KR20210124236A - Car-조작된 t 세포 및 사이토카인을 수반한 치료 - Google Patents

Car-조작된 t 세포 및 사이토카인을 수반한 치료 Download PDF

Info

Publication number
KR20210124236A
KR20210124236A KR1020217024681A KR20217024681A KR20210124236A KR 20210124236 A KR20210124236 A KR 20210124236A KR 1020217024681 A KR1020217024681 A KR 1020217024681A KR 20217024681 A KR20217024681 A KR 20217024681A KR 20210124236 A KR20210124236 A KR 20210124236A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
antigen
rna
cells
car
leu
Prior art date
Application number
KR1020217024681A
Other languages
English (en)
Inventor
우구르 사힌
페트라 오엠
벤자민 렝스틀
카싸리나 레인하드
Original Assignee
비온테크 쎌 & 제네 테라피스 게엠베하
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 비온테크 쎌 & 제네 테라피스 게엠베하 filed Critical 비온테크 쎌 & 제네 테라피스 게엠베하
Publication of KR20210124236A publication Critical patent/KR20210124236A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterized by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2013—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2046—IL-7
    • A61K39/4611—
    • A61K39/4631—
    • A61K39/464402—
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5418—IL-7
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/55—IL-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K2039/55527—Interleukins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K2039/55527—Interleukins
    • A61K2039/55533—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2307—Interleukin-7 (IL-7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2315—Interleukin-15 (IL-15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

본 발명은 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 조작된 T 세포의 효과를 강화하기 위한 방법 및 물질에 관한 것이다. 이러한 방법 및 물질은, 특히 질병에 걸린 세포가 CAR이 겨냥하는 항원을 발현하는 것을 특징으로 하는 질병을 치료하는데 이용가능하다. 보다 상세하게는, 본 발명은 개체에 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 유전자 변형된 T 세포를 제공하는 단계, 및 상기 개체에 IL2 또는 IL2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 IL2 또는 IL2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 추가적인 사이토카인 또는 추가적인 사이토카인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 추가적인 사이토카인은 IL7 또는 IL21일 수 있다. CAR을 발현하도록 유전자 변형된 T 세포는 CAR을 발현하도록 유전자 변형된 T 세포를 투여하거나, 또는 개체 체내에서 CAR을 발현하도록 유전자 변형된 T 세포를 구축함으로써 개체에 제공할 수 있다. 본 발명의 방법은 항원 또는 이의 변이체, 또는 이러한 항원 또는 이의 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 개체에 투여하는 단계를 더 포함할 수 있으며, CAR을 발현하도록 유전자 변형된 T 세포는 항원을 표적으로 한다. 바람직한 일 특정 구현예에서, 본 발명에 따라 투여되는 폴리뉴클레오티드는 RNA이다.

