CN106479975A - 多种免疫细胞混合培养方法 - Google Patents

多种免疫细胞混合培养方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106479975A
CN106479975A CN201511020999.7A CN201511020999A CN106479975A CN 106479975 A CN106479975 A CN 106479975A CN 201511020999 A CN201511020999 A CN 201511020999A CN 106479975 A CN106479975 A CN 106479975A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
culture
cik
plus
ctl
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201511020999.7A
Other languages
English (en)
Inventor
张晓南
陈虎
吴芳春
马盖
马一盖
冯凯
贾绍昌
王蔚
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Yulong Shengshi Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Beijing Yulong Shengshi Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Yulong Shengshi Biotechnology Co Ltd filed Critical Beijing Yulong Shengshi Biotechnology Co Ltd
Priority to CN201511020999.7A priority Critical patent/CN106479975A/zh
Publication of CN106479975A publication Critical patent/CN106479975A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0639—Dendritic cells, e.g. Langherhans cells in the epidermis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C12N5/0638—Cytotoxic T lymphocytes [CTL] or lymphokine activated killer cells [LAK]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/22—Colony stimulating factors (G-CSF, GM-CSF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2315—Interleukin-15 (IL-15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/24—Interferons [IFN]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/25—Tumour necrosing factors [TNF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells
    • C12N2502/1114—T cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells
    • C12N2502/1121—Dendritic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells
    • C12N2502/1164—NK cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了多种免疫细胞混合培养方法,包括以下步骤：将制备好的DC-CIK细胞、DC-CTL细胞、DC-NK细胞按细胞个数比13-17：2-4:4-6的比例混合培养，所述培养基由KBM581培养液和溶质组成，所述溶质及其在KBM581培养液中的浓度为40-400IU/mL白介素2、90-600IU/mL白介素15，在培养基中混合培养3、4天后，半量换培养基；培养到6-7天后，再次半量换培养基，并补加rhIL-450-400U/mL，继续培养，制得所述免疫细胞群。本发明将制备好的DC-CIK细胞、DC-CTL细胞、DC-NK细胞按一定比例混合培养，通过试验获得最佳混合比例，最佳培养方式，获得生命周期一致的具有多重杀伤活性的免疫细胞群，极大地提高了免疫细胞的杀毒活性和细胞增殖率。

Description

多种免疫细胞混合培养方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及多种免疫细胞混合培养方法。
