KR20210143759A - 면역 작용 세포의 특이적 활성화를 위한 인터루킨-2 수용체 (il2r) 및 인터루킨-2 (il2) 변이체 - Google Patents
면역 작용 세포의 특이적 활성화를 위한 인터루킨-2 수용체 (il2r) 및 인터루킨-2 (il2) 변이체 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20210143759A KR20210143759A KR1020217029581A KR20217029581A KR20210143759A KR 20210143759 A KR20210143759 A KR 20210143759A KR 1020217029581 A KR1020217029581 A KR 1020217029581A KR 20217029581 A KR20217029581 A KR 20217029581A KR 20210143759 A KR20210143759 A KR 20210143759A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- il2r
- alpha subunit
- wild
- functional variant
- human
- Prior art date
Links
- 108010038453 Interleukin-2 Receptors Proteins 0.000 title claims abstract description 451
- 102000010789 Interleukin-2 Receptors Human genes 0.000 title claims abstract description 451
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 title claims abstract description 359
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 title claims abstract description 359
- 239000012642 immune effector Substances 0.000 title claims description 91
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 title claims description 91
- 230000004913 activation Effects 0.000 title claims description 60
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 153
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 107
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims abstract description 76
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 63
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims abstract description 59
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims abstract description 59
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims abstract description 17
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 301
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 237
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 206
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 200
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 168
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 162
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 162
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 161
- 102000055277 human IL2 Human genes 0.000 claims description 161
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 159
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 153
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 152
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 152
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 151
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 151
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 124
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 106
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 91
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 89
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 85
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 64
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 57
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 claims description 55
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 53
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 49
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 49
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 49
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 40
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 38
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 33
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 32
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 32
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 29
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 29
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 28
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 25
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 claims description 25
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 24
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 24
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 claims description 19
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 19
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 19
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 18
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 17
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 claims description 15
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims description 13
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims description 13
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims description 12
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 8
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims description 7
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 claims description 5
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 claims description 5
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 claims description 5
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 claims description 2
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 claims description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 90
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 79
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 77
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 67
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 67
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 65
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 description 64
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 63
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 63
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 63
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 62
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 55
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 53
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 53
- 102000006306 Antigen Receptors Human genes 0.000 description 39
- 108010083359 Antigen Receptors Proteins 0.000 description 39
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 37
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 37
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 31
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 31
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 description 30
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 29
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 28
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 24
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 24
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 21
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 21
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 19
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 19
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 19
- 230000006870 function Effects 0.000 description 19
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 18
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 18
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 17
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 15
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 15
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 15
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 15
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 13
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 12
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 12
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 12
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 11
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 11
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 11
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 11
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 11
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 11
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 10
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 10
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 10
- 241000894007 species Species 0.000 description 10
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 10
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 10
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 9
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 9
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 9
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 9
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 9
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 8
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 8
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 8
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 8
- -1 for example Chemical class 0.000 description 8
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 8
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 8
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 7
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 7
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 7
- 102100022153 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Human genes 0.000 description 7
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 7
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 7
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 7
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 7
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 7
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 7
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 7
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 7
- 210000003071 memory t lymphocyte Anatomy 0.000 description 7
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 7
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229940076838 Immune checkpoint inhibitor Drugs 0.000 description 6
- 102000037984 Inhibitory immune checkpoint proteins Human genes 0.000 description 6
- 108091008026 Inhibitory immune checkpoint proteins Proteins 0.000 description 6
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 6
- 102000001712 STAT5 Transcription Factor Human genes 0.000 description 6
- 108010029477 STAT5 Transcription Factor Proteins 0.000 description 6
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 6
- 239000012274 immune-checkpoint protein inhibitor Substances 0.000 description 6
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 description 6
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 6
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 6
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 6
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 6
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 5
- 108091007741 Chimeric antigen receptor T cells Proteins 0.000 description 5
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 5
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 5
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 5
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 5
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 4
- 108010074708 B7-H1 Antigen Proteins 0.000 description 4
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 description 4
- 102100039498 Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Human genes 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 4
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 4
- 101100519207 Mus musculus Pdcd1 gene Proteins 0.000 description 4
- 102100024216 Programmed cell death 1 ligand 1 Human genes 0.000 description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 4
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 4
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 4
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 4
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 4
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 4
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 4
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 3
- 108091008875 B cell receptors Proteins 0.000 description 3
- 102100038449 Claudin-6 Human genes 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 239000004606 Fillers/Extenders Substances 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical class C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 3
- 101000882898 Homo sapiens Claudin-6 Proteins 0.000 description 3
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 3
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 3
- 102000004503 Perforin Human genes 0.000 description 3
- 108010056995 Perforin Proteins 0.000 description 3
- KHGNFPUMBJSZSM-UHFFFAOYSA-N Perforine Natural products COC1=C2CCC(O)C(CCC(C)(C)O)(OC)C2=NC2=C1C=CO2 KHGNFPUMBJSZSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 3
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 3
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 3
- 210000000173 T-lymphoid precursor cell Anatomy 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 3
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 3
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 3
- 101710165473 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Proteins 0.000 description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 3
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 3
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 229930192851 perforin Natural products 0.000 description 3
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 3
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 3
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 3
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 2
- 101710169336 5'-deoxyadenosine deaminase Proteins 0.000 description 2
- 102100036664 Adenosine deaminase Human genes 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 description 2
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 2
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 2
- 102100025137 Early activation antigen CD69 Human genes 0.000 description 2
- 101001091269 Escherichia coli Hygromycin-B 4-O-kinase Proteins 0.000 description 2
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 description 2
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000001398 Granzyme Human genes 0.000 description 2
- 108060005986 Granzyme Proteins 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 description 2
- 101000934374 Homo sapiens Early activation antigen CD69 Proteins 0.000 description 2
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 2
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 description 2
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- 102100033467 L-selectin Human genes 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 description 2
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 2
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 2
- 208000009869 Neu-Laxova syndrome Diseases 0.000 description 2
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 description 2
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 2
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 101001091268 Streptomyces hygroscopicus Hygromycin-B 7''-O-kinase Proteins 0.000 description 2
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 2
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 2
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 2
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 2
- 108010027570 Xanthine phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 102220606633 Zinc finger protein GLIS1_Q74N_mutation Human genes 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- 230000006229 amino acid addition Effects 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 102220452462 c.242G>T Human genes 0.000 description 2
- 102220362795 c.256A>G Human genes 0.000 description 2
- 102220427331 c.274A>T Human genes 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 239000012645 endogenous antigen Substances 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 230000005965 immune activity Effects 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 102200005671 rs1013940 Human genes 0.000 description 2
- 102220234588 rs1114167484 Human genes 0.000 description 2
- 102220234844 rs1131690927 Human genes 0.000 description 2
- 102200131576 rs121912452 Human genes 0.000 description 2
- 102200004150 rs147750704 Human genes 0.000 description 2
- 102220082053 rs201520438 Human genes 0.000 description 2
- 102200158049 rs387906619 Human genes 0.000 description 2
- 102200032604 rs5030773 Human genes 0.000 description 2
- 102220058213 rs730881465 Human genes 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 230000009919 sequestration Effects 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 2
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- UVBYMVOUBXYSFV-XUTVFYLZSA-N 1-methylpseudouridine Chemical compound O=C1NC(=O)N(C)C=C1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 UVBYMVOUBXYSFV-XUTVFYLZSA-N 0.000 description 1
- UVBYMVOUBXYSFV-UHFFFAOYSA-N 1-methylpseudouridine Natural products O=C1NC(=O)N(C)C=C1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UVBYMVOUBXYSFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZAYHVCMSTBRABG-UHFFFAOYSA-N 5-Methylcytidine Natural products O=C1N=C(N)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 ZAYHVCMSTBRABG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZAYHVCMSTBRABG-JXOAFFINSA-N 5-methylcytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 ZAYHVCMSTBRABG-JXOAFFINSA-N 0.000 description 1
- 108010031480 Artificial Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 208000025324 B-cell acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 102100038080 B-cell receptor CD22 Human genes 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000011357 CAR T-cell therapy Methods 0.000 description 1
- 210000001266 CD8-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102100037904 CD9 antigen Human genes 0.000 description 1
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 1
- 108010076667 Caspases Proteins 0.000 description 1
- 102000011727 Caspases Human genes 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 208000001382 Experimental Melanoma Diseases 0.000 description 1
- 206010051841 Exposure to allergen Diseases 0.000 description 1
- BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 1
- 102100026122 High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I Human genes 0.000 description 1
- 101000884305 Homo sapiens B-cell receptor CD22 Proteins 0.000 description 1
- 101000738354 Homo sapiens CD9 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 1
- 101000913074 Homo sapiens High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I Proteins 0.000 description 1
- 101000998146 Homo sapiens Interleukin-17A Proteins 0.000 description 1
- 101000777628 Homo sapiens Leukocyte antigen CD37 Proteins 0.000 description 1
- 101000934338 Homo sapiens Myeloid cell surface antigen CD33 Proteins 0.000 description 1
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 1
- 101000934341 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD5 Proteins 0.000 description 1
- 101000946843 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 208000001953 Hypotension Diseases 0.000 description 1
- 208000001718 Immediate Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 102000016844 Immunoglobulin-like domains Human genes 0.000 description 1
- 108050006430 Immunoglobulin-like domains Proteins 0.000 description 1
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 description 1
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 description 1
- 102100033461 Interleukin-17A Human genes 0.000 description 1
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108010092694 L-Selectin Proteins 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 208000031671 Large B-Cell Diffuse Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 102100031586 Leukocyte antigen CD37 Human genes 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 206010025280 Lymphocytosis Diseases 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 1
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 1
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 1
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 1
- 241000282553 Macaca Species 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010027406 Mesothelioma Diseases 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 102000009664 Microtubule-Associated Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010020004 Microtubule-Associated Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100025243 Myeloid cell surface antigen CD33 Human genes 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 206010028813 Nausea Diseases 0.000 description 1
- 206010061309 Neoplasm progression Diseases 0.000 description 1
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091036407 Polyadenylation Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 229930185560 Pseudouridine Natural products 0.000 description 1
- PTJWIQPHWPFNBW-UHFFFAOYSA-N Pseudouridine C Natural products OC1C(O)C(CO)OC1C1=CNC(=O)NC1=O PTJWIQPHWPFNBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 1
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000712907 Retroviridae Species 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 230000010782 T cell mediated cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 102100025244 T-cell surface glycoprotein CD5 Human genes 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 1
- 102000008579 Transposases Human genes 0.000 description 1
- 108010020764 Transposases Proteins 0.000 description 1
- 206010045240 Type I hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N adenyl group Chemical group N1=CN=C2N=CNC2=C1N GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011360 adjunctive therapy Methods 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 102000006646 aminoglycoside phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000002001 anti-metastasis Effects 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 238000011319 anticancer therapy Methods 0.000 description 1
- 230000005975 antitumor immune response Effects 0.000 description 1
- 208000010216 atopic IgE responsiveness Diseases 0.000 description 1
- 230000008267 autocrine signaling Effects 0.000 description 1
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-TXICZTDVSA-N beta-D-ribose Chemical group OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-TXICZTDVSA-N 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- WGDUUQDYDIIBKT-UHFFFAOYSA-N beta-Pseudouridine Natural products OC1OC(CN2C=CC(=O)NC2=O)C(O)C1O WGDUUQDYDIIBKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004900 c-terminal fragment Anatomy 0.000 description 1
- 230000003185 calcium uptake Effects 0.000 description 1
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000009566 cancer vaccine Methods 0.000 description 1
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 description 1
- 101150058049 car gene Proteins 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000009172 cell transfer therapy Methods 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 238000012054 celltiter-glo Methods 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 230000006364 cellular survival Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 229910052804 chromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011651 chromium Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 208000035250 cutaneous malignant susceptibility to 1 melanoma Diseases 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 102000003675 cytokine receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010057085 cytokine receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 206010012818 diffuse large B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 208000002173 dizziness Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000013931 endocrine signaling Effects 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011124 ex vivo culture Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 102000006815 folate receptor Human genes 0.000 description 1
- 108020005243 folate receptor Proteins 0.000 description 1
- 210000004475 gamma-delta t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 1
- 238000011134 hematopoietic stem cell transplantation Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000052205 human IL2RA Human genes 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000020256 human milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004251 human milk Anatomy 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000036543 hypotension Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 210000003297 immature b lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002861 immature t-cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 230000037189 immune system physiology Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 102000028557 immunoglobulin binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091009323 immunoglobulin binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000002743 insertional mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 229940045426 kymriah Drugs 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000002826 magnetic-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 210000003519 mature b lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000011325 microbead Substances 0.000 description 1
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 210000004898 n-terminal fragment Anatomy 0.000 description 1
- 230000008693 nausea Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000009437 off-target effect Effects 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 230000014306 paracrine signaling Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000007030 peptide scission Effects 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- PTJWIQPHWPFNBW-GBNDHIKLSA-N pseudouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1C1=CNC(=O)NC1=O PTJWIQPHWPFNBW-GBNDHIKLSA-N 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 210000003370 receptor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 238000005316 response function Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000005212 secondary lymphoid organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000001235 sensitizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000036303 septic shock Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 231100000004 severe toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000009097 single-agent therapy Methods 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001138 tear Anatomy 0.000 description 1
- 231100001274 therapeutic index Toxicity 0.000 description 1
- 108010078373 tisagenlecleucel Proteins 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 231100000440 toxicity profile Toxicity 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 230000005751 tumor progression Effects 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 229940045208 yescarta Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
- C07K14/7155—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for interleukins [IL]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/20—Interleukins [IL]
- A61K38/2013—IL-2
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
- A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/55—IL-2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/76—Albumins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
- A61K2239/59—Reproductive system, e.g. uterus, ovaries, cervix or testes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
Abstract
본 발명은 인터루킨-2 수용체 (IL2R)의 알파 서브유닛 및 인터루킨-2 (IL2)의 변이체에 관한 것이다. 일 구현예에서, 본원에 기술된 IL2 변이체는 이형삼량체 IL2 수용체 복합체, IL2Rαβγ의 알파 (α) 서브유닛과 접촉하는 IL2의 영역에서 아미노산 치환을 가져, 이형삼량체 수용체 복합체에 대한 결합능 및 활성화능이 감소된다. 반대로, 본원에 기술된 상응하는 IL2Rα 변이체는 이러한 IL2 변이체의 IL2Rαβγ에 결합하고 활성화시키는 감소된 능력을 보완하는 아미노산 치환, 바람직하게는 본원에서 기술된 IL2 변이체에서 치환된 IL2 아미노산 잔기에 의해 접촉하는 아미노산 치환을 갖는다.
Description
본 발명은 인터루킨-2 수용체 (IL2R)의 알파 서브유닛의 변이체 및 인터루킨-2 (IL2)에 관한 것이다. 일 구현예에서, IL2 변이체는 본원에서 이형삼량체 IL2 수용체 복합체, IL2Rαβγ의 알파 (α) 서브유닛과 접촉하는 IL2의 영역에서 아미노산 치환을 가져, 이형삼량체 수용체 복합체에 결합하고 활성화시키는 능력이 감소된다. 반대로, 이에 상응하는 본원에서 설명된 IL2Rα 변이체는, 바람직하게는 본원에서 설명된 IL2 변이체에서 치환된 IL2 아미노산 잔기에 의해 접촉되는 아미노산 잔기에서, IL2 변이체의 IL2Rαβγ에 결합하고 활성화시키는 것에 대한 감소된 능력을 상쇄하는 아미노산 치환을 갖는다. IL2 변이체는 야생형 IL2R, 즉, IL2R의 (야생형) 알파 서브유닛을 포함하는 IL2R에 대한 손상된 결합 및/또는 활성화를 보여준다. 그러나, IL2R의 알파 서브유닛에서 변형은 적어도 부분적적으로 IL2R의 알파 서브유닛의 변이체를 포함하는 IL2R에 대한 결합 및/또는 활성화를 회복시킨다. 따라서, 본원에서 설명되는 것들은 IL2의 변이체와 야생형 IL2Rαβγ에 의해 나타나는 결합 및/또는 활성화의 수준을 초과하는, 상응하는 IL2R의 알파 서브유닛의 변이체와 IL2의 쌍, 세트 또는 시스템이다.
특히, 본원에서 설명된 수용체 폴리펩티드는 인터루킨-2 수용체 (IL2R)의 알파 서브유닛 또는 IL2R의 알파 서브유닛의 기능성 변이체의 변이를 포함하고, IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체는 야생형 IL2에서 염기성 아미노산 잔기에 접촉하는 IL2R의 야생형 알파 서브유닛에서 산성 아미노산 잔기를 갖는 적어도 하나의 위치에서 치환되어있고/거나 야생형 IL2에서 산성 아미노산 잔기에 접촉하는 IL2R의 야생형 알파 서브유닛에서 염기성 아미노산 잔기를 갖는 적어도 하나의 위치에서 치환되어 있다. 만약 상기 아미노산 잔기가 IL2R의 야생형 알파 서브유닛에서 산성 아미노산 잔기라면, 상기 치환은 염기성 아미노산 잔기에 의한 것이다. 만약 상기 아미노산 잔기가 IL2R의 야생형 알파 서브유닛에서 염기성 아미노산 잔기라면, 상기 치환은 산성 아미노산 잔기에 의한 것이다. 또한, 본원에서 기재된 수용체 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드, 숙주 세포들, 특히, 본원에서 설명된 수용체 폴리펩티드를 발현하도록 유전적으로 변형된 T 세포와 같은 면역 작용 세포, 및 폴리뉴클레오티드 및 숙주 세포를 포함하는 약학 조성물 및 의학 제제가 기재된다.
또한, IL2 또는 IL2의 기능성 변이체의 변이를 포함하는 각각의 리간드 폴리펩티드가 기재되고, IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체가 야생형 IL2에서 염기성 아미노산 잔기에 접촉하는 IL2R의 야생형 알파 서브유닛에서 산성 아미노산 잔기를 갖는 적어도 하나의 위치에서 치환될 때, IL2 또는 이의 기능성 변이체는 야생형 IL2에서 적어도 상기 염기성 아미노산 잔기에서 치환되고/거나 IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체가 야생형 IL2에서 산성 아미노산 잔기에 접촉하는 IL2R의 야생형 알파 서브유닛에서 염기성 아미노산 잔기를 갖는 적어도 하나의 위치에서 치환될 때, IL2 또는 이의 기능성 변이체는 야생형 IL2에서 적어도 상기 산성 아미노산 잔기에서 치환된다. 만약 아미노산 잔기가 야생형 IL2에서 염기성 아미노산 잔기이면, 치환은 산성 아미노산 잔기에 의한 것이다. 만약 아미노산 잔기가 야생형 IL2에서 산성 아미노산 잔기이면, 치환은 염기성 아미노산 잔기에 의한 것이다.
야생형 IL2R을 지닌 T 세포와 같은 면역 작용 세포는 본원에서 기재된 IL2 변이체와 접촉하면 감소된 반응성을 보일 것이다. 그러나, 변이체 IL2R (IL2Rα 변이체 폴리펩티드를 포함하는 IL2R)을 지닌 T 세포와 같은 상응하는 면역 작용 세포의 반응성은, 적어도 부분적으로, 회복될 것이다. 상응하는 IL2R의 알파 서브유닛의 변이체 및 IL2의 쌍, 세트 또는 시스템은 본원에서 설명된 변이체 IL2R을 지닌 T 세포와 같은 면역 작용 세포를 특이적으로 활성화하는 데에 사용될 수 있다.
본원에서 설명된 변이체 IL2R을 지닌 T 세포와 같은 이러한 면역 작용 세포는 ex vivo 또는 in vitro에서 생산된 후 치료를 필요로 하는 개체에 투여될 수 있거나, 치료를 필요로 하는 개체의 in vivo에서 생산될 수 있다. 따라서, 본 명세서는 또한 T 세포와 같은 면역 작용 세포의 효능을 강화하기 위한 방법 및 약제에 관한 것이다. 특히, 본 명세서는, 예를 들어, 상응하는 IL2 변이체, 상응하는 IL2 변이체를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 상응하는 IL2 변이체를 발현하도록 유전적으로 변형된 숙주 세포를 개체에 투여함으로써, 본원에서 기술된 변이체 IL2R을 발현하도록 유전적으로 변형된 면역 작용 세포를 개체에 제공하는 단계 및 상응하는 IL2 변이체를 개체에 제공하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 본원에서 기술된 방법 및 약제는, 특히, 면역 작용 세포가 향하는 항원을 발현하는 질환에 걸린 세포를 특징으로 하는 질환의 치료에 유용하다. 일 구현예에서, 면역 작용 세포는 항원 또는 이의 처리 산물에 결합 특이성을 갖는 T 세포 수용체 (TCR) 또는 키메라 항원 수용체 (CAR)와 같은 항원 수용체를 운반한다. 일 구현예에서, 면역 작용 세포는 항원 수용체를 발현하도록 유전적으로 변형된다. 이러한 유전적 변형은 ex vivo 또는 in vitro에서 달성될 수 있고, 그 후 면역 작용 세포는 치료를 필요로 하는 개체에 투여되거나 치료를 필요로 하는 개체 in vivo에서 달성될 수 있다.
면역계는 암, 자가면역, 알러지 뿐만 아니라 병원체-관련 질환에서 중요한 역할을 한다. T 세포 및 NK 세포는 항-종양 면역 반응의 중요한 매개체이다. CD8+ T 세포 및 NK 세포는 종양 세포를 직접적으로 용해시킬 수 있다. 반면, CD4+ T 세포는 CD8+ T 세포 및 NK 세포를 포함하는 상이한 면역 하위군(subsets)의 종양으로의 유입을 매개할 수 있다. CD4+ T 세포는 수지상 세포 (DCs)가 항-종양 CD8+ T 세포 반응의 감작(priming)을 인가할 수 있고, IFNγ 매개된 MHC 상향조정 및 성장 저해를 통해 종양 세포에 직접적으로 작용할 수 있다. CD8+ 뿐만 아니라 CD4+ 종양 특이적 T-세포 반응은 백신화를 통해 또는 T 세포의 입양전달에 의해 유발될 수 있다.
면역치료에 기반한 입양 세포 전달 (ACT)은 낮은 전구체 빈도부터 임상적으로 관련된 세포 수까지 ex vivo에서 증식 후에 비-면역 이식자에 또는 자가 숙주에 이식하는 사전에 감작된 T 세포에 의한 수동 면역의 한 형태로서 광범위하게 정의될 수 있다. ACT 실험에 사용되어왔던 세포 유형은 림포카인-활성 살해 (LAK) 세포 (Mule, J.J. et al. (1984) Science 225, 1487-1489; Rosenberg, S.A. et al. (1985) N. Engl. J. Med. 313, 1485-1492), 종양-침윤 림프구 (TILs) (Rosenberg, S.A. et al. (1994) J. Natl. Cancer Inst. 86, 1159-1166), 조혈모세포 이식(HSCT) 후 공여자 림프구 뿐 아니라 종양-특이적 T 세포 계통 또는 클론(Dudley, M.E. et al. (2001) J. Immunother. 24, 363-373; Yee, C. et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 99, 16168-16173)이다. 대안적 접근은 단-기간 ex vivo 배양 후 환자에 재 주입 동안 정의된 특이성의 종양-반응성 면역수용체를 발현하도록 재프로그래밍된 자가 T 세포의 입양전달이다(Kershaw M.H. et al. (2013) Nature Reviews Cancer 13 (8):525-41). 이 전략은 종양-반응성 T 세포가 환자에 부존재하더라도 ACT를 다양한 통상의 악성 종양들에 적용 가능하도록 한다. 예를 들어, 키메라 항원 수용체 변형된 T 세포 (CAR T 세포)의 입양전달은 막대한 수의 임상 시험이 전세계적으로 연구되고 있다. 키메라 항원 수용체 (CARs)는 세포외 항원-결합 모이어티, 가장 일반적으로 단일클론 항체로부터의 단일-쇄 가변 단편(scFvs)에 융합된 세포내 T 세포 신호 도메인으로 구성된 항원-표적화된 수용체의 유형이다. CARs는 MHC-매개된 제시와 무관하게, 세포 표면 항원을 직접적으로 인식하여, 모든 환자에서 임의의 주어진 항원에 특이적인 단일 수용체 컨스트럭트의 사용을 허용한다. CARs는 항원-인식 도메인을 T 세포 수용체 (TCR) 복합체의CD3ζ 활성화 사슬에 융합하고 CD28 유래의 세포내 도메인 또는 4-1BB (CD137) 및 OX40 (CD134)와 같은 다양한 TNF 수용체 패밀리 분자를 포함하여, CD3ζ와 함께 이차 보조자극 신호를 포함한다. CARs는 항종양 효능을 급격하게 개선하여, 특히 혈액 종양으로 고통받는 환자에서 괄목할만한 임상적 효능을 보였다 (Hartmann, J. et al. EMBO Mol. Med. 9, 1183-1197 (2017)). 최근, 2개의 CAR T-세포 치료가 B-세포 급성 림프모구 백혈병 (Kymriah®) 및 미만성 거대 B-세포 림프종(Yescarta®)의 치료에 대해 FDA 및 EMA에 의해 승인 받았다 (Zheng, P. et al. Drug. Discov. Today 6, 1175-1182 (2018)). 고형 종양에 대한 T 세포의 입양전달은, 그러나, 아직까지는 제한된 효능을 보였고 개선이 필요하다 (Newick, K. et al. Annu. Rev. Med. 68, 139-152 (2017)).
일반적으로 in vivo에서 대량 배양 및 종양-반응성 면역수용체-변형된 T 세포의 지속성은 혈액 종양을 가진 환자에서 지속성있는 임상적 회복의 중요한 예측자인 것으로 생각하였다(Guedan, S. et al. JCI Insight. 3 (1) (2018); Maude, SL. et al. N Engl J Med. 371, 1507-1517 (2014)). 고형 종양을 가진 환자에 대해서도 동일한 것이 참일 것으로 예상할 수 있다. 따라서, 환자에서 지속성을 지지하거나 심지어 치료적으로 활성 세포 클론을 확장하는 것은 바람직할 것이다.
면역수용체-변형된 T 세포의 임상적 효능을 더 개선할 한가지 잠재적 방법은 세포 생존 및 기능에 영향을 미치는 사이토카인을 통한 상기 세포의 지지 및 변형이다. 따라서, 생존에 중요한 사이토카인의 투여는 화학요법 또는 방사능요법과 같은 가혹한 림프구 제거 요법을 수행할 필요성을 최소화할 수 있고, 이는 입양 전달된 T 세포의 지속성을 증가시키는 데에 IL15 및 IL17과 같은 무생존신호 설정 또는 상주 면역 세포 소비(Gattinoni, L. et al. J. Exp. Med. 202, 907-12 (2005))에 의해 성공적으로 사용된다 (Maus, M. et al. Clin. Cancer Res. 22(8), 1875-1884 (2016)). 또한, 전달된 세포의 치료적 잠재성은 적절한 사이토카인의 동시 투여에 의해 증진될 수 있다. 예를 들어, 인터루킨-2 (IL2)는 면역계의 다양한 세포를 활성화시키는 잠재적 면역 증강제이다. IL2는 분화, 증식, 생존 및 T 세포 및 NK 세포의 작용 기능을 돕는 것으로 알려졌고 (Blattman, J. N. et al. Nat. Med. 9, 540-7 (2003)) 말기 악성 흑색종의 치료에 수십년간 사용되었다(Maas, R. A., Dullens, H. F. & Den Otter, W. 암 Immunol. Immunother. 36, 141-8 (1993)).
그러나, ACT를 지원하기 위해 사이토카인을 투여하는 것과 관련된 몇 가지 어려움이 존재한다:
(1) 재조합 사이토카인은 매우 짧은 혈장 반감기를 가져 다량의 사이토카인을 자주 주사할 필요성을 만든다. IL2의 경우에 이는 혈관 누출 증후군(VLS)과 같은 심각한 부작용을 유발한다(Rosenberg, S. A. et al. N. Engl. J. Med. 316, 889-97 (1987)).
(2) 면역 세포는 일반적으로 생존 신호와 경쟁한다. 따라서, 사이토카인을 투여하는 것은 상주 면역 세포 뿐 아니라 전달된 세포 모두에 의해 소멸되고 영향을 미친다. 전달된 세포는 소수이기 때문에, 대부분의 상주 면역 세포가 영향을 받을 것이다. 이는 ACT에의 사이토카인 효능을 제한할 뿐만 아니라 병용되는 림프박멸성 치료를 필요로 한다(Gattinoni, L. et al. J. Exp. Med. 202, 907-12 (2005)).
(3) 사이토카인 투여는 상주 면역 세포에 원치 않는 효과를 야기할 수 있다. 예를 들어, CD25 (IL2Rα), CD122 (IL2Rβ) 및 CD132 (IL2Rγ)로 구성된 고-친화성 IL2 수용체(IL2Rαβγ)가 Tregs에서 발현될 뿐 아니라 활성화된 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 발현되는 반면, CD25가 없는 중간-친화성 수용체 (IL2Rβγ)는 나이브(na
ve) 및 기억 T 세포 뿐 아니라 NK 세포에서 일반적이기 때문에, IL2는 작용 T 세포에 비하여 더 강력하게 조절 T 세포 (Tregs)를 자극할 수 있는 능력이 있는 것으로 알려졌다 (Todd, J. A. et al. PLoS Med. 13, e1002139 (2016)). Tregs는 항-종양 작용 T 세포 및 NK 세포의 기능을 억제할 수 있기 때문에 암 환자의 감소된 생존율과 관련되어 있다(Nishikawa, H. & Sakaguchi. Curr. Opin. Immunol. 27, 1-7 (2014)).CD25 발현 세포에 대한 선호를 상실하게 하는 방식으로 IL2를 변경하여 나이브 및 기억 T 세포 뿐 아니라 NK 세포에의 자극능을 상대적으로 증가시키기 위한 시도는 이의 항-종양능을 증진하는 것으로 나타났다 (Arenas-Ramirez, N. et al. Sci. Transl. Med. 8, 1-13 (2016)).
명백히, 면역 치료, 특히 자가조직 TIL 또는 TCR- 또는 CAR-형질전환 T 세포 기반 치료 및/또는 백신, 특히 암 백신과 같은 세포-기반 암 면역 치료의 효능을 증진시키기 위한 신규한 전략에 대한 필요성이 존재한다. ACT 또는 면역 세포의 in vivo 리프로그래밍을 사이토카인 치료와 결합할 때 발생하는 제한을 해결하기 위하여, 우리는 본원에서 IL2R, 특히 IL2R의 α 서브유닛의 변이체 및 IL2의 변이체 세트를 제공한다. 본원에 기재된 IL2 변이체는 IL2R의 야생형 α 서브유닛을 발현하는 세포와 비교하여 상응하는 IL2R의 변이체 α 서브유닛을 발현하는 세포를 우선적으로 활성화한다. 변이체 IL2R을 지닌 입양 전달된 면역 작용 세포 또는 in vivo에서 변형된 면역 작용 세포는 상응하는 IL2 변이체에 의해 선택적으로 표적이 되는 반면, 변형되지 않은 숙주 면역 세포에 대한 표적-이탈(off-target) 효과는 제한된다. 결과적으로, IL2 및 IL2R의 신규한 변이체 쌍은 이식된 세포의 생존 및 작용 기능을 강력하게 조절하는 능력을 제공하여 개선된 치료 효능을 갖게 한다. 결과적으로, IL2 및 IL2R의 신규한 변이체 쌍은 이식된 세포의 생존 및 작용 기능을 강력하게 조절하는 능력을 제공하여 개선된 치료 효능을 갖게 한다.
본 발명은 인터루킨-2 수용체 (IL2R)의 알파 서브유닛 또는 IL2R의 알파 서브유닛의 기능성 변이체 및 이를 포함하는 시스템을 제공한다.
요약
본 명세서는 IL2 및 IL2R의 신규한 변이체 쌍을 제공한다. 특히, CD25 결합에 영향을 미치는 변이 ("mutCD25")를 함유하는 IL2의 변이체가 기술된다. 상응하는 IL2Rα의 변이체는 IL2 변이체의 영향받는 CD25 결합에 대해 보상한다. IL2의 결합 표면 상 특정 결합 잔기의 적절한 변형을 통한 IL2의 IL2Rα과의 상호작용의 방해는 IL2Rαβγ를 발현하는 세포에 대한 유효 결합 (그리고 따라서 활성화)을 막는 것으로 가설이 세워졌었다. 그러나 세포에서 상응하는 IL2R의 변이체 α 서브유닛을 포함하는 IL2Rαβγ를 발현하는 세포에서 세포에 대한 결합 (그리고 따라서 활성화) 은 발생될 것이다. 야생형 IL2Rαβγ를 발현하는 세포에 우선하여 면역 작용 세포들, 예를 들어, 기억 T 세포, 나이브 T 세포 및 작용 T 세포와 같은 T 세포 뿐 아니라 NK 세포들 상에서 상응하는 IL2R의 변이체 α 서브유닛을 포함하는 IL2Rαβγ을 선택적으로 활성화할 수 있는 IL2 변이체는 야생형 IL2에 비하여 개선된 치료 지수 및 감소된 독성 프로필을 가질 것으로 예상된다. 개선된 치료 지수를 갖는 IL2 변이체는 면역계 자극을 필요로하는 질환의 치료에서, 예를 들어 암의 치료 (직접 및/또는 부가 치료)에서 상당히 확장된 범위로 사용할 수 있을 것이다. 특히, IL2 변이체 RNA의 투여는 다각적인 T 및 NK 세포-기반 (암) 면역치료의 치료 효능을 향상시키기 위한 유망한 접근이다.
본원에 기재된 변이체 IL2R을 지닌 면역 작용 세포는 in vitro에서 생성되고 이어서 치료를 필요로 하는 개체에 투여될 수 있거나, 치료를 필요로 하는 개체 in vivo에서 생성될 수 있다. 상응하는 IL2 변이체, 상응하는 IL2 변이체를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 상응하는 IL2 변이체를 발현하도록 유전적으로 변형된 숙주 세포를 개체에 투여하는 것은 수용체-조작된 면역 작용 세포의 특이적 자극을 가능하게 한다. 본원에 설명된 방법 및 약제는, 특히 면역 작용 세포가 향하는 항원을 발현하는 병에 걸린 세포를 특징으로 하는 질환의 치료에 유용하다. 일 구현예에서, 면역 작용 세포는 항원 또는 이의 처리 산물에 대한 결합 특이성을 갖는 T 세포 수용체 (TCR) 또는 키메라 항원 수용체 (CAR)와 같은 항원 수용체를 가진다. 일 구현예에서, 면역 작용 세포는 치료받을 개체에 존재하고 본원에서 설명된 수용체 폴리펩티드를 발현하도록 개체 in vivo에서 유전적으로 변형된다. 일 구현예에서, 치료받을 개체로부터 유래되거나 상이한 개체로부터 유래된 면역 작용 세포가 치료받을 개체에 투여된다. 투여된 면역 작용 세포는 투여 전에 ex vivo에서 유전적으로 변형되거나 투여 후에 개체 in vivo에서 본원에서 설명된 수용체 폴리펩티드를 발현하도록 유전적으로 변형될 수 있다. 일 구현예에서, 항원 수용체는 면역 작용 세포에 대하여 내인성이다. 일 구현예에서, 면역 작용 세포는 ex vivo 또는 in vivo에서 항원 수용체를 발현하도록 유전적으로 변형된다. 따라서, 이러한 항원 수용체의 유전적 변형은 in vitro (선택적으로 본원에서 설명된 IL2 수용체 폴리펩티드에 의한 유전적 변형과 함께)에서 그리고 이에 따라 치료를 필요로 하는 개체에 투여된 면역 작용 세포에 영향을 미칠 수 있거나 치료를 필요로 하는 개체 in vivo (선택적으로 본원에서 설명된 IL2 수용체 폴리펩티드에 의한 유전적 변형과 함께)에서 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 일 측면에서, 본 발명은 일반적으로 질환에 걸린 세포, 특히 종양 항원을 발현하는 암 세포와 같은 항원을 발현하는 세포를 표적으로 함으로써 질환을 치료하는 것을 포함한다. 표적 세포는 항원을 세포 표면에 발현하거나 항원의 처리 산물을 제시할 수 있다. 일 구현예에서, 항원은 종양-관련 항원이고, 질환은 암이다. 이러한 치료는 항원을 발현하는 세포의 선택적 제거, 이에 따른 항원을 발현하지 않는 정상 세포에의 부작용의 최소화를 위해 제공한다. 일 구현예에서, 백신 항원 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 면역 작용 세포이 자극, 감작 및/또는 증식을 위한 항원을 제공 (선택적으로 이후에 적합한 표적 세포에 의한 폴리뉴클레오티드의 발현)하기 위하여 투여되고, 면역 작용 세포 (선택적으로 항원 수용체를 발현하도록 유전적으로 변형된)는 항원 또는 이의 처리 산물을 표적으로 하고 면역 반응은 항원을 발현하는 표적 세포 집단 또는 표적 조직에 대한 면역 반응이다. 일 구현예에서, 백신 항원을 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드는 RNA이다. 환자에서 자극, 감작 및/또는 증식된 T 세포와 같은 면역 작용 세포는 항원을 발현하는 세포를 인식할 수 있고 결과적으로 질환에 걸린 세포를 제거하게 한다. 본원에서 설명된 방법 및 약제는 만약 IL2 변이체를 엔코딩하는 RNA가 전신 유효성을 위해 간을 표적으로 한다면 특히 효과적이다. 간 세포는 쉽게 감염될 수 있고 대량의 단백질을 생산할 수 있다. 항원-엔코딩 RNA는 바람직하게는 2차 림프 기관에 표적화된다.
그에 따라, 일 측면은 질환의 치료에서 면역 작용 세포의 특정 활성을 위한 인터루킨-2 수용체의 알파 서브유닛 (IL2Rα) 및 인터루킨-2 (IL2) 변이체의 시스템에 관한 것이고, 여기서 이러한 면역 작용 세포는 고형 종양을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 암 등에 효과적일 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명은 CAR를 발현하도록 변환된 T 세포와 같은 세포의 입양 세포 전달의 전략과 관련되어 있다. CARs는 요망된 항원(예를 들어, 종양 항원)에 대한 바람직하게는 항체-기반인 특이성을 T 세포 수용체-활성화 세포 내 도메인과 병합하여 특이적 세포성 면역 활성(예를 들어, 특이적 항-종양 세포성 면역 활성)을 나타내는 키메라 단백질을 생성하도록 한 분자이다. 바람직하게, 세포는 안정적으로 CAR (및 본원에서 설명된 IL2 수용체 폴리펩티드)를 세포의 표면에서 발현하여 MHC에 독립적으로 신규 항원 특이성을 갖도록 유전적으로 변형될 수 있다. CAR를 발현하는 T 세포는 본원에서 CAR T 세포 또는 CAR-변형된 T 세포로 언급된다.
본 발명의 일 측면은:
(i) 인터루킨-2 수용체 (IL2R)의 알파 서브유닛 또는 IL2R의 알파 서브유닛의 기능성 변이체의 변이를 포함하고, IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체는 적어도 하나의 위치에서 치환되는 수용체 폴리펩티드,
(ii) IL2 또는 IL2의 기능성 변이체의 변이를 포함하고, IL2 또는 이의 기능성 변이체는 적어도 하나의 위치에서 치환되는 리간드 폴리펩티드를 포함하는 시스템에 관한 것이고,
치환되어
(a) (ii)에 따른 변이는 알파 서브유닛으로서 (i)에 따른 변이를 포함하는 IL2R에 결합하고 활성화하고,
(b) 알파 서브유닛으로서 (ii)에 따른 변이에 의한 (i)에 따른 변이를 포함하는 IL2R에의 결합 및 활성화는 알파 서브유닛으로서 (ii)에 따른 변이에 의한 IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 IL2R에의 결합 및/또는 활성화를 초과한다.
일 구현예에서, 알파 서브유닛으로서 (ii)에 따른 변이에 의해 (i)에 따른 변이를 포함하는 IL2R에 대한 결합 및/또는 활성화는 알파 서브유닛으로서 IL2 또는 이의 기능성 변이체에 의한 (i)에 따른 변이를 포함하는 IL2R에 대한 결합 및 또는 활성화를 초과한다. 일 구현예에서, 알파 서브유닛으로서 IL2 또는 이의 기능성 변이체에 의한 IL2R 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 IL2R에 대한 결합 및/또는 활성화는 알파 서브유닛으로서 (ii)에 따른 변이에 의한 IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 IL2R에 대한 결합 및/또는 활성화를 초과한다. 일 구현예에서, 알파 서브유닛으로서 IL2 또는 이의 기능성 변이체에 의한 IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 IL2R에 대한 결합 및/또는 활성화는 알파 서브유닛으로서 IL2 또는 이의 기능성 변이체에 의한 (i)에 따른 변이를 포함하는 IL2R에 대한 결합 및/또는 활성화를 초과한다.
일 구현예에서, 본 발명의 시스템은
(i) IL2R의 알파 서브유닛 또는 IL2R의 알파 서브유닛의 기능성 변이체의 변이를 포함하고, IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체는 야생형 IL2에서 염기성 아미노산 잔기와 접촉하는 IL2R의 야생형 알파 서브유닛에서 산성 아미노산 잔기를 갖는 적어도 하나의 위치에서 치환되고/거나 야생형 IL2에서 산성 아미노산 잔기와 접촉하는 IL2R의 야생형 알파 서브유닛에서 염기성 아미노산 잔기를 갖는 적어도 하나의 위치에서 치환되고, 만약 아미노산 잔기가 IL2R의 야생형 알파 서브유닛에서 산성 아미노산 잔기이면, 치환은 염기성 아미노산 잔기에 의한 것이고, 만약 아미노산 잔기가 IL2R의 야생형 알파 서브유닛에서 염기성 아미노산 잔기이면, 치환은 산성 아미노산 잔기에 의한 것인, 수용체 폴리펩티드,
(ii) IL2 또는 IL2의 기능성 변이체의 변이를 포함하고, IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체가 야생형 IL2에서 염기성 아미노산 잔기와 접촉하는 IL2R의 야생형 알파 서브유닛에서 산성 아미노산 잔기를 갖는 적어도 하나의 위치에서 치환되면, IL2 또는 이의 기능성 변이체는 야생형 IL2에서 적어도 하나의 상기 염기성 아미노산 잔기에서 치환되고/거나 IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체가 야생형 IL2에서 산성 아미노산 잔기와 접촉하는 IL2R의 야생형 알파 서브유닛에서 염기성 아미노산 잔기를 갖는 적어도 하나의 위치에서 치환되면, IL2 또는 이의 기능성 변이체는 야생형 IL2에서 상기 산성 아미노산 잔기에서 치환되고, 만약 아미노산 잔기가 야생형 IL2에서 염기성 아미노산 잔기이면 치환은 산성 아미노산 잔기에 의한 것이고 만약 아미노산 잔기가 야생형 IL2에서 산성 아미노산 잔기이면 치환은 염기성 아미노산 잔기에 의한 것인 리간드 폴리펩티드를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 시스템은
(i) 인터루킨-2 수용체 (IL2R)의 알파 서브유닛 또는 IL2R의 알파 서브유닛의 기능성 변이체의 변이를 포함하고, IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체는 야생형 IL2에서 염기성 아미노산 잔기와 접촉하는 IL2R의 야생형 알파 서브유닛에서 산성 아미노산 잔기를 갖는 적어도 하나의 위치에서 치환되고, 만약 아미노산 잔기가 IL2R의 야생형 알파 서브유닛에서 산성 아미노산 잔기이면 치환은 염기성 아미노산 잔기에 의한 것이고 만약 아미노산 잔기가 IL2R의 야생형 알파 서브유닛에서 염기성 아미노산 잔기이면 치환은 산성 아미노산 잔기에 의한 것인, 수용체 폴리펩티드,
(ii) IL2 또는 IL2의 기능성 변이체의 변이를 포함하고, IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체가 야생형 IL2에서 염기성 아미노산 잔기와 접촉하는 IL2R의 야생형 알파 서브유닛에서 산성 아미노산 잔기를 갖는 적어도 하나의 위치에서 치환되면, IL2 또는 이의 기능성 변이체는 야생형 IL2에서 적어도 상기 염기성 아미노산 잔기에서 치환되고/거나 IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체가 야생형 IL2에서 산성 아미노산 잔기와 접촉하는 IL2R의 야생형 알파 서브유닛에서 염기성 아미노산 잔기를 갖는 적어도 하나의 위치에서 치환되면, IL2 또는 이의 기능성 변이체는 야생형 IL2에서 적어도 상기 산성 아미노산 잔기에서 치환되고, 만약 아미노산 잔기가 야생형 IL2에서 염기성 아미노산 잔기이면 치환은 산성 아미노산 잔기에 의한 것이고 만약 아미노산 잔기가 야생형 IL2에서 산성 아미노산 잔기이면 치환은 염기성 아미노산 잔기에 의한 것인, 리간드 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명의 시스템의 일 구현예에서 IL2R의 알파 서브유닛은 IL2R의 인간 알파 서브유닛이다. 본 발명의 시스템의 일 구현예에서IL2는 인간 IL2이다.
다른 구현예에서, IL2R 또는 이의 기능성 변이체의 인간 알파 서브유닛 및 인간 IL2 또는 이의 기능성 변이체는 적어도 하나의 하기 위치(IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛을 기준으로 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛에 따른 번호이고 야생형 인간 IL2를 기준으로 야생형 인간 IL2에 따른 번호임)에서 치환된다:
(i)
IL2R 또는 이의 기능성 변이체: 위치 1 (글루탐산), 및
IL2 또는 이의 기능성 변이체: 위치 35 (라이신);
(ii)
IL2R 또는 이의 기능성 변이체: 위치 29 (글루탐산), 및
IL2 또는 이의 기능성 변이체: 위치 43 (라이신);
(iii)
IL2R 또는 이의 기능성 변이체: 위치 38 (라이신), 및
IL2 또는 이의 기능성 변이체: 위치 61 (글루탐산);
(iv)
IL2R 또는 이의 기능성 변이체: 위치 1 (글루탐산),
IL2 또는 이의 기능성 변이체: 위치 35 (라이신),
IIL2R 또는 이의 기능성 변이체: 위치 29 (글루탐산), 및
IL2 또는 이의 기능성 변이체: 위치 43 (라이신);
(v)
IL2R 또는 이의 기능성 변이체: 위치 1 (글루탐산),
IL2 또는 이의 기능성 변이체: 위치 35 (라이신),
IL2R 또는 이의 기능성 변이체: 위치 38 (라이신), 및
IL2 또는 이의 기능성 변이체: 위치 61 (글루탐산);
(vi)
IL2R 또는 이의 기능성 변이체: 위치 29 (글루탐산),
IL2 또는 이의 기능성 변이체: 위치 43 (라이신),
IIL2R 또는 이의 기능성 변이체: 위치 38 (라이신), 및
IL2 또는 이의 기능성 변이체: 위치 61 (글루탐산); 또는
(vii)
IL2R 또는 이의 기능성 변이체: 위치 1 (글루탐산),
IL2 또는 이의 기능성 변이체: 위치 35 (라이신),
IIL2R 또는 이의 기능성 변이체: 위치 29 (글루탐산),
IL2 또는 이의 기능성 변이체: 위치 43 (라이신),
IIL2R 또는 이의 기능성 변이체: 위치 38 (라이신), 및
IL2 또는 이의 기능성 변이체: 위치 61 (글루탐산).
