JP5690272B2 - サンプル中の抗原応答性細胞の検出 - Google Patents
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Description
本発明は、主要組織適合抗原複合体(MHC)などの多元標識付け抗原提示化合物を用いてサンプル中の抗原応答性細胞を検出するための方法に関する。さらに、本発明は、サンプル、血液サンプルなどの好ましくは単一のサンプルであるサンプル中の抗原応答性細胞を検出するための、抗原−主要組織適合抗原複合体(MHC)などの本多元標識付け抗原提示化合物の使用に関する。本方法は、T細胞およびB細胞などの特異性抗原応答性細胞の高スループット分析を可能にし、それにより、たとえば、疾患または病状のモニタ、および免疫療法薬、ワクチンまたは同定エピトープもしくは免疫原性アミノ酸配列の開発のための高スループットの方法を提供する。
具体的に、この目的は、(末梢血サンプルなどの生体材料の)サンプル中の抗原応答性細胞を検出するための方法であって、
少なくとも1つの標識を保持する抗原提示化合物に2つ以上の予め定められた抗原を負荷するなどして付与するステップを備え、各々の抗原は少なくとも2つの異なる標識で表わされ(エンコードされ)、さらに
抗原付与された当該抗原提示化合物を当該サンプルと接触させるステップと、
抗原負荷された当該抗原提示化合物の、当該抗原応答性細胞への結合を検出し、これにより当該抗原に応答する細胞を検出するステップとを備え、
当該抗原は、当該抗原を負荷された当該抗原提示化合物によって抗原応答性細胞に結合される当該少なくとも2つの異なる標識の存在を検出することによって検出される、方法によって満たされる。
また別の局面に従うと、本発明は、ポリペプチド中のエピトープまたは免疫原性アミノ酸配列の同定のための本方法の使用に関する。この局面は、本発明に従う方法を用いて、未知のHLA−A3関連T細胞抗原であるQLRALDGGNK,SLYRDPLPR,HAYIQSLLK,RMYNMVPFFおよびGTYEGLLRRの同定に例示される。
方法
ペプチド−MHC複合体の生成
すべてのペプチドは標準的なFmoc化学を用いて社内で合成した、またはPepscanから購入した(オランダ、レリスタット、Pepscan Presto BV)。UVに感受性のあるビルディングブロックJを記載のように合成した(Toebes et al., 2006)。組換HLA−A1、−A2、−A3、および−B7重鎖およびヒトβ2m軽鎖は大腸菌で生産した。MHCクラスIリフォルディング反応は記載のように行なわれ(Garboczi et al., 1992)、かつMHCクラスI複合体はPBSにおけるゲルろ過HPLCによって精製した(pH7.4)。
MHCマルチマーは、SA−Qdot565、SA−Qdot585、SA−Qdot605、SA−Qdot655、SA−Qdot705、SA−Qdot800、SA−フィコエレクチン(phycoerectin)(PE)およびSA−アロフィコシアニン(APC)という8つの異なる蛍光ストレプトアビジン(SA)コンジュゲート(Invitrogen)を用いて生成した。MHCモノマー(濃度100μg/mL)各100μL毎に、7.08μLのSA−Qdotコンジュゲート(1μM)、10.8μLのSA−PE(1mg/ml)または6μLのSA−APC(1mg/ml)を加え、その後氷の上で20分間インキュベートした。MHCペプチド交換後100%救出されたと仮定すると、これはSA−Qdot当たり30個のMHCモノマーの占有率という結果となるであろう。ビオチン(Sigma)およびNaN3(Sigma)を、26.4μMおよび0.02%の最終濃度にそれぞれ加え、その後氷の上で20分間インキュベートした。PEおよびAPC標識付け複合体を0.02%のNaN3でPBS中で2倍に希釈した。各pMHC複合体毎に、表1および表2のスキームに従って2つの異なる蛍光標識でマルチマーを作った。
約1×106のPBMCまたは2×105の培養されたT細胞のT細胞染色について、2μLの単一のpMHCマルチマーまたは50μLの2色エンコードされたpMHCコレクション(collections)(最終濃度:初期モノマー濃度ベースで別々のpMHC当たり2μg/mL)を用いた。最終染色容量は80μlであり、37℃で10分間細胞をインキュベートした。次に、CD8−Alexa700(Caltech MHCD0289)(最終希釈1/200)、CD4−FITC(BD345768)(最終希釈1/8)、CD14−FITC(BD345784)(最終希釈1/32)、CD19−FITC(BD345776)(最終希釈1/16)、CD40−FITC(Serotech MCA1590F)(最終希釈1/40)、CD16−FITC(BD347523)(最終希釈1/64)からなる5倍抗体ミックス20μLを加え、4℃で20−30分間細胞をインキュベートした。フローサイトメトリの前に細胞を2回洗浄し、死んだ細胞を排除できるようにヨウ化プロピジウムを加えた。
488nmのレーザ:PI:685LP、695/40;PE:550LP、575/26;FITC:505LP、530/30;SSC:488/10.633nmのレーザ:Alexa700:685LP、730/45;APC:660/20.405nmのレーザ:Qdot800:770LP、800/30;Qdot705:680LP、710/50;Qdot655:635LP、660/40;Qdot605:595LP、650/12.355nmのレーザ:Qdot585:575LP、585/15;Qdot565:545LP:560/20という11色器具設定を用いてFacsDivaソフトウェアでLSR−IIフローサイトメータ(Becton Dickinson)に対してデータ取得を行なった。
