (a) é um fragmento de anticorpo de cadeia única que se liga a um antígeno tumoral, um antígeno patogênico ou uma célula imune específica para um autoantígeno. Em certos exemplos, o antígeno tumoral está associado a um tumor hematológico. Os exemplos incluem, mas não estão limitados a CD19, CD20, CD22, cadeia Kappa, CD30, CD123, CD33, LeY, CD138, CD5, BCMA, CD7, CD40 e IL-1RAP. Em certos exemplos, o antígeno tumoral está associado a um tumor sólido. Os exemplos incluem, mas não estão limitados a GD2, GPC3, FOLR (por exemplo, FOLR1 ou FOLR2), HER2, EphA2, EFGRVIII, IL13RA2, VEGFR2, ROR1, NKG2D, EpCAM, CEA, Mesotelina, MUC1, CLDN18.2, CD171, CD133, PSCA, cMET, EGFR, PSMA, FAP, CD70, MUC16, L1-CAM, B7H3 e CAIX. Em certos exemplos, o antígeno patogênico é um antígeno bacteriano, um antígeno viral ou um antígeno fúngico, por exemplo, aqueles descritos neste documento.
[0013] Em algumas modalidades, o domínio transmembrana de (b) em qualquer um do polipeptídeo do receptor quimérico (por exemplo, polipeptídeo de ACTR ou CAR) pode ser de uma proteína de membrana de passagem única, por exemplo, CD8, CD8, 4-1BB, CD28, CD34, CD4, FcRI, CD16A, OX40, CD3, CD3, CD3, CD3, TCR, CD32,
CD64, VEGFR2, FAS, e FGFR2B. Alternativamente, o domínio transmembrana de (b) pode ser um segmento de proteína hidrofóbica de ocorrência não natural.
[0014] Em algumas modalidades, o pelo menos um domínio de sinalização coestimulador dos polipeptídeos dos receptores quiméricos descritos neste documento (por exemplo, polipeptídeos de ACTR ou CAR), se aplicável, pode ser de uma molécula coestimuladora, que pode ser 4-1BB, CD28, variante CD28LLGG, OX40, ICOS, CD27, GITR, ICOS, HVEM, TIM1, LFA1 e CD2. Em alguns exemplos, pelo menos um domínio de sinalização coestimulatório é um domínio de sinalização coestimulador CD28 ou um domínio de sinalização coestimulador 4- 1BB. Em alguns casos, o polipeptídeo de ACTR pode compreender dois domínios de sinalização coestimuladores. Em alguns casos, um dos domínios de sinalização coestimulatória é um domínio de sinalização coestimulador de CD28; e o outro domínio coestimulador pode ser um domínio de sinalização coestimulador 4-1BB, um domínio de sinalização coestimulador OX40, um domínio de sinalização coestimulador CD27 ou um domínio de sinalização coestimulador ICOS. Os exemplos específicos incluem, mas não estão limitados a CD28 e 4-1BB; ou CD28LLGG variante e 4-1BB. Alternativamente, qualquer um dos polipeptídeos dos receptores quiméricos pode estar livre de qualquer domínio de sinalização coestimulador.
[0015] Em algumas modalidades, o domínio de sinalização citoplasmático de (c) em qualquer um dos polipeptídeos receptores quiméricos descritos neste documento (por exemplo, polipeptídeos de ACTR ou CAR) pode ser um domínio citoplasmático deCD3 ou FcεR1γ.
[0016] Em algumas modalidades, o domínio de dobradiça de qualquer um dos polipeptídeos quiméricos descritos neste documento (por exemplo, polipeptídeos de ACTR ou CAR), quando aplicável, pode ser de CD28, CD16A, CD8 ou IgG. Em outros exemplos, o domínio de dobradiça é um peptídeo de ocorrência não natural. Por exemplo, o peptídeo de ocorrência não natural pode ser um polipeptídeo recombinante estendido (XTEN) ou um polipeptídeo (Gly4Ser)n, em que n é um número inteiro de 3-12, inclusive. Em alguns exemplos, o domínio de dobradiça é um segmento curto, que pode conter até 60 resíduos de aminoácidos.
[0017] Em exemplos específicos, um polipeptídeo de ACTR conforme descrito neste documento pode compreender (i) um domínio coestimulador de CD28; e (ii) um domínio transmembrana de CD28, um domínio de dobradiça de CD28 ou uma combinação dos mesmos. Por exemplo, o polipeptídeo de ACTR compreende os componentes (a)-(e) conforme mostrado na Tabela 3. Em exemplos particulares, o polipeptídeo de ACTR compreende a sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 1-80.
[0018] Em exemplos específicos, um polipeptídeo de CAR descrito neste documento pode compreender (i) um domínio coestimulador de CD28 ou um domínio coestimulador 4-1BB; e (ii) um domínio transmembrana de CD28, um domínio de dobradiça de CD28 ou uma combinação dos mesmos. Em outros exemplos específicos, um polipeptídeo de CAR descrito neste documento pode compreender (i) um domínio coestimulador de CD28 ou um domínio coestimulador 4- 1BB, (ii) um domínio transmembrana de CD8, um domínio de dobradiça de CD8 ou uma combinação dos mesmos. Por exemplo, o polipeptídeo de CAR pode compreender uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 104 e 105.
[0019] As células hematopoiéticas descritas neste documento, expressando o polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs e, opcionalmente, o polipeptídeo receptor quimérico, podem ser uma célula-tronco hematopoiética ou uma descendência desta. Em algumas modalidades, as células hematopoiéticas podem ser células imunes, como células killer naturais, monócitos/macrófagos, neutrófilos, eosinófilos ou células T. As células imunes podem ser derivadas de células mononucleares do sangue periférico (PBMC), células-tronco hematopoiéticas (HSCs) ou células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). Em alguns exemplos, a célula imune é uma célula T, na qual a expressão de um receptor de célula T endógeno, um complexo endógeno de histocompatibilidade principal, uma beta-2-microglobulina endógena ou uma combinação dos mesmos foi inibida ou eliminada.
[0020] Qualquer uma das células hematopoiéticas (por exemplo, HSCs ou células imunes) descritas neste documento pode compreender um ácido nucleico ou um conjunto de ácido nucleico, que compreende coletivamente: (a) uma primeira sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs; e opcionalmente (b) uma segunda sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo do receptor de antígeno quimérico (CAR). O ácido nucleico ou o conjunto de ácido nucleico é uma molécula de RNA ou um conjunto de moléculas de RNA. Em alguns casos, a célula imune compreende o ácido nucleico, que compreende a primeira sequência de nucleotídeos e a segunda sequência de nucleotídeos. Em algumas modalidades, a sequência de codificação do polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs está a montante daquela do polipeptídeo de CAR. Em algumas modalidades, a sequência de codificação do polipeptídeo de CAR está a montante daquela do polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs. Tal ácido nucleico pode compreender ainda uma terceira sequência de nucleotídeos localizada entre a primeira sequência de nucleotídeos e a segunda sequência de nucleotídeos, em que a terceira sequência de nucleotídeos codifica um sítio de salto ribossomal (por exemplo, um peptídeo P2A), um sítio de entrada de ribossomo interno (IRES), ou um segundo promotor.
[0021] Em alguns exemplos, o ácido nucleico ou o conjunto de ácido nucleico está compreendido em um vetor ou um conjunto de vetores, que pode ser um vetor de expressão ou um conjunto de vetores de expressão (por exemplo, vetores virais, como vetores lentivirais ou vetores retrovirais). Um conjunto de ácido nucleico ou um conjunto de vetor refere-se a um grupo de duas ou mais moléculas de ácido nucleico ou dois ou mais vetores, cada um codificando um dos polipeptídeos de interesse (ou seja, o polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs e o polipeptídeo de CAR). Qualquer um dos ácidos nucleicos descritos neste documento também está dentro do escopo da presente invenção.
[0022] Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica, compreendendo qualquer uma das células imunes descritas neste documento e um veículo farmaceuticamente aceitável.
[0023] Além disso, é fornecido neste documento um método para inibir células que expressam um antígeno alvo (por exemplo, reduzindo o número de tais células, bloqueando a proliferação celular e/ou suprimindo a atividade celular) em um indivíduo, o método compreendendo a administração a um indivíduo em necessidade uma população das células imunes descritas neste documento, que podem coexpressar o polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs e o polipeptídeo de CAR. O indivíduo (por exemplo, um paciente humano, como um paciente humano sofrendo de câncer) pode ter sido tratado ou está sendo tratado com uma terapia anticâncer (por exemplo, um agente anticâncer). Em alguns exemplos, pelo menos algumas das células que expressam o antígeno alvo estão localizadas em um ambiente de baixo teor de glicose, um ambiente de baixo teor de aminoácidos (por exemplo, baixo teor de glutamina), um ambiente de baixo pH e/ou um ambiente hipóxico, para exemplo, um microambiente tumoral.
[0024] Em alguns exemplos, as células imunes são autólogas. Em outros exemplos, as células imunes são alogênicas. Em qualquer um dos métodos descritos neste documento, as células imunes podem ser ativadas, expandidas ou ambas ex vivo. Em alguns casos, as células imunes compreendem células T, que são ativadas na presença de um ou mais de um ou mais de um anticorpo anti-CD3, anticorpo anti-CD28, IL-2, fitohemoaglutinina e uma célula ou partícula estimuladora artificial manipulada. Em outros casos, as células imunes compreendem células killer naturais, que são ativadas na presença de um ou mais 4-1BB ligante, anticorpo anti-4-1BB, IL-15, anticorpo anti-receptor de IL-15, IL- 2, células IL-12, IL-21 e K562, uma célula ou partícula estimuladora artificial manipulada.
[0025] Em alguns exemplos, o indivíduo a ser tratado pelos métodos descritos neste documento pode ser um paciente humano que sofre de um câncer, por exemplo, carcinoma, linfoma, sarcoma, blastoma e leucemia. Cânceres alvo exemplificativos adicionais incluem, mas não estão limitados a um câncer de origem de células B, câncer de mama, câncer gástrico, neuroblastoma, osteossarcoma, câncer de pulmão, câncer de pele, câncer de próstata, câncer de cólon, carcinoma de células renais, câncer de ovário, rabdomiossarcoma, leucemia, mesotelioma, câncer pancreático, câncer de cabeça e pescoço, retinoblastoma, glioma, glioblastoma, câncer de fígado e câncer de tireoide. Cânceres exemplificativos de origem de células B são selecionados do grupo que consiste em leucemia linfoblástica aguda de linhagem B, leucemia linfocítica crônica de células B e linfoma não-Hodgkin de células B.
[0026] Também dentro do escopo da presente invenção estão os usos das células imunes geneticamente manipuladas descritas neste documento, que coexpressam um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs e um polipeptídeo de CAR para o tratamento de uma doença ou distúrbio alvo, como câncer ou um distúrbio infeccioso, e seus usos para a fabricação de um medicamento para o tratamento médico pretendido.
[0027] Os detalhes de uma ou mais modalidades da invenção são apresentados na descrição abaixo. Outras características ou vantagens da presente invenção serão evidentes a partir da descrição detalhada de várias modalidades e também das reivindicações anexas.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0028] As figuras a seguir fazem parte do presente relatório descritivo e são incluídas para demonstrar ainda certos aspectos da presente invenção, que podem ser melhor compreendidos por referência a uma ou mais dessas figuras em combinação com a descrição detalhada de modalidades específicas apresentadas neste documento.
[0029] A Figura 1 é um diagrama que mostra a proliferação de células T que expressam um CAR de direcionamento a GPC3 (SEQ ID NO: 104) ou células T não transduzidas "simuladas" na presença de células alvo JHH7 ou Hep3B que expressam GPC3 e concentrações variáveis de glicose. A proliferação de células CAR-T varia em função da concentração de glicose.
[0030] A Figura 2A e a Figura 2B são diagramas que mostram a proliferação de células T expressando um CAR de direcionamento a GPC3 (SEQ ID NO: 104) ou coexpressando CAR de direcionamento a GPC3 e GOT1 (SEQ ID NO: 87) na presença de GPC3- expressando células alvo JHH7. Figura 2A: glicose 1,25 mM. Figura 2B: glicose 10 mM. A proliferação de células CAR-T que coexpressam GOT1 é aumentada em relação às células que expressam CAR-T apenas em glicose 1,25 mM e 10 mM.
[0031] A Figura 3A e a Figura 3B são diagramas que mostram a proliferação de células T expressando um CAR de direcionamento a GPC3 (SEQ ID NO: 104) ou coexpressando CAR de direcionamento a GPC3 e GOT2 (SEQ ID NO: 88) na presença de GPC3- expressando células alvo JHH7. Figura 3A: glicose 1,25 mM. Figura 3B: glicose 10 mM. A proliferação de células CAR-T que coexpressam GOT2 é aumentada em relação às células que expressam CAR-T apenas em glicose 1,25 mM e 10 mM.
[0032] A Figura 4 é um gráfico que mostra a atividade de inibição do tumor de xenoenxerto JHH7 de células T que expressam um CAR direcionado a GPC3 e células T que coexpressam CAR direcionado a GPC3 (SEQ ID NO: 104) e GOT2 (SEQ ID NO: 88).
[0033] A Figura 5 é um gráfico que mostra a atividade de inibição do tumor de xenoenxerto NCI-H446 de células T que expressam um CAR direcionado a GPC3 e células T que coexpressam CAR direcionado a GPC3 (SEQ ID NO: 104) e GOT2 (SEQ ID NO: 88).
[0034] A Figura 6 é um gráfico que mostra a atividade de inibição do tumor de xenoenxerto Hep3B de células T que expressam um CAR direcionado a GPC3 e células T que coexpressam CAR direcionado a GPC3 (SEQ ID NO: 104) e GOT2 (SEQ ID NO: 88).
[0035] A Figura 7 é um gráfico que mostra contagens de sangue periférico de células T de camundongos portadores de tumores de xenoenxerto Hep3B tratados com células T que expressam um CAR direcionado a GPC3 e células T que coexpressam CAR direcionado a GPC3 (SEQ ID NO: 104) e GOT2 (SEQ ID NO: 88).
[0036] A Figura 8A e a Figura 8B mostram a expressão da proteína e a atividade da aminotransferase em células T que coexpressam CAR anti-GPC3 e GOT2. Figura 8A: Western blot demonstrando expressão aumentada de GOT2 em células T que coexpressam CAR anti-GPC3 (SEQ ID NO: 104) e GOT2 (SEQ ID NO: 88) em relação a células T que expressam CAR apenas. As células T foram ativadas com células tumorais que expressam Hep3B GPC3 por 4 dias. Os blots foram corados com anticorpo GOT2 anti-humano ou GAPDH anti-humano para controle de carregamento, respectivamente. Figura 8B: Células T que coexpressam CAR anti-GPC3 e GOT2 exibem aumento da atividade da enzima aspartato aminotransferase (AST) em relação às células T que expressam CAR apenas. As células T foram ativadas com células tumorais que expressam Hep3B GPC3 por 8 dias e a atividade da enzima aspartato aminotransferase foi medida usando um ensaio de atividade de aspartato aminotransferase disponível comercialmente (Abcam).
[0037] A Figura 9A e a Figura 9B são diagramas que mostram que as células T que coexpressam GOT2 (SEQ ID NO: 88) e anti-GPC3 CAR (SEQ ID NO: 104) ou ACTR (SEQ ID NO: 1) exibem proliferação aumentada em relação às células T expressando CAR ou ACTR apenas. Figura 9A: As células T CAR foram ativadas com células tumorais que expressam Hep3B GPC3 por 6 dias. A proliferação foi avaliada por citometria de fluxo usando diluição de traços de células intracelulares com violeta como uma medida da divisão celular para células T CD3+. Figura 9B: Células T DE ACTR foram ativadas com células tumorais que expressam HepG2 GPC3 mais anticorpo anti- GPC3 (GC33, 1 µg/ml) durante 3 dias. A proliferação foi avaliada por contagens de células de citometria de fluxo de células T CD3+. Os resultados são expressos para construtos coexpressando GOT2 em relação ao construto parental.
[0038] As Figuras 10A-10C são diagramas que mostram que as células T que coexpressam GOT2 (SEQ ID NO: 88) e anti-GPC3 CAR (SEQ ID NO: 104) ou ACTR (SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 57) exibem produção aumentada de IL-17A em relação às células T que expressam CAR ou ACTR apenas. Figura 10A: GPC3-CAR (SEQ ID NO: 104). Figura 10B: ACTR (SEQ ID NO: 1). Figura 10C: ACTR (SEQ ID NO: 57). As células T foram ativadas por 24 horas com células HepG2 que expressam GPC3 com a adição de anticorpo anti-GPC3 para coculturas ACTR, IL-17A foi medida em sobrenadantes usando um ensaio MSD. A produção aumentada de IL-17A em relação às células T que expressam CAR ou ACTR apenas foi observada para construtos que coexpressam GOT2, independente do tipo de construto (CAR ou ACTR) e domínio coestimulador primário (4-1BB ou CD28).
[0039] As Figuras11A-11C são diagramas que mostram que as células T que coexpressam GOT2 (SEQ ID NO: 88) e CAR anti-GPC3 (SEQ ID NO: 104) ou ACTR (SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 57) exibem polifuncionalidade CD4+ aumentada em relação às células T que expressam CAR ou ACTR isoladamente. Figura 11A: GPC3-CAR (SEQ ID NO: 104). Figura 11B: ACTR (SEQ ID NO: 1). Figura 11C: ACTR (SEQ ID NO: 57). As células T foram incubadas a 37 oC, 5% de CO2 por 6 horas com células HepG2 que expressam GPC3, com a adição de anticorpo anti-GPC3 em coculturas ACTR, na presença de inibidores de transporte de proteína Brefeldina A e Monensina. As células foram fixadas e a coloração intracelular para IFN, IL-2, TNFe IL-17A foi avaliada por citometria de fluxo. Uma frequência mais alta de células T CD4+ produzindo mais de uma, duas ou três citocinas simultaneamente foi observada para células T que coexpressam GOT2 e ACTR ou CAR em relação às células que expressam CAR ou ACTR isoladamente, independente do tipo de receptor quimérico (CAR ou ACTR) e domínio coestimulador primário (4-1BB ou CD28).
[0040] As Figuras 12A-12C são diagramas que mostram que as células T que coexpressam GOT2 (SEQ ID NO: 88) e anti-GPC3 CAR (SEQ ID NO: 104) ou ACTR (SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 57) exibiram uma maior população de células T CD8+ similares, não expostas, menos diferenciadas em relação às células T que expressam CAR ou ACTR isoladamente. Figura 12A: GPC3-CAR (SEQ ID NO: 104). Figura 12B: ACTR (SEQ ID NO: 1). Figura 12C: ACTR (SEQ ID NO: 57). As células T CAR (SEQ ID NO: 104) geradas a partir de 11 doadores saudáveis e as células T DE ACTR geradas a partir de 2 doadores saudáveis (domínio de coestimulação primário 4-1BB, SEQ ID NO: 1; domínio de coestimulação primário CD28, SEQ ID NO: 57) foram coradas para um painel de marcadores de superfície e analisadas por citometria de fluxo para marcadores fenotípicos similares aos não expostos. As células foram fechadas em CD8+/CAR+ (CAR) ou CD8+/CD16+ (ACTR+). O subconjunto dessas populações com coloração positiva para os marcadores CD27, CD45RO e CD62L e coloração negativa para CD45RA foi enriquecido em células T que coexpressam GOT2 e ACTR ou CAR em relação às células que expressam CAR ou ACTR apenas, independente do tipo de receptor quimérico (CAR ou ACTR) e domínio coestimulador primário (4-1BB ou CD28).
[0041] A Figura 13 é um diagrama que mostra que as células T que coexpressam GOT2 (SEQ ID NO: 88) e CAR anti-GPC3 (SEQ ID NO: 104) demonstraram um fenótipo de células T CD8+ menos diferenciado (mais jovem) em relação às células T que expressam CAR apenas. Células T CAR geradas a partir de 11 doadores saudáveis foram coradas para um painel de marcadores de superfície e analisadas por citometria de fluxo. As células foram fechadas em CD8+/CAR+. A coloração das populações CD27+ CD45RO+, CD27+ RO-, CD27+ CD45RA+ ou CD27+ CD45RA- indicam um fenótipo menos diferenciado. Esses subconjuntos foram enriquecidos em células T CAR que coexpressam GOT2 em relação às células T que expressam CAR apenas.
[0042] A Figura 14 é um diagrama que mostra que as células T que coexpressam GOT2 (SEQ ID NO: 88) e anti-GPC3 CAR (SEQ ID NO: 104) demonstraram uma vantagem proliferativa em relação às células T que expressam CAR apenas sob estimulação de antígeno crônica e hipóxia. Células T CAR foram ativadas com células tumorais que expressam Hep3B GPC3 por 3 dias; e então reestimuladas com células-
alvo frescas por 3 dias sob condições normóxicas (20% de oxigênio) ou hipóxicas (1,5%) para simular o estresse do microambiente tumoral da estimulação de antígeno crônica com e sem o estresse adicional de hipóxia. A proliferação foi então avaliada por citometria de fluxo de células T CD3+ usando diluição de traços de células intracelulares com violeta como uma medida de divisão celular e o inverso da fluorescência média é traçado.
[0043] A Figura 15 é um diagrama que mostra que as células T que coexpressam GOT2 (SEQ ID NO: 88) e anti-GPC3 CAR (SEQ ID NO: 104) demonstraram uma vantagem proliferativa em relação às células T que expressam CAR apenas sob glicose limitante. As células T CAR foram ativadas com células tumorais que expressam HepG2 GPC3 na presença de glicose 10 mM ou 1,25 mM por 7 dias. A proliferação foi então avaliada por citometria de fluxo usando diluição de traços de células intracelulares com violeta como uma medida de divisão celular e o inverso da fluorescência média é traçado. CARs que expressam GOT2 tiveram uma vantagem proliferativa em ambas as condições de glicose.
[0044] A Figura 16 é um diagrama que mostra as células T que coexpressam GOT2 (SEQ ID NO: 88) e ACTR (SEQ ID NO: 57) demonstraram proliferação aumentada na presença do inibidor de células T quinurenina em relação às células T que expressam ACTR apenas.
[0045] As Figuras 17A-17C são diagramas que mostram que as células T que coexpressam GOT2 (SEQ ID NO: 88) e anti-GPC3 CAR (SEQ ID NO: 104) demonstraram ativação intensificada no tumor em relação às células T que expressam CAR apenas. Figura 17A: CD69. Figura 17B: CD25. Figura 17C: ICOS. As células T que coexpressam CAR e GOT2 demonstraram expressão aumentada de marcadores de ativação em relação às células T que expressam CAR apenas.
[0046] A Figura 18A e a Figura 18B são diagramas que mostram que as células T que coexpressam GOT2 (SEQ ID NO: 88) e CAR anti- GPC3 (SEQ ID NO: 104) demonstraram maior resistência à exaustão em tumores em relação às células T que expressam CAR apenas. Figura 18A: subconjunto de células T CD4+. Figura 18B: subconjunto de células T CD8+.
[0047] As Figuras 19A-19D são diagramas que mostram os CARs que coexpressam GOT2 resistem à exaustão em tumor que expressa GPC3; a ativação de CARs é específica para tumor versus baço negativo para antígeno. Figura 19A: dia 6, subconjunto de células T CD4+. Figura 19B: dia 6, subconjunto de células T CD8+. Figura 19C: dia 13, subconjunto de células T CD4+. Figura 19D: dia 13, subconjunto de células T CD8+.
[0048] A Figura 20A e a Figura 20B são diagramas que mostram que as células T que coexpressam GOT2 (SEQ ID NO: 88) e anti-GPC3 CAR (SEQ ID NO: 104) demonstram maior função após exposição a tumores in vivo em relação a células T que expressam CAR apenas. Figura 20A: IL-17A. Figura 20B: IFN.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0049] Os microambientes tumorais têm características específicas, como baixo teor de glicose, baixo teor de aminoácidos, baixo pH e/ou condições hipóxicas, algumas das quais podem restringir a atividade de células imunes efetoras, como células T efetoras. A presente invenção é baseada, pelo menos em parte, no desenvolvimento de várias abordagens para aumentar as atividades das células imunes efetoras em microambientes tumorais via modulação (por exemplo, aumento) das reações do ciclo de Krebs pelas células imunes efetoras, aumentando assim seu crescimento e bioatividade. O ciclo de Krebs pode ser modulado por vários fatores, incluindo o nível de expressão das enzimas do ciclo de Krebs (por exemplo, enzimas de ocorrência natural ou equivalentes funcionais das mesmas), o estado de ativação de tais enzimas, o nível de expressão e atividade das enzimas que usam metabólitos do ciclo de Krebs como substratos e/ou o nível de expressão e atividade de enzimas que convertem precursores em metabólitos do ciclo de Krebs.
[0050] Os estudos descritos neste documento demonstram, inesperadamente, que a coexpressão de um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs, como GOT1 ou GOT2 e um polipeptídeo do receptor quimérico, como um CAR (por exemplo, tendo um domínio coestimulador 4-1BB) ou um ACTR (por exemplo, tendo um domínio coestimulador 4-1BB ou CD28) em células imunes, como células T, exibiram características superiores tanto in vitro quanto in vivo em relação às células imunes que expressam apenas CAR ou o ACTR. Por exemplo, a coexpressão de GOT1 ou GOT2 com a proliferação/expansão de células T aumentada por CAR ou ACTR e função de células T, particularmente sob condições de microambiente tumoral sólido (por exemplo, hipóxia, condição de baixo teor de glicose e presença de inibidores de TME). Por exemplo, a coexpressão de GOT2 contribuiu para a resistência da expressão de longo prazo de receptores inibitórios (por exemplo, PD1) e manteve a função das células T no microambiente tumoral. Além disso, a coexpressão de GOT1 ou GOT2 com efeitos antitumorais aumentados com CAR ou ACTR.
[0051] Consequentemente, a presente invenção fornece células hematopoiéticas manipuladas (por exemplo, geneticamente manipuladas) (por exemplo, HSCs ou células imunes) que possuem elevada atividade moduladora do ciclo de Krebs. A modificação do ciclo de Krebs em células imunes pode ser alcançada por qualquer abordagem adequada. Por exemplo, as células imunes modificadas podem expressar um ou mais fatores moduladores do ciclo de Krebs,
que podem ser uma molécula de qualquer tipo que esteja envolvida diretamente no ciclo de Krebs (por exemplo, uma enzima que catalisa uma ou mais reações do ciclo de Krebs) ou modula o ciclo de Krebs indiretamente afetando o nível de expressão, atividade e/ou degradação de uma ou mais enzimas do ciclo de Krebs. Em algumas modalidades, o fator de modulação do ciclo de Krebs pode ser um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs como aqueles descritos neste documento que aumentam a modulação do ciclo de Krebs em células imunes que se expressam, como em relação à sua contraparte nativa. Em outras modalidades, o fator de modulação do ciclo de Krebs pode ser um ácido nucleico (por exemplo, microRNA, RNA interferente, como siRNA ou shRNA, ou ácido nucleico antisense) que regula a expressão de uma ou mais enzimas que catalisam uma ou mais reações do ciclo de Krebs. Em outras modalidades, o fator de modulação do ciclo de Krebs pode ser um fator de transcrição que regula a expressão de uma ou mais enzimas do ciclo de Krebs.
[0052] Tal célula imune geneticamente manipulada pode ainda expressar um polipeptídeo do receptor quimérico, por exemplo, um polipeptídeo do receptor de células T acopladas a anticorpo (ACTR) ou um polipeptídeo do receptor de antígeno quimérico (CAR). Também são fornecidos neste documento os usos das células imunes geneticamente manipuladas, opcionalmente em combinação com um agente contendo Fc quando necessário (por exemplo, quando as células imunes expressam um polipeptídeo de ACTR), para melhorar a proliferação de células imunes e/ou inibir ou diminuir células alvo (por exemplo, células cancerosas alvo) em um indivíduo (por exemplo, um paciente humano com câncer), por exemplo, via ADCC. A presente invenção também fornece composições farmacêuticas e kits compreendendo as células imunes descritas por manipulação genética.
[0053] As células imunes geneticamente manipuladas descritas neste documento, expressando (por exemplo, superexpressão) um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs, podem conferir pelo menos as seguintes vantagens. A expressão do polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs aumentaria a atividade metabólica de uma célula T. Assim, as células imunes geneticamente manipuladas podem se proliferar melhor, produzir mais citocinas, exibir maior citotoxicidade antitumoral, exibir menos metabólitos imunossupressores e/ou exibir maior sobrevivência de células T em um ambiente tumoral (por exemplo, baixo teor de glicose, baixo teor de aminoácidos, baixo pH e/ou ambiente hipóxico em relação às células imunes que não expressam (ou não superexpressam) o polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs, levando a produção aumentada de citocinas, taxa de sobrevivência, citotoxicidade e/ou atividade antitumoral. I. Polipeptídeos moduladores de ciclo de Krebs
[0054] Conforme usado neste documento, um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs refere-se a qualquer polipeptídeo que modula o ciclo de Krebs, que liga várias vias metabólicas, tais como as vias metabólicas para processamento de glicose, aminoácidos e/ou ácidos graxos. O ciclo de Krebs, também conhecido como ciclo do ácido cítrico e ciclo do ácido tricarboxílico (TCA), é uma via metabólica que começa com a adição de acetil-CoA gerada na glicólise ao oxaloacetato, formando citrato. Esse polipeptídeo pode regular uma ou mais reações enzimáticas reversíveis no ciclo de Krebs em favor de uma direção em relação à outra, de modo a regular os metabólitos gerados a partir delas. Um aumento de entrada no ciclo de Krebs de uma fonte metabólica pode redirecionar os metabólitos a montante de outra via. Por exemplo, um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs pode redirecionar a alanina para a via glicolítica, aumentar α-ceto-glutarato (KG) para a via de síntese de TCA e/ou serina via, por exemplo, PSAT1, facilitar o ciclo de TCA na mitocôndria e/ou no citoplasma; mover a glicose para fora do ciclo do TCA para produzir serina via PSAT1 ou PSPH.
[0055] Além disso, um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs pode aumentar a atividade do ciclo de Krebs na mitocôndria e/ou no citoplasma. Um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs também pode transformar metabólitos inibitórios, como lactato, em piruvato para promover a atividade do ciclo de Krebs. Qualquer um de tais polipeptídeos moduladores do ciclo de Krebs, que pode ser de qualquer espécie adequada (por exemplo, mamífero, tal como humano), pode ser contemplado para uso com as composições e métodos descritos neste documento.
[0056] Alternativamente, o polipeptídeo de metabólito do ciclo de Krebs pode ser uma molécula que é mutada para imitar um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs ativado (por exemplo, um mimetizador de fosforilação) ou mutado para impactar seu tráfego intracelular (por exemplo, tráfego para mitocôndrias) de modo que a atividade de Krebs o ciclo é modulado. Alternativamente, a expressão de um polipeptídeo do ciclo de Krebs endógeno pode ser modulada, por exemplo, pela expressão de um fator de transcrição ou um microRNA, ou pela modulação da estabilidade ou degradação do polipeptídeo, por exemplo, pela modulação de fatores que medeiam sua degradação, por exemplo, uma ligase E3 isso faz parte da via da ubiquitina/proteassoma. Além disso, o tráfego de um polipeptídeo do ciclo de Krebs endógeno pode ser modulado, por exemplo, pela expressão de um polipeptídeo que aumenta o seu tráfego para um compartimento subcelular desejado, por exemplo, mitocôndrias. Além disso, um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs pode ser um polipeptídeo que converte substratos enzimaticamente, encontrados em níveis elevados no microambiente tumoral, que inibem ou limitam a atividade das células imunes, em moléculas que não têm mais efeitos inibidores, melhorando assim a função das células imunes.
[0057] Os polipeptídeos moduladores do ciclo de Krebs podem ser polipeptídeos com a atividade enzimática para catalisar uma reação no ciclo de Krebs, por exemplo, enzimas de ocorrência natural que catalisam uma reação do ciclo de Krebs ou variantes/homólogos funcionais dos mesmos que catalisam a mesma reação do ciclo de Krebs. Os exemplos incluem, mas não estão limitados a isocitrato desidrogenase (IDH, incluindo IDH1 ou IDH2), malato desidrogenase (MDH, incluindo MDH1 ou MDH2) ou fosfoglicerato desidrogenase (PHGDH).
[0058] Isocitrato desidrogenase (IDH) refere-se a qualquer polipeptídeo (enzima) que catalisa a descarboxilação oxidativa de isocitrato, levando à produção de -cetoglutarato e CO2. Malato desidrogenase (MDH) refere-se a qualquer polipeptídeo (enzima) que catalisa a oxidação de malato em oxaloacetato usando a redução de NAD+ em NADH. Fosfoglicerato desidrogenase (PHGDH) refere-se a qualquer polipeptídeo (enzima) que catalisa as reações para converter 3-fosfo-D-glicerato em 3-fosfonooxipiruvato e converter 2- hidroziglutarato em 2-oxoglutarato, usando a redução de NAD+ em NADH. As sequências de aminoácidos de IDH, MDH e PHGDH exemplificativos são fornecidas abaixo: IDH1 (SEQ ID NO: 81)
MSKKISGGSVVEMQGDEMTRIIWELIKEKLIFPYVELDLHSYDLGIENR DATNDQVTKDAAEAIKKHNVGVKCATITPDEKRVEEFKLKQMWKSPN GTIRNILGGTVFREAIICKNIPRLVSGWVKPIIIGRHAYGDQYRATDFVV PGPGKVEITYTPSDGTQKVTYLVHNFEEGGGVAMGMYNQDKSIEDF AHSSFQMALSKGWPLYLSTKNTILKKYDGRFKDIFQEIYDKQYKSQFE AQKIWYEHRLIDDMVAQAMKSEGGFIWACKNYDGDVQSDSVAQGY GSLGMMTSVLVCPDGKTVEAEAAHGTVTRHYRMYQKGQETSTNPIA SIFAWTRGLAHRAKLDNNKELAFFANALEEVSIETIEAGFMTKDLAACI KGLPNVQRSDYLNTFEFMDKLGENLKIKLAQAKL
IDH2 (SEQ ID NO: 82)
MAGYLRVVRSLCRASGSRPAWAPAALTAPTSQEQPRRHYADKRIKV AKPVVEMDGDEMTRIIWQFIKEKLILPHVDIQLKYFDLGLPNRDQTDD QVTIDSALATQKYSVAVKCATITPDEARVEEFKLKKMWKSPNGTIRNIL GGTVFREPIICKNIPRLVPGWTKPITIGRHAHGDQYKATDFVADRAGT FKMVFTPKDGSGVKEWEVYNFPAGGVGMGMYNTDESISGFAHSCF QYAIQKKWPLYMSTKNTILKAYDGRFKDIFQEIFDKHYKTDFDKNKIW YEHRLIDDMVAQVLKSSGGFVWACKNYDGDVQSDILAQGFGSLGLM TSVLVCPDGKTIEAEAAHGTVTRHYREHQKGRPTSTNPIASIFAWTR GLEHRGKLDGNQDLIRFAQMLEKVCVETVESGAMTKDLAGCIHGLSN
VKLNEHFLNTTDFLDTIKSNLDRALGRQ MDH1 (SEQ ID NO: 83)
MSEPIRVLVTGAAGQIAYSLLYSIGNGSVFGKDQPIILVLLDITPMMGVLD GVLMELQDCALPLLKDVIATDKEDVAFKDLDVAILVGSMPRREGMERK DLLKANVKIFKSQGAALDKYAKKSVKVIVVGNPANTNCLTASKSAPSIPK ENFSCLTRLDHNRAKAQIALKLGVTANDVKNVIIWGNHSSTQYPDVNH AKVKLQGKEVGVYEALKDDSWLKGEFVTTVQQRGAAVIKARKLSSAM SAAKAICDHVRDIWFGTPEGEFVSMGVISDGNSYGVPDDLLYSFPVVIK
NKTWKFVEGLPINDFSREKMDLTAKELTEEKESAFEFLSSA MDH2 (SEQ ID NO: 84)
MLSALARPASAALRRSFSTSAQNNAKVAVLGASGGIGQPLSLLLKNSPL VSRLTLYDIAHTPGVAADLSHIETKAAVKGYLGPEQLPDCLKGCDVVVI PAGVPRKPGMTRDDLFNTNATIVATLTAACAQHCPEAMICVIANPVNST IPITAEVFKKHGVYNPNKIFGVTTLDIVRANTFVAELKGLDPARVNVPVIG GHAGKTIIPLISQCTPKVDFPQDQLTALTGRIQEAGTEVVKAKAGAGSA TLSMAYAGARFVFSLVDAMNGKEGVVECSFVKSQETECTYFSTPLLLG
KKGIEKNLGIGKVSSFEEKMISDAIPELKASIKKGEDFVKTLK PHGDH (SEQ ID NO: 85)
MAFANLRKVLISDSLDPCCRKILQDGGLQVVEKQNLSKEELIAELQDC EGLIVRSATKVTADVINAAEKLQVVGRAGTGVDNVDLEAATRKGILVM NTPNGNSLSAAELTCGMIMCLARQIPQATASMKDGKWERKKFMGTE LNGKTLGILGLGRIGREVATRMQSFGMKTIGYDPIISPEVSASFGVQQ LPLEEIWPLCDFITVHTPLLPSTTGLLNDNTFAQCKKGVRVVNCARGG IVDEGALLRALQSGQCAGAALDVFTEEPPRDRALVDHENVISCPHLG ASTKEAQSRCGEEIAVQFVDMVKGKSLTGVVNAQALTSAFSPHTKP WIGLAEALGTLMRAWAGSPKGTIQVITQGTSLKNAGNCLSPAVIVGLL KEASKQADVNLVNAKLLVKEAGLNVTTSHSPAAPGEQGFGECLLAVA LAGAPYQAVGLVQGTTPVLQGLNGAVFRPEVPLRRDLPLLLFRTQTS DPAMLPTMIGLLAEAGVRLLSYQTSLVSDGETWHVMGISSLLPSLEA WKQHVTEAFQFHF
[0059] Os polipeptídeos moduladores do ciclo de Krebs também podem ser polipeptídeos que usam um metabólito do ciclo de Krebs como substrato, por exemplo, uma transaminase glutâmico- oxaloacética (GOT, incluindo GOT1 e GOT2) ou fosfoenolpiruvato carboxicinase 1 (PCK1). A transaminase glutâmico-oxaloacética (GOT), também conhecida como aspartato aminotransferase (AST), refere-se a qualquer enzima dependente de fosfato de piridoxal (PLP) que catalisa a reação reversível para transferir um grupo-amino entre aspartato e glutamato. Em alguns casos, o GOT existe nas formas citoplasmática e mitocondrial de membrana interna, GOT1 e GOT2, respectivamente. GOT também é conhecido como. Várias enzimas dependentes de PLP, além de GOT1 e GOT2, também podem ser polipeptídeos moduladores do ciclo de Krebs, por exemplo, aminotransferase, triptofano sintase, alanina racemase, D-aminoácido aminotransferase e glicogênio fosforilase. Todas essas enzimas estão dentro do escopo da presente invenção. Fosfoenolpiruvato carboxicinase 1 (PCK1) refere-se a qualquer polipeptídeo (enzima) que converte oxaloacetato em fosfoenolpiruvato e dióxido de carbono. As sequências de aminoácidos de GOT e PCK1 exemplificativas são fornecidas abaixo: PCK1 (SEQ ID NO: 86)
MPPQLQNGLNLSAKVVQGSLDSLPQAVREFLENNAELCQPDHIHICD GSEEENGRLLGQMEEEGILRRLKKYDNCWLALTDPRDVARIESKTVI VTQEQRDTVPIPKTGLSQLGRWMSEEDFEKAFNARFPGCMKGRTM YVIPFSMGPLGSPLSKIGIELTDSPYVVASMRIMTRMGTPVLEAVGDG EFVKCLHSVGCPLPLQKPLVNNWPCNPELTLIAHLPDRREIISFGSGY GGNSLLGKKCFALRMASRLAKEEGWLAEHMLILGITNPEGEKKYLAA AFPSACGKTNLAMMNPSLPGWKVECVGDDIAWMKFDAQGHLRAINP ENGFFGVAPGTSVKTNPNAIKTIQKNTIFTNVAETSDGGVYWEGIDEP LASGVTITSWKNKEWSSEDGEPCAHPNSRFCTPASQCPIIDAAWESP EGVPIEGIIFGGRRPAGVPLVYEALSWQHGVFVGAAMRSEATAAAEH KGKIIMHDPFAMRPFFGYNFGKYLAHWLSMAQHPAAKLPKIFHVNWF RKDKEGKFLWPGFGENSRVLEWMFNRIDGKASTKLTPIGYIPKEDAL NLKGLGHINMMELFSISKEFWEKEVEDIEKYLEDQVNADLPCEIEREIL
ALKQRISQM GOT1 (SEQ ID NO: 87)
MAPPSVFAEVPQAQPVLVFKLTADFREDPDPRKVNLGVGAYRTDDC HPWVLPVVKKVEQKIANDNSLNHEYLPILGLAEFRSCASRLALGDDS PALKEKRVGGVQSLGGTGALRIGADFLARWYNGTNNKNTPVYVSSP TWENHNAVFSAAGFKDIRSYRYWDAEKRGLDLQGFLNDLENAPEFSI VVLHACAHNPTGIDPTPEQWKQIASVMKHRFLFPFFDSAYQGFASGN LERDAWAIRYFVSEGFEFFCAQSFSKNFGLYNERVGNLTVVGKEPES ILQVLSQMEKIVRITWSNPPAQGARIVASTLSNPELFEEWTGNVKTMA DRILTMRSELRARLEALKTPGTWNHITDQIGMFSFTGLNPKQVEYLVN
EKHIYLLPSGRINVSGLTTKNLDYVATSIHEAVTKIQ GOT2 (SEQ ID NO: 88)
MALLHSGRVLPGIAAAFHPGLAAAASARASSWWTHVEMGPPDPILG VTEAFKRDTNSKKMNLGVGAYRDDNGKPYVLPSVRKAEAQIAAKNL DKEYLPIGGLAEFCKASAELALGENSEVLKSGRFVTVQTISGTGALRI GASFLQRFFKFSRDVFLPKPTWGNHTPIFRDAGMQLQGYRYYDPKT CGFDFTGAVEDISKIPEQSVLLLHACAHNPTGVDPRPEQWKEIATVVK KRNLFAFFDMAYQGFASGDGDKDAWAVRHFIEQGINVCLCQSYAKN MGLYGERVGAFTMVCKDADEAKRVESQLKILIRPMYSNPPLNGARIA AAILNTPDLRKQWLQEVKVMADRIIGMRTQLVSNLKKEGSTHNWQHI TDQIGMFCFTGLKPEQVERLIKEFSIYMTKDGRISVAGVTSSNVGYLA HAIHQVTK
[0060] Além disso, um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs pode ser uma enzima que converte um precursor em um metabólito do ciclo de Krebs, por exemplo, fosfoserina aminotransferase (PSAT1), glutamato desidrogenase (GDH1; também conhecido como GLUD1), glutamato-piruvato transaminase 1 (GPT1), ou glutaminase (GLS). Fosfoserina aminotransferase (PSAT1) refere-se a qualquer polipeptídeo (enzima) que catalisa a conversão reversível de 3-fosfo- hidroxipiruvato em fosfoserina e de 3-hidroxi-2-oxo-4- fosfonooxibutanoato em fosfohidroxitreonina. PSAT1 produz 2- oxoglutarato e O-fosfo-L-serina. Glutamato desidrogenase (GDH1) refere-se a qualquer polipeptídeo (enzima) que converte o glutamato em -cetoglutarato e vice-versa. GDH1 converte glutamato em 2- oxoglutarato (alfa-cetoglutarato). Glutamato-piruvato transaminase 1 (GPT1) refere-se a qualquer polipeptídeo (enzima) que catalisa a transaminação reversível entre alanina e 2-oxoglutarato para formar piruvato e glutamato. Glutaminase (GLS) refere-se a qualquer polipeptídeo (enzima) que gera glutamato a partir da glutamina. As sequências de aminoácidos de PSAT1, GDH1, GPT1 e GLS exemplificativas são fornecidas abaixo: GPT1 (SEQ ID NO: 89)
MASSTGDRSQAVRHGLRAKVLTLDGMNPRVRRVEYAVRGPIVQRAL ELEQELRQGVKKPFTEVIRANIGDAQAMGQRPITFLRQVLALCVNPDL LSSPNFPDDAKKRAERILQACGGHSLGAYSVSSGIQLIREDVARYIER RDGGIPADPNNVFLSTGASDAIVTVLKLLVAGEGHTRTGVLIPIPQYPL YSATLAELGAVQVDYYLDEERAWALDVAELHRALGQARDHCRPRAL CVINPGNPTGQVQTRECIEAVIRFAFEERLFLLADEVYQDNVYAAGSQ FHSFKKVLMEMGPPYAGQQELASFHSTSKGYMGECGFRGGYVEVV NMDAAVQQQMLKLMSVRLCPPVPGQALLDLVVSPPAPTDPSFAQFQ AEKQAVLAELAAKAKLTEQVFNEAPGISCNPVQGAMYSFPRVQLPPR AVERAQELGLAPDMFFCLRLLEETGICVVPGSGFGQREGTYHFRMTI
LPPLEKLRLLLEKLSRFHAKFTLEYS GLS (SEQ ID NO: 90)
MMRLRGSGMLRDLLLRSPAGVSATLRRAQPLVTLCRRPRGGGRPAA GPAAAARLHPWWGGGGWPAEPLARGLSSSPSEILQELGKGSTHPQ PGVSPPAAPAAPGPKDGPGETDAFGNSEGKELVASGENKIKQGLLP SLEDLLFYTIAEGQEKIPVHKFITALKSTGLRTSDPRLKECMDMLRLTL QTTSDGVMLDKDLFKKCVQSNIVLLTQAFRRKFVIPDFMSFTSHIDEL YESAKKQSGGKVADYIPQLAKFSPDLWGVSVCTVDGQRHSTGDTKV PFCLQSCVKPLKYAIAVNDLGTEYVHRYVGKEPSGLRFNKLFLNEDD KPHNPMVNAGAIVVTSLIKQGVNNAEKFDYVMQFLNKMAGNEYVGF SNATFQSERESGDRNFAIGYYLKEKKCFPEGTDMVGILDFYFQLCSIE VTCESASVMAATLANGGFCPITGERVLSPEAVRNTLSLMHSCGMYDF SGQFAFHVGLPAKSGVAGGILLVVPNVMGMMCWSPPLDKMGNSVK GIHFCHDLVSLCNFHNYDNLRHFAKKLDPRREGGDQRVKSVINLLFA AYTGDVSALRRFALSAMDMEQRDYDSRTALHVAAAEGHVEVVKFLL EACKVNPFPKDRWNNTPMDEALHFGHHDVFKILQEYQVQYTPQGDS
DNGKENQTVHKNLDGLL PSAT1 (SEQ ID NO: 91)
MDAPRQVVNFGPGPAKLPHSVLLEIQKELLDYKGVGISVLEMSHRSS DFAKIINNTENLVRELLAVPDNYKVIFLQGGGCGQFSAVPLNLIGLKAG RCADYVVTGAWSAKAAEEAKKFGTINIVHPKLGSYTKIPDPSTWNLN PDASYVYYCANETVHGVEFDFIPDVKGAVLVCDMSSNFLSKPVDVSK FGVIFAGAQKNVGSAGVTVVIVRDDLLGFALRECPSVLEYKVQAGNS SLYNTPPCFSIYVMGLVLEWIKNNGGAAAMEKLSSIKSQTIYEIIDNSQ GFYVCPVEPQNRSKMNIPFRIGNAKGDDALEKRFLDKALELNMLSLK
GHRSVGGIRASLYNAVTIEDVQKLAAFMKKFLEMHQL GDH1 (SEQ ID NO: 92)
MTYKCAVVDVPFGGAKAGVKINPKNYTDNELEKITRRFTMELAKKGFI GPGIDVPAPDMSTGEREMSWIADTYASTIGHYDINAHACVTGKPISQ GGIHGRISATGRGVFHGIENFINEASYMSILGMTPGFGDKTFVVQGFG NVGLHSMRYLHRFGAKCIAVGESDGSIWNPDGIDPKELEDFKLQHGS ILGFPKAKPYEGSILEADCDILIPAASEKQLTKSNAPRVKAKIIAEGANG PTTPEADKIFLERNIMVIPDLYLNAGGVTVSYFEWLKNLNHVSYGRLT FKYERDSNYHLLMSVQESLERKFGKHGGTIPIVPTAEFQDRISGASEK DIVHSGLAYTMERSARQIMRTAMKYNLGLDLRTAAYVNAIEKVFKVYN EAGVTFT
[0061] O polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs pode ser um polipeptídeo de ocorrência natural de uma espécie adequada, por exemplo, um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs de mamífero, como aqueles derivados de primata humano ou não humano. Tais polipeptídeos de ocorrência natural são conhecidos na técnica e podem ser obtidos, por exemplo, usando qualquer uma das sequências de aminoácidos acima mencionadas como uma consulta para pesquisar um banco de dados de genes publicamente disponível, por exemplo, GenBank. O polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs para uso na presente invenção pode compartilhar uma identidade de sequência de pelo menos 85% (por exemplo, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou acima) como qualquer uma das proteínas exemplificativas observadas acima.