IL2R 또는 이의 기능성 변이체: 일 구현예에서, 위치 1은 라이신으로 치환된다. 일 구현예에서, 위치 29는 라이신으로 치환된다. 일 구현예에서, 위치 38은 글루탐산으로 치환된다.
IL2 또는 이의 기능성 변이체: 일 구현예에서, 위치 35는 글루탐산으로 치환된다. 일 구현예에서, 위치 43은 글루탐산으로 치환된다. 일 구현예에서, 위치 61은 라이신으로 치환된다.
본 발명의 시스템의 일 구현예에서
(i) IL2R의 알파 서브유닛은 IL2R의 인간 알파 서브유닛이고 IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체는 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛을 기준으로 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛에 따라 번호가 지정되는 경우 적어도 위치 1(글루탐산)이 치환되고,
(ii) IL2는 인간 IL2이고 IL2 또는 이의 기능성 변이체는 야생형 인간 IL2를 기준으로 야생형 인간 IL2에 따라 번호가 지정되는 경우 적어도 위치 35(라이신)가 치환된다.
일 구현예에서, 위치 1은 라이신으로 치환된다. 일 구현예에서, 위치 35는 글루탐산으로 치환된다.
본 발명의 시스템의 일 구현예에서
(i) IL2R의 알파 서브유닛은 IL2R의 인간 알파 서브유닛이고 IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체는 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛을 기준으로 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛에 따라 번호가 지정되는 경우 적어도 위치 29 (글루탐산)가 치환되고,
(ii) IL2는 인간 IL2이고 IL2 또는 이의 기능성 변이체는 야생형 인간 IL2를 기준으로 야생형 인간 IL2에 따라 번호가 지정되는 경우 적어도 위치 43(라이신)이 치환된다.
일 구현예에서, 위치 29는 라이신으로 치환된다. 일 구현예에서, 위치 43은 글루탐산으로 치환된다.
본 발명의 시스템의 일 구현예에서
(i) IL2R의 알파 서브유닛은 IL2R의 인간 알파 서브유닛이고 IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체는 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛을 기준으로 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛에 따라 번호가 지정되는 경우 적어도 위치 38 (라이신)이 치환되고,
(ii) IL2는 인간 IL2이고 IL2 또는 이의 기능성 변이체는 야생형 인간 IL2를 기준으로 야생형 인간 IL2에 따라 번호가 지정되는 경우 적어도 위치 61 (글루탐산)이 치환된다.
일 구현예에서, 위치 38은 글루탐산으로 치환된다. 일 구현예에서, 위치 61은 라이신으로 치환된다.
본 발명의 시스템의 일 구현예에서
(i) IL2R의 알파 서브유닛은 IL2R의 인간 알파 서브유닛이고 IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체는 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛을 기준으로 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛에 따라 번호가 지정되는 경우 적어도 위치 1 (글루탐산)이 라이신으로, 위치 29 (글루탐산)가 라이신으로, 그리고 위치 38 (라이신)이 글루탐산으로 치환되고,
(ii) IL2는 인간 IL2이고 IL2 또는 이의 기능성 변이체는 야생형 인간 IL2를 기준으로 야생형 인간 IL2에 따라 번호가 지정되는 경우 적어도 위치 35 (라이신)이 글루탐산으로, 위치 43 (라이신)이 글루탐산으로, 그리고 위치 61 (글루탐산)이 라이신으로 치환된다.
본 발명의 시스템의 일 구현예에서
(i) IL2R의 알파 서브유닛은 IL2R의 인간 알파 서브유닛이고 IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체는 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛을 기준으로 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛에 따라 번호가 지정되는 경우 적어도 위치 29 (글루탐산)가 라이신으로, 그리고 위치 38 (라이신)이 글루탐산으로 치환되고,
(ii) IL2는 인간 IL2이고 IL2 또는 이의 기능성 변이체는 야생형 인간 IL2를 기준으로 야생형 인간 IL2에 따라 번호가 지정되는 경우 적어도 위치 43 (라이신)이 글루탐산으로, 그리고 위치 61 (글루탐산)이 라이신으로 치환된다.
본 발명의 시스템의 일 구현예에서
(i) IL2R의 알파 서브유닛은 IL2R의 인간 알파 서브유닛이고 IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체는 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛을 기준으로 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛에 따라 번호가 지정되는 경우 적어도 위치 38 (라이신)이 글루탐산으로 치환되고,
(ii) IL2는 인간 IL2이고 IL2 또는 이의 기능성 변이체는 야생형 인간 IL2를 기준으로 야생형 인간 IL2에 따라 번호가 지정되는 경우 적어도 위치 61 (글루탐산)이 라이신으로 치환된다.
본 발명의 시스템의 일 구현예에서
(i) IL2R의 알파 서브유닛은 IL2R의 인간 알파 서브유닛이고 IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체는 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛을 기준으로 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛에 따라 번호가 지정되는 경우 적어도 위치 29 (글루탐산)가 라이신으로 치환되고,
(ii) IL2는 인간 IL2이고 IL2 또는 이의 기능성 변이체는 야생형 인간 IL2를 기준으로 야생형 인간 IL2에 따라 번호가 지정되는 경우 적어도 위치 43 (라이신)이 글루탐산으로 치환된다.
본 발명의 시스템의 일 구현예에서
(i) IL2R의 알파 서브유닛은 IL2R의 인간 알파 서브유닛이고 IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체는 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛을 기준으로 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛에 따라 번호가 지정되는 경우 적어도 위치 29 (글루탐산)가 라이신으로, 그리고 위치 38 (라이신)이 글루탐산으로 치환되고,
(ii) IL2는 인간 IL2이고 IL2 또는 이의 기능성 변이체는 야생형 인간 IL2를 기준으로 야생형 인간 IL2에 따라 번호가 지정되는 경우 적어도 위치 35 (라이신)이 글루탐산으로, 위치 43 (라이신)이 글루탐산으로, 그리고 위치 61 (글루탐산)이 라이신으로 치환된다.
본 발명의 시스템의 일 구현예에서
(i) IL2R의 알파 서브유닛은 IL2R의 인간 알파 서브유닛이고 IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체는 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛을 기준으로 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛에 따라 번호가 지정되는 경우 적어도 위치 29 (글루탐산)가 라이신으로 치환되고,
(ii) IL2는 인간 IL2이고 IL2 또는 이의 기능성 변이체는 야생형 인간 IL2를 기준으로 야생형 인간 IL2에 따라 번호가 지정되는 경우 적어도 위치 35 (라이신)이 글루탐산으로, 위치 43 (라이신)이 글루탐산으로, 그리고 위치 61 (글루탐산)이 라이신으로 치환된다.
본 발명의 시스템의 일 구현예에서
(i) IL2R의 알파 서브유닛은 IL2R의 인간 알파 서브유닛이고 IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체는 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛을 기준으로 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛에 따라 번호가 지정되는 경우 적어도 위치 29 (글루탐산)가 라이신으로 치환되고,
(ii) IL2는 인간 IL2이고 IL2 또는 이의 기능성 변이체는 야생형 인간 IL2를 기준으로 야생형 인간 IL2에 따라 번호가 지정되는 경우 적어도 위치 43 (라이신)이 글루탐산으로, 그리고 위치 61 (글루탐산)이 라이신으로 치환된다.
본 발명의 시스템의 일 구현예에서
(i) IL2R의 알파 서브유닛은 IL2R의 인간 알파 서브유닛이고 IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체는 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛을 기준으로 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛에 따라 번호가 지정되는 경우 적어도 위치 1 (글루탐산)이 라이신으로, 위치 29 (글루탐산)가 라이신으로, 그리고 위치 38 (라이신)이 글루탐산으로 치환되고,
(ii) IL2는 인간 IL2이고 IL2 또는 이의 기능성 변이체는 야생형 인간 IL2를 기준으로 야생형 인간 IL2에 따라 번호가 지정되는 경우 적어도 위치 43 (라이신)이 글루탐산으로, 그리고 위치 61 (글루탐산)이 라이신으로 치환된다.
본 발명의 추가적인 측면은:
(i) 인터루킨-2 수용체 (IL2R)의 인간 알파 서브유닛 또는 IL2R의 인간 알파 서브유닛의 기능성 변이체의 변이를 포함하고, IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체는 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛을 기준으로 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛에 따라 번호가 지정되는 경우 적어도 위치 1 (글루탐산)이 염기성 아미노산 잔기로 치환되는, 수용체 폴리펩티드, 및
(ii) 인간 IL2 또는 인간 IL2의 기능성 변이체의 변이를 포함하고, IL2 또는 이의 기능성 변이체는 야생형 인간 IL2를 기준으로 야생형 인간 IL2에 따라 번호가 지정되는 경우 적어도 위치 35 (라이신)가 산성 아미노산 잔기로 치환되는, 리간드 폴리펩티드를 포함하는 시스템에 관한 것이다.
일 구현예에서, 위치 1은 라이신으로 치환된다. 일 구현예에서, 위치 35는 글루탐산으로 치환된다.
본 발명의 추가적인 측면은:
(i) 인터루킨-2 수용체 (IL2R)의 인간 알파 서브유닛 또는 IL2R의 인간 알파 서브유닛의 기능성 변이체의 변이를 포함하고, IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체는 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛을 기준으로 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛에 따라 번호가 지정되는 경우 적어도 위치 29 (글루탐산)가 염기성 아미노산 잔기로 치환되는, 수용체 폴리펩티드, 및
(ii) 인간 IL2 또는 인간 IL2의 기능성 변이체의 변이를 포함하고, IL2 또는 이의 기능성 변이체는 야생형 인간 IL2를 기준으로 야생형 인간 IL2에 따라 번호가 지정되는 경우 적어도 위치 43 (라이신)이 산성 아미노산 잔기로 치환되는, 리간드 폴리펩티드를 포함하는 시스템에 관한 것이다.
일 구현예에서, 위치 29는 라이신으로 치환된다. 일 구현예에서, 위치 43은 글루탐산으로 치환된다.
본 발명의 추가적인 측면은:
(i) 인터루킨-2 수용체 (IL2R)의 인간 알파 서브유닛 또는 IL2R의 인간 알파 서브유닛의 기능성 변이체의 변이를 포함하고, IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체는 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛을 기준으로 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛에 따라 번호가 지정되는 경우 적어도 위치 38 (라이신)이 산성 아미노산 잔기로 치환되는, 수용체 폴리펩티드, 및
(ii) 인간 IL2 또는 인간 IL2의 기능성 변이체의 변이를 포함하고, IL2 또는 이의 기능성 변이체는 야생형 인간 IL2를 기준으로 야생형 인간 IL2에 따라 번호가 지정되는 경우 적어도 위치 61 (글루탐산)이 염기성 아미노산 잔기로 치환되는, 리간드 폴리펩티드를 포함하는 시스템에 관한 것이다.
일 구현예에서, 위치 38은 글루탐산으로 치환된다. 일 구현예에서, 위치 61은 라이신으로 치환된다.
본 발명의 추가적인 측면은:
(i) 인터루킨-2 수용체 (IL2R)의 인간 알파 서브유닛 또는 IL2R의 인간 알파 서브유닛의 기능성 변이체의 변이를 포함하고, IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체는 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛을 기준으로 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛에 따라 번호가 지정되는 경우 적어도 위치 1 (글루탐산)이 라이신으로, 위치 29 (글루탐산)가 라이신으로, 그리고 위치 38 (라이신)이 글루탐산으로 치환되는, 수용체 폴리펩티드, 및
(ii) 인간 IL2 또는 인간 IL2의 기능성 변이체의 변이를 포함하고, IL2 또는 이의 기능성 변이체는 야생형 인간 IL2를 기준으로 야생형 인간 IL2에 따라 번호가 지정되는 경우 적어도 위치 35 (라이신)가 글루탐산으로, 위치 43 (라이신)이 글루탐산으로 그리고 위치 61 (글루탐산)이 라이신으로 치환되는, 리간드 폴리펩티드를 포함하는 시스템에 관한 것이다.
본 발명의 추가적인 측면은:
(i) 인터루킨-2 수용체 (IL2R)의 인간 알파 서브유닛 또는 IL2R의 인간 알파 서브유닛의 기능성 변이체의 변이를 포함하고, IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체는 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛을 기준으로 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛에 따라 번호가 지정되는 경우 적어도 위치 29 (글루탐산)가 라이신으로, 그리고 위치 38 (라이신)이 글루탐산으로 치환되는, 수용체 폴리펩티드, 및
(ii) 인간 IL2 또는 인간 IL2의 기능성 변이체의 변이를 포함하고, IL2 또는 이의 기능성 변이체는 야생형 인간 IL2를 기준으로 야생형 인간 IL2에 따라 번호가 지정되는 경우 적어도 위치 43 (라이신)이 글루탐산으로 그리고 위치 61 (글루탐산)이 라이신으로 치환되는, 리간드 폴리펩티드를 포함하는 시스템에 관한 것이다.
본 발명의 추가적인 측면은:
(i) 인터루킨-2 수용체 (IL2R)의 인간 알파 서브유닛 또는 IL2R의 인간 알파 서브유닛의 기능성 변이체의 변이를 포함하고, IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체는 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛을 기준으로 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛에 따라 번호가 지정되는 경우 적어도 위치 38 (라이신)이 글루탐산으로 치환되는, 수용체 폴리펩티드, 및
(ii) 인간 IL2 또는 인간 IL2의 기능성 변이체의 변이를 포함하고, IL2 또는 이의 기능성 변이체는 야생형 인간 IL2를 기준으로 야생형 인간 IL2에 따라 번호가 지정되는 경우 적어도 위치 61 (글루탐산)이 라이신으로 치환되는, 리간드 폴리펩티드를 포함하는 시스템에 관한 것이다.
본 발명의 추가적인 측면은:
(i) 인터루킨-2 수용체 (IL2R)의 인간 알파 서브유닛 또는 IL2R의 인간 알파 서브유닛의 기능성 변이체의 변이를 포함하고, IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체는 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛을 기준으로 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛에 따라 번호가 지정되는 경우 적어도 위치 29 (글루탐산)가 라이신으로 치환되는, 수용체 폴리펩티드, 및
(ii) 인간 IL2 또는 인간 IL2의 기능성 변이체의 변이를 포함하고, IL2 또는 이의 기능성 변이체는 야생형 인간 IL2를 기준으로 야생형 인간 IL2에 따라 번호가 지정되는 경우 적어도 위치 43 (라이신)이 글루탐산으로 치환되는, 리간드 폴리펩티드를 포함하는 시스템에 관한 것이다.
본 발명의 추가적인 측면은:
(i) 인터루킨-2 수용체 (IL2R)의 인간 알파 서브유닛 또는 IL2R의 인간 알파 서브유닛의 기능성 변이체의 변이를 포함하고, IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체는 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛을 기준으로 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛에 따라 번호가 지정되는 경우 적어도 위치 29 (글루탐산)가 라이신으로, 그리고 위치 38 (라이신)이 글루탐산으로 치환되는, 수용체 폴리펩티드, 및
(ii) 인간 IL2 또는 인간 IL2의 기능성 변이체의 변이를 포함하고, IL2 또는 이의 기능성 변이체는 야생형 인간 IL2를 기준으로 야생형 인간 IL2에 따라 번호가 지정되는 경우 적어도 위치 35 (라이신)가 글루탐산으로, 위치 43 (라이신)이 글루탐산으로 그리고 위치 61 (글루탐산)이 라이신으로 치환되는, 리간드 폴리펩티드를 포함하는 시스템에 관한 것이다.
본 발명의 추가적인 측면은:
(i) 인터루킨-2 수용체 (IL2R)의 인간 알파 서브유닛 또는 IL2R의 인간 알파 서브유닛의 기능성 변이체의 변이를 포함하고, IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체는 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛을 기준으로 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛에 따라 번호가 지정되는 경우 적어도 위치 29 (글루탐산)가 라이신으로 치환되는, 수용체 폴리펩티드, 및
(ii) 인간 IL2 또는 인간 IL2의 기능성 변이체의 변이를 포함하고, IL2 또는 이의 기능성 변이체는 야생형 인간 IL2를 기준으로 야생형 인간 IL2에 따라 번호가 지정되는 경우 적어도 위치 35 (라이신)가 글루탐산으로, 위치 43 (라이신)이 글루탐산으로 그리고 위치 61 (글루탐산)이 라이신으로 치환되는, 리간드 폴리펩티드를 포함하는 시스템에 관한 것이다.
본 발명의 추가적인 측면은:
(i) 인터루킨-2 수용체 (IL2R)의 인간 알파 서브유닛 또는 IL2R의 인간 알파 서브유닛의 기능성 변이체의 변이를 포함하고, IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체는 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛을 기준으로 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛에 따라 번호가 지정되는 경우 적어도 위치 29 (글루탐산)가 라이신으로 치환되는, 수용체 폴리펩티드, 및
(ii) 인간 IL2 또는 인간 IL2의 기능성 변이체의 변이를 포함하고, IL2 또는 이의 기능성 변이체는 야생형 인간 IL2를 기준으로 야생형 인간 IL2에 따라 번호가 지정되는 경우 적어도 위치 43 (라이신)이 글루탐산으로 그리고 위치 61 (글루탐산)이 라이신으로 치환되는, 리간드 폴리펩티드를 포함하는 시스템에 관한 것이다.
본 발명의 추가적인 측면은:
(i) 인터루킨-2 수용체 (IL2R)의 인간 알파 서브유닛 또는 IL2R의 인간 알파 서브유닛의 기능성 변이체의 변이를 포함하고, IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체는 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛을 기준으로 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛에 따라 번호가 지정되는 경우 적어도 위치 1 (글루탐산)이 라이신으로, 위치 29 (글루탐산)가 라이신으로, 그리고 위치 38 (라이신)이 글루탐산으로 치환되는, 수용체 폴리펩티드, 및
(ii) 인간 IL2 또는 인간 IL2의 기능성 변이체의 변이를 포함하고, IL2 또는 이의 기능성 변이체는 야생형 인간 IL2를 기준으로 야생형 인간 IL2에 따라 번호가 지정되는 경우 적어도 위치 43 (라이신)이 글루탐산으로 그리고 위치 61 (글루탐산)이 라이신으로 치환되는, 리간드 폴리펩티드를 포함하는 시스템에 관한 것이다.
다른 구현예에서, IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체 및/또는 IL2 또는 이의 기능성 변이체는 IL2R의 야생형 알파 서브유닛 및/또는 야생형 IL2에서 산성 또는 염기성 아미노산 잔기를 갖는 특정 위치에서 각각 둘 이상과 같이 하나 이상에서 치환되거나 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 위치와 같이 셋 이상에서 치환되고, IL2R의 야생형 알파 서브유닛 및/또는 야생형 IL2에서 각각의 위치는 서로와 접촉하는 산성/염기성 아미노산의 쌍을 형성하는 위치이다. 일 구현예에서, 야생형 IL2에서 산성 아미노산 잔기는 IL2R의 알파 서브유닛에서 염기성 아미노산 잔기와 접촉한다. 일 구현예에서, 야생형 IL2의 염기성 아미노산 잔기는 IL2R의 알파 서브유닛에서 산성 아미노산 잔기와 접촉한다.
본 발명의 어떤 측면의 시스템의 일 구현예에서, IL2R의 알파 서브유닛은 SEQ ID NO: 2에 따른 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 어떤 측면의 시스템의 일 구현예에서, IL2는 SEQ ID NO: 1에 따른 아미노산 서열을 갖는다.
일 구현예에서, (ii)에 따른 변이는 알파 서브유닛으로서 (i)에 따른 변이를 포함하는 IL2R에 결합하고 활성화한다. 일 구현예에서, (ii)에 따른 변이에 의한 알파 서브유닛으로서 (i)에 따른 변이를 포함하는 IL2R에의 결합 및/또는 활성화는 (ii)에 따른 변이에 의한 알파 서브유닛으로서 IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 IL2R에 대한 결합 및/또는 활성화를 초과한다. 일 구현예에서, (ii)에 따른 변이에 의한 알파 서브유닛으로서 (i)에 따른 변이를 포함하는 IL2R에의 결합 및/또는 활성화는 IL2 또는 이의 기능성 변이체에 의한 알파 서브유닛으로서 (i)에 따른 변이를 포함하는 IL2R에 대한 결합 및/또는 활성화를 초과한다. 일 구현예에서, (ii)에 따른 변이에 의한 알파 서브유닛으로서 (i)에 따른 변이를 포함하는 IL2R에의 결합 및/또는 활성화는 IL2 또는 이의 기능성 변이체에 의한 알파 서브유닛으로서 (i)에 따른 변이를 포함하는 IL2R에 대한 결합 및/또는 활성화를 초과한다. 일 구현예에서, IL2 또는 이의 기능성 변이체에 의한 알파 서브유닛으로서 IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 IL2R에 대한 결합 및/또는 활성화는 (ii)에 따른 변이에 의한 알파 서브유닛으로서 IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 IL2R의 결합 및/또는 활성화를 초과한다. 일 구현예에서, IL2 또는 이의 기능성 변이체에 의한 알파 서브유닛으로서 IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 IL2R에 대한 결합 및/또는 활성화는 IL2 또는 이의 기능성 변이체에 의한 알파 서브유닛으로서 (i)에 따른 변이를 포함하는 IL2R에 대한 결합 및/또는 활성화를 초과한다.
본 발명의 어떤 측면의 시스템의 일 구현예에서, IL2 또는 이의 기능성 변이체에서 치환은 알파 서브유닛으로서 IL2R의 야생형 알파 서브유닛을 포함하는 IL2R (IL2Rαβγ)에 대한 친화도를 감소시킨다.
본 발명의 어떤 측면의 시스템의 일 구현예에서, IL2 또는 이의 기능성 변이체에서 치환은 알파 서브유닛으로서 IL2R의 야생형 알파 서브유닛을 포함하는 IL2R (IL2Rαβγ)에 대한 친화도를 βγ IL2 수용체 복합체 (IL2Rβγ)보다 상당히 감소시킨다.
본 발명의 어떤 측면의 시스템의 일 구현예에서, (ii)에 따른 변이는 야생형 IL2에 비하여 조절 T 세포를 자극하는 것에 대하여 감소된 능력을 갖는다.
일 구현예에서, 상기에서 기술된 치환된 IL2 또는 이의 기능성 변이체 (IL2 변이)는 나머지, 비-치환된 잔기들에서는 야생형 IL2와 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일 구현예에서, 상기에서 기술된 IL2 변이는 야생형 IL2의 나머지 잔기내 또는 나머지 잔기에서 하나 이상에서 아미노산 치환과 같은 아미노산 변형을 갖는다. 일 구현예에서, 이러한 아미노산 치환은 야생형 IL2와 비교할 때 IL2Rβγ에 대하여 상대적으로 증가된 친화도를 야기한다 (또한 "mutβγ" 변이로 본원에서 표시한다). 이러한 변이체들은 강력한 IL2 신호전달 작용제이다. 일 구현예에서, 이러한 아미노산 치환은 IL2Rβ 및/또는 IL2Rγ에 접촉하는 아미노산 잔기에 있다.
일 구현예에서, IL2Rβγ에 대한 친화도를 향상시키는 하나 이상의 아미노산 치환은 K9, L12, Q13, E15, H16, D20, Q74, L80, R81, D84, L85, I86, N88, I92, L94, 및 E95로 이루어진 군으로부터 선택된 IL2의 하나 이상의 위치에서의 치환을 포함한다.
일 구현예에서, IL2Rβγ에 대한 친화도를 향상시키는 하나 이상의 아미노산 치환은 IL2R의 야생형 인간 IL2를 기준으로 야생형 인간 IL2에 따라 번호가 지정되는 경우 위치 24, 65, 74, 80, 81, 85, 86, 89, 92, 및 93 중 적어도 하나에서 치환을 포함한다. 치환된 아미노산 잔기(들)는, 필수적이지는 안지만, 보존적 치환일 수 있다. 예를 들어, 변이는 I24V, P65H, Q74R, Q74H, Q74N, Q74S, L80F, L80V, R81I, R81T, R81D, L85V, I86V, I89V, I92F, V93I일 수 있다.
일 구현예에서, IL2 변이는 다음의 아미노산 치환 세트를 포함한다: 80F/81D/85V/86V/92F. IL2 변이는 아미노산 치환 42A을 더 포함할 수 있다. IL2 변이는 하나 이상의 다음 아미노산 치환을 더 포함할 수 있다: 24V, 65H, 74R, 74H, 74N, 74S, 89V, 93I.
일부 구현예에서, IL2 변이는
(i) 74N, 80F, 81D, 85V, 86V, 89V, 92F;
(ii) 74H, 80F, 81D, 85V, 86V, 92F;
(iii) 74S, 80F, 81D, 85V, 86V, 92F;
(iv) 74N, 80F, 81D, 85V, 86V, 92F;
(v) 80F, 81D, 85V, 86V, 92F;
(vi) 80F, 81D, 85V, 86V, 89V, 92F, 93I;
(vii) 18R, 22E, 80F, 81D, 85V, 86V, 89V, 92F, 93I, 126T;
(viii) 18R, 22E, 74S, 80F, 81T, 85V, 86V, 89V, 92F, 93I, 126T
로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 치환의 세트를 포함한다.
본 발명의 어떤 측면의 시스템의 일 구현예에서, (ii)에 따른 변이는 IL2R
γ에 대한 친화도를 향상시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 더 포함한다. 일 구현예에서, IL2R
γ에 대한 친화도를 향상시키는 하나 이상의 아미노산 치환은 다음의 치환 세트를 포함한다: 80F, 81D, 85V, 86V, 92F.
본원에서 설명된 IL2 변이는 약동학적 변형 기에 부착될 수 있고, 따라서, "약동학적으로(PK) 연장된 IL2"일 수 있다. 일 측면에서 본원에서 기술된 리간드 폴리펩티드는 IL2 변이에 융합된 IL2 또는 이의 기능성 변이체에 이종성인 아미노산 서열을 더 포함하는 약동학적으로(PK) 연장된 IL2이다. 일 구현예에서, IL2 또는 이의 기능성 변이체에 이종성인 아미노산 서열은 혈청 알부민, 면역글로불린 단편, 트랜스페린 및 Fn3, 또는 이들의 변이체로 구성된 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 혈청 알부민은 마우스 혈청 알부민 또는 인간 혈청 알부민을 포함한다. 일 구현예에서, 면역글로불린 단편은 면역글로불린 Fc 도메인을 포함한다.
본 발명의 어떤 측면의 시스템의 일 구현예에서, 리간드 폴리펩티드는 약동학적으로(PK) 연장된 폴리펩티드이다. 일 구현예에서, PK 연장된 폴리펩티드는 융합 단백질을 포함한다. 일 구현예에서 융합 단백질은 (ii)에 따른 변이의 모이어티 및 IL2 또는 이의 기능성 변이체에 이종성인 모이어티를 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 (ii)에 따른 변이의 모이어티 및 혈청 알부민, 면역글로불린 단편, 트랜스페린, Fn3, 및 이의 변이체로 구성된 군으로부터 선택된 모이어티를 포함한다. 일 구현예에서, 혈청 알부민은 마우스 혈청 알부민 또는 인간 혈청 알부민을 포함한다. 일 구현예에서, 면역글로불린 단편은 면역글로불린 Fc 도메인을 포함한다.
상기의 수용체 폴리펩티드는 또한 본원에서 "IL2Rα 변이체 폴리펩티드", "IL2R 변이체 폴리펩티드" 또는 단순히 "IL2R 변이체"로 지칭된다. 상기의 리간드 폴리펩티드는 또한 본원에서 "IL2 변이체 폴리펩티드" 또는 단순히 "IL2 변이체"로 지칭된다.
다른 구현예에서, 본원에서 기술된 시스템은, 각각, IL2R 수용체 폴리펩티드 및 IL2 리간드 폴리펩티드를 포함하는 수용체 폴리펩티드 및 리간드 폴리펩티드의 하기에서 선택되는 조합을 포함한다:
본 발명의 추가적인 측면은 본원에서 설명된 임의의 시스템의 수용체 폴리펩티드에 관한 것이다.
본 발명의 추가적인 측면은 본원에서 설명된 수용체 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 일 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 RNA이다.
본 발명의 추가적인 측면은 본원에서 설명된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명의 추가적인 측면은 본원에서 설명된 임의의 시스템의 수용체 폴리펩티드를 발현하도록 유전적으로 변형된 숙주 세포에 관한 것이다. 일 구현예에서, 숙주 세포는 면역 작용 세포이다. 일 구현예에서, 면역 작용 세포는 T 세포이다.
본 발명의 추가적인 측면은 본원에서 설명된 폴리뉴클레오티드 또는 본원에서 설명된 숙주 세포를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 일 구현예에서, 약학 조성물은 하나 이상의 담체, 희석제 및/또는 부형제를 더 포함한다.
본 발명의 추가적인 측면은 본원에서 설명된 폴리뉴클레오티드, 본원에서 설명된 숙주 세포, 또는 본원에서 설명된 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일 구현예에서, 방법은 개체에서 암을 치료하거나 예방하는 방법이다.
본 발명의 추가적인 측면은
(i) 본원에서 설명된 시스템의 수용체 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 본원에서 설명된 시스템의 수용체 폴리펩티드를 발현하도록 유전적으로 변형된 면역 작용 세포, 및
(ii) (i)에 따른 시스템의 상응하는 리간드 폴리펩티드, 리간드 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 리간드 폴리펩티드를 발현하도록 유전적으로 변형된 숙주 세포를 포함하는 의학 제제에 관한 것이다.
일 구현예에서, 의학 제제는 키트이다. 일 구현예에서, 의학 제제는 분리된 용기에서 각각의 성분 (i) 및 (ii)를 포함한다. 일 구현예에서, 성분은 약학 조성물에 존재한다. 일 구현예에서, 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 및/또는 부형제를 더 포함한다. 일 구현예에서, 의학 제제는 암을 치료 또는 예방하기 위한 의학 제제를 사용하기 위한 설명서를 더 포함한다.
본 발명의 추가적인 측면은 약학적 용도를 위한 본원에 기재된 의학 제제에 관한 것이다. 일 구현예에서, 약학적 용도는 질환 또는 장애의 치료학적 또는 예방학적 치료를 포함한다.
본 발명의 추가적인 측면은 개체에서 암을 치료 또는 예방하는 방법에 사용하기 위한 본원에 기재된 의학 제제에 관한 것이다.
본 발명의 추가적인 측면은
(i) 본원에서 설명된 시스템의 수용체 폴리펩티드를 발현하도록 유전적으로 변형된 면역 작용 세포를 개체에 제공하는 단계, 및
(ii) (i)에 따른 시스템의 상응하는 리간드 폴리펩티드, 리간드 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 리간드 폴리펩티드를 발현하도록 유전적으로 변형된 숙주 세포를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체를 치료하는 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 개체는 암을 지닌다.
일 구현예에서, 방법은 상기 개체에서 면역 반응을 유발하는 방법이다. 일 구현예에서, 면역 반응은 T 세포-매개된 면역 반응이다.
본 발명의 추가적인 측면은
(i) 본원에서 설명된 시스템의 수용체 폴리펩티드를 발현하도록 유전적으로 변형된 면역 작용 세포를 개체에 제공하는 단계로서, 면역 작용 세포는 항원 또는 항원을 발현하는 세포를 표적으로 하는 단계, 및
(ii) (i)에 따른 시스템의 상응하는 리간드 폴리펩티드, 리간드 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 리간드 폴리펩티드를 발현하도록 유전적으로 변형된 숙주 세포를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 항원의 발현 또는 증가된 발현과 관련된 질환, 장애 또는 병태를 가진 개체를 치료하는 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 질환, 장애 또는 병태는 암이고, 항원은 종양-관련 항원이다.
일 구현예에서, 수용체 폴리펩티드를 발현하도록 유전적으로 변형된 면역 작용 세포는 수용체 폴리펩티드를 발현하도록 유전적으로 변형된 면역 작용 세포를 투여하거나 개체 내에서 수용체 폴리펩티드를 발현하도록 유전적으로 변형된 면역 작용 세포를 발생시킴으로써 개체에 제공된다.
일 구현예에서, 본원에서 설명된 방법은 개체에서 암을 치료하거나 예방하기 위한 방법이다. 일 구현예에서, 암은 흑색종, 백혈병, 림프종, 폐암, 유방암, 전립선암, 난소암, 대장암, 중피종, 신장 세포 암종, 및 뇌암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본원에서 설명된 의학 제제 또는 방법의 일 구현예에서, 수용체 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 리간드 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드는 RNA이다.
의학 제제의 일 구현예에서, RNA는 RNA는 액체 형태, 고체 형태 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 형태로 존재한다. 일 구현예에서, 고체 형태는 동결된 형태 또는 탈수된 형태이다. 일 구현예에서, 탈수된 형태는 동결-건조 또는 분무-건조된 형태이다.
본원에서 설명된 의학 제제 또는 방법의 일 구현예에서, 수용체 폴리펩티드를 발현하도록 유전적으로 변형된 면역 작용 세포는 수용체 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본원에서 설명된 의학 제제 또는 방법의 일 구현예에서, 리간드 폴리펩티드를 발현하도록 유전적으로 변형된 숙주 세포는 리간드 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본원에서 설명된 의학 제제 또는 방법의 일 구현예에서, 수용체 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 리간드 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드는 RNA이다.
본원에서 설명된 의학 제제 또는 방법의 일 구현예에서, 면역 작용 세포는 T 세포이다.
일 구현예에서, 본원에서 설명된 방법은 개체에 면역 체크포인트 저해제를 투여하는 것을 더 포함한다. 일 구현예에서, 면역 체크포인트 저해제는 (i) PD-1과 PD-L1 간에, 또는 (ii) CTLA-4와 CD80 또는 CD86 간에 상호작용을 표적으로 한다. 일 구현예에서, 면역 체크포인트 저해제는 항체 또는 항체 단편이다. 일 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 PD-1, PD-L1 또는 CTLA-4를 표적으로 한다.
유사하게, 일 구현예에서, 본원에서 설명된 의학 제제는 면역 체크포인트 저해제를 더 포함한다. 일 구현예에서, 면역 체크포인트 저해제는 (i) PD-1과 PD-L1 간에, 또는 (ii) CTLA-4와 CD80 또는 CD86 간에 상호작용을 표적으로 한다. 일 구현예에서, 면역 체크포인트 저해제는 항체 또는 항체 단편이다. 일 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 PD-1, PD-L1 또는 CTLA-4를 표적으로 한다.
추가적인 측면에서, 발명은 치료학적 용도, 특히 본원에서 설명된 방법에서의 용도를 위한 본원에서 설명된 약제 및 조성물, 예를 들어, 본원에서 설명된 IL2R 변이체, IL2 변이체 또는 IL2R/IL2 변이체 시스템, 본원에서 설명된 IL2R 변이체, IL2 변이체 또는 IL2R/IL2 변이체 시스템을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 본원에서 설명된 IL2R 변이체를 발현하는 세포에 관한 것이다.
본 발명의 다른 특징 및 장점은 하기의 상세한 설명 및 청구항으로부터 명백해질 것이다.
IL2 및 IL2R의 신규한 변이체 쌍은 이식된 세포의 생존 및 작용 기능을 강력하게 조절하는 능력을 제공하여 개선된 치료 효능을 갖게 한다.
도 1: RNA-엔코딩된 hAlb-hIL2 변이체의 in vitro 에서의 발현 및 IL2Rβγ 결합. HEK293T/17 세포 1.2Х106 개를 6-웰 플레이트에 접종하고 약 80% 컨플루언스에 도달하면 mRNA 3 ㎍ (400 ng mRNA 복합체/㎕ 리포펙타민 MessengerMAX)를 총 부피 3.25 mL DMEM + 10% FBS로 리포펙션하였다. 37℃, 7.5% CO2에서 20시간 인큐베이션한 후, 상층액을 수집하고, 이의 연속 희석물을 중간-친화도 IL2 수용체 (IL2Rβγ)를 발현하는 인간 세포주 TF-1_IL2Rβγ와 인큐베이션하였다. 3일 후 CellTiter-Glo® 2.0 분석을 통해 ATP 양에 의해 살아있는 세포를 정량함으로써 증식 반응을 측정하였다. 나타낸 데이터는 기술적 레플리케이트 n=2의 평균 ± 표준 편차 (SD)이다. RLU=상대적인 발광 단위.
도 2: RNA-엔코딩된 hIL2RA (CD25) 변이체의 인간 일차 CD8 + T 세포에서 in vitro 발현. 인간 1차 CD8+ T 세포를 항-CD8 MicroBeads를 이용한 MACS 기술을 통해 PBMC로부터 분리하고 10Х106 CD8+ T 세포를 hIL2RA (CD25) 변이체를 엔코딩하는 mRNA 15 μg으로 250 μL X-Vivo15에서 4-mm 전기천공 큐벳에서 -500 V, 3 ms 진동에서 전기천공하였다. 37℃, 5% CO2에서 20-24시간 인큐베이션한 후, hIL2RA (CD25) 변이체의 세포 표면 발현을 PerCP-Cy??5.5 마우스 항-인간 CD25 항체를 이용한 유세포 분석으로 확인하였다. 나타낸 데이터는 단일 측정된 평균 형광 강도 (MFI) 값이다.
도 3: IL2-로 매개된 STAT5의 인산화로 측정한 hIL2RA (CD25)로 전기천공된 CD8 + T 세포와 비교한 천연적 CD25-발현 CD4 + CD25 + 조절 T 세포에서 hAlb-hIL2 변이체의 기능적 활성. CD4+CD25+ 조절 T 세포 (A) 및 hIL2RA (CD25)로 형질감염된 CD8+ T 세포 (B)에서 STAT5 인산화 (pSTAT5)의 용량-반응 곡선. PBMCs 및 hIL2RA (CD25)로 형질감염된 CD8+ T세포를 hAlb-hIL2 변이체-함유 상층액의 연속 희석액과 인큐베이션하고 그 후 STAT5의 인산화를 유세포 분석을 통해 분석하였다. 나타낸 데이터는 4 파라미터 로그 피트에 피팅하여 EC50 값을 계산하였다.
도 4, 5 및 6: STAT5의 IL2-매개된 인산화에 의해 측정된 hIL2RA (CD25)의 상이한 변이체로 전기천공된 CD8 + T 세포에서 hAlb-hIL2 변이체의 기능적 활성. hIL2RA (CD25)로 형질감염된 CD8+ T 세포에서 STAT5 인산화 (pSTAT5)의 용량-반응 곡선을 hAlb-hIL2 (도 4), hAlb-hIL2_A3 (도 5, A), hAlb-hIL2_A4 (도 5, B), hAlb-hIL2_A5 (도 6, A) 및 hAlb-hIL2_A8 (도 6, B)에 대해 나타낸다. hAlb-hIL2 변이체-함유 상층액의 연속 희석물과 함께 CD8+ T 세포를 인큐베이션하고, 그 후 STAT5의 인산화를 유세포 측정을 통해 분석하였다. 나타낸 데이터는 4개 중 1개의 대표 실험에서 유래된 것이고 4 파라미터 로그 피트에 피팅하여 EC50 값을 계산하였다.
도 7, 8, 9: hAlb-hIL2 변이체의 in vitro 에서 상이한 hIL2RA (CD25) 변이체로 전기천공된 CD8+ T 세포에 리디렉션된 CAR의 항-종양 효능에의 영향.
클라우딘-6 (CLDN6) 양성, eGFP-형질전환 PA-1 종양 스페로이드를 hIL2RA 변이체(hIL2RA_mut1, hIL2RA_mut4 또는 hIL2RA 야생형) 및 CLDN6-특이적 CAR 컨스트럭트를 암호화하는 IVT-mRNA로 전기천공된 CD8+ T 세포와 함께 배양하였다. 클라우딘-18.2 (CLDN18.2)-특이적 CAR 컨스트럭트를 음성 대조군 (mock CAR)으로 사용하였다. 병태 당 n=3으로 10:1의 준-최적 작용세포:표적 비율로 공배양을 시작하고 상응하는 상호 hAlb-hIL2 변이체 hAlb-hIL2_A3, hAlb-hIL2_A4 또는 대조군으로서 hAlb를 함유하는 25% 상층액을 처리하였다. CAR T 세포로 매개된 세포독성은 Incucyte S3 생존 세포 이미지화 시스템에서 세포 생존능에 대한 대체 표지로서 종양 스페로이드의 형광 신호를 이용하여 시간에 따라 평가하였다. 3반복된 각각의 종양 스페로이드의 총 녹색 대상 영역을 기록하고 공-배양의 시작 시의 각각의 스페로이드 영역으로 정규화하였다. 각각의 CAR 컨스트럭트(CLDN18.2 CAR 28ζ, CLDN6 CAR 28ζ 및 CLDN6 CAR BBζ)에 대한 데이터는 각각 분리하여 도 7, 도 8 및 도 9에 곡선으로 작성하였다.
도 2: RNA-엔코딩된 hIL2RA (CD25) 변이체의 인간 일차 CD8 + T 세포에서 in vitro 발현. 인간 1차 CD8+ T 세포를 항-CD8 MicroBeads를 이용한 MACS 기술을 통해 PBMC로부터 분리하고 10Х106 CD8+ T 세포를 hIL2RA (CD25) 변이체를 엔코딩하는 mRNA 15 μg으로 250 μL X-Vivo15에서 4-mm 전기천공 큐벳에서 -500 V, 3 ms 진동에서 전기천공하였다. 37℃, 5% CO2에서 20-24시간 인큐베이션한 후, hIL2RA (CD25) 변이체의 세포 표면 발현을 PerCP-Cy??5.5 마우스 항-인간 CD25 항체를 이용한 유세포 분석으로 확인하였다. 나타낸 데이터는 단일 측정된 평균 형광 강도 (MFI) 값이다.
도 3: IL2-로 매개된 STAT5의 인산화로 측정한 hIL2RA (CD25)로 전기천공된 CD8 + T 세포와 비교한 천연적 CD25-발현 CD4 + CD25 + 조절 T 세포에서 hAlb-hIL2 변이체의 기능적 활성. CD4+CD25+ 조절 T 세포 (A) 및 hIL2RA (CD25)로 형질감염된 CD8+ T 세포 (B)에서 STAT5 인산화 (pSTAT5)의 용량-반응 곡선. PBMCs 및 hIL2RA (CD25)로 형질감염된 CD8+ T세포를 hAlb-hIL2 변이체-함유 상층액의 연속 희석액과 인큐베이션하고 그 후 STAT5의 인산화를 유세포 분석을 통해 분석하였다. 나타낸 데이터는 4 파라미터 로그 피트에 피팅하여 EC50 값을 계산하였다.
도 4, 5 및 6: STAT5의 IL2-매개된 인산화에 의해 측정된 hIL2RA (CD25)의 상이한 변이체로 전기천공된 CD8 + T 세포에서 hAlb-hIL2 변이체의 기능적 활성. hIL2RA (CD25)로 형질감염된 CD8+ T 세포에서 STAT5 인산화 (pSTAT5)의 용량-반응 곡선을 hAlb-hIL2 (도 4), hAlb-hIL2_A3 (도 5, A), hAlb-hIL2_A4 (도 5, B), hAlb-hIL2_A5 (도 6, A) 및 hAlb-hIL2_A8 (도 6, B)에 대해 나타낸다. hAlb-hIL2 변이체-함유 상층액의 연속 희석물과 함께 CD8+ T 세포를 인큐베이션하고, 그 후 STAT5의 인산화를 유세포 측정을 통해 분석하였다. 나타낸 데이터는 4개 중 1개의 대표 실험에서 유래된 것이고 4 파라미터 로그 피트에 피팅하여 EC50 값을 계산하였다.
도 7, 8, 9: hAlb-hIL2 변이체의 in vitro 에서 상이한 hIL2RA (CD25) 변이체로 전기천공된 CD8+ T 세포에 리디렉션된 CAR의 항-종양 효능에의 영향.
클라우딘-6 (CLDN6) 양성, eGFP-형질전환 PA-1 종양 스페로이드를 hIL2RA 변이체(hIL2RA_mut1, hIL2RA_mut4 또는 hIL2RA 야생형) 및 CLDN6-특이적 CAR 컨스트럭트를 암호화하는 IVT-mRNA로 전기천공된 CD8+ T 세포와 함께 배양하였다. 클라우딘-18.2 (CLDN18.2)-특이적 CAR 컨스트럭트를 음성 대조군 (mock CAR)으로 사용하였다. 병태 당 n=3으로 10:1의 준-최적 작용세포:표적 비율로 공배양을 시작하고 상응하는 상호 hAlb-hIL2 변이체 hAlb-hIL2_A3, hAlb-hIL2_A4 또는 대조군으로서 hAlb를 함유하는 25% 상층액을 처리하였다. CAR T 세포로 매개된 세포독성은 Incucyte S3 생존 세포 이미지화 시스템에서 세포 생존능에 대한 대체 표지로서 종양 스페로이드의 형광 신호를 이용하여 시간에 따라 평가하였다. 3반복된 각각의 종양 스페로이드의 총 녹색 대상 영역을 기록하고 공-배양의 시작 시의 각각의 스페로이드 영역으로 정규화하였다. 각각의 CAR 컨스트럭트(CLDN18.2 CAR 28ζ, CLDN6 CAR 28ζ 및 CLDN6 CAR BBζ)에 대한 데이터는 각각 분리하여 도 7, 도 8 및 도 9에 곡선으로 작성하였다.
본 명세서는 아래에서 상세히 설명되지만, 본원에 기술된 구체적인 방법, 프로토콜 및 시약은 변경될 수 있으므로, 본원에 기술된 구체적인 방법, 프로토콜 및 시약으로 한정되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본원에서 사용되는 용어들은 구체적인 구현예를 설명하기 위한 목적일 뿐, 첨부된 청구항에 의해서만 한정되는 본 명세서의 범위를 제한하는 것으로 의도되지는 않는 것으로 이해되어야 한다. 달리 정의되지 않은 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어들은 당해 기술 분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다.
바람직하게는, 본원에서 사용되는 용어들은 "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Kφlbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland, (1995)에 기술된 바와 같이 정의된다.