背景技术
树突状细胞(Dendritic Cells，DC)源自骨髓中的前体细胞，是已知机体内抗原呈递能力最强的细胞，比普通抗原呈递细胞强1000倍，它在负载肿瘤抗原后，能刺激T淋巴细胞分化为具有抗肿瘤活性的细胞毒性T淋巴细胞，对肿瘤细胞实施特异性杀伤。
细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killers,CIK)是一类抗肿瘤抗病毒效应细胞，能在体外被诱导并大量增殖。
细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte,CTL)，亦叫TC细胞(cytotoxic T cell)，是白细胞的亚部，为一种特异T细胞，专门分泌各种细胞因子参与免疫作用。对某些病毒、肿瘤细胞等抗原物质具有杀伤作用，与自然杀伤细胞构成机体抗病毒、抗肿瘤免疫的重要防线。
自然杀伤细胞(natural killer cells，NK)是与T、B细胞并列的第三类群淋巴细胞。可非特异性直接杀伤靶细胞，这种天然杀伤活性既不需要预先由抗原致敏，也不需要抗体参与，且无MHC限制。
现行临床治疗方案中大多为单一免疫细胞疗法，由于单一免疫细胞的杀伤肿瘤活性的局限性，未达到最佳的治疗效果。
在现有技术中，有将DC细胞与CIK细胞、CTL细胞、NK细胞中的一种共同培养的，DC-CIK细胞增殖能力明显高于CIK细胞，DC-CIK细胞对癌细胞的杀伤率显著高于CIK细胞。国家知识产权局申请号CN201410733771.1的专利申请文件公开了一种DC细胞与CIK细胞的共培养方法。包括步骤：1)提取单个核细胞、2)CIK细胞培养、3)DC细胞培养、DC细胞和CIK细胞混合培养、5)扩增培养。此方法在DC细胞刺激成熟，并与CIK细胞共培养后，按浓度来添加因子GM-CSF，并在培养12小时后，补加因子GM-CSF,从而保持DC细胞活性，延长DC细胞在CIK培养体系中的生存期，长时间保持DC细胞的活性。但在这个方法中仅仅将两种细胞混合培养，不能形成多重杀伤活性，限制了杀伤肿瘤细胞的活性，免疫细胞的增殖率低。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明公开了多种免疫细胞混合培养方法，将制备好的DC-CIK细胞,DC-CTL细胞,DC-NK细胞按一定比例混合培养，获得生命周期一致的具有多重杀伤活性的免疫细胞群。
本发明是通过以下技术方法实现的，多种免疫细胞混合培养方法，包括以下步骤，
将DC-CIK细胞、DC-CTL细胞、DC-NK细胞按细胞个数比13-17：2-4:4-6的比例混合培养，所述培养基由KBM581培养液和溶质组成，所述溶质及其在KBM581培养液中的浓度为40-400IU/mL白介素2、90-600IU/mL白介素15，在培养基中混合培养3、4天后，半量换培养基；培养到6-7天后，再次半量换培养基，并补加rhIL-450-400U/mL，继续培养，制得所述免疫细胞群。
DC细胞负载A549抗原，DC-CIK细胞、DC-CTL细胞和DC-NK细胞在培养基中混合培养后，生命周期趋于一致，生成的免疫细胞群具有多重杀伤活性，本发明通过大量试验得出，按照所述培养比例，按照所述步骤，免疫细胞群对肿瘤细胞的杀伤毒性大大提高，也极大地提高了免疫细胞的增殖率。
白介素2即白细胞介素-2(interleukin-2，IL-2)，又名T细胞生长因子(T cellgrowth factor，TCRF)。主要由活化的CD4+T细胞和CD8+T细胞产生的具有广泛生物活性的细胞因子。是所有T细胞亚群的生长因子，并可促进活化B细胞增殖，故为调控免疫应答的重要因子，也参与抗体反应、造血和肿瘤监视；白介素15可在不表达白介素2的部位发挥类似白介素2的效应。试验证明，白介素2、白介素15和KBM581培养液按所述浓度组成的培养基，极大提高了免疫细胞的增殖型和杀毒活性。
优选地，所述溶质还包括浓度为200-550ng/ml的因子GM-CSF、50-300ng/ml的PD-1mAb。
优选地，DC-CIK细胞、DC-CTL细胞、DC-NK细胞的混合培养比例优选为15:3:5。
优选地，所述rhIL-4的浓度优选200U/mL，所述免疫细胞混合培养时间优选8天。
优选地，所述DC-CIK细胞、DC-CTL细胞、DC-NK细胞的制备包括以下步骤，
1)取肺癌A549细胞一瓶，用MEM+10％FBS+双抗+1mol/L谷氨酰胺作培养基，培养至单层，用ET消化液消化，终止液终止消化，收集细胞，800-1200转/分，离心3-7min,弃上清，轻轻吹散细胞团，加培养液，按1：5比例传代，培养至单层后，收集细胞，每瓶加1-2ml生理盐水，放入-80℃冰箱或直接放入液氮，连续冻融三次，300-500转/分离心后，收获A549肺癌负载抗原，测量A549肺癌负载抗原的浓度，放4℃冰箱备用；
2)取新鲜人脐血，2500-3500转/分，离心5-10min,弃血浆，用PBS按1:2稀释混匀；用另一50ml离心管，加20ml淋巴细胞分离液，所述淋巴细胞分离液d＝1.077，将离心管45°倾斜放置，在其液面上轻轻加入混匀的脐血25ml，2500-3500转/分钟，离心5-12min，吸出细胞，加PBS1500-2500转/分，离心8-12min,重复清洗一次，加KBM淋巴细胞无血清培养基，放CO2培养箱，1h后，将悬浮细胞吸入另一培养瓶，贴壁细胞用于培养DC，贴壁细胞第一天加500-1500u/ml GM-CSF、500-1500u/ml IL-4,第五天加入30-100ng/ml的脂多糖，第六天，加A549肺癌负载抗原20ng-40ng/ml，第七、八天收获DC细胞；
