KR20030074680A - 스트렙토코커스 뉴모니에 유래 재조합 보호 단백질 - Google Patents

Abstract

본 발명은 약 20kDa의 분자량을 가지는 스트렙토코커스 뉴모니에 표면결합 뉴모니에 보호 단백질(PPP)에 대한 아미노산서열과 핵산서열을 개시한다. PPP는 뉴모코커스 박테리아의 콜로니형성을 감소시키는 능력을 나타낸다. 따라서 본 발명은 또한 박테리아감염과 관련된 염증과 감염의 치료 및 예방용 조성물에 관한 것이다.

Description

스트렙토코커스 뉴모니에 유래 재조합 보호 단백질 {RECOMBINANT PROTECTIVE PROTEIN FROM ＄I(STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE)}

[우선권]

본 발명은 2000년 12월 28일에 출원되고 그 전체내용이 본 명세서에 참조병합된 미국가특허출원 제60/258,841호에 대해 35 U.S.C§119에 따른 우선권을 주장한다.

중이는 고막에 의해 외이와 분리된 멸균된 공기충진 공동이다. 고막에는 음파가 고막을 두드릴 때 진동하는 3개의 이골(ear bone)이 부착되어 있다. 진동은 뇌에 보내질 신경자극을 생성하는 내이로 전달된다. 공기는 비인강의 벽 속으로 개방된 유스타키오관을 통해 중이로 들어간다.

비인강은 비강에 뒤끝에 위치해 있다. 비인강은 호흡상피와 층상 비늘 상피에 의해 정렬되어 있다. 호흡상피 아래에서, 풍부한 점막결합 림프조직(mucosa-associated lymphoid tissue, MALT)이 비인두 편도선(아데노이드)을 형성한다.

중이의 박테리아 감염 또는 염증은 주로 어린이들에게서 발견된다. 중이는 분리되어 있기 때문에, 중이 감염이 진행되기 위해서는 비인강과 유스타키오관이 관련될 필요가 있다고 제시된다. 스트렙토코커스 뉴모니에 감염은 전세계에서 균혈증, 수막염 및 치명적 폐렴 뿐 아니라 중이감염의 주된 원인 중 하나이다(Butler, J.C., et al., American Journal of Medicine, 1999, 107:69S-76S). 전세계를 통해 다중약제 저항성 뉴모코커스 균주의 신속한 출현은 백신접종에 의한 뉴모코커스 감염의 예방에 대한 강조를 증가시켜 왔다(Goldstein and Garau, Lancet, 1997, 350:233-4).

스트렙토코커스 뉴모니에의 단백질 항원은 뉴모코커스 감염의 동물 모델에서 보호효능에 대해 평가되어 왔다. 가장 흔히 연구된 백신후보 중 일부에는 PspA 단백질, PsaA 지단백질, 및 CbpA 단백질이 포함된다. 많은 연구들은 PspA 단백질이 발병인자이지만(Crain, M.J., et al., Infect Immun, 1990, 58:3293-9; Mcdaniel, L.S., et al., J Exp Med, 1984, 160:386-97), 뉴모코커스 균주 사이에서 항원적으로 다양하다는 것을 보여주고 있다. 또한 최근의 연구는 재조합 PspA 변형체의 일부 항원적으로 보존된 영역이 성인에서 교차반응성 항체를 이끌어낼 수 있다는 것을 나타내고 있다(Nabors, G.S., et al., Vaccine, 2000, 18:1743-1754). 다른 그램양성 부착인자와 유사한 37kDa 지단백질인 PspA는 뉴모코커스에서 망간운반에 관여하고(Dintilhac, A., et al., Molecular Microbiology, 1997, 25(4):727-739; Sampson, J.S., et al., Infect Immun, 1994, 62:319-24), 전신질환의 마우스 모델에서 보호성이 있는 것으로 나타났다(Talkington, D.F., et al., Microb Pathog,1996. 21:17-22). 표면노출 콜린결합단백질인 CbpA는 항원적으로 보존되어 있고 또한 뉴모코커스질환의 마우스 모델에서 보호성이 있다(Rosenow, C., et al. Molecular Microbiology, 1997, 25:819-29). 비인두 콜로니형성이 귀 질환의 필요조건이기 때문에 뉴모코커스 단백질과 적절한 점막 보조제로 마우스의 비강 속을 면역화하는 것이 점막 항체반응을 증진시키는데 사용되어 왔고, 따라서 단백질 백신 후보들의 유효성을 증진시키는데 사용되어 왔다(Briles, D.E., et al., Infect Immun, 2000, 68:796-800; Yamamoto, M., et al., A. J Immunol, 1998, 161:4115-21).

현재 사용할 수 있는 23-가 뉴모코커스 캡슐형 다당류백신은 뉴모코커스 감염 위험이 있는 주된 2 집단인 2세 이하의 어린이 또는 면역저하된 환자에게는 효과적이지 않다(Douglas, R.M., et al., Journal of Infectious Diseases, 1983, 148:131-137). 7-가 뉴모코커스 다당류-단백질 접합체 백신은 백신혈청형에 의해 유발된 전신 뉴모코커스 질환 및 교차반응성 캡슐형 혈청형에 대해 유아와 어린이에서 매우 효과적인 것으로 나타났다(Shinefield and Black, Pediatr Infect Dis J, 2000, 19:394-7). 7가지 캡슐형 타입은 미국에서 질병격리환자의 80% 이상에 해당하지만 세계의 다른 지역에서의 질병격리환자의 57-60%만이 해당한다(Hausdorff, W.P., et al., Clinical Infectious Diseases, 2000, 30:100-21). 따라서, 뉴모코커스의 질병유발 혈청형의 대부분 또는 전부를 담당할 수 있는 백신이 즉각적으로 필요하다.

철은 많은 병원성 박테리아에 의한 콜로니형성과 감염을 위한 필수원소이다.포착과정을 방해하면 콜로니형성이 감소되고 질병가능성이 낮아진다. 이에 제한되지는 않으나 N. 고노리애, N, 메닝기티디스, M. 카타랄리스 및 H. 인플루엔자와 같은 성공적인 병원균에서 철포착복합체가 다른 실험실에서 이들의 백신가능성에 대해 평가되어 왔다(Conte, M.P., et al., Infection and Immunity, 1999, 64:3925; Gray-Owens, S.D., et al. Infection and Immunity, 1995, 64:1201; Luke N.R. et al., Infection and Immunity, 1999, 67:681). 따라서 철포착에 관여하는 구조를 분리하면 백신후보들을 유도할 수 있다.

본 발명은 20kDa의 분자량을 가지는 스트렙토코커스 뉴모니에의 단백질에 관한 아미노산 서열과 핵산서열을 제공한다. 본 발명은 또한 박테리아감염과 관련된 염증 또는 감염의 치료와 예방용 조성물에 관한 것이다.

도 1. 스트렙토코커스 뉴모니에 균주 49136의 PBS 세척으로부터 얻은 DEAE 분획의 SDS-PAGE 겔. 레인 1은 미염색 표준물질이고; 레인 2는 분획 #8이고; 레인 3은 분획 #9이고; 레인 4는 분획 #10이고; 레인 5는 분획 #11이고; 레인 6은 분획 #12이고; 레인 7은 분획 #13이고; 레인 8은 분획 #19이고; 레인 9는 분획 #15이고; 레인 10은 분획 #16이다. 도 1의 겔은 겔에 의해 분석된 분획 #14와 #15(레인 8과 9)에서의 명백한 작은 분자량 밴드를 나타낸다.

도 2. 원하는 생성물의 발현을 보여주는 pLP533의 재조합발현의 전세포 용해물의 겔. 레인 1, Biorad 사전염색 마커; 레인 2, 미유도된 세포; 및 레인 3, 유도된 세포.

도 3. 교차반응성 및 올리고머형성을 나타내는 여러가지 혈청형의 전세포 용해물의 웨스턴 블럿. 레인 1, Biorad Precision 사전염색 마커; 레인 2, 타입 3; 레인 3, 타입 4; 레인 4, 타입 9; 레인 5, 타입 14; 레인 6, 타입 19F; 레인 7, 타입 18C; 레인 8, 타입 5; 및 레인 9, 타입 23F.

도 4. rPPP1에 의한 콜로니형성의 감소. 회수된 박테리아를 조직 1g 당 Log10 CFU로 나타내었다. 평균의 한 표준오차를 나타낸다.^*값은 Tukey-Kramer 통계시험에 의해 대조구와 비교할 때 상당히 다르다.

도 5. SDS-PAGE 겔은 rPPP1의 정제를 나타낸다. 레인 1, BioRad Precision 표준; 레인 2, 투여과물; 레인 3, 정제된 rPPP1.

도 6. 스트렙토코커스 뉴모니에의 혈청형들로부터 얻은 PPP1의 서열비교.

도 7. 겔은 시험관 내 및 생체 내 배양물의 증폭된 PPP1을 나타낸다.

본 발명은 10-20% SDS-PAGE 겔을 사용하여 확인한 분자량이 약 20kDa인 분리된 스트렙토코커스 뉴모니에 표면결합 뉴모 보호 단백질(Pneumo Protective Protein, PPP) 또는 이의 단편에 관한 것으로; PPP는 뉴모코커스 박테리아의 콜로니형성을 감소시키는 능력을 가진다.

본 발명은 10-20% SDS-PAGE 겔을 사용하여 확인한 분자량이 약 20kDa인 재조합 스트렙토코커스 뉴모니에 표면결합 PPP 또는 이의 단편에 관한 것으로; PPP는 뉴모코커스 박테리아의 콜로니형성을 감소시키는 능력을 가진다.

본 발명은 10-20% SDS-PAGE 겔을 사용하여 확인한 분자량이 약 20kDa인 재조합 스트렙토코커스 뉴모니에 표면결합 PPP 또는 이의 단편에 관한 것으로; PPP는 뉴모코커스 박테리아의 콜로니형성을 감소시키는 능력을 가지고; PPP는 약 4.587의 등전점을 가진다.

본 발명은 또한 10-20% SDS-PAGE 겔을 사용하여 확인한 분자량이 약 20kDa인재조합 스트렙토코커스 뉴모니에 표면결합 PPP 또는 이의 단편에 관한 것으로; PPP는 뉴모코커스 박테리아의 콜로니형성을 감소시키는 능력을 가지고; PPP는 약 4.587의 등전점과 pH 7에서 약 -14.214의 전하를 가진다.

본 발명은 또한 10-20% SDS-PAGE 겔을 사용하여 확인한 분자량이 약 20kDa인 분리된 스트렙토코커스 뉴모니에 표면결합 PPP 또는 이의 단편에 관한 것으로; PPP는 SEQ ID NO:5와 같은 아미노산 서열 또는 이의 단편을 가지며; PPP는 뉴모코커스 박테리아의 콜로니형성을 감소시키는 능력을 가진다.

본 발명은 또한 10-20% SDS-PAGE 겔을 사용하여 확인한 분자량이 약 20kDa인 분리된 스트렙토코커스 뉴모니에 표면결합 PPP을 암호화하는 핵산서열 또는 이의 단편에 관한 것으로; 상기 핵산서열은 SEQ ID NO:4와 같은 서열 또는 이의 단편을 가지며; PPP는 뉴모코커스 박테리아의 콜로니형성을 감소시키는 능력을 가진다.

본 발명은 또한 10-20% SDS-PAGE 겔을 사용하여 확인한 분자량이 약 20kDa인 분리된 스트렙토코커스 뉴모니에 표면결합 PPP을 암호화하는 cDNA 또는 이의 단편에 관한 것으로; 상기 핵산서열은 SEQ ID NO:4와 같은 서열 또는 이의 단편을 가지며; PPP는 뉴모코커스 박테리아의 콜로니형성을 감소시키는 능력을 가진다.

본 발명은 또한 10-20% SDS-PAGE 겔을 사용하여 확인한 분자량이 약 20kDa인 분리된 스트렙토코커스 뉴모니에 표면결합 PPP를 암호화하는 핵산서열 또는 이의 단편을 포함하는 발현벡터에 관한 것으로; PPP는 뉴모코커스 박테리아의 콜로니형성을 감소시키는 능력을 가지고; 상기 서열은 발현조절서열과 작동가능하게 결합된다.

본 발명은 또한 10-20% SDS-PAGE 겔을 사용하여 확인한 분자량이 약 20kDa인 분리된 스트렙토코커스 뉴모니에 표면결합 PPP를 암호화하는 핵산서열 또는 이의 단편을 포함하는 벡터에 관한 것으로; PPP는 뉴모코커스 박테리아의 콜로니형성을 감소시키는 능력을 가지고, 상기 서열은 발현조절서열과 작동가능하게 결합되며, PPP는 약 4.587의 등전점을 가진다.

본 발명은 또한 10-20% SDS-PAGE 겔을 사용하여 확인한 분자량이 약 20kDa인 분리된 스트렙토코커스 뉴모니에 표면결합 PPP를 암호화하는 핵산서열 또는 이의 단편을 포함하는 벡터에 관한 것으로; PPP는 뉴모코커스 박테리아의 콜로니형성을 감소시키는 능력을 가지고, 상기 서열은 발현조절서열과 작동가능하게 결합되며, PPP는 약 4.587의 등전점과 pH 7에서 약 -14.214의 전하를 가진다.

본 발명은 또한 10-20% SDS-PAGE 겔을 사용하여 확인한 분자량이 약 20kDa인 분리된 스트렙토코커스 뉴모니에 표면결합 PPP를 암호화하는 핵산서열 또는 이의 단편을 포함하는 발현벡터에 관한 것으로; PPP는 SEQ ID NO:5와 같은 아미노산 서열 또는 이의 단편을 가지며; 상기 핵산서열은 발현조절서열과 작동가능하게 결합된다.

본 발명은 또한 10-20% SDS-PAGE 겔을 사용하여 확인한 분자량이 약 20kDa인 분리된 스트렙토코커스 뉴모니에 표면결합 PPP를 암호화하는 핵산서열 또는 이의 단편을 포함하는 발현벡터에 관한 것으로; PPP는 SEQ ID NO:5와 같은 아미노산 서열 또는 이의 단편을 가지며; 상기 아미노산서열은 SEQ ID NO:4와 같은 핵산서열 또는 이의 단편에 의해 암호화되고; 상기 핵산서열은 발현조절서열과 작동가능하게결합된다.

본 발명은 또한 10-20% SDS-PAGE 겔을 사용하여 확인한 분자량이 약 20kDa인 분리된 스트렙토코커스 뉴모니에 표면결합 PPP을 암호화하는 핵산서열 또는 이의 단편을 포함하는 발현벡터로 트랜스펙션된 숙주세포에 관한 것으로; PPP는 뉴모코커스 박테리아의 콜로니형성을 감소시키는 능력을 가지고; 상기 서열은 발현조절서열과 작동가능하게 결합된다.

본 발명은 또한 10-20% SDS-PAGE 겔을 사용하여 확인한 분자량이 약 20kDa인 분리된 스트렙토코커스 뉴모니에 표면결합 PPP를 암호화하는 핵산서열 또는 이의 단편을 포함하는 벡터로 트랜스펙션된 숙주세포에 관한 것으로; PPP는 SEQ ID NO:5와 같은 아미노산 서열 또는 이의 단편을 가지며; 상기 아미노산서열은 SEQ ID NO:4와 같은 핵산서열 또는 이의 단편에 의해 암호화되고; 상기 서열은 발현조절서열과 작동가능하게 결합된다.

