JP7360440B2 - Pd-l1及びcd137に結合する抗体分子 - Google Patents
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Description
本発明は、PD-L1及びCD137の両方に結合し、CD137のアゴニスト作用を誘導することができる抗体分子に関する。抗体分子は、PD-L1のCDRベースの結合部位と、抗体分子の定常ドメインに位置するCD137抗原結合部位とを含む。本発明の抗体分子は、例えば、癌などの疾患の処置に、用途が見出される。
プログラム細胞死1(PD-1)及びそのリガンドPD-L1(CD274、B7-H1)及びPD-L2(B7-DC)は、T細胞の活性化、耐性、及び免疫病理学のバランスを調節する阻害シグナルを伝達する。PD-L1は、全ての免疫細胞及び一部の腫瘍細胞で一過性に発現する。PD-L1は、B7タンパク質ファミリーのメンバーであり、B7.1及びB7.2とおよそ20%のアミノ酸配列同一性を共有している。ヒトPD-L1は、PD-L1のマウス及びカニクイザルのオルソログとそれぞれ70%及び93%のアミノ酸同一性を共有している。
上記の背景セクションで説明したように、CD137アゴニスト分子の臨床開発は、用量を制限する高グレードの肝臓の炎症(ウレルマブ)又は低い臨床効果(ウトミルマブ)のいずれかに関連する処置のため、制限されてきた。
(a)PD-L1の相補性決定領域(CDR)ベースの抗原結合部位;及び
(b)抗体分子のCH3ドメインに位置するCD137抗原結合部位
を含み、CDRベースの抗原結合部位が、
(i)それぞれ配列番号1、2、3、4、5及び6[E12v2];
(ii)それぞれ配列番号1、2、3、18、19及び20[E05v2];又は
(iii)それぞれ配列番号1、2、3、18、19及び29[G12v2]
に記載のCDR1~6を含み、CD137抗原結合部位が、それぞれ、CH3ドメインのAB、CD及びEF構造ループに位置する第1の配列及び第2の配列を含み、第1及び第2の配列が、それぞれ配列番号113及び114[FS22-172-003]、又は79及び80[FS22-53-008]に記載の配列を有する、プログラム死リガンド1(PD-L1)及びCD137に結合する抗体分子。
(a)PD-L1の相補性決定領域(CDR)ベースの抗原結合部位;及び
(b)抗体分子のCH3ドメインに位置するCD137抗原結合部位
を含み、CDRベースの抗原結合部位が、
(i)それぞれ配列番号7、8、9、10、11及び6[E12v2];
(ii)それぞれ配列番号21、8、9、22、11及び20[E05v2];又は
(iii)それぞれ配列番号21、8、9、22、11及び29[G12v2]
に記載のIMGTに従うCDR1~6を含み、CD137抗原結合部位が、それぞれ、CH3ドメインのAB、CD及びEF構造ループに位置する第1の配列及び第2の配列を含み、第1及び第2の配列が、それぞれ配列番号113及び114[FS22-172-003]、又は79及び80[FS22-53-008]に記載の配列を有する、プログラム死リガンド1(PD-L1)及びCD137に結合する抗体分子。
(i)それぞれ配列番号12及び14[E12v2];
(ii)それぞれ配列番号23及び25[E05v2];又は
(iii)それぞれ配列番号23及び30[G12v2]
に記載のものである、[5]から[6]のいずれか一項に記載の抗体分子。
(i)配列番号115[FS22-172-003];又は
(ii)配列番号81[FS22-53-008]
に記載のCH3ドメイン配列を含む、[1]から[15]のいずれか一項に記載の抗体分子。
(i)それぞれ配列番号134及び17に記載のFS22-172-003-AA/E12v2;
(ii)それぞれ配列番号137及び28に記載のFS22-172-003-AA/E05v2;
(iii)それぞれ配列番号140及び33に記載のFS22-172-003-AA/G12v2;
(iv)それぞれ配列番号143及び17に記載のFS22-053-008-AA/E12v2;
(v)それぞれ配列番号146及び28に記載のFS22-053-008-AA/E05v2;又は
(vi)それぞれ配列番号149及び33に記載のFS22-053-008-AA/G12v2
の重鎖及び軽鎖を含む、[1]から[19]のいずれか一項に記載の抗体分子。
(i)それぞれ配列番号32及び39、又は135及び136に記載のFS22-172-003-AA/E12v2、好ましくは、それぞれ配列番号32及び39;
(ii)それぞれ配列番号138及び139に記載のFS22-172-003-AA/E05v2;
(iii)それぞれ配列番号141及び142に記載のFS22-172-003-AA/G12v2;
(iv)それぞれ配列番号144及び145に記載のFS22-053-008-AA/E12v2;
(v)それぞれ配列番号147及び148に記載のFS22-053-008-AA/E05v2;又は
(vi)それぞれ配列番号150及び151に記載のFS22-053-008-AA/G12v2
の重鎖核酸配列及び/又は軽鎖核酸配列を含む、[1]から[2]、[5]から[7]、[10]から[16]、[19]から[20]及び[23]から[33]のいずれか一項に記載の抗体分子をコードする、1つ又は複数の核酸分子。
ここで、本発明の態様及び実施形態を、添付の図面を参照して論ずる。さらなる態様及び実施形態は、当業者には明らかであろう。この文章で言及される全ての文書は、参照により本明細書に組み込まれる。
(i)抗体E12v2のVH及びVLドメイン配列は、それぞれ配列番号12及び14に示され;
(ii)抗体E05v2のVH及びVLドメイン配列は、それぞれ配列番号23及び25に示され;
(iii)抗体G12v2のVH及びVLドメイン配列は、それぞれ配列番号23及び30に示され;
(iv)抗体lam-G02v3のVH及びVLドメイン配列は、それぞれ配列番号23及び41に示される。
ここで、X1は、P又はTであり、好ましくは、X1は、Pであり;
ここで、CDR配列は、IMGT番号付けスキームに従って定義される。
(i)それぞれ配列番号7、8及び9[E12v2];又は
(ii)それぞれ配列番号21、8及び9[E05v2、G12v2又はlam-G02v3]、
のVHドメインCDR1、CDR2及びCDR3の配列を含み得、
ここで、CDR配列は、IMGT番号付けスキームに従って定義される。
ここで、X2は、S又はGであり、X3は、N又はGであり;X4は、T又はNであり;X5は、S又はLであり;X6は、T又はSであり;X7は、T又はWであり;X8は、不存在又はRであり;X9は、Y、R、又はVであり;
ここで、CDR配列及び位置の番号付けは、Kabat番号付けスキームに従って定義される。
(i)それぞれ配列番号4、5及び6[E12v2];
(ii)それぞれ配列番号18、19及び20[E05v2];
(iii)それぞれ配列番号18、19及び29[G12v2];又は
(iv)それぞれ配列番号34、35及び36[lam-G02v3]、
のVLドメインCDR1、CDR2及びCDR3の配列を含み得、
ここで、CDR配列は、Kabat番号付けスキームに従って定義される。
ここで、X10は、G又はSであり;X11は、N又はGであり;X12は、不在又はTであり;X13は、T、W又はPであり;X14は、P又はRであり;X15は、Y又はRであり、
ここで、CDR配列及び位置の番号付けは、IMGT番号付けスキームに従って定義される。
(i)それぞれ配列番号10、11及び6[E12v2];
(ii)それぞれ配列番号22、11及び20[E05v2];
(iii)それぞれ配列番号22、11及び29[G12v2];又は
(iv)それぞれ配列番号37、38及び36[lam-G02v3]、
のVLドメインCDR1、CDR2及びCDR3の配列を含み得、
ここで、CDR配列は、IMGT番号付けスキームに従って定義される。
(i)それぞれ配列番号79及び80[FS22-053-008];
(ii)それぞれ配列番号79及び83[FS22-053-009];
(iii)それぞれ配列番号79及び86[FS22-053-011];
(iv)それぞれ配列番号79及び89[FS22-053-017];
(v)それぞれ配列番号79及び92[FS22-053-014];
(vi)それぞれ配列番号79及び95[FS22-053-010];
(vii)それぞれ配列番号79及び98[FS22-053-012];
(viii)それぞれ配列番号79及び101[FS22-053-013];
(ix)それぞれ配列番号79及び104[FS22-053-015];
(x)それぞれ配列番号79及び107[FS22-053-016];
(xi)それぞれ配列番号79及び110[FS22-053];
(xii)それぞれ配列番号113及び114[FS22-172-003];
(xiii)それぞれ配列番号117及び114[FS22-172-002];
(xiv)それぞれ配列番号120及び114[FS22-172-004];
(xv)それぞれ配列番号123及び114[FS22-172-001];
(xvi)それぞれ配列番号126及び114[FS22-172-005];
(xvii)それぞれ配列番号129及び114[FS22-172-006];又は
(xviii)それぞれ配列番号129及び114[FS22-172];
に記載の第1及び/又は第2の、好ましくは第1及び第2の配列を含み、ここで、第1及び第2の配列は、好ましくは、それぞれ、抗体分子のCH3ドメインの14位と17位、及び91位と99位の間に位置する。
(i)それぞれ配列番号79及び80[FS22-053-008];
(ii)それぞれ配列番号79及び83[FS22-053-009];
(iii)それぞれ配列番号79及び86[FS22-053-011];
(iv)それぞれ配列番号79及び89[FS22-053-017];
(v)それぞれ配列番号113及び114[FS22-172-003];
(vi)それぞれ配列番号117及び114[FS22-172-002];又は
(vii)それぞれ配列番号120及び114[FS22-172-004];
に記載の第1及び/又は第2の、好ましくは第1及び第2の配列を含む。
(i)1.3位及び1.2位のアラニン残基;及び/又は
(ii)114位のアラニン又はグリシン;及び/又は
(iii)84.4位のアラニン、グルタミン又はグリシン;
を含み、ここで、アミノ酸残基の番号付けは、IMGT番号付けスキームに従う。
(i)1.3位のアラニン残基;及び
(ii)1.2位のアラニン残基;
を含み、ここで、アミノ酸残基の番号付けは、IMGT番号付けスキームに従う。
(i)1.3位のアラニン残基;
(ii)1.2位のアラニン残基;及び
(iii)114位のアラニン;
を含み、ここで、アミノ酸残基の番号付けは、IMGT番号付けスキームに従う。
(a)PD-L1のCDRベースの抗原結合部位;及び
(b)抗体分子のCH3ドメインに位置するCD137抗原結合部位
を含み、CDRベースの抗原結合部位は、抗体E12v2、E05v2、又はG12v2、好ましくはE12v2の3つのVH CDR及び3つのVL CDR(CDR1~6)を含み;
CD137抗原結合部位は、それぞれ、CH3ドメインのAB、CD及びEF構造ループに位置する第1の配列及び第2の配列を含み、第1及び第2の配列は、それぞれ配列番号113及び114[FS22-172-003]、又は79及び80[FS22-53-008]に記載の配列を有し、好ましくは、第1及び第2の配列は、配列番号113及び114[FS22-172-003]に記載の配列を有する。
(a)PD-L1のCDRベースの抗原結合部位;及び
(b)抗体分子のCH3ドメインに位置するCD137抗原結合部位
を含み、CDRベースの抗原結合部位は、抗体E12v2、E05v2、又はG12v2、好ましくはE12v2の3つのVH CDR及び3つのVL CDR(CDR1~6)を含み;
CD137抗原結合部位は、それぞれ、CH3ドメインのAB、CD及びEF構造ループに位置する第1の配列及び第2の配列を含み、第1及び第2の配列は、それぞれ配列番号79及び89[FS22-053-017]に記載の配列を有する。
(a)PD-L1のCDRベースの抗原結合部位;及び
(b)抗体分子のCH3ドメインに位置するCD137抗原結合部位
を含み、CDRベースの抗原結合部位は、抗体E12v2、E05v2、又はG12v2、好ましくはE12v2の3つのVH CDR及び3つのVL CDR(CDR1~6)を含み;
CD137抗原結合部位は、それぞれ、CH3ドメインのAB、CD及びEF構造ループに位置する第1の配列及び第2の配列を含み、第1及び第2の配列は、それぞれ配列番号113及び114[FS22-172-003]、又は79及び80[FS22-53-008]に記載の配列を有し、好ましくは、第1及び第2の配列が、配列番号113及び114[FS22-172-003]に記載の配列を有し、ただし、抗体分子は、配列番号79及び80[FS22-053-008]に記載の第1及び第2の配列を有するCD137抗原結合部位と対形成される抗体G12v2のCDR1~6を含まない。
(a)PD-L1のCDRベースの抗原結合部位;及び
(b)配列番号115[FS22-172-003]、又は81[FS22-53-008]、好ましくは配列番号115[FS22-172-003]、に記載の配列を含むか、それを有するか、又はそれからなる、CH3ドメイン;
を含み、CDRベースの抗原結合部位は、抗体E12v2、E05v2、又はG12v2、好ましくはE12v2の3つのVH CDR及び3つのVL CDR(CDR1~6)を含む。
(a)PD-L1のCDRベースの抗原結合部位;及び
(b)配列番号90[FS22-053-017]に記載の配列を含むか、それを有するか、又はそれからなる、CH3ドメイン;
を含み、CDRベースの抗原結合部位は、抗体E12v2、E05v2、又はG12v2、好ましくはE12v2の3つのVH CDR及び3つのVL CDR(CDR1~6)を含む。
(a)PD-L1のCDRベースの抗原結合部位を含むVHドメイン及びVLドメイン;及び
(b)配列番号115[FS22-172-003]、又は81[FS22-53-008]、好ましくは配列番号115[FS22-172-003]、に記載の配列を含むか、それを有するか、又はそれからなる、CH3ドメイン;
を含み、VH及びVLドメインは、抗体E12v2、E05v2、又はG12v2、好ましくはE12v2のVH及びVLを含むか、それを有するか、又はそれからなる。
(a)PD-L1のCDRベースの抗原結合部位を含むVHドメイン及びVLドメイン;及び
(b)配列番号90[FS22-053-017]に記載の配列を含むか、それを有するか、又はそれからなる、CH3ドメイン;
を含み、VH及びVLドメインは、抗体E12v2、E05v2、又はG12v2、好ましくはE12v2のVH及びVLを含むか、それを有するか、又はそれからなる。
(a)PD-L1のCDRベースの抗原結合部位を含むVHドメイン及びVLドメイン;
(b)配列番号115[FS22-172-003]、又は81[FS22-53-008]、好ましくは配列番号115[FS22-172-003]、に記載の配列を含むか、それを有するか、又はそれからなる、CH3ドメイン;
