CN110381989A - 用于免疫细胞操作的抗原呈递支架 - Google Patents

用于免疫细胞操作的抗原呈递支架 Download PDF

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Abstract

本发明涉及人工抗原呈递细胞(aAPC)支架，以向细胞提供特异性功能性刺激，以获得对于介导肿瘤消退或病毒清除而言理想的表型和功能特性。特别地，本发明的支架包含抗原，例如肽‑MHC(pMHC)I类分子，以及细胞因子和共刺激分子的特定组合，以允许特异性T细胞的有效扩增和功能性刺激。

Description

用于免疫细胞操作的抗原呈递支架
技术领域
本发明涉及人工抗原呈递细胞(aAPC)支架，以向细胞提供特异性功能性刺激，以获得对于介导肿瘤消退或病毒清除而言理想的表型特性和功能特性。特别地，本发明的支架包含抗原，例如肽-MHC(pMHC)I类分子，以及细胞因子和共刺激分子的特定组合，以允许特异性T细胞的有效扩增和功能性刺激。
背景技术
在恶性黑色素瘤研究中，免疫治疗方法过继细胞转移(ACT)——其中从患者体内提取来自外周血(PBMC)或肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的肿瘤反应性T细胞，使其离体激活并扩增，随后返回给患者——在超过50％的患者表现出临床持久反应。然而，来自PBMC或TIL的肿瘤反应性T细胞的扩增需要大量的离体培养，通常以T细胞分化和功能能力为代价。结果，转移的T细胞产物可能不含有足够频率的、具有适当的表型和功能特征以介导肿瘤消退的肿瘤反应性CD8 T细胞。此外，大多数此类肿瘤浸润性T细胞可能不是肿瘤特异性的，而是来自外周的旁观者T细胞浸润，T细胞受体(TCR)识别不匹配任何肿瘤抗原。最后，由于肿瘤部位存在抑制环境，肿瘤反应性T细胞的级分的生长潜力可能降低。
已经尝试利用人工抗原呈递细胞(aAPC)来克服扩增的T细胞的分化和功能能力不足的问题。aAPC背后的简单概念是它们模拟TCR与由主要组织相容性复合物(MHC)呈递的特异性肽抗原之间的天然相互作用。这种相互作用是通过能够引发有效免疫应答的T细胞的激活、扩增和分化来产生免疫力的核心步骤。细胞因子和共刺激分子进一步辅助天然T细胞应答的产生，它们诱导T细胞活化和功能。因此，将所有必需的分子掺入单一aAPC支架中是克服T细胞扩增的一些挑战的有希望的工具。aAPC形成了T细胞活化和分化的理想免疫突触。然而，关键的挑战是揭示使aAPC能够有效地扩增所提取的TIL同时还保持功能性表型的分子的组合。
在WO2002072631中公开了利用MHC平台的许多概念，其中一种是MHC构建体，其包含其上连接有一种或多种MHC分子的载体分子。该构建体还可含有生物活性分子，例如共刺激分子或细胞调节分子。预期该MHC构建体特别用于扩增识别该构建体的细胞并用于产生用于治疗疾病(例如癌症等)的治疗组合物。WO2002072631公开了可能适用于T细胞扩增的许多共刺激分子和细胞因子，但没有鉴定出对于T细胞扩增特别合适且有效的任何特定组合。
US 2011/318380公开了WO2002072631中描述的MHC构建体在癌症疫苗和免疫监测中的应用。然而，US 2011/318380没有举例说明对于T细胞扩增特别合适且有效的共刺激分子和细胞因子的任何特定组合。
WO2009003492主要关注抗原特异性T细胞的检测，但也公开了抗原特异性T细胞的扩增。其中描述了具有和不具有复合肽的MHC多聚体，其制备方法及其在分析和治疗中的用途，包括能够灭活或消除不需要的靶T细胞的抗原特异性T细胞的分离。根据WO2009003492的MHC多聚体可包含葡聚糖支架和共刺激分子和细胞调节分子。然而，该公开没有明确对于T细胞扩增特别有效的分子的特定组合。
在WO2009094273中公开了一种用于扩增抗原特异性T细胞的aAPC组合物，其包含纳米颗粒、细胞因子、偶联剂、T细胞受体活化剂和共刺激分子。T细胞受体活化剂可以是与肽抗原结合的MHC分子。此外，描述了扩增的T细胞在过继免疫疗法中的用途。然而，仅探索了aAPC上单一细胞因子(即IL-2)的适合性，并且仅将其与外源细胞因子进行了比较。
因此，先前对于aAPC支架的公开的共同之处在于它们仅以大致一般的方式描述该概念。由于只有在组合了刺激分子的特定组合时，才能满足T细胞扩增的成功标准，即活性T细胞的比例高、T细胞的抗原特异性高且T细胞的功能性高，因此非常需要定义明确且有效的aAPC支架。只有当满足T细胞扩增的所有三个成功标准时，才能最佳地制备所得的T细胞群以应用它们的抗肿瘤或抗病毒功能。
因此，改进的aAPC支架将是有利的。特别地，需要提供活性T细胞的比例高、T细胞的抗原特异性高且T细胞的功能性高的更有效的aAPC支架。
发明内容
因此，本发明的一个目的涉及提供人工抗原呈递细胞(aAPC)支架，其扩增肿瘤反应性T细胞的能力提高，所述肿瘤反应性T细胞是从外周血(PBMC)或肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)中提取的。
特别地，本发明的一个目的是提供一种aAPC支架，其解决了现有技术的上述问题，即扩增的T细胞群的T细胞分化和功能能力不足。
本发明的另一个目的是利用所获得的具有优化的表型和功能特性的扩增的T细胞群来介导肿瘤消退或病毒清除。
因此，本发明的一个方面涉及一种人工抗原呈递细胞(aAPC)支架，其包含聚合物主链，所述聚合物主链上连接有以下模板分子：
i.至少一种包含抗原肽的主要组织相容性复合物分子(pMHC)，
ii.至少一种细胞因子，其选自由IL-21、IL-2、IL-15、IL-1、IL-6、IL-10和IL-7组成的组，
iii.任选地，至少一种共刺激分子，其选自由B7.2(CD86)、B7.1(CD80)、CD40、ICOS和PD-L1组成的组，和
iv.任选地，至少一种CD47分子。
本发明的一个优选方面涉及一种人工抗原呈递细胞(aAPC)支架，其包含聚合物主链，所述聚合物主链上连接有以下模板分子：
i.至少两种不同的γ链受体细胞因子，例如选自由IL-21、IL-2、IL-15、IL-4、IL-9和IL-7组成的组的至少两种不同的γ链受体细胞因子，
ii.至少一种抗原，
iii.任选地，至少一种共刺激分子，其选自由B7.2(CD86)、B7.1(CD80)、CD40、ICOS和PD-L1组成的组，和
iv.任选地，至少一种CD47分子。
本发明的另一方面涉及同时体外刺激和扩增T细胞的方法，其包括以下步骤：
i.提供包含T细胞的样品，
ii.使所述样品与包含根据本发明的aAPC支架的溶液接触，
iii.刺激并扩增培养中的、对所述aAPC支架具有特异性的T细胞，以及
iv.从培养物中收获步骤iii)的T细胞，以获得扩增的、抗原特异性T细胞群。
本发明的另一方面是提供通过本发明的方法获得的扩增的T细胞群。
本发明的又一方面涉及通过本发明的方法获得的扩增的T细胞群，其用作药物。
本发明的又一方面是提供通过本发明的方法获得的扩增的T细胞群，其用于治疗癌症或病毒病况。
附图说明
图1显示了(A)示例性人工抗原呈递细胞(aAPC)支架的示意图。aAPC支架由主链组成，主链上连接有模板分子，例如肽-MHC(pMHC)分子、细胞因子和任选的共刺激分子。此外，可以将CD47分子连接到aAPC支架上。给出了aAPC支架的实例，其中不同比例的主链和模板分子组装成aAPC支架。(B)仔细选择的模板分子的组合可以如何在aAPC支架中组合并用于扩增从患者提取的特异性T细胞群的图示。
图2显示了(A)使用不同抗原呈递支架染色的T细胞的平均荧光强度(MFI)值，其中所述不同抗原呈递支架以1：1、1：5、1：10、1：20、1：30的支架：pMHC比例组装，并且应用于来自健康供体的PBMC的染色，所述健康供体具有针对CMV pp65 YSE肽的应答。使用不同抗原呈递支架染色的T细胞样品的MFI值(B)和SI值(C)，其中所述不同抗原呈递支架以1：10或1：20的支架：pMHC比例组装，并以5：5的比例与B7-2和IL-15(作为共-刺激分子)共连接。
图3显示了以1：30的比例与B7-2(A)或IL-15(B)组装，并用于健康供体PBMC的染色的支架。Y轴上的荧光染料是PE-Cy7，X轴上的荧光染料是FITC。
图4显示了(A)来自健康供体的HLA-A1 FLU BP-VSD特异性CD8 T细胞的频率，其用PE(X-轴)和APC(Y-轴)标记的四聚体直接离体检测。用比例为1：10：5：5：5(支架：pMHC：B7-2：IL-15：IL-21)的抗原呈递支架，加20IU/ml IL-2(添加到培养基中)(B)，游离的FLU BP-VSD肽、IL-15和IL-21(C)，或携带无关肽特异性的比例为1：10：5：5：5的抗原呈递支架(D)培养两周后HLA-A1 FLU BP-VSD特异性CD8 T细胞的频率。(E)基于HLA-A1 FLU BP-VSD特异性CD8 T细胞的频率的扩增率，从基线、扩增后1周和2周通过四聚体染色检测。(F)扩增2周后HLA-A1 FLU BP-VSD特异性CD8 T细胞的绝对数量。
图5显示了(A)来自健康供体的HLA-A1 FLU BP-VSD特异性CD8 T细胞的频率，其用PE(X-轴)和APC(Y-轴)标记的四聚体直接离体检测。(B)用比例为1：15：5：5(支架：pMHC：B7-2：IL-15)的过滤的抗原呈递支架、未过滤的抗原呈递支架或培养基中的游离的FLU BP-VSD肽(所有培养物中均加入20IU/ml IL-2)培养两周后HLA-A1 FLU BP-VSD特异性CD8 T细胞的频率。用APC和PE标记的四聚体检测频率。(C)基于HLA-A1 FLU BP-VSD特异性CD8 T细胞的频率的扩增率，从基线、扩增后1周和2周通过四聚体染色检测。(D)用比例为1：15：5：5(支架：pMHC：B7-2：IL-15)的过滤的抗原呈递支架、未过滤的抗原呈递支架或游离的FLU BP-VSD肽扩增2周后四聚体阳性CD3/CD8 T细胞的MFI值。
图6显示了(A)用比例为1：15：5：5(支架：pMHC：B7-2：IL-15)的未过滤的或过滤的抗原呈递支架扩增2周后来自健康供体的HLA-A3 FLU NP LIR特异性CD8 T细胞的频率。点图显示了两个抗原特异性CD8 T细胞群，一个与PE-Cy7标记的四聚体(X轴)具有高亲和力(黑色群)，另一个与其具有较低亲和力(深灰色群)，而从PerCP标记的CD8抗体(Y轴)获得了相同的染色强度。(B)用比例为1：15：5：5的未过滤的或过滤的抗原呈递支架扩增2周后，对四聚体具有高结合亲和力和低结合亲和力的HLA-A3 FLU NP LIR特异性CD8 T细胞的CD28表达的条形图。
图7显示了(A)用比例为1：15：5：5(支架：pMHC：B7-2：IL-15)的未过滤的或过滤的抗原呈递支架刺激2周后，通过四聚体染色检测来自健康供体的HLA-A1 FLU BP-VSD特异性CD8 T细胞的频率。CD8抗体是PerCP标记的(Y轴)，四聚体是PE-Cy7标记的(X轴)。示出了用比例为1：15：5：5的未过滤的或过滤的抗原呈递支架扩增2周后HLA-A1 FLU BP-VSD特异性CD8 T细胞的(B)CD45RA和CD28表达的频率，(C)CD45RA和CCR7表达的频率，和(D)CD45RA和CD57表达的频率的点图。
图8显示了(A)与游离的肽、IL-15和IL-21相比，用比例为1：10：5：5：5(支架：pMHC：B7-2：IL-15：IL-21)的过滤的和未过滤的抗原呈递支架扩增2周后，HLA-A1 FLU BP-VSD特异性CD8 T细胞的CD28、CD57和CCR7的表达(所有这些培养物在培养基中均含有20IU/MLIL-2)；(B)与具有游离的IL-2和IL21的抗原呈递支架1：8(支架：pMHC)相比，用比例为1：8：8：8(支架：pMHC：IL-2：IL-21)的过滤的和未过滤的抗原呈递支架扩增2周后，HLA-A1 FLUBP-VSD特异性CD8 T细胞的CD28、CD57和CCR7的表达。(C)用比例为1：10：5：5：5(支架：pMHC：B7-2：IL-15：IL-21)的过滤的和未过滤的抗原呈递支架或游离的肽、IL-15和IL-21扩增2周后，HLA-A1 FLU BP-VSD特异性CD8 T细胞的CD28表达的MFI值。(D)用比例为1：8：8：8(支架：pMHC：IL-2：IL-21)的过滤的和未过滤的抗原呈递支架或含有游离IL-2和IL21的抗原呈递支架1：8(支架：pMHC)扩增2周后，HLA-A1 FLU BP-VSD特异性CD8 T细胞的CD28表达的MFI值。
图9显示了(A)与游离的肽、IL-15和IL-21相比，用比例为1：10：5：5：5(支架：pMHC：B7-2：IL-15：IL-21)的过滤的和未过滤的抗原呈递支架扩增2周后，HLA-A1 FLU BP-VSD特异性CD8 T细胞的PD-1、Tim-3和LAG-3的表达(所有这些培养物在培养基中均含有20IU/MLIL-2)；(B)与具有游离的IL-2和IL21的抗原呈递支架1：8(支架：pMHC)相比，用比例为1：8：8：8(支架：pMHC：IL-2：IL-21)的过滤的和未过滤的抗原呈递支架扩增2周后，HLA-A1 FLUBP-VSD特异性CD8 T细胞的PD-1、Tim-3和LAG-3的表达。(C)用比例为1：10：5：5：5(支架：pMHC：B7-2：IL-15：IL-21)的过滤的和未过滤的抗原呈递支架或游离的肽、IL-15和IL-21扩增2周后，PD-1阴性HLA-A1FLU BP-VSD特异性CD8 T细胞的频率。(D)用比例为1：8：8：8(支架：pMHC：IL-2：IL-21)的过滤的和未过滤的抗原呈递支架或含有游离IL-2和IL21的抗原呈递支架1：8(支架：pMHC)扩增2周后，PD-1阴性HLA-A1 FLU BP-VSD特异性CD8 T细胞的频率。
图10显示了使用HLA-A1 FLU BP-VSD肽在体外肽刺激后，TNF-α、IFN-γ和CD107a表达的频率。通过细胞内细胞因子染色，测量肽响应性CD8 T细胞中的细胞因子分泌。(A)与游离的肽和IL-15、IL-21刺激相比，用比例为1：10：5：5：5(支架：pMHC：B7-2：IL-15：IL-21)的过滤的和未过滤的抗原呈递支架扩增2周后，或(B)与具有游离IL-2和IL-21的抗原呈递支架1：8(支架：pMHC)相比，用比例为1：8：8：8(支架：pMHC：IL-2：IL-21)的过滤的和未过滤的抗原呈递支架(其中培养基中不含有IL-2)扩增2周后，获得测试的细胞培养物。该图显示了三阳性、双阳性和单阳性HLA-A1 FLU BP-VSD特异性CD8 T细胞的频率。在每个图中(通过抬高)突出显示了三阳性份数。
图11显示了点图，其显示了用HLA-A1 FLU BP-VSD肽刺激后CD8 T细胞中(A)CD107a和IFN-γ，以及(B)TNF-α和IFN-γ的表达。用比例为1：10：5：5：5(支架：pMHC：B7-2：IL-15：IL-21)的抗原呈递支架刺激培养物2周，所述抗原呈递支架在MHC复合物中携带相关(左图)或无关肽特异性(右图)。在(A)中CD107a抗体是PE标记的(Y轴)，IFN-γ抗体是APC标记的(X轴)，在(B)中TNF-α抗体是PE-Cy7标记的(Y轴)，IFN-γ抗体是APC标记的(X轴)。这些染色一式两份进行，仅显示了各染色中的一个。
图12显示了用比例为1：10：5：5：5(支架：pMHC：B7-2：IL-15：IL-21)的抗原呈递支架扩增2周后，来自健康供体的4种病毒应答的倍数扩增。建立了五种培养物：
1-4.在单独的培养物中扩增了4种病毒应答(每个培养物一种)
5.同时扩增所述4种病毒应答(每个培养物4种)