[0062] A "percentagem de identidade" de duas sequências de aminoácidos é determinada usando o algoritmo de Karlin e Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990, modificado como em Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993. Esse algoritmo é incorporado nos programas NBLAST e XBLAST (versão 2.0) de Altschul, et al. J. Mol. Biol. 215: 403-10, 1990. As buscas de proteína no BLAST podem ser realizadas com o programa XBLAST, pontuação
= 50, comprimento da palavra = 3 para obter as sequências de aminoácido homólogas às moléculas de proteína da invenção. Onde existem lacunas entre duas sequências, Gapped BLAST pode ser utilizado como descrito em Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25 (17): 3389-3402, 1997. Ao utilizar os programas BLAST e Gapped BLAST, os parâmetros padrão dos respectivos programas (por exemplo, XBLAST e NBLAST) podem ser usados.
[0063] Em algumas modalidades, o polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs pode ser conjugado a um peptídeo de sinalização de localização de compartimento subcelular (por exemplo, peptídeo de sinalização de localização de mitocôndria) para o tráfego do polipeptídeo para um compartimento subcelular desejado. Por exemplo, um polipeptídeo GOT2 pode compreender um peptídeo de sinalização de localização de mitocôndrias de modo que possa ser transportado para mitocôndrias em uma célula imune hospedeira.
[0064] Alternativamente, o polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs pode ser uma variante funcional de uma contraparte nativa. Tal variante funcional pode conter uma ou mais mutações fora do (s) domínio (s) funcional (is) da contraparte nativa. Os domínios funcionais de um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs nativo podem ser conhecidos na técnica ou podem ser previstos com base na sua sequência de aminoácidos. Não se espera que as mutações fora do (s) domínio (s) funcional (is) afetem substancialmente a atividade biológica da proteína. Em alguns casos, a variante funcional pode exibir modulação do ciclo de Krebs aumentada em relação à contraparte nativa. Alternativamente, a variante funcional pode exibir uma modulação do ciclo de Krebs diminuída em relação à contraparte nativa.
[0065] Uma variante funcional de um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs pode ser uma variante funcional de um polipeptídeo de tipo selvagem, que pode compreender uma ou mais mutações em relação à contraparte nativa e reter substancialmente a mesma atividade biológica que a contraparte nativa. Em algumas modalidades, a variante funcional do polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs compreende pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis ou mais mutações em relação à contraparte nativa.
[0066] Por exemplo, uma variante funcional de GOT pode compreender pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis ou mais mutações em relação à contraparte nativa. Em algumas modalidades, uma variante funcional de GOT compreende uma mutação de um resíduo de lisina na posição 159 (por exemplo, K159Q) na SEQ ID NO: 88. Em algumas modalidades, uma variante funcional de GOT compreende uma mutação de um resíduo de lisina na posição 185 (por exemplo, K185Q) na SEQ ID NO: 88. Em algumas modalidades, uma variante funcional de GOT compreende uma mutação de um resíduo de lisina na posição 404 (por exemplo, K404Q) na SEQ ID NO: 88. Em algumas modalidades, uma variante funcional de GOT compreende uma mutação de um resíduo de lisina na posição 159 (por exemplo, K159Q) e posição 185 (por exemplo, K185Q) na SEQ ID NO: 88. Em algumas modalidades, uma variante funcional de GOT compreende uma mutação de um resíduo de lisina na posição 185 (por exemplo, K185Q) na posição 404 (por exemplo, K404Q) na SEQ ID NO: 88. Em algumas modalidades, uma variante funcional de GOT compreende uma mutação de um resíduo de lisina na posição 159 (por exemplo, K159Q) e posição 404 (por exemplo, K404Q) na SEQ ID NO: 88. Em algumas modalidades, uma variante funcional de GOT compreende uma mutação de um resíduo de lisina na posição 159 (por exemplo, K159Q), posição 185 (por exemplo, K185Q), e posição 404 (por exemplo, K404Q) na SEQ ID NO: 88. Ver também Yang et al., The EMBO Journal
(2015) 34: 1100-1125, cujas invenções relevantes são incorporadas por referência neste documento para a finalidade e referência de assunto neste documento.
[0067] Em algumas modalidades, a variante funcional do polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs pode exibir uma ou mais propriedades biológicas (por exemplo, status de modificação, atividade catalítica, localização celular e/ou parceiros de ligação) que podem ser alteradas em relação à contraparte nativa. Exemplos não limitativos de uma variante funcional de um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs incluem uma variante funcional de uma enzima que catalisa uma reação no ciclo de Krebs (por exemplo, uma variante funcional de IDH, MDH ou PHGDH), uma variante funcional de uma enzima que usa um metabólito do ciclo de Krebs como substrato (por exemplo, uma variante funcional de GOT ou PCK1) e uma variante funcional de uma enzima que converte um precursor em um metabólito do ciclo de Krebs (por exemplo, uma variante funcional de PSAT1, GDH1, GPT1, ou GLS).
[0068] Alternativamente ou além disso, a variante funcional pode conter mutação (ões) conservadora (s) em uma ou mais posições na contraparte nativa (por exemplo, até 20 posições, até 15 posições, até 10 posições, até 5, 4, 3, 2, 1 posição (ões)). Conforme usado neste documento, uma "substituição de aminoácido conservadora" refere-se a uma substituição de aminoácido que não altera a carga relativa ou as características de tamanho da proteína na qual a substituição de aminoácido é feita. As variantes podem ser preparadas de acordo com métodos para alterar a sequência polipeptídica conhecida por um versado na técnica, tais como são encontrados em referências que compilam tais métodos, por exemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, or Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley &
Sons, Inc., New York. Substituições conservativas de aminoácidos incluem substituições feitas entre aminoácidos dentro dos seguintes grupos: (a) M, I, L, V; (b) F, Y, W; (c) K, R, H; (d) A, G; (e) S, T; (f) Q, N; e (g) E, D. II. Polipeptídeos dos receptores quiméricos
[0069] Conforme usado neste documento, um polipeptídeo do receptor quimérico refere-se a uma molécula de ocorrência não natural que pode ser expressa na superfície de uma célula hospedeira. Um polipeptídeo receptor quimérico compreende um domínio de ligação ao alvo extracelular que pode ter como alvo um antígeno de interesse (por exemplo, um antígeno associado a uma doença como o câncer ou um antígeno associado a um patógeno; ver discussões neste documento). Um domínio de ligação ao alvo extracelular pode se ligar a um antígeno de interesse diretamente (por exemplo, um domínio de ligação ao antígeno extracelular em um polipeptídeo de CAR como descrito neste documento). Alternativamente, um domínio de ligação ao alvo extracelular pode se ligar ao antígeno de interesse por meio de um intermediário, por exemplo, um agente contendo Fc, como um anticorpo. Um polipeptídeo receptor quimérico pode compreender ainda um domínio transmembrana, um domínio de dobradiça, um domínio de sinalização citoplasmático, um ou mais domínios coestimuladores, um domínio de sinalização citoplasmático ou uma combinação dos mesmos. Em alguns casos, o polipeptídeo do receptor quimérico pode estar livre de domínios coestimuladores. Os polipeptídeos de receptor quimérico são configurados de modo que, quando expresso em uma célula hospedeira, o domínio de ligação ao alvo extracelular está localizado extracelularmente para ligação a um antígeno alvo, direta ou indiretamente. O domínio de sinalização coestimulatório opcional pode estar localizado no citoplasma para desencadear a ativação e/ou sinalização efetora.
[0070] Em algumas modalidades, os polipeptídeos dos receptores quiméricos descritos neste documento podem compreender ainda um domínio de dobradiça, que pode estar localizado no terminal C do domínio de ligação ao alvo extracelular e no terminal N do domínio transmembrana. A dobradiça pode ter qualquer comprimento adequado. Em outras modalidades, o polipeptídeo receptor quimérico descrito neste documento pode não ter nenhum domínio de dobradiça. Em ainda outras modalidades, o polipeptídeo do receptor quimérico descrito neste documento pode ter um domínio de dobradiça encurtado (por exemplo, incluindo até 25 resíduos de aminoácidos).
[0071] Em algumas modalidades, um polipeptídeo do receptor quimérico, conforme descrito neste documento, pode compreender, do terminal N ao terminal C, o domínio de ligação ao alvo extracelular, o domínio transmembrana e o domínio de sinalização citoplasmático. Em algumas modalidades, um polipeptídeo do receptor quimérico, conforme descrito neste documento, compreende, do terminal N ao terminal C, o domínio de ligação ao alvo extracelular, o domínio transmembrana, pelo menos um domínio de sinalização coestimulatório e o domínio de sinalização citoplasmático. Em outras modalidades, um polipeptídeo do receptor quimérico, conforme descrito neste documento, compreende, do terminal N ao terminal C, o domínio de ligação ao alvo extracelular, o domínio transmembrana, os domínios de sinalização citoplasmáticos e pelo menos um domínio de sinalização coestimulador.
[0072] Em algumas modalidades, o polipeptídeo do receptor quimérico pode ser um polipeptídeo do receptor de células T acopladas a anticorpo (ACTR). Conforme usado neste documento, um polipeptídeo de ACTR (também conhecido como um construto ACTR) refere-se a uma molécula de ocorrência não natural que pode ser expressa na superfície de uma célula hospedeira e compreende um domínio extracelular com afinidade de ligação e especificidade para a porção Fc de uma imunoglobulina ("Ligante Fc" ou "domínio de ligação Fc"), um domínio transmembrana e um domínio de sinalização citoplasmático. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de ACTR descritos neste documento podem incluir ainda pelo menos um domínio de sinalização coestimulador.
[0073] Em outras modalidades, o polipeptídeo do receptor quimérico descrito neste documento pode ser um polipeptídeo do receptor de antígeno quimérico (CAR). Conforme usado neste documento, um polipeptídeo de CAR (também conhecido comoum construto CAR) se refere a uma molécula de ocorrência não natural que pode ser expressa na superfície de uma célula hospedeira e compreende um domínio de ligação ao antígeno extracelular, um domínio transmembrana e um domínio de sinalização citoplasmático. Os polipeptídeos de ACTR descritos neste documento podem incluir ainda pelo menos um domínio de sinalização coestimulador.
[0074] O domínio de ligação ao antígeno extracelular pode ser qualquer peptídeo ou polipeptídeo que se liga especificamente a um antígeno alvo, incluindo antígenos de ocorrência natural que estão associados a uma condição médica (por exemplo, uma doença) ou uma fração antigênica conjugada a um agente terapêutico que visa uma doença-antígeno associado.
[0075] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de CAR descritos neste documento podem incluir ainda pelo menos um domínio de sinalização coestimulador. Os polipeptídeos de CAR são configurados de modo que, quando expressos em uma célula hospedeira, o domínio de ligação ao antígeno extracelular está localizado extracelularmente para ligação a uma molécula alvo e ao domínio de sinalização citoplasmático. O domínio de sinalização coestimulatório opcional pode estar localizado no citoplasma para desencadear a ativação e/ou sinalização efetora.
[0076] Conforme usado neste documento, a frase "um domínio transmembrana de proteína X" (por exemplo, um domínio transmembrana CD8) refere-se a qualquer porção de uma determinada proteína, ou seja, proteína X transmembrana que é termodinamicamente estável em uma membrana.
[0077] Conforme usado neste documento, a frase "um domínio de sinalização citoplasmático da proteína X", por exemplo, um domínio de sinalização citoplasmático CD3, refere-se a qualquer porção de uma proteína (proteína X) que interage com o interior de uma célula ou organela e é capaz de retransmitir um sinal primário conforme conhecido na técnica, que leva à proliferação e/ou ativação de células imunes. O domínio de sinalização citoplasmático, conforme descrito neste documento, difere de um domínio de sinalização coestimulador, que retransmite um sinal secundário para ativar totalmente as células imunes.
[0078] Conforme usado neste documento, a frase "um domínio de sinalização coestimulador de proteína X", por exemplo, um domínio de sinalização coestimulador de CD28, refere-se à porção de uma determinada proteína coestimuladora (proteína X, como CD28, 4-1BB, OX40, CD27 ou ICOS) que pode transduzir sinais coestimulatórios (sinais secundários) em células imunes (como células T), levando à ativação total das células imunes. A. Domínio de ligação de alvo extracelular
[0079] Os polipeptídeos receptores quiméricos descritos neste documento compreendem um domínio extracelular que tem como alvo um antígeno de interesse (por exemplo, aqueles descritos neste documento) por meio de ligação direta ou indireta (por meio de um intermediário, como um anticorpo). Os polipeptídeos receptores quiméricos podem ser polipeptídeos de ACTR que compreendem um domínio de ligação Fc. Alternativamente, os polipeptídeos dos receptores quiméricos podem ser polipeptídeos de CAR que compreendem um domínio de ligação ao antígeno extracelular. Domínios de ligação Fc
[0080] Os polipeptídeos de ACTR descritos neste documento compreendem um domínio extracelular que é um domínio de ligação Fc, ou seja, capaz de se ligar à porção Fc de uma imunoglobulina (por exemplo, IgG, IgA, IgM ou IgE) de um mamífero adequado (por exemplo, humano, camundongo, rato, cabra, ovelha ou macaco). Os domínios de ligação Fc adequados podem ser derivados de proteínas de ocorrência natural, tais como receptores Fc de mamíferos ou certas proteínas bacterianas (por exemplo, proteína A, proteína G). Além disso, os domínios de ligação de Fc podem ser polipeptídeos sintéticos manipulados especificamente para ligar a porção Fc de qualquer um dos anticorpos descritos neste documento com alta afinidade e especificidade. Por exemplo, tal domínio de ligação Fc pode ser um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente à porção Fc de uma imunoglobulina. Os exemplos incluem, mas não estão limitados a um fragmento variável de cadeia única (scFv), um anticorpo de domínio ou anticorpos de domínio único (por exemplo, nanocorpos). Alternativamente, um domínio de ligação Fc pode ser um peptídeo sintético que se liga especificamente à porção Fc, como um domínio Kunitz, um pequeno imunofarmacêutico modular (SMIP), uma adnectina, um avímero, um affibody, um DARPin ou uma anticalina, que pode ser identificada por rastreio de uma biblioteca combinatória de péptidos para actividades de ligação a Fc.
[0081] Em algumas modalidades, o domínio de ligação Fc é um domínio de ligação ao ligante extracelular de um receptor Fc de mamífero. Conforme usado neste documento, um "receptor Fc" é um receptor ligado à superfície celular que é expresso na superfície de muitas células imunes (incluindo células B, células dendríticas, células killer naturais (NK), macrófagos, neutrófilos, mastócitos e eosinófilos) e exibe especificidade de ligação ao domínio Fc de um anticorpo. Os receptores Fc são tipicamente compostos de pelo menos dois domínios similares a imunoglobulina (Ig) com especificidade de ligação a uma porção Fc (fragmento cristalizável) de um anticorpo. Em alguns casos, a ligação de um receptor Fc a uma porção Fc do anticorpo pode desencadear efeitos de citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC). O receptor Fc usado para construir um polipeptídeo de ACTR, conforme descrito neste documento, pode ser uma variante do polimorfismo de ocorrência natural (por exemplo, a variante CD16 V158), que pode ter aumentado ou diminuído a afinidade para Fc em comparação com uma contraparte de tipo selvagem. Alternativamente, o receptor Fc pode ser uma variante funcional de uma contraparte de tipo selvagem, que carrega uma ou mais mutações (por exemplo, até 10 substituições de resíduos de aminoácidos incluindo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 mutações) que alteram a afinidade de ligação à porção Fc de uma molécula de Ig. Em alguns casos, a mutação pode alterar o padrão de glicosilação do receptor Fc e, portanto, a afinidade de ligação ao Fc.
[0082] A tabela abaixo lista uma série de polimorfismos exemplificativos em domínios extracelulares do receptor Fc (ver, por exemplo, Kim et al., J. Mol. Evol. 53: 1-9, 2001) que podem ser usados em qualquer um dos métodos ou construtos descritos neste documento em: Tabela 1. Polimorfismos exemplificativos em receptores Fc Número de aminoácidos 19 48 65 89 105 130 134 141 142 158 FCR10 R S D I D G F Y T V P08637 R S D I D G F Y I F S76824 R S D I D G F Y I V J04162 R N D V D D F H I V
Número de aminoácidos 19 48 65 89 105 130 134 141 142 158 M31936 S S N I D D F H I V M24854 S S N I E D S H I V X07934 R S N I D D F H I V X14356 (FcRII) N N N S E S S S I I M31932 (Fc RI) S T N R E A F T I G X06948 (Fc EU) R S E S Q S E S I V
[0083] Os receptores Fc são classificados com base no isotipo do anticorpo ao qual é capaz de se ligar. Por exemplo, os receptores Fc- gama (FcγR) geralmente se ligam a anticorpos IgG, tais como um ou mais subtipos dos mesmos (ou seja, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4); Os receptores Fc-alfa (FcαR) geralmente ligam-se a anticorpos IgA; e os receptores Fc-epsilon (FcεR) geralmente ligam-se a anticorpos IgE. Em algumas modalidades, o receptor Fc é um receptor Fc-gama, um receptor Fc-alfa ou um receptor Fc-epsilon. Exemplos de receptores Fc- gama incluem, sem limitação, CD64A, CD64B, CD64C, CD32A, CD32B, CD16A e CD16B. Um exemplo de um receptor Fc-alfa é FcαR1/CD89. Exemplos de receptores Fc-epsilon incluem, sem limitação, FcεRI e FcεRII/CD23. A tabela abaixo lista receptores Fc exemplificativos para uso no construto dos polipeptídeos de ACTR descritos neste documento e sua atividade de ligação aos domínios Fc correspondentes: Tabela 2. Receptores Fc exemplificativos Ligante de anticorpo Nome do receptor Afinidade pelo ligante principal FcγRI (CD64) IgG1 e IgG3 Alto (Kd ~ 10−9 M) FcγRIIA (CD32) IgG Baixo (Kd > 10−7 M) FcγRIIB1 (CD32) IgG Baixo (Kd > 10−7 M) FcγRIIB2 (CD32) IgG Baixo (Kd > 10−7 M) FcγRIIIA (CD16a) IgG Baixo (Kd > 10−6 M)
FcγRIIIB (CD16b) IgG Baixo (Kd > 10−6 M) FcεRI IgE Alto (Kd ~ 10−10 M) FcεRII (CD23) IgE Baixo (Kd > 10−7 M) FcαRI (CD89) IgA Baixo (Kd > 10−6 M) Alto para IgM, Médio Fcα/μR IgA e IgM para IgA FcRn IgG
[0084] A seleção do domínio de ligação ao ligante de um receptor Fc para uso nos polipeptídeos de ACTR descritos neste documento será aparente para um versado na técnica. Por exemplo, pode depender de fatores como o isotipo do anticorpo ao qual a ligação do receptor Fc é desejada e a afinidade desejada da interação de ligação.
[0085] O domínio de ligação ao antígeno extracelular de qualquer um dos polipeptídeos de CAR. Em alguns exemplos, o domínio de ligação Fc é o domínio de ligação ao ligante extracelular de CD16, que pode incorporar um polimorfismo de ocorrência natural que pode modular a afinidade para Fc. Em alguns exemplos, o domínio de ligação Fc é o domínio de ligação ao ligante extracelular de CD16 que incorpora um polimorfismo na posição 158 (por exemplo, valina ou fenilalanina). Em algumas modalidades, o domínio de ligação Fc é produzido sob condições que alteram seu estado de glicosilação e sua afinidade para Fc.
[0086] As sequências de aminoácidos das variantes humanas CD16A F158 e CD16A V158 são fornecidas abaixo com o resíduo F158 e V158 destacado em negrito/face e sublinhado (peptídeo sinal em itálico): CD16A F158 (SEQ ID NO: 93):
MWQLLLPTALLLLVSAGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDSVTLKC QGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRCQTNLS TLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTALHKVTY LQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLFGSKNVSSETVNI TITQGLAVSTISSFFPPGYQVSFCLVMVLLFAVDTGLYFSVKTNIRSST
RDWKDHKFKWRKDPQDK CD16A V158 (SEQ ID NO: 94):
MWQLLLPTALLLLVSAGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDSVTLKC QGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRCQTNLS TLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTALHKVTY LQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSSETVNI TITQGLAVSTISSFFPPGYQVSFCLVMVLLFAVDTGLYFSVKTNIRSST RDWKDHKFKWRKDPQDK
[0087] Em algumas modalidades, o domínio de ligação Fc é o domínio de ligação ao ligante extracelular de CD16 incorporando modificações que tornam o polipeptídeo de ACTR específico para um subconjunto de anticorpos IgG. Por exemplo, mutações que aumentam ou diminuem a afinidade por um subtipo de IgG (por exemplo, IgG1) podem ser incorporadas.
[0088] Qualquer um dos domínios de ligação Fc descritos neste documento pode ter uma afinidade de ligação adequada para a porção Fc de um anticorpo terapêutico. Conforme usado neste documento, "afinidade de ligação" refere-se à constante de associação aparente ou KA. O KA é o recíproco da constante de dissociação, KD. O domínio de ligação do ligante extracelular de um domínio do receptor Fc dos polipeptídeos de ACTR descritos neste documento pode ter uma afinidade de ligação Kd de pelo menos 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10 M ou inferior para a porção Fc do anticorpo. Em algumas modalidades, o domínio de ligação Fc tem uma afinidade de ligação elevada para um anticorpo, isotipo (s) de anticorpos ou subtipo (s) dos mesmos, em comparação com a afinidade de ligação do domínio de ligação Fc a outro anticorpo, isotipo (s) de anticorpos, ou subtipo (s) dos mesmos.
Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao ligante extracelular de um receptor Fc tem especificidade para um anticorpo, isotipo (s) de anticorpos ou subtipo (s) dos mesmos, em comparação com a ligação do domínio de ligação ao ligante extracelular de um receptor Fc a outro anticorpo, isotipo (s) de anticorpos ou subtipo (s) dos mesmos.
[0089] Outros domínios de ligação Fc como conhecidos na técnica também podem ser usados nos construtos ACTR descritos neste documento incluindo, por exemplo, aqueles descritos em WO2015058018A1 e Pedido PCT n°: PCT/US2018/015999, as invenções relevantes de cada um dos quais são incorporadas por referência para o propósito e assunto referido neste documento. Domínios de ligação de antígeno extracelular
[0090] Os polipeptídeos de CAR descritos neste documento compreendem um domínio de ligação ao antígeno extracelular, que redireciona a especificidade das células imunes que expressam o polipeptídeo de CAR. Conforme usado neste documento, "um domínio de ligação ao antígeno extracelular" refere-se a um peptídeo ou polipeptídeo com especificidade de ligação a um antígeno alvo de interesse, que pode ser um antígeno de ocorrência natural associado a uma condição médica (por exemplo, uma doença) ou uma fração antigênica conjugado a um agente terapêutico que tem como alvo um antígeno associado à doença. O domínio de ligação ao antígeno extracelular, conforme descrito neste documento, não compreende um domínio extracelular de um receptor Fc e pode não se ligar à porção Fc de uma imunoglobulina. Um domínio extracelular que não se liga a um fragmento Fc significa que a atividade de ligação entre os dois não é detectável usando um ensaio convencional ou apenas fundo ou atividade de ligação biologicamente insignificante é detectada usando o ensaio convencional.
[0091] Em alguns casos, o domínio de ligação ao antígeno extracelular de quaisquer polipeptídeos de CAR descritos neste documento é um peptídeo ou polipeptídeo capaz de se ligar a um antígeno de superfície celular (por exemplo, um antígeno tumoral), ou um antígeno (ou um fragmento deste) que é complexo com um complexo principal de histocompatibilidade e ser apresentado na superfície celular de uma célula apresentadora de antígeno.
Esse domínio de ligação ao antígeno extracelular pode ser um fragmento de anticorpo de cadeia única (scFv), que pode ser derivado de um anticorpo que se liga ao antígeno de superfície da célula alvo com uma alta afinidade de ligação.
A Tabela 1 abaixo lista antígenos alvo de superfície celular exemplificativos e anticorpos exemplificativos que se ligam a tais.
Tabela 3. Antígeno alvo de superfície celular exemplificativo e anticorpos que se ligam a tais Antígenos Alvo Anticorpos Antígenos Alvo Anticorpos Exemplificativos Exemplificativos Exemplificativos Exemplificativos e Agentes de fusão Fc CD137 (4-1BB) utomilumab CD74 milatuzumab Glicoproteína de naptumomabe HLA-DR IMMU-114 trofoblasto (5T4) estafenatox Receptor de mAbs anti-A2aR Hsp70 mi-TUMEXtx adenosina A2a (A2aR) Proteína quinase ascrinvacumab Hsp 90 ZSG-102 Alk-1 (ACVRL1) ADAM-10 8C7 ICAM-1 BI-505 (ADAM10) TACE (ADAM17) MEDI-3622 Coestimulador de GSK-3359609 células T induzíveis (ICOS) ADAM-28 GFC-201 Imunoglobulina kappa KappaMab (ADAM28) (Ig kappa) CD156; MAB-1031 Antígeno de LambdaMab Imunoglobulina G1; imunoglobulina (Ig Imunoglobulina G2 lambda) (ADAM8) ADAM-9 (ADAM9) AEX-6003 Receptor IL-6 (IL-6R) tocilizumab
Homólogo de agtuzumab Receptor IL-7 (IL-7R) mAbs anti-IL7R proteína 2 de gradiente precedente (AGR2) Linfoma quinase KTN-0125 Subunidade alfa 1 do ASLAN-004 anaplásico (ALK) receptor IL-13 (IL13RA1) Ligante-2 de vanucizumab Subunidade alfa 2 do mAbs anti-IL13RA2 angiopoietina (Ang- receptor IL-13 2); Fator A de (IL13RA2) crescimento endotelial vascular (VEGF-A) Lactaderina (anti- TriAb (11D10) Proteína acessória do CAN-04 idiotipo) receptor de IL-1 (IL1RAP) Ligante 13 do fator BION-1301 Receptor de IL-2 beta Mikbeta1 de necrose tumoral (IL2R beta) (APRIL) Aspartato beta- PAN-622 Receptor 2 de BAY-1905254 hidroxilase (ASPH) domínio similar a imunoglobulina (ILDR2) Axl tirosina quinase BA-3011 Integrina alfa-X/beta- mAbs anti-integrina (AXL) 1 (Integrina a10b1) a10b1 Antígeno CD276 BVD m276; hu8H9 Integrina alfa-3/beta-1 BCMab-1 (B7-H3) (integrina a3b1) Inibidor 1 de FPA-150 Integrina alfa-6/beta-4 90Y-ITGA6B4 ativação de células (integrina a6b4) T contendo domínio V-set ( VTCN1; também B7-H4) Fator de ativação blisibimod Integrina alfa-9 GND-001 de células B; (Integrina a9) (BAFF; também TNFSF13B e CD257)
Receptor do fator VAY736 CD49b (Integrina alfa Vatelizumabe de ativação de 2) células B; (BAFF- R; também TNFSF13C e CD268)
Regulador da mAbs anti-BAG3 CD49c (Integrina alfa mAbs anti-CD49c chaperona 3)
molecular BAG 3 (BAG3) Basigin (BSG; cHAb18 CD49d; (Integrina alfa mAbs anti-CD49d CD147) 4) Antígeno de SEA-BCMA CD51 abituzumab maturação de células B (BCMA; também TNFRSF17) ADP ribosil ciclase- OX-001 CD29 (integrina beta OS-2966 2 (BST1) 1) Atenuador de 40E4 CD61 (Integrina beta mAbs anti-CD61 linfócitos B e T 3) (BTLA) Receptor C5a do neutrazumab Jagged-1 mAbs anti-Jagged-1 complemento (C5aR) Subunidade do mAbs anti- Antígeno associado AB-3A4 canal de cálcio CACNA2D1 ao rim 1 (KAAG1) CACNA2D1 (CACNA2D1) Anidrase G250 Membro 9 da Y-4 carbônica-IX subfamília K do canal (CAIX) de potássio (KCNK9) Calreticulina MAbs anti-CALR KIR2DL1/2L3 lirilumab (CALR) Caveolina 1 mAbs anti-CAV1 kit proteína tirosina- CDX-0158 (CAV1) quinase (KIT) Anidrase 177Lu-6A10-Fab; L1CAM mAbs anti-L1CAM carbônica-XII mAbs anti-CAXII (CAXII) Receptor de plozalizumab Receptor de morte 5 APOMAB quimiocina CCR2 (DR5) (CCR2) Receptor de mAbs anti-CCR3 CD223 (LAG3) relatlimab quimiocina CCR3 (CCR3) Receptor de mogamulizumab Lewis Y hu3S193; MB311 quimiocina CCR4 (CCR4) Receptor de PRO 140; Transportador de SGN-LIV1 quimiocina CCR5 CCR5mAb004 zinco SLC39A6 (CCR5) (LIV1) Receptor de mAbs anti-CCR7 Proteína 2 similar a AB-0023 quimiocina CCR7 lisil oxidase (LOXL2) (CCR7)
Receptor de mAbs anti-CCR9 Proteína 15 contendo ABBV-085 quimiocina CCR9 repetição rica em (CCR9) leucina (LRRC15) Receptor alfa da CSL362; KHK2823 Proteína 32 contendo ARGX-115 interleucina-3 repetição rica em (IL3RA; CD123) leucina (LRRC32) Aminopeptidase N MI-130110 Antígeno linfocitário MEN-1309 (CD13) 75 (LY75) Prominin 1 mAbs anti-CD133 Proteína 3 contendo BAY-1129980 (CD133) o domínio Ly6/PLAUR (LYPD3) Syndecan-1 ravtansina Antígeno associado LxC-002 (CD138) indatuximab ao melanoma (peptídeo MAGE apresentado no MHC) CD160 ELB-021 Matriptase (ST14) mAbs anti-ST14 Molécula de CX-2009 MICA/B IPH4301 adesão de células leucocitárias ativada (CD166) Antígeno de MOR208 MIF/HLA-A2 RL21A linfócito B CD19 (peptídeo MIF apresentado em MHC) Antígeno de rituximab; Hormônio anti- GM-102 linfócito B CD20 obinituzumab; mulleriano II (MHR2) ocaratuzumab Glicoproteína de samalizumab MMP1/HLA Anti-MMP1/HLA membrana OX2 (Peptídeo MMP1 mAbs CD200 apresentado em MHC1) CD22 epratuzumab Metaloprotease-9 andecaliximab (MMP9) Receptor Fc de lumiliximab Mesotelina (MSLN) MORAb-009 imunoglobulina epsilon II (CD23)
Transdutor de sinal mAbs anti-CD24 Mucina 1 (MUC1) PankoMab-GEX CD24
Subunidade alfa do 90Y-daclizumab Mucina 13 (MUC13) mAbs anti-MUC13 receptor IL-2 CD25 CD27 varilumab Endomucina mAbs anti-MUC14 (MUC14) CD28 teralizumab Mucina 16 (MUC16) sofituzumab
CD3 Muromonab-CD3 Glicoproteína de AA98 (OKT3) superfície celular MUC18 (CD146) CD30 brentuximabe Mucina 5AC ensituximabe vedotin (MUC5AC) Receptor IIB de BI-1206 N-glicolil GM3 14F7 marcado com imunoglobulina (NeuGcGM3) 99mTc gama Fc (CD32B) CD33 lintuzumab Proteína 2B de XMT-1536 transporte de fosfato dependente de sódio (SLC34A2) CD37 otlertuzumab Nucleolina (NCL) mAbs anti- nucleolina ADP ribosil ciclase- daratumumab Nectina-4 enfortumab vedotin 1 (CD38) CD39 OREG-103 Neurofibromina (NF1) mAbs anti- neurofibromina CD4 IT-1208 gangliosídeo racotumomab NGcGM3
CD40 lucatumumab NKG2A monalizumab CD43 leucotuximab proteína de ligação a PAT-LM1 octâmero contendo domínio não POU (NONO) CD44 RG7356 Notch-1 brontictuzumab
CD45 131I-BC8 CD73 oleclumab Proteína cofator de AugmAb Netrin-1 (NTN1) NP-137 membrana (CD46) CD47 Hu5F9-G4 OX-40 PF-04518600 CD52 alemtuzumab P2X purinoceptor 7 BIL-010t (P2RX7) CD55 PAT-SC1 Receptor de FGF MM-161 (pan FGFR) Molécula 1 de IMGN-901 Integrina (Pan NOD201 adesão de células integrina) neurais; (CD56) Antígeno de itolizumab P-caderina, também PCA-062 diferenciação de caderina-3 (CDH3) células T CD6 CD70 SGN-70 Proteína de morte pembrolizumab celular programada 1 (PD-1)
CD79b polatuzumab Ligante 1 de morte avelumab; Euchloe vedotin celular programada H12 (PD-L1) CD8 mAbs anti-CD8 Ligante 2 de morte rHIgM12B7 celular programada (PD-L2) CD80 galiximab Receptor alfa de olaratumumab PDGF (PDGFRA) CD98 IGN-523 Proteína 1 específica mAbs anti-PLAC1 da placenta (PLAC1) CD99 NV-103 PR1/HLA (peptídeo mAbs anti-PR1/HLA PR1 em MHC) Caderina-1 (CDH1) mAbs anti-CDH1 Receptor de ABBV-176 prolactina PRLR Caderina-17 mAbs anti-CDH17 Fosfatidilserina mAbs anti- (CDH17) fosfatidilserina Caderina 19 mAbs anti-CDH19 Antígeno de célula- mAbs anti-PSCA (CDH19) tronco da próstata (PSCA) Caderina-6 (CDH6) HKT-288 Glutamato ATL-101 carboxipeptidase II (PSMA) CD66a CM-24 Proteína relacionada CAL (CEACAM1) ao hormônio da paratireoide (PTH-rP)
CD66e IMMU-130 Proteína tirosina- cofetuzumab (CEACAM5) quinase similar a 7 pelidotina (PTK7) CD66c; CD66e NEO-201 Proteína tirosina PRL3-zumab (CEACAM5/6) fosfatase IVA3 (PTP4A3) Claudin 18 IMAB362 Domínio de COM-701 (Claudin 18.2) imunoglobulina relacionado ao receptor de poliovírus (PVRIG)
Claudin 6 IMAB027 Ativador do receptor denosumab do ligante do fator nuclear kappa-Β (RANKL) Membro da família elotuzumab Recepteur d'origine mAbs anti-RON SLAM 7 (CS1) nantais (RON)
receptor de fator 1 cabiralizumab Receptor cirmtuzumab estimulador de transmembrana colônia (CSF1R) ROR1 da proteína tirosina-quinase (ROR1); também NTRKR1 Proteína 4 de ipilumumab Receptor BA-3021 linfócito T citotóxico transmembrana (CTLA4) ROR2 da proteína tirosina-quinase (ROR2); também NTRKR2
Coxsackievírus e mAbs anti-CXADR R-espondina-3 rosmantuzumab receptor de (RSPO3) adenovírus (CXADR) Quimiocina CXCR2 mAbs anti-CXCR2 Receptor 3 de EDD7H9 receptor esfingosina-1-fosfato (S1PR3) Quimiocina CXCR3 mAbs anti-CXCR3 Antígeno de IGN-786 receptor superfície em leucemia (SAIL)
Quimiocina CXCR4 ulocuplumab Semaforina-4D VX-15 receptor (SEMA4D) Quimiocina CXCR5 STI-B030X antígeno de MVT-1075 receptor carboidrato 19-9 (CA 19-9)
Quimiocina CXCR7 mAbs anti-CXCR7 Antígeno Sialyl mAbs anti-STn receptor Thomsen nouveau (STn) DCLK1 mAbs anti-DCLK1 Lectina 8 similar a Ig AK-002 de ligação ao ácido siálico (Siglec-8) Proteína 1 BHQ-880 Lectina 9 similar a Ig mAbs anti-Siglec-9 relacionada a de ligação ao ácido Dickkopf (DKK1) siálico (Siglec-9) DLK1 ADCT-701 Proteína Alfa OSE-172 Reguladora de Sinal (SIRPA) Ligante de proteína SC16LD6.5 CD48; também SGN-CD48A tipo delta 3 (DLL3) membro da família SLAM 2 (SLAMF2)
Ligante 4 de navicixizumab CD352; Membro da SGN-CD352A proteína tipo delta família SLAM 6 (DLL4); VEGF (SLAMF6) (VEGF) Dipeptidil YSCMA Transportador de KM-8094 peptidase-4 aminoácido neutro B0 (DPP4), (também (SLC1A5) CD26) Receptor de morte- PTX-35 Receptor de XmAb-18087 3 (DR3) somatostatina 2 (SSTR2) Receptor TRAIL-1 HuYON007 Estabilina 1 (STAB1) FP-1305 (DR4) MultYbody Receptor TRAIL-1; DR4/DR5 Metaloredutase 89Zr-DFO- Receptor TRAIL-2 Surrobody (STEAP1) MSTP2109A (DR4/DR5) Receptor TRAIL-2 DS-8273 Survivin mAbs anti-survivina (DR5) Proteína 6 similar a mAbs anti-EGFL6 TAG-72 90Y-IDEC-159 EGF (EGFL6) Receptor do fator cetuximab; Sym004; Receptor de células T mAbs anti-TCR de crescimento nimotuzumab (TCR) epidérmico (EGFR) Receptor vIII do ABT-806 Endosialina (TEM1) ontuxizumab fator de crescimento epidérmico (EGFRvIII) Proteína 2 da ONCR-201 Receptor 1 da toxina mAbs anti-TEM8 membrana epitelial do antraz (ANTXR1); (EMP2) também TEM8 Endoglin carotuximab Fator de tecido (TF) MORAb-066 Ectonucleotídeo AGS-16C3F Fator de mAbs anti-TGFBR2 pirofosfatase/mem transformação de bro da família crescimento, receptor fosfodiesterase 3 beta II TGF-beta tipo (ENPP3) II (TGFBR2) Receptor 2 de mAbs anti-PTGER2 Antígeno Thomsen- JAA-F11 prostaglandina E2 Friedenreich (PTGER2) Receptor 4 de mAbs anti-PTGER4 Imunoreceptor de BMS-986207 prostaglandina E2 células T com (PTGER4) domínios Ig e ITIM (TIGIT) EpCAM oportuzumab Receptor celular 1 do CDX-014 monatox vírus da hepatite A (HAVCR1); também TIM-1
Receptor 2 de MEDI-547 Receptor celular 2 do MBG453 efrina tipo A vírus da hepatite A (EphA2) (HAVCR2); também TIM-3 Receptor 3 de KB004 Receptor tipo Toll 2 OPN-305 efrina tipo A (TLR-2) (EphA3) Proteína de F19 Receptor tipo toll 4 mAbs anti-TLR4 ativação de (TLR-4) fibroblastos (FAP) CD95 (FAS) Asunercept Membro da família 1 mAbs anti-TM4SF1 L6 transmembrana 4 (TM4SF1) Receptor Fc como RG-6160 Receptor 2 do fator mAbs anti-TNFR2 proteína 5 (FCRL5) de necrose tumoral (TNFR2) Receptor 1 de FGF FP-1039 CD71 mAbs anti-CD71 (FGFR1) Receptor de FGF FPA-144 Receptor mAbs anti-TREM1 2b (FGFR2b) desencadeador expresso em células mieloides 1 (TREM1) Receptor 3 de FGF B-701 Transdutor de sinal DS-1062 (FGFR3) de cálcio associado a tumor 2 (Trop-2) tirosina quinase 3 Flysyn Receptor TWEAK MRT-101 similar a fms (TWEAKR) (FLT3) Receptor de folato farletuzumab; Receptor de proteína ELB-031 alfa (FOLR1) IMGN853; KHK2805 tirosina-quinase TYRO3 (TYRO3) Receptor de folato mAbs beta anti- Receptor de MNPR-101 beta (FOLR2) FOLR uroquinase (uPAR) Frizzled-1; vantictumab VEGF-2 (VEGFR2) ramucirumab Frizzled-2; Frizzled-5; Frizzled-7; Frizzled-8; (FZD1,2,5,7,8) Proteína 1 similar à mAbs anti-FSTL1 Vimentina pritumumab folistatina (FSTL1) Fucosil-GM1 BMS-986012 Supressor de Ig de JNJ-61610588 domínio V de ativação de células T (VISTA) Frizzled-10 OTSA-101 Integrina alfa-4/beta-1 natalizumab (FZD10)
GCSF-R (também, CSL324 Cadeia iota de mAbs anti-VPREB1 CD114 e CSFR3) imunoglobulina (VPREB1) Proteína de ligação MP-1959 Proteína de tumor de ESK1 à galectina 3 Wilms (WT1/HLA); (LGALS3) Peptídeo WT1 apresentado em MHC Guanilato ciclase TAK-164 Glípico-3 (GPC3) codrituzumab 2C (GUCY2C) GD2 dinutuximab Glicoproteína CDX-011 transmembrana NMB (GPNMB) GD3 PF-06688992 Receptor 5 acoplado BNC-101 à proteína G contendo repetição rica em leucina (LGR5) proteína BMS-986156 G-proteína acoplada JNJ-64407564 relacionada ao ao receptor de família TNFR induzida por C grupo 5 membro D glicocorticoide (GPRC5D) (GITR) ligante de proteína EU-102 Ferritina Ferritarg P relacionado ao TNFR induzido por glicocorticoide (GITRL) proteína pré- mAbs anti-PMEL Tirosina quinase trastuzumab; melanócito (PMEL) Erbb2 (HER2) pertuzumab; margetuximab Antígeno A33 de MAbs anti-GPA33 Tirosina quinase patritumab superfície celular Erbb3 (HER3) (GPA33) Glípico-1 (GPC1) MIL-38 Globo H OBI-888
[0092] O domínio de ligação ao antígeno extracelular pode compreender um fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, um scFv) derivado de qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 1, dependendo do antígeno alvo de interesse.