본 발명은 또한 발현벡터로 트랜스펙션되고 벡터에 의한 PPP의 발현을 제공하는 조건 하에서 배양된 숙주세포에 의해 생산된 PPP를 분리하는 단계를 포함하고, 상기 벡터가 10-20% SDS-PAGE 겔을 사용하여 확인한 분자량이 약 20kDa인 분리된 스트렙토코커스 뉴모니에 표면결합 PPP를 암호화하는 핵산서열 또는 이의 단편을 포함하고; PPP는 뉴모코커스 박테리아의 콜로니형성을 감소시키는 능력을 가지고; 상기 서열은 발현조절서열과 작동가능하게 결합되는 것을 특징으로 하는 재조합 PPP의 생산방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 벡터로 트랜스펙션되고 벡터에 의한 PPP의 발현을 제공하는조건 하에서 배양된 숙주세포에 의해 생산된 PPP를 분리하는 단계를 포함하고, 상기 벡터가 10-20% SDS-PAGE 겔을 사용하여 확인한 분자량이 약 20kDa인 분리된 스트렙토코커스 뉴모니에 표면결합 PPP를 암호화하는 핵산서열 또는 이의 단편을 포함하는 벡터로 트랜스펙션된 숙주세포에 관한 것으로; PPP는 SEQ ID NO:5와 같은 아미노산서열 또는 이의 단편을 가지고; PPP는 뉴모코커스 박테리아의 콜로니형성을 감소시키는 능력을 가지며; 상기 서열은 발현조절서열과 작동가능하게 결합되는 것을 특징으로 하는 재조합 PPP의 생산방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 (1) 10-20% SDS-PAGE 겔을 사용하여 확인한 분자량이 약 20kDa이고 뉴모코커스 박테리아의 콜로니형성을 감소시키는 능력을 가지는 분리된 스트렙토코커스 뉴모니에 표면결합 PPP 또는 이의 단편; 및 (2) 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 (1) 10-20% SDS-PAGE 겔을 사용하여 확인한 분자량이 약 20kDa이고 뉴모코커스 박테리아의 콜로니형성을 감소시키는 능력을 가지며 SEQ ID NO:5와 같은 아미노산서열 또는 이의 단편을 가지는 분리된 스트렙토코커스 뉴모니에 표면결합 PPP 또는 이의 단편; 및 (2) 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 (1) 10-20% SDS-PAGE 겔을 사용하여 확인한 분자량이 약 20kDa이고 뉴모코커스 박테리아의 콜로니형성을 감소시키는 능력을 가지는 분리된 스트렙토코커스 뉴모니에 표면결합 PPP 또는 이의 단편을 암호화하는, SEQ ID NO:4와 같은 핵산서열을 가지는 핵산서열 또는 이의 단편; 및 (2) 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 (1) 10-20% SDS-PAGE 겔을 사용하여 확인한 분자량이 약 20kDa이고 뉴모코커스 박테리아의 콜로니형성을 감소시키는 능력을 가지는 분리된 스트렙토코커스 뉴모니에 표면결합 PPP 또는 이의 단편을 암호화하고, 발현조절서열에 작동가능하게 결합된 핵산서열을 포함하는 발현벡터; 및 (2) 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 (1) 10-20% SDS-PAGE 겔을 사용하여 확인한 분자량이 약 20kDa이고 SEQ ID NO:5와 같은 아미노산서열 또는 이의 단편을 가지는 분리된 스트렙토코커스 뉴모니에 표면결합 PPP 또는 이의 단편을 암호화하고, 발현조절서열에 작동가능하게 결합된 핵산서열을 포함하는 발현벡터; 및 (2) 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 (1) 10-20% SDS-PAGE 겔을 사용하여 확인한 분자량이 약 20kDa이고 뉴모코커스 박테리아의 콜로니형성을 감소시키는 능력을 가지는 분리된 스트렙토코커스 뉴모니에 표면결합 PPP 또는 이의 단편을 암호화하고, 발현조절서열에 작동가능하게 결합된 핵산서열을 포함하는 발현벡터로 트랜스펙션된 숙주세포; 및 (2) 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 (1) 10-20% SDS-PAGE 겔을 사용하여 확인한 분자량이 약 20kDa이고 뉴모코커스 박테리아의 콜로니형성을 감소시키는 능력을 가지며 SEQ ID NO:5와 같은 아미노산서열을 가지는 분리된 스트렙토코커스 뉴모니에 표면결합 PPP 또는 이의 단편을 암호화하고, 발현조절서열에 작동가능하게 결합된 핵산서열을 포함하는 벡터로 트랜스펙션된 숙주세포; 및 (2) 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 (i) 10-20% SDS-PAGE 겔을 사용하여 확인한 분자량이 약 20kDa인 스트렙토코커스 뉴모니에 표면결합 PPP 또는 이의 단편; (ii) 약제학적으로 허용가능한 담체; 및 (iii) 선택적으로 하나 이상의 보조제를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 (i) 10-20% SDS-PAGE 겔을 사용하여 확인한 분자량이 약 20kDa이고 약 4.587의 등전점을 가지는 스트렙토코커스 뉴모니에 표면결합 PPP 또는 이의 단편; (ii) 약제학적으로 허용가능한 담체; 및 (iii) 선택적으로 하나 이상의 보조제를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 (i) 10-20% SDS-PAGE 겔을 사용하여 확인한 분자량이 약 20kDa이고 약 4.587의 등전점과 pH 7에서 약 -14.214의 전하를 가지는 스트렙토코커스 뉴모니에 표면결합 PPP 또는 이의 단편; (ii) 약제학적으로 허용가능한 담체; 및 (iii) 선택적으로 하나 이상의 보조제를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 (i) 10-20% SDS-PAGE 겔을 사용하여 확인한 분자량이 약 20kDa이고 SEQ ID NO:5와 같은 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 가지는 스트렙토코커스 뉴모니에 표면결합 PPP 또는 이의 단편; (ii) 약제학적으로 허용가능한 담체; 및 (iii) 선택적으로 하나 이상의 보조제를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 (i) 10-20% SDS-PAGE 겔을 사용하여 확인한 분자량이 약 20kDa이고 SEQ ID NO:4와 같은 핵산 서열 또는 이의 면역원성 단편에 의해 암호화된 스트렙토코커스 뉴모니에 표면결합 PPP 또는 이의 단편; (ii) 약제학적으로 허용가능한 담체; 및 (iii) 선택적으로 하나 이상의 보조제를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 (i) 10-20% SDS-PAGE 겔을 사용하여 확인한 분자량이 약 20kDa인 스트렙토코커스 뉴모니에 표면결합 PPP 또는 이의 단편; (ii) 약제학적으로 허용가능한 담체; 및 (iii) 선택적으로 하나 이상의 보조제를 포함하고, 스트렙토코커스 뉴모니에에 의해 유발된 질환으로부터 보호 면역성을 이끌어내는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 (i) 10-20% SDS-PAGE 겔을 사용하여 확인한 분자량이 약 20kDa인 스트렙토코커스 뉴모니에 표면결합 PPP 또는 이의 단편; (ii) 약제학적으로 허용가능한 담체; 및 (iii) 선택적으로 하나 이상의 보조제를 포함하고, 스트렙토코커스 뉴모니에에 의해 유발된 질환으로부터 보호 면역성을 이끌어내고 상기 질환은 중이염, 비부비동염, 균혈증, 수막염, 폐렴 및 하부 기도 감염으로 이루어진 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 (i) 10-20% SDS-PAGE 겔을 사용하여 확인한 분자량이 약 20kDa인 스트렙토코커스 뉴모니에 표면결합 PPP 또는 이의 단편; (ii) 약제학적으로 허용가능한 담체; 및 (iii) 선택적으로 하나 이상의 보조제를 포함하고, 스트렙토코커스 뉴모니에에 의해 유발된 질환으로부터 보호 면역성을 이끌어내며, PPP가SEQ ID NO:5와 같은 아미노산서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 (i) 10-20% SDS-PAGE 겔을 사용하여 확인한 분자량이 약 20kDa이고, SEQ ID NO:4와 같은 핵산서열 또는 이의 면역원성 단편에 의해 암호화되는 스트렙토코커스 뉴모니에 표면결합 PPP 또는 이의 단편; (ii) 약제학적으로 허용가능한 담체; 및 (iii) 선택적으로 하나 이상의 보조제를 포함하고, 스트렙토코커스 뉴모니에에 의해 유발된 질환으로부터 보호 면역성을 이끌어내는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 (i) 10-20% SDS-PAGE 겔을 사용하여 확인한 분자량이 약 20kDa인 PPP를 암호화하는 하나 이상의 발현벡터; (ii) 약제학적으로 허용가능한 담체; 및 (iii) 선택적으로 하나 이상의 보조제를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 (i) 10-20% SDS-PAGE 겔을 사용하여 확인한 분자량이 약 20kDa인 PPP를 암호화하는 하나 이상의 발현벡터; (ii) 약제학적으로 허용가능한 담체; 및 (iii) 선택적으로 하나 이상의 보조제를 포함하고, 뉴모코커스 박테리아가 스트렙토코커스 뉴모니에인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 (i) 10-20% SDS-PAGE 겔을 사용하여 확인한 분자량이 약 20kDa인 PPP를 암호화하는 하나 이상의 발현벡터; (ii) 약제학적으로 허용가능한 담체; 및 (iii) 선택적으로 하나 이상의 보조제를 포함하고, 스트렙토코커스 뉴모니에에 의해 유발된 질환으로부터 보호 면역성을 이끌어내는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 (i) 10-20% SDS-PAGE 겔을 사용하여 확인한 분자량이 약 20kDa인 PPP를 암호화하는 하나 이상의 발현벡터; (ii) 약제학적으로 허용가능한 담체; 및 (iii) 선택적으로 하나 이상의 보조제를 포함하고, 스트렙토코커스 뉴모니에에 의해 유발된 질환으로부터 보호 면역성을 이끌어내고, 상기 질환은 중이염, 비부비동염, 균혈증, 수막염, 폐렴 및 하부 기도 감염으로 이루어진 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 (i) 10-20% SDS-PAGE 겔을 사용하여 확인한 분자량이 약 20kDa이고 약 4.587의 등전점을 가지는 PPP를 암호화하는 하나 이상의 발현벡터; (ii) 약제학적으로 허용가능한 담체; 및 (iii) 선택적으로 하나 이상의 보조제를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 (i) 10-20% SDS-PAGE 겔을 사용하여 확인한 분자량이 약 20kDa이고 약 4.587의 등전점과 pH 7에서 약 14.214의 전하를 가지는 PPP를 암호화하는 하나 이상의 발현벡터; (ii) 약제학적으로 허용가능한 담체; 및 (iii) 선택적으로 하나 이상의 보조제를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 (i) 10-20% SDS-PAGE 겔을 사용하여 확인한 분자량이 약 20kDa인 PPP를 암호화하고, SEQ ID NO:5와 같은 아미노산서열을 암호화하는 핵산서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 하나 이상의 발현벡터; (ii) 약제학적으로 허용가능한 담체; 및 (iii) 선택적으로 하나 이상의 보조제를 포함하는 면역원성조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 (i) 10-20% SDS-PAGE 겔을 사용하여 확인한 분자량이 약 20kDa인 PPP를 암호화하고, SEQ ID NO:5와 같은 아미노산서열을 암호화하는 핵산서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 하나 이상의 발현벡터; (ii) 약제학적으로 허용가능한 담체; 및 (iii) 선택적으로 하나 이상의 보조제를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 (i) 10-20% SDS-PAGE 겔을 사용하여 확인한 분자량이 약 20kDa인 PPP를 암호화하고, SEQ ID NO:4와 같은 핵산서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 하나 이상의 발현벡터; (ii) 약제학적으로 허용가능한 담체; 및 (iii) 선택적으로 하나 이상의 보조제를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 (i) 10-20% SDS-PAGE 겔을 사용하여 확인한 분자량이 약 20kDa인 스트렙토코커스 뉴모니에 표면결합 PPP; (ii) 약제학적으로 허용가능한 담체; 및 (iii) 선택적으로 하나 이상의 보조제를 포함하는 조성물을, 포유동물에서 면역반응을 유도하기에 유효한 양으로 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 면역반응을 유도하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 (i) 10-20% SDS-PAGE 겔을 사용하여 확인한 분자량이 약 20kDa이고 SEQ ID NO:5와 같은 아미노산서열 또는 이의 면역원성 단편을 가지는 스트렙토코커스 뉴모니에 표면결합 PPP; (ii) 약제학적으로 허용가능한 담체; 및 (iii) 선택적으로 하나 이상의 보조제를 포함하는 면역원성 조성물을, 포유동물에서 면역반응을 유도하기에 유효한 양으로 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는,포유동물에서 면역반응을 유도하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 (i) 10-20% SDS-PAGE 겔을 사용하여 확인한 분자량이 약 20kDa이고 약 4.582의 등전점을 가지는 PPP를 암호화하는 하나 이상의 발현벡터; (ii) 약제학적으로 허용가능한 담체; 및 (iii) 선택적으로 하나 이상의 보조제를 포함하는 면역원성 조성물을, 포유동물에서 면역반응을 유도하기에 유효한 양으로 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 면역반응을 유도하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 (i) 10-20% SDS-PAGE 겔을 사용하여 확인한 분자량이 약 20kDa인 PPP를 암호화하는 하나 이상의 발현벡터; (ii) 약제학적으로 허용가능한 담체; 및 (iii) 선택적으로 하나 이상의 보조제를 포함하고, 상기 발현벡터가 SEQ ID NO:5와 같은 아미노산 서열을 암호화하는 핵산서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물을, 포유동물에서 면역반응을 유도하기에 유효한 양으로 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 면역반응을 유도하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 포유동물에서 면역반응을 유도하기 위하여 SEQ ID NO:5와 같은 아미노산서열의 결합을 저해하기에 유효한 양의 화합물을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 뉴모코커스 박테리아에 감염된 포유동물에서 면역반응을 유도하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 화합물의 존재 하에서 SEQ ID NO:5와 같은 아미노산서열의 제1결합량과 상기 화합물의 부재 하에서 SEQ ID NO:5와 같은 아미노산서열의 제2결합량을 비교하는 단계를 포함함으로써 제2결합량보다 더 낮은 제1결합량이 상기 화합물이 포유동물에서 면역반응을 유도할 수 있다는 것을 나타내는, 뉴모코커스 박테리아로 감염된 포유동물에서 면역반응을 유도하는 화합물을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 의심스러운 시료 내의 SEQ ID NO:5와 같은 PPP 또는 이의 단편의 수준을 대조구 시료 내의 SEQ ID NO:5와 같은 PPP 또는 이의 단편의 수준과 비교하는 단계를 포함함으로써 상기 대조구 시료 내의 상기 뉴모 보호 단백질 수준보다 더 높은 수준의 상기 의심스러운 시료 내의 뉴모 보호 단백질 수준이 상기 의심스러운 시료가 뉴모코커스 박테리아감염을 포함한다는 것을 나타내는, 뉴모코커스 박테리아 감염을 진단하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 스트렙토코커스 뉴모니에 PPP에 결합하는 항체에 관한 것이다.

본 발명은 또한 SEQ ID NO:5와 같은 아미노산서열 또는 이의 단편을 선택적으로 인식하는 것을 특징으로 하는, 스트렙토코커스 뉴모니에 PPP에 결합하는 항체에 관한 것이다.

본 발명은 또한 스트렙토코커스 뉴모니에 PPP에 결합하는 키메라항체에 관한 것이다.

본 발명은 또한 스트렙토코커스 뉴모니에 PPP에 결합하는 인간화된 항체에 관한 것이다.

본 발명은 또한 스트렙토코커스 뉴모니에 PPP에 결합하는 항-이디오타입 항체에 관한 것이다.

본 발명은 또한 항체가 약제학적 활성 화합물에 접합된 것을 특징으로 하는, 스트렙토코커스 뉴모니에 PPP에 결합하는 항체에 관한 것이다.

본 발명은 또한 스트렙토코커스 뉴모니에 PPP에 결합하는 모노클로날 항체에 관한 것이다.

본 발명은 또한 항체가 인간화된 것을 특징으로 하는, 스트렙토코커스 뉴모니에 PPP에 결합하는 모노클로날 항체에 관한 것이다.

본 발명은 또한 항체가 항-이디오타입인 것을 특징으로 하는, 스트렙토코커스 뉴모니에 PPP에 결합하는 모노클로날 항체에 관한 것이다.

본 발명은 또한 항체가 약제학적 활성 화합물에 접합된 것을 특징으로 하는, 스트렙토코커스 뉴모니에 PPP에 결합하는 모노클로날 항체에 관한 것이다.

본 발명은 포유동물에서 면역반응을 유도하기에 유효한 양의 스트렙토코커스 뉴모니에 PPP에 결합하는 항-이디오타입 항체를 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 면역반응을 유도하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 포유동물에서 면역반응을 유도하기에 유효한 양의 스트렙토코커스 뉴모니에 PPP에 결합하는 모노클로날 항체를 포유동물에 투여하는 단계를 포함하고, 상기 항체가 항-이디오타입인 것을 특징으로 하는, 포유동물에서 면역반응을 유도하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 포유동물에서 면역반응을 유도하기에 유효한 양의 약제학적 활성화합물에 접합되고 스트렙토코커스 뉴모니에 PPP에 격합하는 항체를 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 뉴모코커스 박테리아에 감염된 포유동물에서 면역반응을 유도하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 포유동물에서 면역반응을 유도하기에 유효한 양의 약제학적 활성 화합물에 접합되고 스트렙토코커스 뉴모니에 PPP에 격합하는 모노클로날 항체를 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 뉴모코커스 박테리아에 감염된 포유동물에서 면역반응을 유도하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 단백질과 핵산은 스트렙토코커스 뉴모니에에 의해 유발된 질환에 대해 진단적, 예방적 및 치료적 유용성을 가진다. 이들은 스트렙토코커스 뉴모니에와 관련된 단백질과 철과의 상호작용을 방해하거나 붕괴시키는 화합물들에 대한 스크리닝 시스템을 디자인하는데 사용될 수 있다. 또한 핵산과 단백질은 외부 유전자를 발현하는데 사용될 때 스트렙토코커스 뉴모니에 감염 및/또는 다른 병원균에 대항하는 조성물을 제조하는데 사용될 수 있다.