4种评估的肽-MHC应答的特异性是：HLA-A2 FLU MP 58-66 GIL、HLA-A2 EBV LMP2FLY、HLA-A2 CMV pp65 NLV和HLA-A2 EBV BRLF1 YVL。
图13显示了(A)用各抗原呈递支架刺激2周，然后暴露于特异性肽(HLA-A2 EBVLMP2 CLG)4小时后，T细胞培养物中TNF-α、IFN-γ和CD107a的表达。使用比例为1：10：5：5：5(支架：pMHC：B7-2：分子1：分子2)的21种不同的抗原呈递支架。最外面的黑色圆圈表示用四聚体染色检测的抗原特异性CD8 T细胞(事件)的绝对数量，圆圈1表示表达三种标志物(TNF-α、IFN-γ和CD107a)之一，圆圈2表示表达三种标志物中的两种，圆圈3表示表达所有三种标志物。(B)比例为1：10：5：5：5(支架：pMHC：B7-2：IL-15：IL-21)的参照抗原呈递支架。
图14显示了(A)用各抗原呈递支架刺激2周，然后暴露于特异性肽(HLA-A2 EBVLMP2 CLG)4小时后，T细胞培养物中TNF-α、IFN-γ和CD107a的表达。使用比例为1：8：8：8(支架：pMHC：IL-2：分子1)的7种不同的抗原呈递支架。分子1在PD-L1、ICOS、OX40L、CD5、IL-1IL-6、IL-10之间变化。最外面的黑色圆圈表示用四聚体染色检测的抗原特异性CD8 T细胞(事件)的绝对数量，圆圈1表示表达三种标志物(TNF-α、IFN-γ和CD107a)之一，圆圈2表示表达三种标志物中的两种，圆圈3表示表达所有三种标志物。(B)比例为1：8：8：8(支架：pMHC：IL-2：IL-21)的参照抗原呈递支架。
图15显示了用如下扩增2周后，HLA-A2 EBV LMP2 CLG特异性CD8 T细胞的CD28和PD-1表达：(A)19种不同的抗原呈递支架，其比例为1：10：5：5：5(支架：pMHC：B7-2：分子1：分子2)，和参照抗原呈递支架(支架：pMHC：B7-2：IL-15：IL-21)，和(B)七种抗原呈递支架，其比例为1：8：8：8(支架：pMHC：IL-2：分子1)，和参照抗原呈递支架(支架：pMHC：IL-2：IL-21)，其中在培养基中不含IL-2。黑色圆圈代表用四聚体染色检测的抗原特异性CD8 T细胞(事件)的绝对数量，x轴和y轴上的相对分布代表它们的两种分子PD-1和CD28的表达。PD-1和CD28抗体均为BV-421标记的。
图16显示了用抗原呈递支架刺激两周后，通过四聚体染色检测来自健康供体的HLA-A2 EBV LMP2 CLG特异性CD8 T细胞的频率，所述抗原呈递支架以不同的支架长度组装：Immudex的270kDa，和Fina Biosolutions的250kDa、750kDa和2000kDa。以1：10：5：5：5(支架：pMHC：B7-2：IL-15：IL-21)的比例组装支架。CD8抗体是BV510标记的(Y轴)，四聚体是PE标记的(X轴)。HLA-A2 EBV LMP2 CLG特异性CD8 T细胞的基线响应为0.01％。
图17显示了使用aAPC支架1：8：8：8(支架：pMHC：IL-2：IL-21)平行扩增来自健康供体的抗原特异性CD8 T细胞，所述健康供体具有五种不同的已知病毒应答。(A)单独地或以1/10特异性aAPC支架加9/10的具有无关不匹配HLA-型的aAPC支架的混合物分别扩增五种不同的病毒应答中的两种(HLA-A2 EBV LMP2 FLY和HLA-A2 CMV pp65 NLV特异性CD8 T细胞)。(B)使用1/10的各特异性的正常aAPC支架浓度，加5/10的具有不匹配HLA-型的aAPC支架，在同一培养物中同时扩增所有五种病毒应答。五种病毒应答的特异性分别为HLA-A2FLU MP 58-66 GIL、HLA-A2 EBV LMP2 FLY、HLA-A2 CMV pp65 NLV、HLA-A2 EBV BRLF1 YVL和HLA-A2 CMV IE1 VLE。
图18显示了用250kDa、750kDa和2000kDa的aAPC支架扩增2周后，来自健康供体的抗原特异性CD8 T细胞的频率。对于所有三种支架，使用了两种不同的支架与分子比例，(A)aAPC支架1：8：8：8(支架：pMHC：IL-2：IL-21)，和(B)aAPC支架1：24：24：24(支架：pMHC：IL-2：IL-21)。
图19显示了C57BL/6小鼠中aAPC支架介导的OVA特异性CD8 T细胞的体内扩增。在接种前、在腹膜内接种OVA+poly IC后第7天和第19天以及在加强免疫后第7天测量OVA特异性CD8 T细胞的频率。在接种后第21天施用四种不同的加强剂。小鼠1静脉注射PBS，小鼠2腹膜内注射OVA，小鼠3静脉注射具有H2-Kb/SIINFEKL的aAPC支架1：8：8：8(支架：pMHC：IL-2：IL21)，小鼠4静脉注射与在aAPC支架1：8：8：8上组装的相同浓度的H2-Kb/SIINFEKL(即，小鼠3的加强剂)。即在小鼠4中，抗原肽作为pMHC复合物的一部分给予，但没有aAPC支架。
图20显示了aAPC支架介导的扩增与单核细胞衍生的树突状细胞(moDC)介导的抗原特异性T细胞的扩增的比较。从最初具有0.01％抗原特异性T细胞的健康供体扩增抗原特异性T细胞。在如下四种条件下平行进行扩增：存在(A)游离pMHC复合物和IL2和IL21(即，没有aAPC支架)、(B)aAPC支架比例1：8：8：8(支架：pMHC：IL-2：IL-21)、(C)未脉冲的moDC或(D)肽脉冲的衍生源相同的moDC。将经受四种条件中任一种的抗原特异性T细胞培养2周，按指示每周刺激两次。两周后，通过MHC四聚体染色追踪抗原特异性T细胞的扩增。图20中示出了代表性的点图。
现在将在下面更详细地描述本发明。
具体实施方式
定义
在进一步详细讨论本发明之前，首先定义以下术语和惯例：
人工抗原呈递细胞(aAPC)支架
在本文中，术语“人工抗原呈递细胞(aAPC)支架”是指如本文所定义的必需分子的组装，以使其功能类似于抗原呈递细胞。
聚合物主链
在本发明的上下文中，术语“聚合物主链”是指aAPC支架的一部分，各个模板分子固定其上。模板分子通过偶联剂(其位于聚合物主链上或作为聚合物主链的整合部分)与亲和标签(其置于模板分子上)之间的相互作用而连接。或者，偶联剂可以位于模板分子上，相应的亲和标签位于聚合物主链上。
聚合物主链可以是选自以下的材料：多糖、乙烯基聚合物、聚乙二醇、聚丙二醇、strep-tactin、聚链霉抗生物素蛋白、生物素结合蛋白和聚组氨酸结合聚合物。
模板分子
在本发明的上下文中，术语“模板分子”是指连接在aAPC支架的聚合物主链上的任何分子。它们可以选自pMHC分子、细胞因子、共刺激分子和CD47。模板分子包含亲和标签。
非共价相互作用
在本发明的上下文中，术语“非共价相互作用”是指通过除共价键之外的其他相互作用的任何键合。非共价键可以通过例如疏水相互作用、亲水相互作用、离子相互作用、范德华力、氢键和它们的组合形成。
偶联剂
在本发明的上下文中，术语“偶联剂”是指位于aAPC的聚合物主链上的分子实体。偶联剂可以与亲和标签非共价结合。偶联剂的实例包括链霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白、strep-tactin、抗体、聚His标签、金属离子螯合物等。
或者，偶联剂可以位于模板分子上，相应的亲和标签位于聚合物主链上。
亲和标签
在本发明的上下文中，术语“亲和标签”是指位于模板分子上的分子种类。亲和标签通过非共价相互作用高度特异性地结合偶联剂。偶联剂的实例包括生物素、抗体表位、His标签、链霉抗生物素蛋白、strep-tactin、聚组氨酸、肽、金属离子螯合物等。
或者，亲和标签可以位于聚合物主链上，相应的偶联剂位于模板分子主链上。
抗原
在本发明的上下文中，术语“抗原”是指能够通过其自身或与其他分子合作而诱导免疫应答的分子。
如本文所定义的aAPC包含至少一种抗原。抗原是aAPC的一部分，作为i)独立的分子或ii)作为分子复合物的一部分。在i)的情况下，抗原可以是蛋白质，例如分化簇(cluster of differentiation，CD)蛋白。在ii)的情况下，抗原可以是蛋白质或抗原肽的形式。这种抗原肽可以是具有主要组织相容性复合物(MHC)(即pMHC复合物)的复合物的一部分。
抗原可以是MHC呈递的抗原肽或无需与MHC复合物结合即可被识别的抗原(即，非MHC呈递的分子)。不与MHC复合呈递的抗原的实例包括但不限于CD蛋白，例如CD19、CD20和CD22。
半抗原
在本发明的上下文中，术语“半抗原”是指仅在连接大载体(例如蛋白质或支架)时才能引发免疫应答的小分子。因此，半抗原是低分子量的非免疫原性化合物，其可以被抗体结合，但不能自身引发免疫应答。半抗原可以与疾病靶向抗体缀合。
半抗原的实例包括但不限于生物素、荧光素、地高辛(digoxigenin)、二硝基苯酚、可替宁(cotinine)、肼屈嗪(hydralazine)和漆酚(urushiol)。
MHC和pMHC
在本发明的上下文中，术语“MHC”和“pMHC”可互换使用，并指具有复合的抗原肽的主要组织相容性复合物(MHC)分子。
在人类中，MHC复合物由人白细胞抗原(HLA)基因复合物编码。因此，在本发明的上下文中，术语“MHC”还涵盖“HLA”。
细胞因子
在本发明的上下文中，术语“细胞因子”是指影响受刺激的T细胞的扩增、存活和效应功能的免疫调节分子。细胞因子包括趋化因子、干扰素、白细胞介素、淋巴因子和肿瘤坏死因子。
γ链受体细胞因子
在本发明的上下文中，术语“γ链受体细胞因子”是指与包含共同γ链亚基的相应细胞因子受体结合的细胞因子组。共同γ-链(γc)受体也称为CD132或白细胞介素-2受体亚基γ(IL-2RG)。γ链受体细胞因子的一个共同点是它们都通过共享的γ链受体传递其细胞内信号并影响T细胞活化和分化。
γc糖蛋白是跨膜蛋白，其包含细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，并且通常在淋巴细胞上表达。γc亚基是至少六种不同细胞因子受体(即IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21受体)的受体复合物的一部分。因此，γ链受体细胞因子组至少包含IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21。
共刺激分子
在本发明的上下文中，术语“共刺激分子”是指相对于未与共刺激分子接触的T细胞，在与T细胞相互作用时增强T细胞应答、增殖、细胞因子的产生和/或分泌，刺激T细胞的分化和效应功能或促进T细胞存活的分子。共刺激分子的实例包括B7.1、B7.2、ICOS、PD-L1、α-半乳糖苷神经酰胺等。
表位
在本发明的上下文中，术语“表位”是指被T细胞的TCR识别的抗原决定簇。由pMHC呈递的表位对任何外来物质都是高度特异性的，并且与TCR的相互作用确保了以肽-MHC指导的方式对特异性T细胞的有效扩增和功能性刺激。
药物组合物
在本发明的上下文中，术语“药物组合物”是指这样一种组合物，其包含根据本发明获得的扩增的T细胞群和/或药学上可接受的载体，所述扩增的T细胞群悬浮在合适量的药学上可接受的稀释剂或赋形剂中。
药学上可接受的
在本发明的上下文中，术语“药学上可接受的”是指当施用于人时生理上可耐受的并且通常不会产生过敏或类似的不良反应(例如胃部不适、头晕等)的分子实体和组合物。优选地，如本文所用，术语“药学上可接受的”是指由联邦或州政府的管理机构批准或在美国药典或其他公认的药典中列出的用于动物，更特别是用于人的。
佐剂
在本发明的上下文中，术语“佐剂”是指增强对抗原的免疫应答的化合物或混合物。佐剂可以作为缓慢释放抗原的组织贮库和作为非特异性地增强免疫应答的淋巴系统激活剂。通常，在没有佐剂的情况下单独使用抗原的初次攻击将不能引起体液或细胞免疫应答。佐剂包括但不限于完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、皂苷、矿物凝胶如氢氧化铝、表面活性物质如溶血卵磷脂、普朗尼克多元醇、聚阴离子、肽、油或烃乳液、匙孔血蓝蛋白、二硝基苯酚和可能有用的人类佐剂如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)。优选地，佐剂是药学上可接受的。
赋形剂
在本发明的上下文中，术语“赋形剂”是指与本发明的组合物一起施用的稀释剂、佐剂、载体或溶媒。此类药物载体可以是无菌液体如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。优选使用水或水溶液盐水溶液和右旋糖水溶液和甘油溶液作为载体，特别是用于可注射溶液。合适的药物载体描述于E.W.Martin的“Remington's Pharmaceutical Sciences”中。
人工抗原呈递细胞(aAPC)支架
T细胞在免疫应答中起关键作用，其中它们通过与抗原呈递细胞(APC)相互作用来识别并响应外来物质，展示与MHC分子(pMHC)复合的外来物质的抗原肽。T细胞是非常特异性的并且仅表达单一特异性的T细胞受体(TCR)，从而允许T细胞仅识别并响应单一的特异性pMHC分子。当T细胞首次被引发以产生抗原和MHC分子的特定组合的受体时，它们随后将不能识别其他特异性。T细胞的这种特化称为MHC限制，并且可用于扩增单一特异性的T细胞，而没有任何无关特异性“污染”扩增的T细胞群。
一些基因修饰的免疫细胞，如CAR T细胞，识别不由MHC分子呈递的抗原。本发明可用于扩增识别任何类型抗原的细胞。
因此，aAPC可以包含能够通过其自身或与其他分子合作而诱导免疫应答的任何抗原。这种抗原可以是蛋白质，例如分化簇(cluster of differentiation，CD)蛋白。
MHC分子存在于几种变体中，其中MHC I类和MHC II类分子可被认为是最重要的。MHC I类分子与CD8阳性细胞毒性T细胞(CD8+ T细胞)相互作用，MHC II类分子与CD4阳性辅助T细胞(CD4+ T细胞)相互作用。一旦被激活，CD8+ T细胞通常会寻找杀死癌细胞、被感染(特别是被病毒感染)的细胞或以其他方式受损的细胞。另一方面，CD4+ T细胞主要通过辅助免疫系统起作用，例如，通过释放细胞因子并增强CD8 T细胞。尽管不限于单一类型的T细胞，但本发明主要涉及CD8+ T细胞的激活、刺激和扩增。这尤其正确，因为aAPC支架的使用在某种程度上完成了CD4+ T细胞的作用。但是，如本文所述的aAPC支架可用于扩增CD4+ T细胞和CD8+ T细胞两者。
尽管TCR-pMHC相互作用是T细胞活化的主要驱动因素，但是需要若干其他刺激来制备T细胞以获得有效的免疫应答。总的来说，CD8+ T细胞的激活需要两个信号：1)TCR与pMHC I类分子之间的相互作用和2)CD28(T细胞上的膜受体)和位于APC上的CD28配体(例如B7.1(CD80)或B7.2(CD86))之间的共刺激相互作用。第二种信号用于增强增殖、细胞因子产生和细胞存活。
除刺激信号外，T细胞应答也受抑制性信号的调节。Tim-3、LAG-3和PD-1是抑制性信号调节子的实例。它们作为一种天然机制来避免过度的T细胞活化，并防止免疫系统在整个生物体中蔓延。
可以通过用CD4+ T细胞释放的细胞因子刺激CD8+ T细胞，来辅助次级信号，或在某些情况下替代次级信号。因此，细胞因子构成参与免疫应答调节的另一组重要分子。细胞因子通常包括白细胞介素、干扰素、趋化因子、淋巴因子和肿瘤坏死因子。它们通过受体起作用，并且其中包括调节T细胞群的成熟、生长和反应性。同时，白细胞介素-2(IL-2)和共刺激信号是保持连续的细胞分裂的最关键因素。共刺激分子和细胞因子之间微妙的相互影响是复杂的，并且是有效的且特异性的T细胞扩增的关键因素之一。