Description

CAR-조작된 T 세포 및 사이토카인을 수반한 치료
본 발명은 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 조작된 T 세포의 효능을 강화하기 위한 방법 및 물질에 관한 것이다. 이러한 방법 및 물질은, 특히, CAR이 인가되는 항원을 발현하는 발병 세포를 특징으로 하는 질환을 치료하는데 이용가능하다. 구체적으로, 본원은 개체에 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 유전자 변형된 T 세포를 제공하는 단계 및 상기 개체에 IL2 또는 IL2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 본원의 방법은 IL2 또는 IL2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 추가적인 사이토카인 또는 추가적인 사이토카인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 단계를 포함할 수 있으며, 추가적인 사이토카인은 IL7 또는 IL21일 수 있다. CAR을 발현하도록 유전자 변형된 T 세포는, CAR을 발현하도록 유전자 변형된 T 세포를 투여하거나 또는 개체 체내에서 CAR을 발현하도록 유전자 변형된 T 세포를 구축함으로써, 개체에 제공할 수 있다. 본원의 방법은 개체에 항원 또는 이의 변이체 또는 항원 또는 이의 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 단계를 더 포함할 수 있으며, CAR을 발현하도록 유전자 변형된 T 세포는 상기한 항원을 표적화한다. 특히 바람직한 일 구현예에서, 본 발명에 따라 투여되는 폴리뉴클레오티드는 RNA이다.
면역 시스템은 암 자가면역, 알레르기뿐 아니라 병원체-관련 질환에서 중요한 역할을 담당한다. T 세포는 인간 및 동물에서 세포-매개 면역에 중요한 역할을 수행한다. 특정 항원에 대한 T 세포의 인지 및 결합은 T 세포의 표면에 발현된 T 세포 수용체 (TCR)에 의해 매개된다. T 세포의 TCR은 주 조직적합성 복합체 (MHC) 분자에 결합하여, 표적 세포의 표면 상에 제시된 면역원성 펩타이드 (에피토프)와 상호작용할 수 있다. 특이적인 TCR 결합은 T 세포에서의 신호 캐스케이드를 촉발하여, 증폭과 성숙한 작동자 T 세포로의 분화를 유발한다.
TCR의 다양성은 TCR의 서로 다른 구조 영역들을 암호화하는 유전자의 여러가지 불연속 세그먼트들을 유전자 재정렬함으로써 수득된다. TCR은 α-쇄 하나와 β-쇄 하나, 또는 γ-쇄 하나와 δ-쇄 하나로 구성된다. TCR α/β 쇄는 항원 인지에 참여하는 N-말단의 고도의 다형성 가변부와 비가변성 불변부로 구성된다. 이들 쇄는, 유전자 수준에서, 개별 영역들, 즉 가변성 (V) 영역, 다양성 (D) 영역 (단 β- 및 δ-쇄), 연결 (J) 영역 및 불변 (C) 영역으로 나눠져 있다. T 세포의 분화 중에 V 영역 하나, D 영역 하나 (단 β-쇄 및 δ-쇄), J 영역 하나 및 C 영역 하나의 재정렬에 의해 특이적인 T 세포 수용체 유전자들이 만들어진다. TCR의 다양성은 부정확한 V-(D)-J 재정렬에 의해 더욱 강화되고, 이때 재조합 부위에서 무작위 뉴클레오티드가 도입 및/또는 결손된다. T 세포의 성숙화 중에 게놈에서 TCR 유전자 좌의 재정렬이 이루어지므로, 각각의 성숙한 T 세포는 특이적인 α/β TCR 또는 γ/δ TCR 하나만 발현한다. TCR은 TCR α-쇄 및 β-쇄로 된 이형이량성 복합체, 공동-수용체 CD4 또는 CD8, 및 CD3 신호 변환 모듈을 포함하는 복합적인 신호전달 기구의 일부이다. CD3 쇄는 활성화 신호를 세포 내부에 전달하는 반면, TCR α/β 이형이량체는 오직 항원 인지만 담당한다.
입양 세포 전달 (ACT)에 기반한 면역요법은, 광의적으로 적은 수의 전구세포를 임상적으로 적절한 세포 수로 생체외 증폭시킨 다음 비-면역 수용자 또는 자가 숙주에 전달하는, 이미 감작된 T 세포를 이용한 수동 면역화 형태로서 정의될 수 있다. ACT 실험에 사용되고 있는 세포 유형은 림포카인-활성화된 살상 (LAK) 세포 (Mule, J.J. et al. (1984) Science 225, 1487-1489; Rosenberg, S.A. et al. (1985) N. Engl. J. Med. 313, 1485-1492), 종양-침윤성 림프구 (TIL)(Rosenberg, S.A. et al. (1994) J. Natl. Cancer Inst. 86, 1159-1166), 조혈 줄기 세포 이식 (HSCT) 이후의 공여 림프구 및 종양-특이 T 세포주 또는 클론 (Dudley, M.E. et al. (2001) J. Immunother. 24, 363-373; Yee, C. et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 99, 16168-16173)이다. 입양 T 세포 전달은 CMV와 같은 인간 바이러스의 감염에 대해 치료학적 활성을 가진 것으로 입증되어 있다. CMV 감염 및 내인성 잠복 바이러스의 재활성화는 건강한 개체에서는 면역 시스템에 의해 제어되지만, 이식 수용자 또는 AIDS 환자와 같이 면역이 약화된 개체에서는 상당한 이환율 및 사망율을 야기한다. 리델 및 공동 연구자들은, HLA-매칭된 CMV-혈청양성 이식 공여자로부터 유래된 CD8+ CMV-특이적인 T 세포 클론을 이식한 후, 면역 억제 환자에서 입양 T 세포 요법에 의해 바이러스 면역성이 재구축된다는 것을 입증하였다 (Riddell, S.R. (1992) Science 257, 238-241). 대안적인 방식으로서, 다클론 공여자-유래 CMV- 또는 EBV-특이적인 T 세포 집단을 이식 수용자에게 전달하였으며, 그 결과 전달된 T 세포의 존속성이 강화되었다 (Rooney, C.M. et al. (1998) Blood 92, 1549-1555; Peggs, K.S. et al. (2003) Lancet 362, 1375-1377). 로젠버그 및 공동 연구자들은, 흑색종의 입양 면역요법에서, 적출된 종양으로부터 분리하여 시험관내 증폭시킨 자가 종양-침윤성 림프구 (TIL)를 비-골수파괴성 림프구 고갈 화학요법 및 고-용량 IL2와 조합하여 주입하는 것을 기반으로 하는, ACT 방식을 확립하였다. 최근 발표된 임상 실험에서는 치료받은 전이성 흑색종 환자들에서 ~50%의 객관적인 반응률이 달성되었다 (Dudley, M.E. et al. (2005) J. Clin. Oncol. 23: 2346-2357).
대안적인 방식은 단기간 생체외 배양한 후 환자에게 재주입하여 정의된 특이성을 가진 종양-반응성 면역수용체를 발현하도록 리프로그래밍화된 자가 T 세포를 입양 전달하는 방법이다 (Kershaw M.H. et al. (2013) Nature Reviews Cancer 13 (8):525-41). 이 전략은, 심지어 종양-반응성 T 세포가 환자에 존재하지 않더라도, 다양한 일반적인 악성들에 ACT를 적용할 수 있도록 해준다. T 세포의 항원 특이성은 전적으로 TCR α-쇄와 β-쇄로 된 이형이량성 복합체에 의존하므로, 클로닝한 TCR 유전자를 T 세포에 전달하게 되면 임의의 대상 항원 쪽으로 이를 다시 향하게 할 가능성을 제공해준다. 따라서, TCR 유전자 요법은 치료 옵션으로서 자가 림프구를 이용한 항원-특이적인 면역요법을 개발하기 위한 매력적인 전략을 제공해준다. TCR 유전자 전달의 주요 이점은 항원-특이적인 T 세포를 수일 이내에 치료학적 함량으로 구축하고, 환자의 내인성 TCR 레퍼토리에 없는 특이성을 도입할 수 있다는 것이다.
여러 그룹들에서, TCR 유전자 전달이 일차 T 세포의 항원-특이성을 다시 지정하기 위한 매력적인 전략임을 입증하였다 (Morgan, R.A. et al. (2003) J. Immunol. 171, 3287-3295; Cooper, L.J. et al.(2000) J. Virol. 74, 8207-8212; Fujio, K. et al. (2000) J. Immunol. 165, 528-532; Kessels, H.W. et al. (2001) Nat. Immunol. 2, 957-961; Dembic, Z. et al. (1986) Nature 320, 232-238). 인간에서 TCR 유전자 요법의 실현 가능성은 로젠버그 그룹에 의해 악성 흑색종을 치료하기 위한 임상 시험에서 최초로 입증되었다. 흑색종/멜라노사이트 항원-특이적인 TCR을 이용한 레트로바이러스 형질전이된 자가 림프구의 입양 전달시, 치료받은 흑색종 환자들 중 최대 30%에서 암 퇴행이 달성되었다 (Morgan, R.A. et al. (2006) Science 314, 126-129; Johnson, L.A. et al. (2009) Blood 114, 535-546). 한편, TCR 유전자 요법에 대한 임상 시험은 다수의 여러가지 종양 항원을 표적으로 하는 흑색종 이외의 다른 암으로도 확장되었다 (Park, T.S. et al., (2011) Trends Biotechnol. 29, 550-557).
정의된 특이성을 가진 항원-표적화 수용체를 T 세포에 삽입하기 위한 유전자 조작 접근법의 사용이 ACT의 잠재적인 능력을 크게 확장시켰다. 키메라 항원 수용체 (CAR)는 세포외 항원-결합 모이어티, 가장 일반적으로는 단일클론 항체로부터 유래된 단쇄 가변성 단편 (scFv)이 융합된 세포내 T 세포 신호전달 도메인으로 구성된 항원-표적화 수용체 유형이다. CAR은 MHC-매개 제시와는 독립적으로 직접 세포 표면 항원을 인지하며, 그래서 모든 환자들에서 임의의 소정의 항원에 대해 특이적인 단일 수용체 구조체를 사용할 수 있다. 초기 CAR은 항원-인지 도메인을 T 세포 수용체 (TCR) 복합체의 CD3ζ 활성화 쇄와 융합시켰다. 이후의 CAR 개정 버전은, 4-1BB (CD137) 및 OX40 (CD134)와 같은 다양한 TNF 수용체 패밀리 분자 또는 CD28로부터 유래된 세포외 도메인을 비롯하여, CD3ζ와 일렬로 이차적인 공동-자극 신호를 포함하였다. 나아가, 3세대 수용체는, CD3ζ 외에도, 가장 일반적으로 CD28 및 4-1BB로부터 유래되는 2종의 공동-자극 신호를 포함한다. 2세대 CAR 및 3세대 CAR은 항-종양 효과가 급격하게 개선되어, 일부 경우에는, 진행된 암 환자에서 완전 관해를 유도하였다.
일반적으로, 전달된 T 세포의 개수는 치료학적 반응과 연관되어 있는 것으로 여겨진다. 그러나, 입양 T 세포 전달에서 환자에 투여가능한 세포수가 제한적이어서, 입양 T 세포 전달을 위해 T 세포를 다량 구축하는 것이 여전히 도전 과제로 남아있다. TIL 또는 수용체-조작된 T 세포를 주입하기 전에 환자에게 림프구고갈 예비 용법을 시술하는 경우, 상당한 세포 존속성 증가를 달성할 수 있었다. 그러나, 조작된 T 세포를 빈 숙주에 다량 전달하는 방식은, 표적화 항원이 관련 정상 조직에서 예기치않게 발현되는 경우에, 심각한 부작용 위험이 존재한다. 따라서, 조작된 T 세포는 안전한 것으로 입증한 후 환자 체내에서 증폭가능한 제한된 양으로 전달하는 것이 바람직할 것이다.
본 발명자들은, IL2를 암호화하는 RNA를, 선택적으로 IL7 또는 IL21과 같은 추가적인 사이토카인을 암호화하는 RNA와 조합하여 투여함으로써, 그리고 선택적으로 CAR-T 세포 자극용 항원을 제공하기 위해 RNA-백신 접종을 이용함으로써, 개체에서 CAR-T 세포를 증폭시키는 것이 가능하다는 것을, 알게 되었다. 본 발명의 방법은 CAR-조작된 T 세포를 환자에게 소량으로만 제공하여 T 세포를 생체내에서 증폭가능하게 한다.
본 발명은 일반적으로 세포 표면에 항원을 발현하는 발병 세포, 특히 세포 표면에 종양 항원을 발현하는 암 세포 등의, 세포 표면에 항원을 발현하는 세포를 표적화함으로써 질환을 치료하는 방법을 포함한다. 본 방법은 표면에 항원을 발현하는 세포를 선택적으로 제거하며, 이로써 항원을 발현하지 않는 정상 세포에서의 부작용을 최소화한다. 항원에의 결합을 통해 세포를 표적화하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 유전자 변형된 T 세포가, T 세포 투여에 의해서와 같이, 개체에 제공된다. 일 구현예에서, IL7 또는 IL21과 같은 추가적인 사이토카인 또는 이를 암호화하는 핵산을 투여한다. 일 구현예에서, (선택적으로, 적절한 표적 세포에 의해 핵산을 발현시킨 후) T 세포를 자극, 감작 및/또는 증폭하기 위한 항원을 제공하기 위해, 항원 또는 이의 변이체 또는 이를 암호화하는 핵산을 투여한다. 환자에서 자극, 감작 및/또는 증폭된 T 세포는 질병에 걸린 세포와 같이 세포 표면에 항원을 발현하는 세포를 인지하여, 질병에 걸린 세포를 제거할 수 있다. 이러한 방식은 수동 및 능동 면역화를 수반하는 것으로 간주될 수 있다. CAR을 발현하도록 유전자 변형된 T 세포의 투여를 수반하는 치료는 수동 면역화의 형태로 간주될 수 있다. 항원 또는 이의 변이체의 투여를 수반하는, 따라서 표적 세포 집단 또는 조직에 대한 T 세포-매개 면역 반응을 자극하는 치료는, 능동 면역화의 형태로 간주될 수 있다.
본원에 따른 면역 반응은 포유류에서 항원을 발현하는 표적 세포 집단 또는 표적 조직에 대한 것이며, 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 유전자 변형된 T 세포는 그 항원을 표적화한다. 본 방법은 또한 선택적으로 항원 또는 이의 변이체의 투여를 수반한다. 일 구현예에서, 면역 반응은 T 세포-매개 면역 반응이다. 일 구현예에서, 면역 반응은 항-종양 면역 반응이고, 표적 세포 집단 또는 표적 조직은 종양 세포 또는 종양 조직이다.
본원에 기술된 방법 및 물질은, 약동학적 특성을 변형시키는 변형기가 부착된 IL2 (이하, "약동학 (PK)적으로 연장된 IL2"로 지칭됨)를 암호화하는 RNA를, 선택적으로, 약동학 변형기가 부착된 IL7 또는 IL21과 같은 추가적인 사이토카인 (이하, "약동학 (PK)적으로 연장된 사이토카인"으로 지칭됨)을 암호화하는 RNA와 조합하여, 투여되는 경우에, 특히 효과적이다. 본원에 기술된 방법 및 물질은, 약동학 (PK)적으로 연장된 IL2를 암호화하는 RNA 및/또는 약동학 (PK)적으로 연장된 사이토카인을 암호화하는 RNA가 전신 이용되도록 간을 표적화하는 경우에, 특히 효과적이다. 간 세포는 효율적으로 형질감염되어, 단백질을 다량으로 생산할 수 있다. 항원-암호화 RNA는 바람직하게는 2차 림프 기관들을 표적화한다.
일 측면에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 개체에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다:
a. 개체에게 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 유전자 변형된 T 세포를 제공하는 단계; 및
b. 상기 개체에게 IL2 또는 IL2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 단계.
일 구현예에서, 본 방법은 IL2 또는 IL2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 추가적인 사이토카인 또는 추가적인 사이토카인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 추가적인 사이토카인은 IL7 및 IL21로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 본 방법은 IL2 또는 IL2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 IL7 또는 IL7을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 본 방법은 IL2 또는 IL2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 IL21 또는 IL21을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, IL2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 RNA이고, 선택적으로 상기 추가적인 사이토카인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 RNA이다.
일 구현예에서, CAR을 발현하도록 유전자 변형된 T 세포는, CAR을 발현하도록 유전자 변형된 T 세포를 투여하거나 또는 개체 체내에서 CAR을 발현하도록 유전자 변형된 T 세포를 구축함으로써, 개체에 제공된다.
일 구현예에서, 본 방법은 개체에 항원 또는 이의 변이체, 또는 항원 또는 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 단계를 더 포함하며, 여기서 CAR을 발현하도록 유전자 변형된 T 세포는 그 항원을 표적화하고, 면역 반응은 그 항원을 발현하는 표적 세포 집단 또는 표적 조직에 대한 면역 반응이다. 일 구현예에서, 항원 또는 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 RNA이다.
일 측면에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 개체에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다:
a. 개체에게 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 유전자 변형된 T 세포를 제공하는 단계; 및
b. 상기 개체에 IL2를 암호화하는 RNA를 투여하는 단계.
일 구현예에서, 본 방법은 IL2를 암호화하는 RNA 및 추가적인 사이토카인을 암호화하는 RNA를 투여하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 추가적인 사이토카인은 IL7 및 IL21로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 본 방법은 IL2를 암호화하는 RNA 및 IL7을 암호화하는 RNA를 투여하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 본 방법은 IL2를 암호화하는 RNA 및 IL21을 암호화하는 RNA를 투여하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, CAR을 발현하도록 유전자 변형된 T 세포는, CAR을 발현하도록 유전자 변형된 T 세포를 투여하거나 또는 개체 체내에서 CAR을 발현하도록 유전자 변형된 T 세포를 구축함으로써, 개체에 제공된다.
일 구현예에서, 본 방법은 개체에 항원 또는 이의 변이체를 암호화하는 RNA를 투여하는 단계를 더 포함하며, 여기서 CAR을 발현하도록 유전자 변형된 T 세포는 그 항원을 표적으로 하며, 면역 반응은 그 항원을 발현하는 표적 세포 집단 또는 표적 조직에 대한 면역 반응이다.
모든 측면들에 대한 일 구현예에서, 면역 반응은 T 세포-매개 면역 반응이다.
일 측면에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 항원의 발현 또는 발현 증가와 관련된 질환, 장애 또는 병태를 가진 개체를 치료하는 방법을 제공한다:
a. 항원을 표적화하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 유전자 변형된 T 세포를 상기 개체에 제공하는 단계; 및
b. 상기 개체에 IL2 또는 IL2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 단계.
일 구현예에서, 본 방법은 IL2 또는 IL2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 추가적인 사이토카인 또는 추가적인 사이토카인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 추가적인 사이토카인은 IL7 및 IL21로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 본 방법은 IL2 또는 IL2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 IL7 또는 IL7을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 본 방법은 IL2 또는 IL2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 IL21 또는 IL21을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, IL2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 RNA이고, 선택적으로 상기 추가적인 사이토카인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 RNA이다.
일 구현예에서, CAR을 발현하도록 유전자 변형된 T 세포는, CAR을 발현하도록 유전자 변형된 T 세포를 투여하거나 또는 개체 체내에서 CAR을 발현하도록 유전자 변형된 T 세포를 구축함으로써, 개체에 제공된다.
일 구현예에서, 본 방법은 상기 개체에 상기 항원 또는 이의 변이체, 또는 항원 또는 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 단계를 더 포함한다. 일 구현예에서, 항원 또는 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 RNA이다.
일 측면에서, 본 방법은 하기 단계를 포함하는 항원의 발현 또는 발현 증가와 관련된 질환, 장애 또는 병태를 가진 개체를 치료하는 방법을 제공한다:
a. 상기 항원을 표적화하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 유전자 변형된 T 세포를 상기 개체에 제공하는 단계; 및
b. 상기 개체에 IL2를 암호화하는 RNA를 투여하는 단계.
일 구현예에서, 본 방법은 IL2를 암호화하는 RNA와 추가적인 사이토카인을 암호화하는 RNA를 투여하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 추가적인 사이토카인은 IL7 및 IL21로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 본 방법은 IL2를 암호화하는 RNA 및 IL7을 암호화하는 RNA의 투여를 포함한다. 일 구현예에서, 본 방법은 IL2를 암호화하는 RNA 및 IL21을 암호화하는 RNA의 투여를 포함한다.
일 구현예에서, CAR을 발현하도록 유전자 변형된 T 세포는, CAR을 발현하도록 유전자 변형된 T 세포를 투여하거나 또는 개체 체내에서 CAR을 발현하도록 유전자 변형된 T 세포를 구축함으로써, 개체에 제공된다.
일 구현예에서, 본 방법은 개체에 항원 또는 이의 변이체를 암호화하는 RNA를 투여하는 단계를 더 포함한다.
전체 측면들에 대한 일 구현예에서, 질환, 장애 또는 병태는 암이고, 항원은 종양-관련 항원이다.
전체 측면들에 대한 일 구현예에서, IL2는 약동학 (PK)적으로 연장된 IL2이다. 일 구현예에서, 약동학 (PK)적으로 연장된 IL2는 융합 단백질을 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 IL2 모이어티와, 혈청 알부민, 면역글로불린 단편, 트랜스페린, Fn3 및 이들의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 모이어티를 포함한다.
전체 측면들에 대한 일 구현예에서, 추가적인 사이토카인, 특히 IL7 또는 IL21은, 약동학 (PK)적으로 연장된 사이토카인, 특히 약동학 (PK)적으로 연장된 IL7 또는 약동학 (PK)적으로 연장된 IL21이다. 일 구현예에서, 약동학 (PK)적으로 연장된 사이토카인, 특히 약동학 (PK)적으로 연장된 IL7 또는 약동학 (PK)적으로 연장된 IL21은 융합 단백질을 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 추가적인 사이토카인 모이어티, 특히 IL7 모이어티 또는 IL21 모이어티, 및 혈청 알부민, 면역글로불린 단편, 트랜스페린, Fn3 및 이들의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 모이어티를 포함한다.
일 구현예에서, 혈청 알부민은 마우스 혈청 알부민 또는 인간 혈청 알부민을 포함한다. 일 구현예에서, 면역글로불린 단편은 면역글로불린 Fc 도메인을 포함한다.
전체 측면들에 대한 일 구현예에서, 본 방법은 개체에서 암 치료 또는 예방 방법에 관한 것이며, 여기서 항원은 종양-관련 항원이다.
일 측면에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 의학적 조제물 (medical preparation)을 제공한다:
a. 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 유전자 변형된 T 세포; 및
b. IL2 또는 IL2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
일 구현예에서, 의학적 조제물은 IL2 또는 IL2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 추가적인 사이토카인 또는 추가적인 사이토카인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일 구현예에서, 추가적인 사이토카인은 IL7 및 IL21로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 의학적 조제물은 IL2 또는 IL2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 IL7 또는 IL7을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일 구현예에서, 의학적 조제물은 IL2 또는 IL2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 IL21 또는 IL21을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일 구현예에서, IL2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 RNA이고, 선택적으로 추가적인 사이토카인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 RNA이다.
일 구현예에서, 의학적 조제물은 항원 또는 이의 변이체, 또는 항원 또는 변이체의 암호화 폴리뉴클레오티드를 더 포함하며, 여기서 CAR을 발현하도록 유전자 변형된 T 세포는 그 항원을 표적화한다. 일 구현예에서, 항원 또는 변이체의 암호화 폴리뉴클레오티드는 RNA이다.
일 구현예에서, 의학적 조제물은 키트이다.
일 구현예에서, 의학적 조제물은 CAR을 발현하도록 유전자 변형된 T 세포, IL2 또는 IL2 암호화 폴리뉴클레오티드, 선택적으로 추가적인 사이토카인 또는 추가적인 사이토카인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 선택적으로 항원 또는 이의 변이체, 또는 항원 또는 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를, 분리된 개별 용기에 포함한다.
일 구현예에서, 의학적 조제물은 종양-관련 항원을 가진 암을 치료 또는 예방하기 위한 의학적 조제물의 사용 설명서를 더 포함한다.
일 구현예에서, 의학적 조제물은 약학적 조성물이다.
일 구현예에서, 약학적 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제를 더 포함한다.
일 측면에서, 본 발명은 하기를 포함하는 의학적 조제물을 제공한다:
a. 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 유전자 변형된 T 세포; 및
b. IL2를 암호화하는 RNA.
일 구현예에서, 의학적 조제물은 IL2를 암호화하는 RNA, 및 추가적인 사이토카인을 암호화하는 RNA를 포함한다. 일 구현예에서, 추가적인 사이토카인은 IL7 및 IL21로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 의학적 조제물은 IL2를 암호화하는 RNA, 및 IL7을 암호화하는 RNA를 포함한다. 일 구현예에서, 의학적 조제물은 IL2를 암호화하는 RNA, 및 IL21을 암호화하는 RNA를 포함한다.
일 구현예에서, 의학적 조제물은 항원 또는 이의 변이체를 암호화하는 RNA를 더 포함하며, CAR을 발현하도록 유전자 변형된 T 세포는 그 항원을 표적화한다.
일 구현예에서, 의학적 조제물은 키트이다.
일 구현예에서, 의학적 조제물은 CAR을 발현하도록 유전자 변형된 T 세포, IL2를 암호화하는 RNA, 선택적으로 추가적인 사이토카인을 암호화하는 RNA, 및 선택적으로 항원 또는 이의 변이체를 암호화하는 RNA를 분리된 개별 용기에 포함한다.
일 구현예에서, 의학적 조제물은 종양-관련 항원을 가진 암을 치료 또는 예방하기 위한 의학적 조제물의 사용 설명서를 더 포함한다.
일 구현예에서, 의학적 조제물은 약학적 조성물이다.
일 구현예에서, 약학적 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제를 더 포함한다.
전체 측면들에 대한 일 구현예에서, IL2는 약동학 (PK)적으로 연장된 IL2이다. 일 구현예에서, 약동학 (PK)적으로 연장된 IL2는 융합 단백질을 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 IL2 모이어티와, 혈청 알부민, 면역글로불린 단편, 트랜스페린, Fn3 및 이들의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 모이어티를 포함한다.
전체 측면들에 대한 일 구현예에서, 추가적인 사이토카인은 약동학 (PK)적으로 연장된 사이토카인이다. 일 구현예에서, 약동학 (PK)적으로 연장된 사이토카인은 융합 단백질을 포함한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 사이토카인 모이어티, 및 혈청 알부민, 면역글로불린 단편, 트랜스페린, Fn3 및 이들의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 모이어티를 포함한다.
일 구현예에서, 혈청 알부민은 마우스 혈청 알부민 또는 인간 혈청 알부민을 포함한다.
일 구현예에서, 면역글로불린 단편은 면역글로불린 Fc 도메인을 포함한다.
일 측면에서, 본 발명은 약학적 용도를 위한 본원에 기술된 의학적 조제물을 제공한다. 일 구현예에서, 약학적 용도는 질환 또는 장애에 대한 치료학적 또는 예방학적 치료를 포함한다.
일 측면에서, 본 발명은 개체에서 암을 치료 또는 예방하는 방법에 사용하기 위한 본원에 기술된, 항원이 종양-관련 항원인, 의학적 조제물을 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 방법으로 사용하기 위한 본원에 기술된 물질 및 조성물을 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 방법으로 사용하기 위한, 항원을 표적화하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 유전자 변형된 T 세포를 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 방법에 사용하기 위한 IL2 또는 IL2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 방법에 사용하기 위한 IL7 또는 IL21 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 등의 IL2 이외의 다른 사이토카인을 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 방법에 사용하기 위한 항원 또는 이의 변이체 또는 항원 또는 이의 변이체를 암호화하는 핵산을 제공한다.
의학적 조제물에 대한 일 구현예에서, RNA는 액체 형태, 고체 형태 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 형태로 존재한다. 일 구현예에서, 고체 형태는 냉동된 형태 또는 건조된 형태이다. 일 구현예에서, 건조된 형태는 냉동-건조되거나 또는 분무-건조된 형태이다.
일 구현예에서, 본원에 기술된 암은 흑색종, 백혈병, 림프종, 폐암, 유방 암, 전립선 암, 난소암, 대장암, 중피종, 신장 세포 암종 및 뇌암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
도 1: mAlb - mIL -2 및 mIL -7- mAlb는 사전- 컨디셔닝화된 마우스에서 유전자 조작된 CAR T 세포의 인 시추 항원-특이적인 반복 증폭을 생체내에서 강화한다. (A) 2.5 Gy 조사 처리된 (XRAD320) C57BL/6BrdCrHsd-Tyr c 마우스 (n = 2-3/군)에, CLDN6-CAR-BBz-Luc-GFP 형질도입된 CC557Bl/6-Thy1.1+ T 세포 5　x　106개를 i.v. 생착시켰다. 1일 후, 마우스에 hCLDN6 또는 OvaI (대조군 RNA)를 암호화하는 mRNA 리포플렉스를 백신 접종 (20 ㎍, i.v.)한 다음 mAlb-mIL-2 및 mIL-7-mAlb를 암호화하는 뉴클레오시드-변형된-RNA 제형 (1 ㎍/ mRNA/ 마우스)을 i.p. 투여하였다. 완충제는 모의 대조군으로 사용하였다. 추가로 7일 후, 치료를 반복 실시하였다. 생발광 영상 촬영 (BLI)을 수행하여, ACT 후 1일 (베이스라인)에서 최대 15일까지 증폭 및 존속성을 모니터링하였다. (B) 입양 전달된 뮤라인 CAR 형질도입된 T 세포의 전이유전자 발현. 세포를 CD8 및 CD4에 대한 형광단-접합 항체 및 CLDN6-CAR의 scFv 부분에 대한 이디오타입-특이 항체 (anti-IMAB206)로 염색하고, 유세포 측정에 의해 분석하였다. 좌측, 세포를 단일 림프구에 대해 게이팅하고; 우측, 세포를 CD8+ T 세포에 대해 게이팅하였다. (C) ACT 및 알부민-사이토카인을 암호화하는 mRNA와 조합하여 항원 RNA(LIP)를 지정된 바와 같이 투여한 후 다양한 시간대에 측위 자세로 촬영한 마우스의 생발광 사진. 오프-컬러 이미지는 회색톤 참조 사진 위에 중첩시킨 빛의 세기 (검정, 최소 강도; 백색에서 진회색, 가장 강함)를 보여준다. (D) 1일 베이스라인 대비, ACT 후 4일 및 11일에 총 플럭스를 계산한 증폭 지수 (expansion index)(평균 ± s.d.); ACT: 입양 T 세포 전달, TBI: 전신 조사, BLI: 생발광 사진, Luc: 유효한 반딧불이 루시퍼라제, mAlb: 뮤라인 혈청 알부민, mIL-2: 뮤라인 인터루킨-2, mIL-7: 뮤라인 인터루킨-7.
도 2: mAlb - mIL -2 및 mIL -7- mAlb는 면역적격 마우스에서도 항원-특이적으로 증폭된 CAR T 세포의 존속성을 생체내에서 연장한다. (A) 조사 처리되지 않은 C57BL/6BrdCrHsd-Tyr c 마우스 (n = 2-3/군)에 CAR-형질도입된 T 세포를 동일 용량으로 투여하고, 도 1A-B에 기술된 바와 같이 처리하였다. (B) ACT 및 알부민-사이토카인을 암호화하는 mRNA와 조합하여 항원 RNA(LIP)를 지정된 바와 같이 투여한 후 다양한 시간대에 측위 자세로 촬영한 마우스의 생발광 사진. 오프-컬러 이미지는 회색톤 참조 사진 위에 중첩시킨 빛의 세기 (검정, 최소 강도; 백색에서 진회색, 가장 강함)를 보여준다. (C) 1일 베이스라인 대비, ACT 후 4일 및 11일째에 총 플럭스를 계산한 증폭 지수 (평균 ± s.d.); ACT: 입양 T 세포 전달, BLI: 생발광 이미지, Luc: 유효한 반딧불이 루시퍼라제, mAlb: 뮤라인 혈청 알부민, mIL-2: 뮤라인 인터루킨-2, mIL-7: 뮤라인 인터루킨-7.
도 3: mAlb - mIL -2의 존재는 mIL -7- mAlb 또는 mIL -21- mAlb와 조합하여 인 시추 항원-특이적인 반복 증폭을 강화하고, 유전자 조작된 CAR T 세포의 존속성을 생체내에서 연장한다. (A) 2.5 Gy 조사 처리된 C57BL/6BrdCrHsd-Tyr c 마우스 (n = 2-3/군)에, 동일 용량의 CAR-형질도입된 T 세포와 hCLDN6 또는 OvaI (대조군 RNA)를 암호화하는 mRNA 리포플렉스 백신을, 도 1A에 기술된 바와 같이, 여러가지 뉴클레오시드-변형된-사이토카인 제형 (1 ㎍/ 사용된 개별 mRNA/ 마우스)과 조합하여 투여하였다. (B) 치료한 마우스의 상대적인 생발광 증가를 정량하고, 3번의 백신 접종 중에 계산하였다 (촬영은 일반적으로 지정된 항원-RNA(LIP) 및 사이토카인 RNA 투여 회차 후 2-3일에 수행함). 증폭 지수를 다음과 같이 계산하였다: 각 증폭 회차의 총 플럭스 [p/s] / ACT 후 1일째 베이스라인의 총 플럭스 [p/s] (평균 ± s.e.m.). (C-D) 지정된 뉴클레오시드-변형된-사이토카인 RNA 제형의 존재 하에 CLDN6-RNA(LIP)을 이용한 증폭 회차 수행 중 및 수행 후 생발광성 측정 (평균 +/- s.e.m.). 화살표는 hCLDN6 RNA(LIP) 백신 접종 및 뉴클레오시드-변형된-사이토키인 (리보사이토카인) 제형의 투여를 표시한다. ACT: 입양 T 세포 전달, TBI: 전신 조사, BLI: 생발광 사진, Luc: 유효한 반딧불이 루시퍼라제, mAlb: 뮤라인 혈청 알부민, mIL-2: 뮤라인 인터루킨-2, mIL-7: 뮤라인 인터루킨-7.
본 발명은 아래에서 상세히 기술되지만, 본원에 언급된 구체적인 방법, 프로토콜 및 시약은 변경 가능하므로, 본원의 내용은 이들로 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본원에서 사용되는 용어들은 특정 구현예를 설명하기 위한 목적일 뿐, 첨부된 청구항으로만 한정되는 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아닌 것으로 이해되어야 한다. 달리 정의되지 않은 한, 본원에서 이용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어들은 당해 기술 분야의 당업자들에게 통상적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 가진다.
바람직하게는, 본원에서 사용되는 용어들은 "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Kolbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland, (1995)에 기술된 바와 같이 정의된다.
본 발명을 실시함에 있어, 달리 지적되지 않은 한, 본 기술 분야의 문헌에 언급된 화학, 생화학, 세포 생물학, 면역학 및 재조합 DNA 기법에 대한 통상적인 방법들이 채택될 것이다 (예, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989 참조).
이하, 본 발명의 요소들이 기술될 것이다. 이들 요소는 구체적인 구현예를 들어 언급하지만, 이들 구현예들은 임의의 방식 및 임의의 수로 조합하여, 부가적인 구현예들을 형성할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 다양하게 기술된 예 및 구현예들은 본 발명을 명시적으로 기술된 구현예들로만 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 이러한 설명은 명시적으로 기술된 구현예들을 개시된 임의 개수의 인자들과 조합된 구현예들을 개시하고 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 기술된 모든 요소들에 대한 순열 및 조합 역시 문맥상 달리 지시되지 않은 한 본 명세서에 의해 개시된 것으로 간주되어야 한다.
용어 "약"은 대략적으로 또는 거의를 의미하며, 본 발명에 기술된 수치 값 또는 범위의 맥락에서, 일 구현예에서, 언급외거나 또는 청구된 수치 값 또는 범위에서의 ±20%, ±10%, ±5% 또는 ±3%를 의미한다.
본원의 내용을 기술하는 맥락에서 (특히 청구항의 맥락에서) 사용되는 용어 정관사 및 부정관사 ("a" 및 "an" 및 "the") 및 비슷한 표현은, 본원에서 달리 명시되지 않거나 또는 문맥상 명확하게 상충되지 않은 한, 단수 및 복수의 의미를 모두 포괄하는 것으로 해석되어야 한다. 본 발명에서 수치 값들에 대한 범위 언급은 주로 범위에 속하는 각각의 개별 값들을 각각 기술하는 약칭적인 방식인 것으로 의도된다. 본원에서 달리 언급되지 않은 한, 각각의 개별 값은 본원에 각각 언급된 것과 같이 명세서에 포함된다. 본 발명에 기술된 모든 방법들은, 본원에서 달리 언급되지 않거나 또는 문맥상 명확하게 상충되지 않은 한, 임의의 적절한 순서로 수행할 수 있다. 본원에 제공되는 임의의 모든 예, 또는 예시적인 표현 (예, "와 같은")의 사용은 주로 개시 내용을 잘 예시하기 위한 것일 뿐, 청구항의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다. 명세서에서 어떤 표현도 개시 내용을 실시하는데 필수적인 임의의 청구되지 않은 요소들을 기술하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
명확하게 달리 명시되지 않은 한, 용어 "포함하는"은 본 발명의 맥락에서 사용되어, "포함하는"에 의해 나열된 목록의 구성원들과 더불어 추가적인 구성원들이 선택적으로 존재할 수 있다는 것을 의미한다. 그러나, 본 발명의 구체적인 구현예로서, 용어 "포함하는"은 추가적인 구성원들이 존재하지 않을 가능성도 내포하는 것으로 간주되며, 즉 이러한 구현예의 경우 "포함하는"은 "로 이루어진"의 의미로 이해되어야 한다.
본 명세서 전체에 걸쳐 몇가지 문헌들이 인용된다. 본원에 인용된 전술한 또는 후술한 각각의 문헌 (모든 특허, 특허 출원, 과학 간행물, 제조사의 명세서, 설명서 등)은, 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 본원에서 어떠한 것도 본원이 이러한 내용을 선행할 자격이 없다는 인정으로서 해석되어서는 안된다.
이하, 본 발명의 모든 측면들에 적용될 정의들이 제공될 것이다. 후술한 용어들은 달리 언급되지 않은 한 후술한 의미를 가진다. 정의되지 않은 임의의 용어들은 당해 기술 분야에서 인정되는 의미를 가진다.
본 발명의 내용에서, 용어 "펩타이드"는 올리고펩타이드 및 폴리펩타이드를 포함하며, 펩타이드 결합으로 서로 연결된 연속적인 아미노산을 약 2개 이상, 약 3개 이상, 약 4개 이상, 약 6개 이상, 약 8개 이상, 약 10개 이상, 약 13개 이상, 약 16개 이상, 약 20개 이상에서 최대 약 50개, 약 100개 또는 약 150개 포함하는 물질을 지칭한다. 용어 "단백질" 또는 "폴리펩타이드"는 큰 펩타이드, 특히 아미노산 약 151개 이상으로 된 펩타이드를 지칭하지만, 용어 "펩타이드", "단백질" 및 "폴리펩타이드"는 본원에서 통상적으로 동의어로 사용된다.
"치료학적 단백질"은 개체에게 치료학적 유효량으로 제공되었을 때 개체의 병태 또는 질환 상태에 대해 긍정적인 또는 유익한 효과를 발휘한다. 일 구현예에서, 치료학적 단백질은 치유적 (curative) 또는 고식적 (palliative) 특성을 가지며, 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상의 개선, 완화, 경감, 역전, 발병 지연 또는 중증도 약화를 달성하기 위해 투여할 수 있다. 치료학적 단백질은 예방학적 특성을 가지며, 질환의 개시를 지연하거나 또는 이러한 질환 또는 병리학적 병태의 중증도를 약화하기 위해 사용할 수 있다. 용어 "치료학적 단백질"은 단백질 또는 펩타이드 전체를 포함하며, 또한 이의 치료학적 활성 단편을 지칭할 수도 있다. 또한, 단백질의 치료학적 활성 변이체도 포함할 수 있다. 치료학적 활성 단백질의 예로는, 비-제한적으로, 사이토카인 등이 있다.
아미노산 서열 (펩타이드 또는 단백질)과 관련하여, "단편"은 아미노산 서열의 일부를 의미하며, 즉 N-말단 및/또는 C-말단에서 절단된 아미노산 서열을 의미한다. C-말단에서 절단된 단편 (N-말단 단편)은, 예를 들어, 오픈 리딩 프래임의 3'-말단이 결핍된 절단형 (truncated) 오픈 리딩 프래임을 번역함으로써, 수득가능하다. N-말단에서 절단된 단편 (C-말단 단편)은, 절단형 오픈 리딩 프래임이 번역 개시에 이용되는 개시 코돈을 포함하는 한, 예를 들어, 오픈 리딩 프래임의 5'-말단이 결핍된 절단형 오픈 리딩 프래임을 번역함으로써, 수득가능하다. 아미노산 서열의 단편은, 예를 들어, 아미노산 서열의 아미노산 잔기들 중 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%를 포함한다. 아미노산 서열의 단편은, 바람직하게는, 아미노산 서열로부터 유래되는 연속적인 아미노산을 적어도 6개, 특히 적어도 8개, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 50개 또는 적어도 100개 포함한다.
본 발명의 목적에서, 아미노산 서열 (펩타이드 또는 단백질)의 "변이체"는 아미노산 삽입 변이체, 아미노산 부가 변이체, 아미노산 결손 변이체 및/또는 아미노산 치환 변이체를 포함한다. 용어 "변이체"는 특히 아미노산 서열의 단편을 포함한다.
아미노산 삽입 변이체는 특정 아미노산 서열에 하나 또는 2 이상의 아미노산이 삽입된 것을 포함한다. 삽입이 존재하는 아미노산 서열의 경우, 수득되는 산물에 대한 적절한 스크리닝을 이용한 무작위 삽입도 가능하지만, 아미노산 서열의 특정 부위에 하나 이상의 아미노산 잔기가 삽입된다. 아미노산 부가 변이체는 하나 이상의 아미노산, 예를 들어 아미노산 1개, 2개, 3개, 5개, 10개, 20개, 30개, 50개 또는 그보다 많은 수로 된 아미노- 및/또는 카르복시-말단 융합체를 포함한다. 아미노산 결손 변이체는 서열에서 하나 이상의 아미노산의 제거, 예를 들어 아미노산 1개, 2개, 3개, 5개, 10개, 20개, 30개, 50개 또는 그 이상의 제거를 특징으로 한다. 결손은 단백질의 임의 위치에 존재할 수 있다. 단백질의 N-말단 및/또는 C-말단에 결손을 포함하는 아미노산 결손 변이체는 N-말단 및/또는 C-말단 절단형 변이체 (truncation variant)로도 지칭된다. 아미노산 치환 변이체는 서열에서 잔기 하나 이상이 제거되고 그 위치에 다른 잔기가 삽입된 것을 특징으로 한다. 상동적인 단백질들 또는 펩타이드들 간의 비-보존된 아미노산 서열 위치에 변형이 존재하거나, 및/또는 아미노산을 유사한 특성의 다른 아미노산으로 치환하는 것이 선호된다. 바람직하게는, 펩타이드 및 단백질 변이체에서 아미노산 변화는 보존적인 아미노산 변화, 즉 유사하게 하전 또는 비-하전된 아미노산의 치환이다. 보존적인 아미노산 변화는 측쇄가 비슷한 아미노산 계열에 속하는 하나로 치환하는 것을 수반한다. 자연 생성 아미노산은 일반적으로 4가지 계열로 나뉜다: 산성 아미노산 (아스파르테이트, 글루타메이트), 염기성 아미노산 (라이신, 아르기닌, 히스티딘), 비-극성 아미노산 (알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 및 비-하전된 극성 아미노산 (글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신). 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신은 때때로 방향족 아미노산으로서 함께 분류된다.
바람직하게는, 주어진 아미노산 서열과 주어진 아미노산 서열의 변이체의 아미노산 서열 간의 유사성, 바람직하게는 동일성 정도는, 적어도 약 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%일 것이다. 유사성 또는 동일성 정도는 바람직하게는 참조 아미노산 서열의 전장에 대해 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 약 100%의 아미노산 영역에 대해 제공된다. 예를 들어, 참조 아미노산 서열이 아미노산 200개로 구성된다면, 유사성 또는 동일성 정도는 바람직하게는 아미노산, 바람직하게는 연속적인 아미노산 적어도 약 20개, 적어도 약 40개, 적어도 약 60개, 적어도 약 80개, 적어도 약 100개, 적어도 약 120개, 적어도 약 140개, 적어도 약 160개, 적어도 약 180개 또는 약 200개들에 대해 제공된다. 바람직한 구현예에서, 유사성 또는 동일성 정도는 참조 아미노산 서열의 전장에 대해 제공된다. 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은 당해 기술 분야에 공지된 도구를 사용해, 바람직하게는 최상의 서열 정렬, 예를 들어, Align을 사용해, 표준 설정 조건으로, 바람직하게는 EMBOSS::needle, 매트릭스: Blosum62, 갭 오픈 (Gap Open) 10.0, 갭 연장 (Gap Extend) 0.5 하에 수행할 수 있다.
"서열 유사성"은 보존적인 아미노산 치환이거나 또는 동일한 아미노산의 %를 나타낸다. 아미노산 서열 2종 간의 "서열 동일성"은 서열 간에 동일한 아미노산의 %를 나타낸다.
