KR20010024299A

KR20010024299A - 스트렙토코쿠스 뉴모니애로부터의 사람 보체 ｃ3 분해단백질분해효소

Info

Publication number: KR20010024299A
Application number: KR1020007003198A
Authority: KR
Inventors: 마가렛 케이. 호스테터; 데이비드 제이. 핀켈; 키 쳉; 브루스 에이. 그린; 에이미 더블유. 마시
Original assignee: 리전츠 오브 더 유니버스티 오브 미네소타; 윌리암 에이취 캘넌; 아메리칸사이아나미드컴파니; 에곤 이 버그
Priority date: 1997-09-24
Filing date: 1998-09-24
Publication date: 2001-03-26
Also published as: CN1291233A; AU9510598A; WO1999015675A1; EP1017828A1; CA2305016A1; JP2001517449A; BR9812525A

Abstract

본 발명은 스트렙토코쿠스 뉴모니애에 의해 발현된 사람 보체 C3 분해 단백질분해효소의 확인하고, 사용하는 것에 관한 것이다. 본 발명의 단백질분해효소는 약 15kD 내지 약 25kD의 분자량을 갖는다. 본 발명의 바람직한 단백질분해효소는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함한다.

Description

스트렙토코쿠스 뉴모니애로부터의 사람 보체 Ｃ3 분해 단백질분해효소 {HUMAN COMPLEMENT C3-DEGRADING PROTEINASE FROM STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE}

발명의 분야

본 발명은 스트렙토코쿠스 뉴모니애, 특히, 사람 보체 단백질인 C3를 분해시킬 수 있는 스트렙토코쿠스 뉴모니애 단백질을 확인하는 것에 관한 것이다.

발명의 배경

박테리움 스트렙토코쿠스 뉴모니애에 의한 호흡기 감염에 의해, 연간 약 50만명의 폐렴 환자가 발생하여, 4만 7천명이 사망한다. 균혈성 폐렴쌍구균에 감염될 위험이 가장 높은 사람은 두 살 이하의 유아, 면역계가 감약된 사람 및 노인들이다. 이들 집단에서, 스트렙토코쿠스 뉴모니애가 세균성 폐렴 및 뇌막염의 주원인이다. 더욱이, 스트렙토코쿠스 뉴모니애는 다양한 연령층의 어린이들의 귀감염을 초래하는 주요 세균이다. 어린이들 및 노인들은 모두, 세균 콜로니화, 국소 또는 전신 감염 또는 정제된 폴리사카라이드에 의한 백신접종 후에, 폐렴쌍구균 캡슐형 폴리사카라이드에 대한 방어 항체를 합성하지 못한다. 스트렙토코쿠스 뉴모니애는 HIV 감염에 의한 성인과 어린이 둘 모두에서의 침입성 세균성 호흡기 질환을 초래하는 주원인이며, 이들 환자에게서 혈행성 감염을 일으킨다 [참조: Connor et al. Current Topics in AIDS 1987;1:185-209 and Janoff et al. Ann. Intern. Med. 1992;117(4):314-324].

중증 감염에 걸릴 위험성이 가장 큰 사람은 이러한 캡슐형 폴리사카라이드 백신에 대한 항체를 생성시킬 수 없다. 결과적으로, 임상 실험 분야에는 현재 4개의 컨쥬게이트 백신이 존재한다. 컨쥬게이트 백신은, 항체 반응을 증가시키기 위해, 폐렴쌍구균 캡슐형 폴리사카라이드가 단백질 담체 또는 보조제에 결합된 형태로 구성되어 있다. 그러나, 현재 임상 실험에 사용되는 컨쥬게이트 백신과 관련된 잠재적 문제가 있다. 예를 들어, 미국에서 가장 유행하는 폐렴쌍구균 혈청형은 이스라엘, 서유럽, 남아프리카 또는 스칸디나비아와 같은 지역에서 가장 보편적인 혈청형과 상이하다. 따라서, 하나의 지리적 장소에서 유용할 수 있는 백신은 또 다른 지리적 장소에서는 유용하지 않을 수 있다. 현재 입수가능한 캡슐형 폴리사카라이드 백신의 개질 또는 지리적 혈청형 변이성에 적합한 캡슐형 백신용 단백질 컨쥬게이트의 개발에는 과도한 재정적 및 기술적 어려움이 따른다. 따라서, 다수의 악성 혈청형 중에서 전세계적으로 보존되는 면역원성 표면 노출된 단백질을 찾는 것이 폐렴쌍구균 감염을 예방하고, 광범위하게 방어적인 폐렴쌍구균 백신을 제형화하는데 가장 중요하다. 더욱이, 전세계적으로 볼때 페니실린 및 세팔로스포린 내성 폐렴쌍구균이 출현함에 따라, 효과적인 백신에 대한 필요성이 더욱 절실하다 [참조: Baquero et al. J. Antimicrob. Chemother. 1991; 28S;31-8].

수 가지의 폐렴쌍구균 단백질은, 스트렙토코쿠스 뉴모니애에 대한 면역을 자극하기 위해, 폐렴쌍구균 캡슐형 폴리사카라이드에 대한 컨쥬게이션을 위해 제공되거나, 단일 면역원들로서 제공되어 왔다. 호흡관의 상피 세포에 대한 스트렙토코쿠스 뉴모니애의 부착에 관여하는 것으로 알려진 표면 단백질로는 PsaA, PspC/CBP112, 및 IA1 단백질분해효소(proteinase)가 있다 [참조: Sampson et al. Infect. Immun. 1994;62:319-324, Sheffield et al. Microb. Pathogen. 1992; 13:261-9, and Wani, et al. Infect. Immun. 1996;64:3967-3974]. 이러한 부착에 대한 항체는 호흡기 상피세포에 대한 폐렴쌍구균의 결합을 억제함으로써, 콜로니화를 감소시킨다. 뉴몰리신, 오토리신, 뉴라미니다아제 또는 히알루로니다아제와 같은 그 밖의 세포질 폐렴쌍구균 단백질이 백신 항원으로서 제시되는데, 이는 항체가, 스트렙토코쿠스 뉴모니애로 감염된 환자내에서 이들 단백질의 유해 효과를 잠재적으로 억제시킬 수 있기 때문이다. 그러나, 이들 단백질은 스트렙토코쿠스 뉴모니애의 표면상에 전형적으로 정위되기 보다는, 세포가 용해되어 사멸함에 따라, 박테리움으로부터 분비되거나 방출된다 [참조: Lee et al. Vaccine 1994; 12:875-8 and Berry et la. Infect. Immun. 1994;62:1101-1108]. 이들 세포질 단백질을 면역원으로서 사용하면 스트렙토코쿠스 뉴모니애 감염의 만기 결과를 개선시킬 수 있지만, 이들 단백질에 대한 항체는 폐렴쌍구균 사멸을 촉진시키거나 초기 또는 후속 폐렴쌍구균 콜로니화를 억제하지 못할 것이다.

폐렴쌍구균 백신으로서 시험되고 있는 중인 프로토타입 표면 단백질은 폐렴쌍구균 표면 단백질 A(PspA) 이다. PspA는 약 70 내지 140kDa의 불균일 단백질이다. PspA 구조는 아미노 말단에 있는 알파 나선에 이어, 프롤린 풍부 서열을 포함하며, 카르복시 말단에 있는 일련의 11개 콜린 결합성 반복체가 끝을 이룬다. 이것의 구조에 대한 방대한 정보가 입수가능하지만, PspA는 다양한 폐렴쌍구균 혈청형 사이에서 구조적으로 보존되지 않고, 이것의 기능도 완전히 알려져 있지 않다 [참조: Yother et al. J. Bacteriol. 1992;174:601-9 and Yother J. Bacteriol. 1994;176:2976-2985]. PspA의 면역원성에도 불구하고, 4개의 구조적 군(또는 클레이드(clade))으로 이것이 존재한다는 것 및 이것의 특징화되지 않은 기능으로 인해, 이것을 백신 항원으로서 사용하는 것이 어려워 진다.

타입 특이적 폴리사카라이드 캡슐에 대해 방어 항체를 생성시킬 수 없는 환자의 경우, 보체의 제 3의 성분인 C3와 또 다른 보체 경로의 관련 단백질이 스트렙토코쿠스 뉴모니애 감염에 대한 숙주 방어의 제 1선을 담당한다. 보체 단백질은 스트렙토코쿠스 뉴모니애의 견고한 세포벽을 투과할 수 없기 때문에, 폐렴쌍구균 표면상에 옵소닌 C3b가 쌓이는 것이 폐렴쌍구균 소거의 주매개요인이 된다. 폐렴쌍구균과 혈장 C3의 상호작용은, C3의 옵소닌 작용성 단편인 C3b의 공유결합이 식세포 인식 및 섭취를 개시하는 경우, 폐렴쌍구균 균혈 도중에 일어나는 것으로 공지되어 있다 [참조: Johnston et al. J. Exp. Med 1969;129:1275-1290, Hasin HE, J. Immunol. 1972; 109:26-31 and Hostetter et al.J. Infect. Dis. 1984;150:653-61]. C3b은 폐렴쌍구균 캡슐 상에 쌓일 뿐만 아니라 세포벽에도 쌓인다. 스트렙토코쿠스 뉴모니애 감염을 제어하는 이러한 방법은 매우 비효율적이다. 스트렙토코쿠스 뉴모니애 옵소닌화를 증대시키는 방법은 이러한 생물체에 의해 유도된 질병 경과를 호전시킬 수 있다. 당업계에는 스트렙토코쿠스 뉴모니애 감염을 제한하는 방법 및 치료법에 대한 필요성이 절실하다.

발명의 요약

본 발명은 스트렙토코쿠스 뉴모니애에 의해 발현된 1군의 사람 보체 C3 분해 단백질(단백질분해효소)을 확인하고, 사용하는 것에 관한 것이다. 단백질은 예를 들어 10% SDS 폴리아크릴아미드겔에서 측정하여 약 15kD 내지 약 25kD의 분자량을 갖는 것이 바람직하다. 본 발명은 스트렙토코쿠스 뉴모니애의 다수의 C3 분해 스트레인으로부터 단리될 수 있는 다수의 단백질을 포함한다.

한 일면에서, 본 발명은 서열번호 2와 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 단리된 단백질에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서, 단백질은 스트렙토코쿠스 뉴모니애로부터 단리되거나, 대안적으로, 단백질은 재조합 단백질이다. 바람직하게는, 단리된 단백질은 사람 보체 단백질 C3를 분해한다. 본 발명의 바람직한 단백질은 서열번호 2를 포함하는 아미노산 서열, 더욱 바람직하게는 서열번호 2인 아미노산 서열을 갖는 단리된 단백질이다. 본원에 사용된 "단리된"이란 용어는 자연 환경으로부터 분리된 천연종 뿐만 아니라 합성종을 의미한다. 본원에 사용된 "단백질"이란 용어는 1종 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하는 하나 이상의 기능적 유닛을 포함한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 C3 분해 단백질분해효소로부터의 단리된 펩티드 또는 폴리펩티드에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 발명은 서열번호 2와 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 단리된 단백질로부터의 15개 이상의 연속 아미노산의 펩티드 또는 폴리펩티드, 더욱 바람직하게는 서열번호 2 중의 15개 이상의 연속 아미노산의 펩티드 또는 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명의 또 다른 일면에서, 펩티드 또는 폴리펩티드는 사람 보체 단백질 C3를 분해할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구체예는 서열번호 2의 약 1개 내지 약 58개의 아미노산을 포함하는 단리된 단백질 및 서열번호 1 또는 이것의 상보적 가닥의 약 1개 내지 약 174개의 누클레오티드를 포함하는 단리된 핵산 단편을 포함한다. 바람직하게는, 단리된 핵산 단편은 서열번호 1 또는 이것의 상보적 가닥의 약 150개 내지 약 174개의 누클레오티드를 포함한다.

또 다른 일면에서, 본 발명은 사람 보체 단백질 C3를 분해하는 단리된 단백질로서, 단백질을 코드화하는 핵산이 매우 엄격한 하이브리드화 조건 하에 서열번호 1 또는 이것의 상보적 가닥에 하이브리드화하는 단백질에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 단백질로부터 유도된 15개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 유효량의 면역계 자극 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하는 면역계 자극 조성물(바람직하게는, 백신)로서, 단백질이 서열번호 2와 80% 이상의 서열 동일성을 가지며, 사람 보체 단백질 C3를 분해할 수 있는 조성물에 관한 것이다.