(c)CH2ドメインが、
(i)1.3位のアラニン残基;
(ii)1.2位のアラニン残基;
を含む、配列番号76に記載の配列を含むか、それを有するか、又はそれからなる、CH2ドメイン;
を含み、ここで、アミノ酸残基の番号付けは、IMGT番号付けスキームに従い;
VH及びVLドメインは、抗体E12v2、E05v2、又はG12v2、好ましくはE12v2のVH及びVLを含むか、それを有するか、又はそれからなる。
(a)CDRベースの抗原結合部位がCDR1~6を含む、PD-L1のCDRベースの抗原結合部位を含むVH及びVLドメイン;及び
(b)抗体分子のCH3ドメインに位置し、CD137抗原結合部位であって、CH3ドメインのAB及びEF構造ループに位置する第1の配列及び第2の配列を含む、CD137抗原結合部位;
を含み、ここで、CDR1~6、第1の配列及び第2の配列は、
(i)それぞれ配列番号1、2、3、4、5、6、113及び114[FS22-172-003-AA/E12v2];
(ii)それぞれ配列番号1、2、3、18、19、20、113及び114[FS22-172-003-AA/E05v2];
(iii)それぞれ配列番号1、2、3、18、19、29、113及び114[FS22-172-003-AA/G12v2];
(iv)それぞれ配列番号1、2、3、4、5、6、79及び80[FS22-053-008-AA/E12v2];又は
(v)それぞれ配列番号1、2、3、18、19、20、79及び80[FS22-053-008-AA/E05v2]、
に記載の配列を有するか、
VHドメイン、VLドメイン、第1の配列及び第2の配列は、
(i)それぞれ配列番号12、14、113及び114[FS22-172-003-AA/E12v2];
(ii)それぞれ配列番号23、25、113及び114[FS22-172-003-AA/E05v2];
(iii)それぞれ配列番号23、30、113及び114[FS22-172-003-AA/G12v2];
(iv)それぞれ配列番号12、14、79及び80[FS22-053-008-AA/E12v2];又は
(v)それぞれ配列番号23、25、79及び80[FS22-053-008-AA/E05v2];
に記載の配列を有するか、
VHドメイン、VLドメイン、及びCH3ドメインは、
(i)それぞれ配列番号12、14、及び115[FS22-172-003-AA/E12v2];
(ii)それぞれ配列番号23、25、及び115[FS22-172-003-AA/E05v2];
(iii)それぞれ配列番号23、30、及び115[FS22-172-003-AA/G12v2];
(iv)それぞれ配列番号12、14、及び81[FS22-053-008-AA/E12v2];又は
(v)それぞれ配列番号23、25、及び81[FS22-053-008-AA/E05v2]
に記載の配列を有する。
(i)それぞれ配列番号134及び17に記載のFS22-172-003-AA/E12v2;
(ii)それぞれ配列番号137及び28に記載のFS22-172-003-AA/E05v2;
(iii)それぞれ配列番号140及び33に記載のFS22-172-003-AA/G12v2;
(iv)それぞれ配列番号143及び17に記載のFS22-053-008-AA/E12v2;
(v)それぞれ配列番号146及び28に記載のFS22-053-008-AA/E05v2;又は
(vi)それぞれ配列番号149及び33に記載のFS22-053-008-AA/G12v2
の重鎖及び軽鎖を含むか、それらを有するか、又はそれらからなる、重鎖を含む。
(i)それぞれ配列番号134及び17に記載のFS22-172-003-AA/E12v2;
(ii)それぞれ配列番号137及び28に記載のFS22-172-003-AA/E05v2;
(iii)それぞれ配列番号140及び33に記載のFS22-172-003-AA/G12v2;
(iv)それぞれ配列番号143及び17に記載のFS22-053-008-AA/E12v2;又は
(v)それぞれ配列番号146及び28に記載のFS22-053-008-AA/E05v2;
の重鎖及び軽鎖を含むか、それらを有するか、又はそれらからなる、重鎖を含む。
(i)それぞれ配列番号134及び17に記載のFS22-172-003-AA/E12v2;又は
(iv)それぞれ配列番号143及び17に記載のFS22-053-008-AA/E12v2
の重鎖及び軽鎖を含むか、それらを有するか、又はそれらからなる、重鎖を含む。
(i)それぞれ配列番号152及び17に記載のFS22-053-017-AA/E12v2;
(ii)それぞれ配列番号153及び28に記載のFS22-053-017-AA/E05v2;又は
(iii)それぞれ配列番号154及び33に記載のFS22-053-017-AA/G12v2
の重鎖及び軽鎖を含むか、それらを有するか、又はそれらからなる、重鎖を含む。
(i)配列番号13に記載の抗体E12v2のVHドメイン核酸配列、及び/又は配列番号15に記載の抗体E12v2のVLドメイン核酸配列;又は
(ii)配列番号24に記載の抗体E05v2のVHドメイン核酸配列、及び/又は配列番号26に記載の抗体E05v2のVLドメイン核酸配列;
(iii)配列番号24に記載の抗体G12v2のVHドメイン核酸配列、及び/又は配列番号31に記載の抗体G12v2のVLドメイン核酸配列;又は
(v)配列番号24に記載の抗体lam-G02v3のVHドメイン核酸配列、及び/又は配列番号42に記載の抗体lam-G02v3のVLドメイン核酸配列
を含み得る。
(i)配列番号32又は135に記載の抗体FS22-172-003-AA/E12v2の重鎖核酸配列、及び/又は配列番号39又は136に記載の抗体FS22-172-003-AA/E12v2の軽鎖核酸配列;又は
(ii)配列番号138に記載の抗体FS22-172-003-AA/E05v2の重鎖核酸配列、及び/又は配列番号139に記載の抗体FS22-172-003-AA/E05v2の軽鎖核酸配列;
(iii)配列番号141に記載の抗体FS22-172-003-AA/G12v2の重鎖核酸配列、及び/又は配列番号142に記載の抗体FS22-172-003-AA/G12v2の軽鎖核酸配列;
(iv)配列番号144に記載の抗体FS22-053-008-AA/E12v2の重鎖核酸配列、及び/又は配列番号145に記載の抗体FS22-053-008-AA/E12v2の軽鎖核酸配列;
(v)配列番号147に記載の抗体FS22-053-008-AA/E05v2の重鎖核酸配列、及び/又は配列番号148に記載の抗体FS22-053-008-AA/E05v2の軽鎖核酸配列;又は
(vi)配列番号150に記載の抗体FS22-053-008-AA/G12v2の重鎖核酸配列、及び/又は配列番号151に記載の抗体FS22-053-008-AA/G12v2の軽鎖核酸配列;
を含み得る。
(i)医薬としての使用のための本明細書に記載の抗体分子、
(ii)疾患又は障害の処置方法における使用のための本明細書に記載の抗体分子、
(iii)疾患又は障害の処置における使用のための医薬品の製造における本明細書に記載の抗体分子の使用;及び
(iv)個体の疾患又は障害の処置方法であって、本明細書に記載の治療有効量の抗体分子を個体に投与することを含む方法
を提供する。
実施例1:抗原選択及び特性評価
PD-L1及びCD137の両方に結合し、CD137にアゴナイジングすることが可能なmAb2を識別するために使用される選択及びスクリーニング方法は、様々なPD-L1及びCD137抗原の使用を必要とする。これらの抗原の産生については、以下でより詳細に記載される。
CD137などの腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー(TNFRSF)メンバーは、同族リガンドに結合する場合、クラスターを形成する多量体を形成する傾向があることで知られている(Croft,M.2003)。それらの機能のために凝集するこの傾向は、ファージ及び酵母ディスプレイなどのインビトロ選択で使用するため、及び選択されたタンパク質の特性評価のために、溶液中で凝集しない可溶性組換えタンパク質を産生することを困難にする。
DO11.10細胞(National Jewish Health)発現完全長マウスCD137(配列番号187)又はヒトCD137(配列番号185)、それぞれ「DO11.10.mCD137」及び「DO11.10.hCD137」と指定され、表2に列挙されたように選択されたFcabの選択及びさらなる特性評価のために、その天然形態に最も類似した膜結合立体配座で抗原を提示するために産生された。
融合タンパク質を含むヒト及びマウスのPD-L1抗原は、抗体の選択及びスクリーニングに使用するために生成された。抗原は、C末端Hisタグ及び単量体ラットCD4+、ドメイン3及び4(rCD4)タグ(Brown and Barclay, 1994)、二量体ヒトIgG1 Fcドメイン又は、ヒトPD-L1のみにつき、Aviタグ、(hPD-L1-rCD4-Hisをもたらす(配列番号195)、hPD-L1-Fc-His(配列番号196)、mPD-L1-rCD4-His(配列番号197)、mPD-L1-Fc-His(配列番号198)及びhPD-L1-His-Avi(配列番号199)のいずれかと共に発現させた。異なる形式での抗原の産生により、抗体ファージディスプレイのパニングの連続ラウンド中に、タグバインダーの除去が可能となった。抗原をコードする発現プラスミドは、Chapple et al.,2006に記載されるように、HEK293細胞にトランスフェクトされた。トランスフェクションの5日後に上清を回収し、分泌された抗原をNi-NTAセファロースアフィニティークロマトグラフィーで精製した(Schofield et al.,2007)。rCD4及びFc含有PD-L1抗原は、EZ-link Sulfo-NHS-ビオチン試薬(Thermo Fisher Scientific、製品コード21326)を使用して、製造元の推奨に従ってビオチン化された。ビオチン化反応生成物をゲル濾過し、単量体画分を回収した。単量体画分は、全ての液相ファージディスプレイの選択のために使用された。蛍光ビオチン定量キット(Thermo Fisher Scientific、製品コード46610)を使用して決定した分子あたりの平均ビオチン数は、PD-L1単量体あたり1から3ビオチンであった。
2.1 抗ヒトCD137 Fcabのナイーブ選択
ヒトCD137に結合するFcabを選択するために、酵母及びファージディスプレイ選択キャンペーンを採用して、同定されたFcabの多様性を最大化した。細胞表面は、両方ともヒトCD137及び組換え二量体ヒトCD137を表示し、二量体又は多量体CD137タンパク質に対して結合力駆動型選択圧を発揮するために、様々な抗原形式を提供するために使用された。単量体CD137への高親和性ではなく、CD137複合体へ強く結合するFcabを取得することは、そのようなFcabがT細胞刺激の後に、CD137のアップレギュレーションが生じる活性化及びプライミングされたT細胞を優先的に標的化するであろうために有益であると考えられた。理論に拘束されることを望むものではないが、CD137膜発現のレベルが非常に低い又は無視できるT細胞は、タンパク質の大部分が二量体、三量体、又はそれ以上の多量体状態である高度にアップレギュレートされたCD137を有する活性化T細胞とは異なり、単量体状態のCD137を持つ可能性が高いと仮定された。結合力駆動型選択の結果、Fcabは活性化T細胞に優先的に結合し、単量体CD137だけに表示するナイーブT細胞には良好に結合しない。結合力の高いCD137 Fcabを選択することにより、潜在的な標的外T細胞の活性化が減少し、それに伴う毒性が減少する。
ファージから単離された76個の抗ヒトCD137 Fcabクローン及び酵母選択から単離された9個のクローンを含むIgG1分子からなる「モック」mAb2抗体は、mAb2形式でFcabの特性評価を可能にするために産生した。モックmAb2は、抗鶏卵リゾチーム抗体HelD1.3のCH3ドメインの対応する領域に対して、AB、CD及びEFループを含むCH3ドメインFcabの一部を置換することにより調製した。HelD1.3抗体の生成は、Tello et al.1993に記載されている。抗体HelD1.3の重鎖及び軽鎖配列は、それぞれ配列番号191及び159に示されている。モックmAb2分子がHEK293-6E細胞中での一過性発現によって産生された。産生されたタンパク質の量を評価するために、PALL(18-5021)のプロテインA定量バイオセンサーを備えたOctet QKeプラットフォームを使用して、バイオレイヤー干渉法によってIgGタンパク質含有量を定量した。タンパク質を、mAb SelectSureカラムを使用したプロテインA親和性クロマトグラフィーによって精製した。53個のファージ由来CD137mAb2タンパク質は、検出閾値を下回る測定値を示し、そのため、さらなる分析には不適であると判断された。32mAb2を、mAb Select SuReプロテインAカラム(GE Healthcare、11003494)を使用して精製した。
TNFRシグナル伝達には多量体化及びクラスター化が必要である(Bitra et al.,2017)。CD137は、NF-κB同族のリガンドであるCD137Lと相互作用する場合、NF-κBシグナル伝達経路をクラスター化し活性化する。アゴニスト分子は、CD137のクラスター化及び活性化を促進するリガンドを模倣し、それによってNF-κBシグナル伝達経路を活性化する。一部のアゴニスト性抗体は、例えば、ウレルマブのように、結合時にCD137クラスター化を本質的に引き起こすことができ、一方で、他の抗体は、例えば、ウトミルマブのように、CD137クラスター化を誘導するために抗体自体の追加の架橋を必要とするものも知られている(Fisher et al,2012)。エフェクター細胞上のFcガンマ受容体は、インビボでそのような架橋を誘導することが知られているが、これは非効率的であり、治療上の関心のある部位から離れて発生する可能性がある。用量制限毒性はウレルマブに関連しているがウトリムマブには関連していないため、本質的にアゴナイズする能力を持たない抗CD137結合Fcabを選択するが、CD137クラスター化を誘導するために追加の架橋を必要とするもののみを選択することにした。そこで、架橋抗体により細胞表面に発現させたCD137のクラスター化することにより、細胞内のNF-κBシグナル伝達経路の活性化を検出できるが、抗体が架橋されていない場合には、ほとんど活性を示さないアッセイを開発した。次に、このアッセイは、FcabがBLIによって組換え抗原に結合することが見出されたかどうかにかかわらず、モックmAb2形式における27個の抗CD137 Fcabクローン、及び抗CD20mAb2形式における6個の抗CD137 Fcabクローンのアゴニスト性機能活性を試験するために使用された。