3)用步骤2中获得的悬浮细胞培养分别得到CIK细胞、CTL细胞、NK细胞，将收获的DC细胞分别与CIK细胞、CTL细胞、NK细胞共培养得到DC-CIK细胞、CD-CTL细胞、DC-NK细胞。
ET消化液将细胞集落分散成单个细胞；DC细胞按所述浓度负载A549肺癌抗原提高了混合培养的免疫细胞群的增殖率，本发明通过滴度测量来定量的计算A549抗原的浓度，测量滴度后，根据20-40ng/ml的浓度使DC细胞负载。
优选地，上述步骤1中，肺癌A549细胞消化液消化后的离心转速为1000转/分，离心时间为5min，冻融三次后，肺癌A549细胞离心转速为400转/分。
优选地，上述步骤2中新鲜人脐血的离心转速为3000转/分，离心时间为8min；淋巴细胞分离液与脐血混匀后的离心转速为3000转/分钟，离心时间为10min；吸出细胞，加PBS后的离心转速为2000转/分，离心时间为10min；所述GM-CSF的浓度为1000u/ml、IL-4的浓度为1000u/ml，所述脂多糖的浓度为50ng/ml，所述A549肺癌负载抗原的浓度为33ng/ml。
优选地，所述步骤1中,还包括于培养第2天加入0.2-1mol/L的碳酸氢钠。
碳酸氢钠用来构成缓冲对，提高培养基的缓冲能力。
优选地，所述步骤1中，所述培养基中还包括浓度为20-90ng/ml的TNF-α、50-150ng/ml的IFN-γ。
TNF-α是一种能够直接杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无明显毒性的细胞因子，是迄今为止所发现的直接杀伤肿瘤作用最强的生物活性因子之一。
IFN-γ诱导巨噬细胞可诱导性一氧化氮合酶(inos)产生，促进NO的合成，IFN-γ还可诱导小胶质细胞星形细胞的inos产生。
本发明通过试验，利用培养出的纯度较高、增殖能力较强的单种免疫细胞，通过优化试验，得到最佳免疫细胞混合培养比例及混合培养时机，创制出多种免疫细胞最优化混合培养体系，进而获得生命周期一致的具有多重杀伤活性的免疫细胞群，该免疫细胞群较单一免疫细胞具有更优异的杀伤肿瘤活性。
本发明利用该细胞进行抗肿瘤效果的临床验证，通过与单种细胞治疗效果的对比分析，确定该疗法的临床效果，试验证明本发明混合培养的免疫细胞群用于抗肿瘤治疗效果极佳。
采用上述混合培养比例，获得的免疫细胞群生命周期一致，具有多重杀伤活性，较单一免疫细胞具有更优异的杀伤肿瘤活性；免疫细胞混合培养方法极大地促进了免疫细胞的增殖性和提高了免疫细胞的杀毒活性，极大提高了混合培养的免疫细胞的杀瘤率。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明进一步说明：
图1是本发明多种免疫细胞混合培养方法的免疫细胞生长曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明；下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围；本发明中所使用的设备，如无特殊规定，均为本领域内常用的设备；本发明中所使用的方法，如无特殊规定，均为本领域内常用的方法。
实施例1
多种免疫细胞混合培养方法，包括以下步骤：
将DC-CIK细胞、DC-CTL细胞、DC-NK细胞按细胞个数比13：2:4的比例混合培养，所述培养基由KBM581培养液和溶质组成，所述溶质及其在KBM581培养液中的浓度为40IU/mL白介素2、90IU/mL白介素15，在培养基中混合培养3天后，半量换培养基；培养到6天后，再次半量换培养基，并补加200U/mL的rhIL-4，继续培养到8天，制得所述免疫细胞群。
所述所述DC-CIK细胞、DC-CTL细胞、DC-NK细胞的制备包括以下步骤，
1)取肺癌A549细胞一瓶，用MEM+10％FBS+双抗+1mol/L谷氨酰胺作培养基，培养至单层，用ET消化液消化，终止液终止消化，收集细胞，1000转/分，离心5min,弃上清，轻轻吹散细胞团，加培养液，按1:5比例传代，培养至单层后，收集细胞，每瓶加1-2ml生理盐水，放入-80℃冰箱或直接放入液氮，连续冻融三次，400转/分离心后，收获A549肺癌负载抗原，测量A549肺癌负载抗原的浓度，放4℃冰箱备用；
2)取新鲜人脐血，3000转/分，离心5-10min,弃血浆，用PBS按1:2稀释混匀；用另一50ml离心管，加20ml淋巴细胞分离液，所述淋巴细胞分离液d＝1.077，将离心管45°倾斜放置，在其液面上轻轻加入混匀的脐血25ml，3000转/分钟，离心10min，吸出细胞，加PBS2000转/分，离心10min,重复清洗一次，加KBM淋巴细胞无血清培养基，放CO2培养箱，1h后，将悬浮细胞吸入另一培养瓶，贴壁细胞用于培养DC，贴壁细胞第一天加GM-CSF1000u/ml、IL-41000u/ml,第五天加入50ng/ml的脂多糖，第六天，加A549肺癌负载抗原33ng/ml，第七天收获DC细胞；