바람직하게는, 단백질은 스트렙토코쿠스 뉴모니애로부터 단리된다. 한 가지 구체예에서, 면역 자극 조성물 또는 백신은 스트렙토코쿠스 뉴모니애로부터 단리된 하나 이상의 다른 면역계 자극 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 추가로 포함한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2와 80% 이상의 서열 동일성을 포함하고, 사람 보체 단백질 C3를 분해할 수 있는 단백질에 결합(전형적으로, 특이적 결합)할 수 있는 항체에 관한 것이다. 한 구체예에서, 항체는 모노클로날 항체이고, 또 다른 구체예에서, 항체는 폴리클로날 항체이다. 또 다른 구체예에서, 항체는 항체 단편이다. 항체 또는 항체 단편은 마우스, 래트, 염소, 닭, 사람 또는 토끼로부터 수득될 수 있다.

또 다른 구체예에서, 항체는 단백질의 일부 또는 전부에 결합할 수 있으며, 이러한 단백질을 코드화하는 핵산은 매우 엄격한 하이브리드화 조건 하에 서열번호 1 또는 이것의 상보적 가닥에 하이브리드화한다.

또한, 본 발명은 매우 엄격한 하이브리드화 조건 하에 서열번호 1 또는 이것의 상보적 가닥에 하이브리드화할 수 있는 단리된 핵산 단편(폴리누클레오티드)에 관한 것이다. 본원에 사용된 매우 엄격한 하이브리드화 조건으로는, 예를 들어, 6XSSC, 5X 덴하르트(Denhardt), 0.5% SDS 및 100㎍/㎖ 단편화되고 변성된 연어 정자 DNA로 65℃에서 밤새 하이브리드화하고, 2X SSC, 0.1% SDS로 실온에서 약 10분간 1회 세척한 다음, 65℃에서 15분간 1회 세척한 후, 0.2XSSC, 0.1% SDS로 실온에서 3 내지 5분 이상 1회 이상 세척하는 것이 있다. 한 가지 구체예에서, 핵산 단편은 스트렙토코쿠스 뉴모니애로부터 단리되고, 또 다른 구체예에서, 핵산 단편은 단백질의 일부 또는 전부를 코드화한다. 한 구체예에서, 단백질은 사람 보체 단백질 C3를 분해한다. 또 다른 구체예에서, 핵산 단편은 사람 보체 C3를 분해하지 않는 펩티드 또는 폴리펩티드를 코드화한다.

또 다른 구체예에서, 핵산 단편은 핵산 벡터이고, 벡터는 단백질의 일부 또는 전부를 생성시킬 수 있는 발현 벡터일 수 있다. 핵산 단편을 함유하는 세포가 또한 본 발명에서 고려된다. 한 가지 구체예에서, 세포는 박테리움 또는 진핵 세포이다.

또한, 본 발명은 서열번호 1 또는 이것의 상보적 가닥의 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 단편에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 서열번호 1을 포함하는 이중 가닥 DNA에 의해 전사된 RNA 단편에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 일면에서, 본 발명은, 치료적 유효량의 단백질의 일부 또는 전부를 포함하는 조성물을 동물에게 투여하는 단계를 포함하여 포유동물(특히, 사람)에게서 스트렙토코쿠스 뉴모니애에 대한 면역 반응을 생성시키는 방법으로서, 단백질을 코드화하는 핵산이 매우 엄격한 하이브리드화 조건 하에 서열번호 1 또는 이것의 상보적 서열에 하이브리드화하여, 단백질에 대한 면역 반응을 생성시키는 방법에 관한 것이다. 면역 반응은 B세포 반응, T세포 반응, 상피세포 반응 또는 내피세포 반응일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 조성물은 백신 조성물이다. 단백질은 길이가 15개 이상의 아미노산인 것이 바람직하고, 또한, 조성물은 스트렙토코쿠스 뉴모니애로부터의 하나 이상의 다른 면역계 자극 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 추가로 포함하는 것이 바람직하다. 한 가지 구체예에서, 단백질은 서열번호 2의 15개 이상의 아미노산을 포함한다.

또한, 본 발명은 사람 보체 C3를 분해할 수 있는 스트렙토코쿠스 뉴모니애로부터의 약 15kDa 내지 약 25kDa의 단리된 단백질에 관한 것이며, 스트렙토코쿠스 뉴모니애 매개된 C3 분해를 억제하는 방법으로서, 스트렙토코쿠스 뉴모니애 박테리움을, 서열번호 2와 80% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 단백질에 결합할 수 있는 항체와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은, 이종이식에 사용되는 동물의 장기의 표면상에서, 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 발현시키는 단계를 포함하여, 이종이식에서 C3 매개된 염증 및 거부반응을 억제하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은, 예를 들어, 돼지의 신장에서 본 발명의 단백질을 발현시켜서, 이종이식 후의 C3 매개된 염증을 억제하는데 특히 유용하다.

또한, 본 발명은, 매우 엄격한 하이브리드화 조건 하에 서열번호 1 또는 이것의 상보적 가닥의 핵산 서열의 일부 또는 전부에 하이브리드화하는 15개 이상의 누클레오티드의 영역을 함유하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다. 한 가지 구체예에서, 단리된 핵산 분자는 매우 엄격한 하이브리드화 조건 하에 서열번호 1 또는 이것의 상보적 가닥의 하나 이상의 영역에 하이브리드화할 수 있다. 바람직하게는, 하나 이상의 영역은 서열번호 1의 누클레오티드 1-174 또는 320-492를 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은, 매우 엄격한 하이브리드화 조건 하에 서열번호 4 또는 이것의 상보적 가닥의 핵산 서열의 일부 또는 전부에 하이브리드화하는 15개 이상의 누클레오티드의 영역을 함유하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다. 한 구체예에서, 단리된 핵산 분자는 매우 엄격한 조건 하에 서열번호 4 또는 이것의 상보적 가닥의 하나 이상의 영역에 하이브리드화할 수 있다. 바람직하게는, 하나 이상의 영역은 서열번호 4의 누클레오티드 507-681 또는 827-999를 포함한다.

또 다른 구체예에서, 서열번호 4의 핵산 분자의 일부 또는 전부는 단백질의 일부 또는 전부를 코드화한다. 바람직하게는, 단백질은 서열번호 5에 도시된 예상된 아미노산 서열을 가지며, 예를 들어, SDS-PAGE로 측정하여, 약 75kDa 내지 약 85kDa의 분자량을 갖는다.

또한, 본 발명은 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9에 도시된 핵산 서열을 갖는 단리된 DNA 단편 또는 프라이머에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 일면에서, 본 발명은 치료적 유효량의 단백질의 일부 또는 전부를 함유하는 면역계 자극 조성물 또는 백신으로서, 단백질을 코드화하는 핵산이 매우 엄격한 하이브리드화 조건 하에 서열번호 4 또는 이것의 상보적 가닥에 하이브리드화할 수 있는 조성물 또는 백신에 관한 것이다. 포유동물에게서 스트렙토코쿠스 뉴모니애에 대한 면역 반응을 생성시키는 방법은, 치료적 유효량의 단백질의 일부 또는 전부를 포함하는 조성물을 포유동물에게 투여하는 단계로서, 단백질을 코드화하는 핵산이 엄격한 하이브리드화 조건 하에 서열번호 4 또는 이것의 상보적 가닥에 하이브리드화하여, 단백질에 대한 면역 반응을 수득하는 단계를 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 스트렙토코쿠스 뉴모니애 감염 또는 콜로니화로부터 포유동물 환자를 면역시키거나 치료하는데 유효한 양의 단백질의 일부 또는 전부와 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 백신 또는 면역계 자극 조성물에 관한 것이다. 단백질은, 매우 엄격한 하이브리드화 조건 하에 이 단백질을 코딩하는 서열번호 4에 도시된 핵산 서열 또는 이것의 상보적 가닥에 하이브리드화하는 핵산 분자로부터 유도된다. 바람직하게는, 단백질은 포유동물 환자, 특히 사람 환자에게 치료 효과를 제공하기에 유효한 양으로 제공된다.

도면의 간단한 설명

도 1은 본 발명의 C3 분해 단백질분해효소의 번역된 부분의 핵산 서열을 제공한다 (서열번호 1).

도 2는 본 발명의 C3 분해 단백질분해효소의 아미노산 서열을 제공한다 (서열번호 2).

도 3은 본 발명에 따른 C3 분해 단백질분해효소를 코드화하는 핵산 서열에 정위된 C3 분해 단백질분해효소의 아미노산 서열을 도시한다 (서열번호 2 내지 3).

도 4는 예상된 79kDa 아미노산 서열에 대한 핵산 서열을 제공한다 (서열번호 4).

도 5는 예상된 79kDa 아미노산 서열을 제공한다 (서열번호 5).

도 6은 서열번호 1과 서열번호 4의 서열 정렬을 도시한다.

도 7은 서열번호 2와 서열번호 5의 상응하는 아미노산 169-331의 서열 정렬을 도시한다.

바람직한 구체예의 상세한 설명

본 발명은 10% SDS-PAGE 상에서의 분자량이 약 20kDa(±5kDa)인 사람 보체 C3 분해 단백질분해효소 및 C3 분해 단백질분해효소를 코드화하는 핵산을 확인하고, 단리하는 것에 관한 것이다. 다수의 혈청형으로부터의 폐렴쌍구균의 지수 증식하는 배양액은 뚜렷한 C3 절단 단편을 생성시킴이 없이 C3의 β사슬을 분해한 후, C3의 α사슬을 분해할 수 있는 것으로 밝혀졌다 [참조: Angel, et al. J. Infect. Dis. 170:600-608, 1994]. 절단이 없는 이러한 분해 패턴은 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa)의 엘라스타아제 효소 및 엔타모에바 히스톨리티카(Entamoeba histolytica)의 시스테인 단백질분해효소와 같은 그 밖의 미생물 생성물의 분해 패턴과 실질적으로 상이하다.

본원에 사용된 "분해"란 용어는 단백질성 분자로부터 아미노산을 제거하여, 펩티드 또는 폴리펩티드를 생성시키는 것을 의미한다. 본 발명의 단백질은 폴리아크릴아미드겔상에서 관찰된 바와 같이 특정한 절단 단편을 생성시킴이 없이 C3를 분해한다. 본 발명의 C3 분해 단백질분해효소는 C3에 대해 약간 이상의 선택성이 있으며, 예를 들어, C3 분해 단백질분해효소는 기타 단백질, 예를 들어 알부민을 분해하는 것으로 여겨지지 않는다.

약 20kDa의 C3 분해 단백질분해효소는, 야생형 스트렙토코쿠스 뉴모니애와 비교하여 C3 분해 활성을 감소시켰던 클론을 확인함으로써, 삽입 간섭된 폐렴쌍구균 유전자의 라이브러리로부터 단리되었다. 클론의 C3 분해 활성을 평가하는 전형적인 검정법은 실시예 1에 제공된다. C3 분해 활성이 감소된 클론이 확인되었고, C3 분해 활성을 감소시킨 것으로 입증된 클론의 서열을 기초로 하여, 546bp SmaI 삽입체가 선택되었다. 이러한 SmaI 단편은 스트레인 CP1200으로부터 제조된 스트렙토코쿠스 뉴모니애 라이브러리를 프로빙하기 위해 사용되었다. SmaI 단편에 하이브리드화된 스트렙토코쿠스 뉴모니애 라이브러리로부터의 포지티브 클론이 단리되었고, C3 분해 활성과 관련된 유전자의 오픈 리딩 프레임이 확인되었다. PspA의 일부와 서열이 동일한 하기 올리고누클레오티드(서열번호 10)는, 디퍼렌셜(differential) 하이브리드화에 의해, C3 분해 단백질분해효소를 코드화하는 유전자가 PspA를 코드화하는 유전자와 상이함을 확인하기 위해 사용되었다.

서열번호 10

GAAAACAATAATGTAGAAGACTACTTTAAAGAAGGTTAGA

20kDa 단백질의 완전한 오픈 리딩 프레임은 492개의 염기쌍(서열번호 1)의 영역에 걸쳐있고, 이로써, 약 20kDa(+/- 5kDa)의 분자량 또는 약 163개의 아미노산(서열번호 2)의 단백질이 예상된다. C3 분해 단백질을 코드화하는 전형적인 유전자 서열은 서열번호 1로서 도 1에 제공되며, 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 2로서 도 2에 제공된다. 도 3은 바람직한 유전자 서열을, 서열번호 3으로서의 상응하는 바람직한 번역된 단백질과 조합시킨다.