용어 "동일성 %"는 최상으로 정렬하여 수득되는, 비교 서열 2종 간에 동일한 아미노산 잔기의 %를 나타내는 것으로 의도되며, 이 %는 순전히 통계이며, 서열 2종 간의 차이는 전장에 걸쳐 무작위로 분포한다. 아미노산 서열 2종 간의 서열 비교는 통상적으로 이들 서열을 최적으로 정렬한 후 비교함으로써 수행되며, 이러한 비교는 국소 서열 유사성 영역을 식별 및 비교하기 위해 세그먼트 또는 "비교 창"에 의해 수행된다. 서열을 비교하기 위한 최적 정렬은 수동 외에도 Smith and Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482의 국소 상동성 알고리즘을 이용하거나, Neddleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443의 국소 상동성 알고리즘을 이용하거나, Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444의 유사성 검색 방법을 이용하거나, 또는 이들 알고리즘을 사용하는 컴퓨터 프로그램 (위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지의 GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N 및 TFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.)을 이용하여, 생성할 수 있다.
동일성 %는 서열 2종 간의 동일성 %를 구하기 위해 비교 중인 서열 2종 간에 동일한 위치의 수를 측정한 다음 이를 비교한 위치의 수로 나눈 후 그 결과에 100을 곱하여 계산한다.
상동적인 아미노산 서열은 본원에 따르면 아미노산 잔기들에 대해 적어도 40%, 특히 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 나타낸다.
본 발명에 기술된 아미노산 서열 변이체는 당해 기술 분야의 당업자에 의해, 예를 들어, 재조합 DNA 조작에 의해 쉽게 제조할 수 있다. 치환, 부가, 삽입 또는 결손을 가진 펩타이드 또는 단백질을 제조하기 위한 DNA 서열의 조작 방법은, 예를 들어 Sambrook et al. (1989)에 상세하게 기술되어 있다. 또한, 본 발명에 기술된 펩타이드 및 아미노산 변이체는, 예를 들어 고상 합성 및 유사 방법과 같이, 공지된 펩타이드 합성 기법을 보조로 사용해, 쉽게 제조할 수 있다.
일 구현예에서, 아미노산 서열 (펩타이드 또는 단백질)의 단편 또는 변이체는 바람직하게는 "기능성 단편" 또는 "기능성 변이체"이다. 아미노산 서열의 "기능성 단편" 또는 "기능성 변이체"라는 용어는 이것이 유래되는 아미노산 서열과 동일한 또는 비슷한 한가지 이상의 기능적 특성을 발휘하는 임의의 단편 또는 변이체를 의미하며, 즉 기능적 등가체이다. 사이토카인과 관련하여, 구체적인 한가지 기능은 단편 또는 변이체가 유래된 아미노산 서열에 의해 발휘되는 하나 이상의 면역조절 활성 및/또는 단편 또는 변이체가 유래된 아미노산 서열이 결합하는 수용체(들)에의 결합이다.
지정된 아미노산 서열 (펩타이드 또는 단백질)"로부터 유래되는" 아미노산 서열 (펩타이드 또는 단백질)은 제1 아미노산 서열의 기원을 참조한다. 바람직하게는, 특정 아미노산 서열로부터 유래된 아미노산 서열은 이 특정 서열 또는 이의 단편과 동일한, 본질적으로 동일한 또는 상동적인 아미노산 서열을 가진다. 특정 아미노산 서열로부터 유래된 아미노산 서열은 이 특정 서열 또는 이의 단편의 변이체일 수 있다. 예를 들어, 당해 기술 분야의 당업자라면, 본원에서 사용하기 적합한 항원 및 사이토카인 (예를 들어, IL2, IL7 또는 IL21)은, 천연 서열의 원하는 활성은 유지하면서 이것이 유래된 자연 생성 서열 또는 천연 서열과 서열상 다르게 변형될 수 있음을, 알 것이다.
T 세포
T 세포는 림프구로 알려진 백혈구 세포의 일군에 속하는 세포로서, 세포-매개 면역에 중추적인 역할을 담당한다. T 세포는 T 세포 수용체 (TCR)로 지칭되는 세포 표면 상의 특수 수용체의 존재에 의해 B 세포 및 자연 살상 세포와 같은 다른 림프구 유형과 구별될 수 있다. 흉선은 T 세포의 성숙을 담당하는 기본 장기이다. 각각 구분되는 기능을 가진, T 세포의 몇가지 다양한 아종들이 발굴되었다.
T 세포의 대부분이 수종의 단백질로 된 복합체로서 존재하는 T 세포 수용체 (TCR)를 가지고 있다. 실제 T 세포 수용체는, 독립적인 T 세포 수용체 α 및 β (TCRα 및 TCRβ) 유전자로부터 만들어지는 구분되는 펩타이드 쇄 2개로 구성되며, α-TCR 쇄 및 β-TCR 쇄로 지칭된다. γδ T 세포 (감마 델타 T 세포)는 표면에 구분되는 T 세포 수용체 (TCR)를 가진 T 세포의 소규모 아종을 나타낸다. 그러나, γδ T 세포에서, TCR은 γ-쇄 하나와 δ-쇄 하나로 구성된다. 이러한 T 세포 군은 αβ T 세포보다 훨씬 더 적다 (총 T 세포의 2%).
모든 T 세포는 골수에서 조혈 줄기 세포로부터 기원한다. 조혈 줄기 세포로부터 유래되는 조혈 전구세포는 흉선에 머무르며, 세포 분열을 통해 증폭해 미성숙 흉선세포 집단을 대규모로 생산한다. 최초기 흉선세포는 CD4도 CD8도 발현하지 않으며, 이중-음성 (CD4-CD8-) 세포로 분류된다. 이는 발달을 통해 진화되어, 이중-양성 흉선세포 (CD4+CD8+)가 되며, 최종적으로 단일-양성 (CD4+CD8- 또는 CD4-CD8+) 흉선세포로 성숙화된 후 흉선에서 말초 조직으로 방출된다.
용어 "T 세포" 및 "T 림프구"는 본원에서 상호 호환적으로 사용되며, T 헬퍼 세포 (CD4+ T 세포) 및 세포용해성 T 세포를 포함한 세포독성 T 세포 (CTL, CD8+ T 세포)를 포함한다. 용어 "항원-특이 T 세포" 또는 유사 용어는, 특히 항원 제시 세포 또는 암 세포와 같은 질병에 걸린 세포의 표면에 존재하고 바람직하게는 T 세포의 작동자 기능을 발휘하는 경우에, T 세포가 표적으로 하는 항원을 인지하는 T 세포를 의미한다. T 세포는, 세포가 항원을 발현하는 표적 세포를 살상한다면, 항원에 특이적인 것으로 간주된다. T 세포는 다양한 임의의 표준 기법으로, 예를 들어 크로뮴 방출 분석 또는 증식 분석으로 평가할 수 있다. 대안적으로, 림포카인 (예, 인터페론-γ)의 합성을 측정할 수 있다.
T 헬퍼 세포는 B 세포에서 형질세포로의 성숙화, 그리고 다른 기능들 중에서도 세포독성 T 세포 및 대식세포의 활성화를 비롯하여, 면역학적 과정에서 다른 백혈구 세포를 보조한다. 이들 세포는 또한 표면에 CD4 단백질을 발현하므로, CD4+ T 세포로도 알려져 있다. 헬퍼 T 세포는 항원 제시 세포 (APC)의 표면에 발현된 MHC 클래스 II 분자에 의해 펩타이드 항원이 제시되었을 때 활성화된다. 일단 활성화되면, 빠르게 분열하여, 활성 면역 반응을 제어 또는 보조하는 사이토카인으로 지칭되는 소형 단백질들을 분비한다.
세포독성 T 세포는 바이러스 감염된 세포 및 종양 세포를 파괴하며, 이식 거부 반응과 연루되어 있다. 이들 세포는 표면에 CD8 당단백질을 발현하므로, CD8+ T 세포로도 알려져 있다. 이들 세포는 신체 거의 모든 세포의 표면 상에 존재하는 MHC 클래스 I에 조합된 항원에 결합함으로써 표적을 인지한다.
T 세포 매개 작동자 기능은, 헬퍼 T 세포 (CD4+ T 세포)의 경우, 사이토카인 방출 및/또는 CD8+ 림프구 (CTL) 및/또는 B-세포의 활성화를 포함하고, CTL의 경우에는, 세포, 즉 예를 들어 세포자살 또는 퍼포린-매개 세포 용해를 통한 항원의 발현을 특징으로 하는 세포의 제거, IFN-γ 및 TNF-α와 같은 사이토카인의 생산 및 항원을 발현하는 표적 세포의 특이적인 세포용해성 살상을 포함한다.
본 발명에서, 용어 "T 세포"는 또한 적절한 자극으로 T 세포로 성숙될 수 있는 세포를 포함한다.
T 세포는 일반적으로 표준 공정을 이용해 시험관내 또는 생체외에서 구축할 수 있다. 예를 들어, T 세포는 환자와 같은 포유류의 골수, 말초혈 또는 포유류의 골수 또는 말초혈의 분획으로부터, 상업적으로 이용가능한 세포 분리 시스템을 사용해 분리할 수 있다. 대안적으로, T 세포는 인척 인간 또는 비-인척 인간, 비-인간 동물, 세포주 또는 배양물로부터 유래할 수 있다. T 세포를 포함하는 샘플은 예를 들어, 말초혈 단핵 세포 (PBMC)일 수 있다.
본 발명에 따라 사용되는 T 세포는 내인성 T 세포 수용체를 발현하거나, 또는 내인성 T 세포 수용체의 발현이 결여될 수 있다.
CAR
CAR을 암호화하는 RNA와 같은 핵산은 T 세포 또는 세포용해 잠재성을 가진 다른 세포, 특히 림프계 세포에 도입할 수 있다.
본원에 따라, CAR은, T 세포 상에 존재할 경우, 항원 제시 세포 또는 암 세포와 같이 질병에 걸린 세포의 표면에서와 같이 항원을 인지하여, T 세포는 자극, 감작 및/또는 증폭되거나 또는 전술한 바와 같이 작동자 기능을 발휘하게 된다.
본 발명에 따라, 용어 "키메라 항원 수용체 (CAR)"는 용어 "키메라 T 세포 수용체" 및 "인공 T 세포 수용체"와 동의어이다.
바람직하게는, CAR은 세포의 표면 상에서 발현된다.
본 발명에서, 용어 "CAR" (또는 "키메라 항원 수용체")은 암 세포와 같은 표적 세포 상에서 표적 구조 (예, 항원)를 (예를 들어, 표적 세포의 표면 상에 발현된 항원에 항원 결합 도메인이 결합함으로써) 인지, 즉 결합하여, 세포 표면 상에 CAR을 발현하는 T 세포와 같은 면역 작동자 세포에 대해 특이성을 부여할 수 있는, 단일 분자 또는 분자 복합체를 포함하는, 인공 수용체를 의미한다. 이러한 세포는 표적 세포를 인지하기 위한 항원의 가공 및 제시가 반드시 필요한 것은 아니나, 바람직하게는 표적 세포 상에 제시된 임의의 항원을 바람직하게는 특이적으로 인지할 수 있다. 바람직하게는, CAR에 의한 표적 구조의 인지시, CAR을 발현하는 면역 작동자 세포가 활성화된다. CAR은 본원에 기술된 바와 같이 하나 이상의 도메인을 포함하는 하나 이상의 단백질 단위를 포함할 수 있다. 용어 "CAR"은 T 세포 수용체를 포함하지 않는다.
본 발명에서, CAR은 일반적으로 수개의 도메인을 포함할 수 있다. 본 발명의 전체 측면들에 대한 일 구현예에서, CAR은 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 T 세포 신호전달 도메인을 포함한다.
결합 도메인은 항원을 인지하여 결합한다. 일 구현예에서, 단일클론 항체로부터 유래되는 단쇄 가변성 단편 (scFv)을 결합 도메인으로 이용한다. 또한 이용가능한 항원 인지 도메인은, 특히 T 세포 수용체 (TCR) α 및 β 단쇄를 포함한다. 실제, 고 친화성으로 소정의 표적에 결합하는 거의 모든 것들을 항원 인지 도메인으로 이용할 수 있다. 본 발명의 전체 측면들에 대한 일 구현예에서, CAR은 항원 결합 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 항원 결합 도메인은 CAR의 엑소도메인에 의해 구성된다. 일 구현예에서, 항원 결합 도메인은 항원에 대한 항체의 단쇄 가변성 단편 (scFv)을 포함한다. 일 구현예에서, 항원 결합 도메인은 항원 (VH(항원))에 대해 특이성을 가진 면역글로불린 (VH) 중쇄의 가변부와, 항원 (VL(항원))에 대해 특이성을 가진 면역글로불린 (VL) 경쇄의 가변부를 포함한다. 일 구현예에서, 중쇄 가변부 (VH) 및 대응되는 경쇄 가변부 (VL)는 펩타이드 링커를 통해, 바람직하게는 아미노산 서열 (GGGGS)3를 포함하는 펩타이드 링커를 통해 연결된다.
본 발명의 전체 측면들에 대한 일 구현예에서, CAR은 막관통 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 막관통 도메인은 막에 걸쳐 있는 소수성 α 나선이다. 일 구현예에서, 막관통 도메인은 CD28 막관통 도메인 또는 이의 단편을 포함한다.
활성화 신호전달 도메인 (또는 T 세포 신호전달 도메인)은, CAR에 항원 결합시, 세포독성 림프구를 활성화하도록 작용한다. 활성화 신호전달 도메인은, CAR에 의한 항원 결합시 선택된 세포독성 림프구의 활성화를 유발할 수 있는 능력을 가지고 있다는 점으로만 한정된다. 적합한 활성화 신호전달 도메인은 T 세포 CD3[zeta] 쇄 및 Fc 수용체 [gamma]를 포함한다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 이들 언급된 활성화 신호전달 도메인의 서열 변이체가, 변이체를 모델링하는 도메인과 동일한 또는 유사한 활성을 가지는 경우에, 본 발명에 부정적으로 영향을 미치지 않으면서 사용할 수 있음을 알 것이다. 이러한 변이체는 기원이 되는 도메인의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80%의 서열 동일성을 가질 것이다.
일 구현예에서, T 세포 신호전달 도메인은 세포내에 위치한다. 일 구현예에서, T 세포 신호전달 도메인은 CD3-zeta, 바람직하게는 CD3-zeta의 엔도도메인을, 선택적으로, CD28과 조합하여 포함한다.
존재할 수 있는 추가의 도메인은 공동-자극 도메인이다. 공동-자극 도메인은 CAR에 표적 모이어티가 결합하면 세포독성 림프구의 증폭 및 생존을 강화하도록 기능한다. 공동-자극 도메인은 CAR에 표적 모이어티가 결합되면 세포 증폭 및 생존을 강화하는 능력을 가진다는 점으로만 제한된다. 적합한 공동-자극 도메인으로는 CD28, CD137 (4-1BB), 종양 괴사 인자 (TNF) 수용체 패밀리의 구성원, CD134 (OX40), 수용체의 TNFR-슈퍼패밀리의 구성원, 및 CD278 (ICOS), 활성화된 T 세포 상에 발현된 CD28-슈퍼패밀리 공동-자극 분자를 포함한다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 이들 언급된 공동-자극 도메인의 서열 변이체들이, 변이체를 모델링한 도메인과 동일한 또는 유사한 활성을 가지는 경우에 본 발명에 부정적인 영향을 미치지 않으면서 이용할 수 있음을 알 것이다. 이러한 변이체는 이의 기원이 되는 도메인의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80%의 서열 동일성을 가질 것이다. 본 발명의 일부 구현예에서, CAR 구조체는 공동-자극 도메인 2개를 포함한다. 구체적인 조합은 언급된 도메인 4종에 대한 모든 가능한 변이체들을 포함하며, 구체적인 예로는 CD28+CD137 (4-1BB) 및 CD28+CD134 (OX40)를 포함한다.
본 발명의 CAR은 상기한 도메인들을 융합 단백질 형태로 함께 포함할 수 있다. 이러한 융합 단백질은 일반적으로 N-말단에서 C-말단 방향으로 연결된 결합 도메인, 하나 이상의 공동-자극 도메인 및 활성화 신호전달 도메인을 포함한다. 그러나, 본 발명의 CAR이 이러한 배열로 제한되는 것은 아니며, 다른 배열도 허용가능하며, 결합 도메인, 활성화 신호전달 도메인 및 하나 이상의 공동-자극 도메인을 포함한다. 결합 도메인은 항원에 결합하기 위해 자유로워야 하므로, 융합 단백질에서 결합 도메인의 치환은 일반적으로 세포의 외부에 이러한 영역의 나열이 달성되도록 행해지는 것으로, 이해될 것이다. 동일한 방식으로, 공동-자극 도메인 및 활성화 신호전달 도메인은 세포독성 림프구의 활성 및 증식을 유도하도록 작용하므로, 융합 단백질은 일반적으로 세포 내부에서 이들 2가지 도메인을 나열할 것이다. CAR은 융합 단백질을 세포 표면으로 적절하게 유출시키기 위한 신호 펩타이드, 융합 단백질이 내부 막 단백질로서 유지되게 하는 막관통 도메인, 및 결합 도메인에 유연성을 부여하고 항원에의 강한 결합을 허용하는 힌지 도메인 (또는 스페이서 영역)과 같은 부가적인 인자를 포함할 수 있다.
본 발명의 전체 측면들에 대한 일 구현예에서, CAR은 발생 초기 단백질이 소포체로 향하게 하는 신호 펩타이드를 포함한다. 일 구현예에서, 신호 펩타이드는 항원 결합 도메인 앞에 위치한다.
본 발명의 전체 측면들에 대한 일 구현예에서, CAR은 막관통 도메인에 항원 결합 도메인을 연결하는 스페이서 영역을 포함한다. 일 구현예에서, 스페이서 영역은 항원 결합 도메인이 항원 인지를 용이하게 하기 위해 여러 방향으로 향하게 허용한다. 일 구현예에서, 스페이서 영역은 IgG1 유래의 힌지부를 포함한다.
본 발명의 전체 측면들에 대한 일 구현예에서, CAR은 하기 구조를 포함한다:
NH2 - 신호 펩타이드 - 항원 결합 도메인 - 스페이서 영역 - 막관통 도메인 - T 세포 신호전달 도메인 - COOH.
본 발명의 전체 측면들에 대한 일 구현예에서, CAR은 바람직하게는 표적이 되는, 특히 질환에 걸린 세포 또는 항원-제시 세포와 같은 세포의 표면 상의 항원에 특이적이다.
본 발명의 전체 측면들에 대한 일 구현예에서, CAR은 T 세포, 바람직하게는 세포독성 T 세포에 의해 발현되거나 및/또는 그 표면 상에 존재할 수 있다. 일 구현예에서, T 세포는 CAR이 표적화하는 항원에 대해 반응성이다.
본 발명의 CAR 시스템에서 함께 사용될 수 있는 세포는, 바람직하게는 T 세포, 특히 세포독성 림프구, 바람직하게는 T 세포로부터 선택되는 세포 독성 림프구, 특히 세포독성 T 세포, 자연 살상 (NK) 세포, 및 림포카인-활성화된 살상 (LAK) 세포이다. 이들 세포독성 림프구는 활성화되면, 각각 표적 세포의 파괴를 촉발한다. 예를 들어, 세포독성 T 세포는 다음과 같은 수단 중 어느 하나 또는 이들에 의해 표적 세포의 파괴를 촉발한다. 첫째, 활성화되면, T 세포는 퍼포린, 그랜자임 및 그래뉼라이신 (granulysin)과 같은 세포독소를 방출한다. 퍼포린 및 그래뉼라이신은 표적 세포에 구멍을 형성하고, 그랜자임은 세포로 들어가 세포질에서 세포의 세포자살 (프로그램화된 세포 사멸)을 유발하는 카스파제 캐스케이드를 촉발한다. 둘째, 세포자살은 T 세포와 표적 세포 간의 Fas-Fas 리간드 상호작용을 통해 유도될 수 있다. 세포독성 림프구는, 이종성 세포 또는 동종이계 세포도 이용가능하지만, 바람직하게는 자가 세포일 것이다.
키메라 항원 수용체를 발현하는 T 세포를 이용한 입양 세포 전달 요법은, CAS-변형된 T 세포가 실제 임의의 종양 항원을 표적화하도록 조작될 수 있어, 기대되는 항암 치료제이다. 예를 들어, 환자의 T 세포는 환자의 종양 세포 상의 항원을 특이적으로 겨냥하는 CAR을 발현하도록 유전자 조작 (유전자 변형)될 수 있으며, 이후 환자에게로 다시 주입될 수 있다.
본 발명에서, CAR은 T 세포 수용체의 기능을 대체할 수 있으며, 특히 T 세포와 같은 세포에 세포용해 활성과 같은 반응성을 부여할 수 있다. 그러나, T 세포 수용체가 항원 펩타이드-MHC 복합체에 결합하는 것과는 대조적으로, CAR은 특히 세포 표면 상에 발현되었을 때 항원에 결합할 수 있다.
비-바이러스-매개 DNA 형질감염, 트랜스포존-매개 시스템 및 바이러스-매개 시스템을 포함한 다양한 방법들을 이용해 CAR 구조체를 T 세포 내로 도입할 수 있다. 비-바이러스-매개 DNA 형질감염은 위험성이 낮은 삽입 돌연변이 유발이다. 트랜스포존-매개 시스템은 삽입 인자를 함유하지 않은 플라스미드보다 더 효과적으로 전이유전자를 삽입시킬 수 있다. 바이러스-매개 시스템은 감마-레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터의 사용을 포함한다. 감마-레트로바이러스는 비교적 생산하기 쉽고, 효과적으로 영구적으로 T 세포를 형질도입하며, 일차 인간 T 세포에서 통합 관점에서 안전한 것으로 사전에 입증된 바 있다. 렌티바이러스 벡터는 또한 T 세포를 효율적이고 영구적으로 형질도입시키지만, 제조하기 더 비싸다. 이는 또한 레트로바이러스 매개 시스템보다 잠재적으로 더 안전하다.
본 발명의 전체 측면들에 대한 일 구현예에서, 본 방법은, T 세포 또는 T 세포 전구세포를 CAR을 암호화하는 핵산으로 생체외 또는 생체내에서 형질감염시켜, CAR을 발현하도록 유전자 변형된 T 세포를 제공하는 것을 더 포함한다.
CAR T 세포는 생체내, 따라서 거의 즉각적으로 T 세포를 표적화하는 나노입자를 이용해 생산할 수 있다. 예를 들어, T 세포 상에서 CD3에 결합하기 위해 폴리(β-아미노 에스테르)에 기반한 나노입자에 항-CD3e f(ab)를 연결시킬 수 있다. 이를 위해, 항-CD3e f(ab) 단편을 폴리글루탐산 (PGA)에 공유 결합시킬 수 있다. PGA는 핵산과 과량의 폴리(β-아미노 에스테르)(PBAE) 폴리머를 포함하는 입자 코어를 둘러싸며, 전하 상호작용을 통해 이에 부착된다. 이 나노입자는, T 세포에 결합시, 세포내 이입된다. 이의 내용물, 예를 들어, 항-종양 항원 CAR을 암호화하는 플라스미드 DNA는, PBAE 폴리머와 공유 결합된 핵 위치화 신호 (NLS) 및 미소관-관련 서열 (MTAS)을 함유한 펩타이드를 포함하고 있어, T 세포는 핵으로 향하게 될 수 있다. CAR 유전자 발현 카세트의 측면의 트랜스포존과 과잉 반응성 트랜스포자제를 암호화하는 분리된 플라스미드의 함유로, CAR 벡터를 염색체에 효과적으로 삽입시킬 수 있다. 나노입자 주입 후 CAR T 세포를 생체내 생산할 수 있는 이러한 시스템은 Smith et al. (2017) Nat. Nanotechnol. 12:813-820에 기술되어 있다.
다른 가능성은 CRISPR/Cas9 방법을 사용해 특정 유전자 좌에서 CAR 코딩 서열을 계획적으로 치환하는 것이다. 예를 들어, 기존재하는 T 세포 수용체 (TCR)는 넉아웃하고, 동시에 CAR을 넉킹하고 TCR 발현을 조정하게 될 내인성 프로모터의 동력학적 제어 조절 하에 이를 배치시킬 수 있으며; 예를 들어, Eyquem et al. (2017) Nature 543:113-117을 참조한다.
본 발명의 전체 측면들에 대한 일 구현예에서, CAR을 발현하도록 유전자 변형된 T 세포는 CAR을 암호화하는 핵산으로 안정적으로 또는 일시적으로 형질감염된다. 즉, CAR을 암호화하는 핵산은 T 세포의 게놈에 삽입되거나 또는 삽입되지 않는다.
본 발명의 전체 측면들에 대한 일 구현예에서, T 세포 또는 T 세포 전구세포는 치료할 개체로부터 유래된다. 본 발명의 전체 측면들에 대한 일 구현예에서, T 세포 또는 T 세포 전구세포는 치료할 개체와는 다른 개체로부터 유래된다.
본 발명의 전체 측면들에 대한 일 구현예에서, T 세포는 치료할 개체에 자가 (autologous)의 것이거나, 동종이계 또는 동계일 수 있다. T 세포는 항원을 표적화하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 시험관내 유전자 변형될 수 있다.
본 발명의 전체 측면들에 대한 일 구현예에서, CAR을 발현하도록 유전자 변형된 T 세포는 내인성 T 세포 수용체 및/또는 내인성 HLA를 발현시키기 위해 불활성화된다.
용어 "자가"는 어떤 것이 동일한 개체로부터 유래됨을 나타내기 위해 사용된다. 예를 들어, "자가 이식"은 동일한 개체로부터 유래된 조직 또는 장기의 이식을 의미한다. 이러한 시술은, 그렇지 않을 경우 거부 반응을 야기하는 면역학적 장벽을 극복하므로, 유리하다.
용어 "동종이계"는 어떤 것이 동일 종의 다른 개체로부터 유래됨을 나타내기 위해 사용된다. 2 이상의 개체는, 하나 이상의 유전자 좌에 위치한 유전자들이 동일하지 않을 경우, 서로에 대해 동종이계이라고 한다.
용어 "동계"는 어떤 것이 동일한 유전자형을 가진 개체 또는 조직, 즉 동일한 일란성 쌍둥이 또는 근친계 (inbred strain)의 동물 또는 이들의 조직으로부터 유래됨을 나타내기 위해 사용된다.
용어 "이종"은 어떤 것이 복수의 여러가지 인자들로 구성됨을 나타내기 위해 사용된다. 예를 들어, 한 개체의 골수를 다른 개체로 이식하는 것은 이종 이식이다. 이종의 유전자는 개체와는 다른 기원으로부터 유래되는 유전자이다.
RNA
본원에서, 용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 게놈 DNA, cDNA, mRNA, 재조합에 의해 생산된 분자 및 화학 합성된 분자와 같은 DNA 및 RNA를 포함하는 것으로 의도된다. 핵산은 단일 가닥이거나 또는 이중 가닥일 수 있다. RNA는 시험관내 전사된 RNA (IVT RNA) 또는 합성 RNA를 포함한다. 본 발명에 따라, 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 단리된다.
핵산은 벡터에 포함될 수 있다. 본원에서, 용어 "벡터"는 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 람다 파지와 같은 파지 벡터, 아데노바이러스 벡터 또는 베큘로바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터, 또는 박테리아 인공 염색체 (BAC), 효모 인공 염색체 (YAC) 또는 P1 인공 염색체 (PAC)와 같은 인공 염색체 벡터를 비롯하여, 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지된 임의 벡터를 포함한다. 이러한 벡터는 발현 벡터뿐 아니라 클로닝 벡터를 포함한다. 발현 벡터는 플라스미드뿐 아니라 바이러스 벡터를 포함하며, 일반적으로 바람직한 암호화 서열과 특정 숙주 유기체 (예, 박테리아, 효모, 식물, 곤충 또는 포유류)에서 또는 시험관내 발현 시스템에서 작동가능하게 연결된 암호화 서열을 발현시키는데 필요한 적절한 DNA 서열을 함유한다. 클로닝 벡터는 일반적으로 원하는 특정 DNA 단편을 조작 및 증폭시키기 위해 사용되며, 원하는 DNA 단편을 발현시키기 위해 필요한 기능적인 서열들이 결핍될 수 있다.
본 발명의 전체 측면들에 대한 일 구현예에서, 사이토카인을 암호화하는 핵산 또는 항원 또는 이의 변이체를 코딩하는 핵산은, 사이토카인 또는 항원 또는 이의 변이체를 제공하기 위해, 치료할 개체의 세포에서 발현된다. 본 발명의 전체 측면들에 대한 일 구현예에서, 핵산은 포유류의 세포에서 일시적으로 발현된다. 따라서, 일 구현예에서, 핵산은 세포의 게놈에 삽입되지 않는다. 본 발명의 전체 측면들에 대한 일 구현예에서, 핵산은 RNA이며, 바람직하게는 시험관내에서 전사된 RNA이다. 본 발명의 전체 측면들에 대한 일 구현예에서, 항원 또는 이의 변이체의 발현은 세포 표면에서 이루어진다.
본 발명의 전체 측면들에 대한 일 구현예에서, 항원 또는 이의 변이체를 코딩하는 핵산은 포유류의 세포에서 발현되어, CAR을 발현하도록 유전자 변형된 T 세포에 의해 결합하기 위한 항원 또는 이의 변이체를 제공하며, 상기한 결합으로 CAR을 발현하도록 유전자 변형된 T 세포의 자극, 감작화 및/또는 증폭이 달성된다.
용어 "발현"은 본 발명에서 가장 일반적인 의미로 사용되며, 예를 들어, 전사 및/또는 발현에 의한, RNA 및/또는 펩타이드 또는 단백질의 생산을 포함한다. 발현은 일시적이거나 또는 안정적일 수 있다. 본 발명에 따라, 용어 발현은 또한 "비정상적인 발현" 또는 "발현 이상"을 포괄한다.
본 발명에 따라, 용어 "핵산이 암호화한다"는, 핵산이 세포내와 같은 적절한 환경에 존재한다면 핵산이 발현되어 이것이 암호화하는 단백질 또는 펩타이드를 생산할 수 있다는 것을 의미한다.
본원에 언급되는 핵산은 재조합 및/또는 단리된 분자일 수 있다.
본원에서, "단리된 분자"는 다른 세포성 물질과 같이 다른 분자가 실질적으로 함유되지 않은 분자를 의미하는 것으로 의도된다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "재조합"은 "유전자 조작을 통해 제조된"을 의미한다. 바람직하게는, 본 발명의 맥락에서, 재조합 세포와 같은 "재조합 대상"은 자연적으로 생성되지 않는다.
본원에서, 용어 "자연 생성"은 대상이 자연계에서 발견 가능하다는 것을 의미한다. 예를 들어, (바이러스를 비롯한) 유기체에 존재하고 천연 기원으로부터 단리될 수 있으며 인간에 의해 실험실에서 의도적으로 변형되지 않은 펩타이드 또는 핵산은, 자연 생성된 것이다.
용어 "형질감염"은 핵산, 특히 RNA를 세포에 도입하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적에서, 용어 "형질감염"은 또한 세포에 핵산 도입 또는 세포에 핵산 흡수를 포함하며, 여기서 세포는 개체, 예를 들어 환자에 존재할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따라, 본원에 기술된 핵산을 형질감염시키기 위한 세포는 시험관내 또는 생체내에 존재할 수 있으며, 예를 들어 세포는 환자의 장기, 조직 및/또는 유기체의 일부를 구성할 수 있다. 본 발명에서, 형질감염은 일시적이거나 또는 안정적일 수 있다. 형질감염의 일부 응용의 경우, 형질감염된 유전 물질이 단순히 일시적으로 발현된다면 충분하다. 형질감염 과정에서 도입된 핵산은 통상적으로 핵 게놈에 삽입되지 않으므로, 외래 핵산은 유사분열을 통해 희석되거나 또는 분해될 것이다. 핵산을 에피좀으로 증폭가능한 세포는 희석 속도를 크게 떨어뜨린다. 형질감염된 핵산이 실제 그 세포와 이의 딸 세포의 게놈내에 잔류하는 것이 바람직하다면, 안정적인 형질감염이 이루어져야 한다. RNA는 세포에 형질감염되어, 이것이 암호하는 단백질을 일시적으로 발현시킬 수 있다.
본 발명의 전체 측면들에 대한 일 구현예에서, 사이토카인을 암호화하거나 또는 항원 또는 이의 변이체를 암호화하는 핵산은 입자와 같은 전달 비히클 내에 제형화된다. 일 구현예에서, 전달 비히클은 하나 이상의 지질을 포함한다. 일 구현예에서, 하나 이상의 지질은 하나 이상의 양이온성 지질을 포함한다. 일 구현예에서, 지질은 핵산과 복합체를 형성하거나 및/또는 핵산을 둘러싼다. 일 구현예에서, 지질은 핵산을 둘러싼 소낭 안에 포함된다. 본 발명의 전체 측면들에 대한 일 구현예에서, 핵산은 리포좀에 제형화된다.
본원에서, 용어 "RNA"는 리보뉴클레오티드 잔기를 포함하는 분자를 의미한다. 바람직한 구현예에서, RNA는 전체가 리보뉴클레오티드 잔기이거나 또는 대부분이 리보뉴클레오티드 잔기이다. 본원에서, "리보뉴클레오티드"는 β-D-리보푸라노스 기의 2'-위치에 하이드록시 기를 가진 뉴클레오티드를 의미한다. RNA는, 비-제한적으로, 이중 가닥 RNA, 단일 가닥 RNA, 단리된 RNA, 예를 들어 일부 정제된 RNA, 기본적으로 순수한 RNA, 합성 RNA, 재조합에 의해 제조된 RNA뿐 아니라 하나 이상의 뉴클레오티드의 부가, 결손, 치환 및/또는 변형에 의해 자연적으로 생성된 RNA와는 다른 변형된 RNA를 포괄한다. 이러한 변형은 RNA의 말단(들)에 또는 RNA 뉴클레오티드 내부에 비-뉴클레오티드 물질의 부가를 의미할 수 있다. RNA 분자에서 뉴클레오티드는 또한 비-표준 뉴클레오티드, 예를 들어, 화학 합성 뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드일 수 있는 것으로 고려된다. 본원에서, 이들 변형된 RNA는 자연적으로 생성된 RNA의 유사체로서 간주된다.
본 발명의 특정 구현예에서, RNA는 펩타이드 또는 단백질을 암호하는 RNA 전사체를 의미하는 메신저 RNA (mRNA)이다. 당해 기술 분야에서 확립된 바와 같이, mRNA는 일반적으로 5' 비-번역 영역 (5'-UTR), 펩타이드 코딩 영역 및 3' 비-번역 영역 (3'-UTR)을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA는 시험관내 전사 또는 화학 합성에 의해 제조된다. 일 구현예에서, mRNA는 데옥시리보뉴클레오티드를 함유한 핵산인 DNA 주형을 이용하여 시험관내 전사에 의해 제조된다.
일 구현예에서, RNA는 시험관내 전사된 RNA (IVT-RNA)이며, 적절한 DNA 주형에 대한 시험관내 전사에 의해 수득할 수 있다. 전사를 제어하기 위한 프로모터는 임의의 RNA 중합효소에 대한 임의의 프로모터일 수 있다. 시험관내 전사용 DNA 주형은 핵산, 특히 cDNA를 클로닝하고 이를 시험관내 전사를 위해 적절한 벡터에 도입함으로써 수득할 수 있다. cDNA는 RNA의 역전사를 통해 수득할 수도 있다.
일 구현예에서, RNA는 변형된 리보뉴클레오티드일 수 있다. 변형된 리보뉴클레오티드에 대한 예로는, 비-제한적으로, 5-메틸시티딘, 슈도우리딘 (pseudouridine) 및/또는 1-메틸-슈도우리딘 등이 있다.
일부 구현예에서, 본원에 따른 RNA는 5'-캡을 포함한다. 일 구현예에서, 본원의 RNA는 캡핑되지 않은 5'-트리포스페이트를 함유하지 않는다. 일 구현예에서, RNA는 5'-캡 유사체에 의해 변형될 수 있다. 용어 "5'-캡"은 mRNA의 5'-말단에서 발견되는 구조를 지칭하며, 일반적으로 5' -> 5' 트리포스페이트 연결을 통해 mRNA에 연결된 구아노신 뉴클레오티드로 구성된다. 일 구현예에서, 이 구아노신은 7번 위치에서 메틸화된다. 5'-캡 또는 5'-캡 유사체를 가진 RNA의 제공은, 5'-캡이 RNA 가닥으로 공동-전사에 의해 발현되는 시험관내 전사에 의해 달성될 수 있거나, 또는 캡핑 효소를 이용해 전사 후에 RNA에 부착시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 따른 RNA는 5'-UTR 및/또는 3'-UTR을 포함한다. 용어 "비-번역 영역" 또는 "UTR"은 DNA 분자에서 전사되지만 아미노산 서열로 번역되지 않는 영역, 또는 mRNA 분자와 같은 RNA 분자에서의 대응되는 영역을 의미한다. 비-번역 영역 (UTR)은 오픈 리딩 프래임의 5' (상류)(5'-UTR) 및/또는 오픈 리딩 프래임의 3' (하류)(3'-UTR)에 존재할 수 있다. 5'-UTR은 (존재할 경우) 5'-캡의 하류이며, 예를 들어 5'-캡에 바로 인접하게 위치한다. 3'-UTR은, 존재할 경우, 3' 말단, 즉 단백질-암호화 영역의 종결 코돈의 하류에 위치하지만, 용어 "3'-UTR"은 바람직하게는 폴리 (A) 꼬리를 포함하지 않는다. 따라서, 3'-UTR은 (존재할 경우) 폴리 (A) 서열의 상류이며, 예를 들어 폴리 (A) 서열에 바로 인접하게 위치한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 RNA는 3'-폴리(A) 서열을 포함한다. 용어 "폴리(A) 서열"은 전형적으로 RNA 분자의 3'-말단에 위치한 아데닐 (A) 잔기들로 구성된 서열을 지칭한다. 본 발명의 내용에서, 일 구현예에서, 폴리(A) 서열은 A 뉴클레오티드를 적어도 약 20개, 적어도 약 40개, 적어도 약 80개 또는 적어도 약 100개, 그리고 약 500개 이하, 약 400개 이하, 약 300개 이하, 약 200개 이하 또는 약 150개 이하로 포함하며, 특히 A 뉴클레오티드 약 120개를 포함한다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "전사"는 유전자 코드가 DNA 서열에서 RNA로 전사되는 과정을 지칭한다. 이후, RNA는 펩타이드 또는 단백질로 번역될 수 있다.
RNA와 관련하여, 용어 "발현" 또는 "번역"은 mRNA 가닥이 아미노산 서열을 조립하여 펩타이드 또는 단백질을 만드는, 세포의 리보솜에서 이루어지는 과정을 지칭한다
본 발명에 따라, 용어 "RNA가 암호화한다"는, RNA가, 표적 세포의 세포 내와 같은 적절한 환경에 존재하는 경우, 아미노산의 조립을 지시하여 번역 과정 중에 암호화하는 펩타이드 또는 단백질을 생산할 수 있는 것을 의미한다. 일 구현예에서, RNA는 세포 번역 기구와 상호작용하여, 펩타이드 또는 단백질의 번역을 허용할 수 있다. 세포는 암호화된 펩타이드 또는 단백질을 세포내에서 (예, 세포질 또는 핵에서) 생산하거나, 암호화된 펩타이드 또는 단백질을 분비할 수 있거나, 또는 이를 표면 상에서 생산할 수 있다.
본원에서, 용어 "연결된", "융합된" 또는 "융합"은 상호 호환적으로 사용된다. 이들 용어는 2가지 이상의 인자 또는 구성성분 또는 도메인을 함께 연결하는 것을 의미한다.
본 발명의 내용에서, "반감기"는, 예를 들어, 자연 기전에 의한 분해 및/또는 소거 또는 격리로 인해, 펩타이드 또는 단백질의 혈청 또는 혈장내 농도가 생체내에서 50%로 감소하는데 소요되는 시간을 의미한다. 본원에서 사용하기 적합한 약동학 (PK)적으로 연장된 인터루킨 (IL)과 같은 약동학 (PK)적으로 연장된 사이토카인은 생체내에서 안정적이며, 그 반감기는, 예를 들어, 분해 및/또는 소거 또는 격리를 견디는 혈청 알부민 (예, HSA 또는 MSA)과의 융합에 의해 연장된다. 반감기는 약동학 분석과 같이 자체 공지된 임의의 수단으로 측정할 수 있다. 적합한 기법들은 당해 기술 분야의 당업자들에게 자명할 것이며, 이는 예를 들어 아미노산 서열 또는 화합물을 적정 용량으로 개체에 적절하게 투여하는 단계; 일정한 간격으로 개체에서 혈액 샘플 또는 기타 샘플을 수집하는 단계; 혈액 샘플에서 아미노산 서열 또는 화합물의 수준 또는 농도를 확인하는 단계; 및 수득한 데이터로부터, 아미노산 서열 또는 화합물의 수준 또는 농도가 투여시 최초 수준과 비교해 50%로 감소할 때까지 걸리는 시간을 계산하는 단계를 일반적으로 수반할 수 있다. 추가적인 상세 내용은, 예를 들어, Kenneth, A. et al., Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists 및 Peters et al., Pharmacokinetic Analysis: A Practical Approach (1996) 등의 표준 문헌에서 제공된다. 또한, Gibaldi, M. et al., Pharmacokinetics, 2nd Rev. Edition, Marcel Dekker (1982)를 참조한다.
사이토카인
사이토카인은 세포 신호전달에 중요한 소형 단백질 (~5-20 kDa) 범주에 속한다. 사이토카인은 주변 세포의 거동에 영향을 미친다. 사이토카인은 면역조절제로서 자가분비 신호전달, 주변분비 신호전달 및 내분비 신호전달에 관여한다. 사이토카인으로는 케모카인, 인터페론, 인터루킨, 림포카인 및 종양 괴사 인자를 포함하지만, 일반적으로 (용어 측면에서 일부 중복되지만) 호르몬 또는 성장인자는 아니다. 사이토카인은 대식 세포, B 림프구, T 림프구 및 비만 세포와 같은 면역 세포뿐 아니라 내피 세포, 섬유모세포 및 다양한 기질 세포 등의, 광범위한 세포들에 의해 생산된다. 소정의 사이토카인은 한가지 보다 많은 타입의 세포들에 의해 만들어질 수 있다. 사이토카인은 수용체를 통해 작용하며, 특히 면역 시스템에 중요하며; 사이토카인은 체액성 면역 반응과 세포성 면역 반응 간의 균형을 조절하고, 특정 세포 집단의 성숙, 증식 및 반응을 조절한다. 일부 사이토카인은 복잡한 방식으로 다른 사이토카인의 작용을 강화하거나 또는 저해한다.
IL2
인터루킨-2 (IL2)는 항원-활성화된 T 세포의 증식을 유도하고 자연 살상 (NK) 세포를 자극하는, 사이토카인이다. IL2의 생물학적 활성은 세포 막에 걸쳐있는 폴리펩타이드 서브유닛 3개로 된 다중-서브유닛 IL2 수용체 복합체 (IL2R)를 통해 매개된다: p55 (IL2Rα, α 서브유닛, 인간에서는 CD25로 공지됨), p75 (IL2Rβ, β 서브유닛, 인간에서는 CD122로 공지됨) 및 p64 (IL2Rγ, γ 서브유닛, 인간에서는 CD132로 공지됨). IL2에 대한 T 세포의 반응은, (1) IL2의 농도; (2) 세포 표면 상의 IL2R 분자의 개수; 및 (3) IL2에 의해 점유된 IL2R의 개수 (즉, IL2와 IL2R 간의 결합 상호작용의 친화성 (Smith, "Cell Growth Signal Transduction is Quantal" In Receptor Activation by Antigens, Cytokines, Hormones, and Growth Factors 766:263-271, 1995)) 등의, 다양한 인자들 따라 결정된다. IL2:IL2R 복합체는 리간드에 결합시 내재화되고, 여러가지 구성성분들은 차별적인 분류를 거치게 된다. IL2는 정맥내 (i.v.) 볼루스 투여시 빠르게 전신에서 소거된다 (반감기 12.9분의 초기 소거 단계를 거친 후 반감기 85분의 느린 소거 단계로 이행)(Konrad et al., Cancer Res. 50:2009-2017, 1990).
암 환자에서 IL2의 전신 투여 결과는 이상적이지 않다. 환자들 중 15-20%는 고 용량의 IL2에 객관적으로 반응하지만, 거의 대부분은 그렇지 않으며, 다수가 구역질, 혼란, 저혈압 및 패혈증 쇼크 등의 심각한 생명을 위협하는 부작용을 겪는다. 고 용량의 IL2 처치와 관련된 심각한 독성은 자연 살상 (NK) 세포의 활성에 크게 기인한다. 용량을 줄이고 투약 용법을 조정함으로써 혈청 농도를 낮추고자 하는 시도가 시도되었지만, 이러한 처치는 독성을 감소시켰지만 효과 역시 떨어뜨렸다.
본 발명의 내용에서, 특정 구현예들에서, IL2에 약동학적 변형 기가 부착된다. 제조되는 분자는 이하 "약동학적으로 (PK) 연장된 IL2"로 지칭되는데, 이것은 유리형 IL2에 비해 연장된 순환 반감기를 가진다. PK-연장된 IL2의 연장된 순환 반감기는 생체내 혈청 IL2 농도를 치료학적 범위에서 유지시킬 수 있어, 잠재적으로 T 세포 등의 다수 타입의 면역 세포에 대해 활성화 강화를 유발한다. PK-연장된 IL2는, 이의 우호적인 약동학적 프로파일로 인해, 비-변형된 IL2와 비교해, 적은 빈도로, 더 장기간 투여할 수 있다.
본원에 따라, IL2 (선택적으로 약동학 (PK)적으로 연장된 IL2의 일부로서)는 자연 생성 IL2 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. IL2는 인간 IL2일 수 있으며, 임의의 척추동물, 특히 임의의 포유류로부터 유래할 수 있다. 일 구현예에서, IL2는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열번호 1에 대해 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일 구현예에서, IL2 또는 IL2 단편 또는 변이체는 IL2 수용체에 결합하거나, 또는 α 서브유닛 및/또는 β/γ 서브유닛과 같은 IL2 수용체의 서브유닛에 결합한다.
특정 구현예에서, 약동학 (PK)적으로 연장된 IL2의 IL2 모이어티는 인간 IL2이다. 다른 구현예들에서, 약동학 (PK)적으로 연장된 IL2의 IL2 모이어티는 인간 IL2의 단편 또는 변이체이다.
본원에 기술된 특정 구현예에서, IL2는 이종의 폴리펩타이드 (즉, IL2가 아닌 폴리펩타이드)에 융합된다. 이종의 폴리펩타이드는 IL2의 순환 반감기를 증가시킬 수 있다. 아래에서 더욱 상세히 기술된 바와 같이, 순환 반감기를 연장하는 폴리펩타이드는 인간의 혈청 알부민 (예, 서열번호 4) 또는 마우스의 혈청 알부민 (예, 서열번호 8, 11)과 같은 혈청 알부민일 수 있다.
IL7
IL7은 골수 및 흉선에서 기질 세포에 의해 분비되는 조혈 성장인자이다. 이는 각질 형성 세포, 수지상 세포, 간세포, 뉴런 및 상피 세포에 의해서도 생산되지만, 정상적인 림프구에 의해서는 생산되지 않는다. IL7은 B 및 T 세포 발달에 중요한 사이토카인이다. IL7 사이토카인과 간세포 성장인자는 프리-프로-B 세포 증식-자극 인자로서 기능하는 이형이량체를 형성한다. 마우스 넉아웃 실험에서는, IL7이 림프 세포 생존에 필수적인 역할을 수행하는 것으로, 시사된 바 있다.
IL7은 IL7 수용체 α와 공통 γ 쇄 수용체로 이루어진 이형이량체, IL7 수용체에 결합한다. 결합하면, 흉선에서 T 세포 발달과 말초에서의 생존에 중요한 신호 캐스케이드가 발생한다. 일반적으로 IL7 수용체가 결핍된 넉아웃 마우스는 흉선 위축증을 나타내며, 이중 양성 단계에서는 T 세포 발달이 정지되고, 중증 림프구 감소증이 발생한다. 마우스에 IL7을 투여하면, 최신 흉선 이주체 (thymic emigrant)가 증가하고, B 세포와 T 세포가 증가하고, 사이클로포스파미드 투여 후 또는 골수 이식 후 T 세포의 회수가 증가한다.
본원에 따라, 특정 구현예들에서, IL7에 약동학적 변형 기가 부착된다. 제조되는 분자는 이하 "약동학적으로 (PK) 연장된 IL7"으로 지칭되는데, 이것은 유리형 IL7에 비해 연장된 순환 반감기를 가진다. PK-연장된 IL7의 연장된 순환 반감기는 생체내 혈청 IL7 농도를 치료학적 범위에서 유지시킬 수 있어, 잠재적으로 T 세포 등의 다수 타입의 면역 세포에 대해 생존 강화를 유도한다. PK-연장된 IL7은, 이의 우호적인 약동학적 프로파일로 인해, 비-변형된 IL7과 비교해, 적은 빈도로, 더 장기간 투여할 수 있다.
본원에 따라, IL7 (선택적으로 약동학 (PK)적으로 연장된 IL7의 일부로서)은 자연 생성 IL7 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. IL7은 인간 IL7일 수 있으며, 임의의 척추동물, 특히 임의의 포유류로부터 유래할 수 있다. 일 구현예에서, IL7은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열번호 2에 대해 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%로 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일 구현예에서, IL7 또는 IL7 단편 또는 변이체는 IL7 수용체에 결합한다.
특정 구현예에서, 약동학 (PK)적으로 연장된 IL7의 IL7 모이어티는 인간 IL7이다. 다른 구현예들에서, 약동학 (PK)적으로 연장된 IL7의 IL7 모이어티는 인간 IL7의 단편 또는 변이체이다.
본원에 기술된 특정 구현예에서, IL7은 이종의 폴리펩타이드 (즉, IL7이 아닌 폴리펩타이드)에 융합된다. 이종의 폴리펩타이드는 IL7의 순환 반감기를 연장할 수 있다. 아래에서 더욱 상세히 기술된 바와 같이, 순환 반감기를 연장하는 폴리펩타이드는 인간의 혈청 알부민 (예, 서열번호 4) 또는 마우스의 혈청 알부민 (예, 서열번호 8, 11)과 같은 혈청 알부민일 수 있다.
IL21
인터루킨-21 (IL21)은 자연 살상 (NK) 세포 및 세포독성 T 세포 등의 면역 시스템에 속하는 세포에 대해 강력한 조절 효과를 가지는 사이토카인이다. 이 사이토카인은 표적 세포에 대해 세포 분열/증식을 유도한다. IL21은 활성화된 인간 CD4+ T 세포에서 발현되지만, 대부분의 다른 조직들에서는 발현되지 않는다. 또한, IL21의 발현은 T 헬퍼 세포의 Th2 및 Th17 아종뿐 아니라 T 여포성 세포에서 상향 조절된다. 아울러, IL21은 NK T 세포에서 발현되어 이들 세포의 기능을 조절한다. 또한, 인터루킨 21은 호지킨 림프종 (HL) 암 세포에 의해서도 생산된다.
IL21 수용체 (IL21R)는 T 세포, B 세포 및 NK 세포의 표면 상에서 발현된다. IL21R은 IL2 또는 IL-15와 같은 다른 I형 사이토카인에 대한 수용체와 구조적으로 유사하며, IL-21에 결합하기 위해 공통 감마 쇄 (γc)와 이량체를 형성하여야 한다. IL21이 결합되면, IL21 수용체는 Jak/STAT 경로를 통해 작용하여, Jak1 및 Jak3 및 STAT3 동형이량체를 이용해 표적 유전자를 활성화한다.
본원에 따라, 특정 구현예들에서, IL21에 약동학적 변형 기가 부착된다. 제조되는 분자는 이하 "약동학적으로 (PK) 연장된 IL21"로 지칭되는데, 이것은 유리형 IL21에 비해 연장된 순환 반감기를 가진다. PK-연장된 IL21의 연장된 순환 반감기는 생체내 혈청 IL21 농도를 치료학적 범위에서 유지시킬 수 있어, 잠재적으로 T 세포 등의 다수 타입의 면역 세포에 대해 활성화 강화를 유도한다. PK-연장된 IL21은, 이의 우호적인 약동학적 프로파일로 인해, 비-변형된 IL21과 비교해, 적은 빈도로, 더 장기간 투여할 수 있다.
본원에 따라, IL21 (선택적으로 약동학 (PK)적으로 연장된 IL21의 일부로서)은 자연 생성 IL21 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. IL21은 인간 IL21일 수 있으며, 임의의 척추동물, 특히 임의의 포유류로부터 유래할 수 있다. 일 구현예에서, IL21은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열번호 3에 대해 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%로 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일 구현예에서, IL21 또는 IL21 단편 또는 변이체는 IL21 수용체에 결합한다.
특정 구현예에서, 약동학 (PK)적으로 연장된 IL21의 IL21 모이어티는 인간 IL21이다. 다른 구현예들에서, 약동학 (PK)적으로 연장된 IL21의 IL21 모이어티는 인간 IL21의 단편 또는 변이체이다.
본원에 기술된 특정 구현예에서, IL21은 이종의 폴리펩타이드 (즉, IL21이 아닌 폴리펩타이드)에 융합된다. 이종의 폴리펩타이드는 IL21의 순환 반감기를 연장할 수 있다. 아래에서 더욱 상세히 기술된 바와 같이, 순환 반감기를 연장하는 폴리펩타이드는 인간의 혈청 알부민 (예, 서열번호 4) 또는 마우스의 혈청 알부민 (예, 서열번호 8, 11)과 같은 혈청 알부민일 수 있다.
PK-연장 기
본원에 기술된, 사이토카인, 예를 들어 IL2, IL7 또는 IL21과 같은 인터루킨에, 순화 반감기를 증가시키는 PK-연장 기가 융합될 수 있다. PK-연장 기에 대한 비-제한적인 예는 아래에 기술되어 있다. 사이토카인 또는 이의 변이체의 순환 반감기를 증가시키는 다른 PK 기들 역시 본원에 적용가능한 것으로 이해하여야 한다. 특정 구현예에서, PK-연장 기는 혈청 알부민 도메인 (예를 들어, 마우스 혈청 알부민, 인간 혈청 알부민)이다.
본 발명의 내용에서, 용어 "PK"는 "약동학"의 두문자어로서, 예를 들어 개체에 의한 흡수, 분배, 대사 및 소거 등의 화합물의 특성들을 포괄한다. 본 발명의 내용에서, "PK-연장 기"는, 생물학적 활성 분자와 함께 투여되거나 또는 이에 융합되었을 때, 생물학적 활성 분자의 순환성 반감기를 연장하는 단백질, 펩타이드 또는 모이어티를 지칭한다. PK-연장 기에 대한 예로는 혈청 알부민 (예를 들어, HSA), Fc 또는 이의 Fc 단편 및 변이체, 트랜스페린 및 이의 변이체, 및 인간 혈청 알부민 (HSA) 결합제 (미국 특허 공개공보 2005/0287153 및 2007/0003549에 개시된 것) 등이 있다. 다른 예시적인 PK-연장 기들은 Kontermann, Current Opinion in Biotechnology 2011; 22: 868-876에 기술되어 있으며, 이 문헌의 전체 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 본원에서, "PK-연장된 사이토카인"은 PK-연장 기가 조합된 사이토카인 모이어티를 의미한다. 일 구현예에서, PK-연장된 사이토카인은 사이토카인 모이어티가 PK-연장 기에 연결 또는 융합된 융합 단백질이다. 본원에서, "PK-연장된 IL"은 PK-연장 기와 조합된 인터루킨 (IL) 모이어티를 지칭한다. 일 구현예에서, PK-연장된 IL은 IL 모이어티가 PK-연장 기와 연결되거나 또는 이와 융합된 융합 단백질이다. 예시적인 융합 단백질은 IL2 모이어티가 HSA와 융합된 HSA/IL2 융합체이다. 융합 단백질에 대한 다른 예는 IL7 모이어티가 HSA와 융합된 HSA/IL7 융합체이다. 융합 단백질에 대한 다른 예는 IL21 모이어티가 HSA와 융합된 HSA/IL21 융합체이다.