活性化T細胞上のアゴニスト分子を介したCD137クラスター化は、T細胞の活性化及び下流のシグナル伝達を誘発し、その結果IL-2産生をもたらすが、これに限定されるものではない。FS22-053及びFS22-172はNF-κBレポーターアッセイにおいて、活性があることが確認されたため、CD137を活性化するそれらの能力をT細胞活性化アッセイで試験した。ヒトCD137を過剰発現するように操作されたDO11.10T細胞を使用してDO11.10T細胞活性化アッセイが開発され、IL-2放出を測定することにより、T細胞活性化が評価された。
前述のように、NF-κBレポーターアッセイ、DO11.10T細胞活性化アッセイにおける機能特性に基づいて、親和性成熟のために2つのクローン(FS22-053及びFS22-172)を選択した。
FS22-053及びFS22-172Fcabクローンから4つの酵母ディスプレイライブラリを構築した。各クローンのCH3ドメインのABループでELLAプライマーを使用して7つの残基(IMGTによる位置15~16.1)をランダム化し、ライブラリーFS22-053AB及びFS22-172ABを作成した。CH3ドメインのEFループでELLAプライマーを使用して5つの残基(IMGTによる位置92~94及び97~98)をランダム化し、ライブラリーFS22-053EF及びFS22-172EFを得た。
親FS22-053クローン(FS22-053-001からFS22-053-016)に由来する16の親和性成熟クローン、及び親FS22-172クローン(FS22-172-001からFS22-172-006)に由来する6つの親和性成熟クローンを「モック」及び「モデル」mAb2形式で調製した。クローンFS22-053-001からFS22-053-007は、さらなる試験及び特性評価のための下流精製を可能にするレベルでmAb2形式において発現しなかったため、さらに追跡されなかった。
列挙されたモックmAb2(HelD1.3)形式の親和性成熟抗ヒトCD137 Fcabの機能的活性を、実施例2.3に記載された同様のNF-κBルシフェラーゼアッセイで試験した。Gen5 Software、BioTekを備えたプレートリーダーで0.5秒の積分時間で発光を測定した。予想通り、Fcabはタンパク質L架橋(-XL)なしでは活性を示さなかった。全ての親和性成熟CD137 Fcabは、親CD137 Fcabよりも大きな改善を示し、このアッセイにおいては陽性であるが、EC50値の計算は不可能であった(実施例2.3参照)FS22-053-008及びFS22-172-003は、たんぱく質L(+XL)で架橋した場合、最も低いEC50(それぞれ26.34nM及び32.64nM)で各ファミリーから最高の活性を示した。
モデルmAb2(PD-L1 LALA)形式の親和性成熟ヒトFcabの機能的活性を、実施例2.4で記載したアッセイと類似のDO11.10T細胞活性化アッセイで試験した。
CD137を過剰発現するT細胞上でCD137を活性化するFcabの能力を実施例3.3に示した。CD137を過剰発現するように操作されていない細胞に対するFcabの活性を試験するには、初代ヒトT細胞アッセイが必要であった。活性化細胞傷害性CD8+T細胞は、癌細胞を直接殺傷するのに関与し、それらの細胞表面にCD137を発現する(Ye et al,2014)。CD137のクラスター化は、下流のシグナル伝達及びさらなるCD8+T細胞の活性化の誘導に不可欠であることが知られている。したがって、CD8+T細胞活性化アッセイを使用して、Fcab(以下に詳述するmAb2形式)がCD137のクラスター化及び下流シグナル伝達を駆動する能力を評価した。CD8+T細胞活性化は、hIL-2の放出を測定することによって検出された。
他の関連するTNFSFRファミリーメンバーと比較したヒトCD137に対する抗ヒトCD137 Fcabの特異性を試験した。Fcabのうち8つを、モックmAb2(HelD1.3)形式で試験し、他のヒトTNFRSF受容体:CD40、OX40及びGITRへの結合を試験することにより、Biacore T200(GE Healthcare)でSPRによって測定された。アミンカップリング(アミンカップリングキット、GE Healthcare、BR-1000-50)を使用して、Biacore CM5チップ(GE Healthcare、カタログ番号29149603)でヒトCD40、GITR、及びOX40を約1000RUにコーティングした。1μMから開始のモックmAb2形式での抗ヒトCD137 Fcabの希釈液(FS22-053-008/HelD1.3、FS22-053-009/HelD1.3、FS22-053-010/HelD1.3、FS22-053-011/HelD1.3、FS22-053-012/HelD1.3、FS22-053-014/HelD1.3、FS22-172-003/HelD1.3、FS22-172-004/HelD1.3)を、HBS-EP+緩衝液(BR100669)で調製し、30μl/分で3分間注入した後、緩衝液中で4分間解離した。チップを、10mMグリシンpH2.5を30μl/分で12秒間注入することにより再生した。異なるTNFRSFメンバーに特異的な抗体を、Biacoreチップコーティングを検証するための陽性対照として使用した。データを、二重参照減算し、BIAevaluation3.2ソフトウェアを使用して分析した。Fcabは、試験したTNFRSF受容体のいずれにも結合せず、CD137に対する特異性を示した。結果として、Fcab、又はこれらのFcabから抗原結合部位を含むmAb2は、CD137以外のいかなるものへ非標的結合を誘発することは期待されていない。
ヒト、カニクイザル(cyno)及びマウスCD137に対するモックmAb2形式(実施例3.2参照)における抗ヒトCD137 Fcab(FS22-053-008、FS22-053-011、FS22-053-014、FS22-172-004、FS22-172-004)の親和性をSPRで測定し、Fcabが動物試験での試験に有用であり得るかどうかを決定した。抗ヒトFab捕捉抗体を、製造業者の推奨(GE Healthcare、ヒトFabキャプチャーキット、#28958325)に従って、平均表面密度6000RUになるように、CM5シリーズSチップ(GE Healthcare#BR-1005-30)の4つのフローセル全てに固定化した。25℃及び10μl/分の流速での固定化は、6000RUの平均最終応答を達成した。各mAb2は、HBS-EP+緩衝液(GE Healthcare#BR1006-69)で希釈したmAb2の3μg/ml溶液を30μl/分で60秒間注入することにより、約150RUまで捕捉した。次に、HBS-EP+緩衝液中の異なる濃度のヒト、Cyno又はマウスCD137抗原(非ビオチン化ヒト、cyno又はマウスCD137-mFc-Avi又はヒトCD137-Avi-His)を、60μl/分で3分間チップ上に流し、次いで10分間解離させた。各抗原濃度の後、10mMグリシンpH2.1を30μl/分の流速で30秒間感染させることにより、チップを再生した。緩衝液HBS-EP+を、参照減算のために、最高濃度の抗原の前及び最低濃度の抗原の後に注入し、ランダムな濃度の1つを2回繰り返した。結合速度論を、1:1ラングミュアモデルに適合させて、各サンプルにつき平衡結合(KD)を生成した。データ分析は、BiaEvaluationソフトウェアバージョン3.2を使用して実行された。結果を表3に示す。
要約すると、親和性成熟抗CD137 Fcabを生成し、mAb2形式に調製され、その後特性評価された。CH3ドメインにこれらのCD137抗原結合ドメイン含有mAb2は、ヒトNF-κBリポーター細胞アッセイにおいて高いレベルの活性を示し、この活性は架橋依存性であることが示された。FS22-053-008及びFS22-172-003Fcabからの抗原結合ドメイン含有mAb2は、このアッセイにおいて最も優れた活性を示した。
4.1 選択
「IONTAS 1」ヒト抗体ファージディスプレイライブラリー(IONTAS Ltd.)を使用して、抗PD-L1クローンを選択した。IONTAS 1ライブラリーの構築のために使用された抗体遺伝子は、ヒトリンパ球(42のバフィーコートの提供)及び1つの扁桃腺組織サンプルに由来した。バフィーコート及び扁桃腺組織の両方が、地域研究倫理委員会(Local Research Ethical Committee)の承認の下で入手された。
4.2.1 モノクローナルscFvELISA
実施例4.1からの選択280scFv集団をELISAによってスクリーニングして、ヒトPD-L1に最もよく結合するクローンを同定した。scFv集団を可溶性scFvベクターpSANG10にサブクローニングし、(Martin et al., 2006; Studier, 2005)に記載されているように、可溶性scFvを含有する大腸菌(E.coli)培養物を調製した。次に、可溶性scFvを、Schofield et al., 2007により記載されたように、固定化されたヒトPD-L1-rCd4-Hisを用いたモノクローナルELISAで使用した。Nunc Maxisorpプレート(Thermo Fisher Scientific、437111)をヒトPD-L1-rCd4-His(5μg/ml、PBS)で一晩コーティングし、2%MPBSで1時間ブロックし、大腸菌(E.coli)培養上清(2x2%MPBSで1:2に希釈)を添加し、scFvを室温で1時間結合させた。結合したscFvは、ユーロピウムで標識された抗FLAG M2抗体(Sigma、F1804)で検出された。合計470のクローンがスクリーニングされ、これにより、抗原を含有しない「空の」ブロックされたウェルと比較して、バックグラウンドより少なくとも10倍高いPD-L1の結合シグナルを持つ346の抗PD-L1クローンが同定された。一次ELISAシグナルによって評価された192の最良の抗ヒトPD-L1クローンが、さらなる分析のために選択された。
PD-L1及びPD-1の間の相互作用を遮断したクローンを特定するために、ELISAを実行してブロッキングscFvのためのスクリーニングを実行した。簡単に説明すると、Nunc Maxisorpプレート(437111、Thermo Fisher Scientific)を抗rCd4(ドメイン3及び4)抗体(MCA1022、OX-68、Bio-Rad)で一晩コーティングし、3%MPBSでブロックし、室温で1時間、ヒトPD-1-rCd4-His(3%MPBS中5μg/ml)でインキュベートした。ヒトPD-L1-Fc-His(50μl、0.2nM)を、scFvを含有する大腸菌(E.coli)培養上清と事前に混合した。Nunc96ウェルプレートを、PBS、0.1%Tween(商標)-20(PBS-T)で3回、PBSで3回洗浄した後、ヒトPD-L1-Fc-His/scFv混合を添加し、室温で1時間インキュベートした。プレートを洗浄し、結合したヒトPD-L1-Fc-Hisをヤギ抗Fc-ビオチン(Jackson ImmunoResearch、109-065-098、Laboratories、0.1μg/ml、3%MPBS)及びストレプトアビジン・ユーロピウム(Streptavidin-Europium)(Perkin Elmer、1244-360)、その後にDELFIAエンハンスメントソリューション(Perkin Elmer、4001-0010)を使用して検出した。スクリーニングされた192個のクローンのうち、培地対照と比較して、183個は少なくとも90%のブロッキング活性を示した。同定された183個の抗PD-L1scFvクローンを、上記の実施例4.2.1に記載されているように、一次ELISAでマウスPD-L1交差反応性についてさらにスクリーニングしたが、ヒトPD-L1の代わりに固定化マウスPD-L1-rCD4-Hisを使用した。これにより、50のマウス交差反応性抗PD-L1クローンが特定され、これは、IgG1形式への変換の候補であった。
PD-L1及びPD-1の間の相互作用を遮断した抗PD-L1scFvクローンは、VL及びVH遺伝子をIgG1発現プラスミドpINT3-IgG1にサブクローニングすることにより、IgG1形式に変換され、Chapple et al., 2006に記載されるように、HEK293で、4mlスケールで発現した。抗体は、製造元の指示に従って、プロテインAセファロースビーズ(PC-A100)及びProteus「1ステップバッチ」ミディスピンカラム(Generon、GEN-1SB08)を使用して、バッチアフィニティー精製された。精製された抗体の透析は、8kDaカットオフのGeBAflexマキシチューブ(Generon、D045)を使用して実行された。必要に応じて、抗体を限外濾過により2μMに濃縮した。
次に、精製された抗PD-L1mAbの機能的活性を、共培養レポーターアッセイスクリーニングで評価した。このスクリーニングは、GloResponse NFAT-luc2/PD-1安定ジャーカット細胞株(Promega、CS187102)及び、解凍及び使用PD-L1細胞(Promega、CS178103)を使用して製造元の指示に従って実行された。PD-L1細胞を、10%FBSを含有するHAM’S-F12培地に播種した。翌日、培地を除去し並行して、PD-1ジャーカットレポーター細胞(Promega、CS187102)をアッセイ培地(90% RPMI1640、1% FBS)中に再懸濁した。付着したPD-L1細胞を含有するプレートに、2倍濃度(200nM)で異なる抗体を含む40μlのアッセイ培地、その後に40μlのPD-1細胞混合物を添加した。プレートは、5%CO2、37℃で6時間インキュベートした。BioGlo試薬(Promega、G7940、80μl)を各ウェルに添加し、BMG pherastarプレートリーダーを使用してルシフェラーゼアウトプットを読み取った。これにより、抗体を含有しない対照と比較してルシフェラーゼ活性が増加するために共培養アッセイでPD-1とPD-L1の相互作用を遮断することができる抗体G1/280_02_G02が特定された。この活性は、用量反応共培養アッセイ(濃度範囲を2倍にする:200から1.56nM)で確認され、計算された半数効果濃度(EC50)は4.2nMになった。
G1/280_02_G02抗体の配列の予備分析により、VH-CDR2の潜在的な脱アミド化部位、具体的にはKabat位54から55のNGモチーフが同定された。この部位での脱アミド化は、潜在的に結合に影響を与える可能性があるため、NGモチーフがNA、NS、SG、又はGGのいずれかに変更された変異体クローンが作成された。これらの修飾は、組換えPD-L1に対する親和性又はPD-L1ブロッキング活性の効力の顕著な低下をもたらさず、軽鎖シャッフルで使用するために、G1/280_02_G02_NSと指定されたNS修飾を含有する変異体クローンを選択した。
ファージ選択戦略により、強力なインビトロPD-1/PD-L1ブロッキング活性とマウスPD-L1交差反応性を備えた50を超える抗ヒトPD-L1結合クローンが同定された。特に、G1/280_02_G02は、細胞ベースのPD-L1レポーターアッセイで強力な活性化を示し、そのためにさらなる最適化のために選択された。