서열번호 2를 사용하는 경우, 단백질의 아미노산 서열은 젠뱅크(GenBank) 또는 스위스 프로트(Swiss Prot) 데이터베이스에 있는 그 밖의 단백질과 관련이 없는 것으로 결정되었다. 예상된 단백질은 원핵생물 중의 막 도메인, 특히 아미노산 80-108 사이의 도메인을 특징으로 하는 프롤린 풍부 서열을 포함하며, 이는 단백질이 표면에서 발현됨을 제시한다. 아미노산 서열은 뚜렷한 콜린 결합 반복체를 나타내지 않는다. CP 1200의 배양액으로부터의 폐렴쌍구균 용해물과 상층액을 C3로 함침된 SDS-PAGE겔상에서 전기영동한 경우, 상층액과 용해물 둘 모두에서 약 20kDa(±5kDa)에서 용해 밴드가 확인되었고, 이로써, 서열번호 2에 의해 예상된 크기의 단백질이 C3 분해 활성을 가짐이 확증된다 (실시예 2). 실시예 3에 제공된 바와 같이, 20kDa C3 분해 단백질분해효소를 코드화하는 유전자는 5가지 혈청형(혈청형 1, 3, 4, 14 및 19F)를 나타내는 24개 이상의 폐렴쌍구균 단리물 중에 보존된다.

본 발명의 C3 분해 단백질분해효소를 코드화하는 온길이 유전자는 대장균에서의 발현을 위해 유전자 발현 벡터 내로 삽입되었다. 재조합 C3 분해 단백질분해효소는 실시예에 기재된 바와 같이 단리되었다. 당업자는 서열번호 1에 제공된 서열과 같은 특정 유전자 서열이 제공되면, 이 유전자를 발현시키는데 사용될 수 있는 다수의 발현 벡터가 있음을 인식한다. 또한, 본 발명의 재조합 단백질을 생성시키고, 단리시키는데 사용될 수 있는 다수의 방법이 당 분야에 공지되어 있으며, 당업자라면, 본 발명의 C3 분해 검정에 의해, 특정 발현 시스템 뿐만 아니라 실시예에 제공된 발현 시스템이 과도한 실험 없이 작용하는 지가 결정될 것임을 인식한다. 다수의 분자 및 면역학적 기법은 샘브룩(Sambrook) 등의 문헌[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 1989 Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY] 및 할로우(Harlow) 등의 문헌[Antibodies; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988]과 같은 기초 기술 교본에서 발견될 수 있다.

본 발명의 C3 분해 단백질을 코드화하는 유전자는 스트레인 CP 1200으로부터의 폐렴쌍구균 게놈 DNA 단편으로 제조된 플라스미드 라이브러리를 사용하여 확인되었다. 플라스미드 라이브러리를 수득하는 다수의 방법이 공지되어 있지만, 바람직한 방법에서, 플라스미드 라이브러리는, 폐렴쌍구균 스트레인 CP 1200 (디.에이. 모리슨(D.A. Morrison, University of Illinois, Champagne-Urbana, Illinois)으로부터 입수되고, 하바스테인 엘에프(Havarstein LF) 등의 문헌(Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 1995;92:11140-11144)에 기재되어 있음)로부터의 Sau 3A 분해된 폐렴쌍구균 게놈 DNA 단편으로 구성되었고, 삽입성 셔틀 벡터 pVA 891(erm^r, cm^r; 대장균에 대한 복제 기원을 가짐)의 Bam HI 부위 내로 삽입되었다. 이러한 라이브러리는 이렉트로포레이션에 의해 대장균 DH5α MCR 스트레인 내로 형질전환되었다. 몇몇 무작위 선택된 대장균 형질전환체의 플라스미드를 추출한 결과, 이들 모두가 재조합 플라스미드를 함유하는 것으로 밝혀졌다.

플라스미드 라이브러리 DNA는 대장균 형질전환체로부터 추출될 수 있고, 삽입 변이유발법을 이용하여 상동 재조합에 의해 CP 1200 모폐렴쌍구균 스트레인을 형질전환시키는데 사용될 수 있다.

폐렴쌍구균 스트레인 CP 1200 세포는 CTM 배지에서 HCl 과정에 의한 pH 시프트를 사용하여 컴피턴트(competent)하게 될 수 있다. 컴피턴트 세포는 사용될 때가지 -70℃에서 동결된다.

본 발명의 단리된 단백질은, C3 분해를 검출하기 위해, PBS의 존재 하에 37℃에서 4시간 동안 사람 보체 C3와 인큐베이팅될 수 있다. 단리된 폐렴쌍구균 단백질이 없는 대조 샘플은 비교용 대조표준으로서 사용된다.

본 발명의 단백질은 10% SDS-폴리아크릴아미드겔 상에서 약 20kDa(±5kDa)의 겉보기 분자량을 가지며, 바람직하게는 약 15kDa 내지 약 25kDa의 분자량을 갖는다. 전형적인 단백질 서열은 서열번호 2에 의해 제공된다. 당업자라면, 아미노산 서열의 일부 변이가 예상되며, 이러한 변이가 본 발명의 범위를 벗어나지 않을 것임을 인식할 것이다. 예를 들어, 보존적 변이는 본 발명을 벗어나지 않을 뿐만 아니라, 아미노산 동일성을, 단백질이 사람 보체 단백질 C3를 분해할 수 있고, 특히, 단백질이 스트렙토코쿠스 뉴모니애 박테리움으로부터 단리되거나 최초 수득되는, 약 80% 미만, 바람직하게는 약 90% 미만의 아미노산 동일성이 되도록 변이시키지 않는다. 또한, 단백질의 단편은, 특히, 이들이 사람 보체 단백질 C3를 분해할 수 있다면, 본 발명의 범위에 속한다.

일부 핵산 서열 변이는 일부 아미노산 변이와 같이 폐렴쌍구균 스트레인 및 혈청형 중에서 예상된다. 보존적 아미노산 치환은 당 분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 아미노산이 속하는 동일한 클래스로부터의 그 밖의 일원을 사용하는 아미노산 치환이 있다. 예를 들어, 비극성 아미노산으로는 알라닌, 루신, 이소루신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌 및 트립토판이 있다. 극성 중성 아미노산으로는 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민이 있다. 양하전된(염기성) 아미노산으로는 아르기닌, 리신 및 히스티딘이 있다. 음하전된(산성) 아미노산으로는 아스파르트산 및 글루탐산이 있다. 이러한 변화는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 측정된 겉보기 분자량 및 등전점에 영향을 미치는 것으로 예상되지 않는다. 특히 바람직한 보존적 치환으로는 양전하를 유지하기 위한 Lys의 Arg 치환 및 그 반대; 음전하를 유지하기 위한 Glu의 Asp 치환 및 그 반대; 유리 OH를 유지하기 위한 Ser의 Thr 치환 및 그 반대; 및 유리 NH₂를 유지하기 위한 Glu의 Asn 치환 및 그 반대가 있다.

본 발명의 바람직한 단백질로는 서열번호 2의 아미노산을 갖는 단백질이 있다. 그 밖의 단백질로는 사람 보체 C3를 분해하고, 매우 엄격한 하이브리드화 조건, 예를 들어, 6XSSC, 5X 덴하르트, 0.5% SDS(소듐 도데실 설페이트), 및 100㎍/㎖ 단편화되고, 변성된 연어 정자 DNA로 65℃에서 밤새 하이브리드화하고, 2X SSC, 0.1% SDS로 실온에서 약 10분간 세척한 다음, 65℃에서 15분간 1회 세척한 후, 0.2XSSC, 0.1% SDS로 실온에서 3 내지 5분 이상 1회 이상 세척하는 조건 하에, 서열번호 1에 하이브리드화하는 단백질을 코드화하는 핵산을 갖는 단백질이 있다. 전형적으로, SSC 용액은 염화나트륨, 시트르산나트륨 및 물을 함유하여, 원액을 구성한다. 단백질의 펩티드 또는 폴리펩티드가 또한 사용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 단백질은 서열번호 2의 약 1개 내지 약 50개의 아미노산을 포함한다.

본 발명의 단백질은 단리되거나 재조합 단백질로서 제조될 수 있다. 즉, 단백질 또는 이것의 일부를 코드화하는 핵산은 발현 벡터 내로 삽입되거나, 세포의 염색체 내로 삽입되어, 세포에서 단백질을 발현시킬 수 있다. 단백질은 박테리움 또는 또 다른 세포, 바람직하게는 진핵세포, 더욱 바람직하게는 동물 세포로부터 정제될 수 있다. 대안적으로, 단백질은 단백질을 발현하는 세포, 예를 들어 스트렙토코쿠스 뉴모니애 세포로부터 단리될 수 있다. 펩티드 또는 폴리펩티드가 본 발명에서 또한 고려된다. 펩티드 또는 폴리펩티드는 길이가 15개 이상의 아미노산인 것이 바람직하며, 바람직한 펩티드 또는 폴리펩티드는 서열번호 2의 15개 이상의 연속 아미노산을 갖는다.

20kDa 단백질을 코드화하는 핵산은 또한 본 발명의 일부이다. 서열번호 1은 C3 분해 단백질분해효소를 코드화하는 바람직한 핵산 단편이다. 당업자라면, 약간의 치환에 의해, C3 분해 단백질분해효소가, 이것의 특성이 실질적으로 변화될 정도로 변화되지 않을 것임을 인식할 것이다. 예를 들어, 서열번호 1과 80% 이상이 동일한 핵산이 본 발명에서 고려된다. 특정 핵산 서열이 본 발명의 범위에 속하는 지를 결정하는 방법은, 특정 핵산 서열이 C3 분해 단백질분해효소를 코드화하고, 서열번호 1과 비교하여 80% 이상의 핵산 동일성을 갖는 지를 고려하는 것이다. C3 단백질분해효소를 코드화하는 그 밖의 핵산 서열로는, 서열번호 2와 동일하거나 90% 이상의 서열 동일성을 갖지만, 핵산 서열에 대한 축중을 포함하는, C3 단백질분해효소를 코드화하는 핵산이 있다. 축중 코돈은 상이한 3문자 코돈이 동일한 아미노산을 지정하기 위해 사용됨을 의미한다. 예를 들어, 하기 RNA 코돈(따라서, U가 T로 치환된 상응하는 DNA 코돈)이 각각의 특정 아미노산을 코딩하기 위해 교환적으로 사용될 수 있는 것으로 당 분야에 널리 공지되어 있다:

페닐알라닌(Phe 또는 F) UUU, UUC, UUA 또는 UUG

루신(Leu 또는 L) CUU, CUC, CUA 또는 CUG

이소루신(Ile 또는 I) AUU, AUC 또는 AUA

메티오닌(Met 또는 M) AUG

발린(Val 또는 V) GUU, GUC, GUA, GUG

세린(Ser 또는 S) AGU 또는 AGC

프롤린(Pro 또는 P) CCU, CCC, CCA, CCG

트레오닌(Thr 또는 T) ACU, ACC, ACA, ACG

알라닌(Ala 또는 A) GCU, GCG, GCA, GCC

트립토판(Trp) UGG

티로신(Tyr 또는 Y) UAU 또는 UAC

히스티딘(His 또는 H) CAU 또는 CAC

글루타민(Glu 또는 Q) CAA 또는 CAG

아스파라긴(Asn 또는 N) AAU 또는 AAC

리신(Lys 또는 K) AAA 또는 AAG

아스파르트산(Asp 또는 D) GAU 또는 GAC

글루탐산(Glu 또는 E) GAA 또는 GAG

시스테인(Cys 또는 C) UGU 또는 UGC

아르기닌(Arg 또는 R) AGA 또는 AGG

글리신(Gly 또는 G) GGU 또는 GGC 또는 GGA 또는 GGG

종결 코돈 UAA, UAG 또는 UGA

또한, 특정 DNA 서열이 특정 세포 타입에 대해 바람직한 코돈을 사용하기 위해 변형될 수 있다. 예를 들어, 대장균에 대한 바람직한 코돈 사용법이, 사람을 포함하는 동물에 대한 바람직한 코돈과 같이, 공지되어 있다. 이들 변화는 당업자에게 공지되어 있고, 이로써, 이들 유전자 서열은 본 발명의 일부로 고려된다. 그 밖의 핵산 서열로는 서열번호 1로부터의 길이가 15개 이상의 핵산, 바람직하게는 30개 이상의 핵산인 핵산 단편, 또는 매우 엄격한 하이브리드화 조건, 예를 들어, 6XSSC, 5X 덴하르트, 0.5% SDS(소듐 도데실 설페이트), 및 100㎍/㎖ 단편화되고, 변성된 연어 정자 DNA로 65℃에서 밤새 하이브리드화하고, 2X SSC, 0.1% SDS로 실온에서 약 10분간 세척한 다음, 65℃에서 15분간 1회 세척한 후, 0.2XSSC, 0.1% SDS로 실온에서 3 내지 5분 이상 1회 이상 세척하는 조건 하에, 서열번호 1에 하이브리드화하는 길이가 15개 이상, 바람직하게는 30개 이상의 핵산인 그 밖의 핵산 단편이 있다.