본 발명에서 비강 내 면역성검사 모델에서 스트렙토코커스 뉴모니에의 콜로니형성을 감소시키는 전체 스트렙토코커스 뉴모니에로부터 얻은 재조합 20kDa 단백질이 확인되었다. 본 명세서에 기재된 단백질은 뉴모 보호 단백질 1(PPP1)이라고 명명되었다. 이 단백질은 L. 이노쿠아로부터 얻은 헴 무함유 철 단백질과 상당히 유사한데, 이는 DNA 결합 단백질의 Dsp계의 구성원이다(Pikis, A. et al., J. Infect. Diseases, 1998, 178:700). 따라서 이 단백질이 콜로니형성을 감소시키는 능력은 세포질 내에서의 이의 예상된 위치때문에 기대하지 못했다.

화학적 연구는 분리된 스트렙토코커스 뉴모니에 표면결합 PPP가 약 20kDa의분자량을 가지고, 이 분자량은 10-20% SDS-PAGE 겔을 사용하여 확인되었다는 것을 나타낸다. 재조합 PPP는 약 4.587의 등전점을 가지는 것으로 확인된다. 또한 상기 단백질은 약 7의 pH에서 약 -14.214의 전하를 가진다.

스트렙토코커스 뉴모니에

스트렙토코커스 뉴모니에는 인체에 매우 전염되기 쉬운 박테리아의 종류이다. 지금까지 80종 이상의 혈청형이 확인되었다. 이들 혈청형 중 일부는 폐렴, 수막염, 심내막염, 관절염, 부비강염, 이염, 기관지염 및 후두염을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 질병상태에서 병인이다. 뉴모코커스 감염은 HIV로 감염된 사람과 같이 면역저하된 신체를 가진 사람들에서 사망의 주된 원인인 것으로 확인되었다.

스트렙토코커스 뉴모니에는 스트렙토코커시애과의 스트렙토코커스속의 종이다. 이 속은 내생포자를 형성하지 않는 그램-양성, 비운동성, 구형 또는 타원형세포를 포함한다. 스트렙토코커스 뉴모니에는 산화성 대사에 대한 무기말단 전자 수용체를 가진다; 그러나 이들은 산소의 존재 하에서 성장할 것이다. 이것은 스트렙토코커스 뉴모니에가 다양한 환경에서 성장하도록 하고 따라서 다양한 인간 조직에서 성장하는데 매우 적합하다. 상기 박테리아는 페니실린으로 표적화하기 어려운데, 이는 많은 균주가 다당류 캡슐을 생산하기 때문이다.

뉴모코커스 감염에 대한 제1단계는 비인강의 콜로니형성이다. 뉴모코커스가 인간 비인두/귀 세포에 결합하는 것을 붕괴하면 콜로니형성이 감소되고 질병가능성이 더 낮아질 것이다. 따라서, 인간세포에 뉴모코커스가 결합하는데 관여하는 구조를 분리하면 백신 후보를 이끌어 낼 수 있다. 뉴모코커스는 PspA, PsaA, 및 CbpA 단백질을 포함하여, 인간 비인두세포에 결합하기 위한 다양한 메카니즘을 발달시켰다. 또한, 뉴모코커스는 콜로니형성에서의 제1단계와 같이 인간 비인두 뮤신에 특이적으로 결합할 수 있다. 따라서, 이러한 상호작용에 관여하는 뉴모코커스 구조를 확인하면 가능한 백신 표적들을 확인할 수 있다.

분자생물학

본 발명의 실시형태는 폴리펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 서열 및 그러한 서열의 변형들에 관한 것이다. 바람직하게는 고긴축조건 하에서, 이들 변형서열이 하나 이상의 뉴모 보호 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 하이브리디제이션한다. 보다 바람직하게는, 고긴축조건 하에서, 이들 변형서열이 SEQ ID NO:4의 폴리뉴클레오타이드 서열과 같은, 하나 이상의 뉴모 보호 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 하이브리디제이션한다. 고긴축 서던 하이브리디제이션 조건을 정의하기 위하여, 본 명세서에 참조병합된 문헌(Sambrook et al.(1989) at pp.387-389)을 참조하는 것이 편리한데, 여기서 세척단계는 고긴축으로 간주된다.

본 발명은 또한 폴리뉴클레오타이드 서열이 뉴클레오타이드 트리플렛의 세번째 뉴클레오타이드의 변화를 통해 대조서열과 다른 보존성 변형체에 관한 것이다. 이들 보존성 변형체는 PPP1 대조 폴리뉴클레오타이드 서열과 생물학적 등가물로서 작용하는 것이 바람직하다. 바람직한 실시형태에서, 생물학적 등가물로 작용하는 변형체는 철에 결합하는 것들이다.

본 발명은 또한 유전암호의 중복성에 의하여, PPP1을 암호화하는 서열과 생물학적 등가물인 DNA 서열을 포함하는데, 즉, 이들 다른 DNA 서열들은 본 명세서에 개시된 것들과 다르지만 SEQ ID NO:4의 DNA 서열에 의해 암호화되는 것과 동일한 아미노산서열을 가지는 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 의해 특징지워진다.

본 발명은 또한 스트렙토코커스 뉴모니에 PPP1의 것과 다르지만 이 단백질에 대해 기재된 것(SEQ ID NO:5)과 생물학적으로 등가인 아미노산서열을 암호화하는 DNA 서열을 포함한다. 그러한 아미노산 서열은 이들의 서열이 PPP1 서열의 사소한 결실, 삽입 또는 치환에 의해서만 달라서 서열의 3차구조가 야생형 단백질의 것으로부터 실질적으로 변화되지 않는다면 그러한 PPP1과 생물학적 등가라고 할 수 있다.

예를 들면, 소수성 아미노산인 아미노산 알라닌에 대한 코돈은 글리신과 같은 다른 덜 소수성인 잔기나 발린, 류신 또는 이소류신과 같은 보다 소수성인 잔기를 암호화하는 코돈에 의해 치환될 수 있다. 이와 유사하게, 글루탐산 대신 아스파르트산과 같이 하나의 음하전잔기를 다른 것으로, 또는 아르기닌 대신 리신과 같은 하나의 양하전 잔기를 다른 것으로 치환시키는 변화 뿐 아니라 이들의 수치료 지수에서 잔기의 유사성에 기초한 변화도 생물학적 등가 생성물을 생산한다고 예상할 수 있다. 단백질 분자의 N-말단 또는 C-말단 부분을 변형시키는 뉴클레오타이드 변화는 단백질의 활성을 변화시킬 것으로 생각되지 않는다.

문헌(Kyte and Doolittle(1982))에서 논의된 바와 같이, 폴리펩타이드에 대한 생물학적 상호작용을 부여하는데 아미노산의 수치료 지수를 이용할 수 있는데, 상기 문헌에서 어떤 아미노산은 유사한 수치료 지수를 가지는 다른 아미노산으로 치환되어 여전히 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있는 것을 확인하였다. 선택적으로 유사한 아미노산의 치환은 특히 생성되는 폴리펩타이드에서 원하는 생물학적 기능이 면역학적 실시형태에서 사용하도록 의도되는 경우, 친수성에 기초하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 이의 인접한 아미노산의 친수성에 의해 조절되는 바와 같이, "단백질"의 최대 국부 평균 친수성이 이의 면역원성과 상호관련된다는 것을 설명하는 미국특허 제4,554,101호(본 명세서에 참조병합됨)를 참조한다. 따라서, 각 아미노산에 부여된 친수성에 기초하여 치환을 할 수 있다. 각 아미노산에 대한 값을 부여하는, 친수성 지수 또는 수치료 지수 중 어느 것을 사용함에 있어서, 이들 값이 ±2, 특히 바람직하게는 ±1, 가장 바람직하게는 ±0.5 내인 아미노산의 치환을 도입하는 것이 바람직하다.

또한, 공지된 가변영역에서의 변화는 보존영역의 3차구조가 PPP1의 것과 실질적으로 변화되지 않은 경우 생물학적으로 등가이다. 생물학적 등가 서열의 다른 정의는 교차반응성 면역반응을 생성할 수 있는 것이다. 특히, 단백질은 변형된 단백질이 여전히 원하는 면역반응을 생성할 수 있는 한, 고노코커스(gonococcal) 필린으로부터 대응하는 삽입을 길게 하거나 짧게 함으로써 변형될 수 있다.

제시된 각 변형은 암호화된 생성물의 구조적 및 생물학적 활성의 보유가 확인되는 한 당해 기술분야에서 통상적인 기술이다. 따라서, "뉴모 보호 단백질" 또는 "PPP1" 또는 "PPP"라는 용어가 명세서 또는 특허청구범위에서 사용되는 경우,생물학적 등가 단백질을 생산하는 그러한 변형 및 변이를 모두 포함하는 것으로 이해될 것이다.

본 발명의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된, 본 명세서에서 기재된 PPP1의 바람직한 특징에는 (a) 막단백질이거나 막과 직접 결합하는 단백질이고; (b) SDS 아크릴아미드 겔을 사용하여 하나의 단백질로 분리될 수 있고; (c) 철과 상호작용하는 생물학적 기능을 보유하는 것 중 하나 이상이 포함된다.

변형체 및 단편은 감쇄될 수 있다, 즉, 본 발명의 야생형 PPP1과 비교할 때 비 철-결합 활성이 감소될 수 있다. 바람직하게는, 단편과 변형 아미노산 서열과 변형 뉴클레오타이드서열 발현 PPP1은 생물학적 등가이다. 즉, 이들은 야생형 PPP1과 실질적으로 동일한 기능을 보유한다. 그러한 변형 아미노산서열은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다. 그러한 변형 아미노산서열은 PPP1의 아미노산 서열과 약 70% 내지 약 80%, 바람직하게는 약 90%의 전체 유사성을 가질 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 이들 서열은 도 6과 SEQ ID NO:10-19에 나타나 있다. 변형 뉴클레오타이드 서열은 전사되었을 때, PPP1의 아미노산서열 또는 PPP1의 변형 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 대해 약 70% 내지 약 80%, 및 바람직하게는 약 90%의 전체 유사성을 가질 수 있다. 본 발명의 감쇄된 단백질은 야생형 단백질의 에피토프 영역을 하나 이상 포함한다. 다른 실시형태에서, 단백질의 에피토프 영역은 20개 이상의 인접 뉴클레오타이드 또는 8개 이상의 인접 아미노산을 포함한다.

본 발명은 또한 PPP1의 전체 컨센서스 서열에 관한 것이다. 스트렙토코커스뉴모니에의 다른 혈청형으로부터의 PPP1의 추론된 아미노산서열은 보존된 서열을 확인하기 위하여 비교될 수 있다. 일실시형태에서, 10개의 다른 혈청형이 비교된다. 보존된 서열은 이에 한정되지는 않으나 단백질 결합, 활성 및/또는 기능에 필요한 최소 필요요건과 같은 많은 용도를 가질 수 있다. 바람직한 실시형태에서, PPP1의 컨센서스 서열은 도 6과 SEQ ID NO:20에 나타나 있다.

본 발명의 "분리된" 서열은 비자연적으로 발생하는 서열이다. 예를 들면, 이들 서열은 박테리아의 게놈 내의 이들의 일반적인 상태로부터 분리될 수 있거나; 또는 상기 서열은 합성, 즉 공지된 재조합 발현시스템과 같은 재조합 기술을 통해 생성되거나 기계에 의해 생성될 수 있다.

본 발명은 또한 프로모터와 개시인자 서열과 프로모터와 개시인자 서열에 대해 3'에 위치한 본 발명의 핵산서열을 가지는 발현 조절서열을 포함하는 PPP1을 발현할 수 있는 재조합 DNA 클로닝 비히클을 제공한다. 클로닝 비히클은 바이러스 벡터를 포함하여, 당해 기술분야에서 공지된 임의의 플라스미드 또는 발현벡터일 수 있다(하기 참조). 다른 면에서, 본 발명의 재조합 DNA 클로닝 비히클 및/또는 재조합 PPP1을 포함하는 숙주세포가 제공된다. 적합한 발현조절서열, 숙주세포 및 발현벡터는 당해 기술분야에서 공지되어 있고, 예를 들면 문헌(Sambrook et al.(1989))에 기재되어 있다.

적합한 숙주세포는 재조합 발현된 단백질의 수율에 영향을 미칠 수 있는 인자들에 기초하여 선택될 수 있다. 이들 인자에는 성장 및 유도조건, mRNA 안정성, 코돈용법, 번역효율 및 프로모터가 읽는 것을 최소화하는 전사종결인자의 존재가포함되지만 이에 한정되지 않는다. 적합한 숙주세포를 선택함으로써 세포는 본 발명의 핵산서열을 포함하는 발현벡터로 트랜스펙션될 수 있다. 세포들은 당해 기술분야에서 공지된 방법들을 사용하여 트랜스펙션될 수 있다(하기 참조).

일단 숙주세포가 본 발명의 발현벡터로 트랜스펙션되면, 세포들은 폴리펩타이드가 발현되는 조건 하에서 배양된다. 폴리펩타이드는 당업자에게 공지된 기술에 의해 숙주세포 성분이 실질적으로 오염되지 않도록 분리된다.

원하는 재조합 단백질의 적용분야에 따라, 이종 뉴클레오타이드 서열은 보조인자, 사이토카인(인터류킨 등), T-헬퍼 에피토프, 제한마커, 보조제 또는 다른 미생물 병원균(예를 들면, 바이러스, 박테리아, 진균류 또는 기생충)의 단백질, 특히 보호 면역성반응을 이끌어 낼 수 있는 단백질을 암호화할 수 있다. 보조인자, 사이토카인(인터류킨 등), T-헬퍼 에피토프, 제한마커, 보조제 또는 다른 미생물 병원균(예를 들면, 바이러스, 박테리아, 진균류 또는 기생충)의 단백질의 면역원성 단백질을 암호화하는 이종서열을 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 다른 형태의 비-PPP1 잔기에는 암세포 또는 종양세포, 알러지항원, 아밀로이드 펩타이드, 단백질 또는 다른 고분자 성분이 포함되지만 이에 한정되지는 않는다.

예를 들면, 어떤 실시형태에서, 이종유전자는 재조합 단백질의 예방 또는 치료특성을 개선시키기 위해 선택되는 인터류킨-12와 같은 사이토카인을 암호화한다.

그러한 암세포 또는 종양세포의 예에는 전립선특이적 항원, 발암-미발달 항원, MUC-1, Her2, CA-125 및 MAGE-3이 포함되지만 이에 한정되지는 않는다.

그러한 알러지항원의 예에는 본 명세서에 참조병합된 미국특허 제5,830,877호와 WO 99/51259에 기재된 것들이 포함되지만 이에 한정되지는 않으며, 꽃가루, 곤충독, 동물비듬, 진균포자 및 약물(페니실린 등)이 포함된다. 그러한 성분은 알러지반응의 공지된 원인인 IgE 항체의 생성을 방해한다.

아밀로이드 펩타이드 단백질(APP)은 알츠하이머병, 아밀로이드증 또는 아밀로이드생성질환과 같은 다양한 병에 관련되어 있다. β-아밀로이드 펩타이드(이하, Aβ 펩타이드라 함)는 APP의 42아미노산 단편이고, 이는 β와 γ 세크라타제 효소에 의해 APP를 가공하여 생성되며, 하기 서열을 가진다:

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala (SEQ ID NO:6).

일부 환자에서, 아밀로이드 침전물은 응집된 Aβ 펩타이드 형태로 일어난다. 놀랍게도, 분리된 Aβ 펩타이드를 투여하면 척추동물숙주에서 아밀로이드 침전물의 Aβ 펩타이드성분에 대한 면역반응이 유도된다는 것이 밝혀졌다(WO 99/27944 참조). 그러한 Aβ 펩타이드는 또한 비관련 잔기에 결합되어 있다. 따라서, 본 발명의 이종 뉴클레오타이드 서열은 이러한 Aβ 펩타이드 뿐 아니라 Aβ 의 단편 및 Aβ 펩타이드 또는 이의 단편에 대한 항체의 발현을 포함한다. Aβ 펩타이드의 그러한 단편중 하나는 하기 서열을 가지는 28아미노산 펩타이드이다(미국특허 제4,666,829호에 개시된 바와 같음):

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gle Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys (SEQ ID NO:7)

이종 뉴클레오타이드 서열은 호흡기를 통해 체 내로 들어가서 예를 들면, 수막, 혈액 및 폐와 같은 다양한 조직과 세포를 감염시킬 수 있는, 뉴모코커스 박테이아의 정상적인 감염경로를 이용하도록 선택될 수 있다. 이종 유전자는 특정 세포를 표적화하기 위하여 또는 유전자치료를 위하여 사용되는 작용제를 제공하는데 사용될 수도 있다. 뉴모코커스감염의 정상적인 경로 동안 노출된 정상세포를 단순히 이용하는 대신, 이종 유전자 또는 단편은 재조합 단백질의 일부로 사용될 때 감염의 정상적인 경로에 있지 않는 세포나 조직에 재조합단백질에 영향을 미치는 다른 병원균의 다른 단백질 또는 아미노산서열을 암호화할 수 있다. 이러한 방식으로 상기 단백질은 더 다양한 외부단백질의 전달을 위하여 표적화 도구가 될 수 있다.