G1/280_02_G02_NS抗体はラムダ軽鎖を有する。臨床状況で使用されてきたほとんどのモノクローナル抗体はカッパ軽鎖を持っているため(Jain et al., 2017)、チェーンシャッフリングキャンペーンを使用して、G1/280_02_G02_NS抗体の重鎖を含むが、ヒトPD-L1及びマウスの交差反応性に対する親和性を保持したカッパ軽鎖と対となる、クローンを生成することが求められた。ファージディスプレイプラスミドpIONTAS-1(カッパライブラリー)のIONTAS(商標)カッパ軽鎖ライブラリーを使用して、軽鎖変異体と結合したG1/280_02_G02_NS抗体の重鎖を含むscFvクローンの軽鎖シャッフルライブラリーを調製した。
ビオチン化ヒトPD-L1-rCD4-His及びマウスPD-L1-rCD4-His抗原(抗原の詳細は実施例1.3を参照)を使用して、3ラウンドで多数のファージディスプレイ溶液の選択を行った。選択は、全てのラウンドで抗原濃度を減少させることによって実行され(100から0.02nMまで変化)、選択の各ラウンドにおいて「非抗原」対照が使用された。
48の抗体は全て、SPR(Biacore T200機器)を使用して親和性によってランク付けされた。ランク付けのために、希釈した上清(1XPBS及び0.002%Tween(商標)-20で作製されたランニングバッファー中1:10)をプロテインAチップ(GE healthcare、製品コード:29127556)上に固定化し、ヒトPD-L1-rCD4-Hisを50nMの濃度で調製した表面上に流した。この1回の注入を使用して生成された結合(ka)及び解離(kd)速度定数を使用して、解離定数(KD)を決定した。クローンのKD値は、Ig1形式(G1/280_02_G02_NS)にクローンG1/280_02_G02_NSのそれと比較した。クローンG1/280_02_G02_NSよりもヒトPD-L1に対して高い親和性を示し、そのためクローンG1/280_02_G02_NSとともに完全な速度論的分析が行われたユニークな配列の10個のクローンが同定された。
5.3.1 細胞ベースのPD-1/PD-L1ブロッキングアッセイ
カッパ軽鎖、G1/887_04_E12、G1/894_08_E05及びG1/887_04_G12を含有する抗PD-L1クローンが、PD-1及びPD-L1の間の相互作用を遮断する能力を、PD-1/PD-L1 Blockade Bioassay製品(Promega、J1250/J1255)を製造元の推奨に従って使用した生体発光細胞ベースのアッセイで評価した。ブロッキング活性をG1/280_02_G02_NSクローンと比較した。
抗PD-L1 mAb G1/887_04_E12、G1/887_04_G12及びG1/894_08_E05の組換えヒト(ビオチン化hPD-L1-Avi-His, Acro Biosystems、PD1-H82E5)、カニクイザル(cPD-L1-His, Acro Biosystems、PD1-C52H4)及びマウス(mPD-L1-His, Acro Biosystems、PD1-M5220)との結合を、Biacore T200処理ユニット(GE Healthcare)を使用してSPRで測定した。親和性をIgG1形式の280_02_G02_NSクローンと比較した(G1-AA/280_02_G02_NS;このクローン名の「AA」は、このクローンがCH2ドメインに「LALA」変異も含んでいたことを示す)。
抗ヒトPD-L1mAb、G1/894_08_E05、G1/887_04_E12及びG1/887_04_G12を、次に、フローサイトメトリーを使用して、ヒトPD-L1(HEK.hPD-L1細胞)を発現するHEK293細胞への結合を試験した。非特異的結合は、ヒトPD-L1を欠くHEK293親細胞(Flp-In T-Rex 293細胞株、Life Technologies、R780-07)への結合を試験することによっても評価された。
抗PD-L1 mAbの活性は、混合リンパ球反応(MLR)アッセイで試験された。MLRアッセイは、2つの同種異系リンパ球集団(同じ種であるが、遺伝的に異なる)間で発生する細胞性免疫応答を測定する。このアッセイでは、あるドナーからのCD4+T細胞及び別のドナーからの単球由来樹状細胞(iDC)を使用する。免疫細胞には生理学的レベルの免疫チェックポイント調節因子が含まれているため、MLRアッセイを使用して、T細胞活性化がヒトシステムのmAbによって増強されることを確認することができる。
PBMCは、フィコール勾配分離によって白血球錐体から分離された。CD4+T細胞は、Human CD4+T Cell Isolation Kit(Miltenyi Biotec Ltd、130-096-533)を使用して、製造元の指示に従って分離した。ヒトT-アクチベーターCD3/CD28 Dynabeads(Life Technologies、11131D)をボルテックスで再懸濁した。ビーズを滅菌15mlチューブに移し、10%FBS(Life Technologies、10270106)を含む10ml RPMI(Life Technologies、61870044)及び1×ペニシリンストレプトマイシン(Life Technologies、15140122)を加えてダイナビーズを洗浄した。上澄みを廃棄した。10%FBS及び1×ペニシリンストレプトマイシン溶液を添加したRPMI中の1.0×106細胞/mlのCD4+T細胞、及び3:1のビーズ対細胞比を有する50IU/mlの組換えヒトIL-2(Peprotech、200-02-50μg)をT75フラスコ(Greiner Bio-one、690195)に移し、37℃+5%CO2でインキュベートした。3日後、細胞を穏やかに再懸濁し、計数した。細胞密度は、必要に応じて新鮮な培地(RPMI-10%FBS+ペニシリンストレプトマイシン溶液1X+50IU/mlのrhuIL-2)を添加することにより、0.8~1×106細胞/mlの範囲に維持した。7日目又は8日目に、CD3/28ビーズを除去し、CD4+T細胞を、減量した10IU/mlのrhuIL-2を有する新鮮培地RPMI-10%FBS+ペニシリンストレプトマイシン溶液1Xの1×106細胞/mlで一晩静置した。細胞は必要になるまで凍結保存した。
未処理の単球は、Human Pan Monocyte Isolation Kit(Miltenyi Biotec Ltd、130-096-537)を使用して、製造元の指示に従ってヒトPBMCから分離した。単球は、ヒトMo-DC分化培地(Miltenyi Biotec Ltd、130-094-812)を使用して、製造元の指示に従ってiDCに分化させた。
抗ヒトPD-L1 mAb G1/887_04_E12、G1/887_4_G12及びG1/894_08_E05はマウスPD-L1に対して弱い交差反応性を示すことが示されたため(実施例5.3.2を参照)、マウスPD-L1に対するそれらの機能的活性を、DO11.10 OVA T-リンパ球及びLK35.2B-リンパ球ハイブリドーマ細胞株に基づく、インターロイキン2(IL-2)放出アッセイで調査した。IL-2放出はT細胞活性化のマーカーである。内因性マウスPD-1を発現するT細胞に空のベクター(pLVX)をトランスフェクトした。B-細胞にマウスPD-L1構築物をトランスフェクトした。
レンチウイルス形質導入法を使用したLenti-X HTXパッケージングシステム(Clontech、631249)を使用して、空のレンチウイルスベクターpLVXを含有するDO11.10細胞(National Jewish Health)を生成した。Lenti-X発現ベクター(pLVX)(カタログ番号631253)をLenti-X HTXパッケージングミックスと共にLenti-X293T細胞株(カタログ番号632180)に同時トランスフェクトして、ウイルスを生成した。DO11.10細胞株は、Lenti-XHTXパッケージングシステムで産生されたレンチウイルス粒子を使用して形質導入された。
レンチウイルス形質導入法を使用したLenti-X HTXパッケージングシステム(カタログ番号631249)を使用してマウスPD-L1を過剰発現するLK35.2 B細胞リンパ腫細胞(ATCC、HB-98)を生成した。cDNAをコードするマウスPD-L1(配列番号187)を含有するLenti-X発現ベクター(pLVX)(カタログ番号631253)は、Lenti-XHTXパッケージングミックスと共にLenti-X293T細胞株(カタログ番号632180)に同時トランスフェクトして、ウイルスを生成した。LK35.2細胞株は、Lenti-X HTXパッケージングシステムで生成したレンチウイルスベクターを使用して形質導入された。
抗PD-L1 mAb G1/887_04_E12、G1/887_4_G12及びG1/894_08_E05又は抗FITC陰性対照mAb(G1-AA/4420)の希釈液は、実験培地(DMEM(Gibco、61965-026)、10% FBS(Gibco、10270-106)、1mMピルビン酸ナトリウム(Gibco、11360-070))で調製された。2.46μM OVAペプチド(H-ISQAVHAAHAEINEAGR-OH(配列番号192)(Pepscan))(100μL LK35.2mPD-L1細胞(マウスPD-L1を過剰発現させるためにmPD-L1を含むレンチウイルスベクターで形質導入されたB細胞ハイブリドーマ)/mAb混合物が96丸底プレートの1ウェルあたり)の存在下、mAbは、4×105/ml LK35.2mPD-L1細胞と1:1で、実験培地中で混合し、37℃、5% CO2で1時間インキュベートした。100μl容量の実験培地中の2×105/ DO11.10 pLVX細胞(空のレンチウイルスベクターで形質導入されたDO11.10 T細胞ハイブリドーマ)を、100μlのLK35.2mPD-L1/(mAbs)混合物に添加した。次いで、細胞を混合し、37℃、5%CO2で、24時間インキュベートした。上清を収集し、製造元の指示に従ってマウスIL-2 ELISAキット(eBioscience、88-7024-88又はR&Dシステム、SM2000)でアッセイした。Gen5 Software、BioTekを備えたプレートリーダーを使用して、プレートを450nmで読み取った。450nm(補正)の吸光度値から570nmの吸光度値を差し引いた。サイトカイン濃度を計算するための標準曲線は、4パラメーターロジスティック曲線適合(Gen5 Software、BioTek)に基づいていた。マウスIL-2の濃度をmAbの対数濃度に対してプロットし、得られた曲線をGraphPad Prismの対数(アゴニスト)対応答式を使用して適合させた。
選択されたカッパ軽鎖を含む抗PD-L1 mAb G1/894_08_E05、G1/887_04_E12、及びG1/887_04_G12は、カニクイザル及びマウスPD-L1の交差反応性を示し、細胞表面に発現したPD-L1への特異的結合を示し、ラムダ軽鎖を含むクローンG1/280_02_G02よりも、組換えヒト及びカニクイザルPD-L1に対してさらに高い親和性を示した。抗PD-L1 mAb G1/894_08_E05、G1/887_04_E12、及びG1/887_04_G12は、インビトロでヒトT細胞の強力な活性化因子であり、且つ機能的なマウス交差反応性を有することを示した。
6.1 潜在的なタンパク質脱アミド化部位の特定及び除去
G1/280_02_G02_NSクローン配列の解析により、H-CDR2ループ(Kabat位54~57)内の配列NSNTが、脱アミド化された場合、結合に影響を与える可能性がある潜在的な脱アミド化部位として同定された。このクローンの重鎖は、実施例5に記載のチェーンシャッフリングキャンペーンによって得られた全てのカッパ軽鎖含有クローンに保持されていたため、この潜在的な脱アミド化部位は、クローンG1/887_04_E12、G1/894_08_A05、G1/894_08_E05、及びG1/887_4_G12にも存在した。生殖細胞系列配列に最も近い特定のプライマーを使用して、4つのカッパ軽鎖含有クローンにおいて、NSNT配列は、部位特異的変異導入法により、GGST、SGGT又はSGNAのいずれかに変化して、特定される変異体クローンを産生した。この潜在的な脱アミド化部位を除去すると同時に、カッパ軽鎖シャッフル中にこの抗体の配列に意図せず導入された、G1/887_04_E12クローンのVH領域内のKabat位28のプロリン残基の役割は、G1/280_02_G02_NSクローンに含まれるスレオニン残基に戻すことによっても調査された。親及び得られた変異体クローン(全てIgG1形式)を0.8mlスケールでトランスフェクトし、トランスフェクションの5日後に回収した培養上清を使用して、SPRによるヒト及びカニクイザルPD-L1-rCD4-Hisに対するクローンの親和性を決定した。Cyno PD-L1-rCD4-Hisを実施例1.3で記載されているように生成した。G1/887_04_E12クローンに由来する変異体クローンを除いて、全ての変異体クローンは、それぞれの親クローンと比較して、ヒト及びカニクイザルPD-L1に対するナノモル濃度以下の親和性を保持していた。
7.1 mAb形式におけるクローンのクローニング化及び産生
実施例6で同定されたG1/929_01_A02「SGGT」変異体クローンのVH領域のKabat位28のスレオニン残基を、ヒト及びカニクイザルPD-L1に対する親和性を改善する目的で、親クローンG1/887_04_E12の同じ位置に存在するようにプロリンに変異させた。HEK293-6E細胞における一過性発現及びmAb Select SuReプロテインAカラムを使用した精製を使用して、この修飾された変異体クローン、及び実施例6においてIgG1形式及びLALA変異で同定された他の3つの「SGGT」変異体クローン(G1/929_01_A08、G1/929_01_A11、及びG1/lam-G02v3)を産生し、エフェクター機能が非存在下の場合の機能的活性の試験を可能にした。得られたmAbは、G1-AA/E12v2、G1-AA/E05v2、G1-AA/G12v2及びG1-AA/lamG02v3(G1-AA/lamG02v3又はG1-AA/lambdav3と呼ばれる)と指定された。重鎖及び軽鎖配列は、それぞれG1-AA/E12v2につき配列番号16及び配列番号17、G1-AA/E05v2につき配列番号27及び配列番号28、G1-AA/G12v2につき配列番号27及び配列番号33、及びG1-AA/lam-G02v3につき配列番号27及び配列番号44に示されている。
G1-AA/lam-G02v3(すなわち、VH-CDR2におけるNSNTからSGGT、VL-CDR1におけるNSからNY、及びLALA変異)及びカッパ軽鎖含有mAbのG1-AA/E12v2、G1-AA/E05v2及びG1-AA/G12v2(すなわち、LALA変異、及びG1-AA/E12v2単独、VH領域におけるKabat位28のスレオニンからプロリン)に存在するさらなる配列修飾が結合動力学に影響を及ぼしたかどうかを決定するために、実施例5.3.2に記載のように、ヒト及びカニクイザルPD-L1についてのこれらの抗PD-L1mAbの親和性が決定された。mAbのG1-AA/lam-G02v3、G1-AA/E05v2、G1-AA/E12v2、及びG1-AA/G12v2は、mAbのG1-AA/280_02_G02_NS、G1/894_08_E05、G1/887_04_E12及びG1/887_04_G12について実施例5.3で観察されたそれらと類似のヒト及びカニクイザルPD-L1についての親和性を示し、試験されたmAb及びmAb2の結合親和性は、潜在的な脱アミノ化部位の修飾又はLALA変異の導入により影響を受けなかったことが実証された。G1-AA/E12v2mAbは、試験した4つのmAb全ての中で最低のKD値を示した(ヒトPD-L1では0.21nM、カニクイザルPD-L1では0.37nM)。結果を表4に示す。