특정 구현예에서, PK-연장된 사이토카인의 혈청 반감기는 사이토카인 단독 (즉, PK-연장 기가 융합되지 않은 사이토카인)에 비해 연장된다. 특정 구현예에서, PK-연장된 사이토카인의 혈청 반감기는 사이토카인 단독의 혈청 반감기에 비해 적어도 20, 40, 60, 80, 100, 120, 150, 180, 200, 400, 600, 800 또는 1000% 더 길다. 특정 구현예에서, PK-연장된 사이토카인의 혈청 반감기는 사이토카인 단독의 혈청 반감기보다 적어도 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 10배, 12배, 13배, 15배, 17배, 20배, 22배, 25배, 27배, 30배, 35배, 40배 또는 50배 더 길다. 특정 구현예에서, PK-연장된 사이토카인의 혈청 반감기는 적어도 10시간, 15시간, 20시간, 25시간, 30시간, 35시간, 40시간, 50시간, 60시간, 70시간, 80시간, 90시간, 100시간, 110시간, 120시간, 130시간, 135시간, 140시간, 150시간, 160시간 또는 200시간이다.
특정 구현예에서, PK-연장 기는 혈청 알부민 또는 이의 단편 또는 혈청 알부민의 변이체 또는 이의 단편 (이들 모두 본 발명의 목적에서 용어 "알부민"에 포함됨)을 포함한다. 본 발명에 기술된 폴리펩타이드에 알부민 (또는 이의 단편 또는 변이체)을 융합하여 알부민 융합 단백질을 제조할 수 있다. 이러한 알부민 융합 단백질은 미국 특허 공개번호 20070048282에 기술되어 있다.
본 발명의 내용에서, "알부민 융합 단백질"은 하나 이상의 알부민 분자 (또는 이의 단편 또는 변이체)를 치료 단백질, 특히 IL2, IL7 또는 IL21 (또는 이의 변이체)와 같은 하나 이상의 단백질 분자에 융합함으로써 만들어지는 단백질을 지칭한다. 알부민 융합 단백질은 치료 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 알부민을 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 인-프래임으로 연결된 핵산의 번역에 의해 제조할 수 있다. 치료 단백질 및 알부민은, 알부민 융합 단백질의 일부인 경우, 알부민 융합 단백질의 "부분", "영역" 또는 "모이어티" (예, "치료 단백질 부분" 또는 "알부민 단백질 부분")로서 각각 언급될 수 있다. 매우 바람직한 구현예에서, 알부민 융합 단백질은 하나 이상의 치료 단백질 (예를 들어, 비-제한적으로 치료 단백질의 성숙 형태) 및 하나 이상의 알부민 분자 (예, 비-제한적으로, 알부민의 성숙한 형태)를 포함한다. 일 구현예에서, 알부민 융합 단백질은 투여된 RNA의 표적 기관의 세포 등의 숙주 세포, 예를 들어 간 세포에 의해 처리되어, 순환계로 분비된다. RNA 발현에 사용되는 숙주 세포의 분비 경로에서 발생하는 생성 초기 알부민 융합 단백질의 처리는 신호 펩타이드 절단; 이황화 결합 형성; 적절한 접힘; 탄수화물의 부가 및 가공 처리 (예, N- 및 O-연결된 당화); 특이적인 단백질분해성 절단; 및/또는 다량체 단백질로의 조립을 포함할 수 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 알부민 융합 단백질은, 바람직하게는, 특히 N-말단에 신호 펩타이드를 가진 비-가공된 형태로 RNA에 의해 암호화되며, 이후 세포에 의해 분비되어 바람직하게는 특히 신호 펩타이드가 절단된 가공된 형태로 존재한다. 가장 바람직한 구현예에서, "알부민 융합 단백질의 가공된 형태"는 본 발명에서 "성숙한 알부민 융합 단백질"로도 지칭되는 N-말단 신호 펩타이드의 절단을 거친 알부민 융합 단백질 생성물을 지칭한다.
바람직한 구현예에서, 치료 단백질을 포함하는 알부민 융합 단백질은 알부민이 융합되지 않은 동일한 치료 단백질의 혈장 안정성과 비교해 더 높은 혈장 안정성을 가진다. 혈장 안정성은 전형적으로 치료 단백질이 생체내 투여되어 혈류로 운반된 다음 치료 단백질이 분해되어 혈류로부터 신장 또는 간과 같은 장기로 흡수되어, 궁극적으로 치료 단백질이 신체에서 소거되는 시간을 의미한다. 혈장 안정성은 혈류에서의 치료 단백질의 반감기 측면에서 계산된다. 혈류에서 치료 단백질의 반감기는 당해 기술 분야에 공지된 통상적인 분석으로 쉽게 측정할 수 있다.
본 발명의 내용에서, "알부민"은, 알부민의 하나 이상의 기능적인 활성 (예를 들어, 생물학적 활성)을 가진, 알부민 단백질 또는 아미노산 서열 또는 알부민 단편 또는 변이체를 의미한다. 구체적으로, "알부민"은 인간 알부민 또는 이의 단편 또는 변이체, 특히 인간 알부민의 성숙한 형태, 또는 기타 척추 동물로부터 유래된 알부민 또는 이의 단편, 또는 이들 분자의 변이체를 지칭한다. 알부민은 임의의 척추동물, 특히 임의의 포유류, 예를 들어, 인간, 소, 양 또는 돼지로부터 유래될 수 있다. 포유류로부터 유래되지 않은 알부민으로는, 비-제한적으로, 암탉 및 연어를 포함한다. 알부민 융합 단백질의 알부민 부분은 치료 단백질 부분과는 다른 동물로부터 유래될 수 있다.
특정 구현예에서, 알부민은 US 5,876,969, WO 2011/124718, WO 2013/075066 및 WO 2011/0514789에 기술된 바와 같이, 인간 혈청 알부민 (HSA), 또는 이의 단편 또는 이의 변이체이다.
용어, 인간 혈청 알부민 (HSA) 및 인간 알부민 (HA)은 본원에서 상호 호환적으로 사용된다. 용어 "알부민 및 "혈청 알부민"은 더 광의적으로 사용되며, 인간 혈청 알부민 (및 이의 단편 및 변이체)뿐 아니라 다른 종으로부터 유래된 알부민 (및 이의 단편 및 변이체)를 포괄한다.
본 발명의 내용에서, 치료 단백질의 치료 활성 또는 혈장 안정성을 늘리는데 충분한 알부민의 단편은, 알부민 융합 단백질의 치료 단백질 부분의 혈장 안정성이, 융합되지 않은 상태에서의 혈장 안정성과 비교해, 연장 또는 길어지도록, 단백질의 치료 활성 또는 혈장 안정성을 안정화 또는 연장하는데 길이 또는 구조 측면에서 충분한 알부민의 단편을 의미한다.
알부민 융합 단백질의 알부민 부분은 알부민 서열의 전장을 포함할 수 있거나, 또는 혈장 안정성 또는 치료 활성을 안정화 또는 연장할 수 있는 이의 하나 이상의 단편을 함유할 수 있다. 이러한 단편은 아미노산 10개 이상의 길이를 포함할 수 있거나, 또는 알부민 서열로부터 유래되는 연속적인 아미노산 약 15개, 20개, 25개, 30개, 50개 또는 그보다 많은 수를 포함할 수 있거나, 또는 알부민의 특정 도메인들 전체 또는 일부를 포함할 수 있다. 예를 들어, 첫 2개의 면역글로불린-유사 도메인에 걸쳐있는 하나 이상의 단편을 이용할 수 있다. 바람직한 구현예에서, HSA 단편은 HSA의 성숙한 형태이다.
일반적으로 말해, 알부민 단편 또는 변이체는 아미노산 100개 이상의 길이, 바람직하게는 아미노산 150개 이상의 길이일 것이다.
본 발명의 내용에서, 알부민은 자연 생성 알부민 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. 알부민은 인간 알부민일 수 있으며, 임의의 척추동물, 특히 임의의 포유류로부터 유래될 수 있다. 일 구현예에서, 알부민은 서열번호 4의 알부민 서열을 포함하거나, 또는 서열번호 4와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
바람직하게는, 알부민 융합 단백질은 N-말단 부분으로서 알부민을, 그리고 C-말단 부분으로서 치료 단백질을 포함한다. 다른 예로, C-말단 부분으로서 알부민을, 그리고 N-말단 부분으로서 치료 단백질을 포함하는, 알부민 융합 단백질 역시 이용할 수 있다. 다른 구현예들에서, 알부민 융합 단백질은 알부민의 N-말단과 C-말단 둘다에 융합된 치료 단백질을 포함한다. 바람직한 구현예에서, N-말단 및 C-말단에 융합된 치료 단백질들은 동일한 치료 단백질이다. 다른 바람직한 구현예에서, N-말단과 C-말단에 융합된 치료 단백질들은 서로 다른 치료 단백질이다. 일 구현예에서, 서로 다른 치료 단백질은 동일한 또는 관련 질환, 장애 또는 병태를 치료 또는 예방하는데 이용가능할 수 있다. 일 구현예에서, 서로 다른 치료 단백질은 둘다 사이토카인이다.
일 구현예에서, 치료 단백질(들)은 (a) 펩타이드 링커(들)를 통해 알부민에 연결된다. 융합되는 부분들 사이에 존재하는 링커 펩타이드는 모이어티들 간에 더 강력한 물리적인 분리를 제공하여, 치료 단백질 부분의, 예를 들어 이의 동족 수용체에의 결합에 있어, 접근성을 극대화할 수 있다. 링커 펩타이드는, 유연하거나 또는 더 뻣뻣한 아미노산으로 구성될 수 있다. 링커 서열은 프로테아제에 의해 절단가능하거나 또는 화학적으로 절단가능할 수 있다.
본 발명의 내용에서, 용어 "Fc 영역"은 중쇄 2개로 된 각각의 Fc 도메인 (또는 Fc 모이어티)들에 의해 형성된 천연 면역글로불린의 영역을 지칭한다. 본 발명의 내용에서, 용어 "Fc 도메인"은 단일 면역글로불린 (Ig) 중쇄 부분 또는 단편을 의미하며, Fc 도메인은 Fv 도메인을 포함하지 않는다. 특정 구현예에서, Fc 도메인은 파파인 절단부의 바로 위 상류에 위치한 힌지부에서 시작해, 항체의 C-말단에서 끝난다. 즉, 완전한 Fc 도메인은 적어도 힌지 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, Fc 도메인은 하기 중 하나 이상을 포함한다: 힌지 (예를 들어, 상류, 중간 및/또는 하류 힌지부) 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, CH4 도메인 또는 이의 변이체, 부분 또는 단편. 특정 구현예에서, Fc 도메인은 완전한 Fc 도메인 (즉, 힌지 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인)을 포함한다. 특정 구현예에서, Fc 도메인은 CH3 도메인 (또는 이의 일부)에 융합된 힌지 도메인 (또는 이의 일부)를 포함한다. 특정 구현예에서, Fc 도메인은 CH3 도메인 (또는 이의 일부)과 융합된 CH2 도메인 (또는 이의 일부)을 포함한다. 특정 구현예에서, Fc 도메인은 CH3 도메인 또는 이의 일부로 구성된다. 특정 구현예에서, Fc 도메인은 힌지 도메인 (또는 이의 일부) 및 CH3 도메인 (또는 이의 일부)으로 구성된다. 특정 구현예에서, Fc 도메인은 CH2 도메인 (또는 이의 일부)과 CH3 도메인으로 구성된다. 특정 구현예에서, Fc 도메인은 힌지 도메인 (또는 이의 일부)과 CH2 도메인 (또는 이의 일부)으로 구성된다. 특정 구현예에서, Fc 도메인에는 적어도 CH2 도메인의 일부 (예를 들어, CH2 도메인 전체 또는 일부)가 존재하지 않는다. 본원에서 Fc 도메인은 일반적으로 면역글로불린 중쇄의 Fc 도메인 전체 또는 일부를 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다. 이러한 것으로는 전체 CH1, 힌지, CH2 및/또는 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 뿐 아니라 오직, 예를 들어 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 이러한 폴리펩타이드의 단편 등이 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다. Fc 도메인은, 비-제한적으로, 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE 또는 IgM 항체를 비롯하여, 임의 종의 및/또는 임의 서브타입의 면역글로불린으로부터 유래될 수 있다. Fc 도메인은 천연 Fc 및 Fc 변이체 분자를 포괄한다. 본 발명에 기술된 바와 같이, 당해 기술 분야의 당업자라면, 임의의 Fc 도메인이 자연 생성 면역글로불린 분자의 천연 Fc 도메인과 아미노산 서열이 다르도록 변형될 수 있음을 이해할 것이다. 특정 구현예에서, Fc 도메인은 작동자 기능 (예를 들어, FcγR 결합성)이 저하된 것이다.
본 발명에 기술된 폴리펩타이드의 Fc 도메인은 여러가지 면역글로불린 분자들로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드의 Fc 도메인은 IgG1 분자로부터 유래되는 CH2 및/또는 CH3 도메인과, IgG3 분자로부터 유래되는 힌지부를 포함할 수 있다. 다른 예로, Fc 도메인은 부분적으로 IgG1 분자로부터 유래되고 일부는 IgG3 분자로부터 유래된 키메라 힌지부를 포함할 수 있다. 다른 예로, Fc 도메인은 일부는 IgG1 분자로부터, 일부는 IgG4 분자로부터 유래되는 키메라 힌지부를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, PK-연장 기는 Fc 도메인 또는 이의 단편 또는 Fc 도메인의 변이체 또는 이의 단편 (이들 모두 본 발명의 목적에서 용어 "Fc 도메인"에 포함됨)을 포함한다. Fc 도메인은 항원에 결합하는 가변부를 포함하지 않는다. 본 발명에서 사용하기 적합한 Fc 도메인은 다수의 여러가지 공급원으로부터 수득할 수 있다. 특정 구현예에서, Fc 도메인은 인간 면역글로불린으로부터 유래한다. 특정 구현예에서, Fc 도메인은 인간 IgG1 불변부로부터 유래한다. 그러나, Fc 도메인은, 예를 들어 설치류 (예, 마우스, 랫, 토끼, 기니아 피그) 또는 인간이 아닌 영장류 (예, 침팬치, 마카크) 종 등의, 다른 포유류 종의 면역글로불린으로부터 유래할 수 있다.
아울러, Fc 도메인 (또는 이의 단편 또는 변이체)은, IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE를 비롯한 임의 면역글로불린 계열로부터, 그리고 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 비롯한 임의의 면역글로불린 이소형으로부터 유래할 수 있다.
다양한 Fc 도메인 유전자 서열들 (예, 마우스 및 인간 불변부 유전자 서열)은 공개적으로 접근가능한 기탁 형태로 이용가능하다. Fc 도메인을 포함하는 불변 영역 도메인은 특정 작동자 기능 및/또는 면역원성을 줄이기 위한 특정 변형이 결여된 것으로 선택될 수 있다. 많은 항체 서열 및 항체-암호화 유전자들이 공개되어 있으며, 적절한 Fc 도메인 서열 (예, 힌지, CH2 및/또는 CH3 서열, 또는 이의 단편 또는 변이체)들은 당해 기술 분야에서 인정되는 기법을 이용해 이들 서열로부터 유래될 수 있다.
특정 구현예에서, PK-연장 기는 US2005/0287153, US2007/0003549, US2007/0178082, US2007/0269422, US2010/0113339, WO2009/083804 및 WO2009/133208에 기술된 것과 같은 혈청 알부민 결합 단백질이며, 이들 문헌은 그 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 특정 구현예에서, PK-연장 기는 US 7,176,278 및 US 8,158,579에 기술된 바와 같이 트랜스페린이며, 이들 문헌은 그 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 특정 구현예에서, PK-연장 기는 US2007/0178082에 기술된 바와 같은 혈청 면역글로불린 결합 단백질이며, 이 문헌은 그 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 특정 구현예에서, PK-연장 기는 US2012/0094909에 기술된 바와 같이 혈청 알부민에 결합하는 파이브로넥틴 (Fn)-기반의 스캐폴드 도메인 단백질이며, 이 문헌은 그 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 파이브로넥틴-기반의 스캐폴드 도메인 단백질의 제조 방법은 또한 US2012/0094909에 기술되어 있다. Fn3-기반의 PK-연장 기에 대한 비-제한적인 예는 Fn3(HSA), 즉, 인간 혈청 알부민에 결합하는 Fn3 단백질이다.
특정 측면에서, 본 발명에 따라 이용하기 적합한 PK-연장된 IL과 같은 PK-연장된 사이토카인은 하나 이상의 펩타이드 링커를 사용할 수 있다. 본원에서, 용어 "펩타이드 링커"는 폴리펩타이드 체인의 선형 아미노산 서열에서 2 이상의 도메인 (예, PK-연장 모이어티 및 IL2, IL7 또는 IL21과 같은 IL 모이어티)을 연결하는 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 지칭한다. 예를 들어, 펩타이드 링커를 사용해 IL2 모이어티를 HSA 도메인에 연결할 수 있다. 다른 구현예에서, 펩타이드 링커를 사용해 IL7 모이어티를 HSA 도메인에 연결할 수 있다. 다른 구현예에서, 펩타이드 링커를 사용해 IL21 모이어티를 HSA 도메인에 연결할 수 있다.
예를 들어 IL2, IL7 또는 IL21에 PK-연장 기를 융합하는데 적합한 링커는 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있다. 예시적인 링커로는 글리신-세린-폴리펩타이드 링커, 글리신-프롤린-폴리펩타이드 링커 및 프롤린-알라닌 폴리펩타이드 링커 등이 있다. 특정 구현예에서, 링커는 글리신-세린-폴리펩타이드 링커, 즉 글리신 잔기와 세린 잔기로 구성된 펩타이드이다.
항원
본 발명에 따라 사용하기 적합한 펩타이드 및 단백질 항원, 즉 항원 또는 이의 변이체는, 전형적으로, 면역 반응 유도용 에피토프를 포함하는 펩타이드 또는 단백질을 포함한다. 펩타이드 또는 단백질 또는 에피토프는 표적 항원으로부터, 즉 면역 반응을 형성하고자 하는 항원으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 펩타이드 또는 단백질 항원, 또는 이러한 펩타이드 또는 단백질 항원에 포함된 에피토프는 표적 항원이거나, 또는 표적 항원의 단편 또는 변이체일 수 있다.
투여되거나 또는 핵산, 특히 투여된 RNA에 의해 암호화되는 펩타이드 항원 및 단백질 항원, 즉 백신 항원은, 바람직하게는, 펩타이드 또는 단백질 항원 또는 핵산이 투여 중인 개체에서 CAR을 발현하도록 유전자 변형된 T 세포의 자극, 감작 및/또는 증폭을 유발한다. 이러한 자극된, 감작된 및/또는 증폭된 T 세포는, 바람직하게는, 표적 항원, 특히 질병에 걸린 세포, 조직 및/또는 장기에 의해 발현되는 표적 항원, 즉 질환-관련 항원을 겨냥한다. 따라서, 백신 항원은 질환-관련 항원, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 이러한 단편 또는 변이체는 질환-관련 항원과 면역학적으로 등가물이다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "항원의 단편" 또는 "항원의 변이체"는 CAR-조작된 T 세포의 자극, 감작 및/또는 증폭을 유발하여, 자극, 감작 및/또는 증폭된 T 세포가 항원, 즉 질환-관련 항원을, 특히 존재하는 경우 질병에 걸린 세포, 조직 및/또는 장기를 표적화하는, 물질을 의미한다. 따라서, 백신 항원은 질환-관련 항원에 해당하거나 또는 질환-관련 항원을 포함할 수 있거나, 또는 질환-관련 항원의 단편에 해당하거나 또는 질환-관련 항원을 단편을 포함하거나, 또는 질환-관련 항원 또는 이의 단편에 상동적인 항원에 해당하거나 또는 질환-관련 항원 또는 이의 단편에 상동적인 항원을 포함할 수 있다. 만일 백신 항원이 질환-관련 항원의 단편에 상동적인 아미노산 서열 또는 질환-관련 항원의 단편을 포함한다면, 이러한 단편 또는 아미노산 서열은 CAR-조작된 T 세포의 CAR가 표적화하는 질환-관련 항원의 에피토프 또는 질환-관련 항원의 에피토프에 상동적인 서열을 포함할 수 있다. 즉, 본원에 따라, 백신 항원은 질환-관련 항원의 면역원성 단편을 포함하거나, 또는 질환-관련 항원의 면역원성 단편에 상동적인 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 본원에 따라 "항원의 면역원성 단편"은 바람직하게는 항원 또는 항원을 발현하는 세포에 결합하는 CAR을 보유한 T 세포를 자극, 감작 및/또는 증폭시킬 수 있는 항원의 단편을 의미한다. CAR-조작된 T 세포에 의해 결합하기 적합한 에피토프를 제공하기 위해, (질환-관련 항원과 유사한) 백신 항원은 항원-제시 세포와 같은 세포의 표면 상에 발현될 수 있는 것이 바람직하다. 백신 항원은 재조합 항원일 수 있다.
용어 "면역학적으로 등가"는 면역학적으로 등가의 아미노산 서열과 같은 면역학적 등가인 분자가 동일한 또는 본질적으로 동일한 면역학적 특성을 나타내거나 및/또는 예를 들어 면역학적 효과의 유형과 관련하여 동일한 또는 본질적으로 동일한 면역학적 효과를 발휘하는 것을 의미한다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "면학적으로 등가"는 바람직하게는 면역화에 사용되는 항원 또는 항원 변이체의 면역학적 효과 또는 특성과 관련하여 사용된다. 예를 들어, 아미노산 서열이, 참조 아미노산 서열에 결합하거나 또는 참조 아미노산 서열을 발현하는 세포에 결합하는 T 세포 등의 개체의 면역 시스템에 노출되었을 때, 참조 아미노산 서열과의 반응 특이성을 가진 면역 반응을 유도한다면, 그 아미노산 서열은 참조 아미노산 서열과 면역학적으로 등가인 것이다. 따라서, 항원과 면역학적으로 등가인 분자는 동일한 또는 본질적으로 동일한 특성을 나타내거나 및/또는 T 세포를 표적화하는 항원으로서 T 세포의 자극, 감작 및/또는 증폭과 관련하여 동일한 또는 본질적으로 동일한 효과를 발휘한다.
용어 "감작"은 T 세포가 이의 특이적인 항원과 최초 접촉시 작동자 T 세포로의 분화를 유발하는 과정을 지칭한다.
용어 "클론 증폭" 또는 "증폭"은 특정 실체가 증폭되는 공정을 의미한다. 본 발명의 맥락에서, 이 용어는 바람직하게는 림프구가 항원에 의해 자극되어, 증식되고, 그 항원을 인지하는 특정 림프구가 증폭되는 면역학적 반응 맥락에서 사용된다. 바람직하게는, 클론 증폭은 림프구의 분화로 이어진다.
용어 "항원"은 이에 대한 면역 반응을 유발할 수 있는 에피토프를 포함하는 물질을 의미한다. 용어 "항원"은, 구체적으로 단백질 및 펩타이드를 포함한다. 일 구현예에서, 항원은 수지상 세포 또는 대식 세포와 같은 항원 제시 세포 등의 면역 시스템의 세포의 표면 상에 존재한다. T 세포 에피토프와 같은 항원 또는 이의 가공 산물은, 일 구현예에서, CAR 분자에 의해 결합된다. 즉, 항원 또는 이의 가공 산물은 T-림프구 (T 세포)와 특이적으로 반응할 수 있다. 일 구현예에서, 항원은 질환-관련 항원, 예를 들어 종양 항원, 바이러스 항원 또는 박테리아 항원이며, 에피토프는 이러한 항원으로부터 유래된다.
용어 "질환-관련 항원"은 광의적인 의미에서 질환과 관련있는 임의의 항원을 지칭하는 것으로 사용된다. 질환-관련 항원은 숙주의 면역 시스템을 자극해 질환에 대한 항원-특이적인 세포성 면역 반응 및/또는 체액성 항체 반응을 야기하게 될 에피토프를 함유한 분자이다. 따라서, 질환-관련 항원 또는 이의 에피토프는 치료학적 목적으로 사용될 수 있다. 질환-관련 항원은 미생물, 전형적으로 미생물 항원에 의한 감염과 관련있을 수 있거나, 또는 암, 전형적으로 종양과 관련있을 수 있다.
용어 "종양 항원"은 세포질, 세포 표면 및 세포 핵으로부터 유래될 수 있는 암 세포의 구성요소를 지칭한다. 구체적으로, 이 용어는 세포 내에서 또는 종양 세포 상의 표면 항원으로서 만들어지는 항원을 지칭한다. 종양 항원은 전형적으로 암 세포에 의해 선호적으로 발현되며 (예, 암 세포가 아닌 세포에 비해 암 세포에서 높은 수준으로 발현됨), 일부 경우에 암 세포에 의해서만 발현된다. 종양 항원의 예로는, 비-제한적으로, p53, ART-4, BAGE, β-카테닌/m, Bcr-abL CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27/m, CDK4/m, CEA, claudin 계열의 세포 표면 단백질, 예를 들어 CLAUDI
Figure pct00001
-6, CLAUDIN-18.2 및 CLAUDIN-12, c-MYC, CT, Cyp-B, DAM, ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gap 100, HAGE, HER-2/neu, HPV-E7, HPV-E6, HAST-2, hTERT (또는 hTRT), LAGE, LDLR/FUT, MAGE-A, 바람직하게는 MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE- A3, MAGE-A4, MAGE- A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11 또는 MAGE-A12, MAGE-B, MAGE-C, MART-1/Melan-A, MC1R, 미오신/m, MUC1, MUM-1 , MUM-2, MUM-3, NA88-A, NF1, NY-ESO-1, NY-BR-1, pl90 minor BCR-abL, Pml/RARa, PRAME, 프로테이나제 3, PSA, PSM, RAGE, RU1 또는 RU2, SAGE, SART-1 또는 SART-3, SCGB3A2, SCP1, SCP2, SCP3, SSX, SURVIVIN, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, TPTE, WT 및 WT-1 등이 있다.
용어 "바이러스 항원"은 항원 특성을 가진, 즉 개체에서 면역 반응을 불러일으킬 수 있는 임의의 바이러스 구성성분을 지칭한다. 바이러스 항원은 바이러스 리보핵산단백질 또는 외막 단백질일 수 있다.
용어 "박테리아 항원"은 항원 특성을 가진, 즉 개체에서 면역 반응을 불러일으킬 수 있는 임의의 박테리아 구성성분을 지칭한다. 박테리아 항원은 박테리아의 세포벽 또는 세포질 막으로부터 유래할 수 있다.
용어 "에피토프"는 면역 시스템에 의해 인지되는 항원과 같은 분자의 일부분 또는 단편을 의미한다. 예를 들어, 에피토프는 T 세포, B 세포 또는 항체에 의해 인지될 수 있다. 항원의 에피토프는 항원의 연속적인 부분 또는 비-연속적인 부분을 포함할 수 있으며, 아미노산 약 5개 내지 약 100개, 예를 들어 약 5개 내지 약 50개, 더 바람직하게 약 8개 내지 약 30개, 가장 바람직하게는 약 10개 내지 약 25개 길이일 수 있으며, 예를 들어, 에피토프는 바람직하게는 아미노산 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개 또는 25개 길이일 수 있다. 일 구현예에서, 에피토프는 아미노산 약 10개 내지 약 25개 길이이다. 용어 "에피토프"는 T 세포 에피토프를 포함한다.
용어 "T 세포 에피토프"는 MHC 분자를 통해 제시되었을 때 T 세포에 의해 인지되는 단백질의 일부분 또는 단편을 지칭한다. 용어 "주 조직적합성 복합체" 및 약어 "MHC"는 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 분자를 포함하며, 이는 모든 척추동물에 존재하는 유전자들의 복합체를 지칭한다. MHC 단백질 또는 분자는 면역 반응에서 림프구와 항원 제시 세포 또는 질병에 걸린 세포 간의 신호전달에 중요하며, MHC 단백질 또는 분자는 펩타이드 에피토프와 결합하여 T 세포 상의 T 세포 수용체에 의해 인지되도록 이를 제시한다. MHC에 의해 암호화되는 단백질은 세포 표면 상에 발현되며, T 세포에 대한 자기-항원 (세포 자체로부터 유래된 펩타이드 단편) 및 비-자기-항원 (예, 침입 미생물의 단편) 둘다를 제시한다. 클래스 I MHC/펩타이드 복합체의 경우에, 결합하는 펩타이드는 전형적으로 아미노산 약 8개 내지 약 10개 길이이지만, 더 길거나 또는 짧은 펩타이드도 유효할 수 있다. 클래스 II MHC/펩타이드 복합체의 경우, 결합하는 펩타이드는 전형적으로 아미노산 약 10개 내지 약 25개 길이이며, 구체적으로 아미노산 약 13개 내지 약 18개 길이이나, 더 긴 펩타이드 및 더 짧은 펩타이드도 유효할 수 있다.
일 구현예에서, 표적 항원은 종양 항원이며, 백신 항원 또는 이의 단편 (예, 에피토프)은 종양 항원으로부터 유래한다. 종양 항원은 일반적으로 다양한 암들에서 발현되는 것으로 알려진 "표준" 항원일 수 있다. 종양 항원은 또한 면역 시스템에 의해 기존에 인지된 바 없는 개별 종양에 특이적인 "신생-항원 (neo-antigen)"일 수 있다. 신생-항원 또는 신생-에피토프는 아미노산 변화를 야기하는 암 세포 게놈 내 하나 이상의 암-특이적인 돌연변이에 의해 만들어질 수 있다. 종양 항원이 신생-항원이라면, 백신 항원은 바람직하게는 하나 이상의 아미노산 변화를 포함하는 신생-항원의 에피토프 또는 단편을 포함한다.
펩타이드 및 단백질 항원은 아미노산 2-100개, 예를 들어, 아미노산 5개, 아미노산 10개, 아미노산 15개, 아미노산 20개, 아미노산 25개, 아미노산 30개, 아미노산 35개, 아미노산 40개, 아미노산 45개 또는 아미노산 50개 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, 펩타이드는 아미노산 50개 길이보다 더 길 수 있다. 일부 구현예에서, 펩타이드는 아미노산 100개 길이보다 더 길 수 있다.
본 발명에 따라, 항원 또는 이의 변이체는 CAR에 의해 인지되어야 한다. 바람직하게는, 항원 또는 변이체가 만일 CAR에 의해 인지된다면 적절한 공동-자극 신호의 존재시 항원 또는 이의 변이체를 인지하는 CAR를 보유한 T 세포의 자극, 감작 및/또는 증폭을 유도할 수 있다. 본 발명의 구현예의 맥락에서, 항원 또는 이의 변이체는 바람직하게는 세포의 표면 상에, 바람직하게는 항원 제시 세포의 표면 상에 존재한다. 질환에 걸립 세포의 표면에서 항원을 인지하면, 항원 (또는 항원을 발현하는 세포)에 대해 면역 반응이 발생할 수 있다.
본 발명의 다양한 측면들에서, 목표는 바람직하게는 CLDN6 또는 CLDN18.2와 같은 종양 항원을 발현하는 암 세포에 대해 면역 반응을 제공하고, CLDN6 또는 CLDN18.2와 같은 종양 항원을 발현하는 세포를 수반하는 암 질환을 치료하고자 하는 것이다. 바람직하게는, 본 발명은 CLDN6 또는 CLDN18.2와 같은 종양 항원을 발현하는 암 세포를 표적화하는 CAR-조작된 T 세포의 투여를 수반한다.
"세포 표면"은 당해 기술 분야에서 일반적인 의미로 사용되고, 단백질 및 기타 분자에 의해 결합하기 위해 접근가능한 세포의 외부를 포함한다. 항원은, 세포의 표면에 위치하고 세포에 첨가된 예를 들어 항원-특이 항체에 의해 결합하도록 접근가능하다면, 세포의 표면 상에 발현되는 것이다. 일 구현예에서, 세포의 표면 상에 발현된 항원은 CAR에 의해 인지되는 세포외 영역을 가진 내장형 (integral) 단백질이다.
용어 "세포외 영역" 또는 "엑소도메인"은, 본 발명의 맥락에서, 세포의 세포외 공간으로 향하며 바람직하게는 예를 들어, 세포의 외부에 위치한 항체 등의 분자에 결합함으로써, 세포의 외부로부터 접근가능한, 단백질과 같은 분자의 일부분을 의미한다. 바람직하게는, 이 용어는 하나 이상의 세포외 루프 또는 이의 도메인 또는 단편을 의미한다.
본 발명의 전체 측면들에 대한 일 구현예에서, 항원은 암 세포와 같은 질환에 걸린 세포에서 발현된다. 일 구현예에서, 항원은 암 세포와 같은 질환에 걸린 세포의 표면 상에 발현된다. 일 구현예에서, CAR은 세포외 도메인에 결합하거나, 또는 항원 또는 이의 변이체의 세포외 도메인 내 에피토프에 결합한다. 일 구현예에서, CAR은 살아있는 세포의 표면 상에 존재하는 항원 또는 이의 변이체의 천연 에피토프에 결합한다. 일 구현예에서, 항원은 claudin, 특히 claudin 6 또는 claudin 18.2이며, CAR은 claudin의 세포외 제1 루프에 결합한다. 일 구현예에서, T 세포에 의해 발현되거나 및/또는 T 세포 상에 존재할 경우에 CAR이 항원 제시 세포와 같은 세포 상에 존재하는 항원 또는 이의 변이체에 결합하면, T 세포의 자극, 감작 및/또는 증폭이 이루어진다. 일 구현예에서, T 세포에 의해 발현되거나 및/또는 T 세포 상에 존재할 경우에 CAR이 암 세포와 같이 질환에 걸린 세포 상에 존재하는 항원에 결합하면, 질환에 걸린 세포의 세포용해 및/또는 세포자살이 발생하며, 이때 T 세포는 바람직하게는 세포독성 인자, 예를 들어 퍼포린 및 그랜자임을 방출한다.
면역 체크포인트 저해제
특정 구현예에서, 면역 체크포인트 저해제는 본 발명에 기술된 다른 치료학적 물질과 조합하여 사용된다.
본 발명의 내용에서, "면역 체크포인트"는 T 세포 수용체의 항원 인지 규모와 특성을 제어하는 공동-자극성 신호 및 저해성 신호를 지칭한다. 특정 구현예에서, 면역 체크포인트는 저해성 신호이다. 특정 구현예에서, 저해성 신호는 PD-1과 PD-L1 간의 상호작용이다. 특정 구현예에서, 저해성 신호는 CD28 결합성을 대체하기 위한 CTLA-4와 CD80 또는 CD86 간의 상호작용이다. 특정 구현예에서, 저해성 신호는 LAG3와 MHC 클래스 II 분자 간의 상호작용이다. 특정 구현예에서, 저해성 신호는 TIM3와 갈렉틴 9 간의 상호작용이다.
본 발명의 내용에서, "면역 체크포인트 저해제"는 하나 이상의 체크포인트 단백질을 일부 또는 완전히 감소, 저해, 간섭 또는 조절하는 분자를 지칭한다. 특정 구현예에서, 면역 체크포인트 저해제는 면역 체크포인트와 관련된 저해성 신호를 방지한다. 특정 구현예에서, 면역 체크포인트 저해제는 면역 체크포인트와 관련된 저해성 신호전달을 교란하는 항체 또는 이의 단편이다. 특정 구현예에서, 면역 체크포인트 저해제는 저해성 신호전달을 교란하는 소분자이다. 특정 구현예에서, 면역 체크포인트 저해제는 체크포인트 차단제 단백질들 간의 상호작용을 방지하는 항체, 이의 단편 또는 항체 모방체, 예를 들어 PD-1과 PD-L1 간의 상호작용을 방지하는 항체 또는 이의 단편이다. 특정 구현예에서, 면역 체크포인트 저해제는 CTLA-4와 CD80 또는 CD86 간의 상호작용을 방지하는, 항체 또는 이의 단편이다. 특정 구현예에서, 면역 체크포인트 저해제는 LAG3와 이의 리간드, 또는 TIM-3와 이의 리간드 간의 상호작용을 방지하는 항체 또는 이의 단편이다. 체크포인트 저해제는 또한 분자 (또는 이의 변이체) 자체의 용해성 형태, 예를 들어 용해성 PD-L1 또는 PD-L1 융합체 형태일 수 있다.
"프로그램화된 사멸-1 (PD-1)" 수용체는 CD28 패밀리에 속하는 면역-저해성 수용체를 지칭한다. PD-1은 이전에 활성화된 T 세포 상에서 주로 생체내 발현되며, 이는 리간드 2종, PD-L1 및 PD-L2와 결합한다. 본 발명의 내용에서, 용어 "PD-1"은 인간 PD-1 (hPD-1), 변이체, 이소형 및 hPD-1의 종 호몰로그, 및 hPD-1과 공통적인 에피토프 하나 이상을 가진 유사체를 포함한다.
"프로그램화된 사멸 리간드-1 (PD-L1)"은 PD-1에 결합하였을 때 T 세포 활성화와 사이토카인 분비를 하향 조절하는 PD-1에 대한 세포 표면 당단백질 리간드 2종 중 하나 (나머지는 PD-L2임)이다. 본 발명의 내용에서, 용어 "PD-L1"은 인간 PD-L1 (hPD-L1), 변이체, 이소형 및 hPD-L1의 종 호몰로그, 및 hPD-L1과 공통적인 에피토프 하나 이상을 가진 유사체를 포함한다.
"세포독성 T 림프구 관련 항원-4 (CTLA-4)"는 T 세포 표면 분자로서, 면역글로불린 슈퍼패밀리에 속하는 구성원이다. 이 단백질은 CD80 및 CD86에 결합함으로써 면역 시스템을 하향 조절한다. 본 발명의 내용에서, 용어 "CTLA-4"는 인간 CTLA-4 (hCTLA-4), 변이체, 이소형 및 hCTLA-4의 종 호몰로그, 및 hCTLA-4와 공통적인 에피토프를 하나 이상 가진 유사체를 포함한다.
"림프구 활성화 유전자-3 (LAG3)"는 MHC 클래스 II 분자에 결합함으로써 림프구의 활성을 저해하는 것과 관련있는 저해성 수용체이다. 이 수용체는 Treg 세포의 기능을 강화하고, CD8+ 작동자 T 세포 기능을 저해한다. 본 발명의 내용에서, 용어 "LAG3"는 인간 LAG3 (hLAG3), 변이체, 이소형 및 hLAG3의 종 호몰로그, 및 하나 이상의 공통적인 에피토프를 가진 유사체를 포괄한다.
"T 세포막 단백질-3 (TIM3)"은 TH1 세포 반응을 저해함으로써 림프구 활성 저해에 참여하는 저해성 수용체이다. 이의 리간드는 갈렉틴 9로서, 이것은 다양한 타입의 암들에서 상향 조절된다. 본 발명의 내용에서, 용어 "TIM3"는 인간 TIM3 (hTIM3), 변이체, 이소형 및 hTIM3의 종 호몰로그, 및 하나 이상의 공통적인 에피토프를 가진 유사체를 포괄한다.
"B7 패밀리"는 수용체가 한정되지 않은 저해성 리간드이다. B7 패밀리는 종양 세포 및 종양 침윤성 세포 상에서 둘다 상향 조절되는 B7-H3 및 B7-H4를 포괄한다.
특정 구현예에서, 본 발명에 기술된 방법에서 이용하기 적합한 면역 체크포인트 저해제는 저해성 신호의 길항제, 예를 들어 PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG3, B7-H3, B7-H4 또는 TIM3를 표적화하는 항체이다. 이들 리간드들과 수용체는 Pardoll, D., Nature. 12: 252-264, 2012에서 검토된 바 있다.
특정 구현예에서, 면역 체크포인트 저해제는, 저해성 면역조절제로부터 신호전달을 교란 또는 저해하는, 항체 및 이의 항원-결합부이다. 특정 구현예에서, 면역 체크포인트 저해제는 저해성 면역조절제로부터의 신호전달을 교란 또는 저해하는 소분자이다.
특정 구현예에서, 저해성 면역조절제는 PD-1/PD-L1 신호전달 경로의 구성요소이다. 이에, 본 발명의 특정 구현예는 PD-1 수용체와 이의 리간드 PD-L1 간의 상호작용을 교란하는 항체 또는 이의 항원-결합부를 개체에게 투여하는 것을 제공한다. PD-1에 결합하여 PD-1과 이의 리간드 PD-L1 간의 상호작용을 교란하는 항체들은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 특정 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합부는 PD-1에 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합부는 PD-L1에 특이적으로 결합하여, 이와 PD-1의 상호작용을 저해하고 면역 활성을 높인다.
특정 구현예에서, 저해성 면역조절제는 CTLA4 신호전달 경로의 구성요소이다. 이에, 본 발명의 특정 구현예는 CTLA4를 표적화하여 CD80 및 CD86과의 상호작용을 교란하는 항체 또는 이의 항원-결합부를 개체에 투여하는 것을 제공한다.
특정 구현예에서, 저해성 면역조절제는 LAG3 (림프구 활성화 유전자 3) 신호전달 경로의 구성요소이다. 이에, 본 발명의 특정 구현예는 LAG3를 표적화하여 이와 MHC 클래스 II 분자와의 상호작용을 교란하는 항체 또는 이의 항원-결합부를 개체에 투여하는 것을 제공한다.
특정 구현예에서, 저해성 면역조절제는 B7 패밀리 신호전달 경로의 구성요소이다. 특정 구현예에서, B7 패밀리 구성원은 B7-H3 및 B7-H4이다. 이에, 본 발명의 특정 구현예는 B7-H3 또는 H4를 표적화하는 항체 또는 이의 항원-결합부를 개체에 투여하는 것을 제공한다. B7 패밀리는 임의의 정의된 수용체를 가지진 않지만, 이들 리간드는 종양 세포 또는 종양-침윤성 세포 상에서 상향 조절된다. 전임상 마우스 모델에서, 이들 리간드를 차단하면 항-종양 면역을 강화할 수 있는 것으로, 입증되어 있다.
특정 구현예에서, 저해성 면역조절제는 TIM3 (T 세포막 단백질 3) 신호전달 경로의 구성요소이다. 이에, 본 발명의 특정 구현예는 TIM3를 표적화하여 이와 갈렉틴 9의 상호작용을 교란하는 항체 또는 이의 항원-결합부를 개체에 투여하는 것을 제공한다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 표적화로, 예를 들어, T 세포 증식 증가, T 세포 활성화 강화 및/또는 사이토카인 (예를 들어, IFN-γ, IL2) 생산 증가에서 반영되는 바와 같이, 항-종양 면역 반응과 같은 면역 반응의 자극이 발생되는 한, 다른 면역 체크포인트들 역시 길항제 또는 항체에 의해 표적화될 수 있음을 이해할 것이다.
본 발명의 내용에서, 용어 "항체"는 이황화 결합에 의해 서로 연결된 적어도 중(H)쇄 2개와 경(L)쇄 2개를 포함하는 당단백질을 지칭한다. 용어 "항체"는 단일클론 항체, 재조합 항체, 인간 항체, 인간화된 항체 및 키메라 항체를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변부 (본원에서 VH로 약칭됨)와 중쇄 불변부로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변부 (본원에서 VL로 약칭됨)와 경쇄 불변부로 구성된다. VH 영역과 VL 영역은 프래임워크 영역 (FR)으로 지칭되는 더욱 보존적인 영역이 사이에 배치된 상보성 결정부 (CDR)로 지칭되는 과변이 영역들로 추가적으로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 CDR 3개와 FR 4개로 구성되며, 아미노 말단에서 카르복시 말단 방향으로 다음과 같은 순서로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변부들은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유하고 있다. 항체의 불변부는 면역 시스템의 다양한 세포 (예, 작동자 세포) 및 고전적인 보체 시스템의 제1 보체 (Clq) 등의 숙주 조직 또는 인자에 면역글로불린이 결합하는 것을 매개할 수 있다.
항체는, 비-제한적으로, 마우스, 랫, 토끼, 기니아피그 및 인간 등의, 여러가지 종들로부터 유래할 수 있다.
본원에 언급된 항체는 IgA, 예를 들어 IgA1 또는 IgA2, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgM 및 IgD 항체를 포함한다. 다양한 구현예들에서, 항체는 IgG1 항체이며, 보다 구체적으로는 IgG1, κ 또는 IgG1, λ 이소형 (즉, IgG1, κ, λ), IgG2a 항체 (예, IgG2a, κ, λ), IgG2b 항체 (예, IgG2b, κ, λ), IgG3 항체 (예, IgG3, κ, λ) 또는 IgG4 항체 (예, IgG4, κ, λ)이다.
항체의 "항원-결합부" (또는 간단하게, "결합부") 또는 "항원 결합 단편" (또는 간단하게 "결합 단편")이라는 용어 또는 유사 용어들은 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유한 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편들에 의해 수행될 수 있는 것으로 알려져 있다. 항체의 "항원-결합부"라는 용어에 포함되는 결합 단편의 예로는, (i) VL, VH, CL 및 CH 도메인들로 구성되는 일가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지부에서 이황화 결합에 의해 연결된 Fab 단편 2개를 포함하는 2가 단편, 즉 F(ab')2 단편; (iii) VH 도메인과 CH 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 싱글 팔의 VL 도메인과 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 구성되는 dAb 단편 (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546); (vi) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR); 및 (vii) 합성 링커에 의해 선택적으로 연결될 수 있는 2개 이상의 단리된 CDR들의 조합을 포함한다. 아울러, Fv 단편의 도메인 2개 VL 및 VH는 개별 유전자들에 의해 암호화되지만, 이들은 VL 영역과 VH 영역이 쌍을 형성하여 일가 분자 (단쇄 Fv (scFv)로 공지됨)를 형성하는 단백질 단쇄로서 만들 수 있는 합성 링커에 의한 재조합 방법을 이용해 서로 연결될 수 있다 (예를 들어, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; 및 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883을 참조함). 이러한 단쇄 항체는 또한 항체의 "항원 결합 단편"이라는 용어에 포괄되는 것으로 의도된다. 추가적인 예는, (i) 면역글로불린 힌지부 폴리펩타이드와 융합된 결합성 도메인 폴리펩타이드, (ii) 힌지부와 융합된 면역글로불린 중쇄 CH2 불변부, 및 (iii) CH2 불변부와 융합된 면역글로불린 중쇄 CH3 불변부를 포함하는, 결합성-도메인 면역글로불린 융합 단백질이다. 결합성 도메인 폴리펩타이드는 중쇄 가변부 또는 경쇄 가변부일 수 있다. 결합성-도메인 면역글로불린 융합 단백질은 US 2003/0118592 및 US 2003/0133939에 추가적으로 기술되어 있다. 이들 항체 단편은 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지된 통상적인 기법을 사용해 수득되며, 이들 단편은 온전한 항체와 동일한 방식으로 유용성을 스크리닝한다.
RNA 표적화
본원에서, 본 발명에 기술된 RNA는 투여 후, RNA의 적어도 일부가 표적 세포로 전달된다. 일 구현예에서, RNA의 적어도 일부는 표적 세포의 세포질로 전달된다. 일 구현예에서, RNA는 표적 세포에 의해 번역되어, 암호화된 펩타이드 또는 단백질을 생산한다.
본 발명의 일부 측면은 본 발명에 기술된 RNA (예, 사이토카인을 암호화하는 RNA 및 항원 또는 이의 변이체를 암호화하는 RNA)의 표적화된 전달을 수반한다.
일 구현예에서, 본 발명은 림프 시스템, 구체적으로 2차 림프 기관, 보다 구체적으로 비장으로의 표적화를 포함한다. 림프 시스템, 구체적으로 2차 림프 기관, 보다 구체적으로 비장으로의 표적화는, 투여되는 RNA가 항원 또는 이의 변이체를 암호화하는 RNA일 경우에, 특히 바람직하다.
일 구현예에서, 표적 세포는 비장 세포이다. 일 구현예에서, 표적 세포는 비장내 전문 항원 제시 세포와 같은 항원 제시 세포이다. 일 구현예에서, 표적 세포는 비장내 수지상 세포이다.
"림프 시스템"은 순환계의 일부이자, 림프액을 운반하는 림프관 네트워크를 포함하는 면역 시스템의 중요한 부분이다. 림프 시스템은 림프 장기, 림프관으로 된 이동 네트워크 및 순환성 림프액으로 구성된다. 일차 또는 중추 림프 장기는 미성숙 전구 세포로부터 림프구를 생성한다. 흉선 및 골수는 일차 림프 장기를 구성한다. 이차 또는 말초 림프 장기는 림프절과 비장을 포함하며, 성숙한 나이브 림프구를 유지시키고, 적응 면역 반응을 개시한다.
RNA는, RNA가 양이온성 지질, 및 선택적으로 부가적인 또는 보조 지질을 포함하는 리포좀에 결합되어 주사가능한 나노입자 제형을 형성하는, 소위 리포플렉스 제형에 의해 비장으로 전달할 수 있다. 리포좀은 에탄올 중의 지질 용액을 물 또는 적절한 수상에 주입함으로써 수득할 수 있다. RNA 리포플렉스 입자는 리포좀을 RNA와 혼합하여 제조할 수 있다. 비장을 표적화하는 RNA 리포플렉스 입자는 WO 2013/143683에 언급되어 있으며, 본원에 원용에 의해 포함된다. 음의 순 전하를 가진 RNA 리포플렉스 입자를 이용하여, 항원-제시 세포와 같은 비장 조직 또는 비장 세포, 구체적으로 수지상 세포를 선호적으로 표적화할 수 있는 것으로 밝혀져 있다. 이에, RNA 리포플렉스 입자가 투여된 후, 비장에서 RNA 축적 및/또는 RNA 발현이 이루어진다. 따라서, 본 발명의 RNA 리포플렉스 입자는 비장에서 RNA를 발현시키기 위해 이용할 수 있다. 일 구현예에서, RNA 리포플렉스 입자의 투여 후, 폐 및/또는 간에서의 RNA 축적 및/또는 RNA 발현은 발생하지 않거나, 또는 본질적으로 발생하지 않는다. 일 구현예에서, RNA 리포플렉스 입자의 투여 후, 비장내 전문 항원 제시 세포와 같은 항원 제시 세포에서 RNA 축적 및/또는 RNA 발현이 발생한다. 따라서, 본 발명의 RNA 리포플렉스 입자는 이러한 항원 제시 세포에서 RNA를 발현시키기 위해 이용할 수 있다. 일 구현예에서, 항원 제시 세포는 수지상 세포 및/또는 대식 세포이다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "RNA 리포플렉스 입자"는 지질, 특히 양이온성 지질과 RNA를 함유한 입자를 지칭한다. 양으로 하전된 리포좀과 음으로 하전된 RNA 간의 정전기적 상호작용으로 복합체화가 이루어지고, RNA 리포플렉스 입자가 자발적으로 만들어진다. 양으로 하전된 리포좀은 일반적으로 DOTMA와 같은 양이온성 지질 및 DOPE와 같은 부가적인 지질을 사용해 합성할 수 있다. 일 구현예에서, RNA 리포플렉스 입자는 나노입자이다.
