CN101511868B - 毒蜥外泌肽融合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明提供包含经多肽连接子与运铁蛋白(Tf)融合的毒蜥外泌肽-4的融合蛋白，和相应的核酸分子，载体，宿主细胞和药物组合物。本发明还提供毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白用于治疗II型糖尿病，肥胖和减轻体重的用途。

Description

毒蜥外泌肽融合蛋白
发明领域
本发明涉及包含毒蜥外泌肽-4(exendin-4)和运铁蛋白的融合蛋白和其用于治疗与升高的葡萄糖血清水平相关的疾病和减轻体重的用途，所述疾病例如II型糖尿病。本发明的融合蛋白还可以用于治疗其他已知受益于用毒蜥外泌肽-4和其他GLP-1受体激动剂治疗的疾病，例如I型糖尿病，充血性心力衰竭，心肌梗死，肠易激综合征，神经系统疾病，例如阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)和亨廷顿病(Huntington’s disease)，以及非酒精、非脂肪肝肝病。
发明背景
糖尿病指来源于多种病因因素并且由升高的血浆葡萄糖水平或禁食期间的或口服葡萄糖耐受测试期间施用葡萄糖后的高血糖表征的疾病过程。通常，存在两种公认的糖尿病形式。对于I型糖尿病，或胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)，患者产生很少的胰岛素或不产生胰岛素(胰岛素是调节葡萄糖利用的激素)。对于II型糖尿病，或非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)，患者通常具有与非糖尿病受试者相比相同或甚至更高的血浆胰岛素水平。但是，这些患者在主要的胰岛素敏感组织中对胰岛素对葡萄糖和类脂代谢的刺激效应产生了抗性，所述主要的胰岛素敏感组织为肌肉，肝和脂肪组织。血浆胰岛素水平虽然升高但也不足以克服显著的胰岛素抗性，导致高血糖。
持续的或不受控制的高血糖与增加的和提早(premature)的发病率和死亡率相关。通常，不正常的葡萄糖体内平衡直接和间接地与脂，脂蛋白和载脂蛋白代谢及其他代谢的改变和血流动力学疾病相关。例如，患有II型糖尿病的患者具有显著增加的患大血管和微血管并发症的风险，包括冠心病，中风，外周血管疾病，高血压，肾病和神经疾病。
通常由与总身体脂肪相关且作为某些疾病风险的测量标准的体重指数(BMI)，定义肥胖和超重。BMI通过以千克为单位的体重除以以米为单位的身高的平方进行计算(kg/m2)。通常，超重定义为25-29.9kg/m2的BMI，肥胖定义为30kg/m2或更高的BMI。参见，例如，NationalHeart，Lung，and Blood Institute，Clinical Guidelines on theIdentification，Evaluation，and Treatment of Overweight andObesity in Adults，The Evidence Report，Washington，DC：U.S.Department of Health and Human Services，NIH publication no.98-4083(1998)。
超重或肥胖的个体具有增加的患小病的风险，例如高血压，血脂异常，II型(非胰岛素依赖型)糖尿病，胰岛素抗性，葡萄糖不耐性，高胰岛素血症，冠心病，心绞痛，充血性心力衰竭，中风，胆结石，胆囊炎，胆石病，痛风，骨关节炎，阻塞性睡眠呼吸暂停和呼吸问题，胆囊疾病，某些形式的癌症(例如，子宫内膜癌，乳腺癌，前列腺癌，和结肠癌)和心理障碍(例如忧郁症，进食障碍，扭曲的身体意象(distorted body image)和低自尊)。肥胖的负面健康结果使其在美国成为可预防性死亡的第二主因并且在社会上显现出显著的经济和社会心理的影响。参见McGinnis M，Foege WH.，“Actual Causes ofDeath in the United States，”JAMA 270：2207-12，1993。
现在，公认肥胖是一种需要治疗以减少其相关的健康风险的慢性疾病。虽然减少体重是重要的治疗成果，但肥胖控制的主要目的之一是改善心血管和代谢值，以减少肥胖相关的发病率和死亡率。已经表明减少5-10％的体重可以充分地改善代谢值，例如血糖、血压和脂质浓度。因此，相信体重减少5-10％可以降低发病率和死亡率。目前用于控制肥胖的可获得的处方药通常通过减少饮食脂肪的吸收，如奥利司他，或通过借助减少摄食和/或增加能量消耗引起能量亏损，如西布曲明，来减少体重。
目前II型糖尿病的治疗包括施用外源性胰岛素，口服药物和饮食疗法和运动养生法。2005年，依泽那太(exenatide)(毒蜥外泌肽-4；
Figure G2007800336434D00031
)被FDA批准为用于服用二甲双胍和/或磺酰脲，但没有达到足够的升胰岛素(glycemic)控制的II型糖尿病患者的辅助治疗。依泽那太是毒蜥外泌肽-4，一种有效的GLP-1受体激动剂，其是毒蜥唾液腺的内源性产物。像GLP-1，毒蜥外泌肽-4是一种肠降血糖素。其是促胰岛素性的，抑制摄食和胃排空，并且对啮齿动物的β细胞是营养性的(trophic)(Parks等，Metabolism.50：583-589，2001；Azizand Anderson，J.Nutr.132：990-995，2002；和Egan等，J.Clin.Endocrinol.Metab.87：1282-1290，2002)。此外，由于其N-末端第2位存在甘氨酸，毒蜥外泌肽-4如GLP-1一样不是DPPIV的底物。使用依泽那太的弊端在于每天必须注射两次，因为它的t1/2仅有2-4小时(Kolterman等，J.Clin.Endocrinol.Metab.88：3082-3089，2003和Fineman等，Diabetes Care.26：2370-2377，2003)。
因此，需要维持更久的，抵抗降解的GLP-1受体激动剂分子，其可以用作治疗剂提供升胰岛素控制以及减少体重。开发长效肠降血糖素模拟物提供了通过葡萄糖依赖性胰岛素分泌的持续增强来增强升胰岛素控制的能力，且提供了较不频繁给药的便利。本发明通过提供与经修饰的运铁蛋白融合的毒蜥外泌肽-4分子实现这一需要，其延长了毒蜥外泌肽-4的体内循环半衰期，同时保持了生物活性。因此，本发明的融合蛋白的使用可以降低通常与肠降血糖素使用相关的恶心和呕吐的高发。
发明概述
本发明提供了融合蛋白，其包含通过肽连接子(linker)，优选通过非螺旋的多肽连接子与运铁蛋白(Tf)分子融合的毒蜥外泌肽-4。
优选地，连接子选自PEAPTD(SEQ ID NO：6)，(PEAPTD)2(SEQ IDNO：5)，与IgG铰链连接子结合的PEAPTD(SEQ ID NO：6)，以及与IgG铰链连接子结合的(PEAPTD)2(SEQ ID NO：6)。更优选地，连接子是(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)。
本发明融合蛋白的Tf部分可来源于任意的哺乳动物Tf，优选地，来源于人Tf。更优选地，Tf是经修饰的Tf(mTf)以表现出与天然运铁蛋白分子相比减少的糖基化，并且甚至更优选地，Tf具有如SEQ IDNO：17所示的氨基酸序列。在其他的优选的实施方案中，修饰Tf以减少铁结合和/或与Tf受体的结合。
在另一个优选的实施方案中，融合蛋白的N-末端进一步包含分泌信号序列，优选地，信号序列来自血清运铁蛋白，乳铁蛋白，黑素运铁蛋白(melanotransferrin)，或其变体，更优选地，人血清白蛋白(HSA)/MFα-1杂合前导序列，经修饰的HSA/MFα-1杂合前导序列，或Tf信号序列，和仍更优选地，信号序列是人Tf信号序列(nL)，如SEQ ID NO：18所示。
优选的实施方案中，本发明提供包括毒蜥外泌肽-4(1-39)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf融合蛋白的融合蛋白，其中所述的融合蛋白包含如SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列，其中后者进一步在N-末端包含nL前导序列。在其他的优选的实施方案中，毒蜥外泌肽-4是毒蜥外泌肽-4(1-39)并且具有如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，和/或毒蜥外泌肽-4分子融合在融合蛋白的N-末端，融合蛋白的C-末端或融合蛋白的N-末端和C-末端。
本发明还提供了编码上述融合蛋白的核酸分子，和包含所述核酸分子的相应载体，和包含所述核酸分子和载体的宿主细胞。
本发明还展示了包含任何上述融合蛋白和药学上可接受的载体的药物组合物。
在优选的实施方案中，药物组合物包含SEQ ID NO：23所示的毒蜥外泌肽-4(1-39)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf融合蛋白，并且在一些实施方案中，包含SEQ ID NO：23所示的毒蜥外泌肽-4(1-39)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf融合蛋白的组合物适合于以约0.5mg至约50mg或约1mg至约100mg的剂量范围给药。
在另一个优选的实施方案中，组合物适合于经吸入给药。
本发明还展示了治疗I I型糖尿病或在有此需要的人类患者中降低血糖的方法，其包括将治疗有效量的包含经多肽连接子，优选非螺旋连接子，与Tf融合的毒蜥外泌肽-4的融合蛋白施用给患者。
优选地，该方法包括施用包含如SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列的毒蜥外泌肽-4(1-39)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf融合蛋白，并且在一些实施方案中，如SEQ ID NO：23所示的融合蛋白以约0.5mg至50mg的剂量，以约每周一次，每两周一次，或每月一次的频率给药。在另一个实施方案中，经多肽连接子，优选非螺旋连接子，与Tf融合的毒蜥外泌肽-4，和更优选地，如SEQ ID NO：23所示的融合蛋白，以比依泽那太更低的频率给药并以相当的治疗剂量达到治疗功效。
本发明还展示了治疗肥胖或在有此需要的人类患者中减轻体重的方法，其包括施用治疗有效量的包含经多肽连接子，优选非螺旋连接子，与Tf融合的毒蜥外泌肽-4的融合蛋白。优选地，融合蛋白包括含有如SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列的毒蜥外泌肽-4(1-39)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf融合蛋白，并且，在一些实施方案中，如SEQ ID NO：23所示的融合蛋白，以约1mg至约100mg的剂量，以约每周一次，每两周一次，或每月一次的频率给药。在另一个实施方案中，经多肽连接子与Tf融合的毒蜥外泌肽-4，优选地，如SEQ ID NO：23所示的融合蛋白，以比依泽那太更低的频率给药以达到治疗功效。
本发明还提供了毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白，或药物组合物在制备用于治疗II型糖尿病或用于在有此需要的患者中降低血糖的药物中的用途，优选地，其中药物适合于以约0.5mg至50mg的剂量给药，或在制备用于在有此需要的人类患者中治疗肥胖或减轻体重的药物中的用途，优选地，其中药物适合于以约1mg至约100mg的剂量给药，所述药物组合物包含毒蜥外泌肽/Tf融合蛋白，优选地，毒蜥外泌肽-4(1-39)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)Tf融合蛋白，和更优选地，其中融合蛋白如SEQ ID NO：23所示。
“毒蜥外泌肽-4”指如SEQ ID NO：4所示的毒蜥外泌肽-4(1-39)，和具有从SEQ ID NO：4所示的序列的C-末端除去多达8或9个氨基酸残基以产生，例如，毒蜥外泌肽-4(1-31)或毒蜥外泌肽-4(1-30)的毒蜥外泌肽-4片段，和与毒蜥外泌肽-4(1-39)或其他上述毒蜥外泌肽-4片段之一具有至少90％，和优选地，至少95％同一性的肽。
如本文所用的，当作为DNA编码序列间的符合读框的融合的结果，DNA编码序列翻译为融合多肽时，两种或多种DNA编码序列称为“连接”或“融合”。术语“连接”或“融合”还可以用于指通过可选择的方法融合的肽，例如，化学方法。关于运铁蛋白(Tf)融合物的术语“融合”包括，但不限于，将至少一种治疗蛋白，治疗多肽或治疗肽与Tf的N-末端连接，与Tf的C-末端连接，和/或插入Tf内的任意两个氨基酸之间。
“药学上可接受的”指必须在化学上和/或毒理学上与包含于制剂的其他成分和/或待用其处理的哺乳动物兼容的物质或组合物。
“治疗有效量”指与在治疗前或在媒剂治疗组中确定的适当的对照值相比，减少血糖，热量摄取，减少体重和/或减少身体脂肪的本发明的毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白的量。
术语“治疗”，“治疗的”或“疗法”包括预防性治疗(即预防疾病的治疗)和姑息治疗。
附图简介
图1是表示比较GLP-1(7-37，A8G，K34A)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf融合蛋白(GLP-1/Tf)(图1A)和毒蜥外泌肽-4(1-39)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf融合蛋白(毒蜥外泌肽-4/Tf)(图1B)体外胶原酶抗性(MMP-1)的图。
图2是表示毒蜥外泌肽-4(1-39)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf融合蛋白(毒蜥外泌肽-4/Tf)对糖尿病(db/db)小鼠中血糖的剂量效应的图，并且展示毒蜥外泌肽-4对照的比较的效应。各个点代表平均葡萄糖测量值(n＝3)。
图3是表示每天注射毒蜥外泌肽-4(1-39)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf融合蛋白(毒蜥外泌肽-4/Tf)对体重的剂量效应的图，并且展示毒蜥外泌肽-4和mTf对照的比较的效应。
图4是比较毒蜥外泌肽-4(1-39)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf融合蛋白(毒蜥外泌肽-4/Tf)和毒蜥外泌肽-4的相对效价的图。其通过基于细胞的cAMP测定来确定。毒蜥外泌肽-4(1-39)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf融合蛋白的EC50是31.3pM和毒蜥外泌肽-4的EC50是6.6pM。
发明详述
毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白
本发明的毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白包含经多肽连接子与Tf肽融合的毒蜥外泌肽-4。优选地，用全长毒蜥外泌肽-4(1-39)(SEQ ID NO.：4)，或者从SEQ ID NO：4所示的序列的C-末端除去多达8或9个氨基酸残基以产生，例如，毒蜥外泌肽-4(1-31)或毒蜥外泌肽-4(1-30)的毒蜥外泌肽-4片段。
优选地，非螺旋多肽连接子部分用于将毒蜥外泌肽-4连接至Tf。