抗PD-L1mAbのG1-AA/E05v2、G1-AA/E12v2、及びG1-AA/G05v2は、実施例5.3.4に記載されているように混合リンパ球反応(MLR)アッセイで試験された。G1-AA/4420を陰性対照として使用した。結果を表5に示す。mAbのG1-AA/E05v2、G1-AA/E12v2及びG1-AA/G12v2は、0.054nM未満のEC50及び600pg/mlを超えるIFN-γの最大レベル(Emax)のMLRアッセイにおいて強力な活性を示した(表5)。EC50、特にEmax値は、実施例5.3.4で記載した値とは顕著に異なっていた。応答は、あるドナーからのT細胞及び別のドナーからの単球由来樹状細胞との間の同種反応に依存するため、この違いはドナーのばらつきによるものと考えられている。抗ヒトPD-L1mAbの効力は、クローンの効力の順序にランク付けしたのと同様に、実施例5.3.4に記載されたデータと一致していた。予想通り、陰性対照G1-AA/4420 mAbの活性は観察されなかった。
mAbのG1-AA/E05v2、G1-AA/E12v2、及びG1-AA/G12v2はラボスケールで産生され、SEC及び示差走査熱量測定(DSC)の標準的な分析方法によって特徴付けられた。
mAbのG1-AA/E05v2、G1-AA/E12v2、及びG1-AA/G12v2をコードするDNA配列を、PEIpro(Polyplus、フランス)を使用してHEK293 6E(カナダ国立研究評議会(National Research Council Canada))細胞にトランスフェクトした。5日後、細胞培養液を回収し、AKTAxpress機器を使用してMabSelectプロテイン-Aプレパックカラム(両方GE Healthcare、ウプサラ(Uppsala)、スウェーデン)で精製した。カラムの平衡化は、50mM Tris、pH7.0の250mM NaCl、で行い、その後、回収した細胞培養液をロードした。樹脂を50mM Tris、pH7.0の250mM NaClを使用して洗浄し、続いてpH3.5未満の緩衝液を使用してmAbを溶出した。
精製後のSE-UPLCは、Acquity H-Class Bio UPLC(Waters Corp、UK)を使用して、単量体の割合を測定するために精製から24時間以内に実施した(材料は4℃で保存した)。Acquity UPLC BEH200 SEC 1.7mmカラム(4.6×150mm)を使用し、移動相は、250mMリン酸ナトリウム、100mM L-アルギニン、pH6.8で構成されていた。単量体、低分子量及び高分子量種の定量化は、Empowerソフトウェア(Waters Corp、UK)を使用して実行された。
G1-AA/E05v2、G1-AA/E12v2、及びG1-AA/G12v2の融解温度(Tm)は、Microcal VPキャピラリー示差走査熱量計(DSC)を使用して測定した。G1-AA/lam-G02v3は、カッパ軽鎖含有mAb及びラムダ軽鎖含有mAbの違いを評価するために含まれていた。サンプルは、サンプル緩衝液中、0.2mg/mlの濃度で測定された。スキャン速度は60℃/時間に設定され、データは35℃から100℃の間で収集された。データ分析は、Origin7.0ソフトウェアを使用して実行された。Fab及びCH3のDSCピークが重複していたため、1つの値が報告された。
8.1 抗ヒトCD137/PD-L1mAb2の産生
3つの抗ヒトCD137 FcabクローンFS22-053-008、FS22-053-017及びFS22-172-003(実施例3参照)を含むIgG1分子からなるCD137/PD-L1mAb2抗体を産生し、mAb2形式でのFcabの特性評価を可能にした。CD137/PD-L1mAb2は、3つの抗PD-L1結合抗体(G1-AA/E05v2、G1-AA/E12v2、G1-AA/G12v2、実施例7.1参照)のうちの1つのCH3ドメインの対応する領域について、AB、CD及びEFループを含むCH3ドメインFcabの一部を置換することによって調製された。全ての結果のmAb2は、LALA変異を含んでいた。CD137/PD-L1mAb2は、PEIpro(Polyplus、France)を使用してHEK293 6E(NRCC、Canada)細胞で一過性に発現した。5日後、細胞培養液を回収し、AKTAxpress機器を使用してMabSelectプロテイン-Aプレパックカラム(両方GE Healthcare、ウプサラ、スウェーデン)で精製した。カラムの平衡化は、50mM Tris-HCl、pH7.0の250mM NaClで行い、続いて、回収した細胞培養液をロードした。次に、樹脂を50mM Tris-HCl、pH7.0の250mM NaClを使用して洗浄し、その後pH<3.5の緩衝液を使用してmAb2を溶出した。
8.2.1 SE-HPLCによる分析
移動相として、20mMリン酸ナトリウム、200mM塩化ナトリウム、pH6.8を使用し、TSK-GEL SUPERSW 3000 4.6mmIDx30.0cmカラム(Tosoh Bioscience)を装備したAgilent1100シリーズHPLC(Agilent、UK)で精製後SE-HPLCを行った。単量体の割合の定量化を、Chemstationソフトウェア(Agilent、UK)を使用して実行した。
CE-SDS分析を、製造元の指示に従い、2100 Bioanalyzerキャピラリー電気泳動システム(Agilent、UK)で実行した。還元条件ために、DTTを添加し、サンプルを70℃で5分間変性させた。
9.1 SPRによるヒト及びカニクイザルPD-L1について抗ヒトCD137/PD-L1mAb2結合親和性
次に、抗ヒトCD137/PD-L1mAb2、FS22-172-003-AA/lam-G02v3、FS22-172-003-AA/E05v2、FS22-053-008-AA/E05v2、FS22-172-003-AA/E12v2、FS22-053-008-AA/E12v2及びFS22-172-003-AA/G12v2の組換えヒト及びカニクイザルPD-L1抗原への結合を、Biacore T200processing unit(GE Healthcare)を使用してSPRにより測定した。
抗ヒトCD137/PD-L1mAb2の組換え二量体ヒト及びカニクイザルCD137抗原への結合も、Biacore T200processing unit(GE Healthcare)を使用してSPRによって測定された。
9.3.1 ヒトPD-L1の特異性
抗ヒトCD137/PD-L1 mAb2の特異性を分析するために、6つのmAb2(FS22-172-003-AA/lam-G02v3、FS22-172-003-AA/E05v2、FS22-053-008-AA/E05v2、FS22-172-003-AA/E12v2、FS22-053-008-AA/E12v2及びFS22-172-003-AA/G12v2)の他のT細胞標的への結合を、SPRを用いて試験した。この目的は、mAb2が、1μMの濃度でPD-L2、CD80、PD-1、及びB7-H3の抗原に対するmAb2の結合を示さないことにより特異性を実証することであった。
CD137/HelD1.3mAb2と比較した場合、CD137/PD-L1 mAb2において、CD137 Fcab結合部位の特異性が保持されていることが予想される(実施例3.6参照)。TNFRファミリーメンバーであるOX40、GITR、CD40及びDR6(R&D Biosystems)に対するFS22-172-003-AA/E12v2の特異性を、実施例9.3.1で記載したように類似してSPRによって分析した。1μMの濃度では、FS22-172-003-AA/E12v2は、ヒトCD137-mFcに対して278RUであったのに対し、ヒトOX40、GITR、CD40及びDR6に対して7RU未満で結合した。この結果は、CD137に対するFS22-172-003-AA/E12v2mAb2の高いレベルの特異性を実証した。
ヒトCD137及びヒトPD-L1-His Avi(抗原の詳細については実施例1.3参照)に同時結合するFS22-172-003-AA/E12v2mAb2の能力を、Biacore T200のSPRにより試験した。G1/S70を対照として使用した。酢酸ナトリウム緩衝液pH5.0(GE Healthcare、18-1069)で10μg/mlに希釈したヒトPD-L1Hisを、CM5センサーSチップ(GE Healthcare、BR100530)に約1100RUの表面密度で固定化した。バックグラウンド除去のために固定化したタンパク質なしで、1つのフローセルを活性化及び不活性化した。HBS-EP緩衝液中で5μg/mlに希釈した抗体を、約200~300RUの密度になるように30μl/分の流速で捕捉した。ヒトCD137-mFc-Aviの結合は、0及び100nMで30μl/分で5分間試験し、次いで2.5分間の解離ステップを行った。20mM NaOHを流速30μl/分で60秒間の各サイクル後、センサーチップを再生した。FS22-172-003-AA/E12v2は、ヒトPD-L1及びヒトCD137の両方に同時に結合できたが、対照G1/S70はヒトPD-L1にのみ結合した。
抗ヒトCD137/PD-L1mAb2の細胞表面ヒト及びカニクイザルPD-L1への結合を評価するために、ヒトPD-L1を過剰発現させたHEK293細胞を生成した。ヒトPD-L1を過剰発現するHEK293細胞(HEK.hPD-L1)を、実施例5.3.3に記載のように産生した。カニクイザルPD-L1をコードするcDNA(配列番号189)を、ヒトPD-L1配列の代わりにpcDNA(商標)5/FRTベクターにサブクローニングした以外は、カニクイザルPD-L1(HEK.cPD-L1)を過剰発現するHEK293細胞もまた、実施例5.3.3.に記載したように作製した。
完全長ヒト(配列番号:185)又はカニクイザルCD137(配列番号:189)を発現するDO11.10細胞(National Jewish Health)は、それぞれ「DO11.10.hCD137」及び「DO11.10.cCD137」と指定され、選択された抗ヒトCD137/PD-L1mAb2のさらなる特性評価のために、その天然形態に最も類似した膜結合立体配座で抗原を提示するために産生された。DO11.10.hCD137及びDO11.10.cCD137細胞の産生及び発現の確認の詳細は、実施例1.2に記載されている。
活性化された初代ヒトT細胞の内因性発現CD137及びPD-L1に対する抗ヒトCD137/PD-L1mAb2の親和性を、フローサイトメトリーを使用して決定した。T細胞を単離するために、血小板提供の副産物である白血球枯渇コーンから末梢血単核細胞(PBMC)を単離した。簡単に説明すると、白血球コーンの内容物をPBSで洗い流し、フィコール(Sigma-Aldrich、1440-02)勾配に重ねた。PBMCを遠心分離により分離し、フィコール勾配を通過しなかった細胞を回収した。PBMCをさらにPBSで洗浄し、残りの赤血球を、製造元の指示に従って10ml 1Xの赤血球溶解緩衝液(eBioscience、00-4300-54)の添加により溶解した。汎T細胞を、汎T細胞単離キットII(Miltenyi Biotec Ltd、130-095-130)を製造業者の指示に従って使用して、溶出液中に存在するPBMCから単離した。CD137は、活性化されたCD8+T細胞上で高レベルに急速に発現し、活性化されたCD4+T細胞上でも低レベルに発現する(Xue-Zhong Yu et al,2013)ので、製造業者の指示に従って、Dynabeads(商標)Human T-Activator CD3/CD28(Thermo、11132D)を使用して、汎T細胞を24時間刺激した。Human T-Activator beads は、FS22-172-003-AA/E12v2mAb2、FS22-172-003-AA/HelD1.3モックmAb2、G1-AA/E12v2陽性対照抗ヒトPD-L1抗体、G1-AA/MOR7480.1陽性対照抗ヒトCD137抗体、G1-AA/4420陰性対照抗体の結合について試験をするために細胞結合アッセイを使用する前に、製造業者の指示に従って、DynaMag(商標)-15マグネット(Thermo、12301D)を使用してT細胞から洗浄した。
胎児性Fc受容体(FcRn)の結合は、抗体のリサイクルに重要である(Martins et al.,2016)。FS22-172-003-AA/lam-G02v3、FS22-172-003-AA/E12v2、及びFS22-053-008-AA/E12v2mAb2のヒト及びマウスFcRnへの結合は、BIAcore T200(GE Healthcare)を使用してSPRにより測定された。G1-AA/HelD1.3は、CH3ドメインに変異がないアイソタイプ対照IgG対照として含まれた。
TNFRSFメンバーを標的とするアゴニスト抗体は、Fcγ受容体を介した架橋を必要とし、標的のクラスター化及び活性化を促進してインビボ活性を達成する(Li et al, 2013)。しかし、Fcγ受容体結合による架橋のため、体系的なCD137活性化などの潜在的な標的外作用を回避し、両標的を発現する免疫細胞、例えばT細胞のADCC誘導の可能性を低下させるため、CH2ドメインにLALA変異(LALA形式の詳細については、実施例3.2参照)を導入することにより、抗ヒトCD137/PD-L1mAb2のFcγ受容体結合能を低下させることを決定した。FcγRIIA(ECACCカタログ番号15042905)、FcγRIIA(ECACCカタログ番号15042903)、FcγRIIA (ECACCカタログ番号15042902)、FcγRIIIA (ECACCカタログ番号15042901)又はFcγRIIB(ECACCカタログ番号15042907)のみを過剰発現しているCHO細胞へのフローサイトメトリーによる細胞結合を使用して、抗ヒトCD137/PD-L1mAb2のCH2ドメインにおけるLALA変異の存在が先述のFcγ受容体に対する結合親和性を低下させることを確認した。
10.1 ヒト初代CD8+T細胞アッセイにおける抗ヒトCD137/PD-L1 mAb2の活性
実施例3.5に記載のヒト初代T細胞アッセイは、mAb2の活性を試験するために使用した。
異なる細胞株によるPD-L1の発現レベルがCD137の活性化に影響することが観察されたため、試験したmAb2の機能的活性に対するPD-L1発現の影響をさらに調査することを決定した。集団ベースのアプローチにおいて、ヒトPD-L1発現のレベルを調節するために、HEK.hPD-L1対HEK.WT細胞の比率を変化させた、実施例10.1に記載されたものと同様のアッセイを実施した。
抗ヒトCD137/PD-L1 mAb2の活性は、混合リンパ球反応(MLR)アッセイで試験された(実施例5.3.4を参照)。MLRアッセイでは、あるドナーからのCD4+T細胞及び別のドナーからの単球由来樹状細胞(iDC)を使用した。免疫細胞には生理学的レベルの免疫チェックポイント調節因子が含まれているため、MLRアッセイを使用して、T細胞活性化がヒト系のmAb2によって増強されることを確認することができる。
