CN110494162A - 改良的抗体-偶联t细胞受体构建体及其治疗用途 - Google Patents

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Abstract

本文公开了抗体偶联的T细胞受体(ACTR)多肽，其包含：CD16A细胞外结构域、跨膜结构域、一个或多个共刺激信号域，其中至少一个共刺激信号域是CD28共刺激信号域，和CD3ζ胞质信号域。本文还公开了基因工程免疫细胞，其表达：抗体偶联的T细胞受体(ACTR)的第一多肽；引发共刺激信号的第二多肽以及增强受试者中抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的方法，包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的治疗性抗体和有效量的表达抗体偶联的T细胞受体(ACTR)多肽的免疫细胞(例如，T淋巴细胞和/或NK细胞)。

Description

改良的抗体-偶联T细胞受体构建体及其治疗用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年1月30日提交的美国临时申请No.62/451,992和2017年10月28日提交的美国临时申请No.62/578,429的申请日的权益。这些参考申请中的每一个的全部内容通过引用并入本文。
背景技术
癌症免疫疗法，包括基于细胞的疗法、抗体疗法和细胞因子疗法，用于激发攻击肿瘤细胞的免疫应答，同时保留正常组织。这有望治疗各种类型癌症，因其可能规避抗药性的遗传和细胞机制，并且在保留正常组织的同时靶向肿瘤细胞。正如针对血液系统恶性肿瘤的异基因造血干细胞移植(HSCT)的结果所证明，T淋巴细胞可以发挥重要的抗肿瘤作用，而T细胞介导的移植物抗宿主病(GvHD)与疾病复发呈负相关，免疫抑制剂撤退或供体淋巴细胞输入可牵制复发。Weiden等人，N EnglJ Med.1979；300(19):1068-1073；Porter等人，NEnglJ Med.1994；330(2):100-106；Kolb等人，Blood.1995；86(5):2041-2050；Slavin等人，Blood.1996；87(6):2195-2204；和Appelbaum，Nature.2001；411(6835):385-389。
基于细胞的疗法可能涉及具有癌细胞偏态反应性的细胞毒性T细胞。Eshhar等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.；1993；90(2):720-724；Geiger等人，J Immunol.1999；162(10):5931-5939；Brentjens等人，Nat.Med.2003；9(3):279-286；Cooper等人，血液Blood.2003；101(4):1637-1644；和Imai等人，白血病Leukemia.2004；18:676-684。一种方法是表达嵌合受体，所述嵌合受体具有与一个或多个T细胞活化信号域融合的抗原结合结构域。通过抗原结合结构域与癌症抗原结合，导致T细胞活化并引发细胞毒性。临床试验输入表达嵌合受体的自体T淋巴细胞，最新临床试验结果为其临床潜力提供了令人信服的证据。Pule等人，Nat.Med.2008；14(11):1264-1270；Porter等人，N Engl J Med；2011；25；365(8):725-733；Brentjens等人，血液Blood.2011；118(18):4817-4828；Till等人，血液Blood.2012；119(17):3940-3950；Kochenderfer等人，血液Blood.2012；119(12):2709-2720；和Brentjens等人，Sci Transl Med.2013；5(177):177ra138。
另一种方法是在免疫细胞(例如NK细胞或T细胞)中表达抗体偶联的T细胞受体(ACTR)蛋白，该ACTR蛋白含有细胞外Fc结合结构域。当表达ACTR的T细胞(也称为“ACTR T细胞”)与抗癌抗体一起施用于受试者时，它们可以通过与抗体的Fc结构域结合，增强其对抗体靶向的癌细胞的毒性。Kudo等人，癌症研究Cancer Research(2014)74:93-103。
使用基于抗体的免疫疗法，例如单克隆抗体、抗体-融合蛋白、和抗体药物偶联物(ADC)，治疗多种疾病，包括多种癌症。此类疗法可能依靠识别细胞表面分子，该细胞表面分子的表达在需要清除的细胞(例如，靶细胞，如癌细胞)上与正常细胞(例如，非癌细胞)存在差异。基于抗体的免疫疗法与癌细胞的结合可通过各种机制导致癌细胞死亡，例如，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)、或抗体-药物偶联物(ADC)负载的直接细胞毒性。
发明内容
本公开基于开发改良的抗体偶联T细胞受体(ACTR)，这种改良ACTR显示出优异的体外和/或体内生物活性，包括治疗活性。这种改良ACTR构建体可含有CD28共刺激结构域。或者或另外，本文所述的改良ACTR构建体可以不具有或具有缩短的铰链结构域。表达本文所述的改良ACTR构建体的T细胞，或者单独使用，或者与能够引发共刺激信号传导的分离的多肽组合，表现出优异的体内和体外生物活性，包括细胞毒性、细胞增殖和活化(例如，IL-2产生，CD3+细胞的百分比)、和/或体内抗肿瘤活性。
因此，本文提供了具有一种或多种生物活性增强的ACTR多肽、编码其的核酸、表达ACTR的免疫细胞(例如，T细胞或天然杀伤细胞)，以及任选地能够引发共刺激信号传导的分离的多肽，及其在免疫疗法中(联合治疗性抗体)的用途。
因此，本发明的一个方面，特征在于，抗体偶联的T细胞受体(ACTR)多肽，其包含：(i)CD16A细胞外结构域，(ii)跨膜结构域，(iii)一个或多个共刺激信号传导结构域，其中至少一个是CD28共刺激信号传导结构域，和(iv)CD3ζ胞质信号传导结构域。
本公开的另一方面，特征在于，抗体偶联的T细胞受体(ACTR)多肽，其包含：(i)CD16A细胞外结构域，(ii)跨膜结构域，(iii)一个或多个共刺激信号传导结构域，其中至少一个是CD28共刺激信号传导结构域，和(iv)CD3ζ胞质传导结构域。如果跨膜结构域(ii)是CD8跨膜结构域，则ACTR多肽或者不含来自任何非CD16A受体的铰链结构域，或者包含一个以上的共刺激信号传导结构域。
在一些实施方案中，ACTR多肽还包含铰链结构域，其长度可为1至60个氨基酸残基(例如，长度为1至30个氨基酸残基，或长度为31至60个氨基酸残基)。在其他实施方案中，本文描述的ACTR多肽可以不含来自非CD16A受体的任何铰链结构域。在一些实例中，ACTR多肽可以不含任何铰链结构域。
在一些实施方案中，铰链结构域是CD16A铰链结构域、非CD16A受体铰链结构域、或其组合。在某些实施方案中，铰链结构域包含CD28铰链结构域。
在一些实施方案中，跨膜结构域(ii)是CD28跨膜结构域。在那种情况下，ACTR多肽可以不含来自任何非CD16A受体的任何铰链结构域，和/或包含一个以上的共刺激结构域。
在一些实施方案中，ACTR多肽包含(i)CD28共刺激结构域；和(ii)CD28跨膜结构域、CD28铰链结构域、或其组合。
在一些实例中，ACTR多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、或SEQ ID NO:27。
在一些实施方案中，ACTR多肽包含两个共刺激信号域，一个是CD28共刺激信号域，另一个是4-1BB共刺激信号域或OX40共刺激信号域。在一些实施方案中，其他共刺激信号域是4-1BB共刺激信号域。在某些实施方案中，4-1BB信号域位于CD28共刺激信号域的N末端。在某些实施方案中，4-1BB信号域位于CD28共刺激信号域的C末端。在一些实施方案中，其他共刺激信号域是OX40共刺激信号域。在某些实施方案中，OX40共刺激信号域位于CD28共刺激信号域的C末端。在某些实施方案中，OX40共刺激信号域位于CD28共刺激信号域的N末端。
在一些实施方案中，跨膜结构域(ii)是CD8跨膜结构域。
在一些实施方案中，本文所述的任何ACTR多肽可以还包含CD8铰链结构域。在某些实例中，ACTR多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8。
在一个方面，本公开提供了一种抗体偶联的T细胞受体(ACTR)多肽，其包含：(i)CD16A细胞外结构域，(ii)跨膜结构域，和(iii)CD3ζ胞质信号域。这种ACTR多肽可以不含来自任何非CD16A受体的铰链结构域(例如，不含任何铰链结构域)。
在一些实施方案中，ACTR多肽还包含一个或多个共刺激信号域。在某些实施方案中，所述一种或多种共刺激信号域选自CD27、CD28、4-1BB、ICOS和OX40。
在一些实施方案中，ACTR多肽包含两个共刺激信号域。在一些实施方案中，两个共刺激信号域之一是CD28共刺激信号域，另一个是4-1BB共刺激信号域、OX40共刺激信号域、CD27共刺激信号域，或ICOS共刺激信号结构域。在一些实施方案中，其他共刺激信号域是4-1BB共刺激信号域。在某些实施方案中，4-1BB共刺激信号域位于CD28共刺激信号域的N末端。在某些实施方案中，4-1BB共刺激信号域位于CD28共刺激信号域的C末端。在一些实施方案中，其他共刺激信号域是OX40共刺激信号域。在某些实施方案中，OX40共刺激信号域位于CD28共刺激信号域的C末端。在某些实施方案中，OX40共刺激信号域位于CD28共刺激信号域的N末端。
在一些实施方案中，ACTR多肽含有单个(即，仅一个)共刺激信号域。在一些实施方案中，单个共刺激信号域来自CD28。在一些实施方案中，跨膜结构域是CD8跨膜结构域。在具体的实施方案中，ACTR多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:13、或SEQ ID NO:17。
在一个方面，本公开内容提供了核酸，其包含编码第一多肽的第一核苷酸序列，所述第一多肽是本文公开的任一ACTR多肽，并且任选地可以包含编码引发共刺激信号的第二多肽的第二核苷酸序列。在一些实施方案中，第二多肽包含共刺激信号域、共刺激受体、共刺激受体的结合部分、或共刺激受体的配体。在一些实施方案中，第二多肽可包含与4-1BB、ICOS、OX40、CD27或CD28的结合部分(例如，单链抗体(scFv))。在一些实施方案中，第二多肽包含4-1BBL、CD80、CD86、OX40L、ICOSL、CD70、或其组合。在某些实施方案中，第二多肽可以是4-1BBL。
在一些实例中，第一多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:38，和/或第二多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:39。在一些实例中，第一多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:13，和/或第二多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:24。
在一些实施方案中，所述核酸还包含位于第一核苷酸序列和第二核苷酸序列之间的第三核苷酸序列，其中所述第三核苷酸序列编码核糖体跳跃位点、内部核糖体进入位点(IRES)、或第二启动子。在某些实施方案中，所述核糖体跳跃位点是P2A肽。
在一些实施方案中，核酸位于载体中。在一些实施方案中，所述载体是表达载体。在一些实施方案中，所述载体是腺相关病毒(AAV)载体。在某些实施方案中，所述载体是逆转录病毒载体，例如，γ逆转录病毒载体或慢病毒载体。
在一个方面，本公开提供了一种包含本文公开的任何核酸的宿主细胞。在某些实施方案中，所述宿主细胞是免疫细胞。
在一个方面，本公开提供了表达第一多肽的免疫细胞(例如，T细胞或NK细胞)，所述第一多肽是本文公开的任何抗体偶联的T细胞受体(ACTR)。在一些实施方案中，所述免疫细胞(例如，T细胞或NK细胞)还表达第二多肽，所述第二多肽包含共刺激结构域或共刺激受体的配体。在一些实施方案中，所述第二多肽包含4-1BBL、CD80、CD86、OX40L、ICOSL、CD70、或其组合。在某些实施方案中，所述第二多肽包含4-1BBL。
在一个方面，本公开提供了增强受试者中抗体依赖性细胞介导的细胞毒性的方法，该方法包括向有需要的受试者施用有效量的任何免疫细胞(例如，T细胞或NK细胞)或本文公开的任何载体，和有效量的治疗性抗体。
在一些实施方案中，治疗性抗体特异性针对TNF-α、HER2、CD52、CD38、BCMA、GPC3、PDGF-R-α、CD25、VEGF、BLyS、CD30、IL1-B、EGFR、RANK配体、GD2、C5、CD11a、CD22、CD123、CD33、CTLA4、CEACAM5、α-4整合素、CD20、CD19、IgE、RSV、VEGFR2、IL6R、IL12、IL-23、FOLR1(叶酸受体α)、Lewis Y、PD-1、B7-H1(PD-L1、CD274)、B7-H2(PD-DC、CD273)、B7-H3、B7-H4、CD138(多配体蛋白聚糖-1)，整合素α4-β7、或PSMA。
在一些实施方案中，治疗性抗体选自阿达木单抗、曲妥珠单抗-美坦新偶联物、阿仑珠单抗、阿特珠单抗、阿维鲁单抗、巴利昔单抗、贝伐珠单抗、贝利木单抗、本妥昔单抗、卡那奴单抗、西妥昔单抗、达雷木单抗、达克珠单抗、狄诺塞麦、达妥昔单抗、德瓦鲁单抗、依库珠单抗、依法珠单抗、依帕珠单抗、吉妥单抗、戈利木单抗、英夫利昔单抗、易普利姆玛、拉贝珠单抗、那他珠单抗、奥滨尤妥珠单抗、奥法木单抗、奥拉单抗,奥马珠单抗、帕利珠单抗、帕尼单抗、帕妥珠单抗、雷莫芦单抗、利妥昔单抗、托珠单抗、曲妥珠单抗、优特克单抗和维多珠单抗。
在一些实施方案中，所述免疫细胞是从受试者分离的自体T细胞。在其他实施方案中，所述免疫细胞是同种异体T细胞。在某些实施方案中，所述免疫细胞是抑制或消除了内源性T细胞受体的T细胞。
在一些实施方案中，所述免疫细胞是在施用前离体扩增和/或活化的T细胞。
在一些实施方案中，所述受试者是患有或怀疑患有癌症的人类患者。
另一方面，本发明提供了一种制备表达抗体偶联T细胞受体(ACTR)的免疫细胞的方法，该方法包括将本文公开的任何核酸引入免疫细胞群(例如，T细胞或NK细胞)中。在一些实施方案中，该方法还包括鉴定或分离表达ACTR的免疫细胞。
在一些实施方案中，将核酸导入免疫细胞(例如，T细胞或NK细胞)的方法选自：逆转录病毒转导、慢病毒转导、DNA电穿孔和RNA电穿孔。
在一个方面，本公开提供了一种基因工程的免疫细胞，表达：(i)第一多肽，所述第一多肽是抗体偶联的T细胞受体(ACTR)(例如，一种包含CD28细胞质信号域的ACTR)；(ii)引发共刺激信号的第二多肽。在一些实例中，所述第二多肽可包含共刺激受体、其配体、或与共刺激受体结合的部分(例如，单链抗体)。实例包括但不限于4-1BB、ICOS、OX40、CD27或CD28、其配体或与该受体结合的部分。
在一些实施方案中，ACTR不含任何共刺激信号域。
另一方面，本发明提供了一种将表达ACTR的免疫细胞与抗CD20抗体一起用于治疗实体瘤(例如，淋巴瘤)的方法。在一些实施方式中，该方法包括：(i)向有需要的受试者施用有效量的一种或多种淋巴清除剂(例如，氟达拉滨、环磷酰胺、或其组合)；(ii)在(i)之后给受试者施用抗CD20抗体(例如，利妥昔单抗)；(iii)在(ii)之后向受试者施用表达抗体偶联的T细胞受体(ACTR)的免疫细胞(例如，T细胞)。所述ACTR可包括：(a)CD16的Fc结合结构域(例如，CD16V亚型)；(b)CD28的共刺激信号传导区，和(c)CD3ζ的细胞质信号域。任选地，ACTR还可包含来自CD28的铰链结构域和/或来自CD28的跨膜结构域，其位于(a)和(b)之间。在一个实例中，所述ACTR包含氨基酸序列SEQ ID NO:9。
通过该方法治疗的受试者可以是患有复发或难治性CD20+淋巴瘤的人类患者，例如弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、原发性纵隔B细胞淋巴瘤(PMBCL)、3b级滤泡性淋巴瘤(Gr3b-FL)和转化组织学滤泡性淋巴瘤(TH-FL)。在一些实例中，所述患者曾经或正在接受用于控制疾病的化学疗法。在一些实施方案中，所述免疫细胞是T细胞，施用于受试者的剂量可以为40×106个细胞、80×106个细胞、150×106个细胞、或300×106个细胞。在一些实施方案中，在步骤(iii)之前和之后向受试者施用抗CD20抗体。
表达ACTR的免疫细胞可以通过从受试者收集免疫细胞并将编码ACTR的核酸引入该免疫细胞以表达ACTR来制备。在一些情况下，收集步骤包括白细胞分离。
此外，本公开提供了用于涉及表达表面抗原细胞的疾病的治疗方法和试剂盒，所述表面抗原也存在于活化的T细胞上。例如，本文提供了用于在受试者中诱导细胞毒性的方法，包括向有此需要的受试者施用(i)特异针对活化T细胞表面表达的抗原(例如，CD5、CD38、或CD7)的抗体；(ii)表达抗体偶联T细胞受体(ACTR)的T细胞。所述ACTR可包括：(a)Fc结合结构域(例如，Fc受体的细胞外配体结合结构域，如CD16)；(b)跨膜结构域(例如，CD28的跨膜结构域)；(c)至少一个共刺激信号域(例如，CD28或4-1BB的共刺激信号域)；(d)细胞质信号域，包含免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)，例如CD3ζ的免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)。(c)或(d)均位于嵌合受体的C末端。在一些实例中，所述ACTR可以还包含位于(a)和(b)之间的铰链域(例如，来自CD28的铰链域)。在一些示例中，ACTR包括:(a)CD16的Fc结合结构域；(b)CD28的铰链和跨膜结构域；(c)CD28的共刺激信号域，和(d)CD3ζ的细胞质信号域。在一个实例中，所述ACTR包含氨基酸序列SEQ ID NO:9。在一些实施方案中，表达ACTR的T细胞在体外扩增。
本文还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含特异性针对活化T细胞上表达的抗原(例如，CD5、CD38、或CD7)的抗体，和表达抗体偶联的T细胞受体(ACTR)的T细胞，例如本文描述的那些。在一些实施方案中，表达ACTR的T细胞在体外扩增。
在下面的描述中阐述了本公开的一个或多个实施例的细节。根据若干实施例的详细描述以及所附权利要求，本公开的其他特征或优点将显而易见。
附图概述
以下附图构成本说明书的一部分并且包括在本说明书内，以进一步说明本公开的某些方面，通过参考这些中的一个或多个附图并结合本文给出的具体实施方案的详细描述，可以更好地理解本公开的某些方面。
图1包括一组图,显示了表达CD20的Raji靶细胞的细胞毒性情况，所述靶细胞与表达ACTR变体的T细胞与CD20特异性抗体利妥昔单抗组合温育。观察到其细胞毒性随编码ACTR变体的核苷酸的表达剂量依赖性增加，所述编码ACTR变体为(A)SEQ ID NO:7，(B)SEQID NO:8，(C)SEQ ID NO:9，(D)SEQ ID NO:13。
图2包括一组图,显示了表达HER2的HCC1954靶细胞的细胞毒性情况，所述靶细胞与表达ACTR变体的T细胞与HER2特异性抗体曲妥珠单抗组合温育。观察到细胞毒性随编码ACTR变体的核苷酸的表达剂量依赖性增加，所述编码ACTR变体为(A)SEQ ID NO:7，(B)SEQID NO:8，(C)SEQ ID NO:9，(D)SEQ ID NO:13，和(E)SEQ ID NO:38/SEQ ID NO:39。
图3组图证明了表达ACTR变体的T细胞产生IL-2情况，所述T细胞与表达CD20的Raji靶细胞和CD20特异性抗体利妥昔单抗组合温育。观察到IL-2释放随编码ACTR变体的核苷酸的表达剂量依赖性增加，所述ACTR变体为(A)SEQ ID NO:7，(B)SEQ ID NO:8，(C)SEQID NO:9，(D)SEQ ID NO:13，和(E)SEQ ID NO:38/SEQ ID NO:39。模拟细胞未显示出IL-2的增加(D，E)。
图4组图证明了表达ACTR变体T细胞产生IL-2情况，所述T细胞与表达HER2的HCC1954靶细胞和HER2特异性抗体曲妥珠单抗组合温育。观察到IL-2释放随编码ACTR变体的核苷酸的表达剂量依赖性增加，所述ACTR变体为(A)SEQ ID NO:7，(B)SEQ ID NO:8，(C)SEQ ID NO:9，(D)SEQ ID NO:13，和(E)SEQ ID NO:38/SEQ ID NO:39。模拟细胞未显示了IL-2的增加(D，E)。
图5组图证明了当表达ACTR变体的T细胞与表达CD20的Raji靶细胞，与或不与CD20特异性抗体利妥昔单抗一起温育7天时，CD3+细胞相对于起始T细胞计数的增加情况。针对各条件，绘制相对于第0天CD3+细胞的细胞计数的增加情况。观察到CD3+细胞随编码ACTR变体的核苷酸的表达抗体依赖性增加，所述ACTR变体为(A)SEQ ID NO:7，(B)SEQ ID NO:9，(C)SEQ ID NO:13，和(D)SEQ ID NO:38/SEQ ID NO:39。
图6组图证明了表达ACTR变体的T细胞的抗肿瘤活性(所述ACTR变体为SEQ ID NO:7,9,13和38/SEQ ID NO.:90)。用Raji肿瘤细胞接种小鼠，分成5个处理组，并或用载体对照(盐水；空心圆圈和实心黑线)处理，或单独使用抗CD20抗体利妥昔单抗(每只小鼠100μg或5mg/kg，腹腔注射，第4,11,18,25天；实线灰色线的实心方块)，或单独使用ACTR T细胞变体(1×107个细胞，静脉注射，第5,12天；黑色虚线的空心三角形)，或组合使用与单一药物的剂量和天数相同的利妥昔单抗和ACTR T细胞变体(实心黑线的闭合圆圈)，或表达抗CD19CAR变体的T细胞(1×107个细胞，静脉注射，第5,12天；灰色虚线的灰色菱形)。随后每周对小鼠进行两次IVIS光谱肿瘤生物荧光成像。随时间绘制以光量子/秒表示的肿瘤负荷。**p<0.01，****p<0.0001(与利妥昔单抗对照相比，Sidac多重比较的双向ANOVA检验)
图7的图证明了每3-4天用利妥昔单抗调理的靶细胞和表达编码ACTR变体的T细胞重复刺激后，CD3阳性T细胞的增殖情况，其中ACTR变体为SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8，SEQID NO:9，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:38/SEQ ID NO:39，和CD19 CAR。
图8组图证明了在每轮表达编码ACTR变体的T细胞再刺激后，对利妥昔单抗调理的Raji靶细胞的细胞毒性，其中ACTR变体为SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9，SEQ IDNO:13，和SEQ ID NO:38/SEQ ID NO:39，和CD19CAR。将相对于前一时间点的靶细胞数量的Raji靶细胞数的倍数变化绘制为时间的函数。将数据绘制为线形图(A)和条形图(B)。低于1的值代表靶细胞生长和细胞毒性的对照。
图9的图证明了在反复模拟“应激测试”中ACTR变体SEQ ID NO:9的活性，在重复“应激测试”中每隔3-4天用新鲜的CD20+Ramos肿瘤细胞和利妥昔单抗刺激表达ACTR变体的T细胞。将总体T细胞和靶细胞计数绘制为时间的函数。
图10的图证明了表达ACTR变体SEQ ID NO:9的T细胞与多个细胞系和适应症的肿瘤靶向抗体组合的T细胞活性(IL-2释放、增殖)。
图11组图证明了使用利妥昔单抗、CD20+肿瘤细胞和ACTR变体SEQ ID NO:9的结合测试结果。图11 A通过流式细胞术测试证明，利妥昔单抗与CD20+淋巴瘤肿瘤细胞Raji、Daudi和RL结合，而与CD20阴性细胞系K562几乎没有结合。图11 B通过流式细胞术测试证明，利妥昔单抗与表达ACTR变体SEQ ID NO:9的T细胞的结合。
图12描述了表达ACTR的T细胞的激活的假设模型。类似于低亲和力的天然T细胞受体和Fc受体，当ACTR参与多个利妥昔单抗分子与肿瘤细胞表面结合时，ACTR T细胞通过结构亲合力激活。
图13组图证明了，(A，B)当存在增加细胞剂量的模拟T细胞或表达ACTR变体SEQ IDNO:9的T细胞和1μg/mL利妥昔单抗时，CD20+肿瘤细胞的细胞毒性测试结果；(C)当存在表达ACTR的T细胞和浓度增加的利妥昔单抗，且E:T(效应细胞与靶细胞)比值为2:1时，CD20+肿瘤细胞的细胞毒性结果。
图14组图证明了，(A,B)当存在CD20+肿瘤细胞和浓度增加的利妥昔单抗，且E:T(效应细胞与靶细胞)比值为2:1时，表达ACTR变体SEQ ID NO:9的T细胞的细胞因子释放测试的结果；(C)当存在CD20+肿瘤细胞和浓度增加的利妥昔单抗，且E:T(效应细胞与靶细胞)比值为1:1时，表达ACTR变体SEQ ID NO:9的T细胞的增殖试验结果。
图15组图证明了在CD20+Ramos或CD20阴性肿瘤细胞和利妥昔单抗或曲妥珠单抗(抗HER2)存在下，表达ACTR变体SEQ ID NO:9的T细胞的(A)细胞毒性，(B)IL-2产生和(C)T细胞增殖测试的结果。抗体以4μg/mL终浓度使用。这些图表证明，仅在抗体(利妥昔单抗)和表达同源抗原的目标(表达CD20的Ramos细胞)存在时，观察到ACTR T细胞强劲的活性。
图16证明了当存在Raji细胞、1μg/mL利妥昔单抗和浓度增加(0mg/mL、0.4mg/mL、1.2mg/mL)的人IgG(最多为利妥昔单抗的3600倍)时，模拟T细胞和表达ACTR变体SEQ IDNO:9的T细胞的细胞因子产生测试结果。
图17组图证明了，(A)正常免疫细胞和多发性骨髓瘤细胞系NCI-H929上IL-6R的流式细胞定量；(B)托珠单抗(抗IL-6R抗体)与表达ACTR变体SEQ ID NO:9的T细胞或模拟T细胞的结合测试结果。
图18组图证明了在不存在T细胞或存在表达ACTR变体SEQ ID NO:9的T细胞或模拟T细胞以及IL-6R+NCI-H929细胞和浓度增加的托单抗(0-25μg/mL)的情况下，(A)细胞毒性和(B)细胞因子释放测试的结果。在与阳性对照相同的条件下，在NCI-H929细胞和抗CD38阳性对照抗体存在下，表达ACTR变体SEQ ID NO:9的T细胞如图所示。
图19证明了有侵袭性Raji异种移植物的小鼠的存活百分比，其中使用表达ACTR变体SEQ ID NO:9的T细胞与不同剂量的利妥昔单抗组合处理，表达抗CD19-CAR的T细胞处理，单独的利妥昔单抗处理，单独的表达ACTR变体SEQ ID NO:9的T细胞处理，或对照处理。在肿瘤接种后第4天给予利妥昔单抗，之后每周给药，总共4剂。在肿瘤接种后第5天施用1×107剂量的T细胞(ACTR或CAR)。