[0093] Em outras modalidades, o domínio de ligação ao antígeno extracelular de qualquer um dos polipeptídeos de CAR descritos neste documento pode ser específico para um antígeno patogênico, como um antígeno bacteriano, um antígeno viral ou um antígeno fúngico. Alguns exemplos são fornecidos abaixo: neuraminidase, hemaglutinina ou proteína M2 do vírus da influenza, glicoproteína F ou glicoproteína G do vírus sincicial respiratório humano (RSV), glicoproteína do vírus herpes simplex gB, gC, gD, ou gE, Chlamydia MOMP ou proteína PorB, Proteína do núcleo do vírus da dengue, proteína da matriz ou glicoproteína E, hemaglutinina do vírus do sarampo, glicoproteína gB do vírus herpes simplex tipo 2, poliovírus I VP1, glicoproteínas do envelope do HIV 1, antígeno do núcleo da hepatite B ou antígeno de superfície, toxina da difteria, epítopo do Streptococcus 24M, pilina gonocócica, vírus da pseudo-raiva g50 (gpD), vírus da pseudo-raiva II (gpB), vírus da pseudo-raiva III (gpC), glicoproteína H do vírus da pseudo-raiva, glicoproteína E do vírus da pseudo-raiva, glicoproteína 195 da gastroenterite transmissível, proteína da matriz da gastroenterite transmissível ou glicoproteína E1 ou E2 do vírus da hepatite C humana.
[0094] Além disso, o domínio de ligação ao antígeno extracelular do polipeptídeo de CAR descrito neste documento pode ser específico para um marcador conjugado a um agente terapêutico, que tem como alvo um antígeno associado a uma doença ou distúrbio (por exemplo, um antígeno tumoral ou um antígeno patogênico como descrito neste documento). Em alguns casos, a tag conjugada ao agente terapêutico pode ser antigênica e o domínio de ligação ao antígeno extracelular do polipeptídeo de CAR pode ser um fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, scFv) de um anticorpo com alta afinidade de ligação e/ou especificidade ao antígeno marcação. Marcadores antigênicos exemplificativos incluem, mas não estão limitados a biotina, avidina, uma molécula fluorescente (por exemplo, GFP, YRP, luciferase ou RFP), Myc, Flag, His (por exemplo, poli His como 6xHis), HA (hemeagglutinina), GST, MBP (proteína de ligação à maltose), KLH (hemocianinas de lapa buraco), trx, T7, HSV, VSV (por exemplo, VSV- G), Glu-Glu, V5, e-tag, S-tag, KT3, E2 Au1, Au5 e/ou tioredoxina.
[0095] Em outros casos, a tag conjugada com o agente terapêutico é um membro de um par ligante-receptor e o domínio de ligação ao antígeno extracelular compreende o outro membro do par ligante- receptor ou um fragmento deste que se liga ao marcador. Por exemplo, a tag conjugada ao agente terapêutico pode ser biotina e o domínio de ligação ao antígeno extracelular do polipeptídeo de CAR pode compreender um fragmento de ligação à biotina de avidina. Ver, por exemplo, Urbanska et al., 2012, Lohmueller et al., 2018. Outros exemplos incluem CAR anti-Tag, em que o domínio de ligação ao antígeno extracelular é um fragmento scFv específico para uma tag de proteína, como FITC (Tamada et al., 2012, Kim et al., 2015; Cao et al., 2016; and Ma et al., 2016), PNE (Rodgers et al., 2016), La-SS-B (Cartellieri et al., 2016), Biotin (Lohmullular et al., 2017), and Leucine- Zipper (Cho et al., 2018). A seleção do domínio de ligação ao antígeno para uso nos polipeptídeos de CAR descritos neste documento será aparente para um versado na técnica. Por exemplo, pode depender de fatores como o tipo de antígeno alvo e a afinidade desejada da interação de ligação.
[0096] O domínio de ligação ao antígeno extracelular de qualquer um dos polipeptídeos de CAR descritos neste documento pode ter afinidade de ligação adequada para um antígeno alvo (por exemplo, qualquer um dos alvos descritos neste documento) ou epítopos antigênicos dos mesmos. Conforme usado neste documento, "afinidade de ligação" refere-se à constante de associação aparente ou KA. O KA é o recíproco da constante de dissociação, (KD). O domínio de ligação ao antígeno extracelular para uso nos polipeptídeos de CAR descritos neste documento pode ter uma afinidade de ligação (KD) de pelo menos 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10 M, ou inferior para o antígeno alvo ou epítopo antigênico. Uma afinidade de ligação aumentada corresponde a uma KD diminuída. A ligação de afinidade mais alta de um domínio de ligação de antígeno extracelular para um primeiro antígeno em relação a um segundo antígeno pode ser indicada por um KA superior (ou um valor numérico menor KD) para ligar o primeiro antígeno do que o KA (ou valor numérico KD) para ligar o segundo antígeno. Em tais casos, o domínio de ligação ao antígeno extracelular tem especificidade para o primeiro antígeno (por exemplo, uma primeira proteína em uma primeira conformação ou mimetizador do mesmo) em relação ao segundo antígeno (por exemplo, a mesma primeira proteína em uma segunda conformação ou mimetizador do mesmo; ou uma segunda proteína). As diferenças na afinidade de ligação (por exemplo, para especificidade ou outras comparações) podem ser de pelo menos 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 37,5, 50, 70, 80, 91, 100, 500, 1000, 10.000 ou 105 vezes.
[0097] A afinidade de ligação (ou especificidade de ligação) pode ser determinada por uma variedade de métodos, incluindo diálise de equilíbrio, ligação de equilíbrio, filtração em gel, ELISA, ressonância plasmônica de superfície ou espectroscopia (por exemplo, usando um ensaio de fluorescência). Condições exemplificativas para avaliar a afinidade de ligação são em tampão HBS-P (HEPES 10 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, 0,005% (v/v) Surfactante P20). Estas técnicas podem ser usadas para medir a concentração da proteína de ligação ligada como uma função da concentração da proteína alvo. A concentração da proteína de ligação ligada ([Limite]) está geralmente relacionada à concentração de proteína alvo livre ([Livre]) pela seguinte equação: [Limite] = [Livre]/(Kd+[Livre])
[0098] Nem sempre é necessário fazer uma determinação exata deKA, pois às vezes é suficiente obter uma medida quantitativa de afinidade, por exemplo, determinada usando um método como ELISA ou análise FACS, é proporcional a KA e, portanto, pode ser usado para comparações, como determinar se uma afinidade mais alta é, por exemplo, 2 vezes maior, para obter uma medição qualitativa de afinidade ou para obter uma inferência de afinidade, por exemplo, por atividade em um ensaio funcional, por exemplo, um in vitro ou ensaio in vivo. B. Domínio Transmembrana
[0099] O domínio transmembrana dos polipeptídeos dos receptores quiméricos (por exemplo, polipeptídeos de ACTR ou polipeptídeos de CAR) descritos neste documento podem estar em qualquer forma conhecida na técnica. Conforme usado neste documento, um "domínio transmembrana" refere-se a qualquer estrutura de proteína que é termodinamicamente estável em uma membrana celular, preferencialmente uma membrana celular eucariótica. Um domínio transmembrana compatível para uso nos polipeptídeos dos receptores quiméricos usados neste documento pode ser obtido a partir de uma proteína de ocorrência natural. Alternativamente, pode ser um segmento de proteína sintético, não natural, por exemplo, um segmento de proteína hidrofóbico que é termodinamicamente estável em uma membrana celular.
[00100] Os domínios transmembrana são classificados com base na estrutura tridimensional do domínio transmembrana. Por exemplo, os domínios transmembrana podem formar uma hélice alfa, um complexo de mais de uma hélice alfa, um barril beta ou qualquer outra estrutura estável capaz de abranger a bicamada fosfolipídica de uma célula. Além disso, os domínios transmembrana também podem ou alternativamente ser classificados com base na topologia do domínio transmembrana, incluindo o número de passagens que o domínio transmembrana faz através da membrana e a orientação da proteína. Por exemplo, proteínas de membrana de passagem única cruzam a membrana celular uma vez e proteínas de membrana de passagem múltipla cruzam a membrana celular pelo menos duas vezes (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou mais vezes).
[00101] As proteínas de membrana podem ser definidas como Tipo
I, Tipo II ou Tipo III, dependendo da topologia de seus terminais e segmento (s) de passagem de membrana em relação ao interior e ao exterior da célula. As proteínas de membrana do tipo I têm uma única região que abrange a membrana e são orientadas de modo que o terminal N da proteína esteja presente no lado extracelular da bicamada lipídica da célula e o terminal C da proteína esteja presente no lado citoplasmático. As proteínas de membrana do tipo II também têm uma única região que abrange a membrana, mas são orientadas de modo que o terminal C da proteína esteja presente no lado extracelular da bicamada lipídica da célula e o terminal N da proteína esteja presente no citoplasma lado. As proteínas de membrana do tipo III têm vários segmentos que abrangem a membrana e podem ainda ser subclassificadas com base no número de segmentos transmembrana e na localização dos terminais N e C.
[00102] Em algumas modalidades, o domínio transmembrana do polipeptídeo receptor quimérico descrito neste documento é derivado de uma proteína de membrana de passagem única Tipo I. Proteínas de membrana de passagem única incluem, mas não estão limitadas a CD8α, CD8β, 4-1BB/CD137, CD27, CD28, CD34, CD4, FcεRIγ, CD16, OX40/CD134, CD3ζ, CD3ε, CD3γ, CD3δ, TCRα, TCRβ, TCRζ, CD32, CD64, CD64, CD45, CD5, CD9, CD22, CD37, CD80, CD86, CD40, CD40L/CD154, VEGFR2, FAS e FGFR2B. Em algumas modalidades, o domínio transmembrana é de uma proteína de membrana selecionada a partir do seguinte: CD8α, CD8β, 4-1BB/CD137, CD28, CD34, CD4, FcεRIγ, CD16, OX40/CD134, CD3ζ, CD3ε, CD3γ, CD3δ, TCRα, CD32, CD64, VEGFR2, FAS e FGFR2B. Em alguns exemplos, o domínio transmembrana é de CD8 (por exemplo, o domínio transmembrana é de CD8α). Em alguns exemplos, o domínio transmembrana é de 4- 1BB/CD137. Em outros exemplos, o domínio transmembrana é de CD28. Em alguns casos, o polipeptídeo receptor quimérico descrito neste documento pode estar livre de um domínio de dobradiça de qualquer receptor não CD16A. Em alguns casos, tal polipeptídeo do receptor quimérico pode estar livre de qualquer domínio de dobradiça. Alternativamente ou adicionalmente, tal polipeptídeo do receptor quimérico pode compreender duas ou mais regiões coestimuladoras como descrito neste documento. Em outros exemplos, o domínio transmembrana é de CD34. Em ainda outros exemplos, o domínio transmembrana não é derivado de CD8 humano. Em algumas modalidades, o domínio transmembrana do polipeptídeo do receptor quimérico é uma hélice alfa de passagem única.
[00103] Os domínios transmembrana de proteínas de membrana de múltiplas passagens também podem ser compatíveis para uso nos polipeptídeos dos receptores quiméricos descritos neste documento. As proteínas de membrana multipassagem podem compreender uma estrutura alfa helicoidal complexa (por exemplo, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou mais alfa hélices) ou uma estrutura de folha beta. Preferencialmente, o N-terminal e o C-terminal de uma proteína de membrana multipassagem estão presentes em lados opostos da bicamada lipídica, por exemplo, o terminal N da proteína está presente no lado citoplasmático da bicamada lipídica e o terminal C da proteína está presente no lado extracelular. Uma ou múltiplas passagens de hélice de uma proteína de membrana de múltiplas passagens podem ser usadas para construir o polipeptídeo do receptor quimérico descrito neste documento.
[00104] Domínios transmembrana para uso nos polipeptídeos dos receptores quiméricos descritos neste dpcumento também podem compreender pelo menos uma porção de um segmento de proteína sintético, não natural. Em algumas modalidades, o domínio transmembrana é uma hélice alfa ou folha beta sintética e não natural. Em algumas modalidades, o segmento de proteína tem pelo menos aproximadamente 20 aminoácidos, por exemplo, pelo menos 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais aminoácidos. Exemplos de domínios transmembrana sintéticos são conhecidos na técnica, por exemplo, na Patente US N°. 7.052.906 B1 e na Publicação PCT N°. WO 2000/032776 A2, as invenções relevantes de cada um dos quais são incorporadas por referência neste documento.
[00105] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos do domínio transmembrana não compreende resíduos de cisteína. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos do domínio transmembrana compreende um resíduo de cisteína. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos do domínio transmembrana compreende dois resíduos de cisteína. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos do domínio transmembrana compreende mais de dois resíduos de cisteína (por exemplo, 3, 4, 5 ou mais).
[00106] O domínio transmembrana pode compreender uma região transmembrana e uma região citoplasmática localizada no lado do terminal C do domínio transmembrana. A região citoplasmática do domínio transmembrana pode compreender três ou mais aminoácidos e, em algumas modalidades, ajuda a orientar o domínio transmembrana na bicamada lipídica. Em algumas modalidades, um ou mais resíduos de cisteína estão presentes na região transmembrana do domínio transmembrana. Em algumas modalidades, um ou mais resíduos de cisteína estão presentes na região citoplasmática do domínio transmembrana. Em algumas modalidades, a região citoplasmática do domínio transmembrana compreende aminoácidos carregados positivamente. Em algumas modalidades, a região citoplasmática do domínio transmembrana compreende os aminoácidos arginina, serina e lisina.
[00107] Em algumas modalidades, a região transmembrana do domínio transmembrana compreende resíduos de aminoácidos hidrofóbicos. Em algumas modalidades, a região transmembrana compreende principalmente resíduos de aminoácidos hidrofóbicos, como alanina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptofano ou valina. Em algumas modalidades, a região transmembrana é hidrofóbica. Em algumas modalidades, a região transmembrana compreende uma sequência de poli-leucina-alanina.
[00108] A hidropatia, características hidrofóbicas ou hidrofílicas de uma proteína ou segmento de proteína, podem ser avaliadas por qualquer método conhecido na técnica incluindo, por exemplo, a análise de hidropatia Kyte e Doolittle. C. Domínios de sinalização coestimulatória
[00109] Muitas células imunes requerem coestimulação, além da estimulação de um sinal específico do antígeno, para promover a proliferação, diferenciação e sobrevivência celular, bem como para ativar funções efetoras da célula. Em algumas modalidades, os polipeptídeos dos receptores quiméricos, como polipeptídeos de ACTR ou CAR, descritos neste documento compreendem pelo menos um domínio de sinalização coestimulador. Em certas modalidades, os polipeptídeos dos receptores quiméricos podem conter um domínio de sinalização coestimulador CD28 ou um domínio de sinalização coestimulador 4-1BB (CD137). O termo "domínio de sinalização coestimuladora". Conforme usado neste documento, refere-se a pelo menos um fragmento de uma proteína de sinalização coestimuladora que medeia a transdução de sinal dentro de uma célula para induzir uma resposta imune, tal como uma função efetora (um sinal secundário). Como conhecido na técnica, a ativação de células imunes, como células T, muitas vezes requer dois sinais: (1) o sinal específico do antígeno (sinal primário) desencadeado pelo envolvimento do receptor de células T (TCR) e complexos de peptídeo antigênico/MHC apresentados por células apresentadoras de antígeno, que normalmente são conduzidas por CD3 como um componente do complexo TCR; e (ii) um sinal coestimulatório (sinal secundário) desencadeado pela interação entre um receptor coestimulador e seu ligante. Um receptor coestimulador transduz um sinal coestimulador (sinal secundário) como uma adição à sinalização disparada por TCR e modula as respostas mediadas por células imunes, como células T, células NK, macrófagos, neutrófilos ou eosinófilos.
[00110] A ativação de um domínio de sinalização coestimulador em uma célula hospedeira (por exemplo, uma célula imune) pode induzir a célula a aumentar ou diminuir a produção e secreção de citocinas, propriedades fagocíticas, proliferação, diferenciação, sobrevivência e/ou citotoxicidade. O domínio de sinalização coestimulador de qualquer molécula coestimuladora pode ser compatível para uso nos polipeptídeos receptores quiméricos descritos neste documento. O (s) tipo (s) de domínio de sinalização coestimulador são selecionados com base em fatores como o tipo de células imunes em que os polipeptídeos receptores quiméricos seriam expressos (por exemplo, células T, células NK, macrófagos, neutrófilos ou eosinófilos) e a função efetora imune desejada (por exemplo, ADCC). Exemplos de domínios de sinalização coestimuladores para uso nos polipeptídeos dos receptores quiméricos podem ser o domínio de sinalização citoplasmático de proteínas coestimuladoras, incluindo, sem limitação, membros da família B7/CD28 (por exemplo, B7-1/CD80, B7-2/CD86, B7-H1/PD-L1, B7-H2, B7-H3, B7-H4, B7-H6, B7-H7, BTLA/CD272, CD28, CTLA-4, Gi24/VISTA/B7-H5, ICOS/CD278, PD-1, PD-L2/B7-DC, e PDCD6); membros da superfamília TNF (por exemplo,4-1BB/TNFRSF9/CD137, 4-1BB Ligante/TNFSF9, BAFF/BLyS/TNFSF13B, BAFF R/TNFRSF13C, CD27/TNFRSF7, CD27 Ligante/TNFSF7, CD30/TNFRSF8, CD30 Ligante/TNFSF8, CD40/TNFRSF5, CD40/TNFSF5, CD40 Ligante/TNFSF5, DR3/TNFRSF25, GITR/TNFRSF18, GITR
Ligante/TNFSF18, HVEM/TNFRSF14, LIGHT/TNFSF14, Linfotoxina- alfa/TNF-beta, OX40/TNFRSF4, OX40 Ligante/TNFSF4, RELT/TNFRSF19L, TACI/TNFRSF13B, TL1A/TNFSF15, TNF-alfa, e TNF RII/TNFRSF1B); membros da família SLAM (por exemplo, 2B4/CD244/SLAMF4, BLAME/SLAMF8, CD2, CD2F-10/SLAMF9, CD48/SLAMF2, CD58/LFA-3, CD84/SLAMF5, CD229/SLAMF3, CRACC/SLAMF7, NTB-A/SLAMF6, e SLAM/CD150); e quaisquer outras moléculas coestimulatórias, como CD2, CD7, CD53, CD82/Kai- 1, CD90/Thy1, CD96, CD160, CD200, CD300a/LMIR1, HLA Classe I, HLA-DR, Ikaros, Integrina alfa 4/CD49d, Integrina alfa 4 beta 1, Integrina alfa 4 beta 7/LPAM-1, LAG-3, TCL1A, TCL1B, CRTAM, DAP12, Dectin- 1/CLEC7A, DPPIV/CD26, EphB6, TIM-1/KIM-1/HAVCR, TIM-4, TSLP, TSLP R, função linfocitária associada ao antígeno-1 (LFA-1), e NKG2C. Em algumas modalidades, o domínio de sinalização coestimulatório é de 4-1BB, CD28, OX40, ICOS, CD27, GITR, HVEM, TIM1, LFA1 (CD11a) ou CD2, ou qualquer variante do mesmo.
[00111] Também dentro do escopo da presente invenção estão as variantes de qualquer um dos domínios de sinalização coestimuladores descritos neste documento, de modo que o domínio de sinalização coestimulatório seja capaz de modular a resposta imune da célula imune. Em algumas modalidades, os domínios de sinalização coestimuladores compreendem até 10 mutações de resíduos de aminoácidos (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5 ou 8), tais como substituições, deleções ou adições de aminoácidos em comparação a uma contraparte do tipo selvagem. Tais domínios de sinalização coestimuladores compreendendo uma ou mais variações de aminoácidos (por exemplo, substituições, deleções ou adições de aminoácidos) podem ser referidos como variantes.
[00112] A mutação de resíduos de aminoácidos do domínio de sinalização coestimulador pode resultar em um aumento na transdução de sinalização e estimulação intensificada de respostas imunes em relação aos domínios de sinalização coestimuladores que não compreendem a mutação. A mutação de resíduos de aminoácidos do domínio de sinalização coestimulador pode resultar em uma diminuição na transdução de sinalização e estimulação reduzida de respostas imunes em relação aos domínios de sinalização coestimuladores que não compreendem a mutação. Por exemplo, a mutação dos resíduos 186 e 187 da sequência de aminoácidos CD28 nativa pode resultar em um aumento na atividade coestimuladora e indução de respostas imunes pelo domínio coestimulador do polipeptídeo do receptor quimérico. Em algumas modalidades, as mutações são a substituição de uma lisina em cada uma das posições 186 e 187 por um resíduo de glicina do domínio coestimulador de CD28, referido como uma variante CD28LL→GG. Mutações adicionais que podem ser feitas em domínios de sinalização coestimuladores que podem aumentar ou reduzir a atividade coestimulatória do domínio serão evidentes para aqueles versados na técnica. Em algumas modalidades, o domínio de sinalização coestimulatório é de 4-1BB, CD28, OX40 ou da variante CD28LL→GG.
[00113] Em algumas modalidades, os polipeptídeos dos receptores quiméricos podem conter um único domínio coestimulador, como, por exemplo, um domínio coestimulador CD27, um domínio coestimulador CD28, um domínio coestimulador 4-1BB, um domínio coestimulador ICOS, ou um domínio coestimulador OX40.
[00114] Em algumas modalidades, os polipeptídeos dos receptores quiméricos podem compreender mais de um domínio de sinalização coestimulador (por exemplo, 2, 3 ou mais). Em algumas modalidades, o polipeptídeo do receptor quimérico compreende dois ou mais dos mesmos domínios de sinalização coestimuladores, por exemplo, duas cópias do domínio de sinalização coestimulador de CD28. Em algumas modalidades, o polipeptídeo do receptor quimérico compreende dois ou mais domínios de sinalização coestimuladores de diferentes proteínas coestimulatórias, como quaisquer duas ou mais proteínas coestimulatórias descritas neste documento. A seleção dos tipos de domínios de sinalização coestimuladores pode ser baseada em fatores como o tipo de células hospedeiras a serem usadas com os polipeptídeos receptores quiméricos (por exemplo, células T ou células NK) e a função imune efetora desejada. Em algumas modalidades, o polipeptídeo do receptor quimérico compreende dois domínios de sinalização coestimuladores, por exemplo, duas cópias do domínio de sinalização coestimulador de CD28. Em algumas modalidades, o polipeptídeo do receptor quimérico pode compreender dois ou mais domínios de sinalização coestimuladores de diferentes receptores coestimuladores, como quaisquer dois ou mais receptores coestimuladores descritos neste documento, por exemplo, CD28 e 4- 1BB, CD28 e CD27, CD28 e ICOS, variante CD28LL → GG e 4-1BB, CD28 e OX40, ou variante CD28LL → GG e OX40. Em algumas modalidades, os dois domínios de sinalização coestimuladores são CD28 e 4-1BB. Em algumas modalidades, os dois domínios de sinalização coestimuladores são a variante CD28LL → GG e 4-1BB. Em algumas modalidades, os dois domínios de sinalização coestimuladores são CD28 e OX40. Em algumas modalidades, os dois domínios de sinalização coestimuladores são a variante CD28LL→ GG e OX40. Em algumas modalidades, os polipeptídeos dos receptores quiméricos descritos neste documento podem conter uma combinação de um CD28 e ICOSL. Em algumas modalidades, o polipeptídeo do receptor quimérico descrito neste documento pode conter uma combinação de CD28 e CD27. Em certas modalidades, o domínio coestimulatório 4-1BB está localizado no terminal N do domínio de sinalização coestimulatório da variante CD28 ou CD28LL → GG.
[00115] Em algumas modalidades, os polipeptídeos dos receptores quiméricos descritos neste documento não compreendem um domínio de sinalização coestimulador. D. Domínio de sinalização citoplasmático
[00116] Qualquer domínio de sinalização citoplasmático pode ser usado para criar os polipeptídeos dos receptores quiméricos descritos neste documento (por exemplo, polipeptídeos de ACTR ou polipeptídeos de CAR). Esse domínio citoplasmático pode ser qualquer domínio de sinalização envolvido no desencadeamento da sinalização celular (sinalização primária) que leva à proliferação e/ou ativação de células imunes. O domínio de sinalização citoplasmático, conforme descrito neste documento, não é um domínio de sinalização coestimulador, que, como conhecido na técnica, retransmite um sinal coestimulatório ou secundário para a ativação completa de células imunes.
[00117] O domínio citoplasmático descrito neste documento pode compreender um domínio de motivo de ativação baseado em tirosina imunorreceptor (ITAM) (por exemplo, pelo menos um domínio ITAM, pelo menos dois domínios ITAM ou pelo menos três domínios ITAM) ou pode ser livre de ITAM. Um "ITAM", como usado neste documento, é um motivo de proteína conservado que geralmente está presente na porção da cauda de moléculas de sinalização expressas em muitas células imunes. O motivo pode compreender duas repetições da sequência de aminoácidos YxxL/I separadas por 6-8 aminoácidos, em que cada x é independentemente qualquer aminoácido, produzindo o motivo conservado YxxL/Ix(6-8)YxxL/I. ITAMs dentro de moléculas de sinalização são importantes para a transdução de sinal dentro da célula, que é mediada, pelo menos em parte, pela fosforilação de resíduos de tirosina no ITAM após a ativação da molécula de sinalização. Os ITAMs também podem funcionar como sítios de encaixe para outras proteínas envolvidas nas vias de sinalização.
[00118] Em alguns exemplos, o domínio de sinalização citoplasmático é de CD3ζ ou FcεR1γ. Em outros exemplos, o domínio de sinalização citoplasmático não é derivado de CD3ζ humano. Em ainda outros exemplos, o domínio de sinalização citoplasmático não é derivado de um receptor Fc, quando o domínio de ligação a Fc extracelular do mesmo polipeptídeo do receptor quimérico é derivado de CD16A.
[00119] Em uma modalidade específica, vários domínios de sinalização podem ser fundidos em conjunto para efeito aditivo ou sinérgico. Exemplos não limitativos de domínios de sinalização adicionais úteis incluem parte ou a totalidade de um ou mais de uma cadeia TCR Zeta, CD28, OX40/CD134, 4-1BB/CD137, FcRIy, ICOS/CD278, IL2R-beta/CD122, IL-2R- gamma/CD132 e CD40.
[00120] Em outras modalidades, o domínio de sinalização citoplasmático descrito neste documento está livre do motivo ITAM. Os exemplos incluem, mas não estão limitados ao domínio de sinalização citoplasmático de Jak/STAT, receptor de Toll-interleucina (TIR) e tirosina quinase. E. Domínio de dobradiça
[00121] Em algumas modalidades, os polipeptídeos dos receptores quiméricos, como polipeptídeos de ACTR ou polipeptídeos de CAR descritos neste documento, compreendem ainda um domínio de dobradiça que está localizado entre o domínio de ligação ao ligante extracelular e o domínio transmembrana. Um domínio de dobradiça é um segmento de aminoácido que geralmente é encontrado entre dois domínios de uma proteína e pode permitir a flexibilidade da proteína e o movimento de um ou ambos os domínios em relação um ao outro. Qualquer sequência de aminoácidos que forneça tal flexibilidade e movimento do domínio de ligação ao ligante extracelular em relação ao domínio transmembrana do polipeptídeo do receptor quimérico pode ser usada.
[00122] Os domínios de dobradiça de qualquer proteína conhecida na técnica por compreender um domínio de dobradiça são compatíveis para uso nos polipeptídeos dos receptores quiméricos descritos neste documento. Em algumas modalidades, o domínio de dobradiça é pelo menos uma porção de um domínio de dobradiça de uma proteína de ocorrência natural e confere flexibilidade ao polipeptídeo do receptor quimérico. Em algumas modalidades, o domínio de dobradiça é de CD8. Em algumas modalidades, o domínio de dobradiça é uma porção do domínio de dobradiça de CD8, por exemplo, um fragmento contendo pelo menos 15 (por exemplo, 20, 25, 30, 35 ou 40) aminoácidos consecutivos do domínio de dobradiça de CD8. Em algumas modalidades, o domínio de dobradiça é de CD28. Em algumas modalidades, o domínio de dobradiça é uma porção do domínio de dobradiça de CD28, por exemplo, um fragmento contendo pelo menos 15 (por exemplo, 20, 25, 30, 35 ou 40) aminoácidos consecutivos do domínio de dobradiça de CD28. O domínio de dobradiça e/ou o domínio transmembrana podem ser ligados a aminoácidos adicionais (por exemplo, 15 aa, 10-aa, 8-aa, 6-aa ou 4-aa) na porção do terminal N, na porção do terminal C, ou ambos. Podem ser encontrados exemplos, por exemplo, em Ying et al., Nature Medicine, 25 (6): 947-953 (2019).
[00123] Em algumas modalidades, o domínio de dobradiça é do receptor CD16A, por exemplo, todo o domínio de dobradiça de um receptor de CD16A ou uma porção do mesmo, que pode consistir em até 40 resíduos de aminoácidos consecutivos do receptor de CD16A (por exemplo, 20, 25, 30, 35 ou 40). Esse polipeptídeo do receptor quimérico (por exemplo, um polipeptídeo de ACTR) pode não conter nenhum domínio de dobradiça de um receptor diferente (um receptor não CD16A).
[00124] Domínios de dobradiça de anticorpos, tais como anticorpos
IgG, IgA, IgM, IgE ou IgD, também são compatíveis para uso nos polipeptídeos dos receptores quiméricos descritos neste documento. Em algumas modalidades, o domínio de dobradiça é o domínio de dobradiça que une os domínios constantes CH1 e CH2 de um anticorpo. Em algumas modalidades, o domínio de dobradiça é de um anticorpo e compreende o domínio de dobradiça do anticorpo e uma ou mais regiões constantes do anticorpo. Em algumas modalidades, o domínio de dobradiça compreende o domínio de dobradiça de um anticorpo e a região constante CH3 do anticorpo. Em algumas modalidades, o domínio de dobradiça compreende o domínio de dobradiça de um anticorpo e as regiões constantes CH2 e CH3 do anticorpo. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo IgG, IgA, IgM, IgE ou IgD. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo IgG. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo IgG1, IgG2, IgG3, ou IgG4. Em algumas modalidades, a região de dobradiça compreende a região de dobradiça e as regiões constantes CH2 e CH3 de um anticorpo IgG1. Em algumas modalidades, a região de dobradiça compreende a região de dobradiça e a região constante CH3 de um anticorpo IgG1.
[00125] Os peptídeos de ocorrência não natural também podem ser usados como domínios de dobradiça para os polipeptídeos dos receptores quiméricos descritos neste documento. Em algumas modalidades, o domínio de dobradiça entre o terminal C do domínio de ligação ao alvo extracelular e o terminal N do domínio transmembrana é um ligante peptídico, tal como um ligante (GlyxSer)n, em que x e n, independentemente, podem ser um número inteiro entre 3 e 12, incluindo 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou mais. Em algumas modalidades, o domínio de dobradiça é (Gly4Ser)n (SEQ ID NO:95), em que n pode ser um número inteiro entre 3 e 60, incluindo 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49,
50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 ou 60. Em certas modalidades, n pode ser um número inteiro maior que 60. Em algumas modalidades, o domínio de dobradiça é (Gly4Ser)3 (SEQ ID NO: 96). Em algumas modalidades, o domínio de dobradiça é (Gly4Ser)6 (SEQ ID NO: 97). Em algumas modalidades, o domínio de dobradiça é (Gly4Ser)9 (SEQ ID NO: 98). Em algumas modalidades, o domínio de dobradiça é (Gly4Ser)12 (SEQ ID NO: 99). Em algumas modalidades, o domínio de dobradiça é ((Gly4Ser)15 (SEQ ID NO: 100). Em algumas modalidades, o domínio de dobradiça é (Gly4Ser)30 (SEQ ID NO: 101). Em algumas modalidades, o domínio de dobradiça é (Gly4Ser)45 (SEQ ID NO: 102). Em algumas modalidades, o domínio de dobradiça é (Gly4Ser)60 (SEQ ID NO: 103).