단백질의 분자량의 당해 기술분야에서 공지된 임의의 방법을 사용하여 확인할 수 있다. 이러한 방법들의 비제한적인 리스트에는 변성 SDS-PAGE 겔, 크기배제 크로마토그라피 및 등전집중이 포함된다. 각 방법에 적합한 조건(예를 들면 분리시간, 전압, 전류 및 완충액)은 당해 기술분야에서 정의된 방법을 사용하여 필요에 따라 결정할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 변성 SDS-PAGE가 단백질의 분자량을 확인하는데 사용된다. 또한 분자량을 확인하는데 사용되는 조건은 20mA와 일정한 전류에서 1시간의 분리시간이 바람직하다.

단백질의 검출은 당해 기술분야에서의 다양한 방법들을 사용하여 확인할 수 있다. 이들 방법에는 웨스턴 블러팅, 쿠마시블루 염색, 은염색, 방사선사진법, 형광 및 인광탐침이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서 단백질은 웨스턴 블러팅에 의해 검출되었다.

하기 본 발명의 실시형태를 설명하는데 있어서 "뉴모 보호 단백질" 또는 "PPP1" 또는 "PPP"라는 용어는 달리 명기되지 않으면 야생형 PPP1의 대체물 또는 이에 대한 부가물로서 이의 단편, 변형체 및 감쇄된 형태를 사용하는 실시형태들을 포함한다.

바이러스 및 비바이러스 벡터

시험관 내 및 생체 내 세포적 분석에 특히 바람직한 벡터는 렌티바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스 바이러서, 아데노바이러스, 아데노위성 바이러스, 백시니아바이러스, 바쿨로바이러스, 알파바이러스 및 원하는 세포향성을 가진 다른 재조합 바이러스와 같은 바이러스 벡터이다. 따라서, 기능적 또는 돌연변이 단백질 또는 이의 폴리펩타이드 도메인 단편을 암호화하는 유전자는 DNA의 직접도입을 통해 또는 바이러스 벡터를 사용하여 생체 내, 생체 외 또는 시험관 내에서 도입될 수 있다. 표적화된 조직에서의 발현은 수용체 리간드 또는 바이러스 벡터와 같은 특정 세포에 대해 유전자변환 벡터를 표적화함으로써, 또는 조직 특이적 프로모터를 사용함으로써, 또는 양자에 의해 유효화될 수 있다. 표적화된 유전자 전달은 PCT 공개 WO 95/28494에 기재되어 있다.

생체 내 또는 생체 외 표적화 및 치료절차에서 흔히 사용되는 바이러스 벡터는 DNA-계 벡터와 레트로바이러스 벡터이다. 바이러스벡터를 구성하고 사용하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다(예를 들면, Miller and Rosman, BioTechniques, 1992, 7:980-990). 바람직하게는 바이러스 벡터는 복제결함, 즉 이들은 표적 세포에서 자동적으로 복제할 수 없다. 바람직하게는 복제결함 바이러스는 최소바이러스, 즉 바이러스입자를 생성하기 위해 게놈을 캡슐화하는데 필요한 이의 게놈 서열만을 보유한다.

알파바이러스의 예로는 이스턴 에퀸 엔세팔리디스 바이러스(EEE), 베네줄란 에퀸 엔세팔리티스 바이러스(VEE), 에버글레이즈 바이러스, 뮤캄보 바이러스, 픽수나 바이러스, 웨스턴 에퀸 엔세팔리디스 바이러스(WEE), 신드비스 바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스, 미들버그 바이러스, 치쿤궁야 바이러스, 오뇽-뇽 바이러스, 로스 리버 바이러스, 바마흐 포레스트 바이러스, 제타 바이러스, 사기야마 바이러스, 베바루 바이러스, 마야로 바이러스, 유나 바이러스, 아우라 바이러스, 화타로아 바이러스, 바반키 바이러스, 키질라가치 바이러스, 하이랜드 J 바이러스, 포트 모건 바이러스, 엔두무 바이러스 및 버기 크릭 바이러스(미국특허 제6,156,558호)가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.

DNA 바이러스 벡터에는 이에 제한되지는 않으나 단순포진 바이러스(HSV), 파필로마바이러스, 엡스테인 바 바이러스(EBV), 아데노바이러스, 아데노위성 바이러스(AAV) 등과 같은 감쇄된 또는 결함 DNA 바이러스가 포함된다. 결함바이러스는 세포 내에 도입된 후에는 감염성이 아니다. 결함 바이러스 벡터를 사용하면 벡터가 다른 세포를 감염시킬 수 있다는 걱정없이 특정 국부화된 영역 내에 세포를 투여할 수 있다. 따라서 특정 조직이 특이적으로 표적화될 수 있다. 특정 벡터의 예로는 결함 헤르페스 바이러스 1(HSV1) 벡터(Kaplitt et al., Molec. Cell. Neurosci., 1991, 2:320-330), 당단백질 L 유전자가 결여된 결함 헤르페스 바이러스 벡터, 또는 다른 결함 헤르페스 바이러스 벡터(PCT 공개 WO 94/21807 및 WO 92/05263); 문헌(Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest., 1992, 90:626-630, 또한 La Salle et al, Science, 1993, 259-988-990도 참조)에 기재된 벡터와 같은 감쇄된 아데노바이러스 벡터; 및 결함 아데노위성 바이러스 벡터(Samulski et al., J. Virol., 1987, 61:3096-3101; Samulski et al., J. Virol., 1989, 63:3822-3828; Lebkowski et al., Mol. Cell. Biol., 1988, 8:3988-3996)가 포함되나 이에 제한되지 않는다.

바이러스 벡터를 상업적으로 생산하는 다양한 회사들에는 Avigen Inc. (Alameda, CA; AAV 벡터), Cell Genesys (Foster City, CA; 레트로바이러스, 아데노바이러스, AAV 벡터 및 렌티바이러스 벡터), Clontech (레트로바이러스 및 바쿨로바이러스 벡터), Genovo, Inc. (Sharon Hiil, PA; 아데노바이러스 및 AAV 벡터), Genvec (아데노바이러스 벡터), IntroGene (Leiden, Netherlands; 아데노바이러스 벡터), Molecular Medicine (레트로바이러스, 아데노바이러스, AAV 및 헤르페스 바이러스 벡터), Norgen (아데노바이러스 벡터), OxfordBioMedica(Oxford, United Kingdom; 렌티바이러스 벡터), 및 Transgene (Strasbourg, France; 아데노바이러스, 백시니아, 레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터)이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.

아데노바이러스 벡터 . 아데노바이러스는 다양한 세포타입에 본 발명의 핵산을 효율적으로 전달할 수 있도록 변형될 수 있는 진핵 DNA 바이러스이다. 이들 혈청형 중에, 본 발명의 범위 내에서, 타입 2 또는 타입 5 인간 아데노바이러스(Ad2 또는 Ad5) 또는 동물유래의 아데노바이러스(PCT 공개 WO 94/26914 참조)를 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 범위 내에서 사용될 수 있는 동물유래의 이들 아데노바이러스에는 개, 소, 쥐(예: (Mavl, Beard et al., Virology, 1990, 75-81), 양, 돼지, 조류 및 유인원(예:SAV) 유래의 아데노바이러스들이 포함된다. 바람직하게는 동물유래의 아데노바이러스는 개의 아데노바이러스, 보다 바람직하게는 CAV2 아데노바이러스(예를 들면, Manhattan 또는 A26/61 균주, 예를 들면, ATCC VR-800)이다. 다양한 복제결함 아데노바이러스와 최소 아데노바이러스 벡터는 기술되어 있다(PCT 공개 WO 94/26194, WO 95/02697, WO 94/28938, WO 94/28152, WO 94/12649, WO 95/02697, WO 96/22378). 본 발명에 따른 복제결함 재조합 아데노바이러스는 당업자에게 공지된 임의의 절차에 의해 제조될 수 있다(Levrero et al., Gene, 1991, 101:195; 유럽공개 EP 185 573, EMBO J., 1984, 3:2917; Graham et al., J. Gen. Virol., 1977, 36:59). 재조합 아데노바이러스는 당업자에게 공지된 표준 분자생물학 기술을 사용하여 회수 및 정제된다.

아데노위성바이러스 . 아데노위성바이러스(AAV)는 이들이 감염시키는 세포의 게놈 속으로 안정하고 위치특이적인 방식으로 통합될 수 있는 비교적 작은 크기의 DNA 바이러스이다. 이들은 세포성장, 형태 또는 분화에 어떤 효과도 유도하지 않고 광역 스펙트럼의 세포 속으로 감염될 수 있고, 인간 병리학에 관련되는 것으로 보이지 않는다. AAV 게놈은 클로닝, 서열확인 및 특성화되었다. 유전자를 시험관 내 및 생체 내 전이시키기 위해 AAV 유래 벡터를 사용하는 것이 기술되어 있다(PCT 공개 WO 91/18088와 WO 93/09239; 미국특허 제4,797,368호와 제5,139,941호; 유럽공개 EP 488 528). 본 발명에 따른 복제결함 재조합 AVV는 두개의 AAV ITR(invertedterminal repeat) 옆에 있는 관심있는 핵산서열을 포함하는 플라스미드와, AAV 캡슐화 유전자(rep 및 cap 유전자)를 가진 플라스미드를 인간 헬퍼 바이러스(예를 들면, 아데노바이러스)로 감염된 세포주 속에 공동트랜스펙션시켜 제조할 수 있다. 그리고나서 생산되는 AAV 재조합체를 표준기술로 정제한다.

레트로바이러스 벡터 . 다른 실시형태에서, 유전자를 문헌(미국특허 제5,399,346호; Mann et al., Cell, 1983, 33:153; 미국특허 제4,650,764호 및 제4,980,289호; Markowitz et al., J. Virol., 1988, 62:1120; 미국특허 제5,124,263호; 유럽공개 EP 453 242 및 EP 178 220; Bernstein et al., Genet. Eng., 1985, 7:235; McCormick, BioTechnology, 1985, 3:689; PCT 공개 WO 95/07358; 및 Kuo et al., Blood, 1993, 82:845)에 기재된 바와 같은 레트로바이러스 내에 도입할 수 있다. 레트로바이러스는 분열하는 세포를 감염시킬 수 있는 통합형 바이러스이다. 레트로바이러스 게놈에는 두개의 LTRs, 캡슐화서열 및 3개의 코딩영역(gag, pol 및 env)을 포함한다. 재조합 레트로바이러스 벡터에서, gag, pol 및 env 유전자는 일반적으로 전체 또는 일부 결실되어 관심있는 이종 핵산서열로 대체된다. 이들 벡터는 HIV, MoMuLV("murine Moloney leukemia virus"), MSV("murine Moloney sarcoma virus"), HaSV("Harvey sarcoma virus"), SNV("spleen necrosis virus"), RSV('Rous sarcoma virus") 및 프렌드 바이러스와 같은 다른 형태의 레트로바이러스로부터 구성될 수 있다. 적합한 패키징 세포주는 종래 기술에 기재되어 있고, 특히 세포주 PA317 (미국특허 제4,861,719호); PsiCRIP 세포주(PCT 공개 WO 90/02806) 및 GP+envAm-12 세포주(PCT 공개 WO89/07150). 또한 재조합 레트로바이러스 벡터는 gag 유전자의 일부를 포함할 수 있는 긴 캡슐화 서열뿐 아니라 전사활성을 억제하는 LTRs 내의 변형을 포함할 수 있다(Bender et al., J. Virol., 1987, 61:1639). 재조합 레트로바이러스 벡터는 당업자에게 공지된 표준기술로 정제된다.

레트로바이러스는 감염성 입자로서 기능하거나 한차례의 트랜스펙션을 할 수 있도록 구성될 수 있다. 전자의 경우, 바이러스는 발암 형질전환특성에 관련된 유전자를 제외한 이의 유전자 모두를 보유하고, 이종 유전자를 발현하도록 변형된다. 비감염성 바이러스 벡터는 바이러스 패키징 신호를 파괴하지만 이종 유전자와 패키징 신호를 포함하도록 유전자조작된 공동도입되는 바이러스를 패키지하는데 필요한 구조적 유전자를 포함하도록 조작된다. 따라서 생산되는 바이러스 입자는 추가 바이러스를 생산할 수 없다.

레트로바이러스 벡터는 DNA 바이러스에 의해 도입될 수 있는데, 이는 레트로바이러스 복제의 한 주기를 허용하고 트랜스펙션 효율을 증폭시킨다(PCT 공개 WO 95/22617, WO 95/26411, WO 96/39036 및 WO 97/19182 참조).

렌티바이러스 벡터 . 다른 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는 뇌, 망막, 근육, 간 및 혈액을 포함하는 여러가지 조직 형태에서 형질전환 유전자의 직접 전달 및 지속발현에 대한 작용제로서 사용될 수 있다. 벡터들은 이들 조직 내의 분열 및 비분열세포에 효과적으로 형질도입하고 관심있는 유전자의 장기간 발현을 유지할 수 있다(Naldini, Curr. Opin. Biotechnol., 1998, 9:457-63; Zuffery et al., J. Virol., 1998, 72:9873-80 참조). 렌티바이러스 패키징 세포주는 당해 기술분야에서 일반적으로 공지되어 있고 이용할 수 있다. 이들은 유전자치료를 위한 고역가 렌티바이러스 벡터의 생산을 촉진한다. 한 예는 적어도 3 내지 4일동안 106 IU/ml 이상의 역가에서 바이러스입자를 생성할 수 있는 테트라사이클린-유도가능 VSV-G 위형 렌티바이러스 패키징 세포주이다(Kafri et al., J. Virol., 1999, 73:576-584). 유도가능 세포주에 의해 생성된 벡터는 시험관 내 및 생체 내에서 비분열세포를 효율적으로 형질전환시키기 위해 필요에 따라 농축될 수 있다.

비바이러스 벡터 . 다른 실시형태에서, 벡터는 노출 DNA와 같이 리포펙션에 의해 또는 다른 트랜스펙션 촉진제(펩타이드, 폴리머 등)와 함께 생체 내에 도입될 수 있다. 합성 양이온성 지질은 마커를 암호화하는 유전자의 생체 내 트랜스펙션을 위한 리포좀을 제조하는데 사용될 수 있다(Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1987, 84:7413-7417; Felgner and Ringold, Science, 1989, 337:387-388; Mackey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, 85:8027-8031; Ulmer et al., Science, 1993, 259:1745-1748). 핵산의 전이에 유용한 지질화합물과 조성물은 PCT 특허공개 WO 95/18863과 WO 96/17823, 및 미국특허 제5,459,127호에 기재되어 있다. 지질은 표적화를 위하여 다른 분자에 화학적으로 결합될 수 있다(상기 Mackey et al. 참조). 호르몬이나 신경전달물질과 같은 표적화된 펩타이드, 항체와 같은 단백질 또는 비펩타이드분자는 리포좀에 화학적으로 결합될 수 있다.

양이온성 올리고펩타이드(예를 들면, PCT 특허공개 WO 95/21931), DNA 결합단백질 유래 펩타이드(예를 들면, PCT 특허공개 WO 96/25508) 또는 양이온성 폴리머(예를 들면, PCT 특허공개 WO 95/21931)와 같은 다른 분자도 생체 내 핵산의 트랜스펙션을 촉진시키는데 유용하다.

노출 DNA 플라스미드로서 생체 내 벡터를 도입할 수도 있다. 유전자치료용 노출 DNA 벡터는 일렉트로포레이션, 미세주입, 세포융합, DEAE 덱스트란, 인산칼슘 침전, 유전자 건의 사용 또는 DNA 벡터 운반체와 같이 당해 기술분야에서 공지인 방법들에 의해 원하는 숙주세포 내로 도입할 수 있다(예를 들면, Wu et al., J. Biol. Chem., 1992, 267:963-967; Wu and Wu, J. Biol. Chem., 1988, 263:14621-14624; 캐나다특허출원 제2,012,311호; Williams et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88:2726-2730). 수용체DNA 전달방법도 사용될 수 있다(Curiel et al., Hum. Gene Ther., 1992, 3:147-154; Wu and Wu, J. Biol. Chem., 1987, 262:4429-4432). 미국특허 제5,580,859호와 제5,589,466호는 포유동물에서 트랜스펙션 촉진제없이 외인성 DNA 서열을 전달하는 것을 개시하고 있다. 최근, 전기전이(electrotransfer)라 불리는 비교적 저전압 고효율 생체 내 DNA 전이기술이 기재되어 있다(Mir et al., C.P.Acad. Sci., 1988, 321:893; PCT 공개 WO 99/01157; WO 99/01158; WO 99/01175).

