CN105154401A - 一种大规模培养nkt细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于细胞生物学领域，具体公开了一种大规模培养NKT细胞的方法。本发明所述大规模培养NKT细胞的方法用含有IL-2和IL-15的RPMI1640培养基重悬PBMC，加入铁皮石斛素和自体血清；将重悬后的PBMC接种到含有成熟DC细胞的诱导NKT细胞的培养板中，37℃、5％CO₂培养箱中孵育；孵育5天后，将培养板中诱导的NKT细胞转入细胞培养瓶扩增培养，培养到第14天收集细胞。本发明所述方法操作简单，安全无害。实验表明，采用本发明所述大规模培养NKT细胞的方法能刺激NKT细胞的大量增殖，并且培养的NKT细胞细胞活率高，对K562细胞的杀伤能力明显增强。

Description

一种大规模培养NKT细胞的方法

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种大规模培养NKT细胞的方法。

背景技术

NKT细胞(自然杀伤T细胞)是继自然杀伤细胞(NK细胞)、T淋巴细胞、B淋巴细胞之后又一类新型的T淋巴细胞，属于第4类免疫细胞。NKT细胞主要分布在骨髓、肝和胸腺，在脾、淋巴结和外周血中也有少量存在。NKT细胞绝大多数为CD4-CD8-双阴性T细胞，少数为CD4+单阳性T细胞。NKT细胞表面TCR可识别不同靶细胞表面CDl分子提呈的共有椭脂类和糖脂类抗原，且不受MHC限制。NKT细胞最佳刺激效应物是α-半乳糖神经酰胺(α-Galcer)，是一类来源于海绵体或共生微生物的提取物。

NKT细胞的主要生物学功能是细胞毒和免疫调节作用。NKT细胞的细胞毒作用表现在NKT细胞可组成性表达IL-l2IL-2和IFN-γ等细胞因子的受体。在相应抗原或细胞因子作用下，NKT细胞活化，并通过分泌穿孔素使某些病毒感染、胞内寄生菌感染的靶细胞和肿瘤靶细胞发生溶解破坏；也可通过表达FasL，经Fas/FasL途径使上述靶细胞发生凋亡。而NKT细胞的免疫调节作用表现在活化NKT细胞可分泌IL-4和IFN-γ等细胞因子。IL-4可诱导CD4+Th0细胞向CD4+Th2细胞分化，参与体液免疫应答或诱导B细胞发生IgE类别转换，参与速发型超敏反应；IFN-γ与IL-12协同作用，可使CD4+Th0细胞向CD4+Thl细胞分化，增强细胞免疫应答。此外NKT细胞还可分泌多种趋化性细胞因子如MCP-1α、MIP-β1等参与炎症反应。

近几年在其表型特征、分布及发育、免疫学效应及与疾病关系、肿瘤治疗和自身免疫性疾病治疗等方面的研究有了很大的发展。现有研究表明，NKT细胞在肝炎、脂肪肝等肝病的发病过程中发挥重要作用，总之，NKT细胞作为一类新型的免疫调节细胞，在癌症抗肿瘤、抗感染、自身免疫性疾病等治疗中具有远大的应用前景。

目前NKT细胞的培养主要是直接添加细胞因子诱导纯化刺激细胞增殖或通过筛选特定细胞株共同培养刺激细胞的增殖，使分离外周血得到的PBMC中NKT细胞纯化增殖。但上述培养方法培养的细胞数量少，操作繁琐、效率低。而效应细胞数量的多少，直接影响了杀伤率，也就影响到各种疾病的治疗效果。此外还可通过筛选癌症细胞株辐照后诱导培养NKT细胞。但此法有具有一定的安全隐患，如辐照不完全，可能给患者引入新的癌细胞。

发明内容

有鉴于此，本发明目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种大规模培养NKT细胞的方法。采用本发明所述大规模培养NKT细胞的方法能刺激NKT细胞的大量增殖，高效简单，安全无害。

