CN105106237B - 一种高效杀伤肿瘤细胞生物制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种高效杀伤肿瘤细胞生物制剂及其制备方法。通过体外诱导扩增人NK细胞、成熟B淋巴细胞和CIK细胞，按一定比例组合，提供一种高效杀伤肿瘤细胞的生物制剂。本发明所使用的联合杀瘤的生物制剂具有杀瘤活性强、杀瘤谱广、非MHC限制性等特点。
Description
技术领域
本发明涉及免疫细胞体外培养领域，具体涉及杀伤肿瘤细胞的生物制剂、制备方法及应用。
背景技术
肿瘤浸润淋巴细胞杀伤肿瘤细胞通过两种机制：一是淋巴细胞与肿瘤细胞相互接触，直接分泌细胞毒颗粒和穿孔素与肿瘤靶细胞结合，使肿瘤细胞裂解；二是分泌具有细胞毒功能的细胞因子，如肿瘤坏死因子、干扰素介导的间接杀伤作用。
多种细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK），是将人外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子（如抗CD3单克隆抗体、IL-2和IFN-γ等）共同培养一段时间后获得的一群异质细胞。由于该种细胞同时表达CD3+和CD56+两种膜蛋白分子,故又被称为NK细胞样T淋巴细胞,兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点。因此，CIK细胞被认为是新一代抗肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案。有研究证实扩增出CD3+CD56+细胞来源于CD3+CD56-T细胞，而非CD3-CD56+NK细胞，即大部分的CIK细胞是由T淋巴细胞分化而来，而通过定向诱导，T淋巴细胞也有一部分转化为CD3+CD8+T细胞，也具有很强的肿瘤杀伤活性，因此CIK细胞可能同时包含CD3+CD56+细胞和CD3+CD8+细胞。
自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生。NK细胞对靶细胞的识别无MHC限制性，无需致敏因子诱导即可直接杀伤肿瘤细胞，NK细胞也可分泌细胞因子，调节其他免疫细胞的功能，因此在机体天然免疫和获得性免疫细胞调节中发挥重大作用。NK细胞在人外周血中含量较低，目前NK体外扩增技术主要是通过在体外培养体系中加入IL-2、IL-12、IL-15和IFN-γ等细胞因子来实现的，但是细胞增效果差，纯度低，对细胞因子的需求量大，培养效果不稳定。
成熟B淋巴细胞（浆细胞）可在周围淋巴器官中接受抗原刺激，在Th细胞及抗原呈递细胞的协助下，及其产生的细胞因子作用下可使B细胞活化，增殖并分化为合成和分泌抗体的B淋巴细胞。此阶段B淋巴细胞可逐渐丢失一些膜分子如CD19和CD22等。并可发生Ig的类别转换，从产生IgM转换为产生IgG 、IgA或IgE的B细胞。B细胞不仅表达MHCⅠ类抗原，而且表达较高比例和密度的MHCⅡ类抗原。除了B淋巴细胞外，从前B细胞至活化B细胞均表达MHCⅡ类抗原。B细胞表面的MHCⅡ类抗原在B细胞与T细胞相互协作时起重要作用，此外，还参与B细胞作为辅佐细胞的抗原提呈作用。与此同时，B细胞在CD4+细胞辅助之下，可对肿瘤分泌的可溶性抗原或瘤细胞膜抗原产生应答，并产生抗肿瘤抗体。目前，有关刺激B细胞产生理想抗体水平的最适宜的体外培养条件(包括添加物、刺激原的选择及培养间期等)没有相对系统的研究，且无成熟的方法借鉴。
发明内容