3)用步骤2中获得的悬浮细胞培养分别得到CIK细胞、CTL细胞、NK细胞，将收获的DC细胞分别与CIK细胞、CTL细胞、NK细胞共培养得到DC-CIK细胞、CD-CTL细胞、DC-NK细胞。
实施例2
多种免疫细胞混合培养方法，包括以下步骤，
将DC-CIK细胞、DC-CTL细胞、DC-NK细胞按细胞个数比17：4:6的比例混合培养，所述培养基由KBM581培养液和溶质组成，所述溶质及其在KBM581培养液中的浓度为400IU/mL白介素2、600IU/mL白介素15，在培养基中混合培养4天后，半量换培养基；培养到7天后，再次半量换培养基，并补加rhIL-450U/mL，继续培养到9天，制得所述免疫细胞群。
所述DC-CIK细胞、DC-CTL细胞、DC-NK细胞的制备包括以下步骤，
1)取肺癌A549细胞一瓶，用MEM+10％FBS+双抗+1mol/L谷氨酰胺作培养基，培养至单层，用ET消化液消化，终止液终止消化，收集细胞，800转/分，离心3min,弃上清，轻轻吹散细胞团，加培养液，按1：5比例传代，培养至单层后，收集细胞，每瓶加1ml生理盐水，放入-80℃冰箱或直接放入液氮，连续冻融三次，300转/分离心后，收获A549肺癌负载抗原，测量A549肺癌负载抗原的浓度，放4℃冰箱备用；
2)取新鲜人脐血，2500转/分，离心5min,弃血浆，用PBS按1:2稀释混匀；用另一50ml离心管，加20ml淋巴细胞分离液，所述淋巴细胞分离液d＝1.077，将离心管45°倾斜放置，在其液面上轻轻加入混匀的脐血25ml，2500转/分钟，离心5min，吸出细胞，加PBS1500转/分，离心8min,重复清洗一次，加KBM淋巴细胞无血清培养基，放CO2培养箱，1h后，将悬浮细胞吸入另一培养瓶，贴壁细胞用于培养DC，贴壁细胞第一天加500u/ml GM-CSF、500u/ml IL-4,第五天加入30ng/ml的脂多糖，第六天，加A549肺癌负载抗原20ngng/ml，第八天收获DC细胞；
3)用步骤2中获得的悬浮细胞培养分别得到CIK细胞、CTL细胞、NK细胞，将收获的DC细胞分别与CIK细胞、CTL细胞、NK细胞共培养得到DC-CIK细胞、CD-CTL细胞、DC-NK细胞。
实施例3
多种免疫细胞混合培养方法,包括以下步骤，
将DC-CIK细胞、DC-CTL细胞、DC-NK细胞按细胞个数比15：3:5的比例混合培养，所述培养基由KBM581培养液和溶质组成，所述溶质及其在KBM581培养液中的浓度为250IU/mL白介素2、400IU/mL白介素15，在培养基中混合培养4天后，半量换培养基；培养到7天后，再次半量换培养基，并补加400U/mL的rhIL-4，继续培养到8天，制得所述免疫细胞群。
所述DC-CIK细胞、DC-CTL细胞、DC-NK细胞的制备包括以下步骤，
1)取肺癌A549细胞一瓶，用MEM+10％FBS+双抗+1mol/L谷氨酰胺作培养基，培养至单层，用ET消化液消化，终止液终止消化，收集细胞，1200转/分，离心7min,弃上清，轻轻吹散细胞团，加培养液，按1：5比例传代，培养至单层后，收集细胞，每瓶加2ml生理盐水，放入-80℃冰箱或直接放入液氮，连续冻融三次，500转/分离心后，收获A549肺癌负载抗原，测量A549肺癌负载抗原的浓度，放4℃冰箱备用；
2)取新鲜人脐血，3500转/分，离心10min,弃血浆，用PBS按1:2稀释混匀；用另一50ml离心管，加20ml淋巴细胞分离液，所述淋巴细胞分离液d＝1.077，将离心管45°倾斜放置，在其液面上轻轻加入混匀的脐血25ml，3500转/分钟，离心5-12min，吸出细胞，加PBS2500转/分，离心12min,重复清洗一次，加KBM淋巴细胞无血清培养基，放CO2培养箱，1h后，将悬浮细胞吸入另一培养瓶，贴壁细胞用于培养DC，贴壁细胞第一天加1500u/ml GM-CSF、1500u/ml IL-4,第五天加入100ng/ml的脂多糖，第六天，加A549肺癌负载抗原40ng/ml，第八天收获DC细胞；
3)用步骤2中获得的悬浮细胞培养分别得到CIK细胞、CTL细胞、NK细胞，将收获的DC细胞分别与CIK细胞、CTL细胞、NK细胞共培养得到DC-CIK细胞、CD-CTL细胞、DC-NK细胞。
实施例4
多种免疫细胞混合培养方法，包括以下步骤，
将DC-CIK细胞、DC-CTL细胞、DC-NK细胞按细胞个数比14：4:4的比例混合培养，所述培养基由KBM581培养液和溶质组成，所述溶质及其在KBM581培养液中的浓度为150IU/mL的白介素2、340IU/mL的白介素15、200ng/ml的因子GM-CSF、50ng/ml的PD-1mAb在培养基中混合培养4天后，半量换培养基；培养到7天后，再次半量换培养基，并补加rhIL-4150U/mL，继续培养到9天，制得所述免疫细胞群。
所述DC-CIK细胞、DC-CTL细胞、DC-NK细胞的制备包括以下步骤，
1)取肺癌A549细胞一瓶，用MEM+10％FBS+双抗+1mol/L谷氨酰胺作培养基，培养至单层，用ET消化液消化，终止液终止消化，收集细胞，900转/分，离心4min,弃上清，轻轻吹散细胞团，加培养液，按1：5比例传代，培养至单层后，收集细胞，每瓶加1ml生理盐水，放入-80℃冰箱或直接放入液氮，连续冻融三次，350转/分离心后，收获A549肺癌负载抗原，测量A549肺癌负载抗原的浓度，放4℃冰箱备用；