优选的连接子为PEAPTDPEAPTD(SEQ ID NO：5)。其他连接子可选自PEAPTD(SEQ ID NO.：6)，与I gG铰链连接子(SEQ ID NO：7-16)结合的PEAPTD(SEQ ID NO.：6)，和与IgG铰链连接子(SEQ ID NO：7-16)结合的PEAPTDPEAPTD(SEQ ID NO.：5)。本发明的包含实质上非螺旋连接子部分的融合蛋白与不具有实质上非螺旋连接子的相似的融合蛋白相比，可表现增加的表达产率。进一步，包含实质上非螺旋连接子的毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白与具有螺旋多肽连接子的相似的融合蛋白相比，可表现增加的表达产率。
优选的毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白包含经连接子(PEAPTD)2(SEQID NO：5)与SEQ ID NO：17中提供的mTf连接的毒蜥外泌肽-4(1-39)(SEQ ID NO：4)。制备时，优选毒蜥外泌肽-4(1-39)(PEAPTD)2(SEQID NO：5)mTf融合蛋白还包含人运铁蛋白分泌信号或前导序列(nL)(SEQ ID NO：18)。编码优选的毒蜥外泌肽-4(1-39)(PEAPTD)2(SEQ IDNO：5)mTf融合蛋白的各个组分的核酸序列如下：nL前导序列(SEQ IDNO：19)，毒蜥外泌肽-4(1-39)(SEQ ID NO：20)，(PEAPTD)2(SEQ IDNO：21)，和mTf(SEQ ID NO：22)。不具有nL前导序列的完整毒蜥外泌肽-4(1-39)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：23；相应的核酸序列为SEQ ID NO：24。在N-末端具有nL前导序列的完整的毒蜥外泌肽-4(1-39)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf的融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：25；其相应的核酸序列为SEQ ID NO：26。
虽然优选的mTf如上所述，可以使用任何运铁蛋白来制备本发明的毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白。作为实例，野生型人Tf是约75kDa的679个氨基酸的蛋白(未计算糖基化)，具有两个主要的结构域或小叶(lobe)，N(约330个氨基酸)和C(约340个氨基酸)，其似乎来源于基因重复。参见GenBank登录号NM_001063，XM_002793，M12530，XM_039845，XM_039847和S95936(所有这些以其全文通过引用并入本文)，以及SEQ ID NO：2和3(SEQ ID NO：2包含nL人运铁蛋白前导序列的额外的19个氨基酸序列)。两个结构域随时间而相异，但是保留很大程度的同一性/相似性。
N和C小叶各进一步分为两个亚域，N1和N2，C1和C2。Tf的功能是将铁转运到身体的细胞。这个过程由Tf受体(TfR)介导，其在所有细胞上表达，特别是活跃生长的细胞。TfR识别Tf的铁结合形态(每个受体结合其两个分子)，引起内吞作用，由此TfR/Tf复合物被转运到内体。内体中pH的局部下降导致释放结合的铁和TfR/Tf复合物循环到细胞表面和释放Tf(已知为未结合铁的形态的apoTf)。受体结合通过Tf的C结构域发生。因为未糖基化的结合铁的Tf与受体结合，C结构域中的两个糖基化位点似乎不涉及受体结合。
每个Tf分子可以运送两个铁离子(Fe3+)。其复合在N1和N2，C1和C2亚域之间的空间中，导致分子中的构象改变。
对于SEQ ID NO：3的人运铁蛋白，铁结合位点至少包含氨基酸Asp 63(SEQ ID NO：2的Asp 82，SEQ ID NO：2包括天然Tf信号序列)，Asp 392(SEQ ID NO：2的Asp 411)，Tyr 95(SEQ ID NO：2的Tyr 114)，Tyr 426(SEQ ID NO：2的Tyr 445)，Tyr 188(SEQ IDNO：2的Tyr 207)，Tyr 514或517(SEQ ID NO：2的Tyr 533或Tyr536)，His 249(SEQ ID NO：2的His 268)，和His 585(SEQ ID NO：2的His 604)。铰链区至少包含SEQ ID NO：3的N结构域氨基酸残基94-96，245-247和/或316-318以及C结构域氨基酸残基425-427，581-582和/或652-658。SEQ ID NO：3的人Tf的碳酸盐(carbonate)结合位点至少包含氨基酸Thr 120(SEQ ID NO：2的Thr 139)，Thr 452(SEQ ID NO：2的Thr 471)，Arg 124(SEQ ID NO：2的Arg 143)，Arg456(SEQ ID NO：2的Arg 475)，Ala 126(SEQ ID NO：2的Ala 145)，Ala 458(SEQ ID NO：2的Ala 477)，Gly 127(SEQ ID NO：2的Gly146)，和Gly 459(SEQ ID NO：2的Gly 478)。
优选地，经修饰的毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白是人源的，尽管任何动物的Tf分子可用于制备本发明的融合蛋白，包括人Tf变体，牛，猪，羊，狗，兔，大鼠，小鼠，仓鼠，echnida，鸭嘴兽，鸡，青蛙，天峨幼虫，猴，和其他牛科，犬科和鸟类物种。所有这些Tf序列都可以在GenBank和其他公开的数据库中容易地获得。人Tf核酸序列是可获得的(参见SEQ ID NO：1和上述登录号)并且可以用于制备Tf或Tf的结构域和所选择的治疗分子之间的基因融合物。融合物还可以由相关分子制备，例如乳运铁蛋白(乳铁蛋白)GenBank Acc：NM_002343)或鼠科黑素运铁蛋白(GenBank Acc.NM_013900)。
黑素运铁蛋白是糖基化蛋白，在恶性黑色素瘤细胞中以高水平发现并且原来被称为人黑色素瘤抗原p97(Brown等，1982，Nature，296：171-173)。它与人血清运铁蛋白，人乳铁蛋白，和鸡运铁蛋白具有高度序列同源性(Brown等，Nature，296：171-173，1982；Rose等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83：1261-1265，1986)。然而，与这些受体不同，未鉴定到黑素运铁蛋白的细胞受体。黑素运铁蛋白可逆性结合铁并且它存在两种形式，其中之一通过糖基磷脂酰肌醇锚定结合到细胞膜，而另一种形式是可溶的和活跃分泌的(Baker等，FEBSLett，298，1992：215-218；Alemany等，J.Cell Sci.，104：1155-1162，1993；Food等，J.Biol.Chem.274：7011-7017，1994)。
已发现乳铁蛋白(Lf)，天然防御铁结合蛋白，具有抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗肿瘤和抗炎活性。该蛋白存在于通常暴露于正常菌群的外分泌物中：乳液、泪液、鼻溢泌物、唾液、支气管粘液、胃肠液、子宫颈阴道粘液和精液。另外，Lf是循环多形核中性粒细胞(PMNs)的二级特异性颗粒的主要成分。载脂蛋白在脓毒性区域中的PMNs的脱粒下进行释放。Lf的主要功能是清除体液和发炎区域中的游离铁，以抑制自由基介导的损伤和减少金属侵害微生物和肿瘤细胞的有效性。在检验成人中的125I Lf周转率的研究中，表明Lf迅速被肝和脾摄取，并且放射性在肝和脾中持续数周(Bennett等，Clin.Sci.(Lond.)57：453-460，1979)。
本发明的毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白的运铁蛋白部分包括运铁蛋白剪接变体。在一个实施例中，运铁蛋白剪接变体可以是人运铁蛋白剪接变体。特别地，人运铁蛋白剪接变体可以是Genbank登录号为AAA61140的那个。
本发明的毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白的运铁蛋白部分包括乳铁蛋白剪接变体。在一个实施例中，人血清乳铁蛋白剪接变体可以是嗜中性粒细胞乳铁蛋白的新的剪接变体。特别地，嗜中性粒细胞乳铁蛋白剪接变体的序列可以如Genbank登录号AAA59479所示。嗜中性粒细胞乳铁蛋白剪接变体也可以包含如下的氨基酸序列，EDCIALKGEADA(SEQID NO：27)，其包括剪接变异的新的区域。
可选择地，本发明的毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白的运铁蛋白部分包括黑素运铁蛋白变体。
经修饰的Tf融合物可以用任意的Tf蛋白，片段，结构域或经工程改造的结构域制备。例如，融合蛋白可以用具有或不具有天然Tf信号序列的全长Tf序列制备。Tf融合蛋白还可以用单一的Tf结构域制备，例如单独的N或C结构域或包含2N或2C结构域的Tf的经修饰的形式(参见美国专利US 2006/0130158)。可制备治疗蛋白与单一的C结构域的融合物，其中C结构域经改变以减少、抑制或防止糖基化。可选择地，单一的N结构域用作C结构域和N结构域中的Tf糖基化位点残基是有益的。优选地，Tf融合蛋白具有以高水平表达的单一的N结构域。
如本文所用的，经修饰以如N样结构域一样起作用的C末端结构域或小叶被修饰，以表现实质上与天然的或野生型N结构域或小叶相像的糖基化模式或铁结合特性。优选地，通过将相关的C结构域区域或氨基酸取代为存在于天然的或野生型N结构域的相应的区域或位点中的那些来修饰C结构域或小叶，使其不被糖基化并且不与铁结合。
如本文所用的，包含“两个N结构域或小叶”的Tf部分包括经修饰的Tf分子，其用天然的或野生型N结构域或小叶或经修饰的N结构域或小叶取代天然C结构域或小叶，或者其包含C结构域，所述的C结构域经修饰以实质上像野生型或经修饰的N结构域那样起作用。
通过两个结构域重叠(overlay)(Swiss PDB Viewer 3.7b2，Iterative Magic Fit)和通过直接的氨基酸比对(ClustalW multiplealignment)进行的两个结构域的分析表明两个结构域随时间而相异。氨基酸比对表明两个结构域之间具有42％的同一性和59％的相似性。然而，就结构等价性而言，大约80％的N结构域与C结构域匹配。与N结构域相比，C结构域还具有一些额外的二硫键。
在一个实施方案中，毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白的运铁蛋白部分包括运铁蛋白的至少两个N末端小叶。在进一步的实施方案中，毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白的运铁蛋白部分包括衍生自人血清运铁蛋白的运铁蛋白的至少两个N末端小叶。
毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白的运铁蛋白部分还可以包括：在至少一个氨基酸残基处具有突变的运铁蛋白的至少两个N末端小叶，所述的氨基酸残基选自SEQ ID NO：3的Asp63，Gly65，Tyr95，Tyr188，和His249；在SEQ ID NO：3的Lys206或His207处具有突变的重组人血清运铁蛋白N-末端小叶突变体；或运铁蛋白的至少两个C末端小叶。在进一步的实施方案中，毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白的运铁蛋白部分包括衍生自人血清运铁蛋白的运铁蛋白的至少两个C末端小叶。
在进一步的实施方案中，C末端小叶突变体进一步包括SEQ ID NO：3的Asn413和Asn611中至少一个的突变，该突变不允许糖基化。
在另一个实施方案中，毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白的运铁蛋白部分包括在至少一个氨基酸残基处具有突变运铁蛋白的至少两个C末端小叶，所述的氨基酸残基选自SEQ ID NO：3的Asp392，Tyr426，Tyr514，Tyr517和His585，其中突变体保留了结合金属的能力。在可选择的实施方案中，毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白的运铁蛋白部分包括在至少一个氨基酸残基处具有突变的运铁蛋白的至少两个C末端小叶，所述的氨基酸残基选自SEQ ID NO：3的Tyr426，Tyr514，Tyr517和His585，其中突变体具有减少的结合金属的能力。在另一个实施方案中，毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白的运铁蛋白部分包括在至少一个氨基酸残基处具有突变的运铁蛋白的至少两个C末端小叶，所述的氨基酸残基选自SEQ ID NO：3的Asp392，Tyr426，Tyr517和His585，其中突变体没有保留结合金属的能力且实质上像N结构域那样起作用。
当Tf的C结构域是融合蛋白的一部分时，为了在酵母系统中表达，防止糖基化或高甘露糖基化(hypermannosylationn)并且延长融合蛋白和/或治疗蛋白的血清半衰期(以制备去唾液酸-Tf，或在一些实例中，单唾液酸-Tf或双唾液酸-Tf)，可以突变两个N连接的糖基化位点，相应于SEQ ID NO：3的N413和N611的氨基酸残基。除相应于N413和N611的Tf氨基酸外，可以突变N-X-S/T糖基化位点内的相邻残基，以防止或充分减少糖基化。参见美国专利5,986,067。已经报道在毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达的Tf的N结构域在S32处用单一已糖进行O连接的糖基化，其也可以被突变或修饰以防止此类糖基化。
因此，毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白还可以包括经修饰的运铁蛋白分子，其中运铁蛋白表现出减少的糖基化，包括但不限于Tf的去唾液酸-，单唾液酸-和双唾液酸形式。在另一个实施方案中，毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白的运铁蛋白部分包括重组的运铁蛋白突变体，其被突变以防止糖基化。毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白的运铁蛋白部分还可以包括重组的运铁蛋白突变体，其被充分糖基化。在进一步的实施方案中，毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白的运铁蛋白部分包括重组的人血清运铁蛋白突变体，其被突变以防止N-连接的糖基化，其中SEQ ID NO：3的Asn413和Asn611中至少一个被突变为不允许糖基化的氨基酸。在另一个实施方案中，毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白的运铁蛋白部分包括重组的人血清运铁蛋白突变体，其被突变以防止或充分减少糖基化，其中，例如使N-X-S/T糖基化位点内的相邻残基突变，例如S/T残基的突变。此外，可以通过突变丝氨酸或苏氨酸残基来减少或防止糖基化。进一步，已知将X变为脯氨酸抑制糖基化。
如下文更详细的论述，本发明的经修饰的Tf融合蛋白还可以被工程改造为不结合铁和/或结合Tf受体。在本发明其他的实施方案中，保留铁结合并且Tf的结合铁的能力可以用于跨过上皮或内皮细胞膜，将治疗蛋白或肽递送到细胞内。通常工程化改造这些结合铁和/或Tf受体的实施方案以减少或防止糖基化，从而延长治疗蛋白的血清半衰期。当装载铁时，单独的N结构域不能与TfR结合，而结合铁的C结构域可以结合TfR，但是不具有与完整分子相同的亲和力。