본 발명의 내용에서, "양이온성 지질"은 양의 순 전하를 가진 지질을 지칭한다. 양이온성 지질은 지질 매트릭스에의 정전기적 상호작용을 통해 음으로 하전된 RNA에 결합한다. 일반적으로, 양이온성 지질은 스테롤, 아실 또는 다이아실 쇄와 같은 친지성 모이어티를 가지고 있으며, 전형적으로 지질 헤드 기는 양 전하를 띤다. 양이온성 지질의 예로는, 비-제한적으로 1,2-다이-O-옥타데세닐-3-트리메틸암모늄 프로판 (DOTMA), 다이메틸다이옥타데실암모늄 (DDAB); 1,2-다이올레오일-3-트리메틸암모늄 프로판 (DOTAP); 1,2-다이올레오일-3-다이메틸암모늄-프로판 (DODAP); 1,2-다이아실옥시-3-다이메틸암모늄 프로판; 1,2-다이알킬옥시-3- 다이메틸암모늄 프로판; 다이옥타데실다이메틸 암모늄 클로라이드 (DODAC), 2,3-다이(테트라데콕시)프로필-(2-하이드록시에틸)-다이메틸아자늄 (DMRIE), 1,2-다이미리스토일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (DMEPC), l,2-다이미리스토일-3-트리메틸암모늄 프로판 (DMTAP), 1,2-다이올레일옥시프로필-3-다이메틸-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드 (DORIE) 및 2,3-다이올레오일옥시-N-[2(스페르민 카르복사미드)에틸]-N,N-다이메틸-l-프로판아미늄 트리플루오로아세테이트 (DOSPA) 등이 있다. DOTMA, DOTAP, DODAC 및 DOSPA가 바람직하다. 특정 구현예에서, 양이온성 지질은 DOTMA 및/또는 DOTAP이다.
총 전하 : 음 전하의 비율과 RNA 리포플렉스 입자의 물리적 안정성을 조정하기 위해 부가적인 지질을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 부가적인 지질은 중성 지질이다. 본 발명의 내용에서, "중성 지질"은 순 전하가 0인 지질을 지칭한다. 중성 지질의 예로는, 비-제한적으로, 1,2-다이-(9Z-옥타데세노일)-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE), 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC), 다이아실포스파티딜 콜린, 다이아실포스파티딜 에탄올 아민, 세라마이드, 스핑고마이엘린, 세팔린, 콜레스테롤 및 세레브로사이드 등이 있다. 특정 구현예에서, 부가적인 지질은 DOPE, 콜레스테롤 및/또는 DOPC이다.
특정 구현예에서, RNA 리포플렉스 입자는 양이온성 지질과 부가적인 지질 둘다 포함한다. 예시적인 구현예에서, 양이온성 지질은 DOTMA이고, 부가적인 지질은 DOPE이다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 양이온성 지질 : 하나 이상의 부가적인 지질의 몰 비는 약 10:0 내지 약 1:9, 약 4:1 내지 약 1:2, 또는 약 3:1 내지 약 1:1이다. 특정 구현예에서, 상기한 몰 비는 약 3:1, 약 2.75:1, 약 2.5:1, 약 2.25:1, 약 2:1, 약 1.75:1, 약 1.5:1, 약 1.25:1 또는 약 1:1일 수 있다. 예시적인 구현예에서, 하나 이상의 양이온성 지질 : 하나 이상의 부가적인 지질의 몰 비는 약 2:1이다.
본 발명에 기술된 RNA 리포플렉스 입자는, 일 구현예에서, 약 200 nm 내지 약 1000 nm, 약 200 nm 내지 약 800 nm, 약 250 내지 약 700 nm, 약 400 내지 약 600 nm, 약 300 nm 내지 약 500 nm 또는 약 350 nm 내지 약 400 nm 범위의 평균 직경을 가진다. 특정 구현예에서, RNA 리포플렉스 입자의 평균 직경은 약 200 nm, 약 225 nm, 약 250 nm, 약 275 nm, 약 300 nm, 약 325 nm, 약 350 nm, 약 375 nm, 약 400 nm, 약 425 nm, 약 450 nm, 약 475 nm, 약 500 nm, 약 525 nm, 약 550 nm, 약 575 nm, 약 600 nm, 약 625 nm, 약 650 nm, 약 700 nm, 약 725 nm, 약 750 nm, 약 775 nm, 약 800 nm, 약 825 nm, 약 850 nm, 약 875 nm, 약 900 nm, 약 925 nm, 약 950 nm, 약 975 nm 또는 약 1000 nm이다. 일 구현예에서, RNA 리포플렉스 입자의 평균 직경은 약 250 nm 내지 약 700 nm 범위이다. 다른 구현예에서, RNA 리포플렉스 입자의 평균 직경은 약 300 nm 내지 약 500 nm 범위이다. 예시적인 구현예에서, RNA 리포플렉스 입자의 평균 직경은 약 400 nm이다.
본 발명의 RNA 리포플렉스 입자의 전하는 하나 이상의 양이온성 지질에 존재하는 전하와 RNA에 존재하는 전하의 총 합이다. 전하 비율은 하나 이상의 양이온성 지질에 존재하는 양 전하 : RNA에 존재하는 음 전하의 비율이다. 하나 이상의 양이온성 지질에 존재하는 양 전하 : RNA에 존재하는 음 전하의 전하 비율은 다음의 식으로 계산한다: 전하 비율 = [(양이온성 지질 농도 (mol)) * (양이온성 지질에 존재하는 양 전하의 총 수)] / [(RNA 농도 (mol)) * (RNA에 존재하는 음 전하의 총 수)].
생리학적 pH에서 비장을 표적화하는 본 발명에 기술된 RNA 리포플렉스 입자는 바람직하게는 양 전하 : 음 전하의 전하 비율 약 1.9:2 내지 약 1:2와 같이 음의 순 전하를 가진다. 특정 구현예에서, 생리학적 pH에서 RNA 리포플렉스 입자의 양 전하 : 음 전하의 전하 비율은 약 1.9:2.0, 약 1.8:2.0, 약 1.7:2.0, 약 1.6:2.0, 약 1.5:2.0, 약 1.4:2.0, 약 1.3:2.0, 약 1.2:2.0, 약 1.1:2.0, 또는 약 1:2.0이다.
사이토카인, 예를 들어 PK-연장된 사이토카인, 특히 본원에 언급된 바와 같은 PK-연장된 인터루킨은, 표적 장기 또는 조직으로 RNA를 선호적으로 전달하기 위한 제형으로 사이토카인을 암호화하는 RNA를 개체에 투여하는 것을 포함하여, 개체의 표적 장기 또는 표적 조직으로 전달될 수 있다.
일 구현예에서, 표적 장기는 림프 시스템, 특히 2차 림프 기관, 보다 구체적으로는 비장이며, 표적 조직은 림프 시스템의 조직, 2차 림프 기관의 조직, 보다 구체적으로는 비장 조직이다. 이러한 표적 조직으로 사이토카인을 전달하는 것이, 특히 이러한 장기 또는 조직에 사이토카인이 존재하는 것이 요망된다면 (예를 들어, 면역 반응을 유도하기 위해, 특히 사이토카인이 T 세포의 감작 중에 필요한 경우 또는 잔류 면역 세포의 활성화를 위해), 바람직하며, (예를 들어, 사이토카인은 전신 독성을 가지므로) 사이토카인이 전신에, 특히 현저한 양으로 존재하는 것은 바람직하지 않다. 적합한 사이토카인에 대해 특히 바람직한 예는 T 세포 감작에 참여하는 사이토카인이다.
사이토카인을 개체의 표적 장기 또는 표적 조직에 전달하는 다른 구현예에서, 표적 장기는 간이고, 표적 조직은 간 조직이다. 이러한 표적 조직에 사이토카인을 전달하는 것이 바람직하며, 특히 이러한 장기 또는 조직에 사이토카인이 존재하는 것이 요망되거나 및/또는 사이토카인을 다량으로 발현시키는 것이 요망되거나 및/또는 사이토카인이 전신에 특히 현저한 양으로 존재하는 것이 요망되거나 또는 요구되는 경우에, 바람직하다.
일 구현예에서, 사이토카인을 암호화하는 RNA는 간을 표적으로 하는 제형으로 투여된다. 이러한 제형은 본원에 기술된다. 적합한 사이토카인에 대한 예로는 IL2, IL7 또는 IL21, 이들의 단편 및 변이체, 및 이들 사이토카인, 단편 및 변이체의 융합 단백질, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같은 PK-연장된 사이토카인을 포함한다. 적합한 사이토카인에 대한 특히 바람직한 예는 T 세포 증식 및/또는 유지에 참여하는 사이토카인이다.
RNA 전달 시스템은 고유한 간 선호성을 가진다. 이는 지질-기반의 입자, 양이온성 및 중성 나노입자, 특히 지질 나노입자, 예를 들어 리포좀, 나노마이셀 및 친지성 리간드와 바이오접합체 형태로서 적용된다. 간 축적은 간 혈관 구조 또는 지질 대사 (리포좀 및 지질 또는 콜레스테롤 접합체)의 불연속적인 특성에 의해 유발된다.
RNA를 간으로 생체내 전달하는 경우, 분해를 방지함으로써 RNA를 간으로 수송하기 위한 약물 전달 시스템을 이용할 수 있다. 예를 들어, 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)-코팅된 표면과 mRNA-함유성 코어로 구성되는 폴리플렉스 나노마이셀은, 나노마이셀이 생리학적 조건에서 우수한 생체내 RNA 안정성을 제공하므로, 유용한 시스템이다. 아울러, 조밀한 PEG 울타리로 구성된, 폴리플렉스 나노마이셀 표면에 의해 제공되는 잠행성은 숙주 면역 방어를 효과적으로 회피한다.
약학적 조성물
본원에 기술된 물질은 약학적 조성물 또는 약제로 투여될 수 있으며, 임의의 적합한 약학적 조성물의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 전체 측면들에 대한 일 구현예에서, CAR을 발현하도록 유전자 변형된 T 세포, 사이토카인을 암호화하는 핵산 또는 항원 또는 이의 변이체를 암호화하는 핵산 등의 본원에 기술된 구성성분들은, 함께 또는 각각 개별적으로, 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있으며, 선택적으로 하나 이상의 보강제, 안정화제 등을 포함할 수 있는, 약학적 조성물 형태로 투여될 수 있다. 일 구현예에서, 약학적 조성물은 치료학적 치료 또는 예방학적 치료, 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이, 암 질환 등의 항원을 수반하는 질환을 치료 또는 예방하는데 이용하기 위한 것이다.
용어 "약학적 조성물"은 치료학적으로 유효한 물질을, 바람직하게는 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제와 함께 포함하는 제형을 의미한다. 이러한 약학적 조성물은, 약학적 조성물을 개체에 투여함으로써 질환 또는 장애의 중증도를 낮추거나, 방지하거나 또는 치료하기 위해 이용가능하다. 약학적 조성물은 또한 약학적 제형으로서 당해 기술 분야에 공지되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 바람직하게는 하나 이상의 보강제를 포함하거나, 또는 하나 이상의 보강제와 함께 투여할 수 있다. 용어 "보강제"는 면역 반응을 연장, 강화 또는 가속화하는 화합물을 지칭한다. 보강제는 오일 에멀젼 (예, 프로인드 보강제), 미네랄 화합물 (예, 알럼), 박테리아 생산물 (예, 백일해균 독소) 또는 면역-자극 복합체와 같은 이종적인 화합물 군을 포함한다. 보강제의 예로는, 비-제한적으로, LPS, GP96, CpG 올리고데옥시뉴클레오티드, 성장인자 및 사이토카인, 예를 들어 모노카인, 림포카인, 인터루킨, 케모카인 등이 있다. 케모카인은 IL1, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL12, IFNα, IFNγ, GM-CSF, LT-a일 수 있다. 추가적으로 알려진 보강제는 알루미늄 하이드록사이드, 프로인드 보강제 또는 오일, 예를 들어 Montanide® ISA51이다. 본 발명에 사용하기 적합한 다른 보강제로는 Pam3Cys과 같은 리포펩타이드 등이 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 일반적으로 "약제학적 유효량"으로, "약제학적으로 허용가능한 제제"로 적용된다.
용어 "약제학적으로 허용가능한"은 약학적 조성물의 활성 성분의 작용과 상호작용하지 않는 물질의 무독성을 의미한다.
용어 "약제학적 유효량" 또는 "치료학적 유효량"은 단독으로 또는 추가적인 투여와 더불어 원하는 반응 또는 원하는 효과를 달성하는 양을 의미한다. 특정 질환을 치료하는 경우에, 원하는 반응은 바람직하게는 질환의 진행 저해를 의미하다. 이는 질환의 진척 속도를 늦추는 것을 포함하며, 구체적으로 질환의 진척을 중단시키거나 또는 역전시키는 것을 포함한다. 질환의 치료에서 원하는 반응은 또한 이러한 질환 또는 장애의 개시 지연 또는 개시 예방일 수 있다. 본 발명에 기술된 조성물의 유효량은 치료할 병태, 질환의 중등도, 나이, 신체 상태, 키 및 체중 등의 환자의 개별 매개변수, 치료 기간, (존재하는 경우) 동반되는 요법의 유형, 구체적인 투여 경로 및 유사 인자에 따라 결정될 것이다. 따라서, 본 발명에 기술된 조성믈의 투여 용량은 이러한 다양한 매개변수에 따라 결정될 수 있다. 환자에서 반응이 1차 투여로 충분하지 않을 경우, 이 보다 고 용량 (또는 효과적으로는 다른, 보다 국지적인 투여 경로에 의해 달성되는 더 높은 용량)을 사용할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 염, 완충제, 보존제, 그리고 선택적으로 다른 치료학적 물질을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물에 사용하기 적합한 보존제로는, 비-제한적으로, 벤즈알코늄 클로라이드, 클로로부탄올, 파라벤 및 티메로살 등이 있다.
본 발명의 내용에서, 용어 "부형제"는 본 발명의 약학적 조성물에 존재할 수 있지만 활성 성분이 아닌 물질을 지칭한다. 부형제에 대한 예로는, 비-제한적으로, 담체, 결합제, 희석제, 윤활제, 증점제, 계면활성제, 보존제, 안정화제, 유화제, 완충제, 착향제 또는 착색제 등이 있다.
용어 "희석제"는 희석하는 물질 및/또는 묽게 하는 물질을 의미한다. 또한, 용어 "희석제"는 유체, 액체 또는 고체 현탁물 및/또는 혼합 매질 중 어느 하나를 포함한다. 적합한 희석제의 예로는 에탄올, 글리세롤 및 물 등이 있다.
용어 "담체"는 약학적 조성물의 투여를 쉽게 만들거나, 강화하거나 또는 투여를 수행할 수 있게 하기 위해 활성 성분과 조합되는 천연, 합성, 유기, 무기성일 수 있는 성분을 지칭한다. 본 발명의 내용에서, 담체는, 개체에 투여하기 적합한, 하나 이상의 혼용가능한 고체 또는 액체 충전제, 희석제 또는 캡슐화 물질일 수 있다. 적합한 담체로는, 비-제한적으로, 멸균수, 링거, 링거 락테이트, 멸균 소듐 클로라이드 용액, 등장성 식염수, 폴리알킬렌 글리콜, 수소화 나프탈렌, 특히, 생체적합한 락티드 폴리머, 락티드/글리콜라이드 코폴리머 또는 폴리옥시에틸렌/폴리옥시-프로필렌 코폴리머 등이 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 등장성 식염수를 포함한다.
치료학적 용도를 위한 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제는 약학 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R Gennaro edit. 1985)에 기술되어 있다.
약제학적 담체, 부형제 또는 희석제는 의도한 투여 경로 및 표준 약제학 실무에 따라 선택할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명에 기술된 약학적 조성물은 정맥내, 동맥내, 피하, 진피내 또는 근육내로 투여할 수 있다. 특정 구현예에서, 약학적 조성물은 국소 또는 전신 투여용으로 제형화된다. 전신 투여는 위장관을 통한 흡수를 수반하는 장 투여 또는 비경구 투여를 포함할 수 있다. 본 발명의 내용에서, "비경구 투여"는 정맥내 주사 등의 위장관을 통해 이루어지는 것 이외의 다른 임의의 방식으로 투여하는 것을 의미한다. 바람직한 구현예에서, 약학적 조성물은 전신 투여용으로 제형화된다. 다른 바람직한 구현예에서, 전신 투여는 정맥내 투여에 의한 것이다.
본 발명의 전체 측면들에 대한 일 구현예에서, 사이토카인을 암호화하는 핵산 또는 항원 또는 이의 변이체를 암호화하는 핵산은 전신으로 투여한다. 본 발명의 전체 측면들에 대한 일 구현예에서, 항원 또는 이의 변이체를 코딩하는 핵산의 전신 투여 후, 항원 또는 이의 변이체는 비장에서 발현된다. 본 발명의 전체 측면들에 대한 일 구현예에서, 항원 또는 이의 변이체를 코딩하는 핵산의 전신 투여 후, 항원 제시 세포, 바람직하게는 전문 항원 제시 세포에서 항원 또는 이의 변이체의 발현이 이루어진다. 일 구현예에서, 항원 제시 세포는 수지상 세포, 대식세포 및 B 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명의 전체 측면들에 대한 일 구현예에서, 항원 또는 이의 변이체를 코딩하는 핵산의 전신 투여 후, 폐 및/또는 간에서 항원 또는 이의 변이체는 전혀 또는 본질적으로 발현되지 않는다. 본 발명의 전체 측면들에 대한 일 구현예에서, 항원 또는 이의 변이체를 코딩하는 핵산의 전신 투여 후, 항원 또는 이의 변이체의 발현은 폐에서 발현되는 양의 적어도 5배이다.
본원에서, 용어 "공동-투여"는 여러가지 화합물 또는 조성물 (예, 인터루킨을 암호화하는 RNA 및 항원 또는 이의 변이체를 암호화하는 RNA)을 동일한 환자에게 동시에, 본질적으로 동일한 시기에, 또는 순차적으로 투여하는 방식을 의미한다. 만일 투여가 동시에 이루어지는 경우, 여러가지 화합물 또는 조성물이 동일한 조성물 형태로 투여되어야 하는 것은 아니다.
치료
본원에 기술된 물질, 조성물 및 방법을 이용해, 질환, 예를 들어 항원을 발현하는 질병에 걸린 세포의 존재를 특징으로 하는 질환에 걸린 개체를 치료할 수 있다. 특히 바람직한 질환은 암 질환이다. 예를 들어, 만일 항원이 바이러스로부터 유래된다면, 물질, 조성물 및 방법은 바이러스에 의해 유발되는 바이러스성 질환을 치료하는데 유용할 수 있다. 만일 항원이 종양 항원이라면, 물질, 조성물 및 방법은 암 세포가 이러한 종양 항원을 발현하는 암 질환을 치료하는데 유용할 수 있다.
일 구현예에서, 본원은 개체에서 면역 반응을 유도하는 방법에 대한 것이다. 예시적인 구현예에서, 면역 반응은 암에 대한 것이다.
용어 "질환"은 개체의 신체에 영향을 미치는 비정상적인 병태를 지칭한다. 질환은 종종 특정 증상 및 신호와 관련있는 의학적인 상태로서 해석된다. 질환은 감염성 질환과 같은 외부 원인으로부터 기원한 인자에 의해 유발될 수 있거나, 또는 자가면역 질환과 같은 내부 기능부전에 의해 유발될 수 있다. 인간에서, "질환"은 보다 넒은 의미에서 개체와 접촉시 질병이 병을 앓고 있는 개체에게 통증, 기능부전, 괴로움, 사회적 문제 또는 사망 또는 비슷한 문제를 유발하는 임의의 병태를 지칭하기 위해 사용된다. 보다 넓은 의미에서, 이는 때때로 상해, 불능, 장애, 증후군, 감염, 독립된 증상, 일탈 행위 및 구조적 및 기능적인 비정형성 변형을 포함하며, 다른 맥락 및 다른 목적에서, 이는 구별할 수 있는 범주로 간주될 수 있다. 질환은, 여러가지 질환으로 인한 위축 및 생활이 개체의 삶에 대한 관점과 성격을 바꿀 수 있으므로, 일반적으로 개체에게 신체적으로뿐 아니라 감정적으로 영향을 미친다.
본 맥락에서, 용어 "치료", "치료하는" 또는 "치료학적 개입"은 질환 또는 장애와 같은 병태를 퇴치할 목적으로 개체를 관리 및 돌보는 것을 의미한다. 이 용어는 증상 또는 합병증을 완화하거나, 질환, 장애 또는 병태의 진행을 지연하거나, 증상 및 합병증을 완화 또는 경감하거나, 및/또는 질환, 장애 또는 병태를 치유 또는 해결하거나 아울러 병태를 예방하기 위해, 치료학적으로 효과적인 화합물의 투여 등의, 병에 걸린 개체로부터 소정의 병태에 대한 전 범위 치료를 포괄하는 것으로 의도되며, 이때 예방은 질환, 병태 또는 장애를 퇴치하기 위한 목적으로 개체를 관리 및 돌보는 것으로서 이해되어야 하며, 증상 또는 합병증의 개시를 방지하기 위한 활성 화합물의 투여를 포함한다.
용어 "치료학적 치료"는 개체의 건강 상태를 개선하거나 및/또는 개체의 수명을 연장(증가)하는 임의의 치료를 의미한다. 이러한 치료는 개체에서 질환의 소거, 개체에서 질환 진행의 정지 또는 서행, 개체에서 질환 진행의 저해 또는 서행, 개체에서 증상의 빈도 또는 중증도 감소, 및/또는 질환을 현재 앓고 있거나 예전에 걸린 적 있는 개체에서 재발 감소일 수 있다.
용어 "예방학적 치료" 또는 "예방적 치료"는 개체에서 질환 발생을 방지하기 위해 의도되는 모든 치료를 의미한다. 용어 "예방학적 치료" 또는 "예방적 치료"는 본원에서 상호 호환적으로 사용된다.
용어 "개인" 및 "개체"는 본원에서 상호 호환적으로 사용된다. 이들 용어는, 질환 또는 장애 (예를 들어, 암)에 걸릴 수 있거나 또는 취약할 수 있는 인간 또는 기타 포유류 (예, 마우스, 랫, 토끼, 개, 고양이, 소, 돼지, 양, 말 또는 영장류)를 지칭하지만, 질환 또는 장애에 걸렸을 수 있거나 또는 걸리지 않았을 수 있다. 다수 구현예들에서, 개체는 인간이다. 달리 명시되지 않은 한, 용어 "개인" 및 "개체"는 특정 연령을 의미하는 것은 아니며, 따라서 성인, 노인, 어린이 및 신생아를 포괄한다. 본 발명의 구현예에서, "개체" 또는 "개인"은 "환자"이다.
용어 "환자"는 치료가 필요한 개인 또는 개체, 구체적으로 질환에 걸린 개인 또는 개체를 의미한다.
본 발명의 일 구현예에서, 목표는 종양 항원을 발현하는 암 세포 등의 항원을 발현하는 질환에 걸린 세포에 대해 면역 반응을 제공하는 것이며, 종양 항원과 같은 항원을 발현하는 세포를 수반하는 암 질환과 같은 질환을 치료하고자 하는 것이다.
치료학적이거나 또는 일부 또는 완전히 예방적일 수 있는 항원에 대해 면역 반응이 유발될 수 있다. 본원에 기술된 약학적 조성물은 면역 반응을 유도 또는 강화하기 위해 적용가능하다. 본원에 기술된 약학적 조성물은 따라서 항원을 수반한 질환을 예방학적 및/또는 치료학적으로 치료하는데 이용가능하다.
본원에서, "면역 반응"은 항원 또는 항원을 발현하는 세포에 대해 일체화된 신체 반응을 지칭하며, 이는 세포성 면역 반응 및/또는 체액성 면역 반응을 지칭한다. 세포성 면역 반응은, 비-제한적으로, 항원을 발현하는 세포에 대한 세포성 반응을 포함한다. 이러한 세포는 세포 표면에 항원의 발현을 특징으로 하거나, 또는 클래스 I 또는 클래스 II MHC 분자를 이용한 항원의 제시를 특징으로 할 수 있다. 세포성 반응은, 면역 반응을 조절함으로써 중추적인 역할을 수행하는 헬퍼 T 세포 (CD4+ T 세포로도 지칭됨) 또는 감염된 세포 또는 암 세포에 세포자살을 유도하는 살상 세포 (세포독성 T 세포, CD8+ T 세포 또는 CTL로도 지칭됨)로서 분류될 수 있는, T 림프구에 관한 것이다. 일 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물의 투여는 하나 이상의 종양 항원을 발현하는 암 세포에 대한 항-종양성 CD8+ T 세포 반응의 자극을 수반한다.
본 발명은 보호적, 예방적, 예방학적 및/또는 치료학적일 수 있는 면역 반응을 고려한다. 본 발명의 내용에서, "면역 반응을 유도한다 [또는 유도하는]"는 유도하기 전 특정 항원에 대한 면역 반응이 없다는 것을 의미할 수 있거나, 또는 유도하기 전 특정 항원에 대한 면역 반응이 기저 수준으로 존재하고 유도 후 강화되는 것을 의미할 수 있다. 따라서, "면역 반응을 유도한다 [또는 유도하는]"는 "면역 반응을 강화한다 [또는 강화하는]"를 포함한다.
용어 "면역요법"은 면역 반응의 유도 또는 강화에 의한 질환 또는 병태의 치료를 의미한다.
용어 "면역화" 또는 "백신 접종"은 면역 반응을 유도하기 위한 목적으로, 예를 들어, 치료학적 또는 예방학적 이유로, 항원을 개체에 투여하는 것을 의미한다.
일 구현예에서, 본원은 본원에 기술된 바와 같은 RNA 입자 등의 RNA 제형을 투여하는 구현예를 고려한다.
이에, 본 발명은 항원을 수반하는 질환, 바람직하게는 암 질환의 예방학적 및/또는 치료학적 치료에 사용하기 위한 본 발명에 기술된 RNA에 관한 것이다.
용어 "대식 세포"는 단핵구의 분화에 의해 만들어진 식세포의 하위군을 지칭한다. 염증, 면역 사이토카인 또는 미생물 산물에 의해 활성화된 대식 세포는 비-특이적으로 탐식 작용을 수행하여, 수소분해성 및 산화성 공격에 의해 대식 세포 내 외인성 병원체를 살상하여 병원체를 분해한다. 분해된 단백질로부터 유래된 펩타이드는 대식 세포의 세포 표면 상에 제시되고, 이는 T 세포에 의해 인지될 수 있으며, B 세포 표면 상의 항체와 직접 상호작용하여, T 세포 및 B 세포를 활성화하고 면역 반응을 추가적으로 자극할 수 있다. 대식 세포는 항원-제시 세포 클래스에 속한다. 일 구현예에서, 대식 세포는 비장 대식 세포이다.
용어 "수지상 세포" (DC)는 항원 제시 세포 클래스에 속하는 식세포의 다른 하위종을 지칭한다. 일 구현예에서, 수지상 세포는 조혈 골수 전구 세포로부터 유래된다. 이들 전구 세포는 먼저 미성숙 수지상 세포로 변환된다. 이들 미성숙 세포는 높은 탐식 활성과 낮은 T 세포 활성화 가능성을 특징으로 한다. 미성숙 수지상 세포는 바이러스 및 박테리아 등의 병원체에 대해 주변 환경을 계속적으로 샘플링한다. 미성숙 수지상 세포가 제시가능한 항원과 접촉하게 되면, 그 세포는 성숙한 수지상 세포로 활성화되어, 비장 또는 림프절로의 이동하게 된다. 미성숙 수지상 세포는 병원체를 탐식하여, 이의 단백질을 작은 조각으로 분해하고, 성숙화되면 이들 조각들을 MHC 분자를 이용해 세포 표면에 제시한다. 동시에, 이들 세포는 CH80, CH86 및 CH40과 같은 T 세포 활성화에서 공동-수용체로서 작용하는 세포-표면 수용체를 상향 조절하여, 이의 T 세포 활성화 능력을 크게 강화한다. 이들 세포는 또한 수지상 세포가 혈류를 통해 비장으로 이동하거나 또는 림프 시스템을 통해 림프절로 이동하게 유도하는 주화성 수용체인 CCR7을 상향 조절한다. 여기서, 이들 세포는 항원-제시 세포로 작용하며, 비-항원 특이적인 공동-자극 신호와 동시에, 헬퍼 T 세포 및 살상 T 세포뿐 아니라 항원 제시에 의해 B 세포를 활성화한다. 따라서, 수지상 세포는 T 세포-관련 면역 반응 또는 B 세포-관련 면역 반응을 활성적으로 유도할 수 있다. 일 구현예에서, 수지상 세포는 비장의 수지상 세포이다.
용어 "항원 제시 세포" (APC)는 세포의 표면 상에 (또는 표면에) 하나 이상의 항원 또는 항원 단편을 나열, 획득 및/또는 제시할 수 있는 다양한 세포이다. 항원-제시 세포는 전문 항원 제시 세포 및 비-전문 항원 제시 세포로 구분될 수 있다.
용어 "전문 항원 제시 세포"는 나이브 T 세포와의 상호작용에 필요한 주 조직적합성 복합체 클래스 II (MHC 클래스 II) 분자를 구성적으로 발현하는 항원 제시 세포이다. T 세포가 항원 제시 세포의 막 상에 MHC 클래스 II 분자 복합체와 상호작용하면, 항원 제시 세포는 T 세포의 활성화를 유도하는 공동-자극성 분자를 생산하게 된다. 전문 항원 제시 세포는 수지상 세포 및 대식 세포를 포함한다.
용어 "비-전문 항원 제시 세포"는 인터페론-γ와 같은 특정 사이토카인에 의한 자극시 MHC 클래스 II 분자를 구성적으로 발현하지 않는 항원 제시 세포를 지칭한다. 예를 들어, 비-전문 항원 제시 세포는 섬유모세포, 흉선 상피 세포, 갑상선 상피 세포, 신경교 세포, 췌장 베타 세포 또는 혈관 내피 세포를 포함한다.
"항원 가공 처리"는 항원을 가공 처리 산물로 분해하는 것을 의미하며, 처리 산물은 항원의 단편 (예, 단백질의 펩타이드로의 분해) 및 특정 T 세포에 대한 항원 제시 세포와 같이 세포에 의해 제시하기 위한 MHC 분자와 이들 하나 이상의 단편의 (예, 결합을 통한) 조합물이다.
용어 "항원을 수반하는 질환", "항원을 발현하는 세포를 수반한 질환" 또는 유사한 용어들은 항원이 연루된 임의 질환, 예를 들어 항원의 존재를 특징으로 하는 질환을 의미한다. 이러한 질환은 감염성 질환 또는 암 질환 또는 간단히 암일 수 있다. 전술한 바와 같이, 항원은 종양-관련 항원, 바이러스 항원 또는 박테리아 항원과 같은 질환-관련 항원일 수 있다. 바람직하게는, 항원을 수반하는 질환은 항원을 바람직하게는 세포 표면 상에 발현하는 세포를 수반하는 질환이다.
용어 "감염성 질환"은 개체에서 개체로 또는 유기체에서 유기체로 전파될 수 있으며, 미생물 물질 (예, 감기)에 의해 유발되는 임의 질환을 지칭한다. 감염성 질환은 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 바이러스, 박테리아 및 기생충에 의해 각각 유발되는 바이러스성 질환, 박테리아성 질환 또는 기생충 질환을 포함한다. 이런 점에서, 감염성 질환은, 예를 들어, 간염, 성 접촉에 의해 전파되는 질환 (예, 클라미디아 또는 임질), 결핵, HIV/후천성 면역결핍 증후군 (AIDS), 디프테리아, B형 간염, C형 간염, 콜레라, 중증 급성 호흡 증후군 (SARS), 조류 독감 및 인플루엔자일 수 있다.
용어 "암 질환" 또는 "암"은 개체에서 전형적으로 통제를 벗어난 세포 증식을 특징으로 하는 병리학적 병태를 지칭하거나 또는 이를 의미한다. 암의 예로는, 비-제한적으로, 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병 등이 있다. 보다 상세하게는, 이러한 암의 예로는 골암, 혈액암, 폐암, 간암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부암 또는 안내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문 부위의 암, 위암, 대장암, 유방암, 전립선암, 자궁암, 성 및 생식 기관의 암종, 호지킨 질환, 식도암, 소장암, 내분비계 암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 방광암, 신장암, 신장 세포 암종, 신우 암종, 중추 신경계 (CNS)의 신생물, 신경외배엽 암, 척추 종양, 신경교종, 수막종 및 뇌하수체 선종을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서, 용어 "암"은 암 전이를 또한 포함한다.
암 치료에서 병용 전략 (combination strategy)은, 단일요법 방식의 효과 보다 더 높은 것으로 간주될 수 있는, 달성되는 상승 효과로 인해 적합할 수 있다. 일 구현예에서, 약학적 조성물은 면역치료제와 함께 투여된다. 본원에서 "면역치료제"는 특이적인 면역 반응 및/또는 면역 작동자 기능(들)을 활성화하는데 관여할 수 있는 임의 물질을 의미한다. 본 발명은 면역치료제로서 항체의 사용을 고려한다. 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 항체는, 세포자살 유도, 신호 전달 경로의 구성요소의 차단 또는 종양 세포의 증식 저해 등의, 다양한 기전을 통해 암 세포에 대해 치료학적 효과를 달성할 수 있다. 특정 구현예에서, 항체는 단일클론 항체이다. 단일클론 항체는 항체-의존적인 세포 매개 세포독성 (ADCC)을 통해 세포 사멸을 유도할 수 있거나, 또는 보체 단백질에 결합하여, 보체 의존적인 세포독성 (CDC)으로 알려진 직접적인 세포 독성을 유도할 수 있다. 본 발명과 조합하여 사용될 수 있는 항암 항체 및 잠재적인 항체 표적(괄호 안)에 대한 비-제한적인 예로는, 아바고보맵 (Abagovomab)(CA-125), 압시시맵 (Abciximab)(CD41), 아데카투무맵 (Adecatumumab)(atumumab)(EpCAM), 아푸투주맵 (Afutuzumab)(CD20), 알라시주맵 (Alacizumab pegol)(VEGFR2), 알투모맵 펜테테이트 (Altumomab pentetate)(CEA), 아마투시맵 (Amatuximab)(MORAb-009), 아나투모맵 마페나톡스 (Anatumomab mafenatox)(TAG-72), 아폴리주맵 (Apolizumab)(HLA-DR), 아르시투모맵 (Arcitumomab)(CEA), 아테졸리주맵 (Atezolizumab)(PD-L1), 바비투시맵 (Bavituximab)(포스파티딜세린), 벡투모맵 (Bectumomab)(CD22), 벨리무맵 (Belimumab)(BAFF), 베바시주맵 (Bevacizumab)(VEGF-A), 비바투주맵 메르탄신 (Bivatuzumab mertansine)(CD44 v6), 빌리나투모맵 (Blinatumomab)(CD19), 브렌투시맵 베도틴 (Brentuximab vedotin)(CD30 TNFRSF8), 칸투주맵 메르탄신 (Cantuzumab mertansin)(mucin CanAg), 칸투주맵 라브탄신 (Cantuzumab ravtansine)(MUC1), 카프로맵 펜데티드 (Capromab pendetide)(전립선 암종 세포), 카를루맵 (Carlumab)(CNT0888), 카투맥소맵 (Catumaxomab)(EpCAM, CD3), 세투시맵 (Cetuximab)(EGFR), 시타투주맵 보가톡스 (Citatuzumab bogatox)(EpCAM), 시수투무맵 (Cixutumumab)(IGF-1 수용체), 클라우디시맵 (Claudiximab)(Claudin), 클리바투주맵 테트라세탄 (Clivatuzumab tetraxetan)(MUC1), 코나투무맵 (Conatumumab)(TRAIL-R2), 다세투주맵 (Dacetuzumab)(CD40), 달로투주맵 (Dalotuzumab)(인슐린-유사 성장인자 I 수용체), 데노수맵 (Denosumab)(RANKL), 데투모맵 (Detumomab)(B-림프종 세포), 드로지투맵 (Drozitumab)(DR5), 에크로멕시맵 (Ecromeximab)(GD3 강글리오시드), 에드레콜로맵 (Edrecolomab)(EpCAM), 엘로투주맵 (Elotuzumab)(SLAMF7), 에나바투주맵 (Enavatuzumab)(PDL192), 엔시투시맵 (Ensituximab)(NPC-1C), 에프라투주맵 (Epratuzumab)(CD22), 에르투막소맵 (Ertumaxomab)(HER2/neu, CD3), 에타라시주맵 (Etaracizumab)(인테그린 αγβ3), 파를레투주맵 (Farletuzumab)(폴레이트 수용체 1), FBTA05 (CD20), 피클라투주맵 (Ficlatuzumab)(SCH 900105), 피기투무맵 (Figitumumab)(IGF-1 수용체), 플란보투맵 (Flanvotumab)(당단백질 75), 프레솔리무맵 (Fresolimumab)(TGF-β), 갈리시맵 (Galiximab)(CD80), 가니투맵 (Ganitumab)(IGF-I), 겜투주맵 오조가미신 (Gemtuzumab ozogamicin)(CD33), 게보키주맵 (Gevokizumab)(IL1β), 기렌투시맵 (Girentuximab)(카보닉 안하이드라제 9 (CA-IX)), 글렘바투무맵 베도틴 (Glembatumumab vedotin)(GPNMB), 이브리투모맵 티우세탄 (Ibritumomab tiuxetan)(CD20), 이크루쿠맵 (Icrucumab)(VEGFR-1), 이고보마 (Igovoma)(CA-125), 인다투시맵 라브탄신 (Indatuximab ravtansine)(SDC1), 인테투무맵 (Intetumumab)(CD51), 이노투주맵 오조가미신 (Inotuzumab ozogamicin)(CD22), 이필리무맵 (Ipilimumab)(CD 152), 이라투무맵 (Iratumumab)(CD30), 라베투주맵 (Labetuzumab)(CEA), 렉사투무맵 (Lexatumumab)(TRAIL-R2), 리비비루맵 (Libivirumab)(B형 간염 표면 항원), 린투주맵 (Lintuzumab)(CD33), 로르보투주맵 메르탄신 (Lorvotuzumab mertansine)(CD56), 루카투무맵 (Lucatumumab)(CD40), 루밀리시맵 (Lumiliximab)(CD23), 마파투무맵 (Mapatumumab)(TRAIL-R1), 마투주맵 (Matuzumab)(EGFR), 메폴리주맵 (Mepolizumab)(IL5), 밀라투주맵 (Milatuzumab)(CD74), 미투모맵 (Mitumomab)(GD3 강글리오시드), 모가물리주맵 (Mogamulizumab)(CCR4), 모세투모맵 파수도톡스 (Moxetumomab pasudotox)(CD22), 나콜로맵 타페나톡스 (Nacolomab tafenatox)(C242 항원), 나프투모맵 에스타페나톡스 (Naptumomab estafenatox)(5T4), 나마투맵 (Namatumab)(RON), 넥시투무맵 (Necitumumab)(EGFR), 니모투주맵 (Nimotuzumab)(EGFR), 니볼루맵 (Nivolumab)(IgG4), 요파투무맵 (Ofatumumab)(CD20), 올라라투맵 (Olaratumab)(PDGF-R a), 오나르투주맵 (Onartuzumab)(인간 스캐터 인자 수용체 키나제 (human scatter factor receptor kinase)), 오포르투주맵 모나톡스 (Oportuzumab monatox)(EpCAM), 오레고보맵 (Oregovomab)(CA-125), 옥셀루맵 (Oxelumab)(OX-40), 파니투무맵 (Panitumumab)(EGFR), 파트리투맵 (Patritumab)(HER3), 펨투모마 (Pemtumoma)(MUC1), 페르투주마 (Pertuzuma)(HER2/neu), 핀투모맵 (Pintumomab)(선암종 항원), 프리투무맵 (Pritumumab)(비멘틴 (vimentin)), 라코투모맵 (Racotumomab)(N-글리콜릴뉴라민산), 라드레투맵 (Radretumab)(파이브로넥틴 엑스트라 도메인-B), 라피비루맵 (Rafivirumab)(광견병 바이러스 당단백질), 라무시루맵 (Ramucirumab)(VEGFR2), 릴로투무맵 (Rilotumumab)(HGF), 리투시맵 (Rituximab)(CD20), 로바투무맵 (Robatumumab)(IGF-1 수용체), 살말리주맵 (Samalizumab)(CD200), 시브로투주맵 (Sibrotuzumab)(FAP), 실투시맵 (Siltuximab)(IL6), 타발루맵 (Tabalumab)(BAFF), 타카투주맵 테트라세탄 (Tacatuzumab tetraxetan)(α-페토프로테인), 타플리투모맵 파프톡스 (Taplitumomab paptox)(CD 19), 테나투모맵 (Tenatumomab)(테나신 C), 테프로투무맵 (Teprotumumab)(CD221), 티실리무맵 (Ticilimumab)(CTLA- 4), 티가투주맵 (Tigatuzumab)(TRAIL-R2), TNX-650 (IL13), 토시투모맵 (Tositumomab)(CD20), 트라스투주맵 (Trastuzumab)(HER2/neu), TRBS07 (GD2), 트레멜리무맵 (Tremelimumab)(CTLA-4), 투코투주맵 셀모루킨 (Tucotuzumab celmoleukin)(EpCAM), 우블리투시맵 (Ublituximab)(MS4A1), 우레루맵 (Urelumab)(4-1 BB), 볼로시시맵 (Volociximab)(인테그린 α5β1), 보투무맵 (Votumumab)(종양 항원 CTAA 16.88), 잘루투무맵 (Zalutumumab)(EGFR) 및 자놀리무맵 (Zanolimumab)(CD4) 등이 있다.
본원에 참조된 문헌 및 실험에 대한 언급이 임의의 전술한 내용이 선행 기술 분야와 관련 있다는 인정으로서 의도하는 것은 아니다. 이들 문헌의 내용에 대한 모든 언급은 출원에 이용가능한 정보를 기반으로 하며, 이들 문헌의 내용에 대한 정확성에 관한 어떠한 인정으로도 간주되지 않는다.
후술한 내용은 당해 기술 분야의 당업자가 다양한 구현예들을 구성 및 이용할 수 있도록 제공된다. 구체적인 장치, 기법 및 이용에 관한 설명은 단지 예로서 제공된다. 본 발명에 기술된 예에 대한 다양한 변형들이 당해 기술 분야의 당업자들에게 용이하게 자명할 것이며, 본원에 정의된 일반적인 원리는 다양한 구현예들의 사상 및 범위로부터 이탈하지 않으면서 다른 예 및 활용에 적용할 수 있다. 따라서, 다양한 구현예들은 본 발명에 기술된 예들로 한정하고자 하는 것은 아니며, 청구항과 일치하는 범위에 부합되는 것으로 의도된다.
실시예
실시예들 :
방법:
동물
C57BL/6BrdCrHsd-Tyr c 마우스는 Envigo Labs에서 구입하였다. 연령 (8-10세) 및 성별 (수컷 또는 암컷) 일치되는 동물을 전체 실험에서 사용하였다. Congenic C57Bl/6-Thy1.1 마우스는 독일 BioNTech AG의 동물 연구소에서 교배하였다.
CAR 구조체 / CAR T 세포
감마-레트로바이러스 자기-비활성화 (SIN) 벡터 pES.12-6을 이용해, 인간 연장 인자 1-α 프로모터 (EFS -213/+31)의 짧은 인트론-제거 버전인 내부 진핵생물 프로모터의 제어 하에 뮤라인 T 세포에서 CLDN6-CAR-BBz-T2A-Luc-T2A-GFP를 안정적으로 과다 발현시켰다. 이 벡터의 백본은 5' 및 3'-LTR에 R- 및 U5-영역의 MLV 야생형 서열뿐 아니라 패키징 영역 (psi 및 psi+)을 가지고 있다. 3'-LTR의 U-3 영역에서 인핸서 인자는 제거되고 (CAAT-Box 포함), TATA-Box 서열은 전사 개시되지 않도록 돌연변이되었다. WHV (Woodchuck Hepatitis Virus)의 전사 후 조절 인자 (PRE)의 절단된 버전을 사용해, 원치않은 바이러스 단백질의 발현을 방지하였다. CLDN6-CAR-BBz는 인간 IgG의 신호전달 펩타이드 (서열번호 12), 중쇄 (VH)(서열번호 13)와 경쇄 (VL)(서열번호 15) 사이에 (G4S)3 링커 (서열번호 14)를 가지고 있으며 VL의 46번 위치에 시스테인에서 세린으로의 치환이 존재하는 Claudin6-특이 항체 IMAB206의 단쇄 Fv-단편 (Ganymed Pharmaceuticals)을 포함한다. ScFv 단편은 인간 CD8 힌지 및 막관통 영역 (서열번호 16)에 융합되어 있으며, 그 이후로 인간 4-1BB (서열번호 17) 및 인간 CD3 (Q14K)(서열번호 18) 신호전달 모이어티가 위치한다. CAR은 T2A 리보좀 스킵 인자 (서열번호 19)를 이용해 유효한 반딧불이 루시퍼라제 (서열번호 20) 및 eGFP (서열번호 21)과 연결되어, 형질도입된 T 세포에서 지정된 단백질을 동일 몰수로 생산할 수 있다.
입양 T 세포 전달을 위한 레트로바이러스 유전자 조작 및 CAR T 세포 제조
비장세포 나이브 C57Bl/6-Thy1.1+를 단리하고, 비드 : T 세포 1:1 비율에서 5 ng/mL 재조합 인간 (rh) IL-7 및 5　ng/mL rh　IL-15 (Miltenyi Biotec)의 존재 하에 Dynabeads™ 마우스 T-활성인자 CD3/CD28 (Invitrogen)에 의해 사전-활성화하였다. 뮤라인 세포를 형질도입하기 위해, MLV-E-슈도타입의 레트로바이러스 상층액을 RetroNectin (2 ㎍/cm2)-코팅된 비-조직 배양물이 처리된 웰 플레이트에 제조사의 지침 (Takara Bio Inc., Otsu, Japan)에 따라 로딩하였으며, 바이러스 로딩 및 원심분리 (1,300　xg, 15℃, 15min)를 결합성을 높이기 위해 3회 사이클로 수행하였다. 사전-활성화 후 24시간 경과시, 0.5-0.6x106 세포/cm2를 바이러스 입자로 코팅된 웰 상으로 스핀 다운 (300 xg, 37℃, 1h)하였다. 밤새 배양한 후, 스핀-다운 형질도입을 신선한 바이러스 입자로 코팅된 플레이트를 사용해 반복 수행하였다. 사전-활성화 후 72시간 경과시, Dynabeads™ 마우스 T-활성인자 CD3/CD28를 배양물에서 제거하고, 5 ng/mL rh IL-7 및 5 ng/mL rh IL-15의 존재 하에 세포를 증폭시켰다. 피콜 클리닝 후, 세포를 PBS로 2회 세척해 혈청 단백질을 제거한 다음 입양 세포 전달 (ACT)을 위해 준비하였다. 2A-스플라이스 인자를 이용해 각각 발현되는 (Szymczak et al. (2004) Nat Biotechnol. 22(5):589-94), 상당히 강화된 반딧불이 루시퍼라제 (effLuc; Rabinovich et al. (2008) PNAS 105(38):14342-6) 및 eGFP (강화된 녹색 형광 단백질) 리포터 유전자로서 암호화된 OT1-TCR 또는 CLDN6-CAR을 함유한 pES12.6 기반의 레트로바이러스 벡터를, 형질도입에 이용하였다.
시험관내 전사된 ( IVT ) mRNA 제조
사이토카인-알부민 융합 단백질을 암호화하는 mRNA의 시험관내 전사는 pST4-T7-GG-TEV-MCS-FI-A30LA70 플라스미드 백본 및 유도체 DNA-구조체를 토대로 하였다. 이들 플라스미드 구조체는 TEV (tobacco etch virus)의 5' 리더 서열, 3' FI 인자 (F는 뉴클레오티드 136개 길이의, 스플리트의 아미노-말단 인핸서의 3'-UTR 단편, mRNA이고, I는 뉴클레오티드 142개 길이의, 미토콘드리아에 암호화된 12S RNA의 단편으로서, 이 둘다 호모 사피엔스에서 동정됨; WO 2017/060314) 및 뉴클레오티드 100개 길이의 폴리(A) 꼬리를 포함하며, 뉴클레오티드 70개 다음에 링커가 존재한다. 시토신 및 혈청 알부민 암호화 서열은 무스 무스쿨러스 (Mus musculus)로부터 기원하며, 생성되는 아미노산 서열에 변화는 도입되지 않았다 (마우스 (m)IL-2, 서열번호 5, mIL-7, 서열번호 6 및 mIL-21, 서열번호 7). 암호화된 단백질에는 N-말단 모이어티의 천연 SP인 N-말단 신호 펩타이드 (SP)가 부가되었다. N-말단 모이어티의 SP만 유일하게 유지되고, 다른 모이어티는 성숙 영역 (SP 없이 단백질)만 암호화된다. 정지 코돈은 대부분의 C-말단 모이어티에서만 유지되었다. 구조체에서 알부민과 사이토카인 모이어티는, 글리신 및 세린 잔기를 암호화하는 뉴클레오티드 30개 길이의 링커 서열에 의해 이격되어 있다. 사용된 알부민-사이토카인 융합 단백질의 배열은 다음과 같다: 알부민-링커-mIL2 (N-말단에서 C-말단 방향으로 연속하여, 서열번호 8, 9 및 10), mIL7-링커-알부민 (N-말단에서 C-말단 방향으로 연속하여, 서열번호 6, 9 및 11), 및 mIL21-링커-알부민 (N-말단에서 C-말단 방향으로 연속하여, 서열번호 7, 9 및 11). 항원을 암호화하는 mRNA의 시험관내 전사는 pST1-T7-GG-hAg-MCS-2hBg-A30LA70 플라스미드 백본 및 유도체 DNA-구조체를 토대로 하였다. 이들 플라스미드 구조체는, 전장 인간 CLDN6 또는 닭 오발부민-에피토프 SIINFEKL (OvaI; Kreiter et al (2008) J Immunol. 180(1):309-18에 기술된 바와 같이, 3' Sec 및 5' TM1-서열이 양쪽에 추가로 위치함) 외에도, 5' 인간 α-글로빈, 2개의 연속적인 3' 인간 β-글로빈 UTR 및 뉴클레오티드 100개로 이루어진 폴리(A) 꼬리를 포함하며, 뉴클레오티드 70개 다음에 링커가 존재한다. 항원 및 사이토카인을 암호화하는 mRNA를 Holtkamp S. et al. (2006) Blood 108(13):4009-17에 기술된 바와 같이 시험관내 전사에 의해 생성하였다. 이후 이는 표준 뉴클레오티드 우리딘을 1-메틸-슈도우리딘으로 치환하여, 추가로 변형시켰다. 생성되는 사이토카인 mRNA에는 Cap1-구조를 부가하였으며, 셀룰로스 정제를 통해 이중 가닥 (dsRNA) 분자를 고갈시켰다. 정제된 mRNA는 H2O에서 용출시키고, 추후 사용시까지 -80℃에서 보관하였다. 언급된 모든 mRNA 구조체들에 대한 시험관내 전사는 BioNTech RNA Pharmaceuticals GmbH에서 수행하였다.
항원 암호화 IVT RNA (RNA (LIP) )의 리포좀 제형 제조
리포좀과 항원을 암호화하는 IVT의 복합체 형성은 기존에 Kranz et al (2016) Nature 534(7607):396-401에 기술되어 있다. 양이온성 DOTMA 및 RNA는 전하 비율 (charge ratio) 1.3:2로 사용하였다. DOTMA 외에도, 지질 분획은 보조 지질 DOPE를 DOTMA : DOPE 몰 비 2:1로 함유한다.
마우스 실험
감마-레트로바이러스 형질도입된 CAR 또는 TCR congenic Thy1.1+ T 세포 5x106개를, 면역적격 또는 적정 수준으로 전신 방사선 처리된 (2.5 Gy - XRAD320) C57BL/6BrdCrHsd-Tyr c 공여 마우스에, 200 ㎕로 정맥내 (i.v.) 전달하였다. 그 후, 마우스에 ACT 후 다양한 시점에 항원을 암호화하는 RNA(LIP)를 F12:RNA 1.3:2 비율로 정맥내 (i.v.) 백신 주사하였다. 지정된 시점에, 뉴클레오티드 변형된 뮤라인 알부민-사이토카인 융합 단백질을 암호화하는 mRNA의 TransIT (Mirrus) 제형 1 ㎍을 반복 투여하거나 또는 완충제를 단독으로 투여하였다. 말초혈을 채혈하고, 전신 생발광 영상 촬영을 지정된 시점에 수행하였다.
생체내 루시퍼라제 영상 촬영 ( BLI )
CAR 또는 TCR-effLuc-GFP 형질도입된 T 세포의 증폭 및 분포를 IVIS 루미나 영상 촬영 시스템 (Caliper Life Sciences)을 이용한 생체내 생발광 영상 촬영을 통해 평가하였다. 간략하게는, 형질도입된 T 세포를 입양 전달한 후 지정된 시점에 D-루시페린 (80 mg/체중 kg; Perkin Elmer) 수용액을 복막내 주사하였다. 5분 후, 방출된 광자를 정량하였다 (노출 시간 1분, 비닝 (binning) 8). 관심 영역 (ROI)에서 생체내 생발광을 IVIS Living Image 4.0 소프트웨어를 이용해 총 플럭스 (total flux, 광자/초)로 정량하였다. 동물 체내에서 루시퍼라제 발현 세포로부터 기인한 투과 광의 강도를 회색표 이미지로 표시하였으며, 여기서 검정색은 강도가 가장 낮은 것이고, 백색에서 진회색은 생발광 신호가 가장 강한 것이다. 마우스의 회색표 참조 이미지는 LED 저조도 조명에서 수득하였다. 이미지는 Living Image 4.0 소프트웨어를 사용해 중첩시켰다.
실시예 1: 선택한 약동학-연장된 감마 쇄 사이토카인 (IL-2/7)은 항원과 접촉시 생체내에서 CAR T 세포의 반복적인 증폭을 유도한다.