2)取新鲜人脐血，3100转/分，离心6min,弃血浆，用PBS按1:2稀释混匀；用另一50ml离心管，加20ml淋巴细胞分离液，所述淋巴细胞分离液d＝1.077，将离心管45°倾斜放置，在其液面上轻轻加入混匀的脐血25ml，2800转/分钟，离心9min，吸出细胞，加PBS1800转/分，离心11min,重复清洗一次，加KBM淋巴细胞无血清培养基，放CO2培养箱，1h后，将悬浮细胞吸入另一培养瓶，贴壁细胞用于培养DC，贴壁细胞第一天加800u/ml GM-CSF、800u/ml IL-4,第五天加入70ng/ml的脂多糖，第六天，加A549肺癌负载抗原30ng/ml，第七天收获DC细胞；
3)用步骤2中获得的悬浮细胞培养分别得到CIK细胞、CTL细胞、NK细胞，将收获的DC细胞分别与CIK细胞、CTL细胞、NK细胞共培养得到DC-CIK细胞、CD-CTL细胞、DC-NK细胞。
实施例5
多种免疫细胞混合培养方法，包括以下步骤，
将DC-CIK细胞、DC-CTL细胞、DC-NK细胞按细胞个数比16：3:4的比例混合培养，所述培养基由KBM581培养液和溶质组成，所述溶质及其在KBM581培养液中的浓度为340IU/mL白介素2、550IU/mL白介素15，在培养基中混合培养3天后，半量换培养基；培养到7天后，再次半量换培养基，并补加rhIL-4200U/mL，继续培养到9天，制得所述免疫细胞群。
所述DC-CIK细胞、DC-CTL细胞、DC-NK细胞的制备包括以下步骤，
1)取肺癌A549细胞一瓶，用MEM+10％FBS+双抗+1mol/L谷氨酰胺作培养基，培养至单层，用ET消化液消化，终止液终止消化，收集细胞，1100转/分，离心7min,弃上清，轻轻吹散细胞团，加培养液，按1：5比例传代，培养至单层后，收集细胞，每瓶加2ml生理盐水，放入-80℃冰箱或直接放入液氮，连续冻融三次，450转/分离心后，收获A549肺癌负载抗原，测量A549肺癌负载抗原的浓度，放4℃冰箱备用；
2)取新鲜人脐血，3400转/分，离心5min,弃血浆，用PBS按1:2稀释混匀；用另一50ml离心管，加20ml淋巴细胞分离液，所述淋巴细胞分离液d＝1.077，将离心管45°倾斜放置，在其液面上轻轻加入混匀的脐血25ml，3500转/分钟，离心12min，吸出细胞，加PBS2500转/分，离心12min,重复清洗一次，加KBM淋巴细胞无血清培养基，放CO2培养箱，1h后，将悬浮细胞吸入另一培养瓶，贴壁细胞用于培养DC，贴壁细胞第一天加1500u/ml GM-CSF、1500u/ml IL-4,第五天加入100ng/ml的脂多糖，第六天，加A549肺癌负载抗原40ng/ml，第八天收获DC细胞；
3)用步骤2中获得的悬浮细胞培养分别得到CIK细胞、CTL细胞、NK细胞，将收获的DC细胞分别与CIK细胞、NK细胞、CTL细胞共培养得到DC-CIK细胞、CD-CTL细胞、DC-NK细胞。
实施例6
多种免疫细胞混合培养方法，包括以下步骤，
将DC-CIK细胞、DC-CTL细胞、DC-NK细胞按细胞个数比13-17：2-4:4-6的比例混合培养，所述培养基由KBM581培养液和溶质组成，所述溶质及其在KBM581培养液中的浓度为40-400IU/mL白介素2、90-600IU/mL白介素15，在培养基中混合培养3、4天后，半量换培养基；培养到7天后，再次半量换培养基，并补加250U/mL的rhIL-4，继续培养到9天，制得所述免疫细胞群。
所述DC-CIK细胞、DC-CTL细胞、DC-NK细胞的制备包括以下步骤，
1)取肺癌A549细胞一瓶，用MEM+10％FBS+双抗+1mol/L谷氨酰胺作培养基，培养至单层，用ET消化液消化，终止液终止消化，收集细胞，800转/分，离心7min,弃上清，轻轻吹散细胞团，加培养液，按1：5比例传代，培养至单层后，收集细胞，每瓶加2ml生理盐水，放入-80℃冰箱或直接放入液氮，连续冻融三次，500转/分离心后，收获A549肺癌负载抗原，测量A549肺癌负载抗原的浓度，放4℃冰箱备用；
2)取新鲜人脐血，3500转/分，离心5-10min,弃血浆，用PBS按1:2稀释混匀；用另一50ml离心管，加20ml淋巴细胞分离液，所述淋巴细胞分离液d＝1.077，将离心管45°倾斜放置，在其液面上轻轻加入混匀的脐血25ml，3500转/分钟，离心12min，吸出细胞，加PBS2500转/分，离心8-12min,重复清洗一次，加KBM淋巴细胞无血清培养基，放CO2培养箱，1h后，将悬浮细胞吸入另一培养瓶，贴壁细胞用于培养DC，贴壁细胞第一天加1500u/ml GM-CSF、1500u/ml IL-4,第五天加入100ng/ml的脂多糖，第六天，加A549肺癌负载抗原40ng/ml，第八天收获DC细胞；
3)用步骤2中获得的悬浮细胞培养分别得到CIK细胞、CTL细胞、NK细胞，将收获的DC细胞分别与CIK细胞、CTL细胞、NK细胞共培养得到DC-CIK细胞、CD-CTL细胞、DC-NK细胞。
试验例1：DC-CIK,DC-CTL，DC-NK,多种免疫细胞混合杀瘤活性检测试验
1)分组：
试验组：本发明培养得到的免疫细胞群；
对照组：DC-CIK细胞CD-CTL细胞DC-NK细胞。
2)试验方法：试验步骤如下：
(1)将生长旺盛的A549细胞消化，离心，计数，稀释至5*106个细胞/ml，共13ml,分别加入13个25cm2培养瓶，每瓶1ml，备用。