为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种大规模培养NKT细胞的方法，包括如下步骤：

A、用含有IL-2和IL-15的RPMI1640培养基重悬PBMC，加入铁皮石斛素和自体血清；

B、将重悬后的PBMC接种到含有成熟DC细胞的诱导NKT细胞的培养板中，37℃、5％CO₂培养箱中孵育；

C、孵育5天后，将培养板中诱导的NKT细胞转入细胞培养瓶扩增培养，培养到第14天收集细胞。

本发明所述的大规模培养NKT细胞的方法步骤A在培养基中添加铁皮石斛素和自体血清。自体血清可以为细胞提供生长所需的细胞因子和营养物质，且安全性高。而铁皮石斛素的添加不仅能促进NKT细胞的增殖和生长，同时具有辅助治疗作用，且安全无毒副作用。

其中，在一些实施方案中，本发明所述的大规模培养NKT细胞的方法步骤A中所述加入铁皮石斛素的终浓度为2mg/mL～12mg/mL。

在一些实施方案中，本发明所述的大规模培养NKT细胞的方法步骤A中所述自体血清的加入量为含有IL-2和IL-15的RPMI1640培养基的10v/v％。

在一些实施方案中，本发明所述的大规模培养NKT细胞的方法步骤A重悬后的PBMC的细胞密度为0.5×10⁶个/mL～1×10⁶个/mL。

在一些实施方案中，本发明大规模培养NKT细胞的方法步骤A中所述RPMI1640培养基中IL-2的浓度为100U/mL～1000U/mL，IL-15的浓度为50ng/mL～200ng/mL。

本发明所述的大规模培养NKT细胞的方法步骤B采用成熟DC细胞固定在培养板上与PBMC共同培养诱导NKT细胞，提供了相对稳定的培养环境，同时提高了安全性。

在一些实施方案中，本发明所述的大规模培养NKT细胞的方法中步骤B所述含有成熟DC细胞的诱导NKT细胞的培养板的制备方法为用含有GM-CSF和IL-4的RPMI1640培养基重悬PBMC于37℃、5％CO₂培养箱中培养，每隔3天换一次液，第5天加入肿瘤抗原，第6天加入TNF-α，第7天收集成熟的DC细胞，在37℃、5％CO₂培养箱中铺板培养。

其中，在一些实施方案中，所述含有成熟DC细胞的诱导NKT细胞的培养板的制备方法中所述含有GM-CSF和IL-4的RPMI1640培养基中GM-CSF和IL-4的浓度均为200U/mL～800U/mL。

在一些实施方案中，所述含有成熟DC细胞的诱导NKT细胞的培养板的制备方法中所述肿瘤抗原的工作浓度为20μg/mL～80μg/mL。

在一些实施方案中，所述含有成熟DC细胞的诱导NKT细胞的培养板的制备方法中所述TNF-α的工作浓度为200U/mL～800U/mL。

在一些具体实施方案中，所述铺板培养的时间为2h。

本发明所述的大规模培养NKT细胞的方法中步骤C将培养板中诱导的NKT细胞转入细胞培养瓶扩增培养。

在一些实施方案中，所述扩增培养具体为每隔2天进行补液，补液前保证细胞的密度不大于3×10⁶个/mL，补液后保证细胞密度为0.5×10⁶个/mL～1×10⁶个/mL。

其中，所述补液成分与步骤A完全相同。即含有IL-2、IL-15、铁皮石斛素和自体血清的RPMI1640培养基，所述RPMI1640培养基中IL-2的浓度为100U/mL～1000U/mL，IL-15的浓度为50ng/mL～200ng/mL，所述铁皮石斛素的终浓度为2mg/mL～12mg/mL，所述自体血清的加入量为含有IL-2和IL-15的RPMI1640培养基的10v/v％。

本发明所述的大规模培养NKT细胞的方法还包括PBMC分离的步骤。

在一些实施方案中，本发明所述的大规模培养NKT细胞的方法采用淋巴细胞分离管分离PBMC，分离得到的PBMC更多，且红细胞少，减少后期红细胞对NKT细胞生长的影响。

在一些实施方案中，所述PBMC分离的步骤具体为抽取外周血，用生理盐水按1:1的比例稀释，缓慢的加到Ficoll淋巴细胞分离液上，800g离心20min；离心结束后，抽取单核球(PBMC)条带层于离心管中，用生理盐水定容后400g离心10min；将上述离心的PBMC再次400g离心10min。