在免疫应答以及细胞过程(如细胞凋亡、增殖、粘附和迁移)中起关键作用的另一种分子是CD47。这种跨膜蛋白在人体细胞中普遍表达，但在许多不同的肿瘤细胞中也过表达，高水平的CD47允许癌细胞逃避吞噬作用。然而，CD47也在免疫细胞中广泛表达，起到“不要吃我”的信号的作用，延长免疫细胞的循环时间。表达CD47的T细胞的扩增可能是优选的，因为预测当在治疗上使用时这些细胞具有增加的半衰期。
因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中模板分子包含能够刺激T细胞群中CD47表达的配体。
推测CD47还可能对aAPC本身具有有益特性，例如，作为“不要吃我”的信号，延长了aAPC支架在培养或循环中的半衰期。
因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中模板分子包含至少一种CD47分子。
如上述说明所示，T细胞的活化和增殖涉及许多因素。然而，出于免疫治疗和/或扩增特异性T细胞群的目的，可以设定一些理想情况下为能够提供适合于这些目的的具有高活性和功能性的T细胞群应满足的条件。因此，扩增的T细胞的优选特征包括：
a.高表达激活剂(如CD28)
b.低表达抑制剂(如PD1)
c.多功能细胞因子应答
必须同时呈递有效激活和刺激所需的不同分子簇，以提供T细胞功能和扩增的最佳能力。aAPC支架的使用收集了所需分子(彼此之间具有规定的接近程度)的组合，因此构成了用于有效扩增特异性T细胞的合适平台。
因此，本发明证明了扩增肿瘤反应性T细胞所需的特定条件，通过使用MHC负载的aAPC支架为细胞提供特异性功能性刺激，以获得对于介导肿瘤消退或病毒清除而言理想的表型和功能特性。这些aAPC支架由与偶联剂缀合的聚合物主链构建，亲和标记的肽-MHC(pMHC)分子与所述偶联剂连接以控制与特异性T细胞的特异性相互作用，并且共连接了同样亲和标记的细胞因子和共刺激分子的组合以提供特异性T细胞的刺激以实现功能特性增加。基于pMHC分子的识别，aAPC支架将特异性地与T细胞相互作用，并且可以通过该特异性相互作用以肽-MHC指导的方式有效地扩增和功能性刺激特异性T细胞。
aAPC支架可以通过种类繁多的不同模板分子(即pMHC分子、细胞因子和共刺激分子)的组合来组装。本文所述的aAPC支架可包含一种或多种共刺激分子，包括但不限于CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD9、CD27、CD28、CD30、CD40、CD48、CD58、CD69、CD70、CD72、B7.1(CD80)、CD83、B7.2(CD86)、Fas(CD95)、OX40(CD134)、CD137(4-1BB)、CD147、SLAM(CDw150)、CTLA-4(CD152)、CD153(CD30L)、CD40L(CD154)、诱导型T细胞共刺激分子(ICOS、CD278)、CD134L、CD137L、OX4OL、NKG2D、HVEM、PD-1、B7RP-1、PD-L1、PD-L2、细胞间粘附分子(ICAM)和ICOSL。
此外，本文所述的aAPC支架可包含一种或多种细胞因子，包括但不限于白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-3(IL-3)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-5(IL-5)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-7(IL-7)、白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-12(IL-12)、白细胞介素-15(IL-15)、白细胞介素-21(IL-21)、干扰素α(IFN-α)、干扰素β(IFN-β)、干扰素γ(IFN-γ)、IGIF、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、肿瘤坏死因子β(TNF-β)和巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)及其变体和片段。
本文描述了适用于T细胞扩增的aAPC支架，确保了活性T细胞的高比例、T细胞的高抗原特异性和T细胞的高功能性。因此，本发明的第一方面涉及一种人工抗原呈递细胞(aAPC)支架，其包含聚合物主链，所述聚合物主链上连接有以下模板分子：
i.至少一种包含抗原肽的主要组织相容性复合物分子(pMHC)，
ii.至少一种细胞因子，其选自由IL-21、IL-2、IL-15、IL-1、IL-6、IL-10和IL-7组成的组，
iii.任选地，至少一种共刺激分子，其选自由B7.2(CD86)、B7.1(CD80)、CD40、ICOS和PD-L1组成的组，和
iv.任选地，至少一种CD47分子。
当同时存在几种细胞因子时，可以增强一些T细胞的扩增。因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中模板分子包含选自由IL-21、IL-2、IL-15、IL-1、IL-6、IL-10和IL-7组成的组的至少两种不同的细胞因子。
根据本发明的aAPC还可以包含无需与MHC复合物结合即可被识别的抗原。此类抗原可以是但不限于属于分化簇(CD)分类的蛋白质。
已经鉴定出了能够产生特别有利的aAPC支架的不同的细胞因子组。不受理论束缚，一组有效的细胞因子是通过共享的γ链受体递送其细胞内信号并影响T细胞活化和分化的细胞因子。在本发明的上下文中，这些细胞因子被称为“γ链受体细胞因子”。因此，本发明的一个优选方面涉及一种人工抗原呈递细胞(aAPC)支架，其包含聚合物主链，所述聚合物主链上连接有以下模板分子：
i.至少两种不同的γ链受体细胞因子，例如选自由IL-21、IL-2、IL-15、IL-4、IL-9和IL-7组成的组的至少两种不同的γ链受体细胞因子，
ii.至少一种抗原，
iii.任选地，至少一种共刺激分子，其选自由B7.2(CD86)、B7.1(CD80)、CD40、ICOS和PD-L1组成的组，和
iv.任选地，至少一种CD47分子。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中γ链受体细胞因子组由IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21组成。
本发明的又一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中γ链受体细胞因子选自由IL-21、IL-2、IL-15、IL-4、IL-9和IL-7组成的组。
发明人已经在γ链受体细胞因子家族内鉴定出了刺激分子的优选组合。
因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中γ链受体细胞因子选自由IL-21、IL-2和IL-15组成的组。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中γ链受体细胞因子包含至少IL-21。
本发明的又一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中γ链受体细胞因子包含：
i.至少IL-2和IL-21，或
ii.至少IL-15和IL-21。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中γ链受体细胞因子是：
i.IL-2和IL-21，或
ii.IL-15和IL-21。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中γ链受体细胞因子包含：
i.至少IL-4和IL-21
ii.至少IL-7和IL-21，或
iii.至少IL-9和IL-21。
本发明的又一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中γ链受体细胞因子是：
i.IL-4和IL-21，
ii.IL-7和IL-21，或
iii.IL-9和IL-21。
抗原可以是MHC呈递的抗原肽或无需与MHC复合物结合即可被识别的抗原(即，非MHC呈递的分子)。不与MHC复合物结合的抗原可以是能够诱导免疫应答的任何类型的蛋白质。
因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中所述至少一种抗原是非MHC呈递的分子。
一类相关的非MHC呈递的抗原是分化簇(CD)蛋白。CD蛋白是一组通常被认为是细胞免疫表型分型的靶标的细胞表面分子，并且可以作为对细胞信号传导重要的信号级联中的受体或配体。CD蛋白可以被包括在专门设计用于刺激和扩增嵌合抗原受体(CAR)T细胞的aAPC中。相关CD蛋白的实例包括但不限于CD19、CD20、CD22和CD269。
另一类相关抗原是半抗原或有机小分子，例如但不限于生物素、荧光素、地高辛、二硝基苯酚、可替宁、肼屈嗪和漆酚。半抗原可以与疾病靶向抗体缀合。已经提出了使用抗半抗原CAR T细胞与半抗原缀合的抗癌抗体的组合的CAR T平台作为一种新方法来使用单一CAR T细胞靶向多种癌症抗原。
本发明的一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中抗原是非MHC呈递的分子，其选自由以下组成的组：CD19、CD20、CD22、CD269、半抗原、BCMA、表皮生长因子受体(EGFR)、间皮素(MSLN)、表皮生长因子受体的变体III(EGFRvIII)、人表皮生长因子受体-2(HER2)、癌胚抗原(CEA)和前列腺特异性膜抗原(PSMA)。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中非MHC呈递的分子是CD蛋白。
CD蛋白可以被包括在专门设计用于刺激和扩增嵌合抗原受体(CAR)T细胞的aAPC中。相关CD蛋白的实例包括但不限于CD19、CD20、CD22和CD269。
因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中CD蛋白选自由CD19、CD20、CD22和CD269组成的组。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中非MHC呈递的分子是半抗原。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中半抗原与抗体连接。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中抗原是包含抗原肽的主要组织相容性复合物分子(pMHC)。
可通过偶联剂和亲和标签之间的相互作用将模板分子连接到聚合物主链上。偶联剂位于aAPC支架的聚合物主链上，并且可以通过但不限于疏水相互作用、静电相互作用或共价键合连接到主链上。当位于聚合物主链上时，偶联剂提供柔性模板，亲和标记的模板分子可以以模块方式固定到该柔性模板上。亲和标签是通过但不限于非共价相互作用与偶联剂特异性结合的分子种类。通过在每个模板分子上连接亲和标签，因此容易组装定制的aAPC支架。
因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中模板分子通过位于聚合物主链上的偶联剂和模板分子上的亲和标签之间的非共价相互作用连接到聚合物主链上。
亲和标签和偶联剂的许多已知的相容配对可用于本发明，包括但不限于生物素/链霉抗生物素蛋白、生物素/抗生物素蛋白、生物素/中性抗生物素蛋白、生物素/strep-tactin、聚-His/金属离子螯合物、肽/抗体、谷胱甘肽-S-转移酶/谷胱甘肽、表位/抗体、麦芽糖结合蛋白/淀粉酶和麦芽糖结合蛋白/麦芽糖。亲和标签和偶联剂的其他已知的相容配对也可用于本发明。
因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中偶联剂/亲和标签选自由以下组成的组：生物素/链霉抗生物素蛋白、生物素/抗生物素蛋白、生物素/中性抗生物素蛋白、生物素/strep-tactin、聚-His/金属离子螯合物、肽/抗体、谷胱甘肽-S-转移酶/谷胱甘肽、表位/抗体、麦芽糖结合蛋白/淀粉酶和麦芽糖结合蛋白/麦芽糖。
本发明的另一个优选实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中偶联剂是链霉抗生物素蛋白，亲和标签是生物素。
与模板分子连接的aAPC支架的聚合物主链也可以基于多种不同的材料。因此，本发明可以使用几种类型的主链，包括但不限于多糖、合成多糖、乙烯基聚合物、聚乙二醇、聚丙二醇、衍生纤维素、strep-tactin和聚链霉抗生物素蛋白。多糖可以是葡聚糖或葡聚糖的不同变体，例如羧甲基葡聚糖、多醛基葡聚糖和环糊精。合成多糖的实例是例如聚蔗糖。乙烯基聚合物包括但不限于聚(丙烯酸)、聚(丙烯酰胺)、聚(丙烯酸酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(马来酸)、聚(丙烯酰胺)、聚(甲基丙烯酸)和聚(乙烯醇)。由衍生的纤维素组成的聚合物主链包括但不限于衍生的纤维素，包括羧甲基纤维素、羧甲基羟乙基纤维素和羟基-乙基纤维素。
另外，存在可以用作形成本发明的自组装aAPC支架的基础的可商购的聚合物主链。这些聚合物主链包括但不限于IBA GmbH和Beckman Coulter的Streptamers，其基于Strep-tactin蛋白，所述Strep-tactin蛋白低聚化(oligomerize)以形成能够结合若干生物素化分子(例如生物素化的pMHC复合物、细胞因子和共刺激分子)的多聚体。
因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中聚合物主链选自由以下组成的组：多糖、乙烯基聚合物、聚乙二醇、聚丙二醇、strep-tactin和聚链霉抗生物素蛋白。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中聚合物主链是多糖。
本发明的另一个优选实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中多糖是葡聚糖。
聚合物主链的大小设定了有多少个模板分子可以连接到每个aAPC支架的物理限制。聚合物主链的大小由其分子量给出。
因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中葡聚糖的分子量为50-3000kDa，例如100-2500kDa，例如250-2500kDa。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中葡聚糖的分子量选自由250kDa、270kDa、750kDa和2000kDa组成的组。
除了每个aAPC支架上连接的分子数量之外，另一个重要参数是模板分子在聚合物主链上分布的密度。可以通过调节aAPC支架所包含的所有分子之间的比例来改变密度。因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中聚合物主链：pMHC分子：共刺激分子：细胞因子之间的比例选自由以下组成的组：1：1：1：1、1：2：1：1、1：4：1：1、1：4：2：1、1：4：2：2、1：10：5：5、1：4：4：4、1：8：8：8、1：10：10：10、1：20：20：20、1：30：30：30、1：40：40：40、1：50：50：50、1：50：10：10或1：50：20：20.