(2)将DC-CIK、CD-CTL、DC-NK分别离心计数，用10ng/ml丝裂霉素各处理1h，稀释至3*106个细胞/ml各4ml，同种细胞分别加入三个已加入A549细胞的培养瓶，每瓶1ml,共9个培养瓶。
(3)取本发明培养得到的免疫细胞混合液，用10ng/ml丝裂霉素处理1h，稀释至3*106个细胞/ml，共3ml，分别加入三个已加入A549细胞的培养瓶，共3个培养瓶，余一个A549培养瓶作为对照，每瓶补液至5ml。
(4)72h后，13个培养瓶分别消化，离心，染色计数，计算A549细胞的凋亡率，其公式为；1-(每瓶细胞总数-免疫细胞数)/对照细胞数*100％。所述A549细胞的凋亡率即免疫细胞的杀瘤率。
表1免疫细胞混合杀瘤活性
结论:上述实验数据表明：采用本发明的免疫细胞混合培养方法得到的免疫细胞群可以大大提高对肿瘤细胞的杀伤能力。
试验例2：细胞增殖试验
试验步骤如下：
1)将A549细胞消化、离心、计数、用10ng/ml丝裂霉素处理1h，稀释至1*106个细胞/ml，共2ml,加入96孔细胞培养板15孔，每孔100ul，其中3孔为阴性对照，12孔为试验孔，设一空白孔备用。
2)将DC-CIK,DC-CTL,DC-NK分别离心、计数、稀释至1*106个细胞/ml，各1ml,分别加入3孔有A549细胞的96孔细胞培养板，每孔100ul，共9孔。
3)将本发明培养方法得到的免疫细胞群，离心，计数，稀释至1*106个细胞/ml加入有A549细胞的96孔培养板3孔，每孔100ul。
4)各孔补液至200ul，放37℃，5％CO2培养箱，培养至第四天，每孔补培养液100Ul,第七天按所购T细胞增殖检测试剂盒得要求进行试验，用酶标仪测其OD值，同种三孔细胞OD值的平均值为其试验OD值，计算出细胞的增殖系数，绘制出表格。
计算公式：(试验孔OD值-空白孔OD值)/(阴性孔OD值-空白孔OD值)*100％
表2免疫细胞增殖率
结论:本发明免疫细胞混合培养方法,极大地提高了免疫细胞增殖率；免疫细胞作用于A549细胞，因为有DC负载过A549抗原，免疫细胞对A549起作用，负载后的DC会刺激免疫细胞增殖，细胞数量多，则OD值大。
试验例3、免疫细胞生长曲线测定
分别取培养到第1、3、6、9天的免疫细胞群，用计数仪进行计数，绘制免疫细胞的生长曲线。结果见表3和图1。
表3不同培养时间免疫细胞的扩增数目
培养天数 第1天 第3天 第6天 第9天
细胞数目*108 1.21 11.42 41.35 78.31
由上述表3和图1可知,免疫细胞混合培养在第1-3天细胞基本呈直线缓慢生长趋势,在第3天后开始达到对数生长期,第9天达到最大数值。
试验4免疫细胞流式抗体检测
1)分组：
试验组：本发明培养得到的免疫细胞群；
对照组：DC-CIK细胞DC-CTL细胞DC-NK细胞。
2)试验方法：试验步骤如下：
(1)分别取本发明实施例1培养得到的DC-CIK细胞、DC-CTL细胞、DC-NK细胞和混合培养得到的免疫细胞群，转移入流式检测管，加3mLPBS充分混匀，离心洗涤细胞(离心条件：1600rpm，5min)；倾去离心上清，根据细胞样本浓度和体积，用适量PBS悬浮细胞，调整细胞浓度为1x107/mL；
(2)荧光标记细胞：标记流式检测管,加入待检测单克隆抗体，待检测单克隆抗体包括CD3+CD56+、CD3+CD8+、CD4+CD16+、CD3+CD5+、CD19+，每种抗体量为8μl，每管加入100ul待测细胞样本悬液；
(3)漩涡振荡器上轻轻转动混匀,室温避光孵育15min；
(4)加3mLPBS洗涤，离心，1600rpm，5min，倾去上清，加入500ulPBS悬浮沉淀，充分混匀；
(5)上机检测，结果见表4、表5、表6、表7
表4 DC-CIK细胞免疫表型
表5 DC-CTL细胞细胞免疫表型
表6 DC-NK细胞细胞免疫表型
表7本发明免疫细胞群免疫表型
由上述表格可知本发明免疫细胞群较DC-CIK细胞、DC-CTL细胞、DC-NK细胞CD3+CD56+细胞、CD3+CD8+细胞、CD3+CD5+细胞所占比例较大，T淋巴细胞(CD3+细胞)占细胞总数的98％以上。
以上所述实施例仅仅是本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.多种免疫细胞混合培养方法，其特征在于，包括以下步骤，
将DC-CIK细胞、DC-CTL细胞、DC-NK细胞按细胞个数比13-17：2-4:4-6的比例混合培养，所述培养基由KBM581培养液和溶质组成，所述溶质及其在KBM581培养液中的浓度为40-400IU/mL白介素2、90-600IU/mL白介素15，在培养基中混合培养3、4天后，半量换培养基；培养到6-7天后，再次半量换培养基，并补加50-400U/mL的rhIL-4，继续培养，制得所述免疫细胞群。
2.根据权利要求1所述多种免疫细胞混合培养方法，其特征在于，所述溶质还包括浓度为200-550ng/ml的因子GM-CSF、50-300ng/ml的PD-1mAb。
3.根据权利要求1所述多种免疫细胞混合培养方法，其特征在于，DC-CIK细胞、DC-CTL细胞、DC-NK细胞的混合培养比例优选为15:3:5。
4.根据权利要求1所述多种免疫细胞混合培养方法，其特征在于，所述rhIL-4的浓度优选200U/mL，所述免疫细胞混合培养时间优选8天。