本发明所述大规模培养NKT细胞的方法用含有IL-2和IL-15的RPMI1640培养基重悬PBMC，加入铁皮石斛素和自体血清；将重悬后的PBMC接种到含有成熟DC细胞的诱导NKT细胞的培养板中，37℃、5％CO₂培养箱中孵育；孵育5天后，将培养板中诱导的NKT细胞转入细胞培养瓶扩增培养，培养到第14天收集细胞。本发明所述方法操作简单，安全无害。实验表明，采用本发明所述大规模培养NKT细胞的方法能刺激NKT细胞的大量增殖，并且培养的NKT细胞细胞活率高，对K562细胞的杀伤能力明显增强。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示实施例3中A组培养方法培养的P2代NKT细胞的细胞表面标志物的表达结果图，其中图a为FSC及SSC表达情况图，图b为CD56及CD3表达情况图；

图2示实施例3中B组培养方法培养的P2代NKT细胞的细胞表面标志物的表达结果图，其中图a为FSC及SSC表达情况图，图b为CD56及CD3表达情况图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供进行详细说明。其中Ficoll为淋巴细胞分离液。

实施例1：诱导NKT细胞的培养板的制备：

1、抽取约20mL外周血，把外周血转移至50mL离心管中，用生理盐水按1:1的比例稀释，缓慢的加到Ficoll淋巴细胞分离液上，800g离心20min；

2、离心结束后，抽取单核球(PBMC)条带层于15mL离心管中，用生理盐水定容至15mL，400g离心10min；将上述离心的PBMC再次400g离心10min；

3、离心后去除上清，用含有浓度500U/mLGM-CSF、500U/mlIL-4的RPMI1640培养液重悬PBMC，接种到75Tflask中，放入37℃、5％CO₂培养箱中培养；

4、每隔3天换一次液，第5天加入浓度50U/mL肿瘤抗原，第6天加入500U/mLTNF-α；第7天收集成熟的DC细胞，将收集到的DC细胞在24孔盘中铺板，在37℃、5％CO₂培养箱中孵育2h后待用。

实施例2：NKT细胞的大规模培养：

1、按照实施例1的方法步骤1和步骤2收集PBMC，同时收集自体血清备用；

2、将收集到的PBMC用含有浓度500U/mLIL-2、100ng/mLIL-15的RPMI1640培养基重悬，并加入铁皮石斛素至终浓度为6mg/mL和10v/v％的自体血清，至细胞密度为0.5～1×10⁶个/mL；

3、将重悬后的PBMC接种到实施例1制备得到含有成熟DC细胞的诱导NKT细胞的培养板中，37℃、5％CO₂培养箱中孵育；

4、孵育5天后，将24孔盘中诱导的NKT细胞转入到T75flask中进行培养，每隔2天进行补液，补液成分与实施例2步骤2完全相同，补液前保证细胞的密度不大于3×10⁶个/mL，补液后保证细胞密度为0.5～1×10⁶个/mL，细胞长满1瓶T75时转入T175flask中扩增培养；

5、培养到第14天收集细胞。

实施例3：NKT细胞的效果测试

分别取相同培养条件(37℃，5％CO2浓度)下，A、B两组不同方法培养的NKT细胞进行效果测试，其中A组为单独用DC诱导培养的NKT细胞，B组为实施例2所述的方法加入铁皮石斛素和DC细胞共同培养的NKT细胞。

1、100μL不同方法培养的NKT细胞，加入FITC标记的TCRVβ11单克隆抗体，避光孵育20min，加入0.5mLPBS，测定人外周血培养的NKT细胞扩增后效应细胞的比较，结果如表1：

表1两种培养方法培养的NKT细胞扩增后效应细胞的比较

对比项目	A组	B组
			效应细胞比率(％)	21.51±7.3	30.68±10.2
效应细胞数目(105)	10.1±5.7	15.7±7.9
			效应细胞扩增倍数	19.4±13.5	27.6±13.9