본 명세서의 실시는, 달리 언급되지 않은 한, 본 기술 분야의 문헌에 설명된 화학, 생화학, 세포 생물학, 면역학 및 재조합 DNA 기법의 통상적인 방법을 채택할 것이다 (참조, 예를 들어, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).
이하, 본 명세서의 요소들을 설명한다. 이들 요소는 구체적인 구현예를 들어 기술되지만, 임의의 방식 및 임의의 수로 조합되어 추가적인 구현예를 만들어낼 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 다양하게 기술된 실시예 및 구현예들은 본 발명세서를 명시적으로 기술된 구현예들로만 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 이러한 설명은 명시적으로 기술된 구현예들을 임의의 수의 기술된 요소들과 조합하는 구현예들을 기술하고 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 아울러, 언급된 모든 요소들의 임의 치환 및 조합은 문맥상 달리 언급되지 않은 한 이러한 설명에 의해 개시되는 것으로 간주되어야 한다.
용어 "약"은 대략적으로 또는 거의를 의미하며, 본원에 기술된 수치 값 또는 범위의 맥락에서, 일 구현예에서, 언급 또는 청구된 수치 값 또는 범위의 ±20%, ±10%, ±5% 또는 ±3%를 의미한다.
내용을 기술하는 문맥에서 (특히 청구항의 맥락에서) 사용되는 용어 정관사 및 부정관사 ("a" 및 "an" 및 "the") 및 비슷한 표현은, 본원에서 달리 명시되지 않거나 또는 문맥상 명확하게 상충되지 않은 한, 단수 및 복수를 모두 포괄하는 것으로 해석되어야 한다. 본원에서 수치 값들에 대한 범위 언급은 주로 범위에 속하는 각각의 개별 값들을 각각 기술하는 약칭적인 방식으로 사용하는 것으로 의도된다. 본원에서 달리 언급되지 않은 한, 각각의 개별 값은 본원에 각각 언급된 것처럼 명세서에 포함된다. 본원에 기술된 모든 방법들은, 본원에서 달리 언급되지 않거나 또는 문맥상 명확하게 상충되지 않은 한, 임의의 적절한 순서로 수행할 수 있다. 본원에 제공되는 임의의 그리고 모든 예, 또는 예시적인 표현 (예, "와 같은")의 사용은 주로 내용을 잘 예시하기 위한 것일 뿐, 청구항의 범위를 제한하는 것은 아니다. 명세서에서 어떤 표현도 본원을 실시하는데 필수적인 임의의 청구되지 않은 요소들을 기술하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
명확하게 달리 명시되지 않은 한, 용어 "포함하는"은 본 발명의 맥락에서 "포함하는"에 의해 나열되는 목록의 구성원들과 더불어 추가적인 구성원들이 선택적으로 존재할 수 있다는 것을 나타내기 위해 사용된다. 그러나, 본 명세서의 구체적인 구현예로서 용어 "포함하는"은 추가적인 구성원들은 존재하지 않을 가능성도 포괄하는 것으로 고려되며, 즉 이러한 구현예의 경우 "포함하는"은 "로 이루어진"의 의미인 것으로 이해되어야 한다.
몇가지 문헌들이 본 명세서의 전체 내용에서 인용된다. 본원에 인용된 각각의 문헌 (모든 특허, 특허 출원, 과학 간행물, 제조사의 명세서, 설명서 등을 포함함)은, 전술되었건 후술되었건, 그 전체가 원용에 의해 본원에 포함된다. 본원에서 어떠한 것도 본 명세서가 이러한 내용을 선행할 자격이 없다는 인정으로서 해석되어서는 안 된다.
이하, 본 명세서의 모든 측면들에 적용되는 정의들을 제시한다. 후술한 용어들은 달리 언급되지 않은 한 하기한 의미를 가진다. 정의되지 않은 임의의 용어들은 당해 기술 분야에서 인지되는 의미를 가진다.
정의
본원에서 사용된 바와 같이 "감소하다", "낮추다" "저해하다" 또는 "손상하다"와 같은 용어는, 수준에서, 예를 들어 결합 수준에서, 전체적인 감소, 바람직하게는 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 더 바람직하게는 50% 이상, 가장 바람직하게는 75% 이상의 전체적인 감소 또는 전체적인 감소를 유발하는 능력을 의미한다.
"증가하다", "강화하다" 또는 "초과하다"와 같은 용어들은 바람직하게는 약 10% 이상, 바람직하게는 20% 이상, 바람직하게는 30% 이상, 더 바람직하게는 40% 이상, 더 바람직하게는 50% 이상, 보다 더 바람직하게는 80% 이상, 가장 바람직하게는 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500% 또는 그 이상으로의 증가 또는 강화에 관한 것이다.
본 발명의 내용에서, 용어 "펩티드"는 올리고펩티드를 포함하며, 펩티드 결합으로 서로 연결된 연속적인 아미노산을 약 2개 이상, 약 3개 이상, 약 4개 이상, 약 6개 이상, 약 8개 이상, 약 10개 이상, 약 13개 이상, 약 16개 이상, 약 20개 이상 및 최대 약 50개, 약 100개 또는 약 150개를 포함하는 물질을 지칭한다. 용어 "단백질" 또는 "폴리펩티드"는 큰 펩티드, 특히 적어도 약 150개의 아미노산을 지닌 펩티드를 지칭하지만, 용어 "펩티드", "단백질" 및 "폴리펩티드"는 본원에서 통상적으로 동의어로 사용된다.
"치료 단백질"은 개체에게 치료학적 유효량으로 제공될 때 개체의 병태 또는 질환 상태에 긍정적인 또는 유익한 효과를 갖는다. 일 구현예에서, 치료 단백질은 치유적 (curative) 또는 고식적 (palliative) 특성을 가지며, 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상의 개선, 완화, 경감, 역전, 발병 지연 또는 중증도 약화를 달성하기 위해 투여될 수 있다. 치료 단백질은 예방학적 특성을 가지며, 질환의 개시를 지연하거나 또는 이러한 질환 또는 병리학적 병태의 중증도를 약화하기 위해 사용될 수 있다. 용어 "치료 단백질"은 전체 단백질 또는 펩티드를 포함하고, 이의 치료학적 활성 단편을 지칭할 수도 있다. 또한, 단백질의 치료학적 활성 변이체도 포함할 수 있다. 치료학적 활성 단백질의 예로는, 이에 제한되지는 않으나, 사이토카인 및 백신화를 위한 항원을 포함한다.
아미노산 서열 (펩티드 또는 단백질)과 관련하여, "단편"은 아미노산 서열의 일부를 의미하며, 즉 N-말단 및/또는 C-말단에서 짧아진 아미노산 서열을 나타내는 서열을 의미한다. C-말단에서 짧아진 단편 (N-말단 단편)은, 예를 들어, 오픈 리딩 프래임의 3'-말단이 결핍된 절단된 오픈 리딩 프래임을 번역함으로써, 수득가능하다. N-말단에서 짧아진 단편 (C-말단 단편)은, 절단된 오픈 리딩 프래임이 번역을 개시하는 역할을 하는 개시 코돈을 포함하는 한, 예를 들어, 오픈 리딩 프래임의 5'-말단이 결핍된 절단된 오픈 리딩 프래임을 번역함으로써, 수득가능하다. 아미노산 서열의 단편은, 예를 들어, 아미노산 서열로부터 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%의 아미노산 잔기들을 포함한다. 아미노산 서열의 단편은 바람직하게는 아미노산 서열로부터 적어도 6개, 특히 적어도 8개, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 50개 또는 적어도 100개의 연속적인 아미노산을 포함한다.
본원의 "변이체" 또는 "변이체 단백질" 또는 "변이체 폴리펩티드"는 야생형 단백질과 하나 이상의 아미노산 변형 측면에서 다른 단백질을 의미한다. 모 (parent) 폴리펩티드는 자연 생성 또는 야생형 (WT) 폴리펩티드일 수 있거나, 또는 야생형 폴리펩티드의 변형된 버전일 수 있다. 바람직하게는, 변이체 폴리펩티드는 모 폴리펩티드와 비교해 하나 이상의 아미노산 변형, 예를 들어 모 폴리펩티드와 비교해 1개 내지 약 20개, 바람직하게는 1개 내지 약 10개 또는 1개 내지 약 5개의 아미노산 변형을 가진다.
본원에서 사용된 것과 같은 "모 폴리펩티드", "모 단백질", "전구체 폴리펩티드" 또는 "전구체 단백질"은 향후 변형되어 변이체를 만드는, 변형되지 않은 폴리펩티드를 의미한다. 모 폴리펩티드는 야생형 폴리펩티드, 또는 야생형 폴리펩티드의 변이체 또는 조작된 버전일 수 있다.
본원에서 "야생형" 또는 "WT" 또는 "천연 (native)"은 대립유전자 변형을 비롯하여, 자연계에서 발견되는 아미노산 서열을 의미한다. 야생형 단백질 또는 폴리펩티드는 의도적으로 변형되지 않은 아미노산 서열을 가진다.
본 명세서의 목적에서, 아미노산 서열 (펩티드, 단백질 또는 폴리펩티드)의 "변이체"는 아미노산 삽입 변이체, 아미노산 부가 변이체, 아미노산 결손 변이체 및/또는 아미노산 치환 변이체를 포함한다. 용어 "변이체"는 모든 스플라이스 변이체, 번역후 변형된 변이체, 입체구조 (conformations), 이소형 및 종 상동체 (species homolog), 특히 세포에 의해 천연적으로 발현되는 것을 포함한다. 용어 "변이체"는, 특히, 아미노산 서열의 단편을 포함한다.
아미노산 삽입 변이체는 특정 아미노산 서열에 하나 또는 2 이상의 아미노산의 삽입을 포함한다. 삽입을 갖는 아미노산 서열 변이체의 경우, 수득되는 산물에 대한 적절한 스크리닝을 이용한 무작위 삽입도 가능하지만, 아미노산 서열에서 특정 부위에 하나 이상의 아미노산 잔기가 삽입된다. 아미노산 부가 변이체는, 예를 들어 아미노산 1개, 2개, 3개, 5개, 10개, 20개, 30개, 50개 또는 그 초과와 같은 하나 이상의 아미노산의 아미노- 및/또는 카르복시-말단 융합을 포함한다. 아미노산 결손 변이체는 1개, 2개, 3개, 5개, 10개, 20개, 30개, 50개 또는 그 이상의 아미노산의 제거와 같이, 서열로부터 하나 이상의 아미노산의 제거를 특징으로 한다. 결손은 단백질의 임의의 위치일 수 있다. 단백질의 N-말단 및/또는 C-말단에 결손을 포함하는 아미노산 결손 변이체는 N-말단 및/또는 C-말단 절단 변이체 (truncation variant)로도 지칭된다. 아미노산 치환 변이체는 서열에서 하나 이상의 잔기를 제거하고 그 위치에 다른 잔기를 삽입하는 것을 특징으로 한다. 상동적인 단백질들 또는 펩티드들 간에 보존되지 않은 아미노산 서열에서 변형이 위치하는 것 및/또는 아미노산을 유사한 특성의 다른 아미노산으로 치환하는 것이 선호된다. 바람직하게는, 펩티드 및 단백질 변이체에서 아미노산 변화는 보존적 아미노산 변화, 즉 유사하게 하전되거나 비-하전된 아미노산의 치환이다. 보존적 아미노산 변화는 측쇄와 관 비슷한 아미노산 계열 중 하나의 치환과 관련된다. 자연 발생 아미노산은 일반적으로 4가지 계열로 나뉜다: 산성 (아스파르테이트, 글루타메이트), 염기성 (라이신, 아르기닌, 히스티딘), 비-극성 아미노산 (알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 및 비-하전된 극성 아미노산 (글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신). 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신은 때때로 방향족 아미노산으로 같이 분류된다. 일 구현예에서, 보존적인 아미노산 치환은 다음과 같은 군 내에서 치환을 포함한다:
글리신, 알라닌;
발린, 이소루신, 루신;
아스파르트산, 글루탐산;
아스파라긴, 글루타민;
세린, 트레오닌;
라이신, 아르기닌; 및
페닐알라닌, 티로신.
용어 "산성 아미노산 잔기"는 바람직하게 글루탐산 (글루타메이트, Glu) 또는 아스파르트산 (아스파르테이트, Asp), 특히 글루탐산과 관련된다. 용어 "염기성 아미노산 잔기"는 라이신 (Lys) 또는 아르기닌 (Arg), 특히 라이신과 관련된다.
바람직하게는, 주어진 아미노산 서열과, 상기 주어진 아미노산 서열의 변이체인 아미노산 서열 간의 유사성, 바람직하게는 동일성 정도는 적어도 약 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%일 것이다. 유사성 또는 동일성 정도는 바람직하게는 참조 아미노산 서열의 전장의 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 약 100%인 아미노산 영역에 대해 제공된다. 예를 들어, 참조 아미노산 서열이 200 아미노산으로 구성된다면, 유사성 또는 동일성 정도는 바람직하게는 적어도 약 20개, 적어도 약 40개, 적어도 약 60개, 적어도 약 80개, 적어도 약 100개, 적어도 약 120개, 적어도 약 140개, 적어도 약 160개, 적어도 약 180개 또는 약 200개 아미노산, 바람직하게는 연속적인 아미노산들에 대해 제공된다. 바람직한 구현예에서, 유사성 또는 동일성 정도는 참조 아미노산 서열의 전장에 대해 제공된다. 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은 당해 기술 분야에 공지된 도구를 사용해, 바람직하게는 최상의 서열 정렬, 예를 들어, Align을 사용해, 표준 설정 조건으로, 바람직하게는 EMBOSS::needle, Matrix: Blosum62, Gap Open 10.0, Gap Extend 0.5 하에 수행할 수 있다.
"서열 유사성"은 동일하거나 보존적 아미노산 치환을 나타내는 아미노산의 백분율을 나타낸다. 2개의 아미노산 서열 간의 "서열 동일성"은 서열 간에 동일한 아미노산의 백분율을 나타낸다.
용어 "동일성 %"는 최상으로 정렬하여 수득되는, 비교되는 2개의 서열 간에 동일한 아미노산 잔기의 백분율을 나타내는 것으로 의도되며, 이 백분율은 순전히 통계적이며, 두 서열 간의 차이는 무작위로, 그리고 전장에 걸쳐 분포된다. 2개의 아미노산 서열 간의 서열 비교는 통상적으로 이들 서열을 최적으로 정렬한 후 비교함으로써 수행되며, 상기 비교는 서열 유사성의 국소 영역을 식별 및 비교하기 위해 세그먼트 또는 "비교 창"에 의해 수행된다. 비교하기 위한 서열의 최적 정렬은 수동 외에도 Smith and Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482의 국소 상동성 알고리즘 수단을 이용하거나, Neddleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443의 국소 상동성 알고리즘의 수단을 이용하거나, Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444의 유사성 검색 방법의 수단을 이용하거나, 또는 이들 알고리즘을 사용하는 컴퓨터 프로그램 (위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지의 GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N 및 TFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.)을 이용하여, 생성할 수 있다.
동일성 %는 2개의 서열 간의 동일성 %를 구하기 위해 비교되는 2개의 서열 간에 동일한 위치의 수를 결정한 다음 이 숫자를 비교한 위치의 수로 나눈 후 수득된 결과에 100을 곱하여 계산한다.
상동성 아미노산 서열은 본 명세서에 따르면 아미노산 잔기들에 대해 적어도 40%, 특히 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 및 바람직하게는 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 나타낸다.
본원에 기술된 아미노산 서열 변이체는 당해 기술 분야의 당업자에 의해, 예를 들어, 재조합 DNA 조작에 의해 쉽게 제조될 수 있다. 치환, 부가, 삽입 또는 결손을 가진 펩티드 또는 단백질을 제조하기 위한 DNA 서열의 조작은 예를 들어 Sambrook et al. (1989)에 상세하게 기술되어 있다. 또한, 본원에 기술된 펩티드 및 아미노산 변이체는, 예를 들어 고상 합성 및 유사 방법과 같은, 공지된 펩티드 합성 기법의 도움을 받아 쉽게 제조할 수 있다.
일 구현예에서, 아미노산 서열 (펩티드 또는 단백질)의 단편 또는 변이체는 바람직하게는 "기능성 단편" 또는 "기능성 변이체"이다. 아미노산 서열의 "기능성 단편" 또는 "기능성 변이체"라는 용어는 이것이 유래되는 아미노산 서열과 동일한 또는 비슷한 한나 이상의 기능적 특성을 나타내는 임의의 단편 또는 변이체에 관한 것이고, 즉 기능적 등가체이다. IL2와 같은 사이토카인과 관련하여, 한가지 구체적인 기능은 단편 또는 변이체가 유래된 아미노산 서열에 의해 나타나는 하나 이상의 면역조절 활성 및/또는 단편 또는 변이체가 유래된 아미노산 서열이 결합하는 수용체(들)에의 결합이다. IL2R와 같은 사이토카인 수용체와 관련하여, 한가지 구체적인 기능은 단편 또는 변이체가 유래된 아미노산 서열에 의해 나타나는 하나 이상의 면역조절 활성 및/또는 단편 또는 변이체가 유래된 아미노산 서열이 결합하는 리간드(들)에의 결합이다. 용어 "기능성 단편" 또는 "기능성 변이체"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 특히 모 분자 또는 서열의 아미노산 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산이 변경된 아미노산 서열을 포함하고 모 분자 또는 서열의 하나 이상의 기능들, 예를 들어, 표적 분자에 결합 또는 표적 분자에 결합에 기여를 여전히 수행할 수 있는 변이체 분자 또는 서열을 의미한다. 일 구현예에서, 모 분자 또는 서열의 아미노산 서열에서 변형은 분자 또는 서열의 결합 특징에 유의미하게 영향을 미치거나 변경하지 않는다. 다른 구현예에서, 기능성 단편 또는 기능성 변이체의 결합은 감소될 수 있지만 여전히 유의미하게 존재하고, 예를 들어, 기능성 변이체의 결합은 모 분자 또는 서열의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%일 수 있다. 그러나, 다른 구현예에서, 기능성 단편 또는 기능성 변이체의 결합은 모 분자 또는 서열에 비하여 증가될 수 있다.
지정된 아미노산 서열 (펩티드, 단백질 또는 폴리펩티드)"로부터 유래되는" 아미노산 서열 (펩티드, 단백질 또는 폴리펩티드)은 제1 아미노산 서열의 기원을 의미한다. 바람직하게는, 특정 아미노산 서열로부터 유래된 아미노산 서열은 이 특정 서열 또는 이의 단편과 동일한, 본질적으로 동일한 또는 상동성인 아미노산 서열을 가진다. 특정 아미노산 서열로부터 유래된 아미노산 서열은 이 특정 서열 또는 이의 단편의 변이체일 수 있다. 예를 들어, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본원에서 사용하기에 적합한 항원 및 사이토카인(예를 들어, IL2)이 이들로부터 유래된 자연적으로 발생되거나 천연의 서열로부터 서열에서는 변형되지만 천연 서열의 요망되는 활성은 유지되도록 변경될 수 있음을 이해할 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "교육 자료" 또는 "설명서"는 간행물, 기록, 도표, 또는 본 발명의 조성물 및 방법의 유용성을 전달하는 데에 사용될 수 있는 다른 표현 매체를 포함한다. 본 발명의 키트의 교육 자료는, 예를 들어, 본 발명의 조성물을 함유하는 용기에 첨부되거나 조성물을 함유하는 용기와 함께 운반될 수 있다. 선택적으로, 교육 자료는 수취인에 의해 교육 자료 및 조성물이 함께 사용되도록 하는 의도로 용기와 분리하여 운반될 수 있다.
"분리된"은 자연적 상태로부터 변경되거나 제거된 것을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 동물에서 자연적으로 존재하는 핵산 또는 펩티드는 "분리된"이 아니지만, 이의 자연 상태의 공존하는 물질로부터 부분적으로 또는 완전히 분리된 동일한 핵산 또는 펩티드는 "분리된"이다. 분리된 핵산 또는 단백질은 실질적으로 정제된 형태로 존재할 수 있거나, 예를 들어, 숙주 세포와 같은 비-자연적 환경에 존재할 수 있다.
본 발명의 맥락에서 용어 "재조합"은 "유전적 조작을 통해 만들어진"을 의미한다. 바람직하게, 본 발명의 맥락에서 재조합 세포와 같은 "재조합 대상"은 자연적으로 발생되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "자연적으로 발생한"은 대상이 자연계에서 발견될 수 있다는 사실을 의미한다. 예를 들어, 유기체 (바이러스 포함) 내에 존재하고 자연계 내 공급원으로부터 분리될 수 있고 실험실에서 인간에 의해 의도적으로 변형되지 않은 펩티드 또는 핵산은 자연적으로 발생한 것이다.
본원에서 사용된 "렌티바이러스"는 Retroviridae 패밀리 속을 의미한다. 렌티바이러스는 비-분화 세포를 감염시킬 수 있다는 점에서 레트로바이러스 중에서 독특하고; 이들은 숙주 세포의 DNA 내로 상당량의 유전 정보를 운반할 수 있기 때문에, 이들은 유전자 전달 벡터의 가장 효과적인 방법 중 하나이다. HIV, SIV, 및 FIV는 렌티바이러스의 모든 예시이다. 렌티바이러스로부터 유래된 벡터는 in vivo에서 상당한 수준의 유전자 전달을 달성하기 위한 수단을 제공한다.
본원에서 사용되는 용어 "특이적으로 결합하다"는 특정 항원을 인식하지만 시료 내의 또는 개체 내의 다른 분자는 실질적으로 인식하지 않거나 결합하지 않는 항체 또는 CAR와 같은 분자를 의미한다. 예를 들어, 한 종으로부터의 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 하나 이상의 다른 종으로부터의 그 항원에 또한 결합할 수 있다. 그러나, 이러한 종간 반응성은 그 자체로 특이성에 대한 항체의 분류를 변경하지 않는다. 다른 예에서, 한 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 그 항원의 다른 대립 유전자 형태에 또한 결합할 수 있다. 그러나, 이러한 교차 반응성은 그 자체로 특이성에 대한 항체의 분류를 변경하지 않는다. 일부 예시에서, 용어 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합"은 항체, 단백질, 또는 펩티드의 제2 화학종과의 상호작용을 참조하는 데에 상호작용이 화학 종 상의 특정 구조 (예를 들어, 항원성 결정자 또는 에피토프)에 의존적임을 의미하기 위하여 사용될 수 있고, 예를 들어, 항체는 일반적으로 단백질들 보다는 특정 단백질 구조를 인식하고 결합한다. 만약 항체가 에피토프 "A"에 특이적이라면, 표지된 "A" 및 항체를 포함하는 반응에서, 에피토프 A를 함유하는 분자 (또는 자유, 표지되지 않은 A)의 존재는 항체에 결합된 표지된 A의 양을 감소시킬 것이다.
용어 "유전적 변형"은 핵산으로 세포를 형질감염시키는 것을 포함한다. 용어 "형질감염"은 핵산, 특히 RNA의 세포로의 도입에 관한 것이다. 본 발명의 모든 목적을 위하여, 용어 "혈질감염"은 또한 핵산의 세포에의 도입 또는 이러한 세포에 의해 핵산의 섭취를 포함하고, 세포는 개체, 예를 들어, 환자에 존재할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따르면, 본원에서 설명된 핵산의 형질감염을 위한 세포는 in vitro 또는 in vivo로 존재할 수 있고, 예를 들어, 세포는 환자의 장기, 조직 및/또는 유기체의 일부를 형성할 수 있다. 본 발명에 따르면, 형질감염은 일시적이거나 안정적일 수 있다. 형질감염의 일부 적용의 경우, 만약 형질감염된 유전 물질이 일시적으로만 발현된다면 충분하다. RNA는 세포에 형질감염되어 이의 암호화된 단백질을 일시적으로 발현할 수 있다. 형질감염 과정에서 도입된 핵산은 일반적으로 핵 유전체에 삽입되지 않기 때문에, 외래 핵산은 유사 분열을 통해 희석되거나 분해될 것이다. 핵산의 에피좀성 증폭이 가능한 세포는 희석 비율을 현저하게 감소시킨다. 만약 형질감염된 핵산이 사실상 세포 및 이의 자세포에 잔존한다면, 안정한 형질감염이 반드시 일어나야 한다. 이러한 안정한 형질감염은 형질감염을 위한 바이러스-기반 시스템 또는 트랜스포존-기반 시스템을 사용함으로써 달성할 수 있다. 일반적으로, 유전적으로 변형되어 수용체 폴리펩티드 및/또는 항원 수용체를 발현하는 세포는 수용체 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산 및/또는 항원 수용체를 엔코딩하는 핵산으로 안정적으로 형질감염되는 반면, 일반적으로 리간드 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산 및/또는 항원을 엔코딩하는 핵산은 일시적으로 세포 내로 형질감염 된다.
면역 작용 세포
본 발명과 관련되어 사용되는 세포이고, IL2 수용체 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산 (DNA 또는 RNA), 특히 IL2Rα, (선택적으로 IL2Rβ 및/또는 IL2Rγ를 엔코딩하는 핵산과 함께), 및 선택적으로 항원 수용체를 엔코딩하는 핵산(DNA 또는 RNA) 이 도입될 수 있는 세포는, 자연적으로 또는 하나 이상의 IL2R 폴리펩티드로 형질감염 후, IL2에 반응성인 세포를 포함한다. 이러한 반응성은 활성화, 분화, 증식, 생존 및/또는 하나 이상의 면역 반응기 기능을 포함한다. 세포는, 특히, 용해능을 가진 세포와 같은 면역 작용 세포, 특히 림프 세포를 포함하고, 바람직하게는 T 세포, 특히 세포독성 림프구, 바람직하게는 세포독성 T 세포, 자연 살해 (NK) 세포, 및 림포카인-활성화된 살해 (LAK) 세포로부터 선택된 세포를 포함한다. 활성화 후, 이들 세포독성 림프구 각각은 표적 세포의 파괴를 유발한다. 예를 들어, 세포독성 T 세포는 하기의 수단들 중 하나 또는 모두에 의해 표적 세포의 파괴를 유발한다. 첫번째로, 활성화 후 T 세포는 퍼포린, 그랜자임, 및 그래눌리신과 같은 세포독을 방출한다. 퍼포린 및 그래눌리신은 표적 세포에서 구멍을 만들고, 그랜자임은 세포에 침입하여 세포질에서 세포의 세포자살 (세포예정사)을 포함하는 카스파아제 캐스캐이드를 유발한다. 두번째로, 세포자살은 T 세포와 표적 세포 간의 Fas-Fas 리간드 상호작용을 통해 유도될 수 있다. 본 발명과 관련하여 사용된 세포는 이종성 세포 또는 동종이형 세포가 사용될 수 있으나, 바람직하게는 자가 세포일 것이다.
본 발명의 맥락에서 용어 "작용세포 효과"는 면역계의 구성성분에 의해 매개되어, 결과적으로 예를 들어, 종양 세포와 같은 질환에 걸린 세포의 사멸, 또는 종양 성장의 억제 및/또는 종양 전파 및 전이를 포함하는 종양 진행의 억제를 가져오는 임의의 기능을 포함한다. 바람직하게, 본 발명의 맥락에서 작용세포 기능은 T 세포 매개된 작용세포 기능이다. 이러한 기능은 헬퍼 T 세포 ((CD4+ T 세포)의 경우 사이토카인의 방출 및/또는 CD8+ 림프구 (CTLs) 및/또는 B 세포의 활성을 포함하고, CTL의 경우 예를 들어, 세포 자살 또는 퍼포린-매개된 세포 용해, IFN-g 및 TNF-α와 같은 사이토카인의 제조, 및 항원 발현 표적 세포의 특이적 세포살해성 살해를 통한 세포, 즉, 항원의 발현을 특징으로 하는 세포의 제거를 포함한다.
본 발명의 맥락에서 용어 "면역 작용 세포" 또는 "면역반응성 세포"는 면역 반응 동안 작용기 기능에 영향을 미치는 세포에 관한 것이다. 일 구현예에서 "면역 작용 세포"는 세포 상에 MHC의 맥락에서 나타나거나 세포의 표면에 발현되어 면역 반응을 매개하는 항원과 같은 항원에 결합할 수 있다. 예를 들어, 면역 작용 세포는 T 세포 (세포독성 T 세포, 헬퍼 T 세포, 종양 침윤 T 세포), B 세포, 자연 살해 세포, 호중구, 대식세포, 및 수지상 세포를 포함한다. 바람직하게, 본 발명의 맥락에서, "면역 작용 세포"는 T 세포, 바람직하게는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포이다. 본 발명에 따르면, 용어 "면역 작용 세포"는 또한 적당한 자극을 이용하여 면역 세포 (예를 들어 T 세포, 특히 T 헬퍼 세포, 또는 세포살해 T 세포)로 성숙될 수 있는 세포를 포함한다. 면역 작용 세포는 CD34+ 조혈모세포, 미성숙 및 성숙 T 세포 및 미성숙 및 성숙 B 세포를 포함한다. T 세포 전구체의 세포살해 T 세포로의 분화는, 항원에 노출되었을 때, 면역계의 클론 선택과 유사하다.
바람직하게, "면역 작용 세포"는, 특히 만약 MHC의 맥락에서 나타나거나 암 세포와 같은 질환에 걸린 세포의 표면에 나타난다면, 일정 정도의 특이성으로 항원을 인식한다. 바람직하게, 상기 인식은 항원을 인식한 세포로 하여금 민감성 또는 반응성이게 할 수 있다. 만약 세포가 헬퍼 T 세포 (CD4+ T 세포)이면, 이러한 민감성 또는 반응성은 사이토카인의 방출 및/또는 CD8+ 림프구 (CTLs) 및/또는 B 세포의 활성화에 관련될 수 있다. 만약 세포가 CTL이라면 이러한 민감성 또는 반응성은 세포자살 또는 퍼포린-매개된 세포 용해를 통한 세포, 즉, 항원의 발현을 특징으로 하는 세포의 제거에 관련될 수 있다. 본 발명에 따르면, CT 반응성은 지속된 칼슘 유동, 세포 분열, IFN-g 및 TNF-α와 같은 사이토카인의 생성, CD44 및 CD69와 같은 활성화 표지의 상향-조절, 및 항원을 발현하는 표적 세포의 특이적 세포살해성 살해를 포함할 수 있다. CTL 반응성은 또한 CTL 반응성을 정확하게 표시하는 인공적인 리포터를 사용하여 결정할 수 있다. 항원을 인식하고 민감성 또는 반응성인 이러한 CTL은 "항원-민감성 CTL"로 본원에서 또한 명명된다.
일 구현예에서, 면역 작용 세포는 CAR-발현 면역 작용 세포이다. 일 구현예에서, 면역 작용 세포는 TCR-발현 면역 작용 세포이다.
본 발명에 따라 사용되는 면역 작용 세포는 T 세포 수용체 또는 B 세포 수용체와 같은 내인성 항원 수용체를 발현할 수 있고, 내인성 항원 수용체의 발현이 결핍되어 있을 수 있다.
"림프 세포"는 선택적으로 적합한 변형 후에, 예를 들어, TCR 또는 CAR와 같은 항원 수용체의 이식 후에, 세포성 면역 반응과 같은 면역 반응을 야기할 수 있는 세포, 또는 이러한 세포의 전구체이고, 림프구, 바람직하게는 T 림프구, 림프아구 및 원형질 세포를 포함한다. 림프 세포는 본원에서 설명된 바와 같은 면역 작용 세포일 수 있다. 바람직한 림프 세포는 세포 표면에 항원 수용체를 발현하도록 변형될 수 있는 T 세포이다. 일 구현예에서, 림프 세포는 T 세포 수용체의 내인성 발현이 결실된다.
용어 "T 세포" 및 "T 림프구" 본원에서 상호교환가능하게 사용되고 T 헬퍼 세포 (CD4+ T 세포) 및 세포살해 T 세포를 포함하는 세포독성 T 세포 (CTLs, CD8+ T 세포)를 포함한다. 용어 "항원-특이적 T 세포" 또는 유사한 용어들은 T 세포가 표적으로 하는 항원을 표적으로 하고 바람직하게는 T 세포의 작용세포 기능을 유발하는 T 세포에 관한 것이다. 만약 세포가 항원을 발현하는 표적 세포를 살해하면, T 세포는 항원에 대해 특이적인 것으로 간주된다. T 세포 특이성은 임의의 다양한 표준 기술, 예를 들어, 크롬 방출 분석법 또는 증식 분석법을 이용하여 평가할 수 있다. 대안적으로, 림포카인 (IFN-γ와 같은)의 합성이 측정될 수 있다.
T 세포는 림프구로 알려진 백혈구의 그룹에 속해 있고, 세포-매개 면역에 중심적인 역할을 한다. 이들은 B 세포 및 자연 살해 세포와 같은 다른 림프구 종류와는 T 세포 수용체 (TCR)로 불리는 이들의 세포 표면 상의 특이한 수용체의 존재로 구분될 수 있다. 흉선은 T 세포의 성숙을 담당하는 주요 기관이다. 몇몇 다른 T 세포의 하위군이 발견되었고, 각각은 상이한 기능을 갖는다.
T 헬퍼 세포는, 다른 기능들 중, B 세포의 원형질 세포로의 성숙 및 세포독성 T 세포 및 대식세포의 활성화를 포함하는 면역학적 과정에서 다른 백혈구를 돕는다.
이들 세포는 또한 이들이 CD4 당단백질을 이들의 표면에 발현하기 때문에 CD4+ T 세포로도 알려져 있다. 헬퍼 T 세포는 이들이 항원 제시 세포 (APCs)의 표면 상에 발현되는 MHC 클래스 II분자에 의해 펩티드 항원으로 표시될 때 활성화되기 시작한다. 일단 활성화되면, 이들은 빠르게 분열하고 활성 면역 반응을 조절하거나 돕는 사이토카인이라고 불리는 작은 단백질을 방출한다.
세포독성 T 세포는 바이러스에 감염된 세포 및 종양 세포를 파괴하고 이식 거부에 또한 연관되어 있다. 이들 세포는 또한 이들 표면에 CD8 당단백질을 발현하기 때문에 CD8+ T 세포로도 알려져 있다. 이들 세포는 이들의 표적을 신체의 거의 모든 세포의 표면에 존재하는 MHC 클래스 I과 관련된 항원에 결합함으로써 인식한다.
"조절 T 세포" 또는 "Tregs"는 면역계를 조절하고, 자기-항원에 대한 내성을 유지하고, 자가면역 질환을 억제하는 T 세포의 하위집단이다. Tregs는 면역억제성이고, 일반적으로 작용 T 세포의 유도 및 증식을 억제하거나 하향 조절한다. Tregs는 생물표지 CD4, FoxP3, 및 CD25를 발현한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "나이브 T 세포"는 활성화된 또는 기억 T 세포와 달리, 말초에서 이의 동족 항원과 접촉한 적 없는, 성숙한 T 세포를 지칭한다. 나이브 T 세포는 통상적으로 L-셀렉틴 (CD62L)의 표면 발현, 활성화 마커 CD25, CD44 또는 CD69의 부재, 및 기억 CD45RO 이소형의 부재를 특징으로 한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "기억 T 세포"는 이전에 동족 항원과 접촉하여 이에 반응한 적 있는 T 세포의 하위군 또는 하위집단을 지칭한다. 항원과 2차 접촉하게 되면, 기억 T 세포가 재생산되어, 면역계가 항원과 최초로 반응하였을 때에 비해 더 신속하고 더 강력하게 면역 반응을 구축할 수 있다. 기억 T 세포는 CD4+ 또는 CD8+일 수 있으며, 통상적으로 CD45RO를 발현한다.
모든 T 세포는 몇몇 단백질의 복합체로서 존재하는 T 세포 수용체 (TCR)를 갖는다. T 세포의 대다수에서, 실제 T 세포 수용체는 2개의 개별적인 펩티드 사슬로 구성되고, 이들은 독립적인 T 세포 수용체 알파 및 베타(TCRα 및 TCR
) 유전자로부터 생산되고, α- 및 
-TCR 사슬로 지칭된다. 훨씬 T 세포의 덜 일반적인 그룹 (전체 T 세포 중 2%), γδ T 세포 (감마 델타 T 세포)는 이들의 표면에 독특한 T 세포 수용체 (TCR)를 갖고, 이는 하나의 γ-사슬 및 하나의 δ-사슬로 구성된다.
모든 T 세포는 골수에서 조혈모세포로부터 유래된다. 조혈모세포로부터 유래된 조혈 전구세포는 흉선에 존재하고 세포 분열로 성장하여 미성숙 흉선세포의 큰 집단을 형성한다. 초기 흉선세포는 CD4나 CD8 둘 다 발현하지 않고, 따라서 이중-음성 (CD4-CD8-) 세포로 분류된다. 이들의 발달(development)을 통해 분화(progress)될 때, 이들은 이중-양성 흉선세포(CD4+CD8+)가 되고, 마침내 성숙하여 흉선에서 말초 조직으로 방출되는 단일-양성 (CD4+CD8- 또는 CD4-CD8+) 흉선 세포가 된다.
T 세포는 표준 방법을 사용하여 in vitro 또는 ex vivo에서 일반적으로 제조될 수 있다. 예를 들어, T 세포는 환자와 같은 포유류의 골수, 말초 혈액 또는 골수 또는 말초 혈액의 분획에서 상업적으로 이용가능한 세포 분리 시스템을 이용하여 분리될 수 있다. 대안적으로, T 세포는 관련되거나 무관한 인간, 비-인간 동물, 세포주 또는 배양액으로부터 유래될 수 있다. T 세포를 포함하는 시료는, 예를 들어, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "NK 세포" 또는 "자연 살해 세포"는 CD56 또는 CD16의 발현 및 T 세포 수용체의 부재에 의해 정의되는 말초 혈액 림프구의 하위군을 지칭한다. 본원에 제공된 바와 같이, NK 세포는 또한 줄기 세포 또는 전구 세포로부터 분화될 수 있다.
핵산
용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은, 본원에서 사용된 바와 같이, 유전체 DNA, cDNA, mRNA, 재조합적으로 생산되고 화학적으로 합성된 분자와 같은 DNA 및 RNA를 포함하도록 의도된다. 핵산은 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다. RNA는 in vitro에서 전사된 RNA (IVT RNA) 또는 합성 RNA를 포함한다. 본 발명에 따라, 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 분리된 것이다.
핵산은 벡터 내에 포함될 수 있다. 용어 "벡터"는 본원에서 사용된 바와 같이, 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 람다 파아지와 같은 파아지 벡터, 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 배큘로바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터, 또는 박테리아 인공 염색체 (BAC), 효모 인공 염색체 (YAC) 또는 P1 인공 염색체 (PAC)와 같은 인공적 염색체 벡터를 포함하는, 당업자에게 공지된 임의이 벡터를 포함한다. 상기 벡터는 발현 뿐 아니라 클로닝 벡터를 포함한다. 발현 벡터는 플라스미드 뿐 아니라 바이러스 벡터를 포함하고, 일반적으로 특정 숙주 유기체 (예를 들어, 박테리아, 효모, 식물, 곤충, 또는 포유류) 또는 in vitro 발현 시스템에서 작동적으로 연결된 암호 서열의 발현에 필요한 요망되는 암호 서열 및 적당한 DNA 서열을 포함한다. 클로닝 벡터는 일반적으로 특정 요망되는 DNA 단편을 조작하고 증폭하기 위해 사용되고 요망되는 DNA 단편의 발현에 필요한 기능성 서열이 없을 수 있다.
본 발명의 모든 측면의 일 구현예에서, IL2 변이체를 엔코딩하는 핵산, IL2R 변이체 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산, 항원 수용체를 엔코딩하는 핵산, 또는 백신 항원을 엔코딩하는 핵산과 같은 핵산은 치료받는 개체의 세포에서 발현되어 IL2 변이체, IL2R 변이체 폴리펩티드, 항원 수용체 또는 백신 항원을 생산한다. 본 발명의 모든 측면의 일 구현예에서 핵산은 개체의 세포에서 일시적으로 발현된다. 따라서, 일 구현예에서, 핵산은 세포의 유전체 내로 삽입되지 않는다. 본 발명의 모든 측면의 일 구현예에서, 핵산은 RNA, 바람직하게는 in vitro에서 전사된 RNA이다.
본원에 기술된 핵산은 재조합 및/또는 분리된 분자일 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "RNA"는 리보뉴클레오티드 잔기를 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서, RNA는 모든 또는 대부분의 리보뉴클레오티드 잔기를 포괄한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "리보뉴클레오티드"는 β-D-리보푸라노실 기의 2'-위치에 하이드록시 기를 가진 뉴클레오티드를 의미한다. RNA는, 비-제한적으로, 이중 가닥 RNA, 단일 가닥 RNA, 일부 정제된 RNA와 같이 분리된 RNA, 본질적으로 순수한 RNA, 합성 RNA, 재조합적으로 생산된 RNA뿐 아니라 자연적으로 발생되는 RNA와 하나 이상의 뉴클레오티드의 부가, 결손, 치환 및/또는 변경에 의해 달라진 변형된 RNA를 포괄한다. 이러한 변경은 내부 RNA 뉴클레오티드에 또는 RNA 말단(들)에 비-뉴클레오티드 물질의 부가를 의미할 수 있다. 또한, 본원에서, RNA에서 뉴클레오티드는 화학적으로 합성된 뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드와 같은 비-표준 뉴클레오티드일 수 있는 것으로 고려된다. 본 명세서에 대하여, 이들 변경된 RNA는 자연적으로 발생되는 RNA의 유사체로 간주된다.
본 명세서의 특정 구현예에서, RNA는 펩티드 또는 단백질을 엔코딩하는 RNA 전사체와 관련된 메신저 RNA (mRNA)이다. 당해 기술 분야에서 확립된 바와 같이, mRNA는 일반적으로 5' 비번역 영역 (5'-UTR), 펩티드 암호화 영역 및 3' 비번역 영역 (3'-UTR)을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA는 in vitro 전사 또는 화학적 합성에 의해 제조된다. 일 구현예에서, mRNA는 DNA 주형을 이용한 in vitro 전사를 통해 제조되며, 여기서 DNA는 데옥시리보뉴클레오티드를 함유하는 핵산을 지칭한다.
일 구현예에서, RNA in vitro에서 전사된 RNA (IVT-RNA)이며, 적절한 DNA 주형으로부터 in vitro에서 전사에 의해 수득할 수 있다. 전사 조절 프로모터는 임의의 RNA 중합효소에 대한 임의의 프로모터일 수 있다. in vitro에서 전사용 DNA 주형은 핵산, 특히 cDNA를 클로닝하고, 이를 in vitro 전사를 위해 적절한 벡터에 도입하여 수득할 수 있다. cDNA는 DNA를 역전사하여 수득할 수 있다.
일 구현예에서, RNA는 변형된 리보뉴클레오티드를 가질 수 있다. 변형된 리보뉴클레오티드의 예로는, 비-제한적으로, 5-메틸시티딘, 슈도우리딘 및/또는 1-메틸-슈도우리딘을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 따른 RNA는 5'-캡을 포함한다. 일 구현예에서, 본 명세서의 RNA는 캡이 없는 5'-트리포스페이트를 갖지 않는다. 일 구현예에서, RNA는 5'-캡 유사체에 의해 변형될 수 있다. 용어 "5'-캡"은 mRNA의 5'-말단에서 발견되는 구조를 지칭하며, 이는 5' -> 5' 트리포스페이트 연결을 통해 mRNA에 연결된 구아노신 뉴클레오티드로 일반적으로 구성된다. 일 구현예에서, 이 구아노신은 7-위치에서 메틸화된다. 5'-캡 또는 5'-캡 유사체가 달린 RNA는, 5'-캡을 RNA 가닥으로 공-전사적으로 발현하는 in vitro 전사에 의해 제공할 수 있거나, 또는 캡핑 효소를 이용하여 번역 후에 RNA에 부착하여 제공할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 따른 RNA는 5'-UTR 및/또는 3'-UTR을 포함한다. 용어 "비-번역 영역" 또는 "UTR"은 DNA 분자에서 전사되지만 아미노산 서열로 번역되진 않는 영역, 또는 mRNA 분자와 같은 RNA 분자에서 대응되는 영역을 지칭한다. 비-번역 영역 (UTR)은 오픈 리딩 프래임의 5' (상류)에 존재 (5'-UTR) 할 수 있고/거나, 오픈 리딩 프래임의 3' (하류)에 존재할 수 있다 (3'-UTR). 5'-UTR은, 존재할 경우, 5' 말단, 단백질-엔코딩 영역의 개시 코돈의 상류에 위치한다. 5'-UTR은 (존재할 경우) 5'-캡의 하류, 예를 들어 5'-캡에 바로 인접하게 존재한다. 3'-UTR은, 존재할 경우, 3' 말단, 단백질-엔코딩 영역의 종결 코돈의 하류에 위치하지만, 용어 "3'-UTR"은 바람직하게는 폴리 (A) 꼬리를 포함하진 않는다. 따라서, 3'-UTR은 (존재할 경우) 폴리 (A) 서열의 상류, 예를 들어 폴리 (A) 서열에 바로 인접하게 존재한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 따른 RNA는 3'-폴리(A) 서열을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "폴리(A) 서열" 또는 "폴리-A 꼬리"는 전형적으로 RNA 분자의 3' 말단에 위치한 개입되지 않거나 개입된 아데닐 (A) 잔기들의 서열을 지칭한다. 폴리(A) 서열은 당해 기술 분야에서 당업자에게 공지되어 있고 본원에서 설명된 RNAs에서 3' UTR을 뒤따른다. 폴리(A) 서열은 임의의 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리(A) 서열은 A 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 80, 또는 적어도 100 그리고 최대 500, 최대 400, 최대 300, 최대 200, 또는 최대 150 뉴클레오티드, 그리고, 특히, 약 110 뉴클레오티드를 포함하거나 구성된다.
일부 구현예에서, 폴리(A) 서열은 A 뉴클레오티드로만 구성되어 있다. 일부 구현예에서, 원용에 의해 본원에 포함된, WO 2016/005324 A1에 개시된 바와 같이, 폴리(A) 서열은 필수적으로 A 뉴클레오티드들로 구성되어 있지만, 4가지 뉴클레오티드(A, C, G, 및 U) 중 무작위 서열로 개입되어 있다. 이러한 무작위 서열은 5 내지 50, 10 내지 30, 또는 10 내지 20 뉴클레오티드 길이일 수 있다. dA 뉴클레오티드로 필수적으로 구성된 DNA의 암호화 서열에 존재하지만, 4가지 뉴클레오티드 (dA, dC, dG, dT)의 동등한 분배를 가지고, 예를 들어, 5 내지 50 뉴클레오티드의 길이를 갖는 무작위 서열에 의해 개입된 폴리(A) 카세트는, DNA 수준에서, E. coli에서 플라스미드 DNA의 꾸준한 증식을 보이고, RNA 수준에서, 여전히 RNA 안정성 및 번역 효율을 뒷받침하는 관점에서 유익한 특성과 연관되어 있다.