生理学的に関連する抗原を含有する2つの異なるペプチドプールに対する免疫応答を測定することによって、抗原リコールT細胞活性化アッセイにおける抗ヒトCD137/PD-L1 mAb2の活性を試験した。1つのプールは、CD8+T細胞の活性化を試験するサイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、及びインフルエンザウイルス(CEF)からのMHCクラスI制限ペプチドを含み、第2のプールは、CD4+T細胞の活性化を試験したサイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、インフルエンザウイルス、及び破傷風毒素(CEFT)からのMHCクラスII制限ペプチドを含む。単一のドナーからのヒトPBMCが使用され、免疫細胞は生理学的レベルの免疫チェックポイント調節因子を含み、抗CD3抗体によるT細胞受容体の架橋ではなく抗原提示によって刺激されたため、アッセイの結果は、抗原駆動T細胞活性化は、ヒトの系におけるmAb2により増強されること確認する。
FS22-172-003-AA/E12v2の活性は、PD-L1チェックポイント遮断活性を調査するために、マウスDO11.10 T細胞活性化アッセイで試験した。ヒトPD-L1に対する機能的活性は、実施例5.4に記載されているように、DO11.10 OVA T細胞及びLK35.2 B細胞ハイブリドーマ細胞を使用するIL-2放出アッセイで調べた。
11.1 カニクイザルDO11.10T細胞活性化アッセイにおける抗ヒトCD137/PD-L1 mAb2の活性
活性化T細胞上のアゴニスト分子を介したCD137クラスター化は、T細胞の活性化及び下流のシグナル伝達を誘発し、その結果IL-2産生をもたらすが、これに限定されるものではない。カニクイザルCD137を発現するDO11.10細胞を活性化する抗ヒトCD137/PD-L1 mAb2の能力は、T細胞活性化アッセイで試験した。カニクイザルCD137を過剰発現するように操作されたDO11.10T細胞を使用してDO11.10T細胞活性化アッセイが開発され、IL-2放出を測定することにより、T細胞活性化が評価された。
抗ヒトCD137/PD-L1 mAb2の活性は、カニクイザル混合リンパ球反応(MLR)アッセイで試験された。実施例10.3に記載のヒトMLRアッセイと同様に、このアッセイは、2つの同種異系リンパ球集団(同じ種であるが、遺伝的に異なる)間で発生する細胞性免疫アッセイ応答を測定する。このアッセイでは、一個体のカニクイザルのCD4+T細胞と、別の個体のCD14+単球を使用する。免疫細胞には生理学的レベルの免疫チェックポイント調節因子が含まれているため、MLRアッセイを使用して、T細胞活性化がカニクイザル系のmAb2によって増強されることを確認することができる。
PBMCは、フィコール勾配分離によってカニクイザル血液サンプルから分離された。CD4+T細胞は、非ヒト霊長類CD4+単離キット(Miltenyi Biotec Ltd、130-091-102)を使用して、製造元の指示に従って単離した。細胞は、MLRアッセイで新鮮に使用された。
未処理の単球は、非ヒト霊長類CD14単離キット(Miltenyi Biotec Ltd、130-091-097)を使用して、製造元の指示に従ってカニクイザルPBMCから単離した。単球は、MLRアッセイで新鮮に使用された。
抗ヒトCD137/PD-L1 mAb2 FS22-172-003-AA/E12v2及び抗ヒトPD-L1抗体G1-AA/E12v2及びアイソタイプ対照抗体G1-AA/4420を、96ウェル丸底プレート(VWR、734-1797)中、50μl AIM V培地で最終濃度の4倍に希釈した。LALA変異を含有するHelD1.3と呼ばれる抗鶏卵リゾチーム(HEL)抗体(実施例2.2に記載)を陰性対照として含めた。300nMから0.02nMまでの4倍希釈系列を試験した。50μlのAIM V培地に懸濁した7.5x104単球細胞、及び100μlのAIM V培地に懸濁した7.5x105CD4+T細胞の両方を、抗体希釈液に添加し、37℃+5%CO2で6日間インキュベートした。以下の陰性対照が含まれていた:CD4+T細胞単独、CD14+T単球単独、CD4+T細胞+iDC、及びAIM V培地単独。上清を2日目に収集し、インターロイキン2(IL-2)濃度をMILLIPLEX MAP非ヒト霊長類サイトカイン磁気ビーズパネル(Merck Millipore、カタログ番号PRCYTOMAG-40K-01)を使用して測定し、上清をまた6日目に収集し、インターフェロンガンマ(IFN-γ)濃度を同じキットを使用して測定した。サンプルは、Bio-RadのBio Plex 200装置で分析した。
抗ヒトCD137/PD-L1 mAb2の活性がカニクイザル初代PMBCアッセイで試験された。このアッセイは、抗CD3 mAbで刺激されたPBMCの混合集団で発生する細胞性免疫アッセイ応答を測定する。アッセイは、一個体のカニクイザルからの全PBMCを使用し、免疫細胞には生理学的レベルの免疫チェックポイント調節因子が含まれているため、PBMCアッセイを使用して、T細胞活性化がカニクイザル系のmAb2によって増強されることを確認することができる。
マウス及びヒトのCD137配列間の配列相同性が低いことから、マウスのヒト交差反応性Fcabを取得できないリスクがあるため、インビボのマウスモデルにおけるCD137抗原結合領域を含有するmAb2の活性を試験するために、マウスCD137に特異的に結合するFcabを生成され、特性評価した。マウスCD137結合Fcabが生成された後、驚くべきことに、FS22-053-14はマウス及びヒトの交差反応性を有することができることがその後見出された。
ヒトCD137に結合するFcabを選択するために、ヒトCD137に結合するFcabの選択について前述したものと同様に、酵母及びファージディスプレイ選択キャンペーンを採用した(実施例2.1を参照)。組換えマウス二量体CD137又は抗原として使用される完全長マウスCD137を発現する細胞(実施例1を参照)。
マウスCD137に対する抗マウスCD137 Fcabの特異性は、HelD1.3「モック」mAb2形式で試験し、Fcabの他のマウスTNFRSF受容体(CD40、OX40、GITR)への結合を試験することにより、Octet QKeシステムのBLIによって測定した。10ng/μlのマウスCD40、GITR、OX40受容体をコーティングするためのストレプトアビジンバイオセンサー(PALL ForteBio 18-5021)(全てR&D Systemsから入手し、Thermoscientific #21328のEZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotinキットを使用してビオチン化した)。モックmAb2形式の抗マウスCD137 Fcabは、少なくとも1μMの最終濃度まで、動的バッファー(PALL 18-1092)で1:1に希釈した。抗原でコーティングされたセンサーをmAb2溶液に180秒間浸した後、1×動的バッファーに180秒間浸した。各TNFRSF受容体の抗体を陽性対照として使用した。FcabクローンFS22m-055、FS22m-063、FS22m-066、FS22m-075、FS22m-135、FS22m-055、FS22m-063、FS22m-066は、試験したTNFRSF受容体のいずれにも結合せず、したがって、そのマウスCD137に対する特異性を示した。
FS22-053-017クローン(HelD1.3モックmAb2形式)も、実施例2.4に記載されているようなマウスCD137DO11.10T細胞活性化アッセイにおいて、親のFS22-053-014クローン(HelD1.3モックmAb2形式)と同様に、マウスCD137結合FcabクローンFS22m-063(HelD1.3モックmAb2形式)と比較された。mAb2分子は、4:1のモル比(mAb2:タンパク質L)で、プロテインLと架橋された。結果を表22に示す。
インビボのマウスモデルにおけるCD137抗原結合領域を含有するmAb2の活性を試験するために、実施例12.3に記載されているように、T細胞活性化アッセイにおいて最良の活性を示したFcabとしてFS22m-063を選択した。
抗マウスCD137 Fcab FS22m-063と、PD-L1結合Fab領域(米国特許第8,217,149 B2号からのクローンYW243.55.S70)も含む、抗マウスCD137/PD-L1 mAb2が産生された。これらは、AB、CD、及びEFループ含有抗PD-L1結合抗体のCH3の一部をFcabの対応する領域で置換することにより、実施例3.2に記載の方法と同様に調製した。これらのPD-L1モデルmAb2は、CH2ドメイン(AA)にLALA変異を含んでいた。ヒトIgG1のCH2ドメインにLALA変異の導入は、すると、Fcγ受容体結合の低下が知られている(Bruhns,P.,et al.(2009)及びHezareh M.,et al.(2001))。
CD137を過剰発現するように操作されていない細胞に対する抗マウスCD137/PD-L1 mAb2の活性を試験するには、マウス初代T細胞アッセイが必要であった。活性化細胞傷害性CD8+T細胞は、癌細胞を直接殺傷するのに関与し、それらの細胞表面にCD137を発現する(Ye et al,2014)。CD137のクラスター化は、下流のシグナル伝達及びさらなるCD8+T細胞の活性化の誘導に不可欠であることが知られている。したがって、CD8+T細胞活性化アッセイを使用して、mAb2がCD137のクラスター化及び下流シグナル伝達を駆動する能力を評価した。ヒトCD8+T細胞活性化アッセイを同じように反映する試みがなされたが、ナイーブC57BL/6又はBalb/c脾臓から単離されたマウスCD8+T細胞は、そのようなアッセイに必要な活性化の可能性を示さなかった。したがって、代替の抗原特異的CD8+T細胞活性化アッセイが開発された。CD8+T細胞の活性化は、オバルブミンペプチド257-264に特異的なT細胞受容体を有するC57BL/6 OT-1マウス(Jackson Laboratory、カタログ番号003831)から単離された遺伝子改変OT-1T細胞の抗原刺激によって達成され、IL-2の放出によって決定された。
14.1 CT26同系マウス腫瘍モデルにおける抗マウスCD137/PD-L1 mAb2の活性
FS22m-063 FcabがインビトロでCD137のクラスター化及び活性化を駆動できることを示したため、インビボでCD137を活性化する能力を試験することが望まれた。
実施例3.2で産生したモデルmAb2と同様の方法を用いて、抗マウスCD137 Fcab、FS22m-063、及びPD-L1に特異的なFab領域を含むmAb2を、CT26同系マウス腫瘍モデルにおけるインビボ抗腫瘍活性について調製及び試験した。
LX(S2)/2
(ここで、L=最長軸、S=最短軸)
用量応答抗腫瘍活性
抗マウスCD137/PD-L1 mAb2 FS22m-063-AA/S70は、2日ごとに3回投与されたマウスあたり20μg(約1mg//kg)の用量で、CT26同系腫瘍モデルにおいて抗腫瘍活性を示した(q2dx3)。インビボでのFS22m-063-AA/S70 mAb2の最適用量を調べるために、一連の用量(2、6、20、及び200μg/マウス、約0.1、0.3、1、及び10mg/kgに相当)が腫瘍細胞接種の7日後に開始する上記のq2dx3投与スケジュールでCT26モデルにおいて試験された。陰性対照抗体G1-AA/4420は、同じスケジュールで、マウス1匹あたり200μg(約10mg/kg)の用量で含まれていた。陽性対照抗体G1/Lob12.3は、同じスケジュールで、マウス1匹あたり20μg(約1mg/kg)の最適以下の用量で含まれていた。
抗マウスCD137/PD-L1 mAb2の作用機序は、実施例14.2に記載されているものと同じCT26担癌マウスモデルで評価された。FS22m-063-AA/S70を4つの異なる用量(2、6、20、及び200μg/マウス、およそ0.1、0.3、1、10mg/kgに相当)で処置したCT26担癌の血液、脾臓、及び腫瘍組織、並びに陰性対照抗体G1-AA/4420は、CD137アゴニスト作用の下流効果であることが知られているT細胞活性化及び増殖マーカーについて試験した(Fisher et al., 2012)。
同系マウスモデルは、治療標的を阻害する抗腫瘍効果を試験するための適切なマウス系として受け入れられており、ヒト治療薬の開発を検証するために広く使用されてきた。MC38腫瘍は、免疫原性が高く、抗CD137抗体単剤療法に応答し(Kocak et al, 2006)、PD-L1を発現する(Juneja et al, 2017)ことが知られているため、この実験ではMC38同系腫瘍モデルを使用した。
LX(S2)/2
(ここで、L=最長軸、S=最短軸)
B16.F10同系マウス腫瘍モデルを、抗マウスCD137/PD-L1 mAb2(FS22m-063-AA/S70)の抗腫瘍活性をインビボで試験するために使用した。このモデルは、治療用抗体で処置するのがより難しいと考えられている(Baird, J. R., et al, 2013)。この試験では、抗体G1-AA/4420をアイソタイプ対照として使用した。B16.F10同系腫瘍モデルは、CD137アゴニスト抗体に感受性があることはこれまで示されていない。しかし、B16.F10腫瘍から単離された腫瘍浸潤リンパ球(TIL)は、CD137を発現する(Curran.M., et al, 2013)。
臨床試験中のウレルマブを伴う固形腫瘍患者の抗CD137 mAb処置は、投与されたウレルマブの用量に関連することが示されている重度の処置関連免疫事象をもたらした。これらの免疫事象の影響は、重度の肝毒性として肝臓に現れた(Segal, N. H., et al, 2017)。
・ 柔組織における混合リンパ球浸潤を有する最小からわずかな肝細胞壊死
・ 門脈周囲管における最小からわずかな混合炎症細胞
・ 最小の変性肝細胞
・ 最小から著しい有糸分裂の増加
実施例14.3において、抗マウスCD137-PD-L1 mAb2 FS22m-063-AA/S70は、複数回投与後に腫瘍内のCD8+T細胞を増加させる能力を示した。T細胞への標的結合、PD-L1遮断、及びFS22m-063-AA/S70がT細胞増殖に及ぼす影響の程度を調べるために、実施例14.1に記載されるものと同じCT26同系腫瘍モデルで単回投与の薬力学的研究を実施した。
マウスにおける抗CD137/PD-L1 mAb2の薬物動態を決定するために、MC38腫瘍を含まないC57BL/6雌マウス(実施例14.4を参照)、すなわち腫瘍のないマウスに、100μlの抗CD137/PD-L1 mAb2を4用量(25mg/kg、10mg/kg、3mg/kg、1mg/kg)で投与し、384時間にわたって監視した。