4℃で1時間、PE−マルチマーで抗原特異性T細胞を染色した(107のPBMCについて1.25μLの各個別のPE−マルチマーの100μg/mLの株)。その後、細胞を洗浄し、20μLの抗PE Absコーティングされた磁気ビーズ(Miltenyi)でインキュベートした。次に、LSカラムを用いてかつ製造者のプロトコールに従って、MACS(Miltenyi)によって細胞を単離した。溶出した細胞を洗浄し、5000個の抗CD3/CD28ダイナビーズ(Invitrogen)を用いて、10%のヒト血清(Invitrogen)、100IU/mLのIL−2(Proleukin)、および20ng/mLのIL−15(Peprotech)で、200μLのT細胞媒質(IMDM(Gibco)中で再懸濁した。強化された細胞を96ウェルプレートで培養し、翌日再懸濁した。培養物(cultures)を分け、少なくとも週に2回媒質を取換えた。2、3週間後、組合せコーディングに基づくMHCマルチマーフローサイトメトリによって抗原特異性T細胞応答を測定した。
関連のpMHCマルチマーでT細胞を染色し、次にMoFlo(Dako)またはFACSAria(Becton Dickinson)上で、105個の照射されたフィーダ細胞(JY plus同種PBMC)に分類した。細胞をスピンし、10%のヒト血清、100IU/mLのIL−2、および0.5μg/mLのPHA(Biochrom AG)でIMDM中に再懸濁した。隔週に培養物に再び刺激を与えた。MHCマルチマー染色により、抗原特異性について樹立された培養物をテストした。
示されたペプチドを1時間T2−A3細胞に負荷し、これを1回洗浄した。次に、示された培養物からの1×105個のT細胞を、10%のヒト血清およびタンパク質輸送抑制剤(BD GolgiPlug)を用いて、IMDM中で37℃で4時間1×105個のT2−A3細胞とともにインキュベートした。25℃で15分間、PEコンジュゲートされた抗CD8 Ab(SK1、BD)で細胞を染色し、固定しかつ透過処理し(BD Cytofix/Cytopermキット)、4℃で30分間、APCコンジュゲートされた抗IFNガンマAb(25723.11、BD)で染色した。フローサイトメトリでサンプルを分析し(Cyan, Dako)、FlowJoを用いてデータ分析を行なった。
本発明に従う組合せコーディング技術は、複数の免疫応答の同時検出および分析のための貴重なツールであることが実証される。
Claims (18)
- サンプル中の抗原応答性細胞を検出するための方法であって、
少なくとも1つの標識を保持する主要組織適合抗原複合体(MHC)に3以上の予め定められた抗原を付与するステップを備え、各々の抗原は少なくとも2つの異なる標識で表わされ、さらに
抗原を担持する前記主要組織適合抗原複合体(MHC)を前記サンプルと接触させるステップと、
抗原を負荷された前記主要組織適合抗原複合体(MHC)の、前記抗原応答性細胞への結合を検出し、これにより前記抗原に応答する細胞を検出するステップとを備え、
前記抗原は、前記抗原を負荷された前記主要組織適合抗原複合体(MHC)によって抗原応答性細胞に結合される前記少なくとも2つの異なる標識の存在を検出することによって検出される、方法。 - 前記3以上の予め定められた抗原は、4以上、5以上、6以上、7以上、8以上、10以上、11以上、12以上、13以上、14以上、15以上、16以上、17以上、18以上、19以上、20以上、20以上、21以上、22以上、23以上、24以上、25以上、26以上、27以上、および28以上からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記主要組織適合抗原複合体(MHC)には1つの標識が付与され、前記抗原は、少なくとも2つの異なって標識付けられた主要組織適合抗原複合体(MHC)によって表わされるかまたはエンコードされる、請求項1または請求項2に記載の方法。
- 前記主要組織適合抗原複合体(MHC)には少なくとも2つの異なる標識が付与され、前記抗原は、1つの標識付けされた主要組織適合抗原複合体(MHC)によって表わされるかまたはエンコードされる、請求項1または請求項2に記載の方法。
- 前記抗原はペプチドである、請求項1から4のいずれかに記載の方法。
- 前記主要組織適合抗原複合体(MHC)は、少なくとも4つのモノマーからなる多量化主要組織適合抗原複合体(MHC)である、請求項1に記載の方法。
- 前記抗原応答性細胞はT細胞および/またはB細胞である、請求項1から6のいずれかに記載の方法。
- 前記標識は蛍光標識である、請求項1から7のいずれかに記載の方法。
- 前記蛍光標識はqDotを備える、請求項8に記載の方法。
- 異なる標識の数は、3以上、4以上、5以上、6以上、7以上、および8以上からなる群から選択される、請求項1から9のいずれかに記載の方法。
- 前記抗原は少なくとも3つまたは少なくとも4つの異なる標識で表わされる、請求項1から10のいずれかに記載の方法。
- 前記サンプルは血液サンプルまたは血液由来のサンプルである、請求項1から11のいずれかに記載の方法。
- 前記検出はフローサイトメトリを備える、請求項1から12のいずれかに記載の方法。
- サンプル中の抗原応答性細胞を検出するための単一の抗原を表わす、請求項1から13のいずれかに規定されるような少なくとも2つの標識の使用。
- 免疫療法薬の開発における、請求項1から13のいずれかに記載の方法の使用。
- ワクチンの開発における、請求項1から13のいずれかに記載の方法の使用。
- エピトープの同定のための、請求項1から13のいずれかに記載の方法の使用。
- 請求項1から13のいずれかに規定されるような、少なくとも2つの標識を用いてリガンドを標識付けするステップを備える、細胞または細胞結合レセプタへのリガンドの結合を検出するための方法。
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