[00126] Em outras modalidades, o domínio de dobradiça é um polipeptídeo recombinante estendido (XTEN), que é um polipeptídeo não estruturado que consiste em resíduos hidrofílicos de comprimentos variados (por exemplo, 10-80 resíduos de aminoácidos). As sequências de aminoácidos de péptidos XTEN serão evidentes para um versado na técnica e podem ser encontradas, por exemplo, na Patente US N°
8.673.860, cujas invenções relevantes são incorporadas por referência neste documento. Em algumas modalidades, o domínio de dobradiça é um peptídeo XTEN e compreende 60 aminoácidos. Em algumas modalidades, o domínio de dobradiça é um peptídeo XTEN e compreende 30 aminoácidos. Em algumas modalidades, o domínio de dobradiça é um peptídeo XTEN e compreende 45 aminoácidos. Em algumas modalidades, o domínio de dobradiça é um peptídeo XTEN e compreende 15 aminoácidos.
[00127] Qualquer um dos domínios de dobradiça usados para preparar o polipeptídeo do receptor quimérico, conforme descrito neste documento, pode conter até 250 resíduos de aminoácidos. Em alguns casos, o polipeptídeo do receptor quimérico pode conter um domínio de dobradiça relativamente longo, por exemplo, contendo 150-250 resíduos de aminoácidos (por exemplo, 150-180 resíduos de aminoácidos, 180-200 resíduos de aminoácidos ou 200-250 resíduos de aminoácidos). Em outros casos, o polipeptídeo do receptor quimérico pode conter um domínio de dobradiça de tamanho médio, que pode conter 60-150 resíduos de aminoácidos (por exemplo, 60-80, 80-100, 100-120 ou 120-150 resíduos de aminoácidos). Alternativamente, o polipeptídeo do receptor quimérico pode conter um domínio de dobradiça curto, que pode conter menos de 60 resíduos de aminoácidos (por exemplo, 1-30 aminoácidos ou 31-60 aminoácidos). Em algumas modalidades, um polipeptídeo do receptor quimérico (por exemplo, um polipeptídeo de ACTR) descrito neste documento não contém domínio de dobradiça ou domínio de dobradiça de um receptor não CD16A. F. Peptídeo de sinal
[00128] Em algumas modalidades, o polipeptídeo do receptor quimérico (por exemplo, polipeptídeo de ACTR ou polipeptídeo de CAR) também pode compreender um peptídeo sinal (também conhecido como uma sequência sinal) no terminal N do polipeptídeo. Em geral, as sequências de sinal são sequências de peptídeos que direcionam um polipeptídeo para o sítio desejado em uma célula. Em algumas modalidades, a sequência sinal direciona o polipeptídeo do receptor quimérico para a via secretória da célula e permitirá a integração e ancoragem do polipeptídeo do receptor quimérico na bicamada lipídica. As sequências de sinal incluindo sequências de sinal de proteínas de ocorrência natural ou sintéticas, sequências de sinal de ocorrência não natural que são compatíveis para uso nos polipeptídeos dos receptores quiméricos descritos neste documento serão evidentes para um versado na técnica. Em algumas modalidades, a sequência sinal de CD8α. Em algumas modalidades, a sequência sinal é de CD28. Em outras modalidades, a sequência sinal é da cadeia kappa murina. Em ainda outras modalidades, a sequência sinal é de CD16.
G. Exemplos de polipeptídeos de ACTR
[00129] Construtos ACTR exemplificativos para uso com os métodos e composições descritos neste documento podem ser encontrados, por exemplo, na presente descrição e nas figuras ou podem ser encontrados na Publicação de Patente PCT n°.: WO2016040441A1, WO2017/161333 e no Pedido PCT n°: PCT/US2018/015999, cada um dos quais é incorporado por referência neste documento para esta finalidade. Os polipeptídeos de ACTR descritos neste documento podem compreender um domínio extracelular de CD16A com afinidade de ligação e especificidade para a porção Fc de uma molécula de IgG, um domínio transmembrana e um domínio de sinalização citoplasmático CD3ζ. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de ACTR podem incluir ainda um ou mais domínios de sinalização coestimuladores, um dos quais pode ser um domínio de sinalização coestimulador CD28 ou um domínio de sinalização coestimulador 4-1BB. Os polipeptídeos de ACTR são configurados de modo que, quando expresso em uma célula hospedeira, o domínio extracelular de ligação do ligante está localizado extracelularmente para ligação a uma molécula alvo e ao domínio de sinalização citoplasmático CD3ζ. O domínio de sinalização coestimulatório pode estar localizado no citoplasma para desencadear a ativação e/ou sinalização efetora.
[00130] Em algumas modalidades, um polipeptídeo de ACTR, conforme descrito neste documento, pode compreender, do terminal N ao terminal C, o domínio de ligação a Fc, tal como um domínio extracelular de CD16A, o domínio transmembrana, um ou mais domínios coestimuladores opcionais (por exemplo, um domínio coestimulatório de CD28, um domínio de sinalização coestimulador 4- 1BB, um domínio de sinalização coestimulador OX40, um domínio de sinalização coestimulador CD27 ou um domínio de sinalização coestimulatório ICOS) e o domínio de sinalização citoplasmático CD3ζ.
[00131] Alternativamente ou adicionalmente, os polipeptídeos de ACTR descritos neste documento podem conter dois ou mais domínios de sinalização coestimuladores, que podem se ligar uns aos outros ou ser separados pelo domínio de sinalização citoplasmático. O ligante a Fc extracelular, domínio transmembrana, domínio (s) de sinalização coestimulador opcional e domínio de sinalização citoplasmático em um polipeptídeo de ACTR podem ser ligados um ao outro diretamente ou por meio de um ligante de peptídeo. Em algumas modalidades, qualquer um dos polipeptídeos de ACTR descritos neste documento pode compreender uma sequência sinal no terminal N.
[00132] A Tabela 4 fornece polipeptídeos de ACTR exemplificativos descritos neste documento. Estes construtos exemplificativos têm, do terminal N ao terminal C em ordem, a sequência sinal, o domínio de ligação a Fc (por exemplo, um domínio extracelular de um receptor Fc), o domínio de dobradiça e a transmembrana, enquanto as posições do opcional o domínio coestimulador e o domínio de sinalização citoplasmático podem ser trocados. Tabela 4: Componentes exemplificativos de polipeptídeos de ACTR. Sequência Domínio Domínio de AA Domínio Domínio Sequên- extracelu-lar Domínio de sinalização exemplifica- Transmem- coestimulató- cia sinal do receptor dobradiça citoplas- tiva (SEQ ID brana rio Fc mático NO) 4-1BB 1 CD8α CD16A-V158 CD8α CD8α CD3ζ (CD137) 4-1BB 4-1BB 2 CD8α CD16A-V158 CD8α CD3ζ (CD137) (CD137) 4-1BB 3 CD8α CD16A-V158 CD8α CD28 CD3ζ (CD137) 4-1BB 4 CD8α CD16A-V158 CD8α CD34 CD3ζ (CD137) Domínio TM 4-1BB 5 CD8α CD16A-V158 CD8α hidrofóbico CD3ζ (CD137) projetado 4-1BB 6 CD8α CD32A CD8α CD8α CD3ζ (CD137) 7 CD8α CD16A-V158 CD8α CD8α CD28 CD3ζ
8 CD8α CD16A-V158 CD8α CD8α OX40 (CD134) CD3ζ CD28 9 CD8α CD16A-V158 CD8α CD8α CD3ζ 4-1BB 4-1BB 10 CD8α CD16A-V158 Nenhum CD8α CD3ζ (CD137) 4-1BB 11 CD8α CD16A-V158 XTEN CD8α CD3ζ (CD137) CD28 mutante beta12 CD8α CD16A-V158 CD8α CD8α CD3ζ LL para GG CD28 mutante 13 CD8α CD16A-V158 CD8α CD8α LL para GG + CD3ζ 4-1BB 4-1BB 14 CD8α CD16A-V158 CD8α CD4 CD3ζ (CD137) CD28 mutante 15 CD8α CD16A-V158 CD8α CD4 LL para GG + CD3ζ 4-1BB 4-1BB 16 CD8α CD16A-V158 CD8α FcεRIγ CD3ζ (CD137) Domínio TM hidrofóbico 4-1BB 17 CD8α CD16A-V158 CD8α projetado, CD3ζ (CD137) dimerização prevista 4-1BB 18 CD8α CD16A-V158 CD8α CD8β CD3ζ (CD137) 4-1BB 19 CD8α CD16A-V158 CD8α C16α CD3ζ (CD137) OX40 4-1BB 20 CD8α CD16A-V158 CD8α CD3ζ (CD134) (CD137) 4-1BB 21 CD8α CD16A-V158 CD8α CD3ζ CD3ζ (CD137) 4-1BB 22 CD8α CD16A-V158 CD8α CD3ε CD3ζ (CD137) 4-1BB 23 CD8α CD16A-V158 CD8α CD3γ CD3ζ (CD137) 4-1BB 24 CD8α CD16A-V158 CD8α CD3δ CD3ζ (CD137) 4-1BB 25 CD8α CD16A-V158 CD8α TCR-α CD3ζ (CD137) 4-1BB 26 CD8α CD16A-V158 CD8α CD32 CD3ζ (CD137) 4-1BB 27 CD8α CD16A-V158 CD8α CD64 CD3ζ (CD137) 4-1BB 28 CD8α CD16A-V158 CD8α VEGFR2 CD3ζ (CD137) 4-1BB 29 CD8α CD16A-V158 CD8α FAS CD3ζ (CD137) 4-1BB 30 CD8α CD16A-V158 CD8α FGFR2B CD3ζ (CD137)
4-1BB 31 CD8α CD16A-F158 CD8α CD8α CD3ζ (CD137) 4-1BB 32 CD8α CD64A CD8α CD8α CD3ζ (CD137)
IgG1 4-1BB 33 CD8α CD16A-V158 (dobradiça- CD8α CD3ζ (CD137) CH2-CH3)
IgG1 4-1BB 34 CD8α CD16A-V158 (dobradiça- CD8α CD3ζ (CD137) CH3) IgG1 4-1BB 35 CD8α CD16A-V158 CD8α CD3ζ (dobradiça) (CD137) Fragmento 1 de CD8-alfa 4-1BB 36 CD8α CD16A-V158 CD8α CD3ζ (30 (CD137) aminoácidos) Fragmento 2 de CD8-alfa 4-1BB 37 CD8α CD16A-V158 CD8α CD3ζ (15 (CD137) aminoácidos) (Gly4Ser) x3 4-1BB 38 CD8α CD16A-V158 (60 CD8α CD3ζ (CD137) aminoácidos) (Gly4Ser) x6 4-1BB 39 CD8α CD16A-V158 (45 CD8α CD3ζ (CD137) aminoácidos) (Gly4Ser)x9 4-1BB 40 CD8α CD16A-V158 (30 CD8α CD3ζ (CD137) aminoácidos) (Gly4Ser)x12 4-1BB 41 CD8α CD16A-V158 (15 CD8α CD3ζ (CD137) aminoácidos) XTEN (60 4-1BB 42 CD8α CD16A-V158 CD8α CD3ζ aminoácidos) (CD137) XTEN (30 4-1BB 43 CD8α CD16A-V158 CD8α CD3ζ aminoácidos) (CD137) XTEN (15 4-1BB 44 CD8α CD16A-V158 CD8α CD3ζ aminoácidos) (CD137) 4-1BB 45 CD28 CD16A-V158 CD8α CD8α CD3ζ (CD137) Cadeia 4-1BB 46 kappa CD16A-V158 CD8α CD8α CD3ζ (CD137) murina 4-1BB 47 CD16 CD16A-V158 CD8α CD8α CD3ζ (CD137) 48 CD8α CD16A-V158 CD8α CD8α ICOS CD3ζ 49 CD8α CD16A-V158 CD8α CD8α CD27 CD3ζ 50 CD8α CD16A-V158 CD8α CD8α GITR CD3ζ 51 CD8α CD16A-V158 CD8α CD8α HVEM CD3ζ 52 CD8α CD16A-V158 CD8α CD8α TIM1 CD3ζ
53 CD8α CD16A-V158 CD8α CD8α LFA1 (CD11a) CD3ζ 54 CD8α CD16A-V158 CD8α CD8α CD2 CD3ζ 4-1BB 55 CD8α CD16A-V158 CD8α FcεR1γ FcεR1γ (CD137) 4-1BB 56 CD8α CD16A-V158 CD8α CD8α FcεR1γ (CD137) CD28 (por 57 CD8α CD16A-V158 exemplo, CD28 CD28 CD3ζ 39aa) 58 CD8α CD16A-V158 nenhuma CD8 CD28 CD3ζ 59 CD8α CD16A-V158 CD8 CD8 CD28 + CD27 CD3ζ 60 CD8α CD16A-V158 CD8 CD8 CD28 + OX40 CD3ζ 61 CD8α CD16A-V158 CD8 CD8 4-1BB + CD28 CD3ζ 62 CD8α CD16A-V158 CD28 CD28 CD28 + 4-1BB CD3ζ 63 CD8α CD16A-V158 CD28 CD28 4-1BB CD3ζ 64 CD8α CD16A-V158 CD8 CD8 CD27 CD3ζ 65 CD8α CD16A-V158 CD8 CD8 CD28 CD3ζ 66 CD8α CD16A-V158 CD8 CD8 ICOS CD3ζ 67 CD8α CD16A-V158 CD8 CD8 OX40 CD3ζ 68 CD8α CD16A-V158 CD8 CD8 CD28 e ICOS CD3ζ 69 CD8α CD16A-V158 nenhum CD8 4-1BB CD3ζ 70 CD8α CD16A-V158 nenhum CD8 CD27 CD3ζ 71 CD8α CD16A-V158 nenhum CD8 ICOS CD3ζ 72 CD8α CD16A-V158 nenhum CD8 OX40 CD3ζ 73 CD8α CD16A-V158 nenhum CD8 + 4aa 4-1BB CD3ζ 74 CD8α CD16A-V158 nenhum CD8 + 4aa CD28 CD3ζ 75 CD8α CD16A -V158 CD8 CD28 CD28 CD3ζ 76 CD8α CD16A-V158 CD28 (26aa) CD28 CD28 CD3ζ 77 CD8α CD16A-V158 CD28 (16aa) CD28 CD28 CD3ζ 78 CD8α CD16A-V158 nenhum CD28 CD28 CD3ζ 79 CD8α CD16A-V158 CD8 CD8 41BB CD3ζ CD28 80 CD8α CD16A-V158 CD8 CD28 CD3ζ (39 aa)
[00133] As sequências de aminoácidos dos polipeptídeos de ACTR de exemplo são fornecidas abaixo (sequência sinal em itálico). SEQ ID NO:1:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPE ACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGR KKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSAD APAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNP QEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDT
YDALHMQALPPR SEQ ID NO:2:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPE ACRPAAGGAVHTRGLDFACDIISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVVKR GKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVK FSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGK PRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGL
STATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO:3:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPE ACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV RSKKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELR VKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMG GKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQ
GLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO:4:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPE ACRPAAGGAVHTRGLDFACDLIALVTSGALLAVLGITGYFLMNRKRG RKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSA DAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKN PQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKD
TYDALHMQALPPR SEQ ID NO:5:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPE ACRPAAGGAVHTRGLDFACDLLAALLALLAALLALLAALLARSKKRGR KKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSAD APAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNP QEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDT
YDALHMQALPPR SEQ ID NO:6:
MALPVTALLLPLALLLHAARPQAAAPPKAVLKLEPPWINVLQEDSVTL TCQGARSPESDSIQWFHNGNLIPTHTQPSYRFKANNNDSGEYTCQT GQTSLSDPVHLTVLSEWLVLQTPHLEFQEGETIMLRCHSWKDKPLVK VTFFQNGKSQKFSHLDPTFSIPQANHSHSGDYHCTGNIGYTLFSSKP VTITVQVPSMGSSSPMGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAA GGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIF KQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQ QGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLY NELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALH MQALPPR
SEQ ID NO:7:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPE ACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRSKR SRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSAD APAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNP QEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDT
YDALHMQALPPR SEQ ID NO:8:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPE ACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCALYLL RRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADA PAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQ EGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTY
DALHMQALPPR SEQ ID NO:9:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPE ACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRSKR SRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLY IFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAY QQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGL YNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDAL
HMQALPPR SEQ ID NO:10:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKR GRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSR SADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRR KNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTAT
KDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO:11:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQGGSPAGSPTSTEEGTSESATPES GPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKR GRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSR SADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRR KNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTAT
KDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO:12:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPE ACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRSKR SRGGHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSA DAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKN PQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKD
TYDALHMQALPPR SEQ ID NO:13:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPE ACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRSKR SRGGHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLL YIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPA YQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQE GLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYD
ALHMQALPPR SEQ ID NO:14:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPE ACRPAAGGAVHTRGLDFACDMALIVLGGVAGLLLFIGLGIFFCVRKRG RKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSA DAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKN PQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKD
TYDALHMQALPPR SEQ ID NO:15:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPE ACRPAAGGAVHTRGLDFACDMALIVLGGVAGLLLFIGLGIFFCVRRSK RSRGGHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRS ADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRK NPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATK
DTYDALHMQALPPR SEQ ID NO:16:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPE ACRPAAGGAVHTRGLDFACDLCYILDAILFLYGIVLTLLYCRLKKRGRK KLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADA PAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQ EGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTY
DALHMQALPPR SEQ ID NO:17:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPE ACRPAAGGAVHTRGLDFACDLLLILLGVLAGVLATLAALLARSKKRGR KKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSAD APAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNP QEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDT
YDALHMQALPPR SEQ ID NO:18:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPE ACRPAAGGAVHTRGLDFACDITLGLLVAGVLVLLVSLGVAIHLCKRGR KKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSAD APAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNP QEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDT
YDALHMQALPPR SEQ ID NO:19:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPE ACRPAAGGAVHTRGLDFACDVSFCLVMVLLFAVDTGLYFSVKTNKR GRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSR SADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRR KNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTAT
KDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO:20:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPE ACRPAAGGAVHTRGLDFACDVAAILGLGLVLGLLGPLAILLALYKRGR KKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSAD APAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNP QEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDT
YDALHMQALPPR SEQ ID NO:21:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPE ACRPAAGGAVHTRGLDFACDLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKKRGR KKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSAD APAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNP QEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDT
YDALHMQALPPR SEQ ID NO:22:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPE ACRPAAGGAVHTRGLDFACDVMSVATIVIVDICITGGLLLLVYYWSKN RKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVK FSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGK PRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGL
STATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO:23:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPE ACRPAAGGAVHTRGLDFACDGFLFAEIVSIFVLAVGVYFIAGQDKRGR KKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSAD APAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNP QEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDT
YDALHMQALPPR SEQ ID NO:24:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPE ACRPAAGGAVHTRGLDFACDGIIVTDVIATLLLALGVFCFAGHETKRG RKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSA DAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKN PQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKD
TYDALHMQALPPR SEQ ID NO:25:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPE ACRPAAGGAVHTRGLDFACDVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWKRGR KKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSAD APAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNP QEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDT YDALHMQALPPR
SEQ ID NO:26:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPE ACRPAAGGAVHTRGLDFACDIIVAVVIATAVAAIVAAVVALIYCRKKRG RKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSA DAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKN PQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKD
TYDALHMQALPPR SEQ ID NO:27:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPE ACRPAAGGAVHTRGLDFACDVLFYLAVGIMFLVNTVLWVTIRKEKRG RKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSA DAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKN PQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKD
TYDALHMQALPPR SEQ ID NO:28:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPE ACRPAAGGAVHTRGLDFACDIIILVGTAVIAMFFWLLLVIILRTKRGRKK LLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAP AYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQE GLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYD
ALHMQALPPR SEQ ID NO:29:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPE ACRPAAGGAVHTRGLDFACDLGWLCLLLLPIPLIVWVKRKKRGRKKL LYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAP AYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQE GLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYD
ALHMQALPPR SEQ ID NO:30:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPE ACRPAAGGAVHTRGLDFACDIAIYCIGVFLIACMVVTVILCRMKKRGR KKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSAD APAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNP QEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDT
YDALHMQALPPR SEQ ID NO:31:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLFGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPE ACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGR KKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSAD APAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNP QEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDT
YDALHMQALPPR SEQ ID NO:32:
MALPVTALLLPLALLLHAARPQVDTTKAVITLQPPWVSVFQEETVTLH CEVLHLPGSSSTQWFLNGTATQTSTPSYRITSASVNDSGEYRCQRG LSGRSDPIQLEIHRGWLLLQVSSRVFTEGEPLALRCHAWKDKLVYNV LYYRNGKAFKFFHWNSNLTILKTNISHNGTYHCSGMGKHRYTSAGIS VTVKELFPAPVLNASVTSPLLEGNLVTLSCETKLLLQRPGLQLYFSFY MGSKTLRGRNTSSEYQILTARREDSGLYWCEAATEDGNVLKRSPEL ELQVLGLQLPTPVWFHIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLY IFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAY QQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGL YNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDAL
HMQALPPR SEQ ID NO:33:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKR GRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSR SADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRR KNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTAT
KDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO:34:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQEPKSCDKTHTCPGQPREPQVYTL PPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS PGKIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTT QEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELN LGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEA
YSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO:35:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQEPKSCDKTHTCPIYIWAPLAGTCG VLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEE EGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRR GRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGK
GHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO:36:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPE AFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQ TTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNE LNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMA
EAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO:37:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQTTTPAPRPPTPFACDIYIWAPLAGT CGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPE EEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDK RRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRR
GKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO:38:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQGGGGSGGGGSGGGGSIYIWAPLA GTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRF PEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLD KRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERR
RGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO:39:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG GGGSGGGGSIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPF MRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQN QLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQ KDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQAL
PPR SEQ ID NO:40:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG GGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITL YCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRV KFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGG KPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQG
LSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO:41:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG GGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSIYIW APLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGC SCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREE YDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGM
KGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO:42:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQGGSPAGSPTSTEEGTSESATPES GPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAIYIWAPLAGT CGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPE EEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDK RRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRR
GKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO:43:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQGGSPAGSPTSTEEGTSESATPES GPGTSTEIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRP VQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLY NELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDK
MAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO:44:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQGGSPAGSPTSTEEGTIYIWAPLAG TCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFP EEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDK RRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRR
GKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO:45:
MLRLLLALNLFPSIQVTGGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDSVTL KCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRCQT NLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTALHK VTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSSET VNITITQGLAVSTISSFFPPGYQTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEA CRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRK KLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADA PAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQ EGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTY
DALHMQALPPR SEQ ID NO:46:
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKD SVTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYR CQTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTA LHKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVS SETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRP EACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRG RKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSA DAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKN PQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKD
TYDALHMQALPPR SEQ ID NO:47:
MWQLLLPTALLLLVSAGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDSVTLKC QGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRCQTNLS TLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTALHKVTY LQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSSETVNI TITQGLAVSTISSFFPPGYQTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRP AAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLL YIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPA YQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQE GLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYD
ALHMQALPPR SEQ ID NO:48:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPE ACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCCWLT KKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTLRVKFSRSADAPA YQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQE GLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYD
ALHMQALPPR SEQ ID NO:49:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPE ACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCQRRK YRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSPRVK FSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGK PRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGL
STATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO:50:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPE ACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCQLGL HIWQLRSQCMWPRETQLLLEVPPSTEDARSCQFPEEERGERSAEEK GRLGDLWVRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDK RRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRR
GKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO:51:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPE ACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCCVKR RKPRGDVVKVIVSVQRKRQEAEGEATVIEALQAPPDVTTVAVEETIPS FTGRSPNHRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKR RGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRG
KGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO:52:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPE ACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKKYF FKKEVQQLSVSFSSLQIKALQNAVEKEVQAEDNIYIENSLYATDRVKF SRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKP RRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLS
TATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO:53:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPE ACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCYKVG FFKRNLKEKMEAGRGVPNGIPAEDSEQLASGQEAGDPGCLKPLHEK DSESGGGKDRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLD KRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERR
RGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO:54:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPE ACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRKK QRSRRNDEELETRAHRVATEERGRKPHQIPASTPQNPATSQHPPPP PGHRSQAPSHRPPPPGHRVQHQPQKRPPAPSGTQVHQQKGPPLPR PRVQPKPPHGAAENSLSPSSNRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNEL NLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAE
AYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO:55:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPE ACRPAAGGAVHTRGLDFACDPQLCYILDAILFLYGIVLTLLYCRLKIQV RKAAITSYEKSDGVYTGLSTRNQETYETLKHEKPPQKRGRKKLLYIFK
QPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL SEQ ID NO:56:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPE ACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGR KKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRLKIQVRKA
AITSYEKSDGVYTGLSTRNQETYETLKHEKPPQ SEQ ID NO:57:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGK HLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRL LHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPA YQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQE GLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYD
ALHMQALPPR SEQ ID NO:58:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRS KRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRS ADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRK NPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATK
DTYDALHMQALPPR SEQ ID NO:59:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPE ACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRSKR SRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSQRRKYRSN KGESPVEPAEPCHYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSPRVKFSRS ADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRK NPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATK
DTYDALHMQALPPR SEQ ID NO:60:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPE ACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRSKR SRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRRDQRLPP DAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQ NQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNEL QKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQ
ALPPR SEQ ID NO:61:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPE ACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGR KKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRSKRSRLLH SDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAY QQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGL YNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDAL
HMQALPPR SEQ ID NO:62:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGK HLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRL LHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFK QPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQ GQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYN ELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHM
QALPPR SEQ ID NO:63:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGK HLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVKRGRKKL LYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAP AYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQE GLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYD
ALHMQALPPR SEQ ID NO:64:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPE ACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCQRRK YRSNKGESPVEPAEPCHYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSPRVK FSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGK PRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGL
STATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO:65:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPE ACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRSKR SRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSAD APAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNP QEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDT
YDALHMQALPPR SEQ ID NO:66:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPE ACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKKKY SSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTLRVKFSRSADAPAYQQG QNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNE LQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHM
QALPPR SEQ ID NO:67:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPE ACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRRDQ RLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQ QGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLY NELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALH
MQALPPR SEQ ID NO:68:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPE ACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRSKR SRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKKKYSSSVH DPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLY NELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDK
MAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO:69:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKR GRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSR SADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRR KNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTAT
KDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO:70:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCQ RRKYRSNKGESPVEPAEPCHYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEM GGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLY
QGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO:71:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKK KYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTLRVKFSRSADAPAYQ QGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLY NELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALH
MQALPPR SEQ ID NO:72:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCR RDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAP AYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQE GLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYD
ALHMQALPPR SEQ ID NO:73:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITL YCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRV KFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGG KPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQG
LSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO:74:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITL YCRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRV KFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGG KPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQG
LSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO:75:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPE ACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFS RSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPR RKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLST
ATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO:76:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPS KPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPR RPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYN ELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKM
AEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO:77:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVV GGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHY QPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREE YDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGM
KGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO:78:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIF WVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRV KFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGG KPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQG
LSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO:79:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPE ACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGR KKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSAD APAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNP QEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDT
YDALHMQALPPR SEQ ID NO:80:
MALPVTALLLPLALLLHAARPGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDS VTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRC QTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSS ETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGK HLCPSPLFPGPSKPIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRSKRSRLLHSD YMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQ GQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYN ELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHM
QALPPR H. Exemplos de polipeptídeos de CAR
[00134] Polipeptídeos de CAR exemplificativos para uso com os métodos e composições descritos neste documento podem ser encontrados, por exemplo, na presente descrição e figuras ou como aqueles conhecidos na técnica. Os polipeptídeos de CAR descritos neste documento podem compreender um domínio extracelular compreendendo um fragmento de anticorpo de cadeia única (scFv) com afinidade de ligação e especificidade para um antígeno de interesse (por exemplo, aqueles listados na Tabela 3 acima), um domínio transmembrana e um domínio de sinalização citoplasmático CD3ζ. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de CAR podem incluir ainda um ou mais domínios de sinalização coestimuladores, um dos quais pode ser um domínio de sinalização coestimulador CD28 ou um domínio de sinalização coestimulador 4-1BB. Os polipeptídeos de CAR são configurados de modo que, quando expressos em uma célula hospedeira, o domínio de ligação ao antígeno extracelular está localizado extracelularmente para ligação a uma molécula alvo e ao domínio de sinalização citoplasmático CD3ζ. O domínio de sinalização coestimulatório pode estar localizado no citoplasma para desencadear a ativação e/ou sinalização efetora.
[00135] Em algumas modalidades, um polipeptídeo de CAR, conforme descrito neste documento, pode compreender, do terminal N ao terminal C, o domínio de ligação ao antígeno extracelular, o domínio transmembrana, um ou mais domínios coestimuladores opcionais (por exemplo, um domínio coestimulatório de CD28, um domínio de sinalização coestimulador 4-1BB, um domínio de sinalização coestimulador OX40, um domínio de sinalização coestimulador CD27 ou um domínio de sinalização coestimulatório ICOS) e o domínio de sinalização citoplasmático CD3ζ.
[00136] Alternativamente ou adicionalmente, os polipeptídeos de CAR descritos neste documento podem conter dois ou mais domínios de sinalização coestimuladores, que podem se ligar uns aos outros ou ser separados pelo domínio de sinalização citoplasmático. O domínio de ligação ao antígeno extracelular, domínio transmembrana, domínio
(s) de sinalização coestimulador opcional e domínio de sinalização citoplasmático em um polipeptídeo de CAR podem ser ligados um ao outro diretamente ou por meio de um ligante de peptídeo. Em algumas modalidades, qualquer um dos polipeptídeos de CAR descritos neste documento pode compreender uma sequência sinal no terminal N.
[00137] A Tabela 5 fornece polipeptídeos de CAR exemplificativos descritos neste documento. Esses construtos exemplificativos têm, do terminal N ao terminal C em ordem, a sequência sinal, o domínio de ligação ao antígeno (por exemplo, um fragmento scFv direcionado a um antígeno, como um antígeno tumoral ou um antígeno patogênico), o domínio de dobradiça e a transmembrana, enquanto as posições do domínio coestimulador opcional e do domínio de sinalização citoplasmático podem ser trocadas. Tabela 5: Componentes exemplificativos de polipeptídeos de CAR. Sequência Domínio Domínio de Domínio Domínio Domínio de sinal extracelular dobradiça Transmem- coestimula- sinalização (ligação ao brana tório citoplasmá- antígeno) tico CD8α scFv (por CD8 CD8 4-1BB CD3ζ exemplo, scFv anti-GPC3) CD8α scFv (por CD28 CD28 CD28 CD3ζ exemplo, scFv anti-GPC3)
[00138] As sequências de aminoácidos dos polipeptídeos de CAR de exemplo são fornecidas abaixo (sequência sinal em itálico). SEQ ID NO:104:
MALPVTALLLPLALLLHAARPDVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQ SLVHSNRNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSG TDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPPTFGQGTKLEIKRGGGGSGG GGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHW VRQAPGQGLEWMGALDPKTGDTAYSQKFKGRVTLTADKSTSTAYM ELSSLTSEDTAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAP TIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLL SLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGG CELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRD PEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHD
GLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO:105:
MALPVTALLLPLALLLHAARPDVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQ SLVHSNRNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSG TDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPPTFGQGTKLEIKRGGGGSGG GGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHW VRQAPGQGLEWMGALDPKTGDTAYSQKFKGRVTLTADKSTSTAYM ELSSLTSEDTAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSSIEVMYPPPYLDNE KSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAF IIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEM GGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLY
QGLSTATKDTYDALHMQALPPR III. Células hematopoiéticas que expressam polipeptídeos moduladores do ciclo de Krebs e polipeptídeos dos receptores opcionalmente quiméricos
[00139] São fornecidas neste documento células hospedeiras geneticamente manipuladas (por exemplo, células hematopoiéticas, como HSCs e células imunes, por exemplo, células T ou células NK) que expressam um ou mais dos polipeptídeos moduladores do ciclo de Krebs como descrito neste documento. As células hospedeiras geneticamente manipuladas podem ainda expressar um polipeptídeo receptor quimérico (por exemplo, células que expressam ACTR, por exemplo, células T de ACTR ou células que expressam CAR, por exemplo, células T CAR) como também descrito neste documento. Em algumas modalidades, as células hospedeiras são células hematopoiéticas ou uma progênie destas. Em algumas modalidades, as células hematopoiéticas podem ser células-tronco hematopoiéticas. Em outras modalidades, as células hospedeiras são células imunes, como células T ou células NK. Em algumas modalidades, as células imunes são células T. Em algumas modalidades, as células imunes são células NK. Em outras modalidades, as células imunes podem ser linhagens celulares estabelecidas, por exemplo, células NK-92.
[00140] Em algumas modalidades, as células hematopoiéticas geneticamente manipuladas, como HSCs ou células imunes (por exemplo, células T ou células NK) podem coexpressar qualquer um dos construtos CAR, tais como aqueles descritos neste documento com qualquer um dos agentes moduladores do ciclo de Krebs, como um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs (por exemplo, GOT1 ou GOT2). Em algumas modalidades, o construto CAR pode compreender um domínio coestimulador de 4-1BB ou CD28 e o polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs é GOT1 ou GOT2. O construto CAR pode compreender ainda uma dobradiça e um domínio transmembrana de CD8 ou CD28.
[00141] Em outras modalidades, as células hematopoiéticas geneticamente manipuladas, como HSCs ou células imunes (por exemplo, células T ou células NK) podem coexpressar qualquer um dos construtos ACTR, tais como aqueles descritos neste documento com qualquer um dos agentes moduladores do ciclo de Krebs, como um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs (por exemplo, GOT1 ou GOT2). Em algumas modalidades, o construto ACTR pode compreender um domínio coestimulador de 4-1BB ou CD28 e o polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs é GOT1 ou GOT2. Os construtos ACTR podem compreender ainda uma dobradiça e um domínio transmembrana de CD8 ou CD28.
[00142] Alternativamente, as células hospedeiras geneticamente manipuladas descritas neste documento podem não expressar quaisquer polipeptídeos receptores quiméricos. Em algumas modalidades, as células imunes geneticamente manipuladas, que podem expressar excessivamente um ou mais polipeptídeos moduladores do ciclo de Krebs, como descrito neste documento, podem ser derivadas linfócitos infiltrantes de tumor (TILs). A superexpressão dos polipeptídeos moduladores do ciclo de Krebs pode aumentar a atividade antitumoral ou os TILs no microambiente tumoral. Alternativamente ou além disso, as células imunes geneticamente manipuladas podem ser células T, que podem ainda ter receptores de células T geneticamente manipuladas. Os TILs e/ou TCRs geneticamente modificados podem ter como alvo o complexo peptídeo- MHC, no qual o peptídeo pode ser derivado de um patógeno, um antígeno tumoral ou um autoantígeno. Alguns exemplos são fornecidos na Tabela 6 abaixo.
[00143] Qualquer um dos construtos CAR descritos neste documento ou um anticorpo a ser coutilizado com células T de ACTR também pode ter como alvo qualquer um dos peptídeos em tal complexo de peptídeo/MHC. Tabela 6. Exemplos de Alvos de Peptídeo-MHC Alvos Indicações NY-ESO-1 Sarcoma, MM MAGE-A10 NSCLC, bexiga, HNSCC MAGE-A4 Sarcomas, outros PMEL Melanoma WT-1 Ovariana
AFP HCC HPV-16 E6 Cervical HPV-16 E7 Cervical
[00144] Em algumas modalidades, as células hospedeiras são células imunes, como células T ou células NK. Em algumas modalidades, as células imunes são células T. Por exemplo, as células T podem ser células helper CD4 + ou células citotóxicas CD8 +, ou uma combinação das mesmas. Alternativamente ou além disso, as células T podem ser células T supressoras, como as células Treg. Em algumas modalidades, as células imunes são células NK. Em outras modalidades, as células imunes podem ser linhagens celulares estabelecidas, por exemplo, células NK-92. Em alguns exemplos, as células imunes podem ser uma mistura de diferentes tipos de células T e/ou células NK, conforme conhecido na técnica. Por exemplo, as células imunes podem ser uma população de células imunes isoladas de um doador adequado (por exemplo, um paciente humano). Veja as invenções abaixo.
[00145] Em alguns casos, o polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs a ser introduzido nas células hospedeiras é idêntico a uma proteína endógena da célula hospedeira. A introdução de cópias adicionais das sequências de codificação do polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs na célula hospedeira aumentaria o nível de expressão do polipeptídeo (ou seja, expressado em excesso) em relação à contraparte nativa. Em alguns casos, o polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs a ser introduzido nas células hospedeiras é heterólogo para a célula hospedeira, isto é, não existe ou não é expresso na célula hospedeira. Esse polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs heterólogo pode ser uma proteína de ocorrência natural não expressa na célula hospedeira na natureza (por exemplo, de uma espécie diferente). Alternativamente, o polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs heterólogo pode ser uma variante de uma proteína nativa, tal como aquelas descritas neste documento. Em alguns exemplos, a cópia exógena (ou seja, não nativa das células hospedeiras) do ácido nucleico codificante pode existir extracromossomicamente. Em outros exemplos,
a cópia exógena da sequência de codificação pode ser integrada no cromossomo da célula hospedeira e pode estar localizada em um sítio que é diferente dos loci nativos do gene endógeno.
[00146] Essas células hospedeiras geneticamente manipuladas têm a capacidade de ter uma taxa aumentada de glicólise e podem, por exemplo, ter uma capacidade aumentada de tirar glicose do ambiente. Assim, essas células hospedeiras geneticamente manipuladas podem exibir melhor crescimento e/ou bioatividades sob baixo teor de glicose, baixo teor de aminoácidos, baixo pH e/ou condições hipóxicas, por exemplo, em um microambiente tumoral. As células geneticamente manipuladas, quando expressam um polipeptídeo receptor quimérico como descrito neste documento, podem reconhecer e inibir as células alvo, seja diretamente (por exemplo, por células imunes que expressam CAR) ou por meio de agentes terapêuticos contendo Fc, como anticorpos antitumorais (por exemplo, porcélulas imunes que expressam ACTR). Dada a sua esperada alta taxa de proliferação, bioatividade e/ou taxa de sobrevivência em ambientes com baixo teor de glicose, baixo teor de aminoácidos, baixo pH e/ou hipóxicos (por exemplo, em um microambiente tumoral), as células geneticamente manipuladas, como células T e células NK seria esperado que tivesse maior eficácia terapêutica em relação às células T do polipeptídeo do receptor quimérico que não expressam ou expressam um nível inferior ou uma forma menos ativa do polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs.
[00147] A população de células imunes pode ser obtida de qualquer fonte, como células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), medula óssea ou tecidos como baço, nódulo linfático, timo, células- tronco ou tecido tumoral. Alternativamente, a população de células imunes pode ser derivada de células-tronco, por exemplo, células- tronco hematopoiéticas e células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). Uma fonte adequada para obter o tipo desejado de células hospedeiras seria evidente para um versado na técnica. Em algumas modalidades, a população de células imunes é derivada de PBMCs, que podem ser obtidas de um paciente (por exemplo, um paciente humano) que precisa do tratamento descrito neste documento. O tipo desejado de células hospedeiras (por exemplo, células T, células NK ou células T e células NK) pode ser expandido dentro da população de células obtida pela coincubação das células com moléculas estimuladoras. Como um exemplo não limitativo, os anticorpos anti-CD3 e anti-CD28 podem ser usados para a expansão de células T.
[00148] Para construir as células imunes que expressam qualquer um dos polipeptídeos moduladores do ciclo de Krebs e, opcionalmente, o polipeptídeo do receptor quimérico descrito neste documento, os vetores de expressão para a expressão estável ou transitória dos polipeptídeos moduladores do ciclo de Krebs e/ou o polipeptídeo do receptor quimérico podem ser criados por meio de métodos convencionais como descrito neste documento e introduzido em células hospedeiras imunes. Por exemplo, os ácidos nucleicos que codificam os polipeptídeos moduladores do ciclo de Krebs e/ou os polipeptídeos dos receptores quiméricos podem ser clonados em um ou dois vetores de expressão adequados, como um vetor viral ou um vetor não viral em ligação operável a um promotor adequado. Em alguns casos, cada uma das sequências de codificação para o polipeptídeo do receptor quimérico e o polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs estão em duas moléculas de ácido nucleico separadas e podem ser clonadas em dois vetores separados, que podem ser introduzidos em células hospedeiras adequadas simultaneamente ou sequencialmente. Alternativamente, as sequências de codificação para o polipeptídeo do receptor quimérico e o polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs estão em uma molécula de ácido nucleico e podem ser clonadas em um vetor. As sequências de codificação do polipeptídeo do receptor quimérico e do polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs podem estar em ligação operável a dois promotores distintos de modo que a expressão dos dois polipeptídeos seja controlada por promotores diferentes. Alternativamente, as sequências de codificação do polipeptídeo do receptor quimérico e do polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs podem estar operativamente em ligação a um promotor de modo que a expressão dos dois polipeptídeos seja controlada por um único promotor. Sequências adequadas podem ser inseridas entre as sequências de codificação dos dois polipeptídeos de modo que dois polipeptídeos separados possam ser traduzidos de uma única molécula de mRNA. Tais sequências, por exemplo, IRES ou sítio de salto ribossomal, são bem conhecidas na técnica. Descrições adicionais são fornecidas abaixo.