통상적으로, 특정 사이토카인 환경은 항원과 접촉하였을 때 T 세포의 존속성을 유지시키는데 필요하다. 감마 쇄 사이토카인, 예를 들어 IL-2 및 IL-7이 T 세포의 증폭 및 생존을 강화하는 것으로 밝혀져 있다 (예, Blattman et al. (2003) Nat. Med. 9(5):540-7, Fry et al. (2001) Trends Immunol. 22(10):564-71, Bradley et al. (2005) Trends Immunol. 26(3):172-6, Jiang et al. (2005) Cytokine Growth Factor Rev. 16(4-5):513-33). 그러나, IL-2와 같은 재조합 사이토카인의 사용은 이의 짧은 반감기뿐 아니라 이의 용량-의존적인 독성으로 인해 제한적이다 (Vial et al. (1992) Drug Saf. 7(6):417-33). 입양 전달된 T 세포의 사이토카인 공급 한계를 극복하기 위해, 사이토카인-알부민 융합 단백질을 암호화하는 mRNA 구조체를 개발하였으며, 실제 전신 투여시 생체내에서 암호화된 사이토카인의 혈청 반감기를 현저하게 연장시킬 수 있었다. 사이토카인-알부민 구조체의 전신 이용성이, 뉴클레오시드-변형된 mRNA로 암호화한 경우에, 연장되었다.
이에, 본 발명자들은, 리포좀 제형의 TAA, 예를 들어 CLDN6-암호화 RNA (RNA(LIP))의 조합이 2차 림프 기관에서 선택적으로 APC를 표적화하는지, 그리고 선택한 사이토카인 공급이 생체내에서 CAR-T 세포의 적절한 반복적인 증폭 및 존속성을 유발할 수 있는지에 대한 의문을 가지게 되었다.
이러한 생각을 조사하기 위해, 감마-레트로바이러스를 이용해 형질도입된 CLDN6-CAR T 세포를 적당히 방사선 조사 (2.5 Gy)된 마우스 또는 면역적격 마우스에 입양 전달하였다 (각각 도 1 및 도 2). 이들 뮤라인 CLDN6-CAR T 세포의 생체내 증폭 및 운명을 시각화하기 위해, CLDN6 CAR 암호화 레트로바이러스 벡터 상에서 바이러스 T2A 서열에 의해 이격되어 배치된 루시퍼라제 및 GFP 리포터의 공동-발현을 이용하였다 (도 1a). 특히, CLDN6-CAR의 표면 발현 및 항원 특이성은 CAR-형질도입된 뮤라인 T 세포에서 루시퍼라제 및 GFP의 공동-발현에 의해 현저한 영향을 받지 않았다 (데이터 도시 안함).
적당히 방사선 처리된 (2.5 Gy, XRAD320) 알비노 C57Bl/6 마우스에, CLDN6-CAR-리포터 형질도입된 congenic Thy1.1+ 뮤라인 벌크 T 세포 5　x　106개 (약 2.5　x　108 세포/체중 kg)를 생착시켰다. CLDN6-암호화 RNA 또는 대조군 RNA 20 ㎍을 비장-표적화 리포좀 제형으로 제조하여, 입양 CAR-T 전달 1일 후 마우스에 정맥내 주사하였다. CLDN6 RNA(LIP)-백신 접종과 동시에, 마우스에 알부민 결합된 뮤라인 IL-2 및 뮤라인 IL-7-암호화 mRNA를 TransIT 제형 (1 ㎍/사이토카인 RNA)으로 투여하거나, 또는 모의 대조군 (완충제)을 투여하였다. 투여는 7일 후 반복 실시하였다. 지정된 시점에, 마우스 1마리당 D-루시페린 용액 1.66 mg을 복막내 투여하여 CAR-T 증폭과 생체 분포를 생체내 추적하였다. ACT 후 24시간 경과시, CAR-T 세포 대부분이 비장에서 이미 발견되었다. 사이토카인이 없을 경우 (모의 대조군), ACT 후 4일 경과시 생발광에 의해 검출된 바와 같이, CAR-T 세포는 CLDN6-RNA(LIP) 투여시에만 (1일과 비교해) ~21배 증가하였다. CLDN6-RNA(LIP)를 이용한 2차 부스트는 11일에 수행하였으며, 1일에 측정된 베이스라인 생발광과 비교해 생발광 강도가 여전히 15배 높았다. CAR T 세포의 증폭 능력은, TransIT 제형의 알부민 융합 IL-2 및 IL-7-암호화 mRNA를 공동-투여하였을 경우, 현저하게 증가하였다. RNA(LIP) 1차 투여 후 CAR-T 세포는 75배 증폭을 달성할 수 있었으며, 심지어 RNA(LIP) 2차 투여시에는 최대 114배 향상되었다 (도 1c &d). 이러한 효과는, CLDN6-암호화 RNA(LIP)를 단독으로 또는 사이토카인-알부민을 암호화하는 RNA와 조합하여 투여한 다음 CLDN6-CAR T 세포를 투여한 마우스에서 관찰되었지만, OvaI을 암호화하는 대조군 RNA(LIP)를 투여한 대응되는 대조군의 경우에는 사이토카인-알부민을 암호화하는 RNA를 조합하여 또는 조합하지 않은 경우 어디에서도 관찰되지 않았다. 이러한 데이터는, 적당히 방사선 처리된 마우스에서 항원 고 특이적인 방식으로 인 시추로 CAR-T 세포를 성공적으로 증폭시킬 수 있다는 것을 입증해준다.
CAR-T 세포가, 적당한 수준으로 방사선 조사된 마우스에서, 해당 항원을 암호화하는 RNA(LIP)를, 사이토카인을 암호화하는 RNA의 존재 하에, 반복적으로 인 시추 증폭시킬 수 있다는 것이 입증된 후, 다음으로 본 발명자들은 면역적격 숙주에서도 이러한 효과를 달성할 수 있는 지를 조사하였다. 그러나, 림프구-고갈은, 잘 알려진 부작용, 및 감염 및 패혈증 가능성과 같은 화학요법과 관련된 위험을 비롯해, 몇가지 문제점을 가지고 있다 (Brentjens et al. (2010) Mol Ther. 18(4):666-8 & Robbins et al. (2015) Clin Cancer Res. 21(5):1019-27). 아울러, 표적 독성 및/또는 비-표적 독성의 경우 - 입양 전달된 CAR-T 세포의 빠른 증폭이 치명적일 수 있다 (Morgan et al. (2010) Mol Ther. 18(4):843-51). 이를 위해, CLDN6-CAR 형질도입된 뮤라인 Thy1.1+ T 세포-생착된 방사선 비-조사된 알비노 C57Bl/6 마우스에, 전술한 바와 같이 투여를 실시하였다 (도 2a). 1차 자극 시기 동안에, IL-2 및 IL-7의 전신 존재는, CLDN6-RNA(LIP) 백신 접종 후, TransIT-제형의 사이토카인-알부민 암호화 RNA 대신 완충제를 투여한 대조군 (모의)과 비교해, CLDN6-CAR T 세포의 증폭에 유의한 영향을 미치지 않았다 (4일: 증폭 지수: 모의 대조군의 경우 192배, IL-2/7의 경우 223배), 그러나, IL-2/7 사이토카인의 부재시에는, CLDN6 RNA(LIP) 매개 1차 증폭 후 CAR-T 세포 집단이 상당히 감소하였으며, 2차시 재-증폭시킬 수 없었다. IL-2/IL-7-알부민을 암호화하는 RNA가 존재하는 경우에만, 면역적격 마우스에서 CLDN6-CAR T 세포가 반복 증폭되어, 수일간 존속할 수 있었다 (11일: 증폭 지수: 모의 대조군 0.5배, IL-2/7: 79배)(도 2b+c).
이들 데이터는, 환자에서 RNA(LIP) 기술을 이용하여 직접 CAR-T 세포 증폭을 조절하는 것이 가능하다는 생각을 강력하게 뒷받침해주지만, 세포에는 존속하기 위해 IL2 및 IL-7과 같은 우호적인 사이토카인 환경이 필요하며, 이는 약동학적으로 연장된 감마 쇄 사이토카인을 암호화하는 RNA를 투여함으로써 달성할 수 있다.
실시예 2: CAR T 세포의 반복 증폭에서의 사이토카인 알부민 융합체의 조합 최적화.
수종의 감마 쇄 사이토카인이 T 세포 생존을 적극적으로 뒷받침하고 T 세포의 치료학적 효과를 항원 특이적인 방식으로 뒷받침하므로 (예, Markley et al. (2010) Blood 115(17):3508-19, He et al. (2006) J Transl Med. 4:24.), 본 발명자들은, mIL-2, mIL-7, mIL-21 및 IL-2/7과 IL-2/21의 조합을 암호화하는 뉴클레오시드-변형된 RNA를, 반복적인 RNA(LIP) 처리시 CAR 변형된 T 세포의 생체내 증폭 및 존속을 뒷받침하는 촉진 효과 측면에서, 비교하였다.
실시예 1에 기술된 바와 비슷한 방식으로, CLDN6-CAR-리포터 형질도입된 T 세포가 이식된 적당히 방사선 조사된 알비노 C57Bl/6 마우스에, 리포좀 제형의 hCLDN6 또는 대조군을 암호화하는 RNA를 백신 접종하였으며, 동시에 뮤라인 알부민 커플링된 mIL-2, mIL-7, mIL-21-암호화 mRNA를 TransIT 제형으로 투여하거나 (1 ㎍/사이토카인 RNA) 또는 뮤라인 알부민 암호화 RNA (Alb 대조군)를 투여하였다. 항원/사이토카인 칵테일을 1주일 간격으로 투여하였다 (도 3a). CAR T 세포의 생체내 증폭이 최대인 수준에서 (통상적으로, RNA 기반의 처리 후 2-3일에 도달함), 생발광 강도를 분석하였다 (도 3b). IL-7 및 IL-21이 단독으로 전신 존재할 경우, 반복적인 RNA(LIP) 처리시 항원-특이적인 CAR T 증폭은 알부민 대조군과 비교해 감소하였다. IL-2과의 공동-처리시, CAR T 세포의 증폭은 베이스라인과 비교해 최대 164배 증가하였다. 그러나, CAR-T 세포의 생체내 축적은, 각각 IL-2 RNA를 IL-7 (3차 증폭 후 최대 214배 증가) 또는 IL-21 (3차 증폭 후 최대 141배 증가)과 공동-투여한 경우에만, 달성할 수 있었다. 생체내 CAR T 세포의 축적 능력 외에도, 입양 전달된 종양 반응성 T 세포 요법의 임상적인 성공은, 이들 세포의 생체내 존속성과 긍정적인 상관관계를 보였다 (Robbins et al. (2004) J Immunol. 173(12):7125-30, Huang et al. (2005) 28(3):258-67). 이에, 본 발명자들은, 항원 특이적인 3차 증폭 후, IL-7 (도 3c) 또는 IL-21 (도 3d) 단독 또는 IL-2와의 조합 존재하는 경우에, 생발광을 이용해 CAR T 세포의 축적을 분석하였다. 한편, CAR T 세포 집단은, 오직 알부민, IL-2 또는 IL-7이 존재할 경우에, 3차 CLDN6 RNA(LIP) 직후 축적되었다. 하지만, IL2와 IL-7의 조합이 항원 회수 후 CLDN6 CAR T 세포의 둔화된 축적을 강화할 수 있었다 (도 3c). 이러한 효과는 IL-2 및 IL-21-RNA의 공동-처리 마우스에서 더욱 뚜렷하였다 (도 3d).
요컨대, 이러한 결과는, IL-2를 암호화하는 뉴클레오시드-변형된 RNA의 전신 투여, 그리고 IL-7과 IL-21의 동시 투여가, 항원 특이적인 자극시, 생체내에서 CAR T 세포의 축적 및 존속성을 고도의 항원 의존적인 방식으로 강화할 수 있음을, 의미한다.
SEQUENCE LISTING <110> BioNTech Cell & Gene Therapies GmbH <120> Treatment involving CAR-engineered T cells and cytokines <130> 674-244 PCT2 <150> PCT/EP2019/053144 <151> 2019-02-08 <160> 22 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 133 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 2 <211> 152 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu 1 5 10 15 Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser 20 25 30 Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp 35 40 45 Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg 50 55 60 Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu 65 70 75 80 Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val 85 90 95 Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser 100 105 110 Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu 115 120 125 Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys 130 135 140 Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His 145 150 <210> 3 <211> 133 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Gln Gly Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile 1 5 10 15 Val Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu 20 25 30 Pro Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser 35 40 45 Cys Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu 50 55 60 Arg Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser 65 70 75 80 Thr Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys 85 90 95 Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys 100 105 110 Ser Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His 115 120 125 Gly Ser Glu Asp Ser 130 <210> 4 <211> 585 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu 1 5 10 15 Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln 20 25 30 Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu 35 40 45 Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys 50 55 60 Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu 65 70 75 80 Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro 85 90 95 Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu 100 105 110 Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His 115 120 125 Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg 130 135 140 Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg 145 150 155 160 Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala 165 170 175 Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser 180 185 190 Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu 195 200 205 Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro 210 215 220 Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys 225 230 235 240 Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp 245 250 255 Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser 260 265 270 Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His 275 280 285 Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser 290 295 300 Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala 305 310 315 320 Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg 325 330 335 Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr 340 345 350 Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu 355 360 365 Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro 370 375 380 Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu 385 390 395 400 Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro 405 410 415 Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys 420 425 430 Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys 435 440 445 Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His 450 455 460 Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser 465 470 475 480 Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr 485 490 495 Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp 500 505 510 Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala 515 520 525 Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu 530 535 540 Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys 545 550 555 560 Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val 565 570 575 Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu 580 585 <210> 5 <211> 169 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Met Tyr Ser Met Gln Leu Ala Ser Cys Val Thr Leu Thr Leu Val Leu 1 5 10 15 Leu Val Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Ser Ser Ser Thr Ala 20 25 30 Glu Ala Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln His Leu 35 40 45 Glu Gln Leu Leu Met Asp Leu Gln Glu Leu Leu Ser Arg Met Glu Asn 50 55 60 Tyr Arg Asn Leu Lys Leu Pro Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Leu 65 70 75 80 Pro Lys Gln Ala Thr Glu Leu Lys Asp Leu Gln Cys Leu Glu Asp Glu 85 90 95 Leu Gly Pro Leu Arg His Val Leu Asp Leu Thr Gln Ser Lys Ser Phe 100 105 110 Gln Leu Glu Asp Ala Glu Asn Phe Ile Ser Asn Ile Arg Val Thr Val 115 120 125 Val Lys Leu Lys Gly Ser Asp Asn Thr Phe Glu Cys Gln Phe Asp Asp 130 135 140 Glu Ser Ala Thr Val Val Asp Phe Leu Arg Arg Trp Ile Ala Phe Cys 145 150 155 160 Gln Ser Ile Ile Ser Thr Ser Pro Gln 165 <210> 6 <211> 154 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Ile Pro Pro Leu Ile 1 5 10 15 Leu Val Leu Leu Pro Val Thr Ser Ser Glu Cys His Ile Lys Asp Lys 20 25 30 Glu Gly Lys Ala Tyr Glu Ser Val Leu Met Ile Ser Ile Asp Glu Leu 35 40 45 Asp Lys Met Thr Gly Thr Asp Ser Asn Cys Pro Asn Asn Glu Pro Asn 50 55 60 Phe Phe Arg Lys His Val Cys Asp Asp Thr Lys Glu Ala Ala Phe Leu 65 70 75 80 Asn Arg Ala Ala Arg Lys Leu Lys Gln Phe Leu Lys Met Asn Ile Ser 85 90 95 Glu Glu Phe Asn Val His Leu Leu Thr Val Ser Gln Gly Thr Gln Thr 100 105 110 Leu Val Asn Cys Thr Ser Lys Glu Glu Lys Asn Val Lys Glu Gln Lys 115 120 125 Lys Asn Asp Ala Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Arg Glu Ile Lys Thr 130 135 140 Cys Trp Asn Lys Ile Leu Lys Gly Ser Ile 145 150 <210> 7 <211> 146 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Met Glu Arg Thr Leu Val Cys Leu Val Val Ile Phe Leu Gly Thr Val 1 5 10 15 Ala His Lys Ser Ser Pro Gln Gly Pro Asp Arg Leu Leu Ile Arg Leu 20 25 30 Arg His Leu Ile Asp Ile Val Glu Gln Leu Lys Ile Tyr Glu Asn Asp 35 40 45 Leu Asp Pro Glu Leu Leu Ser Ala Pro Gln Asp Val Lys Gly His Cys 50 55 60 Glu His Ala Ala Phe Ala Cys Phe Gln Lys Ala Lys Leu Lys Pro Ser 65 70 75 80 Asn Pro Gly Asn Asn Lys Thr Phe Ile Ile Asp Leu Val Ala Gln Leu 85 90 95 Arg Arg Arg Leu Pro Ala Arg Arg Gly Gly Lys Lys Gln Lys His Ile 100 105 110 Ala Lys Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Arg Thr Pro Lys Glu 115 120 125 Phe Leu Glu Arg Leu Lys Trp Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His 130 135 140 Leu Ser 145 <210> 8 <211> 608 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Met Lys Trp Val Thr Phe Leu Leu Leu Leu Phe Val Ser Gly Ser Ala 1 5 10 15 Phe Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Glu Ala His Lys Ser Glu Ile Ala 20 25 30 His Arg Tyr Asn Asp Leu Gly Glu Gln His Phe Lys Gly Leu Val Leu 35 40 45 Ile Ala Phe Ser Gln Tyr Leu Gln Lys Cys Ser Tyr Asp Glu His Ala 50 55 60 Lys Leu Val Gln Glu Val Thr Asp Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp 65 70 75 80 Glu Ser Ala Ala Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp 85 90 95 Lys Leu Cys Ala Ile Pro Asn Leu Arg Glu Asn Tyr Gly Glu Leu Ala 100 105 110 Asp Cys Cys Thr Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln 115 120 125 His Lys Asp Asp Asn Pro Ser Leu Pro Pro Phe Glu Arg Pro Glu Ala 130 135 140 Glu Ala Met Cys Thr Ser Phe Lys Glu Asn Pro Thr Thr Phe Met Gly 145 150 155 160 His Tyr Leu His Glu Val Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro 165 170 175 Glu Leu Leu Tyr Tyr Ala Glu Gln Tyr Asn Glu Ile Leu Thr Gln Cys 180 185 190 Cys Ala Glu Ala Asp Lys Glu Ser Cys Leu Thr Pro Lys Leu Asp Gly 195 200 205 Val Lys Glu Lys Ala Leu Val Ser Ser Val Arg Gln Arg Met Lys Cys 210 215 220 Ser Ser Met Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val 225 230 235 240 Ala Arg Leu Ser Gln Thr Phe Pro Asn Ala Asp Phe Ala Glu Ile Thr 245 250 255 Lys Leu Ala Thr Asp Leu Thr Lys Val Asn Lys Glu Cys Cys His Gly 260 265 270 Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Glu Leu Ala Lys Tyr Met 275 280 285 Cys Glu Asn Gln Ala Thr Ile Ser Ser Lys Leu Gln Thr Cys Cys Asp 290 295 300 Lys Pro Leu Leu Lys Lys Ala His Cys Leu Ser Glu Val Glu His Asp 305 310 315 320 Thr Met Pro Ala Asp Leu Pro Ala Ile Ala Ala Asp Phe Val Glu Asp 325 330 335 Gln Glu Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly 340 345 350 Thr Phe Leu Tyr Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Ser 355 360 365 Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Lys Tyr Glu Ala Thr Leu Glu Lys Cys 370 375 380 Cys Ala Glu Ala Asn Pro Pro Ala Cys Tyr Gly Thr Val Leu Ala Glu 385 390 395 400 Phe Gln Pro Leu Val Glu Glu Pro Lys Asn Leu Val Lys Thr Asn Cys 405 410 415 Asp Leu Tyr Glu Lys Leu Gly Glu Tyr Gly Phe Gln Asn Ala Ile Leu 420 425 430 Val Arg Tyr Thr Gln Lys Ala Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val 435 440 445 Glu Ala Ala Arg Asn Leu Gly Arg Val Gly Thr Lys Cys Cys Thr Leu 450 455 460 Pro Glu Asp Gln Arg Leu Pro Cys Val Glu Asp Tyr Leu Ser Ala Ile 465 470 475 480 Leu Asn Arg Val Cys Leu Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Glu His 485 490 495 Val Thr Lys Cys Cys Ser Gly Ser Leu Val Glu Arg Arg Pro Cys Phe 500 505 510 Ser Ala Leu Thr Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Lys Ala 515 520 525 Glu Thr Phe Thr Phe His Ser Asp Ile Cys Thr Leu Pro Glu Lys Glu 530 535 540 Lys Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Ala Glu Leu Val Lys His Lys 545 550 555 560 Pro Lys Ala Thr Ala Glu Gln Leu Lys Thr Val Met Asp Asp Phe Ala 565 570 575 Gln Phe Leu Asp Thr Cys Cys Lys Ala Ala Asp Lys Asp Thr Cys Phe 580 585 590 Ser Thr Glu Gly Pro Asn Leu Val Thr Arg Cys Lys Asp Ala Leu Ala 595 600 605 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GS-Linker <400> 9 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 <210> 10 <211> 149 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 10 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Ser Ser Ser Thr Ala Glu Ala Gln Gln 1 5 10 15 Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln His Leu Glu Gln Leu Leu 20 25 30 Met Asp Leu Gln Glu Leu Leu Ser Arg Met Glu Asn Tyr Arg Asn Leu 35 40 45 Lys Leu Pro Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Leu Pro Lys Gln Ala 50 55 60 Thr Glu Leu Lys Asp Leu Gln Cys Leu Glu Asp Glu Leu Gly Pro Leu 65 70 75 80 Arg His Val Leu Asp Leu Thr Gln Ser Lys Ser Phe Gln Leu Glu Asp 85 90 95 Ala Glu Asn Phe Ile Ser Asn Ile Arg Val Thr Val Val Lys Leu Lys 100 105 110 Gly Ser Asp Asn Thr Phe Glu Cys Gln Phe Asp Asp Glu Ser Ala Thr 115 120 125 Val Val Asp Phe Leu Arg Arg Trp Ile Ala Phe Cys Gln Ser Ile Ile 130 135 140 Ser Thr Ser Pro Gln 145 <210> 11 <211> 584 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 11 Glu Ala His Lys Ser Glu Ile Ala His Arg Tyr Asn Asp Leu Gly Glu 1 5 10 15 Gln His Phe Lys Gly Leu Val Leu Ile Ala Phe Ser Gln Tyr Leu Gln 20 25 30 Lys Cys Ser Tyr Asp Glu His Ala Lys Leu Val Gln Glu Val Thr Asp 35 40 45 Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Ala Asn Cys Asp Lys 50 55 60 Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Ala Ile Pro Asn Leu 65 70 75 80 Arg Glu Asn Tyr Gly Glu Leu Ala Asp Cys Cys Thr Lys Gln Glu Pro 85 90 95 Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Ser Leu 100 105 110 Pro Pro Phe Glu Arg Pro Glu Ala Glu Ala Met Cys Thr Ser Phe Lys 115 120 125 Glu Asn Pro Thr Thr Phe Met Gly His Tyr Leu His Glu Val Ala Arg 130 135 140 Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Tyr Tyr Ala Glu Gln 145 150 155 160 Tyr Asn Glu Ile Leu Thr Gln Cys Cys Ala Glu Ala Asp Lys Glu Ser 165 170 175 Cys Leu Thr Pro Lys Leu Asp Gly Val Lys Glu Lys Ala Leu Val Ser 180 185 190 Ser Val Arg Gln Arg Met Lys Cys Ser Ser Met Gln Lys Phe Gly Glu 195 200 205 Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Thr Phe Pro 210 215 220 Asn Ala Asp Phe Ala Glu Ile Thr Lys Leu Ala Thr Asp Leu Thr Lys 225 230 235 240 Val Asn Lys Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp 245 250 255 Arg Ala Glu Leu Ala Lys Tyr Met Cys Glu Asn Gln Ala Thr Ile Ser 260 265 270 Ser Lys Leu Gln Thr Cys Cys Asp Lys Pro Leu Leu Lys Lys Ala His 275 280 285 Cys Leu Ser Glu Val Glu His Asp Thr Met Pro Ala Asp Leu Pro Ala 290 295 300 Ile Ala Ala Asp Phe Val Glu Asp Gln Glu Val Cys Lys Asn Tyr Ala 305 310 315 320 Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Thr Phe Leu Tyr Glu Tyr Ser Arg 325 330 335 Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Ser Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Lys 340 345 350 Tyr Glu Ala Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Glu Ala Asn Pro Pro Ala 355 360 365 Cys Tyr Gly Thr Val Leu Ala Glu Phe Gln Pro Leu Val Glu Glu Pro 370 375 380 Lys Asn Leu Val Lys Thr Asn Cys Asp Leu Tyr Glu Lys Leu Gly Glu 385 390 395 400 Tyr Gly Phe Gln Asn Ala Ile Leu Val Arg Tyr Thr Gln Lys Ala Pro 405 410 415 Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Ala Ala Arg Asn Leu Gly Arg 420 425 430 Val Gly Thr Lys Cys Cys Thr Leu Pro Glu Asp Gln Arg Leu Pro Cys 435 440 445 Val Glu Asp Tyr Leu Ser Ala Ile Leu Asn Arg Val Cys Leu Leu His 450 455 460 Glu Lys Thr Pro Val Ser Glu His Val Thr Lys Cys Cys Ser Gly Ser 465 470 475 480 Leu Val Glu Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Thr Val Asp Glu Thr 485 490 495 Tyr Val Pro Lys Glu Phe Lys Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ser Asp 500 505 510 Ile Cys Thr Leu Pro Glu Lys Glu Lys Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala 515 520 525 Leu Ala Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Ala Glu Gln Leu 530 535 540 Lys Thr Val Met Asp Asp Phe Ala Gln Phe Leu Asp Thr Cys Cys Lys 545 550 555 560 Ala Ala Asp Lys Asp Thr Cys Phe Ser Thr Glu Gly Pro Asn Leu Val 565 570 575 Thr Arg Cys Lys Asp Ala Leu Ala 580 <210> 12 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Signal peptide <400> 12 Met Asp Trp Ile Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Gly Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Ala His Ser <210> 13 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable heavy chain <400> 13 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Tyr Gly Phe Val Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 14 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GS-Linker <400> 14 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 15 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable light chain <400> 15 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ile Met Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Ser Ile Tyr 35 40 45 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Arg 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Ala Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Tyr Pro Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ser Asp Pro Ala 100 105 110 <210> 16 <211> 69 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human CD8 hinge and transmembrane domain <400> 16 Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala 1 5 10 15 Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly 20 25 30 Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile 35 40 45 Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val 50 55 60 Ile Thr Leu Tyr Cys 65 <210> 17 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human 4-1BB signalling domain <400> 17 Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 1 5 10 15 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 20 25 30 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 35 40 <210> 18 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human CD3zeta signalling domain <400> 18 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 50 55 60 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 65 70 75 80 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 85 90 95 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 100 105 110 <210> 19 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T2A element <400> 19 Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu 1 5 10 15 Glu Asn Pro Gly Pro 20 <210> 20 <211> 550 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Effective firefly luciferase <400> 20 Met Glu Asp Ala Lys Asn Ile Lys Lys Gly Pro Ala Pro Phe Tyr Pro 1 5 10 15 Leu Glu Asp Gly Thr Ala Gly Glu Gln Leu His Lys Ala Met Lys Arg 20 25 30 Tyr Ala Leu Val Pro Gly Thr Ile Ala Phe Thr Asp Ala His Ile Glu 35 40 45 Val Asp Ile Thr Tyr Ala Glu Tyr Phe Glu Met Ser Val Arg Leu Ala 50 55 60 Glu Ala Met Lys Arg Tyr Gly Leu Asn Thr Asn His Arg Ile Val Val 65 70 75 80 Cys Ser Glu Asn Ser Leu Gln Phe Phe Met Pro Val Leu Gly Ala Leu 85 90 95 Phe Ile Gly Val Ala Val Ala Pro Ala Asn Asp Ile Tyr Asn Glu Arg 100 105 110 Glu Leu Leu Asn Ser Met Gly Ile Ser Gln Pro Thr Val Val Phe Val 115 120 125 Ser Lys Lys Gly Leu Gln Lys Ile Leu Asn Val Gln Lys Lys Leu Pro 130 135 140 Ile Ile Gln Lys Ile Ile Ile Met Asp Ser Lys Thr Asp Tyr Gln Gly 145 150 155 160 Phe Gln Ser Met Tyr Thr Phe Val Thr Ser His Leu Pro Pro Gly Phe 165 170 175 Asn Glu Tyr Asp Phe Val Pro Glu Ser Phe Asp Arg Asp Lys Thr Ile 180 185 190 Ala Leu Ile Met Asn Ser Ser Gly Ser Thr Gly Leu Pro Lys Gly Val 195 200 205 Ala Leu Pro His Arg Thr Ala Cys Val Arg Phe Ser His Ala Arg Asp 210 215 220 Pro Ile Phe Gly Asn Gln Ile Ile Pro Asp Thr Ala Ile Leu Ser Val 225 230 235 240 Val Pro Phe His His Gly Phe Gly Met Phe Thr Thr Leu Gly Tyr Leu 245 250 255 Ile Cys Gly Phe Arg Val Val Leu Met Tyr Arg Phe Glu Glu Glu Leu 260 265 270 Phe Leu Arg Ser Leu Gln Asp Tyr Lys Ile Gln Ser Ala Leu Leu Val 275 280 285 Pro Thr Leu Phe Ser Phe Phe Ala Lys Ser Thr Leu Ile Asp Lys Tyr 290 295 300 Asp Leu Ser Asn Leu His Glu Ile Ala Ser Gly Gly Ala Pro Leu Ser 305 310 315 320 Lys Glu Val Gly Glu Ala Val Ala Lys Arg Phe His Leu Pro Gly Ile 325 330 335 Arg Gln Gly Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Thr Ser Ala Ile Leu Ile Thr 340 345 350 Pro Glu Gly Asp Asp Lys Pro Gly Ala Val Gly Lys Val Val Pro Phe 355 360 365 Phe Glu Ala Lys Val Val Asp Leu Asp Thr Gly Lys Thr Leu Gly Val 370 375 380 Asn Gln Arg Gly Glu Leu Cys Val Arg Gly Pro Met Ile Met Ser Gly 385 390 395 400 Tyr Val Asn Asn Pro Glu Ala Thr Asn Ala Leu Ile Asp Lys Asp Gly 405 410 415 Trp Leu His Ser Gly Asp Ile Ala Tyr Trp Asp Glu Asp Glu His Phe 420 425 430 Phe Ile Val Asp Arg Leu Lys Ser Leu Ile Lys Tyr Lys Gly Tyr Gln 435 440 445 Val Ala Pro Ala Glu Leu Glu Ser Ile Leu Leu Gln His Pro Asn Ile 450 455 460 Phe Asp Ala Gly Val Ala Gly Leu Pro Asp Asp Asp Ala Gly Glu Leu 465 470 475 480 Pro Ala Ala Val Val Val Leu Glu His Gly Lys Thr Met Thr Glu Lys 485 490 495 Glu Ile Val Asp Tyr Val Ala Ser Gln Val Thr Thr Ala Lys Lys Leu 500 505 510 Arg Gly Gly Val Val Phe Val Asp Glu Val Pro Lys Gly Leu Thr Gly 515 520 525 Lys Leu Asp Ala Arg Lys Ile Arg Glu Ile Leu Ile Lys Ala Lys Lys 530 535 540 Gly Gly Lys Ile Ala Val 545 550 <210> 21 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> eGFP <400> 21 Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu 1 5 10 15 Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly 20 25 30 Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile 35 40 45 Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr 50 55 60 Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys 65 70 75 80 Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu 85 90 95 Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu 100 105 110 Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly 115 120 125 Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr 130 135 140 Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn 145 150 155 160 Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser 165 170 175 Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly 180 185 190 Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu 195 200 205 Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe 210 215 220 Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235 <210> 22 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 22 Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu 1 5