일부 구현예에서, A 뉴클레오티드가 아닌 어떤 뉴클레오티드도 이의 3'-말단에서 폴리(A) 서열 옆에 있지 않고, 즉, A 외의 뉴클레오티드가 3' 말단에서 폴리(A) 서열을 가리거나 뒤따르지 않는다.
본 명세서의 맥락에서, 용어 "전사"는 DNA 서열에서 유전적 암호가 RNA로 전사되는 과정을 지칭한다. 이후 RNA는 펩티드 또는 단백질로 번역될 수 있다.
"엔코딩"은 뉴클레오티드의 정의된 서열 (즉, rRNA, tRNA 및 mRNA) 또는 아미노산의 정의된 서열 및 이로부터 유래된 생물학적 특성을 가지는, 생물학적 과정에서 다른 폴리머 및 거대분자의 합성을 위한 주형으로서의 역할을 하도록 하는, 유전자, cDNA 또는 mRNA와 같은, 폴리뉴클레오티드에서 뉴클레오티드의 특정 서열의 내재적 성질을 의미한다. 따라서, 만약 이 유전에 상응하는 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 단백질을 생산한다면, 유전자는 단백질을 엔코딩한다. mRNA 서열과 동일하고 일반적으로 서열 목록으로 제공되는 암호화 가닥 및 유전자 또는 cDNA의 전사를 위해 주형으로 사용되는 비-암호화 가닥 모두는 단백질 또는 이 유전자 또는 cDNA의 다른 산물을 엔코딩하는 것으로 언급될 수 있다.
본원에서 사용된 것과 같이 "내인성"은 유기체, 세포, 조직, 또는 시스템 내부에서 유래되거나 생산된 임의의 물질을 의미한다.
본원에서 사용된 것과 같이 "외인성"은 유기체, 세포, 조직, 또는 시스템 외부에서 유래되거나 생산된 임의의 물질을 의미한다.
본원에서 사용된 것과 같이 용어 "발현"은 특정 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 번역으로 정의된다.
본원에서 사용된 것과 같이, 용어 "연결된", "융합된" 또는 "융합"은 상호교환적으로 사용된다. 이들 용어는 2 이상의 요소 또는 구성성분 또는 도메인들이 함께 연결되는 것을 의미한다.
사이토카인
사이토카인은 세포 신호전달에 중요한 소형 단백질 (~5-20 kDa) 범주에 속한다. 이들의 방출은 이들 주변 세포의 거동에 영향을 미친다. 사이토카인은 면역조절제로서 자가분비 신호전달, 주변분비 신호전달 및 내분비 신호전달에 관여한다. 사이토카인은 케모카인, 인터페론, 인터루킨, 림포카인 및 종양 괴사 인자를 포함하지만, 일반적으로 (용어 측면에서 일부 중복되지만) 호르몬 또는 성장인자는 아니다. 사이토카인은 대식 세포, B 림프구, T 림프구 및 비만 세포와 같은 면역 세포 뿐 아니라 내피 세포, 섬유모세포 및 다양한 기질 세포를 포함하는 광범위한 세포들에 의해 생산된다. 소정의 사이토카인은 하나 이상의 세포 종류에 의해 생산될 수 있다. 사이토카인은 수용체를 통해 작용하며, 특히 면역 시스템에 중요하고; 사이토카인은 체액성 및 세포-기반 면역 반응 간의 균형을 조절하고, 이들은 특정 세포 집단의 성숙, 증식 및 반응을 조절한다. 일부 사이토카인은 복잡한 방식으로 다른 사이토카인의 작용을 강화하거나 저해한다.
IL2 및 IL2R
인터루킨-2 (IL2)는 항원-활성화된 T 세포의 증식을 유도하고 자연 살해 (NK) 세포를 자극하는, 사이토카인이다. IL2의 생물학적 활성은 세포 막에 걸쳐있는 3개의 폴리펩티드 서브유닛의 다중-서브유닛 IL2 수용체 복합체 (IL2R)를 통해 매개된다: p55 (IL2Rα, 알파 서브유닛, 또한 인간에서 CD25로 공지됨), p75 (IL2Rβ, 베타 서브유닛, 또한 인간에서 CD122로 공지됨) 및 p64 (IL2Rγ, 감마 서브유닛, 또한 인간에서 CD132로 공지됨). IL2에 대한 T 세포의 반응은, (1) IL2의 농도; (2) 세포 표면 상의 IL2R 분자의 개수; 및 (3) IL2에 의해 점유된 IL2R의 개수 (즉, IL2와 IL2R 간의 결합 상호작용의 친화성 (Smith, "Cell Growth Signal Transduction is Quantal" In Receptor Activation by Antigens, Cytokines, Hormones, and Growth Factors 766:263-271, 1995))를 포함하는, 다양한 인자들에 의존한다. IL2:IL2R 복합체는 리간드에 결합시 내재화되고, 상이한 구성성분들은 차별적인 분류를 거치게 된다. 정맥내 (i.v.) 볼루스 투여 시, IL2는 빠르게 전신에서 소거된다 (12.9분의 반감기로 초기 소거 단계를 거친 후 85분의 반감기로 느린 소거 단계) (Konrad et al., Cancer Res. 50:2009-2017, 1990).
진핵 세포에서, 인간 IL2는 153개의 아미노산의 전구체 폴리펩티드로 합성되고, 이로부터 20개의 아미노산이 제거되어 성숙한 분비된 IL2가 된다. 재조합 인간 IL2는 E. coli, 곤충 세포 및 포유류 COS 세포에서 생산된 바 있다.
암 환자에서 IL2의 전신 투여 결과는 이상적이지 않다. 15 내지 20%의 환자는 고 용량의 IL2에 객관적으로 반응하지만, 대다수가 그렇지 않으며, 다수가 구역질, 현기증, 저혈압 및 패혈증 쇼크를 포함하는 심각한 생명-위협 부작용을 경험한다. 고-용량 IL2 치료와 관련된 심각한 독성은 자연 살해 (NK) 세포의 활성에 크게 기인한다. 용량을 줄이고 투약 용법을 조정함으로써 혈청 농도를 낮추고자 하는 시도가 시도되었지만, 이러한 처치는 독성은 줄어들었지만 효과 역시 저하되었다.
본 명세서에 따르면, 특정 구현예들에서, 본원에 기술된 IL2 변이체 폴리펩티드는 약동학적 변형 기를 포함한다. 일 구현예에서, 본원에 기술된 IL2 변이체 부분 또는 변이에 약동학적 변형 기가 부착된다. 제조되는 분자는, 하기에서 "약동학적으로 (PK) 연장된 IL2"로 지칭되며, 유리 IL2에 비해 연장된 순환 반감기를 가진다. PK-연장된 IL2의 연장된 순환 반감기는 in vivo에서 혈청 IL2 농도가 치료학적 범위 내로 유지시키도록 하고, 잠재적으로 T 세포를 포함하는 여러 종류의 면역 세포의 개선된 활성화를 유발한다. PK-연장된 IL2는, 이의 우호적인 약동학적 프로파일로 인해, 비변형된 IL2와 비교해, 적은 빈도로, 더 장기간 투여될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "반감기"는, 예를 들어, 자연 기전에 의한 분해 및/또는 소거 또는 격리로 인해, 펩티드 또는 단백질과 같은 화합물의 혈청 또는 혈장 농도가 in vivo에서 50%까지 감소하는데 소요되는 시간을 의미한다. 본원에서 사용하기 적합한 PK-연장된 인터루킨 (IL)과 같은 PK-연장된 사이토카인은 in vivo에서 안정와 되었고, 그 반감기는, 예를 들어, 분해 및/또는 소거 또는 격리에 내성인 혈청 알부민 (예를 들어, HSA 또는 MSA)과의 융합에 의해 연장된다. 반감기는 약동학 분석과 같이 자체 공지된 임의의 수단으로 측정할 수 있다. 적합한 기법들은 당해 기술 분야의 당업자들에게 자명할 것이며, 이는 예를 들어 적정 용량의 아미노산 서열 또는 화합물을 개체에 적절하게 투여하는 단계; 일정한 간격으로 개체에서 혈액 시료 또는 다른 시료를 수집하는 단계; 상기 혈액 시료에서 아미노산 서열 또는 화합물의 수준 또는 농도를 확인하는 단계; 및 수득한 데이터로부터, 아미노산 서열 또는 화합물의 수준 또는 농도가 투여시 최초 수준과 비교해 50%까지 감소될 때까지의 시간을 계산하는 단계를 일반적으로 수반할 수 있다. 추가적인 상세 내용은, 예를 들어, Kenneth, A. et al., Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists and in Peters et al., Pharmacokinetic Analysis: A Practical Approach (1996)와 같은 표준 문헌에서 제공된다. 또한, Gibaldi, M. et al., Pharmacokinetics, 2nd Rev. Edition, Marcel Dekker (1982)를 참조한다.
본 명세서에 따르면, IL2 (선택적으로 PK-연장된 IL2의 부분으로서)는 자연적으로 발생된 IL 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. IL2는 인간 IL2일 수 있고, 임의의 척추 동물, 특히 임의의 포유동물로부터 유래될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "인간 IL2" 또는 "야생형 인간 IL2"는 나이브 또는 재조합된, 나이브 인간 IL2의 일반적으로 나타나는 133 아미노산 서열 (추가적으로 20개의 N-말단 아미노산으로 구성된, 신호 펩티드 제외)을 가진, E. coli에서 세포내 분획에서 단백질이 발현될 때 필수적으로 포함되는 부가적인 N-말단 메티오닌이 존재하거나 존재하지 않는, IL2를 의미하고, 이의 아미노산 서열은 Fujita, et. al, PNAS USA, 80, 7437-7441 (1983)에 개시되어 있다. 일 구현예에서, 인간 IL2는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 인간 IL2의 기능성 변이체는 SEQ ID NO: 1과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일 구현예에서, IL2의 기능성 변이체는 IL2 수용체 또는 알파 서브유닛 및/또는 베타/감마 서브유닛과 같은 IL2 수용체의 서브유닛에 결합한다.
본원에서 기술된 특정 구현예에서, IL2 변이체 부분 또는 변이는 이종성 폴리펩티드 (즉, IL2가 아니고, 바람직하게는 IL2 변이체가 아닌 폴리펩티드)에 융합된다. 이종성 폴리펩티드는 IL2의 순환 반감기를 증가시킬 수 있다. 하기의 추가적인 설명에서 논의되는 바와 같이, 순환 반감기를 증가시키는 폴리펩티드는 인간 또는 마우스 혈청 알부민과 같은 혈청 알부민일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "IL2 변이"는 IL2의 변이체 (이의 기능성 변이체 포함), 특히 IL2 단백질에 특이적인 치환이 이루어진 폴리펩티드를 의미한다. 일 구현예에서, 인간 IL2 단백질에의 치환은 적어도 αβγ IL2 수용체 복합체 (IL2Rαβγ)의 α 서브유닛과 접촉하는 위치에서 수행된다. 일 구현예에서, 이러한 위치는 야생형 인간 IL2에서 산성 또는 염기성 아미노산 잔기를 가지며, 여기서 아미노산 잔기가 야생형 인간 IL2에서 산성 아미노산 잔기인 경우, 치환은 염기성 아미노산 잔기에 의해 이루어지고, 아미노산 잔기가 야생형 인간 IL2에서 염기성 아미노산 잔기인 경우, 치환은 산성 아미노산 잔기에 의해 이루어진다. 특히 바람직한 구현예는 하기를 포함한다: 야생형 인간 IL2를 기준으로 야생형 인간 IL2에 따라 번호가 지정되는 경우, 위치 35에 라이신 (Lys) 잔기, 위치 43에 라이신 (Lys) 잔기, 위치 61에 글루탐산 (Glu) 잔기 또는 이들의 임의 조합.
예를 들어, IL2 변이는 또한 천연 IL2 폴리펩티드의 하나 이상의 위치에서 또는 다른 잔기에서 아미노산의 치환을 특징으로 할 수 있으며, 이러한 아미노산 치환으로, 예를 들어, 야생형 IL2와 비교해 IL2Rβγ에 대해 상대적으로 증가된 친화도가 달성된다 (즉, IL2 변이는, mutCD25 돌연변이와 더불어, "mutβγ" 돌연변이를 또한 포함함). 이러한 돌연변이는 강력한 IL2 신호전달 작용제이다. 이들 돌연변이는 IL2Rβ 및/또는 IL2Rγ와 접촉하는 아미노산 잔기에 존재할 수 있다.
다양한 구현예들에서, 본 발명에 기술된 IL2 변이는, 야생형 IL2와 비교해, 야생형 IL2의 위치 24, 65, 74, 80, 81, 85, 86, 89, 92, 및 93에서 하나 이상의 잔기의 치환 차이를 가질 수 있다. 치환된 아미노산 잔기(들)는, 필수적인 것은 아니나, 보존적인 치환일 수 있다.
예를 들어, 돌연변이는 다음과 같을 수 있다: I24V, P65H, Q74R, Q74H, Q74N, Q74S, L80F, L80V, R81I, R81T, R81D, L85V, I86V, I89V, I92F, V93I.
일 구현예에서, 변이가 다음과 같은 아미노산 치환 세트를 포함하는 IL2 변이가 제공된다: 80F/81D/85V/86V/92F. 변이는 아미노산 치환 42A를 더 포함할 수 있다. 변이는 다음과 같은 아미노산 치환들 중 하나 이상을 더 포함할 수 있다: 24V, 65H, 74R, 74H, 74N, 74S, 89V, 93I.
일부 구현예에서, 변이는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 치환의 세트를 포함하는 IL2 변이가 제공된다:
(i) 74N, 80F, 81D, 85V, 86V, 89V, 92F;
(ii) 74H, 80F, 81D, 85V, 86V, 92F;
(iii) 74S, 80F, 81D, 85V, 86V, 92F;
(iv) 74N, 80F, 81D, 85V, 86V, 92F;
(v) 80F, 81D, 85V, 86V, 92F;
(vi) 80F, 81D, 85V, 86V, 89V, 92F, 93I;
(vii) 18R, 22E, 80F, 81D, 85V, 86V, 89V, 92F, 93I, 126T;
(viii) 18R, 22E, 74S, 80F, 81T, 85V, 86V, 89V, 92F, 93I, 126T.
"야생형 IL2에 따라 번호가 지정되는 경우"는, 아미노산이 야생형 IL2의 성숙 서열에서 정상적으로 발생되는 위치에 따라 선택 아미노산을 식별하는 것을 의미한다. 삽입 또는 결손이 IL2 변이에 이루어지는 경우, 당해 기술 분야의 당업자라면, 특정 위치에서 정상적으로 생성되는 아미노산이 변이에서 위치 변동될 수 있음을 알 것이다. 그러나, 변동된 아미노산의 위치는 양옆 아미노산을 검토하여, 야생형 IL2에서 양옆 아미노산과 연관시켜 쉽게 결정할 수 있다.
본원에 기술된 IL2 변이체 폴리펩티드 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 당해 기술 분야에 공지된 임의의 적절한 방법으로 제조할 수 있다. 이러한 방법은 IL2를 엔코딩하는 핵산에 적절한 뉴클레오티드 변화를 도입하는 것을 포함하거나, 또는 IL2 폴리뉴클레오티드 또는 단백질의 in vitro 합성에 의한 것을 포함한다. 예를 들어, 본원에 기술된 IL2 변이체 폴리펩티드를 엔코딩하는 DNA 서열을 구축하고, 그 서열을 적절하게 형질전환된 숙주 또는 임의의 다른 적절한 발현 시스템에서 발현시킬 수 있다. 이 방법은 본원에 기술된 IL2 변이체 폴리펩티드 및/또는 이를 암호화하는 RNA를 생산할 것이다. 그러나, 본원에 기술된 IL2 변이체 폴리펩티드 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 또한 다소 바람직하지 않지만 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다.
본원에 기술된 IL2 변이체 폴리펩티드는 IL2 변이체 폴리펩티드가 IL2Rα'
γ(α'은 본원에서 IL2R의 변이체 알파 서브유닛임)에 결합하는 친화도보다 낮은 친화도로 IL2Rαβγ에 결합할 수 있다. 본원에서 기술된 IL2Rα
γ에 대한 IL2 변이체 폴리펩티드의 친화도는 IL2 변이체 폴리펩티드가 IL2Rα'
γ에 결합하는 친화도보다 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 50배, 또는 적어도 100배 낮을 수 있다.
본원에 기술된 IL2 변이체 폴리펩티드는 야생형 IL2가 IL2Rαβγ에 결합하는 친화도보다 낮은 친화도로 IL2Rαβγ에 결합할 수 있다. 본원에서 기술된 IL2Rα
γ에 대한 IL2 변이체 폴리펩티드의 친화도는 야생형 IL2가 IL2Rα
γ에 결합하는 친화도보다 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 50배, 또는 적어도 100배 낮을 수 있다.
본원에 기술된 IL2 변이체 폴리펩티드는 야생형 IL2가 IL2Rβγ에 결합하는 친화도보다 더 큰 친화도로 IL2Rβγ에 결합할 수 있다. 본원에서 기술된 IL2R
γ에 대한 IL2 변이체 폴리펩티드의 친화도는 야생형 IL2가 IL2R
γ에 결합하는 친화도보다 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 50배, 또는 적어도 100배 더 클 수 있다.
본원에 기술된 IL2 변이체 폴리펩티드는, 특히 작용 T 세포 및/또는 NK 세포를 자극하는 능력을 비교할 때, 야생형 IL2에 비해 감소된 조절 T 세포 자극 능력을 가질 수 있다.
본원에 기술된 IL2 변이체 폴리펩티드는 야생형 IL2에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 그 보다 많은 수의 아미노산 잔기의 돌연변이 (예, 결손, 부가 또는 치환)를 가질 수 있다.
본원에 기술된 IL2 변이체 폴리펩티드는 야생형 IL2와 적어도 약 50%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 87%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 본원에 기술된 IL2 변이체 폴리펩티드는 다음과 같은 특징들 중 하나 이상, 바람직하게는 모두 가진다:
1) IL2Rβγ에서의 작용제 기능. 이 특성은 IL2 의존적인 세포주를 이용한 in vitro 증식 분석으로 직접 평가할 수 있다.
2) 야생형 IL2와 비교해, in vitro 및/또는 in vivo 조절 T 세포 집단을 자극하는 능력의 저하. 이 특성은, 예를 들어, 조절 T 세포의 증폭을 유도하는 변이의 능력을 야생형 IL2와 비교 연구함으로써, 평가할 수 있다.
3) 동물 모델에서 천연 IL2에 비해 증가된 치료학적 효과. 이 특성은, 예를 들어, 본원에 기술된 IL2 변이체 폴리펩티드의 항종양 또는 항-전이 효과를 단일 요법으로서 이식가능한 종양 모델 (예, B16 흑색종)에서 야생형 IL2와 비교함으로써, 평가할 수 있다. 이는 또한, 관심 백신에 대한 세포성 및/또는 체액성 반응의 효과 강화를 통해 평가할 수 있다.
CD8 T 세포의 감작을 포함하는 면역 반응이 형성되었을 때 IL2 민감성을 높이도록 활성화되면, 다수의 면역 세포는 IL2Rαβγ를 일시적으로 상향 조절한다. IL2에 의한 일부 IL2Rαβγ 결합이 필수적일 수 있으므로, 본 발명은 야생형 IL2와 같은, IL2Rβγ에 대해 감소된 친화성을 나타내지 않는 IL2 (이의 기능성 변이체 포함)와 조합하여, 본원에 기술된 IL2 변이체 폴리펩티드의 혼합물의 사용을 고려한다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 IL2 변이체 폴리펩티드와 IL2Rβγ에 대해 감소된 친화도를 나타내지 않는 IL2의 몰 비는 50:1 내지 1:1, 20:1 내지 2:1, 10:1 내지 5:1 또는 5:1 내지 3:1이다.
본 명세서에 따르면, IL2 수용체 (IL2R)의 알파 서브유닛 또는 IL2Rα는 자연적으로 발생되는 IL2Rα 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. IL2Rα는 인간 IL2Rα일 수 있고, 임의의 척추 동물, 특히 임의의 포유류 유래일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "인간 IL2Rα" 또는 "야생형 인간 IL2Rα"는 일반적으로 발생되는 천연 인간 IL2Rα의 251개 아미노산 서열을 갖는(부가적인 21개의 N-말단 아미노산으로 구성된 신호 펩티드 제외), 천연 또는 재조합 IL2Rα를 의미한다. 천연이든 재조합이든, 부가적인 21 N-말단 아미노산으로 구성된 신호 펩티드를 포함하는 인간 IL2Rα는 SEQ ID NO: 4로 표시되는 272 아미노산 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 인간 IL2Rα는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산을 포함한다. 일 구현예에서, 인간 IL2Rα의 기능성 변이체는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO: 4와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일 구현예에서, IL2Rα의 기능성 변이체, 선택적으로 IL2Rαβγ의 부분으로서, IL2에 결합한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "IL2Rα 변이"는 IL2Rα의 변이체 (이의 기능성 변이체를 포함), 특히, 특정 치환이 IL2Rα 단백질에 이루어진 폴리펩티드를 의미한다. 일 구현예에서, 인간 IL2Rα 단백질에의 치환은 적어도 IL2와 접촉하는 위치에서 이루어진다. 일 구현예에서, 이러한 위치는 야생형 인간 IL2Rα에서 산성 또는 염기성 아미노산 잔기를 갖고, 만약 야생형 인간 IL2Rα에서 아미노산 잔기가 산성 아미노산 잔기이면, 치환은 염기성 아미노산 잔기에 의한 것이고, 만약 야생형 인간 IL2Rα에서 아미노산 잔기가 염기성 아미노산 잔기이면 치환은 산성 아미노산 잔기에 의한 것이다. 특정 바람직한 구현예는 다음을 포함한다: 야생형 인간 IL2Rα를 기준으로 야생형 인간 IL2Rα에 따라 번호가 지정되는 경우, 위치 1에서 글루탐산 (Glu) 잔기, 위치 29에서 글루탐산 (Glu) 잔기, 및 위치 38에서 라이신 (Lys) 잔기 또는 이들의 임의의 조합.
IL2Rα 변이는 나머지, 비-치환된 잔기들에서 야생형 IL2Rα와 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다. 그러나, IL2Rα 변이는 천연 IL2Rα 폴리펩티드 사슬의 나머지 잔기들의 하나 이상의 위치에서 아미노산 삽입, 결손, 치환 및 변형을 또한 특징으로 할 수 있다.
"야생형 IL2Rα에 따라 번호가 지정되는 경우"는, 아미노산이 야생형 IL2Rα의 성숙 서열에서 정상적으로 발생되는 위치에 따라 선택 아미노산을 식별하는 것을 의미한다. 삽입 또는 결손이 IL2Rα변이에 이루어지는 경우, 당해 기술 분야의 당업자라면, 특정 위치에서 정상적으로 생성되는 아미노산이 변이에서 위치 변동될 수 있음을 알 것이다. 그러나, 변동된 아미노산의 위치는 양옆 아미노산을 검토하여, 야생형 IL2Rα에서 양옆 아미노산과 연관시켜 쉽게 결정할 수 있다.
본원에 기술된 IL2Rα 변이체 폴리펩티드 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 당해 기술 분야에 공지된 임의의 적절한 방법으로 제조할 수 있다. 이러한 방법은 IL2Rα를 엔코딩하는 핵산에 적절한 뉴클레오티드 변화를 도입하는 것을 포함하거나, 또는 IL2Rα 폴리뉴클레오티드 또는 단백질의 in vitro 합성에 의한 것을 포함한다. 예를 들어, 본원에 기술된 IL2Rα 변이체 폴리펩티드를 엔코딩하는 DNA 서열을 구축하고, 그 서열을 적절하게 형질전환된 숙주 또는 임의의 다른 적절한 발현 시스템에서 발현시킬 수 있다. 이 방법은 본원에 기술된 IL2Rα 변이체 폴리펩티드 및/또는 이를 엔코딩하는 RNA를 생산할 것이다. 그러나, 본원에 기술된 IL2Rα 변이체 폴리펩티드 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 또한 다소 바람직하지 않지만 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다.
PK-연장 기
본원에 기술된 IL2 변이체 폴리펩티드는 IL2 변이체 부분과 이종성 폴리펩티드 (즉, IL2 또는 이의 변이체가 아닌 폴리펩티드)를 포함하는 융합 또는 키메라 폴리펩티드로서 제조될 수 있다. IL2 변이체를 PK-연장 기와 융합하여, 순환 반감기를 높일 수 있다. PK-연장 기에 대한 비-제한적인 예들은 아래에 기술되어 있다. 사이토카인의 순환 반감기를 높이는 다른 PK 군 또는 이의 변이체 역시 본 명세서에 적용가능한 것으로 이해되어야 한다. 특정 구현예에서, PK-연장 기는 혈청 알부민 도메인 (예를 들어, 마우스 혈청 알부민, 인간 혈청 알부민)이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "PK"는 "약동학"의 두문자이고, 예를 들어 개체에 의한 흡수, 분배, 대사 및 소거를 포함하는 화합물의 특성들을 포괄한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "PK-연장 기"는, 생물학적 활성 분자와 융합되거나 함께 투여되었을 때, 생물학적 활성 분자의 순환 반감기를 증가시키는하는 단백질, 펩티드 또는 모이어티를 지칭한다. PK-연장 기의 예로는 혈청 알부민 (예를 들어, HSA), 면역글로불린 Fc 또는 이의 Fc 단편 및 이의 변이체, 트랜스페린 및 이의 변이체, 및 인간 혈청 알부민 (HSA) 결합제 (미국 특허 공개공보 2005/0287153 및 2007/0003549에 개시된 것)을 포함한다. 다른 예시적인 PK-연장 기들은 Kontermann, Expert Opin Biol Ther, 2016 Jul;16(7):903-15 에 기술되어 있으며, 이들 문헌의 전체 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 본원에서 사용된 바와 같이, "PK-연장된 사이토카인"은 PK-연장 기와 조합된 사이토카인 모이어티를 지칭한다. 일 구현예에서, PK-연장된 사이토카인은 사이토카인 모이어티가 PK-연장 기와 연결되거나 융합된 융합 단백질이다. 본원에서 사용된 바와 같이, "PK-연장된 IL"은 PK-연장 기와 조합된 인터루킨 (IL) 모이어티(IL 변이체 모이어티 포함)를 지칭한다. 일 구현예에서, PK-연장된 IL은 IL 모이어티가 PK-연장 기와 연결되거나 융합된 융합 단백질이다. 예시적인 융합 단백질은 IL2 모이어티가 HSA와 융합된 HSA/IL2 융합체이다.
특정 구현예에서, PK-연장된 IL의 혈청 반감기는 IL 단독 (즉, PK-연장 기가 융합되지 않은 IL)에 비해 증가된다. 특정 구현예에서, PK-연장된 IL의 혈청 반감기는 IL 단독의 혈청 반감기에 비해 적어도 20, 40, 60, 80, 100, 120, 150, 180, 200, 400, 600, 800, 또는 1000% 더 길다. 특정 구현예에서, PK-연장된 IL의 혈청 반감기는 IL 단독의 혈청 반감기보다 적어도 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 10배, 12배, 13배, 15배, 17배, 20배, 22배, 25배, 27배, 30배, 35배, 40배 또는 50배 더 길다. 특정 구현예에서, PK-연장된 IL의 혈청 반감기는 적어도 10시간, 15시간, 20시간, 25시간, 30시간, 35시간, 40시간, 50시간, 60시간, 70시간, 80시간, 90시간, 100시간, 110시간, 120시간, 130시간, 135시간, 140시간, 150시간, 160시간 또는 200시간이다.
특정 구현예에서, PK-연장 기는 혈청 알부민 또는 이의 단편 또는 혈청 알부민 또는 이의 단편의 변이체 (이들 모두 본 발명의 목적에서 용어 "알부민"에 포함됨)을 포함한다. 본원에 기술된 폴리펩티드는 알부민 (또는 이의 단편 또는 변이체)에 융합되여 알부민 융합 단백질이 제조될 수 있다. 이러한 알부민 융합 단백질은 미국 특허 공개번호 20070048282에 기술되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "알부민 융합 단백질"은 적어도 하나의 알부민 분자 (또는 이의 단편 또는 변이체)를 치료 단백질, 특히 IL2 (또는 이의 변이체)와 같은 단백질의 적어도 하나의 분자에 융합함으로써 만들어지는 단백질을 지칭한다. 알부민 융합 단백질은 치료 단백질을 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드가 알부민을 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드와 인-프래임으로 연결된 핵산의 번역에 의해 제조될 수 있다. 치료 단백질 및 알부민은, 알부민 융합 단백질의 일부인 경우, 알부민 융합 단백질의 "부분", "영역" 또는 "모이어티" (예, "치료 단백질 부분" 또는 "알부민 단백질 부분")으로서 각각 언급될 수 있다. 매우 바람직한 구현예에서, 알부민 융합 단백질은 적어도 하나의 치료 단백질 (비-제한적으로 치료 단백질의 성숙 형태를 포함) 및 적어도 하나의 알부민 분자 (알부민의 성숙한 형태를 포함)를 포함한다. 일 구현예에서, 알부민 융합 단백질은 투여된 RNA의 표적 기관의 세포와 같은 숙주 세포, 예를 들어 간 세포에 의해 처리되어, 순환계로 분비된다. RNA 발현에 사용되는 숙주 세포의 분비 경로에서 발생하는 초기 알부민 융합 단백질의 처리는 신호 펩티드 절단; 이황화 결합 형성; 적절한 접힘; 탄수화물의 부가 및 가공 처리 (예, N- 및 O-연결된 당화); 특이적인 단백질분해성 절단; 및/또는 다량체 단백질로의 조립을 포함할 수 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 알부민 융합 단백질은 바람직하게는 특히 N-말단에 신호 펩티드를 가진 비-가공된 형태로 RNA에 의해 엔코딩되며, 이후 세포에 의해 분비되어 바람직하게는 특히 신호 펩티드가 절단된 가공된 형태로 존재한다. 가장 바람직한 구현예에서, "알부민 융합 단백질의 가공된 형태"는 본 발명에서 "성숙한 알부민 융합 단백질"로도 지칭되는 N-말단 신호 펩티드의 절단을 거친 알부민 융합 단백질 생성물을 지칭한다.
바람직한 구현예에서, 치료 단백질을 포함하는 알부민 융합 단백질은 알부민이 융합되지 않은 동일한 치료 단백질의 혈장 안정성과 비교해 더 높은 혈장 안정성을 가진다. 혈장 안정성은 전형적으로 치료 단백질이 in vivo에 투여되어 혈류로 운반된 후 치료 단백질이 분해되어 혈류로부터 신장 또는 간과 같은 장기로 흡수되어, 궁극적으로 치료 단백질이 신체에서 소거되는 시간을 의미한다. 혈장 안정성은 혈류에서의 치료 단백질의 반감기 측면에서 계산된다. 혈류에서 치료 단백질의 반감기는 당해 기술 분야에 공지된 통상적인 분석으로 쉽게 측정할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "알부민"은, 알부민의 하나 이상의 기능적인 활성 (예를 들어, 생물학적 활성)을 가진, 알부민 단백질 또는 아미노산 서열 또는 알부민 단편 또는 변이체를 일괄하여 지칭한다. 특히, "알부민"은 인간 알부민 또는 이의 단편 또는 변이체, 특히 인간 알부민의 성숙한 형태, 또는 기타 척추 동물로부터 유래된 알부민 또는 이의 단편, 또는 이들 분자의 변이체를 지칭한다. 알부민은 임의의 척추동물, 특히 임의의 포유류, 예를 들어, 인간, 마우스, 소, 양 또는 돼지로부터 유래될 수 있다. 비-포유류 알부민으로는, 비-제한적으로, 암탉 및 연어를 포함한다. 알부민 융합 단백질의 알부민 부분은 치료 단백질 부분과는 다른 동물로부터 유래될 수 있다.
특정 구현예에서, 알부민은 US 5,876,969, WO 2011/124718, WO 2013/075066, 및 WO 2011/0514789에 기술된 바와 같이, 인간 혈청 알부민 (HSA), 또는 이의 단편 또는 이의 변이체이다.
용어, 인간 혈청 알부민 (HSA) 및 인간 알부민 (HA)은 본원에서 상호 호환적으로 사용된다. 용어 "알부민 및 "혈청 알부민"은 더 광의적으로 사용되며, 인간 혈청 알부민 (및 이의 단편 및 변이체)뿐 아니라 다른 종으로부터 유래된 알부민 (및 이의 단편 및 변이체)를 포괄한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 치료 단백질의 치료학적 활성 또는 혈장 안정성을 늘리는데 충분한 알부민의 단편은, 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분의 혈장 안정성이, 비-융합 상태에서의 혈장 안정성과 비교해, 연장 또는 길어지도록, 단백질의 치료학적 활성 또는 혈장 안정성을 안정화 또는 연장하는 데에 길이 또는 구조에서 충분한 알부민의 단편을 의미한다.
알부민 융합 단백질의 알부민 부분은 알부민 서열의 전장을 포함할 수 있거나, 치료학적 활성 또는 혈장 안정성을 안정화 또는 연장시킬 수 있는 이의 하나 이상의 단편을 함유할 수 있다. 이러한 단편은 아미노산 10개 이상의 길이일 수 있거나, 또는 알부민 서열로부터 유래되는 약 15개, 20개, 25개, 30개, 50개, 또는 그 초과의 연속적인 아미노산을 포함할 수 있거나, 또는 알부민의 특정 도메인들 일부 또는 전체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 첫 2개의 면역글로불린-유사 도메인에 걸쳐있는 HAS의 하나 이상의 단편이 사용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, HSA 단편은 HSA의 성숙한 형태이다.
일반적으로 말해, 알부민 단편 또는 변이체는 적어도 아미노산 100개의 길이, 바람직하게는 적어도 아미노산 150개의 길이일 것이다.
본 명세서에 따르면, 알부민은 자연적으로 발생되는 알부민 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. 알부민은 인간 알부민일 수 있으며, 임의의 척추동물, 특히 임의의 포유류로부터 유래될 수 있다. 일 구현예에서, 알부민은 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 SEQ ID NO: 3과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
바람직하게는, 알부민 융합 단백질은 N-말단 부분으로서 알부민을, 그리고 C-말단 부분으로서 치료 단백질을 포함한다. 대안적으로, C-말단 부분으로서 알부민을, 그리고 N-말단 부분으로서 치료 단백질을 포함하는, 알부민 융합 단백질 역시 이용할 수 있다.
일 구현예에서, 치료 단백질(들)은 (a) 펩티드 링커(들)를 통해 알부민에 연결된다. 융합되는 부분들 간의 링커 펩티드는 모이어티들 간에 더 강력한 물리적인 분리를 제공하여, 치료 단백질 부분의, 예를 들어 이의 동족 수용체에의 결합에 대하여, 접근성을 극대화할 수 있다. 링커 펩티드는, 유연하거나 또는 더 뻣뻣하도록 하는 아미노산으로 구성될 수 있다. 링커 서열은 프로테아제에 의해 또는 화학적으로 절단가능할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "Fc 영역"은 2개의 중쇄로 된 각각의 Fc 도메인 (또는 Fc 모이어티)들에 의해 형성된 천연 면역글로불린의 부분을 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "Fc 도메인"은 단일 면역글로불린 (Ig) 중쇄 부분 또는 단편을 의미하며, Fc 도메인은 Fv 도메인을 포함하지 않는다. 특정 구현예에서, Fc 도메인은 파파인 절단부의 바로 상류의 힌지 영역에서 시작해, 항체의 C-말단에서 끝난다. 이에 따라, 완전한 Fc 도메인은 적어도 힌지 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, Fc 도메인은 하기 중 적어도 하나를 포함한다: 힌지 (예를 들어, 상부, 중간 및/또는 하부 힌지 영역) 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, CH4 도메인 또는 이의 변이체, 부분 또는 단편. 특정 구현예에서, Fc 도메인은 완전한 Fc 도메인 (즉, 힌지 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인)을 포함한다. 특정 구현예에서, Fc 도메인은 CH3 도메인 (또는 이의 부분)에 융합된 힌지 도메인 (또는 이의 부분)을 포함한다. 특정 구현예에서, Fc 도메인은 CH3 도메인 (또는 이의 부분)과 융합된 CH2 도메인 (또는 이의 부분)을 포함한다. 특정 구현예에서, Fc 도메인은 힌지 도메인 (또는 이의 부분) 및 CH3 도메인 (또는 이의 부분)으로 구성된다. 특정 구현예에서, Fc 도메인은 힌지 도메인 (또는 이의 일부) 및 CH3 도메인 (또는 이의 일부)으로 구성된다. 특정 구현예에서, Fc 도메인은 CH2 도메인 (또는 이의 부분)과 CH3 도메인으로 구성된다. 특정 구현예에서, Fc 도메인은 힌지 도메인 (또는 이의 부분)과 CH2 도메인 (또는 이의 부분)으로 구성된다. 특정 구현예에서, Fc 도메인에는 적어도 CH2 도메인의 일부 (예를 들어, CH2 도메인 전체 또는 일부)가 존재하지 않는다. 본원에서 Fc 도메인은 일반적으로 면역글로불린 중쇄의 Fc 도메인 전체 또는 일부를 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 이는 전체 CH1, 힌지, CH2 및/또는 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드 뿐 아니라 오직, 예를 들어 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 이러한 폴리펩티드의 단편을 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다. Fc 도메인은, 비-제한적으로, 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE 또는 IgM 항체를 포함하는, 임의 종의 및/또는 임의의 서브타입의 면역글로불린으로부터 유래될 수 있다. Fc 도메인은 천연 Fc 및 Fc 변이체 분자를 포괄한다. 본 발명에 기술된 바와 같이, 당해 기술 분야의 당업자는 임의의 Fc 도메인이 자연적으로 생성되는 면역글로불린 분자의 천연 Fc 도메인과 아미노산 서열이 다르도록 변형될 수 있음을 이해할 것이다. 특정 구현예에서, Fc 도메인은 감소된 작용 세포 기능 (예를 들어, FcγR 결합성)을 가진다.
본원에 기술된 폴리펩티드의 Fc 도메인은 여러가지 면역글로불린 분자들로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드의 Fc 도메인은 IgG1 분자로부터 유래되는 CH2 및/또는 CH3 도메인 및 IgG3 분자로부터 유래되는 힌지 영역을 포함할 수 있다. 다른 예로, Fc 도메인은 일부는 IgG1 분자로부터 유래되고 일부는 IgG3 분자로부터 유래된 키메라 힌지 영역을 포함할 수 있다. 다른 예로, Fc 도메인은 일부는 IgG1 분자로부터, 일부는 IgG4 분자로부터 유래되는 키메라 힌지를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, PK-연장 기는 Fc 도메인 또는 이의 단편 또는 Fc 도메인의 변이체 또는 이의 단편 (이들 모두는 본 명세서의 목적을 위하여 용어 "Fc 도메인"으로 포함됨)을 포함한다. Fc 도메인은 항원에 결합하는 가변 영역을 함유하지 않는다. 본 명세서에 사용하기에 적합한 Fc 도메인은 수많은 여러가지 원천으로부터 수득될 수 있다. 특정 구현예에서, Fc 도메인은 인간 면역글로불린으로부터 유래된다. 특정 구현예에서, Fc 도메인은 인간 IgG1 불변 영역으로부터 유래된다. 그러나, Fc 도메인은 예를 들어, 설치류 (예를 들어, 마우스, 랫, 토끼, 기니피그) 또는 비-인간 영장류 (예를 들어, 침팬지, 마카크) 종을 포함하는 다른 포유류 종의 면역글로불린으로부터 유래된 것일 수 있다.
아울러, Fc 도메인 (또는 이의 단편 또는 변이체)은, IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE를 포함하는 임의 면역글로불린 계열로부터, 그리고 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하는 임의의 면역글로불린 이소형으로부터 유래될 수 있다.
다양한 Fc 도메인 유전자 서열들 (예, 마우스 및 인간 불변 영역 유전자 서열)이 공개적으로 접근가능한 기탁 형태로 이용가능하다. Fc 도메인을 포함하는 불변 영역 도메인은 특정 작용세포 기능 및/또는 면역원성을 줄이기 위한 특정 변형이 결여된 것으로 선택될 수 있다. 많은 항체 서열 및 항체-엔코딩 유전자들이 공개되어 있으며, 적절한 Fc 도메인 서열 (예, 힌지, CH2 및/또는 CH3 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체)을 당해 기술 분야에서 인지되는 기술을 이용해 이들 서열로부터 유래할 수 있다.
특정 구현예에서, PK-연장 기는 US2005/0287153, US2007/0003549, US2007/0178082, US2007/0269422, US2010/0113339, WO2009/083804, 및 WO2009/133208에 기술된 것과 같은 혈청 알부민 결합 단백질이며, 이들 문헌은 그 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 특정 구현예에서, PK-연장 기는 US 7,176,278 및 US 8,158,579에 기술된 바와 같이 트랜스페린이며, 이들 문헌은 그 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 특정 구현예에서, PK-연장 기는 US2007/0178082, US2014/0220017, 및 US2017/0145062에 기술된 바와 같은 혈청 면역글로불린 결합 단백질이며, 이 문헌은 그 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 특정 구현예에서, PK-연장 기는 US2012/0094909에 기술된 바와 같이 혈청 알부민에 결합하는 파이브로넥틴 (Fn)-기반의 스캐폴드 도메인 단백질이며, 이 문헌은 그 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 파이브로넥틴-기반의 스캐폴드 도메인 단백질의 제조 방법은 또한 US2012/0094909에 기술되어 있다. Fn3-기반의 PK-연장 기에 대한 비-제한적인 예는 Fn3(HSA), 즉, 인간 혈청 알부민에 결합하는 Fn3 단백질이다.
특정 측면에서, 본 발명에 따라 이용하기 적합한 PK-연장된 IL은 하나 이상의 펩티드 링커를 사용할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "펩티드 링커"는 폴리펩티드 사슬의 선형 아미노산 서열에서 2 이상의 도메인 (예, PK-연장된 모이어티 및 IL2와 같은 IL 모이어티)을 연결하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 예를 들어, 펩티드 링커는 IL2 모이어티를 HSA 도메인에 연결시키는 데에 사용될 수 있다.
예를 들어 IL2에 PK-연장 기를 융합하는데 적합한 링커는 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있다. 예시적인 링커로는 글리신-세린-폴리펩티드 링커, 글리신-프롤린-폴리펩티드 링커 및 프롤린-알라닌 폴리펩티드 링커를 포함한다. 특정 구현예에서, 링커는 글리신-세린-폴리펩티드 링커, 즉 글리신 및 세린 잔기로 구성된 펩티드이다.
전술한 이종성 폴리펩티드와 아울러 또는 그 대신, 본원에 기술된 IL2 변이체 폴리펩티드는 "표지" 또는 "리포터"를 엔코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 표지 또는 리포터 유전자의 예로는 β-락타마제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT), 아데노신 데아미나제 (ADA), 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제, 다이하이드로폴레이트 리덕타제 (DHFR), 히그로마이신-B-포스포트랜스퍼라제 (HPH), 티미딘 키나제 (TK), β-갈락토시다제 및 크산틴 구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (XGPRT)를 포함한다.
항원 수용체
본원에서 기술된 IL2R 변이체 폴리펩티드를 발현하도록 변형(예를 들어, 치료받을 개체의 ex vivo/in vitro 또는 in vivo에서)될 수 있는 면역 작용 세포와 같은 본원에서 기술된 세포들은, 특히 표적 세포 상에 존재하거나 표적 세포에 의해 제시될 때, 항원 또는 이의 처리 산물에 결합하는 T 세포 수용체 (TCR) 또는 키메라 항원 수용체 (CAR)와 같은 항원 수용체를 발현할 수 있다. 세포는 자연적으로 항원 수용체를 발현하거나 항원 수용체를 발현하도록 변형(예를 들어, 치료받을 개체의 ex vivo/in vitro 또는 in vivo에서)될 수 있다. 일 구현예에서, 본원에 기술된 IL2R 변이체 폴리펩티드를 발현하도록 하는 변형 또는 항원 수용체를 발현하도록 하는 변형은 ex vivo/in vitro에서, 동시에 또는 다른 시점에 이루어질 수 있다. 이후에, 변형된 세포는 환자에게 투여될 수 있다. 일 구현예에서, 본원에서 기술된 IL2R 변이체 폴리펩티드를 발현하도록 한 변형은 ex vivo/in vitro에서 이루어지고, 그 후 환자에 세포가 투여되고, 항원 수용체를 발현하도록 한 변형이 in vivo에서 이루어진다. 일 구현예에서 항원 수용체를 발현하도록 한 변형은 ex vivo/in vitro에서 이루어지고, 그 후 환자에 세포가 투여되고, 본원에서 기술된 IL2R 변이체 폴리펩티드를 발현하도록 한 변형이 in vivo에서 이루어진다. 일 구현예에서, 본원에서 기술된 IL2R 변이체 폴리펩티드를 발현하도록 한 변형 및 항원 수용체를 발현하도록 한 변형은 in vivo에서 동시에 또는 다른 시점에 이루어진다. 세포는 환자의 내인성세포일 수 있거나 환자에 투여되었을 수 있다.
키메라 항원 수용체
CAR-변형된 T 세포는 사실상 임의의 종양 항원을 표적으로 하도록 조작될 수 있기 때문에 키메라 항원 수용체를 발현하는 CAR-조작된 T 세포를 이용한 입양 세포 전달 요법은 유망한 항-암 치료법이다. 예를 들어, 환자의 T 세포는 환자의 종양 세포 상의 항원에 특이적으로 향하는 CARs를 발현하도록 유전적으로 조작(유전적으로 변형)되어 환자에게 재 주입될 수 있다.
본 발명에 따르면, 용어 "CAR" (또는 "키메라 항원 수용체")는 "키메라 T 세포 수용체" 및 "인공 T 세포 수용체"와 유의어이고 암 세포와 같은 표적 세포 상의 표적 구조물 (예를 들어, 항원)을 인식, 즉 결합하는 단일 분자 또는 복합체를 포함하는 인공 수용체에 관한 것이고 (예를 들어, 항원 결합 도메인의 표적 세포의 표면에서 발현되는 항원에의 결합에 의함), 세포 표면 상에 상기 CAR를 발현하는 T 세포와 같은 면역 작용 세포에 특이성을 부여할 수 있다. 바람직하게, CAR에 의한 표적 구조의 인식은 상기 CAR를 발현하는 면역 작용 세포의 활성을 불러일으킨다. CAR는 하나 이상의 단백질 유닛을 포함하고, 상기 단백질 유닛은 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 도메인을 포함한다. 용어 "CAR"는 T 세포 수용체를 포함하지 않는다.