분석시스템

PPP1이 철에 결합하는 것을 조절하는 면역원성 조성물과 화합물의 기능적 활성을 평가할 수 있는 임의의 세포분석시스템을 본 발명에 의해 생각할 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 분석법은 본 명세서에서 기재된 PPP1이 철에 결합하는 것을 감소시키기 위하여 PPP1과 상호작용하는 화합물들을 확인하는데 사용될 수 있다. 이것은 본 명세서에 기재된 단백질과의 상호작용에 대한 시험화합물의 효과를 평가함으로써 평가할 수 있다. 화합물이 슈도모나스 뉴모니에에 대한 옵소닌식균항체를 이끌어내는 능력을 평가하는 세포분석시스템도 사용될 수 있다(Gray, B.M. 1990. Conjugate Vaccines Supplement p694-697).

PPP와 철의 결합을 측정하는 임의의 통상적인 방법도 본 발명에서 생각할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 슈도모나스 뉴모니에의 단백질성분은 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분리되어 고체지지체로 전이될 수 있다. 이어서 지지체를 표지된 상호작용성분(예를 들면 철)으로 탐침할 수 있다. 상기 성분은 방사능, 효소계, 염료분자 또는 형광 또는 인광 태그를 포함하지만 이에 제한되지 않는 당해 기술분야에서 공지된 임의의 표지로 표지될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 상기 표지는 방사능이다. 표지는 당해 기술분야에서 공지된 임의의 수단으로 검출할 수 있다. 예를 들면, 방사선사진, 섬광계수기, 또는 자외선광. 바람직한 실시형태에서 방사선표지는 방사선사진으로 검출된다. 바이오틴과 아비딘을 이용하는 것과 같은 탐침의 신호를 증폭시키는 분석법과 ELISA 분석법과 같은 효소표지 면역분석법도 공지되어 있다.

시험관 내 스크리닝방법

당해 기술분야에서 공지된 방법들로 제조된 후보작용제를 분석시스템에 첨가하고 철과 PPP1의 결합수준을 측정한다. 다양한 시험관 내 시스템을 철결합에 대한 화합물의 효과를 분석하는데 사용할 수 있다. 바람직하게는, 각 실험은 화합물의 많은 다른 희석농도에서 1회 이상, 예를 들면 3회 행한다.

본 발명의 스크리닝 시스템은 결합저해제를 검출할 수 있다. 저해제 스크린은 이들 단백질의 상호작용을 조절하는 화합물과 접촉될 때 철과 PPP1의 상호작용을 검출하는 것을 포함한다. 철과 PPP1의 결합이 감소하는 것으로 검출된다면, 그 화합물은 후보 저해제이다. 어떠한 감소도 관찰되지 않는다면, 그 화합물은 본 발명의 단백질과 철의 결합을 변경시키지 않는다.

면역원성 조성물

본 발명의 다른 실시형태에서 PPP1은 (i) 하나 이상의 PPP; (ii) 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 완충액, 희석제, 또는 담체; 및 (iii) 선택적으로 하나 이상의 보조제를 포함하는 면역원성 조성물에서 사용된다. PPP1은 당해 기술분야에서 공지된 방법들에 따라 박테리아 표본으로부터 재조합적으로 생산 또는 분리될 수 있다. 바람직하게는, 이들 화합물은 뉴모코커스 감염을 예방, 보호 및/또는 경감시키는데 면역원성 조성물로서 치료적 및 예방적 적용할 수 있다. 그러한 적용은 하나 이상의 PPP1의 면역학적으로 유효한 양을 정상적인 뉴모코커스 감염 과정에서 감소, 바람직하게는 실질적인 감소를 일으키는 양으로 사용된다. 단백질은 감쇄될 수 있다. "감쇄된"이라는 용어는 하나 이상의 다른 기능적 특성은 감소 또는 결실되면서 이의 면역원성 활성을 유지하는 단백질을 말한다. 예를 들면, 이 단백질의 감쇄된 형태는 철에 결합하는 능력과 같이 감소된 결합특성을 나타낼 수 있다. 선택적으로 감쇄된 형태는 슈도모나스 뉴모니에가 철에 결합하는 능력을 감소시킬 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "유효한 양"이라는 용어는 면역반응을 자극하기 위한, 즉, 환자에게 도입되었을 때 세포-매개 반응 및 항체생산을 일으키는 본 명세서에서 기재된 면역원성분(즉, PPP1)의 양을 말한다. 바람직한 실시형태에서, 유효한 양은 슈도모나스 뉴모니에의 콜로니형성을 감소시킬 것이다. "면역원 성분"이라는 용어는 본 발명에 따른 면역원성 조성물로서 전신에 투여될 때 예를 들면, 비인강과 같은 국부적 영역에서 분비성 항체 및/또는 세포매개 반응 생산을 자극하는 이 성분의 능력을 말한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "보조제"라는 용어는 면역원성 조성물과 함께 투여될 때 환자에서 면역반응을 강화 또는 자극하는 작용제, 화합물 등을 말한다. 따라서, 당해 기술분야에서 공지된 임의의 통상적인 방법으로 측정된 바와 같이 면역원성 조성물 조합에 의해 일어난 면역반응은 면역원성 조성물 단독으로 자극되는 것보다 일반적으로 더 클 것이다.

본 발명의 조성물은 수산화알루미늄; 인산알루미늄; Stimulon™ QS-21 (Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Framingham, MA); MPL™ (3-O-deacylated monophosphoryl lipid A; Corixa, Seattle, Washington); RC529(Corixa) 및 PCT 공개 WO 98/50399(RIBI Immunochem Research)에 기재된 바와 같은 아미노알킬 글루코사민 포스페이트 화합물; IL-12(Genetics Institute, Cambridge, MA); N-아세틸-뮤라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민(thr-MDP); N-아세틸-노르-뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타민(CGP 11637, nor-MDP라 함); N-아세틸뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1'-2'-디팔미토일-sn-글리세로-3-하이드록시포스포릴옥시)-에틸아민(CGP 19835A, MTP-PE라 함); 과립구-마크로파지 콜로니자극인자(GM-CSF) 및 콜레라 톡신이 포함되지만 이에 제한되지 않는 보조제를 포함할 수 있다. 사용될 수 있는다른 보조제는 콜레라톡신의 B 서브유닛을 포함하는, 콜레라톡신의 비독성 유도체(예를 들면, 아미노산 위치 29의 글루탐산이 다른 아미노산, WO 00/18434에 따르면 히스티딘으로 대체된다), 및/또는 콜레라톡신 또는 이의 B 서브유닛, 프로콜레라지노이드, 진균 다당류와 비-PPP 폴리펩타이드의 유전적으로 조작된 융합체 또는 접합체이다. 상기 보조제는 이의 천연형태로 사용될 수 있거나 보조제의 합성 또는 반합성 형태를 사용할 수도 있다. 보조제의 조성은 원하는 반응 및 투여방법에 따라 사용될 수 있다. 예를 들면, 액체, 파우더 또는 에멀젼과 같은 다양한 형태의 보조제가 사용될 수 있다.

면역원성 조성물은 정해진 시간동안(예를 들면, 1년) "일련"의 투여로서 또는 하나의 환약 투여로서 투여될 수 있다. 다음 해에 주어질 때, 그러한 일련의 투여는 "추가자극 투여"라 한다. 이들 투여는 이전 투여에 의해 생산된 항체수준을 증가시킨다. 면역원으로부터 면역성검사에 따라 면역반응을 유도하기에 충분한 항체수준이 환자에게서 확인될 때까지 면역원성 화합물을 투여할 수 있다.

그러한 면역원성 조성물의 조성은 당업자에게 공지되어 있다. 본 발명의 면역원성 조성물은 추가항원성분(예를 들면, 폴리펩타이드 또는 이의 단편 또는 항원을 암호화하는 핵산 또는 이의 단편)을 포함할 수 있고, 바람직하게는 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제에는 임의의 모든 통상적인 용매, 현탁매질, 충전제, 고체 담체, 수용액, 코팅, 항박테리아 및 항진균제, 등장 및 흡수지연제 등이 포함된다. "약제학적으로 허용가능한 담체"라는 용어는 이것이 투여되는 환자에서 알러지반응이나 다른불리한 효과를 일으키지 않는 담체를 말한다. 적합한 약제학적으로 허용가능한 담체에는 예를 들면, 물, 염수, 인산완충염수, 덱스트로즈, 글리세롤, 에탄올 등 뿐 아니라 이의 조합물 중 하나 이상이 포함된다. 약제학적으로 허용가능한 담체는 습윤제 또는 에멀젼화제, 방부제 또는 완충액과 같은 소량의 보조물질을 더 포함할 수 있는데 이는 항원의 저장시간과 유효성을 증진시킨다. 약제학적 활성물질로 그러한 매질이나 작용제를 사용하는 것은 당해 기술분야에서 공지되어 있다. 통상적인 매질이나 작용제가 활성성분과 양립할 수 없는 것이 아닌 한 본 발명의 면역원성 조성물이 사용할 수 있다.

조성물

본 발명의 다른 실시형태에서, PPP1 핵산서열, 아미노산서열, 발현벡터 및 숙주세포는 (i) 하나 이상의 PPP1 단백질 또는 PPP1의 아미노산서열을 암호화하는 핵산 또는 그러한 핵산을 발현하는 발현벡터 또는 숙주세포 및 (ii) 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 완충액, 희석제 또는 담체를 포함하는 조성물에 사용될 수 있다. PPP1은 당해 기술분야에서 공지된 방법에 따라 박테리아 표본으로부터 재조합적으로 생산 또는 분리될 수 있다. 바람직하게는, 이들 조성물은 치료 및 예방적으로 적용할 수 있다. 그러한 적용에서, 약제학적으로 유효한 양의 하나 이상의 PPP1이 정해진 기능적 활성을 생산하기 위한 양으로 사용된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "유효한 양"이란 용어는 기능적 효과를 나타내기 위한, 본 명세서에 기재된 PPP1 단백질의 양을 말한다.

그러한 조성물 또는 면역원성 조성물의 투여는 비강 내, 비경구, 경구 또는에어로졸 스프레이에 의하는 것과 같이 비강 내, 경구, 눈, 폐, 질, 또는 직장표면과 같은 점액질 표면에 국부투여되는 것과 같은 통상적인 유효한 형태에 의해 이루어질 수 있다.

경구제제에는 만니톨, 락토오즈, 스타치, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 셀룰로오즈, 탄산마그네슘 등의 약제학적 등급과 같은 그러한 일반적으로 사용되는 부형제가 포함된다.

본 발명의 폴리뉴클레오타이드와 폴리펩타이드는 면역원성 조성물 내에 단독 활성 면역원으로서 투여될 수 있다. 그러나, 선택적으로, 면역원성 조성물은 다른 병원균종의 다른 면역학적으로 활성인 항원을 포함하는, 다른 활성 면역원을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 다른 면역학적으로 활성인 항원을 제공하는 병원균 종은 예를 들면, 박테리아 감염에 관련되는 박테리아 병원균이다. 또한 본 발명의 PPP 항원을 치료적으로 사용하는 슈도모나스 뉴모니에 또는 다른 병원성 박테리아로부터의 다른 박테리아 항원을 포함하는 다가 백신의 성분으로 있을 것이다. 다른 면역학적으로 활성인 항원은 복제성 작용제 또는 비복제성 작용제일 수 있다. 복제성 작용제에는 예를 들면, 홍역바이러스, 풍진바이러스, 수두-대상포진 바이러스(VZV), 파라인플루엔자 바이러스(PIV) 및 호흡장애바이러스(RSV)가 포함된다.

본 발명의 중요한 면 중 하나는 본 발명의 면역원성 조성물을 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는 포유동물에서 면역반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 면역원성 조성물은 그러한 조성물 내에 포함된 면역학적으로 유효한 양의 폴리펩타이드가 뉴모코커스 감염에 대항한 원하는 반응을 일으키도록 치료된 동물 또는 인간에서 면역원성인 조성물이다. 바람직한 실시형태는, 인간에게 면역학적으로 유효한 양의 면역원성 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 인간에서의 뉴모코커스 감염을 경감 또는 예방하는 것을 포함하는 치료방법에 관한 것이다. 투여량은 개인의 특정 조건에 따라 변할 수 있다. 이 양은 당업자에게 공지된 수단에 의해 통상적인 시험으로 확인될 수 있다.

본 발명의 단백질에 대한 분리된 아미노산서열은 서브유닛 면역원성 조성물을 형성하는데 사용될 수 있다. 이들은 또한 항-PPP1 단백질-반응성 항체의 검출을 위한 면역분석법에서 및 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 야기하기 위한 항원으로 사용될 수 있다. 본 발명에 포함되는 면역분석법은 본 명세서에 참조병합된 미국특허 제4,367,110호(이중 모노클로날 항체 샌드위치 분석법) 및 미국특허 제4,452,901호(웨스턴블럿)에 기재된 것을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 다른 분석법에는 시험관 내 및 생체 내 모두에서의 표지된 리간드의 면역침전 및 면역세포화학이 포함된다.

면역반응을 유도하는 방법

본 발명에 따르면, 슈도모나스 뉴모니에의 콜로니형성은 PPP1 단백질을 포함한다. 본 발명은 환자에서 면역반응을 유도하는 면역원성 조성물의 치료적으로 유효한 양을 환자에게 투여함으로써 뉴모코커스 감염을 예방하는 방법을 제공한다. 이들 방법에는 하나 이상의 PPP1 단백질, 변형체, 단편 또는 이의 감쇄된 형태, 또는 단백질 변형체, 단편 또는 이의 감쇄된 형태를 암호화하는 하나 이상의 발현벡터를 포함하는 면역원성 조성물의 투여를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.

뉴모코커스 감염을 저해하는 방법

본 발명은 PPP1 단백질과 관련된 기능적 효과를 차단하는 조성물 또는 화합물의 치료적으로 유효한 양을 환자에게 투여함으로써 뉴모코커스 박테리아에 감염된 환자에서 면역반응을 유도하는 방법을 제공한다. 이들 방법은 하나 이상의 PPP1 단백질 또는 이의 단편 또는 PPP1 단백질을 암호화하는 하나 이상의 발현벡터를 투여하거나 또는 PPP1 단백질의 기능을 실질적으로 모두 또는 적어도 일부 차단하는 화합물을 투여하는 것이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.

진단방법

본 발명은 또한 SEQ ID NO: 5 또는 10-19 중 어느 것의 아미노산서열이 시료 내에 존재하는지를 확인하는 단계를 포함하는, 뉴모코커스 김염을 진단하거나, 투여된 뉴모코커스 면역원성 조성물 균주를 확인하는 방법을 제공한다. 통상적인 진단방법이 사용될 수 있다. 이들 진단방법은 쉽게 아미노산서열 또는 폴리펩타이드의 존재에 기초할 수 있다. 바람직하게는, 그러한 진단방법은 본 발명에 통상적인 10 이상, 바람직하게는 20 이상의 아미노산을 가지는 폴리펩타이드와 대등하다.

본 명세서에 개시된 핵산서열은 다양한 진단적 적용에 사용될 수 있다. 이들 핵산서열은 PPP1 단백질을 암호화하는 핵산서열에 특이적으로 하이브리디제이션하는 능력을 가지는 비교적 짧은 DNA 및 RNA 서열을 제조하는데 사용될 수 있다. 핵산 탐침은 진단분석의 특이성의 선택적 파라미터의 관점에서 바람직한 길이로 선택된다. 탐침은 주어진 시료에서, 병원성 유기체의 존재를 검출하기 위한 진단분석법에서, 또는 투여된 뉴모코커스 면역원성 조성물을 확인하는데 사용될 수 있다. 재조합 발현을 현재의 진보적인 기술을 사용하여, 핵산서열을 진단 또는 치료적 제제를 생성하는 능력에 대해 또는 기존 항체와의 반응성에 대해 대응하는 올리고펩타이드 및 폴리펩타이드를 스크리닝하기 위하여 발현 구조체 내에 삽입할 수 있다. 적합한 발현조절 서열과 숙주세포/클로닝 비히클 조합은 당해 기술분야에 공지되어 있고 문헌(예를 들면, Sambrook et al.(1989))에 기재되어 있다.