本发明提供一种高效的杀伤肿瘤细胞的生物制剂，其特征在于分别对B淋巴细胞、T淋巴细胞以及NK细胞三种细胞进行活化、刺激、培养之后混合，三种细胞混合的细胞数比例为（1~3）：（0.3~3）：（1~3）。本发明的生物制剂具有杀瘤活性强、杀瘤谱广、非MHC限制性等特点，从根本上解决了NK细胞培养后纯度不够的问题，也解决了全淋巴细胞培养过程中由于细胞之间的竞争营养物质导致原始比例较小的细胞生长缓慢的问题。本发明还提供了进行细胞培养的专用培养基产品、活化刺激细胞的方法和制剂、以及操作方法。
优选地，本发明通过淋巴细胞分离液从人外周血中分离单个核细胞（PBMC）得到初始成熟B淋巴细胞，分离后的PBMC通过细胞分选技术，优选流式细胞技术，得到高浓度的初始成熟B淋巴细胞、CIK细胞以及NK细胞，分别对上述三种淋巴细胞进行活化、刺激、培养，然后按照一定比例混合。本发明可以使用50ml血样就能在体外扩增出三种不同种类的杀瘤细胞，其相互联合表现出很高的杀瘤效果，因此有重要的临床意义。
在本发明的一个实施方案中，先进行NK细胞的增殖培养，然后加入NKG2D配体MICA蛋白、MICB蛋白以及药物Lenalidomide刺激培养。优选在NK细胞增殖培养七天后加入NKG2D配体MICA蛋白、MICB蛋白以及药物Lenalidomide刺激培养。优选加入等量MICA蛋白和MICB蛋白，其在培养液中浓度均为100-500ng/ml，同时加入Lenalidomide刺激剂,其在细胞悬液中浓度为500-1000ng/ml。NKG2D（CD314）在NK 细胞中的功能已得到了深入研究。体外实验证实，NKG2D 的交联可触发人和小鼠的NK 细胞细胞毒活性和IFN-γ 的分泌，人NKG2D 的配体包括MICA和MICB。CD226 是另一个重要的NK细胞活化受体，人CD266的主要配体有CD155 以及CD112，此外，药物Lenalidomide可以增强NK细胞介导的ADCC作用。
肿瘤特异性抗原只存在于某种肿瘤细胞而不存在于正常细胞，因此，在本发明的一个实施方案中，使用MAGE-3作为刺激源，辅以细胞因子IL-2、IL-10、CD156，刺激培养出大量具有高IGg（主要为肿瘤抗体）生产能力及高活性的成熟B淋巴细胞。成熟B淋巴细胞在培养一定时间后加入肿瘤特异性抗原MAGE-3，其在细胞悬液中浓度为600-800ng/ml。优选B细胞在培养至第七天之后加入肿瘤特异性抗原MAGE-3。
本发明还提供了一种用于本发明培养CIK细胞的培养基，其含有刺激因子IL-2、IL-12。培养后将细胞悬液转至CD3单克隆抗体包被培养瓶培养。优选培养2天后将细胞悬液转至CD3单克隆抗体包被培养瓶培养。
在本发明优选的实施方案中，提供了一种杀伤肿瘤细胞的生物制剂，其特征在于分别对初始成熟B淋巴细胞、T淋巴细胞以及NK细胞三种淋巴细胞进行活化、刺激、培养之后混合，三种细胞混合的细胞数比例为（1~3）：（0.3~3）：（1~3），其中，在混合之前，加入NKG2D配体MICA蛋白、MICB蛋白以及药物Lenalidomide对NK细胞刺激培养；使用MAGE-3作为刺激源，辅以细胞因子IL-2、IL-10、CD156对成熟B淋巴细胞刺激培养；用含有刺激因子IL-2、IL-12的培养基培养CIK细胞。
本发明还提供了一种杀伤肿瘤细胞的生物制剂的制备方法，其特征在于分别对初始成熟B淋巴细胞、CIK以及NK细胞上述三种淋巴细胞进行活化、刺激、培养之后混合，三种细胞混合的细胞数比例为（1~3）：（0.3~3）：（1~3），其中，在混合之前，加入NKG2D配体MICA蛋白、MICB蛋白以及药物Lenalidomide对NK细胞刺激培养；使用MAGE-3作为刺激源，辅以细胞因子IL-2、IL-10、CD156，对B淋巴细胞刺激培养；用含有刺激因子IL-2、IL-12的培养基培养CIK细胞。