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中聚合物主链：pMHC分子：细胞因子1：细胞因子2之间的比例选自由以下组成的组：1：1：1：1、1：2：1：1、1：4：1：1、1：4：2：1、1：4：2：2、1：10：5：5、1：4：4：4、1：8：8：8、1：10：10：10、1：20：20：20、1：30：30：30、1：40：40：40、1：50：50：50、1：50：10：10或1：50：20：20。
本发明的又一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中聚合物主链：pMHC分子：共刺激分子：细胞因子1：细胞因子2之间的比例选自由以下组成的组：1：1：1：1：1、1：2：1：1：1、1：4：1：1：1、1：4：2：1：1、1：4：2：2：2、1：10：5：5：5、1：4：4：4：4、1：8：8：8：8、1：10：10：10：10、1：20：20：20：20、1：30：30：30：30、1：40：40：40：40、1：50：50：50：50、1：50：10：10：10或1：50：20：20：20。
本发明可适用于扩增来自各种受试者的T细胞。因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中所述至少一种pMHC分子是脊椎动物MHC分子，例如人、鼠、大鼠、猪、牛或禽分子。
本发明的另一个优选实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中脊椎动物MHC分子是人分子。
如上所述，MHC分子存在几种变体。MHC分子包括但不限于MHC I类分子、MHC II类分子、MHC III类分子、MHC I类样分子(MHC class I like molecule)和MHC II类样分子。MHC I类样分子包括但不限于CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、MICA、MICB、MR1、ULBP-l、ULBP-2和ULBP-3。MHC II类样分子包括但不限于HLA-DM、HLA-DO、I-A β2和I-Eβ2。
因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中所述至少一种pMHC分子选自由以下组成的组：MHC I类分子、MHC II类分子、MHC III类分子、CD1a、CD1b、CD1c、CD1d和MR1。
本发明的另一个优选实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中所述至少一种pMHC分子是MHC I类分子。
本发明的另一个优选实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中所述至少一种pMHC分子是人MHC I类分子。在人类中，主要组织相容性复合物(MHC)由称为人白细胞抗原(HLA)复合物的基因复合物编码。对应于MHC I类的HLA被称为HLA-A、HLA-B和HLA-C。
由pMHC分子呈递的抗原肽最终决定aAPC支架将扩增哪种类型的T细胞——该概念先前被称为MHC限制。本发明使用的抗原可基本上来自任何来源。抗原来源可包括但不限于人、病毒、细菌、寄生虫、植物、真菌或肿瘤。因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中pMHC的抗原肽衍生自选自由以下组成的组的来源：人、病毒、细菌、寄生虫、植物、真菌和肿瘤。
本发明的aAPC支架的一种用途是扩增肿瘤反应性T细胞，用于过继细胞转移(ACT)。ACT策略的强度是T细胞离体存在于与局部肿瘤环境相反的环境中，该环境对于抗原特异性T细胞群的有效扩增是最佳的。
本发明的aAPC支架的另一种潜在用途是用于扩增专门用于抵抗通常在移植后出现的某些感染的T细胞群。接受移植的患者通常接受免疫抑制治疗以避免移植物排斥。在许多情况下，这种治疗使患者易受侵袭性病毒株的侵害，导致已经虚弱的患者严重感染。本发明的aAPC支架非常适合于从移植患者中提取的T细胞的有效扩增，目的是通过ACT策略治疗任意严重感染。
因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中pMHC的抗原肽是癌相关表位或病毒表位。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中抗原包括癌症相关表位或病毒表位。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中pMHC的抗原肽是新表位(neoepitope)，例如癌症新表位。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中癌症相关表位是与病毒诱导的癌症相关的病毒表位。
本发明的aAPC支架与可以被聚合物主链上连接的pMHC分子呈递的任何抗原肽一起起作用。一些适应症在本发明中是优选的。
因此，本发明的一个优选实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中所述病毒表位来自选自由以下组成的组的病毒：人乳头瘤病毒(HPV)、Merkel细胞多瘤病毒(MCV)、巨细胞病毒(CMV)、Epstein-Barr病毒(EBV)、人嗜T淋巴细胞病毒(HTLV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)和流感病毒。
为了优化每种aAPC支架的效率(关于aAPC支架能够扩增单一T细胞特异性的准确性)，在本发明的一个版本中，每种aAPC支架仅包含pMHC分子的单一变体，即，每种类型的aAPC支架仅呈递一种肽抗原。
因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中pMHC分子是相同的并且仅呈递抗原肽的单一变体。
通过每种aAPC支架仅展示单一抗原肽，不同特异性的T细胞之间的竞争被限制到最小。如果需要，可以将几种呈递不同肽的不同支架合并在一起并同时扩增。同时扩增具有多种不同的特异性的T细胞是可能的，因为由于aAPC支架将所有模板分子(即pMHC、共刺激分子和细胞因子)彼此非常接近地聚集在一起，T细胞之间的竞争保持在最小。因此，通过使用本发明的aAPC支架扩增的T细胞群会保持特异性，并且如果重新引入到受试者中，则不同特异性的集合(pool)会确保任意免疫应答的广度。后一特征在临床上对于避免免疫逃逸变体而言是重要的。可以通过决定在单一扩增中将多少种不同的aAPC支架合并在一起来调整应答的广度。
聚合物主链可以包含根据聚合物主链的大小合理的任意数量的pMHc分子。因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中每个聚合物主链包含至少5个pMHC分子，例如至少8个，例如至少10个，例如至少20个，例如至少30个，例如至少40个，例如至少50个，或例如至少100个pMHC分子。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中每个聚合物主链包含至少2个pMHC分子，例如至少3个或例如至少4个pMHC分子。
对于一些应用，将aAPC支架固定在固体支撑物上是可行的，例如，用于某些类型的分析或用于从扩增的T细胞群中分离aAPC支架。因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中所述aAPC支架被固定在固体支撑物上。
存在许多固体支撑物的变体，并且可以根据aAPC支架的应用来选择。固体支撑物的变体包括但不限于珠子、孔板、颗粒、微阵列、膜、过滤器、凝胶和芯片。因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中固体支撑物选自由以下组成的组：珠子、孔板、颗粒、微阵列和膜。
aAPC支架可以通过任何常规手段，例如通过接头、抗体等连接到固体支撑物上。
存在大量的不同的模板分子，因此可以组装多种不同的aAPC支架。发明人已发现，模板分子的某些组合产生特别有效且优选的aAPC支架。
因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中模板分子包含至少IL-21。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中模板分子包含至少IL-15和IL-21。
本发明的又一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中模板分子包含至少B7.2(CD86)。
本发明的又一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中
i.聚合物主链是葡聚糖，
ii.共刺激分子是B7.2(CD86)，并且
iii.细胞因子是IL-15和IL-21。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中
i.聚合物主链是葡聚糖，
ii.γ链受体细胞因子是IL-15和IL-21，并且
iii.共刺激分子是B7.2(CD86)。
本发明的又一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中
i.聚合物主链是葡聚糖，
ii.γ链受体细胞因子是IL-15和IL-21，
iii.抗原是包含抗原肽的主要组织相容性复合物分子(pMHC)，并且
iv.共刺激分子是B7.2(CD86)。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中葡聚糖主链上pMHC、IL-15、IL-21和B7.2(CD86)之间的比例是2：1：1：1。
本发明的又一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中葡聚糖主链、pMHC、IL-15、IL-21和B7.2(CD86)之间的比例为1：10：5：5：5。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中γ链受体细胞因子是IL-2、IL-15和IL-21。
本发明的又一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中
i.聚合物主链是葡聚糖，
ii.γ链受体细胞因子是IL-2、IL-15和IL-21，并且
iii.抗原是包含抗原肽的主要组织相容性复合物分子(pMHC)。
本发明的一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中葡聚糖主链、pMHC、IL-2、IL-15和IL-21之间的比例是1：10：5：5：5。
本发明的又一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中
i.聚合物主链是葡聚糖，
ii.γ链受体细胞因子是IL-2、IL-15和IL-21，
iii.抗原是包含抗原肽的主要组织相容性复合物分子(pMHC)，并且
iv.共刺激分子是B7.2(CD86)。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中葡聚糖主链、pMHC、IL-2、IL-15、IL-21和B7.2(CD86)之间的比例为1：10：5：5：5：5。
本发明的又一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中模板分子包含至少IL-6和IL-10。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中
i.聚合物主链是葡聚糖，
ii.共刺激分子是B7.2(CD86)，并且
iii.细胞因子是IL-6和IL-10。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中葡聚糖主链上pMHC、IL-6、IL-10和B7.2(CD86)之间的比例是2：1：1：1。
本发明的又一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中葡聚糖主链、pMHC、IL-6、IL-10和B7.2(CD86)之间的比例为1：10：5：5：5。
本发明的一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中γ链受体细胞因子包含至少IL-2和IL-21。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中
i.聚合物主链是葡聚糖，并且
ii.细胞因子是IL-2和IL-21。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中
i.聚合物主链是葡聚糖，并且
ii.γ链受体细胞因子是IL-2和IL-21。
本发明的又一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中
i.聚合物主链是葡聚糖，
ii.γ链受体细胞因子是IL-2和IL-21，并且
iii.抗原是包含抗原肽的主要组织相容性复合物分子(pMHC)。
本发明的又一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中葡聚糖主链上pMHC、IL-2和IL-21之间的比例是1：1：1。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中共刺激分子包含至少B7.2(CD86)。
本发明的又一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中葡聚糖主链、pMHC、IL-2和IL-21之间的比例是1：8：8：8。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中聚合物主链包含至少IL-1和PD-L1。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中
i.聚合物主链是葡聚糖，
ii.共刺激分子是B7.2(CD86)和PD-L1，并且
iii.细胞因子是IL-1。
本发明的又一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中葡聚糖主链上pMHC、IL-1、B7.2(CD86)和PD-L1之间的比例为2：1：1：1。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中葡聚糖主链、pMHC、IL-1、B7.2(CD86)和PD-L1之间的比例是1：10：5：5：5。
本发明的又一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中
i.聚合物主链是葡聚糖，
ii.共刺激分子是B7.2(CD86)和ICOS，并且
iii.细胞因子是IL-10。
本发明的又一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中
i.聚合物主链是葡聚糖，并且
ii.细胞因子是IL-1和IL-2。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的aAPC支架，其中