カニクイザルにおける抗ヒトCD137/PD-L2 mAb2に対する薬物動態/薬力学的(PK/PD)応答及びその忍容性を評価するために、予備的な用量範囲発見研究が実施された。簡単に説明すると、FS22-172-003-AA/E12v2 mAb2は、単回投与又は反復投与として静脈内(IV)注入を介してカニクイザルに投与した。体重、食餌量、臨床所見、血液学及び血液化学などの標準的な毒物学パラメーターについて、試験期間中の忍容性評価を評価した。
E12v2 mAbのCDRアミノ酸配列(Kabat)
VH CDR1-SYGIS(配列番号1)
VH CDR2-WISAYSGGTNYAQKLQG(配列番号2)
VH CDR3-DLFPTIFGVSYYYY(配列番号3)
VL CDR1-RASQSIGNRLA(配列番号4)
VL CDR2-EASTSET(配列番号5)
VL CDR3-QQSYSTPYT(配列番号6)
VH CDR1-GYPFTSYG(配列番号7)
VH CDR2-ISAYSGGT(配列番号8)
VH CDR3-ARDLFPTIFGVSYYYY(配列番号9)
VL CDR1-QSIGNR(配列番号10)
VL CDR2-EAS(配列番号11)
VL CDR3-QQSYSTPYT(配列番号6)
IMGT CDR(太字斜体);Kabat CDR(斜体及び下線)。
E12v2 mAbのVHドメイン核酸配列(配列番号13)
E12v2 mAbのVLドメインアミノ酸配列(配列番号14)
IMGT CDR(太字斜体);Kabat CDR(斜体及び下線)。
E12v2 mAbのVLドメイン核酸配列(配列番号15)
G1-AA/E12v2 mAbの重鎖アミノ酸配列(LALAあり)(配列番号16)
VHドメイン(斜体);IMGT CDR(太字及び斜体);Kabat CDR(斜体及び下線);LALA変異(太字及び下線)
G1-AA/E12v2 mAbの軽鎖アミノ酸配列(配列番号17)
VHドメイン(斜体);IMGT CDR(太字及び斜体);Kabat CDR(斜体及び下線)
VH CDR1-SYGIS(配列番号1)
VH CDR2-WISAYSGGTNYAQKLQG(配列番号2)
VH CDR3-DLFPTIFGVSYYYY(配列番号3)
VL CDR1-RASQSISGRLA(配列番号18)
VL CDR2-EASNLES(配列番号19)
VL CDR3-QQSYSTPRVT(配列番号20)
VH CDR1-GYTFTSYG(配列番号21)
VH CDR2-ISAYSGGT(配列番号8)
VH CDR3-ARDLFPTIFGVSYYYY(配列番号9)
VL CDR1-QSISGR(配列番号22)
VL CDR2-EAS(配列番号11)
VL CDR3-QQSYSTPRVT(配列番号20)
IMGT CDR(太字及び斜体);Kabat CDR(斜体及び下線)
E05v2 mAbのVHドメイン核酸配列(配列番号24)
E05v2 mAbのVLドメインアミノ酸配列(配列番号25)
IMGT CDR(太字及び斜体);Kabat CDR(斜体及び下線)
E05v2 mAbのVLドメイン核酸配列(配列番号26)
G1-AA/E05v2 mAbの重鎖アミノ酸配列(LALAあり)(配列番号27)
VHドメイン(斜体);IMGT CDR(太字及び斜体);Kabat CDR(斜体及び下線);LALA変異(太字及び下線)
G1-AA/E05v2 mAb並びにFS22-172-003-AA/E05v2及びFS22-053-008-AA/E05v2 mAb2の軽鎖アミノ酸配列(配列番号28)
VHドメイン(斜体);IMGT CDR(太字及び斜体);Kabat CDR(斜体及び下線)
VH CDR1-SYGIS(配列番号1)
VH CDR2-WISAYSGGTNYAQKLQG(配列番号2)
VH CDR3-DLFPTIFGVSYYYY(配列番号3)
VL CDR1-RASQSISGRLA(配列番号18)
VL CDR2-EASNLES(配列番号19)
VL CDR3-QQSYSWPRT(配列番号29)
VH CDR1-GYTFTSYG(配列番号21)
VH CDR2-ISAYSGGT(配列番号8)
VH CDR3-ARDLFPTIFGVSYYYY(配列番号9)
VL CDR1-QSISGR(配列番号22)
VL CDR2-EAS(配列番号11)
VL CDR3-QQSYSWPRT(配列番号29)
IMGT CDR(太字及び斜体);Kabat CDR(斜体及び下線)
G12v2 mAbのVHドメイン核酸配列(配列番号24)
G12v2 mAbのVLドメインアミノ酸配列(配列番号30)
IMGT CDR(太字及び斜体);Kabat CDR(斜体及び下線)
G12v2 mAbのVLドメイン核酸配列(配列番号31)
G1-AA/G12v2 mAbの重鎖アミノ酸配列(LALAあり)(配列番号27)
VHドメイン(斜体);IMGT CDR(太字及び斜体);Kabat CDR(斜体及び下線);LALA変異(太字及び下線)
G1-AA/G12v2 mAb並びにFS22-172-003-AA/G12v2及びFS22-053-008-AA/G12v2 mAb2の軽鎖アミノ酸配列(配列番号33)
VHドメイン(斜体);IMGT CDR(太字及び斜体);Kabat CDR(斜体及び下線)
VH CDR1-SYGIS(配列番号1)
VH CDR2-WISAYSGGTNYAQKLQG(配列番号2)
VH CDR3-DLFPTIFGVSYYYY(配列番号3)
VL CDR1-TGTSSDVGGYNYVS(配列番号34)
VL CDR2-EVTNRPS(配列番号35)
VL CDR3-SSFKRGSTLVV(配列番号36)
VH CDR1-GYTFTSYG(配列番号21)
VH CDR2-ISAYSGGT(配列番号8)
VH CDR3-ARDLFPTIFGVSYYYY(配列番号9)
VL CDR1-SSDVGGYNY(配列番号37)
VL CDR2-EVT(配列番号38)
VL CDR3-SSFKRGSTLVV(配列番号36)
IMGT CDR(太字及び斜体);Kabat CDR(斜体及び下線)
lambdav3/lam-G02v3 mAbのVHドメイン核酸配列(配列番号24)
lambdav3/lam-G02v3 mAbのVLドメインアミノ酸配列(配列番号41)
IMGT CDR(太字及び斜体);Kabat CDR(斜体及び下線)
lambdav3/lam-G02v3 mAbのVLドメイン核酸配列(配列番号42)
G1-AA/lambdav3/lam-G02v3 mAbの重鎖アミノ酸配列(LALAあり)(配列番号27)
VHドメイン(斜体);IMGT CDR(太字及び斜体);Kabat CDR(斜体及び下線);LALA変異(太字及び下線)
G1-AA/lambdav3/lam-G02v3 mAbの軽鎖アミノ酸配列(LALAあり)(配列番号44)
VLドメイン(斜体);IMGT CDR(太字及び斜体);Kabat CDR(斜体及び下線)
GYX1FTSYG
ここで、X1は、P又はTである
RASQSIX2X3RLA
ここで、X2は、S又はGであり、X3は、N又はGである
EASX4X5EX6
ここで、X4は、T又はNであり;X5は、S又はLであり;X6は、T又はSである
QQSYSX7PX8X9T
ここで、X7は、T又はWであり;X8は、不在又はRであり;X9は、Y、R又はVである
QSIX10X11R
式中、X10は、G又はSであり;X11は、N又はGである
QQSYSX12X13X14X15T
式中、X12は、不在又はTであり;X13は、T、W又はPであり;X14は、P又はRであり;X15は、Y又はRである
HFW1-EVQLVQSGAEVKRPGASVKVSCKASGYX16FT(配列番号51)
ここで、X16は、P又はTである
HFW2-WVRQAPGQGLEWMG(配列番号52)
HFW3-RVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAR(配列番号53)
HFW4-WGQGTLVTVSS(配列番号54)
HFW1-EVQLVQSGAEVKRPGASVKVSCKAS(配列番号55)
HFW2-ISWVRQAPGQGLEWMGW(配列番号56)
HFW3-NYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYC(配列番号57)
HFW4-WGQGTLVTVSS(配列番号54)
LFW1-DIQMTQSPSTLSASVRDRVIITC(配列番号58)
LFW2-WYQHKPGKAPKLLIY(配列番号59)
LFW3-GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(配列番号60)
LFW4-FGQGTKLEIK(配列番号61)
LFW1-DIQMTQSPSTLSASVRDRVIITCRAS(配列番号62)
LFW2-LAWYQHKPGKAPKLLIY(配列番号63)
LFW3-TSETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(配列番号64)
LFW4-FGQGTKLEIK(配列番号61)
LFW1-QSALTQPASVSGSPGQSITISC(配列番号65)
LFW2-WYQQFPGKAPKLMIF(配列番号66)
LFW3-GVSDRFSGSKSDNTASLTISGLQAEDEAEYYC(配列番号67)
LFW4-FGGGTKLTVL(配列番号68)
LFW1-QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGT(配列番号69)
LFW2-VSWYQQFPGKAPKLMIF(配列番号70)
LFW3-NRPSGVSDRFSGSKSDNTASLTISGLQAEDEAEYYC(配列番号71)
LFW4-FGGGTKLTVL(配列番号68)
WT ABループ-RDELTKNQ(配列番号72)
WT CDループ-SNGQPENNY(配列番号73)
WT EFループ-DKSRWQQGNV(配列番号74)
AB、CD、EFループは下線が付されている
CH2ドメインのアミノ酸配列(配列番号76)
LALA変異を有するCH2ドメインのアミノ酸配列(配列番号77)
LALA変異は下線が付されている
LALA変異及びP114A変異を有するCH2ドメインのアミノ酸配列(配列番号176)
LALA変異は下線が付され、P114A変異は太字で下線が付されている
PPY
FS22-053-008 第1の配列-NPPYLFS(配列番号79)
FS22-053-008 第2の配列-DYWRWLE(配列番号80)
FS22-053-009 第1の配列-NPPYLFS(配列番号79)
FS22-053-009 第2の配列-EHTRWLD(配列番号83)
FS22-053-011 第1の配列-NPPYLFS(配列番号79)
FS22-053-011 第2の配列-DYWRWTD(配列番号86)
第1及び第2の配列に下線が付されている。
Fcab FS22-053-011 CH3ドメインの核酸配列(配列番号88)
FS22-053-017 第1の配列-NPPYLFS(配列番号79)
FS22-053-017 第2の配列-YHWRWLE(配列番号89)
第1及び第2の配列に下線が付されている。
Fcab FS22-053-017 CH3ドメインの核酸配列(配列番号91)
FS22-053-014 第1の配列-NPPYLFS(配列番号79)
FS22-053-014 第2の配列-YHWRWLD(配列番号92)
第1及び第2の配列に下線が付されている。
Fcab FS22-053-014 CH3ドメインの核酸配列(配列番号94)
FS22-053-010 第1の配列-NPPYLFS(配列番号79)
FS22-053-010 第2の配列-DYMRWLD(配列番号95)
第1及び第2の配列に下線が付されている。
Fcab FS22-053-010 CH3ドメインの核酸配列(配列番号97)
FS22-053-012 第1の配列-NPPYLFS(配列番号79)
FS22-053-012 第2の配列-DHMRWLE(配列番号98)
第1及び第2の配列に下線が付されている。
Fcab FS22-053-012 CH3ドメインの核酸配列(配列番号100)
FS22-053-013 第1の配列-NPPYLFS(配列番号79)
FS22-053-013 第2の配列-GYERWLE(配列番号101)
第1及び第2の配列に下線が付されている。
Fcab FS22-053-013 CH3ドメインの核酸配列(配列番号103)
FS22-053-015 第1の配列-NPPYLFS(配列番号79)
FS22-053-015 第2の配列-DHWRWLQ(配列番号104)
第1及び第2の配列に下線が付されている。
Fcab FS22-053-015 CH3ドメインの核酸配列(配列番号106)
FS22-053-016 第1の配列-NPPYLFS(配列番号79)
FS22-053-016 第2の配列-DYIRWLN(配列番号107)
第1及び第2の配列に下線が付されている。
Fcab FS22-053-016 CH3ドメインの核酸配列(配列番号109)
FS22-053-008 第1の配列-NPPYLFS(配列番号79)
FS22-053-008 第2の配列-YYNRWQD(配列番号110)
FS22-172-003 第1の配列-PYIIPPY(配列番号113)
FS22-172-003 第2の配列-GADRWLE(配列番号114)
第1及び第2の配列に下線が付されている。
Fcab FS22-172-003 CH3ドメインの核酸配列(配列番号116)
FS22-172-002 第1の配列-PFQMPPY(配列番号117)
FS22-172-002 第2の配列-GADRWLE(配列番号114)
第1及び第2の配列に下線が付されている。
Fcab FS22-172-002 CH3ドメインの核酸配列(配列番号119)
FS22-172-004 第1の配列-NYIYPPY(配列番号120)
FS22-172-004 第2の配列-GADRWLE(配列番号114)
第1及び第2の配列に下線が付されている。
Fcab FS22-172-004 CH3ドメインの核酸配列(配列番号122)
FS22-172-001 第1の配列-PFVMPPY(配列番号123)
FS22-172-001 第2の配列-GADRWLE(配列番号114)
第1及び第2の配列に下線が付されている。
Fcab FS22-172-001 CH3ドメインの核酸配列(配列番号125)
FS22-172-005 第1の配列-QQVYPPY(配列番号126)
FS22-172-005 第2の配列-GADRWLE(配列番号114)
第1及び第2の配列に下線が付されている。
Fcab FS22-172-005 CH3ドメインの核酸配列(配列番号128)
FS22-172-006 第1の配列-RKYYPPY(配列番号129)
FS22-172-006 第2の配列-GADRWLE(配列番号114)
第1及び第2の配列に下線が付されている。
Fcab FS22-172-006 CH3ドメインの核酸配列(配列番号131)
FS22-172 第1の配列-RKYYPPY(配列番号129)
FS22-172 第2の配列-GADRWLE(配列番号114)
第1及び第2の配列に下線が付されている。
Fcab FS22-172 CH3ドメインの核酸配列(配列番号133)
LALA変異を有するFS22-172-003-AA/E12v2 mAb2の重鎖のアミノ酸配列(配列番号134)