CAR는 일반적으로 CAR의 세포외 도메인의 부분인, 항원 결합 모이어티 또는 항원 결합 도메인으로도 불리는, 표적-특이적 결합 요소를 포함한다. 항원 결합 도메인은 특정 질환 상태와 연관된 표적 세포 상의 세포 표면 표지로서 작용하는 리간드를 인식한다. 구체적으로, 본 발명의 CAR는 종양 세포와 같은 질환에 걸린 세포의 종양 항원과 같은 항원을 표적으로 한다.
일 구현예에서, CAR에서 결합 도메인은 항원에 특이적으로 결합한다. 일 구현예에서, CAR에서 결합 도메인이 결합하는 항원은 암 세포 (종양 항원)에서 발현된다. 일 구현예에서, 항원은 암 세포의 표면에 발현된다. 일 구현예에서, 결합 도메인은 세포외 도메인 또는 항원의 세포외 도메인에서의 에피토프에 결합한다. 일 구현예에서, 결합 도메인은 살아있는 세포의 표면 상에 존재하는 항원의 천연 에피토프에 결합한다.
본 발명의 일 구현예에서, 항원 결합 도메인은 항원에 대한 특이성을 가진 면역글로불린의 중쇄의 가변 영역 (VH) 및 항원에 대한 특이성을 가진 면역글로불린의 경쇄의 가변 영역(VL)을 포함한다. 일 구현예에서, 면역글로불린은 항체이다. 일 구현예에서, 상기 중쇄 가변 영역 (VH) 및 상응하는 경쇄 가변 영역 (VL)은 펩티드 링커로 연결된다. 바람직하게, CAR에서 항원 결합 모이어티 부분은 scFv이다.
CAR는 세포외 도메인에 융합된 막관통 도메인을 포함하도록 디자인된다. 일 구현예에서, 막관통 도메인은 CAR 내의 도메인 중 하나와 자연적으로 연관되어 있지 않다. 일 구현예에서, 막관통 도메인은 CAR 내의 도메인 중 하나와 자연적으로 연관되어 있다. 일 구현예에서, 막관통 도메인은 아미노산 치환으로 변형되어 이러한 도메인이 동일 또는 다른 표면 막 단백질의 막관통 도메인에 결합하는 것을 회피하여 수용체 복합체의 다른 요소들과의 상호작용을 최소화한다. 막관통 도메인은 자연계 또는 합성 원천 중 어느 하나로부터 유래될 수 있다. 원천이 자연계라면, 도메인은 임의의 막-결합 또는 막관통 단백질로부터 유래될 수 있다. 본 발명에서 특정 용도의 막관통 영역은 CD28, CD3 입실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, T 세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 사슬 (즉, 적어도 이들의 막관통 영역(들))로부터 유래될 수 있다. 대안적으로, 막관통 도메인은 합성된 것일 수 있고, 이 경우, 루신 및 발린과 같은 소수성 잔기를 주로 포함한다. 바람직하게, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 트리플렛이 합성 막관통 도메인의 각 말단에서 발견될 것이다.
일부 예시에서, 본 발명의 CAR는 막관통 도메인과 세포외 도메인의 연결을 형성하는 힌지 도메인을 포함한다.
CAR의 세포내 신호전달 도메인으로도 불리는 세포질 도메인은 CAR가 위치한 면역 세포의 정상적인 작용세포 기능 중 적어도 하나의 활성화를 담당한다. 용어 "작용세포 기능"은 세포의 특수화된 기능을 의미한다. T 세포의 작용세포 기능은, 예를 들어, 세포 용해 활성 또는 사이토카인의 분비를 포함하는 도움 활성일 수 있다. 따라서 용어 "세포내 신호전달 도메인"은 작용 기능 신호를 전환하고 세포가 특수화된 기능을 수행하도록 하는 단백질의 부분을 의미한다. 대개 전체 세포내 신호전달 도메인이 도입될 수 있는 반면, 많은 경우에, 전체 사슬을 사용할 필요는 없다. 세포내 신호전달 도메인의 절단된 부분이 사용되는 범위까지, 이러한 절단된 부분은 그것이 작용세포 기능 신호를 전환하는 한 온전한 사슬의 위치에서 사용될 수 있다. 용어 세포내 신호전달 도메인은 따라서 작용세포 기능 신호를 전환할 정도로 충분한 세포내 신호전달 도메인의 임의의 절단된 부분을 포함하는 것을 의미한다.
TCR 만을 통해 생성된 신호는 T 세포의 완전한 활성화에 불충분하고, 이차적인 또는 공-자극 신호가 또한 필요하다고 알려져 있다. 따라서, T 세포 활성화는 세포질 신호전달 서열의 2개의 다른 계열들에 의해 매개된다고 언급될 수 있다: TCR을 통한 항원-의존성 1차 활성화하는 계열 (1차 세포질 신호전달 서열)및 항원-독립적 방식으로 2차 또는 공-자극 신호로 작용하는 계열 (2차 세포질 신호전달 서열).
일 구현예에서, CAR는 CD3-제타로부터 유래된 1차 세포질 신호전달 서열을 포함한다. 더욱이, CAR의 세포질 도메인은 공자극 신호전달 영역에 결합된 CD3-제타 신호전달 도메인을 포함할 수 있다.
공-자극 도메인의 정체성은 CAR에 의해 표적이 된 모이어티의 결합 후 세포성 증식 및 생존을 증진시키는 능력을 가진 것으로만 제한된다. 적합한 공-자극 도메인은 CD28, CD137 (4-1BB), 종양 괴사 인자 수용체 (TNFR) 슈퍼패밀리의 구성원, CD134 (OX40), 수용체들의 TNFR-슈퍼패밀리의 구성원, 및 CD278 (ICOS), 활성화된 T 세포에서 발현되는 CD28-슈퍼패밀리 공-자극 분자를 포함한다. 당업자는 기재된 공-자극 도메인의, 모델이 된 도메인과 동일 또는 유사한 활성을 갖는, 서열 변이체가 본 발명에 악영향을 미치지 않고 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 이러한 변이체는 이들이 유래된 도메인의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 가질 것이다. 본 발명의 일부 구현예에서, CAR 컨스트럭트는 3개의 공-자극 도메인을 포함한다. 특정 조합은 4개의 기재된 도메인의 모든 가능한 변형을 포함하지만, 특정 예시는 CD28+CD137 (4-1BB) 및 CD28+CD134 (OX40)를 포함한다.
CAR의 세포질 신호전달 부분의 세포질 신호전달 서열은 무작위로 또는 특정 순서로 서로 간에 연결될 수 있다. 선택적으로, 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커, 바람직하게는 2 내지 10개의 아미노산 서열 길이가 결합을 형성할 수 있다. 글리신-세린 더블렛이 특히 적합한 링커를 제공한다.
일 구현예에서, CAR는 발생초기 단백질을 소포체로 향하게 하는 신호 펩티드를 포함한다. 일 구현예에서, 신호펩티드는 항원 결합 도메인의 앞에 있다. 일 구현예에서, 신호 펩티드는 IgG와 같은 면역글로불린으로부터 유래된다.
용어 "항체"는 이황화 결합에 의해 서로 연결된 적어도 2개의 중(H)쇄와 2개의 경(L)쇄를 포함하는 면역글로불린을 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 VH로 약칭됨)와 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 VL로 약칭됨)와 경쇄 불변 영역으로 구성된다. VH 영역과 VL 영역은 프래임워크 영역 (FR)으로 지칭되는 더욱 보존적인 영역이 사이에 배치된 상보성 결정 영역 (CDR)로 지칭되는 과변이 영역들로 추가적으로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 CDR 3개와 FR 4개로 구성되며, 아미노 말단에서 카르복시 말단 방향으로 다음과 같은 순서로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유하고 있다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포 (예, 작용 세포) 및 고전적인 보체 시스템의 제1 보체 (Clq)를 포함하는 숙주 조직 또는 인자에 면역글로불린이 결합하는 것을 매개할 수 있다. 항체는 자연적인 원천 또는 재조합 원천으로부터 유래된 손상되지 않은 면역글로불린일 수 있고, 손상되지 않은 면역글로불린의 면역반응성 부분 또는 단편일 수 있다. 항체는 통상적으로 면역글로불린 분자의 4량체이다. 본 발명의 항체는 예를 들어, 다중클론 항체, 단일클론 항체, Fv, Fab 및 F(ab')2 뿐 아니라 단일쇄 항체 및 인간화된 항체를 포함한 다양한 형태로 존재할 수 있다 (Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, in: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426).
B 세포에 의해 발현되는 항체는 종종 BCR (B 세포 수용체) 또는 항원 수용체로 언급된다. 단백질의 이 계열에 포함된 5가지 구성원은 IgA, IgG, IgM, IgD, 및 IgE이다. IgA는 침, 눈물, 모유, 위장관 분비물 및 호흡기 및 비뇨생식기관의 점액 분비물과 같은 신체 분비물에 존재하는 1차 항체이다. IgG는 가장 일반적인 순환하는 항체이다. IgM은 대부분의 개체에서 1차 면역 반응에서 생성되는 주된 면역글로불린이다. 이는 응집, 보체 고정, 및 다른 항체 반응에서 가장 효과적인 면역글로불린이고, 박테리아 및 바이러스에 대한 방어에서 중요하다. IgD는 알려진 항체 기능이 없는 면역글로불린이지만 항원 수용체로서 작용할 수 있다. IgE는 알러지 항원에 노출된 후 비만 세포 및 호염기성 세포로부터 매개자의 방출을 유발함으로써 즉각적인 과민증을 매개한다.
용어 "항체 단편"은 초기 항체의 부분을 의미하고 통상적으로 초기 항체의 항원성 결정 가변 영역을 포함한다.
항체 단편의 예시는, 비제한적으로, Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편, 선형 항체, scFv 항체 및 항체 단편들로 형성된 다중특이성 항체를 포함한다.
"항체 중쇄"는, 본원에 사용된 바와 같이, 이들의 자연적으로 발생되는 입체구조에서 항체에 존재하는 2종의 폴리펩티드 사슬 중 더 큰 것을 의미한다.
"항체 경쇄"는, 본원에 사용된 바와 같이, 이들의 자연적으로 발생되는 입체구조에서 항체에 존재하는 2종의 폴리펩티드 사슬 중 더 작은 것을 의미하고, 
및 
경쇄는 두 주요 항체 경쇄 이소형을 의미한다.
본 명세서에 따르면, T 세포에 존재한다면 CAR는 암 세포와 같은 항원 제시 세포 질환에 걸린 세포의 표면과 같은 항원을 인지하여, 상기와 같이, T세포가 자극받고/거나 증폭되거나 작용세포 기능에 영향을 미치도록 한다.
면역 작용 세포의 유전적 변형
다양한 방법이 본원에 기술된 IL2Rα 변이체와 같은 IL2 수용체 폴리펩티드 및 선택적으로 CAR 컨스트럭트와 같은 항원 수용체를 T 세포와 같은 세포에 도입하여 유전적으로 변형된 세포가 본원에 기술된 IL2Rα 변이체와 같은 IL2 수용체 폴리펩티드 및 선택적으로 항원 수용체를 발현하도록 하는 데에 사용될 수 있다. 이러한 방법은 비-바이러스-기반 DNA 형질감염, 비-바이러스-기반 RNA 형질감염, 예를 들어, mRNA 형질감염, 트랜스포존-기반 시스템, 및 바이러스-기반 시스템을 포함한다. 비-바이러스-기반 DNA 형질감염은 삽입형 돌연변이 유발의 낮은 위험도를 갖는다. 트랜스포존-기반 시스템은 융합 요소를 함유하지 않는 플라스미드에 비해 이식 유전자를 더 효과적으로 융합시킬 수 있다. 바이러스-기반 시스템은 γ-레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터의 사용을 포함한다. γ-레트로바이러스는 상대적으로 생산하기 쉽고, 효과적이며 영구적으로 T 세포를 형질전환할 수 있고, 일차 인간 T 세포에서 통합 관점으로부터 임시로 안전한 것으로 입증되었다. 렌티바이러스 벡터 역시 효과적이고 영구적으로 T 세포를 형질전환할 수 있지만, 생산하는 데에 더 비싸다. 이들은 또한 레트로바이러스 기반 시스템에 비하여 잠재적으로 더 안전하다.
본 발명의 모든 측면의 일 구현예에서, T 세포 또는 T 세포 전구체는 IL2 수용체 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산 및 선택적으로 항원 수용체를 엔코딩하는 핵산으로 ex vivo 또는 in vivo에서 형질감염된다. 일 구현예에서, ex vivo 또는 in vivo 형질감염의 조합이 사용될 수 있다. 본 발명의 모든 측면의 일 구현예에서, T 세포 또는 T 세포 전구체는 치료받을 개체로부터 유래된다. 본 발명의 모든 측면의 일 구현예에서, T 세포 또는 T 세포 전구체는 치료받을 개체가 아닌 개체로부터 유래된다.
CAR T 세포는 나노입자를 사용하여, 따라서 거의 바로, in vivo에서 생산될 수 있다. 예를 들어, 폴리(β-아미노 에스터)-기반 나노입자는 T 세포 상의 CD3에 결합하기 위한 항-CD3e F(ab) 단편에 결합할 수 있다. T 세포에 결합한 후, 이들 나노입자는 세포내로 이입된다. 이들 성분, 예를 들어 항-종양 항원 CAR를 엔코딩하는 플라스미드 DNA는 미세소관-관련 서열 (MTAS) 및 핵 위치 신호 (NLSs)를 함유하는 펩티드의 삽입으로 인하여 T 세포 핵을 향할 수 있다. CAR 유전자 발현 카세트 및 과활성 프랜스포사제를 엔코딩하는 분리된 플라스미드 주변 트랜스포존의 통합은 CAR 벡터의 크로모좀으로의 효과적인 통합을 가능하게 한다. in vivo에서 CAR T 세포의 생산과 그 후 나노입자 주입을 가능하게 하는 이러한 시스템은 Smith et al. (2017) Nat. Nanotechnol. 12:813-820에 기술되어 있다.
다른 가능성은 CRISPR/Cas9 방법을 이용하여 의도적으로 CAR 암호화 서열을 특정 위치에 위치시키는 것이다. 예를 들어, 존재하는 T 세포 수용체 (TCR)를 제거하는 한편 CAR를 도입하고 이를 그렇지 않으면 중등 TCR 발현일 내인성 프로모터의 동적 조절 제어 하에 위치시킬 수 있다, 참조, 예를 들어, Eyquem et al. (2017) Nature 543:113-117.
본 발명의 모든 관점의 일 구현예에서, 본원에 기술된 IL2Rα 변이체와 같은 하나 이상의 IL2 수용체 폴리펩티드 및 선택적으로 항원 수용체를 발현하도록 유전적으로 변형된 세포는 안정적으로 또는 일시적으로 본원에서 기술된 IL2Rα 변이체와 같은 IL2 수용체 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산 및 선택적으로 항원 수용체를 엔코딩하는 핵산으로 형질감염된다. 일 구현예에서, 세포는 일부 핵산으로 안정적으로 형질감염되고 다른 핵산으로 일시적으로 형질감염된다. 따라서, 본원에 기술된 IL2Rα 변이체와 같은 IL2 수용체 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산 및 항원 수용체를 엔코딩하는 핵산은 세포의 유전체 내로 삽입되거나 삽입되지 않는다.
본 발명의 모든 측면의 일 구현예에서, 항원 수용체를 발현하도록 유전적으로 변형된 세포는 내인성 T 세포 수용체 및/또는 내인성 HLA의 발현이 비활성화된다.
본 발명의 모든 측면의 일 구현예에서, 본원에 기술된 세포는 치료받을 개체에 대하여 자가 조직, 동종, 또는 동계일 수 있다. 일 구현예에서, 본 명세서는 환자로부터 세포를 적출하고 그 후 환자에 그 세포를 재전달하는 것을 계획한다. 일 구현예에서, 본 명세서는 환자로부터 세포 적출을 계획하지 않는다. 후자의 경우, 세포의 유전적 변형의 모든 단계는 in vivo에서 수행된다.
용어 "자가조직의"는 동일한 개체로부터 유래된 임의의 것을 설명하는 데에 사용된다. 예를 들어, "자가조직의 이식"은 동일한 개체로부터 유래된 조직 또는 장기의 이식을 의미한다. 이러한 과정은 그렇지 않은 경우에 거부를 발생시키는 면역학적 장벽을 극복하기 때문에 유리하다.
용어 "동종"은 동일한 종의 다른 개체로부터 유래된 임의의 것을 지칭하는 데에 사용된다. 하나 이상의 위치에서 유전자가 동일하지 않을 때, 둘 이상의 개체는 서로에 대해서 동종인 것으로 언급된다.
용어 "동계"는 동일한 유전자형을 가진 개체 또는 조직, 즉, 동일한 순계의 동물 또는 일란성 쌍둥이 또는 이들의 조직으로부터 유래된 임의의 것을 지칭하는 데에 사용된다.
용어 "이종성"은 복수의 상이한 요소로 구성된 무엇인가를 설명하는 데에 사용된다. 예시로서, 한 개채의 골수의 다른 개체로의 전달은 이종성 이식에 해당한다. 이종성 유전자는 개체 외의 원천으로부터 유래된 유전자이다.
항원
일 구현예에서, 본원에 기술된 방법은 면역 작용 세포, 특히 항원 수용체를 발현하는 면역 작용 세포, 예를 들어 항원 수용체를 발현하도록 유전적으로 조작된 면역작용 세포를 ex vivo 또는 치료받는 개체에서, 동족 항원 분자와 접촉시키는 단계를 더 포함하고, 여기서 항원 분자 또는 이의 처리 산물, 예를 들어, 이의 단편은 면역 작용 세포에 의해 운반되는 TCR 또는 CAR와 같은 항원 수용체에 결합한다. 일 구현예에서, 동족 항원 분자는 면역 작용 세포가 표적으로 하는 표적세포에 의해 발현되는 항원 또는 이의 단편, 또는 항원 또는 단편의 변이체로 구성된 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 면역 작용 세포는 면역 작용 세포는 병태에 있는 동족 항원 분자와 접촉하여 면역 작용 세포의 증식 및/또는 활성화가 발생된다. 일 구현예에서, 면역 작용 세포가 동족 항원 분자와 접촉하는 단계는 in vivo 또는 ex vivo에서 일어난다.
일 구현예에서, 본원에 설명된 방법은 동족 항원 분자 또는 이를 암호화하는 핵산을 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 동족 항원 분자를 엔코딩하는 핵산은 개체의 세포에서 발현되어 동족 항원 분자를 제공한다. 일 구현예에서, 동족 항원 분자의 발현은 세포 표면에 존재한다. 일 구현예에서, 동족 항원 분자를 엔코딩하는 핵산은 개체의 세포에서 일시적으로 발현된다. 일 구현예에서, 동족 항원 분자를 엔코딩하는 핵산은 RNA이다. 일 구현예에서, 동족 항원 분자 또는 이를 암호화하는 핵산은 전신으로 투여된다. 일 구현예에서, 동족 항원 분자를 엔코딩하는 핵산의 전신 투여 후에, 비장에서 동족 항원을 엔코딩하는 핵산의 발현이 이루어진다. 일 구현예에서, 동족 항원 분자를 엔코딩하는 핵산의 전신 투여 후, 항원 제시 세포, 특히 전문 항원 제시 세포에서 동족 항원 분자를 엔코딩하는 핵산의 발현 이 이루어진다. 일 구현예에서, 항원 제시 세포는 수지상 세포, 대식세포 및 B 세포로 구성된 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 동족 항원 분자를 엔코딩하는 핵산의 전신 투여 후, 폐 및/또는 간에서 동족 항원 분자를 엔코딩하는 핵산의 발현이 일어나지 않거나 본질적으로 일어나지 않는다. 일 구현예에서, 동족 항원 분자를 엔코딩하는 핵산의 전신 투여 후, 비장에서 동족 항원 분자를 엔코딩하는 핵산의 발현이 폐에서 발현 량의 적어도 5배이다.
본 발명에 따른 환자에게 제공되는 펩티드 및 단백질 항원 (펩티드 및 단백질 항원 또는 핵산, 특히 펩티드 및 단백질 항원을 엔코딩하는 RNA 중 하나), 즉, 백신 항원은 바람직하게는 펩티드 또는 단백질 항원 또는 핵산이 투여된 개체에서 면역 작용 세포의 자극, 감작, 및/또는 증식을 야기한다. 상기 자극, 감작 및/또는 증식된 면역 작용 세포는 바람직하게 표적 항원, 특히 질환에 걸린 세포, 조직 및/또는 장기에 의해 발현되는 표적 항원, 즉, 질환-관련 항원을 향한다. 따라서, 백신 항원은 질환-관련 항원 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 이러한 단편 또는 변이체는 질환-관련 항원과 면역학적으로 동등하다. 본 명에서의 맥락에서 용어 "항원의 단편" 또는 "항원의 변이체"는 면역 작용 세포의 자극, 감작 및/또는 증식을 불러일으키는 약제를 의미하고, 특히 질환에 걸린 세포, 조직 및/또는 장기에 의해 제시되었을 때, 자극, 감작 및/또는 증식된 면역 작용 세포는 항원, 즉 질환-관련 항원을 표적으로 한다. 따라서, 백신 항원은 질환-관련 항원에 해당할 수 있거나 포함할 수 있거나, 질환-관련 항원의 단편에 해당할 수 있거나 포함할 수 있거나 질환-관련 항원 또는 이의 단편과 상동성인 항원에 해당할 수 있거나 포함할 수 있다. 백신 항원이 질환-관련 항원의 단편 또는 질환-관련 항원의 단편에 상동성인 아미노산 서열을 포함하면, 상기 단편 또는 아미노산 서열은 면역 작용 세포의 항원 수용체가 표적으로 하는 질환-관련 항원의 에피토프 또는 질환-관련 항원의 에피토프에 상동성인 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 본 명세서에 따르면, 백신 항원은 질환-관련 항원의 면역원성 단편 또는 질환-관련 항원의 변역원성 단편에 상동성인 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 본 명세서에 따른 "항원의 면역원성 단편"은 항원 또는 항원을 발현하는 세포에 결합하는 항원 수용체를 운반하는 면역 작용 세포를 자극, 감작 및/또는 증식할 수 있는 항원의 단편에 관한 것이다. 백신 항원 (질환-관련 항원과 유사)은 면역 작용 세포에 존재하는 항원 결합 도메인에 의해 결합되는 관련된 에피토프를 제공하는 것이 바람직하다. 일 구현예에서, 백신 항원 (질환-관련 항원과 유사)은 항원-제시 세포와 같은 세포의 표면에 발현되어 면역 작용 세포에 의해 결합되는 관련 에피토프를 제공한다. 백신 항원은 재조합 항원일 수 있다.
본 발명의 모든 측면의 일 구현예에서, 백신 항원을 엔코딩하는 핵산은 개체의 세포에서 발현되어 면역 작용 세포에 의해 발현되는 항원 수용체에 의해 결합되기 위한 항원 또는 이의 처리 산물을 제공하고, 상기 결합 결과로 면역 작용 세포의 자극, 감작 및/또는 증식이 일어난다.
용어 "면역학적으로 등가"는 면역학적으로 동일한 아미노산 서열과 같은 면역학적 등가인 분자가 동일한 또는 기본적으로 동일한 면역학적 특성을 나타내고/거나 예를 들어 면역학적 효과의 유형과 관련하여 동일한 또는 기본적으로 동일한 면역학적 효과를 발휘하는 것을 의미한다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "면학적으로 등가"는 바람직하게는 면역화에 사용되는 항원 또는 항원 변이체의 면역학적 효과 또는 특성과 관련하여 사용된다. 예를 들어, 아미노산 서열이, 참조 아미노산 서열에 결합하거나 참조 아미노산 서열을 발현하는 세포에 결합하는 T 세포와 같은 개체의 면역계에 노출되었을 때, 참조 아미노산 서열과의 반응 특이성을 가진 면역 반응을 유도한다면, 그 아미노산 서열은 참조 아미노산 서열과 면역학적으로 등가인 것이다. 따라서, 항원과 면역학적으로 등가인 분자는 동일한 또는 기본적으로 동일한 특성을 나타내고/거나 T 세포를 표적화하는 항원으로서 T 세포의 자극, 감작 및/또는 증식과 관련하여 동일한 또는 기본적으로 동일한 효과를 발휘한다.
"활성화" 또는 "자극"은, 본원에 사용된 바와 같이, 검출 가능한 세포 증식을 유발하도록 충분히 자극된 T 세포와 같은 면역 작용 세포의 상태를 의미한다. 활성화는 신호전달 경로의 개시, 유도된 사이토카인 생산, 및 검출 가능한 작용세포 기능과 또한 관련될 수 있다. 용어 "활성화된 면역 작용 세포"는, 특히, 세포 분열이 일어나고 있는 면역 작용 세포를 의미한다.
용어 "감작"은 T 세포와 같은 면역 작용 세포가 이의 특이적인 항원과 최초로 접촉하여 작용 T 세포와 같은 작용 세포로 분화를 유발하는 과정을 지칭한다.
용어 "클론 증식" 또는 "증식"은 특정 실체가 증폭되는 과정을 의미한다. 본 명세서의 맥락에서, 이 용어는 바람직하게는 림프구가 항원에 의해 자극되어, 증식되고, 상기 항원을 인지하는 특정 림프구가 증폭되는 면역학적 반응 맥락에서 사용된다. 바람직하게는, 클론 증식은 림프구의 분화로 이어진다.
용어 "항원"은 이에 대한 면역 반응을 구축할 수 있는 에피토프를 포함하는 물질을 의미한다. 용어 "항원"은, 구체적으로 단백질 및 펩티드를 포함한다. 일 구현예에서, 항원은 수지상 세포 또는 대식 세포와 같은 항원 제시 세포와 같은 면역계의 세포의 표면에 제시되거나 제시한다. 항원 또는 T 세포 에피토프와 같이 이의 처리 산물은 일 구현예에서 항원 수용체에 의해 결합된다. 따라서, 항원 또는 이의 처리 산물은 T-림프구 (T 세포)와 같은 면역 작용 세포에 특이적으로 반응할 수 있다. 일 구현예에서, 항원은 종양 항원, 바이러스 항원 또는 박테리아 항원과 같은 질환-관련 항원 및 이러한 항원으로부터 유래되는 에피토프이다.
용어 "질환-관련 항원"은 광의적인 의미에서 질환과 관련있는 임의의 항원을 지칭하는 것으로 사용된다. 질환-관련 항원은 숙주의 면역계를 자극해 질환에 대한 세포성 항원-특이적인 면역 반응 및/또는 체액성 항체 반응을 발생시킬 에피토프를 함유한 분자이다. 따라서, 질환-관련 항원 또는 이의 에피토프는 치료학적 목적으로 사용될 수 있다. 질환-관련 항원은 미생물, 전형적으로 미생물 항원에 의한 감염과 관련있을 수 있거나, 또는 암, 전형적으로 종양과 관련있을 수 있다.
용어 "종양 항원"은 세포질, 세포 표면 및 세포 핵으로부터 유래될 수 있는 암 세포의 구성요소를 지칭한다. 구체적으로, 이 용어는 세포 내에서 또는 종양 세포 상의 표면 항원으로서 만들어지는 항원을 지칭한다. 종양 항원은 전형적으로 암 세포에 의해 선호적으로 발현되며 (예, 암 세포가 아닌 세포에 비해 암 세포에서 높은 수준으로 발현됨), 일부 경우에 암 세포에 의해서만 발현된다. 종양 항원의 예로는, 비-제한적으로, p53, ART-4, BAGE, β-카테닌/m, Bcr-abL CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27/m, CDK4/m, CEA, CLAUDIN-6, CLAUDIN-18.2 및 CLAUDIN-12과 같은 claudin 계열의 세포 표면 단백질, c-MYC, CT, Cyp-B, DAM, ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gap 100, HAGE, HER-2/neu, HPV-E7, HPV-E6, HAST-2, hTERT (또는 hTRT), LAGE, LDLR/FUT, MAGE-A, 바람직하게는 MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE- A3, MAGE-A4, MAGE- A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11 또는 MAGE-A12, MAGE-B, MAGE-C, MART-1/Melan-A, MC1R, 미오신/m, MUC1, MUM-1 , MUM-2, MUM-3, NA88-A, NF1, NY-ESO-1, NY-BR-1, pl90 minor BCR-abL, Pml/RARa, PRAME, 프로테이나제 3, PSA, PSM, RAGE, RU1 또는 RU2, SAGE, SART-1 또는 SART-3, SCGB3A2, SCP1, SCP2, SCP3, SSX, SURVIVIN, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, TPTE, WT 및 WT-1 을 포함한다.
용어 "바이러스 항원"은 항원 특성을 가진, 즉 개체에서 면역 반응을 불러일으킬 수 있는 임의의 바이러스 구성성분을 지칭한다. 바이러스 항원은 바이러스 리보핵산단백질 또는 외막 단백질일 수 있다.
용어 "박테리아 항원"은 항원 특성을 가진, 즉 개체에서 면역 반응을 불러일으킬 수 있는 임의의 박테리아 구성성분을 지칭한다. 박테리아 항원은 박테리아의 세포벽 또는 세포질 막으로부터 유래할 수 있다.
용어 "세포 표면에 발현된" 또는 "세포 표면과 연관된"은 수용체 또는 항원과 같은 분자가 세포의 혈장 세포막과 연관되고 혈장 세포막에 위치하는 것을 의미하고, 여기서 분자의 적어도 일부는 상기 세포의 세포외 공간에 면해 있고 상기 세포의 외부로부터, 예를들어, 세포의 외부에 위치한 항체에 의해, 접근 가능하다. 이 맥락에서, 부분은 바람직하게는 적어도 4, 바람직하게는 적어도 8, 바람직하게는 적어도 12, 더 바람직하게는 적어도 20개의 아미노산이다. 연관은 직접 또는 간접적일 수 있다. 예를 들어, 연관은 하나 이상의 막관통 도메인, 하나 이상의 지질 앵커에 의해, 또는 임의의 다른 단백질, 지질, 당류, 또는 세포의 혈장 세포막의 외부의 리플렛(leaflet)에서 발견될 수 있는 다른 구조물과의 상호작용에 의할 수 있다. 예를 들어, 세포의 표면에 연관된 분자는 세포외 부분을 가진 막관통 단백질일 수 있거나 막관통 단백질인 다른 단백질과 상호작용에 의해 세포의 표면에 연관된 단백질일 수 있다.
"세포 표면" 또는 "세포의 표면"은 당해 기술 분야에서 보통의 의미에 따라 사용되고, 따라서 단백질 및 다른 분자에 의한 결합이 가능한 세포의 외부를 포함한다.
본 발명의 맥락에서 "세포외 부분" 또는 "세포외 도메인 (exodomain)"은 세포의 세포외 공간에 면하는 단백질과 같은 분자의 부분을 의미하고, 바람직하게는 상기 세포의 외부로부터, 예를 들어, 세포의 외부에 위치한 항체와 같은 분자의 결합에 의해, 접근이 가능하다. 바람직하게, 용어는 하나 이상의 세포외 루프 또는 도메인 또는 이의 단편을 의미한다.
용어 "에피토프"는 면역계에 의해 인지되는 항원과 같은 분자의 부분 또는 단편을 의미한다. 예를 들어, 에피토프는 T 세포, B 세포 또는 항체에 의해 인지될 수 있다. 항원의 에피토프는 항원의 연속적이거나 비-연속적인 부분을 포함할 수 있으며, 약 5개 내지 약 50개, 더 바람직하게 약 8개 내지 약 30개, 가장 바람직하게는 약 10개 내지 약 25개 아미노산 길이와 같이 약 5개 내지 약 100개 아미노산 길이일 수 있으며, 예를 들어, 에피토프는 바람직하게는 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개 또는 25개의 아미노산 길이일 수 있다. 일 구현예에서, 에피토프는 약 10개 내지 약 25개 아미노산 길이이다. 용어 "에피토프"는 T 세포 에피토프를 포함한다.
용어 "T 세포 에피토프"는 MHC 분자를 통해 제시되었을 때 T 세포에 의해 인지되는 단백질의 부분 또는 단편을 지칭한다. 용어 "주 조직적합성 복합체" 및 약어 "MHC"는 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 분자를 포함하며, 이는 모든 척추동물에 존재하는 유전자들의 복합체와 관련된다. MHC 단백질 또는 분자는 면역 반응에서 림프구와 항원 제시 세포 또는 질환에 걸린 세포 간의 신호전달에 중요하며, MHC 단백질 또는 분자는 펩티드 에피토프와 결합하여 T 세포 상의 T 세포 수용체에 의해 인지되도록 이를 제시한다. MHC에 의해 암호화되는 단백질은 세포 표면 상에 발현되며, T 세포에 대한 자기-항원 (세포 자체로부터 유래된 펩티드 단편) 및 비-자기-항원 (예, 침입 미생물의 단편) 둘 다를 제시한다. 클래스 I MHC/펩티드 복합체의 경우에, 결합하는 펩티드는 전형적으로 약 8개 내지 약 10개 아미노산 길이이지만, 더 길거나 또는 짧은 펩티드도 효과적일 수 있다. 클래스 II MHC/펩티드 복합체의 경우, 결합하는 펩티드는 전형적으로 약 10개 내지 약 25개 아미노산 길이이며, 구체적으로 약 13개 내지 약 18개 아미노산 길이이나, 더 긴 펩티드 및 더 짧은 펩티드도 효과적일 수 있다.
일 구현예에서, 표적 항원은 종양 항원이고, 백신 항원 또는 이의 단편 (예를 들어, 에피토프)은 종양 항원으로부터 유래된다. 종양 항원은 다양한 암에서 발현되는 것으로 일반적으로 알려진 "표준 항원"일 수 있다. 종양 항원은 또한 개별 종양에 특이적이고 면역계에 의해 기존에 인지된 바 없는 "신생-항원 (neo-antigen)"일 수 있다. 신생-항원 또는 신생-에피토프는 아미노산 변화를 발생시키는 암 세포의 유전체 내 하나 이상의 암-특이적인 돌연변이로부터 유발될 수 있다. 만약 종양 항원이 신생-항원이라면, 백신 항원은 바람직하게는 하나 이상의 아미노산 변화를 포함하는 상기 신생-항원의 에피토프 또는 단편을 포함한다.
암 돌연변이는 각 개체에 따라 다양한다. 따라서, 새로운 에피토프 (신생-에피토프)를 암호화하는 암 돌연변이는 백신 조성물 및 면역요법의 개발에 매력적인 표적이 된다. 종양 면역요법의 효과는 숙주에서 강력한 면역 반응을 유도할 수 있는 암-특이적인 항원 및 에피토프의 선정에 좌우된다. 환자에게 환자-특이적인 종양 에피토프를 전달하기 위해 RNA를 이용할 수 있다. 비장에 존재하는 수지상 세포 (DCs)는 종양 에피토프와 같은 면역원성 에피토프 또는 항원을 RNA로 발현시키기 위한 특히 흥미로운 항원-제시 세포를 대표한다. 복수의 에피토프를 사용하는 것이 종양 백신 조성물에서 치료학적 효과를 촉진하는 것으로 입증되어 있다. 종양 뮤타놈 (mutanome)의 신속한 서열분석은 본원에 언급된 RNA에 의해 엔코딩될 수 있는 개인화된 백신을 위한 복수의 에피토프를, 예를 들어, 에피토프들이 선택적으로 링커에 의해 분리된 단일 폴리펩티드로서 제공할 수 있다. 본 명세서의 특정 구현예에서, RNA는 적어도 1개의 에피토프, 적어도 2개의 에피토프, 적어도 3개의 에피토프, 적어도 4개의 에피토프, 적어도 5개의 에피토프, 적어도 6개의 에피토프, 적어도 7개의 에피토프, 적어도 8개의 에피토프, 적어도 9개의 에피토프, 또는 적어도 10개의 에피토프를 엔코딩한다. 예시적인 구현예는 적어도 5개의 에피토프("펜타토프"로 지칭됨)를 암호화하는 RNA 및 적어도 10개의 에피토프("데카토프"로 지칭됨)를 암호화하는 RNA를 포함한다.
본 발명의 다양한 측면에 따르면, 목적은 바람직하게는 종양 항원을 발현하는 암 세포에 대한 면역 반응을 제공하여 종양 항원을 발현하는 세포가 연루된 암 질환을 치료하는 것이다. 바람직하게 본 발명은 종양 항원을 발현하는 암 세포를 표적으로 하는 T 세포와 같은 항원 수용체-조작된 면역 작용 세포의 투여를 수반한다.
펩티드 및 단백질 항원은 예를 들어 5개 아미노산, 10개 아미노산, 15개 아미노산, 20개 아미노산, 25개 아미노산, 30개 아미노산, 35개 아미노산, 40개 아미노산, 45개 아미노산, 또는 50개 아미노산 길이를 포함하는, 2-100개 아미노산 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, 펩티드는 50개 아미노산 길이보다 더 길 수 있다. 일부 구현예에서, 펩티드는 100개 아미노산 길이보다 더 길 수 있다.
본 발명에 따르면, 백신 항원은 면역 작용 세포에 의해 인지된다. 바람직하게, 만약 면역 작용 세포에 의해 인지된다면, 항원은 적절한 공-자극 신호의 존재 하에, 항원을 인지하는 항원 수용체를 운반하는 면역작용 세포의 자극, 감작 및/또는 증식을 유도할 수 잇다. 본 발명의 구현예의 맥락에서, 항원은 바람직하게는 세포, 바람직하게는 항원 제시 세포의 표면에 표시된다. 질환에 걸린 세포의 표면 상의 항원의 인지는 항원 (또는 항원을 발현하는 세포)에 대한 면역 반응을 불러일으킬 수 있다.
본 발명의 모든 측면의 일 구현예에서, 암 세포와 같은 질환에 걸린 세포에서 발현되는 항원은 암 세포와 같은 질환에 걸린 세포의 표면에서 발현된다. 일 구현예에서, 항원 수용체는 세포외 도메인 또는 항원의 세포외 도메인에서의 에피토프에 결합하는 CAR이다. 일 구현예에서, CAR는 살아있는 세포의 표면 상에 나타나는 항원의 천연 에피토프에 결합한다. 일 구현예에서, T 세포에 의해 발현되고/거나 T 세포 상에 존재하는 CAR의 항원 제시 세포와 같은 세포 상에 존재하는 항원에의 결합은 상기 T 세포의 자극, 감작 및/또는 증식을 불러일으킨다. 일 구현예에서, T 세포에 의해 발현되고/거나 T 세포에 존재하는 CAR의 암 세포와 같은 질환에 걸린 세포 상에 존재하는 항원에의 결합은 질환에 걸린 세포의 세포사멸 및/또는 세포자살을 야기하고, 여기서 상기 T 세포는 바람직하게는, 세포독성 인자들, 예를 들어, 퍼포린 및 그랜자임을 방출한다.
면역 체크포인트 저해제
특정 구현예에서, 면역 체크포인트 저해제는 본원에서 기술된 다른 치료학적 약제와 조합하여 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "면역 체크포인트"는 T 세포 수용체의 항원 인지 규모와 특성을 제어하는 공-자극성 및 저해성 신호를 지칭한다. 특정 구현예에서, 면역 체크포인트는 저해성 신호이다. 특정 구현예에서, 저해성 신호는 PD-1과 PD-L1 간의 상호작용이다. 특정 구현예에서, 저해성 신호는 CD28 결합을 대체하기 위한 CTLA-4와 CD80 또는 CD86 간의 상호작용이다. 특정 구현예에서, 저해성 신호는 LAG3와 MHC 클래스 II 분자 간의 상호작용이다. 특정 구현예에서, 저해성 신호는 TIM3와 갈렉틴 9 간의 상호작용이다.
본원에 사용된 바와 같이, "면역 체크포인트 저해제"는 하나 이상의 체크포인트 단백질을 일부 또는 완전히 감소, 저해, 간섭 또는 조절하는 분자를 지칭한다. 특정 구현예에서, 면역 체크포인트 저해제는 면역 체크포인트와 관련된 저해성 신호를 억제한다. 특정 구현예에서, 면역 체크포인트 저해제는 면역 체크포인트와 관련된 저해성 신호전달을 교란하는 항체 또는 이의 단편이다. 특정 구현예에서, 면역 체크포인트 저해제는 저해성 신호전달을 교란하는 소분자이다. 특정 구현예에서, 면역 체크포인트 저해제는 체크포인트 차단제 단백질들 간의 상호작용을 방지하는 항체, 이의 단편 또는 항체 모방체, 예를 들어 PD-1과 PD-L1 간의 상호작용을 방지하는 항체 또는 이의 단편이다. 특정 구현예에서, 면역 체크포인트 저해제는 CTLA-4와 CD80 또는 CD86 간의 상호작용을 억제하는, 항체 또는 이의 단편이다. 특정 구현예에서, 면역 체크포인트 저해제는 LAG3와 이의 리간드, 또는 TIM-3와 이의 리간드 간의 상호작용을 억제하는 항체 또는 이의 단편이다. 체크포인트 저해제는 또한 분자 (또는 이의 변이체) 자체의 수용성 형태, 예를 들어 수용성 PD-L1 또는 PD-L1 융합체의 형태일 수 있다.
"프로그램화된 사멸-1 (PD-1)" 수용체는 CD28 패밀리에 속하는 면역-저해성 수용체를 지칭한다. PD-1은 in vivo에서 사전에 활성화된 T 세포 상에서 주로 발현되며, 이는 2개의 리간드, PD-L1 및 PD-L2에 결합한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "PD-1"은 인간 PD-1 (hPD-1), 변이체, 이소형 및 hPD-1의 종 호몰로그, 및 hPD-1과 적어도 하나의 공통 에피토프를 가진 유사체를 포함한다.
"프로그램화된 사멸 리간드-1 (PD-L1)"은 PD-1에 결합하였을 때 T 세포 활성화와 사이토카인 분비를 하향 조절하는 PD-1에 대한 세포 표면 당단백질 리간드 2종 중 하나 (나머지는 PD-L2임)이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "PD-L1"은 인간 PD-L1 (hPD-L1), 변이체, 이소형 및 hPD-L1의 종 호몰로그, 및 hPD-L1과 적어도 하나의 공통 에피토프를 가진 유사체를 포함한다.
"세포독성 T 림프구 관련 항원-4 (CTLA-4)"는 T 세포 표면 분자이고, 면역글로불린 슈퍼패밀리에 속하는 구성원이다. 이 단백질은 CD80 및 CD86에 결합함으로써 면역계를 하향 조절한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "CTLA-4"는 인간 CTLA-4 (hCTLA-4), 변이체, 이소형 및 hCTLA-4의 종 호몰로그, 및 hCTLA-4와 적어도 하나의 공통 에피토프를 가진 유사체를 포함한다.
"림프구 활성화 유전자-3 (LAG3)"는 MHC 클래스 II 분자에 결합함으로써 림프구의 활성을 저해하는 것과 관련된 저해성 수용체이다. 이 수용체는 Treg 세포의 기능을 강화하고, CD8+ 작용 T 세포 기능을 저해한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "LAG3"는 인간 LAG3 (hLAG3), 변이체, 이소형 및 hLAG3의 종 호몰로그, 및 적어도 하나의 공통 에피토프를 가진 유사체를 포함한다.
"T 세포막 단백질-3 (TIM3)"은 TH1 세포 반응을 저해함으로써 림프구 활성의 저해에 연관된 저해성 수용체이다. 이의 리간드는 갈렉틴 9이고, 이것은 다양한 유형의 암들에서 상향 조절된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "TIM3"는 인간 TIM3 (hTIM3), 변이체, 이소형 및 hTIM3의 종 호몰로그, 및 적어도 하나의 공통적 에피토프를 가진 유사체를 포함한다.
"B7 패밀리"는 수용체가 분명하지 않은 저해성 리간드이다. B7 패밀리는 종양 세포 및 종양 침윤성 세포 상 모두에서 상향 조절되는 B7-H3 및 B7-H4를 포괄한다.
특정 구현예에서, 본원에 기술된 방법에서 이용하기 적합한 면역 체크포인트 저해제는 저해성 신호의 길항제, 예를 들어, PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG3, B7-H3, B7-H4, 또는 TIM3를 표적화하는 항체이다. 이들 리간드들과 수용체는 Pardoll, D., Nature. 12: 252-264, 2012에서 검토된 바 있다.
특정 구현예에서, 면역 체크포인트 저해제는, 저해성 면역조절제로부터 신호전달을 교란 또는 저해하는, 항체 및 이의 항원-결합 부분이다. 특정 구현예에서, 면역 체크포인트 저해제는 저해성 면역조절제로부터의 신호전달을 교란 또는 저해하는 소분자이다.
특정 구현예에서, 저해성 면역조절제는 PD-1/PD-L1 신호전달 경로의 구성성분이다. 이에따라, 본 명세서의 특정 구현예는 PD-1 수용체와 이의 리간드 PD-L1 간의 상호작용을 교란하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 개체에게 투여하는 것을 제공한다. PD-1에 결합하여 PD-1과 이의 리간드 PD-L1 간의 상호작용을 교란하는 항체들은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 특정 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 PD-1에 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 PD-L1에 특이적으로 결합하고, 이와 PD-1의 상호작용을 저해함으로써 면역 활성을 증진시킨다.
특정 구현예에서, 저해성 면역조절제는 CTLA4 신호전달 경로의 구성성분이다. 이에따라, 본 명세서의 특정 구현예는 CTLA4를 표적으로하고 이의 CD80 및 CD86과의 상호작용을 교란하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 개체에 투여하는 것을 제공한다.
특정 구현예에서, 저해성 면역조절제는 LAG3 (림프구 활성화 유전자 3) 신호전달 경로의 구성성분이다. 이에따라, 본 명세서의 특정 구현예는 LAG3를 표적으로하고, 이의 MHC 클래스 II 분자와의 상호작용을 교란하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 개체에 투여하는 것을 제공한다.
특정 구현예에서, 저해성 면역조절제는 B7 패밀리 신호전달 경로의 구성성분이다. 특정 구현예에서, B7 패밀리 구성원은 B7-H3 및 B7-H4이다. 이에따라, 본 명세서의 특정 구현예는 B7-H3 또는 H4를 표적으로하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 개체에 투여하는 것을 제공한다. B7 패밀리는 임의의 정의된 수용체를 가지진 않지만, 이들 리간드는 종양 세포 또는 종양-침윤 세포 상에서 상향 조절된다. 전임상 마우스 모델에서, 이들 리간드를 차단하면 항-종양 면역을 강화할 수 있는 것으로, 입증되어 있다.