바람직한 실시형태에서, 하이브리디제이션연구 또는 분석법에 사용되는 핵산서열은 약 10 이상, 바람직하게는 약 15, 및 보다 바람직하게는 약 20뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 스트레치에 상보적인 서열을 포함한다. 문헌(Falkow et al., 미국특허 제4,358,535호)에 기재된 바와 같은 진단분석법을 포함하여, 다양한 공지의 하이브리디제이션 기술과 시스템이 본 발명의 하이브리디제이션 면을 실시하는데 사용될 수 있다. 바람직하게는, PPP1 단백질 상의 핵산서열을 인식하거나 결합하는 서열은 연속적이다.

일반적으로, 본 명세서에 설명된 하이브리디제이션 탐침은 고상을 이용한 실시형태에서뿐 아니라 용액 하이브리디제이션에서의 시약으로서도 유용할 것이라고 생각된다. 고상을 포함하는 실시형태에서, 삼출물, 체액(예를 들면, 중이유출물, 기관지기포 세척액) 또는 심지어 조직과 같은, 의심스러운 임상시료로부터 얻은 시험 DNA(또는 RNA)를 선택된 매트릭스 또는 표면에 흡수시키거나 고정시킨다. 이어서 이러한 고정된 단일가닥 핵산을 원하는 조건 하에서 선택된 탐침을 사용하여 특이적 하이브리디제이션시킨다. 선택된 조건은 필요한 특정 기준에 기초하여 특정환경에 따라 다를 것이다(예를 들면, G+C함량, 표적 핵산의 형태, 핵산의 출처, 하이브리디제이션탐침의 크기 등에 따라). 비특이적으로 결합된 탐침분자를 제거하기 위하여 하이브리디제이션된 표면을 세척한 후, 특이적 하이브리디제이션을 라벨에 의해 검출하거나 정량한다.

본 발명의 PPP1 단백질 또는 이의 변형체를 암호화하는 핵산서열은 예를 들면 미국특허 제4,603,102호에 개시된 바와 같은 PCR^*기술과 함께 유용할 수 있다. 본 발명의 PPP1 단백질 서열 중 어느 것의 다양한 부분을 PPP1 유전자 또는 뉴클레오타이드의 정해진 부분의 증폭을 위한 올리고뉴클레오타이드 탐침으로 이용할 수 있으며, 이 서열은 상보적 서열을 포함하는 하이브리디제이션 탐침을 사용한 하이브리디제이션에 의해 검출될 수 있다. 이러한 방식으로 매우 적은 농도의 PPP1 핵산서열을 본 발명의 뉴클레오타이드서열을 이용하는 시료 중에서 검출할 수 있다.

하기 실시예는 본 발명의 특정 실시형태를 설명하기 위하여 포함된 것이다. 그러나, 본 발명의 개시내용에 비추어, 개시된 특정 실시형태에 많은 변화가 이루어질 수 있고 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않고 유사한 결과를 얻을 수 있다는 것을 당업자는 잘 알 것이다.

항체

본 발명은 시료 중에 존재하는 PPP1 단백질의 존재를 검출하기 위해 사용되는 항체를 설명한다. 또한, 상기 항체(예를 들면, 항-이디오타입 항체)는 뉴모코커스 감염에 대한 면역반응을 억제하는데 사용될 수 있다.

본 발명에 따르면, 재조합적으로 또는 화학합성에 의해 생산된 PPP1 단백질 폴리펩타이드, 또는 단편 또는 다른 유도체들은 폴리펩타이드 또는 이의 일부를 인식하는 항체를 생성하는 면역원으로 사용될 수 있다. 면역원으로 사용되는 폴리펩타이드의 일부는 발현된 항체의 면역원성을 조절하기 위하여 특이적으로 선택될 수 있다. 그러한 항체에는 폴리클로날, 모노클로날, 인간화, 키메라, 단일체인, Fab 단편, 및 Fab 발현 라이브러리가 포함되지만 이에 한정되지는 않는다. 인간 PPP1 단백질에 특이적인 항체는 야생형 또는 돌연변이형태의 PPP1 단백질을 인식할 수 있다. 특정 실시형태에서, 항체는 8개 이상의 아미노산, 바람직하게는 8 내지 10개의 아미노산, 및 보다 특이적으로는 15 내지 30개의 아미노산으로 구성된다. 바람직하게는, 상기 항체는 PPP1 상의 연속적인 아미노산을 인식하거나 이에 결합한다.

당해 기술분야에서 공지된 다양한 절차가 폴리펩타이드, 유도체 또는 유사체에 대한 폴리클로날 항체를 생산하는데 사용될 수 있다. 항체를 생산하기 위하여, 토끼, 래트, 양, 염소 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 숙주동물에 폴리펩타이드 또는 유도체(예를 들면 단편 또는 융합단백질)를 주사하여 면역화시킬 수 있다. 폴리펩타이드 또는 이의 단편은 예를 들면 우형청 알부민(BSA) 또는 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)과 같은 면역원성 담체에 접합도리 수 있다. 프로인트(완전 및 불완전), 수산화알루미늄과 같은 미네랄 겔, 리소레시틴과 같은 계면활성물질, 플루로닉 폴리올, 폴리음이온, 펩타이드, 오일 에멀젼, KLH, 디니트로페놀 및 BCG(bacille Calmette-Guerin)와 같은 잠정적으로 유용한 인간 보조제 및 코린박테리움 파르붐이 포함되지만 이에 한정되지는 않는 다양한 보조제가 면역원성 반응을증진시키는데 사용될 수 있다.

배양액 중의 연속적인 세포주에 의한 항원분자의 생산을 제공하는 임의의 기술에 의해 제조될 수 있는 PPP1 단백질, 단편, 유사체 또는 이의 유도체에 대한 모노클로날 항체가 사용될 수 있다. 이들에는 Kohler와 Milstein이 처음 개발한 하이브리도마기술(Nature 256:495-497, 1975)뿐 아니라 트리오마 기술, 인간 B-세포 하이브리도마기술(Kozbor et al., Immunology Today 4:72, 1983; Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:2026-2030, 1983) 및 인간 모노클로날 항체를 생산하기 위한 EBV-하이브리도마기술(Cole et al., in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96, 1985)이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. "키메라 항체"는 폴리펩타이드에 특이적인 비인간 항체분자의 유전자를 적합한 생물학적 활성을 가진 인간 항체분자의 유전자와 함께 스플라이싱함으로써 생산될 수 있다(Morrison et al., J. Bacteriol. 159:870, 1984; Neuberger et al., Nature 312:604-608, 1984; Takeda et al., Nature 314:452-454, 1985).

항체를 생산하고 사용함에 있어서, 원하는 항체를 스크리닝하거나 시험하는 것은 방사선면역분석, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), "샌드위치" 면역분석, 면역방사선측정분석, 겔확산 침전반응, 면역확산분석, 그 자리 면역분석(콜로이드성 금, 효소 및 방사선동위원소 표지 등을 사용), 웨스턴 블럿, 침전반응, 응집분석(예를 들면, 겔응집분석, 혈구응집분석), 보체고정분석, 면역형광분석, 단백질 A 분석, 및 면역전기영동분석 등과 같은 당해 기술분야에서 공지된 기술로 행할 수 있다.

상기 항체는 웨스턴 블러팅, 그 자리에서 폴리펩타이드를 이미지화하는 것 및 상기 언급되거나 당해 기술분야에서 공지된 검출기술 중 어느 것을 사용하여 적합한 생리학적 시료 중의 그 수준을 측정하기 위하는 것과 같이 폴리펩타이드의 이치와 활성과 관련하여 당해 기술분야에서 공지된 방법에서 사용될 수 있다. 그러한 항체는 미국특허 제5679,582호에 기재된 바와 같은 리간드결합을 위한 분석에서도 사용될 수 있다. 항체결합은 일반적으로 생리학적 조건, 예를 들면 약 7 내지 8의 pH와 생리학적 이온강도 하에서 가장 쉽게 일어난다. 완충용액 중에 담체 단백질이 존재하면 분석이 안정화된다. 예를 들면 이온강도, 온도, 또는 pH를 증가시키거나 감소시키는 것 또는 세제 또는 교란반응염을 첨가하는 것과 같은 최적 조건의 교란에 약간 내성을 가지는 동시에, 그러한 교란은 결합안정성을 감소시킬 것이다.

특정 실시형태에서, PPP1 단백질의 활성에 대항하는 항체가 생성될 수 있다. 특히 , 세포내 단일가닥 Fv 항체가 PPP1 단백질을 조절하는데 사용될 수 있다. 그러한 항체는 리간드를 확인하기 위하여 하기 설명되는 분석법을 사용하여 시험될 수 있다.

다른 특정 실시형태에서, 본 발명의 항체는 항-이디오타입 항체이다. 이들 항체는 시스템 내에 존재하는 다른 항체를 인식하고 및/또는 결합한다. 항-이디오타입 항체는 모노클로날, 폴리클로날, 키메라, 인간화될 수 있다.

다른 특정 실시형태에서, 본 발명의 항체는 소분자, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드와 같은 2차 성분에 접합된다. 접합은 항체의 화학적 변형을 통해 행성될 수 있고, 이는 항체를 2차 성분에 접합시킨다. 접합된 항체는 관심있는 부위에 항생제와 같은 2차 성분을 표적화할 수 있을 것이다. 2차 성분은 임의의 크기나 길이일 수 있다. 특정 실시형태에서, 2차 성분은 약제학적 활성 화합물이다.

본 발명의 다른 면은 약제학적 화합물을 표적화하기 위한 상기 논의된 바와 같은 항체의 사용에 관한 것이다. 이 실시형태에서, PPP1 단백질에 대한 항체는 감염된 부위에 특정 화합물을 제시하는데 사용된다. 상기 화합물, 바람직하게는 항생제는, 항체에 접합되었을 때 표적화된 화합물 또는 표적화된 약제라 불린다. 그러한 표적화합물과 약제를 생성하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 표적화합물 및 이의 제조에 관한 예시적 내용은 미국특허 제5,053,934호; 제5,773,001호 및 제6,015,562호에 개시되어 있다.

재료 및 방법

박테리아균주 및 플라스미드

이 작업에서 이용되는 스트렙토코커스 뉴모니에 균주는 예일대학교(CT)에서 Magaret Hostetter로부터 입수한 스트렙토코커스 뉴모니에 CP1200, R36A의 캡슐화되지 않은 높은 형질전환성 유도체, D39의 미가공 변형체, 독성 타입 2 균주, (Morrison, D.A. et al., J. Bacteriology, 1983, 156:281), 및 ATCC로부터 입수한 스트렙토코커스 뉴모니에 균주 49136이었다. 스트렙토코커스 뉴모니에는 37℃에서 폭기처리하면서 0.5% 효모추출물(Difco)가 첨가된 Todd Hewitt 배지(Difco Lab.,Detroi, MI) 중에서 또는 트립틱 소이(Difco) 혈액 아가플레이트에서 로그상(600nm에서 대략적인 O.D가 0.6-0.8)까지 성장시켰다. 본 연구에 사용된 대장균 균주는 BL21(DE3), BLR(DE3)(Novagen, Madison, wi), Top10F'(Invitrogen, San Diego, CA)였고, 적합한 항생제를 함유하는 SOB배지(15)중에서 37℃에서 폭기처리하면서 성장시켰다. 이 작업에서 사용되는 플라스미드는 PCR2.1 TOPO(Invitrogen) 및 pET28a(Novagen)였다. 명기된 경우에, 클로람페니콜은 20㎍/㎖, 앰피실린은 100㎍/㎖, 스트렙토마이신은 100㎍/㎖, 및 가나마이신은 25㎍/㎖로 사용되었다. 제한효소는 New Englad Biolabs (Beverly, MA)에서 구입하여 제조자 지시에 따라 사용하였다.

스트렙토코커스 뉴모니에의 외막분획 중의 표면결합단백질의 확인

표면결합성분의 추출 - 박테리아를 Todd Hewitt 브로스 4ℓ 중에서 성장시키고 8000xg에서 30분 동안 원심분리하여 수집하였다. 펠렛을 피펫을 사용하여 ~175㎖의 PBS 중에 현탁시키고 즉시 20000xg에서 30분동안 원심분리하였다. 세척물을 0.45m 필터((Nalgene, Rochester, NY)로 여과하고, 투석하고 동결건조시켰였다.

표면결합단백질성분의 이온교환크로마토그래피 - 스트렙토코커스 뉴모니에의 PBS 추출물을 Tris-HCl, pH 7.6(10mM, 100㎖)에 용해시키고 EAE-세파로즈 CL-6B의 칼럼에서 이온교환 크로마토그래피를 하였다. 칼럼을 시료완충액으로 세척한 후, 200mM Tris-HCl, pH 7.6으로 먼저 용리시킨 후 300㎖ 이상 0.75M의 최종 NaCl 농도(200mM Tris-HCl, pH 7.6 중)까지 직선 NaCl 구배하였다. 칼럼분획을 SDS-PAGE겔로 분석하였다. 양 18-20kDa의 실질적인 양의 표면결합단백질을 함유하는 분획을 모으고, Centricon SR3 농축기로 탈염하고 동결건조시켰다.

PVDF 블럿 제거에 의한 N-말단 아미노산서열분석

시료를 1mg/㎖ 총 단백질까지 희석하고 2X Tris-SDS-β-ME 시료 로딩 완충액(0.25M Tris-HCl, pH 6.8, 2% SDS, 10% β-멜캅토에탄올, 30% 글리세롤, 0.01% 브로모페놀 블루)(Owl Separation, Portsmouth, NH)으로 1:1 결합시키고, 100℃에서 5분 동안 가열하였다. 대략 10㎍의 총 단백질(가열된 용액 10㎕) 시료를 12레인, 10cm x 10cm x 1mm, 10-20% 구배 아크릴아미드/비스-아크릴아미드겔(Zaxis, Hudson, OH) 상의 10레인 각각에 로딩하였다. 분자량표지(Novex, San Diego, CA)를 겔의 각 측면의 두개의 가장 바깥쪽 레인에 로딩하였다. 50mA의 일정한 암페어수에서 1시간 동안 Bio-Rad Tris-글리신-SDS 러닝 완충액 중에서 Owl Separation Mini-Gel 장치 상에서 전기영동을 하였다. 그 다음에 겔을 탈이온수로 세정하고 150mA의 일정한 암페어수에서 1시간 동안 Owl Separation 사의 반건조 블러팅시스템을 사용하여 Millipore Immobilon-P PVDF(폴리비닐리덴 플루오라이드)로 옮겼다. 생성된 블럿을 아미도블랙(Amido Black; 탈이온수 중의 10% 아세트산, 0.1% 아미도블랙)으로 염색하고 10% 아세트산 중에서 탈염하였다. 그 다음에 메탄올 세정 메스 또는 미니-Exacto 나이프를 사용하여 모든 10개의 레인에서 단백질 밴드를 잘라서 Applied Biosystems 477A 단백질 서열분석기(Foster City, CA)의 반응카트리지 속에 넣었다. 그 다음에 N-말단 서열분석기를12주기 이상(1주기 블랭크, 1주기 표준, 및 10주기 이상 원하는 잔기확인) 최적 블럿 조건 하에서 가동시켰다. PTH-아미노산검출을 Applied Biosystems 120A PTH 분석기에서 행하였다. 주기들을 장치 소프트웨어를 통해 아날로그 챠트 기록기 및 디지털적으로 모두 모았다. 아날로그와 디지탈 데이터를 표준 세트의 PTH-아미노산과 분석기 상의 이의 각 보유시간(전환되는 동안 시스테인잔기는 파괴되어 검출되지 않는다)을 비교하여 N-말단 아미노산 지정을 하였다.

재조합 20kDa 표면결합단백질의 서브클로닝과 발현

N-말단 서열을 Altschul(Altschul, SF, et al., J. Mol-Biol., 1990, 215:403)이 개발한 BLAST 알고리즘을 사용하여 www.ncbi.nlm.org 상에 위치한 NCBI 비과잉 데이터베이스와 비교하였다. 이것은 N-말단서열이 NCBI 데이터베이스 내의 오픈리딩 프레임(ORF)이 동일성을 가진다는 것을 보여주었다. 이 ORF는 이미 서열확인되었고 미확인 ORF로 기재되어 있다(Pikis, A. et al., J. Infect. Dis., 1998, 178:700). 이어서 The Institute for Genomic Research (TIGR, www.tigr.org)에서 입수할 수 있는 일반공개된 스트렙토코커스 뉴모니에 게놈(혈청형 4)에 대한 미지 ORF의 BLAST 분석을 한 결과 상기 ORF가 게놈 중에 존재하지만 미확인된 것으로 나타났다. DNASTAR(Madison, WI) Lasergene DNA 및 단백질 분석 소프트웨어를 사용하여 스트렙토코커스 뉴모니에 게놈 서열 중의 미지 ORF 의 DNA 분석과 프라이머 디자인을 하였다.