可选择地，毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白的运铁蛋白部分可以包括具有突变的重组运铁蛋白突变体，其中突变体不保留结合金属离子的能力。在可选择的实施方案中，毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白的运铁蛋白部分包括具有突变的重组运铁蛋白突变体，其中突变体具有比野生型血清运铁蛋白弱的对金属离子的结合亲和力。在可选择的实施方案中，毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白的运铁蛋白部分包括具有突变的重组运铁蛋白突变体，其中突变体具有比野生型血清运铁蛋白强的对金属离子的结合亲和力。
在另一个实施方案中，毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白的运铁蛋白部分包括具有突变的重组运铁蛋白突变体，其中突变体不保留结合运铁蛋白受体的能力。例如，本发明的毒蜥外泌肽-4和Tf融合蛋白可以结合细胞表面GLP-1受体而不能结合Tf受体。此类融合蛋白在细胞表面(即不进入细胞)可以是治疗活性的。
可选择地，毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白的运铁蛋白部分可以包括：具有突变的重组运铁蛋白突变体，其中突变体具有比野生型血清运铁蛋白弱的对运铁蛋白受体的结合亲和力；具有突变的重组运铁蛋白突变体，其中突变体具有比野生型血清运铁蛋白强的对运铁蛋白受体的结合亲和力；具有突变的重组运铁蛋白突变体，其中突变体不保留结合碳酸盐离子的能力；具有突变的重组运铁蛋白突变体，其中突变体具有比野生型血清运铁蛋白弱的对碳酸盐离子的结合亲和力；或具有突变的重组运铁蛋白突变体，其中突变体具有比野生型血清运铁蛋白强的对碳酸盐离子的结合亲和力。
在另一个实施方案中，毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白的运铁蛋白部分包括重组的人血清运铁蛋白突变体，其在至少一个选自SEQ ID NO：3的Asp63，Gly65，Tyr95，Tyr188，His249，Asp392，Tyr426，Tyr514，Tyr517和His585的氨基酸残基中具有突变，其中突变体保留结合金属离子的能力。在可选择的实施方案中，重组人血清运铁蛋白突变体在至少一个选自SEQ ID NO：3的Asp63，Gly65，Tyr95，Tyr188，His249，Asp392，Tyr426，Tyr514，Tyr517和His585的氨基酸残基中具有突变，其中突变体具有减弱的结合金属离子的能力。在另一个实施方案中，重组人血清运铁蛋白突变体在至少一个选自SEQ ID NO：3的Asp63，Gly65，Tyr95，Tyr188，His249，Asp392，Tyr426，Tyr517和His585的氨基酸残基中具有突变，其中突变体不保留结合金属离子的能力。
在另一个实施方案中，毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白的运铁蛋白部分包括在SEQ ID NO：3的Lys206或His207处具有突变的重组人血清运铁蛋白突变体，其中突变体具有比野生型人血清运铁蛋白强的对金属离子的结合亲和力(参见美国专利5,986,067)。在可选择的实施方案中，毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白的运铁蛋白部分包括在SEQ ID NO：3的Lys206或His207处具有突变的重组人血清运铁蛋白突变体，其中突变体具有比野生型人血清运铁蛋白弱的对金属离子的结合亲和力。在进一步的实施方案中，毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白的运铁蛋白部分包括在SEQ ID NO：3的Lys206或His207处具有突变的重组人血清运铁蛋白突变体，其中突变体不结合金属离子。
任何可利用的技术可以用于制备本发明的毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白，包括但不限于常用(commonly available)的分子技术，例如，在Sambrook等Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989中公开的那些分子技术。当使用本领域公知的实现位点特异性诱变的技术进行核苷酸取代时，被编码的氨基酸的改变优选次类(minor nature)，即保守氨基酸取代，然而其他的，非保守的取代也是预期的，特别是当制备Tf融合蛋白的经修饰的运铁蛋白部分时，例如，表现出减少的糖基化，减弱的铁结合等等的经修饰的Tf蛋白。尤其预期的是氨基酸取代，小的缺失或插入，典型地1至约30个氨基酸的缺失或插入；运铁蛋白结构域之间的插入；小的氨基或羧基端的延伸，例如氨基端的甲硫氨酸残基，或运铁蛋白结构域之间或连接运铁蛋白和毒蜥外泌肽-4的少于50，40，30，20或10个残基的小的连接子肽或促进纯化的小的延伸，例如，多聚组氨酸束(tract)，抗原表位或结合结构域。
保守氨基酸取代的实例是相同组内的取代，例如碱性氨基酸(例如精氨酸，赖氨酸，组氨酸)，酸性氨基酸(例如谷氨酸和天冬氨酸)，极性氨基酸(例如谷氨酰胺和天冬酰胺)，疏水性氨基酸(例如亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸)，芳香性氨基酸(例如苯丙氨酸，色氨酸，酪氨酸)和小氨基酸(例如甘氨酸，丙氨酸，丝氨酸，苏氨酸，甲硫氨酸)组内的取代。
非保守性取代包括一组中的氨基酸被另一组中的氨基酸取代。例如，非保守性取代可以包括用极性氨基酸取代疏水性氨基酸。对于核苷酸取代的一般性描述，参见例如Ford等，Prot.Exp.Pur.2：95-107，1991。非保守性取代，缺失和插入对于制备本发明的Tf融合蛋白特别有用，所述的Tf融合蛋白表现为不与铁结合或与铁减少的结合，融合蛋白不与Tf受体结合或与Tf受体减少的结合和/或无糖基化或减少的糖基化。
通过突变(包括缺失，取代或插入到)相应于SEQ ID NO：3的Tf N结构域残基Asp63，Tyr95，Tyr188，His249和/或C结构域残基Asp 392，Tyr 426，Tyr 514和/或His 585的一个或多个的氨基酸残基，可以减少或破坏铁结合和/或受体结合。还可以通过突变SEQID NO：3的氨基酸Lys206，His207或Arg632影响铁结合。通过突变(包括缺失，取代或插入到)相应于SEQ ID NO：3的Tf N结构域残基Thr120，Arg124，Ala126，Gly 127和/或C结构域残基Thr 452，Arg 456，Ala 458和/或Gly 459的一个或多个的氨基酸残基，可以减少或破坏碳酸盐的结合。碳酸盐结合的减少或破坏可以负面影响铁和/或受体结合。
通过突变(包括缺失，取代或插入到)相应于上述针对铁结合的Tf N结构域残基的一个或多个的氨基酸残基，可以减少或破坏与Tf受体的结合。
如上所述，通过突变(包括缺失，取代或插入到)相应于N-X-S/T位点附近的Tf C结构域残基的一个或多个的氨基酸残基，可以减少或防止糖基化，所述N-X-S/T位点相应于C结构域残基N413和/或N611(见美国专利5,986,067)。例如，N413和/或N611可以突变为Glu残基。
在其中不修饰本发明的Tf融合蛋白以防止糖基化，铁结合，碳酸盐结合和/或受体结合的情况下，糖基化，铁和/或碳酸盐离子可从融合蛋白剥离或切离。例如，可获得的去糖基化酶(deglycosylases)可以用于从融合蛋白切离糖基化残基，特别是连接到Tf部分的糖残基，糖基化酶缺陷的酵母可用于防止糖基化和/或重组细胞可以在防止糖基化的试剂(例如衣霉素)存在的条件下培养。
通过用去糖基化酶处理融合蛋白，可以酶促地减少或完全除去融合蛋白上的糖。去糖基化酶是本领域已知的。去糖基化酶的实例包括但不限于半乳糖苷酶，PNGase A，PNGase F，葡糖苷酶，甘露糖苷酶，岩藻糖苷酶，和Endo H去糖基化酶。
然而，在某些情况下，对于口服递送而言，可优选融合蛋白的Tf部分被充分糖基化。
可以对Tf进行其他突变以改变Tf的三维结构，例如修饰铰链区以防止铁结合和Tf受体识别所需要的构象改变。例如，可以在N结构域氨基酸残基94-96，245-247和/或316-318以及C结构域氨基酸残基425-427，581-582和/或652-658中或附近进行突变。另外，可以在这些位点的侧翼区域中或附近进行突变以改变Tf的结构和功能。
毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白可以作为载体蛋白起作用，以延长治疗蛋白的半衰期或生物利用率，和在一些实例中，递送治疗蛋白到细胞内和/或跨过血脑屏障(BBB)。在可选择的实施方案中，融合蛋白包括经修饰的运铁蛋白分子，其中运铁蛋白未保留跨过BBB的能力。
在另一个实施方案中，毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白包括经修饰的运铁蛋白分子，其中运铁蛋白分子保留与运铁蛋白受体结合和运送治疗肽到细胞内的能力。在可选择的实施方案中，毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白包括经修饰的运铁蛋白分子，其中运铁蛋白分子未保留与运铁蛋白受体结合和运送治疗肽到细胞内的能力。
在进一步的实施方案中，毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白包括经修饰的运铁蛋白分子，其中运铁蛋白分子保留与运铁蛋白受体结合和运送治疗肽到细胞内的能力并且保留跨过BBB的能力。在可选择的实施方案中，毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白包括经修饰的运铁蛋白分子，其中运铁蛋白分子保留跨过BBB的能力，但未保留与运铁蛋白受体结合和运送治疗肽到细胞内的能力。
本发明的经修饰的融合蛋白可以由通过肽键或经修饰的肽键而相互连接的氨基酸组成，可以包含20个基因编码的氨基酸以外的氨基酸。多肽可以通过自然过程，例如翻译后加工，或通过本领域已知的化学修饰技术进行修饰。此类修饰在基础课本和更详细的专著中，以及大量的研究文献中被详细描述。
修饰可以存在于多肽中的任何位置，包括肽主链，氨基酸侧链和氨基或羧基末端。应理解相同种类的修饰可以以相同或不同的程度存在于给定的多肽中的几个位点。给定的多肽也可以包含很多种类的修饰。多肽可以分支，例如，作为泛素化的结果，并且它们可以是环状的，具有或不具有支链。环状的，分支的和分支的环状多肽可以由翻译后的天然加工产生或可以通过合成方法制备。修饰包括乙酰化，酰化，ADP-核糖基化，酰胺化，黄素的共价结合，血红素部分的共价结合，核苷酸或核苷酸衍生物的共价结合，脂质或脂质衍生物的共价结合，磷脂酰肌醇的共价结合，交联，环化，二硫键形成，去甲基化，共价交联的形成，半胱氨酸的形成，糖基化，GPI锚定形成，羟基化，碘化，甲基化，十四烷基化，氧化，聚乙二醇化，蛋白酶解加工，磷酸化，异戊烯化，外消旋化，硫酸化，转移RNA介导的氨基酸加入蛋白质(例如精氨酰化)，和泛素化(参见，例如，Proteins-Structureand Molecular Properties，2nd Ed.，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，New York，1993；Post-translationalCovalent Modification of Proteins，B.C.Johnson，Ed.，AcademicPress，New York，pgs.1-12，1983；和Seifter等Meth.Enzymol.182：626-646，1990)。
编码毒蜥外泌肽-4/Tf的核酸分子
本发明还提供了编码毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白的核酸分子。优选的核酸分子编码SEQ ID NO：23，其是通过(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)与mTf连接的毒蜥外泌肽-4(1-39)的氨基酸序列。示例性核酸序列如SEQ ID NO：24所示。更优选地，本发明的核酸序列编码SEQ ID NO：25，其是加上了表示人运铁蛋白分泌信号或前导序列的额外的N-末端19个氨基酸的毒蜥外泌肽-4(1-39)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf的氨基酸序列。示例性编码SEQ ID NO：25的核酸序列如SEQ ID NO：26所示。
编码毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白的序列还可包括C-末端的终止密码子(例如，tga，taa，tag)，并且可以容易地用多种方法获得，包括但不限于，化学合成，获自cDNA或基因组文库筛选的野生型毒蜥外泌肽-4和运铁蛋白多核苷酸序列的基因突变，表达文库筛选，和/或cDNA的聚合酶链式反应(PCR)扩增。编码毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白的核酸分子可以用定点诱变，PCR扩增或其他适当的方法制备，其中引物具有期望的点突变。本文所述的重组DNA方法和诱变方法通常为Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989，和Current Protocols inMolecular Biology，Ausubel等，Green Publishers Inc.and Wileyand Sons，1994中所述的方法。
编码毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白氨基酸序列的核酸多核苷酸可以通过表达克隆来鉴定，其使用基于表达蛋白的性质的阳性克隆的检测。通常，通过抗体或其他结合伴侣(例如受体或配体)与在宿主细胞表面表达和展示的克隆蛋白质的结合，筛选核酸文库。用可检测的标记修饰抗体或结合伴侣以鉴定表达期望克隆的那些细胞。
可以依照如下所述的说明进行重组表达技术以制备毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白编码多核苷酸和表达所编码的多肽。例如，通过将编码毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白氨基酸序列的核酸序列插入到合适的载体中，本领域技术人员可以容易地制备大量期望的核苷酸序列。然后该序列可以用于产生检测探针或扩增引物。可选择地，编码毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白氨基酸序列的多核苷酸可以插入到表达载体中。通过将表达载体导入合适的宿主，可以大量制备所编码的毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白。
另一种用于获得合适的核酸序列的方法为聚合酶链式反应(PCR)。在该方法中，用逆转录酶从poly(A)+RNA或总RNA制备cDNA。然后将两个引物(通常与编码毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白氨基酸序列的cDNA的两个分离的区域互补)与聚合酶，例如Taq聚合酶一起加入到cDNA，聚合酶扩增两个引物之间的cDNA区域。