图20证明了有侵袭性Raji异种移植物的小鼠的存活百分比，其中使用一剂或两剂表达ACTR变体SEQ ID NO:9的T细胞与利妥昔单抗组合处理，单独的利妥昔单抗处理，单独的表达ACTR变体SEQ ID NO:9的T细胞处理，或对照处理。在肿瘤接种后第4天给予利妥昔单抗(100μg)，然后每周给药，总共4剂。利妥昔单抗给药后1天，在第5天、或第5天和第12天，施用一剂或两剂1×107表达ACTR变体SEQ ID NO:9的T细胞。
图21组图证明了使用来自三种独特的表达ACTR变体SEQ ID NO:9的非霍奇金淋巴瘤(NHL)供体(NHL1，NHL2和NHL3)的T细胞的实验结果。图21 A证明来自三个独特的非霍奇金淋巴瘤(NHL)供体PBMC的T细胞中ACTR变体SEQ ID NO:9的表达水平。当存在CD20+肿瘤细胞和浓度增加的利妥昔单抗，且E:T比值为1:1时，表达ACTR变体SEQ ID NO:9的T细胞释放的细胞因子，如图21 B所示。当存在CD20+肿瘤细胞和浓度增加的利妥昔单抗，且E:T比值为1:1，表达ACTR变体SEQ ID NO:9的T细胞增殖情况，如图21 C所示。
图22描述了患有复发或难治性CD20+B细胞淋巴瘤的患者的示例性治疗方案，示例性治疗方案中ACTR表达的T细胞与利妥昔单抗组合作为示例性治疗性抗体。
图23描述了HER2扩增的细胞系(OE19、N87和SKBR3)和HER2无扩增的细胞系(MCF7和KATOIII)上的HER2蛋白表达情况。在用抗人HER2抗体染色后，通过流式细胞术测试HER2表达水平。针对每种细胞系，绘制染色细胞的平均荧光强度(MFI)。
图24组图证明了在HER2扩增的和HER2无扩增的细胞系和曲妥珠单抗(抗-HER2)存在下，表达ACTR变体SEQ ID NO:9的T细胞的(A)细胞毒性，(B)细胞因子产生和(C)T细胞增殖的测试结果。以5μg/mL终浓度使用抗体。
图25组图证明了在HER2扩增和HER2无扩增的细胞系存在下，基于曲妥珠单抗的HER2靶向CAR-T细胞的(A)细胞毒性，(B)细胞因子产生和(C)T细胞增殖的测试结果。
图26组图证明了(A)在曲妥珠单抗和HER2扩增和HER2无扩增细胞系存在下，表达ACTR变体SEQ ID NO:9的T细胞的增殖测试结果；和(B)在HER2扩增和HER2无扩增细胞系存在下，HER2靶向CAR-T细胞的增殖测试结果。第0天输入的总体T细胞为100,000个细胞。在第6天CD3染色后通过流式细胞术定量T细胞，绘制在ACTR的实验中(A)或在CART的实验中(B)总体T细胞相对每种靶细胞系或每种靶细胞的抗体浓度的函数。
图27描述了对有约80mm3起始体积的皮下N87胃异种移植肿瘤的雌性NOD.Cg-PrkdcscidIL-2rgtm1Wj1/SzJ小鼠，表达ACTR变体SEQ ID NO:9的T细胞联合曲妥珠单抗的体内给药方案。在肿瘤接种后7天开始，每周一次给予曲妥珠单抗(100μg/每只小鼠，腹腔给药)，持续4周。在肿瘤细胞接种后第8天开始，每周一次给予表达ACTR变体SEQ ID NO:9的T细胞或基于曲妥珠单抗的靶向HER2的CAR-T细胞(1.5×107/总T细胞)，持续2周。对照小鼠以相同的方案单独给予载体。
图28描述了图27中所示实验的结果。绘制处理组的平均肿瘤体积相对时间的函数，所述处理组为：载体，单独的曲妥珠单抗，单独的表达ACTR变体SEQ ID NO:9的T细胞，表达ACTR变体SEQ ID NO:9的T细胞与曲妥珠单抗，和抗HER2 CAR T细胞。
图29描述了HER2扩增的肿瘤系(N87)细胞，HER无扩增的肿瘤细胞系(MCF7)，HER-2阴性细胞系(Daudi)细胞，和各种正常细胞系(乳腺上皮、肺动脉平滑肌、心肌细胞、支气管上皮或肾上皮)上HER2的表达。在用抗人HER2抗体染色后，通过流式细胞术测量HER2水平。染色细胞的平均荧光强度(MFI)如图所示。
图30组图描述了使用(A)表达ACTR变体SEQ ID NO:9的T细胞与曲妥珠单抗(5μg/mL)组合；或(B)基于曲妥珠单抗的靶向HER2的CAR-T细胞，细胞毒性测试的结果。靶细胞是N87(HER2扩增)、MCF7(HER2降低)、Daudi(HER2阴性)和正常细胞系(乳腺上皮、肺动脉平滑肌、心肌细胞、支气管上皮或肾上皮)。
图31组图描述了在曲妥珠单抗(A)和抗HER2 CAR T细胞(B)和正常原代细胞(乳腺上皮、肺动脉平滑肌、心肌细胞、支气管上皮或肾上皮)存在下，表达ACTR变体SEQ ID NO:9的T细胞的细胞因子(IL-2)释放曲线。以HER2扩增的肿瘤细胞系(N87)；HER无扩增的肿瘤细胞系(MCF7)；和HER-2阴性细胞系(Daudi)细胞为对照。
图32组图描述了在曲妥珠单抗(A)和抗HER2 CAR T细胞(B)和正常原代细胞(乳腺上皮、肺动脉平滑肌、心肌细胞、支气管上皮或肾上皮)存在下，表达ACTR变体SEQ ID NO:9的T细胞的细胞因子(IFN-α)的释放曲线。以HER2扩增的肿瘤细胞系(N87)；HER无扩增的肿瘤细胞系(MCF7)；和HER-2阴性细胞系(Daudi)细胞为对照。
图33组图描述了通过流式细胞术测试细胞表面上的CD38的表达，所述细胞为(A)多发性骨髓瘤和淋巴瘤细胞系(用U266B1作为CD38阴性对照细胞系)；(B)与RPMI-8226、KMS-20、和NCI-H929多发性骨髓瘤细胞系相比，来自多发性骨髓瘤患者的浆细胞；(C)来自两个健康供体的PBMC子集；(D)来自五个健康供体的红细胞。针对评估的各种细胞类型，绘制平均荧光强度。
图34组图描述了通过流式细胞术测量活化的表达ACTR变体SEQ ID NO:9的T细胞或Daudi细胞表面上的CD38的表达。结果显示用Daudi靶细胞或利妥昔单抗(1μg/mL)刺激的表达ACTR变体SEQ ID NO:9的T细胞的结果。相对于Daudi靶细胞的平均荧光强度,将总体T细胞(A)和ACTR阳性T细胞(B)的平均荧光强度绘制为时间的函数。
图35组图描述了在100U/mL IL-2存在下，用抗人CD3和抗人CD28刺激抗体活化并扩增10天的T细胞的倍数扩增(A)，活力(B)，细胞大小(C)和CD38表达(D)。在第3天,用编码ACTR或CAR的病毒(分别)转导表达ACTR变体SEQ ID NO:9的T细胞和靶向CD38的THB7 CAR T细胞；模拟T细胞未被转导。
图36组图描述了在达雷木单抗存在下，模拟T细胞或表达ACTR变体SEQ ID NO:9的T细胞与(A)NCI-H929，(B)MM.1S，(C)RPMI-8226或(D)Daudi靶细胞培养，观察到的细胞毒性。细胞毒性百分比绘制为抗体浓度的函数。
图37组图描述了在达雷木单抗调理的NCI-H929、MM.1S、RPMI-8226和Daudi靶细胞存在下温育的表达ACTR变体SEQ ID NO:9的T细胞的IL-2(A)和IFN-γ(B)的产生情况。模拟T细胞产生的细胞因子(未绘图)低于标准曲线的线性范围。
图38组图描述了在达雷木单抗调理的NCI-H929、MM.1S、RPMI-8226和Daudi靶细胞存在下，模拟T细胞或表达ACTR变体SEQ ID NO:9的T细胞的增殖测试结果。图A和B中总T细胞计数绘制为达雷木单抗抗体浓度的函数。在图38 C中，计算在总CD3+ T细胞门控内CD16+细胞出现的频率(％)，并绘制为达雷木单抗抗体浓度的函数。
图39组图描述了与供体匹配的PBMC和RPMI-8226多发性骨髓瘤细胞(MM细胞)和1μg/mL或10μg/mL达雷木单抗温育的模拟T细胞(A)或表达ACTR变体SEQ ID NO:9的T细胞(B)的抗体特异性细胞毒性测试的结果。为了分离对不同PBMC亚型的细胞毒性作用，反应通过流式细胞术进行分析。将细胞毒性百分比绘制为细胞类型的函数。
图40组图描述了在自体PBMC存在下或在自体PBMC和RPMI-8226靶细胞存在下以及浓度增加的达雷木单抗,表达ACTR变体SEQ ID NO:9的T细胞的IFN-γ(A)和IL-2(B)释放测试的结果。
图41组团描述了通过流式细胞术评估红细胞上CD38表达(A)；通过流式细胞术评估达雷木单抗与红细胞的结合(B)；并使用ACTR和红细胞共培养测试法评估在浓度不一的达雷木单抗存在下,表达ACTR变体SEQ ID NO:9的T细胞介导的溶血反应。
图42描述了在存在曲妥珠单抗和表达Her2的HCC1954或SKBR3靶细胞的情况下，相对于来自T细胞的ACTR变体SEQ ID NO:2的平均IL-2产量，来自表达ACTR变体SEQ ID NO:2,9,13,19,20,21,22,和78的两个不同供体的平均IL-2产量。
图43组图描述了在浓度增加的HER2靶向抗体曲妥珠单抗和HER2表达靶标BT20和SKBR3存在的情况下，模拟T细胞和表达ACTR变体SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:77的T细胞的IL-2(A)和IFN-γ(B)的释放。
图44组图描述了在100U/mL IL-2存在下，用抗人CD3和抗人CD28刺激抗体活化并扩增10天的T细胞的倍数扩增(A)，细胞大小(B)和生存力(C)随时间的变化。在第3天用编码ACTR或CAR的病毒(视情况而定)转导表达ACTR变体SEQ ID NO:9的T细胞和靶向CD38的THB7CAR和056 CAR T细胞；模拟T细胞未被转导。
图45组图描述了通过流式细胞术测量，在100U/mL IL-2存在下，在第6.8和10天，CD38在用抗人CD3和抗人CD28刺激抗体活化并扩增10天的T细胞上的表达。在第3天用编码ACTR或CAR的病毒(视情况而定)转导表达ACTR变体SEQ ID NO:9的T细胞和靶向CD38的THB7CAR和056 CAR T细胞；模拟T细胞未被转导。
图46组图描述了在不存在或存在达雷木单抗的情况下，用(A)Daudi或(B)NCI-H929靶细胞，与模拟T细胞、表达ACTR变体SEQ ID NO:9的T细胞、THB7 CAR T细胞和056 CART细胞共同培养，观察到的细胞毒性。细胞毒性百分比绘制为效应子:靶比(E:T)的函数。
图47组图描述了在达雷木单抗存在下的模拟T细胞，在达雷木单抗存在下的表达ACTR变体SEQ ID NO:9的T细胞，THB7 CAR T细胞和与NCI-H929、RPMI-8226或Daudi靶细胞培养的056 CAR T细胞中IFN-γ(A)和IL-2(B)的产生情况。
发明详述
使用基于抗体的免疫疗法，治疗多种疾病，包括许多类型的癌症。这种疗法通常取决于对需要消除的细胞(例如，靶细胞如癌细胞)相对于正常细胞(例如，非癌细胞)差异表达的细胞表面分子的识别(Weiner等人Cell(2012)148(6):1081-1084)。已经在体外证明了几种基于抗体的促进靶细胞(例如癌细胞)的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性的免疫疗法，并且对于其中一些，通常认为这也是体内的作用机制。ADCC是一种细胞介导的先天免疫机制，其中免疫系统的效应细胞，如自然杀伤(NK)细胞、T细胞、单核细胞、巨噬细胞或嗜酸性粒细胞，通过特异性抗体识别主动裂解靶细胞(例如，癌细胞)。
本公开还(至少部分地)基于以下意外发现：包含CD16A细胞外结构域和CD28共刺激结构域的ACTR多肽，或包含CD16A细胞外结构域和缩短的铰链结构域或没有铰链结构域的ACTR多肽表现出优越的活性。此外，本发明还基于以下发现：本文所述的ACTR技术克服了与常规CAR-T细胞相关的体外扩增/生产的问题，所述常规CAR-T细胞由于自相残杀作用靶向存在于活化T细胞上的抗原。与对这些抗原特异的抗体组合，ACTR-T细胞可用于治疗与表达表面抗原的细胞相关的疾病，所述表面抗原也存在于活化的T细胞上，例如CD5、CD38或CD7。
因此，本公开内容提供了改进的ACTR多肽，表达此多肽的基因工程的免疫细胞，以及使用组合疗法在受试者中增强抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的方法，所述方法为包含治疗有效量的治疗性抗体和治疗有效量的表达如本文所述的ACTR多肽的免疫细胞(例如，T淋巴细胞或NK淋巴细胞)的组合疗法。本公开还提供了表达ACTR多肽和能够引发共刺激信号的另一种外源多肽的免疫细胞(例如，T淋巴细胞和/或NK细胞)。
如本文所用，ACTR多肽或构建体是指可以在宿主细胞表面上表达的非天然存在的分子，包含能够结合靶分子的细胞外结构域(例如，CD16A细胞外结构域)，其含有Fc部分和一个或多个细胞质信号域，用于触发表达ACTR多肽的免疫细胞的效应子功能，其中ACTR多肽的至少两个结构域可以衍生自不同的分子。ACTR多肽可包含能够结合含有Fc部分的靶分子的CD16A细胞外结构域，跨膜结构域，一个或多个共刺激信号域和CD3ζ细胞质信号域。至少一个共刺激信号结构域可以是CD28共刺激结构域。如果跨膜结构域是CD8跨膜结构域，则ACTR多肽可以不含来自任何非CD16A受体的铰链结构域，或者包含一个以上的共刺激信号结构域。
用于所述方法的抗体可以结合靶细胞(例如，癌细胞)表面上的蛋白质。表达能够与这种含Fc的分子(如本文所述的ACTR多肽分子)结合的受体的免疫细胞，识别靶细胞结合的抗体，并且该受体/抗体结合刺激免疫细胞执行效应功能，例如释放细胞毒性颗粒或表达细胞死亡诱导分子，导致靶细胞的细胞毒性增强。
本文所述的ACTR多肽、细胞和方法将带来许多优点。例如，通过结合Fc的CD16A细胞外结构域，本文所述的ACTR多肽可结合与靶细胞结合的抗体的Fc部分，而不是直接结合特异性靶抗原(例如，癌抗原)。因此，表达本文所述ACTR多肽的免疫细胞将能够诱导/增强由治疗性抗体结合的任何类型细胞的细胞死亡。此外，改进的ACTR构建体显示了如本文所述的优异的生物活性。因此，涉及表达此类改良的ACTR构建体和治疗性抗体的免疫细胞的组合疗法，预期将对靶疾病细胞(例如癌细胞)发挥更好的治疗效果。
I.ACTR构建体
在一些实施方案中，本文所述的ACTR构建体(也称为ACTR多肽)包含对免疫球蛋白的Fc部分具有结合亲和力和特异性的细胞外结构域(“Fc结合子”或“Fc结合结构域”)，跨膜结构域和包含基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)的细胞质信号域。在一些实施方案中，本文描述的ACTR多肽可以进一步包括至少一个共刺激信号域。当ACTR多肽在宿主细胞上表达时，设计其细胞外配体结合结构域位于细胞外，以结合靶分子和含有ITAM的细胞质信号域。任选的共刺激信号域可位于细胞质中，以触发激活和/或效应子信号传导。在一些实施方案中，如本文所述的ACTR多肽从N末端到C末端可以包含Fc结合结构域、跨膜结构域和含有ITAM的细胞质信号域。在一些实施方案中，如本文所述的ACTR多肽从N末端到C末端包含Fc结合结构域、跨膜结构域、至少一个共刺激信号域和含有ITAM的细胞质信号域。在其他实施方案中，如本文所述的ACTR多肽从N末端到C末端包含Fc结合结构域、跨膜结构域、含ITAM的细胞质信号域和至少一个共刺激信号域。
用于本文所述方法和组合物的示例性ACTR构建体可以(例如)在本说明书和附图中找到，或者可以在PCT专利公开号WO2016040441A1中找到，为此目的通过引用并入本文。
本文所述的改进的ACTR多肽可包含对免疫球蛋白的Fc部分具有结合亲和力和特异性的CD16A细胞外结构域(“Fc结合子”或“Fc结合结构域”)、跨膜结构域和CD3ζ细胞质信号域。在一些实施方案中，ACTR多肽还可以包括一个或多个共刺激信号域，其中至少一个是CD28共刺激信号域。当ACTR多肽在宿主细胞上表达时，设计其细胞外配体结合结构域位于细胞外，以结合靶分子和CD3ζ细胞质信号域。共刺激信号域可位于细胞质中，以触发激活和/或效应子信号传导。在一些实施方案中，如本文所述的ACTR多肽从N末端到C末端可以包含Fc结合结构域(如CD16A细胞外结构域)，跨膜结构域，任选的一个或多个共刺激结构域(例如，CD28共刺激结构域、4-1BB共刺激信号结构域、OX40共刺激信号域、CD27共刺激信号域、或ICOS共刺激信号域)，以及CD3ζ细胞质信号域。
如本说明书中所用，短语“蛋白质X跨膜结构域”(例如，CD8跨膜结构域)是指给定蛋白质的任何部分，即跨膜蛋白X，其在膜中是热力学稳定的。
如本说明书中所用，短语“蛋白质X细胞质信号域”(例如，CD3+细胞质信号域)，是指与细胞或细胞器内部相互作用并能够传递信号的蛋白质的任何部分(蛋白质X)。
如本说明书中所用，短语“蛋白质X共刺激信号域”(例如，CD28共刺激信号域)，是指可以将共刺激信号转导到免疫细胞(例如T细胞)中的给定共刺激蛋白的一部分(蛋白X，例如CD28、4-1BB、OX40、CD27或ICOS)。
在一些实施方案中，如果ACTR多肽的跨膜结构域是CD8跨膜结构域，则ACTR多肽可以不含来自任何非CD16A受体的铰链结构域或含有缩短的铰链结构域。或者或另外，ACTR多肽可包含一个以上的共刺激信号域。
在一些实施方案中，本文所述的ACTR多肽可进一步包含铰链结构域，其可位于Fc结合结构域的C末端和跨膜结构域的N末端。在其他实施方案中，本文所述的ACTR多肽可以不具有非CD16A铰链结构域，或者根本不包含铰链结构域。在其他实施方案中，本文所述的ACTR多肽可具有缩短的铰链结构域(例如，最多包括25个氨基酸残基)。
或者或另外，本文所述的ACTR多肽可含有两个或更多个共刺激信号域，所述共刺激信号域可彼此连接或被含有ITAM的细胞质信号域分开。ACTR多肽中的细胞外Fc结合域、跨膜结构域、任选的共刺激信号域和含有ITAM的细胞质信号域可以直接相互连接，或通过肽接头连接。在一些实施方案中，本文所述的任何ACTR多肽可包含N末端的信号序列。
如在本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”，“一个”和“该”包括复数指代，除非上下文另有明确说明。
A.Fc结合结构域
本文所述的ACTR多肽包含细胞外结构域，所述细胞外结构域是Fc结合结构域，即能够结合合适哺乳动物(例如，人类，小鼠，大鼠，山羊，绵羊或猴子)的免疫球蛋白(例如，IgG、IgA、IgM或IgE)的Fc部分。合适的Fc结合结构域可以衍生自天然存在的蛋白质，例如哺乳动物Fc受体或某些细菌蛋白质(例如，蛋白质A，蛋白质G)。另外，Fc结合结构域可以是特异性改造的合成多肽，以高亲和力和特异性结合本文所述任何抗体的Fc部分。例如，这种Fc结合结构域可以是特异性结合免疫球蛋白Fc部分的抗体或其抗原结合片段。实例包括但不限于单链可变片段(scFv)、结构域抗体或纳米抗体。或者，Fc结合结构域可以是特异性结合Fc部分的合成肽，例如库尼茨型结构域，小分子免疫药物(SMIP)，非免疫球蛋白的配体(adnectin)，高亲合性多聚体(avimer)，亲和体(affibody)，锚蛋白重复蛋白(DARPin)或模拟抗体(anticalin)，所述合成肽可以通过筛选肽组合文库来鉴定对Fc的结合活性。
在一些实施方案中，Fc结合结构域是哺乳动物Fc受体的细胞外配体结合结构域。如本文所用，“Fc受体”是在许多免疫细胞(包括B细胞、树突细胞、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、肥大细胞和嗜酸性粒细胞)的表面上表达的细胞表面结合受体，并显示出对抗体Fc结构域的结合特异性。Fc受体通常包含至少两个免疫球蛋白(Ig)样结构域，所述免疫球蛋白(Ig)样结构域对抗体的Fc(可结晶片段)部分具有结合特异性。在一些情况下，Fc受体与抗体的Fc部分的结合可以触发抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)效应。用于构建如本文所述的ACTR多肽的Fc受体可以是天然存在的多态性变体(例如，CD16 V158变体)，所述多态性变体与野生型对应物相比可具有增加或降低的对Fc的亲和力。或者，Fc受体可以是野生型对应物的功能性变体，所述功能性变体携带一个或多个改变对Ig分子的Fc部分的结合亲和力的突变(例如，最多10个氨基酸残基取代，包括1,2,3,4,5,6,7,8,9或10个突变)。在一些情况下，突变可以改变Fc受体的糖基化模式并因此改变对Fc的结合亲和力。
下表列出了Fc受体细胞外结构域中的许多示例性多态性(参见，例如，Kim等人，J.Mol.EVOL.53:1-9,2001)可以在本文所述的任何方法或构造中使用的。
表1 Fc受体中的多态性示例
氨基酸数 19 48 65 89 105 130 134 141 142 158
FCR10 R S D I D G F Y T V
P08637 R S D I D G F Y I F
S76824 R S D I D G F Y I V
J04162 R N D V D D F H I V
M31936 S S N I D D F H I V
M24854 S S N I E D S H I V
X07934 R S N I D D F H I V
X14356(FcγRII) N N N S E S S S I I
M31932(FcγRI) S T N R E A F T I G
X06948(FcαεI) R S E S Q S E S I V
Fc受体基于其能够结合的抗体的亚型进行分类。例如，Fc-γ受体(FcγR)通常与IgG抗体结合，例如其一种或多种亚型(即，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)；Fc-α受体(FcαR)通常与IgA抗体结合；Fc-ε受体(FcεR)通常与IgE抗体结合。在一些实施方案中，Fc受体是Fc-γ受体、Fc-α受体或Fc-ε受体。Fc-γ受体的实例包括但不限于CD64A、CD64B、CD64C、CD32A、CD32B、CD16A和CD16B。Fc-α受体的实例是FcαR1/CD89。Fc-ε受体的实例包括但不限于FcεRI和FcεRII/CD23。下表列出了用于构建本文所述ACTR多肽的Fc受体示例及其对相应Fc结构域的结合活性：
表2 Fc受体示例
用于本文所述ACTR多肽的Fc受体的配体结合结构域的选择对于本领域技术人员而言是显而易见的。例如，它可取决于诸如期望Fc受体结合的抗体亚型和结合相互作用的所需亲和力等因素。
在一些实例中，Fc结合结构域是CD16的细胞外配体结合结构域，其可以掺入天然存在的多态体，其可以调节对Fc的亲和力。在一些实例中，Fc结合结构域是CD16的细胞外配体结合结构域，其在158位掺入多态体(例如，缬氨酸或苯丙氨酸)。在一些实施方案中，Fc结合结构域在改变其糖基化状态及其对Fc的亲和力的条件下产生。
下文提供了人CD16A F158和CD16A V158变体的氨基酸序列，其中F158和V158残基以粗体突出显示了并加下划线(信号肽斜体):
CD16A F158(SEQ ID NO:36):
GMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDSVTLKCQGAYSPEDNS
TQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRCQTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPR
WVFKEEDPIHLRCHSWKNTALHKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYF
CD16A V158(SEQ ID NO:37):
GSKNVSSETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQVSFCLVMVLLFAVDTGLYFSVKTNIRSSTRDWKDHKFKWRKDPQDK
在一些实施方案中，Fc结合结构域是CD16的细胞外配体结合结构域，包含使ACTR多肽对IgG抗体子集特异性的修饰。例如，可以包括增加或降低对IgG亚型(例如，IgG1)的亲和力的突变。
本文描述的任何Fc结合结构域可以对治疗性抗体的Fc部分有合适的结合亲和力。如本文所用，“结合亲和力”是指表观缔合常数或KA。KA是解离常数KD的倒数。本文所述的ACTR多肽的Fc受体结构域的细胞外配体结合结构域对于抗体的Fc部分可具有至少10-5,10-6,10-7,10-8,10-9,10-10M或更低的结合亲和力Kd。在一些实施方案中，与Fc结合结构域与另一抗体、抗体同种型或其亚型的结合亲和力相比，Fc结合结构域对抗体，抗体同种型或其亚型具有高结合亲和力。在一些实施方案中，与Fc受体的细胞外配体结合结构域与另一抗体、抗体同种型或其亚型的结合相比，Fc受体的细胞外配体结合结构域对抗体，抗体同种型或其亚型具有特异性。
本领域已知的其他Fc结合结构域也可用于本文所述的ACTR构建体，包括例如WO2015058018A1中描述的那些，其相关公开内容通过引用并入本文，用于本文引用的目的和主题。
B.跨膜结构域
本文描述的ACTR多肽的跨膜结构域可以是本领域已知的任何形式。如本文所用，“跨膜结构域”是指在细胞膜中，优选真核细胞膜中，热力学稳定的任何蛋白质结构。可以从天然存在的蛋白质获得与本文使用的ACTR多肽相容的跨膜结构域。或者，它可以是合成的、非天然存在的蛋白质区域，例如，在细胞膜中热力学稳定的疏水蛋白质区域。
跨膜结构域基于跨膜结构域的三维结构分类。例如，跨膜结构域可以形成α螺旋，多于一个α螺旋的复合物，β桶，或能够跨越细胞的磷脂双层的任何其他稳定结构。此外，跨膜结构域也可以或可选地基于跨膜结构域拓扑结构进行分类，包括跨膜结构域穿过膜的通过次数和蛋白质的方向。例如，单跨膜蛋白穿过细胞膜一次，并且多跨膜蛋白穿过细胞膜至少两次(例如，2,3,4,5,6,7或更多次)。
膜蛋白可以定义为I型、II型或III型，取决于其末端和相对于细胞内部和外部的跨膜区的拓扑结构。I型膜蛋白具有单个跨膜区域并且定向使得蛋白质的N-末端存在于细胞的脂质双层的细胞外侧，并且蛋白质的C-末端存在于细胞质侧。II型膜蛋白也具有单个跨膜区域，但其定向使得蛋白质的C末端存在于细胞的脂质双层的细胞外侧，并且蛋白质的N末端存在于细胞质侧。III型膜蛋白具有多个跨膜区域，并且可以基于跨膜区域的数量和N末端、C末端的位置进一步细分。
在一些实施方案中，本文描述的ACTR多肽的跨膜结构域衍生自I型单跨膜蛋白。单跨膜蛋白包括但不限于CD8α、CD8β、4-1BB/CD137、CD27、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40/CD134、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、TCRβ、TCRζ、CD32、CD64、CD64、CD45、CD5、CD9、CD22、CD37、CD80、CD86、CD40、CD40L/CD154、VEGFR2、FAS和FGFR2B。在一些实施方案中，跨膜结构域来自选自以下的膜蛋白:CD8α、CD8β、4-1BB/CD137、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40/CD134、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、CD32、CD64、VEGFR2、FAS和FGFR2B。在一些实例中，跨膜结构域是CD8(例如，跨膜结构域是CD8α)。在一些实例中，跨膜结构域是4-1BB/CD137。在其他实例中，跨膜结构域是CD28。在那种情况下，本文所述的ACTR多肽可以不含任何非CD16A受体的铰链结构域。在某些情况下，这种ACTR多肽可以不含任何铰链结构域。或者或另外，此类ACTR多肽可包含两个或更多个如本文所述的共刺激区域。在其他实例中，跨膜结构域是CD34。在其他实例中，跨膜结构域不是源自人CD8α。在一些实施方案中，ACTR多肽的跨膜结构域是单跨α螺旋。