[00149] Os ácidos nucleicos e os vetores podem ser colocados em contato, sob condições adequadas, com uma enzima de restrição para criar extremidades complementares em cada molécula que podem emparelhar umas com as outras e serem unidas com uma ligase. Alternativamente, os ligantes de ácido nucleico sintéticos podem ser ligados aos terminais do ácido nucleico que codifica os polipeptídeos moduladores do ciclo de Krebs e/ou os polipeptídeos do receptor quimérico. Os ligantes sintéticos podem conter sequências de ácido nucleico que correspondem a um sítio de restrição particular no vetor. A seleção de vetores de expressão/plasmídeos/vetores virais dependeria do tipo de células hospedeiras para a expressão dos polipeptídeos moduladores do ciclo de Krebs e/ou dos polipeptídeos do receptor quimérico, mas devem ser adequados para integração e replicação em células eucarióticas.
[00150] Uma variedade de promotores pode ser usada para a expressão dos polipeptídeos moduladores do ciclo de Krebs e/ou os polipeptídeos do receptor quimérico descritos neste documento, incluindo, sem limitação, o promotor inicial intermediário do citomegalovírus (CMV), um LTR viral tal como o vírus do sarcoma de Rous LTR, HIV -LTR, HTLV-1 LTR, o promotor inicial do vírus símio 40 (SV40), o promotor EF1-alfa humano ou o promotor do vírus herpes simplex tk. Promotores adicionais para a expressão dos polipeptídeos moduladores do ciclo de Krebs e/ou os polipeptídeos do receptor quimérico incluem qualquer promotor constitutivamente ativo em uma célula imune. Alternativamente, qualquer promotor regulável pode ser usado, de modo que sua expressão possa ser modulada dentro de uma célula imune.
[00151] Além disso, o vetor pode conter, por exemplo, alguns ou todos os seguintes: um gene marcador selecionável, como o gene da neomicina ou o gene da canamicina para a seleção de transfectantes estáveis ou transitórios em células hospedeiras; sequências poteniadoras/promotoras do gene inicial imediato do CMV humano para níveis elevados de transcrição; sequências de íntron do gene EF1-alfa humano, terminação da transcrição e sinais de processamento de RNA de SV40 para estabilidade de mRNA; Origens de replicação de poliomavírus SV40 e ColE1 para replicação epissomal adequada; sítios internos de ligação ao ribossomo (IRESes), sítios versáteis de clonagem múltipla; Promotores de RNA T7 e SP6 para a transcrição in vitro de RNA sense e antisense; um "interruptor suicida" ou "gene suicida" que, quando acionado, faz com que as células que transportam o vetor para que morra (por exemplo, timidina quinase de HSV ou uma caspase induzível, como iCasp9) e o gene repórter para avaliar a expressão dos polipeptídeos moduladores do ciclo de Krebs e/ou o polipeptídeo do receptor quimérico.
[00152] Em uma modalidade específica, tais vetores também incluem um gene suicida. Conforme usado neste documento, o termo "gene suicida" se refere a um gene que faz com que a célula que expressa o gene suicida morra. O gene suicida pode ser um gene que confere sensibilidade a um agente, por exemplo, uma droga, na célula na qual o gene é expresso e faz com que a célula morra quando a célula é contatada ou exposta ao agente. Genes suicidas são conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Suicide Gene Therapy: Methods and Reviews, Springer, Caroline J. (Cancer Research UK Centre for Cancer Therapeutics at the Institute of Cancer Research, Sutton, Surrey, UK), Humana Press, 2004) e incluem, por exemplo, o gene da timidina quinase (TK) do vírus Herpes Simplex (HSV), citosina desaminase, purina nucleosídeo fosforilase, nitro-redutase e caspases, como a caspase 8.
[00153] Os vetores e métodos adequados para a produção de vetores contendo transgenes são bem conhecidos e estão disponíveis na técnica. Exemplos da preparação de vetores para expressão de polipeptídeos moduladores do ciclo de Krebs e/ou polipeptídeos receptores quiméricos podem ser encontrados, por exemplo, em US2014/0106449, incorporado neste documento em sua totalidade por referência.
[00154] Qualquer um dos vetores que compreendem uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs e/ou um polipeptídeo do receptor quimérico descrito neste documento também está dentro do escopo da presente invenção. Tal vetor, ou a sequência que codifica um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs e/ou um polipeptídeo do receptor quimérico nele contido, pode ser distribuído em células hospedeiras, tais como células imunes hospedeiras por qualquer método adequado. Os métodos de distribuição de vetores às células imunes são bem conhecidos na técnica e podem incluir eletroporação de DNA, eletroporação de RNA, transfecção usando reagentes, como lipossomas, ou transdução viral (por exemplo, transdução retroviral, como transdução lentiviral).
[00155] Em algumas modalidades, os vetores para expressão dos polipeptídeos moduladores do ciclo de Krebs e/ou os polipeptídeos dos receptores quiméricos são entregues às células hospedeiras por transdução viral (por exemplo, transdução retroviral, como transdução lentiviral ou gama-retroviral). Métodos virais exemplificativos para distribuição incluem, mas não estão limitados a retrovírus recombinantes (ver, por exemplo, Publicação PCT N°s. WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; WO 93/11230; WO 93/10218; e WO 91/02805; Patentes US N°s. 5.219.740 e 4.777.127; Patente GB N°. 2.200.651; e Patente EP N°. 0 345 242), vetores baseados em alfavírus e vetores de vírus adeno-associados (AAV) (ver, por exemplo, Publicaes PCT N°s. WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984; e WO 95/00655). Em algumas modalidades, os vetores para expressão dos polipeptídeos moduladores do ciclo de Krebs e/ou os polipeptídeos do receptor quimérico são retrovírus. Em algumas modalidades, os vetores para expressão dos polipeptídeos moduladores do ciclo de Krebs e/ou os polipeptídeos do receptor quimérico são lentivírus.
[00156] Exemplos de referências que descrevem transdução retroviral incluem Anderson et al., Pat. N°. 5.399.346; Mann et al., Cell 33: 153 (1983); Temin et al., Pat. US N°. 4.650.764; Temin et al., Pat. US N°. 4.980.289; Markowitz et al., J. Virol. 62: 1120 (1988); Temin et al., Pat.US N°. 5.124.263; Publicação de Patente Internacional N°. WO 95/07358, publicada em 16 de março de 1995, por Dougherty et al e Kuo et al., Blood 82: 845 (1993). A Publicação de Patente Internacional n°. WO 95/07358 descreve a transdução de alta eficiência de linfócitos B primários. Consulte também WO 2016/040441A1, que é incorporado por referência ao presente documento para a finalidade e o assunto referido neste documento.
[00157] Em exemplos em que os vetores que codificam polipeptídeos moduladores do ciclo de Krebs e/ou polipeptídeos dos receptores quiméricos são introduzidos nas células hospedeiras usando um vetor viral, as partículas virais que são capazes de infectar as células imunes e transportar o vetor podem ser produzidas por qualquer método conhecido na técnica e podem ser encontrados, por exemplo, no Pedido PCT n°. WO 1991/002805A2, WO 1998/009271 A1 e na Patente US
6.194.191. As partículas virais são colhidas do sobrenadante da cultura de células e podem ser isoladas e/ou purificadas antes do contato das partículas virais com as células imunes.
[00158] Em algumas modalidades, as moléculas de RNA que codificam qualquer um dos polipeptídeos moduladores do ciclo de Krebs e/ou os polipeptídeos dos receptores quiméricos, conforme descrito neste documento, podem ser preparadas por um método convencional (por exemplo, transcrição in vitro) e, em seguida, introduzidas em células hospedeiras adequadas, por exemplo, aquelas descritas neste documento, por meio de métodos conhecidos, por exemplo, Rabinovich et al., Human Gene Therapy 17: 1027-1035.
[00159] Em alguns casos, o ácido nucleico que codifica um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs e o ácido nucleico que codifica um polipeptídeo do receptor quimérico adequado podem ser clonados em vetores de expressão separados, que podem ser introduzidos em células hospedeiras adequadas simultaneamente ou sequencialmente. Por exemplo, um vetor de expressão (ou uma molécula de RNA) para expressar o polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs pode ser introduzido primeiramente nas células hospedeiras e as células hospedeiras transfectadas que expressam o polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs podem ser isoladas e cultivadas in vitro. Um vetor de expressão (ou uma molécula de RNA) para expressar um polipeptídeo do receptor quimérico adequado pode então ser introduzido nas células hospedeiras que expressam o polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs e células transfectadas que expressam ambos os polipeptídeos podem ser isoladas. Em outro exemplo, os vetores de expressão (ou moléculas de RNA) cada um para expressar o polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs e o polipeptídeo do receptor quimérico podem ser introduzidos nas células hospedeiras simultaneamente e as células hospedeiras transfectadas que expressam ambos os polipeptídeos podem ser isoladas através de metodologia de rotina.
[00160] Em outros casos, o ácido nucleico que codifica o polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs e o ácido nucleico que codifica o polipeptídeo do receptor quimérico podem ser clonados no mesmo vetor de expressão. Os polinucleotídeos (incluindo vetores nos quais tais polinucleotídeos estão operacionalmente ligados a pelo menos um elemento regulador) para a expressão do polipeptídeo do receptor quimérico e polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs também estão dentro do escopo da presente invenção. Exemplos não limitativos de vetores úteis da invenção incluem vetores virais, tais como, por exemplo, vetores retrovirais incluindo vetores retrovirais gama e vetores lentivirais e vetores de vírus adeno-associados (vetores AAV).
[00161] Em alguns casos, o (s) ácido (s) nucleico (s) que codificam o polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs e/ou o polipeptídeo receptor quimérico podem ser entregues nas células hospedeiras via transposon. Em alguns casos, o (s) ácido (s) nucleico (s) de codificação pode (m) ser distribuído (s) às células hospedeiras por meio da edição de genes, por exemplo, por CRISPR, TALEN, nuclease de dedo de zinco (ZFN) ou meganucleases.
[00162] Em alguns casos, o ácido nucleico descrito neste documento pode compreender duas sequências de codificação, uma que codifica um polipeptídeo do receptor quimérico, conforme descrito neste documento, e a outra que codifica um polipeptídeo capaz de modular o ciclo de Krebs (ou seja, um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs). O ácido nucleico que compreende as duas sequências de codificação descritas neste documento pode ser configurado de modo que os polipeptídeos codificados pelas duas sequências de codificação possam ser expressos como polipeptídeos independentes (e fisicamente separados). Para atingir este objetivo, o ácido nucleico descrito neste documento pode conter uma terceira sequência de nucleotídeos localizada entre a primeira e a segunda sequências de codificação. Esta terceira sequência de nucleotídeos pode, por exemplo, codificar um sítio de salto ribossomal. Um sítio de salto ribossomal é uma sequência que prejudica a formação normal da ligação peptídica. Este mecanismo resulta na tradução de quadros de leitura abertos adicionais de um RNA mensageiro. Esta terceira sequência de nucleotídeos pode, por exemplo, codificar um peptídeo P2A, T2A ou F2A (ver, por exemplo, Kim et al., PLoS One. 2011; 6 (4): e18556). Como um exemplo não limitativo, um peptídeo P2A exemplificativo pode ter a sequência de aminoácidos de ATNFSLLKQAGDVEENPGP SEQ ID NO: 106.
[00163] Em outra modalidade, a terceira sequência de nucleotídeos pode codificar um sítio de entrada de ribossomo interno (IRES). Um IRES é um elemento de RNA que permite a iniciação da tradução de uma maneira independente da extremidade, permitindo também a tradução de frames abertos adicionais de um RNA mensageiro. Alternativamente, a terceira sequência de nucleotídeos pode codificar um segundo promotor que controla a expressão do segundo polipeptídeo. A terceira sequência de nucleotídeos também pode codificar mais de uma sequência de salto ribossomal, sequência de IRES, sequência de promotor adicional ou uma combinação das mesmas.
[00164] O ácido nucleico também pode incluir sequências de codificação adicionais (incluindo, mas não se limitando a quarta e quinta sequências de codificação) e pode ser configurado de modo que os polipeptídeos codificados pelas sequências de codificação adicionais sejam expressos como polipeptídeos independentes e fisicamente separados. Para este fim, as sequências de codificação adicionais podem ser separadas de outras sequências de codificação por uma ou mais sequências de nucleotídeos que codificam uma ou mais sequências de salto ribossomal, sequências de IRES ou sequências de promotor adicionais.
[00165] Em alguns exemplos, o ácido nucleico (por exemplo, um vetor de expressão ou uma molécula de RNA como descrito neste documento) pode compreender sequências de codificação para o polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs (por exemplo, aqueles descritos neste documento) e um polipeptídeo de receptor quimérico adequado, as duas sequências de codificação, em qualquer ordem, sendo separados por uma terceira sequência de nucleotídeos que codifica para um peptídeo P2A (por exemplo, ATNFSLLKQAGDVEENPGP; SEQ ID NO: 106). Como resultado, dois polipeptídeos separados, o polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs e o receptor quimérico, podem ser produzidos a partir de um tal ácido nucleico, em que a porção P2A ATNFSLLKQAGDVEENPG (SEQ ID NO: 107) está ligada ao polipeptídeo a montante (codificado pelo a montante sequência de codificação) e o resíduo P do peptídeo P2A está ligado ao polipeptídeo a jusante (codificado pela sequência de codificação a jusante). Em alguns exemplos, o polipeptídeo do receptor quimérico é o a montante e o polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs é o a jusante. Em outros exemplos, o polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs é o a montante e o polipeptídeo do receptor quimérico é o a jusante.
[00166] Em alguns exemplos, o ácido nucleico (por exemplo, um vetor de expressão ou uma molécula de RNA como descrito neste documento) pode compreender sequências de codificação para o polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs (por exemplo, aqueles descritos neste documento) e um polipeptídeo de ACTR adequado, as duas sequências de codificação, em qualquer ordem, sendo separados por uma terceira sequência de nucleotídeos que codifica para um peptídeo P2A (por exemplo, ATNFSLLKQAGDVEENPGP; SEQ ID NO: 106). Como resultado, dois polipeptídeos separados, o polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs e o ACTR, podem ser produzidos a partir de um tal ácido nucleico, em que a porção P2A ATNFSLLKQAGDVEENPG (SEQ ID NO: 107) está ligada ao polipeptídeo a montante (codificado pelo a montante sequência de codificação) e o resíduo P do peptídeo P2A está ligado ao polipeptídeo a jusante (codificado pela sequência de codificação a jusante). Em alguns exemplos, o polipeptídeo de ACTR é o a montante e o polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs é o a jusante. Em outros exemplos, o polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs é o a montante e o polipeptídeo de ACTR é o a jusante.
[00167] Em alguns exemplos, o ácido nucleico descrito acima pode ainda codificar um ligante (por exemplo, um ligante GSG) entre dois segmentos das sequências codificadas, por exemplo, entre o polipeptídeo a montante e o peptídeo P2A.
[00168] Em exemplos específicos, o ácido nucleico descrito neste documento é configurado de modo que expressa dois polipeptídeos separados na célula hospedeira para a qual o ácido nucleico é transfectado: (i) o primeiro polipeptídeo que contém, do terminal N para o terminal C, um CAR adequado (por exemplo, SEQ ID NO: 104 ou SEQ ID NO: 105), um ligante peptídico (por exemplo, o ligante GSG) e o segmento ATNFSLLKQAGDVEENPG (SEQ ID NO: 107) derivado do peptídeo P2A; e (ii) um segundo polipeptídeo que contém, do terminal N ao terminal C, o resíduo P derivado do peptídeo P2A e o polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs (por exemplo, qualquer uma das SEQ ID
NOs: 81-92).
[00169] Em exemplos específicos, o ácido nucleico descrito neste documento é configurado de modo que expresse dois polipeptídeos separados na célula hospedeira para a qual o ácido nucleico é transfectado: (i) o primeiro polipeptídeo que contém, do terminal N ao terminal C, um ACTR adequado (por exemplo, qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-80 descritas neste documento, por exemplo, SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 57), um ligante peptídico (por exemplo, o ligante GSG) e o ATNFSLLKQAGDVEENPG (SEQ ID NO: 107) segmento derivado do peptídeo P2A; e (ii) um segundo polipeptídeo que contém, do terminal N ao terminal C, o resíduo P derivado do peptídeo P2A e o polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs (por exemplo, qualquer uma das SEQ ID NOs: 81-92).
[00170] Em alguns casos, polipeptídeos adicionais de interesse também podem ser introduzidos nas células imunes do hospedeiro.
[00171] Após a introdução nas células hospedeiras, um vetor que codifica qualquer um dos polipeptídeos moduladores do ciclo de Krebs e/ou os polipeptídeos dos receptores quiméricos fornecidos neste documento, ou o ácido nucleico que codifica o polipeptídeo do receptor quimérico e/ou polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs (por exemplo, uma molécula de RNA), as células podem ser cultivadas em condições que permitem a expressão dos polipeptídeos moduladores do ciclo de Krebs e/ou o polipeptídeo do receptor quimérico. Em exemplos em que o ácido nucleico que codifica os polipeptídeos moduladores do ciclo de Krebs e/ou o polipeptídeo do receptor quimérico é regulado por um promotor regulável, as células hospedeiras podem ser cultivadas em condições em que o promotor regulável é ativado. Em algumas modalidades, o promotor é um promotor indutível e as células imunes são cultivadas na presença da molécula indutora ou em condições nas quais a molécula indutora é produzida. Determinar se o polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs e/ou o polipeptídeo do receptor quimérico é expresso será evidente para um versado na técnica e pode ser avaliado por qualquer método conhecido, por exemplo, a detecção do polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs e/ou o quimérico mRNA que codifica o polipeptídeo receptor por PCR de transcriptase reversa quantitativa (qRT-PCR) ou detecção do polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs e/ou da proteína polipeptídica do receptor quimérico por métodos incluindo Western blotting, microscopia de fluorescência e citometria de fluxo.
[00172] Alternativamente, a expressão do polipeptídeo do receptor quimérico pode ocorrer in vivo após as células imunes serem administradas a um indivíduo. Conforme usado neste documento, o termo "indivíduo" se refere a qualquer mamífero, como um ser humano, macaco, camundongo, coelho ou mamífero doméstico. Por exemplo, o indivíduo pode ser um primata. Em uma modalidade preferencial, o indivíduo é humano.
[00173] Alternativamente, a expressão de um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs e/ou um polipeptídeo receptor quimérico em qualquer uma das células imunes descritas neste documento pode ser alcançada através da introdução de moléculas de RNA que codificam os polipeptídeos moduladores do ciclo de Krebs e/ou os polipeptídeos dos receptores quiméricos. Essas moléculas de RNA podem ser preparadas por transcrição in vitro ou por síntese química. As moléculas de RNA podem então ser introduzidas em células hospedeiras adequadas, como células imunes (por exemplo, células T, células NK ou ambas as células T e células NK) por, por exemplo, eletroporação. Por exemplo, as moléculas de RNA podem ser sintetizadas e introduzidas nas células imunes do hospedeiro seguindo os métodos descritos em Rabinovich et al., Human Gene Therapy, 17: 1027-1035 e WO 2013/040557.
[00174] Em certas modalidades, vetores ou moléculas de RNA compreendendo o polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs e/ou o polipeptídeo do receptor quimérico podem ser introduzidos nas células hospedeiras ou células imunes in vivo. Como um exemplo não limitativo, isso pode ser realizado pela administração de um vetor ou molécula de RNA que codifica um ou mais polipeptídeos moduladores do ciclo de Krebs e/ou um ou mais polipeptídeos dos receptores quiméricos descritos neste documento diretamente ao indivíduo (por exemplo, através de administração intravenosa), produzindo células hospedeiras compreendendo polipeptídeos moduladores do ciclo de Krebs e/ou polipeptídeos dos receptores quiméricos in vivo.
[00175] Os métodos para preparar células hospedeiras que expressam qualquer um dos polipeptídeos moduladores do ciclo de Krebs e/ou os polipeptídeos dos receptores quiméricos descritos neste documento também podem compreender a ativação das células hospedeiras ex vivo. Ativar uma célula hospedeira significa estimular uma célula hospedeira em um estado ativado no qual a célula pode ser capaz de realizar funções efetoras. Os métodos de ativação de uma célula hospedeira dependerão do tipo de célula hospedeira usada para a expressão dos polipeptídeos moduladores do ciclo de Krebs e/ou polipeptídeos do receptor quimérico. Por exemplo, as células T podem ser ativadas ex vivo na presença de uma ou mais moléculas, incluindo, mas não se limitando a: um anticorpo anti-CD3, um anticorpo anti-CD28, IL-2, fitohemoaglutinina, células estimuladoras artificiais projetadas ou partículas, ou uma combinação dos mesmos. As células estimuladoras artificiais manipuladas podem ser células apresentadoras de antígenos artificiais, conforme conhecido na técnica. Ver, por exemplo, Neal et al., J. Immunol. Res. Ther. 2017, 2(1):68-79 and Turtle et al., Cancer J. 2010, 16(4):374-381, as invenções relevantes de cada uma das quais são incorporadas ao presente documento por referência para a finalidade e o assunto referido neste.
[00176] Em outros exemplos, as células NK podem ser ativadas ex vivo na presença de uma ou mais moléculas, como um ligante 4-1BB, um anticorpo anti-4-1BB, IL-15, um anticorpo anti-receptor de IL-15, IL- 2, IL12, IL-21, células K562 e/ou células ou partículas estimuladoras artificiais manipuladas. Em algumas modalidades, as células hospedeiras que expressam qualquer um dos polipeptídeos moduladores do ciclo de Krebs e/ou os polipeptídeos do receptor quimérico (células que expressam polipeptídeos moduladores do ciclo ACTR/CAR e/ou Krebs) descritos neste documento são ativadas ex vivo antes da administração a um indivíduo. Determinar se uma célula hospedeira é ativada será evidente para um versado na técnica e pode incluir avaliar a expressão de um ou mais marcadores de superfície celular associados à ativação celular, expressão ou secreção de citocinas e morfologia celular.
[00177] Os métodos para preparar células hospedeiras que expressam qualquer um dos polipeptídeos moduladores do ciclo de Krebs e/ou os polipeptídeos dos receptores quiméricos descritos neste documento pode compreender a expansão das células hospedeiras ex vivo. A expansão das células hospedeiras pode envolver qualquer método que resulte em um aumento no número de células que expressam polipeptídeos moduladores do ciclo de Krebs e/ou polipeptídeos do receptor quimérico, por exemplo, permitindo que as células hospedeiras proliferem ou estimulando a proliferação das células hospedeiras. Os métodos para estimular a expansão das células hospedeiras dependerão do tipo de célula hospedeira usada para a expressão dos polipeptídeos moduladores do ciclo de Krebs e/ou dos polipeptídeos do receptor quimérico e serão evidentes para um especialista na técnica. Em algumas modalidades, as células hospedeiras que expressam qualquer um dos polipeptídeos moduladores do ciclo de Krebs e/ou os polipeptídeos do receptor quimérico descritos neste documento são expandidas ex vivo antes da administração a um indivíduo.
[00178] Em algumas modalidades, as células hospedeiras que expressam os polipeptídeos moduladores do ciclo de Krebs e/ou os polipeptídeos do receptor quimérico são expandidas e ativadas ex vivo antes da administração das células ao indivíduo. A ativação e expansão da célula hospedeira pode ser usada para permitir a integração de um vetor viral no genoma e a expressão do gene que codifica um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs e/ou um polipeptídeo do receptor quimérico como descrito neste documento. Se a eletroporação de mRNA for usada, nenhuma ativação e/ou expansão pode ser necessária, embora a eletroporação possa ser mais eficaz quando realizada em células ativadas. Em alguns casos, um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs e/ou um polipeptídeo do receptor quimérico é transitoriamente expresso em uma célula hospedeira adequada (por exemplo, por3-5 dias). A expressão transitória pode ser vantajosa se houver uma toxicidade potencial e deve ser útil nas fases iniciais dos testes clínicos para possíveis efeitos colaterais.
[00179] Qualquer uma das células hospedeiras que expressam os polipeptídeos moduladores do ciclo de Krebs e/ou os polipeptídeos dos receptores quiméricos podem ser misturados com um transportador farmaceuticamente aceitável para formar uma composição farmacêutica, que também está dentro do escopo da presente invenção.
[00180] A frase "farmaceuticamente aceitável", conforme usada em conexão com as composições da presente invenção, refere-se a entidades moleculares e outros ingredientes de tais composições que são fisiologicamente toleráveis e não produzem tipicamente reações indesejáveis quando administradas a um mamífero (por exemplo, um humano). Preferivelmente, conforme usado neste documento, o termo
"farmaceuticamente aceitável" significa aprovado por uma agência reguladora do Governo Federal ou Estadual ou listado na Farmacopeia dos EUA, ou outra farmacopeia geralmente reconhecida para uso em mamíferos e, mais particularmente, em humanos. "Aceitável" significa que o transportador é compatível com o ingrediente ativo da composição (por exemplo, os ácidos nucleicos, vetores, células ou anticorpos terapêuticos) e não afeta negativamente o indivíduo ao qual as composições são administradas. Qualquer uma das composições farmacêuticas a serem utilizadas nos presentes métodos pode compreender veículos, excipientes ou estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis na forma de formações liofilizadas ou soluções aquosas.
[00181] Os transportadores farmaceuticamente aceitáveis, incluindo tampões, são bem conhecidos na técnica e podem compreender fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes; polipeptídeos de baixo peso molecular; proteínas, tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; aminoácidos; polímeros hidrofóbicos; monossacarídeos; dissacarídeos; e outros carboidratos; complexos metálicos; e/ou surfactantes não iônicos. Veja, por exemplo Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover.
[00182] As composições farmacêuticas da invenção também podem conter um ou mais compostos ativos adicionais, conforme necessário para a indicação particular a ser tratada, preferencialmente aqueles com atividades complementares que não se afetam adversamente. Exemplos não limitativos de possíveis compostos ativos adicionais incluem, por exemplo, IL-2, bem como vários agentes conhecidos no campo e listados na discussão de tratamentos de combinação, abaixo. IV. Imunoterapia usando células hematopoiéticas geneticamente manipuladas descritas neste documento
[00183] As células hematopoiéticas geneticamente manipuladas (por exemplo, células-tronco hematopoiéticas, células imunes, como células NK ou células T) descritas neste documento podem ser usadas em imunoterapia contra vários distúrbios, por exemplo, câncer, doenças infecciosas e doenças autoimunes. (a) Imunoterapia combinada de células hematopoiéticas geneticamente manipuladas que expressam polipeptídeos de ACTR e agentes terapêuticos contendo Fc
[00184] Os polipeptídeos de ACTR exemplificativos da presente invenção conferem capacidade de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) para linfócitos T e aumentam ADCC em células NK. Quando o receptor é engajado por um anticorpo ligado às células, ele desencadeia a ativação das células T, proliferação sustentada e citotoxicidade específica contra as células ligadas.
[00185] O grau de afinidade do CD16 para a porção Fc da Ig é um determinante crítico do ADCC e, portanto, das respostas clínicas à imunoterapia com anticorpos. O CD16 com o polimorfismo V158 que tem uma maior afinidade de ligação para Ig e medeia ADCC superior em relação ao CD16 com o polimorfismo F158 foi selecionado como um exemplo. Embora o receptor F158 tenha menor potência do que o receptor V158 na indução da proliferação de células T e ADCC, o receptor F158 pode ter menor toxicidade in vivo do que o receptor V158, tornando-o útil em alguns contextos clínicos.
[00186] Os polipeptídeos moduladores do ciclo de Krebs a serem coexpressos com polipeptídeos de ACTRem células imunes facilitariam a terapia imune baseada em células, como terapia com células T ou terapia com células NK, permitindo que as células cresçam e/ou funcionem efetivamente em um baixo teor de glicose, baixo teor de aminoácidos, baixo pH e/ou ambiente hipóxico. A citotoxicidade direcionada por anticorpos pode ser interrompida sempre que necessário, pela simples retirada da administração de anticorpos. A segurança clínica pode ser ainda melhorada usando eletroporação de mRNA para expressar os polipeptídeos moduladores do ciclo de Krebs e/ou os polipeptídeos de ACTRtransitoriamente, para limitar qualquer reatividade autoimune potencial.
[00187] Assim, em uma modalidade, a invenção fornece um método para aumentar a eficácia de uma imunoterapia baseada em anticorpos de um câncer em um indivíduo em necessidade, cujo indivíduo está sendo tratado com um agente terapêutico contendo Fc, como um anticorpo terapêutico, que pode ligar-se a células que expressam antígeno. O agente terapêutico contendo Fc contém uma porção Fc, por exemplo, uma porção Fc humana ou humanizada, que pode ser reconhecida e ligada pela porção de ligação a Fc (por exemplo, o domínio extracelular de CD16A humano) do ACTR expresso nas células imunológicas.
[00188] Os métodos descritos neste documento podem compreender a introdução no indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo e uma quantidade terapeuticamente eficaz das células hospedeiras geneticamente manipuladas, como células hematopoiéticas, por exemplo, células imunes (por exemplo, linfócitos T ou células NK), que coexpressam um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs e um polipeptídeo de ACTR da invenção. O indivíduo (por exemplo, um paciente humano, como um paciente humano com câncer) foi tratado ou está sendo tratado com um agente terapêutico contendo Fc específico para um antígeno alvo. Um antígeno alvo pode ser qualquer molécula que está associada a uma doença ou condição, incluindo, mas não se limitando a antígenos tumorais, antígenos patogênicos (por exemplo, bacterianos ou virais) ou antígenos presentes em células doentes, tais como aqueles descritos neste documento.
[00189] No contexto da presente invenção, na medida em que se refere a qualquer uma das condições de doença citadas neste documento, os termos "tratar", "tratamento" e similares significam aliviar ou aliviar pelo menos um sintoma associado a tal condição, ou retardar ou reverter a progressão de tal condição. Dentro do significado da presente invenção, o termo "tratar" também denota interromper, atrasar o início (ou seja, o período precedente à manifestação clínica de uma doença) e/ou reduzir o risco de desenvolver ou agravar uma doença. Por exemplo, em conexão com o câncer, o termo "tratar" pode significar eliminar ou reduzir a carga tumoral de um paciente, ou prevenir, retardar ou inibir metástases etc.
[00190] Conforme usado neste documento, o termo "terapeuticamente eficaz" aplicado à dose ou quantidade refere-se à quantidade de um composto ou composição farmacêutica que é suficiente para resultar em uma atividade desejada após a administração a um indivíduo em necessidade. Observe que quando uma combinação de ingredientes ativos é administrada (por exemplo, uma primeira composição farmacêutica compreendendo um anticorpo e uma segunda composição farmacêutica compreendendo uma população de linfócitos T ou células NK que expressam um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs e/ou um construto de receptor de células T acopladas a anticorpo (ACTR), a quantidade eficaz da combinação pode ou não incluir quantidades de cada ingrediente que teria sido eficaz se administrado individualmente. No contexto da presente invenção, o termo "terapeuticamente eficaz" refere-se à quantidade de um composto ou composição farmacêutica que é suficiente para atrasar a manifestação, interromper a progressão, atenuar ou aliviar pelo menos um sintoma de um distúrbio tratado pelos métodos da presente invenção.
[00191] As células hospedeiras (por exemplo, células hematopoiéticas, por exemplo, células imunes, como células T e células NK) que expressam polipeptídeos moduladores do ciclo de Krebs e polipeptídeos de ACTR descritos neste documento são úteis para aumentar ADCC em um indivíduo e/ou para aumentar a eficácia de um anticorpo imunoterapia baseada e/ou para aumentar o crescimento e/ou proliferação de células imunes em um ambiente de baixo teor de glicose. Em algumas modalidades, o indivíduo é um mamífero, como um humano, macaco, camundongo, coelho ou mamífero doméstico. Em algumas modalidades, o indivíduo é um humano. Em algumas modalidades, o indivíduo é um paciente humano com câncer. Em algumas modalidades, o indivíduo foi tratado ou está sendo tratado com qualquer um dos anticorpos terapêuticos descritos neste documento.
[00192] Para praticar o método descrito neste documento, uma quantidade eficaz das células hospedeiras, por exemplo, células imunes (por exemplo, células NK e/ou linfócitos T) que expressam qualquer um dos polipeptídeos moduladores do ciclo de Krebs e os polipeptídeos de ACTR descritos neste documento e uma quantidade eficaz de um anticorpo, ou composições dos mesmos, podem ser administrados a um indivíduo em necessidade do tratamento por meio de uma via adequada, tal como administração intravenosa. Conforme usado neste documento, uma quantidade eficaz refere-se à quantidade do respectivo agente (por exemplo, as células NK e/ou linfócitos T que expressam polipeptídeos moduladores do ciclo de Krebs, polipeptídeos de ACTR, anticorpos ou composições dos mesmos) que após a administração confere um efeito terapêutico no tema. A determinação de se uma quantidade das células ou composições descritas neste documento alcançou o efeito terapêutico seria evidente para um versado na técnica. As quantidades eficazes variam, conforme reconhecido pelos versados na técnica, dependendo da condição particular a ser tratada, da gravidade da condição, dos parâmetros individuais do paciente, incluindo idade, condição física, tamanho, gênero, sexo e peso, a duração do tratamento, a natureza da terapia simultânea (se houver), a via específica de administração e fatores similares dentro do conhecimento e experiência do profissional de saúde. Em algumas modalidades, a quantidade eficaz alivia, alivia, melhora, melhora, reduz os sintomas ou atrasa a progressão de qualquer doença ou distúrbio no indivíduo. Em algumas modalidades, o indivíduo é um humano. Em algumas modalidades, o indivíduo em necessidade de tratamento é um paciente humano com câncer. Em algumas modalidades, o indivíduo em necessidade de tratamento sofre de uma ou mais infecções patogênicas (por exemplo, infecções virais, bacterianas e/ou fúngicas).
[00193] Os métodos da invenção podem ser usados para o tratamento de qualquer câncer ou qualquer patógeno. Exemplos específicos não limitativos de cânceres que podem ser tratados pelos métodos da invenção incluem, por exemplo, linfoma, câncer de mama, câncer gástrico, neuroblastoma, osteossarcoma, câncer de pulmão, câncer de pele, câncer de próstata, câncer colorretal, carcinoma de células renais, câncer de ovário, rabdomiossarcoma, leucemia, mesotelioma, câncer pancreático, câncer de cabeça e pescoço, retinoblastoma, glioma, glioblastoma, câncer de tireoide, câncer hepatocelular, câncer de esôfago e câncer cervical. Em certas modalidades, o câncer pode ser um tumor sólido.
[00194] Os métodos desta invenção também podem ser usados para tratar doenças infecciosas, que podem ser causadas por infecção bacteriana, infecção viral ou infecção por fungo. Em tais casos, as células imunes geneticamente manipuladas podem ser coutilizadas com um agente terapêutico contendo Fc (por exemplo, um anticorpo) que tem como alvo um antígeno patogênico (por exemplo, um antígeno associado à bactéria, vírus ou fungo que causa a infecção). Exemplos específicos não limitativos de antígenos patogênicos incluem, mas não estão limitados a antígenos bacterianos, virais e/ou fúngicos. Alguns exemplos são fornecidos abaixo: neuraminidase, hemaglutinina ou proteína M2 do vírus da influenza, glicoproteína F ou glicoproteína G do vírus sincicial respiratório humano (RSV), glicoproteína do vírus herpes simplex gB, gC, gD, ou gE, Chlamydia MOMP ou proteína PorB, Proteína do núcleo do vírus da dengue, proteína da matriz ou glicoproteína E, hemaglutinina do vírus do sarampo, glicoproteína gB do vírus herpes simplex tipo 2, poliovírus I VP1, glicoproteínas do envelope do HIV 1, antígeno do núcleo da hepatite B ou antígeno de superfície, toxina da difteria, epítopo do Streptococcus 24M, pilina gonocócica, vírus da pseudo-raiva g50 (gpD), vírus da pseudo-raiva II (gpB), vírus da pseudo-raiva III (gpC), glicoproteína H do vírus da pseudo-raiva, glicoproteína E do vírus da pseudo-raiva, glicoproteína 195 da gastroenterite transmissível, proteína da matriz da gastroenterite transmissível ou glicoproteína E1 ou E2 do vírus da hepatite C humana.
[00195] Em algumas modalidades, as células imunes são administradas a um indivíduo em uma quantidade eficaz no aumento da atividade de ADCC em pelo menos 20% e/ou em pelo menos 2 vezes, por exemplo, aumentando ADCC em 50%, 80%, 100%, 2- vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 50 vezes, 100 vezes ou mais.
[00196] As células imunes são coadministradas com um agente terapêutico contendo Fc, tal como um anticorpo terapêutico, a fim de direcionar as células que expressam o antígeno ao qual o agente terapêutico contendo Fc se liga. Em algumas modalidades, mais de um agente terapêutico contendo Fc, como mais de um anticorpo, pode ser coutilizado com as células imunes. A imunoterapia baseada em anticorpos pode ser usada para tratar, aliviar ou reduzir os sintomas de qualquer doença ou distúrbio para o qual a imunoterapia é considerada útil em um indivíduo.
[00197] Um anticorpo (usado alternadamente na forma plural) é uma molécula de imunoglobulina capaz de ligação específica a um alvo, como um carboidrato, polinucleotídeo, lipídeo, polipeptídeo etc., através de pelo menos um local de reconhecimento de antígeno, localizado na região variável da molécula de imunoglobulina.
Conforme usado neste documento, o termo "anticorpo" engloba não apenas anticorpos policlonais ou monoclonais intactos (ou seja, de comprimento total), mas também fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que compreendem uma região Fc, mutantes dos mesmos, proteínas de fusão compreendendo uma porção de anticorpo, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, diacorpos, anticorpos de domínio único (por exemplo, nanocorpos), anticorpos lineares, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) e qualquer outra configuração modificada da molécula de imunoglobulina que compreende um sítio de reconhecimento de antígeno da especificidade necessária e uma região Fc, incluindo variantes de glicosilação de anticorpos, variantes de sequência de aminoácidos de anticorpos e anticorpos modificados covalentemente.
Um anticorpo inclui um anticorpo de qualquer classe, como IgD, IgE, IgG, IgA ou IgM (ou sua subclasse), e o anticorpo não precisa ser de nenhuma classe particular.
Dependendo da sequência de aminoácidos de anticorpo do domínio constante de suas cadeias pesadas, as imunoglobulinas podem ser atribuídas a diferentes classes.
Existem cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM e várias delas podem ser divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são chamados de alfa, delta, épsilon, gama e mu, respectivamente.
As estruturas de subunidade e as configurações tridimensionais de diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas.
O anticorpo para uso na presente invenção contém uma região Fc reconhecível pelas células imunes que expressam polipeptídeo que expressam polipeptídeo de modulação de ciclo de ACTR e/ou Krebs coutilizadas. A região Fc pode ser uma região Fc humana ou humanizada.
[00198] Qualquer um dos anticorpos descritos neste documento pode ser monoclonal ou policlonal. Um "anticorpo monoclonal" refere- se a uma população de anticorpos homogêneos e um "anticorpo policlonal" se refere a uma população de anticorpos heterogênea. Esses dois termos não limitam a origem de um anticorpo ou a maneira como ele é feito.
[00199] Em um exemplo, o anticorpo usado nos métodos descritos neste documento é um anticorpo humanizado. Os anticorpos humanizados referem-se a formas de anticorpos não humanos (por exemplo, murinos) que são imunoglobulinas quiméricas específicas, cadeias de imunoglobulina ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que contêm uma sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Em sua maioria, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) nas quais resíduos de uma região determinante de complementaridade (CDR) do receptor são substituídos por resíduos de uma CDR de uma espécie não humana (anticorpo doador), tal como camundongo, rato ou coelho com a especificidade, afinidade e capacidade desejada. Em alguns casos, resíduos de região de framework (FR) de Fv da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, o anticorpo humanizado pode compreender resíduos que não são encontrados nem no anticorpo receptor nem na CDR importada ou sequências estruturais, mas são incluídos para refinar e otimizar ainda mais o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente a totalidade de pelo menos um e, tipicamente dois, domínios variáveis,
em que todos ou substancialmente todas as regiões de CDR correspondem aos de uma imunoglobulina não humana e todas, ou substancialmente todas, as regiões FR são as de uma sequência de consenso imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado idealmente compreenderá também pelo menos uma porção de uma região ou domínio constante de imunoglobulina (Fc), normalmente o de uma imunoglobulina humana. Os anticorpos podem ter regiões Fc modificadas como descrito em WO 99/58572. Os anticorpos usados neste documento podem ser glicosilados (por exemplo, fucosilados) ou fucosililados. Outras formas de anticorpos humanizados têm um ou mais CDRs (um, dois, três, quatro, cinco, seis) que são alterados em relação ao anticorpo original, que também são denominados um ou mais CDRs "derivados de" um ou mais CDRs do anticorpo original. Os anticorpos humanizados também podem envolver maturação de afinidade.
[00200] Em outro exemplo, o anticorpo descrito neste documento é um anticorpo quimérico, que pode incluir uma região constante pesada e uma região constante leve de um anticorpo humano. Os anticorpos quiméricos referem-se a anticorpos com uma região variável ou parte da região variável de uma primeira espécie e uma região constante de uma segunda espécie. Normalmente, nestes anticorpos quiméricos, a região variável de ambas as cadeias leve e pesada imita as regiões variáveis de anticorpos derivados de uma espécie de mamíferos (por exemplo, um mamífero não humano, como camundongo, coelho e rato), enquanto as porções constantes são homólogos às sequências em anticorpos derivados de outro mamífero, como um ser humano. Em algumas modalidades, modificações de aminoácidos podem ser feitas na região variável e/ou na região constante.