结果显示，在相同的培养条件下，B组所培养的NKT细胞中效应细胞数目、比率及扩增倍数都明显优于A组。

2、A、B两组培养方法培养的NKT细胞体外杀伤活性的比较

取靶细胞K562细胞离心，调整靶细胞的密度为1×10⁵个/mL，离心收集两组不同方法培养的NKT细胞，使效靶比分别为10:1、20:1和40:1，每组设置3个复孔，37℃、5％CO₂培养箱中孵育2h，待充分溶解沉淀后于酶联免疫检测仪检测吸光度(A)，计算杀伤率，结果如表2。其中杀伤率的计算公式为：杀伤率(％)＝[1-(实验孔-效应孔/靶细胞孔)]×100％。

表2A、B两组不同培养方法培养的NKT细胞体外杀伤活性对比

结果显示，在相同的效靶比条件下，B组的杀伤率明显优于A组，且差异有统计学意义(P<0.01)。

3、流式检测两组细胞中细胞表面抗原的数量

分别抽取相同数量(细胞数在1×10⁶个以上)两种不同方法培养的A、B两组的细胞，A、B两组不同方法培养14天后，用流式细胞仪测定两组不同培养方法的NKT细胞表面抗原CD3⁺，CD56⁺，结果见图1和图2。

结果显示，B组培养方法培养的NKT细胞表面抗原CD3+、CD56+的比例高于A组，说明B组NKT效应细胞的含量高于A组。

Claims (10)

1.一种大规模培养NKT细胞的方法，包括如下步骤：

A、用含有IL-2和IL-15的RPMI1640培养基重悬PBMC，加入铁皮石斛素和自体血清；

B、将重悬后的PBMC接种到含有成熟DC细胞的诱导NKT细胞的培养板中，37℃、5％CO₂培养箱中孵育；

C、孵育5天后，将培养板中诱导的NKT细胞转入细胞培养瓶扩增培养，培养到第14天收集细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，步骤A中所述加入铁皮石斛素的终浓度为2mg/mL～12mg/mL。

3.根据权利要求1或2所述的方法，步骤A中所述自体血清的加入量为含有IL-2和IL-15的RPMI1640培养基的10v/v％。

4.根据权利要求1-3任意一项所述的方法，步骤A中所述RPMI1640培养基中IL-2的浓度为100U/mL～1000U/mL，IL-15的浓度为50ng/mL～200ng/mL。

5.根据权利要求1-4任意一项所述的方法，步骤A重悬后的PBMC的细胞密度为0.5×10⁶个/mL～1×10⁶个/mL。

6.根据权利要求1-5任意一项所述的方法，步骤B所述含有成熟DC细胞的诱导NKT细胞的培养板的制备方法为用含有GM-CSF和IL-4的RPMI1640培养基重悬PBMC于37℃、5％CO₂培养箱中培养，每隔3天换一次液，第5天加入肿瘤抗原，第6天加入TNF-α，第7天收集成熟的DC细胞，在37℃、5％CO₂培养箱中铺板培养。

7.根据权利要求6所述的方法，所述含有GM-CSF和IL-4的RPMI1640培养基中GM-CSF和IL-4的浓度均为200U/mL～800U/mL。

8.根据权利要求6所述的方法，所述肿瘤抗原的工作浓度为20μg/mL～80μg/mL，所述TNF-α的工作浓度为200U/mL～800U/mL。

9.根据权利要求1-8任意一项所述的方法，步骤C所述扩增培养具体为每隔2天进行补液，补液的培养基及添加成分与步骤A完全相同，补液前保证细胞的密度不大于3×10⁶个/mL，补液后保证细胞密度为0.5×10⁶个/mL～1×10⁶个/mL。

10.根据权利要求1-10任意一项所述的方法，还包括PBMC分离的步骤，所述PBMC分离具体为抽取外周血，用生理盐水按1:1的比例稀释，缓慢的加到Ficoll淋巴细胞分离液上，800g离心20min；离心结束后，抽取单核球条带层于离心管中，用生理盐水定容后400g离心10min；将上述离心的PBMC再次400g离心10min。