在本发明优选的实施方案中，培养第10-13天成熟B淋巴细胞和CIK细胞混合培养，混合培养使用CIK细胞培养基。活化的NK细胞加入混合培养体系的时间之前的培养时间为10-14天(杀瘤效果检测前)。
在本发明中，细胞培养条件优选在37℃ 5% CO2二氧化碳培养箱中培养。
NK细胞、成熟B淋巴细胞、CIK细胞专用培养基组成如下：
本发明优选培养基体系如下：
对本发明制备的生物制剂进行了杀瘤活性检测，杀瘤活性检测前细胞混合培养是根据如下方案：
| 混合时间 | 混合比例 |
| CIK第10天+成熟B淋巴细胞第10天+NK细胞第14天 | （1~3）：（0.3~3）：（1~3） |
| CIK第11天+成熟B淋巴细胞第11天+NK细胞第14天 | （1~3）：（0.3~3）：（1~3） |
| CIK第13天+成熟B淋巴细胞第13天+MTT检测前NK细胞 | （1~3）：（0.3~3）：（1~3） |
本发明优选的杀瘤活性检测所针对的生物制剂是培养第13天的CIK +培养第13天的成熟B淋巴细胞+CCK8检测前的NK细胞，优选细胞数比例为3:1:3。CIK + 成熟B淋巴细胞混合培养使用CIK细胞培养基。
本发明还提供了本发明的生物制剂在制备杀伤肿瘤细胞的药物中的用途。
附图说明：
图1是本发明培养方法所获NK细胞的流式检测结果。
图2是本发明培养方法获得的成熟B淋巴细胞的流式检测结果。
图3是本发明培养方法获得的CIK细胞的流式检测结果。
图4 是本发明获得的联合杀瘤细胞生物制剂与单纯的活化NK细胞、浆细胞（成熟B淋巴细胞）、CIK细胞杀瘤效果的比较。
具体实施方式
实施例1 PBMC分离
1)将使用肝素抗凝采血管静脉采集的50－80ml外周血1500r/mim离心5min，用移液器小心吸取上层血清备用，细胞沉淀用等量PBS重悬；
2)将上述细胞悬液缓慢加入等体积Ficoll（葡聚糖－泛影葡胺）（购于通用电气医疗集团，货号：17-5442-02/03）分离液中，设置离心机自然升降速度，2000r/min离心20min，离心后吸取中间白膜层细胞为外周血单个核细胞；
3)用PBS洗上述单核细胞两次，除去Ficoll分离液。
实施例2 细胞分选
1)向实施例1获得的细胞中加入带有荧光标记的流式分选抗体CD56-PE（美国BD公司，货号：555516）以及CD19-FITC（美国BD公司，货号：555412），室温避光孵育20min；
2)用PBS洗去多余抗体；
3)用美国BD公司的流式分选仪Infiux进行细胞分选，其中CD56+作为NK细胞分选标准，CD19+作为成熟B淋巴细胞分选标准，CD56-CD19-作为CIK细胞分选标准；
4)收获分选所得NK细胞、成熟B淋巴细胞以及CIK细胞作为培养基础细胞。
实施例3 细胞培养（NK细胞培养、成熟B细胞培养、T细胞培养）
1)分别将实施例2中获取的CIK细胞、成熟B淋巴细胞、NK细胞按照比例3:1:3转入75cm2细胞培养瓶中，加入培养三种细胞所需的不同培养基各10ml，于37℃ 5% CO2二氧化碳培养箱中培养，不同细胞专用培养基组成如下：
2)专用培养基组成
3)
4)上述细胞在培养过程中根据细胞生长情况及时补加上述培养基，NK细胞在培养第七天时加入等量MICA（Reliatech公司，货号：101-M569）蛋白和MICB（Reliatech公司，货号：101-M570）蛋白，其在培养液中浓度均为500ng/ml，同时加入Lenalidomide（Medchemexpress公司，货号：HY-A0003）刺激剂,其在细胞悬液中浓度为800ng/ml。