[00201] As células hematopoiéticas, por exemplo, células imunes (por exemplo, linfócitos T e/ou células NK) ou HSCs que expressam qualquer um dos polipeptídeos moduladores do ciclo de Krebs e/ou os polipeptídeos de ACTR descritos neste documento podem ser administrados a um indivíduo que foi tratado ou está sendo tratado com um anticorpo contendo Fc. Por exemplo, as células imunes podem ser administradas a um indivíduo humano simultaneamente com um anticorpo. Alternativamente, as células imunes podem ser administradas a um indivíduo humano durante o curso de uma imunoterapia baseada em anticorpos. Em alguns exemplos, as células imunes e um anticorpo podem ser administrados a um indivíduo humano com pelo menos 4 horas de intervalo, por exemplo, pelo menos 12 horas de intervalo, pelo menos 1 dia de intervalo, pelo menos 3 dias de intervalo, pelo menos uma semana de intervalo, em pelo menos duas semanas de intervalo, ou pelo menos um mês de intervalo.
[00202] Em algumas modalidades, os anticorpos descritos neste documento se ligam especificamente ao antígeno alvo correspondente ou um epítopo do mesmo. Um anticorpo que "se liga especificamente" a um antígeno ou epítopo é um termo bem conhecido na técnica. Diz- se que uma molécula exibe "ligação específica" se ela reage mais frequentemente, mais rapidamente, com maior duração e/ou com maior afinidade com um antígeno alvo específico do que com alvos alternativos. Um anticorpo "se liga especificamente" a um antígeno ou epítopo alvo se ele se liga com maior afinidade, avidez, mais prontamente e/ou com maior duração do que se liga a outras substâncias. Por exemplo, um anticorpo que especificamente (ou preferencialmente) se liga a um antígeno ou um epítopo antigênico nele é um anticorpo que se liga a este antígeno alvo com maior afinidade, avidez, mais prontamente e/ou com maior duração do que se liga a outros antígenos ou outros epítopos no mesmo antígeno. Também é entendido com esta definição que, por exemplo, um anticorpo que se liga especificamente a um primeiro antígeno alvo pode ou não se ligar especificamente ou preferencialmente a um segundo antígeno alvo.
Assim, "ligação específica" ou "ligação preferencial" não requer necessariamente (embora possa ser incluída) uma ligação exclusiva. Em alguns exemplos, um anticorpo que "se liga especificamente" a um antígeno alvo ou um epítopo do mesmo pode não se ligar a outros antígenos ou outros epítopos no mesmo antígeno.
[00203] Em algumas modalidades, um anticorpo conforme descrito neste documento tem uma afinidade de ligação adequada para o antígeno alvo (por exemplo, qualquer um dos alvos descritos neste documento) ou epítopos antigênicos dos mesmos. Os anticorpos para uso nos métodos de terapia imunológica descritos neste documento podem se ligar a (por exemplo, ligar-se especificamente a) um antígeno alvo de interesse, ou uma região específica ou um epítopo antigênico nela. A Tabela 3 acima lista antígenos alvo exemplificativos de interesse e anticorpos exemplificativos específicos para tais. (b) Imunoterapia de células hematopoiéticas geneticamente manipuladas que expressam polipeptídeos de CAR
[00204] As células hematopoiéticas geneticamente manipuladas (por exemplo, células-tronco hematopoiéticas, células imunes, como células T ou células natural killer) descritas neste documento, coexpressando um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs e um polipeptídeo de CAR podem ser usadas em terapia imunológica, como células T terapia ou terapia com células NK para inibir células doentes que expressam um antígeno ao qual o polipeptídeo de CAR se dirige, direta ou indiretamente (por exemplo, por meio de um agente terapêutico conjugado a um marcador ao qual o polipeptídeo de CAR se liga). O polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs coexpresso com um polipeptídeo de CAR em células imunes facilitaria a terapia imune baseada em células, permitindo que as células cresçam e/ou funcionem efetivamente em um baixo teor de glicose, baixo teor de aminoácidos, baixo pH e/ou um ambiente hipóxico, por exemplo, em um microambiente tumoral. A segurança clínica pode ser ainda melhorada usando eletroporação de mRNA para expressar os polipeptídeos moduladores do ciclo de Krebs e/ou os polipeptídeos de CAR transitoriamente, para limitar qualquer reatividade potencial não específica do tumor.
[00205] Os métodos descritos neste documento podem compreender a introdução no indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de células hospedeiras geneticamente manipuladas, tais como células hematopoiéticas, por exemplo, células imunes (por exemplo, linfócitos T ou células NK), que coexpressam um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs e um polipeptídeo de CAR da invenção. O indivíduo (por exemplo, um paciente humano, como um paciente humano com câncer) pode, adicionalmente, ter sido tratado ou está sendo tratado com uma terapia anticâncer ou anti-infecção, incluindo, mas não se limitando a um agente terapêutico anticâncer ou agente anti-infecção. O CAR tem um domínio de ligação ao antígeno que pode se ligar a qualquer antígeno alvo. Tal antígeno alvo pode ser qualquer molécula que está associada a uma doença ou condição, incluindo, mas não está limitada a antígenos tumorais, antígenos patogênicos (por exemplo, bacterianos, fúngicos ou virais) ou antígenos presentes em células doentes, tais como aqueles descritos neste documento.
[00206] As células hospedeiras (por exemplo, células hematopoiéticas, por exemplo, células imunes, como células T e células NK) que expressam polipeptídeos moduladores do ciclo de Krebs e polipeptídeos de CAR descritos neste documento são úteis para inibir células que expressam um antígeno alvo e/ou para aumentar o crescimento e/ou proliferação de células imunes em um ambiente de baixo teor de glicose, um ambiente de baixo teor de aminoácidos, um ambiente de baixo pH e/ou um ambiente hipóxico, por exemplo, em um microambiente tumoral. Em algumas modalidades, o indivíduo é um mamífero, como um humano, macaco, camundongo, coelho ou mamífero doméstico. Em algumas modalidades, o indivíduo é um humano. Em algumas modalidades, o indivíduo é um paciente humano com câncer. Em algumas modalidades, o indivíduo foi tratado adicionalmente ou está sendo tratado com qualquer um dos anticorpos terapêuticos descritos neste documento.
[00207] Para praticar o método descrito neste documento, uma quantidade eficaz das células hematopoiéticas, por exemplo, células imunes (células NK e/ou linfócitos T) que expressam qualquer um dos polipeptídeos moduladores do ciclo de Krebs e os polipeptídeos de CAR descritos neste documento, ou composições dos mesmos podem ser administradas a um indivíduo em necessidade de tratamento por uma via adequada, como administração intravenosa. Conforme usado neste documento, uma quantidade eficaz se refere à quantidade do respectivo agente (por exemplo, as células NK e/ou linfócitos T que expressam polipeptídeos moduladores do ciclo de Krebs, polipeptídeos de CAR ou composições dos mesmos) que após a administração confere um efeito terapêutico ao indivíduo. A determinação de se uma quantidade das células ou composições descritas neste documento alcançou o efeito terapêutico seria evidente para um versado na técnica. As quantidades eficazes variam, conforme reconhecido pelos versados na técnica, dependendo da condição particular a ser tratada, da gravidade da condição, dos parâmetros individuais do paciente, incluindo idade, condição física, tamanho, gênero, sexo e peso, a duração do tratamento, a natureza da terapia simultânea (se houver), a via específica de administração e fatores similares dentro do conhecimento e experiência do profissional de saúde. Em algumas modalidades, a quantidade eficaz alivia, alivia, melhora, melhora, reduz os sintomas ou atrasa a progressão de qualquer doença ou distúrbio no indivíduo. Em algumas modalidades, o indivíduo é um humano. Em algumas modalidades, o indivíduo em necessidade de tratamento é um paciente humano com câncer. Em algumas modalidades, o indivíduo em necessidade de tratamento sofre de uma ou mais infecções patogênicas (por exemplo, infecções virais, bacterianas e/ou fúngicas).
[00208] Os métodos da invenção podem ser usados para o tratamento de qualquer câncer ou qualquer patógeno. Exemplos específicos não limitativos de cânceres que podem ser tratados pelos métodos da invenção incluem, por exemplo, linfoma, câncer de mama, câncer gástrico, neuroblastoma, osteossarcoma, câncer de pulmão, câncer de pele, câncer de próstata, câncer colorretal, carcinoma de células renais, câncer de ovário, rabdomiossarcoma, leucemia, mesotelioma, câncer pancreático, câncer de cabeça e pescoço, retinoblastoma, glioma, glioblastoma, câncer de tireoide, câncer hepatocelular, câncer de esôfago e câncer cervical. Em certas modalidades, o câncer pode ser um tumor sólido.
[00209] Os métodos desta invenção também podem ser usados para tratar doenças infecciosas, que podem ser causadas por infecção bacteriana, infecção viral ou infecção por fungo. Em tais casos, as células imunes geneticamente manipuladas que expressam um polipeptídeo de CAR específico para um antígeno patogênico (por exemplo, um antígeno associado à bactéria, vírus ou fungo que causa a infecção) podem ser usadas para eliminar as células infectadas. Exemplos específicos não limitativos de antígenos patogênicos incluem, mas não estão limitados a antígenos bacterianos, virais e/ou fúngicos.
[00210] Em algumas modalidades, as células imunes são administradas a um indivíduo em uma quantidade eficaz na inibição de células que expressam o antígeno alvo em pelo menos 20% e/ou pelo menos 2 vezes, por exemplo, inibindo células que expressam o antígeno alvo em 50%, 80%, 100%, 2 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 50 vezes, 100 vezes ou mais.
[00211] Agentes terapêuticos adicionais (por exemplo, agentes imunoterapêuticos baseados em anticorpos) podem ser usados para tratar, aliviar ou reduzir os sintomas de qualquer doença ou distúrbio para o qual o agente terapêutico é considerado útil em um indivíduo.
[00212] A eficácia da imunoterapia baseada em células, conforme descrito neste documento, pode ser avaliada por qualquer método conhecido na técnica e seria evidente para um profissional médico qualificado. Por exemplo, a eficácia da imunoterapia baseada em células pode ser avaliada pela sobrevivência do indivíduo ou tumor ou carga de câncer no indivíduo ou tecido ou amostra do mesmo. Em algumas modalidades, as células imunes são administradas a um indivíduo em necessidade do tratamento em uma quantidade eficaz no aumento da eficácia de uma imunoterapia baseada em células em pelo menos 20% e/ou em pelo menos 2 vezes, por exemplo, aumentando o eficácia de uma imunoterapia baseada em anticorpos em 50%, 80%, 100%, 2 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 50 vezes, 100 vezes ou mais, em comparação com a eficácia no ausência das células imunes que expressam o polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs e/ou o polipeptídeo de CAR.
[00213] Em qualquer uma das composições ou métodos descritos neste documento, as células imunes (por exemplo, células NK e/ou T) podem ser autólogas para o indivíduo, ou seja, as células imunes podem ser obtidas a partir do indivíduo em necessidade do tratamento, geneticamente manipuladas para expressão dos polipeptídeos moduladores do ciclo de Krebs e/ou polipeptídeos de CAR e, em seguida, administrados ao mesmo indivíduo. Em uma modalidade específica, antes da reintrodução no indivíduo, as células imunes autólogas (por exemplo, linfócitos T ou células NK) são ativadas e/ou expandidas ex vivo. A administração de células autólogas a um indivíduo pode resultar na rejeição reduzida das células hospedeiras em comparação com a administração de células não autólogas.
[00214] Alternativamente, as células hospedeiras são células alogênicas, ou seja, as células são obtidas de um primeiro indivíduo, geneticamente manipuladas para a expressão do polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs e/ou o polipeptídeo receptor quimérico (por exemplo, polipeptídeo de ACTR ou polipeptídeo de CAR) e administradas a um segundo indivíduo diferente do primeiro indivíduo, mas da mesma espécie. Por exemplo, as células imunes alogênicas podem ser derivadas de um doador humano e administradas a um receptor humano que é diferente do doador. Em uma modalidade específica, os linfócitos T são linfócitos T alogênicos nos quais a expressão do receptor de células T endógeno foi inibida ou eliminada. Em uma modalidade específica, antes da introdução no indivíduo, os linfócitos T alogênicos são ativados e/ou expandidos ex vivo. Os linfócitos T podem ser ativados por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, na presença de anti-CD3/CD28, IL-2, fitohemoaglutinina, células estimuladoras artificiais projetadas ou partículas, ou uma combinação dos mesmos.
[00215] As células NK podem ser ativadas por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, na presença de um ou mais agentes selecionados do grupo que consiste em proteína ligante CD137, anticorpo CD137, proteína IL-15, anticorpo receptor IL-15, IL-2 proteína, proteína IL-12, proteína IL-21 e linhagem celular K562 e/ou células ou partículas estimuladoras artificiais manipuladas. Ver, por exemplo, as Patentes US Nos. 7.435.596 e 8.026.097 para a descrição de métodos úteis para expandir células NK. Por exemplo, as células NK utilizadas nas composições ou métodos da invenção podem ser preferencialmente expandidas por exposição a células que não possuem ou expressam mal as moléculas do complexo principal de histocompatibilidade I e/ou II e que foram geneticamente modificadas para expressar IL-15 ligada à membrana e Ligante 4-1BB (CDI37L). Essas linhagens celulares incluem, mas não estão necessariamente limitadas a K562 [ATCC, CCL 243; Lozzio et al., Blood 45(3):321-334 (1975); Klein et al., Int. J. Cancer 18: 421-431 (1976)], e a linhagem celular tumoral Wilms HFWT (Fehniger et al., Int Rev Immunol 20(3- 4):503-534 (2001); Harada H, et al., Exp Hematol 32(7):614-621 (2004)), a linhagem celular tumoral do endométrio uterino HHUA, a linhagem celular de melanoma HMV-II, a linhagem celular de hepatoblastoma HuH-6, as linhagens celulares de carcinoma de células pequenas do pulmão Lu-130 e Lu-134-A, as linhagens de células de neuroblastoma NB 19 e N1369, a linhagem celular de carcinoma embrionário de testículo NEC 14, a linhagem celular de carcinoma do colo do útero TCO-2 e a linhagem celular de neuroblastoma metastizado da medula óssea TNB 1 [Harada, et al., Jpn. J. Cancer Res 93: 313-319 (2002)]. Preferencialmente, a linhagem celular usada não possui ou expressa fracamente as moléculas MHC I e II, tais como as linhagens celulares K562 e HFWT. Um suporte sólido pode ser usado em vez de uma linhagem celular. Tal suporte deve preferencialmente ter anexado em sua superfície pelo menos uma molécula capaz de se ligar a células NK e induzir um evento de ativação primária e/ou uma resposta proliferativa ou capaz de se ligar a uma molécula tendo tal efeito agindo assim como uma estrutura em andaime. O suporte pode ter anexado à sua superfície a proteína ligante CD137, um anticorpo CD137, a proteína IL-15 ou um anticorpo receptor de IL-15. Preferencialmente, o suporte terá o anticorpo do receptor de IL-15 e o anticorpo CD137 ligados à sua superfície.
[00216] Em uma modalidade das composições ou métodos descritos, a introdução (ou reintrodução) de linfócitos T, células NK ou linfócitos T e células NK ao indivíduo é seguida pela administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de IL-2.
[00217] De acordo com a presente invenção, os pacientes podem ser tratados por infusão de doses terapeuticamente eficazes de células imunes, como linfócitos T ou células NK compreendendo um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs e/ou um polipeptídeo de CAR da invenção na faixa de cerca de 105 a 1010 ou mais células por quilograma de peso corporal (células/Kg). A infusão pode ser repetida quantas vezes e quantas vezes o paciente puder tolerar até que a resposta desejada seja alcançada. A dose de infusão apropriada e o cronograma irão variar de paciente para paciente, mas podem ser determinados pelo médico assistente para um paciente particular. Normalmente, doses iniciais de aproximadamente 106 células/Kg serão infundidas, aumentando para 108 ou mais células/Kg. A IL-2 pode ser coadministrada para expandir as células infundidas. A quantidade de IL- 2 pode ser de cerca de 1-5 x 106 unidades internacionais por metro quadrado de superfície corporal.
[00218] Conforme usado neste documento, o termo "cerca de" ou "aproximadamente" significa dentro de um intervalo de erro aceitável para o valor particular conforme determinado por um versado na técnica, o qual dependerá em parte de como o valor é medido ou determinado, ou seja, as limitações do sistema de medição. Por exemplo, "cerca de" pode significar dentro de um desvio padrão aceitável, de acordo com a prática da técnica. Alternativamente, "cerca de" pode significar uma faixa de até ±20%, preferencialmente até ±10%, mais preferencialmente até ± 5% e mais preferencialmente ainda até ±1% de um determinado valor. Alternativamente, particularmente a respeito dos sistemas ou processos biológicos, o termo pode significar dentro de uma ordem de magnitude, preferencialmente dentro de 2 vezes um determinado valor. Sempre que valores particulares forem descritos no pedido e nas reivindicações, a menos que indicado de outra forma, o termo "cerca de" está implícito e, neste contexto, significa dentro de uma faixa de erro aceitável para o valor particular.
[00219] A eficácia das composições ou métodos descritos neste documento pode ser avaliada por qualquer método conhecido na técnica e seria evidente para um profissional médico qualificado. Por exemplo, a eficácia das composições ou métodos descritos neste documento pode ser avaliada pela sobrevivência do indivíduo ou câncer ou carga de patógeno no indivíduo ou tecido ou amostra do mesmo. Em algumas modalidades, as composições e métodos descritos neste documento podem ser avaliados com base na segurança ou toxicidade da terapia (por exemplo, administração das células imunes que expressam os polipeptídeos moduladores do ciclo de Krebs e os polipeptídeos de CAR) no indivíduo, por exemplo, pela saúde geral do indivíduo e/ou a presença de eventos adversos ou eventos adversos graves. (c) Outras Imunoterapias
[00220] Em algumas modalidades, as células imunes geneticamente manipuladas, expressando um ou mais polipeptídeos moduladores do ciclo de Krebs (por exemplo, GOT, como GOT1 ou GOT2), podem ser derivadas de células imunes naturais específicas para células doentes (por exemplo, células cancerosas ou patógeno células infectadas). Essas células imunes geneticamente manipuladas (por exemplo, linfócitos infiltrantes de tumor ou TILs) podem não coexpressar qualquer polipeptídeo receptor quimérico e podem ser usadas para destruir as células da doença alvo, por exemplo, células cancerosas. Os TILs geneticamente modificados, expressando um ou mais polipeptídeos moduladores do ciclo de Krebs, mas não receptores quiméricos, podem ser cousados com um anticorpo biespecífico capaz de se ligar às células tumorais alvo e aos TILs (BiTE).
[00221] Em algumas modalidades, as células imunes geneticamente manipuladas, expressando um ou mais dos polipeptídeos moduladores do ciclo de Krebs (por exemplo, GOT, como GOT1 ou GOT2), podem ser células Treg. Tais células Treg podem coexpressar um polipeptídeo receptor quimérico conforme descrito neste documento. Alternativamente, as células Treg podem não coexpressar qualquer polipeptídeo receptor quimérico e podem ser usadas para a terapia pretendida. V. Tratamentos Combinados
[00222] As composições e métodos descritos na presente invenção podem ser utilizados em conjunto com outros tipos de terapia para câncer, tais como quimioterapia, cirurgia, radiação, terapia genética e assim por diante, ou terapia anti-infecção. Essas terapias podem ser administradas simultaneamente ou sequencialmente (em qualquer ordem) com a imunoterapia de acordo com a presente invenção. Quando coadministrado com um agente terapêutico adicional, as dosagens terapeuticamente eficazes adequadas para cada agente podem ser reduzidas devido à ação aditiva ou sinergia.
[00223] Em alguns casos, as células imunes (por exemplo, linfócitos T e/ou células NK) que expressam qualquer um dos polipeptídeos moduladores do ciclo de Krebs e/ou os polipeptídeos do receptor quimérico descritos neste documento podem ser administrados a um indivíduo que foi tratado ou está sendo tratado com um agente terapêutico adicional (por exemplo, um agente terapêutico anticâncer adicional). Por exemplo, as células imunes podem ser administradas a um indivíduo humano simultaneamente com o agente terapêutico adicional. Alternativamente, as células imunes podem ser administradas a um indivíduo humano antes do agente terapêutico adicional. Alternativamente, as células imunes podem ser administradas a um indivíduo humano após o agente terapêutico adicional.
[00224] As células imunes geneticamente manipuladas (por exemplo, células T ou células NK) que coexpressam um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs e um polipeptídeo de CAR específico para uma etiqueta podem ser coutilizadas com um agente terapêutico conjugado à etiqueta. Por meio do agente terapêutico, que é capaz de se ligar a um antígeno associado a células doentes, como células tumorais, tais células imunes geneticamente manipuladas podem ser envolvidas com as células doentes e inibir seu crescimento. Qualquer um dos anticorpos listados na Tabela 1 acima, ou outros específicos para o mesmo antígeno alvo também listado na Tabela 1 podem ser conjugados a uma marca adequada (por exemplo, aqueles descritos neste documento) e ser cousados com células imunes que coexpressam o Krebs polipeptídeo modulador de ciclo e um polipeptídeo de CAR específico para o marcador.
[00225] Os tratamentos da invenção podem ser combinados com outros tratamentos imunomoduladores, tais como, por exemplo, vacinas terapêuticas (incluindo, mas não se limitando a GVAX, vacinas baseadas em DC etc.), inibidores de checkpoint (incluindo, mas não se limitando a agentes que bloqueiam CTLA4, PD1, LAG3, TIM3 etc.) ou ativadores (incluindo, mas não se limitando a agentes que aumentam 41BB, OX40 etc.).
[00226] Exemplos não limitativos de outros agentes terapêuticos úteis para combinação com a imunoterapia da invenção incluem: (i) agentes antiangiogênicos (por exemplo, TNP-470, fator de plaquetas 4, trombospondina-1, inibidores de tecidos de metaloproteases (TIMP1 e TIMP2), prolactina (fragmento de 16-Kd), angiostatina (fragmento de 38- Kd e plasminogênio), endostatina, receptor solúvel de bFGF, fator de crescimento transformante beta, interferon alfa, receptores solúveis de KDR e FLT-1, proteína placentária relacionada à proliferina, assim como aqueles listados por Carmeliet e Jain (2000)); (ii) um antagonista de VEGF ou um antagonista de receptor de VEGF, tal como anticorpos anti-VEGF, variantes de VEGF, fragmentos de receptor solúvel de
VEGF, aptâmeros capazes de bloquear VEGF ou VEGFR, anticorpos neutralizantes anti-VEGFR, inibidores de tirosina quinases de VEGFR e quaisquer combinações dos mesmos; e (iii) compostos quimioterapêuticos, tais como, por exemplo, análogos de pirimidina (5- fluorouracila, floxuridina, capecitabina, gencitabina e citarabina), análogos de purina, antagonistas de folato e inibidores relacionados (mercaptopurina, tioguanina, pentostatina e 2-clorodesoxiadenosina (cladribina)); agentes antiproliferativos/antimitóticos, incluindo produtos naturais, tais como alcaloides de vinca (vinblastina, vincristina e vinorelbina), disruptores de microtúbulos, tais como taxano (paclitaxel, docetaxel), vincristina, vinblastina, nocodazol, eptilonas e navelbina, epidipodofilotoxinas (etoposídeo e tonoposídeo), agentes que danificam o DNA (actinomicina, ansacrina, antraciclinas, bleomicina, bussulfano, camptotecina, carboplatina, clorambucila, cisplatina, ciclofosfamida, citoxano, dactinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, epirrubicina, hexametilmelamina, oxaliplatina, ifosfamida, melfalano, mecloretamina, mitomicina, mitoxantrona, nitrosoureia, plicamicina, procarbazina, taxol, taxotere, teniposídeo, trietilenotiofosforamida e etoposídeo (VP16)); antibióticos, tais como dactinomicina (actinomicina D), daurrubicina, doxorrubicina (adriamicina), idarrubicina, antraciclinas, mitoxantrona, bleomicina, plicamicina (mitramicina) e mitomicina; enzimas (L- asparaginase que metaboliza sistematicamente L-asparagina e se livra de células que não têm a capacidade de sintetizar sua própria asparagina); agentes antiplaquetas; agentes alquilantes antiproliferativos/antimitóticos, tais como mostardas de nitrogênio (mecloretamina, ciclofrosfamida e análogos, melfalano, clorambucila), etilenoniminas e metilmelaminas (hexametilmelanina e tiotepa), alquil sufonatos-bussulfano, nitrosoureias (carmustina (BCNU) e análogos, estrepozocina), trazenos-dacarbazinina (DTIC); antimetabólitos antiproliferativos/antimitóticos, tais como análogos de ácido fólico
(metotrexato); complexos de coordenação de platina (cisplatina, carboplatina), procarbozina, hidroxiureia, mitotano, aminoglutetimida; hormônios, análogos de hormônios (estrogênio, tamoxifeno, goserelina, bicalutamida, nilutamida) e inibidores de aromatase (letrozol, anastrozol); anticoagulantes (heparina, sais sintéticos de heparina e outros inibidores de trombina), agentes fibrinolíticos (tais como ativador de plasminogênio tecidual, estreptoquinase e uroquinase), aspirina, dipiridamol, ticlopidina, clopidogrel, abciximab; angetes antimigratórios; agnetes antisecretórios (brefeldina); imunossupressores (ciclosporina, tacrolimo (FK-506), sirolimo (rapamicina), azatioprina, micofenolato de mofetila); compostos antiangiogênicos (por exemplo, TNP-470, genisteína, bevacizumabe) inibidores de fator de crescimento (por exemplo, inibidores de fator de crescimento de fibroblastos (FGF)); bloqueador de receptor de angiotensina; doadores de óxido nítrico; oligonucleotídeos antisense; anticorpos (trastuzumabe); inibidores do ciclo celular e indutores de diferenciação (tretinoína); inibidores de AKT (tais como MK-2206 2HCl, Perifosina (KRX-0401), GSK690693, Ipatasertibe (GDC-0068), AZD5363, uprosertibe, afuresertibe ou triciribina); inibidores de mTOR, inibidores de topoisomerase (doxorrubicina (adriamicina), ansacrina, camptotecina, daunorrubicina, dactinomicina, eniposídeo, epirrubicina, etoposídeo, idarrubicina, mitoxantrona, topotecano e irinotecano), corticosteroides (cortisona, dexametasona, hidrocortisona, metilprednisolona, prenisona e prednisolona); inibidores da quinase de transdução de sinais do fator de crescimento; indutores de disfunção mitocondrial e ativadores de caspase; e disruptores de cromatina.
[00227] Para exemplos de agentes úteis adicionais, ver também Physician's Desk Reference, 59ª edição, (2005), Thomson P D R, Montvale N.J.; Gennaro et al., Eds. Remington's The Science and Practice of Pharmacy 20ª edição, (2000), Lippincott Williams e Wilkins,
Baltimore Md.; Braunwald et al., Eds. Harrison's Principles of Internal Medicine, 15ª edição, (2001), McGraw Hill, NY; Berkow et al., Eds. The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, (1992), Merck Research Laboratories, Rahway N.J.
[00228] A administração de um agente terapêutico adicional pode ser realizada por qualquer via adequada, incluindo a administração sistêmica, bem como a administração diretamente no sítio da doença (por exemplo, a um tumor).
[00229] Em algumas modalidades, o método envolve a administração do agente terapêutico adicional (por exemplo, um anticorpo) ao indivíduo em uma dose. Em algumas modalidades, o método envolve a administração do agente terapêutico adicional (por exemplo, um anticorpo) ao indivíduo em doses múltiplas (por exemplo, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 doses). Em algumas modalidades, o agente terapêutico adicional (por exemplo, um anticorpo) é administrado ao indivíduo em doses múltiplas, com a primeira dose do agente terapêutico adicional (por exemplo, um anticorpo) administrado ao indivíduo cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dias antes da administração das células imunes que expressam o polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs e/ou o polipeptídeo de CAR. Em algumas modalidades, a primeira dose do agente terapêutico adicional (por exemplo, um anticorpo) é administrada ao indivíduo entre cerca de 24-48 horas antes da administração das células imunes que expressam o polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs e/ou o polipeptídeo de CAR. Em alguns casos, o agente terapêutico adicional pode ser um anticorpo específico para um antígeno alvo de interesse, por exemplo, aqueles listados na Tabela 1 e outros que são específicos para o mesmo alvo.
[00230] Em algumas modalidades, o agente terapêutico adicional (por exemplo, um anticorpo) é administrado ao indivíduo antes da administração das células imunes que expressam o polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs e/ou o polipeptídeo de CAR e, então, subsequentemente, a cada duas semanas. Em algumas modalidades, as duas primeiras doses do agente terapêutico adicional (por exemplo, um anticorpo) são administradas com cerca de uma semana (por exemplo, cerca de 6, 7, 8 ou 9 dias) de intervalo. Em certas modalidades, a terceira e as doses seguintes são administradas a cada duas semanas.
[00231] Em qualquer uma das modalidades descritas neste documento, o momento da administração do agente terapêutico adicional (por exemplo, um anticorpo) é aproximado e inclui três dias antes e três dias após o dia indicado (por exemplo, a administração a cada três semanas engloba a administração no dia 18, dia 19, dia 20, dia 21, dia 22, dia 23 ou dia 24).
[00232] A eficácia dos métodos descritos neste documento pode ser avaliada por qualquer método conhecido na técnica e seria evidente para um profissional médico qualificado e/ou aqueles descritos neste documento. Por exemplo, a eficácia da imunoterapia baseada em anticorpos pode ser avaliada pela sobrevivência do indivíduo ou carga de câncer no indivíduo ou tecido ou amostra do mesmo. Em algumas modalidades, a imunoterapia baseada em anticorpos é avaliada com base na segurança ou toxicidade da terapia no indivíduo, por exemplo, pela saúde geral do indivíduo e/ou a presença de eventos adversos ou eventos adversos graves. VI. Kits para uso terapêutico
[00233] A presente invenção também fornece kits para uso das composições descritas neste documento. Por exemplo, a presente invenção também fornece kits que compreendem uma população de células imunes (por exemplo, linfócitos T ou células NK, construídos in vitro ou in vivo) que expressam um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs e opcionalmente um polipeptídeo receptor quimérico para uso na inibição do crescimento de células doentes, por exemplo, células tumorais e/ou aumento do crescimento e/ou proliferação de células imunes em um ambiente de baixo teor de glicose, um ambiente de baixo teor de aminoácidos, um ambiente de baixo pH e/ou ambiente hipóxico, por exemplo, em um microambiente tumoral. O kit pode compreender ainda um agente terapêutico ou um agente terapêutico conjugado a um marcador (por exemplo, aqueles descritos neste documento), ao qual se liga o polipeptídeo receptor quimérico expresso nas células imunes. Esses kits podem incluir um ou mais recipientes compreendendo a população de células imunes geneticamente manipuladas, conforme descrito neste documento (por exemplo, linfócitos T e/ou células NK), que coexpressam um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs e um polipeptídeo receptor quimérico, tal como aqueles descritos neste documento, e opcionalmente um agente terapêutico ou um agente terapêutico conjugado a um marcador.
[00234] Em algumas modalidades, o kit descrito neste documento compreende células imunes que expressam polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs e células imunes que expressam polipeptídeo receptor quimérico, que são expandidas in vitro, e um anticorpo específico para um anticorpo de superfície celular que está presente em células T ativadas, por exemplo, um anticorpo anti-CD5, um anticorpo anti-CD38 ou um anticorpo anti-CD7. As células imunes que expressam polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs e que expressam polipeptídeo receptor quimérico podem expressar qualquer uma das construções polipeptídicas receptoras quiméricas conhecidas na técnica ou descritas neste documento.
[00235] Alternativamente, o kit descrito neste documento pode compreender um ácido nucleico ou um conjunto de ácido nucleico conforme descrito neste documento, que codifica coletivamente qualquer um dos polipeptídeos receptores quiméricos e qualquer um dos polipeptídeos moduladores do ciclo de Krebs como também descritos neste documento.
[00236] Em algumas modalidades, o kit pode compreender adicionalmente instruções para uso em qualquer um dos métodos descritos neste documento. As instruções incluídas podem compreender uma descrição da administração da primeira e da segunda composições farmacêuticas a um indivíduo para atingir a atividade pretendida, por exemplo, inibindo o crescimento de células alvo em um indivíduo e/ou aumentando o crescimento e/ou proliferação de células imunes em um ambiente de baixo teor de glicose, um ambiente de baixo teor de aminoácidos (por exemplo, um ambiente de baixa glutamina), um ambiente de baixo pH e/ou um ambiente hipóxico (por exemplo, uma baixo teor de glicose, baixo teor de aminoácidos, baixo pH ou microambiente tumoral hipósico). O kit pode compreender ainda uma descrição de seleção de um indivíduo adequado para tratamento com base na identificação de se o indivíduo está em necessidade do tratamento. Em algumas modalidades, as instruções compreendem uma descrição da administração da população de células imunes geneticamente manipuladas e, opcionalmente, uma descrição da administração do agente terapêutico conjugado com tag.
[00237] As instruções relacionadas ao uso das células imunes e, opcionalmente, o agente terapêutico conjugado com tag, conforme descrito neste documento, geralmente incluem informações quanto à dosagem, cronograma de dosagem e via de administração para o tratamento pretendido. Os recipientes podem ser doses unitárias, embalagens em lote (por exemplo, embalagens multidose) ou doses de subunidade. As instruções fornecidas nos kits da invenção são normalmente instruções escritas em um rótulo ou bula. O rótulo ou bula indica que as composições farmacêuticas são usadas para tratar, retardar o início e/ou aliviar uma doença ou distúrbio em um indivíduo.
[00238] Os kits fornecidos neste documento estão em embalagens adequadas. A embalagem adequada inclui, mas não está limitada a frascos, garrafas, potes, embalagens flexíveis e similares. Também são contempladas embalagens para uso em combinação com um dispositivo específico, como um inalador, dispositivo de administração nasal ou um dispositivo de infusão. Os kits podem também ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser um saco de solução intravenosa ou uma ampola possuindo uma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). O recipiente também pode ter uma porta de acesso estéril. Pelo menos um agente ativo na segunda composição farmacêutica é um anticorpo conforme descrito neste documento. Pelo menos um agente ativo na primeira composição farmacêutica é uma população de células imunes (por exemplo, linfócitos T ou células NK) que expressam um polipeptídeo receptor quimérico e um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs conforme descrito neste documento.
[00239] Os kits opcionalmente podem fornecer componentes adicionais, como tampões e informações interpretativas. Normalmente, o kit compreende um recipiente e um rótulo ou bula(s) sobre ou associada(s) com o recipiente. Em algumas modalidades, a invenção fornece artigos de fabricação que compreendem o conteúdo dos kits descritos acima. Técnicas Gerais
[00240] A prática da presente invenção usará, a menos que indicado de outra forma, técnicas convencionais de biologia molecular (incluindo técnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular, bioquímica e imunologia, que estão dentro da habilidade na técnica. Tais técnicas são totalmente explicadas na literatura, tais como Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edição (Sambrook, et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (MJ Gait, ed. 1984);
Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1989) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather e P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, JB Griffiths e D.G. Newell, eds. 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir e C.C. Blackwell, eds.): Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller e M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. Eds. 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, et al., Eds. 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., Eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway e P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practice approach (D. Catty., Ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd e C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow e D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti e J.D. Capra, eds. Harwood Academic Publishers, 1995); DNA Cloning: A practical Approach, Volumes I e II (D.N. Glover ed. 1985); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985 »; Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984»; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1986 »; Immobilized Cells and Enzymes (lRL Press, (1986»; e B. Perbal, A Practice Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel et al. (eds.).
[00241] Sem elaboração adicional, acredita-se que uma pessoa versada na técnica pode, com base na descrição acima, utilizar a presente invenção em toda sua extensão. As modalidades específicas a seguir devem ser, portanto, interpretados como meramente ilustrativos e não limitativos no que diz respeito ao restante desta invenção de maneira alguma. Todas as publicações citadas neste documento são incorporadas por referência para os fins ou assuntos mencionados neste documento.
EXEMPLOS Exemplo 1: Impacto da expressão de um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs na função das células T em ambientes com baixo teor de glicose.
[00242] Um transgene polipeptídico modulador do ciclo de Krebs é coexpresso na mesma célula T com um polipeptídeo de ACTR. O transgene é, por exemplo, PHGDG, PCK1, IDH1, IDH1, MDH1, MDH2, GOT1, GOT2, PSAT1, GDH1, GPT1 ou GLS (por exemplo, SEQ ID NOs: 81-92). As células T são transduzidas com um vírus que codifica o polipeptídeo de ACTR e o polipeptídeo de importação de glicose separados, por exemplo, por uma sequência de salto ribossomal P2A. As células T são misturadas a uma dada razão efetor-alvo (E: T) com células-alvo tumorais, como células IGROV-1, e um anticorpo direcionado a tumor, como um anticorpo anti-FOLR1. As reações são então incubadas a 37°C em uma incubadora de 5% de CO2 por um período (por exemplo, 6 - 8 dias) em diferentes concentrações iniciais de glicose (por exemplo, 0 - 20 mM). A função das células T é então avaliada, por exemplo, usando a produção de citocinas ou ensaios de proliferação de células T ou para resistência à estimulação crônica. A produção de citocinas (por exemplo, IL-2 e/ou IFN-gama) é medida a partir do sobrenadante da reação. Para experimentos de proliferação, coculturas são colhidas e coradas com um anticorpo anti-CD3 e uma coloração de células vivas-mortas. O número de células positivas para CD3 vivas é avaliado por citometria de fluxo como uma medida da proliferação de células T. As células T que expressam um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs além do polipeptídeo de ACTR exibem função de células T aumentada em relação às células T que expressam
ACTR apenas incluindo, por exemplo, produção aumentada de citocina ou proliferação aumentada. Esta função aprimorada pode ser mais pronunciada em concentrações mais baixas de glicose. Estes experimentos demonstram que a expressão de um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs em células T tem um impacto positivo na atividade das células T. Exemplo 2: Impacto da expressão de um gene polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs na função das células T em ambientes com concentrações mais altas de inibidor solúvel.
[00243] Um transgene polipeptídico modulador do ciclo de Krebs é coexpresso na mesma célula T com um polipeptídeo de ACTR. O transgene é, por exemplo, PHGDG, PCK1, IDH1, IDH1, MDH1, MDH2, GOT1, GOT2, PSAT1, GDH1, GPT1 ou GLS (por exemplo, SEQ ID NOs: 81-92). As células T são transduzidas com um vírus que codifica o polipeptídeo de ACTR e o polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs separados, por exemplo, por uma sequência de salto ribossomal P2A. As células T transduzidas são misturadas a uma dada razão efetor-alvo (E:T) com células-alvo tumorais, como células IGROV-1, e um anticorpo direcionado a tumor, como um anticorpo anti-FOLR1, em meio contendo diferentes concentrações de inibidores solúveis que estão presentes no microambiente tumoral (por exemplo, TGF-beta, PGE2, quinurenina e/ou adenosina). As reações são então incubadas a 37 °C em uma incubadora de 5% de CO2 por um período (por exemplo, 6 - 8 dias). A função das células T é então avaliada, por exemplo, usando a produção de citocinas ou ensaios de proliferação de células T ou para resistência à estimulação crônica. A produção de citocinas (por exemplo, IL-2 e/ou IFN-gama) é medida a partir do sobrenadante da reação. Para experimentos de proliferação, coculturas são colhidas e coradas com um anticorpo anti-CD3 e uma coloração de células vivas-mortas. O número de células positivas para CD3 vivas é avaliado por citometria de fluxo como uma medida da proliferação de células T. As células T que expressam um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs além do polipeptídeo de ACTR exibem função de células T aumentada em relação às células T que expressam ACTR apenas incluindo, por exemplo, produção aumentada de citocina ou proliferação aumentada. Esta função aprimorada pode ser alcançada em concentrações de inibidor solúvel mais altas. Estes experimentos demonstram que a expressão de um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs em células T tem um impacto positivo na atividade das células T. Exemplo 3: Impacto da expressão de um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs na função das células T em ambientes com maior presença de células imunossupressoras.