특정 구현예에서, 저해성 면역조절제는 TIM3 (T 세포막 단백질 3) 신호전달 경로의 구성성분이다. 이에따라, 본 명세서의 특정 구현예는 TIM3를 표적화하고 이와 갈렉틴 9의 상호작용을 교란하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 개체에 투여하는 것을 제공한다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 표적화로, 예를 들어, T 세포 증식 증가, 강화된 T 세포 활성화 및/또는 증가된 사이토카인 (예를 들어, IFN-γ, IL2) 생산에서 반영되는 바와 같이, 항-종양 면역 반응과 같은 면역 반응의 자극이 발생된다면, 다른 면역 체크포인트 표적들 또한 길항제 또는 항체에 의해 표적화될 수 있음을 이해할 것이다.
RNA 표적화
본원에 기술된 펩티드, 단백질 또는 폴리펩티드, 특히 IL2 변이체 폴리펩티드 및/또는 백신 항원이 본원에 기술된 펩티드, 단백질 또는 폴리펩티드를 엔코딩하는 RNA 형태로 투여되는 것이 본 발명에 따를 때 특히 바람직하다. 일 구현예에서, 본원에 기술된 다른 펩티드, 단백질 또는 폴리펩티드는 다른 RNA 분자에 의해 엔코딩된다.
일 구현예에서, RNA는 전달 부형제로 제형화된다. 일 구현예에서, 전달 부형제는 입자를 포함한다. 일 구현예에서, 전달 부형제는 적어도 하나의 지질을 포함한다. 일 구현예에서, 적어도 하나의 지질은 적어도 하나의 양이온성 지질을 포함한다. 일 구현예에서, 지질은 RNA와 함께 복합체를 형성하고/거나 RNA를 캡슐화한다. 일 구현예에서, 지질은 RNA를 캡슐화하는 소포를 구성한다. 일 구현예에서, RNA는 리포좀에 제형화된다.
본 명세서에 따르면, 본원에 기술된 RNA의 투여 후, RNA의 적어도 일부가 표적 세포로 전달된다. 일 구현예에서, RNA의 적어도 일부는 표적 세포의 사이토졸로 전달된다. 일 구현예에서, RNA는 표적 세포에 의해 번역되어, 엔코딩된 펩티드 또는 단백질을 생산한다.
본 명세서의 일부 측면은 본원에 기술된 RNA (예를 들어, IL2 변이체 폴리펩티드를 엔코딩하는 RNA, 및/또는 백신 항원을 엔코딩하는 RNA)의 표적화된 전달을 수반한다.
일 구현예에서, 본 명세서는 림프 시스템, 구체적으로 2차 림프 기관, 보다 구체적으로 비장으로의 표적화를 포함한다. 림프 시스템, 구체적으로 2차 림프 기관, 보다 구체적으로 비장으로의 표적화는, 만약 투여된 RNA가 백신 항원을 엔코딩하는 RNA인 경우에, 특히 바람직하다.
일 구현예에서, 표적 세포는 비장 세포이다. 일 구현예에서, 표적 세포는 비장내 전문적 항원 제시 세포와 같은 항원 제시 세포이다. 일 구현예에서, 표적 세포는 비장내 수지상 세포이다.
"림프 시스템"은 순환계의 일부이고, 림프액을 운반하는 림프관 네트워크를 포함하는 면역계의 중요한 부분이다. 림프계는 림프 장기, 림프관의 전달 네트워크 및 순환성 림프액으로 구성된다. 일차 또는 중추 림프 장기는 미성숙 전구 세포로부터 림프구를 생성한다. 흉선 및 골수는 일차 림프 장기를 구성한다. 이차 또는 말초 림프 장기는 림프절과 비장을 포함하며, 성숙한 나이브 림프구를 유지시키고, 적응성 면역 반응을 개시한다.
RNA는, RNA가 양이온성 지질 및 선택적으로 부가적인 또는 보조 지질을 포함하는 리포좀에 결합되어 주사가능한 나노입자 제형을 형성하는, 소위 리포플렉스 제형에 의해 비장으로 전달될 수 있다. 리포좀은 에탄올 중의 지질 용액을 물 또는 적절한 수상에 주입함으로써 수득할 수 있다. RNA 리포플렉스 입자는 리포좀을 RNA와 혼합하여 제조될 수 있다. 비장을 표적화하는 RNA 리포플렉스 입자는 WO 2013/143683에 언급되어 있으며, 본원에 원용에 의해 포함된다. 순 음전하를 가진 RNA 리포플렉스 입자는 항원-제시 세포, 특히 수지상 세포와 같은 비장 조직 또는 비장 세포를 선호적으로 표적화하는 데에 사용될 수 있는 것으로 밝혀져 있다. 이에따라, RNA 리포플렉스 입자를 투여한 후, 비장에서 RNA 축적 및/또는 RNA 발현이 이루어진다. 따라서, 본 명세서의 RNA 리포플렉스 입자는 비장에서 RNA를 발현시키기 위해 활용할 수 있다. 일 구현예에서, RNA 리포플렉스 입자를 투여한 후, 폐 및/또는 간에서의 RNA 축적 및/또는 RNA 발현은 발생하지 않거나, 또는 본질적으로 발생하지 않는다. 일 구현예에서, RNA 리포플렉스 입자를 투여한 후, 비장내 전문적 항원 제시 세포와 같은 항원 제시 세포에서 RNA 축적 및/또는 RNA 발현이 발생한다. 따라서, 본 명세서의 RNA 리포플렉스 입자는 이러한 항원 제시 세포에서 RNA를 발현시키기 위해 이용할 수 있다. 일 구현예에서, 항원 제시 세포는 수지상 세포 및/또는 대식 세포이다.
본 명세서의 맥락에서, 용어 "RNA 리포플렉스 입자"는 지질, 특히 양이온성 지질 및 RNA를 함유한 입자를 지칭한다. 양으로 하전된 리포좀과 음으로 하전된 RNA 간의 정전기적 상호작용으로 복합체화가 이루어지고, RNA 리포플렉스 입자가 자발적으로 형성된다. 양으로 하전된 리포좀은 일반적으로 DOTMA와 같은 양이온성 지질 및 DOPE와 같은 부가적인 지질을 사용해 합성될 수 있다. 일 구현예에서, RNA 리포플렉스 입자는 나노입자이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "양이온성 지질"은 순 양전하를 가진 지질을 지칭한다. 양이온성 지질은 지질 매트릭스에의 정전기적 상호작용을 통해 음으로 하전된 RNA에 결합한다. 일반적으로, 양이온성 지질은 스테롤, 아실 또는 다이아실 사슬과 같은 친지성 모이어티를 가지고 있으며, 전형적으로 지질 헤드 기는 양 전하를 띈다. 양이온성 지질의 예로는, 비-제한적으로 1,2-다이-O-옥타데세닐-3-트리메틸암모늄 프로판 (DOTMA), 다이메틸다이옥타데실암모늄 (DDAB); 1,2-다이올레오일-3-트리메틸암모늄 프로판 (DOTAP); 1,2-다이올레오일-3-다이메틸암모늄-프로판 (DODAP); 1,2-다이아실옥시-3-다이메틸암모늄 프로판; 1,2-다이알킬옥시-3- 다이메틸암모늄 프로판; 다이옥타데실다이메틸 암모늄 클로라이드 (DODAC), 2,3-다이(테트라데콕시)프로필-(2-하이드록시에틸)-다이메틸아자늄 (DMRIE), 1,2-다이미리스토일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (DMEPC), l,2-다이미리스토일-3-트리메틸암모늄 프로판 (DMTAP), 1,2-다이올레일옥시프로필-3-다이메틸-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드 (DORIE) 및 2,3-다이올레오일옥시-N-[2(스페르민 카르복사미드)에틸]-N,N-다이메틸-l-프로판아미늄 트리플루오로아세테이트 (DOSPA)를 포함한다. DOTMA, DOTAP, DODAC 및 DOSPA가 바람직하다. 특정 구현예에서, 양이온성 지질은 DOTMA 및/또는 DOTAP이다.
총 양전하 대 음 전하의 비율과 RNA 리포플렉스 입자의 물리적 안정성을 조정하기 위해 부가적인 지질이 포함될 수 있다. 특정 구현예에서, 부가적인 지질은 중성 지질이다. 본원에서 사용된 바와 같이, "중성 지질"은 0의 순 전하를 가진 지질을 지칭한다. 중성 지질의 예로는, 비-제한적으로, 1,2-다이-(9Z-옥타데세노일)-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE), 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC), 다이아실포스파티딜 콜린, 다이아실포스파티딜 에탄올 아민, 세라마이드, 스핑고마이엘린, 세팔린, 콜레스테롤 및 세레브로사이드를 포함한다. 특정 구현예에서, 부가적인 지질은 DOPE, 콜레스테롤 및/또는 DOPC이다.
특정 구현예에서, RNA 리포플렉스 입자는 양이온성 지질 및 부가적인 지질 모두를 포함한다. 예시적인 구현예에서, 양이온성 지질은 DOTMA이고, 부가적인 지질은 DOPE이다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 양이온성 지질 대 적어도 하나의 부가적인 지질의 몰 비는 약 10:0 내지 약 1:9, 약 4:1 내지 약 1:2, 또는 약 3:1 내지 약 1:1이다. 특정 구현예에서, 상기한 몰 비는 약 3:1, 약 2.75:1, 약 2.5:1, 약 2.25:1, 약 2:1, 약 1.75:1, 약 1.5:1, 약 1.25:1 또는 약 1:1일 수 있다. 예시적인 구현예에서, 적어도 하나의 양이온성 지질 대 적어도 하나의 부가적인 지질의 몰 비는 약 2:1이다.
본원에 기술된 RNA 리포플렉스 입자는, 일 구현예에서, 약 200 nm 내지 약 1000 nm, 약 200 nm 내지 약 800 nm, 약 250 내지 약 700 nm, 약 400 내지 약 600 nm, 약 300 nm 내지 약 500 nm 또는 약 350 nm 내지 약 400 nm 범위의 평균 직경을 가진다. 특정 구현예에서, RNA 리포플렉스 입자는 약 200 nm, 약 225 nm, 약 250 nm, 약 275 nm, 약 300 nm, 약 325 nm, 약 350 nm, 약 375 nm, 약 400 nm, 약 425 nm, 약 450 nm, 약 475 nm, 약 500 nm, 약 525 nm, 약 550 nm, 약 575 nm, 약 600 nm, 약 625 nm, 약 650 nm, 약 700 nm, 약 725 nm, 약 750 nm, 약 775 nm, 약 800 nm, 약 825 nm, 약 850 nm, 약 875 nm, 약 900 nm, 약 925 nm, 약 950 nm, 약 975 nm 또는 약 1000 nm의 평균 직경을 갖는다. 일 구현예에서, RNA 리포플렉스 입자는 약 250 nm 내지 약 700 nm 범위의 평균 직경을 갖다. 다른 구현예에서, RNA 리포플렉스 입자는 약 300 nm 내지 약 500 nm 범위의 평균 직경을 갖는다. 예시적인 구현예에서, RNA 리포플렉스 입자는 약 400 nm의 평균 직경을 갖는다.
본 명세서의 RNA 리포플렉스 입자의 전하는 적어도 하나의 양이온성 지질에 존재하는 전하와 RNA에 존재하는 전하의 합이다. 전하 비율은 적어도 하나의 양이온성 지질에 존재하는 양 전하 대 RNA에 존재하는 음 전하의 비율이다. 적어도 하나의 양이온성 지질에 존재하는 양 전하 대 RNA에 존재하는 음 전하의 전하 비율은 다음의 식으로 계산한다: 전하 비율=[(양이온성 지질 농도 (mol)) * (양이온성 지질 내 양 전하의 총 수)] / [(RNA 농도 (mol)) * (RNA 내 음 전하의 총 수)].
생리학적 pH에서 비장을 표적화하는 본원에 기술된 RNA 리포플렉스 입자는 바람직하게는 양 전하 대 음 전하의 전하의 비율 약 1.9:2 내지 약 1:2와 같이 순 음전하를 가진다. 특정 구현예에서, 생리학적 pH에서 RNA 리포플렉스 입자 내 양 전하 대 음 전하의 전하 비율은 약 1.9:2.0, 약 1.8:2.0, 약 1.7:2.0, 약 1.6:2.0, 약 1.5:2.0, 약 1.4:2.0, 약 1.3:2.0, 약 1.2:2.0, 약 1.1:2.0, 또는 약 1:2.0이다.
RNA 전달 시스템은 고유한 간 선호성을 가진다. 이는 지질-기반 입자, 양이온성 및 중성 나노입자, 특히 리포좀, 나노마이셀 및 바이오접합체에서 친지성 리간드와 같은 지질 나노입자에 존재한다. 간 축적은 간 혈관 구조 또는 지질 대사 (리포좀 및 지질 또는 콜레스테롤 접합체)의 불연속적인 특성에 의해 유발된다.
본원에 기술된 IL2 변이체 폴리펩티드의 표적 전달의 일 구현예에서, 표적 기관은 간이고, 표적 조직은 간 조직이다. 특히, 만약 IL2 변이체 폴리펩티드가 이러한 장기 또는 조직내 존재하는 것이 바람직하고/거나 만약 IL2 변이체 폴리펩티드를 다량으로 발현하는 것이 바람직하고/거나 IL2 변이체 폴리펩티드의, 특히 현저한 양으로의 전신 존재가 바람직하거나 또는 필요한 경우에, 이러한 표적 조직으로의 전달이 바람직하다.
일 구현예에서, IL2 변이체 폴리펩티드를 엔코딩하는 RNA는 간을 표적으로 하기 위한 제형으로 투여된다. 이러한 제형은 본원의 상기에 기술되어 있다.
RNA를 간으로 in vivo에서 전달하기 위하여, 약물 전달 시스템은 분해를 방지함으로써 RNA의 간으로의 수송에 이용될 수 있다. 예를 들어, 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG)-코팅된 표면과 mRNA-함유 코어로 구성되는 폴리플렉스 나노마이셀은, 나노마이셀이 생리학적 조건에서 우수한 RNA의 in vivo 안정성을 제공하므로, 유용한 시스템이다. 아울러, 조밀한 PEG 울타리로 구성된, 폴리플렉스 나노마이셀 표면에 의해 제공되는 잠행성은 숙주 면역 방어를 효과적으로 회피한다.
약학 조성물
본원에 기술된 펩티드, 단백질, 폴리펩티드, RNA, RNA 입자 및 추가적인 물질, 예를 들어, 면역 체크포인트 저해제는 치료학적 또는 예방학적 치료를 위한 약학 조성물 또는 약제로 투여될 수 있으며, 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있고, 선택적으로 하나 이상의 보강제, 안정화제 등을 포함할 수 있는 임의의 적합한 약학적 조성물의 형태로 투여될 수 있다. 일 구현예에서, 약학 조성물은 치료학적 또는 예방학적 치료, 예를 들어 본원에 기술된 것들과 같은 암 질환과 같은 항원이 연관된 질환을 치료 또는 예방하는 데에 사용하기 위한 것이다.
용어 "약학 조성물"은 치료학적으로 유효한 물질을, 바람직하게는 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제와 함께, 포함하는 제형에 관한 것이다. 상기 약학 조성물은, 상기 약학 조성물을 개체에 투여함으로써 질환 또는 장애의 중증도를 낮추거나, 예방하거나 또는 치료하는 데에 유용하다. 약학 조성물은 또한 약학적 제형으로서 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 본 발명의 맥락에서, 약학 조성물은 본원에 기술된 바와 같이 펩티드, 단백질, 폴리펩티드, RNA, RNA 입자, 면역 작용 세포 및/또는 추가적인 물질을 포함한다.
본 명세서의 약학 조성물은 하나 이상의 보강제를 포함할 수 있거나, 하나 이상의 보강제와 함께 투여될 수 있다. 용어 "보강제"는 면역 반응을 연장, 강화 또는 가속화하는 화합물을 지칭한다. 보강제는 오일 에멀젼 (예, 프로인드 보강제), 미네랄 화합물 (예, 알럼), 박테리아 생산물 (예, 백일해균 독소) 또는 면역-자극 복합체와 같은 이종적인 화합물 군을 포함한다. 보강제의 예로는, 비-제한적으로, LPS, GP96, CpG 올리고데옥시뉴클레오티드, 성장인자 및 모노카인, 림포카인, 인터루킨, 케모카인과 같은 사이토카인을 포함한다. 사이토카인은 IL1, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL12, IFNα, IFNγ, GM-CSF, LT-a일 수 있다. 추가적으로 알려진 보강제는 알루미늄 하이드록사이드, 프로인드 보강제 또는 Montanide® ISA51과 같은 오일이다. 본 명세서에서 사용하기 위한 적합한 다른 보강제는 Pam3Cys과 같은 리포펩티드를 포함한다.
본 명세서에 따른 약학 조성물은 일반적으로 "약제학적 유효량"으로, "약제학적으로 허용가능한 제제"로 적용된다.
용어 "약제학적으로 허용가능한"은 약학 조성물의 활성 성분의 작용과 상호작용하지 않는 물질의 무독성을 의미한다.
용어 "약제학적 유효량" 또는 "치료학적 유효량"은 단독으로 또는 추가적인 투여와 더불어 원하는 반응 또는 원하는 효과를 달성하는 양을 의미한다. 특정 질환을 치료하는 경우에, 원하는 반응은 바람직하게는 질환의 진행 저해를 의미하다. 이는 질환의 진척 속도를 늦추는 것을 포함하며, 특히 질환의 진척을 중단시키거나 또는 역전시키는 것을 포함한다. 질환의 치료에서 원하는 반응은 또한 상기 질환 또는 상기 병태의 개시 지연 또는 개시 예방일 수 있다. 본원에 기술된 조성물의 유효량은 치료할 병태, 질환의 중등도, 나이, 신체 상태, 키 및 체중을 포함하는 환자의 개별 특성, 치료 기간, (존재하는 경우) 동반되는 요법의 유형, 구체적인 투여 경로 및 유사 인자에 따라 결정될 것이다. 따라서, 본원에 기술된 조성믈의 투여 용량은 이러한 다양한 특성에 따라 결정될 수 있다. 환자에서 반응이 1차 투여로 충분하지 않을 경우, 이 보다 고 용량 (또는 효과적으로는 다른, 보다 국지적인 투여 경로에 의해 달성되는 더 높은 용량)이 사용될 수 있다.
본 명세서의 약학적 조성물은 염, 완충제, 보존제, 그리고 선택적으로 다른 치료학적 물질을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 본 명세서의 약학적 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함한다.
본 명세서의 약학 조성물에 사용하기 적합한 보존제는, 비-제한적으로, 벤즈알코늄 클로라이드, 클로로부탄올, 파라벤 및 티메로살을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "부형제"는 본 명세서의 약학 조성물에 존재할 수 있지만 활성 성분이 아닌 물질을 지칭한다. 부형제에 대한 예로는, 비-제한적으로, 담체, 결합제, 희석제, 윤활제, 증점제, 계면활성제, 보존제, 안정화제, 유화제, 완충제, 착향제 또는 착색제를 포함한다.
용어 "희석제"는 희석 및/또는 묽게 하는 물질을 의미한다. 또한, 용어 "희석제"는 유체, 액체 또는 고체 현탁물 및/또는 혼합 매질 중 어느 하나 이상을 포함한다. 적합한 희석제의 예는 에탄올, 글리세롤 및 물을 포함한다.
용어 "담체"는 약학 조성물의 투여를 쉽게 만들거나, 강화하거나 또는 투여를 수행할 수 있게 하기 위해 활성 성분과 조합되는 천연, 합성, 유기, 무기일 수 있는 성분을 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 담체는, 개체에 투여하기 적합한, 하나 이상의 혼용가능한 고체 또는 액체 충전제, 희석제 또는 캡슐화 물질일 수 있다. 적합한 담체로는, 비-제한적으로, 멸균수, 링거, 링거 락테이트, 멸균 소듐 클로라이드 용액, 등장성 식염수, 폴리알킬렌 글리콜, 수소화 나프탈렌, 및, 특히, 생체적합성 락티드 폴리머, 락티드/글리콜라이드 코폴리머 또는 폴리옥시에틸렌/폴리옥시-프로필렌 코폴리머를 포함한다. 일 구현예에서, 본 명세서의 약학 조성물은 등장성 식염수를 포함한다.
치료학적 용도를 위한 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제는 약학 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R Gennaro edit. 1985)에 기술되어 있다.
약학적 담체, 부형제 또는 희석제는 의도한 투여 경로 및 표준 약학 실무에 따라 선택될 수 있다.
일 구현예에서, 본원에 기술된 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 피하, 진피내 또는 근육내로 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 약학 조성물은 국소 투여 또는 전신 투여를 위해 제형화된다. 전신 투여는 위장관을 통한 흡수를 수반하는 장 투여 또는 비경구 투여를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "비경구 투여"는 정맥내 주사와 같이, 위장관을 통해 이루어지는 것 이외의 다른 임의의 방식으로 투여하는 것을 의미한다. 바람직한 구현예에서, 약학 조성물은 전신 투여용으로 제형화된다. 다른 바람직한 구현예에서, 전신 투여는 정맥내 투여에 의한 것이다. 본 발명의 모든 측면의 일 구현예에서, 본원에서 설명된 IL2 변이체 폴리펩티드를 엔코딩하는 RNA 및 선택적으로 항원을 엔코딩하는 RNA는 전신으로 투여된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "공동-투여"는 여러가지 화합물 또는 조성물 (예를 들어, 면역 작용 세포, IL2 변이체 폴리펩티드를 엔코딩하는 RNA, 및 선택적으로 백신 항원을 엔코딩하는 RNA)을 동일한 환자에게 투여하는 것을 의미한다. 여러가지 화합물 또는 조성물은 동시에, 본질적으로 동시에, 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
치료
본원에 기술된 물질, 조성물 및 방법은 질환, 예를 들어, 항원을 발현하는 질환에 걸린 세포의 존재를 특징으로 하는 질환을 가진 개체를 치료하는 데에 사용될 수 있다. 특히 바람직한 질환은 암 질환이다. 예를 들어, 만약 항원이 바이러스에서 유래되었다면, 물질, 조성물 및 방법은 상기 바이러스에 의해 야기되는 바이러스 질환의 치료에 유용할 수 잇다. 만약 항원이 종양 항원이라면, 물질, 조성물 및 방법은 암 질환의 치료에 유용하고, 여기서 암 세포는 상기 종양 항원을 발현한다.
본원에 기술된 물질, 조성물 및 방법은 다양한 질환의 치료학적 또는 예방학적 치료에 사용될 수 있고, 여기서 본원에 기술된 바와 같이 면역 작용 세포의 지원 및/또는 면역 작용 세포의 활성은 암 및 감염성 질환과 같은 환자에 유리하다. 일 구현예에서, 본원에 기술된 물질, 조성물 및 방법은 항원과 연관된 질환의 예방학적 및/또는 치료학적 치료에 유용하다.
용어 "질환"은 개체의 신체에 영향을 미치는 비정상적인 병태를 지칭한다. 질환은 종종 특정 증상 및 신호와 관련있는 의학적인 상태로서 해석된다. 질환은 감염성 질환과 같은 외부 원인으로부터 기원한 인자에 의해 유발될 수 있거나, 또는 자가면역 질환과 같은 내부 기능부전에 의해 유발될 수 있다. 인간에서, "질환"은 보다 넒은 의미에서 개체와 접촉시 질병이 병을 앓고 있는 개체에게 통증, 기능부전, 괴로움, 사회적 문제 또는 사망 또는 비슷한 문제를 유발하는 임의의 병태를 지칭하기 위해 사용된다. 보다 넓은 의미에서, 이는 때때로 상해, 불능, 장애, 증후군, 감염, 단독 증상, 일탈 행위 및 구조적 및 기능적인 비정형성 변형을 포함하며, 다른 맥락 및 다른 목적에서, 이는 구별할 수 있는 범주로 간주될 수 있다. 질환은, 여러가지 질환에 걸려 생활하면 개체의 삶에 대한 관점과 성격을 바꿀 수 있으므로, 일반적으로 개체에게 신체적으로뿐 아니라 감정적으로 영향을 미친다.
본 맥락에서, 용어 "치료", "치료하는" 또는 "치료학적 개입"은 질환 또는 장애와 같은 병태를 퇴치할 목적으로 개체를 관리 및 돌보는 것을 의미한다. 이 용어는 증상 또는 합병증을 완화하고/거나, 질환, 장애 또는 병태의 진행을 지연하고/거나, 증상 및 합병증을 완화 또는 경감하고/거나, 질환, 장애 또는 병태를 치유 또는 제거하는 것 뿐 아니라 병태를 예방하기 위해, 치료학적으로 효과적인 화합물의 투여와 같이, 개체가 고통받는 소정의 병태에 대한 전 범위 치료를 포함하는 것으로 의도되며, 여기서 예방은 질환, 병태 또는 장애를 퇴치하기 위한 목적으로 개체를 관리 및 돌보는 것으로서 이해될 것이고, 증상 또는 합병증의 개시를 방지하기 위한 활성 화합물의 투여를 포함한다.
용어 "치료학적 치료"는 개체의 건강 상태를 개선하고/거나 개체의 수명을 연장(증가)하는 임의의 치료를 의미한다. 상기 치료는 개체에서 질환의 소거, 개체에서 질환 진행의 정지 또는 서행, 개체에서 질환 진행의 저해 또는 서행, 개체에서 증상의 빈도 또는 중증도 감소, 및/또는 질환을 현재 앓고 있거나 예전에 걸린 적 있는 개체에서 재발 감소일 수 있다.
용어 "예방학적 치료" 또는 "예방적 치료"는 개체에서 질환이 발생되는 것을 방지하기 위해 의도되는 임의의 치료를 의미한다. 용어 "예방학적 치료" 또는 "예방적 치료"는 본원에서 상호 호환적으로 사용된다.
용어 "개인" 및 "개체"는 본원에서 상호 호환적으로 사용된다. 이들 용어는, 질환 또는 장애 (예를 들어, 암)에 걸릴 수 있거나 또는 취약할 수 있는 인간 또는 기타 포유류 (예, 마우스, 랫, 토끼, 개, 고양이, 소, 돼지, 양, 말 또는 영장류)를 지칭하지만, 질환 또는 장애에 걸렸을 수 있거나 또는 걸리지 않았을 수 있다. 다수 구현예들에서, 개체는 인간이다. 달리 명시되지 않은 한, 용어 "개인" 및 "개체"는 특정 연령을 의미하지 않으며, 따라서 성인, 노인, 어린이 및 신생아를 포괄한다. 본 명세서의 구현예에서, "개체" 또는 "개인"은 "환자"이다.
용어 "환자"는 치료가 필요한 개인 또는 개체, 구체적으로 질환에 걸린 개인 또는 개체를 의미한다.
본 명세서의 일 구현예에서, 목표는 종양 항원을 발현하는 암 세포와 같은 항원을 발현하는 질환에 걸린 세포에 대해 면역 반응을 제공하는 것 및 종양 항원과 같은 항원을 발현하는 세포를 수반하는 암 질환과 같은 질환을 치료하는 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "면역 반응"은 항원 또는 항원을 발현하는 세포에 대한 일체화된 신체 반응을 지칭하며, 세포성 면역 반응 및/또는 체액성 면역 반응을 지칭한다.
"세포-매개 면역", "세포성 면역", "세포성 면역 반응", 또는 유사 용어는 항원의 발현을 특징으로 하는, 특히 클래스 I 또는 클래스 II MHC로 항원을 제시하는 것을 특징으로 하는 세포에 대한 세포성 반응을 포함하는 것을 의미한다. 세포성 반응은 "헬퍼" 또는 "살상" 중 하나로서 작동하는 T 세포 또는 T 림프구로 불리는 세포에 관한 것이다. 헬퍼 T 세포 (CD4+ T 세포로도 지칭됨)는 면역 반응을 조절함으로써 중추적인 역할을 하고, 살상 세포 (세포독성 T 세포, 세포용해성 T 세포, CD8+ T 세포 또는 CTL로도 지칭됨)는 암 세포와 같은 질환에 걸린 세포를 죽여 더 많은 질환에 걸린 세포의 발생을 예방한다.
본 명세서는 보호적, 예방적, 예방학적 및/또는 치료학적일 수 있는 면역 반응을 고려한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "면역 반응을 유도하다 [또는 유도하는]"는 유도하기 전 특정 항원에 대한 면역 반응이 없다는 것을 의미할 수 있거나, 또는 유도하기 전 특정 항원에 대한 면역 반응이 기저 수준으로 존재하고 유도 후 강화되는 것을 의미할 수 있다. 따라서, "면역 반응을 유도하다 [또는 유도하는]"는 "면역 반응을 강화하다 [또는 강화하는]"를 포함한다.
용어 "면역요법"은 면역 반응의 유도 또는 강화에 의한 질환 또는 병태의 치료를 의미한다. 용어 "면역요법"은 항원 면역화 또는 항원 백신 접종을 포함한다.
용어 "면역화" 또는 "백신 접종"은 예를 들어, 치료학적 또는 예방학적 이유로, 면역 반응을 유도하기 위한 목적으로 항원을 개체에 투여하는 과정을 의미한다.
용어 "대식 세포"는 단핵구의 분화에 의해 만들어진 식세포의 하위군을 지칭한다. 염증, 면역 사이토카인 또는 미생물 산물에 의해 활성화된 대식 세포는 비특이적으로 탐식 작용을 수행하여, 수소분해성 및 산화성 공격에 의해 대식 세포 내 외인성 병원체를 사멸시켜 병원체를 분해한다. 분해된 단백질로부터 유래된 펩티드는 대식 세포의 세포 표면 상에 제시되고, 이는 T 세포에 의해 인지될 수 있으며, B 세포 표면 상의 항체와 직접 상호작용하여, T 및 B 세포를 활성화하고 면역 반응을 추가적으로 자극할 수 있다. 대식 세포는 항원 제시 세포 클래스에 속한다. 일 구현예에서, 대식 세포는 비장 대식 세포이다.
용어 "수지상 세포" (DC)는 항원 제시 세포 클래스에 속하는 식세포의 다른 하위종을 지칭한다. 일 구현예에서, 수지상 세포는 조혈 골수 전구 세포로부터 유래된다. 이들 전구 세포는 먼저 미성숙 수지상 세포로 변환된다. 이들 미성숙 세포는 높은 탐식 활성과 낮은 T 세포 활성화 가능성을 특징으로 한다. 미성숙 수지상 세포는 바이러스 및 박테리아와 같은 병원체에 대해 주변 환경을 계속적으로 샘플링한다. 일단 이들이 제시가능한 항원과 접촉하게 되면, 그 세포는 성숙한 수지상 세포로 활성화되어, 비장 또는 림프절로의 이동하기 시작한다. 미성숙 수지상 세포는 병원체를 탐식하여, 이의 단백질을 작은 조각으로 분해하고, 성숙화되면 이들 조각들을 MHC 분자를 이용해 세포 표면에 제시한다. 동시에, 이들 세포는 CD80, CD86 및 CD40과 같은 T 세포 활성화에서 공동-수용체로서 작용하는 세포-표면 수용체를 상향 조절하여, 이의 T 세포 활성화 능력을 크게 강화한다. 이들은 또한 수지상 세포가 혈류를 통해 비장으로 이동하거나 또는 림프 시스템을 통해 림프절로 이동하게 유도하는 주화성 수용체인 CCR7을 상향 조절한다. 여기서, 이들은 항원-제시 세포로 작용하며, 비-항원 특이적인 공동-자극 신호와 동시에, 헬퍼 T 세포 및 살상 T 세포뿐 아니라 항원 제시에 의해 B 세포를 활성화한다. 따라서, 수지상 세포는 T 세포- 또는 B 세포-관련 면역 반응을 적극적으로 유도할 수 있다. 일 구현예에서, 수지상 세포는 비장의 수지상 세포이다.
용어 "항원 제시 세포" (APC)는 세포의 표면 상에 (또는 에) 적어도 하나의 항원 또는 항원 단편을 나열, 획득 및/또는 제시할 수 있는 다양한 세포이다. 항원-제시 세포는 전문적 항원 제시 세포 및 비-전문적 항원 제시 세포로 구분될 수 있다.
용어 "전문적 항원 제시 세포"는 나이브 T 세포와의 상호작용에 필요한 주 조직적합성 복합체 클래스 II (MHC 클래스 II) 분자를 구성적으로 발현하는 항원 제시 세포이다. 만약 T 세포가 항원 제시 세포의 막 상에 MHC 클래스 II 분자 복합체와 상호작용하면, 항원 제시 세포는 T 세포의 활성화를 유도하는 공동-자극성 분자를 생산한다. 전문적 항원 제시 세포는 수지상 세포 및 대식 세포를 포함한다.
용어 "비-전문적 항원 제시 세포"는 인터페론-감마와 같은 특정 사이토카인에 의한 자극시 MHC 클래스 II 분자를 구성적으로 발현하지 않는 항원 제시 세포를 지칭한다. 예를 들어, 비-전문적 항원 제시 세포는 섬유모세포, 흉선 상피 세포, 갑상선 상피 세포, 신경교 세포, 췌장 베타 세포 또는 혈관 내피 세포를 포함한다.
"항원 가공 처리"는 항원을 처리 산물로 분해하는 것을 의미하며, 처리 산물은 상기 항원의 단편 (예, 단백질의 펩티드로의 분해) 및 특정 T 세포에 대한 항원 제시 세포와 같이 세포에 의해 제시하기 위한 MHC 분자와 하나 이상의 이들 단편의 (예, 결합을 통한) 조합이다.
용어 "항원을 수반하는 질환"은 항원이 관련된 임의의 질환, 예를 들어 항원의 존재를 특징으로 하는 질환을 의미한다. 항원을 수반한 질환은 감염성 질환 또는 암 질환 또는 단순 암일 수 있다. 전술한 바와 같이, 항원은 종양-관련 항원, 바이러스 항원 또는 박테리아 항원과 같은 질환-관련 항원일 수 있다. 일 구현예에서, 항원을 수반하는 질환은, 바람직하게는 세포의 표면에, 항원을 발현하는 세포를 수반하는 질환이다.
용어 "감염성 질환"은 개체에서 개체로 또는 유기체에서 유기체로 전파될 수 있으며, 미생물 물질 (예, 감기)에 의해 유발되는 임의의 질환을 지칭한다. 감염성 질환은 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 바이러스, 박테리아 및 기생충에 의해 각각 유발되는 바이러스성 질환, 박테리아성 질환 또는 기생충성 질환을 포함한다. 이런 점에서, 감염성 질환은, 예를 들어, 간염, 성적으로 전파되는 질환 (예, 클라미디아 또는 임질), 결핵, HIV/후천성 면역결핍 증후군 (AIDS), 디프테리아, B형 간염, C형 간염, 콜레라, 중증 급성 호흡 증후군 (SARS), 조류 독감 및 인플루엔자일 수 있다.
용어 "암 질환" 또는 "암"은 개체에서 전형적으로 통제되지 않은 세포 증식을 특징으로 하는 병리학적 병태를 지칭하거나 또는 이를 의미한다. 암의 예로는, 비-제한적으로, 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병을 포함한다. 보다 상세하게는, 이러한 암의 예로는 골암, 혈액암, 폐암, 간암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문 부위의 암, 위암, 대장암, 유방암, 전립선암, 자궁암, 성 및 생식 기관의 암종, 호지킨 질환, 식도암, 소장암, 내분비계 암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 방광암, 신장암, 신장 세포 암종, 신우 암종, 중추 신경계 (CNS)의 신생물, 신경외배엽 암, 척추 종양, 신경교종, 수막종 및 뇌하수체 선종을 포함한다. 본 명세서에 따를 때, 용어 "암"은 암 전이를 또한 포함한다.
암 치료에서 병용 전략 (combination strategy)은, 단일요법 방식의 효과 보다 더 높은 것으로 간주될 수 있는, 달성되는 상승 효과로 인해 적합할 수 있다. 일 구현예에서, 약학 조성물은 면역요법제와 함께 투여된다. 본원에서 사용된 바와 같이, "면역요법제"는 특이적인 면역 반응 및/또는 면역 작용세포 기능(들)을 활성화하는데 관여할 수 있는 임의 물질을 의미한다. 본 명세서는 면역요법제로서 항체의 사용을 고려한다. 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 항체는, 세포자살 유도, 신호 전달 경로의 구성성분의 차단 또는 종양 세포의 증식 저해를 포함하는, 다양한 기전을 통해 암 세포에 대해 치료학적 효과를 달성할 수 있다. 특정 구현예에서, 항체는 단일클론 항체이다. 단일클론 항체는 항체-의존적인 세포 매개 세포독성 (ADCC)을 통해 세포 사멸을 유도할 수 있거나, 보체 단백질에 결합하여, 보체 의존적인 세포독성 (CDC)으로 알려진 직접적인 세포 독성을 유도할 수 있다. 본 발명과 조합하여 사용될 수 있는 항-암 항체 및 잠재적인 항체 표적(괄호 안)에 대한 비-제한적인 예로는, 아바고보맵 (Abagovomab) (CA-125), 압시시맵 (Abciximab) (CD41), 아데카투무맵 (Adecatumumab)(atumumab) (EpCAM), 아푸투주맵 (Afutuzumab) (CD20), 알라시주맵 (Alacizumab pegol) (VEGFR2), 알투모맵 펜테테이트 (Altumomab pentetate) (CEA), 아마투시맵 (Amatuximab) (MORAb-009), 아나투모맵 마페나톡스 (Anatumomab mafenatox) (TAG-72), 아폴리주맵 (Apolizumab) (HLA-DR), 아르시투모맵 (Arcitumomab) (CEA), 아테졸리주맵 (Atezolizumab) (PD-L1), 바비투시맵 (Bavituximab) (포스파티딜세린), 벡투모맵 (Bectumomab) (CD22), 벨리무맵 (Belimumab) (BAFF), 베바시주맵 (Bevacizumab) (VEGF-A), 비바투주맵 메르탄신 (Bivatuzumab mertansine)(CD44 v6), 빌리나투모맵 (Blinatumomab) (CD19), 브렌투시맵 베도틴 (Brentuximab vedotin) (CD30 TNFRSF8), 칸투주맵 메르탄신 (Cantuzumab mertansin) (mucin CanAg), 칸투주맵 라브탄신 (Cantuzumab ravtansine) (MUC1), 카프로맵 펜데티드 (Capromab pendetide) (전립선 암종 세포), 카를루맵 (Carlumab) (CNT0888), 카투맥소맵 (Catumaxomab) (EpCAM, CD3), 세투시맵 (Cetuximab) (EGFR), 시타투주맵 보가톡스 (Citatuzumab bogatox) (EpCAM), 시수투무맵 (Cixutumumab) (IGF-1 수용체), 클라우디시맵 (Claudiximab) (Claudin), 클리바투주맵 테트라세탄 (Clivatuzumab tetraxetan) (MUC1), 코나투무맵 (Conatumumab) (TRAIL-R2), 다세투주맵 (Dacetuzumab) (CD40), 달로투주맵 (Dalotuzumab) (인슐린-유사 성장인자 I 수용체), 데노수맵 (Denosumab) (RANKL), 데투모맵 (Detumomab) (B-림프종 세포), 드로지투맵 (Drozitumab) (DR5), 에크로멕시맵 (Ecromeximab) (GD3 강글리오시드), 에드레콜로맵 (Edrecolomab) (EpCAM), 엘로투주맵 (Elotuzumab) (SLAMF7), 에나바투주맵 (Enavatuzumab) (PDL192), 엔시투시맵 (Ensituximab) (NPC-1C), 에프라투주맵 (Epratuzumab) (CD22), 에르투막소맵 (Ertumaxomab) (HER2/neu, CD3), 에타라시주맵 (Etaracizumab) (인테그린 αγβ3), 파를레투주맵 (Farletuzumab)(폴레이트 수용체 1), FBTA05 (CD20), 피클라투주맵 (Ficlatuzumab) (SCH 900105), 피기투무맵 (Figitumumab) (IGF-1 수용체), 플란보투맵 (Flanvotumab) (당단백질 75), 프레솔리무맵 (Fresolimumab) (TGF-β), 갈리시맵 (Galiximab) (CD80), 가니투맵 (Ganitumab) (IGF-I), 겜투주맵 오조가미신 (Gemtuzumab ozogamicin) (CD33), 게보키주맵 (Gevokizumab) (IL1β), 기렌투시맵 (Girentuximab) (카보닉 안하이드라제 9 (CA-IX)), 글렘바투무맵 베도틴 (Glembatumumab vedotin) (GPNMB), 이브리투모맵 티우세탄 (Ibritumomab tiuxetan) (CD20), 이크루쿠맵 (Icrucumab) (VEGFR-1), 이고보마 (Igovoma) (CA-125), 인다투시맵 라브탄신 (Indatuximab ravtansine) (SDC1), 인테투무맵 (Intetumumab) (CD51), 이노투주맵 오조가미신 (Inotuzumab ozogamicin) (CD22), 이필리무맵 (Ipilimumab) (CD 152), 이라투무맵 (Iratumumab) (CD30), 라베투주맵 (Labetuzumab) (CEA), 렉사투무맵 (Lexatumumab) (TRAIL-R2), 리비비루맵 (Libivirumab) (B형 간염 표면 항원), 린투주맵 (Lintuzumab) (CD33), 로르보투주맵 메르탄신 (Lorvotuzumab mertansine) (CD56), 루카투무맵 (Lucatumumab) (CD40), 루밀리시맵 (Lumiliximab) (CD23), 마파투무맵 (Mapatumumab) (TRAIL-R1), 마투주맵 (Matuzumab) (EGFR), 메폴리주맵 (Mepolizumab) (IL5), 밀라투주맵 (Milatuzumab) (CD74), 미투모맵 (Mitumomab) (GD3 강글리오시드), 모가물리주맵 (Mogamulizumab) (CCR4), 모세투모맵 파수도톡스 (Moxetumomab pasudotox) (CD22), 나콜로맵 타페나톡스 (Nacolomab tafenatox) (C242 항원), 나프투모맵 에스타페나톡스 (Naptumomab estafenatox) (5T4), 나마투맵 (Namatumab) (RON), 넥시투무맵 (Necitumumab) (EGFR), 니모투주맵 (Nimotuzumab) (EGFR), 니볼루맵 (Nivolumab) (IgG4), 요파투무맵 (Ofatumumab) (CD20), 올라라투맵 (Olaratumab) (PDGF-R a), 오나르투주맵 (Onartuzumab) (인간 스캐터 인자 수용체 키나제 (human scatter factor receptor kinase)), 오포르투주맵 모나톡스 (Oportuzumab monatox) (EpCAM), 오레고보맵 (Oregovomab) (CA-125), 옥셀루맵 (Oxelumab) (OX-40), 파니투무맵 (Panitumumab) (EGFR), 파트리투맵 (Patritumab) (HER3), 펨투모마 (Pemtumoma) (MUC1), 페르투주마 (Pertuzuma) (HER2/neu), 핀투모맵 (Pintumomab) (선암종 항원), 프리투무맵 (Pritumumab) (비멘틴 (vimentin)), 라코투모맵 (Racotumomab) (N-글리콜릴뉴라민산), 라드레투맵 (Radretumab) (파이브로넥틴 엑스트라 도메인-B), 라피비루맵 (Rafivirumab) (광견병 바이러스 당단백질), 라무시루맵 (Ramucirumab) (VEGFR2), 릴로투무맵 (Rilotumumab) (HGF), 리투시맵 (Rituximab) (CD20), 로바투무맵 (Robatumumab) (IGF-1 수용체), 살말리주맵 (Samalizumab) (CD200), 시브로투주맵 (Sibrotuzumab) (FAP), 실투시맵 (Siltuximab) (IL6), 타발루맵 (Tabalumab) (BAFF), 타카투주맵 테트라세탄 (Tacatuzumab tetraxetan)(α-페토프로테인), 타플리투모맵 파프톡스 (Taplitumomab paptox) (CD 19), 테나투모맵 (Tenatumomab) (테나신 C), 테프로투무맵 (Teprotumumab) (CD221), 티실리무맵 (Ticilimumab) (CTLA- 4), 티가투주맵 (Tigatuzumab) (TRAIL-R2), TNX-650 (IL13), 토시투모맵 (Tositumomab) (CD20), 트라스투주맵 (Trastuzumab) (HER2/neu), TRBS07 (GD2), 트레멜리무맵 (Tremelimumab) (CTLA-4), 투코투주맵 셀모루킨 (Tucotuzumab celmoleukin) (EpCAM), 우블리투시맵 (Ublituximab) (MS4A1), 우레루맵 (Urelumab) (4-1 BB), 볼로시시맵 (Volociximab) (인테그린 α5β1), 보투무맵 (Votumumab) (종양 항원 CTAA 16.88), 잘루투무맵 (Zalutumumab) (EGFR) 및 자놀리무맵 (Zanolimumab) (CD4)를 포함한다.
본원에 참조된 문헌 및 연구에 대한 언급은 임의의 전술한 내용이 선행 기술 분야와 관련 있다는 인정으로서 의도되진 않는다. 이들 문헌의 내용에 대한 모든 언급은 출원인에게 이용가능한 정보를 기반으로 하며, 이들 문헌의 내용에 대한 정확성에 관한 어떠한 인정으로도 간주되지 않는다.
후술한 내용은 당해 기술 분야의 당업자가 다양한 구현예들을 만들고 이용할 수 있게 하기 위해 제공된다. 구체적인 장치, 기법 및 이용에 관한 설명은 단지 예로서 제공된다. 본원에 기술된 예에 대한 다양한 변형들이 당해 기술 분야의 당업자들에게 용이하게 자명할 것이며, 본원에 정의된 일반적인 원리는 다양한 구현예들의 사상 및 범위로부터 이탈하지 않으면서 다른 예 및 활용에 적용될 수 있다. 따라서, 다양한 구현예들은 본원에 기술되고 보여진 예들로 한정하고자 하는 것은 아니며, 청구항과 일치하는 범위에 부합되는 것으로 의도된다.