5)成熟B淋巴细胞在培养至第七天时加入肿瘤特异性抗原MAGE-3，其在细胞悬液中浓度为800ng/ml。
6)培养第13天的浆细胞（成熟的B淋巴细胞）和CIK细胞按细胞数比例1：3混合，于37℃ 5%CO2培养箱中培养至杀伤活性检测前，混合培养使用CIK细胞培养基。NK细胞培养至14天时按细胞数比例：NK细胞:浆细胞:CIK细胞=3:1:3（假设浆细胞的细胞数在24小时内无变化）混合，混合后不进行后续培养，直接进行杀伤活性检测，
实施例4 培养后细胞的检测
使用流式细胞技术，对混合培养前实验所得三种细胞细胞进行检测，检测结果分别见附图1、附图2、附图3。检测结果显示本发明获得的NK细胞纯度为95.9%；浆细胞（成熟B淋巴细胞）纯度也高达93.6%；CIK细胞中的CD3+CD56+细胞占56.6%，CD3+CD8+细胞占45.4%。
实施例5 杀伤效果检测
1)取实施例3中优选方案混合培养的细胞生物制剂和未混合培养的活化NK细胞、成熟B淋巴细胞、CIK细胞，调节细胞浓度为1*106个/ml，以处于对数生长期的A549细胞（上海麒盟生物科技有限公司，货号：SE1008）作为靶细胞，按效靶比1:1、2:1、5:1和10:1的比例将效应细胞和靶细胞混合，每组平均设3个孔，每孔终体积为200ul。
2)放置在37℃、5%CO2孵箱中继续培养12h后，每孔加入20ul CCK8（天津百萤生物科技有限公司，货号：35000）溶液，继续孵育4h，用酶标仪检测450nm时的OD值。
3)按以下计算公式计算杀伤活性:
杀伤活性(%)=[1-（实验孔OD值-效应孔OD值）/靶细胞孔OD值]×100%
实验结果如下表：
上表中“**”表示对于其它组来说，P<0.01
实验结果显示混合培养后的生物制剂的杀伤活性显著（P<0.01）高于单种细胞的杀伤活性。
Claims (8)
1.一种杀伤肿瘤细胞生物制剂，其特征在于分别对B淋巴细胞、T淋巴细胞以及NK细胞进行活化、刺激、培养之得到浆细胞（成熟B细胞）、CIK细胞及活化的NK细胞，三种细胞混合得到一种高效杀伤肿瘤的生物制剂，培养后细胞混合的细胞数比例为（1~3）：（0.3~3）：（1~3）。
2.根据权利要求1的生物制剂，其特征在于混合之前将NK细胞增殖培养，然后加入NKG2D配体MICA蛋白、MICB蛋白以及药物Lenalidomide刺激培养。
3.根据权利要求1的生物制剂，其特征在于培养浆细胞，即成熟B淋巴细胞，混合之前使用MAGE-3作为刺激源，辅以细胞因子IL-2、IL-10、CD156，刺激培养。
4.根据权利要求1的生物制剂，其特征在于用含有刺激因子IL-2、IL-12的培养基培养CIK细胞，然后将细胞悬液转至CD3单克隆抗体包被培养瓶培养。
5.一种杀伤肿瘤细胞生物制剂的制备方法，其特征在于分别对初始成熟B淋巴细胞、CIK以及NK细胞三种细胞进行活化、刺激、培养之后混合，三种细胞混合的细胞数比例为（1~3）：（0.3~3）：（1~3），其中，在混合之前，加入NKG2D配体MICA蛋白、MICB蛋白以及药物Lenalidomide对NK细胞刺激培养；使用MAGE-3作为刺激源，辅以细胞因子IL-2、IL-10、CD156，对B淋巴细胞刺激培养；用含有刺激因子IL-2、IL-12的培养基培养CIK细胞。
6.根据权利要求5的方法，其特征在于培养第10-13天成熟B淋巴细胞和CIK细胞混合培养，活化的NK细胞加入混合培养体系的时间为第10-14天。
7.一种根据权利要求5或6的方法制备的生物制剂。
8.权利要求1－4、7任一项的生物制剂在制备杀伤肿瘤细胞的药物中的用途。
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