来自多跨膜蛋白的跨膜结构域也可以与本文所述的ACTR多肽相容。多跨膜蛋白可包含复合α螺旋结构(例如，至少2,3,4,5,6,7或更多个α螺旋)或β折叠结构。优选地，多跨膜蛋白的N-末端和C-末端存在于脂质双层的相对侧，例如，蛋白质的N-末端存在于脂质双层的细胞质侧并且蛋白质的C末端存在于细胞外侧。来自多跨膜蛋白的一个或多个螺旋通道可用于构建本文所述的ACTR多肽。
用于本文所述ACTR多肽的跨膜结构域还可包含至少一部分合成的非天然存在的蛋白质区域。在一些实施方案中，跨膜结构域是合成的、非天然存在的α螺旋或β折叠。在一些实施方案中，蛋白质区域为至少约20个氨基酸，例如，至少18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30或更多个氨基酸。合成的跨膜结构域的实例是本领域已知的，例如在美国专利号7,052,906 B1和PCT公开号WO 2000/032776 A2中，其相关公开内容通过引用结合到本文中。
在一些实施方案中，跨膜结构域的氨基酸序列不包含半胱氨酸残基。在一些实施方案中，跨膜结构域的氨基酸序列包含一个半胱氨酸残基。在一些实施方案中，跨膜结构域的氨基酸序列包含两个半胱氨酸残基。在一些实施方案中，跨膜结构域的氨基酸序列包含多于两个半胱氨酸残基(例如，3,4,5或更多)。
跨膜结构域可包含跨膜区和位于跨膜结构域的C末端侧的细胞质区。跨膜结构域的细胞质区域可包含三个或更多个氨基酸，并且在一些实施方案中，有助于使脂质双层中的跨膜结构域定向。在一些实施方案中，一个或多个半胱氨酸残基存在于跨膜结构域的跨膜区中。在一些实施方案中，一个或多个半胱氨酸残基存在于跨膜结构域的细胞质区域中。在一些实施方案中，跨膜结构域的细胞质区域包含带正电荷的氨基酸。在一些实施方案中，跨膜结构域的细胞质区域包含氨基酸精氨酸，丝氨酸和赖氨酸。
在一些实施方案中，跨膜结构域的跨膜区包含疏水性氨基酸残基。在一些实施方案中，跨膜区主要包含疏水性氨基酸残基，例如丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或缬氨酸。在一些实施方案中，跨膜区是疏水的。在一些实施方案中，跨膜区包含聚亮氨酸-丙氨酸序列。
蛋白质或蛋白质区域的亲水性或疏水性或亲水性特征可通过本领域已知的任何方法评估，例如Kyte和Doolittle亲水性分析。
C.共刺激信号域
除刺激抗原特异性信号外，许多免疫细胞还需要共刺激，以促进细胞增殖、分化和存活，以及激活细胞的效应功能。在一些实施方案中，本文所述的ACTR多肽包含至少一个共刺激信号域。在某些实施方案中，ACTR多肽可含有CD28共刺激信号域。如本文所用，术语“共刺激信号域”是指共刺激信号传导蛋白的至少一个片段，介导细胞内的信号转导以诱导免疫应答，例如效应子功能。如本领域所知，免疫细胞如T细胞的激活通常需要两个信号:(1)由抗原呈递细胞呈递的T细胞受体(TCR)和抗原肽/MHC复合物的参与引发的抗原特异性信号，其通常由作为TCR复合物组分的CD3ζ驱动；及(ii)由共刺激受体与其配体之间的相互作用触发的共刺激信号。共刺激受体转导共刺激信号作为TCR触发的信号传导的添加并调节由免疫细胞介导的反应，例如T细胞、NK细胞、巨噬细胞、中性粒细胞或嗜酸性粒细胞。
宿主细胞(例如，免疫细胞)中共刺激信号域的激活可以诱导细胞增加或减少细胞因子的产生和分泌、吞噬特性、增殖、分化、存活和/或细胞毒性。任何共刺激分子的共刺激信号域可以与本文所述的ACTR多肽相容。基于诸如ACTR多肽将在其中表达的免疫细胞的类型(例如，T细胞、NK细胞、巨噬细胞、中性粒细胞或嗜酸性粒细胞)和期望的免疫效应功能(例如，ADCC)等因素，来选择共刺激信号域的类型。用于ACTR多肽的共刺激信号域的实例可以是共刺激蛋白的细胞质信号域，包括但不限于B7/CD28家族的成员(例如，B7-1/CD80、B7-2/CD86、B7-H1/PD-L1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-H7、BTLA/CD272、CD28、CTLA-4、Gi24/VISTA/B7-H5、ICOS/CD278、PD-1、PD-L2/B7-DC和PDCD6)；TNF超家族成员(例如，4-1BB/TNFSF9/CD137,4-1BB配体/TNFSF9、BAFF/BLyS/TNFSF13B、BAFF R/TNFRSF13C、CD27/TNFRSF7、CD27配体/TNFSF7、CD30/TNFRSF8、CD30配体/TNFSF8、CD40/TNFRSF5、CD40/TNFSF5、CD40配体/TNFSF5、DR3/TNFRSF25、GITR/TNFRSF18、GITR配体/TNFSF18、HVEM/TNFRSF14、LIGHT/TNFSF14、淋巴毒素-α/TNF-β、OX40/TNFRSF4、OX40配体/TNFSF4、RELT/TNFRSF19L、TACI/TNFRSF13B、TL1A/TNFSF15、TNF-α和TNF RII/TNFRSF1B)；SLAM家族成员(例如，2B4/CD244/SLAMF4、BLAME/SLAMF8、CD2、CD2F-10/SLAMF9、CD48/SLAMF2、CD58/LFA-3、CD84/SLAMF5、CD229/SLAMF3、CRACC/SLAMF7、NTB-A/SLAMF6和SLAM/CD150)；和任何其他共刺激分子，如CD2、CD7、CD53、CD82/Kai-1、CD90/Thy1、CD96、CD160、CD200、CD300a/LMIR1、HLA I类、HLA-DR、Ikaros、整合素α4/CD49d、整合素α4β1、整合素α4β7/LPAM-1、LAG-3、TCL1A、TCL1B、CRTAM、DAP12、Dectin-1/CLEC7A、DPPIV/CD26、EphB6、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-4、TSLP、TSLP R、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)和NKG2C。在一些实施方案中，共刺激信号域是4-1BB、CD28、OX40、ICOS、CD27、GITR、HVEM、TIM1、LFA1(CD11a)或CD2、或其任何变体。
本公开内容的任何共刺激信号域的变体也在本公开的范围内，使得共刺激信号域能够调节免疫细胞的免疫应答。在一些实施方案中，共刺激信号域包含多达10个氨基酸残基突变(例如，1,2,3,4,5或8)，例如与野生型对应物相比的氨基酸取代、缺失或添加。包含一个或多个氨基酸变异(例如，氨基酸取代、缺失或添加)的此类共刺激信号域可称为变体。
相对于不包含突变的共刺激信号域，共刺激信号域的氨基酸残基的突变可导致信号转导的增加和免疫应答的增强刺激。相对于不包含突变的共刺激信号域，共刺激信号域的氨基酸残基的突变可导致信号转导的减少和免疫应答的刺激减少。例如，天然CD28氨基酸序列的残基186和187的突变可导致共刺激活性的增加和ACTR多肽的共刺激结构域对免疫应答的诱导。在一些实施方案中，突变是CD28共刺激结构域第186和187位每一个处的赖氨酸取代为甘氨酸残基，称为CD28LL→GG变体。可以在共刺激信号域中进行的可以增强或降低结构域的共刺激活性的其他突变对于本领域普通技术人员来说是显而易见的。在一些实施方案中，共刺激信号域是4-1BB、CD28、OX40或CD28LL→GG变体。
在一些实施方案中，ACTR多肽可含有单个共刺激结构域，例如CD27共刺激结构域、CD28共刺激结构域、4-1BB共刺激结构域、ICOS共刺激结构域、或OX40共刺激域。
在一些实施方案中，ACTR多肽可包含一个以上的共刺激信号域(例如，2,3或更多)。在一些实施方案中，ACTR多肽包含两个或更多个相同的共刺激信号域，例如两个拷贝的CD28的共刺激信号域。在一些实施方案中，ACTR多肽包含来自不同共刺激蛋白的两个或更多个共刺激信号域，例如本文所述的任何两种或更多种共刺激蛋白。共刺激信号域的类型的选择可以基于诸如与ACTR多肽一起使用的宿主细胞的类型(例如，T细胞或NK细胞)和所需的免疫效应子功能等因素。在一些实施方案中，ACTR多肽包含两个共刺激信号域，例如两个拷贝的CD28的共刺激信号域。在一些实施方案中，ACTR多肽可包含来自不同共刺激受体的两个或更多个共刺激信号传导区，例如本文所述的任何两种或更多种共刺激受体，例如CD28和4-1BB、CD28和CD27、CD28和ICOS、CD28LL→GG变体和4-1BB、CD28和OX40、或CD28LL→GG变体和OX40。在一些实施方案中，两个共刺激信号域是CD28和4-1BB。在一些实施方案中，两个共刺激信号域是CD28LL→GG变体和4-1BB。在一些实施方案中，两个共刺激信号域是CD28和OX40。在一些实施方案中，两个共刺激信号域是CD28LL→GG变体和OX40。在一些实施方案中，本文描述的ACTR构建体可含有CD28和ICOSL的组合。在一些实施方案中，本文所述的ACTR构建体可含有CD28和CD27的组合。在某些实施方案中，4-1BB共刺激结构域位于CD28或CD28LL→GG变体共刺激信号域的N末端。
本文所述的任何ACTR多肽，含有一个或多个共刺激信号域或不含这种信号域，可以在免疫细胞(例如，NK细胞或T细胞)中共表达，具有一个或多个分开的能够反过来引发共刺激信号的多肽，例如，包含共刺激受体、其配体或与共刺激受体结合的部分(例如，单链抗体)的多肽。作为非限制性实例，一种或多种单独的多肽可包含4-1BB配体(4-1BBL)、CD80、CD86、OX40配体(OX40L)、ICOS配体(ICOSL)、CD70、其片段或其组合。在一些实施方案中，一种或多种分开的多肽可包含4-1BB、CD28、CD27、CD40L、OX40、ICOS、其片段、及其组合。在其他实施方案中，分开的多肽可包含对本文所述的任何共刺激受体或配体特异的结合部分(例如，scFv)。作为非限制性实例，一种或多种单独的多肽可包含结合4-1BB、ICOS、OX40、CD27或CD28的scFv。例如，一种或多种单独的多肽可包含来自竞争性抗-4-1BB mAb的scFv。
例如，下面提供4-1BBL的氨基酸:
4-1BBL序列(SEQ ID NO:24)
MEYASDASLDPEAPWPPAPRARACRVLPWALVAGLLLLLLLAAACAVFLACPWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE
D.包含基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)的细胞质信号域
包含基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)的任何细胞质信号域可用于产生本文所述的ACTR多肽。如本文所用，“ITAM”是保守的蛋白质基序，通常存在于许多免疫细胞中表达的信号分子的尾部。该基序可包含两个重复的氨基酸序列YxxL/I，其中间隔6-8个氨基酸，其中每个x独立地为任何氨基酸，产生保守基序YxxL/Ix(6-8)YxxL/I。信号分子内的ITAM对于细胞内的信号转导是重要的，其中信号分子活化后ITAM中酪氨酸残基的磷酸化至少部分地介导细胞内的信号转导。ITAM还可以作为参与信号传导途径的其他蛋白质的停靠位点。在一些实例中，包含ITAM的细胞质信号域是CD3ζ或FcεR1γ。在其他实例中，含有ITAM的细胞质信号域不是源自人CD3ζ。在其他实例中，当相同ACTR多肽的细胞外配体结合结构域衍生自CD16A时，含有ITAM的细胞质信号域不源自Fc受体。
在一个具体实施方案中，可以将几个信号域融合在一起以获得累加或协同效应。其他信号域的有用的非限制性实例，包括TCR Zeta链、CD28、OX40/CD134、4-1BB/CD137、FcγRIy、ICOS/CD278、ILRB/CD122、IL-2RG/CD132和CD40中的一种或多种的部分或全部。
E.铰链结构域
在一些实施方案中，本文所述的ACTR多肽还包含位于细胞外配体结合结构域和跨膜结构域之间的铰链结构域。铰链结构域是通常在蛋白质的两个结构域之间发现的氨基酸区域，并且可以保证蛋白质的灵活性和一个或两个结构域相对于彼此的运动。可以使用提供这种灵活性和相对于ACTR多肽的跨膜结构域的Fc受体的细胞外配体结合结构域的运动的任何氨基酸序列。
铰链结构域可含有约1-100个氨基酸，例如，约1-60个氨基酸(包括1-30个氨基酸或31-60个氨基酸)或约50-100个氨基酸(包括51-75个氨基酸或76-100个氨基酸)。作为非限制性实例，铰链可以是1-15个氨基酸、15-75个氨基酸、20-50个氨基酸或30-60个氨基酸。在一些实施方案中，铰链结构域可以是1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,45,50,55,60,65,70或75个氨基酸的长度。在一些实施方案中，本文描述的ACTR构建体不含铰链结构域。
术语“约”或“近似”意味着在本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，这将部分地取决于如何测量或确定该值(即测量系统)的限制。例如，根据本领域的实践，“约”可以表示在可接受的标准偏差内。或者，“约”可表示给定值的至多±20％，优选至多±10％，更优选至多±5％，更优选至多±1％的范围。或者，特别是关于生物系统或反应，该术语可以表示在一个数量级内，优选在数值的2倍内。在本申请和权利要求中描述了特定值的情况下，除非另有说明，否则术语“约”是隐含的，并且在该上下文中意味着在特定值的可接受误差范围内。在一些实施方案中，铰链结构域是天然存在的蛋白质的铰链结构域。
本领域已知的任何蛋白质的铰链结构域包含与本文所述的ACTR多肽相容的铰链结构域。在一些实施方案中，铰链结构域是天然存在的蛋白质的铰链结构域的至少一部分并赋予ACTR多肽灵活性。在一些实施方案中，铰链结构域是CD8。在一些实施方案中，铰链结构域是CD8的铰链结构域的一部分，例如，含有CD8铰链结构域的至少15个(例如，20,25,30,35或40个)连续氨基酸的片段。在一些实施方案中，铰链结构域是CD28。在一些实施方案中，铰链结构域是CD28的铰链结构域的一部分，例如，含有CD28铰链结构域的至少15个(例如，20,25,30,35或40个)连续氨基酸的片段。
在一些实施方案中，铰链结构域是CD16A受体，例如，CD16A受体的整个铰链结构域或其部分，其可以由CD16A受体的多达40个连续氨基酸残基组成(例如，20,25,30,35或40)。这种ACTR构建体可以不含来自不同受体(非CD16A受体)的铰链结构域。
抗体的铰链结构域，例如IgG、IgA、IgM、IgE或IgD抗体，也与本文所述的ACTR多肽相容。在一些实施方案中，铰链结构域是与抗体的恒定结构域CH1和CH2相连接的铰链结构域。在一些实施方案中，铰链结构域是抗体并且包含抗体的铰链结构域和抗体的一个或多个恒定区。在一些实施方案中，铰链结构域包含抗体的铰链结构域和抗体的CH3恒定区。在一些实施方案中，铰链结构域包含抗体的铰链结构域和抗体的CH2和CH3恒定区。在一些实施方案中，抗体是IgG、IgA、IgM、IgE或IgD抗体。在一些实施方案中，抗体是IgG抗体。在一些实施方案中，抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。在一些实施方案中，铰链区包含IgG1抗体的铰链区和CH2和CH3恒定区。在一些实施方案中，铰链区包含IgG1抗体的铰链区和CH3恒定区。
非天然存在的肽也可以用作本文所述的ACTR多肽的铰链结构域。在一些实施方案中，Fc受体的细胞外配体结合结构域的C末端与跨膜结构域的N末端之间的铰链结构域是肽接头，例如(GlyxSer)n接头，其中x和n独立地可以是3至12之间的整数，包括3,4,5,6,7,8,9,10,11,12或更多。在一些实施方案中，铰链结构域是(Gly4Ser)n(SEQ ID NO:25)，其中n可以是3到60之间的整数，包括3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60。在某些实施方案中，n可以是大于60的整数。在一些实施方案中，铰链结构域是(Gly4Ser)3(SEQ ID NO:28)。在一些实施方案中，铰链结构域是(Gly4Ser)6(SEQ ID NO:29)。在一些实施方案中，铰链结构域是(Gly4Ser)9(SEQ IDNO:30)。在一些实施方案中，铰链结构域是(Gly4Ser)12(SEQ ID NO:31)。在一些实施方案中，铰链结构域是(Gly4Ser)15(SEQ ID NO:32)。在一些实施方案中，铰链结构域是(Gly4Ser)30(SEQ ID NO:33)。在一些实施方案中，铰链结构域是(Gly4Ser)45(SEQ ID NO:34)。在一些实施方案中，铰链结构域是(Gly4Ser)60(SEQ ID NO:35)。
在其他实施方案中，铰链结构域是延伸的重组多肽(XTEN)，其是由不同长度(例如，10-80个氨基酸残基)的亲水残基组成的非结构化多肽。XTEN肽的氨基酸序列对于本领域技术人员而言是显而易见的，并且可以在例如美国专利号8,673,860中找到，其相关公开内容通过引用结合到本文中。在一些实施方案中，铰链结构域是XTEN肽并且包含60个氨基酸。在一些实施方案中，铰链结构域是XTEN肽并且包含30个氨基酸。在一些实施方案中，铰链结构域是XTEN肽并且包含45个氨基酸。在一些实施方案中，铰链结构域是XTEN肽并且包含15个氨基酸。
F.信号肽
在一些实施方案中，ACTR多肽还在多肽的N末端包含信号肽(也称为信号序列)。通常，信号序列是将多肽靶向细胞中所需位点的肽序列。在一些实施方案中，信号序列将ACTR多肽靶向细胞的分泌途径，并且将ACTR多肽整合和锚定到脂质双层中。包括天然存在的蛋白质的信号序列或与本文所述的ACTR多肽相容的合成的、非天然存在的信号序列的信号序列，对于本领域技术人员而言是显而易见的。在一些实施方案中，信号序列来自CD8α。在一些实施方案中，信号序列来自CD28。在其他实施方案中，信号序列来自鼠κ链。在其他实施方案中，信号序列来自CD16。
G.ACTR多肽的实例
本文所述的ACTR多肽的某些实例可具有例如CD16A Fc结合结构域、CD28共刺激结构域和CD3ζ细胞质信号域。此类ACTR多肽可进一步包含CD28铰链结构域、CD28跨膜结构域或其组合。在一些实例中，ACTR多肽可以进一步包含信号序列，所述信号序列可以来自CD8α。在一个具体实例中，ACTR多肽从N末端到C末端依次包括：CD8α的信号序列、CD16A Fc结合结构域、CD28铰链结构域、CD28跨膜结构域、CD28共刺激结构域、和CD3ζ细胞质信号域，例如，SEQ ID NO:9。在一些实例中，上述的任一ACTR多肽(SEQ ID NO:9)可能与单独的多肽结合，所述多肽提供如本文所述的共刺激信号传导区如包含4-1BBL结构域(SEQ ID NO:39)。
本文描述的ACTR多肽的其他实例可以不含来自任何非CD16A受体的铰链结构域(例如，可以没有铰链结构域)。此类ACTR多肽可具有例如CD16A Fc结合结构域、CD28共刺激结构域和CD3ζ细胞质信号域，但不具有铰链结构域。在一些实例中，ACTR多肽可另外包含CD8跨膜结构域。在一些实例中，ACTR多肽可以进一步包含信号序列，所述信号序列可以来自CD8α。在一个具体实例中，ACTR多肽从N末端到C末端依次包括：CD8α的信号序列、CD16AFc结合域、CD8跨膜结构域、CD28共刺激结构域和CD3ζ细胞质信号域，例如，SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:38。在某些情况下，ACTR多肽可以表达第二多肽，例如能够引发共刺激信号的多肽。本文描述了用于表达具有此类第二多肽的ACTR多肽的构建体。
表3提供了本文所述的示例性ACTR多肽。这些示例性构建体从N末端到C末端依次具有信号序列、Fc结合结构域(例如，Fc受体的细胞外结构域)、铰链结构域和跨膜结构，而任选的共刺激结构域和细胞质信号域的位置为可以交换。在一些实施方案中，ACTR多肽可包含SEQ ID NO:1-22,26,26,38或40中的任一个。在某些实施方案中，ACTR多肽可以由SEQID NO:1-22,26,26,38和40中的任何一个组成。
表3:示例性ACTR多肽。
以下提供实施例ACTR多肽的氨基酸序列(信号序列斜体)。
ACTR变体SEQ ID NO:1
ACTR变体SEQ ID NO:2
ACTR变体SEQ ID NO:3
ACTR变体SEQ ID NO:4
ACTR变体SEQ ID NO:5
ACTR变体SEQ ID NO:6
ACTR变体SEQ ID NO:7
ACTR变体SEQ ID NO:8
ACTR变体SEQ ID NO:9
ACTR变体SEQ ID NO:11
ACTR变体SEQ ID NO:12
ACTR变体SEQ ID NO:13
ACTR变体SEQ ID NO:14
ACTR变体SEQ ID NO:15
ACTR变体SEQ ID NO:16
ACTR变体SEQ ID NO:17
ACTR变体SEQ ID NO:19
ACTR变体SEQ ID NO:20
ACTR变体SEQ ID NO:21
ACTR变体SEQ ID NO:22
ACTR变体SEQ ID NO:26
ACTR变体SEQ ID NO:27
以下进一步提供了反式形式的示例性ACTR构建体(含有ACTR多肽和提供反式共刺激信号传导的单独多肽)。
ACTR变体SEQ ID NO:38/SEQ ID NO:39：
ACTR变体：
反式共刺激子多肽(包含4-1BBL):
PMEYASDASLDPEAPWPPAPRARACRVLPWALVAGLLLLLLLAAACAVFLACPWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE(SEQ ID NO:39)
ACTR变体SEQ ID NO:40/SEQ ID NO:39
ACTR变体：
反式共刺激子多肽为上述提供的SEQ ID NO:39。
SEQ ID NO:38,39和40中斜体的结构域和下划线体的结构域，连接SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19，其说明如下所示。
H.编码ACTR构建体的核酸
本公开还提供了编码本文公开的ACTR受体的多核苷酸。结合多核苷酸，本发明还提供了包含此类多核苷酸的载体(包括此类多核苷酸与至少一种用于表达嵌合受体的调节元件可操作连接于其中的载体)。本公开内容的有用载体的非限制性实例包括病毒载体，例如，包括γ逆转录病毒载体的逆转录病毒载体、腺相关病毒载体(AAV载体)和慢病毒载体。
在一些情况下，本文所述的核酸可包含两种编码序列，一种编码如本文所述的ACTR多肽，另一种编码能够引发共刺激信号的多肽。这种多肽可包含来自共刺激受体的共刺激结构域，例如4-1BB、CD28、OX40、CD27、ICOS或其组合。或者或另外，多肽可包含共刺激受体的配体，例如，4-1BB配体(4-1BBL)、CD80、CD86、OX40配体(OX40L)、ICOS配体(ICOSL)、CD70、其功能片段、或其组合。
可以配置包含本文所述的两种编码序列的核酸，使得由两种编码序列编码的多肽可以表达为独立的(和物理上分开的)多肽。为了实现该目标，本文描述的核酸可含有位于第一和第二编码序列之间的第三核苷酸序列。该第三核苷酸序列可以例如编码核糖体跳跃位点。核糖体跳跃位点是损害正常肽键形成的序列。该机制导致来自一个信使RNA的其他开放阅读框的翻译。该第三核苷酸序列可以例如编码P2A、T2A或F2A肽(参见，例如，Kim等人，PLoS One.2011；6(4):e18556)。作为非限制性实例，示例性P2A肽可具有ATNFSLLKQAGDVEENPGP SEQ ID NO:23的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，第三核苷酸序列可以编码核糖体内部进入位点(IRES)。IRES是一种RNA元件，它以与末端不依赖的方式启动翻译，也可以从一个信使RNA的其他开放阅读框的翻译。
在另一个实施方案中，第三核苷酸序列可以编码控制第二多肽表达的第二启动子。
第三核苷酸序列还可以编码一种以上核糖体跳跃序列、IRES序列、其他的启动子序列、或其组合。
核酸还可以包括其他的编码序列(包括但不限于第四和第五编码序列)，并且可以配置成使得由其他的编码序列编码的多肽表达为其他的独立和物理上分开的多肽。为此，可以通过编码一种或多种核糖体跳跃序列、IRES序列或其他启动子序列的一种或多种核苷酸序列，将其他编码序列与另一编码序列分开。
在一些实例中，本文所述的核酸可编码ACTR多肽和能够引发共刺激信号的第二多肽，两者通过P2A肽连接。在表达过程中，由于存在P2A位点，ACTR和第二多肽将作为独立且物理上分开的多肽产生。作为一组非限制性实例，编码均携带P2A核糖体跳跃位点的SEQ IDNO:10和SEQ ID NO:18的核苷酸序列的表达，将产生两个物理上分开的蛋白质:一个包含ACTR蛋白质(分别为SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:38)和另一个包含4-1BB配体(4-1BBL)蛋白(SEQ ID NO:39)。在一个实施方案中，通过表达编码SEQ ID NO:18的核苷酸序列产生的两种蛋白质为SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39。在另一个实施方案中，通过表达编码SEQ IDNO:10的核苷酸序列产生的两种蛋白质为SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:39。
ACTR序列+接头+P2A+4-1BBL
ACTR序列+接头+P2A+4-1BBL
在以上SEQ ID NOs：10和18中，N末端斜体片段是信号肽，以下结构域是ACTR多肽区域，斜体的GSG肽是接头，下划线的肽是P2A核糖体跳跃位点，黑体字的C端结构域是4-1BBL结构域。跳过核糖体后，含有4-1BBL结构域的多肽在N端包含一个额外的“P”残基，其余的接头和P2A序列与ACTR多肽的C端相连。
I.包含ACTR多肽的药物组合物及其制备
本文所述的任何ACTR多肽可通过常规方法制备，例如重组技术。用于制备ACTR多肽的方法包括产生编码包含ACTR多肽的每个结构域的多肽的核酸，包括Fc受体的细胞外配体结合结构域、跨膜结构域和包含ITAM的细胞质信号域。核酸构建体还可以包括一个或多个共刺激信号域。在一些实施方案中，核酸还编码Fc受体的细胞外配体结合结构域和跨膜结构域之间的铰链结构域。编码ACTR多肽的核酸也可以编码信号序列。在一些实施方案中，核酸序列编码SEQ ID NO:1-22,26,26,38或40中的任一种示例性ACTR多肽。