VHドメイン(斜体);LALA変異(太字下線)
LALA変異を有するFS22-172-003-AA/E12v2 mAb2の重鎖の核酸配列(配列番号135)
FS22-172-003-AA/E12v2及びFS22-053-008-AA/E12v2 mAb2の軽鎖のアミノ酸配列(配列番号17)
FS22-172-003-AA/E12v2 mAb2の軽鎖の核酸配列(配列番号136)
LALA変異を有するFS22-172-003-AA/E05v2 mAb2の重鎖のアミノ酸配列(配列番号137)
VHドメイン(斜体);LALA変異(太字下線)
LALA変異を有するFS22-172-003-AA/E05v2 mAb2の重鎖の核酸配列(配列番号138)
FS22-172-003-AA/E05v2 mAb2の軽鎖の核酸配列(配列番号139)
LALA変異を有するFS22-172-003-AA/G12v2 mAb2の重鎖のアミノ酸(AA)配列(配列番号140)
VHドメイン(斜体);LALA変異(太字下線)
LALA変異を有するFS22-172-003-AA/G12v2 mAb2の重鎖の核酸配列(配列番号141)
FS22-172-003-AA/G12v2 mAb2の軽鎖の核酸配列(配列番号142)
LALA変異を有するFS22-053-008-AA/E12v2 mAb2の重鎖のAA配列(配列番号143)
VHドメイン(斜体);LALA変異(太字下線)
LALA変異を有するFS22-053-008-AA/E12v2 mAb2の重鎖の核酸配列(配列番号144)
FS22-053-008-AA/E12v2 mAb2の軽鎖の核酸配列(配列番号145)
LALA変異を有するFS22-053-008-AA/E05v2の重鎖のAA配列(配列番号146)
VHドメイン(斜体);LALA変異(太字下線)
LALA変異を有するFS22-053-008-AA/E05v2 mAb2の重鎖の核酸配列(配列番号147)
FS22-053-008-AA/E05v2 mAb2の軽鎖の核酸配列(配列番号148)
LALA変異を有するFS22-053-008-AA/G12v2の重鎖のAA配列(配列番号149)
VHドメイン(斜体);LALA変異(太字下線)
LALA変異を有するFS22-053-008-AA/G12v2 mAb2の重鎖の核酸配列(配列番号150)
FS22-053-008-AA/G12v2 mAb2の軽鎖の核酸配列(配列番号151)
LALA変異を有するFS22-053-017AA/E12v2の重鎖のAA配列(配列番号152)
VHドメイン(斜体);LALA変異(太字下線)
LALA変異を有するFS22-053-017AA/E05v2の重鎖のAA配列(配列番号153)
VHドメイン(斜体);LALA変異(太字下線)
LALA変異を有するFS22-053-017AA/G12v2の重鎖のAA配列(配列番号154)
VHドメイン(斜体);LALA変異(太字下線)
LALA変異を有するFS22-172-003AA/lam-G02v3の重鎖のAA配列(配列番号155)
VHドメイン(斜体);LALA変異(太字下線)
LALA変異を有するFS22-172-003AA/S70の重鎖のAA配列(配列番号156)
VHドメイン(斜体);LALA変異(太字下線)
S70の軽鎖のAA配列(配列番号157)
VLドメイン(斜体);
LALA変異を有するFS22-172-003AA/HelD1.3の重鎖のAA配列(配列番号158)
VHドメイン(斜体);LALA変異(太字下線)
HelD1.3の軽鎖のAA配列(配列番号159)
VLドメイン(斜体)
LALA変異を有するFS22m-063AA/S70の重鎖のAA配列(配列番号160)
VHドメイン(斜体);LALA変異(太字下線)
LALA変異を有するFS22m-063AA/HelD1.3の重鎖のAA配列(配列番号161)
VHドメイン(斜体);LALA変異(太字下線)
LALA変異を有するG1-AA/E12v2の重鎖のAA配列(配列番号162)
VHドメイン(斜体);LALA変異(太字下線)
G1/S70の重鎖のAA配列(配列番号163)
VHドメイン(斜体)
LALA変異を有するG1-AA/S70の重鎖のAA配列(配列番号164)
VHドメイン(斜体);LALA変異(太字下線)
G1/4420の重鎖のAA配列(配列番号165)
VHドメイン(斜体)
4420の軽鎖のAA配列(配列番号166)
VLドメイン(斜体)
LALA変異を有するG1-AA/4420の重鎖のAA配列(配列番号167)
VHドメイン(斜体);LALA変異(太字下線)
LALA変異を有するG1-AA/HelD1.3の重鎖のAA配列(配列番号168)
VHドメイン(斜体);LALA変異(太字下線)
LALA変異を有するG1-AA/MLS109の重鎖のAA配列(配列番号169)
VHドメイン(斜体);LALA変異(太字下線)
MLS109の軽鎖のアミノ酸配列(配列番号170)
VLドメイン(斜体)
FS22-172-003 CH3ドメインAB及びEFループのアミノ酸配列
ABループ-RDELPYIIPPYNQ(配列番号171)
EFループ-GADRWLEGNV(配列番号172)
ABループ-RDELNPPYLFSNQ(配列番号173)
EFループ-DYWRWLEGNV(配列番号174)
ABループ-RDELNPPYLFSNQ(配列番号173)
EFループ-YHWRWLEGNV(配列番号175)
VHドメイン(斜体)
G1/280_02_G02の軽鎖のアミノ酸配列(配列番号178)
VLドメイン(斜体)
ヒトPD-L1のアミノ酸配列(配列番号179)
細胞外ドメイン(斜体);膜貫通及び細胞内ドメイン(太字)
ヒトPD-L1細胞外ドメインのアミノ酸配列(配列番号180)
マウスPD-L1のアミノ酸配列(配列番号181)
細胞外ドメイン(斜体);膜貫通及び細胞内ドメイン(太字)
マウスPD-L1細胞外ドメインのアミノ酸配列(配列番号182)
カニクイザルPD-L1のアミノ酸配列(配列番号183)
細胞外ドメイン(斜体);膜貫通及び細胞内ドメイン(太字)
カニクイザルPD-L1細胞外ドメインのアミノ酸配列(配列番号184)
ヒトCD137のアミノ酸配列(配列番号185)
細胞外ドメイン(斜体);膜貫通及び細胞内ドメイン(太字)
ヒトCD137細胞外ドメインのアミノ酸配列(配列番号186)
マウスCD137のアミノ酸配列(配列番号187)
細胞外ドメイン(斜体);膜貫通及び細胞内ドメイン(太字)
マウスCD137細胞外ドメインのアミノ酸配列(配列番号188)
カニクイザルCD137のアミノ酸配列(配列番号189)
細胞外ドメイン(斜体);膜貫通及び細胞内ドメイン(太字)
カニクイザルCD137細胞外ドメインのアミノ酸配列(配列番号190)
G1/HelD1.3の重鎖のアミノ酸配列(配列番号191)
VHドメイン(斜体)
OVAペプチド(配列番号192)
ISQAVHAAHAEINEAGR
ヒトB7-H3細胞外ドメインのアミノ酸配列(配列番号193)
SIINFEKLペプチド(配列番号194)
SIINFEKL
ヒトPD-L1-rCD4-Hisのアミノ酸配列(配列番号195)
シグナルペプチド(下線);PD-L1の細胞外ドメイン(通常フォント);C末端ラットCD4+(ドメイン3及び4)(斜体);NotI制限部位をコードする、抗原とC末端融合の間の接合部(太字及び下線);C末端ヘキサヒスチジンタグ(太字)
ヒトPD-L1-Fc-Hisのアミノ酸配列(配列番号196)
シグナルペプチド(下線) PD-L1の細胞外ドメイン(通常フォント) ヒトIgG1 Fc(斜体) NotI制限部位をコードする、抗原とC末端融合の間の接合部(太字及び下線) C末端ヘキサヒスチジンタグ(太字)
マウスPD-L1-rCD4-Hisのアミノ酸配列(配列番号197)
シグナルペプチド(下線);PD-L1の細胞外ドメイン(通常フォント);C末端ラットCD4+(ドメイン3及び4)(斜体);NotI制限部位をコードする、抗原とC末端融合の間の接合部(太字及び下線);C末端ヘキサヒスチジンタグ(太字)
マウスPD-L1-Fc-Hisのアミノ酸配列(配列番号198)
シグナルペプチド(下線) PD-L1の細胞外ドメイン(通常フォント) ヒトIgG1 Fc(斜体) NotI制限部位をコードする、抗原とC末端融合の間の接合部(太字及び下線) C末端ヘキサヒスチジンタグ(太字)
ヒトPD-L1-His-Aviのアミノ酸配列(配列番号199)
PD-L1の細胞外ドメイン(通常フォント) C末端ヘキサヒスチジンタグ(斜体) Aviタグ(太字)
FS22-172-003-AA/E12v2重鎖をコードするコドン最適化核酸配列(配列番号32)
FS22-172-003-AA/E12v2軽鎖をコードするコドン最適化核酸配列(配列番号39)
本明細書で言及されている全ての文書は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
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Claims (16)
- プログラム死リガンド1(PD-L1)及びCD137に結合する抗体分子であって、
(a)PD-L1の相補性決定領域(CDR)ベースの抗原結合部位;及び
(b)前記抗体分子のCH3ドメインに位置するCD137抗原結合部位
を含み、前記CDRベースの抗原結合部位が、Kabat番号付けにより、
(i)それぞれ配列番号1、2、3、4、5及び6[E12v2];
(ii)それぞれ配列番号1、2、3、18、19及び20[E05v2];又は
(iii)それぞれ配列番号1、2、3、18、19及び29[G12v2];
に記載のVH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及びVL CDR3を含むか、又は
前記CDRベースの抗原結合部位が、ImMunoGeneTics(IMGT)番号付けにより、
(iv)それぞれ配列番号7、8、9、10、11及び6[E12v2];
(v)それぞれ配列番号21、8、9、22、11及び20[E05v2];又は
(vi)それぞれ配列番号21、8、9、22、11及び29[G12v2];
に記載のVH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及びVL CDR3を含み、
前記CD137抗原結合部位が、それぞれ、前記CH3ドメインのAB及びEF構造ループに位置する第1の配列及び第2の配列を含み、前記第1及び第2の配列が、それぞれ配列番号113及び114[FS22-172-003]、又は79及び80[FS22-53-008]に記載の配列を有する、
抗体分子。 - 前記抗体分子が、
(i)それぞれ配列番号12及び14[E12v2];
(ii)それぞれ配列番号23及び25[E05v2];又は
(iii)それぞれ配列番号23及び30[G12v2]
に記載のVHドメイン及びVLドメインを含む、請求項1に記載の抗体分子。 - 前記抗体分子が、
(i)Kabat番号付けにより、それぞれ配列番号1、2、3、4、5及び6に記載のVH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及びVL CDR3[E12v2];
(ii)IMGT番号付けにより、それぞれ配列番号7、8、9、10、11及び6に記載のVH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及びVL CDR3[E12v2];及び/又は
(iii)それぞれ配列番号12及び14に記載のVHドメイン及びVLドメイン[E12v2]
を含む、請求項1又は2に記載の抗体分子。 - (i)前記第1の配列が、前記抗体分子の前記CH3ドメインの14位と17位の間に位置している;及び/又は
(ii)前記第2の配列が、前記抗体分子の前記CH3ドメインの91位と99位の間に位置しており;並びに
アミノ酸残基の番号付けが、IMGT番号付けスキームに従う、
請求項1から3のいずれか一項に記載の抗体分子。 - 前記抗体分子が、配列番号115[FS22-172-003]又は配列番号81[FS22-53-008]に記載のCH3ドメインを含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の抗体分子。
- 前記CH3ドメイン配列が、当該CH3ドメイン配列のC末端のすぐ隣にリジン残基(K)をさらに含む、請求項5に記載の抗体分子。
- 前記抗体分子が、抗体:
(i)それぞれ配列番号134及び17に記載のFS22-172-003-AA/E12v2;
(ii)それぞれ配列番号137及び28に記載のFS22-172-003-AA/E05v2;
(iii)それぞれ配列番号140及び33に記載のFS22-172-003-AA/G12v2;
(iv)それぞれ配列番号143及び17に記載のFS22-053-008-AA/E12v2;
(v)それぞれ配列番号146及び28に記載のFS22-053-008-AA/E05v2;又は
(vi)それぞれ配列番号149及び33に記載のFS22-053-008-AA/G12v2
の重鎖及び軽鎖を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の抗体分子。 - 前記抗体分子が、それぞれ配列番号134及び17[FS22-172-003-AA/E12v2]に記載の重鎖及び軽鎖を含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の抗体分子。
- 前記重鎖配列の前記CH3ドメイン配列が、当該CH3ドメイン配列のC末端のすぐ隣にリジン残基(K)をさらに含む、請求項8に記載の抗体分子。
- 前記抗体分子が、CH2ドメインを含み、
(i)前記抗体分子が、1つ以上のFcγ受容体への前記抗体分子の前記CH2ドメインの結合を低減又は抑制するように修飾されている、
(ii)前記抗体分子が、1つ以上のFcγ受容体に結合しない、及び/又は
(iii)免疫細胞上のCD137への及び腫瘍細胞表面に結合したPD-L1への前記抗体分子の結合が、前記免疫細胞上のCD137のクラスター化を引き起こす、
請求項1から8のいずれか一項に記載の抗体分子。 - 請求項1から10のいずれか一項に記載の抗体分子をコードする、1つ又は複数の核酸分子。
- 請求項11に記載の1つ又は複数の核酸分子を含む、1つ又は複数のベクター。
- 請求項11に記載の1つ又は複数の核酸分子、又は請求項12に記載の1つ又は複数のベクターを含む、組換え宿主細胞。
- 前記抗体分子の産生条件下で請求項13の組換え宿主細胞を培養することを含み、任意で、前記抗体分子を単離及び/又は精製することをさらに含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の抗体分子を産生する方法。
- 請求項1から10のいずれか一項に記載の抗体分子と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
- 個体における癌の治療のための医薬組成物であって、請求項1から10のいずれか一項に記載の抗体分子を含む、医薬組成物。
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