ORF 측면에 위치하는 프라이머를 디자인하였고(SEQ ID No: 1과 2), 이어서ABI380A DNA 합성기를 사용하여 합성하였다. PCR 산물의 pET28a 발현벡터를 서브클로닝하는 것을 촉진하기 위하여, PCR 프라이머 내에 제한효고부위를 디자인하였다. 5' 프라이머 중에 양자가 발현벡터의 NcoI 부위 속으로 결찰시킬 수 있도록 하는 NcoI 부위를 포함시켰고 또한 ATG 개시코돈을 포함시켰다. 올바른 리딩 프레임을 유지하기 위하여, 5'에 2개의 추가 염기를 포함시켜, 류신에 대한 코돈을 추가하였다. 3' 프라이머 내에 Sal1 부위를 포함시켰다.

예상된 크기의 PCR 단편을 CP1200으로부터 생성하고, pCR2.1 벡터 속에 결찰시키고 OneShot Tpo 10F' 세포(Invitrogen)를 형질전화시키는데 사용하였다. 앰피실린 저항성 형질전환체를 알칼리성 용해에 의해 제조된 플라스미드 DNA의 제한효소분해에 의해 스크리닝하였다(Birnboim, H.C. and Duly, J., Nuc. Acid Res., 1978 7:1513). 20kDa 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드를 확인하였다. 판매자가 제공한 Prism 프로토콜에 기초해 Applied Biosystems Prism Dye Terminator 주기-서열확인 코어 키트를 사용하여 클론들로부터 DNA 서열을 얻었다. 대략 1㎍의 주형 DNA와 100ng의 프라이머를 각 주기반응에 사용하였다. 반응을 GeneAmp PCR Systems 2400 유닛에서 반복하였고, Prism 방법을 사용하여 정제하고, ABI 373A DNA 서열분석기(Applied Biosystems)에서 분석하였다.

r20kDa 유전자를 포함하는 삽입체를 NcoI과 Sal1을 이용한 제한효소분해로 잘라내고, 1.5% 아가로즈 겔 상에 분리하였다. DNA 단편을 겔로부터 잘라내고 Biol101 Spin 키드(Vista, CA)로 아가로즈에서 정제하였다. 삽입체를 NcoI과 Sal1으로 분해된 플라스미드벡터 DNA(pET28a)로 결찰시키고, 이어서 Top10F'세포(Invitrogen) 속으로 형질전환시켰다. 가나마이신 저항성 형질전환체를 알칼리성 용해로 제조된 플라스미드 DNA의 제한효소분해로 스크리닝하였다(Birnboim, H.C. and Duly, J., Nuc. Acid Res., 1978 7:1513). 재조합 플라스미드를 이어서 BL21 세포(Novagen) 속으로 형질전화시켜 pLP533을 만들고 30㎍/㎖ 가나마이신이 보충된 SOB 배지에서 성장시켰다. 세포는 0.6의 O.D.₆₀₀까지 성장시킨 후 0.4mM IPTG(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)로 2-4시간 유도하였다. 전세포 용해물을 제조하여 15% SDS-PAGE 겔(Laemmli, U.K., Nature, 1970, 227:680) 상에서 전기영동하여 원하는 재조합 산물의 발현을 확인하였다.

재조합 20kDa 표면결합단백질의 정제

30㎍/㎖ 가나마이신(Sigma, St.Louis, MO)이 보충된 50㎖의 SOB 배지를 함유하는 250㎖ 플라스크를 대장균 pLP533의 동결배양물로부터 긁은 것으로 접종하였다, 배양물은 200rpm에서 대략 16시간 동안 흔들면서 37℃에서 배양하였다. 이어서, SOB + 30㎍/㎖ 가나마이신을 함유하는 2개의 1ℓ 플라스크에 하룻밤 배양한 배양물 20㎖를 접종하고 200rpm에서 흔들면서 37℃에서 배양하였다. 배양물이 OD₆₀₀0.7-0.8의 광학농도에 도달했을 때, IPTG(Gold Biotechnology, St. Louis, MO)를 0.8mM까지 첨가하였다. 배양물을 동일한 온도에서 추가 3시간 동안 흔들면서 배양하였다. 이어서 세포를 7300xg에서 15분동안 원심분리하여 모았다. 세포펠렛을 -20℃에서 동결시킨 후 녹여서 300㎖의 10mM 인산나트륨 pH 6.0(J.T.Baker,Phillipsburg, PA)에 재현탁시켰다. 그 다음에 세포현탁액을 미세유체화기(Microfluidics Corporation, Newton, MA)을 통과시켜 세포를 용해시켰다. 용해물을 16,000xg에서 15분 동안 원심분리하고 생성된 상등액을 200,000xg에서 45분 동안 원심분리하였다. 각 단계에서 상등액과 펠렛을 SDS-PAGE로 분석하였다. 상등액을 10mM 인산나트륨 pH 6.0에서 500㎖까지 희석하였다. 이어서 용액을 1ℓ의 동일 완충액에 대해 100,000 MW 절단막(Millipore, Bedford, MA)으로 투여과하고 2.5배 농축하였다. 보유물 중의 단백질을 10mM 인산나트륨 pH 6.0 중에서 70㎖ 세라믹 하이드록시아파타이트 칼럼(Bio-Rad Laboratories Hercules, CA) 상에 로딩하였다. 이어서 칼럼을 10 칼럼부피(CV)의 로딩완충액으로 세척하였다. 10CV의 108mM 인산나트륨 pH 6.0으로 칼럼을 세척하여 오염단백질을 제거하였다. 단백질을 108mM에서 500mM의 인산나트륨 pH 6.0의 직선구배로 칼럼으로부터 용출시켰다. 피크분획을 10% - 20% SDS-PAGE 겔(Zaxis, Hudson, OH) 상에서 이동시켰다. 단백질을 포함하는 분획을 모아서 -20℃에서 저장하였다. 단백질을 SDS-PAGE에 의해 균질성에 대해 분석하고, 정제하는 동안 단백질의 농도를 Lowry의 방법(Lowry, O.H., et al., S. Biol.Chem., 1951, 198:265)으로 확인하였다. 면역화 전 단백질농도를 Pierce Chemicals에서 입수한 BCA 키트(Northbrook, IL)를 사용하여 확인하고, 제조자지시에 따라 사용하였다. BSA를 단백질표준으로 사용하였다.

웨스턴블럿 분석을 위한 폴리클로날 항혈청

마우스에서 폴리클로날 항혈청을 생성하는데 재조합 단백질을 사용하였다.간단하게 말하면, 10㎍의 r20kDa 단백질에 불완전 프로인트 보조제(IFA)와의 에멀젼(1:1 v/v)을 각 투여량에 대해 보조제로 넣고 6-8주령 스위스 웹스터 마우스에 피하주사하였다. 마우스로부터 0주에 혈액을 채취하고 백신접종하고, 4주에 추가자극한 후 6주에 방혈하였다. 10마리의 마우스에 IFA를 보조제로 가진 r20kDa로 백신접종하였다. 혈청을 모아 추가분석에 사용하였다.

SDS-PAGE 및 웨스턴 블러팅

전세포용해물을 미세원심분리기에서 30초 동안 OD₆₀₀에 기초하여 동수의 뉴모코커스 세포를 원심분리하여 제조하였다. 뉴모코커스 세포 펠렛을 적당한 부피의 로딩완충액에 재현탁하였다. 표시된 경우, 시료를 5분 동안 끓이고 Laemmli의 방법(Laemmli, Nature, 1970; 227:680)을 사용하여 10% SDS-PAGE 겔 상에서 분리하였다. 시료를 Biorad Mini Transblot 세포(Biorad)를 사용하여 나이트로셀룰로오즈(Biorad, Hercules, CA)로 옮기고, 블럿을 5% 무지방우유-PBS(BLOTTO) 중에서 30분 동안 실온에서 차단하였다. 모아진 마우스 항혈청을 BLOTTO 중 1:1000 희석에서 60분 동안 사용한 후 PBS-0.2% Tween80 중에서 25분 세척하였다. 알칼라인 포스파타제에 접합된 염소 항-마우스 IgG+M(Biosource International, Camarillo, CA)을 BLOTTO 중 1:1000 희석에서 결합된 항체를 검출하는데 사용하였다. 블럿을 상기한 바와 같이 세척하고 제조자의 지시에 따라 BioRad의 NBT와 BCIP로 검출하였다.

면역성검사 전 마우스의 비강 내 면역화

6주령, 무병원균, Balb/c 마우스를 Jacson Laboratories(Bar Harbor, Maine)에서 구입하여 표준온도, 습도 및 조명조건 하에서 우리에 수용하였다. 그룹당 10 동물로 BALB/C 마우스를 5㎍의 r20kDa 단백질로 면역화하였다. 0, 2 및 4주에. 각 경우에, 효소적 활성과 독성이 감소된 유전적으로 변형된 콜레라독소인 CT-E29H(Tebbey, P.W., et al., Vaccine, 2000, 18:2723) 0.1㎍과 함께 조성된 5㎍ r20kDa을 10㎕ 부피 중에서 각 마우스의 콧구멍에 서서히 주입하였다. 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)-CT-E29H로 면역화된 마우스를 대조구로 사용하였다. 혈청시료를 최종 면역화 4일 후 모았다.

마우스 비강 내 면역성검사모델

Balb/c 마우스를 1X10⁵CFU의 혈청형 3 스트렙토마이신저항성 스트렙토코커스 뉴모니에로 4주 6일에 면역성검사를 하였다. 뉴모코커스를 100㎍/㎖의 스트렙토마이신을 포함하는 3㎖의 Todd-Hewitt 브로스에 접종하였다. 배양물을 중간로그상가지 37℃에서 성장시킨 후 Todd-Hewitt 브로스로 원하는 농도까지 희석하고 사용할 때까지 얼음 위에서 저장하였다. 각 마우스를 1.2mg의 케타민 HCl(Fort Dodge Laboratory, Ft. Dodge, Iowa)을 복강내 주사하여 마취시켰다. 박테리아현탁액을 마취된 마우스의 콧구멍에 접종하였다(마우스당 10㎕). 투여된 박테리아의 실제 투여량은 플레이트계수로 확인하였다. 면역성검사 4일 후, 마우스를 희생시켜 코를 제거하고 3㎖ 멸균염수에서 조직 균질화기(Ultra-Turax T25, Janke & Kunkel Ika-Labortechnik, Staufen, Germany)로 균질화하였다. 균질액을 염수로 10배 연속 희석하고 스트렙토마이신포함 TSA 플레이트 상에 놓았다. 각 마우스로부터 면역성검사 2일 후 모은 50㎕의 혈액을 동일한 종류의 플레이트에 놓았다. 플레이트를 37℃에서 밤새 배양한 후 콜로니를 계수하였다.

r20kDa 단백질에 대한 ELISA 분석

r20kDa 단백질에 대한 항체역가를 ELISA로 확인하였다. r20kDa(PBS 중의 5㎍/㎖ 스톡의 웰당 100㎕, pH 7.1)을 사용하여 ELISA를 행하여 Nunc-Immuno™ PolySorp 플레이트를 코팅하도록 하였다. 플레이트를 4℃에서 밤새 코팅하였다. 실온에서 1시간 동안 5% 무지방분유를 포함하는 PBS(차단완충액) 200㎕로 차단한 후, 플레이트를 실온에서 1.5시간 동안 차단완충액으로 희석된 시험혈청의 연속희석액으로 배양하였다. 그 다음에 플레이트를 0.1% Tween(PBS-T)를 포함하는 PBS로 5회 세척하고 실온에서 1시간 동안 바이오틴화된 염소 항-마우스 IgG 또는 IgA (PBS 중 1:8000 또는 1:4000; Brookwood Biomedical, Birmingham, AL)로 배양하였다. PBS-T로 5회 추가세척한 후, 실온에서 1시간 동안 플레이트를 스트렙타빈 접합된 서양고추냉이 퍼옥시다제(PBS 중 1:10,000; Zymed Laboratory Inc., San Francisco, CA) 로 배양하였다. 그 다음에 플레이트를 PBS-T로 5회 세척하고, 100㎕의 ABTS 기질(KPL, Gaithersburg, MD)과 함께 20분 동안 배양한 후 100㎕ 정지용액(1% SDS)을 첨가하였다. 흡수도값을 VERSAmax 마이크로플레이트 판독기(Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA)를 사용하여 405nm에서 판독하였다. 시험혈청의 종결점 역가는 OD₄₀₅판독이 0.1인 최고평균희석액의 역수였다. 시험혈청의 평균배경역가를 혈청을 제외한 모든 시약을 가진 웰 상에서 405nm에서 읽은 흡수도값으로 정량하였다.

통계적 방법. Tukey-Kramer 시험(Ludbrook, J., Clin Exp Pharmacol Physiol., 1998, 25:1032)을 이용하여 그룹들 간의 비강 콜로니화를 비교하였다. 결과를 p<0.05에서 유의성이 있는 것으로 보았다.

PPP1의 서열 이종성

PPP1 단백질에 대한 서열 이종성을 조사하기 위하여, 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 10개의 다른 혈청형 사이에서 비교하였다. 게놈 DNA를 스트렙토코커스 뉴모니에의 각 혈청형의 하룻밤 배양물로부터 제조하였다. 4℃에서 15분 동안 1000xg에서 원심분리하여 세포를 모으고 2㎖ TE 완충액에 재현탁시켰다. SDS를 0.3%까지 및 프로테이나제 K(Sigma)를 10㎍/㎖까지 첨가하여 세포를 용해시켰다. 세포를 55℃에서 밤새 배양하였다. 동일부피의 페놀/클로로포름/이소아밀알콜(클로로포름/이소아밀알콜의 24:1 혼합물과 동일부피의 수포화 페놀을 조합하여 제조)을 첨가하여 맑은 용해물로부터 단백질을 추출하였다. 실온에서 10분 동안 7500xg에서 원심분리하여 상을 분리한 후, 수성상을 새로운 튜브로 제거하였다. 절차를 반복한후, DNA를 10.4M NH₄Ac를 20%까지 첨가하고 2.5부피의 에탄올을 첨가하여 수성상으로부터 침전시켰다. 게놈 DNA를 유리막대를 사용하여 감아내고 200㎕ TE 완충액에 재현탁하였다. 판매자가 공급한 Prism 프로토콜에 기초한 Applied Biosystems Prism Dye Terminator 주기-서열확인 코어 키트를 사용하여, PPP1에 대한 유전자를 혈청형 1,3,4,5,6,7,9,14,18,23F, 및 CP1200의 게놈 DNA로부터 서열확인하였다. 대략 1㎍ 주형 DNA와 100ng의 프라이머를 각 주기반응에 사용하였다. 반응을 Gene Amp PCR Systems 2400유닛에서 반복하고, Prism 방법을 사용하여 정제하고, ABI373A DNA 서열분석기(Applied Biosystems)에서 분석하였다. 뉴클레오타이드 서열과 이의 예상된 아미노산서열을 Clustal W 알고리즘을 사용하여, DNAstar로부터 DNA Lasergene 패키지의 Megalign application 내에 정렬시켰다.

생체 내 발현된 PPP1 메시지의 평가

시험관 내 성장된 세포로부터 RNA 제조

다양한 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형을 5% CO₂와 함께 37℃에서 60㎖ THB-0.5%YE에서 로그상(O.D.₅₅₀약 0.3)까지 성장시켰다. 세포를 4℃에서 15분 동안 1000xg에서 원심분리하여 모았다. 상등액을 흡인하고 세포를 100㎕ 10% 데옥시콜레이트(DOC)에 재현탁시켰다. 1100㎕의 RNAZOL B(Tel-Test, Inc)를 첨가하고, 현탁액을 뒤집어 짧게 혼합하였다. 120㎕의 CHCl₃를 첨가하고, 시료를 뒤집어 혼합한 후, 4℃에서 10분 동안 최고속도로 마이크로퓨즈에서 원심분리하였다. 수성층을 제거하고 동일부피의 2-프로판올을 첨가하여 RNA를 침전시켰다. RNA를 4℃에서 >1시간 배양하고 실온에서 10분 동안 최고속도로 마이크로퓨즈에서 원심분리하였다. 상등액을 흡인하고 RNA를 75% 에탄올로 세척하고 5분 동안 재원심분리하였다. 상등액을 흡인하고 RNA를 50-100㎕의 뉴클레아제가 없는 물에 재현탁하였다. 37℃에서 20분 동안 무-RNAse인 DNAse(DNA FREE, Ambion)로 시료를 처리하여 DNA를 RNA에서 제거한 후 DNA FREE 킬레이터를 첨가하여 효소를 불활성화시켰다. 260 및 280nm에서 흡수도를 측정하여 RNA의 순도와 수율을 평가하였다.