ACTR多肽的每种组分的序列可以通过常规技术获得，例如，来自本领域已知的多种来源中的任何一种的PCR扩增。在一些实施方案中，ACTR多肽的一种或多种组分的序列获自人细胞。或者，可以合成ACTR多肽的一种或多种组分的序列。可以使用诸如PCR扩增或连接的方法直接或间接(例如，使用编码肽接头的核酸序列)连接每个组分(例如，结构域)的序列以形成编码ACTR多肽的核酸序列。或者，可以合成编码ACTR多肽的核酸。在一些实施方案中，核酸是DNA。在其他实施方案中，核酸是RNA。
CAR-T细胞的已知限制是靶抗原限制。当CAR-T细胞对T细胞抗原具有特异性时，由于自相残杀，这种CAR-T细胞的体外扩增将显著受阻，使得难以在体外生产这种CAR-T细胞。例如，Dusséaux等人报道了“CD38在正常活化T细胞上的表达是发展针对该蛋白质的CAR T细胞的重要障碍。”Dusséaux等人欧洲血液病协会European Hemalogical Association；2016年6月,海报365。进一步，Gomes-Silva等人报道了“由于残留的CD7表达和随后的自相残杀，CD7特异性CAR的表达削弱了转导的T细胞的扩增。”Gomes-Silva等人，血液，2017,130:285-296。同样地，对于CD5，也可参见Mamonkin等人，癌症免疫研究，2018,6:47-58。相反，本发明的ACTR T细胞不直接靶向细胞表面抗原，因此当体外扩增时不具有自相残杀作用。
II.表达ACTR多肽的免疫细胞
表达本文所述的ACTR多肽的基因工程宿主细胞(例如，免疫细胞，例如T细胞或NK细胞)(表达ACTR的细胞，例如ACTR T细胞)提供可与含Fc的抗肿瘤抗体结合识别靶细胞的特定细胞群。在一个实施方案中，在这种宿主细胞上表达的ACTR多肽的细胞外配体结合结构域与抗肿瘤抗体的Fc部分的结合将激活信号传递给任选的共刺激信号域和/或ACTR多肽的含有ITAM的细胞质信号域，反过来激活宿主细胞的细胞增殖和/或效应子功能，例如由宿主细胞触发的ADCC效应。在另一个实施方案中，在这些宿主细胞上表达的ACTR多肽的细胞外Fc结合结构域与抗体的Fc部分的结合将激活信号传递至ACTR多肽的含ITAM的细胞质信号域和/或在这些宿主细胞中共表达的一个或多个共刺激信号域，其反过来激活宿主细胞的细胞增殖和/或效应功能，例如由宿主细胞触发的ADCC效应。共刺激信号域和包含ITAM的细胞质信号域的组合可以使细胞内多个信号传导途径的强烈激活。在一些实施方案中，宿主细胞是免疫细胞，例如T细胞或NK细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是NK细胞。在其他实施方案中，免疫细胞可以是建立的细胞系，例如NK-92细胞。
本文所述的任何ACTR多肽可在免疫细胞(例如，NK细胞或T细胞)中与一种或多种本文所述的单独多肽共表达，用于提供反向共刺激信号，例如，包含一种或更多信号域(例如，共刺激结构域或共刺激因子的配体)。作为非限制性实例，一种或多种单独的多肽可包含4-1BB配体(4-1BBL)、CD80、CD86、OX40配体(OX40L)、ICOS配体(ICOSL)、CD70、其片段、或其组合。在一个实例中，一种或多种分开的多肽可以编码4-1BBL。
免疫细胞群可以从任何来源获得，例如外周血单核细胞(PBMC)，骨髓或组织，例如脾、淋巴结、胸腺、干细胞或肿瘤组织。获得所需宿主细胞类型的合适，来源对于本领域技术人员而言是显而易见的。在一些实施方案中，免疫细胞群衍生自PBMC。所需的宿主细胞类型(例如，T细胞、NK细胞或T细胞和NK细胞)可以通过在细胞与刺激分子共培养获得的细胞群内扩增。作为非限制性实例，抗CD3和抗CD28抗体可用于T细胞的扩增。
为了构建表达本文所述的任何ACTR多肽的免疫细胞，可以通过本文所述的常规方法产生用于稳定或瞬时表达ACTR多肽的表达载体，并将其导入免疫宿主细胞中。例如，可以将编码ACTR多肽的核酸克隆到合适的表达载体中，例如与合适的启动子可操作连接的病毒载体。核酸和载体可以在合适的条件下与限制酶接触，以在每个分子上产生可以彼此配对的互补末端，并用连接酶连接。或者，可以将合成的核酸接头连接到编码ACTR多肽的核酸的末端。合成接头可含有对应于载体中特定限制性位点的核酸序列。表达载体/质粒/病毒载体的选择将取决于用于表达ACTR多肽的宿主细胞的类型，但应适合于在真核细胞中整合和复制。
多种启动子可用于表达本文所述的ACTR多肽，包括但不限于巨细胞病毒(CMV)中间早期启动子，病毒LTR如劳氏肉瘤病毒LTR、HIV-LTR、HTLV-1LTR、猿猴病毒40(SV40)早期启动子、或单纯疱疹病毒tk病毒启动子。用于表达ACTR多肽的其他启动子包括免疫细胞中的任何组成型活性启动子。或者，可以使用任何可调节的启动子，使得可以在免疫细胞内调节其表达。
另外，载体可以含有，例如，以下的一些或全部：筛选标记基因，例如新霉素基因或卡那霉素基因，用于在宿主细胞中选择稳定或瞬时转染子；来自人CMV的立即早期基因的增强子/启动子序列，用于高水平的转录；来自SV40的转录终止和RNA加工信号，用于mRNA稳定性；SV40多瘤病毒复制起点和ColE1，用于正常的游离复制；核糖体内部结合位点(IRES)，多功能多克隆位点；T7和SP6 RNA启动子，用于体外的正义和反义RNA转录；“自杀开关”或“自杀基因”，其在被触发时导致携带载体的细胞死亡(例如，HSV胸苷激酶或可诱导的半胱天冬酶如iCasp9)，以及用于评估ACTR多肽表达的报告基因。
在一个具体实施方案中，此类载体还包括自杀基因。如本文所用，术语“自杀基因”是指使表达该自杀基因的细胞死亡的基因。自杀基因可以是赋予表达基因的细胞对药剂(例如药物)敏感的基因，并且当细胞与该药剂接触或暴露于该药剂时使细胞死亡。自杀基因是本领域已知的(参见，例如，自杀基因疗法：方法和回顾Suicide Gene Therapy:Methods and Reviews，斯普林格，Caroline J.(癌症研究所癌症治疗英国研究中心，萨顿，萨里郡，英国)，胡门娜出版社，2004)，包括例如单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)基因、胞嘧啶脱氨酶、嘌呤核苷磷酸化酶、硝基还原酶、和半胱天冬酶如半胱天冬酶8。
用于产生含有转基因的载体的合适载体和方法是本领域熟知的并且是可获得的。用于表达ACTR多肽的载体的制备的实例可以在例如US2014/0106449中找到，其通过引用整体并入本文。
包含编码本文所述ACTR多肽的核酸序列的任何载体也在本公开的范围内。可以通过任何合适的方法，将这种载体或编码其中包含的ACTR多肽的序列，递送到宿主细胞如宿主免疫细胞中。将载体递送至免疫细胞的方法是本领域熟知的，并且可包括DNA电穿孔、RNA电穿孔、使用诸如脂质体的试剂的转染、或病毒转导(例如，逆转录病毒转导，例如慢病毒转导)。
在一些实施方案中，表达ACTR多肽的载体通过病毒转导(例如，逆转录病毒转导，例如慢病毒转导)递送至宿主细胞。用于递送的示例性病毒方法包括但不限于重组逆转录病毒(参见，例如，PCT公开号WO90/07936；WO94/03622；WO93/25698；WO93/25234；WO93/11230；WO93/10218；和WO91/02805；美国专利号5,219,740和4,777,127；GB专利2,200,651；和EP专利号0 345 242)，基于α病毒的载体，和腺相关病毒(AAV)载体(参见例如，PCT公开号WO94/12649,WO93/03769；WO93/19191；WO94/28938；WO95/11984；和WO95/00655)。在一些实施方案中，用于表达ACTR多肽的载体是逆转录病毒。在一些实施方案中，用于表达ACTR多肽的载体是慢病毒。
描述逆转录病毒转导的参考文献的实例包括Anderson等人，美国专利号5,399,346；Mann等人，细胞Cell 33:153(1983)；Temin等人，美国专利号4,650,764；Temin等人，美国专利号4,980,289；Markowitz等人，J.Virol.62:1120(1988)；Temin等人，美国专利号5,124,263；由Dougherty等人于1995年3月16日公布的国际专利公开号WO95/07358；和Kuo等人，血液Blood 82:845(1993)。国际专利公开号WO95/07358描述了原代B淋巴细胞的高效转导。还参见WO2016040441A1，其通过引用并入本文用于本文引用的目的和主题。
在使用病毒载体将编码ACTR多肽的载体导入宿主细胞的实施例中，能够感染免疫细胞并携带载体的病毒颗粒可以通过本领域已知的任何方法产生并且可以找到，例如，在PCT申请号WO1991/002805A2，WO1998/009271 A1和美国专利6,194,191中。从细胞培养上清液中收获病毒颗粒，并且可以在使病毒颗粒与免疫细胞接触之前分离和/或纯化病毒颗粒。
在一些实施方案中，编码如本文所述的任何ACTR多肽的RNA分子可以通过常规方法(例如，体外转录)制备，然后通过经由已知的方法，例如，Rabinovich等人，人类基因疗法Human Gene Therapy 17:1027-1035，引入合适的宿主细胞，例如，本文所述的那些。
在将编码本文提供的任何ACTR多肽的载体或编码嵌合载体(例如，RNA分子)的核酸导入宿主细胞后，可以在表达ACTR多肽的条件下培养细胞。在可调节启动子调节编码ACTR多肽的核酸的实例中，宿主细胞可以在可调节启动子被激活的条件下培养。在一些实施方案中，启动子是诱导型启动子，免疫细胞在诱导分子存在下或在产生诱导分子的条件下培养。确定ACTR多肽是否表达对于本领域技术人员而言是显而易见的，并且可以通过任何已知方法评估，例如通过定量逆转录酶PCR(qRT-PCR)检测ACTR多肽编码mRNA，或检测ACTR多肽蛋白质通过包括蛋白质印迹、荧光显微术和流式细胞术的方法进行。或者，ACTR多肽的表达可以在施用免疫细胞的受试者体内发生。
如本文所用，术语“受试者”是指任何哺乳动物例如人、猴、小鼠、兔或家养哺乳动物。例如，受试者可以是灵长类动物。在优选的实施方案中，受试者是人。
或者，可以通过引入编码ACTR多肽的RNA分子来实现本文公开的任何免疫细胞中ACTR多肽的表达。这种RNA分子可以通过体外转录或通过化学合成来制备。然后可以通过例如电穿孔将RNA分子引入合适的宿主细胞，例如免疫细胞(例如，T细胞、NK细胞、或T细胞和NK细胞)。例如，可以按照Rabinovich等人，人类基因疗法Human Gene Therapy，17:1027-1035和WO2013/040557中描述的方法合成RNA分子并将其引入宿主免疫细胞中。
在某些实施方案中，可以将包含ACTR多肽的载体或RNA分子在体内引入宿主细胞或免疫细胞。作为非限制性实例，这可以通过将编码本文所述的一种或多种ACTR多肽的载体或RNA分子直接施用于受试者(例如，通过静脉内施用)，在体内产生包含ACTR多肽的宿主细胞来实现。
制备表达本文所述的任何ACTR多肽的宿主细胞的方法还可以包括离体激活宿主细胞。激活宿主细胞意味着刺激宿主细胞进入能够执行效应功能的激活状态，例如ADCC。激活宿主细胞的方法取决于用于表达ACTR多肽的宿主细胞的类型。例如，T细胞可以在一种或多种分子的存在下离体活化，所述分子包括但不限于：抗CD3抗体、抗CD28抗体、IL-2和/或植物血凝素。在其他实例中，NK细胞可以在一种或多种分子存在下离体活化，所述分子如4-1BB配体、抗-4-1BB抗体、IL-15、抗IL-15受体抗体、IL-2、IL12、IL-21和/或K562细胞。在一些实施方案中，表达本文所述的任何ACTR多肽的宿主细胞(表达ACTR的细胞)在施用于受试者之前离体活化。对于本领域技术人员而言，确定宿主细胞是否被激活是显而易见的，并且也可以评估与细胞活化、细胞因子的表达或分泌以及细胞形态相关的一种或多种细胞表面标志物的表达。
表达本文所述任何ACTR多肽的宿主细胞的制备方法可包括离体扩增宿主细胞。扩增宿主细胞可涉及诱导表达ACTR多肽的细胞数量增加的任何方法，例如，使宿主细胞增殖或刺激宿主细胞增殖。刺激宿主细胞扩增的方法将取决于用于表达ACTR多肽的宿主细胞的类型，并且对于本领域技术人员而言是显而易见的。在一些实施方案中，表达本文所述的任何ACTR多肽的宿主细胞在施用于受试者之前离体扩增。
在一些实施方案中，表达ACTR多肽的宿主细胞在将细胞施用于受试者之前离体扩增和活化。宿主细胞活化和扩增可用于将病毒载体整合到基因组并表达编码如本文所述的ACTR多肽的基因。如果使用mRNA电穿孔，则可能不需要活化和/或扩增，尽管当在活化细胞上进行时电穿孔可能更有效。在一些情况下，ACTR多肽在合适的宿主细胞中瞬时表达(例如，持续3-5天)。如果存在潜在的毒性，则瞬时表达可能是有利的，并且在临床测试的初始阶段对可能的副作用应该是有益的。
表达ACTR多肽的任何宿主细胞可以与药学上可接受的载体混合以形成药物组合物，这也在本公开的范围内。
与本公开的组合物一起使用的术语“药学上可接受的”是指在生理上是可耐受的并且当施用于哺乳动物(例如，人)时通常不产生不良反应的组合物的分子实体和其他成分。优选地，如本文所用，术语“药学上可接受的”意指由联邦或州政府的管理机构批准或在美国药典或其他公认的药典中列出的用于哺乳动物，更特别是人类。“可接受的”是指载体与组合物的活性成分(例如，核酸、载体、细胞或治疗性抗体)相容，并且不会对施用组合物的受试者产生负面影响。用于本发明方法的任何药物组合物可包含冻干形式或水溶液形式的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂。
药学上可接受的载体，包括缓冲剂，是本领域熟知的，并且可包含磷酸盐，柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂；低分子量多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；氨基酸；疏水聚合物；单糖；双糖；和其他碳水化合物；金属配合物；和/或非离子表面活性剂。可见，例如雷明顿:药学的科学与实践第20版(2000)Lippincott Williams和Wilkins,K.E.Hoover编辑。
本公开的药物组合物还可含有一种或多种另外的活性化合物，这些活性化合物对于所治疗的特定适应症和/或用于增强ADCC是必需的，优选具有互补活性且彼此不产生不利影响的活性化合物。可能的其他活性化合物的非限制性实例包括例如，IL-2以及本领域已知的各种试剂，并在下面的组合治疗的讨论中列出。
在本公开的上下文中，就其涉及本文所述的任何疾病状况而言，术语“处理”、“治疗”等意指减轻或缓解与这种病症相关的至少一种症状，或缓慢或逆转这种情况的进展。在本公开的含义内，术语“处理”还表示阻止、延迟发作(即，临床表现疾病之前的时期)和/或降低发展或恶化疾病的风险。例如，关于癌症，术语“处理”可以意指消除或减少患者肿瘤负荷，或预防、延迟或抑制转移发生，等。
III.表达ACTR多肽的免疫细胞和治疗性抗体的联合免疫治疗
本公开的示例性ACTR多肽赋予T淋巴细胞抗体依赖性细胞毒性(ADCC)能力并增强NK细胞中的ADCC。当受体通过抗体与细胞结合时，它会触发T细胞活化、持续增殖和针对结合细胞的特异性细胞毒性。
CD16对Ig的Fc部分的亲和力程度是ADCC的关键决定因素，因而也是抗体免疫疗法的临床反应起关键决定因素。选择具有V158多态性的CD16作为实例，其对Ig具有高结合亲和力并介导优良的ADCC。尽管F158受体在诱导T细胞增殖和ADCC方面具有比V158受体更低的效力，但F158受体可能具有比V158受体更低的体内毒性，使其可用于一些临床环境。
当与特异性结合癌抗原的抗体组合时，本发明的ACTR多肽和方法，通过一种用于所有癌症的单一受体，促进T细胞疗法。可以在需要时，通过简单地撤回抗体施用，停止抗体导向的细胞毒性。通过使用mRNA电穿孔瞬时表达ACTR多肽，可以进一步增强临床安全性，以限制任何潜在的自身免疫反应性。
因此，在一个实施方案中，本公开内容提供了用于增强有需要的受试者中基于抗体的免疫疗法的效力的方法，所述受试者用可以与抗原表达细胞结合且具有人CD16的人源化的Fc部分的抗体进行治疗，所述方法包括向受试者导入治疗有效量的抗体和治疗有效量的T淋巴细胞或NK细胞，其中T淋巴细胞或NK细胞包含本公开的ACTR多肽。
如本文所用，应用于剂量或量的术语“治疗有效”是指化合物或药物组合物的量足以对有需要的受试者产生所需活性。注意，当施用活性成分的组合时(例如，包含抗体的第一药物组合物，和包含表达抗体偶联的T细胞受体(ACTR)的T淋巴细胞群或NK细胞群的第二药物组合物)，组合物的有效量可以包括或不包括每种成分单独给药的有效量。在本公开内容的上下文中，术语“治疗有效”是指通过本公开的内容所述方法治疗，足以延迟表现，阻止进展，减轻或缓解病症的至少一种的症状的化合物或药物组合物的量。
A.增强免疫疗法功效
表达本文所述ACTR多肽的宿主细胞(例如，免疫细胞)可用于增强受试者中的ADCC和/或用于增强基于抗体的免疫疗法的功效。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物，例如人、猴、小鼠、兔或家养哺乳动物。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，受试者是人类癌症患者。在一些实施方案中，受试者已经接受或正在接受用本文所述的任何治疗性抗体的治疗。
为了实施本文所述的方法，可将有效量的表达本文所述的任何ACTR多肽的免疫细胞(NK细胞和/或T淋巴细胞)和有效量的抗体或其组合物可以通过合适的途径给予有需要的受试者进行治疗，例如静脉内给药。如本文所用，有效量是指在施用后赋予受试者治疗效果的相应药剂(例如，表达ACTR多肽的NK细胞和/或T淋巴细胞、抗体或其组合物)的量。确定本文所述的细胞或组合物的量是否达到治疗效果，对于本领域技术人员而言是显而易见的。如本领域技术人员所认识到的，有效量根据所治疗的具体病症，病症的严重程度，个体患者参数(包括年龄、身体状况、大小、性别、性别和体重)，治疗时程，同期治疗(如果有的话)的性质，特定的给药途径以及如健康从业者的知识和专业知识领域的因素而变化。在一些实施方案中，有效量减轻、缓解、改善、进展、减轻症状或延迟受试者中任何疾病或病症的进展。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，需要治疗的受试者是人类癌症患者。
本公开的方法可用于治疗任何癌症。可以通过本公开的方法治疗的癌症的具体非限制性实例包括，例如，淋巴瘤、乳腺癌、胃癌、神经母细胞瘤、骨肉瘤、肺癌、皮肤癌、前列腺癌、结肠直肠癌、肾细胞癌、卵巢癌、横纹肌肉瘤、白血病、间皮瘤、胰腺癌、头颈癌、视网膜母细胞瘤、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、甲状腺癌、肝细胞癌、食道癌、宫颈癌和神经母细胞瘤。在某些实施方案中，癌症可以是实体瘤。
在一些实施方案中，将免疫细胞以有效增强ADCC活性至少20％和/或至少2倍的量施用于受试者，例如将ADCC增强50％、80％、100％、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍或更多。
免疫细胞与治疗性抗体共同施用，以靶向表达与抗体结合的抗原的细胞。由于免疫疗法被认为对受试者有用，基于抗体的免疫疗法可用于治疗、减轻或减轻任何疾病或病症的症状。
一种抗体(可互换地使用复数形式“多种抗体”)是能够通过至少一个抗原识别位点特异性结合靶标(如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等)的免疫球蛋白分子，所述抗原识别位点位于免疫球蛋白分子可变区中。如本文所用，术语“抗体”不仅包括完整(即，全长)多克隆或单克隆抗体，还包括其包含Fc区的抗原结合片段，其突变体，包含抗体部分的融合蛋白，人源化抗体，嵌合抗体，双抗体，纳米抗体，线性抗体，多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和包含所需特异性的抗原识别位点和Fc区的免疫球蛋白分子的任何其他修饰构型，包括抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体和共价修饰的抗体。抗体包括任何类别的抗体，例如IgD、IgE、IgG、IgA或IgM(或其亚类)，且抗体不需要是任何特定类别。取决于其重链恒定结构域的抗体氨基酸序列，可以将免疫球蛋白分配到不同的类别。有五大类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中的一些可以进一步分亚类(亚型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。用于本公开的抗体含有共用的ACTR T细胞可识别的Fc区。Fc区可以是人或人源化Fc区。
本文描述的任何抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。“单克隆抗体”是指同源抗体群，“多克隆抗体”是指异质抗体群。这两个术语不限制抗体的来源或其制备方式。
在一个实例中，本文描述的方法中使用的抗体是人源化抗体。人源化抗体是指非人(例如鼠)抗体的形式，其是特异性嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其含有源自非人免疫球蛋白的最小序列抗原结合片段。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的互补决定区(CDR)的残基被具有所需特异性，亲和力和能力的来自非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠或兔子的CDR的残基取代。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应的非人残基取代。此外，人源化抗体可包含既不在受体抗体中也不在输入的CDR或框架序列中发现的残基，但为进一步改进和优化抗体性能而包括在内。通常，人源化抗体将包含至少一个、通常是两个可变结构域的基本上全部，其中所有或基本上所有CDR区对应于非人免疫球蛋白，而所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白共有序列的FR区。人源化抗体最佳地还将包含免疫球蛋白恒定区或结构域(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区或结构域。抗体可以具有如WO99/58572中所述修饰的Fc区。其他形式的人源化抗体具有一个或多个CDR(一个、两个、三个、四个、五个、六个)，所述CDR相对于原始抗体被改变，这也被称为一个或多个CDR“衍生自”原始抗体的一个或多个CDR。人源化抗体也可能涉及亲和力成熟。
在另一个实例中，本文描述的抗体是嵌合抗体，其可以包括来自人抗体的重恒定区和轻恒定区。嵌合抗体是指具有来自第一物种的可变区或部分可变区和来自第二物种的恒定区的抗体。通常，在这些嵌合抗体中，轻链和重链的可变区都模拟来自一种哺乳动物(例如，非人类哺乳动物，如小鼠、兔和大鼠)的抗体的可变区，而恒定部分与衍生自另一种哺乳动物如人的抗体中的序列同源。在一些实施方案中，可以在可变区和/或恒定区中进行氨基酸修饰。
表达本文公开的任何ACTR多肽的免疫细胞(例如，T淋巴细胞和/或NK细胞)可以施用于已经用含Fc抗体治疗或正在用含Fc抗体治疗的受试者。例如，免疫细胞可以与抗体同时施用于人受试者。或者，可以在基于抗体的免疫疗法的过程中将免疫细胞施用于人受试者。在一些实例中，免疫细胞和抗体可以间隔至少4小时施用于人受试者，例如，间隔至少12小时、间隔至少1天、间隔至少3天、间隔至少一周、相隔至少两周、或至少相隔一个月。
在一些实施方案中，本文描述的抗体特异性结合相应的靶抗原或其表位。“特异性结合”抗原或表位的抗体是本领域熟知的术语。如果分子与其他靶标相比，如果它更频繁、更快速地、更长时间地和/或亲和力更强地与特定靶抗原的反应，则称其表现出“特异性结合”。如果抗体以比其与其他物质结合的更大亲和力、活性，更容易和/或更长的持续时间地结合，则抗体“特异性结合”靶抗原或表位。例如，特异性(或优先)与抗原或其抗原表位结合的抗体，是相比与其他抗原和同一抗原中的其他表位结合，与该靶抗原结合具有更强的亲和力、活性，更容易和/或持续时间更长的抗体。。对该定义还应理解，例如，特异性结合第一靶抗原的抗体可以或可以不特异性或优先结合第二靶抗原。因此，“特异性结合”或“优先结合”不一定需要(尽管可以包括)排他性结合。在一些实例中，“特异性结合”靶抗原或其表位的抗体可能不与其他抗原或同一抗原中的其他表位结合。在一些实施方案中，本文所述的抗体特异性结合TNF-α、HER2、CD52、CD38、BCMA、GPC3、PDGF-R-α、CD25、VEGF、BLyS、CD30、IL1-B、EGFR、RANK配体、GD2、C5、CD11a、CD22、CD33、CTLA4、CEACAM5、α-4整合素、CD20、CD19、IgE、RSV、VEGFR2、IL6R、IL12、IL23、整合素α4-β7或PSMA。
在一些实施方案中，如本文所述的抗体对靶抗原具有合适的结合亲和力(例如，TNF-α、HER2、CD52、CD38、BCMA、GPC3、PDGF-R-α、CD25、VEGF、BLyS、CD30、IL1-B、EGFR、RANK配体、GD2、C5、CD11a、CD22、CD33、CTLA4、CEACAM5、α-4整合素、CD20、CD19、IgE、RSV、VEGFR2、IL6R、IL12、IL23、整合素α4-β7、或PSMA)或其抗原表位。如本文所用，“结合亲和力”是指表观缔合常数或KA。KA是解离常数(KD)的倒数。用于本文所述方法的抗体对靶抗原或抗原表位可具有至少10-5,10-6,10-7,10-8,10-9,10-10M或更低的结合亲和力(KD)。增加的结合亲和力对应于降低的KD。抗体对第一抗原相对于第二抗原的更高亲和力结合可以显示为与结合第二抗原的KA(或KD值)，结合第一抗原的KA更高(或KD值更小)。在这种情况下，抗体对第一抗原(例如，第一构象中的第一蛋白或其模拟物)相对于第二抗原(例如，第二构象中的相同第一蛋白或其模拟物；或第二种蛋白质)具有特异性。结合亲和力的差异(例如，特异性或其他比较)可以是至少1.5,2,3,4,5,10,15,20,37.5,50,70,80,91,100,500,1000,10,000或105倍。在一些实施方案中，任何抗体可以进一步亲和力成熟以增加抗体与靶抗原或其抗原表位的结合亲和力。
结合亲和力(或结合特异性)可通过多种方法测试，包括平衡透析、平衡结合、凝胶过滤、ELISA、表面等离子共振或光谱(例如，使用荧光测试)。用于评估结合亲和力的示例性条件是HBS-P缓冲液(10mM HEPES pH7.4,150mM NaCl，0.005％(v/v)表面活性剂P20)。这些技术可用于测量结合的结合蛋白的浓度是靶蛋白浓度的函数。结合的结合蛋白的浓度([Bound])通常与游离靶蛋白的浓度([Free])有关，方程式如下:
[Bound]＝[Free]/(Kd+[Free])
然而，并不总是需要精确确定KA，因为有时获得亲和力的定量测量(如使用ELISA或FACS分析等方法测试)就足够了，亲和力与KA成正比，因此可以用于比较，例如确定是否有更高的亲和力(如高2倍)，以获得亲和力的定性测量，或获得亲和力的推断，例如，通过功能测试的活性(如，体外或体内测试)。