编码多肽的氨基端的DNA片段可具有ATG，其编码甲硫氨酸残基。甲硫氨酸在毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白的成熟形式上可以存在或不存在，取决于宿主细胞中产生的多肽是否设计为从细胞中分泌。编码异亮氨酸的密码子也可以用作起始位点。本领域技术人员已知的其他方法也可以使用。在一些实施方案中，核酸变体包含经改变的密码子，以在给定的宿主细胞中最优化毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白的表达。具体的密码子改变取决于毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白和所选择的用于表达的宿主细胞。此类密码子优化可以通过多种方法进行，例如，通过选择在给定宿主细胞的高表达基因中优选使用的密码子。可以使用针对高表达细菌基因的密码子偏好合并密码子频率表(例如″Eco_high.Cod″)的计算机运算法，其由University of WisconsinPackage Version 9.0(Genetics Computer Group，Madison，Wis.)提供。其他的有用的密码子频率表包括″Celegans_high.cod，″″Celegans_low.cod，″″Drosophila_high.cod，″″Human_high.cod，″″Maize_high.cod，″和″Yeast_high.cod.″。
载体
编码毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白氨基酸序列的核酸分子用标准连接技术插入到合适的表达载体中。载体通常选择为在所用的特定的宿主细胞中有功能的(即，载体与宿主细胞机制兼容，以便可以发生基因的扩增和/或基因的表达)。编码毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白氨基酸序列的核酸分子可以在原核，酵母，昆虫(杆状病毒系统)和/或真核宿主细胞中扩增/表达。对于表达载体的综述，参见Meth.Enz.，vol.185，D.V.Goeddel，Academic Press，1990。
通常，在任意宿主细胞中使用的表达载体包含用于质粒维持和用于外源核苷酸序列的克隆和表达的序列。此类序列，在一些实施方案中统称为“侧翼序列”，通常包括下列核苷酸序列的一种或多种：启动子，一个或多个增强子序列，复制起点，转录终止序列，包含供体和受体剪接位点的完整内含子序列，编码用于多肽分泌的前导序列的序列，核糖体结合位点，多聚腺苷酸化序列，用于插入编码待表达的多肽的核酸的多连接子区，和选择性标记元件。这些序列各在下面进行讨论。
任选地，载体可包含“标签”编码序列，即，位于毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白编码序列5’或3’末端的寡核苷酸分子；该寡核苷酸序列编码polyHis(例如6His)，或其他“标签”例如，FLAG，HA(流感病毒血凝素)，或存在商业可获得的针对其的抗体的myc。多肽表达后，该标签通常与多肽融合，并且可用作从宿主细胞亲和纯化毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白的手段。亲和纯化可例如通过使用抗标签的抗体作为亲和基质的柱层析完成。任选地，随后可通过多种方法，例如使用一些用于切割的肽酶，例如，用肠激酶消化在氨基酸序列之一的上游的FLAG标签序列的3’端，从已纯化的毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白中除去标签。
侧翼序列可以是同源的(即，来自与宿主细胞相同的物种和/或株系)，异源的(即来自宿主细胞物种或株系以外的物种)，杂合的(即，来自多于一种来源的侧翼序列的组合)，或合成的，或侧翼序列可以是天然序列，其正常起作用以调节毒蜥外泌肽-4表达。侧翼序列的来源可以是任意原核或真核生物，任何脊椎或无脊椎生物，或任何植物，只要侧翼序列在宿主细胞机制中起作用且可由宿主细胞机制激活。
可以通过现有技术已知的任意方法获得有用的侧翼序列。通常，本文中有用的侧翼序列之前已经通过定位和/或通过限制性核酸内切酶消化进行鉴定，并且因此可以从合适的组织来源中用适当的限制性核酸内切酶进行分离。在一些情况中，侧翼序列的完整核苷酸序列可以是已知的。这里，侧翼序列可以用本文描述的用于核酸合成或克隆的方法进行合成。
其中侧翼序列的全部或仅一部分是已知的，其可以用PCR和/或通过用合适的寡核苷酸和/或来自相同或另一种物种的侧翼序列片段筛选基因组文库来获得。其中侧翼序列是未知的，包含侧翼序列的DNA片段可以分离自可包含，例如，编码序列或甚至另一种基因或多种基因的较大量的DNA。分离可以通过以下来完成：用限制性核酸内切酶消化以产生合适的DNA片段，然后使用琼脂糖凝胶纯化，柱层析(Qiagen，Chatsworth，CA)，或其他的本领域技术人员已知的方法进行分离。选择合适的酶来实现这一目的对本领域技术人员来说是显而易见的。
复制起点通常是商业购买的那些原核表达载体的一部分，并且该起点帮助载体在宿主细胞中扩增。载体扩增到一定拷贝数，在一些实例中，对于毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白的最优化表达是重要的。如果所选择的载体不包含复制起始位点，那么基于已知的序列可以化学合成复制起始位点，并且连接到载体中。例如，质粒pBR 322(New EnglandBiolabs，Beverly，MA)的复制起点适用于大多数革兰氏阴性细菌并且不同复制起点(例如，SV40，多瘤病毒，腺病毒，水疱性口炎病毒(VSV)，或乳头瘤病毒例如HPV或BPV)适用于哺乳动物细胞中的克隆载体。通常，对哺乳动物的表达载体来说，不需要复制起点成分(例如，经常使用SV40起点只是因为它包含早期启动子)。
转录终止序列通常位于多肽编码区的3’末端并且用于终止转录。通常，原核细胞中的转录终止序列是随后接着poly-T序列的富含G-C的片段。当序列易于从文库中克隆或甚至作为载体的部分商业购买时，该序列也可易于用核酸合成方法例如本文所述的那些方法来合成。
选择性标记基因元件编码对在选择性培养基中培养的宿主细胞的存活和生长来说必需的蛋白质。代表性的选择性标记基因编码这样的蛋白，所述的蛋白(a)赋予原核宿主细胞对抗生素或其他毒素的抗性，例如，氨苄青霉素，四环素，或卡那霉素；(b)补充细胞的营养缺陷；或(c)供应不能从复合培养基获得的关键营养。优选的选择性标记是卡那霉素抗性基因，氨苄青霉素抗性基因，和四环素抗性基因。新霉素抗性基因也可以用于原核和真核宿主细胞的选择。
其他的选择基因可以用于扩增待表达的基因。扩增是一个过程，其中对于对生长必须的蛋白质的产生来说大量需要的基因在重组细胞的连续世代的染色体内依次重复。对哺乳动物细胞来说合适的选择性标记的实例包括二氢叶酸还原酶(DHFR)和胸腺嘧啶激酶。将哺乳动物细胞转化体置于选择压力下，其中只有转化体依靠载体中存在的选择性基因而唯一适合存活。通过在其中培养基中的选择性试剂的浓度连续改变的条件下培养转化细胞来利用选择压力，从而导致选择性基因和编码毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白的DNA两者的扩增。结果，增加数量的毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白从扩增的DNA合成。
核糖体结合位点对mRNA的翻译起始来说通常是必需的并且由Shine-Dalgarno序列(原核生物)或Kozak序列(真核生物)表征。该元件通常位于启动子的3’端和待表达的毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白编码序列的5’端。Shine-Dalgarno序列多种多样但是通常为多聚嘌呤(即具有高A-G含量)。很多Shine-Dalgarno序列已经被鉴定，其各自可以用本文所述的方法容易地合成并且用于原核载体中。
术语“分泌信号序列”或“信号序列”或“分泌前导序列”可替换使用并且描述于例如美国专利6,291,212和5,547,871中。分泌信号序列或信号序列或分泌前导序列编码分泌肽。分泌肽是用于引导成熟多肽或蛋白质从细胞中分泌的氨基酸序列。分泌肽通常由疏水性氨基酸核心表征并且通常发现其(但不是唯一地)在新合成的蛋白质的氨基末端。经常地，在分泌期间，分泌肽被从成熟蛋白中切除。分泌肽可以包含加工位点，当成熟蛋白通过分泌路径时所述的加工位点允许从成熟蛋白中切除信号肽。加工位点可以编码于信号肽内或可以通过，例如，体外诱变添加到信号肽。
分泌肽可以用于引导本发明的融合蛋白的分泌。可以与其他分泌肽结合使用的一个这样的分泌肽是α配对因子前导序列。分泌信号序列或信号序列或分泌前导序列对于导致蛋白质分泌的一系列复杂的翻译后加工步骤来说是必需的。如果存在完整信号序列，表达的蛋白质进入粗面内质网腔然后经高尔基体被运送到分泌囊泡并最终被运送到细胞外。通常，信号序列紧接着起始密码子并且在待分泌的蛋白质的氨基末端编码信号肽。在大多数情况下，信号序列由特定的蛋白酶(称为信号肽酶)切除。优选的信号序列提高了用病毒，哺乳动物或酵母表达载体表达的重组蛋白的加工和输出效率。
在一个实施方案中，天然的Tf信号序列可以用于本发明的融合蛋白的表达和分泌。由于运铁蛋白分子存在于多种类型的分泌物中，例如血液，泪液，和乳液，存在很多不同的运铁蛋白信号肽。例如，运铁蛋白信号肽可以来自血清运铁蛋白，乳铁蛋白，或黑素运铁蛋白。天然的运铁蛋白信号肽还可以来自多种物种，例如昆虫，哺乳动物，鱼，蛙，鸭，鸡，或其他物种。优选地，信号肽来自哺乳动物运铁蛋白分子。更优选地，信号肽来自人血清运铁蛋白。来自不同哺乳动物运铁蛋白分子的信号肽序列在公开号为2006/0205037的美国专利中描述。
优选地，得自运铁蛋白的信号序列可以用于分泌异源蛋白质，例如，可以用Tf信号表达和分泌与Tf信号序列异源的任意目的蛋白。特别地，Tf信号序列可以用于从重组酵母分泌蛋白质。优选地，信号肽来自人血清运铁蛋白(SEQ ID NO：18；由SEQ ID NO：19编码)。其他优选的信号肽包括HSA/MFα-1(SEQ ID NO：40；由SEQ ID NO：41编码)，和经修饰的HSA/MFα-1(SEQ ID NO：42；由SEQ ID NO：43编码)。
为了确保有效移除信号肽序列，在一些情况下，可以优选在信号序列和成熟蛋白之间包括短的前肽序列，其中前肽的C末端部分包含蛋白酶(例如酵母kex2p蛋白酶)的识别位点。优选地，前肽序列的长度为约2-12个氨基酸，更优选地长度为约4-8个氨基酸。此类前肽的实例为Arg-Ser-Leu-Asp-Lys-Arg(SEQ ID NO：113)，Arg-Ser-Leu-Asp-Arg-Arg(SEQ ID NO：114)，Arg-Ser-Leu-Glu-Lys-Arg(SEQ ID NO：115)，和Arg-Ser-Leu-Glu-Arg-Arg(SEQ ID NO：116)。
表达和克隆载体通常包含这样的启动子，其被宿主生物体识别并且可操作地与编码毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白的分子连接。启动子是非转录序列，位于结构基因的起始密码子的上游(即5’端)(通常在约100至1000bp内)，其控制结构基因的转录。启动子常规地分为两类：诱导型启动子和组成型启动子。响应于培养条件的一些改变，例如营养的存在或缺失或温度的改变，诱导型启动子引起在其控制下的DNA的转录水平增加。另一方面，组成型启动子引起持续的基因产物产生；即，很少控制或不控制基因表达。大量的被多种潜在的宿主细胞识别的启动子是已知的。通过借助限制性酶消化从来源DNA移除启动子并将期望的启动子序列插入到载体中，将合适的启动子可操作地与编码毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白的DNA连接。天然的毒蜥外泌肽-4或运铁蛋白启动子序列可以用于指导毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白核酸分子的扩增和/或表达。然而，如果与天然启动子相比异源启动子允许表达的蛋白质的更大量的转录和更高的产量，并且如果其与所选择使用的宿主细胞的系统兼容，则其是优选的。
用于酵母宿主的合适的启动子也是本领域已知的并且在下面进一步论述。酵母增强子与酵母启动子一起使用是有利的。用于哺乳动物宿主细胞的合适的启动子是已知的，并且包括但不限于，从病毒基因组获得的那些启动子，例如多瘤病毒，禽痘病毒，腺病毒(例如腺病毒2)，牛乳头瘤病毒，禽肉瘤病毒，巨细胞病毒，逆转录病毒，乙型肝炎病毒和最优选地猿猴病毒40(SV40)。其他合适的哺乳动物启动子包括异源的哺乳动物启动子，例如，热休克启动子和肌动蛋白启动子。
适用于原核宿主的启动子包括β-内酰胺酶和乳糖启动子系统；E.coli T7可诱导RNA聚合酶；碱性磷酸酶；色氨酸(trp)启动子系统；和杂合启动子例如tac启动子。其他已知的细菌启动子也是合适的。它们的序列已经被公开，从而使得本领域技术人员能够通过使用所需的连接子或接头(以提供任何有用的限制性位点)而将它们与期望的DNA序列连接。
有利于控制毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白表达的其他的启动子包括但不限于：SV40早期启动子区域(Bemoist和Chambon，Nature290：304-10，1981)；CMV启动子；包含于劳氏肉瘤病毒(Rous sarcomavirus)的3’长末端重复中的启动子(Yamamoto et al，Cell 22：787-97，1980)；疱疹胸苷激酶(herpes thymidine kinase)启动子(Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：1444-45，1981)；金属硫蛋白(metallothionine)基因的调控序列(Brinster等，Nature296：39-42，1982)；原核表达载体例如β-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75：3727-31，1978)；或tac启动子(DeBoer等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，80：21-25，1983)。
增强子序列可以插入到载体中以在较高级的真核细胞中增加编码毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白的DNA的转录。增强子是DNA的顺式作用元件，通常长度为约10-300bp，其作用于启动子以增加转录。增强子的相对不依赖于方向和位置。它们已发现于转录单元的5’和3’端。一些获自哺乳动物基因的增强子序列是已知的(例如珠蛋白，弹性蛋白酶，白蛋白，甲胎蛋白，和胰岛素)。然而，通常使用来自病毒的增强子。SV40增强子，巨细胞病毒早期启动子增强子，多瘤增强子，和腺病毒增强子是用于激活真核启动子的示例性增强元件。虽然增强子可以剪接到载体中的毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白编码核酸分子的5’或3’端位置，但它通常位于启动子5’端的位点。
可以从起始载体，例如商业可获得的载体构建表达载体。此类载体可以包含或不包含所有的期望的侧翼序列。当一个或多个本文描述的侧翼序列不存在于载体中时，它们可以单独地获得并连接到载体中。用于获得各个侧翼序列的方法是本领域技术人员公知的。
在本发明中使用的合适的酵母载体描述于例如美国专利6,291,212中，并且包括YRp7(Struhl等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76：1035-1039，1978)，YEp13(Broach等，Gene 8：121-133，1979)，pJDB249和pJDB219(Beggs，Nature 275：104-108，1978)，pPPC0005，pSeCHSA，pScNHSA，pC4和其衍生物。有用的酵母质粒载体还包括获自Stratagene Cloning Systems(La Jolla，CA)的pRS403-406，pRS413-416和毕赤酵母载体。质粒pRS403，pRS404，pRS405和pRS406是酵母整合型质粒(YIp)并且并入了酵母选择性标记HIS3，TRP1，LEU2和URA3。质粒pRS413～41.6是酵母中心粒质粒(YCp)。