본 발명의 핵산 단편은 서열번호 2 또는 서열번호 5의 서열을 전부 코드화하거나, 전혀 코드화하지 않거나(즉, 전사될 수 없는 단편, 유전자의 조절 부분을 포함하는 단편 등), 일부, 바람직하게는 서열번호 2 또는 서열번호 5로부터의 9개 이상의 아미노산을 코드화하는 연속 핵산을 함유하는 서열을 코드화할 수 있다. C3 단백질분해효소의 일부를 코드화하는 핵산 단편이 본 발명에서 고려되기 때문에, 모든 핵산 단편이 C3 분해 활성을 갖는 단백질 또는 펩티드 또는 폴리펩티드를 코드화할 것으로 이해되지 않을 것이다. 또한, 본 발명의 핵산은 이러한 단백질의 C3 분해 활성을 제거하거나 불활성화시키도록 변이될 수 있다. 따라서, 상기 기재된 하이브리드화 요건을 만족하는, C3 분해 활성이 없는 단편이 또한 고려된다. 핵산 서열을 변이시키거나 변화시키는 방법은 당 분야에 잘 기술되어 있으며, 면역원성이지만 효소적으로 불활성인 단백질의 생성이 치료적 이용을 위해 시험될 수 있다.

본 발명의 핵산 단편은 핵산 벡터내에 삽입되거나 숙주 게놈내에 안정하게 삽입되어, 재조합 키메라 단백질을 포함하는 재조합 단백질을 생성시킬 수 있다. 한 가지 구체예에 있어서, C3 분해 단백질은 벡터내의 유전자에 의해 코드화되고, 벡터는 숙주내에 존재한다. 바람직하게는, 세포는 원핵세포, 예를 들어 박테리움이다. 유전자 및 유전자 단편은 유전자의 전부 또는 일부와 또 다른 유전자의 융합체로서 존재할 수 있고, C3 분해 단백질은 하나의 단백질로서 발현되는 1종 이상의 단백질의 융합 단백질로서 존재할 수 있다. 본 발명의 다양한 핵산 벡터는 당 분야에 공지되어 있고, 다수의 시판되는 발현 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 포함한다. 이들 벡터를 사용하는 것은 당업계의 보통의 기술 범위에 속한다. 전형적인 벡터가 실시예에 사용되지만, 이로써, 본 발명의 범위가 제한되는 것으로 여겨지지 않아야 한다.

또한, 본 발명은, 바람직하게는 사람 보체 C3를 분해할 수 있는, 스트렙토코쿠스 뉴모니애로부터의 약 20kDa의 단백질, 바람직하게는 약 15kDa 내지 약 25kDa의 단백질에 결합(전형적으로, 특이적 결합)할 수 있는 항체에 관한 것이다. 폴리클로날 항체는 단백질의 일부 또는 단백질의 전부에 대해 제조될 수 있다. 유사하게는, 모노클로날 항체는 본 발명의 약 20kDa C3 분해 단백질의 전부 또는 펩티드 또는 폴리펩티드(단편)에 대해 제조될 수 있다. 단백질에 대한 항체를 제조하는 방법은 널리 공지되어 있고, 잘 기술되어 있다 [참조: Harlow et al., (Antibodies; A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, NY; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988]. 바람직한 예에서, 항체는 사람, 래트, 마우스, 염소, 닭 또는 토끼 유도될 수 있다. 단배질 결합 항체 단편 및 키메라 단편은 또한 널리 공지되어 있고, 본 발명의 범위에 속한다.

또한, 본 발명은 면역 자극 조성물의 용도에 관한 것이다. "면역 자극" 또는 "면역계 자극" 조성물이란 용어는 대상, 예를 들어 포유동물에게서 면역계의 1종 이상의 세포 타입을 활성화시키는 본 발명에 따른 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드를 의미한다. 바람직하게는, 면역 자극 조성물, 전형적으로 백신은 정상, 즉, 비감염된 대상에게 면역 반응 또는 예방적 잇점을 제공한다. 그러나, 임의의 측정가능한 면역 반응은 치료 응용 또는 프로토콜에서 환자에게 이롭다. 면역계의 바람직한 활성화된 세포로는 호중구 또는 대식세포와 같은 식세포, T세포, B세포, 상피세포 및 내피세포가 있다. 본 발명의 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 포함하는 면역 자극 조성물은 래트, 마우스, 염소, 닭, 토끼 또는 사람과 같은 동물 또는 스트렙토코쿠스 뉴모니애 감염 실험용 동물 모델에서 항체를 생성시키는데 사용될 수 있다. 바람직한 면역 자극 조성물로는 면역 자극량, 예를 들어 치료적 유효량의 C3 분해 단백질분해효소로부터의 15개 이상의 아미노산을 포함하는 1종 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함한다.

"백신"이란 용어는 면역을 위한 조성물을 의미한다. 이러한 프로세스는 단백질, 펩티드, 폴리펩티드, 항원, 핵산 서열 또는 상보적 서열, 예를 들어 안티센스, 또는 항체, 또는 이들의 현탁액의 투여를 포함할 수 있으며, 투여시에, 분자는 활성 면역을 생성시키고, 스트렙토코쿠스 뉴모니애 감염 또는 콜로니화에 대한 방어를 제공할 것이다. 전형적으로, 이러한 백신은 액체 용액 또는 현탁액과 같은 주사물질로서 제조된다. 주사 전에 액체 중의 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태가 또한 제조될 수 있다. 백신 제제는 임의로 에멀션화되거나, 리포솜내에 캡슐화될 수 있다.

면역 자극 조성물(예를 들어 백신)은 그 밖의 단백질을 약제학적으로 허용되는 완충제 또는 담체, 예를 들어 PBS(포스페이트 완충 식염) 또는 단백질을 숙주내에 도입시켜서 면역계를 자극하기에 적합하고 안정한 것으로 당 분야에 인식된 또 다른 완충제 중에 추가로 포함할 수 있다. 면역 자극 조성물은 그 밖의 면역계 자극 단백질, 예를 들어 보조제 또는 스트렙토코쿠스 뉴모니애 또는 그 밖의 생물체로부터의 면역 자극 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드를 또한 포함할 수 있다. 예를 들어, 펩티드 또는 폴리펩티드의 칵테일이 스트렙토코쿠스 뉴모니애 감염을 조절하는데 가장 유용할 수 있다. 바람직하게는, 하나 이상의 본 발명의 단백질의 단편이 백신 제제에 사용되어, 스트렙토코쿠스 뉴모니애 콜로니화 또는 스트렙토코쿠스 뉴모니애 콜로니화의 병원성 결과를 방어하거나 제한하기 위한 백신 제제에 사용된다.

본원에 사용된 "치료적 유효량"이란 용어는 원하는 결과를 생성시키는데 효과적인 양을 의미한다. 이러한 양은 대상의 면역계의 건강 및 신체 조건, 즉, 항체를 합성하는 기능, 원하는 방어의 정도, 제조되는 제형 및 기타 관련 인자에 따라 다르다. 이러한 양은 일상적 실험을 통해 측정될 수 있는 비교적 광범위한 범위에 속할 것으로 예상된다.

활성 면역 자극 성분은, 담체로서 약제학적으로 허용되고, 활성 성분과 양립가능한 부형제 또는 희석제와 종종 혼합된다. "약제학적으로 허용되는 담체"란 용어는 조성물의 그 밖의 성분과 양립가능하고, 이것의 수용자에게 무해하다는 점에서 "허용되는" 담체(들)을 의미한다. 적합한 부형제로는, 예를 들어, 물, 식염, 덱스트로오스, 글리세롤, 에탄올 등과 이들의 조합물이 있다. 또한, 소망에 따라, 면역 자극 조성물(백신을 포함함)은 소량의 보조 물질, 예를 들어 습윤제 또는 에멀션화제, pH 완충제, 및/또는 면역 자극 조성물의 효과를 증대시키는 보조제를 함유할 수 있다.

유효할 수 있는 보조제 또는 담체의 예로는 알루미늄 히드록시드, N-아세틸-무라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민(thr-MDP); N-아세틸-노르-무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민(CGP 11637, 노르-MDP로서 언급됨), N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1'-2'-디팔미토일-sn-글리세로-3-히드록시포스포릴옥시)-에틸아민(CGP 19835A, MTP-PE로서 언급됨), 및 박테리아로부터 추출된 3가지 성분, 즉, 모노포스포릴 리피드 A, 트레할로오스 디미콜레이트 및 세포벽 스켈레톤(MPL+TDM+CWS)을 2% 스쿠알렌/Tween 80 에멀션 중에 함유하는 RIBI이 있지만, 이들에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 스트렙토코쿠스 뉴모니애 매개된 C3 분해를 억제하는 방법으로서, 스트렙토코쿠스 뉴모니애 박테리움을, 단백질, 예를 들어 스트렙토코쿠스 뉴모니애로부터의 약 15kDa 내지 약 25kDa의 단리된 단백질에 결합할 수 있는 항체 또는 또 다른 단백질과 접촉시키는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 약 15kDa 내지 약 25kDa의 단리된 단백질에 결합할 수 있는 단백질은 항체 또는 이것의 단편일 수 있거나, 단백질은 항체 결합 도메인, 예를 들어 C3 분해 활성을 갖는 스트렙토코쿠스 뉴모니애로부터의 약 15kDa 내지 약 25kDa의 단백질을 특이적으로 인식할 수 있는 항체로부터의 가변 도메인을 포함하는 키메라 단백질일 수 있다.

본 발명의 단리된 스트렙토코쿠스 뉴모니애는 단리되고, 임의로 정제될 수 있고, 단리된 단백질 또는 이것의 면역원성 단편은, 일례로 사람 또는 실험용 동물 중의 항체 반응을 포함하는 면역학적 반응을 생성시키는데 사용될 수 있다. C3 분해 활성이 없는 단백질의 펩티드 또는 폴리펩티드 단편은 스트렙토코쿠스 뉴모니애 감염의 효과를 제한하는 이들의 능력에 대해 시험될 수 있다. 유사하게는, 본 발명의 단백질은, 예를 들어 단백질의 C3 분해 활성을 간섭하거나 불활성화시키는 변이를 통해 개질될 수 있다. 본 발명의 단백질의 C3 분해 활성을 억제할 수 있는 항체는 C3 분해를 억제하고, 옵소닌 경로를 통한 스트렙토코쿠스 뉴모니애의 소거를 촉진시키기 위한 전술로서 사용될 수 있다. 단리된 단백질은 스트렙토코쿠스 뉴모니애에 대한 항체를 검출하기 위한 검정에 사용되거나, 스트렙토코쿠스 뉴모니애 치료용의 백신 또는 다가 또는 다중 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드 함유 백신의 일부로서 사용될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "치료(treatment)"란 정상 포유동물 또는 다양한 스트렙토코쿠스 뉴모니애 감염에 의해 콜로니화되거나, 이러한 감염으로 진단되거나, 이러한 감염의 특징 또는 증상을 나타내는 포유동물의 예방 및/또는 치료를 의미한다. 용어 "치료(therapy)"란 포유동물에게 치료 효과를 제공하여, 포유동물이 폐렴쌍구균 감염 또는 기타 관련 질환을 거의 나타내지 않거나 전혀 나타내지 않게 하는 것을 의미한다. 이러한 치료는 본 발명의 핵산 분자(센스 또는 안티센스), 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드 또는 항체를 투여함으로써 달성될 수 있다.

본 발명의 단백질은 척추동물 세포상에서 표면 발현될 수 있고, 예를 들어, 이종이식 또는 보체 매개된 사구체신염과 같이 보체 분해(또는 활성화)가 문제가 되는 경우에 C3를 분해시키는데 사용될 수 있는 것으로 또한 고려된다. 예를 들어, 전체 폐렴쌍구균 단백질, 재조합 단백질 또는 이들 모두의 일부가 이종이식 세포 내에 삽입될 수 있고, 표면 단백질 또는 분비 단백질로서 발현되어, 보체 분해(및/또는 보체 매개된 염증)을 억제하거나 최소화시킬 수 있다.