用于本文所述免疫治疗方法的抗体可以结合(例如，特异性结合)其中的特定区域或抗原表位。
与本文所述组合物和方法一起使用的示例性抗体包括对TNF-α、HER2、CD52、CD38、BCMA、GPC3、PDGF-R-α、CD25、VEGF、BLyS、CD30、IL1-B、EGFR、RANK配体、GD2、C5、CD11a、CD22、CD33、CTLA4、CEACAM5、α-4整合素、CD20、CD19、IgE、RSV、VEGFR2、IL6R、IL12、IL23、整合素α4-β7或PSMA特异性的抗体，以及其他已知的抗体。作为非限制性实例，与本文描述的组合物和方法一起使用的抗体可以是以下一种或多种:阿达木单抗、曲妥珠单抗-美坦新偶联物、阿仑单抗、阿特珠单抗、阿维鲁单抗、巴利昔单抗、贝伐单抗、贝利木单抗、苯妥昔单抗、康纳单抗、西妥昔单抗、达克珠单抗、达雷木单抗、狄诺塞麦、达妥昔单抗、德瓦鲁单抗、依库珠单抗、依法珠单抗、依帕珠单抗、吉妥单抗、戈利木单抗、英夫利昔单抗、易普利姆玛、拉贝珠单抗、那他珠单抗、奥滨尤妥珠单抗、奥法木单抗、奥拉单抗、奥玛珠单抗、帕利珠单抗、帕尼单抗、帕妥珠单抗、雷莫芦单抗、利妥昔单抗、托珠单抗、曲妥珠单抗、优特克单抗和维多珠单抗。
基于抗体的免疫疗法的功效可以通过本领域已知的任何方法评估，并且对于熟练的医学专业人员是显而易见的。例如，可以通过受试者或组织或其样品中的，受试者的存活、或肿瘤或癌症负荷，来评估基于抗体的免疫疗法的功效。在一些实施方案中，将免疫细胞以有效量施用于需要治疗的受试者增强基于抗体的免疫疗法的功效至少20％和/或至少2倍，例如，与未表达ACTR多肽和/或抗体的免疫细胞的功效相比，将基于抗体的免疫疗法的功效提高50％、80％、100％、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍或更多。
在本文所述的任何组合物或方法中，免疫细胞(例如，NK和/或T细胞)可以是受试者自体的，即免疫细胞可以从需要治疗的受试者获得，遗传工程改造以表达ACTR多肽，然后给予相同的受试者。在一个具体实施方案中，在重新引入受试者之前，自体免疫细胞(例如，T淋巴细胞或NK细胞)被离体活化和/或扩增。与施用非自体细胞相比，向受试者施用自体细胞可使宿主细胞的排斥减少。
或者，宿主细胞是同种异体细胞，即细胞从第一个受试者获得，经遗传工程改造以表达ACTR多肽，并施用于不同于第一个受试者但属于相同物种的第二个受试者。例如，同种异体免疫细胞可以源自人供体并施用于不同于供体的人类受体。在一个具体实施方案中，T淋巴细胞是同种异体T淋巴细胞，其中内源性T细胞受体的表达已被抑制或消除。在一个具体实施方案中，在引入受试者之前，同种异体T淋巴细胞离体活化和/或扩增。T淋巴细胞可以通过本领域已知的任何方法活化，例如在抗CD3/CD28、IL-2和/或植物血凝素的存在下。
NK细胞可以通过本领域已知的任何方法活化，例如，在存在一种或多种选自下组试剂的情况下：CD137配体蛋白、CD137抗体、IL-15蛋白、IL-15受体抗体、IL-2蛋白、IL-12蛋白、IL-21蛋白和K562细胞系。参见例如，美国专利号7,435,596和8,026,097，其中描述了用于扩增NK细胞的有用方法。例如，本公开的组合物或方法中使用的NK细胞可以通过暴露于缺乏或低表达主要组织相容性复合物I和/或II分子而优先扩增，并且已经遗传修饰以表达膜结合的IL-15和4-1BB配体(CDI37L)的细胞。这些细胞系包括但不必限于K562[ATCC，CCL243；Lozzio等人，Blood 45(3):321-334(1975)；Klein等人，Int.J.Cancer 18:421-431(1976)]，和Wilms肿瘤细胞系HFWT(Fehniger等人，Int Rev Immunol 20(3-4):503-534(2001)；Harada H等人，Exp Hematol 32(7):614-621(2004))，子宫内膜肿瘤细胞系HHUA，黑色素瘤细胞系HMV-II，肝母细胞瘤细胞系HuH-6，肺小细胞癌细胞系Lu-130和Lu-134-A，神经母细胞瘤细胞系NB19和N1369，来自睾丸NEC14的胚胎癌细胞系，子宫颈癌细胞系TCO-2和骨髓转移的神经母细胞瘤细胞系TNB1[Harada等人，Jpn.J.Cancer Res 93:313-319(2002)].优选地，所使用的细胞系缺乏或低表达MHC I和II分子，例如K562和HFWT细胞系。可以使用实心载体支持物代替细胞系。这种载体应优选在其表面上附着至少一种能够结合NK细胞并诱导初级活化事件和/或增殖反应或能够结合具有这种作用的分子从而起到支架作用的分子。载体可以在其表面附着CD137配体蛋白、CD137抗体、IL-15蛋白或IL-15受体抗体。优选地，载体将在其表面结合IL-15受体抗体和CD137抗体。
在所述组合物或方法的一个实施方案中，向受试者导入(或重新导入)T淋巴细胞、NK细胞或T淋巴细胞和NK细胞，然后向受试者施用治疗有效量的IL-2。
根据本公开，可以通过输注治疗有效剂量的免疫细胞(例如T淋巴细胞或NK细胞)来治疗患者，所述免疫细胞包含本公开的ACTR多肽，其在约105至1010或更多细胞/千克体重的范围内(细胞/千克)。输注可以以患者可以耐受的频率和次数重复，直到达到所需的反应。适当的输注剂量和时间表将因患者而异，但可由治疗医师为特定患者决定。通常，将输注约106细胞/Kg的初始剂量，升高至108或更高细胞/Kg。可以共同施用IL-2以扩增输注的细胞。IL-2的量可以是每平方米体表约1-5×106国际单位。
在一些实施方案中，将一个或多个剂量的约100-500mg、500-1000mg、1000-1500mg或1500-2000mg抗体施用于受试者。在一些实施方案中，将一个或多个剂量的约500mg、约600mg、约700mg、约800mg或约900mg抗体施用于受试者。在一些实施方案中，将一个或多个剂量的约1000mg、约1100mg、约1200mg、约1300mg、约1400mg、约1500mg、约1600mg、约1700mg、或约1800毫克抗体施用于受试者。在一些实施方案中，将一个或多个剂量的约1600mg抗体施用于受试者。
在本文描述的方法中使用的具体剂量方案，即剂量、时间和重复将取决于特定受试者和受试者病史。所用抗体的合适剂量取决于待治疗的癌症类型，疾病的严重程度和病程，既往治疗，患者的临床病史和对抗体的反应，以及主治医师的判断。可以一次性或在一系列治疗中将抗体施用于患者。通过常规技术和检测可以容易地监测本公开内容的治疗进展。
抗体的施用可以通过任何合适的途径进行，包括全身施用以及直接施用于疾病部位(例如，施用于肿瘤)。
在一些实施方案中，该方法包括以一剂给予受试者抗体。在一些实施方案中，该方法包括以多剂量(例如，至少2,3,4,5,6,7或8个剂量)向受试者施用抗体。在一些实施方案中，以多剂量将抗体施用于受试者，在施用表达ACTR的免疫细胞之前约1,2,3,4,5,6或7天将第一剂抗体施用于受试者。在一些实施方案中，在施用表达ACTR的免疫细胞之前约24-48小时，将第一剂抗体施用于受试者。
在一些实施方案中，在施用表达ACTR的免疫细胞之前将抗体施用于受试者，然后大约每两周施用一次。在一些实施方案中，前两个剂量的抗体相隔约一周(例如，约6,7,8或9天)施用。在某些实施方案中，第三次和之后剂量大约每两周施用。
在本文所述的任何实施方案中，抗体给药的时间是近似的并且包括在指定日之前三天和之后三天(例如，每三周给药包括在第18天、第19天、第20天、第21天、第22天、第23天或第24天给药)。
本文所述的组合物或方法的功效可通过本领域已知的任何方法评估，并且对于熟练的医学专业人员而言是显而易见的。例如，可以通过受试者或组织或其样品的受试者的存活或癌症负荷，评估基于抗体的免疫疗法的功效。在一些实施方案中，基于抗体的免疫疗法的评估基于在受试者中治疗(例如，施用抗体和表达ACTR多肽的免疫细胞)的安全性或毒性，例如通过受试者的总体健康和/或存在不良事件或严重不良事件。
B.组合治疗
本公开中描述的组合物和方法可以与其他类型的癌症治疗结合使用，例如化疗、手术、放射、基因治疗等。这些疗法可以与根据本发明的免疫疗法同时或相继(以任何顺序)施用。
当与其他治疗剂共同施用时，由于添加剂作用或协同作用，可以降低每种药剂的合适的治疗有效剂量。
本公开的治疗可以与其他免疫调节治疗组合，例如，治疗性疫苗(包括但不限于GVAX、基于DC的疫苗等)，检查点抑制剂(包括但不限于阻断CTLA4、PD1、LAG3、TIM3等药剂)或激活剂(包括但不限于增强41BB、OX40等药剂)。
可用于与本公开的免疫疗法组合的其他治疗剂的非限制性实例包括:(i)抗血管生成剂(例如，TNP-470、血小板因子4、血小板反应蛋白-1、金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP1和TIMP2)，催乳素(16-Kd片段)，血管抑制素(纤溶酶原的38-Kd片段))，内皮抑素，bFGF可溶性受体，转化生长因子β，干扰素α，可溶性KDR和FLT-1受体，胎盘增殖素相关蛋白，以及Carmeliet和Jain(2000)列出的那些；(ii)VEGF拮抗剂或VEGF受体拮抗剂，例如抗VEGF抗体，VEGF变体，可溶性VEGF受体片段，能够阻断VEGF或VEGFR的适体，中和抗VEGFR抗体，VEGFR酪氨酸激酶抑制剂及其任意组合；(iii)化学治疗化合物，例如，嘧啶类似物(5-氟尿嘧啶、氟尿嘧啶、卡培他滨、吉西他滨和阿糖胞苷)，嘌呤类似物，叶酸拮抗剂和相关抑制剂(巯嘌呤、硫鸟嘌呤、喷司他丁和2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨)))；抗增殖剂/抗有丝分裂剂，包括长春花生物碱(长春碱、长春新碱和长春瑞滨)等天然产物，紫杉烷(紫杉醇、多西紫杉醇)，长春新碱，长春碱，诺考达唑，埃博霉素和长春瑞滨等微管破坏剂，表鬼臼毒素(依托泊苷和替尼泊苷)，DNA损伤剂(放线菌素、安吖嗪、蒽环霉素、博莱霉素、白消烟、喜树碱、卡铂、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、环磷酰胺、放线菌素、柔红霉素、多柔比星、表柔比星、六甲基蜜胺奥沙利铂、异膦胺、美法仑、氯苄胺、丝裂霉素、米托蒽醌、亚硝基脲、普利霉素、丙卡巴肼、紫杉醇、泰索帝、替尼泊苷、三乙基硫代磷酰胺和依托泊苷(VP16))；放线菌素(放线菌素D)，柔红霉素，多柔比星(阿霉素)，伊达比星，蒽环霉素，米托蒽醌，博来霉素，普鲁霉素(光神霉素)和丝裂霉素等抗生素；酶(L-天冬酰胺酶系统地代谢L-天冬酰胺并剥夺不具有合成自身天冬酰胺能力的细胞)；抗血小板药；抗增殖/抗有丝分裂烷化剂，如氮芥(氮芥、环磷酰胺和类似物、美法仑、苯丁酸氮芥)，乙烯亚胺和甲基三聚氰胺(六甲基三聚氰胺和塞替派)，烷基磺酸盐-白消安，亚硝基脲(卡莫司汀(BCNU)和类似物、链脲佐菌素)、trazenes-dacarbazinine(DTIC)；抗增殖/抗有丝分裂抗代谢物如叶酸类似物(甲氨蝶呤)；铂配位配合物(顺铂、卡铂)，丙卡巴肼，羟基脲，米托坦，氨基戊二酰亚胺；激素，激素类似物(雌激素、他莫昔芬、戈舍瑞林、比卡鲁胺、尼鲁米特)和芳香酶抑制剂(来曲唑、阿那曲唑)；抗凝血剂(肝素、合成肝素盐和其他凝血酶抑制剂)；纤维蛋白溶解剂(如组织纤溶酶原激活剂、链激酶和尿激酶)，阿司匹林，双嘧达莫，噻氯匹定，氯吡格雷，阿昔单抗；抗迁移剂；抗分泌剂(布雷菲尔德丁)；免疫抑制剂(环孢菌素、他克莫司(FK-506)，西罗莫司(雷帕霉素)，硫唑嘌呤，霉酚酸酯)；抗血管生成化合物(例如，TNP-470、染料木黄酮、贝伐单抗)和生长因子抑制剂(例如，成纤维细胞生长因子(FGF)抑制剂)；血管紧张素受体阻滞剂；一氧化氮供体；反义寡核苷酸；抗体(曲妥珠单抗)；细胞周期抑制剂和分化诱导剂(维甲酸)；AKT抑制剂(如MK-2206 2HCl、哌立福新(KRX-0401)、GSK690693、Ipatasertib(GDC-0068)、AZD5363、uprosertib、afuresertib或triciribine)；mTOR抑制剂，拓扑异构酶抑制剂(多柔比星(阿霉素)、安吖啶、喜树碱、柔红霉素、放线菌素、栀子苷、表柔比星、依托泊苷、伊达比星、米托蒽醌、拓扑替康和伊立替康)，皮质类固醇(可的松、地塞米松、氢化可的松、甲基强的松龙、泼尼松和泼尼松龙)；生长因子信号转导激酶抑制剂；线粒体功能障碍诱导因子和半胱天冬酶激活因子；和染色质干扰物。
对于其他有用药剂的实例，还参见医师手册第59版(2005)，Thomson P D R，Montvale N.J.；Gennaro等人编辑雷明顿的药学科学与实践第20版，(2000)，LippincottWilliams和Wilkins，Baltimore医学博士；Braunwald等人编辑哈里森的内科学原理，第15版，(2001)，纽约麦格希；Berkow等人编辑默克诊断和治疗手册，(1992)，默克研究所，Rahway N.J.。
C.使用ACTR-T细胞与抗肿瘤抗体组合治疗实体瘤的方案
本文描述的方法还至少部分基于以下发现：表达ACTR(例如，SEQ ID NO:9的ACTR)的免疫细胞和抗肿瘤抗体(例如，利妥昔单抗或曲妥珠单抗)的组合，导致免疫细胞的增殖和活化响应于结合表达肿瘤抗原如CD20或HER2的靶癌细胞的抗体，且此增殖和活化是抗体依赖性和自限性的。对充分暴露于抗肿瘤抗体(例如，利妥昔单抗或曲妥珠单抗)的依赖性表明表达ACTR的免疫细胞的活性可以通过抗体剂量和给药方案来调节，使本文所述方法优于以前使用的CAR T细胞。
因此，本公开内容还提供了使用ACTR-T细胞和抗肿瘤(例如，抗CD20或抗HER2)抗体的组合来治疗实体瘤(例如，淋巴瘤，特别是复发和/或难治性淋巴瘤、或HER2+的肿瘤，比如HER2+乳腺癌、胃癌和食道癌)的治疗方案。在该治疗中，需要治疗的受试者可以接受组合的抗肿瘤抗体(例如，抗CD20抗体或抗HER2抗体)/ACTR-T细胞的预处理方案治疗(例如，淋巴清除治疗)，其包括施用抗肿瘤抗体(例如，CD20抗体，如利妥昔单抗或抗HER2抗体，比如曲妥珠单抗)和输注表达ACTR的免疫细胞(例如，T细胞)。以下是使用表达具有CD28共刺激结构域(例如，SEQ ID NO.:9)和抗CD20抗体(例如利妥昔单抗)的ACTR多肽的T细胞的说明性和非限制性实例。
适合于治疗的受试者可以通过常规医学实践来指定。这样的受试者可以是患有CD20+淋巴瘤的人类患者，特别是复发性或难治性CD20+淋巴瘤。淋巴瘤是指从淋巴细胞发展而来的一组血细胞肿瘤。霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤是两种主要类型的淋巴瘤。如果在经历淋巴瘤治疗后淋巴瘤细胞存在于受试者的骨髓中，则淋巴瘤可被认为是“难治的”。或者，如果在骨髓中检测到在淋巴瘤缓解后淋巴瘤细胞的恢复以及正常血细胞的数量减少，则认为淋巴瘤是“复发的”。在一些实施方案中，复发或难治性CD20+淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤。在一些实施方案中，CD20+B细胞淋巴瘤是大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、原发性纵隔B细胞淋巴瘤(PMBCL)、3b级滤泡性淋巴瘤(Gr3b-FL)、或转化组织学滤泡性淋巴瘤(TH-FL)。
在抗CD20/ACTR治疗之前，诸如人实体瘤(例如，淋巴瘤)患者的受试者可以进行预处理方案，例如淋巴清除疗法，以减少或消耗受试者的内源性淋巴细胞。
淋巴细胞耗竭是指内源性淋巴细胞和/或T细胞的破坏，其通常在免疫移植和免疫疗法之前使用。可以通过辐射和/或化学疗法实现淋巴细胞消除。“淋巴消退剂”可以是当给予受试者时能够减少、消除或消除内源性淋巴细胞和/或T细胞的任何分子。在一些实施方案中，以有效量施用淋巴清除剂,使淋巴细胞数量与施用药剂之前的淋巴细胞数相比，减少至少10％,20％,30％,40％,50％,60％,70％,80％,90％,95％,96％,96％,97％,98％或至少99％。在一些实施方案中，淋巴清除剂以减少淋巴细胞数量的有效量施用，使得受试者中淋巴细胞的数量低于检测限。在一些实施方案中，向受试者施用至少一种(例如，2,3,4,5或更多种)淋巴清除剂。在一些实施方案中，淋巴清除剂是特异性杀死淋巴细胞的细胞毒性剂。淋巴清除剂的实例包括但不限于氟达拉滨、环磷酰胺、苯扎那嗪、5-氟尿嘧啶、吉西他滨、甲氨蝶呤、达卡巴嗪、美法仑、多柔比星、长春碱、顺铂、奥沙利铂、紫杉醇、多西紫杉醇、伊立替康、磷酸依托泊苷、米托蒽醌、克拉屈滨、地尼白介素或DAB-IL-2。在某些情况下，淋巴清除剂可伴有低剂量辐射。可以通过常规实践监测预处理方案的淋巴消退效果。
在一些实施方案中，淋巴清除疗法包含一种或多种淋巴清除剂，例如氟达拉滨和环磷酰胺。通过本文所述方法治疗的受试者可在调节阶段接受多剂量的一种或多种淋巴清除剂持续合适的时期(例如，2-5天)。
在预处理方案(淋巴清除疗法)之后，受试者接受抗CD20/ACTR治疗方案，其包括施用抗CD20抗体如利妥昔单抗和输注表达ACTR的免疫细胞(例如，T细胞)。
在表达ACTR的免疫细胞治疗之前，可以如本文所述对受试者进行抗CD20治疗。CD-20是在所有阶段的B细胞表面上表达的B淋巴细胞抗原。CD20阳性细胞存在于霍奇金病、骨髓瘤和胸腺瘤的病例中。人CD20由MS4A1基因编码。本领域已知的任何抗CD20抗体均可用于本文提供的方法中。抗CD20抗体是能够特异性结合CD20分子的免疫球蛋白分子，例如，在B细胞表面上表达的CD20分子。在一个实例中，抗CD20抗体是利妥昔单抗。可以使用医学领域普通技术人员已知的常规方法，将含有抗CD20抗体的药物组合物给予需要治疗的受试者。该组合物还可以通过其它常规途径给药，例如肠胃外给药。本文所用的术语“肠胃外”包括皮下、皮内、静脉内、肌肉内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内和颅内注射或输注技术。
在抗CD20治疗后，受试者通过如输注，接受表达ACTR的免疫细胞如T细胞。表达ACTR的T细胞能以任何治疗有效剂量给予受试者。作为一组非限制性实例，表达ACTR的T细胞可以40×106个细胞、80×106个细胞、150×106个细胞或300×106个细胞的剂量施用于受试者。一个或多于一剂(例如，1,2,3,4,5,6或7个剂量)的表达ACTR的T细胞可以施用于同一受试者。
本文所述的任何ACTR构建体均可用于该方法。在一些实施方案中，该治疗中使用的ACTR构建体可包含Fc受体的细胞外配体结合结构域，例如CD16(例如，CD16V亚型)、CD28的铰链结构域、CD28的跨膜结构域、CD28的共刺激结构域和CD3ζ的细胞质信号结构域。在特定实例中，ACTR构建体可以是SEQ ID NO:9。
在ACTR-T细胞治疗之后，如果需要，可以进行一个或多个抗CD20治疗周期，这可以由医生确定。例如，在ACTR-T细胞处理后可以进行一个额外的抗CD20抗体治疗循环。可以对受试者进行剂量限制毒性(DLT)评估。然后可以对受试者进行另一轮抗CD20抗体治疗，然后进行反应评估。抗CD20抗体治疗可以持续另外21天直至观察到疾病进展。
图22描述了使用ACTR T细胞与利妥昔单抗组合治疗患有复发或难治性CD20+B细胞淋巴瘤的患者的示例性治疗方案。组织学证实的复发或难治性CD20+B细胞淋巴瘤的受试者可能符合资格，具有以下组织学亚型之一：DLBCL、MCL、PMBCL、Gr3b-FL、TH-FL。
本文描述的方法的功效可以通过本领域已知的任何方法评估，并且对于熟练的医学专业人员是显而易见的。例如，可以通过受试者或组织或其样品的受试者的存活或癌症负荷，评估基于抗体的免疫疗法的功效。在一些实施方案中，基于抗体的免疫疗法的评估基于该治疗(例如，施用抗CD20抗体和表达ACTR的免疫细胞)在受试者中的安全性或毒性，例如通过受试者的总体健康状况评估，和/或不良事件或严重不良事件的存在。
D.治疗涉及活化T细胞抗原的疾病
传统的CAR-T疗法涉及使用对细胞表面抗原特异的CAR构建体，从而消除表达这些抗原的病理细胞。当CAR-T细胞靶向的表面抗原也存在于活化T细胞上时，例如CD5、CD38或CD7，这种CAR-T细胞的体外扩增将受损，因为活化的CAR-T细胞也表达这种表面抗原并被其他CAR-T细胞杀死(自相残杀效应)。因此，CAR-T疗法的发展受其靶向的细胞抗原的限制。
ACTR-T疗法没有这种抗原限制。ACTR-T细胞不直接靶向病理细胞，且使用抗体作为中间体。因此，ACTR-T细胞的体外扩增不受ACTR-T细胞靶向的抗原类型的限制。
因此，本发明还提供了诱导受试者体内细胞毒性的方法，包括联合使用对活化T细胞表面上表达的抗原特异的抗体；以及表达抗体偶联T细胞受体(ACTR)的T细胞。该方法有益于涉及表达表面抗原的细胞的疾病的治疗，所述表面抗原也存在于活化的T细胞上。
任何ACTR构建体，例如，本领域已知的或本文公开的那些，可用于该方法。例如，用于该方法的ACTR构建体可以包括：(a)Fc结合结构域；(b)跨膜结构域；(c)至少一个共刺激信号域；(d)包含基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)的细胞质信号域，其中(c)或(d)位于嵌合受体的C-末端。在一些实施方案中，ACTR可进一步包含铰链结构域，其可位于(a)和(b)之间。
本文所述的任何Fc结合结构域、跨膜结构域、细胞质信号域和/或铰链结构域可用于构建用于该方法的ACTR。
除了上述CD28的共刺激结构域之外，其他共刺激结构域也可用于制备用于该方法的ACTR构建体。实例包括但不限于B7/CD28家族的成员(例如，B7-1/CD80、B7-2/CD86、B7-H1/PD-L1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-H7、BTLA/CD272、CD28、CTLA-4、Gi24/VISTA/B7-H5、ICOS/CD278、PD-1、PD-L2/B7-DC和PDCD6)；TNF超家族成员(例如，4-1BB/TNFSF9/CD137、4-1BB配体/TNFSF9、BAFF/BLyS/TNFSF13B、BAFF R/TNFRSF13C、CD27/TNFRSF7、CD27配体/TNFSF7、CD30/TNFRSF8、CD30配体/TNFSF8、CD40/TNFRSF5、CD40/TNFSF5、CD40配体/TNFSF5、DR3/TNFRSF25、GITR/TNFRSF18、GITR配体/TNFSF18、HVEM/TNFRSF14、LIGHT/TNFSF14、淋巴毒素-α/TNF-β、OX40/TNFRSF4、OX40配体/TNFSF4、RELT/TNFRSF19L、TACI/TNFRSF13B、TL1A/TNFSF15、TNF-α和TNF RII/TNFRSF1B)；SLAM家族成员(例如，2B4/CD244/SLAMF4、BLAME/SLAMF8、CD2、CD2F-10/SLAMF9、CD48/SLAMF2、CD58/LFA-3、CD84/SLAMF5、CD229/SLAMF3、CRACC/SLAMF7、NTB-A/SLAMF6和SLAM/CD150)；和任何其他共刺激分子，如CD2、CD7、CD53、CD82/Kai-1、CD90/Thy1、CD96、CD160、CD200、CD300a/LMIR1、HLA I类、HLA-DR、Ikaros、整合素α4/CD49d、整合素α4β1、整合素α4β7/LPAM-1、LAG-3、TCL1A、TCL1B、CRTAM、DAP12、树突状细胞相关性C型植物血凝素/CLEC7A、DPPIV/CD26、EphB6、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-4、TSLP、TSLP R、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)和NKG2C。在一些实施方案中，共刺激信号域是4-1BB、CD28、OX40、ICOS、CD27、GITR、HVEM、TIM1、LFA1(CD11a)或CD2、或其任何变体。
用于诱导受试者细胞毒性的方法的示例性ACTR构建体，可以在例如本说明书和附图中找到(例如，SEQ ID NO:9)或可在国际专利申请号:PCT/US2015/049126中找到，为此目的通过引用并入本文。
在一些实施方案中，用于诱导细胞毒性的方法中的ACTR-T细胞在体外扩增，例如遵循本文所述的方法。
对T细胞表面上表达的抗原特异的抗体，可包括针对T细胞表面上表达的任何抗原的抗体。例如，抗体可以结合CD38或CD7。作为另一组非限制性实例，抗体可以结合CD2、CD3或CD5。结合在T细胞表面上表达的抗原的抗体可包括但不限于达雷木单抗、SAR650984、西利珠单抗、BTI-322、奥昔珠单抗、替利珠单抗、维西珠单抗、阿佐莫单抗、阿替莫单抗。
V.用于治疗用途的试剂盒
本公开还提供了用于本文所述组合物的试剂盒。例如，本公开还提供了使用抗体和表达抗体偶联的T细胞受体(ACTR)构建体的免疫细胞群(例如，T淋巴细胞或NK细胞)的试剂盒，以增强抗体依赖的细胞介导的细胞毒性并增强基于抗体的免疫疗法。此类试剂盒可包括一个或多个容器，容器包括含有抗体和药学上可接受的载体的第一药物组合物，和含有如本文所述的那些表达抗体偶联T细胞受体(ACTR)构建体的T淋巴细胞和/或NK细胞群的第二药物组合物。T淋巴细胞和/或NK细胞群可以进一步表达包含共刺激结构域或共刺激因子配体的外源多肽。
在一些实施方案中，本文所述的试剂盒包含体外扩增的ACTR-T细胞，以及存在于活化T细胞上的细胞表面抗体特异性抗体，例如抗CD5抗体、抗-CD38抗体或抗CD7抗体。ACTR-T细胞可以表达本领域已知的或本文公开的任何ACTR构建体。在一个实例中，ACTR-T细胞表达ACTR变体SEQ ID NO:9。
在一些实施方案中，试剂盒可另外包含用于本文所述任何方法的说明书。所包含的说明书可包括向受试者施用第一和第二药物组合物以达到受试者体内预期活性的说明，例如，增强ADCC活性和/或增强基于抗体的免疫疗法的功效。所述试剂盒可以进一步包括基于鉴定所述受试者是否需要所述治疗来选择适合于治疗的受试者的描述。在一些实施方案中，说明书包括向需要治疗的受试者施用第一和第二药物组合物的说明。
与本文所述的第一和第二药物组合物的使用有关的说明书通常包括关于预期治疗的剂量、给药方案和给药途径的信息。容器可以是单位剂量，大容积包装(例如，多剂量包装)或亚单位剂量。本公开的试剂盒中提供的说明通常是标签或包装说明书上的书面说明。标签或包装说明书指示药物组合物用于治疗、延迟发作和/或减轻受试者的疾病或病症。
本文提供的试剂盒是合适的包装。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶子、罐子、柔性包装等。还考虑了与特定装置组合使用的包装，例如吸入器、鼻腔给药装置或输注装置。试剂盒可以具有无菌入口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有可由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。容器还可具有无菌入口。第一药物组合物中的至少一种活性物质是如本文所述的抗体。第二种药物组合物中的至少一种活性物质是表达如本文所述的抗体偶联的T细胞受体(ACTR)构建体的免疫细胞群(例如，T淋巴细胞或NK细胞)。