i.聚合物主链是葡聚糖，并且
ii.细胞因子是IL-2和IL-15。
本发明的另一个实施方案涉及一种人工抗原呈递细胞(aAPC)支架，其包含聚合物主链，所述聚合物主链上连接有以下模板分子：
i.至少一种包含抗原肽的主要组织相容性复合物分子(pMHC)，和
ii.B7.2(CD86)、ICOS和PD-L1。
本发明的aAPC支架可以是适合医院和实验室使用的试剂盒的一部分。这样的试剂盒可以包含一种或多种、适合于扩增具有不同特异性的T细胞的不同aAPC支架，以及适合于扩增从样品中提取的T细胞的培养基。该试剂盒还可以容纳扩增含T细胞样品所必需的其他化合物或分子。
本发明的aAPC支架可以用作免疫疗法，用于给受试者直接施用以帮助受试者的免疫系统。aAPC可以通过任何途径局部或全身施用，例如静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、透皮或口服。
T细胞扩增的方法
通过从不健康的受试者中提取免疫反应性T细胞，离体扩增T细胞并将扩增的T细胞群重新引入受试者中，有可能克服可能会使免疫系统瘫痪的免疫抑制疾病的一些挑战。然而，虽然通过单采(apheresis)法从例如外周血中提取T细胞并随后重新引入到患者中是没有问题的，但是给定特异性的T细胞的激活和扩增仍然是一个巨大的挑战，所得T细胞群通常缺乏足够的分化和功能能力。
本发明的aAPC支架适用于同时体外刺激和扩增T细胞，并产生活性T细胞的比例高、T细胞的抗原特异性高且T细胞的功能性高的T细胞群。因此，本发明的第二方面涉及同时体外刺激和扩增T细胞的方法，其包括以下步骤：
i.提供包含T细胞的样品，
ii.使所述样品与包含如本文所述的aAPC支架的溶液接触，
iii.刺激并扩增培养中的、对所述aAPC支架具有特异性的T细胞，以及
iv.从培养物中收获步骤iii)的T细胞，以获得扩增的抗原特异性T细胞群。
从受试者中提取包含T细胞的样品，随后将其置于处于允许T细胞生长的条件下的包含aAPC支架的培养物中。因此，应理解，T细胞的扩增应在除aAPC支架外还含有细胞增殖所需的所有化合物和因子的溶液或培养基中进行。因此，在其中进行T细胞扩增的培养物可含有抑制无关细胞生长或促进T细胞生长的化合物，例如IL-2。
为了提高扩增的T细胞群的质量，可以经过分子量截留过滤器通过离心过滤aAPC支架，以便在aAPC与样品混合之前除去所有未结合的pMHC分子。这是为了避免来自未与支架缀合的pMHC分子的刺激，并去除过量的肽、细胞因子和共刺激分子，以限制无关T细胞亚群的刺激。这同样适用于未与MHC分子复合的抗原，其也可以通过分子量截留过滤器离心除去。
因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的方法，其中步骤ii)的包含aAPC支架的溶液在与样品接触之前已经被过滤。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的方法，其中经分子量截留过滤器通过离心过滤所述包含aAPC支架的溶液。
本发明的aAPC支架的一个优点是它们允许同时扩增不同的T细胞特异性，因为当使用多种不同的aAPC支架时，交叉反应性被降低到最小，如上所述。因此，本发明的方法对于含有具有不同特异性的多种T细胞的样品也是有效的。
因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的方法，其中步骤i)的所述样品包含至少2种不同特异性，例如至少5种不同特异性，例如至少10种不同特异性，例如至少15种不同特异性，例如至少20种不同特异性，或例如至少50种不同特异性的T细胞。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的方法，其中包含aAPC支架的所述溶液包含至少2种不同的aAPC支架，例如至少5种不同的aAPC支架，例如至少10种不同的aAPC支架，例如至少15种不同的aAPC支架，例如至少20种不同的aAPC支架，或者例如至少20种不同的aAPC支架。
本发明的又一个实施方案涉及如本文所述的方法，其中在同一样品中平行地刺激和扩增至少2种不同特异性的T细胞，例如至少5种不同特异性，例如至少10种不同特异性，例如至少15种不同特异性，或例如至少20种不同特异性的T细胞。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
i.提供样品，所述样品包含具有至少5种不同特异性的T细胞，
ii.使所述样品与包含至少5种不同aAPC支架的溶液接触，
iii.平行刺激和扩增培养中的所述T细胞，所述T细胞具有针对所述至少5种不同的aAPC支架的至少5种不同的特异性，和
iv.从培养物中收获步骤iii)的T细胞，以获得具有至少5种不同特异性的扩增的抗原特异性T细胞群。
包含待扩增的T细胞的样品可以源自任何来源，但通常从血液、组织或体液中提取。因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的方法，其中所述样品选自由以下组成的组：外周血单核细胞、肿瘤、组织、骨髓、活组织检查、血清、血液、血浆、唾液、淋巴液、胸膜液、脑脊液(cerospinal fluid)和滑液。
根据本文所述方法，包含待扩增的T细胞的样品也可选自干细胞、TCR修饰的/转染的细胞、嵌合抗原受体(CAR)T细胞。
因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的方法，其中所述样品包含CAR T细胞，并且所述至少一种抗原不由MHC分子呈递。
因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的方法，其中所述样品包含CAR T细胞，并且aAPC支架的所述至少一种抗原是CD蛋白。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的方法，其中所述样品包含CART细胞，并且所述至少一种抗原选自由CD19、CD20和CD22组成的组。
本发明的方法可用于扩增表达与aAPC支架上的pMHC分子相互作用所必需的TCR的任何T细胞。因此，适于通过本发明的方法扩增的T细胞包括但不限于CD8 T细胞、CD4 T细胞、调节性T细胞、天然杀伤T(NKT)细胞、α-βT细胞、γ-δT细胞、先天的粘膜相关恒定T(mucosal-associated invariant T，MAIT)细胞和淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞。
因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的方法，其中T细胞选自由以下组成的组：CD8 T细胞、CD4 T细胞、调节性T细胞、天然杀伤T(NKT)细胞、γ-δT细胞和先天的黏膜相关恒定T(MAIT)细胞。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的方法，其中T细胞选自由以下组成的组：CAR T细胞、CD8 T细胞、CD4 T细胞、调节性T细胞、天然杀伤T(NKT)细胞、γ-δT细胞和先天的黏膜相关恒定T(MAIT)细胞。
本发明的一个优选实施方案涉及如本文所述的方法，其中T细胞是CD8 T细胞。
本发明的又一个实施方案涉及如本文所述的方法，其中T细胞是CAR T细胞。
为了将扩增的T细胞群重新引入患者，以使从治疗的角度来看具有意义，有必要使提取的T细胞扩增至临床相关数量。通过本发明的方法进行的T细胞的扩增的量级为100-3000倍。在重新引入到患者之前可用的细胞数量是可行的，每次施用109-1011个细胞。根据施用途径，细胞以20mL至1L的体积施用。
因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的方法，其中将T细胞扩增至临床相关数量。如上文针对aAPC支架所述，pMHC分子可以呈递多种抗原肽。关于抗原肽的选择的注意事项同样适用于该方法。因此，本发明的一个实施方案涉及如本文所述的方法，其中pMHC的抗原肽是癌症相关表位或病毒表位。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的方法，其中抗原包含癌症相关表位或病毒表位。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的方法，其中癌症相关表位是与病毒诱导的癌症相关的病毒表位。
本发明的又一个实施方案涉及所述的方法，其中所述病毒表位来自选自由以下组成的组的病毒：人乳头瘤病毒(HPV)、Merkel细胞多瘤病毒(MCV)、巨细胞病毒(CMV)、Epstein-Barr病毒(EBV)、人嗜T淋巴细胞病毒(HTLV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)和流感病毒。
扩增的T细胞群的用途
设想通过本发明的方法获得的扩增的T细胞群可以有效地用于专注于过继免疫疗法(或过继细胞转移)的治疗方案中。在这种治疗方案中，从需要治疗的受试者中提取免疫反应性T细胞。受试者可以是任意哺乳动物，例如人、牛、猪、鸟、狗、猫、小鼠、大鼠等。T细胞的来源可以是例如外周血单核细胞、肿瘤、组织、骨髓、活组织检查、血清、血液、血浆、唾液、淋巴液、胸膜液、脑脊液或滑液。
从受试者中提取后，使用针对受试者和待治疗的病况或疾病定制的aAPC支架扩增含有具有所需的一种或多种特异性的T细胞的样品。该扩增根据如上所述的本发明的方法进行。当T细胞群扩增至临床相关数量时，将其施用于受试者以诱导免疫应答并治疗疾病。
因此，本发明的第三方面涉及通过本文所述的方法获得的扩增的T细胞群。
本发明的第四方面涉及通过本文所述的方法获得的扩增的T细胞群，其用作药物。
更具体地，本发明的一个实施方案涉及用于疾病或病症的过继免疫疗法的方法，其包含：
i.从受试者中提取包含T细胞的样品，
ii.使所述样品与包含如本文所述的aAPC支架的溶液接触，
iii.在培养中刺激并扩增对所述aAPC支架具有特异性的T细胞，
iv.从培养物中收获步骤iii)的T细胞，以获得扩增的抗原特异性T细胞群，
以及
v.以有效诱导免疫应答的量向受试者施用扩增的抗原特异性T细胞群。
如上文针对aAPC支架所述，pMHC分子可以呈递多种抗原肽。关于抗原肽的选择的注意事项同样适用于通过本发明的方法获得的扩增的T细胞群的用途。
因此，本发明的第五方面涉及通过本文所述的方法获得的扩增的T细胞群，其用于治疗癌症或病毒病况。
本发明的一个实施方案涉及如本文所述的用途的扩增的T细胞群，其中癌症与病毒病况有关。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的用途的扩增的T细胞群，其中病毒病况与选自由以下组成的组的病毒相关：人乳头瘤病毒(HPV)、Merkel细胞多瘤病毒(MCV)、巨细胞病毒(CMV)、Epstein-Barr病毒(EBV)、人嗜T淋巴细胞病毒(HTLV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)和流感病毒。
通过本文所述的方法获得的扩增的T细胞群可以配制成药物组合物，所述药物组合物还包含一种或多种佐剂和/或赋形剂和/或药学上可接受的载体。赋形剂可包括但不限于缓冲剂、悬浮剂、分散剂、增溶剂、pH调节剂和/或防腐剂。
药物组合物可以用于过继免疫疗法(或过继细胞转移)，通过任意途径局部或全身施用，例如静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、透皮或口服。
应当注意，在本发明的多个方面之一的背景中描述的实施方案和特征也适用于本发明的其他方面。
本申请中引用的所有专利和非专利参考文献都通过引用整体并入本文。
现在将在以下非限制性实施例中进一步详细描述本发明。
实施例
实施例1：人工抗原呈递(aAPC)支架的组装和使用该aAPC进行特异性T细胞扩增 (图1)
这里描述了如何通过链霉抗生物素蛋白-生物素相互作用将pMHC复合物、细胞因子和刺激分子偶联到葡聚糖上来制备aAPC支架。原则上，生物素-链霉抗生物素蛋白可以被任何二聚化结构域替代，其中二聚化结构域的一半与pMHC复合物、细胞因子或共刺激分子偶联，另一半与葡聚糖或类似的支架主链偶联(参见图1A)。
链霉抗生物素蛋白修饰的葡聚糖可以以各种大小的葡聚糖商购获得，例如来自Fina Biosolutions的MW 250KDa、750KDa、2000KDa和来自Immudex的具有约270KDa的葡聚糖。pMHC单体可以通过经典的大肠杆菌表达方法生产，或者可以从供应商如BioLegend商业购买。pMHC、细胞因子和共刺激分子可以通过标准化学和酶促方案进行生物素化。例如，pMHC可以通过以下方法以酶促方式进行生物素化：使MHC重链包括生物素化一致肽序列，从而允许使用BirA酶和游离生物素进行位点特异性生物素化。细胞因子和共刺激分子可从供应商如BioLegend和PreProtech商购获得。通过使用市售的生物素化试剂，例如ThermoFisher Scientific的EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin，并根据供应商的方案进行反应，可以很容易地将这些蛋白质生物素化。
通过链霉抗生物素蛋白-生物素相互作用将所有上述给定组分组装到aAPC支架上。简而言之，根据下述实施例，将分子以相对化学计量在水性缓冲液(例如PBS)中组合，得到最终浓度为60nM的组装的aAPC支架。使aAPC支架在4℃下组装1小时，然后保持在4℃直至加入细胞培养物中。组装好的支架可以在4℃下储存至少一个月。通过MW截留过滤器，如Amicon Ultra离心过滤器单元Ultra-4，MWCO 100kDa离心未结合的分子，可以纯化组装的aAPC支架并使其与未结合的肽、pMHC、细胞因子和共刺激分子分离。
从人PBMC或TIL建立T细胞培养物，并在48孔平底培养板中以2×106个细胞/ml起始，并在37℃和5％CO2下培养2周。通过添加1mL新鲜X-VIVO15培养基(补充有5％热灭活的人血清和20IU/ml重组人IL-2)中的0.2nM终浓度的aAPC支架来每周刺激细胞两次。培养1周后，将细胞转移到24孔平底培养板中，每周一次从培养物中取出样品用于MHC四聚体染色，以通过流式细胞术追踪抗原特异性CD8 T细胞的扩增。
组装的aAPC可用于扩增从患者中提取的特异性T细胞群(参见图1B)。T细胞可以例如是CD8 T细胞、CD4 T细胞、调节性T细胞或自然杀伤T(NKT)细胞，其可以被扩增至临床相关数量并重新引入到患者中以治疗疾病。使用aAPC支架扩增T细胞确保了活性T细胞的高比例、T细胞的高抗原特异性和T细胞的高功能性。通过在单一样品中使用几种不同的aAPC支架，可以同时扩增不同的抗原特异性T细胞，而没有特异性之间的竞争，从而保留了T细胞特异性和不同特异性的集合，确保了广泛免疫应答。
实施例2：支架与分子比例的确定(图2和3)
重要的是，抗原呈递支架(图例中称为MHC-支架)与T细胞受体(TCR)之间的相互作用是由pMHC分子指导的，而不是由细胞因子或共刺激分子指导的，因为所有T细胞均具有结合这些分子的受体。因此，在抗原呈递支架上连接最佳数量和密度的pMHC分子以确保相互作用受pMHC和TCR之间的特定相互作用控制是至关重要的。为了确定抗原呈递支架的最佳组成和TCR-pMHC驱动的相互作用所需的pMHC分子的数量，将不同比例的pMHC、细胞因子和共刺激分子与支架主链缀合并应用于健康供体外周血单核细胞(PBMC)的染色并通过流式细胞术分析。