[00244] Um transgene polipeptídico modulador do ciclo de Krebs é coexpresso na mesma célula T com um polipeptídeo de ACTR. O transgene é, por exemplo, PHGDG, PCK1, IDH1, IDH1, MDH1, MDH2, GOT1, GOT2, PSAT1, GDH1, GPT1 ou GLS (por exemplo, SEQ ID NOs: 81-92). As células T são transduzidas com um vírus que codifica o polipeptídeo de ACTR e o polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs separados, por exemplo, por uma sequência de salto ribossomal P2A. As células T transduzidas são misturadas a uma dada razão efetor-alvo (E:T) com células-alvo tumorais, como células IGROV-1, e um anticorpo direcionado a tumor, como um anticorpo anti-FOLR1, na presença de imunossupressores células (por exemplo, células supressoras derivadas de mieloides e/ou células T reguladoras). As reações são então incubadas a 37 °C em uma incubadora de 5% de CO2 por um período (por exemplo, 3 - 10 dias). A função das células T é então avaliada, por exemplo, usando a produção de citocinas ou ensaios de proliferação de células T ou para resistência à estimulação crônica. A produção de citocinas (por exemplo, IL-2 e/ou IFN-gama) é medida a partir do sobrenadante da reação. Para experimentos de proliferação,
coculturas são colhidas e coradas com um anticorpo anti-CD3 e uma coloração de células vivas-mortas. O número de células positivas para CD3 vivas é avaliado por citometria de fluxo como uma medida da proliferação de células T. As células T que expressam um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs além do polipeptídeo de ACTR exibem função de células T aumentada em relação às células T que expressam ACTR apenas incluindo, por exemplo, produção aumentada de citocina ou proliferação aumentada. Essa função aprimorada pode ser alcançada na presença de quantidades aumentadas (por exemplo, maior número ou porcentagem) de células imunossupressoras. Estes experimentos demonstram que a expressão de um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs em células T tem um impacto positivo na atividade das células T. Exemplo 4: Impacto da expressão de um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs na função das células T em modelos tumorais.
[00245] Um transgene polipeptídico modulador do ciclo de Krebs é coexpresso na mesma célula T com um polipeptídeo de ACTR. O transgene é, por exemplo, PHGDG, PCK1, IDH1, IDH1, MDH1, MDH2, GOT1, GOT2, PSAT1, GDH1, GPT1 ou GLS (por exemplo, SEQ ID NOs: 81-92). As células T são transduzidas com um vírus que codifica o polipeptídeo de ACTR e o polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs separados, por exemplo, por uma sequência de salto ribossomal P2A. As células T transduzidas são avaliadas quanto à atividade antitumoral em modelos tumorais de camundongo. Para estes experimentos, uma linhagem celular tumoral, por exemplo IGROV-1, é inoculada em camundongos NSG™ (NOD scid gama, NOD.Cg-Prkdcscid IL2rgtm1Wjl/SzJ, Cepa 005557). Os camundongos com tumor são subsequentemente doseados com um anticorpo direcionado ao tumor e células T que expressam ACTR apenas ou ACTR e um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs. O crescimento do tumor é monitorado ao longo do experimento. Em combinação com um anticorpo direcionado a tumor, as células T que expressam um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs além de um polipeptídeo de ACTR exibem atividade antitumoral aumentada em relação às células T que expressam um polipeptídeo de ACTR apenas. Além disso, em combinação com um anticorpo de direcionamento a tumor, as células T que expressam um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs, além de um polipeptídeo de ACTR, podem exibir atividade aumentada de células T incluindo, por exemplo, proliferação aumentada, persistência aumentada de células T e/ou produção aumentada de citocinas em relação às células T que expressam o polipeptídeo de ACTR apenas. Estes experimentos demonstram que a expressão de um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs em células T que expressam ACTR tem um impacto positivo na função das células T in vivo. Exemplo 5: Impacto das concentrações reduzidas de glicose na função das células T
[00246] Retrovírus gama que codifica um construto de expressão de CAR de direcionamento de GPC3 exemplificativo de SEQ ID NO: 104 foi gerado por meio de tecnologia recombinante e usado para infectar células T humanas primárias para gerar células que expressam um polipeptídeo de CAR de direcionamento de GPC3 em sua superfície celular. Um ensaio de proliferação baseado em fluxo de seis dias foi então usado para testar a funcionalidade das células que expressam CAR de direcionamento a GPC3. Especificamente, 200.000 células T simuladas não transduzidas ou células T que expressam o construto CAR de direcionamento a GPC3 foram incubadas juntas a uma razão de 4:1 (células efetoras/células T que expressam CAR para células alvo) com 50.000 células tumorais JHH7 ou Hep3B de carcinoma hepatocelular GPC3+. A cocultura foi incubada a 37 °C em uma incubadora de 5% de CO2 por seis dias na presença de diferentes concentrações de glicose. Ao final de seis dias, as coculturas foram colhidas e coradas com um anticorpo anti-CD3. O número de células positivas para CD3 foi avaliado por citometria de fluxo como uma medida da proliferação de células T. Em concentrações mais baixas de glicose, menos proliferação de CAR-T foi observada (FIG. 1). Esses experimentos demonstram que ambientes de baixo teor de glicose podem ter um impacto negativo na atividade de proliferação de células CAR-T. Exemplo 6: Impacto da expressão de um gene modulador do ciclo de Krebs na função de células T usando um construto de expressão de CAR-T direcionado a GPC3
[00247] Retrovírus gama que codifica um construto de expressão de polipeptídeo de CAR de direcionamento de GPC3 exemplificativo (SEQ ID NO: 104) foi gerado por meio de tecnologia recombinante e usado para infectar células T humanas primárias para gerar células que expressam um polipeptídeo de CAR de direcionamento de GPC3 em sua superfície celular. Além disso, retrovírus gama que codificam um polipeptídeo de CAR de direcionamento a GPC3 exemplificativo e um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs (GOT1 ou GOT2) (SEQ ID NOs: 87 e 88, respectivamente) foram gerados por meio de tecnologia recombinante e usados para infectar células T humanas primárias para gerar células que expressaram um polipeptídeo direcionado a GPC3 e um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs. Nos construtos que codificam o polipeptídeo de CAR e o polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs, os dois polipeptídeos foram separados por uma sequência de salto ribossomal P2A. As variantes expressas foram anti-GPC3 CAR + GOT1 e anti-GPC3 CAR + GOT2. Um ensaio de proliferação baseado em fluxo de seis dias foi então usado para testar a funcionalidade das células que expressam CAR de direcionamento a GPC3. Especificamente, 200.000 células T simuladas não transduzidas,
células T que expressam um polipeptídeo de CAR direcionado a GPC3 ou células T que expressam um polipeptídeo de CAR direcionado a GPC3 e um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs foram incubadas juntas a uma razão de 4:1 (células T efetoras que expressam CAR T para células-alvo) com 50.000 células tumorais JHH7 de carcinoma hepatocelular GPC3+. A cocultura foi incubada a 37 °C em 5% de CO 2 durante seis dias na presença de 1,25 mM de glicose (relevante para o tumor) e 10 mM de glicose (níveis aproximados de sangue periférico). Ao final de seis dias, as coculturas foram colhidas e coradas com um anticorpo anti-CD3.
[00248] O número de células positivas para CD3 foi avaliado por citometria de fluxo como uma medida da proliferação de células T. As células T que expressam os polipeptídeos moduladores do ciclo de Krebs, além do polipeptídeo de CAR, demonstraram proliferação de células T aumentada em relação às células T que expressam o construto CAR apenas (Figuras 2A, 2B, 3A e 3B). Esta proliferação aumentada também ocorreu em baixas concentrações de glicose relevantes para o tumor. Estes experimentos demonstraram que a expressão de polipeptídeos moduladores do ciclo de Krebs em células T tem um impacto positivo na atividade de proliferação de células CAR- T. Exemplo 7: Impacto da expressão de um gene modulador do ciclo de Krebs na função das células T em ambientes com baixo teor de glicose.
[00249] Um transgene modulador do ciclo de Krebs é coexpresso na mesma célula T com um polipeptídeo receptor de antígeno quimérico (CAR). O transgene é, por exemplo, GPT1, GLS, PCK1, GOT1, GOT2, IDH1, IDH2, MDH1, MDH2, PHGDH, PSAT1 ou GDH1 (por exemplo SEQ ID NOs: 81-92). As células T são transduzidas com um vírus que codifica o polipeptídeo de CAR e o polipeptídeo de metabólitos do ciclo de Krebs separados, por exemplo, por uma sequência de salto ribossomal P2A. As células T são misturadas a uma determinada razão efetor-alvo (E:T) com células-alvo tumorais, como células HepG2. As reações são então incubadas a 37 °C em uma incubadora de 5% de CO2 por um período (por exemplo, 6 - 8 dias) em diferentes concentrações iniciais de glicose (por exemplo, 0 - 20 mM). A função das células T é então avaliada, por exemplo, usando a produção de citocinas ou ensaios de proliferação de células T. A produção de citocinas (por exemplo, IL-2 e/ou IFN-gama) é medida a partir do sobrenadante da reação. Para experimentos de proliferação, coculturas são colhidas e coradas com um anticorpo anti-CD3 e uma coloração de células vivas-mortas. O número de células positivas para CD-3 vivas é avaliado por citometria de fluxo como uma medida da proliferação de células T.
[00250] Espera-se que as células T que expressam um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs além do polipeptídeo de CAR exibam função de células T aumentada em relação às células T que expressam CAR apenas incluindo, por exemplo, produção aumentada de citocina ou proliferação aumentada. Esta função aprimorada pode ser mais pronunciada em concentrações mais baixas de glicose. Exemplo 8: Impacto da expressão de um gene modulador do ciclo de Krebs na função das células T em ambientes com concentrações mais altas de inibidor solúvel
[00251] Um transgene modulador do ciclo de Krebs é coexpresso na mesma célula T com um polipeptídeo receptor de antígeno quimérico (CAR). O transgene é, por exemplo, GPT1, GLS, PCK1, GOT1, GOT2, IDH1, IDH2, MDH1, MDH2, PHGDH, PSAT1 ou GDH1 (por exemplo, SEQ ID NOs: 81-92). As células T são transduzidas com um vírus que codifica o polipeptídeo de CAR e o polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs separados, por exemplo, por uma sequência de salto ribossomal
P2A. As células T transduzidas são misturadas a uma determinada razão efetor-alvo (E:T) com células-alvo tumorais, como células HepG2, em meios contendo diferentes concentrações de inibidores solúveis que estão presentes no microambiente tumoral (por exemplo, TGF-beta, PGE2 e/ou adenosina). As reações são então incubadas a 37 °C em uma incubadora de 5% de CO2 por um período (por exemplo, 6 - 8 dias). A função das células T é então avaliada, por exemplo, usando a produção de citocinas ou ensaios de proliferação de células T. A produção de citocinas (por exemplo, IL-2 e/ou IFN-gama) é medida a partir do sobrenadante da reação. Para experimentos de proliferação, coculturas são colhidas e coradas com um anticorpo anti-CD3 e uma coloração de células vivas-mortas. O número de células positivas para CD3 vivas é avaliado por citometria de fluxo como uma medida da proliferação de células T.
[00252] Espera-se que as células T que expressam um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs além do polipeptídeo de CAR exibam função de células T aumentada em relação às células T que expressam CAR apenas incluindo, por exemplo, produção aumentada de citocina ou proliferação aumentada. Esta função aprimorada pode ser alcançada em concentrações de inibidor solúvel mais altas. Exemplo 9: Impacto da expressão de um gene modulador do ciclo de Krebs na função das células T em ambientes com maior presença de células imunossupressoras
[00253] Um transgene de shunt de metabólitos do ciclo de Krebs é coexpresso na mesma célula T com um polipeptídeo receptor de antígeno quimérico (CAR). O transgene é, por exemplo, GPT1, GLS, PCK1, GOT1, GOT2, IDH1, IDH2, MDH1, MDH2, PHGDH, PSAT1 ou GDH1 (por exemplo, SEQ ID NOs: 81-92). As células T são transduzidas com um vírus que codifica o polipeptídeo de CAR e o polipeptídeo de shunt de metabólitos do ciclo de Krebs separados, por exemplo, por uma sequência de salto ribossomal P2A. As células T transduzidas são misturadas a uma determinada razão efetor-alvo (E:T) com células-alvo tumorais, como células HepG2, na presença de células imunossupressoras (por exemplo, células supressoras derivadas de mieloide e/ou células T reguladoras) com marcação fluorescente. As reações são então incubadas a 37 °C em uma incubadora de 5% de CO2 por um período (por exemplo, 3 - 10 dias). A função das células T é então avaliada, por exemplo, usando a produção de citocinas ou ensaios de proliferação de células T. A produção de citocinas (por exemplo, IL-2 e/ou IFN-gama) é medida a partir do sobrenadante da reação. Para experimentos de proliferação, coculturas são colhidas e coradas com um anticorpo anti-CD3 e uma coloração de células vivas- mortas. O número de células positivas para CD3 sem marcação vivas é avaliado por citometria de fluxo como uma medida da proliferação de células T.
[00254] Espera-se que as células T que expressam um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs além do polipeptídeo de CAR exibam função de células T aumentada em relação às células T que expressam CAR apenas incluindo, por exemplo, produção aumentada de citocina ou proliferação aumentada. Essa função aprimorada pode ser alcançada na presença de quantidades aumentadas (por exemplo, maior número ou porcentagem) de células imunossupressoras. Exemplo 10: Impacto da expressão de um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs na função de células T em um modelo tumoral de camundongo usando um construto de expressão de CAR-T direcionado a GPC3
[00255] Um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs (GOT2) (SEQ ID NO: 88) foi coexpresso nas mesmas células T com um polipeptídeo de CAR-T direcionado a GPC3 (SEQ ID NO: 104). Gama-retrovírus que codifica o construto de expressão de CAR-T direcionado a GPC3 foi gerado e usado para infectar células T humanas primárias para gerar células que expressaram um CAR-T direcionado a GPC3 em sua superfície celular. As células T também foram transduzidas com vírus que codificam o polipeptídeo de CAR anti-GPC3 e GOT2 separados por uma sequência de salto ribossomal P2A.
[00256] As células T transduzidas por CAR foram avaliadas quanto à atividade antitumoral em um modelo tumoral de camundongo. Para estes experimentos, a linhagem celular tumoral de carcinoma hepatocelular, JHH7, foi inoculada em camundongos NSGTM (NOD scid gama, NOD.Cg-Prkdcscid IL2rgtmWj1/SzJ, cepa 005557). O tratamento com células T que expressam CAR anti-GPC3 foi iniciado quando os volumes do tumor atingiram aproximadamente 50 mm 3 (dia 8 após a inoculação). Os camundongos foram randomizados em grupos de tratamento de 5 camundongos cada um com base no volume do tumor e tratados com células T que expressam CAR direcionado a GPC3 a uma dose de 5 x 106 células T CAR+ no 8º e 15º dias após a inoculação. A dose total de células T variou com base na eficiência de transdução de CAR de cada construção.
[00257] O volume do tumor e os pesos corporais foram medidos duas a três vezes por semana durante o experimento. Células CAR-T que coexpressam GOT2 demonstraram eficácia antitumoral aumentada em relação às células T que expressam apenas o construto CAR GPC3 (FIG. 4). Estes experimentos demonstraram que a expressão do polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs em células CAR-T teve um impacto positivo na eficácia antitumoral das células CAR-T em um modelo de xenoenxerto de camundongo de carcinoma hepatocelular.
[00258] As células T transduzidas por CAR foram avaliadas quanto à atividade antitumoral em um modelo tumoral de camundongo. Para estes experimentos, a linhagem celular tumoral de carcinoma hepatocelular, Hep3B, foi inoculada em camundongos NSGTM (NOD scid gama, NOD.Cg-Prkdcscid IL2rgtmWj1/SzJ, cepa 005557). O tratamento com células T que expressam CAR anti-GPC3 foi iniciado quando os volumes do tumor atingiram aproximadamente 100 mm3 (dia 20 após a inoculação). Os camundongos foram randomizados em grupos de tratamento de 5 camundongos cada um com base no volume do tumor e tratados com células T que expressam CAR direcionado a GPC3 a uma dose de 1 x 106 células T CAR+ no 20º e 27º dias após a inoculação. A dose total de células T variou com base na eficiência de transdução de CAR de cada construção.
[00259] O volume do tumor e os pesos corporais foram medidos duas a três vezes por semana durante o experimento. Células CAR-T que coexpressam GOT2 demonstraram eficácia antitumoral aumentada em relação às células T que expressam apenas o construto CAR GPC3 (FIG. 6). Estes experimentos demonstraram que a expressão do polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs em células CAR-T teve um impacto positivo na eficácia antitumoral das células CAR-T em um modelo de xenoenxerto de camundongo de carcinoma hepatocelular.
[00260] As células T transduzidas por CAR foram avaliadas quanto à atividade antitumoral em um modelo tumoral de camundongo. Para estes experimentos, a linhagem celular tumoral de câncer de pulmão de pequenas células, NCI-H446, foi inoculada em camundongos NSGTM (NOD scid gama, NOD.Cg-Prkdcscid IL2rgtmWj1/SzJ, cepa 005557). O tratamento com células T que expressam CAR anti-GPC3 foi iniciado quando os volumes do tumor atingiram aproximadamente 100 mm3 (dia 18 após a inoculação). Os camundongos foram randomizados em grupos de tratamento de 5 camundongos cada um com base no volume do tumor e tratados com células T que expressam CAR direcionado a GPC3 a uma dose de 5 x 106 células T CAR+ no 18º e 25º dias após a inoculação. A dose total de células T variou com base na eficiência de transdução de CAR de cada construção.
[00261] O volume do tumor e os pesos corporais foram medidos duas a três vezes por semana durante o experimento. Células CAR-T que coexpressam GOT2 demonstraram eficácia antitumoral aumentada em relação às células T que expressam apenas o construto CAR GPC3 (FIG. 5). Estes experimentos demonstraram que a expressão do polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs em células CAR-T teve um impacto positivo na eficácia antitumoral das células CAR-T em um modelo de xenoenxerto de camundongo de câncer de pulmão de células pequenas. Exemplo 11: Impacto da expressão de um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs na expansão de células T em um modelo tumoral de camundongo usando um construto de expressão de CAR-T direcionado a GPC3
[00262] Um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs (GOT2) (SEQ ID NO: 88) foi coexpresso nas mesmas células T com um polipeptídeo de CAR-T direcionado a GPC3 (SEQ ID NO: 104). Gama-retrovírus que codifica o construto de expressão de CAR-T direcionado a GPC3 foi gerado e usado para infectar células T humanas primárias para gerar células que expressaram um CAR-T direcionado a GPC3 em sua superfície celular. As células T também foram transduzidas com vírus que codificam o polipeptídeo de CAR anti-GPC3 e GOT2 separados por uma sequência de salto ribossomal P2A.
[00263] As células T transduzidas por CAR foram avaliadas quanto à expansão e em um modelo tumoral de camundongo. Para estes experimentos, a linhagem celular tumoral de carcinoma hepatocelular, Hep3B, foi inoculada em camundongos NSGTM (NOD scid gama, NOD.Cg-Prkdcscid IL2rgtmWj1/SzJ, cepa 005557). O tratamento com células T que expressam CAR anti-GPC3 foi iniciado quando os volumes do tumor atingiram aproximadamente 100 mm3 (dia 20 após a inoculação). Os camundongos foram randomizados em grupos de tratamento de 5 camundongos cada um com base no volume do tumor e tratados com células T que expressam CAR direcionado a GPC3 a uma dose de 1 x 106 células T CAR+ no 20º e 27º dias após a inoculação. A dose total de células T variou com base na eficiência de transdução de CAR de cada construção.
[00264] O sangue periférico foi coletado e corado com um anticorpo anti-CD3 e um anti-CAR. O número de células positivas para CD3 e positivas para CAR foi avaliado por citometria de fluxo como uma medida da expansão das células T e atividade do CAR. Células CAR-T que coexpressam GOT2 demonstraram expansão de células T aumentada em relação às células T que expressam apenas o construto GPC3 CAR (FIG. 7). Estes experimentos demonstraram que a expressão do polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs em células CAR-T teve um impacto positivo na expansão das células CAR-T em um modelo de xenoenxerto de camundongo de carcinoma hepatocelular. Exemplo 12: A coexpressão de um gene modulador do ciclo de Krebs (GOT2) e um CAR direcionado a GPC3 em células T aumenta a atividade da enzima aspartato aminotransferase
[00265] Retrovírus gama que codifica um construto de expressão de polipeptídeo de CAR de direcionamento de GPC3 exemplificativo (SEQ ID NO: 104) foi gerado por meio de tecnologia recombinante e usado para infectar células T humanas primárias para gerar células que expressam um polipeptídeo de CAR de direcionamento de GPC3 em sua superfície celular. Além disso, o gama-retrovírus que codifica um polipeptídeo de CAR de direcionamento a GPC3 exemplificativo e um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs (GOT2) (SEQ ID NO: 88) foi gerado por meio de tecnologia recombinante e usado para infectar células T humanas primárias para gerar células que expressaram um polipeptídeo direcionado a GPC3 e GOT2, com os dois polipeptídeos separados por uma sequência de salto ribossomal P2A. A expressão de GOT2 foi confirmada usando Western blot. Células T transduzidas por CAR foram misturadas a uma razão efetor-alvo de 4:1 com células tumorais Hep3B de carcinoma hepatocelular GPC3+ e incubadas a 37 °C, 5% de CO2 por 4 dias. Após a incubação, os lisados celulares foram preparados a partir de 1 x 106 células, o lisado celular foi combinado com tampão de amostra Bolt LDS (Invitrogen) e DTT 100 nM e corrido em dois géis separados. As proteínas dos géis foram então transferidas para membranas de nitrocelulose (Transblot turbo transfer pack da BioRad). Os blots foram sondados durante a noite para a expressão de GOT2 usando anticorpo de coelho anti-GOT2 humano (Origene) e, em seguida, sondados com anticorpo anti-coelho conjugado com HRP ou para expressão de GAPDH usando GAPDH anti-humano de camundongo (Biolegend) e, em seguida, sondados com anti-conjugado com HRP anticorpo secundário IgG de camundongo. A expressão de GOT2 foi maior em células T transduzidas com o construto CAR + GOT2 em relação ao CAR parental (Figura 8A)
[00266] Células T transduzidas foram misturadas a uma razão efetor- alvo de 4:1 com células tumorais Hep3B de carcinoma hepatocelular GPC3+ e incubadas a 37°C, 5% de CO2 por 8 dias. A atividade enzimática da aspartato aminotransferase (AST) foi medida usando um kit de ensaio de atividade de aspartato aminotransferase (Abcam) de acordo com o protocolo do fabricante. A atividade da AST é calculada medindo a quantidade de glutamato gerado por minuto a 37 °C. Neste exemplo, a atividade AST foi calculada em 50 minutos após a adição do substrato. As células T que expressam o polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs GOT2, além do polipeptídeo de CAR, demonstraram atividade aumentada de AST após ativação com células tumorais. (Figura 8B). Estes experimentos demonstram que a expressão de um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs em células T tem um impacto positivo na função das células T. Exemplo 13: A coexpressão de um gene modulador do ciclo de Krebs (GOT2) e um CAR ou ACTR direcionado a GPC3 em células T aumenta a proliferação
[00267] Um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs (GOT2) (SEQ ID NO: 10) foi coexpresso nas mesmas células T com um polipeptídeo de CAR-T direcionado a GPC3 (SEQ ID NO: 1). As células T foram transduzidas com um vírus que codifica o polipeptídeo de CAR apenas ou CAR e GOT2 separados por uma sequência de salto ribossomal P2A. As células T que expressam CAR de direcionamento a GPC3 e coexpressam GPC3-CAR e GOT2 foram marcadas com traço celular violeta, proteínas celulares com marcação fluorescente e, em seguida, misturadas a uma razão efetor-alvo de 2:1 com células tumorais Hep3B de carcinoma hepatocelular GPC3+. No dia 6 após a ativação, as células foram coradas com anti-CD3 e a diluição de traço celular violeta foi medida por citometria de fluxo no dia 6 após a ativação para medir a proliferação. O inverso da intensidade de fluorescência média de traço celular violeta das células CD3+ dentre as células T que coexpressam CAR e GOT2 foi expresso em relação à intensidade de fluorescência inversa média de células T que expressam CAR apenas. As células T que expressam GOT2 em combinação com o polipeptídeCAR demonstraram aumento das divisões celulares em relação às células T que expressam CAR apenas. Figura 9A
[00268] Um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs (GOT2) (SEQ ID NO: 10) foi coexpresso nas mesmas células T com um polipeptídeo de ACTR (SEQ ID NO: 1). As células T foram transduzidas com um vírus que codifica o polipeptídeo de ACTR apenas ou ACTR e GOT2 separados por uma sequência de salto ribossomal P2A. As células T que expressam ACTR e coexpressam ACTR e GOT2 foram misturadas a uma razão efetor-alvo de 2:1 com células tumorais HepG2 de carcinoma hepatocelular GPC3+ e 1 µg/mL de anticorpo anti-GPC3 GC33 (ver Nakano, K et al. Anticâncer Drugs. Nov 2010; 21(10):907- 16). No dia 3 após a ativação, as contagens de células T foram medidas por citometria de fluxo após a coloração com um anticorpo anti-CD3. As contagens totais de células CD3+ de células T que coexpressam ACTR e GOT2 foram expressas em relação às contagens de células T CD3+ totais de células T que expressam ACTR apenas. As células T que expressam o GOT2 além do polipeptídeo de ACTR demonstraram aumento na contagem de células T. Figura 9B.
[00269] Estes experimentos demonstram que a expressão de um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs em células T tem um impacto positivo na proliferação das células T. Exemplo 14: A coexpressão de um gene modulador do ciclo de Krebs (GOT2) e um CAR ou ACTR direcionado a GPC3 em células T aumenta a produção de citocinas IL-17A
[00270] Um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs (GOT2) (SEQ ID NO: 88) foi coexpresso em células T com um polipeptídeo de CAR-T direcionado a GPC3 (SEQ ID NO: 104) ou foi coexpresso células T com um polipeptídeo ACTR-4-1BB (SEQ ID NO: 1) ou um polipeptídeo de ACTR-CD28 (SEQ ID NO: 57). As células T foram transduzidas com um vírus que codifica o polipeptídeo de CAR ou ACTR apenas ou CAR ou ACTR e GOT2 separados por uma sequência de salto ribossomal P2A. As células T transduzidas foram misturadas a uma razão efetor-alvo de 2:1 com células tumorais HepG2 de carcinoma hepatocelular GPC3+; em experiências com células T de ACTR, o anticorpo anti-GPC3 GC33 (1 µg/mL) foi adicionado. As células foram incubadas por 24 horas a 37 °C em uma incubadora de 5% de CO2. Após a incubação, 100 µL de sobrenadante de cultura de células foram coletados e IL-17A foi medido usando um MSD ELISA (Meso Scale Discovery, Pacific BioLabs) de acordo com as instruções do fabricante. A produção de IL-17A é representada graficamente como uma função do construto da expressão (Figuras 10A-10C). As células T que coexpressam GOT2 e CAR (Figura 10A) ou polipeptídeos de ACTR (Figuras 10B-10C) demonstraram a capacidade aprimorada de produzir IL-17A em relação às células T que expressam CAR ou ACTR apenas. Estas experiências demonstram que a expressão de um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs em células T tem um impacto positivo na produção de citocinas IL-17A. Exemplo 15: A coexpressão de um gene modulador do ciclo de Krebs (GOT2) e um CAR ou ACTR direcionado a GPC3 aumenta a polifuncionalidade das células T CD4+
[00271] Um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs (GOT2) (SEQ ID NO: 88) foi coexpresso nas mesmas células T com um polipeptídeo de CAR-T direcionado a GPC3 (SEQ ID NO: 104) ou foi coexpresso nas mesmas células T com um polipeptídeo de ACTR contendo um domínio coestimulatório primário 4-1BB (SEQ ID NO: 1) ou CD28 (SEQ ID NO: 57). As células T foram transduzidas com um vírus que codifica o polipeptídeo de CAR ou ACTR apenas ou CAR ou ACTR e GOT2 separados por uma sequência de salto ribossomal P2A. As células T transduzidas foram misturadas a uma razão efetor-alvo de 1:1 com células tumorais HepG2 de carcinoma hepatocelular GPC3+; em experiências com células T de ACTR, o anticorpo anti-GPC3 GC33 (1 µg/mL) foi adicionado. As células foram incubadas na presença de inibidores do transporte de proteínas, Brefeldin A (5 µg/mL) e Monensina (2 µM), durante 6 horas a 37 °C numa incubadora de CO2 a 5%. Após a incubação, as coculturas foram coradas com anticorpos anti-CD4 e anti-CD8 para células T CAR e ACTR; As células T de ACTR também foram coradas com um anticorpo anti-CD16. As células foram posteriormente fixadas, permeabilizadas e coradas com anticorpos anti- IFN, anti-IL-2, anti-TNF e anti-IL-17A para quantificar a produção de citocinas intracelulares.
[00272] A frequência de células T CD4+ produzindo múltiplas citocinas foi quantificada por citometria de fluxo. As células T que expressam GOT2 além dos polipeptídeos CAR ou ACTR tinham uma frequência mais alta de células T CD4+ produzindo mais de uma, duas ou três citocinas simultaneamente em relação às células T que expressam CAR ou ACTR apenas, demonstrando maior polifuncionalidade nas células que expressam GOT2 (Figuras 11A- 11C). Estes experimentos demonstram que a expressão de um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs em células T tem um impacto positivo na polifuncionalidade das células T CD4. Exemplo 16: A coexpressão de um gene modulador do ciclo de Krebs (GOT2) e um CAR ou ACTR direcionado a GPC3 aumenta a frequência de células CD8+ com fenótipo similar ao não exposto menos diferenciado
[00273] Um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs (GOT2) (SEQ ID NO: 88) foi coexpresso nas mesmas células T com um polipeptídeo de CAR-T direcionado a GPC3 (SEQ ID NO: 104) ou foi coexpresso nas mesmas células T com um polipeptídeo de ACTR contendo um domínio coestimulatório primário 4-1BB (SEQ ID NO: 1) ou CD28 (SEQ ID NO: 57). As células T foram transduzidas com um vírus que codifica o polipeptídeo de CAR ou ACTR apenas ou CAR ou ACTR e GOT2 separados por uma sequência de salto ribossomal P2A. O fenótipo de células T de construtos CAR de 11 doadores saudáveis e de construtos ACTR para dois doadores saudáveis foi avaliado por citometria de fluxo. Para essas experiências, as células foram descongeladas e coradas com anticorpos anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD45RA, anti- CD45RO, anti-CD27 e anti-CD62L para células T que expressam CAR e ACTR. As células CAR T também foram coradas com proteína GPC3 recombinante para detectar o polipeptídeo de CAR e as células T de
ACTR também foram coradas com um anticorpo anti-CD16 para detectar o polipeptídeo de ACTR. A frequência de células T CD8 + CAR + ou ACTR + que coraram positivamente para CD27, CD45RA, CD62L e negativas para CD45RO foi maior em células T que também coexpressaram GOT2 em relação ao pai cognato, demonstrando que células que expressam GOT2 têm uma população CD8+ mais similares às não expostas (Figuras 12A-12C). No geral, o fenótipo de células T de CAR ou ACTR CD8+ que coexpressam GOT2 exibe uma maior proporção de células com marcadores fenotípicos de fenótipo menos diferenciado (mais jovem) (CD27+/CD45RO+, CD27+/CD45 RO-, CD27+/CD45RA+, CD27+/CD45RA-) em relação ao CAR parental (Figura 13). Estes experimentos demonstram que a expressão de um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs em células T tem um impacto positivo no fenótipo CD8. Exemplo 17: A coexpressão de um gene modulador do ciclo de Krebs (GOT2) e um CAR direcionado a GPC3 em células T melhora a proliferação sob estimulação de antígeno crônica e hipóxia
[00274] Um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs (GOT2) (SEQ ID NO: 88) foi coexpresso nas mesmas células T com um polipeptídeo de CAR-T direcionado a GPC3 (SEQ ID NO: 104). As células T foram transduzidas com um vírus que codifica o polipeptídeo de CAR apenas ou CAR e GOT2 separados por uma sequência de salto ribossomal P2A. As células T que expressam CAR de direcionamento a GPC3 e células T que coexpressam GPC3-CAR e células GOT2 foram marcadas com traço celular violeta, proteínas celulares com marcação fluorescente e, em seguida, misturadas a uma razão efetor-alvo de 2:1 com células tumorais Hep3B de carcinoma hepatocelular GPC3+. No dia 3 após a ativação, as células foram lavadas e, em seguida, misturadas a uma razão efetor-alvo de 2:1 com células tumorais Hep3B de carcinoma hepatocelular GPC3+ frescas como uma segunda estimulação de antígeno. As células foram incubadas sob condições normóxicas (20% de oxigênio) ou hipóxicas (1,5% de oxigênio) por 3 dias adicionais e, em seguida, coradas com anti-CD3 e diluição de traço celular violeta foi medida por citometria de fluxo para medir a proliferação, expressa como o inverso da intensidade média de fluorescência de traço celular violeta (MFI-1). As células T que expressam GOT2, além do polipeptídeo de CAR, demonstraram proliferação aumentada sob estimulação de antígeno crônica, tanto em condições normóxicas quanto hipóxicas (Figura 14), simulando vários estresses do microambiente tumoral. Estas experiências demonstram que a expressão de um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs em células T proporciona uma vantagem proliferativa sob condições desfavoráveis presentes no microambiente tumoral sólido. Exemplo 18: A coexpressão de um gene modulador do ciclo de Krebs (GOT2) e um CAR direcionado a GPC3 em células T melhora a proliferação em condições de glicose limitante
[00275] Um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs (GOT2) (SEQ ID NO: 88) foi coexpresso nas mesmas células T com um polipeptídeo de CAR-T direcionado a GPC3 contendo um domínio coestimulatório 4- 1BB (SEQ ID NO: 104) ou CD28 (SEQ ID NO: 105). As células T foram transduzidas com um vírus que codifica o polipeptídeo de CAR apenas ou CAR e GOT2 separados por uma sequência de salto ribossomal P2A. As células T transduzidas com o polipeptídeo de CAR-T direcionado a GPC3 foram isoladas com a proteína recombinante GPC3 conjugada com AlexaFluor 647 e microesferas anti-AlexaFluor647 (Miltenyi Biotec) e deixadas em repouso em RPMI + 10% de FBS durante a noite. As células T transduzidas foram então marcadas com traço celular violeta e misturadas a uma proporção de efetor-alvo de 2:1 com células tumorais HepG2 de carcinoma hepatocelular GPC3+. As coculturas foram incubadas na presença de glicose alta (10 mM) ou baixa (1,25 mM) para imitar a disponibilidade limitada de nutrientes no microambiente tumoral. Após 7 dias a 37 °C em uma incubadora de CO2 a 5%, as células foram coradas com um anticorpo anti-CD3 e a divisão celular foi avaliada por diluição de traços de células por meio de citometria de fluxo.
[00276] As células T que coexpressam GOT2 e o polipeptídeo de CAR demonstraram maior proliferação em glicose 10 mM e 1,25 mM em relação às células T que expressam CAR apenas, conforme indicado pela diminuição da intensidade de fluorescência de traço celular violeta. O inverso da intensidade da fluorescência de traço celular violeta foi representado graficamente como uma função da condição de glicose e do tipo de célula T (Figura 15). Essas experiências demonstram que a expressão de um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs em células T tem um impacto positivo na proliferação de células T em células CAR- T que contêm domínios coestimuladores 4-1BB ou CD28 e em condições de alta e baixo teor de glicose. Exemplo 19: A coexpressão de um gene modulador do ciclo de Krebs (GOT2) e um CAR direcionado a GPC3 em células T melhora a proliferação na presença do inibidor de células T quinurenina
[00277] Um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs (GOT2) (SEQ ID NO: 88) foi coexpresso nas mesmas células T com um polipeptídeo de ACTR (SEQ ID NO: 57) contendo um domínio coestimulador primário de CD28 e comparado em ensaios funcionais com células T expressando o polipeptídeo de ACTR apenas. As células T foram transduzidas com um vírus que codifica o polipeptídeo de ACTR apenas ou ACTR e GOT2 separados por uma sequência de salto ribossomal P2A. As células T foram misturadas a uma razão efetor-alvo de 4:1 com células tumorais IGROV-1 de carcinoma ovariano que expressam receptor de folato alfa (FOLR+) (fixadas em paraformaldeído) com a adição de anticorpo anti-FOLR (5 µg/mL). As coculturas foram incubadas por 6 dias a 37 °C em uma incubadora de 5% de CO 2. Após a incubação, metade das células foram transferidas para uma nova placa, pulsadas com BrdU (Millipore Sigma), incubadas por ~16 horas a 37 °C em uma incubadora de 5% de CO2 e analisadas para absorção de BrdU seguindo as instruções do fabricante usando um leitor de placas EnVision (Perkin Elmer) para detectar quimioluminescência. As células T que coexpressam GOT2 e ACTR demonstraram proliferação melhorada, conforme mostrado pelo aumento da captação de BrdU, tanto na ausência quanto na presença de quinurenina em relação às células T que expressam ACTR apenas. Estas experiências demonstram que expressar um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs em células T proporciona uma vantagem proliferativa na presença de moléculas inibidoras encontradas no microambiente tumoral sólido. Figura 16. Exemplo 20: A coexpressão de um gene modulador do ciclo de Krebs (GOT2) e um CAR direcionado a GPC3 em células T resulta na diminuição da expressão de receptor inibitória sustentada em células T isoladas de xenoenxertos de tumor sólido GPC3+
[00278] Um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs (GOT2) (SEQ ID NO: 88) foi coexpresso nas mesmas células T com um polipeptídeo de CAR-T direcionado a GPC3 (SEQ ID NO: 104). As células T foram transduzidas com um vírus que codifica o polipeptídeo de CAR apenas ou CAR e GOT2 separados por uma sequência de salto ribossomal P2A.
[00279] O fenótipo ex vivo das células T CAR foi avaliado após a injeção em um modelo tumoral de camundongo. Para estes experimentos, a linhagem celular tumoral de carcinoma hepatocelular GPC3+, JHH7, foi inoculada em camundongos NSGTM (NOD scid gama, NOD.Cg-Prkdcscid IL2rgtmWj1/SzJ, cepa 005557). O tratamento com células T foi iniciado quando os volumes do tumor atingiram aproximadamente 100 mm3 (dia 11 após a inoculação). Os camundongos foram randomizados em grupos de tratamento de 5 camundongos cada com base no volume do tumor e tratados com células T que expressam CAR direcionado a GPC3 ou células T que coexpressam CAR direcionado a GPC3 e GOT2 a uma dose de 5 x 106 células T CAR+ no dia 11 após a inoculação.
[00280] Os tumores subcutâneos foram colhidos de camundongos com tumor JHH7 nos dias 2, 7 e 14 após a dosagem de células T. Os tumores foram picados com uma lâmina de barbear e digeridos enzimaticamente usando um kit de dissociação de tumor humano (Miltenyi Biotec) durante 1 hora a 37 °C. Os tumores digeridos foram passados através de um filtro de células de 70 µm antes de serem semeados em uma placa de 96 poços para coloração de células.
[00281] Camundongos imunodeficientes com tumores subcutâneos que expressam JHH7 GPC3 estabelecidos foram tratados com uma única injeção intravenosa de 5 x 106 células T que coexpressam CAR e GOT2 ou células T que expressam CAR apenas. Coortes de animais foram sacrificados nos dias 2, 7 e 14 e as células T foram isoladas dos tumores por digestão manual e enzimática. A citometria de fluxo foi realizada, e a intensidade média de fluorescência das moléculas de ativação de CD69, CD25 e ICOS foi quantificada em subconjuntos de células T CD4+ e CD8+. O fenótipo de células T foi avaliado por citometria de fluxo após lise de glóbulos vermelhos e coloração de células. Para essas experiências, as células isoladas de tumores foram coradas com anticorpos anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8, anti-PD-1, anti- TIM-3, anti-CD69, anti-CD25 e anti-ICOS. A intensidade média de fluorescência das moléculas de ativação de CD69, CD25 e ICOS foi quantificada em subconjuntos de células T CD4+ e CD8+ isoladas do tumor no dia 2 (CD69) ou dia 7 (CD25, ICOS) e plotados para cada tipo de célula T. Conforme mostrado nas Figuras 17A-17C, as células T que coexpressam GOT2 e o polipeptídeo de CAR demonstraram expressão aumentada de marcadores de ativação de CD69, CD25 e ICOS em relação às células T que expressam CAR apenas.
[00282] Camundongos imunodeficientes com tumores subcutâneos que expressam JHH7 GPC3 estabelecidos foram tratados com uma única injeção intravenosa de 5 x 106 células T que coexpressam CAR e GOT2 ou células T que expressam CAR apenas. Coortes de animais foram sacrificados nos dias 2, 7 e 14 e as células T foram isoladas dos tumores e do baço por digestão manual e enzimática. A citometria de fluxo foi realizada, e a frequência de células T que coexpressam as moléculas inibidoras de PD-1 e TIM-3 foi quantificada em subconjuntos de células T CD4+ e CD8+. A frequência de células T que coexpressam moléculas inibidoras de PD-1 e TIM-3 foi quantificada em subconjuntos de células T CD4+ e CD8+ isoladas do tumor e plotados para cada tipo de célula T em função do ponto no tempo. As células T que coexpressam CAR e GOT2 exibiram frequência comparável ou mais alta de células T PD-1+TIM-3+ no dia 7 em relação às células T que expressam CAR apenas, mas frequência mais baixa de células T PD- 1+TIM-3+ no dia 14. Figuras 18A-18B. Estes resultados mostram que as células T que coexpressam CAR e GOT2 são mais resistentes à expressão sustentada de receptores inibitórios em relação às células T que expressam CAR apenas. Estas experiências demonstram que a expressão de um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs em células T aumenta a ativação e limita a expressão de receptor inibitória sustentada de células T no microambiente tumoral sólido. Exemplo 21: A coexpressão de um gene modulador do ciclo de Krebs (GOT2) e um CAR direcionado a GPC3 em células T resulta em resistência à expressão de receptor inibitória sustentada em células T isoladas de xenoenxertos de tumor sólido GPC3+
[00283] Um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs (GOT2) (SEQ
ID NO: 88) foi coexpresso nas mesmas células T com um polipeptídeo de CAR-T direcionado a GPC3 (SEQ ID NO: 104). As células T foram transduzidas com um vírus que codifica o polipeptídeo de CAR apenas ou CAR e GOT2 separados por uma sequência de salto ribossomal P2A.