试剂盒可选地可以提供其他的组件，例如缓冲器和解释信息。通常，该试剂盒包括容器和在容器上或与容器相关联的标签或包装插件。在一些实施方案中，本公开提供了包含上述试剂盒的内容物的制品。
常用技术
除非另有说明，本公开的实践将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些技术在本领域的技术范围内。这些技术在文献中有充分解释，例如分子克隆：实验室手册，第二版(Sambrook，等人，1989)冷泉港出版社；寡核苷酸合成(M.J.Gait，编辑,1984)；分子生物学方法，Humana出版社；细胞生物学:实验室笔记本(J.E.Cellis,编辑,1989)学术出版社；动物细胞培养(R.I.Freshney,编辑,1987)；对细胞和组织培养的介绍(J.P.Mather和P.E.Roberts，1998)Plenum出版社；细胞和组织培养:实验室程序(A.Doyle，J.B.Griffiths和D.G.Newell，编辑1993-8)J.Wiley和Sons；酶学方法(学术出版社，股份有限公司)；实验免疫学手册(D.M.Weir和C.C.Blackwell，编辑):用于哺乳动物细胞的基因转移载体(J.M.Miller和M.P.Calos，编辑，1987)；目前的分子生物学协议(F.M.Ausubel等人编辑。1987)；PCR:聚合酶链反应(Mullis等人，编辑1994)；免疫学现行方案(J.E.Coligan等人，编辑，1991)；分子生物学短程序(Wiley及其子，1999)；免疫生物学(C.A.Janeway和P.Travers，1997)；抗体(P.Finch，1997)；抗体:一种实践方法(D.Catty编辑，IRL出版社，1988-1989)；单克隆抗体：一种实用的方法(P.Shepherd和C.Dean编辑，牛津大学出版社，2000)；使用抗体:实验室手册(E.Harlow和D.Lane(冷泉港实验室出版社，1999)；抗体(M.Zanetti和J.D.Capra编辑，哈伍德学术出版社，1995)；DNA克隆:一种实用的方法，第一卷和第二卷(D.N.Glover编辑,1985)；核酸杂交N(B.D.Hames&S.J.Higgins编辑,1985)；转录和翻译(B.D.Hames&S.J.Higgins编辑,1984)；动物细胞培养(R.I.Freshney编辑,1986)；固定化细胞和酶(LRL出版社,1986)；和B.Perbal，分子克隆实施指南(1984)；F.M.Ausubel等人(编)。
无需进一步详细说明，相信本领域技术人员基于以上描述可以最大程度地利用本公开。因此，以下具体实施方案应被解释为仅是说明性的，并且不以任何方式限制本公开的其余部分。出于本文引用的目的或主题，本文引用的所有出版物均通过引用并入。
实施例
例1:ACTR-T细胞对靶细胞的细胞毒性测试。
产生编码表3中的ACTR变体的γ-逆转录病毒。这些病毒用于感染原代人T细胞，产生在感染细胞表面表达这些ACTR变体的细胞。随后将该细胞用于组成型表达萤火虫荧光素酶和CD20靶向的利妥昔单抗的CD20阳性Raji靶细胞，或组成型表达萤火虫荧光素酶和HER2靶向的曲妥珠单抗的HER2阳性HCC1954细胞的细胞毒性测试。
在补充有10％胎牛血清的RPMI 1640培养基的200μL反应体积中不同浓度的利妥昔单抗(0-10μg/mL)存在下，将T细胞(效应子；E)和Raji靶细胞(靶标；T)以4:1的效应物与靶标比例(120,000个效应细胞；30,000个靶细胞)温育。所有反应均重复进行。将反应物在CO2(5％)培养箱中于37℃温育40-48小时。从每个反应中除去100μL体积的上清液。将100-μL体积的Bright-Glo荧光素酶测试试剂(Promega公司；麦迪森，威斯康星州)加入剩余的反应中，并在室温下温育10分钟。然后使用Envision多功能酶标仪(PerkinElmer公司；沃尔瑟姆，马萨诸塞州)测量发光。通过将给定样品的发光信号除以不存在针对每种T细胞类型的抗体的发光信号并乘以100来确定活细胞的百分比。通过从100减去活细胞百分比来确定细胞毒性百分比。
在另外的实验中，在不同浓度的曲妥珠单抗(0-1μg/mL)在补充有10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中的200μL反应体积中，将T细胞(效应子；E)和HCC1954靶细胞(靶标；T)以1:4的效应物-靶标比例(30,000个效应细胞；30,000个靶细胞)温育。所有反应均重复进行。将反应物在CO2(5％)培养箱中于37℃温育20-24小时。进行荧光素酶测试，测量荧光值，并如上测试细胞毒性百分比。
当目标Raji细胞与表达SEQ ID No:7,8,9和13变体的ACTR T细胞一起温育时，增加利妥昔单抗浓度，观察到细胞毒性的浓度依赖性增加(图1)。当目标HCC1954细胞与表达编码SEQ ID NO:7,8,9,13和SEQ ID NO:89/SEQ ID NO:90变体的核酸的ACTR T细胞一起温育时,曲妥珠单抗浓度增加，也观察到细胞毒性的浓度依赖性增加(图2)。
在类似的实验中，在两种细胞系中也观察到其他的ACTR变体的细胞毒性。将细胞毒性百分比作为抗体浓度的函数作图，并用GraphPad Prism产生非线性回归分析，并用于确定EC50值。这些实验的最大细胞毒性百分比和EC50可在下表4中找到。还评估了包含CD28共刺激结构域的其他ACTR变体。含有C28共刺激结构域的ACTR变体显示了一系列与Raji靶细胞和利妥昔单抗(0.02-0.38μg/mL)，和与HCC1954靶细胞和曲妥珠单抗(0.003-0.09μg/mL)的EC50。这些实验证明了ACTR变体显示了针对表达抗体同源靶标的细胞系的抗体依赖性的细胞毒性。
表4:不同ACTR变体的细胞毒性
*n.d.＝未检出
**ACTR构建体SEQ ID NO:38与SEQ ID NO:39反向表达例2:在靶细胞存在下ACTR-T细胞释放IL-2细胞因子。
产生编码表3中的ACTR变体的γ-逆转录病毒。这些病毒用于感染原代人T细胞，产生在感染细胞表面表达这些ACTR变体的细胞。随后将这些细胞进行与CD20阳性Raji靶细胞和靶向CD20的利妥昔单抗的IL-2释放测试，和与HER2阳性HCC1954靶细胞和靶向HER2的曲妥珠单抗的IL-2释放测试。模拟T细胞(不表达ACTR变体的T细胞)用作该实验中的对照。
在补充有10％胎牛血清的RPMI 1640培养基的100μL反应体积中不同浓度的利妥昔单抗(0-10μg/mL)存在下，将T细胞(效应子；E)和Raji靶细胞(靶标；T)以4:1的效应物与靶标比例(120,000个效应细胞；30,000个靶细胞)温育。所有反应均重复进行。将反应物在CO2(5％)培养箱中于37℃温育20-24小时。
在单独的实验中，在补充有10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中的100μL反应体积中存在不同浓度曲妥珠单抗(0-1μg/mL)，将T细胞(效应子；E)和HCC1954靶细胞(靶标；T)以1:4的效应物-靶标比例(30,000个效应细胞；120,000个靶细胞)温育。所有反应均重复进行。将反应物在CO2(5％)培养箱中于37℃温育20-24小时。
对于每个实验，根据制造商的方案使用Meso Scale Discovery V-Plex人IL-2试剂盒从上清液测量释放的细胞因子IL-2的量。简言之，根据制造商的步骤制备促炎组1校准物混合物、SULFO-TAG检测抗体和读取缓冲液。将共培养上清液在冰上解冻并在RP10培养基(补充有10％胎牛血清的RPMI 1640)中稀释，以获得在测试的线性范围内的值。然后将促炎校准物混合物或样品(50μL)加入MSD板中。随后将板密封，用箔覆盖，并在室温振荡器上以600×g温育2小时。然后将板用含有0.05％Tween-20(PBST)的150μL磷酸盐缓冲盐水洗涤三次，之后将人IL-2 SULFO-TAG硫代标签检测抗体(25μL)加入板中。然后将板密封，用箔覆盖，并在室温振荡器上以600×g温育2小时。将板用150μL PBST洗涤三次。将读取缓冲液(150μL)加入板中，并将板在MSD Quickplex SQ 120上运行。
使用为Single Plex IL-2 MSD试剂盒创建的平板布局在MSD工作台中分析原始数据。调整标准曲线以匹配所分析的每个板的试剂盒批次。光单位形式的原始数据，使用促炎校准品标准曲线，推测出其细胞因子浓度(pg/mL)。将细胞因子数据作为抗体浓度的函数作图。
当靶标Raji细胞与表达编码SEQ ID NO:7,8,9,13和SEQ ID NO:38/SEQ ID NO:39变体的核酸的ACTR T细胞一起温育时,利妥昔单抗浓度增加，观察到IL-2释放的抗体依赖性和浓度依赖性增加(图3)。类似地，当靶HCC1954细胞与表达编码SEQ ID NO:7,8,9,13和SEQ ID NO:38/SEQ ID NO:39变体的核酸的ACTR T细胞一起温育时,曲妥珠单抗浓度增加，观察到IL-2释放的浓度依赖性增加(图4)。模拟T细胞显示了很少或没有IL-2释放。在类似的实验中，还观察到在这两种细胞系/抗体对中与其他ACTR变体一起温育时的IL-2释放量，并且这些实验的IL-2最大释放量可以在表5中找到。在Raji靶细胞和利妥昔单抗(280-3600pg/mL)存在下，以及在HCC1954靶细胞和曲妥珠单抗(50-700pg/mL)存在下，含有C28共刺激结构域的ACTR变体表现出一系列最大IL-2释放。这些实验证明了，ACTR变体在表达抗体同源靶标的细胞系存在下显示了抗体依赖性细胞因子释放。
表5:表达ACTR变体的T细胞的IL-2释放量
*ACTR构建体SEQ ID NO:40与SEQ ID NO:39反向表达
**ACTR构建体SEQ ID NO:38与SEQ ID NO:39反向表达
例3:ACTR-T细胞的增殖。
产生编码表3中的ACTR变体的γ-逆转录病毒。这些病毒用于感染原代人T细胞，产生在感染细胞表面表达这些ACTR变体的细胞。随后将这些细胞用于CD20阳性Raji靶细胞和CD20靶向利妥昔单抗的增殖试验。
在培养基(补充有10％胎牛血清的RPMI 1640培养基)中的200μL反应体积中的4μg/mL利妥昔单抗存在下或者不添加抗体，以1:1的比例(各30,000个细胞)混合T细胞和靶细。将反应物在CO2(5％)培养箱中于37℃温育7天；在第4天向每个反应中加入70μL培养基。通过离心沉淀细胞，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤，并用Fixable Viability DyeeFluor450(eBioscience)染色。用含有牛血清白蛋白和叠氮化钠(Biolegend)的细胞染色缓冲液洗涤细胞两次。然后用抗CD16-Alexa-Fluor-647(克隆3G8，Biolegend)和抗CD3-Alexa-Fluor-488(克隆OKT3，Biolegend)抗体染色细胞。然后将细胞在细胞染色缓冲液中洗涤两次，然后重悬于200μL染色缓冲液中。
通过使用AttuneTM NxT声学聚焦细胞计数器的流式细胞术分析染色细胞。单峰的活的CD3阳性T细胞用于评估增殖。将第7天的细胞计数相对于第0天的倍数增加作为条件的函数作图(图5)。当靶标Raji细胞与表达编码SEQ ID NO:7,8,9,13和SEQ ID NO:89/SEQ IDNO:90变体的核酸的ACTR T细胞和利妥昔单抗一起温育时，观察到CD3+细胞数量的抗体依赖性增加，表明抗体依赖性T细胞增殖(图5)。在另外的实验中，在5μg/mL利妥昔单抗存在下，在与上述相似的条件下评估T细胞增殖，其中T细胞表达许多不同的ACTR变体。测试CD3+细胞数量相对于不含抗体的反应的增加。这些ACTR变体显示出抗体依赖性增殖(表6)。还评估了编码CD28共刺激结构域的其他ACTR变体。含有C28共刺激结构域的ACTR变体显示了CD3+细胞数量相对于无抗体反应的增加(2.5-15倍)。这些实验证明了，在表达抗体同源靶标的细胞系存在下ACTR变体显示了抗体依赖性增殖。
表6:表达不同ACTR变体的T细胞的抗体依赖性增殖
*ACTR构建体SEQ ID NO:40与SEQ ID NO:39反向表达
**ACTR构建体SEQ ID NO:38与SEQ ID NO:39反向表达
例4:ACTR-T细胞在Raji肿瘤动物模型中的抗肿瘤作用。
Raji模型
Raji细胞系(ATCC，目录号CCL-86)是人类Burkitt淋巴瘤细胞系，其在静脉内、腹膜内或皮下植入时在免疫受损小鼠中形成肿瘤。对于本实施例中的实验，使用RediFectFFLuc-嘌呤霉素(Perkin Elmer公司)慢病毒颗粒的萤火虫荧光素酶转导Raji细胞，并在补充有10％热灭活的胎牛血清和1μg/mL嘌呤霉素的RPMI-1640培养基中在37℃，5％CO2保温箱储藏。收获后接种肿瘤细胞活力为98％。
6周龄的雌性NSG TM(NODscidγ，NOD.Cg-PrkdcscidIL-2rgtm1Wj1/SzJ，菌株005557)小鼠获自杰克逊实验室(巴尔港，缅因州)。这些缺乏功能性T、B和NK细胞的小鼠，特别适合植入人类肿瘤并有效重组人T细胞如ACTR T细胞。收到后，在研究开始前使小鼠适应8天。在到达时或在研究开始之前，小鼠没有表现出疾病或疾病的迹象。将这些动物每笼5只饲养在独立通风的Innovive笼中，放置在独立的微型隔离架中。
通过将表达荧光素酶的Raji细胞的悬浮液接种到雌性NSGTM小鼠中，来建立静脉内Raji异种移植模型。将悬浮在0.1mL DPBS中的Raji细胞(每只小鼠1×105细胞)静脉内注射到侧尾静脉中。小鼠在6天内形成可检测的肿瘤，主要位于骨髓(脊柱、颅骨、长骨)。
在第4,11,18和25天，用100μg利妥昔单抗(100μL体积)对小鼠腹膜内给药。在第5天和第12天，给小鼠静脉内施用100μL 1×107T细胞(表达编码ACTR变体SEQ ID NO:7,9,13和SEQ ID NO:38/SEQ ID NO:39)的核酸的T细胞。给一组小鼠服用表达CD19靶向CAR的T细胞(抗CD19 scFv、CD8铰链和跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域、CD3-zeta信号域)；这些小鼠没有给予利妥昔单抗。从细胞接种后第6天开始，使用IVIS光谱成像系统(Perkin Elmer公司)通过生物荧光成像每周两次监测肿瘤负荷。将小鼠每周称重两次以监测其健康状况。平均光子/秒相对时间作图(图6)。安乐死标准基于体重减轻或增加，及临床症状，特别是后肢麻痹。跟踪小鼠存活直至研究终止(第55天)。
治疗组包括用载体对照处理，单独使用利妥昔单抗抗CD20抗体(罗氏公司，100μg/小鼠或5mg/kg)，单独的ACTR变体，CD19 CAR，或利妥昔单抗和ACTR变体T细胞的组合处理的小鼠。
在第18天或第19天，对照小鼠死于疾病负担。单独利妥昔单抗治疗诱导肿瘤负荷降低并将小鼠的存活期延长至24天。无论测试的ACTR变体如何，单独用ACTR T细胞治疗都不能显著降低肿瘤负荷或存活率。用CD19 CAR治疗导致肿瘤负荷降低，类似于单独使用利妥昔单抗所观察到的肿瘤负荷。
与载体对照、单独的ACTR变体或单独的利妥昔单抗相比，用ACTR变体与利妥昔单抗组合治疗导致更大的肿瘤生长抑制。对于所有ACTR变体相较单独利妥昔单抗的差异，达到统计学显著性(双向ANOVA与Sidak多重比较检验)(7，p<0.0001；9，p<0.01；13，p<0.0001；和18，p<0.0001)(图6)。
例5:重复刺激增殖试验
1×106细胞/mL ACTR-T细胞或CD19 CAR T细胞在RPMI-10培养基(RPMI1640+10％FBS)中产生和制备，以用于测试。通过流式细胞术(参见下文)测试ACTR和CAR表达，并调节至ACTR/CAR阳性细胞占供体匹配的模拟T细胞的30％，以使所有变体的ACTR/CAR表达正常化。
收获Raji肿瘤细胞，计数，并用RPMI-10培养基调节至2×106细胞/mL。将利妥昔单抗抗体稀释至4μg/mL，在测试中达到最终抗体浓度1μg/mL。将T细胞(550μL)加入24孔板中，然后加入275μL Raji细胞使效应物:靶(E:T)比为1:1，以及275μL利妥昔单抗或培养基对照。将细胞充分混合，取70μL等分试样进行流式细胞术分析(基线计数)。将板在37℃温育3-4天，ACTR变体T细胞或CAR-T细胞杀死靶细胞和T细胞增殖。
在第3天或第4天，取出每份培养物的等分试样(70μL)并通过流式细胞术分析T细胞和肿瘤细胞计数。通过离心(500×g，5分钟)沉淀剩余的培养物，并重悬于预定体积的新鲜培养基中。将含有在3-4天温育期间扩增的T细胞的培养物重新调节至约1×106细胞/mL并转移至12孔板。将非增殖培养物重悬于1-1.25mL新鲜培养基中并保持在24孔板中。以4×106细胞/mL制备新鲜的Raji细胞，并将适当的体积加入混合的T细胞/肿瘤细胞培养物中，以使E:T细胞比率回到1:1，如果需要的话。将利妥昔单抗加至终浓度为1μg/mL至刺激孔，同时仅将培养基加入对照孔中。将培养物再次培养3-4天。每3-4天重复该再刺激过程，总共进行4次刺激。
在第14天，收获所有培养物并通过流式细胞术分析T细胞(CD3+)和肿瘤细胞(CD3-)计数。随时间分析累积的T细胞扩增和肿瘤杀伤。
对于流式细胞术分析，将每种培养物充分混合，取出70μL并转移到96孔圆底聚丙烯板中。将两个25μL的等分试样各自用150μLMACS缓冲液(Miltenyi公司)中的抗人CD3-AlexaFluor488(T细胞标记物；Biolegend公司)和抗人CD16-AlexaFluor647(ACTR标记；克隆3G8，Biolegend公司)抗体染色。将样品混合并在4℃，黑暗中温育15分钟。然后将样品与碘化丙啶(PI)溶液在25μLMACS缓冲液中温育，并在流式细胞仪(Attune NxT)上分析。每个样品获得100μL体积。使用FlowJo(TreeStar公司)进行流式细胞术数据分析。活的单峰细胞群用于进一步确定活CD3+ T细胞和CD3阴性Raji细胞的绝对计数。
将T细胞数相对于T细胞起始数的倍数变化作为时间的函数作图(图7)。所有测试的ACTR变体在靶细胞和利妥昔单抗存在下增殖。除ACTR变体SEQ ID NO:8外，所有ACTR T细胞变异均增殖出自CD19 CAR-T细胞，与CD19 CAR-T细胞相当。在使用抗体调理的靶细胞快速再刺激的情况下，ACTR T细胞变体在14天测试期间扩增3-8倍，其中ACTR变体SEQ ID NO:9显示出最大的扩增。在不存在抗体的情况下用靶细胞刺激的ACTR T细胞不扩增，并且在靶细胞附近过度生长(数据未显示)。
将Raji靶细胞数相对于前一时间点的靶细胞数的倍数变化绘制为函数时间(图8A和B)。在第一次刺激后，Raji靶细胞继续生长。在第二轮刺激后开始，ACTR变体和CD19 CART细胞在不同程度上控制和杀死Raji靶细胞。在不存在利妥昔单抗抗体的情况下，Raji靶细胞在ACTR变体存在下继续生长(数据未显示)。
例6:表达ACTR变体SEQ ID NO:9的T细胞与利妥昔单抗组合，在体外和体内与表达CD20的肿瘤细胞系结合的应用
该实施例证明了表达ACTR变体SEQ ID NO:9(在此实施例中简称为ACTR)的T细胞与利妥昔单抗组合时，成功地介导了体外抗肿瘤细胞活性和体内侵袭性CD20+淋巴瘤的肿瘤消退。使用该构建体的实验细节和结果如下。
ACTR的初步测试
在重复模拟“压力测试”中分析表达ACTR的T细胞的活性，其中用类似于实施例5中所述的程序，表达ACTR的变体T细胞每三天用新鲜的CD20+Ramos肿瘤细胞和利妥昔单抗刺激。在三次重复刺激后，ACTR T细胞继续增殖并对目标Ramos细胞有细胞毒性，并在第四次刺激后开始丧失增殖和细胞毒性能力(图9)。
以与实施例2和3中所述类似的方式，对血液学和实体肿瘤疾病环境中表达的六种不同靶标具有特异性的抗体和表达同源靶标的细胞系，进行细胞因子释放(IL-2)和增殖测试。通过多种细胞系和适应症证实了通过IL-2释放和增殖测量的T细胞活性(图10)。
利妥昔单抗结合CD20+肿瘤细胞和ACTR T细胞
通过用利妥昔单抗和荧光染料标记的抗人Fc检测抗体染色细胞，通过流式细胞术分析利妥昔单抗与Raji、Daudi和RL CD20+淋巴瘤肿瘤细胞的结合(图11 A)。没有观察到CD20阴性细胞系K562的特异性结合。还通过将不同浓度的利妥昔单抗与表达ACTR的T细胞一起温育，来评估利妥昔单抗结合ACTR T细胞的能力。用荧光染料标记的抗人Fc抗体检测结合的利妥昔单抗，并通过流式细胞术分析。利妥昔单抗以浓度依赖性方式结合表达ACTR的T细胞(图11 B)。利妥昔单抗对ACTR T细胞的表观亲和力为689±82nM。
不受理论束缚，图12显示了可能的ACTR-T细胞活化作用机制的假设模型。与低亲和力天然T细胞受体和Fc受体类似，当ACTR接触结合肿瘤细胞表面的多个利妥昔单抗分子时，ACTR T细胞可通过结构亲合力激活。
在1μg/mL利妥昔单抗存在下，用模拟(无ACTR)和表达ACTR的T细胞和CD20+肿瘤细胞进行细胞毒性测试。将T细胞和靶细胞以不同的效应物(E)与靶(T)比混合，并在37℃下在5％CO2培养箱中温育24小时。用细胞活性染料抗人CD3和抗人CD19抗体染色，并通过流式细胞术分析。通过将与T细胞、靶细胞和利妥昔单抗的反应中活的CD19+细胞的数量除以没有T细胞的对照反应中的活的CD19+细胞的数量，从1减去所得值，然后乘以100来确定细胞毒性百分比。对于不同E:T比率的模拟细胞(图13 A)和表达ACTR的T细胞(图13 B)，将细胞毒性百分比作为靶细胞的函数作图。这些实验的结果证明了，强烈的细胞毒性是ACTR依赖性的，而模拟细胞观察到很少或没有细胞毒性，并且细胞毒性依赖于ACTR T细胞剂量(图13 A和B)。用不同浓度的利妥昔单抗，用2:1的E:T比例的ACTR T细胞和CD20+靶细胞进行类似的实验。从这些反应中除去的上清液，用于细胞因子分析。ACTR T细胞介导对CD20+肿瘤细胞的利妥昔单抗剂量依赖性细胞毒性(图13 C)。
根据制造商的方案，使用Meso Scale Discovery V-Plex人IFN-γ和V-Plex人IL-2试剂盒，分析上清液中的IFN-γ和IL-2。简言之，根据制造商的步骤制备促炎组1校准物混合物、SULFO-TAG检测抗体和读取缓冲液。将共培养上清液在冰上解冻并在RP10(含有10％胎牛血清的RPMI 1640)培养基中稀释，以获得在测试的线性范围内的值。将促炎校准物混合物或样品(50μL)加入MSD板中。将板密封，用箔覆盖，并在室温振荡器上以600×g温育2小时。将板用含有0.05％Tween-20的150μL磷酸盐缓冲盐水洗涤三次。将人IFN-γ或人IL-2SULFO-TAG检测抗体(25μL)加入板中。将板密封，用箔覆盖，并在室温振荡器上以600×g温育2小时。将板用含有0.05％Tween-20的150μL磷酸盐缓冲盐水洗涤三次。将读取缓冲液(150μL)加入板中，并将板在MSD Quickplex SQ 120上运行。
使用为Single Plex IFN-γ和Single Plex IL-2MSD试剂盒创建的平板布局，在MSD工作台中分析原始数据。调整标准曲线以匹配所分析的每个板的试剂盒批次。光单位形式的原始数据，使用促炎校准品标准曲线，推测出其细胞因子浓度(pg/mL)。将细胞因子数据作为抗体浓度的函数作图(图14 A和B)。用表达ACTR的T细胞观察到利妥昔单抗浓度依赖性IL-2和IFN-γ细胞因子释放。
在37℃5％CO2培养箱中，通过在浓度增加的利妥昔单抗存在下，以1:1 E:T温例温育表达ACTR的T细胞和CD20+靶细胞(Raji、Ramos、Daudi、RL)，以进行增殖测试7天。用活性染料和抗CD3抗体染色细胞，并通过流式细胞术分析。将活的CD3+细胞作为利妥昔单抗浓度的函数作图(图14 C)。显示了ACTR表达T细胞以利妥昔单抗依赖性和抗体浓度依赖性方式增殖。
ACTR活性的特异性
如上所述，在CD20+Ramos细胞或CD20阴性K562细胞，和CD20靶向利妥昔单抗或靶向HER2的曲妥珠单抗的存在下，用模拟或ACTR T细胞进行细胞毒性、IL-2产生和T细胞增殖测试；其中Ramos和K562细胞均为HER2阴性。细胞毒性和IL-2释放实验以2:1的E:T比进行，增殖实验以1:1的E:T比进行。抗体以4μg/mL终浓度使用。这些实验的结果如图15的图A-C中所示。在表达ACTR的T细胞、利妥昔单抗和CD20+细胞的存在下观察到细胞毒性，IL-2释放和增殖；在测试的任何其他反应条件下观察到很少甚至没有T细胞活性。这些实验证明了ACTRT细胞活性依赖于ACTR表达和靶标结合抗体。
还在非靶向IgG存在下评估ACTR活性。在这些实验中，将模拟或表达ACTR的T细胞以4:1的E:T比例与表达CD20的Raji细胞混合。将细胞与1μg/mL利妥昔单抗和浓度增加的血清中非靶向人IgG(0-3.6mg/mL)一起温育。通过混合合并的人AB血清和去除IgG的血清来滴定IgG，以在反应中获得IgG的不同的终浓度。反应在37℃5％CO2培养箱中温育24小时。如上所述，测试IFN-γ释放。模拟T细胞显示出很少或没有IL-2释放；ACTR T细胞显示出强烈的IL-2释放，这在所有测试的非靶向IgG浓度中是相似的(图16)。这些实验证明了，非靶向IgG对抗体靶向的ACTR活性几乎没有影响。
在各种抗体存在下，ACTR-T细胞的激活
托珠单抗是一种抗IL6受体(IL-6R)抗体，用于T细胞疗法治疗方案，以减轻细胞因子释放综合征(CRS)的影响。在表达IL-6R的细胞存在下，托珠单抗的ACTR结合可能加剧与CRS相关的毒性。这些实验表明，在表达IL-6R的细胞存在下，表达ACTR的T细胞不能与托珠单抗有效结合。
通过流式细胞术测试正常免疫细胞和多发性骨髓瘤细胞系NCI-H929上IL-6R的受体的量(图17A)。这些实验证明了，与正常免疫细胞相比，NCI-H929细胞每个细胞表达相当或更多数量的IL-6R。以类似于上述利妥昔单抗与表达ACTR的T细胞结合的方式进行与托珠单抗的结合试验。托珠单抗以剂量依赖性方式与表达ACTR的T细胞结合，而不表达ACTR的模拟T细胞显示出不与托珠单抗结合(图17 B)。
如上所述进行细胞毒性和IL-2释放测试。对于这些实验，在浓度增加的托珠单抗存在下，将模拟或表达ACTR的T细胞与NCI-H929细胞以4:1的E:T比例温育。在不存在T细胞的情况下，NCI-H929细胞也与递增浓度的托珠单抗一起温育。用ACTR T细胞、NCI-H929靶细胞和抗CD38抗体达雷木单抗进行对照实验；NCI-H929细胞表达CD38。这些实验的结果表明在存在IL-6R+NCI-H929细胞和高于模拟T细胞或不存在T细胞时观察到的托珠单抗浓度增加时，ACTR T细胞不介导细胞毒性(图18 A)。这些实验的结果还表明，与模拟T细胞或没有T时观察到的相似(图18 B)，ACTR T细胞在IL-6R+NCI-H929细胞存在和托珠单抗浓度增加下不会介导IL-2释放。