以不同的支架：pMHC比例组装携带病毒肽HLA-A1 CMV pp65 YSE的抗原呈递支架，并使其与共刺激共连接，并应用于一个健康供体的PBMC的染色，所述健康供体具有针对CMVpp65 YSE肽的应答。使用每个染色的平均荧光强度(MFI)来确定有待与支架缀合的pMHC的最佳数量，并且将染色指数(SI)用作阳性事件和阴性事件之间分离的量度。针对每次染色检测的抗原特异性CD8 T细胞的MFI值和SI值显示在图2中。
结论：(图2A)发现比例1：10和1：20(支架：pMHC)是最佳的，因为它们显示出最高的MFI值，但TCR-pMHC相互作用甚至在1：5的比例时仍保留。(图2B-C)从这些染色中可以得出结论，抗原呈递支架组合物1：10：5：5和1：20：5：5(支架：pMHC：B7-2：IL-15)是最佳的，因为与1：10：10：10的比例相比，这些显示出最高的MFI值和SI值。
使用1：15：5：5(支架：pMHC：B7-2：IL-15)、1：10：5：5：5(支架：pMHC：B7-2：IL-15：IL-21)和1：8：8：8(支架：pMHC：IL-2：IL-21)的抗原呈递支架比例进行来自健康供体PBMC的病毒特异性CD8 T细胞的进一步扩增实验。
用不携带任何pMHC分子，但含有B7-2或IL-15(支架：B7-2和支架：IL-15的比例分别为1：30)的支架进行两个对照染色。进行该操作以研究B7-2和/或IL-15介导的抗原呈递支架与T细胞的结合水平。图3中显示了两个对照染色的代表性点图。
结论：(图3A-B)基于两个对照染色，支架和非特异性T细胞群之间的相互作用非常有限，因为两个支架中的任一个均没有观察到显著的结合。
实施例3：使用抗原呈递支架扩增抗原特异性CD8 T细胞(图4)
在比例为1：10：5：5：5(支架：pMHC：B7-2：IL-15：IL-21)的抗原呈递支架，游离FLUBP-VSD肽、IL-15和IL-21细胞因子，或在MHC复合物中携带无关肽特异性的比例为1：10：5：5：5的抗原呈递支架的存在下，平行扩增来自健康供体的HLA-A1 FLU BP-VSD特异性CD8 T细胞。所有培养物均补充有20IU/ML IL-2并培养2周。每周一次通过四聚体染色追踪HLA-A1FLU BP-VSD特异性CD8 T细胞的扩增。图4中示出了代表性的点图。
结论：(图4A-D)该实验表明，使用抗原呈递支架以pMHC指导的方式扩增具有低频率基线响应的抗原特异性CD8 T细胞是可行的。当将用培养基中游离添加的肽IL-15和IL-21刺激的细胞的扩增与用抗原呈递支架刺激的细胞的扩增进行比较时，显然用抗原呈递支架刺激的细胞在频率上和在特异性CD8 T细胞的绝对数量上扩增最多(参见图4E-F)。此外，携带无关肽MHC特异性的抗原呈递支架不能刺激A1 FLU BP-VSD特异性CD8 T细胞扩增，证明在没有建立pMHC指导的相互作用的情况下，细胞不能从共连接的细胞因子和共刺激分子中受益。
实施例4：在扩增抗原特异性CD8 T细胞之前过滤抗原呈递支架(图5-7)
在组装抗原呈递支架后，通过分子量截留过滤器使用离心将这些支架过滤，以除去所有未结合的pMHC分子，以避免来自未缀合至支架的pMHC的刺激，并去除过量的肽、细胞因子和共刺激分子，以限制无关T细胞亚群的刺激。为了研究和比较在用于刺激抗原特异性CD8 T细胞之前过滤抗原呈递支架和不过滤抗原呈递支架的效果，平行进行了大量实验。研究了扩增的CD8 T细胞的多种分化标志物的扩增水平，以确定它们的表型。在这些实验中，使用比例为1：15：5：5(支架：pMHC：B7-2：IL-15)的抗原呈递支架。参见图5-7。
结论：(图5A-D)与用未过滤的抗原呈递支架和游离肽刺激的细胞相比，用过滤的抗原呈递支架刺激的细胞显示出最高的MFI，表明过滤的抗原呈递支架优先刺激具有高亲和力TCR的T细胞或引发扩增的T细胞群上TCR表达的上调。然而，与未过滤的MHC支架相比，过滤的MHC支架的扩增率略微受损。过滤试剂的使用提供了最佳功能特征(如稍后所示)。与用游离肽-细胞因子刺激相比，使用过滤的和未过滤的支架均提供了更好的T扩增和优异的功能特征。
(图6A-B)与用未过滤的抗原呈递支架刺激(深灰色群)相比，用过滤的抗原呈递支架刺激的高亲和力结合群(黑色群)检测到最高的CD28表达。
(图7A-D)与用未过滤的抗原呈递支架刺激的细胞相比，用过滤的抗原呈递支架刺激的细胞明显获得了更高的CD28表达，这意味着在T细胞刺激培养物之前过滤抗原呈递支架可以为过继转移目的提供更稳健的表型——高水平的CD28表达与体内存活和扩增的增强相关。在过滤的和未过滤的抗原呈递支架之间，CCR7和CD57表达没有显著差异。
实施例5：用抗原呈递支架扩增的抗原特异性CD8 T细胞上分化标志物和共抑制标 志物的表达(图8和9)
T细胞的特征在于不同的表面分子，它们决定了T细胞的分化和功能状态。分化状态可以由T细胞表型定义。T细胞随着给定抗原暴露的时间而动态演变，但可大致分为四个不同的组。幼稚T细胞、效应T细胞(TEM)、晚期效应T细胞(TEMRA)和中枢记忆性T细胞。幼稚池(pool)负责对先前未经历的病原体产生T细胞应答，而通常通过在T CM或TEM的某些组中产生强烈且快速的T细胞应答来清除再感染。这些T细胞是高度增殖性的并且对抗原刺激非常敏感。对于过继转移目的，这种表型是优选的。因此，我们的目标是CD28高表达和CD57低表达。由于其归巢能力，CCR7表达的一些水平是优选的。
Tim-3、LAG-3和PD-1是T细胞上的衰竭/活化标志物。这些分子在T细胞活化后起调节免疫应答的作用。它们作为避免T细胞过度活化的天然机制，但在免疫治疗的背景下，理想地，这些分子应在T细胞上最低限度地表达，以提供T细胞功能和体内扩增的最佳能力。PD-1似乎是其中最关键且动态的标志物。已显示阻断PD-1信号传导提供显著的T细胞活化，并因此导致患者的癌症排斥。
对于用比例为1：10：5：5：5(支架：pMHC：B7-2：IL-15：IL-21)的过滤的和未过滤的抗原呈递支架扩增的培养物，研究了扩增的CD8 T细胞的分化标志物和共抑制标志物的表达，并将其与用游离的肽和细胞因子扩增的细胞进行了比较。同样，将用比例为1：8：8：8(支架：pMHC：IL-2：IL-21)的过滤的和未过滤的抗原呈递支架扩增的培养物与用抗原呈递支架1：8(支架：pMHC)加培养基中游离的细胞因子进行比较。参见图8-9。
结论：(图8A-D)这些染色显示，与所有其他刺激相比，用比例为1：10：5：5：5和1：8：8：8的过滤的抗原呈递支架刺激的A1 FLU BP-VSD特异性CD8 T细胞产生CD28表达更高的细胞。对于用两种不同的抗原呈递支架(包括比例1：10：5：5：5和1：8：8：8)刺激的细胞，未观察到CCR7和CD57表达的特别差异。
(图9A-D)这些染色显示，与用游离的肽和细胞因子，以及1：8抗原呈递支架和游离的细胞因子刺激的细胞相比，用组成为1：10：5：5：5和1：8：8：8的过滤的和未过滤的抗原呈递支架刺激的细胞具有最低的PD-1阳性表达。对于任何刺激，均未观察到Tim-3或LAG-3表达的特别差异。此外，与用未过滤的抗原呈递支架或游离的肽和细胞因子刺激的细胞相比，过滤的抗原呈递支架能够刺激PD-1阴性A1 FLU BP-VSD特异性CD8 T细胞的最高频率。
实施例6：扩增的抗原特异性CD8 T细胞的功能(图10)
为了表征抗原呈递支架刺激后扩增的抗原特异性CD8 T细胞的功能能力，用抗原攻击细胞，并用细胞内细胞因子抗体染色以检测TNF-α和IFN-γ的产生和脱粒标志物CD107a的表面表达。CD107a的表达与细胞毒活性和诱导靶细胞凋亡的能力有关。响应于抗原识别的TNF-α和IFN-γ的产生对于间接细胞毒性杀伤是重要的。同时表达所有三种标志物的CD8 T细胞被理解为具有高杀伤能力。
图10中显示的功能性结果描绘了用比例为1：10：5：5：5(支架：pMHC：B7-2：IL-15：IL-21)的过滤的和未过滤的抗原呈递支架扩增的T细胞培养物，并将其与用游离的肽和细胞因子扩增的细胞进行比较。同样，将用比例为1：8：8：8(支架：pMHC：IL-2：IL-21)的过滤的和未过滤的抗原呈递支架扩增的培养物与用抗原呈递支架1：8(支架：pMHC)加培养基中的游离的细胞因子扩增的细胞进行比较。此外，研究了IL-2作为培养基中的补充物是否对于刺激CD8T细胞扩增是必需的，或者是否可以将其从培养基中排除，并以1：8：8：8的比例连接到支架上。
结论：(图10A)与用游离的肽和细胞因子刺激的细胞相比，用过滤的或未过滤的抗原呈递支架刺激的培养物的三阳性CD8 T细胞的频率更高。这意味着需要基于支架的相互作用来提供有效的T细胞刺激和多功能T细胞的活化。
(图10B)这些结果表明，可以从培养基中排除IL-2，改为将其连接到抗原呈递支架上，并且仍然获得了多功能CD8 T细胞(三阳性)。此外，与用未过滤的抗原呈递支架刺激的细胞相比，用过滤的抗原呈递支架刺激的细胞获得了最高频率的多功能(三阳性)CD8 T细胞。
实施例7：pMHC指导的刺激(图11)
研究了抗原呈递支架是否以pMHC依赖性方式指导其刺激性信号，或者抗原特异性CD8 T细胞是否也可以受益于单独基于与抗原呈递支架上共连接的细胞因子和共刺激分子的相互作用的刺激，而无需MHC分子中相关的肽特异性。为了研究这一问题，将来自健康供体的HLA-A1 FLU BP-VSD特异性CD8 T细胞用在MHC复合物中携带HLA-A3LTA ASF作为无关肽特异性或HLA-A1 FLU BP-VSD作为相关肽特异性的1：10：5：5：5(支架：pMHC：B7-2：IL-15：IL-21)的抗原呈递支架刺激2周。然后在用HLA-A1 FLU BP-VSD肽攻击后，比较CD8 T细胞表达CD107a和产生TNF-α和IFN-γ的能力。该实验一式两份进行。图11中示出了代表性的点图。
结论：(图11A-B)从这些分析中可以明显看出，抗原呈递支架刺激仅由所连接的pMHC分子的特异性决定，并且在没有与pMHC分子的特异性识别和相互作用的情况下，细胞不能受益于共连接的细胞因子和共刺激分子的刺激。
实施例8：使用抗原呈递支架同时扩增多种抗原特异性CD8 T细胞(图12)
抗原呈递支架系统在同时刺激多种CD8 T细胞特异性而不发生肽竞争方面具有潜在优势。广泛的T细胞应答对于临床应用是优选的，以避免靶丢失(loss-of-target)机制引起的免疫逃逸。然而，使用传统的基于肽的刺激策略，对于结合MHC I类分子以被呈递给T细胞而言，将会发生肽之间的竞争。对具有最高结合亲和力和稳定性的肽给出了呈递优势。因此，用游离肽同样良好地刺激多种T细胞应答是具有挑战性的。当使用抗原呈递支架同时刺激多种CD8 T细胞特异性时，避免了肽竞争，因为肽已经被插入到MHC分子中并组装到支架上。
为了证明抗原呈递支架的这种性质，进行了实验，其中使用具有4种病毒应答(HLA-A2 EBV BRLF1 YVL、HLA-A2 CMV pp65 NLV、HLA-A2 EBV LMP2 FLY和HLA-A2 FLU MP58-66 GIL)的来自健康供体的PMBC来研究使用抗原呈递支架在同一培养物中可以同时刺激多少不同的特异性。
从该供体建立了五种培养物，其中使用4种培养物分别扩增4种应答，并使用一种培养物同时扩增所有4种应答。因此，组装了4种不同的抗原呈递支架，每种支架携带4种病毒特异性中的1种，并且将它们单独添加到培养物1-4中，因此每种培养物扩增一种特异性。然后，在培养物5中，同时添加所有4种抗原呈递支架以在同一培养物中同时扩增4种病毒应答。简言之，通过对每种特异性添加1mL新鲜X-VIVO 15培养基(补充有5％热灭活的人血清和20IU/ml重组人IL-2)中的0.2nM终浓度的aAPC支架，来每周两次地刺激细胞。培养1周后，将细胞转移到24孔平底培养板中，每周一次从培养物中取出样品用于MHC四聚体染色，以通过流式细胞术追踪抗原特异性CD8 T细胞的扩增。在扩增2周后，通过四聚体染色评估对应于4种病毒应答的pMHC特异性T细胞的数量。然后，通过将扩增2周后获得的特异性CD8 T细胞的绝对数量除以来自基线的特异性CD8 T细胞的绝对数量，来计算每种特异性的扩增倍数。扩增倍数结果示于图12中。
预期使用aAPC支架单独扩增的应答，和使用aAPC支架同时扩增的应答均比在溶液中游离的相应模板分子更有效地扩增。因此，推断溶液中相应的模板分子存在特异性(也即，无关特异性)之间的竞争，并因此导致比使用aAPC支架扩增的T细胞群具有更少的抗原特异性和T细胞功能性的扩增的T细胞群。这种情况与同时扩增几种特异性尤其相关。
结论：(图12)从该实验可以清楚地看出，当在一种培养物中仅刺激一种特异性时，实现了抗原特异性CD8 T细胞的最高扩增倍数(黑条)。当混合不同的抗原呈递支架以同时扩增4种特异性时，扩增倍数降低。然而，证明抗原呈递支架能够同时扩增多种特异性。在临床情况下，起始材料通常是最少的，并且在单一样品中刺激多种不同的特异性是有利的。
实施例9：抗原呈递支架上刺激分子的组合决定了效果(图13-15)
这里证明了分子(细胞因子和共刺激分子)的组合对于基于抗原呈递支架的T细胞扩增的结果是重要的。可以使用特定组合为T细胞提供足够的刺激，以使细胞获得高杀伤功能并维持年轻表型，这是用于基于TIL的ACT的T细胞的关键特征，因为它与肿瘤消退增加有关。
进行了两项实验以研究用各种抗原呈递支架刺激后抗原特异性CD8 T细胞的功能和CD28和PD-1标志物的表达，所述抗原呈递支架携带已知提供差异免疫效应的分子的组合。将这些刺激与参照抗原呈递支架进行比较，所述参照抗原呈递支架携带先前已验证(参见图4-12)，并且已知对CD8 T细胞提供正刺激的分子组合。
在这些实验中使用比例为1：10：5：5：5和1：8：8：8的抗原呈递支架，其中来自健康供体的HLA-A2 EBV LMP2 CLG特异性CD8 T细胞被扩增2周。
在使用比例为1：10：5：5：5(支架：pMHC：B7-2：分子1：分子2)的抗原呈递支架的实验中，生成了21种不同的支架，所有支架均以1：10：5(支架：pMHC：B7-2)的比例携带了相同的pMHC分子和B7-2，并且以5：5(分子1：分子2)的比例另外连接了PD-L1、ICOS、OX40L、CD5、IL-1IL-6、IL-10的不同组合。图13中示出了用这21种不同的抗原呈递支架扩增后，HLA-A2EBV LMP2 CLG特异性CD8 T细胞的功能性。比例为1：10：5：5：5(支架：pMHC：B7-2：IL-15：IL-21)的参照支架一式两份地示出。
同样地，以1：8：8：8(支架：pMHC：IL-2：分子1)的比例组装了另一种支架。组装了7种不同的抗原呈递支架，其以1：8：8(支架：pMHC：IL-2)的比例携带了相同的pMHC特异性和IL-2，并且以8(分子1)的比例另外连接了PD-L1、ICOS、OX40L、CD5、IL-1IL-6、IL-10的不同组合。图14中显示了用7种不同抗原呈递支架中的每一种扩增后，特异性T细胞的数量和HLA-A2 EBV LMP2 CLG特异性CD8 T细胞的功能性。比例为1：8：8：8(支架：pMHC：IL-2：IL-21)的参照支架一式两份地示出。
结论：(图13和14)这些实验证明了抗原呈递支架上的各种分子在抗原识别时向T细胞提供相关刺激，以使细胞扩增并形成有利的功能特征和表型特征(特征在于PD1低表达、CD28高表达和多功能细胞因子应答(TNF-α、IFN-γ和CD107a))的相对效力。同时表达所有三种功能标志物(圆圈3)被解释为多功能性，表明这些细胞具有最高的杀伤能力。组合为支架：pMHC：B7-2：IL-1：PD-L1和支架：pMHC：B7-2：IL-15：IL-21(1：10：5：5：5)的抗原呈递支架(参见图13A-B)，和组合为支架：pMHC：IL-2：IL-1和支架：pMHC：IL-2：IL-21(1：8：8：8)的支架(参见图14A-B)产生了最高数量的、同时表达所有三种标志物的抗原特异性CD8 T细胞。