본 발명의 또 다른 특정 일면은 단리된 단백질 및 이로부터의 펩티드 또는 폴리펩티드를 발현하는 백신 벡터를 사용하는 것에 관한 것이다. 따라서, 또 다른 일면에서, 본 발명은 포유동물에게서 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 포유동물에게 1종 이상의 본 발명의 단리된 단백질 및/또는 펩티드 또는 폴리펩티드 또는 이들의 혼합물을 발현하는 백신 벡터를 제공하는 것을 포함한다. 본 발명의 단백질 및 펩티드 또는 폴리펩티드는, 단백질 및/또는 펩티드 또는 폴리펩티드를 외래 폴리펩티드로서 발현시키는데 필요한 유전 물질을 함유하는, 살아있는 백신 벡터, 특히, 살아있는 재조합 박테리아, 바이러스 또는 그 밖의 살아있는 제제를 사용하여 포유동물에게 전달될 수 있다. 특히, 위장관에 콜로니화하는 박테리아, 예를 들어 살모넬라(Salmonella), 쉬겔라(Shigella), 예르시니아(Yersinia), 비브리오(Vibrio), 에스케리챠(Escherichia) 및 BCG가 백신 벡터로서 개발되었고, 그 밖의 예들은 제이.홀름그렌(J.Holmgren) 등의 문헌[Immunobiol., 184, 157-179 (1992)] 및 제이.맥기(J.McGhee) 등의 문헌[Vaccine, 10, 75-88 (1992)]에 기재되어 있다.

본 발명의 또 다른 구체예는, 대상에게, 본 발명의 단리된 단백질 및/또는 이로부터의 펩티드 또는 폴리펩티드를 코드화하는 DNA 분자의 양을, 임의로, 트랜스펙션 촉진제와 함께 투여하는 것을 포함하여, 대상, 예를 들어 포유동물에게서 면역 반응을 유도시키는 방법으로서, 단백질 및/또는 펩티드 또는 폴리펩티드는 면역원성을 유지하고, 면역 자극 조성물, 예를 들어 백신내에 혼입되어, 사람에게 투여시에, 스트렙토코쿠스 뉴모니애 병원균에 의한 사람의 후속 감염시에 질환 증대를 유도시킴이 없이 방어를 제공하는 방법에 관한 것이다. 트랜스펙션 촉진제는 당 분야에 공지되어 있다.

20kDa 단백질을 코드화하는 유전자의 안티센스 서열은 폐렴쌍구균 감염에 대한 백신 또는 치료제로서 사용될 수 있는 것으로 또한 고려된다. 안티센스 DNA는 서열번호 1의 전부 또는 일부와 상보적인 비코딩 서열, 즉, 상보적 가닥으로서 규정된다. 예를 들어, 5'-ATGTCAAGC-3'에 대한 안티센스 서열은 3'-TACAGTTCG-5' 이다. 안티센스 서열 또는 올리고누클레오티드를 동물내로 전달하면, 동물에 의해 항체가 생성되거나, 서열이 살아있는 박테리아 또는 그 밖의 세포내로 삽입되어, 20kDa의 전부 또는 일부의 전사 및/또는 번역이 억제될 수 있다.

안티센스 핵산 서열의 도입은, 예를 들어, 안티센스 핵산을, 폐렴쌍구균 또는 감염된 세포내에 도입시키기에 적당한 담체, 예를 들어 리포솜내에 로딩시킴으로써 달성될 수 있다. 전형적으로, 8개 이상의 누클레오티드를 갖는 안티센스 핵산 서열은 박테리아 핵산 또는 박테리아 메센저 RNA에 결합할 수 있다. 안티센스 핵산 서열은 전형적으로 약 15개 이상의 누클레오티드, 바람직하게는 약 30개 이상의 누클레오티드를 함유하여, 박테리아 핵산 또는 박테리아 메센저 RNA의 하이브리드화 생성물의 필수적 안정성을 제공한다. 서열의 도입은, 바람직하게는, 하나 이상의 내인성 스트렙토코쿠스 뉴모니애 핵산 서열의 전사 또는 번역을 억제한다. 안티센스 핵산을 로딩하는 방법은 미국 특허 제 4,242,046호에 예시된 바와 같이 당 분야에 공지되어 있다.

또한, 본 발명은 분자량이 약 20kDa인 단백질(서열번호 2)을 코드화하는 핵산 서열의 오픈 리딩 프레임(서열번호 1)을 포함하는 2163개 염기의 오픈 리딩 프레임(서열번호 4)을 갖는 핵산 서열을 제공한다. 본원에 기재된 20kDa 단백질은 C3 분해 단백질로서 추가로 특징화된다. 거대한 오픈 리딩 프레임, 예를 들어 2163개 bp(서열번호 4)는 약 79kDa의 추정 단백질(서열번호 5)을 코드화한다.

본원에 인용된 모든 참고문헌 및 공보는 본원의 참고문헌으로 명백히 인용되어 있다. 당업자에게는 본 발명의 상세한 설명에 비추어 본 발명을 성공적으로 수행하게 할 수 있는 다수의 또 다른 기법 및 방법이 이용될 수 있다. 당업자라면, 본 발명이 특정 구체예 및 실시예과 관련하여 상기 기술되었지만, 본 발명이 반드시 이에 제한되지는 않으며, 다수의 그 밖의 구체예, 실시예, 사용예, 변형예, 및 이러한 구체예, 실시예 및 사용예로부터의 새로운 예가 본 발명의 범위를 벗어남이 없이 이루질 수 있음을 인식할 것이다.

실시예 1

감소된 C3 분해 활성을 갖는 삽입 변이체의 확인

삽입 변이체를 엘라인 톨우마넨(Elaine Tuomanen) 박사(뉴욕 뉴욕에 소재하는 록케펠러 인스티튜트(Rockefeller inst.))로부터 입수하였다. 삽입체를 갖는 클론을 검정 시험에서 사용하여 감소된 C3 분해 활성을 검출하였다. 상기 세포를 역가판에서, 실온에서 토드 휴이트(Todd Hewitt) 육즙에서 배양시킴으로써 137개의 클론을 시험하였다. 상기 세포를 폐렴쌍구균을 위해 합성 배지중에서 1:1으로 희석시키고[참고문헌: Sicard A.M., Genetics 50:31-44, 1984], 나머지 세포를 역가판에서 동결시켰다. 포스페이트 완충 식염(PBS)중에 1mg/ml의 0.1%BSA를 함유하는 배지 100㎕ 당 63ng 또는 83ng의 C3를 희석된 세포 약 200㎕에 첨가하였다. 상기 세포를 4시간 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 100㎕의 상기 혼합물을 ELISA 판에 가하고 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 상기 판을 세척 완충액으로 3회 세척하고, 상기 세포를 세척과 세척 사이에 5분 동안 인큐베이션시킨 PBS중의 0.05% 트윈(Tween) 20으로 충전시켰다. C3에 대한 항체(사람의 C3-IgG 분획에 특이적인 양고추냉이 페록시다아제 컨쥬게이션된 염소 항체) 100㎕를 PBS중에서 3% BSA로 1:1200으로 희석시켰다. ELISA 판을 어두운 상태에서 약 30분 내지 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션시키고 상기와 같이 세척 완충액으로 세척하였다. 검정물을 30%의 과산화수소 12㎕로 0.1M 나트륨 시트레이트 완충액 30ml중에서 OPD 12mg을 사용하여 전개시켰다. 검정 결과는 ELISA 판 판독기상에서 490nm에서의 광학 밀도 판독에 의해 결정하였다.

각각의 클론을 4회 시험하였다. 비변이된 대조군과 비교하여 40% 미만으로 C3 분해되는 19개의 클론을 선택하였다, 이들 19개의 클론을 상기한 검정에 의해 6회 선별하고, 이들 결과로부터 대조군과 비교하여 30% 미만으로 C3 분해되는 6개의 클론을 선택하였다. 이들 6개의 클론을 각각 11회 선별하고 가장 낮은 C3 분해 활성을 갖는 두 개의 클론을 추가의 연구에 사용하기 위해 선택하였다.

클론들중의 하나의 부분 서열을 수득하고, 546bp의 SmaI 단편을 임의의 프라이머 표지(캘리포니아 라졸라에 소재하는 스트라타겐(Stratagene)으로부터 입수가능한 키트)에 의해³²P로 표지하였다. 서열번호 1로부터의 546bp SmaI 단편을 서던 블롯상에서 다수의 폐렴쌍구균 스트레인의 EcoRI 및 KpnI 분해물에 하이브리드화시켰다. 이러한 동일한 단편을 사용하여 스트렙토코쿠스 뉴모니애 스트레인 CP 1200으로부터 게놈 DNA의 Sau3A 단편의 라이브러리를 선별하였다.

3.5kb 삽입물을 CP 1200 라이브러리로부터 확인하였다. 삽입물을 시퀀싱하고, 정지 코돈을 포함하는 492염기쌍의 오픈 리딩 프레임을 확인하였다. 오픈 리딩 프레임은 아미노산수가 163개이며 예견된 분자량이 약 18,500달톤인 단백질을 코딩하였다.

오픈 리딩 프레임을 증폭시키기 위해 PCR 프라이머를 구성시켰다; BamHI 5' PCR 프라이머는 BamHI 부위를 함유하고; 3' 프라이머는 PstI 부위를 함유하였다. 증폭된 삽입물을 프레임내에서 His 표지된 E. coli 발현 벡터 pQE30 (캘리포니아 산디에고에 소재하는 퀴아겐(Qiagen))에 결찰시켰다. 생성된 플라스미드를 사용하여 lac 억제체 플라스미드 pREP4(퀴아겐(Qiagen))를 함유하는 E. coli 스트레인 BL21(위스콘신 매디슨에 소재하는 노바겐(Novagen))을 형질전환시켰다. E. coli 배양액을 유도하여 His 표지된 단백질을 발현시키고, 상기 단백질을 Ni-NTA 레진(퀴아겐)으로 칼럼 정제하였다. 정제된 단백질을 SDS-PAGE 겔을 사용하여 확인하였다.

실시예 2

20kDa의 C3 분해 단백질분해효소의 확인

20kDa 단백질의 C3 분해 능력을 결정하기 위해서, 0.5mg/ml의 C3(문헌[Tack et al., Meth. Enzymol. 80:64-101, 1984]에 따라서 제조한)를 15% 아크릴아미드를 함유하는 나트륨 도데실 술페이트(SDS) 겔(15% SDS-PAGE 겔)중에서 공중합시켰다. 토드 휴위트 육즙중에서 지수 상태로 성장시킨 스트렙토코쿠스 뉴모니애 스트레인 CP1200의 배양액으로부터 폐렴쌍구균 상청액을 수득하고; 실온에서 30분 동안 5% SDS와 함께 5x10⁸개의 세포를 인규베이팅시킴으로써 폐렴쌍구균 용해물을 수득하였다. 상기 용해물을 10,000mw 컷오프를 갖는 센트리콘(Centricon) 여과 장치(매사추세츠 베보를리에 소재하는 아미콘(Amicon))을 사용하여 10배 농축시켰다. 샘플을 가열한 후 전기영동을 수행하였다. 상청액과 용해물 샘플을 15% C3 함유 SDS-PAGE 겔에 가하고, 염료 전면이 소진될 때까지 150V 및 4℃에서 전기영동을 수행하였다. 상기 겔을 수중 2.5% 트리톤(Triton) X-100(2회, 10분), pH 7.4에서 50mM 트리스-HCl중의 2.5% 트리톤 X-100(2회, 10분) 및 pH 7.4에서 50mM 트리스-HCl (2회, 10분) 50ml씩으로 연속적으로 세척하여 SDS를 제거하였다. 세척후, pH 7.4, 50mM 트리스-HCl 50ml를 겔을 함유하는 접시에 붓고, 상기 접시를 커버링하고, 37℃에서 1.5시간 동안 및 밤새(약 16시간) 인큐베이션시켰다. 상기 겔을 10분 동안 쿠마시에(Coomassie) 블루우로 착색시키고, 모두 탈색시켰다.

두 개의 용해 밴드를 가시화시켰는데, 이중 하나는 용해물 및 상청액중에서 암청색 배경에 대하여 약 20kDa이었다. 폐렴쌍구균 용해물중에서의 C3 단백질분해효소 활성은 37℃에서 1.5시간 동안 인큐베이션시킨 후에 관찰되었으며, 반면에 Pn 상청액중에서의 C3 단백질분해효소 활성은 밤새 인큐베이션한 후에 관찰되었다. 따라서, C3 단백질분해효소가 관련된 주된 세포인 것으로 입증된 것이다.