显示ACTR T细胞在相同条件下在对照实验中在NCI-H929细胞和抗CD38抗体达雷木单抗存在下介导细胞毒性和细胞因子释放。
体内ACTR活性
在另一个实验中，在NSGTM(NODscidγ，NOD.Cg-PrkdcscidIL-2rgtm1Wj1/SzJ，菌株005557)小鼠中的侵袭性Raji异种移植物中测试ACTR T细胞的抗肿瘤功效。
解冻Raji-luc细胞用于研究，并使其在培养基中生长进行有限的传代次数。将Raji-luc细胞(每只小鼠1×105个细胞，在0.1mL无血清培养基中)静脉内注入雌性NSG小鼠的侧尾静脉中。细胞接种后第4天，将小鼠随机分为处理组(n＝5)。通过耳穿刺鉴定每组中的个体小鼠。从细胞接种后第6天开始，使用IVIS频谱(珀金·埃尔默)通过生物发光成像监测肿瘤负荷。小鼠的体重为17.1至23.5克(20.5±1.3，平均值±SD)。随时间测量平均肿瘤辐射度(光子/秒)和体重(克)，安乐死的标准是基于体重减轻和临床症状，而不是基于生物发光截断值。所有动物实验均根据Unum国际动物护理和使用委员会(IACUC)批准的协议进行。所有步骤均根据《实验动物的护理和使用指南》(国家研究委员会)进行。
实验组分为无处理(对照)，单独用ACTR，单独用每剂20μg，50μg或100μg的利妥昔单抗，以及用每剂20μg，50μg和100μg利妥昔单抗的ACTR+利妥昔单抗。在该实验中还评估了表达CD19 CAR的T细胞(与4-1BB共刺激结构域和CD3-zeta信号域连接的抗CD19 Fc)。在接受利妥昔单抗的组中，在肿瘤细胞接种4天后第一次给予抗体，并且每周给药，总共4个剂量。在接受ACTR T细胞的组中，在第一次利妥昔单抗剂量1天后即第5天给予单剂量的1×107ACTR T细胞。将存活百分比作为所有处理组的时间函数作图(图19)。抗肿瘤功效是有效的并且是利妥昔单抗剂量依赖性(图19)。
类似的实验证明了ACTR+利妥昔单抗的抗肿瘤功效是ACTR T细胞剂量依赖性的。实验组分为无处理(对照)，单独用利妥昔单抗，单独用ACTR(2剂)，用ACTR(1剂)+利妥昔单抗，和用ACTR(2剂)+利妥昔单抗。在接受利妥昔单抗的组中，在肿瘤细胞接种4天后第一次给予抗体，并且每周给药，总共4个剂量。在接受ACTR T细胞的组中，在第一次利妥昔单抗剂量1天后即第5天给予单剂量的1×107ACTR T细胞；在第12天，接受两剂ACTR T细胞组再次用1×107ACTR T细胞处理。将存活百分比作为时间的函数作图(图20)。用ACTR和利妥昔单抗治疗的组显示出强大的抗肿瘤活性，如增强的存活率所证明。与一剂ACTR处理组相比，两剂ACTR处理组的存活率更高，表明ACTR活性是剂量依赖性的。
由非霍奇金淋巴瘤(NHL)供体制备的T细胞中的ACTR活性
将编码ACTR的γ逆转录病毒导入来自三个独立的非霍奇金淋巴瘤(NHL)供体PBMC的T细胞中，并且使用抗CD16检测抗体通过流式细胞术证实T细胞上的ACTR的表面表达(图21 A)。在浓度增加的利妥昔单抗存在下，用与上述Raji靶细胞相似的方式以1:1的E:T比例进行IL-2释放和增殖实验。显示了由NHL供体产生的ACTR T细胞介导利妥昔单抗浓度依赖性IL-2释放(图21 B)和增殖(图21C)。
结果概述
当与利妥昔单抗组合时，表达ACTR的T细胞在CD20+淋巴瘤细胞系存在下显示出有效的活化、增殖、细胞因子产生和定向肿瘤的细胞毒性。表达ACTR的T细胞的体外活性依赖于利妥昔单抗并且是剂量可滴定的。表达ACTR的T细胞在NSG小鼠的侵袭性Raji淋巴瘤异种移植模型中具有有效的体内抗肿瘤功效。这种抗肿瘤活性是ACTR T细胞和利妥昔单抗剂量依赖性，更高的T细胞数和抗体浓度介导改善的反应。总之，这些数据证明了表达ACTR的T细胞治疗方法针对多种癌抗原的特异性和多功能性。
例7:用曲妥珠单抗与表达ACTR变体SEQ ID NO:9的T细胞组合有效靶向HER2扩增的癌症
HER2在测试细胞系上的表达
在用抗人HER2抗体染色后，通过流式细胞术评估HER2扩增的细胞系(OE19、N87和SKBR3)和HER2无扩增的细胞系(MCF7和KATOIII)上的HER2蛋白表达。针对评估的每个细胞系绘制染色细胞的平均荧光强度(MFI)(图23)。HER2扩增的细胞系用抗HER2抗体显示为强染色，而用HER2无扩增的细胞观察到最低染色。这些结果与报道的这些细胞系的拷贝数数据一致(见下文)。
各种细胞系的HER2拷贝数(log2)及其组织来源如表7所示。HER2基因在OE19、N87和SKBR3细胞系中扩增，在MCF7和KatoIII细胞系中不扩增。HER2拷贝数描述于癌细胞系百科全书(CCLE)，通过引用并入以描述这些细胞系。
表7:HER2基因在扩增和非扩增细胞系中的表达
ACTR与曲妥珠单抗组合对HER2扩增的肿瘤细胞系具有选择性体外活性
评估ACTR T细胞和HER2扩增的细胞系(OE19、N87和SKBR3)和HER2无扩增的细胞系(MCF7和KATOIII)的细胞毒性、IL-2释放和IFN-γ释放。在37℃5％CO2培养箱中，在200μL反应体积中，在5μg/mL抗HER2抗体曲妥珠单抗的存在下，以2:1的E:T比例进行反应。24小时后除去上清液，并使用均质时间分辨荧光(HTRF)测试(Cisbio公司)分析IL-2和IFN-γ。简而言之，根据制造商的方案制备细胞因子标准品和缀合物。在低体积384孔板中，将10-μL体积的缀合物和10-μL体积的细胞上清液(1:4稀释用于IL-2,1:16稀释用于IFN-α)共培养24小时。使用EnVision多标读板器测量荧光信号，并根据制造商的推荐分析数据。48小时后，使用ATPlite一步(Perkin Elmer公司)评估细胞毒性，已检测活的靶细胞。先前的实验证明了T细胞占极少的ATPlite信号。比较ACTR和抗体孔与没有抗体的对照孔中的ATPlite信号，来确定细胞毒性百分比。这些实验表明，ACTR T细胞+曲妥珠单抗在HER2扩增的细胞系OE19、N87和SKBR3存在下显示出强烈的细胞毒性、IL-2释放和IFN-γ释放，但在非扩增细胞系MCF7和KatoIII存在下则没有(图24)。
用表达抗HER2 CAR的T细胞进行类似的实验。该CAR变体由来自曲妥珠单抗序列(4D5)的scFv、CD8铰链和跨膜结构域、CD28共刺激结构域和CD3-zeta信号域组成。如上所述，在不存在曲妥珠单抗的情况下，以2:1的E:T比例，进行细胞毒性和细胞因子释放实验。这些实验证明了在HER2扩增的细胞系OE19、N87和SKBR3存在下以及在非扩增细胞系MCF7和KatoIII存在下，抗HER2CAR T细胞具有强大的细胞毒性、IL-2释放和IFN-γ释放(图25)。
这些实验证明了ACTR T细胞+曲妥珠单抗对HER2扩增的细胞系显示出选择性活性，而抗HER2 CAR T细胞不因靶细胞表达HER2的功能而显示选择性活性。
ACTR T细胞和靶向HER2的CAR-T细胞在HER2扩增的肿瘤细胞系上增殖
以与实施例6中所述类似的方式，以2:1的E:T比例进行增殖测试，持续6天，从每孔100,000T细胞开始。用浓度增加的曲妥珠单抗(0-5μg/mL)进行ACTR T细胞实验；在没有曲妥珠单抗的情况下进行抗HER2 CAR T细胞的实验。在HER2扩增的细胞系(OE19、N87和SKBR3)和HER2无扩增的细胞系(MCF7和KATOIII)的存在下评估T细胞增殖。这些实验的结果证明了ACTR T细胞在HER2扩增的细胞系N87和OE19存在下显示了曲妥珠单抗剂量依赖性增殖(图26A)；靶向HER2的CAR-T细胞在N87和OE19靶细胞上具有相当的增殖(图26 B)。用SKBR3、MCF7和KatoIII靶细胞观察到很少或没有增殖，
ACTR T细胞与曲妥珠单抗组合在N87胃癌异种移植模型中介导强大的抗肿瘤活性
携带约80mm3起始体积的皮下N87(人胃癌细胞系)肿瘤的雌性NSG(NOD.Cg-PrkdcscidIL-2rgtm1Wjl/SzJ)小鼠中，使用表达ACTR的T细胞与曲妥珠单抗的组合体内给药方案进行实验。给药方案详见图27。该研究中的实验组是载体(对照；未处理)，单独的曲妥珠单抗，单独的ACTR T细胞，ACTR T细胞+曲妥珠单抗和抗HER2 CAR T细胞。
在体外测试中，发现抗HER2 CAR T细胞与曲妥珠单抗竞争结合HER2阳性靶细胞，从而降低细胞毒性。因此，预期抗HER2 CAR T细胞和曲妥珠单抗的共同使用不会增强体内的抗肿瘤活性。
接受曲妥珠单抗的组在肿瘤接种7天后开始每周一次腹腔注射100μg施用，持续四周。接受ACTR T细胞(1.5×107的总T细胞)或抗HER2 CAR T细胞(1.5×107的总T细胞)的组在肿瘤接种后第8天和第15天给予。对于抗体(载体为PBS)和T细胞(载体为无血清培养基)，对照小鼠以相同的方案单独给予载体。在整个实验中测量平均肿瘤体积并作为时间的函数作图(图28)。
与曲妥珠单抗组合的ACTR T细胞相对于单独的曲妥珠单抗或ACTR T细胞显示出强大的抗肿瘤活性，并且显示出比用抗HER2 CAR T细胞观察到的更快的抗肿瘤动力学。
与肿瘤细胞系相比，HER2在正常细胞上的表达
在用抗人HER2抗体染色后，通过流式细胞术测量，HER2在HER2扩增的肿瘤细胞系(N87)，非HER增强的肿瘤细胞系(MCF7)细胞，HER-2阴性细胞系(Daudi)细胞和各种正常细胞系(乳腺上皮、肺动脉平滑肌、心肌细胞、支气管上皮或肾上皮细胞)中的表达。绘制每种细胞类型的平均荧光强度(MFI)(图29)。如所预期的，N87细胞显示了高水平的HER2表达，MCF7细胞显示了低水平的HER2表达，Daudi细胞显示了几乎没有HER2表达。在正常细胞系中，乳腺上皮细胞显示出中等水平的HER2表达，而所有其他细胞显示了低水平的HER2表达。
ACTR与曲妥珠单抗的体外活性与抗HER2 CAR T细胞对正常细胞的体外活性相比的差异，提示ACTR+曲妥珠单抗的有利治疗参数
如上所述用ACTR T细胞/抗HER2 CAR T细胞和靶细胞以2:1 E:T进行细胞毒性测试48小时；ACTR T细胞的实验也含有曲妥珠单抗(0-5μg/mL)。在该实验中评估的靶细胞是N87(HER2扩增的)、MCF7(HER2低)、Daudi(HER2阴性)和正常细胞系(乳腺上皮、肺动脉平滑肌、心肌细胞、支气管上皮和肾上皮)。ACTR T细胞加曲妥珠单抗介导对HER2扩增的N87细胞的强烈细胞毒性，而对低表达或阴性靶细胞系和正常细胞系几乎没有或没有活性(5μg/mL曲妥珠单抗数据如图30 A中所绘)。相反，抗HER2 CAR T细胞对HER2扩增的N87细胞、HER2-低表达的MCF7细胞和几种正常细胞系显示出强烈的细胞毒性(图30 B)。结果表明，与抗HER2 CAR T细胞相比，ACTR T细胞与曲妥珠单抗组合具有高的肿瘤选择性。
如上所述，上清液移自细胞毒性反应并用于分析IL-2和IFNγ的释放。ACTR T细胞在HER2扩增的N87细胞存在下显示出曲妥珠单抗浓度依赖性IL-2释放，而在测试的其他靶细胞(包括正常细胞系)存在下几乎没有IL-2释放(图31 A)。相反，抗HER2 CAR T细胞在HER2扩增的N87细胞和低表达HER2的MCF7细胞存在下显示出IL-2强释放，在正常肺动脉平滑肌细胞和心肌细胞存在下释放IL-2(图31 B)。ACTR T细胞在HER2扩增的N87细胞存在下显示出曲妥珠单抗浓度依赖性IFN释放，并且在测试的其他靶细胞(包括正常细胞系)存在下几乎没有IFN释放(图32 A)。相反，抗HER2 CAR T细胞在HER2扩增的N87细胞和低表达HER2的MCF7细胞存在下显示出强烈的IFNγ释放，在正常肺动脉平滑肌细胞和心肌细胞存在下释放IFNα(图32 B)。这些结果表明，在曲妥珠单抗和正常原代细胞(乳腺上皮、肺动脉平滑肌、心肌细胞、支气管上皮或肾上皮细胞)存在的情况下，表达ACTR的T细胞不释放细胞因子，而在抗HER2 CAR T细胞存在下这些正常细胞观察到细胞因子释放。
结果概述
如上所示，当与曲妥珠单抗组合时，ACTR T细胞对HER2扩增的靶细胞系具有有效增殖、细胞因子产生和肿瘤定向细胞毒性的作用，但对无扩增的MCF7和KATOIII细胞系的其活性降低。基于曲妥珠单抗(4D5 scFv)靶向HER2的CAR-T细胞在HER2扩增和非扩增细胞系中均显示出细胞毒性和细胞因子释放，表明与HER2 CAR相比，ACTR T细胞活化需要HER2表达的差异阈值。ACTR T细胞在NSG小鼠的皮下N87胃癌异种移植模型中具有有效的抗肿瘤功效，其活性与HER2CAR-T相当。当在曲妥珠单抗存在下与正常细胞一起温育时，ACTR T细胞未显示出显著的细胞毒性或细胞因子释放。相反，HER2 CAR-T细胞释放细胞因子并介导针对这些正常细胞的细胞毒性。总之，这些数据支持ACTR T细胞+曲妥珠单抗的功效，并且提示与基于曲妥珠单抗的HER2靶向CAR T细胞相比，该组合具有降低的“中靶/脱靶肿瘤”毒性的风险。
例8:用达雷木单抗与表达ACTR变体SEQ ID NO:9的T细胞组合有效靶向CD38阳性的癌症
多发性骨髓瘤和淋巴瘤细胞系、多发性骨髓瘤浆细胞、免疫细胞和红细胞表面的CD38的表达
通过流式细胞术评估癌细胞系、患者来源的细胞和正常细胞的表面上的CD38表达。
在淋巴瘤细胞系Daudi、Raji、Ramos和RL，以及多发性骨髓瘤细胞系NCI-H929、MM.1S、OPM2、RPMI 8226和U266B1上评估CD38表达。将细胞系在含有BSA(染色缓冲液)的PBS中洗涤两次，然后与人Fc温育10分钟封闭。然后在室温下将细胞与10μg/mL达雷木单抗温育20分钟。然后在染色缓冲液中洗涤两次，并在4℃下与PE缀合的山羊抗人IgG(Fab')2二抗温育30分钟。在染色缓冲液中洗涤两次后，通过流式细胞术分析染色的细胞。针对每种细胞系绘制每种细胞系的几何平均荧光强度(gMFI)(图33 A)。除了CD38阴性表达的U266B1外，所有细胞系均显示了不同程度的CD38表达。
还通过流式细胞术评估NCI-H929、KMS-20和RPMI-8226多发性骨髓瘤(MM)细胞系以及来自原发性MM患者的骨髓单核细胞(BMMC)样品的CD38表达。将患者来源的BMMC和MM细胞系在PBS中洗涤一次，然后在4℃下用Live/Dead eFluor780染料染色30分钟。在活性染色后，将细胞洗涤一次，在室温下与人Fc(50μL)一起温育封闭10分钟。然后用100μL由AF488缀合的抗人CD38抗体和Brilliant Violet 510缀合的抗人CD27抗体组成的抗体混合物染色细胞。染色30分钟后，用染色缓冲液洗涤细胞两次，并通过流式细胞术评估。在双重排斥和死细胞排除后，对多发性骨髓瘤细胞系和MM患者衍生的BMMC进行流式细胞术门控。在所有细胞上检测到CD38表达，且患者来源的BMMC细胞观察到最高表达(图33 B)。
还通过流式细胞术评估NCI-H929多发性骨髓瘤、Daudi淋巴瘤和来自两个供体的外周血单核细胞(PBMC)亚组的CD38表达。解冻PBMC并用染色缓冲液洗涤一次。用100μL由AlexaFluor488缀合的抗人CD3、APC缀合的抗人CD19、PE-Cy7缀合的抗人CD14、BrilliantViolet 421缀合的抗人CD56和PE缀合的抗人CD38抗体组成的抗体混合物染色细胞。然后，在4℃温育30分钟，用染色缓冲液洗涤细胞两次，并通过流式细胞术评估。在双重排除后，在CD3+(T细胞)，CD19+(B细胞)，CD3-CD56+(自然杀伤(NK)细胞)和CD3-CD14+(单核细胞)群内计算CD38的gMFI。将PBMC亚组的CD38表达水平与Daudi和NCI-H929细胞的CD38表达(gMFI)水平进行比较。在两个供体中，NK细胞表现出免疫细胞亚群中的最高CD38表达，但其CD38表达水平显著低于在NCI-H929多发性骨髓瘤和Daudi淋巴瘤细胞上观察到的水平(图33 C)。
还评估了来自五个不同健康供体的红血球(红细胞)表面的CD38表达。将来自五个健康供体的新鲜全血在含有叠氮化钠的细胞染色缓冲液中以1:10000稀释。将细胞洗涤一次，然后与100μL由APC缀合的抗人CD235a、Brilliant Violet 605缀合的抗-人CD45和PE缀合的抗人CD38抗体组成的抗体混合物温育30分钟。温育后，用细胞染色缓冲液洗涤细胞两次，并通过流式细胞术评估。在CD235a+红细胞的表面上观察到低CD38表达(gMFI)(图33D)。
活化的ACTR T细胞表面上的CD38的表达
在1μg/mL CD20靶向抗体利妥昔单抗存在下，表达ACTR的T细胞(效应子；E)和Daudi靶细胞(靶标；T)以1:1效应物-靶标比例(30,000个靶细胞)温育。在37℃/5％CO2培养箱中温育1,2或3天，然后染色，用于流式细胞术分析。简而言之，用PBS洗涤细胞一次，然后用可固定的活性染料eFluor450染色。用PBS再次洗涤细胞，然后与100μL含有AlexaFluor488缀合的抗人CD3、APC缀合的抗人CD16和PE缀合的抗人CD38抗体的抗体混合物一起温育。温育20分钟后，将细胞洗涤两次，并在流式细胞仪上获得数据。在CD3+总T细胞和CD3+CD16+ACTR+ T细胞和Daudi靶细胞上测试CD38的gMFI。将CD38的gMFI作为刺激后时间的函数作图(图34)。相对于在没有利妥昔单抗的情况下温育的细胞，在利妥昔单抗和Daudi细胞存在下活化后，总T细胞(所有CD3+细胞)上的CD38的gMFI随时间增加，但其CD38表达显著低于Daudi靶细胞上的CD38表达(图34A)。在利妥昔单抗存在下，在ACTR T细胞(CD3+CD16+细胞)上的CD38的gMFI显著上调，刺激后24小时的峰值表达类似于在Daudi靶细胞上观察到的峰值表达(图34 B)。这些实验证明了，在用靶向抗体和表达抗体的同源抗原的靶细胞活化后，ACTR T细胞上的CD38上调。
模拟、ACTR、T细胞和CD38靶向CAR-T细胞的生产
T细产自用抗CD3和抗CD28抗体活化的PBMC。在激活三天后，用编码ACTR或靶向CD38的CAR序列的γ-逆转录病毒转导细胞，所述CAR序列由与4-1BB共刺激结构域连接的THB7单链可变片段和T细胞受体CD3ζ细胞内结构域组成(THB7-41BB-CD3zeta)(Mihara等人2009.J Immunother.32(7):737-43)；模拟T细胞不用病毒转导。使用Nucleocounter NC-200细胞计数器在整个扩增过程中监测倍数扩增(图35 A)，活力(图35 B)和细胞大小(图35C)。还在扩增的第5,7和10天通过流式细胞术评估CD38表达(图35 D)。简而言之，将细胞在含有BSA的PBS(染色缓冲液)中洗涤一次，然后与100μL含有APC-Cy7缀合的抗人CD3、Brilliant Violet 421缀合的抗人CD4、PE缀合的抗人CD8、APC缀合的抗人CD16和FITC缀合的抗人CD38的抗体混合物温育20分钟。在染色缓冲液中洗涤两次后，通过流式细胞术进行检测。相对于抗-CD38 CAR T细胞，ACTR T细胞显示了增强的扩增(图35 A)，活力(图35 B)，细胞直径(图35 C)和CD38表达(图35 D)。
在类似的实验中，评估了其他的抗CD38 CAR。056 CAR由与4-1BB共刺激结构域连接的056单链可变片段和T细胞受体CD3ζ细胞内结构域(056-41BB-CD3zeta)组成(Drent等人2016.Haematologica.101(5):616-25).用编码ACTR、THB7 CAR或056 CAR的γ-逆转录病毒转导T细胞；模拟T细胞未用病毒转导。使用Nucleocounter NC-200细胞计数器在整个扩增过程中监测倍数扩增(图44 A)，细胞大小(图44 B)和细胞活力(图44 C)。相对于表达两种抗CD38CAR变体的T细胞，ACTR T细胞显示了增强的扩增(图44 A)，细胞直径(图44 B)和细胞活力(图44 C)。
还在扩增的第6，8和10天通过流式细胞术评估CD38表达。简而言之，将细胞在含有BSA的PBS(染色缓冲液)中洗涤一次，然后与100μL含有APC-Cy7缀合的抗人CD3、BrilliantViolet 421缀合的抗人CD4、PE缀合的抗人CD8、APC缀合的抗人CD16和FITC缀合的抗人CD38的抗体混合物温育20分钟。在染色缓冲液中洗涤两次后，通过流式细胞术进行检测。图45中显示了表示每个T细胞扩增的CD38表达的直方图。模拟和ACTR T细胞的直方图均显示了在扩增过程中向CD38较低表达的转变，但在整个实验中保持强烈的CD38表达。THB7 CAR和056CAR T细胞的直方图显示了在实验过程中CD38表达显著降低，对于两种CAR变体，在第8天和第10天观察到很少或没有观察到CD38表达，表明CAR介导的CD38阳性T细胞耗尽。
这些实验证明了，CD38靶介导的自溶作用抑制了抗CD38 CAR T细胞的产生，而不抑制ACTR T细胞的产生。
与抗CD38 CAR T细胞相比，ACTR T细胞表现出增强的细胞毒性和细胞因子产生
评估上述实验中产生的T细胞，通过与表达CD38的靶细胞的活性实验。将表达ACTR和CAR的细胞标准化以获得与模拟T细胞匹配的转导效率。对于这些实验，模拟T细胞、ACTRT细胞、THB7 CAR T细胞和056 CAR T细胞以不同的E:T比例(1:4,1:2,1:1,2:1和4:1)与表达CD38的Daudi、NCI-H929或RPMI-8226靶细胞温育。模拟和ACTR T细胞的实验在不存在和存在达雷木单抗(1μg/mL)的情况下进行。反应在37℃5％CO2培养箱中温育24小时。取出上清液(100μL)进行细胞因子分析。
通过流式细胞术评估细胞毒性。简而言之，用PBS洗涤细胞一次，然后用可固定的活性染料染色。细胞用PBS再次洗涤，然后与100μLAlexaFluor488缀合的抗人CD3抗体一起温育。温育30分钟后，将细胞洗涤两次，并在流式细胞仪上获得数据。通过对活性染料阴性的CD3细胞进行门控来确定活靶细胞计数。通过将来自给定样品的活靶细胞计数除以仅靶细胞孔中的活靶细胞计数来确定活靶细胞的百分比。通过从100减去活细胞百分比来确定细胞毒性百分比。将细胞毒性百分比作为E:T比的函数作图(图46)。
ACTR与达雷木单抗、THB7 CAR和056 CAR T细胞同Daudi(图46 A)和NCI-H929(图46 B)细胞一同培养，观察到其细胞毒性为效应细胞剂量依赖性增加。单独的模拟T细胞和单独的ACTR T细胞对任一靶细胞系显示了很少或没有细胞毒性。在达雷木单抗存在下的模拟T细胞显示出对Daudi细胞的一些细胞毒性，表明单独的达雷木单抗可能对这些靶细胞具有细胞毒性作用(图46 A)。在达雷木单抗存在下的ACTR T细胞显示出，相对于具有较低E:T比率的THB7和056 CAR T细胞，对Daudi和NCI-H929靶细胞的优异细胞毒性(分别为图46 A和B)。
使用Cisbio均相时间分辨荧光(HTRF)测试，分析来自这些实验的上清液的IFNα和IL-2。简而言之，根据制造商的方案制备细胞因子标准品和缀合物。在低体积384孔板中，将10μL体积的缀合物和10μL体积的细胞上清液共温育2小时(IL-2)或24小时(IFNα)。在EnVision多标读板器上读板。将在1:1 E:T比例下进行的反应的细胞上清液中测量的IFNγ或IL-2的浓度作为靶细胞的函数作图(图47)。
在Narat-H929、RPMI-8226和Daudi靶细胞存在下，观察到ACTR T细胞(在达雷木单抗存在下)，THB7 CAR T细胞和056 CAR T细胞有强烈的IFNγ产生(图47 A)。在达雷木单抗存在下模拟T细胞产生的IFNγ非常低或低于检测试量的限值。在Narat-H929、RPMI-8226和Daudi靶细胞存在下，观察到在达雷木单抗存在下的ACTR T细胞有强烈IL-2产生(图47 B)。在NCI-H929、RPMI-8226和Daudi靶细胞存在下，观察到THB7 CAR、056 CAR和模拟T细胞(在达雷木单抗存在下)有低水平IL-2产生(图47 B)。
这些实验证明了，在达雷木单抗存在下的ACTR T细胞相对于抗CD38 CAR T细胞具有优异的细胞毒性和细胞因子产生。
在达雷木单抗存在下，针对NCI-H929、MM.1S、RPMI-8226和Daudi细胞的介导的ACTR T细胞细胞毒性是剂量依赖性的和ACTR特异性的。
在浓度增加的CD38-靶向抗体达雷木单抗存在下，将ACTR或模拟T细胞(效应子；E)和靶细胞(靶标；T)以2:1的E:T比例温育。对于这些实验，使用NCI-H929、MM.1S、RPMI-8226和Daudi靶细胞。将反应物在CO2(5％)培养箱中于37℃温育24小时，然后进行流式细胞术染色。简而言之，用PBS洗涤细胞一次，然后用可固定的活性染料染色。用PBS再次洗涤细胞，然后与100μL含有AlexaFluor488缀合的抗人CD3和AlexaFluor 647缀合的抗人CD16抗体的抗体混合物一起温育。温育30分钟后，将细胞洗涤两次，并在流式细胞仪上获得数据。通过对活性染料阴性的CD3-CD16-细胞进行门控来确定活靶细胞计数。通过将来自给定样品的活靶细胞计数除以仅靶细胞孔中的活靶细胞计数来确定活靶细胞的百分比。通过从100减去活细胞百分比来确定细胞毒性百分比。将细胞毒性百分比作为抗体浓度的函数作图(图36)。
在达雷木单抗存在下，ACTR T细胞与NCI-H929(图36 A)、MM.1S(图36 B)、RPMI-8226(图36 C)和Daudi(图36 D)靶细胞培养，观察到其细胞毒性呈抗体剂量依赖性增加。当在浓度增加的达雷木单抗存在下培养模拟T细胞时，未观察到细胞毒性的增加。
在NCI-H929、MM.1S，RPMI-8226和Daudi细胞和达雷木单抗存在下ACTR T细胞的细胞因子释放是抗体剂量依赖性的
在浓度增加的CD38-靶向抗体达雷木单抗存在下，以1:1的E:T比例温育ACTR或模拟T细胞(效应子；E)和靶细胞(靶标；T)。在37℃/5％CO2培养箱中温育24小时后收集细胞上清液。使用Cisbio同源时间分辨荧光(HTRF)测试，分析上清液的IFNα和IL-2。简而言之，根据制造商的方案制备细胞因子标准品和缀合物。在低体积384孔板中，将10μL体积的缀合物和10μL体积的细胞上清液共温育2小时(IL-2)或24小时(IFNα)。在EnVision多标读板器上读板。将细胞上清液中测量的IFNγ或IL-2的浓度作为达雷木单抗浓度的函数作图。
在达雷木单抗调理的NCI-H929、MM.1S、RPMI-8226和Daudi靶细胞存在下，观察到ACTR T细胞强烈的IL-2(图37 A)和IFNγ(图37 B)的产生。模拟T细胞产生的细胞因子(未绘图)低于标准曲线的线性范围。
在达雷木单抗调理的NCI-H929、MM.1S、RPMI-8226和Daudi靶细胞存在下ACTR T细胞特异性增殖