Claims (78)

  1. a. 개체에 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 유전자 변형된 T 세포를 제공하는 단계; 및
    b. 상기 개체에 IL2 또는 IL2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 유도하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    IL2 또는 IL2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및 추가적인 사이토카인 또는 추가적인 사이토카인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 추가적인 사이토카인이 IL7 및 IL21로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    IL2 또는 IL2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 IL7 또는 IL7을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    IL2 또는 IL2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 IL21 또는 IL21을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 IL2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 RNA이고, 선택적으로, 상기 추가적인 사이토카인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 RNA인, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CAR을 발현하도록 유전자 변형된 T 세포는 CAR을 발현하도록 유전자 변형된 T 세포를 투여하거나 또는 개체 체내에서 CAR을 발현하도록 유전자 변형된 T 세포를 구축함으로써 상기 개체에 제공되는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 개체에 항원 또는 이의 변이체, 또는 상기 항원 또는 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 단계를 더 포함하고,
    상기 CAR을 발현하도록 유전자 변형된 T 세포는 상기 항원을 표적화하고, 상기 면역 반응이 상기 항원을 발현하는 표적 세포 집단 또는 표적 조직에 대한 면역 반응인, 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 항원 또는 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 RNA인, 방법.
  10. a. 개체에 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 유전자 변형된 T 세포를 제공하는 단계; 및
    b. 상기 개체에 IL2를 암호화하는 RNA를 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 유도하는 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    IL2를 암호화하는 RNA와 추가적인 사이토카인을 암호화하는 RNA를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 추가적인 사이토카인이 IL7 및 IL21로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    IL2를 암호화하는 RNA와 IL7을 암호화하는 RNA를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  14. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    IL2를 암호화하는 RNA와 IL21을 암호화하는 RNA를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  15. 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CAR을 발현하도록 유전자 변형된 T 세포는, CAR을 발현하도록 유전자 변형된 T 세포를 투여하거나 또는 개체 체내에서 CAR을 발현하도록 유전자 변형된 T 세포를 구축함으로써 개체에 제공되는, 방법.
  16. 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원 또는 이의 변이체를 암호화하는 RNA를 개체에 투여하는 단계를 더 포함하고,
    상기 CAR을 발현하도록 유전자 변형된 T 세포가 상기 항원을 표적화하고, 상기 면역 반응이 상기 항원을 발현하는 표적 세포 집단 또는 표적 조직에 대한 면역 반응인, 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역 반응이 T 세포-매개 면역 반응인, 방법.
  18. a. 항원을 표적화하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 유전자 변형된 T 세포를 개체에 제공하는 단계; 및
    b. 상기 개체에 IL2 또는 IL2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 단계를 포함하는, 항원의 발현 또는 발현 증가와 관련된 질환, 장애 또는 병태를 가진 개체를 치료하는 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    IL2 또는 IL2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및 추가적인 사이토카인 또는 추가적인 사이토카인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 추가적인 사이토카인이 IL7 및 IL21로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    IL2 또는 IL2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 IL7 또는 IL7을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  22. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    IL2 또는 IL2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 IL21 또는 IL21을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  23. 제18항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 IL2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 RNA이고, 선택적으로 상기 추가적인 사이토카인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 RNA인, 방법.
  24. 제18항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CAR을 발현하도록 유전자 변형된 T 세포는 CAR을 발현하도록 유전자 변형된 T 세포를 투여하거나 또는 개체 체내에서 CAR을 발현하도록 유전자 변형된 T 세포를 구축함으로써 개체에 제공되는, 방법.
  25. 제18항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 개체에 항원 또는 이의 변이체, 또는 상기 항원 또는 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 항원 또는 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 RNA인, 방법.
  27. a. 항원을 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 유전자 변형된 T 세포를 개체에 제공하는 단계; 및
    b. 상기 개체에 IL2를 암호화하는 RNA를 투여하는 단계를 포함하는, 항원의 발현 또는 발현 증가와 관련된 질환, 장애 또는 병태를 가진 개체를 치료하는 방법.
  28. 제27항에 있어서,
    IL2를 암호화하는 RNA와 추가적인 사이토카인을 암호화하는 RNA를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  29. 제28항에 있어서,
    상기 추가적인 사이토카인이 IL7 및 IL21로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  30. 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    IL2를 암호화하는 RNA와 IL7을 암호화하는 RNA를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  31. 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    IL2를 암호화하는 RNA와 IL21을 암호화하는 RNA를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  32. 제27항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CAR을 발현하도록 유전자 변형된 T 세포는 CAR을 발현하도록 유전자 변형된 T 세포를 투여하거나 또는 개체 체내에서 CAR을 발현하도록 유전자 변형된 T 세포를 구축함으로써 상기 개체에 제공되는, 방법.
  33. 제27항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 개체에 항원 또는 이의 변이체를 암호화하는 RNA를 투여하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  34. 제18항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 질환, 장애 또는 병태가 암이고, 상기 항원이 종양-관련 항원인, 방법.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 IL2가 약동학 (PK)적으로 연장된 IL2인, 방법.
  36. 제35항에 있어서,
    상기 약동학 (PK)적으로 연장된 IL2가 융합 단백질을 포함하는, 방법.
  37. 제36항에 있어서,
    상기 융합 단백질이 IL2 모이어티; 및 혈청 알부민, 면역글로불린 단편, 트랜스페린, Fn3 및 이들의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 모이어티를 포함하는, 방법.
  38. 제2항 내지 제9항, 제11항 내지 제17항, 제19항 내지 제26항 또는 제28항 내지 37항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 추가적인 사이토카인, 특히 IL7 또는 IL21이 약동학 (PK)적으로 연장된 사이토카인, 특히 약동학 (PK)적으로 연장된 IL7 또는 약동학 (PK)적으로 연장된 IL21인, 방법.
  39. 제38항에 있어서,
    상기 약동학 (PK)적으로 연장된 사이토카인, 특히 약동학 (PK)적으로 연장된 IL7 또는 약동학 (PK)적으로 연장된 IL21이 융합 단백질을 포함하는, 방법.
  40. 제39항에 있어서,
    상기 융합 단백질이 상기 추가적인 사이토카인의 모이어티, 특히 IL7 모이어티 또는 IL21 모이어티; 및 혈청 알부민, 면역글로불린 단편, 트랜스페린, Fn3 및 이들의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 모이어티를 포함하는, 방법.
  41. 제37항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 혈청 알부민이 마우스 혈청 알부민 또는 인간 혈청 알부민을 포함하는, 방법.
  42. 제37항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역글로불린 단편이 면역글로불린 Fc 도메인을 포함하는, 방법.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
    개체에서 암 치료 또는 예방 방법이고,
    상기 항원이 종양-관련 항원인, 방법.
  44. a. 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 유전자 변형된 T 세포; 및
    b. IL2 또는 IL2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 의학적 조제물.
  45. 제44항에 있어서,
    IL2 또는 IL2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 추가적인 사이토카인 또는 추가적인 사이토카인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 의학적 조제물.
  46. 제45항에 있어서,
    상기 추가적인 사이토카인이 IL7 및 IL21로 이루어진 군으로부터 선택되는, 의학적 조제물.
  47. 제44항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서,
    IL2 또는 IL2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 IL7 또는 IL7을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 의학적 조제물.
  48. 제44항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서,
    IL2 또는 IL2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 IL21 또는 IL21을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 의학적 조제물.
  49. 제44항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 IL2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 RNA이고, 선택적으로 상기 추가적인 사이토카인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 RNA인, 의학적 조제물.
  50. 제44항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원 또는 이의 변이체, 또는 상기 항원 또는 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하고,
    상기 CAR을 발현하도록 유전자 변형된 T 세포가 상기 항원을 표적화하는, 의학적 조제물.
  51. 제50항에 있어서,
    상기 항원 또는 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 RNA인, 의학적 조제물.
  52. 제44항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서,
    키트인, 의학적 조제물.
  53. 제52항에 있어서,
    CAR을 발현하도록 유전자 변형된 T 세포, IL2 또는 IL2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 선택적으로 추가적인 사이토카인 또는 상기 추가적인 사이토카인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 선택적으로 항원 또는 이의 변이체 또는 항원 또는 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 분리된 개별 용기들에 포함하는, 약학적 조제물.
  54. 제52항 또는 제53항에 있어서,
    암을 치료 또는 예방하기 위한 약학적 조제물의 사용 설명서를 더 포함하고, 상기 항원이 종양-관련 항원인, 의학적 조제물.
  55. 제44항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서,
    약학적 조성물인, 의학적 조제물.
  56. 제55항에 있어서,
    상기 약학적 조성물이 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제를 더 포함하는, 의학적 조제물.
  57. a. 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 유전자 변형된 T 세포; 및
    b. IL2를 암호화하는 RNA를 포함하는, 의학적 조제물.
  58. 제57항에 있어서,
    IL2를 암호화하는 RNA와 추가적인 사이토카인을 암호화하는 RNA를 포함하는, 의학적 조제물.
  59. 제58항에 있어서,
    상기 추가적인 사이토카인이 IL7 및 IL21로 이루어진 군으로부터 선택되는, 의학적 조제물.
  60. 제57항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서,
    IL2를 암호화하는 RNA와 IL7을 암호화하는 RNA를 포함하는, 의학적 조제물.
  61. 제57항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서,
    IL2를 암호화하는 RNA와 IL21을 암호화하는 RNA를 포함하는, 의학적 조제물.
  62. 제57항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원 또는 이의 변이체를 암호화하는 RNA를 더 포함하고, 상기 CAR을 발현하도록 유전자 변형된 T 세포가 상기 항원을 표적화하는, 의학적 조제물.
  63. 제57항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서,
    키트인, 의학적 조제물.
  64. 제63항에 있어서,
    CAR을 발현하도록 유전자 변형된 T 세포, IL2를 암호화하는 RNA, 선택적으로 추가적인 사이토카인을 암호화하는 RNA, 및 선택적으로 항원 또는 이의 변이체를 암호화하는 RNA를 분리된 개별 용기들에 포함하는, 의학적 조제물.
  65. 제63항 또는 제64항에 있어서,
    암을 치료 또는 예방하기 위한 의학적 조제물의 사용 설명서를 더 포함하고, 상기 항원이 종양-관련 항원인, 의학적 조제물.
  66. 제57항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서,
    약학적 조성물인, 의학적 조제물.
  67. 제66항에 있어서,
    상기 약학적 조성물이 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제를 더 포함하는, 의학적 조제물.
  68. 제44항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 IL2가 약동학 (PK)적으로 연장된 IL2인, 의학적 조제물.
  69. 제68항에 있어서,
    상기 약동학 (PK)적으로 연장된 IL2가 융합 단백질을 포함하는, 의학적 조제물.
  70. 제69항에 있어서,
    상기 융합 단백질이 IL2 모이어티; 및 혈청 알부민, 면역글로불린 단편, 트랜스페린, Fn3 및 이들의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 모이어티를 포함하는, 의학적 조제물.
  71. 제45항 내지 제56항 또는 제58항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 추가적인 사이토카인이 약동학 (PK)적으로 연장된 사이토카인, 의학적 조제물.
  72. 제71항에 있어서,
    상기 약동학 (PK)적으로 연장된 사이토카인이 융합 단백질을 포함하는, 의학적 조제물.
  73. 제72항에 있어서,
    상기 융합 단백질이 사이토카인 모이어티; 및 혈청 알부민, 면역글로불린 단편, 트랜스페린, Fn3 및 이들의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 모이어티를 포함하는, 의학적 조제물.
  74. 제70항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 혈청 알부민이 마우스 혈청 알부민 또는 인간 혈청 알부민을 포함하는, 의학적 조제물.
  75. 제70항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역글로불린 단편이 면역글로불린 Fc 도메인을 포함하는, 의학적 조제물.
  76. 제44항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서,
    약학적 용도인, 의학적 조제물.
  77. 제76항에 있어서,
    상기 약학적 용도가 질환 또는 장애에 대한 치료학적 치료 또는 예방학적 치료를 포함하는, 의학적 조제물.
  78. 제44항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서,
    개체에서 암을 치료 또는 예방하는 방법에 사용하기 위한 것이며,
    상기 항원이 종양-관련 항원인, 의학적 조제물.
KR1020217024681A 2019-02-08 2020-02-06 Car-조작된 t 세포 및 사이토카인을 수반한 치료 KR20210124236A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP2019053144 2019-02-08
EPPCT/EP2019/053144 2019-02-08
PCT/EP2020/052965 WO2020161224A1 (en) 2019-02-08 2020-02-06 Treatment involving car-engineered t cells and cytokines