此类载体通常包括选择性标记，所述的选择性标记可以是任意数量的表现显性表型的基因之一，对于所述显性表型存在表型测定以使得能够选择转化体。优选的选择性标记为补充宿主细胞营养缺陷的，提供抗生素抗性或使得细胞能够利用特定碳源的那些选择性标记，并且包括LEU2(Broach等supra)，URA3(Botstein等，Gene 8：17，1979)，HIS3(Struhl等，supra)或POT1(Kawasaki和Bell，欧洲专利EP 171，142)。其他合适的选择性标记包括CAT基因，其赋予酵母细胞氯霉素抗性。在酵母中使用的优选的启动子包括来自酵母糖酵解基因(Hitzeman等，J Biol.Chem.225：12073-12080，1980；Alber和Kawasaki，J.Mol.Appl.Genet.1：419-434，1982；Kawasaki，美国专利4,599,311)或醇脱氢酶基因(Young等，inGenetic Engineering of Microorganisms for Chemicals，Hollaender等，p.355，Plenum，N.Y.，1982；Ammerer，Meth.Enzymol.101：192-201，1983)的启动子。在这方面，特别优选的启动子为TPI1启动子(Kawasaki，美国专利4,599,311)和ADH2-4C(参见美国专利6,291,212启动子(Russell等，Nature 304：652-654，1983)。表达单元还可以包括转录终止子。优选的转录终止子为TPI1终止子(Alber和Kawasaki，同上)。其他的优选的载体和优选的成分例如酵母表达系统的启动子和终止子公开于欧洲专利EP 0258067，EP 0286424，EP0317254，EP 0387319，EP 0386222，EP 0424117，EP0431880，EP 1002095EP，EP 0828759，EP 0764209，EP 0749478，和EP 0889949；PCT公开号WO 00/44772和WO 94/04687；和美国专利5,739,007，5,637,504，5,302,697，5,260,202，5,667,986，5,728,553，5,783,423，5,965,386，6150,133，6,379,924，和5,714,377中。
除酵母之外，本发明的融合蛋白还可以在丝状真菌中表达，例如曲霉菌属(Aspergillus)菌株。有用的启动子的实例包括得自构巢曲霉(Aspergillus nidulans)糖酵解基因的启动子，例如adh3启动子(McKnight等，EMBO J.4：2093-2099，1985)和tpiA启动子。合适的终止子的实例为adh3终止子(McKnight等，同上)。利用此类成分的表达单元可以克隆到例如能够插入曲霉染色体DNA的载体中。
其他载体为与细菌，昆虫，和哺乳动物宿主细胞兼容的载体。此类载体尤其包括，pCRII，pCR3，和pcDNA3.1(Invitrogen，Carlsbad，CA)，pBSII(Stratagene)，pET15(Novagen，Madison，WI)，pGEX(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)，pEGFP-N2(Clontech，PaloAlto，CA)，pETL(BlueBacll，Invitrogen)，pDSR-α(PCT公开号WO 90/14363)和pFastBacDual(Gibco-BRL，Grand Island，NY)。
另外的合适的载体包括但不限于，粘粒，质粒，或经修饰的病毒，但应当理解载体系统必须与所选择的宿主细胞兼容。此类载体包括，但不限于，质粒，例如
Figure G2007800336434D00281
质粒衍生物(高拷贝数的基于ColE1的噬粒，Stratagene)，经设计用于克隆Taq-扩增的PCR产物的PCR克隆质粒(例如，
Figure G2007800336434D00282
TA试剂盒，
Figure G2007800336434D00284
质粒衍生物，Invitrogen)，和哺乳动物，酵母或病毒载体，例如杆状病毒表达系统(pBacPAK质粒衍生物，Clontech)。
在表达载体中还包含位于目的编码序列的下游的多聚腺苷酸化信号。多聚腺苷酸化信号包括来自SV40的早期或晚期多聚腺苷酸化信号(Kaufman和Sharp，同上)，来自腺病毒5E1B区域的多聚腺苷酸化信号和人生长激素基因终止子(DeNoto等，Nucl.Acid Res.9：3719-3730，1981)。特别优选的多聚腺苷酸化信号为VH基因终止子(参见美国专利6,291,212)。表达载体可以包括位于启动子和RNA剪接位点之间的非编码病毒前导序列，例如腺病毒2三联前导序列。优选的载体还可以包括增强子序列，例如SV40增强子(见美国专利6,291,212)和小鼠增强子(Gillies，Cell 33：717-728，1983)。表达载体还可以包括编码腺病毒VA RNA的序列。
在构建载体和将编码毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白的核酸分子插入到载体的适当位点后，完整的载体可以插入到合适的宿主细胞中，用于扩增和/或多肽表达。将毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白的表达载体转化到所选择的宿主细胞中可以通过公知的方法实现，包括方法，例如转染，侵染，电穿孔，显微注射，脂转染，DEAE-葡聚糖法，或其他已知的技术。所选择的方法将部分地是所用的宿主细胞的种类的函数。这些方法和其他的合适的方法是本领域技术人员公知的，并且描述于例如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989中。包含本发明的融合蛋白的克隆DNA序列可以通过例如磷酸钙介导的转染(Wigler等，Cell 14：725，1978；Corsaro和Pearson，Somatic Cell Genetics7：603，1981；Graham and Van der Eb，Virology 52：456，1973.)导入培养的哺乳动物细胞中。还可以使用用于将克隆DNA序列导入到哺乳动物细胞中的其他技术，例如电穿孔(Neumann等，EMBO J.1：841-845，1982)，或脂转染。为了鉴定已经整合了克隆DNA的细胞，通常将选择性标记与目的基因或cDNA一起导入细胞中。用于培养的哺乳动物细胞中的优选的选择性标记包括赋予药物(例如新霉素，潮霉素和甲氨喋呤)抗性的基因。选择性标记可以是可扩增的选择性标记。优选的可扩增的选择性标记为DHFR基因。特别优选的可扩增的标记为DHFRr(参见美国专利6,291,212)cDNA(Simonsen和Levinson，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：2495-2499，1983)。选择性标记由Thilly(Mammalian Cell Technology，Butterworth Publishers，Stoneham，MA)评述并且选择性标记的选择在本领域普通技术人员的水平之内。
宿主细胞
本发明还包括细胞，优选酵母细胞，其经转化以表达本发明的毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白。除经转化的宿主细胞本身以外，本发明还包括在营养培养基中的这些细胞的培养物，优选单克隆(克隆同源的)培养物，或得自单克隆培养物的培养物。如果多肽被分泌，培养基将包含多肽，和细胞，或不包含细胞(如果细胞已经被过滤或离心除去)。
产生本发明的毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白的特别有用的宿主细胞是甲基营养型毕赤酵母(Pichia pastoris)(Steinlein等，ProteinExpress.Purif.6：619-624，1995)。毕赤酵母已经被开发为一种用于产生外源蛋白的重要宿主，自从它的醇氧化酶启动子被分离和克隆；它的转化首次报道于1985年。毕赤酵母可以在缺乏葡萄糖时利用甲醇作为碳源。毕赤酵母表达系统可以使用甲醇诱导的醇氧化酶(AOX1)启动子，其控制编码醇氧化酶的表达的基因，所述醇氧化酶催化甲醇代谢的第一步。该启动子已被表征并被并入到一系列毕赤酵母表达载体中。由于在毕赤酵母中产生的蛋白通常是正确折叠的并分泌到培养基中，因此遗传工程化的毕赤酵母的发酵提供了大肠杆菌表达系统的优秀的替代物。已经用该系统产生了许多蛋白质，包括破伤风毒素片段，百日咳博得特菌黏附素(Bordatella pertussis pertactin)，人血清白蛋白和溶菌酶。
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株是另一种优选的宿主。在优选的实施方案中，使用酵母细胞，或更特别地，在糖蛋白的天冬酰胺连接的糖基化所必需的基因中包含遗传缺陷的酿酒酵母宿主细胞。具有此类缺陷的酿酒酵母宿主细胞可以用突变和选择的标准技术进行制备，尽管很多可获得的酵母菌株已经被修饰以防止或减少糖基化或高甘露糖基化。Ballou等人(J.Biol.Chem.255：5986-5991，1980)已经描述了在影响天冬酰胺连接的糖基化的基因中有缺陷的甘露糖蛋白生物合成突变体的分离。Gentzsch和Tanner(Glycobiology7：481-486，1997)已经描述了编码负责酵母中蛋白的O-糖基化的第一步的酶的至少六个基因(PMT1-6)的家族。在这些基因的一个或多个中有缺陷的突变体表现出减少的O-连接的糖基化和/或改变的O-糖基化的特异性。
在一个实施方案中，宿主为PCT公开号WO 05/061718中描述的酿酒酵母菌株。例如，宿主可以在具有敲除了PDI1或其他伴侣的宿主形式(host version)的菌株中分别包含携带一个拷贝的PDI1基因或任何其他伴侣基因的基于pSAC35的质粒。此类构建体赋予增强的稳定性。
为最优化异源蛋白质的生产，还优选宿主菌株携带突变，例如酿酒酵母pep4突变(Jones，Genetics 85：23-33，1977)，该突变导致蛋白水解(proteolytic)活性降低。在其他蛋白酶编码区包含突变的宿主菌株对于生产大量的本发明的毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白特别有用。
在适当条件下培养时，宿主细胞合成毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白，其随后可以从培养基中收集(如果宿主细胞将其分泌到培养基中)或直接从宿主细胞产生(如果其不被分泌)。适当的宿主细胞的选择取决于多种因素，例如期望的表达水平，对活性来说期望或必需的多肽修饰(例如糖基化或磷酸化)和折叠成生物学活性分子的容易程度。
其他宿主细胞可以是原核宿主细胞(例如大肠杆菌)或真核宿主细胞(例如昆虫或脊椎动物细胞)。许多合适的宿主细胞是本领域已知的并且很多可以从美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Manassas，Va获得。实例包括但不限于，哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，CHO DHFR(-)细胞(Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97：4216-20，1980)，人胚肾(HEK)293或293T细胞，或3T3细胞。合适的哺乳动物宿主细胞的选择和用于转化，培养，扩增，筛选，产生产物，和纯化的方法是本领域已知的。其他合适的哺乳动物细胞系为猴COS-1和COS-7细胞系，和CV-1细胞系。进一步的示例性哺乳动物宿主细胞包括灵长类细胞系和啮齿动物细胞系，包括转化的细胞系。正常的二倍体细胞，得自原代组织体外培养的细胞株以及原代外植体也是合适的。候选细胞可以是在选择基因中基因型缺陷的，或可以包含显性作用选择基因。其他合适的哺乳动物细胞系包括但不限于，小鼠神经母细胞瘤N2A细胞，HeLa，小鼠L-929细胞，得自Swiss，Balb-c或NIH小鼠的3T3细胞系，BHK或HaK仓鼠细胞系。这些细胞系各自为蛋白表达领域技术人员所已知并且可获得。
类似的用作合适的宿主细胞的是细菌细胞。例如，大肠杆菌的多种菌株(例如HB101，DH5α，DH10，和MC1061)是生物技术领域公知的宿主细胞。枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，假单胞菌属的种(Pseudomonas spp.)，其他芽孢杆菌属的种(Bacillus spp.)和链霉菌属的种(Streptomyces spp)的多种菌株也可以使用。
另外，当需要时，昆虫细胞系统可以用于表达毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白。此类系统描述于例如Kitts等人，Biotechniques14：810-17，1993；Lucklow，Curr.Opin.Biotechnol.4：564-72，1993；和Lucklow等，J.Virol.，67：4566-79，1993中。优选的昆虫细胞是Sf-9和Hi5(Invitrogen)。
毒蜥外泌肽-4/Tf融合细胞的产生
本发明的包含DNA构建体的宿主细胞在适当的生长培养基中培养。如本文所用的，术语“适当的生长培养基”表示包含细胞生长所必需的营养的培养基。细胞生长所必需的营养可包括碳源，氮源，必需氨基酸，维生素，矿物质和生长因子。生长培养基通常通过例如药物选择或必需营养(其由DNA构建体上的或与DNA构建体共转染的选择性标记补充)的缺乏而选择包含DNA构建体的细胞。酵母细胞，例如，优选培养于包含碳源(例如蔗糖)，非氨基酸氮源，无机盐，维生素和必需氨基酸补充物的化学成分明确的培养基中。培养基的pH优选维持在大于2且小于8的pH，优选pH为5.5-6.5。用于维持稳定pH的方法包括缓冲和恒定pH控制。优选的缓冲剂包括琥珀酸和Bis-Tris(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。在天冬酰胺连接的糖基化所必需的基因中有缺陷的酵母细胞优选在包含渗透压稳定剂的培养基中培养。优选的渗透压稳定剂为以0.1M和1.5M之间，优选0.5M或1.0M的浓度添加到培养基中的山梨醇。
用于培养大肠杆菌细胞的合适的培养基包括，例如，Luria Broth(LB)和/或Terrific Broth(TB)。用于培养真核细胞的合适的培养基包括Roswell Park Memorial Institute培养基1640(RPMI 1640)，Minimal Essential Medium(MEM)和/或Dulbecco′s Modified EagleMedium(DMEM)，上述培养基全部可以补充血清和/或培养的特定细胞系所必需的生长因子。用于昆虫细胞培养的合适的培养基是补充酵母粉(yeastolate)，乳清蛋白水解物，和/或胎牛血清(如果必需)的Grace′s培养基。
通常，将用于选择性培养转染的或转化的细胞的抗生素或其他化合物作为补充物加入到培养基。所用的化合物可以由转化宿主细胞所用的质粒中存在的选择性标记元件确定。例如，当选择性标记元件是卡那霉素抗性时，加入到培养基中的化合物是卡那霉素。用于选择性培养的其他化合物包括氨苄青霉素，四环素和新霉素。