结论：(图15)从这些分析中，确定了CD28和PD1的相对表达。组合为支架：pMHC：B7-2：IL-10：IL-6和支架：pMHC：B7-2：IL-15：IL-21(1：10：5：5：5)的抗原呈递支架(参见图15A)，和组合为支架：pMHC：IL-2：ICOS和支架：pMHC：IL-2：IL-21(1：8：8：8)的支架(参见图15B)在抗原特异性CD8 T细胞中产生了最高的CD28表达。此外，组合为支架：pMHC：B7-2：ICOS：IL10和支架：pMHC：B7-2：PD-L1：IL6(1：10：5：5：5)的抗原呈递支架(参见图15A)，和组合为支架：pMHC：IL-2：IL21和支架：pMHC：IL-2：IL1(1：8：8：8)的支架(参见图15B)在抗原特异性CD8 T细胞中产生了最低的PD-1表达。CD28的高表达和PD1的低表达是用于过继细胞疗法的细胞群的理想特征。
用于T细胞刺激的最佳支架应产生具有高的多功能特性、良好扩增(特异性细胞的绝对数量高)、CD28高表达和PD1低表达的抗原特异性T细胞。组合了这些特征的最有前景的支架是：pMHC与IL2、IL15、IL21、B7-2、ICOS、IL1的组合。
实施例10：用不同长度的支架刺激抗原特异性CD8 T细胞(图16)
研究了使用不同长度的支架作为抗原呈递支架的主链。使用250kDa、750kDa和2000kDa的支架作为比例为1：10：5：5：5(支架：pMHC：B7-2：IL-15：IL-21)的抗原呈递支架的主链，并用于刺激来自健康供体的HLA-A2 EBV LMP2 CLG特异性CD8 T细胞两周。通过四聚体染色检测特异性扩增的频率，以比较三种支架的扩增潜力。
对于所有其他实验，使用了250kDa支架。通过使用更长的支架，可以连接更多的分子，这可以导致TCR-pMHC相互作用和刺激增加，并且可能可以实现T细胞的表型和功能结果的增强。或者，在更长的支架上，分子可以更好地分布，因为分子之间存在更多空间，这可以导致T细胞的刺激增强。
结论：(图16)从该实验显示，所有测试的葡聚糖长度均可以用作抗原呈递支架中的支架，因为它们均获得了针对携带pMHC部分的支架的抗原特异性T细胞的特异性扩增。750kDA支架产生了最高频率的特异性CD8 T细胞。
实施例11：在一种培养物中平行扩增来自一个供体样品的多种抗原特异性(图 17A-B)
除了平行扩增多种T细胞特异性外，基本上如实施例1中所述，平行扩增来自健康供体(具有五种病毒应答)的抗原特异性CD8 T细胞，并使用MHC四聚体测定第0天(基线)和用aAPC支架1：8：8：8(支架：pMHC：IL-2：IL-21)扩增14天后抗原特异性T细胞的频率。
在图17A中，基本上如实施例1中所述，建立了两种培养物以分别单独扩增HLA-A2EBV LMP2 FLY和HLA-A2 CMV pp65 NLV特异性CD8 T细胞。将这两种培养物分别与其中也分别单独扩增了HLA-A2 EBV LMP2 FLY和HLA-A2 CMV pp65 NLV特异性CD8 T细胞的两种培养物进行比较，但使用正常aAPC支架浓度的1/10，加上具有不匹配HLA-型的aAPC支架的9/10浓度。
在图17B中，使用来自一个健康供体(其含有五种已知的病毒应答)的材料作为起始材料，在一个单一培养物中同时扩增所有五种抗原特异性。这基本上如实施例1中那样进行，分别使用五种抗原特异性的、在实施例1中使用的aAPC支架1：8：8：8(支架：pMHC：IL-2：IL-21)浓度的1/10，加上具有不匹配HLA-型的aAPC支架的5/10。在第0天(基线)和扩增14天后，使用MHC四聚体测量五种特异性中每一种的抗原特异性T细胞的频率。五种病毒应答的特异性分别为HLA-A2 FLU MP 58-66 GIL、HLA-A2 EBV LMP2 FLY、HLA-A2 CMV pp65 NLV、HLA-A2 EBV BRLF1 YVL和HLA-A2 CMV IE1 VLE。
结论：(图17A-B)从实施例11可以得出结论，当使用实施例1中使用的aAPC支架浓度的1/10，加上具有无关不匹配HLA-型的aAPC支架的9/10时，抗原特异性T细胞(HLA-A2EBV LMP2 FLY和HLA-A2 CMV pp65 NLV特异性CD8 T细胞)可以有效扩增(图17A)。还可以得出结论，通过同时应用多种aAPC支架特异性，可以在单一培养物中平行地有效地扩增来自单一供体材料的五种不同病毒应答(图17B)。
实施例12：用大小不同和支架、pMHC和细胞因子的化学计量学不同的aAPC支架扩 增抗原特异性T细胞(图18A-B)
基本上如实施例1中那样，在六个平行培养物中扩增来自健康供体的抗原特异性CD8 T细胞，并且在扩增2周后使用MHC多聚体测量具有给定抗原特异性的T细胞的频率。用两种不同的支架与分子比例，测试MW 250kDa、750kDa和2000kDa的各支架。(A)aAPC支架1：8：8：8(支架：pMHC：IL-2：IL-21)，和(B)aAPC支架1：24：24：24(支架：pMHC：IL-2：IL-21)。
结论：(图18A-B)从实施例12可以得出结论，用不同MW(例如250KDa、750KDa和2000KDa)和支架：pMHC：IL-2：IL-21比例为1：8：8：8(图18A)和1：24：24：24(图18B)(对于所有支架尺寸)的支架可以有效扩增抗原特异性CD8 T细胞。
实施例13：使用aAPC支架在C57BL/6小鼠中体内扩增OVA特异性CD8 T细胞(图19)
用卵清蛋白(OVA)和polyIC接种四只C57BL/6小鼠，以建立限制于呈递OVA衍生肽SIINFEKL(SEQ ID NO：1)的C57BL/6等位基因H2-Kb的抗原特异性T细胞应答。在接种前、在腹膜内接种OVA+poly IC后第7天和第19天以及在加强免疫后第7天(第28天)，使用H2-Kb/SIINFEKL四聚体测量OVA特异性CD8 T细胞的频率。在接种后第21天，施用四种不同的加强剂。小鼠1静脉注射PBS，小鼠2腹膜内注射OVA，小鼠3静脉注射具有H2-Kb/SIINFEKL的aAPC支架1：8：8：8(支架：pMHC：IL-2：IL21)，小鼠4静脉注射与在aAPC支架1：8：8：8上组装的相同浓度的H2-Kb/SIINFEKL(即，小鼠3的加强剂)。即，在小鼠4中，抗原肽作为pMHC复合物的一部分给予，但没有aAPC支架。
结论：(图19)实施例13证明，aAPC支架可以在体内应用，这种应用是安全的(没有观察到毒性)并且aAPC在体内有效地扩大抗原特异性T细胞应答(图19)。
实施例14：使用aAPC支架与肽脉冲的单核细胞衍生的树突状细胞扩增抗原特异性 CD8 T细胞的比较(图20A-D)
使用PromoCell的树突状细胞生成方案和培养基，从HLA-A0201 CMV阳性供体的自体PBMC生成树突状细胞，其促进人单核细胞(hMo)体外成熟，成为成熟的CD83+单核细胞衍生的树突状细胞(moDC)。使用PromoCell单核细胞附着培养基(C-28051)和PromoCell树突状细胞生成培养基(C-28050)的组合，将单核细胞分化成moDC。简而言之，将PromoCell单核细胞附着培养基中的PBMC以2-3百万/cm2的密度铺在组织培养板中，在5％CO2和37℃下孵育1小时。通过去除非贴壁细胞捕获单核细胞。通过添加补充有Cytokine Pack moDC的1xComponent A(以100x提供)的PromoCell树突状细胞生成培养基开始向不成熟moDC的分化(第0天)，并在37℃和5％CO2下孵育3天。在第3天通过从细胞中吸出培养基并向细胞中添加补充有Cytokine Pack moDC的1x Component A的新鲜PromoCell DC生成培养基进行培养基更换。通过在第6天用Cytokine Pack moDC的1x Component B(以100x提供)补充整个体积，并在37℃和5％CO2下再孵育40小时，来完成moDC成熟过程。通过台盼蓝染色计数moDC。
通过将37.500个细胞/mL悬浮在含有50μg/ml肽(CMV pp65 NLVPMVATV(SEQ IDNO：2))的X-VIVO培养基中，并在37℃下孵育4小时，来产生肽脉冲的moDC。孵育后，将细胞在X-VIVO培养基中洗涤一次，并悬浮于50μL X-VIVO+5％中。
从最初具有0.01％HLA-A201/CMV pp65 NLVPMVATV阳性T细胞的、来自健康供体的100.000个PBMC中，扩增HLA-A201/CMV pp65 NLVPMVATV肽特异性T细胞。在如下四种条件下平行进行扩增：存在(A)游离的MHC复合物(HLA-A201/NLVPMVATV)和IL2和IL21，(B)aAPC支架，比例为1：8：8：8(HLA-A201/NLVPMVATV)(支架：pMHC：IL-2：IL-21)，(C)衍生自同一供体的37.500个未脉冲的moDC，其补充有IL-7至终浓度为120U/ml(第一天)和IL-12至终浓度为120U/ml(第2天)，或(D)衍生自同一供体的、NLVPMVATV肽脉冲的37.500个moDC，其补充有IL-7至终浓度为120U/ml(第一天)和IL-12至终浓度为120U/ml(第2天)。所有条件在补充有5％人血清的X-VIVO培养基中培养2周。两周后，通过MHC四聚体染色，追踪HLA-A201/CMVpp65 NLVPMVATV肽特异性T细胞的扩增。图20中示出了代表性的点图。
结论：(图20)实施例14证明，对于抗原特异性T细胞的扩增而言，与使用肽脉冲的moDC(图20D，2,8％，280倍扩增)相比，使用aAPC支架扩增抗原特异性CD8 T细胞显著(约为2倍)更有效(图20B，5.5％，550倍扩增)
参考文献
WO2002072631
WO2009003492
WO2009094273
项目
现在将在以下非限制性项目中进一步详细描述本发明。
项目1、一种人工抗原呈递细胞(aAPC)支架，其包含聚合物主链，所述聚合物主链上连接有以下模板分子：
i.至少一种包含抗原肽的主要组织相容性复合物分子(pMHC)，
ii.至少一种细胞因子，其选自由以下组成的组：IL-21、IL-2、IL-15、IL-1、IL-6、IL-10和IL-7，
iii.任选地，至少一种共刺激分子，其选自由以下组成的组：B7.2(CD86)、B7.1(CD80)、CD40、ICOS和PD-L1，以及
iv.任选地，至少一种CD47分子。
项目2、根据项目1所述的aAPC支架，其中所述模板分子包含至少两种不同细胞因子，其选自由以下组成的组：IL-21、IL-2、IL-15、IL-1、IL-6、IL-10和IL-7。
项目3、根据项目1或2所述的aAPC支架，其中所述模板分子通过位于聚合物主链上的偶联剂和位于模板分子上的亲和标签之间的非共价相互作用连接到聚合物主链上。
项目4、根据项目3所述的aAPC支架，其中所述偶联剂是链霉抗生物素蛋白，并且所述亲和标签是生物素。
项目5、根据前述任一项的aAPC支架，其中所述聚合物主链选自由以下组成的组：多糖、乙烯基聚合物、聚乙二醇、聚丙二醇、strep-tactin和聚链霉抗生物素蛋白。
项目6、根据前述任一项的aAPC支架，其中所述聚合物主链是多糖。
项目7、根据项目5或6所述的aAPC支架，其中所述多糖是葡聚糖。
项目8、根据项目7所述的aAPC支架，其中所述葡聚糖的分子量为50-3000kDa，例如100-2500kDa，例如250-2500kDa。
项目9、根据项目7或8所述的aAPC支架，其中所述葡聚糖的分子量选自由250kDa、270kDa、750kDa和2000kDa组成的组。
项目10、根据前述任一项的aAPC支架，其中所述至少一种pMHC分子是脊椎动物MHC分子，例如人、鼠、大鼠、猪、牛或禽分子。
项目11、根据项目10所述的aAPC支架，其中所述脊椎动物MHC分子是人分子。
项目12、根据前述任一项的aAPC支架，其中所述至少一种pMHC分子选自由以下组成的组：MHC I类分子、MHC II类分子、MHC III类分子、CD1a、CD1b、CD1c、CD1d和MR1。
项目13、根据项目12所述的aAPC支架，其中所述至少一种pMHC分子是MHC I类分子。
项目14、根据前述任一项的aAPC支架，其中所述pMHC的抗原肽是癌症相关表位或病毒表位。
项目15、根据项目14所述的aAPC支架，其中所述癌症相关表位是与病毒诱导的癌症相关的病毒表位。
项目16、根据项目14或15所述的aAPC支架，其中所述病毒表位来自选自由以下组成的组的病毒：人乳头瘤病毒(HPV)、Merkel细胞多瘤病毒(MCV)、巨细胞病毒(CMV)、Epstein-Barr病毒(EBV)、人嗜T淋巴细胞病毒(HTLV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)和流感病毒。
项目17、根据前述任一项的aAPC支架，其中所述pMHC分子是相同的并且仅呈递抗原肽的单一变体。
项目18、根据前述任一项的aAPC支架，其中每个聚合物主链包含至少5个pMHC分子，例如至少8个，例如至少10个，例如至少20个，例如至少30个，例如至少40个，例如至少50个，或例如至少100个。
项目19、根据前述任一项的aAPC支架，其中所述aAPC支架被固定在固体支撑物上。
项目20、根据项目19所述的aAPC支架，其中所述固体支撑物选自由以下组成的组：珠子、孔板、颗粒、微阵列和膜。
项目21、根据前述任一项的aAPC支架，其中所述模板分子包括至少IL-21。
项目22、根据前述任一项的aAPC支架，其中所述模板分子包括至少IL-15和IL-21。
项目23、根据前述任一项的aAPC支架，其中所述模板分子包括至少B7.2(CD86)。
项目24、根据前述任一项的aAPC支架，其中
i.所述聚合物主链是葡聚糖，
ii.所述共刺激分子是B7.2(CD86)，并且
iii.所述细胞因子是IL-15和IL-21。
项目25、根据项目24所述的aAPC支架，其中所述葡聚糖主链上pMHC、IL-15、IL-21和B7.2(CD86)之间的比例是2：1：1：1。
项目26、根据项目24或25的任一项所述的aAPC支架，其中葡聚糖主链、pMHC、IL-15、IL-21和B7.2(CD86)之间的比例是1：10：5：5：5。
项目27、根据项目1-20中的任一项所述的aAPC支架，其中所述模板分子包括至少IL-6和IL-10。
项目28、根据项目27所述的aAPC支架，其中
i.所述聚合物主链是葡聚糖，
ii.所述共刺激分子是B7.2(CD86)，并且
iii.所述细胞因子是IL-6和IL-10。
项目29、根据项目28所述的aAPC支架，其中所述葡聚糖主链上pMHC、IL-6、IL-10和B7.2(CD86)之间的比例是2：1：1：1。
项目30、根据项目28或29的任一项所述的aAPC支架，其中葡聚糖主链、pMHC、IL-6、IL-10和B7.2(CD86)之间的比例是1：10：5：5：5。
项目31、根据项目1-21中的任一项所述的aAPC支架，其中
i.所述聚合物主链是葡聚糖，并且
ii.所述细胞因子是IL-2和IL-21。
项目32、根据项目31所述的aAPC支架，其中所述葡聚糖主链上pMHC、IL-2和IL-21之间的比例是1：1：1。
项目33、根据项目31或32的任一项所述的aAPC支架，其中葡聚糖主链、pMHC、IL-2和IL-21之间的比例是1：8：8：8。