실시예 3

다수의 스트렙토코쿠스 뉴모니애 스트레인중에 보존되는 20kD 단백질을 코딩하는 유전자

DNA를 다양한 스트렙토코쿠스 뉴모니애 스트레인(임상 단리물 유형 1, 유형 3, LOO2 및 LOO3(유형 3), 유형 4, 유형 14 및 실험실 단리물 CP1200, WU2, R6X, 6303, 109, 110, JY1119, JY182 및 JY53)으로부터 수득하였고, 서열번호 3을 프로브로 사용하여 이들 스트레인으로부터 DNA 중의 20kD 단백질을 코딩시키는 핵산의 존재를 검출하였다. 단리된 염색체 DNA를 EcoRI로 분해하고, 전기영동에 의해 분리하였다. DNA를 고형 지지체에 옮기고, 하이브리드화 및 6X SSC, 5X 덴하르트 0.5% SDS의 세척 조건하에서 말단 표지된 서열번호 3에 하이브리드화시키고 100㎍/ml의 변성되고 단편화된 연어 정액 DNA를 65℃에서 밤새 하이브리드화시키고, 2X SSC중에서 10분 동안 실온에서 1회 그리고 2X SSC, 0.1% SDS중에서 15분 동안 65℃에서 1회 세척한 후, 0.2X SSC, 0.1% SDS중에서 각각 3분 동안 실온에서 2회 세척하였다.

얻어진 결과는 서열번호 3이 DNA 샘플 각각에서 동일하게 하이브리드화되었음을 나타내며, 이는 단백질이 스트레인중에 보존됨을 나타낸다. 일부 스트레인에서, 20kDa의 C3 분해 단백질을 코딩시키는 DNA는 79kDa의 단백질을 코딩시키는 것으로 추정되는 2163bp의 커다란 오픈 리딩 프레임의 일부인 것으로 여겨진다.

실시예 4

스트렙토코쿠스 뉴모니애 DNA/5F1 프로브의 서던 블롯

5㎍의 게놈 DNA 샘플을 11개의 스트렙토코쿠스 뉴모니애 스트레인으로부터 수득하였다. 각각의 샘플을 제한 효소 Kpn1를 사용하여 분해하였다. 그런 다음, 샘플을 아가로우스겔상에 로딩시키고 전기영동에 의해 분해시켰다. 그런 다음, 겔중에 함유된 샘플을 모세관 전달에 의해 아머샴(Amersham)(스웨덴 ??살라에 소재)으로부터 구입가능한 하이본드(Hybond)-N+ 막으로 옮겼다. 5Fl 단리물로부터의 540bp SmaI 단편을,^T7퀵프라임 키트(QuickPrime)(뉴저지 피스카스어웨이에 소재하는 파르마시아(Pharmacia))를 사용하여 P³²로 랜덤 프라임 표지시키고, NucTrap 칼럼(캘리포니아 라졸라에 소재하는 스트라겐)을 사용하여 비혼입된 누클레오티드로부터 정제하고, 하이브리드화시켰다.

하이브리드화 조건은 6XSSC, 5X 덴하르트(Denhardt), 0.5% SDS 및 100㎍/㎖ 단편화되고 변성된 연어 정자 DNA로 65℃에서 밤새 하이브리드화하고, 2X SSC, 0.1% SDS로 실온에서 약 10분간 1회 세척한 다음, 65℃에서 15분간 1회 세척한 후, 0.2XSSC, 0.1% SDS로 실온에서 3 내지 5분 이상 1회 이상 세척하는 것이었다. 블롯은 20kDa의 유전자가 모든 시험된 스트렙토코쿠스 뉴모니애 스트레인에 존재함을 나타내었다.

실시예 5

두 개의 DNA 프라이머를 서열번호 1로부터 제조하고, 이를 사용하여 스트렙토코쿠스 뉴모니애(혈청형 3) 게놈 DNA로부터 20kDa의 유전자 서열을 증폭시켰다. 제 1 프라이머, 5'-프라이머, 서열번호 6은 20kDa 유전자의 ATG 개시 코돈을 스패닝시키고, Ncol 부위를 삽입시키고, 정확한 리딩 프레임을 유지시키기 위해 ATG 개시 코돈 다음에 삽입된 Ala 잔기를 가졌다. 제 2 프라이머, 3'-프라이머, 서열번호 7은 20kDa 유전자의 종결 코돈을 스패닝시키고, BamH1 부위를 삽입시킨다.

5'-GGGGGCCA TGG CC TCA AGC CTT TTA CGT GAA TTG-3';

(서열번호 6)

5'-GGGGG GGA TCC CTA GCT ATA TGA GAT AAA CTT TCC TGC T-3' (서열번호 7)

두 개의 프라이머를 글렌 리써치(Glen Research)(버지니아 스털링에 소재)에서 구입한 시약을 사용하여 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 380A DNA 합성기(캘리포니아 포스터 시티)에서서 합성하였다. 제조업자의 지시에 따라서 퍼킨 엘머 써모사이클러(에이비아이(ABI))를 사용하여 증폭을 수행하였다. 확인된 PCR 생성물을 캘리포니아 칼스버그에 소재하는 인비트로겐(Invitrogen)으로부터 입수한 TA 부착된 PCR 클로닝 벡터 PCR2.1에 결찰시키고, 이를 사용하여 원샵 탑 10F' 적격 세포(인비트로겐)를 형질전환시켰다. 카나마이신 내성 형질전환체를 알칼리 분해에 의해 제조된 플라스미드 DNA의 제한 효소 분석에 의해 선별하였다. 약 500bp의 삽입 단편을 확인한 후 제한 효소 Nco1 및 BamH1로 분해시켰다. 500bp 단편을 저융점 아가로우스겔로부터 정제한 다음, 노바겐(위스콘신 매디슨)으로부터 입수한 T7 프로모팅된 발현 벡터 pET 28a의 Nco1-BamH1 부위에 결찰시켰다.

그런 다음, 결찰 혼합물을 탑 10F' 세포(인비트로겐)로 형질전환시키고, 카나마이신 내성 형질전환체를 알칼리 분해에 의해 제조된 플라스미드 DNA의 제한 효소 분석에 의해 선별하였다. 그런 다음, 재조합 플라스미드(pLP505)를 BL21(노바겐) 세포로 형질전환시키고, 30ug/ml의 카나마이신으로 보충된 SOB 배지에서 배양시켰다. 세포를 0.6의 O.D.₆₀₀,으로 배양시킨 후, 2 내지 4시간 동안 0.4mM IPTG(인디아나 인디아나폴리스에 소재하는 뵈링거 만하임(Boehringer Mannheim)))으로 유도하였다. 전체 세포 용해물을 제조하고, 14% SDS-PAGE겔상에서 전기영동시켰다. 상기 겔을 쿠마시에로 착색시키고, 발현 생성물을 검출해냈다. 쿠마시에 착색된 겔은 28kDa과 18kDa의 분자량 마커 사이에서 밴드를 나타내었으며, 약 20kDa인 것으로 입증되었다.

재조합 pLP505 플라스미드중으로의 삽입물의 DNA 서열을 ABI 370A DNA 시퀀서를 사용하여 수득하였다. DNA 서열을 맥 벡터(Mac Vector)(캘리포니아 캄벨에 소재하는 옥스퍼드 몰리큘라 그룹(Oxford Molecular Group))의 푸스텔(Pustell) DNA 매트릭스 플롯 피처를 사용하여 서열번호 1의 DNA 서열과 함께 정렬시켰다. pLP505 플라스미드로부터 수득된 DNA 서열, 서열번호 1과 스트렙토코쿠스 뉴모니애(혈청형 4) 게놈의 정렬은 20kDa의 단백질을 코딩시키는 오픈 리딩 프레임(ORF)이 약 79kDa의 예견된 분자량을 갖는 단백질(서열번호 4)을 코딩시키는 혈청형 4 게놈의 커다란 ORF의 일부, 즉, 2163bp일 수 있다는 것을 나타내었다. DNA 서열번호 4는 서열번호 5에 나타내어진 바와 같이 예견된 아미노산 서열을 코딩시킨다.

스트렙토코쿠스 뉴모니애(혈청형 4) 게놈을 맥 벡터(캘리포니아 캄벨에 소재하는 옥스퍼드 몰리큘라 그룹)의 클러스탈(Clustal)W 피처를 사용하여 www.tigr.org의 더 인스티튜트 포 게노믹 리써치(The Institute for Genomic Research)로부터 및/또는 www.ncbi.nlm.nih.gov의 엔씨비아이(NCBI)를 통해 수득하였다. 20kDa 아미노산 서열(서열번호 2)와 예견된 79kDa 아미노산 서열(서열번호 5) 사이에서 서열 비교를 수행하였다. 서열번호 2의 아미노산 1-58 및 아미노산 90-132이 각각 서열번호 5의 아미노산 170-227 및 아미노산 258-300과 실질적인 서열 동일성을 지니고 있음이 관찰되었다. 이들 특정 영역을 함유하는 단백질 및 펩티드 또는 폴리펩티드는 본 발명의 바람직한 구체예이다.

입수 가능한 게놈 DNA(혈청형 4) 서열에 기초하여, 2163bp ORF의 측면에 위치한 두 개의 프라이머를 설계한 후, ABI 380A DNA 합성기를 사용하여 합성하였다(서열번호 8 및 9). 서열번호 8은 정확한 리딩 프레임을 유지시키기 위해 삽입된 Nco1 부위 및 ATG 개시 코돈 다음에 부가된 "Glu" 잔기를 갖는 스트렙토코쿠스 뉴모니애 5'-프라이머였다. 서열번호 9는 삽입된 HindIII 부위를 갖는 스트렙토코쿠스 뉴모니애 3'-프라이머였다.

5'-AGA GCT CCT CCC ATG GAA GAT CCG AAT TAT CAG-3'; (서열번호 8)

5'-CCG GGC AAG CTT TTA CTT ACT CTC CT-3'-; (서열번호 9)

그런 다음, 약 2100bp DNA 단편을 4개의 단편을 생성시키는 4개의 상이한 스트렙토코쿠스 뉴모니애 혈청형(혈청형 3, 5, 6B 및 7)으로부터 증폭시켰다. 그런 다음, 4개의 단편 각각을 PCR 클로닝 벡터 PCR2.1(인비트로겐)에 결찰시키고, 이를 사용하여 원샵 탑 10F' 세포(인비트로겐)를 형질전환시켰다. 카나마이신 내성 형질전환체를 알칼리 분해에 의해 제조된 플라스미드 DNA의 제한 분석에 의해 선별하였다. 혈청형 7 PCR 생성물을 함유하는 재조합 플라스미드를 확인하였다(예, pLP512). DNA 서열을 ABI 모델 370A DNA 시퀀서를 사용하여 혈청형 7 클론으로부터 수득하였다. DNA 서열은 본질적으로는 서열번호 4와 동일하였고, 서열번호 5와 본질적으로 동일한 예견된 아미노산 서열을 코딩시켰다.

이상에서와 같이, 본 발명은 특정의 바람직한 구체예를 들어 상기에 기술되었으며, 그 밖의 다수의 구체예, 실시예, 사용예, 변형예, 및 이들 구체예, 실시예, 사용예로부터의 확대가 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 실시될 수 있다는 것은 당업자에게는 자명할 것이다.

SEQUENCE LISTING

＜110＞ HOSTETTER, Margaret K.

FINKEL, David J.

CHENG, Qi

GREEN, Bruce A.

MASI, Amy W.