실시예
실시예 1: 컨스트럭트 설계
인간 IL2 (hIL2) 및 인터루킨 2 수용체 서브유닛 알파 (hIL2RA, CD25)의 상호 쌍을 설계하기 위하여, 다양한 아미노산 치환을 hIL2:hIL2RA 결합 계면에 수행하였다. 더욱 구체적으로, Stauber et al. (Stauber, D. et al. PNAS February 21, 2006 103 (8) 2788-2793)에 출판된 바와 같이 hIL2 고-친화도 수용체 복합체의 결정 구조에 따라, hIL2:hIL2RA 결합을 갖게하는 이온성 상호작용의 부분인 염기성 및 산성 아미노산 잔기 3쌍을 찾았다. 각각의 잔기를 역 방식, 염기성 아미노산을 산성 아미노산으로, 그리고 반대의 경우도 마찬가지 방식으로 교환하였다. hIL2 및 상응하는 hIL2RA 모두에 대해 최대 3개의 아미노산 위치를 변이시켜 예상된 변경된 hIL2RA 결합능을 가진 4가지의 hIL2 변이체 및 예상된 변경된 hIL2 결합능을 가진 4가지 hIL2RA 돌연변이를 제조하였다.
4개의 상이한 hIL2 변이체는 다음의 아미노산 치환을 포함한다:
-
hIL2_A3: K35E, K43E 및 E61K
-
hIL2_A4: K43E 및 E61K
-
hIL2_A5: E61K
-
hIL2_A8: K43E
4개의 상이한 hIL2RA 돌연변이는 다음의 치환을 포함한다:
-
hIL2RA_mut1: E29K 및 K38E
-
hIL2RA_mut2: K38E
-
hIL2RA_mut3: E29K
-
hIL2RA_mut4: E1K, E29K 및 K38E
이 초기 설계에 기반하여, 변이된 hIL2 및 hIL2RA를 매칭하는 것에 대한 유익한 조합을 예상하였다 (표 1을 보아라).
표 1: hIL2 및 hIL2RA 서열 내 아미노산 치환의 위치에 기반한 hIL2RA 돌연변이 및 hAlb-hIL2 변이체 쌍 매칭 (X로 표시함) 예측
| hIL2RA 돌연변이 | |||||
| hIL2RA_mut1 (E29K,K38E) | hIL2RA_mut2 (K38E) |
hIL2RA_mut3 (E29K) |
hIL2RA_mut4 (E1K,E29K,K38E) |
||
| hAlb-hIL2 변이체 | hAlb-hIL2_A3 (K35E,K43E,E61K) |
X | |||
| hAlb-hIL2_A4 (K43E,E61K) |
X | ||||
| hAlb-hIL2_A5(E61K) | X | ||||
| hAlb-hIL2_A8(K43E) | X | ||||
실시예 2: mRNA 생산
in vitro 전사를 위한 사이토카인을 엔코딩하는 mRNA는 pST1-T7-AGA-dEarI-hAg-MCS-FI-A30LA70 플라스미드-백본 및 유도체 DNA-컨스트럭트를 기반으로 하였다. 이들 플라스미드 컨스트럭트는 5´ UTR (비번역 영역, 호모 사피엔스 헤모글로빈 (hAg) 서브유닛 α1의 5´-UTR의 유도체), 3' FI 인자 (F는 136개 뉴클레오티드 길이, 스플리트 mRNA의 아미노-말단 인핸서의 3´-UTR 단편이고, I는 호모 사피엔스에서 둘다 동정된 12S RNA를 미토콘드리아에서 엔코딩하는 142개 뉴클레오티드 길이의 단편임; WO 2017/060314) 및 100개 뉴클레오티드로 된 폴리(A) 꼬리를, 70개 뉴클레오티드 이후에 링커와 함께 포함한다.
사이토카인 및 혈청 알부민 (hAlb) 엔코딩 서열은 호모 사피엔스로부터 기원하고, 전술한 hIL2 변이체에서 계획된 돌연변이를 제외하고는 제조되는 아미노산 서열에 변형을 도입하지 않았다 (hIL2: NP_000577.2; NCBI 단백질 소스). 사이토카인 컨스트럭트를 위해, hIL2 변이체를 hAlb의 C-말단에 추가하였고 엔코딩된 단백질을 각각의 단백질의 천연 SP인 N-말단 신호 펩티드 (SP)를 장착하였다. 융합 단백질의 경우, N-말단 모이어티의 SP만을 유지시켰고, 추가적인 모이어티로 성숙 부분 (SP가 없는 단백질)만을 엔코딩하였다. 종결-코돈을 가장 C-말단 모이어티에만 도입하였다. 사이토카인 및 hAlb 융합 컨스트럭트에서 다른 단백질 모이어티들은 글리신 및 세린 잔기를 엔코딩하는 30-뉴클레오티드 길이의 링커 서열로 분리시켰다.
IL2RA 엔코딩 서열은 호모 사피엔스로부터 기원하고, 전술한 상응하는 hIL2RA 돌연변이에서 hIL2 결합능을 바꾸기 위한 계획된 돌연변이를 제외하고는 제조되는 아미노산 서열에 변형을 도입하지 않았다 (hIL2RA: NP_000408.1; NCBI 단백질 소스). 엔코딩된 단백질에 hIL2RA의 천연 SP인 N-말단 신호 펩티드 (SP)를 장착하였다. mRNA를 Kreiter et al. (Kreiter, S. et al. Cancer Immunol. Immunother. 56, 1577-87 (2007))에 기술된 바와 같이 정상 뉴클레오시드 우리딘을 1-메틸-슈도우리딘으로의 치환과 함께 in vitro 전사를 통해 생산하였다. 생산된 mRNA에 Cap1-구조를 장착하고 이중-가닥 (dsRNA) 분자를 제거하였다. 정제된 mRNA를 H2O로 희석시키고 추가적으로 사용할 때 까지 -80℃에서 저장하였다. 모든 기술된 mRNA 컨스트럭트의 in vitro 전사를 BioNTech RNA Pharmaceuticals GmbH에서 수행하였다. 하기 실험에서 사용된 모든 컨스트럭트 목록은 표 2에 나타내었다.
표 2: mRNA에 엔코딩되어 발현된 단백질의 아미노산 서열
| hAlb | MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL |
| hAlb-hIL2 | MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLGGSGGGGSGGAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT |
| hAlb-hIL2_A3 | MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLGGSGGGGSGGAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPELTRMLTFEFYMPKKATELKHLQCLEKELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT |
| hAlb-hIL2_A4 | MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLGGSGGGGSGGAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFEFYMPKKATELKHLQCLEKELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT |
| hAlb-hIL2_A5 | MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLGGSGGGGSGGAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEKELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT |
| hAlb-hIL2_A8 | MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLGGSGGGGSGGAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFEFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT |
| hIL2RA | MDSYLLMWGLLTFIMVPGCQAELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSLYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTGEMETSQFPGEEKPQASPEGRPESETSCLVTTTDFQIQTEMAATMETSIFTTEYQVAVAGCVFLLISVLLLSGLTWQRRQRKSRRTI |
| hIL2RA_mut1 | MDSYLLMWGLLTFIMVPGCQAELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCKCKRGFRRIESGSLYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTGEMETSQFPGEEKPQASPEGRPESETSCLVTTTDFQIQTEMAATMETSIFTTEYQVAVAGCVFLLISVLLLSGLTWQRRQRKSRRTI |
| hIL2RA_mut2 | MDSYLLMWGLLTFIMVPGCQAELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIESGSLYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTGEMETSQFPGEEKPQASPEGRPESETSCLVTTTDFQIQTEMAATMETSIFTTEYQVAVAGCVFLLISVLLLSGLTWQRRQRKSRRTI |
| hIL2RA_mut3 | MDSYLLMWGLLTFIMVPGCQAELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCKCKRGFRRIKSGSLYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTGEMETSQFPGEEKPQASPEGRPESETSCLVTTTDFQIQTEMAATMETSIFTTEYQVAVAGCVFLLISVLLLSGLTWQRRQRKSRRTI |
| hIL2RA_mut4 | MDSYLLMWGLLTFIMVPGCQAKLCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCKCKRGFRRIESGSLYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTGEMETSQFPGEEKPQASPEGRPESETSCLVTTTDFQIQTEMAATMETSIFTTEYQVAVAGCVFLLISVLLLSGLTWQRRQRKSRRTI |
실시예 3: RNA-엔코딩된 hAlb-hIL2 변이체
in vitro
발현
생성된 hAlb-hIL2 변이체-엔코딩 mRNA의 in vitro 발현을 mRNA의 HEK293T/17 세포로의 리포펙션(lipofection) 후 hAlb-hIL2 변이체 함유 상층액에 의한 IL2R
γ-발현 리포터 세포의 CD25-독립적 활성의 분석을 통해 분석하였다 (도 1A, B). 리포펙션 하루 전, .2Х106 HEK293T/17 세포를 6-웰 플레이트에서 3mL DMEM (Life Technologies GmbH, cat. no. 31966-021) + 10% 소 태아 혈청 (FBS, Biochrom GmbH, cat. no. S0115)에 접종하였다. 리포펙션을 위해 3 μg IVT-mRNA를 무균성 및 RNase-결핍 조건 하에 리포펙타민 MessengerMax (Thermo Fisher Scientific, cat. No. LMRNA015) 400 ng/㎕ mRNA으로 제형화고, 이를 HEK293T/17 세포에 약 80% 컨플루언스에서 10cm2 배양 접시 각각에 적용하였다. 20시간 발현 후, 상층액을 무균 조건에서 수집하여, 향후 사용시까지 -20℃에서 보관하였다. 중간-친화성 IL2 수용체 (IL2Rβγ)를 발현하는 TF-1_IL2Rβγ 세포의 특이적인 증식 반응을 측정함으로써, hAlb-hIL2 변이체의 CD25-독립적인 생활성을 분석하였다. 이 세포주는 IL2R 공통 γ-쇄를 천연적으로 발현하는 인간 적백혈병 세포주인 TF-1 세포주 (ATCC CRL-2003)로부터, Farner et al. (Farner, N. L. et al. Blood 86, 4568-4578 (1995))와 유사하게 인간 IL2Rβ 사슬의 서열 (Gene ID: 3560)을 엔코딩하는 레트로바이러스 벡터를 형질도입하여, 구축하였다. 간략하게는, TF-1_IL2Rβγ 세포를 D-PBS로 2번 세척하고 10% 소 태아 혈청 (FBS; Biochrom GmbH, cat. no. S0115) 및 1 mM 소듐 파이루베이트 (Life Technologies GmbH, cat. no. 11360-039)가 첨가된 RPMI 1640 (+ GlutaMAX, Life Technologies GmbH, cat. no. 61870-010)에 재현탁하였다. 총 세포 5,000주/웰로 바닥이 평평한 백색 96웰 플레이트 (Fisher Scientific GmbH, cat. no. 10072151)에 접종하여, hAlb-hIL2 변이체-함유 상층액의 4배 연속 희석물과 인큐베이션하였다. 3일간 배양한 후, CellTiter-Glo® 2.0 분석(Promega, cat. no. G9242)을 이용한 ATP 양을 통해 살아있는 세포를 정량함으로써 증식을 측정하였다. Tecan Infinite® F200 PRO 리더 (Tecan Deutschland GmbH)에서 발광을 기록하고, GraphPad Prism version 6.04 (GraphPad Software, Inc.)에서 용량-반응 곡선을 작성하였다.
야생형 hAlb-hIL2 뿐 아니라 감소된 CD25 결합 친화도를 갖는 hAlb-hIL2 변이체(즉, hAlb-hIL2_A3, hAlb-hIL2_A4, hAlb-hIL2_A5 및 hAlb-hIL2_A8)에 대하여 IL2Rβγ-발현 TF-1_IL2Rβγ 세포의 CD25-독립적인 증식을 유도하는 것에 동일하게 적용하였으며, 거의 겹치는 용량-반응 곡선 (도 1A, B)을 나타내었다. 이는 또한 hAlb-hIL2_A5의 경우 4.62 %-상층액 내지 hAlb-hIL2_A4의 경우 6.82 %-상층액 범위인, EC50 값에서도 반영되었다 (표 3). 종합하면, 이는 hAlb-hIL2 뿐 아니라 hAlb-IL2 변이체를 엔코딩하는 mRNA가 기능성 사이토카인과 비슷한 양으로 번역되는 것을 나타낸다.
표 3: 인간 TF-1_IL2Rβγ 증식 용량-반응으로부터 유래된, 중간-친화성 IL2 수용체 (IL2Rβγ)-의존적인 세포 배양물에서의 hAlb-hIL2 변이체의 EC50 값 [%-상층액].
| hAlb-hIL2 변이체 | EC 50 [%-상층액] |
| hAlb-hIL2 | 4.65 |
| hAlb-hIL2_A3 | 6.44 |
| hAlb-hIL2_A4 | 6.82 |
| hAlb-hIL2_A5 | 4.62 |
| hAlb-hIL2_A8 | 5.16 |
실시예 4: 인간 1차 CD8
+
T 세포에서 RNA-엔코딩된 hIL2RA (CD25) 돌연변이의
in vitro
발현
인간 1차 CD8+ T 세포의 발현을 실험하기 위하여, CD8+ T 세포를 자기-활성화 세포 분류 (MACS) 기술로 항-CD8 MicroBeads (Miltenyi, cat. no. 130-045-201)를 이용하여 제조자의 설명서에 따라 PBMC로부터 분리하였다. 약 10Х106 CD8+ T 세포를 hIL2RA (CD25) 돌연변이를 엔코딩하는 in vitro 전사된 (IVT)-mRNA 15 μg로 4-mm 전기천공 큐벳(VWR International GmbH, cat. no. 732-0023)에서 내 X-Vivo15 (Biozym Scientific GmbH, cat. no.881026) 250 μL에서 BTX ECM® 830 Electroporation System device (BTX; 500 V, 1Х 3 ms pulse)를 이용하여 전기천공하였다. 전기천공 직후, 세포를 5% 인간 혈장-유래 AB 혈청 (One Lambda, cat. no. A25761)이 첨가된 신선한 이소코브의 변형된 둘베코 배지(IMDM; Life Technologies GmbH, cat. no. 12440-053)로 옮기고 37°C, 5% CO2에서 거의 24시간동안 휴지시켰다. 다음날, CD8+ T 세포를 수집하고 hIL2RA (CD25) 돌연변이의 세포 표면 발현을 유세포 분석으로 확인하였다. CD8+ T 세포는 PerCP-CyTM5.5 마우스 항-인간 CD25 항체 (Becton Dickinson GmbH, cat. no. 560503)로 염색하였다. hIL2RA (CD25) 변이체의 개별 세포 표면 발현 분석은 파라미터를 읽어 평균 형광 강도 (MFI)를 평가함으로써 수행하였다.
mock-전기천공된 CD8+ T 세포와 비교하면, hIL2RA 또는 hIL2RA 돌연변이 전기천공된 CD8+ T 세포의 MFI는 ≥ 9-배의 인자까지 증가 (1837 대 ≥ 17998 MFI; 도 2)하여, 시험된 모든 hIL2RA 컨스트럭트의 성공적인 표면 발현을 확인하였다. 중요한 사실은, 모든 hIL2RA 컨스트럭트의 발현 수준이 17998 내지 27352 MFI 범위로, 광도와 동일한 순서였다는 점이다.
실시예 5: IL2-매개된 STAT5의 인산화를 통해 측정된 hIL2RA (CD25)로 전기천공된 1차 CD8
+
T 세포에 비한 CD25-발현 CD4
+
CD25
+
조절 T 세포 상에서 hAlb-hIL2 변이체의 기능적 활성의 비교
여러가지 hIL2RA 돌연변이로 형질감염된 분리된 1차 인간 CD8+ T 세포를 정성분석하기 위하여, 여러가지 상응하게 설계된 hAlb-hIL2 변이체의 생리 활성을 실험하기 위한 적합한 모델 시스템으로서, 2개의 예시적인 CD25-결합능이 결핍된 hAlb-hIL2 변이체 (hAlb-hIL2_A3, hAlb-hIL2_A4) 대 hAlb-hIL2의 생리 활성을 hIL2RA (CD25)로 전기천공된 자가조직의 CD8+ T 세포와 비교하여 자연적 CD25-발현 CD4+CD25+ 조절 T 세포에서 STAT5 인산화 신호감지로 분석하였다.
첫번째 단계에서, CD8+ T 세포를 건강한 기증자로부터 수득한 PBMC (Transfusionszentrale, University Hospital, Mainz, Germany)로부터 제조자의 설명서에 따라 항-CD8 MicroBeads를 사용하여 MACS 기술로 분리하였다. 약 10Х106개의 CD8+ T 세포를 250 μL의 X-Vivo15에서 15 μg의 hIL2RA (CD25)를 엔코딩하는 IVT-mRNA로 실시예 4에서 기재된 바와 같이(500 V, 1Х 3 ms pulse) 전기천공하였다. 전기천공 직후, 세포를 5% 인간 AB 혈청이 부가된 신선한 IMDM 배양액에 옮기고, 37°C, 5% CO2에서 밤새 휴지시켰다. 다음날, 자가조직 PBMC를 해동하고, 5% 인간 AB 혈청이 부가된 IMDM에서 재-현탁한 후 37 °C 및 5% CO2에서 2시간 동안 휴지시켰다. 휴지 후, i) 125,000 hIL2RA (CD25)-전기천공된 CD8+ T 세포, 및 ii) 125,000 PBMC를 V-바닥 플레이트 (Greiner Bio-One GmbH, cat. no. 651101)의 웰마다 5% 인간 AB 혈청이 부가된 IMDM에 접종하였다. 이와 병행하여, 8개의 hAlb-hIL2 변이체-함유 상층액의 6-배 연속 희석액을 5% 인간 AB 혈청이 부가된 IMDM에서 제조하였다. 접종된 세포를 hAlb-hIL2 변이체 상층액과 1:1로 혼합하고 37℃ 및 5% CO2에서 10분간 자극하였다. 다음으로, 1:1,000 고정가능한 생활성 염료 eFluor?? 780 (eBioscience, cat. No. 65-0865-14)를 첨가하고 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 5분간 추가 자극하였다. 완충된 포름알데하이드 (Carl Roth GmbH + Co. KG, cat. no. P087.4)를 2%의 최종 농도로 첨가하여 세포를 고정하고, 얼음에서 10분간 배양하였다. 고정된 PBMCs/CD8+ T 세포를 빙랭한 D-PBS로 세척하고 얼음 위에서 100% 빙랭한 메탄올로 30분간 투과 처리하였다. 투과화된 PBMC/CD8+ T 세포를 2% FBS 및 2 mM EDTA가 부가된 D-PBS로 2번 세척한 후, 염색하였다. hIL2RA (CD25)-전기천공된 CD8+ T 세포를 2% FBS 및 2 mM EDTA가 부가된 1:10 Alexa Fluor® 488 Anti-Stat5 (pY694) (Becton Dickinson GmbH, cat. no. 612598), 1:25 PerCP-Cy™5.5 마우스 항-인간 CD25 (Becton Dickinson GmbH, cat. no. 560503)로 2-8℃에서 빛을 차단하고 30분간 염색하였고, PBMC는 1:10 Alexa Fluor® 488 Anti-Stat5 (pY694), 1:25 PerCP-Cy™5.5 마우스 항-인간 CD25, 1:50 BV421 마우스 항-인간 CD4 (Becton Dickinson GmbH, cat. no. 565997) 및 1:25 BV510 마우스 항-인간 CD8 (Becton Dickinson GmbH, cat. no. 563256)로 염색하였다. 염색한 PBMC/CD8+ T 세포를 2번 헹구고, 마지막으로 2% FBS 및 2 mM EDTA가 부가된 D-PBS에 재현탁하였다. 유세포 분석을 BD FACSCanto™ II 유세포 측정기 (Becton Dickinson GmbH)에서 수행하였으며, 수득한 데이터를 FlowJo 소프트웨어 버전 10으로 분석하였다. GraphPad Prism version 6.04 (GraphPad Software, Inc.)에서 용량-반응 곡선을 작성하고, EC50 값을 계산하였다.
CD4+CD25+ 조절 T 세포s 및 hIL2RA (CD25) 전기천공된 CD8+ T 세포에서, hAlb-hIL2는 모범적으로 실험된, 감소된 CD25 결합 친화도를 가진 hAlb-hIL2 변이체 (hAlb-hIL2_A3, hAlb-hIL2_A4) 둘 모두에 비하여 우수한 효과를 나타냈다 (도 3 및 표 4, 5). 구체적으로, hAlb-hIL2_A3의 생물학적 활성은 hAlb-hIL2와 비교하여 약 1718 내지 1937-배로 강하게 감소된 반면 hAlb-hIL2_A4는 중간 수준의 표현형을 나타냈다 (hAlb-hIL2에 비하여 255 내지 269배 감소된 활성). 가장 중요한 점은, 자연계의 CD25+ 조절 T 세포에서 개별적인 EC50 값 (도 3A)은 인공의 hIL2RA (CD25)-전기천공된 CD8+ T 세포 군 (도 3B)와 비교하였을 때 ~3배 높음에도 불구하고, 변이된 변이체들 hAlb-hIL2_A3/A4 및 hAlb-hIL2 사이의 배수-차이는 자연적인 그리고 인공적인 하위-집단 전체에 관하여 일관된다. 이러한 발견은 여러가지 상응하도록 설계된 hAlb-hIL2 변이체의 생리학적 활성을 테스트하기 위한 적합한 대체 집단으로서 hIL2RA (CD25) 및 따라서 또한 hIL2RA 돌연변이 전기천공된 CD8+ T 세포를 입증한 것이다.
표 4: 상이한 세포 집단에서 the hAlb-hIL2 변이체에 대한 STAT5 인산화 용량-반응에 기반하여 계산된 EC50 값 [%-상층액]
| hAlb-hIL2 변이체 | CD4 + CD25 + 조절 T 세포s | hIL2RA-전기천공된 CD8 + T 세포s |
| hAlb-hIL2 | 0.01746 | 0.0062 |
| hAlb-hIL2_A3 | ~30 | 12.01 |
| hAlb-hIL2_A4 | 4.70 | 1.58 |
표 5: 자연적 대 인공적 CD25+ T 세포 군에서 변이된 hAlb-hIL2 변이체 및 hAlb-hIL2 사이의 생리학적 활성의 차이를 hAlb-hIL2에 대한 hAlb-hIL2 변이체의 효과의 배수-감소로서 나타낸다. 배수-감소된 효과는 각각의 T 세포 집단에서 각각의 hAlb-hIL2 변이체에 대한 개별적 EC50 값 대 hAlb-hIL2에 대한 EC50 값의 비로 계산하였다.
| hAlb-hIL2 변이체 | CD4 + CD25 + 조절 T 세포 | hIL2RA-전기천공된 CD8 + T 세포 |
| hAlb-hIL2_A3 | ~1718 | 1937 |
| hAlb-hIL2_A4 | 269 | 255 |
실시예 6: STAT5의 IL2-매개된 인산화를 통해 측정된, 여러가지 hIL2RA (CD25) 돌연변이로 전기천공된 1차 CD8
+
T 세포 상에서 hAlb-hIL2 변이체의 기능적 활성의 비교
야생형 hAlb-hIL2는 0.0067 %-상층액의 EC50 값에 의해 hIL2RA 형질감염된 CD8+ T 세포에서 가장 높은 생리학적 활성을 나타냈다. hIL2RA 돌연변이 내에 시행된 변이의 수가 증가함에 따라 그리고 결과적으로 반발하는 상호작용의 수가 증가함에 따라, hIL2RA_mut4 (3 변이; 7.76 %-상층액의 EC50)로 형질감염된 CD8+ T 세포에서 나타나는 가장 강한 감소에 대하여 hAlb-hIL2의 생리학적 활성이 약 인수 10 내지 1000까지 점진적으로 감소하였다 (도 4, 표 6). 야생형 hAlb-hIL2와 비교하여 3개의 아미노산 치환을 가진 hAlb-hIL2_A3 또는 2개의 아미노산 치환을 가진 hAlb-hIL2_A4 변이체는 hIL2RA 야생형 전기천공된 CD8+ T 세포에서 현저하게 감소된 생리학적 활성을 보였지만 (각각 49.4 및 5.017 %-상층액의 EC50), hAlb-hIL2 변이체 모두는 모든 여러가지 상응하도록 설계된 hIL2RA 돌연변이를 발현하는 CD8+ T 세포 배양에서 효능을 재수득하였다. 중요한점은, 예상된 매칭 hIL2RA 돌연변이를 발현하는 CD8+ T 세포 상에서의 생리학적 활성, 즉, hAlb-hIL2_A3에 대한 hIL2RA_mut4 (EC50 0.663 %-상층액) 및 hAlb-hIL2_A4에 대한 hIL2RA_mut1 (EC50 0.116 %-상층액) (도 5A, B 및 표 6)은 모든 다른 hIL2RA 돌연변이를 능가하였으므로, hIL2RA 야생형 전기천공된 CD8+ T 세포에 대하여 hIL2RA 돌연변이에서 hAlb-hIL2_3는 약 74배 그리고 hAlb-hIL2_A4는 약 43배 증가된 고 선택성을 반영한다 (표 7). hIL2RA 발현하는 CD8+ T 세포 배양물에서 중간 생리학적 활성을 갖는 변이체 hAlb-hIL2_A5는 예측된 hIL2RA_mut2로 형질감염된 CD8+ T 세포에 대하여 약 5배 증가된 선택성을 나타낸 반면 (hIL2RA_mut2-양성 배양물에서 0.237 %-상층액 대 1.106 %-상층액 EC50), hIL2RA 야생형과 비교해 모든 다른 hIL2RA 돌연변이에서 효능이 더 낮았다 (도 6A, 표 6 & 7). 이와 유사하게, hIL2RA 야생형으로 전기천공된 CD8+ T 세포에서 0.0677 %-상층액과 비교하여 0.0059 %-상층액의 EC50 값 (도 6B, 표 6)으로 대변되듯, 변이체 hAlb-hIL2_A8는 상응하게 설계된 hIL2RA_mut3를 발현하는 CD8+ T 세포에 대해서만 약 11배 증가된 선택성을 또한 나타냈다(표 7).
요약하자면, 상응하게 설계된 hAlb-hIL2 변이체 및 hIL2RA 돌연변이 (표 1) 쌍에 대해 세워진 가설이 확인되었다. 상응하도록 설계된 hIL2RA 돌연변이에 대한 hAlb-hIL2 변이체의 선택성에서 가장 높은 증가는 hAlb-hIL2_A4와 hIL2RA_mut1 및 hAlb-hIL2_A3와 hIL2RA_mut4의 쌍에서 달성되었고, 여기서 2 또는 심지어 3개의 아미노산 위치가 상호적으로 치환되어 hIL2RA 야생형에 비하여 각각 약 43배 및 75배 증가된 효능을 나타냈다. 두 가지 조합은 모두 0.1 및 0.6% 상층액 범위의 EC50 값의 높은 생리학적 활성을 나타냈다. 중요한 점은, hIL2RA_mut3를 발현하는 CD8+ T 세포 상에서 hAlb-hIL2_A8의 생리학적 활성은 심지어 hIL2RA 야생형으로 형질감염된 CD8+ T 세포 상에서 hAlb-hIL2 야생형의 수준을 초과하지만, 돌연변이 hIL2RA 수용체에 대한 선택성은 오직 인수 10만큼 증가하였다.
표 6: STAT5 인산화 용량-반응에 기반하여 계산된, 여러가지 hIL2RA 돌연변이로 전기천공된 CD8 + T 세포에서 hAlb-hIL2 변이체에 대한 EC 50 값 [%-상층액]
| hAlb-hIL2 변이체 | hIL2RA | hIL2RA_mut1 | hIL2RA_mut2 | hIL2RA_mut3 | hIL2RA_mut4 |
| hAlb-hIL2 | 0.0067 | 1.427 | 0.107 | 0.069 | 7.76 |
| hAlb-hIL2_A3 | 49.4 | 1.795 | 31.66 | 3.717 | 0.663 |
| hAlb-hIL2_A4 | 5.017 | 0.116 | 3.059 | 0.265 | 0.694 |
| hAlb-hIL2_A5 | 1.106 | 1.725 | 0.237 | 3.539 | 11.01 |
| hAlb-hIL2_A8 | 0.0677 | 0.048 | 1.6 | 0.0059 | 0.315 |
표 7: hIL2RA 야생형 전기천공된 CD8+ T 세포에 비하여 hIL2RA 돌연변이 상에서 각각 hAlb-hIL2 변이체의 각각의 hIL2RA 돌연변이에 대한 선택성을 배수-증가된 효능으로 나타냈다. 배수-증가된 효능은 hIL2RA 돌연변이 전기천공된 CD8+ T 세포에서 결정된 각각의 hAlb-hIL2 변이체에 대한 개별적인 EC50 값 대 hIL2RA 야생형 전기천공된 CD8+ T 세포에서 결정된 EC50 값의 비로 계산하였다.
| hAlb-hIL2 변이체 | hIL2RA_mut1 | hIL2RA_mut2 | hIL2RA_mut3 | hIL2RA_mut4 |
| hAlb-hIL2 | 0.005 | 0.063 | 0.097 | 0.001 |
| hAlb-hIL2_A3 | 27.52 | 1.560 | 13.29 | 74.35 |
| hAlb-hIL2_A4 | 43.10 | 1.64 | 18.96 | 7.231 |
| hAlb-hIL2_A5 | 0.641 | 4.659 | 0.313 | 0.101 |
| hAlb-hIL2_A8 | 1.407 | 0.042 | 11.43 | 0.215 |
실시예 7: 여러가지 hIL2RA (CD25) 돌연변이로 전기천공된 CAR 재설정된 CD8
+
T 세포의
in vitro
항-종양 효능에서 hAlb-hIL2 변이체의 효과
CAR T 세포 매개된 세포독성에서 상응하는 시스템의 장점을 조사하기 위하여, 돌연변이 또는 야생형 hIL2RA 중 하나로 전기천공된 CAR T 세포를 비교하는 in vitro 사멸 분석법을 설정하였다. CAR T 세포를 표적으로서 PA-1 인간 난소암 세포 스페로이드와 공-배양하였다. PA-1 세포주를 렌티바이러스 형질전환을 통하여 eGFP로 안정적으로 형질감염시키켜 형광-기반 생존 이미징을 가능하도록 하였다. 공-배양은 상응하는 상호 hAlb-hIL2 변이체의 존재 하에 설계하였다. 적용된 10:1의 E:T 비율로 차선의 세포독성을 부여했고, 결과적으로 hAlb-hIL2 변이체:hIL2RA 돌연변이 매개된 증진된 사멸의 평가가 가능해졌다.
첫번째 단계에서, CD8+ T 세포를 건강한 기증자로부터 수득한 PBMC (Transfusionszentrale, University Hospital, Mainz, Germany)로부터 제조자의 설명서에 따라 항-CD8 MicroBeads를 사용하여 MACS 기술로 분리하였다. 웰 당 2Х106개의 CD8+ T 세포를 50 U/mL의 IL2 (Proleukin®S, Novartis Pharma, cat. no. 02238131)의 존재 하에 웰 당 1 μg 항-CD3 항체(Abcam plc, cat.no. ab86883)로 코팅된 24-웰 플레이트 plates (VWR international, cat. no. 701605)에서 2일간 활성화 시켰다. 다음으로, 전기천공에 앞서 추가적인 3일간의 휴지를 위하여, T 세포를 50 U/mL의 IL2를 함유한 신선한 배양액이 담긴 새 24-웰 플레이트에 옮겼다. 약 107개의 CD8+ T 세포를 4-mm 큐벳 당 CD28-CD3제타(ζ) 키메라 세포질 도메인 (28ζ) (Kofler et al. Mol Ther 2011)을 함유하는 CLDN6-특이적 CAR 컨스트럭트를 엔코딩하는 20 μg의 IVT-mRNA, 또는 41BB-ζ 키메라 세포질도메인 (BBζ) (Reinhard et al. Science 2020)을 함유하는 CLDN6-특이적 CAR 컨스트럭트를 엔코딩하는 15 μg의 IVT-mRNA로 실시예 4에 기재된 바와 같이 전기천공하였다. 클라우딘 18.2 (CLDN18.2)-특이적 CAR 컨스트럭트를 엔코딩하는 20 μg의 IVT-mRNA로 전기천공된 CD8+ T 세포를 음성 대조군 (mock CAR)으로 사용하였다. 모든 CAR 컨스트럭트를 hIL2RA, hIL2RA_mut1 또는 hIL2RA_mut4를 엔코딩하는 10 μg의 IVT-mRNA와 조합하여 전기천공하였다. 전기천공 직후, 세포를 5% 인간 AB 혈청이 부가된 RPMI 1640 배양액에 옮기고 37℃, 5% CO2에서 밤새 휴지시켰다. 같은 날, CLDN6-양성 PA-1 종양 세포(ATCC® CRL-1572??)를 아큐타제(Sigma-Aldrich Chemie GmbH, cat. no. A6964-100ML)를 이용하여 연속 배양액에서 수집하고 10% 열-불활성화된 FBS, 1 mM 소듐 파이루베이트 (Life Technologies GmbH, cat. no. 11360-039), 1% NEAA (Gibco, cat. no. 11140050) 및 2% 소듐 바이카보네이트 (Gibco, cat. no. 25080094)가 부가된 MEM Glutamax (Gibco, cat. no. 41090036)에서 4x105 cells/mL로 조절하였다. 웰 당 25 μL의 PA-1 세포 현탁액을 96-웰 초-저 부착 플레이트 (Corning, cat. no. 7007)에 옮기고 37℃ 및 5% CO2에서 24시간 동안 배양하여 종양 스페로이드 형성을 개시하였다. 다음날, 전기천공된 CD8+ T 세포에서 hIL2RA 야생형 및 돌연변이 뿐 아니라 CAR 컨스트럭트의 표면 발현을 항-CD25 (실시예 4를 보라) 및 맞춤-개발된 항-CAR 유전자형 항체를 사용한 유세포 분석을 통해 확인하였다. 유세포 분석법은 BD FACSCanto?? II 유세포 분석기에서 수행하였고 수득된 데이터는 FlowJo 소프트웨어 버전 10을 이용하여 분석하였다. 웰 당 105 CAR- 및 hIL2RA-변형된 CD8+ T 세포를 5% 인간 AB 혈청이 부가된 125 μL의 FluoroBrite DMEM 배양액 (Thermo Fisher Scientific, cat. no. 15266695)에서 PA-1 종양 스페로이드 배양물에 첨가하였고 기술적으로 3반복하였다. 50 μL의 각각의 hAlb-hIL2 변이체-함유 상층액을 CAR T 세포:종양 스페로이드 공-배양물에 첨가하고 96-웰 플레이트를 Incucyte S3 생존 세포 이미징 시스템(Essen Bioscience)으로 옮겼다. hAlb-함유 상층액을 음성 대조군으로 사용하였다. eGFP 양성 PA-1 종양 스페로이드의 형광 신호를 세포 생존에 대한 대리 표지로서 5일간 측정하였다. 전체 3반복된 각각의 종양 스페로이드의 녹색 물체 영역을 기록하고 공-배양의 시작점에서 각각의 스페로이드 영역으로 표준화하였다. 각각의 hIL2RA 컨스트럭트를 발현하는 CAR T 세포에 의해 매개되는 PA-1 종양 스페로이드에의 세포독성 효능을 상응하는 상호 hAlb-hIL2 변이체의 첨가 후 분석하고 hIL2RA 야생형으로 전기천공된 CAR T 세포와 비교하였다. 각각의 CAR 컨스트럭트 (CLDN18.2 CAR 28ζ, CLDN6 CAR 28ζ 및 CLDN6 CAR BBζ)에 대한 데이터를 각각 도 7, 도 8, 및 도 9로 분리하여 작성하였다.
hAlb-hIL2 변이체 또는 적용된 대조군 상층액과 무관하게, 공-배양물을 함유하는 mock CAR (CLDN18.2 28ζ)는 CAR-매개된 세포독성의 신호를 보이지 않았다 (관찰 종료 시점에 92 내지 120% 생존, 도 7A-C). 이와 유사하게, hAlb 대조군 상층액이 처리된 CLDN6-특이적 CAR T 세포 (CLDN6 28ζ 및 CLDN6 BBζ 둘 모두): PA-1 종양 스페로이드 공-배양물은 이들의 생존에 영향을 받지 않았다 (관찰 종료 시점에 90% 내지 101% 생존, 도 8-9A). 이는 종양 스페로이드에 적용된 CAR T 세포의 준최적성 숫자와 일치하는 것이다. 반면, 공-배양물을 함유하는 상응하는 상호 hIL2RA-전기천공된 CLDN6 28ζ CAR T 세포에 hAlb-hIL2_A3 및 hAlb-hIL2_A4 둘 모두를 첨가하는 것은 공-배양물을 함유하는 hIL2RA 야생형 전기천공된 CLDN6에 첨가는 어떤 효과도 없었기 때문에, PA-1 스페로이드의 사멸을 선택적으로 증진시켰다 (도 8B-C). 구체적으로, hIL2RA 야생형 공-전기천공된 상태에 대해 110% 생존과 비교하여, hAlb-hIL2_A3 처리는 공-배양물을 함유하는 hIL2RA_mut4 공-전기천공된 CLDN6 28ζ CAR T 세포에 대한 관찰 완료 시점에 81%의 PA-1 종양 스페로이드 생존을 나타냈다 (도 8B). 이는 hIL2RA 야생형 공-전기천공된 상태에 대해 107% 생존과 비교하여, hAlb-hIL2_A4 처리는 공-배양물을 함유하는 hIL2RA_mut1 공-전기천공된 CLDN6 28ζ CAR T 세포에 대한 관찰 완료 시점에 56%의 PA-1 종양 스페로이드 생존을 나타내는 것과 일치하는 것이다 (도 8C). hAlb-hIL2_A3 처리의 효과를 더 명확히 하기 위하여, 더 강력한 CLDN6 BBζ CAR 컨스트럭트로 변형된 T 세포를 함유하는 공-배양물을 사용하였다. 이에 따라, hIL2RA 야생형 공-전기천공된 상태에 대한 스페로이드 생존의 감소가 없었던 것과 비교하여 (관찰 종료 시점에 106% 생존, 도 9B), hAlb-hIL2_A3 처리는 공-배양물을 함유하는 hIL2RA_mut4 공-전기천공된 CLDN6 BBζ CAR T 세포에 대한 PA-1 종양 스페로이드의 선택적 살상 (관찰 완료 시점에 51% 생존)을 나타냈다.
결론적으로, 종양 스페로이드 세포독성 분석 데이터는 CAR T 세포가 IL2RA 돌연변이로 변형되고 상응하는 상호 hAlb-hIL2 변이체로 처리될 때, CAR T 세포 매개된 세포독성이 선택적으로 상승할 수 있음을 보여준다.
SEQUENCE LISTING
<110> BioNTech RNA Pharmaceuticals GmbH et al.