用编码ACTR的γ逆转录病毒转导T细胞；流式细胞术实验表明，这些细胞中有24-32％为ACTR阳性。在浓度增加的CD38靶向抗体达雷木单抗存在下，将ACTR或模拟T细胞(效应子；E)和靶细胞(靶标；T)以1:1的效应物与靶标比例温育。将反应在37℃/5％CO2培养箱中温育7天，然后进行流式细胞术染色。简而言之，用PBS洗涤细胞一次，然后用可固定的活性染料eFluor450染色。用PBS再次洗涤细胞，然后与100μL含有AlexaFluor488缀合的抗人CD3和AlexaFluor647缀合的抗人CD16抗体的抗体混合物一起温育。温育30分钟后，将细胞洗涤两次，并在流式细胞仪上获得数据。通过对活性染料阴性的CD3+细胞进行门控来确定活T细胞计数。在图38 A和B中，将总T细胞计数绘制为达雷木单抗抗体浓度的函数。在不存在或存在达雷木单抗和NCI-H929、MM.1S、RPMI-8226和Daudi靶细胞的情况下，模拟T细胞不增殖(图38 A)。在存在但不存在达雷木单抗的情况下，ACTR T细胞在NCI-H929、MM.1S、RPMI-8226和Daudi靶细胞存在下显示出强烈的增殖(图38 B)。在图38 C中，在总CD3+ T细胞门内计算CD16+细胞的百分比，并作为达雷木单抗抗体浓度的函数作图。ACTR+ T细胞的百分比以抗体剂量依赖性方式增加证明了ACTR+ T细胞在增殖期间优先于未转导的细胞富集。
ACTR T细胞的细胞毒性和细胞因子释放对自体PBMC亚群的影响很小，但是对CD38表达靶细胞系具有特异性。
在含有ACTR T细胞、自体PBMC和表达CD38的多发性骨髓瘤靶细胞系的共培养测试中，在CD38靶向达雷木单抗存在下评估ACTR T细胞对PBMC和PBMC亚群的潜在靶向。如上所述，在一些PBMC子集上观察到CD38的低表达(图33 C)。
ACTR或模拟T细胞，自体PBMC存在下以1:1 E:T比例(每个100,000个细胞)与之温育，存在或不存在RPMI-8226多发性骨髓瘤靶细胞(25,000个细胞)时以4:1 E:T比与之温育。在存在或不存在达雷木单抗的情况下，将反应在37℃/5％CO2下温育20小时。在20-24小时后，收集一半细胞上清液用于细胞因子分析，收获细胞用于流式细胞术分析。
简而言之，用PBS洗涤细胞一次，然后用可固定的活性染料eFluor780染色。活性染色后，用PBS洗涤细胞一次，并与100μL由AlexaFluor488缀合的抗人CD3、APC缀合的抗人CD19、PE-Cy7缀合的抗人CD14、Brilliant Violet 421缀合的抗人CD56和BrilliantViolet 510缀合的抗人CD138组成的抗体混合物温育30分钟。用染色缓冲液洗涤细胞两次，并通过流式细胞术评估。在双重排斥和死细胞排除后，测定CD3+ T细胞、CD19+B细胞、CD3-CD56+天然杀伤细胞、CD3-CD14+单核细胞和CD3-CD138+MM靶细胞计数。通过将给定样品孔中的活靶细胞计数除以不存在抗体的活靶细胞计数，计算每个指定细胞亚群的活靶细胞的百分比。通过从100减去活细胞百分比来确定抗体特异性细胞毒性。在1或10μg/mL达雷木单抗存在下，将与模拟T细胞(图39 A)和ACTR T细胞(图39 B)反应的各种细胞亚群的抗体特异性细胞毒性(％)作为抗体浓度的函数作图。数据来自三个供体。用模拟T细胞观察到很少或没有细胞毒性；ACTR T细胞对RPMI-8226细胞(MM细胞)显示出强烈的细胞毒性，但对自体PBMC亚群几乎没存在或不存在细胞毒性。
如上所述分析来自上清液的细胞因子。简而言之，使用Cisbio同源时间分辨荧光(HTRF)测试收集一半细胞上清液(100μL)用于IFNγ和IL-2细胞因子分析。根据制造商的方案制备细胞因子标准品和缀合物。在低体积384孔板中，将10μL体积的缀合物和10μL体积的细胞上清液共温育2小时(IL-2)或24小时(IFNγ。在EnVision多标读板器上读板。存在或不存在RPMI-8226细胞情况下ACTR T细胞与PBMC的反应，将细胞上清液中测量的细胞因子浓度作为达雷木单抗抗体浓度的函数作图(图40)。在RPTR-8226多发性骨髓瘤细胞存在而非在RPTR-8226多发性骨髓瘤细胞不存在时，ACTR T细胞与达雷木单抗培养，观察到IFNγ(图40 A)和IL-2(图40 B)产生的增加。
与达雷木单抗组合的ACTR T细胞不介导溶血
通过流式细胞术在血红细胞上评估CD38表达。将来自五个健康供体的新鲜全血在含有叠氮化钠的细胞染色缓冲液(细胞染色缓冲液)中以1:10000稀释。用细胞染色缓冲液洗涤细胞一次，然后与100μL由APC缀合的抗人CD235a、Brilliant Violet 605缀合的抗人CD45和PE缀合的抗人CD38或同种型对照抗体组成的抗体混合物温育30分钟。温育后，用细胞染色缓冲液洗涤细胞两次，并通过流式细胞术评估。在CD235a+红细胞的表面上评估CD38表达，并绘制在图41的图A中。得到的直方图显示了用抗CD38抗体染色的红细胞相对于用同种型对照染色的轻微变化，表明红细胞上CD38少量表达。
还通过流式细胞术评估了达雷木单抗与红细胞的结合。将来自五个健康供体的新鲜全血在细胞染色缓冲液中以1:1000稀释。将稀释的全血(100μL)置于96孔圆底板中，并通过以200×g离心5分钟沉淀。将细胞在含有预制终浓度为8μg/mL的达雷木单抗的细胞染色缓冲液中37℃/5％CO2温育30分钟。然后用细胞染色缓冲液洗涤细胞两次，并与PE缀合的山羊抗人IgG(Fab')2二抗在室温下温育20分钟。在染色缓冲液中洗涤两次后，通过流式细胞术进行PE检测。显示了测试的五个供体之一的达雷木单抗最大结合，并将其与单独的二抗进行比较(图41 B)。相对于单独的二抗，在达雷木单抗存在下，观察到所得直方图的小变化，表明部分达雷木单抗与红细胞结合。
使用ACTR和红细胞共培养测试，评估ACTR T细胞介导的溶血。在来自五个健康供体的红细胞存在下温育ACTR T细胞以达到约1:200的ACTR+ T细胞:红细胞比率。将未转导的模拟T细胞和达雷木单抗的反应、与在没有T细胞的情况下单独使用达雷木单抗的反应用作该实验中的对照。将反应物在存在600μg/mL、200μg/mL、66.7μg/mL、22.2μg/mL、7.4μg/mL或0μg/mL达雷木单抗下在37℃/5％CO2恒温箱中温育24小时。在24小时共培养后，通过500×g离心10分钟沉淀活的红细胞。收集上清液(60μL)用于血红蛋白ELISA分析，其中在细胞上清液中测得血红蛋白指示红细胞裂解。简言之，根据制造商说明书制备洗涤缓冲液、稀释液、酶-抗体缀合物和血红蛋白标准品。将样品和标准品(100μL)加入ELISA板中并在室温下温育20分钟。用300μL洗涤缓冲液洗涤板四次，然后与100μL酶-抗体缀合物一起温育20分钟。再次用300μL洗涤缓冲液洗涤板四次，然后与100μL TMB显色剂底物溶液一起温育10分钟。向每个孔中加入终止溶液(100μL)并使用SpectraMax I3X测定450nm处的吸光度。将每个样品孔与添加了导致完全裂解的2％Triton-X(对照虚线)的孔中测量的血红蛋白浓度进行比较。将血红蛋白浓度作为达雷木单抗浓度的函数作图(图41 C)。在反应上清液中检测到很少甚至没有血红蛋白，并且与ACTR T细胞、模拟T细胞或单独的达雷木单抗的反应之间没有差异。
例9:表达ACTR变体和CD28共刺激结构域的T细胞中的IL-2产生
产生γ-逆转录病毒，其编码具有SEQ ID NO:2,9,13,19,20,21,22和78的ACTR变体。这些病毒用于感染来自两个不同供体的原代人T细胞，产生在感染细胞表面上表达这些ACTR变体的细胞。随后将这些细胞与Her2阳性HCC1954或SKBR3靶细胞和Her2靶向曲妥珠单抗用于IL2释放测试。
在200μL反应体积的存在1μg/mL曲妥珠单抗的补充有10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中，将T细胞(效应子；E)和HCC1954靶细胞(靶标；T)以1:1的效应物-靶标比率(120,000个效应细胞；120,000个靶细胞)温育。在100μL反应体积的存在1μg/mL曲妥珠单抗的补充有10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中，将T细胞(效应子；E)和SKBR3靶细胞(靶标；T)以1:1的效应物与靶标比例(30,000个效应细胞；30,000个靶细胞)温育。将反应物在CO2(5％)培养箱中于37℃温育24小时。
使用均相时间分辨荧光(HTRF)测试(Cisbio)分析上清液的IL-2。简而言之，根据制造商的方案制备细胞因子标准品和缀合物。在低体积的384孔板中，将10μL体积的缀合物和10μL体积的细胞上清液共温育24小时。使用EnVision多标读板器测量荧光信号，并根据制造商的推荐分析数据。
对于每个靶/供体对，IL-2的释放量与ACTR变体SEQ ID NO:2的IL-2释放量标准化。图42中，将IL-2相对均值作为ACTR变体的函数作图。表达所有测试的ACTR变体的T细胞显示了IL-2的产生，IL-2是T细胞活性的指示物。ACTR变体SEQ ID NO:9显示了相对于其他ACTR变体更多的IL-2产生。
例10:用ACTR变体SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:77的细胞因子的产生
在许多不同的抗体-靶对的存在下评估ACTR变体SEQ ID NO:9和77产生细胞因子的能力。对于这些实验，表达SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:77的ACTR T细胞与靶细胞以1:1的E:T比例和不同浓度的靶向抗体在37℃，5％CO2培养箱中温育24小时。包括不表达ACTR的模拟T细胞作为对照。如实施例6中所述，分离上清液并使用Meso Scale Discovery V-Plex人IFN-γ和V-Plex人IL-2试剂盒分析细胞因子IL-2和IFN-γ。对于表达HER2的BT20和SKBR3靶细胞的实验，曲妥珠单抗的滴定浓度为0-0.5μg/mL；对于表达CD20的Daudi、Raji和RL靶细胞的实验，利妥昔单抗的滴定浓度为0-10μg/mL；对于表达B7H3的BT474靶细胞，抗B7H3抗体hu8H9-6m的实验(Ahmed等人2015.J.Biol.Chem.,290,pp.30018–30029)。利妥昔单抗和曲妥珠单抗来自商业渠道。通过将编码抗体重链和轻链的质粒转染到Freestyle 293F细胞(Thermo Scientific)中产生抗B7H3抗体hu8H9-6m，并利用蛋白A亲和力从细胞培养上清液中纯化抗体。
对于表达HER2的细胞系的实验，将IL-2(图43 A)和IFN-γ(图43 B)值作为测试的针对不同曲妥珠单抗浓度和靶细胞系T细胞的函数作图。ACTR变体SEQ ID NO:9和ACTR变体SEQ ID NO:26均以抗体依赖性方式产生IL-2和IFN-γ。与曲妥珠单抗和HER2表达靶细胞一起温育，与ACTR变体SEQ ID NO:9一起释放的IL-2和IFN-γ均高于与ACTR变体SEQ ID NO:26。用利妥昔单抗和表达CD20的靶细胞以及抗B7H3抗体和表达B7H3的靶细胞获得了类似的结果。用ACTR变体SEQ ID NO:9和ACTR变体SEQ ID NO:26测试的最高抗体的每个靶-抗体对产生的相对IL-2和IFN-γ显示于表8中。使用其他靶-抗体对进行类似的实验，并且也表现出与ACTR变体SEQ ID NO:9相对ACTR变体SEQ ID NO:26的细胞因子释放增加。
表8:用ACTR变体SEQ ID NO:9和77的相对细胞因子释放:
该研究的结果表明，表达含有CD28共刺激结构域(和任选的CD28跨膜结构域和/或CD28铰链结构域)的ACTR构建体的T细胞显示出某些优越的效果，例如细胞因子释放曲线，表明这种ACTR构建体可能具有某些优越的治疗方面(例如，用于治疗缺乏共刺激分子表达的癌症(造血或非造血的)。
其他实施方案
本说明书中公开的所有特征能以任何组合方式组合。本说明书中公开的每个特征可以由用于相同、等同或类似目的的替代特征代替。因此，除非另有明确说明，否则所公开的每个特征仅是一系列等效或类似特征的示例。
根据以上描述，本领域技术人员可以容易地确定本公开的基本特征，并且在不脱离其精神和范围的情况下，可以对本公开进行各种改变和修改以使其适应各种用途和条件。因此，其他实施例也在权利要求内。

Claims (97)

1.一种抗体偶联的T细胞受体(ACTR)多肽，包括:
(i)CD16A细胞外结构域，
(ii)跨膜结构域，
(iii)一个或多个共刺激信号结构域，其中至少一个是CD28共刺激信号传导区，和
(iv)CD3+胞质信号域；
其中如果跨膜结构域(ii)是CD8跨膜结构域，则ACTR多肽不含任何非CD16A受体的铰链结构域，或者包含一个以上的共刺激信号结构域。
2.如权利要求1所述的ACTR多肽，所述的ACTR多肽还包含铰链结构域，其中所述铰链结构域的长度为1至60个氨基酸残基。
3.如权利要求2所述的ACTR多肽，其中所述铰链结构域的长度为1至30个氨基酸残基。
4.如权利要求2所述的ACTR多肽，其中所述铰链结构域的长度为31至60个氨基酸残基。
5.如权利要求2所述的ACTR多肽，其中铰链结构域是CD16A铰链结构域、非CD16A受体铰链结构域、或其组合。
6.如权利要求2-5中任一项所述的ACTR多肽，其中所述铰链结构域包含CD28铰链结构域。
7.如前述权利要求中任一项所述的ACTR多肽，其中跨膜结构域(ii)是CD28跨膜结构域。
8.如权利要求1-7中任一项所述的ACTR多肽，所述的ACTR多肽包含(i)CD28共刺激结构域；(ii)CD28跨膜结构域、CD28铰链结构域、或其组合。
9.如权利要求8所述的ACTR多肽，其包含SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:22，或SEQ ID NO:27的氨基酸序列。
10.如权利要求1或权利要求2所述的ACTR多肽，所述的ACTR多肽包含两个共刺激信号域，一个是CD28共刺激信号域，另一个是4-1BB共刺激信号域或OX40共刺激信号域。
11.如权利要求10所述的ACTR多肽，其中跨膜结构域(ii)为CD8跨膜结构域。
12.如权利要求11所述的ACTR多肽，所述的ACTR多肽还包含CD8铰链结构域。
13.如权利要求1所述的ACTR多肽，所述的ACTR多肽不含任何非CD16A受体的铰链结构域。
14.一种抗体偶联的T细胞受体(ACTR)多肽，包括:
(i)CD16A细胞外结构域，
(ii)跨膜结构域，和
(iii)CD3ζ胞质信号域；
其中ACTR多肽不含任何非CD16A受体的铰链结构域。
15.如权利要求14所述的ACTR多肽，所述的ACTR多肽不含任何铰链结构域。
16.如权利要求13或14所述的ACTR多肽，所述的ACTR多肽还包含一个或多个共刺激信号域。
17.如权利要求16所述的ACTR多肽，其中所述一种或多种共刺激信号结构域选自下组：CD27、CD28、4-1BB、ICOS和OX40。
18.如权利要求16或17所述的ACTR多肽，所述的ACTR多肽包含两个共刺激信号域。
19.如权利要求18所述的ACTR多肽，其中两个共刺激信号域之一是CD28共刺激信号域，另一个是4-1BB共刺激信号域、OX40共刺激信号域、CD27共刺激信号域、或ICOS共刺激信号域。
20.如权利要求19所述的ACTR多肽，其中所述其他共刺激信号域是4-1BB共刺激信号域。
21.如权利要求20所述的ACTR多肽，其中所述4-1BB共刺激信号域位于CD28共刺激信号域的N末端。
22.如权利要求19所述的ACTR多肽，其中所述其他共刺激信号域是OX40共刺激信号域区。
23.如权利要求22所述的ACTR多肽，其中OX40共刺激信号域位于CD28共刺激信号域的C末端。
24.如权利要求16所述的ACTR多肽，所述的ACTR多肽含有单个共刺激信号域，其中单个共刺激信号域来自CD28。
25.如权利要求24所述的ACTR多肽，其中所述跨膜结构域是CD8跨膜结构域。
26.如权利要求25的ACTR多肽，其中ACTR多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:2,SEQ IDNO:13，或SEQ ID NO:17。
27.一种核酸，其包含编码第一多肽的第一核苷酸序列，所述第一多肽是权利要求1-26中任一项的ACTR多肽。
28.如权利要求27所述的核酸，所述的核酸还包含编码引发共刺激信号的第二多肽的第二核苷酸序列。
29.如权利要求28所述的核酸，其中所述第二多肽包含共刺激受体、其配体、或与共刺激受体的结合部分。
30.如权利要求28所述的核酸，其中第二多肽包含与4-1BB、ICOS、OX40、CD27或CD28的结合部分。
31.如权利要求29或30所述的核酸，其中结合部分是单链抗体(scFv)。
32.如权利要求28所述的核酸，其中第二多肽包含4-1BBL、CD80、CD86、OX40L、ICOSL、CD70、或其组合。
33.如权利要求32所述的核酸，其中所述第二多肽包含4-1BBL。
34.如权利要求33所述的核酸，其中第一多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:13，和/或第二多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:24。
35.如权利要求27-34中任一项所述的核酸，所述的核酸还包含位于第一核苷酸序列和第二核苷酸序列之间的第三核苷酸序列，其中第三核苷酸序列编码核糖体跳跃位点、核糖体内部进入位点(IRES)、或第二个启动子。
36.如权利要求35所述的核酸，其中所述核糖体跳跃位点是P2A肽。
37.如权利要求27-36中任一项所述的核酸，所述的核酸在载体中。
38.如权利要求37所述的核酸，其中所述载体是表达载体。
39.如权利要求37或38所述的核酸，其中载体是腺相关病毒(AAV)。
40.如权利要求37或38所述的核酸，其中载体是逆转录病毒载体。
41.如权利要求40所述的核酸，其中所述逆转录病毒载体是慢病毒载体或γ逆转录病毒载体。
42.一种宿主细胞，包含权利要求27-41中任一项所述的核酸。
43.一种表达第一多肽的免疫细胞，所述第一多肽是权利要求1-26中任一项所述的抗体偶联的T细胞受体(ACTR)多肽。
44.如权利要求43所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞是T细胞或自然杀伤(NK)细胞。
45.如权利要求43或权利要求44所述的免疫细胞，所述的免疫细胞还表达第二多肽，所述的第二多肽包含共刺激结构域或共刺激受体的配体。
46.如权利要求45所述的免疫细胞，其中所述第二多肽包含4-1BBL、CD80、CD86、OX40L、ICOSL、CD70、或其组合。
47.如权利要求43-46中任一项所述的免疫细胞，其中第二多肽包含4-1BBL。
48.一种增强受试者中抗体依赖性细胞介导的细胞毒性的方法，该方法包括给予有需要的受试者(i)有效量的如权利要求43-47中任一项所述的免疫细胞或如权利要求43-47中任一项所述的载体，和(ii)有效量的治疗性抗体。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述的治疗性抗体特异针对TNF-α、HER2、CD52、CD38、BCMA、GPC3、PDGF-R-α、CD25、VEGF、BLyS、CD30、IL1-B、EGFR、RANK配体、GD2、C5、CD11a、CD22、CD33、CTLA4、CEACAM5、α-4整合素、CD20、CD19、IgE、RSV、VEGFR2、IL6R、IL12、IL23、整合素α4-β7、或PSMA。
50.如权利要求48或权利要求49所述的方法，其中所述的治疗性抗体选自阿达木单抗、曲妥珠单抗-美坦新偶联物、阿仑珠单抗、阿特珠单抗、阿维鲁单抗、巴利昔单抗、贝伐珠单抗、贝利木单抗、本妥昔单抗、卡那奴单抗、西妥昔单抗、达雷木单抗、达克珠单抗、狄诺塞麦、达妥昔单抗、德瓦鲁单抗、依库珠单抗、依法珠单抗、依帕珠单抗、吉妥单抗、戈利木单抗、英夫利昔单抗、易普利姆玛、拉贝珠单抗、那他珠单抗、奥滨尤妥珠单抗、奥法木单抗、奥拉单抗、奥马珠单抗、帕利珠单抗、帕尼单抗、帕妥珠单抗、雷莫芦单抗、利妥昔单抗、托珠单抗、曲妥珠单抗、优特克单抗和维多珠单抗。
51.如权利要求48-50中任一项所述的方法，其中所述的免疫细胞是从受试者分离的自体T细胞。
52.如权利要求48-50中任一项所述的方法，其中所述的免疫细胞是T细胞，并且其中T细胞是同种异体的。
53.如权利要求48-52中任一项所述的方法，其中所述的免疫细胞是T细胞，并且其中T细胞具有被抑制或消除的内源性T细胞受体。
54.如权利要求48-53中任一项所述的方法，其中免疫细胞是T细胞，并且其中T细胞在给药前离体扩增和/或活化。
55.如权利要求48-54中任一项所述的方法，其中所述受试者是患有或怀疑患有癌症的人类患者。
56.一种制备表达抗体偶联T细胞受体(ACTR)的免疫细胞的方法，该方法包括将权利要求27-41中任一项所述的核酸导入免疫细胞群。
57.如权利要求56所述的方法，其中所述的方法还包括鉴定或分离表达ACTR的免疫细胞。
58.如权利要求56或权利要求57所述的方法，其中将核酸通过选自逆转录病毒转导、慢病毒转导、DNA电穿孔、和RNA电穿孔的方法引入免疫细胞。
59.一种基因工程免疫细胞，表达:
(i)第一多肽，其是抗体偶联的T细胞受体(ACTR)，其中所述的ACTR包含CD28细胞质信号域；和
(ii)引发共刺激信号的第二多肽。
60.如权利要求59所述的基因工程免疫细胞，其中所述的ACTR不含任何共刺激信号域。
61.如权利要求59或权利要求60所述的基因工程免疫细胞，其中第二多肽包含共刺激受体、其配体、或与共刺激受体结合的部分。
62.如权利要求61所述的基因工程免疫细胞，其中所述的结合部分是单链抗体(scFv)。
63.一种治疗实体瘤的方法，包括：
(i)向有此需要的受试者施用有效量的一种或多种淋巴清除剂；
(ii)在(i)之后给受试者施用抗CD20抗体；和
(iii)在(ii)之后向受试者施用表达抗体偶联的T细胞受体(ACTR)的免疫细胞，其中ACTR包括：
(a)CD16的Fc结合结构域；
(b)CD28的共刺激信号结构域，和
(c)CD3ζ的细胞质信号结构域。
64.如权利要求63所述的方法，其中所述的ACTR还包含位于(a)和(b)之间的，来自CD28的铰链结构域和/或来自CD28的跨膜结构域。
65.如权利要求63或64所述的方法，其中所述的CD16是CD16V同种型。
66.如权利要求63所述的方法，其中所述的ACTR包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。
67.如权利要求63所述的方法，其中所述的实体瘤是淋巴瘤。
68.如权利要求63-67中任一项所述的方法，其中所述的受试者是患有复发或难治性CD20+B细胞淋巴瘤的人类患者。
69.如权利要求68所述的方法，其中复发或难治的CD20+B细胞淋巴瘤选自弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、原发性纵隔B细胞淋巴瘤(PMBCL)、3b级滤泡性淋巴瘤(Gr3b-FL)、和转化组织学滤泡性淋巴瘤(TH-FL)。
70.如权利要求63-69中任一项所述的方法，其中所述的一种或多种淋巴清除剂是氟达拉滨和环磷酰胺。
71.如权利要求63-70中任一项所述的方法，其中所述的抗CD20抗体是利妥昔单抗。
72.如权利要求63-71中任一项所述的方法，其中所述的免疫细胞是T细胞。
73.如权利要求72所述的方法，其中所述的表达ACTR的T细胞以40×106细胞、80×106细胞、150×106细胞、或300×106细胞的剂量给予受试者。
74.如权利要求63-73中任一项所述的方法，其中在步骤(iii)之前和之后向受试者施用抗CD20抗体。
75.如权利要求63-74中任一项所述的方法，其中所述的表达ACTR的免疫细胞的制备，通过收集来自受试者的免疫细胞，并将编码ACTR的核酸导入免疫细胞，以表达ACTR。
76.如权利要求75所述的方法，其中所述收集步骤包括去除白细胞。
77.如权利要求63-76中任一项所述的方法，其中所述受试者曾接受或正接受用于疾病控制的化疗。
78.一种用于在受试者中诱导细胞毒性的方法，包括向有此需要的受试者施用
(i)特异性针对活化T细胞表面表达的抗原的抗体；和
(ii)表达抗体偶联T细胞受体(ACTR)的T细胞，其中所述的ACTR包括：
(a)Fc结合结构域；
(b)跨膜结构域；
(c)至少一个共刺激信号域；和
(d)包含基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)的细胞质信号域；其中
(c)或(d)位于嵌合受体的C末端。
79.如权利要求78所述的方法，其中所述的Fc结合结构域是Fc受体的细胞外配体结合结构域。
80.如权利要求79所述的方法，其中所述的Fc受体是CD16。
81.如权利要求78-80中任一项所述的方法，其中所述共刺激信号域是4-1BB或CD28。
82.如权利要求78-81中任一项所述的方法，其中所述的ACTR还包含位于(a)和(b)之间的铰链结构域。
83.如权利要求78-82中任一项所述的方法，其中所述细胞质信号传导区是CD3ζ。
84.如权利要求78-83中任一项所述的方法，其中，ACTR包括：
(a)CD16的Fc结合结构域；
(b)CD28的铰链结构域、CD28的跨膜结构域、或其组合；
(c)CD28的共刺激信号结构域、和
(d)CD3ζ的细胞质信号结构域。
85.如权利要求84所述的方法，其中所述的ACTR包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。
86.如权利要求78-85中任一项所述的方法，其中所述抗体特异性针对CD38、CD7或CD5。
87.如权利要求78-86中任一项所述的方法，其中所述表达ACTR的T细胞在体外扩增。
88.一个试剂盒包括：
(i)特异性针对在活化的T细胞上表达的抗原的抗体，和
(ii)表达抗体偶联T细胞受体(ACTR)的T细胞，其中所述的ACTR包括：
(a)Fc结合结构域；
(b)跨膜结构域；
(c)至少一个共刺激信号域；和
(d)包含基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)的细胞质信号传导区；
其中(c)或(d)位于嵌合受体的C末端。
89.如权利要求88所述的试剂盒，其中所述Fc结合结构域是Fc受体的细胞外配体结合结构域。
90.如权利要求89所述的试剂盒，其中Fc受体是CD16。
91.如权利要求88-90中任一项所述的试剂盒，其中所述共刺激信号传导区是4-1BB或CD28。
92.如权利要求88-91中任一项所述的试剂盒，其中所述ACTR还包含位于(a)和(b)之间的铰链结构域。
93.如权利要求88-92中任一项所述的试剂盒，其中所述细胞质信号传导区是CD3ζ。
94.如权利要求88-93中任一项所述的试剂盒，其中所述ACTR包括：
(a)CD16的Fc结合结构域；
(b)CD28的铰链和跨膜结构域；
(c)CD28的共刺激信号结构域、和
(d)CD3ζ的细胞质信号结构域。
95.如权利要求94所述的试剂盒，其中所述ACTR包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。
96.如权利要求88-95中任一项所述的试剂盒，其中所述抗体特异性针对CD38、CD7、或CD5。
97.如权利要求88-96中任一项所述的试剂盒，其中表达ACTR的T细胞在体外扩增。
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