REGENTS OF THE UNIVERSITY OF MINNESOTA

＜120＞ HUMAN COMPLEMENT C3-DEGRADING PROTEINASE FROM

STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE

＜130＞ 11000570201 Human Complement

＜140＞ Not Assigned

＜141＞ 1998-09-24

＜150＞ 60/059,907

＜151＞ 1997-09-24

＜160＞ 10

＜170＞ PatentIn Ver. 2.0

＜210＞ 1

＜211＞ 492

＜212＞ DNA

＜213＞ Streptococcus pneumoniae

＜400＞ 1

atgtcaagcc ttttacgtga attgtatgct aaacccttat cagaacgcca tgtagaatct 60

gatggtctta ttttcgaccc agcgcaaatc acaagtcgaa ccgccaatgg tgttgctgta 120

ccgcacggag accattatca ctttattcct tattcacaac tgtcaccttt ggaagaaaaa 180

ttggtcgtat tattcccctt cgttatcgtt caaaccattg ggtaccagat tcaaagacca 240

gaacaaccag tccacaatcg actccgggaa cctagtccaa gtccgaaacc tgcaccaaat 300

cctcaaccag ctccaagcaa tccaattgat gagaaattgg tcaaagaagc tgttcgaaaa 360

gtaggcgatg gttatgtctt tgaggagaat ggagttgcct cgttatatcc caagccaagg 420

atcttacagc agaaacagca gcaggcattg atagcaaact ggccaagcag gaaagtttat 480

ctcataagct ag 492

＜210＞ 2

＜211＞ 163

＜212＞ PRT

＜213＞ Streptococcus pneumoniae

＜400＞ 2

Met Ser Ser Leu Leu Arg Glu Leu Tyr Ala Lys Pro Leu Ser Glu Arg

1 5 10 15

His Val Glu Ser Asp Gly Leu Ile Phe Asp Pro Ala Gln Ile Thr Ser

20 25 30

Arg Thr Ala Asn Gly Val Ala Val Pro His Gly Asp His Tyr His Phe

35 40 45

Ile Pro Tyr Ser Gln Leu Ser Pro Leu Glu Glu Lys Leu Val Val Leu

50 55 60

Phe Pro Phe Val Ile Val Gln Thr Ile Gly Tyr Gln Ile Gln Arg Pro 65

70 75 80

Glu Gln Pro Val His Asn Arg Leu Arg Glu Pro Ser Pro Ser Pro Lys

85 90 95

Pro Ala Pro Asn Pro Gln Pro Ala Pro Ser Asn Pro Ile Asp Glu Lys

100 105 110

Leu Val Lys Glu Ala Val Arg Lys Val Gly Asp Gly Tyr Val Phe Glu

115 120 125

Glu Asn Gly Val Ala Ser Leu Tyr Pro Lys Pro Arg Ile Leu Gln Gln

130 135 140

Lys Gln Gln Gln Ala Leu Ile Ala Asn Trp Pro Ser Arg Lys Val Tyr 145

150 155 160

Leu Ile Ser

＜210＞ 3

＜211＞ 492

＜212＞ DNA

＜213＞ Streptococcus pneumoniae

＜400＞ 3

ctagcttatg agataaactt tcctgcttgg ccagtttgct atcaatgcct gctgctgttt 60

ctgctgtaag atccttggct tgggatataa cgaggcaact ccattctcct caaagacata 120

accatcgcct acttttcgaa cagcttcttt gaccaatttc tcatcaattg gattgcttgg 180

agctggttga ggatttggtg caggtttcgg acttggacta ggttcccgga gtcgattgtg 240

gactggttgt tctggtcttt gaatctggta cccaatggtt tgaacgataa cgaaggggaa 300

taatacgacc aatttttctt ccaaaggtga cagttgtgaa taaggaataa agtgataatg 360

gtctccgtgc ggtacagcaa caccattggc ggttcgactt gtgatttgcg ctgggtcgaa 420

aataagacca tcagattcta catggcgttc tgataagggt ttagcataca attcacgtaa 480

aaggcttgac at 492

＜210＞ 4

＜211＞ 2163

＜212＞ DNA

＜213＞ Streptococcus pneumoniae

＜400＞ 4

atgaaagatc cgaattatca gttgaaggat tcagacattg tcaatgaaat caagggtggt 60

tatgttatca aggtagatgg aaaatactat gtttacctta aggatgcagc tcatgcggat 120

aatattcgga caaaagaaga gattaaacgt cagaagcagg aacacagtca taatcacggg 180

ggtggttcta acgatcaagc agtagttgca gccagagccc aaggacgcta tacaacggat 240

gatggttata tcttcaatgc atctgatatc attgaggaca cgggtgatgc ttatatcgtt 300

cctcacggcg accattacca ttacattcct aagaatgagt tatcagctag cgagttagct 360

gctgcagaag cctattggaa tgggaagcag ggatctcgtc cttcttcaag ttctagttat 420

aatgcaaatc cagctcaacc aagattgtca gagaaccaca atctgactgt cactccaact 480

tatcatcaaa atcaagggga aaacatttca agccttttac gtgaattgta tgctaaaccc 540

ttatcagaac gccatgtgga atctgatggc cttattttcg acccagcgca aatcacaagt 600

cgaaccgcca gaggtgtagc tgtccctcat ggtaaccatt accactttat cccttatgaa 660

caaatgtctg aattggaaaa acgaattgct cgtattattc cccttcgtta tcgttcaaac 720

cattgggtac cagattcaag accagaacaa ccaagtccac aatcgactcc ggaacctagt 780

ccaagtccgc aacctgcacc aaatcctcaa ccagctccaa gcaatccaat tgatgagaaa 840

ttggtcaaag aagctgttcg aaaagtaggc gatggttatg tctttgagga gaatggagtt 900

tctcgttata tcccagccaa ggatctttca gcagaaacag cagcaggcat tgatagcaaa 960

ctggccaagc aggaaagttt atctcataag ctaggagcta agaaaactga cctcccatct 1020

agtgatcgag aattttacaa taaggcttat gacttactag caagaattca ccaagattta 1080

cttgataata aaggtcgaca agttgatttt gaggctttgg ataacctgtt ggaacgactc 1140

aaggatgtcc caagtgataa agtcaagtta gtggatgata ttcttgcctt cttagctccg 1200

attcgtcatc cagaacgttt aggaaaacca aatgcgcaaa ttacctacac tgatgatgag 1260

attcaagtag ccaagttggc aggcaagtac acaacagaag acggttatat ctttgatcct 1320

cgtgatataa ccagtgatga gggggatgcc tatgtaactc cacatatgac ccatagccac 1380

tggattaaaa aagatagttt gtctgaagct gagagagcgg cagcccaggc ttatgctaaa 1440

gagaaaggtt tgacccctcc ttcgacagac catcaggatt caggaaatac tgaggcaaaa 1500

ggagcagaag ctatctacaa ccgcgtgaaa gcagctaaga aggtgccact tgatcgtatg 1560

ccttacaatc ttcaatatac tgtagaagtc aaaaacggta gtttaatcat acctcattat 1620

gaccattacc ataacatcaa atttgagtgg tttgacgaag gcctttatga ggcacctaag 1680

gggtatactc ttgaggatct tttggcgact gtcaagtact atgtcgaaca tccaaacgaa 1740

cgtccgcatt cagataatgg ttttggtaac gctagcgacc atgttcaaag aaacaaaaat 1800

ggtcaagctg ataccaatca aacggaaaaa ccaagcgagg agaaacctca gacagaaaaa 1860

cctgaggaag aaacccctcg agaagagaaa ccgcaaagcg agaaaccaga gtctccaaaa 1920

ccaacagagg aaccagaaga atcaccagag gaatcagaag aacctcaggt cgagactgaa 1980

aaggttgaag aaaaactgag agaggctgaa gatttacttg gaaaaatcca ggatccaatt 2040

atcaagtcca atgccaaaga gactctcaca ggattaaaaa ataatttact atttggcacc 2100

caggacaaca atactattat ggcagaagct gaaaaactat tggctttatt aaaggagagt 2160

aag 2163

＜210＞ 5

＜211＞ 721

＜212＞ PRT

＜213＞ Streptococcus pneumoniae

＜400＞ 5

Met Lys Asp Pro Asn Tyr Gln Leu Lys Asp Ser Asp Ile Val Asn Glu

1 5 10 15

Ile Lys Gly Gly Tyr Val Ile Lys Val Asp Gly Lys Tyr Tyr Val Tyr

20 25 30

Leu Lys Asp Ala Ala His Ala Asp Asn Ile Arg Thr Lys Glu Glu Ile

35 40 45

Lys Arg Gln Lys Gln Glu His Ser His Asn His Gly Gly Gly Ser Asn

50 55 60

Asp Gln Ala Val Val Ala Ala Arg Ala Gln Gly Arg Tyr Thr Thr Asp 65

70 75 80

Asp Gly Tyr Ile Phe Asn Ala Ser Asp Ile Ile Glu Asp Thr Gly Asp

85 90 95

Ala Tyr Ile

Val Pro His Gly Asp His Tyr His Tyr Ile Pro Lys Asn 100

105 110

Glu Leu Ser Ala Ser Glu Leu Ala Ala Ala Glu Ala Tyr Trp Asn Gly

115 120 125

Lys Gln Gly Ser Arg Pro Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Asn Ala Asn Pro

130 135 140

Ala Gln Pro

Arg Leu Ser Glu Asn His Asn Leu Thr Val Thr Pro Thr 145

150 155 160

Tyr His Gln Asn Gln Gly Glu Asn Ile Ser Ser Leu Leu Arg Glu Leu

165 170 175

Tyr Ala Lys Pro Leu Ser Glu Arg His Val Glu Ser Asp Gly Leu Ile

180 185 190

Phe Asp Pro Ala Gln Ile Thr Ser Arg Thr Ala Arg Gly Val Ala Val

195 200 205

Pro His Gly Asn His Tyr His Phe Ile Pro Tyr Glu Gln Met Ser Glu

210 215 220

Leu Glu Lys Arg Ile Ala Arg Ile Ile Pro Leu Arg Tyr Arg Ser Asn

225 230 235 240

His Trp Val Pro Asp Ser Arg Pro Glu Gln Pro Ser Pro Gln Ser Thr

245 250 255

Pro Glu Pro Ser Pro Ser Pro Gln Pro Ala Pro Asn Pro Gln Pro Ala

260 265 270

Pro Ser Asn Pro Ile Asp Glu Lys Leu Val Lys Glu Ala Val Arg Lys

275 280 285

Val Gly Asp Gly Tyr Val Phe Glu Glu Asn Gly Val Ser Arg Tyr Ile

290 295 300

Pro Ala Lys Asp Leu Ser Ala Glu Thr Ala Ala Gly Ile Asp Ser Lys 305

310 315 320

Leu Ala Lys Gln Glu Ser Leu Ser His Lys Leu Gly Ala Lys Lys Thr

325 330 335

Asp Leu Pro Ser Ser Asp Arg Glu Phe Tyr Asn Lys Ala Tyr Asp Leu

340 345 350

Leu Ala Arg Ile His Gln Asp Leu Leu Asp Asn Lys Gly Arg Gln Val

355 360 365

Asp Phe Glu Ala Leu Asp Asn Leu Leu Glu Arg Leu Lys Asp Val Pro

370 375 380

Ser Asp Lys

Val Lys Leu Val Asp Asp Ile Leu Ala Phe Leu Ala Pro 385

390 395 400

Ile Arg His Pro Glu Arg Leu Gly Lys Pro Asn Ala Gln Ile Thr Tyr

405 410 415

Thr Asp Asp Glu Ile Gln Val Ala Lys Leu Ala Gly Lys Tyr Thr Thr

420 425 430

Glu Asp Gly Tyr Ile Phe Asp Pro Arg Asp Ile Thr Ser Asp Glu Gly

435 440 445

Asp Ala Tyr Val Thr Pro His Met Thr His Ser His Trp Ile Lys Lys

450 455 460

Asp Ser Leu Ser Glu Ala Glu Arg Ala Ala Ala Gln Ala Tyr Ala Lys 465

470 475 480

Glu Lys Gly Leu Thr Pro Pro Ser Thr Asp His Gln Asp Ser Gly Asn

485 490 495

Thr Glu Ala Lys Gly Ala Glu Ala Ile Tyr Asn Arg Val Lys Ala Ala

500 505 510

Lys Lys Val Pro Leu Asp Arg Met Pro Tyr Asn Leu Gln Tyr Thr Val

515 520 525

Glu Val Lys Asn Gly Ser Leu Ile Ile Pro His Tyr Asp His Tyr His

530 535 540

Asn Ile Lys Phe Glu Trp Phe Asp Glu Gly Leu Tyr Glu Ala Pro Lys 545

550 555 560

Gly Tyr Thr Leu Glu Asp Leu Leu Ala Thr Val Lys Tyr Tyr Val Glu

565 570 575

His Pro Asn Glu Arg Pro His Ser Asp Asn Gly Phe Gly Asn Ala Ser

580 585 590

Asp His Val Gln Arg Asn Lys Asn Gly Gln Ala Asp Thr Asn Gln Thr

595 600 605

Glu Lys Pro

Ser Glu Glu Lys Pro Gln Thr Glu Lys Pro Glu Glu Glu 610

615 620

Thr Pro Arg Glu Glu Lys Pro Gln Ser Glu Lys Pro Glu Ser Pro Lys 625

630 635 640

Pro Thr Glu Glu Pro Glu Glu Ser Pro Glu Glu Ser Glu Glu Pro Gln

645 650 655

Val Glu Thr Glu Lys Val Glu Glu Lys Leu Arg Glu Ala Glu Asp Leu

660 665 670

Leu Gly Lys

Ile Gln Asp Pro Ile Ile Lys Ser Asn Ala Lys Glu Thr 675

680 685

Leu Thr Gly Leu Lys Asn Asn Leu Leu Phe Gly Thr Gln Asp Asn Asn

690 695 700

Thr Ile Met Ala Glu Ala Glu Lys Leu Leu Ala Leu Leu Lys Glu Ser 705

710 715 720

Lys

＜210＞ 6

＜211＞ 34

＜212＞ DNA

＜213＞ Artificial Sequence

＜220＞

＜223＞ Description of Artificial Sequence: primer

＜220＞

＜223＞ Incorporates a Nco1 site and a DNA codon for Ala.