<120> Interleukin-2 receptor (IL2R) and interleukin-2 (IL2) variants
for specific activation of immune effector cells
<130> 674-243 PCT2
<150> PCT/EP2019/056719
<151> 2019-03-18
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 133
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 2
<211> 251
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Glu Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro Glu Ile Pro His Ala Thr Phe Lys
1 5 10 15
Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn Cys Glu Cys Lys Arg
20 25 30
Gly Phe Arg Arg Ile Lys Ser Gly Ser Leu Tyr Met Leu Cys Thr Gly
35 40 45
Asn Ser Ser His Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys Gln Cys Thr Ser Ser
50 55 60
Ala Thr Arg Asn Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro Gln Pro Glu Glu Gln
65 70 75 80
Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro Met Gln Pro Val Asp
85 90 95
Gln Ala Ser Leu Pro Gly His Cys Arg Glu Pro Pro Pro Trp Glu Asn
100 105 110
Glu Ala Thr Glu Arg Ile Tyr His Phe Val Val Gly Gln Met Val Tyr
115 120 125
Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His Arg Gly Pro Ala Glu
130 135 140
Ser Val Cys Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg Trp Thr Gln Pro Gln
145 150 155 160
Leu Ile Cys Thr Gly Glu Met Glu Thr Ser Gln Phe Pro Gly Glu Glu
165 170 175
Lys Pro Gln Ala Ser Pro Glu Gly Arg Pro Glu Ser Glu Thr Ser Cys
180 185 190
Leu Val Thr Thr Thr Asp Phe Gln Ile Gln Thr Glu Met Ala Ala Thr
195 200 205
Met Glu Thr Ser Ile Phe Thr Thr Glu Tyr Gln Val Ala Val Ala Gly
210 215 220
Cys Val Phe Leu Leu Ile Ser Val Leu Leu Leu Ser Gly Leu Thr Trp
225 230 235 240
Gln Arg Arg Gln Arg Lys Ser Arg Arg Thr Ile
245 250
<210> 3
<211> 609
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala
20 25 30
His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu
35 40 45
Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val
50 55 60
Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp
65 70 75 80
Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp
85 90 95
Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala
100 105 110
Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln
115 120 125
His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val
130 135 140
Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys
145 150 155 160
Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro
165 170 175
Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys
180 185 190
Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu
195 200 205
Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys
210 215 220
Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val
225 230 235 240
Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser
245 250 255
Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly
260 265 270
Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile
275 280 285
Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu
290 295 300
Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp
305 310 315 320
Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser
325 330 335
Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly
340 345 350
Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val
355 360 365
Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys
370 375 380
Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu
385 390 395 400
Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys
405 410 415
Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu
420 425 430
Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val
435 440 445
Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His
450 455 460
Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val
465 470 475 480
Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg
485 490 495
Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe
500 505 510
Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala
515 520 525
Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu
530 535 540
Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys
545 550 555 560
Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala
565 570 575
Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe
580 585 590
Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly
595 600 605
Leu
<210> 4
<211> 272
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Met Asp Ser Tyr Leu Leu Met Trp Gly Leu Leu Thr Phe Ile Met Val
1 5 10 15
Pro Gly Cys Gln Ala Glu Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro Glu Ile Pro
20 25 30
His Ala Thr Phe Lys Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn
35 40 45
Cys Glu Cys Lys Arg Gly Phe Arg Arg Ile Lys Ser Gly Ser Leu Tyr
50 55 60
Met Leu Cys Thr Gly Asn Ser Ser His Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys
65 70 75 80
Gln Cys Thr Ser Ser Ala Thr Arg Asn Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro
85 90 95
Gln Pro Glu Glu Gln Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro
100 105 110
Met Gln Pro Val Asp Gln Ala Ser Leu Pro Gly His Cys Arg Glu Pro
115 120 125
Pro Pro Trp Glu Asn Glu Ala Thr Glu Arg Ile Tyr His Phe Val Val
130 135 140
Gly Gln Met Val Tyr Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His
145 150 155 160
Arg Gly Pro Ala Glu Ser Val Cys Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg
165 170 175
Trp Thr Gln Pro Gln Leu Ile Cys Thr Gly Glu Met Glu Thr Ser Gln
180 185 190
Phe Pro Gly Glu Glu Lys Pro Gln Ala Ser Pro Glu Gly Arg Pro Glu
195 200 205
Ser Glu Thr Ser Cys Leu Val Thr Thr Thr Asp Phe Gln Ile Gln Thr
210 215 220
Glu Met Ala Ala Thr Met Glu Thr Ser Ile Phe Thr Thr Glu Tyr Gln
225 230 235 240
Val Ala Val Ala Gly Cys Val Phe Leu Leu Ile Ser Val Leu Leu Leu
245 250 255
Ser Gly Leu Thr Trp Gln Arg Arg Gln Arg Lys Ser Arg Arg Thr Ile
260 265 270
<210> 5
<211> 133
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hIL2_A3
<400> 5
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Glu Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Glu Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Lys Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 6
<211> 133
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hIL2_A4
<400> 6
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Glu Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Lys Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 7
<211> 133
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hIL2_A5
<400> 7
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Lys Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 8
<211> 133
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hIL2_A8
<400> 8
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Glu Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 9
<211> 752
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hAlb-hIL2
<400> 9
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala
20 25 30
His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu
35 40 45
Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val
50 55 60
Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp
65 70 75 80
Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp
85 90 95
Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala
100 105 110
Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln
115 120 125
His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val
130 135 140
Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys
145 150 155 160
Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro
165 170 175
Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys
180 185 190
Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu
195 200 205
Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys
210 215 220
Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val
225 230 235 240
Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser
245 250 255
Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly
260 265 270
Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile
275 280 285
Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu
290 295 300
Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp
305 310 315 320
Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser
325 330 335
Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly
340 345 350
Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val
355 360 365
Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys
370 375 380
Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu
385 390 395 400
Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys
405 410 415
Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu
420 425 430
Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val
435 440 445
Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His
450 455 460
Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val
465 470 475 480
Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg
485 490 495
Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe
500 505 510
Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala
515 520 525
Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu
530 535 540
Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys
545 550 555 560
Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala
565 570 575
Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe
580 585 590
Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly
595 600 605
Leu Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ala Pro Thr Ser Ser
610 615 620
Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu
625 630 635 640
Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr
645 650 655
Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu
660 665 670
Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val
675 680 685
Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu
690 695 700
Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr
705 710 715 720
Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe
725 730 735
Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
740 745 750
<210> 10
<211> 752
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hAlb-hIL2_A3
<400> 10
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala
20 25 30
His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu
35 40 45
Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val
50 55 60
Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp
65 70 75 80
Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp
85 90 95
Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala
100 105 110
Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln
115 120 125
His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val
130 135 140
Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys
145 150 155 160
Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro
165 170 175
Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys
180 185 190
Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu
195 200 205
Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys
210 215 220
Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val
225 230 235 240
Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser
245 250 255
Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly
260 265 270
Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile
275 280 285
Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu
290 295 300
Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp
305 310 315 320
Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser
325 330 335
Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly
340 345 350
Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val
355 360 365
Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys
370 375 380
Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu
385 390 395 400
Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys
405 410 415
Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu
420 425 430
Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val
435 440 445
Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His
450 455 460
Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val
465 470 475 480
Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg
485 490 495
Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe
500 505 510
Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala
515 520 525
Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu
530 535 540
Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys
545 550 555 560
Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala
565 570 575
Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe
580 585 590
Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly
595 600 605
Leu Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ala Pro Thr Ser Ser
610 615 620
Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu
625 630 635 640
Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Glu Leu Thr
645 650 655
Arg Met Leu Thr Phe Glu Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu
660 665 670
Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Lys Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val
675 680 685
Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu
690 695 700
Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr
705 710 715 720
Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe
725 730 735
Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
740 745 750
<210> 11
<211> 752
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hAlb-hIL2_A4
<400> 11
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala
20 25 30
His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu
35 40 45
Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val
50 55 60
Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp
65 70 75 80
Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp
85 90 95
Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala
100 105 110
Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln
115 120 125
His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val
130 135 140
Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys
145 150 155 160
Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro
165 170 175
Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys
180 185 190
Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu
195 200 205
Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys
210 215 220
Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val
225 230 235 240
Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser
245 250 255
Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly
260 265 270
Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile
275 280 285
Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu
290 295 300
Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp
305 310 315 320
Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser
325 330 335
Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly
340 345 350
Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val
355 360 365
Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys
370 375 380
Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu
385 390 395 400
Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys
405 410 415
Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu
420 425 430
Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val
435 440 445
Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His
450 455 460
Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val
465 470 475 480
Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg
485 490 495
Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe
500 505 510
Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala
515 520 525
Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu
530 535 540
Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys
545 550 555 560
Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala
565 570 575
Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe
580 585 590
Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly
595 600 605
Leu Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ala Pro Thr Ser Ser
610 615 620
Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu
625 630 635 640
Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr
645 650 655
Arg Met Leu Thr Phe Glu Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu
660 665 670
Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Lys Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val
675 680 685
Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu
690 695 700
Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr
705 710 715 720
Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe
725 730 735
Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
740 745 750
<210> 12
<211> 752
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hAlb-hIL2_A5
<400> 12
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala
20 25 30
His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu
35 40 45
Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val
50 55 60
Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp
65 70 75 80
Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp
85 90 95
Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala
100 105 110
Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln
115 120 125
His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val
130 135 140
Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys
145 150 155 160
Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro
165 170 175
Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys
180 185 190
Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu
195 200 205
Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys
210 215 220
Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val
225 230 235 240
Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser
245 250 255
Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly
260 265 270
Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile
275 280 285
Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu
290 295 300
Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp
305 310 315 320
Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser
325 330 335
Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly
340 345 350
Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val
355 360 365
Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys
370 375 380
Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu
385 390 395 400
Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys
405 410 415
Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu
420 425 430
Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val
435 440 445
Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His
450 455 460
Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val
465 470 475 480
Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg
485 490 495
Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe
500 505 510
Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala
515 520 525
Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu
530 535 540
Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys
545 550 555 560
Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala
565 570 575
Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe
580 585 590
Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly
595 600 605
Leu Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ala Pro Thr Ser Ser
610 615 620
Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu
625 630 635 640
Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr
645 650 655
Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu
660 665 670
Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Lys Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val
675 680 685
Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu
690 695 700
Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr
705 710 715 720
Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe
725 730 735
Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
740 745 750
<210> 13
<211> 752
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hAlb-hIL2_A8
<400> 13
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala
20 25 30
His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu
35 40 45
Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val
50 55 60
Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp
65 70 75 80
Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp
85 90 95
Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala
100 105 110
Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln
115 120 125
His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val
130 135 140
Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys
145 150 155 160
Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro
165 170 175
Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys
180 185 190
Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu
195 200 205
Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys
210 215 220
Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val
225 230 235 240
Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser
245 250 255
Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly
260 265 270
Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile
275 280 285
Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu
290 295 300
Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp
305 310 315 320
Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser
325 330 335
Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly
340 345 350
Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val
355 360 365
Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys
370 375 380
Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu
385 390 395 400
Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys
405 410 415
Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu
420 425 430
Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val
435 440 445
Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His
450 455 460
Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val
465 470 475 480
Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg
485 490 495
Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe
500 505 510
Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala
515 520 525
Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu
530 535 540
Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys
545 550 555 560
Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala
565 570 575
Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe
580 585 590
Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly
595 600 605
Leu Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ala Pro Thr Ser Ser
610 615 620
Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu
625 630 635 640
Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr
645 650 655
Arg Met Leu Thr Phe Glu Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu
660 665 670
Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val
675 680 685
Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu
690 695 700
Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr
705 710 715 720
Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe
725 730 735
Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
740 745 750
<210> 14
<211> 272
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hIL2RA_mut1
<400> 14
Met Asp Ser Tyr Leu Leu Met Trp Gly Leu Leu Thr Phe Ile Met Val
1 5 10 15
Pro Gly Cys Gln Ala Glu Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro Glu Ile Pro
20 25 30
His Ala Thr Phe Lys Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn
35 40 45
Cys Lys Cys Lys Arg Gly Phe Arg Arg Ile Glu Ser Gly Ser Leu Tyr
50 55 60
Met Leu Cys Thr Gly Asn Ser Ser His Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys
65 70 75 80
Gln Cys Thr Ser Ser Ala Thr Arg Asn Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro
85 90 95
Gln Pro Glu Glu Gln Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro
100 105 110
Met Gln Pro Val Asp Gln Ala Ser Leu Pro Gly His Cys Arg Glu Pro
115 120 125
Pro Pro Trp Glu Asn Glu Ala Thr Glu Arg Ile Tyr His Phe Val Val
130 135 140
Gly Gln Met Val Tyr Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His
145 150 155 160
Arg Gly Pro Ala Glu Ser Val Cys Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg
165 170 175
Trp Thr Gln Pro Gln Leu Ile Cys Thr Gly Glu Met Glu Thr Ser Gln
180 185 190
Phe Pro Gly Glu Glu Lys Pro Gln Ala Ser Pro Glu Gly Arg Pro Glu
195 200 205
Ser Glu Thr Ser Cys Leu Val Thr Thr Thr Asp Phe Gln Ile Gln Thr
210 215 220
Glu Met Ala Ala Thr Met Glu Thr Ser Ile Phe Thr Thr Glu Tyr Gln
225 230 235 240
Val Ala Val Ala Gly Cys Val Phe Leu Leu Ile Ser Val Leu Leu Leu
245 250 255
Ser Gly Leu Thr Trp Gln Arg Arg Gln Arg Lys Ser Arg Arg Thr Ile
260 265 270
<210> 15
<211> 272
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hIL2RA_mut2
<400> 15
Met Asp Ser Tyr Leu Leu Met Trp Gly Leu Leu Thr Phe Ile Met Val
1 5 10 15
Pro Gly Cys Gln Ala Glu Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro Glu Ile Pro
20 25 30
His Ala Thr Phe Lys Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn
35 40 45
Cys Glu Cys Lys Arg Gly Phe Arg Arg Ile Glu Ser Gly Ser Leu Tyr
50 55 60
Met Leu Cys Thr Gly Asn Ser Ser His Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys
65 70 75 80
Gln Cys Thr Ser Ser Ala Thr Arg Asn Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro
85 90 95
Gln Pro Glu Glu Gln Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro
100 105 110
Met Gln Pro Val Asp Gln Ala Ser Leu Pro Gly His Cys Arg Glu Pro
115 120 125
Pro Pro Trp Glu Asn Glu Ala Thr Glu Arg Ile Tyr His Phe Val Val
130 135 140
Gly Gln Met Val Tyr Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His
145 150 155 160
Arg Gly Pro Ala Glu Ser Val Cys Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg
165 170 175
Trp Thr Gln Pro Gln Leu Ile Cys Thr Gly Glu Met Glu Thr Ser Gln
180 185 190
Phe Pro Gly Glu Glu Lys Pro Gln Ala Ser Pro Glu Gly Arg Pro Glu
195 200 205
Ser Glu Thr Ser Cys Leu Val Thr Thr Thr Asp Phe Gln Ile Gln Thr
210 215 220
Glu Met Ala Ala Thr Met Glu Thr Ser Ile Phe Thr Thr Glu Tyr Gln
225 230 235 240
Val Ala Val Ala Gly Cys Val Phe Leu Leu Ile Ser Val Leu Leu Leu
245 250 255
Ser Gly Leu Thr Trp Gln Arg Arg Gln Arg Lys Ser Arg Arg Thr Ile
260 265 270
<210> 16
<211> 272
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hIL2RA_mut3
<400> 16
Met Asp Ser Tyr Leu Leu Met Trp Gly Leu Leu Thr Phe Ile Met Val
1 5 10 15
Pro Gly Cys Gln Ala Glu Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro Glu Ile Pro
20 25 30
His Ala Thr Phe Lys Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn
35 40 45
Cys Lys Cys Lys Arg Gly Phe Arg Arg Ile Lys Ser Gly Ser Leu Tyr
50 55 60
Met Leu Cys Thr Gly Asn Ser Ser His Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys
65 70 75 80
Gln Cys Thr Ser Ser Ala Thr Arg Asn Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro
85 90 95
Gln Pro Glu Glu Gln Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro
100 105 110
Met Gln Pro Val Asp Gln Ala Ser Leu Pro Gly His Cys Arg Glu Pro
115 120 125
Pro Pro Trp Glu Asn Glu Ala Thr Glu Arg Ile Tyr His Phe Val Val
130 135 140
Gly Gln Met Val Tyr Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His
145 150 155 160
Arg Gly Pro Ala Glu Ser Val Cys Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg
165 170 175
Trp Thr Gln Pro Gln Leu Ile Cys Thr Gly Glu Met Glu Thr Ser Gln
180 185 190
Phe Pro Gly Glu Glu Lys Pro Gln Ala Ser Pro Glu Gly Arg Pro Glu
195 200 205
Ser Glu Thr Ser Cys Leu Val Thr Thr Thr Asp Phe Gln Ile Gln Thr
210 215 220
Glu Met Ala Ala Thr Met Glu Thr Ser Ile Phe Thr Thr Glu Tyr Gln
225 230 235 240
Val Ala Val Ala Gly Cys Val Phe Leu Leu Ile Ser Val Leu Leu Leu
245 250 255
Ser Gly Leu Thr Trp Gln Arg Arg Gln Arg Lys Ser Arg Arg Thr Ile
260 265 270
<210> 17
<211> 272
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hIL2RA_mut4
<400> 17
Met Asp Ser Tyr Leu Leu Met Trp Gly Leu Leu Thr Phe Ile Met Val
1 5 10 15
Pro Gly Cys Gln Ala Lys Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro Glu Ile Pro
20 25 30
His Ala Thr Phe Lys Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn
35 40 45
Cys Lys Cys Lys Arg Gly Phe Arg Arg Ile Glu Ser Gly Ser Leu Tyr
50 55 60
Met Leu Cys Thr Gly Asn Ser Ser His Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys
65 70 75 80
Gln Cys Thr Ser Ser Ala Thr Arg Asn Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro
85 90 95
Gln Pro Glu Glu Gln Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro
100 105 110
Met Gln Pro Val Asp Gln Ala Ser Leu Pro Gly His Cys Arg Glu Pro
115 120 125
Pro Pro Trp Glu Asn Glu Ala Thr Glu Arg Ile Tyr His Phe Val Val
130 135 140
Gly Gln Met Val Tyr Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His
145 150 155 160
Arg Gly Pro Ala Glu Ser Val Cys Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg
165 170 175
Trp Thr Gln Pro Gln Leu Ile Cys Thr Gly Glu Met Glu Thr Ser Gln
180 185 190
Phe Pro Gly Glu Glu Lys Pro Gln Ala Ser Pro Glu Gly Arg Pro Glu
195 200 205
Ser Glu Thr Ser Cys Leu Val Thr Thr Thr Asp Phe Gln Ile Gln Thr
210 215 220
Glu Met Ala Ala Thr Met Glu Thr Ser Ile Phe Thr Thr Glu Tyr Gln
225 230 235 240
Val Ala Val Ala Gly Cys Val Phe Leu Leu Ile Ser Val Leu Leu Leu
245 250 255
Ser Gly Leu Thr Trp Gln Arg Arg Gln Arg Lys Ser Arg Arg Thr Ile
260 265 270
Claims (85)
- (i) 인터루킨-2 수용체 (IL2R)의 알파 서브유닛 또는 IL2R의 알파 서브유닛의 기능성 변이체의 변이를 포함하고, IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체는 적어도 하나의 위치에서 치환된, 수용체 폴리펩티드,
(ii) IL2 또는 IL2의 기능성 변이체의 변이를 포함하고, IL2 또는 이의 기능성 변이체는 하나 이상의 위치에서 치환된, 리간드 폴리펩티드를 포함하고,
치환은
(a) (ii)에 따른 변이는 알파 서브유닛으로서 (i)에 따른 변이를 포함하는 IL2R에 결합하고 활성화하고,
(b) (ii)에 따른 변이에 의한 알파 서브유닛으로서 (i)에 따른 변이를 포함하는 IL2R에 대한 결합 및/또는 활성화는 (ii)에 따른 변이에 의한 알파 서브유닛으로서 IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 IL2R에의 결합 및/또는 활성화를 초과하는, 시스템.
- 제1항에 있어서, (ii)에 따른 변이에 의한 알파 서브유닛으로서 (i)에 따른 변이를 포함하는 IL2R에 대한 IL2 또는 이의 기능성 변이체에 의한 결합 및/또는 활성화는 알파 서브유닛으로서 (i)에 따른 변이를 포함하는 IL2R에 대한 결합 및/또는 활성화를 초과하는, 시스템.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 알파 서브유닛으로서 IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 IL2R에 대한 IL2 또는 이의 기능성 변이체에 의한 결합 및/또는 활성화는 (ii)에 따른 변이에 의한 알파 서브유닛으로서 IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 IL2R에 대한 결합 및/또는 활성화를 초과하는, 시스템.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 알파 서브유닛으로서 IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 IL2R에 대한 IL2 또는 이의 기능성 변이체에 의한 결합 및/또는 활성화는 알파 서브유닛으로서 (i)에 따른 변이를 포함하는 IL2R에 대한 IL2 또는 이의 기능성 변이체에 의한 결합 및/또는 활성화를 초과하는, 시스템.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
(i) IL2R의 알파 서브유닛 또는 IL2R의 알파 서브유닛의 기능성 변이체의 변이를 포함하고, IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체는 야생형 IL2에서 염기성 아미노산 잔기와 접촉하는 IL2R의 야생형 알파 서브유닛에서 산성 아미노산 잔기를 갖는 적어도 하나의 위치에서 치환되고/거나 야생형 IL2에서 산성 아미노산 잔기와 접촉하는 IL2R의 야생형 알파 서브유닛에서 염기성 아미노산 잔기를 갖는 적어도 하나의 위치에서 치환되고, 만약 아미노산 잔기가 IL2R의 야생형 알파 서브유닛에서 산성 아미노산 잔기라면 치환은 염기성 아미노산 잔기에 의한 것이고, 만약 아미노산 잔기가 IL2R의 야생형 알파 서브유닛에서 염기성 아미노산 잔기라면 치환은 산성 아미노산 잔기에 의한 것인, 수용체 폴리펩티드,
(ii) IL2 또는 IL2의 기능성 변이체의 변이를 포함하고, IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체가 야생형 IL2에서 염기성 아미노산 잔기와 접촉하는 IL2R의 야생형 알파 서브유닛에서 산성 아미노산 잔기를 갖는 적어도 하나의 위치에서 치환될 때 IL2 또는 이의 기능성 변이체는 야생형 IL2에서 적어도 하나의 상기 염기성 아미노산 잔기에서 치환되고/거나, IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체가 야생형 IL2에서 산성 아미노산 잔기와 접촉하는 IL2R의 야생형 알파 서브유닛에서 염기성 아미노산 잔기를 갖는 적어도 하나의 위치에서 치환될 때 IL2 또는 이의 기능성 변이체는 야생형 IL2에서 적어도 하나의 상기 산성 아미노산 잔기에서 치환되고, 만약 아미노산 잔기가 야생형 IL2에서 염기성 아미노산 잔기라면 치환은 산성 아미노산 잔기에 의한 것이고, 만약 아미노산 잔기가 야생형 IL2에서 산성 아미노산 잔기라면 치환은 염기성 아미노산 잔기에 의한 것인 리간드 폴리펩티드를 포함하는, 시스템
- (i) 인터루킨-2 수용체 (IL2R)의 알파 서브유닛 또는 IL2R의 알파 서브유닛의 기능성 변이체의 변이를 포함하고, IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체는 야생형 IL2에서 염기성 아미노산 잔기와 접촉하는 IL2R의 야생형 알파 서브유닛에서 산성 아미노산 잔기를 갖는 적어도 하나의 위치에서 치환되고/거나 야생형 IL2에서 산성 아미노산 잔기와 접촉하는 IL2R의 야생형 알파 서브유닛에서 염기성 아미노산을 갖는 적어도 하나의 위치에서 치환되고, 만약 아미노산 잔기가 IL2R의 야생형 알파 서브유닛에서 산성 아미노산 잔기라면 치환은 염기성 아미노산 잔기에 의한 것이고, 만약 아미노산 잔기가 IL2R의 야생형 알파 서브유닛에서 염기성 아미노산 잔기라면 치환은 산성 아미노산 잔기에 의한 것인, 수용체 폴리펩티드,
(ii) IL2 또는 IL2의 기능성 변이체의 변이를 포함하고, IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체가 야생형 IL2에서 염기성 아미노산 잔기와 접촉하는 IL2R의 야생형 알파 서브유닛에서 산성 아미노산 잔기를 갖는 적어도 하나의 위치에서 치환될 때 IL2 또는 이의 기능성 변이체는 야생형 IL2에서 적어도 하나의 상기 염기성 아미노산 잔기에서 치환되고/거나, IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체가 야생형 IL2에서 산성 아미노산 잔기와 접촉하는 IL2R의 야생형 알파 서브유닛에서 염기성 아미노산 잔기를 갖는 적어도 하나의 위치에서 치환될 때 IL2 또는 이의 기능성 변이체는 야생형 IL2에서 적어도 하나의 상기 산성 아미노산 잔기에서 치환되고, 만약 아미노산 잔기가 야생형 IL2에서 염기성 아미노산 잔기라면 치환은 산성 아미노산 잔기에 의한 것이고, 만약 아미노산 잔기가 야생형 IL2에서 산성 아미노산 잔기라면 치환은 염기성 아미노산 잔기에 의한 것인, 리간드 폴리펩티드를 포함하는 시스템.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, IL2R의 알파 서브유닛은 IL2R의 인간 알파 서브유닛인, 시스템.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, IL2는 인간 IL2인, 시스템.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
(i) IL2R의 알파 서브유닛은 IL2R의 인간 알파 서브유닛이고 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛을 기준으로 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛에 따라 번호가 지정되는 경우 IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체는 적어도 위치 1 (글루탐산)에서 치환되고,
(ii) IL2는 인간 IL2이고 야생형 인간 IL2를 기준으로 야생형 인간 IL2에 따라 번호가 지정되는 경우 IL2 또는 이의 기능성 변이체는 적어도 위치 35 (라이신)에서 치환되는, 시스템.
- 제9항에 있어서, 위치 1은 라이신으로 치환되는, 시스템.
- 제9항 또는 제10항에 있어서, 위치 35는 글루탐산으로 치환되는, 시스템.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
(i) IL2R의 알파 서브유닛은 IL2R의 인간 알파 서브유닛이고 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛을 기준으로 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛에 따라 번호가 지정되는 경우 IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체는 적어도 위치 29 (글루탐산)에서 치환되고,
(ii) IL2는 인간 IL2이고 야생형 인간 IL2를 기준으로 야생형 인간 IL2에 따라 번호가 지정되는 경우 IL2 또는 이의 기능성 변이체는 적어도 위치 43 (라이신)에서 치환되는, 시스템.
- 제12항 있어서, 위치 29는 라이신으로 치환되는, 시스템.
- 제12항 또는 제13항에 있어서, 위치 43은 글루탐산으로 치환되는, 시스템.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
(i) IL2R의 알파 서브유닛은 IL2R의 인간 알파 서브유닛이고 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛을 기준으로 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛에 따라 번호가 지정되는 경우 IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체는 적어도 위치 38 (라이신)에서 치환되고,
(ii) IL2는 인간 IL2이고 야생형 인간 IL2를 기준으로 야생형 인간 IL2에 따라 번호가 지정되는 경우 IL2 또는 이의 기능성 변이체는 적어도 위치 61 (글루탐산)에서 치환되는, 시스템.
- 제15항 있어서, 위치 38은 글루탐산으로 치환되는, 시스템.
- 제15항 또는 제16항에 있어서, 위치 61은 라이신으로 치환되는, 시스템.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
(i) IL2R의 알파 서브유닛은 IL2R의 인간 알파 서브유닛이고 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛을 기준으로 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛에 따라 번호가 지정되는 경우 IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체는 적어도 위치 1 (글루탐산)에서 라이신으로, 위치 29 (글루탐산)에서 라이신으로, 그리고 위치 38 (라이신)에서 글루탐산으로 치환되고,
(ii) IL2는 인간 IL2이고 야생형 인간 IL2를 기준으로 야생형 인간 IL2에 따라 번호가 지정되는 경우 IL2 또는 이의 기능성 변이체는 적어도 위치 35 (라이신)에서 글루탐산으로, 위치 43 (라이신)에서 글루탐산으로, 그리고 위치 61 (글루탐산)에서 라이신으로 치환되는, 시스템.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
(i) IL2R의 알파 서브유닛은 IL2R의 인간 알파 서브유닛이고 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛을 기준으로 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛에 따라 번호가 지정되는 경우 IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체는 적어도 위치 29 (글루탐산)에서 라이신으로, 그리고 위치 38 (라이신)에서 글루탐산으로 치환되고,
(ii) IL2는 인간 IL2이고 야생형 인간 IL2를 기준으로 야생형 인간 IL2에 따라 번호가 지정되는 경우 IL2 또는 이의 기능성 변이체는 적어도 위치 43 (라이신)에서 글루탐산으로, 그리고 위치 61 (글루탐산)에서 라이신으로 치환되는, 시스템.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
(i) IL2R의 알파 서브유닛은 IL2R의 인간 알파 서브유닛이고 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛을 기준으로 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛에 따라 번호가 지정되는 경우 IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체는 적어도 위치 38 (라이신)에서 글루탐산으로 치환되고,
(ii) IL2는 인간 IL2이고 야생형 인간 IL2를 기준으로 야생형 인간 IL2에 따라 번호가 지정되는 경우 IL2 또는 이의 기능성 변이체는 적어도 위치 61 (글루탐산)에서 라이신으로 치환되는, 시스템.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
(i) IL2R의 알파 서브유닛은 IL2R의 인간 알파 서브유닛이고 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛을 기준으로 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛에 따라 번호가 지정되는 경우 IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체는 적어도 위치 29 (글루탐산)에서 라이신으로 치환되고,
(ii) IL2는 인간 IL2이고 야생형 인간 IL2를 기준으로 야생형 인간 IL2에 따라 번호가 지정되는 경우 IL2 또는 이의 기능성 변이체는 적어도 위치 43 (라이신)에서 글루탐산으로 치환되는, 시스템.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
(i) IL2R의 알파 서브유닛은 IL2R의 인간 알파 서브유닛이고 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛을 기준으로 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛에 따라 번호가 지정되는 경우 IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체는 적어도 위치 29 (글루탐산)에서 라이신으로, 그리고 위치 38 (라이신)에서 글루탐산으로 치환되고,
(ii) IL2는 인간 IL2이고 야생형 인간 IL2를 기준으로 야생형 인간 IL2에 따라 번호가 지정되는 경우 IL2 또는 이의 기능성 변이체는 적어도 위치 35 (라이신)에서 글루탐산으로, 위치 43 (라이신)에서 글루탐산으로, 그리고 위치 61 (글루탐산)에서 라이신으로 치환되는, 시스템.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
(i) IL2R의 알파 서브유닛은 IL2R의 인간 알파 서브유닛이고 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛을 기준으로 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛에 따라 번호가 지정되는 경우 IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체는 적어도 위치 29 (글루탐산)에서 라이신으로 치환되고,
(ii) IL2는 인간 IL2이고 야생형 인간 IL2를 기준으로 야생형 인간 IL2에 따라 번호가 지정되는 경우 IL2 또는 이의 기능성 변이체는 적어도 위치 43 (라이신)에서 글루탐산으로, 그리고 위치 61 (글루탐산)에서 라이신으로 치환되는, 시스템.
- (i) 인터루킨-2 수용체 (IL2R)의 인간 알파 서브유닛 또는 IL2R의 인간 알파 서브유닛의 기능성 변이체의 변이를 포함하고, IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛을 기준으로 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛에 따라 번호가 지정되는 경우 IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체는 적어도 위치 1 (글루탐산)에서 염기성 아미노산 잔기로 치환되는, 수용체 폴리펩티드, 및
(ii) 인간 IL2 또는 인간 IL2의 기능성 변이체의 변이를 포함하고, 야생형 인간 IL2를 기준으로 야생형 인간 IL2에 따라 번호가 지정되는 경우 IL2 또는 이의 기능성 변이체는 적어도 위치 35 (라이신)에서 산성 아미노산 잔기로 치환되는, 리간드 폴리펩티드를 포함하는 시스템.
- 제24항에 있어서, 위치 1은 라이신으로 치환되는, 시스템.
- 제24항 또는 제25항에 있어서, 위치 35는 글루탐산으로 치환되는, 시스템.
- (i) 인터루킨-2 수용체 (IL2R)의 인간 알파 서브유닛 또는 IL2R의 인간 알파 서브유닛의 기능성 변이체의 변이를 포함하고, IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛을 기준으로 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛에 따라 번호가 지정되는 경우 IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체는 적어도 위치 29 (글루탐산)에서 염기성 아미노산 잔기로 치환되는, 수용체 폴리펩티드, 및
(ii) 인간 IL2 또는 인간 IL2의 기능성 변이체의 변이를 포함하고, 야생형 인간 IL2를 기준으로 야생형 인간 IL2에 따라 번호가 지정되는 경우 IL2 또는 이의 기능성 변이체는 적어도 위치 43 (라이신)에서 산성 아미노산 잔기로 치환되는, 리간드 폴리펩티드를 포함하는 시스템.
- 제27항에 있어서, 위치 29는 라이신으로 치환되는, 시스템.
- 제27항 또는 제28항에 있어서, 위치 43은 글루탐산으로 치환되는, 시스템.
- (i) 인터루킨-2 수용체 (IL2R)의 인간 알파 서브유닛 또는 IL2R의 인간 알파 서브유닛의 기능성 변이체의 변이를 포함하고, IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛을 기준으로 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛에 따라 번호가 지정되는 경우 IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체는 적어도 위치 38 (라이신)에서 산성 아미노산 잔기로 치환되는, 수용체 폴리펩티드, 및
(ii) 인간 IL2 또는 인간 IL2의 기능성 변이체의 변이를 포함하고, 야생형 인간 IL2를 기준으로 야생형 인간 IL2에 따라 번호가 지정되는 경우 IL2 또는 이의 기능성 변이체는 적어도 위치 61 (글루탐산)에서 염기성 아미노산 잔기로 치환되는, 리간드 폴리펩티드를 포함하는 시스템.
- 제30항에 있어서, 위치 38은 글루탐산으로 치환되는, 시스템.
- 제30항 또는 제31항에 있어서, 위치 61은 라이신으로 치환되는, 시스템.
- (i) 인터루킨-2 수용체 (IL2R)의 인간 알파 서브유닛 또는 IL2R의 인간 알파 서브유닛의 기능성 변이체의 변이를 포함하고, IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛을 기준으로 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛에 따라 번호가 지정되는 경우 IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체는 적어도 위치 1 (글루탐산)에서 라이신으로, 위치 29 (글루탐산)에서 라이신으로, 그리고 위치 38 (라이신)에서 글루탐산으로 치환되는, 수용체 폴리펩티드, 및
(ii) 인간 IL2 또는 인간 IL2의 기능성 변이체의 변이를 포함하고, 야생형 인간 IL2를 기준으로 야생형 인간 IL2에 따라 번호가 지정되는 경우 IL2 또는 이의 기능성 변이체는 적어도 위치 35 (라이신)에서 글루탐산으로, 위치 43 (라이신)에서 글루탐산으로, 그리고 위치 61 (글루탐산)에서 라이신으로 치환되는, 리간드 폴리펩티드를 포함하는 시스템.
- (i) 인터루킨-2 수용체 (IL2R)의 인간 알파 서브유닛 또는 IL2R의 인간 알파 서브유닛의 기능성 변이체의 변이를 포함하고, IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛을 기준으로 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛에 따라 번호가 지정되는 경우 IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체는 적어도 위치 29 (글루탐산)에서 라이신으로, 그리고 위치 38 (라이신)에서 글루탐산으로 치환되는, 수용체 폴리펩티드, 및
(ii) 인간 IL2 또는 인간 IL2의 기능성 변이체의 변이를 포함하고, 야생형 인간 IL2를 기준으로 야생형 인간 IL2에 따라 번호가 지정되는 경우 IL2 또는 이의 기능성 변이체는 적어도 위치 43 (라이신)에서 글루탐산으로, 그리고 위치 61 (글루탐산)에서 라이신으로 치환되는, 리간드 폴리펩티드를 포함하는 시스템.
- (i) 인터루킨-2 수용체 (IL2R)의 인간 알파 서브유닛 또는 IL2R의 인간 알파 서브유닛의 기능성 변이체의 변이를 포함하고, IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛을 기준으로 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛에 따라 번호가 지정되는 경우 IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체는 적어도 위치 38 (라이신)에서 글루탐산으로 치환되는, 수용체 폴리펩티드, 및
(ii) 인간 IL2 또는 인간 IL2의 기능성 변이체의 변이를 포함하고, 야생형 인간 IL2를 기준으로 야생형 인간 IL2에 따라 번호가 지정되는 경우 IL2 또는 이의 기능성 변이체는 적어도 위치 61 (글루탐산)에서 라이신으로 치환되는, 리간드 폴리펩티드를 포함하는 시스템.
- (i) 인터루킨-2 수용체 (IL2R)의 인간 알파 서브유닛 또는 IL2R의 인간 알파 서브유닛의 기능성 변이체의 변이를 포함하고, IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛을 기준으로 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛에 따라 번호가 지정되는 경우 IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체는 적어도 위치 29 (글루탐산)에서 라이신으로 치환되는, 수용체 폴리펩티드, 및
(ii) 인간 IL2 또는 인간 IL2의 기능성 변이체의 변이를 포함하고, 야생형 인간 IL2를 기준으로 야생형 인간 IL2에 따라 번호가 지정되는 경우 IL2 또는 이의 기능성 변이체는 적어도 위치 43 (라이신)에서 글루탐산으로 치환되는, 리간드 폴리펩티드를 포함하는 시스템.
- (i) 인터루킨-2 수용체 (IL2R)의 인간 알파 서브유닛 또는 IL2R의 인간 알파 서브유닛의 기능성 변이체의 변이를 포함하고, IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛을 기준으로 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛에 따라 번호가 지정되는 경우 IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체는 적어도 위치 29 (글루탐산)에서 라이신으로, 그리고 위치 38 (라이신)에서 글루탐산으로 치환되는, 수용체 폴리펩티드, 및
(ii) 인간 IL2 또는 인간 IL2의 기능성 변이체의 변이를 포함하고, 야생형 인간 IL2를 기준으로 야생형 인간 IL2에 따라 번호가 지정되는 경우 IL2 또는 이의 기능성 변이체는 적어도 위치 35 (라이신)에서 글루탐산으로, 위치 43 (라이신)에서 글루탐산으로, 그리고 위치 61 (글루탐산)에서 라이신으로 치환되는, 리간드 폴리펩티드를 포함하는 시스템.
- (i) 인터루킨-2 수용체 (IL2R)의 인간 알파 서브유닛 또는 IL2R의 인간 알파 서브유닛의 기능성 변이체의 변이를 포함하고, IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛을 기준으로 IL2R의 야생형 인간 알파 서브유닛에 따라 번호가 지정되는 경우 IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체는 적어도 위치 29 (글루탐산)에서 라이신으로 치환되는, 수용체 폴리펩티드, 및
(ii) 인간 IL2 또는 인간 IL2의 기능성 변이체의 변이를 포함하고, 야생형 인간 IL2를 기준으로 야생형 인간 IL2에 따라 번호가 지정되는 경우 IL2 또는 이의 기능성 변이체는 적어도 위치 43 (라이신)에서 글루탐산으로, 그리고 위치 61 (글루탐산)에서 라이신으로 치환되는, 리간드 폴리펩티드를 포함하는 시스템.
- 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, IL2R의 알파 서브유닛은 SEQ ID NO: 2에 따른 아미노산 서열을 갖는, 시스템.
- 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, IL2는 SEQ ID NO: 1에 따른 아미노산 서열을 갖는, 시스템.
- 제6항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, (ii)에 따른 변이는 알파 서브유닛으로서 (i)에 따른 변이를 포함하는 IL2R에 결합하고 활성화시키는, 시스템.
- 제41항에 있어서, (ii)에 따른 변이에 의한 알파 서브유닛으로서 (i)에 따른 변이를 포함하는 IL2R에 대한 결합 및/또는 활성화는 (i)에 따른 변이에 의한 알파 서브유닛으로서 IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 IL2R에 대한 결합 및/또는 활성화를 초과하는, 시스템.
- 제41항 또는 제42항에 있어서, (ii)에 따른 변이에 의한 알파 서브유닛으로서 (i)에 따른 변이를 포함하는 IL2R에 대한 IL2 또는 이의 기능성 변이체에 의한 결합 및/또는 활성화는 알파 서브유닛으로서 (i)에 따른 변이를 포함하는 IL2R에 대한 결합 및/또는 활성화를 초과하는, 시스템.
- 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 알파 서브유닛으로서 IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 IL2R에 대한 IL2 또는 이의 기능성 변이체에 의한 결합 및/또는 활성화는 (ii)에 따른 변이에 의한 알파 서브유닛으로서 IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 IL2R에 대한 결합 및/또는 활성화를 초과하는, 시스템.
- 제41항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 알파 서브유닛으로서 IL2R의 알파 서브유닛 또는 이의 기능성 변이체를 포함하는 IL2R에 대한 IL2 또는 이의 기능성 변이체에 의한 결합 및/또는 활성화는 알파 서브유닛으로서 (i)에 따른 변이를 포함하는 IL2R에 대한 IL2 또는 이의 기능성 변이체에 의한 결합 및/또는 활성화를 초과하는, 시스템.
- 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, IL2 또는 이의 기능성 변이체에서 치환은 알파 서브유닛으로서 IL2R의 야생형 알파 서브유닛을 포함하는 IL2R(IL2Rαβγ)에 대한 친화도를 감소시키는, 시스템.
- 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, IL2 또는 이의 기능성 변이체에서 치환은 알파 서브유닛으로서 IL2R의 야생형 알파 서브유닛을 포함하는 IL2R(IL2Rαβγ)에 대한 친화도를 βγ IL2 수용체 복합체 (IL2Rβγ)에 대한 것 보다 현저하게 감소시키는, 시스템.
- 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, (ii)에 따른 변이는 야생형 IL2에 비하여 조절 T 세포를 자극하는 능력이 감소된, 시스템.
- 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, (ii)에 따른 변이는 IL2Rβγ에 대한 친화도를 향상시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 더 포함하는, 시스템.
- 제49항에 있어서, IL2Rβγ에 대한 친화도를 향상시키는 하나 이상의 아미노산 치환은 다음의 치환 세트를 포함하는, 시스템: 80F, 81D, 85V, 86V, 92F.
- 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 리간드 폴리펩티드는 약동학적으로(PK) 연장된 폴리펩티드인, 시스템.
- 제51항에 있어서, PK-연장된 폴리펩티드는 융합 단백질을 포함하는, 시스템.
- 제52항에 있어서, 융합 단백질은 (ii)에 따른 변이의 모이어티 및 IL2 또는 이의 기능성 변이체에 대해 이종성인 모이어티를 포함하는, 시스템.
- 제52항 또는 제53항에 있어서, 융합 단백질은 (ii)에 따른 변이의 모이어티 및 혈청 알부민, 면역글로불린 단편, 트랜스페린, Fn3, 및 이의 변이체로 구성된 군으로부터 선택되는 모이어티를 포함하는, 시스템.
- 제54항에 있어서, 혈청 알부민은 마우스 혈청 알부민 또는 인간 혈청 알부민을 포함하는, 시스템.
- 제54항에 있어서, 면역글로불린 단편은 면역글로불린 Fc 도메인을 포함하는, 시스템.
- 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항의 시스템의 수용체 폴리펩티드.
- 제57항의 수용체 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드.
- 제58항에 있어서, RNA인, 폴리뉴클레오티드.
- 제58항 또는 제59항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포.
- 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항의 시스템의 수용체 폴리펩티드를 발현하도록 유전적으로 변형된 숙주 세포.
- 제60항 또는 제61항에 있어서, 면역 작용 세포인, 숙주 세포.
- 제62항에 있어서, 면역 작용 세포는 T 세포인, 숙주 세포.
- 제58항 또는 제59항의 폴리뉴클레오티드 또는 제62항 또는 제63항의 숙주 세포를 포함하는 약학 조성물.
- 제58항 또는 제59항의 폴리뉴클레오티드 또는 제62항 또는 제63항의 숙주 세포 또는 제64항의 약학 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체를 치료하는 방법.
- 제65항에 있어서, 대상체에서 암을 치료하거나 예방하기 위한 방법인, 방법.
- (i) 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항의 시스템의 수용체 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항의 시스템의 수용체 폴리펩티드를 발현하도록 유전적으로 변형된 면역 작용 세포 및
(ii) (i)에 따른 시스템의 상응하는 리간드 폴리펩티드, 리간드 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 리간드 폴리펩티드를 발현하도록 유전적으로 변형된 숙주 세포를 포함하는 의학 제제.
- 제67항에 있어서, 키트인, 의학제제.
- 제67항 또는 제68항에 있어서, 분리된 용기에서 각각의 구성성분 (i) 및 (ii)를 포함하는, 의학 제제.
- 제67항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 암을 치료 또는 예방하기 위한 의학 제제의 사용을 위한 설명서를 더 포함하는, 의학 제제.
- 제67항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 의학적 용도를 위한, 의학 제제.
- 제71항에 있어서, 의학적 용도는 질환 또는 장애의 치료학적 또는 예방학적 치료를 포함하는, 의학 제제.
- 제67항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 암을 치료하거나 예방하기 위한 방법에 사용하기 위한, 의학 제제.
- (i) 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항의 시스템의 수용체 폴리펩티드를 발현하도록 유전적으로 변형된 면역 작용 세포를 대상체에 제공하는 단계, 및
(ii) (i)에 따른 시스템의 상응하는 리간드 폴리펩티드, 리간드 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 리간드 폴리펩티드를 발현하도록 유전적으로 변형된 숙주 세포를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체를 치료하는 방법.
- 제74항에 있어서, 상기 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법인, 방법.
- 제75항에 있어서, 면역 반응은 T 세포-매개된 면역 반응인, 방법.
- (i) 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항의 시스템의 수용체 폴리펩티드를 발현하도록 유전적으로 변형된 면역 작용 세포를 대상체에 제공하는 단계로서, 면역 작용 세포는 항원 또는 항원을 발현하는 세포인, 단계, 및
(ii) (i)에 따른 시스템의 상응하는 리간드 폴리펩티드, 리간드 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 리간드 폴리펩티드를 발현하도록 유전적으로 변형된 숙주 세포를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 항원의 발현 또는 증가된 발현과 연관된 질환, 장애 또는 병태를 갖는 대상체를 치료하는 방법.
- 제77항에 있어서, 질환, 장애 또는 병태는 암이고, 항원은 종양-관련 항원인, 방법.
- 제74항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 수용체 폴리펩티드를 발현하도록 유전적으로 변형된 면역 작용 세포는 수용체 폴리펩티드를 발현하도록 유전적으로 변형된 면역 작용 세포를 투여함으로써, 또는 대상체에서 수용체 폴리펩티드를 발현하도록 유전적으로 변형된 면역 작용 세포를 발생시킴으로써 대상체에 제공되는, 방법.
- 제74항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 암을 치료 또는 예방하기 위한 방법인, 방법.
- 제67항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 수용체 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 리간드 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드는 RNA인, 의학 제제 또는 방법.
- 제67항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 수용체 폴리펩티드를 발현하도록 유전적으로 변형된 면역 작용 세포는 수용체 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 의학 제제 또는 방법.
- 제67항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 리간드 폴리펩티드를 발현하도록 유전적으로 변형된 숙주 세포는 리간드 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 의학 제제 또는 방법.
- 제62항 또는 제83항에 있어서, 수용체 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 리간드 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드는 RNA인, 의학 제제 또는 방법.
- 제67항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 작용 세포는 T 세포인, 의학 제제 또는 방법.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP2019056719 | 2019-03-18 | ||
| EPPCT/EP2019/056719 | 2019-03-18 | ||
| PCT/EP2020/057140 WO2020187848A1 (en) | 2019-03-18 | 2020-03-16 | Lnterleukin-2 receptor (il2r) and interleukin-2 (il2) variants for specific activation of immune effector cells |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20210143759A true KR20210143759A (ko) | 2021-11-29 |
Family
ID=69780223
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020217029581A KR20210143759A (ko) | 2019-03-18 | 2020-03-16 | 면역 작용 세포의 특이적 활성화를 위한 인터루킨-2 수용체 (il2r) 및 인터루킨-2 (il2) 변이체 |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20220177544A1 (ko) |
| EP (1) | EP3941935A1 (ko) |
| JP (1) | JP2022525921A (ko) |
| KR (1) | KR20210143759A (ko) |
| CN (1) | CN113874389A (ko) |
| AU (1) | AU2020242254A1 (ko) |
| CA (1) | CA3133414A1 (ko) |
| CL (1) | CL2021002407A1 (ko) |
| CO (1) | CO2021013687A2 (ko) |
| CU (1) | CU20210078A7 (ko) |
| IL (1) | IL285584A (ko) |
| MX (1) | MX2021011258A (ko) |
| SG (1) | SG11202108857SA (ko) |
| WO (1) | WO2020187848A1 (ko) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023180527A1 (en) | 2022-03-25 | 2023-09-28 | Universität Zürich | Adenoviral mediated targeting of activated immune cells |
Family Cites Families (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2686899B1 (fr) | 1992-01-31 | 1995-09-01 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant. |
| US20050287153A1 (en) | 2002-06-28 | 2005-12-29 | Genentech, Inc. | Serum albumin binding peptides for tumor targeting |
| US7176278B2 (en) | 2001-08-30 | 2007-02-13 | Biorexis Technology, Inc. | Modified transferrin fusion proteins |
| US7696320B2 (en) | 2004-08-24 | 2010-04-13 | Domantis Limited | Ligands that have binding specificity for VEGF and/or EGFR and methods of use therefor |
| DK2316852T3 (da) | 2002-11-08 | 2014-06-16 | Ablynx Nv | Stabiliserede enkeltdomæne-antistoffer |
| PL1729795T3 (pl) | 2004-02-09 | 2016-08-31 | Human Genome Sciences Inc | Białka fuzyjne albuminy |
| WO2005091956A2 (en) * | 2004-03-05 | 2005-10-06 | Chiron Corporation | In vitro test system for predicting patient tolerability of therapeutic agents |
| US20070269422A1 (en) | 2006-05-17 | 2007-11-22 | Ablynx N.V. | Serum albumin binding proteins with long half-lives |
| EP2046826B1 (en) | 2006-07-24 | 2011-09-14 | Biorexis Pharmaceutical Corporation | Exendin fusion proteins |
| CN101646689A (zh) | 2006-09-08 | 2010-02-10 | 埃博灵克斯股份有限公司 | 具有长半衰期的血清清蛋白结合蛋白 |
| US20100322930A1 (en) | 2007-12-27 | 2010-12-23 | Frank Kolbinger | Fibronectin-based binding molecules and their use |
| EP2383292A1 (en) | 2008-05-02 | 2011-11-02 | Novartis AG | Improved fibronectin-based binding molecules and uses thereof |
| GB2488077A (en) | 2009-10-30 | 2012-08-15 | Novozymes Biopharma Dk As | Albumin variants |
| KR20130070576A (ko) | 2010-04-09 | 2013-06-27 | 노보자임스 바이오파마 디케이 에이/에스 | 알부민 유도체 및 변이체 |
| BR112012026216B1 (pt) | 2010-04-13 | 2022-07-26 | Bristol-Myers Squibb Company | Proteínas com domínio "scaffold" baseado em fibronectina que se ligam à pcsk9, seu uso, bem como composição farmacêutica compreendendo as mesmas |
| US20140220017A1 (en) | 2011-09-23 | 2014-08-07 | Universitat Stuttgart | Serum half-life extension using igbd |
| WO2013075066A2 (en) | 2011-11-18 | 2013-05-23 | Eleven Biotherapeutics, Inc. | Proteins with improved half-life and other properties |
| WO2013143555A1 (en) | 2012-03-26 | 2013-10-03 | Biontech Ag | Rna formulation for immunotherapy |
| WO2016005004A1 (en) | 2014-07-11 | 2016-01-14 | Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh | Stabilization of poly(a) sequence encoding dna sequences |
| MA40721A (fr) * | 2014-08-06 | 2017-06-13 | The Univ Of Miami | Protéines de fusion de l'interleukine-2/récepteur alpha de l'interleukine-2 et procédés d'utilisation |
| WO2017059902A1 (en) | 2015-10-07 | 2017-04-13 | Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh | 3' utr sequences for stabilization of rna |
| AU2019311233A1 (en) * | 2018-07-24 | 2021-01-21 | BioNTech SE | IL2 agonists |
-
2020
- 2020-03-16 AU AU2020242254A patent/AU2020242254A1/en active Pending
- 2020-03-16 JP JP2021556460A patent/JP2022525921A/ja active Pending
- 2020-03-16 KR KR1020217029581A patent/KR20210143759A/ko unknown
- 2020-03-16 CN CN202080022877.4A patent/CN113874389A/zh active Pending
- 2020-03-16 WO PCT/EP2020/057140 patent/WO2020187848A1/en active Application Filing
- 2020-03-16 MX MX2021011258A patent/MX2021011258A/es unknown
- 2020-03-16 EP EP20710187.4A patent/EP3941935A1/en active Pending
- 2020-03-16 CU CU2021000078A patent/CU20210078A7/es unknown
- 2020-03-16 SG SG11202108857SA patent/SG11202108857SA/en unknown
- 2020-03-16 US US17/439,367 patent/US20220177544A1/en active Pending
- 2020-03-16 CA CA3133414A patent/CA3133414A1/en active Pending
-
2021
- 2021-08-12 IL IL285584A patent/IL285584A/en unknown
- 2021-09-15 CL CL2021002407A patent/CL2021002407A1/es unknown
- 2021-10-13 CO CONC2021/0013687A patent/CO2021013687A2/es unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CO2021013687A2 (es) | 2021-10-29 |
| SG11202108857SA (en) | 2021-09-29 |
| MX2021011258A (es) | 2021-12-10 |
| CL2021002407A1 (es) | 2022-05-27 |
| EP3941935A1 (en) | 2022-01-26 |
| AU2020242254A9 (en) | 2021-10-28 |
| AU2020242254A1 (en) | 2020-09-24 |
| WO2020187848A1 (en) | 2020-09-24 |
| CU20210078A7 (es) | 2022-04-07 |
| IL285584A (en) | 2021-09-30 |
| CA3133414A1 (en) | 2020-09-24 |
| CN113874389A (zh) | 2021-12-31 |
| US20220177544A1 (en) | 2022-06-09 |
| JP2022525921A (ja) | 2022-05-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20210292386A1 (en) | IL2 Agonists | |
| US20210113606A1 (en) | Treatment using cytokine encoding rna | |
| US20220356223A1 (en) | IL2 Agonists | |
| US20230000962A1 (en) | Treatment involving immune effector cells genetically modified to express antigen receptors | |
| US20220143144A1 (en) | Treatment involving interleukin-2 (il2) and interferon (ifn) | |
| US20220177544A1 (en) | Interleukin-2 receptor (IL2R) and interleukin-2 (IL2) variants for specific activation of immune effector cells | |
| US20220125836A1 (en) | Treatment involving car-engineered t cells and cytokines |