杆状病毒/昆虫细胞表达系统也可以用于产生本发明的经修饰的Tf融合蛋白。BacPAKTM杆状病毒表达系统(BD Biosciences(Clontech))在昆虫宿主细胞中高水平地表达重组蛋白。将靶基因插入到转移载体中，所述的转移载体与线性化的BacPAK6病毒DNA一起共转染到昆虫宿主细胞中。BacPAK6DNA缺失杆状病毒基因组的必需部分。当DNA与载体重组时，必需元件被修复并且靶基因被转移到杆状病毒基因组。重组后，挑选并纯化一些病毒空斑，并且检验重组表型。然后新的分离的重组病毒可以进行扩增并用于感染昆虫细胞培养物以产生大量期望的蛋白质。
本发明的毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白还可以用转基因植物和动物产生。例如，绵羊和山羊可以在它们的乳液中产生治疗蛋白。或烟草植物可以在它们的叶中包含蛋白。转基因植物和动物蛋白的产生都包括将新的编码融合蛋白的基因加入到生物体基因组中。转基因生物体不仅可以产生新蛋白，而且它还可以将这种能力传递给它的后代。
由宿主细胞产生的毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白的量可以用本领域已知的标准方法评估。此类方法包括，但不限于，Western印迹分析，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，非变性凝胶电泳，高效液相色谱(HPLC)分离，免疫沉淀，和/或活性测定，例如DNA结合凝胶移位测定。
如果毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白已设计为从宿主细胞系分泌，则可以在细胞培养基中发现大部分多肽。然而，如果多肽不从宿主细胞分泌，则多肽存在于细胞质和/或细胞核中(对于真核宿主细胞来说)或胞质溶胶中(对于革兰氏阴性细菌宿主细胞来说)。
对于位于宿主细胞的细胞质和/或细胞核中(对于真核宿主细胞来说)或胞质溶胶中(对于革兰氏阴性细菌宿主细胞来说)的毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白来说，细胞内的物质(包括革兰氏阴性细菌的包含体)可以用任何本领域技术人员已知的标准技术从宿主细胞中提取。例如，可以通过弗氏压碎器，匀浆，和/或超声处理然后离心而裂解宿主细胞以释放周质/细胞质的内容物。
如果毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白在胞质溶胶中形成包含体，则包含体通常与内侧和/或外侧细胞膜结合并且因此可以发现其主要在离心后的沉淀物质(pellet material)中。然后可以用极端pH或在还原剂(例如碱性pH下的二硫苏糖醇或酸性pH下的三羧乙基膦)存在下用离液剂，例如去污剂，胍，胍衍生物，尿素，或尿素衍生物处理沉淀物质以释放，分裂，和溶解包含体。然后用凝胶电泳，免疫沉淀等等分析溶解的毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白。如果期望分离多肽，则可以用标准方法，例如在本文和Marston等，Meth.Enz.182：264-75，1990中描述的那些方法来实现分离。
如果在毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白表达后，没有以显著量形成包含体，则可以发现多肽主要在细胞匀浆物离心后的上清液中。多肽可以进一步用方法，例如本文描述的这些方法，从上清液中分离。
用于产生多肽的许多其他方法是本领域已知的，并且这些方法可以用于产生毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白。例如参见Roberts等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A..94：12297-303，1997，其描述了mRNA和其编码的肽之间的融合蛋白的产生。还参见Roberts，Curr.Opin.Chem.Biol.3：268-73，1999。
用于产生肽或多肽的方法还在美国专利5,763,192，5,814,476，5,723,323，和5,817,483中描述。该方法包括产生随机基因或其片段，然后将这些基因导入到产生由随机基因编码的一种或多种蛋白的宿主细胞中。然后筛选宿主细胞以鉴定那些产生具有期望的活性的肽或多肽的克隆。用于重组肽表达的其他方法在美国专利6,103,495，6,210,925，6,627,438，和6,737,250中公开。该方法使用大肠杆菌和大肠杆菌的普通的分泌途径。肽与信号序列融合；因此，肽被靶向分泌。
另一种用于产生肽或多肽的方法在PCT公开号WO 99/15650中描述。该公开的方法，称为用于发现基因的基因表达的随机活化，包括内源基因表达活化或通过原位重组方法进行的基因过表达。例如，通过将调控序列整合到能够通过非同源重组或异常重组活化基因表达的靶细胞中而活化或增加内源基因的表达。首先靶DNA经历放射，并且插入基因启动子。启动子最终位于基因前的裂口(break)，启动基因转录。这导致期望的肽或多肽的表达。
毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白的分离/纯化
分泌的，生物学活性的，毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白可以在允许生物学活性融合蛋白分泌的条件下从培养宿主细胞的培养基中分离。细胞物质从培养基中除去，并且用本领域已知的分离技术分离生物学活性融合蛋白。合适的分离技术包括沉淀和通过多种层析方法(包括凝胶过滤，离子交换层析和亲和层析)的分离。
特别优选的纯化方法是在铁结合或金属螯合柱上的亲和层析或使用抗多肽融合物的运铁蛋白或治疗蛋白的抗原的免疫亲和层析。抗原优选固定或结合到固体支持物或基质上。在一个实施方案中，基质为CNBr活化的Sepharose(Pharmacia LKB Technologies，Inc.，Piscataway，N.J.)。通过这个方法，培养基在允许结合发生的条件下与抗原/基质结合。洗涤复合物以除去未结合的物质，并且通过使用不利于复合物形成的条件释放或洗脱毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白。特别有用的洗脱方法包括改变pH，其中固定的抗原在第一种pH下具有对毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白的高亲和力而在第二种pH(更高或更低)下具有减少的亲和力；改变某些离液剂的浓度；或通过使用去污剂。
从溶液中纯化毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白可以用多种技术实现。如果已经合成了包含标签(例如位于其羧基端或氨基端的6组氨酸9或其他小肽，例如FLAG(Eastman Kodak Co.，New Haven，CT)或myc(Invitrogen))的多肽，则可在一步法中通过使溶液经过亲和柱进行纯化，其中柱基质对标签具有高亲和力。
例如，多聚组氨酸高亲和力和特异性地和镍结合。从而，镍亲和柱(例如
Figure G2007800336434D00351
镍柱)可以用于纯化。参见Current Protocols inMolecular Biology，§10.11.8(同上)。
另外，毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白可以通过使用能够特异性识别和结合毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白的单克隆抗体进行纯化。
当优选部分或完全纯化毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白以便其部分或充分无污染物时，可以使用本领域技术人员已知的标准方法。此类方法包括，但不限于，电泳分离然后电洗脱，多种类型的层析(亲和，免疫亲和，分子筛，和离子交换)，HPLC，和制备式等电聚焦(“Isoprime”仪/技术，Hoefer Scientific，San Francisco，CA)。在一些情况下，可以组合两种或多种纯化技术以达到提高的纯度。
药物组合物
本发明的毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白通常可以以药物组合物的形式施用。药物组合物可以，例如是用于口服的(例如，片剂，胶囊，丸剂，粉剂，溶液，悬浮液)，用于胃肠外注射的(例如无菌溶液，悬浮液或乳剂)，用于鼻内给药的(例如气雾剂滴剂(aerosol drops)等)，用于直肠给药的(例如栓剂)或用于经皮肤的(例如贴片)合适的形式。药物组合物可以是适合于单次施用精确剂量的单位剂量形式。药物组合物将包括本发明的毒蜥外泌肽-4Tf融合蛋白作为有效成分并且可以包括常规的药学载体。另外，其可以包括其他药物制剂，佐剂等。
制备生物活性肽的多种药物组合物的方法是制药科学领域中已知的。例如，参见美国专利2005/0009748(用于口服给药)；以及美国专利2004/0157777，2005/0002927和2005/0215475(用于经粘膜给药，例如鼻内或口腔给药)。还参见Remington：The Practice ofPharmacy，Lippincott Williams和Wilkins，Baltimore，MD，20th ed.，2000。
传统上，肽和蛋白药物通过注射给药，因为口服给药时生物利用率低。这些药物易于化学和构象不稳定并且经常被胃里的酸性环境和胃和胃肠道中的酶降解。针对这些递送问题，开发了一些用于口服递送的技术，例如封装到由具有疏水性骨架和作为药物载体的亲水性分支的聚合体组成的纳米颗粒中，封装到微粒中，插入到乳剂中的脂质体，和与其他分子缀合。所有这些技术都可以用于本发明的融合分子。
纳米颗粒的实例包括用壳聚糖和聚羧乙烯包被的粘膜粘着性纳米颗粒(Takeuchi等，Adv.Drug Deliv.Rev.47：39-54，2001)和包含带电荷的结合聚酯，聚(2-磺丁基-乙烯醇)和聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物的纳米颗粒(Jung等人，Eur.J.Pharm.Biopharm.50：147-160，2000)。包含具有聚N-异丙基丙烯酰胺区域和阳离子聚-乙烯胺基团的表面聚合体的纳米颗粒在口服施用给兔时，表现出提高的鲑鱼降钙素的吸收。
用多聚赖氨酸增强的由藻酸盐和果胶组成的药物递送颗粒，相对抗酸和碱并且可以用作药物载体。这些颗粒结合了生物粘着，增强的吸收和持续的释放的优势(Liu等，J.Pharm.Pharmacol.51：141-149，1999)。
另外，已表明缀合到肽(例如合成的促生长素抑制素)的N-和C-末端的脂氨基酸基团和脂多糖基团，产生两性表面活性剂，产生保留生物活性的组合物(Toth等，J.Med.Chem.42(19)：4010-4013，1999)。
其他肽递送技术的实例包括包含目的肽的聚羧乙烯包被的粘膜粘着性乳剂以及亚硝基-N-乙酰基-D，L-青霉胺和聚羧乙烯或牛磺胆酸盐和聚羧乙烯。已表明当给兔口服给药以降低血钙浓度时这些技术是有效的(Ogiso等人，Biol.Pharm.Bull.24：656-661，2001)。衍生自磷脂酰胆碱的磷脂酰乙醇用于制备作为胰岛素载体的包含磷脂酰乙醇的脂质体。当给兔口服给药时，已表明这些脂质体是起作用的(Kisel等人，Int.J.Pharm.216：105-114，2001)。
已将胰岛素配制到包含胰岛素和蛋白酶抑制剂(例如抑肽酶或杆菌肽)的聚(乙烯醇)-凝胶球中。已在兔中证实这些凝胶球的降低葡萄糖的性质，其中胰岛素在低位肠中大量释放(Kimura等人，Biol.Pharm.Bull.19：897-900，1996。
还已使用用油相中的表面活性剂分散的由聚(烷基氰基丙烯酸酯)制备的纳米颗粒(Damge等，J.Pharm.Sci.86：1403-1409，1997)和使用用壳聚糖包被的藻酸钙珠(Onal等，Artif.Cells BloodSubstit.Immobil.Biotechnol.30：229-237，2002)来研究胰岛素的口服递送。
在其他方法中，将肽的N-和C-末端与聚乙二醇连接然后与烯丙基链连接以形成具有增强的对酶降解的抗性和增强的通过胃肠道壁(GIwell)的扩散性的缀合物(www.nobexcorp.com)。
是阳离子脂质混合物，其与肽非共价相互作用以产生保护性包被或保护层。肽-脂质复合物可以与细胞的质膜融合，由此肽被内化到细胞中。
在用脂质体作为起始材料的方法中，已开发螺旋形颗粒作为药学媒剂。将肽加入到主要包含带负电的脂质的脂质体的悬浮液。钙的加入引起脂质体崩解并融合到由脂质双分子层组成的大膜片(sheet)中，然后其自发卷起或堆积成螺旋形(美国专利5,840,707)。
此外，本发明包括毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白制剂的肺部递送。肺部递送特别有希望用于大分子的递送，其通过其他给药途径难以递送。此类肺部递送对于全身递送和局部递送以治疗肺部疾病都是有效的，因为递送到肺部的药物易于通过肺泡区域直接吸收到血液循环中。
本发明提供了适合于形成药物分散物以用于经口吸入(肺部递送)以治疗不同病况或疾病的组合物。融合蛋白制剂可以通过不同途径递送，例如液体喷雾器，基于气雾剂的定量吸入器(MDI’s)，和干粉分散装置。在配制用于肺部递送的组合物的过程中一般加入包括表面活化剂或表面活性剂在内的药学上可接受的载体和膨胀(bulk)载体以提供稳定性，可分散性，一致性和/或膨胀(bulking)性质从而增强对受试者均匀肺部递送组合物。
表面活化剂或表面活性剂促进通过粘膜或粘膜内衬吸收肽。有用的表面活化剂或表面活性剂包括脂肪酸和其盐，胆汁盐，磷脂，或烷基糖。脂肪酸及其盐的实例包括辛酸(C8)，癸酸(C10)，月桂酸(C12)和肉豆蔻酸(C14)的钠，钾和赖氨酸盐。胆汁盐的实例包括胆酸，鹅脱氧胆酸，甘胆酸，牛磺胆酸，鹅脱氧甘胆酸，牛磺鹅脱氧胆酸，脱氧胆酸，甘氨脱氧胆酸，牛磺脱氧胆酸，石胆酸，熊脱氧胆酸。
磷脂的实例包括单链磷脂，例如溶血磷脂酰胆碱，溶血磷脂酰甘油，溶血磷脂酰乙醇胺，溶血磷脂酰肌醇，和溶血磷脂酰丝氨酸，或双链磷脂，例如二酰基磷脂酰胆碱，二酰基磷脂酰甘油，二酰基磷脂酰乙醇胺，二酰基磷脂酰肌醇和二酰基磷脂酰丝氨酸。烷基糖的实例包括烷基葡萄糖苷或烷基麦芽糖苷，例如癸基葡萄糖苷和十二烷基麦芽糖苷。
用作载体的药学赋形剂包括稳定剂例如人血清白蛋白(HSA)，膨胀剂(bulking agent)例如糖，氨基酸和多肽；pH调节剂或缓冲剂，和盐例如氯化钠。这些载体可以是晶态或非晶态或可以是两者的混合物。
用作膨胀剂的糖的实例包括单糖例如半乳糖，D-甘露糖，和山梨糖，二糖，例如乳糖和海藻糖；环式糊精，例如2-羟丙基-β-环式糊精，和多糖，例如棉子糖，麦芽糖糊精，和extrans，糖醇，例如甘露醇和木糖醇。用作膨胀剂的多糖的实例包括阿斯巴甜。氨基酸包括丙氨酸和甘氨酸，优选甘氨酸。
可以包括作为组合物的微量成分的添加剂以在喷雾干燥期间用于构象稳定和用于提高粉末分散性。这些添加剂包括疏水性氨基酸例如色氨酸，酪氨酸，亮氨酸和苯丙氨酸。
合适的pH调节剂或缓冲剂包括由有机酸和碱制备的有机盐，例如柠檬酸钠，和抗坏血酸钠；优选柠檬酸钠。
用于肺部递送的GLP-1受体激动剂融合组合物可以作为单位剂量包装，其中治疗有效量的组合物存在于单位剂量容器中，例如罩板包装(blister pack)或明胶胶囊。罩板包装或明胶胶囊的制备通常通过包装领域中通常已知的方法进行。
美国专利6,524,557公开了药学气雾制剂，其包含(a)HFA推进剂；(b)分散在推进剂中的药物活性多肽；和(c)表面活性剂，其为C8-C16脂肪酸或其盐，胆汁盐，磷脂，或烷基糖，所述表面活性剂增强下呼吸道中多肽的全身吸收。本发明还提供了制备此类制剂的方法和此类制剂在治疗患者中的用途。