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20210124236A true KR20210124236A (ko) 2021-10-14

Family

ID=69374314

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020217024681A KR20210124236A (ko) 2019-02-08 2020-02-06 Car-조작된 t 세포 및 사이토카인을 수반한 치료

Country Status (12)

Country Link
US (1) US20220125836A1 (ko)
EP (2) EP3920960B1 (ko)
JP (1) JP2022519713A (ko)
KR (1) KR20210124236A (ko)
CN (1) CN113795272A (ko)
AU (1) AU2020218615A1 (ko)
BR (1) BR112021015455A2 (ko)
CA (1) CA3129100A1 (ko)
DK (1) DK3920960T3 (ko)
ES (1) ES2984609T3 (ko)
MX (1) MX2021009506A (ko)
WO (1) WO2020161224A1 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW202332687A (zh) * 2021-12-23 2023-08-16 比利時商ｅＴｈｅＲＮＡ免疫治療公司 免疫刺激性mrna組成物及其用途
WO2024121426A1 (en) 2022-12-09 2024-06-13 Cemm - Forschungszentrum Für Molekulare Medizin Gmbh Method for optimizing t cells for immuno-therapy

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
US20050287153A1 (en) 2002-06-28 2005-12-29 Genentech, Inc. Serum albumin binding peptides for tumor targeting
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US7176278B2 (en) 2001-08-30 2007-02-13 Biorexis Technology, Inc. Modified transferrin fusion proteins
US7696320B2 (en) 2004-08-24 2010-04-13 Domantis Limited Ligands that have binding specificity for VEGF and/or EGFR and methods of use therefor
DK2316852T3 (da) 2002-11-08 2014-06-16 Ablynx Nv Stabiliserede enkeltdomæne-antistoffer
KR101184391B1 (ko) 2004-02-09 2013-03-14 휴먼 게놈 사이언시즈, 인코포레이티드 알부민 융합 단백질
US20070269422A1 (en) 2006-05-17 2007-11-22 Ablynx N.V. Serum albumin binding proteins with long half-lives
CA2658654A1 (en) 2006-07-24 2008-01-31 Biorexis Pharmaceutical Corporation Exendin fusion proteins
US20100113339A1 (en) 2006-09-08 2010-05-06 Ablynx N. V. Serum albumin binding proteins with long half-lives
BRPI0821924A2 (pt) 2007-12-27 2015-07-07 Novartis Ag Moléculas de ligação baseadas em fibronectina melhoradas e seu uso
CA2723277A1 (en) 2008-05-02 2009-11-05 Novartis Ag Improved fibronectin-based binding molecules and uses thereof
EP2556087A1 (en) 2010-04-09 2013-02-13 Novozymes Biopharma DK A/S Albumin derivatives and variants
MX2012011781A (es) 2010-04-13 2012-11-16 Squibb Bristol Myers Co Proteinas de dominio de armazon basadas en fibronectina que se unen a la proteina convertasa subtilisina kexina tipo q (pcsk9).
ES2716298T3 (es) * 2011-09-16 2019-06-11 Baylor College Medicine El microentorno tumoral como diana mediante el uso de células NKT manipuladas
US20140315817A1 (en) 2011-11-18 2014-10-23 Eleven Biotherapeutics, Inc. Variant serum albumin with improved half-life and other properties
WO2013143555A1 (en) 2012-03-26 2013-10-03 Biontech Ag Rna formulation for immunotherapy
CA2945388A1 (en) * 2014-04-23 2015-10-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Chimeric antigen receptors (car) for use in therapy and methods for making the same
ES2948133T3 (es) * 2015-04-17 2023-08-31 Novartis Ag Métodos para mejorar la eficacia y expansión de células que expresan un receptor de antígeno quimérico
WO2016180467A1 (en) * 2015-05-11 2016-11-17 Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh Enhancing the effect of car-engineered t cells by means of nucleic acid vaccination
CN108633287A (zh) * 2015-09-17 2018-10-09 诺华股份有限公司 功效增强的car t细胞治疗
WO2017059902A1 (en) 2015-10-07 2017-04-13 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh 3' utr sequences for stabilization of rna
CN106279432B (zh) * 2016-08-10 2019-09-20 深圳市再生之城生物医药技术有限公司 一种vc-car分子及在清除hiv-1感染细胞中的应用
CN110381989A (zh) * 2016-12-21 2019-10-25 丹麦技术大学 用于免疫细胞操作的抗原呈递支架

Also Published As

Publication number Publication date
DK3920960T3 (da) 2024-07-22
ES2984609T3 (es) 2024-10-30
JP2022519713A (ja) 2022-03-24
EP4414033A3 (en) 2024-10-30
WO2020161224A1 (en) 2020-08-13
CN113795272A (zh) 2021-12-14
BR112021015455A2 (pt) 2021-10-19
EP4414033A2 (en) 2024-08-14
EP3920960B1 (en) 2024-04-17
EP3920960A1 (en) 2021-12-15
MX2021009506A (es) 2021-09-08
US20220125836A1 (en) 2022-04-28
AU2020218615A1 (en) 2021-09-30
CA3129100A1 (en) 2020-08-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7550745B2 (ja) Ｉｌ２アゴニスト
JP7505984B2 (ja) サイトカインをコードするｒｎａを用いた治療
EP3920960B1 (en) Treatment involving car-engineered t cells and cytokines
US20220356223A1 (en) IL2 Agonists
US20220143144A1 (en) Treatment involving interleukin-2 (il2) and interferon (ifn)
US20220177544A1 (en) Interleukin-2 receptor (IL2R) and interleukin-2 (IL2) variants for specific activation of immune effector cells