5.根据权利要求1所述的多种免疫细胞混合培养方法，其特征在于，所述DC-CIK细胞、DC-CTL细胞、DC-NK细胞的制备包括以下步骤，
1)取肺癌A549细胞一瓶，用MEM+10％FBS+双抗+1mol/L谷氨酰胺作培养基，培养至单层，用ET消化液消化，终止液终止消化，收集细胞，800-1200转/分，离心3-7min,弃上清，轻轻吹散细胞团，加培养液，按1：5比例传代，培养至单层后，收集细胞，每瓶加1-2ml生理盐水，放入-80℃冰箱或直接放入液氮，连续冻融三次，300-500转/分离心后，收获A549肺癌负载抗原，测量A549肺癌负载抗原的浓度，放4℃冰箱备用；
2)取新鲜人脐血，2500-3500转/分，离心5-10min,弃血浆，用PBS按1:2稀释混匀；用另一50ml离心管，加20ml淋巴细胞分离液，所述淋巴细胞分离液d＝1.077，将离心管45°倾斜放置，在其液面上轻轻加入混匀的脐血25ml，2500-3500转/分钟，离心5-12min，吸出细胞，加PBS1500-2500转/分，离心8-12min,重复清洗一次，加KBM淋巴细胞无血清培养基，放CO2培养箱，1h后，将悬浮细胞吸入另一培养瓶，贴壁细胞用于培养DC，贴壁细胞第一天加500-1500u/ml GM-CSF、500-1500u/ml IL-4,第五天加入30-100ng/ml的脂多糖，第六天，加A549肺癌负载抗原20ng-40ng/ml，第七、八天收获DC细胞；
3)用步骤2中获得的悬浮细胞培养分别得到CIK细胞、CTL细胞、NK细胞，将收获的DC细胞分别与CIK细胞、CTL细胞、NK细胞共培养得到DC-CIK细胞、CD-CTL细胞、DC-NK细胞。
6.根据权利要求4所述的多种免疫细胞混合培养方法，其特征在于，所述步骤1中,还包括于培养第2天加入0.2-1mol/L的碳酸氢钠。
7.根据权利要求4所述多种免疫细胞混合培养方法，其特征在于，所述步骤1中，所述培养基中还包括浓度为20-90ng/ml的TNF-α、50-150ng/ml的IFN-γ。
8.根据权利要求4所述的多种免疫细胞混合培养方法，其特征在于，所述步骤1中，肺癌A549细胞消化液消化后的离心转速优选1000转/分，离心时间优选5min，冻融三次后，离心转速优选400转/分。
9.根据权利要求4所述的多种免疫细胞混合培养方法，其特征在于，所述步骤2中，新鲜人脐血的离心转速优选3000转/分，离心时间优选8min；淋巴细胞分离液与脐血混匀后的离心转速优选3000转/分钟，离心时间优选10min；吸出细胞，加PBS后的离心转速优选2000转/分，离心时间优选10min。
10.根据权利要求4所述的多种免疫细胞混合培养方法，其特征在于，所述步骤2中贴壁细胞的培养，GM-CSF的浓度优选1000u/ml、IL-4的浓度优选1000u/ml，所述脂多糖的浓度优选50ng/ml，所述A549肺癌负载抗原的浓度优选33ng/ml。
CN201511020999.7A 2015-12-30 2015-12-30 多种免疫细胞混合培养方法 Pending CN106479975A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201511020999.7A CN106479975A (zh) 2015-12-30 2015-12-30 多种免疫细胞混合培养方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201511020999.7A CN106479975A (zh) 2015-12-30 2015-12-30 多种免疫细胞混合培养方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106479975A true CN106479975A (zh) 2017-03-08

Family

ID=58238680

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201511020999.7A Pending CN106479975A (zh) 2015-12-30 2015-12-30 多种免疫细胞混合培养方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106479975A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110305840A (zh) * 2019-07-12 2019-10-08 赛德特生物科技开发有限公司 改善自身免疫疾病的免疫细胞培养基及其制备方法与应用
CN113061577A (zh) * 2017-09-05 2021-07-02 四川新生命干细胞科技股份有限公司 一种高纯度nk细胞的分离培养方法
CN114657124A (zh) * 2022-05-26 2022-06-24 全球细胞控股(广州)有限公司 一种对肿瘤细胞具有高杀伤能力的复合型免疫细胞制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103800898A (zh) * 2014-03-13 2014-05-21 蔡颖 一种肿瘤特异性杀伤细胞制剂及其制备方法