用于干粉药物肺部递送的一种方法，利用具有用于提供加压气体的来源的手泵的手持装置。加压气体通过粉末分散装置突然释放，例如文丘里喷嘴，并且使分散的粉末为患者吸入可获得。
干粉分散装置在一些专利中有所描述。美国专利3,921,637描述了具有用于刺穿粉状药物的单个胶囊的针的手动泵。多容器盘或药物带的使用在欧洲专利EP 0 467 172；PCT公开号WO 91/02558和WO93/09832；和美国专利4,627,432，4,811,731，5,035,237，5,048,514，4,446,862，5,048,514，和4,446,862中描述。
蛋白治疗剂的气雾化在欧洲专利EP 0 289 336中公开。治疗性气雾制剂在PCT公开号WO 90/09781中公开。
治疗方法
本发明的毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白可以与其他药物制剂结合使用，用于治疗本文描述的病情或病况。因此包括将本发明的化合物与其他药物制剂组合施用的治疗方法也由本发明提供。
在本发明的方法方面，单独的或与一种或多种药物制剂结合的本发明的毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白，以任意的本领域已知的外周给药的常规方法分开或共同地外周施用给患者。因此，毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白或组合可以经肠胃外(例如，静脉内，腹膜内，肌内，或皮下)，鼻内，口服，舌下，口腔，通过吸入(例如通过气雾剂)，经直肠(例如通过栓剂)或透皮施用给患者。肠胃外的，但非口服的给药(例如注射)是优选的给药方法，并且皮下给药是优选的肠胃外给药方法。通过吸入的肺部递送也是优选的给药方法。
适合于肠胃外注射的组合物通常包括药学上可接受的无菌水性或非水性溶液，分散物(dispersion)，悬浮液，或乳剂，和用于重构到无菌注射溶液或分散物中的无菌粉末。合适的水性和非水性载体或稀释剂(包括溶剂和媒剂)的实例包括水，乙醇，多元醇(丙二醇，聚乙二醇，甘油，等等)，其合适的混合物，包括植物油(例如橄榄油)的甘油三酸酯，和可注射的有机酯例如油酸乙酯。
用于肠胃外注射的这些组合物还可以包含赋形剂，例如防腐剂，润湿剂，增溶剂，乳化剂和分散剂。可以用不同的抗菌剂和抗真菌剂来防止组合物的微生物污染，例如，对羟基苯甲酸酯(paraben)，氯丁醇，苯酚和山梨酸。还可能期望包括等渗剂，例如糖和氯化钠。可以通过使用能够延迟吸收的药剂延长可注射的药物组合物的吸收，例如单硬脂酸铝和明胶。
本发明的毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白可以以依赖于许多因素而改变的剂量施用给患者，所述因素包括给药方式，受试者的年龄和体重，疾病严重程度，要治疗的病况或病症，和待施用的毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白的药物学活性。剂量范围的确定和用于特定患者的最佳剂量完全在本领域普通技术人员掌握内。
对于用于治疗以降低血糖的肠胃外注射，如SEQ ID NO：23所示的毒蜥外泌肽-4(1-39)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf融合蛋白可以以每剂量约0.5-50mg，更优选每剂量0.5-20mg范围的剂量水平施用给人类受试者，并以约每周一次，每两周一次或每月一次进行剂量给药。
对于用于治疗以减轻体重的肠胃外注射，其剂量范围可以比用于减少血糖的剂量范围高。因此，对于用于治疗以减少体重的肠胃外给药，如SEQ ID NO：23所示的毒蜥外泌肽-4(1-39)(PEAPTD)2(SEQ IDNO：5)mTf融合蛋白可以以每剂量约1-100mg范围的剂量水平施用给人类受试者，并且以约每周一次，每两周一次或每月一次进行剂量给药。
本发明还提供了用于在人类患者中治疗II型糖尿病或降低血糖的毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白。进一步提供了用于在人类患者中治疗肥胖或减少食物摄入的本发明的毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白。本发明的进一步的方面提供了本发明的毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白在制备用于在人类患者中治疗II型糖尿病或降低血糖的药物中的用途。更进一步的方面提供了本发明的毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白在制备用于治疗肥胖或减少食物摄入的药物中的用途。本发明的方法方面的特征可以应用于这些方面。
本发明的实施方案通过下列实施例举例说明。然而，应当理解，本发明的实施方案不限于这些实施例的特定细节，因为对本领域普通技术人员来说，其其他的变化是已知的，或根据直接公开的内容和附属的权利要求是显而易见的。本文引用的所有参考文献以其全文通过引用并入本文。
实施例
实施例1：毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白的构建
毒蜥外泌肽-4(1-39)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf融合蛋白
将毒蜥外泌肽-4(1-39)DNA序列(SEQ ID NO：20)用位点重叠延伸(SOE)PCR插入到pREX0549的分泌信号序列(nL)(SEQ ID NO：19)和mTf序列(SEQ ID NO：22)之间。设计两条引物，P0702(SEQ IDNO：28)和P0703(SEQ ID NO：29)，以使用pREX0549作为模板插入序列。
通过使用针对酵母表达最优化的密码子回译毒蜥外泌肽-4氨基酸序列来获得DNA序列(SEQ ID NO.：30)。最初用5’有AflII位点的引物P0177(SEQ ID NO：31)和P0702，或3’有BamHI位点的引物P0014(SEQ ID NO：32)和P0703产生两个PCR产物。凝胶纯化来自这些反应的产物并且将其加入到仅使用外侧引物P0177和P0014的第二轮PCR中。
凝胶纯化来自该第二反应的产物并且如对质粒pREX0549进行的，用限制性酶AflII和BamHI消化。将来自这些反应的适当的产物连接在一起以得到pREX 0561，在AflII和BamHI位点之间对其进行DNA测序以确定毒蜥外泌肽-4序列的正确插入。通过用限制性酶NotI消化从pREX0561回收表达盒并且将其连接入NotI消化的牛肠碱性磷酸酶处理的pSAC35以得到pREX0589。
用pREX0561作为模板，用引物P1810(SEQ ID NO：33)和P1811(SEQ ID NO：34)进行SOE PCR以在毒蜥外泌肽-4序列的编码C末端和编码的mTf序列的N末端之间用上述相同方法导入连接子肽序列(PEAPTD)2(SEQ ID NO.：21)。
凝胶纯化来自该PCR的最终产物并且如对质粒pREX0549进行的，用限制性酶AflII和BamHI消化。将来自这些反应的适当的产物连接在一起以得到pREX0935，在AflII和BamHI位点之间对其进行DNA测序以确定编码(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)的序列的正确插入。通过用限制性酶NotI消化从pREX0935回收表达盒并且将其连接入NotI消化的，碱性磷酸酶处理的pSAC35以得到pREX0936。不具有nL前导序列的毒蜥外泌肽-4(1-39)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf融合蛋白的氨基酸序列在本文提供为SEQ ID NO：23。编码SEQ ID NO：23的核酸序列在本文提供为SEQ ID NO：24。具有nL前导序列的毒蜥外泌肽-4(1-39)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf融合蛋白的氨基酸序列在本文提供为SEQ ID NO：25。编码SEQ ID NO：25的核酸序列在本文提供为SEQ ID NO：26。
其他的毒蜥外泌肽-4/Tf构建体
与GLP-1相比，毒蜥外泌肽-4在C末端具有额外的9个氨基酸。在游离肽的情况下，认为这些额外的残基赋予增加的对GLP-1受体的亲和力和更强的蛋白酶抗性。然而，其在一定程度上可能还负责肽的免疫原性。用与上述方法实质上相同的方法制备另外两种构建体，以通过分别缺失编码残基32-39或31-39的DNA序列制备只具有与GLP-1同源的序列的构建体，即毒蜥外泌肽-4(1-31)或毒蜥外泌肽-4(1-30)。对于毒蜥外泌肽-4(1-31)，使用引物P0904(SEQ ID NO：35)和P0941(SEQ ID NO：36)并且连接适当的产物(pREX0629/pREX0658)。对于毒蜥外泌肽-4(1-30)，使用引物P0942(SEQ ID NO：37)和P0943(SEQ ID NO：38)并且连接适当的产物(pREX0630/pREX0659)。
还用毒蜥外泌肽-4(1-39)序列和可选择的连接子，例如(GGGGS)3(SEQ ID NO：39)，PEAPTD(pREX1005)(SEQ ID NO：6)，或IgG铰链(pREX0938)(SEQ ID NO：7-16)制备构建体。
具有其他信号序列(影响相对生产率)的另外的毒蜥外泌肽-4/Tf构建体
产生构建体以表达与信号序列HSA/MFα-1(pREX 1354)(SEQ IDNO：40；由SEQ ID NO：41编码)和经修饰的HSA/MFα-1(pREX 1345)(SEQ ID NO：42；由SEQ ID NO：43编码)连接的毒蜥外泌肽-4/mTf(SEQ ID NO：23；由SEQ ID NO：24编码)。表达具有三种不同的信号序列的毒蜥外泌肽-4/mTf的酵母菌株的生产率的比较表明运铁蛋白信号序列(nL)/HSA/MFα-1/经修饰的HSA/MFα-1的相对生产率为1/1.75/1.32。
实施例2：毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白的效力的确定
从测量的cAMP反应计算效力，所述的cAMP作为与样品温育后在用兔GLP-1受体转染的CHO细胞(CHO-GLP-1R)中GLP-1受体介导的配体结合的结果产生。用CHO-GLP-1R细胞接种96孔组织培养板并过夜培养。次日，用Krebs-Ringer缓冲液(KRB)冲洗细胞并且在包含磷酸二酯酶抑制剂3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX，2mM)的KRB中温育以抑制细胞内加工cAMP的酶。在KRB/IBMX中制备的测试化合物和对照的连续稀释物并且用样品和对照接种(inoculate)细胞的孔(一式三份)。温育后，用基于竞争的荧光免疫测定法(cAMPFluorescent Assay Kit，Molecular Devices Corp.，Sunnyvale，CA)测定单独的样品裂解物以测量细胞内cAMP水平的增加。在GLP-1受体介导的配体结合后细胞中cAMP积累的量用于确定生物活性和相对效力。
表1中的数据表明毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白在活化GLP-1受体方面比GLP-1(7-37，A8G，K34A)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf融合蛋白更有效。各个融合蛋白中的mTf部分具有SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列。
表1：GLP-1/mTf和毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白的效力
Figure G2007800336434D00451
实施例3：毒蜥外泌肽-4(1-39)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf融合蛋白的MMP抗性
测试毒蜥外泌肽-4(1-39)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf融合蛋白(SEQ ID NO：23)对通过基质金属蛋白酶I(MMP-1，胶原酶)的体外灭活的抗性。将毒蜥外泌肽-4(1-39)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf融合蛋白和GLP-1(7-37，A8G，K34A)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf融合蛋白的样品与重组MMP-1一起在37℃下温育48小时然后测试其活性。图1表明毒蜥外泌肽-4/Tf融合蛋白(图1B)与GLP-1/mTf融合蛋白(图1A)相比抵抗MMP-1的灭活。尽管在分子的活性部分中的氨基酸序列非常相似，但还是在降解中出现了这一差异。
实施例4：毒蜥外泌肽-4(1-39)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf融合蛋白在糖尿病小鼠中对血糖的影响
用不同剂量的毒蜥外泌肽-4(1-39)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf融合蛋白(SEQ ID NO：23)，GLP-1(7-37，A8G，K34A)(PEAPTD)2mTf融合蛋白，或毒蜥外泌肽-4(Bachem，King of Prussia，PA)注射糖尿病(db/db)小鼠并且通过用血糖仪分析血液样品来监控血糖浓度。如图2所示，低至1.3nmole/kg剂量的毒蜥外泌肽-4(1-39)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf融合蛋白在皮下注射后经过3小时显著降低这些动物中的血糖。葡萄糖水平在所有处理组中几乎正常化并且该水平持续24小时。葡萄糖浓度在处理后48-72小时间逐渐增加到处理前水平，取决于施用的剂量。毒蜥外泌肽-4肽降低血糖不如毒蜥外泌肽-4(1-39)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf融合蛋白多，不论剂量，并且毒蜥外泌肽-4的降低葡萄糖的效果经过约12小时后完全消失。用毒蜥外泌肽-4可达到的血糖最大降低量为约37％，这与文献报告一致；用毒蜥外泌肽-4(1-39)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf融合蛋白所观察到的降低量为约70％。毒蜥外泌肽-4(1-39)(PEAPTD)2(SEQID NO：5)mTf融合蛋白对血糖的影响也显著地比等价剂量的GLP-1(7-37，A8G，K34A)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf融合蛋白更强并且具有更久的持续时间。
实施例5：毒蜥外泌肽-4(1-39)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf融合蛋白对兔的体重的影响
用不同剂量的毒蜥外泌肽-4(1-39)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf融合蛋白(SEQ ID NO：23)，和毒蜥外泌肽-4皮下注射SpragueDawley兔。mTf或生理盐水用作对照。每天给兔称重(给药期间在给药前称量)。动物在所有时间充分接近食物和水。