[00284] O fenótipo ex vivo das células T CAR foi avaliado após a injeção em um modelo tumoral de camundongo. Para estes experimentos, a linhagem celular tumoral de carcinoma hepatocelular GPC3+, JHH7, foi inoculada em camundongos NSGTM (NOD scid gama, NOD.Cg-Prkdcscid IL2rgtmWj1/SzJ, cepa 005557). O tratamento com células T foi iniciado quando os volumes do tumor atingiram aproximadamente 80 mm3 (dia 10 após a inoculação). Os camundongos foram randomizados em grupos de tratamento de 3 camundongos cada com base no volume do tumor e tratados com células T que expressam CAR direcionado a GPC3 ou células T que coexpressam CAR direcionado a GPC3 e GOT2 a uma dose de 5 x 106 células T CAR+ no dia 11 após a inoculação.
[00285] Tumores subcutâneos e tecidos do baço foram colhidos de camundongos com tumor JHH7 no dia 1, 6 e 13 após a dosagem de células T. Os tumores foram picados com uma lâmina de barbear e digeridos enzimaticamente usando um kit de dissociação de tumor humano (Miltenyi Biotec) durante 1 hora a 37 °C. Os baços foram dissociados mecanicamente usando a extremidade de um êmbolo de seringa. Os tumores e baços digeridos foram passados através de um filtro de células de 70 µm antes de serem semeados em uma placa de 96 poços para coloração de células.
[00286] Camundongos imunodeficientes com tumores subcutâneos JHH7 que expressam GPC3 estabelecidos foram tratados com uma única injeção intravenosa de 5 x 106 células T que coexpressam CAR e GOT2 ou células T que expressam CAR apenas. Coortes de animais foram sacrificados nos dias 6 e 13 e as células T foram isoladas dos tumores e do baço por digestão manual e enzimática. A citometria de fluxo foi realizada, e a frequência de células T que coexpressam as moléculas inibidoras de PD-1 e TIM-3 foi quantificada em subconjuntos de células T CD4+ e CD8+.
[00287] O fenótipo de células T foi avaliado por citometria de fluxo após lise de glóbulos vermelhos e coloração de células. Para esses experimentos, as células foram coradas com anticorpos anti-CD3, anti- CD4, anti-CD8, anti-PD-1 e anti-TIM-3. A frequência de células T que coexpressam PD-1 e TIM-3 foi quantificada em subconjuntos de células T CD4+ e CD8+. As células T nos subconjuntos CD4+ e CD8+ que coexpressam CAR e GOT2 demonstraram ser comparáveis à frequência mais alta de células T PD-1+ TIM-3+ no dia 6 em relação às células T que expressam CAR apenas, indicando ativação, mas uma frequência diminuída de expressão após a exposição prolongada ao microambiente tumoral (dia 13) comparou as células T que expressam CAR apenas, indicando uma resistência à expressão do receptor inibitório sustentado. As células T isoladas do baço não exibiram expressão de PD-1+ TIM-3+ no dia 6 ou 13, demonstrando a especificidade da ativação apenas para o tumor que expressa GPC3. Figuras 19A-19D. As células T que coexpressam CAR e GOT2 exibiram maior frequência de células T PD-1+ TIM-3+ no dia 6 em relação às células T que expressam CAR apenas. Figuras 19A e 18B. Por outro lado, as células T que coexpressam CAR e GOT2 exibiram menor frequência de células T PD-1+TIM-3+ no dia 13, após exposição prolongada ao microambiente tumoral, indicando uma resistência à expressão sustentada do receptor inibitório, em comparação com células T que expressam CAR apenas. Figuras 19C e 19D. As células T isoladas do baço não exibiram expressão de PD-1+ TIM-3+ no dia 6 ou 13, demonstrando a especificidade da ativação de células T apenas no tumor que expressa GPC3. Figuras 19A-19D.
[00288] Estas experiências demonstram que a expressão de um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs em células T proporciona a expressão de receptor inibidor de resistência sustentada no microambiente tumoral sólido. Exemplo 22: A coexpressão de um gene modulador do ciclo de Krebs (GOT2) e um CAR direcionado a GPC3 em células T resulta em funcionalidade sustentada de células T após exposição ao microambiente tumoral in vivo
[00289] Um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs (GOT2) (SEQ ID NO: 88) foi coexpresso nas mesmas células T com um polipeptídeo de CAR-T direcionado a GPC3 (SEQ ID NO: 104). As células T foram transduzidas com um vírus que codifica o polipeptídeo de CAR apenas ou CAR e GOT2 separados por uma sequência de salto ribossomal P2A.
[00290] A função das células transduzidas por CAR foi avaliada em um modelo tumoral de camundongo. Para estes experimentos, a linhagem celular tumoral de carcinoma hepatocelular GPC3+, JHH7, foi inoculada em camundongos NSGTM (NOD scid gama, NOD.Cg-Prkdcscid IL2rgtmWj1/SzJ, cepa 005557). O tratamento com células T foi iniciado quando os volumes do tumor atingiram aproximadamente 80 mm3 (dia 10 após a inoculação). Os camundongos foram randomizados em grupos de tratamento de 3 camundongos cada um com base no volume do tumor e tratados com células T que expressam CAR direcionado a GPC3 a uma dose de 5 x 106 células T CAR+ no dia 11 após a inoculação.
[00291] Os tumores subcutâneos foram colhidos de camundongos com tumor JHH7 no dia 3 após a dose de CAR. Os tumores foram picados com uma lâmina de barbear e digeridos enzimaticamente usando um kit de dissociação de tumor humano (Miltenyi Biotec) durante
1 hora a 37 °C. Os tumores digeridos foram passados através de um filtro de células de 70 µm antes de serem semeados em uma placa de 24 poços (1 x 106 células/volume de 1 mL). Após incubação por 18 horas a 37 °C em uma incubadora de CO2 a 5%, os sobrenadantes das células foram coletados para análise de citocinas. A concentração de IFN e IL- 17A nos sobrenadantes celulares foi determinada usando ensaio de fluorescência resolvido no tempo homogêneo (Cisbio) e tecnologia de ensaio Meso Scale Discovery V-Plex, respectivamente. Ambos os ensaios foram realizados de acordo com o protocolo do fabricante.
[00292] As células T em tumores de camundongos dosados com células T que coexpressam GOT2 e CAR demonstraram produção aumentada de IFN e IL-17A em relação às células T em tumores de camundongos dosados com células T que expressam CAR apenas. Figuras 20A-20B. Estes experimentos demonstram que a expressão de um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs em células T tem um impacto positivo na função das células T no microambiente tumoral.
OUTRAS MODALIDADES
[00293] Todas as características descritas neste relatório descritivo podem ser combinadas em qualquer combinação. Cada característica descrita neste relatório descritivo pode ser substituída por uma característica alternativa servindo ao mesmo propósito, equivalente ou similar. Assim, a menos que expressamente indicado em contrário, cada característica descrita é apenas um exemplo de uma série genérica de características equivalentes ou similares.
[00294] A partir do relatório descritivo acima, um versado na técnica pode facilmente determinar as características essenciais da presente invenção, e sem desviar de seu espírito e escopo, pode fazer diversas mudanças e modificações da invenção para adaptá-la para diversos usos e condições. Assim, outras modalidades também estão dentro das reivindicações.
EQUIVALENTES
[00295] Embora várias modalidades inventivas tenham sido descritas e ilustradas neste documento, aqueles versados na técnica irão prontamente imaginar uma variedade de outros meios e/ou estruturas para realizar a função e/ou obter os resultados e/ou uma ou mais das vantagens descritas neste documento, e cada uma de tais variações e/ou modificações é considerada como estando dentro do escopo das modalidades inventivas descritas neste documento. De forma mais geral, aqueles versados na técnica apreciarão prontamente que todos os parâmetros, dimensões, materiais e configurações descritos neste documento se destinam a ser exemplificativos e que os parâmetros, dimensões, materiais e/ou configurações reais dependerão da aplicação ou aplicações específicas para o qual os ensinamentos inventivos são usados. Aqueles versados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de verificar o uso de não mais que a experimentação de rotina, muitos equivalentes às modalidades inventivas específicas descritas neste documento. Deve, portanto, ser entendido que as modalidades precedentes são apresentadas a título de exemplo apenas e que, dentro do escopo das reivindicações anexas e equivalentes às mesmas, as modalidades inventivas podem ser praticadas de outra forma diferente da especificamente descrita e reivindicada. Modalidades inventivas da presente invenção são direcionadas a cada característica, sistema, artigo, material, kit e/ou método individual descrito neste documento. Além disso, qualquer combinação de dois ou mais características, sistemas, artigos, materiais, kits e/ou métodos, se essas características, sistemas, artigos, materiais, kits e/ou métodos não forem mutuamente inconsistentes, está incluída no escopo inventivo da presente invenção.
[00296] Todas as definições, conforme definidas e usadas neste documento, devem ser entendidas como controlando as definições de dicionário, definições em documentos incorporados por referência e/ou significados comuns dos termos definidos.
[00297] Todas as referências, patentes e pedidos de patentes descritos neste documento são incorporados por referência em relação ao assunto para o qual cada um é citado, o que em alguns casos pode englobar a totalidade do documento.
[00298] Os artigos indefinidos "um" e "uma", conforme usados neste documento no relatório descritivo e nas reivindicações, a menos que seja claramente indicado o contrário, devem ser entendidos como significando "pelo menos um".
[00299] A frase "e/ou", conforme usada neste documento no relatório descritivo e nas reivindicações, deve ser entendida como significando "um ou ambos" dos elementos assim conjugados, ou seja, elementos que estão conjuntivamente presentes em alguns casos e disjuntivamente presentes em outros casos. Vários elementos listados com "e/ou" devem ser interpretados da mesma maneira, ou seja, "um ou mais" dos elementos assim unidos. Outros elementos podem, opcionalmente, estar presentes além dos elementos especificamente identificados pela cláusula "e/ou", sejam eles relacionados ou não a esses elementos especificamente identificados. Assim, como um exemplo não limitativo, uma referência a "A e/ou B", quando usada em conjunto com a linguagem aberta, como "compreendendo" pode se referir, em uma modalidade, apenas a A (opcionalmente incluindo elementos diferentes de B); em outra modalidade, para B apenas (opcionalmente incluindo elementos diferentes de A); em ainda outra modalidade, para A e B (opcionalmente incluindo outros elementos); etc.
[00300] Conforme usado neste documento no relatório descritivo e nas reivindicações, "ou" deve ser entendido como tendo o mesmo significado que "e/ou" conforme definido acima. Por exemplo, ao separar itens em uma lista, "ou" ou "e/ou" deve ser interpretado como inclusivo, ou seja, a inclusão de pelo menos um, mas também incluindo mais de um, de uma série ou lista de elementos, e, opcionalmente, itens adicionais não listados. Apenas os termos claramente indicados em contrário, como "apenas um de" ou "exatamente um de", ou, quando usados nas reivindicações, "consistindo em", se referem à inclusão de exatamente um elemento de uma série ou lista de elementos. Em geral, o termo "ou", conforme usado neste documento, só deve ser interpretado como indicando alternativas exclusivas (ou seja, "um ou outro, mas não ambos") quando precedido por termos de exclusividade, como "qualquer um", "um de", "apenas um de" ou "exatamente um de". "Consistindo essencialmente em", quando usado nas reivindicações, deve ter seu significado comum conforme usado no campo do direito de patentes.
[00301] Conforme usado neste documento no relatório descritivo e nas reivindicações, a frase "pelo menos um", em referência a uma lista de um ou mais elementos, deve ser entendida como significando pelo menos um elemento selecionado a partir de qualquer um ou mais dos elementos na lista de elementos, mas não necessariamente incluindo pelo menos um de cada um dos elementos especificamente listados na lista de elementos e não excluindo quaisquer combinações de elementos na lista de elementos. Esta definição também permite que elementos possam opcionalmente estar presentes diferentes dos elementos especificamente identificados na lista de elementos aos quais a frase "pelo menos um" se refere, sejam eles relacionados ou não àqueles elementos especificamente identificados. Assim, como um exemplo não limitativo, "pelo menos um de A e B" (ou, equivalentemente, "pelo menos um de A ou B" ou, equivalentemente "pelo menos um de A e/ou B") pode se referir, em uma modalidade, para pelo menos um, opcionalmente incluindo mais de um, A, sem B presente (e opcionalmente incluindo elementos diferentes de B); em outra modalidade, para pelo menos um, opcionalmente incluindo mais de um, B, sem A presente (e opcionalmente incluindo elementos diferentes de A); em ainda outra modalidade, para pelo menos um, opcionalmente incluindo mais de um, A, e pelo menos um, opcionalmente incluindo mais de um, B (e opcionalmente incluindo outros elementos); etc.
[00302] Também deve ser entendido que, a menos que seja claramente indicado o contrário, em quaisquer métodos reivindicados neste documento que incluam mais de uma etapa ou ato, a ordem das etapas ou atos do método não está necessariamente limitada à ordem em que as etapas ou atos do método são recitados.

Claims (103)

REIVINDICAÇÕES
1. Célula hematopoiética geneticamente manipulada, caracterizada pelo fato de que tem um ciclo de Krebs modulado em comparação com uma célula hematopoiética nativa do mesmo tipo.
2. Célula hematopoiética geneticamente manipulada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que expressa ou expressa excessivamente (i) um fator modulador do ciclo de Krebs.
3. Célula hematopoiética geneticamente manipulada, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o fator modulador do ciclo de Krebs é um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs.
4. Célula hematopoiética geneticamente manipulada, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs é (a) uma enzima que catalisa uma reação no ciclo de Krebs, (b) uma enzima que usa um metabólito do ciclo de Krebs como substrato ou (c) uma enzima que converte um precursor em um metabólito do ciclo de Krebs.
5. Célula hematopoiética geneticamente manipulada, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs é (a), que é isocitrato desidrogenase (IDH), malato desidrogenase (MDH) ou fosfoglicerato desidrogenase (PHGDH).
6. Célula hematopoiética geneticamente manipulada, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o IDH é IDH1 ou IDH2 e/ou em que o MDH é MDH1 ou MDH2.
7. Célula hematopoiética geneticamente manipulada, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs é (b), que é uma transaminase glutâmico-oxalacética (GOT) ou fosfoenolpiruvato carboxicinase 1
(PCK1).
8. Célula hematopoiética geneticamente manipulada, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a GOT é GOT1 ou GOT2.
9. Célula hematopoiética geneticamente manipulada, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs é (c), que é fosfoserina aminotransferase (PSAT1), glutamato desidrogenase (GDH1), glutamato-piruvato transaminase 1 (GPT1) ou glutaminase (GLS).
10. Célula hematopoiética geneticamente manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que expressa ainda: (ii) um polipeptídeo do receptor quimérico, em que o polipeptídeo do receptor quimérico compreende: (a) um domínio de ligação ao alvo extracelular; (b) um domínio transmembrana; e (c) um domínio de sinalização citoplasmático.
11. Célula hematopoiética geneticamente manipulada, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo do receptor quimérico é um polipeptídeo do receptor de célula T acoplado ao anticorpo (ACTR), em que (a) é um domínio de ligação a Fc extracelular.
12. Célula hematopoiética geneticamente manipulada, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo do receptor quimérico é um polipeptídeo do antígeno do receptor quimérico (CAR), em que (a) é um domínio de ligação ao antígeno extracelular.
13. Célula hematopoiética geneticamente manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo do receptor quimérico compreende ainda pelo menos um domínio de sinalização coestimulador.
14. Célula hematopoiética geneticamente manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo do receptor quimérico, que opcionalmente é um polipeptídeo de ACTR, está livre de domínios de sinalização coestimuladores.
15. Célula hematopoiética geneticamente manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 14, caracterizada pelo fato de que o domínio de sinalização citoplasmático compreende um motivo de ativação do imunorreceptor baseado em tirosina (ITAM).
16. Célula hematopoiética geneticamente manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 15, caracterizada pelo fato de que (c) está localizado no terminal C do polipeptídeo do receptor quimérico.
17. Célula hematopoiética geneticamente manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 16, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo do receptor quimérico compreende ainda um domínio de dobradiça, que está localizado no terminal C de (a) e no terminal N de (b).
18. Célula hematopoiética geneticamente manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 17, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo do receptor quimérico compreende ainda um peptídeo sinal em seu terminal N.
19. Célula hematopoiética geneticamente manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 18, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo do receptor quimérico é um polipeptídeo de ACTR, em que o domínio de ligação ao alvo extracelular (a) é um domínio de ligação a Fc extracelular e em que o domínio de ligação a Fc é selecionado do grupo que consiste em: (A) um domínio de ligação ao ligante extracelular de um receptor Fc, (B) um fragmento de anticorpo que se liga à porção Fc de uma imunoglobulina, (C) uma proteína de ocorrência natural que se liga à porção Fc de uma imunoglobulina ou um fragmento de ligação ao Fc desta e (D) um polipeptídeo sintético que se liga à porção Fc de uma imunoglobulina.
20. Célula hematopoiética geneticamente manipulada, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que o domínio de ligação a Fc é (A), que é um domínio de ligação ao ligante extracelular de um receptor Fc-gama, um receptor Fc-alfa ou um receptor Fc-épsilon.
21. Célula hematopoiética geneticamente manipulada, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que o domínio de ligação a Fc é um domínio de ligação ao ligante extracelular de CD16A, CD32A ou CD64A.
22. Célula hematopoiética geneticamente manipulada, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que o domínio de ligação a Fc é um domínio de ligação ao ligante extracelular de F158 CD16A ou V158 CD16A.
23. Célula hematopoiética geneticamente manipulada, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que o domínio de ligação a Fc é (B), que é um fragmento variável de cadeia única (scFv) ou um anticorpo de domínio único.
24. Célula hematopoiética geneticamente manipulada, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que o domínio de ligação a Fc é (C), que é Proteína A ou Proteína G ou um fragmento de ligação a Fc desta.
25. Célula hematopoiética geneticamente manipulada, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que o domínio de ligação a Fc é (D), que é um peptídeo Kunitz, um SMIP, um avimer, um affibody, um DARPin ou um anticalin.
26. Célula hematopoiética geneticamente manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 18, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo do receptor quimérico é um polipeptídeo de CAR, em que o domínio de ligação ao alvo extracelular de (a) é um domínio de ligação ao antígeno e em que o domínio de ligação ao antígeno é um fragmento de anticorpo de cadeia única que se liga a um antígeno tumoral, um antígeno patogênico ou uma célula imune específica para um autoantígeno.
27. Célula hematopoiética geneticamente manipulada, de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que o antígeno tumoral está associado a um tumor hematológico.
28. Célula hematopoiética geneticamente manipulada, de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que o antígeno tumoral é selecionado do grupo que consiste em CD19, CD20, CD22, cadeia Kappa, CD30, CD123, CD33, LeY, CD138, CD5, BCMA, CD7, CD40 e IL-1RAP.
29. Célula hematopoiética geneticamente manipulada, de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que o antígeno tumoral está associado a um tumor sólido.
30. Célula hematopoiética geneticamente manipulada, de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato de que o antígeno tumoral é selecionado do grupo que consiste em GD2, GPC3, FOLR, HER2, EphA2, EFGRVIII, IL13RA2, VEGFR2, ROR1, NKG2D, EpCAM, CEA, Mesotelina, MUC1, CLDN18.2, CD171, CD133, PSCA, cMET, EGFR, PSMA, FAP, CD70, MUC16, L1-CAM e CAIX.
31. Célula hematopoiética geneticamente manipulada, de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que o antígeno patogênico é um antígeno bacteriano, um antígeno viral ou um antígeno fúngico.
32. Célula hematopoiética geneticamente manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 31, caracterizada pelo fato de que o domínio transmembrana de (b) é de uma proteína de membrana de passagem única.
33. Célula hematopoiética geneticamente manipulada, de acordo com a reivindicação 32, caracterizada pelo fato de que o domínio transmembrana é de uma proteína de membrana selecionada do grupo que consiste em CD8, CD8, 4-1BB, CD28, CD34, CD4, FcRI, CD16A, OX40, CD3, CD3, CD3, CD3, TCR, CD32, CD64, VEGFR2, FAS e FGFR2B.
34. Célula hematopoiética geneticamente manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 31, caracterizada pelo fato de que o domínio transmembrana de (b) é um segmento de proteína hidrofóbica de ocorrência não natural.
35. Célula hematopoiética geneticamente manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 13 e 15 a 34, caracterizada pelo fato de que pelo menos um domínio de sinalização coestimulador é de uma molécula coestimuladora selecionada do grupo que consiste em 4-1BB, CD28, variante de CD28LLGG, OX40, ICOS, CD27, GITR, ICOS, HVEM, TIM1, LFA1 e CD2.
36. Célula hematopoiética geneticamente manipulada, de acordo com a reivindicação 35, caracterizada pelo fato de que pelo menos um domínio de sinalização coestimulador é um domínio de sinalização coestimulador CD28 ou um domínio de sinalização coestimulador 4-1BB.
37. Célula hematopoiética geneticamente manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 13 e 15 a 36, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo do receptor quimérico compreende dois domínios de sinalização coestimuladores.
38. Célula hematopoiética geneticamente manipulada, de acordo com a reivindicação 37, caracterizada pelo fato de que os dois domínios coestimuladores são: (i) CD28 e 4-1BB; ou (ii) Variante de CD28LLGG e 4-1BB.
39. Célula hematopoiética geneticamente manipulada, de acordo com a reivindicação 37, caracterizada pelo fato de que um dos domínios de sinalização coestimuladores é um domínio de sinalização coestimulador CD28; e em que o outro domínio coestimulador é selecionado do grupo que consiste em um domínio de sinalização coestimulador 4-1BB, um domínio de sinalização coestimulador OX40, um domínio de sinalização coestimulador CD27 e um domínio de sinalização coestimulador ICOS.
40. Célula hematopoiética geneticamente manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 39, caracterizada pelo fato de que o domínio de sinalização citoplasmático de (c) é um domínio citoplasmático de CD3ou FcεR1γ.
41. Célula hematopoiética geneticamente manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 40, caracterizada pelo fato de que o domínio de dobradiça tem 1 a 60 aminoácidos de comprimento.
42. Célula hematopoiética geneticamente manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 41, caracterizada pelo fato de que o domínio de dobradiça é CD28, CD16A, CD8 ou IgG.
43. Célula hematopoiética geneticamente manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 42, caracterizada pelo fato de que o domínio de dobradiça é um peptídeo de ocorrência não natural.
44. Célula hematopoiética geneticamente manipulada, de acordo com a reivindicação 43, caracterizada pelo fato de que o domínio de dobradiça é um polipeptídeo recombinante estendido (XTEN) ou um polipeptídeo (Gly4Ser)n, em que n é um número inteiro de 3-12, inclusive.
45. Célula hematopoiética geneticamente manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 16 e 18- a 40, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo do receptor quimérico, que opcionalmente é um polipeptídeo de ACTR, está livre de qualquer domínio de dobradiça.
46. Célula hematopoiética geneticamente manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 44, caracterizada pelo fato de que o receptor quimérico, que opcionalmente é um polipeptídeo de ACTR, está livre de um domínio de dobradiça de qualquer receptor não CD16A.
47. Célula hematopoiética geneticamente manipulada, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo de ACTR compreende (i) um domínio coestimulador CD28; e (ii) um domínio transmembrana CD28, um domínio de dobradiça CD28 ou uma combinação destes.
48. Célula hematopoiética geneticamente manipulada, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo de ACTR compreende os componentes (a)-(e), conforme mostrado na Tabela 3.
49. Célula hematopoiética geneticamente manipulada, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo de ACTR compreende a sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID NOs:1-80.
50. Célula hematopoiética geneticamente manipulada, de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo do receptor quimérico é um polipeptídeo de CAR, que compreende (i) um domínio coestimulador CD28 em combinação com um domínio transmembrana CD28, um domínio de dobradiça CD28 ou uma combinação destes ou (ii) um domínio coestimulador 4-1BB em combinação com um domínio transmembrana CD8, um domínio de dobradiça CD8 ou uma combinação destes.
51. Célula hematopoiética geneticamente manipulada, de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo de CAR compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 104 ou 105.
52. Célula hematopoiética geneticamente manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 51, caracterizada pelo fato de que a célula hematopoiética é uma célula-tronco hematopoiética ou uma célula imune, opcionalmente, em que a célula imune é uma célula killer natural, macrófago, neutrófilo, eosinófilo ou célula T.
53. Célula hematopoiética geneticamente manipulada, de acordo com a reivindicação 52, caracterizada pelo fato de que a célula imune é uma célula T na qual a expressão de um receptor de célula T endógeno, um complexo principal de histocompatibilidade endógeno, uma beta-2-microglobulina endógena ou uma combinação destes, foi inibida ou eliminada.
54. Célula hematopoiética geneticamente manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 53, caracterizada pelo fato de que a célula hematopoiética é uma célula imune, que é derivada de células mononucleares de sangue periférico (PBMC), células-tronco hematopoiéticas (HSCs) ou células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs).
55. Célula hematopoiética geneticamente manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 54, caracterizada pelo fato de que a célula hematopoiética compreende um ácido nucleico ou conjunto de ácido nucleico, que compreende coletivamente: (A) uma primeira sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo modulador do metabólito do ciclo de Krebs; e opcionalmente (B) uma segunda sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo do receptor quimérico.
56. Célula hematopoiética geneticamente manipulada, de acordo com a reivindicação 55, caracterizada pelo fato de que o ácido nucleico ou o conjunto de ácido nucleico é uma molécula de RNA ou um conjunto de moléculas de RNA.
57. Célula hematopoiética geneticamente manipulada, de acordo com a reivindicação 55 ou 56, caracterizada pelo fato de que a célula hematopoiética compreende o ácido nucleico, que compreende a primeira sequência de nucleotídeos e a segunda sequência de nucleotídeos.
58. Célula hematopoiética geneticamente manipulada, de acordo com a reivindicação 57, caracterizada pelo fato de que o ácido nucleico compreende ainda uma terceira sequência de nucleotídeos localizada entre a primeira sequência de nucleotídeos e a segunda sequência de nucleotídeos, em que a terceira sequência de nucleotídeos codifica um sítio de salto (skipping) ribossomal, um sítio de entrada de ribossomo interno (IRES) ou um segundo promotor.
59. Célula hematopoiética geneticamente manipulada, de acordo com a reivindicação 57, caracterizada pelo fato de que a terceira sequência de nucleotídeos codifica um sítio de salto ribossomal, que é um peptídeo P2A.
60. Célula hematopoiética geneticamente manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 55 a 59, caracterizada pelo fato de que o ácido nucleico ou o conjunto de ácido nucleico está compreendido em um vetor ou um conjunto de vetores.
61. Célula hematopoiética geneticamente manipulada, de acordo com a reivindicação 60, caracterizada pelo fato de que o vetor ou conjunto de vetores é um vetor de expressão ou um conjunto de vetores de expressão.
62. Célula hematopoiética geneticamente manipulada, de acordo com a reivindicação 60 ou 61, caracterizada pelo fato de que o vetor ou conjunto de vetores compreende um ou mais vetores virais.
63. Célula hematopoiética geneticamente manipulada, de acordo com a reivindicação 62, caracterizada pelo fato de que um ou mais vetores virais é um vetor retroviral, que opcionalmente é um vetor lentiviral ou gama-retroviral.
64. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de compreender uma célula hematopoiética geneticamente manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 63, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
65. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 64, caracterizada pelo fato de que a célula hematopoiética geneticamente manipulada expressa um polipeptídeo de ACTR e em que a composição compreende ainda um agente terapêutico contendo Fc.
66. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 65, caracterizada pelo fato de que o agente terapêutico contendo Fc é um anticorpo terapêutico ou uma proteína de fusão Fc.
67. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 65 ou 66, caracterizada pelo fato de que o agente terapêutico contendo Fc se liga a um antígeno alvo, que opcionalmente é um antígeno tumoral, um antígeno patogênico ou uma célula imune específica para um autoantígeno.
68. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 67, caracterizada pelo fato de que o antígeno patogênico é um antígeno bacteriano, um antígeno viral ou um antígeno fúngico.
69. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 68, caracterizada pelo fato de que o agente terapêutico contendo Fc é um anticorpo terapêutico selecionado do grupo que consiste em Adalimumabe, Ado-Trastuzumabe entansina, Alemtuzumabe, Basiliximabe, Bevacizumabe, Belimumabe, Brentuximabe, Canakinumabe, Cetuximabe, Certolizumabe, Daclizumabe, Denosumabe, Dinutuximabe, Eculizumabe, Efalizumabe, Epratuzumabe, Gemtuzumabe, Golimumabe, hu14.18K322A, Ibritumomabe, Infliximabe, Ipilimumabe, Labetuzumabe, Muromonabe, Natalizumabe, Obinutuzumabe, Ofatumumabe, Omalizumabe, Palivizumabe, Panitumumabe, Pertuzumabe, Ramucirumabe, Ranibizumabe, Rituximabe, Tocilizumabe, Trastuzumabe, Tositumomabe, Ustekinumabe e Vedolizumabe.
70. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende: uma primeira composição farmacêutica que compreende uma célula hematopoiética geneticamente manipulada, como definida em qualquer uma das reivindicações 10 a 63, e um veículo farmaceuticamente aceitável; e uma segunda composição farmacêutica que compreende um agente terapêutico contendo Fc e um veículo farmaceuticamente aceitável.
71. Kit, de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico contendo Fc é uma proteína de fusão Fc ou um anticorpo terapêutico.
72. Kit, de acordo com a reivindicação 70 ou 71, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico contendo Fc se liga a um antígeno alvo, que opcionalmente é um antígeno tumoral, um antígeno patogênico ou uma célula imune específica para um autoantígeno.
73. Kit, de acordo com a reivindicação 72, caracterizada pelo fato de que o anticorpo terapêutico é selecionado do grupo que consiste em Adalimumabe, Ado-Trastuzumabe entansina, Alemtuzumabe, Basiliximabe, Bevacizumabe, Belimumabe, Brentuximabe, Canakinumabe, Cetuximabe, Certolizumabe, Daclizumabe, Denosumabe, Dinutuximabe, Eculizumabe, Efalizumabe, Epratuzumabe, Gemtuzumabe, Golimumabe, hu14.18K322A, Ibritumomabe, Infliximabe, Ipilimumabe, Labetuzumabe, Muromonabe, Natalizumabe, Obinutuzumabe, Ofatumumabe, Omalizumabe, Palivizumabe, Panitumumabe, Pertuzumabe, Ramucirumabe, Ranibizumabe, Rituximabe, Tocilizumabe, Trastuzumabe, Tositumomabe, Ustekinumabe e Vedolizumabe.
74. Método para inibir células que expressam um antígeno alvo em um indivíduo, sendo o método caracterizado pelo fato de que compreende administrar a um indivíduo em necessidade uma população de células hematopoiéticas geneticamente manipuladas, como definidas em qualquer uma das reivindicações 10 a 63.
75. Método, de acordo com a reivindicação 74, caracterizado pelo fato de que as células hematopoiéticas geneticamente manipuladas expressam um polipeptídeo de ACTR e em que o indivíduo foi tratado ou está sendo tratado com um agente terapêutico contendo Fc específico para um antígeno alvo.
76. Método, de acordo com a reivindicação 74, caracterizado pelo fato de que as células hematopoiéticas geneticamente manipuladas expressam um polipeptídeo de CAR, que compreende um domínio de ligação ao antígeno extracelular específico para um antígeno alvo.
77. Método, de acordo com a reivindicação 75 ou 76, caracterizado pelo fato de que o antígeno alvo é um antígeno tumoral, um antígeno patogênico ou uma célula imune específica para um autoantígeno.
78. Método, de acordo com a reivindicação 77,
caracterizado pelo fato de que o antígeno patogênico é um antígeno bacteriano, um antígeno viral ou um antígeno fúngico.
79. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 75 a 78, caracterizado pelo fato de que pelo menos algumas das células que expressam o antígeno alvo estão localizadas em um ambiente com baixo teor de glicose.
80. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 74 a 79, caracterizado pelo fato de que as células hematopoiéticas geneticamente manipuladas são autólogas.
81. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 74 a 79, caracterizado pelo fato de que as células hematopoiéticas geneticamente manipuladas são alogênicas.
82. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 74 a 81, caracterizado pelo fato de que as células hematopoiéticas geneticamente manipuladas são ativadas, expandidas ou ambas ex vivo.
83. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 75 e 77 a 80, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico contendo Fc é um anticorpo terapêutico ou uma proteína de fusão Fc.
84. Método, de acordo com a reivindicação 83, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico contendo Fc é um anticorpo terapêutico selecionado do grupo que consiste em Adalimumabe, Ado-Trastuzumabe entansina, Alemtuzumabe, Basiliximabe, Bevacizumabe, Belimumabe, Brentuximabe, Canakinumabe, Cetuximabe, Certolizumabe, Daclizumabe, Denosumabe, Dinutuximabe, Eculizumabe, Efalizumabe, Epratuzumabe, Gemtuzumabe, Golimumabe, hu14.18K322A, Ibritumomabe, Infliximabe, Ipilimumabe, Labetuzumabe, Muromonabe, Natalizumabe, Obinutuzumabe, Ofatumumabe, Obinutuzumabe,
Omalizumabe, Palivizumabe, Panitumumabe, Pertuzumabe, Ramucirumabe, Ranibizumabe, Rituximabe, Tocilizumabe, Tositumomabe, Trastuzumabe, Ustekinumabe e Vedolizumabe.
85. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 74 a 84, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um paciente humano que sofre de um câncer e o antígeno alvo é um antígeno tumoral.
86. Método, de acordo com a reivindicação 85, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado do grupo que consiste em carcinoma, linfoma, sarcoma, blastoma e leucemia.
87. Método, de acordo com a reivindicação 85 ou 86, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado do grupo que consiste em um câncer de origem de células B, câncer de mama, câncer gástrico, neuroblastoma, osteossarcoma, câncer de pulmão, câncer de pele, câncer de próstata, câncer de cólon, carcinoma de células renais, câncer de ovário, rabdomiossarcoma, leucemia, mesotelioma, câncer de pâncreas, câncer de cabeça e pescoço, retinoblastoma, glioma, glioblastoma, câncer de fígado e câncer de tireoide.
88. Método, de acordo com a reivindicação 87, caracterizado pelo fato de que o câncer de origem de células B é selecionado do grupo que consiste em leucemia linfoblástica aguda de linhagem B, leucemia linfocítica crônica de células B e linfoma não- Hodgkin de células B.
89. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 74 a 88, caracterizado pelo fato de que as células hematopoiéticas geneticamente manipuladas compreendem células T, que são ativadas na presença de um ou mais entre anticorpo anti-CD3, anticorpo anti-CD28, IL-2, fito-hemaglutinina e um célula ou partícula estimuladora artificial manipulada.
90. Método, de acordo com a reivindicação 74,
caracterizado pelo fato de que as células hematopoiéticas geneticamente manipuladas compreendem células killer naturais, que são ativadas na presença de um ou mais ligante 4-1BB, anticorpo anti- 4-1BB, IL-15, anticorpo do receptor de anti-IL-15, células IL-2, IL-12, IL- 21, K562 e uma célula ou partícula estimuladora artificial manipulada.
91. Ácido nucleico ou conjunto de ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que compreende coletivamente: (A) uma primeira sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo do receptor de células T acoplado ao anticorpo (ACTR), como definido em qualquer uma das reivindicações 10 a 51; e (B) uma segunda sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs.
92. Ácido nucleico ou conjunto de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 91, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo modulador do ciclo de Krebs é selecionado do grupo que consiste em: fosfoenolpiruvato carboxicinase 1 (PCK1), transaminase glutâmico- oxalacética (GOT), isocitrato desidrogenase (IDH), malato desidrogenase (MDH), fosfoglicerato desidrogenase (PHGDH), fosfoserina aminotransferase (PSAT1), glutamato desidrogenase (GDH1), glutamato-piruvato transaminase 1 (GPT1) e glutaminase (GLS).
93. Ácido nucleico ou conjunto de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 92, caracterizado pelo fato de que a GOT é GOT1 ou GOT2.
94. Ácido nucleico ou conjunto de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 92, caracterizado pelo fato de que a IDH é IDH1 ou IDH2 e/ou a MDH é MDH1 ou MDH2.
95. Ácido nucleico ou conjunto de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 89 a 94, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico ou o conjunto de ácido nucleico é uma molécula de RNA ou um conjunto de moléculas de RNA.
96. Ácido nucleico ou conjunto de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 89 a 95, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico compreende tanto a primeira sequência de nucleotídeos quanto a segunda sequência de nucleotídeos e em que o ácido nucleico compreende ainda uma terceira sequência de nucleotídeos localizada entre a primeira sequência de nucleotídeos e a segunda sequência de nucleotídeos, em que a terceira sequência de nucleotídeos que codifica um sítio de salto ribossomal, um sítio de entrada de ribossomo interno (IRES) ou um segundo promotor.
97. Ácido nucleico ou conjunto de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 96, caracterizado pelo fato de que o sítio de salto ribossomal é um peptídeo P2A.
98. Ácido nucleico ou conjunto de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 97, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico ou o conjunto de ácido nucleico está compreendido dentro de um vetor ou um conjunto de vetores.
99. Ácido nucleico ou conjunto de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 98, caracterizado pelo fato de que o vetor ou conjunto de vetores é um vetor de expressão ou um conjunto de vetores de expressão.
100. Ácido nucleico ou conjunto de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 98 ou 99, caracterizado pelo fato de que o vetor ou conjunto de vetores compreende um ou mais vetores virais.
101. Ácido nucleico ou conjunto de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 100, caracterizado pelo fato de que um ou mais vetores virais é um vetor retroviral, que opcionalmente é um vetor lentiviral ou vetor gama-retroviral.
102. Método para gerar células hematopoiéticas modificadas in vivo, sendo o método caracterizado pelo fato de que compreende administrar a um indivíduo em necessidade o ácido nucleico ou conjunto de ácido nucleico, como definido em qualquer uma das reivindicações 91 a 101.
103. Método, de acordo com a reivindicação 101, caracterizado pelo fato de que compreende ainda administrar ao indivíduo um agente terapêutico contendo Fc específico para o antígeno alvo.
Petição 870210023534, de 12/03/2021, pág. 214/238 Figura 1
Hep3B simulada JHH7 simulada 1/20
Contagem de Células T Conc.
De Glicose (mM)
Figura 2B
Simuladas Contagem de células T Figura 2A
Simuladas
Contagem de Células T
Figura 3B
Simuladas Contagem de Células T Figura 3A
Simuladas
Contagem de Células T
Sem células T Figura 4
Dia
Volume Tumoral (mm³, média ± DP)
Sem células T Figura 5
Dia
Volume Tumoral (mm³, média ± DP)
Sem células T Figura 6
Dia
Volume Tumoral (mm³, média ± DP)
Figura 7
Dia
Cont. de CAR/µL de sangue (mm³, média ± DP)
Figura 8B
Atividade enzimática das células T Figura 8A
Petição 870210023534, de 12/03/2021, pág. 222/238 Proliferação em relação à origem Figura 9A
Proliferação em relação à origem Figura 9B 9/20
Figura 10C Figura 10B Figura 10A
Petição 870210023534, de 12/03/2021, pág. 224/238 Figura 11A Figura 11B Figura 11C 11/20
Percentual (%)
Percentual (%) Percentual (%) Número de Citocinas Número de Citocinas Número de Citocinas
Figura 12C
Percentual (%) Figura 12B
Percentual (%) Figura 12A
Percentual (%)
Figura 13
Concentração de Oxigênio (%) Figura 14
Concentração de Oxigênio (%) Figura 15
Quinurenina (uM) Figura 16
Absorção de BrdU (RLU)
Figura 17C
MFI Geométrica Figura 17B
MFI Geométrica Figura 17A
MFI Geométrica
Figura 18B
Dia Percentual (%) Figura 18A
Dia
Percentual (%)
PD-1+TIM-3+ Duplo Positivo
Petição 870210023534, de 12/03/2021, pág. 232/238 Figura 19A Figura 19B
Dia 6
Percentual (%) Percentual (%) Baço Baço Figura 19C Figura 19D 19/20
Dia 13
Percentual (%) Percentual (%)
Baço Baço (percentual de CD4+CD3+) (percentual de CD8+CD3+)
Figura 20B
IFNγ por célula T (pg/mL) Figura 20A
IL-17A por célula T (pg/mL)
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