CN104651311A (zh) * 2014-09-03 2015-05-27 深圳市茵冠生物科技有限公司 制备dc-ctl的试剂盒及其应用
CN105106237A (zh) * 2015-08-25 2015-12-02 北京康爱瑞浩生物科技股份有限公司 一种高效杀伤肿瘤细胞生物制剂
CN105176927A (zh) * 2015-10-15 2015-12-23 丛秀丽 一种细胞毒性增强的高效靶向杀伤nk/cik细胞的制备方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103800898A (zh) * 2014-03-13 2014-05-21 蔡颖 一种肿瘤特异性杀伤细胞制剂及其制备方法
CN104651311A (zh) * 2014-09-03 2015-05-27 深圳市茵冠生物科技有限公司 制备dc-ctl的试剂盒及其应用
CN105106237A (zh) * 2015-08-25 2015-12-02 北京康爱瑞浩生物科技股份有限公司 一种高效杀伤肿瘤细胞生物制剂
CN105176927A (zh) * 2015-10-15 2015-12-23 丛秀丽 一种细胞毒性增强的高效靶向杀伤nk/cik细胞的制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
WANG Y等: "The combination of dendritic cells‑cytotoxic T lymphocytes/cytokine‑induced killer (DC‑CTL/CIK) therapy exerts immune and clinical responses in patients with malignant tumors", 《EXP HEMATOL ONCOL》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113061577A (zh) * 2017-09-05 2021-07-02 四川新生命干细胞科技股份有限公司 一种高纯度nk细胞的分离培养方法
CN110305840A (zh) * 2019-07-12 2019-10-08 赛德特生物科技开发有限公司 改善自身免疫疾病的免疫细胞培养基及其制备方法与应用
CN114657124A (zh) * 2022-05-26 2022-06-24 全球细胞控股(广州)有限公司 一种对肿瘤细胞具有高杀伤能力的复合型免疫细胞制备方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105087487B (zh) 一种高效扩增cik的方法
CN108220239B (zh) 一种刺激诱导单个核细胞扩增为γδT细胞的组合物及其应用
CN107326008A (zh) 一种从外周血中高效高纯度扩增自然杀伤细胞的方法
CN101302491B (zh) 高效扩增活化淋巴细胞的方法和培养系统
CN102600462B (zh) 人树突状细胞肿瘤疫苗及其制备方法和应用
CN107022524A (zh) 一种从外周血单个核细胞中大量扩增nk细胞的方法
CN104928243A (zh) 实体瘤患者自体nk细胞分离、活化扩增及活性检测方法
CN105349489A (zh) 一种cik细胞的培养方法
CN105754941A (zh) 一种外周血nk细胞的体外诱导扩增培养方法
CN105087488A (zh) 一种肿瘤抗原诱导的dc-cik细胞的制备方法及应用
CN110938594A (zh) 一种功能增强型til细胞的培养方法
CN105087486A (zh) 一种cik细胞培养液及cik细胞的培养方法和香菇多糖在cik细胞培养中的应用
CN104789527A (zh) 一种自体自然杀伤细胞鸡尾酒式培养的制备方法及其试剂盒产品
CN106479975A (zh) 多种免疫细胞混合培养方法
CN102827809B (zh) 高增殖能力、高细胞毒活性、高存活率的cik细胞制备方法、相关cik细胞及应用
CN108949685A (zh) 一种体外诱导扩增高杀伤活性γδT细胞的方法
CN105039255A (zh) 一种nkt细胞诱导培养的添加剂及诱导培养的方法
CN105154401A (zh) 一种大规模培养nkt细胞的方法
CN104711224A (zh) 一种提高人Vδ2T细胞扩增效率的体外培养方法及应用
CN103374548A (zh) 一种肿瘤浸润淋巴细胞的高效扩增培养液
CN103800897A (zh) 一种肿瘤特异抗原表位多肽负载的树突状细胞疫苗制备方法及其试剂盒
CN102988415A (zh) 人异基因有核细胞工业化制备自然杀伤性细胞（nk）及注射液
CN110272871A (zh) 一种刺激诱导单个核细胞扩增为γδT细胞的组合物及其应用
CN103834614A (zh) 一种附子多糖诱导nkt细胞增殖的制备方法及其应用
CN105002140B (zh) 一种增强lak细胞杀伤活性和增殖活性的培养方法和用途

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20170308