생체내 성장된 세포로부터 RNA 제조

로그상 스트렙토코커스 뉴모니에 세포를 상기한 바와 같이 제조하고 0.4% 포도당이 보충된 RPMI 배지(Celltech)에서 106cfu/㎖로 재현탁하였다. 세포현탁액 1㎖를 80,000 MW 절단을 가진 PVDF 투석막(SpectraPor) 내에 밀봉하였다. 2개의 그러한 백을 400g 스프라그 돌리 래트의 복강 내에 임플란트하였다. 백은 래트 내에 22시간 동안 두었다가 래트를 사망시키고 백을 회수하였다. 상기한 바와 같이 복강 내 성장한 세포로부터 RNA를 제조하였다.

생체 내 PPP1에 대한 메시지를 조사하기 위한 RT-PCR

PPP1 유전자에 대한 메시지를 RT-PCR을 사용하여 시험관 내 및 생체 내 성장한 세포로부터 제조된 양 RNA로부터 증폭시켰다. 유전자의 3' 말단에 대응하는 역 PCR 프라이머를 사용하여 하기 반응에서 ds cDNA를 생성하였다. 1㎍ RNA를 0.25μM의 역 프라이머: GGG GTC GAC TAA ACC AGG TGC TTG TCC AAG TTC (SEQ ID NO:8)를 사용하여 75℃에서 3분 동안 배양한 후, 44℃까지 냉각시켰다. 메시지를 제조자의지시에 따라 RETROscript(Ambion) 키트를 사용하여 역전사하였다. 0.25μMDML 상기 역 프라이머와 전방 프라이머: GGG GCC ATG GCT GTRA GAA TTG AAA AAA GAA (SEQ ID NO:9)를 사용하여 2-5㎕의 시료로부터 PPP1 메시지를 증폭하는데 ReddyMix(ABgene)를 제조자의 지시에 따라 사용하였다. 10㎕의 증폭된 산물을 2% 아가로즈 겔 상에서 전기영동하였다.

결과

20kDa 표면결합단백질의 확인- PBS 세척과 이온교환크로마토그래피를 사용하여 스트렙토코커스 뉴모니에의 20kDa 표면결합성분을 확인하였다(도 1). 도 1에서 레인 2-9는 DEAE 칼럼에서 분획 #8-16을 나타낸다. 15와 20kDa 사이에 분명히 주된 단백질 밴드가 있다. 저분자량 밴드는 예비 SDS-PAGE 겔 상에 분해되고 PVDF 막으로 옮겨졌다. PVDF 막은 고결합능을 가져서, 시료회수 및 서열확인 성능을 증가시켜, 아미노말단 잔기를 효율적으로 확인할 수 있도록 한다. 이 단백질의 아미노말단 서열(SEQ ID NO:3)은 스트렙토코커스 뉴모니에 게놈 내의 대응하는 오픈 리딩 프레임(SEQ ID NOs:4와 5)을 확인할 수 있도록 한다. 이 ORF는 다른 유기체에서의 비헴철함유 페리틴 단백질과 유사한 유사성을 나타내어, 스트렙토코커스 뉴모니에에서 유사한 기능을 나타낼 수 있다(Pikis, A., et al., J. Infectious Diseases, 1998, 178:700). 그러나, 스트렙토코커스 뉴모니에 내에서 단백질들의 정확한 기능 및 세포내 위치는 알려지지 않았다. 이 ORF의 서브클로닝 및 발현은 예상된 크기의 재조합 물질을 제공하였다(도 2).

재조합 20kDa 표면결합단백질의 정제. 재조합단백질의 용해도의 도움으로 정제를 하였다. 세포막으로부터 상당한 정제는 순차적 원심분리로 이루어졌다. 또한, 올리고머 형성의 특징은 투여과에 의해 잔존하는 저분자량 오염단백질을 제거하는데 성공적으로 이용되었다. 중성 pH에서 단백질의 예상된 전하는 단백질이 도 5에서 보는 바와 같이, 하이드록시아파타이트 칼럼 상에서 90% 이상의 동종성까지 정제되도록 하였다.

항-r20kDa 표면결합단백질 혈청의 반응성. 재조합 20kDa 표면결합단백질에 대한 폴리클로날 항혈청을 스위스 웹스터 바우스에서 생성하여 균주간 단백질의 항원적 보존성을 평가하였다. r20kDa 단백질에 대한 항혈청을 천연 종들의 비가열 전세포 용해물 중 대략 20, 40 및 80kDa의 단백질들과 반응시키는 반면(도 3), 가열된 시료 중에 보인 주 반응성 종들은 대략 20kDa에 있었다(도시되지 않음). 이 결과는 이 단백질이 4서브유닛 또는 그 이상의 복합체의 일부라는 것을 암시한다.

비강 내 면역성검사. r20kDa 표면결합단백질을 사용한 비강 내 면역화가 혈청 면역반응을 유도할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, Balb/c 마우스에 점액성 보조제로서 CT-E29H(0.1㎍/투여량)를 사용하여 2주 간격으로 5㎍ r20kDa를 3회 투여하였다. 최종 추가자극 면역화 4일 후 모은 면역혈청을 항원특이적 ELISA 분석법으로 시험하였다. 최종 추가자극면역화 4일 후, r20kDa-E29H로 면역화된 마우스에서 강한 항원특이적 IgG와 IgA 항체반응이 생성되었다(표 6). 관련되지 않은 단백질 KLH와 비교할 때, r20kDa 표면결합단백질로 면역화하면 BALB/C 마우스의 비인강에서의 타입 3 스트렙토코커스 뉴모니에의 콜로니화를 상당히 감소시킬 수 있었다(도 4). 결과는 동종 혈청형의 콜로니화를 감소시키는 타입 3 접합체의 능력과 비교할만하다(Henrikson, J, et al. Alcohol Clin Exp Res, 1997, 21:1630).

스트렙토코커스 뉴모니에의 r20kDa 표면결합단백질에 대한 항원특이적 ELISA 역가

그룹	혈청 4주5일IgG	혈청 4주5일IgA
5㎍ r20kDa + 0.1㎍ CT-E29H	79,726	1563
5㎍ 타입-3-접합체 + 0.1㎍ CT-E29H	<50	<50
5㎍ KLH + 0.1㎍ CT-E29H	<50	<50
주: 종결점역가는 5BALB/c 마우스의 풀로부터 확인하였다.

10 혈청형으로부터 PPP1 단백질의 서열정렬.도 6에 도시된 바와 같이, PPP1의 서열을 혈청형간 크게 보존되어 있다. 알 수 있는 바와 같이, 혈청형 9는 가장 일탈한 혈청형이다. 이 혈청형으로부터 분리된 PPP1은 대다수로부터 15개 아미노산 차이를 나타내었다. 나머지 혈청형은 5개 이하의 아미노산 차이를 나타내었다. PPP1의 총 컨센서스 서열을 도 6에 나타낸다(SEQ ID NO:20).

RNA 증폭.예상된 크기의 분리된 밴드가 시험관 내 및 생체 내 시료 모두에서 나타난다(도 7). 생성물의 크기는 람다 DNA의 Hae III 제한효소 단편과 비교해 전장인 것으로 생각하였다.

본 명세서에서 언급된 특허, 출원, 시험방법 및 간행물은 그 전체가 참조병합된다.

본 발명의 많은 변형이 상기 상세한 설명에 비추어 당업자에게 제시될 것이다. 모든 그러한 자명한 변형은 첨부한 특허청구범위의 의도하는 범위 내에 있다.

Claims (61)

10-20% SDS-PAGE 겔을 사용하여 확인한 분자량이 약 20kDa이고 뉴모코커스 박테리아의 콜로니형성을 감소시키는 능력을 가지는 분리된 스트렙토코커스 뉴모니에 표면결합 뉴모 보호 단백질(PPP).

제1항에 있어서,

상기 PPP가 재조합단백질인 것을 특징으로 하는 PPP.

제2항에 있어서,

상기 PPP가 약 4.587의 등전점을 가지는 것을 특징으로 하는 PPP.

제3항에 있어서,

상기 PPP가 pH 7에서 약 -14.214의 전하를 가지는 것을 특징으로 하는 PPP.

제1항에 있어서,

상기 PPP가 SEQ ID NO:5와 같은 아미노산서열 또는 이의 단편을 가지는 것을 특징으로 하는 PPP.

SEQ ID NO:4와 같은 서열 또는 이의 단편을 가지는, 제1항에 따른 PPP를 암호화하는 핵산서열.

제6항에 있어서,

상기 핵산이 cDNA인 것을 특징으로 하는 핵산.

제1항에 따른 PPP를 암호화하는 핵산서열을 포함하고, 상기 서열이 발현조절서열과 작동가능하게 결합된 것을 특징으로 하는 발현벡터.

제8항에 있어서,

상기 PPP가 약 4.587의 등전점을 가지는 것을 특징으로 하는 벡터.

제9항에 있어서,

상기 PPP가 pH 7에서 약 -14.214의 전하를 가지는 것을 특징으로 하는 벡터.

제5항에 따른 PPP를 암호화하는 핵산서열을 포함하고, 상기 서열이 발현조절서열과 작동가능하게 결합된 것을 특징으로 하는 발현벡터.

제11항에 있어서,

상기 핵산서열은 SEQ ID NO:4와 같은 서열 또는 이의 단편을 가지는 것을 특징으로 하는 벡터.

제8항에 따른 벡터로 트랜스펙션된 숙주세포.

제11항에 따른 벡터로 트랜스펙션된 숙주세포.

제13항에 따른 숙주세포에 의해 생산된 상기 PPP를 분리하는 단계를 포함하고, 상기 숙주세포가 상기 벡터에 의한 상기 PPP의 발현을 제공하는 조건 하에서 배양된 것을 특징으로 하는 재조합 PPP의 생산방법.

제14항에 따른 숙주세포에 의해 생산된 상기 PPP를 분리하는 단계를 포함하고, 상기 숙주세포가 상기 벡터에 의한 상기 PPP의 발현을 제공하는 조건 하에서 배양된 것을 특징으로 하는 재조합 PPP의 생산방법.

제1항에 따른 PPP와 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.

제5항에 따른 PPP와 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.

제6항에 따른 PPP를 암호화하는 핵산서열과 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.

제8항에 따른 발현벡터와 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.

제11항에 따른 발현벡터와 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.

제13항에 따른 숙주세포와 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.

제14항에 따른 숙주세포와 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.

(i) 10-20% SDS-PAGE 겔을 사용하여 확인한 분자량이 약 20kDa인 스트렙토코커스 뉴모니에 표면 결합 PPP 또는 이의 단편; (ii) 약제학적으로 허용가능한 담체; 및 (iii) 선택적으로 하나 이상의 보조제를 포함하는 면역원성 조성물.

제24항에 있어서,

상기 PPP가 약 4.587의 등전점을 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.

제25항에 있어서,

상기 PPP가 pH 7에서 약 -14.214의 전하를 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.

제24항에 있어서,

상기 PPP가 SEQ ID NO:5와 같은 아미노산서열 또는 이의 면역원성 단편을 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.

제27항에 있어서,

상기 PPP가 SEQ ID NO:4와 같은 핵산서열 또는 이의 면역원성 단편에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는 조성물.

제24항에 있어서,

상기 조성물이 스트렙토코커스 뉴모니에에 의해 유발된 질환으로부터 보호 면역성을 이끌어내는 것을 특징으로 하는 조성물.

제29항에 있어서,

상기 질환이 중이염, 비부비동염, 균혈증, 수막염, 폐렴 및 하부 기도 감염으로 이루어진 그룹에서 선택된 것임을 특징으로 하는 조성물.

제29항에 있어서,

상기 PPP가 SEQ ID NO:5와 같은 아미노산서열 또는 이의 면역원성 단편을포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.

제29항에 있어서,

상기 PPP가 SEQ ID NO:4와 같은 핵산서열 또는 이의 면역원성 단편에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는 조성물.

(i) 10-20% SDS-PAGE 겔을 사용하여 확인한 분자량이 약 20kDa인 스트렙토코커스 뉴모니에 표면 결합 PPP를 암호화하는 하나 이상의 발현벡터; (ii) 약제학적으로 허용가능한 담체; 및 (iii) 선택적으로 하나 이상의 보조제를 포함하는 면역원성 조성물.

제33항에 있어서,

상기 뉴모코커스 박테리아가 스트렙토코커스 뉴모니에인 것을 특징으로 하는 조성물.

제34항에 있어서,

상기 조성물이 스트렙토코커스 뉴모니에에 의해 유발된 질환으로부터 보호 면역성을 이끌어내는 것을 특징으로 하는 조성물.

제35항에 있어서,

상기 질환이 중이염, 비부비동염, 균혈증, 수막염, 폐렴 및 하부 기도 감염으로 이루어진 그룹에서 선택된 것임을 특징으로 하는 조성물.

제33항에 있어서,

상기 PPP가 약 4.582의 등전점을 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.

제37항에 있어서,

상기 PPP가 pH 7에서 약 14.214의 전하를 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.

제33항에 있어서,

상기 발현벡터가 SEQ ID NO:5와 같은 아미노산서열을 암호화하는 핵산서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.

제33항에 있어서,

상기 발현벡터가 SEQ ID NO:4와 같은 핵산서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.

포유동물에서 면역반응을 유도하기에 유효한 양의 제24항에 따른 조성물을 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 면역반응을 유도하는 방법.

포유동물에서 면역반응을 유도하기에 유효한 양의 제27항에 따른 조성물을 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 면역반응을 유도하는 방법.

포유동물에서 면역반응을 유도하기에 유효한 양의 제33항에 따른 조성물을 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 면역반응을 유도하는 방법.

포유동물에서 면역반응을 유도하기에 유효한 양의 제39항에 따른 조성물을 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 면역반응을 유도하는 방법.

포유동물에서 면역반응을 유도하기 위하여 SEQ ID NO:5와 같은 아미노산서열의 결합을 저해하기에 유효한 양의 화합물을 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 뉴모코커스 박테리아로 감염된 포유동물에서 면역반응을 유도하는 방법.

화합물의 존재 하에서 SEQ ID NO:5와 같은 아미노산서열의 제1결합량과 상기 화합물의 부재 하에서 SEQ ID NO:5와 같은 아미노산서열의 제2결합량을 비교하는 단계를 포함함으로써 제2결합량보다 더 낮은 제1결합량이 상기 화합물이 포유동물에서 면역반응을 유도할 수 있다는 것을 나타내는, 뉴모코커스 박테리아로 감염된 포유동물에서 면역반응을 유도하는 화합물을 스크리닝하는 방법.

의심스러운 시료 내의 SEQ ID NO:5와 같은 PPP 또는 이의 단편의 수준을 대조구 시료 내의 SEQ ID NO:5와 같은 PPP 또는 이의 단편의 수준과 비교하는 단계를 포함함으로써, 상기 대조구 시료 내의 상기 PPP 수준보다 더 높은 수준의 상기 의심스러운 시료 내의 PPP수준이 상기 의심스러운 시료가 뉴모코커스 박테리아감염을 포함한다는 것을 나타내는, 뉴모코커스 박테리아 감염을 진단하는 방법.

스트렙토코커스 뉴모니에 PPP에 결합하는 항체.

제48항에 있어서,

SEQ ID NO:5와 같은 아미노산서열 또는 이의 단편을 선택적으로 인식하는 것을 특징으로 하는 항체.

제48항에 있어서,

상기 항체가 키메라인 것을 특징으로 하는 항체.

제48항에 있어서,

상기 항체가 인간화된 것을 특징으로 하는 항체.

제48항에 있어서,

상기 항체가 항-이디오타입인 것을 특징으로 하는 항체.

제48항에 있어서,

상기 항체가 약제학적 활성 화합물에 접합된 것을 특징으로 하는 항체.

제48항에 있어서,

상기 항체가 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 항체.

제54항에 있어서,

상기 항체가 인간화된 것을 특징으로 하는 항체.

제54항에 있어서,

상기 항체가 항-이디오타입인 것을 특징으로 하는 항체.

제54항에 있어서,

상기 항체가 약제학적 활성 화합물에 접합된 것을 특징으로 하는 항체.

포유동물에서 면역반응을 유도하기에 유효한 양의 제52항에 따른 항체를 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 면역반응을 유도하는 방법.

포유동물에서 면역반응을 유도하기에 유효한 양의 제56항에 따른 항체를 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 면역반응을 유도하는 방법.

포유동물에서 면역반응을 유도하기에 유효한 양의 제53항에 따른 항체를 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 뉴모코커스 박테리아에 감염된 포유동물에서 면역반응을 유도하는 방법.

포유동물에서 면역반응을 유도하기에 유효한 양의 제57항에 따른 항체를 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 뉴모코커스 박테리아에 감염된 포유동물에서 면역반응을 유도하는 방법.