如图3所示，用10和100nmole/kg剂量的毒蜥外泌肽-4(1-39)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf融合蛋白处理的动物在第一次注射后减少体重并且在整个给药期间继续减少体重。到第5天，用100nmole/kg剂量处理的动物与对照相比平均减少75克体重(17％)，并且体重减少与食物和水摄入的降低相关。因为观察到的显著的和急剧的体重减少，每天的药物施用在第5天停止。在5天的给药期间后，所有动物以类似的比例增加体重。然而，用毒蜥外泌肽-4(1-39)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf融合蛋白处理的组，尤其是高剂量组，在最后给药后的20天仍然比对照动物轻。
实施例6：用于在II型糖尿病患者中的升胰岛素控制和用于减少体重的毒蜥外泌肽-4(1-39)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf融合蛋白的预测剂量
基于已公开的数据，治疗性单剂量的10μg的依泽那太(
Figure G2007800336434D00461
)在人体中产生200pg/mL的Cmax。在血糖降低效果方面，依泽那太和毒蜥外泌肽-4(1-39)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf融合蛋白(SEQ ID NO：23)(4.2kDa比80.5kDa)之间分子大小的区别表明约3.8ng/mL的毒蜥外泌肽-4(1-39)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf融合蛋白血液水平等价于依泽那太的治疗水平。除分子大小之外，基于在表达人GLP-1受体的CHO细胞中的体外测试，毒蜥外泌肽-4(1-39)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf融合蛋白比毒蜥外泌肽-4有效性低约5倍(图4)。因此，为了达到10μg依泽那太的相似治疗活性，需要约20ng/ml的毒蜥外泌肽-4(1-39)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf融合蛋白的循环浓度。
毒蜥外泌肽-4(1-39)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf融合蛋白和GLP-1(7-37，A8G，K34A)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf融合蛋白在分子大小和结构上相似。毒蜥外泌肽-4(1-39)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf融合蛋白的分子量为80.5kDa而GLP-1(7-37，A8G，K 34A)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf融合蛋白的分子量为79.6kDa。毒蜥外泌肽-4(1-39)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf融合蛋白比GLP-1(7-37，A8G，K34A)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf融合蛋白有效性高约4-8倍。静脉内和皮下给猕猴施用1mg/kg后的毒蜥外泌肽-4(1-39)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf融合蛋白的平均药代动力学参数列于表2。皮下给猕猴施用0.6mg/kg后的GLP-1(7-37，A8G，K34A)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf融合蛋白的平均药代动力学参数列于表3。
表2：静脉内和皮下给猕猴施用1mg/kg后的毒蜥外泌肽-4(1-39)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf融合蛋白的平均药代动力学参数概要
  参数   静脉内   皮下
  Cmax(ng/mL)   33,981±14,826(4)   5,236±1,038(4)
  Tmax(h)   0.542(4)   9.02(4)
  AUC(0-t)(h·ng/mL)   567,364±68,102(4)   278,067±24,367(4)
  AUC(inf)(h·ng/mL)   572,314±68,660(4)   280,279±29,261(3)
  λz(h-1)   0.0313±0.0137(4)   0.0252±0.0084(3)
  T1/2(h)   25.5±10.3(4)   29.3±08.2(3)
  CL(mL/min/kg)   1.77±0.24(4)   -
  Vz(mL/kg)   65.9±31.0(4)   -
  F(％)   -   49.0
表3.皮下给猕猴施用0.6mg/kg后的GLP-1(7-37，A8G，K34A)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf融合蛋白的平均药代动力学参数概要
  参数   雄性   雌性
  Cmax(ng/mL)   2,922±1,530(3)   3,173±1,767(3)
  Tmax(h)   12.0(3)   24.2(3)
  AUC(0-t)(h·ng/mL)   168,087±58,749(3)   165,474±32,756(3)
  AUC(inf)(h·ng/mL)   171,963±61,998(3)   186,065±140(2)
  λz(h-1)   0.0216±0.0042(3)   0.0250±0.0002(2)
  t(h)   32.9±6.78(3)   27.7±0.23(2)
  CL(mL/min/kg)   -   -
  Vz(mL/kg)   -   -
  F(％)   -   -
在单独的实验中，GLP-1(7-37，A8G，K34A)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf融合蛋白的生物利用率在猕猴中显示为约50％。
用于静脉内和皮下给药的毒蜥外泌肽-4(1-39)(PEAPTD)2(SEQID NO：5)mTf融合蛋白的清除半衰期(t1/2)，Tmax的范围，以及生物利用率(F(％))与GLP-1(7-37，A8G，K34A)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf融合蛋白的猴药代动力学参数相似。
之前使用GLP-1(7-37，A8G，K34A)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf的人类经验表明药代动力学从30μg/kg至900μg/kg剂量是线性的，平均Tmax在48小时，而平均t1/2为约50小时。在剂量为300μg/kg(或30mg/100kg患者)时，Cmax为758±435ng/mL并且在剂量为900μg/kg(90mg/100kg患者)时，Cmax为1,609±805ng/mL。然而，融合蛋白在这些剂量，或1800μg/kg剂量下对糖尿病受试者中的血糖水平都不表现鲁棒效应(robust effect)。
由于大小和结构的相似性，以及这两种化合物之间在猴中相似的临床前药代动力学图谱，预期毒蜥外泌肽-4(1-39)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf融合蛋白在人体中的药代动力学特征与GLP-1(7-37，A8G，K34A)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf融合蛋白相似。
基于与GLP-1(7-37，A8G，K34A)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf的相似性，与GLP-1(7-37，A8G，K34A)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf相比，毒蜥外泌肽-4(1-39)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf融合蛋白的体外效力相对高4-8倍，而与依泽那太相比毒蜥外泌肽-4(1-39)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf融合蛋白的体外效力相对低5倍，令人惊讶的是2mg剂量的毒蜥外泌肽-4(1-39)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf融合蛋白可具有降低葡萄糖的效应。进一步地，需要每个受试者10mg剂量，每周一次给药，以达到稳定的20ng/mL的Cmin。因此，用于治疗性血糖降低的毒蜥外泌肽-4(1-39)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf融合蛋白(SEQ ID NO：23)的有效剂量范围为每剂量0.5至50mg，每周施用一次。此类剂量还可以每两周施用一次或每个月施用一次。
除对血糖的影响以外，10nmole/kg或以上的毒蜥外泌肽-4(1-39)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf融合蛋白与小鼠和兔的动物体重的减少相关。将10或100nmole/kg的毒蜥外泌肽-4(1-39)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf融合蛋白的单剂量施用给小鼠后24小时导致体重平均分别降低6％和14％，对比于对照中或1nmole/kg的毒蜥外泌肽-4处理的动物中平均减少1％。以100nmol/kg剂量每日施用毒蜥外泌肽-4(1-39)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf融合蛋白还导致兔体重减少16％。体重减少可归因于在施用毒蜥外泌肽-4(1-39)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf融合蛋白的动物中观察到的食物摄入的减少，其是已知的GLP-1受体活化的药代动力学效应。可获得的数据表明用于减少体重所需的剂量比用于降低葡萄糖所需的剂量高约2-3倍。因此，用于减少体重的毒蜥外泌肽-4(1-39)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf融合蛋白(SEQ ID NO：23)有效剂量范围为每剂量1.0至100mg，每周施用一次。此类剂量还可以每两周施用一次或每个月施用一次。
实施例7：毒蜥外泌肽-4(1-39)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf融合蛋白的通过吸入的递送
用Aerotech II压缩空气喷射雾化器(jet nebulizer)(CIS-USInc.，Bedford，MA)产生气雾剂并且将其通过1.58cm直径的不锈钢气雾剂递送线导入24端口的流经啮齿动物的暴露系统(IN-TOX，ABQ，NM)。腔外的排气流速为～11.5L/min。雾化器压力保持在～30psi。
为了测试融合蛋白的雾化效果，将在10mM组氨酸pH 7.4，100mMNaCl中的10mg/mL的毒蜥外泌肽-4(1-39)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf融合蛋白(SEQ ID NO：23)溶液雾化，并随后在生物取样器中收集来自气雾剂的5mL浓缩液体超过8分钟并且测试其完整性和活性。如通过SDS-PAGE和SEC-HPLC所判断的，雾化过程对毒蜥外泌肽-4(1-39)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf融合蛋白的结构没有可检测的副作用；没有明显的分解或聚集体形成。回收的物质也显示为生物学活性的。
对于体内测试，将糖尿病小鼠(db/db)置于吸入腔中并且允许其呼吸雾化的毒蜥外泌肽-4(1-39)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf融合蛋白不同长度的时间。吸入暴露期间结束时，在下一个72小时期间监控小鼠的血糖。选择腔中的吸入时间，以便动物接受等价于皮下施用0.3，1和3mg/kg剂量的暴露。作为对照，皮下(SC)施用这些剂量以比较吸入途径给药的体内活性。通过吸入接受毒蜥外泌肽-4(1-39)(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)mTf融合蛋白的动物中的血糖水平在暴露于药物后表现出显著的降低。毒蜥外泌肽-4(1-39)(PEAPTD)2(SEQ IDNO：5)mTf融合蛋白的循环水平的评估表明该非最优化的系统和制剂的生物利用率为约10％。

Claims (21)

1.一种融合蛋白，其包含经多肽连接子(PEAPTD)2(SEQ ID NO：5)与运铁蛋白(Tf)融合的毒蜥外泌肽-4(SEQ ID NO：4)，其中所述的Tf经修饰以表现出与天然运铁蛋白分子相比减少的糖基化，且所述的Tf具有如SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列。
2.权利要求1的融合蛋白，其中毒蜥外泌肽-4分子在融合蛋白的N-末端，融合蛋白的C-末端或融合蛋白的N-末端和C-末端处融合。
3.权利要求1的融合蛋白，其中融合蛋白的N-末端进一步包含分泌信号序列。
4.权利要求3的融合蛋白，其中所述信号序列是来自血清运铁蛋白，乳铁蛋白，黑素运铁蛋白，或其变体的信号序列。
5.权利要求3的融合蛋白，其中所述信号序列是人血清白蛋白(HSA)/MFα-1杂合前导序列，经修饰的HSA/MFα-1杂合前导序列，或Tf信号序列。
6.权利要求3的融合蛋白，其中所述信号序列是如SEQ ID NO：18所示的人Tf信号序列。
7.编码权利要求1-6中任一项的融合蛋白的核酸。
8.包含权利要求7的核酸的载体。
9.包含权利要求8的载体的宿主细胞。
10.一种融合蛋白，其包含与经修饰的运铁蛋白(mTf)融合的毒蜥外泌肽-4，其中所述的融合蛋白包含如SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列。
11.编码SEQ ID NO：23的融合蛋白的核酸。
12.权利要求11的核酸，其中所述的核酸包含如SEQ ID NO：24所示的序列。
13.包含权利要求11或12的核酸的载体。
14.包含权利要求13的载体的宿主细胞。
15.一种药物组合物，其包含权利要求1-6中任一项的融合蛋白和药学上可接受的载体。
16.一种药物组合物，其包含权利要求10的融合蛋白和药学上可接受的载体。
17.权利要求16的药物组合物，其中所述组合物适合于以0.5mg至50mg范围的剂量给药。
18.权利要求17的药物组合物，其中所述组合物适合于以1mg至100mg的剂量给药。
19.权利要求15或16的药物组合物，其中所述组合物适合于经吸入给药。
20.治疗有效量的根据权利要求1-6和10中任一项的融合蛋白在制备用于治疗II型糖尿病或在有此需要的人类患者中降低血糖的药物中的用途。
21.治疗有效量的根据权利要求1-6和10中任一项的融合蛋白在制备用于治疗肥胖或在有此需要的人类患者中减轻体重的药物中的用途。
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