＜400＞ 6

gggggccatg gcctcaagcc ttttacgtga attg 34

＜210＞ 7

＜211＞ 39

＜212＞ DNA

＜213＞ Artificial Sequence

＜220＞

＜223＞ Description of Artificial Sequence: primer

＜220＞

＜223＞ Incorporates a BamH1 site.

＜400＞ 7

gggggggatc cctagctata tgagataaac tttcctgct 39

＜210＞ 8

＜211＞ 33

＜212＞ DNA

＜213＞ Artificial Sequence

＜220＞

＜223＞ Description of Artificial Sequence: primer

＜220＞

＜223＞ Incorporates a Nco1 site and a DNA codon for Glu.

＜400＞ 8

agagctcctc ccatggaaga tccgaattat cag 33

＜210＞ 9

＜211＞ 26

＜212＞ DNA

＜213＞ Artificial Sequence

＜220＞

＜223＞ Description of Artificial Sequence: primer

＜220＞

＜223＞ Incorporates a HinD III site.

＜400＞ 9

ccgggcaagc ttttacttac tctcct 26

＜210＞ 10

＜211＞ 40

＜212＞ DNA

＜213＞ Artificial Sequence

＜220＞

＜223＞ Description of Artificial Sequence: probe

＜220＞

＜223＞ Oligonucleotide

＜400＞ 10

gaaaacaata atgtagaaga ctactttaaa gaaggttaga 40

10

Claims

사람 보체 단백질 C3를 분해할 수 있는, 서열번호 2와 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 단리된 단백질.
제 1항에 있어서, 스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)로부터 단리됨을 특징으로 하는 단백질.
제 1항에 있어서, 재조합 단백질임을 특징으로 하는 단백질.
제 1항에 있어서, 분자량이 약 15kDa 내지 약 25kDa임을 특징으로 하는 단백질.
제 1항의 단백질로부터의 15개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 단리된 펩티드 또는 폴리펩티드.
서열번호 2의 15개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 단리된 펩티드 또는 폴리펩티드.
서열번호 2를 포함하는 단리된 단백질.
제 7항에 있어서, 분자량이 약 15kDa 내지 약 25kDa임을 특징으로 하는 단백질.
제 8항에 있어서, 스트렙토코쿠스 뉴모니애로부터 단리됨을 특징으로 하는 단백질.
제 8항에 있어서, 사람 보체 단백질 C3를 분해함을 특징으로 하는 단백질.
제 7항에 있어서, 서열번호 2임을 특징으로 하는 단백질.
서열번호 2의 약 1개 내지 약 58개의 아미노산을 포함하는 단리된 단백질.
제 12항에 있어서, 서열번호 2의 약 90개 내지 약 132개의 아미노산을 추가로 포함함을 특징으로 하는 단백질.
서열번호 5의 약 170개 내지 약 227개의 아미노산을 포함하는 단리된 단백질.
제 14항에 있어서, 서열번호 5의 약 258개 내지 약 300개의 아미노산을 추가로 포함함을 특징으로 하는 단백질.
사람 보체 단백질 C3를 분해하는 단리된 단백질로서, 단백질을 코드화하는 핵산이 매우 엄격한 하이브리드화 조건 하에 서열번호 1 또는 이것의 상보적 가닥에 하이브리드화하는 단백질.
사람 보체 C3를 분해할 수 있는, 스트렙토코쿠스 뉴모니애로부터의 약 15kDa 내지 약 25kDa의 단리된 단백질.
단백질로부터 유도된 15개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 유효량의 면역계 자극 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하는 면역계 자극 조성물로서, 단백질이 서열번호 2와 80% 이상의 서열 동일성을 가지며, 사람 보체 단백질 C3를 분해할 수 있는 조성물.
제 18항에 있어서, 단백질이 스트렙토코쿠스 뉴모니애로부터 단리됨을 특징으로 하는 조성물.
제 19항에 있어서, 스트렙토코쿠스 뉴모니애로부터 단리된 하나 이상의 다른 면역계 자극 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드를 추가로 포함함을 특징으로 하는 조성물.
치료적 유효량의 단백질의 일부 또는 전부를 포함하는 면역계 자극 조성물로서, 단백질을 코드화하는 핵산이 엄격한 하이브리드화 조건 하에 서열번호 1 또는 이것의 상보적 가닥에 하이브리드화하는 조성물.
스트렙토코쿠스 뉴모니애 감염 또는 콜로니화에 대해 포유동물을 면역시키거나 치료하기에 효과적인 유효량의 제 17항의 단백질의 일부 또는 전부, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 면역계 자극 조성물.
제 22항에 있어서, 단백질이 포유동물에게 치료 효과를 제공하기에 유효한 양으로 제공됨을 특징으로 하는 조성물.
서열번호 2와 80% 이상의 서열 동일성을 포함하는 단백질에 결합할 수 있고, 사람 보체 단백질 C3를 분해할 수 있는 항체.
제 24항에 있어서, 모노클로날 항체임을 특징으로 하는 항체.
제 24항에 있어서, 마우스, 래트, 염소, 닭, 사람 또는 토끼로부터 수득됨을 특징으로 하는 항체.
단백질의 일부 또는 전부에 결합할 수 있는 항체로서, 단백질을 코드화하는 핵산이 매우 엄격한 하이브리드화 조건 하에 서열번호 1 또는 이것의 상보적 가닥에 하이브리드화하는 항체.
매우 엄격한 하이브리드화 조건 하에 서열번호 1 또는 이것의 상보적 가닥에 하이브리드화할 수 있는 단리된 핵산 단편.
제 28항에 있어서, 스트렙토코쿠스 뉴모니애로부터 단리됨을 특징으로 하는 핵산 단편.
제 28항에 있어서, 핵산 단편이 단백질의 일부 또는 전부를 코드화함을 특징으로 하는 핵산 단편.
제 30항에 있어서, 단백질이 사람 보체 C3를 분해함을 특징으로 하는 핵산 단편.
제 28항에 있어서, 핵산 벡터임을 특징으로 하는 핵산 단편.
제 32항에 있어서, 벡터가 단백질의 일부 또는 전부를 생성시킬 수 있는 발현 벡터임을 특징으로 하는 핵산 단편.
제 28항의 핵산을 포함하는 세포.
제 34항에 있어서, 세포가 박테리움 또는 진핵세포임을 특징으로 하는 세포.
서열번호 1 또는 이것의 상보적 가닥의 약 1개 내지 약 174개의 누클레오티드를 포함하는 단리된 핵산 단편.
제 36항에 있어서, 서열번호 1 또는 이것의 상보적 가닥의 약 320개 내지 약 492개의 누클레오티드를 추가로 포함함을 특징으로 하는 단리된 핵산 단편.
서열번호 1 또는 이것의 상보적 가닥의 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 단편.
서열번호 1 또는 이것의 상보적 가닥을 포함하는 이중 가닥 DNA 서열에 의해 전사된 RNA 단편.
치료적 유효량의 단백질의 일부 또는 전부를 약제학적으로 허용되는 담체 중에 포함하는 조성물을 포유동물에게 투여하여 면역 반응을 생성시키는 단계를 포함하여, 포유동물에게서 스트렙토코쿠스 뉴모니애에 대한 면역 반응을 생성시키는 방법으로서, 단백질을 코드화하는 핵산이 매우 엄격한 하이브리드화 조건 하에 서열번호 1 또는 이것의 상보적 가닥에 하이브리드화하는 방법.
제 40항에 있어서, 면역 반응이 B세포 반응, T세포 반응, 상피세포 반응 또는 내피세포 반응임을 특징으로 하는 방법.
제 40항에 있어서, 단백질의 일부 또는 전부가 길이가 15개 이상의 아미노산임을 특징으로 하는 방법.
제 40항에 있어서, 조성물이 스트렙토코쿠스 뉴모니애로부터의 하나 이상의 면역계 자극 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 40항에 있어서, 단백질의 일부 또는 전부가 서열번호 2의 15개 이상의 아미노산을 포함함을 특징으로 하는 방법.
스트렙토코쿠스 뉴모니애 매개된 C3 분해를 억제하는 방법으로서,

스트렙토코쿠스 뉴모니애 박테리움을, 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 이것의 단편에 결합할 수 있는 항체와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
이종이식에서 C3 매개된 염증 및 거부반응을 억제하는 방법으로서,

이종이식에 사용된 동물의 장기의 표면상에서, 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 이것의 단편을 발현시키는 단계를 포함하는 방법.
매우 엄격한 하이브리드화 조건 하에 서열번호 1 또는 이것의 상보적 가닥의 핵산 서열의 일부 또는 전부에 하이브리드화하는 15개 이상의 누클레오티드의 영역을 포함하는 단리된 핵산 분자.
매우 엄격한 하이브리드화 조건 하에 서열번호 1 또는 이것의 상보적 가닥 중의 하나 이상의 영역에 하이브리드화하는 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자로서, 영역이 누클레오티드 1-174 및 320-492로 구성된 군으로부터 선택되는 핵산 분자.
매우 엄격한 하이브리드화 조건 하에 서열번호 4 또는 이것의 상보적 가닥의 핵산 서열의 일부 또는 전부에 하이브리드화하는 15개 이상의 누클레오티드의 영역을 포함하는 단리된 핵산 분자.
매우 엄격한 하이브리드화 조건 하에 서열번호 4 또는 이것의 상보적 가닥 중의 하나 이상의 영역에 하이브리드화하는 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자로서, 영역이 누클레오티드 507-681 및 827-999로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 핵산 분자.
제 49항에 있어서, 단백질의 일부 또는 전부를 코드화하는 핵산 분자.
제 51항에 있어서, 단백질이 서열번호 5의 추정된 아미노산을 가짐을 특징으로 하는 핵산 분자.
서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 서열을 갖는 단리된 핵산 단편.
치료적 유효량의 단백질의 일부 또는 전부를 포함하는 면역계 자극 조성물로서, 단백질을 코드화하는 핵산이 매우 엄격한 하이브리드화 조건 하에 서열번호 4 또는 이것의 상보적 가닥에 하이브리드화하는 조성물.
치료적 유효량의 단백질의 일부 또는 전부를 약제학적으로 허용되는 담체 중에 포함하는 조성물을 포유동물에게 투여하여 면역 반응을 생성시키는 단계를 포함하여, 포유동물에게서 스트렙토코쿠스 뉴모니애에 대한 면역 반응을 생성시키는 방법으로서, 단백질을 코드화하는 핵산이 매우 엄격한 하이브리드화 조건 하에 서열번호 4 또는 이것의 상보적 가닥에 하이브리드화하는 방법.
스트렙토코쿠스 뉴모니애 감염 또는 콜로니화에 대해 포유동물을 면역시키거나 치료하기에 효과적인 유효량의 제 51항의 단백질의 일부 또는 전부, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 면역계 자극 조성물.
제 56항에 있어서, 단백질이 포유동물에게 치료 효과를 제공하기에 유효한 양으로 제공됨을 특징으로 하는 조성물.
제 56항에 있어서, 조성물이 백신임을 특징으로 하는 조성물.
서열번호 5를 갖는 폴리펩티드.
제 23항에 있어서, 핵산 서열 또는 이것의 상보적 가닥에 의해 코드화된 단백질이 하나 이상의 내인성 스트렙토코쿠스 뉴모니애 핵산 서열의 전사 또는 번역을 억제함을 특징으로 하는 조성물.
제 56항에 있어서, 핵산 서열 또는 이것의 상보적 가닥에 의해 코드화된 단백질이 하나 이상의 내인성 스트렙토코쿠스 핵산 서열의 전사 또는 번역을 억제함을 특징으로 하는 조성물.