项目34、根据项目1所述的aAPC支架，其中聚合物主链包括至少IL-1和PD-L1。
项目35、根据项目34所述的aAPC支架，其中
i.所述聚合物主链是葡聚糖，
ii.所述共刺激分子是B7.2(CD86)和PD-L1，并且
iii.所述细胞因子是IL-1。
项目36、根据项目35所述的aAPC支架，其中所述葡聚糖主链上pMHC、IL-1、B7.2(CD86)和PD-L1之间的比例是2：1：1：1。
项目37、根据项目35或36的任一项所述的aAPC支架，其中葡聚糖主链、pMHC、IL-1、B7.2(CD86)和PD-L1之间的比例是1：10：5：5：5。
项目38、一种同时体外刺激和扩增T细胞的方法，其包括以下步骤：
i.提供包含T细胞的样品，
ii.使所述样品与包含根据前述任一项的aAPC支架的溶液接触，
iii.刺激并扩增培养中的、对所述aAPC支架具有特异性的T细胞，以及
iv.从培养物中收获步骤iii)的T细胞，以获得扩增的抗原特异性T细胞群。
项目39、根据项目38所述的方法，其中步骤ii)中包含aAPC支架的溶液在与样品接触之前已经被过滤。
项目40、根据项目39所述的方法，其中通过分子量截留过滤器离心过滤所述包含aAPC支架的溶液。
项目41、根据项目38-40中的任一项所述的方法，其中步骤i)的所述样品包含至少2种不同特异性的T细胞，例如至少5种不同特异性，例如至少10种不同特异性，例如至少15种不同特异性，例如至少20种不同特异性，或例如至少50种不同特异性的T细胞。
项目42、根据项目38-41中的任一项所述的方法，其中所述包含aAPC支架的溶液包含至少2种不同的aAPC支架，例如至少5种不同的aAPC支架，例如至少10种不同的aAPC支架，例如至少15种不同的aAPC支架，例如至少20种不同的aAPC支架，或者例如至少20种不同的aAPC支架。
项目43、根据项目38-42中的任一项所述的方法，其中在同一样品中平行地刺激和扩增至少2种不同特异性的T细胞，例如至少5种不同特异性，例如至少10种不同特异性，例如至少15种不同特异性，或例如至少20种不同特异性的T细胞。
项目44、根据项目38-43中的任一项所述的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
i.提供样品，所述样品包含具有至少5种不同特异性的T细胞，
ii.使所述样品与包含至少5种不同aAPC支架的溶液接触，
iii.平行刺激和扩增培养中的所述T细胞，所述T细胞具有针对所述至少5种不同的aAPC支架的至少5种不同的特异性，和
iv.从培养物中收获步骤iii)的T细胞，以获得具有至少5种不同特异性的扩
增的抗原特异性T细胞群。
项目45、根据项目38-44中的任一项所述的方法，其中所述样品选自由以下组成的组：外周血单核细胞、肿瘤、组织、骨髓、活组织检查、血清、血液、血浆、唾液、淋巴液、胸膜液、脑脊液和滑液。
项目46、根据项目38-47中的任一项所述的方法，其中所述T细胞选自由以下组成的组：CD8 T细胞、CD4 T细胞、调节性T细胞、天然杀伤T(NKT)细胞、γ-δT细胞和先天的黏膜相关恒定T(MAIT)细胞。
项目47、根据项目38-46中的任一项所述的方法，其中所述T细胞是CD8 T细胞。
项目48、根据项目38-47中的任一项所述的方法，其中将所述T细胞扩增至临床相关数量。
项目49、根据项目38-48中的任一项所述的方法，其中所述pMHC的抗原肽是癌症相关表位或病毒表位。
项目50、根据项目49所述的方法，其中所述癌症相关表位是与病毒诱导的癌症相关的病毒表位。
项目51、根据项目49或50所述的方法，其中所述病毒表位来自选自由以下组成的组的病毒：人乳头瘤病毒(HPV)、Merkel细胞多瘤病毒(MCV)、巨细胞病毒(CMV)、Epstein-Barr病毒(EBV)、人嗜T淋巴细胞病毒(HTLV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)和流感病毒。
项目52、通过项目38-51中任一项所述的方法获得的扩增的T细胞群。
项目53、通过项目38-51中任一项所述的方法获得的扩增的T细胞群，其用作药物。
项目54、通过项目38-51中任一项的方法获得的扩增的T细胞群，其用于治疗癌症或病毒病况。
项目55、根据项目54使用的扩增的T细胞群，其中所述癌症与病毒病况有关。
项目56、根据项目54或55使用的扩增的T细胞群，其中所述病毒病况与选自由以下组成的组的病毒相关：人乳头瘤病毒(HPV)、Merkel细胞多瘤病毒(MCV)、巨细胞病毒(CMV)、Epstein-Barr病毒(EBV)、人嗜T淋巴细胞病毒(HTLV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)和流感病毒。
序列表
<110> 丹麦技术大学
<120> 用于免疫细胞操作的抗原呈递支架
<130> 58678PC01
<160> 2
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 1
Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu
1 5
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 巨细胞病毒（Cytomegalovirus）
<400> 2
Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val
1 5

Claims (50)

1.一种人工抗原呈递细胞(aAPC)支架，其包含聚合物主链，所述聚合物主链上连接有以下模板分子：
i.至少两种不同的γ链受体细胞因子，例如选自由IL-21、IL-2、IL-15、IL-4、IL-9和IL-7组成的组的至少两种不同的γ链受体细胞因子，
ii.至少一种抗原，
iii.任选地，至少一种共刺激分子，其选自由B7.2(CD86)、B7.1(CD80)、CD40、ICOS和PD-L1组成的组，和
iv.任选地，至少一种CD47分子。
2.根据权利要求1所述的aAPC支架，其中所述γ链受体细胞因子选自由IL-21、IL-2、IL-15、IL-4、IL-9和IL-7组成的组。
3.根据前述权利要求中任一项所述的aAPC支架，其中所述γ链受体细胞因子选自由IL-21、IL-2和IL-15组成的组。
4.根据前述权利要求中任一项所述的aAPC支架，其中所述γ链受体细胞因子包含至少IL-21。
5.根据前述权利要求中任一项所述的aAPC支架，其中所述γ链受体细胞因子包含：
i.至少IL-2和IL-21，或
ii.至少IL-15和IL-21。
6.根据前述权利要求中任一项所述的aAPC支架，其中所述γ链受体细胞因子是：
i.IL-2和IL-21，或
ii.IL-15和IL-21。
7.根据前述权利要求中任一项所述的aAPC支架，其中所述至少一种抗原是包含抗原肽的主要组织相容性复合物分子(pMHC)。
8.根据权利要求7所述的aAPC支架，其中所述pMHC分子是相同的并且仅呈递抗原肽的单一变体。
9.根据权利要求7或8任一项所述的aAPC支架，其中每个聚合物主链包含至少5个pMHC分子，例如至少8个，例如至少10个，例如至少20个，例如至少30个，例如至少40个，例如至少50个，或例如至少100个。
10.根据权利要求7-9中任一项所述的aAPC支架，其中所述抗原包含癌症相关表位或病毒表位。
11.根据权利要求10所述的aAPC支架，其中所述癌症相关表位是与病毒诱导的癌症相关的病毒表位。
12.根据权利要求10或11任一项所述的aAPC支架，其中所述病毒表位来自选自由以下组成的组的病毒：人乳头瘤病毒(HPV)、Merkel细胞多瘤病毒(MCV)、巨细胞病毒(CMV)、Epstein-Barr病毒(EBV)、人嗜T淋巴细胞病毒(HTLV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)和流感病毒。
13.根据前述权利要求中任一项所述的aAPC支架，其中所述聚合物主链选自由以下组成的组：多糖、乙烯基聚合物、聚乙二醇、聚丙二醇、strep-tactin和聚链霉抗生物素蛋白。
14.根据前述权利要求中任一项所述的aAPC支架，其中所述聚合物主链是多糖。
15.根据权利要求13或14任一项所述的aAPC支架，其中所述多糖是葡聚糖。
16.根据前述权利要求中任一项所述的aAPC支架，其中
i.所述聚合物主链是葡聚糖，并且
ii.所述γ链受体细胞因子是IL-2和IL-21。
17.根据前述权利要求中任一项所述的aAPC支架，其中
i.所述聚合物主链是葡聚糖，
ii.所述γ链受体细胞因子是IL-2和IL-21，并且
iii.所述抗原是包含抗原肽的主要组织相容性复合物分子(pMHC)。
18.根据权利要求17所述的aAPC支架，其中所述葡聚糖主链上pMHC、IL-2和IL-21之间的比例是1：1：1。
19.根据权利要求17或18任一项所述的aAPC支架，其中葡聚糖主链、pMHC、IL-2和IL-21之间的比例是1：8：8：8。
20.根据前述权利要求中任一项所述的aAPC支架，其中所述共刺激分子包括至少B7.2(CD86)。
21.根据权利要求1-15中任一项所述的aAPC支架，其中
i.所述聚合物主链是葡聚糖，
ii.所述γ链受体细胞因子是IL-15和IL-21，并且
iii.所述共刺激分子是B7.2(CD86)。
22.根据权利要求21所述的aAPC支架，其中
i.所述聚合物主链是葡聚糖，
ii.所述γ链受体细胞因子是IL-15和IL-21，
iii.所述抗原是包含抗原肽的主要组织相容性复合物分子(pMHC)，并且
iv.所述共刺激分子是B7.2(CD86)。
23.根据权利要求22所述的aAPC支架，其中所述葡聚糖主链上pMHC、IL-15、IL-21和B7.2(CD86)之间的比例是2：1：1：1。
24.根据权利要求22或23任一项所述的aAPC支架，其中葡聚糖主链、pMHC、IL-15、IL-21和B7.2(CD86)之间的比例是1：10：5：5：5。
25.根据前述权利要求中任一项所述的aAPC支架，其中所述模板分子包括至少一种CD47分子。
26.根据权利要求1-6中任一项所述的aAPC支架，其中所述至少一种抗原是非MHC呈递的分子。
27.根据权利要求26所述的aAPC支架，其中所述非MHC呈递的分子选自由以下组成的组：CD19、CD20、CD22、CD269、半抗原、BCMA、表皮生长因子受体(EGFR)、间皮素(MSLN)、表皮生长因子受体的变体III(EGFRvIII)、人表皮生长因子受体-2(HER2)、癌胚抗原(CEA)和前列腺特异性膜抗原(PSMA)。
28.根据前述权利要求中任一项所述的aAPC支架，其中所述模板分子通过位于聚合物主链上的偶联剂和位于模板分子上的亲和标签之间的非共价相互作用连接到聚合物主链上。
29.根据权利要求28所述的aAPC支架，其中所述偶联剂是链霉抗生物素蛋白，并且所述亲和标签是生物素。
30.根据前述权利要求中任一项所述的aAPC支架，其中所述aAPC支架被固定在固体支撑物上。
31.根据权利要求30所述的aAPC支架，其中所述固体支撑物选自由以下组成的组：珠子、孔板、颗粒、微阵列和膜。
32.一种同时体外刺激和扩增T细胞的方法，其包括以下步骤：
i.提供包含T细胞的样品，
ii.使所述样品与包含根据前述权利要求中任一项所述的aAPC支架的溶液接触，
iii.刺激并扩增培养中的、对所述aAPC支架具有特异性的T细胞，以及
iv.从培养物中收获步骤iii)的T细胞，以获得扩增的抗原特异性T细胞群。
33.根据权利要求32所述的方法，其中步骤ii)中包含aAPC支架的溶液在与样品接触之前已经被过滤。
34.根据权利要求33所述的方法，其中通过分子量截留过滤器离心过滤所述包含aAPC支架的溶液。
35.根据权利要求32-34中任一项所述的方法，其中步骤i)的所述样品包含至少2种不同特异性的T细胞，例如至少5种不同特异性，例如至少10种不同特异性，例如至少15种不同特异性，例如至少20种不同特异性，或例如至少50种不同特异性的T细胞。
36.根据权利要求32-35中任一项所述的方法，其中所述包含aAPC支架的溶液包含至少2种不同的aAPC支架，例如至少5种不同的aAPC支架，例如至少10种不同的aAPC支架，例如至少15种不同的aAPC支架，例如至少20种不同的aAPC支架，或者例如至少20种不同的aAPC支架。
37.根据权利要求32-36中任一项所述的方法，其中在同一样品中平行地刺激和扩增至少2种不同特异性的T细胞，例如至少5种不同特异性，例如至少10种不同特异性，例如至少15种不同特异性，或例如至少20种不同特异性的T细胞。
38.根据权利要求32-37中任一项所述的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
i.提供样品，所述样品包含具有至少5种不同特异性的T细胞，
ii.使所述样品与包含至少5种不同aAPC支架的溶液接触，
iii.平行刺激和扩增培养中的所述T细胞，所述T细胞具有针对所述至少5种不同的aAPC支架的至少5种不同的特异性，和
iv.从培养物中收获步骤iii)的T细胞，以获得具有至少5种不同特异性的扩增的抗原特异性T细胞群。
39.根据权利要求32-38中任一项所述的方法，其中所述样品选自由以下组成的组：外周血单核细胞、肿瘤、组织、骨髓、活组织检查、血清、血液、血浆、唾液、淋巴液、胸膜液、脑脊液和滑液。
40.根据权利要求32-39中任一项所述的方法，其中所述T细胞选自由以下组成的组：CAR T细胞、CD8 T细胞、CD4 T细胞、调节性T细胞、天然杀伤T(NKT)细胞、γ-δT细胞和先天的黏膜相关恒定T(MAIT)细胞。
41.根据权利要求32-40中任一项所述的方法，其中所述T细胞是CD8 T细胞。
42.根据权利要求32-41中任一项所述的方法，其中将所述T细胞扩增至临床相关数量。
43.根据权利要求32-42中任一项所述的方法，其中所述抗原包含癌症相关表位或病毒表位。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述癌症相关表位是与病毒诱导的癌症相关的病毒表位。
45.根据权利要求43或44任一项所述的方法，其中所述病毒表位来自选自由以下组成的组的病毒：人乳头瘤病毒(HPV)、Merkel细胞多瘤病毒(MCV)、巨细胞病毒(CMV)、Epstein-Barr病毒(EBV)、人嗜T淋巴细胞病毒(HTLV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)和流感病毒。
46.通过权利要求32-45中任一项所述的方法获得的扩增的T细胞群。
47.通过权利要求32-45中任一项所述的方法获得的扩增的T细胞群，其用作药物。
48.通过权利要求32-45中任一项所述的方法获得的扩增的T细胞群，其用于治疗癌症或病毒病况。
49.根据权利要求48使用的所述扩增的T细胞群，其中所述癌症与病毒病况有关。
50.根据权利要求48或49任一项使用的所述扩增的T细胞群，其中所述病毒病况与选自由以下组成的组的病毒相关：人乳头瘤病毒(HPV)、Merkel细胞多瘤病毒(MCV)、巨细胞病毒(CMV)、Epstein-Barr病毒(EBV)、人嗜T淋巴细胞病毒(HTLV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)和流感病毒。
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